ES2944982T3 - Anticuerpos anti-CD154 y métodos para utilizarlos - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a CD154, polinucleótidos que codifican los anticuerpos o fragmentos y métodos para preparar y usar los anteriores. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-CD154 y métodos para utilizarlos
Campo de la invención
[0001] La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a CD154, polinucleótidos que codifican los anticuerpos o fragmentos, y métodos para fabricar y usar lo anterior. La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
[0002] Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.
Antecedentes de la invención
[0003] CD154, también conocido como ligando CD40 (CD40L), gp39, proteína de activación relacionada con TNF (TRAP), antígeno 5c8 o TBAM, es una proteína transmembrana trimérica de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF). CD154 se expresa de manera temporalmente restringida y dependiente de la activación en la superficie de las células T CD4+. CD154 también se expresa, después de la activación, en un subconjunto de células T CD8+, basófilos, mastocitos, eosinófilos, células asesinas naturales, células B, macrófagos, células dendríticas y plaquetas. CD154 también existe como una forma soluble en la sangre.
[0004] CD154 se une a CD40 en las células presentadoras de antígeno (APC), lo que conduce a varias respuestas dependiendo del tipo de célula diana. La interacción CD40-CD154 es esencial para las interacciones normales de las células de TB, incluido el aumento de la coestimulación, el cebado de células T, la producción de citocinas, el cambio de clase de anticuerpos y la maduración de la afinidad, y la producción de anticuerpos y autoanticuerpos.
[0005] Se ha demostrado que la interrupción de la ruta de CD40/CD154 a través del bloqueo de CD154 es beneficiosa en enfermedades autoinmunes tales como lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide (AR), esclerosis múltiple (EM), enfermedad inflamatoria intestinal (EII), diabetes tipo I (T1D) y rechazo de aloinjertos. En humanos, las mutaciones en CD40 o CD154 dan como resultado un síndrome hiper-IgM caracterizado por la falta de isotipos IgG o IgA (Aruffo et al., Cell 72:291, 1993).
[0006] Los anticuerpos anti-CD154 se han descrito, por ejemplo, en Publ. Pat. Int. N.° WO1993/08207, WO1994/10308, WO1996/40918, WO1993/009812, WO1999/051258, WO1995/006480, WO1995/006481, WO1995/006666, W02001/002057, WO1997/017446, WO1999/012566, WO2001/068860, WO2005/003175, WO2006/033702, WO2006/030220, WO2008/118356, WO2012/052205, WO2012/138768, WO2012/138768, WO2013/055745 y WO2013/056068.
[0007] Los anticuerpos anti-CD154 han demostrado ser eficaces en el tratamiento de enfermedades autoinmunes en humanos. Sin embargo, el tromboembolismo debido a la activación plaquetaria observado durante el tratamiento impidió el desarrollo clínico continuado. Se ha demostrado que la unión de FcyRlla con las plaquetas es causante de la activación plaquetaria por el anticuerpo anti-CD154 5c8 (Xie et al., J Immunol 192:4083-4092, 2014). Gobburu et al., J Pharmacol Exp Ther 286(2):925-930, 1998 se refiere a 5c8 quimérico y humanizado, un anticuerpo monoclonal que se une a CD154. El documento WO 01/24823 analiza composiciones antagonistas de CD40 para tratar enfermedades autoinmunes y neoplásicas en un mamífero. Kuwana et al., Blood 103(4): 1229-1236, 2004 evalúa la respuesta autoinmune a la glicoproteína Ilb/IIIa como parte de un ensayo de fase 1, multicéntrico y de aumento de dosis de un anticuerpo monoclonal humanizado contra CD154 en pacientes con púrpura trombocitopénica inmune refractaria. Robles-Carrillo et al., J Immunol 185: 1577-1583, 2010 examina los efectos protrombóticos de los inmunocomplejos anti-CD40L in vivo. Langer et al., Thromb Haemostasis 93(6): 1137-1146, 2005 analiza el papel de CD40 en la activación de plaquetas mediada por anticuerpos y CD40L.
[0008] Por lo tanto, existe la necesidad de anticuerpos anti-CD154 adicionales con perfiles mejorados de seguridad y eficacia.
Resumen de la invención
[0009] La invención proporciona un anticuerpo antagonista o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD154 humano de SEQ ID NO:1, que comprende una región determinante de complementariedad de cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 17 (SYGIS), un HCDR2 de SEQ ID NO: 23 (WISPIFGNTNYAQKFQG), un HCDR3 de SEQ ID NO: 30 (SRYYGDLDY), una región determinante de complementariedad de cadena ligera (LCd R) 1 de SEQ ID NO: 37 (RASQSISSYLN), un LCDR2 de SEQ ID NO: 44 (YANSLQS), SEQ ID NO: 49 (YASSLQS) o SEQ ID NO: 50 (YANTLQS), y un LCDR3 de SEQ ID NO: 52 (QQSDSIPWT). La invención también proporciona un anticuerpo antagonista aislado específicamente unir CD154 de SEQ ID NO: 1 que comprende
HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 17, 23, 30, 37, 44 y 52, respectivamente; el VH de SEQ ID NO: 59 y el VL de SEQ ID NO: 66; o la cadena pesada de s Eq ID NO: 80 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 81.
[0010] La invención proporciona un anticuerpo antagonista aislado o una parte de unión a antígeno del mismo que puede unirse específicamente a CD154 de SEQ ID NO:1, donde CD154 es un homotrímero y el anticuerpo se une a un primer monómero de CD 154 en el homotrímero dentro de los residuos de aminoácidos 182-207 de CD154 y un segundo monómero de CD154 en el homotrímero dentro de los residuos de aminoácidos 176-253 de CD154, donde la numeración de los residuos es de acuerdo con SEQ ID NO: 1.
[0011] La invención también proporciona un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo o la parte de unión al antígeno del anticuerpo de la invención unido a un agente terapéutico agente o un agente de formación de imágenes.
[0012] La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptado.
[0013] La invención también proporciona un polinucleótido que codifica el anticuerpo VH de la invención, el anticuerpo VL de la invención o los anticuerpos VH y VL de la invención.
[0014] La invención también proporciona un vector que comprende el polinucleótido de la invención.
[0015] La invención también proporciona una célula huésped que comprende el vector de la invención.
[0016] La invención también proporciona un método para producir un anticuerpo, que comprende cultivar la célula huésped de la invención en condiciones en las que se expresa el anticuerpo y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped.
[0017] La invención también proporciona un método para tratar una enfermedad autoinmune o una enfermedad inflamatoria inmunomediada que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la invención o una composición farmacéutica de la invención a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar la enfermedad.
[0018] La invención también proporciona un anticuerpo antiidiotípico que se une al anticuerpo de la invención.
[0019] La invención también proporciona un kit que comprende el anticuerpo de la invención.
Breve descripción de los dibujos
[0020]
Figura 1 muestra el efecto del anticuerpo Fc sobre la activación plaquetaria por CD 154: inmunocomplejos de anticuerpo (IC). IC de CD154 humano soluble (shCD154, indicado como sCD40L en la figura) y plaquetas activadas con anticuerpo anti-CD154 5c8 (isotipo IgG1) (Sc8IgG1 IC), mientras que IC de shCD154 y 5c8 clonadas en esqueletos IgG1 silenciados IgG1sigma, IgG1sigma-YTE, IgG2sigma o IgG2sigma-YTE (5c8IgG1z, 5c8IgG1z-YTE, Sc8IgG2z o Sc8IgG2z-YTE, respectivamente) no tuvieron efecto. La activación plaquetaria se evaluó como % de plaquetas totales que expresan PAC-1 (el anticuerpo PAC-1 reconoce específicamente la forma activa conformacional de la integrina aIIbp3) y CD62p (expresión superficial de selectina P). ADP: control positivo. PBS: control negativo. Se evaluó la activación plaquetaria de cinco donantes. Los resultados se muestran como la media de cada experimento ± DE.
Figura 2 muestra que los inmunocomplejos (IC) de shCD154 (sCD40L en la Figura) y el efector silencioso IgG2sigma/K anticuerpos anti-CD154 c 4l B5, C4LB89, C4LB189, C4LB191, C4LB199 y C4LB150 no activan las plaquetas. La activación plaquetaria se evaluó como % de plaquetas totales que expresan PAC-1 y CD62p. IC de plaquetas activadas por shCD154 y Sc8IgG1 (Sc8IgG1 IC). ADP: control positivo. Se evaluó la activación plaquetaria de cinco donantes. Los resultados se muestran como la media de cada experimento ± DE.
Figura 3 muestra que los inmunocomplejos (IC) de shCD154 (sCD40L) y los anticuerpos anti-CD154 C4LB89 (IgG2sigma/K), C4LB231 (IgG1sigma/K) y C4LB232 (IgG1sigma/K) no activan las plaquetas. La activación plaquetaria se evaluó como % de plaquetas totales que expresan PAC-1 y CD62p. Plaquetas activadas por 5c8-IgG1 IC, cuya activación fue bloqueada por un anticuerpo anti-FcyIIa, lo que indica que la activación plaquetaria de CD154/5c8-IgG1 IC está mediada por FcyRIIa en las plaquetas. ADP: control positivo. PBS: control negativo. Se evaluó la activación plaquetaria de cinco donantes. Los resultados se muestran como la media de cada experimento ± DE.
Figura 4 muestra la superficie de interacción entre CD154 y C4LB89. Los residuos aromáticos F55, Y101 e Y102 en HCDR2 y HCDR3 contribuyen a la mayoría de las interacciones (numeración de residuos según SEQ ID NO: 59). La cadena ligera de C4LB89 no contribuye a la unión.
Figura 5 muestra una caricatura bidimensional de residuos de epítopos y paratopos identificados a partir de la estructura cristalina del tití CD154 en complejo con C4LB89. Los residuos del epítopo están rodeados por una elipse y se muestran los residuos del paratopo en la cadena pesada HCDR1, HCDR2 y HCDR3 (indicados como CDR1, CDR2 y CDR3 en la figura). El anticuerpo se une simultáneamente a dos monómeros A y B de CD154. La numeración de residuos de epítopos es según CD154 humano (SEQ ID NO: 1) y la numeración de residuos de paratopo es según la región variable de cadena pesada de C4LB89 (SEQ ID NO: 59).
Figura 6A muestra la alineación de los residuos 1-180 de CD154 humano (SEQ ID NO:1, fila superior) y CD154 de tití (SQ ID NO: 2, fila inferior) que muestra que los residuos del epítopo C4LB89 se conservan entre CD1514 humano y de tití. Los residuos del epítopo en el monómero 1 de CD154 están subrayados y los residuos del epítopo en el monómero 2 están doblemente subrayados.
Figura 6B muestra la alineación de los residuos 181-261 de CD154 humano (SEQ ID NO:1, fila superior) y CD154 de tití (SQ ID NO: 2, fila inferior) que muestra que los residuos del epítopo C4LB89 se conservan entre CD1514 humano y de tití. Los residuos del epítopo en el monómero 1 de CD154 están subrayados y los residuos del epítopo en el monómero 2 están subrayados doblemente.
Figura 7 muestra que los inmunocomplejos (IC) de shCD154 (sCD40L en la figura) y un anticuerpo IgG 1 /k anti-CD154 C4LB237 no activan plaquetas, mientras que IC de shCD154 y otro anticuerpo IgG 1 5c8 activan plaquetas. Los anticuerpos solos no tuvieron efecto sobre la activación plaquetaria, que se evaluó como % del total de plaquetas que expresan PAC-1 y CD62p. ADP: control positivo. PBS: control negativo. Se evaluó la activación plaquetaria de cinco donantes. Los resultados se muestran como la media de cada experimento ± DE. n=4 en cada grupo.
Figura 8A muestra que los inmunocomplejos (IC) de shCD154 (sCD40L en la figura) y un C4LB119 silencioso Fc activan las plaquetas de forma independiente de FcyRIIa, mientras que el IC de shCD154 y el anticuerpo con dominios VH/VL de C4LB119 se expresan en plaquetas activadas con IgG 1 (C4LB287). en forma dependiente de FcyRIIa. ADP: control positivo. PBS: control negativo.
Figura 8B muestra que los inmunocomplejos (IC) de shCD154 (sCD40L en la figura) y un C4LB94 silencioso Fc activan las plaquetas de forma independiente de FcyRIIa, mientras que el IC de shCD154 y el anticuerpo con dominios VH/VL de C4LB94 se expresan en plaquetas activadas por IgG1 (C4LB289). en forma dependiente de FcyRIIa. ADP: control positivo. PBS: control negativo.
Figura 8C muestra que los inmunocomplejos (IC) de shCD154 (sCD40L en la figura) y un Fc silencioso C4LB83 activan moderadamente las plaquetas, mientras que el IC de shCD154 y el anticuerpo con dominios VH/VL de C4LB83 expresados en IgG1 (C4LB288) activaron plaquetas de una manera dependiente de FcyRIIa. ADP: control positivo. PBS: control negativo.
Descripción detallada de la invención
[0021] Debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir formas de realización particulares únicamente y no pretende ser limitativa. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece la invención.
[0022] Como se usa aquí y en las reivindicaciones, las formas singulares “un”, “y” y “el” incluyen una referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
[0023] Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica para probar la presente invención, aquí se describen materiales y métodos ejemplares. Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología.
[0024] “Unión específica” o “se une específicamente” o “se une” se refiere a la unión de un anticuerpo a un antígeno o un epítopo dentro del antígeno con mayor afinidad que por otros antígenos. Por lo general, el anticuerpo se une al antígeno o al epítopo dentro del antígeno con una constante de disociación (Kd) de alrededor de 1 x 10-8 M o menos, por ejemplo, alrededor de 1x10-9 M o menos, alrededor de 1 x 10-10 M o menos, alrededor de 1 x 10-11 M o menos, o alrededor de 1 x 10-12 M o menos, típicamente con una Kd que es al menos cien veces menor que su Kd para unirse a un antígeno no específico (ej., BSA, caseína). La constante de disociación se puede medir usando procedimientos estándar. Sin embargo, los anticuerpos que se unen específicamente al antígeno o al epítopo dentro del antígeno pueden tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, con el mismo antígeno de otras especies (homólogos), como humanos o monos, por ejemplo, Macaca fascicularis (cynomolgus, cyno), Pan troglodytes (chimpancé, chimpancé) o Callithrixjacchus (tití común, tití). Mientras que un anticuerpo monoespecífico se une específicamente a un antígeno o un epítopo, un anticuerpo biespecífico se une específicamente a dos antígenos distintos o dos epítopos distintos.
