ES2928247T3 - Aparato para medir analitos con un área superficial de puerta flotante extendida - Google Patents

Abstract

Métodos y aparatos relacionados con conjuntos de FET que incluyen conjuntos de FET grandes para monitorear reacciones químicas y/o biológicas tales como reacciones de secuenciación por síntesis de ácidos nucleicos. Algunos métodos proporcionados en este documento se relacionan con la mejora de la señal (y también la relación señal/ruido) de los iones de hidrógeno liberados durante las reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Aparato para medir analitos con un área superficial de puerta flotante extendida

Campo de la descripción

La presente descripción se refiere en general a métodos y aparatos relacionados con la detección y medición de uno o más analitos, incluidos analitos asociados con o resultantes de una reacción de síntesis de ácido nucleico.

La presente invención se refiere a un aparato como se define en la reivindicación 1. Detalles adicionales del aparato se definen en las reivindicaciones dependientes.

Antecedentes

"Analito", como se usa dentro de esta descripción, se refiere a una sustancia que no se mide en sí misma, sino que contiene una propiedad medible que se puede medir. En muchas realizaciones, el analito se refiere a una molécula o célula biológica de interés que afecta directamente a un sensor electrónico en una región de retención de muestra, tal como un micropozo, o que afecta indirectamente tal sensor electrónico mediante un subproducto de una reacción que implica tal molécula o célula biológica localizada en tal región de retención de muestra, o región de confinamiento de reacción, tal como un micropozo. En un aspecto, el analito es un molde de ácido nucleico que se somete a una reacción de secuenciación que, a su vez, genera un subproducto de reacción, tal como iones de hidrógeno, que afecta a un sensor electrónico. El término "analito" también comprende múltiples copias de analitos, tales como proteínas, péptidos, ácidos nucleicos o similares, unidos a soportes sólidos, tales como perlas o partículas. En una realización, el término "analito" significa un amplicón de ácido nucleico o un amplicón de fase sólida.

Los dispositivos y componentes electrónicos han encontrado numerosas aplicaciones en química y biología (más generalmente, "ciencias de la vida"), especialmente para la detección y medición de diversas reacciones químicas y biológicas y la identificación, detección y medición de diversos compuestos. Uno de tales dispositivos electrónicos se denomina como transistor de efecto de campo sensible a iones, a menudo denominado en la literatura relevante como ISFET (o pHFET). Los ISFET se han explorado de manera convencional, principalmente en la comunidad académica y de investigación, para facilitar la medición de la concentración de iones de hidrógeno de una solución (comúnmente denominada "pH").

Más específicamente, un ISFET es un dispositivo de transformación de impedancia que funciona de manera similar a un MOSFET (transistor de efecto de campo metal-óxido semiconductor), y está particularmente configurado para medir selectivamente la actividad iónica en una solución (por ejemplo, iones de hidrógeno en la solución son los "analitos"). Una teoría detallada del funcionamiento de un ISFET se da en " Thirty years of ISFETOLOGY: what happened in the past 30 years and what may happen in the next 30 years," P. Bergveld, Sens Actuators, 88 (2003), págs. 1-20 (en adelante denominado como "Bergveld").

La Figura 1 ilustra una sección transversal de un ISFET de tipo p (canal p) 50 fabricado usando un proceso CMOS (semiconductor complementario de óxido de metal) convencional. Sin embargo, también se puede usar el procesamiento biCMOS (es decir, bipolar y CMOS), tal como un proceso que incluiría una matriz PMOS FET con estructuras bipolares en la periferia. Alternativamente, se pueden emplear otras tecnologías en las que se puede fabricar un elemento de detección con dispositivos de tres terminales en los que un ion detectado conduce al desarrollo de una señal que controla uno de los tres terminales; tales tecnologías también pueden incluir, por ejemplo, GaAs y tecnologías de nanotubos de carbono. Tomando el ejemplo de CMOS, la fabricación de ISFET de tipo P se basa en un sustrato de silicio de tipo p 52, en el que se forma un pozo de tipo n 54 que forma un "cuerpo" de transistor. Las regiones S y D de tipo p (p+) altamente dopadas, que constituyen una fuente 56 y un drenaje 58 del ISFET, se forman dentro del pozo de tipo n 54. Una región B de tipo n (n+) altamente dopada también se forma dentro del pozo de tipo n para proporcionar una conexión de cuerpo conductor (o “en masa”) 62 al pozo de tipo n. Una capa de óxido 65 está dispuesta por encima de las regiones de conexión de fuente, drenaje y cuerpo, a través de las cuales se hacen aberturas para proporcionar conexiones eléctricas (a través de conductores eléctricos) a estas regiones; por ejemplo, el contacto metálico 66 sirve como conductor para proporcionar una conexión eléctrica al drenaje 58, y el contacto metálico 68 sirve como conductor para proporcionar una conexión común a la fuente 56 y al pozo de tipo n 54, a través de la conexión del cuerpo altamente conductor 62. Se forma una puerta de polisilicio 64 sobre la capa de óxido en una localización sobre una región 60 del pozo de tipo n 54, entre la fuente 56 y el drenaje 58. Debido a que está dispuesta entre la puerta de polisilicio 64 y el cuerpo del transistor (es decir, el pozo de tipo n), la capa de óxido 65 a menudo se denomina "óxido de puerta".

Al igual que un MOSFET, el funcionamiento de un ISFET se basa en la modulación de la concentración de carga (y, por lo tanto, de la conductancia del canal) provocada por una capacitancia MOS (metal-óxido-semiconductor) constituida por la puerta de polisilicio 64, la puerta de óxido 65 y la región 60 del pozo de tipo n 54 entre la fuente y el drenaje. Cuando se aplica una tensión negativa a través de las regiones de puerta y fuente (V^gs < 0 voltios), se crea un "canal p" 63 en la interfaz de la región 60 y el óxido de puerta 65 agotando esta área de electrones. Este canal p 63 se extiende entre la fuente y el drenaje, y la corriente eléctrica se conduce a través del canal p cuando el potencial puerta-fuente V^gs es lo suficientemente negativo como para atraer agujeros desde la fuente hacia el canal. El potencial puerta-fuente en el que el canal 63 comienza a conducir corriente se denomina tensión umbral del transistor V^th (el transistor conduce cuando V^gs tiene un valor absoluto mayor que la tensión umbral V^th). La fuente se denomina así porque es la fuente de los portadores de carga (agujeros para un canal p) que fluyen a través del canal 63; de manera similar, el drenaje es donde los portadores de carga salen del canal 63.

En el ISFET 50 de la Figura 1, el pozo de tipo n 54 (cuerpo del transistor), a través de la conexión del cuerpo 62, está forzado a polarizarse al mismo potencial que la fuente 56 (es decir, V^sb = 0 voltios), como se ve por el contacto de metal 68 conectado tanto a la fuente 56 como a la conexión del cuerpo 62. Esta conexión evita la polarización directa de la región fuente p+ y el pozo de tipo n, y por lo tanto facilita el confinamiento de los portadores de carga al área de la región 60 en la que se puede formar el canal 63. Cualquier diferencia de potencial entre la fuente 56 y el cuerpo/pozo de tipo n 54 (una tensión de la fuente a cuerpo VSB distinto de cero) afecta la tensión umbral V^th del ISFET según una relación no lineal, y comúnmente se denomina como el "efecto del cuerpo", que en muchas aplicaciones es inconveniente.

Como también se muestra en la Figura 1, la puerta de polisilicio 64 del ISFET 50 está acoplada a múltiples capas de metal dispuestas dentro de una o más capas de óxido adicionales 75 dispuestas sobre el óxido de puerta 65 para formar una estructura de "puerta flotante" 70. La estructura de puerta flotante se llama así porque está aislada eléctricamente de otros conductores asociados con el ISFET; es decir, está intercalado entre el óxido de puerta 65 y una capa de pasivación 72. En el ISFET 50, la capa de pasivación 72 constituye una membrana sensible a los iones que da lugar a la sensibilidad a los iones del dispositivo. La presencia de analitos tales como iones en una "solución de analito" 74 (es decir, una solución que contiene analitos (incluidos iones) de interés o que se prueba para detectar la presencia de analitos de interés) en contacto con la capa de pasivación 72, particularmente en un área sensible 78 sobre la estructura de puerta flotante 70 altera las características eléctricas del ISFET para modular una corriente que fluye a través del canal p 63 entre la fuente 56 y el drenaje 58. La capa de pasivación 72 puede comprender cualquiera de una variedad de materiales diferentes para facilitar la sensibilidad a iones particulares; por ejemplo, las capas de pasivación que comprenden nitruro de silicio u oxinitruro de silicio, así como óxidos de metal tales como los óxidos de silicio, aluminio o tántalo, generalmente proporcionan sensibilidad a la concentración de iones de hidrógeno (pH) en la solución de analito 74, mientras que las capas de pasivación que comprenden cloruro de polivinilo que contienen valinomicina proporcionan sensibilidad a la concentración de iones de potasio en la solución de analito 74. Se conocen materiales adecuados para capas de pasivación y sensibles a otros iones tales como sodio, plata, hierro, bromo, yodo, calcio y nitrato, por ejemplo.

Con respecto a la sensibilidad de los iones, surge una diferencia de potencial eléctrico, comúnmente denominada "potencial de superficie", en la interfaz sólido/líquido de la capa de pasivación 72 y la solución de analito 74 en función de la concentración de iones en el área sensible 78 debido a una reacción química (por ejemplo, normalmente implicando la disociación de grupos de superficie de óxido por los iones en la solución de analito 74 en la proximidad del área sensible 78). Este potencial de superficie, a su vez, afecta la tensión umbral V^th del ISFET; por lo tanto, es la tensión umbral V^th del ISFET que varía con los cambios en la concentración de iones en la solución de analito 74 en la proximidad del área sensible 78.

La Figura 2 ilustra una representación del circuito eléctrico del ISFET de canal p 50 que se muestra en la Figura 1. Con referencia nuevamente a la Figura 1, un electrodo de referencia 76 (un electrodo de Ag/AgCl convencional) en la solución de analito 74 determina el potencial eléctrico de la mayor parte de la propia solución de analito 74 y es análogo al terminal de puerta de un MOSFET convencional, como se muestra en la Figura 2. En una región operativa lineal o no saturada del ISFET, la corriente de drenaje I^d se da como:

donde V^ds es la tensión entre el drenaje y la fuente, y p es un parámetro de transconductancia (en unidades de Amperios/Voltios2) dado por:

donde y representa la movilidad de la portadora, Cox es la capacitancia de óxido de puerta por unidad de superficie, y la relación W/L es la relación de ancho a largo del canal 63. Si el electrodo de referencia 76 proporciona una referencia eléctrica o tierra (V^g = 0 voltios), y la corriente de drenaje I^d y la tensión de drenaje a fuente V^ds se mantienen constantes, las variaciones de la tensión de la fuente V^s del ISFET siguen directamente las variaciones de la tensión umbral V^th, según la Ecuación (1); esto puede observarse reorganizando la Ecuación (1) como:

Dado que la tensión umbral V^th del ISFET es sensible a la concentración de iones como se discutió anteriormente, según la Ecuación (3) la tensión de la fuente Vs proporciona una señal que está directamente relacionada con la concentración de iones en la solución de analito 74 en la proximidad del área sensible 78 del ISFET. Más específicamente, la tensión umbral Vth se da por:

m ~ VF8 ^Qi + 2(¡)^f , (4)

^ o x

donde Vfb es la tensión de banda plana, Qb es el cargo por agotamiento en el silicio y es el potencial de Fermi. La tensión de banda plana, a su vez, está relacionada con las propiedades del material, tales como las funciones de trabajo y la acumulación de carga. En el caso de un ISFET, con referencia a las Figuras 1 y 2, la tensión de banda plana contiene términos que reflejan interfaces entre 1) el electrodo de referencia 76 (que actúa como la puerta de transistor G) y la solución de analito 74; y 2) la solución de analito 74 y la capa de pasivación 72 en el área sensible 78 (que a su vez imita la interfaz entre la puerta de polisilicio 64 de la estructura de puerta flotante 70 y el óxido de puerta 65). La tensión de banda plana V^fb se da por:

donde Eref es el potencial del electrodo de referencia en relación con el vacío, ^ 0 es el potencial de superficie que resulta de las reacciones químicas en la interfaz de la capa de pasivación/solución de analito (por ejemplo, disociación de grupos superficiales en la capa de pasivación), y Xso/ es el potencial dipolar de superficie de la solución de analito 74. El cuarto término en la Ecuación (5) se relaciona con la función de trabajo del silicio (q es la carga del electrón), y el último término se relaciona con las densidades de carga en la superficie del silicio y en el óxido de puerta. El único término en la Ecuación (5) sensible a la concentración de iones en la solución de analito 74 es ^o, ya que la concentración de iones en la solución de analito 74 controla las reacciones químicas (disociación de grupos superficiales) en la interfaz de capa de pasivación/solución de analito. Por lo tanto, sustituyendo la Ecuación (5) en la ecuación (4), se puede observar fácilmente que es el potencial de superficie ^o lo que hace que la tensión umbral Vth sea sensible a la concentración de iones en la solución de analito 74.

Con respecto a las reacciones químicas en la interfaz de la solución de analito/capa de pasivación, la superficie de un material dado empleado para la capa de pasivación 72 puede incluir grupos químicos que pueden donar o aceptar protones de la solución de analito 74, dejando en un momento dado sitios cargados negativamente, cargados positivamente y neutros en la superficie de la capa de pasivación 72 en la interfaz con la solución de analito 74. Un modelo para este proceso de donación/aceptación de protones en la interfaz de la capa de pasivación/solución del analito se denomina en la literatura relevante "Modelo de disociación del sitio" o "Modelo de unión del sitio", y los conceptos subyacentes a dicho proceso pueden aplicarse generalmente para caracterizar la actividad superficial de las capas de pasivación que comprenden diversos materiales (por ejemplo, óxidos de metal, nitruros metálicos, oxinitruros metálicos).

Usando el ejemplo de un óxido de metal con fines ilustrativos, la superficie de cualquier óxido de metal contiene grupos hidroxilo que pueden donar un protón o aceptar un protón del analito para dejar sitios con carga negativa o positiva, respectivamente, en la superficie. Las reacciones de equilibrio en estos sitios pueden describirse por:

AOH² ¿AOH Hs+ (7)

donde A denota un metal ilustrativo, Hs+ representa un protón en la solución de analito 74. Ecuación (6) describe la donación de protones por un grupo de superficie, y la Ecuación (7) describe la aceptación de protones por un grupo de superficie. Debe apreciarse que las reacciones dadas en las Ecuaciones (6) y (7) también están presentes y deben considerarse en el análisis de una capa de pasivación que comprende nitruros metálicos, junto con la reacción de equilibrio:

ANH^*3 * ANH² + r f , (7b)

donde la Ecuación (7b) describe otra reacción de equilibrio de aceptación de protones. Sin embargo, para los propósitos de la presente discusión, nuevamente solo las reacciones de donación y aceptación de protones dadas en las Ecuaciones (6) y (7) se consideran inicialmente para ilustrar los conceptos relevantes.

Con base en las respectivas constantes de velocidad de reacción hacia adelante y hacia atrás para cada reacción de equilibrio, las constantes de disociación intrínsecas Ka (para la reacción de la Ecuación (6)) y Kb (para la reacción de la Ecuación (7)) se pueden calcular que describen las reacciones de equilibrio. Estas constantes de disociación intrínsecas, a su vez, pueden usarse para determinar una densidad de carga de superficie O^q (en unidades de culombios/unidad de superficie) de la capa de pasivación 72 según:

donde el término B denota el número de grupos superficiales cargados negativamente menos el número de grupos superficiales cargados positivamente por unidad de superficie, que a su vez depende del número total de sitios donantes/aceptores de protones por unidad de superficie N^s en la superficie de la capa de pasivación, multiplicado por un factor relacionado con las constantes de disociación intrínsecas Ka y Kb de las respectivas reacciones de equilibrio de donación y aceptación de protones y la actividad superficial de protones (o pHs). El efecto de un pequeño cambio en la actividad de los protones superficiales (pHs) sobre la densidad de carga de superficie se da por:

donde $nt se conoce como la "capacidad de amortiguación intrínseca" de la superficie. Debe apreciarse que dado que los valores de N^s, K^a y K^b dependen del material, la capacidad de amortiguación intrínseca pmt de la superficie también depende del material.

El hecho de que las especies iónicas en la solución de analito 74 tengan un tamaño finito y no puedan acercarse a la superficie de la capa de pasivación más cerca que el radio iónico da como resultado un fenómeno denominado "capacitancia de doble capa" próximo a la interfaz de la capa de pasivación/solución de analito. En el modelo de Gouy-Chapman-Stem para la capacitancia de doble capa como se describe en Bergveld, la densidad de carga de superficie 00 se equilibra con una densidad de carga igual pero opuesta en la solución de analito 74 en alguna posición desde la superficie de la capa de pasivación 72. Estas dos cargas opuestas paralelas forman la llamada "capacitancia de doble capa" C^di (por unidad de superficie), y la diferencia de potencial a través de la capacitancia C^di se define como el potencial de superficie %, según:

^{<J0 ~ C d¡XÍ l Q — G dl} (10)

donde O^di es la densidad de carga en el lado de la solución de analito de la capacitancia de doble capa. Esta densidad de carga Odi a su vez, es una función de la concentración de todas las especies de iones u otras especies de analitos (es decir, no solo protones) en la solución de analitos a granel 74; en particular, la densidad de carga de superficie se puede equilibrar no solo con iones de hidrógeno, sino con otras especies de iones (por ejemplo, Na+, K+) en la solución de analito a granel.

En el régimen de fuerzas iónicas relativamente más bajas (por ejemplo, < 1 mol/litro), la teoría de Debye se puede utilizar para describir la capacidad de doble capa C^di según:

donde k es la constante dieléctrica ^e/^eq (para fuerzas iónicas relativamente bajas, se puede usar la constante dieléctrica del agua), y A es la longitud de apantallamiento de Debye (es decir, la distancia sobre la cual puede producirse una separación de carga significativa). La longitud de Debye A es a su vez inversamente proporcional a la raíz cuadrada de la fuerza de las especies iónicas en la solución del analito, y en agua a temperatura ambiente se da por:

La fuerza iónica I del analito a granel es una función de la concentración de todas las especies iónicas presentes y se da por:

donde z s es el número de carga de especies iónicas s y c s es la concentración molar de especies iónicas s. En consecuencia, de las Ecuaciones (10) a (13), se puede observar que el potencial de superficie es mayor para longitudes de cribado de Debye más grandes (es decir, fuerzas iónicas más pequeñas).

La relación entre los valores de pH presentes en la interfaz de la capa de pasivación/solución de analito y en la solución a granel se expresa en la literatura relevante mediante estadísticas de Boltzman con el potencial de superficie % como parámetro:

( p H , - p H , ) = & £ -. (14)

De las Ecuaciones (9), (10) y (14), la sensibilidad del potencial de superficie ^0 particularmente a los cambios en el pH a granel de la solución de analito (es decir, "sensibilidad al pH") se da por:

donde el parámetro a es un factor de sensibilidad adimensional que varía entre cero y uno y depende de la capacitancia de doble capa Cdi y la capacidad de amortiguamiento intrínseca de la superficie ¡^nt como se discutió anteriormente en relación con la Ecuación (9) En general, los materiales de la capa de pasivación con una alta capacidad de amortiguación intrínseca fin hacen que el potencial de superficie ^0 sea menos sensible a la concentración en la solución de analito 74 de especies iónicas distintas de los protones (por ejemplo, a se maximiza con un jSint grande). De la Ecuación (15), a una temperatura T de 298 grados Kelvin, se puede apreciar que se puede lograr una sensibilidad de pH máxima teórica de 59,2 mV/pH en a =1. De las Ecuaciones (4) y (5), como se indicó anteriormente, los cambios en la tensión umbral de ISFET V^th rastrean directamente los cambios en el potencial de superficie %; en consecuencia, la sensibilidad al pH de un ISFET se indica en la Ecuación (15) también se puede indicar y denominar en la presente descripción como AV^jh por conveniencia. En los ISFET convencionales ilustrativos que emplean una capa de pasivación de nitruro de silicio u oxinitruro de silicio 72 para la sensibilidad al pH, las sensibilidades al pH AV^jh (es decir, un cambio en la tensión umbral con el cambio en el pH de la solución de analito 74) en un rango de aproximadamente 30 mV/pH a 60 mV/pH se han observado experimentalmente.

Otra métrica notable en relación con la sensibilidad al pH de ISFET se relaciona con el pH a granel de la solución de analito 74 en la que no hay una densidad de carga de superficie neta 00 y, en consecuencia, un potencial de superficie ^0 de cero voltios. Este pH se denomina "punto de carga cero" y se indica como pHpzc. Con referencia nuevamente a las Ecuaciones (8) y (9), al igual que la capacidad de amortiguación intrínseca fiint, el pHpzc es un parámetro dependiente del material. De lo anterior, se puede apreciar que el potencial de superficie a cualquier pHe a granel dado de la solución de analito 74 se puede calcular según:

La Tabla 1 a continuación enumera varios óxidos de metal y nitruros metálicos y sus correspondientes puntos de carga cero (pH^pzc), sensibilidades de pH (AV^{j h} ) y potencial de superficie máximo teórico a un pH de 9:

Tabla 1

Los esfuerzos de investigación anteriores para fabricar ISFET para mediciones de pH basados en técnicas de procesamiento CMOS convencionales generalmente tenían como objetivo lograr una alta linealidad de la señal en un rango de pH de 1-14. Usando una sensibilidad umbral ilustrativa de aproximadamente 50 mV/pH, y considerando la Ecuación (3) anterior, esto requiere un rango operativo lineal de aproximadamente 700 mV para la tensión de la fuente Vs. Como se discutió anteriormente en relación con la Figura 1, la tensión umbral Vth de los ISFET (así como los MOSFET) se ve afectado por cualquier tensión Vsb entre la fuente y el cuerpo (pozo de tipo n 54). Más específicamente, la tensión umbral V^th es una función no lineal de una tensión de la fuente a cuerpo V^sb distinto de cero. En consecuencia, para evitar comprometer la linealidad debido a una diferencia entre los potenciales de tensión de la fuente y del cuerpo (es decir, para mitigar el "efecto del cuerpo"), como se muestra en la Figura 1, la fuente 56 y la conexión del cuerpo 62 del ISFET 50 a menudo se acoplan a un potencial común a través del contacto metálico 68. Este acoplamiento cuerpo-fuente también se muestra en la representación del circuito eléctrico del ISFET 50 que se muestra en la Figura 2.

Si bien la discusión anterior se relaciona principalmente con un análisis de estado estacionario de la respuesta ISFET se basa en las reacciones de equilibrio dadas en las Ecuaciones (6) y (7), la respuesta transitoria o dinámica de un ISFET convencional a un cambio esencialmente instantáneo en la fuerza iónica de la solución de analito 74 (por ejemplo, un cambio gradual en la concentración de protones u otras especies iónicas) se ha explorado en algunos esfuerzos de investigación. Un tratamiento ilustrativo de la respuesta transitoria o dinámica de ISFET se encuentra en " ISFET responses on a stepwise change in electrolyte concentration at constant pH," J.C. van Kerkof, J.C.T. Eijkel and P. Bergveld, Sensors and Actuators B, 18-19 (1994), págs. 56-59.

Para la respuesta transitoria de ISFET, un cambio gradual en la concentración de una o más especies iónicas en la solución de analito, a su vez, cambia instantáneamente la densidad de carga O^di en el lado de la solución de analito de la capacitancia de doble capa C^di. Debido a que el cambio instantáneo en la densidad de carga O^di es más rápido que la cinética de reacción en la superficie de la capa de pasivación 72, la densidad de carga de superficie 00 inicialmente permanece constante y el cambio en la concentración de iones da como resultado un cambio repentino en la doble capa capacitancia C^di. De la Ecuación (10), puede apreciarse que tal cambio repentino en la capacitancia C^di a una densidad de carga de superficie constante 00 da como resultado un cambio repentino correspondiente en el potencial de superficie ^0. La Figura 2A ilustra este fenómeno, en el que un aumento esencialmente instantáneo o por etapas en la concentración de iones en la solución de analito, como se muestra en el gráfico superior, da como resultado un cambio correspondiente en el potencial de superficie ^0, como se muestra en el gráfico inferior de la Figura 2A. Después de un tiempo, a medida que los grupos de superficie de la capa de pasivación reaccionan al estímulo (es decir, a medida que se ajusta la densidad de carga de superficie), el sistema vuelve a algún punto de equilibrio, como se ilustra por la caída del "pulso" de respuesta ISFET 79 que se muestra en el gráfico inferior de la Figura 2A. El fenómeno anterior se denomina en la literatura relevante (y en lo sucesivo en esta descripción) como una respuesta de "paso de iones".

Como se indica en el gráfico inferior de la Figura 2A, una amplitud A ^ ^ü de la respuesta de paso de iones 79 se puede caracterizar por:

donde es un potencial de superficie de equilibrio a una concentración inicial de iones en la solución de analito, Cdi,1 es la capacitancia de doble capa por unidad de superficie a la concentración inicial de iones, ^2 es el potencial de superficie correspondiente al estímulo de paso de iones, y Cdi,2 es la capacitancia de doble capa por unidad de superficie basada en el estímulo de paso de iones. El perfil de disminución del tiempo 81 asociado con la respuesta 79 está determinado, al menos en parte, por la cinética de las reacciones de equilibrio en la interfaz de la capa de pasivación/solución de analito (por ejemplo, como se indica en las Ecuaciones (6) y (7) para óxidos de metal, y también la Ecuación (7b) para nitruros metálicos). Un tratamiento instructivo en este sentido se proporciona por el documento "Modeling the short-time response of ISFET sensors," P. Woias y otros, Sensors and Actuators B, 24-25 (1995) 211-217 (en lo sucesivo, "Woias").

En la publicación de Woias, se considera un ISFET ilustrativo que tiene una capa de pasivación de nitruro de silicio. Un sistema de ecuaciones diferenciales no lineales acopladas se basa en las reacciones de equilibrio indicadas en las Ecuaciones (6), (7) y (7a) se formulan para describir la respuesta dinámica del ISFET a un cambio de paso (esencialmente instantáneo) en el pH; más específicamente, estas ecuaciones describen el cambio en la concentración a lo largo del tiempo de las diversas especies superficiales involucradas en las reacciones de equilibrio, con base en las constantes de velocidad hacia adelante y hacia atrás para las reacciones involucradas de aceptación y donación de protones y cómo los cambios en el pH del analito afectan una o más de las constantes de velocidad de reacción. Se proporcionan soluciones ilustrativas, algunas de las cuales incluyen múltiples funciones exponenciales y constantes de tiempo asociadas, para la concentración de cada una de las especies de iones superficiales en función del tiempo. En un ejemplo proporcionado por Woias, se supone que la reacción de donación de protones indicado en la Ecuación (6) domina la respuesta transitoria de la superficie de la capa de pasivación de nitruro de silicio para cambios de pH relativamente pequeños, lo que facilita de esta manera una aproximación monoexponencial para el perfil de disminución del tiempo 81 de la respuesta 79 según:

donde la función exponencial representa esencialmente el cambio en la densidad de carga de superficie en función del tiempo. En la Ecuación (l6), la constante de tiempo ^t es tanto una función del pH general como de los parámetros del material de la capa de pasivación, según:

r = r0xlO^, (19)

donde To denota un tiempo de estabilización mínimo teórico que solo depende de los parámetros del material. Para el nitruro de silicio, Woias proporciona valores ilustrativos para ^tq del orden de 60 microsegundos a 200 microsegundos. Con el propósito de proporcionar un ejemplo ilustrativo, usando ^tq = 60 microsegundos y un pH global de 9, la constante de tiempo t indicada en la Ecuación (19) es de 1,9 segundos. Los valores ilustrativos para otros tipos de materiales de pasivación se pueden encontrar en la literatura relevante y/o se pueden determinar empíricamente.

Los esfuerzos anteriores para fabricar matrices bidimensionales de ISFET basados en el diseño ISFET de la Figura 1 han dado como resultado un máximo de 256 elementos sensores ISFET (o "píxeles") en una matriz (es decir, una matriz de 16 píxeles por 16 píxeles). Las investigaciones ilustrativas sobre la fabricación de matrices de ISFET se recogen en las publicaciones "A large transistor-based sensor array chip for direct extracellular imaging," M.J. Milgrew, M.O. Riehle, and D.R.S. Cumming, Sensors and Actuators, B: Chemical, 111-112, (2005), pp. 347-353, y "The development of scalable sensor arrays using standard CMOS technology," M.J. Milgrew, P.A. Hammond, and D.R.S. Cumming, Sensors and Actuators, B: Chemical, 103, (2004), págs. 37-42, cuyas publicaciones se denominarán colectivamente en lo sucesivo "Milgrew y otros" Otros esfuerzos de investigación relacionados con la realización de matrices de ISFET se recogen en las publicaciones "A very large integrated pH-ISFET sensor array chip compatible with standard CMOS processes," T. C. W. Yeow, M. R. Haskard, D. E. Mulcahy, H. I. Seo y D. H. Kwon, Sensors and Actuators B: Chemical, 44, (1997), págs. 434-440 y "Fabrication of a two-dimensional pH image sensor using a charge transfer technique," Hizawa, T., Sawada, K., Takao, H., Ishida, M., Sensors and Actuators, B: Chemical 117 (2), 2006, págs. 509-515.

La Figura 3 ilustra una columna 85j de una matriz del ISFET bidimensional según el diseño de Milgrew y otros La columna 85j incluye dieciséis (16) píxeles 8O1 a 8O16 y, como se describe más adelante en relación con la Figura 7, una matriz bidimensional completa incluye dieciséis (16) de tales columnas 85j (j = 1, 2, 3,....16) dispuestas una al lado de la otra. Como se muestra en la Figura 3, una columna dada 85j incluye una fuente de corriente Ifuent^ que es compartida por todos los píxeles de la columna, y un circuito de polarización/lectura ISFET 82j (incluido el sumidero de corriente ISUMIDEROj) que también es compartido por todos los píxeles de la columna Cada píxel 8O1 a 8O16 de ISFET incluye un ISFET de canal p 50 que tiene una fuente y un cuerpo acoplados eléctricamente (como se muestra en las Figuras 1 y 2), más dos conmutadores S1 y S2 que responden a una de dieciséis señales de selección de hilera (RSEL1 a RSEL16, y sus complementos). Como se describe a continuación en relación con la Figura 7, una señal de selección de hilera y su complemento se generan simultáneamente para "habilitar" o seleccionar un píxel dado de la columna 85j, y dichos pares de señales se generan en alguna secuencia para habilitar sucesivamente diferentes píxeles de la columna de una en una.

Como se muestra en la Figura 3, el conmutador S2 de cada píxel 80 en el diseño de Milgrew y otros se implementa como un MOSFET de canal n convencional que acopla la fuente de corriente IFUENTEj a la fuente del ISFET 50 al recibir la señal de selección de hilera correspondiente. El conmutador S1 de cada píxel 80 se implementa como una puerta de transmisión, es decir, un par CMOS que incluye un MOSFET de canal n y un MOSFET de canal p, que acopla la fuente del ISFET 50 al circuito de polarización/lectura 82j al recibirlo de la señal de selección de hilera correspondiente y su complemento. En la Figura 4 se muestra un ejemplo del conmutador S11 del píxel 8O1, en el que el MOSFET de canal p de la puerta de transmisión se indica como S1-^ip y el MOSFET de canal n se indica como S11N. En el diseño de Milgrew y otros, se emplea una puerta de transmisión para el conmutador S1 de cada píxel de manera que, para un píxel habilitado, cualquier tensión de la fuente ISFET dentro del rango de suministro de energía Vdd a Vss puede aplicarse a la polarización/ circuito de lectura 82j y salida por la columna como la señal VSj. De lo anterior, debe apreciarse que cada píxel 80 en el diseño de matriz de sensores ISFET de Milgrew y otros incluye cuatro transistores, es decir, un ISFET de canal p, una puerta de transmisión de par CMOS que incluye un MOSFE^t de canal n y un MOSFET de canal p para el conmutador S1, y un MOSFET de canal n para el conmutador S2.

Como también se muestra en la Figura 3, el circuito de polarización/lectura 82j emplea una configuración de seguidor de fuente-drenaje en forma de puente Kelvin para mantener una tensión constante de drenaje-fuente VDSj y aislar la medición de la tensión de la fuente Vsj de la corriente de drenaje constante Ifuente para el ISFET de un píxel habilitado en la columna 85j. Con este fin, el circuito de polarización/lectura 82j incluye dos amplificadores operacionales A1 y A2, un sumidero de corriente IsuMIDEROj y una resistencia RsDj. La tensión desarrollada a través de la resistencia RsDj debido a la corriente IsuMIDEROj que fluye a través de la resistencia es forzada por los amplificadores operacionales a aparecer a través del drenaje y la fuente del ISFET de un píxel habilitado como una tensión constante de drenaje-fuente VDSj. Por lo tanto, con referencia nuevamente a la Ecuación (3), debido a la constante VDSj y la constante Ifuent^ , la tensión de la fuente Vsj del ISFET del píxel habilitado proporciona una señal correspondiente a la tensión umbral de los ISFET V^th, y por lo tanto una medición de pH en la proximidad del área sensible de los ISFET (ver la Figura 1). El amplio rango dinámico para la tensión de la fuente VSj proporcionado por la puerta de transmisión S1 asegura que se pueda medir un rango completo de valores de pH de 1-14, y la conexión fuente-cuerpo de cada ISFET asegura suficiente linealidad de la tensión umbral de los ISFET sobre el rango completo de medición de pH.

En el diseño de columna de Milgrew y otros como se muestra en la Figura 3, debe apreciarse que para que la configuración de puente Kelvin del circuito de polarización/lectura de columna 82j funcione correctamente, se debe emplear un ISFET de canal p 50 como se muestra en la Figura 1 en cada píxel; más específicamente, una implementación alternativa basada en la configuración del puente de Kelvin no es posible utilizando un ISFET de canal n. Con referencia nuevamente a la Figura 1, para un ISFET de canal n basado en un proceso CMOS convencional, el pozo de tipo n 54 no se usaría, y las regiones de tipo n altamente dopadas para el drenaje y la fuente se formarían directamente en el sustrato de silicio tipo p 52 (que constituiría el cuerpo del transistor). Para los dispositivos FET de canal n, el cuerpo del transistor normalmente está acoplado a tierra eléctrica. Dado el requisito de que la fuente y el cuerpo de un ISFET en el diseño de Milgrew y otros están acoplados eléctricamente para mitigar el rendimiento no lineal debido al efecto del cuerpo, esto daría como resultado que la fuente de un ISFET de canal n también esté conectada a tierra eléctrica (es decir, Vs = Vb = 0 voltios), lo que impide de esta manera cualquier señal de salida útil de un píxel activado. En consecuencia, el diseño de columna de Milgrew y otros que se muestra en la Figura 3 requiere ISFET de canal p para un funcionamiento adecuado.

También debe apreciarse que en el diseño de la columna de Milgrew y otros que se muestra en la Figura 3, los dos MOSFET de canal n necesarios para implementar los conmutadores S1 y S2 en cada píxel no se pueden formar en el pozo de tipo n 54 que se muestra en la Figura 1, en el que se forma el ISFET de canal p para el píxel; más bien, los MOSFET de canal n se forman directamente en el sustrato de silicio 52 de tipo p, más allá de los límites del pozo de tipo n 54 para el ISFET. La Figura 5 es un diagrama similar a la Figura 1, que ilustra una sección transversal más ancha de una porción del sustrato de silicio de tipo p 52 correspondiente a un píxel 80 de la columna 85j que se muestra en la Figura 3, en la que el pozo de tipo n 54 que contiene el drenaje 58, la fuente 56 y la conexión del cuerpo 62 del ISFET 50 se muestra junto con un primer MOSFET de canal n correspondiente al conmutador S2 y un segundo MOSFET de canal n S1-ⁱⁿ que constituye uno de los dos transistores de la puerta de transmisión S11 mostrado en la Figura 4.

Además, en el diseño de Milgrew y otros, el MOSFET de canal p requerido para implementar la puerta de transmisión S1 en cada píxel (por ejemplo, vea S1-^ip en la Figura 4) no se puede formar en el mismo pozo de tipo n en el que se forma el ISFET del canal p 50 para el píxel. En particular, debido a que el cuerpo y la fuente del ISFET de canal p están acoplados eléctricamente, implementar el MOSFET de canal p S1-^ip en el mismo pozo n que el ISFET de canal p 50 conduciría a una operación impredecible de la puerta de transmisión o impedir la operación por completo. En consecuencia, se requieren dos pozos de tipo n separados para implementar cada píxel en el diseño de Milgrew y otros. La Figura 6 es un diagrama similar a la Figura 5, que muestra una sección transversal de otra porción del sustrato de silicio de tipo p 52 correspondiente a un píxel 80, en el que el pozo de tipo n 54 correspondiente al ISFET 50 se muestra junto a un segundo pozo de tipo n 55 en el que se forma el MOSFET de canal p S1-^ip que constituye uno de los dos transistores de la puerta de transmisión S11 que se muestra en la Figura 4. Debe apreciarse que los dibujos en las Figuras 5 y 6 no están a escala y es posible que no representen exactamente el diseño real de un píxel en particular en el diseño de Milgrew y otros; más bien, estas figuras son de naturaleza conceptual y se proporcionan principalmente para ilustrar los requisitos de múltiples pozos n y MOSFET de canal n separados fabricados fuera de los pozos n, en el diseño de Milgrew y otros.

El diseño de matriz de Milgrew y otros se implementó utilizando un proceso de fabricación CMOS convencional de 0,35 micras (pm). En este proceso, varias reglas de diseño dictan distancias mínimas de separación entre características. Por ejemplo, según las reglas de diseño de CMOS de 0,35 pm, con referencia a la Figura 6, una distancia "a" entre pozos n vecinos debe ser de al menos tres (3) micras. También se indica una distancia "a/2" en la Figura 6 a la izquierda del pozo n 54 y a la derecha del pozo n 55 para indicar la distancia mínima requerida para separar el píxel 80 que se muestra en la Figura 6 de píxeles vecinos en otras columnas a la izquierda y derecha, respectivamente. Además, según las reglas típicas de diseño CMOS de 0,35 pm, una distancia "b" que se muestra en la Figura 6 que representa el ancho en sección transversal del pozo de tipo n 54 y una distancia "c" que representa el ancho en sección transversal del pozo de tipo n 55 son cada uno del orden de aproximadamente 3 pm a 4 pm (dentro del pozo de tipo n, se hace una asignación de 1,2 pm entre el borde del pozo n y cada uno de la fuente y el drenaje, y la fuente y el drenaje tienen un ancho del orden de 0,7 pm). En consecuencia, la distancia total "d" mostrada en la Figura 6 que representa el ancho del píxel 80 en sección transversal es del orden de aproximadamente 12 pm a 14 pm. En una implementación, Milgrew y otros informa de una matriz basada en el diseño de columna/píxel que se muestra en la Figura 3 que comprende píxeles geométricamente cuadrados, cada uno de los cuales tiene una dimensión de 12,8 pm por 12,8 pm.

En resumen, el diseño de píxeles ISFET de Milgrew y otros tiene como objetivo garantizar mediciones precisas de la concentración de iones de hidrógeno en un rango de pH de 1-14. Para garantizar la linealidad de la medición, la fuente y el cuerpo del ISFET de cada píxel están acoplados eléctricamente entre sí. Para garantizar una gama completa de mediciones de pH, se emplea una puerta de transmisión S1 en cada píxel para transmitir la tensión de la fuente de un píxel habilitado. Por lo tanto, cada píxel de la matriz de Milgrew requiere cuatro transistores (ISFET de canal p, MOSFET de canal p y dos MOSFET de canal n) y dos pozos n separados (Figura 6). Basado en un proceso de fabricación de CMOS convencional de 0,35 micras y reglas de diseño correspondientes, los píxeles de dicha matriz tienen un tamaño mínimo apreciablemente superior a 10 |jm, es decir, del orden de aproximadamente 12 jm a 14 jm.

La Figura 7 ilustra una matriz de píxeles bidimensional completa 95 según el diseño de Milgrew y otros, junto con el circuito decodificador de hileras y columnas adjunto y el circuito de lectura de medición. La matriz 95 incluye dieciséis columnas 85i a 85i6 de píxeles, cada columna que tiene dieciséis píxeles como se describió anteriormente en relación con la Figura 3 (es decir, una matriz de 16 píxeles por 16 píxeles). Un decodificador de hilera 92 proporciona dieciséis pares de señales de selección de hilera complementarias, en el que cada par de señales de selección de hilera habilita simultáneamente un píxel en cada columna 851 a 8516 para proporcionar un conjunto de señales de salida de columna de la matriz 95 en función de las tensiones de la fuente respectivas V^s1 a V^s16 de la hilera habilitada de los ISFET. El decodificador de hileras 92 se implementa como un decodificador convencional de cuatro a dieciséis (es decir, una entrada binaria de cuatro bits FILA1 - FILA4 para seleccionar una de 24 salidas). El conjunto de señales de salida de columna V^s1, a V^s16 para una hilera habilitada de la matriz se aplica a la lógica de conmutación 96, que incluye dieciséis puertas de transmisión S1 a S16 (una puerta de transmisión para cada señal de salida). Como anteriormente, cada puerta de transmisión de la lógica de conmutación 96 se implementa utilizando un MOSFET de canal p y un MOSFET de canal n para garantizar un rango dinámico suficiente para cada una de las señales de salida Vs1 a Vs16. El decodificador de columna 94, como el decodificador de hilera 92, se implementa como un decodificador convencional de cuatro a dieciséis y se controla a través de la entrada binaria de cuatro bits COL1 - COL4 para habilitar una de las puertas de transmisión S1 a S16 de la lógica de conmutación 96 en cualquier momento dado, para proporcionar una única señal de salida Vs desde la lógica de conmutación 96. Esta señal de salida V^s se aplica a un convertidor de analógico a digital (ADC) 98 de 10 bits para proporcionar una representación digital D1 - D10 de la señal de salida Vs correspondiente a un píxel dado de la matriz.

Como se señaló anteriormente, los ISFET individuales y las matrices de ISFET similares a los descritos anteriormente se han empleado como dispositivos de detección en una variedad de aplicaciones químicas y biológicas. En particular, los ISFET se han empleado como sensores de pH en el monitoreo de varios procesos que involucran ácidos nucleicos tales como el ADN. En las siguientes publicaciones se dan algunos ejemplos los ISFET que se emplean en diversas aplicaciones relacionadas con las ciencias de la vida: Massimo Barbaro, Annalisa Bonfiglio, Luigi Raffo, Andrea Alessandrini, Paolo Facci and Imrich Barák, "Fully electronic DNA hybridization detection by a standard CMOS biochip," Sensors and Actuators B: Chemical, volumen 118, números 1 y 2, 2006, págs. 41-46; Toshinari Sakurai and Yuzuru Husimi, "Real-time monitoring of DNA polymerase reactions by a micro ISFET pH sensor," Anal. Chem., 64(17), 1992, págs. 1996 - 1997; S. Purushothaman, C. Toumazou, J. Georgiou, "Towards fast solid state DNA sequencing," Circuits and Systems, vol. 4, 2002, págs. IV-169 a IV-172; S. Purushothaman, C. Toumazou, C.P. Ou, "Protons and single nucleotide polymorphism detection: A simple use for the Ion Sensitive Field Effect Transistor," Sensors and Actuators B: Chemical, vol. 114, núm. 2, 2006, págs. 964-968; A.L. Simonian, A.W. Flounders, J.R. Wild, "FET-Based Biosensors for The Direct Detection of Organophosphate Neurotoxins," Electroanalysis, vol. 16, núm. 22, 2004, págs. 1896-1906; C. Toumazou, S. Purushothaman, "Sensing Apparatus and Method," solicitud de patente de Estados Unidos 2004-0134798, publicada el 15 de julio de 2004; y T.W. Koo, S. Chan, X. Su, Z. Jingwu, M. Yamakawa, V.M. Dubin, "Sensor Arrays and Nucleic Acid Sequencing Applications," solicitud de patente de Estados Unidos 2006-0199193, publicada el 7 de septiembre de 2006.

En general, el desarrollo de métodos de secuenciación de ácidos nucleicos rápidos y sensibles que utilizan secuenciadores de ADN automatizados ha hecho avanzar significativamente la comprensión de la biología. El término "secuenciación" se refiere a la determinación de una estructura primaria (o secuencia primaria) de un biopolímero no ramificado, lo que da como resultado una representación lineal simbólica conocida como "secuencia" que resume de forma sucinta gran parte de la estructura a nivel atómico de la molécula secuenciada. La secuenciación de ácidos nucleicos (como el ADN) se refiere particularmente al proceso de determinar el orden de los nucleótidos de un fragmento de ácido nucleico dado. Ahora es posible el análisis de genomas completos de virus, bacterias, hongos, animales y plantas, pero dicho análisis generalmente está limitado debido al costo y al tiempo que se emplea para secuenciar genomas tan grandes. Además, los métodos de secuenciación convencionales actuales están limitados en cuanto a su precisión, la longitud de los moldes individuales que pueden secuenciarse y la tasa de determinación de la secuencia.

A pesar de las mejoras en las tecnologías de secuenciación y preparación de muestras, ninguna de las estrategias de secuenciación convencionales actuales, incluidas las que hasta la fecha pueden involucrar los ISFET, ha proporcionado las reducciones de costos necesarias para aumentar el rendimiento para el análisis de grandes cantidades de genomas humanos individuales. La capacidad de secuenciar muchos genomas humanos facilita un análisis de la base genética subyacente a la enfermedad (por ejemplo, tal como el cáncer) y el envejecimiento, por ejemplo. Algunos esfuerzos recientes han logrado avances significativos tanto en la capacidad de preparar genomas para la secuenciación como en la secuenciación de un gran número de moldes simultáneamente. Sin embargo, estos y otros esfuerzos todavía están limitados por el tamaño relativamente grande de los volúmenes de reacción, así como por la necesidad de análogos de nucleótidos especiales y métodos enzimáticos o fluorescentes complejos para "leer" la secuencia de nucleótidos.

Resumen

Los ejemplos divulgados en la presente descripción se relacionan en parte con el uso de grandes matrices de FET químicamente sensibles (chemFET) o más específicamente ISFET para monitorear reacciones, incluidas, por ejemplo, reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN), basadas en el monitoreo de analitos presentes, generados o utilizados durante una reacción. Más generalmente, las matrices que incluyen grandes matrices de chemFET se pueden emplear para detectar y medir cantidades o concentraciones estáticas y/o dinámicas de una variedad de analitos (por ejemplo, iones de hidrógeno, otros iones, moléculas o compuestos no iónicos, etc.) en un variedad de procesos químicos y/o biológicos (por ejemplo, reacciones biológicas o químicas, cultivo o monitoreo de células o tejidos, actividad neuronal, secuenciación de ácidos nucleicos, etc.) en los que se puede obtener información valiosa basada en dichas mediciones de analitos. Dichos arreglos de chemFET pueden emplearse en métodos que detectan analitos y/o métodos que monitorean procesos biológicos o químicos a través de cambios en la carga en la superficie del chemFET. En consecuencia, los sistemas y métodos que se muestran en la presente descripción proporcionan usos para las matrices de chemFET que implican la detección de analitos en solución y/o la detección de cambios en la carga unida a la superficie del chemFET.

Se presentan métodos para mantener o aumentar la señal (y, por lo tanto, la relación señal/ruido) cuando se utilizan matrices de chemFET muy grandes y, en particular, cuando se aumenta la densidad de una matriz de chemFET (y, al mismo tiempo, se reduce el área de cualquier chemFET individual dentro de la matriz). Se ha encontrado que a medida que el área de chemFET disminuye para acomodar un número cada vez mayor de sensores en una matriz determinada, la señal que se puede obtener de un solo chemFET puede disminuir en algunos casos.

Las realizaciones de la presente invención están según la reivindicación 1. En el aparato de la presente invención, el área superficial disponible de la puerta chemFET aumenta, lo que la hace más sensible a la reacción en los pozos. Breve descripción de los dibujos

En los dibujos, los caracteres de referencia similares generalmente se refieren a las mismas partes en las diferentes vistas. Además, los dibujos no están necesariamente a escala, sino que se hace hincapié en ilustrar en general los diversos conceptos descritos en la presente descripción.

La Figura 1 ilustra una sección transversal de un transistor de efecto de campo sensible a iones (ISFET) de tipo p (canal p) fabricado utilizando un proceso CMOS convencional.

La Figura 2 ilustra una representación del circuito eléctrico del ISFET de canal p que se muestra en la Figura 1. La Figura 2A ilustra una respuesta transitoria ilustrativa de ISFET a un cambio de paso en la concentración de iones de un analito.

La Figura 3 ilustra una columna de una matriz del ISFET bidimensional basada en el ISFET que se muestra en la Figura 1.

La Figura 4 ilustra una puerta de transmisión que incluye un MOSFET de canal p y un MOSFET de canal n que se emplea en cada píxel de la columna de matriz que se muestra en la Figura 3.

La Figura 5 es un diagrama similar a la Figura 1, que ilustra una sección transversal más amplia de una porción de un sustrato que corresponde a un píxel de la columna de matriz que se muestra en la Figura 3, en la que se muestra el ISFET junto con dos MOSFET de canal n también incluido en el píxel.

La Figura 6 es un diagrama similar a la Figura 5, que ilustra una sección transversal de otra porción del sustrato correspondiente a un píxel de la columna de matriz que se muestra en la Figura 3, en la que se muestra el ISFET junto con el MOSFET de canal p de la puerta de transmisión que se muestra en la Figura 4.

La Figura 7 ilustra un ejemplo de una matriz de píxeles ISFE^t bidimensional completa basada en el diseño de columna de la Figura 3, junto con el circuito decodificador de hilera y columna adjunto y el circuito de lectura de medición.

La Figura 8 ilustra en general un sistema de procesamiento de ácidos nucleicos que comprende una matriz de chemFET a gran escala.

La Figura 9 ilustra una columna de una matriz chemFET similar a la que se muestra en la Figura 8.

La Figura 9A ilustra un diagrama de circuito para un amplificador ilustrativo empleado en la columna de matriz que se muestra en la Figura 9.

La Figura 9B es un gráfico de la polarización del amplificador frente al ancho de banda.

La Figura 10 ilustra una vista superior de un diseño de disposición de chip para un píxel de la columna de una matriz chemFET que se muestra en la Figura 9.

La Figura 10-1 ilustra una vista superior de un diseño de disposición de chip para un grupo de cuatro píxeles vecinos de una matriz chemFET que se muestra en la Figura 9.

La Figura 11A muestra una vista en sección transversal compuesta a lo largo de la línea I--I del píxel que se muestra en la Figura 10, que incluye elementos adicionales en la mitad derecha de la Figura 10 entre las líneas II--II y III—III que ilustra una vista capa por capa de la fabricación de píxeles.

La Figura 11A-1 muestra una vista en sección transversal compuesta de varios píxeles vecinos, a lo largo de la línea I--I de uno de los píxeles que se muestran en la Figura 10-1, que incluye elementos adicionales del píxel entre las líneas N--II, que ilustra una vista capa por capa de la fabricación de píxeles.

Las Figuras 11B(1)-(3) proporciona las estructuras químicas de diez receptores PPi (compuestos 1 a 10).

La Figura 11 C(1) es un esquema de un protocolo de síntesis para el compuesto 7 de la Figura 11B(3). La Figura 11C(2) es un esquema de un protocolo de síntesis para el compuesto 8 de la Figura 11B(3). La Figura 11C(3) es un esquema de un protocolo de síntesis para el compuesto 9 de la Figura 11B(3). Las Figuras 11D(1) y (2) son esquemas que ilustran una variedad de productos químicos que se pueden aplicar a la capa de pasivación para unir compuestos de reconocimiento molecular (tales como, pero sin limitarse a, receptores PPi).

La Figura 11E es un esquema de la unión del compuesto 7 de la Figura 11B(3) a una superficie de óxido de metal.

Las Figuras 12A a 12L proporcionan vistas superiores de cada una de las capas de fabricación que se muestran en la Figura 11A.

Las Figuras 12-1A a 12-1L proporcionan vistas superiores de cada una de las capas de fabricación que se muestran en la Figura 11A 1.

La Figura 13 ilustra un diagrama de bloques de una implementación de chip IC CMOS ilustrativa de una matriz de sensores chemFET similar a la que se muestra en la Figura 8, basada en los diseños de columnas y píxeles que se muestran en las Figuras 9-12.

La Figura 14 ilustra un registro de desplazamiento de selección de hilera de la matriz que se muestra en la Figura 13.

La Figura 15 ilustra uno de los dos registros de desplazamiento de selección de columna de la matriz que se muestra en la Figura 13.

La Figura 16 ilustra uno de los dos controladores de salida de la matriz que se muestra en la Figura 13.

La Figura 17 ilustra un diagrama de bloques de la matriz de sensores chemFET de la Figura 13 acoplada a un controlador de matriz.

La Figura 18 ilustra un diagrama de temporización ilustrativo para varias señales proporcionadas por el controlador de matriz de la Figura 17.

La Figura 18A ilustra otro diagrama de temporización ilustrativo para varias señales proporcionadas por el controlador de matriz de la Figura 17.

La Figura 18B muestra un diagrama de flujo que ilustra un método ilustrativo para procesar y corregir datos de matriz adquiridos a altas velocidades de adquisición.

Las Figuras 18C y 18D ilustran tensiones de píxel ilustrativas que muestran transiciones de píxel a píxel en una señal de salida de matriz dada.

Las Figuras 19-20 ilustran diagramas de bloques de implementaciones alternativas de chips IC CMOS de matrices de sensores chemFET.

La Figura 20A ilustra una vista superior de un diseño de disposición de chip para un píxel de la matriz chemFET que se muestra en la Figura 20.

Las Figuras 21-23 ilustran diagramas de bloques de implementaciones alternativas adicionales de chips IC CMOS de matrices de sensores chemFET.

La Figura 24 ilustra el diseño de píxeles de la Figura 9 implementado con un chemFET de canal n y los MOSFET de canal n acompañantes.

Las Figuras 25-27 ilustran diseños de píxeles alternativos y circuitos de columna asociados para matrices chemFET.

Las Figuras 28A y 28B son ilustraciones isométricas de porciones de matrices de micropozos como se emplean en la presente descripción, que muestran pozos redondos y pozos rectangulares, para ayudar a la visualización tridimensional de las estructuras de la matriz.

La Figura 29 es una representación esquemática de una vista superior de una esquina (es decir, la esquina inferior izquierda) de la disposición de un chip que muestra una matriz de sensores ISFET individuales en una pastilla CMOS.

La Figura 30 es una ilustración de un ejemplo de una disposición para una porción de una máscara (típicamente de cromo) para un ejemplo de un sensor por pozo de la matriz de sensores descrita anteriormente, correspondiente a la porción de la pastilla que se muestra en la Figura 29.

La Figura 31 es una disposición correspondiente para una máscara para un ejemplo de 4 sensores por pozo.

La Figura 32 es una ilustración de una segunda máscara utilizada para enmascarar un área que rodea la matriz, para construir un collar o pared (o cuenca, usando ese término en el sentido geológico) de resistencia que rodea la matriz activa de sensores en un sustrato, como se muestra en la Figura 33A.

La Figura 33 es una ilustración de la cuenca resultante.

La Figura 33A es una ilustración de un proceso PCM de tres capas para fabricar la matriz de micropozos.

La Figura 33B es una sección transversal esquemática de un micropozo con una característica de "protuberancia" grabada en la parte inferior.

La Figura 33B-1 es una imagen de un microscopio electrónico de barrido que muestra en sección transversal una parte de una arquitectura de matriz como se enseña en la presente descripción, con micropozos formados en una capa de dióxido de silicio sobre los ISFET.

La Figura 33B-2 es una ilustración esquemática de un micropozo en sección transversal, el micropozo se produce como se enseña en la presente descripción y tiene lados inclinados, y muestra cómo se puede separar un cordón de un diámetro correspondientemente apropiado mayor que el de la parte inferior del pozo por interferencia con las paredes laterales del pozo.

La Figura 33B-3 es otra ilustración esquemática de tal micropozo que muestra perlas de diferentes diámetros e indica el uso opcional de perlas de relleno debajo de la perla portadora de ácido nucleico, tal como una perla portadora de a Dn .

Las Figuras 34 - 37 ilustran esquemáticamente un primer ejemplo de un aparato experimental adecuado que incorpora una interfaz fluídica con la matriz de sensores, con la Figura 35 que proporciona una sección transversal a través del aparato de la Figura 34 a lo largo de la línea de sección 35-35' y la Figura 36 expandiendo la parte de la Figura 35, en perspectiva, y la Figura 37 ampliando aún más una parte de la estructura para hacer que el fluido fluya más visible.

La Figura 38 es una ilustración esquemática de un sustrato con una capa fotorresistente grabada que comienza la formación de una celda de flujo de ejemplo de una determinada configuración.

Las Figuras 39 - 41 son diagramas de máscaras adecuadas para producir una primera configuración de celda de flujo consistente con la Figura 38.

Las Figuras 42 - 54 (pero sin incluir las Figuras 42A - 42L) y 57-58 son pares de vistas en sección parcialmente isométricas de aparatos de ejemplo y ampliaciones, que muestran formas de introducir un electrodo de referencia en, y formar, una celda de flujo y una cámara de flujo usando materiales tales como plástico y PDMS.

La Figura 42A es una ilustración de una posible configuración en sección transversal de una antecámara de cámara de flujo no rectangular (sección difusora) para usar para promover el flujo laminar en una celda de flujo como se usa en las disposiciones que se muestran en la presente descripción;

Las Figuras 42B-42F son ilustraciones esquemáticas de ejemplos de estructuras de celdas de flujo para unificar el flujo de fluidos.

La Figura 42F1 es una ilustración esquemática de un ejemplo de una disposición de deflector de techo para una celda de flujo en la que el fluido se introduce en una esquina del chip y sale por una esquina diagonal, la disposición de deflector que facilita el flujo de fluido deseado a través de la matriz.

Las Figuras 42F2-42F8 comprenden un conjunto de ilustraciones de un miembro de celda de flujo de ilustrativo que puede fabricarse mediante moldeo por inyección y puede incorporar deflectores para facilitar el flujo de fluido, así como una superficie metalizada para servir como electrodo de referencia, incluida una ilustración de dicho miembro montado a un paquete de matriz de sensores sobre una matriz de sensores, para formar una cámara de flujo encima.

Las Figuras 42G y 42H son ilustraciones esquemáticas de ejemplos alternativos de celdas de flujo en las que el flujo de fluido se introduce en el centro del conjunto de chips.

Las Figuras 421 y 42J son ilustraciones en sección transversal del tipo de realizaciones de celda de flujo que se muestran en las Figuras 42G y 42H, montadas en un conjunto de chips;

Las Figuras 42K y 42L son ilustraciones esquemáticas de celdas de flujo en las que el fluido se introduce en una esquina del conjunto de chips.

La Figura 42M es una ilustración esquemática del flujo de fluido desde una esquina de una matriz en un conjunto de chips hasta una esquina opuesta, en un aparato como el representado en las Figuras 42K y 42L.

Las Figuras 55 y 56 son vistas esquemáticas en sección transversal de disposiciones de vidrio (o plástico) de dos capas para fabricar aparatos fluídicos para montar en un chip para usar como se enseña en la presente descripción.

Las Figuras 57 y 58 son realizaciones esquemáticas de un conjunto fluídico.

Las Figuras 59A-59C son ilustraciones de las piezas para dos ejemplos de piezas moldeadas por inyección de dos piezas para formar una celda de flujo.

La Figura 60 es una ilustración esquemática, en sección transversal, para introducir un tubo capilar de acero inoxidable como electrodo, en un puerto aguas abajo de una celda de flujo tal como las celdas de flujo de las Figuras 59A - 59C, u otras celdas de flujo.

La Figura 61A es un esquema que ilustra la incorporación de un dNTP en una cadena de ácido nucleico sintetizada con la liberación concomitante de pirofosfato inorgánico (PPi).

La Figura 61B es un esquema que ilustra una realización en la que la región monocatenaria del molde no se hibrida con oligómeros de ARN. El ion de hidrógeno que se libera como resultado de la incorporación de nucleótidos puede interactuar con y posiblemente aislarse por bases libres en la región monocatenaria del molde. Dichos iones de hidrógeno no pueden entonces fluir hacia la superficie del ISFET y ser detectados. Las bases libres en las regiones monocatenarias son aceptores de protones a pH por debajo de 7,5.

La Figura 61C es un esquema que ilustra una realización en la que la región monocatenaria del molde se hibrida con oligómeros de ARN. El ion de hidrógeno que se libera como resultado de la incorporación de nucleótidos no puede interactuar con el molde que se hibrida con los oligómeros de ARN. Por lo tanto, estos iones de hidrógeno pueden fluir hacia la superficie del ISFET y ser detectados.

La Figura 61D es la estructura de la sal de potasio de PNSE.

La Figura 61E es la estructura de la sal sódica de poli(ácido estirenosulfónico).

La Figura 61F es la estructura de la sal de cloruro de poli(dialildimetilamonio).

La Figura 61G es la estructura de la sal de cloruro de tetrametilamonio.

La Figura 61H es un esquema que muestra la química para conjugar covalentemente un cebador a una perla. La Figura 61I es una tabla que muestra los posibles grupos reactivos que se pueden usar en combinación en las posiciones B1, B2, P1 y P2 para conjugar covalentemente un cebador a una perla.

Las Figuras 61J y K son imágenes de captura de datos de matrices de micropozos después de la deposición de perlas. Los puntos blancos son perlas.

La Figura 61j es una imagen de microscopio óptico y la Figura 61K es una imagen capturada utilizando el sensor chemFET subyacente a la matriz de micropozos.

Las Figuras 62-70 ilustran la carga de perlas en las matrices microfluídicas de la invención. La Figura 71 ilustra un proceso de secuenciación ilustrativo.

Las Figuras 72A-D son gráficos que muestran la detección en chip de la incorporación de nucleótidos usando un molde de secuencia conocida.

Las Figuras 73A y B son gráficos que muestran un rastro de un dispositivo ISFET (A) y una lectura de nucleótidos (B) de una reacción de secuenciación de un oligonucleótido sintético de 23 mer.

Las Figuras 74A y B son gráficos que muestran un rastro de un dispositivo ISFET (A) y una lectura de nucleótidos (B) de una reacción de secuenciación de un producto de PCR de 25 mer.

La Figura 75A es un diagrama de circuito de modelado para usar en el análisis de los factores que influyen en la ganancia de la puerta ISFET;

La Figura 75B es un gráfico de la dependencia de la ganancia de la puerta ISFET simulada con el grosor de la capa de pasivación para un primer conjunto de parámetros establecidos en la especificación;

La Figura 75C es un gráfico de la dependencia de la ganancia de la puerta ISFET simulada con el grosor de la capa de pasivación para un segundo conjunto de parámetros establecidos en la especificación;

La Figura 75D es un gráfico de la dependencia de la ganancia de la puerta ISFET simulada con el grosor de la capa de pasivación para un tercer conjunto de parámetros establecidos en la especificación;

La Figura 75E es una ilustración esquemática de dos micropozos formados sobre ISFET que tienen electrodos de puerta flotante extendidos que revisten las paredes de los micropozos;

La Figura 75E-1 es un diagrama funcional de un sistema para implementar una deposición de material por haz de electrones direccional sobre una oblea;

La Figura 75E-2a es un diagrama detallado para depositar material dentro de micropozos utilizando un haz de electrones direccional;

La Figura 75E-2b es un diagrama de los resultados logrados a partir de la Figura 75e2a;

La Figura 75F es una ilustración parcialmente esquemática y parcialmente de circuito de una realización de ejemplo de un píxel (sensor) de cuatro transistores que emplea un diseño de circuito activo;

La Figura 75G es un diagrama de un segundo ejemplo de un píxel activo de cuatro transistores, que emplea una fuente de corriente de MOSFET único para evitar (o al menos minimizar) la introducción de una perturbación en el nodo de detección;

La Figura 75H es un diagrama de un grupo de cuatro píxeles, cada uno similar al de la Figura 75G, que comparten ciertos componentes para reducir los requisitos de área del chip;

La Figura 751 es un diagrama de un píxel activo que emplea seis transistores; la Figura 75J es un diagrama de un grupo de cuatro píxeles, cada uno similar al de la Figura 751, que comparten ciertos componentes para reducir los requisitos de área del chip;

La Figura 75K es una ilustración esquemática de un ejemplo de una matriz de sensores ISFET (píxeles) como se enseña en la presente descripción, que comparten un convertidor de analógico a digital (a Dc ) común para producir valores de píxeles digitales;

La Figura 75L es una ilustración esquemática de otro ejemplo de una matriz del ISFET en la que se proporciona un ADC por columna (o grupo de columnas) para acelerar la lectura digital;

Las Figuras 75M y 75N son ilustraciones que muestran cómo las matrices de las Figuras 75K y 75L pueden segmentarse para formar submatrices, por ejemplo, para acelerar el funcionamiento o para tratar de manera diferente partes diferentes de la matriz general;

La Figura 75O es un circuito parcialmente esquemático, parcialmente un diagrama de bloques de un solo píxel, que ilustra básicamente cómo se puede generar la salida digital al nivel de píxel individual en una matriz;

La Figura 75P es un diagrama de un grupo de cuatro píxeles, cada uno similar al de la Figura 75P, que comparten un ADC y una memoria para proporcionar una salida digital por píxel;

La Figura 75Q es un diagrama de circuitos de direccionamiento de hileras y amplificadores de detección de columna que proporcionan funcionalidad de lectura desde una matriz de píxeles en la que los píxeles proporcionan salidas digitales;

Las Figuras 75R - 75T son diagramas de circuitos esquemáticos que ilustran alternativas para ISFET de protección de diodos como se describe en la presente descripción;

La Figura 76A es un diagrama de circuito parcial de bloque parcial de alto nivel que muestra un píxel de sensor pasivo básico en el que la tensión cambia en la fuente ISFET y el ruido de inyección de drenaje en el analito, provocando errores en los valores detectados;

La Figura 76B es un diagrama de circuito parcialmente de bloque parcial de alto nivel que muestra un píxel de sensor pasivo básico en el que los cambios de tensión en el drenaje ISFET se eliminan conectándolo a tierra, la salida de píxel se obtiene a través de un amortiguador de columna, y CDS es empleado en la salida del amortiguador de columna para reducir el ruido correlacionado;

La Figura 76C es un diagrama de circuito parcial de bloque parcial de alto nivel que muestra un píxel sensor pasivo de dos transistores en el que los cambios de tensión en el drenaje y la fuente ISFET se eliminan sustancialmente, la salida del píxel se obtiene a través de un amortiguador y se emplea CDS en la salida del amortiguador de columna para reducir el ruido correlacionado;

Descripción detallada

A continuación, se incluyen descripciones más detalladas de varios conceptos relacionados con matrices de chemFET a gran escala para la detección y/o medición de analitos. Debe apreciarse que varios conceptos presentados anteriormente y descritos con mayor detalle a continuación pueden implementarse de numerosas formas, ya que los conceptos descritos no se limitan a ninguna forma particular de implementación. Los ejemplos de implementaciones y aplicaciones específicas se proporcionan principalmente con fines ilustrativos.

