ES2928363T3 - Cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado y procedimiento para producir el mismo - Google Patents

Cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado y procedimiento para producir el mismo Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a cristales de trisulfuro de glutatión dihidrato ya un método para producirlos. De acuerdo con la presente invención, por ejemplo, al concentrar una solución en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión y luego recoger los cristales del dihidrato de trisulfuro de glutatión precipitado, se pueden proporcionar dichos cristales. La presente invención también se refiere a un método simple para producir polisulfuro en un solvente acuoso donde no se usa sulfuro de hidrógeno pero se usa tiosulfato, produciéndose el polisulfuro agitando o dejando reposar una solución en la que un compuesto que tiene un grupo tiol o un disulfuro enlace y un tiosulfato se disuelven. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado y procedimiento para producir el mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere a un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado y a un procedimiento para producir el mismo.
Técnica anterior
El trisulfuro de glutatión, que es un tipo de trisulfuro, es conocido como un análogo del glutatión oxidado (documento distinto de patente 1). El trisulfuro de glutatión se reduce por la glutatión reductasa in vivo, y en ese momento se genera sulfuro de hidrógeno (documento distinto de patente 2). El sulfuro de hidrógeno generado activa la y -glutamilcisteína sintasa, y la Y-glutamilcisteína sintasa activada incrementa un nivel de glutatión in vivo (documento distinto de patente 3).
Puesto que el glutatión tiene un efecto antioxidante, cuando se incrementa el nivel de glutatión in vivo, es posible proteger eficazmente las células de las especies de peróxido y oxígeno activo. A partir del efecto anterior, en los últimos años, se ha esperado cada vez más que el trisulfuro de glutatión sea un componente antioxidante.
Como procedimiento para preparar trisulfuro de glutatión, es conocido un procedimiento de síntesis química en el que se hace reaccionar disulfuro de carbono con glutatión oxidado en condiciones básicas (documento distinto de patente 2). Y como procedimiento para purificar el trisulfuro de glutatión, son conocidos un procedimiento de obtención de un concentrado de trisulfuro de glutatión por una técnica tal como cromatografía de líquidos de alta velocidad (documento distinto de patente 2) y un procedimiento de separación que usa una resina de intercambio iónico y una resina de adsorción sintética por un lecho mixto (documento distinto de patente 4). En los procedimientos descritos en los documentos distintos de patentes 2 y 4, el trisulfuro de glutatión sintetizado y purificado se recogió por liofilización.
Al igual que el trisulfuro de glutatión, un compuesto que tiene una estructura en la que están conectados una pluralidad de átomos de azufre se denomina polisulfuro. Como procedimiento para producir polisulfuro, hasta ahora se ha informado mucho sobre un procedimiento para producir polisulfuro de alquilo (documento distinto de patente 5). El polisulfuro de alquilo se usa ampliamente como agente de sulfuración preliminar, inhibidor de refinación de coque y aditivo de aceite lubricante. El polisulfuro de alquilo es un compuesto hidrófobo y tiene una solubilidad en agua sumamente baja. Por lo tanto, como procedimiento de fabricación de polisulfuro de alquilo, muchos procedimientos han usado un disolvente orgánico como disolvente.
En el documento distinto de patente 6 se sintetizó trisulfuro de tripanotiona de acuerdo con dos estrategias. Se descubrió que se reconoció y redujo por la tripanotiona reductasa como sustrato de disulfuro natural. A diferencia del mecanismo observado para la reducción del trisulfuro de glutatión por la glutatión reductasa, el persulfuro de tripanotiona intermedio se redujo rápidamente.
Técnica relacionada
Documento distinto de patente
Documento distinto de patente 1: Biochem. Biophys. Res. Commun. 42, 730-738, 1971
Documento distinto de patente 2: Biochem. Biophys. Res. Commun., 202, 1380-1386, 1994
Documento distinto de patente 3: FASEB J., 18, 1165-1167, 2004
Documento distinto de patente 4: J. Chromatogr., 59, 181-184, 1971
Documento distinto de patente 5: David A. Atwood, M. Kamruz Zaman, "Sulfur: Organic Polysulfanes", Encyclopedia of Inorganic Chemistry, John Wiley & Sons, Ltd., 2006
Documento distinto de patente 6: Moutiez M. et al., "Compared recognition of di- and trisulfide substrates by glutathione and trypanothione reductases", BBA - General Subjects, 19/10/1995, páginas 161 - 166.
Divulgación de la invención
Problemas que se van a resolver por la invención
Sin embargo, el trisulfuro de glutatión obtenido por liofilización descrito en los documentos distintos de patentes 2 y 4 no es cristalino, y hasta el momento no existe ningún informe relacionado con un cristal de trisulfuro de glutatión y un procedimiento para producir el mismo.
Además, se divulga que en el procedimiento conocido convencionalmente para producir polisulfuro de alquilo, a menudo se usaba un disolvente orgánico como disolvente, y teniendo el polisulfuro hidrófilo una baja solubilidad no se podía producir eficazmente en un disolvente orgánico. En un procedimiento para producir polisulfuro usando un disolvente acuoso, a menudo se usaba un gas tóxico tal como sulfuro de hidrógeno y sulfuro de cloro, o a menudo se usaba un compuesto inestable que tenía el riesgo de generar un gas tóxico.
Se divulga que se ha requerido un procedimiento simple para producir polisulfuro en un disolvente acuoso, que no use un gas tóxico o use un compuesto estable.
En consecuencia, la presente invención tiene como objetivo proporcionar un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado y un procedimiento para producir el mismo.
Medios para resolver los problemas
La presente invención se refiere a las siguientes (1) a (10).
(1) Un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado.
(2) El cristal de acuerdo con (1) anterior, que tiene picos en ángulos de difracción (20°) de 30,5° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 17,7° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 17,5° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° y 21,2° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° en difracción de rayos X en polvo, en la que se usa CuKa como fuente de rayos X. (3) El cristal de acuerdo con (2) anterior, que además tiene picos en ángulos de difracción (20°) de 25,3° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 21,5° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 21,8° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° y 19,0° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° en difracción de rayos X de polvo.
(4) El cristal de acuerdo con (3) anterior, que además tiene picos en ángulos de difracción (20°) de 19,2° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 12,1° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 25,0° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° y 20,3° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° en difracción de rayos X de polvo.
(5) El cristal de acuerdo con (4) anterior, que además tiene picos en ángulos de difracción (20°) de 20,6° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 29,7° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 9,5° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° y 14,4° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° en difracción de rayos X de polvo.
(6) El cristal de acuerdo con (5) anterior, que además tiene picos en ángulos de difracción (20°) de 27,3° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 19,5° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 16,5° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° y 25,8° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° en difracción de rayos X de polvo.
(7) El cristal de acuerdo con (6) anterior, que además tiene picos en ángulos de difracción (20°) de 11,9° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 23,2° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° y 30,0° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° en difracción de rayos X de polvo.
(8) El cristal de acuerdo con una cualquiera de (1) a (7) anteriores, que tiene los siguientes parámetros de celda unitaria aproximados cuando se mide a -173 °C en análisis de estructura de rayos X de monocristal: a = 5,3777 A; b = 9,4390 A; c = 14,7822 A; a = 82,833°; p = 89,101°; y = 89,392°; V = 744,37 A3; Z = 1, y tiene un grupo espacial PI, en el que CuKa se usa como fuente de rayos X.
