ES2918323T3

ES2918323T3 - Células madre mesenquimatosas ABC5 positivas como inmunomoduladores

Info

Publication number: ES2918323T3
Application number: ES14168199T
Authority: ES
Inventors: Markus Frank
Original assignee: Boston Childrens Hospital
Current assignee: Boston Childrens Hospital
Priority date: 2006-05-31
Filing date: 2007-05-31
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2027-05-31
Also published as: PL2035549T3; EP2035549A1; AU2007254894B2; EP2035549B1; HK1201295A1; SI2772535T1; US8455245B2; LT2772535T; HUE059011T2; PT2035549E; US20080003206A1; DK2035549T3; PT2772535T; AU2007254894A1; US20180320131A1; HK1129703A1; DK2772535T3; AU2007254894B9; EP2772535A1; SI2035549T1

Abstract

La presente invención se dirige a preparaciones purificadas de células madre mesenquimales dérmicas que se caracterizan por la expresión de la superficie celular de la glicoproteína P ABCB 5. Las células pueden usarse para cualquier propósito que se usen células madre mesenquimales de otro curso. Por ejemplo, se pueden administrar para tratar a un receptor de trasplante de órganos para mejorar la supervivencia del aloinjerto o como tratamiento para pacientes con enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple y la artritis reumatoide. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Células madre mesenquimatosas ABC5 positivas como inmunomoduladores

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a métodos para la generación de tejido usando preparaciones purificadas y multiplicadas de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas, y a composiciones de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas para su uso en la promoción de la regeneración de tejido para tratar un trastorno de tejido conjuntivo. La invención también se refiere a matrices sembradas con células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5+, y a composiciones de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas para su uso en la reconstrucción de una córnea dañada en un sujeto que tiene una córnea dañada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las estrategias inmunomoduladoras basadas en células madre son ahora una nueva frontera terapéutica en el alotrasplante clínico (Frank, et al., Lancet 363:1411 (2004)). Se ha descubierto, por ejemplo, que las células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea (CMM-MO) adulta pueden inhibir la proliferación de linfocitos T en respuesta a mitógenos y aloantígenos in vitro (Le Blanc, et al., Scand. J. Immunol. 57:11 (2003); Rasmusson, et al., Exp. Cell Res. 305:33 (2005)). Debido a su fácil accesibilidad, la piel es una posible fuente particularmente atractiva de células madre terapéuticamente útiles. Sin embargo, la identificación de marcadores moleculares para el aislamiento y la expansión de células madre dérmicas puras es un problema significativo y los efectos biológicos específicos de estas células son en gran parte desconocidos.

Recientemente, se clonó un novedoso transportador de casete de unión a ATP (ABC) humano, la P-glucoproteína ABCB5, y se ha indicado que esta proteína puede servir de marcador para el aislamiento de una subpoblación de células madre (Frank, et al., J. Biol. Chem. 278:47156 (2003); Frank, et al., Cancer Res. 65:4320 (2005); documento de patente US 6.846.883).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se explica en el conjunto adjunto de reivindicaciones.

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que las células madre mesenquimatosas dérmicas que expresan ABCB5 tienen propiedades inmunomoduladoras y pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades inmunomediadas. La proteína ABCB5 se expresa sobre la superficie de las células madre y se puede usar tanto en su identificación, por ejemplo, usando inmunofluorescencia, como purificación, por ejemplo, usando anticuerpos inmovilizados sobre un sustrato inerte.

Las células madre mesenquimatosas dérmicas (CMM dérmicas) inmunomoduladoras se obtienen de una muestra de piel humana y entonces las células ABCB5 positivas se aíslan de la muestra. Las células ABCB5 se pueden identificar, por ejemplo, por inmunofluorescencia usando anticuerpos contra la proteína humana y por otros métodos también. A este respecto, se debe observar que las secuencias de aminoácidos completas y de genes para ABCB5 humana se conocen en la técnica (véase el N.° de acceso de GenBank NM_178559 y NP_848654) y se han descrito previamente anticuerpos monoclonales específicos para esta proteína (véanse, por ejemplo, Frank, et al., Cancer Res. 65:4320-4333 (2005); Frank, et al., J. Biol. Chem. 278:47156-47165 (2003)). Un método preferido para el aislamiento de células ABCB5 positivas es mediante el uso de anticuerpos que reconocen específicamente esta proteína y que se han inmovilizado, por ejemplo, sobre una perla o relleno de columna. Una vez obtenidas, las células se pueden clonar por dilución limitante y expandir usando métodos bien conocidos en la técnica (véase la sección de ejemplos para una discusión adicional). Las CMM dérmicos ABCB5 purificadas se pueden administrar a un sujeto con el fin de modular la actividad de las células asociadas con la inmunidad, por ejemplo para inhibir la activación de linfocitos T. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, por vía intravenosa inyectando o infundiendo el sujeto con entre 1x107 - 1x1010 células.

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un método in vitro de generación de tejido que comprende activar una preparación purificada y multiplicada aislada de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas in vitro para la diferenciación en células de hueso, cartílago, ligamento, tendón, estroma, músculo y adiposas.

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona una composición de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas para su uso en promocionar la regeneración de tejido para tratar un trastorno de tejido conjuntivo, en donde las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se usan in vivo para generar tejido por inducción de diferenciación, y en donde el tejido es hueso, cartílago, ligameno, tendón, estroma, músculo o adiposo.

Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona una matriz sembrada con una población de células madre dérmicas, en donde al menos el 95 % de la población de células madre dérmicas son células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5+.

Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una composición de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas para su uso en la reconstrucción de una córnea dañada en un sujeto que tiene una córnea dañada, en donde la composición de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se administra al sujeto.

También se desvelan células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas para su uso en la modulación de la expresión de moléculas inmunitarias en una célula de un sujeto administrando a un sujeto células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas en una cantidad eficaz para modular la expresión de moléculas inmunitarias en células del sujeto. Por ejemplo, se demuestra en el presente documento que el trasplante in vivo de células madre mesenquimatosas dérmicas derivadas de ABCB5+ puede inhibir una señal coestimulante positiva expresada por APC que participa de forma crítica en la activación de linfocitos T. En algunas realizaciones, el sujeto se administra con 1x107 - 1x1010 células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas por inyección intravenosa o infusión.

También se desvelan células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas para su uso en la promoción de la supervivencia del aloinjerto, administrando a un sujeto que tiene un trasplante de órganos una cantidad eficaz de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas para promover la supervivencia del aloinjerto. Las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se pueden administrar al sujeto antes de, al mismo tiempo que o después del trasplante de órganos. En algunas realizaciones, el aloinjerto es un corazón; un pulmón; un hígado; o un riñón.

En algunas realizaciones, las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas son singénicas. En otras realizaciones, las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas son alógenas, por ejemplo, las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas pueden ser autólogas a una persona que donó el órgano o derivaron de un tercero.

El tratamiento puede ser administrado hasta siete días antes del trasplante y todavía ser eficaz. La administración se puede repetir a intervalos regulares, por ejemplo, diariamente, semanalmente o mensualmente, para suprimir aún más la activación celular inmunitaria y prevenir el rechazo de órganos trasplantados. Las células pueden ser administradas por vía intravenosa por inyección o infusión y se espera que un único tratamiento implique la administración de entre 1x107 y 1 x1010 células y más normalmente entre 1x108 y 5x109 células. Este tratamiento puede ser administrado o solo o junto con otros tratamientos para promover la aceptación del injerto, por ejemplo, la administración de ciclosporina.

Además, la capacidad para reducir la actividad de células inmunitarias también demostrará ser útil en el tratamiento de otros tipos de sujetos. Por ejemplo, las células pueden ser administradas como un tratamiento en enfermedades autoinmunitarias, tales como: esclerosis múltiple; artritis reumatoide; lupus eritematoso sistémico, esclerodermia psoriasis; miastenia grave; enfermedad de Graves, enfermedad de Crohn; y colitis ulcerosa. Además, las células pueden ser administradas para el tratamiento de enfermedad injerto contra huésped.

Por lo tanto, también se desvelan células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas para su uso en el tratamiento de enfermedad autoinmunitaria. Las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se administran a un sujeto que tiene enfermedad autoinmunitaria en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad autoinmunitaria.

Por tanto, se desvelan células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas para su uso en el tratamiento de enfermedad hepática. Las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se administran a un sujeto que tiene una enfermedad hepática en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad hepática. En una realización, la enfermedad hepática es hepatitis.

También se desvelan células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa administrando a un sujeto que tiene una enfermedad neurodegenerativa células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad neurodegenerativa, en donde la enfermedad neurodegenerativa está asociada con una respuesta inmunitaria contra las células hospedadoras. En una realización, la enfermedad neurodegenerativa es esclerosis lateral amiotrófica.

También se desvelan células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas para su uso en el tratamiento de enfermedad cardiovascular. Las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se administran a un sujeto que tiene enfermedad cardiovascular células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad cardiovascular, en donde la enfermedad cardiovascular está asociada con la remodelación de tejido. En una realización, la enfermedad cardiovascular es aterosclerosis. En otra realización, la enfermedad cardiovascular es infarto de miocardio.

En algunas realizaciones, las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas son singénicas. En otras realizaciones, las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas son alógenas. En aun otras realizaciones, las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas son no autólogas.

En algunas realizaciones, las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se administran al sujeto por inyección intravenosa o infusión.

También se desvela una preparación aislada de células madre mesenquimatosas dérmicas inmunomoduladoras caracterizada por la expresión de ABCB5 sobre su superficie celular. En algunas realizaciones, las células madre son sustancialmente puras. También se proporciona un vial de inyección precargado, ampolla o bolsa para infusión en forma de dosis unitaria, que engloba las células madre mesenquimatosas dérmicas aisladas. La inyección vial, ampolla o bolsa para infusión puede comprender 1x107 - 1x1010 de las células madre mesenquimatosas dérmicas. En otras realizaciones, la inyección vial, ampolla o bolsa para infusión comprende 1x108 - 5x109 de las células madre mesenquimatosas dérmicas.

También se desvela un kit. El kit incluye el vial de inyección precargado, ampolla o bolsa para infusión o la preparación aislada de células madre mesenquimatosas dérmicas inmunomoduladoras, caracterizado por la expresión de ABCB5 junto con instrucciones sobre la administración de las células madre mesenquimatosas dérmicas a tanto un sujeto que ha recibido o está a punto de recibir un trasplante de órganos, un sujeto que tiene una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad hepática, una enfermedad neurodegenerativa, o una enfermedad cardiovascular. Otros kits pueden incluir reactivos para aislar y purificar dichas células.

Según algunas realizaciones, las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas tienen un ácido nucleico exógeno. El ácido nucleico exógeno puede ser un vector.

Las composiciones para el tratamiento de una afección particular se pueden administrar a un sujeto usando varios métodos desvelados en el presente documento. Se debe entender que la divulgación de cada dicho método incluye específicamente, por tanto, la composición para su uso en el tratamiento de esa afección particular.

Otras ventajas y características novedosas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de diversas realizaciones no limitantes de la invención cuando se consideran junto con las figuras adjuntas. En los casos en los que la presente especificación y un documento referido incluyan una divulgación opuesta y/o incoherente, deberá controlar la presente memoria descriptiva.

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y no está limitada en su aplicación a los detalles de construcción y la disposición de componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención es capaz de otras realizaciones y de ser puesta en práctica o de ser llevaba a cabo de diversas formas. Por tanto, la fraseología y la terminología usadas en el presente documento es con el fin de descripción y no debe ser considerada como limitante. El uso de "que incluye", "que comprende" o "que tiene", "que contiene", "que implica" y variaciones de los mismos en el presente documento pretende englobar los elementos enumerados a partir de aquí y equivalentes de los mismos, así como elementos adicionales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los dibujos adjuntos no pretenden estar dibujados a escala. En los dibujos, cada componente idéntico o casi idéntico que se ilustra en diversas figuras se representa por un número similar. Para los fines de claridad, no todo componente puede estar etiquetado en cada dibujo. En los dibujos:

Figura 1. Gráficos que representan el análisis de citometría de flujo de un color de la expresión superficial de ABCB5 de cultivos derivados de piel murina de Balb/c en subcultivos iniciales (A) y después de >40 subcultivos (B). Línea gris clara: ABCB5; sombreado: control de isotipo; línea negra oscura: sin teñir

Figura 2. Un gráfico de barras que representa el patrón de expresión de marcadores de CMM en CMM dérmicas sin separar (barras lisas) frente a ABCB5-(barras con puntos) o ABCB5+ (barras rayadas) determinado por citometría de flujo de dos colores.

Figura 3. Gráficos de Kaplan-Meier que representan la supervivencia del injerto en (A) receptores B6 tratados con CMM derivadas de donante de corazones de donantes Balb/c, y (B) con y sin bloqueo simultáneo de CD40L, usando el mAb anti-CD40L, MR1. (C) Gráficos de Kaplan-Meier que representan la supervivencia del injerto en receptores B6 tratados con CMM derivadas de un tercero de corazones de donantes C3H, y en (D) receptores Balb/c tratados con CMM derivadas de receptor de corazones de donantes B6. Se evaluaron diferencias estadísticas como se indica por los valores de P para cada combinación de razas usando la prueba del orden logarítmico.