La presente descripción está dirigida, al menos en parte, a un sistema híbrido microfluídico/basado en semiconductores que combina el poder de la microelectrónica con la biocompatibilidad de un sistema microfluídico. En algunos ejemplos a continuación, la porción de microelectrónica del sistema híbrido se implementa en tecnología CMOS con fines ilustrativos. Debe apreciarse, sin embargo, que la descripción no pretende ser limitativa en este sentido, ya que se pueden utilizar otras tecnologías basadas en semiconductores para implementar varios aspectos de la parte microelectrónica de los sistemas descritos en la presente descripción.

Una realización descrita en la presente descripción está dirigida a una gran matriz de sensores (por ejemplo, una matriz bidimensional) de transistores de efecto de campo químicamente sensibles (chemFET). En realizaciones relacionadas, los elementos sensores chemFET individuales o "píxeles" de la matriz están configurados para detectar la presencia (o ausencia) de analitos, los niveles (o cantidades) de analitos y/o la concentración de analitos en una muestra tal como una muestra no manipulada, o como un resultado de procesos químicos y/o biológicos (por ejemplo, reacciones químicas, cultivos celulares, actividad neuronal, reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos, etc.) que se producen en las proximidades de la matriz. Los ejemplos de chemFET contemplados por varias realizaciones descritas con mayor detalle a continuación incluyen, pero no se limitan a, transistores de efecto de campo sensibles a iones (ISFET) y transistores de efecto de campo sensibles a enzimas (EnFET). En una implementación ilustrativa, se fabrican una o más estructuras microfluídicas por encima de la matriz de sensores chemFET para proporcionar contención y/o confinamiento de una reacción biológica o química en la que un analito de interés puede ser capturado, producido o consumido, como puede ser el caso. Por ejemplo, en una implementación, la(s) estructura(s) microfluídica(s) puede(n) configurarse como uno o más pozos (o micropozos, o cámaras de reacción, o pozos de reacción como los términos se usan indistintamente en la presente descripción) dispuestos sobre uno o más sensores de la matriz, de manera que el uno o más sensores sobre los que se dispone un pozo determinado detectan y miden la presencia, el nivel y/o la concentración del analito en el pozo dado. En una realización, existe una correspondencia 1:1 de sensores chemFET y pozos de reacción. Sin embargo, también se prevén otras correspondencias de sensores chemFET y pozos de reacción, tal como un pozo de reacción para dos o más sensores ChemFET y un sensor ChemFET para dos o más pozos.

En otra implementación ilustrativa, un sistema que comprende al menos una matriz bidimensional de cámaras de reacción, en el que cada cámara de reacción está acoplada a un transistor de efecto de campo químicamente sensible ("chemFET") y cada cámara de reacción no tiene más de 10 pm3 (es decir, 1 pL) en volumen. Preferentemente, cada cámara de reacción no tiene más de 0,34 pL, y con mayor preferencia no más de 0,096 pL o incluso 0,012 pL en volumen. Una cámara de reacción puede tener opcionalmente 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92 o 102 micras cuadradas en el área de la sección transversal en la parte superior. Preferentemente, la matriz tiene al menos 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o más cámaras de reacción. Las cámaras de reacción pueden estar acopladas capacitivamente a los chemFET, y preferentemente están acopladas capacitivamente a los chemFET. Dichos sistemas pueden usarse para la secuenciación de alto rendimiento de ácidos nucleicos.

Como se usa en la presente descripción, una matriz es una disposición plana de elementos tales como sensores o pozos. La matriz puede ser de una o dos dimensiones. Una matriz unidimensional es una matriz que tiene una columna (o hilera) de elementos en la primera dimensión y una pluralidad de columnas (o hileras) en la segunda dimensión. Un ejemplo de una matriz unidimensional es una matriz de 1 * 5. Una matriz bidimensional es una matriz que tiene una pluralidad de columnas (o hileras) tanto en la primera como en la segunda dimensión. El número de columnas (o hileras) en la primera y segunda dimensión puede o no ser el mismo. Un ejemplo de una matriz bidimensional es una matriz de 5 * 10.

En algunos ejemplos, tal matriz chemFET/estructura híbrida de microfluidos puede usarse para analizar solución(ones)/material(es) de interés que contienen ácidos nucleicos. Por ejemplo, tales estructuras pueden emplearse para secuenciar ácidos nucleicos. La secuenciación de ácidos nucleicos se puede realizar para determinar la secuencia de nucleótidos parcial o completa de un ácido nucleico, para detectar la presencia y, en algunos casos, la naturaleza de una mutación tal como, pero sin limitarse a, un polimorfismo de un solo nucleótido en un ácido nucleico, para identificar la fuente de una(s) célula(s) o ácido nucleico, por ejemplo, con fines forenses, para detectar células anormales, tales como células cancerosas en el cuerpo, opcionalmente en ausencia de masas tumorales detectables, para identificar patógenos en una muestra, tal como una muestra corporal, por ejemplo, para diagnóstico y/o con fines terapéuticos, para identificar cepas de patógenos resistentes a los antibióticos a fin de evitar regímenes terapéuticos innecesarios (e ineficaces), para determinar qué régimen terapéutico será más eficaz para tratar a un sujeto que tiene una afección particular, según se puede determinar por la composición genética del sujeto (por ejemplo, medicina personalizada), para determinar y comparar perfiles de expresión de ácidos nucleicos de dos o más estados (por ejemplo, comparar perfiles de expresión de tejido enfermo y normal, o comparar perfiles de expresión de tejido no tratado y tejido tratado con fármacos, enzimas, radiación o tratamiento químico), para haplotipar una muestra (por ejemplo, comparar genes o variaciones en genes en cada uno de los dos alelos presentes en un sujeto humano), para cariotipar una muestra (por ejemplo, analizar la composición cromosómica de una célula o un tejido, tal como un embrión, para detectar anomalías cromosómicas macroscópicas u otras anomalías genómicas), y al genotipo (por ejemplo, analizar uno o más loci genéticos para determinar, por ejemplo, el estado de portador y/o las relaciones especie-género).

Los sistemas descritos en la presente descripción se pueden utilizar para secuenciar los ácidos nucleicos de un genoma completo o de cualquier parte del mismo. Los genomas que se pueden secuenciar incluyen genomas de mamíferos y, preferentemente, genomas humanos. Otros genomas que se pueden secuenciar incluyen genomas bacterianos, virales, fúngicos y parasitarios. Tal secuenciación puede conducir a la identificación de mutaciones que dan lugar a la resistencia a los medicamentos o a la desviación evolutiva general de las especies conocidas. Este último aspecto es útil para determinar, por ejemplo, si un agente terapéutico anterior (tal como una vacuna) puede ser eficaz contra las cepas infectantes actuales. Un ejemplo específico es la detección de nuevas cepas de influenza y una determinación de si el cóctel de vacunas del año anterior será efectivo contra un nuevo brote de influenza.

Por lo tanto, los métodos de diferentes ejemplos pueden abarcarse por métodos para detectar un ácido nucleico en una muestra. El ácido nucleico puede ser un marcador de su origen, tal como un patógeno que incluye, pero sin limitarse a, un virus, un cáncer o un tumor en un individuo. En el último aspecto, una muestra tal como una muestra de sangre puede recogerse de un sujeto y analizarse para detectar la presencia de una célula cancerosa oculta tal como una que se ha extravasado desde su sitio tumoral original. En todavía otro aspecto, los métodos pueden usarse con fines forenses en los que las muestras se analizan para determinar la presencia de un ácido nucleico conocido (por ejemplo, de un sospechoso o de un banco de ADN encargado de hacer cumplir la ley). En aspectos relacionados, se puede analizar una muestra para determinar la heterogeneidad del ácido nucleico con el fin de determinar si una muestra se deriva de una fuente (por ejemplo, un solo sujeto) o más de una fuente (por ejemplo, una muestra contaminada). Los métodos descritos en la presente descripción también se pueden usar para detectar la presencia de una mutación de nucleótido tal como, pero sin limitarse a, un polimorfismo de un solo nucleótido. Tal análisis o evaluación de mutaciones se realiza típicamente en diagnósticos prenatales o posnatales. La naturaleza de la mutación se puede usar para determinar el curso de terapia más adecuado, en algunos casos. Cualquiera de los métodos proporcionados en la presente descripción puede usarse en uno o más métodos de diagnóstico, forenses y/o terapéuticos.

Varios aspectos emplean un enfoque de secuenciación por síntesis para secuenciar ácidos nucleicos. Este enfoque implica la síntesis de una nueva cadena de ácido nucleico usando un ácido nucleico molde. La cadena molde puede cebarse intermolecularmente mediante la hibridación de un cebador de secuenciación en un extremo, o intramolecularmente plegándose sobre sí misma en un extremo. La cadena molde también puede cebarse introduciendo una rotura o una mella en una cadena de un ácido nucleico de doble cadena, preferentemente, pero no exclusivamente, cerca de un extremo, como se describe con mayor detalle en la presente descripción. En estos ejemplos, los nucleótidos conocidos se incorporan al "cebador" en base a la complementariedad con el molde. El método prevé que los nucleótidos se pongan en contacto con el cebador (y, por tanto, con el molde) (en presencia de polimerasa y cualquier otro factor utilizado para la incorporación) de forma selectiva.

En muchos ejemplos, cada tipo de nucleótido se pone en contacto individualmente con el cebador y/o el molde. En otros ejemplos, las combinaciones de dos o tres tipos de nucleótidos pueden ponerse en contacto con el cebador y/o el molde simultáneamente. Dado que se conoce la identidad de los nucleótidos en contacto con el cebador y/o el molde en un momento dado, también se conoce la identidad de los nucleótidos incorporados (si se incorporan). Y en base a la necesaria complementariedad con el molde, también se puede deducir la secuencia del molde. Usando diferentes tipos de nucleótidos por separado (por ejemplo, usando dATP, dCTP, dGTP o dTTP por separado), se puede obtener una secuencia de alta resolución. Usando combinaciones (o mezclas) de nucleótidos (por ejemplo, usando dATP, dCTP y dGTP juntos y por separado de dTTP), se puede obtener una secuencia de menor resolución que, sin embargo, es valiosa para ciertas aplicaciones (por ejemplo, ordenar y alinear varias secuencias de mayor resolución). Con respecto a la última realización, se entenderá que la invención contempla el uso de mezclas de tres nucleótidos cualquiera y, en algunos casos, dos nucleótidos cualquiera, y no solo las combinaciones específicas enumeradas anteriormente.

Los nucleótidos (o trifosfatos de nucleótidos o desoxirribonucleótidos o dNTP, como se denominan en la presente descripción indistintamente) no necesitan estar y típicamente no están marcados extrínsecamente. Por tanto, los nucleótidos naturales (es decir, nucleótidos idénticos a los que existen in vivo de forma natural) o sus homólogos sintéticos son adecuados para su uso en los métodos descritos para realizaciones particulares. Dichos nucleótidos pueden denominarse en la presente descripción como "no marcados".

En un ejemplo, los nucleótidos se administran sustancialmente al mismo tiempo a cada molde. La(s) polimerasa(s) ya están preferentemente presentes, aunque también pueden introducirse junto con los nucleótidos. Las polimerasas pueden estar inmovilizadas o pueden fluir libremente. Una vez que se incorporan los nucleótidos (si existe complementariedad) y se detecta cualquier señal asociada, normalmente se administra una enzima, tal como la apirasa, para degradar cualquiera de los nucleótidos no utilizados, seguido de un paso de lavado para eliminar sustancialmente toda la enzima, así como cualquier otros componentes restantes e inconvenientes. La reacción puede producirse en una cámara de reacción en algunos ejemplos, mientras que en otros puede producirse en ausencia de cámaras de reacción. En estos últimos ejemplos, la superficie del sensor puede ser continua sin ningún divisor físico entre los sensores.

En ejemplos importantes, la reacción de secuenciación se realiza simultáneamente en una pluralidad de moldes idénticos en una cámara de reacción y, opcionalmente, en una pluralidad de cámaras de reacción. La secuenciación de un molde diferente en cada cámara de reacción permite obtener una mayor cantidad de datos de secuencia en cualquier ejecución determinada. Por lo tanto, usar tantas cámaras de reacción (y sensores) como sea posible en una ejecución determinada también maximiza la cantidad de datos de secuencia que se pueden obtener en cualquier ejecución determinada. En realizaciones importantes, los moldes en un pozo de reacción se inmovilizan (por ejemplo, de forma covalente o no covalente) sobre y/o en una perla, denominada en la presente descripción perla de captura, o sobre un soporte sólido tal como la superficie del chemFET.

Debe entenderse que en este y otros ejemplos, una pluralidad puede representar un subconjunto de elementos en lugar de la totalidad de todos los elementos. Como ejemplo, en el ejemplo anterior, la pluralidad de moldes en la cámara de reacción que están secuenciadas pueden representar un subconjunto o todos los moldes en la cámara de reacción. Por lo tanto, este ejemplo particular requiere que se secuencien al menos dos moldes, y no requiere que se secuencien todos los moldes presentes en la cámara de reacción.

Como se describe ampliamente en la presente descripción, en algunos ejemplos, la incorporación de nucleótidos se detecta a través de subproductos de la incorporación o por cambios en la carga del ácido nucleico recién sintetizado, especialmente cuando se inmoviliza en una superficie del chemFET, en lugar de detectar el propio nucleótido incorporado. Más específicamente, algunos ejemplos aprovechan la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi), fosfato inorgánico (Pi) e iones de hidrógeno (todos los cuales se consideran subproductos de la reacción de secuenciación) que se produce después de la incorporación de un nucleótido en un ácido nucleico (tal como un imprimador, por ejemplo). En algunos ejemplos, el método detecta los iones de hidrógeno liberados como indicación de la incorporación de nucleótidos. Los chemFET (y las matrices de chemFET) descritos en la presente descripción son adecuados para la detección de estos iones, así como de otros subproductos de la reacción de secuenciación. Debe entenderse que los ejemplos descritos en la presente descripción relacionados con los chemFET contemplan y abarcan igualmente los ISFET a menos que se indique lo contrario.

Un ejemplo incluye métodos para mejorar la detección de los iones de hidrógeno por el chemFET. Estos métodos incluyen generar y/o detectar más iones de hidrógeno en una reacción de secuenciación determinada. Esto se puede hacer aumentando la cantidad de moldes por cámara de reacción, aumentando la cantidad de moldes unidos a cada perla de captura, aumentando la cantidad de moldes secuenciados por cámara de reacción, aumentando la cantidad de moldes unidos a la superficie del sensor, aumentando la estabilidad del híbrido cebador/molde, aumentando la procesividad de la polimerasa y/o combinando la incorporación de nucleótidos con la escisión de nucleótidos (por ejemplo, realizando la reacción de secuenciación por síntesis en el contexto de una reacción de traducción de mella), entre otras cosas. Otro enfoque alternativo o adicional es aumentar la cantidad de iones de hidrógeno liberados que realmente detecta el chemFET. Esto se puede hacer evitando que los iones de hidrógeno liberados interactúen con otros componentes en el pozo de reacción, incluidos los componentes con potencial de amortiguación. Estos ejemplos incluyen el uso de inhibidores de amortiguación (como se describe más detalladamente en la presente descripción) para saturar los componentes que, de otro modo, podrían secuestrar los iones de hidrógeno liberados. Los inhibidores de amortiguación pueden ser oligómeros de ARN cortos que se unen a regiones monocatenarias de los moldes o compuestos químicos que interactúan con los materiales incluidos en las cámaras de reacción y/o los propios chemFET.

Algunos ejemplos presentados en la presente descripción involucran matrices chemFET densas y matrices de cámaras de reacción. Será evidente que a medida que las matrices se vuelven más densas, el área y/o el volumen de los elementos individuales (por ejemplo, las superficies de los sensores y las cámaras de reacción) normalmente se volverán más pequeños para acomodar una mayor cantidad de sensores o cámaras de reacción sin un efecto concomitante (o significativo) aumento en el área de matriz total. Sin embargo, se ha determinado que a medida que disminuye el volumen de una cámara de reacción, la relación señal/ruido puede en realidad aumentar debido a una mayor concentración de ácido nucleico. Por ejemplo, se ha determinado que una disminución de aproximadamente 2,3 veces en el volumen de la cámara de reacción puede producir un aumento de aproximadamente 1,5 veces en la relación señal/ruido. Este aumento puede producirse incluso si se reduce el número total de ácidos nucleicos que se secuencian. Por lo tanto, en algunos casos, en lugar de perder la señal al pasar a matrices más densos, algunas realizaciones contemplan una mayor señal debido a una mayor concentración de ácidos nucleicos en las cámaras de reacción de menor volumen.

Los ejemplos también contemplan métodos de secuenciación por síntesis que detectan eventos de incorporación de nucleótidos basados en cambios en la carga en la superficie del chemFET debido al cambio en la carga de un resto unido a la superficie, tal como un ácido nucleico o un complejo de ácido nucleico (por ejemplo, un híbrido molde/cebador). Tales métodos incluyen los que usan o extienden ácidos nucleicos que están inmovilizados (por ejemplo, covalentemente) a la superficie de un chemFET. La incorporación de nucleótidos en un ácido nucleico que se une a una superficie del chemFET generalmente da como resultado un aumento en la carga negativa del ácido nucleico unido o del complejo en el que está presente (por ejemplo, un híbrido molde/cebador). En algunos casos, el cebador se unirá a la superficie del chemFET, mientras que en otros casos, el molde se unirá a la superficie del chemFET. En tales casos, una pluralidad de ácidos nucleicos idénticos, normalmente separados físicamente, se inmovilizan en superficies del chemFET individuales y se realizan reacciones de secuenciación por síntesis en la pluralidad de manera simultánea y sincrónica. En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos no son concatémeros y, más bien, cada uno incluirá solo una única copia del ácido nucleico a secuenciar.

Se entenderá que los métodos de secuenciación proporcionados en la presente descripción se pueden usar para secuenciar un genoma o parte del mismo. Como ejemplo, dicho método puede incluir la entrega de ácidos nucleicos fragmentados del genoma o parte del mismo a un sistema para la secuenciación de alto rendimiento que comprende al menos una serie de cámaras de reacción, en la que cada cámara de reacción está acoplada a un chemFET, y detectar una reacción de secuenciación en una cámara de reacción a través de una señal del chemFET acoplado con la cámara de reacción. Alternativamente, el método puede incluir la entrega de ácidos nucleicos fragmentados del genoma o parte del mismo a un aparato de secuenciación que comprende una serie de cámaras de reacción, en el que cada una de las cámaras de reacción está dispuesta en una relación de detección con un chemFET asociado individual, y detectar una reacción de secuenciación de una cámara de reacción a través de una señal de su chemFET asociado. Por lo general, los cuatro nucleótidos fluyen hacia la misma cámara de reacción, ya sea individualmente (o por separado) o como una mezcla de menos de los cuatro nucleótidos, de manera ordenada y conocida.

Los métodos proporcionados en la presente descripción pueden permitir que se determinen (o secuencien) 103, 104 105 o 106 bases por hora. En diferentes realizaciones, se pueden secuenciar 107 bases, 108 bases, 109 bases o 1010 bases por hora usando los métodos y matrices descritos en la presente descripción. Por lo tanto, se pueden usar diversos ejemplos que emplean los métodos descritos en la presente descripción para secuenciar un genoma humano completo en aproximadamente 24 horas, en aproximadamente 20 horas, en aproximadamente 15 horas, en aproximadamente 10 horas, en aproximadamente 5 horas o en aproximadamente 1 hora.

Debe apreciarse, sin embargo, que aunque algunos ejemplos ilustrativos de los conceptos descritos en la presente descripción se centran en la secuenciación de ácidos nucleicos, se contempla una aplicación más amplia de estos métodos y no se pretende limitar estos ejemplos.

La Figura 8 ilustra en general un sistema de procesamiento de ácido nucleico 1000 que comprende una matriz de chemFET a gran escala. Un ejemplo de un sistema de procesamiento de ácidos nucleicos es un sistema de secuenciación de ácidos nucleicos. En la descripción que sigue, los sensores chemFET de la matriz se describen con fines ilustrativos como ISFET configurados para ser sensibles a la concentración de iones estática y/o dinámica, que incluye, pero sin limitarse a, la concentración de iones de hidrógeno. Sin embargo, debe apreciarse que la presente descripción no está limitada en este sentido, y que en cualquiera de los ejemplos descritos en la presente descripción en los que se emplean ISFET como ejemplo ilustrativo, otros tipos de chemFET pueden emplearse de manera similar en ejemplos alternativos, como se describió con más detalle a continuación. De manera similar, debe apreciarse que varios ejemplos pueden emplear ISFET como sensores y aun así detectar una o más especies iónicas que no son iones de hidrógeno.

El sistema 1000 incluye una estructura híbrida de semiconductor/ microfluidos 300 que comprende una matriz de sensores ISFET 100 y una celda de flujo de microfluidos 200. En un aspecto, la celda de flujo 200 puede comprender varios pozos (no se muestran en la Figura 8) dispuestos encima de los sensores correspondientes de la matriz del ISFET 100. En otro aspecto, la celda de flujo 200 está configurada para facilitar la secuenciación de uno o más ácidos nucleicos moldes idénticos dispuestos en la celda de flujo a través de la introducción controlada y ordenada en la celda de flujo de varios reactivos de secuenciación 272 (por ejemplo, dATP, dCTP, dGTP, dTTP (denominado genéricamente en la presente descripción como dNTP), cationes divalentes tales como, pero sin limitarse a, Mg2+, soluciones de lavado y similares).

Como se ilustra en la Figura 8, la introducción de los reactivos de secuenciación en la celda de flujo 200 se puede lograr a través de una o más válvulas 270 y una o más bombas 274 que están controladas por un ordenador 260. Pueden utilizarse varias técnicas para admitir (es decir, introducir) los diversos materiales de procesamiento (es decir, soluciones, muestras, reactivos de reacción, soluciones de lavado y similares) en los pozos de tal celda de flujo. Como se ilustra en la Figura 8, los reactivos que incluyen dNTP se pueden admitir en la celda de flujo (por ejemplo, a través de la válvula 270 controlada por ordenador y las bombas 274) desde donde se difunden hacia los pozos, o se pueden agregar reactivos a la celda de flujo por otros medios como un chorro de tinta. En todavía otro ejemplo, la celda de flujo 200 puede no contener pozos, y las propiedades de difusión de los reactivos pueden aprovecharse para limitar la diafonía entre los sensores respectivos de la matriz del ISFET 100, o los ácidos nucleicos pueden inmovilizarse en las superficies de los sensores de la matriz del ISFET 100.

La celda de flujo 200 en el sistema de la Figura 8 se puede configurar de varias maneras para proporcionar uno o más analitos (o una o más soluciones de reacción) en la proximidad de la matriz del ISFE^t 100. Por ejemplo, un ácido nucleico molde puede unirse o aplicarse directamente en una proximidad adecuada a uno o más píxeles de la matriz de sensores 100, o en o sobre un material de soporte (por ejemplo, una o más "perlas") localizadas encima de la matriz de sensores, pero dentro de las cámaras de reacción, o en la propia superficie del sensor. Los reactivos de procesamiento (por ejemplo, enzimas como las polimerasas) también se pueden colocar en los sensores directamente, o en uno o más soportes sólidos (por ejemplo, se pueden unir a las perlas de captura o a otras perlas) cerca de los sensores, o puede estar en solución y fluir libremente. Debe entenderse que el dispositivo puede usarse sin pozos ni perlas.

En el sistema 1000 de la Figura 8, según un ejemplo, la matriz de sensores ISFET 100 monitorea las especies iónicas y, en particular, los cambios en los niveles/cantidades y/o concentración de especies iónicas, incluidos los iones de hidrógeno. En ejemplos importantes, las especies son aquellas que resultan de una síntesis de ácido nucleico o una reacción de secuenciación.

El aparato, por ejemplo, en una configuración como la ilustrada en la Figura 8, puede usarse en métodos para determinar secuencias de nucleótidos. En un aspecto, dichos métodos comprenden las siguientes etapas: (a) disponer una pluralidad de perlas en una pluralidad de cámaras de reacción en una matriz de sensores de una pluralidad de sensores formados en un sustrato semiconductor, cada cámara de reacción que comprende una sola perla, cada perla unida a una pluralidad de ácidos nucleicos moldes idénticos, cada uno de los ácidos nucleicos moldes hibridado con un cebador de secuenciación y unido a una polimerasa, y cada cámara de reacción en contacto o acoplada capacitivamente a al menos un transistor de efecto de campo sensible a productos químicos (chemFET) de un sensor, cada uno de estos chemFET tiene una puerta flotante que tiene una capa de pasivación laminada que comprende una primera capa de óxido de metal en contacto con la puerta flotante y una segunda capa de óxido de metal en contacto con la cámara de reacción y sensible a al menos un subproducto de la reacción de secuenciación, y cada chemFET está configurado para proporcionar al menos una salida que representa una presencia y/o concentración de un subproducto de reacción de secuenciación t próximo al mismo; (b) introducir un trifosfato de nucleósido conocido en cada cámara de reacción, (c) detectar la incorporación secuencial en el extremo 3' del cebador de secuenciación de uno o más trifosfatos de nucleósido mediante la generación de un subproducto de reacción de secuenciación si el trifosfato de nucleósido conocido es complementario a nucleótidos correspondientes en el ácido nucleico molde, (d) lavar los trifosfatos de nucleósidos no incorporados de las cámaras de reacción, y (e) repetir los pasos (b) a (d) hasta que se secuencia el ácido nucleico. Como se usa en la oración inmediatamente anterior, en un aspecto, "sensible" en referencia a un subproducto de reacción de secuenciación significa la capacidad de la segunda capa de óxido de metal para cargarse y/o mantener la carga en respuesta a la presencia de un subproducto de reacción de secuenciación. En una realización, la segunda capa de óxido de metal es sensible al pH y el subproducto de la reacción de secuenciación es la concentración de iones de hidrógeno. En otro ejemplo, la polimerasa se inmoviliza en la perla. Todavía en otro ejemplo, los ácidos nucleicos moldes son ADN de doble cadena y en el que cada uno de dichos moldes de ácido nucleico incluye un sitio de ADN nickasa para crear una mella en la que una polimerasa puede incorporar nucleótidos. En otra realización, la primera capa de óxido de metal es Al 2 O 3 y la segunda capa de óxido de metal es Ta2O5. En aún otra realización, la primera capa de óxido de metal y la segunda capa de óxido de metal tienen cada una un grosor en el rango de 2,5 a 10 nm.

En otro aspecto, tales métodos de secuenciación de ácidos nucleicos comprenden las siguientes etapas: (a) fragmentar un ácido nucleico diana para generar una pluralidad de ácidos nucleicos fragmentados; (b) unir cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos fragmentados a perlas individuales para generar una pluralidad de perlas, cada una unida a un único ácido nucleico fragmentado; (c) amplificar los ácidos nucleicos fragmentados en cada perla dando como resultado una pluralidad de ácidos nucleicos fragmentados idénticos en cada perla; (d) entregar una pluralidad de perlas unidas a ácidos nucleicos fragmentados a una serie de cámaras de reacción dispuestas en una matriz de sensores que tiene una pluralidad de sensores formados en un sustrato semiconductor, cada cámara de reacción que está en una relación de detección con un electroquímico, no óptico sensor de la matriz, en la que solo se sitúa una perla en cada cámara de reacción y en la que cada sensor es un chemFET que tiene una puerta flotante que tiene una capa de pasivación laminada que comprende una segunda capa de óxido de metal en contacto con la cámara de reacción y una primera capa de óxido de metal en contacto con la puerta flotante, cada chemFET se configura para proporcionar al menos una salida que represente una presencia y/o concentración de un subproducto de reacción de secuenciación próximo al mismo; y (e) realizar reacciones de secuenciación simultáneamente en la pluralidad de cámaras de reacción.

En todavía otro aspecto, tales métodos de secuenciación de ácidos nucleicos comprenden las siguientes etapas: (a) disponer una pluralidad de ácidos nucleicos moldes en una pluralidad de cámaras de reacción, en los que la pluralidad de cámaras de reacción está en contacto o acoplada capacitivamente a una matriz chemFET de una pluralidad de chemFET formados en un sustrato semiconductor, la matriz de chemFET comprende al menos un chemFET para cada cámara de reacción, dicho chemFET tiene una puerta flotante que tiene una capa de pasivación laminada que comprende una segunda capa de óxido de metal en contacto con la cámara de reacción y una primera capa de óxido de metal en contacto con la puerta flotante, y en los que cada uno de los ácidos nucleicos moldes se hibrida con un cebador de secuenciación y se une a una polimerasa, (b) sintetizar una nueva cadena de ácido nucleico incorporando uno o más trifosfatos de nucleósidos conocidos secuencialmente en el extremo 3' del cebador de secuenciación, y (c) detectar la incorporación del uno o más trifosfatos de nucleósidos conocidos mediante un cambio en la tensión y/o corriente en al menos un chemFET dentro de la matriz en respuesta a la presencia y/o concentración de un subproducto de reacción de secuenciación próximo al mismo.

Varios ejemplos pueden relacionarse con técnicas de monitoreo/medición que involucran las respuestas estáticas y/o dinámicas de un ISFET. Debe entenderse que aunque el ejemplo particular de una síntesis de ácido nucleico o una reacción de secuenciación se proporciona para ilustrar la respuesta transitoria o dinámica de un chemFET como un ISFET, la respuesta transitoria o dinámica de un chemFET tal como un ISFET, como se describe a continuación, puede explotarse para monitorear/detectar otros tipos de actividad química y/o biológica más allá del ejemplo específico de una síntesis de ácido nucleico o una reacción de secuenciación.

Como se indicó anteriormente, el ISFET se puede emplear para medir los valores de pH en estado estacionario, ya que en algunas realizaciones el cambio de pH es proporcional al número de nucleótidos incorporados en la cadena de ácido nucleico recién sintetizada. En otras realizaciones descritas con mayor detalle a continuación, la matriz de sensores FET puede configurarse particularmente para la sensibilidad a otros analitos que pueden proporcionar información relevante sobre las reacciones químicas de interés. Un ejemplo de dicha modificación o configuración es el uso de receptores específicos de analitos para unirse a los analitos de interés, como se describe con mayor detalle en la presente descripción.

A través de un controlador de matriz 250 (también bajo el funcionamiento del ordenador 260), la matriz de ISFET puede controlarse para adquirir datos (por ejemplo, señales de salida de los respectivos ISFET de la matriz) relacionados con la detección y/o mediciones de analitos, y los datos recogidos pueden procesarse por el ordenador 260 para producir información significativa asociada con el procesamiento (incluyendo la secuenciación) del ácido nucleico molde.

Con respecto a la matriz del ISFET 100 del sistema 1000 que se muestra en la Figura 8, en una realización, la matriz 100 se implementa como un circuito integrado diseñado y fabricado utilizando procesos CMOS estándar (por ejemplo, proceso de 0,35 micras, proceso de 0,18 micras), que comprende todos los sensores y la electrónica necesarios para monitorear/medir uno o más analitos y/o reacciones. Con referencia nuevamente a la Figura 1, uno o más electrodos de referencia 76 a emplear en conexión con la matriz del ISFET 100 pueden colocarse en la celda de flujo 200 (por ejemplo, dispuestos en pozos "no utilizados" de la celda de flujo) o expuestos de otro modo a una referencia (por ejemplo, uno o más de los reactivos de secuenciación 172) para establecer una línea de base contra la cual se comparan los cambios en la concentración de analitos próximos a los ISFET respectivos de la matriz 100. El(los) electrodo(s) de referencia 76 pueden acoplarse eléctricamente a la matriz 100, el controlador de matriz 250 o directamente al ordenador 260 para facilitar las mediciones de analitos basadas en señales de tensión obtenidas de la matriz 100; en algunas implementaciones, los electrodos de referencia pueden estar acoplados a una tierra eléctrica u otro potencial predeterminado, o la tensión del electrodo de referencia puede medirse con respecto a tierra, para establecer una referencia eléctrica para las mediciones de la señal de salida ISFET, como se describe más adelante.

La matriz del ISFET 100 no está limitada a ningún tamaño en particular, como matrices unidimensionales o bidimensionales, que incluyen, pero sin limitarse a, tan solo de dos a 256 píxeles (por ejemplo, 16 por 16 píxeles en una implementación bidimensional) o tantos como 54 megapíxeles (por ejemplo, 7400 por 7400 píxeles en una implementación bidimensional) o incluso mucho más pueden fabricarse y emplearse para diversos fines de análisis químico/biológico según los conceptos descritos en la presente descripción. En el sistema ilustrativo que se muestra en la Figura 8, los sensores ISFET individuales de la matriz pueden configurarse para ser sensibles a los iones de hidrógeno; sin embargo, también debe apreciarse que la presente descripción no está limitada en este sentido, ya que los sensores individuales de una matriz de sensores ISFET pueden configurarse particularmente para ser sensibles a otros tipos de concentraciones de iones para una variedad de aplicaciones (materiales sensibles a otros iones como sodio, plata, hierro, bromo, yodo, calcio y nitrato, por ejemplo).

Más generalmente, una matriz de chemFET según varias realizaciones de la presente descripción puede configurarse para ser sensible a uno o más de una variedad de analitos. En una realización, uno o más chemFET de una matriz pueden configurarse particularmente para sensibilidad a uno o más analitos y/o uno o más eventos de unión, y en otras realizaciones diferentes chemFET de una matriz dada pueden configurarse para sensibilidad a diferentes analitos. Por ejemplo, en una realización, uno o más sensores (píxeles) de la matriz pueden incluir un primer tipo de chemFET configurado para ser sensible a un primer analito, y uno o más sensores de la matriz pueden incluir un segundo tipo de chemFET configurado ser sensible a un segundo analito diferente del primer analito. En una implementación ilustrativa, tanto un primer como un segundo analito pueden indicar una reacción particular, como por ejemplo la incorporación de nucleótidos en un método de secuenciación por síntesis. Por supuesto, debe apreciarse que se pueden emplear más de dos tipos diferentes de chemFET en cualquier matriz dada para detectar y/o medir diferentes tipos de analitos y/u otras reacciones. En general, debe apreciarse en cualquiera de las matrices de sensores descritas en la presente descripción que una matriz de sensores dada puede ser "homogénea" e incluir chemFET de tipos sustancialmente similares o idénticos para detectar y/o medir un mismo tipo de analito (por ejemplo, iones de hidrógeno), o una matriz de sensores puede ser "heterogénea" e incluir chemFET de diferentes tipos para detectar y/o medir diferentes analitos. Para simplificar la descripción, nuevamente el ejemplo de un ISFET se describe a continuación en varios ejemplos de matrices de sensores, pero la presente descripción no está limitada en este sentido, y varias otras opciones para la sensibilidad del analito se describen con mayor detalle a continuación (por ejemplo, en relación con la Figura 11A).

Las matrices de chemFET configuradas para la sensibilidad a cualquiera o más de una variedad de analitos pueden disponerse en chips electrónicos, y cada chip puede configurarse para realizar una o más reacciones biológicas diferentes. Los chips electrónicos se pueden conectar a las partes del sistema descrito anteriormente que leen la salida de la matriz por medio de patillas codificados de tal manera que las patillas transmitan información al sistema en cuanto a las características de la matriz y/o qué tipo de reacción(es) biológica(s) se va(n) a realizar en el chip particular.

Un chip electrónico configurado para realizar reacciones biológicas en el mismo, que comprende una o más patillas para entregar información a un circuito que identifica una característica del chip y/o un tipo de reacción a realizar en el chip. Dichas reacciones o aplicaciones pueden incluir, pero sin limitarse a, detección de polimorfismos de nucleótidos, detección de repeticiones cortas en tándem o secuenciación general.

Un sistema adaptado para realizar más de una reacción biológica en un chip, el sistema que comprende un módulo receptor de chip adaptado para recibir el chip, y un receptor para detectar información del chip electrónico, en el que la información determina una reacción biológica a realizar en el chip. Normalmente, el sistema comprende además uno o más reactivos para realizar la reacción biológica seleccionada.

Un aparato para secuenciar un molde de polímero que comprende al menos un circuito integrado que está configurado para transmitir información sobre la localización espacial de una cámara de reacción, el tipo de monómero agregado a la localización espacial y el tiempo para completar la reacción de un reactivo que comprende una pluralidad de los monómeros con un polímero de elongación.

En implementaciones ilustrativas basadas en técnicas de procesamiento CMOS de 0,35 micras (o técnicas de procesamiento CMOS capaces de tamaños de elementos más pequeños), cada píxel de la matriz del ISFET 100 puede incluir un ISFET y los componentes de habilitación/selección acompañantes, y puede ocupar un área en una superficie de la matriz de aproximadamente diez micras por diez micras (es decir, 100 micras2) o menos; dicho de otra manera, se pueden realizar matrices que tienen un paso (centro de píxel a centro de separación de píxel) del orden de 10 micras o menos. Un intervalo entre canales del orden de 10 micras o menos utilizando una técnica de procesamiento CMOS de 0,35 micras constituye una mejora significativa en términos de reducción de tamaño con respecto a los intentos anteriores de fabricar matrices ISFET, que dieron como resultado tamaños de píxeles del orden de al menos 12 micras o mayor.

Más específicamente, en algunas realizaciones descritas más adelante, un intervalo entre canales de aproximadamente nueve (9) micras permite que una matriz del ISFET que incluye más de 256 000 píxeles (por ejemplo, una matriz de 512 por 512), junto con selección de hilera y columna asociada y electrónica de polarización/lectura, se fabrique en una matriz de semiconductores de 7 milímetros por 7 milímetros, y se fabrique una matriz de sensor similar que incluye más de cuatro millones de píxeles (por ejemplo, una matriz de 2048 por 2048) en una matriz de 21 milímetros por 21 milímetros. En otros ejemplos, un intervalo entre canales de aproximadamente 5 micras permite fabricar una matriz del ISFET que incluye aproximadamente 1,55 megapíxeles (por ejemplo, una matriz de 1348 por 1152) y la electrónica asociada en una pastilla de 9 milímetros por 9 milímetros, y una matriz de sensores ISFET incluyendo más de 14 megapíxeles y la electrónica asociada en una pastilla de 22 milímetros por 20 milímetros. En todavía otras implementaciones, utilizando un proceso de fabricación de CMOS en el que son posibles tamaños de elementos de menos de 0,35 micras (por ejemplo, técnicas de procesamiento CMOS de 0,18 micras), se pueden fabricar matrices de sensores ISFET con un paso significativamente menor que 5 micras (por ejemplo, intervalo entre canales de 2,6 micras o un área de píxeles de menos de 8 o 9 micras2), lo que proporciona matrices de ISFET significativamente densos.

Como entenderán los expertos en la técnica, la capacidad de miniaturizar las reacciones de secuenciación reduce el tiempo, el costo y el trabajo implicados en la secuenciación de genomas grandes (tal como el genoma humano). Por supuesto, debe apreciarse que los tamaños de píxel superiores a 10 micras (por ejemplo, del orden de aproximadamente 20, 50, 100 micras o más) pueden implementarse también en diversas realizaciones de matrices chemFET según la presente descripción.

En otros aspectos del sistema que se muestra en la Figura 8, se pueden emplear uno o más controladores de matriz 250 para operar la matriz del ISFET 100 (por ejemplo, seleccionar/habilitar píxeles respectivos de la matriz para obtener señales de salida que representen mediciones de analitos). En varias implementaciones, uno o más componentes que constituyen uno o más controladores de matriz pueden implementarse junto con elementos de píxeles de las propias matrices, en el mismo chip de circuito integrado (IC) que la matriz pero en una parte diferente del chip IC, o fuera del chip. En relación con el control de matriz, la conversión de analógico a digital de las señales de salida ISFET se puede realizar mediante circuitos implementados en el mismo chip de circuito integrado que la matriz ISFET, pero localizada fuera de la región de la matriz de sensores (localizando los circuitos de conversión analógica a digital fuera de la región de la matriz de sensores permite un paso más pequeño y, por lo tanto, una mayor cantidad de sensores, así como un ruido reducido). En varias implementaciones ilustrativas descritas más adelante, la conversión de analógico a digital puede ser de 4 bits, 8 bits, 12 bits, 16 bits u otras resoluciones de bits dependiendo del rango dinámico de la señal deseada.

En general, los datos pueden eliminarse de la matriz en serie o en paralelo o alguna combinación de los mismos. Los controladores en chip (o amplificadores de detección) pueden controlar todo el chip o una parte del mismo. Por lo tanto, los controladores de chip o los amplificadores de señal pueden replicarse según sea necesario según las demandas de la aplicación. La matriz puede, pero no necesita ser, uniforme. Por ejemplo, si el procesamiento de señales o alguna otra restricción requiere, en lugar de una matriz grande, múltiples matrices más pequeñas, cada una con sus propios amplificadores de detección o lógica de controlador, eso es bastante factible.

Habiendo proporcionado una descripción general del papel de una matriz 100 de chemFET (por ejemplo, ISFET) en un sistema ilustrativo 1000 para medir uno o más analitos, a continuación hay descripciones más detalladas de matrices de chemFET ilustrativas según la presente descripción que pueden emplearse en una variedad de aplicaciones. Nuevamente, con fines ilustrativos, las matrices de chemFET según la presente descripción se describen a continuación usando el ejemplo particular de una matriz de ISFET, pero se pueden emplear otros tipos de chemFET en realizaciones alternativas. También, de nuevo, con fines ilustrativos, las matrices de chemFET se describen en el contexto de las aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos, sin embargo, la invención no está tan limitada y más bien contempla una variedad de aplicaciones para las matrices de chemFET descritas en la presente descripción.

Como se señaló anteriormente, varias realizaciones descritas en la presente descripción mejoran el diseño de matriz del ISFET de Milgrew et al descrito anteriormente en relación con las Figuras 1-7, así como otros diseños de matriz del ISFET anteriores, para reducir significativamente el tamaño de píxel y el paso de la matriz y, por lo tanto, aumentar la cantidad de píxeles de una matriz del ISFET para un tamaño de pastilla de semiconductor dado (es decir, aumentar la densidad de píxeles). En algunas implementaciones, se logra un aumento en la densidad de píxeles y, al mismo tiempo, aumenta la relación señal-ruido (SNR) de las señales de salida correspondientes a las mediciones respectivas relacionadas con uno o más analitos y la velocidad con la que dichas señales de salida pueden leerse de la matriz. En particular, relajando los requisitos para la linealidad de ISFET y enfocándose en un rango de medición/salida de señal más limitado (por ejemplo, salidas de señal correspondientes a un rango de pH de aproximadamente 7 a 9 o menor en lugar de 1 a 14, así como señales de salida que puede no relacionarse necesariamente de manera significativa con los cambios de pH en la muestra), la complejidad y el tamaño de los píxeles individuales pueden reducirse significativamente, lo que facilita de esta manera la realización de matrices de ISFET densas a gran escala.

Con este fin, la Figura 9 ilustra una columna 102j de una matriz del ISFET 100, según una realización de la presente descripción, en la que el diseño de píxeles ISFET se simplifica considerablemente para facilitar un tamaño de píxel pequeño. La columna 102j incluye n píxeles, el primero y el último de los cuales se muestran en la Figura 9 como los píxeles 105l y 105n. Como se describe más adelante en relación con la Figura 13, una matriz de ISFET bidimensional 100 completa basada en el diseño de columna que se muestra en la Figura 9 incluye m columnas 102j (j = 1, 2, 3,.... m) con columnas sucesivas de píxeles generalmente dispuestas una al lado de la otra. Por supuesto, los ISFET se pueden disponer en una cuadrícula que no sea hilera-columna, tal como en un patrón de panal.

En un aspecto de la realización que se muestra en la Figura 9, cada píxel 105l a 105n de la columna 102j incluye solo tres componentes, específicamente, un ISFET 150 (también etiquetado como Q1) y dos conmutadores MOSFET Q2 y Q3. Los conmutadores MOSFET Q2 y Q3 responden ambos a una de n señales de selección de hilera (RowSell a RowSeln, lógica baja activa) para habilitar o seleccionar un píxel dado de la columna 102j. Usando el píxel 105l como un ejemplo que se aplica a todos los píxeles de la columna, el conmutador de transistor Q3 acopla una fuente de corriente controlable 106j a través de la línea 1121 a la fuente del ISFET 150 al recibir la señal de selección de hilera correspondiente a través de la línea 118ⁱ. El conmutador de transistor Q2 acopla la fuente del ISFET 150 al circuito de polarización/lectura de columna 110j a través de la línea 1141 al recibir la señal de selección de hilera correspondiente. El drenaje del ISFET 150 está directamente acoplado a través de la línea 116i al circuito de polarización/lectura 110j. Por lo tanto, empleando sólo cuatro líneas de señal por píxel, específicamente, las líneas 112i, 114i, 116i y 118i, se pueden operar los tres componentes del píxel 105|. En una matriz de m columnas, una señal de selección de hilera dada se aplica simultáneamente a un píxel de cada columna (por ejemplo, en las mismas posiciones en las columnas respectivas).

Como se ilustra en la Figura 9, el diseño de la columna 102j según una realización se basa en principios generales similares a los descritos anteriormente en relación con el diseño de la columna de Milgrew y otros mostrado en la Figura 3. En particular, el ISFET de cada píxel, cuando está habilitado, se configura con una corriente de drenaje constante Ipj y una tensión de drenaje a fuente constante VDSj para obtener una señal de salida VSj de un píxel habilitado según la Ecuación (3) arriba. Con este fin, la columna 102j incluye una fuente de corriente controlable 106j, acoplada a una tensión de suministro positivo de circuito analógico VDDA y que responde a una tensión de polarización VB1, que es compartida por todos los píxeles de la columna para proporcionar una corriente de drenaje constante Ipj al ISFET de un píxel habilitado. En un aspecto, la fuente de corriente 106j se implementa como un espejo de corriente que incluye dos MOSFET de longitud de canal largo y alta impedancia de salida. La columna también incluye un circuito de polarización/lectura 110j que también es compartido por todos los píxeles de la columna para proporcionar una tensión de drenaje a fuente constante al ISFET de un píxel habilitado. El circuito de polarización/lectura 110j se basa en una configuración de puente Kelvin e incluye dos amplificadores operacionales 107A (A1) y 107B (A2) configurados como amplificadores amortiguador y acoplados a la tensión de suministro positivo del circuito analógico VDDA y la tensión de suministro analógico a tierra V^sSA. El circuito de polarización/lectura también incluye un sumidero de corriente controlable 108j (similar a la fuente de corriente 106j) acoplado a la tierra analógica V^sSA y que responde a una tensión de polarización VB2, y un MOSFET Q6 conectado a un diodo. Las tensiones de polarización VB1 y VB2 se ajustan/controlan en tándem para proporcionar una fuente y una corriente de sumidero complementarias. La tensión desarrollada a través del MOSFET Q6 conectado por diodo como resultado de la corriente consumida por el sumidero de corriente 108j es forzada por los amplificadores operacionales a aparecer a través del drenaje y la fuente del ISFET de un píxel habilitado como una tensión constante de drenaje-fuente VDSj.

Empleando el MOSFET Q6 conectado a diodos en el circuito de polarización/lectura 110j de la Figura 9, en lugar de la resistencia RsDj como se muestra en el diseño de Milgrew y otros ilustrado en la Figura 3, se proporciona una ventaja significativa en un proceso de fabricación de CMOS; específicamente, las resistencias coincidentes se pueden fabricar con tolerancias de error generalmente del orden de ±20 %, mientras que la coincidencia de MOSFET en un proceso de fabricación de CMOS es del orden de ±1 % o mejor. El grado en que el componente responsable de proporcionar una tensión constante de drenaje a fuente ISFET VDSj puede coincidir de columna a columna afecta significativamente la precisión de la medición (por ejemplo, compensación) de columna a columna. Por lo tanto, el empleo del MOSFET Q6 en lugar de una resistencia mitiga considerablemente las compensaciones de medición de columna a columna. Además, mientras que las características de deriva térmica de una resistencia y un ISFET pueden ser apreciablemente diferentes, las características de deriva térmica de un MOSFET y un ISFET son sustancialmente similares, si no virtualmente idénticas; por lo tanto, cualquier deriva térmica en MOSFET Q6 prácticamente cancela cualquier deriva térmica de ISFET q 1, lo que da como resultado una mayor estabilidad de medición con cambios en la temperatura de la matriz.

En la Figura 9, los circuitos de polarización/lectura de columna 110j también incluye circuitos de muestra/retención y amortiguador para proporcionar una señal de salida V^colj desde la columna. En particular, después de habilitar o seleccionar uno de los píxeles 105l a 105n a través de los transistores Q2 y Q3 en cada píxel, la salida del amplificador 107A (A1), es decir, un Vsj almacenado en amortiguador, se almacena en una muestra de columna y mantener el condensador Csh a través de la operación de un conmutador (por ejemplo, una puerta de transmisión) que responde a una muestra de columna y mantener la señal COL SH. Los ejemplos de capacitancias adecuadas para el capacitor de muestra y mantenimiento incluyen, pero no se limitan a, un rango de aproximadamente 500 fF a 2 pF. La tensión muestreada se amortigua a través de un amplificador amortiguador de salida de columna 111j (BUF) y se proporciona como la señal de salida de columna V^colj. Como también se muestra en la Figura 9, se puede aplicar una tensión de referencia VREF al amplificador amortiguador 111j, a través de un conmutador que responde a una señal de control CAL, para facilitar la caracterización de las faltas de uniformidad de columna a columna debido al amplificador amortiguador 111j y por lo tanto, permite la corrección de datos posteriores a la lectura.

La Figura 9A ilustra un diagrama de circuito ilustrativo para uno de los amplificadores 107A del circuito de polarización/lectura 110j (el amplificador 107B se implementa de manera idéntica), y la Figura 9B es un gráfico de polarización del amplificador frente al ancho de banda para los amplificadores 107A y 107B. Como se muestra en la Figura 9A, el amplificador 107A emplea una disposición de múltiples espejos de corriente basada en nueve MOSFET (M1 a M9) y está configurado como un amortiguador de ganancia unitaria, en el que las entradas y salidas del amplificador están etiquetadas en general como ENTRADA+ y VSALIDA, respectivamente. La tensión de polarización VB4 (que representa una corriente de polarización correspondiente) controla la transimpedancia del amplificador y sirve como control de ancho de banda (es decir, mayor ancho de banda con mayor corriente). Con referencia de nuevo a la Figura 9, debido al condensador de muestra y retención Csh, la salida del amplificador 107A activa esencialmente un filtro cuando el conmutador de muestreo y retención está cerrado. En consecuencia, para lograr velocidades de datos apreciablemente altas, la tensión de polarización VB4 puede ajustarse para proporcionar corrientes de polarización más altas y un mayor ancho de banda del amplificador. A partir de la Figura 9B, se puede observar que, en algunas implementaciones ilustrativas, se pueden realizar anchos de banda del amplificador de al menos 40 MHz y significativamente mayores. En algunas implementaciones, los anchos de banda del amplificador de hasta 100 MHz pueden ser apropiados para facilitar altas velocidades de adquisición de datos y tiempos de "permanencia" o muestreo de píxeles relativamente más bajos (por ejemplo, del orden de 10 a 20 microsegundos).

En la realización que se muestra en la Figura 9, a diferencia del diseño de píxeles de Milgrew y otros mostrados en la Figura 3, los píxeles 105l a 105n no incluyen ninguna puerta de transmisión u otros dispositivos que requieran componentes ^fE^t de canal n y canal p; en particular, los píxeles 105l a 105n de esta realización incluyen solo dispositivos FET del mismo tipo (es decir, solo canal n o solo canal p). Con fines ilustrativos, los píxeles 1051 y 105n ilustrados en la Figura 9 se muestran que comprenden solo componentes de canal p, es decir, dos MOSFET de canal p Q2 y Q3 y un ISFET de canal p 150. Al no emplear una puerta de transmisión para acoplar la fuente del ISFET al circuito de polarización/lectura 110j, se puede sacrificar cierto rango dinámico para la señal de salida del ISFET (es decir, la tensión de la fuente del ISFET V^s). Sin embargo, al prescindir potencialmente de algún rango dinámico de la señal de salida (y, por lo tanto, limitar potencialmente el rango de medición para una propiedad química estática y/o dinámica dada, tal como el pH), el requisito de diferentes tipos de dispositivos FET (tanto de canal n como de canal p) en cada píxel puede eliminarse y el conteo de componentes de píxeles puede reducirse. Como se describe más adelante en relación con las Figuras 10-12, esto facilita significativamente la reducción del tamaño de los píxeles. Por lo tanto, en un aspecto, existe una compensación beneficiosa entre un rango dinámico reducido y un tamaño de píxel más pequeño.

En todavía otro aspecto de la realización que se muestra en la Figura 9, a diferencia del diseño de píxeles de Milgrew y otros, el ISFET 150 de cada píxel 105i a 105n no tiene su conexión de cuerpo ligada a su fuente (es decir, no hay conductor eléctrico que acople la conexión del cuerpo y la fuente del ISFET de manera que se ven obligados a tener el mismo potencial eléctrico durante la operación). Más bien, las conexiones del cuerpo de todos los ISFET de la matriz están unidas entre sí y a una tensión de polarización del cuerpo V^cuerpo. Si bien no se muestra explícitamente en la Figura 9, las conexiones del cuerpo para los MOSFET Q2 y Q3 tampoco están vinculadas a sus fuentes respectivas, sino a la tensión de polarización del cuerpo V^cuerpo. En una implementación ilustrativa basada en píxeles que tienen todos los componentes de canal p, la tensión de polarización del cuerpo V^cuerpo se acopla al potencial de tensión más alto disponible para la matriz (por ejemplo, VDDA), como se describe más adelante en relación con la Figura 17.

Al no vincular la conexión del cuerpo de cada ISFET a su fuente, la posibilidad de que exista una tensión de la fuente a cuerpo distinto de cero V^sb puede dar lugar al "efecto del cuerpo", como se describió anteriormente en relación con la Figura 1, que afecta la tensión umbral V^th del ISFET según una relación no lineal (y por lo tanto, según las Ecuaciones (3), (4) y (5) pueden afectar la detección y/o la medición de la actividad del analito dando lugar a cambios de potencial de superficie en la interfaz de la capa de pasivación/analito). Sin embargo, al centrarse en un rango dinámico de señal de salida de ISFET reducido, cualquier efecto de cuerpo que pueda surgir en el ISFET a partir de una tensión de la fuente a cuerpo distinto de cero puede ser relativamente mínimo. Por lo tanto, cualquier no linealidad de medición que pueda resultar sobre el rango dinámico reducido puede ignorarse como insignificante o tomarse en consideración y compensarse (por ejemplo, a través de técnicas de procesamiento de datos y calibración de matriz, como se describe más adelante en relación con la Figura 17). Al no vincular cada fuente ISFET a su conexión de cuerpo, todos los FET que constituyen el píxel pueden compartir una conexión de cuerpo común, lo que facilita aún más la reducción del tamaño del píxel, como se describe más adelante en relación con las Figuras 10-12. En consecuencia, en otro aspecto, existe una compensación beneficiosa entre linealidad reducida y tamaño de píxel más pequeño.

La Figura 10 ilustra una vista superior de un diseño de disposición de chip para el píxel 1051 que se muestra en la Figura 9, según una realización de la presente descripción. La Figura 11A muestra una vista en sección transversal compuesta a lo largo de la línea I--I del píxel que se muestra en la Figura 10, que incluye elementos adicionales en la mitad derecha de la Figura 10 entre las líneas II—II y III-III, que ilustran una vista capa por capa de la fabricación de píxeles, y las Figuras 12A a 12L proporcionan vistas superiores de cada una de las capas de fabricación que se muestran en la Figura 11A (las imágenes respectivas de las Figuras 12A a 12L se superponen una encima de otra para crear el diseño de disposición de chips de píxeles que se muestra en la Figura 10). En una implementación ilustrativa, el diseño de píxeles ilustrado en las Figuras 10-12 puede realizarse utilizando un proceso CMOS estándar de 4 metales, 2 poli de 0,35 micras para proporcionar un píxel geométricamente cuadrado que tiene una dimensión "e" como se muestra en la Figura 10 de aproximadamente 9 micras, y una dimensión "f” correspondiente al área sensible de ISFET de aproximadamente 7 micras.

En la vista superior de la Figura 10, el ISFET 150 (etiquetado como Q1 en la Figura 10) generalmente ocupa la porción central derecha de la ilustración de píxeles, y las localizaciones respectivas de la puerta, la fuente y el drenaje del ISFET se indican como Q1^g, Q1^s y Q1^d. Los MOSFET Q2 y Q3 generalmente ocupan la porción central izquierda de la ilustración de píxeles; la puerta y la fuente del MOSFET Q2 se indican como Q2^g y Q2^s , y la puerta y la fuente del MOSFET Q3 se indican como Q3^g y Q3^s. En un aspecto del diseño que se muestra en la Figura 10, los MOSFET Q2 y Q3 comparten un drenaje, indicado como Q2/3^d. En otro aspecto, se puede observar generalmente desde la vista superior de la Figura 10 que el ISFET está formado de manera que su canal se encuentra a lo largo de un primer eje del píxel (por ejemplo, paralelo a la línea I--I), mientras que los MOSFET Q2 y Q3 se forman de manera que sus canales se encuentran a lo largo de un segundo eje perpendicular al primer eje. La Figura 10 también muestra las cuatro líneas utilizadas para operar el píxel, específicamente, la línea 1121 acoplada a la fuente de Q3, la línea 1141 acoplada a la fuente de Q2, la línea 1161 acoplada al drenaje del ISFET, y la línea de selección de hilera 1181 acoplada a las puertas de Q2 y Q3. Con referencia a la Figura 9, se puede apreciar que todos los píxeles de una columna dada comparten las líneas 112, 114 y 116 (por ejemplo, que atraviesan verticalmente a través del píxel en la Figura 10), y que todos los píxeles de una hilera dada comparten la línea 118 (por ejemplo, que atraviesan horizontalmente a través del píxel en la Figura 10); por lo tanto, según el diseño de píxeles de la Figura 9 y el diseño que se muestra en la Figura 10, solo cuatro líneas metálicas atraviesan cada píxel.

Con referencia ahora a la vista en sección transversal de la Figura 11A, las regiones de tipo p altamente dopadas 156 y 158 (que se encuentran a lo largo de la línea I--I en la Figura 10) en el pozo n 154 constituyen la fuente (S) y el drenaje (D) del ISFET, entre los cuales se encuentra una región 160 del pozo n en el que se forma el canal p de los ISFET debajo de la puerta de polisilicio de los ISFET 164 y una puerta de óxido 165. Según un aspecto mostrado en las Figuras 10 y 11, todos los componentes FET del píxel 1051 se fabrican como FET de canal p en el único pozo de tipo n 154 formado en un sustrato semiconductor de tipo p 152. Esto es posible porque, a diferencia del diseño de Milgrew y otros, 1) no se requiere una puerta de transmisión en el píxel; y 2) la fuente de los ISFET no está vinculada a la conexión del cuerpo del pozo n. Más específicamente, las regiones de tipo n altamente dopadas 162 proporcionan una conexión del cuerpo (B) al pozo n 154 y, como se muestra en la Figura 10, la conexión del cuerpo B está acoplada a un conductor de metal 322 alrededor del perímetro del píxel 1051. Sin embargo, la conexión del cuerpo no está directamente acoplada eléctricamente a la región de la fuente 156 del ISFET (es decir, no hay un conductor eléctrico que acople la conexión del cuerpo y la fuente de manera que se vean obligados a tener el mismo potencial eléctrico durante la operación), ni tampoco la conexión del cuerpo acoplada eléctricamente de manera directa a la puerta, fuente o drenaje de cualquier componente en el píxel. Por lo tanto, los otros componentes FET de canal p del píxel, específicamente, Q2 y Q3, pueden fabricarse en el mismo pozo n 154.

En la vista en sección transversal compuesta de la Figura 11A, también es visible una región de tipo p altamente dopada 159 (que se encuentra a lo largo de la línea I--I en la Figura 10), correspondiente al drenaje compartido (D) de los MOSFET Q2 y Q3. A modo de ilustración, también es visible una puerta de polisilicio 166 del MOSFET Q3 en la Figura 11A, aunque esta puerta no se encuentra a lo largo de la línea I--I en la Figura 10, sino "detrás del plano" de la sección transversal a lo largo de la línea I--I. Sin embargo, por simplicidad, las fuentes respectivas de los MOSFET Q2 y Q3 que se muestran en la Figura 10, así como la puerta de Q2, no son visibles en la Figura 11A, ya que se encuentran a lo largo del mismo eje (es decir, perpendiculares al plano de la Figura) como el drenaje compartido (si se muestran en la Figura 11A, estos elementos complicarían indebidamente la vista en sección transversal compuesta de la Figura 11A).

Sobre las capas de sustrato, óxido de puerta y polisilicio que se muestran en la Figura 11A, se proporcionan varias capas adicionales para establecer conexiones eléctricas a los diversos componentes de píxeles, incluidas capas de metal alternas y capas de óxido a través de las cuales se forman vías conductoras. De acuerdo con el ejemplo de un proceso CMOS de 4 metales, estas capas están etiquetadas en la Figura 11A como "Contacto", "Metal1", "Via1", "Metal2", "Vía2", "Metal3", "Vía3" y "Metal4". (Tenga en cuenta que se pueden emplear más o menos capas de metal). Para facilitar la comprensión en particular de las conexiones eléctricas ISFET, la vista en sección transversal compuesta de la Figura 11A muestra elementos adicionales de la fabricación de píxeles en el lado derecho de la vista superior de la Figura 10 entre las líneas II--II y MI—III. Con respecto a las conexiones eléctricas de los ISFET, la capa de metal superior 304 corresponde al área sensible de los ISFET 178, encima de la cual se dispone una capa de pasivación sensible al analito 172. La capa de metal superior 304, junto con la puerta de polisilicio ISFET 164 y los conductores intermedios 306, 308, 312, 316, 320, 326 y 338, forman la estructura de "puerta flotante" de ISF^eT 170, de manera similar a la descrita anteriormente en relación con un diseño ISFET convencional que se muestra en la Figura 1. Los conductores 340, 328, 318, 314 y 310 acoplados a la línea 1161 proporcionan una conexión eléctrica al drenaje de los ISFET. La fuente de ISFET está acoplada al drenaje compartido de los MOSFET Q2 y Q3 a través de los conductores 334 y 336 y el conductor 324 (que se encuentra a lo largo de la línea I-I en la Figura 10). Las conexiones del cuerpo 162 al pozo n 154 están eléctricamente acopladas a un conductor de metal 322 alrededor del perímetro del píxel en la capa "Metal1" a través de los conductores 330 y 332.

Como se indicó anteriormente, las Figuras 12A a 12L proporcionan vistas superiores de cada una de las capas de fabricación que se muestran en la Figura 11A (las imágenes respectivas de las Figuras 12A a 12L se superponen una encima de otra para crear el diseño de disposición de chips de píxeles que se muestra en la Figura 10). En la Figura 12, la correspondencia entre las vistas superiores marcadas con letras de las capas respectivas y la vista en sección transversal de la Figura 11A es la siguiente: A) pozo de tipo n 154; B) Implante; C) Difusión; D) puertas de polisilicio 164 (ISFET) y 166 (MOSFET Q2 y Q3); E) contactos; F) Metal; G) Vía1; H) Metal2; I) Vía2; J) Metal3; K) Vía3; L) Metal4 (electrodo superior en contacto con la puerta ISFET). Los diversos números de referencia indicados en las Figuras 12A a 12L corresponden a las características idénticas que están presentes en la vista en sección transversal compuesta de la Figura 11A.