(9) Un procedimiento para producir un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado, que comprende una etapa de precipitación de un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en una solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión, y una etapa de recogida del cristal precipitado de trisulfuro de glutatión dihidratado; en el que el procedimiento comprende además una etapa de preparación de la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión dejando reposar o agitando una solución acuosa en la que se disuelven el glutatión oxidado y tiosulfato, antes de la etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión.
(10) El procedimiento de producción de acuerdo con (9) anterior, en el que la etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión, es una etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado concentrando la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión.
Breve descripción de los dibujos
[Fig. 1] La fig. 1 representa una correlación entre el pH de la solución acuosa de glutatión oxidado y la eficacia de generación de trisulfuro de glutatión, obtenida en el ejemplo 1. El eje vertical representa una concentración de trisulfuro de glutatión (g/l), y el eje horizontal representa el tiempo de agitación (tiempo).
[Fig. 2] La fig. 2 representa los resultados de la difracción de rayos X de polvo de un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado obtenido en el ejemplo 2. El eje vertical representa la intensidad (cps), y el eje horizontal representa un ángulo de difracción 20 (°).
[Fig. 3] La fig. 3 representa los resultados del análisis de espectroscopia infrarroja (IR) del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado obtenido en el ejemplo 2. El eje vertical representa la transmitancia de luz (%T) y el eje horizontal representa un número de onda (1/cm).
Modos de realización para llevar a cabo la invención
1. Cristal de la presente invención
El cristal de la presente invención es un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado.
Se puede confirmar que el cristal es un cristal de trisulfuro de glutatión, por ejemplo, por análisis usando HPLC. Las condiciones de análisis en el análisis usando HPLC, por ejemplo, pueden incluir las siguientes condiciones.
Columna: Inertsil ODS-3 $ 3,0 * 150 mm 3 pm (fabricada por GL Sciences Inc.)
Temperatura de columna: 35 °C
Velocidad de flujo: 0,5 ml/min
Eluyente: una solución de metanol al 3 % que contiene 1 -heptanosulfonato de sodio al 0,2 % y dihidrogenofosfato de potasio al 6,8 % (ajustado a pH 3,0 con ácido fosfórico)
Detector: Detector UV (longitud de onda 210 nm)
Se puede confirmar que el cristal es un cristal de trisulfuro de glutatión también por análisis por difracción de rayos X de polvo.
El análisis por difracción de rayos X de polvo se puede realizar, por ejemplo, usando un difractómetro de rayos X de polvo (XRD) Ultima IV (fabricado por Rigaku Corporation), y usando CuKa como fuente de rayos X, de acuerdo con las instrucciones para su uso adjuntas.
Se puede confirmar que el cristal de trisulfuro de glutatión es un cristal dihidratado, por el procedimiento de Karl-Fischer o análisis térmico diferencial termogravimétrico, por el hecho de que el contenido de humedad en el cristal es en general 5,3 ± 1,0 % en peso, preferentemente 5,3 ± 0,5 % en peso y más preferentemente 5,3 ± 0,3 % en peso. El análisis diferencial termogravimétrico, por ejemplo, se puede realizar midiendo un cambio de peso y un diferencial térmico de 30 °C a 200 °C (tasa de cambio de temperatura: 10 °C/min) usando EXSTAR 6000 (fabricado por Seiko Instruments Inc.), de acuerdo con las instrucciones para su uso adjuntas.
Los ejemplos del cristal de la presente invención pueden incluir un cristal que tiene picos en ángulos de difracción (20°) descritos en el siguiente (i) en la difracción de rayos X de polvo usando CuKa como fuente de rayos X, preferentemente un cristal que tiene picos en ángulos de difracción (29°) descritos en los siguientes (i) y (ii), más preferentemente un cristal que tiene picos en ángulos de difracción (29°) descritos en los siguientes (i) a (iii), más preferentemente un cristal que tiene un pico en ángulos de difracción (20°) descritos en los siguientes (i) a (iv), en particular preferentemente un cristal que tiene picos en ángulos de difracción (20°) descritos en los siguientes (i) a (v) y lo más preferentemente un cristal que tiene picos en ángulos de difracción (20°) descritos en los siguientes (i) a (vi).
(i) 30,5° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 17,7° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 17,5° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° y 21,2° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°
(ii) 25,3° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 21,5° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 21,8° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° y 19,0° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°
(iii) 19,2° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 12,1° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 25,0° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° y 20,3° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°
(iv) 20,6° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 29,7° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 9,5° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° y 14,4° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°
(v) 27,3° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 19,5° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 16,5° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° y 25,8° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°
(vi) 11,9° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°, 23,2° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1° y 30,0° ± 0,2°, preferentemente ± 0,1°
Los ejemplos específicos del cristal de la presente invención pueden incluir un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado, en el que un patrón de difracción de rayos X de polvo que usa CuKa como fuente de rayos X se define por un patrón mostrado en la fig. 2 y por los valores del ángulo de difracción mostrados en la tabla 2, y un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado, en el que un patrón de difracción de rayos X de polvo que usa CuKa como fuente de rayos X se define por los valores del ángulo de difracción mostrados en la tabla 3.
Además, cuando se proporciona para el análisis de espectroscopia infrarroja (IR), el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado que muestra el espectro de absorción infrarrojo mostrado en la fig. 3 también se puede incluir como un ejemplo específico del cristal de la presente invención.
El análisis de espectroscopia infrarroja (IR), por ejemplo, se puede realizar usando el tipo FTIR-8400 (fabricado por Shimadzu Corporation) de acuerdo con las instrucciones para su uso adjuntas.
Además, por ejemplo, cuando se mide en un análisis de estructura de rayos X de monocristal a aproximadamente -173 °C, el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado que tiene dimensiones de celda unitaria: a = 5,3777 A; b = 9,4390 A; c = 14,7822 A; a = 82,833°; (3 = 89,101°; y = 89,392°; V = 744,37 A3; Z = 1, y que tiene un grupo espacial PI, también se puede incluir como un ejemplo del cristal de la presente invención.
Los ejemplos más específicos pueden incluir un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado que muestra diversos resultados mostrados en la tabla 6 cuando se realiza el análisis de estructura de rayos X de monocristal.
El análisis de estructura de rayos X de monocristal se puede realizar, por ejemplo, usando R-AXIS RAPD-F (fabricado por Rigaku Corporation) de acuerdo con las instrucciones para su uso.
Específicamente, por ejemplo, se fija un monocristal de trisulfuro de glutatión dihidratado a un difractómetro y se mide una imagen de difracción usando rayos X que tienen una longitud de onda predeterminada en la atmósfera a temperatura ambiente o una corriente de gas inerte a una temperatura predeterminada. Se obtiene una estructura monocristalina por la determinación de estructura por un procedimiento directo y el refinamiento de estructura por un procedimiento de mínimos cuadrados, a partir de una combinación del índice de plano y la intensidad de difracción calculada a partir de la imagen de difracción.