Figura 4. Gráficos de puntos que representan el análisis de citometría de flujo de dos colores de cultivos derivados de cultivos derivados de piel murina de Balb/c para la expresión de ABCB5 (FITC, fluorescencia FL1) y para los marcadores PD-1, PD-L1 y PD-L2 (PE, fluorescencia ^fL2). Las células ABCB5+ que coexpresan los marcadores superficiales respectivos se encuentran en el cuadrante superior derecho de cada gráfico de fluorescencia.

Figura 5. Gráficos de barras que representan la expresión de PD-1, PD-L1 y PD-L2 en las células CD4+, CD8+ y CD11c+ de receptor completamente discordante in vivo 7 días después del alotrasplante de 3x106 CMM, determinada por citometría de flujo. Controles no tratados (barras lisas), tratamiento con CMM (barras con puntos), tratamiento con esplenocitos (barras rayadas); NS: no significativo; el (los) valor(es) de p indican cambios estadísticamente significativos

Figura 6. Gráfico de barras que representa la expresión de CD40 (% de positividad, media ± EEM) determinada por citometría de flujo de dos colores en subconjuntos de esplenocitos de APC CD11c+ derivados de bazos de o animales tratados con CMM (7 días después de la inyección i.v. de 3x106 CMM dérmicas ABCB5+) (barra gris, etiquetado Trat. con CMM) o no tratados de control (barra negra, etiquetado Sin trat.). B y C. Gráficos que ^{representa la captación de linfocitos T purificados con 3H-timidina de ratones C57BL6 tratados con c}M^mdérmicas ABCB5+ (7 días después de la inyección i.v. de 3x106 CMM dérmicas ABCB5+) o sin tratar, tras la aloestimulación durante 120 horas en reacciones de linfocitos mixtos (MLR) unilaterales habituales con esplenocitos de Balb/c (B) o C3H/HeJ (C) intactos irradiados (1750 rad). Se ilustran valores medios ± EEM representados frente a relaciones crecientes entre estimulante y respondedor. D. Gráfico de barras que representa la captación de linfocitos T con 3H-timidina derivados de bazos de o ratones C57BL6 tratados con CMM (7 días después de la inyección i.v. de 3x106 CMM dérmicas ABCB5+) (barra gris, etiquetado Trat. con CMM) o sin tratar (barra negra, etiquetado Sin trat.) tras la estimulación con mitógeno (ConA) durante 72 horas. Se ilustran valores medios ± EEM.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención se basa en parte en el desarrollo de métodos de aislamiento de una subpoblación de células madre mesenquimatosas dérmicas que se caracterizan por la expresión de la P-glucoproteína ABCB5 sobre su superficie celular y por la expresión del regulador inmunitario PD-1. Se ha descubierto que las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5+ prolongan notablemente la supervivencia cardíaca murina heterotópica del aloinjerto in vivo y, con el bloqueo simultáneo de las vías coestimulantes positivas de CD40-CD40L, inducen la supervivencia a largo plazo del aloinjerto. No se ha determinado con certeza el mecanismo exacto responsable de la reducción del rechazo inmunitario de órganos trasplantados, pero parece que las células madre dérmicas expresan PD-1, un factor que se cree que inhibe la activación de linfocitos T. Los resultados obtenidos indican que las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5+ son más eficaces como moduladores in vivo del rechazo del aloinjerto que las células madre mesenquimatosas de médula ósea (CMM-MO), que hasta la fecha se ha mostrado que solo inducen una modesta prolongación de la supervivencia del aloinjerto (Bartholomew, et al., Exp. Hematol. 30:42 (2002)) Sin embargo, las células madre mesenquimatosas dérmicas pueden ser de otro modo comparables con CMM-MO en que muestran una capacidad de diferenciación similar y muestran un perfil casi idéntico con respecto a otros marcadores superficiales (Fernandes, et al., Nat. Cell Biol. 6:1082 (2004); Shih, et al., Stem Cells 23:1012 (2005)). La posible promesa de células madre mesenquimatosas dérmicas clónicas para su uso en estrategias terapéuticas inmunomoduladoras basadas en células en alotrasplante y las otras enfermedades descritas en el presente documento se enfatiza por la ventaja adicional de la fácil accesibilidad de la piel como un tejido fuente para el aislamiento de células madre. Las células madre mesenquimatosas dérmicas descritas en el presente documento son fácilmente aisladas y expandidas. Las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5+ se pueden purificar, clonar, propagar y expandir entre cultivos de diferenciación derivados de forma clónica durante más de 50 pases.

La activación de linfocitos T dependientes de antígeno requiere dos señales distintas: en el encuentro con el antígeno, los linfocitos T intactos reciben la señal 1 a través de la interacción del receptor de linfocitos T con el complejo de péptido más antigénico del MHC, y la señal 2 a través de las vías coestimulantes positivas que conducen a la activación completa. Las señales coestimulantes de linfocitos T negativos, por otra parte, sirven para regular por disminución respuestas inmunitarias (Rothstein, et al., Immunol. Rev. 196:85 (2003)). Ya se ha mostrado que PD-1, un constituyente de la novedosa vía coestimulante negativa PD-1-(PD-L1/PD-L2) (Carter, et al, Eur. J. Immunol. 32:634 (2002); Freeman, et al, J. Exp. Med. 192:1027 (2000); Ito, et al., J. Immunol. 174:6648 (2005)), se expresa en CMM-MO e inhibe la activación de linfocitos in vitro (Augello, et al., Eur. J. Immunol. 35:1482 (2005)). Aunque no se atenga a teoría particular alguna, se cree que las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5+ pueden servir similarmente para regular por disminución in vivo respuestas aloinmunitarias por la señalización coestimulante negativa mediada por PD1-(PD-L1/PD-L2), y que las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5+ aloinjertadas pueden, por lo tanto, sinergizar con el bloqueo coestimulante de CD40-CD40L para suprimir aún más el rechazo del aloinjerto en comparación con cualquier terapia sola.

"Células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas", como se usa en el presente documento, se refiere a células de la piel que tienen la capacidad de autorrenovación y de diferenciación en células maduras de múltiples linajes celulares adultos, tales como hueso, grasa y cartílago. Estas células se caracterizan por la expresión de ABCB5 sobre la superficie celular. En cultivo, las células madre mesenquimatosas pueden ser guiadas para diferenciarse en células de hueso, grasa, cartílago o músculo usando medios específicos (Hirschi KK y Goodell MA. Gene Ther. 2002; ^{9: 648-652. Pittenger m}F, ^{et al., Science. 1999; 284: 143-147. Schwartz r}E, ^{et al., J Clin Invest. 2002; 109: 1291-1302.}Hirschi K y Goodell M. Differentiation. 2001; 68: 186-192).

Se ha mostrado que las células madre mesenquimatosas ejercen funciones inmunorreguladoras: por ejemplo, las CMM-MO adultas pueden inhibir la proliferación de linfocitos T frente a antígeno, aloantígeno y mitógeno relacionados in vitro y atenuar la enfermedad injerto contra huésped (GVHD), el rechazo del aloinjerto y la autoinmunidad mediada por células. Las células madre mesenquimatosas expresan antígenos del MHC de clase I y se pueden inducir para expresar moléculas del MHC de clase II por exposición a interferón-y, que indica una capacidad para proporcionar la señal 1 en un entorno proinflamatorio. Aunque las células madre mesenquimatosas expresan los miembros de la vía coestimulante positiva CD80, CD86, CD40 o CD40L para proporcionar la señal 2, pueden expresar PD-1, un constituyente de la novedosa vía coestimulante negativa PD-1-(PD-L1/PD-L2), que, tras la interacción con sus ligandos en células inmunocompetentes diana, puede ser responsable de la activación de linfocitos mediada por células madre mesenquimatosas in vitro. Estos resultados elevan la posibilidad de que las células madre mesenquimatosas alógenas o autólogas puedan ejercer sus efectos inmunorreguladores en sitios de inflamación mediante la provisión de señales coestimulantes inhibidoras a linfocitos T reactivos con antígeno, debido a que dichas señales se pueden proporcionar en cis o trans conduciendo a la inactivación de linfocitos T. Además, las células madre mesenquimatosas podrían ejercer efectos inmunorreguladores y retener el inmunoprivilegio en el entorno inflamatorio por secreción de mediadores inmunorreguladores solubles: miembros de la superfamilia de TGF-p, que se producen por células madre mesenquimatosas, pueden suprimir las respuestas de antígenos mediadas por linfocitos T in vitro, y la producción de proteína 2 morfogenética ósea (BMP-2) por células madre mesenquimatosas podría mediar en la inmunosupresión por la generación de TREG CD8+. Por lo tanto, es probable que existan varios mecanismos distintos por los que las células madre mesenquimatosas modulen la activación de las respuestas inmunitarias, que incluyen la inducción de anergia de linfocitos T y B, la inhibición de la maduración de APC como se demuestra por la regulación por disminución de CD40 y la generación de TREG.

Las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se pueden obtener de la piel. La piel puede derivar de cualquier sujeto que tenga piel, pero en algunas realizaciones preferentemente es piel humana. La piel puede derivar de un sujeto de cualquier edad, pero en algunas realizaciones es preferentemente piel adulta, en vez de piel de adolescente o lactante.

Las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas pueden derivar de un sujeto aislando una muestra de piel y luego purificando las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas. Será evidente para los expertos habituales en la técnica que la piel se puede enriquecer en células que tienen ABCB5 de varias formas. Por ejemplo, se pueden seleccionar células por la unión de ABCB5 sobre las moléculas de la superficie celular con anticuerpos u otras moléculas de unión. Los ejemplos de métodos se exponen en los ejemplos que siguen. Las muestras de piel se pueden obtener directamente de un donante o recuperar de almacenamiento en crioconservante. Las células madre mesenquimatosas dérmicas se pueden aislar, por ejemplo, usando anticuerpos contra ABCB5 y mantener en cultivo usando metodología habitual o congeladas, por ejemplo, en nitrógeno líquido, para su uso posterior.

Para estudiar las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5+ murinas, el protocolo se puede usar para aislar, clonar, propagar y expandir esta población de células madre in vitro en condiciones de medio definido, tal como los en los ejemplos que siguen. Brevemente, se recogió piel murina de ratones adultos de la raza Balb/c o C57BL/6, se diseccionaron en trozos pequeños y se disociaron con colagenasa, seguido por el aislamiento de las células ABCB5+ usando el mAb anti-ABCB5, microperlas magnéticas recubiertas con Ig anti-ratón de cabra y columnas de separación MiniMACS, y posterior clonación de las células por dilución limitante. La expresión superficial de ABCB5 murinas se determinó en pases sucesivos de células derivadas de forma clónica usando tinción de inmunofluorescencia con el mAb anti-ABCB5 y citometría de flujo.

La presente divulgación contempla cualquier método de empleo adecuado de anticuerpos monoclonales para separar células madre mesenquimatosas de otras células. Por consiguiente, en la presente divulgación se incluye un método de producción de una población de células madre mesenquimatosas que comprende las etapas de proporcionar una suspensión de células de piel que contiene células madre mesenquimatosas; poner en contacto la suspensión de células con uno o una combinación de anticuerpos monoclonales que reconocen un epítope, que incluye ABCB5, sobre las células madre mesenquimatosas; y separar y recuperar de la suspensión de células las células unidas por los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden unir a una fase sólida y utilizar para capturar células madre mesenquimatosas de muestras de piel. Las células unidas se pueden separar entonces de la fase sólida por métodos conocidos dependiendo de la naturaleza del anticuerpo y la fase sólida.

Los sistemas basados en monoclonales apropiados para la preparación de la población de células deseada incluyen columna de perlas magnéticas/partículas paramagnéticas que utilizan anticuerpos para selección positiva o negativa; separación basada en afinidad por biotina o estreptavidina; y clasificación por citometría de flujo de alta velocidad de células madre mesenquimatosas teñidas inmunofluorescentes mezcladas en una suspensión de otras células. Por lo tanto, el método de la presente divulgación incluye el aislamiento de una población de células madre mesenquimatosas y el potenciamiento usando anticuerpos monoclonales producidos contra ABCB5 de antígeno de superficie.

Las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se aíslan preferentemente. Una "célula madre mesenquimatosa dérmica ABCB5 positiva aislada" como se usa aquí se refiere a una preparación de células que se pone en condiciones distintas de su entorno natural. El término "aislada" no descarta el uso posterior de estas células a partir de aquí en combinaciones o mezclas con otras células o en un entorno in vivo.

Las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se pueden preparar como preparaciones sustancialmente puras. El término "sustancialmente puras" significa que una preparación está sustancialmente libre de células de la piel distintas de las células ABCB5 positivas madre. Por ejemplo, las células ABCB5 deben constituir al menos el 70 por ciento de las células totales presentes, prefiriéndose mayores porcentajes, por ejemplo, al menos 85, 90, 95 o 99 por ciento. Las células se pueden envasar en un envase farmacéutico terminado, tal como un vial para inyección, ampolla o bolsa para infusión junto con cualquier otro componente que se pueda desear, por ejemplo, agentes para conservar células, o reducir el crecimiento bacteriano. La composición debe estar en forma farmacéutica unitaria.

Las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas son útiles para tratar enfermedades inmunomediadas. Las enfermedades inmunomediadas son enfermedades asociados a una respuesta inmunitaria perjudicial, es decir, una que daña el tejido. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, trasplante, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad cardiovascular, enfermedad hepática, enfermedad renal y enfermedad neurodegenerativa.