[0025] “Neutralizar” o “neutraliza” o “anticuerpo neutralizante” o “anticuerpo antagonista” o “antagonista” o “antagonista” se refiere a un anticuerpo o una parte del mismo que se une a antígeno que inhibe parcial o completamente la actividad biológica de CD154 humano. Los anticuerpos antagonistas pueden identificarse usando ensayos para la actividad biológica de CD154 como se describe en este documento. El anticuerpo antagonista que se une específicamente al CD154 humano puede inhibir la actividad biológica del CD154 humano en aproximadamente un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
[0026] “CD154” se refiere a la proteína CD154 humana (hCD154) (por ejemplo, CD40L humana). La secuencia de aminoácidos de la proteína CD154 humana de longitud completa se muestra en SEQ ID NO: 1. La CD154 humana se encuentra tanto en la membrana celular como en la proteína de membrana tipo II y existe como forma soluble en el plasma. La forma unida a la membrana de CD154 comprende los residuos 1-261 de SEQ ID NO:1, con el dominio transmembrana posicionado entre los residuos 23-46 y el dominio extracelular que abarca los residuos 47-261. La forma soluble de CD154 humano (shCD154) se forma por procesamiento proteolítico de la forma unida a la membrana y comprende los residuos 113-261 de SEQ ID NO: 1 (la secuencia de aminoácidos de shCD154 se muestra en SEQ ID NO: 4). Tanto el CD154 unido a la membrana como el soluble forman trímeros biológicamente activos. “CD154” abarca las diversas formas de CD154, incluidas las formas monomérica, dímera, trímera, unida a la membrana y soluble, así como variantes naturales de CD 154 humano. El temporizador de CD 154 humano soluble (temporizador shCD154) está compuesto por tres cadenas polipeptídicas, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
[0027] “Anticuerpos” como se usa en el presente documento se entiende en un sentido amplio e incluye moléculas de inmunoglobulina que incluyen anticuerpos monoclonales que incluyen anticuerpos monoclonales murinos, humanos, humanizados y quiméricos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos, anticuerpos diméricos, tetrámeros o multiméricos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de dominio y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de unión a antígeno de la especificidad requerida. Las “moléculas de anticuerpo completas” se componen de dos cadenas pesadas (HC) y dos cadenas ligeras (LC) interconectadas por enlaces disulfuro, así como sus multímeros (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (compuesta por los dominios CH1, CH2 y CH3). Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro segmentos FR, dispuestos desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y Fr4.
[0028] Las “regiones determinantes de complementariedad (CDR)” son “sitios de unión a antígeno” en un anticuerpo. Las CDR se pueden definir utilizando varios términos: (i) Regiones determinantes de complementariedad (CDR), tres en VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres en VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) se basan en la variabilidad de secuencia (Wu y Kabat, J Exp Med 132:211 - 50, 1970, Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) “Regiones hipervariables”, “HVR” o “HV”, tres en VH (H1, H2, H3) y tres en VL (L1, L2, L3) se refieren a las regiones de dominios variables de anticuerpos que son de estructura hipervariable según lo definido por Chothia y Lesk (Chothia y Lesk, Mol Biol 196:901-17, 1987). La base de datos de International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) proporciona una numeración y una definición estandarizadas de los sitios de unión a antígenos. La correspondencia entre las delineaciones de CDR, HV e IMGT se describe en Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003. Los términos “CDR”, “HCDR1”, “HCDR2”, “HCDR3”, “LCDR1”, “LCDR2” y “LCDR3” incluyen CDR definidas por cualquiera de los métodos descritos anteriormente, Kabat, Chothia o IMGT, a menos que se establezca explícitamente lo contrario en la especificación.
[0029] Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. IgA e IgG se subclasifican además como los isotipos IgAi, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, a saber, kappa (k) y lambda (A), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
[0030] “Fragmentos de anticuerpo” o “parte de unión a antígeno de un anticuerpo” se refiere a una parte de una molécula de inmunoglobulina que retiene el sitio de unión de antígeno de cadena pesada y/o de cadena ligera, como las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR) 1,2 y 3, regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR) 1,2 y 3, una región variable de cadena pesada (VH) o una región variable de cadena ligera (VL). Los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, F(ab')2, Fd y Fv bien conocidos, así como anticuerpos de dominio (dAb) que consisten en un dominio VH. Los dominios VH y VL pueden unirse entre sí a través de un conector sintético para formar varios tipos de diseños de anticuerpos de cadena sencilla en los que los dominios VH/VL se emparejan intramolecularmente, o intermolecularmente en aquellos casos en los que los dominios VH y VL se expresan mediante construcciones de anticuerpos de cadena sencilla separadas. para formar un sitio de unión a antígeno monovalente, tal como Fv de cadena sencilla (scFv) o diacuerpo; descrito por ejemplo en Publ. Pat. Int. N.° WO1998/44001, Publ. Pat. Int. N.2 WO1988/01649; Publ. Pat. Int. N.2 WO1994/13804; Publ. Pat. Int. N.2 WO1992/01047.
[0031] “Anticuerpo monoclonal” se refiere a una población de anticuerpos con una composición de un solo aminoácido en cada cadena pesada y cada cadena ligera, excepto posibles alteraciones bien conocidas tales como la eliminación de la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales normalmente se unen a un epítopo antigénico, excepto que los anticuerpos monoclonales biespecíficos se unen a dos epítopos antigénicos distintos. Los anticuerpos monoclonales pueden tener una glicosilación heterogénea dentro de la población de anticuerpos. El anticuerpo monoclonal puede ser monoespecífico o multiespecífico, o monovalente, bivalente o multivalente. Un anticuerpo biespecífico está incluido en el término anticuerpo monoclonal.
[0032] “Anticuerpo aislado” se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (p. ej., un anticuerpo aislado que se une específicamente a CD154 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de CD154).
“Anticuerpo aislado” abarca anticuerpos que se aíslan con una pureza superior, como anticuerpos que son 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % puro.
[0033] Los “residuos de Chothia” son los residuos VL y VH del anticuerpo numerados según Al-Lazikani (Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48, 1997).
[0034] “Anticuerpos humanizados” se refiere a anticuerpos en los que los sitios de unión al antígeno se derivan de especies no humanas y los marcos de la región variable se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados pueden incluir sustituciones en las regiones marco, de modo que el marco puede no ser una copia exacta de la inmunoglobulina humana expresada o las secuencias de genes de la línea germinal.
[0035] “Anticuerpos humanos” se refiere a anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera en las que tanto el marco como el sitio de unión al antígeno se derivan de secuencias de origen humano. Si el anticuerpo contiene una región constante o una parte de la región constante, la región constante también deriva de secuencias de origen humano.
[0036] El anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena ligera o pesada que se “derivan de” secuencias de origen humano si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa inmunoglobulina de línea germinal humana o genes de inmunoglobulina reorganizados. Dichos sistemas ejemplares son bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana presentadas en fagos y animales transgénicos no humanos tales como ratones o ratas que portan loci de inmunoglobulina humana como se describe en el presente documento. El “anticuerpo humano” puede contener diferencias de aminoácidos cuando se compara con la línea germinal humana o secuencias de inmunoglobulina reorganizadas debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas naturales o a la introducción intencional de sustituciones en el marco o sitio de unión al antígeno, o ambos. Por lo general, el “anticuerpo humano” es al menos alrededor del 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina reorganizado o de línea germinal humana. En algunos casos, el “anticuerpo humano” puede contener secuencias de estructura de consenso derivadas de análisis de secuencias de estructura humana, por ejemplo, como se describe en Knappik et al., J Mol Biol 296: 57-86, 2000, o HCDR3 sintético incorporado en bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. mostrado en fago, por ejemplo, como se describe en Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010 e Publ. Pat. Int. N.2 WO2009/085462.
[0037] Los anticuerpos humanizados aislados son sintéticos. Los anticuerpos humanos, aunque se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana, pueden generarse utilizando sistemas como la presentación en fagos que incorporan CDR sintéticas y/o marcos sintéticos, o pueden someterse a mutagénesis in vitro para mejorar las propiedades de los anticuerpos, lo que da como resultado anticuerpos que no son expresados por el repertorio de línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
[0038] Los anticuerpos en los que los sitios de unión al antígeno se derivan de una especie no humana no están incluidos en la definición de “anticuerpo humano”.
[0039] “Recombinante” incluye anticuerpos y otras proteínas que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes.
[0040] “Epítopo”, como se usa en el presente documento, se refiere a una parte de un antígeno al que se une específicamente un anticuerpo. Los epítopos suelen consistir en agrupaciones superficiales químicamente activas (como polares, no polares o hidrofóbicas) de restos como aminoácidos o cadenas laterales de polisacáridos y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede estar compuesto de aminoácidos contiguos y/o no contiguos que forman una unidad espacial conformacional. Para un epítopo no contiguo, los aminoácidos de diferentes porciones de la secuencia lineal del antígeno se acercan mucho en un espacio tridimensional a través del plegamiento de la molécula de proteína.
[0041] “Paratopo” se refiere a una parte de un anticuerpo al que se une específicamente un antígeno. Un paratopo puede ser de naturaleza lineal o puede ser discontinuo, formado por una relación espacial entre aminoácidos no contiguos de un anticuerpo en lugar de una serie lineal de aminoácidos. Un “paratopo de cadena ligera” y un “paratopo de cadena pesada” o “residuos de aminoácido de paratopo de cadena ligera” y “residuos de aminoácido de paratopo de cadena pesada” se refieren a residuos de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo en contacto con un antígeno, respectivamente, o en en general, “residuos de paratopo de anticuerpo” se refieren a aquellos aminoácidos de anticuerpo que están en contacto con el antígeno.
[0042] “Biespecífico” se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a dos antígenos distintos o dos epítopos distintos dentro del mismo antígeno. El anticuerpo biespecífico puede tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados o puede unirse a un epítopo que se comparte entre dos o más antígenos distintos.
[0043] “Multiespecífico” se refiere a un anticuerpo que se une específicamente al menos a dos antígenos distintos o al menos a dos epítopos distintos dentro del mismo antígeno. El anticuerpo multiespecífico puede unirse, por ejemplo, a dos, tres, cuatro o cinco antígenos distintos o epítopos distintos dentro del mismo antígeno.
[0044] “En combinación con” significa que los fármacos o productos terapéuticos se administran a un sujeto tal como un ser humano juntos en una mezcla, al mismo tiempo como agentes únicos o secuencialmente como agentes únicos en cualquier orden.
[0045] La “actividad biológica de CD154” se refiere a cualquier actividad que se produzca como resultado de la unión de CD154 a su receptor CD40. La actividad biológica de CD154 puede ser, por ejemplo, la activación mediada por CD154 de células B CD40+ o células dendríticas (DC), o la activación corriente abajo de vías de señalización de CD40. La actividad biológica de CD154 puede medirse utilizando métodos bien conocidos y métodos descritos en el presente documento, como la medición de la proliferación de células B mediada por CD154 o la activación de células B mediante la evaluación de la regulación al alza de ICAM-1 o el aumento de la producción de citoquinas por parte de las células B, la activación de DC mediada por CD154 evaluando el aumento de la expresión superficial de CD80 y/o CD86 o la secreción de citocinas por parte de las células DC, o la activación de la vía de señalización de CD40 evaluada mediante ensayos de genes informadores, como la medición de la secreción de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) por células que expresan SEAP bajo el control del promotor inducible por NF-kB.
[0046] “Vector” significa un polinucleótido capaz de duplicarse dentro de un sistema biológico o que puede moverse entre tales sistemas. Los polinucleótidos de vector normalmente contienen elementos, tales como orígenes de replicación, señal de poliadenilación o marcadores de selección, que funcionan para facilitar la duplicación o el mantenimiento de estos polinucleótidos en un sistema biológico. Los ejemplos de tales sistemas biológicos pueden incluir una célula, virus, animal, planta y sistemas biológicos reconstituidos que utilizan componentes biológicos capaces de duplicar un vector. El polinucleótido que comprende un vector puede ser moléculas de ADN o ARN o un híbrido de éstas.
[0047] “Vector de expresión” significa un vector que se puede utilizar en un sistema biológico o en un sistema biológico reconstituido para dirigir la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos presente en el vector de expresión.
[0048] “Polinucleótido” significa una molécula que comprende una cadena de nucleótidos unidos covalentemente por un esqueleto de azúcar-fosfato u otra química covalente equivalente. El ADN y el ARN de cadena doble y sencilla son ejemplos típicos de polinucleótidos.
[0049] “Polipéptido” o “proteína” significa una molécula que comprende al menos dos residuos de aminoácidos unidos por un enlace peptídico para formar un polipéptido. Los polipéptidos pequeños de menos de 50 aminoácidos pueden denominarse “péptidos”.
[0050] Los códigos de aminoácidos convencionales de una y tres letras se usan aquí como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1.
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Composiciones de la materia
[0051] La presente invención proporciona anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a CD154 con alta afinidad y neutralizan eficazmente la actividad biológica de CD154. La invención se basa, al menos en parte, en la identificación de que, contrariamente a la comprensión actual de que la unión de los anticuerpos que se unen específicamente a CD154 al FcyRIIa en las plaquetas da como resultado la activación y agregación de las plaquetas y el tromboembolismo posterior, se ha descubierto aquí que las plaquetas la activación también depende del epítopo CD154 al que se une el anticuerpo. Se ha descubierto aquí que los anticuerpos de la invención que se unen a cierto epítopo en CD154 que son capaces de unirse a FcyRIIa no median en la activación plaquetaria. Además, los anticuerpos de la invención se modifican opcionalmente con Fc para evitar la activación de funciones inmunoestimuladoras adicionales no deseadas. Por lo tanto, los anticuerpos de la invención pueden tener perfiles de seguridad más favorables en el entorno clínico en comparación con los anticuerpos existentes que se unen específicamente a CD154.
[0052] CD154 es un objetivo en la autoinmunidad, el rechazo de injertos y otras enfermedades relacionadas con la inmunidad en ratones, primates no humanos (NHP) y humanos. En varios ensayos clínicos de fase II, se ha demostrado que los anticuerpos que se unen específicamente a CD154 bloquean eficazmente las actividades de CD154 in vivo y mejoran la enfermedad. Los antagonistas de CD154 se diferencian de todos los demás tratamientos en su impacto sobre la respuesta inmunitaria; son las únicas terapias que pueden inducir tolerancia inmunológica funcional, como se ha demostrado tanto en ratones como en monos. En ratones, prácticamente todos los modelos de enfermedades autoinmunes pueden mejorarse de manera efectiva con antagonistas de CD154 (Noelle et al., Ann NY Acad Sci 815: 384­ 391, 1997; Mackey et al., J Leukoc Biol 63: 418-428, 1998; Noelle, Agents Actions Suppl 49: 17-22, 1998; Quezada et al., Annu Rev Immunol 22: 307-328, 2004), observándose una remisión a largo plazo.
[0053] La invención proporciona un anticuerpo antagonista aislado o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD154 de SEQ ID NO:1, como se define en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
[0054] La invención proporciona un anticuerpo antagonista aislado o una parte de unión a antígeno del mismo que puede unirse específicamente a CD154, donde CD154 es un homotrímero y el anticuerpo se une a un primer monómero de CD154 en el homotrímero dentro de los residuos de aminoácidos 182-207 de CD154 y un segundo monómero de CD154 en el homotrímero dentro de los residuos de aminoácidos 176-253 de CD154, en donde la numeración de los residuos es según SEQ ID NO: 1. Tal anticuerpo ejemplar es el del anticuerpo C4LB89. Dado que las regiones variables de los anticuerpos C4LB235 y C4LB236 difieren en un residuo de aminoácido en el LCDR2 en comparación con las de C4LB89, y dado que C4LB231 y C4LB232 tienen secuencias VH/VL idénticas a las de C4LB89, se espera que estos anticuerpos también se unan al mismo epítopo de CD154 que C4LB89. Los anticuerpos que se unen a CD154 dentro de los residuos 182-207 y 176-253 son incapaces de activar las plaquetas incluso cuando pueden unirse a FcyR, incluido FcyRIIa. Por lo tanto, estos anticuerpos pueden tener un perfil de seguridad mejorado en comparación con otros anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a CD154.
[0055] La invención proporciona un anticuerpo antagonista o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD154 humano de SEQ ID NO:1, que comprende una región determinante de complementariedad de cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 17 (SYGIS), un HCDR2 de SEQ ID NO: 23 (WISPIFGNTNYAQKFQG). un HCDR3 de SEQ ID NO: 30 (SRYYGDLDY), una región determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 37 (RASQSISSYLN), un LCDR2 de SEQ ID NO: 44 (YANSLQS), SEQ ID NO: 49 (YASSLQS), o SEQ ID NO: 50 (YANTLQS), y un LCDR3 de SEQ ID NO: 52 (QQSDSIPWT).
