ES2940903T3

ES2940903T3 - Glucomanipulación específica del sitio de restos orientadores

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Publication number: ES2940903T3
Application number: ES15714117T
Authority: ES
Inventors: Luis Avila; Clark Pan; Huawei Qiu; Qun Zhou
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2015-03-18
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2035-03-18
Also published as: US10995148B2; PL3129067T3; PT3129067T; MX384991B; HRP20251317T1; HUE061339T2; EP4640239A3; MX2021009126A; LT3129067T; EP4640239A2; EP3129067B1; AU2020294201A1; SI3129067T1; SG11201607198WA; US20240117071A1; US11697690B2; RS67352B1; AU2015231307B2; EP4015535C0; EP4015535B1

Abstract

La descripción actual proporciona polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos) y conjugados de restos de direccionamiento de los mismos, que comprenden un enlace de glucano diseñado específicamente para el sitio dentro de los glucanos nativos o modificados por ingeniería genética del polipéptido de unión. La descripción actual también proporciona ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de unión a antígenos, vectores de expresión recombinantes y células hospedadoras para producir tales polipéptidos de unión a antígenos. También se proporcionan métodos para usar los polipéptidos de unión a antígeno descritos en el presente documento para tratar enfermedades. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Glucomanipulación específica del sitio de restos orientadores

ANTECEDENTES

El uso de anticuerpos específicos para tratar a las personas y otros animales es una poderosa herramienta que ha sido muy eficaz para tratar muchas afecciones y trastornos. Sin embargo, existe una gran demanda de terapias orientadas más eficaces, especialmente terapias específicas orientadas con una eficacia superior y mayores márgenes terapéuticos. Uno de estos tratamientos específicos orientados emplea conjugados de anticuerpo-resto efector en los que un resto orientador dirige un anticuerpo específico a una zona de tratamiento deseada. Estas moléculas han mostrado un índice terapéutico mejorado - una eficacia superior y/o perfiles de toxicidad inferiores que el anticuerpo no orientado en un entorno clínico. Sin embargo, el desarrollo de estas terapias puede suponer un reto, ya que muchos factores, incluyendo las propiedades físicas y/o estructurales del propio anticuerpo así como la estabilidad del enlace, pueden tener un impacto significativo sobre la especificidad para la enfermedad elegida (p. ej. tumor), reduciendo de ese modo la eficacia. Con una alta unión inespecífica y baja estabilidad en circulación, el conjugado anticuerpo-resto efector se depura típicamente a través de tejidos normales antes de alcanzar la zona diana. Por otra parte, los conjugados de anticuerpo-resto efector con subpoblaciones significativas de alta carga de fármaco podrían generar agregados que serían eliminados por macrófagos, conduciendo a una semivida más corta. Así, existen necesidades crecientes de un control crítico del procedimiento así como de prevenir complicaciones, tales como agregación del anticuerpo y toxicidad inespecífica mediada por el anticuerpo.

Aunque los conjugados de anticuerpo-resto efector generados según los métodos actuales pueden ser eficaces, el desarrollo de estas terapias supone un reto, ya que las mezclas heterogéneas a menudo son una consecuencia de las químicas de conjugación usadas. Por ejemplo, la conjugación de un resto efector a residuos de lisina del anticuerpo es complicada por el hecho de que hay muchos residuos de lisina (~30) en un anticuerpo disponibles para la conjugación. Puesto que el número óptimo de la relación de resto efector a anticuerpo conjugados (DAR) es mucho menor para minimizar la pérdida de función del anticuerpo (p. ej., alrededor de 4:1), la conjugación a lisina a menudo genera un perfil muy heterogéneo. Por otra parte, muchas lisinas están situadas en parátopos críticos de la región CDR, y la conjugación al fármaco puede conducir a un reducción en la afinidad del anticuerpo. La conjugación mediada por tiol se orienta principalmente a las ocho cisteínas implicadas en enlaces disulfuro de bisagra. Sin embargo, todavía es difícil predecir e identificar cuáles cuatro de las ocho cisteínas se conjugan coherentemente entre las diferentes preparaciones. Más recientemente, la manipulación genética de residuos de cisteína libres ha permitido la conjugación específica del sitio con químicas basadas en tiol, pero estos enlaces a menudo exhiben una estabilidad muy variable, sufriendo el enlazador reacciones de intercambio con albúmina y otras moléculas séricas que contienen tiol. Por lo tanto, una estrategia de conjugación específica del sitio que genere un conjugado de anticuerpo con un sitio de conjugación definido y un enlace estable sería útil para permitir la conjugación del resto efector mientras que minimizaría efectos adversos sobre la estructura o la función del anticuerpo.

Un método para la conjugación anticuerpo-fármaco específica de un sitio a través de glucomanipulación es descrito por Zhou y cols. (Bioconjugate Chem. (2014) 25:510-520). Zhou y cols. no describen la conjugación de un polipéptido con un resto orientador que se une a una célula. Otros métodos de conjugación específica de un sitio a polipéptidos tales como anticuerpos se describen en las publicaciones de patente internacionales WO2014/164534 A2, WO2014/164503 A1 y WO2014/043361 A1 (todas de Genzyme Corporation), que tampoco muestran la conjugación de un polipéptido con un resto orientador según la presente invención.

SUMARIO

La actual divulgación proporciona polipéptidos (p. ej., anticuerpos) de unión y sus conjugados con restos orientadores. En ciertos casos, los conjugados comprenden un enlace resto orientador-glucano manipulado específicamente para un sitio dentro de glucanos naturales o modificados del polipéptido de unión. La actual divulgación también proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de unión a antígeno, vectores de expresión recombinantes y células anfitrionas para elaborar estos polipéptidos que se unen a antígeno. También se proporcionan métodos para usar los polipéptidos que se unen a antígeno divulgados en este documento para tratar una enfermedad.

Según esto, en un aspecto, la invención proporciona un polipéptido de unión que comprende al menos un glucano modificado, donde el glucano comprende al menos un resto de Fórmula (IV):

Fórmula (IV)

donde:

A) Q es NH u O;

B) CON es un resto conector;

C) X es un resto orientador que se une a una célula, donde el resto orientador es un resto de glucano GalNAc trivalente o un glucopéptido trigalactosilado;

D) Gal es un resto de galactosa; y

E) Sia es un resto de ácido siálico;

donde el glucano comprende al menos un resto de la siguiente fórmula estructural:

En una realización, la célula es una célula de mamífero. En una realización adicional, la célula se selecciona de una célula inmunitaria, una célula hepática, una célula tumoral, una célula vascular, una célula epitelial o una célula mesenquimal. En otra realización más, la célula se selecciona de una célula B, una célula T, una célula dendrítica, una célula agresora natural (NK), un macrófago, un neutrófilo, un hepatocito, una célula endotelial sinusoidal hepática o una célula de hepatoma.

En una realización, el polipéptido de unión es internalizado por la célula. En otra realización, la cantidad del polipéptido de unión internalizada por la célula es mayor que la cantidad de un polipéptido de unión de referencia que carece de un resto orientador internalizado por la célula.

En una realización, el resto orientador se une a un receptor de 6-fosfato de manosa sobre la célula. En otra realización, el resto orientador comprende un resto de 6-fosfato de manosa (Man 6-P).

En una realización, el resto orientador se une a una Siglec sobre la célula. En una realización adicional, la Siglec es sialoadhesina (Siglec-1), CD22 (Siglec-2), CD33 (Siglec-3), MAG (Siglec-4), Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Siglec-12, Siglec-14 o Siglec-15. En otra realización, el resto orientador comprende un residuo de ácido siálico enlazado en a2,3, a2,6 o a2,8. En una realización adicional, el resto orientador comprende un resto de a2,3-sialil-lactosa o un resto de a2,6-sialil-lactosa.

En una realización, el resto orientador se une a un receptor de lectina tipo C, una galectina, un receptor de lectina tipo L u otros receptores de carbohidratos. En una realización adicional, el resto orientador se une a DEC-205 (CD205; antígeno linfocítico 75), receptor de manosa de macrófagos (MMR; CD206), dectina-1, dectina-2, lectina tipo C inducible por macrófagos (Mincle), nointegrina de asimiento a ICAM3 específica de células dendríticas (DC-SIGN; CD209), receptor 1 del grupo de lectina DC NK (DNGR-1), langerina (CD207), un lecticano, un receptor de asialoglucoproteína (ASGPR), inmunorreceptor de células dendríticas del receptor de lectina C (CLEC4A; CLECSF6; DCIR), lectina de tipo galactosa de macrófagos (MGL), un receptor de DC, una colectina, una selectina, un receptor de células NK, un receptor endocítico del dominio de lectina tipo multi-C (CTLD), una lectina del grupo Reg (tipo VII), condrolectina, tetranectina, policistina, atractina (ATRN), proteína básica principal de eosinófilos (EMBP), gen 2 de la región crítica del síndrome de DiGeorge (DGCR2), trombomodulina, Bimlec, una lectina del grupo XVI (SEEC) o una lectina del grupo XVII (CBCP/Frem1/QBRICK).

En una realización, Q es O.

En una realización, el resto orientador es un resto de glucano GalNAc trivalente.

En una realización adicional, el resto orientador es un glucopéptido trigalactosilado, p. ej., lactosa³-Cys³Gly⁴.

En una realización, el resto lactosa³-Cys³Gly⁴está representado por la Fórmula V:

[Fórmula V]

En una realización, el glucano comprende al menos un resto de la siguiente fórmula estructural:

En una realización, el resto de glucano GalNAc trivalente está representado por la Fórmula VIII:

donde q es un número entero entre 1 y 29 inclusive.

En otra realización, el glucano comprende al menos un resto que tiene la siguiente fórmula estructural:

donde q es un número entero entre 1 y 29 inclusive.

donde q es un número entero entre 1 y 29 inclusive.

En una realización, el resto de glucano GalNAc trivalente está representado por la Fórmula VII, la Fórmula XIII o la Fórmula XIV:

[Fórmula XIII];

o

[Fórmula XIV]

En una realización, el glucano comprende al menos un resto seleccionado de las siguientes fórmulas estructurales:

En una realización, el polipéptido de unión comprende un dominio Fc. En una realización adicional, el glucano modificado está enlazado por N al polipéptido de unión a través de un residuo de asparagina en la posición del aminoácido 297 del dominio Fc, según la numeración de EU. En otra realización, el glucano modificado está enlazado por N al polipéptido de unión a través de un residuo de asparagina en la posición del aminoácido 298 del dominio Fc, según la numeración de EU

En una realización, el dominio Fc es humano. En otra realización, el polipéptido de unión comprende un dominio CH1. En una realización adicional, el glucano modificado está enlazado por N al polipéptido de unión a través de un residuo de asparagina en la posición del aminoácido 114 del dominio CH1 según la numeración de Kabat.

En una realización, el resto conector comprende un enlazador sensible al pH, un enlazador de disulfuro, un enlazador sensible a enzimas u otro resto enlazador escindible. En una realización, el resto conector que comprende un resto enlazador se selecciona del grupo de restos enlazadores representados en la Tabla 2 o 14.

En una realización, el polipéptido de unión es un anticuerpo o una inmunoadhesina.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para elaborar el polipéptido de unión de la invención, comprendiendo el método hacer reaccionar un resto efector de Fórmula (I):

NH²-Q-CON-X Fórmula (I),

donde:

A) Q es NH u O;

B) CON es un resto conector; y

C) X es un resto orientador que se une a una célula, donde el resto orientador es un resto de glucano GalNAc trivalente o un glucopéptido trigalactosilado,

con un polipéptido de unión precursor que comprende un glucano oxidado.

En una realización, el polipéptido de unión inicial comprende al menos un resto de la siguiente fórmula estructural:

En una realización, el polipéptido de unión precursor comprende un glucano oxidado comprende al menos un resto de la siguiente fórmula estructural:

En una realización, el polipéptido de unión precursor que comprende un glucano oxidado se genera al hacer reaccionar un polipéptido de unión inicial que comprende un glucano con un agente suavemente oxidante. En una realización adicional, el agente suavemente oxidante es peryodato sódico. En otra realización, no se emplea peryodato sódico más de 1 mM. En otra realización, el agente suavemente oxidante es galactosa oxidasa.

En una realización, el método para elaborar una proteína de unión comprende hacer reaccionar un resto efector de la siguiente fórmula estructural:

NH²-O-CON-X

con el polipéptido de unión precursor que comprende un glucano oxidado que comprende al menos un resto de la siguiente fórmula estructural:

para formar un polipéptido de unión de la siguiente fórmula estructural:

En una realización, el resto orientador es un resto de glucano GalNAc trivalente. En una realización, la etapa de reacción se efectúa en presencia de una sal que comprende un ion metálico. En una realización adicional, donde el ion metálico es un ion cobre. En una realización, la sal es acetato de cobre. En otra realización, la sal que comprende un ion metálico está presente en una concentración de al menos 0,1 mM.

En otra realización, el polipéptido de unión que comprende el glucano comprende uno o dos residuos de ácido siálico terminales. En una realización adicional, los residuos de ácido siálico terminales se introducen mediante el tratamiento del polipéptido de unión con una sialiltransferasa o una combinación de sialiltransferasa y galactosiltransferasa. En una realización, un polipéptido de unión inicial se pone en contacto con un agente suavemente oxidante a fin de producir un polipéptido de unión precursor o proteína de unión precursora. En una realización, el polipéptido de unión precursor o proteína de unión precursora comprende un resto de ácido siálico oxidado que comprende un aldehído terminal.

La presente divulgación también se refiere a un polipéptido de unión que comprende al menos un glucano modificado que comprende al menos un resto de Fórmula (IV):

Fórmula (IV),

donde:

A) Q es NH u O;

B) CON es un resto conector; y

C) X es un resto de lactosa3-Cys3Gly4;

D) Gal es un componente derivado de galactosa;

E) Sia es un componente derivado de ácido siálico; y

donde Sia está presente y el resto de lactosa3-Cys3Gly4 está representado por la Fórmula V:

[Fórmula V].

La presente divulgación también proporciona una composición que comprende un polipéptido de unión descrito anteriormente y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En un caso, la relación de resto orientador a polipéptido de unión es igual a o mayor quee aproximadamente 4. En otro caso, la relación de resto orientador a polipéptido de unión es al menos aproximadamente 2. La presente divulgación se refiere además a un método para tratar a un paciente que lo necesite, que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición.

Fórmula (IV),

donde:

A) Q es NH u O;

B) CON es un resto conector; y

C) X es un resto que comprende PEG;

D) Gal es un componente derivado de galactosa; y

E) Sia es un componente derivado de ácido siálico;

donde Sia está presente o ausente.

En una realización, el glucano comprende al menos un resto representado por la Fórmula IX o la Fórmula XI:

donde p tiene un valor de 1 a 32; o

donde p tiene un valor de 1 a 32.

donde p tiene un valor de 1 a 32; o

donde p tiene un valor de 1 a 32.

donde p tiene un valor de 1 a 32; o

donde p tiene un valor de 1 a 32.

En una realización, el resto orientador comprende PEG y está representado por la Fórmula X o la Fórmula XII:

[Fórmula X];

o

[Fórmula XII].

En una realización, el resto PEG comprende mono-PEG, bi-PEG o tri-PEG. En otra realización, el resto PEG comprende de 3 a 3,5 PEG. En otra realización, el polipéptido de unión es un anticuerpo o una inmunoadhesina. La presente divulgación se refiere además a un método para elaborar un polipéptido de unión PEGilado que comprende al menos un glucano oxidado, donde el método comprende:

(a) hacer reaccionar un polipéptido de unión que comprende al menos un glucano con un agente suavemente oxidante en presencia de una sal que comprende un ion metálico, y (b) conjugar el polipéptido de unión oxidado con al menos un resto que comprende PEG.

En un caso, el ion metálico es un ion cobre. En otro caso, la sal es acetato de cobre. En otro caso, la sal que comprende un ion metálico está presente a una concentración de al menos 0,1 mM. En otro caso, el agente suavemente oxidante es peryodato o galactosa oxidasa. En otro caso, el al menos un glucano es un glucano modificado.

En un caso, el método para elaborar un polipéptido de unión comprende: a) hacer reaccionar un polipéptido de unión que comprende al menos un glucano modificado con un agente suavemente oxidante en presencia de una sal que comprende un ion metálico; y b) conjugar el polipéptido de unión oxidado con el resto que comprende PEG. En un caso adicional, el resto PEG comprende mono-PEG, bi-PEG o tri-PEG.

Fórmula (IV),

donde:

A) Q es NH u O;

B) CON es un resto conector; y

C) X es un glucano GalNAc trivalente;

D) Gal es un componente derivado de galactosa; y

E) Sia es un componente derivado de ácido siálico;

donde Sia está presente y el resto de glucano GalNAc trivalente está representado por la Fórmula VI.

La proteína de unión puede comprender una glucoforma de N-glucano seleccionada del grupo que consiste en: una glucoforma G0, una glucoforma G1 y una glucoforma G2. La glucoforma de N-glucano se puede seleccionar además del grupo que consiste en: una glucoforma G1S1, una glucoforma G2S 1, una glucoforma G2S2, una glucoforma GIF, una glucoforma G2F, una glucoforma G1S1F, una glucoforma G2S1F y una glucoforma G2S2F.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las características y ventajas precedentes y otras de la presente divulgación se entenderán más a fondo a partir de la siguiente descripción detallada de realizaciones ilustrativas tomadas junto con los dibujos adjuntos.

Las Figuras 1 (A-C) son una ilustración esquemática de la síntesis de un conjugado de anticuerpo-fármaco donde un resto de toxina se enlaza a un residuo de ácido siálico oxidado de un glucano de anticuerpo usando un enlace oxima. La Figura 1A reproduce anticuerpos con carbohidratos silvestres (existentes) en la posición Asn297 y con sitios de glicosilación manipulados en las posiciones 114 (según la numeración de Kabat) y 298 (según es sistema de numeración de EU). La Figura 1B reproduce tanto la estructura canónica del glucano GIF (izquierda, observada en la posición Asn297 en los anticuerpos mostrados en la Figura 1A) como la estructura G2S1F (derecha, observada en las posiciones Ala114 y Asn298 en los anticuerpos mostrados en la Figura 1A). Las estructuras de glucano mostradas en la Figura 1B tienen varias subunidades diferentes: las cajas cuadradas blancas representan GlcNAc, el triángulo blanco invertido representa fucosa, los círculos blancos representan manosa, los círculos sombreados representan galactosa y el triángulo derecho sombreado representa ácido siálico. La Figura 1C reproduce la preparación de un conjugado de la actual divulgación. A la izquierda hay una proteína de unión inicial con un resto Gal y Sia. Después de la oxidación con NaIO4, el resto siálico se oxida para formar una proteína de unión precursora y a continuación se hace reaccionar con un resto que contiene toxina para formar un péptido de unión que comprende al menos un resto de Fórmula IV.

La Figura 2 es un gel teñido con azul de Coomassie que muestra la expresión y la purificación de mutantes de glucosilación.

La Figura 3 reproduce los resultados de experimentos de resonancia plasmónica superficial usados para valorar la unión de mutantes de anticuerpo apTCR HEBE1 IgG a FcYRIIIa humano recombinante (V158 & F158).

La Figura 4 reproduce los resultados de experimentos de resonancia plasmónica superficial usados para valorar la unión de mutantes de anticuerpo apTCR HEBE1 IgG a FcyRI humano recombinante.

La Figura 5 reproduce el perfil de liberación de citocinas desde PBMC para TNFa, GM-CSF, IFNy e IL10 en presencia de anticuerpos anti-apTCR mutantes (día 2).

La Figura 6 reproduce el perfil de liberación de citocinas desde PBMC para IL6, IL4 e IL2 en presencia de anticuerpos anti-apTCR mutantes (día 2).

La Figura 7 reproduce el perfil de liberación de citocinas desde PBMC para TNFa, GM-CSF, IFNy e IL10 en presencia de anticuerpos anti-apTCR mutantes (día 4).

La Figura 8 reproduce el perfil de liberación de citocinas desde PBMC para IL6, IL4 e IL2 en presencia de anticuerpos anti-apTCR mutantes (día 4).

Las Figuras 9 (A-B) reproducen los resultados de experimentos que investigan el nivel de expresión de mutantes 2C3 mediante transferencia Western (Figura 9A) y resonancia plasmónica superficial (Figura 9B).

La Figura 10 reproduce los resultados de experimentos que investigan la glucosilación de mutantes 2C3 antes y después del tratamiento con PNGasa F.

La Figura 11 reproduce los resultados de experimentos de SDS-PAGE que investigan sitios de glucosilación sobre mutantes 2C3 aislados de cultivo celular.

Las Figuras 12 (A-C) reproducen los resultados de experimentos de resonancia plasmónica superficial usados para valorar la unión de anti-CD52 modificado a FcyRIIIa humano recombinante (V158). Se usaron anti-CD52 que comprenden mutaciones S298N/Y300S en el domino Fc para valorar la función efectora de la molécula modificada, la unión al péptido CD52 (Figura 12A), la unión a FcyRIIIa (V158, Figura 12B) y la unión de control a FcRn de ratón (Figura 12C).

La Figura 13 reproduce los resultados de experimentos de resonancia plasmónica superficial que investigan las propiedades de unión a Fc de mutantes 2C3.

Las Figuras 14 (A-B) reproducen los resultados de experimentos de resonancia plasmónica superficial que investigan la unión de anti-CD52 modificado tanto a FcyRIIIa (Val158) (como anteriormente) como a FcYRIIIa (Phe158). Se usaron anticuerpos anti-CD52 que comprenden mutaciones S298N/Y300S en el dominio Fc para valorar la función efectora de la molécula modificada que se une a FcyRIIIa (Val158, Figura 14A) y FcyRIIIa (Phe58, Figura 14B).

Las Figuras 15 (A-B) reproducen el análisis de la unión a C1q en el mutante S298N/Y300S y el control WT 2C3 (Figura 15A) y los resultados de un análisis de Eliza que confirma el revestimiento equivalente de los pocillos (Figura 15B).

La Figura 16 reproduce los resultados de experimentos experimentos de resonancia plasmónica que miden la cinética de unión de mutantes 2C3 al péptido 741 de CD-52.

La Figura 17 reproduce los resultados de experimentos experimentos de resonancia plasmónica que comparan la afinidad de unión a antígeno de WT anti-CD-522C3 y el mutante de hiperglucosilación A114N.

Las Figuras 18 (A-D) reproducen los resultados de experimentos de caracterización de carga por enfoque isoeléctrico y espectrometría de masas para determinar el contenido de glucano de mutantes 2C3.

Las Figuras 19 (A-B) reproducen los resultados de experimentos de concentración (Octet) y resonancia plasmónica que comparan la afinidad de unión a antígeno de WT anti-CD52 2C3 y mutantes.

La Figura 20 reproduce los resultados de experimentos de SDS-PAGE para demonstrar la glucosilación adicional del mutante anti-TEM1 A114N.

La Figura 21 reproduce los resultados de SDS-PAGE y análisis por cromatografía de interacción hidrófoba del mutante A114N de anti-Her2.

La Figura 22 reproduce los resultados de experimentos de SDS-PAGE para demostrar la conjugación de PEG al mutante 2C3 A114N a través de un enlace aminooxi.

La Figura 23 reproduce los resultados de experimentos de LC-MS para determinar el contenido de glucano del mutante de hiperglucosilación anti-TEM1 A114N.

La Figura 24 reproduce los resultados de experimentos de LC-MS para determinar el contenido de glucano de un anticuerpo HER2 silvestre y un mutante de hiperglucosilación A114N de anti-Her2.

Las Figuras 25 (A-C) reproducen un método ejemplar para realizar la conjugación específica del sitio de un anticuerpo. La Figura 26 reproduce una síntesis de restos efectores ejemplares: aminooxi-Cys-MC-VC-PABC-MMAE y aminooxi-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10.

Las Figuras 27 (A-C) reproducen información de caracterización para un anticuerpo HER2 sialilado. Las Figuras 28 (A-D) reproducen información de caracterización para un anticuerpo anti-HER 2 sialilado oxidado.

La Figura 29 reproduce cromatografías de interacción hidrófoba de glucoconjugados preparados con tres anticuerpos sialilados diferentes con dos grupos aminooxi diferentes.

La Figura 30 muestra una cromatografía de HIC de un conjugado del mutante de glucosilación antiHer2 A114 con AO-MMAE preparado usando química GAM(+).

Las Figuras 31 (A-D) reproducen una comparación de la potencia in vitro de un glucoconjugado y un conjugado tiólico de anti-HER2.

La Figura 32 reproduce una comparación de la potencia in vitro de un glucoconjugado y un conjugado tiólico de anti FAP B11.

Las Figuras 33 (A-D) reproducen una comparación de la eficacia in vivo de glucoconjugados y conjugados tiólicos de anti-HER2 en un modelo de xenoinjerto de células tumorales Her2+.

La Figura 34 reproduce los resultados de experimentos de LC-MS para determinar el contenido de glucano de un anticuerpo anti-apTCR mutante que contiene la mutación S298N/Y300S.

La Figura 35 reproduce los resultados de experimentos de dicroísmo circular para determinar la estabilidad térmica relativa de un anticuerpo anti-apTCR silvestre y un anticuerpo anti-apTCR mutante que contiene la mutación S298N/Y300S.

La Figura 36 reproduce los resultados de un ensayo de proliferación celular para ADC preparadas con el anticuerpo anti-HER que tiene la mutación de hiperglucosilación A114N y AO-MMAE.

La Figura 37 es una ilustración esquemática de la síntesis de un conjugado de anticuerpo-fármaco donde un resto orientador se enlaza a un residuo de ácido siálico oxidado del glucano del anticuerpo usando un enlace oxima. La Figura 38 es una ilustración esquemática que representa un método ejemplar para realizar la conjugación específica del sitio de un anticuerpo a un glucopéptido a través de un enlace oxima según los métodos descritos. La Figura 39 es una ilustración esquemática que representa la conjugación específica del sitio de neoglucanos a anticuerpo a través de ácido siálico en glucanos Fc naturales.

La Figura 40 es una serie de glucanos ejemplares que se pueden usar para conjugación incluyendo lactosa aminooxi y bis Man-6-P (o bisM6P) hexamanosa aminooxi (para la conjugación con aminooxi).

La Figura 41 es una reproducción esquemática de la preparación de Man-6-P hexamanosa-maleimida.

La Figura 42 reproduce la caracterización por SDS-PAGE y MALDI-TOF de conjugados de Man-6-P hexamanosa aminooxi elaborados con anticuerpo policlonal de conejo.

La Figura 43 reproduce los resultados de experimentos de resonancia plasmónica superficial usados para valorar la unión de anticuerpos de IgG de conejo de control y conjugados a Man-6-P hexamanosa al receptor de Man-6-P. La Figura 44 reproduce la captación de anticuerpo IgG de conejo conjugado a Man-6-P en células HepG2 y RAW. La Figura 45 reproduce la caracterización de anticuerpos de control, conjugados a Man-6-P y conjugados a lactosa a través de SDS-PAGE y transferencia de lectina.

La Figura 46 reproduce los resultados de análisis de proteína intacta por MALDI-TOF para anticuerpos de control, conjugados a Man-6-P y conjugados a lactosa.

La Figura 47 reproduce la caracterización de anticuerpo policlonal conjugado a Man-6-P hexamanosa-maleimida (conjugación a tiol en las cisteínas de bisagra) a través de SDS-PAGE (no reductora y reductora), transferencia de lectina (reductora) y cuantificación de Man-6-P.

La Figura 48 reproduce la caracterización de anticuerpo policlonal conjugado a lactosa-maleimida (conjugación a tio en las cisteínas de bisagra) a través de SDS-PAGE y cuantificación de galactosa.

La Figura 49 reproduce la caracterización de anticuerpo monoclonal conjugado a Man-6-P hexamanosa-maleimida (conjugación a tiol en las cisteínas de bisagra) a través de SDS-PAGE (no reductora y reductora) y cuantificación de glucano (bis Man-6-P).

La Figura 50 reproduce los resultados de un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de un conjugado cisteína de bisagra-anticuerpo policlonal.

La Figura 51 reproduce los resultados de un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de un conjugado cisteína de bisagra-anticuerpo monoclonal.

La Figura 52 reproduce los resultados de la titulación de sialidasa y la cuantificación de ácido siálico para determinar la cantidad de liberación de ácido siálico de anticuerpos NNAS, NNAs sialilados y NNAS desialilados y galactosilados. La Figura 53 reproduce los resultados del análisis por MALDI-TOF MS para determinar las estructuras de glucano de un anticuerpo NNAS de ratón y un anticuerpo NNAS desialilado y galactosilado.

La Figura 54 reproduce los resultados del análisis por MALDI-TOF MS para determinar las estructuras de glucano de un anticuerpo NNAS de ratón y un anticuerpo NNAS sialilado.

La Figura 55 reproduce la caracterización de receptor de Man-6-P (CI-MPR) unido a anticuerpos policlonales y monoclonales conjugados a glucano Man-6-P a través de glucano Fc natural o disulfuros de bisagra usando PAGE natural.

La Figura 56 reproduce la caracterización de anticuerpos NNAS modificados enzimáticamente y conjugados a glucopéptido mediante SDS-PAGE (4-12% NuPAGE; reductora y no reductora) y transferencia de lectina ECL (reductora).

La Figura 57 reproduce los resultados de la cuantificación de galactosa terminal en un anticuerpo NNAS, un anticuerpo NNAS desialilado/galactosilado, y un anticuerpo NNAS conjugado en moles de galactosa o moles de glucopéptido por mol de anticuerpo.

La Figura 58 reproduce el examen de lactosa-maleimida que se ha modificado con alfa-2,3-sialiltransferasa y eluido de columnas de purificación QAE con NaCl 20 mM. El eluido resultante se caracterizó usando MALDI-TOF MS y HPLC Dionex.

Las Figuras 59 (A-B) reproducen la caracterización de anticuerpo policlonal de conejo conjugado con sialil-lactosamaleimida (reacción con tiol) usando SDS-PAGE y HPLC Dionex (cuantificación de ácido siálico).

Las Figuras 60 (A-D) reproducen la caracterización de lactosa-maleimida sialilada con alfa-2,6-sialiltransferasa y purificada usando una columna de QAE-sepharose. El análisis usando HPLC Dionex se muestra para (Figura 60A) un estándar de lactosa; (Figura 60B) un estándar de alfa-2,6-sialil-lactosa; (Figura 60C) un estándar de lactosamaleimida; y (Figura 60D) una fracción de alfa-2,6-sialil-lactosa-maleimida eluida de un columna de QAE-sepharose. La Figura 61 reproduce la caracterización de una fracción de alfa-2,6-sialil-lactosa-maleimida eluida de una columna de QAE-sepharose usando MALDI-TOF MS.

Las Figuras 62 (A-B) reproducen la caracterización de un anticuerpo de control, un anticuerpo policlonal conjugado a glucano alfa-2,3-sialil-lactosa y un anticuerpo policlonal conjugado a glucano alfa-2,6-sialil-lactosa a través de SDS-PAGE y HPLC Dionex (se muestra la gráfica del análisis de ácido siálico).

La Figura 63 reproduce la caracterización de anticuerpos de control y mutantes de NNAS modificados enzimáticamente (desialilados/galactosilados) usando SDS-PAGE y transferencia de lectina.

La Figura 64 reproduce la caracterización a través de SDS-PAGE reductora y no reductora del anticuerpo de control PEGilado y Gal NNAS con diversas cantidades de galactosa oxidasa.

La Figura 65 reproduce los resultados de la PEGilación estimada de una cadena pesada de anticuerpo a partir de la titulación previa de galactosa oxidasa usando ProteinSimple.

La Figura 66 reproduce la caracterización a través de SDS-PAGE reductora y no reductora del anticuerpo de control PEGilado y Gal NNAS con diverso exceso molar de PEG sobre el anticuerpo.

La Figura 67 reproduce los resultados de la PEGilación estimada de una cadena pesada de anticuerpo a partir de la titulación previa de PEG usando ProteinSimple

La Figura 68 es un dibujo estructural del aminooxiglucopéptido, lactosa3-Cys3Gly4.

Las Figuras 69 (A-B) reproducen la caracterización a través de SDS-PAGE reductora del anticuerpo de control PEGilado y Gal NNAS con galactosa oxidasa en ausencia de acetato de cobre (Figura 69A) y en presencia de cantidades variables de acetato de cobre (Figura 69A y Figura 69B).

La Figura 70 reproduce la caracterización de Herceptin silvestre, A114N, NNAS y A114N/NNAS modificada enzimáticamente mediante SDS-PAGE (4-12% NuPAGE; reductora y no reductora) y transferencia de lectina ECL (reductora) junto con los resultados de la cuantificación de galactosa terminal en moles de galactosa por mol de anticuerpo.

La Figura 71 es una tabla que reproduce el contenido de ácido siálico (en mol/mol) de anticuerpos silvestres y mutantes según se mide usando HPLC Dionex.

La Figura 72 reproduce la caracterización de la PEGilación de anticuerpos silvestres y mutantes a través de SDS-PAGE reductora y no reductora.

La Figura 73 es una tabla que reproduce la PEGilación (en mol/mol) de anticuerpos silvestres y mutantes estimada usando ProteinSimple.

La Figura 74 es una serie de fotografías que reproducen la tinción por inmunofluorescencia de la captación por células HepG2 de anticuerpos de control, modificados enzimáticamente (con galactosiltransferasa) o conjugados (con lactosaaminoxi o lactosa-maleimida).

La Figura 75 es una reproducción de un glucano GalNAc trivalente ejemplar.

La Figura 76 reproduce los resultados de experimentos de resonancia plasmónica superficial usados para valorar la unión de anticuerpos conjugados a glucano GalNAc trivalente a la subunidad HI de ASGPR.

La Figura 77 es una representación de un glucano que contiene GalNAc trivalente y un glucopéptido que contiene galactosa trivalente usados para conjugación.