2. Procedimiento para producir el cristal de la presente invención
El procedimiento para producir el cristal de la presente invención es un procedimiento para producir un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado, que comprende una etapa de precipitación de un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en una solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión, y una etapa de recogida del cristal precipitado de trisulfuro de glutatión dihidratado, en el que el procedimiento comprende además una etapa de preparación de la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión dejando reposar o agitando una solución acuosa en la que se disuelven el glutatión oxidado y tiosulfato, antes de la etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión.
El trisulfuro de glutatión contenido en la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión se puede producir por cualquier procedimiento de producción tal como un procedimiento de reacción del glutatión oxidado y tiosulfato en una solución acuosa y otros procedimientos de síntesis química, un procedimiento de fermentación, un procedimiento enzimático y un procedimiento de extracción de materia natural.
Cuando la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión contiene material sólido que puede ser un obstáculo para la cristalización, se puede retirar el material sólido usando separación centrífuga, filtración, un filtro cerámico o similares.
Además, cuando la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión contiene impurezas o sales solubles en agua que pueden ser un obstáculo para la cristalización, es posible retirar las impurezas o sales solubles en agua pasando a través de una columna rellena con una resina de intercambio iónico o similares.
Además, cuando la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión contiene impurezas hidrófobas que pueden ser un obstáculo para la cristalización, es posible retirar las impurezas hidrófobas pasándolas a través de una columna rellena con una resina de adsorción sintética, carbón activado o similares.
La solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión para su uso en el procedimiento para producir un cristal de la presente invención se ajusta y se usa preferentemente de modo que la concentración de trisulfuro de glutatión sea en general de 0,1 g/l o más y preferentemente de 0,5 g/l o más.
La etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en la solución acuosa se puede realizar, por ejemplo, concentrando la solución acuosa, enfriando la solución acuosa, añadiendo o goteando una solución de alcohol en la solución acuosa o similares.
Además, por ejemplo, la concentración de la solución acuosa, el enfriamiento de la solución acuosa, la adición o goteo de la solución de alcohol en la solución acuosa y similares también se pueden realizar en combinación de uno o más.
Cuando la solución acuosa se concentra, por ejemplo, se puede usar un procedimiento de concentración general tal como un procedimiento de concentración por calentamiento o un procedimiento de concentración a presión reducida.
Los ejemplos de una temperatura de la solución acuosa en caso de concentración por calentamiento de la solución acuosa pueden incluir en general de 40 °C a 80 °C, preferentemente de 40 °C a 70 °C y lo más preferentemente de 40 °C a 60 °C.
El tiempo requerido para la concentración en el caso de concentración por calentamiento de la solución acuosa varía con la concentración de trisulfuro de glutatión en la solución acuosa y la temperatura de la solución acuosa, pero puede ser el tiempo para que el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado precipite en la solución acuosa. Los expertos en la técnica pueden establecerlo apropiadamente, por ejemplo, en un intervalo en general de 2 a 100 horas, preferentemente de 3 a 70 horas y lo más preferentemente de 5 a 50 horas.
Los ejemplos de una temperatura de la solución acuosa cuando la solución acuosa se concentra a presión reducida pueden incluir en general de 10 °C a 60 °C, preferentemente de 20 °C a 55 °C y lo más preferentemente de 30 °C a 50 °C.
El tiempo requerido para la concentración en el caso de la concentración a presión reducida de la solución acuosa varía con la concentración de trisulfuro de glutatión en la solución acuosa y la temperatura de la solución acuosa, pero puede ser el tiempo para que el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado precipite en la solución acuosa. Específicamente, por ejemplo, es preferente un intervalo en general de 2 a 100 horas, preferentemente de 3 a 70 horas y lo más preferentemente de 5 a 50 horas.
Específicamente, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 2 más adelante, cuando una solución acuosa en la que se disuelve trisulfuro de glutatión que tiene una concentración de 0,56 g/l se concentra a presión reducida, el cristal de la presente invención puede precipitar por concentración a presión reducida a preferentemente de 40 a 50 °C, preferentemente durante 10 horas.
La temperatura de la solución acuosa y el tiempo requeridos para el enfriamiento de la solución acuosa en el caso de enfriamiento de la solución acuosa varían con la concentración de trisulfuro de glutatión en la solución acuosa, pero pueden ser las condiciones en las que precipita el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en la solución acuosa. Específicamente, por ejemplo, la temperatura de la solución acuosa está preferentemente en un intervalo en general de 0 a 15 °C, preferentemente de 0 a 10 °C y lo más preferentemente de 0 a 5 °C. Además, por ejemplo, el tiempo requerido para el enfriamiento es en general de 6 horas a 8 días, preferentemente de 12 horas a 7 días y lo más preferentemente de 24 horas a 6 días.
Cuando se añade o gotea una solución de alcohol en la solución acuosa, la solución de alcohol puede ser una mezcla de diversos tipos de alcohol, o una mezcla de alcohol y otro disolvente orgánico o agua.
Cuando la solución de alcohol es una mezcla de alcohol y agua (a continuación en el presente documento también denominada solución acuosa de alcohol), los ejemplos de alcohol pueden incluir preferentemente alcoholes de C1 a C6, más preferentemente alcoholes de C1 a C3, todavía más preferentemente alcoholes seleccionados del grupo que consiste en metanol, etanol, n-propanol y alcohol isopropílico, incluso más preferentemente metanol o etanol y lo más preferentemente metanol.
Además, cuando la solución de alcohol es una solución acuosa de alcohol, los ejemplos de contenido de humedad pueden incluir en general un 40 % en peso o menos, preferentemente un 20 % en peso o menos, más preferentemente un 10 % en peso o menos y lo más preferentemente un 5 % en peso o menos.
Cuando la solución de alcohol se añade o gotea en la solución acuosa, la temperatura de la solución acuosa, la cantidad de la solución de alcohol que se gotea o añade y el tiempo requerido para añadir o gotear la solución de alcohol varían con la concentración de trisulfuro de glutatión en la solución acuosa, pero pueden ser las condiciones en las que precipita el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en la solución acuosa. Específicamente, por ejemplo, la temperatura de la solución acuosa está preferentemente en un intervalo en general de 0 a 40 °C, preferentemente de 0 a 35 °C y lo más preferentemente de 5 a 30 °C. Además, por ejemplo, la cantidad de la solución de alcohol que se añade o gotea está preferentemente en un intervalo en general de una cantidad igual de 0,1 a 100 veces, preferentemente una cantidad igual de 0,1 a 10 veces y lo más preferentemente una cantidad igual de 0,1 a 3 veces de la solución acuosa. Además, por ejemplo, el tiempo requerido para añadir o gotear la solución de alcohol está preferentemente en un intervalo en general de 1 minuto a 24 horas, preferentemente de 1 minuto a 10 horas y lo más preferentemente de 1 a 7 horas.
En el procedimiento para producir un cristal de la presente invención, se puede añadir un cristal semilla inmediatamente antes de comenzar la etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en la solución acuosa, o antes de que precipite el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en la etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en la solución acuosa.
Como cristal semilla, por ejemplo, se puede usar el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado obtenido por el procedimiento para producir un cristal de la presente invención.
El cristal semilla se añade de modo que la concentración del mismo en la solución acuosa sea en general de 0,001 a 50 g/l, preferentemente de 0,01 a 5 g/l.
