RS67352B1 - Glikoinženjering ciljnih delova molekula na određenom mestu - Google Patents

Glikoinženjering ciljnih delova molekula na određenom mestu

Info

Publication number
RS67352B1
RS67352B1 RS20251071A RSP20251071A RS67352B1 RS 67352 B1 RS67352 B1 RS 67352B1 RS 20251071 A RS20251071 A RS 20251071A RS P20251071 A RSP20251071 A RS P20251071A RS 67352 B1 RS67352 B1 RS 67352B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
molecule
antibody
binding
binding polypeptide
domain
Prior art date
Application number
RS20251071A
Other languages
English (en)
Inventor
Luis Avila
Clark Pan
Huawei Qiu
Qun Zhou
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of RS67352B1 publication Critical patent/RS67352B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2893—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD52
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

[0001] Opis
[0002] POZADINA PRONALASKA
[0004] Upotreba specifičnih antitela za lečenje ljudi i životinja moćan je alat koji se pokazao veoma efikasnim u lečenju mnogih stanja i poremećaja. Međutim, postoji velika potražnja za efikasnijim ciljanim terapijama, posebno onima koje su specifične za cilj, sa većom efikasnošću i širim terapijskim prozorima. Jedan od ovih tretmana specifičnih za cilj koristi konjugate antitela i efektorskog dela molekula, u kojima ciljni deo molekula usmerava specifično antitelo ka željenom mestu lečenja. Ovi molekuli su pokazali poboljšani terapijski indeks - veću efikasnost i/ili niže profile toksičnosti u odnosu na neciljano antitelo u kliničkom okruženju. Ipak, razvoj takvih terapija može biti izazovan, budući da mnogi faktori, uključujući fizička i/ili strukturna svojstva samog antitela, kao i stabilnost veze, mogu imati značajan uticaj na specifičnost za cilj (npr. tumor), čime se smanjuje efikasnost. Uz visoko nespecifično vezivanje i nisku stabilnost u cirkulaciji, konjugat antitela i efektorskog dela molekula se obično uklanja kroz normalna tkiva pre nego što stigne do ciljnog mesta. Štaviše, konjugati antitela i efektorskog dela molekula sa značajnim subpopulacijama visokog opterećenja lekom mogu generisati agregate koji bi bili eliminisani od strane makrofaga, što bi dovelo do kraćeg poluživota. Stoga, postoji sve veća potreba za kritičnom kontrolom i poboljšanjem procesa, kao i za sprečavanjem komplikacija, kao što su agregacija antitela i nespecifična toksičnost posredovana antitelima.
[0006] [0002] Iako konjugati antitela i efektorskog dela molekula generisani prema sadašnjim metodama mogu biti efikasni, razvoj takvih terapija je izazovan, jer su heterogene smese često posledica korišćenih hemijskih procesa konjugacije. Na primer, konjugacija efektorskog dela molekula sa lizinskim reziduama antitela je komplikovana zbog činjenice da u antitelu postoji mnogo lizinskih rezidua (~30) dostupnih za konjugaciju. Budući da je optimalan broj konjugovanog efektorskog dela molekula u odnosu na antitelo (DAR) mnogo manji da bi se smanjio gubitak funkcije antitela (npr. oko 4:1), konjugacija lizina često stvara veoma heterogen profil. Nadalje, mnogi lizini se nalaze na ključnim mestima vezivanja antigena u CDR regionu, a konjugacija leka može dovesti do smanjenja afiniteta antitela. Konjugacija posredovana tiolom uglavnom cilja osam cisteina uključenih u disulfidne veze šarki. Međutim, i dalje je teško predvideti i identifikovati koja četiri od osam cisteina su konzistentno konjugovana među različitim preparatima. U novije vreme, genetski inženjering slobodnih cisteinskih rezidua omogućio je konjugaciju specifičnu za mesto sa hemijskim procesima na bazi tiola, ali takve veze često pokazuju veoma promenljivu stabilnost, pri čemu se linker podvrgava reakcijama razmene sa albuminom i drugim molekulima seruma koje sadrže tiol. Stoga bi strategija konjugacije specifične za mesto, koja generiše konjugat antitela sa definisanim mestom konjugacije i stabilnom vezom, bila korisna za omogućavanje konjugacije efektorskog dela molekula uz minimiziranje štetnih efekata na strukturu ili funkciju antitela.
[0008] Metodu konjugacije leka sa antitelom na specifičnom mestu putem glikoinženjeringa opisao je Zhou et al. (Bioconjugate Chem. (2014) 25:510-520). Zhou et al. ne opisuju konjugaciju polipeptida sa ciljnim delom molekula koja se vezuje za ćeliju. Rachmawati et al., (Drug Metabolism and Disposition (2007) 35:814-821) opisuju da hemijska modifikacija Interleukina-10 sa grupama manoza-6-fosfata daje citokin selektivan za jetru. WO 2004/099231 opisuje metode glikopegilacije i proteine/peptide proizvedene tim metodama. Nijedan od ovih dokumenata ne otkriva konjugat za upotrebu u terapijskoj metodi kako je ovde opisano.
[0010] SAŽETAK PRONALASKA
[0012] Trenutno otkriće pruža vezujuće polipeptide (npr. antitela), i konjugate ciljnog dela molekula sa njima. Konjugati mogu obuhvatati glikansku vezu ciljnog dela molekula specifično stvorenu glikoinženjeringom unutar nativnih ili modifikovanih glikana vezujućeg polipeptida. Trenutno otkriće takođe pruža sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptide koji vezuju antigen, rekombinantne ekspresione vektore, i ćelije domaćina za proizvodnju takvih polipeptida. Takođe su predviđene metode korišćenja ovde otkrivenih polipeptida za lečenje bolesti.
[0014] Sadašnji pronalazak je izložen u priloženim patentnim zahtevima. Konkretno, pronalazak pruža konjugat koji se sastoji od vezujućeg polipeptida i efektorskog dela molekula za upotrebu u terapijskoj metodi olakšavanja isporuke vezujućeg polipeptida do ćelije, pri čemu efektorski molekul obuhvata ciljni molekul koji sadrži manoza-6-fosfat molekul koji se vezuje za manoza-6-fosfatni receptor na ćeliji, pri čemu je efektorski molekul konjugovan, bilo direktno ili preko linkera, za N-vezani i/ili oksidovani glikan vezujućeg polipeptida, a vezujući polipeptid je imunoadhezin, antitelo, fragment antitela koji vezuje antigen, ili varijanta antitela.
[0016] U jednom ostvarenju, konjugat obuhvata najmanje jedan modifikovani glikan koji se sastoji od najmanje jednog dela molekula formule (IV):
[0018] pri čemu:
[0020] 1. A) Q je NH ili O;
[0022] 2. B) CON je konektorski deo molekula;
[0024] 3. C) X je ciljni deo molekula;
[0026] 4. D) Gal je komponenta izvedena iz galaktoze; i
[0028] 5. E) Sia je komponenta izvedena iz sijalinske kiseline;
[0030] pri čemu je Sia prisutna ili odsutna, i pri čemu se ciljni deo molekula vezuje za ćeliju.
[0032] U jednom otelotvorenju, ćelija je ćelija sisara. U daljem otelotvorenju, ćelija je izabrana iz grupe koja obuhvata imunološku ćeliju, ćeliju jetre, tumorsku ćeliju, vaskularnu ćeliju, epitelnu ćeliju, ili mezenhimnu ćeliju. U još jednom otelotvorenju, ćelija je izabrana iz grupe koja obuhvata B-ćeliju, T-ćeliju, dendritičnu ćeliju, ćeliju prirodnog ubice (NK), makrofag, neutrofil, hepatocit, endotelijalnu ćeliju jetrenog sinusa ili hepatomsku ćeliju.
[0034] U jednom otelotvorenju, vezujući polipeptid je internalizovan od strane ćelije. U drugom otelotvorenju, količina vezujućeg polipeptida internalizovanog od strane ćelije veća je od količine referentnog vezujućeg polipeptida kome nedostaje ciljni deo molekula, a koji je internalizovan od strane ćelije.
[0035] Ciljni deo molekula obuhvata deo molekula manoza-6-fosfata (Man 6-P) koji se vezuje za manoza-6-fosfatni receptor na ćeliji.
[0037] Ciljni deo molekula se može vezati za Siglec na ćeliji. U daljem slučaju, Siglec je sialoadhezin (Siglec-1), CD22 (Siglec-2), CD33 (Siglec-3), MAG (Siglec-4), Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Siglec-12, Siglec-14, ili Siglec-15. U drugom slučaju, ciljni deo molekula obuhvata α2,3-, α2,6-, ili α2,8-vezani rezidu sijalinske kiseline. U daljem slučaju, ciljni deo molekula obuhvata α2,3-sialilaktozni deo molekula ili α2,6-sialilaktozni deo molekula.
[0039] Ciljni deo molekula se može vezati za C-tip lektinskog receptora, galektin, L-tip lektinskog receptora ili druge receptore za ugljene hidrate. U daljem slučaju, ciljni deo molekula se vezuje za DEC-205 (CD205; limfocitni antigen 75), makrofagni manoza receptor (MMR; CD206), Dectin-1, Dectin-2, C-tip lektin indukovan makrofagom (Mincle), neintegrin koji vezuje ICAM3 specifičan za dendritičnu ćeliju (DC-SIGN; CD209), DC NK lektinsku grupu receptor-1 (DNGR-1), Langerin (CD207), lektikan, asijaloglikoproteinski receptor (ASGPR), C-lektin receptor dendritični imunoreceptor (CLEC4A; CLECSF6; DCIR), makrofagni galaktoza-tip lektina (MGL), DC receptor, kolektin, selektin, NK-ćelijski receptor, multi-C-tip lektinske domene (CTLD) endocitni receptor, Reg grupa (tip VII) lektina, hondrolektin, tetranektin, policistin, atraktin (ATRN), bazni protein eozinofila (EMBP), gen 2 kritične regije DiGeorgeovog sindroma (DGCR2), trombomodulin, Bimlec, lektin grupe XVI (SEEC), ili lektin grupe XVII (CBCP/Frem1/QBRICK).
[0041] U jednom otelotvorenju, Q je O.
[0043] U jednom otelotvorenju, glikan obuhvata najmanje jedan deo molekula sledeće strukturne formule:
[0045]
[0048] U jednom otelotvorenju, ciljni deo molekula je glikopeptid.
[0049] U jednom otelotvorenju, vezujući polipeptid obuhvata Fc domen. U daljem otelotvorenju, modifikovani glikan je N-vezan za vezujući polipeptid preko asparaginskog rezidua na poziciji 297 Fc domena, prema EU numeraciji. U drugom otelotvorenju, modifikovani glikan je N-vezan za vezujući polipeptid preko asparaginskog rezidua na poziciji 298 Fc domena, prema EU numeraciji.
[0051] U jednom otelotvorenju, Fc domen je human. U drugom otelotvorenju, vezujući polipeptid obuhvata CH1 domen. U daljem otelotvorenju, modifikovani glikan je N-vezan za vezujući polipeptid preko asparaginskog rezidua na poziciji 114 CH1 domena, prema Kabat numeraciji.
[0053] U jednom otelotvorenju, konektorski deo molekula obuhvata pH-senzitivni linker, disulfidni linker, enzimski-senzitivni linker ili drugi rascepljivi linker. U jednom otelotvorenju, konektorski deo molekula obuhvata linker iz grupe prikazane u tabeli 2 ili 14.
[0055] U jednom otelotvorenju, vezujući polipeptid je antitelo ili imunoadhezin.
[0057] Konjugati za upotrebu u skladu sa pronalaskom mogu biti proizvedeni metodom koja obuhvata reagovanje efektorskog dela molekula formule (I):
[0059] NH<2>-Q-CON-X formula (I),
[0061] pri čemu:
[0063] 1. A) Q je NH ili O;
[0065] 2. B) CON je konektorski deo molekula; i
[0067] 3. C) X je ciljni deo molekula,
[0069] sa prekursorom vezujućeg polipeptida koji obuhvata oksidovani glikan.
[0070] U jednom otelotvorenju, početni vezujući polipeptid obuhvata najmanje jedan deo molekula sledeće strukturne formule:
[0072]
[0075] U jednom otelotvorenju, početni vezujući polipeptid obuhvata najmanje jedan deo molekula sledeće strukturne formule:
[0077]
[0080] U jednom otelotvorenju, prekursor vezujućeg polipeptida sa oksidovanim glikanom obuhvata najmanje jedan deo molekula sledeće strukturne formule:
[0082] U jednom otelotvorenju, prekursor vezujućeg polipeptida sa oksidovanim glikanom obuhvata najmanje jedan deo molekula sledeće strukturne formule:
[0084]
[0087] U jednom otelotvorenju, prekursor vezujućeg polipeptida sa oksidovanim glikanom se generiše reakcijom početnog vezujućeg polipeptida koji sadrži glikan sa blagim oksidacionim sredstvom. U daljem otelotvorenju, blago oksidaciono sredstvo je natrijum-periodat. U drugom otelotvorenju, ne koristi se više od 1mM natrijum-periodata. U drugom otelotvorenju, blago oksidaciono sredstvo je galaktoza-oksidaza.
[0088] Metoda može obuhvatiti reagovanje efektorskog dela molekula sledeće strukturne formule:
[0090] NH<2>-O-CON-X
[0092] sa prekursorom vezujućeg polipeptida koji sadrži oksidovani glikan, obuhvatajući najmanje jedan deo molekula sledeće strukturne formule:
[0094]
[0097] da se formira vezujući polipeptid sledeće strukturne formule:
[0099]
[0102] U jednom otelotvorenju, korak reakcije se sprovodi u prisustvu soli koja sadrži metalni jon. U daljem otelotvorenju, metalni jon je jon bakra. U jednom otelotvorenju, so je bakar-acetat. U drugom otelotvorenju, so koja sadrži metalni jon je prisutna u koncentraciji od najmanje 0,1 mM.
[0104] U drugom otelotvorenju, vezujući polipeptid koji sadrži glikan obuhvata jedan ili dva terminalna rezidua sijalinske kiseline. U daljem otelotvorenju, terminalni rezidui sijalinske kiseline se uvode tretiranjem vezujućeg polipeptida sa sijaliltransferazom ili kombinacijom sijaliltransferaze i galaktoziltransferaze. U jednom otelotvorenju, početni vezujući polipeptid je u kontaktu sa blagim oksidacionim sredstvom kako bi se proizveo prekursor vezujućeg polipeptida ili prekursor vezujućeg proteina. U jednom otelotvorenju, prekursor vezujućeg polipeptida ili prekursor vezujućeg proteina obuhvata oksidovani deo molekula sijalinske kiseline koji sadrži terminalni aldehid.
[0106] Konjugati za upotrebu u skladu sa pronalaskom mogu biti formulisani kao kompozicija koja obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent. U jednom otelotvorenju, odnos ciljnog dela molekula prema vezujućem polipeptidu je jednak ili veći od oko 4. U drugom otelotvorenju, odnos ciljnog dela molekula prema vezujućem polipeptidu je najmanje oko 2. U otelotvorenjima, kompozicija je za upotrebu u metodi za lečenje pacijenta kome je to potrebno.
[0108] U jednom otelotvorenju, efektorski deo molekula obuhvata PEG.
[0110] U jednom otelotvorenju, PEG deo molekula obuhvata mono-PEG, bi-PEG, ili tri-PEG. U drugom otelotvorenju, PEG deo molekula obuhvata 3 do 3,5 PEG. U drugom otelotvorenju, vezujući polipeptid je antitelo ili imunoadhezin.
[0112] U jednom otelotvorenju, vezujući protein obuhvata N-glikanski glikoform izabran iz grupe koja se sastoji od: G0 glikoforma, G1 glikoforma, i G2 glikoforma. U daljem otelotvorenju, N-glikanski glikoform je izabran iz grupe koja se sastoji od: G1S1 glikoforma, G2S1 glikoforma, G2S2 glikoforma, G1F glikoforma, G2F glikoforma, G1S1F glikoforma, G2S1F glikoforma, i G2S2F glikoforma.
[0114] KRATAK OPIS CRTEŽA
[0116] Prethodno navedene i druge karakteristike i prednosti sadašnjeg otkrića biće u potpunosti shvaćene iz sledećeg detaljnog opisa ilustrativnih otelotvorenja u vezi sa priloženim crtežima.
[0118] Slike 1 (A-C) su šematska ilustracija sinteze konjugata antitela i leka, gde je toksični deo molekula vezan za oksidovanu rezidu sijalinske kiseline glikana antitela koristeći oksimsku vezu. Slika 1A pprikazuje antitela sa ugljenim hidratima divljeg tipa (postojeći) na poziciji Asn297 i sa glikozilacionim mestima stvorenim inženjeringom na pozicijama 114 (prema Kabat numeraciji) i 298 (prema EU sistemu numeracije). Slika 1B prikazuje i kanonsku strukturu glikana G1F (levo, viđenu na poziciji Asn297 na antitelima prikazanim na slici 1A) i strukturu G2S1F (desno, viđenu na pozicijama Ala114 i Asn298 na antitelima prikazanim na slici 1A). Strukture glikana prikazane na slici 1B imaju nekoliko različitih podjedinica: beli kvadratni okviri predstavljaju (GlcNAc), obrnuti beli trougao predstavlja fukozu, beli krugovi predstavljaju manozu, osenčeni krugovi predstavljaju galaktozu, a osenčeni uspravni trougao predstavlja sijalinsku kiselinu. Slika 1C prikazuje pripremu konjugata prema trenutnom otkriću. Levo je početni vezujući protein sa Gal i Sia delom molekula. Nakon oksidacije sa NaIO4, sijalinski deo molekula se oksiduje da bi se formirao prekursor vezujućeg proteina, a zatim reaguje sa delom molekula koji sadrži toksin da bi se formirao vezujući peptid koji obuhvata najmanje jedan deo molekula formule IV.
[0120] Slika 2 je gel obojen Coomassie-plavom bojom koji prikazuje ekspresiju i prečišćavanje mutanata glikozilacije.
[0122] Slika 3 prikazuje rezultate eksperimenata sa površinskom plazmonskom rezonancom koji su korišćeni za procenu vezivanja αβTCR HEBE1 IgG mutanata antitela za rekombinantni humani FcγRIIIa (V158 & F158).
[0124] Slika 4 prikazuje rezultate eksperimenata sa površinskom plazmonskom rezonancom koji su korišćeni za procenu vezivanja αβTCR HEBE1 IgG mutanata antitela za rekombinantni humani FcγRI.
[0126] Slika 5 prikazuje profil oslobađanja citokina iz PBMC za TNFa, GM-CSF, IFNy i IL10 u prisustvu mutantnih anti-αβTCR antitela (dan 2).
[0128] Slika 6 prikazuje profil oslobađanja citokina iz PBMC za IL6, IL4 i IL2 u prisustvu mutantnih anti-αβTCR antitela (dan 2).
[0130] Slika 7 prikazuje profil oslobađanja citokina iz PBMC za TNFa, GM-CSF, IFNy i IL10 u prisustvu mutantnih anti-αβTCR antitela (dan 4).
[0132] Slika 8 prikazuje profil oslobađanja citokina iz PBMC za IL6, IL4 i IL2 u prisustvu mutantnih anti-αβTCR antitela (dan 4).
[0134] Slike 9 (A-B) prikazuju rezultate eksperimenata koji istražuju nivo ekspresije 2C3 mutanata Western blotting metodom (slika 9A) i površinskom plazmonskom rezonancom (slika 9B).
[0136] Slika 10 prikazuje rezultate eksperimenata koji istražuju glikozilaciju 2C3 mutanata pre i nakon tretmana sa PNGase F.
[0137] Slika 11 prikazuje rezultate SDS-PAGE eksperimenata koji istražuju glikozilaciona mesta na 2C3 mutantima izolovanim iz ćelijske kulture.
[0139] Slike 12 (A-C) prikazuju rezultate eksperimenata sa površinskom plazmonskom rezonancom koji su korišćeni za procenu vezivanja modifikovanog anti-CD52 za rekombinantni humani FcγRIIIa (V158). Anti-CD52 koji obuhvata S298N/Y300S mutacije u Fc domenu je korišćen za procenu efektorske funkcije modifikovanog dela molekula. vezivanje za CD52 peptid (slika 12A), vezivanje za FcγRIIIa (V158, slika 12B) i kontrolno vezivanje za mišji FcRn (slika 12C).
[0141] Slika 13 prikazuje rezultate eksperimenata sa površinskom plazmonskom rezonancom koji istražuju svojstva vezivanja Fc domena 2C3 mutanata.
[0143] Slike 14 (A-B) prikazuju rezultate eksperimenata sa površinskom plazmonskom rezonancom koji istražuju vezivanje modifikovanog anti-CD52 za FcγRIIIa (Val158) (kao gore) i FcγRIIIa (Phe158). Anti-CD52 antitela koja obuhvataju S298N/Y300S mutacije u Fc domenu su korišćena za procenu efektorske funkcije modifikovanog dela molekula, vezivanje za FcγRIIIa (Val158, slika 14A) i FcγRIIIa (Phe58, slika 14B).
[0145] Slike 15 (A-B) prikazuju analizu vezivanja C1q u S298N/Y300S mutantu i WT 2C3 kontroli (slika 15A) i rezultate Eliza analize koja potvrđuje ekvivalentno pokrivanje bunarčića (slika 15B).
[0147] Slika 16 prikazuje rezultate eksperimenata sa plazmonskom rezonancom koji mere kinetiku vezivanja 2C3 mutanata za CD-52 peptid 741.
[0149] Slika 17 prikazuje rezultate eksperimenata sa plazmonskom rezonancom koji porede afinitet vezivanja antigena WT anti-CD-522C3 i A114N hiperglikozilacionog mutanta.
[0151] Slike 18 (A-D) pikazuju rezultate eksperimenata sa izoelektričnim fokusiranjem i masenom spektrometrijom za karakterizaciju naboja, kako bi se odredio sadržaj glikana 2C3 mutanata.
[0153] Slike 19 (A-B) prikazuju rezultate eksperimenata sa koncentracijom (Octet) i plazmonskom rezonancom koji porede afinitet vezivanja antigena WT anti-CD522C3 i mutanata.
[0154] Slika 20 prikazuje rezultate SDS-PAGE eksperimenata da se demonstrira dodatna glikozilacija anti-TEM1 A114N mutanta.
[0156] Slika 21 prikazuje rezultate SDS-PAGE i analize hidrofobne interakcione hromatografije A114N anti-Her2 mutanta.
[0158] Slika 22 prikazuje rezultate SDS-PAGE eksperimenata da se demonstrira konjugacija PEG-a sa 2C3 A114N mutantom kroz aminooksidnu vezu.
[0160] Slika 23 prikazuje rezultate LC-MS eksperimenata da se odredi sadržaj glikana u anti-TEM1 A114N hiperglikozilacionom mutantu.
[0162] Slika 24 prikazuje rezultate LC-MS eksperimenata da se odredi sadržaj glikana u HER2 antitelu divljeg tipa i A114N anti-Her2 hiperglikozilacionom mutantu.
[0164] Slike 25 (A-C) prikazuju primer metode za izvođenje konjugacije antitela specifične za mesto.
[0166] Slika 26 prikazuje sintezu primeraka efektorskih delova molekula: aminooxy-Cys-MC-VC-PABC-MMAE i aminooxy-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10.
[0168] Slike 27 (A-C) prikazuju informacije o karakterizaciji sijalilovanog HER2 antitela.
[0170] Slike 28 (A-D) prikazuju informacije o karakterizaciji oksidovanog sijalilovanog anti-HER2 antitela.
[0172] Slika 29 prikazuje hidrofobne interakcione hromatografe glikokonjugata pripremljenih sa tri različita sijalilovana antitela sa dve različite aminooksidne grupe.
[0174] Slika 30 prikazuje HIC hromatograf antiHer2 A114 glikozilacionog mutantnog konjugata sa AO-MMAE pripremljenog korišćenjem GAM(+) hemije.
[0176] Slike 31 (A-D) prikazuju poređenje in vitro potencije anti-HER2 glikokonjugata i tiol konjugata.
[0177] Slika 32 prikazuje poređenje in vitro potencije anti-FAP B11 glikokonjugata i tiol konjugata.
[0179] Slike 33 (A-D) prikazuju poređenje in vivo efikasnosti anti-HER2 glikokonjugata i tiol konjugata u ksenograft modelu tumora Her2+ ćelijama.
[0181] Slika 34 prikazuje rezultate LC-MS eksperimenata da se odredi sadržaj glikana u mutantnom anti-αβTCR antitelu koje sadrži S298N/Y300S mutaciju.
[0183] Slika 35 prikazuje rezultate eksperimenata sa cirkularnim dihroizmom da se odredi relativna termalna stabilnost anti-αβTCR antitela divljeg tipa i mutantnog anti-αβTCR antitela koje sadrži S298N/Y300S mutaciju.
[0185] Slika 36 prikazuje rezultate testa o proliferaciji ćelija za ADC pripremljen sa anti-HER antitelom koje nosi A114N hiperglikozilacionu mutaciju i AO-MMAE.
[0187] Slika 37 je šematska ilustracija sinteze konjugata antitela i leka, gde je ciljni deo molekula vezan za oksidovanu rezidu sijalinske kiseline glikana antitela koristeći oksimsku vezu.
[0189] Slika 38 je šematska ilustracija koja prikazuje primer metode za izvođenje konjugacije antitela na specifičnom mestu sa glikopeptidom kroz oksimsku vezu prema opisanim metodama.
[0191] Slika 39 je šematska ilustracija koja prikazuje konjugaciju neoglikana na antitelu specifičnu za mesto kroz sijalinsku kiselinu u nativnim Fc glikanima.
[0193] Slika 40 je serija primeraka glikana koji se mogu koristiti za konjugaciju, uključujući laktozu aminooksid i bis Man-6-P (ili bisM6P) heksamanozu aminooksid (za aminooksidnu konjugaciju).
[0195] Slika 41 je šematski prikaz pripreme Man-6-P heksamanoze maleimida.
[0197] Slika 42 prikazuje SDS-PAGE i MALDI-TOF karakterizaciju Man-6-P heksamanoze aminooksid konjugata napravljenih sa poliklonalnim antitelom kunića.
[0198] Slika 43 prikazuje rezultate eksperimenata sa površinskom plazmonskom rezonancom koji su korišćeni za procenu vezivanja kontrolnih i Man-6-P heksamanoze konjugovanih IgG antitela kunića za Man-6-P receptor.
[0200] Slika 44 prikazuje apsorpciju Man-6-P konjugovanog IgG antitela kunića u HepG2 i RAW ćelijama.
[0202] Slika 45 prikazuje karakterizaciju kontrolnih, Man-6-P konjugovanih i laktoze konjugovanih antitela kroz SDS-PAGE i lektin blotting.
[0204] Slika 46 prikazuje rezultate MALDI-TOF analiza intaktnog proteina za kontrolna, Man-6-P konjugovana i laktoze konjugovana antitela.
[0206] Slika 47 prikazuje karakterizaciju poliklonalnog antitela konjugovanog sa Man-6-P heksamanozom maleimidom (tiol konjugacija na cisteinima šarki) kroz SDS-PAGE (nereducirajući i reducirajući), lektin blot (reducirajući) i kvantifikaciju Man-6-P.
[0208] Slika 48 prikazuje karakterizaciju poliklonalnog antitela konjugovanog sa laktozom maleimidom (tiol konjugacija na cisteinima šarki) kroz SDS-PAGE i kvantifikaciju galaktoze.
[0210] Slika 49 prikazuje karakterizaciju monoklonalnog antitela konjugovanog sa Man-6-P heksamanozom maleimidom (tiol konjugacija na cisteinima šarki) kroz SDS-PAGE (nereducirajući i reducirajući), i kvantifikaciju glikana (bis Man-6-P).
[0212] Slika 50 prikazuje rezultate analize hromatografije isključivanja po veličini (SEC) konjugata poliklonalnog antitela na cisteinima šarki.
[0214] Slika 51 prikazuje rezultate analize hromatografije isključivanja po veličini (SEC) konjugata monoklonalnog antitela na cisteinima šarki.
[0216] Slika 52 prikazuje rezultate titracije sijalidaze i kvantifikacije sijalinske kiseline da se odredi količina oslobođene sijalinske kiseline iz NNAS, sijalilovanog NNAS i desijalilovanog i galaktozilovanog NNAS antitela.
[0217] Slika 53 prikazuje rezultate MALDI-TOF MS analize da se odrede strukture glikana mišjeg NNAS antitela i desijalilovanog i galaktozilovanog NNAS antitela.
[0219] Slika 54 prikazuje rezultate MALDI-TOF MS analize da se odrede strukture glikana mišjeg NNAS antitela i sijalilovanog NNAS antitela.
[0221] Slika 55 prikazuje karakterizaciju Man-6-P receptora (CI-MPR) vezanog za poliklonalna i monoklonalna antitela konjugovana sa bis Man-6-P glikanom kroz nativni Fc glikan ili disulfidne veze šarki koristeći nativni PAGE.
[0223] Slika 56 prikazuje karakterizaciju NNAS antitela modifikovanih enzimom i konjugovanih sa glikopeptidom pomoću SDS-PAGE (4-12% NuPAGE; reducirajući i nereducirajući) i ECL lektin blotting (reducirajući).
[0225] Slika 57 prikazuje rezultate kvantifikacije terminalne galaktoze u NNAS antitelu, desijalilovanom/galaktozilovanoj NNAS antitelu i konjugovanom NNAS antitelu u molovima galaktoze ili molovima glikopeptida po molu antitela.
[0227] Slika 58 prikazuje ispitivanje laktoze maleimida koji je bio modifikovan alfa-2,3-sijaliltransferazom i eluiran iz QAE prečišćavajućih kolona sa 20 mM NaCl. Dobijeni eluat je okarakterisan korišćenjem MALDI-TOF MS i Dionex HPLC.
[0229] Slike 59 (A-B) prikazuju karakterizaciju poliklonalnog antitela kunića konjugovanog sa sialilaktozom maleimidom (tiolna reakcija) korišćenjem SDS-PAGE i Dionex HPLC (kvantifikacija sijalinske kiseline).
[0231] Slike 60 (A-D) prikazuju karakterizaciju laktoze maleimida sijalilovanog sa alfa-2,6-sijaliltransferazom i prečišćenog korišćenjem QAE-sepharose kolone. aliza korišćenjem Dionex HPLC prikazana je za (slika 60A) standard laktoze; (slika 60B) standard alfa-2,6-sialilaktoze; (slika 60C) standard laktoze maleimida; i (slika 60D) frakciju alfa-2,6-sialilaktoze maleimida eluiranu iz QAE-sepharose kolone.
[0233] Slika 61 prikazuje karakterizaciju frakcije alfa-2,6-sialilaktoze maleimida eluiranu iz QAE-sepharose kolone korišćenjem MALDI-TOF MS.
[0234] Slike 62 (A-B) prikazuju karakterizaciju kontrolnog antitela, poliklonalnog antitela konjugovanog sa alfa-2,3-sialilaktoznim glikanom i poliklonalnog antitela konjugovanog sa alfa-2,6-sialilaktoznim glikanom kroz SDS-PAGE i Dionex HPLC (prikaz grafikona analize sijalinske kiseline).
[0236] Slika 63 prikazuje karakterizaciju kontrolnih i enzimski modifikovanih (desijalilovanih/galaktozilovanh) NNAS mutantnih antitela korišćenjem SDS-PAGE i lektin blotting.
[0238] Slika 64 prikazuje karakterizaciju kroz reducirajući i nereducirajući SDS-PAGE PEGilovanog kontrolnog antitela i Gal NNAS sa različitim količinama galaktoze oksidaze.
[0240] Slika 65 prikazuje rezultate procenjene PEGilacije teškog lanca antitela iz prethodne titracije galaktoze oksidaze korišćenjem ProteinSimple-a.
[0242] Slika 66 prikazuje karakterizaciju kroz reducirajući i nereducirajući SDS-PAGE PEGilovanog kontrolnog antitela i Gal NNAS sa različitim molarnim viškom PEG-a u odnosu na antitelo.
[0244] Slika 67 prikazuje rezultate procenjene PEGilacije teškog lanca antitela iz prethodne titracije PEG-a korišćenjem ProteinSimple-a.
[0246] Slika 68 je strukturni crtež aminooksid glikopeptida, lactose<3>-Cys<3>Gly<4>.
[0248] Slike 69 (A-B) prikazuju karakterizaciju kroz reducirajući SDS-PAGE PEGilovanog kontrolnog antitela i Gal NNAS sa galaktozom oksidazom u odsustvu bakar acetata (slika 69A) i u prisustvu različitih količina bakar acetata (slika 69A i slika 69B).
[0250] Slika 70 prikazuje karakterizaciju enzimski modifikovanih divljeg tipa, A114N, NNAS i A114N/NNAS Herceptin-a pomoću SDS-PAGE (4-12% NuPAGE; reducirajući i nereducirajući) i ECL lektin blotting (reducirajući), zajedno sa rezultatima kvantifikacije terminalne galaktoze u molovima galaktoze po molu antitela.
[0251] Slika 71 je tabela koja prikazuje sadržaj sijalinske kiseline (u mol/mol) u antitelima divljeg tipa i mutantnim antitelima, izmeren korišćenjem Dionex HPLC-a.
[0253] Slika 72 prikazuje karakterizaciju PEGilacije antitela divljeg tipa i mutantnih antitela kroz reducirajući i nereducirajući SDS-PAGE.
[0255] Slika 73 je tabela koja prikazuje PEGilaciju (u mol/mol) antitela divljeg tipa i mutantnih antitela, procenjenu korišćenjem ProteinSimple-a.
[0257] Slika 74 je serija fotografija koje prikazuju imunofluorescentno bojenje apsorpcije kontrolnih, enzimski modifikovanih (sa galaktoziltransferazom) ili konjugovanih (sa laktozom aminoksid ili laktozom maleimidom) antitela u HepG2 ćelijama.
[0259] Slika 75 je prikaz primerka trivalentnog GalNAc glikana.
[0261] Slika 76 prikazuje rezultate eksperimenata sa površinskom plazmonskom rezonancom koji su korišćeni za procenu vezivanja antitela konjugovanih sa trivalentnim GalNAc glikanom za ASGPR podjedinicu H1.
[0263] Slika 77 je prikaz trivalentnog glikana koji sadrži GalNAc i trivalentnog glikopeptida koji sadrži galaktozu korišćenog za konjugaciju.
[0265] Slika 78 prikazuje rezultate eksperimenata sa površinskom plazmonskom rezonancom koji su korišćeni za procenu vezivanja rekombinantnih lizozomalnih enzima konjugovanih sa trivalentnim GalNAc konjugatima i trivalentnim glikopeptidima koji sadrže galaktozu za ASGPR podjedinicu H1.
[0267] Slike 79 (A-D) su prikaz dodatnih trivalentnih GalNAc glikana.
[0269] Slika 80 je prikaz rezultata konjugacije rekombinantnog lizozomalnog enzima rhGAA oksidovanog periodatom sa viškom trivalentnog GalNAc glikana C12 (u 20-, 40-, 80- i 200-strukom molarnom višku glikana u odnosu na rhGAA). Prikazan je rezultujući glikan konjugovan po rhGAA.
[0270] Slika 81 prikazuje vezivanje ASGPR rekombinantnih lizozomalnih enzima konjugovanih sa trivalentnim GalNAc glikanom C12 na Biacore-u. Enzimi konjugovani sa 20- (konjugat 1), 40-, 80- i 200-strukim (konjugat 4) viškom glikana svi pokazuju snažno vezivanje za ASGPR podjedinicu 1. Nema značajne razlike u vezivanju među konjugatima (konjugati 1 do 4).
[0272] DETALJAN OPIS
[0274] Trenutno otkriće pruža vezujuće polipeptide (npr. antitela), i konjugate efektorskog deo molekula (npr. konjugate ciljnog deo molekula) sa njima. U određenim slučajevima, konjugati obuhvataju vezu leka i glikana, stvorenu specifično za mesto unutar nativnih ili modifikovanih glikana polipeptida koji vezuje antigen, kao što je molekul IgG. Trenutno otkriće takođe pruža nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide koji vezuju antigen, rekombinantne ekspresione vektore i ćelije domaćina za proizvodnju polipeptida koji vezuju antigen. Takođe su opisane metode korišćenja polipeptida koji vezuju antigen, a koji su ovde otkriveni, za lečenje bolesti.
[0276] I. Definicije
[0278] Ukoliko ovde nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini korišćeni u ovom dokumentu imaju značenja koja su opšte poznata onima sa uobičajenim znanjem u datoj oblasti. U slučaju bilo kakve latentne dvosmislenosti, ovde navedene definicije imaju prednost nad bilo kojim rečničkim ili spoljnim definicijama. Osim ako kontekst ne zahteva drugačije, termini u jednini uključuju množinu, a termini u množini uključuju jedninu. Upotreba reči „ili” znači „i/ili” osim ako nije drugačije navedeno. Upotreba termina „uključujući”, kao i drugih oblika, kao što su „uključuje” i „uključeno”, nije ograničavajuća.
[0280] [0030] Uopšteno, nomenklature korišćene u vezi sa kulturom ćelija i tkiva, molekularnom biologijom, imunologijom, mikrobiologijom, genetikom i hemijom proteina i nukleinskih kiselina, kao i hibridizacijom, ovde opisane, su one koje su dobro poznate i uobičajeno se koriste u datoj oblasti. Metode i tehnike koje su ovde navedene generalno se izvode prema konvencionalnim metodama dobro poznatim u datoj oblasti i kako je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane u celoj ovoj specifikaciji, osim ako nije drugačije naznačeno. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja izvode se prema specifikacijama proizvođača, kako se to uobičajeno postiže u datoj oblasti ili kako je ovde opisano. Nomenklature korišćene u vezi sa, i laboratorijski postupci i tehnike analitičke hemije, sintetičke organske hemije, kao i medicinske i farmaceutske hemije, ovde opisane, su one koje su dobro poznate i uobičajeno se koriste u datoj oblasti. Standardne tehnike se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsku pripremu, formulaciju i isporuku, kao i lečenje pacijenata.
[0282] Da bi se otkriće lakše razumelo, odabrani termini su definisani u nastavku.
[0284] [001] Termin „polipeptid” se odnosi na bilo koji polimerni lanac aminokiselina i obuhvata nativne ili veštačke proteine, analoge polipeptida ili varijante proteinske sekvence, ili njihove fragmente, osim ako kontekst ne ukazuje na suprotno. Polipeptid može biti monomerni ili polimerni. Za antigenski polipeptid, fragment polipeptida opcionalno sadrži najmanje jedan susedni ili nelinearni epitop polipeptida. Precizne granice najmanje jednog epitopnog fragmenta mogu se potvrditi korišćenjem uobičajenih veština u datoj oblasti. Fragment polipeptida obuhvata najmanje oko 5 susednih aminokiselina, najmanje oko 10 susednih aminokiselina, najmanje oko 15 susednih aminokiselina, ili najmanje oko 20 susednih aminokiselina, na primer.
[0286] [002] Termin „izolovani protein” ili „izolovani polipeptid” odnosi se na protein ili polipeptid koji, zbog svog porekla ili izvora dobijanja, nije povezan sa prirodno povezanim komponentama koje ga prate u njegovom nativnom stanju; je suštinski slobodan od drugih proteina iste vrste; je ekspresovan od strane ćelije druge vrste; ili se ne javlja u prirodi. Stoga, protein ili polipeptid koji je hemijski sintetizovan ili sintetizovan u ćelijskom sistemu različitom od ćelije iz koje prirodno potiče biće „izolovan” od svojih prirodno povezanih komponenti. Protein ili polipeptid takođe može biti učinjen suštinski slobodnim od prirodno povezanih komponenti izolacijom korišćenjem tehnika prečišćavanja proteina dobro poznatih u datoj oblasti.
[0288] Kao što se ovde koristi, termin „vezujući protein” ili „vezujući polipeptid” odnosi se na protein ili polipeptid (npr. antitelo ili njegov fragment) koji sadrži najmanje jedno mesto vezivanja koje je odgovorno za selektivno vezivanje za ciljni antigen od interesa (npr. humani antigen). Primeri mesta vezivanja uključuju varijabilni domen antitela, mesto vezivanja liganda receptora, ili mesto vezivanja liganda receptora. U određenim aspektima, vezujući proteini ili vezujući polipeptidi obuhvataju više (npr. dva, tri, četiri, ili više) mesta vezivanja. U određenim aspektima, vezujući protein ili vezujući polipeptid nije terapeutski enzim.
[0289] Kao što se ovde koristi, termin „nativna rezidua” odnosi se na aminokiselinsku reziduu koja se prirodno javlja na određenoj aminokiselinskoj poziciji vezujućeg polipeptida (npr. antitela ili njegovog fragmenta) i koja nije modifikovana, uvedena ili izmenjena ljudskom rukom. Kao što se ovde koristi, termin „izmenjeni vezujući protein,” „izmenjeni vezujući polipeptid,” „modifikovani vezujući protein” ili „modifikovani vezujući polipeptid” odnosi se na vezujuće polipeptide i/ili vezujuće proteine (npr. antitelo ili njegov fragment) koji obuhvataju najmanje jednu supstituciju, deleciju i/ili dodatak aminokiseline u odnosu na nativnu (tj. divljeg tipa) aminokiselinsku sekvencu, i/ili mutaciju koja rezultira izmenjenom glikozilacijom (npr. hiperglikozilacija, hipoglikozilacija i/ili aglikozilacija) na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija u odnosu na nativnu (tj. divljeg tipa) aminokiselinsku sekvencu.
[0291] Kao što se ovde koristi, termin „početni vezujući polipeptid” ili „početni vezujući protein” odnosi se na vezujući polipeptid ili vezujući protein koji je u kontaktu sa blagim oksidacionim sredstvom da bi se proizveo „prekursor vezujućeg polipeptida” ili „prekursor vezujućeg proteina”, respektivno (videti slike 1A-C). Kao što se ovde koristi, termin „prekursor vezujućeg polipeptida” ili „prekursor vezujućeg proteina” odnosi se na blago oksidovani polipeptid ili protein koji može reagovati sa jednim ili više efektorskih delova molekula opisanih ovde. U određenim otelotvorenjima, početni vezujući polipeptid, početni vezujući protein, prekursor vezujućeg polipeptida, i/ili prekursor vezujućeg proteina (npr. antitelo ili njegov fragment) sadrži najmanje jedno mesto vezivanja koje je odgovorno za selektivno vezivanje za ciljni antigen od interesa (npr. humani antigen). Primeri mesta vezivanja uključuju varijabilni domen antitela, mesto vezivanja liganda receptora, ili mesto vezivanja liganda receptora. U određenim aspektima, početni vezujući polipeptid, početni vezujući protein, prekursor vezujućeg polipeptida, i/ili prekursor vezujućeg proteina obuhvata više (npr. dva, tri, četiri, ili više) mesta vezivanja. U određenim aspektima, početni vezujući polipeptid, početni vezujući protein, prekursor vezujućeg polipeptida, i/ili prekursor vezujućeg proteina nije terapeutski enzim. Početni vezujući polipeptid, početni vezujući protein, prekursor vezujućeg polipeptida, i/ili prekursor vezujućeg proteina mogu imati sekvencu divljeg tipa ili mogu obuhvatiti najmanje jednu supstituciju, deleciju i/ili dodatak aminokiseline u odnosu na nativnu (tj. divljeg tipa) aminokiselinsku sekvencu, i/ili mutaciju koja rezultira izmenjenom glikozilacijom (npr. hiperglikozilacija, hipoglikozilacija i/ili aglikozilacija) na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija u odnosu na nativnu (tj. divljeg tipa) aminokiselinsku sekvencu.