La Figura 78 reproduce los resultados de experimentos de resonancia plasmónica superficial usados para valorar la unión de enzimas lisosómicas recombinantes conjugadas a GalNAc trivalente y conjugadas a glucopéptido que contiene galactosa trivalente a la subunidad HI de ASGPR.

Las Figuras 79 (A-D) son una representación de glucanos GalNAc trivalentes adicionales.

La Figura 80 es una representación de los resultados de la conjugación de la enzima lisosómica recombinante rhGAA oxidada con peryodato con un exceso de glucano GalNAc trivalente C12 (en un exceso molar de glucano de 20, 40, 80 y 200 veces sobre rhGAA). Se representa el glucano resultante conjugado por rhGAA.

La Figura 81 reproduce la unión a ASGPR de enzimas lisosómicas recombinantes conjugadas con glucano GalNAc trivalente C12 en Biacore. Las enzimas conjugadas con un exceso de 20 (conjugado 1), 40, 80 y 200 veces (conjugado 4) de glucano muestran todas una fuerte unión a la subunidad 1 de ASGPR. No existe una diferencia significativa en la unión entre los conjugados (conjugados 1 a 4).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La actual divulgación proporciona polipéptidos (p. ej., anticuerpos) de unión y sus conjugados con restos efectores (p. ej., conjugados con restos orientadores). En ciertos casos, los conjugados comprenden un enlace fármaco-glucano manipulado específicamente para un sitio dentro de glucanos naturales o modificados de un polipéptido de unión a antígeno tal como una molécula de IgG. La actual divulgación también proporciona ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de unión a antígeno, vectores de expresión recombinantes y células anfitrionas para elaborar polipéptidos de unión a antígenos. También se describen métodos para usar los polipéptidos de unión a antígeno divulgados en este documento para tratar una enfermedad.

I. Definiciones

A menos que se defina lo contrario en este documento, los términos científicos y técnicos usados en este documento tienen los significados que son entendidos comúnmente por los expertos normales en la técnica. En caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en este documento tienen prioridad sobre cualquier definición de diccionario o extrínseca. A menos que se requiera lo contrario por el contexto, los términos singulares incluirán los plurales y los términos plurales incluirán el singular. El uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. El uso del término "que incluye", así como otras formas tales como "incluye" e "incluido", no es limitativo.

Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con el cultivo celular y tisular, la biología molecular, la inmunología, la microbiología, la genética y la química de las proteínas y los ácidos nucleicos y la hibridación descritas en este documento son las bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Los métodos y las técnicas proporcionados en este documento se realizan generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y que se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique otra cosa. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante, según se efectúa comúnmente en la técnica o según se describe en este documento. Las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de, la química analítica, la química orgánica sintética y la química médica y farmacéutica descritas en este documentos son las bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Se usan técnicas estándar para las síntesis químicas, los análisis químicos y la preparación, la formulación y el aporte farmacéuticos y el tratamiento de los pacientes.

Para que la divulgación se pueda entender más fácilmente, se definen posteriormente términos seleccionados.

El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos y abarca proteínas, análogos polipeptídicos o variantes naturales o artificiales de una secuencia proteínica, o fragmentos de los mismos, a menos que se contradiga de otro modo por el contexto. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. Para un polipéptido antigénico, un fragmento de un polipéptido contiene opcionalmente al menos un epítopo contiguo o no lineal de un polipéptido. Los límites precisos del al menos un fragmento epitópico se pueden confirmar usando la experiencia normal en la técnica. Un fragmento polipeptídico comprende al menos aproximadamente 5 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos o al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, por ejemplo.

El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" se refiere a una proteína o un polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación no está asociado con componentes naturalmente asociados que lo acompañan en su estado natural; está sustancialmente libre de otras proteínas de la misma especie; es expresado por una célula de una especie diferente; o no está presente en la naturaleza. Así, una proteína o un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la que se que origina naturalmente estará "aislado" de sus componentes naturalmente asociados. Una proteína o polipéptido se puede liberar sustancialmente de componentes naturalmente asociados mediante aislamiento usando técnicas de purificación de proteínas muy conocidas en la técnica.

Según se usa en este documento, el término "proteína de unión" o "polipéptido de unión" se referirá a una proteína o un polipéptido (p. ej., un anticuerpo o fragmento del mismo) que contiene al menos un sitio de unión que es responsable de unirse selectivamente a un antígeno diana de interés (p. ej., un antígeno humano). Sitios de unión ejemplares incluyen un dominio variable de anticuerpo, un sitio de unión al ligando de un receptor o un sitio de unión al receptor de un ligando. En ciertos aspectos, las proteínas de unión o los polipéptidos de unión comprenden múltiples (p. ej., dos, tres, cuatro o más) sitios de unión. En ciertos aspectos, la proteína de unión o polipéptido de unión no es una enzima terapéutica.

Según se usa en este documento, el término "residuo natural" se referirá a un residuo de aminoácido que está presente en la naturaleza en una posición de aminoácido particular de un polipéptido de unión (p. ej., un anticuerpo o fragmento del mismo) y que no se ha modificado, introducido o alterado por la mano del hombre. Según se usa en este documento, el término "proteína de unión alterada", "polipéptido de unión alterado", "proteína de unión modificada" o "polipéptido de unión modificado" se referirá a polipéptidos de unión y/o proteínas de unión (p. ej., un anticuerpo o fragmento del mismo) que comprende al menos una sustitución, eliminación y/o adición de aminoácidos con relación a la secuencia de aminoácidos natural (es decir, silvestre) y/o una mutación que da como resultado una glucosilación alterada (p. ej., hiperglucosilación, hipoglucosilación y/o aglucosilación) en una o más posiciones de aminoácido con relación a la secuencia de aminoácidos natural (es decir, silvestre).

Según se usa en este documento, el término "polipéptido de unión inicial" o "proteína de unión inicial" se referirá a un polipéptido de unión o proteína de unión que se pone en contacto con un agente suavemente oxidante para producir un "polipéptido de unión precursor" o una "proteína de unión precursora", respectivamente, (véanse las Figuras 1A-C). Según se usa en este documento, el término "polipéptido de unión precursor" o "proteína de unión precursora" se referirá a un polipéptido o una proteína suavemente oxidados que se pueden hacer reaccionar con uno o más de los restos efectores descritos en este documento. En ciertos casos, un polipéptido de unión inicial, una proteína de unión inicial, un polipéptido de unión precursor y/o una proteína de unión precursora (p. ej., un anticuerpo o fragmento del mismo) contiene al menos un sitio de unión que es responsable de unirse selectivamente a un antígeno diana de interés (p. ej., un antígeno humano). Sitios de unión ejemplares incluyen un dominio variable de anticuerpo, un sitio de unión a ligando de un receptor o un sitio de unión a receptor de un ligando. En ciertos aspectos, un polipéptido de unión inicial, una proteína de unión inicial, un polipéptido de unión precursor y/o una proteína de unión precursora comprende múltiples (p. ej., dos, tres, cuatro o más) sitios de unión. En ciertos aspectos, el polipéptido de unión inicial, la proteína de unión inicial, el polipéptido de unión precursor y/o la proteína de unión precursora no es una enzima terapéutica. Un polipéptido de unión inicial, una proteína de unión inicial, un polipéptido de unión precursor y/o una proteína de unión precursora puede tener una secuencia silvestre o puede comprender al menos una sustitución, eliminación y/o adición de aminoácidos con relación a la secuencia de aminoácidos natural (es decir, silvestre), y/o una mutación que dé como resultado una glucosilación alterada (p. ej., hiperglucosilación, hipoglucosilación y/o aglucosilación) en una o más posiciones de aminoácido con relación a la secuencia de aminoácidos natural (es decir, silvestre).

El término "ligando" se refiere a cualquier sustancia capaz de unión, o de unirse, a otra sustancia. De forma similar, el término "antígeno" se refiere a cualquier sustancia para la que se pueda generar un anticuerpo. Aunque "antígeno" se usa comúnmente en referencia a un sustrato de unión a anticuerpo y "ligando" se usa a menudo cuando se hace referencia a sustratos de unión a receptor, estos términos no se distinguen uno de otro, y abarcan una amplia gama de entidades químicas que se solapan. Para evitar dudas, antígeno y ligando se usan indistintamente a lo largo de este documento. Los antígenos/ligandos pueden ser un péptido, un polipéptido, una proteína, un aptámero, un polisacárido, una molécula de azúcar, un carbohidrato, un lípido, un oligonucleótido, un polinucleótido, una molécula sintética, una molécula inorgánica, una molécula orgánica, y cualquier combinación de los mismos.

El término "se une específicamente", según se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse a un antígeno con una constante de disociación (Kd) de como mucho aproximadamente 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M, o menos, y/o para unirse a un antígeno con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad para un antígeno inespecífico.

Según se usa en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a estos ensamblajes (p. ej., moléculas de anticuerpo intactas, fragmentos de anticuerpo, o variantes de los mismos) que tienen actividad inmunorreactiva específica conocida significativa para un antígeno de interés (p. ej. un antígeno asociado a un tumor). Los anticuerpos y las inmunoglobulinas comprenden cadenas ligeras y pesadas, con o sin un enlace covalente intercatenario entre ellas. Las estructuras inmunoglobulínicas básicas en sistemas de vertebrados se entienden relativamente bien.

Como se entenderá con más detalle posteriormente, el término genérico "anticuerpo" comprende cinco clases distintas de anticuerpo que se pueden distinguir bioquímicamente. Aunque las cinco clases de anticuerpos están claramente dentro del alcance de la actual divulgación, el siguiente análisis se dirigirá generalmente a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, las inmunoglobulinas comprenden dos cadenas ligeras idénticas de peso molecular aproximadamente 23.000 daltons, y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular 53.000-70.000. Las cuatro cadenas estas empalmadas por uniones disulfuro en una configuración en "Y" en la que las cadenas ligeras encuadran a las cadenas pesadas partiendo de la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable.

Las cadenas ligeras de inmunoglobulina se clasifican bien como kappa o bien como lambda (^k, A). Cada clase de cadena pesada puede estar unida con una cadena ligera bien kappa o bien lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas están unidas covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas bien por hibridomas, bien por células B o bien por células anfitrionas genéticamente manipuladas. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un extremo N en las puntas bifurcadas de la configuración de Y hasta el extremo C en la parte inferior de cada cadena. Los expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon (^y, ^m, a, 5, e) con algunas subclases entre ellas (p. ej., ^y1-^y4). Es la naturaleza de esta cadena lo que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de isotipos de inmunoglobulina (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc.) están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles por el experto a la vista de la actual divulgación y, según esto, están dentro del alcance de la actual divulgación.

Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. El término "región" se refiere a una parte o porción de una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo e incluye región constante o regiones variables, así como partes o porciones más discretas de dichas regiones. Por ejemplo, las regiones variables de las cadenas ligeras incluyen "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" intercaladas entre "regiones marco" o "FR", según se definen en este documento.

Las regiones de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina se pueden definir como región "constante" (C) o regiones "variables" (V), basándose en la falta relativa de variación de secuencia dentro de las regiones de diversos miembros de la clase en el caso de una "región constante", o la variación significativa dentro de las regiones de diversos miembros de una clase en el caso de "regiones variables". Los términos "región constante" y "región variable" también se pueden usar funcionalmente. A este respecto, se apreciará que las regiones variables de una inmunoglobulina o un anticuerpo determinan el reconocimiento y la especificidad para el antígeno. A la inversa, las regiones constantes de una inmunoglobulina o un anticuerpo confieren importantes funciones efectoras tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión a receptores de Fc, unión al complemento, y similares. Las estructuras subunitarias y las configuraciones tridimensionales de las regiones constantes de las diversas clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

Las regiones constantes y variables de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina se pliegan en dominios. El término "dominio" se refiere a una región globular de una cadena pesada o ligera que comprende bucles peptídicos (p. ej., que comprende de 3 a 4 bucles peptídicos) estabilizados, por ejemplo, la lámina plegada p y/o una unión disulfuro intracatenaria. Los dominios de la región constante en la cadena ligera de una inmunoglobulina se denominan indistintamente "dominios de la región constante de la cadena ligera", "regiones CL" o "dominios CL". Los dominios constantes en la cadena pesada (p. ej. dominios bisagra, CH1, CH2 o CH3) se denominan indistintamente "dominios de la región constante de la cadena pesada", dominios de la región "CH" o "dominios CH". Los dominios variables en la cadena ligera se denominan indistintamente "dominios de la región variable de la cadena ligera", "dominios de la región VL o "dominios VL". Los dominios variables en la cadena pesada se denominan indistintamente "dominios de la región variable de la cadena pesada", "dominios de la región VH" o "dominios VH".

Por convención, la numeración de los dominios de las regiones constantes variables se incrementa a medida que se hacen más distales del sitio de unión al antígeno o el extremo amino de la inmunoglobulina o el anticuerpo. El extremo N de cada cadena pesada y ligera de inmunoglobulina es una región variable y en el extremo C es una región constante; los dominios CH3 y CL comprenden realmente el extremo carboxi de la cadena pesada y ligera, respectivamente. Según esto, los dominios de una inmunoglobulina de cadena ligera están dispuestos en una orientación VL-CL, mientras que los dominios de la cadena pesada están dispuestos en la orientación VH-CH1-bisagra-CH2-CH3.

Las posiciones de los aminoácidos en una región constante de la cadena pesada, incluyendo las posiciones de los aminoácidos en los dominios CH1, bisagra , CH2, CH3 y CL, se pueden numerar según el sistema de numeración del índice de Kabat (véase Kabat y cols., en "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. Health and Human Services, 5a edición, 1991). Alternativamente, las posiciones de los aminoácidos de un anticuerpo se pueden numerar según el sistema de numeración del índice EU (véase Kabat y cols, ibíd.).

Según se usa en este documento, el término "dominio VH" incluye el dominio variable aminoterminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, y el término "dominio VL" incluye el dominio variable aminoterminal de una cadena ligera de inmunoglobulina.

Según se usa en este documento, el término "dominio CH1" incluye el primer (el más aminoterminal) dominio de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina que se extiende, p. ej., desde aproximadamente las posiciones 114-223 en el sistema de numeración de Kabat (posiciones EU 118-215). El dominio CH1 es adyacente al dominio VH y aminoterminal a la región de bisagra de una molécula de la cadena pesada de inmunoglobulina, y no forma parte de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina.

Según se usa en este documento, el término "región de bisagra" incluye la porción de una molécula de la cadena pesada que empalma el dominio CH1 al dominio CH2. Esta región de bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, permitiendo así que las dos regiones de unión a antígeno N-terminales se muevan independientemente. Las regiones de bisagra se pueden subdividir en tres dominios distintos: dominios de bisagra superior, medio e inferior (Roux y cols. J. Immunol. 1998, 161 :4083).

Según se usa en este documento, el término "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada que se extiende, p. ej., desde aproximadamente las posiciones 244-360 en el sistema de numeración de Kabat (posiciones EU 231 -340). El dominio CH2 es único en que no está estrechamente apareado con otro dominio. En cambio, dos cadenas de carbohidrato enlazadas por N están interpuestas entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG natural intacta. En una realización, un polipéptido de unión de la actual divulgación comprende un dominio CH2 derivado de una molécula de IgG1 (p. ej. una molécula de IgG1 humana).

Según se usa en este documento, el término "dominio CH3" incluye la porción de una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada que se extiende aproximadamente 110 residuos desde el extremo N del dominio CH2, p. ej., desde aproximadamente las posiciones 361-476 del sistema de numeración de Kabat (posiciones EU 341-445). El dominio CH3 forma típicamente la porción C-terminal del anticuerpo. Sin embargo, en algunas inmunoglobulinas, dominios adicionales se pueden extender desde el dominio CH3 para formar la porción C-terminal de la molécula (p. ej. el dominio CH4 en la cadena p de IgM y la cadena e de IgE). En una realización, un polipéptido de unión de la actual divulgación comprende un dominio CH3 derivado de una molécula de IgG1 (p. ej. una molécula de IgG1 humana).

Según se usa en este documento, el término "dominio CL" incluye el dominio de la región constante de una cadena ligera de inmunoglobulina que se extiende, p. ej., desde aproximadamente la posición Kabat 107A-216. El dominio CL es adyacente al dominio VL. En una realización, un polipéptido de unión de la actual divulgación comprende un dominio CL derivado de una cadena ligera kappa (p. ej., una cadena ligera kappa humana).

Según se usa en este documento, el término "región Fc" se define como la porción de una región constante de la cadena pesada que comienza en la región de bisagra justo aguas arriba del sitio de escisión de papaína (es decir, el residuo 216 en IgG, considerando que el primer residuo de la región constante de la cadena pesada es 114) y que termina en el extremo C del anticuerpo. Según esto, una región Fc completa comprende al menos un dominio de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3.

El término "Fc natural", según se usa en este documento, se refiere a una molécula que comprende la secuencia de un fragmento que no se une a antígeno resultante de la digestión de un anticuerpo o producido por otros medios, ya esté en forma monómera o multímera, y puede contener la región de bisagra. La fuente de inmunoglobulina original del Fc natural es típicamente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, tales como IgG1 e IgG2. Las moléculas Fc naturales están constituidas por polipéptidos monómeros que pueden estar enlazados en formas dímeras o multímeras mediante asociación covalente (es decir, uniones disulfuro) y no covalente. El número de uniones disulfuro intermoleculares entre subunidades monómeras de moléculas de Fc natural varía de 1 a 4 dependiendo de la clase (p. ej., IgG, IgA y IgE) o subclase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 y IgGA2). Un ejemplo de un Fc natural es un dímero unido por disulfuro resultante de la digestión con papaína de una IgG. El término "Fc natural", según se usa en este documento, es genérico para las formas monómeras, dímeras y multímeras.

El término "variante de Fc", según se usa en este documento, se refiere a una molécula o secuencia que está modificada con respecto a un Fc natural pero todavía comprende un sitio de unión para el receptor de rescate, FcRn (receptor de Fc neonatal). Se conocen en la técnica variantes de Fc ejemplares, y su interacción con el receptor de rescate. Así, el término "variante de Fc" puede comprender una molécula o secuencia que se humaniza a partir de un Fc natural no humano. Por otra parte, un Fc natural comprende regiones que se pueden retirar debido a que proporcionan rasgos estructurales o actividad biológica que no se requieren para polipéptidos de unión de tipo anticuerpo presentados en esta divulgación. Así, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos de Fc natural, o en la que uno o más sitios o residuos de Fc se han modificado, que afectan o están implicados en: (1) la formación de uniones disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula anfitriona seleccionada, (3) heterogeneidad N-terminal tras la expresión en una célula anfitriona seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con el complemento, (6) unión a un receptor de Fc distinto al receptor de rescate, o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

El término "dominio Fc", según se usa en este documento, abarca Fc natural y variantes y secuencias de Fc según se definen anteriormente. Como con las variantes de Fc y las moléculas de Fc natural, el término "dominio Fc" incluye moléculas en forma monómera o multímera, ya sea digeridas a partir del anticuerpo entero o producidas por otros medios.

Según se indica anteriormente, las regiones variables de un anticuerpo le permiten reconocer selectivamente y unirse específicamente a epítopos sobre antígenos. Esto es, el dominio VL y el dominio VH de un anticuerpo se combinan para formar la región variable (Fv) que define un sitio de unión a antígeno tridimensional. Esta estructura cuaternaria del anticuerpo forma el sitio de unión a antígeno presente al final de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión a antígeno está definido por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) sobre cada una de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras. Según se usa en este documento, el término "sitio de unión a antígeno" incluye un sitio que se une específicamente a (inmunorreacciona con) un antígeno (p. ej., un antígeno de la superficie celular o soluble). El sitio de unión a antígeno incluye una región variable de la cadena pesada y la cadena ligera de inmunoglobulina y el sitio de unión formado por estas regiones variables determina la especificidad del anticuerpo. Un sitio de unión a antígeno está formado por regiones variables que varían de un anticuerpo a otro. Los anticuerpos alterados de la actual divulgación comprenden al menos un sitio de unión a antígeno.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos de unión de la actual divulgación comprenden al menos dos dominios de unión a antígeno que proporcionan la asociación del polipéptido de unión con el antígeno seleccionado. Los dominios de unión a antígeno no necesitan derivarse de la misma molécula de inmunoglobulina. A este respecto, la región variable puede derivarse o se deriva de cualquier tipo de animal que pueda ser inducido para montar una respuesta humoral y generar inmunoglobulinas contra el antígeno deseado. Como tal, la región variable del un polipéptido de unión puede ser, por ejemplo, de origen mamífero, p. ej., puede ser humana, murina, de rata, cabra, oveja, primate no humano (tal como macaco de Java, macacos, etc.), lupina o de camélido (p. ej., de camellos, llamas y especies relacionadas).

En anticuerpos presentes en la naturaleza, las seis CDR presentes sobre cada anticuerpo monomérico son secuencias no contiguas cortas de aminoácidos que están situadas específicamente para formar el sitio de unión a antígeno cuando el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un ambiente acuoso. El resto de los dominios variables pesados y ligeros muestra menos variabilidad intermolecular en la secuencia de aminoácidos y se denominan las regiones marco. Las regiones marco adoptan en gran parte una conformación de lámina p y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de la lámina p. Así, estas regiones marco actúan para formar un andamiaje que proporciona la colocación de las seis CDR en orientación correcta mediante interacciones no covalentes intercatenarias. El dominio de unión a antígeno formado por las CDRs colocadas define una superficie complementaria al epítopo sobre el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo al epítopo antigénico inmunorreactivo.

Polipéptidos de unión ejemplares incluyen variantes de anticuerpo. Según se usa en este documento, el término "variante de anticuerpo" incluye formas sintéticas y manipuladas de anticuerpos que se alteran de modo que no sean anticuerpos presentes en la naturaleza, p. ej., que comprenden al menos dos porciones de cadena pesada pero no dos cadenas pesadas completas (tales como anticuerpos con dominios eliminados o minicuerpos); formas multiespecíficas de anticuerpos (p. ej., biespecíficas, triespecíficas, etc.) alteradas para unirse a dos o más antígenos diferentes o a diferentes epítopos sobre un solo antígeno); moléculas de cadena pesada empalmadas a moléculas de scFv y similares. Además, el término "variante de anticuerpo" incluye formas multivalentes de anticuerpos (p. ej., anticuerpos trivalentes, tetravalentes, etc., que se unen a tres, cuatro o más copias del mismo antígeno.

Según se usa en este documento, el término "valencia" se refiere al número de sitios de unión a una diana potenciales en un polipéptido. Cada sitio de unión a una diana se une específicamente a una molécula diana o un sitio específico sobre una molécula diana. Cuando un polipéptido comprende más de un sitio de unión a una diana, cada sitio de unión a una diana puede unirse específicamente a moléculas iguales o diferentes (p. ej., se puede unir a diferentes ligandos o diferentes antígenos, o diferentes epítopos sobre el mismo antígeno). Los polipéptidos de unión en cuestión típicamente tiene al menos un sitio de unión específico para una molécula de antígeno humano.

El término "especificidad" se refiere a la capacidad para unirse específicamente (p. ej., inmunorreacionar con) un antígeno diana dado (p. ej., un antígeno diana humano). Un polipéptido de unión puede der monoespecífico y contener uno o más sitios de unión que se unen específicamente a una diana o un polipéptido puede ser multiespecífico y contener dos o más sitios de unión que se unen específicamente a dianas iguales o diferentes. En ciertas realizaciones, un polipéptido de unión es específico para dos porciones diferentes (p. ej., no solapadas) de la misma diana. En ciertas realizaciones, un polipéptido de unión es específico para más de una diana. Se conocen en la técnica polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos) ejemplares que comprenden sitios de unión a antígeno que se unen a antígenos expresados sobre células tumorales y una o más CDR procedentes de estos anticuerpos se pueden incluir en un anticuerpo caracterizado en esta divulgación.

El término "resto de enlace" incluye restos que son capaces de enlazar el resto efector a los polipéptidos de unión divulgados en este documento. El resto de enlace se puede seleccionar de modo que sea escindible (p. ej., escindible enzimáticamente o sensible al pH) o no escindible. Restos de enlace ejemplares se indica en la Tabla 2 en este documento.

Según se usa en este documento, el término "resto efector" comprende agentes (p. ej. proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, glucopéptidos, y fragmentos de los mismos) con actividad biológica u otra funcional. Por ejemplo, un polipéptido de unión modificado que comprende un resto efector conjugado a un polipéptido de unión tiene al menos una función o propiedad adicional en comparación con el anticuerpo no conjugado. Por ejemplo, la conjugación de un fármaco citotóxico (p. ej., un resto efector) a un polipéptido de unión da como resultado la formación de un polipéptido de unión con citotoxicidad farmacológica como segunda función (es decir además de la unión a antígeno). En otro ejemplo, la conjugación de un segundo polipéptido de unión al polipéptido de unión puede conferir propiedades de unión adicionales. En ciertos casos, cuando el resto efector es una proteína o un ácido nucleico terapéutico o diagnóstico codificado genéticamente, el resto efector se pueden sintetizar o expresar mediante métodos bien de síntesis de péptidos o bien de ADN recombinante que son bien conocidos en la técnica. En otro aspecto, cuando el resto efector sea un péptido no codificado genéticamente, o un resto farmacológico, el resto efector se puede sintetizar artificialmente o purificar a partir de una fuente natural. Según se usa en este documento, el término "resto farmacológico" incluye agentes terapéuticos antiinflamatorios, anticancerosos, antiinfecciosos (p. ej., antifúngicos, antibacterianos, antiparasitarios, antivirales, etc.), y agentes terapéuticos anestésicos. En un caso adicional, el resto farmacológico es un agente anticanceroso o citotóxico. Restos farmacológicos compatibles también pueden comprender profármacos. Restos efectores ejemplares se indican en la Tabla 1 en este documento.

Según se usa en este documento, el término "suavemente oxidante" se refiere a un reactivo que acepta un electrón de otra especie (y por lo tanto se reduce), pero no atrae esos electrones muy fuertemente. Ejemplos de agentes suavemente oxidantes incluyen, pero no se limitan a, peryodato oxidasa y galactosa oxidasa.

En ciertos casos, un "resto efector" comprende un "resto orientador." Según se usa en este documento, el término "resto orientador" se refiere a un resto efector que se une a una molécula diana. Restos orientadores pueden comprender, sin limitación, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos (p. ej., glucanos), y combinaciones de los mismos (p. ej., glucoproteínas, glucopéptidos y glucolípidos).

Según se usa en este documento, el término "profármaco" se refiere a una forma precursora o derivada de un agente farmacéuticamente activo que es menos activa, reactiva o propensa a efectos secundarios en comparación con el fármaco original y es capaz de activarse enzimáticamente o convertirse de otro modo en una forma más activa in vivo. Profármacos compatibles con las composiciones de la actual divulgación incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfatos, profármacos que contienen aminoácidos, profármacos que contienen tiofosfatos, profármacos que contienen sulfatos, profármacos que contienen péptidos, profármacos que contienen p-lactamas, profármacos que contienen fenoxiacetamidas opcionalmente sustituidas o profármacos que contienen fenilacetamidas opcionalmente sustituidas, profármacos de 5-fluorocitosina y otras 5-fluorouridinas que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Un experto en la técnica puede realizar modificaciones químicas en el resto farmacológico deseado o su profármaco a fin de hacer a las reacciones de ese compuesto más convenientes con los fines de preparar polipéptidos de unión modificados de la actual divulgación. Los restos farmacológicos también incluyen derivados, sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, amidas y éteres de los restos farmacológicos descritos en este documento. Los derivados incluyen modificaciones en los fármacos identificados en este documento que pueden mejorar o no reducir significativamente una actividad terapéutica deseada de un fármaco particular.

Según se usa en este documento, el término "agente anticanceroso" incluye agentes que son perjudiciales para el crecimiento y/o la proliferación de células neoplásticas o tumorales y pueden actuar para reducir, inhibir o destruir la neoplasia maligna. Ejemplos de estos agentes incluyen, pero no se limitan a, agentes citostáticos, agentes alquilantes, antibióticos, nucleósidos citotóxicos, agentes que se unen a tubulina, hormonas, antagonistas de hormonas, agentes citotóxicos, y similares. Agentes citotóxicos incluyen derivados de tomaimicina, derivados de maitansina, derivados de criptoficina, derivados de antraciclina, derivados de bisfosfonato, derivados de leptomicina, derivados de estreptonigrina, derivados de auristatina y derivados de duocarmicina. Cualquier agente que actúe para retardar o frenar el crecimiento de células inmunorreactivas o células malignas está dentro del alcance de la actual divulgación.

El término "antígeno" o "antígeno diana", según se usa en este documento, se refiere a una molécula o una porción de una molécula que es capaz de ser unida por el sitio de unión de un polipéptido de unión. Un antígeno diana puede tener uno o más epítopos.

El término "sal" comprende un ion metálico. Por ejemplo, un ion metálico incluye, pero no se limita a, un metal alcalino (Grupo Ia), p. ej. litio, sodio y potasio, un metal alcalinotérreo (Grupo IIa), p. ej., magnesio y calcio, un metal de transición, p. ej., cobre, cinc, níquel, hierro y manganeso en valencias habituales. Valencias habituales ejemplares de metales incluyen, por ejemplo, sodio(I), calcio(II), magnesio(II), cinc(II), cobre(I) y cobre(II). Sales ejemplares que comprenden un ion metálico incluyen, pero no se limitan a, acetato de cobre(II) (Cu2(OAc)4), acetato de cinc(II) (Zn2(OAc)4), cloruro de hierro (Fe3Cl3) y cloruro cálcico (CaCl2).

II. Polipéptidos de unión

En un aspecto, la actual divulgación proporciona polipéptidos (p. ej., anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, variantes de anticuerpo y proteínas de fusión) de unión que comprenden un dominio glucosilado, p. ej., un dominio constante glucosilado. Los polipéptidos de unión divulgados en este documento abarcan cualquier polipéptido de unión que comprende un dominio que tiene un sitio de glucosilación enlazado por N. En ciertas realizaciones, el polipéptido de unión es un anticuerpo o un fragmento o derivado del mismo. Cualquier anticuerpo procedente de cualquier fuente o especie se puede emplear en los polipéptidos de unión divulgados en este documento. Anticuerpos adecuados incluyen, sin limitación, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos.

En ciertas realizaciones, el dominio glucosilado es un dominio Fc. En ciertas realizaciones, el dominio de glucosilación es un dominio de glucosilación natural en N297, según la numeración de EU.

En otras realizaciones, el dominio de glucosilación es un dominio de glucosilación manipulado. Dominios de glucosilación manipulados ejemplares en el dominio Fc comprenden un residuo de asparagina en la posición de aminoácido 298, según la numeración de EU y/o un residuo de serina o treonina en la posición de aminoácido 300, según la numeración de EU.

Dominios de Fc procedentes de cualquier clase de inmunoglobulina (p. ej., IgM, IgG, IgD, IgA e IgE) y especie se pueden usar en los polipéptidos de unión divulgados en este documento. También se pueden emplear dominios Fc quiméricos que comprenden porciones de dominios Fc de diferentes especies o clases de Ig. En ciertas realizaciones, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG 1 humana. En el caso de un dominio Fc de IgG 1 humana, la mutación del aminoácido silvestre en la posición de Kabat 298 por una asparagina y la posición de Kabat 300 por una serina o treonina da como resultado la formación de un sitio de consenso de glucosilación enlazado por N (es decir, el secuón N-X-T/S, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina). Sin embargo, en el caso de dominios Fc de otras especies y/o clases o isotipos de Ig, el experto apreciará que puede ser necesario mutar la posición de Kabat 299 del dominio Fc si está presente un residuo de prolina para recrear un secuón N-X-T/S.

En otras realizaciones, la actual divulgación proporciona polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, variantes de anticuerpo y proteínas de fusión) que comprenden al menos un dominio CH1 que tiene un sitio de glucosilación enlazado por N. Estos polipéptidos de unión ejemplares pueden comprender, por ejemplo, y sitio de glucosilación manipulado en la posición 114, según la numeración de Kabat.

Se pueden usar dominios CH1 procedentes de cualquier clase de inmunoglobulina (p. ej., IgM, IgG, IgD, IgA e IgE) y especie en los polipéptidos de unión divulgados en este documento. También se pueden emplear dominios CHI quiméricos que comprenden porciones de dominios CHI procedentes de diferentes especies o clases de Ig. En ciertas realizaciones, el dominio CH1 es un dominio CH1 de IgG1 humana. En el caso de un dominio de IgG1 humana, la mutación del aminoácido silvestre en la posición 114 por una asparagina da como resultado la formación de un sitio de consenso de glucosilación enlazado por N (es decir, el secuón N-X-T/S, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina). Sin embargo, en el caso de otros dominios CH1 de otras especies y/o clases o isotipos de Ig, el experto apreciará que puede ser necesario mutar las posiciones 115 y/o 116 del dominio CH1 para crear un secuón N-X-T/S.

En ciertas realizaciones, el polipéptido de unión de la actual divulgación puede comprender un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. El término "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento polipeptídico de una inmunoglobulina o un anticuerpo que se une al antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que se derivaban) con respecto a la unión al antígeno (es decir, unión específica). Los fragmentos de unión a antígeno se pueden producir mediante métodos recombinantes o bioquímicos que son muy conocidos en la técnica. Fragmentos de unión a antígeno ejemplares incluyen Fv, Fab, Fab' y (Fab')2. En realizaciones ejemplares, el fragmento de unión a antígeno de la actual divulgación es un fragmento de unión a antígeno alterado que comprende al menos un sitio de glucosilación manipulado. En una realización ejemplar, un fragmento de unión a antígeno alterado de la actual divulgación comprende un dominio VH alterado descrito anteriormente. En otra realización ejemplar, un fragmento que se une a antígeno alterado de la actual divulgación comprende un dominio CH1 alterado descrito.