Cuando el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado precipita añadiendo o goteando la solución de alcohol en la solución acuosa, el tiempo para añadir el cristal semilla se puede establecer, por ejemplo, en un intervalo en general de 0 a 12 horas, preferentemente de 0 a 8 horas y lo más preferentemente de 0 a 4 horas después de comenzar la adición o goteo de la solución de alcohol.
Después de precipitar el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado por el procedimiento anterior, el cristal precipitado se puede envejecer durante en general de 1 a 48 horas, preferentemente de 1 a 24 horas y lo más preferentemente de 1 a 12 horas.
El envejecimiento del cristal se refiere al crecimiento del cristal deteniendo la etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado.
El crecimiento del cristal se refiere a incrementar el cristal comenzando a partir del cristal precipitado.
El envejecimiento del cristal se realiza principalmente para hacer crecer el cristal, pero se puede precipitar un nuevo cristal simultáneamente con el crecimiento del cristal.
Detener la etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado, por ejemplo, se refiere a detener la adición o goteo de la solución de alcohol cuando el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado precipita añadiendo o goteando la solución de alcohol en la solución acuosa.
Después de que se envejece el cristal, se puede reanudar la etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado.
En la etapa de recogida del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado, por ejemplo, se puede realizar filtración, filtración a presión, filtración por succión, separación centrífuga y similares. Además, para reducir la adhesión de las aguas madres al cristal y mejorar la calidad del cristal, el cristal se puede lavar apropiadamente después de recoger el cristal.
Como solución usada para el lavado del cristal, por ejemplo, se puede usar una solución obtenida mezclando uno o más tipos seleccionados del grupo que consiste en agua, metanol, etanol, acetona, n-propanol y alcohol isopropílico en una proporción arbitraria.
El cristal de la presente invención se puede obtener secando un cristal húmedo obtenido de esta manera.
Las condiciones de secado no están en particular limitadas siempre que se pueda mantener una forma del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado y, por ejemplo, se pueda aplicar secado a presión reducida, secado al vacío, secado en lecho fluidizado, secado por ventilación y similares.
La temperatura de secado puede estar en cualquier intervalo siempre que se pueda retirar la humedad adhesiva o la solución, y los ejemplos de la misma pueden incluir preferentemente 80 °C o menos, más preferentemente 70 °C o menos y lo más preferentemente 60 °C o menos.
Los ejemplos de tiempo de secado pueden incluir preferentemente de 1 a 60 horas y más preferentemente de 1 a 48 horas.
El procedimiento para producir un cristal de la presente invención comprende una etapa de preparación de una solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión dejando reposar o agitando una solución acuosa en la que se disuelven el glutatión oxidado y tiosulfato, antes de la etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión.
El trisulfuro de glutatión se genera haciendo reaccionar el glutatión oxidado y tiosulfato dejando reposar o agitando la solución acuosa en la que se disuelven el glutatión oxidado y el tiosulfato.
El glutatión oxidado usado en la etapa anterior puede ser una forma amorfa no cristalina o un cristal; y cuando es un cristal, puede ser un anhídrido o puede contener agua hidratada.
El tiosulfato usado en la etapa anterior no está en particular limitado, y los ejemplos del mismo pueden incluir tiosulfato de sodio y tiosulfato de amonio, preferentemente tiosulfato de sodio.
El tiosulfato usado en la etapa anterior puede ser anhídrido o puede contener agua hidratada.
Los ejemplos de una concentración de glutatión oxidado en la solución acuosa en la etapa anterior pueden incluir en general 1 g/l o más, preferentemente 5 g/l o más y más preferentemente 10 g/l o más.
Los ejemplos de una concentración de tiosulfato en la solución acuosa en la etapa anterior pueden incluir en general 0,1 g/l o más, preferentemente 0,5 g/l o más y más preferentemente 1 g/l o más.
Los ejemplos de una temperatura de la solución acuosa en la etapa anterior pueden incluir en general de 5 a 40 °C y preferentemente de 10 a 30 °C.
Los ejemplos de pH de la solución acuosa en la etapa anterior pueden incluir un pH en general de 2 a 4.
Los ejemplos de tiempo para dejar reposar o agitar la solución acuosa en la que se disuelven el glutatión oxidado y el tiosulfato en la etapa anterior pueden incluir en general de 2 a 48 horas, preferentemente de 5 a 36 horas y más preferentemente de 8 a 24 horas.
Cuando la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión preparado por la etapa anterior contiene material sólido que puede ser un obstáculo para la cristalización, cuando contiene impurezas y sales solubles en agua que pueden ser un obstáculo para la cristalización y cuando contiene impurezas hidrófobas que pueden ser un obstáculo para la cristalización, las impurezas se pueden retirar como se describe anteriormente.
Específicamente, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 2 más adelante, la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión preparado por el procedimiento descrito anteriormente se filtra para retirar material sólido tal como azufre, y a continuación el filtrado se pasa a través de una columna rellena con una resina de adsorción sintética, en consecuencia, se puede preparar una solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión que tiene una alta pureza.
Se puede obtener un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado que tiene una alta pureza por el procedimiento anterior.
Los ejemplos de la pureza del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado pueden incluir en general un 93 % o más, preferentemente un 94 % o más, más preferentemente un 95 % o más y lo más preferentemente un 96 % o más. La pureza del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado se puede confirmar, por ejemplo, por análisis usando HPLC de la misma manera que en el punto 1 anterior.
Los ejemplos del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado que se puede producir por el procedimiento de producción anterior, por ejemplo, pueden incluir un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en el que se prescribe un patrón de difracción de rayos X de polvo usando CuKa como fuente de rayos X por un patrón mostrado en la fig. 2 y los valores del ángulo de difracción mostrados en la tabla 2, y un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en el que se prescribe un patrón de difracción de rayos X de polvo usando CuKa como fuente de rayos X por los valores del ángulo de difracción mostrados en la tabla 3.
Además, cuando se proporciona para el análisis de espectroscopia infrarroja (IR), el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado que muestra el espectro de absorción infrarrojo mostrado en la fig. 3 también se puede incluir como un ejemplo específico del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado que se puede producir por el procedimiento de producción anterior.
Además, el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado que muestra diversos resultados mostrados en la tabla 6 por análisis de estructura de rayos X de monocristal también se puede incluir como un ejemplo específico del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado que se puede producir por el procedimiento de producción anterior.
3. Procedimiento para producir polisulfuro (pertinente para la invención reivindicada en lo que respecta al trisulfuro de glutatión)
Además, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para producir polisulfuro, que comprende una etapa de dejar reposar o agitar una solución acuosa en la que se disuelven un compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro y tiosulfato.
El polisulfuro se refiere a un compuesto que contiene un gran número de átomos de azufre continuos representados por la siguiente fórmula general (I):
Fórmula (I) R-Sn-R
(en la que n representa cualquier número natural igual o mayor que 3, preferentemente cualquier número natural de 3 a 10, más preferentemente cualquier número natural de 3 a 6 y lo más preferentemente 3 o 4; además, R representa una composición obtenida retirando un átomo de hidrógeno de un compuesto arbitrario; y en R, un átomo de azufre está enlazado a un átomo de carbono de R).
Los ejemplos específicos de R, por ejemplo, pueden incluir una composición (C10H16N3O6) obtenida retirando un átomo de hidrógeno de un grupo tiol de glutatión reducido, una composición (C5H8NO3) obtenida retirando un átomo de hidrógeno de un grupo tiol de N-acetil-L-cisteína y una composición (C3H6NO2) obtenida retirando un átomo de hidrógeno de un grupo tiol de L-cisteína.