Al menos en algunas aplicaciones, la capacitancia de píxeles puede ser un parámetro destacado para algún tipo de medición de analitos. En consecuencia, en otra realización relacionada con la disposición y el diseño de píxeles, se pueden reconfigurar varias vías y capas de metal para mitigar al menos parcialmente el potencial de que surjan capacitancias parásitas durante la operación de píxeles. Por ejemplo, en una realización de este tipo, los píxeles se diseñan de manera que haya una mayor distancia vertical entre las líneas de señal 1121, 1141, 1161 y 1181 y la capa de metal superior 304 que constituye la estructura de puerta flotante 170.

En la realización descrita inmediatamente arriba, con referencia nuevamente a la Figura 11A, se puede observar fácilmente que la capa de metal superior 304 se forma en la capa Metal4 (ver también la Figura 12L), y las líneas de señal 1121, 1141, y 1161 se forman en la capa Metal3 (ver también la Figura 12J). Además, aunque no es visible en la vista de la Figura 11A, puede observarse en la Figura 12H que la línea de señal 1181 se forma en la capa Metal2. Como una o más de estas señales pueden conectarse a tierra de vez en cuando durante la operación de la matriz, puede surgir una capacitancia parásita entre cualquiera o más de estas líneas de señal y la capa de metal 304. Al aumentar una distancia entre estas líneas de señal y la capa de metal 304, se puede reducir dicha capacitancia parásita.

Con este fin, en otra realización, algunas capas de vía y metal se reconfiguran de manera que las líneas de señal 1121, 1141, 1161 y 1181 se implementan en las capas Metal 1 y Metal2, y la capa Metal3 se usa solo como puente entre el componente de capa Metal2 de la estructura de puerta flotante 170 y la capa de metal superior 304, asegurando de esta manera una mayor distancia entre las líneas de señal y la capa de metal 304. La Figura 10-1 ilustra una vista superior de tal diseño de disposición de chip para un grupo de cuatro píxeles vecinos de una matriz chemFET que se muestra en la Figura 9, con un píxel particular 105i identificado y etiquetado. La Figura 11A-1 muestra una vista en sección transversal compuesta de píxeles vecinos, a lo largo de la línea I--I del píxel 1051 que se muestra en la Figura 10-1, que incluye elementos adicionales entre las líneas II—II, que ilustran una vista capa por capa de la fabricación de píxeles, y las Figuras 12-1A a 12-1L proporcionan vistas superiores de cada una de las capas de fabricación que se muestran en la Figura 11A-1 (las imágenes respectivas de las Figuras 12-1A a 12-1L se superponen una encima de otra para crear el diseño de distribución de chip de píxeles mostrado en la Figura 10-1).

En la Figura 10-1, se puede observar que el diseño de la vista superior de píxeles es generalmente similar al que se muestra en la Figura 10. Por ejemplo, en la vista superior, el ISFET 150 generalmente ocupa la porción central derecha de cada píxel, y los MOSFET Q2 y Q3 generalmente ocupan la porción central izquierda de la ilustración de píxeles. Muchas de las etiquetas de componentes incluidas en la Figura 10 se omiten de la Figura 10-1 para mayor claridad, aunque la puerta de polisilicio ISFET 164 se indica en el píxel 1051 para orientación. La Figura 10-1 también muestra las cuatro líneas (1121, 1141, 1161 y 1181) utilizadas para operar el píxel. Una diferencia notable entre la Figura 10 y la Figura 10-1 se relaciona con el conductor de metal 322 (localizado en la capa Metall) que proporciona una conexión eléctrica a la región del cuerpo 162; específicamente, en la Figura 10, el conductor 322 rodea un perímetro del píxel, mientras que en la Figura 10-1, el conductor 322 no rodea completamente un perímetro del píxel, pero incluye discontinuidades 727. Estas discontinuidades 727 permiten que la línea 1181 también se fabrique en la capa de Metal 1 y atraviese el píxel para conectarse a los píxeles vecinos de una hilera.

Con referencia ahora a la vista en sección transversal de la Figura 11A-1, se muestran tres píxeles adyacentes en sección transversal, correspondiendo el píxel central al píxel 1051 en la Figura 10-1 para fines de descripción. Como en la realización de la Figura 11A, todos los componentes FET del píxel 105i se fabrican como FET de canal p en el único pozo de tipo n 154. Además, como en la Figura 11A, en la vista en sección transversal compuesta de la Figura 11A-1 también es visible la región de tipo p altamente dopada 159 (que se encuentra a lo largo de la línea I--I en la Figura 10-1), correspondiente al drenaje compartido (D) de los MOSFET Q2 y Q3. A modo de ilustración, la puerta de polisilicio 166 del MOSFET Q3 también es visible en la Figura 11A-1, aunque esta puerta no se encuentra a lo largo de la línea I--I en la Figura 10-1, sino más bien "detrás del plano" de la sección transversal a lo largo de la línea I--I. Sin embargo, para simplificar, las fuentes respectivas de los MOSFET Q2 y Q3 que se muestran en la Figura 10­ 1, así como la puerta de Q2, no son visibles en la Figura 11A-1, ya que se encuentran a lo largo del mismo eje (es decir, perpendicular al plano de la figura) como el drenaje compartido. Además, para facilitar la comprensión de las conexiones eléctricas de la puerta flotante ISFET, la vista en sección transversal compuesta de la Figura 11A-1 muestra elementos adicionales de la fabricación de píxeles entre las líneas II--II de la Figura 10-1.

Más específicamente, como en la realización de la Figura 11A, la capa de metal superior 304 corresponde al área sensible de los ISFET 178, encima de la cual se dispone una capa de pasivación sensible al analito 172. La capa de metal superior 304, junto con la puerta de polisilicio ISFET 164 y los conductores intermedios 306, 308, 312, 316, 320, 326 y 338, forman la estructura de puerta flotante de los ISFET 170. Sin embargo, a diferencia de la realización de la Figura 11A, los conductores 340, 328 y 318, acoplados a la línea 1161 que se forma en la capa Metal2 en lugar de la capa Metal3, proporcionan una conexión eléctrica al drenaje de los ISFET. Además, las líneas 1121 y 1141 también se muestran en la Figura 11A-1 como formadas en la capa Metal2 en lugar de la capa Metal3. La configuración de estas líneas, así como la línea 1181, puede apreciarse más a partir de las respectivas imágenes de las Figuras 12-1A a 12-1L (en las que la correspondencia entre las vistas superiores con letras de las respectivas capas y la vista en sección transversal de la Figura 11A-1 es la misma que la descrita en relación con las Figuras 12A-12L); en particular, se puede observar en la Figura 12-1F que la línea 1181, junto con el conductor metálico 322, se forma en la capa Metal 1, y se puede observar que las líneas 1121, 1141 y 1161 se forman en la capa Metal2, dejando solo el puente 308 de la estructura de puerta flotante 170 en la capa Metal3 que se muestra en la Figura 12-1J.

En consecuencia, consolidando las líneas de señal 1121, 1141, 1161 y 1181 en las capas Metal 1 y Metal 2 y aumentando de esta manera la distancia entre estas líneas de señal y la capa superior 304 de la estructura de puerta flotante 170 en la capa Metal 4, las capacidades parásitas en el ISFET pueden mitigarse al menos parcialmente. Debe apreciarse que este concepto general (por ejemplo, incluir una o más capas de metal intermedias entre las líneas de señal y la capa superior de la estructura de la puerta flotante) puede implementarse en otros procesos de fabricación que involucren un mayor número de capas de metal. Por ejemplo, la distancia entre las líneas de señal de píxel y la capa de metal superior se puede aumentar agregando capas de metal adicionales (más de cuatro capas de metal en total) en las que solo se forman puentes a la capa de metal superior en las capas de metal adicionales. En particular, se puede emplear un proceso de fabricación de seis capas de metal, en el que las líneas de señal se fabrican utilizando las capas Metal 1 y Metal2, la capa de metal superior de la estructura de la puerta flotante se forma en la capa Metal6 y los puentes a la capa de metal superior se forman en las capas Metal3, Metal4 y Metal5, respectivamente (con vías asociadas entre las capas de metal). En otra implementación ilustrativa basada en un proceso de fabricación de seis capas de metal, la configuración general de píxeles que se muestra en las Figuras 10, 11A y 12A-12L (líneas de señal en las capas Metal2 y Metal 3), en las que la capa de metal superior se forma en la capa Metal6 y los puentes se forman en las capas Metal4 y Metal5, respectivamente.

En todavía otro aspecto relacionado con la capacitancia reducida, una dimensión "f" de la capa de metal superior 304 (y por lo tanto el área sensible de ISFET 178) puede reducirse para reducir la capacitancia cruzada entre píxeles vecinos. Como se puede observar en la Figura 11A-1 (y como se describe más adelante en relación con otras realizaciones dirigidas a la fabricación de pozos por encima de una matriz ISFET), el pozo 725 se puede fabricar para que tenga una forma ahusada, de manera que una dimensión " g" en la parte superior del pozo es menor que el distancia entre píxeles "e" pero aún más grande que una dimensión "f" en la parte inferior del pozo. En base a tal ahusamiento, la capa de metal superior 304 también puede diseñarse con la dimensión "f" en lugar de la dimensión "g" para proporcionar un espacio adicional entre las capas de metal superiores de los píxeles vecinos. En algunas implementaciones ilustrativas no limitativas, para píxeles que tienen una dimensión "e" del orden de 9 micras, la dimensión "f" puede ser del orden de 6 micras (en lugar de 7 micras, como se describió anteriormente), y para píxeles que tienen una dimensión "e" del orden de 5 micras, la dimensión "f" puede ser del orden de 3,5 micras. Los tamaños de disminución anteriores son solo ejemplos y se pueden usar diferentes tamaños y/o proporciones con estos diseños de disminución.

Por lo tanto, los diseños de disposición de chips de píxeles mostrados respectivamente en las Figuras 10, 11A y 12A a 12L, y las Figuras 10-1, 11A-1 y 12-1A a 12-1L, ilustran que, según varias realizaciones, se pueden emplear dispositivos FET del mismo tipo para todos los componentes de un píxel, y que todos los componentes se pueden implementar en un solo pozo. Esto reduce drásticamente el área utilizada para el píxel, lo que facilita de esta manera una mayor densidad de píxeles en un área determinada.

En una implementación ilustrativa, el óxido de puerta 165 para el ISFET puede fabricarse para que tenga un grosor del orden de aproximadamente 75 Angstroms, dando lugar a una capacitancia de óxido de puerta por unidad de superficie Cox de 4,5 fF/pm2. Además, la puerta de polisilicio 164 puede fabricarse con dimensiones correspondientes a un ancho de canal W de 1,2 pm y una longitud de canal L de 0,35 a 0,6 pm (es decir, W/L que varía de aproximadamente 2 a 3,5), y el dopaje de la región 160 puede seleccionarse de manera que la movilidad de la portadora para el canal p sea de 190 cm2 /V s (es decir, 1,9E10 pm2 /Vs). De la Ecuación (2) anterior, esto da como resultado un parámetro de transconductancia ISFET p del orden de aproximadamente 170 a 300 pA/V2. En otros aspectos de esta implementación ilustrativa, la tensión de suministro analógico VDDA es de 3,3 voltios, y VB1 y VB2 están polarizados para proporcionar una corriente de drenaje ISFET constante Ipj del orden de 5 pA (en algunas implementaciones, VB1 y VB2 pueden ajustarse para proporcionar corrientes de drenaje de aproximadamente 1 pA a 20 pA). Además, el MOSFET Q6 (consulte el circuito de polarización/lectura 110j en la Figura 9) está dimensionado para tener una relación de ancho a largo del canal (por ejemplo, W/L de aproximadamente 50) de manera que la tensión a través de Q6, dado Ipj de 5 pA, es 800 mV (es decir, Vpsj = 800 mV). De la Ecuación (3), en base a estos parámetros ilustrativos, esto proporciona tensiones de salida de píxeles Vsj en un rango de aproximadamente 0,5 a 2,5 voltios para cambios de tensión umbral ISFET en un rango de aproximadamente 0 a 2 voltios.

Con respecto a la capa de pasivación sensible al analito 172 que se muestra en la Figura 11A, en implementaciones ilustrativas de CMOS, la capa de pasivación puede ser significativamente sensible a la concentración de varias especies de iones, incluido el hidrógeno. En los procesos CMOS convencionales, una capa de pasivación puede estar formada por una o más deposiciones sucesivas de estos materiales, y se emplea generalmente para tratar o recubrir dispositivos para protegerlos contra la contaminación y aumentar la estabilidad eléctrica. Las propiedades del material del nitruro de silicio y el oxinitruro de silicio son tales que una capa de pasivación que comprende estos materiales proporciona protección contra rayones y sirve como una barrera importante para la difusión de agua y sodio, lo que puede causar que la metalización del dispositivo se corroa y/o que la operación del dispositivo se vuelva inestable. Una capa de pasivación proporciona sensibilidad a los iones en los dispositivos ISFET, ya que la capa de pasivación contiene grupos de superficie que pueden donar o aceptar protones de una solución de analito con la que están en contacto, alterando de esta manera el potencial de superficie y la tensión umbral Vth del dispositivo, como se describió anteriormente en relación con las Figuras 1 y 2A.

Para los procesos CMOS que involucran aluminio como el metal (que tiene un punto de fusión de aproximadamente 650 grados Celsius), generalmente se forma una capa de pasivación de nitruro de silicio y/u oxinitruro de silicio a través de la deposición de vapor químico mejorada con plasma (PECVD), en la cual una descarga luminiscente a 250-350 grados Celsius ioniza los gases constituyentes que forman nitruro de silicio u oxinitruro de silicio, creando especies activas que reaccionan en la superficie de la oblea para formar un laminado de los materiales respectivos. En un proceso ilustrativo, se puede formar una capa de pasivación que tiene un grosor del orden de aproximadamente 1,0 a 1,5 pm mediante una deposición inicial de una capa delgada de oxinitruro de silicio (del orden de 0,2 a 0,4 pm) seguida de una deposición levemente más gruesa de oxinitruro de silicio (del orden de 0,5 pm) y una deposición final de nitruro de silicio (del orden de 0,5 pm). Debido a la baja temperatura de deposición involucrada en el proceso PECVD, la metalización del aluminio no se ve afectada negativamente.

Sin embargo, mientras que un proceso PECVD de baja temperatura proporciona una pasivación adecuada para los dispositivos CMOS convencionales, el proceso de baja temperatura da como resultado una capa de pasivación generalmente de baja densidad y algo porosa, que en algunos casos puede afectar negativamente la estabilidad de la tensión umbral ISFET. En particular, durante la operación del dispositivo ISFET, una capa de pasivación porosa de baja densidad con el tiempo puede absorber y saturarse con iones de la solución, lo que a su vez puede causar una deriva variable en el tiempo inconveniente en la tensión umbral Vth de los ISFET, lo que dificulta las mediciones precisas.

En vista de lo anterior, se puede emplear un proceso CMOS que usa metal de tungsteno en lugar de aluminio para fabricar matrices de ISFET según la presente descripción. La alta temperatura de fusión del tungsteno (superior a 3400 grados Celsius) permite el uso de un proceso de deposición química de vapor a baja presión (LPCVD) a mayor temperatura (por ejemplo, aproximadamente 700 a 800 grados Celsius) para una capa de pasivación de nitruro de silicio u oxinitruro de silicio. El proceso de LPCVD generalmente da como resultado películas significativamente más densas y menos porosas para la capa de pasivación, lo que mitiga los efectos potencialmente adversos de la absorción de iones de la solución de analito que conduce a la desviación de la tensión umbral de ISFET.

En aún otra realización en la que se emplea un proceso CMOS basado en aluminio para fabricar matrices de ISFET según la presente descripción, la capa de pasivación 172 que se muestra en la Figura 11A puede comprender deposiciones y/o materiales adicionales más allá de los empleados típicamente en un proceso CMOS convencional. Por ejemplo, la capa de pasivación 172 puede incluir deposiciones iniciales asistidas por plasma a baja temperatura (PECVD) de nitruro de silicio y/u oxinitruro de silicio como se describió anteriormente; para los fines de la presente descripción, estas deposiciones convencionales se ilustran en la Figura 11A como una primera porción 172A de la capa de pasivación 172. En una realización, después de la primera porción 172A, se disponen uno o más materiales de pasivación adicionales para formar al menos una segunda porción 172B para aumentar la densidad y reducir la porosidad (y la absorción) de la capa de pasivación general 172. Si bien una porción adicional 172B se muestra principalmente con fines ilustrativos en la Figura 11A, debe apreciarse que la descripción no está limitada en este sentido, ya que la capa de pasivación general 172 puede comprender dos o más porciones constituyentes, en las que cada porción puede comprender una o más capas/deposiciones de materiales iguales o diferentes, y las porciones respectivas pueden configurarse de manera similar o diferente. Independientemente de los materiales específicos, la(s) capa(s) de pasivación proporcionan aislamiento químico entre el analito y el circuito.

En aún otra realización en la que se emplea un proceso CMOS basado en aluminio para fabricar matrices ISFET, la capa de pasivación 172 que se muestra en la Figura 11A puede comprender materiales derivados del metal de aluminio 304 existente utilizado para formar la puerta del píxel ISFET 105i. Se puede permitir que el aluminio del metal superior 304 se oxide creando un óxido de aluminio, tal como AhO3. El metal superior 304 se puede exponer a través de un proceso de grabado después del cual se formaría el óxido de aluminio. Esto daría como resultado un óxido nativo que no requeriría un paso adicional para colocar realmente una capa de óxido de aluminio sobre el electrodo de puerta flotante formado por el metal superior 304. Este óxido de aluminio en realidad sería parte de la puerta del ISFET, por lo tanto, la adherencia a la puerta de metal 304 no sería un problema. El óxido de aluminio también exhibe buenas características de adherencia a metales como el tungsteno. Tener óxido de aluminio dentro de la primera porción 172A de la capa de pasivación 172 ayuda en el uso de materiales adicionales para la segunda porción 172B de la capa de pasivación 172. Estos materiales adicionales pueden funcionar bien como capas de detección, pero pueden no tener buenas propiedades de adherencia a metales como el aluminio y el tungsteno.

En aún otra realización para la primera porción 172A de la capa de pasivación 172a, se podría depositar una capa de óxido de aluminio sobre el metal 304 utilizado para la puerta del ISFET 1051. Una capa de AhO3 dentro de la primera porción 172A de la capa de pasivación 172 proporciona buenas propiedades de adherencia al metal superior 304 utilizado para la puerta del ISFET 105i. El óxido de aluminio exhibe buenas características de adherencia a metales como el tungsteno y el aluminio y, por lo tanto, sería útil en cualquier tipo de realización. Diferentes realizaciones pueden aplicar capas más gruesas o más delgadas de laminados de AhO3. Se pueden aplicar capas de laminado más delgadas mediante deposición de capa atómica (ALD) para crear capas de 2,5 nM, 5,0 nM o 10 nm de grosor. La primera porción 172A se puede depositar a través de una variedad de procesos de temperatura relativamente baja que incluyen, pero sin limitarse a, pulverización catódica de RF, pulverización catódica de magnetrón de CC, evaporación térmica o por haz de electrones y deposiciones asistidas por iones. También se podrían aplicar capas más gruesas utilizando procesos de semiconductores convencionales. Como se indicó anteriormente, una capa de óxido de aluminio dentro de la primera porción 172A de la capa de pasivación 172 ayuda en el uso de materiales adicionales para la segunda porción 172B de la capa de pasivación 172. Los materiales pueden funcionar bien como capas de detección, pero pueden no tener buenas propiedades de adherencia a metales como el aluminio y el tungsteno y algunos de estos materiales se adhieren bien al óxido de aluminio óxidos de tantalio (Ta3Os) no tienen buenas propiedades de adherencia pero funcionan así como sensores de iones H+. Se pueden aplicar capas de laminado más delgadas mediante deposición de capa atómica (ALD) para crear capas de 2,5 nM, 5,0 nM o 10 nm de grosor.

En una realización, se hace un laminado de óxido de aluminio (AhO3) del orden de 10-20 angstroms para la primera porción 172A y se hace un laminado de óxido de tantalio (Ta3Os) del orden de 10-20 angstroms para segunda porción 172B.

En otra realización, varias capas de laminado están hechas de cualquiera de los materiales descritos anteriormente para la primera porción 172A y la segunda porción 172B de la capa de pasivación 172. Estas capas se pueden aplicar repetidamente como se indicó anteriormente para aumentar las características de sensibilidad y protección proporcionadas por la capa de pasivación 172.

En una realización específica, varias capas de laminado están hechas de un laminado de óxido de aluminio (AI2O3) del orden de 10-20 angstroms como primera porción 172A y un laminado de óxido de tantalio (Ta3Os) del orden de 10-20 angstroms como segunda porción 172B aplicada de manera repetida.

Los ejemplos de materiales adecuados para la segunda porción 172B (u otras porciones adicionales) de la capa de pasivación 172 incluyen, pero sin limitarse a, óxido de aluminio (AhO3), óxido de tantalio (Ta3Os), óxido de estaño (SnO2). En un aspecto, la segunda porción 172B (u otras porciones adicionales) se puede depositar a través de una variedad de procesos de temperatura relativamente baja que incluyen, pero sin limitarse a, pulverización catódica de RF, pulverización catódica de magnetrón de CC, evaporación térmica o por haz de electrones y deposiciones asistidas por iones. En otro aspecto, se puede emplear un proceso de grabado previo a la pulverización, antes de la deposición de la segunda porción 172B, para eliminar cualquier óxido nativo que resida en la primera porción 172A (alternativamente, se puede emplear un entorno reductor, como un entorno de hidrógeno a temperatura elevada para eliminar el óxido nativo que reside en la primera porción 172A). En todavía otro aspecto, el grosor de la segunda porción 172B puede ser del orden de aproximadamente 0,04 pm a 0,06 pm (400 a 600 Angstroms) y el grosor de la primera porción puede ser del orden de 1,0 a 1,5 pm, como se ha descrito anteriormente. En algunas implementaciones ilustrativas, la primera porción 172A puede incluir múltiples capas de oxinitruro de silicio y nitruro de silicio con un grosor combinado de 1,0 a 1,5 pm, y la segunda porción 172B puede incluir una sola capa de óxido de aluminio u óxido de tantalio con un grosor de aproximadamente 400 a 600 Angstroms. Nuevamente, debe apreciarse que los grosores ilustrativos anteriores se proporcionan principalmente con fines ilustrativos, y que la descripción no se limita a estos aspectos.

Por lo tanto, debe entenderse que las matrices de chemFET descritas en la presente descripción pueden usarse para detectar y/o medir varios analitos y, al hacerlo, pueden monitorear una variedad de reacciones y/o interacciones. También se debe entender que la descripción en la presente descripción relacionada con la detección de iones de hidrógeno (en forma de un cambio de pH) es por conveniencia y brevedad y que los niveles/concentraciones estáticas o dinámicas de otros analitos (incluidos otros iones) pueden sustituirse por hidrógeno en estas descripciones. En particular, los cambios de concentración suficientemente rápidos de cualquiera o más de varias especies de iones presentes en el analito pueden detectarse a través de la respuesta dinámica o transitoria de un chemFET, como se describió anteriormente en relación con la Figura 2A. Como también se describió anteriormente en relación con el modelo de disociación del sitio (o enlace del sitio) para la interfaz de la capa de pasivación/analito, debe apreciarse que varios parámetros relacionados con las reacciones de equilibrio en la interfaz de la capa de pasivación/analito (por ejemplo, constantes de velocidad para las reacciones de equilibrio hacia adelante y hacia atrás, el número total de sitios donantes/aceptores de protones por unidad de superficie en la superficie de la capa de pasivación, la capacidad de amortiguación intrínseca, el pH en el punto de carga cero) son propiedades que dependen del material y, por lo tanto, se ven afectadas por la elección de los materiales empleados para la capa de pasivación.

Los chemFET, incluidos los ISFET, descritos en la presente descripción son capaces de detectar cualquier analito que sea capaz de inducir un cambio en el campo eléctrico cuando esté en contacto con la superficie del chemFET o sea detectado o detectado de otro modo. No es necesario cargar el analito para que el sensor lo detecte. Por ejemplo, dependiendo de la realización, el analito puede tener carga positiva (es decir, un catión), carga negativa (es decir, un anión), zwitteriónico (es decir, capaz de tener dos cargas iguales y opuestas, pero siendo neutral en general) y polar pero neutral. Esta lista no pretende ser exhaustiva ya que otras clases de analitos, así como las especies dentro de cada clase, serán fácilmente contempladas por los expertos en la técnica en base a la descripción proporcionada en la presente descripción.

En diferentes realizaciones, la capa de pasivación puede o no estar recubierta y el analito puede o no interactuar directamente con la capa de pasivación.

Especificidad de la capa de pasivación

En algunas realizaciones, la capa de pasivación y/o las capas y/o las moléculas recubiertas dictan la especificidad del analito de la lectura de matriz.

La detección de iones de hidrógeno y otros analitos se puede llevar a cabo utilizando una capa de pasivación hecha de óxido de aluminio (AhO3), pentóxido de tantalio (Ta2Os), óxido de estaño u óxido estánnico (SnO2), y similares. La capa de pasivación también puede detectar otras especies de iones directamente, incluidos, pero sin limitarse a, calcio, potasio, sodio, yoduro, magnesio, cloruro, litio, plomo, plata, cadmio, nitrato, fosfato, dihidrógeno fosfato y similares.

En algunas realizaciones, la capa de pasivación está recubierta con un receptor para el analito de interés. Preferentemente, el receptor se une selectivamente al analito de interés o, en algunos casos, a una clase de agentes a los que pertenece el analito. Como se usa en la presente descripción, un receptor que se une selectivamente a un analito es una molécula que se une preferentemente a ese analito (es decir, su afinidad de unión por ese analito es mayor que su afinidad de unión por cualquier otro analito). Su afinidad de unión por el analito de interés puede ser de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 100 veces o más que su afinidad de unión por cualquier otro analito. Además de su afinidad de unión relativa, el receptor también debe tener una afinidad de unión absoluta que sea suficientemente alta para unirse de manera eficiente al analito de interés (es decir, debe tener una sensibilidad suficiente). Son adecuados los receptores que tienen afinidades de unión en el rango picomolar a micromolar. Preferentemente tales interacciones son reversibles.

El receptor puede ser de cualquier naturaleza (por ejemplo, químico, ácido nucleico, péptido, lípido, sus combinaciones y similares). En tales realizaciones, el analito también puede ser de cualquier naturaleza siempre que exista un receptor que se una a él de forma selectiva y, en algunos casos, específicamente. Sin embargo, debe entenderse que diversas realizaciones contemplan además la detección de analitos en ausencia de un receptor. Un ejemplo de esto es la detección de PPi y Pi por la capa de pasivación en ausencia de receptores PPi o Pi.

En un aspecto, una realización contempla receptores que son ionóforos. Como se usa en la presente descripción, un ionóforo es una molécula que se une selectivamente a una especie iónica, ya sea un anión o un catión. En el contexto de la realización, el ionóforo es el receptor y el ion al que se une es el analito. Los ionóforos de la invención incluyen ionóforos portadores reconocidos en la técnica (es decir, moléculas pequeñas solubles en lípidos que se unen a un ion particular) derivados de microorganismos. Varios ionóforos están disponibles comercialmente de fuentes tales como Calbiochem.

La detección de algunos iones se puede lograr mediante el uso de la propia capa de pasivación o mediante el uso de receptores que recubren la capa de pasivación. Por ejemplo, el potasio puede detectarse selectivamente usando polisiloxano, valinomicina o salinomicina; el sodio se puede detectar de forma selectiva utilizando monensina, nistatina o SQI-Pr; el calcio se puede detectar de forma selectiva usando ionomicina, calcimicina (A23187) o CA 1001 (ETH 1001).

En algunos casos, también se pueden usar receptores capaces de unirse a más de un ion. Por ejemplo, la beauvericina se puede usar para detectar iones de calcio y/o bario, la nigericina se puede usar para detectar iones de potasio, hidrógeno y/o plomo, y la gramicidina se puede usar para detectar iones de hidrógeno, sodio y/o potasio. Un experto en la técnica reconocerá que estos compuestos pueden usarse en aplicaciones en las que no se requiere especificidad de ion único o en las que es poco probable (o imposible) que estén presentes o generados otros iones a los que se unen los compuestos. De manera similar, los receptores que se unen a múltiples especies de un género particular también pueden ser útiles en algunas realizaciones, incluidas aquellas en las que solo estará presente una especie dentro del género o en las que el método no requiere distinción entre especies.

Como otro ejemplo, los receptores para neurotoxinas se describen en Simonian Electroanalysis 2004, 16: 1896­ 1906.

Capa de pasivación y receptores PPi

En otras realizaciones, que incluyen pero no se limitan a aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos, se pueden usar receptores que se unen selectivamente a PPi. Los ejemplos de receptores de PPi incluyen los compuestos que se muestran en las Figuras 11B(1)-(3) (compuestos 1-10). El compuesto 1 se describe en Angew, Chem Int (Ed. 2004) 43:4777-4780 y US 2005/0119497 A1 y se denomina p-naftil-bis[(bis(2-piridilmetil)amino)metil]fenol. El compuesto 2 se describe en J Am Chem Soc 2003 125: 7752-7753 y US 2005/0119497 A1 y se denomina p-(p-nitrofenilazo)-bis[(bis(2-piridilmetil-1)amino)metil]fenol (o su complejo dinuclear Zn). Los esquemas de síntesis para los compuestos 1 y 2 se muestran en US 2005/0119497 A1. El compuesto 3 se describe en por Lee y otros Organic Letters 2007 9(2):243-246, y Sensors and Actuators B 1995 29:324-327. El compuesto 4 se describe en Angew, Chem Int (Ed. 2002) 41(20):3811-3814. Las síntesis ilustrativas para los compuestos 7, 8 y 9 se muestran en las Figuras 11C(1)-(3). El compuesto 5 se describe en WO 2007/002204 y se denomina allí bis-Zn2+ -dipicolilamina (Zn2+ -DPA). El compuesto 6 se ilustra en la Figura 11B(3) unido a PPi. (Mc Donough y otros Chem. Commun. 20062971-2973.) En la Figura 11E se muestra la unión del compuesto 7 a una superficie de óxido de metal.

Capa de pasivación - Unión al receptor

Los receptores se pueden unir a la capa de pasivación de forma covalente o no covalente. La unión covalente de un receptor a la capa de pasivación puede ser directa o indirecta (por ejemplo, a través de un enlazador). Las Figuras 11D(1) y (2) ilustran el uso de la química del silanol para unir covalentemente los receptores a la capa de pasivación. Los receptores pueden inmovilizarse en la capa de pasivación utilizando, por ejemplo, aminas primarias alifáticas (panel inferior izquierdo) o isotiocianatos de arilo (panel inferior derecho). En estas y otras realizaciones, la capa de pasivación, que en sí misma puede estar compuesta por óxido de aluminio, pentóxido de tántalo o similares, se une a una capa de silanización a través de sus grupos superficiales reactivos. Para obtener más detalles sobre la química del silanol para la unión covalente a la superficie FET, se puede hacer referencia al menos a las siguientes publicaciones: para nitruro de silicio, consulte Sensors and Actuators B 199529:324-327, Jpn J Appl Phys 199938: 3912-3917 y Langmuir 2005 21:395-402; para óxido de silicio, consulte Protein Sci 1995 4: 2532-2544 y Am Biotechnol Lab 200220(7):16-18; y para el óxido de aluminio, consulte Colloids and Surfaces 199263:1-9, Sensors and Actuators B 2003 89:40-47, y Bioconjugate Chem 19978:424-433. A continuación, el receptor se conjuga con los grupos reactivos de la capa de silanización. Esta última unión puede producirse directa o indirectamente mediante el uso de un enlazador bifuncional, como se ilustra en las Figuras 11D(1) y (2).

Un enlazador bifuncional es un compuesto que tiene al menos dos grupos reactivos a los que se pueden unir dos entidades. En algunos casos, los grupos reactivos están localizados en extremos opuestos del enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador bifuncional es un enlazador bifuncional universal como el que se muestra en las Figuras 11D(1) y (2). Un enlazador universal es un enlazador que se puede utilizar para enlazar una variedad de entidades. Debe entenderse que las químicas mostradas en las Figuras 11D(1) y (2) pretenden ser ilustrativas y no limitativas.

El enlazador bifuncional puede ser un enlazador homobifuncional o un enlazador heterobifuncional, dependiendo de la naturaleza de las moléculas a conjugar. Los enlazadores homobifuncionales tienen dos grupos reactivos idénticos. Los enlazadores heterobifuncionales tienen dos grupos reactivos diferentes. Varios tipos de enlazadores disponibles comercialmente son reactivos con uno o más de los siguientes grupos: aminas primarias, aminas secundarias, sulfhidrilos, carboxilos, carbonilos y carbohidratos. Ejemplos de enlazadores específicos de amina son suberato de bis(sulfosuccinimidilo), bis[2-(succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfona, suberato de disuccinimidilo, tartrato de disuccinimidilo, dimetil adipimato-2-HCl, dimetilpimelimidato-2-HCl, dimetil suberimidato-2HCl y etileno glicolbis-[succinimidil-[succinato]]. Los enlazadores reactivos con grupos sulfhidrilo incluyen bismaleimidohexano, 1,4-di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido)] butano, 1-[p-azidosalicilamido]-4-[yodoacetamido] butano y N-[4 -(p-azidosalicilamido) butil]-3'-[2'-piridilditio] propionamida. Los enlazadores preferentemente reactivos con carbohidratos incluyen azidobenzoil hidracina. Los enlazadores preferentemente reactivos con grupos carboxilo incluyen 4-[pazidosalicilamido]butilamina.

Los enlazadores heterobifuncionales que reaccionan con aminas y sulfhidrilos incluyen propionato de N-succinimidil-3-[2-piridilditio], [4-yodoacetil]aminobenzoato de succinimidilo, 4-[N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, m-maleimidobenzoil-N- éster de hidroxisuccinimida, 6-[3-[2-piridilditio]propionamido]hexanoato de sulfosuccinimidilo y 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo. Los enlazadores heterobifuncionales que reaccionan con grupos carboxilo y amina incluyen clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]-carbodiimida. Los enlazadores heterobifuncionales que reaccionan con carbohidratos y sulfhidrilos incluyen 4-[N-maleimidometil]-ciclohexano-1-carboxilhidrazida-2 HCl, 4-(4-N-maleimidofenil)-butírico ácido hidrazida-2 HCl y 3-[2-piridilditio] hidrazida de propionilo.

Alternativamente, los receptores se pueden recubrir de forma no covalente sobre la capa de pasivación. La deposición no covalente del receptor sobre la capa de pasivación puede implicar el uso de una matriz polimérica. El polímero puede ser de origen natural o no natural y puede ser de cualquier tipo, incluidos, pero sin limitarse a, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, APN, LNA y similares, o imitaciones, derivados o sus combinaciones), amino ácido (por ejemplo, péptidos, proteínas (nativas o desnaturalizadas) y similares, o imitaciones, derivados o sus combinaciones, lípidos, polisacáridos y copolímeros de bloques funcionalizados. El receptor puede ser adsorbido y/o atrapado dentro de la matriz polimérica. La naturaleza del polímero dependerá de la naturaleza del receptor que se utilice y/o del analito que se detecte.

Alternativamente, el receptor puede conjugarse covalentemente o reticularse con el polímero (por ejemplo, puede "injertarse" en un polímero funcionalizado).

Un ejemplo de un polímero peptídico adecuado es la polilisina (por ejemplo, poli-L-lisina). Los ejemplos de otros polímeros incluyen copolímeros de bloque que comprenden polietilenglicol (PEG), poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenglicoles, óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, alcoholes de polivinilo, éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, haluros de polivinilo, polivinilpirrolidona, poliglicólidos, polisiloxanos, poliuretanos, alquilcelulosa, hidroxialquilcelulosa, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitrocelulosas, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxibutilmetilcelulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, butirato de acetato de celulosa, acetato de celulosa ftalato, carboxiletilcelulosa, triacetato de celulosa, sulfato de celulosa sal sódica, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(lauril metacrilato), poli(fenilmetacrilato e), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), poli(acrilato de octadecil), polietileno, polipropileno, poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), poli(tereftalato de etileno), poli (alcoholes vinílicos), acetato de polivinilo, cloruro de polivinilo, poliestireno, ácidos polihialurónicos, caseína, gelatina, glutina, polianhídridos, ácido poliacrílico, alginato, quitosano, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo) y poli(acrilato de octadecilo)), poli(láctidoglicólido), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido polihidroxibutírico, polianhídridos, copolímero en bloque de poli(estireno-b-isobutileno-b-estireno) (SIBS), acetato de etilenvinilo, ácido poli(met)acrílico, polímeros de ácido láctico y ácido glicólico, polianh hidruros, poli(orto)ésteres, poliuretanos, poli(ácido bútico), poli(ácido valérico) y poli(láctido-cocaprolactona), y polímeros naturales como alginato y otros polisacáridos, incluidos dextrano y celulosa, colágeno, albúmina y otros hidrófilos proteínas, zeína y otras prolaminas y proteínas hidrofóbicas, copolímeros y mezclas de los mismos, y derivados químicos de los mismos, incluidas sustituciones y/o adiciones de grupos químicos, por ejemplo, alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones y otras modificaciones realizadas de forma rutinaria por los expertos en la técnica.

Carga atrapada

Otro problema que se relaciona con la estabilidad y/o la previsibilidad de la tensión umbral de ISFET involucra la carga atrapada que puede acumularse (especialmente) en las capas metálicas de los dispositivos fabricados con CMOS como resultado de varias actividades de procesamiento durante o después de la fabricación de la matriz (por ejemplo, procesamiento de final de línea, tal como grabado de metales con plasma, limpieza de obleas, corte en dados, envasado, manipulación, etc.). En particular, con referencia a la Figura 11A, la carga atrapada puede acumularse en algunos casos en uno o más de los diversos conductores 304, 306, 308, 312, 316, 320, 326, 338 y 164 que constituyen la estructura de puerta flotante de los ISFET 170. Este fenómeno también se denomina en la literatura relevante como el "efecto antena".

Una oportunidad para que se acumule la carga atrapada incluye el grabado con plasma de la capa de metal superior 304. Otras oportunidades para que la carga se acumule en uno o más conductores de la estructura de la puerta flotante u otras partes de los FET incluyen el corte de obleas, durante el cual el proceso abrasivo de una sierra de corte en cubos que corta una oblea genera electricidad estática y/o varios pasos de manipulación/empaquetado de obleas posteriores al procesamiento, tal como la unión de alambre entre la matriz y el paquete, donde en algunos casos la maquinaria automatizada que manipula/transporta las obleas puede ser fuente de descargas electrostáticas (ESD) para los conductores de la estructura de la puerta flotante. Si no hay conexión con el sustrato de silicio (u otro sustrato semiconductor) para proporcionar una trayectoria eléctrica para purgar dicha acumulación de carga, la carga puede acumularse hasta el punto de causar cambios no deseados o daños en el óxido de puerta 165 (por ejemplo, inyección de carga en el óxido, o descomposición del óxido de bajo nivel en el sustrato subyacente). La carga atrapada en el óxido de la puerta o en la interfaz del semiconductor de óxido de la puerta, a su vez, puede causar variaciones no deseadas y/o impredecibles en el funcionamiento y el rendimiento del ISFET, como fluctuaciones en la tensión umbral.

En vista de lo anterior, la presente descripción está dirigida a métodos y aparatos para mejorar el rendimiento de ISFET reduciendo la carga atrapada o mitigando el efecto de antena. En una realización, la carga atrapada puede reducirse después de que se haya fabricado una matriz de sensores, mientras que en otras realizaciones el proceso de fabricación en sí mismo puede modificarse para reducir la carga atrapada que podría inducirse mediante algunos pasos de proceso convencionales. En aún otras realizaciones, las técnicas "durante la fabricación" y "posteriores a la fabricación" pueden emplearse en combinación para reducir la carga atrapada y mejorar de esta manera el rendimiento del ISFET.

Con respecto a las alteraciones del propio proceso de fabricación para reducir la carga atrapada, en una realización, el grosor del óxido de puerta 165 que se muestra en la Figura 11A puede seleccionarse particularmente para facilitar el sangrado de la carga acumulada al sustrato; en particular, un óxido de puerta más delgado puede permitir que una cantidad suficiente de carga acumulada pase a través del óxido de puerta al sustrato de abajo sin quedar atrapada. En otra realización basada en este concepto, se puede diseñar un píxel para que incluya un dispositivo de "sacrificio" adicional, es decir, otro transistor que tenga un óxido de puerta más delgado que el óxido de puerta 165 del ISFET. La estructura de puerta flotante del ISFET puede entonces acoplarse a la puerta del dispositivo de sacrificio de manera que sirva como un "transistor de purga de carga". Por supuesto, debe apreciarse que algunas compensaciones para incluir un dispositivo de sacrificio de este tipo incluyen un aumento en el tamaño y la complejidad de los píxeles.

En otra realización, la capa de metal superior 304 de la estructura de puerta flotante de los ISFET 170 que se muestra en la Figura 11A puede cubrirse con un dieléctrico antes del grabado con plasma para mitigar la carga atrapada. Como se describió anteriormente, la carga acumulada en la estructura de la puerta flotante puede, en algunos casos, acoplarse desde el plasma que se usa para el grabado de metales. Por lo general, se aplica una fotoprotección sobre el metal que se va a grabar y luego se modela según la geometría deseada para el metal subyacente. En una implementación ilustrativa, se puede depositar una capa dieléctrica de protección (por ejemplo, un óxido) sobre el metal que se va a grabar, antes de la aplicación de la fotoprotección, para proporcionar una barrera adicional en la superficie del metal contra la carga del proceso de grabado con plasma. En un aspecto, la capa dieléctrica de protección puede permanecer detrás y formar una parte de la capa de pasivación 172.

En aún otra realización, el proceso de grabado de metal para la capa de metal superior 304 puede modificarse para incluir química húmeda o fresado de haces iónicos en lugar de grabado con plasma. Por ejemplo, la capa de metal 304 podría grabarse utilizando una química acuosa selectiva para el dieléctrico subyacente (por ejemplo, consulte el sitio web de Transene relacionado con el aluminio). Otro enfoque alternativo emplea fresado de iones en lugar de grabado con plasma para la capa de metal 304. La fresado de iones se usa comúnmente para grabar materiales que no se pueden eliminar fácilmente con plasma convencional o productos químicos húmedos. El proceso de fresado de iones no emplea un campo eléctrico oscilante como lo hace un plasma, por lo que no se acumula carga en la(s) capa(s) de metal. Todavía otra alternativa de grabado de metales implica optimizar las condiciones del plasma para reducir la tasa de grabado (es decir, menos densidad de potencia).

En aún otra realización, se pueden realizar cambios en la arquitectura de la capa de metal para facilitar el aislamiento eléctrico completo durante la definición de la puerta flotante. En un aspecto, el diseño del apilamiento de metal para que la puerta flotante ISFET de gran área no esté conectada a nada durante su definición final puede requerir una capa de metal posterior que sirva como "puente" para realizar la conexión eléctrica a la puerta flotante del transistor. Este esquema de conexión de "puente" evita el flujo de carga desde la puerta flotante grande al transistor. Este método se puede implementar de la siguiente manera (M = capa de metal): i) M1 en contacto con el electrodo de puerta de polietileno; ii) M2 en contacto con M1; iii) M3 define la puerta flotante y se conecta por separado a M2 con isla aislada; iv) El puente M4, que tiene un área muy pequeña grabada sobre las islas aisladas y las conexiones a la puerta flotante m 3, conecta la puerta flotante M3 a la pila M1/M2/M3 conectada a la puerta de polisilicio inmediatamente sobre el área activa del transistor; y v) el dieléctrico de la capa intermedia M3 a M4 se retira solo sobre la puerta flotante para exponer la puerta flotante M3 desnuda. En el método descrito inmediatamente antes, no es necesario realizar el paso v), ya que la arquitectura ISFET según algunas realizaciones descritas anteriormente deja la pasivación M4 en su lugar sobre la puerta flotante M4. En un aspecto, la eliminación puede, no obstante, mejorar el rendimiento de ISFET de otras maneras (es decir, la sensibilidad). En cualquier caso, la capa de pasivación sensible final puede ser una fina capa de óxido de metal sensible a iones depositada por pulverización catódica. Debe tenerse en cuenta que la arquitectura puenteada sobre capa descrita anteriormente puede implementarse en el flujo de fabricación de CMOS estándar para permitir que cualquiera de las tres primeras capas de metal se use como puertas flotantes (es decir, M1, M2 o M3).

Con respecto a los procesos posteriores a la fabricación para reducir la carga atrapada, en una realización se puede emplear un "recocido con gas de formación" como proceso posterior a la fabricación para mitigar los efectos potencialmente adversos de la carga atrapada. En un recocido de gas de formación, los dispositivos ISFET fabricados con CMOS se calientan en una mezcla de gas hidrógeno y nitrógeno. El gas hidrógeno en la mezcla se difunde en el óxido de puerta 165 y neutraliza ciertas formas de cargas atrapadas. En un aspecto, el recocido con gas de formación no necesita eliminar necesariamente todos los daños por óxido de puerta que pueden resultar de las cargas atrapadas; más bien, en algunos casos, una neutralización parcial de alguna carga atrapada es suficiente para mejorar significativamente el rendimiento de ISFET. En procesos de recocido ilustrativos según la presente descripción, los ISFET pueden calentarse durante aproximadamente 30 a 60 minutos a aproximadamente 400 a 425 grados Celsius en una mezcla de hidrógeno/nitrógeno que incluye 10 % a 15 % de hidrógeno. En una implementación particular, se observa que el recocido a 425 grados Celsius durante 30 minutos en una mezcla de hidrógeno/nitrógeno que incluye un 10 % de hidrógeno es particularmente eficaz para mejorar el rendimiento de ISFET. Para los procesos CMOS de aluminio, la temperatura de recocido debe mantenerse a 450 grados Celsius o menos para evitar dañar la metalurgia del aluminio. En otro aspecto de un proceso de recocido según la presente descripción, el recocido del gas de formación se realiza después de que las obleas de las matrices de ISFET fabricadas se cortan en cubos, para garantizar que el daño debido a la carga atrapada inducida por el propio proceso de corte en cubos y/u otras etapas del proceso de precorte en cubos (por ejemplo, grabado con plasma de metales) pueden mejorarse eficazmente. En todavía otro aspecto, el recocido con gas de formación se puede realizar después de la unión de alambres de matriz a paquete para mejorar de manera similar el daño debido a la carga atrapada. En este punto del proceso de ensamblaje, un chip de matriz cortada en dados normalmente se encuentra en un paquete de cerámica resistente al calor y a los productos químicos, y se pueden emplear procedimientos de unión de cables de baja tolerancia, así como adhesivos de troquel a paquete resistentes al calor para soportar el procedimiento de recocido. Por lo tanto, una realización ilustrativa abarca un método para fabricar una matriz de FET, cada uno de los cuales tiene o está acoplado a una puerta flotante que tiene una carga atrapada de cero o sustancialmente cero que comprende: fabricar una pluralidad de FET en un sustrato semiconductor común, cada uno de una pluralidad del cual está acoplado a una puerta flotante; aplicar un recocido de gas de formación al semiconductor antes de un paso de corte en dados; trocear el semiconductor; y aplicar un recocido de gas de formación al semiconductor después del paso de corte en dados. Preferentemente, el sustrato semiconductor comprende al menos 100 000 FET. Preferentemente, la pluralidad de FET son chemFET. El método puede comprender además depositar una capa de pasivación sobre el semiconductor, depositar una capa de material polimérico, de vidrio, grabable con iones reactivos o fotodefinible sobre la capa de pasivación y grabar el material polimérico, de vidrio, grabable con iones reactivos o fotodefinible para formar una matriz de reacción cámaras en la capa de vidrio.

En otros procesos más para mitigar los efectos potencialmente adversos de la carga atrapada según las realizaciones de la presente descripción, se puede adoptar una variedad de "protocolos sensibles a descargas electrostáticas (ESD)" durante cualquiera de una variedad de pasos de empaque/manipulación posteriores a la fabricación de obleas. Por ejemplo, en un proceso de ejemplo, se puede emplear cinta antiestática para cortar en cubitos para mantener los sustratos de la oblea en su lugar (por ejemplo, durante el proceso de corte en cubitos). Además, aunque convencionalmente se emplea agua desionizada de alta resistividad (por ejemplo, 10 MQ) en relación con el enfriamiento de las sierras de corte en dados, según una realización de la presente descripción, se puede emplear agua menos resistiva/más conductora para este propósito para facilitar la conducción de carga a través del agua; por ejemplo, el agua desionizada se puede tratar con dióxido de carbono para reducir la resistividad y mejorar la conducción de la carga que surge del proceso de corte en dados. Además, las herramientas de eyección de troquel conductoras y conectadas a tierra se pueden usar durante varios pasos de corte en dados/manipulación/empaquetado de obleas, nuevamente para proporcionar vías de conducción efectivas para la carga generada durante cualquiera de estos pasos y, por lo tanto, reducir las oportunidades de que la carga se acumule en uno o más conductores de la estructura de puerta flotante de los respectivos ISFET de una matriz.

En aún otra realización que implica un proceso posterior a la fabricación para reducir la carga atrapada, la región de óxido de puerta de un ISFET puede irradiarse con radiación UV. Con referencia nuevamente a la Figura 11A, en una implementación ilustrativa basada en esta realización, se incluye un orificio o ventana opcional 302 durante la fabricación de una matriz del ISFET en la capa de metal superior 304 de cada píxel de la matriz, próxima a la estructura de puerta flotante ISFET. Esta ventana está destinada a permitir que la radiación UV, cuando se genere, ingrese a la región de puerta de los ISFET; en particular, las diversas capas del píxel 1051, como se muestra en las Figuras 11 y 12 AL, están configurados de tal manera que la radiación UV que entra por la ventana 302 puede incidir esencialmente sin obstrucciones en el área próxima a la puerta de polisilicio 164 y el óxido de puerta 165.

Para facilitar un proceso de irradiación UV para reducir la carga atrapada, en la capa de pasivación 172 que se muestra en la Figura 11A pueden emplearse generalmente materiales distintos del nitruro de silicio y el oxinitruro de silicio, ya que el nitruro de silicio y el oxinitruro de silicio absorben significativamente la radiación UV. En vista de lo anterior, es necesario sustituir estos materiales por otros sensiblemente transparentes a la radiación UV, entre los que se incluyen, pero sin limitarse a, el vidrio de fososilicato (PSG) y el vidrio de fososilicato dopado con boro (BPSG). PSG y BPSG, sin embargo, no son impermeables a los iones de hidrógeno e hidroxilo; en consecuencia, a emplear en una capa de pasivación de un ISFE^t diseñado para la sensibilidad al pH, PSG y BPSG pueden usarse junto con un material impermeable a los iones que también es significativamente transparente a la radiación UV, como el óxido de aluminio (AhOs), para formar la capa de pasivación. Por ejemplo, con referencia nuevamente a la Figura 11A, se puede emplear PSG o BPSG como sustituto del nitruro de silicio o del oxinitruro de silicio en la primera porción 172A de la capa de pasivación 172, y una capa delgada (por ejemplo, de 400 a 600 Angstroms) de se puede emplear óxido de aluminio en la segunda porción 172B de la capa de pasivación 172 (por ejemplo, el óxido de aluminio se puede depositar usando un proceso de litografía de despegue post-CMOS).

En otro aspecto de una realización que implica la irradiación UV, cada ISFET de una matriz de sensores puede polarizarse durante un proceso de irradiación UV para facilitar la reducción de la carga atrapada. En particular, los fotones de alta energía de la radiación ultravioleta, que inciden sobre la región de silicio a granel 160 en la que se forma el canal conductor de ISFET, crean pares electrón-hueco que facilitan la neutralización de la carga atrapada en el óxido de la puerta a medida que la corriente fluye a través del canal conductor de los ISFET. Con este fin, un controlador de matriz, que se describe más adelante en relación con la Figura 17, genera señales apropiadas para polarizar los ISFET de la matriz durante un proceso de irradiación UV. En particular, con referencia nuevamente a la Figura 9, cada una de las señales RowSeh a RowSeln se genera para habilitar/seleccionar (es decir, encender) todas las hileras de la matriz de sensores al mismo tiempo y, por lo tanto, acoplar todos los ISFET de la matriz a las respectivas fuentes de corriente controlables 106j en cada columna. Con todos los píxeles de cada columna seleccionados simultáneamente, la corriente de la fuente de corriente 106j de una columna dada es compartida por todos los píxeles de la columna. Los amplificadores de columna 107A y 107B se desactivan eliminando la tensión de polarización VB4 y, al mismo tiempo, la salida del amplificador 107B, conectada al drenaje de cada ISFET en una columna dada, se conecta a tierra a través de un conmutador que responde a una señal de control “UV". Además, la tensión de cuerpo común Vcuerpo para todos los ISFET de la matriz está acoplado a tierra eléctrica (es decir, V^cuerpo = 0 voltios) (como se describió anteriormente, durante la operación normal de la matriz, la tensión de polarización del cuerpo Vcuerpo está acoplado al potencial de tensión más alto disponible para la matriz, por ejemplo, VDDA). En un procedimiento ilustrativo, la tensión de polarización VB1 para todas las fuentes de corriente controlables 106j se establece de manera que el ISFET de cada píxel conduzca aproximadamente 1 pA de corriente. Con la matriz del ISFET por lo tanto polarizada, la matriz se irradia con una dosis suficiente de radiación UV (por ejemplo, desde un borrador de EPROM que genera aproximadamente 20 milivatios/cm2 de radiación a una distancia de aproximadamente una pulgada de la matriz durante aproximadamente 1 hora). Después de la irradiación, se puede dejar que la matriz descanse y se estabilice durante varias horas antes de usarla para medir propiedades químicas, como la concentración de iones.

Utilizando al menos una de las técnicas descritas anteriormente para reducir la carga atrapada, hemos podido fabricar puertas flotantes FET con una carga atrapada de cero o sustancialmente cero. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un aspecto de la invención abarca una puerta flotante que tiene un área superficial de aproximadamente 4 pm2 a aproximadamente 50 pm2 que tiene una tensión umbral de referencia y preferentemente una carga atrapada de cero o sustancialmente cero. Preferentemente, los FET son chemFET. La carga atrapada debe mantenerse en un nivel que no cause variaciones apreciables de FET a FET en la matriz, ya que eso limitaría el rango dinámico de los dispositivos, la consistencia de las mediciones y afectaría negativamente el rendimiento.

Diseño de matrices y chips

La Figura 13 ilustra un diagrama de bloques de una implementación ilustrativa de chip IC CMOS de una matriz de sensores ISFET 100 basada en los diseños de columna y píxel descritos anteriormente en relación con las Figuras 9-12, según una realización de la presente descripción. En un aspecto de esta realización, la matriz 100 incluye 512 columnas 102i a 102512 con el correspondiente circuito de polarización/lectura de columna 110i a IIO512 (uno para cada columna, como se muestra en la Figura 9), donde cada columna incluye 512 geométricamente píxeles cuadrados 1051 a 105512, cada uno que tiene un tamaño de aproximadamente 9 micras por 9 micras (es decir, la matriz es de 512 columnas por 512 hileras). En otro aspecto, la matriz completa (incluidos los píxeles junto con el circuito de selección de hilera y columna asociado y el circuito de polarización/lectura de columna) puede fabricarse en una pastilla semiconductora como un circuito integrado de aplicación específica (ASIC) que tiene unas dimensiones de aproximadamente 7 milímetros por 7 milímetros. Si bien se muestra una matriz de 512 por 512 píxeles en la realización de la Figura 13, debe apreciarse que las matrices pueden implementarse con diferentes números de hileras y columnas y diferentes tamaños de píxeles según otras realizaciones, como se describe más adelante en relación con las Figuras 19-23.

Además, como se describió anteriormente, debe apreciarse que las matrices según varias realizaciones de la presente invención pueden fabricarse según técnicas de fabricación de CMOS convencionales, así como técnicas de fabricación de CMOS modificadas (por ejemplo, para facilitar la realización de varios aspectos funcionales de las matrices chemFET descritas en la presente descripción, como la deposición adicional de materiales de pasivación, pasos de proceso para mitigar la carga atrapada, etc.) y otras técnicas de fabricación de semiconductores más allá de las empleadas convencionalmente en la fabricación de CMOS. Además, se pueden emplear varias técnicas de litografía como parte de un proceso de fabricación de matrices. Por ejemplo, en una implementación ilustrativa, se puede emplear una técnica de litografía en la que se "cosen" bloques diseñados apropiadamente superponiendo los bordes de un escalón y repitiendo exposiciones de litografía en un sustrato de oblea en aproximadamente 0,2 micras. En una sola exposición, el tamaño máximo de pastilla normalmente es de aproximadamente 21 milímetros por 21 milímetros. Mediante la exposición selectiva de diferentes bloques (lados, parte superior e inferior, núcleo, etc.) se pueden definir chips muy grandes en una oblea (hasta un máximo, en extremo, de un chip por oblea, comúnmente denominado "integración a escala de oblea"").

En un aspecto de la matriz 100 que se muestra en la Figura 13, las dos primeras y últimas columnas 1021, 1022, 102511 y 102512, así como los dos primeros píxeles 1051 y 1052 y los dos últimos píxeles 105511 y 105512 de cada una de las columnas 1023 a 102510 (por ejemplo, dos hileras y columnas de píxeles alrededor de un perímetro de la matriz) pueden configurarse como píxeles 103 de "referencia" o "ficticios". Con referencia a la Figura 11A, para los píxeles ficticios de una matriz, la capa de metal superior 304 del ISFET de cada píxel ficticio (acoplado en última instancia a la puerta de polisilicio de ISFET 164) está unida a la misma capa de metal de otros píxeles ficticios y se hace accesible como terminal del chip, que a su vez puede estar acoplado a una tensión de referencia VREF. Como se describió anteriormente en relación con la Figura 9, la tensión de referencia VREF también se puede aplicar al circuito de polarización/lectura de las columnas respectivas de la matriz. En algunas implementaciones ilustrativas descritas más adelante, los datos preliminares de prueba/evaluación pueden adquirirse de la matriz en base a aplicar la tensión de referencia VREF y seleccionar y leer píxeles ficticios, y/o leer columnas en base a la aplicación directa de VREF a la soluciones reguladoras de columna respectivas (por ejemplo, a través de la señal ^cA^l ), para facilitar la determinación de la compensación (por ejemplo, varianzas de píxel a píxel y de columna a columna) y la calibración de matrices.

En otra implementación más de una matriz similar a la que se muestra en la Figura 13, en lugar de reservar las dos primeras y últimas columnas de 512 columnas y los dos primeros y últimos píxeles de cada columna de 512 píxeles como píxeles de referencia, la matriz puede fabricarse para incluir dos hileras/columnas adicionales de píxeles de referencia que rodean un perímetro de una región de píxeles activos de 512 por 512, de manera que el tamaño total de la matriz en términos de píxeles reales es de 516 por 516 píxeles. Dado que la presente descripción contempla matrices de varios tamaños y configuraciones, debe apreciarse que el concepto anterior puede aplicarse a cualquiera de las otras realizaciones de matrices descritas en la presente descripción. Para los fines de la descripción que sigue inmediatamente con respecto a la matriz ilustrativa 100 que se muestra en la Figura 13, se considera un conteo total de píxeles para la matriz de 512 por 512 píxeles.

En la Figura 13, varias tensiones de fuente de alimentación y polarización utilizadas para la operación de la matriz (como se describió anteriormente en relación con la Figura 9) se proporcionan a la matriz a través de conexiones eléctricas (por ejemplo, patillas, almohadillas metálicas) y están etiquetados para simplificar en el bloque 195 como "Conexiones de alimentación y polarización". La matriz 100 de la Figura 13 también incluye un registro de desplazamiento de selección de hilera 192, dos conjuntos de registros de desplazamiento de selección de columna 1941,2 y dos controladores de salida 1981 y 1982 para proporcionar dos señales de salida de matriz paralelas, Vsal1 y Vsal2, que representan las mediciones del sensor (es decir, colecciones de señales de salida individuales generadas por los respectivos ISFET de la matriz). Las diversas tensiones de fuente de alimentación y de polarización, las señales de control para los registros de desplazamiento de hilera y columna y las señales de control para el circuito de polarización/lectura de columna que se muestran en la Figura 13 son proporcionados por un controlador de matriz, como se describe más adelante en relación con la Figura 17, que también lee las señales de salida de la matriz Vsal1 y Vsal2 (y otras señales opcionales de estado/diagnóstico) de la matriz 100. En otro aspecto de la realización de matriz que se muestra en la Figura 13, configurar la matriz de manera que se puedan leer múltiples regiones (por ejemplo, varias columnas) de la matriz al mismo tiempo a través de múltiples señales de salida de matriz paralelas (por ejemplo, Vsal1 y Vsal2) facilita mayores velocidades de adquisición de datos, como se describe más adelante en relación con las Figuras 17 y 18. Mientras que la Figura 13 ilustra una matriz que tiene dos registros de selección de columna y señales de salida de matriz paralelas Vsall y Vsal2 para adquirir datos simultáneamente de dos columnas a la vez, debe apreciarse que, en otras realizaciones, las matrices según la presente descripción pueden configurarse para tener una sola salida de señal de medida, o más de dos salidas de señal de medida; en particular, como se describe más adelante en relación con las Figuras 19-23, las matrices más densas según otras realizaciones pueden configurarse para tener cuatro de nuestras salidas de señal de medición más paralelas y permitir simultáneamente que diferentes regiones de la matriz proporcionen datos a través de las cuatro o más salidas.

La Figura 14 ilustra el registro de desplazamiento de selección de hilera 192, la Figura 15 ilustra uno de los registros de desplazamiento de selección de columna 1942 y la Figura 16 ilustra uno de los controladores de salida 1982 de la matriz 100 que se muestra en la Figura 13, según un ejemplo implementación. Como se muestra en las Figuras 14 y 15, los registros de desplazamiento de selección de hilera y columna se implementan como una serie de biestables de tipo D acoplados a una tensión de suministro positivo de circuitos digital VDDD y un VsSD de tierra de suministro digital. En los registros de desplazamiento de hilera y columna, se aplica una señal de datos a una entrada D del primer biestable de cada serie y una señal de reloj se aplica simultáneamente a una entrada de reloj de todos los biestables de la serie. Para cada biestable, una salida "Q" reproduce el estado de la entrada D en una transición (por ejemplo, flanco de bajada) de la señal del reloj. Con referencia a la Figura 14, el registro de desplazamiento de selección de hilera 192 incluye 512 biestables de tipo D, en los que un primer biestable 193 recibe una señal de datos vertical DV y todos los biestables reciben una señal de reloj vertical CV. Una salida "Q" del primer biestable 193 proporciona la señal de selección de primera hilera RowSeh y está acoplada a la entrada D del siguiente biestable de la serie. Las salidas Q de biestables sucesivos se acoplan a las entradas D del siguiente biestable en la serie y proporcionan las señales de selección de hilera RowSeh a RowSel512 con transiciones de flanco de bajada sucesivas de la señal de reloj vertical CV, como se explica más adelante a continuación en relación con la Figura 18. La señal de selección de la última hilera RowSel512 también se puede tomar como una salida opcional de la matriz 100 como la señal LSTV (Vertical de última etapa), que proporciona una indicación (por ejemplo, con fines de diagnóstico) de que se ha seleccionado la última hilera de la matriz. Si bien no se muestra explícitamente en la Figura 14, cada una de las señales de selección de hilera RowSeh a RowSel512 se aplica a un inversor correspondiente, cuya salida se usa para habilitar un píxel dado en cada columna (como se ilustra en la Figura 9 por las señales RowSeh a RowSeh).

Con respecto a los registros de desplazamiento de selección de columna 1941 y 1942, estos se implementan de manera similar a los registros de desplazamiento de selección de hilera, con cada registro de desplazamiento de selección de columna que comprende 256 biestables conectados en serie y responsable de permitir la lectura desde las columnas impares de la matriz o las columnas pares de la matriz. Por ejemplo, la Figura 15 ilustra el registro de desplazamiento de selección de columna 1942, que está configurado para permitir la lectura de todas las columnas con número par de la matriz una tras otra a través de las señales de selección de columna ColSeh, ColSel4,....ColSel512, mientras que otro registro de desplazamiento de selección de columna 1941 está configurado para permitir la lectura de todas las columnas con número impar de la matriz una tras otra (a través de las señales de selección de columna ColSeh, ColSeh,....Col Sehn). Ambos registros de desplazamiento de selección de columna están controlados simultáneamente por la señal de datos horizontal DH y la señal de reloj horizontal CH para proporcionar las respectivas señales de selección de columna, como se describe más adelante en relación con la Figura 18. Como se muestra en la Figura 15, la última señal de selección de columna ColSel512 también se puede tomar como una salida opcional de la matriz 100 como la señal LSTH (Horizontal de última etapa), que proporciona una indicación (por ejemplo, con fines de diagnóstico) de que la última columna de la matriz se ha seleccionado.