En realizaciones ejemplares, el polipéptido de unión comprende una secuencia de la región variable monocatenaria (ScFv). Las secuencias de la región variable monocatenarias comprenden un solo polipéptido que tiene uno o más sitios de unión a antígeno, p. ej., un dominio VL enlazado por un enlazador flexible a un dominio VH. Las moléculas de ScFv se pueden construir en una orientación VH-enlazador-VL o una orientación VL-enlazador-VH. La bisagra flexible que enlaza los dominios VL y VH que constituyen el sitio de unión a antígeno incluye de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 residuos de aminoácido. Se conocen en la técnica péptidos de conexión. Los polipéptidos de unión pueden comprender al menos una scFv y/o al menos una región constante. En una realización, un polipéptido de unión de la actual divulgación puede comprender al menos una scFv enlazada o fusionada a un anticuerpo o fragmento que comprende un dominio CH1 (p. ej. un dominio CH1 que comprende un residuo de asparagina en la posición de Kabat 114/la posición de EU 118) y/o un dominio CH2 (p. ej. un dominio CH2 que comprende un residuo de asparagina en la posición de EU 298 y un residuo de serina o treonina en la posición de EU 300).

En ciertas realizaciones ejemplares, un polipéptido de unión de la actual divulgación es un anticuerpo multivalente (p. ej., tetravalente) que se produce al fusionar una secuencia de ADN que codifica un anticuerpo con una molécula de ScFv (p. ej., una molécula de ScFv alterada). Por ejemplo, en una realización, estas secuencias se combinan de modo que la molécula de ScFv (p. ej., una molécula de ScFv alterada) esté enlazada en su extremo N o extremo C a un fragmento Fc de un anticuerpo a través de un enlazador flexible (p. ej., un enlazador de gly/ser). En otra realización, un anticuerpo tetravalente de la actual divulgación se puede elaborar al fusionar una molécula de ScFv a un péptido de conexión, que está fusionado a un dominio CH1 (p. ej., un dominio CH1 que comprende un residuo de asparagina en la posición de Kabat 114/la posición de EU 118) para construir una molécula tetravalente de ScFv-Fab.

En otra realización, un polipéptido de unión de la actual divulgación es un minicuerpo alterado. Un minicuerpo alterado de la actual divulgación es una molécula dímera constituida por dos cadenas polipeptídicas que comprenden cada una una molécula de ScFv (p. ej., una molécula de ScFv alterada que comprende un dominio VH alterado descrita anteriormente) que está fusionada a un dominio CH3 o una porción del mismo a través de un péptido de conexión. Los minicuerpos se pueden elaborar al construir un componente de ScFv y conectar los componentes péptido-CH3 usando métodos descritos en la técnica (véanse, p. ej., la patente de Ee . UU. 5.837.821 o el documento WO 94/09817A1). En otra realización, se puede construir un minicuerpo tetravalente. Los minicuerpos tetravalentes se pueden construir del mismo modo que los minicuerpos, excepto que dos moléculas de ScFv se enlazan usando un enlazador flexible. La construcción scFv-scFv enlazada se empalma entonces a un dominio CH3.

En otra realización, un polipéptido de unión de la actual divulgación comprende un diacuerpo. Los diacuerpos son moléculas tetravalentes dímeras que tienen cada una un polipéptido similar a moléculas de scFv, pero que habitualmente tienen un enlazador de residuos de aminoácido corto (menos de 10, p. ej., 1-5) que conecta ambos dominios variables, de modo que los dominios VL y VH sobre la misma cadena polipeptídica no puedan interactuar. En cambio, el dominio VL y VH de una cadena polipeptídica interactúa con el dominio VH y VL (respectivamente) sobre una segunda cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, el documento WO 02/02781). Los diacuerpos de la actual divulgación comprenden una molécula de scFv fusionada a un dominio CH3.

En otras realizaciones, los polipéptidos de unión comprenden anticuerpos multiespecíficos o multivalentes que comprenden uno o más dominios variables en serie sobre la misma cadena polipeptídica, p. ej., polipéptidos de dominios variables en tándem (TVD). Polipéptidos de TVD ejemplares incluyen la configuración de "doble cabeza" o "Fv dual" descrita en la Patente de EE. UU. N° 5.989.830. En la configuración de Fv dual, los dominios variables de dos anticuerpos diferentes se expresan en una orientación en tándem sobre dos cadenas separadas (una cadena pesada y una cadena ligera), donde una cadena polipeptídica tiene dos dominios VH en serie separados por un enlazador peptídico (VH1-enlazador-VH2) y la otra cadena polipeptídica consiste en dominios VL complementarios conectados en serie por un enlazador peptídico (VL1 -enlazador-VL2). En la configuración de doble cabeza transversal, los dominios variables de dos anticuerpos diferentes se expresan en una orientación en tándem sobre dos cadenas polipeptídicas separadas (una cadena pesada y una cadena ligera), donde una cadena polipeptídica tiene dos dominios VH en serie separados por un enlazador peptídico (VH1-enlazador-VH2) y la otra cadena polipeptídica consiste en dominios VL complementarios conectados en serie por un enlazador peptídico en la orientación opuesta (VL2-enlazador-VL1). Variantes de anticuerpo adicionales basadas en el formato de "Fv dual" incluyen el anticuerpo biespecífico de IgG de dominio variable dual (DVD-IgG) (véase la Patente de EE. UU. N° 7.612.181 y el formato TBTI (véase el documento US 2010/0226923 A1). La adición de dominios constantes a cadenas respectivas de la Fv dual (CH1-Fc a la cadena pesada y el dominio contante kappa o lambda a la cadena ligera) conduce a anticuerpos biespecíficos funcionales sin la necesidad de modificaciones adicionales (es decir, adición obvia de dominios constantes para potenciar la estabilidad).

En otra realización ejemplar, el polipéptido de unión comprende un anticuerpo biespecífico de IgG de dominio variable dual transversal (CODV-IgG) basado en una configuración de "doble cabeza" (véase el documento US20120251541 A1). Las variantes de anticuerpo de CODV-IgG tienen una cadena polipeptídica con dominios VL conectados en serie a un dominio CL (VL1-L1-VL2-L2-CL) y una segunda cadena polipeptídica con dominios VH complementarios conectados en serie en la orientación opuesta a un dominio CH1 (VH2-L3-VH1-L4-CH1), donde las cadenas polipeptídicas forman un par cadena ligera-cadena pesada transversal. En cierta realización, el segundo polipéptido puede estar conectado además a un dominio Fc (VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc). En ciertas realizaciones, el enlazador L3 es al menos dos veces más largo que el enlazador L1 y/o el enlazador L4 es al menos más largo que el enlazador L2. Por ejemplo, L1 y L2 pueden tener una longitud de 1 -3 residuos de aminoácido, L3 puede tener una longitud de 2 a 6 residuos de aminoácido y L4 puede tener una longitud de 4 a 7 residuos de aminoácido. Ejemplos de enlazadores adecuados incluyen un residuo de una sola glicina (Gly); un péptido de diglicina (Gly-Gly); un tripéptido (Gly-Gly-Gly); un péptido con cuatro residuos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly) (SEQ ID NO: 40); un péptido con cinco residuos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly) (SEQ ID NO: 41); un péptido con seis residuos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly) (SEQ ID NO: 42); un péptido con siete residuos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly) (SEQ ID NO: 43); un péptido con ocho residuos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly) (s Eq ID NO: 44). Se pueden usar otras combinaciones de residuos de aminoácidos tales como el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SE^qID NO: 45) y el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 46).

En ciertas realizaciones, el polipéptido de unión comprende una molécula de inmunoadhesina que comprende una región que no es de unión a anticuerpo (p. ej., un receptor, un ligando o una molécula de adhesión celular) fusionada a una región constante de anticuerpo (véase, p. ej., Ashkenazi y cols., Methods, 19958(2), 104-115)

En ciertas realizaciones, el polipéptido de unión comprende dominios inmunoglobulínicos. Dominios inmunoglobulínicos adecuados incluyen, sin limitación, dominios de fibronectina (véase, por ejemplo, Koide y cols. (2007), Methods Mol. Biol. 352: 95-109), DARPin (véase, por ejemplo, Stumpp y cols. (2008) Drug Discov. Today 13 (15-16): 695-701), dominios Z de proteína A (véase Nygren y cols. (2008) FEBS J. 275 (11): 2668-76), lipocalinas (véase, por ejemplo, Skerra y cols. (2008) FEBS J. 275 (11): 2677-83), afilinas (véase, por ejemplo, Ebersbach y cols. (2007) J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85), afitinas (véase, por ejemplo, Krehenbrink y cols. (2008). J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-68), avímeros (véase, por ejemplo, Silverman y cols. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61), finómeros, (véase, por ejemplo, Grabulovski y cols. (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196-3204), y péptidos del dominio de Kunitz (véase, por ejemplo, Nixon y cols. (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261-8).

III. Glucanos enlazados por N

En ciertas realizaciones, los polipéptidos de unión presentados en la invención emplean glucanos que están "enlazados por N" a través de un residuo de asparagina a un sitio de glucosilación en el esqueleto polipeptídico del polipéptido de unión. El sitio de glucosilación puede ser un sitio de glucosilación natural o manipulado. Adicionalmente o alternativamente, el glucano puede ser un glucano natural o un glucano manipulado (p. ej., un glucano modificado) que contiene uno o más enlaces no naturales. Los "N-glucanos" o "glucanos enlazados por N" están ligados a un nitrógeno amídico de una residuo de asparagina o arginina en una proteína a través de un residuo de N-acetilglucosamina. Estos "sitios de glucosilación enlazados por N" se presentan en la estructura primaria del péptido que contiene, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos asparagina-X-serina/treonina, donde X es cualquier residuo de aminoácido excepto prolina y ácido aspártico. Estos N-glucanos se describen a fondo, por ejemplo, en Drickamer K, Taylor ME (2006). Introduction to Glycobiology, 2° ed..

En ciertas realizaciones, se proporcionan proteínas de unión y/o polipéptidos de unión glucomanipulados y métodos para elaborar proteínas de unión y/o polipéptidos de unión glucomanipulados. Según se usa en este documento, el término "glucomanipulación" se refiere a cualquier método reconocido en la técnica para alterar el perfil de la glucoforma de una composición de proteína de unión para generar un "glucano modificado."

Según se usan en el presente documento, los términos "glucoforma G0", "glucoforma G1" y "glucoforma G2" se refieren a glucoformas de N-glucano que tienen cero, uno o dos residuos de galactosa terminales, respectivamente. Estos términos incluyen glucoformas G0, G1 y G2 que están fucosiladas o comprenden un residuo de N-acetilglucosamina bisector.

En ciertas realizaciones, las glucoformas G1 y G2 comprenden además residuos de ácido siálico enlazados a uno o ambos de los residuos de galactosa terminales para formar las glucoformas G1S1, G2S1 y G2S2. Según se usan en este documento, los términos "glucoforma G1S1", "glucoforma G2S1" y "glucoforma G2S2" se refieren a glucoformas de N-glucano que tienen un residuo de ácido siálico enlazado al único residuo de galactosa terminal en una glucoforma G1, uno del residuo de galactosa terminal en una glucoforma G2 o ambos residuos de galactosa terminales en una glucoforma G2, respectivamente. Estos términos incluyen glucoformas G1S1, G2S1 y G2S2 que están fucosiladas o comprenden un residuo de N-acetilglucosamina bisector. En ciertas realizaciones, los residuos de ácido siálico de las glucoformas G1S1, G2S1 y G2S2 están enlazados por enlaces de ácido alfa-2,6-siálico al residuo de galactosa terminal de cada glucoforma a fin de potenciar la actividad antiinflamatoria de la molécula de unión (véase p. ej., Anthony y cols., PNAS 105: 19571-19578, 2008).

Según se usan en este documento, los términos "glucoforma GIF", "glucoforma G2F", "glucoforma G1S1F", "glucoforma G2S1F" y "glucoforma G2S2F" se refieren a la "glucoforma G1", la "glucoforma G2", la "glucoforma G1S1", la "glucoforma G2S1" y la "glucoforma G2S2" que están fucosiladas, respectivamente.

En ciertas realizaciones ejemplares, el polipéptido de unión comprende el sitio de glucosilación natural de un dominio Fc de anticuerpo. Este sitio de glucosilación natural comprende un residuo de asparagina silvestre en la posición 297 del dominio Fc (N297), según la numeración de EU. El glucano enlazado por N natural que reside en esta posición generalmente está enlazado a través de un enlace de p-glucosilamida al grupo nitrógeno de la cadena lateral de N297. Sin embargo, también se pueden emplear otros enlaces reconocidos en la técnica. Un glucano enlazado por N a N297 puede contener una manosa, N-acetilglucosamina, galactosa o ácido siálico terminal.

En otras realizaciones ejemplares, los polipéptidos de unión comprenden uno o más sitios de glucosilación manipulados. Estos sitios de glucosilación manipulados comprenden la sustitución de uno o más aminoácidos silvestres en el esqueleto polipeptídico del polipéptido de unión por un residuo de asparagina que es capaz de ser N-glucosilado por las enzimas de glucosilación de una célula. Sitios de glucosilación manipulados ejemplares incluyen la introducción de mutación de asparagina en la posición de aminoácido 298 del dominio Fc (298N) según la numeración de EU o la posición de aminoácido 114 de un dominio CH1 (114N) según la numeración de Kabat (posición 118 de un dominio CH1 según la numeración de EU).

Cualquier tipo de glucano enlazado por N presente en la naturaleza o sintético (es decir, no natural o modificado) se puede enlazar a un sitio de glucosilación de un polipéptido de unión presentado en esta divulgación. En ciertos casos, el glucano comprende un sacárido (p. ej., un residuo de sacárido situado en el extremo de un oligosacárido) que se puede oxidar (p. ej., mediante tratamiento con peryodato o galactosa oxidasa) para producir un grupo adecuado para la conjugación a un resto efector (p. ej., un grupo aldehído reactivo). Sacáridos oxidables adecuados incluyen, sin limitación, galactosa y ácido siálico (p. ej., ácido N-acetilneuramínico). En ciertos casos, el glucano es un glucano biantenario. En ciertos casos, el glucano es una glucoforma de mamífero presente en la naturaleza.

La glucosilación se puede conseguir a través de cualquier medio conocido en la técnica. En ciertas realizaciones, la glucosilación se consigue mediante la expresión de los polipéptidos de unión en células capaces de glucosilación enlazada por N. Cualquier célula natural o manipulada (p. ej., se pueden emplear procarióticas o eucarióticas (p. ej., células CHO o NSO)). En general, se emplean células de mamífero para efectuar la glucosilación. Los N-glucanos que se producen en células de mamífero se denominan comúnmente N-glucanos de tipo híbrido complejos con alto contenido de manosa (véase p. ej., Drickamer (2006)). Estos N-glucanos complejos tienen una estructura que típicamente tiene de dos a seis ramificaciones externas con una secuencia de sialil-lactosamina enlazada a una estructura central interna Man3GlcNAc2. Un N-glucano complejo tiene al menos una ramificación, y/o al menos dos ramificaciones, de residuos de GlcNAc y galactosa (Gal) alternos que terminan en oligosacáridos tales como, por ejemplo: NeuNAc-; NeuAc a2,6 GalNAc a1-; NeuAc a2,3 Gal p1,3 GalNAc a1-; y NeuAc a2,3/6 Gal p1,4 GlcNAc p 1.; Además, se pueden presentar ésteres de sulfato sobre residuos de galactosa, GalNAc, y GlcNAc. NeuAc puede estar O-acetilado o se puede reemplazar por NeuGl (ácido N-glicolilneuramínico). Los N-glucanos complejos también pueden tener sustituciones intracatenarias de GlcNAc bisector y fucosa (Fuc) central.

Adicionalmente o alternativamente, la glucosilación se puede conseguir o modificar a través de medios enzimáticos, in vitro. Por ejemplo, se pueden emplear una o más glucosiltransferasas para añadir residuos de sacárido específicos al N-glucano natural o manipulado de un polipéptido de unión, y se pueden emplear una o más glucosidasas para retirar sacáridos no deseados del glucano enlazado por N. Estos medios enzimáticos son muy conocidos en la técnica (véase. p. ej., el documento WO2007/005786).

IV Funciones Electoras Inmunológicas y Modificaciones de Fc

En ciertas realizaciones, los polipéptidos de unión pueden comprender una región constante de anticuerpo (p. ej., una región constante de IgG p. ej., una región constante de IgG humana, p. ej., una región constante de IgG1 o IgG4 humanas) que media en una o más funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del complejo C1 a una región constante de anticuerpo puede activar el sistema del complemento. La activación del sistema del complemento es importante en la opsonización y la lisis de patógenos celulares. La activación del sistema del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede estar implicada en la hipersensibilidad autoinmunitaria. Además, los anticuerpos se unen a los receptores sobre diversas células a través de la región Fc (sitios de unión a receptores Fc sobre la región Fc del anticuerpo se unen a receptores de Fc (FcR) sobre una célula). Existe un número de receptores de Fc que son específicos para diferentes clases de anticuerpo, incluyendo IgG (receptores gamma), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión del anticuerpo a receptores de Fc sobre superficies celulares desencadena un número de respuestas biológicas importantes y diversas incluyendo la fagocitación y la destrucción de partículas revestidas con anticuerpo, la depuración de complejos inmunitarios, la lisis de células diana revestidas con anticuerpo por células agresoras (llamada citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, o ADCC), la liberación de mediadores inflamatorios, la transferencia placentaria y el control de la producción de inmunoglobulinas. En algunas realizaciones, los polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígenos) se unen a un receptor gamma de Fc. En realizaciones alternativas, los polipéptidos de unión pueden comprender una región constante que carece de una o más funciones efectoras (p. ej., actividad ADCC) y/o es incapaz de unirse a un receptor de Fcy.

Ciertas realizaciones incluyen anticuerpos en los que al menos un aminoácido en uno o más de los dominios de la región constante se han eliminado o alterado de otro modo a fin de proporcionar características bioquímicas deseadas tales como una reducción o potenciación de las funciones efectoras, la capacidad para dimerizarse no covalentemente, un incremento en la capacidad para localizarse en la zona de un tumor, una reducción en la semivida sérica o un incremento en la semivida sérica en comparación con un anticuerpo inalterado entero de aproximadamente la misma inmunogenicidad. Por ejemplo, ciertos anticuerpos para el uso en métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en este documento son anticuerpos con dominios eliminados, que comprenden una cadena polipeptídica similar a una cadena pesada de inmunoglobulina, pero que carecen de al menos una porción de uno o más dominios de la cadena pesada. A modo de ejemplo, en ciertos anticuerpos, se eliminará un dominio completo de la región constante del anticuerpo modificado, por ejemplo, se eliminará la totalidad o parte del dominio CH2.

En ciertas otras realizaciones, los polipéptidos de unión comprenden regiones constantes derivadas de diferentes isotipos de anticuerpo (p. ej., regiones constantes procedentes de dos o más de una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana). En otras realizaciones, los polipéptidos de unión comprenden una bisagra quimérica (es decir, una bisagra que comprende porciones de la bisagra derivadas de dominios de bisagra de diferentes isotipos de anticuerpo, p. ej., un dominio de bisagra superior procedente de una molécula de IgG4 y un dominio de bisagra medio IgG1). En una realización, los polipéptidos de unión comprenden una región Fc o porción de la misma procedente de una molécula de IgG4 humana y una mutación Ser228Pro (numeración de EU) en la región de bisagra central de la molécula.

En ciertas realizaciones, la porción Fc se puede mutar para incrementar o disminuir una función efectora usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la eliminación o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de la región constante puede reducir la unión al receptor de Fc del anticuerpo modificado circulante incrementando de ese modo la localización del tumor. En otros casos, puede ser que modificaciones de la región constante de acuerdo con la actual divulgación moderen la unión al complemento y así reduzcan la semivida sérica y la asociación inespecífica de una citotoxina conjugada. Sin embargo, se pueden usar otras modificaciones de la región constante para modificar enlaces disulfuro o restos de oligosacárido que permitan la potenciación de la localización debido a un incremento en la especificidad o flexibilidad del antígeno. El perfil fisiológico, la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos resultantes de las modificaciones, tales como localización tumoral, biodistribución y semivida sérica, se pueden medir y cuantificar fácilmente usando técnicas inmunológicas bien conocidas sin una experimentación excesiva.

En ciertas realizaciones, un dominio Fc empleado en un anticuerpo es una variante de Fc. Según se usa en este documento, el término "variante de Fc" se refiere a un dominio Fc que tiene al menos una sustitución de aminoácido con relación al dominio Fc silvestre del que se deriva dicho dominio Fc. Por ejemplo, cuando el dominio Fc se derive de un anticuerpo de IgG1 humana, la variante de Fc de dicho dominio Fc de IgG1 humana comprende al menos una sustitución de aminoácido con relación a dicho dominio Fc.

La sustitución o las sustituciones de aminoácidos de una variante de Fc pueden estar situadas en cualquier posición (es decir, cualquier posición de aminoácido de la convención de EU) dentro del dominio Fc. En una realización, la variante de Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio de bisagra o una porción del mismo. En otra realización, la variante de Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio CH2 o una porción del mismo. En otra realización, la variante de Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio CH3 o una porción del mismo. En otra realización, la variante de Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio CH4 o una porción del mismo.

Los polipéptidos de unión pueden emplear cualquier variante de Fc reconocida en la técnica conocida por impartir una mejora (p. ej., reducción o potenciación) en una función efectora y/o la unión a FcR. Dichas variantes de Fc pueden incluir, por ejemplo, una cualquiera de las sustituciones de aminoácido divulgadas en las Publicaciones PCT Internacionales WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WOOO/09560A2, WOOO/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2 y WO06/085967A2 o las Pat. EE. UU. N25.648.260, 5.739.277, 5.834.250, 5.869.046, 6.096.871, 6.121.022, 6.194.551, 6.242.195, 6.277.375, 6.528.624, 6.538.124, 6.737.056, 6.821.505, 6.998.253 y 7.083.784. En una realización ejemplar, un polipéptido de unión puede comprender una variante de Fc que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 268 de EU (p. ej., H268D o H268E). En otra realización ejemplar, un polipéptido de unión puede comprender una sustitución de aminoácido en la posición 239 de EU (p. ej., S239D o S239E) y/o la posición 332 de EU (p. ej., I332D o I332Q).

En ciertas realizaciones, un polipéptido de unión puede comprender una variante de Fc que comprende una sustitución de aminoácido que altera las funciones efectoras independientes de antígeno del anticuerpo, en particular la semivida circulatoria del polipéptido de unión. Estos polipéptidos de unión exhiben bien un incremento o bien una reducción en la unión a FcRn en comparación con polipéptidos de unión que carecen de estas sustituciones, por lo tanto, tienen un incremento o una disminución en la semivida en suero, respectivamente. Se anticipa que las variantes de Fc con afinidad mejorada para FcRn tienen semividas séricas más prolongadas, y estas molécula tienen aplicaciones útiles en métodos para tratar a mamíferos en los que se desee una semivida prolongada del anticuerpo administrado, p. ej., para tratar una enfermedad o trastorno crónicos. En contraste, se espera que las variantes de Fc con una disminución en la unión a FcRn tengan semividas más breves, y estas moléculas también son útiles, por ejemplo, para la administración a un mamífero cuando pueda ser deseable un tiempo de circulación abreviado, p. ej. para diagnóstico por imagen in vivo o en situaciones en las que el anticuerpo de partida tenga efectos secundarios tóxicos cuando esté presente en la circulación durante períodos prolongados. Las variantes de Fc con una disminución en la afinidad de unión a FcRn también son menos propensas a cruzar la placenta y, así, también son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos en mujeres embarazadas. Además, otras aplicaciones en las que se puede desear una reducción en la afinidad de unión a FcRn incluyen aplicaciones localizadas en el cerebro, el riñón y/o el hígado. En una realización ejemplar, los polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) alterados exhiben una reducción en el transporte a través del epitelio de los glomérulos renales desde la vasculatura. En otra realización, los polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) alterados exhiben una reducción en el transporte a través de la barrera hematoencefálica (BBB) desde el cerebro hasta el interior del espacio vascular. En una realización, un anticuerpo con una alteración en la unión a FcRn comprende un dominio Fc que tiene una o más sustituciones de aminoácidos dentro del "bucle de unión a FcRn" de un dominio Fc. El bucle de unión a FcRn está comprendido por los residuos de aminoácido 280-299 (según la numeración de EU). Sustituciones de aminoácidos ejemplares que alteran la actividad de unión a FcRn se divulgan en la Publicación PCT Internacional N° WO05/047327. En ciertas realizaciones ejemplares, los polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) comprenden un dominio Fc que tiene una o más de las siguientes sustituciones: V284E, H285E, N286D, K290E y S304D (numeración de EU). En otras realizaciones ejemplares adicionales, las moléculas de unión comprenden un dominio de Fc humano con la mutación doble H433K/N434F (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. N° 8.163.881).

En otras realizaciones, los polipéptidos de unión, para el uso en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en este documento tienen una región constante, p. ej., una región constante de la cadena pesada de IgG1 o IgG4, que se altera para reducir o eliminar la glucosilación. Por ejemplo, los polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) también pueden comprender una variante de Fc que comprende una sustitución de aminoácido que altere la glucosilación del Fc del anticuerpo. Por ejemplo, dicha variante de Fc puede tener una reducción en la glucosilación (p. ej., glucosilación enlazada por N u O). En realizaciones ejemplares, la variante de Fc comprende una reducción en la glucosilación del glucano enlazado por N normalmente encontrado en la posición de aminoácido 297 (numeración de EU). En otra realización, el anticuerpo tiene una sustitución de aminoácido cerca de o dentro de un motivo de glucosilación, por ejemplo, un motivo de glucosilación enlazado por N que contiene la secuencia de aminoácidos NXT o NXS. En una realización particular, el anticuerpo comprende una variante de Fc con una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido 228 o 299 (numeración de EU). En realizaciones más particulares, el anticuerpo comprende una región constante de IgG1 o IgG4 que comprende una mutación S228P y una T299A (numeración de EU).

Sustituciones de aminoácidos ejemplares que confieren una reducción o alteración en la glucosilación se divulgan en la Publicación PCT Internacional N° WO05/018572. En algunas realizaciones, los polipéptidos de unión se modifican para eliminar la glucosilación. Estos polipéptidos de unión se pueden denominar polipéptidos de unión "aglu" (p. ej. anticuerpos "aglu"). Aunque sin limitarse por una teoría, se cree que los polipéptidos de unión "aglu" pueden tener una mejora en el perfil de seguridad y estabilidad in vivo. Los polipéptidos de unión aglu pueden ser de cualquiera de sus isotipos o subclases, p. ej., IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de unión aglu comprenden una región Fc aglucosilada de un anticuerpo de IgG4 que carece de la función efectora de Fc, eliminando de ese modo el potencial de toxicidad mediada por Fc para los órganos vitales normales que expresan IL-6. En otras realizaciones adicionales, los polipéptidos de unión comprenden un glucano alterado. Por ejemplo, el anticuerpo puede tener un número reducido de residuos de fucosa sobre un N-glucano en Asn297 de la región Fc, es decir, está afucosilado. La afucosilación incrementa a unión a FcyRII sobre las células NK e incrementa potencialmente la ADCC. Se ha mostrado que un diacuerpo que comprende una scFV anti-IL-6 y una scFv anti-CD3 induce la destrucción de células que expresan IL-6 mediante ADCC. Según esto, en una realización, se usa un anticuerpo anti-IL-6 afucosilado para orientarse a y destruir células que expresan IL-6. En otra realización, el polipéptido de unión puede tener un número alterado de residuos de ácido siálico sobre el N-glucano en Asn297 de la región Fc. Están disponibles numerosos métodos reconocidos en la técnica para elaborar anticuerpos "aglu" o anticuerpos con glucanos alterados.

Por ejemplo, se pueden usar células anfitrionas manipuladas genéticamente (p. ej., levadura, p. ej., Picchia, o células CHO, modificadas) con rutas de glucosilación modificadas (p. ej., eliminaciones de glicosil-transferasa) para producir estos anticuerpos.

V. Restos Efectores

En ciertos casos, los polipéptidos de unión de la actual divulgación comprenden restos efectores (p. ej., restos orientadores). En general, estos restos efectores se conjugan (bien directamente o bien a través de un resto enlazador) a un glucano enlazado por N sobre el polipéptido de unión, (p. ej., un glucano enlazado por N enlazado a N298 (numeración de EU) del dominio CH2 y/o N114 (numeración de Kabat) de un dominio CH1). En ciertos casos, el polipéptido de unión es un anticuerpo de longitud completa que comprende dos dominios CH1 con un glucano en la posición de Kabat 114 (posición 118 de EU), donde ambos glucanos se conjugan a uno o más restos efectores. Cualquier resto efector se puede añadir a los polipéptidos de unión divulgados en este documento. Los restos efectores pueden añadir una función no natural a un anticuerpo alterado o sus fragmentos sin alterar significativamente la actividad intrínseca del polipéptido de unión. En ciertos casos ejemplares, un resto efector es un resto orientador (p. ej., un glucopéptido o neoglucano). Un polipéptido de unión (p. ej., un anticuerpo) modificado de la actual divulgación puede comprender uno o más restos efectores, que pueden ser iguales o diferentes.

En un caso, el resto efector puede ser de Fórmula (I):

H2N-Q-CON-X Fórmula (I),

en la que:

A) Q es NH u O; y

B) CON es un resto conector; y

C) X es un resto efector (p. ej., un resto orientador según se define en este documento).

El resto conector conecta el agente terapéutico a H2N-Q-. El resto conector puede incluir al menos uno de cualquier componente adecuado conocido por los expertos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, un componente de alquilenilo, un componente de polietilenglicol, un componente de poli(glicina), un componente de poli(oxazolina), un componente de carbonilo, un componente derivado de cisteinamida, un componente derivado de valina acoplada con citrulina, y un componente derivado de carbamato de 4-aminobencilo, o cualquiera de sus combinaciones.

En otro caso, el resto efector de Fórmula (I) puede ser de Fórmula (Ia):

H2N-Q-CH2-C(O)-Z-X Fórmula (Ia),

en la que:

A) Q es NH u O; y

B) Z es -Cys-(MC)^a-(VC)^b-(PABC)^c-(C¹⁶H³²O^eC²H⁴)^f,

donde

i. Cys es una cisteinamida derivada componente;

ii. MC es un componente derivado de maleimida;

iii. VC es un componente derivado de valina acoplada con citrulina;

iv. PABC es un componente derivado de carbamato de 4-aminobencilo;

v. X es un resto efector (p. ej., un resto orientador según se define en este documento); vi. a es 0 o 1;

v i i . b e s 0 o 1 ;

v i i i . c e s 0 o 1 ; y

ix . f e s 0 o 1

E l " c o m p o n e n t e d e r i v a d o d e c i s t e i n a m id a " e s e l p u n t o d e l ig a z ó n a H 2N - Q - C H 2- C ( O ) - . E n u n c a s o , e l " c o m p o n e n t e d e r i v a d o d e c i s t e i n a m id a " s e p u e d e r e f e r i r a u n a o m á s p o r c io n e s d e l r e s t o e f e c t o r q u e t ie n e la e s t r u c t u r a :

E n u n c a s o , e l c o m p o n e n t e " C y s " d e u n r e s t o e f e c t o r p u e d e i n c lu i r u n a d e e s t a s p o r c io n e s . P o r e je m p lo , la s ig u ie n t e e s t r u c t u r a m u e s t r a u n r e s t o e f e c t o r c o n u n a d e e s t a s p o r c io n e s ( d o n d e e l c o m p o n e n t e d e " C y s " e s t á in d ic a d o c o n la c a j a d e l í n e a d e p u n t o s ) :

E n o t r o c a s o , e l c o m p o n e n t e " C y s " d e u n r e s t o e f e c t o r p u e d e i n c lu i r d o s o m á s d e e s t a s p o r c io n e s . P o r e j e m p lo , e l s ig u ie n t e r e s t o c o n t i e n e d o s d e e s t a s p o r c io n e s :

(MC)a-(VC)b-(PABC)c(C16H3208C2H4)fX

H

C)a-(VC)b-(PABC)c(C16H320 8C2H4)fX

R -h 'T NT ^ s'

0 cr^m 2

C o m o s e p u e d e o b s e r v a r a p a r t i r d e la e s t r u c t u r a , c a d a c o m p o n e n t e " C y s " t ie n e u n g r u p o - ( M C ) a - ( V C ) b - ( P A B C ) c -( C 16H 32O 8C 2 H 4) - X .

E n u n c a s o , la e x p r e s i ó n " c o m p o n e n t e d e r i v a d o d e m a le i m i d a " s e p u e d e r e f e r i r a c u a l q u i e r p o r c ió n d e l r e s t o e f e c t o r q u e t e n g a la e s t r u c t u r a :

d o n d e d e s u n n ú m e r o e n t e r o d e 2 a 5. E l n ú m e r o d e c o m p o n e n t e s M C in c lu i d o e n c u a l q u i e r g r u p o C y s - ( M C ) a - ( V C ) b -( P A B C M C 16H 32O 8C 2 H 4) - X e n e l r e s t o e f e c t o r e s t á in d ic a d o p o r e l s u b í n d i c e " a " , y p u e d e s e r 0 o 1 E n u n c a s o , a e s 1. E n o t r o c a s o , b e s 0.