[0056] Una estructura cristalina de un complejo de anticuerpo C4LB89 y CD154 reveló que el anticuerpo se une a CD154 solo con residuos de VH. Análisis adicionales indicaron que no se espera que ciertas sustituciones, como se muestra en la Tabla 19 y la Tabla 20, como se indicó anteriormente, en las CDR del anticuerpo afecten la estructura general del complejo y, por lo tanto, las características del anticuerpo.
[0057] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 37, 44 y 52, respectivamente.
[0058] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 17, 23, 30, 37, 44 y 52, respectivamente.
[0059] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 17, 23, 30, 37, 49 y 52, respectivamente.
[0060] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 17, 23, 30, 37, 50 y 52, respectivamente.
[0061] En algunas formas de realización, un inmunocomplejo del anticuerpo de la invención y el CD154 humano soluble (shCD154) no activa las plaquetas, en donde la activación de las plaquetas se mide mediante la expresión superficial de P-selectina en las plaquetas.
[0062] La activación plaquetaria es un proceso bien conocido que convierte la plaqueta lisa y no adherente en una partícula espiculada pegajosa que libera y expresa sustancias biológicamente activas y adquiere la capacidad de unirse a la proteína plasmática fibrinógena. La activación también puede ocurrir como resultado del estímulo físico de la tensión de cizallamiento de fluidos altos, como la que se encuentra en el sitio de un estrechamiento arterial crítico (Quinn et al., 2005, Platelet Function: assessment, diagnosis, and treatment, Humana Press, págs. 3-20). La activación de las plaquetas da como resultado la activación de las vías de señalización intracelular que dan como resultado una regulación al alza de la expresión de la P-selectina en la superficie de las plaquetas y una mayor afinidad de unión del fibrinógeno a los receptores de la integrina aIIbp3. Por lo tanto, la activación de las plaquetas puede medirse midiendo el aumento de la expresión de la P-selectina en la superficie o unión del ligando de la sonda, por ejemplo, PAC-1, a la integrina aIIbp3 en plaquetas usando, por ejemplo, citometría de flujo. Los anticuerpos de la invención no activan las plaquetas humanas cuando el anticuerpo en complejo con shCD154 no eleva la expresión superficial de la pselectina ni aumenta la unión del ligando de la sonda (p. ej., PAC-1) a la integrina aIIbp3 de manera estadísticamente significativa en comparación con la expresión superficial de P-selectina y aumento de la unión del ligando de la sonda (p. ej., PAC-1) a la integrina aIIbp3 inducida por shCD154.
[0063] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención tiene al menos una de las siguientes propiedades:
se une a CD154 con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 5 x 10-9 M o menos, cuando la Kd se mide usando sistema ProteOn XPR36 a 25 °C en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contiene polisorbato P20 al 0,03 % y 100 μg/ml de albúmina sérica bovina; inhibe la proliferación de células B humanas mediada por CD154 con un valor CI50 de aproximadamente 2,7x10-9 M o menos; o inhibe la expresión mediada por CD154 de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el promotor mínimo de interferónp (IFN-P) inducible por NF-kB en células HEK293 que expresan de forma estable SEAP y CD40 humano con un valor CI50 de aproximadamente 2,1x10-8 M o menos.
[0064] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención se une a CD154 con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 5 x 10-9 M o menos, aproximadamente 1x10-9 M o menos, aproximadamente 5 x 10-10 M o menos, aproximadamente 1 x 10-10 M o menos, aproximadamente 5 x 10-11 M o menos, o aproximadamente 1 x 10-11 M o menos.
[0065] En algunas formas de realización, el anticuerpo que se une específicamente a CD154 presenta reacción cruzada con CD154 de Macaca fascicularis (cyno) o CD154 de Callithrix jacchus (tití).
[0066] La afinidad de un anticuerpo por el CD154 humano, cyno o tití puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado. Dichos métodos pueden utilizar instrumentación ProteOn XPR36, Biacore 3000 o KinExA, ELISA o ensayos de unión competitiva conocidos por los expertos en la técnica. La afinidad medida de un anticuerpo particular por CD154 puede variar si se mide en diferentes condiciones (p. ej., osmolaridad, pH). Por lo tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión (p. ej., KD, Kon, Koff) se realizan típicamente con condiciones estandarizadas y un tampón estandarizado, tal como el tampón descrito en el presente documento. Los expertos en la materia apreciarán que el error interno para las mediciones de afinidad, por ejemplo, usando Biacore 3000 o ProteOn (medido como desviación estándar, SD) puede estar típicamente dentro del 5-33 % para mediciones dentro de los límites típicos de detección. Por lo tanto, el término “aproximadamente” refleja la desviación estándar típica del ensayo. Por ejemplo, la SD típica para una Kd de 1x10-9 M es de hasta ± 0,33 x 10-9 M.
[0067] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención inhibe la proliferación de células B humanas mediada por CD154 con un valor CI50 de aproximadamente 2,7x10-9 M o menos.
[0068] En el ensayo de proliferación de células B, se pueden cultivar 1 x105 células B de amígdala humana con 100 ng/ml de IL-21 humana recombinante, 0,5 μg/ml de CD154 humano soluble recombinante trimérico expresado como una proteína de fusión con cremallera de leucina y anticuerpos antiCD154 en un rango de 0,000064-25 μg/ml en un volumen final de 200 μl/pocillo. Después de 2 días de incubación, se puede agregar metil (-3H)-timidina (0,5 μCi/pocillo) a los cultivos y se puede determinar el efecto de los anticuerpos sobre la proliferación de células B humanas después de la incubación durante la noche.
[0069] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención inhibe la expresión inducida por CD154 de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el promotor mínimo de interferón-p (IFN-p) inducible por NF-kB en células HEK293 que expresan establemente SEAP y humanos. CD40 con un valor CI50 de aproximadamente 2,1 x 10-8 M o menos.
[0070] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención inhibe la expresión inducida por CD154 de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el promotor mínimo de IFN-p inducible por NF-kB en células HEK293 que expresan establemente SEAP y CD40 humano con un CI50 valor de entre aproximadamente 2,1x10-8 M y 5,4 x 10-10 M.
[0071] Las células que se pueden usar son, por ejemplo, células HEK-Blue™ CD40L (InvivoGen, San Diego, CA). El CD154 humano se puede proporcionar como proteína de fusión de cremallera de leucina-CD154 soluble trimérica. Puede detectarse la señal de la fosfatasa alcalina secretada y puede calcularse un CI50 para la inhibición utilizando métodos bien conocidos.
[0072] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención se une a un primer monómero de CD154 y a un segundo monómero de CD154 simultáneamente en un homotrímero de CD154.
[0073] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención se une al menos a uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho residuos de CD154 en el primer monómero de CD154 dentro de los residuos de aminoácidos 182-207 de CD154 de SEQ ID NO: 1.
[0074] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención se une al menos a uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho residuos de CD154 en el segundo monómero de CD154 dentro de los residuos de aminoácidos 176­ 253 de CD154 de SEQ ID NO: 1.
[0075] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención se une a los residuos E182, S185, Q186, A187, P188, S214, A215 y R207 en el primer monómero de CD154, en donde la numeración de los residuos es de acuerdo con SEQ ID NO: 1.
[0076] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención se une a los residuos T 176, F177, C178, Q220, S248, H249, G250 y F253 en el segundo monómero de CD154, en donde la numeración de los residuos es según SEQ ID NO: 1.
[0077] “Dentro de” significa que el anticuerpo se une solo a residuos dentro de los tramos de aminoácidos 182-207, 176­ 354 o 182-207 y 176-354.
[0078] Tal anticuerpo ejemplar es el anticuerpo C4LB89. Dado que las regiones variables de los anticuerpos C4LB235 y C4LB236 difieren en un residuo de aminoácido en el LCDR2 en comparación con las de C4LB89, y dado que C4LB231 y C4LB232 tienen secuencias VH/VL idénticas a las de C4LB89, se espera que estos anticuerpos también se unan al mismo epítopo de CD154 que C4LB89.
[0079] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención se une al CD 154 humano con residuos de paratopo que residen en la VH del anticuerpo.
[0080] El “residuo de paratopo” es un residuo en el anticuerpo VH o VL que reside dentro de 4 Á de los residuos de CD154. Los residuos de paratopo pueden identificarse a partir de estructuras cristalinas del complejo de anticuerpo con CD154.
[0081] Un ejemplo de anticuerpo que se une a CD154 con restos de paratopo de VH solo sin VL en contacto con el antígeno es un anticuerpo que comprende la VH y la VL del anticuerpo C4LB89. Dado que las regiones variables de C4LB235 y C4LB236 difieren en un residuo de aminoácido en el LCDR2 en comparación con las de C4LB89, y dado que C4LB231 y C4LB232 tienen secuencias VH/VL idénticas a las de C4LB89, se espera que estos anticuerpos también se unan a CD154 con residuos VH solamente. Anticuerpos que se unen a CD154 dentro de los residuos 182-207 o 176-354 de SEQ ID NO: 1 o residuos E182, S185, Q186, A187, P188, S214, A215 y R207 en el primer monómero de CD154 y residuos T176, F177, C178, Q220, S248, H249, G250 y F253 en el segundo monómero de CD154 en el homotrímero de CD154 son incapaces de activar las plaquetas incluso cuando pueden unirse a FcyR, incluido FcyRIIa. Por lo tanto, estos anticuerpos pueden tener una seguridad mejorada en comparación con otros anticuerpos que se unen específicamente a CD154.
[0082] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 59, comprendiendo opcionalmente la VH uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones de aminoácidos.
[0083] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende la región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 59.
[0084] Los anticuerpos con secuencias de CDR distintas de las definidas en las reivindicaciones se analizan en este documento porque son útiles para entender la invención, pero no son parte de la invención. Un anticuerpo que comprende el HCDR1, el h Cd R2 y el HCDR3 de SEQ ID NO: 17, 23 y 30, respectivamente, o que tiene los HCDR de VH de SEQ ID NO: 59 o el VH de SEQ ID NO: 59 se une a CD154 con el anticuerpo VH solamente. Por lo tanto, la VH de SEQ ID NO: 59 o la VH que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 17, 23 y 30, respectivamente, pueden combinarse con cualquier secuencia de región variable (VL) de cadena ligera y la la unión del anticuerpo resultante a CD154 puede probarse utilizando ensayos descritos en el presente documento para generar un anticuerpo que se una específicamente a CD154.
[0085] Por ejemplo, el VH que comprende el HCDR1, el HCDR2 y el HCDR3 de SEQ ID NO: 17, 23 y 30, respectivamente, o el VH de SEQ ID NO: 59 puede usarse para seleccionar dominios VL capaces de formar un fragmento de unión a antígeno específico de dos dominios capaz de unirse a CD154. El cribado se puede realizar mediante métodos de cribado de presentación de fagos usando, por ejemplo, un enfoque combinatorio dual jerárquico descrito en PCT Publ. N.° WO1992/01047. En este enfoque, una colonia individual que contiene un clon de cadena H o L, por ejemplo, VH de SEQ ID NO: 59, se usa para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H), y los dos el dominio de unión a antígeno específico de la cadena se selecciona de acuerdo con las técnicas de presentación en fagos como se describe en el presente documento y se analiza su actividad de unión y antagonista frente a CD154.
[0086] Alternativamente, el VH o SEQ ID NO: 59 o el VH que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 17, 23 y 30, respectivamente, pueden combinarse con dominios VL de anticuerpos CD154 o CD154 existentes. anticuerpos descritos en el presente documento, y el anticuerpo resultante se analiza para determinar su actividad antagonista y de unión frente a CD154.
[0087] Por ejemplo, tal anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 o 73, comprendiendo opcionalmente la VL uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones de aminoácidos.
[0088] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 66, 72 o 73, comprendiendo opcionalmente la VL uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones de aminoácidos.
[0089] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende la VH de SEQ ID NO: 59 y la VL de SEQ ID NO: 66.
[0090] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende la VH de SEQ ID NO: 59 y la VL de SEQ ID NO: 72.
[0091] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende la VH de SEQ ID NO: 59 y la VL de SEQ ID NO: 73.
[0092] En algunas formas de realización, comprendiendo el anticuerpo de la invención al menos una sustitución en una región Fc, en donde el anticuerpo no activa las plaquetas humanas.
[0093] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención tiene una unión reducida a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa o FcyRIIIb.
[0094] “Unión reducida” se refiere a la unión reducida de los anticuerpos de la invención que tienen al menos una sustitución en la región Fc a un receptor FcyR en comparación con la unión del anticuerpo original sin la sustitución al mismo receptor FcyR. La “unión reducida” puede ser al menos unas 100 veces, al menos unas 500 veces, al menos unas 1000 veces, al menos unas 5000 veces, al menos unas 10.000 veces, o al menos unas 20.000 veces la unión reducida. En la práctica, los anticuerpos que exhiben “unión reducida” a un FcyR particular se refieren a anticuerpos que tienen una función efectora estadísticamente insignificante mediada por el FcyR particular.
[0095] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende al menos una sustitución en la región Fc.
[0096] En algunas formas de realización, la al menos una sustitución en la región Fc es una sustitución L234A, L235A, G237A, P238S, M252Y, S254T, T256E, H268A, A330S o P331S, donde la numeración de residuos está de acuerdo con el índice UE.
[0097] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende sustituciones L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S o P331S en la región Fc, en donde la numeración de residuos es de acuerdo con el índice UE.
[0098] En algunas formas de realización, la al menos una sustitución en la región Fc es una sustitución V234A, G237A, P238S, M252Y, S254T, T256E H268A, V309L, A330S o P331S, donde la numeración de residuos es según el índice UE.
[0099] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende las sustituciones V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S en la región Fc, en donde la numeración de residuos está de acuerdo con el índice UE.
[0100] La invención también proporciona un anticuerpo antagonista o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD154 de SEQ ID NO:1, que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 80 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 81.
[0101] La invención también proporciona un anticuerpo antagonista o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD154 de SEQ ID NO:1, que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 82 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 81.
[0102] la invención también proporciona un anticuerpo antagonista o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD154 de SEQ ID NO:1, que comprende una cadena pesada de SEQ ID NO: 83 y una cadena ligera de SEQ ID NO: 81.
SEQ ID NO: 80 (C4LB89 VH en IgGIsigma: C4LB231 HC)
Figure imgf000012_0001
SEQ ID NO: 81 (cadena ligera de C4LB89 y C4LB231)
Figure imgf000012_0002
SEQ ID NO: 82 (C4LB89 VH en IgG1sigmaYTE)
Figure imgf000012_0003
SEQ ID NO: 83 (C4LB89 VH en IgG2sigma)
Figure imgf000012_0004
[0103] Las propiedades efectoras inmunitarias de los anticuerpos de la invención pueden potenciarse o silenciarse mediante modificaciones de Fc mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las funciones efectoras de Fc como la unión a C1q, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis, la regulación a la baja de los receptores de la superficie celular (p. ej., receptor de células B; BCR), etc. proporcionarse y/o controlarse mediante la modificación de residuos en el Fc responsable de estas actividades. Por ejemplo, las sustituciones de Fc V234NG237NP238S, V234NG237NH268Q, H268AN309L/A330S/P331 o V234NG237NP238S/H268AN309L/A330S/P331S (Publ. Pat. Int. N.2 WO1 1/066501) o L234NL235NG237NP238S/H268NA330S/P331S pueden introducirse en los anticuerpos de la invención.