[0292] Termin „ligand” se odnosi na bilo koju supstancu sposobnu da se veže, ili da bude vezana, za drugu supstancu. Slično, termin „antigen” se odnosi na bilo koju supstancu za koju se može generisati antitelo. Iako se „antigen” obično koristi u vezi sa supstratom vezivanja antitela, a „ligand” se često koristi kada se odnosi na supstrate vezivanja receptora, ovi termini se ne razlikuju jedan od drugog i obuhvataju širok spektar preklapajućih hemijskih entiteta. Da bi se izbegla sumnja, antigen i ligand se ovde koriste naizmenično. Antigeni/ligandi mogu biti peptid, polipeptid, protein, aptamer, polisaharid, molekul šećera, ugljeni hidrat, lipid, oligonukleotid, polinukleotid, sintetički molekul, neorganski molekul, organski molekul, i bilo koja njihova kombinacija.
[0294] Termin „specifično se vezuje”, kao što se ovde koristi, odnosi se na sposobnost antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen da se veže za antigen sa konstantom disocijacije (Kd), od najviše oko 1 x 10<-6>M, 1 x 10<-7>M, 1 x 10<-8>M, 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, 1 x 10<-12>M, ili manje, i/ili da se veže za antigen sa afinitetom koji je najmanje dvostruko veći od njegovog afiniteta za nespecifični antigen.
[0296] Kao što se ovde koristi, termin „antitelo” odnosi se na takve sklopove (npr. intaktne molekule antitela, fragmente antitela, ili njihove varijante) koji imaju značajnu poznatu specifičnu imunoreaktivnu aktivnost za antigen od interesa (npr. antigen povezan sa tumorom). Antitela i imunoglobulini obuhvataju lake i teške lance, sa ili bez međulančane kovalentne veze između njih. Osnovne strukture imunoglobulina u sistemima kičmenjaka su relativno dobro shvaćene.
[0298] Kao što će biti detaljnije diskutovano u nastavku, generički termin „antitelo” obuhvata pet različitih klasa antitela koje se mogu biohemijski razlikovati. Iako je svih pet klasa antitela jasno unutar opsega trenutnog otkrića, sledeća diskusija će generalno biti usmerena na klasu molekula imunoglobulina IgG. Što se tiče IgG, imunoglobulini obuhvataju dva identična laka lanca molekulske težine približno 23.000 Daltona, i dva identična teška lanca molekulske težine 53.000-70.000. Četiri lanca su spojena disulfidnim vezama u „Y” konfiguraciji, pri čemu laki lanci obuhvataju teške lance počevši od grla „Y” i nastavljajući se kroz varijabilni region.
[0300] [0039] Laki lanci imunoglobulina klasifikuju se kao kapa ili lambda (κ, λ). Svaka klasa teškog lanca može biti vezana sa kapa ili lambda lakim lancem. Generalno, laki i teški lanci su kovalentno vezani jedan za drugog, a „repni” delovi dva teška lanca su vezani jedan za drugog kovalentnim disulfidnim vezama ili nekovalentnim vezama kada se imunoglobulini generišu bilo hibridomima, B ćelijama, ili genetski modifikovanim ćelijama domaćina. U teškom lancu, sekvence aminokiselina teku od N-terminusa na račvastim krajevima Y konfiguracije do C-terminusa na dnu svakog lanca. Oni koji su stručni u datoj oblasti razumeće da se teški lanci klasifikuju kao gama, mu, alfa, delta, ili epsilon (γ, µ, α, δ, ε) sa nekim podklasama među njima (npr. γ1-γ4). Priroda ovog lanca je ta koja određuje „klasu” antitela kao IgG, IgM, IgA, ili IgE, respektivno. Izotipovi imunoglobulina (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, itd.) su dobro okarakterisani i poznato je da im daju funkcionalnu specijalizaciju. Modifikovane verzije svake od ovih klasa i izotipova su lako prepoznatljive veštom stručnjaku u datoj oblasti u svetlu trenutnog otkrića i, shodno tome, nalaze se unutar opsega trenutnog otkrića.
[0302] I laki i teški lanci su podeljeni u regione strukturne i funkcionalne homologije. Termin „region” se odnosi na deo ili porciju lanca imunoglobulina ili antitela i uključuje konstantni region ili varijabilne regione, kao i diskretnije delove ili porcije tih regiona. Na primer, varijabilni regioni lakog lanca uključuju „komplementarno određujuće regione” ili „CDR” ispresecane sa „okvirnim regionima” ili „FR”, kao što je ovde definisano.
[0304] Regioni imunoglobulina teškog ili lakog lanca mogu biti definisani kao „konstantni” (C) region ili „varijabilni” (V) regioni, na osnovu relativnog nedostatka varijacije sekvence unutar regiona različitih članova klase u slučaju „konstantnog regiona”, ili značajne varijacije unutar regiona različitih članova klase u slučaju „varijabilnih regiona”. Termini „konstantni region” i „varijabilni region” mogu se takođe koristiti funkcionalno. U tom smislu, biće jasno da varijabilni regioni imunoglobulina ili antitela određuju prepoznavanje i specifičnost antigena. Nasuprot tome, konstantni regioni imunoglobulina ili antitela daju važne efektorske funkcije kao što su sekrecija, transplacentarna mobilnost, vezivanje Fc receptora, vezivanje komplementa i slično. Podjedinične strukture i trodimenzionalne konfiguracije konstantnih regiona različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate.
[0306] [0042] Konstantni i varijabilni regioni teških i lakih lanaca imunoglobulina su presavijeni u domene. Termin „domen” odnosi se na globularni region teškog ili lakog lanca koji obuhvata peptidne petlje (npr. koje obuhvataju 3 do 4 peptidne petlje) stabilizovane, na primer, βnaboranim listom i/ili unutar-lančanom disulfidnom vezom. Domeni konstantnog regiona na lakom lancu imunoglobulina nazivaju se naizmenično „domenima konstantnog regiona lakog lanca”, „CL regionima” ili „CL domenima”. Konstantni domeni na teškom lancu (npr. domen šarke, CH1, CH2 ili CH3) nazivaju se naizmenično „domenima konstantnog regiona teškog lanca”, „CH regionima” ili „CH domenima”. Varijabilni domeni na lakom lancu nazivaju se naizmenično „domenima varijabilnog regiona lakog lanca”, „VL regionima” ili „VL domenima”. Varijabilni domeni na teškom lancu nazivaju se naizmenično „domenima varijabilnog regiona teškog lanca”, „VH regionima” ili „VH domenima”.
[0308] Prema konvenciji, numerisanje domena varijabilnog konstantnog regiona raste kako postaju udaljeniji od mesta vezivanja antigena ili amino-terminusa imunoglobulina ili antitela. N-terminus svakog teškog i lakog imunoglobulinskog lanca je varijabilni region, a na C-terminusu je konstantni region; domeni CH3 i CL zapravo obuhvataju karboksi-terminus teškog i lakog lanca, respektivno. Shodno tome, domeni lakog lanca imunoglobulina su raspoređeni u VL-CL orijentaciji, dok su domeni teškog lanca raspoređeni u VH-CH1-šarka-CH2-CH3 orijentaciji.
[0310] Pozicije aminokiselina u konstantnom regionu teškog lanca, uključujući pozicije aminokiselina u domenima CH1, šarke, CH2, CH3 i CL, mogu biti numerisane prema sistemu numeracije Kabat indeksa (videti Kabat et al, u „Sequences of Proteins of Immunological Interest”, U.S. Dept. Health and Human Services, 5th edition, 1991). Alternativno, pozicije aminokiselina antitela mogu biti numerisane prema sistemu numeracije EU indeksa (videti Kabat et al, ibid).
[0312] Kao što se ovde koristi, termin „VH domen” uključuje amino-terminalni varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina, a termin „VL domen” uključuje amino-terminalni varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina.
[0314] Kao što se ovde koristi, termin „CH1 domen” uključuje prvi (najviše amino-terminalni) domen konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji se proteže, npr., od približno pozicija 114-223 u sistemu numeracije Kabat (EU pozicije 118-215). CH1 domen je susedan VH domenu i amino-terminalan u odnosu na region šarke molekula teškog lanca imunoglobulina, i ne čini deo Fc regiona molekula teškog lanca imunoglobulina.
[0316] [0047] Kao što se ovde koristi, termin „region šarke” uključuje deo molekula teškog lanca koji spaja CH1 domen sa CH2 domenom. Ovaj region šarke obuhvata približno 25 rezidua i fleksibilan je, čime omogućava da se dva N-terminalna regiona za vezivanje antigena kreću nezavisno. Regioni šarke mogu biti podeljeni u tri različita domena: gornji, srednji i donji domen šarke (Roux et al. J. Immunol. 1998, 161 :4083).
[0318] Kao što se ovde koristi, termin „CH2 domen” uključuje deo molekula teškog lanca imunoglobulina koji se proteže, npr., od približno pozicija 244-360 u sistemu numeracije Kabat (EU pozicije 231-340). CH2 domen je jedinstven po tome što nije blisko uparen sa drugim domenom. Umesto toga, dva N-vezana razgranata lanca ugljenih hidrata su umetnuta između dva CH2 domena intaktnog nativnog molekula IgG. U jednom otelotvorenju, vezujući polipeptid trenutnog otkrića obuhvata CH2 domen izveden iz molekula IgG1 (npr. humanog molekula IgG1).
[0320] Kao što se ovde koristi, termin „CH3 domen” uključuje deo molekula teškog lanca imunoglobulina koji se proteže približno 110 rezidua od N-terminusa CH2 domena, npr. od približno pozicija 361-476 Kabat sistema numeracije (EU pozicije 341-445). CH3 domen obično formira C-terminalni deo antitela. Međutim, u nekim imunoglobulinima, dodatni domeni se mogu protezati od CH3 domena da bi formirali C-terminalni deo molekula (npr. CH4 domen u µ lancu IgM i ε lancu IgE). U jednom otelotvorenju, vezujući polipeptid trenutnog otkrića obuhvata CH3 domen izveden iz molekula IgG1 (npr. humanog molekula IgG1).
[0322] Kao što se ovde koristi, termin „CL domen” uključuje domen konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina koji se proteže, npr., od približno Kabat pozicije 107A-216. CL domen je susedan VL domenu. U jednom otelotvorenju, vezujući polipeptid trenutnog otkrića obuhvata CL domen izveden iz kapa lakog lanca (npr. humanog kapa lakog lanca).
[0324] Kao što se ovde koristi, termin „Fc region” je definisan kao deo konstantnog regiona teškog lanca koji počinje u regionu šarke neposredno uzvodno od mesta cepanja papaina (tj. rezidue 216 u IgG, uzimajući da je prva rezidua konstantnog regiona teškog lanca 114) i završava na C-terminusu antitela. Shodno tome, kompletan Fc region obuhvata najmanje domen šarke, CH2 domen i CH3 domen.
[0326] [0052] Termin „nativni Fc”, kao što se ovde koristi, odnosi se na molekul koji obuhvata sekvencu neantigen-vezujućeg fragmenta koji je rezultat digestije antitela ili je proizveden drugim sredstvima, bilo u monomernom ili multimetričnom obliku, i može sadržati region šarke. Originalni izvor imunoglobulina nativnog Fc-a je tipično humanog porekla i može biti bilo koji od imunoglobulina, kao što su IgG1 i IgG2. Nativni Fc molekuli se sastoje od monomernih polipeptida koji se mogu povezati u dimerne ili multimerne oblike kovalentnim (tj. disulfidnim vezama) i nekovalentnim udruživanjem. Broj intermolekularnih disulfidnih veza između monomernih podjedinica nativnih Fc molekula kreće se od 1 do 4 u zavisnosti od klase (npr. IgG, IgA i IgE) ili podklase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 i IgGA2). Jedan primer nativnog Fc-a je disulfidno vezani dimer koji je rezultat digestije IgG-a papainom. Termin „nativni Fc” kao što se ovde koristi je generički za monomerni, dimerni i multimerne oblike.
[0328] Termin „Fc varijanta” kao što se ovde koristi odnosi se na molekul ili sekvencu koja je modifikovana u odnosu na nativni Fc, ali i dalje obuhvata mesto vezivanja za receptor spašavanja, FcRn (neonatalni Fc receptor). Primeri Fc varijanti i njihova interakcija sa receptorom spašavanja su poznati u datoj oblasti. Stoga, termin „Fc varijanta” može obuhvatati molekul ili sekvencu koja je humanizovana iz nehumanog nativnog Fc-a. Nadalje, nativni Fc obuhvata regione koji se mogu ukloniti jer pružaju strukturne karakteristike ili biološku aktivnost koje nisu potrebne za vezujuće polipeptide slične antitelima predstavljene u ovom otkriću. Stoga, termin „Fc varijanta” obuhvata molekul ili sekvencu kojoj nedostaje jedno ili više nativnih Fc mesta ili rezidua, ili u kojoj je jedno ili više Fc mesta ili rezidua modifikovano, što utiče ili je uključeno u: (1) formiranje disulfidne veze, (2) nekompatibilnost sa izabranom ćelijom domaćinom, (3) N-terminalnu heterogenost nakon ekspresije u izabranoj ćeliji domaćinu, (4) glikozilaciju, (5) interakciju sa komplementom, (6) vezivanje za Fc receptor osim za receptor spašavanja, ili (7) ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC).
[0330] Termin „Fc domen” kao što se ovde koristi obuhvata nativni Fc i Fc varijante i sekvence kako je gore definisano. Kao i kod Fc varijanti i nativnih Fc molekula, termin „Fc domen” uključuje molekule u monomernom ili multimetričnom obliku, bilo da su digestirani iz celog antitela ili proizvedeni drugim sredstvima.
[0332] [0055] Kao što je gore navedeno, varijabilni regioni antitela omogućavaju mu da selektivno prepoznaje i specifično veže epitope na antigenima. Odnosno, VL domen i VH domen antitela se kombinuju da bi formirali varijabilni region (Fv) koji definiše trodimenzionalno mesto vezivanja antigena. Ova kvaternarna struktura antitela formira mesto vezivanja antigena prisutno na kraju svakog kraka Y. Konkretnije, mesto vezivanja antigena je definisano sa tri komplementarna određujuća regiona (CDR) na svakom od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca. Kao što se ovde koristi, termin „mesto vezivanja antigena” uključuje mesto koje se specifično vezuje (imunoreaguje sa) za antigen (npr. površinski ili rastvorljivi antigen ćelije). Mesto vezivanja antigena uključuje varijabilni region teškog lanca i lakog lanca imunoglobulina, a mesto vezivanja formirano ovim varijabilnim regionima određuje specifičnost antitela. Mesto vezivanja antigena je formirano varijabilnim regionima koji variraju od jednog antitela do drugog. Izmenjena antitela iz trenutnog otkrića obuhvataju najmanje jedno mesto vezivanja antigena.
[0334] U određenim otelotvorenjima, vezujući polipeptidi iz trenutnog otkrića obuhvataju najmanje dva domena vezivanja antigena koja omogućavaju udruživanje vezujućeg polipeptida sa izabranim antigenom. Domeni vezivanja antigena ne moraju biti izvedeni iz istog molekula imunoglobulina. U tom smislu, varijabilni region može ili biti izveden iz bilo koje vrste životinje koja može biti indukovana da stvori humoralni odgovor i generiše imunoglobuline protiv željenog antigena. Kao takav, varijabilni region vezujućeg polipeptida može biti, na primer, sisarskog porekla, npr. može biti human, mišji, pacovski, kozji, ovčiji, od nehumanog primata (kao što su cynomolgus majmuni, makaki, itd.), vučji, ili od kamilida (npr. od kamila, lama i srodnih vrsta).
[0336] U prirodno prisutnim antitelima, šest CDR-a prisutnih na svakom monomernom antitelu su kratke, nesusedne sekvence aminokiselina koje su specifično pozicionirane da formiraju mesto vezivanja antigena dok antitelo poprima svoju trodimenzionalnu konfiguraciju u vodenom okruženju. Ostatak varijabilnih domena teškog i lakog lanca pokazuje manju intermolekularnu varijabilnost u sekvenci aminokiselina i naziva se okvirnim regionima. Okvirni regioni uglavnom poprimaju β-list konformaciju, a CDR-i formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima čine deo, β-list strukture. Dakle, ovi okvirni regioni deluju tako da formiraju skelu koja omogućava pozicioniranje šest CDR-a u ispravnoj orijentaciji putem nekovalentnih interakcija između lanaca. Domen vezivanja antigena formiran od strane pozicioniranih CDR-a definiše površinu komplementarnu epitopu na imunoreaktivnom antigenu. Ova komplementarna površina pospešuje nekovalentno vezivanje antitela za epitop imunoreaktivnog antigena.
[0338] [0058] Primeri vezujućih polipeptida uključuju varijante antitela. Kao što se ovde koristi, termin „varijanta antitela” uključuje sintetičke i genetski modifikovane oblike antitela koji su izmenjeni tako da se ne javljaju prirodno, npr. antitela koja obuhvataju najmanje dve porcije teškog lanca, ali ne i dva kompletna teška lanca (kao što su antitela sa izbrisanom domenom ili minibodies); multispecifične oblike antitela (npr. bispecifična, trispecifična, itd.) izmenjena da se vežu za dva ili više različitih antigena ili za različite epitope na jednom antigenu; molekule teškog lanca spojene sa scFv molekulima i slično. Pored toga, termin „varijanta antitela” uključuje multivalentne oblike antitela (npr. trivalentna, tetravalentna, itd., antitela koja se vežu za tri, četiri ili više kopija istog antigena.
[0340] Kao što se ovde koristi, termin „valentnost” odnosi se na broj potencijalnih mesta vezivanja cilja u polipeptidu. Svako mesto vezivanja cilja specifično se vezuje za jedan ciljni molekul ili specifično mesto na ciljnom molekulu. Kada polipeptid obuhvata više od jednog mesta vezivanja cilja, svako mesto vezivanja cilja može se specifično vezati za iste ili različite molekule (npr. može se vezati za različite ligande ili različite antigene, ili različite epitope na istom antigenu). Vezujući polipeptidi obično imaju najmanje jedno mesto vezivanja specifično za molekul humanog antigena.
[0342] Termin „specifičnost” odnosi se na sposobnost specifičnog vezivanja (npr. imunoreagovanja sa) za dati ciljni antigen (npr. humani ciljni antigen). Vezujući polipeptid može biti monospecifičan i sadržati jedno ili više mesta vezivanja koja se specifično vezuju za cilj, ili polipeptid može biti multispecifičan i sadržati dva ili više mesta vezivanja koja se specifično vezuju za iste ili različite ciljeve. U određenim otelotvorenjima, vezujući polipeptid je specifičan za dva različita (npr. koja se ne preklapaju) dela istog cilja. U određenim otelotvorenjima, vezujući polipeptid je specifičan za više od jednog cilja. Primeri vezujućih polipeptida (npr. antitela) koji obuhvataju mesta vezivanja antigena koja se vežu za antigene ekspresovane na tumorskim ćelijama su poznati u datoj oblasti i jedan ili više CDR-a iz takvih antitela mogu biti uključeni u antitelo predstavljeno u ovom otkriću.
[0344] Termin „povezujući deo molekula” uključuje delove molekula koji su sposobni da povežu efektorski deo molekula sa vezujućim polipeptidima otkrivenim ovde. Povezujući deo molekula može biti izabran tako da je cepiv (npr. enzimski cepiv ili pH-senzitivni) ili necepiv. Primeri povezujućih delova molekula su navedeni u tabeli 2 ovde.
[0346] [0062] Kao što se ovde koristi, termin „efektorski deo molekula” obuhvata agense (npr. proteine, nukleinske kiseline, lipide, ugljene hidrate, glikopeptide, i njihove fragmente) sa biološkom ili drugom funkcionalnom aktivnošću. Na primer, modifikovani vezujući polipeptid koji obuhvata efektorski deo molekula konjugovan sa vezujućim polipeptidom ima najmanje jednu dodatnu funkciju ili svojstvo u poređenju sa nekonjugovanim antitelom. Na primer, konjugacija citotoksičnog leka (npr. efektorskog dela molekula) sa vezujućim polipeptidom rezultira formiranjem vezujućeg polipeptida sa citotoksičnošću leka kao drugom funkcijom (tj. pored vezivanja antigena). U drugom primeru, konjugacija drugog vezujućeg polipeptida sa vezujućim polipeptidom može dati dodatna svojstva vezivanja. U određenim slučajevima, gde je efektorski deo molekula genetski kodirani terapeutski ili dijagnostički protein ili nukleinska kiselina, efektorski deo molekula može biti sintetizovan ili ekspresovan bilo peptidnom sintezom ili rekombinantnim DNK metodama koje su dobro poznate u datoj oblasti. U drugom aspektu, gde je efektorski deo molekula negenetski kodirani peptid, ili deo molekula leka, efektorski deo molekula može biti sintetizovan veštački ili prečišćen iz prirodnog izvora. Kao što se ovde koristi, termin „deo molekula leka” uključuje antiinflamatorne, antikancerogene, anti-infektivne (npr. antifungalne, antibakterijske, antiparazitske, antivirusne, itd.), i anestetičke terapeutske agense. U daljim slučajevima, deo molekula leka je antikancerogeni ili citotoksični agens. Kompatibilni delovi molekula leka takođe mogu obuhvatiti prolekove. Primeri efektorskih delova molekula su navedeni u tabeli 1 ovde.
[0348] Kao što se ovde koristi, termin „blago oksidirajući” odnosi se na reagens koji prihvata elektron od druge vrste (i stoga se sam redukuje), ali ne privlači te elektrone vrlo snažno. Primeri blago oksidirajućih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, periodat oksidazu i galaktoza oksidazu.
[0350] U pronalasku, „efektorski deo molekula” obuhvata „ciljni deo molekula”. Kao što se ovde koristi, termin „ciljni deo molekula” odnosi se na efektorski deo molekula koji se vezuje za ciljni molekul. Ciljni delovi molekula mogu obuhvatiti, bez ograničenja, proteine, nukleinske kiseline, lipide, ugljene hidrate (npr. glikane), i njihove kombinacije (npr. glikoproteine, glikopeptide, i glikolipide). Ciljni deo molekula u pronalasku obuhvata deo molekula manoza-6-fosfata koji se vezuje za manoza-6-fosfatni receptor na ćeliji.
[0352] [0065] Kao što se ovde koristi, termin „prolek” odnosi se na prekursor ili derivatni oblik farmaceutski aktivnog agensa koji je manje aktivan, reaktivan ili sklon nuspojavama u poređenju sa roditeljskim lekom i sposoban je da bude enzimski aktiviran ili na drugi način konvertovan u aktivniji oblik in vivo. Prolekovi kompatibilni sa kompozicijama trenutnog otkrića uključuju, ali nisu ograničeni na, prolekove koji sadrže fosfat, prolekove koji sadrže aminokiseline, prolekove koji sadrže tiofosfat, prolekove koji sadrže sulfat, prolekove koji sadrže peptid, prolekove koji sadrže β-laktam, opcionalno supstituisane prolekove koji sadrže fenoksiacetamid ili opcionalno supstituisane prolekove koji sadrže fenilacetamid, 5-fluorocitozin i druge prolekove 5-fluorouridina koji se mogu konvertovati u aktivniji citotoksični slobodni lek. Stručnjak u datoj oblasti može napraviti hemijske modifikacije željenog dela molekula leka ili njegovog proleka kako bi reakcije tog jedinjenja bile pogodnije za svrhe pripreme modifikovanih vezujućih polipeptida trenutnog otkrića. Delovi molekula leka takođe uključuju derivate, farmaceutski prihvatljive soli, estre, amide i etere delova molekula leka opisanih ovde. Derivati uključuju modifikacije lekova identifikovanih ovde koje mogu poboljšati ili ne značajno smanjiti željenu terapeutsku aktivnost određenog leka.
[0354] Kao što se ovde koristi, termin „antikancerogeni agens” uključuje agense koji su štetni za rast i/ili proliferaciju neoplastičnih ili tumorskih ćelija i mogu delovati da smanje, inhibiraju ili unište malignitet. Primeri takvih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, citostatske agense, alkilirajuće agense, antibiotike, citotoksične nukleozide, agense koji vezuju tubulin, hormone, hormonske antagoniste, citotoksične agense i slično. Citotoksični agensi uključuju derivate tomajmicina, derivate majtansina, derivate kriptoficina, derivate antraciklina, derivate bisfosfonata, derivate leptomicina, derivate streptonigrina, derivate auristatina i derivate duokarmiicina. Bilo koji agens koji deluje da retardira ili uspori rast imunoreaktivnih ćelija ili malignih ćelija je unutar opsega trenutnog otkrića.
[0356] Termin „antigen” ili „ciljni antigen” kao što se ovde koristi odnosi se na molekul ili deo molekula koji je sposoban da bude vezan mestom vezivanja vezujućeg polipeptida. Ciljni antigen može imati jedan ili više epitopa.
[0358] Termin „so” obuhvata metalni jon. Na primer, metalni jon uključuje, ali nije ograničen na, alkalni metal (grupa Ia), npr. litijum, natrijum i kalijum, zemnoalkalni metal (grupa IIa), npr. magnezijum i kalcijum, prelazni metal, npr. bakar, cink, nikl, gvožđe i mangan u uobičajenim valencama. Primeri uobičajenih valenci metala uključuju, na primer, natrijum(I), kalcijum(II), magnezijum(II), cink(II), bakar(I), i bakar(II). Primeri soli koje obuhvataju metalni jon, uključuju, ali nisu ograničene na, bakar(II) acetat (Cu<2>(OAc)<4>), cink(II) acetat (Zn<2>(OAc)<4>), gvožđe hlorid (Fe<3>Cl<3>) i kalcijum hlorid (CaCl<2>).
[0359] II. Vezujući polipeptidi
[0361] U jednom aspektu, trenutno otkriće pruža vezujuće polipeptide (npr. antitela, fragmenti antitela, varijante antitela i fuzioni proteini) koji obuhvataju glikozilovani domen, npr. glikozilovani konstantni domen. VeVezujući polipeptidi otkriveni ovde obuhvataju bilo koji vezujući polipeptid koji obuhvata domen koji ima N-vezano mesto glikozilacije. U određenim otelotvorenjima, vezujući polipeptid je antitelo, ili fragment ili derivat istog. Bilo koje antitelo iz bilo kog izvora ili vrste može se koristiti u vezujućim polipeptidima otkrivenim ovde. Odgovarajuća antitela uključuju, bez ograničenja, humana antitela, humanizovana antitela ili himerična antitela.
[0363] U pronalasku, vezujući polipeptid je imunoadhezin, antitelo, fragment antitela koji vezuje antigen, ili varijanta antitela.
[0365] U određenim otelotvorenjima, glikozilovani domen je Fc domen. U određenim otelotvorenjima, domen glikozilacije je nativni domen glikozilacije na N297, prema EU numeraciji.
[0367] U drugim otelotvorenjima, domen glikozilacije je inženjeringom stvoren domen glikozilacije. Primeri inženjeringom stvorenih domena glikozilacije u Fc domenu obuhvataju asparaginsku reziduu na aminokiselinskoj poziciji 298, prema EU numeraciji, i/ili serinsku ili treoninsku reziduu na aminokiselinskoj poziciji 300, prema EU numeraciji.
[0369] Fc domeni iz bilo koje klase imunoglobulina (npr. IgM, IgG, IgD, IgA i IgE) i vrste mogu se koristiti u vezujućim polipeptidima otkrivenim ovde. Himerični Fc domeni koji obuhvataju delove Fc domena iz različitih vrsta ili Ig klasa takođe se mogu koristiti. U određenim otelotvorenjima, Fc domen je humani IgG1 Fc domen. U slučaju humanog IgG1 Fc domena, mutacija aminokiseline divljeg tipa na Kabat poziciji 298 u asparagin i Kabat poziciji 300 u serin ili treonin rezultira formiranjem konsenzus mesta N-vezane glikozilacije (tj. N-X-T/S sekvence, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina). Međutim, u slučaju Fc domena drugih vrsta i/ili Ig klasa ili izotipova, vešt stručnjak će ceniti da može biti potrebno mutirati Kabat poziciju 299 Fc domena ako je prisutna prolinska rezidua da bi se ponovo stvorila N-X-T/S sekvenca.
[0370] U drugim otelotvorenjima, trenutno otkriće pruža vezujuće polipeptide (npr. antitela, fragmente antitela, varijante antitela i fuzione proteine) koji obuhvataju najmanje jedan CH1 domen sa N-vezanim mestom glikozilacije. Takvi primeri vezujućih polipeptida mogu obuhvatiti, na primer, inženjeringom stvoreno mesto glikozilacije na poziciji 114, prema Kabat numeraciji.
[0372] CH1 domeni iz bilo koje klase imunoglobulina (npr. IgM, IgG, IgD, IgA i IgE) i vrste mogu se koristiti u vezujućim polipeptidima otkrivenim ovde. Himerični CH1 domeni koji obuhvataju delove CH1 domena iz različitih vrsta ili Ig klasa takođe se mogu koristiti. U određenim otelotvorenjima, CH1 domen je humani IgG1 CH1 domen. U slučaju humanog IgG1 domena, mutacija aminokiseline divljeg tipa na poziciji 114 u asparagin rezultira formiranjem konsenzus mesta N-vezane glikozilacije (tj. N-X-T/S sekvence, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina). Međutim, u slučaju drugih CH1 domena drugih vrsta i/ili Ig klasa ili izotipova, vešt stručnjak će ceniti da može biti potrebno mutirati pozicije 115 i/ili 116 CH1 domena da bi se stvorila N-X-T/S sekvenca.
[0374] U određenim otelotvorenjima, vezujući polipeptid trenutnog otkrića može obuhvatati fragment antitela koji vezuje antigen. Termin „fragment koji vezuje antigen“ odnosi se na polipeptidni fragment imunoglobulina ili antitela koji vezuje antigen ili se takmiči sa intaktnim antitelom (tj. sa intaktnim antitelom iz kojeg su izvedeni) za vezivanje antigena (tj. specifično vezivanje). Fragmenti koji vezuju antigen mogu se proizvesti rekombinantnim ili biohemijskim metodama koje su dobro poznate u datoj oblasti. Primeri fragmenata koji vezuju antigen uključuju Fv, Fab, Fab' i (Fab')2. U primernim otelotvorenjima, fragment koji vezuje antigen iz trenutnog otkrića je izmenjeni fragment koji vezuje antigen, a obuhvata najmanje jedno inženjeringom stvoreno mesto glikozilacije. U jednom primernom otelotvorenju, izmenjeni fragment koji vezuje antigen iz trenutnog otkrića obuhvata izmenjeni VH domen opisan supra. U drugom primernom otelotvorenju, izmenjeni fragment koji vezuje antigen iz trenutnog otkrića obuhvata izmenjeni CH1 domen opisan.
[0376] [0076] U primernim otelotvorenjima, vezujući polipeptid obuhvata sekvencu varijabilnog regiona sa jednim lancem (ScFv). Sekvence varijabilnog regiona sa jednim lancem obuhvataju jedan polipeptid koji ima jedno ili više mesta vezivanja antigena, npr. VL domen povezan fleksibilnim linkerom sa VH domenom. ScFv molekuli mogu biti konstruisani u VH-linker-VL orijentaciji ili VL-linker-VH orijentaciji. Fleksibilna šarka koja povezuje VL i VH domene koji čine mesto vezivanja antigena obuhvata od oko 10 do oko 50 aminokiselinskih rezidua. Povezujući peptidi su poznati u datoj oblasti. Vezujući polipeptidi mogu obuhvatiti najmanje jedan scFv i/ili najmanje jedan konstantni region. U jednom otelotvorenju, vezujući polipeptid trenutnog otkrića može obuhvatiti najmanje jedan scFv povezan ili fuzionisan sa antitelom ili fragmentom koji obuhvata CH1 domen (npr. CH1 domen koji obuhvata asparaginsku reziduu na Kabat poziciji 114/EU poziciji 118) i/ili CH2 domen (npr. CH2 domen koji obuhvata asparaginsku reziduu na EU poziciji 298, i serinsku ili treoninsku reziduu na EU poziciji 300).
[0378] U određenim primernim otelotvorenjima, vezujući polipeptid trenutnog otkrića je multivalentno (npr. tetravalentno) antitelo koje se proizvodi fuzionisanjem DNK sekvence koja kodira antitelo sa ScFv molekulom (npr. izmenjenim ScFv molekulom). Na primer, u jednom otelotvorenju, ove sekvence su kombinovane tako da je ScFv molekul (npr. izmenjeni ScFv molekul) povezan na svom N-terminusu ili C-terminusu sa Fc fragmentom antitela putem fleksibilnog linkera (npr. gly/ser linker). U drugom otelotvorenju, tetravalentno antitelo trenutnog otkrića može biti napravljeno fuzionisanjem ScFv molekula sa povezujućim peptidom, koji je fuzionisan sa CH1 domenom (npr. CH1 domen koji obuhvata asparaginsku reziduu na Kabat poziciji 114/EU poziciji 118) da bi se konstruisao ScFv-Fab tetravalentni molekul.
[0380] U drugom otelotvorenju, vezujući polipeptid trenutnog otkrića je izmenjeno minitelo. Izmenjeno minitelo trenutnog otkrića je dimerni molekul napravljen od dva polipeptidna lanca, od kojih svaki obuhvata ScFv molekul (npr. izmenjeni ScFv molekul koji obuhvata izmenjeni VH domen opisan supra) koji je fuzionisan sa CH3 domenom ili njegovim delom putem povezujućeg peptida. Minitela se mogu napraviti konstruisanjem ScFv komponente i komponenti povezujućeg peptida-CH3 korišćenjem metoda opisanih u datoj oblasti (videti, npr. američki patent 5,837,821 ili WO 94/09817Al). U drugom otelotvorenju, može se konstruisati tetravalentno minitelo. Tetravalentna minitela se mogu konstruisati na isti način kao i minitela, osim što su dva ScFv molekula povezana korišćenjem fleksibilnog linkera. Povezani scFv-scFv konstrukt se zatim spaja sa CH3 domenom.
[0382] [0079] U drugom otelotvorenju, vezujući polipeptid trenutnog otkrića obuhvata diatelo. Diatela su dimerni, tetravalentni molekuli, od kojih svaki ima polipeptid sličan scFv molekulima, ali obično sa kratkim (manje od 10, npr.1-5) aminokiselinskih rezidua u linkeru koji povezuje oba varijabilna domena, tako da VL i VH domeni na istom polipeptidnom lancu ne mogu da interaguju. Umesto toga, VL i VH domen jednog polipeptidnog lanca interaguju sa VH i VL domenom (respektivno) na drugom polipeptidnom lancu (videti, na primer, WO 02/02781). Diatela iz trenutnog otkrića obuhvataju scFv molekul fuzionisan sa CH3 domenom.
[0384] U drugim otelotvorenjima, vezujući polipeptidi obuhvataju multispecifična ili multivalentna antitela koja obuhvataju jedan ili više varijabilnih domena u nizu na istom polipeptidnom lancu, npr. polipeptide sa tandem varijabilnim domenom (TVD). Primeri TVD polipeptida uključuju konfiguraciju sa „duplom glavom“ ili „Dual-Fv“ opisanu u američkom patentu br. 5,989,830. U Dual-Fv konfiguraciji, varijabilni domeni dva različita antitela su ekspresovani u tandem orijentaciji na dva odvojena lanca (jedan teški lanac i jedan laki lanac), pri čemu jedan polipeptidni lanac ima dva VH domena u nizu odvojena peptidnim linkerom (VH1-linker-VH2), a drugi polipeptidni lanac se sastoji od komplementarnih VL domena povezanih u nizu peptidnim linkerom (VL1-linker-VL2). U unakrsnoj dvoglavoj konfiguraciji, varijabilni domeni dva različita antitela su ekspresovani u tandem orijentaciji na dva odvojena polipeptidna lanca (jedan teški lanac i jedan laki lanac), pri čemu jedan polipeptidni lanac ima dva VH domena u nizu odvojena peptidnim linkerom (VH1-linker-VH2), a drugi polipeptidni lanac se sastoji od komplementarnih VL domena povezanih u nizu peptidnim linkerom u suprotnoj orijentaciji (VL2-linker-VL1). Dodatne varijante antitela zasnovane na „Dual-Fv“ formatu uključuju bispecifično antitelo Dual-Variable-Domain IgG (DVD-IgG) (videti američki patent br. 7,612,181 i TBTI format (videti US 2010/0226923 A1). odavanje konstantnih domena na odgovarajuće lance Dual-Fv (CH1-Fc na teški lanac i kapa ili lambda konstantni domen na laki lanac) dovodi do funkcionalnih bispecifičnih antitela bez potrebe za dodatnim modifikacijama (tj. očiglednog dodavanja konstantnih domena radi povećanja stabilnosti).
[0386] U drugom primernom otelotvorenju, vezujući polipeptid trenutnog otkrića je bispecifično antitelo sa unakrsnim dvostrukim varijabilnim domenom IgG (CODV-IgG) bazirano na „dvoglavoj“ konfiguraciji (videti US20120251541 A1).
[0388] [0082] CODV-IgG varijante antitela imaju jedan polipeptidni lanac sa VL domenima povezanim u nizu sa CL domenom (VL1-L1-VL2-L2-CL) i drugi polipeptidni lanac sa komplementarnim VH domenima povezanim u nizu u suprotnoj orijentaciji sa CH1 domenom (VH2-L3-VH1-L4-CH1), pri čemu polipeptidni lanci formiraju par unakrsnog lakog lanca i teškog lanca. U određenom otelotvorenju, drugi polipeptid može biti dalje povezan sa Fc domenom (VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc). U određenim otelotvorenjima, linker L3 je najmanje dvostruko duži od linkera L1 i/ili linker L4 je najmanje dvostruko duži od linkera L2. Na primer, L1 i L2 mogu imati dužinu od 1-3 aminokiselinske rezidue, L3 može imati dužinu od 2 do 6 aminokiselinskih rezidua, a L4 može imati dužinu od 4 do 7 aminokiselinskih rezidua. Primeri odgovarajućih linkera uključuju jednu glicinsku (Gly) reziduu; diglicinski peptid (Gly-Gly); tripeptid (Gly-Gly-Gly); peptid sa četiri glicinske rezidue (Gly-Gly-Gly-Gly) (SEQ ID NO: 40); peptid sa pet glicinskih rezidua (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly) (SEQ ID NO: 41); peptid sa šest glicinskih rezidua (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly) (SEQ ID NO: 42); peptid sa sedam glicinskih rezidua (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly) (SEQ ID NO: 43); peptid sa osam glicinskih rezidua (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly) (SEQ ID NO: 44). Mogu se koristiti i druge kombinacije aminokiselinskih rezidua kao što su peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 45) i peptid Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 46).
[0390] U određenim otelotvorenjima, vezujući polipeptid obuhvata molekul imunoadhezina koji obuhvata neregularni region vezivanja (npr. receptor, ligand, ili molekul adhezije ćelije) fuzionisan sa konstantnim regionom antitela (videti npr. Ashkenazi et al., Methods, 19958(2), 104-115).
[0392] U određenim otelotvorenjima, vezujući polipeptid obuhvata domene nalik imunoglobulinu. Odgovarajući domeni nalik imunoglobulinu uključuju, bez ograničenja, domene fibronektina (videti, na primer, Koide et al. (2007), Methods Mol. Biol.352: 95-109), DARPin (videti, na primer, Stumpp et al. (2008) Drug Discov. Today 13 (15-16): 695-701), Z domene proteina A (videti, Nygren et al. (2008) FEBS J.275 (11): 2668-76), Lipocalins (videti, na primer, Skerra et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2677-83), Affilins (videti, na primer, Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol.372 (1): 172-85), Affitins (videti, na primer, Krehenbrink et al. (2008). J. Mol. Biol.383 (5): 1058-68), Avimers (videti, na primer, Silverman et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61), Fynomers, (videti, na primer, Grabulovski et al. (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196-3204), i Kunitz domenske peptide (videti, na primer, Nixon et al. (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261-8).
[0394] III. N-vezani glikani
[0396] [0085] U određenim otelotvorenjima, vezujući polipeptidi predstavljeni u pronalasku koriste glikane koji su „N-vezani” preko asparaginske rezidue za mesto glikozilacije u polipeptidnom skeletu vezujućeg polipeptida. Mesto glikozilacije može biti nativno ili inženjeringom stvoreno mesto glikozilacije. Dodatno ili alternativno, glikan može biti nativni glikan ili inženjeringom stvoren glikan (npr. modifikovani glikan) koji sadrži jednu ili više nenativnih veza. „N-glikani” ili „N-vezani glikani” su pričvršćeni na amidni azot asparaginske ili argininske rezidue u proteinu preko N-acetilglukozaminske rezidue. Ova „N-vezana mesta glikozilacije” se javljaju u primarnoj strukturi peptida koja sadrži, na primer, aminokiselinsku sekvencu asparagin-X-serin/treonin, gde je X bilo koja aminokiselinska rezidua osim prolina i asparaginske kiseline. Takvi N-glikani su potpuno opisani, na primer, u Drickamer K, Taylor ME (2006). Introduction to Glycobiology, 2nd ed.
[0398] Ovde su otkriveni gliko-inženjeringom stvoreni vezujući proteini i/ili vezujući polipeptidi, kao i metode za pravljenje gliko-inženjeringom stvorenih vezujućih proteina i/ili vezujućih polipeptida. Kao što se ovde koristi, termin „gliko-inženjering” se odnosi na bilo koju metodu, prepoznatu u datoj oblasti, za promenu glikoformnog profila kompozicije vezujućeg proteina u cilju generisanja „modifikovanog glikana”.
[0400] Kao što se ovde koriste, termini „G0 glikoform,” „G1 glikoform,” i „G2 glikoform” odnose se na N-glikanske glikoforme koje imaju nula, jednu ili dve terminalne galaktozne rezidue, respektivno. Ovi termini uključuju G0, G1 i G2 glikoforme koje su fukozilovane ili obuhvataju bisektorsku N-acetilglukozaminsku reziduu.