E n u n c a s o , e l c o m p o n e n t e " C y s " p u e d e e s t a r c o n e c t a d o a l c o m p o n e n t e " M C " a t r a v é s d e l á t o m o d e a z u f r e d e l c o m p o n e n t e " C y s " , s e g ú n s e in d i c a p o r la c a j a d e l í n e a d e p u n t o s d e la e s t r u c t u r a p o s t e r io r :

E n u n c a s o , la e x p r e s i ó n " c o m p o n e n t e d e r i v a d o d e v a l i n a a c o p la d a c o n c i t r u l i n a " s e p u e d e r e f e r i r a c u a l q u i e r p o r c ió n d e l r e s t o e f e c t o r c o n la s i g u ie n t e e s t r u c t u r a :

5

E l n ú m e r o d e c o m p o n e n t e s V C in c lu i d o e n c u a l q u i e r g r u p o C y s - ( M C ) a - ( V C ) b - ( P A B C ) c - ( C 16 H 32 O 8 C 2 H 4 ) f - X e n e l r e s t o e f e c t o r e s t á in d ic a d o p o r e l s u b í n d i c e " b " , y p u e d e s e r 0 o 1. E n u n c a s o , b e s 1. E n o t r o c a s o , b e s 0.

10 E n u n c a s o , la e x p r e s i ó n " c o m p o n e n t e d e r i v a d o d e c a r b a m a t o d e 4 - a m in o b e n c i l o " s e p u e d e r e f e r i r a c u a l q u i e r p o r c ió n d e l r e s t o e f e c t o r c o n la s i g u ie n t e e s t r u c t u r a :

15 E l n ú m e r o d e c o m p o n e n t e s P A B C in c lu i d o e n c u a l q u i e r g r u p o C y s - ( M C ) a - ( V C ) b - ( P A B C ) c - ( C 16 H 32 O 8 C 2 H 4 ) f - X e n e l r e s t o e f e c t o r e s t á in d ic a d o p o r e l s u b í n d i c e " c " , y p u e d e s e r 0 o 1. E n u n c a s o , c e s 1. E n o t r o c a s o , c e s 0.

E n u n c a s o , " C 16H 32O 8C 2 H 4" s e r e f i e r e a la s i g u ie n t e e s t r u c t u r a :

20

E l n ú m e r o d e u n i d a d e s C 16H 32O 8 in c lu i d o e n c u a l q u i e r g r u p o C y s - ( M C ) a - ( V C ) b - ( P A B C ) c - ( C 16 H 32 O 8 C 2 H 4 ) f - X e n e l r e s t o e f e c t o r e s t á in d ic a d o p o r e l s u b í n d i c e " f " , E n u n c a s o , f e s 1. E n o t r o c a s o , f e s 0.

E n u n c a s o , a e s 1 , b e s 1 , c e s 1 y f e s 0.

25 a) Restos Efectores Terapéuticos

E n c ie r t a s r e a l i z a c io n e s , lo s p o l i p é p t i d o s d e u n ió n d e la a c t u a l d i v u lg a c ió n e s t á n c o n j u g a d o s a u n r e s t o e f e c t o r q u e c o m p r e n d e u n a g e n t e t e r a p é u t i c o , p . e j . u n r e s t o f a r m a c o l ó g i c o ( o s u p r o f á r m a c o ) o u n c o m p u e s t o r a d io m a r c a d o . E n u n a r e a l i z a c ió n e l a g e n t e t e r a p é u t i c o e s u n a c i t o t o x in a . A g e n t e s t e r a p é u t i c o s c i t o t ó x i c o s e j e m p la r e s s e in d ic a n e n la T a b l a 1 e n e s t e d o c u m e n t o .

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 Restos farmacológicos ejemplares adicionales incluyen agentes terapéuticos antinflamatorios, anticancerosos, antiinfecciosos (p. ej., antifúngicos, antibacterianos, antiparasitarios, antivirales, etc.) y anestésicos. En una realización adicional, el resto farmacológico es un agente anticanceroso. Agentes anticancerosos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, citostáticos, inhibidores enzimáticos, reguladores génicos, nucleósidos citotóxicos, agentes de unión a tubulina o inhibidores de tubulina, inhibidores del proteasoma, hormonas y antagonistas de hormonas, agentes antiangiogénicos, y similares. Agentes anticancerosos citostáticos ejemplares incluyen agentes alquilantes tales como la familia de fármacos de antraciclina (p. ej. adriamicina, carminomicina, ciclosporina-A, cloroquina, metopterina, mitramicina, porfiromicina, estreptonigrina, porfiromicina, antracenodiones y aziridinas). Otros agentes anticancerosos citostáticos incluyen inhibidores de la síntesis de ADN (p. ej., metotrexato y diclorometotrexato, 1,4-dióxido de 3-amino-1,2,4-benzotriazina, aminopterina, p-D-arabinofuranósido de citosina, 5-fluoro-5'-desoxiuridina, 5-fluorouracilo, ganciclovir, hidroxiurea, actinomicina-D y mitomicina C), intercaladores o reticuladores de ADN (p. ej., bleomicina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida, dicloruro de cisdiaminoplatino(II) (cisplatino), melfalano, mitoxantrona y oxaliplatino), y reguladores de la transcripción de ADN-ARN (p. ej., actinomicina D, daunorrubicina, doxorrrubicinaa, homoharringtonina e idarrubicina). Otros agentes citostáticos ejemplares que son compatibles con la presente divulgación incluyen ansamicinabenzoquinonas, derivados quinonoides (p. ej. quinolonas, genisteína, bactaciclina), busulfano, ifosfamida, mecloretamina, triazicuona, diazicuona, carbazilquinona, indoloquinona EO9, diaziridinil-benzoquinona metil DZQ, trietilenfosforamida y compuestos de nitrosourea (p. ej. carmustina, lomustina, semustina).

Agentes anticancerosos de nucleósido citotóxicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a: arabinósido de adenosina, citarabina, arabinósido de citosina, 5-fluorouracilo, fludarabina, floxuridina, ftorafur y 6-mercaptopurina. Agentes de unión a tubulina anticancerosos ejemplares incluyen, pero no se limitan a: taxoides (p. ej. paclitaxel, docetaxel, taxano), nocodazol, rizoxina, dolastatinas (p. ej. dolastatina-10, -11 o -15), colchicina y colchicinoides (p. ej. ZD6126), combretastatinas (p. ej. combretastatina A-4, AVE-6032) y alcaloides de las vincas (p. ej. vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina (navelbina)). Hormonas y antagonistas hormonales anticancerosos ejemplares incluyen, pero no se limitan a: corticosteroides (p. ej. prednisona), progestinas (p. ej. hidroxiprogesterona o medroprogesterona), estrógenos, (p. ej. dietilestilbestrol), antiestrógenos (p. ej. tamoxifeno), andrógenos (p. ej. testosterona), inhibidores de aromatasas (p. ej. aminoglutetimida), 17-(alilamino)-17-desmetoxigeldanamicina, 4-amino-1,8-naftalimida, apigenina, brefeldina A, cimetidina, ácido diclorometilendifosfónico, leuprolida (leuprorelina), hormona liberadora de la hormona luteinizante, pifitrina-a, rapamicina, globulina de unión a hormonas sexuales, y tapsigargina. Compuestos antiangiogénicos anticancerosos ejemplares incluyen, pero no se limitan a: angiostatina Kl-3, DL-adifluorometilornitina, endostatina, fumagilina, genisteína, minociclina, estaurosporina y (±)-talidomida.

Inhibidores enzimáticos anticancerosos ejemplares incluyen, pero no se limitan a: S(+)-camptotecina, curcumina, (-)-deguelina, 1-p-D-ribofuranósido de 5,6-diCH1orobencimidazol, etopósido, formestano, fostriecina, hispidina, ácido 2-imino-1 -imidazolidinacético (ciclocreatina), mevinolina, tricostatina A, tirfostina AG 34 y tirfostina AG 879.

Reguladores génicos anticancerosos ejamplares incluyen, pero no se limitan a: 5-aza-2'-desoxicitidina, 5-azacitidina, colecalciferol (vitamina D3), 4-hidroxitamoxifeno, melatonina, mifepristona, raloxifeno, trans-retinal (aldehídos de vitamina A), ácido retinoico, vitamina A ácida, ácido 9-cis-retinoico, ácido 13-cis-retinoico, retinol (vitamina A), tamoxifeno y troglitazona.

Otras clases de agentes anticancerosos incluyen, pero no se limitan a: la familia de fármacos de pteridina, diinenos y las podofilotoxinas. Miembros de esas clases particularmente útiles incluyen, por ejemplo, metopterina, podofilotoxina o derivados de podofilotoxina tales como etopósido, fosfato de etopósido, leurosidina, vindesina, leurosina y similares.

Otros agentes anticancerosos adicionales que son compatibles con las enseñanzas del presente documento incluyen auristatinas (p. ej. auristatina E y monometilauristana E), geldanamicina, calicheamicina, gramicidina D, maitansanoides (p. ej. maitansina), neocarzinostatina, topotecano, taxanos, citocalasina B, bromuro de etidio, emetina, tenopósido, colchicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, y análogos u homólogos de los mismos.

Otros agentes anticancerosos adicionales que son compatibles con las enseñanzas del presente documento incluyen derivados de tomaimicina, derivados de maitansina, derivados de criptoficina, derivados de antraciclina, derivados de bisfosfonato, derivados de leptomicina, derivados de estreptonigrina, derivados de auristatina y derivados de duocarmicina.

Otra clase de agentes anticancerosos compatibles que se pueden usar como restos farmacológicos son fármacos radiosensibilizadores que se pueden dirigir eficazmente a células tumorales o inmunorreactivas. Estos restos farmacológicos potencian la sensibilidad a la radiación ionizante, incrementando de ese modo la eficacia de la radioterapia. Sin limitarse a una teoría, un anticuerpo modificado con un resto farmacológico radiosensibilizador e internalizado por la célula tumoral aportaría el radiosensibilizador más cerca del núcleo en el que la radiosensibilización sería máxima. Los anticuerpos que perdieran el resto radiosensibilizador se depurarían rápidamente de la sangre, localizando el agente de radiosensibilización restante en el tumor diana y proporcionando una captación mínima en tejidos normales. Después de la depuración de la sangre, se podría administrar radioterapia adyuvante mediante radiación de haz externo dirigida específicamente al tumor, radiactividad implantada directamente en el tumor o radioinmunoterapia sistémica con el mismo anticuerpo modificado.

En una realización, el agente terapéutico comprende radionúclidos o radiomarcadores con radiación ionizante de alta energía que son capaces de provocar múltiples roturas de cadena en ADN nuclear, conduciendo a muerte celular. Radionúclidos de alta energía ejemplares incluyen: 90 Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re y 188Re. Estos isótopos producen típicamente partículas a o p de alta energía que tienen una longitud de recorrido corta. Estos radionúclidos destruyen células con las que están en estrecha proximidad, por ejemplo células neoplásticas a la que se ha ligado el conjugado o en las que ha entrado. Tienen poco o ningún efecto sobre células no localizadas y son esencialmente ininmunogénicos. Alternativamente, se pueden generar isótopos de alta energía mediante la irradiación térmica de un isótopo por lo demás estable, por ejemplo como en la terapia de captura de neutrones del boro (Guan y cols., PNAS, 95: 13206-10, 1998).

En una realización, el agente terapéutico se selecciona de MMAE, MMAF y PEG8-Do110.

Restos efectores terapéuticos ejemplares incluyen las estructuras:

En u n a rea liza c ió n , el res to e fe c to r se s e le c c io n a de:

En c ie rta s rea liza c io nes , el res to e fe c to r co n tie n e m ás de un a g e n te te ra p é u tico . E s tos m ú ltip le s ag e n te s te ra p é u tico s

pu ed en se r ig ua les o d ife ren te s .

b) Restos efectores diagnósticos

En c ie rta s rea liza c io nes , los p o lip é p tid o s de un ión de la ac tua l d ivu lg a c ió n es tán c o n ju g a d o s a un res to e fe c to r que

co m p re n d e un a g en te d iag nós tico . En u n a rea liza c ió n , el a g en te d ia g n ó s tico es un m a rca d o r de m o lé cu la p e q u e ñ a

de te c ta b le , p. ej. b io tina , flu o ró fo ro s , c ro m ó fo ro s , son da s de re so n a n c ia de esp ín o rad io m a rca d o re s . F luo ró fo ro s

e je m p la re s in c luye n c o lo ra n te s flu o re sce n te s (p. ej. f lu o re sce ín a , rodam ina , y s im ila re s ) y o tra s m o lécu las

lu m in isce n te s (p. ej. lum ina l). Un f lu o ró fo ro pu ed e se r a m b ie n ta lm e n te sen s ib le de m odo que su flu o re s c e n c ia cam b ie

si se s itú a ce rc a de uno o m ás re s id u o s en el p o lip é p tid o de un ión m od ifica do que su fre c a m b io s es tru c tu ra le s al un irse

a un su s tra to (p. ej. so n d a s de da ns ilo ). R a d io m a rca d o re s e je m p la re s in c luye n m o lé cu la s p e q u e ñ a s que con tie n e n

á to m o s con uno o m ás nú c le os de b a ja s e n s ib ilid a d (13C, 15N, 2H, 125I, 124I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 64Cu, s im ila re s ). El ra d io n ú c lid o pu ed e ser, p. ej., un ra d io n ú c lid o e m iso r de pa rtícu la s gam m a, fo to n e s o po s itro n e s con una

s e m iv id a a d e cu a d a p a ra p e rm itir la ac tiv ida d o de te cc ió n d e sp u é s de l t ie m p o tra n scu rrid o en tre la a d m in is tra c ió n y la

lo ca liza c ió n en la z o n a de ob te n c ió n de im ágenes .

E n u n a r e a l i z a c ió n , e l a g e n t e d i a g n ó s t i c o e s u n p o l ip é p t i d o . P o l i p é p t i d o s d i a g n ó s t i c o s e j e m p la r e s in c lu y e n e n z i m a s c o n a c t i v i d a d f l u o r o g é n i c a o c r o m o g é n i c a , p . e j . la c a p a c id a d p a r a e s c i n d i r u n s u s t r a t o q u e f o r m a u n f l u o r ó f o r o o c r o m ó f o r o c o m o u n p r o d u c t o ( e s d e c i r p r o t e í n a s in d i c a d o r a s t a le s c o m o lu c i f e r a s a ) . O t r a s p r o t e í n a s d ia g n ó s t i c a s p u e d e n t e n e r a c t i v i d a d f l u o r o g é n i c a o c r o m o g é n i c a i n t r í n s e c a ( p . e j . , p r o t e í n a s a e c u o r i n a b io lu m in i s c e n t e s 5 f l u o r e s c e n t e s v e r d e , r o ja y a m a r i l l a p r o c e d e n t e s d e o r g a n i s m o s m a r i n o s b i o lu m in i s c e n t e s ) o p u e d e n c o m p r e n d e r u n a p r o t e í n a q u e c o n t i e n e u n o o m á s n ú c l e o s r a d ia c t i v o s d e b a j a e n e r g í a ( 13C , 15N , 2 H , 125I, 124I, 123I, 99T c , 43K , 52F e , 64C u , 68G a , 111In y s im i la r e s ) .

25 E n c ie r t a s r e a l i z a c io n e s , e l r e s t o e f e c t o r d i a g n ó s t i c o e s u n a s o n d a d e F R E T ( t r a n s f e r e n c ia d e e n e r g í a f l u o r e s c e n t e m e d ia n t e r e s o n a n c ia ) . F R E T s e h a u s a d o p a r a u n a v a r i e d a d d e a p l i c a c i o n e s d i a g n ó s t i c a s i n c lu y e n d o e l d i a g n ó s t i c o d e l c á n c e r . U n a s o n d a d e F R E T p u e d e i n c lu i r u n e n l a z a d o r e s c i n d ib le ( e n la z a d o r s e n s i b le a e n z i m a s o d e p H ) q u e c o n e c t a lo s r e s t o s d o n a n t e y a c e p t o r d e la s o n d a d e F R E T , d o n d e la e s c i s ió n d a c o m o r e s u l t a d o u n a p o t e n c i a c ió n e n la f lu o r e s c e n c ia ( in c l u y e n d o e l in f r a r r o j o c e r c a n o ) ( v é a s e , p . e j . , A . C o b o s - C o r r e a y c o l s . M e m b r a n e - b o u n d F R E T p r o b e 30 v i s u a l i z e s M M P 12 a c t i v i t y in p u l m o n a r y i n f l a m m a t io n , N a t u r e C h e m i c a l B i o lo g y ( 2009 ) , 5 ( 9 ) , 628 - 63 ; S . G e h r ig y c o ls .

S p a t i a l l y R e s o lv e d M o n i t o r in g o f N e u t r o p h i l E la s t a s e A c t i v i t y w i t h R a t i o m e t r i c F l u o r e s c e n t R e p o r t e r s ( 2012 ) A n g e w . C h e m . In t . E d . , 5 1 , 6258 - 6261 ) .

E n u n a r e a l i z a c ió n , e l r e s t o e f e c t o r s e s e l e c c io n a d e :

35

R 1-4 = H o C H 3 o C 2 H 6 u o t r o s g r u p o s a l i f á t i c o s

c) Restos efectores funcionalizados

E n c ie r t a s r e a l i z a c io n e s , lo s r e s t o s e f e c t o r e s s e p u e d e n f u n c io n a l i z a r p a r a c o n t e n e r u n o o m á s g r u p o s a d i c io n a le s a d e m á s d e l p r o p i o r e s t o e f e c t o r . P o r e j e m p lo , e l r e s t o e f e c t o r p u e d e c o n t e n e r e n l a z a d o r e s e s c i n d ib le s q u e l i b e r a n e l r e s t o e f e c t o r d e l p o l i p é p t i d o d e u n ió n b a j o c o n d i c io n e s p a r t i c u l a r e s . E n r e a l i z a c io n e s e j e m p la r e s , e l r e s t o e f e c t o r p u e d e i n c lu i r u n e n l a z a d o r q u e e s e s c i n d ib le p o r e n z i m a s c e l u la r e s y / o e s s e n s i b le a l p H . A d i c i o n a lm e n t e o a l t e r n a t i v a m e n t e , e l r e s t o e f e c t o r p u e d e c o n t e n e r u n a u n ió n d i s u l f u r o q u e s e e s c i n d e m e d ia n t e g l u t a t i o n a in t r a c e l u la r t r a s la c a p t a c i ó n e n la c é lu la . E n la z a d o r e s s e n s i b le s a d i s u l f u r o y p H e j e m p la r e s s e p r o p o r c io n a n p o s t e r i o r m e n t e :

R 1-4 = H o C H 3 o C 2 H 6 u o t r o s g r u p o s a l i f á t i c o s

R = H o g r u p o s a lq u i l o , a l q u i l a r i l o s u s t i t u i d o s o n o s u s t i t u id o s

E n o t r a s r e a l i z a c io n e s a d i c io n a le s , e l r e s t o e f e c t o r p u e d e i n c lu i r r e s t o s h i d r ó f i l o s y b i o c o m p a t i b l e s t a le s c o m o r e s t o s p o l i ( g l i c in a ) , p o l i ( o x a z o l i n a ) y / o P E G . E s t r u c t u r a s ( " Y " ) e j e m p la r e s s e p r o p o r c io n a n p o s t e r i o r m e n t e :

P y Q = grupos funcionales iguales o diferentes para enlazar fármacos, moléculas indicadoras y proteína

En ciertas realizaciones, el resto efector contiene un grupo aminooxi que facilita la conjugación a un polipéptido de unión a través de un enlace oxima estable. Restos efectores ejemplares que contienen grupos aminooxi se indican en la Tabla 2 en este documento.

Tabla 2. Restos efectores de aminoxi ejemplares (donde X puede ser cualquier enlazador, Y es cualquier espaciador y donde X y/o Y son opcionales)

c o n t in u a c ió n

En otras realizaciones, el resto efector contiene un grupo hidrazida y/o hidrazida alquilada en N para facilitar la conjugación a un polipéptido de unión a través de un enlace hidrazona estable. Restos efectores que contienen grupos aminooxi ejemplares se indica en la Tabla 14 en este documento.

Tabla 14. restos efectores de hidracina y/o hidrazida ejemplares

d) Restos orientadores

El polipéptido de unión de la presente invención comprende un resto orientador que se une a una célula, donde el resto orientador es un resto de glucano GalNAc trivalente o un glucopéptido trigalactosilado. Más generalmente, sin embargo, la presente divulgación describe restos efectores que comprenden restos orientadores que se unen específicamente a una o más moléculas diana. Se puede emplear cualquier tipo de resto orientador incluyendo, sin limitación, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos (p. ej., glucanos), y sus combinaciones (p. ej., glucoproteínas, glucopéptidos y glucolípidos). En ciertos casos, el resto orientador es un carbohidrato o un glucopéptido. En ciertos casos, el resto orientador es un glucano. Los restos orientadores pueden ser moléculas presentes o no en la naturaleza. Restos orientadores adecuados para la conjugación pueden incluir los que contienen enlazadores de aminooxi (véanse, p. ej., la Figura 40 y 41).

Los restos orientadores descritos en la presente invención se pueden unir a cualquier tipo de célula, incluyendo células de animales (p. ej., mamíferos), plantas o insectos bien in vitro o bien in vivo, sin limitación. Las células pueden ser de orígenes endodérmico, mesodérmico o ectodérmico, y pueden incluir cualquier tipo de célula. En ciertas realizaciones, el resto orientador se une a una célula, p. ej., una célula de mamífero, una facilita el aporte de un polipéptido de unión a la célula elegida, p. ej., para mejorar la orientación a la célula y/o la captación. Células diana ejemplares incluyen, sin limitación, células inmunitarias (p. ej., linfocitos tales como células B, células T, células agresoras naturales (NK), basófilos, macrófagos o células dendríticas), células hepáticas (p. ej., hepatocitos o células no parenquimales tales como células endoteliales sinusoidales hepáticas, células de Kupffer o células estrelladas hepáticas), células tumorales (p. ej., cualquier célula maligna o benigna incluyendo células de hepatoma, células de cáncer de pulmón, células de sarcoma, células de leucemia o células de linfoma), células vasculares (p. ej., células endoteliales aórticas o células endoteliales de la arteria pulmonar), células epiteliales (p. ej., células epiteliales escamosas simples, células epiteliales columnares simples, células epiteliales columnares seudoestratificadas células epiteliales escamosas estratificadas) o células mesenquimales (p. ej., células de los sistemas linfático y circulatorio, células de hueso y cartílago).

En una realización, el polipéptido de unión que comprende uno o más restos orientadores es internalizado por la célula. En otra realización, la cantidad del polipéptido de unión que comprende uno o más restos orientadores internalizados por la célula es mayor que la cantidad de un polipéptido de unión de referencia que carece de un resto orientador Internalizado por la célula.

En una realización, el resto orientador se une a un receptor sobre la célula diana. Por ejemplo, el resto orientador puede comprender un resto 6-fosfato de manosa que se une a un receptor de 6-fosfato de manosa sobre la célula. En otras realizaciones ejemplares, el resto orientador se une a una Siglec sobre una célula diana. Siglecs ejemplares incluyen sialoadhesina (Siglec-1), CD22 (Siglec-2), CD33 (Siglec-3), MAG (Siglec-4), Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Siglec-12, Siglec-14 o Siglec-15. En otras realizaciones adicionales, el resto orientador comprende un residuo de ácido siálico enlazado en a2,3, a2,6 o a2,8. En una realización adicional, el resto orientador comprende un resto de a2,3-sialil-lactosa o un resto de a2,6-sialil-lactosa. Otros receptores ejemplares incluyen receptores de lectina, incluyendo, pero no limitados a, receptores de lectina tipo C, galectinas y receptores de lectina tipo L. Receptores de lectina ejemplares incluyen: DEC-205 (CD205; antígeno linfocítico 75), receptor de manosa de macrófagos (MMR; CD206), dectina-1, dectina-2, lectina tipo C inducible por macrófagos (Mincle), ICAM3 no asociada a integrina específica de células dendríticas (DC-SIGN, CD209), receptor-1 del grupo de lectina DC NK (DNGR-1), langerina (CD207), un lecticano, un receptor de asialoglucoproteína, inmunorreceptor de células dendríticas del receptor de lectina C (CLEC4A; CLECSF6 ; DCIR), lectina de tipo galactosa de macrófagos (MGL), un receptor de DC, una colectina, una selectina, un receptor de células NK, un receptor endocítico del dominio de lectina tipo multi-C (CTLD), una lectina del grupo Reg (tipo VII), condrolectina, tetranectina, policistina, atractina (ATRN), proteína básica principal de eosinófilos (EMBP), gen 2 de la región crítica del síndrome de DiGeorge (DGCR2), trombomodulina, Bimlec, una lectina del grupo XVI (SEEC) y una lectina del grupo XVII (CBCP/Frem1/QBRICK).

Los polipéptidos de unión de la presente invención se pueden usar para retirar compuestos tóxicos y sustancias nocivas del hígado en múltiples enfermedades al orientarse a receptores de carbohidratos (p. ej., receptor de 6-fosfato de manosa, receptor de manosa y receptor de asialoglucoproteína). Por favor, véanse: Ganesan, L.P. y cols: Rapid and Efficient Clearance of Blood-borne Virus by Liver Sinusoidal Endothelium. PLoS Pathogens 2011,9: 1; y Monnier, V.M. y cols: Glucosepane: a poorly understood advanced glycation end product of growing importance for diabetes and its complications. Clin Chem Lab Med 2014; 52: 21.

Los polipéptidos de unión de la presente invención también se pueden usar para orientarse a células tumorales a través de la orientación a uno o más receptores celulares diferentes incluyendo, pero no limitados a: receptores de carbohidratos, receptores de asialoglucoproteína y/o Siglecs. Por favor, véanse: Chen, W.C. y cols: In vivo targeting of B-cell lymphoma with glycan ligands of CD22. Blood 2010, 115: 4778; Chen, W.C. y cols: Targeting B lymphoma with nanoparticles bearing glycan ligands of CD22. Leuk Lymphoma 2012, 53: 208; Hatakeyama, S. y cols: Targeted drug delivery to tumor vasculature by a carbohydrate mimetic peptide. PNAS, 2011, 108: 19587; Hong, F. y cols: p-Glycan Functions as an Adjuvant for Monoclonal Antibody Immunotherapy by Recruiting Tumoricidal Granulocytes as Killer Cells. Cancer Res. 2003, 23: 9023; Kawasakia, N. y cols: Targeted delivery of lipid antigen to macrophages via the CD169/sialoadhesin endocytic pathway induces robust invariant natural killer T cell activation. PNAS 2013, 110: 7826; y Medina, S.H. y cols: N-acetylgalactosamine-functionalized dendrimers as hepatic cancer cell-targeted carriers. Biomaterials 2011,32: 4118.

Los péptidos de unión de la presente invención también se pueden usar para regular la respuesta inmunitaria a través de diversos receptores incluyendo, pero no limitados a, receptores de carbohidratos, DC-SIGNs y/o Siglecs. Por favor, véanse: Anthony, R.M. y cols: Recapitulation of IVIG Anti-Inflammatory Activity with a Recombinant IgG Fc. Science 2008, 320: 373; Anthony, R.M. y cols: Identification of a receptor required for the anti-inflammatory activity of IVIG. PNAS 2008, 105: 19571; Kaneko, Y. y cols: Anti-Inflammatory Activity of Immunoglobulin G Resulting from Fc Sialylation. Science 2006, 313: 670; y Mattner, J. y cols: Exogenous and endogenous glycolipid antigens activate NKT cells during microbial infections. Nature 2005, 434: 525.

En una realización, el resto orientador es un glucopéptido. En una realización adicional, el resto orientador es un glucopéptido trigalactosilado, p. ej., lactosa3-Cys3Gly4 (mostrada en la Fórmula V, posteriormente):

[ F ó r m u l a V ] .

E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l r e s t o o r i e n t a d o r s e p u e d e r e p r e s e n t a r m e d ia n t e la F ó r m u la V I I :

E n a l g u n a s r e a l i z a c io n e s , e l r e s t o c o n e c t o r d e l r e s t o e f p e r o n o l i m i t a d o a , u n a l q u i l o C 2-30 o d e 1 a 32 P E G . E n ^{e l ig e b a s á n d o s e e n la l o n g i t u d a p r o x i m a d a} (Figura 79). l im i t a n a , ~ 12 Á , ~ 16 Á , ~ 20 Á , ~ 31 Á , ~ 45 Á , ~ 60 Á , ~ 80

En ciertas realizaciones, el resto efector de Fórmula (I) se puede representar mediante la Fórmula VIII:

[Fórmula VIII],

donde q es un número entero entre 1 y 29, inclusive. Por ejemplo, q puede ser 6, 8, 10, 11, 12, 16, 18 o 22. En realizaciones ejemplares, el resto efector de Fórmula VIII se puede representar mediante:

[Fórmula XIV].

En otras realizaciones, el resto efector de Fórmula (I) se puede representar mediante la Fórmula IX:

donde p tiene un valor de 1 a 32. Por ejemplo, p puede ser 2, 4, 6, 8, 11, 12 o 24. En realizaciones ejemplares, el resto efector de Fórmula IX se puede representar mediante la Fórmula X:

[Fórmula X].

En otras realizaciones, el resto efector de Fórmula (I) se puede representar mediante la Fórmula XI:

donde p tiene un valor de 1 a 32. Por ejemplo, p puede ser 2, 4, 6, 8, 11, 12 o 24. En realizaciones ejemplares, el resto efector de Fórmula XI se puede representar mediante la Fórmula XII:

e) Restos de PEG

En otros casos, el resto efector es un resto que comprende poli(etilenglicol) (PEG, PEO o POE). El PEG es un oligómero o polímero de óxido de etileno y tiene la estructura química H-(O-CH2-CH2)n-OH en la que el elemento entre paréntesis se repite. La PEGilación (o pegilación) es un procedimiento en el que cadenas poliméricas de PEG se ligan a otra molécula (p. ej., un polipéptido de unión), que se describe entonces como PEGilada (o pegilada). La PEGilación puede servir para reducir la inmunogenicidad y la antigenicidad así como para incrementar el tamaño hidrodinámico (tamaño en solución) de la molécula a la que se liga, reducir la depuración renal y prolongar el tiempo de circulación. La PEGilación también puede hacer a las moléculas más solubles en agua. En un caso, el resto de PEG puede comprender mono-PEG, bi-PEG o tri-PEG. En otro caso, el resto de PEG comprende de 3 a 3,5 PEG.

VI. Conjugación de restos efectores a polipéptidos de unión

En ciertos casos, los restos efectores se conjugan (bien directamente o bien a través de un resto enlazador) a un glucano oxidado (p. ej., un glucano enlazado por N oxidado) de un polipéptido de unión alterado (p. ej., un glucano manipulado en N114 de un dominio CH1 de anticuerpo o un glucano natural en N297 de un dominio F de anticuerpo). El término "glucano oxidado" significa que un sustituyente alcohol en el glucano se ha oxidado, proporcionando un sustituyente carbonilo. El sustituyente carbonilo puede reaccionar con un nucleófilo nitrogenado adecuado para formar un doble enlace carbono-nitrógeno. Por ejemplo, la reacción del grupo carbonilo con un grupo aminooxi o una hidrazina formaría una oxima o hidrazina, respectivamente. En un caso, el sustituyente carbonilo es un aldehído. Glucanos oxidados adecuados incluyen galactosa oxidada y ácido siálico oxidado.

En un caso, el polipéptido modificado de Fórmula (II) puede ser de Fórmula (II):

Ab(Gal-C(O)H)^x(Gal-Sia-C(O)H)^yFórmula (II),

en la que

A) Ab es un anticuerpo u otro polipéptido de unión según se define en este documento;

B) Gal es un componente derivado de galactosa;

C) Sia es un componente derivado de ácido siálico;

D) x es de 0 a 5; y

E) y es de 0 a 5,

donde al menos uno de x e y no es 0.

Se puede emplear cualquier química reconocida en la técnica para conjugar un resto efector (p. ej., un resto efector que comprende un resto enlazador) a un glucano (véase p. ej., Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques. Academic Press (1996)). En ciertas realizaciones, se oxida en primer lugar un residuo de sacárido (p. ej., un residuo de ácido siálico o galactosa) (p. ej., usando tratamiento de ácido siálico con peryodato sódico o tratamiento de galactosa con galactosa oxidasa) para generar un grupo aldehído reactivo. Este grupo aldehído se hace reaccionar con resto efector un grupo aminooxi o un grupo hidrazina para formar un enlazador de oxima o hidrazona, respectivamente. Métodos ejemplares que emplean este esquema de reacción general se indican en los Ejemplos 10 a 15.

En ciertas realizaciones, los glucanos naturales o manipulados de un polipéptido de unión se pretratan en primer lugar con enzimas glucosiltransferasa in vitro para proporcionar un residuo de sacárido terminal que es adecuadamente reactivo. Por ejemplo, la sialilación se puede conseguir en primer lugar usando una combinación de galactosiltransferasa (Gal T) y sialiltransferasa (Sial T). En ciertas realizaciones, glucanos biantenarios que carecen de galactosa (GOF o GO) o que contienen una galactosa (G1F o G1) se pueden convertir en estructuras galactosiladas o sialiladas de orden superior adecuadas para la conjugación (G1F, G1, G2F, G2, G1S1F, G1S1, G2S1F, G2S1, G2S2F o G2S2).

Un esquema de conjugación ejemplar para producir glucoconjugados sialilados se muestra en la Figura 25C. En una realización ejemplar, se introducen residuos de ácido siálico enzimáticamente y específicamente para un sitio en el glucano de un anticuerpo (p. ej., un glucano natural en Asn-297) usando una combinación de galactosiltransferasa (Gal T) y sialiltransferasa (Sial T). Los residuos de ácido siálico introducidos se oxidan posteriormente con una baja concentración de peryodato sódico para dar aldehídos de ácido siálico reactivos, adecuadamente reactivos con enlazadores (p. ej., enlazadores de aminooxi) para generar conjugados de anticuerpo-resto efector (p. ej., conjugados enlazados por oxima de anticuerpo-resto efector). Al controlar el número de glucano y el número de residuos siálicos con remodelación in vitro, el experto tiene un control preciso sobre la relación fármaco-anticuerpo (DAR) de los conjugados de anticuerpo-resto efector. Por ejemplo, si se añade ~1 ácido siálico sobre un solo glucano biantenario (A1F) en cada cadena pesada, se puede obtener homogéneamente un anticuerpo o polipéptido de unión con una DAR de 2.