Con referencia nuevamente por el momento a la Figura 7, una implementación para la selección de hileras y columnas de matrices basada en registros de desplazamiento, como se describió anteriormente en relación con las Figuras 13-15, es una mejora significativa del enfoque del decodificador de hileras y columnas empleado en varios diseños de matrices de ISFET de la técnica anterior, incluido el diseño de Milgrew y otros se muestra en la Figura 7. En particular, con respecto al decodificador de hilera 92 y el decodificador de columna 94 que se muestran en la Figura 7, la complejidad de implementar estos componentes en un diseño de matriz de circuito integrado aumenta drásticamente a medida que aumenta el tamaño de la matriz, ya que se requieren entradas adicionales para ambos decodificadores. Por ejemplo, una matriz que tiene 512 hileras y columnas como se describió anteriormente en relación con la Figura 13 requeriría nueve entradas (29 = 512) por decodificador de hilera y columna si se empleara tal esquema para la selección de hilera y columna; de manera similar, las matrices que tienen 7400 hileras y 7400 columnas, como se describe a continuación en relación con otras realizaciones, requerirían 13 entradas (213 = 8192) por decodificador de hilera y columna. Por el contrario, los registros de desplazamiento de selección de hilera y columna que se muestran en las Figuras 14 y 15 no requieren señales de entrada adicionales a medida que aumenta el tamaño de la matriz, sino biestables de tipo D adicionales (que se implementan de forma rutinaria en un proceso CMOS). Por lo tanto, las implementaciones del registro de desplazamiento mostradas en las Figuras 14 y 15 proporcionan una solución fácilmente escalable para la selección de hileras y columnas de matrices.

En la realización de la Figura 13, el registro de desplazamiento de selección de columna "impar" 1941 proporciona señales de selección de columna impar a un controlador de salida "impar" 1981 y el registro de desplazamiento de selección de columna par 1942 proporciona señales de selección de columna par a un controlador de salida "par" controlador de salida 1982. Ambos controladores de salida están configurados de manera similar, y en la Figura 16 se muestra un ejemplo del controlador de salida par 1982. En particular, la Figura 16 muestra que las respectivas señales de salida de columna pares V^col2, V^col4,...V^col512 (consulte la Figura 9 para la salida de señal de columna genérica Vcolí) se aplican a los conmutadores correspondientes 1912, 1914,...19E i2, en respuesta a las señales de selección de columna par ColSeh, ColSel4,....ColSel5i2 proporcionadas por el registro de selección de columna 1942, para acoplar sucesivamente las señales de salida de columna par a la entrada de un amplificador amortiguador 199 (BUF) a través de un bus 175. En la Figura 16, el amplificador amortiguador 199 recibe energía de una tensión de suministro positivo del amortiguador de salida VDDO y de una tierra de suministro del amortiguador de salida V^sSO, y responde a una tensión de polarización del amortiguador de salida VBO0 para establecer una corriente de polarización correspondiente para la salida del amortiguador. Dada la entrada de alta impedancia del amplificador amortiguador 199, un sumidero de corriente 197 que responde a una tensión de polarización VB3 se acopla al bus 175 para proporcionar una corriente de excitación adecuada (por ejemplo, del orden de aproximadamente 100 ^jA) para la salida del amortiguador de salida de la columna (consulte el amplificador amortiguador 111j de la Figura 9) de una columna seleccionada. El amplificador amortiguador 199 proporciona la señal de salida Vsal2 en base a la columna par seleccionada de la matriz; al mismo tiempo, con referencia a la Figura 13, un amplificador amortiguador correspondiente del controlador de salida "impar" 198i proporciona la señal de salida Vsall basada en una columna impar seleccionada de la matriz.

En una implementación ilustrativa, los conmutadores de los controladores de salida par e impar 198i y 1982 (por ejemplo, los conmutadores 1912, 1914, 191512 que se muestran en la Figura 16) pueden implementarse como puertas de transmisión pares CMOS (incluido un MOSFET de canal n y un MOSFET de canal p; consulte la Figura 4) e inversores para que cada señal de selección de columna y su complemento puedan aplicarse a un conmutador de puerta de transmisión dado 191 para permitir la conmutación. Cada conmutador 191 tiene una resistencia en serie cuando está habilitado o "encendido" para acoplar una señal de salida de columna correspondiente al bus 175; igualmente, cada conmutador añade una capacitancia al bus 175 cuando el conmutador está apagado. Un conmutador más grande reduce la resistencia en serie y permite una corriente de excitación más alta para el bus 175, lo que generalmente permite que el bus 175 se estabilice más rápidamente; por otro lado, un conmutador más grande aumenta la capacitancia del bus 175 cuando el conmutador está apagado, lo que a su vez aumenta el tiempo de estabilización del bus 175. Por lo tanto, existe una compensación entre la resistencia y la capacitancia en serie del conmutador en relación con el tamaño del conmutador.

La capacidad del bus 175 para establecerse rápidamente después de la habilitación de conmutadores sucesivos facilita a su vez la adquisición rápida de datos de la matriz. Con este fin, en algunas realizaciones, los conmutadores 191 de los controladores de salida 198i y 1982 están particularmente configurados para reducir significativamente el tiempo de estabilización del bus 175. Tanto los MOSFET de canal n como de canal p de un conmutador dado se suman a la capacitancia del bus 175; sin embargo, los MOSFET de canal n generalmente tienen una mejor respuesta de frecuencia y capacidades de conducción de corriente que sus contrapartes de canal p. En vista de lo anterior, algunas de las características superiores de los MOSFET de canal n pueden aprovecharse para mejorar el tiempo de estabilización del bus 175 implementando conmutadores "asimétricos" en los que los tamaños respectivos para el MOSFET de canal n y el MOSFET de canal p de un conmutador dado son diferentes.

Por ejemplo, en una realización, con referencia a la Figura 16, el sumidero de corriente 197 puede configurarse de manera que el bus 175 normalmente se "baja" cuando todos los conmutadores 1912, 1914,_I9I512 están abiertos o apagado (no conducen). Dado un rango dinámico de señal esperado algo limitado para las señales de salida de columna basadas en mediciones ISFET, cuando un conmutador determinado está habilitado o encendido (conduciendo), en muchos casos, la mayor parte de la conducción la realiza el MOSFET de canal n del par CMOS que constituye el conmutador. En consecuencia, en un aspecto de esta realización, el MOSFET de canal n y el MOSFET de canal p de cada conmutador 191 tienen un tamaño diferente; específicamente, en una implementación ilustrativa, el MOSFET de canal n tiene un tamaño significativamente mayor que el MOSFET de canal p. Más específicamente, considerando los MOSFET de canal n y canal p de igual tamaño como punto de referencia, en una implementación, el MOSFET de canal n se puede aumentar para que sea de 2 a 2,5 veces más grande, y el MOSFET de canal p se puede reducir en tamaño de 8 a 10 veces más pequeño, de manera que el MOSFET de canal n es aproximadamente 20 veces más grande que el MOSFET de canal p. Debido a la disminución significativa en el tamaño del MOSFET de canal p y el aumento relativamente modesto en el tamaño del MOSFET de canal n, la capacitancia general del conmutador en el estado apagado se reduce notablemente y hay una reducción notable correspondiente en la capacitancia para el bus 175; al mismo tiempo, debido al MOSFET de canal n más grande, hay un aumento significativo en la capacidad de conducción de corriente, la respuesta de frecuencia y la transconductancia del conmutador, lo que a su vez da como resultado una reducción significativa en el tiempo de estabilización del bus 175.

Si bien el ejemplo anterior describe conmutadores asimétricos 191 para los controladores de salida 198i y 1982 en los que el MOSFET de canal n es más grande que el MOSFET de canal p, debe apreciarse que en otra realización, se puede implementar lo contrario, específicamente, conmutadores asimétricos en los que el MOSFET de canal p es más grande que el MOSFET de canal n. En un aspecto de esta realización, con referencia nuevamente a la Figura 16, el sumidero de corriente 197 puede servir alternativamente como una fuente de corriente para impulsar adecuadamente la salida del amortiguador de salida de columna (ver el amplificador amortiguador l l l j de la Figura 9) de una columna seleccionada, y configurarse de manera que el bus 175 normalmente se "suba" cuando todos los conmutadores 1912, 1914,.... 191512 están abiertos o apagados (sin conducir). En esta situación, la mayor parte de la conducción del conmutador puede realizarse por el MOSFET de canal p del par CMOS que constituye el conmutador. Los beneficios de la capacitancia del conmutador reducida (y, por lo tanto, la capacitancia del bus reducida) pueden obtenerse en esta realización, aunque el efecto beneficioso general del tiempo de estabilización reducido para el bus 175 puede ser algo menor que el descrito anteriormente, debido a la respuesta de frecuencia más baja de p MOSFET de canal en comparación con MOSFET de canal n. Sin embargo, los conmutadores asimétricos basados en MOSFET de canal p más grandes aún pueden facilitar una reducción notable en el tiempo de estabilización del bus y también pueden proporcionar implementaciones de circuitos en las que el amplificador amortiguador de salida de columna (111j de la Figura 9) puede ser un seguidor de fuente atado al cuerpo con una ganancia notablemente mayor.

En aún otra realización dirigida a facilitar la estabilización rápida del bus 175 que se muestra en la Figura 16, se puede apreciar que menos conmutadores 191 acoplados al bus 175 dan como resultado una capacitancia del bus más pequeña. Con esto en mente, y con referencia nuevamente a la Figura 13, en aún otra realización, se pueden emplear más de dos controladores de salida 1981 y 1982 en la matriz del ISFET 100 de manera que cada controlador de salida gestione un número menor de columnas de la matriz. Por ejemplo, en lugar de tener todas las columnas pares gestionadas por un controlador y todas las columnas impares gestionadas por otro controlador, la matriz puede incluir cuatro registros de selección de columna 1941,2,3,4 y cuatro controladores de salida correspondientes 1981,2,3, 4 de manera que cada controlador de salida gestione una cuarta parte del total de columnas de la matriz, en lugar de la mitad de las columnas. En tal implementación, cada controlador de salida tendría la mitad del número de conmutadores 191 en comparación con la realización descrita anteriormente en relación con la Figura 16, y el bus 175 de cada controlador de salida tendría una capacitancia más baja correspondiente, mejorando de esta manera el tiempo de estabilización del bus. Si bien se describen cuatro controladores de salida con fines ilustrativos en este ejemplo, debe apreciarse que la presente descripción no está limitada en este sentido, y prácticamente cualquier número de controladores de salida mayor que dos puede emplearse para mejorar el tiempo de estabilización del bus en el escenario descrito arriba. Otras realizaciones de matriz en las que se emplean más de dos controladores de salida para facilitar la adquisición rápida de datos de la matriz se describen con mayor detalle a continuación (por ejemplo, en relación con las Figuras 19-23).

Con fines ilustrativos, el bus 175 puede tener una capacitancia en el rango de aproximadamente 5 pF a 20 pF en cualquiera de las realizaciones descritas inmediatamente arriba (por ejemplo, conmutadores simétricos, conmutadores asimétricos, mayor número de controladores de salida, etc.). Por supuesto, debe apreciarse que la capacitancia del bus 175 no se limita a estos valores ilustrativos, y que son posibles otros valores de capacitancia en diferentes implementaciones de una matriz según la presente descripción.

En un aspecto del diseño de matriz descrito anteriormente en relación con las Figuras 13-16, se proporcionan en la matriz conexiones de tensión de suministro analógico independientes (para VDDA, V^sSA), conexiones de tensión de suministro digital (para VDDD, V^sSD) y conexiones de tensión de suministro de amortiguador de salida (para VDDO, VsSO) para facilitar el aislamiento del ruido y reducir la diafonía de la señal entre varios componentes de la matriz, lo que aumenta la relación señal-ruido (SNR) de las señales de salida Vsal1 y Vsal2. En una implementación ilustrativa, las tensiones de suministro positivos VDDA, VDDD y VDDO pueden ser cada una de aproximadamente 3,3 voltios. En otro aspecto, estas tensiones respectivamente pueden ser proporcionadas "fuera del chip" por una o más fuentes de tensión programables, como se describe más adelante en relación con la Figura 17.

La Figura 17 ilustra un diagrama de bloques de la matriz de sensores 100 de la Figura 13 acoplada a un controlador de matriz 250, según una realización de la presente descripción. En varias implementaciones de ejemplo, el controlador de matriz 250 puede fabricarse como un controlador "independiente", o como una o más "tarjetas" compatibles con ordenador que forman parte de un ordenador 260, como se describió anteriormente en relación con la Figura 8. En un aspecto, las funciones del controlador de matriz 250 pueden ser controladas por el ordenador 260 a través de un bloque de interfaz 252 (por ejemplo, interfaz en serie, mediante puerto USB o bus PCI, conexión Ethernet, etc.), como se muestra en la Figura 17. En una realización, la totalidad o una parte del controlador de matriz 250 se fabrica como una o más placas de circuito impreso, y la matriz 100 está configurada para conectarse a una de las placas de circuito impreso, similar a un chip IC convencional (por ejemplo, la matriz 100 está configurada como un ASIC que se conecta a un enchufe de chip, tal como un enchufe de fuerza de inserción nula o "ZIF", de una placa de circuito impreso). En un aspecto de dicha realización, una matriz 100 configurada como un ASIC puede incluir una o más conexiones de patillas/de terminales dedicadas a proporcionar un código de identificación, indicado como "ID" en la Figura 17, al que la matriz controlador 250 puede acceder/leer y/o pasar al ordenador 260. Dicho código de identificación puede representar varios atributos de la matriz 100 (por ejemplo, tamaño, número de píxeles, número de señales de salida, varios parámetros de funcionamiento, como tensiones de alimentación y/o polarización, etc.) y puede procesarse para determinar los modos de funcionamiento correspondientes, parámetros y/o señales proporcionadas por el controlador de matriz 250 para garantizar un funcionamiento adecuado con cualquiera de varios tipos diferentes de matrices 100. En una implementación ilustrativa, una matriz 100 configurada como un ASIC puede tener tres patillas dedicadas a un código de identificación y, durante el proceso de fabricación, el ASIC puede codificarse para proporcionar uno de los tres posibles estados de tensión en cada una de estas tres patillas (es decir, un esquema de codificación de patilla de tres estados) para leerse por el controlador de matriz 250, proporcionando de esta manera 27 códigos de identificación de matriz únicos. En otro aspecto de esta realización, la totalidad o partes del controlador de matriz 250 pueden implementarse como una matriz de puertas programares en campo (FPGA) configurada para realizar varias funciones de controlador de matriz descritas con más detalle a continuación.

En general, el controlador de matriz 250 proporciona varias tensiones de suministro y tensiones de polarización a la matriz 100, así como varias señales relacionadas con la selección de hileras y columnas, muestreo de salidas de píxeles y adquisición de datos. En particular, el controlador de matriz 250 lee una o más señales de salida analógicas (por ejemplo, Vsal1 y Vsal2) que incluyen señales de tensión de píxeles respectivas multiplexadas de la matriz 100 y luego digitaliza estas señales de píxeles respectivas para proporcionar datos de medición al ordenador 260, que a su vez podrá almacenar y/o procesar los datos. En algunas implementaciones, el controlador de matriz 250 también puede configurarse para realizar o facilitar varias funciones de diagnóstico y calibración de matriz, y un tratamiento de radiación UV de matriz opcional como se describió anteriormente en relación con la Figura 11A.

Como se ilustra en la Figura 17, el controlador de matriz 250 generalmente proporciona a la matriz 100 la tensión de suministro analógico y tierra (VDDA, VsSA), la tensión de suministro digital y tierra (VDDD, VsSD) y la tensión de suministro de salida de amortiguador y tierra (VDDO, V^sSO). En una implementación ilustrativa, cada una de las tensiones de suministro VDDA, VDDD y VDDO es de aproximadamente 3,3 voltios. En otra implementación, las tensiones de suministro VDDA, VDDD y VDDO pueden ser tan bajas como aproximadamente 1,8 voltios. Como se describió anteriormente, en un aspecto, cada una de estas tensiones de suministro de energía se proporciona a la matriz 100 a través de trayectorias de conducción separadas para facilitar el aislamiento del ruido. En otro aspecto, estas tensiones de suministro pueden originarse en los respectivos reguladores/suministros de energía, o una o más de estas tensiones de suministro pueden originarse en una fuente común en un suministro de energía 258 del controlador de matriz 250. La fuente de alimentación 258 también puede proporcionar las diversas tensiones de polarización que se pueden usar para el funcionamiento de la matriz (por ejemplo, VB1, VB2, VB3, VB4, VBO0, Vcuerpo) y la tensión de referencia VREF utilizada para el diagnóstico y la calibración de la matriz.

En otro aspecto, el suministro de alimentación 258 incluye uno o más convertidores de digital a analógico (DAC) que pueden controlarse por el ordenador 260 para permitir que cualquiera o todas las tensiones de polarización, la tensión de referencia y las tensiones de suministro se cambien bajo control de software (es decir, ajustes de polarización programables). Por ejemplo, una fuente de alimentación 258 que responda al control del ordenador (por ejemplo, a través de la ejecución del software) puede facilitar el ajuste de una o más de las tensiones de alimentación (por ejemplo, cambiar entre 3,3 voltios y 1,8 voltios según el tipo de chip representado por un código de identificación) y/o el ajuste de una o más de las tensiones de polarización VB1 y VB2 para la corriente de drenaje de píxeles, VB3 para el accionamiento con bus de columna, VB4 para el ancho de banda del amplificador de columna y VBO0 para la generación de corriente de amortiguador de salida de columna. En algunos aspectos, se pueden ajustar una o más tensiones de polarización para optimizar los tiempos de establecimiento de las señales de los píxeles habilitados. Además, la tensión de cuerpo común Vcuerpo para todos los ISFET de la matriz se puede conectar a tierra durante un tratamiento opcional de irradiación UV posterior a la fabricación para reducir la carga atrapada y luego acoplarse a una tensión más alta (por ejemplo, VDDA) durante el análisis de diagnóstico, la calibración y funcionamiento normal de la matriz para medición/adquisición de datos. Asimismo, la tensión de referencia VREF se puede variar para facilitar una variedad de funciones de diagnóstico y calibración.

Como también se muestra en la Figura 17, el electrodo de referencia 76 que normalmente se emplea en relación con una solución de analito que va a medir la matriz 100 (como se explicó anteriormente en relación con la Figura 1), puede acoplarse al suministro de alimentación 258 para proporcionar un potencial de referencia para las tensiones de salida de píxeles. Por ejemplo, en una implementación, el electrodo de referencia 76 se puede acoplar a una tierra de suministro (por ejemplo, la tierra analógica VsSA) para proporcionar una referencia para las tensiones de salida de píxeles en base a la Ecuación (3) arriba. En otras implementaciones ilustrativas, la tensión del electrodo de referencia puede establecerse colocando una solución/muestra de interés que tenga un nivel de pH conocido cerca de la matriz de sensores 100 y ajustando la tensión del electrodo de referencia hasta que las señales de salida de la matriz Vsal1 y Vsal2 proporcionen tensiones de píxel en un nivel de referencia deseado, a partir del cual los cambios posteriores en las tensiones de los píxeles reflejan cambios locales en el pH con respecto al nivel de pH de referencia conocido. En general, debe apreciarse que una tensión asociada con el electrodo de referencia 76 no tiene que ser necesariamente idéntica a la tensión de referencia VREF descrita anteriormente (que puede emplearse para una variedad de funciones de calibración y diagnóstico de matriz), aunque en algunas implementaciones la tensión de referencia VREF proporcionada por el suministro de alimentación 258 puede usarse para establecer la tensión del electrodo de referencia 76.

Con respecto a la adquisición de datos de la matriz 100, en una realización, el controlador de matriz 250 de la Figura 17 puede incluir uno o más preamplificadores 253 para amortiguar aún más una o más señales de salida (por ejemplo, Vsal1 y Vsal2) de la matriz de sensores y proporcionar una ganancia seleccionable. En un aspecto, el controlador de matriz 250 puede incluir un preamplificador para cada señal de salida (por ejemplo, dos preamplificadores para dos señales de salida analógicas). En otros aspectos, los preamplificadores pueden configurarse para aceptar tensiones de entrada de 0,0 a 1,8 voltios o de 0,0 a 3,3 voltios, pueden tener ganancias programables/seleccionables por ordenador (por ejemplo, 1, 2, 5, 10 y 20) y salidas de bajo ruido (por ejemplo,, <10 nV/sqrtHz), y puede proporcionar filtrado de paso bajo (por ejemplo, anchos de banda de 5 MHz y 25 MHz). Con respecto a la reducción de ruido y al aumento de la relación señal/ruido, en una implementación en la que la matriz 100 está configurada como un ASIC colocado en un enchufe de chip de una placa de circuito impreso que contiene la totalidad o una parte del controlador de matriz 250, los condensadores de filtrado pueden emplearse cerca del enchufe del chip (por ejemplo, la parte inferior de un enchufe ZIF) para facilitar la reducción del ruido. En todavía otro aspecto, los preamplificadores pueden tener una compensación programable/seleccionable por ordenador para señales de tensión de entrada y/o salida para establecer un nivel nominal para cualquiera en un rango deseado.

El controlador de matriz 250 de la Figura 17 también comprende uno o más convertidores de analógico a digital 254 (ADC) para convertir las señales de salida de la matriz de sensores Vsal1 y Vsal2 en salidas digitales (por ejemplo, 10 bits o 12 bits) para proporcionar datos al ordenador 260. En un aspecto, se puede emplear un ADC para cada salida analógica de la matriz de sensores, y cada ADC se puede acoplar a la salida de un preamplificador correspondiente (si se emplean preamplificadores en una implementación dada). En otro aspecto, los ADC pueden tener un rango de entrada seleccionable por ordenador (por ejemplo, 50 mV, 200 mV, 500 mV, 1 V) para facilitar la compatibilidad con diferentes rangos de señales de salida de matriz y/o parámetros de preamplificador. En otros aspectos más, el ancho de banda de los ADC puede ser superior a 60 MHz, y la velocidad de adquisición/conversión de datos superior a 25 MHz (por ejemplo, tan alta como 100 MHz o superior).

En la realización de la Figura 17, la temporización de adquisición del ADC y la selección de hileras y columnas de matriz pueden controlarse mediante un sincronizador 256. En particular, el sincronizador proporciona los datos verticales digitales y las señales de reloj (DV, CV) para controlar la selección de hileras, los datos horizontales digitales y las señales de reloj (DH, CH) para controlar la selección de columnas, y la muestra de columna y la señal de retención COL SH para muestrear las respectivas tensiones de píxeles para una hilera habilitada, como se describió anteriormente en relación con la Figura 9. El sincronizador 256 también proporciona una señal de reloj CS de muestreo al ADC 254 para muestrear y digitalizar adecuadamente valores de píxeles consecutivos en el flujo de datos de una señal de salida analógica de matriz dada (por ejemplo, Vsal1 y Vsal2), como se explica más adelante a continuación en relación con la Figura 18. En algunas implementaciones, el sincronizador 256 puede implementarse mediante un código de ejecución de microprocesador y configurarse como un generador de patrones digitales multicanal para proporcionar señales de control sincronizadas apropiadamente. En una implementación ilustrativa, el generador de sincronización 256 puede implementarse como una matriz de puertas programables en campo (FPGA).

La Figura 18 ilustra un diagrama de temporización ilustrativo para varias señales de control de matriz, proporcionadas por el sincronizador 256, para adquirir datos de píxeles de la matriz de sensores 100. Para los propósitos de la siguiente descripción, una "trama" se define como un conjunto de datos que incluye un valor (por ejemplo, señal de salida de píxel o tensión Vs) para cada píxel en la matriz, y una "velocidad de trama" se define como la velocidad a la que se pueden adquirir tramas sucesivas de la matriz. Por lo tanto, la velocidad de tramas corresponde esencialmente a una "velocidad de muestreo de píxeles" para cada píxel de la matriz, ya que los datos de cualquier píxel dado se obtienen a la velocidad de tramas.

En el ejemplo de la Figura 18, se elige una velocidad de tramas ilustrativa de 20 tramas/segundo para ilustrar el funcionamiento de la matriz (es decir, selección de hileras y columnas y adquisición de señales); sin embargo, debe apreciarse que las matrices y los controladores de matriz según la presente descripción no están limitados en este sentido, ya que las diferentes velocidades de trama, incluidas las velocidades de trama más bajas (por ejemplo, 1 a 10 tramas/segundo) o las velocidades de tramas más altas (por ejemplo, 25, 30, 40, 50, 60, 70 a 100 tramas/seg., etc.), con matrices que tienen el mismo o mayor número de píxeles. En algunas aplicaciones ilustrativas, se puede adquirir un conjunto de datos que incluye muchas tramas durante varios segundos para realizar un experimento en un analito o analitos dados. Se pueden realizar varios de estos experimentos uno tras otro, en algunos casos con pausas entre ellos para permitir la transferencia/procesamiento de datos y/o el lavado del ASIC de la matriz de sensores y la preparación de reactivos para un experimento posterior.

Por ejemplo, con respecto al método para detectar la incorporación de nucleótidos, se pueden elegir velocidades de tramas apropiadas para muestrear suficientemente la señal de salida del ISFET. En algunas implementaciones ilustrativas, una señal de iones de hidrógeno puede tener un ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) del orden de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 2,5 segundos, dependiendo del número de eventos de incorporación de nucleótidos. Dados estos valores ilustrativos, una velocidad de tramas (o velocidad de muestreo de píxeles) de 20 Hz es suficiente para resolver de manera confiable las señales en la señal de salida de un píxel dado. Nuevamente, las velocidades de tramas proporcionadas en este ejemplo se proporcionan principalmente con fines ilustrativos, y otras implementaciones pueden involucrar diferentes frecuencias de trama.

En una implementación, el controlador de matriz 250 controla la matriz 100 para habilitar hileras sucesivamente, una a la vez. Por ejemplo, con referencia nuevamente por el momento a la Figura 9, una primera hilera de píxeles se habilita a través de la señal de selección de hilera RowSel-i. Se permite que los píxeles habilitados se estabilicen durante un período de tiempo, después del cual la señal COL SH se activa brevemente para cerrar el conmutador de muestra/retención en cada columna y almacenar en el condensador de muestra/retención de la columna Csh el valor de tensión emitido por el primer píxel en la columna Esta tensión está entonces disponible como la tensión de salida de columna Vcolj aplicado a uno de los dos controladores de salida de matriz (columna par e impar) 1981 y 1982 (por ejemplo, consulte la Figura 16). A continuación, se anula la señal COL SH, abriendo de esta manera los conmutadores de muestra/retención en cada columna y desacoplando el amortiguador de salida de columna 111j de los amplificadores de columna 107A y 107B. Poco después, la segunda hilera de píxeles se habilita a través de la señal de selección de hilera RowSeh. Durante el período de tiempo en el que se permite que se estabilice la segunda hilera de píxeles, las señales de selección de columna se generan de dos en dos (una impar y una par; las señales de selección de columna impar se aplican una tras otra al controlador de salida impar, las señales de selección de columna par) las señales se aplican una tras otra al controlador de salida par) para leer las tensiones de salida de la columna asociadas con la primera hilera. Por lo tanto, mientras una hilera dada en la matriz se habilita y se estabiliza, la hilera anterior se lee, de dos columnas a la vez. Al escalonar la selección de hileras y el muestreo/lectura (por ejemplo, a través de diferentes señales de reloj verticales y horizontales y muestra/retención de columnas), y al leer varias columnas a la vez para una hilera dada, se puede adquirir una trama de datos de la matriz en una manera significativamente simplificada.

La Figura 18 ilustra los detalles de temporización del proceso anterior para una velocidad de tramas ilustrativa de 20 tramas/seg. Dada esta velocidad de tramas y 512 hileras en la matriz, cada hilera debe leerse en aproximadamente 98 microsegundos, como lo indican las delineaciones verticales en la Figura 18. En consecuencia, la señal de reloj vertical CV tiene un período de 98 microsegundos (es decir, una frecuencia de reloj de más de 10 kHz), habilitando una nueva hilera en un borde posterior (transición negativa) de la señal CV. El lado izquierdo de la Figura 18 refleja el comienzo de un nuevo ciclo de trama, momento en el que la señal de datos vertical Dv se afirma antes del primer flanco posterior de la señal CV y se anula antes del siguiente borde posterior de la señal CV (por adquisición de datos de tramas sucesivas, la señal de datos verticales se reafirma nuevamente solo después de que se habilita la hilera 512). Además, inmediatamente antes de cada borde posterior de la señal CV (es decir, nueva hilera habilitada), la señal COL SH se afirma durante 2 microsegundos, dejando aproximadamente 50 nanosegundos antes del borde posterior de la señal CV.

En la Figura 18, la primera aparición de la señal COL SH muestrea en realidad los valores de píxel de 512 hileras de la matriz. Por lo tanto, en el primer borde posterior de la señal CV, la primera hilera se habilita y se deja estabilizar (durante aproximadamente 96 microsegundos) hasta la segunda aparición de la señal COL SH. Durante este tiempo de estabilización para la primera hilera, los valores de píxel de 512 hileras se leen a través de las señales de selección de columna. Debido a que se generan dos señales de selección de columna simultáneamente para leer 512 columnas, la señal de reloj horizontal CH debe generar 256 ciclos dentro de este período, cada borde posterior de la señal CH genera una señal de selección de columna impar y una par. Como se muestra en la Figura 18, el primer borde posterior de la señal CH en una hilera dada está programado para que se produzca dos microsegundos después de la selección de la hilera (después de la desactivación de la señal COL SH) para permitir el establecimiento de los valores de tensión almacenados en los condensadores de muestra/retención Csh y proporcionados por los amortiguadores de salida de la columna. Sin embargo, debe apreciarse que, en otras implementaciones (por ejemplo, como se describe a continuación en relación con la Figura 18A), el período de tiempo entre el primer borde posterior de la señal CH y un borde posterior (es decir, desactivación) de la señal COL SH puede ser significativamente menos de dos microsegundos y, en algunos casos, tan pequeño como poco más de 50 nanosegundos. También para cada hilera, la señal de datos horizontal DH se afirma antes del primer borde posterior de la señal CH y se desactiva antes del siguiente borde posterior de la señal CH. Las dos últimas columnas (por ejemplo, 511 y 512) se seleccionan antes de que se produzca la señal COL SH que, como se explicó anteriormente, se produce aproximadamente dos microsegundos antes de que se habilite la siguiente hilera. Por lo tanto, se leen 512 columnas, dos a la vez, dentro de un período de tiempo de aproximadamente 94 microsegundos (es decir, 98 microsegundos por hilera, menos dos microsegundos al principio y al final de cada hilera). Esto da como resultado una velocidad de datos para cada una de las señales de salida de la matriz Vsal1 y Vsal2 de aproximadamente 2,7 MHz.

La Figura 18A ilustra otro diagrama de tiempo de un proceso de adquisición de datos de una matriz 100 que está ligeramente modificado del diagrama de tiempo de la Figura 18. Como se describió anteriormente en relación con la Figura 13, en algunas implementaciones, una matriz similar a la que se muestra en la Figura 13 puede configurarse para incluir una región de 512 por 512 píxeles "activos" que están rodeados por un perímetro de píxeles de referencia (es decir, la primera y las últimas dos hileras y columnas de la matriz), lo que da como resultado una matriz que tiene un conteo total de píxeles de 516 por 516 píxeles. En consecuencia, dada la velocidad de tramas ilustrativa de 20 tramas/seg y 516 hileras en la matriz, cada hilera debe leerse en aproximadamente 97 microsegundos, como indican las delineaciones verticales en la Figura 18A. En consecuencia, la señal de reloj vertical CV tiene un período ligeramente menor de 97 microsegundos. Debido a que se generan dos señales de selección de columna simultáneamente para leer 516 columnas, la señal de reloj horizontal CH debe generar 258 ciclos dentro de este período, a diferencia de los 256 ciclos a los que se hace referencia en relación con la Figura 18. En consecuencia, en un aspecto ilustrado en la Figura 18A, el primer borde posterior de la señal CH en una hilera determinada está sincronizado para que se produzca justo a más de 50 nanosegundos desde el borde posterior (es decir, la desactivación) de la señal COL SH, para que "comprima" ciclos de reloj horizontales adicionales en un período ligeramente más pequeño de la señal de reloj vertical CV. Como en la Figura 18, la señal de datos horizontal DH se afirma antes del primer borde posterior de la señal CH y, como tal, también aparece un poco antes en el diagrama de tiempo de la Figura 18A en comparación con la Figura 18. Las últimas dos columnas (es decir, las columnas 515 y 516, etiquetadas como "Ref3,4 en la Figura 18A) se seleccionan antes de que se produzca la señal COL SH que, como se mencionó anteriormente, se produce aproximadamente dos microsegundos antes de que se habilite la siguiente hilera. Por lo tanto, se leen 516 columnas, dos a la vez, dentro de un período de tiempo de aproximadamente 95 microsegundos (es decir, 97 microsegundos por hilera, menos dos microsegundos al final de cada hilera y un tiempo insignificante al principio de cada hilera). Esto da como resultado esencialmente la misma velocidad de datos para cada una de las señales de salida Vsal1 y Vsal2 de la matriz proporcionada por el diagrama de tiempo de la Figura 18, es decir, aproximadamente 2,7 MHz.

Como se describió anteriormente en relación con la Figura 17, el sincronizador 256 también genera la señal de reloj CS de muestreo al (a los) ADC 254 para muestrear y digitalizar apropiadamente valores de píxeles consecutivos en el flujo de datos de una señal de salida de matriz dada. En un aspecto, la señal de reloj CS de muestreo permite muestrear un valor de píxel dado en el flujo de datos al menos una vez. Aunque la señal de reloj CS de muestreo no se muestra en los diagramas de temporización de las Figuras 18 y 18A, se puede apreciar que en implementaciones ilustrativas la señal CS puede seguir esencialmente la temporización de la señal de reloj horizontal CH; en particular, la señal de reloj CS de muestreo puede coordinarse con la señal de reloj horizontal CH para hacer que los ADC muestreen un valor de píxel inmediatamente antes de que CH habilite un valor de píxel siguiente en el flujo de datos, lo que permite de esta manera tanto tiempo de estabilización de la señal como sea posible antes de muestrear un valor de píxel dado. Por ejemplo, los ADC pueden configurarse para muestrear un valor de píxel de entrada en una transición positiva de CS, y el sincronizador 256 puede sincronizar las respectivas transiciones positivas de CS para que se produzcan inmediatamente antes o, en algunos casos, esencialmente coincidentes con transiciones negativas respectivas de CH, para muestrear un píxel dado justo antes de habilitar el siguiente píxel en el flujo de datos. En otra implementación ilustrativa, los ADC 254 pueden controlarse por el sincronizador 256 a través de la señal de reloj CS de muestreo para muestrear las señales de salida Vsal1 y Vsal2 a una velocidad significativamente mayor para proporcionar múltiples muestras digitalizadas para cada medición de píxel, lo que puede luego promediarse (por ejemplo, la velocidad de adquisición de datos del ADC puede ser de aproximadamente 100 MHz para muestrear las señales de salida de la matriz de 2,7 MHz, proporcionando de esta manera hasta aproximadamente 35-40 muestras por medición de píxel).

En una realización, una vez que los ADC 254 muestrean y digitalizan los valores de píxeles, el ordenador 260 puede programarse para procesar datos de píxeles obtenidos de la matriz 100 y el controlador de matriz 250 para facilitar altas velocidades de adquisición de datos que en algunos casos pueden exceder un tiempo de estabilización suficiente para las tensiones de píxeles representados en una señal de salida de matriz dada. En la Figura 18B se ilustra un diagrama de flujo que ilustra un método ilustrativo que puede implementar el ordenador 260 para procesar y corregir datos de matriz adquiridos a altas velocidades de adquisición. En varios aspectos de esta realización, el ordenador 260 está programado para caracterizar primero un tiempo de estabilización suficiente para las tensiones de píxeles en una señal de salida de matriz dada, así como la respuesta de matriz a frecuencias operativas apreciablemente altas, utilizando una entrada de referencia o "seca" a la matriz (por ejemplo, no hay analito presente). Esta caracterización forma la base para derivar factores de corrección que posteriormente se aplican a los datos obtenidos de la matriz a las altas frecuencias operativas y en presencia de un analito a medir.

Con respecto al tiempo de estabilización de píxeles, con referencia nuevamente a la Figura 16, como se describió anteriormente, una señal de salida de matriz dada (por ejemplo, Vsal2 en la Figura 16) incluye una serie de valores de tensión de píxeles que resultan de la operación secuencial de los conmutadores de selección de columna 191 para aplicar las respectivas tensiones de columna VoOLj a través del bus 175 al amplificador amortiguador 199 (las respectivas tensiones de columna VcoLj representan a su vez versiones amortiguadas de las tensiones de la fuente ISFET VSj). En algunas implementaciones, se observa que los cambios de tensión AVpix en la señal de salida de la matriz entre dos lecturas de píxeles consecutivas se caracterizan como un proceso exponencial dado por

AK„z(() = i ( l - ^ ) , (PP)

donde A es la diferencia (VcoLj - Vcolj-1) entre dos valores de tensión de píxel y k es una constante de tiempo asociada con una capacitancia del bus 175. Las Figuras 18C y 18D ilustran tensiones de píxel ilustrativas en una señal Vsal de salida de matriz dada (por ejemplo, una de Vsal1 y Vsal2) que muestran transiciones de píxel a píxel en la señal de salida en función del tiempo, graficadas contra señales de reloj CS de muestreo ilustrativas. En la Figura 18C, la señal de reloj CS de muestreo tiene un período 524, y un ADC controlado por CS muestrea una tensión de píxel en una transición positiva de CS (como se describió anteriormente, en una implementación, CS y CH tienen esencialmente el mismo período). La Figura 18C indica dos muestras 525A y 525B, entre las cuales se puede observar fácilmente una transición de tensión exponencial 522 correspondiente a AV^{p ix} (t), entre una diferencia de tensión A.

Para los propósitos de la presente descripción, el "tiempo de estabilización" del píxel testabiiización se define como el tiempo t en el que A Vpix(t) alcanza un valor que difiere de su valor final en una cantidad que es igual al nivel máximo de ruido de la señal de salida de matriz. Si el nivel máximo de ruido de la señal de salida de la matriz se denota como np, entonces la tensión en el tiempo de estabilización testabiiización se indica en AVpix (testabuzación) = A[1 -(np/A)]. Sustituyendo en la Ecuación (PP) y se resuelve para rendimientos testabilización

La Figura 18D ilustra conceptualmente un tiempo de estabilización de píxeles testabilización (número de referencia 526) para una única transición de tensión 522 entre dos tensiones de píxeles que tienen una diferencia A, usando una señal de reloj CS de muestreo que tiene un período suficientemente largo para permitir una estabilización completa. Para proporcionar algunos parámetros ilustrativos con fines ilustrativos, en una implementación un valor máximo para A, que representa un rango máximo para transiciones de tensión de píxeles (por ejemplo, píxeles consecutivos en valores mínimo y máximo), es del orden de aproximadamente 250 mV. Además, un nivel de ruido máximo np de la señal de salida de la matriz se toma como aproximadamente 100 ^j V, y la constante de tiempo k se toma como 5 nanosegundos. Estos valores proporcionan un tiempo de estabilización testabiiización ilustrativo de aproximadamente 40 nanosegundos. Si se toma una velocidad de datos máxima de una señal de salida de matriz como el inverso del tiempo de estabilización testabinzacón, un tiempo de estabilización de 40 nanosegundos corresponde a una velocidad de datos máxima de 25 MHz. En otras implementaciones, A puede ser del orden de 20 mV y la constante de tiempo k puede ser del orden de 15 nanosegundos, lo que da como resultado un tiempo de estabilización testabilización de aproximadamente 80 nanosegundos y una velocidad de datos máxima de 12,5 MHz. Los valores de k indicados anteriormente corresponden generalmente a capacidades para el bus 175 en un rango de aproximadamente 5 pF a 20 pF. Debe apreciarse que los valores anteriores se proporcionan principalmente con fines ilustrativos, y que varias realizaciones no se limitan a estos valores ilustrativos; en particular, las matrices pueden tener diferentes tiempos de estabilización de píxeles testabilización (por ejemplo, en algunos casos menos de 40 nanosegundos).

Como se indicó anteriormente, en una realización, los datos de píxeles se pueden adquirir de la matriz a velocidades de datos que exceden las dictadas por el tiempo de estabilización de píxeles. La Figura 18B ilustra un diagrama de flujo para dicho método según una realización de la presente descripción. En el método de la Figura 18B, inicialmente se eligen frecuencias de reloj lo suficientemente lentas para las señales CV, CH y CS, de manera que la velocidad de datos resultante por señal de salida de la matriz sea igual o menor que el recíproco del tiempo de estabilización de píxeles testabiiización para permitir los valores de tensión de píxel completamente establecidos de píxel a píxel en una señal de salida dada. Con estas frecuencias de reloj, como se indica en el bloque 502 de la Figura 18B, se adquieren valores de tensión de píxel establecidos para toda la matriz en ausencia de un analito (o en presencia de un analito de referencia) para proporcionar una primera imagen de datos "secos" o de referencia para la matriz. En el bloque 504 de la Figura 18B, para cada tensión de píxel que constituye la primera imagen de datos, un valor de transición entre la tensión final del píxel y la tensión final del píxel inmediatamente anterior en el flujo de datos de la señal de salida correspondiente (es decir, la diferencia de tensión A) se recoge y almacena. La recogida de estos valores de transición para todos los píxeles de la matriz proporciona un primer conjunto de datos de valores de transición.

Posteriormente, en el bloque 506 de la Figura 18B, las frecuencias de reloj para las señales CV, CH y CS se incrementan de manera que la velocidad de datos resultante por señal de salida de matriz excede una velocidad en la que los valores de tensión de píxel se estabilizan por completo (es decir, una velocidad de datos mayor que el recíproco del tiempo de estabilización testabinzacón). Para los propósitos de la presente descripción, la velocidad de datos por señal de salida de matriz que resulta de la selección de tales frecuencias de reloj aumentadas para las señales CV, CH y CS se denomina "velocidad de datos de velocidad excesiva". Usando las frecuencias de reloj correspondientes a la velocidad de datos de velocidad excesiva, los valores de tensión de píxel se obtienen nuevamente para toda la matriz en ausencia de un analito (o en presencia del mismo analito de referencia) para proporcionar una segunda imagen de datos "seca" o de referencia para la matriz En el bloque 508 de la Figura 18B, se calcula y almacena un segundo conjunto de datos de valor de transición basado en la segunda imagen de datos obtenida a la velocidad de datos de velocidad excesiva, como se describió anteriormente para la primera imagen de datos.

En el bloque 510 de la Figura 18B, se calcula un factor de corrección para cada píxel de la matriz en base a los valores almacenados en el primer y segundo conjuntos de datos de valores de transición. Por ejemplo, se puede calcular un factor de corrección para cada píxel como una relación de su valor de transición del primer conjunto de datos de valores de transición y su valor de transición correspondiente del segundo conjunto de datos de valores de transición (por ejemplo, el valor de transición del primer conjunto de datos puede dividirse por el valor de transición del segundo conjunto de datos, o viceversa) para proporcionar un conjunto de datos del factor de corrección que luego se almacena. Como se indica en los bloques 512 y 514 de la Figura 18B, este conjunto de datos de factor de corrección puede emplearse para procesar datos de píxeles obtenidos de la matriz operada a frecuencias de reloj correspondientes a la velocidad de datos de velocidad excesiva, en presencia de un analito real a medir; en particular, los datos obtenidos de la matriz a la velocidad de datos de velocidad excesiva en presencia de un analito pueden multiplicarse o dividirse, según corresponda, por el conjunto de datos del factor de corrección (por ejemplo, cada píxel multiplicado o dividido por un factor de corrección correspondiente) para obtener los datos corregidos representativo de la propiedad deseada del analito a medir (por ejemplo, concentración de iones). Debe apreciarse que una vez que se calcula y almacena el conjunto de datos del factor de corrección, puede usarse repetidamente para corregir múltiples tramas de datos adquiridos de la matriz a la velocidad de datos de velocidad excesiva.

Además de controlar la matriz de sensores y los ADC, el sincronizador 256 puede configurarse para facilitar diversas funciones de calibración y diagnóstico de la matriz, así como un tratamiento de radiación UV opcional. Con este fin, el sincronizador puede utilizar la señal LSTV que indica la selección de la última hilera de la matriz y la señal LSTH para indicar la selección de la última columna de la matriz. El sincronizador 256 también puede ser responsable de generar la señal CAL que aplica la tensión de referencia VREF a los amplificadores amortiguador de columna y generar la señal UV que conecta a tierra los drenajes de todos los ISFE^t en la matriz durante un proceso de irradiación UV (consulte la Figura 9).). El sincronizador también puede proporcionar alguna función de control sobre el suministro de alimentación 258 durante diversas funciones de calibración y diagnóstico, o irradiación UV, para controlar apropiadamente las tensiones de alimentación o polarización; por ejemplo, durante la irradiación UV, el sincronizador puede controlar el suministro de alimentación para acoplar la tensión del cuerpo V^cuerpo a tierra mientras la señal UV se activa para poner a tierra los drenajes ISFET. Con respecto a la calibración y el diagnóstico de la matriz, así como la irradiación UV, en algunas implementaciones el sincronizador puede recibir programas especializados del ordenador 260 para proporcionar señales de control apropiadas. En un aspecto, el ordenador 260 puede usar varios datos obtenidos de píxeles de referencia y/o ficticios de la matriz, así como información de columna basada en la aplicación de la señal CAL y la tensión de referencia VREF, para determinar varios parámetros de calibración asociados con una matriz dada y/o generar programas especializados para funciones de calibración y diagnóstico.

Habiendo descrito varios aspectos de una matriz del ISFET ilustrativo, las Figuras 19-23 ilustran diagramas de bloques de implementaciones alternativas de chip IC CMOS de matrices de sensores ISFET que tienen un mayor número de píxeles, según todavía otras realizaciones. En un aspecto, cada una de las matrices de ISFET descritas más adelante en relación con las Figuras 19-23 puede controlarse por un controlador de matriz similar al que se muestra en la Figura 17, en algunos casos con modificaciones menores para acomodar un mayor número de píxeles (por ejemplo, preamplificadores adicionales 253 y convertidores de analógico a digital 254).

La Figura 19 ilustra un diagrama de bloques de una matriz de sensores ISFET 100A basada en los diseños de columnas y píxeles descritos anteriormente en relación con las Figuras 9-12 y un proceso de fabricación de CMOS de 0,35 micras, según una realización. La matriz 100A incluye 2048 columnas 1021 a 1022048, donde cada columna incluye 2048 píxeles geométricamente cuadrados 1051 a 1052048, cada uno con un tamaño de aproximadamente 9 micras por 9 micras. Por lo tanto, la matriz incluye más de cuatro millones de píxeles (> 4 megapíxeles) y, en una implementación ilustrativa, la matriz completa (píxeles ISFET y circuitos asociados) puede fabricarse como un chip de circuito integrado que tiene unas dimensiones de aproximadamente 20,5 milímetros por 20,5 milímetros.

En un aspecto de la realización que se muestra en la Figura 19, la matriz 100A puede configurarse, al menos en parte, como múltiples grupos de píxeles que pueden controlarse respectivamente. Por ejemplo, cada columna de píxeles se puede dividir en mitades superior e inferior, y la colección de píxeles en las respectivas mitades superiores de las columnas forman un primer grupo 4001 de hileras (por ejemplo, un grupo superior, hileras 1-1024) y la colección de píxeles en las respectivas mitades inferiores de las columnas forman un segundo grupo 4002 de hileras (por ejemplo, un grupo inferior, hileras 1025-2048). A su vez, cada uno del primer y segundo (por ejemplo, superior e inferior) grupos de hileras está asociado con registros de selección de hilera correspondientes, circuitos de polarización/lectura de columna, registros de selección de columna y controladores de salida. De esta manera, la selección de píxeles y la adquisición de datos de cada uno del primer y segundo grupos de hileras 4001 y 4002 es sustancialmente similar a la selección de píxeles y la adquisición de datos de toda la matriz 100 que se muestra en la Figura 13; dicho de otra manera, en un aspecto, la matriz 100A de la Figura 19 comprende sustancialmente dos "submatrices" controladas simultáneamente de diferentes grupos de píxeles para proporcionar una adquisición de datos significativamente optimizada a partir de un mayor número de píxeles.

En particular, la Figura 19 muestra que la selección de hileras del primer grupo 4001 de hileras puede controlarse mediante un registro de selección de primera hilera 1921, y la selección de hileras del segundo grupo 4002 de hileras puede controlarse mediante un registro de selección de segunda hilera 1922. En un aspecto, cada uno de los registros de selección de hilera 1921 y 1922 puede configurarse como se explicó anteriormente en relación con la Figura 14 para recibir señales de reloj vertical (CV) y datos verticales (DV) y generar señales de selección de hilera en respuesta; por ejemplo, el registro de selección de la primera hilera 1921 puede generar las señales RowSeh a RowSel1024 y el registro de selección de la segunda hilera 1922 puede generar las señales RowSel1025 a RowSel2048. En otro aspecto, ambos registros de selección de hilera 1921 y 1922 pueden recibir simultáneamente señales de reloj y datos verticales comunes, de manera que se habilitan dos hileras de la matriz en un momento dado, una del grupo superior y otra del grupo inferior.

Para cada uno del primer y segundo grupos de hileras, la matriz 100A de la Figura 19 comprende además un circuito de polarización/lectura de columna 1101T -1102048T (para el primer grupo de hileras 4001) y 1101^bb -1102048^b (para segundo grupo de hileras 4002), de manera que cada columna incluya dos instancias del circuito de polarización/lectura 110j que se muestra en la Figura 9. La matriz 100A también comprende dos registros de selección de columna 1921,2 (par e impar) y dos controladores de salida 1981,2 (par e impar) para el segundo grupo de hilera 4002, y dos registros de selección de columna 1923,4 (par e impar) y dos controladores de salida 1983,4 (pares e impares) para el primer grupo de hileras 4001 (es decir, un total de cuatro registros de selección de columna y cuatro controladores de salida). Los registros de selección de columna reciben señales de reloj horizontales (CHT y CHB para el primer grupo de hileras y el segundo grupo de hileras, respectivamente) y señales de datos horizontales (DHT y DHB para el primer grupo de hileras y el segundo grupo de hileras, respectivamente) para controlar la selección de columnas pares e impares. En una implementación, las señales CHT y CHB pueden proporcionarse como señales comunes, y DHT y DHB pueden proporcionarse como señales comunes, para leer simultáneamente cuatro columnas a la vez de la matriz (es decir, una columna impar y una par de cada grupo de hileras); en particular, como se describió anteriormente en relación con las Figuras 13-18, se pueden leer simultáneamente dos columnas para cada hilera habilitada y las tensiones de píxel correspondientes se proporcionan como dos señales de salida. Por lo tanto, mediante la habilitación de dos hileras en cualquier momento dado y la lectura de dos columnas por hilera en cualquier momento dado, la matriz 100A puede proporcionar cuatro señales de salida simultáneas Vsal1, Vsal2, Vsal3 y Vsal4.

En una implementación ilustrativa de la matriz 100A de la Figura 19, en la que las tramas de datos completos (todos los píxeles del primer y segundo grupos de hileras 4001 y 4002) se adquieren a una velocidad de trama de 20 tramas/seg, 1024 pares de las hileras se habilitan sucesivamente por períodos de aproximadamente 49 microsegundos cada una. Para cada hilera habilitada, cada controlador de registro/salida de selección de columna lee 1024 píxeles durante aproximadamente 45 microsegundos (permitiendo 2 microsegundos al principio y al final de cada hilera, como se describió anteriormente en relación con la Figura 18). Por lo tanto, en este ejemplo, cada una de las señales de salida de la matriz Vsal1, Vsal2, Vsal3 y Vsal4 tiene una velocidad de datos de aproximadamente 23 MHz. Nuevamente, debe apreciarse que en otras implementaciones, los datos pueden adquirirse desde la matriz 100A de la Figura 19 a velocidades de trama distintas de 20 tramas/seg (por ejemplo, 50­ 100 tramas/seg).

Al igual que la matriz 100 de la Figura 13, en otros aspectos, la matriz 100A de la Figura 19 puede incluir varias hileras y columnas de píxeles ficticios o de referencia 103 alrededor de un perímetro de la matriz para facilitar datos preliminares de prueba/evaluación, determinación de compensación y/o o calibración de matrices. Además, varias tensiones de fuente de alimentación y de polarización utilizados para el funcionamiento de la matriz (como se explicó anteriormente en relación con la Figura 9) se proporcionan a la matriz 100A en el bloque 195, de manera similar a la descrita anteriormente en relación con la Figura 13.

La Figura 20 ilustra un diagrama de bloques de una matriz de sensores ISFET 100B basada en un proceso de fabricación de CMOS de 0,35 micras y que tiene una configuración sustancialmente similar a la matriz 100A descrita anteriormente en la Figura 19

Mientras que la matriz 100B también se basa generalmente en los diseños de columnas y píxeles descritos anteriormente en relación con las Figuras 9-12, el tamaño/distancia entre píxeles en la matriz 100B es menor que el del píxel que se muestra en la Figura 10. En particular, con referencia de nuevo a las Figuras 10 y 11, la dimensión "e" que se muestra en la Figura 10 se reduce sustancialmente en la realización de la Figura 20, sin afectar la integridad de los componentes de píxel activos dispuestos en la región central del píxel, de aproximadamente 9 micras a aproximadamente 5 micras; de manera similar, la dimensión "f" que se muestra en la Figura 10 se reduce de aproximadamente 7 micras a aproximadamente 4 micras. Dicho de otra manera, parte del área periférica del píxel que rodea los componentes activos se reduce sustancialmente con respecto a las dimensiones dadas en relación con la Figura 10, sin alterar la vista superior y la disposición y el diseño de la sección transversal de los componentes activos del píxel como se muestra en las Figuras 10 y 11. En la Figura 20A se muestra una vista superior de dicho píxel 105^a , en la que la dimensión "e" es de 5,1 micras y la dimensión "f" es de 4,1 micras. En un aspecto de este diseño de píxel, para facilitar la reducción de tamaño, se incluyen menos conexiones de cuerpo B en el píxel 105A (por ejemplo, una en cada esquina del píxel) en comparación con el píxel que se muestra en la Figura 10, que incluye varias conexiones de cuerpo B alrededor de todo el perímetro del píxel.

Como se observa en la Figura 20, la matriz 100B incluye 1348 columnas 1021 a 1021348, en la que cada columna incluye 1152 píxeles geométricamente cuadrados 105A1 a 105A1152, cada uno con un tamaño de aproximadamente 5 micras por 5 micras. Por lo tanto, la matriz incluye más de 1,5 millones de píxeles (> 1,5 megapíxeles) y, en una implementación ilustrativa, la matriz completa (píxeles ISFET y circuitos asociados) puede fabricarse como un chip de circuito integrado que tiene unas dimensiones de aproximadamente 9 milímetros por 9 milímetros. Al igual que la matriz 100A de la Figura 19, en un aspecto la matriz 100B de la Figura 20 se divide en dos grupos de hileras 4001 y 4002, como se explicó anteriormente en relación con la Figura 19. En una implementación ilustrativa, las tramas de datos completos (todos los píxeles del primer y segundo grupos de hileras 4001 y 4002) se adquieren a una velocidad de trama de 50 tramas/segundo, lo que requiere que se habiliten sucesivamente 576 pares de hileras durante períodos de aproximadamente 35 microsegundos cada uno. Para cada hilera habilitada, cada registro de selección de columna/controlador de salida lee 674 píxeles durante aproximadamente 31 microsegundos (permitiendo 2 microsegundos al principio y al final de cada hilera, como se describió anteriormente en relación con la Figura 18). Por lo tanto, en este ejemplo, cada una de las señales de salida de la matriz Vsal1, Vsal2, Vsal3 y Vsal4 tiene una velocidad de datos de aproximadamente 22 MHz. Nuevamente, debe apreciarse que en otras implementaciones, los datos pueden adquirirse desde la matriz 100B de la Figura 20 a velocidades de trama distintas de 50 tramas/seg.

La Figura 21 ilustra un diagrama de bloques de una matriz de sensores ISFET 100C basada en un proceso de fabricación de CMOS de 0,35 micras y que incorpora el tamaño de píxel más pequeño descrito anteriormente en relación con las Figuras 20 y 20A (píxeles cuadrados de 5,1 micras), según aún otra realización. Como se observa en la Figura 21, la matriz 100C incluye 4000 columnas 1021 a 1024000, donde cada columna incluye 3600 píxeles geométricamente cuadrados 105A1 a 105A3600, cada uno con un tamaño de aproximadamente 5 micras por 5 micras. Por lo tanto, la matriz incluye más de 14 millones de píxeles (> 14 megapíxeles) y, en una implementación ilustrativa, la matriz completa (píxeles ISFET y circuitos asociados) puede fabricarse como un chip de circuito integrado que tiene unas dimensiones de aproximadamente 22 milímetros por 22 milímetros. Al igual que las matrices 100A y 100B de las Figuras 19 y 20, en un aspecto la matriz 100C de la Figura 21 está dividida en dos grupos de hileras 4001 y 4002. Sin embargo, a diferencia de las matrices 100A y 100B, para cada grupo de hileras, la matriz 100C incluye dieciséis registros de selección de columna y dieciséis controladores de salida para leer simultáneamente dieciséis píxeles a la vez en una hilera habilitada, de manera que treinta y dos señales de salida Vsal1-Vsal32 pueden proporcionarse desde la matriz 100C. En una implementación ilustrativa, las tramas de datos completos (todos los píxeles del primer y segundo grupos de hileras 4001 y 4002) se pueden adquirir a una velocidad de trama de 50 tramas/seg, lo que requiere que se habiliten sucesivamente 1800 pares de hileras durante períodos de aproximadamente 11 microsegundos cada uno. Para cada hilera habilitada, 250 píxeles (4000/16) se leen por cada controlador de salida/registro de selección de columna durante aproximadamente 7 microsegundos (permitiendo 2 microsegundos al principio y al final de cada hilera). Por lo tanto, en este ejemplo, cada una de las señales de salida de la matriz Vsal1 - Vsal32 tiene una velocidad de datos de aproximadamente 35 MHz. Al igual que con las realizaciones anteriores, debe apreciarse que en otras implementaciones, los datos pueden adquirirse desde la matriz 100C a velocidades de trama distintas de 50 tramas/seg.

Mientras que las matrices ilustrativas descritas anteriormente en relación con las Figuras 13-21 se basan en un proceso de fabricación de CMOS convencional de 0,35 micras, debe apreciarse que las matrices según la presente descripción no están limitadas en este sentido, ya que se pueden emplear procesos de fabricación de CMOS que tienen tamaños de elementos de menos de 0,35 micras (por ejemplo, técnicas de procesamiento CMOS de 0,18 micras) para fabricar dichas matrices. En consecuencia, pueden fabricarse matrices de sensores ISFET con un tamaño/distancia entre píxeles significativamente inferior a 5 micras, proporcionando matrices de ISFET significativamente más densas. Por ejemplo, las Figuras 22 y 23 ilustran diagramas de bloques respectivos de matrices de sensores ISFET 100D y 100E según otras realizaciones basadas en un proceso de fabricación de CMOS de 0,18 micras, en el que se logra un tamaño de píxel de 2,6 micras. El diseño de píxel en sí se basa sustancialmente en el píxel 105A que se muestra en la Figura 20A, aunque a menor escala debido al proceso CMOS de 0,18 micras.

La matriz 100D de la Figura 22 incluye 2800 columnas 1021 a 1022800, en la que cada columna incluye 2400 píxeles geométricamente cuadrados, cada uno con un tamaño de aproximadamente 2,6 micras por 2,6 micras. Por lo tanto, la matriz incluye más de 6,5 millones de píxeles (> 6,5 megapíxeles) y, en una implementación ilustrativa, la matriz completa (píxeles ISFET y circuitos asociados) puede fabricarse como un chip de circuito integrado que tiene unas dimensiones de aproximadamente 9 milímetros por 9 milímetros. Al igual que las matrices 100A, 100B y 100C de las Figuras 19-21, en un aspecto, la matriz 100D de la Figura 22 está dividida en dos grupos de hileras 4001 y 4002. Sin embargo, a diferencia de las matrices 100A, 100B y 100C, para cada grupo de hileras, la matriz 100D incluye ocho registros de selección de columna y ocho controladores de salida para leer simultáneamente ocho píxeles a la vez en una hilera habilitada, de manera que dieciséis señales de salida Vsal1-Vsal16 pueden proporcionarse desde la matriz 100D. En una implementación ilustrativa, las tramas de datos completos (todos los píxeles del primer y segundo grupos de hileras 4001 y 4002) se pueden adquirir a una velocidad de trama de 50 tramas/seg, lo que requiere que se habiliten sucesivamente 1200 pares de hileras durante períodos de aproximadamente 16-17 microsegundos cada uno. Para cada hilera habilitada, 350 píxeles (2800/8) se leen por cada controlador de salida/registro de selección de columna durante aproximadamente 14 microsegundos (permitiendo 1 a 2 microsegundos al principio y al final de cada hilera). Por lo tanto, en este ejemplo, cada una de las señales de salida de la matriz Vsal1 - Vsal16 tiene una velocidad de datos de aproximadamente 25 MHz. Al igual que con las realizaciones anteriores, debe apreciarse que en otras implementaciones, los datos pueden adquirirse desde la matriz 100D a velocidades de trama distintas de 50 tramas/seg.

La matriz 100E de la Figura 23 incluye 7400 columnas 1021 a 1027400, donde cada columna incluye 7400 píxeles geométricamente cuadrados, cada uno con un tamaño de aproximadamente 2,6 micras por 2,6 micras. Por lo tanto, la matriz incluye más de 54 millones de píxeles (> 54 megapíxeles) y, en una implementación ilustrativa, la matriz completa (píxeles ISFET y circuitos asociados) puede fabricarse como un chip de circuito integrado que tiene unas dimensiones de aproximadamente 21 milímetros por 21 milímetros. Al igual que las matrices 100A-100D de las Figuras 19-22, en un aspecto, la matriz 100E de la Figura 23 está dividida en dos grupos de hileras 4001 y 4002. Sin embargo, a diferencia de las matrices 100A-100D, para cada grupo de hileras, la matriz 100E incluye treinta y dos registros de selección de columna y treinta y dos controladores de salida para leer simultáneamente treinta y dos píxeles a la vez en una hilera habilitada, de manera que sesenta y cuatro las señales Vsal1-Vsal64 pueden proporcionarse desde la matriz 100E. En una implementación ilustrativa, las tramas de datos completos (todos los píxeles del primer y segundo grupos de hileras 4001 y 4002) se pueden adquirir a una velocidad de trama de 100 tramas/seg, lo que requiere que se habiliten sucesivamente 3700 pares de hileras durante períodos de aproximadamente 3 microsegundos cada uno. Para cada hilera habilitada, cada controlador de registro/salida de selección de columna lee 230 píxeles (7400/32) durante aproximadamente 700 nanosegundos. Por lo tanto, en este ejemplo, cada una de las señales de salida de la matriz Vsal1 - Vsal64 tiene una velocidad de datos de aproximadamente 328 MHz. Al igual que con las realizaciones anteriores, debe apreciarse que en otras implementaciones, los datos pueden adquirirse desde la matriz 100D a velocidades de trama distintas de 100 tramas/seg.

Por lo tanto, en varios ejemplos de matrices de ISFET basados en los conceptos descritos en la presente descripción, un intervalo entre canales de aproximadamente nueve (9) micras (por ejemplo, un área superficial del sensor de menos de diez micras por diez micras) permite que una matriz de ISFET incluya más de 256000 píxeles (es decir,, una matriz de 512 por 512), junto con la selección de hileras y columnas asociada y la electrónica de polarización/lectura, que se fabricará en una matriz de semiconductores de 7 milímetros por 7 milímetros, y una matriz de sensores similar que incluye más de cuatro millones de píxeles (es decir, una matriz de 2048 por 2048, más de 4 megapíxeles) para fabricarse en una pastilla de 21 milímetros por 21 milímetros. En otros ejemplos, un intervalo entre canales de aproximadamente 5 micras permite fabricar una matriz del ISFET que incluye aproximadamente 1,55 megapíxeles (es decir, una matriz de 1348 por 1152) y la electrónica asociada en una pastilla de 9 milímetros por 9 milímetros, y una matriz de sensores ISFET que incluye más de 14 megapíxeles y la electrónica asociada en una pastilla de 22 milímetros por 20 milímetros. En todavía otras implementaciones, utilizando un proceso de fabricación de CMOS en el que son posibles tamaños de elementos de menos de 0,35 micras (por ejemplo, técnicas de procesamiento CMOS de 0,18 micras), se pueden fabricar matrices de sensores ISFET con un tamaño/distancia entre píxeles significativamente inferior a 5 micras (por ejemplo, intervalo entre canales de 2,6 micras o área de píxel/sensor de menos de 8 o 9 micras2), proporcionando matrices de ISFET significativamente densas.