[0402] G1 i G2 glikoforme mogu dodatno obuhvatati rezidue sijalinske kiseline povezane sa jednom ili obe terminalne galaktozne rezidue da bi formirale G1S1, G2S1 i G2S2 glikoforme. Kao što se ovde koriste, termini „G1S1 glikoform,” „G2S1 glikoform,” i „G2S2 glikoform” odnose se na N-glikanske glikoforme koje imaju reziduu sijalinske kiseline povezanu sa jedinom terminalnom galaktoznom reziduom u G1 glikoformu, sa jednom od terminalnih galaktoznih rezidua u G2 glikoformu, ili sa obe terminalne galaktozne rezidue u G2 glikoformu, respektivno. Ovi termini uključuju G1S1, G2S1 i G2S2 glikoforme koje su fukozilovane ili obuhvataju bisektorsku N-acetilglukozaminsku reziduu. Rezidue sijalinske kiseline G1S1, G2S1 i G2S2 glikoforma mogu biti povezane alfa-2,6-vezama sijalinske kiseline sa terminalnom galaktoznom reziduom svakog glikoforma kako bi se poboljšala antiinflamatorna aktivnost vezujućeg molekula (videti npr. Anthony et al., PNAS 105: 19571-19578, 2008).
[0403] Kao što se ovde koriste, termini „G1F glikoform,” „G2F glikoform,” „G1S1F glikoform,” „G2S1F glikoform,” i „G2S2F glikoform” odnose se na „G1 glikoform,” „G2 glikoform,” „G1S1 glikoform,” „G2S1 glikoform,” i „G2S2 glikoform” koji su fukozilovani, respektivno.
[0405] Vezujući polipeptid može obuhvatati nativno mesto glikozilacije Fc domena antitela. Ovo nativno mesto glikozilacije obuhvata asparaginsku reziduu divljeg tipa na poziciji 297 Fc domena (N297), prema EU numeraciji. Nativni N-vezani glikan koji se nalazi na ovoj poziciji generalno je vezan preko β-glikozilamidne veze za azotnu grupu bočnog lanca N297. Međutim, mogu se koristiti i druge, u datoj oblasti prepoznate, odgovarajuće veze. N-vezani glikan N297 može sadržati terminalnu manozu, N-acetil-glukozamin, galaktozu ili sijalinsku kiselinu.
[0407] Vezujući polipeptid može obuhvatati jedno ili više inženjeringom stvorenih mesta glikozilacije. Takva inženjeringom stvorena mesta glikozilacije obuhvataju supstituciju jedne ili više aminokiselina divljeg tipa u polipeptidnom skeletu vezujućeg polipeptida sa asparaginskom reziduom koja je sposobna da bude N-glikozilovana od strane enzima glikozilacije ćelije. Primeri inženjeringom stvorenih mesta glikozilacije uključuju uvođenje asparaginske mutacije na aminokiselinskoj poziciji 298 Fc domena (298N) prema EU numeraciji ili aminokiselinskoj poziciji 114 CH1 domena (114N) prema Kabat numeraciji (pozicija 118 CH1 domena prema EU numeraciji).
[0409] Bilo koja vrsta prirodno prisutnog ili sintetičkog (tj. nenaturalnog ili modifikovanog) N-vezanog glikana može biti povezana sa mestom glikozilacije vezujućeg polipeptida predstavljenog u ovom otkriću. Glikan može obuhvatiti saharid (npr. saharidnu reziduu koja se nalazi na terminusu oligosaharida) koja se može oksidovati (npr. tretmanom periodatom ili galaktoza oksidazom) da bi se proizvela grupa pogodna za konjugaciju sa efektorskim deo molekula (npr. reaktivna aldehidna grupa). Odgovarajući oksidirajući saharidi uključuju, bez ograničenja, galaktozu i sijalinsku kiselinu (npr. N-acetilneuraminsku kiselinu). Glikan može biti biantenski glikan. Glikan može biti prirodno prisutna glikoforma sisara.
[0411] Glikozilacija se može postići bilo kojim sredstvom poznatim u datoj oblasti. U određenim otelotvorenjima, glikozilacija se postiže ekspresijom vezujućih polipeptida u ćelijama sposobnim za N-vezanu glikozilaciju. Može se koristiti bilo koja prirodna ili inženjeringom stvorena ćelija (npr. prokariotske ili eukariotske (npr. CHO ili NS0 ćelije)).
[0412] Generalno, ćelije sisara se koriste za postizanje glikozilacije. N-glikani koji se proizvode u ćelijama sisara se obično nazivaju kompleksnim, visoko-manoza, hibridnim tipom N-glikana (videti npr. Drickamer (2006)). Ovi kompleksni N-glikani imaju strukturu koja tipično ima dve do šest spoljnih grana sa sijalilaktozaminskom sekvencom povezanom sa unutrašnjom jezgrovnom strukturom Man<3>GlcNAc<2>. Kompleksni N-glikan ima najmanje jednu granu, i/ili najmanje dve grane, naizmeničnih GlcNAc i galaktoznih (Gal) rezidua koje se završavaju oligosaharidima kao što su, na primer: NeuNAc-; NeuAc α2,6 GalNAc α1-; NeuAc α2,3 Gal β1,3 GalNAc α1-; i NeuAc α2,3/6 Gal β1,4 GlcNAc β 1.; pored toga, sulfatni estri mogu se javiti na reziduama galaktoze, GalNAc i GlcNAc. NeuAc može biti O-acetilovan ili zamenjen NeuGl (N-glikolilneuraminskom kiselinom). Kompleksni N-glikani takođe mogu imati unutarlančane supstitucije bisektorskog GlcNAc-a i fukoze jezgra (Fuc).
[0414] Dodatno ili alternativno, glikozilacija se može postići ili modifikovati enzimskim putem, in vitro. Na primer, može se koristiti jedan ili više glikoziltransferaza za dodavanje specifičnih saharidnih rezidua na nativni ili inženjeringom stvoreni N-glikan vezujućeg polipeptida, a može se koristiti jedan ili više glikozidaza za uklanjanje neželjenih saharida sa N-vezanog glikana. Takvi enzimski načini su dobro poznati u datoj oblasti (videti npr. WO2007/005786).
[0416] IV. Imunološkog efektorske funkcije i Fc modifikacije
[0418] [0095] U određenim otelotvorenjima, vezujući polipeptidi mogu obuhvatati konstantni region antitela (npr. konstantni region IgG, npr. humani konstantni region IgG, npr. humani konstantni region IgG1 ili IgG4) koji posreduje u jednoj ili više efektorskih funkcija. Na primer, vezivanje C1-kompleksa za konstantni region antitela može aktivirati komplementni sistem. Aktivacija komplementnog sistema je važna za opsonizaciju i lizu ćelijskih patogena. Aktivacija komplementnog sistema takođe stimuliše inflamatorni odgovor i može biti uključena u autoimunu preosetljivost. Nadalje, antitela se vezuju za receptore na raznim ćelijama preko Fc regiona (mesta vezivanja Fc receptora na Fc regionu antitela vezuju se za Fc receptore (FcR) na ćeliji). Postoji niz Fc receptora koji su specifični za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptori), IgE (epsilon receptori), IgA (alfa receptori) i IgM (mu receptori). Vezivanje antitela za Fc receptore na površini ćelija pokreće niz važnih i raznolikih bioloških odgovora uključujući gutanje i uništavanje čestica obloženih antitelima, uklanjanje imunih kompleksa, lizu ciljnih ćelija obloženih antitelima pomoću ćelija ubica (nazvano citotoksičnost zavisna od antitela posredovana ćelijama, ili ADCC), oslobađanje inflamatornih medijatora, transplacentalni prenos i kontrolu proizvodnje imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, vezujući polipeptidi (npr. antitela ili fragmenti koji vezuju antigen) vezuju se za Fc-gama receptor. U alternativnim otelotvorenjima, vezujući polipeptidi mogu obuhvatati konstantni region kome nedostaje jedna ili više efektorskih funkcija (npr. ADCC aktivnost) i/ili koji nije u stanju da se veže za Fcγ receptor.
[0420] Određena otelotvorenja uključuju antitela u kojima je najmanje jedna aminokiselina u jednom ili više domena konstantnog regiona obrisana ili na drugi način izmenjena kako bi se obezbedile željene biohemijske karakteristike kao što su smanjene ili pojačane efektorske funkcije, sposobnost nekovalentnog dimerenja, povećana sposobnost lokalizacije na mestu tumora, smanjen serumski poluživot ili povećan serumski poluživot u poređenju sa celim, neizmenjenim antitelom približno iste imunogenosti. Na primer, određena antitela za upotrebu u dijagnostičkim i terapijskim metodama opisanim ovde su antitela sa obrisanim domenom, koja obuhvataju polipeptidni lanac sličan teškom lancu imunoglobulina, ali kojima nedostaje najmanje jedan deo jednog ili više domena teškog lanca. Na primer, u određenim antitelima, ceo jedan domen konstantnog regiona modifikovanog antitela će biti obrisan, na primer, ceo ili deo CH2 domena će biti obrisan.
[0422] U određenim drugim otelotvorenjima, vezujući polipeptidi obuhvataju konstantne regione izvedene iz različitih izotipova antitela (npr. konstantne regione iz dva ili više humanih IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4). U drugim otelotvorenjima, vezujući polipeptidi obuhvataju himeričnu šarku (tj. šarku koja obuhvata delove šarke izvedene iz domena šarki različitih izotipova antitela, npr. gornji domen šarke iz molekula IgG4 i srednji domen šarke iz IgG1). U jednom otelotvorenju, vezujući polipeptidi obuhvataju Fc region ili njegov deo iz humanog molekula IgG4 i Ser228Pro mutaciju (EU numeracija) u regionu jezgra šarke molekula.
[0424] [0098] U određenim otelotvorenjima, Fc porcija može biti mutirana da bi se povećala ili smanjila efektorska funkcija korišćenjem tehnika poznatih u datoj oblasti. Na primer, delecija ili inaktivacija (putem tačkastih mutacija ili drugih sredstava) domena konstantnog regiona može smanjiti vezivanje Fc receptora cirkulišućeg modifikovanog antitela, čime se povećava lokalizacija tumora. U drugim slučajevima, modifikacije konstantnog regiona u skladu sa ovim otkrićem mogu ublažiti vezivanje komplementa i time smanjiti serumski poluživot i nespecifično udruživanje konjugovanog citotoksina. Druge modifikacije konstantnog regiona mogu se koristiti za modifikovanje disulfidnih veza ili oligosaharidnih delova molekula koji omogućavaju poboljšanu lokalizaciju zbog povećane specifičnosti antigena ili fleksibilnosti. Rezultujući fiziološki profil, bioraspoloživost i drugi biohemijski efekti modifikacija, kao što su lokalizacija tumora, biodistribucija i serumski poluživot, mogu se lako izmeriti i kvantifikovati korišćenjem dobro poznatih imunoloških tehnika bez preteranog eksperimentisanja.
[0426] U određenim otelotvorenjima, Fc domen korišćen u antitelu je Fc varijanta. Kao što se ovde koristi, termin „Fc varijanta” odnosi se na Fc domen koji ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na Fc domen divljeg tipa iz kojeg je pomenuti Fc domen izveden. Na primer, gde je Fc domen izveden iz humanog IgG1 antitela, Fc varijanta pomenutog humanog IgG1 Fc domena obuhvata najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na pomenuti Fc domen.
[0428] Supstitucija(e) aminokiseline Fc varijante može se nalaziti na bilo kojoj poziciji (tj. bilo kojoj aminokiselinskoj poziciji EU konvencije) unutar Fc domena. U jednom otelotvorenju, Fc varijanta obuhvata supstituciju na aminokiselinskoj poziciji koja se nalazi u domenu šarke ili njegovom delu. U drugom otelotvorenju, Fc varijanta obuhvata supstituciju na aminokiselinskoj poziciji koja se nalazi u CH2 domenu ili njegovom delu. U drugom otelotvorenju, Fc varijanta obuhvata supstituciju na aminokiselinskoj poziciji koja se nalazi u CH3 domenu ili njegovom delu. U drugom otelotvorenju, Fc varijanta obuhvata supstituciju na aminokiselinskoj poziciji koja se nalazi u CH4 domenu ili njegovom delu.
[0430] Vezujući polipeptidi mogu koristiti bilo koju u datoj oblasti prepoznatu Fc varijantu za koju se zna da daje poboljšanje (npr. smanjenje ili pojačanje) efektorske funkcije i/ili vezivanja FcR. Pomenute Fc varijante mogu uključivati, na primer, bilo koju od aminokiselinskih supstitucija otkrivenih u Međunarodnim PCT publikacijama WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, i WO06/085967A2 ili u američkim patentima br.
[0431] 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; i 7,083,784.
[0433] U jednom primernom otelotvorenju, vezujući polipeptid može obuhvatati Fc varijantu koja sadrži supstituciju aminokiseline na EU poziciji 268 (npr. H268D ili H268E). U drugom primernom otelotvorenju, vezujući polipeptid može obuhvatati supstituciju aminokiseline na EU poziciji 239 (npr. S239D ili S239E) i/ili EU poziciji 332 (npr. I332D ili I332Q).
[0435] U određenim otelotvorenjima, vezujući polipeptid može obuhvatati Fc varijantu koja sadrži supstituciju aminokiseline koja menja efektorske funkcije antitela nezavisne od antigena, posebno cirkulišući poluživot vezujućeg polipeptida. Takvi vezujući polipeptidi pokazuju ili povećano ili smanjeno vezivanje za FcRn u poređenju sa vezujućim polipeptidima kojima nedostaju ove supstitucije, te stoga imaju povećan ili smanjen poluživot u serumu, respektivno. Očekuje se da će Fc varijante sa poboljšanim afinitetom za FcRn imati duži serumski poluživot, i takvi molekuli imaju korisne primene u metodama lečenja sisara gde se želi dug poluživot primenjenog antitela, npr. za lečenje hronične bolesti ili poremećaja. Nasuprot tome, očekuje se da će Fc varijante sa smanjenim afinitetom vezivanja za FcRn imati kraći poluživot, i takvi molekuli su takođe korisni, na primer, za primenu sisarima gde skraćeno vreme cirkulacije može biti prednost, npr. za in vivo dijagnostičko snimanje ili u situacijama gde početno antitelo ima toksične nuspojave kada je prisutno u cirkulaciji tokom produženih perioda. Fc varijante sa smanjenim afinitetom vezivanja za FcRn takođe imaju manju verovatnoću da pređu placentu i, stoga, su takođe korisne u lečenju bolesti ili poremećaja kod trudnica. Pored toga, druge primene u kojima smanjen afinitet vezivanja za FcRn može biti poželjan uključuju primene lokalizovane na mozak, bubrege i/ili jetru. U jednom primernom otelotvorenju, izmenjeni vezujući polipeptidi (npr. antitela ili fragmenti koji vezuju antigen) pokazuju smanjen transport preko epitela bubrežnih glomerula iz vaskulature. U drugom otelotvorenju, izmenjeni vezujući polipeptidi (npr. antitela ili fragmenti koji vezuju antigen) pokazuju smanjen transport preko krvno-moždane barijere (KMB) iz mozga u vaskularni prostor. U jednom otelotvorenju, antitelo sa izmenjenim vezivanjem za FcRn obuhvata Fc domen koji ima jednu ili više supstitucija aminokiselina unutar „petlje za vezivanje FcRn” Fc domena. Petlja za vezivanje FcRn sastoji se od aminokiselinskih rezidua 280-299 (prema EU numeraciji). Primeri supstitucija aminokiselina koje menjaju aktivnost vezivanja za FcRn su otkriveni u Međunarodnoj PCT publikaciji br. WO05/047327.
[0436] U određenim primernim otelotvorenjima, vezujući polipeptidi (npr. antitela ili fragmenti koji vezuju antigen) obuhvataju Fc domen koji ima jednu ili više sledećih supstitucija: V284E, H285E, N286D, K290E i S304D (EU numeracija). U drugim primernim otelotvorenjima, vezujući molekuli obuhvataju humani Fc domen sa dvostrukom mutacijom H433K/N434F (videti, npr. američki patent br.8,163,881).
[0438] Vezujući polipeptidi za upotrebu u dijagnostičkim i terapijskim metodama opisanim ovde mogu imati konstantni region, npr. konstantni region teškog lanca IgG1 ili IgG4, koji je izmenjen da bi se smanjila ili eliminisala glikozilacija. Na primer, vezujući polipeptidi (npr. antitela ili fragmenti koji vezuju antigen) takođe mogu obuhvatiti Fc varijantu koja sadrži supstituciju aminokiseline koja menja glikozilaciju Fc-a antitela. Na primer, pomenuta Fc varijanta može imati smanjenu glikozilaciju (npr. N- ili O-vezanu glikozilaciju). U primernim otelotvorenjima, Fc varijanta obuhvata smanjenu glikozilaciju N-vezanog glikana koji se normalno nalazi na aminokiselinskoj poziciji 297 (EU numeracija). U drugom otelotvorenju, antitelo ima supstituciju aminokiseline u blizini ili unutar motiva glikozilacije, na primer, motiva N-vezane glikozilacije koji sadrži aminokiselinsku sekvencu NXT ili NXS. U posebnom otelotvorenju, antitelo obuhvata Fc varijantu sa supstitucijom aminokiseline na aminokiselinskoj poziciji 228 ili 299 (EU numeracija). U posebnijim otelotvorenjima, antitelo obuhvata konstantni region IgG1 ili IgG4 koji obuhvata mutaciju S228P i T299A (EU numeracija).
[0440] Primeri supstitucija aminokiselina koje daju smanjenu ili izmenjenu glikozilaciju su otkriveni u Međunarodnoj PCT publikaciji br. WO05/018572.
[0442] [0107] U nekim otelotvorenjima, vezujući polipeptidi su modifikovani da bi se eliminisala glikozilacija. Takvi vezujući polipeptidi mogu se nazivati „agly“ vezujućim polipeptidima (npr. „agly“ antitelima). Iako nismo vezani teorijom, veruje se da „agly“ vezujući polipeptidi mogu imati poboljšan profil sigurnosti i stabilnosti in vivo. Agly vezujući polipeptidi mogu biti bilo kog izotipa ili podklase, npr. IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4. U određenim otelotvorenjima, agly vezujući polipeptidi obuhvataju aglikozilovani Fc region IgG4 antitela kome nedostaje Fcefektorska funkcija, čime se eliminiše potencijal za toksičnost posredovanu Fc-om za normalne vitalne organe koji ekspresuju IL-6. U drugim otelotvorenjima, vezujući polipeptidi obuhvataju izmenjeni glikan. Na primer, antitelo može imati smanjen broj rezidua fukoze na N-glikanu na Asn297 Fc regiona, tj. da je afukozilovano. Afukozilacija povećava vezivanje za FcγRII na NK ćelijama i snažno povećava ADCC. Pokazano je da diatelo koje obuhvata anti-IL-6 scFv i anti-CD3 scFv indukuje ubijanje ćelija koje ekspresuju IL-6 putem ADCC. Shodno tome, u jednom otelotvorenju, afukozilovano anti-IL-6 antitelo se koristi za ciljanje i ubijanje ćelija koje ekspresuju IL-6. U drugom otelotvorenju, vezujući polipeptid može imati izmenjen broj rezidua sijalinske kiseline na N-glikanu na Asn297 Fc regiona. Brojne metode za pravljenje „agly” antitela ili antitela sa izmenjenim glikanima su prepoznate u datoj oblasti. Na primer, genetski modifikovane ćelije domaćina (npr. modifikovani kvasac, npr. Picchia, ili CHO ćelije) sa modifikovanim putevima glikozilacije (npr. delecije glikozil-transferaze) mogu se koristiti za proizvodnju takvih antitela.
[0444] V. Effektorski deo molekula
[0446] U pronalasku, efektorski deo molekula obuhvata ciljni deo molekula koji sadrži deo molekula manoza-6-fosfata koji se vezuje za manoza-6-fosfatni receptor na ćeliji. Efektorski deo molekula je konjugovan, bilo direktno ili preko povezujućeg dela molekula, za N-vezani i/ili oksidovani glikan vezujućeg polipeptida.
[0448] Uopšteno, ovi efektorski delovi molekula su konjugovani (bilo direktno ili preko povezujućeg dela molekula) za N-vezani glikan na vezujućem polipeptidu (npr. N-vezani glikan povezan sa N298 (EU numeracija) CH2 domena i/ili N114 (Kabat numeracija) CH1 domena). U određenim otelotvorenjima, vezujući polipeptid je antitelo pune dužine koje obuhvata dva CH1 domena sa glikanom na Kabat poziciji 114 (EU pozicija 118), pri čemu su oba glikana konjugovana sa jednim ili više efektorskih delova molekula.
[0450] Bilo koji efektorski deo molekula može se dodati vezujućim polipeptidima otkrivenim ovde. Efektorski delovi molekula mogu dodati nenativnu funkciju izmenjenom antitelu ili njegovim fragmentima bez značajne izmene intrinzične aktivnosti vezujućeg polipeptida. U jednom otelotvorenju, efektorski deo molekula je ciljni deo molekula (npr. glikopeptid ili neoglikan). Modifikovani vezujući polipeptid (npr. antitelo) iz trenutnog otkrića može obuhvatiti jedan ili više efektorskih delova molekula, koji mogu biti isti ili različiti.
[0452] U jednom otelotvorenju, efektorski deo molekula može biti formule (I):
[0454] H<2>N-Q-CON-X formula (I),
[0455] pri čemu:
[0456] 1. A) Q je NH ili O; i
[0457] 2. B) CON je konektorski deo molekula; i
[0458] 3. C) X je ciljni deo molekula.
[0459] Konektorski deo molekula povezuje terapeutski agens sa H<2>N-Q- . Konektorski deo molekula može uključivati najmanje jednu od bilo kojih odgovarajućih komponenti poznatih stručnjacima u datoj oblasti, uključujući, na primer, alkilenil komponentu, komponentu polietilen glikola, komponentu poli(glicina), komponentu poli(oksazolina), karbonil komponentu, komponentu izvedenu iz cisteinamida, komponentu izvedenu iz valina spojenog sa citrulinom, i komponentu izvedenu iz 4-aminobenzil karbamata, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0460] U drugom otelotvorenju, efektorski deo molekula formule (I) može biti formule (Ia):
[0461] H<2>N-Q-CH<2>-C(O)-Z-X formula (Ia),
[0462] pri čemu:
[0463] 1. A) Q je NH ili O; i
[0464] 2. B) Z je -Cys-(MC)<a>-(VC)<b>-(PABC)<c>-(C<16>H<32>O<8>C<2>H<4>)<f>,
[0465] pri čemu
[0466] i. Cys je komponenta izvedena iz cisteinamida;
[0467] ii. MC je komponenta izvedena iz maleimida;
[0468] iii. VC je komponenta izvedena iz valina spojenog sa citrulinom;
[0469] iv. PABC je komponenta izvedena iz 4-aminobenzil karbamata;
[0471] v. X je ciljni deo molekula;
[0473] vi. a je 0 ili 1;
[0475] vii. b je 0 ili 1;
[0477] 8. viii.c je 0 ili 1; i
[0479] ix. f je 0 ili 1
[0481] „Komponenta izvedena iz cisteinamida“ je tačka pričvršćivanja za H<2>N-Q-CH<2>-C(O)-. U jednom otelotvorenju, „komponenta izvedena iz cisteinamida“ se može odnositi na jednu ili više porcija efektorskog dela molekula sa strukturom:
[0483]
[0486] U jednom otelotvorenju, „Cys” komponenta efektorskog dela molekula može uključivati jednu takvu porciju. Na primer, sledeća struktura prikazuje efektorski deo molekula sa jednom takvom porcijom (gde je „Cys” komponenta naznačena isprekidanom linijom):
[0488]
[0491] U drugom otelotvorenju, „Cys” komponenta efektorskog dela molekula može uključivati dve ili više takvih porcija. Na primer, sledeći deo molekula sadrži dve takve porcije:
[0494] Kao što se može videti iz strukture, svaka „Cys” komponenta nosi -(MC)<a>-(VC)<b>-(PABC)<c>-(C<16>H<32>O<8>C<2>H<4>)<f>-X grupu.
[0496] U jednom otelotvorenju, fraza „komponenta izvedena iz maleimida” se može odnositi na bilo koju porciju efektorskog dela molekula sa strukturom:
[0498]
[0501] gde je d ceo broj od 2 do 5. Broj MC komponenti uključenih u bilo koju Cys-(MC)<a>-(VC)<b>-(PABC)<c>-(C<16>H<32>O<8>C<2>H<4>)<f>-X grupu u efektorskom delu molekula je naznačen indeksom „a”, i može biti 0 ili 1. U jednom otelotvorenju, a je 1. U drugom otelotvorenju, b je 0.
[0503] U jednom otelotvorenju, „Cys” komponenta može biti povezana sa „MC” komponentom preko atoma sumpora u „Cys” komponenti, kao što je naznačeno isprekidanom linijom u strukturi ispod:
[0505]
[0508] U jednom otelotvorenju, fraza „komponenta izvedena iz valina spojenog sa citrulinom” se može odnositi na bilo koju porciju efektorskog dela molekula sa sledećom strukturom:
[0511] Broj VC komponenti uključenih u bilo koju Cys-(MC)<a->(VC)<b>-(PABC)<c>-(C<16>H<32>O<8>C<2>H<4>)<f>-X grupu u efektorskom delu molekula je naznačen indeksom „b”, i može biti 0 ili 1. U jednom otelotvorenju, b je 1. U drugom otelotvorenju, b je 0.
[0513] U jednom otelotvorenju, fraza „komponenta izvedena iz 4-aminobenzil karbamata” se može odnositi na bilo koju porciju efektorskog dela molekula sa sledećom strukturom:
[0515]
[0518] Broj PABC komponenti uključenih u bilo koju Cys-(MC)<a>-(VC)<b>-(PABC)<c>-(C<16>H<32>O<8>C<2>H<4>)<f>-X grupu u efektorskom delu molekula je naznačen indeksom „c”, i može biti 0 ili 1. U jednom otelotvorenju, c je 1. U drugom otelotvorenju, c je 0.
[0520] u jednom otelotvorenju, „C<16>H<32>O<8>C<2>H<4>“ se odnosi na sledeću strukturu:
[0522]
[0525] Broj C<16>H<32>O<8>jedinica uključenih u bilo koju Cys-(MC)<a>-(VC)<b>-(PABC)<c>-(C<16>H<32>O<8>C<2>H<4>)<f>-X grupu u efektorskom delu molekula je naznačen indeksom „f”. U jednom otelotvorenju, f je 1. U drugom otelotvorenju, f je 0.
[0527] u jednom otelotvorenju, a je 1, b je 1, c je 1, a f je 0.
[0529] A) Terapeutski efektorski deo molekula
[0530] Vezujući polipeptidi iz trenutnog otkrića takođe mogu biti konjugovani sa efektorskim delom molekula koji obuhvata terapeutski agens, npr. deo molekula leka (ili njegov prolek) ili radio-obeleženo jedinjenje. Terapeutski agens može biti citotoksin. Primeri citotoksičnih terapeutskih agenasa su navedeni u tabeli 1 ovde.
[0532] Tabela 1. Primeri citotoksičnih terapeutskih agenasa
[0534]
[0535]
[0538] Dalji primeri delova molekula leka uključuju antiinflamatorne, antikancerogene, antiinfektivne (npr. antifungalne, antibakterijske, antiparazitske, antivirusne, itd.) i anestetičke terapeutske agense.
[0540] Primeri antikancerogenih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, citostatike, enzimske inhibitore, regulatore gena, citotoksične nukleozide, agense koji vezuju tubulin ili inhibitore tubulina, inhibitore proteazoma, hormone i hormonske antagoniste, agense protiv angiogeneze i slično. Primeri citostatskih antikancerogenih agenasa uključuju alkilirajuće agense kao što je porodica lekova antraciklina (npr. adriamicin, karminomicin, ciklosporin-A, hlorokvin, metopterin, mitramicin, porfiromicin, streptonigrin, porfiromicin, antracenedioni i aziridini). Drugi citostatski antikancerogeni agensi uključuju inhibitore sinteze DNK (npr. metotreksat i dihlorometotreksat, 3-amino-1,2,4-benzotriazin 1,4-dioksid, aminopterin, citozin β-D-arabinofuranozid, 5-fluoro-5'-deoksiuridin, 5-fluorouracil, ganciklovir, hidroksiurea, aktinomicin-D i mitomicin C), DNK-interkalatore ili unakrsne linkere (npr. bleomicin, karboplatin, karmustin, hlorambucil, ciklofosfamid, cis-diaminplatin(II) dihlorid (cisplatin), melfalan, mitoksantron i oksaliplatin), i regulatore transkripcije DNK-RNK (npr. aktinomicin D, daunorubicin, doksorubicin, homoharingtonin i idarubicin). Drugi primeri citostatskih agenasa koji su kompatibilni sa sadašnjim otkrićem uključuju ansamicin benzohinone, hinonoidne derivate (npr. hinolone, genistein, baktaciklin), busulfan, ifosfamid, mehloretamin, triazikvon, diazihon, karbazilhinon, indohinon EO9, diaziridinil-benzohinon metil DZQ, trietilenfosforamid i jedinjenja nitrozo-uree (npr. karmustin, lomustin, semustin).
[0542] Primeri citotoksičnih nukleozidnih antikancerogenih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na: adenozin arabinozid, citarabin, citozin arabinozid, 5-fluorouracil, fludarabin, floksuridin, ftorafur i 6-merkaptopurin. Primeri antikancerogenih agenasa koji vezuju tubulin uključuju, ali nisu ograničeni na: taksoide (npr. paklitaksel, docetaksel, taksan), nokodazol, rizoksin, dolastatine (npr. Dolastatin-10, -11, ili -15), kolhicin i kolhicinoidi (npr. ZD6126), kombretastatini (npr. Kombretastatin A-4, AVE-6032) i vinka alkaloide (npr. vinblastin, vinkristin, vindesin i vinorelbin (navelbine)). Primeri antikancerogenih hormona i hormonskih antagonista uključuju, ali nisu ograničeni na: kortikosteroide (npr. prednizon), progestine (npr. hidroksiprogesteron ili medroprogesteron), estrogene, (npr. dietilstilbestrol), antiestrogene (npr. tamoksifen), androgene (npr. testosteron), inhibitore aromataze (npr. aminoglutetimid), 17-(alilamino)-17-demetoksigeldanamicin, 4-amino-1,8-naftalimid, apigenin, brefeldin A, cimetidin, dihlorometilen-difosfonska kiselina, leuprolid (leuprorelin), hormon koji oslobađa luteinizirajući hormon, pifitrin-a, rapamicin, globulin koji vezuje polne hormone i tapsigargin. Primeri antikancerogenih, anti-angiogeneznih jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na: Angiostatin Kl -3, DL-a-difluorometil-ornitin, endostatin, fumagilin, genistein, minociklin, staurosporine i (±)-talidomid.
[0544] Primeri antikancerogenih enzimskih inhibitora uključuju, ali nisu ograničeni na: S(+)-kamptotecin, kurkumin, (-)-deguelin, 5,6-dihlorobenz-imidazol 1-β-D-ribofuranozid, etopozid, formestan, fostriecin, hispidin, 2-imino-1-imidazolidinsirćetnu kiselinu (ciklokreatin), mevinolin, trihostatin A, tirfostin AG 34 i tirfostin AG 879.
[0545] Primeri antikancerogenih regulatora gena uključuju, ali nisu ograničeni na: 5-aza-2'-deoksicitidin, 5-azacitidin, holekalciferol (vitamin D3), 4-hidroksitamoksifen, melatonin, mifepriston, raloksifen, trans-retinal (aldehidi vitamina A), retinoinsku kiselinu, kiselinu vitamina A, 9-cis-retinoinsku kiselinu, 13-cis-retinoinsku kiselinu, retinol (vitamin A), tamoksifen i troglitazon.
[0547] Druge klase antikancerogenih agenasa uključuju, ali nisu ograničene na: porodicu lekova pteridina, diinene i podofilotoksine. Posebno korisni članovi tih klasa uključuju, na primer, metopterin, podofilotoksin, ili derivate podofilotoksina kao što su etopozid ili etopozid fosfat, leurosidin, vindesin, leurosin i slično.
[0549] Drugi antikancerogeni agensi koji su kompatibilni sa ovde navedenim uputstvima uključuju auristatine (npr. auristatin E i monometilauristan E), geldanamicin, kaliheamicin, gramicidin D, majtansanoide (npr. majtansin), neokarcinostatin, topotekan, taksane, citochalasin B, etidijum bromid, emetin, tenopozid, kolhicin, dihidroksi anthracindion, mitoksantron, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, puromicin i analoge ili homologe istih.
[0551] Drugi antikancerogeni agensi koji su kompatibilni sa ovde navedenim uputstvima uključuju derivate tomaymicina, derivate majtansina, derivate kriptoficina, derivate antraciklina, derivate bisfosfonata, derivate leptomicina, derivate streptonigrina, derivate auristatina i derivate duokarmiicina.
[0553] [0133] Druga klasa kompatibilnih antikancerogenih agenasa koji se mogu koristiti kao delovi molekula leka su radiosenzibilizujući lekovi koji se mogu efikasno usmeriti na tumor ili imunoreaktivne ćelije. Takvi delovi molekula leka pojačavaju osetljivost na jonizujuće zračenje, čime se povećava efikasnost radioterapije. Ne ograničavajući se teorijom, antitelo modifikovano radiosenzibilizujućim delom molekula leka i internalizovano od strane tumorske ćelije isporučilo bi radiosenzibilizator bliže jezgru gde bi radiosenzibilizacija bila maksimalna. Antitela koja izgube radiosenzibilizujući deo molekula bi bila brzo očišćena iz krvi, lokalizujući preostali radiosenzibilizujući agens u ciljnom tumoru i pružajući minimalnu apsorpciju u normalnim tkivima. Nakon čišćenja iz krvi, dopunska radioterapija bi se mogla primeniti spoljnim zračenjem usmerenim specifično na tumor, radioaktivnošću direktno implantiranom u tumor, ili sistemskom radioimunoterapijom sa istim modifikovanim antitelom.
[0555] Terapeutski agens može obuhvatiti radionuklide ili radioobeleživače sa visokoenergetskim jonizujućim zračenjem koji su sposobni da izazovu višestruke prekide lanca u nuklearnoj DNK, što dovodi do ćelijske smrti. Primeri visokoenergetskih radionuklida uključuju:<90>Y,<125>I,<131>I,<123>I,<111>In,<105>Rh,<153>Sm,<67>Cu,<67>Ga,<166>Ho,<177>Lu,<186>Re i<188>Re. Ovi izotopi tipično proizvode visokoenergetske α- ili β-čestice koje imaju kratak put. Takvi radionuklidi ubijaju ćelije u čijoj se neposrednoj blizini nalaze, na primer neoplastične ćelije za koje se konjugat vezao ili je u njih ušao. Oni imaju malo ili nimalo efekta na nelokalizovane ćelije i suštinski su neimunogeni. Alternativno, visokoenergetski izotopi se mogu generisati termalnim zračenjem inače stabilnog izotopa, na primer kao u terapiji hvatanja neutrona borom (Guan et al., PNAS, 95: 13206-10, 1998).
[0557] Terapeutski agens može biti izabran iz MMAE, MMAF i PEG8-Do 110.
[0559] Primeri terapeutskih efektorskih delova molekula uključuju strukture:
[0561]
[0562]
[0564] Efektorski deo molekula može biti izabran iz:
[0565]
[0566]
[0569] Efektorski deo molekula može sadržati više od jednog terapeutskog agensa. Ovi višestruki terapeutski agensi mogu biti isti ili različiti.
[0571] b) Dijagnostički efektorski deo molekula
[0573] Vezujući polipeptidi iz trenutnog otkrića takođe mogu biti konjugovani sa efektorskim delom molekula koji obuhvata dijagnostički agens. Dijagnostički agens može biti
[0575] detektabilna mala molekula, npr. biotin, fluorofori, hromofori, sonde za spin rezonancu, ili radioobeleživači. Primeri fluorofora uključuju fluorescentne boje (npr. fluorescein, rodamin i slično) i druge luminiscentne molekule (npr. luminal). Fluorofor može biti osetljiv na okolinu, tako da se njegova fluorescencija menja ako se nalazi blizu jedne ili više rezidua u modifikovanom vezujućem polipeptidu koje prolaze kroz strukturne promene nakon vezivanja supstrata (npr. dansyl sonde). Primeri radioobeleživača uključuju male molekule koji sadrže atome sa jednim ili više jezgara niske osetljivosti (<13>C,<15>N,<2>H,<125>I,<124>I<123>I,<99>Tc,<43>K,<52>Fe,<64>Cu,<68>Ga,<111>In i slično). Radionuklid može biti, npr, radionuklid koji emituje gama, fotone ili pozitrone sa poluživotom pogodnim da omogući aktivnost ili detekciju nakon proteklog vremena između primene i lokalizacije na mestu snimanja.
[0577] Dijagnostički agens može biti polipeptid. Primeri dijagnostičkih polipeptida uključuju enzime sa fluorogenom ili hromogenom aktivnošću, npr. sposobnost cepanja supstrata koji formira fluorofor ili hromofor kao proizvod (tj. reporterski proteini kao što je luciferaza). Drugi dijagnostički proteini mogu imati intrinzičnu fluorogenu ili hromogenu aktivnost (npr. zelene, crvene i žute fluorescentne bioluminiscentne aekvorinske proteine iz bioluminiscentnih morskih organizama) ili mogu obuhvatiti protein koji sadrži jedno ili više jezgara sa niskom energijom radioaktivnosti (<13>C,<15>N,<2>H,<125>I,<124>I,<123>I,<99>Tc,<43>K,<52>Fe,<64>Cu,<68>Ga,<111>In i slično).
[0578] Što se tiče upotrebe radioobeleženih konjugata u vezi sa sadašnjim otkrićem, vezujući polipeptidi trenutnog otkrića mogu biti direktno obeleženi (kao što je jodiranjem) ili mogu biti obeleženi indirektno korišćenjem helatnog agensa. Kao što se ovde koristi, fraze „indirektno obeležavanje“ i „indirektni pristup obeležavanju“ obe znače da je helatni agens kovalentno pričvršćen za vezujući polipeptid i da je najmanje jedan radionuklid povezan sa helatnim agensom. Takvi helatni agensi se obično nazivaju bifunkcionalnim helatnim agensima jer vezuju i polipeptid i radioizotop. Primeri helatnih agenasa obuhvataju derivate 1-izotiocikmatobenzil-3-metildiotelen triaminepentaacetatne kiseline („MX-DTPA“) i cikloheksil dietilentriamin pentaacetatne kiseline („CHX-DTPA“). Drugi helatni agensi obuhvataju derivate P-DOTA i EDTA. Primeri radionuklida za indirektno obeležavanje uključuju 111In i 90Y. Većina studija snimanja koristi 5 mCi 111In-obeleženog antitela, jer je ova doza i sigurna i ima povećanu efikasnost snimanja u poređenju sa nižim dozama, pri čemu se optimalno snimanje dešava tri do šest dana nakon primene antitela. Videti, na primer, Murray, (1985), J. Nuc. Med.26: 3328 i Carraguillo et al, (1985), J. Nuc. Med.26: 67. Primer radionuklida za direktno obeležavanje je 131I. Oni koji su stručni u datoj oblasti ceniće da se mogu sastaviti i neradioaktivni konjugati u zavisnosti od izabranog agensa koji se konjuguje.
[0580] Dijagnostički efektorski deo molekula može biti FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) sonda. FRET je korišćen za različite dijagnostičke primene, uključujući dijagnostiku raka. FRET sonda može uključivati cepiv linker (enzimski osetljiv ili pH linker) koji povezuje donorske i acceptorske delove molekula FRET sonde, pri čemu cepanje rezultira pojačanom fluorescencijom (uključujući bliski infracrveni spektar) (videti, npr. A. Cobos-Correa et. al. Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation, Nature Chemical Biology (2009), 5(9), 628-63; S. Gehrig et.al. Spatially Resolved Monitoring of Neutrophil Elastase Activity with Ratiometric Fluorescent Reporters (2012) Angew. Chem. Int. Ed. , 51, 6258 -6261).
[0582] Dijagnostički efektorski deo molekula može biti izabran iz:
[0583]
[0586] c) Functionalizovani efektorski delovi molekula
[0588] U određenim otelotvorenjima, efektorski delovi molekula mogu biti funkcionalizovani da sadrže jednu ili više dodatnih grupa pored samog efektorskog dela molekula. Na primer, efektorski deo molekula može sadržati cepive linkere koji oslobađaju efektorski deo molekula iz vezujućeg polipeptida pod određenim uslovima. U primernim otelotvorenjima, efektorski deo molekula može uključivati linker koji je cepiv pomoću ćelijskih enzima i/ili je pH osetljiv. Dodatno ili alternativno, efektorski deo molekula može sadržati disulfidnu vezu koja se cepa intracelularnim glutationom nakon apsorpcije u ćeliju. Primeri disulfidnih i pH osetljivih linkera su navedeni u nastavku:
[0589]
[0591] R<1-4>= H iliCH<3>ili C<2>H<6>ili drugi alifati.
[0592]
[0594] U drugim otelotvorenjima, efektorski deo molekula može uključivati hidrofilne i biokompatibilne delove molekula kao što su poli(glicin), poli(oksazolin) i/ili PEG delovi molekula. Primeri struktu H ili sup Ystit”uisane ili nesupst dituisan ie alkil, alkilaril k grupe
[0595]
[0596] U određenim otelotvorenjima, efektorski deo molekula sadrži aminooksidnu grupu koja olakšava konjugaciju sa vezujućim polipeptidom putem stabilne oksimske veze. Primeri efektorskih delova molekula koji sadrže aminooksidne grupe navedeni su u tabeli 2 ovde.
[0598] Tabela 2. Primeri aminooksidnih efektorskih delova molekula (gde X može biti bilo koji linker, Y je bilo koji spejser, i gde su X i/ili Y opcioni)
[0601]
[0602]
[0603]
[0606] U drugim otelotvorenjima, efektorski deo molekula sadrži hidrazid i/ili N-alkilovanu hidrazinsku grupu kako bi se olakšala konjugacija sa vezujućim polipeptidom putem stabilne hidrazonske veze. Primeri efektorskih delova molekula koji sadrže aminooksidne grupe navedeni su u tabeli 14 ovde.
[0608]
[0609] d) Ciljni delovi molekula
[0611] U pronalasku, efektorski deo molekula obuhvata ciljni deo molekula koji sadrži deo molekula manoza-6-fosfata koji se vezuje za manoza-6-fosfatni receptor na ćeliji. Međutim, generalno, sadašnje otkriće opisuje efektorske delove molekula koji obuhvataju ciljne delove molekula koji se specifično vezuju za jedan ili više ciljnih molekula. Primeri ciljnih delova molekula uključuju, bez ograničenja, proteine, nukleinske kiseline, lipide, ugljene hidrate (npr. glikane), i njihove kombinacije (npr. glikoproteine, glikopeptide, i glikolipide). U određenim slučajevima, ciljni deo molekula je ugljeni hidrat ili glikopeptid. U određenim slučajevima, ciljni deo molekula je glikan. Ciljni delovi molekula mogu biti prirodno ili nenaturalno prisutni molekuli Ciljni delovi molekula pogodni za konjugaciju mogu uključivati one koji sadrže aminooksidne linkere (videti, npr. slike 40 i 41).