VII. Polipéptidos de unión modificados

En ciertos casos, la divulgación proporciona polipéptidos modificados que son el producto de que se conjuguen restos efectores conjugantes (bien directamente o bien a través de un resto enlazador) a uno o más glucanos oxidados (p. ej., un glucano enlazado por N oxidado) de un polipéptido de unión alterado (p. ej., un glucano manipulado en N114 de un dominio de CH1 de anticuerpo o un glucano natural en N297 de un dominio F de anticuerpo).

En un caso, el polipéptido de unión puede ser de Fórmula (III):

Ab(Gal-C(H)=N-Q-CON-X)^x(Gal-Sia-C(H)=N-Q-CON-X)^yFórmula (III),

en la que:

A) Ab es un anticuerpo según se define en este documento;

B) Q es NH u O;

C) CON es un resto conector según se define en este documento;

D) X es un resto orientador según se define en este documento;

E) Gal es un componente derivado de galactosa;

F) Sia es un componente derivado de ácido siálico;

G) x es de 0 a 5; y

H) y es de 0 a 5,

donde al menos uno de x e y no es 0.

En un caso, el polipéptido de unión de Fórmula (III) puede ser de Fórmula (IIIa):

Ab(Gal-C(H)=N-Q-CH²-C(O)-Z-X)^x(Gal-Sia-C(H)=N-Q-CH²-C(O)-Z-X)^y, Fórmula (Illa), en la que:

A) Ab es un anticuerpo;

B) Q es NH u O;

C) Z es Cys-(MC)^a-(VC)^b-(PABC)^c-(C¹⁶H³²O⁸C²H⁴)^f-, donde

i. Cys es una cisteinamida derivada componente;

ii. MC es un componente derivado de maleimida;

iii. VC es un componente derivado de valina acoplada con citrulina;

iv. PABC es un componente derivado de carbamato de 4-aminobencilo;

v. X es un resto efector (p. ej., un resto orientador según se define en este documento); vi. a es 0 o 1 ;

vii. b es 0 o 1 ;

viii. c es 0 o 1 ; y

ix. f es 0 o 1 ;

D) X es un agente terapéutico según se define en este documento;

E) Gal es un componente derivado de galactosa;

F) Sia es un componente derivado de ácido siálico;

G) x es de 0 a 5; y

H) y es de 0 a 5,

donde al menos uno de x e y no es 0.

Se debe entender que la Fórmula (III) no está destinada a implicar que el anticuerpo, el sustituyente Gal y el sustituyente Gal-Sia estén conectados en forma de cadena. En cambio, cuando están presentes estos sustituyentes, el anticuerpo está conectado directamente a cada sustituyente. Por ejemplo, un polipéptido de unión de Fórmula (III) en la que x es 1 e y es 2 podría tener la disposición mostrada posteriormente:

Fórmula (III)

El sustituyente CON en la Fórmula (III) y los componentes de la misma son como se describen con respecto a la Fórmula (I) para los restos efectores.

En un caso, Q es NH. En otro caso, Q es O.

En un caso, x es 0.

El anticuerpo Ab de Fórmula (III) puede ser cualquier anticuerpo adecuado según se describe en este documento. En un caso, se proporciona un método para preparar el polipéptido de unión de Fórmula (III), comprendiendo el método hacer reaccionar un resto efector de Fórmula (I):

NH²-Q-CON-X Fórmula (I),

en la que:

A) Q es NH u O;

B) CON es un resto conector; y

C) X es un resto efector (p. ej., un resto orientador según se define en este documento),

con un anticuerpo modificado de Fórmula (II)

Ab(OXG)^rFórmula (II)

en la que

A) OXG es un glucano oxidado; y

B) r se selecciona de 0 a 4;

En un caso, se proporciona un método para preparar el polipéptido de unión de Fórmula (III), comprendiendo el método hacer reaccionar un resto efector de Fórmula (I):

NH²-Q-CON-X Fórmula (I),

en la que:

A) Q es NH u O;

B) CON es un resto conector; y

con un anticuerpo modificado de Fórmula (IIa)

Ab(Gal-C(O)H)^x(Gal-Sia-C(O)H)^yFórmula (IIa),

en la que

A) Ab es un anticuerpo según se describe en este documento;

B) Gal es un componente derivado de galactosa;

C) Sia es un componente derivado de ácido siálico;

D) x es de 0 a 5; y

E) y es de 0 a 5,

donde al menos uno de x e y no es 0.

VII. Métodos de tratamiento con anticuerpos modificados

La divulgación proporciona métodos para tratar o diagnosticar a un paciente que lo necesite que comprenden administrar una cantidad eficaz de un polipéptido de unión divulgado en este documento. En ciertos casos, la presente divulgación proporciona estuches y métodos para el diagnóstico y/o el tratamiento de trastornos, p. ej., trastornos neoplásticos en un sujeto mamífero que necesite este tratamiento. En ciertos casos ejemplares, el sujeto es un ser humano.

Los polipéptidos de unión de la actual divulgación son útiles en un número de diferentes aplicaciones. Por ejemplo, en un caso, los polipéptidos de unión en cuestión son útiles para reducir o eliminar células que soportan un epítopo reconocido por el dominio de unión del polipéptido de unión. En otro caso, los polipéptidos de unión en cuestión son eficaces para reducir la concentración de o eliminar antígeno soluble en la circulación. En un caso, los polipéptidos de unión pueden reducir el tamaño del tumor, inhibir el crecimiento tumoral y/o prolongar el tiempo de supervivencia de animales que tienen tumores. Según esto, esta divulgación también se refiere a un método para tratar tumores en un ser humano u otro animal al administrar a este ser humano o animal una cantidad atóxica eficaz de anticuerpo modificado. Un experto en la técnica podría, mediante experimentación habitual, determinar qué cantidad atóxica eficaz de polipéptido de unión modificado tendría el fin de tratar neoplasias malignas. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de un anticuerpo modificado o uno o más fragmentos del mismo puede variar según factores tales como el estadio de enfermedad (p. ej., estadio I frente a estadio IV), la edad, el sexo, las complicaciones médicas (p. ej., afecciones o enfermedades inmunosuprimidas) y el peso del sujeto, y la capacidad del anticuerpo modificado para provocar una respuesta deseada en el sujeto. El régimen de dosificación se puede ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente, o la dosis se puede reducir proporcionalmente según esté indicado por las exigencias de la situación terapéutica.

En general, las composiciones proporcionadas en la actual divulgación se pueden usar para tratar profilácticamente o terapéuticamente cualquier neoplasma que comprenda un marcador antigénico que permita la elección de las células cancerosas por el anticuerpo modificado.

VIII. Métodos para administrar anticuerpos modificados o fragmentos de los mismos

Métodos para preparar y administrar polipéptidos de unión de la actual divulgación a un sujeto son bien conocidos o son determinados fácilmente por los expertos en la técnica. La vía de administración de los polipéptidos de unión de la actual divulgación puede ser oral, parenteral, mediante inhalación o tópica. El término parenteral según se usa en este documento incluye la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Aunque se contempla claramente que todas estas formas de administración estén dentro del alcance de la actual divulgación, una forma para la administración sería una solución para inyección, en particular para inyección o goteo intravenosos o intraarteriales. Habitualmente, una composición adecuada para inyección puede comprender un tampón (p. ej. un tampón de acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (p. ej. polisorbato), opcionalmente un agente estabilizante (p. ej. albúmina humana), etc. Sin embargo, en otros métodos compatibles con las enseñanzas de este documento, los anticuerpos modificados se pueden aportar directamente a la zona de la población celular adversa incrementando de ese modo la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico.

En un caso, el polipéptido de unión que se administra es un polipéptido de unión de Fórmula (III):

Ab(Gal-C(H)=N-Q-CON-X)^x(Gal-Sia-C(H)=N-Q-CON-X)^yFórmula (III),

en la que:

A) Ab es un anticuerpo según se define en este documento;

B) Q es NH u O;

C) CON es a resto conector según se define en este documento;

D) X es un resto efector (p. ej., a resto orientador según se define en este documento);

E) Gal es un componente derivado de galactosa;

F) Sia es un componente derivado de ácido siálico;

G) x es de 0 a 5; y

H) y es de 0 a 5,

donde al menos uno de x e y no es 0.

Preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. En las composiciones y los métodos de la actual divulgación, portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, tampón de fosfato 0,01 -0,1 M, p. ej., 0,05 M, o solución salina al 0,8%. Otros vehículos parenterales comunes incluyen soluciones de fosfato sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, medio de Ringer con lactato, o aceites fijos. Vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Más particularmente, composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones (cuando sean solubles en agua) o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En estos casos, la composición tiene que ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que exista una fácil administración con jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y típicamente estará conservada contra la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos.

La prevención de la acción de microorganismos se puede alcanzar mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, se incluirán agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo al incluir en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En cualquier caso, se pueden preparar soluciones inyectables estériles al incorporar un compuesto activo (p. ej., un polipéptido de unión modificado por sí mismo o en combinación con otros agentes activos) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en este documento, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, métodos de preparación ejemplares incluyen secado a vacío y liofilización, que da un polvo de un ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional procedente de una solución del mismo previamente filtrada estérilmente. Las preparaciones para inyecciones se procesan, se cargan en recipientes tales como ampollas, bolsas, jeringas o viales, y se sellan bajo condiciones asépticas según métodos conocidos en la técnica. Además, las preparaciones se pueden envasar y vender en forma de estuche tal como los descritos en los documentos en tramitación junto con el presente U.S.S.N. 09/259.337 y U.S.S.N. 09/259.338. Estos artículos de fabricación tendrán típicamente etiquetas o prospectos que indiquen que las composiciones asociadas son útiles para tratar a un sujeto que sufra, o esté predispuesto a, trastornos autoinmunitarios o neoplásticos.

Dosis eficaces de las composiciones de la presente divulgación, para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente, varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, la zona elegida, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otras medicaciones administradas y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente, el paciente es un ser humano pero también se pueden tratar mamíferos no humanos incluyendo mamíferos transgénicos. Las dosificaciones de tratamiento se pueden titular usando métodos habituales conocidos por los expertos en la técnica para optimizar la seguridad y la eficacia.

Para la inmunización pasiva con un polipéptido de unión, la dosificación puede variar, p. ej., de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg (p. ej., 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, lmg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del enfermo. Por ejemplo, las dosificaciones puede ser 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg, p. ej., al menos 1 mg/kg. Dosis intermedias en los intervalos anteriores también pretenden estar dentro del alcance de la actual divulgación. Estas dosis de pueden administrar a los sujetos diariamente, en días alternos, semanalmente o según cualquier otro esquema determinado mediante análisis empírico. Un tratamiento ejemplar implica la administración en múltiples dosificaciones a lo largo de un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Regímenes de tratamiento ejemplares adicionales implican la administración una vez cada dos semana o una vez al mes o una vez cada de 3 a 6 meses. Esquemas de dosificación ejemplares incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg semanalmente. En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con anticuerpo modificado se administrará dentro de un año de cualquier agente quimioterapéutico o tratamiento. En otros casoslos polipéptidos de unión se administrarán dentro de los 10, 8, 6, 4 o 2 meses de cualquier agente quimioterapéutico o tratamiento. En otros casos adicionalesel polipéptido de unión se administrará dentro de las 4, 3, 2 o 1 semana(s) de cualquier agente quimioterapéutico o tratamiento. En otros casos adicionaleslos polipéptidos de unión se administrarán dentro de los 5, 4, 3, 2 o 1 día(s) del agente quimioterapéutico o tratamiento seleccionados. Se apreciará además que los dos agentes o tratamientos se pueden administrar al paciente dentro de una cuestión de horas o minutos (es decir sustancialmente simultáneamente).

Se apreciará además que los polipéptidos de unión de la actual divulgación se pueden usar junto o en combinación con cualquier agente o agentes quimioterapéuticos (p. ej. para proporcionar un régimen terapéutico combinado) que eliminen, reduzcan, inhiban o controlen el crecimiento de células neoplásticas in vivo. Agentes quimioterapéuticos ejemplares que son compatibles con la actual divulgación incluyen agentes alquilantes, alcaloides de las vincas (p. ej., vincristina y vinblastina), procarbazina, metotrexato y prednisona. La combinación de cuatro fármacos MOPP (mecletamina (mostaza nitrogenada), vincristina (Oncovin), procarbazina y prednisona) es muy eficaz para tratar diversos tipos de linfoma. En pacientes resistentes, se pueden usar las combinaciones MOPP, ABVD (p. ej., adriamicina, bleomicina, vinblastina y dacarbazina), ChIVPP (clorambucilo, vinblastina, procarbazina y prednisona), CABS (lomustina, doxorrubicina, bleomicina y estreptozotocina), MOPP más ABVD, MOPP más ABV (doxorrubicina, bleomicina y vinblastina) o BCVPP (carmustina, ciclofosfamida, vinblastina, procarbazina y prednisona). Arnold S. Freedman y Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, en HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774 1788 (Kurt J. Isselbacher y cols, eds., 13a ed. 1994) y V. T. DeVita y cols, (1997) y las referencias citadas en las mismas para una dosificación y planificación estándar. Estas terapias se pueden usar inalteradas o alterarse según sea necesario para un paciente particular, en combinación con uno o más polipéptidos de unión de la actual divulgación según se describe en este documento.

Regímenes adicionales que son útiles en el contexto de la presente divulgación incluyen el uso de agentes alquilantes individuales tales como ciclofosfamida o clorambucilo, o combinaciones tales como CVP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona), CHOP (CVP y doxorrubicina), C-MOPP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona y procarbazina), CAP-BOP (CHOP más procarbazina y bleomicina), m-BACOD (CHOP más metotrexato, bleomicina y leucovorina), ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido y leucovorina más MOPP estándar), ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, citarabina, bleomicina, vincristina, metotrexato y leucovorina) y MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona en dosis fija, bleomicina y leucovorina). Los expertos en la técnica podrán determinar fácilmente dosificaciones y una programación estándar para cada uno de estos regímenes. CHOP también se ha combinado con bleomicina, metotrexato, procarbazina, mostaza nitrogenada, arabinósido de citosina y etopósido. Otros agentes quimioterapéuticos compatibles incluyen, pero no se limitan a, 2-clorodesoxiadenosina (2-CDA), 2'-desoxicoformicina y fludarabina.

Para pacientes con NHL (linfoma no hodgkiniano) de grado intermedio y alto, que no consiguen alcanzar la remisión o recaen, se usa una terapia de rescate. Las terapias de rescate emplean fármacos tales como arabinósido de citosina, carboplatino, cisplatino, etopósido e ifosfamida administrados solos o en combinación. En formas recidivantes o agresivas de ciertos trastornos neoplásticos, a menudo se usan los siguientes protocolos: IMVP-16 (ifosfamida, metotrexato y etopósido), MIME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato y etopósido), DHAP (dexametasona, citarabina en dosis altas y cisplatino), ESHAP (etopósido, metilpredisolona, citarabina HD, cisplatino), CEPP(B) (ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, prednisona y bleomicina) y CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina y prednisona) cada uno con grados y esquemas de dosificación bien conocidos.

La cantidad de agente quimioterapéutico a usar en combinación con los anticuerpos modificados de la actual divulgación puede variar por sujeto o se puede administrar según lo que se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Bruce A Chabner y cols, Antineoplastic Agents, en GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 ((Joel G. Hardman y cols, eds., 9a ed. 1996).

Como se analizó previamente, los polipéptidos de unión de la presente divulgación, los fragmentos inmunorreactivos o los recombinantes de los mismos se pueden administrar en una cantidad farmacéuticamente eficaz para el tratamiento in vivo de trastornos en mamíferos. A este respecto, se apreciará que los polipéptidos de unión divulgados se formularán para facilitar la administración y promover la estabilidad del agente activo.

Una composición farmacéutica según la presente divulgación puede comprender un portador estéril atóxico farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina fisiológica, tampones atóxicos, conservantes y similares. Para los fines de la actual solicitud, una cantidad farmacéuticamente eficaz del polipéptido de unión modificado, el fragmento inmunorreactivo o el recombinante del mismo, conjugado o no conjugado a un agente terapéutico, se considerará una cantidad suficiente para conseguir la unión eficaz a un antígeno y para conseguir un beneficio, p. ej., para mejorar los síntomas de una enfermedad o un trastorno o para detectar una sustancia o una célula. En el caso de células tumorales, el polipéptido de unión modificado puede interactuar con antígenos inmunorreactivos seleccionados sobre células neoplásticas o inmunorreactivas y proporcionar un incremento en la muerte de esas células. Por supuesto, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden administrar en dosis individuales o múltiples para proporcionar una cantidad farmacéuticamente eficaz del polipéptido de unión modificado.

De acuerdo con el alcance de la presente divulgación, los polipéptidos de unión de la divulgación se pueden administrar a un ser humano u otro animal según los susodichos métodos de tratamiento en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico o profiláctico. Los polipéptidos de unión de la divulgación se pueden administrar a este ser humano u otro animal en una forma de dosificación convencional preparada al combinar el anticuerpo de la divulgación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable convencional según técnicas conocidas. Será identificado por un experto en la técnica que la forma y el carácter del portador o diluyente farmacéuticamente aceptable están dictados por la cantidad de ingrediente activo con la que se ha de combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas. Los expertos en la técnica apreciarán además que un cóctel que comprenda una o más especies de polipéptidos de unión descritos en la actual divulgación puede resultar ser particularmente eficaz.

IX. Expresión de polipéptidos de unión

En un caso, la divulgación proporciona polinucleótidos que codifican los polipéptidos de unión divulgados en este documento. También se proporciona un método para elaborar un polipéptido de unión que comprende expresar estos polinucleótidos.

Polinucleótidos que codifican los polipéptidos de unión divulgados en este documento se insertan típicamente en un vector de expresión para la introducción en células anfitrionas que se pueden usar para producir la cantidad deseada de los anticuerpos reivindicados, o fragmentos de los mismos. Según esto, en ciertos aspectos, la divulgación proporciona vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos divulgados en este documento y células anfitrionas que comprenden estos vectores y polinucleótidos.

El término "vector" o "vector de expresión" se usa en este documento con los fines de la memoria descriptiva y las reivindicaciones para indicar vectores usados según la presente divulgación como un vehículo para introducirse en y expresar un gen deseado en una célula. Como es sabido por los expertos en la técnica, estos vectores se pueden seleccionar fácilmente del grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la actual divulgación comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción apropiados para facilitar la clonación del gen deseado y la capacidad para entrar y/o replicarse en células eucarióticas o procarióticas.

Se pueden emplear numerosos sistemas de vectores de expresión para los fines de esta divulgación. Por ejemplo, una clase de vector utiliza elementos de ADN que se derivan de virus animales tales como el virus del papiloma bovino, el virus del polioma, un adenovirus, virus variolovacunal, un baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV), o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios internos de unión al ribosoma. Adicionalmente, células que tienen integrado el ADN en sus cromosomas se pueden seleccionar al introducir uno o más marcadores que permiten la selección de células anfitrionas transfectadas. El marcador puede proporcionar prototrofía a un anfitrión auxótrofo, resistencia a biocidas (p. ej., antibióticos) o resistencia a metales pesados tales como cobre. El gen marcador seleccionable bien se puede enlazar directamente a las secuencias de ADN que se van a expresar, o bien se introduce en la misma célula mediante cotransformación. También pueden ser necesarios elementos adicionales para la síntesis óptima de ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias de señalización, señales de corte y empalme, así como promotores, potenciadores y señales de terminación de la transcripción. En algunos casoslos genes de la región variable clonados se insertan en un vector de expresión junto con los genes de la región constante de la cadena pesada y ligera (tales como genes humanos) sintetizados según se analiza anteriormente.

En otros casoslos polipéptidos de unión presentados en la divulgación se pueden expresar usando construcciones policistrónicas. En estos sistemas de expresión, se pueden producir múltiples productos génicos de interés tales como cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos a partir de una sola construcción policistrónica. Estos sistemas usan ventajosamente un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para proporcionar niveles relativamente altos de polipéptidos en células anfitrionas eucarióticas. Secuencias de IRES compatibles se divulgan en la Pat. EE. UU. N° 6.193.980. Los expertos en la técnica apreciarán que estos sistemas de expresión se pueden usar para producir eficazmente toda la gama de polipéptidos divulgados en la actual solicitud.

Más generalmente, una vez que se ha preparado un vector o una secuencia de ADN que codifica un anticuerpo, o un fragmento del mismo, el vector de expresión se puede introducir en una célula anfitriona apropiada. Esto es, las células anfitrionas se pueden transformar. La introducción del plásmido en la célula anfitriona se puede realizar mediante diversas técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas incluyen, pero no se limitan a, transfección (incluyendo electroforesis y electroporación), fusión de protoplastos, precipitación de fosfato cálcico, fusión celular con ADN envuelto, microinyección e infección con virus intacto. Véase Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Capítulo 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodríguez y Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). Las células transformadas se hacen crecer bajo condiciones apropiadas para la producción de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas, y se ensayan con respecto a la síntesis de proteínas de la cadena pesada y/o ligera. Técnicas de ensayo ejemplares incluyen ensayo de inmunoadsorción con enzimas ligadas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) o análisis de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS), inmunohistoquímica y similares.

Según se usa en este documento, el término "transformación" se usará en un sentido amplio para referirse a la introducción de ADN en una célula anfitriona receptora que cambia el genotipo y por consiguiente da como resultado un cambio en la célula receptora.

A lo largo de esas mismas líneas, "células anfitrionas" se refiere a células que se han transformado con vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un gen heterólogo. En las descripciones de procedimientos para el aislamiento de polipéptidos a partir de anfitriones recombinantes, los términos "célula" y "cultivo celular" se usan indistintamente para indicar la fuente de anticuerpo a menos que se especifique claramente lo contrario. En otras palabras, la recuperación de polipéptido de las "células" puede significar bien a partir de células enteras centrifugadas o bien a partir de cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas.

En un caso, la línea celular anfitriona usada para la expresión del anticuerpo es de origen mamífero; los expertos en la técnica pueden determinar líneas celulares anfitrionas particulares que son las más adecuadas para el producto génico deseado que se va a expresar en las mismas. Líneas celulares anfitrionas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, DG44 y DUXB11 (líneas de ovario de hámster chino, DHFR menos), HELA (carcinoma de cuello uterino humano), CVI (línea renal de mono), COS (un derivado de CVI con antígeno T de SV40), R1610 (fibroblasto de hámster chino) BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón), HAK (línea renal de hámster), SP2/O (mieloma de ratón), BFA-1c1BPT (células endoteliales bovinas), RAJI (linfocito humano), 293 (riñón humano). En un caso, la línea celular proporciona una glucosilación alterada, p. ej., afucosilación, del anticuerpo expresado a partir de la misma (p. ej., PER.C6.RTM. (Crucell) o líneas celulares CHO con inactivación de FUT8 (Potelligent.RTM. Cells) (Biowa, Princeton, N.J.)). En un caso, se pueden usar células NSO. Las líneas celulares anfitrionas están disponibles típicamente de servicios comerciales, the American Tissue Culture Collection o de bibliografía publicada.

La producción in vitro permite el aumento a escala para dar grandes cantidades de los polipéptidos deseados. Técnicas para el cultivo de células de mamífero bajo condiciones de cultivo tisular son conocidas en la técnica e incluyen cultivo en suspensión homogénea, p. ej. en un reactor neumático o en un reactor agitador continuo, o cultivo celular inmovilizado o atrapado, p. ej. en fibras huecas, microcápsulas, sobre microcuentas de agarosa o cartuchos cerámicos. Si es necesario y/o se desea, las soluciones de polipéptidos se pueden purificar mediante los métodos cromatográficos habituales, por ejemplo filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre DEAE-celulosa y/o cromatografía de (inmuno)afinidad.

Uno o más genes que codifican polipéptidos de unión también se pueden expresar células que no son de mamífero tales como bacterias o levaduras o células vegetales. A este respecto, se apreciará que diversos microorganismos unicelulares no mamíferos tales como bacterias también se pueden transformar; es decir los capaces de hacerse crecer en cultivos o fermentación. Las bacterias, que son sensibles a la transformación, incluyen miembros de las enterobacteriaceae, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, y Haemophilus influenzae. Se apreciará adicionalmente que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos pueden volverse parte de cuerpos de inclusión. Los polipéptidos se deben aislar, purificar y a continuación ensamblar en moléculas funcionales.

Además de los procariotas, también se pueden usar microbios eucarióticos. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de los panaderos, es el más comúnmente usado entre los microorganismos eucarióticos, aunque está disponible un número de otras cepas. Para la expresión en Saccharomyces, se usa comúnmente el plásmido YRp7, por ejemplo, (Stinchcomb y cols., Nature, 282:39 (1979); Kingsman y cols., Gene, 7:141 (1979); Tschemper y cols., Gene, 10:157 (1980)). Este plásmido ya contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo ATCC N° 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). La presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de la célula anfitriona de levadura proporciona un ambiente eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano.

EJEMPLOS

La presente divulgación se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no se deben considerar limitativos de la invención reivindicada.

Ejemplo 1. Diseño, preparación y caracterización de mutantes de anticuerpo de hiperglucosilación anti-CD-52 2C3

Se diseñaron múltiples mutaciones de hiperglucosilación en la cadena pesada del anticuerpo anti-CD-52, 2C3, con el fin de añadir un grupo voluminoso a una interfase de interacción (p. ej., el sitio de unión a FcRn para modular la farmacocinética del anticuerpo), para modular la función efectora del anticuerpo al cambiar su interacción con FcyRs, o para introducir una nueva modificación química de la subsecuencia del sitio de reticulación para la conjugación al resto efector, incluyendo, pero no limitado a, fármacos, toxinas, agentes citotóxicos, radionucleótidos y similares. Los mutantes 2C3 hiperglucosilados se indican en la Tabla 3.

Tabla 3. Mutantes de anti-CD-522C3 hi er lucosilados

1A. Creación de mutantes de hiperglucosilación del anticuerpo anti-CD-522C3

La mutación A114N, diseñada basándose en el sistema de numeración de Kabat (equivalente a la posición de EU 118), se introdujo en el dominio CH1 de 2C3 mediante PCR mutagénica. Para crear el anticuerpo de longitud completa, el dominio VH más el residuo A114N mutado se insertó mediante clonación independiente de ligación (LIC) en el vector pENTR-LIC-IgG1 que codifica los dominios CH de anticuerpo 1-3. Todas las otras mutaciones se introdujeron en pENTR-LIC-IgG1 mediante mutagénesis dirigida al sitio con un estuche de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, EE. UU. de A.). El WT 2C3 VH se clonó en vectores mutados mediante LIC. Los mutantes de longitud completa se clonaron en el vector de expresión pCEP4(-E+I)Dest mediante clonación de Gateway. Las mutaciones Fc se diseñaron basándose en el sistema de numeración de EU. Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de WT 2C3 y las cadenas pesadas de 2C3 mutadas se indican en la Tabla 4. Los aminoácidos mutados están sombreados y los sitios diana de glucosilación de consenso creados por la mutación están subrayados.

Tabla 4. Secuencias de aminoácidos de anticuer os anti-CD-522C3

Los mutantes y el control WT se transfectaron en células HEK293-EBNA en un formato de placa de 6 pocilios. Como se muestra en la Figura 9A, se encontró que el nivel de expresión era ~0,1 pg/ml, según se analizaba mediante SDS-PAGE y transferencia Western. La expresión de mutantes en medios acondicionados también se midió mediante captura de proteína A sobre Biacore. La concentración se determinó usando la respuesta de disociación 6 minutos después de la inyección en proteína A inmovilizada. WT 2C3 producido por CHO diluido en serie en medio de 90 pg/ml a 1,5 ng/ml L se usó como una curva estándar. Las concentraciones se calcularon hasta ~0,2 pg/ml mediante una curva de calibración usando un ajuste de 4 parámetros. Según se muestra en la Figura 9B, los niveles de expresiones relativos eran bajos y generalmente correspondían a los resultados de la transferencia Western.

1B. Verificación de la hiperglucosilación

Para determinar si se introducían sitios de glucosilación adicionales mediante mutación, el mutante 2C3 y proteínas silvestres se trataron con la enzima desglucosilante universal PNGasa F y las muestras de proteína se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western. Según se muestra en la Figura 10, solo el mutante A114N tenía un incremento del peso molecular aparente, indicando la presencia de un carbohidrato enlazado por N adicional.

Se produjeron preparaciones de anticuerpo a pequeña escala para purificar los mutantes 2C3 para una verificación adicional de la introducción de sitios de glucosilación. Según se muestra en la Figura 11, se confirmaba mediante SDS-PAGE que sólo el mutante A114N tenía sitios de glucosilación adicionales introducidos.

IC. Propiedades de unión de mutantes de anti-CD-522C3

Se usó Biacore para comparar las propiedades de unión de las proteínas purificadas. FcRn-HPC4 de ratón y ser humano purificado por SEC se inmovilizaron sobre un chip CM5 a través de acoplamiento a amina. Cada anticuerpo se diluyó hasta 200, 50 y 10 nM y se inyectó sobre los receptores de Fc inmovilizados. Se incluyeron Campath, WT 2C3 producido por CHO y Campath tratado con DEPC como controles positivos y negativos. Según se muestra en la Figura 13, el mutante Y436S presentaba aproximadamente una disminución de 2 veces en la unión a FcRn humano. De forma interesante, la unión de este mutante a FcRn de ratón no se veía afectada. Ninguna de las otras mutaciones 2C3 tenía efecto considerable sobre la unión a FcRn de ser humano o ratón.

Se usó Biacore para comparar las propiedades de unión a antígeno de las proteínas purificadas usando el ensayo de unión a Biacore del péptido 741 de CD-52. El péptido 741 de CD-52 y el péptido 777 de control se inmovilizaron a un chip CM5. Los anticuerpos se diluyeron en serie 2 veces de 60 a 0,2 nM en HBS-EP y se inyectaron por duplicado durante 3 min seguido por una disociación de 5 min en tampón a un caudal de 50 pl/min. El lote de GLD52 17200-084 se incluyó como un control. La superficie se regeneró con 1 pulso de HC1 40 mM. Se usó un modelo de unión 1:1 para ajustar las curvas de 7,5 a 0,2 nM. Según se muestra en la Figura 16, el mutante A114N tenía una afinidad de unión a CD-52 ligeramente inferior mientras que el mutante NGT tenía una afinidad ligeramente superior que el resto de los mutantes en este ensayo. El ensayo de unión a Biacore del péptido 741 de CD-52 se repitió con proteína purificada de una preparación a mayor escala. Según se muestra en la Figura 17, el mutante A114N exhibía una unión al péptido CD-52 que era comparable a WT 2C3.

ID. Caracterización de carga del mutante A114N

Se realizó enfoque isoeléctrico (IEF) para caracterizar la carga de los mutantes 2C3. Se hizo correr proteína purificada sobre geles de acrilamida de gradiente de pH (pH 3-10) inmovilizados (IPG). Según se muestra en la Figura 18A, se encontró que A114N tenía cargas más negativas, probablemente debido a residuos de ácido siálico. Los datos de MS intactos confirmaban la estructura compleja con ácidos siálicos sobre el mutante A114N. En contraste, se mostró que el WT 2C3 tenía G0F y G1F como la especie de glucosilación dominante (Figuras 18C y 18D, respectivamente).

Ejemplo 2. Preparación de mutantes de hiperglucosilación en varios esqueletos de anticuerpo

Además del anticuerpo anti-CD-522C3, la mutación A114N se manipuló en varios otros esqueletos de anticuerpo para confirmar que el sitio de hiperglucosilación único se podía introducir en secuencias de dominios variables de la cadena pesada no relacionadas. Los mutantes de anti-TEM1, anti-FAP y anti-Her2 hiperglucosilados se indican en la Tabla 5.

Tabla 5. Mutantes A114N /o S298N diseñados en varias es ueletos de anticuer o no relacionados

2A. Creación de mutantes de hiperglucosilación de anticuerpos anti-TEM1 y anti-FAP

La mutación A114N, diseñada basándose en el sistema de numeración de Kabat, se introdujo en el dominio CH1 de anti-TEM1 y anti-FAP mediante PCR mutagénica. Para crear el anticuerpo de longitud completa, el VH mutado más el residuo 114 se insertó mediante clonación independiente de ligación (LIC) en los dominios CH 1-3 de anticuerpo que codifican el vector pENTR-LIC-IgG1. A continuación, se clonaron mutantes de longitud completa en el vector de expresión pCEP4(-E+I)Dest mediante clonación de Gateway. Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera mutadas silvestres de anti-TEM1 se indican en la Tabla 6. Los aminoácidos mutados están sombreadas y los sitios diana de glucosilación de consenso creados por la mutación están subrayados.

Tabla 6. Secuencias de aminoácidos de anticuer os anti-TEM1 anti-FAP

Los mutantes y el control silvestre se transfectaron en células HEK293-EBNA en un formato de triple matraz y se purificaron sobre columnas de proteína A HiTrap (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, EE. UU. de A.). Según se analiza mediante A280 en un espectrofotómetro NanoDrop, la expresión de A114N de anti-FAP y A114N de anti-FAP era aproximadamente 3 pg/ml y aproximadamente 1 pg/ml, respectivamente. La expresión de A114N de anti-TEM1 era aproximadamente 0,04 pg/ml.