En las realizaciones de matrices de ISFET descritas anteriormente, los píxeles de la matriz emplean un ISFET de canal p, como se describió anteriormente en relación con la Figura 9. Debe apreciarse, sin embargo, que las matrices de ISFET según la presente descripción no están limitadas en este sentido, y que en otras realizaciones los diseños de píxeles para las matrices de ISFET pueden basarse en un ISFET de canal n. En particular, cualquiera de las matrices descritas anteriormente en relación con las Figuras 13 y 19-23 pueden implementarse con píxeles basados en ISFET de canal n.

Por ejemplo, la Figura 24 ilustra el diseño de píxeles de la Figura 9 implementado con un ISFET de canal n y los MOSFET de canal n acompañantes, según otra realización de la presente descripción. Más específicamente, la Figura 24 ilustra un píxel ilustrativo 1051 de una columna de matriz (es decir, el primer píxel de la columna), junto con un circuito de polarización/lectura de columna 110j, en el que el ISFET 150 (Ql) es un ISFET de canal n. Al igual que el diseño de píxeles de la Figura 9, el diseño de píxeles de la Figura 24 incluye solo tres componentes, específicamente, el ISFET 150 y dos conmutadores MOSFET de canal n Q2 y Q3, que responden a una de las señales de selección de hilera n (RowSeh a RowSeln, lógica alta activa). No se utilizan puertas de transmisión en el píxel de la Figura 24, y todos los dispositivos del píxel son del "mismo tipo", es decir, dispositivos de canal n. También como el diseño de píxel de la Figura 9, solo se utilizan cuatro líneas de señal por píxel, específicamente, las líneas 1121, 1141, 1161 y 1181, para operar los tres componentes del píxel 1051 que se muestra en la Figura 24. En otros aspectos, los diseños de píxeles de la Figura 9 y la Figura 24 son similares, ya que ambos están configurados con una corriente de drenaje constante Ip¡ y una tensión de drenaje a fuente constante Vosj para obtener una señal de salida VSj de un píxel habilitado.

Una de las principales diferencias entre el diseño de píxel ISFET de canal n de la Figura 24 y el diseño de ISFET de canal p de la Figura 9 es la dirección opuesta del flujo de corriente a través del píxel. Con este fin, en la Figura 24, el elemento 106j es un sumidero de corriente controlable acoplado a la tierra VsSA de la tensión de suministro del circuito analógico, y el elemento 108j del circuito de polarización/lectura 110j es una fuente de corriente controlable acoplada a la tensión de alimentación positiva analógica VDDA. Además, la conexión del cuerpo del ISFET 150 no está ligada a su fuente, sino a las conexiones del cuerpo de otros ISFET de la matriz, que a su vez está acoplada al VSSA de tierra analógico, como se indica en la Figura 24.

Además de los diseños de píxeles mostrados en las Figuras 9 y 24 (basado en una corriente de drenaje ISFET constante y una tensión de la fuente de drenaje ISFET constante), se contemplan diseños de píxeles alternativos para matrices de ISFET, basados tanto en ISFET de canal p como en ISFET de canal n, como se ilustra en las Figuras 25-27. Como se describe a continuación, algunos diseños de píxeles alternativos pueden requerir señales adicionales y/o modificadas del controlador de matriz 250 para facilitar la adquisición de datos. En particular, una característica común de los diseños de píxeles mostrados en las Figuras 25-27 incluye un condensador de muestra y retención dentro de cada píxel, además de un condensador de muestra y retención para cada columna de la matriz. Mientras que los diseños de píxeles alternativos de las Figuras 25-27 generalmente incluyen un mayor número de componentes que los diseños de píxeles de las Figuras 9 y 24, la característica de un muestreo de píxeles y un condensador de retención permite tipos de matrices de "instantáneas", en los que todos los píxeles de una matriz pueden habilitarse simultáneamente para muestrear una trama completa y adquirir señales que representan mediciones de uno o más analitos en la proximidad de respectivos ISFET de la matriz. En algunas aplicaciones, esto puede proporcionar mayores velocidades de adquisición de datos y/o una mejor sensibilidad de la señal (por ejemplo, mayor relación señal/ruido).

La Figura 25 ilustra uno de tales diseños alternativos para un solo píxel 105C y un circuito de columna asociado 110j. El píxel 105C emplea un ISFET de canal n y generalmente se basa en la premisa de proporcionar una tensión constante a través del ISFET Q1 basado en un amplificador de retroalimentación (Q4, Q5 y Q6). En particular, el transistor Q4 constituye la carga del amplificador de retroalimentación, y la corriente del amplificador se establece mediante la tensión de polarización VB1 (proporcionado por el controlador de matriz). El transistor Q5 es un amplificador de puerta común y el transistor Q6 es un amplificador de fuente común. Nuevamente, el propósito del amplificador de retroalimentación es mantener constante la tensión a través del ISFET Q1 ajustando la corriente suministrada por el transistor Q3. El transistor Q2 limita la corriente máxima que puede consumir el ISFET Q1 (por ejemplo, para evitar daños por sobrecalentamiento de una gran variedad de píxeles). Esta corriente máxima se establece mediante la tensión de polarización VB2 (también proporcionado por el controlador de matriz). En un aspecto del diseño de píxel que se muestra en la Figura 25, la alimentación al píxel 105C se puede desconectar ajustando la tensión de polarización VB2 a 0 voltios y la tensión de polarización VB1 a 3,3 voltios. De esta manera, la energía suministrada a grandes matrices de tales píxeles puede modularse (encenderse durante un período de tiempo corto y luego apagarse mediante el controlador de matriz) para obtener mediciones de concentración de iones y al mismo tiempo reducir el consumo total de energía de la matriz. La potencia de modulación de los píxeles también reduce la disipación de calor de la matriz y el calentamiento potencial de la solución de analito, lo que también reduce los efectos potencialmente nocivos del calentamiento de la muestra.

En la Figura 25, la salida del amplificador de retroalimentación (la puerta del transistor Q3) es muestreada por el conmutador MOS Q7 y almacenada en una muestra de píxel y retiene el condensador Csh dentro del propio píxel. El conmutador Q7 está controlado por una muestra de píxeles y una señal de retención pSH (proporcionada al chip de matriz por el controlador de matriz), que se aplica simultáneamente a todos los píxeles de la matriz para almacenar simultáneamente las lecturas de todos los píxeles en sus condensadores de muestra y retención respectivos. De esta manera, las matrices basadas en el diseño de píxeles de la Figura 25 pueden considerarse como matrices "instantáneas", en las que se muestrea una trama completa de datos en un momento dado, en lugar de muestrear hileras sucesivas de la matriz. Después de almacenar cada valor de píxel en condensador de muestra y retención de píxel correspondiente Csh, cada píxel 105C (ISFET y amplificador de retroalimentación) es libre de adquirir otra lectura de pH o puede apagarse para conservar energía.

En la Figura 25, los valores de píxeles almacenados en todos los condensadores de muestra y retención de píxeles Csh se aplican al circuito de columna 110j una hilera a la vez a través del seguidor de fuente Q8, que se habilita a través del transistor Q9 en respuesta a una señal de selección de hilera (por ejemplo, RowSel1). En particular, después de seleccionar y establecer una hilera, los valores almacenados en los condensadores de muestra y retención de píxeles se almacenan a su vez en los condensadores de muestra y retención de columna Csh2, según lo permita la señal de muestra y retención de columna COL SH, y se proporciona como la señal de salida de la columna Vcolj.

La Figura 26 ilustra otro diseño alternativo para un solo píxel 105D y un circuito de columna asociado 110j, según una realización de la presente descripción. En esta realización, el ISFET se muestra como un dispositivo de canal p. Al comienzo de un ciclo de adquisición de datos, los conmutadores CMOS controlados por las señales pSH (muestra/retención de píxeles) y pRST (restablecimiento de píxeles) se cierran (estas señales se suministran por el controlador de matriz). Esto lleva la fuente de ISFET (Q1) a la tensión VRST. Posteriormente, se abre el conmutador controlado por la señal pRST y la fuente de ISFET Q1 extrae el condensador de muestra y retención de píxeles Csh en un umbral por debajo del nivel establecido por el pH. Entonces se abre el conmutador controlado por la señal pSH, y el valor de salida de píxel se acopla, mediante la operación de un conmutador que responde a la señal de selección de hilera RowSel1, al circuito de columna 110j para proporcionar la señal de salida de columna V^colj. Al igual que el diseño de píxeles en la realización ilustrada en la Figura 25, las matrices basadas en el píxel 105D son matrices de tipo "instantánea" en el sentido de que todos los píxeles de la matriz pueden funcionar simultáneamente. En un aspecto, este diseño permite un largo tiempo de integración simultánea en todos los píxeles seguido de una lectura de alta velocidad de una trama completa de datos.

La Figura 27 ilustra todavía otro diseño alternativo para un solo píxel 105E y un circuito de columna asociado 110j, según una realización de la presente descripción. En esta realización, nuevamente el ISFET se muestra como un dispositivo de canal p. Al comienzo de un ciclo de adquisición de datos, los conmutadores operados por las señales de control pi y pRST se cierran brevemente. Esto borra el valor almacenado en el condensador de muestreo Csh y permite almacenar una carga en el ISFET (Ql). Posteriormente, el conmutador controlado por la señal pSH se cierra, lo que permite que la carga almacenada en el ISFET Q1 se almacene en el condensador de muestra y retención de píxeles Csh. Entonces se abre el conmutador controlado por la señal pSH, y el valor de salida de píxel se acopla, mediante la operación de un conmutador que responde a la señal de selección de hilera RowSel1, al circuito de columna 110j para proporcionar la señal de salida de columna V^colj. La ganancia puede proporcionarse en el píxel 105E a través de la relación entre la capacitancia ISFET y el condensador Csh, es decir, ganancia = CQ1/Csh, o habilitando el píxel varias veces (es decir, tomando múltiples muestras de la medición del analito) y acumulando la salida ISFET en el condensador de muestra y retención de píxeles Csh sin restablecer el condensador (es decir, la ganancia es una función del número de acumulaciones). Al igual que las realizaciones de las Figuras 25 y 26, las matrices basadas en el píxel 105D son matrices de tipo "instantánea" en el sentido de que todos los píxeles de la matriz pueden funcionar simultáneamente.

Hardware y software informático

Con respecto a la interfaz de ordenador 252 del controlador de matriz 250, en una implementación ilustrativa, la interfaz está configurada para facilitar una velocidad de datos de aproximadamente 200 MB/seg al ordenador 260 y puede incluir almacenamiento local de hasta 400 MB o más. El ordenador 260 está configurado para aceptar datos a una velocidad de 200 MB/seg, y procesar los datos para reconstruir una imagen de los píxeles (por ejemplo, que puede mostrarse en color falso en un monitor). Por ejemplo, el ordenador puede configurarse para ejecutar un programa de propósito general con rutinas escritas en C++ o Visual Basic para manipular los datos y mostrarlos como se desee.

Los sistemas descritos en la presente descripción, cuando se usan para la secuenciación, generalmente involucran una matriz de chemFET que admite cámaras de reacción, los chemFET se acoplan a una interfaz capaz de ejecutar lógica que convierte las señales de los chemFET en información de secuenciación.

La información de secuenciación obtenida del sistema puede enviarse a un dispositivo informático portátil, tal como un asistente digital personal. Por lo tanto, una realización abarca la lógica para mostrar un genoma completo de un organismo en un dispositivo informático portátil. La realización también abarca la lógica adaptada para enviar datos desde una matriz chemFET a un dispositivo informático portátil. Cualquiera de tales lógicas puede implementarse por ordenador.

Matrices de microfluidos y de micropozos

Pasando de la descripción del sensor, ahora abordaremos la combinación de la matriz del ISFET con una matriz de micropozos y los fluidos correspondientes. Como la mayoría de los dibujos de la estructura de la matriz de micropozos se presentan solo en sección transversal o muestran esa matriz solo como un bloque en un diagrama simplificado, las Figuras 28A y 28B se proporcionan para ayudar al lector a comenzar a visualizar el aparato resultante en tres dimensiones. La Figura 28A muestra un grupo de pozos cilíndricos redondos 2810 dispuestos en una matriz, mientras que la Figura 28B muestra un grupo de pozos de sección transversal rectangular 2830 dispuestos en una matriz. Se verá que los pozos están separados (aislados) entre sí por el material 2840 que forma las paredes del pozo. Aunque ciertamente es posible fabricar pozos de otras secciones transversales, en algunas realizaciones puede no ser ventajoso hacerlo. Tal matriz de micropozos se asienta sobre la matriz del ISFET mencionada anteriormente, con uno o más ISFET por pozo. En los dibujos posteriores, cuando se identifica la matriz de micropozos, se puede representar una de estas matrices.

Sistema fluídico: Aparato y método para usar con matrices de sensores electrónicos de alta densidad

Para muchos usos, para completar un sistema para detectar reacciones químicas o agentes químicos utilizando las matrices electrónicas de alta densidad explicadas anteriormente, se utilizan técnicas y aparatos para suministrar a los elementos de la matriz (llamados "píxeles") fluidos que contienen componentes químicos o bioquímicos para la detección. En esta sección se ilustrarán técnicas y métodos ilustrativos, que son útiles para tales fines, con características convenientes.

Dado que puede desearse un funcionamiento a alta velocidad del sistema, se prefiere que el sistema de suministro de fluido, en la medida de lo posible, no limite la velocidad de funcionamiento del sistema global.

En consecuencia, existen necesidades no solo de matrices de ISFET de alta densidad y alta velocidad u otros elementos sensibles a las concentraciones de iones u otros atributos químicos, o cambios en los atributos químicos, sino también de mecanismos y técnicas relacionados para suministrar a los elementos de la matriz las muestras a evaluar, en volúmenes de reacción suficientemente pequeños como para avanzar sustancialmente en la velocidad y calidad de detección de la variable a detectar.

Hay dos y, a veces, tres componentes o subsistemas, y métodos relacionados, involucrados en el suministro de las muestras químicas en cuestión a los elementos de la matriz: (1) sistema de macrofluidos de suministros de reactivos y fluidos de lavado y válvulas apropiadas y aparatos auxiliares, (2) un flujo celular y (3) en muchas aplicaciones, una matriz de micropozos. Se describirá cada uno de estos subsistemas, aunque en orden inverso.

Matriz de micropozos

Como se describió en otra parte, para muchos usos, tal como en la secuenciación de ADN, es conveniente proporcionar sobre la matriz de sensores semiconductores una matriz correspondiente de micropozos, cada micropozo es lo suficientemente pequeño preferentemente para recibir solo una perla cargada de ADN, en relación con la cual un píxel subyacente en la matriz proporcionará una señal de salida correspondiente.

El uso de una matriz de micropozos de este tipo implica tres etapas de fabricación y preparación, cada una de las cuales se describe por separado: (1) crear la matriz de micropozos para dar como resultado un chip que tiene un revestimiento que comprende una capa de matriz de micropozos; (2) montaje del chip revestido en una interfaz fluídica; y en el caso de la secuenciación de ADN, (3) cargar una o varias perlas cargadas con ADN en los pozos. Se entenderá, por supuesto, que en otras aplicaciones, las perlas pueden ser innecesarias o pueden emplearse perlas que tengan diferentes características.

Los sistemas descritos en la presente descripción pueden incluir una serie de cámaras de reacción de microfluidos integradas con un semiconductor que comprende una matriz de chemFET. Algunas realizaciones abarcan tal matriz. Las cámaras de reacción pueden, por ejemplo, formarse en un material de vidrio, dieléctrico, fotodefinible o grabable. El material de vidrio puede ser dióxido de silicio.

En una realización, la matriz comprende al menos 100000 cámaras. En otra realización, cada cámara de reacción tiene un ancho horizontal y una profundidad vertical que tiene una relación de aspecto de aproximadamente 1:1 o menos. En una realización, el intervalo entre las cámaras de reacción no es superior a aproximadamente 10 micras. La matriz descrita anteriormente también se puede proporcionar en un kit para secuenciación. Por lo tanto, en algunos ejemplos se incluye un kit que comprende una matriz de cámaras de reacción de microfluidos integradas con una matriz de chemFET y uno o más reactivos de amplificación.

En algunas realizaciones, la invención abarca un aparato de secuenciación que comprende una capa dieléctrica que recubre un chemFET, la capa dieléctrica que tiene un rebaje lateralmente centrado encima del chemFET. Preferentemente, la capa dieléctrica está formada por dióxido de silicio.

Fabricación de matrices de micropozos

La fabricación de micropozos se puede lograr de varias maneras. Los detalles reales de fabricación pueden requerir algo de experimentación y varían según las capacidades de procesamiento disponibles.

En general, la fabricación de una matriz de micropozos de alta densidad implica modelar fotolitográficamente la configuración de la matriz de pozos en una capa o capas de material tal como fotoprotector (orgánico o inorgánico), un dieléctrico, mediante el uso de un proceso de grabado. El patrón puede realizarse con el material de la matriz de sensores o puede realizarse por separado y luego transferirse al chip de la matriz de sensores, o alguna combinación de los dos. Sin embargo, las técnicas distintas de la fotolitografía no deben excluirse si proporcionan resultados aceptables.

Ahora se describe un ejemplo de un método para formar una matriz de micropozos, comenzando con referencia a la Figura 29. Esa figura representa esquemáticamente una vista superior de una esquina (es decir, la esquina inferior izquierda) del diseño de un chip que muestra una matriz 2910 de los sensores ISFE^t individuales 2912 en la pastilla CMOS 2914. Las líneas de señal 2916 y 2918 se utilizan para direccionar la matriz y leer su salida. El bloque 2920 representa algunos de los componentes electrónicos de la matriz, como se explicó anteriormente, y la capa 2922 representa una parte de una pared que se convierte en parte de una estructura de microfluidos, la celda de flujo, como se explica con más detalle a continuación; la celda de flujo es la estructura que proporciona un flujo de fluido sobre la matriz de micropozos o sobre la superficie del sensor directamente, si no hay una estructura de micropozos. En la superficie de la matriz, se puede formar un patrón como el patrón 2922 en la parte inferior izquierda de la Figura 29 durante el procesamiento de semiconductores para formar los ISFET y los circuitos asociados, para usar como marcas de alineación para localizar los pozos sobre los píxeles del sensor cuando el dieléctrico ha cubierto la superficie de la matriz.

Después de que se forman las estructuras semiconductoras, como se muestra, la estructura de micropozos se aplica a la matriz. Es decir, la estructura de micropozos puede formarse directamente en la pastilla o puede formarse por separado y luego montarse en la matriz, siendo aceptable cualquier enfoque. Para formar la estructura de micropozos en la pastilla, pueden usarse varios procesos. Por ejemplo, toda la pastilla se puede recubrir por rotación con, por ejemplo, una fotorresistencia negativa tal como Microchem's SU-82015 o una poliimida/resistencia positiva tal como HD Microsystems HD8820, hasta la altura deseada de los micropozos. En una realización, la altura de los pozos (por ejemplo, aproximadamente 4 - 12 pm en el ejemplo de un píxel por pozo, aunque no tan limitada como una cuestión general) en la(s) capa(s) fotorresistente(s) se puede lograr girando el protector apropiado a velocidades predeterminadas (que se pueden encontrar por referencia a la literatura y las especificaciones del fabricante, o empíricamente), en una o más capas. (Normalmente, la altura del pozo se puede seleccionar en correspondencia con la dimensión lateral del píxel del sensor, preferentemente para una relación de aspecto nominal de 1:1 - 1,5:1, altura: ancho o diámetro. Según las consideraciones de señal a ruido, existe una relación entre las dimensiones y las velocidades de muestreo de datos para lograr el nivel deseado de rendimiento. Por lo tanto, hay una serie de factores que entrarán en la selección de parámetros óptimos para una aplicación dada). Alternativamente, se pueden aplicar múltiples capas de diferentes fotorresistencias o se puede depositar otra forma de material dieléctrico. También se pueden usar varios tipos de deposición de vapor químico para construir una capa de materiales adecuados para la formación de micropozos en la misma.

Una vez que la capa fotorresistente (la forma singular "capa" se usa para abarcar múltiples capas en el agregado también) está en su lugar, los pozos individuales (típicamente mapeados para tener uno o cuatro sensores ISFET por pozo) pueden generarse colocando una máscara (por ejemplo, de cromo) sobre la pastilla con recubrimiento resistente y exponiendo la resistencia a la radiación de reticulación (típicamente UV). Toda la resistencia expuesta a la radiación (es decir, donde la máscara no bloquea la radiación) se retícula y como resultado formará una capa de plástico permanente unida a la superficie del chip (plantilla). La resistencia sin reaccionar (es decir, la resistencia en áreas que no están expuestas, debido a que la máscara impide que la luz llegue a la resistencia y evita la reticulación) se elimina lavando el chip en un solvente adecuado (es decir, revelador) tal como propilenglicolmetiletilacetato (PGMEA) u otro solvente apropiado. La estructura resultante define las paredes de la matriz de micropozos.

La Figura 30 muestra un ejemplo de una disposición para una porción de una máscara de cromo 3010 para una realización de un sensor por pozo, correspondiente a la porción de la pastilla que se muestra en la Figura 29. Las áreas en gris 3012, 3014 son las que bloquean la radiación UV. Las marcas de alineación en las porciones blancas 3016 en el cuadrante inferior izquierdo de la Figura 30, dentro del área gris 3012, se utilizan para alinear la disposición de los pozos con los sensores ISFET en la superficie del chip. La serie de círculos 3014 en el cuadrante superior derecho de la máscara impide que la radiación llegue a las áreas de los pozos, para dejar una resistencia sin reaccionar que puede disolverse al formar los pozos.

La Figura 31 muestra una disposición correspondiente para la máscara 3020 para una realización de 4 sensores por pozo. Tenga en cuenta que el patrón de alineación 3016 todavía se usa y que los círculos de enmascaramiento de pozos individuales 3014A en la matriz 2910 ahora tienen el doble del diámetro que los pozos 3014 en la Figura 30, para acomodar cuatro sensores por pozo en lugar de un sensor por pozo.

Después de la exposición de la matriz/resistencia a la radiación UV, se puede recubrir una segunda capa de resistencia sobre la superficie del chip. Esta capa de resistencia puede ser relativamente gruesa, tal como aproximadamente 400 - 450 pm de grosor, normalmente. Una segunda máscara 3210 (Figura 32), que también puede ser de cromo, se usa para enmascarar un área 3220 que rodea la matriz, para construir un collar o pared (o cuenca, usando ese término en el sentido geológico) 3310 de resistencia que rodea la matriz activa de sensores en el sustrato 3312, como se muestra en la Figura 33. En el ejemplo particular que se describe, el collar es 150 pm más ancho que la matriz de sensores, en cada lado de la matriz, en la dirección x, y 9 pm más ancho en cada lado que la matriz de sensores, en la dirección y. Las marcas de alineación en la máscara 3210 (la mayoría no se muestran) coinciden con las marcas de alineación en la primera capa y el propio chip CMOS.

Se pueden usar otros enfoques fotolitográficos para la formación de la matriz de micropozos, por supuesto, lo anterior solo es un ejemplo.

Por ejemplo, puede emplearse litografía de contacto de varias resoluciones y con varios grabadores y reveladores. Pueden usarse tanto materiales orgánicos como inorgánicos para la(s) capa(s) en las que se forman los micropozos. La(s) capa(s) puede(n) grabarse en un chip que tiene una capa dieléctrica sobre las estructuras de píxeles en la matriz de sensores, tal como una capa de pasivación, o la(s) capa(s) puede(n) formarse por separado y luego aplicarse sobre la matriz de sensores. La elección o los procesos específicos dependerán de factores tales como el tamaño de la matriz, el tamaño del pozo, la instalación de fabricación disponible, los costos aceptables y similares. Entre los diversos materiales orgánicos que pueden usarse en algunas realizaciones para formar la(s) capa(s) de micropozos están el tipo SU-8 de fotorresistencia de acción negativa mencionado anteriormente, una fotorresistencia de acción positiva convencional y una poliimida fotodefinible de acción positiva. Cada uno tiene sus virtudes y sus inconvenientes, bien conocidos por los familiarizados con la técnica fotolitográfica.

Naturalmente, en un entorno de producción, las modificaciones serán apropiadas.

La litografía de contacto, aunque se puede usar para ciertas realizaciones, puede imponer un límite de paso mínimo más alto que el deseado en las direcciones laterales. Otras técnicas, como un proceso de paso y repetición UV profundo, son capaces de proporcionar una litografía de mayor resolución y se pueden utilizar para producir pasos pequeños y posiblemente diámetros de pozo más pequeños. Por supuesto, para diferentes especificaciones deseadas (por ejemplo, números de sensores y pozos por chip), diferentes técnicas pueden resultar óptimas. Y los factores pragmáticos, como los procesos de fabricación disponibles para un fabricante, pueden motivar el uso de un método de fabricación específico.

Preferentemente, la oblea CMOS con la matriz del ISFET se planarizará después del proceso de metalización final. Es adecuada una planarización dieléctrica mecánica química antes de la pasivación con nitruro de silicio. Esto permitirá que los pasos litográficos posteriores se realicen en superficies muy planas que están libres de topografía CMOS de parte inferior.

Mediante la utilización de sistemas de litografía de paso y repetición UV profundo, es posible resolver pequeñas características con una resolución, registro y repetibilidad superiores. Sin embargo, la alta resolución y la gran apertura numérica (NA) de estos sistemas impide que tengan una gran profundidad de enfoque. Como tal, puede ser necesario, cuando se usa tal sistema de fabricación, usar capas más delgadas fotodefinibles giradas (es decir, resisten del orden de 1-2 |jm en lugar de las capas más gruesas que se usan en la litografía de contacto) para transferir patrones y luego grabar las características de los micropozos en la capa o capas subyacentes. A continuación, se puede utilizar litografía de alta resolución para modelar las características de los micropozos y se pueden utilizar químicas de grabado de SiO2 convencionales, una para cada una de las áreas de la zona de soldadura y luego para las áreas de los micropozos, que tienen detenciones del grabado selectivas; las detenciones del grabado pueden ser en zonas de soldadura de aluminio y pasivación de nitruro de silicio (o similar), respectivamente. Alternativamente, se pueden emplear otros procesos de grabado y transferencia de patrones sustitutos adecuados para producir micropozos de materiales inorgánicos.

Otro enfoque es formar la estructura de micropozos en un material orgánico. Por ejemplo, se puede emplear un proceso de "máscara blanda" de resistencia dual, mediante el cual se utiliza una resistencia UV profunda delgada de alta resolución sobre un material orgánico más grueso (por ejemplo, poliimida curada o resistencia de acción opuesta). La capa superior de resistencia está moldeada. El patrón se puede transferir utilizando un proceso de grabado de iones reactivos con plasma de oxígeno. Esta secuencia de proceso a veces se denomina técnica de "máscara adaptable portátil" (PCM). Ver BJ Lin y otros, " Practicing the Novolac deep-UV portable conformable masking technique", Journal of Vacuum Science and Technology 19, No. 4, 1313-1319 (1981); y A. Cooper y otros, "Optimization of a photosensitive spin-on dielectric process for copper inductor coil and interconnect protection in RF SoC devices."

Alternativamente, se puede emplear una técnica de "enfoque de perforación", mediante la cual se realizan varias exposiciones secuenciales de paso y repetición a diferentes profundidades focales para compensar la profundidad de enfoque limitada (DOF) de los fotorrepetidores de alta resolución cuando se modelan capas gruesas de resistencia. Esta técnica depende del NA y DOF fotorrepetidor, así como de las propiedades de contraste del material resistente.

Otra técnica de PCM puede adaptarse a estos fines, como la que se muestra en Publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2006/0073422 de Edwards y otros. Este es un proceso PCM de tres capas y se ilustra en la Figura 33A. Como se muestra ahí, se utilizan básicamente seis pasos para producir la matriz de micropozos y el resultado es bastante similar al que produciría la litografía de contacto.

En un primer paso, 3320, una capa de fotorresistencia de acción negativa de alto contraste tal como el tipo Shipley InterVia Photodielectric Material 8021 (IV8021) 3322 se hila sobre la superficie de una oblea, que supondremos que es la oblea que proporciona el sustrato 3312 de la Figura 33 (en la que se fabrica la matriz de sensores), y se realiza una operación de horneado suave. A continuación, en el paso 3324, se aplica una capa 3326 de recubrimiento antirreflectante de bloqueo (BARC) y se hornea suavemente. En la parte superior de esta estructura, se hila una capa resistente delgada 3328 y se hornea suavemente, paso 3330, la capa resistente delgada es adecuada para una definición fina de las características. A continuación, la capa resistente 3328 se modela, expone y revela, y se elimina el BARC en las regiones expuestas 3329, que ya no están protegidas por la capa resistente 3328, paso 3332. Esto abre las regiones 3329 hasta la capa IV8021 sin curar. La capa BAR^c ahora puede actuar como una máscara de contacto conforme. Una exposición general con una herramienta de exposición de inundación, paso 3334, reticula el IV8021 expuesto, que ahora se muestra distinto del IV8021 sin curar en 3322. Luego se realizan uno o más pasos de revelador 3338, eliminando todo menos el IV8021 reticulado en las regiones 3336. Las regiones 3336 ahora constituyen las paredes de los micropozos.

Aunque, como se muestra arriba, los pozos tocan parte inferior (es decir, terminan) en la capa superior de pasivación de los ISFET, se cree que se puede obtener una mejora en el rendimiento del sensor ISFET (es decir, como la relación señal-ruido) si la(s) perla(s) activa(s) se mantiene(n) ligeramente elevada(s) de la capa de pasivación ISFET. Una forma de hacerlo es colocar una "protuberancia" espaciadora dentro del límite del micropozo de píxeles. Un ejemplo de cómo se podría representar esto sería no grabar una parte de la capa o capas utilizadas para formar la estructura de micropozos (es decir, dos pasos litográficos para formar los micropozos: uno para grabar parcialmente, el otro para modelar el protuberancia y terminar el grabado hasta la parte inferior), depositando y definiendo litográficamente y grabando una capa separada para formar la "protuberancia", usando un material fotodefinible permanente para la protuberancia una vez que los micropozos están completos, o formando la protuberancia antes para formar el micropozo. La característica de la protuberancia se muestra como 3350 en la Figura 33B. Un enfoque no integrado alternativo (o adicional) consiste en cargar los pozos con una o dos capas de esferas de relleno muy pequeñas antes de cargar las esferas de relleno que contienen ADN.

Usando una capa de 6 micras de grosor de tetra-metil-orto-silicato (TEOS) como una capa similar a SiO2 para la formación de micropozos, la Figura 33B-1 muestra una imagen de microscopio electrónico de barrido (SEM) de una sección transversal de una porción 3300A de una arquitectura de matriz como se enseña en la presente descripción. Los micropozos 3302A se forman en la capa de TEOS 3304A. Los pozos se extienden aproximadamente 4 jm en la capa de 6 jm de grosor. Normalmente, la parte inferior del pozo grabado sobre un material de detención de grabado que puede ser, por ejemplo, un óxido, un material orgánico u otro material adecuado conocido en el procesamiento de semiconductores para uso de detención de grabado. Se puede formar una capa delgada de material de detención de grabado sobre una capa más gruesa de poliimida u otro dieléctrico adecuado, de manera que haya aproximadamente 2 jm de detención de grabado poliimida entre la parte inferior del pozo y la capa Metal4 (M4) del chip en el que se forma el electrodo de puerta extendido 3308A para cada ISFET subyacente en la matriz. Como se etiquetó en el lateral, se muestran las capas de metalización CMOS M3, M2 y M1, que forman interconexiones y estructuras de nivel inferior, con los canales ISFET formados en las áreas indicadas por las flechas 3310A.

En la vista en sección transversal ortogonal (es decir, mirando hacia abajo desde la parte superior), los pozos pueden tener forma redonda o cuadrada. Los pozos redondos pueden mejorar la captura de perlas y pueden obviar la necesidad de empaquetar perlas en la parte inferior o en la parte superior de los pozos.

En una realización, las pendientes ahusadas a los lados de los micropozos también se pueden utilizar con ventaja. Con referencia a la Figura 33B-2, si las perlas 3320A tienen un diámetro mayor que el tramo inferior a través de los pozos, pero lo suficientemente pequeño para que quepa en las bocas de los pozos, las perlas estarán separadas dla parte inferior de los pozos debido a las restricciones geométricas. Por ejemplo, en otra realización, la Figura 33B-2 ilustra el ejemplo de micropozos que tienen una sección transversal cuadrada vistos desde arriba, 4 pm de lado, con perlas de 3,8 pm de diámetro 3320A cargadas. Experimentalmente y con algunos cálculos, se pueden determinar combinaciones adecuadas de tamaño de perla y dimensiones del pozo. Otra realización en la Figura 33B-3 muestra una parte de un pozo de 4 pm cargado con una perla de 2,8 pm de diámetro 3322A, que obviamente es relativamente pequeña y cae hasta la parte inferior del pozo; en otra realización, una perla de 4,0 pm de diámetro 3324A que se detiene para que no alcance la parte inferior por el ahusamiento de la pared lateral del pozo; y todavía en otra realización, una perla de tamaño intermedio 3326A de 3,6 pm de diámetro que está separada dla parte inferior del pozo por perlas de relleno 3328A. Claramente, el tamaño de la perla debe adaptarse cuidadosamente al ahusamiento del grabado del micropozo. Se contemplan todas las realizaciones que emplean configuraciones de perla a pozo como se describió anteriormente para las perlas 3320A, 3322A, 3324A, 3326A y 3328A.

Por lo tanto, los micropozos se pueden fabricar mediante cualquier proceso de película delgada fotodefinible o grabable de alta relación de aspecto, que pueda proporcionar el grosor requerido (por ejemplo, aproximadamente 4 -10 um). Entre los materiales que se cree que son adecuados están los polímeros fotosensibles, el dióxido de silicio depositado, los polímeros no fotosensibles que se pueden grabar utilizando, por ejemplo, procesos de grabado con plasma, etc. En la familia del dióxido de silicio, TEOs y el óxido nitroso de silano (SILOX) parecen adecuados. Las estructuras finales son similares, pero los diversos materiales presentan diferentes composiciones superficiales que pueden hacer que la biología o la química diana reaccionen de manera diferente.

Cuando se forma la capa de micropozos, puede ser necesario proporcionar una capa de detención de grabado para que el proceso de grabado no prosiga más allá de lo deseado. Por ejemplo, puede haber una capa subyacente que conservar, tal como un dieléctrico de bajo K. El material de detención de grabado debe seleccionarse según la aplicación. Los materiales de SiC y SiN pueden ser adecuados, pero eso no significa que no se puedan emplear otros materiales en su lugar. Estos materiales de detención de grabado también pueden servir para mejorar la química de la superficie que impulsa la sensibilidad del sensor ISFET, eligiendo el material de detención de grabado para tener un punto apropiado de carga cero (PZC). Varios óxidos de metal pueden ser una adición adecuada al dióxido de silicio y al nitruro de silicio.

Los PZC para varios óxidos de metal se pueden encontrar en varios textos, como " Metal Oxides - Chemistry and Applications" por J. Fierro. Hemos aprendido que se puede preferir Ta2O5 como una detención de grabado sobre AhO3 porque el PZC de AhO3 está justo en el pH que se usa (es decir, aproximadamente 8,8) y, por lo tanto, justo en el punto de carga cero Además, Ta2O5 tiene una mayor sensibilidad al pH (es decir, mV/pH), otro factor importante en el rendimiento del sensor. La optimización de estos parámetros puede requerir una selección juiciosa de los materiales de la superficie de pasivación.

El uso de materiales delgados de óxido de metal para este fin (es decir, como una capa de detención del grabado) es difícil debido al hecho de que se depositan de manera muy delgada (típicamente 200-500A). Una técnica de deposición de óxido de metal posterior a la fabricación de micropozos puede permitir la colocación de películas de óxido de metal PZC adecuadas en la parte inferior de los micropozos de alta relación de aspecto.

Las deposiciones de haces de electrones de (a) óxido de tantalio pulverizado reactivamente, (b) óxido de tantalio estequiométrico no reactivo, (c) óxido de tungsteno o (d) óxido de vanadio pueden demostrar tener una cobertura superior "en el pozo" debido a la direccionalidad superior del proceso de deposición.

La matriz puede comprender al menos 100 pozos de microfluidos, cada uno de los cuales está acoplado a uno o más sensores chemFET. Los pozos se pueden formar en al menos uno de un vidrio (por ejemplo, SiO2), un material polimérico, un material fotodefinible o un material de película delgada grabable con iones reactivos. En una realización, los pozos tienen una relación de ancho a altura menor que aproximadamente 1:1. El sensor puede ser un transistor de efecto de campo o un chemFET. El chemFET puede acoplarse opcionalmente a un receptor PPi. Cada uno de los chemFET puede ocupar un área de la matriz que es de 102 micras o menos según diversas realizaciones.

En una realización, un dispositivo de secuenciación que comprende un dispositivo de oblea semiconductora acoplado a una capa dieléctrica tal como un material de vidrio (por ejemplo, SO2), polimérico, fotodefinible o grabable con iones reactivos en el que se forman cámaras de reacción. Normalmente, el material de vidrio, dieléctrico, polimérico, fotodefinible o grabable con iones reactivos se integra con la capa de oblea semiconductora. En algunos casos, la capa de vidrio, polimérica, fotodefinible o grabable con iones reactivos no es cristalina. En algunos casos, el vidrio puede ser SiO2. El dispositivo puede comprender opcionalmente además un módulo de suministro de fluidos de un material adecuado tal como un material polimérico, preferentemente un material moldeable por inyección. Con mayor preferencia, la capa polimérica es policarbonato.

Algunos ejemplos abarcan un método para fabricar un dispositivo de secuenciación que comprende: usar fotolitografía, generar pozos en un material de vidrio, dieléctrico, fotodefinible o grabable con iones reactivos encima de una serie de transistores.

Aún otra alternativa cuando se utiliza un CMOS o un proceso de fabricación similar para la fabricación de matrices es formar los micropozos directamente utilizando los materiales CMOS. Es decir, la capa de metalización superior de CMOS que forma las puertas flotantes de la matriz del ISFET generalmente está recubierta con una capa de pasivación de aproximadamente 1,3 pm de grosor. Se pueden formar micropozos de 1,3 pm de profundidad grabando el material de pasivación. Por ejemplo, se pueden formar micropozos que tengan una relación de aspecto de 1:1, 1,3 pm de profundidad y 1,3 pm de ancho en sus partes superiores. El modelado indica que a medida que se reduce el tamaño del pozo, de hecho, aumenta la concentración de ADN y, por lo tanto, la SNR. Por lo tanto, en igualdad de condiciones, tales pozos pequeños pueden resultar convenientes.

Montaje de la celda de flujo (interfaz de fluidos) al chip del sensor

El proceso de usar el ensamblaje de una matriz de sensores en un chip combinado con una matriz de micropozos para secuenciar el ADN en una muestra se denomina "experimento". Para ejecutar un experimento, los pozos pueden cargarse con perlas unidas al ADN y el flujo de varias soluciones fluidas diferentes (es decir, reactivos y lavados) a través de los pozos. Se necesita un sistema de suministro de fluidos (por ejemplo, válvulas, conductos, fuente(s) de presión, etc.) acoplado con una interfaz fluídica que haga fluir las diversas soluciones a través de los pozos en un flujo uniforme controlado con volúmenes muertos aceptablemente pequeños y poca contaminación cruzada entre soluciones secuenciales. La interfaz fluídica con el chip (a veces denominada "celda de flujo") haría que el fluido llegara a todos los micropozos al mismo tiempo. Para maximizar la velocidad de la matriz, las salidas de la matriz pueden estar disponibles lo más cerca posible al mismo tiempo. Un ejemplo busca minimizar los diferenciales, o sesgos, de los tiempos de llegada de un fluido introducido, en los diversos pozos, para maximizar la velocidad general de adquisición de todas las señales de la matriz.

Son posibles diseños de celdas de flujo de muchas configuraciones; por lo tanto, el sistema y los métodos presentados en la presente descripción no dependen del uso de una configuración de celda de flujo específica. Sin embargo, es conveniente que una celda de flujo adecuada se ajuste sustancialmente al siguiente conjunto de objetivos:

• tener conexiones adecuadas para interconectarse con un sistema de suministro de fluidos, por ejemplo, a través de un tubo de tamaño apropiado;

tener un espacio de cabeza apropiado sobre los pozos;

minimizar los volúmenes muertos que encuentran los fluidos;

minimizar los espacios pequeños en contacto con líquido, pero que no se limpian rápidamente mediante el flujo de un líquido de lavado a través de la celda de flujo (para minimizar la contaminación cruzada); configurarse para lograr un tiempo de tránsito uniforme del flujo sobre la matriz;

generar o propagar burbujas mínimas en el flujo sobre los pozos;

puede adaptarse a la colocación de un electrodo de referencia extraíble dentro o lo más cerca posible de la cámara de flujo;

facilitar la carga fácil de perlas;

puede fabricarse a un costo aceptable; y

puede ensamblarse y adjuntarse fácilmente al paquete de chips.

La satisfacción de estos criterios en la medida de lo posible contribuirá positivamente al rendimiento del sistema. Por ejemplo, la minimización de las burbujas es importante para que las señales de la matriz realmente indiquen la reacción en un pozo en lugar de ser un ruido falso.

Cada uno de varios diseños de ejemplo se describirá, cumpliendo estos criterios en diferentes formas y grados. En cada caso, normalmente se puede elegir implementar el diseño de una de dos maneras: ya sea adjuntando la celda de flujo a un marco y pegando el marco (o adhiriéndolo de otro modo) al chip o integrando el marco en la estructura de la celda de flujo y unir este conjunto unificado al chip. Además, los diseños pueden categorizarse por la forma en que el electrodo de referencia está integrado en la disposición. En dependencia del diseño, el electrodo de referencia puede estar integrado en la celda de flujo (por ejemplo, formar parte del techo de la cámara de flujo) o estar en la trayectoria de flujo (normalmente en la salida o en el lado aguas abajo de la trayectoria de flujo, después de la matriz del sensor).

Un primer ejemplo de un aparato de experimentación adecuado 3410 que incorpora tal interfaz fluídica se muestra en las Figuras 34 - 37, cuya fabricación y construcción se describirá en mayor detalle más adelante.

El aparato comprende un chip semiconductor 3412 (indicado generalmente, aunque oculto) sobre o en el que se forman las matrices de pozos y sensores, y un conjunto de fluidos 3414 encima del chip y se suministra la muestra al chip para su lectura. El conjunto de fluidos incluye una porción 3416 para introducir el fluido que contiene la muestra, una porción 3418 para permitir que el fluido se canalice y una porción de la cámara de flujo 3420 para permitir que el fluido fluya desde la entrada hasta la salida y a lo largo del camino interactúe con el material en los pozos Esas tres porciones están unificadas por una interfaz que comprende un portaobjetos de vidrio 3422 (por ejemplo, Erie Microarray Cat #C22-5128-M20 de Erie Scientific Company, Portsmouth, NH, cortado en tercios, cada uno con un tamaño de aproximadamente 25 mm x 25 mm).

Montados en la cara superior del portaobjetos de vidrio hay dos accesorios, 3424 y 3426, tales como los accesorios de nanopuerto Parte # N-333 de Upchurch Scientific de Oak Harbor, WA. Un puerto (por ejemplo, 3424) sirve como una entrada que suministra líquidos desde el sistema de bombeo/válvula que se describe a continuación pero que no se muestra aquí. El segundo puerto (por ejemplo, 3426) es la salida que canaliza los líquidos hacia el desecho. Cada puerto se conecta a un conducto 3428, 3432 como un tubo flexible de diámetro interior apropiado. Los nanopuertos se montan de manera que el tubo pueda penetrar los orificios correspondientes en el portaobjetos de vidrio. Las aberturas de los tubos deben quedar al ras con la superficie inferior del portaobjetos.

En la parte inferior del portaobjetos de vidrio, la cámara de flujo 3420 puede comprender varias estructuras para promover un flujo sustancialmente laminar a través de la matriz de micropozos. Por ejemplo, una serie de canales de microfluidos que se abren en abanico desde el tubo de entrada hasta el borde de la cámara de flujo pueden modelarse mediante litografía de contacto utilizando fotorresistencias positivas tal como la fotorresistencia SU-8 de MicroChem Corp. de Newton, MA. Otras estructuras se describirán a continuación.

El chip 3412, a su vez, se montará en un portador 3430, para empaquetarlo y conectarlo a las patillas del conector 3432.

Para facilitar la descripción, para describir la fabricación a partir de la Figura 38, ahora consideraremos que el portaobjetos de vidrio 3422 está invertido en relación con la orientación que tiene en las Figuras 34-37.

Se aplica una capa de fotorresistencia 3810 a la "parte superior" del portaobjetos (que se convertirá en el lado "inferior" cuando el portaobjetos y sus capas adicionales se den la vuelta y se monten en el conjunto del sensor de la matriz del ISFET con la matriz de micropozos). La capa 3810 puede tener un grosor de aproximadamente 150 pm en este ejemplo, y formará la capa principal de transporte de fluidos desde el extremo del tubo en los nanopuertos hasta el borde del chip de matriz de sensores. La capa 3810 está modelada usando una máscara como la máscara 3910 de la Figura 39 ("modelada" significa que se usa una fuente de radiación para exponer la resistencia a través de la máscara y luego se retira la resistencia no plastificada). La máscara 3910 tiene regiones transparentes a la radiación que se muestran en blanco y regiones que bloquean la radiación 3920, que se muestran sombreadas. Las regiones de bloqueo de radiación están en 3922-3928. La región 3926 formará un canal alrededor del conjunto del sensor; se forma aproximadamente 0,5 mm dentro del límite exterior de la máscara 3920, para evitar el borde típico. Las regiones 3922 y 3924 bloquearán la radiación de manera que las partes correspondientes de la resistencia se eliminen para formar huecos con la forma que se muestra. Cada una de las regiones 3922, 3924 tiene un extremo redondeado dimensionado para recibir un extremo de uno tubo correspondiente de los tubos 3428, 3432 que pasa a través de un nanopuerto correspondiente 3424, 3426. Desde el extremo redondeado, las regiones 3922, 3924 se abren en abanico en la dirección de la matriz de sensores para permitir que el líquido se extienda de manera que el flujo a través de la matriz sea sustancialmente laminar. La región 3928 es simplemente un patrón de alineación y puede ser cualquier patrón de alineación adecuado o reemplazarse por un mecanismo de alineación sustituto adecuado. Se han proporcionado líneas discontinuas en la Figura 38 para ilustrar la formación de los vacíos 3822 y 3824 debajo de las regiones de máscara 3922 y 3924.

Una segunda capa de fotorresistencia se forma de manera bastante separada, no en la resistencia 3810 ni en el portaobjetos 3422. Preferentemente, se forma sobre una superficie plana y flexible (no se muestra), para crear una capa de plástico modelada que se despega. Como se muestra en la Figura 40, esta segunda capa de fotorresistencia puede formarse usando una máscara como la máscara 4010, que dejará en el sustrato flexible, después de modelar, el borde debajo de la región 4012, dos ranuras debajo de las regiones 4014, 4016, cuyo uso se describirá a continuación, y las marcas de alineación producidas por las regiones modeladas 4018 y 4022. La segunda capa de fotorresistencia se aplica luego a la primera capa de fotorresistencia utilizando una marca de alineación o un conjunto de marcas de alineación, digamos producidas por el patrón 4018, para la alineación de estas capas. A continuación, se despega la segunda capa de su sustrato flexible y se retira esta última.

La otra marca de alineación o conjunto de marcas producido por el patrón 4022 se usa para la alineación con una capa posterior que se describirá.

La segunda capa tiene preferentemente una profundidad de aproximadamente 150 |jm y recubrirá el canal de transporte de fluidos con la excepción de una hendidura de aproximadamente 150 jm de largo en cada borde respectivo del chip de matriz de sensores, debajo de las regiones de formación de hendiduras 4014 y 4016.

Una vez que la segunda capa de fotorresistencia se dispone sobre la primera capa, se forma una tercera capa modelada de fotorresistencia sobre la segunda capa, usando una máscara como la máscara 4110, que se muestra en la Figura 41. La tercera capa proporciona un miembro deflector debajo de la región 4112 que es tan ancho como el collar 3310 en la matriz de chips de sensores (ver la Figura 33) pero aproximadamente 300 jm más estrecho para permitir la superposición con el canal de transporte de fluidos de la primera capa. La tercera capa puede tener un grosor de aproximadamente 150 jm y penetrará en el collar de chips 3310, hacia el suelo de la cuenca de esta manera formada, en 150 jm. Esta configuración dejará un espacio de cabeza de aproximadamente 300 jm por encima de los pozos en el chip de matriz de sensores. Los líquidos fluyen a través de los pozos a lo largo de todo el ancho de la matriz de sensores a través de las ranuras de 150 jm debajo de 4014, 4016.

La Figura 36 muestra una vista en sección parcial, en perspectiva, del ejemplo descrito anteriormente de un conjunto de sensores y microfluidos, también representado en las Figuras 34 y 35, ampliadas para hacer más visible la trayectoria del flujo de fluido. (En la Figura 37 se muestra un esquema ampliado adicional de la mitad de la trayectoria del flujo). Aquí, se verá que el fluido entra a través del tubo de entrada 3428 en el puerto de entrada 3424. En la parte inferior de la tubería 3428, el fluido fluye a través de la cámara de expansión de flujo 3610 formada por el área de la máscara 3922, el fluido fluye sobre el collar 3310 y luego hacia la parte inferior 3320 del recipiente, y a través del pastilla 3412 con su matriz de micropozos. Después de pasar sobre la matriz, el fluido entonces toma un giro vertical en la pared opuesta del collar 3310 y fluye sobre la parte superior del collar hacia y a través de la cámara de concentración de flujo 3612 formada por el área de la máscara 3924, saliendo a través del tubo de salida 3432 en la salida puerto 3426. Parte de este flujo, desde el centro de la matriz hasta la salida, también puede verse en la ilustración esquemática ampliada de la Figura 37, en el que las flechas indican el flujo del fluido.

El conjunto de fluidos se puede asegurar al conjunto de chips de matriz de sensores aplicando un adhesivo a las partes de las superficies de acoplamiento de esos dos conjuntos, y presionándolos juntos, en alineación.

Aunque no se ilustra en las Figuras 34-36, se puede entender que el electrodo de referencia es una metalización 3710, como se muestra en la Figura 37, en el techo de la cámara de flujo.

En la Figura 42 se muestra otra forma de introducir el electrodo de referencia. Allí, se proporciona un orificio 4210 en el techo de la cámara de flujo y se ajusta un ojal 4212 (por ejemplo, de silicona) en ese orificio, proporcionando un pasaje u orificio central a través del cual se puede insertar un electrodo de referencia 4220. Los deflectores u otros microelementos (que no se muestran en la Figura 42 pero que se describen a continuación en relación con la Figura 42A) se pueden modelar en el canal de flujo para promover el flujo laminar sobre la matriz de micropozos.

El logro de un frente de flujo uniforme y la eliminación de áreas de trayectoria de flujo problemáticas puede lograrse mediante diversas realizaciones por varias razones. Una de las razones es que la transición muy rápida de las interfaces de fluidos dentro de la celda de flujo del sistema ayuda a muchas aplicaciones, en particular a la secuenciación de genes. En otras palabras, un fluido entrante debe desplazar completamente el fluido anterior en un corto período de tiempo. Las velocidades y la difusión desiguales del fluido dentro de la celda de flujo, así como las trayectorias de flujo problemáticas, pueden competir con este requisito. El flujo simple a través de un conducto de sección transversal rectangular puede exhibir una disparidad considerable de la velocidad del fluido desde las regiones cercanas al centro del volumen de flujo hasta las adyacentes a las paredes laterales, una pared lateral es la superficie superior de la capa de micropozos y el fluido en los pozos. Tal disparidad conduce a grandes gradientes de concentración espacial y temporalmente entre los dos fluidos que se desplazan. Además, es probable que queden atrapadas o se creen burbujas en áreas estancadas como esquinas afiladas dentro de la celda de flujo. (La energía superficial (hidrofílica versus hidrofóbica) puede afectar significativamente la retención de burbujas. Se debe considerar evitar la contaminación de la superficie durante el procesamiento y el uso de un tratamiento de superficie para crear una superficie más hidrófila si la superficie moldeada es demasiado hidrófoba). Por supuesto, la disposición física de la cámara de flujo es probablemente el factor que más influye en la grado de uniformidad alcanzable para el frente de flujo.

Un enfoque consiste en configurar la sección transversal de flujo de la cámara de flujo para lograr velocidades de flujo que varíen a lo largo del ancho de la matriz, de manera que los tiempos de tránsito sean uniformes en toda la matriz. Por ejemplo, la sección transversal de la sección 3416, 3610 del difusor (es decir, la cámara de expansión de flujo) puede hacerse como se muestra en 4204A en la Figura 42A, en lugar de ser simplemente rectangular, como en 4204A. Es decir, puede tener una pared curva (por ejemplo, cóncava). La pared no plana 4206A del difusor puede ser la parte superior o la parte inferior. Otro enfoque consiste en configurar las longitudes de trayectoria efectivas en la matriz de manera que las longitudes de trayectoria totales desde la entrada hasta la salida de la matriz sean esencialmente las mismas. Esto se puede lograr, por ejemplo, colocando elementos que interrumpen el flujo, como cilindros u otras estructuras orientadas normales a la dirección del flujo, en la trayectoria del flujo. Si la cámara de flujo tiene como piso la parte superior de la matriz de micropozos y como techo una pared opuesta, estas estructuras de interrupción del flujo pueden proporcionarse en la parte superior de la capa de micropozos o sobre (o dentro) de la pared del techo. Las estructuras deben proyectarse lo suficiente en el flujo para tener el efecto deseado, pero incluso las pequeñas perturbaciones del flujo pueden tener un impacto significativo. Volviendo a las Figuras 42B-42F, se muestran esquemáticamente algunos ejemplos de tales estructuras. En la Figura 42B, en la superficie de la capa de micropozos 4210B se forman una serie de disruptores de flujo cilíndricos 4214B que se extienden verticalmente hacia la pared del techo de la cámara de flujo 4212B y sirven para perturbar el flujo laminar del fluido que se mueve en la dirección de la flecha A. La Figura 42C representa una disposición similar excepto que los disruptores de flujo 4216C tienen la parte superior redondeada y parecen más protuberancias, tal vez hemisferios o cilindros con las partes superiores esféricas. Por el contrario, en la Figura 42D, los disruptores de flujo 4218D sobresalen, o dependen, de la pared del techo 4212B de la cámara de flujo. Solo se muestra una columna de disruptores de flujo, pero debe apreciarse que se puede usar una pluralidad de columnas más o menos paralelas. Por ejemplo, la Figura 42E muestra varias columnas 4202E de tales disruptores de flujo (que se proyectan hacia fuera desde la pared del techo 4212B (aunque la orientación es invertida con respecto a las Figuras 42B-42D). El espacio entre los disruptores y sus alturas puede seleccionarse para influir en la distancia sobre la cual el perfil de flujo se vuelve parabólico, de manera que el tiempo de tránsito se equilibre.

Otra configuración, mostrada en las Figuras 42F y 42F1, implica el uso de proyecciones sólidas similares a vigas o deflectores 4220F como disruptores. Este concepto puede usarse para formar un miembro de techo para la cámara de flujo. Tal disposición favorece un flujo de fluido más uniforme y reduce significativamente los tiempos de desplazamiento de fluido en comparación con una sección transversal rectangular simple sin estructura del disruptor. Además, en lugar de que la entrada de fluido a la matriz se produzca a lo largo de un borde, el fluido puede introducirse en una esquina 4242F, a través de un pequeño puerto, y puede salir por la esquina opuesta, 4244F, a través de un puerto en comunicación de fluidos con esa área de esquina. La serie de deflectores paralelos 4220F separa el volumen de flujo entre las esquinas de entrada y salida en una serie de canales. La trayectoria resistente a fluidos más baja está a lo largo del borde del chip, perpendicular a los deflectores. A medida que el líquido entrante llena este canal, el fluido se dirige entre los deflectores hacia el lado opuesto del chip. La profundidad del canal entre cada par de deflectores está preferentemente graduada a lo largo del chip, de manera que se favorece que el flujo se desplace hacia el puerto de salida a través del canal más alejado, igualando de esta manera el frente de flujo entre los deflectores. Los deflectores se extienden hacia abajo casi hasta la superficie del chip (es decir, la capa de micropozos), pero debido a que son bastante delgados, el fluido puede difundirse debajo de ellos rápidamente y exponer el área asociada del conjunto de matriz.

Las Figuras 42F2-42F8 ilustran un ejemplo de un miembro de celda de flujo moldeado por inyección (preferentemente de policarbonato) de una sola pieza 42F200 que se puede usar para proporcionar deflectores 4220F, un techo para la cámara de flujo, puertos de entrada y salida de fluido e incluso el electrodo de referencia. La Figura 42F7 muestra una vista ampliada de los deflectores en la parte inferior del miembro 42F200 y los deflectores se muestran como parte de la parte inferior del miembro 42F200 en la Figura 42F6. Como es difícil formar elementos rectangulares en pequeñas dimensiones mediante moldeo por inyección, el ejemplo particular de estos deflectores, que se muestra como 4220F', tiene una sección transversal triangular.

En la Figura 42F2, hay una vista isométrica superior del miembro 42F200 montado en un paquete de matriz de sensores 42F300, con un sello 42F202 formado entre ellos y las patillas de contacto 42F204 que dependen del paquete de chip de matriz de sensores. Las Figuras 42F3 y 42F4 muestran secciones, respectivamente, a través de las líneas de sección HH y II de la Figura 42F5, lo que permite ver en relación el chip de matriz de sensores 42F250, los deflectores 4220F' y las trayectorias de flujo de fluido a través de los puertos de entrada 42F260 y salida 42F270. Aplicando una metalización a la parte inferior 42F280 del miembro 42F200, se puede formar el electrodo de referencia.

También se pueden usar otras localizaciones y enfoques para introducir el flujo de fluido en la cámara de flujo. Además de las realizaciones en las que se puede introducir fluido a lo ancho de un borde del conjunto de chip 42F1, como en las Figuras 57-58, por ejemplo, o se puede introducir fluido en una esquina del conjunto de chips, como en la Figura 42F1. También se puede introducir fluido, por ejemplo, como en las Figuras 42G y 42H, donde el fluido fluye a través de un conducto de entrada 4252G para descargarse adyacente y hacia el centro del chip, como en 4254G, y fluye radialmente hacia fuera desde el punto de introducción.

Las Figuras 421 y 42J junto con las Figuras 42G y 42H representan en sección transversal un ejemplo de tal estructura y su funcionamiento. A diferencia de los ejemplos anteriores, esta realización contiene un elemento adicional, una válvula de diafragma, 42601. Inicialmente, como se muestra en la Figura 42H, la válvula 42601 está abierta, proporcionando una trayectoria a través del conducto 42621 a un depósito de residuos (no se muestra). La válvula abierta proporciona un flujo de baja impedancia al depósito o salida de desechos. Luego se aplica presión de aire a la válvula de diafragma, como en la Figura 42J, cerrando la trayectoria de baja impedancia y haciendo que el flujo de fluido continúe hacia abajo a través del orificio central 4264J en el miembro 4266J que forma el techo de la cámara de flujo y a través del conjunto de chips (sensor). El flujo se recoge por los canales en los bordes del sensor, como se describe arriba, y sale a la salida de desechos a través del conducto 4268J.

Una variación de esta idea se representa en las Figuras 42K-42M, que muestran que el fluido no se introduce en el centro del conjunto de chips, sino en una esquina, 4272K, en su lugar. Fluye a través del chip 3412 como se indica simbólicamente por las líneas 4274K y se elimina en la esquina diagonalmente opuesta, 4276K. La ventaja de este concepto es que casi elimina cualquier punto de estancamiento. También tiene la ventaja de que la matriz de sensores se puede posicionar verticalmente para que el flujo se introduzca en la parte inferior y se elimine en la parte superior para ayudar a eliminar las burbujas. Este tipo de realización, por cierto, puede considerarse como un cuadrante de las realizaciones con el flujo introducido en el centro de la matriz. En la Figura 42L se muestra un ejemplo de una implementación con una válvula 4278L cerrada y que desvía el flujo a la salida o depósito de desechos. La principal diferencia con respecto a la realización de las Figuras 421 y 42J es que el flujo de fluido se introduce en una esquina de la matriz en lugar de en su centro.

En todos los casos, se debe prestar atención para garantizar un lavado completo de toda la cámara de flujo, junto con los micropozos, entre ciclos de reactivos. Las alteraciones del flujo pueden exacerbar el desafío de limpiar completamente la cámara de flujo.

Las alteraciones del flujo también pueden inducir o multiplicar las burbujas en el fluido. Una burbuja puede evitar que el fluido llegue a un micropozo o retrasar su introducción en el micropozo, introduciendo un error en la lectura del micropozo o haciendo que la salida de ese micropozo sea inútil en el procesamiento de las salidas de la matriz. Por lo tanto, se debe tener cuidado al seleccionar las configuraciones y dimensiones de los elementos disruptores de flujo para gestionar estos posibles factores adversos. Por ejemplo, se puede hacer una compensación entre las alturas de los elementos disruptores y el cambio de perfil de velocidad que se desea.

Las Figuras 43 - 44 muestran otro diseño alternativo de celda de flujo, 4310. Este diseño se basa en el moldeo de una sola pieza de plástico o miembro 4320 que se unirá al chip para completar la celda de flujo. La conexión al sistema de fluidos se realiza a través de conexiones roscadas se introduce en los orificios correspondientes de la pieza de plástico en 4330 y 4340. O, si el miembro 4320 está hecho de un material tal como polidimetilsiloxano (PDMS), las conexiones se pueden realizar simplemente insertando el tubo en un orificio de tamaño adecuado en el miembro 4320. Una sección transversal vertical de este diseño se muestra en las Figuras 43-44. Este diseño puede usar un collar de plástico sobresaliente 4350 (que puede ser una pared sólida como se muestra o una serie de patas dependientes separadas que forman una pared similar a una cerca que se extiende hacia abajo) para encerrar el paquete de chips y alinear la pieza de plástico con el paquete de chips, u otra estructura adecuada, y por lo tanto para alinear el marco del chip con el miembro que forma la celda de flujo 4320. El líquido se dirige al interior de la celda de flujo a través de una de las aberturas 4330, 4340, y desde allí desciende hacia la cámara de flujo.

En el ejemplo ilustrado, el electrodo de referencia se introduce en la parte superior de la cámara de flujo a través de un orificio 4325 en el miembro 4320. La colocación del electrodo de referencia extraíble se ve facilitada por un manguito de silicona 4360 y un anillo de tope de epoxi 4370 (consulte la ampliación de la Figura 44). El manguito de silicona proporciona un sello hermético y el anillo de tope de epoxi evita que el electrodo se inserte demasiado en la celda de flujo. Por supuesto, se pueden emplear otros mecanismos para los mismos fines y puede que no sea necesario emplear una estructura para detener el electrodo. Y si se usa un material como PDMS para el miembro 4320, el propio material puede formar un sello hermético cuando se inserta el electrodo, obviando la necesidad del manguito de silicona.

Las Figuras 45 y 46 muestran una disposición similar excepto que el miembro 4510 carece de un orificio para recibir un electrodo de referencia. En su lugar, el electrodo de referencia 4515 está formado o fijado a la parte inferior de la porción central 4520 y forma al menos parte del techo de la cámara de flujo. Por ejemplo, se puede aplicar una capa de metalización en la parte inferior de la porción central 4520 antes de montar el miembro 4510 en el paquete de chips.

Las Figuras 47-48 muestran otro ejemplo, que es una variante del ejemplo mostrado en las Figuras 43-44, pero en el que el marco se fabrica como parte de la celda de flujo más bien uniendo una estructura de puerto de flujo a un marco previamente unido a la superficie del chip. En diseños de este tipo, el ensamblaje es algo más delicado ya que las soldaduras de los cables al chip no están protegidas por el epoxi que encapsula el chip. El éxito de este diseño depende de la colocación precisa y el pegado seguro del "marco" integrado a la superficie del chip. Una realización equivalente a la de las Figuras 45-46, con el electrodo de referencia 4910 en el techo de la cámara de flujo y con el marco fabricado como parte de la celda de flujo, se muestra en las Figuras 49-50.

Aún otra alternativa para un conjunto de fluidos, como se muestra en las Figuras 51-52, tiene un elemento de control de fluidos 5110 elevado aproximadamente 5,5 mm en los separadores 5120 desde la parte superior del paquete de chips 5130. Esto permite que un operador inspeccione visualmente la calidad de la unión entre la pieza de plástico 5140 y la superficie del chip y refuerce la unión externamente si es necesario.

Algunos de los ejemplos alternativos anteriores también pueden implementarse en una configuración híbrida de plástico/PDMS. Por ejemplo, como se muestra en las Figuras 53-54, una pieza de plástico 5310 puede formar el marco y la cámara de flujo, descansando sobre una porción de "base" de PDMS 5320. La parte de plástico 5310 también puede proporcionar una región 5330 a la matriz, para la expansión del flujo de fluido desde el puerto de entrada; y la parte de PDMS puede incluir ranuras de comunicación 5410, 5412 a través de las cuales pasan líquidos desde la parte de PDMS hacia y desde la cámara de flujo de abajo.