Se ha descubierto que las células madre mesenquimatosas se pueden usar en un trasplante para mejorar una respuesta por el sistema inmunitario de forma que se reduzca o elimine una respuesta inmunitaria a un antígeno(s). El trasplante es el acto o proceso de trasplante de un tejido o un órgano de un cuerpo o parte del cuerpo a otro. Las células madre mesenquimatosas pueden ser autólogas para el hospedador (obtenidas del mismo hospedador) o no autólogas, tales como células que son alógenas o singénicas para el hospedador. Las células no autólogas derivan de otra persona distinta del paciente o el donante del órgano. Alternativamente, las células madre mesenquimatosas se pueden obtener de una fuente que es xenógena al hospedador.

Alógenas se refiere a células que son genéticamente diferentes, aunque pertenecen a o se obtienen de la misma especie que el hospedador o donante. Por lo tanto, una célula madre mesenquimatosa humana alógena es una célula madre mesenquimatosa obtenida de un ser humano distinto del receptor previsto de las células madre mesenquimatosas o el donante del órgano. Singénicas se refiere a células que son genéticamente idénticas o están estrechamente relacionadas y son inmunológicamente compatibles con el hospedador o donante, es decir, de individuos o tejidos que tienen genotipos idénticos. Xenógenas se refiere a células derivadas u obtenidas de un organismo de una especie diferente que el hospedador o donante.

Por lo tanto, las células madre mesenquimatosas se usan para suprimir o mejorar una respuesta inmunitaria a un trasplante (tejido, órgano, células, etc.) administrando al receptor del trasplante las células madre mesenquimatosas en una cantidad eficaz para suprimir o mejorar una respuesta inmunitaria contra el trasplante.

Por consiguiente, los métodos se pueden lograr poniendo en contacto el receptor del tejido del donante con células madre mesenquimatosas. Las células madre mesenquimatosas se pueden administrar al receptor antes o al mismo tiempo que el trasplante o posterior al trasplante. Cuando las células madre se administran antes del trasplante, normalmente las células madre se deben administrar hasta 14 días y preferentemente hasta 7 días antes de la cirugía. La administración se puede repetir regularmente a partir de entonces (por ejemplo, una vez a la semana).

Las células madre mesenquimatosas también se pueden administrar al receptor como parte del trasplante. Por ejemplo, las células madre mesenquimatosas pueden ser perfundidas en el órgano o el tejido antes del trasplante. Alternativamente, el tejido se puede trasplantar y luego tratar durante la cirugía.

El tratamiento de un paciente que ha recibido un trasplante, para reducir la intensidad o eliminar un episodio de rechazo contra el trasplante, también se puede lograr administrando al receptor del tejido del donante células madre mesenquimatosas después de que el tejido del donante se haya trasplantado en el receptor.

La reducción de una respuesta inmunitaria por tejido, órgano o células del donante contra un receptor, es decir, respuesta de injerto frente a hospedador, se puede llevar a cabo tratando el tejido, órgano o células del donante con células madre mesenquimatosas ex vivo antes del trasplante del tejido, órgano o células en el receptor. Las células madre mesenquimatosas reducen la sensibilidad de los linfocitos T en el trasplante, que puede ser posteriormente activada contra las células presentadoras de antígenos del receptor de forma que el trasplante se pueda introducir en el cuerpo del receptor (hospedador) sin la aparición de, o con una reducción en, una respuesta adversa del trasplante al hospedador. Por lo tanto, se puede evitar lo que se conoce como enfermedad de "injerto contra huésped".

Las células madre mesenquimatosas se pueden obtener del receptor o del donante, por ejemplo, antes del trasplante. Las células madre mesenquimatosas se pueden aislar y guardar congeladas hasta que se necesiten. Las células madre mesenquimatosas también pueden ser expandidas en cultivo hasta cantidades deseadas y guardadas hasta que se necesiten. Alternativamente, se pueden obtener inmediatamente antes de uso.

Las células madre mesenquimatosas se administran al receptor en una cantidad eficaz para reducir o eliminar una respuesta inmunitaria adversa en curso causada por el trasplante del donante contra el hospedador. La presentación de las células madre mesenquimatosas al hospedador que sufre una respuesta inmunitaria adversa causada por un transplante inhibe la respuesta en curso y previene la reestimulación de los linfocitos T, por lo que se reduce o elimina una respuesta adversa por linfocitos T activados al tejido del hospedador.

Como parte de un procedimiento de trasplante, las células madre mesenquimatosas también se pueden modificar para expresar una molécula para potenciar el efecto protector, tal como una molécula que induce la muerte celular. Como se describe en más detalle más adelante, las células madre mesenquimatosas dérmicas se pueden manipular para producir proteínas usando ácidos nucleicos exógenamente añadidos. Por ejemplo, las células madre mesenquimatosas se pueden usar para administrar al sistema inmunitario una molécula que induce la apoptosis de linfocitos T activados que llevan un receptor para la molécula. Esto produce la deleción de linfocitos T activados y la supresión de una respuesta inmunitaria no deseada a un trasplante. Por lo tanto, las células madre mesenquimatosas dérmicas se pueden modificar para expresar una molécula de muerte celular. En realizaciones preferidas de los métodos descritos en el presente documento, las células madre mesenquimatosas expresan la molécula de muerte celular el ligado Fas o el ligado TRAIL.

En todos los casos, una dosis eficaz de células (es decir, se debe administrar al paciente un número suficiente para prolongar la supervivencia del aloinjerto). El número de células administradas debe estar, en general, en el intervalo de 1x107 - 1x1010 y, en la mayoría de los casos debe estar entre 1x108 y 5x109. Las administraciones y los programas de administración concretos serán determinados en cada caso por el especialista usando métodos que son habituales en la técnica de la medicina clínica y teniendo en cuenta factores tales como la edad del paciente, el peso y el estado físico. En los casos en los que un paciente presente signos de rechazo del trasplante, se puede aumentar la dosis y/o la frecuencia de administración. Las células se administrarán normalmente por inyección intravenosa o infusión, aunque también se pueden usar métodos de implantación de células, por ejemplo cerca del sitio de implantación del órgano.

Las células madre mesenquimatosas se pueden administrar a un paciente de trasplante como el único inmunomodulador o como parte de un plan de tratamiento que incluye también otros inmunomoduladores. Por ejemplo, a los pacientes también se les puede administrar: anticuerpos monoclonales u otros compuestos que bloquean la interacción entre CD40 y CD40L; inhibidores de la activación de linfocitos y posterior proliferación, tal como ciclosporina, tacrolimus y rapamicina; o con inmunosupresores que actúan por otros mecanismos, tales como metotrexato, azatioprina, ciclofosfamida o compuestos antiinflamatorios (por ejemplo, corticoides, tales como dexametasona y prednisolona).

Las células madre mesenquimatosas dérmicas desveladas en el presente documento también son útiles para tratar y prevenir una enfermedad autoinmunitaria. Una enfermedad autoinmunitaria es una clase de enfermedad en la que los propios anticuerpos de un sujeto reaccionan con el tejido del hospedador o en la que linfocitos T efectores inmunitarios son autorreactivos con autopéptidos endógenos y provocan la destrucción de tejido. Por lo tanto, se genera una respuesta inmunitaria contra los propios antígenos de un sujeto, denominados los autoantígenos. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico (LES), encefalomielitis autoinmunitaria, miastenia grave (MG), tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Goodpasture, pénfigo (por ejemplo, pénfigo vulgar), enfermedad de Graves, anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, esclerodermia con anticuerpos anticolágeno, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, polimiositis, anemia perniciosa, enfermedad de Addison idiopática, infertilidad asociada con la autoinmunidad, glomerulonefritis (por ejemplo, glomerulonefritis crescéntica, glomerulonefritis proliferativa), pénfigo ampolloso, síndrome de Sjogren, resistencia a la insulina y diabetes mellitus autoinmunitaria. Un "autoantígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a un antígeno de un tejido normal del hospedador. El tejido normal del hospedador no incluye células cancerosas.

Un ejemplo de enfermedad autoinmunitaria es la enfermedad antimembrana basal glomerular (AMBG). La enfermedad AMBG resulta de una respuesta autoinmunitaria dirigida contra el dominio 1 no colagenoso de la cadena 3 de colágeno de tipo IV (3(IV)NC1) y provoca una glomerulonefritis (GN) rápidamente progresiva y, por último lugar, insuficiencia renal en los pacientes afectados. Como se describe en los ejemplos que siguen, se ha mostrado la eficacia de células madre mesenquimatosas dérmicas en un modelo de AMBG. Los anticuerpos autorreactivos que reconocen 3(IV)NC1 se consideran un distintivo de la enfermedad. Además, la inmunidad celular mediada por linfocitos auxiliares T autorreactivos (Th)1 con 3(IV)NC1 participa en su patogénesis. La enfermedad anti-MBG se puede inducir experimentalmente en razas de ratón susceptibles por inmunización con preparaciones de antígeno que contienen 3(IV)NC1 recombinante (r3(IV)NC1), que proporcionan un valioso sistema modelo de enfermedad para estudiar las respuestas a la inmunomodulación terapéutica. La activación de linfocitos T dependiente de antígenos y la producción resultante de interleucina 2 (IL-2) requiere dos señales distintas: en el encuentro del antígeno, los linfocitos T intactos reciben la señal 1 a través de la interacción del receptor de linfocitos T con el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) más el complejo de péptido antigénico en células presentadoras de antígenos (APC), y la señal 2 a través de vías coestimulantes positivas que conducen a la activación completa. Se ha mostrado recientemente la función esencial de dicha vía coestimulante positiva, la interacción de CD40 expresado en APC con su ligando Th CD40L, para el desarrollo de enfermedad en GN autoinmunitaria anti-MBG experimental, y se ha demostrado que el bloqueo de la vía de CD40-CD40L previene el desarrollo de GN autoinmunitaria. Las señales coestimulantes negativas de linfocitos T sirven, por otra parte, para regular por disminución las respuestas inmunitarias. Los linfocitos T reguladores (TREG) y los mediadores de citocinas solubles, tales como la interleucina 10 y los miembros de la familia del factor de crecimiento transformante p (TGF-p), también pueden atenuar la activación de linfocitos T y respuestas efectoras inmunitarias.

Otra enfermedad autoinmunitaria es la enfermedad de Crohn. Se han realizado ensayos clínicos para el tratamiento de la enfermedad de Crohn usando células madre mesenquimatosas. La enfermedad de Crohn es una afección crónica asociada a la inflamación de los intestinos y el tubo gastrointestinal. Basándose en los ensayos realizados, parece prometedor el uso de células madre mesenquimatosas para el tratamiento de la enfermedad de Crohn.

Cuando se usa en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se administrarán preferentemente por inyección intravenosa y una dosis eficaz será la cantidad necesaria para ralentizar la progresión de la enfermedad o aliviar uno o más síntomas asociados a la enfermedad. Por ejemplo, en el caso de esclerosis múltiple recidivante, una dosis eficaz debe ser al menos la cantidad necesaria para reducir la frecuencia o intensidad de los ataques. En el caso de artritis reumatoide, una cantidad eficaz sería al menos el número de células necesarias para reducir el dolor y la inflamación sufrida por los pacientes. Una única dosis unitaria de células debe ser normalmente entre 1x107 y 1x1010 células y la administración se debe repetir en intervalos regulares (por ejemplo, semanalmente, mensualmente etc.) como se determina que es apropiado por el médico adjunto.

Las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas también son útiles en el tratamiento de enfermedad hepática. La enfermedad hepática incluye enfermedades tales como la hepatitis que produce daño al tejido del hígado. De forma más general, las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas desveladas en el presente documento se pueden usar para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones hepáticos que incluyen, pero no se limitan a: enfermedad hepática alcohólica, hepatitis (A, B, C, D, etc.), lesiones hepáticas focales, carcinoma hepatocelular primario, lesiones quísticas grandes del hígado, hiperplasia nodular focal, enfermedad hepática granulomatosa, granulomas hepáticos, hemocromatosis, tal como hemocromatosis hereditaria, síndromes de sobrecarga de hierro, hígado graso agudo, hiperémesis gravídica, enfermedad hepática intercurrente durante el embarazo, colestasis intrahepática, insuficiencia hepática, fallo hepático fulminante, ictericia o hiperbilirrubinemia asintomática, lesión a hepatocitos, síndrome de Crigler-Najjar, enfermedad de Wilson, deficiencia de alfa-1 -antitripsina, síndrome de Gilbert, hiperbilirrubinemia, esteatohepatitis no alcohólica, porfirias, hipertensión portal no cirrótica, hipertensión portal no cirrótica, fibrosis portal, esquistosomiasis, cirrosis biliar primaria, síndrome de Budd-Chiari, enfermedad venooclusiva hepática tras trasplante de médula ósea, etc.

El estrés en el cuerpo puede provocar que las células madre se transformen en células especializadas que migran al área dañada y ayudan a reparar la lesión. Por ejemplo, un hígado dañado puede enviar señales a las células madre que responden creando células del hígado para el hígado dañado (Journal of Clinical Investigation 15 de julio de 2003;112 (2): 160-169)

En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a composiciones para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, con células madre mesenquimatosas dérmicas. En algunos casos, la divulgación contempla el tratamiento de sujetos que tienen enfermedad neurodegenerativa, o una lesión a las células nerviosas que puede conducir a neurodegeneración. Las células neuronales se clasifican predominantemente basándose en sus conexiones sinápticas locales/regionales (por ejemplo, interneuronas del circuito local frente a neuronas de proyección de largo alcance) y conjuntos de receptores, y sistemas de segundo mensajero asociados. Las células neuronales incluyen tanto las neuronas del sistema nervioso central (SNC) como las neuronas del sistema nervioso periférico (SNP). Existen muchos tipos diferentes de células neuronales. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, neuronas sensoriales y simpáticas, neuronas colinérgicas, neuronas de los ganglios de la raíz dorsal, neuronas proprioceptivas (en el núcleo mesencefálico trigeminal), neuronas de los ganglios ciliares (en el sistema nervioso parasimpático), etc. Un experto habitual en la técnica será capaz de identificar fácilmente células neuronales y distinguirlas de las células no neuronales, tales como las células de la glía, utilizando normalmente características morfológicas de las células, expresión de marcadores específicos de células, secreción de ciertas moléculas, etc.