2B. Verificación de la hiperglucosilación

Para confirmar que el sitio de glucosilación adicional se introducía en los mutantes A114C, se analizó proteína purificada procedente de los mutantes A114N con SDS-PAGE reductora junto con la proteína de control silvestre. Un sitio de glucosilación adicional añadiría 2000-3000 daltons al peso molecular de la cadena pesada. Según se muestra en la Figura 20, SDS-PAGE indicaba que las bandas de cadena pesada de los mutantes de anti-FAP y anti-TEM1 A114N habían incrementado el peso molecular aparente, de acuerdo con una introducción satisfactoria de un sitio de glucosilación adicional en ambos anticuerpos.

2C. Creación de mutantes de hiperglucosilación del anticuerpo anti-Her2

Se crearon los anticuerpos Her-2 A114N, Her-2 A114N/NNAS y WT Her-2 mediante clonación independiente de ligación. El dominio VH de Herceptin se sintetizó y se amplificó por PCR con dos grupos de cebadores compatibles con LIC, bien WT o bien con la mutación A114N. Para obtener un anticuerpo de longitud completa, inserciones de VH amplificadas (WT o A114N) se clonaron en dos vectores pENTR que codificaban los dominios CH 1-3, pENTR-LICIgG1 WT y pENTR-LIC-IgG1 NNAS, dando como resultado tres mutantes de longitud completa (A114N, NNAS, A114N/NNAS) y control WT como clones de entrada sobre pENTR. Estos mutantes se clonaron en el vector de expresión pCEP4(-E+I)Dest, mediante clonación de Gateway. Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras silvestres y mutadas de anti-Her-2 se indican en la Tabla 7. Los aminoácidos mutados están sombreados y las secuencias diana de glucosilación de consenso creadas por la mutación están subrayadas.

Tabla 7. Secuencias de aminoácidos de anticuer os anti-Her-2

2D. Expresión del mutante de hiperglucosilación del anticuerpo A114N de anti-IIer2

Las construcciones de anti-Her2 A114N y silvestre se transfectaron con Lipofectamine-2000 (relación 2,5:1 de reactivo a ADN) y XtremeGene HP (relación 3:1 de reactivo a ADN) en células HEK293-EBNA en 12 matraces triples. La medición por Octet de partes alícuotas a partir de medios acondicionados (CM) 3 días mostraba que la expresión de proteína era coherente en 6 matraces tanto para Lipofectamine-2000 como para XtremeGene HP. Según se muestra en la Tabla 8, la eficacia de transfección global era aproximadamente 30% superior con XtremeGene HP. Los medios acondicionados recogidos el día 3 se reunieron entre sí para ambas condiciones de transfección y se purificaron mediante una columna de proteína A. La medición con Octet mostraba 1,8 ug/ml de anticuerpo en el medio simulado que contiene suero frente a 0 ug/ml en medios simulados sin suero.

Tabla 8. Ex resión de mutantes de hi er lucosilación de anti-Her2 A114N

Medios acondicionados desde el día 6 se recogieron y se purificaron separadamente para cada condición de transfección. Ambos eluatos se intercambiaron con tampón separadamente en PBS, pH 7,2, y se concentraron -15 veces usando columnas Amicon-4 (corte 50 kD). Los C^mdel día 6 mostraban un nivel de expresión superior en comparación con CM del día 3. Según se muestra en la Tabla 8, un total de 3 mg de Herceptin A114N 15,59 mg/ml (procedentes de transfección de Lipofectamine) y 6 mg de Herceptin A114N 16,86 mg/ml (procedente de transfección de XtremeGene HP) se produjeron a partir de medios acondicionados el día 6 para aplicaciones posteriores adicionales, tales como conjugación de anticuerpo-fármaco.

2E. Análisis por SDS-PAGE y HIC del mutante de anti-Her2 A114N

Antes de la conjugación, Herceptin A114N purificada se caracterizó por SDS-PAGE y HIC (cromatografía de interacción hidrófoba). Como se muestra en la Figura 21, se determinó que la calidad de la Herceptin A114N purificada era adecuada para aplicaciones posteriores adicionales.

2F. Conjugación a glucosilación manipulada

Se demostró que: a) se introducía un sitio de glucosilación en el sitio de la posición 114 de Kabat (posición 118 de EU) en anti-TEM1; b) el mutante A114N tenía hiperglucosilación en la cadena pesada mediante SDS-PAGE reductora; y c) el muíante de hiperglucosilación A114N tenía estructura de carbohidrato complejo mediante LC/MS intacta, incluyendo ácidos siálicos y galactosa terminales, que son ideales para conjugación SAM y GAM. Para confirmar que el sitio de glucosilación manipulado era adecuado para la conjugación, anti-TEM1 A114N se conjugó con un PEG de 5 kDa a través de química de aminooxi. Según se muestra en la Figura 22, el PEG se conjugaba satisfactoriamente a anti-TEM1 A114N a través de un enlace aminooxi. Este mutante también se preparaba satisfactoriamente sobre los esqueletos de 2C3 de anti-FAP y anti-CD-52 (no mostrados). Estos datos demuestran que el sitio de glucosilación en N114 es útil para la conjugación de restos efectores.

Ejemplo 3: Generación de mutantes de Fc S298N/Y300S

Se diseñaron y generaron variantes de Fc manipuladas en las que se introducía un nuevo sitio de glucosilación en la posición EU Ser 298, posteriormente en el sitio Asn297 presente en la naturaleza. La glucosilación en Asn297 bien se mantenía o bien se suprimía mediante mutación. Las mutaciones y los resultados de glucosilación deseados se indican en la Tabla 9.

Tabla 9: Estados de lucosilación de diversas variantes de anticuer o

3A. Creación de variantes de glucosilación alterados del anticuerpo aB-TCR H66

Se realizaron mutaciones sobre la cadena pesada del clon n° 66 del anticuerpo receptor de células T ap mediante Quikchange usando una plantilla de pENTR_LIC_IgG1. El dominio VH de HEBE1 Aab IgG1 n° 66 se amplificó con cebadores de LIC antes de clonarse en pENTR_LIC_IgG1 mutado o silvestre mediante LIC para crear anticuerpos mutantes o silvestres de longitud completa. La subclonación se verificó con digestión doble con DraIII/XhoI, produciendo una inserción de aproximadamente 1250 pb de tamaño en los clones satisfactorios. A continuación, los mutantes de longitud completa se clonaron en un vector de expresión, pCEP4(-E+I)Dest, a través de clonación de Gateway. Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de WT H66 anti-apTCR y las cadenas pesadas mutadas H66 se indican en la Tabla 10. Los aminoácidos mutados están sombreados y las secuencias diana de glucosilación de consenso creadas por la mutación están subrayadas.

Tabla 10: Secuencias de aminoácidos of H66 anti-a TCR anticuer os

Las construcciones mutante, silvestre y dos aglucosiladas de (HEBE1 Agly IgG4 y HEBE1 Aab IgG1 en pCEP4) se transfectaron en células HEK293-EBNA en matraces triples para la expresión. Se purificaron proteínas de 160 ml de medio acondicionado (CM) con 1 ml de columnas de proteína A HiTrap (GE) usando una bomba peristáltica de múltiples canales. Se analizaron cinco microgramos de cada sobrenadante resultante sobre geles de SDS-PAGE reductores y no reductores con tris-glicina al 4-20% (véase la Figura 2). Las cadenas pesadas de los mutantes aglucosilados (N297Q, T299A y controles aglu), han migrado adicionalmente (punta de flecha), de acuerdo con la pérdida de los glucanos en estos anticuerpos. Sin embargo, las cadenas pesadas de los anticuerpos glucosilados manipulados (NSY, STY, SY, Aab y control wt, flechas) migran de forma similar al control silvestre. Este resultado está de acuerdo con la existencia de un sitio de glucosilación manipulado en la posición EU 298. El análisis por SEC-HPLC indicaba que todos los mutantes se expresan como monómeros.

3B. Análisis de glucosilación mediante LC-MS

Las variantes de Fc de IgG1 H66 manipuladas se redujeron parcialmente con DTT 20 mM a 37°C durante 30 min. A continuación, las muestras se analizaron mediante LC/MS capilar en un sistema de HPLC capilar Agilent 1100 acoplado con un sistema híbrido QSTAR qq TOF (Applied Biosystems). Se usoó una reconstrucción bayesiana de proteínas con corrección de referencia y modelado informático en Analyst QS 1.1 (Applied Bisoystem) para el análisis de datos. En el mutante de anticuerpo S298N/T299A/Y300S H66, se observó un sitio de glucosilación en el aminoácido 298 con glucanos de tipo complejo biantenario y triantenario detectados como las especies principales junto con G0F, G1F y G2F (véase la Figura 34). Este perfil de glucosilación alterado está de acuerdo con una glucosilación cambiada en n 298 en lugar del sitio de glucosilación silvestre en N297.

3C. Propiedades de unión de mutantes de anticuerpo aBTCR a FcvRIIIa y FcvRI humanos usando Biacore

Se usó Biacore para valorar la unión a FcyRIIIa (V158 & F158) y FcyRI humanos recombinantes. Las cuatro células de flujo de un chip CM5 se inmovilizaron con anticuerpo anti-HPC4 a través del procedimiento de acoplamiento a amina estándar proporcionado por Biacore. El anticuerpo anti-HPC4 se diluyó hasta 50 gg/ml en acetato sódico 10 mM pH 5,0 para la reacción de acoplamiento y se inyectó durante 25 min en 5 gl/min. Se inmovilizaron aproximadamente 12.000 RU de anticuerpo en la superficie del chip. Se diluyeron FcYRIIIa-V158 y FcYRIIIa-F158 humanos recombinantes hasta 0,6 gg/ml en tampón de unión (HBS-P con CaCl²1 mM) y se inyectaron en las células de flujo 2 y 4, respectivamente, durante 3 min a 5 gl/min para capturar 300 - 400 RU de receptor sobre el chip de anti-HPC4. A fin de distinguir entre los aglutinantes inferiores, se capturaron tres veces más rhFcYRIIIa sobre la superficie de anti-HPC4 que lo usado habitualmente en este ensayo. Las células de flujo 1 y 3 se usaron como controles de referencia. Cada anticuerpo se diluyó hasta 200 nM en tampón de unión y se inyectó en las cuatro células de flujo durante 4 min, seguido por 5 min se disociación en tampón. Las superficies se regeneraron con EDTA lO mM en tampón HBS-EP durante 3 min a 20 gl/min. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 3.

También se usó Biacore para comparar la unión a FcyRI. Anticuerpo anti-tetra His se intercambió con tampón en acetato sódico lO mM pH 4,0 usando una columna de desalación Zeba y se diluyó hasta 25 gg/ml en el tampón de acetato para el acoplamiento a amina. Dos células de flujo de un chip CM5 se inmovilizaron con -9000 RU del anticuerpo anti-tetra-His después de 20 min de inyección a 5 gl/min. Como en el experimento previo, se capturaron diez veces más FcyRI a la superficie de anti-tetra-His a fin de comparar muestras con unión débil. FcyRI humano recombinante se diluyó 10 gg/ml en tampón de unión de HBS-EP y se inyectó en la célula de flujo 2 durante 1 min a 5 gl/min para capturar -1000 RU de receptor en el chip de anti-tetra-His. Se inyectó una sola concentración de anticuerpo, 100 nM, durante 3 min a 30 gl/min sobre el receptor capturado y la superficie de control. Posteriormente, la disociación se comprobó durante tres minutos. A continuación, la superficie se regeneró con dos inyecciones de 30 segundos de glicina lO mM pH 2,5 a 20 gl/min. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 4.

E stos re su lta d o s d e m u e s tra n u n a no tab le d ism in u c ió n en la un ión de los m u tan tes g lu co m a n ip u la d o s a F cyR IIIa o FcyR I. H 66 S 298 N /T 299 A /Y 300 S , en pa rticu la r, t ie n e un a un ión cas i c o m p le ta m e n te su p rim id a a am b os recep to res . E ste m u tan te se e lig ió pa ra un a n á lis is m ás d e ta llado .

3D. Caracterización de la estabilidad usando dicroísmo circular (CD)

La e s ta b ilid a d de l m u tan te de a n ticu e rp o S 298 N /T 299 A /Y 300 S se co m p ro b ó m ed ia n te un e xp e rim e n to de te rm o fu s ió n F a r-U V C D en e l que se co m p ro b ó la seña l de C D a 216 nm y 222 nm ya que e l in c rem en to de la te m p e ra tu ra co n d u ce al d e sp lie g u e de l an ticu e rp o (d e sn a tu ra liza c ió n ).

La te m p e ra tu ra se co n tro ló m ed ia n te un a cé lu la de P e ltie r te rm o e lé c tr ic a (Jasco m ode lo A W C 100 ) y se in c re m e n tó a u n a v e lo c id a d de 1°C /m in de sd e 25 -89 °C . Los e sp e c tro s de C D se reco g ie ron en un e s p e c tro fo tó m e tro Ja sco 815 a u n a co n ce n tra c ió n de p ro te ín a de a p ro x im a d a m e n te 0 ,5 m g /m l en ta m p ó n de PBS en una c u b e ta de cua rzo (H e llm a , Inc) con un a long itud de reco rrido de 10 m m . La ve lo c id a d de ba rrido e ra 50 nm /m in y un c a m p o de d a to s de 0 ,5 nm. S e usó una an ch u ra de ba nd a de 2 ,5 nm con u n a g ra d u a c ió n se sen s ib ilid a d de m ed ia . La seña l de C D y e l v o lta je HT se reco g ie ron de 210 -260 nm con in te rva los de d a to s de 0 ,5 nm y a in te rva los de te m p e ra tu ra de 1°C y se rea liza ron cu a tro ba rrid o s de ré p lica pa ra ca d a m uestra . Los resu ltad os d e m u e s tra n qu e ta n to d e lta A B H 66 co m o el m u tan te S 298 N /T 299 A /Y 300 S H 66 exh ib en c o m p o rta m ie n to s té rm ic o s s im ila re s y tie n e n a p ro x im a d a m e n te la m ism a ^{te m p e ra tu ra de in ic io p a ra la d e g ra d a c ió n (a lre d e d o r de 63 °C )} (Figura 35 ^{), su g ir ie n d o a d ic io n a lm e n te qu e tie n e n una}e s ta b ilid a d com p ara b le .

Ejemplo 4: Análisis funcional de mutantes con Fc manipulado

M utan tes con Fc m an ip u la d o se va lo ra ro n a tra vé s de un e n sa yo de p ro life ra c ió n de P B M C y un e n sa yo de libe rac ión de c itoc ina s . En el e n sa yo de p ro life ra c ió n de P B M C , se cu ltiva ro n P B M C hu m an as con c o n c e n tra c io n e s c re c ie n te s de an ticu e rp o te ra p é u tico d u ra n te 72 ho ras, se añ ad ió 3H -tim id in a y las cé lu la s se reco g ie ron 18 ho ras m ás ta rde . P ara e l e n sayo de ag o ta m ie n to de cé lu la s T /lib e ra c ió n de c itoc ina s , se cu ltiva ro n P B M C hu m an as con co n ce n tra c io n e s c re c ie n te s de an ticu e rp o te ra p é u tic o y se a n a liza ro n d ia r ia m e n te con resp ec to a recu en to s y v ia b ilid a d ce lu la re s (V i-C e ll, B eckm an C o u lte r) ha s ta el d ía 7. T a m b ié n se reco g ie ron los s o b re n a d a n te s ce lu la res , se a lm a ce n a ro n a -20 °C y se an a liza ro n en un g ru p o de 8 c ito c in a s (B io -R ad ).

P B M C de d o n a n te s no rm a le s se d e sco n g e la ro n y se tra ta ro n ba jo las s ig u ie n te s c o n d ic io n e s (todas en m ed ios que co n tie n e n co m p le m e n to ): S in tra ta r; B M A 031 , m o IgG 2 b 10 ug /m l; O K T3 , m o Ig G 2 a 10 ug /m l; H66, hulgG1 de lta A B 10 ug /m l, 1 ug /m l y 0,1 ug /m l; H 66, huIgG 1 S 298 N /T 299 A /Y 300 S 10 ug /m l, 1 ug /m l y 0,1 ug /m l.

Las c ito c in a s se reco g ie ron el d ía 2 (D 2) y e l d ía 4 (D 4) p a ra e l an á lis is B io p lex (IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, G M -C S F , IFNg, T N F a). Las cé lu la s se t iñ e ro n el D4 con resp ec to a la e xp re s ió n de C D 4, C D 8, C D 25 y abTC R .

^{Los resu ltad os , m o s tra d o s las} Figuras 5-8, ^{d e m u e s tra n q u e H 66 S 298 N /T 299 A /Y 300 S se c o m p o rta b a de fo rm a}s im ila r al H 66 d e lta A B en to d o s los e n sa yo s ba sa d o s en cé lu la s rea liza do s , m os tran do u n a a c tiva c ió n m ín im a de cé lu la s T p o r e xp re s ió n de C D 25, un ión a ab T C R (con c in é tica lig e ra m e n te d ife re n te a de lta A B ) y libe ra c ió n m ín im a de c ito c in a s en los m om e n tos ta n to D2 co m o D4. El m u tan te S 298 N /T 299 A /Y 300 S e lim in a b a a s í la fu n c ió n e fe c to ra tan e fica zm e n te co m o la m u tac ión de ltaA B .

Ejemplo 5: Preparación y caracterización de una variante de Fc manipulada en el esqueleto de anticuerpo anti-CD52.

A d e m á s de l an ticu e rp o H 66 a n ti-a p T C R , ta m b ié n se m an ip u ló la m u tac ión S 298 N /Y 300 S en un e sq u e le to de an ticu e rp o an ti-C D 52 (c lon 2C 3). A co n tin u a c ió n , es te m u tan te se e xa m in ó a fin de d e te rm in a r si la m od u lac ió n de la fu n c ió n e fe c to ra o b s e rv a d a a p re c ia d a en el an ticu e rp o S 298 N /Y 300 S H 66 a n ti-a T C R e ra co h e re n te en o tro e sq u e le to de an ticue rpo .

5A. Creación de variantes de glucosilación alteradas de anticuerpo anti-CD52 2C3

En p r im e r lugar, se p re pa ró A D N de la va r ia n te S 298 N /Y 300 S 2C 3 m ed ia n te m u ta g é n e s is de c a m b io ráp ido usa nd o p E N T R _ L IC _ Ig G 1 , y W T 2C 3 V H se c lo n ó en el v e c to r m u tad o m ed ia n te LIC . S e c lo n a ro n m u tan tes de long itud co m p le ta en e l v e c to r de e xp re s ió n p C E P 4 (-E I)D es t u sa nd o te c n o lo g ía G a tew ay. P os te rio rm e n te , las m u ta c io n e s se co n firm a ro n m ed ia n te se cu e n c ia c ió n de A D N y las s e cu e n c ia s se ind ican en la T a b la 11. Los am in o á c id o s m u tad os es tá n s o m b re a d o s y las se cu e n c ia s d ia n a de g lu co s ila c ió n de co n se n so c re a d a s p o r la m u tac ión es tá n sub ra ya d a s . A c o n tin u a c ió n , los m u ta n te s se tra n s fe c ta ro n en cé lu la s H E K 293 -E B N A en un fo rm a to de p laca de 6 po c illos y la p ro te ín a se pu rificó a p a rtir de m ed ios a co n d ic io n a d o s . A n ticu e rp o s ilve s tre a n ti-C D 52 2C 3 se p ro du jo en pa ra le lo co m o un con tro l. Se e n co n tró q u e el n ive l de exp re s ió n e ra 0,1 pg /m l u sa nd o an á lis is de S D -P A G E y tra n s fe re n c ia ^{W e ste rn} (Figura 9A). ^{La exp res ión de m u ta n te s en m ed io a co n d ic io n a d o pu ro ta m b ié n se m id ió m ed ia n te c a p tu ra de}p ro te ín a A sob re B iaco re . La co n ce n tra c ió n se d e te rm in ó usa nd o la re sp u e s ta de d iso c ia c ió n d e sp u é s de una in yecc ió n de se is m in u to s a p ro te ín a A in m ov iliza da . S e usó W T 2C 3 p ro d u c id o p o r C H O d ilu id o en se rie en m ed io de 90 pg /m l a 1,5 ng /m l co m o u n a c u rv a es tá nda r. Las co n ce n tra c io n e s se c a lcu la ro n d e n tro de a p ro x im a d a m e n te 0 ,2 pg /m l m e d ia n te una c u rv a de ca lib ra c ió n usa nd o un a jus te de 4 pa rá m e tro s . Los n ive le s de exp res ión re la tivo s eran ba jo s y ^{g e n e ra lm e n te co in c id ía n con los d a to s de la tra n s fe re n c ia W e s te rn} (Figura 9B).

Tabla 11: Secuencias del anticuer o anti-CD52 clon 2C3

5B. Análisis de glucosilación usando PNGasa F

P ara e va lu a r los s itio s de g lu co s ila c ió n a d ic io n a le s in tro d u c id o s po r la m u tac ión , el m u tan te S 298 N /Y 300 S en riq u e c id o se d e sg lu co s iló con P N G asa F. La d e sg lu co s ila c ió n no d e m o s tra b a n ingún ca m b io a p a re n te en el pe so m o lecu la r, lo ^{q u e in d ica que no e s ta b a p re se n te ca rb o h id ra to ad ic io na l} (Figura 10). ^{S e rea liza ron p re p a ra c io n e s a p e q u e ñ a e sca la}a fin de p u rif ica r es to s m u ta n te s p a ra u n a ca ra c te riza c ió n ad ic io n a l y los re su lta d o s re co n firm a ro n que no ha b ía ^{ca rb o h id ra to ad ic io na l p re se n te en el m u tan te} S298N/Y300S (Figura 11).

5C. Propiedades de unión de anticuerpo anti-CD52 2C3 a FcvRIIIa humano usando Biacore

T a m b ié n se usó B ia co re pa ra ca ra c te r iz a r la un ión a an tígeno , FcyR III, y las p ro p ie d a d e s de un ión de los a n ticu e rp o s ^{p u rif ica d o s (véa nse las} Figuras 12, 13 y 14). ^{La va ria n te S 298 N /Y 300 S 2C 3 se u n ía al pé p tid o C D 52 e s tre ch a m e n te}y el s e n so rg ra m a de un ión e ra in d is tin g u ib le de l con tro l s ilves tre , d e m o s tra n d o q u e es ta m u tac ión no a fe c ta a su un ión ^{a a n tíg e n o} (Figura 12A).

P ara e n sa ya r la fun c ión e fe c to ra de Fc, se uso el re ce p to r FcyR III (V a l158 ) en es tu d io s de un ión . El a n ticu e rp o m u tan te y de co n tro l s ilves tre se d iluye ron h a s ta 200 nM y se in yec ta ro n en F cyR IIIa ca p tu ra d o con m a rca d o r H P C 4. La un ión a FcyR III e ra cas i in d e te c ta b le p a ra el m u tan te S 298 N /Y 300 S , lo que in d ica b a u n a p é rd id a de fun c ión e fe c to ra po r ^{e s ta va ria n te} (Figura 12B ^y Figura 14A). ^{P ara e n s a y a r a d ic io n a lm e n te la fu n c ió n e fe c to ra de Fc, ta m b ié n se usó el}re c e p to r FcyR III (P he158) en e s tu d io s de un ión . Los a n ticu e rp o s m u tan te y de c o n tro l s ilves tre se d ilu ye ro n ha s ta 200 nM y se in yec ta ro n a F cyR IIIa c a p tu ra d o con m a rc a d o r H P C 4. La un ión a FcyR III e ra cas i in d e te c ta b le pa ra el m u tan te ^{S 298 N /Y 300 S , lo q u e in d ica una p é rd id a de fu n c ió n e fe c to ra con la va ria n te P he158} (Figura 14B). ^{F ina lm en te , se usó}B ia co re pa ra c o m p a ra r las p ro p ie d a d e s de un ión a FcR n de las p ro te ín a s pu rifica das . F cR n -H P C 4 de ra tón y se r h u m an o p u rif ica d o p o r S E C se in m ov iliza ro n en un ch ip C M 5 a tra vé s de a c o p la m ie n to am ín ico . C a d a an ticu e rp o se d ilu yó ha s ta 200, 50 y 10 nM y se in yec tó sob re los rece p to re s . C am pa th , W T 2C 3 p ro d u c id o p o r C H O y C a m pa th tra ta d o con D E P C se in c luye ron co m o c o n tro le s po s itivo s y ne ga tivos . E stos d a to s m ue s tra n q u e el m u tan te se une a re ce p to r de FcRn ta n to h u m an o co m o m urino con la m ism a a fin id ad q u e e l c o n tro l de an ticu e rp o s ilve s tre y que p ro b a b le m e n te no tie n e a lte ra c io n e s en su s e m iv id a en c ircu la c ió n u o tra s p ro p ie d a d e s fa rm a co c in é tica s . (véa nse la Figura 12C, Figura 13A y B). ^{S eg ún esto , la m u tac ión S 298 N /Y 300 S es ap lica b le a a n ticu e rp o s en ge n e ra l, pa ra}re d u c ir o e lim in a r la fu n c ió n e fe c to ra no d e se a d a de Fc, po r e je m p lo a tra vé s de a so c ia c ión de rece p to re s de F^cyhum anos.

Ejemplo 6: Detección del complejo inmunitario en circulación en el mutante S298N/Y300S.

T a m b ié n se in ves tig ó la de te cc ió n de l c o m p le jo in m un ita rio en c ircu la c ió n u sa nd o un e n sa yo de un ión a C 1q p a ra el m u tan te S 298 N /Y 300 S y el c o n tro l W T . P lacas de po c illo s C o s ta r 96 de a lta ca p a c id a d de un ió n se rev is tie ron du ran te la no che a 4 °C con 100 pl de A bs 2C 3 d ilu id o s en se rie 2 ve ce s a c o n c e n tra c io n e s que va ría n de 10 - 0,001 pg /m l en ta m p ó n de re ve s tim ie n to (N aC H O 3 0,1 M pH 9,2 ). El an á lis is p o r E L IS A m o s tra b a q u e la un ión a C 1q se red uce para ^{el m u tan te S 298 N /Y 300 S en c o m p a ra c ió n con W t} (Figura 15A). ^{La un ión de A b a n ti-F a b a los A bs 2C 3 reve s tido s c o n firm a b a un re ve s tim ie n to e q u iva le n te de los po c illo s} (Figura 15B).

Ejemplo 7: Separación y análisis del mutante S298N/Y300S usando enfoque isoeléctrico.

Un ge l de e n fo q u e iso e lé c tr ico (IE F) de pH 3 -10 se reco rrió pa ra c a ra c te r iz a r los m u ta n te s S 298 N /Y 300 S . Se e n con tró ^{q u e S 298 /Y 300 S te n ía c a rg a s m ás nega tivas y, p o r lo tan to , p ro b a b le m e n te m ás m o lécu las de ác ido s iá lico} (Figura 18A). ^{S e o b se rvó m ed ia n te M S in ta c ta que ta n to e l m u tan te S 298 N /Y 300 S co m o W T 2C 3 ten ía n G 0F y G 1F co m o la e sp e c ie de g lu co s ila c ió n d o m in a n te} (Figura 18 B y D, ^{re sp e c tiva m e n te ).}

Ejemplo 8: Afinidad de unión a antígenos de S298N/Y300S.

S e usó B ia co re pa ra c o m p a ra r la a fin id ad de un ión a a n tíg e n o s de l A b W T a n ti-C D 52 2C 3 y el m u tan te S 298 N /Y 300 S ^{q u e se hab ían p re p a ra d o y p u rif ica d o a p a rtir de e x p re s io n e s ta n to a e s c a la m e n o r} (Figura 16) ^{co m o m a yo r} (Figura 17) ^{. S e ob tu v ie ro n ch ip s C M 5 in m o v iliza d o s con pé p tid o 741 de C D 52 y p é p tid o 777 de con tro l. Los a n ticu e rp o s se}d ilu ye ro n en se rie 2 ve ce s de 60 a 0 ,2 nM en H B S -E P y se in yec ta ro n sob re la sup e rfic ie de los ch ip s d u ra n te 3 m in se g u id o po r u n a d iso c ia c ió n de 5 m in en ta m p ó n a un cau da l de 50 p l/m in . A c o n tin u a c ió n , la sup e rfic ie se regeneró con un pu lso de HC l 40 m M . E stos an á lis is se rea liza ron po r d u p lica d o y d e m u e s tra n q u e los a n ticu e rp o s m u tan te S 298 N /Y 300 S y W T 2C 3 m uestran u n a un ión c o m p a ra b le al p é p tid o de C D 52.

S e d ise ñ ó u n a p la ta fo rm a de c rib a d o de m ed io s p a ra p ro b a r las p ro p ie d a d e s de un ión fu n c io n a le s an tes de la pu rifica c ió n a fin de c r ib a r a n ticu e rp o s c re a d o s d u ra n te tra n s fe c c io n e s a p e q u e ñ a esca la . E stas p ru eb as se rea liza ron ^{u sa n d o O cte t} (Figura 19A) ^{pa ra d e te rm in a r la co n ce n tra c ió n y usaban b io se n so re s de p ro te ín a A y una cu rva e s tá n d a r}de G LD 52. Las m ue s tra s se d ilu ye ro n ha s ta 7 ,5 y 2 nM en H B S -E p pa ra u n a c o m p a ra c ió n de la un ión a C D 52 usando ^{B ia co re} (Figura 19B). ^{Los resu ltad os de l e n sa yo de un ión a p é p tid o m ostrab an q u e los a n ticu e rp o s ta n to m u tan te}S 298 N /Y 300 S co m o W T 2C 3 tie n e n un ión co m p a ra b le al p é p tid o de C D 52. P o r o tra pa rte , e s to s an á lis is d e m ue s tra n q u e O cte t y B ia co re fu n c io n a n b ien pa ra p re d e c ir la un ión a an tíg e n o p o r a n ticu e rp o s a p a rtir de tra n s fe c c io n e s a p e q u e ñ a esca la .

Ejemplo 9: Preparación de mutantes de glucosilación alterada S298N/Y300S, S298N/T299A/Y300S y N297Q/S298N/Y300S en esqueletos de anticuerpo adicionales.

A d e m á s de l a n ticu e rp o a n ti-a p -T C R y el an ticu e rp o 2C 3 a n ti-C D -52 , las m u ta c io n e s S 298 /Y 300S , S 298 N /T 299 A /Y 300 S y N 297 Q /S 298 N /Y 300 S se m an ip u la ro n en o tros e sq u e le to s de a n ticu e rp o p a ra c o n firm a r que p o d ía in tro d u c irse e l s itio de g lu co s ila c ió n en tán dem ad ic io na l en s e cu e n c ia s de l d o m in io va ria b le de la ca d e n a pe sad a no re lac io na da s . Los m u tan tes a n ti-C D -52 12G 6 y an ti-H e r2 g lu co s ila d o s a lte rn a tiva m e n te se ind ican en las T ab las 12 y 13. Los a m in o á c id o s m u tad os es tá n s o m b re a d o s y las s e cu e n c ia s d ia n a de g lu co s ila c ió n de co n se n so c rea da s p o r la m u tac ión es tá n sub ra ya d a s .

Tabla 12: Secuencias del anticuer o anti-CD52 clon 12G6

Tabla 13: Secuencias del anticuer o anti-Her2

Ejemplo 10. Generación de anticuerpos alterados que contienen restos glucano reactivos

A fin de g e n e ra r a n ticu e rp o s q u e co n tie n e n res tos g lu ca n o ca p a ce s de re a cc io n a r con res tos e fe c to re s de riva d o s , un an ticu e rp o an ti-H E R se g lu co s iló en p rim e r lu ga r in v itro usa nd o g lu c o s iltra n s fe ra s a y d o n a n te s de nu c le ó tido s g lu c íd ic o s p e rtine n tes . P or e jem p lo , p a ra in tro d u c ir los res idu os de á c ido s iá lico , los a n tic u e rp o s d o n a n te s se g a la c to s ila ro n en p rim e r lu ga r con p -g a la c to s iltra n s fe ra sa , se g u id o p o r s ia lila c ió n con a 2 ,6 -s ia liltra n s fe ra s a seg ún los m é to d o s de K an eko y co ls . (K aneko , Y., N im m erja hn , F., y R a ve tch , J. V. (2006 ) A n ti- in fla m m a to ry a c tiv ity o f im m u n o g lo b u lin G resu ltin g from Fc s ia ly la tion . S c ie nce 313, 670 -3 ). La rea cc ió n se rea lizó en u n a e ta p a de s ín tes is en un rec ip ie n te usa nd o p -g a la c to s iltra n s fe ra s a (50 m U /m g, S ig m a) y a 2 ,6 -s ia liltra n a fre a s a (5 ug /m g , R &D sys tem ) con su s tra to s n u c le o tíd ico s g lu c íd ico s d o n a n te s , U D P -g a la c to sa (10 m M ) y C M P -á c id o s iá lico (10 m M ) en tam pó n de M E S 50 m M (pH 6,5 ) q u e c o n te n ía M nC l²5 m M . La m e zc la de reacc ión q u e c o n te n ía 5 m g /m l de an ticu e rp o an ti-H E R 2 se in cub ó d u ra n te 48 ho ras a 37 °C . La s ia lila c ió n se v e rificó usa nd o an á lis is po r M A L D I-T O F M S de g lu ca n o s p e rm e tila d o s libe ra do s de l a n ticu e rp o con P N G a sa F, an á lis is de l co n te n id o de ác ido s iá lico usa nd o H P LC D ione x y tra n s fe re n c ia de le c tin a con S N A , u n a le c tin a e s p e c ífica pa ra al ác id o a2 ,6 -s iá lico .