La estructura fluídica también puede estar hecha de vidrio como se ha comentado anteriormente, tal como vidrio fotodefinible (PD). Tal vidrio puede tener una velocidad de grabado mejorada en ácido fluorhídrico una vez expuesto selectivamente a la luz ultravioleta y, por lo tanto, las características pueden micromaquinarse en la parte superior y la parte posterior, que cuando se pegan juntas pueden formar una celda fluídica tridimensional de baja relación de aspecto.

En la Figura 55 se muestra un ejemplo. Una primera capa o lámina de vidrio 5510 ha sido modelada y grabada para crear orificios fluídicos de nanopuertos 5522 y 5524 en el lado superior y canales de expansión de fluidos 5526 y 5528 en el lado posterior. Una segunda capa o lámina de vidrio 5530 ha sido modelada y grabada para proporcionar canales de entrada/salida de fluido hacia abajo 5532 y 5534, de aproximadamente 300 pm de altura (el grosor de la capa). La superficie inferior de la capa 5530 se adelgaza hacia el exterior de los canales 5532 y 5534, para permitir que la capa 5530 descanse sobre el marco del chip y el área saliente 5542 para estar a una altura adecuada para formar la parte superior del canal de flujo. Se utilizan dos capas de vidrio, u obleas, y cuatro pasos de litografía. Ambas obleas deben estar alineadas y unidas (por ejemplo, con un pegamento apropiado, que no se muestra) de manera que los puertos de entrada/salida de fluido hacia abajo estén alineados correctamente con los canales de expansión de fluido. Las dianas de alineación se pueden grabar en el cristal para facilitar el proceso de alineación. Los nanopuertos se pueden asegurar sobre los orificios fluídicos de los nanopuertos para facilitar la conexión de los tubos de entrada y salida.

Se puede grabar un orificio central 5550 a través de las capas de vidrio para recibir un electrodo de referencia, 5560. El electrodo se puede asegurar y sellar en su lugar con un collar de silicona 5570 o una estructura similar; o el electrodo puede estar equipado integralmente con una arandela adecuada para realizar el mismo propósito.

Al usar materiales de vidrio para la celda fluídica de dos capas, el electrodo de referencia también puede ser una capa conductora o patrón depositado en la superficie inferior de la segunda capa de vidrio (no se muestra). O, como se muestra en la Figura 56, la región sobresaliente se puede grabar para formar una membrana de vidrio permeable 5610 sobre la cual se recubre una película delgada de plata (u otro material) 5620 para formar un electrodo de referencia integrado. Se puede grabar un orificio 5630 en la capa superior para acceder al electrodo y, si ese orificio es lo suficientemente grande, también puede servir como depósito para una solución de cloruro de plata. La conexión eléctrica al electrodo de plata de película delgada se puede realizar de cualquier forma adecuada, tal como mediante un conector de pasador con clip o, alternativamente, mediante soldaduras de alambre al paquete ISFET de cerámica.

Otra alternativa es integrar el electrodo de referencia al chip secuenciador/celda de flujo utilizando una superficie metalizada en el techo de la cámara de flujo, es decir, en la parte inferior del miembro que forma el techo de la celda fluídica. Se puede realizar una conexión eléctrica a la superficie metalizada en cualquiera de una variedad de formas, que incluyen, pero sin limitarse a, mediante la aplicación de un epoxi conductor al anillo de sello de cerámica del paquete que, a su vez, se puede conectar eléctricamente a través de una vía en el sustrato cerámico a un pin de repuesto en la parte inferior del paquete de chips. Hacer esto permitiría el control a nivel del sistema del potencial de referencia en la celda de fluido por medio de entradas a través del soporte del enchufe del chip a la electrónica de control del chip.

Por el contrario, un electrodo insertado externamente requiere un tubo de fluido adicional al puerto de entrada, lo que requiere un flujo de fluido adicional entre ciclos.

El paquete de matriz de rejilla de patillas de cerámica (PGA) se puede usar para la matriz ISFET, lo que permite conexiones eléctricas personalizadas entre varias superficies en la cara frontal con patillas en la parte posterior. La celda de flujo se puede considerar como una "tapa" para el chip ISFET y su PGA. La celda de flujo, como se indica en otra parte, puede fabricarse con muchos materiales diferentes. El policarbonato moldeado por inyección parece ser bastante adecuado. Se puede depositar un metal conductor (por ejemplo, oro) utilizando una capa de adhesión (por ejemplo, cromo) en la parte inferior del techo de la celda incandescente (el techo de la cámara de flujo). Preferentemente, se emplean técnicas apropiadas de deposición de película delgada a baja temperatura en la deposición del electrodo de referencia de metal debido a los materiales (por ejemplo, policarbonato) y la topografía de gran cobertura de escalones en el lado inferior de la celda fluídica (es decir, el borde del marco de matriz ISFET). Un posible enfoque sería utilizar la evaporación por haz de electrones en un sistema planetario.

El área del electrodo activo se limita a la cámara de flujo central dentro del marco de la matriz ISFET, ya que es la única superficie metalizada que estaría en contacto con el fluido iónico durante la secuenciación.

Una vez que se completa el ensamblaje, se puede dispensar epoxi conductivo (por ejemplo, Epo-Tek H20E o similar) en el anillo de sello con la celda de flujo alineada, colocada, prensada y curada, la celda de flujo ISFET está lista para funcionar con el potencial de referencia aplicado a la patilla asignada del paquete.

Las conexiones del sistema de fluidos resultante al dispositivo ISFET incorporan por lo tanto líneas de fluidos de entrada y salida acortadas, lo cual es conveniente.

En las Figuras 57-58 se muestra todavía otro ejemplo de un conjunto fluídico. Este diseño se limita a una pieza de plástico 5710 que incorpora el marco y se une directamente a la superficie del chip, y a una segunda pieza 5720 que se utiliza para conectar los tubos del sistema de fluidos y, de manera similar a la pieza de PDMS descrita anteriormente, distribuye los líquidos desde el tubo de pequeño calibre hasta una hendidura ancha y plana. Las dos piezas se pegan entre sí y se pueden usar múltiples (por ejemplo, tres) marcadores de alineación (no se muestran) para alinear con precisión las dos piezas durante el proceso de pegado. Se puede proporcionar un orificio en la placa inferior y se puede usar el orificio para llenar la cavidad con un epoxi (por ejemplo) para proteger las uniones de cables al chip y para llenar cualquier espacio potencial en el contacto marco/chip. En el ejemplo ilustrado, el electrodo de referencia es externo a la celda de flujo (aguas abajo en el flujo de escape, a través del puerto de salida; consulte a continuación), aunque, por supuesto, se pueden usar otras configuraciones de electrodo de referencia.

Todavía otros ejemplos de estructuras de celdas de flujo se muestran en las Figuras 59-60. La Figura 59A comprende ocho vistas (A-H) de una capa o placa inferior moldeada por inyección, 5910, para una interfaz de fluídica de celda de flujo, mientras que la Figura 59B comprende siete vistas (A-G) de una placa o capa superior moldeada por inyección coincidente, 5950. La parte inferior de la placa 5910 tiene un borde que cuelga hacia abajo 5912 configurado y dispuesto para encerrar el chip del sensor y un borde que se extiende hacia arriba 5914 para acoplarse con la placa superior 5610 a lo largo de su borde exterior. Para formar dos cámaras de fluido (una cámara de entrada y una cámara de salida) entre estas. Una porción escalonada que cuelga hacia abajo 5960 de la placa superior 5950 separa la cámara de entrada de la cámara de salida. Un tubo de entrada 5970 y un tubo de salida 5980 están moldeados integralmente con el resto de la placa superior 5950. Desde el tubo de entrada 5970, que desemboca en el extremo pequeño de la cámara de entrada formada por una depresión 5920 en la parte superior de la placa 5910, hasta el borde de salida de la cámara de entrada, se abre para dirigir el fluido por todo la matriz. Ya sea que se use vidrio, plástico u otro material para formar la celda de flujo, puede ser conveniente, especialmente con matrices más grandes, incluir en la cámara de entrada de la celda de flujo, entre el conducto de entrada y el borde frontal de la matriz, no solo un espacio que se expande gradualmente (abanico), sino también alguna estructura para facilitar el flujo a través de la matriz que es adecuadamente laminar. Usando la capa inferior 5990 de una celda de flujo moldeada por inyección como ejemplo, un tipo de estructura de ejemplo para este propósito, que se muestra en la Figura 59C, es una estructura de árbol 5992 de canales desde la localización de entrada de la celda de flujo hasta el borde frontal de la matriz de micropozos o matriz de sensores, que debe entenderse que está debajo del lado de salida de la estructura, en 5994.

Los sistemas descritos anteriormente utilizan típicamente un sistema de flujo de fluido laminar. En parte, el sistema de flujo de fluido incluye preferentemente una cámara de flujo formada por el chip del sensor y un miembro moldeado por inyección de una sola pieza que comprende puertos de entrada y salida y se puede montar sobre el chip para establecer la cámara de flujo. La superficie de tal miembro interior a la cámara se forma preferentemente para facilitar un flujo de fluido conveniente deseado, como se describe en la presente descripción.

Algunos ejemplos abarcan un aparato para la detección de pH que comprende un sistema de flujo de fluido laminar. El aparato se puede usar para secuenciar una pluralidad de moldes de ácido nucleico presentes en una matriz. El aparato normalmente incluye un conjunto de fluidos que comprende un miembro que comprende una o más aberturas para dirigir de manera no mecánica un fluido para que fluya a una matriz de al menos 100 K (100 mil), 500 K (500 mil) o 1 M (1 millón) de cámaras de reacciones de microfluidos de manera que el fluido llegue a todas las cámaras de reacción de microfluidos al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo. Normalmente, el flujo de fluido es paralelo a la superficie del sensor. Normalmente, el conjunto tiene un número de Reynolds menor que 1000, 500, 200, 100, 50, 20 o 10. Preferentemente, el miembro comprende además una primera abertura para dirigir el fluido hacia la matriz de sensores y una segunda abertura para dirigir el fluido lejos de la matriz de sensores. Algunos ejemplos abarcan un método para dirigir un fluido a una matriz de sensores que comprende: proporcionar un conjunto de fluidos que comprende una abertura que acopla de forma fluida una fuente de fluido a la matriz de sensores; y dirigir de forma no mecánica un fluido a la matriz de sensores. Por "no mecánicamente" se entiende que el fluido se mueve bajo presión desde una fuente de presión gaseosa, en lugar de una bomba mecánica.

Algunos ejemplos abarcan una serie de pozos, cada uno de los cuales está acoplado a una tapa que tiene un puerto de entrada y un puerto de salida y un sistema de suministro de fluido para suministrar y extraer fluido de dichos puertos de entrada y salida de forma no mecánica.

Algunos ejemplos abarcan un método para secuenciar un polímero biológico tal como un ácido nucleico que utiliza el aparato descrito anteriormente, que comprende: dirigir un fluido que comprende un monómero a una matriz de cámaras de reacción en las que el fluido tiene un número de Reynolds de flujo de fluido de 2000 como máximo, 1000, 200, 100, 50 o 20. El método opcionalmente puede comprender además detectar un pH o un cambio en el pH de cada una de dichas cámaras de reacción. Esto generalmente se detecta mediante la difusión de iones a la superficie del sensor. Hay varias otras formas de proporcionar un conjunto de fluidos para suministrar un flujo de fluido apropiado a través del conjunto de matriz de micropozos y sensores y, por lo tanto, los ejemplos anteriores no pretenden ser exhaustivos.

Electrodo de referencia

Los electrodos fluídicos comerciales de tipo flujo, tales como los electrodos permeables a los protones de cloruro de plata, se pueden insertar en serie en una línea de fluidos y generalmente están diseñados para proporcionar un potencial eléctrico estable a lo largo de la línea de fluidos para diversos fines electroquímicos. Sin embargo, en el sistema descrito anteriormente, dicho potencial debe mantenerse en el volumen fluídico en contacto con el chip ISFET de micropozos. Con los electrodos de cloruro de plata convencionales, se ha encontrado que es difícil lograr un potencial estable debido a una trayectoria de fluidos eléctricamente larga entre la superficie del chip y el electrodo (a través de pequeños canales en la celda de flujo). Esto condujo a la recepción de ruido en la electrónica del chip. Además, el gran volumen dentro de la cavidad de flujo del electrodo tendía a atrapar y acumular burbujas de gas que degradaban la conexión eléctrica con el fluido. Con referencia a la Figura 60, se ha encontrado una solución a este problema en el uso de un electrodo de tubo capilar de acero inoxidable 6010, conectado directamente al puerto de salida de la celda de flujo del chip 6020 y conectado a una fuente de tensión (no se muestra) a través de un cable blindado 6030. El tubo capilar de metal 6010 tiene un diámetro interior pequeño (por ejemplo, del orden de 0,01") que no atrapa gas en un grado apreciable y transporta fluido y gas de forma eficaz como otros tubos microfluídicos. Además, debido a que el tubo capilar se puede insertar directamente en el puerto de la celda de flujo 6020, se acerca a la superficie del chip, lo que reduce las posibles pérdidas eléctricas a través del fluido. La gran superficie interna del tubo capilar (típicamente aproximadamente 2" de largo) también puede contribuir a su alto rendimiento. La construcción de acero inoxidable es muy resistente a los químicos y no debe estar sujeta a efectos electroquímicos debido al uso muy bajo de corriente eléctrica en el sistema (< 1 ^jA). Un accesorio fluídico 6040 está unido al extremo del capilar que no está en el puerto de la celda de flujo, para la conexión a la tubería al subsistema de suministro y extracción de fluidos.

Sistema fluídico

Un sistema completo para usar la matriz de sensores incluirá fuentes de fluidos adecuadas, válvulas y un controlador para operar las válvulas para reactivos bajos y lavados sobre la micromatriz o la matriz de sensores, dependiendo de la aplicación. Estos elementos se ensamblan fácilmente a partir de componentes listos para usar, y el controlador se puede programar fácilmente para realizar un experimento deseado.

Debe entenderse que la lectura en el chemFET puede ser corriente o tensión (y cambio de los mismos) y que cualquier referencia particular a cualquiera de las lecturas está destinada a simplificar y no a la exclusión de la otra lectura. Por lo tanto, cualquier referencia en el siguiente texto a la detección de corriente o tensión en el chemFET debe entenderse que contempla y se aplica igualmente a la otra lectura también. En ejemplos importantes, la lectura refleja un cambio rápido y transitorio en la concentración de un analito. La concentración de más de un analito puede detectarse en diferentes momentos. En algunos casos, tales mediciones deben contrastarse con métodos que se centran en mediciones de concentración en estado estacionario.

Reacciones biológicas y químicas

Como ya se ha descrito, los aparatos, sistemas y métodos pueden usarse para detectar y/o monitorear interacciones entre varias características. Estas interacciones incluyen reacciones biológicas y químicas y pueden implicar reacciones enzimáticas y/o interacciones no enzimáticas tales como, pero sin limitarse a, eventos de unión. Un ejemplo contempla el seguimiento de reacciones enzimáticas en las que se consumen sustratos y/o reactivos y/o se generan intermedios de reacción, subproductos y/o productos. Un ejemplo de una reacción que puede controlarse es un método de síntesis de ácido nucleico como el que proporciona información sobre la secuencia de ácido nucleico. Esta reacción se describirá con mayor detalle en la presente descripción.

Secuenciación de ácidos nucleicos

En el contexto de una reacción de secuenciación, el aparato y el sistema proporcionados en la presente descripción pueden detectar la incorporación de nucleótidos en base a los cambios en la corriente y/o la tensión del chemFET, ya que estos últimos parámetros están interrelacionados. Los cambios de corriente pueden ser el resultado de uno o más de los siguientes eventos, ya sea solos o una combinación de los mismos: generación de hidrógeno (y cambios concomitantes en el pH, por ejemplo, en presencia de un amortiguador de baja resistencia o sin amortiguador), generación de PPi, generación de Pi (por ejemplo, en presencia de pirofosfatasa), aumento de la carga de ácidos nucleicos unidos a la superficie del chemFET y similares.

Como se describe en la presente descripción, un ejemplo contempla métodos para determinar la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico. Dichos métodos implican la síntesis de un nuevo ácido nucleico (por ejemplo, usando un cebador que se hibrida con un ácido nucleico molde o un molde autocebante, como apreciarán los expertos en la materia), basado en la secuencia de un ácido nucleico molde. Es decir, la secuencia del ácido nucleico recién sintetizado es complementaria a la secuencia del ácido nucleico molde y, por lo tanto, el conocimiento de la secuencia del ácido nucleico recién sintetizado proporciona información sobre la secuencia del ácido nucleico molde.

Más específicamente, el conocimiento de la secuencia del ácido nucleico recién sintetizado se obtiene determinando si se ha incorporado un nucleótido conocido en el ácido nucleico recién sintetizado y, en caso afirmativo, cuántos de tales nucleótidos conocidos se han incorporado. Es importante destacar que se conoce el orden en el que se añaden los nucleótidos conocidos a la mezcla de reacción y, por tanto, también se conoce el orden de los nucleótidos incorporados (si los hay). En un ejemplo ilustrativo, un molde hibridado con un cebador se pone en contacto con un primer conjunto de nucleótidos idénticos conocidos (por ejemplo, dATP) en presencia de polimerasa. Si la siguiente posición disponible en el molde es un residuo de timidina, entonces el dATP se incorpora a la cadena de ácido nucleico cebada y se detecta una señal, por ejemplo, basada en la liberación de hidrógeno. Si la siguiente posición disponible no es un residuo de timidina, entonces el dATP no se incorporará y no se detectará ninguna señal porque no se liberará hidrógeno. Si la siguiente posición disponible y una o más posiciones contiguas a continuación son residuos de timidina, entonces se incorporará un número correspondiente de dATP y se detectará una señal acorde con el número de nucleótidos incorporados. A continuación, se lava el pozo o la cámara de reacción para eliminar los nucleótidos no incorporados y el hidrógeno liberado, después de lo cual se añade otro grupo de nucleótidos conocidos idénticos (por ejemplo, dCTP). El proceso se repite hasta que los cuatro nucleótidos se añaden por separado al pozo de reacción (es decir, un ciclo), y luego se repiten los ciclos. Los ciclos pueden repetirse 50 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 750 veces o más, dependiendo de la longitud de la secuencia de información deseada.

La incorporación de nucleótidos se puede controlar de varias formas, incluida la producción de productos como PPi, Pi y/o H+. La incorporación de un dNTP en la cadena de ácido nucleico libera PPi que luego puede hidrolizarse a dos ortofosfatos (Pi) y un ion hidrógeno (Fig. 61A). Por lo tanto, la generación del ion hidrógeno puede detectarse como un indicador de la incorporación de nucleótidos. Alternativamente, Pi puede detectarse directa o indirectamente. Alternativamente, cuando se unen moldes o cebadores a la superficie del sensor, la incorporación de nucleótidos se detecta en base a un aumento en la carga (típicamente, carga negativa) del molde, el cebador o el complejo molde/cebador. Los moldes se pueden unir a la superficie del chemFET o se pueden hibridar con cebadores que se unen a la superficie del chemFET. Los cebadores hibridados con los moldes pueden extenderse en presencia de polimerasa y uno o una combinación de nucleótidos conocidos. La incorporación de nucleótidos se detecta mediante aumentos en la carga en la superficie del chemFET que resultan de la adición de enlaces fosfodiéster en el esqueleto que llevan cargas negativas. Por lo tanto, con cada adición sucesiva de un nucleótido, aumenta la carga negativa del ácido nucleico inmovilizado, y este aumento puede ser detectado por el chemFET. El número de incorporaciones de nucleótidos que se pueden detectar de esta manera puede ser de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, o más. Una realización contempla que, en este caso, la incorporación de nucleótidos puede detectarse midiendo el cambio de carga en la superficie del chemFET, así como los iones de hidrógeno liberados que entran en contacto con el chemFET.

Cualquiera y todos estos eventos (y más como se describe en la presente descripción) pueden detectarse en el chemFET provocando de esta manera un cambio de corriente que se correlaciona con la incorporación de nucleótidos.

Los sistemas descritos en la presente descripción se pueden usar para secuenciar ácidos nucleicos sin detección óptica. En algunos ejemplos, se secuencian al menos 106 pares de bases por hora, en otros ejemplos se secuencian al menos 107 pares de bases por hora, y en otros ejemplos se secuencian al menos 108 pares de bases por hora usando el método descrito anteriormente. Por lo tanto, el método puede usarse para secuenciar un genoma humano completo en aproximadamente 24 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 5 horas o aproximadamente 1 hora. Estas velocidades se pueden lograr utilizando múltiples matrices de ISFET como se muestra en la presente descripción y procesando sus salidas en paralelo. Secuenciación de ácidos nucleicos basada en pH

Amortiguación reducida

Por lo tanto, ciertos ejemplos se refieren a la detección de iones de hidrógeno liberados en función de la incorporación de nucleótidos y en algunos ejemplos en función de la escisión de nucleótidos. Es importante en estos y varios otros aspectos detectar tantos iones de hidrógeno liberados como sea posible para lograr una señal (y/o una relación señal/ruido) tan alta como sea posible. Las estrategias para aumentar la cantidad de protones liberados que finalmente son detectados por la superficie del chemFET incluyen, sin limitarse a, limitar la interacción de los protones liberados con los grupos reactivos en el pozo, elegir un material a partir del cual fabricar el pozo en primera instancia que sea relativamente inerte a los protones, evitando que los protones liberados salgan del pozo antes de la detección en el chemFET, y aumentando el número de copias de moldes por pozo (para amplificar la señal de cada incorporación de nucleótido), entre otros.

Algunos ejemplos emplean un entorno, incluida una solución de reacción, que está mínimamente amortiguada, si es que lo está. La amortiguación puede ser aportada por los componentes de la solución o por los soportes sólidos en contacto con dicha solución. Una solución que no tiene capacidad (o actividad) amortiguadora o que tiene una capacidad baja es aquella en la que los cambios en la concentración de iones hidrógeno son del orden de al menos aproximadamente /-0,005 unidades de pH, al menos aproximadamente /- 0,01, al menos aproximadamente /-0,015, al menos aproximadamente /- 0,02, al menos aproximadamente /- 0,03, al menos aproximadamente /-0,04, al menos aproximadamente /- 0,05, al menos aproximadamente /- 0,10, al menos aproximadamente /-0,15, al menos aproximadamente /- 0,20, al menos aproximadamente /- 0,25, al menos aproximadamente /-0,30, al menos aproximadamente /- 0,35, al menos aproximadamente /- 0,45, al menos aproximadamente /-0,50, o más son detectables (por ejemplo utilizando los sensores chemFET descritos en la presente descripción). En algunos ejemplos, el cambio de pH por incorporación de nucleótidos es del orden de aproximadamente 0,005. En algunos ejemplos, el cambio de pH por incorporación de nucleótidos es una disminución del pH. Las soluciones de reacción que no tienen capacidad amortiguadora o tienen una capacidad baja pueden no contener ninguna o muy baja concentración de amortiguación, o pueden utilizar amortiguadores débiles.

Un amortiguador es una molécula iónica (o una solución que comprende una molécula iónica) que resiste, en mayor o menor medida, los cambios de pH. Los amortiguadores incluyen, sin limitación, Tris, tricina, fosfato, ácido bórico, borato, acetato, morfolina, ácido cítrico, ácido carbónico y ácido fosfórico. La resistencia de un amortiguador es un término relativo, ya que depende de la naturaleza, la resistencia y la concentración del ácido o la base que se añade o se genera en la solución de interés. Un amortiguador débil es un amortiguador que permite detectar (y por lo tanto no puede controlar ni enmascarar) cambios de pH del orden de los enumerados anteriormente.

La solución de reacción puede tener una concentración de amortiguación igual o menor que 1 mM, igual o menor que 0,9 mM, igual o menor que 0,8 mM, igual o menor que 0,7 mM, igual o menor que 0,6 mM, igual a o menos de 0,5 mM, igual o menos de 0,4 mM, igual o menos de 0,3 mM, igual o menos de 0,2 mM, igual o menos de 0,1 mM, o menos incluyendo cero. La concentración de amortiguación puede ser de 50-100 pM. Un ejemplo no limitativo de un amortiguador débil adecuado para las reacciones de secuenciación descritas en la presente descripción en el que el cambio de pH es la lectura es Tris o Tricina de 0,1 mM.

En algunos aspectos, además de o en lugar de usar soluciones amortiguadorasas reducidas, la incorporación de nucleótidos (y opcionalmente la escisión) se lleva a cabo en presencia de agentes adicionales que sirven para proteger eventos de amortiguación potenciales que pueden producirse en la solución. Estos agentes se denominan en la presente descripción inhibidores de amortiguación, ya que inhiben la capacidad de los componentes dentro de una solución o un soporte sólido en contacto con la solución para secuestrar y/o interferir de cualquier otra manera con los iones hidrógenos liberados antes de su detección por la superficie del chemFET. En ausencia de tales inhibidores, los iones hidrógenos liberados pueden interactuar o aislarse por grupos reactivos en la solución o en soportes sólidos en contacto con la solución. Es menos probable que estos iones hidrógenos alcancen y sean detectados por la superficie del chemFET, lo que genera una señal más débil de lo que sería posible de cualquier otra manera. En presencia de tales inhibidores, sin embargo, habrá menos grupos reactivos disponibles para la interacción o secuestro de iones hidrógenos. Como resultado, una mayor proporción de los iones hidrógenos liberados llegarán y serán detectados por la superficie del chemFET, lo que generará señales más fuertes. Los grupos reactivos que pueden interferir con los iones hidrógenos liberados incluyen, sin limitarse a, grupos reactivos tales como bases libres en ácidos nucleicos monocatenarios y grupos Si-OH que pueden estar presentes en la capa de pasivación. Algunos inhibidores de amortiguación adecuados demuestran poca o ninguna capacidad de amortiguación en el intervalo de pH de 5-9, lo que significa que el pH cambia del orden de 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 o más, las unidades de pH son detectables (por ejemplo, usando un ISFET) en presencia de tales inhibidores.

Hay varios tipos de inhibidores de amortiguación. Un ejemplo de un agente amortiguador es un agente que se une a ácidos nucleicos monocatenarios (o regiones de ácidos nucleicos monocatenarios, como puede producirse en un ácido nucleico molde) protegiendo de esta manera a grupos reactivos tales como bases libres. Estos agentes pueden ser oligonucleótidos de ARN (u oligómeros de a Rn , u oligorribonucleótidos, como se denominan en la presente descripción indistintamente) que tienen secuencias complementarias a las regiones monocatenarias de ácidos nucleicos moldes mencionadas anteriormente. Los oligonucleótidos de ARN son útiles porque no pueden servir como cebadores para una reacción de secuenciación en comparación con los oligonucleótidos de ADN. Para unirse a (o proteger los efectos de) la mayor cantidad posible de un ácido nucleico monocatenario, se puede usar una pluralidad (o conjunto, o mezcla) de oligonucleótidos de ARN. Como ejemplo, se puede usar un conjunto de oligonucleótidos de ARN que tienen 2, 3, 4, 5, 6 o más nucleótidos de longitud junto con moldes monocatenarios. La corta longitud de estos oligonucleótidos de ARN les permite ser desplazados por la polimerasa a medida que avanza junto con la longitud del molde de ácido nucleico. Tal desplazamiento no requiere actividad exonucleasa de la polimerasa. Normalmente, los oligonucleótidos de ARN son de secuencia aleatoria. En algunos ejemplos, no se requiere conocimiento previo de la secuencia de la región monocatenaria del molde. Las Figuras 61B y 61C ilustran la diferencia en la detección de iones en un ISFET en presencia o ausencia de un hexámero de ARN unido a un molde monocatenario.

Otro ejemplo de una clase de inhibidores de amortiguación son los fosfolípidos. Los fosfolípidos pueden ser fosfolípidos naturales o no naturales. Los ejemplos de fosfolípidos que pueden usarse como inhibidores de amortiguación incluyen, pero sin limitarse a, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol y fosfatidilserina. Otro ejemplo de un inhibidor de amortiguación son los tensioactivos basados en ácido sulfónico tales como poli(etilenglicol) 4-nonilfenil 3-sulfopropil éter (PNSE), cuya sal de potasio se muestra en la Figura 61D. Además de proteger a los grupos reactivos que de cualquier otra manera interferirían con los protones liberados, también se ha informado que PNSE mejora la actividad de la polimerasa.

Otro ejemplo de un inhibidor de amortiguación son los electrolitos polianiónicos como el poli(ácido estirenosulfónico), cuya sal sódica se muestra en la Figura 61E.

Otro ejemplo de un inhibidor de amortiguación son los electrolitos policatiónicos como el poli(dialdimetilamonio), cuya sal de cloruro se muestra en la Figura 61F. Se sabe que estos compuestos se unen al ^a Dⁿ .

Otro ejemplo de un inhibidor de amortiguación es el tetrametilamonio, cuya sal de cloruro se muestra en la Figura 61G.

Estos diversos inhibidores pueden estar presentes a lo largo de una reacción al incluirse en soluciones de nucleótidos, soluciones de lavado y similares. Alternativamente, pueden fluir a través de la cámara en tiempos establecidos en relación con el flujo de nucleótidos y/u otros reactivos de reacción. En aún otros ejemplos, se pueden recubrir la superficie del chemFET (o la superficie de la cámara de reacción). Tal recubrimiento puede ser covalente o no covalente.

Otra forma de reducir la capacidad de amortiguación en el pozo de reacción es unir covalentemente ácidos nucleicos a perlas de captura, en los ejemplos en los que se utilizan perlas de captura. Tal unión covalente contrasta con los métodos no covalentes descritos en la presente descripción que incluyen, por ejemplo, interacciones biotina, estreptavidina. En estos últimos ejemplos, los cebadores biotinilados se pueden unir a perlas recubiertas de estreptavidina, seguido de hibridación con el molde. Sin embargo, la estreptavidina, al igual que otras proteínas, es capaz de amortiguar, por lo que su presencia interferiría en la detección de iones hidrógenos liberados como consecuencia de la incorporación de nucleótidos. Por lo tanto, un ejemplo contempla enfoques que no dependen de la estreptavidina en el mecanismo de unión. Una de estas alternativas implica el acoplamiento covalente de cebadores a perlas (y/u otros soportes sólidos como la superficie del chemFET). Los cebadores de acoplamiento covalente a tales soportes sólidos sirven al menos para dos propósitos. En primer lugar, elimina la necesidad de proteínas, como la estreptavidina, que comprenden grupos laterales funcionales (como aminas primarias, secundarias o terciarias y ácidos carboxílicos) que pueden amortiguar los cambios de pH en el intervalo de pH 5-9. En segundo lugar, sirve para aumentar el número de moldes que se pueden conjugar con el soporte sólido, como una sola perla, al reducir los efectos de impedimento estérico que pueden existir cuando se usan proteínas voluminosas como la estreptavidina. En aún otros ejemplos, los moldes se pueden conjugar directamente de forma covalente con soportes sólidos tales como perlas.

Los cebadores se pueden acoplar covalentemente a perlas de varias maneras, varias de las cuales se muestran en las Figuras 61H y 611 o se describen en Steinberg y otros Biopolymers 73:597-605, 2004, como ejemplo. Los grupos reactivos que se pueden usar para conjugar cebadores con perlas incluyen grupos epóxido, tosilo, amino y carboxilo. Además, las perlas que tienen una superficie de sílice, como se describe a continuación, se pueden usar con grupos reactivos de clorofila, azida y alquino. En algunos ejemplos, la combinación es una perla de núcleo de polímero con una superficie de polímero que usa grupos reactivos tosilo.

El aumento del número de moldes o cebadores (es decir, el número de copias) da como resultado un mayor número de incorporaciones de nucleótidos por sensor y/o por cámara de reacción, lo que conduce a una mayor señal y, por lo tanto, a una relación señal/ruido. El número de copias se puede aumentar, por ejemplo, mediante el uso de moldes que son concatémeros (es decir, ácidos nucleicos que comprenden múltiples copias dispuestas en tándem del ácido nucleico que se va a secuenciar), aumentando el número de ácidos nucleicos en o en perlas hasta saturar tales perlas, y uniendo moldes o cebadores a perlas o a la superficie del sensor de manera que reduzcan el impedimento estérico y/o aseguren la unión del molde (por ejemplo, uniendo covalentemente moldes), entre otras cosas. Los moldes de concatémeros pueden inmovilizarse sobre o en perlas o sobre otros soportes sólidos como la superficie del sensor, aunque en algunas realizaciones los moldes de concatémeros pueden estar presentes en una cámara de reacción sin inmovilización. Por ejemplo, los moldes (o los complejos que comprenden moldes y cebadores) se pueden unir de forma covalente o no covalente a la superficie del chemFET y su secuenciación puede implicar la detección de iones hidrógenos liberados y/o la adición de carga negativa a la superficie del chemFET tras un evento de incorporación de nucleótido. El último esquema de detección se puede realizar en una solución o entorno amortiguado (es decir, el chemFET no detectará ningún cambio en el pH y, por lo tanto, dichos cambios no interferirán con la detección de la adición de carga negativa a la superficie del chemFET).

Para algunos aspectos descritos en la presente descripción, es importante que la capacidad de amortiguación no se vea afectada en el proceso de aumento del número de copias. Por tanto, se proporcionan varios métodos para aumentar el número de copias utilizando estrategias y/o enlazadores que no afectan a la capacidad de amortiguación del entorno. En algunos casos, los propios grupos funcionales, enlazadores y/o polímeros no tienen capacidad de amortiguación o la tienen limitada, y su uso no oscurece la detección de iones hidrógenos liberados como resultado de la incorporación o escisión de nucleótidos, según sea el caso.

El aumento del número de copias también puede lograrse aumentando el número de puntos de unión para los cebadores (o moldes). Algunas de estas metodologías se describen a continuación.

En un ejemplo, el soporte sólido se recubre con un polímero tal como polietilenglicol (PEG) que no comprende grupos funcionales que interactúan con el cebador y sus grupos funcionales, excepto como se indica a continuación para la fijación inicial del cebador. Se pueden usar enlazadores PEG de diferentes longitudes para que los cebadores se puedan unir a distancias variables de la superficie del soporte sólido, lo que reduce de esta manera la cantidad de impedimento estérico que de cualquier otra manera podría existir entre los cebadores y los complejos que finalmente forman (por ejemplo, híbridos de cebador/molde). Los soportes sólidos se pueden recubrir una o más veces con una mezcla de 2, 3, 4 o más enlazadores PEG de diferentes longitudes. El resultado final es una mayor distancia entre los extremos de los enlazadores PEG unidos al soporte sólido. La unión de los cebadores a los enlazadores PEG se puede lograr utilizando cualquier grupo reactivo conocido en la técnica. Como ejemplo, la química clic se puede usar entre grupos azida en los extremos de los enlazadores PEG y grupos alquídicos en los cebadores.

En otro ejemplo, se utilizan polímeros que tienen preferentemente más de un grupo funcional (o reactivo). Cada uno de los grupos funcionales está disponible para la conjugación con un cebador separado. Los polímeros útiles en este sentido incluyen aquellos que tienen grupos hidroxilo, grupos amina, grupos tiol y similares. Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen dextrano y quitosano. Se pueden usar formas lineales o ramificadas de estos polímeros. Un ejemplo de polímero ramificado con múltiples funcionalidades es el dextrano ramificado. Será evidente para los expertos en la técnica que también se puede utilizar cualquier polímero o copolímero quimérico siempre que tenga un número suficiente de grupos funcionales para la unión del cebador.

Todavía otro ejemplo implica el uso de dendrímeros y preferentemente dendrímeros de orden superior para unir el cebador. Los dendrímeros son complejos tridimensionales que se pueden formar con cualquier grupo funcional. Los ejemplos de dendrímeros incluyen los dendrímeros PAMAM, un ejemplo de los cuales es CAS No. 163442-69-1 que tiene 256 grupos amina. Los dendrímeros están disponibles comercialmente de fuentes tales como Sigma-Aldrich y Dendritic Nanotechnologies Inc. Se entenderá que también se pueden usar dendrímeros con otros grupos funcionales.

El ejemplo contempla además el uso de cualquier combinación de los ejemplos anteriores para maximizar el número de cebadores unidos a un soporte sólido. Por lo tanto, por ejemplo, la superficie del soporte sólido se puede recubrir una o más veces (por ejemplo, una o dos veces) con los enlazadores PEG de diferentes longitudes, y a dichos enlazadores se les pueden unir polímeros multifuncionales como dextrano o quitosano (ya sea en forma lineal o ramificada), seguido de la unión de cebadores. Como otro ejemplo, los dendrímeros pueden unirse a los enlazadores PEG, seguido de la unión del cebador a los dendrímeros.

En todavía otro ejemplo, el ejemplo contempla recubrir la superficie del soporte sólido con una población de monómeros autoensamblables, parte de los cuales están unidos a cebadores. Como ejemplo, los monómeros pueden ser monómeros de acrilamida, algunos de los cuales están unidos a cebadores. El resultado final es un soporte sólido que tiene un recubrimiento de poliacrilamida con cebadores intercalados. La densidad de los cebadores unidos al soporte sólido se puede manipular cambiando la proporción de monómeros que tienen cebadores y monómeros que carecen de cebadores. Esta estrategia ha sido reportada por Rehman y otros Nucleic Acids Research, 1999, 27(2):649-655.

Otros métodos más para unir ácidos nucleicos a perlas son enseñados por Lund y otros, Nucleic Acids Research, 1988, 16(22):10861-10880, Joos y otros Anal Biochem, 1997, 247:96-101, Steinberg y otros Biopolymers, 2004, 73:597-605, y Steinberg-Tatman y otros Bioconjugate Chem 200617:841-848.

Las perlas pueden estar hechas de cualquier material, que incluyen, pero sin limitarse a, celulosa, derivados de celulosa, gelatina, resinas acrílicas, vidrio, gel de sílice, polivinilpirrolidina (PVP), copolímeros de vinilo y acrilamida, poliestireno, poliestireno reticulado con divinilbenceno o similares (ver, Merrifield Biochemistry 1964, 3, 1385-1390), poliacrilamidas, geles de látex, dextrano, dextranos reticulados (por ejemplo, Sephadex™), caucho, silicona, plásticos, nitrocelulosa, esponjas naturales, metal y gel de agarosa (Sepharose™). En una realización, las perlas son perlas recubiertas de estreptavidina.

Las perlas adecuadas para unión covalente pueden ser de naturaleza magnética o no magnética. Pueden tener un núcleo de polímero con una superficie de polímero, un núcleo de polímero con una superficie de sílice y un núcleo de sílice con una superficie de sílice. El núcleo de la perla puede ser hueco, poroso o sólido, como se describe a continuación.

El diámetro de la perla dependerá de la densidad del chemFET y de las matrices de micropozos utilizadas; las matrices más grandes (y, por lo tanto, los pozos de menor tamaño) utilizan perlas más pequeñas. Generalmente, el tamaño de la perla puede ser de aproximadamente 1-10 micras, y con mayor preferencia de 2-6 micras. En algunos ejemplos, las perlas tienen aproximadamente 5,9 micras, mientras que en otros ejemplos las perlas tienen aproximadamente 2,8 micras. En aún otros ejemplos, las perlas tienen un diámetro de aproximadamente 1,5 micras, o aproximadamente 1 micra. En algunos ejemplos, las perlas que tienen un diámetro que varía entre aproximadamente 3,3 a 3,5 micras pueden usarse para matrices de pozos de reacción que tienen un paso del orden de aproximadamente 5,1 micras. En otros ejemplos, las perlas que tienen un diámetro que varía entre aproximadamente 5 y 6,5 micras pueden usarse para matrices de pozos de reacción que tienen un intervalo del orden de aproximadamente 9 micras. Debe entenderse que las perlas pueden tener o no una forma perfectamente esférica. También debe entenderse que se pueden usar otras perlas y se pueden usar otros mecanismos para unir el ácido nucleico a las perlas. En algunos casos, las perlas de captura (es decir, las perlas en las que se produce la reacción de secuenciación) son las mismas que las perlas de preparación de molde, incluidas las perlas de amplificación. En algunos casos, incluso cuando se contempla la unión no covalente, se usa un espaciador para distanciar el ácido nucleico molde (y en particular la secuencia de ácido nucleico diana comprendida en el mismo) de un soporte sólido como una perla. Esto facilita la secuenciación del extremo de la diana más cercana a la perla, por ejemplo. En la técnica se conocen ejemplos de enlazadores adecuados (ver Diehl y otros Nature Methods, 2006, 3(7):551-559) e incluyen pero no se limitan a enlazadores carbono-carbono tales como pero no se limitan a iSp18. Las perlas se pueden comprar de proveedores comerciales como Bangs, Dynal y Micromod. Los espaciadores adicionales y los mecanismos de unión de ácidos nucleicos se han descrito anteriormente.

Como se indicó anteriormente, algunas perlas pueden ser sólidas mientras que otras pueden ser porosas o huecas. Estas perlas tendrán una superficie porosa de manera que los reactivos de la solución de reacción puedan entrar y salir de la perla. Estos pueden tener canales vacíos o núcleos huecos que comprenden al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % del volumen de la perla. Estas perlas se denominarán en la presente descripción perlas porosas, micropartículas porosas o cápsulas en vista de sus núcleos no sólidos, y estos términos pretenden abarcar perlas tanto porosas como huecas independientemente del diámetro o volumen. Pueden o no ser esféricas.

El ejemplo contempla el uso de dichas perlas porosas en los diversos métodos de secuenciación descritos en la presente descripción. Más específicamente, el ejemplo contempla la secuenciación de ácidos nucleicos que están presentes en perlas porosas. Las perlas porosas pueden generarse mediante métodos conocidos en la técnica. Ver por ejemplo Mac y otros Adv. Funct. Mater. 2008 18:2930-2937; Morimoto y otros MEMS 2008 Tucson AZ EE. UU.

13-17 de enero de 2008 Poster Abstract 304-307; Lee y otros Adv. Mater. 2008 20:3498-3503; Martín-Banderas y otros Small. 20051(7):688-92; y la Solicitud PCT publicada WO03/078659.

Inicialmente se pueden generar micropartículas porosas para que contengan un solo ácido nucleico molde que luego se amplifica reteniendo todas las copias amplificadas del ácido nucleico en la micropartícula. La amplificación puede producirse antes o mientras la perla está en contacto con una matriz de chemFET y/u opcionalmente en una cámara de reacción. Si se realiza antes del contacto con la matriz de chemFET, se pueden seleccionar perlas que se han sometido con éxito a la amplificación y, por lo tanto, se pueden enriquecer. Como ejemplo, las perlas que tienen ácidos nucleicos amplificados se pueden separar de otras perlas en base a la densidad. La amplificación puede ser una amplificación isotérmica o por PCR, u otros medios de amplificación, ya que la invención no se limita en este sentido. Las perlas pueden contener al menos dos tipos de enzimas, tales como dos tipos de polimerasas. Por ejemplo, las perlas pueden contener un tipo de polimerasa que sea adecuado para la amplificación del ácido nucleico y un segundo tipo de polimerasa que sea adecuado para secuenciar los ácidos nucleicos amplificados. Las perlas preferentemente contienen una pluralidad de ambos tipos de polimerasas y preferentemente el número de cada polimerasa será superior a una cantidad de saturación para no crear un entorno limitado por polimerasa. Una vez completada la amplificación, la polimerasa de amplificación se puede inactivar, mientras se mantiene la actividad de la polimerasa de secuenciación. Por lo general, las enzimas y los ácidos nucleicos se retendrán en la perla mientras que los compuestos más pequeños, como los dNTP y otros reactivos y cofactores de síntesis de ácidos nucleicos, pueden difundirse dentro y fuera de la perla. Es importante para la invención que los subproductos de la síntesis, como el PPi y los iones hidrógenos, también se difundan fuera de las perlas para detectarse por el chemFET.

Traslación de mellas

La descripción proporciona otros modos para analizar, incluyendo, por ejemplo, secuenciación, ácidos nucleicos usando reacciones que involucran la incorporación de nucleótidos interdependientes y la escisión de nucleótidos. Como se usa en la presente descripción, la incorporación interdependiente de nucleótidos y la escisión de nucleótidos significa que ambas reacciones se producen en la misma molécula nucleica en sitios contiguos en el ácido nucleico, y una reacción facilita la otra.

Un ejemplo de tal reacción es una reacción de traslación de mella. Una reacción de traslación de mellas, como se usa en la presente descripción, se refiere a una reacción catalizada por una enzima polimerasa que tiene actividad de exonucleasa de 5' a 3', que implica la incorporación de un nucleótido en el extremo 3' libre de una región mellada de ADN de doble cadena y la escisión de un nucleótido localizado en el extremo 5' libre de la región mellada del ADN de doble cadena. Por lo tanto, la traslación de mella se refiere al movimiento del sitio mellado a lo largo de la cadena de ADN mellada en una dirección de 5' a 3'. Como reconocerán los expertos en la técnica, la reacción de traslación de mellas incluye una reacción de secuenciación por síntesis basada en la cadena intacta del ADN de doble cadena. Esta cadena actúa como molde a partir del cual se sintetiza la nueva cadena. El método no requiere el uso de un cebador porque el ADN de doble cadena puede cebar la reacción de forma independiente. Estos aspectos se referirán específicamente a la traslación de mellas en aras de la brevedad, pero debe entenderse que cualquier otra reacción combinada de escisión e incorporación de nucleótidos tendrá la misma y completa intención en la siguiente descripción.

El enfoque de traslación de mella tiene dos características que lo hacen muy adecuado para los métodos de detección proporcionados en la presente descripción. En primer lugar, la reacción de traslación de mellas da como resultado la liberación de dos iones hidrógenos para cada paso combinado de escisión/incorporación, lo que proporciona una señal más sólida en el chemFET cada vez que se incorpora un nucleótido en una cadena recién sintetizada. Un método de secuenciación por síntesis, en ausencia de escisión de nucleótidos, libera un ion de hidrógeno por incorporación de nucleótidos. Por el contrario, la traslación de mellas libera un primer ion de hidrógeno tras la incorporación de un nucleótido y un segundo ion de hidrógeno tras la escisión de otro nucleótido. Esto aumenta la señal que se puede detectar en el chemFET, lo que aumenta la relación señal/ruido y proporciona una lectura más definitiva de la incorporación de nucleótidos.

En segundo lugar, el uso de un molde de ADN de doble cadena (en lugar de un molde de ADN de una sola cadena) da como resultado una menor interferencia del molde con los iones liberados y una mejor señal en el chemFET. Un ADN monocatenario tiene grupos expuestos que pueden interferir (por ejemplo, secuestrar) iones hidrógenos. Estos grupos reactivos están protegidos en un ADN de doble cadena donde están unidos por enlaces de hidrógeno a grupos complementarios. Al estar tan protegidos, estos grupos no afectan sustancialmente el nivel o la concentración de iones hidrógenos. Como resultado, la señal resultante de la liberación de iones hidrógenos es mayor en presencia de moldes de cadena doble en comparación con las monocatenaria, al igual que la relación señal/ruido, lo que contribuye aún más a una lectura más definitiva de la incorporación de nucleótidos.

Los moldes adecuados para la traslación de mellas suelen ser completo o parcialmente de doble cadena. Dichos moldes comprenden una abertura (o mella) que actúa como punto de entrada para una polimerasa. Dichas aberturas pueden introducirse en el molde de forma controlada, como se describe a continuación y se conoce en la técnica. Como apreciará un experto en la técnica, es que estas aberturas pueden estar presentes en cada uno de la pluralidad de moldes idénticos en la misma localización en la secuencia de moldes. Las técnicas típicas de biología molecular que implican la traslación de mellas utilizan mellas creadas al azar a lo largo del ADN de doble cadena porque su objetivo es producir un ácido nucleico marcado detectable. Estos métodos de la técnica anterior generan mellas mediante el uso de enzimas de mella independientes de la secuencia tales como ADNasa I. En los métodos, sin embargo, la localización de la mella debe ser conocida, no aleatoria y uniforme para todos los moldes de secuencia idéntica. Hay varias formas de lograr esto, y algunas de estas se describen a continuación.

Una forma de lograr esto es crear una población de moldes de ácido nucleico de doble cadena idénticas que comprendan un residuo de uracilo en una localización definida en una cadena. El uracilo puede estar presente en un cebador que se usa para generar el ácido nucleico de doble cadena o una sonda que se hibrida con una región de una sola cadena de un ácido nucleico predominantemente de doble cadena. La población de ácidos nucleicos moldes idénticos puede generarse mediante una reacción de amplificación, por ejemplo, una reacción de PCR. La reacción de PCR se puede realizar utilizando un par de cebadores, uno de los cuales comprende un residuo de uracilo. Alternativamente, la reacción de PCR se puede realizar con cebadores que no contienen uracilo, seguida de la desnaturalización de los productos amplificados de doble cadena y la hibridación de una cadena con un cebador que contiene uracilo. Este último ejemplo requiere que los moldes cebados monocatenarios se hagan bicatenarios antes de la reacción de traslación de mella. Estas reacciones pueden llevarse a cabo mientras los ácidos nucleicos están unidos a un soporte sólido tal como una perla. Alternativamente, los moldes de ácido nucleico de doble cadena pueden generarse primero y luego unirse a un soporte sólido.

A continuación, los ácidos nucleicos de doble cadena que contienen uracilo se ponen en contacto con uracilo-ADN glicosilasa (UDG). UDG es una enzima que elimina el uracilo del ADN mediante la escisión del enlace N-glucosílico. En algunos casos, el ácido nucleico se pone en contacto con una segunda enzima que elimina el uracilo. La segunda enzima puede ser una endonucleasa AP, o una liasa u otra enzima que tenga una actividad de nucleasa similar. Los ácidos nucleicos pueden estar en la cámara de reacción (o pozo) descrita en la presente descripción durante la exposición a estas enzimas, o pueden agregarse a la cámara de reacción (o pozo) después del contacto con la enzima. Después del contacto con una (en algunos casos) o ambas enzimas, el ácido nucleico de doble cadena presenta una mella en una localización específica. Más importante aún, todos los ácidos nucleicos de la misma secuencia y tratados de manera idéntica se cortarán en el mismo lugar. Estos ácidos nucleicos mellados se pueden usar luego como moldes para la secuenciación de ácidos nucleicos u otros análisis.

Otra forma en la que los ácidos nucleicos de doble cadena pueden cortarse uniformemente es similar al método que se acaba de describir, con la excepción de que se incorpora al ácido nucleico una secuencia de nucleótidos reconocida por una enzima nickasa o melladora. La nickasa corta solo una cadena del ADN de doble cadena. Algunas nickasas cortan su secuencia de reconocimiento mientras que otras cortan a distancia de su secuencia de reconocimiento (por ejemplo, nickasas de tipo II). Se prefieren las nickasas con sitios de reconocimiento más largos porque dichos sitios son menos frecuentes y, por lo tanto, es menos probable que estén presentes en el ácido nucleico diana (por ejemplo, el fragmento genómico) incluido en el ácido nucleico molde. Los ejemplos de nucleasas específicas de secuencia monocatenaria (y sus respectivas secuencias) incluyen, sin limitarse a, Nb.BbvCI (CCTCA^GC), Nt.BbvCI (CC^TCAGC), Nb.Bsml (GAATG^C), Nt.SapI (GCTCTTCN^), Nb.BsrDI (GCAATG^) y Nb.Btsl (GCAGTG|), en los que la flecha indica el sitio de corte. Las Nickasas están disponibles comercialmente de varios proveedores, incluido NEB. En consecuencia, los ácidos nucleicos se preparan con una copia de la secuencia de reconocimiento de nickasa en una región de secuencia conocida (por ejemplo, un cebador u otra secuencia artificial en el ácido nucleico molde). Estos ácidos nucleicos luego se ponen en contacto con la nickasa correspondiente para cortar el ácido nucleico. Al igual que con el ejemplo del uracilo, el contacto con la nickasa puede producirse antes o después de que los ácidos nucleicos se unan a un soporte sólido, tal como perlas, y antes o después de que los ácidos nucleicos se carguen en los pozos de reacción.

Todavía otra forma en la que los ácidos nucleicos de doble cadena pueden cortarse uniformemente es mediante la incorporación de ribonucleótidos (en lugar de desoxirribonucleótidos) en una cadena de los ácidos nucleicos de doble cadena. Esto puede lograrse de manera similar a la descrita para la generación de ácidos nucleicos que contienen uracilo. En otras palabras, se puede generar un ácido nucleico de doble cadena utilizando cebadores que contienen uno o más ribonucleótidos en posiciones predeterminadas y, por lo tanto, conocidas. Los ácidos nucleicos resultantes luego se ponen en contacto con RNasa H u otra enzima que degrada la porción de ARN de los híbridos de ADN-ARN. La RNasa H, en particular, hidroliza los enlaces fosfodiéster del ARN en los heterodúplex ARN:ADN, produciendo de esta manera grupos OH en 3' y grupos fosfato en 5'. Si el ácido nucleico de doble cadena se genera con un solo ribonucleótido, solo resultará un solo sitio abásico, mientras que si el ácido nucleico de doble cadena se genera con múltiples ribonucleótidos, resultarán múltiples sitios abásicos. En cualquier caso, los ácidos nucleicos idénticos aún pueden analizarse usando una reacción de traslación de mellas una vez que la polimerasa llena todos los sitios abásicos excepto uno. Se prefiere la polimerasa Taq en algunos ejemplos que implican estos híbridos de ARN-ADN. Nuevamente, al igual que con los otros métodos descritos anteriormente, el contacto con la RNasa H u otra enzima similar puede producirse antes o después de que los ácidos nucleicos se unan a un soporte sólido, como perlas, y antes o después de que los ácidos nucleicos se carguen en los pozos de reacción.

Aún otra forma de preparar ácidos nucleicos de doble cadena adecuados como moldes para la incorporación de nucleótidos y eventos de escisión es generar un ácido nucleico de doble cadena que tenga un saliente 3' en un extremo y luego hibridar con el saliente 3' un ácido nucleico que sea más corto que el saliente por al menos un nucleótido. Preferentemente, después de la hibridación de los dos ácidos nucleicos entre sí, habrá un nucleótido interno desapareado en el saliente y este será el sitio desde el que comenzará la traslación de mella. Nuevamente, se conocerá la secuencia del saliente 3' y el ácido nucleico de hibridación y, por lo tanto, también se conocerá la localización del sitio abásico y será idéntica para todos los ácidos nucleicos molde. La hibridación puede producirse antes o después de que los ácidos nucleicos se unan a un soporte sólido, como perlas, y antes o después de que los ácidos nucleicos se carguen en los pozos de reacción.

Otro ejemplo de un molde de traslación de mellas adecuada es un ácido nucleico autocebante. El ácido nucleico autocebante puede comprender una región de doble cadena y una de una sola cadena que es capaz de autorrecogerse para cebar una reacción de síntesis de ácido nucleico. La región monocatenaria es típicamente una secuencia sintética conocida ligada a un ácido nucleico de interés. Su longitud puede ser predeterminada y diseñada para crear una apertura después del autorrecocido, y dicha apertura puede actuar como un punto de entrada para una polimerasa.

Debe entenderse que, como se usa el término en la presente descripción, un ácido nucleico mellado, tal como un ácido nucleico de doble cadena mellado, es un ácido nucleico que tiene una abertura (por ejemplo, una ruptura en su cadena, o que tiene sitios abásicos, etc.) a partir del cual una polimerasa puede incorporar y, opcionalmente, escindir nucleótidos. El término no se limita a los ácidos nucleicos sobre los que ha actuado una enzima, tal como una enzima melladora, ni se limita simplemente a roturas en una cadena de ácido nucleico, como quedará claro en base a los métodos ilustrativos descritos en la presente descripción para crear tales ácidos nucleicos.

Una vez que se generan los ácidos nucleicos de doble cadena mellados, se someten a una reacción de traslación de mellas. Si la reacción de traslación de mellas se realiza para secuenciar el ácido nucleico molde, la traslación de mellas puede llevarse a cabo de manera paralela a los métodos de secuenciación por síntesis descritos en la presente descripción. Más específicamente, en algunos ejemplos, cada uno de los cuatro nucleótidos se pone en contacto por separado con los moldes mellados en presencia de una polimerasa que tiene actividad de exonucleasa de 5' a 3'. En otros ejemplos, se usan combinaciones conocidas de nucleótidos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen ADN polimerasa I de E. coli, ADN polimerasa Bst y ADN polimerasa Taq. El orden de los nucleótidos no es importante siempre que se conozca y, preferentemente, permanece igual a lo largo de una ejecución. Después de que cada nucleótido se pone en contacto con los moldes mellados, se lava seguido de la introducción de otro nucleótido, tal como se describe en la presente descripción. En los ejemplos de traslación de mellas, el lavado también llevará el nucleótido extirpado fuera del chemFET.

Debe apreciarse que, al igual que con otros ejemplos descritos en la presente descripción, los nucleótidos que se incorporan en la región mellada no necesitan marcarse extrínsecamente ya que es un subproducto de su incorporación que se detecta como una lectura en lugar del propio nucleótido incorporado. Por lo tanto, los métodos de traslación de mellas pueden denominarse métodos sin etiquetas o métodos sin fluorescencia, ya que la detección de la incorporación no depende de una etiqueta extrínseca en el nucleótido incorporado. Los nucleótidos son típicamente nucleótidos naturales. También debe reconocerse que dado que los métodos se benefician de la incorporación consecutiva de tantos nucleótidos como sea posible, los nucleótidos no son, por ejemplo, versiones modificadas que conduzcan a una terminación prematura de la cadena, como las que se utilizan en algunos métodos de secuenciación.

Ácidos nucleicos diana y molde

El ácido nucleico que se está secuenciando se denomina en la presente descripción ácido nucleico diana. Los ácidos nucleicos diana incluyen, pero sin limitarse a, ADN tal como, pero sin limitarse a, ADN genómico, ADN mitocondrial, cADN y similares, y ARN tal como, pero sin limitarse a, mARN, miARN y otras especies de ARN de interferencia, y similares. Los ácidos nucleicos pueden ser de origen natural o no natural. Pueden obtenerse de cualquier fuente, incluidas las fuentes naturales, tal como cualquier fluido corporal o tejido que contenga ADN, que incluye, pero sin limitarse a, sangre, saliva, líquido cefalorraquídeo ("LCR"), piel, cabello, orina, heces y moco, o fuentes sintéticas. Los ácidos nucleicos pueden ser productos de PCR, cósmidos, plásmidos, bibliotecas naturales o sintéticas y similares. La invención no pretende limitarse en este sentido. Por lo tanto, debe entenderse que la invención contempla el análisis, incluida la secuenciación, tanto del ADN como del ARN.

Con respecto al ARN, los métodos de amplificación como el sistema SMART y NASBA son conocidos en la técnica y han sido informados por van Gelder y otros PNAS, 1990, 87:1663-1667, Chadwick y otros BioTechniques, 1998, 25:818-822, Brink y otros J Clin Microbiol, 1998, 36(11):3164-3169, Voisset y otros BioTechniques, 2000, 29:236-240, y Zhu y otros BioTechniques, 2001, 30:892-897.

Las cantidades iniciales de ácidos nucleicos que se van a secuenciar determinan los requisitos mínimos de la muestra. Considerando los siguientes tamaños de perlas, con un promedio de 450 bases en la región monocatenaria de un molde, con un peso molecular promedio de 325 g/mol por base, la Tabla 2 muestra lo siguiente:

Tabla 2

Dado el número de esferas y micropozos contemplados para su uso en una matriz, en algunos ejemplos, será evidente que una muestra tomada de un sujeto a probar solo necesita ser del orden de 3 |jg. Por lo tanto, los sistemas y métodos descritos en la presente descripción se pueden utilizar para secuenciar un genoma completo de un organismo a partir de aproximadamente 3 jg de ADN o menos. Como se describe en la presente descripción, dichas secuencias se pueden obtener sin el uso de etiquetas ópticas o extrínsecas.

Los ácidos nucleicos diana se preparan de cualquier manera conocida en la técnica. Como ejemplo, el ADN genómico se puede recoger de una muestra según técnicas conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y otros " Maniatis "). Después de la cosecha, el ADN puede fragmentarse para producir ácidos nucleicos de menor longitud. Los fragmentos resultantes pueden tener una longitud del orden de cientos, miles o decenas de miles de nucleótidos. En algunos ejemplos, los fragmentos tienen un tamaño de 200-1000 pares de bases, o de 300-800 pares de bases, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 900 o aproximadamente 1000 pares de bases de longitud, aunque no están tan limitados.

Los ácidos nucleicos pueden fragmentarse por cualquier medio, que incluye, pero sin limitarse a, medios mecánicos, enzimáticos o químicos. Los ejemplos incluyen cizallamiento, sonicación, nebulización, digestión con endonucleasas (por ejemplo, ADNasa I), amplificación tal como la amplificación por PCR o cualquier otra técnica conocida en la técnica para producir fragmentos de ácido nucleico, preferentemente de una longitud deseada. Como se usa en la presente descripción, la fragmentación también abarca el uso de la amplificación para generar una población de fragmentos de menor tamaño del ácido nucleico diana. Es decir, los ácidos nucleicos diana pueden fundirse y luego hibridarse con dos (y preferentemente más) cebadores de amplificación y luego amplificarse usando, por ejemplo, una polimerasa termoestable (tal como Taq). Un ejemplo es una amplificación masiva y paralela basada en PCR. La fragmentación puede ir seguida de técnicas de selección de tamaño para enriquecer o aislar fragmentos de una longitud o tamaño particular. Dichas técnicas también se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, electroforesis en gel o SPRI.

Alternativamente, se pueden usar ácidos nucleicos diana que ya tienen un tamaño (o longitud) suficientemente pequeño. Dichos ácidos nucleicos diana incluyen los derivados de un proceso de enriquecimiento de exones. Por lo tanto, en lugar de fragmentar (aleatoria o no aleatoria) ácidos nucleicos diana más largos, los diana s pueden ser ácidos nucleicos que existen naturalmente o pueden aislarse en longitudes más cortas y utilizables, como mARN, cADN, exones, productos de PCR (como se describió anteriormente), y similares. Ver Alberto y otros Nature Methods 2007 4(11):903-905 (hibridación de micromatrices de exones y regiones específicas de locus), Porreca y otros Nature Methods 2007 4(11):931-936, y Okou y otros Nature Methods 2007 4(11):907-909 para métodos de aislamiento y/o enriquecimiento de secuencias tales como exones antes de la secuenciación.

Los ácidos nucleicos diana normalmente se ligan a secuencias adaptadoras en los extremos 5' y 3'. El ácido nucleico resultante se denomina en la presente descripción ácido nucleico molde. Por lo tanto, el ácido nucleico molde comprende al menos el ácido nucleico diana y normalmente comprende secuencias de nucleótidos además de la diana en los extremos 5' y 3'. Los ácidos nucleicos moldes pueden diseñarse de manera que diferentes moldes tengan extremos 5' idénticos y extremos 3' idénticos. Los extremos 5' y 3' en cada molde individual son preferentemente de secuencia diferente.

Las secuencias adaptadoras pueden comprender secuencias complementarias a las secuencias de los cebadores de amplificación, para usarse en la amplificación de los ácidos nucleicos diana. Una secuencia adaptadora también puede comprender una secuencia complementaria al cebador de secuenciación (es decir, el cebador a partir del cual se produce la secuenciación). La secuencia adaptadora opuesta puede comprender un resto que facilita la unión del ácido nucleico a un soporte sólido tal como, pero sin limitarse a, una perla. Un ejemplo de tal resto es una molécula de biotina (o un resto de biotina doble, como se describe por Diehl y otros Nature Methods, 2006, 3(7):551-559) y, por lo tanto, dicho ácido nucleico marcado puede unirse a un soporte sólido que tiene grupos avidina o estreptavidina. Otro resto que se puede usar es el par de afinidad NHS-éster y amina. Debe entenderse que la invención no está limitada en este sentido y que un experto en la técnica puede sustituir estos pares de afinidad con otros pares de unión. En algunos ejemplos, el soporte sólido es una perla y en otros es una pared de la cámara de reacción (o pozo) tal como una pared inferior o una pared lateral, o ambas. En algunos ejemplos,

el ejemplo contempla el uso de una pluralidad de poblaciones de molde, en el que cada miembro de una pluralidad dada comparte el mismo extremo 3' pero diferentes poblaciones de molde difieren entre sí en base a sus secuencias de extremo 3'. El ejemplo contempla como ejemplo, en algunos casos, la secuenciación de ácidos nucleicos de más de un sujeto o fuente. Los ácidos nucleicos de una primera fuente pueden tener una primera secuencia 3', los ácidos nucleicos de una segunda fuente pueden tener una segunda secuencia 3', y así sucesivamente, siempre que la primera, la segunda y cualquier secuencia 3' adicional sean diferentes entre sí. A este respecto, el extremo 3', que normalmente es una secuencia única, se puede utilizar como código de barras o identificador para etiquetar (o identificar) la fuente del ácido nucleico particular en un pozo dado. Se puede hacer referencia a Meyer y otros Nucleic Acids Research 200735(15):e97 para una descripción de ácidos nucleicos marcados con códigos de barras seguido de secuenciación.