"Trastorno neurodegenerativo" o "enfermedad neurodegenerativa" se define en el presente documento como un trastorno en el que la pérdida progresiva de neuronas ocurre tanto en el sistema nervioso periférico como en el sistema nervioso central. Los ejemplos no limitantes de trastornos neurodegenerativos incluyen: (i) enfermedades neurodegenerativas crónicas, tales como esclerosis lateral amiotrófica familiar y esporádica (ELAF y ELA, respectivamente), enfermedad de Parkinson familiar y esporádica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer familiar y esporádica, esclerosis múltiple, atrofia olivopontocerebelosa, atrofia multisistémica, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad difusa con cuerpos de Lewy, degeneración corticodentatonígrica, epilepsia mioclónica familiar progresiva, degeneración estrionígrica, distonía de torsión, temblor familiar, síndrome de Down, síndrome de Gilles de la Tourette, enfermedad de Hallervorden-Spatz, neuropatía periférica diabética, demencia pugilística, demencia por sida, demencia senil, deterioro de la memoria relacionado con la edad y enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la amiloidosis, tales como las causadas por la proteína priónica (PrP) que está asociada con la encefalopatía espongiforme transmisible (enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, encefalopatía espongiforme ovina y kuru), y las causadas por un exceso de acumulación de cistatina C (angiopatía hereditaria por cistatina C); y (ii) trastornos neurodegenerativos agudos, tales como lesión cerebral traumática (por ejemplo, lesión cerebral relacionada con la cirugía), edema cerebral, daño nervioso periférico, lesión de la médula espinal, enfermedad de Leigh, síndrome de Guillain-Barré, trastornos de almacenamiento lisosómico, tales como lipofuscinosis, enfermedad de Alper, vértigo como resultado de degeneración del SNC; patologías que surgen con el alcoholismo crónico o la drogadicción, que incluyen, por ejemplo, la degeneración de neuronas en el locus cerúleo y el cerebelo; patologías que surgen con el envejecimiento, que incluyen la degeneración de neuronas cerebelosas y neuronas corticales que conducen a alteraciones cognitivas y motoras; y patologías que surgen con el abuso crónico de anfetaminas, que incluyen la degeneración de neuronas de los ganglios basales que conducen a alteraciones motoras; cambios patológicos resultantes de traumatismo focal, tales como accidente cerebrovascular, isquemia focal, insuficiencia vascular, encefalopatía hipóxica-isquémica, hiperglucemia, hipoglucemia o traumatismo directo; patologías que surgen como un efecto secundario negativo de fármacos y tratamientos terapéuticos (por ejemplo, degeneración de las neuronas de la corteza cingulada y entorrinal en respuesta a dosis anticonvulsivas de antagonistas de la clase de NMDA del receptor de glutamato) y demencia relacionada con Wernicke-Korsakoff. Las enfermedades neurodegenerativas que afectan a las neuronas sensitivas incluyen ataxia de Friedreich, diabetes, neuropatía periférica y degeneración neuronal retiniana. Las enfermedades neurodegenerativas de sistemas límbicos y corticales incluyen amiloidosis cerebral, atrofia de Pick y síndrome de Retts.

Los ejemplos anteriores no pretenden ser completos, pero sirven simplemente de ilustración del término "trastorno neurodegenerativo" o "enfermedad neurodegenerativa".

La mayoría de las enfermedades neurodegenerativas crónicas se caracterizan por aparecer durante los años adultos medios y conducen a una rápida degeneración de subconjuntos específicos de neuronas dentro del sistema neural, dando como resultado por último lugar la muerte prematura. Las composiciones que comprenden células madre mesenquimatosas dérmicas se pueden administrar a un sujeto para tratar enfermedad neurodegenerativa solas o en combinación con la administración de otros compuestos terapéuticos para el tratamiento o la prevención de estos trastornos o enfermedades. Muchos de estos fármacos se conocen en la técnica. Por ejemplo, los agentes antiparkinsonianos incluyen, pero no se limitan a, mesilato de benztropina; biperiden; clorhidrato de biperiden; lactato de biperiden; carmantadina; clorhidrato de ciladopa; dopamantina; clorhidrato de etopropazina; lazabemida; levodopa; clorhidrato de lometralina; clorhidrato de mofegilina; clorhidrato de naxagolida; sulfato de pareptida; clorhidrato de prociclidina; clorhidrato de quinelorane; clorhidrato de ropinirol; clorhidrato de selegilina; tolcapona; clorhidrato de trihexifenidilo. Los fármacos para el tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica incluyen, pero no se limitan a, riluzol. Los fármacos para el tratamiento de enfermedad de Paget incluyen, pero no se limitan a, tiludronato disódico.

Se ha descrito la utilidad de las células madre adultas en el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa. Se ha mostrado que las células madre mesenquimatosas se pueden transformar en células similares a neuronas en ratones que han sufrido accidentes cerebrovasculares. Journal of Cell Transplantation Vol. 12, pp. 201-213, 2003. Además, las células madre derivadas de médula ósea se desarrollaron en células neurales que mantienen la promesa de tratar pacientes con enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y lesiones de la médula espinal.

Las composiciones desveladas en el presente documento también son útiles en el tratamiento de trastornos asociados a enfermedad renal. Se ha demostrado que las células madre mesenquimatosas previamente inyectadas en riñones producen una mejoría casi inmediata en la función renal y la renovación celular. Resnick, Mayer, Stem Cells Brings Fast Direct Improvement, Without Differentiation, in Acute Renal Failure, EurekAlert!, 15 de Agosto de 2005. Por lo tanto, las células madre mesenquimatosas dérmicas desveladas en el presente documento se pueden administrar a un sujeto que tiene enfermedad renal solas o en combinación con otros terapéuticos o procedimientos, tales como diálisis, para mejorar la función renal y la renovación celular.

Otras enfermedades que se pueden tratar usando las composiciones desveladas en el presente documento incluyen enfermedades de la córnea y el pulmón. Las terapias basadas en la administración de células madre mesenquimatosas en estos tejidos han mostrado resultados positivos. Por ejemplo, se han usado células madre mesenquimatosas humanas para la reconstrucción de córneas dañadas. Ma Y et al., Stem Cells, 18 de agosto de 2005. Además, se descubrió que las células madre derivadas de médula eran importantes para la reparación del pulmón y la protección contra la lesión del pulmón. Rojas, Mauricio, et al., American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, Vol.

33, pp. 145-152, 12 de mayo de 2005. Por lo tanto, las células madre mesenquimatosas dérmicas desveladas en el presente documento también se pueden usar en la reparación de tejido de la córnea y tejido pulmonar.

También se han usado células madre mesenquimatosas de fuentes tales como médula ósea en terapias para el tratamiento de enfermedad cardiovascular. Las células madre de médula ósea pueden ayudar en la reparación del músculo cardíaco dañado ayudando a que el corazón desarrolle tejido nuevo y funcional. Goodell MA, Jackson KA, Majka SM, Mi T, Wang H, Pocius J, Hartley CJ, Majesky MW, Entman ML, Michael LH, Hirschi KK. Stem cell plasticity in muscle and bone marrow. Ann N Y Acad Sci. 2001 Jun;938:208-18. Las células madre de la médula ósea colocadas en corazones dañados tras un infarto de miocardio mejoraron la capacidad de bombeo de los corazones en un 80 %. Nature Medicine Journal. Septiembre de 2003 vol. 9 no. 9: 1195-1201.

Enfermedad cardiovascular se refiere a una clase de enfermedades que implican al corazón y/o a los vasos sanguíneos. Aunque el término se refiere técnicamente a enfermedades que afectan al corazón y/o los vasos sanguíneos, otros órganos, tales como, por ejemplo, los pulmones y las articulaciones, podrían ser afectados o estar implicadas en la enfermedad. Los ejemplos de enfermedades cardiovasculares incluyen, pero no se limitan a, aterosclerosis, arteriosclerosis, aneurismas, angina, angina de pecho estable crónica, angina de pecho inestable, isquemia miocárdica (IM), síndrome coronario agudo, enfermedad de las arterias coronarias, accidente cerebrovascular, reestenosis coronaria, reestenosis por prótesis endovascular coronaria, retrombosis por prótesis endovascular coronaria, revascularización, remodelación posterior al infarto de miocardio (IM) (por ejemplo, remodelación posterior al IM del ventrículo izquierdo), hipertrofia ventricular izquierda posterior al IM, angioplastia, ataque isquémico transitorio, embolia pulmonar, oclusión vascular, trombosis venosa, arritmias, cardiomiopatías, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad cardíaca congénita, miocarditis, enfermedad de las válvulas, cardiomiopatía dilatada, disfunción diastólica, endocarditis, fiebre reumática, hipertensión (hipertensión arterial), cardiomiopatía hipertrófica, aneurismas y prolapso de la válvula mitral.

La aterosclerosis es una enfermedad de las arterias musculares de tamaño grande y medio y se caracteriza por disfunción endotelial, inflamación vascular y la acumulación de lípidos, colesterol, calcio y/o residuos celulares dentro de la capa íntima de la pared del vaso sanguíneo. Esta acumulación produce la formación de placa (placa ateromatosa), remodelación vascular, obstrucción luminal aguda y crónica, anomalías de la circulación sanguínea y reducción del suministro de oxígeno a órganos diana.

La aterosclerosis puede causar dos problemas principales. Primero, las placas ateromatosas pueden conducir a roturas de placas y a estenosis (estrechamiento) de las arterias y, por lo tanto, a un riego sanguíneo insuficiente al órgano que alimenta. Alternativamente, resulta un aneurisma. Estas complicaciones son crónicas, lentamente progresivas y acumuladas. Lo más común, la(s) placa(s) se rompe(n) de repente ("placa vulnerable"), causando la formación de un trombo que ralentizará o detendrá rápidamente la circulación sanguínea (por ejemplo, durante algunos minutos) conduciendo a la muerte de los tejidos alimentados por la arteria. Este acontecimiento se denomina un infarto. Uno de los escenarios reconocidos más comunes se denomina la trombosis coronaria de una arteria coronaria que causa un infarto de miocardio (IM) (comúnmente conocido como un ataque al corazón). Otro escenario común en una enfermedad muy avanzada es la claudicación de riego sanguíneo insuficiente a las piernas, normalmente debido a una combinación de tanto estenosis como segmentos de aneurisma estrechados con coágulos. Puesto que la aterosclerosis es un proceso de todo el cuerpo, también ocurren acontecimientos similares en las arterias al cerebro, intestinos, riñones, piernas, etc.

La aterosclerosis puede empezar en la adolescencia, y se encuentra normalmente en la mayoría de las arterias principales, pero es asintomática y no es detectada por la mayoría de los métodos de diagnóstico durante la vida. Lo más habitual es que se convierta en gravemente sintomática cuando interfiere con la circulación coronaria que suministra al corazón o a la circulación cerebral que suministra al cerebro, y se considera que es la causa subyacente más importante de accidentes cerebrovasculares, infartos de miocardio, diversas enfermedades cardíacas que incluyen insuficiencia cardíaca congestiva y la mayoría de las enfermedades cardiovasculares en general. Aunque puede estar implicada cualquier arteria en el cuerpo, normalmente solo se reconoce el grave estrechamiento u obstrucción de algunas arterias, aquellas que suministran a los órganos esencialmente más importantes. La obstrucción de las arterias que suministran al músculo del corazón produce un infarto de miocardio. La obstrucción de las arterias que suministran al cerebro produce un accidente cerebrovascular. La(s) placa(s) ateromatosa(s) en las arterias de los brazos o las piernas que producen una disminución de la circulación sanguínea provocan la enfermedad oclusiva de las arterias periféricas (EOAP).

La prueba de esfuerzo cardíaco es uno de los métodos de prueba no invasivos realizados más comúnmente para la limitación de la circulación sanguínea. En general, detecta un estrechamiento de la luz de ~75 % o mayor. Las áreas de grave estenosis detectables por angiografía, y a un menor grado la "prueba de esfuerzo", han sido desde hace tiempo el objetivo de las técnicas de diagnóstico humano para enfermedad cardiovascular, en general. Los acontecimientos más graves ocurren en localizaciones con muchas placas. La rotura de placas puede conducir a la oclusión de la luz de la arteria en de segundos a minutos, y al posible daño permanente al tejido y algunas veces a la muerte súbita.