El an á lis is po r M A LD I-T O F de g lu ca n o s libe ra do s po r tra ta m ie n to con P N G asa F de l a n ticu e rp o an ti-H E R 2 s ia lilad o in d ica b a q u e los g lu ca n o s na tu ra le s se han re m o d e la d o co m p le ta m e n te con u n a e s tru c tu ra b ia n te n a ria p rin c ip a lm e n te ^{m on os ia lilad a , A 1 F} (Figura 27A) ^{, ju n to con una p e q u e ñ a ca n tid a d de e sp ec ie d is ia lila da . El tra ta m ie n to de l an ticu e rp o}con c a n tid a d e s s u p e rio re s de a 2 ,6 -s ia liltra n s fe ra s a p ro d u c ía p o b la c io n e s m ás h o m o g é n e a s de la g lu c o fo rm a A1F, su g ir ie n d o que b ien la a c tiv id a d e n z im á tic a o b ien la lo ca lizac ión de l g lu ca n o pued en e v ita r la s ia lila c ió n to ta l. Se d e te rm in ó q u e el co n te n id o de ác ido s iá lico e ra ~2 m ol p o r m ol de a n ticu e rp o , lo q u e es tá de a cu e rd o con un g luca no A 1F com o la p rin c ip a l e sp ec ie de g lu c o fo rm a (Figura 27B). ^{La tra n s fe re n c ia de le c tina con una le c tin a de S A N , a g lu tin in a de} Sambucus nigra ^{e s p e c ífic a p a ra ác ido s iá lico e n la za d o en a2 ,6 , c o n firm a b a que el ác ido s iá lico e s ta b a p re se n te en una co n fig u ra c ió n de en la ce a2 ,6} (Figura 27C).

En co n c lu s ió n , a u nq ue los g lu ca n o s p ro te ín ico s na tu ra les son a lgo he te ro g é n e o s , la rem o de lac ión a tra vé s de g a la c to s il- y s ia liltra n s fe ra sa s d a un an ticu e rp o cas i ho m o g é n e o con g lu ca n o s b ia n te n a rio s m o n o s ia lila d o s pe ro totalmente galactosilados (A1F). La introducción de solo ~1 ácido siálico en los dos aceptores de galactosa en cada glucano ramificado se puede deber a una accesibilidad limitada de una de las galactosas procedentes de glucanos que a menudo están enterradas en el anticuerpo o las interacciones no covalentes de los glucanos con la superficie de la proteína.

Ejemplo 11. Oxidación de anticuerpos alterados que contienen restos de glucano reactivos

Una vez que se verificaba la sialilación, se investigó la oxidación en el procedimiento de anticuerpo anti-HER2 sialilado con diversas concentraciones de peryodato (de 0,25 a 2 mM). El anticuerpo sialilado se intercambio con tampón en primer lugar en Tris-HCl 25 mM (pH 7,5) que contenía EDTA 5 mM seguido por intercambio con tampón con tampón de PBS. La mezcla de anticuerpo tamponada se aplicó a continuación a columna Sepharose de proteína A preequilibrada con tampón de PBS. Después de que la columna se lavara con 15 volúmenes de columna de PBS, 15 volúmenes de columna de PBS que contenía EDTA 5 mM y 30 volúmenes de columna de PBS, se eluyó a continuación con tampón de citrato-fosfato 25 mM (pH 2,9). Los eluatos se neutralizaron inmediatamente con tampón de fosfato dibásico y el anticuerpo se concentró usando Amicon ultra de Millipore. Después de la purificación, el anticuerpo anti-HER2 sialilado se oxidó a continuación con peryodato sódico (Sigma) en tampón de acetato sódico 100 mM (pH 5,6) sobre hielo en la oscuridad durante 30 minutos, y la reacción se desactivó con glicerol al 3% sobre hielo durante 15 minutos. El producto se desaló y se intercambió en acetato sódico 100 mM (pH 5,6) mediante 5 rondas de ultrafiltración sobre Amicons de 50 kDa. La Figura 28A muestra el análisis del contenido de ácido siálico de anticuerpo sialilado titulado con diversas cantidades de peryodato. La oxidación completa de los residuos de ácido siálico se consiguió a una concentración de peryodato por encima de 0,5 mM. En efecto, una concentración de peryodato tan baja como 0,5 mM era suficiente para oxidar totalmente el ácido siálico introducido. Según esto, se eligió una concentración de peryodato de 1 mM para la oxidación de anticuerpo sialilado para la conjugación del fármaco.

La oxidación puede tener efectos adversos sobre la integridad de un anticuerpo. Por ejemplo, se sabe que la oxidación de residuos de metionina, incluyendo Met-252 y Met-428, situados en la región CH3 de Fc, cerca del sitio de unión a FcRn afecta a la unión a FcRn que es crítica para prolongar la semivida en suero del anticuerpo (Wang, W., y cols. (2011) Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Mol Immunol 48, 860-6). Según esto, para examinar los efectos secundarios potenciales de la oxidación con peryodato sobre residuos de metionina (p. ej., Met-252) críticos para la interacción con FcRn, el estado de oxidación del anticuerpo sialilado se determinó mediante análisis de LC/MS de un digesto de péptido tripsinado. Este análisis revelaba ~30% de oxidación de Met-252 y < 10% de oxidación de Met-428 después del tratamiento del trastuzumab sialilado con peryodato 1 mM. Para determinar el impacto de este grado de oxidación de metionina sobre la unión a FcRn, se evaluó la cinética de unión a FcRn para cada anticuerpo usando resonancia plasmónica superficial (BIACORE). Este análisis revelaba que el estado de oxidación se correlacionaba con una pequeña pérdida en la unión a FcRn (12% y 26% de reducción a FcRn de ratón y ser humano, véanse las Figuras 28B y 28C, respectivamente). Notablemente, se ha presentado que una reducción de ~25% en la Ka para FcRn humano no tiene efecto sobre la semivida en suero en un ratón transgénico con FcRn humano, puesto que un solo sitio FcRn intacto en cada anticuerpo es suficiente para proporcionar funcionalidad y la ventaja PK (Wang y cols., Id).

En resumen, estos datos indican que la introducción de residuos de ácido siálico sensibles a peryodato mediante tratamiento con sialiltransferasa permite el uso de concentraciones muy inferiores de peryodato, dando como resultado efectos secundarios mínimos sobre las interacciones anticuerpo-FcRn e integridad del anticuerpo según se valora mediante agregación (£1%). Así, el uso de anticuerpos sialilados proporciona un margen más amplio de las condiciones de oxidación a emplear, permitiendo la generación reproducible de glucoconjugados activos sin efecto sobre la semivida en suero.

La galactosa en un mutante de anticuerpos hiperglucosilado también se puede oxidar específicamente usando galactosa oxidasa para generar un grupo aldehído para la conjugación. Para confirmar este enfoque, un anticuerpo anti-TEM1 A114N se concentró hasta 13-20 mg/ml y a continuación se trató con 20 mU/mg de sialidasa en PBS durante 6 horas a 37°C. A continuación, el producto desialilado se oxidó con galactosa oxidasa ("GAO"), en primer lugar con 5 ug de GAO/mg de proteína durante la noche a 37°C, seguido por adición de 2 ug de GAO/mg de proteína e incubación durante 5 horas adicionales. Se añadió acetato sódico para ajustar el pH hasta 5,6 (0,1 v/v, pH 5,6) y se añadió DMSO para conseguir una concentración de reacción final de 16%, se añadieron antes de la conjugación. El anticuerpo anti-HER mutante de hiperglucosilación A114N (15 mg/ml) se desialiló de forma similar con sialidasa (20 mU/mg) y se oxidó con 5 ug de GAO por mg de proteína en una sola reacción durante la noche a 37°C.

Ejemplo 12. Síntesis de restos efectores reactivos

A fin de facilitar la conjugación con glucoformas de anticuerpo derivadas con aldehído, restos efectores de los posibles fármacos (p. ej., momometilauristatina E (MMAE) y dolastatina 10 (Dol10)) se derivaron con aminooxicistamida para contener grupos funcionales (p. ej., aminooxi-cys) específicamente reactivos con el aldehído.

B reve m en te , p a ra g e n e ra r a m in o o x ic is ta m id a co m o u n a m a te ria p rim a , se añ ad ió S -tr it il-L -c is te in a m id a (362 m g, 1 m m o l) a 3 ml de u n a so luc ió n en D M F de é s te r de W -h id rox isu cc in im id a de ác ido t- fíO C -a m in o o x ia c é tic o (289 m g, 1 m m ol). La reacc ión e ra co m p le ta d e sp u é s de 3 h co m o e ra e v id e n te a p a rtir de l an á lis is po r H P LC . P o s te rio rm e n te , la m ezc la de reacc ión se d ilu yó con 30 ml de d ic lo ro m e ta n o y se lavó con so luc ió n de b ica rb o n a to só d ico 0,1 M (2 x 20 m l), ag ua (2 x 20 m l) y s a lm u e ra (2 x 20 m l). La so luc ión se secó sob re su lfa to só d ico an h id ro , se filtró y se con ce n tró ha s ta se q ue da d . S e añ ad ie ro n a es te res iduo seca do 3 ml de T F A se g u id o p o r 150 pl de tr ie tils ila n o . La so luc ión resu lta n te se p re c ip itó en t-b u til-m e til-é te r y e l p ro ce d im ie n to se rep itió tre s vece s . D espués de la filtra c ió n , e l res iduo se secó ba jo p res ión red u c id a da nd o 205 mg de un só lido b la n q u e c in o (67% de re n d im ien to ). El co m p u e s to se usó pa ra la s ig u ie n te e ta p a sin p u rifica c ió n ad ic iona l.

P ara g e n e ra r M M A E d e riva d a con am ino ox i (a m in o o x i-C ys -M C -V C -P A B C -M M A E ), se c o m b in a ro n 30,1 m g de a m in o o x ic is ta m id a (0 ,098 m m ol, 2 e q .) con 64 ,6 mg de M C -V C -P A B C -M M A E (0 ,049 m m o l) y 100 pl de tr ie t ila m in a en 3 m l de DM F. La m ezc la de reacc ión resu ltan te se ag itó a te m p e ra tu ra am b ie n te d u ra n te 15 m inu tos , t ie m p o pa ra el cua l la reacc ión e ra c o m p le ta seg ún el an á lis is po r H P LC . El co m p u e s to se pu rificó m ed ia n te H P LC p re p a ra tiva dand o 45 mg (62% ) de l p ro d u c to d e se a d o co m o un só lido b lan que c in o . El an á lis is p o r H P LC en fa se in ve rsa su g e ría qu e la p u re za de l co m p u e s to e ra > 96% . ESI ca lc . pa ra C 73 H 116 N 14 O 18 S (MH)+ 1509 ,8501 ; e n co n tra d o , m /z 1509 ,8469.

P ara g e n e ra r D o l10 d e riva d a con am ino ox i (a m in o o x i-C ys -M C -V C -P A B C -P E G 8 -D o l10 ), se co m b in a ro n 7 ,4 mg (0 ,024 m m ol, 3 eq .) de am in o o x ic is ta m id a , 12 mg (0 ,008 m m ol) de M C -V C -P A B C -P E G 8 -D o l10 y 30 pl de tr ie tila m in a en en 3 m l de DM F. La rea cc ió n se c o m p le ta b a en 15 m in u tos seg ún el an á lis is p o r H P LC . La p u rifica c ió n p o r H P LC p re p a ra tiva d a b a co m o resu ltad o 6 ,2 mg (46% ) d e l p ro d u c to d e se a d o co m o un só lid o b lan que c in o . El an á lis is H P LC en fa se in ve rsa sug ie re q u e la p u re za de l co m p u e s to es > 96% . ESI ca lc . p a ra C 80 H 124 N 16 O 19 S 2 (MH)+ 1678 ,0664 ; e n co n tra d o , m /z 1678 ,0613.

Ejemplo 13. Conjugación mediada por ácido siálico (SAM) de restos efectores reactivos

D e spu és de l d e sa lado , los e n la za d o re s de fá rm a c o s de l E jem p lo 11 se co m b in a ro n con los a n ticu e rp o s s ia lilad os o x id a d o s de l E je m p lo 10 con D M S O al 75% (0 ,167 v /v) a u n a co n ce n tra c ió n de 25 m M pa ra c o n s e g u ir u n a re lac ión m o la r de 24:1 de e n la z a d o r de fá rm a co a an ticu e rp o y un a c o n ce n tra c ió n de an ticu e rp o fina l a 5 m g/m l. La m ezc la se in cub ó d u ra n te la noche a te m p e ra tu ra am b ie n te . Los e n la za d o re s de fá rm a c o s no in co rp o ra d o s y c u a lq u ie r fá rm a co lib re se reco g ie ron u sa nd o B io B ea ds. El p ro d u c to se in te rca m b io con ta m p ó n a d ic io n a lm e n te en ta m p ó n de h is tid ina -T w ee n u sa n d o co lu m n a s P D -10 y se filtró es té rilm e n te . S e d e te rm in a ro n los n ive le s de e n d o to x in a s y c o n s ig u ió m enos de 0,1 E U /m g de A D C pa ra el e s tu d io in v ivo .

^La Figura 29A-C ^{m u e s tra un c ro m a tó g ra fo de in te racc ión h id ró fo b a (H IC ) de d ife re n te s a n ticu e rp o s s ia lila d o s (anti}FAP B11 y G11 y e l a n ticu e rp o an ti-H E R 2 de l E je m p lo 11) g lu c o c o n ju g a d o s a A O -M M A E . El an ticu e rp o de H E R 2 ^{s ia lila d o ta m b ié n se co n ju g ó con el e n la z a d o r de fá rm a co , A O -C y s -M C -V C -P A B C -P E G 8 -D o l10} (Figura 29D). ^Estean á lis is reve la q u e ex is te n p r in c ip a lm e n te uno o do s co n ju g a d o s d e fá rm a c o p o r an ticu e rp o con una re lac ión de fá rm a c o a an ticu e rp o (D A R ) q u e v a ría de 1 ,3 -1 ,9. El in c rem en to en el t ie m p o de re tenc ión de l g lu c o c o n ju g a d o de ^{D o l10} (Figura 29D) ^{en c o m p a ra c ió n con e l g lu co co n ju g a d o de M M A E} (Figura 29C) ^{se de be p ro b a b le m e n te a la m ayo r}h id ro fo b ia de D o l10.

T a m b ié n se e fe c tu ó un an á lis is p o r LC -M S con un an ticu e rp o an ti-H E R co n ju g a d o con do s e n la z a d o re s de fá rm a co d ife re n te s (A O -M M A E o A O -P E G 8 -D o l10 ) a un a e s c a la de 30 mg. Este an á lis is m o s tra b a va lo re s de D A R s im ila res de 1,7 y 1,5 d e sp u é s de la co n ju g a c ió n , lo que es co m p a ra b le con e l a n á lis is p o r H IC . La c ro m a to g ra fía de exc lus ió n p o r ta m a ñ o (S E C ) m o s tra b a n ive le s m uy ba jo (1% ) de a g re g a d o s en e s to s con ju gad os .

Ejemplo 14. Conjugación mediada por galactosa (GAM) de restos efectores reactivos

El a ld e h id o de g a la c to s a g e n e ra d o con g a la c to sa o x id a sa en e l an ticu e rp o m u tan te de h ip e rg lu co s ila c ió n an ti-TE M 1 A 114N seg ún se d e sc rib e en e l E jem p lo 11 se co n ju g ó con un e xce so m o la r de 24 de e n la z a d o r de fá rm a c o am ino ox i-M C -V C -P A B C -M M A E sob re el an ticu e rp o m ed ia n te in cub ac ió n d u ra n te la noche a 25°C , da nd o un c o n ju g a d o de A D C con u n a D AR de 1,72.

A l an ticu e rp o tra ta d o con g a la c to s a o x id a s a p re p a ra d o según se d e sc rib e en el E je m p lo 11 se añ ad ió un v o lu m e n de rea cc ió n de un d é c im o de a ce ta to sód ico 1 M, pH 5,6 , pa ra a ju s ta r el th e pH ha s ta 5 ,6 y se añ ad ió D M S O pa ra ha ce r la co n ce n tra c ió n fin a l 14% an tes de a ñ a d ir 24 eq. de e n la z a d o r de fá rm a co a m in o o x i-M C -V C -P A B C -M M A E . Las re a cc io n e s se in cub a ron d u ra n te la noche a te m p e ra tu ra a m b ie n te . El fá rm a c o y el e n la z a d o r de fá rm a c o lib res se reco g ie ron con B io be ads y el ta m p ó n de l p ro d u c to se in te rca m b ió m ed ia n te S E C (65% de re n d im ien to ). El co n ju g a d o ^{de l p ro d u c to se an a lizó m ed ia n te H IC . S egún se m u e s tra en la} Figura 30, ^{A O -M M A E se ha b ía c o n ju g a d o a -60 % de}las m o lécu las .

Ejemplo 15. Ensayos de proliferación de células ADC in vitro

La actividad in vitro de las moléculas de glucoconjugado de anti-HER y anti-FAP también se compararon con los correspondientes conjugados tiólicos que contienen el mismo resto farmacológico enlazado a través de enlaces tiol a cisteínas de la región de bisagra del mismo anticuerpo donante. Los conjugados tiólicos contenían aproximadamente dos veces el número de fármacos por anticuerpo (DAR) que los glucoconjugados. La conjugación basada en tiol se realizó según se describe por Stefano y cols (Methods in Molecular Biology 2013, en prensa). A continuación, se emplearon las líneas celulares Her2+ SK-BR-3 y Her2- MDA-MB-231 para evaluar la eficacia relativa de cada ADC. Los resultados de este análisis se presentan en la Tabla 15 a continuación

Tabla 15. Com aración de EC⁵⁰de lucoconu ados conu ados tiólicos

Las Figuras 31(A-D) muestran una comparación de la potencia in vitro de glucoconjugado de anti-HER y su conjugado tiólico homólogo. La viabilidad celular se determinó después de 72 h de exposición de los conjugados a antígeno de Her2 que expresa células (SK-BR-3) (Figuras 31A y C) o que no expresa (MDA-MB-231) células (Figuras 31B y D).

Las ADCs contenían bien MMAE o bien PEG8-Dol10 enlazados a los glucanos (''glyco'') o mediante química convencional a las cisteínas de la región de bisagra (''thiol''). Según se muestra en las Figuras 31A y C, se observaba una EC⁵⁰~2 veces menor para los conjugados tiólicos en comparación con los glucoconjugados, lo que es coherente con una DAR 2 veces superior en los primeros que en los últimos. No se observó toxicidad con la línea celular Her2-con un anticuerpo hasta 100 ug/ml.

También se observaron tendencias similares en la proliferación celular para ADC preparadas con anticuerpos contra un antígeno tumoral (FAP) que es altamente expresado por fibroblastos estromáticos reactivos en cánceres epiteliales incluyendo cáncer de colon, pancreático y de mama (Teicher, B. A. (2009) Antibody-drug conjugate targets. Curr Cancer Drug Targets 9, 982-1004). Estos conjugados se prepararon de nuevo al conjugar bien enlazador de fármaco de aminooxi-MMAE o bien enlazador de fármaco de maleimido-MMAE a glucanos o un grupo tiol. Ensayos de proliferación celular de estos conjugados mostraban que la EC⁵⁰del conjugado tiólico tenía una potencia ~ 100 veces superior sobre las células CHO transfectadas con FAP humano que las mismas células que carecen de expresión de FAP según se representa en la Figura 32, que muestra una comparación de la potencia in vitro de glucoconjugado y conjugado tiólico de anti FAP B11. La viabilidad celular se determinó después de la exposición de los conjugados a células CHO transfectadas con o sin antígeno FAP. Las ADC contenían MMAE enlazada a los glucanos ("glyco") o mediante química convencional a cisteínas de la región de bisagra ("thiol"). Nótese que la EC50 -2 veces inferior para el tiol en comparación con los glucoconjugados es coherente con las cantidades relativas de fármaco aportadas por anticuerpo suponiendo eficacias similares para la unión a la diana y la internalización en células CHO que expresan antígeno. En paralelo, se ensayó un glucoconjugado de ADC anti FAP (B11) con una DAR de 1,5 según se describe previamente y mostraba una EC⁵⁰-2 veces superior que el conjugado tiólico de comparación (DAR 3,3).

Según se muestra en la Figura 36, se observaban tendencias similares en el ensayo de proliferación celular para ADC preparadas con el anticuerpo anti-HER que tiene la mutación de hiperglucosilación A114N y AO-MMAE según se describe en el Ejemplo 14, cuando se ensayan sobre células que expresan SK-BR-3 o células MDA-MB-231. El glucoconjugado de A114N muestra claramente una potenciación de la toxicidad celular contra la línea celular que expresa Her2 sobre la línea sin expresión. La toxicidad relativa comparada con el glucoconjugado de SialT preparado con el mismo anticuerpo es coherente con la carga de fármaco inferior de esta preparación.

También se realizó un ensayo de proliferación celular para ADC preparadas con el anticuerpo anti-TEM1 que tiene la mutación de hiperglucosilación A114N y AO-MMAE preparada como se describe en el Ejemplo 14. Se observó una toxicidad superior con las líneas de células que expresan TEM1 SJSA-1 y A673 en comparación con la línea MDA-MB-231 sin expresión. El nivel de toxicidad en comparación con un conjugado tiólico convencional con el mismo anticuerpo estaba de acuerdo con la carga de fármaco (DAR) de esta preparación.

En resum en , la co n ju g a c ió n e s p e c ífic a de l s itio de los fá rm a co s a tra vé s de los g lu ca n o s con e n la ce s e sc in d ió le s p ro d u ce A D C con to x ic id a d e s y e fic a c ia in v itro que son e q u iva le n te s a c o n ju g a d o s ba sa d o s en tio l co n ve n c io n a le s , según se d e m u e s tra usando d ife re n te s a n ticu e rp o s y d ife re n te s e n la za d o re s de fá rm a co s . P or o tra pa rte , p o r de ba jo de 2 m M de pe ryod a to , e l n ive l de c o n ju g a c ió n de fá rm a c o se co rre la c io n a con la red ucc ión de ác ido s iá lico . In c re m e n ta r la c o n ce n tra c ió n de p e ryo d a to po r e n c im a de 2 m M p ro d u ce po co bene fic io , seg ún se e s p e ra de la c o n ve rs ió n c o m p le ta de ác ido s iá lico en la fo rm a ox ida da . S in em b a rg o , ba jo to d a s las c o n d ic io n e s , e l nú m ero de fá rm a co s p o r an ticu e rp o e ra lig e ra m e n te in fe rio r qu e el co n te n id o de ác ido s iá lico , in d ica nd o q u e a lgu nos de los ác idos s iá lico s o x id a d o s p u ed en de fo rm a s im ila r no e s ta r d isp o n ib le s pa ra e l aco p la m ie n to , b ien d e b id o a e s ta r e n te rra d o s o b ien de o tro m odo d e b id o a im p e d im e n to e s té rico qu e su rg e de l v o lu m e n de l e n la z a d o r de fá rm aco .

Ejemplo 16. Caracterización in vivo de conjugados de anticuerpo-fármaco

T a m b ié n se e va lu ó la e fica c ia de g lu c o c o n ju g a d o s de a n ti-H E R en un m odo de x e n o in je rto tu m o ra l H e r2+ y se co m p a ró con co m p a ra d o re s de co n ju g a d o s tió lic o s q u e tie n e n u n a D A R -2 ve ce s superio r. A ra ton es be ig e /S C ID se les im p la n ta ro n cé lu la s tu m o ra le s S K -O V -3 H e r2+ q u e se de jó q u e e s ta b le c ie ra n tu m o re s de -150 m m 3 an tes de l in ic io de l tra ta m ie n to . S e in yec ta ro n A D C en do s is de 3 o 10 m g /kg a tra vé s de la v e n a cau da l los d ía s 38, 45, 52 y 59. H abía -10 ra ton es p o r g ru po . S e m id ió e l v o lu m e n de l tu m o r de los ra tones en un g ru p o d ife re n te y se reg is tró su su p e rv ive n c ia . La cu rv a de su p e rv ive n c ia se re p re se n tó b a sá n d o se en e l m é tod o de K ap la n -M e ie r.

^Las Figuras 33(A-D) ^{m uestran una c o m p a ra c ió n de la e fica c ia in v ivo de los g lu co co n ju g a d o s de an ti-H E R y los}co n ju g a d o s tió lic o s en un m ode lo de xe n o in je rto de cé lu la s tu m o ra le s H er2+ . A ra ton es b e ig e /S C ID im p la n ta d o s con ^{cé lu la s tu m o ra le s S K -O V -3 H er2+ se les d o s ifica ro n M M A E} (Figuras 33 A y B) ^{y P E G 8 -D o l10} (Figuras 33 C y D) ^queco n te n ía n g lu c o c o n ju g a d o s o co m p a ra d o re s de c o n ju g a d o t ió lico con u n a D AR ~2 ve ce s sup e rio r. La c in é tic a de ^{c re c im ie n to tu m o ra l de los co n ju g a d o s de M M A E se m ue s tra en la F igu ra} 33A. ^{En es te caso , e l g lu co co n ju g a d o}m o s tra b a u n a e fic a c ia s ig n ifica tiva m e n te s u p e rio r q u e el a n ticu e rp o d e sn u d o so lo (neg ro ) pe ro m enos q u e un c o m p a ra d o r de co n ju g a d o t ió lico q u e te n ía una D A R -2 ve ce s s u p e rio r (ve rde ). El g lu c o c o n ju g a d o de M M A E m os trab a ^{u n a reg res ió n tu m o ra l s ig n ifica tiva y un re traso de -20 d ía s en e l c re c im ie n to tu m o ra l} (Figura 33A) ^{y un in c re m e n to de -2 ve ce s en e l t ie m p o de su p e rv ive n c ia de sd e la p rim e ra do s is} (Figura 33B). ^{El c o n ju g a d o t io l-M M A E m o s tra b a una}sup re s ió n tu m o ra l cas i c o m p le ta a la m ism a d o s is de A D C (10 m g/kg).

La e fic a c ia in v ivo de un g lu c o c o n ju g a d o de P E G 8-D o l10 ("G lu co Dol 10') y un co m p a ra d o r de c o n ju g a d o t ió lico con u n a D AR ~2 ve ce s s u p e rio r ("T io l D o l10") ta m b ié n se d e te rm in ó en el m ism o m ode lo de xe n o in je rto de cé lu la s tu m o ra le s H er2+ . A m b o s co n ju g a d o s m os trab an una e fica c ia in fe r io r q u e co n ju g a d o s de M M A E co m o los d e sc rito s p re v ia m e n te . S in em b a rg o , e l g lu c o c o n ju g a d o de a m in o o x i-P E G 8 -D o l10 ("G lyco D o l10") a 10 m g/kg m o s tra b a un ^{re traso de 15 d ía s en el c re c im ie n to tu m o ra l} (Figura 33C) ^{y un in c rem en to de -20 d ía s (1 ,7 ve ce s ) en el t ie m p o de su p e rv iv e n c ia d e sp u é s de la p rim e ra ad m in is tra c ió n} (Figura 33D). ^{El c o n ju g a d o t ió lico e ra m ás e fica z a la m ism a}do s is , m os tran do un in c rem en to de 2 ve ce s en la su p e rv ive n c ia . A u n a do s is in fe rio r (3 m g /kg ), e l c o n ju g a d o tió lico m o s tra b a u n a e fic a c ia m en os q u e el g lu c o c o n ju g a d o a 10 m g /kg . E sta do s is co rre sp o n d e a 80 um o l de fá rm a c o P E G 8-D o l10 p o r kg de dos is , en c o m p a ra c ió n con 110 um o l de fá rm a co de P E G 8-D o l10 p o r kg de do s is pa ra el g lu co co n ju g a d o .

E stos d a to s d e m u e s tra n q u e la co n ju g a c ió n e s p e c ífic a de l s itio de fá rm a c o s sob re ác ido s iá lico de g lu ca n o s de an ticu e rp o d a m o lécu las con p o te n c ia c o m p a ra b le a A D C g e n e ra d a s a tra vé s de q u ím ic a b a sa d a en tio l. La e fica c ia in v ivo a lgo in fe rio r su rg e p ro b a b le m e n te de l m e n o r n ú m ero de fá rm a c o s q u e son s o p o rta d o s p o r c a d a a n ticu e rp o a las cé lu la s tu m o ra le s m ed ia n te la in te rn a liza c ió n de ca d a a n tíg e n o un id o a a n ticue rpo . A u n q u e los p re sen te s in ve n to re s no han co m p a ra d o e s to s g lu co co n ju g a d o s con co n ju g a d o s tió lic o s de la m ism a DAR , la e fic a c ia o b se rva d a a d ife re n te s do s is de las dos A D C qu e rep rese n tan n ive le s co m p a ra b le s de fá rm a co a d m in is tra d o m u e s tra q u e los g lu c o c o n ju g a d o s tie n e n e fica c ia in trín se ca co m p a ra b le con sus h o m ó logo s tió lico s , ind ica nd o a u se n c ia de e fe c to p e rju d ic ia l de la co n ju g a c ió n en es te s itio . P or o tra pa rte , una d o s is de 10 m g/kg de l g lu c o c o n ju g a d o de D o l10 que in tro d u c ía so lo 28 % m ás fá rm a c o p ro p o rc io n a b a un in c re m e n to de 2 ve ce s en la s u p e rv ive n c ia sob re e l co n ju g a d o tió lic o (a 3 m g /kg ), su g ir ie n d o q u e e s to s co n ju g a d o s in c luso p u ed en p ro p o rc io n a r e fica c ia s su p e rio re s a la m ism a DAR. D ada la lim itac ión ap a re n te en la in co rp o ra c ió n de ác ido s iá lico en g lu ca n o s na tu ra les , se p o d ría c o n s e g u ir u n a ca rg a de fá rm a co s u p e rio r m ed ia n te un nú m ero de e s tra te g ia s d ife re n te s in c lu ye n d o e l uso de e n la za d o re s de fá rm a co ra m ifica d o s o la in tro du cc ión de s itio s de g lu co s ila c ió n a d ic io n a le s y u sa n d o e l m ism o m étodo .

Ejemplo 17. Conjugación de restos orientadores

La Figura 37 muestra el esquema global para la conjugación de restos orientadores a carbohidratos existentes o sitios de glucosilación manipulados. Esta conjugación se puede realizar a través de la ligazón de neoglucanos, glucopéptidos u otros restos orientadores a anticuerpos sialilados oxidados (Figuras 38 y 39). Restos adecuados para la conjugación pueden incluir los que contienen enlazadores de aminooxi (Figura 40 y 41).

Ejemplo 18. Conjugación a través de ácido siálico en glucanos Fc naturales

Man-6-P hexamanosa-aminooxi se conjugó bien a anticuerpo policlonal o bien a anticuerpo monoclonal que se dirige específicamente a un receptor de Man-6-P. Los análisis de SDS-PAGE y MALDI-TOF MS de la conjugación del anticuerpo policlonal de conejo con Man-6-P hexamanosa-aminooxi se muestran en la Figura 42. La Figura 43 reproduce los resultados de experimentos de resonancia plasmónica superficial usados para valorar la unión de anticuerpos IgG policlonales de conejo de control y conjugados a Man-6-P hexamanosa a receptor de Man-6-P independiente de cationes (CI-MPR). Los análisis in vitro de este anticuerpo conjugado demuestran un incremento en la captación en líneas celulares tanto HepG2 (carcinoma hepatocelular hepático de Homo sapiens) como RAW (leucemia murina de Mus musculus) (Figura 44). Los cultivos se tiñeron con anticuerpo anti-Alexa 488 de conejo teñido por contraste con DAPI.

Los anticuerpos conjugados con Man-6-P o restos lactosa-aminooxi se probaron adicionalmente a través de SDS-PAGE y transferencia de lectina y se compararon con anticuerpos no conjugados (Figura 45). Los análisis de proteínas intactas por MALDI-TOF de los anticuerpos de control y conjugados demuestran que los conjugados tienen aproximadamente dos restos de glucano por anticuerpo, mientras que los anticuerpos de control no tienen ninguno (Figura 46).

Ejemplo 19. Conjugación a través de ácido siálico a residuos de cisteína de la bisagra en un anticuerpo

Man-6-P hexamanosa-maleimida (Figura 41) se conjugó bien a anticuerpo policlonal o bien a anticuerpo monoclonal.

La conjugación de un anticuerpo policlonal con Man-6-P hexamanosa-maleimida a través de cisteínas de bisagra se examinó a través de SDS-PAGE, transferencia de lectina y cuantificación de Man-6-P (para determinar el número de glucanos conjugados por anticuerpo) (Figura 47). La conjugación de un anticuerpo policlonal con lactosa-maleimida también se examinó a través de uno de SDS-PAGE y cuantificación de galactosa del anticuerpo de control, el anticuerpo conjugado y el filtrado se muestran en la Figura 48. Se observaba poco incremento de la agregación en anticuerpos policlonales conjugados a cisteína de bisagra mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (Figura 50).

La conjugación de un anticuerpo monoclonal con Man-6-P hexamanosa-maleimida a través de cisteínas de bisagra también se examinó a través de SDS-PAGE y cuantificación de glucano (para determinar el número de glucanos conjugados por anticuerpo) (Figura 49). Se observaba por incremento de la agregación en anticuerpos policlonales conjugados a cisteínas de bisagra mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (Figura 51).

La unión de receptor de Man-6-P (CI-MPR) a anticuerpos policlonales y monoclonales conjugados a bis Man-6-P hexamanosa a través de glucanos de Fc naturales o disulfuros de bisagra también se demostró a través de desplazamiento en gel sobre una PAGE natural (Figura 55).