[0613] Ciljni delovi molekula mogu se vezati za bilo koju vrstu ćelije, uključujući životinjske (npr. sisarske), biljne ili ćelije insekata, bilo in vitro ili in vivo, bez ograničenja. Ćelije mogu biti endodermalnog, mezodermalnog ili ektodermalnog porekla, i mogu uključivati bilo koji tip ćelije. Ciljni deo molekula konjugata vezuje se za ćeliju, npr. ćeliju sisara, i olakšava isporuku vezujućeg polipeptida ciljanoj ćeliji, npr. da bi se poboljšalo ciljanje i/ili apsorpcija ćelije. Primeri ciljnih ćelija uključuju, bez ograničenja, imune ćelije (npr. limfocite kao što su B ćelije, T ćelije, ćelije prirodnog ubice (NK), bazofili, makrofagi, ili dendritične ćelije), ćelije jetre (npr. hepatociti ili neparenhimske ćelije kao što su endotelijalne ćelije jetrenog sinusa, Kupfferove ćelije, ili hepatične zvezdaste ćelije), tumorske ćelije (npr. bilo koja maligna ili benigna ćelija uključujući hepatomske ćelije, ćelije raka pluća, sarkomske ćelije, ćelije leukemije, ili ćelije limfoma), vaskularne ćelije (npr. aortne endotelijalne ćelije ili endotelijalne ćelije plućne arterije), epitelne ćelije (npr. jednostavne skvamozne epitelne ćelije, jednostavne kolumnarne epitelne ćelije, pseudostratifikovane kolumnarne epitelne ćelije, ili stratifikovane skvamozne epitelne ćelije), ili mezenhimne ćelije (npr. ćelije limfnog i cirkulacionog sistema, kosti i hrskavične ćelije).
[0615] [0149] U jednom otelotvorenju, vezujući polipeptid koji obuhvata jedan ili više ciljnih delova molekula je internalizovan od strane ćelije. U drugom otelotvorenju, količina vezujućeg polipeptida koji obuhvata jedan ili više ciljnih delova molekula internalizovanog od strane ćelije je veća od količine referentnog vezujućeg polipeptida kome nedostaje ciljni deo molekula, a koji je internalizovan od strane ćelije.
[0617] Uopšteno, ciljni deo molekula se vezuje za receptor na ciljnoj ćeliji. Ciljni deo molekula konjugata obuhvata deo molekula manoza-6-fosfata koji se vezuje za manoza-6-fosfatni receptor na ćeliji. Ciljni deo molekula se takođe može vezati za Siglec na ciljnoj ćeliji. Primeri Siglec-a uključuju sialoadhezin (Siglec-1), CD22 (Siglec-2), CD33 (Siglec-3), MAG (Siglec-4), Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Siglec-12, Siglec-14, ili Siglec-15.
[0619] Ciljni deo molekula može obuhvatati α2,3-, α2,6-, ili α2,8-vezanu reziduu sijalinske kiseline.
[0621] Ciljni deo molekula se takođe može sastojati od α2,3-sialilaktoznog dela molekula ili α2,6-sialilaktoznog dela molekula. Drugi primeri receptora uključuju lektinske receptore, uključujući, ali ne ograničavajući se na, C-tip lektinske receptore, galektine i L-tip lektinske receptore. Primeri lektinskih receptora uključuju: DEC-205 (CD205; limfocitni antigen 75), makrofagni manoza receptor (MMR; CD206), Dectin-1, Dectin-2, C-tip lektin indukovan makrofagom (Mincle), neintegrin koji vezuje ICAM3 specifičan za dendritičnu ćeliju (DC-SIGN, CD209), DC NK lektinsku grupu receptor-1 (DNGR-1), Langerin (CD207), lektikan, asijaloglikoproteinski receptor, C-lektin receptor dendritični imunoreceptor (CLEC4A; CLECSF6; DCIR), makrofagni galaktoza-tip lektina (MGL), a DC receptor, kolektin, selektin, NK-ćelijski receptor, multi-C-tip lektinske domene (CTLD) endocitni receptor, Reg grupa (tip VII) lektina, hondrolektin, tetranektin, policistin, atraktin (ATRN), bazni protein eozinofila (EMBP), gen 2 kritične regije DiGeorgeovog sindroma (DGCR2), trombomodulin, Bimlec, lektin grupe XVI (SEEC) i lektin grupe XVII (CBCP/Frem1/QBRICK).
[0623] Vezujući polipeptidi iz sadašnjeg otkrića mogu se koristiti za uklanjanje toksičnih jedinjenja i štetnih supstanci iz jetre kod višestrukih bolesti ciljanjem receptora za ugljene hidrate (npr. manoza-6-fosfatni receptor, manoza receptor i asijaloglikoproteinski receptor). Videti: Ganesan, L.P. et al: Rapid and Efficient Clearance of Blood-borne Virus by Liver Sinusoidal Endothelium. PLoS Pathogens 2011, 9: 1; i Monnier, V.M. et al: Glucosepane: a poorly understood advanced glycation end product of growing importance for diabetes and its complications. Clin Chem Lab Med 2014; 52: 21.
[0624] Vezujući polipeptidi iz sadašnjeg otkrića se takođe mogu koristiti za ciljanje tumorskih ćelija putem ciljanja jednog ili više različitih ćelijskih receptora, uključujući, ali ne ograničavajući se na: receptore za ugljene hidrate, asijaloglikoproteinske receptore i/ili Siglece. Videti: Chen, W.C. et al: In vivo targeting of B-cell lymphoma with glycan ligands of CD22. Blood 2010, 115: 4778; Chen, W.C. et al: Targeting B lymphoma with nanoparticles bearing glycan ligands of CD22. Leuk Lymphoma 2012, 53: 208; Hatakeyama, S. et al: Targeted drug delivery to tumor vasculature by a carbohydrate mimetic peptide. PNAS, 2011, 108: 19587; Hong, F. et al: β-Glucan Functions as an Adjuvant for Monoclonal Antibody Immunotherapy by Recruiting Tumoricidal Granulocytes as Killer Cells. Cancer Res. 2003, 23: 9023; Kawasakia, N. et al: Targeted delivery of lipid antigen to macrophages via the CD169/sialoadhesin endocytic pathway induces robust invariant natural killer T cell activation. PNAS 2013, 110: 7826; i
[0626] Medina, S.H. et al: N-acetylgalactosamine-functionalized dendrimers as hepatic cancer celltargeted carriers. Biomaterials 2011, 32: 4118.
[0628] Vezujući peptidi iz sadašnjeg otkrića se takođe mogu koristiti za regulisanje imunog odgovora putem različitih receptora, uključujući, ali ne ograničavajući se na, receptore za ugljene hidrate, DC-SIGNs i/ili Siglec-e. Videti: Anthony, R.M. et al: Recapitulation of IVIG Anti-Inflammatory Activity with a Recombinant IgG Fc. Science 2008, 320: 373; Anthony, R.M. et al: Identification of a receptor required for the anti-inflammatory activity of IVIG. PNAS 2008, 105: 19571; Kaneko, Y. et al: Anti-Inflammatory Activity of Immunoglobulin G Resulting from Fc Sialylation. Science 2006, 313: 670; i Mattner, J. et al: Exogenous and endogenous glycolipid antigens activate NKT cells during microbial infections. Nature 2005, 434: 525.
[0630] U nekim otelotvorenjima, konektorski deo molekula efektorskog dela molekula formule (I) obuhvata spejser, uključujući, ali ne ograničavajući se na, C<2-30>alkil ili 1 do 32 PEG. U nekim otelotvorenjima, konektorski deo molekula efektorskog dela molekula je izabran na osnovu približne dužine (slika 79). Odgovarajuće dužine spejsera uključuju, ali nisu ograničene na ~12 Å, ~16 Å, ~20 Å, ~31 Å, ~45 Å, ~60 Å, ~80 Å i ~88 Å.
[0632] e) PEG delovi molekula
[0633] U otelotvorenjima, efektorski deo molekula obuhvata poli(etilen glikol) (PEG, PEO, ili POE). PEG je oligomer ili polimer etilen oksida i ima hemijsku strukturu H-(O-CH2-CH2)n-OH, pri čemu se element u zagradi ponavlja. PEGilacija (ili pegilacija) je proces u kojem se lanci PEG polimera pričvršćuju na drugi molekul (npr. vezujući polipeptid), koji se zatim naziva PEGilovanim (ili pegilovanim). PEGilacija može služiti za smanjenje imunogenosti i antigenosti, kao i za povećanje hidrodinamičke veličine (veličine u rastvoru) molekula za koji je pričvršćen, čime se smanjuje renalni klirens i produžava vreme cirkulacije. PEGilacija takođe može učiniti molekule rastvorljivijim u vodi. U jednom otelotvorenju, PEG deo molekula obuhvata mono-PEG, bi-PEG, ili tri-PEG. U drugom otelotvorenju, PEG deo molekula obuhvata 3 do 3,5 PEG.
[0635] VI. Konjugacija efektorskih delova molekula sa vezujućim polipeptidima
[0637] U određenim otelotvorenjima, efektorski delovi molekula su konjugovani (bilo direktno ili preko povezujućeg dela molekula) sa oksidovanim glikanom (npr. oksidovanim N-vezanim glikanom) izmenjenog vezujućeg polipeptida (npr. inženjeringom stvorenim glikanom na N114 domena CH1 antitela ili nativnim glikanom na N297 F domena antitela). Termin „oksidovani glikan” znači da je supstituent alkohola na glikanu oksidovan, dajući karbonilni supstituent. Karbonilni supstituent može reagovati sa odgovarajućim azotnim nukleofilom da bi formirao dvostruku vezu ugljenik-azot. Na primer, reakcija karbonilne grupe sa aminooksidnom grupom ili hidrazinskom grupom formirala bi oksim ili hidrazin, respektivno. U jednom otelotvorenju, karbonilni supstituent je aldehid. Odgovarajući oksidovani glikani uključuju oksidovanu galaktozu i oksidovanu sijalinsku kiselinu.
[0639] U jednom otelotvorenju, modifikovani vezujući polipeptid je formule (II):
[0641] Ab(Gal-C(O)H)<x>(Gal-Sia-C(O)H)<y>formula (II),
[0643] pri čemu
[0645] 1. A) Ab je antitelo ili drugi vezujući polipeptid kako je ovde definisano;
[0647] 2. B) Gal je komponenta izvedena iz galaktoze;
[0648] 3. C) Sia je komponenta izvedena iz sijalinske kiseline;
[0650] 4. D) x je 0 do 5; i
[0652] 5. E) y je 0 do 5,
[0654] pri čemu najmanje jedan od x i y nije 0.
[0656] Bilo koja hemijska metoda prepoznata u datoj oblasti može se koristiti za konjugaciju efektorskog dela molekula (npr. efektorskog dela molekula koji obuhvata povezujući deo molekula) sa glikanom (videti npr. Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques. Academic Press (1996).
[0658] U određenim otelotvorenjima, rezidua saharida (npr. rezidua sijalinske kiseline ili galaktoze) glikana se prvo oksiduje (npr. korišćenjem tretmana sijalinske kiseline natrijumperiodatom ili tretmanom galaktoze galaktoza oksidazom) da bi se generisala reaktivna aldehidna grupa. Ova aldehidna grupa reaguje sa efektorskim delom molekula, sa aminooksidnom grupom ili hidrazinskom grupom, da bi se formirao oksim ili hidrazonski linker, respektivno. Primeri metoda koje koriste ovu opštu šemu reakcije navedeni su u primerima 10 do 15.
[0660] U određenim otelotvorenjima, nativni ili inženjeringom stvoreni glikani vezujućeg polipeptida se prvo tretiraju in vitro enzimima glikoziltransferaze kako bi se obezbedila terminalna rezidua saharida koja je na odgovarajući način reaktivna. Na primer, sijalilacija se može postići prvo korišćenjem kombinacije galaktoziltransferaze (Gal T) i sijaliltransferaze (Sial T). U određenim otelotvorenjima, biantenski glikani kojima nedostaje galaktoza (G0F ili G0) ili koji sadrže samo jednu galaktozu (G1F ili G1) mogu se konvertovati u galaktozilovane ili sijalilovane strukture višeg reda pogodne za konjugaciju (G1F, G1, G2F, G2, G1S1F, G1S1, G2S1F, G2S1, G2S2F, ili G2S2).
[0662] [0161] Primer šeme konjugacije za proizvodnju sijalilovanih glikokonjugata prikazan je na slici 25C. U primernom otelotvorenju, rezidue sijalinske kiseline se uvode enzimski i specifično na mesto u glikanu antitela (npr. nativni glikan na Asn-297) korišćenjem kombinacije galaktoziltransferaze (Gal T) i sijaliltransferaze (Sial T). Uvedene rezidue sijalinske kiseline se naknadno oksiduju niskom koncentracijom natrijum-periodata da bi se dobili reaktivni aldehidi sijalinske kiseline, pogodni za reakciju sa linkerima (npr. aminooksidnim linkerima) kako bi se generisali konjugati antitela i efektorskog dela molekula (npr. konjugati antitela i efektorskog dela molekula povezani oksimskom vezom). Kontrolisanjem broja glikana i broja rezidua sijalinske kiseline in vitro remodelovanjem, vešt stručnjak ima preciznu kontrolu nad odnosom leka i antitela (DAR) konjugata antitela i efektorskog dela molekula. Na primer, ako se doda ~1 rezidua sijalinske kiseline na jedan biantenski glikan (A1F) u svakom teškom lancu, antitelo ili vezujući polipeptid sa DAR od 2 može se homogeno dobiti.
[0664] VII. Modifikovani vezujući polipeptidi
[0666] U određenim slučajevima, otkriće pruža modifikovane polipeptide koji su proizvod konjugacije efektorskih delova molekula koji su konjugovani (bilo direktno ili preko povezujućeg dela molekula) sa jednim ili više oksidovanih glikana (npr. oksidovanim N-vezanim glikanom) izmenjenog vezujućeg polipeptida (npr. inženjeringom stvorenim glikanom na N114 CH1 domena antitela ili nativnim glikanom na N297 F domena antitela).
[0668] U jednom slučaju, vezujući polipeptid može biti formule (III):
[0670] Ab(Gal-C(H)=N-Q-CON-X)<x>(Gal-Sia-C(H)=N-Q-CON-X)<y>formula (III),
[0672] pri čemu:
[0674] 1. A) Ab je antitelo kako je ovde definisano;
[0676] 2. B) Q je NH ili O;
[0678] 3. C) CON je konektorski deo molekula kako je ovde definisano;
[0680] 4. D) X je ciljni deo molekula kako je ovde definisano;
[0682] 5. E) Gal je komponenta izvedena iz galaktoze;
[0683] 6. F) Sia je komponenta izvedena iz sijalinske kiseline;
[0684] 7. G) x je 0 do 5; i
[0685] 8. H) y je 0 do 5,
[0686] pri čemu najmanje jedan od x i y nije 0.
[0687] U jednom slučaju, vezujući polipeptid može biti formule (IIIa):
[0688] Ab(Gal-C(H)=N-Q-CH<2>-C(O)-Z-X)<x>(Gal-Sia-C(H)=N-Q-CH<2>-C(O)-Z-X)<y>formula (IIIa),
[0689] pri čemu:
[0690] A) ABb je antitelo;
[0691] B) Q je NH ili O;
[0692] C) Z je Cys-(MC)<a->(VC)<h>-(PABC)<c->(C<16>H<32>O<8>C<2>H<4>)<f>-, pri čemu
[0693] i. Cys je komponenta izvedena iz cisteinamida;
[0694] ii. MC je komponenta izvedena iz maleimida;
[0695] iii. VC je komponenta izvedena iz valina spojenog sa citrulinom;
[0696] iv. PABC je komponenta izvedena iz 4-aminobenzil karbamata;
[0697] v. X je efektorski deo molekula (npr. ciljni deo molekula kako je ovde definisano);
[0698] vi. a je 0 ili 1;
[0699] vii. b je 0 ili 1;
[0700] viii.c je 0 ili 1; i
[0701] ix. f je 0 ili 1;
[0702] D) X je terapeutski agens kako je ovde definisano;
[0703] E) Gal je komponenta izvedena iz galaktoze;
[0704] F) Sia je komponenta izvedena iz sijalinske kiseline;
[0705] G) x je 0 do 5; i
[0706] H) y je 0 do 5,
[0707] pri čemu najmanje jedan od x i y nije 0.
[0708] Treba razumeti da formula (III) nema nameru da implicira da su antitelo, Gal supstituent i Gal-Sia supstituent povezani na način sličan lancu. Naprotiv, kada su takvi supstituenti prisutni, antitelo je povezano direktno sa svakim supstituentom. Na primer, vezujući polipeptid formule (III) u kojem je x 1 i y je 2 može imati raspored prikazan ispod:
[0710]
[0712] CON supstituent u formuli (III) i komponente u njoj su kako je opisano u vezi sa formulom (I) za efektorske delove molekula.
[0713] U jednom otelotvorenju, Q je NH. U drugom otelotvorenju, Q je O.
[0714] U jednom otelotvorenju, x je 0.
[0715] Antitelo Ab formule (III) može biti bilo koje odgovarajuće antitelo kako je ovde opisano.
[0716] U jednom slučaju, data je metoda za pripremu vezujućeg polipeptida formule (III), pri čemu metoda obuhvata reagovanje efektorskog dela molekula formule (I):
[0717] NH<2>-Q-CON-X formula (I),
[0718] pri čemu:
[0719] 1. A) Q je NH ili O;
[0720] 2. B) CON je konektorski deo molekula; i
[0721] 3. C) X je efektorski deo molekula (npr. ciljni deo molekula kako je ovde definisano), sa modifikovanim antitelom formule (II)
[0722] Ab(OXG)<r>formula (II)
[0723] pri čemu
[0724] 1. A) OXG je oksidovani glikan; i
[0725] 2. B) r je izabrano od 0 do 4;
[0726] U jednom slučaju, data je metoda za pripremu vezujućeg polipeptida formule (III), pri čemu metoda obuhvata reagovanje efektorskog dela molekula formule (I):
[0727] NH<2>-Q-CON-X formula (I),
[0728] pri čemu:
[0729] 1. A) Q je NH ili O;
[0730] 2. B) CON je konektorski deo molekula; i
[0731] 3. C) X je efektorski deo molekula (npr. ciljni deo molekula kako je ovde definisano),
[0732] sa modifikovanim antitelom formule (IIa)
[0733] Ab(Gal-C(O)H)<x>(Gal-Sia-C(O)H)<y>formula (IIa),
[0734] pri čemu
[0735] 1. A) Ab je antitelo kako je ovde opisano;
[0736] 2. B) Gal je komponenta izvedena iz galaktoze;
[0737] 3. C) Sia je komponenta izvedena iz sijalinske kiseline;
[0738] 4. D) x je 0 do 5; i
[0739] 5. E) y je 0 do 5,
[0740] pri čemu najmanje jedan od x i y nije 0.
[0741] VII. Metode lečenja modifikovanim antitelima
[0742] Sadašnji pronalazak pruža konjugat kako je definisan u zahtevima za upotrebu u terapeutskoj metodi olakšavanja isporuke vezujućeg polipeptida do ćelije. Međutim, generalno, sadašnje otkriće pruža metode lečenja ili dijagnostikovanja pacijenta kome je to potrebno, a koje obuhvataju primenu efektivne količine vezujućeg polipeptida otkrivenog ovde. U određenim slučajevima sadašnje otkriće pruža setove i metode za dijagnostikovanje i/ili lečenje poremećaja, npr. neoplastičnih poremećaja kod sisarskog subjekta kome je takvo lečenje potrebno. U određenim primernim slučajevima, subjekt je čovek.
[0743] Vezujući polipeptidi iz trenutnog otkrića su korisni u nizu različitih primena. Na primer, u jednom slučaju, vezujući polipeptidi su korisni za smanjenje ili eliminisanje ćelija koje nose epitop prepoznat od strane domena vezivanja vezujućeg polipeptida. U drugom slučaju, vezujući polipeptidi su efikasni u smanjenju koncentracije ili eliminisanju rastvorljivog antigena u cirkulaciji. U jednom slučaju, vezujući polipeptidi mogu smanjiti veličinu tumora, inhibirati rast tumora i/ili produžiti vreme preživljavanja životinja koje imaju tumor. Shodno tome, ovo otkriće se takođe odnosi na metodu lečenja tumora kod čoveka ili druge životinje primenom efektivne, netoksične količine modifikovanog antitela. Stručnjak u datoj oblasti bi mogao, rutinskim eksperimentisanjem, da odredi koja bi bila efektivna, netoksična količina modifikovanog vezujućeg polipeptida u svrhu lečenja malignih oboljenja. Na primer, terapeutski aktivna količina modifikovanog antitela ili jednog ili više njegovih fragmenata može varirati u zavisnosti od faktora kao što su stadijum bolesti (npr. stadijum I u odnosu na stadijum IV), starost, pol, medicinske komplikacije (npr. imunosupresivna stanja ili bolesti) i težina subjekta, kao i sposobnost modifikovanog antitela da izazove željeni odgovor kod subjekta. Režim doziranja može biti podešen da obezbedi optimalan terapeutski odgovor. Na primer, nekoliko podeljenih doza se može primeniti dnevno, ili doza može biti proporcionalno smanjena kako to zahtevaju okolnosti terapijske situacije.
[0745] Uopšteno, kompozicije pružene u trenutnom otkriću mogu se koristiti za profilaktičko ili terapeutsko lečenje bilo koje neoplazme koja obuhvata antigenski marker koji omogućava ciljanje kancerogenih ćelija modifikovanim antitelom.
[0747] Razume se da se ovde navedene reference na metode lečenja odnose na supstance i kompozicije za upotrebu u takvim metodama.
[0749] VIII. Metode primene modifikovanih antitela ili njihovih fragmenata
[0751] [0175] Metode pripreme i primene vezujućih polipeptida iz trenutnog otkrića subjektu su dobro poznate ili ih lako mogu utvrditi stručnjaci u datoj oblasti. Put primene vezujućih polipeptida iz trenutnog otkrića može biti oralni, parenteralni, putem inhalacije ili topikalni. Termin parenteralni, kao što se ovde koristi, uključuje intravensku, intraarterijalnu, intraperitonealnu, intramuskularnu, supkutanu, rektalnu ili vaginalnu primenu. Iako su svi ovi oblici primene jasno predviđeni da budu unutar opsega trenutnog otkrića, oblik za primenu bi bio rastvor za injekciju, posebno za intravensku ili intraarterijalnu injekciju ili infuziju. Obično, odgovarajuća farmaceutska kompozicija za injekciju može obuhvatiti pufer (npr. acetatni, fosfatni ili citratni pufer), surfaktant (npr. polisorbate), opcionalno stabilizirajući agens (npr. humani albumin), itd. Međutim, u drugim metodama kompatibilnim sa ovde navedenim uputstvima, modifikovana antitela se mogu isporučiti direktno na mesto nepovoljne ćelijske populacije, čime se povećava izloženost obolelog tkiva terapeutskom agensu.
[0753] U jednom slučaju, vezujući polipeptid koji se primenjuje je vezujući polipeptid formule (III):
[0755] Ab(Gal-C(H)=N-Q-CON-X)<x>(Gal-Sia-C(H)=N-Q-CON-X)<y>formula (III),
[0757] pri čemu:
[0759] 1. A) Ab je antitelo kako je ovde definisano;
[0761] 2. B) Q je NH ili O;
[0763] 3. C) CON je konektorski deo molekula kako je ovde definisano;
[0765] 4. D) X je efektorski deo molekula (npr. ciljni deo molekula kako je ovde definisano);
[0767] 5. E) Gal je komponenta izvedena iz galaktoze;
[0769] 6. F) Sia je komponenta izvedena iz sijalinske kiseline;
[0771] 7. G) x je 0 do 5; i
[0773] 8. H) y je 0 do 5,
[0775] pri čemu najmanje jedan od x i y nije 0.
[0777] [0177] Preparati za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene ili nevodene rastvore, suspenzije i emulzije. Primeri nevodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje, i injekcioni organski estri kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferovane medijume. U kompozicijama i metodama trenutnog otkrića, farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, 0,01-0,1 M, npr.0,05 M fosfatni pufer, ili 0,8% fiziološkog rastvora. Druga uobičajena parenteralna vozila uključuju rastvore natrijumfosfata, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum-hlorid, laktatni Ringerov rastvor, ili fiksna ulja. Intravenska vozila uključuju tečne i hranljive dopune, dopune elektrolita, kao što su one zasnovane na Ringerovoj dekstrozi, i slično. Konzervansi i drugi aditivi takođe mogu biti prisutni, na primer, antimikrobni agensi, antioksidansi, helatni agensi, i inertni gasovi i slično. Konkretnije, farmaceutske kompozicije pogodne za injekcionu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore (gde su rastvorljive u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporanu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. U takvim slučajevima, kompozicija mora biti sterilna i treba da bude dovoljno tečna da omogući lako ubrizgavanje. Trebalo bi da bude stabilna pod uslovima proizvodnje i skladištenja i obično će biti sačuvana od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (npr. glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), i odgovarajuće mešavine istih. Pravilna tečnost se može održati, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata.
[0779] Sprečavanje delovanja mikroorganizama može se postići raznim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U mnogim slučajevima, u kompoziciju će biti uključeni izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi, kao što su manitol, sorbitol, ili natrijumhlorid. Produžena apsorpcija injekcionih kompozicija može se postići uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum-monostearata i želatina.
[0781] [0179] U svakom slučaju, sterilni injekcioni rastvori se mogu pripremiti inkorporiranjem aktivnog jedinjenja (npr. modifikovanog vezujućeg polipeptida samog po sebi ili u kombinaciji sa drugim aktivnim agensima) u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom ovde navedenih sastojaka, kako je potrebno, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilno vozilo, koje sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke iz gore navedenih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, primeri metoda pripreme uključuju sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem, čime se dobija prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora istog. Preparati za injekcije se obrađuju, pune u kontejnere kao što su ampule, kese, boce, špricevi ili bočice, i zatvaraju u aseptičnim uslovima prema metodama poznatim u datoj oblasti. Nadalje, preparati se mogu pakovati i prodavati u obliku seta kao što su oni opisani u tekućim američkim serijama patenata br. 09/259,337 i američkim serijama patenata br. 09/259,338 . Takvi proizvodi će obično imati etikete ili uputstva za pakovanje koja ukazuju na to da su povezane kompozicije korisne za lečenje subjekta koji pati od, ili je predisponiran za autoimune ili neoplastične poremećaje.
[0783] Efikasne doze kompozicija iz sadašnjeg otkrića, za lečenje gore opisanih stanja, variraju u zavisnosti od mnogih različitih faktora, uključujući način primene, ciljano mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, druge primenjene lekove, i da li je lečenje profilaktičko ili terapeutsko. Obično, pacijent je čovek, ali se mogu lečiti i nehumani sisari, uključujući transgenične sisare. Doze lečenja mogu se titrirati korišćenjem rutinskih metoda poznatih stručnjacima u datoj oblasti kako bi se optimizovala sigurnost i efikasnost.
[0785] Za pasivnu imunizaciju sa vezujućim polipeptidom, doziranje se može kretati, npr., od oko 0,0001 do 100 mg/kg, i uobičajeno 0,01 do 5 mg/kg (npr. 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, itd.), telesne težine domaćina. Na primer, doziranje može biti 1 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili unutar opsega od 1-10 mg/kg, npr. najmanje 1 mg/kg. Doze u opsezima između gore navedenih takođe se smatraju unutar opsega trenutnog otkrića. Subjektima se takve doze mogu davati dnevno, naizmenično, nedeljno ili prema bilo kom drugom rasporedu utvrđenom empirijskom analizom. Primeran tretman podrazumeva primenu u više doza tokom produženog perioda, na primer, od najmanje šest meseci. Dodatni primerni režimi lečenja podrazumevaju primenu jednom u dve nedelje ili jednom mesečno ili jednom svakih 3 do 6 meseci. Primeri rasporeda doziranja uključuju 1-10 mg/kg ili 15 mg/kg tokom uzastopnih dana, 30 mg/kg naizmeničnim danima ili 60 mg/kg nedeljno. U nekim metodama, dva ili više monoklonalnih antitela sa različitim specifičnostima vezivanja primenjuju se istovremeno, u kom slučaju doziranje svakog primenjenog antitela spada u naznačene opsege.
[0787] [0182] Vezujući polipeptidi iz trenutnog otkrića mogu se primenjivati u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti nedeljni, mesečni ili godišnji. Intervali takođe mogu biti nepravilni, kako je naznačeno merenjem nivoa modifikovanog vezujućeg polipeptida ili antigena u krvi pacijenta. U nekim metodama, doziranje se prilagođava kako bi se postigla koncentracija modifikovanog vezujućeg polipeptida u plazmi od 1-1000 µg/ml, a u nekim metodama 25-300 µg/ml. Alternativno, vezujući polipeptidi se mogu primenjivati kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebna ređa primena. Za antitela, doziranje i učestalost variraju u zavisnosti od poluživota antitela kod pacijenta. Uopšteno, humanizovana antitela pokazuju najduži poluživot, a slede himerična antitela i ne-humana antitela.
[0789] Doziranje i učestalost primene mogu varirati u zavisnosti od toga da li je lečenje profilaktičko ili terapeutsko. U profilaktičkim primenama, kompozicije koje sadrže sadašnja antitela ili koktel istih se primenjuju pacijentu koji već nije u stanju bolesti kako bi se poboljšala pacijentova otpornost. Takva količina je definisana kao „profilaktička efektivna doza“. U ovoj upotrebi, precizne količine ponovo zavise od pacijentovog zdravstvenog stanja i opšteg imuniteta, ali se generalno kreću od 0,1 do 25 mg po dozi, posebno 0,5 do 2,5 mg po dozi. Relativno niska doza se primenjuje u relativno retkim intervalima tokom dugog vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da primaju tretman do kraja života. U terapeutskim primenama, ponekad je potrebna relativno visoka doza (npr. od oko 1 do 400 mg/kg antitela po dozi, pri čemu se doze od 5 do 25 mg češće koriste za radioimunokonjugate, a veće doze za citotoksin-lek modifikovana antitela) u relativno kratkim intervalima dok se napredovanje bolesti ne smanji ili ne zaustavi, ili dok pacijent ne pokaže delimično ili potpuno ublažavanje simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu se može primeniti profilaktički režim.
[0791] Vezujući polipeptidi iz trenutnog otkrića se opcionalno mogu primenjivati u kombinaciji sa drugim agensima koji su efikasni u lečenju poremećaja ili stanja kojima je potrebno lečenje (npr. profilaktičko ili terapeutsko). Efikasne pojedinačne doze lečenja (tj. terapeutski efektivne količine)
[0792] 90Y-obeleženih modifikovanih antitela iz trenutnog otkrića kreću se od između oko 5 i oko 75 mCi, kao što je između oko 10 i oko 40 mCi. Efikasne pojedinačne doze lečenja koje ne ablaciraju koštanu srž<131>I-modifikovanih antitela kreću se od između oko 5 i oko 70 mCi, ili između oko 5 i oko 40 mCi. Efikasne pojedinačne doze ablativnog lečenja (tj. mogu zahtevati autolognu transplantaciju koštane srži)<131>I-obeleženih antitela kreću se od između oko 30 i oko 600 mCi, kao što je između oko 50 i manje od oko 500 mCi. U kombinaciji sa himeričnim antitelom, zbog dužeg cirkulišućeg poluživota u odnosu na mišja antitela, efikasne pojedinačne doze lečenja koje ne ablaciraju koštanu srž jodom-131 obeleženih himeričnih antitela kreću se od između oko 5 i oko 40 mCi, kao što je manje od oko 30 mCi. Kriterijumi za snimanje za, npr.,<111>In obeleživač, tipično su manji od oko 5 mCi.
[0794] Iako se vezujući polipeptidi mogu primenjivati kao što je opisano neposredno iznad, mora se naglasiti da se u drugim slučajevima vezujući polipeptidi mogu primenjivati inače zdravim pacijentima kao terapija prve linije. U takvim slučajevima, vezujući polipeptidi se mogu primenjivati pacijentima koji imaju normalne ili prosečne rezerve crvene koštane srži i/ili pacijentima koji nisu i ne prolaze kroz tretman. Kao što se ovde koristi, primena modifikovanih antitela ili njihovih fragmenata u vezi ili kombinaciji sa dopunskom terapijom znači sekvencijalnu, simultanu, koekstenzivnu, konkurentnu, konkomitantnu ili savremenu primenu ili nanošenje terapije i otkrivenih antitela. Oni koji su stručni u datoj oblasti ceniće da se primena ili nanošenje različitih komponenti kombinovanog terapeutskog režima može vremenski uskladiti kako bi se poboljšala ukupna efikasnost lečenja. Na primer, hemoterapijski agensi bi se mogli primeniti u standardnim, dobro poznatim kursevima lečenja, nakon čega bi se u roku od nekoliko nedelja primenili radioimunokonjugati iz sadašnjeg otkrića. Nasuprot tome, vezujući polipeptidi povezani sa citotoksinom bi se mogli primeniti intravenski, nakon čega bi usledilo spoljno zračenje usmereno na tumor. U drugim slučajevima, modifikovani vezujući polipeptid se može primenjivati istovremeno sa jednim ili više izabranih hemioterapijskih agenasa u jednoj poseti ordinaciji. Vešt stručnjak (npr. iskusan onkolog) bi lako mogao da razazna efikasne kombinovane terapijske režime bez preteranog eksperimentisanja, na osnovu izabrane dopunske terapije i uputstava iz sadašnje specifikacije.
[0796] [0186] U tom smislu, biće cenjeno da se kombinacija vezujućih polipeptida i hemioterapijskog agensa može primenjivati u bilo kom redosledu i u bilo kom vremenskom okviru koji pruža terapeutsku korist pacijentu. Odnosno, hemioterapijski agens i vezujući polipeptidi se mogu primenjivati u bilo kom redosledu ili istovremeno. U odabranim slučajevima, vezujući polipeptidi iz sadašnjeg otkrića će se primenjivati pacijentima koji su prethodno prošli hemioterapiju. U drugim slučajevima, vezujući polipeptidi i hemioterapijski tretman će se primenjivati suštinski simultano ili istovremeno. Na primer, pacijentu se mogu davati vezujući polipeptidi dok prolazi kroz kurs hemioterapije. U nekim slučajevima, modifikovano antitelo će biti primenjeno u roku od jedne godine od bilo kog hemioterapijskog agensa ili tretmana. U drugim slučajevima, vezujući polipeptidi će biti primenjeni u roku od 10, 8, 6, 4, ili 2 meseca od bilo kog hemioterapijskog agensa ili tretmana. U drugim slučajevima, vezujući polipeptid će biti primenjen u roku od 4, 3, 2, ili 1 nedelje od bilo kog hemioterapijskog agensa ili tretmana. U drugim slučajevima, vezujući polipeptidi će biti primenjeni u roku od 5, 4, 3, 2, ili 1 dana od izabranog hemioterapijskog agensa ili tretmana. Dalje će biti cenjeno da se dva agensa ili tretmana mogu primeniti pacijentu u roku od nekoliko sati ili minuta (tj. suštinski simultano).
[0798] Dalje će biti cenjeno da se vezujući polipeptidi iz trenutnog otkrića mogu koristiti u vezi ili kombinaciji sa bilo kojim hemioterapijskim agensom ili agensima (npr. da bi se obezbedio kombinovani terapeutski režim) koji eliminiše, smanjuje, inhibira ili kontroliše rast neoplastičnih ćelija in vivo. Primeri hemioterapijskih agenasa koji su kompatibilni sa trenutnim otkrićem uključuju alkilirajuće agense, vinka alkaloide (npr. vinkristin i vinblastin), prokarbazin, metotreksat i prednizon. Kombinacija od četiri leka MOPP (mehloretamin (azotni iperit), vinkristin (Oncovin), prokarbazin i prednizon) je veoma efikasna u lečenju različitih vrsta limfoma. Kod pacijenata otpornih na MOPP, mogu se koristiti kombinacije ABVD (npr. adriamicin, bleomicin, vinblastin i dakarbazin), ChIVPP (hlorambucil, vinblastin, prokarbazin i prednizon), CABS (lomustin, doksorubicin, bleomicin i streptozotocin), MOPP plus ABVD, MOPP plus ABV (doksorubicin, bleomicin i vinblastin) ili BCVPP (karmustin, ciklofosfamid, vinblastin, prokarbazin i prednizon). Videti Arnold S. Freedman and Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, u HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher et al, eds., 13th ed. 1994) i V. T. DeVita et al, (1997) i reference citirane tamo za standardno doziranje i rasporede. Ove terapije se mogu koristiti neizmenjeno, ili modifikovane po potrebi za određenog pacijenta, u kombinaciji sa jednim ili više vezujućih polipeptida iz trenutnog otkrića kako je ovde opisano.
[0800] Dodatni režimi koji su korisni u kontekstu sadašnjeg otkrića uključuju upotrebu pojedinačnih alkilirajućih agenasa kao što su ciklofosfamid ili hlorambucil, ili kombinacije kao što su CVP (ciklofosfamid, vinkristin i prednizon), CHOP (CVP i doksorubicin), C-MOPP (ciklofosfamid, vinkristin, prednizon i prokarbazin), CAP-BOP (CHOP plus prokarbazin i bleomicin), m-BACOD (CHOP plus metotreksat, bleomicin i leukovorin), ProMACE-MOPP (prednizon, metotreksat, doksorubicin, ciklofosfamid, etopozid i leukovorin plus standardni MOPP), ProMACE-CytaBOM (prednizon, doksorubicin, ciklofosfamid, etopozid, citarabin, bleomicin, vinkristin, metotreksat i leukovorin) i MACOP-B (metotreksat, doksorubicin, ciklofosfamid, vinkristin, fiksna doza prednizona, bleomicin i leukovorin). Oni koji su stručni u datoj oblasti će lako moći da odrede standardno doziranje i rasporede za svaki od ovih režima.
[0801] CHOP je takođe kombinovan sa bleomicinom, metotreksatom, prokarbazinom, azotnim iperitom, citozin arabinozidom i etopozidom. Drugi kompatibilni hemioterapijski agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, 2-hlorodeoksiadenozin (2-CDA), 2'-deoksikoformicin i fludarabin.
[0803] Za pacijente sa NHL-om srednjeg i visokog stepena (ne-Hočkinov limfom), koji ne uspeju da postignu remisiju ili imaju recidiv, koristi se terapija spašavanja. Terapije spašavanja koriste lekove kao što su citozin arabinozid, karboplatin, cisplatin, etopozid i ifosfamid dati sami ili u kombinaciji. U relapsu ili agresivnim oblicima određenih neoplastičnih poremećaja često se koriste sledeći protokoli: IMVP-16 (ifosfamid, metotreksat i etopozid), MIME (metilgag, ifosfamid, metotreksat i etopozid), DHAP (deksametazon, visoka doza citarabina i cisplatin), ESHAP (etopozid, metilpredisolon, HD citarabin, cisplatin), CEPP(B) (ciklofosfamid, etopozid, prokarbazin, prednizon i bleomicin) i CAMP (lomustin, mitoksantron, citarabin i prednizon), svaki sa dobro poznatim stopama doziranja i rasporedima.
[0805] Količina hemioterapijskog agensa koja se koristi u kombinaciji sa modifikovanim antitelima iz trenutnog otkrića može varirati po subjektu ili se može primeniti prema onome što je poznato u datoj oblasti. Videti, na primer, Bruce A Chabner et al, Antineoplastic Agents, u GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 ((Joel G. Hardman et al, eds., 9th ed.1996).
[0807] Kao što je prethodno diskutovano, vezujući polipeptidi iz sadašnjeg otkrića, imunoreaktivni fragmenti ili rekombinanti istih mogu se primenjivati u farmaceutski efektivnoj količini za in vivo lečenje sisarskih poremećaja. U tom smislu, biće cenjeno da će otkriveni vezujući polipeptidi biti formulisani da olakšaju primenu i promovišu stabilnost aktivnog agensa.
[0809] [0192] Farmaceutska kompozicija u skladu sa sadašnjim otkrićem može obuhvatiti farmaceutski prihvatljiv, netoksičan, sterilan nosač kao što je fiziološki rastvor, netoksični puferi, konzervansi i slično. Za svrhe ove primene, farmaceutski efektivna količina modifikovanog vezujućeg polipeptida, imunoreaktivnog fragmenta ili rekombinanta istog, konjugovanog ili nekonjugovanog sa terapeutskim agensom, treba smatrati količinom dovoljnom za postizanje efektivnog vezivanja za antigen i postizanje koristi, npr. za ublažavanje simptoma bolesti ili poremećaja ili za detekciju supstance ili ćelije. U slučaju tumorskih ćelija, modifikovani vezujući polipeptid može interagovati sa odabranim imunoreaktivnim antigenima na neoplastičnim ili imunoreaktivnim ćelijama i obezbediti povećanje smrtnosti tih ćelija. Naravno, farmaceutske kompozicije sadašnjeg otkrića se mogu primenjivati u pojedinačnim ili višestrukim dozama kako bi se obezbedila farmaceutski efektivna količina modifikovanog vezujućeg polipeptida.
[0811] U skladu sa opsegom sadašnjeg otkrića, vezujući polipeptidi iz otkrića mogu se primenjivati čoveku ili drugoj životinji u skladu sa gore navedenim metodama lečenja u količini dovoljnoj da proizvede terapeutski ili profilaktički efekat. Vezujući polipeptidi iz otkrića se mogu primenjivati takvom čoveku ili drugoj životinji u konvencionalnom doznom obliku pripremljenom kombinovanjem antitela iz otkrića sa konvencionalnim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razređivačem prema poznatim tehnikama. Stručnjak u datoj oblasti će prepoznati da su oblik i karakter farmaceutski prihvatljivog nosača ili razređivača diktirani količinom aktivnog sastojka sa kojom se treba kombinovati, putem primene i drugim dobro poznatim varijablama. Oni koji su stručni u datoj oblasti će dalje ceniti da se koktel koji obuhvata jednu ili više vrsta vezujućih polipeptida opisanih u trenutnom otkriću može pokazati kao posebno efikasan.
[0813] IX. Ekspresija vezujućih polipeptida
[0815] Sadašnje otkriće takođe pruža polinukleotide koji kodiraju vezujuće polipeptide otkrivene ovde. Takođe je data metoda za pravljenje vezujućeg polipeptida koja obuhvata ekspresiju ovih polinukleotida.
[0817] Polinukleotidi koji kodiraju vezujuće polipeptide otkrivene ovde obično se ubacuju u ekspresioni vektor radi uvođenja u ćelije domaćina koje se mogu koristiti za proizvodnju željene količine pronalaskom zaštićenih antitela, ili njihovih fragmenata. Shodno tome, u određenim aspektima, otkriće pruža ekspresione vektore koji obuhvataju polinukleotide otkrivene ovde i ćelije domaćina koje obuhvataju ove vektore i polinukleotide.