En la presente divulgación, un polisulfuro no está en particular limitado, pero es preferentemente un polisulfuro hidrófilo.
En la presente memoria descriptiva, el "polisulfuro hidrófilo" se refiere a polisulfuro en el que la concentración de polisulfuro cuando el polisulfuro se disuelve en agua puede ser de 0,1 g/l o más.
Los ejemplos específicos de polisulfuro hidrófilo, por ejemplo, pueden incluir trisulfuro de glutatión (C10H16N3O6-S3-C10H16N3O6), tetrasulfuro de glutatión (C10H16N3O6-S4-C10H16N3O6), pentasulfuro de glutatión (C10H16N3O6-S5-C10H16N3O6), trisulfuro de N-acetil-L-cisteína (C5H8NO3-S3-C5H8NO3), tetrasulfuro de N-acetil-L-cisteína (C5H8NO3-S4-C5H8NO3), pentasulfuro de N-acetil-L-cisteína (C5H8NO3-S5-C5H8NO3) y hexasulfuro de N-acetil-L-cisteína (C5H8NO3-S6-C5H8NO3), preferentemente trisulfuro de glutatión, trisulfuro de N-acetil-L-cisteína y tetrasulfuro de N-acetil-L-cisteína.
El tiosulfato no está en particular limitado y los ejemplos del mismo pueden incluir tiosulfato de sodio y tiosulfato de amonio, preferentemente tiosulfato de sodio. La sal de tiosulfato puede ser un anhídrido o puede contener agua hidratada.
El compuesto que tiene un grupo tiol se refiere a un compuesto representado por la siguiente fórmula general (II):
Fórmula (II) R-S-H
(en la que, R representa una composición obtenida retirando un átomo de hidrógeno de un compuesto arbitrario; y, en R, un átomo de azufre está enlazado a un átomo de carbono de R).
El compuesto que tiene un enlace disulfuro se refiere a un compuesto representado por la siguiente fórmula general
Fórmula (III) R-S-S-R
(en la que, R representa una composición obtenida retirando un átomo de hidrógeno de un compuesto arbitrario; y en R, un átomo de azufre está enlazado a un átomo de carbono de R).
Los ejemplos específicos de un compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro, por ejemplo, pueden incluir preferentemente glutatión oxidado y glutatión reducido, y más preferentemente glutatión oxidado, cuando polisulfuro de glutatión, más específicamente al menos uno seleccionado de trisulfuro de glutatión, tetrasulfuro de glutatión y pentasulfuro de glutatión, se produce como el polisulfuro. Cuando se usa glutatión oxidado como el compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro, el glutatión oxidado puede ser una forma amorfa no cristalina o un cristal, cuando es un cristal, puede no estar hidratado o puede contener agua hidratada.
Además, por ejemplo, cuando un polisulfuro de N-acetil-L-cisteína, más específicamente al menos uno seleccionado de trisulfuro de N-acetil-L-cisteína, tetrasulfuro de N-acetil-L-cisteína, pentasulfuro de N-acetil-L-cisteína y hexasulfuro de N-acetil-L-cisteína, se produce como el polisulfuro, los ejemplos específicos pueden incluir preferentemente disulfuro de N-acetil-L-cisteína y N-acetil-L-cisteína, más preferentemente disulfuro de N-acetil-L-cisteína.
Los expertos en la técnica pueden establecer apropiadamente una concentración del compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro, una concentración de tiosulfato y el pH de una solución acuosa de reacción en una solución acuosa de reacción cuando el polisulfuro se produce por el procedimiento de la presente divulgación de acuerdo con el compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro para su uso.
Cuando se usa glutatión oxidado como el compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro, los ejemplos de una concentración de glutatión oxidado en una solución acuosa en la que se disuelven el compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro y tiosulfato pueden incluir en general 1 g/l o más, preferentemente 5 g/l o más y más preferentemente 10 g/l o más.
Cuando se usa glutatión oxidado como el compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro, los ejemplos de una concentración de tiosulfato en la solución acuosa pueden incluir en general 0,1 g/l o más, preferentemente 0,5 g/l o más y más preferentemente 1 g/l o más.
Cuando se usa glutatión oxidado como el compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro, los ejemplos del pH de la solución acuosa en general pueden incluir un pH de 2 a 4.
Cuando se usa disulfuro de N-acetil-N-cisteína como el compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro, los ejemplos de una concentración de disulfuro de N-acetil-N-cisteína en una solución acuosa en la que se disuelven el compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro y tiosulfato, puede incluir en general 10 g/l o más, preferentemente 30 g/l o más y más preferentemente 50 g/l o más.
Cuando se usa disulfuro de N-acetil-N-cisteína como el compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro, los ejemplos de una concentración de tiosulfato en la solución acuosa pueden incluir en general 1 g/l o más, preferentemente 5 g/l o más y más preferentemente 10 g/l o más.
Cuando se usa disulfuro de N-acetil-N-cisteína como el compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro, los ejemplos del pH de la solución acuosa pueden incluir en general un pH de 1,5 a 4.
Los ejemplos de una temperatura para dejar reposar o agitar la solución acuosa en la que se disuelven el compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro y tiosulfato pueden incluir en general de 5 a 40 °C, preferentemente de 10 a 30 °C.
Los ejemplos de tiempo para dejar reposar o agitar la solución acuosa en la que se disuelven el compuesto que tiene un grupo tiol o un enlace disulfuro y tiosulfato pueden incluir en general de 2 a 48 horas, preferentemente de 5 a 36 horas y más preferentemente de 8 a 24 horas.
Por las etapas anteriores, el polisulfuro se puede producir fácilmente en un disolvente acuoso sin usar sulfuro de hidrógeno.
Cuando la solución acuosa en la que se disuelve el polisulfuro preparado por las etapas anteriores contiene material sólido y cuando contiene impurezas distintas del polisulfuro objetivo, el polisulfuro objetivo se puede aislar y purificar por filtración, separación centrífuga, cromatografía usando una resina de adsorción sintética o una resina de intercambio iónico y similares.
Ejemplos
A continuación en el presente documento se muestran ejemplos, pero la presente invención no se limita a los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 (pertinente para la invención reivindicada en lo que respecta al trisulfuro de glutatión)
Producción de polisulfuro de glutatión
Se usaron diversos compuestos que contienen azufre y glutatión oxidado para estudiar la generación de polisulfuro de glutatión.
Se disolvió en agua glutatión oxidado (fabricado por Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.) y se ajustó hasta 100 g/l, y se le añadió al mismo sulfato de sodio, sulfito de sodio, hidrogenosulfito de sodio, tiosulfato de sodio, ácido sulfúrico o ácido sulfuroso de modo que sus concentraciones molares fueran las mismas que las del glutatión oxidado, seguido de agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 40 horas. Se midió la concentración de trisulfuro de glutatión en la solución 0 horas, 16 horas y 41 horas después del inicio de la agitación. La concentración de trisulfuro de glutatión (g/l) para cada tiempo transcurrido cuando se añadió cada compuesto se muestra en la tabla 1.