Los moldes dispuestos en una matriz de chemFET (y, por lo tanto, en más de un sensor de la matriz) pueden compartir secuencias de unión de cebadores idénticas. Esto facilita el uso de un cebador idéntico en los micropozos y también garantiza que se produzca un grado similar (o idéntico) de hibridación del cebador en los micropozos. Una vez hibridados con cebadores complementarios tales como cebadores de secuenciación, los moldes se encuentran en un complejo denominado en la presente descripción híbrido molde/cebador. En este híbrido, al menos una región del molde es de doble cadena (es decir, donde está unida a su cebador complementario) y en algunos casos la región restante del molde es monocatenaria. Es esta región monocatenaria la que actúa como molde para la incorporación de nucleótidos al final del cebador y, por lo tanto, también es esta región monocatenaria la que finalmente se secuencia, de secuencia conocida o desconocida (es decir, aleatoria), y aún capaz de secuenciarse. En algunos ejemplos, el ácido nucleico molde es capaz de autorrecogerse creando de esta manera un extremo 3' desde el que incorporar nucleótidos trifosfato. Por lo tanto, en tales casos, no hay necesidad de un cebador de secuenciación separado ya que el molde actúa como molde y como cebador. Ver Eriksson y otros Electrophoresis 25:20-27, 2004 para una descripción sobre el uso del molde de autorrecocido en una reacción de pirosecuenciación. En otros casos, los cebadores de secuenciación se hibridan (o recocen, ya que los términos se usan indistintamente en la presente descripción) con los moldes antes de la introducción o el contacto con el chemFET o la cámara de reacción.

La pluralidad de moldes en cada micropozo puede introducirse en los micropozos (por ejemplo, a través de una perla cargada con ácido nucleico) o puede generarse en el propio micropozo. Una pluralidad se define en la presente descripción como al menos dos, y en el contexto de los ácidos nucleicos moldes en un micropozo o en una perla cargada con ácido nucleico incluye decenas, centenas, miles, diez mil, cien mil, millones o más copias del ácido nucleicomolde. El límite en el número de copias dependerá de una serie de variables, incluido el número de sitios de unión para los ácidos nucleicos moldes (por ejemplo, en las perlas o en las paredes de los micropozos), el tamaño de las perlas, la longitud del ácido nucleico molde, la extensión de la reacción de amplificación usada para generar la pluralidad, y similares. En un ejemplo, se proporcionan numerosas copias de un molde dado por pozo para aumentar la relación señal/ruido tanto como sea posible, como se describe en la presente descripción. En algunos ejemplos, la amplificación es una amplificación representativa. Una amplificación representativa es una amplificación que no altera la representación relativa de ninguna especie de ácido nucleico.

Por tanto, el ácido nucleico molde puede amplificarse antes o después de la colocación en el pozo y/o el contacto con el sensor. La amplificación y conjugación de ácidos nucleicos con soportes sólidos, como perlas, se puede lograr de varias formas. Por ejemplo, en un aspecto, una vez que se carga un ácido nucleico molde en un pozo de la celda de flujo 200, la amplificación se puede realizar en el pozo, el producto amplificado resultante se desnaturaliza y luego se realiza la secuenciación por síntesis. En un ejemplo, el molde se amplifica en solución y luego se hibrida con un cebador único que se inmoviliza en la superficie del chemFET. El uso de un solo tipo de imprimación en la superficie garantiza que solo una de las cadenas amplificadas finalmente se una a la superficie y la otra cadena se elimine mediante el lavado.

Los métodos de amplificación incluyen, pero sin limitarse a, PCR en emulsión (es decir, amplificación de emulsión de agua en aceite) como se describe en Margulies y otros Nature 2005 437(15):376-380 y los materiales complementarios acompañantes, la amplificación de puente, la amplificación de círculo rodante (RCA), la reacción en cadena de concatémeros (CCR) u otras estrategias que utilizan técnicas de amplificación isotérmicas o no isotérmicas.

La amplificación de puente se puede utilizar para producir un soporte sólido (como una pared de cámara de reacción o una perla) que tenga copias amplificadas del mismo molde. El método implica poner en contacto los ácidos nucleicos del molde con la matriz de cámara de reacción/chemFET en una dilución límite para garantizar que las cámaras de reacción contengan un solo molde. La superficie del chemFET normalmente se recubrirá con dos poblaciones de cebadores. En una realización, la superficie del chemFET está recubierta con cebadores tanto directos como inversos que son complementarios a las secuencias 5' y 3' modificadas por ingeniería genética del molde. El molde se une directamente a la superficie del chemFET y luego se deja hibridar en su extremo libre con un cebador complementario en la superficie. El cebador se extiende usando nucleótidos no marcados y luego se desnaturaliza el ácido nucleico de doble cadena resultante. Esto da como resultado copias inmovilizadas del ácido nucleico molde y su complemento muy cerca de la superficie. Este proceso se repite permitiendo que el molde y su complemento hibriden en sus extremos libres con otros cebadores en la superficie. El resultado neto es una población de molde inmovilizada y una población de complemento inmovilizada que se intercalan entre sí. A continuación, la reacción de secuenciación por síntesis se lleva a cabo utilizando un cebador de secuenciación que se une a una cadena inmovilizada, pero no a ambas. Esto selecciona de manera efectiva una de las cadenas y asegura que solo se secuencie una cadena. Cualquier cadena se puede secuenciar ya que son complementos entre sí.

En un ejemplo relacionado, el soporte sólido es una perla y la perla está recubierta con las dos poblaciones de cebadores y solo un ácido nucleico molde monocatenario, al menos inicialmente. Este método de amplificación se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5641658 de Adams y otros.

En todavía otro ejemplo, cada superficie de soporte sólido (ya sea una perla o una pared de la cámara de reacción) se ha unido a ella con un par de cebadores único y específico que puede ser, pero no se limita a, un par de cebadores específicos de genes. Uno o ambos cebadores del par seleccionan moldes en una biblioteca que se aplica al soporte sólido. Debido a la secuencia única de los cebadores, se espera que solo el molde deseado hibridará y luego se amplificará y secuenciará, como se describió anteriormente.

Los métodos de amplificación RCA o CCR generan concatémeros de ácidos nucleicos moldes que comprenden decenas, cientos, miles o más copias dispuestas en tándem del molde. Dichos concatémeros aún pueden denominarse en la presente descripción como ácidos nucleicos molde, aunque pueden contener múltiples copias de ácidos nucleicos moldes de partida. En algunos ejemplos, también pueden denominarse ácidos nucleicos moldes amplificados. Alternativamente, pueden denominarse en la presente descripción como que comprenden múltiples copias del fragmento de ácido nucleico diana. Los concatémeros pueden contener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 1000 o más copias del ácido nucleico inicial. Pueden contener 10-102, 102 -103, 103 -104, 103 -105, o más copias del ácido nucleico de partida. Los concatémeros generados usando estos u otros métodos (tales como, por ejemplo, nanobolas de ADN) se pueden usar en los métodos de secuenciación por síntesis descritos en la presente descripción. Los concatémeros pueden generarse in vitro aparte de la matriz y luego colocarse en las cámaras de reacción de la matriz o pueden generarse en las cámaras de reacción. Una o más paredes interiores de la cámara de reacción pueden tratarse para mejorar la unión y retención de los concatémeros, aunque esto no es necesario. En algunos ejemplos, si los concatémeros se unen a una pared interior de la cámara de reacción, como la superficie del chemFET, la incorporación de nucleótidos, al menos en el contexto de una reacción de secuenciación por síntesis, puede detectarse mediante un cambio de carga en la superficie del chemFET, como alternativa o además de la detección de iones hidrógenos liberados como se describe en la presente descripción. Si los concatémeros se depositan sobre una superficie del chemFET y/o en una cámara de reacción, la secuenciación por síntesis puede producirse a través de la detección de iones hidrógenos liberados como se describe en la presente descripción. La invención abarca el uso de otros enfoques para generar moldes concatemerizados. Uno de estos enfoques es una PCR descrita por Stemmer y otros en la Patente de Estados Unidos No. 5834252.

La capacidad de usar ácidos nucleicos moldes independientemente de las perlas y que se pueden depositar en cámaras de reacción o en superficies del chemFET facilita el uso de matrices chemFET densas. Como se comprenderá, las matrices más densas incorporarán normalmente más chemFET y, opcionalmente, más cámaras de reacción (cuando se utilicen) por matriz (o chip). Para adaptarse al mayor número de chemFET y, opcionalmente, cámaras de reacción, se reduce el tamaño de los chemFET y, opcionalmente, de las cámaras de reacción. En consecuencia, en algunos casos, se pueden usar ácidos nucleicos que son concatémeros del ácido nucleico que se va a secuenciar, independientemente de las perlas. Se puede permitir que dichos ácidos nucleicos se autoensamblen en una superficie del chemFET tratada, o se pueden asentar en el pozo (por ejemplo, por gravedad), o se pueden atraer por fuerza magnética o de otro tipo. Por lo tanto, la realización contempla el uso de dichos ácidos nucleicos moldes concatemerizados en los métodos de secuenciación por síntesis basados en el pH descritos en la presente descripción.

Como se describe en la presente descripción, un enfoque para generar ácidos nucleicos que comprenden múltiples copias de un ácido nucleico que se va a secuenciar implica la amplificación de un molde circular. El producto amplificado resultante forma una estructura tridimensional que puede ocupar un volumen esférico u otro volumen y forma tridimensional. El volumen ocupado puede variar, dependiendo del tamaño del ácido nucleico resultante. Por ejemplo, en algunos casos el volumen esférico puede tener un diámetro promedio del orden de aproximadamente 100-300 nm. La generación de estas estructuras tridimensionales se describe con aún más en las solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas US20070072208A1 y US20070099208A1, ambas para Drmanac y otros.

Tales ácidos nucleicos pueden generarse en solución (es decir, la amplificación se produce en solución) y, por lo tanto, en algunos casos no son necesarias técnicas basadas en emulsión o cámaras de reacción o pozos. Como cada ácido nucleico resultante consta de una población clonal amplificada de un ácido nucleico inicial, no habrá contaminación cruzada de ácidos nucleicos y tampoco tiene que haber ninguna separación física entre las reacciones de amplificación individuales. Por lo tanto, en algunos aspectos, se contempla que los ácidos nucleicos (tales como "nanobolas de ADN" o "amplicones") se generen en solución y luego se depositen sobre superficies del chemFET y/o en cámaras de reacción. Otras referencias que describen métodos de amplificación adecuados para la síntesis de estos ácidos nucleicos incluyen los Números de patente de Estados Unidos 4683195, 4965188, 4683202, 4800159, 5210015, 6174670, 5399491, 6287824, 5854033 y la solicitud de patente de Estados Unidos publicada US20060024711. La amplificación de círculo rodante lineal, la amplificación de desplazamiento múltiple y la amplificación de círculo rodante con sonda de candado se pueden usar para generar amplicones clonales sin necesidad de limitar la dilución para evitar la contaminación cruzada de los moldes de ácido nucleico entre sí.

Las superficies del chemFET pueden estar tratadas (o modeladas) o no tratadas (o no modeladas). En algunos casos, se prefieren las superficies tratadas (o modeladas) para maximizar la deposición y/o retención de ácido nucleico sobre una superficie. Se conoce además en la técnica que estos ácidos nucleicos pueden autoensamblarse sobre la superficie de chemFET siempre que la superficie de la matriz de chemFET comprenda regiones a las que se unen los ácidos nucleicos y, opcionalmente, regiones a las que no se unen. Además, la unión de un ácido nucleico a una región de la superficie rechazará la unión de otro ácido nucleico, lo que excluye la posibilidad de que dos o más ácidos nucleicos de diferente secuencia puedan coexistir en la misma superficie del chemFET. La matriz de chemFET puede tener una ocupación del orden de más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 % o el 90 % o más (es decir, el número de superficies individuales de chemFET en las que se encuentra un solo ácido nucleico) se deposita el ácido). Se entenderá que, como se usa en la presente descripción, el término depositado se refiere simplemente a la colocación del ácido nucleico muy cerca y potencialmente en contacto con una superficie del chemFET (y opcionalmente con una cámara de reacción), pero no requiere ninguna interacción particular, ya sea covalente o no covalente, entre el ácido nucleico y la superficie del chemFET.

Los ácidos nucleicos amplificados descritos en la presente descripción pueden unirse a la superficie del chemFET a través de funcionalidades incorporadas (por ejemplo, durante la amplificación) o añadidas después de la síntesis al ácido nucleico. Dichas funcionalidades pueden localizarse en regiones adaptadoras dentro del ácido nucleico que no están destinadas a la secuenciación según los métodos proporcionados en la presente descripción. Por ejemplo, se puede generar un concatémero a partir de un molde circular que tenga dos o más secuencias adaptadoras (o ácidos nucleicos) localizadas aguas arriba y aguas abajo de los ácidos nucleicos que se están secuenciando. Alternativamente, el ácido nucleico de partida (o inicial) puede consistir en una sola secuencia adaptadora y un solo ácido nucleico a secuenciar y en el proceso de amplificación (como, por ejemplo, RCA) la secuencia adaptadora se usa para separar las copias del ácido nucleico a secuenciar entre sí. Ya sea en esta realización o en otras descritas en la presente descripción, las funcionalidades presentes en las secuencias adaptadoras pueden usarse para unir y/o retener los ácidos nucleicos amplificados resultantes en una superficie del chemFET y, opcionalmente, en una cámara de reacción. Las funcionalidades ilustrativas incluyen pero no se limitan a grupos amino, grupos sulfhidrilo, grupos carbonilo, biotina, estreptavidina, avidina, nucleótidos marcados con alilo de amina, interacción NHS-éster, enlaces tioéter y similares.

La unión puede ser a través de enlaces no covalentes entre los ácidos nucleicos de captura presentes en la superficie del chemFET y las secuencias complementarias en las regiones del adaptador, o adsorción a la superficie a través de las fuerzas de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, interacciones de carga estática, interacciones iónicas e hidrofóbicas y similares. Las técnicas utilizadas para unir ADN a micromatrices también pueden usarse para unir los productos amplificados a la superficie del chemFET. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a las descritas por Smirnov, Genes, Chrom & Cancer 40:72-77, 2004 y Beaucage Curr Med Chem 8:1213-1244, 2001. La deposición y/o retención también se puede lograr usando fuerzas magnéticas. En estos ejemplos, las partículas magnéticas pueden incorporarse y/o unirse después de la síntesis a los ácidos nucleicos amplificados (por ejemplo, en regiones no previstas para la secuenciación). Una vez que los ácidos nucleicos se distribuyen en una matriz de chemFET y, opcionalmente, en una matriz de cámara de reacción, la matriz se coloca cerca de un imán para mover los ácidos nucleicos hacia la superficie de chemFET y, opcionalmente, en una cámara de reacción.

También debe entenderse que los métodos descritos en la presente descripción contemplan la síntesis de los ácidos nucleicos amplificados sobre o cerca del chemFET y opcionalmente en una cámara de reacción además de la síntesis en solución seguida por la deposición sobre la superficie del chemFET. Sin embargo, se espera que el último enfoque resulte en un mayor grado de ocupación de superficies del chemFET en la matriz.

En consecuencia, en la presente descripción se proporciona una matriz de ácidos nucleicos que comprende una pluralidad de chemFET, cada uno de los cuales tiene una superficie, y una pluralidad de ácidos nucleicos, cada ácido nucleico depositado sobre (o unido a) superficies individuales de chemFET, en la que cada ácido nucleico comprende múltiples copias idénticas de un ácido nucleico inicial a secuenciar. En algunos casos, el ácido nucleico tiene un estado de espiral aleatorio.

También se proporciona en la presente descripción un método para secuenciar un ácido nucleico presente en una cámara de reacción de una matriz de cámaras de reacción, que comprende sintetizar un concatémero de un ácido nucleico de partida, en el que el concatémero tiene un diámetro transversal mayor que el diámetro del pozo de reacción, inmovilizar opcionalmente (ya sea de forma covalente o no covalente) el concatémero en la cámara de reacción y secuenciar el concatémero, preferentemente mediante métodos de secuenciación por síntesis proporcionados en la presente descripción (por ejemplo, métodos de secuenciación por síntesis basados en pH). Se entenderá que si la cámara de reacción tiene una sección transversal no circular, entonces se pueden usar una o más o un promedio de las dimensiones de la sección transversal (al igual que el área de la sección transversal) al comparar los tamaños o dimensiones del concatémero y de la cámara de reacción. También debe entenderse que el tamaño del concatémero en relación con la cámara de reacción impedirá la presencia de más de un concatémero por cámara de reacción.

Soportes sólidos y perlas de captura

El soporte sólido al que se unen los ácidos nucleicos moldes o los cebadores se denomina en la presente descripción "soporte sólido de captura". El soporte sólido puede ser una pared de la cámara de reacción (o pozo) que incluye la superficie del chemFET, o una pared inferior o lateral de la cámara de reacción siempre que dicha pared esté acoplada capacitivamente al chemFET. Si el soporte sólido es una perla, dicha perla puede denominarse en la presente descripción como una "perla de captura". Tales perlas se denominan generalmente en la presente descripción como "cargadas" o "portadoras" de ácido nucleico si tienen ácidos nucleicos unidos a su superficie (ya sea de forma covalente o no covalente) y/o presentes en su núcleo interior. Algunas perlas de captura tienen una superficie porosa que permite la entrada y salida de compuestos pequeños, como reactivos de amplificación o secuenciación (por ejemplo, dNTP, cofactores, etc.). Esta clase de perlas típicamente comprenderá ácidos nucleicos internamente y de esta manera funcionan para localizar los ácidos nucleicos, opcionalmente sin necesidad de unir los ácidos nucleicos a un soporte sólido. En realizaciones en las que se usan perlas de captura, preferentemente cada pozo de reacción comprende solo una única perla de captura.

El grado de saturación de cualquier perla de captura (es decir, secuenciación) con el ácido nucleico molde que se va a secuenciar puede no ser del 100 %. En algunas realizaciones, existe un nivel de saturación de 10 %-100 %. Como se usa en la presente descripción, el grado de saturación de una perla de captura con un molde se refiere a la proporción de sitios en la perla que están conjugados con el molde. En algunos casos, este puede ser de al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o puede ser 100 %.

Matrices de micropozos

Aspectos importantes de la invención contemplan la secuenciación de una pluralidad de diferentes ácidos nucleicos moldes simultáneamente. Esto se puede lograr utilizando las matrices de sensores descritas en la presente descripción. Las matrices de sensores se superponen (y/o son integrales con) una matriz de micropozos (o cámaras de reacción o pozos, ya que esos términos se usan indistintamente en la presente descripción), con la condición de que haya al menos un sensor por micropozo. Presente en una pluralidad de micropozos hay una población de copias idénticas de un ácido nucleico molde. No existe ningún requisito de que dos micropozos cualesquiera lleven ácidos nucleicos moldes idénticos, aunque en algunos casos dichos moldes pueden compartir secuencias superpuestas. Por tanto, cada micropozo comprende una pluralidad de copias idénticas de un ácido nucleico molde, y los moldes entre los micropozos pueden ser diferentes.

Los micropozos pueden variar en tamaño entre matrices. El tamaño de estos micropozos se puede describir en términos de una relación de ancho (o diámetro) a altura. En algunas realizaciones, esta relación es de 1:1 a 1:1,5. El tamaño del perla al pozo (por ejemplo, el diámetro del perla al ancho, diámetro o altura del pozo) está preferentemente en el intervalo de 0,6-0,8.

El tamaño de los micropozos puede describirse en términos de sección transversal. La sección transversal puede referirse a una "rebanada" paralela a la profundidad (o altura) del pozo, o puede ser una rebanada perpendicular a la profundidad (o altura) del pozo. Los micropozos pueden tener una sección transversal cuadrada, pero no están tan limitados. Las dimensiones en la parte inferior de un micropozo (es decir, en una sección transversal que es perpendicular a la profundidad del pozo) pueden ser de 1,5 pm por 1,5 pm, o pueden ser de 1,5 pm por 2 pm. Los diámetros adecuados incluyen, pero sin limitarse a, aproximadamente 100 pm, 95 pm, 90 pm, 85 pm, 80 pm, 75 pm, 70 pm, 65 pm, 60 pm, 55 pm, 50 pm, 45 pm, 40 pm, 35 pm, 30 pm, 25 pm, 20 pm, 15 pm, 10 pm, 9 pm, 8 pm, 7 pm, 6 pm, 5 pm, 4 pm, 3 pm, 2 pm, 1 pm o menos. En algunas realizaciones particulares, los diámetros pueden ser de aproximadamente 44 pm, 32 pm, 8 pm, 4 pm o 1,5 pm. Las alturas adecuadas incluyen, pero sin limitarse a, aproximadamente 100 pm, 95 pm, 90 pm, 85 pm, 80 pm, 75 pm, 70 pm, 65 pm, 60 pm, 55 pm, 50 pm, 45 pm, 40 pm, 35 pm, 30 pm, 25 pm, 20 pm, 15 pm, 10 pm, 9 pm, 8 pm, 7 pm, 6 pm, 5 pm, 4 pm, 3 pm, 2 pm, 1 pm o menos. En algunas realizaciones particulares, las alturas pueden ser de aproximadamente 55 pm, 48 pm, 32 pm, 12 pm, 8 pm, 6 pm, 4 pm, 2,25 pm, 1,5 pm o menos. Diversas realizaciones de la invención contemplan la combinación de cualquiera de estos diámetros con cualquiera de estas alturas. En aún otras realizaciones, las dimensiones del pozo de reacción pueden ser (diámetro en pm por altura en pm) 44 por 55, 32 por 32, 32 por 48, 8 por 8, 8 por 12, 4 por 4, 4 por 6, 1,5 por 1,5, o 1,5 por 2,25.

El volumen del pozo de reacción puede variar (entre matrices, y preferentemente no dentro de una única matriz) en base a las dimensiones del pozo. Este volumen puede ser de o aproximadamente 100 picolitros (pL), 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 o menos pL. En realizaciones importantes, el volumen del pozo es menor que 1 pL, incluyendo igual o menor que 0,5 pL, igual o menor que 0,1 pL, igual o menor que 0,05 pL, igual o menor que 0,01 pL, igual o inferior superior a 0,005 pL, o igual o menor que 0,001 pL. El volumen puede ser de 0,001 a 0,9 pL, de 0,001 a 0,5 pL, de 0,001 a 0,1 pL, de 0,001 a 0,05 pL o de 0,005 a 0,05 pL. En realizaciones particulares, el volumen del pozo es 75 pL, 34 pL, 23 pL, 0,54 pL, 0,36 pL, 0,07 pL, 0,045 pL, 0,0024 pL o 0,004 pL. En algunas realizaciones, cada cámara de reacción no tiene un volumen superior a aproximadamente 0,39 pL y una apertura superficial de aproximadamente 49 pm2, y con mayor preferencia tiene una apertura no superior a aproximadamente 16 pm2 y un volumen no superior a aproximadamente 0,064 pL.

Debe entenderse, por lo tanto, que la invención contempla un aparato de secuenciación para secuenciar ácidos nucleicos no marcados, utilizando opcionalmente nucleótidos no marcados, sin detección óptica y que comprende una matriz de al menos 100 cámaras de reacción. En algunas realizaciones, la matriz comprende 103, 104, 105, 106, 107 o más cámaras de reacción. El intervalo (o distancia de centro a centro entre cámaras de reacción adyacentes) es del orden de 1-10 micras, incluyendo 1-9 micras, 1-8 micras, 1-7 micras, 1-6 micras, 1-5 micras, 1-4 micras, 1-3 micras o 1-2 micras.

En varios ejemplos, las perlas cargadas con ácido nucleico, de las cuales puede haber decenas, cientos, miles o más, primero entran a la celda de flujo y luego las perlas individuales entran a los pozos individuales. Las perlas pueden entrar en los pozos de forma pasiva o no. Por ejemplo, las perlas pueden entrar en los pozos por gravedad sin aplicar ninguna fuerza externa. Las perlas pueden entrar en los pozos a través de una fuerza externa aplicada que incluye, pero sin limitarse a, una fuerza magnética o una fuerza centrífuga. En algunos ejemplos, si se aplica una fuerza externa, se aplica en una dirección paralela a la altura/profundidad del pozo en lugar de transversal a la altura/profundidad del pozo, con el objetivo de "capturar" la mayor cantidad posible de perlas. En un ejemplo, los pozos (o matrices de pozos) no se agitan, como puede producirse, por ejemplo, a través de una fuerza externa aplicada que es perpendicular a la altura/profundidad del pozo. Además, una vez que los pozos están tan cargados, no están sujetos a ninguna otra fuerza que pueda desalojar las perlas de los pozos.

Los ejemplos proporcionan una breve descripción de un protocolo de carga de perlas ilustrativo en el contexto de perlas magnéticas. Debe entenderse que podría usarse un enfoque similar para cargar otros tipos de perlas. Se ha demostrado que el protocolo reduce la probabilidad y la incidencia de aire atrapado en los pozos de la cámara de flujo, distribuye uniformemente perlas cargadas con ácido nucleico en la totalidad de los pozos de la cámara de flujo y evita la presencia y/o acumulación de exceso de perlas en la cámara de flujo.

En varios casos, se contempla que cada pozo en la cámara de flujo contenga solo una perla cargada con ácido nucleico. Esto se debe a que la presencia de dos perlas por pozo producirá información de secuenciación inutilizable derivada de dos ácidos nucleicos moldes diferentes.

En algunos ejemplos, la matriz de micropozos puede analizarse para determinar el grado de carga de perlas en los micropozos y, en algunos casos, para identificar los micropozos que tienen perlas y los que carecen de perlas. La capacidad de saber qué micropozos carecen de perlas proporciona otro control interno para la reacción de secuenciación. La presencia o ausencia de una perla en un pozo se puede determinar por microscopía estándar o por el propio sensor. Las Figuras 61J y K son imágenes capturadas de una inspección con microscopio óptico de una matriz de micropozos (J) y de la matriz de sensores subyacente a la matriz de micropozos (K). Cada uno de los puntos blancos en ambas imágenes representa una perla en un pozo. Dicha observación de micropozos normalmente solo se realiza una vez por ciclo, especialmente porque las perlas, una vez depositadas en un micropozo, es poco probable que se muevan a otro pozo.

También se ha encontrado que en ausencia de flujo, la señal de parte inferior (es decir, el ruido) es menor o igual a aproximadamente 0,25 mV, pero que en presencia de perlas de captura cargadas con ADN, esa señal aumenta a aproximadamente 1,0 mV =/- 0,5 mV. Este aumento es suficiente para permitir determinar pozos con perlas.

El porcentaje de pozos ocupados en la matriz de pozos puede variar según los métodos que se realicen. Si el método tiene como objetivo extraer el máximo de datos de secuencia en el menor tiempo posible, entonces es conveniente una mayor ocupación. Si la velocidad y el recorrido no son tan críticos, entonces se puede tolerar una ocupación más baja. Por lo tanto, dependiendo del ejemplo, los porcentajes de ocupación adecuados pueden ser al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o el 100% de los pozos. Como se usa en la presente descripción, la ocupación se refiere a la presencia de una perla cargada con ácido nucleico en un pozo y el porcentaje de ocupación se refiere a la proporción del total de pozos en una matriz que está ocupada por una sola perla. Los pozos que están ocupados por más de una perla típicamente no pueden usarse en los análisis contemplados por la invención.

Reacciones de secuenciación simultánea

Por lo tanto, se contempla realizar una pluralidad de diferentes reacciones de secuenciación simultáneamente. Se produce una pluralidad de reacciones de secuenciación idénticas en cada pozo ocupado simultáneamente. Es esta incorporación simultánea e idéntica de dNTP dentro de cada pozo lo que aumenta la relación señal/ruido. Realizando reacciones de secuenciación en una pluralidad de pozos simultáneamente, se secuencian simultáneamente una pluralidad de diferentes ácidos nucleicos. Los métodos apuntan a maximizar la incorporación completa en todos los micropozos para cualquier dNTP dado, reducir o disminuir la cantidad de dNTP no incorporados que permanecen en los pozos después de que se completa la detección de la señal y lograr una relación señal/ruido lo más alta posible.

Antes y/o mientras están en los pozos, los ácidos nucleicos moldes se incuban con un cebador de secuenciación que se une a su secuencia complementaria localizada en el extremo 3' del ácido nucleico molde (es decir, en la secuencia del cebador de amplificación o en otra secuencia adaptadora ligado al extremo 3' del ácido nucleico diana) y con una polimerasa durante un tiempo y en condiciones que promuevan la hibridación del cebador con su secuencia complementaria y que promuevan la unión de la polimerasa al ácido nucleico molde. El cebador puede ser de prácticamente cualquier secuencia siempre que sea lo suficientemente largo para ser único. Las condiciones de hibridación son tales que el cebador se hibridará solo con su verdadero complemento en el extremo 3' del molde. Las condiciones adecuadas se describen en Margulies y otros Nature 2005 437(15):376-380 y los materiales complementarios acompañantes.

Se entenderá que la cantidad de cebadores de secuenciación y polimerasas puede ser saturante, por encima del nivel de saturación o, en algunos casos, por debajo de los niveles de saturación. Como se usa en la presente descripción, un nivel de saturación de un cebador de secuenciación o una polimerasa es un nivel en el que cada ácido nucleico molde se hibrida con un cebador de secuenciación o se une a una polimerasa, respectivamente. Por tanto, la cantidad de saturación es el número de polimerasas o cebadores que es igual al número de moldes en una sola perla. En algunas realizaciones, el nivel es mayor que esto, incluyendo al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más que el nivel del ácido nucleico molde. En otras realizaciones, el número de polimerasas y/o cebadores puede ser del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o hasta el 100 % del número de moldes en una sola perla en un solo pozo.

Las polimerasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, ADN polimerasa, ARN polimerasa o una subunidad de las mismas, siempre que sea capaz de sintetizar una nueva cadena de ácido nucleico basada en el molde y comenzando a partir del cebador hibridado. Un ejemplo de una subunidad de polimerasa adecuada para algunas, pero no todas las realizaciones de la invención es la versión exo menos (exo-) del fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli I que carece de actividad de exonucleasa de 3' a 5'. Otras polimerasas incluyen las polimerasas T4 exo-, Therminator y Bst. En aún otros ejemplos que requieren la escisión de nucleótidos (por ejemplo, en el proceso de una reacción de traslación de mellas), se prefieren las polimerasas con actividad de exonucleasa. La polimerasa puede estar libre en solución (y puede estar presente en soluciones de lavado y dNTP) o puede estar unida, por ejemplo, a las perlas (o al soporte sólido correspondiente) o a las paredes del chemFET, pero preferentemente no a la propia superficie del ISFET. La polimerasa puede ser una que esté modificada para comprender factores accesorios que incluyen, sin limitación, proteínas de unión a ADN monocatenario o bicatenario. Algunos ejemplos emplean una polimerasa con suficiente procesividad. Tal como se usa en la presente descripción, la procesividad es la capacidad de una polimerasa para permanecer unida a un único híbrido cebador/molde. Como se usa en la presente descripción, se mide por el número de nucleótidos que una polimerasa incorpora en un ácido nucleico (tal como un cebador de secuenciación) antes de la disociación de la polimerasa del híbrido cebador/molde. En algunos ejemplos, la polimerasa tiene una procesividad de al menos 100 nucleótidos, aunque en otros ejemplos tiene una procesividad de al menos 200 nucleótidos, al menos 300 nucleótidos, al menos 400 nucleótidos o al menos 500 nucleótidos. Los expertos en la técnica entenderán que cuanto mayor es la procesividad de la polimerasa, más nucleótidos se pueden incorporar antes de la disociación y, por lo tanto, más larga es la secuencia que se puede obtener. En otras palabras, las polimerasas que tienen una baja procesividad proporcionarán longitudes de lectura más cortas que las polimerasas que tienen una mayor procesividad. Como ejemplo, una polimerasa que se disocia del híbrido después de cinco incorporaciones solo proporcionará una secuencia de 5 nucleótidos de longitud, mientras que una polimerasa que se disocia en promedio del híbrido después de 500 incorporaciones proporcionará una secuencia de aproximadamente 500 nucleótidos.

La velocidad a la que una polimerasa incorpora nucleótidos variará dependiendo de la aplicación particular. La velocidad de "secuenciación" dependerá de la cantidad de matrices en el chip, el tamaño de los pozos, la temperatura y las condiciones en las que se realizan las reacciones, etc.

En algunos ejemplos, el tiempo para un ciclo de 4 nucleótidos puede ser de 50-100 segundos, de 60-90 segundos o de aproximadamente 70 segundos. En otros ejemplos, este tiempo de ciclo puede ser igual o menor que 70 segundos, incluso igual o menor que 60 segundos, igual o menor que 50 segundos, igual o menor que 40 segundos, o igual o menor que 30 segundos. Una longitud de lectura de aproximadamente 400 bases puede tardar del orden de 30 minutos, 60 minutos, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas, 3,5 horas, 4 horas, 4,5 horas o, en algunos casos, 5 horas o más. Estos tiempos son suficientes para la secuenciación de megabases, y con mayor preferencia gigabases de secuencia, pudiendo lograrse mayores cantidades de secuencia mediante el uso de matrices más densas (es decir, matrices con mayor número de pozos de reacción y FET) y/o el uso simultáneo de matrices múltiples.

La Tabla 3 proporciona estimaciones para las velocidades de secuenciación basadas en varias configuraciones de matriz, chip y sistema contempladas en la presente descripción. Debe entenderse que la invención contempla matrices incluso más densas que las que se muestran en la Tabla 3. Estas matrices más densas se pueden caracterizar como CMOS de 90 nm con un intervalo de 1,4 pm y un tamaño de pozo de 1 pm que se puede usar con perlas de 0,7 pm, o CMOS de 65 nm con un intervalo de 1 pm y un tamaño de pozo de 0,5 pm que se puede usar con perlas de 0,3 pm o CMOS de 45 pm con un intervalo de 0,7 pm y un tamaño de pozo de 0,3 pm que se puede usar con perlas de 0,2 pm.

Tabla 3. Parámetros de reacción velocidades de lectura.

El ácido nucleico molde también se pone en contacto con otros reactivos y/o cofactores que incluyen, pero sin limitarse a, amortiguador, detergente, agentes reductores como ditiotritol (DTT, reactivo de Cleland), proteínas de unión monocatenarias y similares antes y/o durante en el pozo. En un ejemplo, la polimerasa comprende una o más proteínas de unión monocatenarias (por ejemplo, la polimerasa puede ser una que esté diseñada para incluir una o más proteínas de unión monocatenarias). En un ejemplo, el ácido nucleico molde se pone en contacto con el cebador y la polimerasa antes de su introducción en la cámara de flujo y sus pozos.

Los cebadores pueden ser de naturaleza ADN o pueden ser fracciones modificadas tales como PNA o LNA, o pueden comprender alguna otra modificación como las descritas en la presente descripción, o alguna combinación de las anteriores. Se ha encontrado que los cebadores que contienen LNA se unen de manera eficiente a los moldes de ADN en condiciones estrictas y aún pueden mediar en una extensión mediada por polimerasa.

Algunas reacciones pueden llevarse a cabo a un pH igual o mayor que 7,5, igual o mayor que 8, igual o mayor que 8,5, igual o mayor que 9, igual o mayor que 9,5, igual o mayor que 10, o igual o mayor que 11. La polimerasa puede ser una que incorpore nucleótidos en un ácido nucleico a un pH de 7-11, 7,5-10,5, 8-10, 8,5-9,5 o aproximadamente 9.

En algunos ejemplos, la enzima tiene una alta actividad en bajas concentraciones de dNTP. En algunos ejemplos, la concentración de dNTP es de 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM y preferentemente 20 pM o menos.

La apirasa es una enzima que degrada los nucleótidos no incorporados residuales convirtiéndolos en monofosfato y liberando fosfato inorgánico en el proceso. Es útil para degradar los dNTP que no se incorporan y/o que se encuentran en exceso. Es importante que el exceso y/o el dNTP no incorporado se eliminen de todos los pozos después de completar las mediciones y antes de la introducción del dNTP posterior. En consecuencia, la adición de apirasa entre la introducción de diferentes dNTP es útil para eliminar los dNTP no incorporados que, de cualquier otra manera, oscurecerían los datos de secuenciación.

Por lo tanto, según algunos aspectos, se coloca una población homogénea de (o una pluralidad de ácidos nucleicos de molde idénticos) en cada uno de una pluralidad de pozos, cada pozo situado sobre y por lo tanto correspondiente a al menos un sensor. Como se describió anteriormente, preferentemente el pozo contiene al menos 10, al menos 100, al menos 1000, al menos 104, al menos 105, al menos 106 o más copias de un ácido nucleico molde idéntico. Ácidos nucleicos molde idénticos significa que los moldes son idénticas en secuencia. La mayoría y preferentemente todos los ácidos nucleicos moldes dentro de un pozo se hibridan uniformemente con un cebador. La hibridación uniforme de los ácidos nucleicos moldes con los cebadores significa que el cebador se hibrida con el molde en la misma localización (es decir, la secuencia a lo largo del molde que es complementaria al cebador) que cualquier otro híbrido molde/cebador en el pozo. El posicionamiento uniforme del cebador en cada molde permite la síntesis coordinada de todas las nuevas cadenas de ácido nucleico dentro de un pozo, lo que da como resultado de esta manera una mayor relación señal-ruido.

En algunos ejemplos, los nucleótidos se añaden luego en flujo, o mediante cualquier otro método adecuado, en orden secuencial a la cámara de flujo y, por lo tanto, a los pozos. Los nucleótidos se pueden añadir en cualquier orden, siempre que se conozca y, en aras de la simplicidad, se mantengan constantes a lo largo de una serie.

En algunos ejemplos, el método consiste en agregar ATP al amortiguador de lavado para que los dNTP que fluyen hacia un pozo desplacen el ATP del pozo. El ATP coincide con la fuerza iónica de los dNTP que entran a los pozos y también tiene un perfil de difusión similar al de los dNTP. De esta forma, la entrada y salida de dNTP durante la reacción de secuenciación no interfieren con las mediciones en el chemFET. La concentración de ATP utilizada es del orden de la concentración de dNTP utilizada.

En algunos ejemplos, el dNTP y/o la polimerasa se pueden preincubar con un catión divalente tal como, pero sin limitarse a, Mg2+ (por ejemplo, en forma de MgCh) o Mn2+ (por ejemplo, en forma de MnCh). También se pueden usar otros cationes divalentes, que incluye, pero sin limitarse a, Ca2+, Co2+. Esta incubación previa (y, por lo tanto, la "carga previa" del dNTP y/o la polimerasa puede garantizar que la polimerasa esté expuesta a una cantidad suficiente de catión divalente para un funcionamiento adecuado y necesario, incluso si está presente en un entorno de baja fuerza iónica). La preincubación puede producirse durante 1-60 minutos, 5-45 minutos o 10-30 minutos, según los ejemplos, aunque no se limita a estos intervalos de tiempo.

Por lo tanto, un ciclo de secuenciación puede proceder de la siguiente manera: lavado de la cámara de flujo (y los pozos) con amortiguador de lavado (que opcionalmente contiene ATP), introducción de una primera especie de dNTP (por ejemplo, dATP) en la cámara de flujo (y los pozos), liberación y detección de PPi y luego nucleótidos no incorporados (si se produjo la incorporación) o detección únicamente de nucleótidos no incorporados (si no se produjo la incorporación) (por cualquiera de los mecanismos descritos en la presente descripción), lavado de la cámara de flujo (y pozos) con amortiguador de lavado, lavado de la cámara de flujo (y pozos) con amortiguador de lavado que contiene apirasa (para eliminar tantos nucleótidos no incorporados como sea posible antes del flujo del siguiente dNTP, lavado de la cámara de flujo (y pozos) con amortiguador de lavado e introducción de una segunda especies de dNTP. Este proceso continúa hasta que los 4 dNTP (es decir, dATP, dCTP, dGTP y dTTP) hayan fluido a través de la cámara y se les haya permitido incorporarse a las cadenas recién sintetizadas. Este ciclo de 4 nucleótidos puede repetirse cualquier número de veces, que incluyen, pero sin limitarse a, 10, 25, 50, 100, 200 o más veces. El número de ciclos se regirá por la longitud del molde que se está secuenciando y la necesidad de reponer los reactivos de reacción, en particular, las reservas de dNTP y los amortiguadores de lavado.

Como parte de la reacción de secuenciación, se ligará un dNTP (o "se incorporará" como se usa en la presente descripción) al extremo 3' de la cadena recién sintetizada (o al extremo 3' del cebador de secuenciación en el caso del primer dNTP incorporado) si su nucleótido complementario está presente en esa misma localización en el ácido nucleico molde. Por lo tanto, la incorporación del dNTP introducido (y la liberación concomitante de PPi) indica la identidad del nucleótido correspondiente en el ácido nucleico molde. Si no se ha incorporado dNTP, no se liberan hidrógenos y no se detecta ninguna señal en la superficie del chemFET. Por lo tanto, se puede concluir que el nucleótido complementario no estaba presente en el molde en esa localización. Si el dNTP introducido se ha incorporado a la cadena recién sintetizada, el chemFET detectará una señal. La intensidad de la señal y/o el área bajo la curva es una función del número de nucleótidos incorporados (por ejemplo, como puede producirse en un tramo de homopolímero en el molde). El resultado es que no se pierde información de la secuencia a través de la secuenciación de un tramo de homopolímero (por ejemplo, poli A, poli T, poli C o poli G) en el molde.

La reacción de secuenciación se puede llevar a cabo en un intervalo de temperaturas. Normalmente, la reacción se lleva a cabo en el intervalo de 30 °C a 70 °C, 30 °C a 65 °C, 30-60 °C, 35-55 °C, 40-50 °C o 40-45 °C. Las reacciones se pueden realizar a temperaturas que evitan la formación de una estructura secundaria en el ácido nucleico; sin embargo, esto se puede equilibrar con la unión del cebador (y la cadena recién sintetizada) al ácido nucleico molde y la vida media reducida de la apirasa a temperaturas más altas. La temperatura óptima para la polimerasa también se puede considerar como un factor, ya que cuanto más se acerque la reacción a esa temperatura, mayor será la velocidad de incorporación de nucleótidos. La polimerasa Bst tiene una temperatura óptima de aproximadamente 65 °C, mientras que la polimerasa T4 tiene una temperatura óptima de aproximadamente 37 °C. Por lo tanto, la temperatura seleccionada dependerá de la polimerasa que se utilice. Algunos ejemplos utilizan una temperatura de aproximadamente 41 °C. Otras realizaciones usan una temperatura que es más alta que incluye, por ejemplo, aproximadamente 45 °C, aproximadamente 50 °C o aproximadamente 65 °C. Las soluciones, incluidos los amortiguadores de lavado y las soluciones de dNTP, generalmente se calientan a estas temperaturas para no alterar la temperatura de los pozos. Sin embargo, el amortiguador de lavado que contiene apirasa se mantiene preferentemente a una temperatura más baja para prolongar la vida media de la enzima. Normalmente, esta solución se mantiene a aproximadamente 4-15 °C, y con mayor preferencia 4-10 °C. Como se apreciará, todos los métodos anteriores pueden automatizarse de manera que las diversas reacciones biológicas y/o químicas se realicen mediante robótica. Además, la información obtenida a través de la señal del chemFET (o matriz de chemFET) se puede proporcionar a un ordenador personal, un asistente digital personal, un teléfono celular, un sistema de videojuegos o un televisor para que un usuario pueda monitorear el progreso de las reacciones de secuenciación de forma remota. Este proceso se ilustra, por ejemplo, en la Figura 71.

Control de difusión

La reacción de incorporación de nucleótidos puede producirse muy rápidamente. Como resultado, puede ser conveniente en algunos casos ralentizar la reacción o ralentizar la difusión de los analitos en el pozo para asegurar la máxima captura de datos durante la reacción. La difusión de reactivos y/o subproductos se puede ralentizar de varias formas, entre las que se incluyen, pero sin limitarse a, la adición de perlas de relleno en los pozos y/o el uso de polímeros como el polietilenglicol en los pozos (por ejemplo, PEG unido a las perlas de captura y/o las perlas de relleno). Las perlas de relleno también tienden a aumentar la concentración de reactivos y/o subproductos en la superficie del chemFET, lo que aumenta el potencial de señal. La presencia de perlas de relleno generalmente permite un mayor tiempo para muestrear (por ejemplo, 2 o 4 veces).

Las velocidades de captura de datos pueden variar y ser, por ejemplo, de 10-100 tramas por segundo y la elección de la velocidad a utilizar estará determinada, al menos en parte, por el tamaño del pozo y la presencia de perlas de relleno u otras técnicas que limitan la difusión. Los tamaños de pozo más pequeños generalmente requieren velocidades de captura de datos más rápidas.

En algunos aspectos que se basan en el flujo y donde la cara superior del pozo está abierta y en comunicación con fluido sobre la totalidad del chip, es importante detectar el ion hidrógeno liberado antes de su difusión fuera del pozo. La difusión de los subproductos de la reacción fuera del pozo dará lugar a falsos negativos (porque el subproducto no se detecta en ese pozo) y posibles falsos positivos en pozos adyacentes o aguas abajo (donde se puede detectar el subproducto), por lo que debe evitarse. Las perlas de relleno y/o polímeros como PEG también pueden ayudar a reducir el grado de difusión y/o diafonía entre pozos.

Además de las perlas cargadas con ácido nucleico, cada pozo también puede comprender una pluralidad de perlas más pequeñas, denominadas en la presente descripción "perlas de relleno". Las perlas de relleno pueden estar compuestas de cualquier material inerte que no interactúe ni interfiera con analitos, reactivos, parámetros de reacción y similares, presentes en los pozos. Las perlas de relleno pueden ser magnéticas (incluyendo superparamagnéticas) pero no están tan limitadas. En algunas realizaciones, las perlas de relleno y las perlas de captura están hechas del mismo material (por ejemplo, ambas son magnéticas, ambas son de poliestireno, etc.), mientras que en otras realizaciones están hechas de diferentes materiales (por ejemplo, las perlas de relleno son de poliestireno y las perlas de captura son magnéticas).

Las perlas de relleno son generalmente más pequeñas que las perlas de captura. La diferencia de tamaño puede variar y puede ser de 5, 10, 15, 20 o más veces. Como ejemplo, se pueden usar perlas de relleno de 0,35 pm de diámetro con perlas de captura de 5,91 pm. Dichas perlas de relleno están disponibles comercialmente de fuentes tales como Bang Labs.

La localización de las perlas de relleno en relación con la perla de captura puede variar. Las perlas de relleno se pueden posicionar entre la superficie del chemFET y la perla cargada con ácido nucleico, en cuyo caso se pueden introducir en los pozos antes que las perlas cargadas con ácido nucleico. De esta forma, las perlas de relleno evitan el contacto y, por lo tanto, la interferencia de la superficie del chemFET con los ácidos nucleicos moldes unidos a las perlas de captura. Una capa de perlas de relleno de 0,1-0,5 pm de profundidad o altura impediría esta interacción. La presencia de perlas de relleno entre la perla de captura y la superficie del chemFET también puede ralentizar la difusión de los subproductos de la secuenciación, como los iones hidrógenos, lo que facilita la captura de datos en algunos ejemplos. Alternativamente, las perlas de relleno se pueden posicionar alrededor de las perlas cargadas con ácido nucleico, en cuyo caso se pueden agregar a los pozos antes, durante y/o después de las perlas cargadas con ácido nucleico. En aún otros ejemplos, la mayoría de las perlas de relleno se pueden posicionar encima de las perlas cargadas con ácido nucleico, en cuyo caso se pueden agregar a los pozos después de las perlas cargadas con ácido nucleico. Si se colocan encima de las perlas cargadas con ácido nucleico, las perlas de relleno pueden actuar para minimizar o evitar por completo el desalojo de las perlas cargadas con ácido nucleico de los pozos. En aún otros ejemplos, los pozos de reacción pueden comprender perlas de relleno incluso si no se utilizan perlas cargadas con ácido nucleico. Debe entenderse que en otros ejemplos, sin embargo, no se requieren perlas de relleno ya que no hay necesidad de ralentizar la difusión de los subproductos de la reacción, tales como iones hidrógenos.

En algunos ejemplos, la difusión también puede verse afectada al incluir en las cámaras de reacción agentes que aumentan la viscosidad. Un ejemplo de dicho agente es un polímero que no es un ácido nucleico (es decir, un polímero que no es un ácido nucleico). El polímero puede ser de origen natural o no natural, y puede ser de cualquier naturaleza siempre que no interfiera con la incorporación y/o escisión de nucleótidos y su detección excepto para ralentizar la difusión de polimerasa, iones hidrógenos liberados, PPi, nucleótidos no incorporados, y/u otros subproductos de reacción o reactivos. Un ejemplo de un polímero adecuado es el polietilenglicol (PEG). Otros ejemplos incluyen PEO, PEA, dextranos, acrilamidas, celulosas (por ejemplo, metilcelulosa) y similares. El polímero puede estar libre en solución (por ejemplo, PEG, DMSO, glicerol y similares) o puede estar inmovilizado (covalente o no covalentemente) en uno o más lados de la cámara de reacción, en la perla de captura (por ejemplo, PEG, PEO, dextranos y similares), y/o a cualquier perlas de relleno que pueda estar presente. La unión no covalente puede lograrse a través de una interacción biotina avidina.

El ejemplo contempla además en algunos ejemplos el uso de contraiones solubles que se unen a los iones hidrógenos liberados y evitan su salida del pozo. Se prefieren los contraiones que tienen un pKa cercano al pH de la reacción. Los ejemplos de contraiones con velocidades de difusión más lentas que las de los protones (tanto a 25 °C como a 37 °C) incluyen, sin limitarse a, Cl-, H2PO4- HCO3", acetato, butirato, histidilo, formiato, lactato y similares. En algunos ejemplos, los contraiones están libres en solución, mientras que en otros están inmovilizados en un soporte sólido que incluye, sin limitarse a, las paredes de la cámara de reacción. Un experto en la técnica podrá seleccionar el contraión y la concentración más apropiados en base a su pKa y el pH al que se lleva a cabo la reacción, y la movilidad del contraión. Se entenderá que varios ejemplos no requieren el uso de contraiones.

Kits

El ejemplo contempla además kits que comprenden los diversos reactivos necesarios para realizar una reacción de secuenciación e instrucciones de uso según los métodos establecidos en la presente descripción.

Un kit preferido comprende uno o más recipientes que contienen amortiguador de lavado, uno o más recipientes que contienen cada uno de los siguientes reactivos: amortiguador dATP, amortiguador dCTP, amortiguador dGTP o amortiguador dTTP, dATP, dCTP, dGTP y reservas de dTTP, apirasa, SSB, polimerasa, perlas de relleno y, opcionalmente, pirofosfatasa. Es importante destacar que los kits pueden comprender solo dNTP de origen natural. Los kits también pueden comprender uno o más amortiguadores de lavado que comprenden componentes como se describe en los Ejemplos, pero no se limitan a ellos. Los kits también pueden incluir instrucciones de uso que incluyan diagramas

Los siguientes Ejemplos se incluyen con fines de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

Los Ejemplos proporcionan una prueba de demostración de principio de la secuenciación de cuatro moldes de secuencia conocida. Este modelo artificial pretende mostrar que las realizaciones de los aparatos y sistemas (no reivindicados) descritos en la presente descripción pueden leer la incorporación de nucleótidos que se correlaciona con la secuencia conocida de los moldes. Esto no pretende representar el uso típico del método o sistema en el campo. La siguiente es una breve descripción de estos métodos.

Ejemplo 1. Preparación de perlas

Unión de oligonucleótidos monocatenarios a perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Se solicitaron moldes de oligonucleótidos de ADN monocatenario con una etiqueta de doble biotina en 5' (purificada por HPLC) y un cebador universal de 20 bases a IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, IN). Los moldes tenían una longitud de 60 bases y se diseñaron para incluir 20 bases en el extremo 3' que eran complementarias al cebador de 20 bases (Tabla 4, cursiva). Los moldes y el cebador liofilizados y biotinilados se resuspendieron en amortiguador TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) como soluciones estándares 40 |^jM y como solución estándar 400 |^jM, respectivamente, y se almacenaron a -20 °C hasta su uso.

Para cada molde, se prepararon 60 j l de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina de 5,91 jim (Bangs Laboratories, Inc. Fishers, IN), almacenadas como una suspensión amortiguada acuosa (8,57 * 104 perlas/jL), a 4 °C, se prepararon lavando con 120 j l de amortiguación de lavado de perlas tres veces y luego incubando con los moldes 1, 2, 3 y 4 (T1, T2, T3, T4: Tabla 4) con biotina en el extremo 5', respectivamente.

Debido a la fuerte afinidad de unión covalente de la estreptavidina por la biotina (Kd ~ 10-15), estas perlas magnéticas se utilizan para inmovilizar los moldes en un soporte sólido, como se describe a continuación. La capacidad de unión notificada de estas perlas para la biotina libre es de 0,650 pmol/ j l de solución estándar de perlas. Para un molde de ssDNA biotinilada pequeña (<100 bases), se calculó de manera conservadora que 9,1 * 105 moldes podrían unirse por perla. Las perlas se concentran fácilmente utilizando imanes simples, como con el concentrador de partículas magnéticas Dynal o MPC-s (Invitrogen, Carlsbad, CA). El MPC-s se utilizó en los experimentos descritos.

Se usó un MPC-s para concentrar las perlas durante 1 minuto entre cada lavado, luego se añadió amortiguador y las perlas se resuspendieron. Después del tercer lavado, las perlas se resuspendieron en 120 j l de amortiguador de lavado de perlas más 1 j l de cada molde (40 jM). Las perlas se incubaron durante 30 minutos con rotación (Labquake Tube Rotator, Barnstead, Dubuque, IA). Después de la incubación, las perlas se lavaron tres veces en 120 j l de amortiguador de hibridación (Tris-HCl 20 mM, acetato de magnesio 5 mM, pH 7,5) y se resuspendieron en 60 j l del mismo amortiguador.

Tabla 4. Secuencias para los moldes 1, 2, 3 y 4

TI: 5’/52Bio/GCA AGT GCC CTT AGG CTT CAG TTC AAA AGT CCT AAC TGG GCA AGG CAC ACA GGG GATAGG-3 ’ (SEQ ID NO:l)

T2: 5’/52Bio/CCA TGT CCC CTT AAG CCC CCC CCA TTC CCC CCT GAA CCC C CA AGG CAC ACA GGG GATAGG-3 ’ (SEQ ID NO:2)

T3: 57 52Bio/AAG CTC AAA AAC GGT AAA AAA AAG CCA AAA AAC TGG AAA ACA AGG CAC ACA GGG GATAGG-3 ’ (SEQ ID NO:3)

T4: 57 52Bio/TTC GAG TTT TTG CCA TTT TTT TTC GGT TTT TTG ACC TTT T CA AGG CAC ACA GGG GATAGG-3 ' (SEQ ID NO:4)

Recocido del cebador de secuenciación. Los moldes inmovilizados, unidos en el extremo 5' a perlas magnéticas de 5,91 jm, se hibridan luego con un cebador de 20 bases complementario al extremo 3' de los moldes (Tabla 4). Luego se agrega una alícuota de 1,0 jL de la solución estándar de cebador 400 jM, que representa un exceso de cebador de 20 veces respecto al molde inmovilizado, y luego se incuban las perlas más el molde con el cebador durante 15 minutos a 95 °C y luego se baja lentamente la temperatura a temperatura ambiente. A continuación, las perlas se lavaron 3 veces en 120 j l de amortiguador ricina 25 mM (Tricina 25 mM, PVP 0,4 mg/ml, Tween 20 al 0,1 %, Acetato de magnesio 8,8 mM; ph 7,8) como se describió anteriormente usando el MPC-s. Las perlas se resuspendieron en amortiguador Tricina 25 mM.

Incubación de moldes hibridados/cebador con ADN polimerasa. Los híbridos molde y cebador se incuban con polimerasa esencialmente como se describe en Margulies y otros Nature 2005 437(15):376-380 y los materiales complementarios acompañantes.

Carga de muestras de prueba preparadas en la matriz de sensores ISFET. Las dimensiones y la densidad de la matriz del ISFET y los microfluidos posicionados en la misma pueden variar según la aplicación. Un ejemplo no limitante es una matriz de 512 * 512. Cada cuadrícula de dicha matriz (de la cual habría 262 144) tiene un solo ISFET. Cada rejilla también tiene un pozo (o como pueden denominarse indistintamente en la presente descripción como un "micropozo") posicionado encima de él. El pozo (o micropozo) puede tener cualquier forma, incluyendo columnar, cónica, cuadrada, rectangular y similares. En una conformación ilustrativa, los pozos son pozos cuadrados que tienen unas dimensiones de 7 * 7 * 10 pm. La distancia de centro a centro entre pozos se denomina en la presente descripción "intervalo". El intervalo puede ser de cualquier distancia, aunque es preferible tener intervalos más cortos para acomodar una matriz lo más grande posible. El intervalo puede ser menor que 50 pm, menor que 40 pm, menor que 30 pm, menor que 20 pm o menor que 10 pm. En una realización, el intervalo es de aproximadamente 9 pm. Toda la cámara por encima de la matriz (dentro de la cual se sitúan los pozos) puede tener un volumen igual o menor que aproximadamente 30 pL, igual o menor que aproximadamente 20 pL, igual o menor que aproximadamente 15 pL, o igual o menor que 10 pL. Por lo tanto, estos volúmenes corresponden también al volumen de solución dentro de la cámara.

Carga de perlas en un sistema 'abierto'. Se cargaron perlas con los moldes 1-4 en el chip (10 pL de cada molde). Brevemente, se añadió una alícuota de cada molde al chip usando una pipeta Eppendorf. A continuación, se usó un imán para tirar de las perlas hacia los pozos.

Carga de perlas en un sistema 'cerrado'. Tanto las perlas de captura como las perlas de relleno se cargan mediante flujo. La precisión en microlitros del volumen de la solución de perlas, así como el posicionamiento de la solución de perlas a través de las conexiones de fluidos, se logra como se muestra en las Figs. 62-70 utilizando el accesorio de carga de perlas, que incluye un depósito mayor (de aproximadamente 1 mL de volumen), un depósito menor (de aproximadamente 10 pL de volumen) y un canal microfluídico para manejar pequeños volúmenes de solución de perlas. Este método también aprovecha la precisión en microlitros de la aplicación de fluidos que permiten las pipetas de precisión.

El chip que comprende la matriz del ISFET y la celda de flujo se asienta en el enchufe ZIF (fuerza de inserción nula) del accesorio de carga y luego se conecta un capilar de acero inoxidable a un puerto de la celda de flujo y un tubo de nailon flexible en el otro puerto. Ambos materiales son trayectorias de fluidos de tipo microfluídico (por ejemplo, del orden de <0,01" de diámetro interior). El accesorio de carga de perlas, que consiste en los depósitos mayor y menor, se unió al extremo del capilar. Una jeringa de plástico común se llena con solución amortiguadora y luego se conecta al extremo libre del tubo de nailon. Los cables eléctricos que sobresalen de la parte inferior del chip se insertan en un enchufe en la parte superior de una unidad de fijación (no se muestra).

El chip que comprende la matriz del ISFET y la celda de flujo se asienta en un enchufe tal como un enchufe ZIF (fuerza de inserción nula) del accesorio de carga, luego se puede conectar un capilar de acero inoxidable a un puerto de la celda de flujo y una tubería de nailon flexible en el otro puerto. Ambos materiales son trayectorias de fluidos de tipo microfluídico (por ejemplo, del orden de <0,01" de diámetro interior). El accesorio de carga de perlas, que consiste en los depósitos mayor y menor, se unió al extremo del capilar. Una jeringa de plástico común se llena con solución amortiguadora y luego se conecta al extremo libre del tubo de nailon. Los cables eléctricos que sobresalen de la parte inferior del chip se insertan en un enchufe en la parte superior de una unidad de fijación (no se muestra).

Se apreciará que habrá otras formas de introducir las perlas en los pozos de la cámara de flujo, incluidas la centrifugación o la gravedad.

Secuenciación de ADN utilizando la matriz de sensores ISFET en un sistema abierto. Se puede realizar una reacción de secuenciación ilustrativa en un sistema 'abierto' (es decir, el chip ISFET se coloca en la plataforma del aparato ISFET y luego cada nucleótido (5 pL que dan como resultado 6,5 pM cada uno) se agrega manualmente en el siguiente orden: dATP, dCTP, dGTp y dTT (soluciones estándares 100 mM, Pierce, Milwaukee, WI), pipeteando el nucleótido dado en el líquido que ya está en la superficie del chip y recogiendo datos del chip a una velocidad de 2,5 MHz. Esto puede dar como resultado una recogida de datos de más de 7,5 segundos a aproximadamente 18 tramas/segundo. Luego, los datos pueden analizarse usando LabView.

Dadas las secuencias de los moldes, se espera que la adición de dATP dé como resultado una extensión de 4 bases para el molde 4. La adición de dCTP dará como resultado una extensión de base 4 en el molde 1. La adición de dGTP hará que los moldes 1, 2 y 4 se extiendan como se indica en la Tabla 5 y la adición de dTTP dará como resultado una escorrentía (extensión de todos los moldes como se indica).

Preferentemente, cuando el método se realiza de forma no automatizada (es decir, en ausencia de flujo automático y de introducción de reactivos), cada pozo contiene apirasa para degradar los dNTP no incorporados o, alternativamente, se añade apirasa a cada pozo después de la adición e incorporación de cada dNTP (por ejemplo, dATP) y antes de la adición de otro dNTP (por ejemplo, dTTP). Debe entenderse que la apirasa se puede sustituir, en este ejemplo o en cualquier otro ejemplo descrito en la presente descripción, con otro compuesto (o enzima) capaz de degradar los dNTP.

Tabla 5. Confi uración del ex erimento orden de adición^ de nucleótidos.

Secuenciación de ADN mediante microfluidos en chip del sensor. La secuenciación en régimen de flujo es una extensión de la aplicación abierta de reactivos de nucleótidos para su incorporación en el ADN. En lugar de agregar los reactivos a una solución a granel en el chip ISFET, los reactivos fluyen de manera secuencial a través de la superficie del chip, extendiendo una sola base de ADN a la vez. Los dNTP fluyen secuencialmente, comenzando con dTTP, luego dATP, dCTP y dGTP. Debido a la naturaleza de flujo laminar del movimiento de fluido sobre el chip, la difusión del nucleótido en los micropozos y finalmente alrededor de la perla cargada con ácido nucleico es el principal mecanismo de administración. El régimen de flujo también garantiza que la gran mayoría de la solución de nucleótidos se lave entre aplicaciones. Esto implica enjuagar el chip con una solución amortiguadora y una solución de apirasa después de cada flujo de nucleótidos. Los nucleótidos y las soluciones de lavado se almacenan en botellas químicas en el sistema y se hacen fluir sobre el chip mediante un sistema de tubos de fluidos y válvulas automáticas. El chip ISFET se activa para detectar productos químicos de la extensión del ADN durante el flujo de nucleótidos.

Ejemplo 2. Extensión de polimerasa en chip detectada por cambio de pH en una matriz ISFET.

Las perlas de 2,8 micras recubiertas de estreptavidina que llevan un molde sintético biotinilado al que se unen los cebadores de secuenciación y la ADN polimerasa T4 se sometieron a tres flujos secuenciales de cada uno de los cuatro nucleótidos. La secuencia molde aguas abajo del cebador de secuenciación era un G(C)10(A)10 (SEQ ID NO:5). Cada ciclo de nucleótido constaba de flujos de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, cada uno intercalado con un flujo de lavado del amortiguador únicamente. Los flujos del primer ciclo se muestran en azul, los flujos del segundo ciclo en rojo y el tercer ciclo en amarillo. Como se muestra en la Figura 72A, la señal generada para los dos flujos de dATP fue muy similar. La Figura 72B muestra que la primera traza (azul) de dCTP es más alta que los flujos de dCTP de los ciclos posteriores, lo que corresponde al flujo en el que la polimerasa debería incorporar un solo nucleótido por molécula molde. La Figura 72C muestra que la primera traza (azul) de dGTP es aproximadamente 6 conteos más alta (pico a pico) que los flujos de dGTP de los ciclos posteriores, lo que corresponde al flujo en el que la polimerasa debería incorporar una cadena de 10 nucleótidos por molécula molde. La Figura 72D muestra que la primera traza (azul) de dTTP también es aproximadamente 6 conteos más alta (pico a pico) que los flujos de dTTP de ciclos posteriores, lo que corresponde al flujo en el que la polimerasa debería incorporar 10 nucleótidos por molécula molde.

Ejemplo 3. Secuenciación en un Sistema Cerrado y Manipulación de Datos

La secuencia se ha obtenido a partir de un oligonucleótido sintético de 23 mer y un oligonucleótido producto de PCR de 25 mer. Los oligonucleótidos se unieron a perlas que luego se cargaron en pozos individuales en un chip que tenía 1,55 millones de sensores en una matriz de 1348 x 1152 que tenía un intervalo de 5,1 micras (38400 sensores por mm2). Se cargaron aproximadamente 1 millón de copias del oligonucleótido sintético por perla, y aproximadamente 300000 a 600000 copias del producto de PCR se cargaron por perla. Un ciclo de 4 nucleótidos a través y sobre la matriz tenía una duración de 2 minutos. Los nucleótidos se usaron a una concentración de 50 micromolar cada uno. La polimerasa fue la única enzima utilizada en el proceso. Los datos se recogieron a 32 tramas por segundo.