[0819] Termin „vektor” ili „ekspresioni vektor” se ovde koristi za svrhe specifikacije i zahteva, da znači vektore koji se koriste u skladu sa sadašnjim otkrićem kao vozilo za uvođenje i ekspresiju željenog gena u ćeliji. Kao što je poznato onima koji su stručni u datoj oblasti, takvi vektori se lako mogu izabrati iz grupe koja se sastoji od plazmida, faga, virusa i retrovirusa.
[0820] Uopšteno, vektori kompatibilni sa sadašnjim otkrićem obuhvataće selekcioni marker, odgovarajuća restrikciona mesta za olakšavanje kloniranja željenog gena i sposobnost ulaska i/ili replikacije u eukariotskim ili prokariotskim ćelijama.
[0822] Mnogi sistemi ekspresionih vektora se mogu koristiti za svrhe ovog otkrića. Na primer, jedna klasa vektora koristi DNK elemente koji su izvedeni iz životinjskih virusa kao što su virus goveđeg papiloma, polioma virus, adenovirus, vakcinia virus, bakulovirus, retrovirusi (RSV, MMTV ili MOMLV), ili SV40 virus. Drugi uključuju upotrebu policistronskih sistema sa unutrašnjim mestima vezivanja ribozoma. Dodatno, ćelije koje su integrisale DNK u svoje hromozome mogu se odabrati uvođenjem jednog ili više markera koji omogućavaju selekciju transfekovanih ćelija domaćina. Marker može obezbediti prototrofiju auksofonom domaćinu, otpornost na biocid (npr. antibiotike) ili otpornost na teške metale kao što je bakar. Gen selekcionog markera može biti direktno povezan sa DNK sekvencama koje treba ekspresovati, ili uveden u istu ćeliju kotransformacijom. Dodatni elementi takođe mogu biti potrebni za optimalnu sintezu iRNK. Ovi elementi mogu uključivati signalne sekvence, signale spajanja, kao i transkripcione promotere, pojačivače i terminacione signale. U nekim slučajevima, klonirani geni varijabilnog regiona se ubacuju u ekspresioni vektor zajedno sa genima konstantnog regiona teškog i lakog lanca (kao što su humani geni) sintetizovanim kako je gore diskutovano.
[0824] U drugim slučajevima, vezujući polipeptidi predstavljeni u otkriću mogu biti ekspresovani korišćenjem policistronskih konstrukta. U takvim ekspresionim sistemima, višestruki genski proizvodi od interesa, kao što su teški i laki lanci antitela, mogu se proizvesti iz jednog policistronskog konstrukta. Ovi sistemi na prednostan način koriste unutrašnje mesto ulaska ribozoma (IRES) da bi obezbedili relativno visoke nivoe polipeptida u eukariotskim ćelijama domaćina. Kompatibilne IRES sekvence su otkrivene u američkom patentu br.
[0825] 6,193,980 .
[0827] Oni koji su stručni u datoj oblasti ceniće da se takvi ekspresioni sistemi mogu koristiti za efikasnu proizvodnju celog spektra polipeptida otkrivenih u sadašnjoj primeni.
[0829] [0200] Uopšteno, nakon što je vektor ili DNK sekvenca koja kodira antitelo, ili njegov fragment, pripremljen, ekspresioni vektor se može uvesti u odgovarajuću ćeliju domaćina. Odnosno, ćelije domaćina mogu biti transformisane. Uvođenje plazmida u ćeliju domaćina može se postići raznim tehnikama dobro poznatim onima koji su stručni u datoj oblasti. Ovo uključuje, ali nije ograničeno na, transfekciju (uključujući elektroforezu i elektroporaciju), fuziju protoplasta, taloženje kalcijum-fosfata, ćelijsku fuziju sa obavijenom DNK, mikroinjekciju i infekciju intaktnim virusom. Videti, Ridgway, A. A. G. „Mammalian Expression Vectors” Chapter 24,2, pp, 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass.1988). Transformisane ćelije se gaje pod uslovima pogodnim za proizvodnju lakih lanaca i teških lanaca, i testiraju se na sintezu proteina teškog i/ili lakog lanca. Primeri tehnika testiranja uključuju enzimski-vezani imunosorbentni test (ELISA), radioimunotest (RIA), ili analizu ćelijskog sortera aktiviranog fluorescencijom (FACS), imunohistohemiju i slično.
[0831] Kao što se ovde koristi, termin „transformacija” će se koristiti u širokom smislu da se odnosi na uvođenje DNK u recipijentnu ćeliju domaćina koja menja genotip i posledično rezultira promenom u recipijentnoj ćeliji.
[0833] U tom smislu, „ćelije domaćina” se odnose na ćelije koje su transformisane vektorima konstruisanim korišćenjem rekombinantnih DNK tehnika i koje kodiraju najmanje jedan heterologni gen. U opisima procesa za izolaciju polipeptida iz rekombinantnih domaćina, termini „ćelija” i „ćelijska kultura” se koriste naizmenično da označe izvor antitela, osim ako nije jasno drugačije naznačeno. Drugim rečima, dobijanje polipeptida iz „ćelija” može značiti bilo iz centrifugiranih celih ćelija, bilo iz ćelijske kulture koja sadrži i medijum i suspendovane ćelije.
[0835] [0203] U jednom slučaju, ćelijska linija domaćina korišćena za ekspresiju antitela je sisarskog porekla; oni koji su stručni u datoj oblasti mogu odrediti određene ćelijske linije domaćina koje su najbolje prilagođene za željeni genski proizvod koji treba ekspresovati u njima. Primeri ćelijskih linija domaćina uključuju, ali nisu ograničeni na, DG44 i DUXB11 (linije kineskog hrčka jajnika, DHFR minus), HELA (humani karcinom grlića materice), CVI (linija majmunskog bubrega), COS (derivat CVI sa SV40 T antigenom), R1610 (fibroblast kineskog hrčka), BALBC/3T3 (mišji fibroblast), HAK (linija hrčkovog bubrega), SP2/O (mišji mijelom), BFA-1c1BPT (goveđe endotelijalne ćelije), RAJI (humani limfocit), 293 (ljudski bubreg). U jednom slučaju, ćelijska linija obezbeđuje izmenjenu glikozilaciju, npr. afukozilaciju, antitela ekspresovanog iz nje (npr. PER.C6.RTM. (Crucell) ili FUT8-knock-out CHO ćelijske linije (Potelligent.RTM. Cells) (Biowa, Princeton, N.J.)). U jednom slučaju, mogu se koristiti NS0 ćelije. Ćelijske linije domaćina su obično dostupne iz komercijalnih usluga, iz Američke kolekcije kultura tkiva ili iz objavljene literature.
[0837] In vitro proizvodnja omogućava povećanje obima radi dobijanja velikih količina željenih polipeptida. Tehnike za kultivaciju ćelija sisara pod uslovima kulture tkiva poznate su u datoj oblasti i uključuju homogenu suspenziju kulture, npr. u reaktoru sa vazdušnim podizanjem ili u reaktoru sa kontinuiranim mešačem, ili imobilizovanu ili zarobljenu ćelijsku kulturu, npr. u šupljim vlaknima, mikrokapsulama, na agaroznim mikrozrnima ili keramičkim kertridžima. Ako je neophodno i/ili poželjno, rastvori polipeptida se mogu prečistiti uobičajenim hromatografskim metodama, na primer gel filtracijom, hromatografijom jonske razmene, hromatografijom preko DEAE-celuloze i/ili (imuno-)afinitetnom hromatografijom.
[0839] Jedan ili više gena koji kodiraju vezujuće polipeptide takođe se mogu ekspresovati u ćelijama koje nisu sisarske, kao što su bakterije ili kvasac ili biljne ćelije. U tom smislu, biće cenjeno da se razni jednoćelijski ne-sisarski mikroorganizmi kao što su bakterije takođe mogu transformisati; tj. oni koji su sposobni da se gaje u kulturama ili fermentaciji. Bakterije koje su podložne transformaciji uključuju članove enterobacteriaceae, kao što su sojevi Escherichia coli ili Salmonella; Bacillaceae, kao što je Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, i Haemophilus influenzae. Dalje će biti cenjeno da, kada se ekspresuju u bakterijama, polipeptidi mogu postati deo inkluzionih tela. Polipeptidi se moraju izolovati, prečistiti i zatim sastaviti u funkcionalne molekule.
[0841] Pored prokariota, mogu se koristiti i eukariotski mikroorganizmi. Saccharomyces cerevisiae, ili običan pekarski kvasac, je najčešće korišćen među eukariotskim mikroorganizmima, iako je niz drugih sojeva uobičajeno dostupan. Za ekspresiju u Saccharomyces, plazmid YRp7, na primer, (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)) se uobičajeno koristi. Ovaj plazmid već sadrži TRP1 gen koji obezbeđuje selekcioni marker za mutantni soj kvasca kome nedostaje sposobnost rasta u triptofanu, na primer ATCC br. 44076 ili PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). Prisustvo trpl lezije kao karakteristike genoma ćelije domaćina kvasca zatim obezbeđuje efikasno okruženje za detekciju transformacije putem rasta u odsustvu triptofana.
[0843] PRIMERI
[0844] Sadašnje otkriće je dalje ilustrovano sledećim primerima koje ne treba tumačiti kao ograničavajuće za pronalazak.
[0846] Primeri 18 i 19 u nastavku opisuju konjugaciju delova molekula koji sadrže manoza-6-fosfat sa vezujućim polipeptidima. Drugi primeri u nastavku mogu pružiti korisne smernice stručnom čitaocu za razumevanje sadašnjeg pronalaska i/ili sprovođenje pronalaska u praksi.
[0848] Primer 1. Dizajn, priprema i karakterizacija 2C3 anti-CD-52 hiperglikozilacionih mutanata antitela
[0850] Dizajnirano je više hiperglikozilacionih mutacija u teškom lancu anti-CD-52 antitela, 2C3, sa ciljem dodavanja glomazne grupe na interfejs interakcije (npr. mesto vezivanja FcRn radi modulacije farmakokinetike antitela), za modulaciju efektorske funkcije antitela promenom njegove interakcije sa FcγR, ili za uvođenje novog mesta unakrsnog povezivanja nakon hemijske modifikacije za konjugaciju efektorskog dela molekula, uključujući, ali ne ograničavajući se na, lekove, toksine, citotoksične agense, radionuklide i slično. Hiperglikozilovani 2C3 mutanti su navedeni u tabeli 3.
[0852] Tabela 3. Hiperglikozilovani 2C3 anti-CD-52 mutanti
[0854]
[0855]
[0858] 1 A. Stvaranje 2C3 anti-CD-52 hiperglikozilacionih mutanata antitela
[0860] Mutacija A114N, označena na osnovu Kabat sistema numeracije (ekvivalentno EU poziciji 118), je uvedena u CH1 domen 2C3 pomoću mutageneze PCR-om. Da bi se stvorilo antitelo pune dužine, VH domen plus mutirana rezidua A114N je ubačena kloniranjem nezavisnim od ligacije (LIC) u pENTR-LIC-IgG1 vektor koji kodira CH domene antitela 1-3. Sve ostale mutacije su uvedene na pENTR-LIC-IgG1 pomoću mutagenetskog kita za mutagenizu specifičnu za mesto QuikChange (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, SAD). WT 2C3 VH je kloniran u mutirane vektore pomoću LIC. Mutanti pune dužine su klonirani u pCEP4(-E+I)Dest ekspresioni vektor pomoću Gateway kloniranja. Fc mutacije su označene na osnovu EU sistema numeracije. Mutacije su potvrđene sekvenciranjem DNK. Aminokiselinske sekvence WT 2C3 teškog i lakog lanca i mutiranih 2C3 teških lanaca su navedene u tabeli 4. Mutirane aminokiseline su osenčene, a konsenzusna ciljna mesta glikozilacije stvorena mutacijom su podvučena.
[0862] Tabela 4. Aminokiselinske sekvence 2C3 anti-CD-52 antitela
[0864]
[0865] SEQ ID Naziv Aminokiselinska sekvenca
[0866]
[0867]
[0868]
[0869] Mutanti i WT kontrola su transfektovani u IIEK293-EBNA ćelije u formatu ploče sa 6 bunarčića. Kao što je prikazano na slici 9A, nivo ekspresije je bio ~0,1 µg/ml, kako je analizirano pomoću SDS-PAGE i Western blot-a. Ekspresija mutanata u kondicioniranom medijumu je takođe merena hvatanjem proteina A na Biacore-u. Koncentracija je određena korišćenjem disocijacionog odgovora 6 minuta nakon injekcije u imobilizovani Protein A. WT 2C3 proizveden u CHO ćelijama, serijski razređen u medijumu od 90 µg/ml do 1,5 ng/ml, korišćen je kao standardna kriva. Koncentracije su izračunate do ~0,2 µg/ml pomoću kalibracione krive koristeći 4-parametarsko uklapanje. Kao što je prikazano na slici 9B, relativni nivoi ekspresije su bili niski i generalno su odgovarali rezultatima Western blot-a.
[0871] 1B. Provera hiperglikozilacije
[0873] Da bi se utvrdilo da li su mutacijom uvedena dodatna mesta glikozilacije, mutirani 2C3 i proteini divljeg tipa su tretirani univerzalnim enzimom za deglikozilaciju PNGase F i uzorci proteina su analizirani pomoću SDS-PAGE i Western blot-a. Kao što je prikazano na slici 10, samo je A114N mutant imao povećanu prividnu molekulsku težinu, što ukazuje na prisustvo dodatnog N-vezanog ugljenog hidrata.
[0875] Pripreme antitela malog obima su proizvedene radi prečišćavanja 2C3 mutanata za dalju proveru uvođenja mesta glikozilacije. Kao što je prikazano na slici 11, SDS-PAGE metodom je potvrđeno da je samo A114N mutant imao uvedena dodatna mesta glikozilacije.
[0877] 1C. Svojstva vezivanja 2C3 anti-CD-52 mutanata
[0879] Biacore je korišćen za poređenje svojstava vezivanja prečišćenih proteina. Mišji i SEC-prečišćeni humani FcRn-HPC4 su imobilizovani na CM5 čipu putem spajanja amina. Svako antitelo je razređeno na 200, 50 i 10 nM i ubrizgano preko imobilizovanih Fc receptora. Campath, WT 2C3 proizveden u CHO ćelijama, i Campath tretiran DEPC-om uključeni su kao pozitivne i negativne kontrole. Kao što je prikazano na slici 13, Y436S mutant je pokazao oko 2 puta smanjenje vezivanja za humani FcRn. Zanimljivo je da vezivanje ovog mutanta za mišji FcRn nije bilo pogođeno. Nijedna od ostalih 2C3 mutacija nije imala značajan efekat na vezivanje humanog ili mišjeg FcRn.
[0880] Biacore je korišćen za poređenje svojstava vezivanja antigena prečišćenih proteina pomoću testa vezivanja Biacore za CD-52 peptid 741. CD-52 peptid 741 i kontrolni peptid 777 su imobilizovani na CM5 čipu. Antitela su serijski razređena 2 puta od 60 do 0,2 nM u HBS-EP i ubrizgana u duplikatu tokom 3 min, nakon čega je usledila 5-minutna disocijacija u puferu pri protoku od 50 µL/min. GLD52 partija 17200-084 je uključena kao kontrola. Površina je regenerisana sa 1 pulsom 40 mM HCl. Model vezivanja 1:1 je korišćen za uklapanje krivih od 7,5 do 0,2 nM. Kao što je prikazano na slici 16, A114N mutant je imao nešto niži afinitet vezivanja za CD-52, dok je NGT mutant imao nešto viši afinitet od ostalih mutanata u ovom testu. Test vezivanja Biacore za CD-52 peptid 741 je ponovljen sa proteinom prečišćenim iz veće pripreme. Kao što je prikazano na slici 17, A114N mutant je pokazao vezivanje za CD-52 peptid koje je bilo uporedivo sa WT 2C3.
[0882] 1D. Karakterizacija naboja A114N mutanta
[0884] Izoelektrično fokusiranje (IEF) je izvršeno da bi se okarakterisao naboj 2C3 mutanata. Prečišćeni protein je testiran na imobilizovanim pH gradijentnim (pH 3-10) akrilamidnim (IPG) gelovima. Kao što je prikazano na slici 18A, utvrđeno je da A114N ima više negativnih naboja, verovatno zbog rezidua sijalinske kiseline. Podaci intaktnog MS su potvrdili kompleksnu strukturu sa sijalinskim kiselinama na A114N mutantu. Nasuprot tome, pokazano je da WT 2C3 ima G0F i G1F kao dominantne glikozilacione vrste (slike 18C i 18D, respektivno).
[0886] Primer 2. Priprema hiperglikozilacionih mutanata u nekoliko kičmi antitela
[0888] Pored 2C3 anti-CD-52 antitela, mutacija A114N je stvorena inženjeringom u nekoliko drugih kičmi antitela kako bi se potvrdilo da se jedinstveno mesto hiperglikozilacije može uvesti u nepovezane sekvence varijabilnog domena teškog lanca. Hiperglikozilovani anti-TEM1, anti-FAP i anti-Her2 mutanti su navedeni u tabeli 5.
[0890] Tabela 5. A114N i/ili S298N mutanti dizajnirani u nekoliko nepovezanih kičmi antitela
[0892]
[0893] Mutacija Antitelo Željene koristi Primena
[0895]
[0898] 2A. Stvaranje anti-TEM1 i anti-FAP hiperglikozilacionih mutanata antitela
[0900] Mutacija A114N, označena na osnovu Kabat sistema numeracije, je uvedena u CH1 domen anti-TEM1 i anti-FAP pomoću mutageneze PCR-om. Da bi se stvorilo antitelo pune dužine, mutirani VH plus rezidua 114 je ubačena kloniranjem nezavisnim od ligacije (LIC) u pENTR-LIC-IgG1 vektor koji kodira CH domene antitela 1-3. Mutanti pune dužine su zatim klonirani u pCEP4(-E+I)Dest ekspresioni vektor pomoću Gateway kloniranja. Mutacije su potvrđene sekvenciranjem DNK. Aminokiselinske sekvence anti-TEM1 divljeg tipa i mutiranih teških i lakih lanaca su navedene u tabeli 6. Mutirane aminokiseline su osenčene, a konsenzusna ciljna mesta glikozilacije stvorena mutacijom su podvučena.
[0901] Tabela 6. Aminokiselinske sekvence anti-TEM1 i anti-FAP antitela
[0902]
[0903] SEQ ID Naziv Aminokiselinska sekvenca
[0905]
[0908] Mutanti i kontrola divljeg tipa su transfektovani u HEK293-EBNA ćelije u formatu trostruke boce i prečišćeni na HiTrap protein A kolonama (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, SAD). Kao što je analizirano pomoću A280 na NanoDrop spektrofotometru, ekspresija anti-FAP A114N i anti-FAP A114C bila je oko 3 µg/ml i oko 1 µg/ml, respektivno. Ekspresija anti-TEM1 A114N je bila oko 0,04 µg/ml.
[0910] 2B. Provera hiperglikozilacije
[0912] Da bi se potvrdilo da je dodatno mesto glikozilacije uvedeno u A114N mutante, prečišćeni protein iz A114N mutanata je analiziran na reducirajućem SDS-PAGE gelu zajedno sa kontrolnim proteinom divljeg tipa. Jedno dodatno mesto glikozilacije dodalo bi 2000-3000 Daltona molekulskoj težini teškog lanca. Kao što je prikazano na slici 20, SDS-PAGE je pokazao da su trake teškog lanca anti-FAP i anti-TEM1 A114N mutanata imale povećanu prividnu molekulsku težinu, što je u skladu sa uspešnim uvođenjem dodatnog mesta glikozilacije u oba antitela.
[0914] 2C. Stvaranje anti-Her2 hiperglikozilacionih mutanata antitela
[0916] [0220] Her-2 A114N, Her-2 A114N/NNAS i WT Her-2 antitela su stvorena kloniranjem nezavisnim od ligacije. VH domen Herceptin-a je sintetizovan i pojačan PCR-om sa dva skupa prajmera kompatibilna sa LIC-om, bilo WT ili sa mutacijom A114N. Da bi se dobilo antitelo pune dužine, pojačani VH inserti (WT ili A114N) su klonirani u dva pENTR vektora koji kodiraju CH 1-3 domene, pENTR-LIC-IgG1 WT i pENTR-LIC-IgG1 NNAS, što je rezultiralo sa tri mutanta pune dužine (A114N, NNAS, A114N/NNAS) i WT kontrolom kao ulaznim klonovima na pENTR. Ovi mutanti su klonirani u pCEP4(-E+I)Dest ekspresioni vektor, pomoću Gateway kloniranja. Mutacije su potvrđene sekvenciranjem DNK. Aminokiselinske sekvence anti-Her-2 divljeg tipa i mutiranih teških i lakih lanaca su navedene u tabeli 7.
[0917] Mutirane aminokiseline su osenčene, a konsenzusna ciljna mesta glikozilacije stvorena mutacijom su podvučena.
[0919] Tabela 7. Aminokiselinske sekvence anti-Her-2 antitela
[0920] SEQ ID Naziv Aminokiselinska sekvenca
[0922]
[0925] 2D. Ekspresija A114N anti-Her2 hiperglikozilacionog mutanta antitela
[0927] A114N anti-Her2 i konstrukti divljeg tipa su transfektovani sa Lipofectamine-2000 (odnos reagensa i DNK 2,5:1) i XtremeGene HP (odnos reagensa i DNK 3:1) u HEK293-EBNA ćelije u 12 trostrukih boca. Octet merenje alikvota iz kondicioniranog medijuma (CM) 3. dana pokazalo je da je ekspresija proteina bila konzistentna u svih 6 boca za Lipofectamine-2000 i XtremeGene HP. Kao što je prikazano u tabeli 8, ukupna efikasnost transfekcije bila je oko 30% veća sa XtremeGene HP. Kondicionirani medijum sakupljen 3. dana je sjedinjen za oba uslova transfekcije i prečišćen kolonom proteina A. Octet merenje je pokazalo 1,8 µg/ml antitela u kontrolnom medijumu koji sadrži serum, u odnosu na 0 µg/ml u kontrolnom medijumu bez seruma.
[0929] Tabela 8. Ekspresija A114N anti-Her2 hiperglikozilacionog mutanta
[0931]
[0932]
[0934] Lipofectamine- XtremeGene
[0936]
[0939] Kondicionirani medijum sa 6. dana je sakupljen i prečišćen odvojeno za svaki uslov transfekcije. Oba eluata su odvojeno razmenjena sa PBS puferom, pH 7,2, i koncentrovana ~15 puta korišćenjem Amicon-4 (50 kD granična vrednost) kolona. CM 6. dana je pokazao viši nivo ekspresije u poređenju sa CM 3. dana. Kao što je prikazano u tabeli 8, proizvedeno je ukupno 3 mg Herceptin A114N 15,59 mg/ml (iz Lipofectamine transfekcije) i 6 mg Herceptin A114N 16,86 mg/ml (iz XtremeGene HP transfekcije) iz kondicioniranog medijuma 6. dana za dodatne nizvodne primene, kao što je konjugacija antitela i leka.
[0941] 2E. SDS-PAGE i HIC analiza A114N anti-Her2 mutanta
[0943] Pre konjugacije, prečišćeni A114N Herceptin je okarakterisan pomoću SDS-PAGE i HIC (hromatografije hidrofobne interakcije). Kao što je prikazano na slici 21, kvalitet prečišćenog A114N Herceptina je utvrđen kao pogodan za dalje nizvodne primene.
[0945] 2F. Konjugacija sa inženjeringom stvorenom glikozilacijom
[0947] Pokazano je da: a) je mesto glikozilacije uvedeno na Kabat poziciji 114 (EU pozicija 118) na anti-TEM1; b) A114N mutant je imao hiperglikozilaciju na teškom lancu pomoću reducirajućeg SDS-PAGE; i c) A114N hiperglikozilovani mutant je imao kompleksnu strukturu ugljenih hidrata pomoću intaktnog LC/MS-a, uključujući terminalne sijalinske kiseline i galaktozu, koji su idealni za SAM i GAM konjugaciju. Da bi se potvrdilo da je inženjeringom stvoreno mesto glikozilacije pogodno za konjugaciju, anti-TEM1 A114N je konjugovan sa 5 kDa PEG-om putem aminooksidne hemije. Kao što je prikazano na slici 22, PEG je uspešno konjugovan sa anti-TEM1 A114N putem aminooksidne veze. Ovaj mutant je takođe uspešno pripremljen na anti-FAP i anti-CD-522C3 kičmama (nije prikazano). Ovi podaci pokazuju da je mesto glikozilacije na N114 korisno za konjugaciju efektorskih delova molekula.
[0949] Primer 3: Generisanje S298N/Y300S Fc mutanata
[0950] Inženjeringom su dizajnirane i generisane Fc varijante u kojima je novo mesto glikozilacije uvedeno na EU poziciji Ser 298, pored prirodno prisutnog mesta Asn297. Glikozilacija na Asn297 je ili održana ili eliminisana mutacijom. Mutacije i željeni rezultati glikozilacije su navedeni u tabeli 9.
[0952] Tabela 9: Stanja glikozilacije različitih varijanti antitela
[0954]
[0957] 3A. Stvaranje H66 αβ-TCR varijanti antitela sa izmenjenom glikozilacijom
[0959] [0226] Mutacije su napravljene na teškom lancu klona antitela αβ T-ćelijskog receptora #66 pomoću Quikchange metode koristeći pENTR_LIC_IgG1 šablon. VH domen HEBE1 Δab IgG1 #66 je pojačan LIC prajmerima pre nego što je kloniran u mutirani ili divlji tip pENTR_LIC_IgG1 pomoću LIC-a da bi se stvorila mutirana antitela pune dužine ili antitela divljeg tipa. Subkloniranje je verifikovano dvostrukim varenjem DraIII/XhoI, što je proizvelo insert veličine približno 1250 bp u uspešnim klonovima. Ovi mutanti pune dužine su zatim klonirani u ekspresioni vektor, pCEP4(-E+I)Dest, putem Gateway kloniranja. Mutacije su potvrđene sekvenciranjem DNK. Aminokiselinske sekvence WT H66 anti-αβTCR teških i lakih lanaca i mutiranih H66 teških lanaca su navedene u tabeli 10. Mutirane aminokiseline su osenčene, a konsenzusna ciljna mesta glikozilacije stvorena mutacijom su podvučena.
[0961] Tabela 10: Aminokiselinske sekvence H66 anti-αβTCR antitela
[0962] SEO ID Naziv Aminokiselinska sekvenca
[0964]
[0965] SEO ID Naziv Aminokiselinska sekvenca
[0966]
[0967] SEO ID Naziv Aminokiselinska sekvenca
[0969]
[0972] Mutantni, divlji tip, i dva aglikozilovana kontrolna konstrukta (HEBE1 Agly IgG4 i HEBE1 Δab IgG1 u pCEP4) su transfektovani u HEK293-EBNA ćelije u trostrukim bocama za ekspresiju. Proteini su prečišćeni iz 160 ml kondicioniranog medijuma (CM) sa 1 ml HiTrap protein A kolona (GE) koristeći višestruku peristaltičku pumpu. Pet mikrograma svakog dobijenog supernatanta je analizirano na 4-20% Tris-Glicin reducirajućim i nereducirajućim SDS-PAGE gelovima (videti sliku 2). Teški lanci aglikozilovanih mutanata (N297Q, T299A i Agly kontrole) su migrirali dalje (strelica), što je u skladu sa gubitkom glikana u ovim antitelima. Teški lanci inženjeringom stvorenih glikozilovanih antitela (NSY, STY, SY, Δab, i wt kontrola, strelice), međutim, migriraju slično kao kontrola divljeg tipa. Ovaj rezultat je u skladu sa postojanjem inženjeringom stvorenog mesta glikozilacije na EU poziciji 298. SEC-HPLC analiza je ukazala da su svi mutanti ekspresovani kao monomeri.
[0974] 3B. Analiza glikozilacije pomoću LC-MS
[0976] [0228] Inženjeringom stvorene H66 IgG1 Fc varijante su delimično redukovane sa 20 mM DTT na 37°C tokom 30 min. Uzorci su zatim analizirani kapilarnom LC/MS na Agilent 1100 kapilarnom HPLC sistemu spojenom sa QSTAR qq TOF hibridnim sistemom (Applied Biosystems). Za analizu podataka korišćena je Bajazijska proteinska rekonstrukcija sa korekcijom osnovne linije i kompjuterskim modeliranjem u Analyst QS 1.1 (Applied Bisoystem). U S298N/T299A/Y300S H66 mutantnom antitelu, jedno mesto glikozilacije je primećeno na aminokiselini 298 sa biantenskim i tri-antenskim glikanima kompleksnog tipa detektovanim kao glavne vrste pored G0F, G1F i G2F (videti sliku 34). Ovaj izmenjeni profil glikozilacije je u skladu sa pomerenom glikozilacijom na N298 umesto na mesto glikozilacije divljeg tipa na N297.
[0978] 3C. Svojstva vezivanja mutanata αβTCR antitela za humani FcγRIIIa i FcγRI pomoću Biacore-a
[0980] Biacore je korišćen za procenu vezivanja za rekombinantni humani FcγRIIIa (V158 i F158) i FcγRI. Sve četiri protočne ćelije CM5 čipa su imobilizovane anti-HPC4 antitelom putem standardne procedure spajanja amina koju je obezbedio Biacore. Anti-HPC4 antitelo je razređeno na 50 µg/ml u 10 mM natrijum-acetatu pH 5,0 za reakciju spajanja i ubrizgano tokom 25 minuta pri 5 µL/min. Približno 12.000 RU antitela je imobilizovano na površini čipa. Rekombinantni humani FcyRIIIa-V158 i FcγRIIIa-F158 su razređeni na 0,6 µg/ml u puferu za vezivanje (HBS-P sa 1 mM CaCl<2>) i ubrizgani u protočne ćelije 2 i 4, respektivno, tokom 3 minuta pri 5 µL/min da bi se uhvatilo 300 - 400 RU receptora na anti-HPC4 čipu. Da bi se napravila razlika između slabih vezivača, uhvaćeno je tri puta više rhFcγRIIIa na anti-HPC4 površini nego što se obično koristi u ovom testu. Protočne ćelije 1 i 3 su korišćene kao referentne kontrole. Svako antitelo je razređeno na 200 nM u puferu za vezivanje i ubrizgano preko sve četiri protočne ćelije tokom 4 min, nakon čega je usledila 5-minutna disocijacija u puferu. Površine su regenerisane sa 10 mM EDTA u HBS-EP puferu tokom 3 minuta pri 20 µL/min. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na slici 3.
[0982] [0230] Biacore je takođe korišćen za poređenje vezivanja za FcγRI. Anti-tetra His antitelo je razmenjeno u 10 mM natrijum-acetat pH 4,0 koristeći Zeba Desalting kolonu i razređeno na 25 µg/ml u acetatnom puferu za spajanje amina. Dve protočne ćelije CM5 čipa su imobilizovane sa ~9000 RU anti-Tetra-His antitela nakon 20 min injekcije pri 5 µL/min. Kao i u prethodnom eksperimentu, uhvaćeno je deset puta više FcγRI na anti-tetra-His površini da bi se uporedili uzorci sa slabim vezivanjem. Rekombinantni humani FcγRI je razređen na 10 µg/ml u HBS-EP puferu za vezivanje i ubrizgan u protočnu ćeliju 2 tokom 1 min pri 5 µL/min da bi se uhvatilo ~1000 RU receptora na anti-tetra-His čipu. Jedna koncentracija antitela, 100 nM, je ubrizgana tokom 3 min pri 30 µL/min preko uhvaćenog receptora i kontrolne površine. Nakon toga, disocijacija je praćena tri minuta. Površina je zatim regenerisana sa dve injekcije od 30 sekundi 10 mM glicina pH 2,5 pri 20 µL/min. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na slici 4.
[0984] Ovi rezultati pokazuju izrazito smanjenje vezivanja gliko-inženjeringom stvorenih mutanata za FcγRIIIa ili FcγRI. H66 S298N/T299A/Y300S posebno ima skoro potpuno ukinuto vezivanje za oba receptora. Ovaj mutant je izabran za detaljniju analizu.
[0986] 3D. Karakterizacija stabilnosti pomoću cirkularnog dihroizma (CD)
[0988] Stabilnost S298N/T299A/Y300S mutantnog antitela je praćena Far-UV CD eksperimentom termalnog topljenja u kojem je CD signal na 216 nm i 222 nm praćen kako je povećanje temperature dovelo do razvijanja antitela (denaturacije).
[0990] Temperatura je kontrolisana termoelektričnim Peltierom (Jasco model AWC100) i povećavana je brzinom od 1°C/min od 25 do 89 °C. CD spektri su prikupljeni na Jasco 815 spektrofotometru pri koncentraciji proteina od približno 0,5 mg/ml u PBS puferu u kvarcnoj kiveti (Hellma, Inc) sa dužinom puta od 10 mm. Brzina skeniranja je bila 50 nm/min i interval podataka od 0,5 nm. Korišćena je širina pojasa od 2,5 nm sa podešavanjem osetljivosti na srednje. CD signal i HT napon su prikupljeni od 210-260 nm sa intervalima podataka od 0,5 nm i na temperaturnim intervalima od 1°C, a za svaki uzorak su izvršena četiri ponovljena skeniranja. Rezultati pokazuju da i delta AB H66 i S298N/T299A/Y300S H66 mutant pokazuju slična termalna ponašanja i imaju približno istu početnu temperaturu za degradaciju (oko 63 °C) (slika 35), što dalje sugeriše da imaju uporedivu stabilnost.
[0992] Primer 4: Funkcionalna analiza Fc-inženjeringom stvorenih mutanata
[0994] Fc-inženjeringom stvoreni mutanti su procenjeni putem testa proliferacije PBMC i testa oslobađanja citokina. U testu proliferacije PBMC, humani PBMC su kultivisani sa povećavajućim koncentracijama terapeutskog antitela tokom 72 sata, dodat je<3>H-timidin i ćelije su sakupljene 18 sati kasnije. Za test deplecije T ćelija/oslobađanja citokina, humani PBMC su kultivisani sa povećavajućim koncentracijama terapeutskog antitela i analizirani su svakodnevno radi broja ćelija i održivosti (Vi-Cell, Beckman Coulter) do 7. dana. Supernatanti ćelija su takođe sakupljeni, čuvani na -20°C i analizirani na 8-pleks citokinskom panelu (Bio-Rad).
[0995] PBMC normalnog donora su odmrznuti i tretirani pod sledećim uslovima (sve u medijumu koji sadrži komplement): Netretirano; BMA031, moIgG2b 10 µg/ml; OKT3, moIgG2a 10 µg/ml; H66, huIgG1 deltaAB 10 µg/ml, 1 µg/ml i 0,1 µg/ml; H66, huIgG1 S298N/T299A/Y300S 10 µg/ml, 1 µg/ml i 0,1 µg/ml.
[0997] Citokini su sakupljeni 2. dana (D2) i 4. dana (D4) za Bioplex analizu (IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, GM-CSF, IFNg, TNFa). Ćelije su obojene 4. dana radi ekspresije CD4, CD8, CD25 i abTCR.
[0999] Rezultati, prikazani na slikama 5-8, pokazuju da se H66 S298N/T299A/Y300S ponašao slično kao H66 deltaAB u svim izvedenim testovima baziranim na ćelijama, pokazujući minimalnu aktivaciju T-ćelija ekspresijom CD25, vezivanjem za abTCR (sa nešto drugačijom kinetikom od deltaAB), i minimalnim oslobađanjem citokina u oba vremenska trenutka, D2 i D4. Mutant S298N/T299A/Y300S je stoga eliminisao efektorsku funkciju jednako efikasno kao i mutacija deltaAB.
[1001] Primer 5: Priprema i karakterizacija inženjeringom stvorene Fc varijante u kičmi anti-CD52 antitela.
[1003] Pored H66 anti-αβTCR antitela, mutacija S298N/Y300S je takođe stvorena inženjeringom u kičmi anti-CD52 antitela (klon 2C3). Ovaj mutant je zatim ispitan kako bi se utvrdilo da li je uočena modulacija efektorske funkcije u S298N/Y300S H66 anti-αTCR antitelu konzistentna i u drugoj kičmi antitela.
[1005] 5A. Stvaranje 2C3 anti-CD52 varijanti antitela sa izmenjenom glikozilacijom
[1007] [0239] Prvo, DNK 2C3 varijante S298N/Y300S je pripremljena quick change mutagenezom koristeći pENTR_LIC_IgG1, a WT 2C3 VH je kloniran u mutirani vektor pomoću LIC-a. Mutanti pune dužine su klonirani u pCEP4 (-E+I)Dest ekspresioni vektor koristeći Gateway tehnologiju. Mutacije su naknadno potvrđene sekvenciranjem DNK i sekvence su navedene u tabeli 11. Mutirane aminokiseline su osenčene, a konsenzusna ciljna mesta glikozilacije stvorena mutacijom su podvučena. Mutanti su zatim transfektovani u HEK293-EBNA ćelije u formatu ploče sa 6 bunarčića, a protein je prečišćen iz kondicioniranog medijuma. Anti-CD52 2C3 antitelo divljeg tipa je proizvedeno paralelno kao kontrola. Nivo ekspresije je bio 0,1 µg/mL korišćenjem SD-PAGE i Western blot analiza (slika 9A). Ekspresija mutanata u čistom kondicioniranom medijumu je takođe merena hvatanjem proteina A na Biacore-u. Koncentracija je određena korišćenjem disocijacionog odgovora nakon šestominutne injekcije u imobilizovani protein A. WT 2C3 proizveden u CHO ćelijama, serijski razređen u medijumu od 90 µg/ml do 1,5 ng/ml, korišćen je kao standardna kriva. Koncentracije su izračunate unutar približno 0,2 µg/ml pomoću kalibracione krive koristeći 4-parametarsko uklapanje. Relativni nivoi ekspresije su bili niski i generalno se slažu sa podacima Western blot-a (slika 9B).
[1009] Tabela 11: Sekvence anti-CD52 klon 2C3 antitela
[1010]
[1013] 5B. Analiza glikozilacije pomoću PNGaseF
[1015] Da bi se procenila dodatna mesta glikozilacije uvedena mutacijom, obogaćeni S298N/Y300S mutant je deglikozilovan pomoću PNGase F. Deglikozilacija nije pokazala bilo kakvu prividnu promenu u molekulskoj težini, što ukazuje na to da nije bio prisutan nikakav dodatni ugljeni hidrat (slika 10). Pripreme malog obima su izvršene kako bi se ovi mutanti prečistili za dalju karakterizaciju i rezultati su ponovo potvrdili da nije bio prisutan dodatni ugljeni hidrat na S298N/Y300S mutantu (slika 11).
[1017] 5C. Svojstva vezivanja 2C3 anti-CD52 mutanata antitela za humani FcγRIIIa pomoću Biacore
[1019] Biacore je takođe korišćen za karakterizaciju vezivanja antigena, FcγRIII, i svojstava vezivanja prečišćenih antitela (videti slike 12, 13 i 14). S298N/Y300S 2C3 varijanta se čvrsto vezala za CD52 peptid i senzogram vezivanja se nije mogao razlikovati od kontrole divljeg tipa, što pokazuje da ova mutacija ne utiče na njeno vezivanje antigena (slika 12A).
[1021] [0242] Da bi se testirala Fc efektorska funkcija, FcγRIII receptor (Val158) je korišćen u studijama vezivanja. Mutant i kontrolno antitelo divljeg tipa su razređeni na 200 nM i ubrizgani u FcγRIIIa uhvaćen HPC4-tagom. Vezivanje za FcγRIII je bilo skoro nedetektabilno za S298N/Y300S mutanta, što je ukazivalo na gubitak efektorske funkcije kod ove varijante (slika 12B i slika 14A). Da bi se dalje testirala Fc efektorska funkcija, FcyRIII receptor (Phe158) je takođe korišćen u studijama vezivanja. Mutant i kontrolna antitela divljeg tipa su razređeni na 200 nM i ubrizgani u FcγRIIIa uhvaćen HPC4-tagom. Vezivanje za FcγRIII je bilo skoro nedetektabilno za S298N/Y300S mutanta, što ukazuje na gubitak efektorske funkcije sa Phe158 varijantom (slika 14B). Konačno, Biacore je korišćen za poređenje svojstava vezivanja FcRn prečišćenih proteina. Mišji i SEC-prečišćeni humani FcRn-HPC4 su imobilizovani na CMS čip putem spajanja amina. Svako antitelo je razređeno na 200, 50 i 10 nM i ubrizgano preko receptora. Campath, WT 2C3 proizveden u CHO ćelijama, i Campath tretiran DEPC-om uključeni su kao pozitivne i negativne kontrole. Ovi podaci pokazuju da se mutant vezuje i za humani i za mišji FcRn receptor sa istim afinitetom kao i kontrolno antitelo divljeg tipa i da verovatno nema izmena u svom poluživotu cirkulacije ili drugim farmakokinetičkim svojstvima. (videti sliku 12C, sliku 13A i B). Shodno tome, S298N/Y300S mutacija je primenljiva na antitela uopšte, da bi se smanjila ili eliminisala neželjena Fc efektorska funkcija, na primer kroz angažovanje humanih Fcγ receptora.
[1023] Primer 6: Detekcija cirkulišućeg imunog kompleksa u S298N/Y300S mutantu.
[1025] Detekcija cirkulišućeg imunog kompleksa je takođe istraživana korišćenjem testa vezivanja C1q za S298N/Y300S mutant i WT kontrolu. Visoko-vezivne Costar ploče sa 96 bunarčića su obložene preko noći na 4°C sa 100 µl 2 puta serijski razređenog 2C3 Ab u koncentracijama u rasponu od 10 - 0,001 µg/ml u puferu za oblaganje (0,1M NaCHO<3>pH 9.2). ELISA analiza je pokazala da je vezivanje C1q smanjeno za S298N/Y300S mutant u poređenju sa WT (slika 15A). Vezivanje anti-Fab Ab za obložene 2C3 Ab je potvrdilo ekvivalentno oblaganje bunarčića (slika 15B).
[1027] Primer 7: Razdvajanje i analiza S298N/Y300S mutanta korišćenjem izoelektričnog fokusiranja.
[1029] pH 3-10 Izoelektrično fokusiranje (IEF) gel je korišćen za karakterizaciju S298N/Y300S mutanata. Utvrđeno je da S298/Y300S ima više negativnih naboja, i stoga, verovatno više molekula sijalinske kiseline (slika 18A). I S298N/Y300S mutant i WT 2C3 su pokazani intaktnim MS-om da imaju G0F i G1F kao dominantne glikozilacione vrste (slike 18 B i D, respektivno).
[1031] Primer 8: Afinitet vezivanja antigena S298N/Y300S.
[1033] [0245] Biacore je korišćen za poređenje afiniteta vezivanja antigena WT anti-CD522C3 Ab i S298N/Y300S mutanta koji je pripremljen i prečišćen iz manjih (slika 16) i većih (slika 17) ekspresija. Dobijeni su CM5 čipovi imobilizovani CD52 peptidom 741 i kontrolnim peptidom 777. Antitela su serijski razređena 2 puta od 60 do 0,2 nM u HBS-EP i zatim su ubrizgana preko površine čipa tokom 3 min, nakon čega je usledila 5-minutna disocijacija u puferu pri brzini protoka od 50 µl/min. Površina je zatim regenerisana pulsom od 40 mM HCl. Ove analize su izvršene u duplikatu i pokazuju da S298N/Y300S mutant i WT 2C3 antitela pokazuju uporedivo vezivanje za CD52 peptid.
[1035] Platforma za skrining medijuma je dizajnirana da testira funkcionalna svojstva vezivanja pre prečišćavanja, kako bi se ispitala antitela stvorena tokom transfekcija malog obima. Ovi testovi su izvedeni korišćenjem Octet-a (slika 19A) da bi se odredila koncentracija i korišćeni su biosensori proteina A i GLD52 standardna kriva. Uzorci su razređeni na 7,5 i 2 nM u HBS-Ep za poređenje vezivanja za CD52 korišćenjem Biacore-a (slika 19B). Rezultati testa vezivanja peptida su pokazali da i S298N/Y300S mutant i WT 2C3 antitela imaju uporedivo vezivanje za CD52 peptid. Štaviše, ove analize pokazuju da Octet i Biacore dobro funkcionišu za predviđanje vezivanja antigena antitelima iz transfekcija malog obima.
[1037] Primer 9: Priprema S298N/Y300S, S298N/T299A/Y300S i N297Q/S298N/Y300S mutanata sa izmenjenom glikozilacijom u dodatnim kičmama antitela.
[1039] Pored anti-αβ-TCR antitela i 2C3 anti-CD-52 antitela, mutacije S298/Y300S, S298N/T299A/Y300S i N297Q/S298N/Y300S su stvorene inženjeringom u drugim kičmama antitela kako bi se potvrdilo da se dodatno tandem mesto glikozilacije može uvesti u nepovezane sekvence varijabilnog domena teškog lanca. Alternativno glikozilovani anti-CD-52 12G6 i anti-Her2 mutanti su navedeni u tabelama 12 i 13. Mutirane aminokiseline su osenčene, a konsenzusna ciljna mesta glikozilacije stvorena mutacijom su podvučena.
[1041] Tabela 12: Sekvence anti-CD52 klon 12G6 antitela
[1043]
[1044]
[1045] SEQ ID Naziv Aminokiselinska sekvenca
[1046]
[1047]
[1050] Primer 10. Generisanje izmenjenih antitela koja sadrže reaktivne deo molekula glikana