Se conocen diversos factores de riesgo anatómicos, fisiológicos y conductuales para la aterosclerosis. Estos factores de riesgo incluyen edad avanzada, sexo masculino, diabetes, dislipidemia (niveles elevados de colesterol o triglicéridos en suero), elevada concentración en suero de lipoproteína de baja densidad (LDL, "colesterol malo"), lipoproteína(a) (una variante de LDL) y/o partículas de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), baja concentración en suero de partículas de lipoproteína de alta densidad funcional (HDL, "colesterol bueno"), tabaquismo, hipertensión, obesidad (por ejemplo, obesidad central, también denominada obesidad abdominal o de tipo masculina), antecedentes familiares de enfermedad cardiovascular (por ejemplo, enfermedad cardíaca coronaria o accidente cerebrovascular), niveles elevados de marcadores inflamatorios (por ejemplo, proteína C reactiva (CRP o hs-CRP), sCD40L, sICAM, etc.), elevados niveles de homocisteína en suero, elevados niveles de ácido úrico en suero y elevadas concentraciones de fibrinógeno en suero.

El término infarto de miocardio (IM) deriva de miocardium (el músculo del corazón) e infarction (muerte de tejido debida a privación de oxígeno). El IM es un estado de enfermedad que ocurre cuando se interrumpe el riego sanguíneo a una parte del corazón. El IM agudo (IMA) es un tipo de síndrome coronario agudo, que es lo más frecuentemente (pero no siempre) una manifestación de enfermedad de las arterias coronarias. El acontecimiento desencadenante más común es la rotura de una placa aterosclerótica en una arteria coronaria epicárdica, que conduce a una cascada de coagulación, que algunas veces produce la oclusión total de la arteria. La isquemia o la falta de oxígeno resultante causa un daño y la posible muerte de tejido cardíaco.

Los factores de riesgo importantes para el IM o IMA incluyen antecedentes de enfermedad vascular, tales como enfermedad cardíaca coronaria aterosclerótica y/o angina, un infarto de miocardio o accidente cerebrovascular previo, cualquier episodio previo de ritmos cardíacos anormales o síncope, edad avanzada (por ejemplo, hombres de más de 40 y mujeres de más de 50), tabaquismo, consumo excesivo de alcohol, niveles elevados de triglicéridos, LDL ("lipoproteína de baja densidad") alta y HDL ("lipoproteína de alta densidad") baja, diabetes, hipertensión, obesidad y estrés.

Los síntomas del IM o IMA incluyen dolor torácico, apnea, náuseas, vómitos, palpitaciones, sudoración y ansiedad o sensación de muerte inminente. Los sujetos frecuentemente se sienten enfermos de repente. Aproximadamente un tercio de todos los infartos de miocardio son silenciosos, sin dolor torácico ni otros síntomas.

Un sujeto que se sospecha que tiene un IM es sometido a varias pruebas de diagnóstico, tales como un electrocardiograma (ECG), una radiografía del tórax y un análisis de sangre para detectar niveles elevados de creatina cinasa (CK) o troponina (marcadores liberados por tejidos dañados, especialmente el miocardio). Un angiograma coronario permite visualizar estrechamientos u obstrucciones en los vasos del corazón.

El infarto de miocardio causa una pérdida irreversible de células del músculo del corazón que conduce a una delgada cicatriz fibrótica que no puede contribuir a la función del corazón. La terapia con células madre proporciona un posible enfoque al tratamiento de la insuficiencia cardíaca después del infarto de miocardio, así como de la aterosclerosis asociada con la remodelación. El concepto básico de la terapia con células madre es aumentar el número de células funcionales del músculo del corazón inyectando células inmaduras del músculo del corazón directamente en la pared del corazón dañado. El infarto de miocardio conduce a la pérdida de cardiomiocitos, seguido por remodelación patológica y progresión a insuficiencia cardíaca. Un objetivo de la terapia con células madre es sustituir los cardiomiocitos perdidos después de la isquemia, induciendo la revascularización de la región lesionada. Otro objetivo es prevenir la remodelación patológica perjudicial después del infarto de miocardio y asociada con la aterosclerosis. Se considera que las células madre mesenquimatosas autólogas o alógenas son una de las posibles fuentes de células para la terapia con células madre. Por lo tanto, las células madre mesenquimatosas dérmicas desveladas en el presente documento se pueden usar en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

Las células madre mesenquimatosas dérmicas también pueden ser para su uso en la regeneración de tejido. Las células ABCB5 positivas se usan para generar tejido por inducción de diferenciación. Las células madre mesenquimatosas aisladas y purificadas se pueden cultivar en un estado indiferenciado a través de expansión mitótica en un medio específico. Estas células se pueden recoger entonces y activar para diferenciar en hueso, cartílago y diversos otros tipos de tejido conjuntivo por varios factores, que incluyen estímulos mecánicos, celulares y bioquímicos. Las células madre mesenquimatosas humanas poseen el potencial de diferenciación en células, tales como osteoblastos y condrocitos, que producen una amplia variedad de células de tejido mesenquimatoso, así como tendón, ligamento y dermis, y este potencial es retenido después del aislamiento y durante varias expansiones de población en cultivo. Por lo tanto, siendo capaces de aislar, purificar, multiplicar enormemente, y luego activar células madre mesenquimatosas para la diferenciación en los tipos específicos de células mesenquimatosas deseadas, tales como tejidos esqueléticos y conjuntivos, tales como hueso, cartílago, tendón, ligamento, músculo y adiposo, existe un proceso de tratamiento de trastornos esqueléticos y otros de tejido conjuntivos. El término tejido conjuntivo se usa en el presente documento para incluir los tejidos del cuerpo que soportan los elementos especializados, e incluye hueso, cartílago, ligamento, tendón, estroma, músculo y tejido adiposo.

Las composiciones de la invención utilizan células progenitoras mesenquimatosas dérmicas aisladas que, en ciertas condiciones, se pueden inducir para diferenciarse en y producir diferentes tipos de tejido conjuntivo deseado, tal como en células formadoras de hueso o cartílago.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a las células madre mesenquimatosas dérmicas para su uso en la reparación del daño de tejido conjuntivo. El tratamiento comprende las etapas de aplicar las células madre mesenquimatosas dérmicas a un área de daño de tejido conjuntivo en condiciones adecuadas para la diferenciación de las células en el tipo de tejido conjuntivo que se necesita reparar.

El término "defectos del tejido conjuntivo" se refiere a defectos que incluyen cualquier daño o irregularidad en comparación con el tejido conjuntivo normal que pueden ocurrir debido a traumatismo, enfermedad, edad, defecto congénito, intervención quirúrgica, etc. Defectos del tejido conjuntivo también se refiere a áreas no dañadas en las que la formación de hueso se desea únicamente, por ejemplo, para potenciación cosmética.

Las células madre mesenquimatosas dérmicas se pueden administrar directamente a un sujeto por cualquier modo de administración conocido o se pueden sembrar en una matriz o implante. Las matrices o implantes incluyen matrices poliméricas, tales como dispositivos fibrosos o basados en hidrogel. Se usan comúnmente dos tipos de matrices para soportar las células madre mesenquimatosas ya que se diferencian en cartílago o hueso. Una forma de matriz es una malla polimérica o una esponja; la otra es un hidrogel polimérico. La matriz puede ser biodegradable o no biodegradable. El término biodegradable, como se usa en el presente documento, significa un polímero que se disuelve o degrada en un periodo que es aceptable en la aplicación deseada, menos de aproximadamente seis meses y lo más preferentemente menos de aproximadamente doce semanas, una vez se expone a una disolución fisiológica de pH 6 8 que tiene una temperatura de entre aproximadamente 25 °C y 38 °C. Una matriz puede ser biodegradable durante un periodo de tiempo, por ejemplo, de menos de un año, más preferentemente menos de seis meses, lo más preferentemente durante dos a diez semanas.

Las matrices fibrosas se pueden fabricar o construir usando materiales comercialmente disponibles. Las matrices se forman normalmente de un polímero natural o sintético. Se prefieren los polímeros biodegradables, de manera que el cartílago recién formado pueda mantenerse él mismo y funcionar normalmente bajo la carga presente en las articulaciones sinoviales. Se prefieren los polímeros que se degradan en una a veinticuatro semanas. Se prefieren los polímeros sintéticos debido a que su tasa de degradación puede ser determinada con más exactitud y tienen más consistencia entre lotes y menos inmunogenicidad que los polímeros naturales. Los polímeros naturales que se pueden usar incluyen proteínas, tales como colágeno, albúmina y fibrina; y polisacáridos, tales como alginato y polímeros de ácido hialurónico. Los polímeros sintéticos incluyen tanto polímeros biodegradables como no biodegradables. Los ejemplos de polímeros biodegradables incluyen polímeros de hidroxiácidos, tales como ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA) y ácido poliláctico-ácido glicólico (PLGA), poliortoésteres, polianhídridos, polifosfacenos y combinaciones de los mismos. Los polímeros no biodegradables incluyen poliacrilatos, polimetacrilatos, etileno-acetato de vinilo y poli(alcoholes vinílicos). Estos se deben evitar puesto que su presencia en el cartílago conducirá inevitablemente a daño mecánico y degradación del cartílago.

En la realización preferida, los polímeros forman fibras que se entrelazan, tejen o forman una malla para formar una matriz que tiene una separación intersticial de entre 100 y 300 micrómetros. Las mallas de ácido poliglicólico que se pueden usar se pueden obtener de empresas de suministro quirúrgico, tales como Ethicon, N.J. También se pueden usar esponjas. Como se usa en el presente documento, el término "fibroso" se refiere a una matriz entrelazada, tejida o en forma de malla o una matriz de esponja.

La matriz se forma preferentemente para llenar el defecto. En la mayoría de los casos esto se puede lograr cortando las fibras de polímero con tijeras o una cuchilla; alternativamente, la matriz puede ser colada de una disolución de polímero formada calentando o disolución en un disolvente volátil.

Las células madre mesenquimatosas se siembran sobre la matriz por aplicación de una suspensión de células a la matriz. Esto se puede llevar a cabo sumergiendo la matriz en un recipiente de cultivo celular, o inyección u otra aplicación directa de las células a la matriz.

La matriz sembrada con células se implanta en el sitio del defecto usando técnicas quirúrgicas habituales. La matriz se puede sembrar y cultivar in vitro antes de la implantación, sembrar e implantar inmediatamente, o implantar y luego sembrar con células. En la realización preferida, las células se siembran sobre y dentro de la matriz y se cultivan in vitro durante entre aproximadamente dieciséis horas y dos semanas. Solo es esencial que las células se fijen a la matriz. Dos semanas es un tiempo preferido para el cultivo de las células, aunque puede ser más largo. La densidad celular en el momento de la siembra o la implantación debe ser aproximadamente 25.000 células/mm3.

Se usan polímeros que pueden formar hidrogeles iónicos o covalentemente reticulados que son maleables para encapsular células. Por ejemplo, se produce un hidrogel por reticulación de la sal aniónica de polímero, tal como ácido algínico, un polímero de hidrato de carbono aislado de alga marina, con cationes calcio, cuya resistencia aumenta con concentraciones crecientes de iones calcio o alginato. La disolución de alginato se mezcla con las células a implantar para formar una suspensión de alginato. Entonces, la suspensión se inyecta directamente en un paciente antes del endurecimiento de la suspensión. La suspensión se endurece entonces durante un corto periodo de tiempo debido a la presencia in vivo de concentraciones fisiológicas de iones calcio.

El material polimérico que se mezcla con las células para la implantación en el cuerpo debe formar un hidrogel. Un hidrogel se define como una sustancia formada cuando un polímero orgánico (natural o sintético) se reticula por enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno para crear una estructura tridimensional de red abierta que atrapa moléculas de agua para formar un gel. Los ejemplos de materiales que se pueden usar para formar un hidrogel incluyen polisacáridos, tales como alginato, polifosfazinas y poliacrilatos, que se reticulan iónicamente, o copolímeros de bloque, tales como Pluronics.TM. o Tetronics.TM., copolímeros de bloque de poli(óxido de etileno)-polipropilenglicol que se reticulan por temperatura o pH, respectivamente. Otros materiales incluyen proteínas, tales como fibrina, polímeros tales como polivinilpirrolidona, ácido hialurónico y colágeno.

En general, estos polímeros son al menos parcialmente solubles en disoluciones acuosas, tales como agua, disoluciones salinas tamponadas o disoluciones alcohólicas acuosas, que tienen grupos laterales cargados, o una sal iónica monovalente de los mismos. Los ejemplos de polímeros con grupos laterales ácido que se pueden hacer reaccionar con cationes son poli(fosfacenos), poli(ácidos acrílicos), poli(ácidos metacrílicos), copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, poli(acetato de vinilo) y polímeros sulfonatados, tales como poliestireno sulfonatado. También se pueden usar copolímeros que tienen grupos laterales ácidos formados haciendo reaccionar ácido acrílico o metacrílico y monómeros o polímeros de vinil éter. Los ejemplos de grupos ácidos son grupos ácido carboxílico, grupos ácido sulfónico, grupos alcohol halogenado (preferentemente fluorados), grupos OH fenólicos y grupos OH ácidos.

Los ejemplos de polímeros con grupos laterales básicos que se pueden hacer reaccionar con aniones son poli(vinil aminas), poli(vinil piridina), poli(vinil imidazol), y algunos polifosfacenos sustituidos con imino. La sal de amonio o cuaternaria de los polímeros también se puede formar a partir de los nitrógenos de esqueleto o grupos imino laterales. Los ejemplos de grupos laterales básicos son grupos amino y imino.