[Tabla 1]
Figure imgf000011_0001
Como se muestra en la tabla 1, se generó trisulfuro de glutatión en una cantidad significativa solo cuando se añadió tiosulfato de sodio, y no se generó trisulfuro de glutatión en los otros casos. Además, se confirmó que se generaba tetrasulfuro de glutatión y pentasulfuro de glutatión además de trisulfuro de glutatión en la solución como resultado de la medición de espectrometría de masas con cromatografía de líquidos usando 3200 QTRAP (fabricado por AB Sciex LLC).
Además, se estudiaron el pH y la eficacia de reacción de la solución de reacción en el momento de la producción de trisulfuro de glutatión. Se disolvieron 10 g de glutatión oxidado (fabricado por Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.) en 75 ml de agua a 30 °C para preparar una solución acuosa de glutatión oxidado. Después de esto, se ajustó el pH de la solución acuosa de glutatión oxidado a 3, 4, 5, 6 o 7 respectivamente usando hidróxido de sodio 2 N (fabricado por Wako Pure Chemical Corporation), a continuación se ajustó hasta 100 ml añadiendo agua.
Posteriormente, se añadieron 1,3 g de tiosulfato de sodio (fabricado por Wako Pure Chemical Corporation) a cada solución acuosa de glutatión oxidado y se inició la agitación. Durante la agitación, se midió la concentración de trisulfuro de glutatión en cada solución acuosa cada 24 horas. Los resultados se muestran en la fig. 1.
Como se muestra en la fig. 1, se encontró que cuanto menor era el pH de la solución de reacción, mayor era la concentración de trisulfuro de glutatión en cada momento y mayor era la eficacia de generación de trisulfuro de glutatión.
Ejemplo 2
Adquisición del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado - 1
A 1 l de la solución acuosa de glutatión oxidado preparada disolviendo 65 g de glutatión oxidado (fabricado por Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.) en agua, se le añadieron 17 g de tiosulfato de sodio (fabricado por Wako Pure Chemical Corporation), seguido de agitación a temperatura ambiente durante 12 horas, para preparar 15,9 g/l de una solución acuosa de trisulfuro de glutatión (pureza: 34 %).
Se filtró la solución acuosa anterior y se separó por filtración un precipitado tal como azufre, se pasó el filtrado obtenido a través de una columna rellena con 500 ml de resina de adsorción sintética SP207 (fabricada por Mitsubishi Chemical Corporation). Posteriormente, se realizó la elución usando 30 l de agua para obtener 25 l de 0,56 g/l de una solución acuosa de trisulfuro de glutatión (pureza: 98 %).
Se concentraron a presión reducida 25 l de la solución acuosa de trisulfuro de glutatión obtenida a de 40 a 50 °C durante 10 horas, y cuando se concentró hasta 500 ml, precipitó un cristal. Se separó el cristal precipitado de la solución acuosa por filtración y se recogió, y se secó el cristal a presión reducida a temperatura ambiente para obtener 9,1 g del cristal.
Se confirmó que el cristal obtenido era un cristal de trisulfuro de glutatión por análisis usando HPLC.
Además, de acuerdo con el análisis térmico diferencial termogravimétrico, se encontró que el cristal obtenido de trisulfuro de glutatión se deshidrató gradualmente con el aumento de la temperatura (de 30 °C a 200 °C) para obtener un anhídrido a 61 °C, y que el cristal era un dihidrato de un peso de humedad reducida (valor teórico: 5,3 % en peso, valor de medición: 5,3 % en peso).
Además, de acuerdo con la medición de pureza por HPLC, se confirmó que el cristal obtenido tiene una pureza de trisulfuro de glutatión de un 96 % (% del área) o más.
La tabla 2 muestra los ángulos de difracción de los picos en los que la proporción de intensidad relativa (I/10) es 30 o más a partir de los resultados de difracción de rayos X de polvo del cristal obtenido. En la tabla, "20" indica un ángulo de difracción (20°) e "intensidad relativa" indica una proporción de intensidad relativa. Los resultados de la difracción de rayos X de polvo usando CuKa como fuente de rayos X del cristal obtenido se muestran en la fig. 2, los resultados del análisis de espectroscopia infrarroja (IR) se muestran en la fig. 3.
[Tabla 2]
Figure imgf000012_0001
Ejemplo 3
Adquisición del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado - 2
Se disolvieron 30 g de glutatión oxidado (fabricado por Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.) y 4 g de tiosulfato de sodio (fabricado por Wako Pure Chemical Corporation) en 3 l de agua, se agitó la solución acuosa a 25 °C durante 20 horas y a continuación precipitó un cristal. Se filtró la solución acuosa y se recuperaron 10 g de un precipitado que contenía el cristal precipitado.
Posteriormente, se disolvieron 10 g del precipitado recuperado en 3 l de agua a 60 °C, se filtró la solución acuosa con un filtro de membrana de 0,45 pm (fabricado por Millipore Corporation), y a continuación se concentró a presión reducida el filtrado obtenido a 50 °C durante 5 horas hasta 500 ml, y precipitó un cristal.
Se separó el cristal precipitado de la solución acuosa por filtración y se recogió, y se secó el cristal a presión reducida a temperatura ambiente para obtener 6,5 g del cristal.
La tabla 3 muestra los ángulos de difracción de picos en los que la proporción de intensidad relativa (I/I0) es 30 o más a partir de los resultados de difracción de rayos X de polvo del cristal obtenido. En la tabla, "20" indica un ángulo de difracción (20°) e "intensidad relativa" indica una proporción de intensidad relativa.
[Tabla 3]
Figure imgf000013_0001
Además, se sometió el cristal a análisis de espectroscopia infrarroja (IR) y análisis diferencial termogravimétrico. Los resultados de un patrón de difracción de cristal de rayos X de polvo, un espectro de absorción infrarrojo y análisis térmico diferencial termogravimétrico del cristal fueron los mismos que los del cristal obtenido en el ejemplo 2 y, por lo tanto, se encontró que el cristal es un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado.
Ejemplo 4
Estabilidad de almacenamiento del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado
Se disolvieron en agua 1 g del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado producido en el ejemplo 2 y se completó el volumen hasta 100 ml. Se filtró la solución acuosa con un filtro de 0,45 pm y a continuación se liofilizó para obtener un polvo transparente blanquecino. Cuando se midió la difracción de rayos X de polvo del polvo, se encontró que el polvo era una forma amorfa no cristalina de trisulfuro de glutatión puesto que no se confirmó ningún pico de difracción de rayos X.
Posteriormente, se comparó la higroscopicidad de la forma amorfa no cristalina obtenida de trisulfuro de glutatión y el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado producido en el ejemplo 2.
Se pesaron aproximadamente 100 mg de cada muestra con una balanza precisa y a continuación se llenaron en un recipiente de vidrio, y después del almacenamiento en THE051A (fabricado por Advantec Toyo Kaisha, Ltd.) en condiciones de 40 °C y 75 % de humedad relativa, se pesó la muestra de nuevo para calcular una tasa de cambio de peso. El peso de la muestra después de cada tiempo transcurrido se midió con respecto al 100 % del peso al inicio de la prueba.
Los resultados se muestran en la tabla 4.