[0104] La unión de los anticuerpos de la invención a FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa y FcyRIIIb puede evaluarse utilizando formas solubles recombinantes o formas asociadas a células de los receptores Fcy. Por ejemplo, se pueden aplicar medidas directas o indirectas, por ejemplo, de unión competitiva, para evaluar las afinidades y avidez relativas de los anticuerpos de la invención por varios FcyR. En un ensayo de ejemplo, la unión del anticuerpo de prueba al FcyR soluble capturado en una placa se evalúa utilizando la unión competitiva entre 1 μg/ml de IgG1 humana biotinilada y diluciones en serie del anticuerpo de prueba precomplejado con antígeno.
[0105] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención tiene citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos” (“ADCP”) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
[0106] “Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos”, “citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos” o “ADCC” es un mecanismo para inducir la muerte celular que depende de la interacción de células diana recubiertas de anticuerpos con células efectoras que poseen actividad lítica, como células asesinas naturales, monocitos, macrófagos y neutrófilos a través de receptores gamma Fc (FcyR) expresados en células efectoras. Por ejemplo, las células NK expresan FcyRIIIa, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIIIa. Para evaluar la actividad ADCC de los anticuerpos de la invención, el anticuerpo puede agregarse al objetivo células en combinación con células efectoras inmunitarias, que pueden ser activadas por los complejos antígeno-anticuerpo dando como resultado la citólisis de la célula diana. La citólisis generalmente se detecta mediante la liberación de etiquetas (p. ej., sustratos radiactivos, colorantes fluorescentes o proteínas intracelulares naturales) de las células lisadas. Ejemplos de células efectoras para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células NK. Ejemplos de células diana incluyen células D1.1 Jurkat (ATCC® CRL-10915™) o células T que expresan CD154.
[0107] “Fagocitosis celular dependiente de anticuerpos” (“ADCP”) se refiere a un mecanismo de eliminación de células diana recubiertas de anticuerpos por internalización por células fagocíticas, tales como macrófagos o células dendríticas. ADCP puede evaluarse utilizando macrófagos derivados de monocitos como células efectoras y células Jurkat D1.1 que expresan CD154 diseñadas para expresar GFP u otra molécula marcada como células diana. La proporción de células efectoras:diana puede ser, por ejemplo, 4:1. Las células efectoras pueden incubarse con células diana durante 4 horas con o sin el anticuerpo CD154 de prueba. Después de la incubación, las células pueden separarse utilizando Accutase. Los macrófagos pueden identificarse con anticuerpos anti-CD11b y anti-CD14 acoplados a un marcador fluorescente, y el porcentaje de fagocitosis puede determinarse en función del % de GFP fluorescente en los macrófagos CD11 CD14+ utilizando métodos estándar.
[0108] “Citotoxicidad dependiente del complemento”, o “CDC”, se refiere a un mecanismo para inducir la muerte celular en donde un dominio efector Fc de un anticuerpo unido a la diana se une y activa el componente C1q del complemento que, a su vez, activa la cascada del complemento que conduce a muerte de la célula diana. La activación del complemento también puede resultar en el depósito de componentes del complemento en la superficie de la célula diana que facilitan la ADCC al unirse a los receptores del complemento (p. ej., CR3) en los leucocitos. La CDC de las células que expresan CD154 se puede medir, por ejemplo, sembrando células Jurkat en un medio apropiado, añadiendo anticuerpos anti-CD154 a la mezcla, seguido de la adición de suero humano combinado. Después del período de incubación, el porcentaje (%) de células lisadas puede detectarse como % de células teñidas con yoduro de propidio en el ensayo FACS usando métodos estándar.
[0109] “ADCC reducida”, “CDC reducida” y “ADCP reducida” se refieren a ADCC, CDC y/o ADCP inducidos por anticuerpos que son estadísticamente insignificantes en ensayos estándar que miden ADCC, CDC y/o ADCP, tales como los ensayos descritos del presente documento y en los ensayos descritos en la patente de EE. UU. N.° 8.871.204.
[0110] Los anticuerpos de la invención con una afinidad deseada y un perfil de neutralización pueden seleccionarse de bibliotecas de variantes o fragmentos mediante cribado con CD154 humano o CD154 de tití y, opcionalmente, mediante maduración adicional de la afinidad del anticuerpo. En una campaña de cribado ejemplar, las bibliotecas de fagos pueden cribarse con tití CD154. Alternativamente, los anticuerpos de la invención pueden generarse inmunizando ratones con CD154 humano o CD154 de tití o ambos, y seleccionando los hibriomas para unirse a CD154 humano, y evaluando posteriormente las propiedades antagonistas de los anticuerpos usando los métodos descritos en este documento.
[0111] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención compite por unirse a CD154 con un anticuerpo que comprende la VH de SEQ ID NO: 59 y la VL de SeQ ID NO: 66.
[0112] La competencia entre la unión específica a CD 154 con los anticuerpos de la invención que comprenden ciertas secuencias de VH y VL pueden ensayarse in vitro utilizando métodos bien conocidos. Por ejemplo, la unión del anticuerpo marcado con éster NHS Sulfo-Tag™ de MSD a CD154 en presencia de un anticuerpo no marcado puede evaluarse mediante ELISA, o pueden usarse análisis Bioacore o citometría de flujo para demostrar la competencia con los anticuerpos de la presente invención. El anticuerpo compite por unirse a CD154 con un anticuerpo de referencia (p. ej., un anticuerpo que comprende la VH de SEQ ID NO: 59 y la VL de SEQ ID NO: 66) cuando el anticuerpo inhibe la unión del anticuerpo de referencia a CD154 en un 80 % o más., por ejemplo 85 % o más, 90 % o más, o 95 % o más.
[0113] En algunas formas de realización, la VH de SEQ ID NO: 59 puede combinarse con la VL de cualquiera de los anticuerpos anti-CD154 descritos en Publ. Pat. Int. N.2 WO1993/08207, WO1994/10308, WO1996/40918, WO1993/009812, WO1999/051258, WO1995/006480, WO1995/006481, WO1995/006666, W02001/002057, WO1997/ 017446, WO1999/012566, WO2001/068860, WO2005/003175, WO2006/033702, W02006/030220, WO2008/118356, WO2012/052205, WO2012/138768, WO2012/138768, WO2013/055745 y WO2013/056068 para generar un anticuerpo anti-CD154 antagonista. La actividad de unión y antagonismo de los anticuerpos resultantes puede probarse usando ensayos y protocolos descritos en este documento.
[0114] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 17, 23 y 30, respectivamente, y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 37, 44 y 52, respectivamente; o el VH de SEQ ID NO: 59 y el VL de SEQ ID NO: 66.
[0115] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende el HCDR1, el HCDR2 y el HCDR3 de SEQ ID NO: 17, 23 y 30, respectivamente, y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 37, 49 y 52, respectivamente; o el VH de SEQ ID NO: 59 y el VL o SEQ ID NO: 72.
[0116] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende el HCDR1, el HCDR2 y el HCDR3 de SEQ ID NO: 17, 23 y 30, respectivamente, y el LCDR1, el LCDR2 y el LCDR3 de SEQ ID NO: 37, 50 y 52, respectivamente; o la VH de SEQ ID NO: 59 y la VL o SEQ ID NO: 73.
[0117] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende la VH y la VL donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.
[0118] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende VH y VL, donde VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 72 o 73.
[0119] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende la VH de SEQ ID NO: 59 y la VL de SEQ ID NO: 66, 72 o 73.
[0120] El anticuerpo de la invención comprende las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de la VH de SEQ ID NO: 59 y las secuencias de aminoácidos LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de la VL de s Eq ID NO: 66, 72 o 73, en donde las CDR se definen según Kabat, Chothia y/o IMGT.
[0121] Las variantes de anticuerpos se muestran en la Tabla 8, Tabla 9 y Tabla 14. Las variantes pueden comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones de aminoácidos en el VH y/o el VL que no afectan negativamente a las propiedades del anticuerpo. La identidad de secuencia puede ser de aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos VH o VL de la invención.
[0122] El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = n.° de posiciones idénticas/n.° total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que deben introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias.
[0123] El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN. (versión 2.0), usando una tabla de peso de residuos PAM120, una penalización de longitud de brecha de 12 y una penalización de brecha de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando la tabla de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://_www_gcg_com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de brecha de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6.
[0124] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende el VH que está en al menos 90 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico al VH de SEQ ID NO: 59, en donde el anticuerpo exhibe uno o más de las siguientes propiedades:
un inmunocomplejo del anticuerpo y shCD154 no activa las plaquetas, en donde la activación de las plaquetas se mide mediante la expresión superficial de P-selectina en las plaquetas; se une a CD154 con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 5 x 10-9 M o menos, cuando la Kd se mide usando el sistema ProteOn XPR36 usando el diseño experimental descrito en el Ejemplo 1, medidas de afinidad; inhibe la proliferación de células B humanas mediada por CD154 con un valor CI50 de aproximadamente 2,7x10-9 M o menos; o inhibe la expresión mediada por CD154 de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el promotor mínimo de interferón-p (IFN-p) inducible por NF-kB en células HEK293 que expresan de forma estable SEAP y CD40 humano con un valor CI50 de aproximadamente 2,1x10-8 M o menos.
[0125] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende la CV que es al menos 90 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico al VL de s Eq ID NO: 66, 72 o 73, en donde el anticuerpo presenta una o más de las siguientes propiedades:
un complejo inmunitario del anticuerpo y shCD154 no activa las plaquetas,
en donde la activación plaquetaria se mide mediante expresión superficial de P-selectina en plaquetas; se une a CD154 con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 5 x 10-9 M o menos, cuando la Kd se mide usando el sistema ProteOn XPR36 usando el diseño experimental descrito en el Ejemplo 1, medidas de afinidad;
inhibe la proliferación de células B humanas mediada por CD154 con un valor CI50 de aproximadamente 2,7x10-9 M o menos; o
inhibe la expresión mediada por CD154 de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el promotor mínimo de interferón-p (IFN-p) inducible por NF-kB en células HEK293 que expresan de forma estable SEAP y CD40 humano con un valor CI50 de aproximadamente 2,1x10-8 M o menos.
[0126] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende el VH que es al menos 90 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico al VH de SEQ ID NO: 59, y el VL que es al menos 90 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico al VL de SEQ ID NO: 66, 72 o 73, en donde el anticuerpo presenta una o más de las siguientes propiedades:
un complejo inmunitario del anticuerpo y shCD154 no activa las plaquetas,
en donde la activación plaquetaria se mide mediante expresión superficial de P-selectina en plaquetas; se une a CD154 con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 5 x 10-9 M o menos, cuando la Kd se mide usando el sistema ProteOn XPR36 usando el diseño experimental descrito en el Ejemplo 1, medidas de afinidad;
inhibe la proliferación de células B humanas mediada por CD154 con un valor CI50 de aproximadamente 2,7x10-9 M o menos; o
inhibe la expresión mediada por CD154 de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el promotor mínimo de interferón-p (IFN-p) inducible por NF-kB en células HEK293 que expresan de forma estable SEAP y CD40 humano con un valor CI50 de aproximadamente 2,1x10-8 M o menos.
[0127] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende el VH que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico al VH de SEQ ID NO: 59.
[0128] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende el VL que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a la VL de SEQ ID NO: 66.
[0129] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende la VL que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico al VL de SEQ ID NO: 72.
[0130] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende el VL que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico al VL de SEQ ID NO: 73.
[0131] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende el VH de SEQ ID NO: 59 y el VL o SEQ ID NO: 66, donde el VH, el VL o tanto el VH como el VL comprenden opcionalmente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones de aminoácidos.
[0132] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende el VH de SEQ ID NO: 59 y el VL o SEQ ID NO: 72, donde el VH, el VL o tanto el VH como el VL comprenden opcionalmente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones de aminoácidos.
[0133] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende el VH de SEQ ID NO: 59 y el VL o SEQ ID NO: 73, en donde el VH, el VL o tanto el VH como el VL comprenden opcionalmente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones de aminoácidos.
[0134] El anticuerpo de la invención comprende el HCDR1, el HCDR2 y el HCDR3 de SEQ ID NO: 17, 23 y 30, respectivamente.
[0135] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende el LCDR1, el LCDR2 y el LCDR3 SEQ ID NO: 37, 44 y 52, respectivamente.
[0136] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3 SEQ ID NO: 37, 49 y 52.
[0137] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3 SEQ ID NO: 37, 50 y 52, respectivamente.
[0138] Los anticuerpos de la invención que comprenden pueden exhibir una o más de las siguientes propiedades:
un inmunocomplejo del anticuerpo y shCD 154 no activa las plaquetas, en donde la activación de las plaquetas se mide mediante la expresión superficial de P-selectina en las plaquetas;
unirse a CD154 con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 5 x 10-9 M o menos, cuando la Kd se mide usando el sistema ProteOn XPR36 usando el diseño experimental descrito en el Ejemplo 1, medidas de afinidad;
inhibir la proliferación de células B humanas mediada por CD154 con un valor CI50 de aproximadamente 2,7 x 10-9 M o menos; o
inhibir la expresión mediada por CD154 de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el promotor mínimo de interferón-p (IFN-p) inducible por NF-kB en células HEK293 que expresan de manera estable SEAP y CD40 humano con un valor CI50 de aproximadamente 2.1x10-8 M o menos.
[0139] “Modificación conservadora” se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene las secuencias de aminoácidos. Las modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y eliminaciones de aminoácidos. Las sustituciones conservativas son aquellas en las que el aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares están bien definidas e incluyen aminoácidos con cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina, triptófano), cadenas laterales aromáticas (p. ej., fenilalanina, triptófano, histidina, tirosina), cadenas laterales alifáticas (p. ej., glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina), amida (p. ej., asparagina, glutamina), cadenas laterales ramificadas beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y azufre -que contienen cadenas laterales (cisteína, metionina). Además, cualquier resto nativo en el polipéptido también se puede sustituir con alanina, como se ha descrito previamente para la mutagénesis de barrido de alanina (MacLennan et al., Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67, 1998; Sasaki et al., Adv. Biophys. 35:1-24, 1998). Las sustituciones de aminoácidos en los anticuerpos de la invención se pueden realizar mediante métodos bien conocidos, por ejemplo mediante mutagénesis por PCR (patente de EE. UU. N.° 4.683.195). Alternativamente, las bibliotecas de variantes pueden generarse usando métodos conocidos, por ejemplo usando codones aleatorios (NNK) o no aleatorios, por ejemplo codones DVK, que codifican 11 aminoácidos (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp). Las variantes de anticuerpos resultantes pueden analizarse en cuanto a sus características utilizando los ensayos descritos en el presente documento.
[0140] Aunque los anticuerpos ilustrados en los ejemplos comprenden pares de regiones variables, una de una cadena pesada y otra de una cadena ligera, un experto en la técnica reconocerá que los anticuerpos alternativos pueden comprender regiones variables únicas de cadena pesada o ligera. La región variable única puede usarse para rastrear dominios variables capaces de formar un fragmento de unión a antígeno específico de dos dominios capaz, por ejemplo, de unirse específicamente a CD154. La selección se puede lograr mediante métodos de selección de presentación de fagos usando, por ejemplo, un enfoque combinatorio dual jerárquico descrito en Publ. Pat. Int. N.° WO1992/01047 como se describe en este documento.
[0141] Los anticuerpos de la invención pueden generarse utilizando diversas tecnologías. Por ejemplo, puede usarse el método de hibridoma de Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975 para generar anticuerpos monoclonales. En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped, como un hámster, una rata o un mono, con CD154 humano, de tití o cyno o fragmentos de CD154, como la forma soluble de CD154, seguido de la fusión de células de bazo de células inmunizadas. animales con células de mieloma usando métodos estándar para formar células de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Las colonias que surgen de células de hibridoma individuales inmortalizadas se analizan para la producción de anticuerpos con las propiedades deseadas, tales como especificidad de unión, reactividad cruzada o ausencia de la misma y afinidad por el antígeno.