Ejemplo 20. Preparación de anticuerpo monoclonal completamente galactosilado y conjugación de un glucopéptido trigalactosilado al anticuerpo sialilado

Un mutante de anticuerpo monoclonal de ratón con una mutación STY (NNAS) se modificó con sialidasa y galactosiltransferasa para elaborar glucanos trigalactosilados principalmente naturales (2 glucanos por anticuerpo). El mismo mutante también se sialiló con sialiltransferasa y se conjugó con un glucopéptido que contiene galactosa trivalente (Figura 68) usando el enfoque SAM. Se examinó el contenido de ácido siálico de los anticuerpos modificados con enzima (Figura 52). Además, se examinaron el análisis por MALDI-TOF de los glucanos liberados de NNAS de control y desialilado/galactosilado (Figura 53) así como los glucanos liberados de NNAS de control y sialilado (Figura 54). SDS-PAGE (NuPAGE al 4-12%) y transferencia de lectina de NNAS modificado con enzima y conjugado se muestran en (Figura 56). También se midió la cuantificación de galactosa terminal para el anticuerpo NNAS de control, anticuerpo NNAS desialilado/galactosilado y anticuerpo NNAS conjugado a glucopéptido (Figura 57).

Ejemplo 21. Preparación de lactosa-maleimida sialilada en a2.3 usando un enfoque de quimioenzima y la conjugación posterior a IgG de conejo no inmunitaria a través de disulfuros de bisagra.

Las proteínas de unión a carbohidratos (incluyendo proteínas Siglec) son capaces de unirse más eficazmente a zonas con mayor densidad de ácido siálico. Así, los glucanos monosialilados en un anticuerpo dado pueden no proporcionar suficiente densidad de ácido siálico para facilitar la unión a otras proteínas Siglec. Por lo tanto, se investigó un enfoque de conjugación a disulfuro de bisagra para introducir múltiples copias de glucanos sialilados. Para producir glucanos sialilados para la conjugación, se sialiló lactosa-maleimida (5 mg) in vitro con a2,3-sialiltransferasa de Photobacterium damsela en tampón de Tris (pH 7,5) durante 2 h a 37°C. Un glucano de control se incubó sin sialiltransferasa y se comparó con los glucanos originales. El análisis por MALDI-TOF MS mostraba que la incubación de lactosa-maleimida sin enzima en tampón de Tris (pH 7,5) durante 2 h a 37°C no cambiaba el peso molecular esperado de la molécula, sugiriendo que la condición examinada no da como resultado hidrólisis de maleimida. El análisis por MALDI-TOF y HPLC Dionex de glucanos modificados con a2,3-sialiltransferasa indican la presencia de sialil-lactosa, aunque no como pico principal (datos no mostrados). Por lo tanto, la sialil-lactosa-maleimida se purificó adicionalmente usando columnas de QAE-sepharose y cada fracción se analizó posteriormente usando MALDI-TOF y HPLC Dionex. Estos análisis indicaban que la sialil-lactosa-maleimida existía como especie principal en el eluato de NaCl 20 mM procedente de la columna de QAE (Figura 58). La cantidad de glucanos sialilados purificados se estimó usando análisis de cuantificación de ácido siálico de las muestras, indicando una recuperación de ~1,8 mg de sialil-lactosamaleimida.

La conjugación posterior de un anticuerpo policlonal de conejo con esta sialil-lactosa-maleimida se probó usando química de tiol-maleimida. Un anticuerpo IgG de conejo (1 mg) se redujo con TCEP a un exceso molar de 4 (sobre el anticuerpo) durante 2 h a 37°C antes de conjugarse a un exceso molar de 24 de sialil-lactosa durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, el conjugado se intercambió con tampón en PBS para el análisis en SDS-PAGE (Figura 59A). También se realizó una cuantificación de ácido siálico usando HPLC Dionex (Figura 59B). Partes alícuotas de conjugado de control y tiólico se trataron con o sin sialidasa (1 U por mg) durante la noche a 37°C antes de que los sobrenadantes se recuperaran a través de filtración (MWCO 10 kDa). El contenido de ácido siálico de los sobrenadantes se midió y se comparó con muestras tratadas sin sialidasa. Hay aproximadamente 4 restos de a2,3-sialil-lactosa por anticuerpo.

Ejemplo 22. Preparación de a2.6-s¡alil-lactosa-male¡m¡da mediante sialilación de lactosa-maleimida y conjugación a disulfuros de bisagra de un anticuerpo policlonal de conejo a través de enlaces a2,3 o a2,6 que da como resultado alta sialilación

También se investigó la conjugación de múltiples copias de glucanos sialilados en a2,6 a los disulfuros de bisagra de un anticuerpo policlonal de conejo. Puesto que la a2,3-sialil-lactosa-maleimida se producía satisfactoriamente usando un enfoque de quimioenzima (véase anteriormente, Ejemplo 21), se usó un método similar para producir a2,6-sialillactosa-maleimida (pequeñas modificaciones del protocolo incluían el uso de una sialiltransferasa diferente). Para producir glucano sialilado en a2,6 para la conjugación, se sialiló lactosa-maleimida (~5 mg) in vitro con 0,5 U de una a2,6-sialiltransferasa bacteriana de Photobacterium damsela en tampón de Tris (pH 8) durante 1 h a 37°C. Después de la reacción enzimática, el producto se aplicó a una columna de QAE-sepharose. La columna se lavó con 10 fracciones de 1 ml de Tris 2 mM (pH 8), 5 fracciones de 1 ml de tampón de Tris que contiene NaCl 20 mM y 5 fracciones de 1 ml de tampón de Tris que contiene NaCl 70 mM. Las partes alícuotas procedentes de cada fracción se analizaron usando HPLC Dionex junto con patrones de lactosa y a2,6-sialil-lactosa. Los perfiles de oligosacáridos de los patrones y una de las fracciones eluidas se muestran en las Figuras 60 (A-D). También se analizaron las fracciones que contenían a2,6-sialil-lactosa-maleimida y se conformaron mediante MALDI-TOF. El glucano en una de las fracciones se puede observar en la Figura 61.

La cantidad de a2,6-sialil-lactosa-maleimida purificada se estimó a continuación usando análisis de cuantificación de ácido siálico que indicaba una recuperación de ~1,5 mg de sialil-lactosa-maleimida. Una vez que se preparaba el glucano, la conjugación de anticuerpo bien con a2,6-sialil-lactosa-maleimida o bien a2,3-sialil-lactosa-maleimida se probó usando química de tiol. Un anticuerpo IgG policlonal de conejo (1 mg) se intercambió con tampón y se redujo con TCEP en un exceso molar de 4 (sobre el anticuerpo) durante 2 h a 37°C. A continuación, el anticuerpo reducido se dividió por la mitad: una porción se conjugó a un exceso molar de 24 de a2,6-sialil-lactosa-maleimida, y la otra a a2,3-sialil-lactosa-maleimida durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, los dos conjugados se intercambiaron con tampón en PBS antes del análisis por SDS-PAGE (Figura 62A) y la cuantificación de ácido siálico usando HPLC Dionex (Figura 62B). La cuantificación de ácido siálico se se usó para estimar el número de glucano conjugado. Partes alícuotas del anticuerpo de control y el anticuerpo conjugado a tiol se trataron con o sin sialidasa (1 U por mg) durante la noche a 37°C antes de que los sobrenadantes se recuperaran a través de filtración (MWCO 10 kDa). El contenido de ácido siálico de los sobrenadantes se midió y se comparó con muestras tratadas sin sialidasa (control). El análisis demostraba que aproximadamente 7 glucanos (glucanos bien de a2,3 o bien de a2,6-sialil-lactosa) se conjugaban al anticuerpo policlonal por este método.

Ejemplo 23. PEGilación de NNAS usando química de GAM

Un anticuerpo monoclonal mutante NNAS de ratón (S298N/T299A/Y300S) se galactosiló y desialiló, generando un anticuerpo monoclonal Gal NNAS sin ninguna degradación por proteasa. Este anticuerpo se modificó con galactosa o x id a s a (G A O ) pa ra g e n e ra r a ld e h id o de g a la c to sa . A c o n tin u a c ió n , e l a ld e h id o de g a la c to s a se co n ju g ó con 2 o 5 ^{kD a de a m in o o x ip o lie tile n g lico l (P E G ). La} Figura 63 ^{rep rod uce la ca ra c te r iza c ió n de a n ticu e rp o s de con tro l y m u tan tes}N N A S m o d ifica d o e n z im á tica m e n te (d e s ia lila d o /g a la c to s ila d o ) u sa nd o S D S -P A G E y tra n s fe re n c ia de lectina . La Figura 64 ^{rep rod uce la ca ra c te r iza c ió n a tra vé s de S D S -P A G E re d u c to ra de la P E G ilac ión de un an ticu e rp o de con tro l}y G al N N A S con d ive rsa s ca n tid a d e s de g a la c to s a ox ida sa . E stos resu ltad os d e m u e s tra n q u e G al N N A S se puede ^{P E G ila r e fica zm e n te con c a n tid a d e s s ig n ifica tiva s de m ono-, b i- y tr i-P E G co n ju g a d o s po r ca d e n a pe sad a . La} Figura 66 ^{rep rod uce la ca ra c te riza c ió n a tra vé s de S D S -P A G E red u c to ra de la P E G ila c ió n de un a n ticu e rp o de c o n tro l y G al}N N A S con d ive rso e xce so m o la r de PEG sob re el a n ticue rpo . B a rrido s con P ro te inS im p le que ca ra c te riza n la P E G ilac ión de los an ticu e rp o s d e m u e s tra n q u e a p ro x im a d a m e n te 1 ,5 -1 ,7 res tos de PEG se c o n ju g a n p o r ca d e n a ^{p e sa d a (o a p ro x im a d a m e n te 3 -3 ,4 PEG p o r a n ticu e rp o )} (Figuras 65 ^y 67).

Ejemplo 24. PEGilación de NNAS usando química de GAM

Un an ticu e rp o N N A S se g a la c to s iló con 50 m U /m g de g a la c to s iltra n s fe ra s a y p o s te rio rm e n te se d e s ia liló con 1 U /m g de s ia lid a sa en ta m p ó n de M E S 50 m M (pH 6,5 ). A c o n tin u a c ió n , fe tu ín a d e s ia lila d a y N N A S a s í co m o N N A S g a la c to s ila d o se tra ta ro n con g a la c to s a o x id a sa 57 m U /m g )/ca ta la sa en p re se n c ia o a u se n c ia de a ce ta to de co b re 0,5 ^{m M an tes de la c o n ju g a c ió n con un e xce so m o la r de 25 de am ino x i-P E G de 5 kD a} (Figura 69A). ^{En o tro e xp e rim e n to ,}se tra tó N N A S g a la to s ila d o con g a la c to s a o x id a s a (57 m U /m g )/ca ta la sa en p re se n c ia de a ce ta to de co b re 0, 0 ,02, 0,1 ^{y 0 ,5 m M an tes de la co n ju g a c ió n con un exce so m o la r de 25 de am ino x i-P E G de 5 kD a} (Figura 69B). ^{El an ticue rpo}o x id a d o con g a la c to sa o x id a sa en p re se n c ia de a ce ta to de co b re m o s tra b a un g ra d o s u p e rio r de P E G ilac ión q u e el m ism o an ticu e rp o hecho re a cc io n a r con g a la c to s a o x id a sa en a u se n c ia de ace ta to de cob re . De m a n e ra s ig n ifica tiva , se o b se rva b a n n ive les su p e rio re s de P E G ilac ión cu a n d o la co n ju g a c ió n se rea liza b a en u n a reacc ión q u e co n te n ía su lfa to de co b re en c o n ce n tra c io n e s p o r e n c im a de 0,1 mM.

Ejemplo 25. Modificación de Herceptin silvestre y mutante usando sialidasa/galactosiltransferasa

A n ticu e rp o s de H e rcep tin s ilve s tre s y m u tan tes (A 114N , N N A S y A 114 N /N N A S ) se m od ifica ro n e n z im á tica m e n te con 50 m U /m g de g a la c to s iltra n s fe ra s a y p o s te r io rm e n te se d e s ia lila ro n con 1 U /m g de s ia lid a s a en ta m p ó n de M ES 50 m M (pH 6,5 ). Los a n ticu e rp o s m o d ifica d o s se an a liza ro n u sa nd o S D S -P A G E (re d u c to ra y no red uc to ra ), tra n s fe re n c ia de le c tin a con EC L (una le c tin a v e g e ta l e s p e c ífic a p a ra g a la c to s a te rm in a l) y cu a n tif ica c ió n de g a la c to sa te rm in a l ^{u sa nd o an á lis is p o r H P LC D ionex de g a la c to s a lib e ra d a po r g a la c to s id a s a} (Figura 70). ^{S e ob tu v ie ro n an ticue rpos}m o d ifica d o s e n z im á tic a m e n te qu e co n te n ía n a p ro x im a d a m e n te de tre s a nueve g a la c to sa s te rm in a le s con los m u ta n te s N N A S y N N A S /A 114 N do b le d e m o s tra n d o un n ive l s u p e rio r de g a la c to sa te rm in a l que el s ilve s tre y el m u tan te A 114N .

Ejemplo 26. PEGilación de anticuerpos silvestres y mutantes usando el método de conjugación SAM

A n ticu e rp o s de H e rcep tin s ilves tres y m u tan tes (A 114N , N N A S y A 114 N /N N A S ) se P E G ila ron u sa nd o con ju g a c ió n m e d ia d a p o r ác ido s iá lico (S A M ). P os te rio rm e n te , los a n ticu e rp o s se ox id a ro n con p e ryo d a to 2 m M . D e spu és del in te rca m b io con ta m p ó n , los a n ticu e rp o s o x id a d o s se P E G ila ron con un e xce so m o la r de 25 de am ino x i-P E G de 5 ^{kD a. El co n te n id o de ác ido s iá lico de los a n ticu e rp o s s ilve s tre s y m u tan tes se m id ió u sa nd o H P LC D ionex} (Figura 71).

^{A c o n tin u a c ió n , los a n ticu e rp o s P E G ila do s se a n a liza ro n u sa nd o S D S -P A G E re d u c to ra y no re d u c to ra} (Figura 72).

A de m ás , la P E G ila c ió n (P A R , nú m ero de PEG p o r an ticu e rp o ) se e s tim ó al a n a liza r los ge le s b a rrid o s usa nd o ^{P ro te inS im p le} (Figura 73). ^{Los m u ta n te s N N A S , A 114N y A 114 N /N N A S m uestran to d o s un PAR s u p e rio r (2 ,7 -4 ,6 )}qu e los a n ticu e rp o s de H e rcep tin s ilves tres (1 ,4).

Ejemplo 27. Investigación de la captación de anticuerpos glucomanipulados con ligandos de glucano que contiene galactosa

Un a n ticu e rp o po lic lo n a l b ien se m od ificó e n z im á tic a m e n te con g a la c to s iltra n s fe ra s a (G al T ra n s fe ra sa ), b ien se co n ju g ó a la c to sa -a m in o x i (G a l-G lc ha s ta 297 : se co n ju g ó a ác ido s iá lico en g lu ca n o s a p a rtir de A sn -297 de an ticue rpo s ia lila d o ) o b ien se co n ju g ó a la c to sa -m a le im id a (G a l-G lc ha s ta b isag ra : se co n ju g ó a c is te ín a s en d isu lfu ro s de b isag ra ). Los a n ticu e rp o s de con tro l, m o d ifica d o s o co n ju g a d o s se in cubaron a co n tin u a c ió n con cé lu la s H e pG 2 (una líne a c e lu la r de h e p a to c ito s que e xp re sa A S G P R ) d u ra n te 1-2 h a 37°C an tes de q u e los a n ticu e rp o s ca p ta d o s se ^{m id ie ran u sa nd o tin c ió n p o r in m u n o flu o re s c e n c ia} (Figura 74). ^{Los resu ltad os m os trab an un in c re m e n to de la cap tac ió n}de cé lu la s H e pG 2 de a n ticu e rp o s m o d ifica d o s e n z im á tic a m e n te o co n ju g a d o s a lac tosa .

Ejemplo 28. Conjugación de un glucano GalNAc trivalente a Herceptin

^{H e rcep tin (an ti-H e r2 ) se s ia liló y co n ju g ó con un g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te} (Figura 75) ^{p a ra o rie n ta rse a A S G P R}u sa n d o e l m é tod o de c o n ju g a c ió n SA M . P os te rio rm e n te , se usa ron e xp e rim e n to s de re so n a n c ia p la sm ó n ica sup e rfic ia l (B ia co re ) p a ra v a lo ra r la un ión de e s to s a n ticu e rp o s co n ju g a d o s a g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te a la su b un ida d HI de ^{A S G P R} (Figura 76).

Ejemplo 29. Conjugación de glucano GalNAc trivalente y glucopéptido que contiene galactosa trivalente a una enzima lisosómica recombinante

U na e n z im a liso só m ica re co m b in a n te se co n ju g ó b ien con g lu ca n o G a lN A c tr iv a le n te o b ien con g lu co p é p tid o s que ^{co n tie n e n g a la c to s a tr iva le n te s} (Figura 77) ^{p a ra o rie n ta rse a A S G P R u sa n d o e l m é tod o de c o n ju g a c ió n SA M .}P os te rio rm e n te , se usa ron e xp e rim e n to s de re so n a n c ia p la sm ó n ica su p e rfic ia l (B ia co re ) pa ra v a lo ra r la un ió n de es ta s e n z im a s co n ju g a d a s a g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te y co n ju g a d a s a g lu co p é p tid o q u e co n tie n e g a la c to s a tr iv a le n te a la ^{su b u n id a d H1 de A S G P R} (Figura 78). ^{Los resu ltad os m os trab an u n a un ión fu e rte a A S G P R de la e n z im a liso só m ica re co m b in a n te s c o n ju g a d a a g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te . Las} Figuras 79(A-D) ^{m ue stra n un nú m ero de res tos G a lN A c}tr iv a le n te s e je m p la re s . S e m ue s tra n e je m p lo s qu e no tie n e n esp a c ia d o r, un e s p a c ia d o r de 12 Á, un e s p a c ia d o r de 1 kD a (a p ro x im a d a m e n te 80 Á ) y ta n to un e s p a c ia d o r de -20 Á c o m o un e s p a c ia d o r de 1 kD a (a p ro x im a d a m e n te 80 Á). U na s e g u n d a e n z im a liso só m ica re co m b in a n te (rhG A A ) ta m b ié n se co n ju g ó con g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te C 12. La Figura 80 m u e s tra u n a g rá fica q u e re p re se n ta los resu ltad os de la co n ju g a c ió n de e n z im a liso só m ica reco m b in an te rhG A A o x id a d a con p e ryo d a to con un e xce so de g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te C 12. El g lu ca n o po r G A A co n ju g a d o ^{resu lta n te se re p re se n ta con un e xce so de m o la r de g lu ca n o de 20, 40, 80 y 200 ve c e s sob re e l rhG A A . La} Figura 81 re p ro d u ce la un ión a A S G P R de e n z im a s liso só m ica s re co m b in a n te s co n ju g a d a s con g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te C12 so b re B iacore . Las e n z im a s co n ju g a d a s con un e xce so de 20 (co n ju g a d o 1), 40, 80, y 200 ve ce s (co n ju g a d o 4) de g lu ca n o m ue s tra n to d a s u n a un ión fu e rte a la su b u n id a d 1 de A S G P R . No e x is te u n a d ife re n c ia s ig n ifica tiva en la un ión e n tre los co n ju g a d o s (con ju g a d o s 1 a 4).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un p o lip é p tid o de un ión que co m p re n d e al m e n o s un g lu ca n o m od ifica do , do nd e el g lu ca n o c o m p re n d e al m enos un res to de F ó rm u la (IV):

d o n d e :

A ) Q es NH u O;

B) C O N es un resto con ec to r;

C) X es un res to o r ie n ta d o r que se une a u n a cé lu la , do n d e el res to o r ie n ta d o r es un resto de g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te o un g lu co p é p tid o trig a la c to s ila d o ;

D ) G a l es un res idu o de g a la c to sa ; y

E ) S ia es un res to de á c id o s iá lico ;

do n d e el g lu ca n o c o m p re n d e al m en os un resto de la s ig u ie n te fó rm u la e s truc tu ra l:

2. El p o lip é p tid o de un ión según la re iv in d ica c ió n 1, d o n d e el res to o r ie n ta d o r se une a un re ce p to r de le c tin a tipo C o a un re ce p to r de a s ia lo g lu c o p ro te ín a (A S G P R ).

3. El p o lip é p tid o de un ión seg ún la re iv in d ica c ió n 1, do n d e el po lip é p tid o de un ión es in te rn a liza d o p o r la cé lu la , y do n d e la ca n tid a d de l p o lip é p tid o de un ión in te rn a liza d o po r la cé lu la es m a yo r q u e la ca n tid a d de un po lip é p tid o de un ión de re fe re n c ia que ca re ce de un res to o r ie n ta d o r in te rn a liza d o p o r la cé lu la .

4. El p o lip é p tid o de un ión seg ún la re iv in d ica c ió n 1, do n d e el res to o r ie n ta d o r es un g lu co p é p tid o tr ig a la c to s ila d o .

5. El p o lip é p tid o de un ión seg ún la re iv in d ica c ió n 4, d o n d e el g lu c o p é p tid o tr ig a la c to s ila d o es un res to de lactosa3-C ys ³G ly ⁴.

6. El p o lip é p tid o de un ión según la re iv ind ica c ión 4, d o n d e el g lu ca n o m o d ifica d o co m p re n d e un res to s e le cc io n a d o de l g ru p o q u e co n s is te en:

a) un res to re p re se n ta d o po r la F ó rm u la V:

[F ó rm u la V ];

b) un res to de la s ig u ie n te fó rm u la e s truc tu ra l:

y

c) un resto de la s ig u ie n te fó rm u la es truc tu ra l:

7. El p o lip é p tid o de un ión según la re iv in d ica c ió n 1, do n d e el res to o rie n ta d o r es un res to de g lu ca n o G a lN A c triva len te .

8. El p o lip é p tid o de un ión según la re iv ind ica c ión 7, d o n d e el g lu ca n o m od ifica do c o m p re n d e un res to se le cc io n a d o de l g ru po qu e co n s is te en:

a) un res to de g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te co m o el re p re se n ta d o po r la F ó rm u la V III:

[F ó rm u la V III], do nd e q es un nú m ero e n te ro e n tre 1 y 29 inc lus ive ;

b) un res to qu e tie n e la s ig u ie n te fó rm u la e s truc tu ra l:

d o n d e q es un nú m ero e n te ro e n tre 1 y 29 inc lus ive ;

c) un resto que tie n e la s ig u ie n te fó rm u la e s truc tu ra l:

d o n d e q es un n ú m ero e n te ro en tre 1 y 29 inc lus ive ;

d) un res to de g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te co m o el rep re se n ta d o po r la F ó rm u la V II:

[F ó rm u la V II];

e) un res to de g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te co m o el rep re se n ta d o po r la F ó rm u la X III:

[F ó rm u la X III];

f) un res to de g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te com o el re p re se n ta d o po r la F ó rm u la X IV :

[F ó rm u la X IV ];

g) un res to qu e tie n e la s ig u ie n te fó rm u la e s truc tu ra l:

h) un res to qu e tie n e la s ig u ie n te fó rm u la e s truc tu ra l:

i) un resto que tien e la s ig u ie n te fó rm u la e s truc tu ra l:

j) un resto que tien e la s ig u ie n te fó rm u la e s truc tu ra l:

k) un resto que tien e la s ig u ie n te fó rm u la e s truc tu ra l:

y

l) un res to que tien e la s ig u ie n te fó rm u la e s truc tu ra l:

9. El p o lip é p tid o de un ión según una c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s p re ced en te s , do n d e se cu m p le n una o m ás de las s ig u ie n te s co n d ic io n e s :

a) e l p o lip é p tid o de un ión co m p re n d e un d o m in io Fc, do n d e el d o m in io Fc es o p c io n a lm e n te hum ano ;

b) e l p o lip é p tid o de un ión co m p re n d e un d o m in io C H 1 ;

c) el res to co n e c to r c o m p re n d e un e n la z a d o r se n s ib le al pH , un e n la za d o r de d isu lfu ro , un e n la za d o r se n s ib le a en z im a s u o tro res to e n la za d o r esc ind ib le ;

d) el res to c o n e c to r co m p re n d e un res to e n la z a d o r s e le cc io n a d o de l g ru po q u e co n s is te en los res tos en la za d o re s re p re se n ta d o s en la T a b la 2 y 14; y

e) e l p o lip é p tid o de un ión es un a n ticu e rp o o una in m un oad he s ina .

10. El p o lip é p tid o de un ión seg ún la re iv in d ica c ió n 9, do n d e el g lu ca n o m o d ifica d o e s tá e n la zado po r N al p o lip ép tido de un ión a tra vé s de un res iduo de a s p a ra g in a en la po s ic ió n de a m in o á c id o 297 de l d o m in io Fc, seg ún la n u m era c ión de EU, o do n d e el g lu ca n o m o d ifica d o e s tá e n la za d o po r N al p o lip é p tid o de un ión a tra vé s de un res idu o de a sp a ra g in a en la po s ic ió n de a m in o á c id o 298 de l d o m in io Fc, según la nu m e ra c ió n de EU.

11. El p o lip é p tid o de un ión seg ún la re iv in d ica c ió n 9, do n d e el g lu ca n o m o d ifica d o e s tá e n la zado po r N al po lip é p tid o de un ión a tra vé s de un res idu o de a sp a ra g in a en la po s ic ió n de a m in o á c id o 114 de l d o m in io C H 1, seg ún la nu m era c ión de K aba t.

12. Un m étod o p a ra e la b o ra r e l p o lip é p tid o de un ión según u n a cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s p re ced en te s , c o m p re n d ie n d o el m é tod o ha ce r re a cc io n a r un res to e fe c to r de F ó rm u la (I):

N H ²-Q -C O N -X F ó rm u la (I),

do nd e :

A ) Q es NH u O ;

B) C O N es un resto co n e c to r; y

C) X es un res to o r ie n ta d o r que se une a u n a cé lu la , do n d e el res to o r ie n ta d o r es un resto de g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te o un g lu co p é p tid o tr ig a la c to s ila d o ,

con un p o lip é p tid o de un ión p re cu rso r que co m p re n d e un g lu ca n o ox ida do .

13. El m é tod o seg ún la re iv ind ica c ión 12, do n d e se cu m p le n u n a o m ás de las s ig u ie n te s co n d ic io n e s :

a) e l p o lip é p tid o de un ión in ic ia l c o m p re n d e al m en os un resto de la s ig u ie n te fó rm u la e s truc tu ra l:

b) e l p o lip é p tid o de un ión in ic ia l c o m p re n d e al m en os un resto de la s ig u ie n te fó rm u la e s truc tu ra l:

c) el p o lip é p tid o de un ión p re cu rso r co m p re n d e un g lu ca n o o x id a d o c o m p re n d e al m en os un resto de la s ig u ie n te fó rm u la es truc tu ra l:

“ I-G al—Sia— C=0

H •

d) el p o lip é p tid o de un ión p re cu rso r co m p re n d e un g lu ca n o o x id a d o c o m p re n d e al m en os un res to de la s ig u ie n te fó rm u la es truc tu ra l:

y

e) el p o lip é p tid o de un ión p re cu rso r que co m p re n d e un g lu ca n o o x id a d o se g e n e ra al h a ce r re a cc io n a r un p o lip é p tid o de un ión in ic ia l qu e c o m p re n d e un g lu ca n o con un a g e n te su a ve m e n te ox ida n te ,

o p c io n a lm e n te do n d e el a g en te su a ve m e n te o x id a n te es pe ryo d a to sód ico ,

d o n d e se e m p le a m enos de 1 m M de p e ryo d a to sód ico , o

d o n d e el a g en te s u a ve m e n te o x id a n te es pe ryo d a to o g a la c to s a ox ida sa .

14. El m é tod o según la re iv ind ica c ión 12, que c o m p re n d e ha ce r re a cc io n a r un res to e fe c to r de la s ig u ie n te fó rm u la e s tru c tu ra l:

N H ²-O -C O N -X

con el p o lip é p tid o de un ión p re cu rso r que co m p re n d e un g lu ca n o o x id a d o que co m p re n d e al m en os un res to de la s ig u ie n te fó rm u la e s tru c tu ra l:

p a ra fo rm a r un p o lip é p tid o de un ión de la s ig u ie n te fó rm u la e s tru c tu ra l:

15. El m é tod o seg ún la re iv ind ica c ión 13, do n d e la e ta p a de rea cc ió n se e fe c tú a en p re se n c ia de una sal que co m p re n d e un ion m e tá lico , o p c io n a lm e n te do nd e

el ion m e tá lico es un ion cob re ,

la sa l es ace ta to de cob re , o

la sa l co m p re n d e un ion m e tá lico p re sen te en una co n ce n tra c ió n de al m en os 0,1 mM.

16. El m é tod o seg ún u n a c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 12-15 , do n d e el p o lip é p tid o de un ión q u e c o m p re n d e el g lu ca n o co m p re n d e uno o d o s res idu os de ác ido s iá lico te rm in a le s , o p c io n a lm e n te do nd e el uno o dos res idu os de ác ido s iá lico te rm in a le s se in tro du cen m ed ia n te el tra ta m ie n to de l po lip é p tid o de un ión con una s ia liltra n s fe ra s a o una c o m b in a c ió n de s ia liltra n s fe ra s a y g a la c to s iltra n s fe ra sa .

17. U na co m p o s ic ió n q u e co m p re n d e un po lip é p tid o de un ión según una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s p re ce d e n te s y un p o rta d o r o e xc ip ie n te fa rm a cé u tica m e n te ace p tab le , o p c io n a lm e n te do n d e la re lac ión de res to o r ie n ta d o r a p o lip é p tid o de un ión es al m en os a p ro x im a d a m e n te 2 o igua l a o m a yo r de a p ro x im a d a m e n te 4.

18. U na c o m p o s ic ió n seg ún la re iv in d ica c ió n 17, p a ra el uso com o un m ed ica m e n to .

19. Un p o lip é p tid o de un ión q u e co m p re n d e al m e n o s un g lu ca n o m o d ifica d o q u e c o m p re n d e al m en os un res to de F ó rm u la (IV):

d o n d e :

A ) Q es NH u O;

B) C O N es un resto con ec to r;

C) X es un res to o r ie n ta d o r que se une a una cé lu la , do n d e el res to o r ie n ta d o r c o m p re n d e un res to de g lu ca n o G a lN A c tr iva le n te o un g lu co p é p tid o tr ig a la c to s ila d o y co m p re n d e a d e m á s PEG ;

D) G a l es un res to de g a la c to sa ; y

E) S ia es un res to de á c ido s iá lico .

20. El po lip é p tid o de un ión seg ún la re iv in d ica c ió n 19, do nd e se cu m p le n u n a o m ás de las s ig u ie n te s co n d ic io n e s :

a) e l g lu ca n o co m p re n d e al m en os un res to re p re se n ta d o po r la F ó rm u la IX o la F ó rm u la XI:

[F ó rm u la IX], do n d e p tie n e un v a lo r de 1 a 32 ; o

[F ó rm u la X I], do n d e p tie n e un v a lo r de 1 a 32 ;

b) e l g lu ca n o co m p re n d e al m en os un res to s e le cc io n a d o de las s ig u ie n te s fó rm u la s e s tru c tu ra le s :

d o n d e p tien e un v a lo r de 1 a 32 ;

d o n d e p tien e un v a lo r de 1 a 32 ;

d o n d e p tien e un v a lo r de 1 a 32 ; o

d o n d e p tien e un v a lo r de 1 a 32 ;

c) e l resto o r ie n ta d o r co m p re n d e PEG y e s tá re p re se n ta d o po r la F ó rm u la X o la F ó rm u la X II:

o

d) el g lu ca n o co m p re n d e al m en os un res to s e le cc io n a d o de las s ig u ie n te s fó rm u la s e s tru c tu ra le s :

o

e) el PEG c o m p re n d e m on o -P E G , b i-P E G o tri-P E G , d o n d e el PEG c o m p re n d e o p c io n a lm e n te de 3 a 3 ,5 PEG ; y

f) el p o lip é p tid o de un ión es un a n ticu e rp o o u n a in m un oad he s ina .

21. Un m é tod o p a ra e la b o ra r un p o lip é p tid o de un ión P E G ila do seg ún la re iv in d ica c ió n 19 o 20, d o n d e el m é todo c o m p re n d e :

(a ) ha ce r re a cc io n a r un p o lip é p tid o de un ión q u e co m p re n d e al m en os un g lu ca n o con un a g en te su a ve m e n te o x id a n te en p re se n c ia de una sal q u e c o m p re n d e un ion m e tá lico p a ra g e n e ra r un po lip é p tid o de un ión ox id a d o q u e c o m p re n d e al m en os un g lu ca n o o x ida do , y

(b ) c o n ju g a r el po lip é p tid o de un ión o x id a d o con al m en os un res to q u e co m p re n d e PEG , g e n e ra n d o de ese m odo el p o lip é p tid o de un ión P E G ilado .

22. El m é tod o seg ún la re iv ind ica c ión 21, do n d e se cu m p le n u n a o m ás de las s ig u ie n te s co n d ic io n e s :

a) e l ion m e tá lico es un ion cob re ;

b) la sa l es a ce ta to de cob re ;

c) la sa l que co m p re n d e un ion m e tá lico e s tá p re se n te en una c o n ce n tra c ió n de al m en os 0,1 m M ;

d) el a g e n te su a ve m e n te o x id a n te es p e ryod a to o x id a s a o g a la c to s a o x id a sa ; y

e) e l a l m en os un g lu ca n o es un g lu ca n o m od ifica do .

23. El p o lip é p tid o de un ión seg ún la re iv ind ica c ión 1 o 19, do n d e el resto c o n e c to r co m p re n d e un res to en la za d o r se le cc io n a d o de l g ru p o que co n s is te en:

d o n d e R 1-R 5 se se le cc io n a n c a d a uno in d e p e n d ie n te m e n te de un g ru p o qu e co n s is te en: H, un res to a lqu ilo o un resto arilo .