[1052] [0248] Da bi se generisala antitela koja sadrže delove molekula glikana sposobne da reaguju sa derivatizovanim efektorskim delovima molekula, anti-HER antitelo je prvo glikozilovano in vitro korišćenjem glikoziltransferaze i relevantnih šećernih nukleotidnih donora. Na primer, da bi se uvele rezidue sijalinske kiseline, antitela donora su prvo galaktozilovana sa βgalaktoziltransferazom, a zatim sijalilovana sa α2,6-sijaliltransferazom prema metodama Kaneka et al. (Kaneko, Y., Nimmerjahn, F., and Ravetch, J. V. (2006) Anti-inflammatory activity of immunoglobulin G resulting from Fc sialylation. Science 313, 670-3). Reakcija je izvedena u koraku sinteze „u jednoj posudi“ korišćenjem β-galaktoziltransferaze (50 mU/mg, Sigma) i α2,6-sijaliltransferaze (5 µg/mg, R&D system) sa šećernim nukleotidnim supstratima donora, UDP-galaktozom (10 mM) i CMP-sijalinskom kiselinom (10 mM) u 50 mM MES puferu (pH 6,5) koji sadrži 5 mM MnCl<2>. Reakciona smeša koja sadrži 5 mg/ml anti-HER2 antitela inkubirana je 48 sati na 37 °C. Sijalilacija je verifikovana korišćenjem MALDI-TOF MS analize permetilovanih glikana oslobođenih iz antitela pomoću PNGase F, analize sadržaja sijalinske kiseline korišćenjem Dionex HPLC-a i lektin blottinga sa SNA, lektinom specifičnim za α2,6-sijalinsku kiselinu.
[1054] MALDI-TOF analiza glikana oslobođenih tretmanom PNGase F sijalilovanog anti-HER2 antitela ukazala je da su nativni glikani potpuno remodelovani sa uglavnom monosijalilovanom biantenskom strukturom, A1F (slika 27A), zajedno sa malom količinom disijalilovanih vrsta. Tretman antitela sa većim količinama α2,6-sijaliltransferaze proizveo je homogenije populacije A1F glikoforma, što sugeriše da ili aktivnost enzima ili lokalizacija glikana može sprečiti potpunu sijalilaciju. Sadržaj sijalinske kiseline je utvrđen na ~2 mola po molu antitela, što je u skladu sa A1F glikanom kao glavnom vrstom glikoforma (slika 27B). Lektin blotting sa SAN lektinom, Sambucus nigra aglutininom specifičnim za α2,6-vezanu sijalinsku kiselinu, potvrdio je da je sijalinska kiselina prisutna u konfiguraciji α2,6-veze (slika 27C).
[1056] Zaključno, iako su glikani nativnog proteina donekle heterogeni, remodelovanje putem galaktozil i sijaliltransferaza daje skoro homogeno antitelo sa monosijalilovanim, ali potpuno galaktozilovanim biantenskim glikanima (A1F). Uvođenje samo ~1 sijalinske kiseline na dva galaktozna akceptora na svakom razgranatom glikanu može biti posledica ograničene pristupačnosti jedne od galaktoza iz glikana koje su često zakopane u antitelu ili nekovalentnih interakcija glikana sa površinom proteina.
[1058] Primer 11. Oksidacija izmenjenih antitela koja sadrže reaktivne delove molekula glikana
[1060] [0251] Nakon što je sijalilacija verifikovana, in-process oksidacija sijalilovanog anti-HER2 antitela sa različitim koncentracijama periodata (0,25 do 2 mM) je istraživana. Sijalilovano antitelo je prvo razmenjeno sa 25 mM Tris-HCl puferom (pH 7,5) koji sadrži 5 mM EDTA, nakon čega je usledila razmena sa PBS puferom. Smeša sa puferisanim antitelom je zatim primenjena na protein A Sepharose kolonu prethodno ekvilibriranu sa PBS puferom. Nakon što je kolona oprana sa 15 zapremina kolone PBS-a, 15 zapremina kolone PBS-a koji sadrži 5 mM EDTA, i 30 zapremina kolone PBS-a, eluirana je sa 25 mM citrat fosfatnim puferom (pH 2,9). Eluati su odmah neutralizovani dibaznim fosfatnim puferom, a antitelo je koncentrovano korišćenjem Amicon ultra od Millipore-a. Nakon prečišćavanja, sijalilovano anti-HER2 antitelo je zatim oksidovano natrijum-periodatom (Sigma) u 100 mM natrijum-acetatnom puferu (pH 5,6) na ledu u mraku tokom 30 minuta, a reakcija je ugašena sa 3% glicerola na ledu tokom 15 minuta. Proizvod je desaltovan i razmenjen u 100 mM natrijum-acetat (pH 5,6) pomoću 5 krugova ultrafiltracije preko 50 kDa Amicon-a. Slika 28A prikazuje analizu sadržaja sijalinske kiseline sijalilovanog antitela titrovanog sa različitim količinama periodata. Potpuna oksidacija rezidua sijalinske kiseline postignuta je pri koncentraciji periodata iznad 0,5 mM. Zaista, koncentracija periodata od samo 0,5 mM bila je dovoljna da potpuno oksiduje uvedenu sijalinsku kiselinu. Shodno tome, 1 mM koncentracija periodata je izabrana za oksidaciju sijalilovanog antitela za konjugaciju leka.
[1062] Oksidacija može imati neželjene efekte na integritet antitela. Na primer, poznato je da oksidacija metioninskih rezidua, uključujući Met-252 i Met-428, koje se nalaze u Fc CH3 regionu, blizu mesta vezivanja FcRn, utiče na vezivanje FcRn, što je kritično za produženje serumskog poluživota antitela (Wang, W., et al. (2011) Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Mol Immunol 48, 860-6). Shodno tome, da bi se ispitali potencijalni neželjeni efekti oksidacije periodatom na metioninske rezidue (npr. Met-252) kritične za FcRn interakciju, stanje oksidacije sijalilovanog antitela je određeno analizom LC/MS digestije triptičnog peptida. Ova analiza je otkrila ~30% oksidacije Met-252 i < 10% oksidacije Met-428 nakon tretmana sijalilovanog trastuzumaba sa 1 mM periodata. Da bi se utvrdio uticaj ovog stepena oksidacije metionina na vezivanje FcRn, kinetika vezivanja za FcRn za svako antitelo je procenjena korišćenjem površinske plazmonske rezonance (BIACORE). Ova analiza je otkrila da je stanje oksidacije koreliralo sa manjim gubitkom u vezivanju za FcRn (12% i 26% smanjenja Ka za mišji i humani FcRn, videti slike 28B i 28C, respektivno). Posebno, ~25% smanjenja Ka za humani FcRn je prijavljeno da nema efekta na serumski poluživot kod transgeničnog miša sa humanim FcRn, pošto je jedno intaktno FcRn mesto na svakom antitelu dovoljno da obezbedi funkcionalnost i farmakokinetičku prednost (Wang et al., Id).
[1064] [0253] Ukratko, ovi podaci ukazuju na to da uvođenje rezidua sijalinske kiseline osetljivih na periodat, tretmanom sijaliltransferazom, omogućava upotrebu mnogo nižih koncentracija periodata, što rezultira minimalnim neželjenim efektima na interakcije antitela i FcRn i na integritet antitela, procenjen agregacijom (≤1%). Dakle, upotreba sijalilovanih antitela pruža širi prozor oksidacionih uslova koji se mogu koristiti, omogućavajući reproduktivno generisanje aktivnih glikokonjugata bez efekta na serumski poluživot.
[1066] Galaktoza u hiperglikozilovanom mutantnom antitelu se takođe može oksidovati specifično korišćenjem galaktoza oksidaze da bi se generisala aldehidna grupa za konjugaciju. Da bi se potvrdio ovaj pristup, A114N anti-TEM1 antitelo je koncentrovano na 13-20 mg/ml, a zatim tretirano sa 20 mU/mg sijalidaze u PBS-u tokom 6 sati na 37°C. Desijalilovani proizvod je zatim oksidovan sa galaktoza oksidazom („GAO“), prvo sa 5 µg GAO/mg proteina preko noći na 37°C, nakon čega je usledilo dodavanje 2 µg GAO/mg proteina i inkubacija tokom dodatnih 5 sati. Natrijum-acetat je dodat da bi se podesio pH na 5,6 (0,1 v/v, pH 5,6), a DMSO je dodat da bi se postigla konačna reakciona koncentracija od 16%, pre konjugacije. Hiperglikozilacioni mutant A114N anti-HER antitela (15 mg/ml) je na sličan način desijalilovan sa sijalidazom (20 mU/mg) i oksidovan sa 5 µg GAO po mg proteina u jednoj reakciji preko noći na 37 °C.
[1068] Primer 12. Sinteza reaktivnih efektorskih delova molekula
[1070] Da bi se olakšala konjugacija sa aldehidom derivatizovanim glikoformama antitela, kandidatni efektorski delovi molekula leka (npr. momometil auristatin E (MMAE) i Dolastatin 10 (Dol10)) su derivatizovani sa aminooksid-cistamidom da bi sadržali funkcionalne grupe (npr. aminooksid-cys) specifično reaktivne sa aldehidom.
[1072] Ukratko, da bi se generisao aminooksid-cistamid kao početni materijal, S-Trityl-L-cisteinamid (362 mg, 1 mmol) je dodat u 3 ml DMF rastvora t-BOC-aminooksid sirćetne kiseline N-hidroksisukcinimidnog estra (289 mg, 1 mmol). Reakcija je bila završena nakon 3 h, što je bilo evidentno iz HPLC analize. Reakciona smeša je naknadno razređena sa 30 ml dihlorometana i oprana je sa 0,1 M rastvorom natrijum-bikarbonata (2 x 20 ml), vodom (2 x 20 ml) i slanim rastvorom (2 x 20 ml). Rastvor je osušen preko bezvodnog natrijum-sulfata, filtriran i koncentrovan do suvoće. Ovom osušenom talogu je dodato 3 ml TFA, nakon čega je dodato 150 µl trietilsilana. Dobijeni rastvor je istaložen iz t-butil metil etra i proces je ponovljen tri puta. Nakon filtracije, talog je osušen pod smanjenim pritiskom, dajući 205 mg prljavo-bele čvrste supstance (prinos 67%). Jedinjenje je korišćeno za sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.
[1073] Da bi se generisao aminooksid-derivatizovani MMAE (Aminooxy-Cys-MC-VC-PABC-MMAE), 30,1 mg aminooksid-cistamida (0,098 mmol, 2 ekv.) je kombinovano sa 64,6 mg MC-VC-PABC-MMAE (0,049 mmol) i 100 µl trietilamina u 3 ml DMF-a. Dobijena reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta, nakon čega je reakcija bila završena prema HPLC analizi. Jedinjenje je prečišćeno preparativnom HPLC, dajući 45 mg (62%) željenog proizvoda kao prljavo-bele čvrste supstance. Reverzno-fazna HPLC analiza je sugerisala da je čistoća jedinjenja >96%. ESI izračunato za C73H116N14O18S (MH)<+>1509.8501; nađeno, m/z 1509,8469.
[1075] Da bi se generisao aminooksid-derivatizovani Dol10 (Aminooxy-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10), 7,4 mg (0,024 mmol, 3 ekv.) aminooksid-cistamida, 12 mg (0,008 mmol) MC-VC-PABC-PEG8-Dol10 i 30 µl trietilamina su kombinovani u 3 ml DMF-a. Reakcija je bila završena u roku od 15 minuta prema HPLC analizi. Preparativno HPLC prečišćavanje je rezultiralo sa 6,2 mg (46%) željenog proizvoda kao prljavo-bele čvrste supstance. Reverznofazna HPLC analiza sugeriše da je čistoća jedinjenja >96%. ESI izračunato za C80H124N16O19S2 (MH)<+>1678.0664; nađeno, m/z 1678,0613.
[1077] Primer 13. Konjugacija reaktivnih efektorskih delova molekula posredovana sijalinskom kiselinom (SAM)
[1079] Nakon desaltovanja, lek-linkeri iz primera 11 su kombinovani sa oksidovanim, sijalilovanim antitelima iz primera 10 sa 75% DMSO (0,167 v/v) pri koncentraciji od 25 mM da bi se postigao molarni odnos lek-linkera i antitela 24:1 i konačna koncentracija antitela od 5 mg/ml. Smeša je inkubirana preko noći na sobnoj temperaturi. Nekonjugovani lek-linkeri i bilo koji slobodni lekovi su uklonjeni korišćenjem BioBeads. Proizvod je razmenjen sa Histidine-Tween puferom korišćenjem PD-10 kolona i sterilno je filtriran. Nivoi endotoksina su određeni i postignuto je manje od 0,1 EU/mg ADC-a za in vivo studiju.
[1081] [0260] Slika 29A-C prikazuju hidrofobni interakcioni hromatograf (HIC) različitih sijalilovanih antitela (anti FAP B11 i G11 i anti-HER2 antitela iz primera 11) glikokonjugovanih sa AO-MMAE. Sijalilovano HER2 antitelo je takođe konjugovano sa leklinkerom, AO-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10 (slika 29D). Ova analiza otkriva da postoje uglavnom jedan ili dva konjugata leka po antitelu sa odnosom leka i antitela (DAR) u rasponu od 1,3-1,9. Povećano vreme zadržavanja Dol10 glikokonjugata (slika 29D) u poređenju sa MMAE glikokonjugatom (slika 29C) verovatno je zbog veće hidrofobnosti Dol10.
[1083] LC-MS analiza je takođe sprovedena sa anti-HER antitelom konjugovanim sa dva različita lek-linkera (AO-MMAE ili AO-PEG8-Dol10) na skali od 30 mg. Ova analiza je pokazala slične DAR vrednosti od 1,7 i 1,5 nakon konjugacije, što je uporedivo sa HIC analizom. Hromatografija isključivanja po veličini (SEC) je pokazala vrlo niske nivoe (1%) agregata u ovim konjugatima.
[1085] Primer 14. Konjugacija reaktivnih efektorskih delova molekula posredovana galaktozom (GAM)
[1087] Galaktozni aldehid generisan sa galaktoza oksidazom na A114N anti-TEM1 hiperglikozilacionom mutantnom antitelu, kao što je opisano u primeru 11, konjugovan je sa 24 molarna viška aminooksid-MC-VC-PABC-MMAE lek-linkera u odnosu na antitelo inkubacijom preko noći na 25°C, što je dalo ADC konjugat sa DAR-om od 1,72.
[1089] U anti-HER antitelo tretirano galaktoza oksidazom pripremljeno kao što je opisano u primeru 11, dodata je jedna desetina zapremine reakcije 1M natrijum-acetata, pH 5,6, da bi se podesio pH na 5,6, a DMSO je dodat da bi se postigla konačna koncentracija reakcije od 14% pre dodavanja 24 ekvivalentna aminooksid MC-VC-PABC-MMAE lek-linkera. Reakcije su inkubirane preko noći na sobnoj temperaturi. Slobodni lek i lek-linker su uklonjeni pomoću Biobeads-a, a proizvod je razmenjen sa puferom pomoću SEC-a (prinos 65%). Produkt konjugata je analiziran pomoću HIC-a. Kao što je prikazano na slici 30, AO-MMAE je bio konjugovan sa ~60% molekula.
[1091] Primer 15. In vitro testovi ćelijske proliferacije ADC-a
[1093] [0263] In vitro aktivnost anti-HER i anti-FAP glikokonjugatnih molekula je takođe upoređena sa odgovarajućim tiol konjugatima koji sadrže isti deo molekula leka povezan tiolnim vezama sa cisteinima regiona šarke istog antitela donora. Tiol konjugati su sadržali približno dvostruko veći broj lekova po antitelu (DAR) nego glikokonjugati. Konjugacija bazirana na tiolu je izvršena kao što su opisali Stefano et al (Methods in Molecular Biology 2013, u štampi). Her2+ SK-BR-3 i Her2- MDA-MB-231 ćelijske linije su zatim korišćene za procenu relativne efikasnosti svakog ADC-a. Rezultati ove analize su predstavljeni u tabeli 15 u nastavku
[1095] Tabela 15. Poređenje EC50 glikokonjugata i tiol konjugata
[1097]
[1100] Slike 31(A-D) prikazuju poređenje in vitro potencije anti-HER glikokonjugata i njegovog srodnog tiol konjugata. Održivost ćelija je određena nakon 72-satne izloženosti konjugata ćelijama koje ekspresuju Her2 antigen (SK-BR-3) (slike 31A i C) ili ćelijama koje ga ne ekspresuju (MDA-MB-231) (slike 31B i D). ADC-i su sadržali ili MMAE ili PEG8-Dol10 vezane za glikane („gliko“) ili konvencionalnom hemijom za cisteine regiona šarke („tiol“). Kao što je prikazano na slikama 31A i C, uočena je ~2 puta niža EC<50>za tiol konjugate u poređenju sa glikokonjugatima, što je u skladu sa 2 puta višim DAR-om kod prvih u odnosu na potonje. Nije primećena toksičnost sa Her2- ćelijskom linijom sa bilo kojim antitelom do 100 µg/ml.
[1102] [0265] Slični trendovi su takođe primećeni u proliferaciji ćelija za ADC pripremljen sa antitelima protiv tumorskog antigena (FAP) koji je visoko ekspresovan od strane reaktivnih stromalnih fibroblasta u epitelijalnim kancerima, uključujući rak debelog creva, pankreasa i dojke (Teicher, B. A. (2009) Antibody-drug conjugate targets. Curr Cancer Drug Targets 9, 982-1004). Ovi konjugati su ponovo pripremljeni konjugacijom ili aminooksid MMAE linkera leka ili maleimido MMAE linker-a leka sa glikanima ili tiolnom grupom. Testovi proliferacije ćelija ovih konjugata pokazali su da je EC<50>tiol konjugata imao ~100 puta veću potenciju na CHO ćelijama transfektovanim sa humanim FAP-om nego na istim ćelijama kojima nedostaje ekspresija FAP-a, kao što je prikazano na slici 32, koja prikazuje poređenje in vitro potencije anti FAP B11 glikokonjugata i tiol konjugata. Održivost ćelija je određena nakon izloženosti konjugata CHO ćelijama transfektovanim sa ili bez FAP antigena. ADC-i su sadržali MMAE vezan za glikane („gliko“) ili konvencionalnom hemijom za cisteine regiona šarke („tiol“). Imajte na umu da je ~2 puta niža EC50 za tiol u poređenju sa glikokonjugatima u skladu sa relativnim količinama leka isporučenim po antitelu, pretpostavljajući slične efikasnosti za ciljanje i internalizaciju antigena u CHO ćelijama koje ekspresuju antigen. Paralelno, glikokonjugat anti FAP (B11) ADC sa DAR-om od 1,5, kako je prethodno opisano, testiran je i pokazao je ~2 puta višu EC<50>od komparatornog tiol konjugata (DAR 3,3).
[1104] Kao što je prikazano na slici 36, slični trendovi su primećeni u testu proliferacije ćelija za ADC pripremljen sa anti-HER antitelom koje nosi A114N hiperglikozilacionu mutaciju i AO-MMAE, kao što je opisano u Primeru 14, kada je testirano na ćelijama koje ekspresuju SK-BR-3 ili na MDA-MB-231 ćelijama. A114N glikokonjugat jasno pokazuje pojačanu ćelijsku toksičnost protiv ćelijske linije koja ekspresuje Her2 u odnosu na liniju koja ga ne ekspresuje. Relativna toksičnost u poređenju sa SialT glikokonjugatom pripremljenim sa istim antitelom je u skladu sa nižim opterećenjem lekom ove pripreme.
[1106] Test proliferacije ćelija je takođe izvršen za ADC pripremljen sa anti-TEM1 antitelom koje nosi A114N hiperglikozilacionu mutaciju i AO-MMAE pripremljenim kao što je opisano u primeru 14. Viša toksičnost je primećena kod ćelijskih linija koje ekspresuju TEM1, SJSA-1 i A673, u poređenju sa linijom MDA-MB-231 koja ga ne ekspresuje. Nivo toksičnosti u poređenju sa konvencionalnim tiol konjugatom sa istim antitelom bio je u skladu sa opterećenjem lekom (DAR) ove pripreme.
[1108]
[1109]
[1112] Ukratko, konjugacija lekova specifična za mesto, kroz glikane sa cepivim linkerima, proizvodi ADC-e sa toksičnošću i in vitro efikasnošću koje su ekvivalentne konvencionalnim konjugatima baziranim na tiolu, kao što je demonstrirano korišćenjem različitih antitela i različitih lek-linkera. Štaviše, ispod 2 mM periodata, nivo konjugacije leka korelira sa smanjenjem sijalinske kiseline. Povećanje koncentracije periodata iznad 2 mM proizvodi malu korist, kao što se očekuje od potpune konverzije sijalinske kiseline u oksidovani oblik. Međutim, pod svim uslovima, broj lekova po antitelu bio je nešto niži od sadržaja sijalinske kiseline, što ukazuje na to da neki od oksidovanih sijalinskih kiselina možda slično nisu dostupni za spajanje, bilo zbog toga što su zakopane ili zbog prostorne smetnje koja proizlazi iz glomaznosti lek-linkera.
[1114] Primer 16. In vivo karakterizacija konjugata antitela i leka
[1116] Efikasnost anti-HER glikokonjugata je takođe procenjena u ksenograft modelu tumora Her2+ ćelijama i upoređena sa tiol konjugatima komparatorima sa ~2 puta višim DAR-om. Beige/SCID miševi su implantirani SK-OV-3 Her2+ tumorskim ćelijama kojima je omogućeno da formiraju tumore veličine ~150 mm<3>pre početka lečenja. ADC-i u dozama od 3 ili 10 mg/kg su ubrizgani kroz repnu venu 38, 45, 52 i 59. dana. U svakoj grupi je bilo ~10 miševa. Zapremina tumora miševa u različitim grupama je merena, a njihovo preživljavanje je zabeleženo. Kriva preživljavanja je iscrtana na osnovu Kaplan-Meier metode.
[1118] [0270] Slike 33(A-D) prikazuju poređenje in vivo efikasnosti anti-HER glikokonjugata i tiol konjugata u ksenograft modelu tumorskih ćelija Her2+. Beige/SCID miševi implantirani SK-OV-3 Her2+ tumorskim ćelijama su dozirani sa glikokonjugatima koji sadrže MMAE (slike 33A i B) i PEG8-Dol10 (slike 33C i D) ili sa tiol konjugatima komparatorima sa ~2 puta višim DAR-om. Kinetika rasta tumora MMAE konjugata je prikazana na slici 33A. U ovom slučaju, glikokonjugat je pokazao značajno višu efikasnost od samog golog antitela (crno), ali manju od tiol konjugata komparatora sa ~2 puta višim DAR-om (zeleno). MMAE glikokonjugat je pokazao značajnu regresiju tumora i ~20 dana kašnjenja u rastu tumora (slika 33A) i ~2 puta povećanje vremena preživljavanja od prve doze (slika 33B). Tiol MMAE konjugat je pokazao skoro potpunu supresiju tumora pri istoj dozi ADC-a (10 mg/kg).
[1120] In vivo efikasnost PEG8-Dol10 glikokonjugata („Gliko Dol10”) i tiol konjugata komparatora sa ~2 puta višim DAR-om („Tiol Dol10”) je takođe određena u istom ksenograft modelu tumora Her2+ ćelijama. Oba konjugata su pokazala nižu efikasnost od MMAE konjugata kao što je prethodno opisano. Međutim, aminooksid-PEG8-Dol10 glikokonjugat („Gliko Dol10”) pri 10 mg/kg je pokazao kašnjenje od 15 dana u rastu tumora (slika 33C) i ~20 dana (1,7 puta) povećanje vremena preživljavanja nakon prve primene (slika 33D). Tiol konjugat je bio efikasniji pri istoj dozi, pokazujući 2 puta povećanje preživljavanja. Pri nižoj dozi (3 mg/kg), tiol konjugat je pokazao manju efikasnost od glikokonjugata pri 10 mg/kg. Ova doza odgovara 80 µmol PEG8-Dol10 leka po kg doze, u poređenju sa 110 µmol PEG8-Dol10 leka po kg doze za glikokonjugat.
[1122] Ovi podaci pokazuju da konjugacija lekova specifična za mesto na sijalinsku kiselinu glikana antitela daje molekule sa uporedivom potencijom kao ADC-i generisani hemijom baziranom na tiolu. Nešto niža in vivo efikasnost verovatno potiče od manjeg broja lekova koji se nose svakim antitelom u tumorske ćelije putem internalizacije svakog antigena vezanog za antitelo. Iako nismo uporedili ove glikokonjugate sa tiol konjugatima istog DAR-a, efikasnost primećena pri različitim dozama dva ADC-a koja predstavljaju uporedive nivoe primenjenog leka pokazuje da glikokonjugati imaju uporedivu intrinzičnu efikasnost kao i njihovi tiolni ekvivalenti, što ukazuje na nepostojanje štetnog efekta konjugacije na ovom mestu. Štaviše, doza od 10 mg/kg Dol10 glikokonjugata, koja je uvela samo 28% više leka, obezbedila je 2 puta veće preživljavanje u odnosu na tiol konjugat (pri 3 mg/kg), što sugeriše da ovi konjugati mogu čak pružiti superiornu efikasnost pri istom DAR-u. S obzirom na očigledno ograničenje inkorporacije sijalinske kiseline na nativnim glikanima, veće opterećenje lekom se može postići nizom različitih strategija, uključujući upotrebu razgranatih linker-a leka ili uvođenje dodatnih mesta glikozilacije i korišćenjem iste metode.
[1124] Primer 17. Konjugacija ciljnih delova molekula
[1125] Slika 37 demonstrira opštu šemu za konjugaciju ciljnih delova molekula sa postojećim ugljenim hidratima ili inženjeringom stvorenim mestima glikozilacije. Ova konjugacija se može izvesti pričvršćivanjem neoglikana, glikopeptida ili drugih ciljnih delova molekula na oksidovana sijalilovana antitela (slike 38 i 39). Delovi molekula pogodni za konjugaciju mogu uključivati one koji sadrže aminooksidne linkere (slika 40 i 41).
[1127] Primer 18. Konjugacija kroz sijalinsku kiselinu u nativnim Fc glikanima
[1129] Man-6-P heksamanoza aminooksid je konjugovan ili sa poliklonalnim antitelom ili sa monoklonalnim antitelom koje specifično cilja Man-6-P receptor. SDS-PAGE i MALDI-TOF MS analize konjugacije poliklonalnog antitela kunića sa Man-6-P heksamanozom aminooksidom prikazane su na slici 42. Slika 43 prikazuje rezultate eksperimenata sa površinskom plazmonskom rezonancom koji su korišćeni za procenu vezivanja kontrole i Man-6-P heksamanoze konjugovanih poliklonalnih IgG antitela kunića za katjon-nezavisni Man-6-P receptor (CI-MPR). In vitro analize ovog konjugovanog antitela demonstriraju povećanu apsorpciju u obe ćelijske linije HepG2 (Homo sapiens karcinom hepatocelularnog karcinoma) i RAW (Mus musculus mišja leukemija) (slika 44 ). Kulture su obojene anti-zečjim-Alexa 488 antitelom kontrabojene sa DAPI-jem.
[1131] Antitela konjugovana sa Man-6-P ili laktoza aminooksid delovima molekula su dalje testirana pomoću SDS-PAGE i lektin blottinga i upoređena sa nekonjugovanim antitelima (slika 45). MALDI-TOF analize intaktnog proteina kontrolnih i konjugovanih antitela pokazuju da konjugati imaju približno dva dela glikana po antitelu, dok kontrolna antitela nemaju nijedan (slika 46).
[1133] Primer 19. Konjugacija kroz sijalinsku kiselinu sa cisteinskim reziduama šarke u antitelu
[1135] Man-6-P heksamanoza maleimid (slika 41) je konjugovan ili sa poliklonalnim antitelom ili sa monoklonalnim antitelom.
[1137] [0277] Konjugacija poliklonalnog antitela sa Man-6-P heksamanozom maleimidom kroz cisteine šarke je ispitana pomoću SDS-PAGE, lektin blottinga i kvantifikacije manoza-6-fosfata (da bi se odredio broj glikana konjugovanih po antitelu) (slika 47 ). Konjugacija poliklonalnog antitela sa laktoza maleimidom je takođe ispitana korišćenjem SDS-PAGE i kvantifikacije galaktoze kontrolnog antitela, konjugovanog antitela i filtrata prikazani su na slici 48. Mala povećana agregacija je primećena kod poliklonalnih antitela konjugovanih na cisteine šarke pomoću hromatografije isključivanja po veličini (SEC) (slika 50).
[1139] Konjugacija monoklonalnog antitela sa manoza-6-fosfat heksamanozom maleimidom kroz cisteine šarke je takođe ispitana pomoću SDS-PAGE i kvantifikacije glikana (da bi se odredio broj glikana konjugovanih po antitelu) (slika 49). Mala povećana agregacija je primećena kod poliklonalnih antitela konjugovanih na cisteine šarke pomoću hromatografije isključivanja po veličini (SEC) (slika 51).
[1141] Vezivanje Man-6-P receptora (CI-MPR) za poliklonalna i monoklonalna antitela konjugovana sa bis Man-6-P heksamanozom kroz nativne Fc glikane ili disulfidne veze šarki je takođe demonstrirano pomeranjem gela na nativnom PAGE-u (slika 55).
[1143] Primer 20. Priprema potpuno galaktozilovane monoklonalne varijante antitela i konjugacija trigalaktozilovanim glikopeptidom sa sijalilovanim antitelom
[1145] Mutant mišjeg monoklonalnog antitela sa STY mutacijom (NNAS) je modifikovan sijalidazom i galaktoziltransferazom za pravljenje uglavnom nativnih trigalaktozilovanih glikana (2 glikana po antitelu). Isti mutant je takođe sijalilovan sa sijaliltransferazom i konjugovan sa trivalentnim glikopeptidom koji sadrži galaktozu (slika 68) koristeći SAM pristup. Sadržaj sijalinske kiseline u enzimski modifikovanim antitelima je ispitan (slika 52). Dalje, analizom MALDI-TOF-a ispitani su glikani oslobođeni od kontrole i desijalilovanog/galaktozilovanog (slika 53) NNAS-a, kao i glikani oslobođeni od kontrole i sijalilovanog (slika 54) NNAS-a. SDS-PAGE (4-12%NuPAGE) i lektin blotting enzimski modifikovanog i konjugovanog NNAS-a prikazani su na (slici 56). Kvantifikacija terminalne galaktoze je takođe merena za kontrolno NNAS antitelo, desijalilovani/galaktozilovani NNAS antitelo, i glikopeptidom konjugovano NNAS antitelo (slika 57).
[1147] Primer 21. Priprema α2,3 sijalilovanog laktoza maleimida korišćenjem hemoenzimskog pristupa i naknadna konjugacija sa neimunim IgG kunića kroz disulfidne veze šarke.
[1149] [0281] Proteini koji vezuju ugljene hidrate (uključujući Siglec proteine) su u stanju da se efikasnije vezuju za oblasti sa većom gustinom sijalinske kiseline. Stoga, monosijalilovani glikani na datom antitelu možda ne obezbeđuju dovoljnu gustinu sijalinske kiseline da bi se olakšalo vezivanje za druge Siglec proteine. Iz tog razloga, istražen je pristup konjugacije na disulfidne veze šarke radi uvođenja višestrukih kopija sijalilovanih glikana. Da bi se proizveli sijalilovani glikani za konjugaciju, laktoza maleimid (5 mg) je sijalilovan in vitro sa α2,3 sijaliltransferazom iz Photobacterium damsela u Tris puferu (pH 7,5) tokom 2 sata na 37°C. Kontrolni glikan je inkubiran bez sijaliltransferaze i upoređen sa originalnim glikanima. MALDI-TOF MS analiza je pokazala da inkubacija laktoza maleimida bez enzima u Tris puferu (pH 7,5) tokom 2 sata na 37°C nije promenila očekivanu molekulsku težinu molekula, što sugeriše da ispitani uslov nije rezultirao hidrolizom maleimida. MALDI-TOF i Dionex HPLC analiza glikana modifikovanih sa α2,3 sijaliltransferazom ukazuju na prisustvo sijalilaktoze, iako ne kao glavni pik (podaci nisu prikazani). Stoga, sijalilaktoza maleimid je dodatno prečišćena korišćenjem QAE-sepharose kolona i svaka frakcija je naknadno analizirana korišćenjem MALDI-TOF-a i Dionex HPLC-a. Ove analize su ukazale da je sijalilaktoza maleimid postojao kao glavna vrsta u eluatu od 20 mM NaCl iz QAE kolone (slika 58). Količina prečišćenih sijalilovanih glikana je procenjena korišćenjem analize kvantifikacije sijalinske kiseline uzoraka, što ukazuje na povrat od ~1,8 mg sijalilaktoze maleimida.
[1151] Naknadna konjugacija poliklonalnog antitela kunića sa ovim sijalilaktoza maleimidom je testirana korišćenjem tiol-maleimid hemije. IgG antitelo kunića (1 mg) je redukovano sa TCEP-om u 4 molarna viška (u odnosu na antitelo) tokom 2 sata na 37°C pre nego što je konjugovano sa 24 molarna viška sijalilaktoze tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Konjugat je zatim razmenjen sa PBS puferom radi analize na SDS-PAGE (slika 59A). Kvantifikacija sijalinske kiseline je takođe izvršena korišćenjem Dionex HPLC-a (slika 59B). Alikvoti kontrole i tiol konjugata su tretirani sa ili bez sijalidaze (1U po mg) preko noći na 37°C pre nego što su supernatanti dobijeni filtracijom (10 kDa MWCO). Sadržaj sijalinske kiseline supernatanata je izmeren i upoređen sa uzorcima tretiranim bez sijalidaze. Postoje približno 4 α2,3 sijalilaktoza dela molekula spojena po antitelu.
[1153] Primer 22. Priprema α2,6 sijalilaktoza maleimida sijalilovanjem laktoza maleimida i konjugacija sa disulfidnim vezama šarke poliklonalnog antitela kunića putem α2,3- ili α2,6- veza što rezultira visokom sijalilacijom
[1155] [0283] Konjugacija višestrukih kopija α2,6- sijalilovanih glikana sa disulfidnim vezama šarke poliklonalnog antitela kunića je takođe istražena. Budući da je α2,3 sijalilaktoza maleimid uspešno proizveden korišćenjem hemoenzimskog pristupa (videti gore, primer 21), slična metoda je korišćena za proizvodnju α2,6 sijalilaktoza maleimida (manje modifikacije protokola uključivale su upotrebu drugačije sijaliltransferaze). Da bi se proizveo α2,6 sijalilovani glikan za konjugaciju, laktoza maleimid (~5 mg) je sijalilovan in vitro sa 0,5 U bakterijske α2,6 sijaliltransferaze iz Photobacterium damsela u Tris puferu (pH 8) tokom 1 sata na 37 °C. Nakon enzimske reakcije, proizvod je primenjen na QAE-sepharose kolonu. Kolona je oprana sa 10 frakcija od 1 ml 2 mM Tris-a (pH 8), 5 frakcija od 1 ml Tris pufera koji sadrži 20 mM NaCl, i 5 frakcija od 1 ml Tris pufera koji sadrži 70 mM NaCl. Alikvoti iz svake frakcije su analizirani korišćenjem Dionex HPLC-a zajedno sa standardima laktoze i α2,6 sijalilaktoze. Profili oligosaharida standarda i jedne od eluiranih frakcija prikazani su na slikama 60 (A-D). Frakcije koje sadrže α2,6 sijalilaktoza maleimid su takođe analizirane i potvrđene pomoću MALDI-TOF-a. Glikan u jednoj od frakcija može se videti na slici 61.
[1157] Količina prečišćenog α2,6 sijalilaktoza maleimida je zatim procenjena korišćenjem analize kvantifikacije sijalinske kiseline koja je ukazala na povrat od ~1,5 mg sijalilaktoze maleimida. Nakon što je glikan pripremljen, konjugacija antitela sa bilo α2,6 sijalilaktoza maleimidom ili α2,3 sijalilaktoza maleimidom je testirana korišćenjem tiolne hemije. IgG antitelo kunića (1 mg) je razmenjeno sa puferom i redukovano sa TCEP-om u 4 molarna viška (u odnosu na antitelo) tokom 2 sata na 37 °C. Redukovano antitelo je zatim podeljeno na pola: jedna porcija je konjugovana sa 24 molarna viška α2,6 sijalilaktoza maleimida, a druga sa α2,3 sijalilaktoza maleimidom tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Dva konjugata su zatim razmenjena sa PBS puferom pre analize na SDS-PAGE (slika 62A) i kvantifikacije sijalinske kiseline korišćenjem Dionex HPLC-a (slika 62B). Kvantifikacija sijalinske kiseline je korišćena za procenu broja konjugovanih glikana. Alikvoti kontrolnog antitela i tiolom konjugovanog antitela su tretirani sa ili bez sijalidaze (1 U po mg) preko noći na 37 °C pre nego što su supernatanti dobijeni filtracijom (10 kDa MWCO). Sadržaj sijalinske kiseline supernatanata je izmeren i upoređen sa uzorcima tretiranim bez sijalidaze (kontrola). Analiza je pokazala da je približno 7 glikana (bilo α2,3- ili α2,6-sijalilaktoza glikana) konjugovano sa poliklonalnim antitelom ovom metodom.
[1159] Primer 23. PEGilacija NNAS-a korišćenjem GAM hemije
[1161] [0285] Mišje NNAS (S298N/T299A/Y300S) mutantno monoklonalno antitelo je galaktozilovano i desijalilovano, generišući Gal NNAS monoklonalno antitelo bez ikakve degradacije proteazom. Ovo antitelo je modifikovano sa galaktoza oksidazom (GAO) da bi se generisao galaktozni aldehid. Galaktozni aldehid je zatim konjugovan sa 2 ili 5 kDa aminooksid polietilen glikola (PEG). Slika 63 prikazuje karakterizaciju kontrolnih i enzimski modifikovanih (desijalilovanih/galaktozilovanih) NNAS mutantnih antitela korišćenjem SDS-PAGE i lektin blottinga. Slika 64 prikazuje karakterizaciju putem reducirajućeg SDS-PAGE-a PEGilacije kontrolnog antitela i Gal NNAS-a sa različitim količinama galaktoza oksidaze. Ovi rezultati pokazuju da se Gal NNAS može PEGilovati efikasno sa značajnim količinama mono-, bi- i tri-PEG konjugovanih po teškom lancu. Slika 66 prikazuje karakterizaciju putem reducirajućeg SDS-PAGE-a PEGilacije kontrolnog antitela i Gal NNAS-a sa različitim molarnim viškom PEG-a u odnosu na antitelo. Skeniranja Protein Simple-a koja karakterišu PEGilaciju antitela pokazuju da je približno 1,5-1,7 PEG delova molekula konjugovano po teškom lancu (ili oko 3-3,4 PEG po antitelu) (slike 65 i 67).
[1163] Primer 24. PEGilacija NNAS-a korišćenjem GAM hemije
[1165] NNAS antitelo je galaktozilovano sa 50 mU/mg galaktoziltransferaze i naknadno desijalilovano sa 1 U/mg sijalidaze u 50 mM MES puferu (pH 6,5). Desijalilovani fetuin i NNAS, kao i galaktozilovani NNAS, su zatim tretirani sa galaktoza oksidazom (57 mU/mg)/katalazom u prisustvu ili odsustvu 0,5 mM bakar-acetata pre konjugacije sa 25 molarnim viškom 5 kDa aminooksid PEG-a (slika 69A). U drugom eksperimentu, galaktozilovani NNAS je tretiran sa galaktoza oksidazom (57 mU/mg)/katalazom u prisustvu 0, 0,02, 0,1 i 0,5 mM bakar-acetata pre konjugacije sa 25 molarnim viškom 5 kDa aminooksid PEG-a (slika 69B). Antitelo oksidovano sa galaktoza oksidazom u prisustvu bakar-acetata pokazalo je viši stepen PEGilacije od istog antitela koje je reagovalo sa galaktoza oksidazom u odsustvu bakar-acetata. Značajno viši nivoi PEGilacije su primećeni kada je konjugacija izvedena u reakciji koja je sadržala bakar-sulfat u koncentracijama iznad 0,1 mM.
[1167] Primer 25. Modifikacija Herceptina divljeg tipa i mutanta korišćenjem sijalidaze/galaktoziltransferaze
[1169] [0287] Herceptin antitela divljeg tipa i mutanta (A114N, NNAS i A114N/NNAS) su enzimski modifikovana sa 50 mU/mg galaktoziltransferaze i naknadno desijalilovana sa 1 U/mg sijalidaze u 50 mM MES puferu (pH 6,5). Modifikovana antitela su analizirana korišćenjem SDS-PAGE (reducirajući i nereducirajući), lektin blottinga sa ECL (biljni lektin specifičan za terminalnu galaktozu), i kvantifikacije terminalne galaktoze korišćenjem Dionex HPLC analize oslobođene galaktoze pomoću galaktozidaze (slika 70 ). Enzimski modifikovana antitela koja sadrže približno tri do devet terminalnih galaktoza dobijena su sa NNAS i NNAS/A114N dvostrukim mutantima, demonstrirajući viši nivo terminalne galaktoze od mutanta divljeg tipa i A114N.
[1171] Primer 26. PEGilacija antitela divljeg tipa i mutanta korišćenjem SAM metode konjugacije
[1173] Herceptin antitela divljeg tipa i (A114N, NNAS i A114N/NNAS) su PEGilovana korišćenjem konjugacije posredovane sijalinskom kiselinom (SAM). Antitela su naknadno oksidisana sa 2 mM periodata. Nakon razmene sa puferom, oksidovana antitela su PEGilovana sa 25 molarnim viškom 5 kDa aminooksid PEG-a. Sadržaj sijalinske kiseline u antitelima divljeg tipa i mutantnim antitelima je izmeren korišćenjem Dionex HPLC-a (slika 71). PEGilovana antitela su zatim analizirana korišćenjem reducirajućeg i nereducirajućeg SDS-PAGE-a (slika 72). Dalje, PEGilacija (PAR, broj PEG-ova po antitelu) je procenjena analizom skeniranih gelova korišćenjem ProteinSimple-a (slika 73). NNAS, A114N i A114N/NNAS mutanti su svi pokazali viši PAR (2,7-4,6) od Herceptin antitela divljeg tipa (1,4).
[1175] Primer 27. Istraživanje apsorpcije gliko-inženjeringom stvorenih antitela sa glikan ligandima koji sadrže galaktozu
[1177] Poliklonalno antitelo je ili enzimski modifikovano galaktoziltransferazom (Gal Transferaza), konjugovano sa laktoza aminooksidom (Gal-Glc to 297: konjugovano sa sijalinskom kiselinom u glikanima iz Asn-297 sijalilovanog antitela), ili konjugovano sa laktoza maleimidom (Gal-Glc to Hinge: konjugovano sa cisteinima u disulfidnim vezama šarke). Kontrolna, modifikovana ili konjugovana antitela su zatim inkubirana sa HepG2 ćelijama (ćelijskom linijom hepatocita koja ekspresuje ASGPR) tokom 1-2 sata na 37°C pre nego što su apsorbovana antitela izmerena korišćenjem imunofluorescentnog bojenja (slika 74). Rezultati su pokazali povećanu apsorpciju enzimski modifikovanih ili laktozom konjugovanih antitela u HepG2 ćelijama.
[1179] Primer 28. Konjugacija trivalentnog GalNAc glikana sa Herceptinom
[1180] Herceptin (anti-Her2) je sijalilovan i konjugovan sa trivalentnim GalNAc glikanom (slika 75) za ciljanje ASGPR-a korišćenjem SAM metode konjugacije. Naknadno, eksperimenti sa površinskom plazmonskom rezonancom (Biacore) su korišćeni za procenu vezivanja ovih trivalentnih glikana konjugovanih sa GalNAc-om za ASGPR podjedinicu H1 (slika 76).
[1182] Primer 29. Konjugacija trivalentnog GalNAc glikana i trivalentnog glikopeptida koji sadrži galaktozu sa rekombinantnim lizozomalnim enzimom
[1184] Rekombinantni lizozomalni enzim je konjugovan ili sa trivalentnim GalNAc glikanom ili sa trivalentnim glikopeptidima koji sadrže galaktozu (slika 77) za ciljanje ASGPR-a korišćenjem SAM metode konjugacije. Naknadno, eksperimenti sa površinskom plazmonskom rezonancom (Biacore) su korišćeni za procenu vezivanja ovih trivalentnih glikana konjugovanih sa GalNAc-om i trivalentnih glikopeptida koji sadrže galaktozu konjugovanih enzima za ASGPR podjedinicu H1 (slika 78). Rezultati su pokazali snažno vezivanje za ASGPR rekombinantnog lizozomalnog enzima konjugovanog sa trivalentnim GalNAc glikanom. Slike 79(A-D) prikazuju niz primernih trivalentnih GalNAc delova molekula. Prikazani su primeri koji nemaju spejser, spejser od 12 Å, spejser od 1 kDa (približno 80 Å), i oba: spejser od ~20 Å i spejser od 1 kDa (približno 80 Å). Drugi rekombinantni lizozomalni enzim (rhGAA) je takođe konjugovan sa trivalentnim GalNAc glikanom C12. Slika 80 prikazuje grafikon koji prikazuje rezultate konjugacije rekombinantnog lizozomalnog enzima rhGAA oksidovanog periodatom sa viškom trivalentnog GalNAc glikana C12. Prikazan je rezultujući glikan po GAA konjugovan sa 20, 40, 80 i 200 puta molarnim viškom glikana u odnosu na rhGAA. Slika 81 prikazuje vezivanje ASGPR rekombinantnih lizozomalnih enzima konjugovanih sa trivalentnim GalNAc glikanom C12 na Biacore-u. Enzimi konjugovani sa 20-(konjugat 1), 40-, 80- i 200-strukim (konjugat 4) viškom glikana svi pokazuju snažno vezivanje za ASGPR podjedinicu 1. Nema značajne razlike u vezivanju među konjugatima (konjugati 1 do 4).