[0142] Se pueden usar diversos animales huéspedes para producir los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, se pueden usar ratones Balb/c para generar anticuerpos. Los anticuerpos fabricados en ratones Balb/c y otros animales no humanos pueden humanizarse utilizando diversas tecnologías para generar secuencias más similares a las humanas. Se conocen ejemplos de técnicas de humanización que incluyen la selección de estructuras aceptoras humanas e incluyen injerto de Cd R (patente de EE. UU. N.° 5.225.539), injerto de SDR (patente de EE. UU. n.° 6.818.749), Rejuvenecimiento (Padlan, Mol Immunol 28:489-499, 1991), Rejuvenecimiento de residuos determinantes de la especificidad (publicación de patente de EE. UU. N.° 20100261620), adaptación humana (o adaptación del marco humano) (publicación de patente de EE. UU. N.° US2009/0118127), superhumanización (patente de EE. selección (Osbourn et al (2005) Methods 36:6168, 2005; Patente de EE. UU. N.° 5.565.332). En estos métodos, las CDR de anticuerpos parentales se transfieren a marcos humanos que pueden seleccionarse en función de su homología general con los marcos parentales, en función de la longitud de c Dr del marco, la homología o la información de estructura canónica, o una combinación de los mismos.
[0143] Los anticuerpos humanizados pueden optimizarse adicionalmente para mejorar su selectividad o afinidad por un antígeno deseado mediante la incorporación de residuos de soporte de la estructura alterada para preservar la afinidad de unión (mutaciones inversas) mediante técnicas como las descritas en Publ. Pat. Int. N.° WO90/007861 y en Publ. Pat. Int. N.° WO92/22653, o introduciendo la variación de cualquiera de las CDR para mejorar, por ejemplo, la afinidad del anticuerpo.
[0144] Los ratones transgénicos que portan loci de inmunoglobulina humana (Ig) en su genoma pueden usarse para generar anticuerpos humanos contra una proteína diana, y se describen, por ejemplo, en Publ. Pat. Int. N.° WO90/04036, Patente de EE. UU. N.26150584, Publ. Pat. Int. N.2 WO99/45962, Publ. Pat. Int. N.2 WO02/066630, Publ. Pat. Int. N.2 WO02/43478, Lonberg et al (1994) Nature 368:856-9; Green y otros (1994) Nature Genet. 7:13-21; Green & Jakobovits (1998) Exp. Medicina. 188:483-95; Lonberg y Huszar (1995) Int. Rev. Inmunol. 13:65-93; Bruggemann y otros (1991) Eur. J. Immunol. 21:1323-1326; Fishwild y otros (1996) Nat. Biotecnología. 14:845-851; Méndez et al (1997) Nat. Gineta.
15:146-156; Green (1999) J. Immunol. Métodos 231:11 -23; Yang y otros (1999) Cancer Res. 59:1236-1243; Brüggemann y Taussig (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458; Publ. Pat. Int. N.° WO02/043478). Los locus de inmunoglobulina endógenos en tales ratones pueden romperse o eliminarse, y al menos un locus de inmunoglobulina humana completo o parcial puede insertarse en el genoma del ratón usando recombinación homóloga o no homóloga, usando transcromosomas o usando minigenes. Empresas como Regeneron (http://_www_regeneron_com), Harbor Antibodies (http://_www_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http://_www_omtinc_net), KyMab (http://_www_kymab_com), Trianni (http://_www.trianni_com) y Ablexis (http://_www_ablexis_com) se pueden contratar para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando la tecnología descrita anteriormente.
[0145] Los anticuerpos humanos se pueden seleccionar de una biblioteca de presentación de fagos, donde el fago se modifica para expresar inmunoglobulinas humanas o porciones de las mismas, como Fab, anticuerpos de cadena única (scFv) o regiones variables de anticuerpos emparejados o no emparejados (Knappik et al., J. Mol Biol 296:57-86, 2000, Krebs y col., J Immunol Meth 254:67-84, 2001, Vaughan y col., Nature Biotechnology 14:309-314, 1996, Sheets y col., PITAS (USA) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom and Winter, J Mol Biol 227:381, 1991; Marks et al., J Mol Biol 222:581, 1991). Los anticuerpos de la invención se pueden aislar, por ejemplo, de la biblioteca de presentación de fagos que expresan regiones variables de cadena ligera y pesada de anticuerpo como proteínas de fusión con la proteína de cubierta pIX del bacteriófago como se describe en Shi et al., J Mol Biol 397: 385-96, 2010 e Publ. Pat. Int. N.° WO09/085462). Las bibliotecas pueden examinarse para determinar la unión de fagos a CD154 humano, de tití y/o cyno y los clones positivos obtenidos pueden caracterizarse adicionalmente, aislarse los Fab de los lisados de clones y expresarse como IgG de longitud completa. Dichos métodos de presentación en fagos para aislar anticuerpos humanos se describen, por ejemplo, en: Patentes de EE. UU. Nos 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 de Ladner et al; Patentes de EE. UU. Nos 5.427.908 y 5.580.717 de Dower et al; Patentes de EE. UU. Nos 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty et al; y Patentes de EE. UU. Nos 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 de Griffiths et al.
[0146] La preparación de antígenos inmunogénicos y la producción de anticuerpos monoclonales se pueden realizar utilizando cualquier técnica adecuada, como la producción de proteínas recombinantes. Los antígenos inmunogénicos pueden administrarse a un animal en forma de proteína purificada, o mezclas de proteínas que incluyen células completas o extractos de células o tejidos, o el antígeno puede formarse de novo en el cuerpo del animal a partir de ácidos nucleicos que codifican dicho antígeno o una parte del mismo.
[0147] Los anticuerpos de la invención pueden ser humanos o humanizados.
[0148] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende un marco de VH derivado del gen de la línea germinal humana VH1_1 -69, Vh4_4-39, VH1_1 -02 o VH4_4-59.
[0149] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención comprende un marco de VL derivado del gen de la línea germinal humana VKIV_B3, VKI_O12 o VL3_3R.
[0150] Los anticuerpos de la invención pueden ser de tipo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. Los anticuerpos de la invención pueden ser de tipo IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4.
[0151] Los anticuerpos de la invención pueden modificarse además para generar anticuerpos modificados con propiedades similares o alteradas en comparación con el anticuerpo original. El VH, el VL, el VH y el VL, las regiones constantes, el marco de VH, el marco de VL o cualquiera o todas las seis CDR pueden diseñarse en los anticuerpos de la invención.
[0152] Los anticuerpos de la invención pueden diseñarse mediante injerto de CDR. Una o más secuencias de CDR de los anticuerpos de la invención pueden injertarse en una secuencia marco diferente. El injerto de CDR se puede realizar usando métodos descritos en este documento. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención comprenden un VH que comprende HDCR1 de SEQ ID NO: 17, HCDR2 de SEQ ID NO: 23, HCDR3 de SEQ ID NO: 30 y el VL que comprende LCDR1 de SEQ ID NO. NO: 37, el LCDR2 de SEQ ID NO: 44, 49 o 50 y/o el LCDR3 de SEQ ID NO: 52, en donde el marco VH no se deriva de VH1_1 -69, VH4_4-39, VH1_1 -02 o VH4_4- 59, y el marco VL no se deriva de VKIV_B3, VKI_O12 o VL3_3R. Las secuencias marco que se utilizarán se pueden obtener de bases de datos de ADN públicas o referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de línea germinal. Por ejemplo, el ADN de la línea germinal y las secuencias de proteínas codificadas para los genes de la región variable de la cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en IMGT®, el sistema de información internacional ImMunoGeneTics® http://_www-imgt_org. Las secuencias marco que se pueden usar para reemplazar las secuencias marco existentes en los anticuerpos de la invención son aquellas que muestran el mayor porcentaje de identidad con C4LB5, C4LB89, C4LB94, C4LB150, C4LB189, C4LB191, C4LB199, C4LB231, C4LB232, C4LB35 y C4LB256.
[0153] Las secuencias marco de los anticuerpos parentales y modificados pueden modificarse adicionalmente, por ejemplo, mediante retromutaciones para restaurar y/o mejorar la unión del anticuerpo resultante al antígeno como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N.° 6.180.370. Las secuencias marco de los anticuerpos parentales y manipulados pueden modificarse aún más mediante la mutación de uno o más residuos dentro de la región marco, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para eliminar epítopos de células T para reducir así la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque también se denomina “desinmunización” y se describe con mayor detalle en la Publ. Pat. EE. UU. No. 20030153043.
[0154] Los residuos de CDR de los anticuerpos de la invención pueden mutarse para mejorar una o más propiedades de unión del anticuerpo de interés. Se puede realizar mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR para introducir la(s) mutación(es) y el efecto sobre la unión de anticuerpos, u otra propiedad funcional de interés, se puede evaluar en ensayos in vitro o in vivo como se describe en este documento y se proporciona en los Ejemplos. Las sustituciones ejemplares que pueden introducirse son modificaciones conservadoras como se discutió anteriormente. Además, típicamente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR.
[0155] Se pueden realizar sustituciones de Fc en el anticuerpo de la invención para modular la vida media del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las sustituciones M252Y, S254T y T256E para aumentar la vida media del anticuerpo resultante (Dall'Acqua et al., J Biol Chem 281:23514-240, 2006).
[0156] Además, los anticuerpos de la invención pueden modificarse postraduccionalmente mediante procesos tales como glicosilación, isomerización, desglicosilación o modificación covalente no natural tal como la adición de fracciones de polietilenglicol (pegilación) y lipidación. Tales modificaciones pueden ocurrir in vivo o in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden conjugarse con polietilenglicol (PEGilado) para mejorar sus perfiles farmacocinéticos. La conjugación puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia. Se ha demostrado que la conjugación de anticuerpos terapéuticos con PEG mejora la farmacodinámica sin interferir con la función (Knigh et al., Platelets 15:409-18, 2004; Leong et al., Cytokine 16:106-19, 2001; Yang et al., Protein Eng. 16:761-70, 2003).
[0157] Los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención modificados para mejorar la estabilidad, selectividad, reactividad cruzada, afinidad, inmunogenicidad u otra propiedad biológica o biofísica deseable están dentro del alcance de la invención. La estabilidad de un anticuerpo está influenciada por una serie de factores, que incluyen (1) el empaquetamiento del núcleo de los dominios individuales que afecta su estabilidad intrínseca, (2) las interacciones de la interfaz proteína/proteína que tienen un impacto en el emparejamiento HC y LC, (3) el entierro de residuos polares y cargados, (4) red de enlaces H para residuos polares y cargados; y (5) carga superficial y distribución de residuos polares entre otras fuerzas intramoleculares e intermoleculares (Worn et al., J Mol Biol 305:989-1010, 2001). Los posibles residuos desestabilizadores de la estructura pueden identificarse en función de la estructura cristalina del anticuerpo o mediante modelado molecular en ciertos casos, y el efecto de los residuos en la estabilidad del anticuerpo puede probarse generando y evaluando variantes que albergan mutaciones en los residuos identificados. Una de las formas de aumentar la estabilidad de los anticuerpos es elevar el punto medio de transición térmica (Tm) medido por calorimetría diferencial de barrido (DSC). En general, la proteína Tm está correlacionada con su estabilidad e inversamente correlacionada con su susceptibilidad al desdoblamiento y desnaturalización en solución y los procesos de degradación que dependen de la tendencia de la proteína a desdoblarse (Remmele et al., Biopharm 13:36-46, 2000). Varios estudios han encontrado una correlación entre la clasificación de la estabilidad física de las formulaciones medidas como estabilidad térmica por DSC y la estabilidad física medida por otros métodos (Gupta et al., AAPS PharmSci 5E8, 2003; Zhang et al., J Pharm Sci 93:3076-89, 2004; Maa et al., Int J Pharm 140:155-68, 1996; Bedu-Addo et al., Pharm Res 21:1353-61, 2004; Remmele et al., Pharm Res 15:200 -8, 1997). Los estudios de formulación sugieren que un Fab T m tiene implicaciones para la estabilidad física a largo plazo de un mAb correspondiente.
[0158] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo biespecífico.
[0159] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo multiespecífico.
[0160] Los anticuerpos monoespecíficos que se unen específicamente a CD154 de la invención pueden diseñarse en anticuerpos biespecíficos que también están incluidos dentro del alcance de la invención. Las regiones VL y/o VH de los anticuerpos de la invención pueden diseñarse utilizando métodos publicados en anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla como estructuras tales como diseños TandAb® (Publ. Pat. Int. N.° WO1999/57150; publicación de patente de EE.
UU. N.° 2011/0206672) o en scFV biespecíficos como estructuras como las descritas en la patente de EE. UU. N.° 5.869.620; Publ. Pat. Int. N.2 WO1995/15388, Publ. Pat. Int. N.2 WO1997/14719 o Publ. Pat. Int. N.2 WO2011/036460.
[0161] Las regiones VL y/o VH de los anticuerpos de la invención pueden diseñarse en anticuerpos biespecíficos de longitud completa, donde cada brazo de anticuerpo se une a un antígeno o epítopo distinto. Dichos anticuerpos biespecíficos pueden fabricarse modulando las interacciones CH3 entre las dos cadenas pesadas de anticuerpos para formar anticuerpos biespecíficos utilizando tecnologías como las descritas en las patentes de EE. UU. N.° 7.695.936; Publ. Pat. Int. N.2 WO2004/111233; Publ. Pat. EE. UU. N.22010/0015133; Publ. Pat. EE. UU. N.22007/0287170; Publ. Pat. Int. N.2 WO2008/119353; Publ. Pat. EE. UU. N.22009/0182127; Publ. Pat. EE. UU. N.22010/0286374; Publ. Pat. EE. UU. N.2 2011/0123532; Publ. Pat. Int. N.2 WO2011/131746; Publ. Pat. Int. N.2 WO2011/143545; o la Publ. Pat. EE. UU. N.2 2012/0149876.
[0162] Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden generarse in vitro en un entorno libre de células introduciendo mutaciones asimétricas en las regiones CH3 de dos anticuerpos homodiméricos monoespecíficos y formando el anticuerpo heterodimérico biespecífico a partir de dos anticuerpos homodiméricos monoespecíficos parentales en condiciones reductoras para permitir el disulfuro. isomerización de enlaces según métodos descritos en Publ. Pat. Int. N.° WO2011/131746. En los métodos, se modifican por ingeniería genética dos anticuerpos bivalentes monoespecíficos para que tengan ciertas sustituciones en el dominio CH3 que promuevan la estabilidad del heterodímero; los anticuerpos se incuban juntos en condiciones reductoras suficientes para permitir que las cisteínas en la región bisagra experimenten la isomerización del enlace disulfuro; generando así el anticuerpo biespecífico por intercambio de brazos Fab. Las condiciones de incubación pueden restaurarse óptimamente a no reductoras. Ejemplos de agentes reductores que pueden usarse son 2-mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutatión, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), Lcisteína y beta-mercaptoetanol, preferiblemente un agente reductor seleccionado del grupo compuesto por: 2-mercaptoetilamina, ditiotreitol y tris(2-carboxietil)fosfina. Por ejemplo, la incubación durante al menos 90 min a una temperatura de al menos 20 °C en presencia de al menos 25 mM de 2-MEA o en presencia de al menos 0,5 mM de ditiotreitol a un pH de 5-8, por ejemplo se puede usar a pH de 7,0 o a pH de 7,4.