El alginato puede ser iónicamente reticulado con cationes divalentes, en agua, a temperatura ambiente, para formar una matriz de hidrogel. Debido a estas condiciones suaves, el alginato ha sido el polímero más comúnmente usado para la encapsulación de células de hibridoma, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.° 4.352.883 a Lim. En el proceso de Lim, una disolución acuosa que contiene los materiales biológicos a encapsular se suspende en una disolución de un polímero soluble en agua, la suspensión se conforma en gotitas que se configuran en microcápsulas discretas por contacto con cationes multivalentes, entonces la superficie de las microcápsulas se reticula con poliaminoácidos para formar una membrana semipermeable alrededor de los materiales encapsulados.

Los polifosfacenos son polímeros con esqueletos que consisten en nitrógeno y fósforo separados por enlaces sencillos y dobles enlaces alternos. Los polifosfacenos adecuados para la reticulación tienen una mayoría de grupos de cadena lateral que son ácidos y capaces de formar puentes de sal con cationes di- o trivalentes. Los ejemplos de grupos laterales ácidos preferidos son grupos ácido carboxílico y grupos ácido sulfónico. Se pueden sintetizar polímeros que se degradan por hidrólisis incorporando monómeros que tienen grupos laterales imidazol, éster de aminoácido o glicerol. Por ejemplo, se puede sintetizar un poli[bis(carboxilatofenoxi)]fosfaceno (PCPP) polianiónico, que se reticula con cationes multivalentes disueltos en medios acuosos a temperatura ambiente o inferior para formar matrices de hidrogel.

El polímero soluble en agua con grupos laterales cargados se reticula iónicamente haciendo reaccionar el polímero con una disolución acuosa que contiene iones multivalentes de carga opuesta, ya sea cationes multivalentes si el polímero tiene grupos laterales ácidos o aniones multivalentes si el polímero tiene grupos laterales básicos. Los cationes preferidos para la reticulación de los polímeros con grupos laterales ácidos para formar un hidrogel son cationes divalentes y trivalentes, tales como cobre, calcio, aluminio, magnesio, estroncio, bario, cinc y estaño, aunque cationes orgánicos di-, tri- o tetra-funcionales, tales como las sales de alquilamonio. Se añaden disoluciones acuosas de las sales de estos cationes a los polímeros para formar hidrogeles y membranas blandas altamente hinchadas. Cuanto más alta sea la concentración de catión, o mayor sea la valencia, mayor será el grado de reticulación del polímero. Se ha mostrado que concentraciones de tan solo 0,005 M reticulan el polímero. Concentraciones más altas están limitadas por la solubilidad de la sal.

Preferentemente, el polímero se disuelve en una disolución acuosa, preferentemente una disolución 0,1 M de fosfato de potasio, a pH fisiológico, hasta una concentración que forma un hidrogel polimérico, por ejemplo, para alginato, de entre el 0,5 y el 2 % en peso, preferentemente del 1 %, de alginato. Las células aisladas se suspenden en la disolución de polímero hasta una concentración de entre 1 y 10 millones de células/ml, lo más preferentemente entre 10 y 20 millones de células/ml.

En una realización, las células se mezclan con la disolución de hidrogel y se inyectan directamente en un sitio donde se desea implantar las células, antes del endurecimiento del hidrogel. Sin embargo, la matriz también se puede moldear e implantar en una o más áreas diferentes del cuerpo para adecuarse a una aplicación particular. La presente solicitud es particularmente relevante donde se desea un diseño estructural específico o donde el área en el que las células se van a implantar carece de estructura o soporte específico para facilitar el crecimiento y la proliferación de las células.

El sitio, o los sitios, donde se van a implantar las células se determina basándose en la necesidad individual, al igual que el número requerido de células. También se podría aplicar un molde externo para moldear la disolución inyectada. Además, controlando la tasa de polimerización, es posible moldear el implante inyectado con células- hidrogel

Alternativamente, la mezcla se puede inyectar en un molde, dejar que el hidrogel endurezca, entonces se implanta el material.

La suspensión se puede inyectar por una jeringa y aguja directamente en un área específica donde se desee un material de relleno, especialmente defectos de tejido blando. La suspensión también se puede inyectar como un material de relleno para defectos de tejido duro, tales como defectos de hueso o cartílago, ya sea estados de enfermedad congénita o adquirida, o derivados de traumatismo, quemaduras, o similares. Un ejemplo de esto sería una inyección en el área que rodea el cráneo donde existe una deformidad ósea derivada de un traumatismo. La inyección en estos casos se puede hacer directamente dentro del área necesaria usando una aguja y jeringa con anestesia local o general.

Las células madre mesenquimatosas dérmicas se pueden modificar para expresar proteínas que también son útiles en las indicaciones terapéuticas, como se describe en más detalle más adelante. Por ejemplo, las células pueden incluir un ácido nucleico que produce al menos un factor bioactivo que induce o acelera más la diferenciación de las células madre mesenquimatosas en un linaje diferenciado. En el caso en que se esté formando hueso, el factor bioactivo puede ser un miembro de la superfamilia de TGF-beta que comprende diversos factores de crecimiento de tejido, particularmente proteínas morfogénicas óseas, tales como al menos una seleccionada del grupo que consiste en BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-6 y BMP-7.

Las células desveladas en el presente documento pueden ser útiles en un método de inducción de anergia de linfocitos T, in vitro. La inducción de anergia de linfocitos T implica cultivar las células madre mesenquimatosas dérmicas en presencia de antígeno en condiciones suficientes para inducir la formación de linfocitos T y/o progenitores de linfocitos T y para inhibir la activación de los linfocitos T y/o progenitores de linfocitos T formados. La anergia se define como un estado insensible de los linfocitos T (es decir, dejan de producir IL-2 con la reestimulación, o proliferan cuando se reestimulan) (Zamoyska R, Curr Opin Immunol, 1998, 10(1):82-87; Van Parijs L, et al., Science, 1998, 280(5361):243-248; Schwartz RH, Curr Opin Immunol, 1997, 9(3):351-357; Immunol Rev, 1993, 133:151-76). La anergia se puede medir tomando los linfocitos T tratados y reestimulándolos con un antígeno en presencia de APC. Si las células son anérgicas, no responderán al antígeno en una concentración apropiada en el contexto de APC.

Como se usa en el presente documento, un sujeto es un humano, primate no humano, vaca, caballo, cerdo, oveja, cabra, perro, gato o roedor. Las células madre mesenquimatosas dérmicas humanas y los sujetos humanos son realizaciones particularmente importantes.

También se describe en el presente documento que las células madre mesenquimatosas pueden ser genéticamente manipuladas (o transducidas o transfectadas) con un gen de interés. Las células transducidas se pueden administrar a un paciente en necesidad de las mismas, por ejemplo para tratar trastornos o enfermedades genéticas.

Las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas, y la descendencia de las mismas, pueden ser genéticamente alteradas. La alteración genética de una célula madre mesenquimatosa dérmica ABCB5 positiva incluye todos los cambios transitorios y estables del material genético celular que se crean mediante la adición de material genético exógeno. Los ejemplos de alteraciones genéticas incluyen cualquier procedimiento de genoterapia, tal como la introducción de un gen funcional para sustituir un gen mutado o no expresado, la introducción de un vector que codifica un producto génico negativo dominante, la introducción de un vector manipulado para expresar una ribozima y la introducción de un gen que codifica un producto génico terapéutico. Los cambios genéticos naturales, tales como la transposición espontánea de un gen de receptor de linfocitos T sin la introducción de cualquier agente, no se incluyen en este concepto. El material genético exógeno incluye ácidos nucleicos u oligonucleótidos, ya sean naturales o sintéticos, que se introducen en las células madre mesenquimatosas dérmicas. El material genético exógeno puede ser una copia del que está naturalmente presente en las células, o puede no ser encontrado naturalmente en las células. Normalmente es al menos una porción de un gen natural que se ha puesto bajo el control operativo de un promotor en una construcción de vector.

Se pueden emplear diversas técnicas para introducir ácidos nucleicos en las células. Dichas técnicas incluyen la transfección de precipitados de ácido nucleico-CaPO4, la transfección de ácidos nucleicos asociados a DEAE, la transfección con un retrovirus que incluye el ácido nucleico de interés, la transfección mediada por liposomas y similares. Para ciertos usos, se prefiere dirigir el ácido nucleico a células particulares. En dichos casos, un vehículo usado para administrar un ácido nucleico en una célula (por ejemplo, un retrovirus, u otro virus; un liposoma) puede tener una molécula de direccionamiento unido al mismo. Por ejemplo, una molécula, tal como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana superficial sobre la célula diana o un ligando para un receptor sobre la célula diana, se puede unir a o incorporar dentro del vehículo de administración de ácido nucleico. Por ejemplo, donde se emplean liposomas para administrar los ácidos nucleicos, las proteínas que se unen a una proteína de la membrana superficial asociada a endocitosis, se pueden incorporar en la formulación de liposoma para el direccionamiento y/o para facilitar la captación. Dichas proteínas incluyen proteínas o fragmentos de las mismas específicas para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que se someten a internalización en el ciclado, proteínas que se dirigen a una localización intracelular y potencian la semivida intracelular, y similares. También se han usado satisfactoriamente sistemas de administración poliméricos para administrar ácidos nucleicos en células, como se conoce por los expertos en la técnica. Dichos sistemas permiten incluso la administración oral de ácidos nucleicos.

Un método de introducción de material genético exógeno en las células madre mesenquimatosas dérmicas es transduciendo las células usando retrovirus deficientes en la replicación. Los retrovirus deficientes en la replicación son capaces de dirigir la síntesis de todas las proteínas de viriones, pero son incapaces de preparar partículas infecciosas. Por consiguiente, estos vectores retrovíricos genéticamente alterados tienen utilidad general para la transducción de alta eficiencia de genes en células cultivadas. Se han usado ampliamente retrovirus para la transferencia de material genético en células. Se proporcionan en la técnica protocolos convencionales para producir retrovirus deficientes en la replicación (incluyendo las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, transfección de una estirpe celular de encapsidación con plásmido, producción de retrovirus recombinantes por la estirpe celular de encapsidación, recogida de partículas víricas de medios de cultivo de tejido e infección de las células diana con las partículas víricas).

La principal ventaja de uso de los retrovirus es que los virus insertan eficientemente una única copia del gen que codifica el agente terapéutico en el genoma de la célula hospedadora, por lo que se permite que el material genético exógeno sea pasado a la descendencia de la célula cuando se divide. Además, se ha informado que las secuencias promotoras de genes en la región LTR potencian la expresión de una secuencia codificante insertada en una variedad de tipos de células. Las principales desventajas de uso de un vector de expresión de retrovirus son (1) mutagénesis de inserción, es decir, la inserción del gen terapéutico en una posición no deseable en el genoma de la célula diana que, por ejemplo, conduce a un crecimiento celular no regulado y (2) la necesidad de dirigir la proliferación celular con el fin de que el gen terapéutico llevado por el vector se integre en el genoma diana. A pesar de estas limitaciones evidentes, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico por un retrovirus puede ser eficaz si la eficiencia de transducción es alta y/o el número de células diana disponible para la transducción es alto.

Otro candidato vírico útil más como vector de expresión para la transformación de células madre mesenquimatosas dérmicas es el adenovirus, un virus de ADN bicatenario. Al igual que los retrovirus, el genoma del adenovirus es adaptable para su uso como un vector de expresión para la transducción de genes, es decir, retirando la información genética que controla la producción del virus en sí. Debido a que el adenovirus funciona normalmente en un modo extracromosómico, el adenovirus recombinante no tiene el problema teórico de la mutagénesis de inserción. Por otra parte, la transformación adenovírica de una célula madre mesenquimatosa dérmica diana puede no dar como resultado la transducción estable. Sin embargo, más recientemente se ha informado que ciertas secuencias adenovíricas confieren la especificidad de integración intracromosómica a las secuencias de vehículo y, por lo tanto, producen una transducción estable del material genético exógeno.

Por lo tanto, como será evidente para un experto habitual en la técnica, está disponible una variedad de vectores adecuados para transferir material genético exógeno en células madre mesenquimatosas dérmicas. La selección de un vector apropiado para administrar un agente terapéutico para una afección particular tributaria de terapia de sustitución génica y la optimización de las condiciones para la inserción del vector de expresión seleccionado en la célula están dentro del alcance de un experto habitual en la técnica sin la necesidad de excesiva experimentación. El promotor tiene característicamente una secuencia de nucleótidos específica necesaria para iniciar la transcripción. Opcionalmente, el material genético exógeno adicional incluye secuencias adicionales (es decir, potenciadores) requeridos para obtener la actividad de transcripción génica deseada. Con el fin de la presente discusión, un "potenciado^ es simplemente cualquier secuencia de ADN no traducida que funciona contigua con la secuencia codificante (en cis) para cambiar el nivel de transcripción basal dictado por el promotor. Preferentemente, el material genético exógeno se introduce en el genoma de la célula madre mesenquimatosa dérmica inmediatamente en la dirección 3’ del promotor de manera que el promotor y la secuencia codificante se unan operativamente para permitir la transcripción de la secuencia codificante. Un vector de expresión retrovírico preferido incluye un elemento promotor exógeno para controlar la transcripción del gen exógeno insertado. Dichos promotores exógenos incluyen tanto promotores constitutivos como inducibles.