Claims (14)

1. Patentni zahtevi
1. Konjugat koji obuhvata vezujući polipeptid i efektorski deo molekula za upotrebu u terapeutskoj metodi olakšavanja isporuke vezujućeg polipeptida do ćelije, pri čemu efektorski deo molekula obuhvata ciljni deo molekula koji sadrži deo molekula manoza-6-fosfata koji se vezuje za manoza-6-fosfatni receptor na ćeliji, pri čemu je efektorski deo molekula konjugovan, bilo direktno ili preko povezujućeg dela molekula, za N-vezani i/ili oksidovani glikan vezujućeg polipeptida, i pri čemu je vezujući polipeptid imunoadhezin, antitelo, fragment antitela koji vezuje antigen, ili varijanta antitela.
2. Konjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je vezujući polipeptid internalizovan od strane ćelije, opcionalno pri čemu je količina vezujućeg polipeptida internalizovanog od strane ćelije veća od količine referentnog vezujućeg polipeptida kome nedostaje ciljni deo molekula, a koji je internalizovan od strane ćelije.
3. Konjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu je efektorski deo molekula konjugovan sa N-vezanim glikanom na vezujućem polipeptidu.
4. Konjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu:
(a) vezujući polipeptid obuhvata Fc domen i pri čemu je glikan N-vezan za vezujući polipeptid preko asparaginske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 297 Fc domena, prema EU numeraciji; ili
(b) vezujući polipeptid obuhvata Fc domen i pri čemu je glikan N-vezan za vezujući polipeptid preko asparaginske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 298 Fc domena, prema EU numeraciji; ili
(c) vezujući polipeptid obuhvata CH1 domen i pri čemu je glikan N-vezan za vezujući polipeptid preko asparaginske rezidue na aminokiselinskoj poziciji 114 CH1 domena, prema Kabat numeraciji.
5. Konjugat za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je efektorski deo molekula formule (I):
NH<2>-Q-CON-X formula (I),
pri čemu:
A) Q je NH ili O;
B) CON je konektorski deo molekula; i
C) X je ciljni deo molekula.
6. Konjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, pri čemu efektorski deo molekula obuhvata bisM6P heksamanozu aminooksid ili bisM6P heksamanozu maleimid.
7. Konjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, pri čemu bisM6P heksamanoza aminooksid ima sledeću strukturnu formulu:
8. Konjugat za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 7, pri čemu konektorski deo molekula obuhvata spejser, opcionalno pri čemu je spejser C<2-30>alkil ili 1 to 32 PEG.
9. Konjugat za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu vezujući polipeptid obuhvata najmanje jedno mesto vezivanja odgovorno za selektivno vezivanje za ciljni antigen od interesa.
10. Konjugat za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, pri čemu najmanje jedno mesto vezivanja obuhvata mesto vezivanja izabrano iz: varijabilnog domena antitela, mesta vezivanja liganda receptora i mesta vezivanja liganda receptora; opcionalno pri čemu je ligand izabran iz grupe koja se sastoji od peptida, polipeptida, proteina, aptamera, polisaharida, molekula šećera, ugljenog hidrata, lipida, oligonukleotida, polinukleotida, sintetičkog molekula, organskog molekula i bilo koje njihove kombinacije.
11. Konjugat za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu vezujući polipeptid obuhvata CH1 domen ili Fc domen, opcionalno pri čemu je Fc domen human.
12. Konjugat za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je vezujući polipeptid antitelo, ili fragment ili derivat istog; ili pri čemu vezujući polipeptid obuhvata izmenjeno minitelo, ili diatelo; ili pri čemu vezujući polipeptid obuhvata sekvencu varijabilnog regiona sa jednim lancem (ScFv).
13. Konjugat za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je vezujući polipeptid bispecifično ili trispecifično antitelo, opcionalno pri čemu vezujući polipeptid obuhvata bispecifično antitelo unakrsnog dvostrukog varijabilnog domena IgG (CODV-IgG).
14. Konjugat za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu efektorski deo molekula obuhvata PEG, opcionalno pri čemu PEG deo molekula obuhvata mono-PEG, bi-PEG, ili tri-PEG i/ili opcionalno pri čemu PEG deo molekula obuhvata 3 do 3,5 PEG.
RS20251071A 2014-03-19 2015-03-18 Glikoinženjering ciljnih delova molekula na određenom mestu RS67352B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461955682P 2014-03-19 2014-03-19
US201462061556P 2014-10-08 2014-10-08
EP21207026.2A EP4015535B1 (en) 2014-03-19 2015-03-18 Site-specific glycoengineering of targeting moieties