[0163] Las mutaciones ejemplares de CH3 que pueden usarse en una primera cadena pesada y en una segunda cadena pesada del anticuerpo biespecífico son K409R y/o F405L. Las estructuras biespecíficas adicionales en las que se pueden incorporar las regiones VL y/o VH de los anticuerpos de la invención son, por ejemplo, inmunoglobulinas de dominio variable dual (DVD) (Publ. Pat. Int. N.° WO2009/134776), o estructuras que incluyen varios dominios de dimerización para conectar los dos brazos de anticuerpo con diferente especificidad, como la cremallera de leucina o los dominios de dimerización de colágeno (Publ. Pat. Int. N.° WO2012/022811, patente de EE. UU. N.° 5.932.448; patente de EE. UU. N.° 6.833.441). Los DVD son anticuerpos de longitud completa que comprenden la cadena pesada que tiene una estructura VH1-enlazador-VH2-CH y la cadena ligera que tiene la estructura VL1 -enlazador-VL2-CL; el enlazador es opcional.
[0164] La invención también proporciona un anticuerpo antagonista que se une específicamente a CD154 de SEQ ID NO: 1 que tiene ciertas secuencias VH y VL, en donde el anticuerpo VH está codificado por un primer polinucleótido y el anticuerpo VL está codificado por un segundo polinucleótido sintético. El polinucleótido puede ser un ácido desoxinucleico complementario (ADNc) y puede tener codones optimizados para la expresión en un huésped adecuado. La optimización de codones es una tecnología bien conocida.
[0165] En algunas formas de realización, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo VH o VL de la invención comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 76 o 77.
SEQ ID NO: 76 (que codifica VH de C4LB231)
Figure imgf000019_0001
SEQ ID NO: 77 (que codifica VL de C4LB231)
Figure imgf000020_0001
SEQ ID NO: 78 (que codifica VH de C4LB191)
Figure imgf000020_0002
SEQ ID NO: 79 (que codifica VL de C4LB191)
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[0166] La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica cualquiera de las regiones variables de cadena pesada de anticuerpo, las regiones variables de cadena ligera de anticuerpo, las cadenas pesadas de anticuerpo y /o las cadenas ligeras del anticuerpo de la invención. Ciertos polinucleótidos ejemplares se describen aquí, sin embargo, otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o las preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican los anticuerpos de la invención también están dentro del alcance de la invención. Ejemplos de polinucleótidos son, por ejemplo, polinucleótidos que tienen las secuencias que se muestran en las SEQ ID NO: 76 y 77. Las secuencias de polinucleótidos que codifican el VH o el VL o un fragmento del mismo del anticuerpo de la invención pueden unirse operativamente a uno o más elementos reguladores, tales como promotor o potenciador, que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos en la célula huésped prevista. El polinucleótido puede ser un ADNc.
[0167] La invención también proporciona un vector que comprende el polinucleótido de la invención. Dichos vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción del polinucleótido sintético de la invención en un organismo dado o trasfondo genético por cualquier medio. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican regiones variables de cadena ligera y/o pesada de los anticuerpos de la invención, opcionalmente unidos a regiones constantes, se insertan en vectores de expresión. Las cadenas ligeras y/o pesadas pueden clonarse en los mismos o diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican cadenas de inmunoglobulina pueden unirse operativamente a secuencias de control en el vector o vectores de expresión que aseguran la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina. Dichas secuencias de control incluyen secuencias señal, promotores (p. ej., promotores heterólogos o asociados de forma natural), elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción, y se eligen para que sean compatibles con la célula huésped elegida para expresar el anticuerpo. Una vez que el vector se ha incorporado al huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para un alto nivel de expresión de las proteínas codificadas por los polinucleótidos incorporados.
[0168] Los vectores de expresión adecuados son típicamente replicables en los organismos huéspedes como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección tales como resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a kanamicina o resistencia a neomicina para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.
[0169] Los elementos promotores y potenciadores adecuados son conocidos en la técnica. Para la expresión en una célula eucariótica, los ejemplos de promotores incluyen elementos promotores y potenciadores del gen de la inmunoglobulina de cadena ligera y/o pesada; promotor temprano inmediato de citomegalovirus; promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simple; promotores tempranos y tardíos de SV40; promotor presente en repeticiones terminales largas de un retrovirus; promotor de metalotioneína-I de ratón; y diversos promotores específicos de tejido conocidos en la técnica.
[0170] La selección del vector y el promotor apropiados se encuentra dentro del nivel de los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados; muchos son comercialmente disponibles para generar construcciones recombinantes en cuestión. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo. Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, California, EE. u U.); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 y pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, μMSG y pSVL (Pharmacia).
[0171] La invención también proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de la invención. “Célula huésped” se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector. Se entiende que el término célula huésped se refiere no sólo a la célula objeto particular sino también a la progenie de tal célula, y también a una línea celular estable generada a partir de la célula objeto particular. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie puede no ser idéntica a la célula original, pero todavía está incluida dentro del alcance del término “célula huésped” como se usa aquí. Dichas células huésped pueden ser células eucariotas, células procariotas, células vegetales o células arqueales.
[0172] Escherichia coli, bacilos, como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias, como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas, son ejemplos de células huésped procarióticas. Otros microbios, como la levadura, también son útiles para la expresión. Saccharomyces (p. e j, S. cerevisiae) y Pichia son ejemplos de células huésped de levadura adecuadas. Ejemplos de células eucarióticas pueden ser de mamíferos, insectos, aves u otros orígenes animales. Las células eucariotas de mamíferos incluyen líneas celulares inmortalizadas tales como hibridomas o líneas celulares de mieloma tales como SP2/0 (Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC N.° 85110503), líneas celulares murinas FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC c Rl -1580). Una línea celular de mieloma humano ejemplar es U266 (ATTC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen aquellas derivadas de células de ovario de hámster chino (CHO) tales como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL-61) o DG44.
[0173] La invención también proporciona un método para producir un anticuerpo de la invención que comprende cultivar la célula huésped de la invención en condiciones en las que se expresa el anticuerpo y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped. Los métodos para producir anticuerpos y purificarlos son bien conocidos en la técnica. Una vez sintetizados (ya sea químicamente o de forma recombinante), los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligeras y/o pesadas individuales u otros fragmentos de anticuerpos como VH y/o VL, pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar, incluida la precipitación con sulfato de amonio, la afinidad columnas, cromatografía en columna, purificación por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), electroforesis en gel y similares (véase en general Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, (1982)). Un anticuerpo sujeto puede ser sustancialmente puro, p. ej. al menos alrededor del 80 % al 85 % puro, al menos alrededor del 85 % al 90 % puro, al menos alrededor del 90 % al 95 % puro, o al menos alrededor del 98 % al 99 %, o más, puro, por ejemplo, libre de contaminantes tales como desechos celulares, macromoléculas, etc., distintos del anticuerpo en cuestión.
[0174] La invención también proporciona un método para producir un anticuerpo antagonista que se une específicamente a CD154 de SEQ ID NO: 1 como se establece en el conjunto de reivindicaciones adjunto, que comprende:
incorporar el primer polinucleótido que codifica la VH del anticuerpo y el segundo polinucleótido que codifica la VL del anticuerpo en un vector de expresión;
transformar una célula huésped con el vector de expresión;
cultivar la célula huésped en medio de cultivo en condiciones en las que VL y VH se expresan y forman el anticuerpo; y
recuperar el anticuerpo de la célula huésped o del medio de cultivo.
[0175] Los polinucleótidos que codifican ciertas secuencias VH o VL de la invención pueden incorporarse en vectores usando métodos estándar de biología molecular. La transformación, el cultivo, la expresión de anticuerpos y la purificación de la célula huésped se realizan utilizando métodos bien conocidos.
Métodos de tratamiento
[0176] Los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a CD154 de la invención, por ejemplo, los anticuerpos C4LB89, C4LB35 y C4LB236, pueden usarse para el tratamiento y/o prevención de cualquier afección o enfermedad en la que antagonizar los efectos de CD154 puede ser terapéuticamente eficaz y puede reducir los síntomas de la enfermedad. Los ejemplos de los mismos incluyen el tratamiento de condiciones alérgicas, autoinmunes, de cáncer, trasplante, GVHD, inflamatorias y otras, especialmente condiciones en las que la inducción de tolerancia y/o la supresión de la inmunidad humoral son terapéuticamente deseables. Las enfermedades que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención son enfermedades inflamatorias inmunomediadas o enfermedades autoinmunes tales como artritis, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad inflamatoria intestinal, trasplante, trasplante de riñón, trasplante de piel, trasplante de médula ósea, injerto contra huésped. (GVHD), trombocitopenia inmune (ITP), esclerosis múltiple, tiroiditis, diabetes tipo I o aterosclerosis.
[0177] Más allá de simplemente bloquear las interacciones CD154-CD40, la terapia anti-CD154 conduce a la inducción de tolerancia inmunológica (Gordon et al., Diabetes 47: 1199-1206, 1988); Markees y col., Transplantation 64: 329-335, 1997; Jarvinen y col., Transplantation 76: 1375-1379, 2003; Quezada et al., Sangre 102: 1920-1926, 2003; Frleta y col., J Immunother 26: 72-84, 2003; Elster y col., Transplantation 72: 1473-1478, 2001; Benda et al., Cell Transplantation 11: 715-720, 2002; Wekerle y Sykes, Annual review of medicine 2001. 52: 353-370 19; Camirand et al., Transplantation 73: 453-461,2002).
[0178] La invención también proporciona un método para tratar una enfermedad inflamatoria inmunomediada o una enfermedad autoinmune, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención a un sujeto que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar la enfermedad inflamatoria inmunomediada o enfermedad autoinmune.
[0179] La invención también proporciona un método para tratar la artritis, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención a un sujeto que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar la artritis.
[0180] En algunas formas de realización, la artritis es artritis juvenil, artritis reumatoide, artritis psoriásica, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante o artritis gotosa.
[0181] La invención también proporciona un método para tratar el lupus, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención a un sujeto que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar el lupus.
[0182] En algunas formas de realización, el lupus es lupus eritematoso sistémico (SLE) o lupus eritematoso cutáneo (CLE).
[0183] En algunas formas de realización, el sujeto tiene nefritis lúpica.
[0184] La invención también proporciona un método para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención a un sujeto que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal.
[0185] En algunas formas de realización, la enfermedad inflamatoria intestinal es la enfermedad de Crohn.
[0186] En algunas formas de realización, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa.
[0187] “Tratamiento” o “tratar” se refiere a un tratamiento terapéutico. Los individuos que necesitan tratamiento incluyen aquellos sujetos diagnosticados con el trastorno o un síntoma del trastorno. Los sujetos que pueden tratarse también incluyen aquellos propensos o susceptibles de tener el trastorno, de aquellos en los que se debe prevenir el trastorno. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen el alivio de los síntomas, la disminución de la extensión de la enfermedad, el estado de la enfermedad estabilizado (es decir, sin empeoramiento), el retraso o la desaceleración de la progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. Los resultados clínicos beneficiosos incluyen, en un sujeto que ha recibido tratamiento, por ejemplo, reducción de la proliferación de células B o células dendríticas, reducción de citocinas inflamatorias, moléculas de adhesión, proteasas, inmunoglobulinas (en los casos en que la célula portadora de CD40 es una célula B), combinaciones de los mismos, aumento de la producción de proteínas antiinflamatorias, reducción del número de células autorreactivas, aumento de la tolerancia inmunitaria, inhibición de la supervivencia de las células autorreactivas y/o disminución de uno o más síntomas mediados por la estimulación de células que expresan CD40 por CD154.
[0188] La respuesta clínica puede evaluarse utilizando técnicas de cribado tales como exploración por imágenes de resonancia magnética (IRM), imágenes radiográficas, exploración por tomografía computarizada (TC), citometría de flujo o análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), histología, patología macroscópica y química sanguínea, incluidos, entre otros, cambios detectables por ELISA, RIA, cromatografía y similares.
[0189] Los anticuerpos ejemplares que se pueden usar en los métodos de la invención comprenden C4LB89, C4LB35 y C4LB236.
[0190] Los métodos de la invención se pueden usar para tratar un sujeto perteneciente a cualquier clasificación animal. Los ejemplos de sujetos que pueden tratarse incluyen mamíferos tales como humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja.
[0191] Los anticuerpos de la invención pueden ser útiles en la preparación de un medicamento para dicho tratamiento, en donde el medicamento se prepara para la administración en las dosis definidas en el presente documento.
[0192] Los anticuerpos de la invención pueden administrarse en combinación con un segundo agente terapéutico.
[0193] El segundo agente terapéutico puede ser cualquier terapia conocida para enfermedades autoinmunes e inflamatorias, incluido cualquier agente o combinación de agentes que se sabe que son útiles, o que se han usado o están actualmente en uso, para el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Dichas terapias y agentes terapéuticos incluyen cirugía o procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, esplenectomía, linfadenectomía, tiroidectomía, plasmaféresis, leucoforesis, trasplante de células, tejidos u órganos, procedimientos intestinales, perfusión de órganos y similares), radioterapia, terapia tal como terapia con esteroides y terapia no esteroidea, terapia hormonal, terapia con citocinas, terapia con agentes dermatológicos (por ejemplo, agentes tópicos utilizados para tratar afecciones de la piel como alergias, dermatitis de contacto y psoriasis), terapia inmunosupresora y otra terapia con anticuerpos monoclonales antiinflamatorios.
[0194] El segundo agente terapéutico puede ser un corticosteroide, un fármaco antipalúdico, un inmunosupresor, un fármaco citotóxico o un modulador de células B.
[0195] En algunas formas de realización, el segundo agente terapéutico es prednisona, prednisolona, metilprednisolona, deflazcort, hidroxicloroquina, azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, micofenolato de mofetilo (MMF), micofenolato de sodio, ciclosporina, leflunomida, tacrolimus, RITUXAN® (rituximab), o BENLYSTA® (belimumab).
[0196] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la invención se administran en combinación con un segundo agente terapéutico. Ejemplos de segundos agentes terapéuticos son corticosteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), salicilatos, hidroxicloroquina, sulfasalazina, fármacos citotóxicos, fármacos inmunosupresores, anticuerpos inmunomoduladores, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribina, clorambucilo, ciclosporina, tacrolimus (FK506; ProGrafrM), micofenolato de mofetilo, y azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), desoxiespergualina, leflunomida y sus análogos de malononitriloamida; anticuerpos anti-CTLA4 y fusiones de Ig, anticuerpos anti-estimulador de linfocitos B (p. ej., LYMPHOSTAT-BTM) y fusiones de CTLA4-Ig (BLyS-lg), anticuerpos anti-CD80, anticuerpos anti­ células T como anti-CD3 (OKT3), anti-CD4, corticosteroides tales como, por ejemplo, clobetasol, halobetasol, hidrocortisona, triamcinolona, betametasona, fluocinol, fluocinonida, prednisona, prednisolona, metilprednisolona; medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) como, por ejemplo, sulfasalazina, medicamentos que contienen mesalamina (conocidos como agentes 5-ASA), celecoxib, diclofenaco, etodolaco, fenprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, ketoprofeno, meclofamato, meloxicam, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, piroxicam, rofecoxib, salicilatos, sulindac y tolmetin; inhibidores de la fosfodiesterasa-4, anticuerpos anti-TNFα Re MICADe® (infliximab), SIMPONI® (golimumab) y HUMIRA® (adalimumab), talidomida o sus análogos como lenalidomida.
[0197] Los anticuerpos de la invención se pueden administrar en combinación con un segundo agente terapéutico de forma simultánea, secuencial o por separado.