Los promotores constitutivos naturales controlan la expresión de funciones celulares esenciales. Como resultado, un gen bajo el control de un promotor constitutivo se expresa en todas las condiciones de crecimiento celular. Los promotores constitutivos a modo de ejemplo incluyen los promotores para los siguientes genes que codifican ciertas funciones constitutivas o "de mantenimiento": hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT), dihidrofolato reductasa (DHFR) (Scharfmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4626-4630 (1991)), adenosina desaminasa, fosfoglicerol cinasa (PGK), piruvato cinasa, fosfoglicerol mutasa, el promotor de actina (Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10006-10010 (1989)), y otros promotores constitutivos conocidos por los expertos en la técnica. Además, muchos promotores víricos funcionan constitutivamente en células eucariotas. Estos incluyen: los promotores temprano y tardío del SV40; las repeticiones terminales largas (LTRS) del virus de la leucemia de Moloney y otros retrovirus; y el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple, entre muchos otros. Por consiguiente, cualquiera de los promotores constitutivos anteriormente referenciados se puede usar para controlar la transcripción de una inserción de gen heterólogo.

Los genes que están bajo el control de promotores inducibles se expresan solos o a un grado mayor en presencia de un agente inductor (por ejemplo, la transcripción bajo el control del promotor de la metalotioneína se incrementa enormemente en presencia de ciertos iones metálicos). Los promotores inducibles incluyen elementos sensibles (RE) que estimulan la transcripción cuando sus factores inductores están unidos. Por ejemplo, hay RE para factores del suero, hormonas esteroideas, ácido retinoico y AMP cíclico. Se pueden elegir promotores que contienen un RE particular para obtener una respuesta inducible y en algunos casos el RE en sí se puede unir a un promotor diferente, por lo que se confiere inducibilidad al gen recombinante. Por lo tanto, seleccionando el promotor apropiado (constitutivo frente a inducible; fuerte frente a débil), es posible controlar tanto la existencia como el nivel de expresión de un agente terapéutico en la célula madre mesenquimatosa dérmica genéticamente modificada. Se considera que la selección y la optimización de estos factores para la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico particular está dentro del alcance de un experto habitual en la técnica sin excesiva experimentación, teniendo en cuenta los factores anteriormente desvelados y el perfil clínico del sujeto.

Además de al menos un promotor y al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica el agente terapéutico, el vector de expresión incluye preferentemente un gen de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, para facilitar la selección de células madre mesenquimatosas dérmicas que se han transfectado o transducido con el vector de expresión. Alternativamente, las células madre mesenquimatosas dérmicas se transfectan con dos o más vectores de expresión, conteniendo al menos un vector el (los) gen(es) que codifican el (los) agente(s) terapéutico(s), conteniendo el otro vector un gen de selección. Se considera que la selección de un promotor, potenciador, gen de selección y/o secuencia señal adecuado está dentro del alcance de un experto habitual en la técnica sin excesiva experimentación.

La selección y la optimización de un vector de expresión particular para expresar un producto génico específico en una célula madre mesenquimatosa dérmica aislada se lleva a cabo obteniendo el gen, preferentemente con una o más regiones de control apropiadas (por ejemplo, promotor, secuencia de inserción); preparando una construcción de vector que comprende el vector en el que se inserta el gen; transfectando o transduciendo células madre mesenquimatosas dérmicas cultivadas in vitro con la construcción de vector; y determinando si el producto génico está presente en las células cultivadas.

Por lo tanto, la presente divulgación hace posible manipular genéticamente células madre mesenquimatosas dérmicas de tal manera que produzcan polipéptidos, hormonas y proteínas que no se producen normalmente en células madre humanas en cantidades biológicamente significativas o se producen en pequeñas cantidades, pero en situaciones en las que la sobreproducción conduciría a un beneficio terapéutico. Estos productos serían entonces secretados en la circulación sanguínea u otras áreas del cuerpo, tales como el sistema nervioso central. Las células madre humanas formadas de esta forma pueden servir de sistemas continuos de administración de fármacos para sustituir los regímenes actuales, que requieren administración periódica (por ingestión, inyección, infusión lenta, etc.) de la sustancia necesaria. Esto tiene aplicabilidad en proporcionar hormonas, enzimas y fármacos a seres humanos, en necesidad de dichas sustancias. Es particularmente valioso proporcionar dichas sustancias, tales como hormonas (por ejemplo, hormona paratiroidea, insulina), que se necesitan en dosis sostenidas durante periodos de tiempo prolongados.

Por ejemplo, se puede usar para proporcionar la administración continua de insulina, y, como resultado, no habría necesidad de inyecciones diarias de insulina. Las células madre mesenquimatosas humanas genéticamente manipuladas también se pueden usar para la producción de factores de coagulación, tales como el factor VIII, o para el suministro continuo de distrofina a las células musculares para distrofia muscular.

La incorporación del material genético de interés en células madre mesenquimatosas dérmicas es particularmente valioso en el tratamiento de enfermedad hereditaria y adquirida. En el caso de enfermedades hereditarias, este enfoque se usa para proporcionar células madre mesenquimatosas humanas genéticamente modificadas y otras células que se pueden usar como sumidero metabólico. Es decir, dichas células madre mesenquimatosas dérmicas servirían para degradar una sustancia posiblemente tóxica. Por ejemplo, esta se podría usar en tratar trastornos del catabolismo de los aminoácidos, que incluyen las hiperfenilalaninemias, debido a un defecto en la fenilalanina hidroxilasa; las homocisteinemias, debido a un defecto en la cistationina beta-sintasa.

Las células madre mesenquimatosas dérmicas se pueden modificar aún más para expresar una molécula de muerte celular para potenciar la eliminación de linfocitos T activados, en el tratamiento del trasplante de órganos o de tejido. Por ejemplo, la molécula de muerte celular se puede expresar por las células madre mesenquimatosas que han sido manipuladas para expresar la molécula de muerte celular exógena. Como se usa en el presente documento, una "molécula de muerte celular" es una molécula que interactúa con o se une con su receptor relacionado en un linfocito T estimulado que induce la muerte o apoptosis de linfocitos T. Fas media en la apoptosis de linfocitos T recientemente activados que se exponen nuevamente a la estimulación (van Parijs et al., Immunity 4: 321-328 (1996)). Fas es un receptor de membrana de tipo I que cuando se reticula con su ligando relacionado induce la apoptosis en una amplia variedad de células. La interacción entre la molécula de Fas (CD95) en los linfocitos T diana y su ligando Fas L en células madre mesenquimatosas produce la agregación de receptores, que transduce señales que conducen a la apoptosis de la célula diana. Se ha mostrado que el sistema Fas participa en varias funciones en varias funciones celulares in vivo que incluyen la selección negativa de timocitos, el mantenimiento de los sitios de privilegio inmunitario dentro del cuerpo y la citotoxicidad mediada por linfocitos T citotóxicos (CTL) (Green y Ware, Proc Natl Acad Sci, 94(12):5986-90 (1997)).

Otros miembros de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral receptor (TNFR) tienen funciones en la muerte celular programada. El ligando TRAIL, que interactúa con su receptor DR4, puede inducir la apoptosis en una variedad de estirpes celulares transformadas (G. Pan et al. Science, 277:815-818 (1997)); y la expresión de CD27 y su ligando CD70 (Prasad et al., Proc Natl Acad Sci, 94:6346-6351 (1997)) también induce la apoptosis. La expresión de Fas está restringida a linfocitos T estimulados y sitios de privilegio inmunitario. TRAIL se detecta en muchos tejidos normales.

Tanto el ligando Trail como CD27, pero no el ligando Fas, se expresan en células madre mesenquimatosas humanas sin manipular. Los linfocitos T activados, pero no en reposo, expresan al receptor Trail y CD70. La mayoría de los linfocitos T encontrados en el cuerpo están en un estado en reposo; los linfocitos T se activan cuando encuentran células tanto en el contexto de MHC como la molécula coestimulante apropiada, tal como B7-1 o B7-2.

Por lo tanto, la interacción de los receptores de muerte celular en linfocitos T activados con sus ligandos expresados en las células madre mesenquimatosas produce la muerte de linfocitos T por apoptosis. Los ligandos y sus receptores distintos de los específicamente mencionadas anteriormente, ya sea presentes dentro de la célula madre mesenquimatosa como introducidos en la célula madre mesenquimatosa, pueden realizar esta función. Por lo tanto, las células madre mesenquimatosas administradas a un individuo delecionan linfocitos T activados, reduciendo la intensidad o incidencia de la enfermedad de rechazo de trasplante.

La dosis de las células madre mesenquimatosas dérmicas varía dentro de amplios límites y, por supuesto, se ajustará a los requisitos individuales en cada caso particular. El número de células usadas dependerá del peso y la condición del receptor y otras variables conocidas por los expertos en la técnica.

Las células se pueden administrar por una vía que es adecuada para el tejido u órgano particular que se va a tratar. Los modos de administración de la preparación de células madre mesenquimatosas incluyen, pero no se limitan a, inyección intravenosa sistémica e inyección directamente al sitio de actividad previsto. La preparación se puede administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, y se puede administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración es preferentemente sistémica, es decir, por vía parenteral, por inyección intravenosa. En algunos casos, las células madre mesenquimatosas dérmicas se administran al sitio de tratamiento o terapia deseado y puede ser dirigidas a un tejido u órgano particular.

En general, en el caso de administración parenteral, es habitual administrar desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 5 millones de células por kilogramo de peso corporal del receptor. El número de células usado dependerá del peso y la afección del receptor, el número o la frecuencia de administraciones, y otras variables conocidas por los expertos en la técnica. Las células madre mesenquimatosas se pueden administrar por una vía que es adecuada para el tejido, el órgano o las células a trasplantar. Se pueden administrar por vía sistémica, es decir, por vía parenteral, por inyección intravenosa, o se pueden dirigir a un tejido u órgano particular, tal como la médula ósea. Las células madre mesenquimatosas humanas se pueden administrar por una implantación subcutánea de células o por inyección de células madre en tejido conjuntivo, por ejemplo músculo.

Las células se pueden suspender en un diluyente apropiado, a una concentración de desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 5x106 células/ml. Los excipientes adecuados para las disoluciones para inyección son los que son biológicamente y fisiológicamente compatibles con las células y con el receptor, tales como solución salina tamponada u otros excipientes adecuados. La composición para administración se debe formular, producir y guardar según métodos convencionales que cumplen la esterilidad y la estabilidad apropiadas. Otros excipientes incluyen agua, disoluciones isotónicas de sal común, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales. La composición para administración se debe formular, producir y guardar según métodos convencionales que cumplen la esterilidad y la estabilidad apropiadas.

La célula madre mesenquimatosa se puede administrar sola, sin embargo, en una realización preferida, las células madre mesenquimatosas se utilizan en forma de composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de las células madre mesenquimatosas dérmicas, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo incluye, pero no se limita a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua y combinaciones de los mismos.

En una realización preferida, la preparación o composición de células madre mesenquimatosas se formula según procedimientos habituales como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son disoluciones en tampón acuoso isotónico estéril. En caso necesario, la composición también puede incluir un anestésico local para mejorar cualquier dolor en el sitio de la inyección. En general, los componentes se suministran ya sea por separado o mezclados juntos en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, como un concentrado crioconservado en un envase herméticamente sellado, tal como una ampolla que indica la cantidad de agente activo. Donde la composición se vaya a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella para infusión que contiene agua estéril de calidad farmacéutica o solución salina. Donde la composición se administre por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de manera que los componentes se puedan mezclar antes de la administración.

La divulgación también incluye recipientes farmacéuticos precargados (por ejemplo, viales para inyección, ampollas, bolsas para infusión, etc.) que contienen una dosis unitaria de células (es decir, el número de células a administrar de una vez al paciente). Las células se pueden suspender en una disolución (por ejemplo, solución salina isotónica estéril) junto con agentes que ayudan en su preservación (por ejemplo, glicerol). También se pueden incluir otros agentes, tales como antibióticos, sales farmacéuticamente aceptables, tampones y excipientes. Los recipientes farmacéuticos precargados en forma de dosis unitaria se pueden mantener refrigerados o guardar congelados. También se pueden suministrar como parte de un kit que tiene instrucciones para la administración de las células a pacientes trasplantados o pacientes con una enfermedad autoinmunitaria.

La presente divulgación también proporciona cualquiera de las composiciones anteriormente mencionadas en kits, que incluyen opcionalmente instrucciones para el uso de la composición para el tratamiento de una afección descrita en el presente documento. Es decir, el kit puede incluir una descripción de uso de la composición para participación en cualquier mecanismo biológico o químico desvelado en el presente documento. Los kits pueden incluir además una descripción de actividad de la afección en el tratamiento de la patología, a diferencia de los síntomas de la afección. Es decir, el kit puede incluir una descripción de uso de las composiciones como se trata en el presente documento. El kit también puede incluir instrucciones para el uso de una combinación de dos o más composiciones desveladas en el presente documento, o instrucción para el uso de una combinación de una composición desvelada en el presente documento, y uno o varios de otros compuestos indicados para el tratamiento de las enfermedades. También se pueden proporcionar instrucciones para administrar la composición por cualquier técnica adecuada, como se describe previamente, por ejemplo, por vía oral, por vía intravenosa, bomba o dispositivo de administración implantable, o mediante otra vía conocida de administración de fármacos. Los kits también pueden ser uno o más reactivos asociados al aislamiento y la purificación de las células madre mesenquimatosas dérmicas, es decir, anticuerpos ABCB5, e instrucciones para aislar y/o purificar las células.