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67352B1 true RS67352B1 (sr) 2025-11-28

Family

ID=52808173

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230222A RS64072B1 (sr) 2014-03-19 2015-03-18 Mesto-specifični glikoinženjering ciljnih delova
RS20251071A RS67352B1 (sr) 2014-03-19 2015-03-18 Glikoinženjering ciljnih delova molekula na određenom mestu

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230222A RS64072B1 (sr) 2014-03-19 2015-03-18 Mesto-specifični glikoinženjering ciljnih delova

Country Status (18)

Country Link
US (4) US10995148B2 (sr)
EP (3) EP4015535B1 (sr)
CN (2) CN116333148A (sr)
AU (3) AU2015231307B2 (sr)
CA (1) CA2942769A1 (sr)
DK (1) DK3129067T5 (sr)
ES (2) ES3051373T3 (sr)
FI (1) FI3129067T3 (sr)
HR (2) HRP20230260T1 (sr)
HU (2) HUE061339T2 (sr)
LT (1) LT3129067T (sr)
MX (2) MX384991B (sr)
PL (2) PL3129067T3 (sr)
PT (1) PT3129067T (sr)
RS (2) RS64072B1 (sr)
SG (2) SG11201607198WA (sr)
SI (1) SI3129067T1 (sr)
WO (1) WO2015143091A1 (sr)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
US9701753B2 (en) 2013-03-11 2017-07-11 Genzyme Corporation Hyperglycosylated binding polypeptides
WO2015143091A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Genzyme Corporation Site-specific glycoengineering of targeting moieties
CA3205824A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
JP6951825B2 (ja) 2015-09-04 2021-10-20 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート インスリン免疫グロブリン融合タンパク質
AU2016354100B2 (en) * 2015-11-10 2023-11-30 Yale University Compositions and methods for treating autoimmune diseases and cancers
CN109843327B (zh) 2016-07-07 2022-05-13 小利兰·斯坦福大学托管委员会 抗体佐剂缀合物
AU2017381585B2 (en) 2016-12-19 2025-02-13 Fundacio Privada Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats Antibodies against LIF and uses thereof
US10583191B2 (en) 2016-12-19 2020-03-10 Mosaic Biomedicals Slu Antibodies against LIF and uses thereof
CA3082231A1 (en) * 2017-11-09 2019-05-16 National Research Council Of Canada Antibody glycoconjugates and methods of production and use
WO2019127004A1 (zh) * 2017-12-26 2019-07-04 广州市锐博生物科技有限公司 修饰的寡核苷酸和可用于合成修饰的寡核苷酸的化合物
CN109957566B (zh) * 2017-12-26 2023-08-25 广州市锐博生物科技有限公司 修饰的寡核苷酸和可用于合成修饰的寡核苷酸的化合物
AU2019205279A1 (en) * 2018-01-08 2020-07-30 Susavion Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating cancer with glycomimetic peptides
CN119291194A (zh) * 2018-01-12 2025-01-10 建新公司 用于定量多肽的方法
EP3773727A4 (en) 2018-04-09 2022-05-04 Yale University BIFUNCTIONAL SMALL MOLECULES TO TARGETING THE SELECTIVE DEGRADATION OF CIRCULATING PROTEINS
US20230097887A1 (en) 2018-04-09 2023-03-30 Yale University Bi-functional Molecules to Degrade Circulating Proteins
US12485178B2 (en) 2018-04-09 2025-12-02 Yale University Bifunctional small molecules to target the selective degradation of circulating proteins
GB201812331D0 (en) * 2018-07-27 2018-09-12 Mologic Ltd Bacterial vaginosis diagnostic
AU2019404061A1 (en) * 2018-12-19 2021-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bifunctional molecules for lysosomal targeting and related compositions and methods
WO2020190725A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting her2
CN120192414A (zh) 2019-04-03 2025-06-24 建新公司 具有降低的断裂的抗αβTCR结合多肽
KR102501394B1 (ko) * 2019-05-02 2023-02-21 주식회사 레고켐 바이오사이언스 트리스 구조를 가지는 링커를 포함하는 리간드-약물 접합체
JP2022530482A (ja) * 2019-05-02 2022-06-29 レゴケム バイオサイエンシズ， インク． トリス構造を有するリンカーを含むリガンド―薬物複合体
KR20220099963A (ko) * 2019-10-10 2022-07-14 예일 유니버시티 세포 수용체를 통한 분자 분해제로서의 조작된 항체
WO2021155317A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Avilar Therapeutics, Inc. Asgpr-binding compounds for the degradation of extracellular proteins
KR20220148235A (ko) 2020-02-28 2022-11-04 젠자임 코포레이션 최적화된 약물 접합을 위한 변형된 결합 폴리펩티드
GB2613225B (en) 2020-03-04 2024-01-03 Verve Therapeutics Inc Compositions and methods for targeted RNA delivery
KR20230005907A (ko) 2020-05-01 2023-01-10 볼트 바이오테라퓨틱스 인코퍼레이티드 항-dectin-2 항체
AU2021376384B2 (en) 2020-11-06 2026-04-16 Cho Pharma, Inc. Immune composition comprising antigen and glycoengineered antibody thereof
KR20240017423A (ko) 2021-05-03 2024-02-07 아빌라 테라퓨틱스, 인크. 이뮤노글로불린 및 다른 단백질의 분해를 위한 강력한 asgpr-결합 화합물
EP4370157A1 (en) 2021-07-14 2024-05-22 Lycia Therapeutics, Inc. Asgpr cell surface receptor binding compounds and conjugates
AU2022310346A1 (en) 2021-07-14 2024-01-25 Lycia Therapeutics, Inc. M6pr cell surface receptor binding compounds and conjugates
WO2023015223A2 (en) 2021-08-03 2023-02-09 Verve Therapeutics, Inc. Compositions and methods for targeted rna delivery
KR20230099677A (ko) * 2021-12-27 2023-07-04 주식회사 진켐 신규한 메토트렉세이트 결합체와 이의 용도
CN114656523B (zh) * 2022-03-14 2022-12-23 南京市第一医院 靶向siglec-10蛋白的多肽及免疫调控应用
WO2024089609A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Ablynx N.V. Glycoengineered fc variant polypeptides with enhanced effector function
CN120882430A (zh) 2023-01-18 2025-10-31 利西亚治疗公司 循环溶酶体靶向抗体缀合物
EP4651902A2 (en) 2023-01-18 2025-11-26 Lycia Therapeutics, Inc. Asgpr binding compounds and conjugates
CN120835794A (zh) 2023-01-18 2025-10-24 利西亚治疗公司 M6pr结合化合物和缀合物
JP2026503462A (ja) 2023-01-18 2026-01-29 ライシア セラピューティクス， インコーポレイテッド 自己抗体の分解のためのリソソーム標的化二官能性分子
EP4719482A1 (en) * 2023-06-05 2026-04-08 Vib Vzw Glyco-engineered antibody-drug-conjugates comprising an oxime linker
WO2025035040A1 (en) 2023-08-09 2025-02-13 Lycia Therapeutics, Inc. Lysosomal targeting bifunctional molecules for degradation of muscle-specific kinase autoantibodies
TW202535925A (zh) 2023-10-25 2025-09-16 比利時商艾伯霖克斯公司 具有增強的Ｆｃ受體結合之Ｆｃ結構域變體
WO2026015664A1 (en) 2024-07-10 2026-01-15 Lycia Therapeutics, Inc. Cycling lysosomal targeting chimeras targeting immunoglobulin e (ige)

Family Cites Families (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
DE68928427T2 (de) 1988-09-15 1998-06-04 Univ Columbia Antikörper mit modifiziertem Kohlenhydratgehalt und Verfahren zur Herstellung und Verwendung
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
CA2018248A1 (en) 1989-06-07 1990-12-07 Clyde W. Shearman Monoclonal antibodies against the human alpha/beta t-cell receptor, their production and use
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
EP0627932B1 (en) 1992-11-04 2002-05-08 City Of Hope Antibody construct
US5792456A (en) 1994-08-04 1998-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Mutant BR96 antibodies reactive with human carcinomas
DE69523857T2 (de) 1994-09-16 2002-06-13 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
BR9606706A (pt) 1995-10-16 1999-04-06 Unilever Nv Análogo de fragmento de anticorpo biespecífico ou bivalente uso processo para produzir o mesmo
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
SE9601245D0 (sv) 1996-03-29 1996-03-29 Pharmacia Ab Chimeric superantigens and their use
DE69738522T2 (de) 1996-08-02 2009-04-02 Bristol-Myers Squibb Co. Ein verfahren zur inhibierung immunglobulininduzierter toxizität aufgrund von der verwendung von immunoglobinen in therapie und in vivo diagnostik
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6953675B2 (en) 1997-11-06 2005-10-11 Immunomedics, Inc. Landscaped antibodies and antibody fragments for clinical use
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
AU6059699A (en) 1998-09-23 2000-04-10 Regents Of The University Of California, The Synthetic peptides, conjugation reagents and methods
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
PL209392B1 (pl) 1999-01-15 2011-08-31 Genentech Inc Przeciwciało, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała oraz zastosowanie przeciwciała
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20020102208A1 (en) 1999-03-01 2002-08-01 Paul Chinn Radiolabeling kit and binding assay
CN1110322C (zh) 1999-07-21 2003-06-04 中国医学科学院医药生物技术研究所 单克隆抗体Fab'－平阳霉素偶联物及其抗肿瘤作用
CA2410551A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw (Vib) Heterodimeric fusion proteins
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
US7083784B2 (en) 2000-12-12 2006-08-01 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US20050107595A1 (en) 2001-06-20 2005-05-19 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
US6900292B2 (en) 2001-08-17 2005-05-31 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human erythropoietin with increased biological activities
ES2411007T3 (es) 2001-10-10 2013-07-04 Novo Nordisk A/S Remodelación y glicoconjugación de péptidos
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
JP2006502091A (ja) 2002-03-01 2006-01-19 イミューノメディクス、インコーポレイテッド クリアランス速度を高めるための二重特異性抗体点変異
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
DK1534335T4 (en) 2002-08-14 2015-10-05 Macrogenics Inc FCGAMMARIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
EP1553975B8 (en) 2002-09-27 2023-04-12 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
DK1562972T3 (da) 2002-10-15 2010-12-06 Facet Biotech Corp Modifikation af FcRn-bindingsaffiniteter eller serumhalveringstider for antistoffer ved mutagenese
CA2512729C (en) 2003-01-09 2014-09-16 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant fc regions and methods of using same
PL1615945T3 (pl) * 2003-04-09 2012-03-30 Ratiopharm Gmbh Sposoby glikopegylacji i białka/peptydy wytwarzane tymi sposobami
DK1641823T3 (da) 2003-06-12 2011-12-12 Lilly Co Eli GLP-1-analog fusionsproteiner
WO2005014049A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Novo Nordisk A/S Synthesis and application of new structural well defined branched polymers as conjugating agents for peptides
AU2004266159A1 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
RU2392324C2 (ru) 2003-09-18 2010-06-20 Симфоген А/С Способ связывания интересующих последовательностей
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
EP2478912B1 (en) 2003-11-06 2016-08-31 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates with anti-HER2 or anti-CD22 antibodies and their use in therapy
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
US7001978B2 (en) 2003-11-19 2006-02-21 Xerox Corporation Unsaturated ester substituted polymers with reduced halogen content
AU2004297616B2 (en) 2003-12-04 2008-12-18 Xencor, Inc. Methods of generating variant proteins with increased host string content and compositions thereof
EP1697520A2 (en) 2003-12-22 2006-09-06 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites
NZ548123A (en) 2004-01-08 2010-05-28 Novo Nordisk As O-linked glycosylation of peptides
SI1706424T1 (sl) 2004-01-12 2010-01-29 Applied Molecular Evolution Variante fc regij
EP1737890A2 (en) 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
KR20070008645A (ko) 2004-05-04 2007-01-17 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 폴리펩티드의 ｏ-연결된 단백당형 및 그들의 제조 방법
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
EP2471813B1 (en) 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
DK1791565T3 (en) * 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
WO2006036922A2 (en) 2004-09-27 2006-04-06 Centocor, Inc. Srage mimetibody, compositions, methods and uses
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
JP4829609B2 (ja) 2004-12-22 2011-12-07 独立行政法人科学技術振興機構 ヒト抗体酵素およびその生産方法
US8217154B2 (en) 2005-02-23 2012-07-10 Lipoxen Technologies Limited Activated sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
PT2343320T (pt) 2005-03-25 2018-01-23 Gitr Inc Anticorpos anti-gitr e as suas utilizações
JP2008537941A (ja) 2005-03-31 2008-10-02 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化特性を有するＦｃ変異体
WO2006105338A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES
WO2006130834A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Board Of Regents, The University Of Texas System IGGl ANTIBODIES WITH MUTATED FC PORTION FOR INCREASED BINDING TO FCRN RECEPTOR AND USES THEREOF
EP1907001B1 (en) 2005-06-17 2015-07-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Ilt3 binding molecules and uses therefor
PT1896071E (pt) 2005-06-30 2015-07-09 Janssen Biotech Inc Métodos e composições com melhorias na atividade terapêutica
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
CA2655903A1 (en) 2006-06-19 2008-08-07 Tolerx, Inc. Ilt3 binding molecules and uses therefor
US8460364B2 (en) 2006-07-20 2013-06-11 Orbusneich Medical, Inc. Bioabsorbable polymeric medical device
EP2049144B8 (en) 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
FI20060946A0 (fi) 2006-10-26 2006-10-26 Glykos Finland Oy Influenssaviruksen nukleiinihappoja ja peptidejä
JP2010512306A (ja) 2006-10-27 2010-04-22 ザ ロックフェラー ユニバーシティー 抗炎症特性が増強され、細胞毒性特性が減少したポリペプチドおよび関連する方法
AR063975A1 (es) 2006-11-28 2009-03-04 Centelion Fusiones fc con receptor para fgf soluble modificadas con actividad biologica mejorada
BRPI0806340B8 (pt) 2007-01-09 2021-05-25 Biogen Idec Inc anticorpo isolado que se liga especificamente a sp35, seu uso e composição farmacêutica
EP2125893A2 (en) 2007-01-23 2009-12-02 Xencor, Inc. Optimized cd40 antibodies and methods of using the same
CL2008001334A1 (es) 2007-05-08 2008-09-22 Genentech Inc Anticuerpo anti-muc16 disenado con cisteina; conjugado que lo comprende; metodo de produccion; formulacion farmaceutica que lo comprende; y su uso para tratar el cancer.
US20100260751A1 (en) 2007-09-28 2010-10-14 Raju T Shantha Methods and Structural Conformations of Antibody Preparations with Increased Resistance to Proteases
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
NZ584514A (en) 2007-10-19 2012-07-27 Genentech Inc Cysteine engineered anti-tenb2 antibodies and antibody drug conjugates
CA2711503A1 (en) 2008-01-08 2009-07-16 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
KR101607346B1 (ko) 2008-01-31 2016-03-29 제넨테크, 인크. 항-ｃｄ７９ｂ 항체 및 면역접합체 및 사용 방법
US20110137011A1 (en) 2008-04-21 2011-06-09 Novo Nordisk A/S Hyperglycosylated human coagulation factor ix
UA40611U (ru) 2008-05-26 2009-04-27 Владимир Семенович Живченко Способ десульфурации железоуглеродистого расплава в тигельной печи
WO2010027797A1 (en) 2008-08-26 2010-03-11 Macrogenics Inc. T-cell receptor antibodies and methods of use thereof
EP2233499A1 (en) 2009-03-26 2010-09-29 CSL Behring AG Antibody composition with altered Fab sialylation
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
CN102812039B (zh) 2010-02-16 2016-01-20 诺沃—诺迪斯克有限公司 缀合蛋白质
EP2542256B1 (en) 2010-03-04 2019-05-22 MacroGenics, Inc. Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
PT2603528T (pt) 2010-08-10 2016-12-01 Glycotope Gmbh Anticorpos glicosilados em fab
AR085302A1 (es) 2011-02-24 2013-09-18 Sanofi Sa Metodo de produccion de anticuerpos sialilados
SG10201604757RA (en) 2011-03-11 2016-08-30 Amicus Therapeutics Inc Dosing regimens for the treatment of fabry disease
TWI743461B (zh) 2011-03-28 2021-10-21 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
PL3366705T3 (pl) 2012-09-12 2023-09-18 Genzyme Corporation FC zawierające polipeptydy o zmienionej glikozylacji i zmniejszonej funkcji efektorowej
US9701753B2 (en) 2013-03-11 2017-07-11 Genzyme Corporation Hyperglycosylated binding polypeptides
WO2015143091A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Genzyme Corporation Site-specific glycoengineering of targeting moieties
AU2015243512B2 (en) 2014-04-08 2020-06-04 University Of Georgia Research Foundation Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
CA3205824A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
CN120192414A (zh) 2019-04-03 2025-06-24 建新公司 具有降低的断裂的抗αβTCR结合多肽

Also Published As

Publication number Publication date
US10995148B2 (en) 2021-05-04
PL3129067T3 (pl) 2023-05-08
PT3129067T (pt) 2023-03-22
MX384991B (es) 2025-03-14
HRP20251317T1 (hr) 2025-12-05
HUE061339T2 (hu) 2023-06-28
EP4640239A3 (en) 2026-01-14
MX2021009126A (es) 2021-09-10
LT3129067T (lt) 2023-03-27
EP4640239A2 (en) 2025-10-29
EP3129067B1 (en) 2023-01-04
AU2020294201A1 (en) 2021-01-28
SI3129067T1 (sl) 2023-06-30
SG11201607198WA (en) 2016-09-29
US20240117071A1 (en) 2024-04-11
US11697690B2 (en) 2023-07-11
AU2015231307B2 (en) 2021-01-28
EP4015535C0 (en) 2025-08-06
EP4015535B1 (en) 2025-08-06
ES2940903T3 (es) 2023-05-12
EP3129067A1 (en) 2017-02-15
AU2024205057A1 (en) 2024-08-15
US20160060354A1 (en) 2016-03-03
US20220119547A1 (en) 2022-04-21
WO2015143091A1 (en) 2015-09-24
CN106471010A (zh) 2017-03-01
SG10201808158UA (en) 2018-10-30
ES3051373T3 (en) 2025-12-26
HRP20230260T1 (hr) 2023-04-28
PL4015535T3 (pl) 2026-01-19
EP4015535A1 (en) 2022-06-22
DK3129067T5 (da) 2024-10-14
RS64072B1 (sr) 2023-04-28
CA2942769A1 (en) 2015-09-24
US20240059793A1 (en) 2024-02-22
DK3129067T3 (da) 2023-03-27
HUE073366T2 (hu) 2026-01-28
FI3129067T3 (fi) 2023-04-04
CN116333148A (zh) 2023-06-27
AU2015231307A1 (en) 2016-10-13
MX2016012122A (es) 2017-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11697690B2 (en) Site-specific glycoengineering of targeting moieties
US20240182595A1 (en) Hyperglycosylated binding polypeptides
US11160874B2 (en) Glycoengineered antibody drug conjugates
US10836813B2 (en) Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
HK40049269A (en) Glycoengineered antibody drug conjugates
HK40076070B (en) Site-specific glycoengineering of targeting moieties
HK40076070A (en) Site-specific glycoengineering of targeting moieties
HK1232454B (en) Site-specific glycoengineering of targeting moieties
HK1232454A1 (en) Site-specific glycoengineering of targeting moieties
HK1242336B (en) Glycoengineered antibody drug conjugates
HK1242336A1 (en) Glycoengineered antibody drug conjugates