La Figura 73A representa los datos sin procesar medidos directamente desde un ISFET para el oligonucleótido sintético (SE ID NO: 6). Un milivoltio equivale a 68 conteos. Los datos se muestrean en cada sensor del chip (1550 200 sensores en un chip 314) muchas veces por segundo. La Figura está codificada por colores para cada flujo de nucleótidos. Con cada flujo de nucleótidos, se producen varios segundos de formación de imágenes. El gráfico representa la concatenación de esas mediciones individuales tomadas durante cada flujo. El eje Y está en conteos sin procesar y el eje X está en segundos. Superpuestas justo encima del eje X están las incorporaciones esperadas en cada flujo.

La Figura 73B representa el valor integrado para cada flujo de nucleótidos, normalizado al molde que se está secuenciando. El valor integrado se toma de las mediciones de traza sin procesar que se muestran en la Figura 73A, y los límites integrales se eligieron para maximizar la relación señal/ruido. Los resultados se han normalizado a la señal por incorporación de base y se han representado gráficamente por flujo de nucleótidos. El eje Y es el conteo de incorporación y el eje X es el número de flujo de nucleótidos, alternando a través de TACG.

Las Figuras 74A y 74B representan el mismo tipo de mediciones tomadas y mostradas en las Figuras 73A y 73B, con la excepción de que la señal que se detecta aquí proviene de un producto de PCR (el oligonucleótido de 25 mer, SEQ ID NO: 7), en lugar de un oligonucleótido sintético.

Mejora de la relación señal-ruido de píxeles y matrices

La fiabilidad de la decodificación de la señal de cada ISFET y de la matriz de ISFET en su conjunto depende de la amplitud de la salida de señal de cada ISFET y de su respectiva relación señal/ruido. Se pueden emplear algunos cambios en los métodos de fabricación anteriores, la selección juiciosa de materiales y cambios en el diseño de píxeles y matriz para aumentar considerablemente la salida de los ISFET en la matriz y disminuir varias fuentes de ruido. Es decir, estos cambios dan como resultado una matriz de sensores más sensible y precisa. Las mejoras se pueden implementar individualmente o en varias combinaciones, y pueden dar como resultado ganancias significativas en el rendimiento de la relación señal-ruido (SNR).

Como se describe más detalladamente a continuación, las mejoras implican: (1) recubrir (es decir, "pasivar") las paredes laterales (normalmente formadas de óxido de TEOS u otro material adecuado, como se describió anteriormente) y la superficie del sensor en la parte inferior de los micropozos con diversos óxidos de metal o materiales similares, para mejorar su química superficial (es decir, hacer que las paredes laterales sean menos reactivas) y propiedades eléctricas; (2) diluir el recubrimiento (material de deposición) en la puerta flotante; (3) aumentar el área superficial para la recolección de carga en la puerta flotante; (4) y diseños de matriz y píxeles modificados para reducir la inyección de carga en el electrolito y otras fuentes de ruido.

Material y grosor de la capa de deposición de puerta flotante

Como se ilustra en la Figura 75A, ahora se aprecia que si se agrega una capa dieléctrica sobre la estructura de puerta flotante de la disposición del sensor ISFET, la trayectoria desde el analito hasta la puerta ISFET se puede modelar como una conexión en serie de tres capacitancias: (1) la capacitancia atribuible a la doble capa de carga descrita anteriormente en la interfaz analito-capa dieléctrica (etiquetada como Cdl), (2) la capacitancia debida a la capa dieléctrica de puerta flotante (Cfgd), y (3) el óxido de puerta capacitancia (Cox). (Obsérvese que en el texto anterior, la capa dieléctrica de puerta flotante se denomina a veces capa de "pasivación". Aquí, nos referimos más específicamente a la capa como una capa dieléctrica de puerta flotante para evitar cualquier sugerencia de que la composición del material de la capa esté necesariamente relacionada con los llamados materiales de pasivación que se usan a menudo en el procesamiento de CMOS (por ejemplo, nitruro de silicio PECVD) para recubrir y proteger los elementos del circuito). La cadena de capacitancia en serie se extiende entre el analito líquido 75-1 en los pozos y la puerta ISFET 75-2.

Es bien sabido que las capacitancias en serie forman un divisor de tensión capacitivo. En consecuencia, solo una fracción de la tensión de la señal, V^s, generada por o en el analito, se aplica al óxido de puerta como la tensión V^g que activa el ISFET. Si definimos la ganancia de puerta como Vg /Vs, lo ideal sería tener una ganancia unitaria, es decir, sin pérdida de señal en ninguna de las tres capacitancias. Por supuesto, la ganancia unitaria no se puede lograr, pero la ganancia real de la puerta se puede optimizar. El valor de C^dl es una función de las propiedades del material y normalmente es del orden de aproximadamente 10 - 40 pF/cm2. La capacitancia de óxido de puerta es típicamente un valor muy pequeño en comparación. Por lo tanto, al hacer que C^fgd sea mucho mayor que la combinación en serie de C^ox y C^dl (para abreviar, C^fgd>>C^ox), la ganancia de puerta se puede hacer para acercarse a la unidad tanto como sea práctico.

Para lograr la relación C^fgd>>C^ox, se puede minimizar C^ox, maximizar C^fgd o ambas. No se puede hacer mucho para alterar la capacitancia del óxido de la puerta cuando se utilizan técnicas de fundición CMOS estándar para fabricar los ISFET. Es decir, por razones prácticas, normalmente se debe aceptar el valor de la capacitancia del óxido de puerta como "dado". Por lo tanto, se puede poner énfasis en maximizar Cfgd. Tal maximización se puede lograr utilizando una capa delgada de material de alta constante dieléctrica o aumentando el área de metalización de la puerta flotante. Dado que el aumento del área de la puerta flotante entra en conflicto con el objetivo de tener una matriz de sensores de alta densidad, la atención se ha centrado en la capa dieléctrica.

Existen materiales y pueden usarse que tienen constantes dieléctricas más altas que el material de óxido de puerta CMOS habitual, dióxido de silicio. Por lo tanto, si en el curso de la fabricación se ha depositado dicho material de óxido de puerta sobre la metalización de puerta flotante, se puede grabar ese material, eliminándolo esencialmente, y depositar una capa dieléctrica adecuada de puerta flotante de alta constante dieléctrica directamente sobre la metalización de puerta flotante. O bien, se puede depositar simplemente una capa dieléctrica de puerta flotante de este tipo directamente sobre la metalización de puerta flotante sin tener que grabar primero. En cualquier situación, solo hay dos capacitancias en serie que importan entre el analito y la puerta ISFET, C^dl y C^fgd. La ganancia de puerta se puede maximizar entonces haciendo C^fgd >>C^dl. Por lo tanto, es conveniente lograr un valor grande para C^fgd, al mismo tiempo que se satisfacen otros requisitos (por ejemplo, fabricación confiable).

La capacitancia C^fgd está formada esencialmente por un capacitor de placas paralelas que tiene la capa dieléctrica de puerta flotante como su dieléctrico. En consecuencia, para un área de placa dada (es decir, metalización de puerta flotante), los parámetros principalmente disponibles para aumentar el valor de C^fgd son (1) el grosor de la capa dieléctrica y (2) la selección del material dieléctrico y, por lo tanto, su constante dieléctrica. La capacitancia de la capa dieléctrica de puerta flotante varía directamente con su constante dieléctrica e inversamente con su grosor.

Por lo tanto, sería preferible una capa delgada de alta constante dieléctrica para satisfacer el objetivo de obtener la ganancia de puerta máxima.

Un candidato para el material de capa dieléctrica de puerta flotante es el material de pasivación utilizado por los procesos de fundición CMOS estándar. La capa de pasivación estándar (típicamente, nitruro de PECVD o, para ser más precisos, nitruro de silicio sobre oxinitruro de silicio) es relativamente gruesa cuando se forma (por ejemplo, aproximadamente 1,3 |jm), y los materiales de pasivación típicos tienen una constante dieléctrica limitada. Se puede lograr una primera mejora diluyendo la capa de pasivación después de la formación. Esto se puede lograr grabando la capa de pasivación de CMOS, como mediante un paso de grabado excesivo durante la formación de micropozos, para grabar y consumir gran parte de la capa de pasivación de nitruro, dejando una capa más delgada, como una capa de solo aproximadamente 200- 600 Angstroms de grosor. Si bien es simple, este enfoque es propenso a variaciones de grabado de oblea a oblea, lo que da como resultado una variabilidad en el grosor y la capacitancia de la capa de pasivación final.

Se han evaluado al menos parcialmente dos enfoques para grabar una capa de pasivación CMOS estándar de nitruro de silicio depositada sobre oxinitruro de silicio. El primer enfoque se conoce como la técnica de "grabado parcial". Implica eliminar la capa de nitruro de silicio más aproximadamente la mitad de la capa de oxinitruro de silicio antes de depositar la capa de detección de óxido de metal de película delgada. El segundo enfoque se conoce como la técnica de "grabado sobre metal". Implica grabar todas las capas de nitruro de silicio y oxinitruro de silicio antes de depositar la capa de detección de óxido de metal de película delgada. El modelado teórico indica que el enfoque de grabado parcial debería conducir a una ganancia de puerta ISFET de aproximadamente 0,42. Esto corresponde a un aumento del nivel de la señal de aproximadamente un 50 % en comparación con una capa de pasivación no grabada. Con una capa de detección de película delgada ALD Ta2O5 depositada sobre un "grabado parcial", se han obtenido empíricamente ganancias ISFET de aproximadamente 0,37 a aproximadamente 0,43, con sensibilidades de sensor de aproximadamente 15,02 - 17,08 mV/pH.

El modelo teórico indica que en el enfoque de "grabado sobre metal" con la misma capa de detección, debería ser posible una ganancia de puerta ISFET de aproximadamente 0,94. Esto correspondería a un aumento de más de tres veces en la señal. Con un proceso de grabado imperfecto que no produce un grabado uniforme a lo largo de la superficie de la puerta flotante, la ganancia obtenida empíricamente solo ha sido de aproximadamente 0,6, lo que corresponde a un poco más del doble de la señal. Con una química/proceso de grabado mejorado para obtener una superficie más uniforme y plana en la parte inferior del pozo, debería ser posible una ganancia cercana a la ganancia del modelo de 0,94.

Un enfoque para mejorar la uniformidad y planitud del proceso de grabado consiste en realizar dos o más grabados separados en serie, es decir, utilizar un proceso de grabado de varios pasos. Se puede realizar un primer paso de grabado y el progreso de ese paso de grabado puede controlarse ópticamente, en una o múltiples longitudes de onda. Cuando se detecta que el grabado del primer paso ha expuesto una parte de la superficie metálica subyacente, se puede detener el primer proceso de grabado y se puede iniciar un segundo proceso o paso, utilizando condiciones que eliminarán el material dieléctrico sin eliminar (gran parte) el metal.

Una alternativa al uso de los procesos de grabado anteriores es simplemente depositar una capa más delgada de material dieléctrico (pasivación) en primer lugar, como los 200 - 600 Angstroms indicados en lugar de los 1,3 jm del proceso de pasivación CMOS convencional. Incluso se puede lograr un mejor rendimiento con el uso de otros materiales y técnicas de deposición para formar una capa dieléctrica delgada, preferentemente una de constante dieléctrica relativamente más alta. Entre los materiales que se cree que son útiles para la capa dieléctrica de puerta flotante se encuentran los óxidos de metal como el óxido de tantalio, el óxido de tungsteno, el óxido de aluminio y el óxido de hafnio, aunque se pueden sustituir por otros materiales de constante dieléctrica superior a la del material de pasivación de nitruro de silicio habitual, siempre que dicho material es sensible al ion de interés. Se prefiere el enfoque de grabado sobre metal, con el óxido de pasivación del proceso CMOS en la puerta flotante que se elimina por completo antes de depositar la capa de material dieléctrico de puerta flotante. Esa capa dieléctrica se puede aplicar directamente sobre el electrodo de puerta flotante ISFET extendido de metal. Esto ayudará a maximizar el valor de la capacitancia C^fgd.

El enfoque de grabado sobre metal se considera inventivo, con el óxido de pasivación del proceso CMOS en la puerta flotante que se elimina completamente antes de depositar la capa de material dieléctrico de puerta flotante. Esa capa dieléctrica se puede aplicar directamente sobre el electrodo de puerta flotante ISFET extendido de metal. Esto ayudará a maximizar el valor de la capacitancia C^fgd.

Entre los procesos que se pueden usar para depositar una capa delgada de material dieléctrico de puerta flotante se encuentran la pulverización catódica reactiva o no reactiva, la resonancia de ciclotrón de electrones (ECR), la evaporación por haz de electrones y la deposición de capas atómicas (ALD), aunque cualquier técnica adecuada puede emplearse. Cada uno de los procesos anteriores tiene características bien conocidas. Sin embargo, es importante destacar que estos procesos difieren en su capacidad para proporcionar películas conformadas y uniformes, que son cualidades que pueden ser importantes para algunas aplicaciones. Por lo tanto, todos son utilizables, pero no necesariamente igualmente convenientes. De las cuatro técnicas enumeradas, ALD parece ser superior con respecto a las cualidades particulares deseadas. Es bueno para depositar capas cuyo grosor se puede controlar con precisión para que la repetibilidad de oblea a oblea no sea un problema. Además, es un proceso a baja temperatura que no amenaza las interconexiones de aluminio que, normalmente, ya se habrán formado en la oblea cuando se aplique la capa de material dieléctrico de puerta flotante. ALD, además, promete permitir una cobertura de película conformada, sin agujeros y sin grietas en la parte inferior del pozo, que se utiliza; y es compatible con la extensión de la deposición desde los parte inferior de los pozos hasta las paredes laterales de los pozos de alta relación de aspecto (es decir, empinadas). Cubrir las paredes laterales con una capa de pasivación o amortiguadora las hará más inertes al analito.

Para crear dichas estructuras, debe formarse una capa de micropozos encima de los ISFET en los que los micropozos estén abiertos en la parte inferior. Si la estructura se va a formar sin una capa dieléctrica de puerta flotante que no sea un material de pasivación convencional sobre la puerta flotante, entonces el material de pasivación preferentemente debe grabarse parcialmente hasta la delgadez deseada. Esto por sí solo aumenta la capacidad dieléctrica de la puerta flotante Cfgd en relación con Cdl, mejorando la ganancia de la puerta. Opcionalmente, se puede depositar o formar de cualquier otra manera una capa delgada de constante dieléctrica más alta sobre dicho material de pasivación.

La capa depositada preferentemente debería ser relativamente delgada, por ejemplo, sólo aproximadamente 200 -600 Angstroms de grosor, posiblemente incluso menos. A medida que la capa delgada de material dieléctrico de puerta flotante se deposita sobre la parte inferior del pozo sobre la puerta flotante o su capa de recubrimiento inmediata, también se puede permitir que se deposite de manera conformada sobre las paredes laterales del pozo utilizando, por ejemplo, el proceso ALD mencionado anteriormente.

El potencial de mejora es considerable. Como punto de partida, considere un material de pasivación de fundición CMOS estándar, nitruro de silicio, Si3N4. Este material en particular tiene una respuesta sub-Nernstiana al pH. En consecuencia, la mejor respuesta que hemos podido medir es de aproximadamente 40 mV/pH para un sensor ISFET con una capa de deposición de puerta flotante de nitruro de silicio (aunque se podría obtener alguna mejora con una deposición de nitruro mejorada). Esto es considerablemente menor que la respuesta Nernstiana ideal de 59 mV/pH a 25 °C. Por lo tanto, alrededor de un tercio de la tensión de la señal en la interfaz entre el analito y la capa de deposición de puerta flotante se pierde debido al uso de materiales con una respuesta sub-Nernstiana tan grande. De hecho, en un ejemplo, las simulaciones indicaron que es posible una mejora triple en la ganancia de puerta con cambios tanto en el material de deposición de puerta flotante como en el grosor de la capa de deposición de puerta flotante, para las geometrías de puerta estudiadas. Luego, esto se corroboró empíricamente con los resultados de las pruebas eléctricas en un material de deposición de puerta flotante de óxido de aluminio (AhO3) de 400 Angstrom. Como se usa en la presente descripción, una respuesta Nernstiana se refiere a una respuesta ideal de 59 mV/pH a 25 °C. Una respuesta sub-Nernstiana tendría una respuesta de menos de 59 mV/pH a 25 °C, y una respuesta super-Nernstiana tendría un factor de pendiente superior a 59 mV/pH a 25°C.

A partir de la literatura disponible o de la experimentación, se puede determinar que además del AhO3, existen otros óxidos de metal que se pueden sustituir por nitruro de silicio en la parte inferior del pozo, para obtener una respuesta más cercana a la Nernstiana. Por ejemplo, la Tabla 6 compara la respuesta de pH de los ISFET con varios óxidos de deposición de puerta flotante (específicamente, SiO2, Si3N4, AhO3 y Ta2O5, utilizando datos publicados.

Tabla 6

Característica SÍO2 SÍ3N4 AI2O3 Ta2O5 rango de pH 4-10 1-13 1-13 1-13 Sensibilidad (mV/pH) 23-35 (pH > 7) 46-56 53-57 56-57

37-48 (pH<7)

Sensibilidad (mV/pX)

Na+ 30-50 5-20 2 <1

K+ 20-30 5-25 2 <1

Tiempo de respuesta

(95%) (s) 1 < 0,1 < 0,1 <0,1

(98%) (min) Indefinido 4-10 2 1

Deriva (mV/hr, pH 1-7) Inestable 1,0 0,1-0,2 0,1-0,2

De los cuatro materiales comparados en la Tabla 6, el SiO2 tenía la sensibilidad más baja al pH y no tenía dependencia lineal del pH. La literatura indicó que el Si3N4 tenía sensibilidades más altas (46-56 mV/pH), pero los experimentos han demostrado que su rendimiento depende del tipo de técnica de deposición y del contenido de oxígeno. Los materiales mejor reportados fueron AhO3 y Ta2O5, los cuales exhibieron mayor sensibilidad en los rangos de 53-57 y 56-57 mV/pH, respectivamente. Otro estudio ha indicado que el óxido de tungsteno, WO3, un material con una constante dieléctrica alta (aproximadamente 300), tiene una sensibilidad de 50 mV/pH.

En consecuencia, los datos indican que el uso de un material de deposición de puerta flotante como Ta2O5, AhO3, HfO3 o WO3 dará como resultado una señal más grande en respuesta a los cambios de pH. En otras palabras, si se supone que la sensibilidad de Ta2O5 es de 56 mV/pH y que la ganancia Nernstiana se define como la sensibilidad del material dividida por la respuesta Nernstiana ideal de 59 mV/pH a 25 °C, entonces la ganancia Nernstiana aumenta de 0,67 para S13N4 a aproximadamente 0,95 - 0,96 para Ta2O5,. Por lo tanto, con Ta2O5, solo aproximadamente 4-5 % de la tensión de la señal se pierde a través de la capa de deposición de la puerta flotante. La deposición de una capa de deposición de puerta flotante de película delgada sobre las paredes laterales de los micropozos proporciona un beneficio adicional. Al recubrir las paredes con un material cuyo valor de pKa es más propicio para las condiciones de pH del analito que la pared lateral de óxido de TEOS mencionada anteriormente, el material de deposición de puerta flotante amortigua las paredes laterales para que las reacciones superficiales capturen menos protones que, de lo contrario, estarían disponibles como generadores de señal una vez que llegan a la región de la puerta.

Por lo tanto, las capas de deposición de puerta flotante de película delgada mencionadas anteriormente se pueden usar para proporcionar tres beneficios: En primer lugar, mejoran el rendimiento del sensor en la superficie del sensor al proporcionar una interfaz más reactiva entre el analito y la puerta ISFET (o, es decir, son más Nernstianos). En segundo lugar, sirven como un dieléctrico más delgado de reemplazo entre el analito y la puerta ISFET de metal (si se aplica directamente al metal) o entre el analito y el óxido de puerta (si se aplica sobre una capa de óxido de puerta), aumentando de esta manera la capacitancia de acoplamiento y ganancia de puerta En tercer lugar, si también se utilizan para cubrir las paredes laterales de los micropozos, como sería habitual en la mayoría de los procesos de deposición, proporcionan amortiguación al recubrir las paredes laterales de óxido de TEOS con un material cuyo pKa difiere más sustancialmente del pH del analito que el del propio material de la pared lateral.

También hay materiales como el óxido de iridio que proporcionan respuestas súper Nernstianas, que pueden proporcionar aún más mejoras en la SNR si se utilizan como capa de deposición de puerta flotante de película delgada. Véase, por ejemplo, DO Wipf y otros," Microscopic Measurement of pH with Iridium Oxide Microelectrodes", Anal. Chem. 2000, 72, 4921-4927, y YJ Kim et al, "Configuration for Micro pH Sensor," Electronics Letters, vol. 39, núm. 21 (16 de octubre de 2003)).

Las Figuras 75B-D modelan la dependencia de la ganancia de puerta en el grosor y el material de la capa de deposición de puerta flotante, suponiendo el uso de un óxido de puerta convencional, en diferentes condiciones. Las condiciones para la Figura 75B se dan en la Tabla 7, a continuación:

Tabla 7

Las condiciones para la Figura 75C se dan en la Tabla 8, a continuación:

Tabla 8

Las condiciones para la Figura 75D se dan en la Tabla 9, a continuación:

Tabla 9

Las capas de película delgada de ALD depositadas descritas anteriormente, como todas las películas delgadas depositadas, tienen una tensión intrínseca y un gradiente de tensión resultante de las propiedades del material y/o las condiciones de deposición. Estas propiedades pueden afectar la adhesión de la película depositada al sustrato subyacente (la metalización de la puerta flotante y las paredes laterales de los micropozos). En los ejemplos de fabricación anteriores, varios materiales cerámicos de óxido de metal se depositarán sobre dióxido de silicio (es decir, el material TEOS de los micropozos), nitruro de silicio (es decir, el material de pasivación CMOS restante que se ha grabado pero que todavía está presente en la parte inferior de las paredes laterales) y aluminio (es decir, el electrodo de puerta flotante ISFET de metal).

Algunos procesos de ALD involucran el depósito de materiales a temperaturas por debajo de los 400 °C; otros, a temperaturas superiores a 400 °C. Como se describió anteriormente, se puede emplear un recocido de gas de formación al final de la línea por encima de 400 °C como parte del proceso de neutralización de carga atrapada CMOS. Las capas de ALD depositadas a temperaturas inferiores a esta tienden a deslaminarse o desconcharse de las paredes laterales de dióxido de silicio. Se ha encontrado empíricamente que el Ta2O5 (depositado a 325 °C) se desprende de las paredes del pozo y el AhO3 (depositado a 460 °C) no lo hace.

En una realización, se realiza un recocido con gas a 425-450 °C. Se emplea ALD para crear una capa delgada de AhO3 a aproximadamente 450 °C. Esta capa de AhO3 puede ser tan delgada como 2-3 nm, 4-5 nm, 10-20 nm o tan grueso como 100-200 nm. A esto le sigue una deposición de una capa delgada de Ta3O5 usando ALD a una temperatura no superior a 350 °C. Esta capa de Ta3O5 puede ser tan delgada como 2-3 nm, 4-5 nm, 10-20 nm o tan grueso como 100-200 nm. En este tipo de realización, TaCN podría depositarse usando ALD en lugar de o en combinación con la capa delgada de Ta3O5 en un intervalo de temperatura que está limitado a no más de 350 °C. En otro ejemplo, podría usarse una capa gruesa (200-400 Angstroms) de TaN como capa de pasivación, depositándose a altas temperaturas de aproximadamente 450 °C o más.

Se proponen dos métodos para corregir este problema, aplicados a la fabricación de un material dieléctrico (resistencia) de puerta flotante/pasivación de micropozo óptimo en un micropozo y en una puerta de sensor ISFET. En un primer método, se puede usar una película laminada para aliviar la tensión en la cerámica de óxido de metal depositado. En un segundo método, primero se deposita una capa de pegamento, que tiene una adhesión superior sobre la cual se deposita un material dieléctrico (protección) de puerta flotante/pasivación de micropozos de química de superficie óptima.

Como ejemplo, la capa laminada puede ser una estructura de aproximadamente 400 Angstrom de grosor de capas alternas de Ta2O5 y AhO3 (por ejemplo, pero sin limitarse a, cada una de aproximadamente 10 - 20 Angstrom de grosor, o de diferentes grosores). Una realización comenzará con AhO3 (ya que muestra una mejor adhesión al óxido) y terminará con Ta2O5 (por su química de superficie superior). El proceso ALD es ideal para esto, ya que los grosores de la película se pueden controlar hasta la capa atómica (es decir, unos pocos Angstroms) y se pueden cambiar fácilmente de un material a otro simplemente cambiando los gases precursores introducidos en el sistema del reactor.

La tensión global de una capa de laminado de este tipo sería una combinación de las tensiones intrínsecas -compresión y tracción - de las capas individuales. Podrían usarse más de dos materiales si, por ejemplo, se empleara un laminado terciario.

La idea de la "capa de pegamento" es una implantación más directa. En primer lugar, se puede depositar una capa muy fina (por ejemplo, 50 Angstrom) de material adherente (por ejemplo, AhO3 de alta temperatura) y luego, inmediatamente después, una capa más gruesa (por ejemplo, 400 Angstrom) de Ta2O5.

Aumento del área superficial de la puerta flotante

Los diversos materiales de óxido de metal descritos anteriormente para mejorar las propiedades superficiales tanto de la superficie del pozo como de la superficie del sensor en la parte inferior del pozo no son eléctricamente conductores. Sin embargo, se puede crear un electrodo de puerta flotante extendido debajo de dicho material, extendiendo las propiedades conductoras de electricidad del electrodo de puerta ISFET, primero depositando y planarizando-grabando un delgado recubrimiento de metal conformado antes de la deposición de la capa de "pasivación". La eliminación a través de CMP (pulido químico-mecánico) u otras técnicas de grabado del metal delgado de la parte superior de los micropozos produciría pozos aislados eléctricamente discretos que tienen puertas pasivadas que consisten sustancialmente en toda el área superficial interior de las paredes laterales de los micropozos. Esto aumentaría varias veces el área superficial disponible de la puerta ISFET. Hacerlo eliminaría virtualmente los "protones perdidos en las paredes de los micropozos" (es decir, los protones que emanan de la reacción de secuenciación en la perla y que, de lo contrario, golpean la pared del micropozo sin detección).

El condensador dieléctrico de puerta flotante extendido se formaría (por ejemplo, por ALD) después del grabado de los micropozos. Podría ser necesario realizar ajustes en las dimensiones laterales de los micropozos, según el grosor de las capas delgadas de metal más pasivación que se depositen y el tamaño de la perla.

La Figura 75E representa esquemáticamente dos micropozos 75E1 y 75E2 que se forman con tal estructura de puerta flotante extendida según algunas realizaciones de la invención. Como quedará claro en un momento, las estructuras de la Figura 75E se encuentran en un estado parcial de terminación. Con referencia a la Figura 75E, una secuencia posible para fabricar la estructura de micropozos con un electrodo de puerta extendido podría ser la siguiente: Después de formar la capa 75E3 de material (por ejemplo, TEOS) que proporcionará las paredes de micropozos, encima de un semiconductor (CMOS, NMOS o PMOS) en la que se han formado las estructuras ISFET, las áreas que se convertirán en los pozos están grabadas en la capa de metal, etiquetada como M4, que constituye la puerta flotante de los ISFET. (O, alternativamente, si como se indicó anteriormente, los micropozos se forman directamente en la capa de pasivación de semiconductores, la capa 75E3 se puede omitir y este y otros pasajes que se refieren a dicha capa se pueden entender como referencias en su lugar a la capa de pasivación y la formación de los micropozos) en la capa de pasivación, en su lugar). A continuación, mediante un proceso como pulverización catódica o ALD, se deposita una capa delgada de metal (por ejemplo, aproximadamente 0,25-0,50 pm de aluminio, titanio, tántalo u otro material adecuado) para formar una capa 74E4 en contacto con la capa M4, que recorre la parte inferior del pozo y sube por las paredes laterales. La capa de metal delgada también cubrirá la parte superior del material (por ejemplo, TEOS) entre los micropozos, formando un cortocircuito eléctrico entre los pozos, que deberá eliminarse. A continuación, se pueden llenar opcionalmente los pozos con un material adecuado, como varios materiales de relleno orgánicos que están fácilmente disponibles, para evitar que el siguiente paso deje residuos no deseados en los micropozos. El siguiente paso es emplear CMP u otra técnica adecuada para aplanar la parte superior de la estructura hasta un nivel que exponga la parte superior de los micropozos y la capa de material 75E4 en la parte superior de las paredes laterales. Habiendo expuesto por lo tanto la capa de metal 75E4, ese metal se retira de la parte superior de la matriz de micropozos (especialmente la parte superior de las paredes laterales y el TEOS entre las paredes laterales de cualquier manera satisfactoria). Por ejemplo, el metal 75E4' en la parte superior de la estructura del micropozo (es decir, en la parte superior exterior de las paredes laterales) puede grabarse o eliminarse usando CMP de metal para aplanar aún más la parte superior de los pozos. Una vez eliminado el cortocircuito entre los pozos, se elimina el material de relleno, si se utiliza. La metalización de puerta extendida se recubre luego mediante la aplicación de la capa dieléctrica delgada 75E5, descrita anteriormente, tal como una pasivación ALD con pentóxido de tantalio (Ta2Os), usando ALD, por ejemplo. El dieléctrico/pasivación debe cubrir todos los bordes de la capa 75E4 para evitar un cortocircuito eléctrico en los pozos a través del fluido analito.

Como proceso de fabricación alternativo, la eliminación del material 75E4' podría realizarse modelando un patrón inverso del micropozo como una máscara (es decir, abriendo las áreas entre los pozos) y luego usando un grabado de metal estándar.

La acumulación de toda la carga que llega a las paredes laterales de los micropozos, así como a su parte inferior, hace que los píxeles sean más sensibles a la reacción en los pozos.

Otra forma de mejorar la recolección de carga y la sensibilidad es emplear para las superficies en contacto con el electrolito un material que tenga un punto de carga cero que coincida con el pH operativo del analito.

Todavía otra realización para mejorar la sensibilidad de un sensor es usar evaporación por haz de electrones fuera del eje para aplicar materiales a las paredes laterales de los micropozos. Como se ilustra en la Figura 75E-1, la oblea 75E10 tiene un eje central 75E18. La oblea 75E10 se puede girar en un ángulo a con respecto al eje central 75E18 mientras que el haz de electrones 75E14 procedente de la fuente 75E18 irradia la oblea 75E10. El haz de electrones 75E14 puede transportar un material que se depositará en la oblea 75E10.

Una realización emplea un haz de electrones 75E14 para depositar materiales en un proceso de fabricación posterior a los micropozos para mejorar la sensibilidad de ISFET. El objetivo es cubrir las paredes laterales y las superficies superiores de los micropozos con un material que: (a) no absorba iones H+; (b) no es compatible con la química de recubrimiento de silano (es decir, permanece sin recubrir); y evita recubrir las superficies inferiores de los micropozos. En una realización, el proceso para implementar la deposición de haz de electrones después de completar la fabricación de micropozos incluye: (a) proteger los circuitos periféricos y las áreas de la almohadilla de unión con una fotorresistencia orgánica; (b) exponer la oblea 75E10 a una deposición de película delgada del material a depositar; y retirar la fotorresistencia. La eliminación de la resistencia orgánica se puede lograr mediante un proceso de despegue convencional.

En una realización particular de la invención, la oblea 75E10 tendrá una capa de oro en un intervalo de aproximadamente 200-500 Angstroms depositada en los lados y en la parte superior de los micropozos usando evaporación direccional por haz de electrones. También pueden ser convenientes capas más delgadas de oro. También se puede usar otro material, como la plata, en lugar del oro. Una técnica para la evaporación direccional de haz de electrones, denominada en la presente descripción "sombreado de la pared lateral", permite la deposición solo en la superficie de la línea de sitio. Esta técnica se ilustra en la Figura 75E-1 en la que la oblea 75E10 está inclinada en un ángulo a75E12 con respecto al eje central de la oblea 75E10. El giro de la oblea 75E10 forma un revestimiento sobre todas las superficies de las paredes laterales de los micropozos. Al posicionar y controlar el haz de electrones 75E14 por la fuente 75E16 durante la rotación planetaria de la oblea 75E10, se mejora la uniformidad del recubrimiento.

Haciendo referencia a la Figura 75E-2a, que es un diagrama más detallado que ilustra los micropozos 75E20 se irradian por el haz de electrones 75E14. El ángulo a 75E12 en el que gira la oblea 75E10 proporciona un efecto protector para las partes inferiores de los micropozos 75E20. En una realización, el ángulo a puede estar en un intervalo de 40-50 grados desde el eje central 75E18. Aunque será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que el ángulo a 75E12 variará según las geometrías variables de los micropozos 75E20. El ángulo a 75E12 en la realización ilustrada en la Figura 75E-2 muestra "sombreado de la pared lateral" en el que las paredes laterales 75E24 a los micropozos 75E20 ocultan efectivamente las partes inferiores 75E22 de los micropozos 75E20 del haz de electrones 75E14, evitando por lo tanto que el material sea transportado por el haz de electrones 75E14 se deposite en las partes inferiores 75E22. El ángulo a 75E12 se puede controlar durante la fabricación de obleas en las que los sustratos se montan en el soporte planetario. El soporte planetario hace girar cada oblea 75E10 permitiendo que el haz de electrones 75E14 deposite material sobre las obleas 75E10. Se puede colocar una plantilla (no se muestra) debajo de los sustratos de las obleas 75E10 para establecer el ángulo a 75E12 de incidencia. Fuente de evaporación de haz de electrones debajo (fuera de la vista).

La Figura 75E-2b es una ilustración del objetivo final del "sombreado de la pared lateral" utilizando el haz de electrones 75E14. Las partes superiores 75E26 y las paredes laterales 75E24 están recubiertas con el material transportado por el haz de electrones 75E14, pero las partes inferiores 75E22 permanecen libres del material 75E22.

Electrónica en chip mejorada

Hay dos áreas clave en las que se puede mejorar potencialmente la electrónica en el chip para aumentar la ganancia de la señal de tensión y reducir el ruido: el circuito de píxeles y el circuito de lectura.

Circuito de píxeles

En un circuito de píxel básico como el que se ilustra arriba en la Figura 9, por ejemplo, el potencial general del ISFET 150 se lleva al potencial de circuito más alto. Desafortunadamente, la tensión umbral V^t del dispositivo se ve afectada por la diferencia de potencial entre la fuente y la masa, Vsb. Este fenómeno se conoce como el efecto del cuerpo y se modela como:

donde V^t0 es la tensión umbral cuando la tensión de la fuente es igual al potencial global, 2|0^f| es el potencial de superficie en el umbral, y y es el coeficiente de efecto del cuerpo. En consecuencia, la tensión umbral variará debido al efecto del cuerpo; y la ganancia de la fuente ISFET, definida como la relación Vs/VG, será menor que el valor ideal de la unidad. Aunque no se puede medir directamente, se cree que la ganancia de la fuente ISFET está en la vecindad de 0,9. En otras palabras, hasta un 10 % de la señal de tensión máxima que podría medirse puede perderse debido al efecto del cuerpo.

Si cada ISFET se coloca en su propio pozo n, y los terminales de fuente y volumen se conectan entre sí, entonces se puede eliminar el efecto de cuerpo y se puede lograr una ganancia de unidad de fuente de ISFET. Además, si cada ISFET está aislado del resto del chip mediante un diodo polarizado inversamente entre el pozo n y el sustrato, entonces el dispositivo será menos susceptible al ruido del sustrato. En otras palabras, el ruido ISFET total debe ser menor si el dispositivo está localizado en su propio pozo n.

Reducción de la inyección de ruido en el electrolito

Un segundo aspecto para mejorar la SNR es el de reducir el ruido. Un componente importante de este ruido es el que se acopla al fluido analítico por los píxeles de cada columna de la matriz, debido a la dinámica del circuito. Se han identificado dos mecanismos de inyección de ruido: el amortiguador de columna del lado de drenaje inyecta ruido a través de cada píxel y cada selección de hilera bombea carga en el fluido. Estos mecanismos se centran en el drenaje ISFET y en la fuente ISFET.

El problema del drenaje ISFET

Cuando se selecciona una hilera en la matriz, la tensión del terminal de drenaje compartido entre todos los ISFET en una columna se mueve hacia arriba o hacia abajo (como un requisito necesario del seguidor de fuente y drenaje). Esto cambia las capacidades de puerta a drenaje de todos los ISFET no seleccionados en la columna. A su vez, este cambio en la capacitancia se acopla desde la puerta de cada ISFET no seleccionado que inyecta carga en el fluido, y finalmente se manifiesta como ruido en el fluido (es decir, una carga incorrecta, que no se debe a la reacción química que se monitorea). Es decir, se puede considerar que cualquier cambio en la tensión del terminal de drenaje compartido inyecta ruido en el fluido por parte de todos y cada uno de los ISFET no seleccionados en la columna. Por lo tanto, si la tensión del terminal de drenaje compartido de los ISFET no seleccionados puede mantenerse constante cuando se selecciona una hilera en la matriz, este mecanismo de ruido de acoplamiento en el fluido puede reducirse o incluso eliminarse de manera efectiva.

El problema de la fuente ISFET

Cuando se selecciona una hilera en la matriz, la tensión del terminal fuente de todos los ISFET no seleccionados en la columna también cambia. A su vez, eso cambia la capacitancia de puerta a fuente de todos estos ISFET en la columna. Este cambio en la capacitancia se acopla desde la puerta de cada ISFET no seleccionado que inyecta carga en el fluido, y finalmente se manifiesta nuevamente como ruido en el fluido. Es decir, cualquier cambio en la tensión del terminal fuente de un ISFET no seleccionado en la columna se puede considerar como una inyección de ruido en el fluido. Por lo tanto, si la tensión del terminal fuente de los ISFET no seleccionados se puede mantener al seleccionar una hilera en la matriz, este mecanismo de acoplamiento de ruido en la vía del fluido se puede reducir o incluso eliminar de manera efectiva.

Se puede usar un amortiguador de columna con algunos diseños de píxeles pasivos para aliviar el problema de drenaje de ISFET pero no el problema de fuente de ISFET. Por lo tanto, se puede utilizar un amortiguador de columna como alternativa al seguidor de fuente y drenaje ilustrado anteriormente. Con los píxeles pasivos de tres transistores ilustrados que emplean una disposición de seguidor de fuente y drenaje, existen esencialmente dos nodos de detección, los terminales de fuente y drenaje del ISFET. Al conectar el píxel a un amortiguador de columna y conectar a tierra el terminal de drenaje del ISFET, habrá solo un nodo de sentido: el terminal fuente ISFET. Así se elimina el problema del drenaje.

Diseño de píxeles activos

Todos los circuitos de píxeles pasivos descritos anteriormente presentan desafíos de ruido y escalabilidad. Es decir, aumentar el tamaño de la matriz generalmente conduce a una mayor capacitancia del bus y a un aumento no lineal de las necesidades de energía. El aumento de la velocidad de lectura se produce a expensas de un mayor ruido de lectura. Reemplazar píxeles ISFET pasivos con píxeles activos, cada uno con un transistor amplificador activo como elemento integral, puede reducir el ruido acoplado al fluido, además de reducir el ruido de lectura, el ruido de baja frecuencia y el ruido de patrón fijo. Además, este enfoque parece proporcionar un píxel ISFET de bajo ruido que elimina con éxito tanto el problema del drenaje ISFET como el problema de la fuente ISFET, el último porque el nodo de detección (es decir, el terminal fuente ISFET) está desacoplado del bus de columna.

Tenga en cuenta que, para realizar una medición, el nodo sensor debe estar conectado a una fuente de corriente, con corriente que fluye. Sin embargo, apagar y encender la fuente de corriente introduce una perturbación propia en el nodo sensor y, por lo tanto, acopla ruido en el fluido. Para evitar este problema y mejorar aún más la relación señal-ruido, se puede introducir una fuente de corriente de un solo transistor en cada píxel ISFET activo. Entonces, la corriente fluiría a través de cada píxel en cada columna de la matriz todo el tiempo. Por supuesto, existen implicaciones obvias para el consumo de energía y sería posible operar este transistor de fuente de corriente en modo subumbral para minimizar el consumo de energía.

Volviendo a la Figura 75F, se muestra un primer ejemplo 75F1 de dicho píxel activo. El píxel activo 75F1 tiene cuatro transistores, 75F2 -75F5, de los cuales 75F2 es el ISFET, su puerta flotante se muestra esquemáticamente en 75F6. Mientras que el bus de columna 75F7 está desacoplado del nodo de detección por los transistores seguidores de fuente 75F4 y 75F5 para reducir el ruido de lectura, encender y apagar la fuente de corriente (no se muestra) con el transistor 75F3 introduce una perturbación en el nodo de detección (la fuente del ISFET 75F2) que acopla el ruido al fluido.

En la Figura 75G se muestra un segundo ejemplo de un píxel activo 75G1 de cuatro transistores. Este píxel utiliza una fuente de corriente MOSFET única 75G3 para evitar la introducción de una perturbación en el nodo de detección. El transistor de fuente de corriente se puede operar como un diodo de polarización inversa (corte) o en modo de subumbral para minimizar el consumo de energía.

Al compartir algunos transistores entre píxeles, se puede reducir la cantidad promedio de transistores por píxel y, por lo tanto, el tamaño de píxel. Por ejemplo, vea la disposición de la Figura 75H, en la que los transistores 75H1 y 75H2 se comparten entre cuatro píxeles 75H3-74H6, lo que da como resultado un promedio de 3,5 transistores por píxel. En la Figura 751 se muestra un ejemplo de un píxel activo 7510 de seis transistores. En funcionamiento, la entrada de reinicio 7511 se habilita, el transistor 7513 está encendido y la tensión resultante del ISFET 7512 es medido por los transistores seguidores de fuente 7514-7515. La diferencia entre el nivel de reinicio y el nivel de señal de ISFET 7512 es la salida del sensor.

Tomando dos muestras por píxel (es decir, usando muestreo doble correlacionado (CDS), se pueden diseñar diversas realizaciones para reducir y/o eliminar la falta de coincidencia del amplificador, suprimir el ruido 1/f y el ruido de patrón fijo debido a variaciones de tensión umbral.

Como se muestra en la Figura 75J, el concepto de compartir transistores entre un grupo de píxeles también se puede aplicar al ejemplo de píxeles de seis transistores de la Figura 751. Al compartir tres transistores 7511, 7514 y 7515, cuatro píxeles 75J1-75J4 pueden tener un promedio de 3,75 transistores cada uno. Los dos ejemplos de uso compartido utilizan cuatro píxeles, pero no hay razón para que los transistores no se puedan compartir entre un número diferente de píxeles.

Pasar de un diseño de píxeles pasivos a un diseño de píxeles amplificado activo mejora la escalabilidad del diseño y reduce el ruido de lectura. Se puede emplear una fuente de corriente de un solo MOSFET en cada píxel ISFET para evitar el ruido de acoplamiento en el fluido. Las técnicas de doble muestreo correlacionado se pueden utilizar a nivel de píxel o de columna para aliviar la falta de coincidencia del amplificador, reducir el ruido de parpadeo y el ruido de patrón fijo. Además, el concepto de "píxel compartido" se puede utilizar para reducir el número efectivo de transistores por píxel para lograr un tamaño de píxel más pequeño.

Para reducir el consumo de energía, los FET (o algunos de ellos seleccionados) pueden funcionar en el modo denominado "inversión débil" o "subumbral".

Circuito de lectura

El circuito de lectura descrito anteriormente, que comprende bloques multiplexores y de muestreo y retención, también tiene una ganancia que es menor que el valor ideal de la unidad. Además, el bloque de muestreo y retención contribuye con un porcentaje significativo del ruido total del chip, quizás más del 25 %. A partir de la teoría del capacitor conmutado, el ruido "kT/C" de muestreo y retención es inversamente proporcional a la capacitancia. Por lo tanto, al elegir un capacitor más grande, se puede reducir el ruido de muestreo y retención. Otro enfoque para reducir el ruido es emplear el muestreo doble correlacionado (CDS), donde se usa un segundo circuito de muestreo y retención y diferencia para cancelar el ruido correlacionado. Este enfoque se describe con más detalle a continuación.

Muestreo doble correlacionado

El muestreo doble correlacionado (CDS) es una técnica conocida para medir valores eléctricos tales como tensiones o corrientes que permite la eliminación de una compensación no deseada. La salida del sensor se mide dos veces: una en una condición conocida y otra en una condición desconocida. El valor medido de la condición conocida se resta luego de la condición desconocida para generar un valor con una relación conocida con la cantidad física que se mide. El desafío aquí es cómo ser eficiente en la implementación de CDS y cómo abordar tanto el ruido correlacionado como la minimización de la inyección de ruido en el fluido del analito.

Un punto de partida es el píxel del sensor y su configuración de lectura como se expresó en partes anteriores de esta solicitud. Haciendo referencia a la Figura 76A, el píxel sensor pasivo básico 76A1 es una disposición de tres transistores de un ISFET 77A2 y un par de transistores de selección de hilera, 77A3 y 77A4 conectados a la fuente ISFET. El transistor 77A3 está conectado a su vez a una fuente o sumidero de corriente 77A5. Se obtiene una lectura a través del transistor 77A4 que está conectado a la entrada del amplificador de detección 77A6. Un transistor 77A7 conectado por diodo en serie con otro amplificador, 77A8, se conecta en un circuito de retroalimentación desde la salida del amplificador de detección al drenaje del ISFET. La salida del amplificador de detección es capturada por un circuito de muestreo y retención 77A9, que alimenta un amplificador de salida 77A10. Como se describió anteriormente, los cambios de tensión en la fuente y el drenaje del ISFET pueden inyectar carga en el analito, lo que genera ruido y provoca errores en los valores detectados. Dos modificaciones constructivas pueden reducir apreciablemente el nivel de ruido, como se muestra en la Figura 76B.

El primer cambio es alterar las señales en el ISFET. El bucle de retroalimentación al drenaje del ISFET se elimina y el drenaje se conecta a una tensión estable, como tierra. Un amortiguador de columna 77B está conectado a la fuente del transistor 77A4.

El segundo cambio es incluir un circuito para realizar CDS en la salida del amortiguador de columna. Como se mencionó anteriormente, CDS requiere un primer valor de referencia. Esto se obtiene conectando la entrada del amortiguador de columna 77B1 a una tensión de referencia a través del conmutador 77B2, durante una primera fase o fase de referencia de un reloj, indicada como la fase "SH". Luego, un circuito combinado de CDS y muestreo y retención duplica la muestra de la salida del amortiguador de columna, obtiene una muestra de referencia y un valor detectado, realiza una resta y proporciona un valor de salida con reducción de ruido resultante, ya que el mismo ruido correlacionado aparece en la muestra de referencia y en la salida del sensor.

El funcionamiento del CDS y del circuito de muestreo y retención es sencillo. El circuito opera en un reloj de dos fases, la primera fase es la fase SH y la segunda fase es la fase SHb. Normalmente, las fases serán valores simétricos y, por lo tanto, invertidos entre sí. La muestra de referencia se obtiene en la fase SH y coloca una carga (y por lo tanto una tensión) en el capacitor Cin, que se resta de la salida del amortiguador de columna cuando cambia la fase del reloj.

En la Figura 76C se muestra una realización alternativa, todavía con un píxel de sensor pasivo. El píxel del sensor en esta realización es un circuito de dos transistores que comprende ISFET cuyo drenaje está conectado a una tensión de suministro fijo, V^sSA. No hay ningún transistor comparable al 77A4 y, en cambio, la salida de píxeles se toma del emisor del transistor 77A3. El CDS y el circuito de muestreo y retención se han simplificado ligeramente mediante la eliminación de un circuito de retroalimentación, pero cumplen la misma función, junto con la carga (tensión) almacenada en el capacitor Cbl, de restar un valor de referencia en el capacitor Cin de la señal suministrada por el píxel del sensor.

Píxeles digitales y lecturas

Dado que las relaciones señal-ruido a menudo se pueden mejorar pasando del dominio analógico al dominio digital, también hemos comenzado a explorar las posibilidades de crear píxeles ISFET digitales y lecturas de píxeles digitales.

Considere primero la arquitectura que se muestra en la Figura 75K. Allí, un único convertidor de analógico a digital (ADC) 75K1 convierte la salida analógica de un circuito de direccionamiento de columna 75K2, suministrando salida desde la matriz de píxeles 75K3, a forma digital. Se puede lograr un ruido de patrón fijo bajo, pero la operación de esta arquitectura es baja, siendo el ADC único un cuello de botella. La velocidad de tramas está limitada por la cantidad de píxeles y el tiempo empleado por el ADC para completar una conversión. Por lo tanto, esta arquitectura no es apta para altas resoluciones.

Para lograr un mayor rendimiento (es decir, velocidad de trama), se puede usar un ADC 75L11 - 75L1n para cada columna de la matriz 75K3, como se ilustra en la Figura 75L. De hecho, la velocidad de tramas puede ser casi n veces más rápida. En lugar de que el ADC sea un factor limitante de la velocidad, la velocidad de tramas puede verse limitada por las capacidades de transferencia de salida de la matriz. La desventaja, por supuesto, es que aumenta el consumo de energía.

En cualquiera de estos dos casos, el paralelismo y la velocidad de tramas se pueden aumentar dividiendo la matriz en dos grupos (75M1, 75M2 en la Figura 75M y 75N1, 75N2 en la Figura 75N) y leyendo cada grupo por separado. Una vez más, sin embargo, hay que pagar una penalización por consumo de energía. No se ilustra en las Figuras 75M y 75N un multiplexor que puede usarse, si se desea, para proporcionar un único flujo de salida (por ejemplo, salidas intercaladas del primer grupo o grupo superior con salidas del segundo grupo o grupo inferior).

Para ir más directamente al dominio digital, uno tiene que pasar de convertir una salida de matriz analógica a generar una salida digital directamente en cada píxel. En general, esto requiere proporcionar en cada píxel alguna forma de conversión de analógico a digital y memoria (al menos 1 bit, para cada uno). La conversión de la señal del sensor analógico a digital sobre una base de "inpixel" crea una oportunidad para lograr la relación señal-ruido (SNR) más grande posible. También es intrínsecamente escalable, lo que permite una lectura paralela masiva y de alta velocidad de los datos del sensor digital, con las limitaciones de la velocidad de tramas dominadas por la velocidad de transferencia de entrada/salida (E/S) de la matriz, debido al hecho de que todos los píxeles convierten los valores detectados en forma digital en paralelo.

Una arquitectura básica de píxeles digitales 7501 es como se muestra en la Figura 75O. Incluye un ISFET 75O2, una fuente de corriente 75O3, un ADC 75O4 y una memoria 75O5, cuyo funcionamiento es el descrito anteriormente. Al igual que con los píxeles ISFET activos descritos anteriormente, el circuito alrededor del nodo de detección (que no se muestra en detalle aquí, para mayor claridad) se elige preferentemente para evitar el ruido de acoplamiento en el fluido.

El concepto de compartir circuitos entre múltiples píxeles, para reducir el área de chip promedio por píxel y reducir el consumo de energía promedio y total, también se puede extender a las arquitecturas de píxeles digitales. Por ejemplo, la Figura 75P muestra un ADC 75P1 y la memoria 75P2 compartidos por cuatro celdas ISFET 75P3-75P6 o píxeles (aquí se usa ese término, aunque el ADC y la memoria se comparten y no forman parte de las celdas dentro de las líneas punteadas).

Con dichos píxeles digitales formados en una matriz, desde una perspectiva de lectura, la matriz se parece a una matriz de memoria. Por lo tanto, como se muestra en la Figura 75Q, cuando los píxeles individuales proporcionan valores de salida digital, el circuito de direccionamiento de hileras 75Q1 y los amplificadores de detección de columna 75Q2 pueden proporcionar la funcionalidad de lectura desde la matriz de píxeles 75Q3, como lo harían en una matriz de memoria.

Los enfoques de las Figuras 75M y 75N, es decir, subdividir o segmentar la matriz y procesar por separado las subdivisiones/segmentos, puede implementarse con cualquier arquitectura de píxeles adecuada, como las de las Figuras 76B y 76C, con salida de píxeles digital o analógica. Por ejemplo, la salida del multiplexor de columna 77B4 o 77C4 de cada segmento puede ser una entrada a un multiplexor adicional, no se muestra para seleccionar entre segmentos para suministrar una salida común.

Por lo tanto, un esquema de direccionamiento de hileras y columnas permite la selección de una subregión de tamaño variable dentro de la matriz. Esto facilita una compensación entre el tamaño de la matriz que se interroga y la velocidad de lectura (es decir, tramas por segundo). Una velocidad de muestreo más rápida puede tener varias ventajas potenciales:

1. ) Una velocidad de muestreo más rápida cuando se combina con un filtro digital puede producir mejores mediciones de señal a ruido para los píxeles dentro de la subregión. Por ejemplo, seleccionar una subregión de un cuarto del tamaño de la matriz permitiría frecuencias de muestreo aproximadamente cuatro veces más altas para los píxeles dentro de la subregión. Un filtro simple que promedia cuatro muestras consecutivas juntas reduciría la velocidad de muestreo final a la frecuencia de trama nominal de matriz completa, pero cada medición solo tendría aproximadamente la mitad del contenido de ruido.

2. ) La velocidad de muestreo más rápida se puede utilizar para examinar señales de frecuencia más alta de lo que sería posible de cualquier otra manera a la frecuencia de trama de matriz completa nominal del dispositivo. Por ejemplo, seleccionar una subregión de un cuarto del tamaño de la matriz permitiría frecuencias de muestreo aproximadamente cuatro veces más altas y el límite de ancho de banda para las señales medidas se incrementaría en un factor de cuatro.

3. ) Ambos casos se pueden combinar para proporcionar una respuesta de alta frecuencia y una SNR más alta. Por ejemplo, la selección de una subregión de un dieciseisavo del tamaño de toda la matriz permitiría un aumento del doble en SNR y un aumento de cuatro veces en el ancho de banda.

En algunas aplicaciones, la sensibilidad y/o el ancho de banda de la señal pueden ser más importantes que la cantidad de píxeles activos. La disponibilidad de tamaño de trama variable (que también podría llamarse asignación de ancho de banda flexible, o tal vez asignación de ancho de banda dinámica) es valiosa en estas situaciones.

Con una matriz adecuadamente segmentada, también sería posible realizar una reacción de secuenciación 'rodante' en una matriz grande. Uno haría fluir lentamente* dNTP a través de un chip grande. A medida que la onda de dNTP fluye lentamente a través del chip, la reacción de secuenciación solo se produciría en una pequeña región a lo largo del "frente" del flujo de dNTP. En teoría, sería posible sincronizar el sobremuestreo de la subregión con el frente dNTP para obtener mediciones muy precisas de toda la matriz.

Diodos de protección

Para reducir la posible degradación del óxido de puerta durante el procesamiento con plasma (por ejemplo, grabado con plasma, pulverización catódica, PECVD, etc.), se puede emplear un diodo de pozo y/o un diodo de sustrato, como se ilustra en las Figuras 75R-75T.

En la Figura 75R, el diodo 75R1 entre la puerta 75R2 del ISFET 75R3 y el pozo 75R4 limita la tensión que puede acumularse en la puerta en relación con el pozo. La "sobrecarga" agregada en forma de inmuebles ocupados son bastante pequeños. Un ISFET típico, por ejemplo, podría tener 1,2 x 0,5 pm, y el diodo podría tener un perímetro de aproximadamente 2,8 pm y ocupar solo 0,49 pm2.

En la Figura 75S, el diodo 75S1 entre la puerta 75R1 del ISFET 75R3 y el sustrato 75S2 limita la tensión que se puede acumular en la puerta en relación con el sustrato. La "sobrecarga" agregada en forma de inmuebles ocupados son bastante pequeños. Un ISFET típico, por ejemplo, podría tener 1,2 x 0,5 pm, y el diodo podría tener un perímetro de aproximadamente 2,8 pm y ocupar solo 0,49 pm2.

Como se muestra en la Figura 75T, ambos diodos se pueden usar juntos y su área total podría ser típicamente de solo 0,98 pm2.

Si bien en la presente descripción se han descrito e ilustrado varias realizaciones de la invención, los expertos en la técnica visualizarán fácilmente una variedad de otros medios y/o estructuras para realizar la función y/u obtener los resultados y/o una o más de las ventajas descritas en la presente descripción, y cada una de dichas variaciones y/o modificaciones se considera que está dentro del alcance de las realizaciones de la invención descritas en la presente descripción. De manera más general, los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que todos los parámetros, dimensiones, materiales y configuraciones descritos en la presente descripción tienen el propósito de ser ilustrativos y que los parámetros, dimensiones, materiales y/o configuraciones reales dependerán de la aplicación o aplicaciones específicas para los que se utilizan las enseñanzas de la invención. Por lo tanto, debe entenderse que las realizaciones anteriores se presentan únicamente a modo de ejemplo y que, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, las realizaciones de la invención pueden llevarse a la práctica de cualquier otra manera a como se describe específicamente.

Todas las definiciones, como se definen y utilizan en la presente descripción, deben entenderse como un control sobre las definiciones del diccionario y/o los significados ordinarios de los términos definidos.

Los artículos indefinidos "un" y "una", como se usan en la presente descripción en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deben entenderse como "al menos uno".

La frase "y/o", como se usa en la presente descripción en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debe entenderse como "cualquiera o ambos" de los elementos así unidos, es decir, elementos que están presentes en forma conjunta en algunos casos y disyuntivamente presentes en otros casos. Los elementos múltiples enumerados con "y/o" deben interpretarse de la misma manera, es decir, "uno o más" de los elementos así unidos. Opcionalmente, pueden estar presentes otros elementos además de los elementos específicamente identificados por la cláusula "y/o", ya sea que estén relacionados o no con esos elementos específicamente identificados. Por lo tanto, como un ejemplo no limitativo, una referencia a "A y/o B", cuando se usa junto con un lenguaje abierto como "que comprende" puede referirse, en una realización, solo a A (que incluye opcionalmente elementos distintos de B); en otra realización, sólo a B (incluye opcionalmente elementos distintos de A); en aún otra realización, tanto para A como B (que incluyen opcionalmente otros elementos); etc.

Como se usa en la presente descripción en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "o" debe entenderse que tiene el mismo significado que "y/o" como se define anteriormente. Por ejemplo, al separar elementos en una lista, "o" o "y/o" se interpretará como inclusivo, es decir, la inclusión de al menos uno, pero también incluye más de uno, de un número o lista de elementos, y, opcionalmente, artículos adicionales no listados. Solo los términos que indiquen claramente lo contrario, como "solo uno de" o "exactamente uno de" o, cuando se utilicen en las reivindicaciones, "compuesto por", se referirán a la inclusión de exactamente un elemento de un número o lista de elementos. En general, el término "o" tal como se usa en la presente descripción solo se interpretará como una indicación de alternativas exclusivas (es decir, "uno o el otro, pero no ambos") cuando esté precedido por términos de exclusividad, como "cualquiera", "uno de", " solo uno de" o "exactamente uno de". "Que consistente esencialmente en", cuando se usa en las reivindicaciones, tendrá su significado ordinario tal como se usa en el campo de la ley de patentes.

Como se usa en la presente descripción en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la frase "al menos uno", en referencia a una lista de uno o más elementos, debe entenderse que significa al menos un elemento seleccionado de cualquiera o más de los elementos en el lista de elementos, pero sin incluir necesariamente al menos uno de todos y cada uno de los elementos enumerados específicamente en la lista de elementos y sin excluir ninguna combinación de elementos en la lista de elementos. Esta definición también permite que opcionalmente puedan estar presentes elementos distintos de los elementos específicamente identificados dentro de la lista de elementos a los que se refiere la frase "al menos uno", ya sea relacionado o no con esos elementos específicamente identificados. Por lo tanto, como ejemplo no limitativo, "al menos uno de A y B" (o, de manera equivalente, "al menos uno de A o B" o, de manera equivalente, "al menos uno de A y/o B") puede referirse, en una realización, a al menos uno, que incluye opcionalmente más de uno, A, sin presencia de B (y que incluye opcionalmente elementos distintos de B); en otra realización, a al menos uno, que incluye opcionalmente más de uno, B, sin A presente (y que incluye opcionalmente elementos distintos de A); en aún otra realización, a al menos uno, que incluye opcionalmente más de uno, A, y al menos uno, que incluye opcionalmente más de uno, B (y que incluye opcionalmente otros elementos); etc.

También debe entenderse que, a menos que se indique claramente lo contrario, en cualquier método descrito en la presente descripción que incluya más de un paso o acto, el orden de los pasos o actos del método no se limita necesariamente al orden en que los pasos o actos del método se recitan.

En las reivindicaciones, así como en la memoria descriptiva anterior, todas las frases de transición como "que comprende", "que incluye", "que lleva", "que tiene", " que contiene", " que involucra", " que sostiene", "compuesto de", y similares deben entenderse como abiertos, es decir, que significan que incluyen pero no se limitan a. Solo las frases de transición "que consisten en" y "que consisten esencialmente en" serán frases de transición cerradas o semicerradas.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un aparato (1000), que comprende:

una matriz (100) de sensores, cada sensor que comprende al menos un transistor de efecto de campo químicamente sensible (chemFET), cada uno de dichos chemFET que tiene una estructura de puerta flotante (170) y una capa de pasivación (172) localizada sobre dichas estructuras de puerta flotante (170), dicha estructura de puerta flotante (170) que comprende una capa de metal superior (304);

una pluralidad de micropozos que definen una pluralidad de cavidades con un micropozo dispuesto sobre cada una de dichas estructuras de puerta flotante (170), dichas cavidades tienen un tamaño y forma capaces de retener el analito en estas, y

una capa de primer material dispuesta sobre dichos chemFET, en la que dichos micropozos se forman en dicho primer material y tienen una configuración de paredes laterales con una capa delgada de metal (75E4) sobre dicha configuración de paredes laterales, dicha capa delgada de metal (75E4) que está en contacto con dicha capa de metal superior (304) de dichas estructuras de puerta flotante (170) y que se retiran de las partes superiores de la matriz de micropozos, y dicha capa delgada de metal (75E4) y dicha capa de metal superior (304) están recubiertas por dicha capa de pasivación (172),

en la que dicha capa de pasivación (172) tiene al menos una primera capa de detección de óxido de metal.

2. El aparato (1000) de la reivindicación 1, en el que dicho primer material es óxido de TEOS que forma los lados de dicho micropozo.

3. El aparato (1000) de la reivindicación 1, donde dicha capa de pasivación (172) tiene al menos una segunda capa de óxido de metal (172B), en el que dicha primera capa de óxido de metal (172A) y dicha segunda capa de óxido de metal (172B) se forman usando diferentes metales.

4. El aparato (1000) de la reivindicación 3, en el que dicha primera capa de óxido de metal (172A) es AhO3 y dicha segunda capa de óxido de metal (172B) es Ta2O5.

5. El aparato (1000) de la reivindicación 4, en el que dicha capa de pasivación comprende una serie de capas alternas de AhO3 y Ta2O5, dicha serie comienza con una capa de AhO3 más cercana a dicha estructura de puerta flotante (170) y termina con una capa de Ta2O5 que se forma más alejada de dicha estructura de puerta flotante (170) dentro de dicha serie de capas alternas.

6. El aparato (1000) de la reivindicación 5, en el que dicha capa de AhO3 que comienza dicha serie de capas alternas de AhO3 y Ta2O5 se adhiere a dicha estructura de puerta flotante (170) y dicha capa de Ta2O5 que termina dicha serie de capas alternas de AhO3 y Ta2O5 se orienta hacia dichas cavidades.

7. El aparato (1000) de la reivindicación 1, en el que dicha capa de pasivación (172) incluye al menos un miembro del grupo de SiO2, Si3N4, HfO3, WO3, AhO3, Ta2O5, o un material súper-nernstiano y mezclas de los mismos.

8. El aparato (1000) de la reivindicación 1, en el que dicha capa de metal delgada está formada por metal dorado o plateado sobre dicha configuración de paredes laterales.

9. El aparato (1000) de la reivindicación 3, en el que dicha primera capa de óxido de metal (172A) es un óxido de aluminio que se forma permitiendo que se oxide una capa de aluminio.

10. El aparato (1000) de la reivindicación 3, en el que dicha primera capa de óxido de metal (172A) es AhO3, dicha segunda capa de óxido de metal (172B) es Ta2O5 y dicha capa de pasivación está formada como una serie de laminados de dicha primera capa de óxido de metal (172A) y dicha segunda capa de óxido de metal (172B) en el que cada uno de dichos laminados tiene un grosor seleccionado del grupo de grosores de: capas de menos de aproximadamente 2,5 nm, menos de aproximadamente 5,0 nm o capas de menos de aproximadamente 10 nm, y sus combinaciones.