[0198] La eficacia del tratamiento o RA puede evaluarse utilizando la eficacia medida por las respuestas clínicas definidas por los criterios del American College of Rheumatology, los criterios de la European League of Rheumatism, o cualquier otro criterio. Véase, por ejemplo, Felson et al. (1995) Artritis Rheum. 38: 727-35 y van Gestel et al. (1996) Artritis Rheum.
39: 34-40.
Administración/Composiciones farmacéuticas
[0199] La invención proporciona composiciones farmacéuticas de los anticuerpos antagonistas que se unen específicamente a CD154 de la invención (como se establece en las reivindicaciones adjuntas) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Para uso terapéutico, los anticuerpos de la invención se pueden preparar como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del anticuerpo como ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto activo. Dichos vehículos pueden ser líquidos, como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, se puede utilizar solución salina al 0,4 % y glicina al 0,3 %. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de partículas. Pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (p. ej., filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes tamponadores y reguladores del pH, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración de las moléculas o anticuerpos de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente., es decir, desde menos de aproximadamente el 0,5 %, normalmente hasta al menos aproximadamente el 1 % hasta tanto como el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % o 50 % por peso y se seleccionará principalmente en función de la dosis requerida, los volúmenes de líquido, las viscosidades, etc., según el modo particular de administración seleccionado. Los vehículos y formulaciones adecuados, incluidas otras proteínas humanas, por ejemplo, albúmina sérica humana, se describen, por ejemplo, en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, Troy, DB ed., Lipincott Williams and Wilkins, Filadelfia, PA 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing, págs. 691-1092, Ver especialmente págs. 958-989.
[0200] El modo de administración de los anticuerpos de la invención en los métodos de la invención puede ser cualquier vía adecuada, como la administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea, transmucosa (oral, intranasal, intravaginal, rectal) u otros medios apreciados por el experto en la materia, como bien conocidos en la técnica.
[0201] Los anticuerpos de la invención pueden administrarse a un sujeto por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por vía parenteral mediante infusión intravenosa (i.v.) o inyección en bolo, por vía intramuscular o subcutánea o intraperitoneal. La infusión i.v. se puede administrar durante, por ejemplo, 15, 30, 60, 90, 120, 180 o 240 minutos, o desde 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 horas.
[0202] La dosis administrada a un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria inmunomediada o una enfermedad autoinmune como la artritis reumatoide es suficiente para aliviar o al menos detener parcialmente la enfermedad que se está tratando (“cantidad terapéuticamente eficaz”) y puede ser a veces de 0,005 mg. /kg a alrededor de 100 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 0,05 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg o alrededor de 0,1 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg, o alrededor de 1 mg a alrededor de 20 mg/kg, o alrededor de 4 mg/kg kg, alrededor de 8 mg/kg, alrededor de 16 mg/kg o alrededor de 24 mg/kg, o, por ejemplo, alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg, pero puede incluso mayor, por ejemplo alrededor de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg.
[0203] También se puede administrar una dosis unitaria fija, por ejemplo, 50, 100, 200, 500 o 1000 mg, o la dosis puede basarse en el área de superficie del paciente, por ejemplo, 500, 400, 300, 250, 200, o 100 mg/ M2. Por lo general, se pueden administrar entre 1 y 8 dosis (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) para tratar la enfermedad inflamatoria inmunomediada, como la artritis reumatoide, pero 9, 10, 11, Se pueden administrar 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más dosis.
[0204] La administración de los anticuerpos de la invención puede repetirse después de un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, cinco semanas, seis semanas, siete semanas, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más. También son posibles cursos repetidos de tratamiento, así como la administración crónica. La administración repetida puede ser a la misma dosis o a una dosis diferente. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se pueden administrar a 0,1 mg/kg, a 1 mg/kg, a 5 mg/kg, a 8 mg/kg o a 16 mg/kg a intervalos semanales durante 8 semanas, seguido de la administración a 8 mg/kg o a 16 mg/kg cada dos semanas durante 16 semanas adicionales, seguido de la administración a 8 mg/kg o a 16 mg/kg cada cuatro semanas mediante infusión intravenosa.
[0205] Los anticuerpos de la invención pueden proporcionarse mediante una terapia de mantenimiento, como, por ejemplo, una vez a la semana durante un período de 6 meses o más.
[0206] Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se pueden proporcionar como una dosificación diaria en una cantidad de aproximadamente 0,1-100 mg/kg, como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por día, en al menos uno de los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40, o alternativamente, al menos uno de la semana 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 después del inicio del tratamiento, o cualquier combinación de los mismos, utilizando dosis únicas o divididas cada 24, 12, 8, 6, 4 o 2 horas, o cualquier combinación de los mismos.
[0207] Los anticuerpos de la invención también pueden administrarse profilácticamente para reducir el riesgo de desarrollar la enfermedad inflamatoria inmunomediada o una enfermedad autoinmune tal como artritis o artritis reumatoide, y/o retrasar la aparición de la enfermedad inflamatoria inmunomediada. enfermedad de la enfermedad autoinmune.
[0208] Por lo tanto, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular se puede preparar para contener 1 ml de agua tamponada estéril, y entre alrededor de 1 ng a alrededor de 100 mg/kg, por ejemplo, alrededor de 50 ng a alrededor de 30 mg/kg o más preferiblemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg/kg, del anticuerpo de la invención.
[0209] Por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende los anticuerpos de la invención para infusión intravenosa se puede preparar para que contenga alrededor de 200 ml de solución de Ringer estéril, y alrededor de 8 mg a alrededor de 2400 mg, alrededor de 400 mg a alrededor de 1600 mg, o de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 800 mg de los anticuerpos de la invención para la administración a un paciente de 80 kg. Los métodos para preparar composiciones administrables por vía parenteral son bien conocidos y se describen con más detalle, por ejemplo, en “Remington's Pharmaceutical Science”, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.
[0210] La “cantidad terapéuticamente eficaz” de los anticuerpos de la invención eficaz en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria inmunomediada o una enfermedad autoinmune puede determinarse mediante técnicas de investigación estándar. Por ejemplo, pueden emplearse ensayos in vitro para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. Opcionalmente, la dosificación de los anticuerpos de la invención que puede ser eficaz en el tratamiento de enfermedades inflamatorias inmunomediadas o enfermedades autoinmunes tales como artritis o artritis reumatoide puede determinarse administrando los anticuerpos a modelos animales relevantes bien conocidos en la técnica. La selección de una dosis efectiva particular puede ser determinada (p. ej., a través de ensayos clínicos) por los expertos en la técnica basándose en la consideración de varios factores. Dichos factores incluyen la enfermedad a tratar o prevenir, los síntomas implicados, la masa corporal del paciente, el estado inmunitario del paciente y otros factores conocidos por el experto en la materia. La dosis precisa a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad, y debe decidirse según el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba en modelos animales o in vitro. Los anticuerpos de la invención pueden probarse en cuanto a su eficacia y dosificación efectiva utilizando cualquiera de los modelos descritos en el presente documento.
[0211] Los anticuerpos de la invención pueden liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con preparaciones de proteínas convencionales y se pueden emplear técnicas de liofilización y reconstitución bien conocidas.
Anticuerpos antiid iotípicos
[0212] La presente invención proporciona un anticuerpo antiidiotípico que se une al anticuerpo de la invención.
[0213] La invención también proporciona un anticuerpo anti-idiotípico que se une específicamente al anticuerpo que comprende el VH de SEQ ID NO: 59 y el VL o SEQ ID NO: 66. El anticuerpo que comprende el VH de SEQ ID NO: 59 y el VL o SEQ ID NO: 72.
[0214] La invención también proporciona un anticuerpo anti-idiotípico que se une específicamente al anticuerpo que comprende el VH de SEQ ID NO: 59 y el VL o SEQ ID NO: 73.
[0215] Un anticuerpo anti-idiotípico (Id) es un anticuerpo que reconoce los determinantes antigénicos (por ejemplo, el paratopo o las CDR) del anticuerpo. El anticuerpo Id puede bloquear o no bloquear el antígeno. El Id de bloqueo de antígeno puede usarse para detectar el anticuerpo libre en una muestra (por ejemplo, el anticuerpo CD154 de la invención descrito en este documento). El Id sin bloqueo se puede utilizar para detectar el anticuerpo total (libre, parcialmente unido al antígeno o totalmente unido al antígeno) en una muestra. Se puede preparar un anticuerpo Id inmunizando a un animal con el anticuerpo para el que se está preparando un anti-Id.
[0216] También se puede usar un anticuerpo anti-Id como inmunógeno para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal más, produciendo un denominado anticuerpo anti-anti-Id. Un anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al mAb original, que indujo el anti-Id. Por lo tanto, mediante el uso de anticuerpos contra los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica. Los anticuerpos anti-Id pueden variarse (produciendo así variantes de anticuerpos anti-Id) y/o derivatizarse mediante cualquier técnica adecuada, como las descritas en otra parte del presente documento con respecto a los anticuerpos que se unen específicamente a los anticuerpos HLA-DR.
Inmunoconjugados
[0217] Un “inmunoconjugado” se refiere al anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas heterólogas.
[0218] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención se conjuga con uno o más agentes citotóxicos. Entre los ejemplos de tales agentes citotóxicos se incluyen agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (p. ej., toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas) e isótopos radiactivos.
[0219] En algunas formas de realización, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) en donde el anticuerpo de la invención se conjuga con uno o más fármacos, como un maitansinoide (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 5.208.020, 5.416,06)); una auristatina tal como fracciones de fármaco de monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. 5,635,483 and 5,780,588, and 7,498,298), una dolastatina, una caliqueamicina o un derivado de las mismas (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 5,712,374, 5.714.586, 5.739, 116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296, Hinman et al., (1993) Cancer Res 53:3336-3342 y Lode et al., (1998) Cáncer Res 58:2925-2928); una antraciclina tal como daunomicina o doxorrubicina (ver, por ejemplo, Kratz et al., (2006) Current Med. Chem 13:477-523; Jeffrey et al., (2006) Bioorganic & Med Chem Letters 16:358-362; Torgov et al., (2005) Bioconj Chem 16:717-721, Nagy et al., (2000) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 97:829-834, Dubowchik et al, Bioorg. & Med. Chem Letters 12: 1529-1532 (2002); King y col., (2002) J Med Chem 45:4336-4343; y Patente de EE. UU. N.° 6.630.579), metotrexato, vindesina, un taxano como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel.
[0220] En algunas formas de realización, el inmunoconjugado comprende el anticuerpo de la invención conjugado con una toxina enzimáticamente activa o un fragmento de la misma, como la cadena A de la difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.
[0221] En algunas formas de realización, el anticuerpo de la invención se conjuga con un átomo radiactivo para formar un radioconjugado. Se dispone de una variedad de isótopos radiactivos para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, 1131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el radioconjugado se utiliza para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, tc99m o 1123, o una marca de espín para imágenes de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imágenes de resonancia magnética, mri), como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-I l, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
[0222] Los conjugados del anticuerpo de la invención y el agente citotóxico se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como dimetil adipimidato HQ), ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (como glutaraldehído), compuestos bis-azido (como como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bisactivos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricino como se describe en Vitetta et al., (1987) Science 238: 1098. El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Véase, por ejemplo, WO94/11026. El enlazador puede ser un “enlazador escindible” que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede usarse un enlazador lábil en ácido, un enlazador sensible a peptidasas, un enlazador fotolábil, un enlazador de dimetilo o un enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., (1992) Cancer Res 52: 127-131; Patente de EE. UU. N.25.208.020).
[0223] Los inmunoconjugados o ADC se pueden preparar con reactivos de entrecruzamiento tales como BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfoMBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).
[0224] La invención también proporciona un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo que se une específicamente a CD154 de SEQ ID NO: 1 de la invención (como se establece en el conjunto de reivindicaciones adjunto) unido a un agente terapéutico o un agente de formación de imágenes.
[0225] La invención también proporciona un anticuerpo aislado o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD154 humano de SEQ ID NO:1, que comprende una región determinante de complementariedad de cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 17 (SYGIS), un HCDR2 de SEQ ID NO: 23 (WISPIFGNTNYAQKFQG), un HCDR3 de SEQ ID NO: 30 (SRYYGDLDY), una región determinante de complementariedad de cadena ligera (LCd R) 1 de SEQ ID NO: 37 (RASQSISSYLN), un LCDR2 de SEQ ID NO: 44 (YANSLQS) y un LCDR3 de SEQ ID NO: 52 (QQSDSIPWT).
[0226] La invención también proporciona un anticuerpo antagonista aislado que se une específicamente al CD154 humano soluble (shCD154) de SEQ ID NO: 4, que comprende el HCDR1 de SEQ ID NO: 17 (SYGIS), el HCDR2 de SEQ ID NO: 23 (WISPIFGNTNYAQKFQG), el HCDR3 de SEQ ID NO: 30 (SRYYGDLDY), LCDR1 de SEQ ID NO: 37 (RASQSISSYLN), LCDR2 de SEQ ID NO: 44 (YANSLQS) y LCDR3 de SEQ ID NO: 52 (QQSDSIPWT).
[0227] En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 59 y la VL de SEQ ID NO: 66.
[0228] En algunas formas de realización, el anticuerpo se une a shCD154 con una constante de disociación Kd de aproximadamente 5 x 10-9 M o menos, aproximadamente 1 x 10-9 M o menos, aproximadamente 5 x 10-10 M o menos, alrededor de 1 x 10-10 M o menos, alrededor de 5 x 10-11 M o menos, o alrededor de 1 x 10-11 M o menos, cuando la Kd se mide usando el sistema ProteOnXPR36 usando el diseño experimental descrito en el Ejemplo 1, medidas de afinidad.
[0229] En algunas formas de realización, el anticuerpo inhibe la proliferación de células B humanas mediada por shCD154 con un valor CI50 de entre aproximadamente 7,0 x 10-11 M y aproximadamente 6 x 10-10 M.
[0230] En algunas formas de realización, el anticuerpo inhibe Expresión mediada por shCD154 de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el promotor mínimo de interferón-p (IFN-p) inducible por NF-kB en células HEK293 que expresan de forma estable SEAP y CD40 humano con un valor CI50 de aproximadamente 2,1x10-8 M o menos.
[0231] En algunas formas de realización, el anticuerpo es de isotipo IgG1, que comprende opcionalmente sustituciones de cadena pesada L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S y P331S en comparación con la IgG 1 de tipo salvaje.
[0232] En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 59 y la VL de SEQ ID NO: 66 y es de isotipo IgG 1, que comprende opcionalmente sustituciones de cadena pesada L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S y P331S en comparación con la IgG1 de tipo salvaje.
[0233] En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 59 y la VL de SEQ ID NO: 66 y es de isotipo IgG1/K que comprende sustituciones de cadena pesada L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S y P331S en comparación con la IgG1 de tipo salvaje.
[0234] En algunas formas de realización, el anticuerpo es del isotipo IgG2, que comprende opcionalmente sustituciones de cadena pesada V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S en comparación con la IgG2 de tipo salvaje.
[0235] En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende la VH de SEQ ID NO: 59 y la VL de SEQ ID NO: 66 y es de isotipo IgG2/K que comprende sustituciones de cadena pesada V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S en comparación con la IgG2 de tipo salvaje.
[0236] En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada (HC) de SEQ ID NO: 80 y una cadena ligera (LC) de SEQ ID NO: 81.
[0237] En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada (HC) de SEQ ID NO: 80 y una cadena ligera (LC) de SEQ ID NO: 81.
[0238] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.
[0239] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de una enfermedad autoinmune.
[0240] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria inmunomediada.
[0241] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de la artritis.
[0242] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento del lupus eritematoso sistémico.
[0243] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal.
[0244] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de trasplantes.
[0245] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de trasplante de riñón.
[0246] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de trasplantes de piel.
[0247] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de trasplante de médula ósea.