[Tabla 4]
Figure imgf000014_0001
Como se muestra en la tabla 4, el peso de la forma amorfa no cristalina se incrementa con el transcurso del tiempo, y el peso del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado casi no cambió. A partir de esto, se encontró que el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado tiene baja higroscopicidad y excelente estabilidad al almacenamiento, en comparación con la forma amorfa no cristalina.
Ejemplo 5
Selectividad de impurezas del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado
Se disolvieron en agua 3 g del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado producido en el ejemplo 2, 0,3 g de glutatión reducido (fabricado por Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.) y 0,3 g de glutatión oxidado (fabricado por Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.) y se completó el volumen hasta 100 ml. Se filtró la solución acuosa con un filtro de 0,45 pm y a continuación se liofilizó para obtener un polvo transparente blanquecino. Cuando se midió la difracción de rayos X de polvo del polvo, se encontró que el polvo era una forma amorfa no cristalina puesto que no se confirmó ningún pico de difracción de rayos X.
Además, se disolvieron en agua 3 g del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado producido en el ejemplo 2, 0,3 g de glutatión reducido (fabricado por Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.) y 0,3 g de glutatión oxidado (fabricado por Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.) y se completó el volumen hasta 100 ml. Se concentró la solución acuosa hasta 100 ml a 50 °C reduciendo la presión y se obtuvo una suspensión que contenía el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado. Se filtró la suspensión para recuperar el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado.
Se pesaron 200 mg de cada uno de la forma amorfa no cristalina y el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado obtenidos anteriormente en un matraz de medición de 100 ml y a continuación se añadió agua hasta 100 ml. Posteriormente, se determinó la cantidad de glutatión reducido y glutatión oxidado contenidos en la solución acuosa por análisis usando HPLC, y se calculó el peso (% en peso) de glutatión reducido y glutatión oxidado con respecto al peso de trisulfuro de glutatión contenido en la solución acuosa.
Los resultados se muestran en la tabla 5.
[Tabla 5]
Figure imgf000014_0002
Como se muestra en la tabla 5, el glutatión reducido y el glutatión oxidado contenidos en el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado eran menos que la forma amorfa no cristalina. A partir de esto, se encontró que las impurezas se pueden retirar eficazmente del trisulfuro de glutatión por cristalización en el cristal dihidratado.
Ejemplo 6
Análisis de la estructura de rayos X de monocristal de trisulfuro de glutatión dihidratado
Para determinar la estructura cristalina, se sometió el cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado obtenido en el ejemplo 2 a difracción de rayos X de monocristal (SXRD) a -173 °C usando un dispositivo de medición (analizador de estructura de rayos X de monocristal SuperNova fabricado por Agilent Technologies).
En primer lugar, se colocaron monocristales de trisulfuro de glutatión dihidratado en un difractómetro y se midió la imagen de difracción en una atmósfera a temperatura ambiente o bajo una corriente de gas inerte a una temperatura predeterminada, usando rayos X de una longitud de onda predeterminada. A continuación, se obtuvo una estructura monocristalina por la determinación de estructura por un procedimiento directo y el refinamiento de la estructura por un procedimiento de mínimos cuadrados [Acta Cryst. A64, 112 (2008)], a partir de una combinación del índice de plano y la intensidad de difracción calculada a partir de la imagen de difracción. Los resultados se resumieron en la tabla 6.
[Tabla 6]
Datos del cristal
Fórmula química C20H36N6O14S3
M, 680,72
Sistema cristalino, grupo espacial Triclínico, P1
Temperatura (K) 300
a, b, c (A) 5,3777(3), 9,4390(5), 14,7822(8) a, A Y (°) 82,833(6), 89,101(6), 89,392 (6)
V (A3) 744,37 (7)
Z 1
Tipo de radiación Cu Ka
U (mm-1) 2,96
Tamaño del cristal (mm) 0,120*0,070*0,040
Recopilación de datos
Difractómetro Rigaku R-AXIS RAPD-F Corrección de absorción Numérica
N.° de reflexiones medidas, independientes y observadas 13481, 4888, 2985 13481,4888,
[/ > 2 o(/)] 2985
Rint 0,078
(seno 0M)máx (A'1) 0,602
Refinamiento
R[F2 > 2o (F2)], wR(F2), S 0,0902, 0,2395, 1,028
N.° de reflejos 4888
N.° de parámetros 402
Tratamiento de átomo de H Parámetros de átomo de hidrógeno restringidos
Apmáx, Apmín (e A 3) 0,39, -0,32
Estructura absoluta 2278 pares de Friedel (Flack, 1983) Parámetro de estructura absoluta 0,15(4)
Programas de ordenador: RAPID AUTO (Rigaku, 2015), CrystalStructure (Rigaku, 2016),
SIR92 (Altmare et al., 1994), SHELXL-97 (Sheldrick, 2008), Mercury (Macrae et al., 2008).
Referencias
Flack, H. D. (1983). Acta Cryst. A39, 876-881.
Macrae, C. F., Bruno, I. J., Chisholm, J. A., Edgington, P. R., McCabe. P., Pidcock, E.,
Rodriguez-Monge, L, Taylor, R., van de Streek, J., Wood, P. A (2008). J. Appl. Cryst. 41,466-470.
Sheldrick, G. M. (2008). Acta Cryst A64, 112-122.
Palatinus L., Chapuis G. (2007), J. Appl. Cryst. 40,786-790.
Los resultados del análisis de estructura de rayos X de monocristal confirmaron que el cristal era seguramente un cristal de trisulfuro de glutatión, y era un cristal dihidratado que tenía moléculas de agua dentro de la red unitaria. Además, el parámetro de Flack [Acta Cryst. A39, 876. (1983)] fue de 0,15 (4), cercano a cero, lo que confirma que no hubo contradicción en la estructura absoluta revelada por el análisis.
Ejemplo 7 El ejemplo 7 es un ejemplo de referencia.
Producción de polisulfuro de N-acetil-L-cisteína - 1
En 2 l de la solución acuosa de N-acetil-L-cisteína preparada disolviendo 202 g de N-acetil-L-cisteína (fabricada por Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.) en agua, se añadió 2 mol/l de una solución acuosa de hidróxido de sodio (fabricada por Wako Pure Chemical Corporation) seguido del ajuste del pH a 7,5, y a continuación se añadieron 63 ml de una solución de peróxido de hidrógeno (fabricada por Wako Pure Chemical Corporation) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 24 horas para oxidar N-acetil-L-cisteína a disulfuro de N-acetil-L-cisteína.
Posteriormente, se pasó la solución acuosa a través de una columna rellena con 160 ml de una resina de intercambio catiónico fuerte de tipo H+ UBK16 (fabricada por Mitsubishi Chemical Corporation), y se obtuvieron 3100 ml de 65 g/l de una solución acuosa de disulfuro de N-acetil-N-cisteína. A la solución acuosa de disulfuro de N-acetil-L-cisteína obtenida, se le añadieron 48 g de tiosulfato de sodio (fabricado por Wako Pure Chemical Corporation) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 12 horas.
Como resultado de la medición de espectrometría de masas con cromatografía de líquidos usando 3200QTRAP (fabricado por AB Sciex LLC), se confirmó que se generaron trisulfuro de N-acetil-L-cisteína, tetrasulfuro de N-acetil-L-cisteína, pentasulfuro de N-acetil-L-cisteína y hexasulfuro de N-acetil-L-cisteína en la solución acuosa después de agitar.