Los kits descritos en el presente documento también pueden contener uno o más recipientes, que pueden contener la composición y otros componentes como se describe previamente. Los kits también pueden contener instrucciones para la mezcla, dilución y/o administración de las composiciones desveladas en el presente documento en algunos casos. Los kits también pueden incluir otros recipientes con uno o más disolventes, tensioactivos, conservantes y/o diluyentes (por ejemplo, solución salina normal (0,9 % de NaCl), o 5 % de dextrosa), así como recipientes para la mezcla, dilución o administración de los componentes en una muestra o a un sujeto en necesidad de tal tratamiento.

Las composiciones del kit se pueden proporcionar como cualquier forma adecuada, por ejemplo, como disoluciones líquidas o como polvos secos. Cuando la composición proporcionada es un polvo seco, la composición se puede reconstituir mediante la adición de un disolvente adecuado, que también se puede proporcionar. En realizaciones donde se usan formas líquidas de la composición, la forma líquida se puede concentrar o estar lista para uso. El disolvente dependerá de la composición y el modo de uso o administración. Los disolventes adecuados para las composiciones de fármacos se conocen bien, por ejemplo como se describe previamente, y están disponibles en la bibliografía. El disolvente dependerá de la composición y el modo de uso o administración.

Ejemplos

Ejemplo 1:

A. ABCB5 marca CMM dérmicas murinas

La P-glucoproteína ABCB5 humana marca subpoblaciones de células madre que expresan el fenotipo de CMM en piel fisiológica y melanomas malignos (Frank, et al., J. Biol. Chem. 278:47156 (2003); Frank, et al., Cancer Res. 65:4320 (2005)). ABCB5 murina, que se encontró en experimentos de transfección que era reconocida por el mAb anti-ABCB5 3C2-1D12 dirigido contra un epítope extracelular conservado en la especie de la molécula (Frank, et al., J. Biol. Chem.

278:47156 (2003)), marca subpoblaciones de CMM dérmicas idénticas, como se ha determinado por tinción inmunoenzimática con HRP para ABCB5, cuando se compararon secciones congeladas de tejido a través de la anastomosis de xenoinjertos de piel humana y de ratones SCID.

B. Clonación y caracterización de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5+

El protocolo se desarrolló para estudiar las propiedades inmunomoduladoras de CMM dérmicas ABCB5+ murinas. El protocolo incluyó aislar, clonar, propagar y expandir esta población de células madre in vitro en las condiciones de medio definidas previamente descritas (Frank, et al., J. Biol. Chem. 278:47156 (2003)). Brevemente, se recogió piel murina de ratones adultos (6-10 semanas de edad) de la raza Balb/c o C57BL/6 (se obtuvieron ratones no mutantes C57BL/6 (H-2b) y BALB/c (H-2d) de Taconic Farms, Germantown, NY), se diseccionaron en trozos pequeños y se disociaron con colagenasa, seguido por el aislamiento de células ABCB5+ usando el mAb anti-ABCB5, microperlas magnéticas recubiertas con Ig anti-ratón de cabra y columnas de separación MiniMACS, y posterior clonación de células por dilución limitante. La expresión superficial de ABCB5 murina se determinó en pases sucesivos de células derivadas de forma clónica usando tinción de inmunofluorescencia con el mAb anti-ABCB5 y citometría de flujo (Fig. 1A, B).

Aunque ABCB5 se expresó en pases previos por la mayoría de células (Fig. 1A), los presentes inventores descubrieron que ABCB5 se expresó en el 5-15 % de las células en cultivos sucesivos derivados de células individuales (Fig. 1B), que indica que las células madre ABCB5+ dan lugar en cultivo a descendencia de ABCB5- más diferenciada. Sin embargo, células dérmicas ABCB5+ mantuvieron relaciones de abundancia relativa constante frente a las poblaciones globales de ABCB5- durante la expansión del cultivo de larga duración, lo que muestra la capacidad de autorrenovación de este subconjunto de células. La caracterización fenotípica adicional de cultivos derivados de células individuales murinas de Balb/c reveló una expresión significativa de los marcadores asociados a CMM CD29 (98,1+/-0,1 %; media+/-DE), CD44 (95,6+/- 4,7 %), CD49e (95,2+/-3,5 %), CD166 (14,5+/-2,4 %) y CD133 (4,0+/-1,4 %) entre todas las células, incluso en pases posteriores (>30, n=3), con expresión preferencial de los marcadores de células madre más primitivos CD133 y CD166 observados en ABCB5+ en comparación con subpoblaciones de ABCB5-(76,4+/-18,5 % frente a 0,7+/-0,9 % y 70,7+/-17,9 % frente a 10,8+/- 2,8 %, respectivamente; media+/-DE) (Fig. 2). Se encontró que las CMM dérmicas ABCB5+ derivadas de forma clónica poseían potencial de diferenciación multipotente, que indica además su fenotipo de CMM, en condiciones de cultivo distintas in vitro, con la capacidad para generar miocitos, osteocitos y adipocitos multinucleados que expresan la cadena pesada de miosina, cuando se tiñe con marcadores de linaje apropiados (mAb de cadena pesada de antimiosina conjugado con FITC, tinción con rojo de alizarina Red S, tinción con Oil Red, respectivamente).

Ejemplo 2:

Efecto inmunomodulador de CMM dérmicas positivas ABCB5

A. Se estudió in vivo la función inmunomoduladora de CMM dérmicas clónicas derivadas de ABCB5+, usando un modelo de alotrasplante cardíaco heterotópico murino como se describe previamente (Yamada, et al., J. Immunol.

167:140 (2001)). En una combinación de razas completamente discrepante, el tratamiento de receptores C57BL/6 de aloinjertos cardíacos de Balb/c con CMM dérmicas de tipo donante (3x106 células i.v., día -7) produjo una prolongación significativa de la supervivencia del aloinjerto en comparación con receptores tratados con esplenocitos de tipo donante o de control no tratado (mediana de la supervivencia del injerto 29,5 días frente a 10 días (P=0,012) o 7,5 días (P=0,006), respectivamente), (Fig. 3A) lo que demuestra la eficacia in vivo de CMM dérmicas para retardar el rechazo del injerto.

B. Se logró supervivencia del aloinjerto de larga duración > 100 días en n= 4/4 animales cuando el tratamiento con CMM dérmicas se combinó con el bloqueo coestimulante dirigido por CD40L usando el mAb anti-CD40L MR1 (250 mg/kg i.p. q.o.d. desde el día 0-10) como se describe previamente (Ozkaynak, et al., J. Immunol. 169:6546 (2002); Kishimoto, et al., J. Clin. Invest. 106:63 (2000)) (Fig. 3B). Las CMM dérmicas de la raza Balb/c de terceros también prolongaron la supervivencia cardíaca del aloinjerto en receptores C57BL/6 de corazones de C3H/HeJ en comparación con controles no tratados (mediana de la supervivencia del injerto 28 días frente a 7,5 días, P=0,016) (Fig. 3C). Sin embargo, los receptores Balb/c de aloinjertos de corazón C57BL/6 tratados con CMM de la raza del receptor rechazaron los corazones del donante con el mismo ritmo que los ratones de control no tratado (Fig. 3D). Los resultados indican que la administración de CMM para la prolongación de la supervivencia del aloinjerto es la más eficaz en estas condiciones en presencia de un estímulo alógeno dependiente de células madre. Sin embargo, esto no descarta actividad en condiciones más rigurosas con células no alógenas.

Ejemplo 3:

CMM dérmicas ABCB5+ coexpresan PD-1 y se activan tras el alotrasplante

La expresión del ligando de PD-1 PD-L2 sobre los linfocitos T de receptor in vivo

La vía coestimulante negativa de PD-1-(PD-L1/PD-L2) se ha implicado recientemente en la regulación inmunitaria mediada por CMM-MO in vitro (Augello, et al., Eur. J. Immunol. 35:1482 (2005)). El mecanismo que subyace a la prolongación mediada por CMM dérmicas de la supervivencia del aloinjerto cardíaco se trató analizando sistemáticamente la expresión de receptores coestimulantes conocidos y sus ligandos (Rothstein, et al., Immunol. Rev.

^{196:85 (2003)) en}C^mM ^{dérmicas derivadas de ABCB5+ de Balb/c.}

De >20 moléculas coestimulantes examinadas, la tinción doble por inmunofluorescencia y la citometría de flujo revelaron la coexpresión específica de ABCB5 con la molécula coestimulante negativa PD-1, (Fig. 4F), pero no sus ligandos, PD-L1 (Fig.4G) y PD-L2 (Fig.4H), que no se expresan por CMM dérmicas, y se compararon con los controles (Fig. 4A, E, B-D). No se detectó expresión significativa de moléculas coestimulantes positivas. El examen de la expresión in vivo de moléculas coestimulantes en células inmunitarias periféricas de receptores C57BL/6 7 días después de la inyección i.v. de 3x106 CMM dérmicas Balb/c alógenas, antes del alotrasplante cardíaco, reveló que el tratamiento con CMM dérmicas había activado específica y significativamente (P<0,01) la expresión del ligando de PD-1 PD-L2 en 12,5+/-3,8 % de linfocitos T CD4+ de receptor (media /- DE) y 12,9+/-2,4 % de linfocitos T CD8+ de receptor, pero no en las APC CD11c+ de receptor, cuando se comparó con animales tratados con esplenocitos de Balb/c o de control intactos (Fig. 5C). Además, la expresión de linfocitos T de receptor del ligando de PD-1 PD-L1 se conservó en animales tratados con CMM dérmicas, a diferencia de en ratones Balb/c tratados con esplenocitos alógenos, donde la expresión de PD-L1 se reguló notablemente por disminución (Fig. 5B). No se detectó patrón de expresión diferencial de PD-1 en células inmunitarias de receptor (Fig. 5A).

Estos resultados indican que el efecto inmunosupresor de las CMM dérmicas ABCB5+ en el alotrasplante está estrechamente unido a la coexpresión específica del coestimulante negativo PD-1. Además, la inducción específica mediada por CMM dérmicas de la expresión de PD-L2 en linfocitos T de receptor indica una función funcional de estas poblaciones de células no previamente reconocidas en la prolongación de la supervivencia del aloinjerto cardíaco.

Ejemplo 4:

Función inmunomoduladora in vivo de CMM dérmicas murinas ABCB5+

Cuando 3x106 CMM dérmicas ABCB5+ murinas autólogas derivadas de forma clónica se injertaron por vía intravenosa (i.v.) en ratones C57/BL6, la administración de CMM dérmicas ABCB5+ produjo una reducción de 3,4 veces en la expresión superficial del miembro CD40 de la vía coestimulante en las APC CD11c+ aisladas 7 días después del trasplante de bazos de animales tratados con CMM en comparación con APC CD11c+ derivadas de controles no tratados (48,71 ± 11,43 % frente a 14,34 ± 4,53 %, P < 0,05, media ± EEM) (Fig. 6A), que indica que el trasplante in vivo de CMM dérmicas derivadas de ABCB5+ puede inhibir una señal coestimulante positiva expresada por APC críticamente implicada en la activación de linfocitos T. Los linfocitos T derivados de animales tratados con CMM autólogas presentaron proliferación significativamente alterada en comparación con los derivados de controles no tratados, con tanto estimulación alógena en las reacciones mixtas de linfocitos (MLR) unilaterales habituales con esplenocitos intactos irradiados de Balb/c o C3H/HeJ (inhibición 82 % ± 9 % para estimulantes de Balb/c y 84 % ± 5 % para estimulantes de C3H/HeJ en relaciones 1:1 entre estimulante y respondedor, media ± DE, P < 0,001, respectivamente) (Fig. 6B y 6C), o con estimulación mitogénica con ConA (Fig. 6D). Estos resultados muestran que las CMM dérmicas murinas ABCB5+ pueden ejercen efectos moduladores distintos, sobre tanto la maduración de APC como la activación de linfocitos T in vivo.

Claims

REIVINDICACIONES

I. Un método in vitro de generación de tejido que comprende activar una preparación purificada y multiplicada aislada de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas in vitro para la diferenciación en células de hueso, cartílago, ligamento, tendón, estroma, músculo y adiposas.
2. El método según la reivindicación 1, en donde la preparación aislada de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se cultiva primero en un estado indiferenciado mediante expansión mitótica.
3. El método según la reivindicación 1, en donde la preparación aislada de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se siembra sobre una matriz.
4. El método según la reivindicación 3, en donde la matriz es una malla polimérica o una esponja.
5. El método según la reivindicación 3, en donde la matriz es un hidrogel polimérico.
6. Una composición de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas para su uso en la promoción de la regeneración de tejido para tratar un trastorno de tejido conjuntivo, en donde las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se usan in vivo para generar tejido por inducción de diferenciación, y en donde el tejido es hueso, cartílago, ligamento, tendón, estroma, músculo o adiposo.
7. La composición para su uso, según la reivindicación 6, en donde las células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se inyectan en un defecto de tejido blando o duro.
8. La composición para su uso, según la reivindicación 7, en donde el defecto de tejido es un traumatismo o quemadura.
9. Una matriz sembrada con una población de células madre dérmicas, en donde al menos el 95 % de la población de células madre dérmicas es células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5+.
10. La matriz de la reivindicación 9, en donde la matriz se forma para llenar un defecto de tejido.
I I . La matriz de la reivindicación 9, en donde la matriz es una matriz de colágeno.
12. Una composición de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas para su uso en la reconstrucción de una córnea dañada en un sujeto que tiene una córnea dañada, en donde la composición de células madre mesenquimatosas dérmicas ABCB5 positivas se administra al sujeto.