Se filtró la solución acuosa para separar por filtración un precipitado tal como azufre, y se pasó el filtrado obtenido a través de una columna rellena con 160 ml de resina de adsorción sintética SP207 (fabricada por Mitsubishi Chemical Corporation). Posteriormente, se lavó la columna en un orden de 240 ml de agua y 700 ml de una solución acuosa de metanol al 5 % (fabricada por KANTO CHEMICAL CO., INC.), a continuación se realizó la elución usando una solución acuosa de metanol al 10 % (fabricada por KANTO CHEMICAL CO., INC.), y se obtuvieron 2500 ml de una solución acuosa que contenía trisulfuro de N-acetil-L-cisteína.
Se evaporaron todos los componentes líquidos concentrando 2500 ml de la solución acuosa de trisulfuro de N-acetil-L-cisteína obtenida a presión reducida a de 40 a 50 °C durante 3 horas para obtener 0,2 g de un sólido que contenía trisulfuro de acetil-L-cisteína.
Como resultado de la medición de pureza por HPLC, se confirmó que el sólido obtenido tiene una pureza de trisulfuro de acetil-L-cisteína de un 75 % (% del área) o más.
Ejemplo 8 El ejemplo 8 es un ejemplo de referencia.
Producción de polisulfuro de N-acetil-L-cisteína - 2
En 2 l de la solución acuosa de N-acetil-L-cisteína preparada disolviendo 202 g de N-acetil-L-cisteína (fabricada por Kyowa Hakko Bio Co., Ltd.) en agua, se añadió 2 mol/l de una solución acuosa de hidróxido de sodio (fabricada por Wako Pure Chemical Corporation) seguido del ajuste del pH a 7,5, y a continuación se añadieron 63 ml de una solución de peróxido de hidrógeno (fabricada por Wako Pure Chemical Corporation) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 24 horas para oxidar N-acetil-L-cisteína a disulfuro de N-acetil-L-cisteína.
Posteriormente, se pasó la solución acuosa a través de una columna rellena con 160 ml de una resina de intercambio catiónico fuerte de tipo H+ UBK16 (fabricada por Mitsubishi Chemical Corporation), y se obtuvieron 3100 ml de 65 g/l de una solución acuosa de disulfuro de N-acetil-N-cisteína. A la solución acuosa de disulfuro de N-acetil-L-cisteína obtenida, se le añadieron 48 g de tiosulfato de sodio (fabricado por Wako Pure Chemical Corporation) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 12 horas.
Como resultado de la medición de espectrometría de masas con cromatografía de líquidos usando 3200QTRAP (fabricado por AB Sciex LLC), se confirmó que se generaron trisulfuro de N-acetil-L-cisteína, tetrasulfuro de N-acetil-L-cisteína, pentasulfuro de N-acetil-L-cisteína y hexasulfuro de N-acetil-L-cisteína en la solución acuosa después de agitar.
Se filtró la solución acuosa para separar por filtración un precipitado tal como azufre, se pasó el filtrado obtenido a través de una columna rellena con 160 ml de resina de adsorción sintética SP207 (fabricada por Mitsubishi Chemical Corporation). Posteriormente, se lavó la columna con 240 ml de agua, 700 ml de una solución acuosa de metanol al 5 % (fabricada por KANTO CHEMICAL CO., INC.) y 2500 ml de una solución acuosa de metanol al 10 % (fabricada por KANTO CHEMICAL CO., INC.) en este orden, a continuación se realizó la elución usando una solución acuosa de metanol al 30 % (fabricada por KANTO CHEMICAL CO., INC.), y se obtuvieron 550 ml de una solución acuosa que contenía tetrasulfuro de N-acetil-L-cisteína.
Se evaporaron todos los componentes líquidos concentrando 550 ml de la solución acuosa de tetrasulfuro de N-acetil-L-cisteína obtenida a presión reducida a de 40 a 50 °C durante 3 horas para obtener 0,2 g de un sólido que contenía tetrasulfuro de N-acetil-L-cisteína.
Como resultado de la medición de pureza por HPLC, se confirmó que el sólido obtenido tiene una pureza de tetrasulfuro de N-acetil-L-cisteína de un 73 % (% del área) o más.
Si bien la invención se ha descrito en detalle y con referencia a modos de realización específicos de la misma, será evidente para un experto en la técnica que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la misma. La presente solicitud se basa en la solicitud de patente japonesa n.° 2016-246115 presentada el 20 de diciembre de 2016, el contenido de la que se incorpora en el presente documento por referencia. Además, todas las referencias citadas en el presente documento se incorporan en su totalidad.
Aplicabilidad industrial
La presente invención proporciona un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado que es útil como componente antioxidante y un procedimiento para producir el mismo.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado.
2. El cristal de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene picos en ángulos de difracción (20°) de 30,5° ± 0,2°, 17,7° ± 0,2°, 17,5° ± 0,2° y 21,2° ± 0,2° en difracción de rayos X de polvo, en el que se usa CuKa como fuente de rayos X.
3. El cristal de acuerdo con la reivindicación 2, que además tiene picos en ángulos de difracción (20°) de 25,3° ± 0,2°, 21,5° ± 0,2°, 21,8° ± 0,2° y 19,0° ± 0,2° en difracción de rayos X de polvo.
4. El cristal de acuerdo con la reivindicación 3, que además tiene picos en ángulos de difracción (20°) de 19,2° ± 0,2°, 12,1° ± 0,2°, 25,0° ± 0,2° y 20,3° ± 0,2° en difracción de rayos X de polvo.
5. El cristal de acuerdo con la reivindicación 4, que además tiene picos en ángulos de difracción (20°) de 20,6° ± 0,2°, 29,7° ± 0,2°, 9,5° ± 0,2° y 14,4° ± 0,2° en difracción de rayos X de polvo.
6. El cristal de acuerdo con la reivindicación 5, que además tiene picos en ángulos de difracción (20°) de 27,3° ± 0,2°, 19,5° ± 0,2°, 16,5° ± 0,2° y 25,8° ± 0,2° en difracción de rayos X de polvo.
7. El cristal de acuerdo con la reivindicación 6, que además tiene picos en ángulos de difracción (20°) de 11,9° ± 0,2°, 23,2° ± 0,2° y 30,0° ± 0,2° en difracción de rayos X de polvo.
8. El cristal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene los siguientes parámetros de celda unitaria aproximados cuando se mide a -173 °C en análisis de estructura de rayos X de monocristal: a = 5,3777 A; b = 9,4390 A; c = 14,7822 A; a = 82,833°; p = 89,101°; y = 89,392°; V = 744,37 A3; Z = 1, y tiene un grupo espacial PI, en el que se usa CuKa como fuente de rayos X.
9. Un procedimiento para producir un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado, que comprende una etapa de precipitación de un cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en una solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión, y una etapa de recogida del cristal precipitado de trisulfuro de glutatión dihidratado; en el que el procedimiento comprende además una etapa de preparación de la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión dejando reposar o agitando una solución acuosa en la que se disuelven el glutatión oxidado y tiosulfato, antes de la etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión.
10. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado en la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión es una etapa de precipitación del cristal de trisulfuro de glutatión dihidratado concentrando la solución acuosa en la que se disuelve el trisulfuro de glutatión.
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