[0248] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped.
[0249] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de trombocitopenia inmune.
[0250] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de la esclerosis múltiple.
[0251] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de tiroiditis.
[0252] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de diabetes tipo I.
[0253] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de la aterosclerosis.
[0254] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de la artritis reumatoide.
[0255] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de la enfermedad de Crohn.
[0256] El anticuerpo es adecuado para uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de colitis ulcerosa.
[0257] El anticuerpo es adecuado para su uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal, en combinación con un segundo agente terapéutico.
[0258] Los anticuerpos de la presente invención y otros anticuerpos que se unen a CD154 se describirán ahora con referencia a los siguientes ejemplos específicos.
Ejemplo 1. Materiales y métodos
Generación de proteínas utilizadas
[0259] Como señales de CD154 endógenas como un trímero, se expresó CD154 recombinante de múltiples formas para obtener un trímero recombinante funcional. CD154 humano soluble (shCD154; SEQ ID NO: 4), Callithrix jacchus soluble (tí común; en el presente documento denominado tití) CD154 (smCD154; SEQ ID NO: 5) o Macaca fascicularis soluble (cynomolgous, en el presente documento denominado cyno) CD154 (scCD154; SEQ ID NO: 6) se clonaron y expresaron como His6 (s Eq ID NO: 10) fusiones (shCD154-his, SEQ iD NO: 7; smCD154-his, SEQ ID n O: 8; scCD154-his, SEQ ID NO: 9) o como una fusión con cremallera de leucina (ILZ) (SEQ ID NO: 11) (shCD154-ILZ, SEQ ID NO: 12; smCD154-ILZ, SEQ ID NO: 13; scCD154-ILZ, SEQ ID NO: 14). La clonación, expresión y purificación de proteínas se realizó utilizando métodos estándar. Tanto la fusión de His como la de ILZ eran predominantemente trímeros. smCD154 y smCD154-ILZ se biotinilaron usando EZ-Link™ Sulfo-NHS-LCBiotin and Labeling Kit (Thermo, cat n.° 21327), el éxito de la biotinilación se analizó mediante el ensayo HABA-avidin (Thermo, cat n.° 46610) y Octet. En algunos ensayos se usaron células que expresaban CD40 humano (SEQ ID NO: 15). En algunos ensayos se usaron células Jurkat D1.1 (ATCC® CRL-10915™) que expresan endógenamente CD154 humano.
CD154 humano; SEQ ID NO: 1
Figure imgf000028_0001
CD154 de tití; SEQ ID NO: 2
Figure imgf000028_0002
Cynomolgus CD154; SEQ ID NO: 3
Figure imgf000028_0003
shCD154; SEQ ID NO: 4
Figure imgf000028_0004
smCD154; SEQ ID NO: 5
Figure imgf000029_0001
scCD154; SEQ ID NO: 6
Figure imgf000029_0006
shCD154-his; SEQ ID NO: 7
Figure imgf000029_0002
smCD 154-his; SEQ ID NO: 8
Figure imgf000029_0007
scCD154-his; SEQ ID NO: 9
Figure imgf000029_0003
His6; SEQ ID NO: 10
HHHHHH
ILZ; SEQ ID NO: 11
RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGER
shCD154 -ILZ; SEQ ID NO: 12
Figure imgf000029_0004
smCD154-ILZ; SEQ ID NO: 13
Figure imgf000029_0005
scCD154-ILZ; SEQ ID NO: 14
Figure imgf000030_0001
GASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
CD40 humano; SEQ ID NO: 15
Figure imgf000030_0002
Mediciones de afinidad
[0260] Las mediciones de afinidad usando resonancia de plasmón superficial (SPR) se realizaron usando un sistema ProteOn XPR36 (BioRad). Se preparó una superficie de biosensor acoplando IgG Fc anti-humana (Jackson Cat N.° 109­ 005-098) a la superficie de la capa de polímero de alginato modificado de un chip GLC (BioRad, Cat N.° 176-5011) utilizando las instrucciones del fabricante para el acoplamiento de amina. química. Se inmovilizaron aproximadamente 4700 RU (unidades de respuesta) de anticuerpos de prueba. Los experimentos cinéticos se realizaron a 25 °C en tampón de corrida (DPBS+0,03 % polisorbato P20+100 qg/ml BSA). Para realizar experimentos cinéticos, se capturaron 100 RU de anticuerpos seguidos de inyecciones de analitos (shCD154-his y smCD154-his) en concentraciones que oscilaban entre 0,391 nM y 100 nM (en una dilución en serie de 4 veces). La fase de asociación se controló durante 3 minutos a 50 qL/min seguido de 15 minutos de flujo de tampón (fase de disociación). La superficie del chip se regeneró con dos pulsos de 18 segundos de H3PO4100 mM (Sigma, Cat N.° 7961) a 100 qL/min.
[0261] Los datos recopilados se procesaron utilizando el software ProteOn Manager. Primero, los datos se corrigieron por el fondo usando puntos intermedios. A continuación, se realizó la sustracción de referencia doble de los datos utilizando la inyección de tampón para inyecciones de analitos. El análisis cinético de los datos se realizó utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1.
Activación de células Ramos inducida por CD154
[0262] La capacidad de los anticuerpos anti-CD154 para inhibir la activación de células Ramos se evaluó usando CD54 como marcador para la activación celular. Se sembraron células Ramos (células de linfoma de Burkitt, ATCC® CRL-1596™) mantenidas según el protocolo del proveedor en una placa con fondo en V de 96 pocillos a 2,0 x 105 células/pocillo en medio de crecimiento completo en 100 ql/pocillo. Los anticuerpos de prueba a concentraciones de 0,2, 2 o 20 qg/ml se preincubaron con 40 ng/ml de smCD154-his durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) y luego se agregaron a las células. La placa se cubrió y se incubó durante la noche (37 °C, 5 % CO2). Al día siguiente, se centrifugó la placa de ensayo y se retiró el medio de tratamiento gastado. Los sedimentos de células resultantes se lavaron con PBS frío/FBS al 2 % y luego las células se tiñeron con anticuerpo anti-CD54 (ICAM-1) marcado con PE o control de isotipo apropiado durante 1 h a 4 °C. Las células se lavaron con PBS frío/FBS al 2 %, se resuspendieron en 100 ql/pocillo de PBS frío/FBS al 2 % y se midió la señal fluorescente (canal amarillo) en un citómetro de flujo. Se determinó que los anticuerpos eran antagonistas cuando cumplían los criterios: % de potencia en relación con el anticuerpo 5C8 > 5 % de potencia en 5C8, donde % de potencia se refiere al porcentaje normalizado de inhibición en relación con 5C8 a la concentración más alta probada.
Ensayo del gen informador NF-kB-SEAP
[0263] La capacidad de los anticuerpos anti-CD154 para inhibir las vías de señalización corriente abajo de CD40 inducidas por CD154 se evaluó utilizando células HEK-Blue™ CD40L (Invivogen), diseñadas para expresar CD40 humano y transfectadas con un gen indicador de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el control del promotor inducible por NF-kB (promotor mínimo de IFN-p). Las células se estimularon con CD 154 humano o cyno, o con células Jurkat. Las células HEK-Blue™ CD40L se mantuvieron de acuerdo con el protocolo del proveedor y todos los ensayos de actividad se realizaron en DMEM complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % y 1X Glutamax. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a una densidad celular de 2,5 o 5 x 104 células por pocillo en un volumen de 100 ql e incubadas durante la noche (37 °C, 5 % de CO2). Al día siguiente, se preincubaron soluciones 4X de shCD154-His o shCD154-ILZ, o células D1.1 Jurkat con soluciones 4X de anticuerpos antiCD154 (en concentraciones apropiadas) en una proporción de 1:1 para producir soluciones 2X de CD154:anticuerpo. mezclas precomplejas. Las mezclas de anticuerpos CD 154: se incubaron a TA durante 1 hora, mientras que la mezcla de D1.1 JurkatmAb se incubó a 37 °C y CO2 al 5 % durante 1 hora. Al final del período de incubación del precomplejo, se añadieron 100 μl/pocillo de las soluciones del precomplejo 2X a la placa de ensayo de 96 pocillos que contenía células HEK-Blue™ CD40L; el volumen de ensayo final fue de 200 μl/pocillo con concentraciones finales de CD154 de 80 ng/ml de shCD154-His, o 40 ng/ml de shCD154-ILZ, o 2,5 - 6,0 x 104 D1.1 células Jurkat. Después de 16-24 h de tiempo de tratamiento (37 °C, 5 % CO2) se analizó la actividad de fosfatasa (SEAP) de los sobrenadantes midiendo la absorbancia (650 nm) de 40 μL/pocillo de sobrenadantes que se incubaron con 160 μl/pocillo de QUANTI-Blue™ (Invivogen) a 37 °C durante 30-60.
Ensayo de activación de células dendríticas mediada por células Jurkat
[0264] La capacidad de los anticuerpos anti-CD154 para inhibir la activación de DC mediada por células Jurkat se evaluó midiendo la producción reducida de varias citoquinas por las DC. Se cultivaron monocitos humanos (Biologic Specialties) con 50 ng/ml de IL-4 y GM-CSF durante seis días. Las células se repusieron con medio fresco (con IL-4 y GM-CSF) el día 3. Las DC inmaduras (iDC) (CD1 a+ CD14bajo CD83-) se usaron en ensayos celulares el día 6. 2,5 x 105 D1. 1 Se incubaron células Jurkat (irradiadas a 1000 rads) con 0,000064-25 μg/ml μg/ml de anticuerpos anti-CD154 durante 15-20 minutos y luego se cocultivaron con 2,5 x 104 iDC en un volumen final de 200 μl/pocillo en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Después de 48 horas de incubación, se recogieron los sobrenadantes para el análisis de citoquinas.
Ensayo de activación de células B mediada por células Jurkat
[0265] Se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-CD154 para inhibir la activación de células B mediada por células Jurkat evaluando el efecto de los anticuerpos sobre la proliferación de células B. Se cocultivaron 1 x105 células Jurkat D1.1 (irradiadas a 5000 rads) con 1 x105 células B de amígdalas humanas en presencia de IL-21 (100 ng/ml) y 0,0077 ng/ml- 15 μg/ml de anticuerpos anti-CD154 en un volumen final de 200 μl/pocillo en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Después de 2 días de incubación, se añadió metil (-3H)-timidina (0,5 μCi/pocillo) a los cultivos y se determinó la proliferación de células B humanas después de una incubación durante la noche.
Ensayo de activación de células B mediada por CD154
[0266] La capacidad de los anticuerpos anti-CD154 para inhibir la activación de células B mediada por CD154 recombinante se evaluó en células B humanas o de Cynomolgus. 1 x105 células B de amígdalas humanas o células de bazo de mono cangrejo se cultivaron con 100 ng/ml de rhIL-21, 0,5 μg/ml de shCD154-ILZ y 0,0077 ng/ml-15 μg/ml de anticuerpos anti-CD154 en un volumen final de 200 μl/pocillo en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Después de 2 días de incubación, se añadió metil (-3H)-timidina (0,5 μCi/pocillo) a los cultivos y se determinó la proliferación de células B humanas después de una incubación durante la noche.
Ejemplo 2. Aislamiento de anticuerpos anti-CD154 de bibliotecas de presentación en fagos
[0267] Se seleccionaron Fab de unión a CD154 de bibliotecas de presentación en fagos pIX de novo como se describe en Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010; Publ. Pat. Int. N.2 WO2009/085462; Publ. Pat. EE. UU. N.2 US2010/0021477). Brevemente, las bibliotecas se generaron mediante la diversificación de andamios humanos donde los genes VH de la línea germinal 1GHV1-69*01, IGHV3-23*01 e IGHV5-51*01 se recombinaron con el minigen IGHJ-4 humano a través del bucle H3 y el VLkappa de la línea germinal humana. Los genes 012 (IGKV1-39*01), L6 (IGKV3-11*01), A27 (IGKV3-20*01) y B3 (IGKV4-1*01) se recombinaron con el minigen IGKJ-1 para ensamblar VH completo y dominios VL. Las posiciones en las regiones variables de cadena pesada y ligera alrededor de los bucles H1, H2, L1, L2 y L3 correspondientes a posiciones identificadas para estar frecuentemente en contacto con antígenos proteicos y peptídicos se eligieron para diversificación. La diversidad de secuencias en las posiciones seleccionadas se limitó a los residuos que se encontraban en cada posición en las familias de genes de línea germinal IGHV o IGLV de los respectivos genes IGHV o IGLV. La diversidad en el bucle H3 se generó utilizando bucles sintéticos de tamaño corto a mediano de longitudes de 7-14 aminoácidos. La distribución de aminoácidos en H3 fue diseñada para imitar la variación observada de aminoácidos en anticuerpos humanos. El diseño de la biblioteca se detalla en Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010. Los andamios utilizados para generar bibliotecas se nombraron de acuerdo con su origen del gen de la línea germinal VH y VL humana. Las tres bibliotecas de cadenas pesadas se combinaron con las cuatro cadenas germinales ligeras o las bibliotecas de cadenas ligeras de la línea germinal para generar 12 combinaciones únicas de VH:VL para experimentos panorámicos contra smCD154 o células que expresan cyno CD154 de longitud completa.
[0268] Las bibliotecas se analizaron frente a cyno CD154 de longitud completa (SEQ ID NO: 3) expresado de manera estable en células CHO-s o smCD154 biotinilado y no biotinilado (SEQ ID NO: 5). Después de varias rondas de selección, se realizó un ELISA de fago policlonal usando smCD154 como antígenos para detectar el enriquecimiento específico de los experimentos de selección individuales. El fago recolectado de esos experimentos de paneo que demostraron un enriquecimiento para los aglutinantes de smCD154 fueron examinados adicionalmente con un Fab ELISA monoclonal en donde se usaron proteínas Fab expresadas a partir de clones individuales de Fab como aglutinantes para smCD154 no biotinilado revestido directamente sobre la placa. Los clones de Fab con una señal de unión cuatro veces mayor que los Fab de control negativo se seleccionaron para examinarlos en formato IgG completo. Los Fab seleccionados se clonaron en el esqueleto IgG2sigma/K appa y se caracterizaron adicionalmente usándolos para la unión a células Jurkat D1.1.
IgG2sigma es una Fc silenciosa y tiene sustituciones V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S en comparación con la IgG2 de tipo salvaje. IgG2sigma se describe en la patente de EE. UU. N.° 8.961.967.
Ejemplo 3. Generación de anticuerpos anti-CD154 en ratas
[0269] Se generaron anticuerpos anti-CD154 usando ratas transgénicas que expresaban loci de inmunoglobulina humana, el OmniRat®; OMT, Inc. Los loci endógenos de inmunoglobulina OmniRat® se reemplazan por locus de IgK e IgA humanos y un locus quimérico de IgH humano/rata con segmentos V, D y J de origen humano unidos al locus Ch de rata. El locus IgH contiene 22 Vh humanos, todos los segmentos D y Jh humanos en configuración natural unidos al locus Ch de rata. La generación y caracterización de OmniRat® se describe en Osborn, et al. J Immunol 190: 1481-1490, 2013; e Publ. Pat. Int. N.° WO2014/093908.
[0270] Se inmunizó OmniRat® con smCD154 mediante el protocolo de inmunización repetitiva en sitios múltiples (RIMMS). Después de un régimen de inmunización de 45 días, se recolectaron los ganglios linfáticos de las cuatro ratas y se usaron para generar hibridomas. Los sobrenadantes de hibridomas en placas de 96 pocillos se seleccionaron mediante ELISA de unión para identificar mAbs que exhibieron unión a smCD154, de los cuales se seleccionaron los sobrenadantes de hibridomas que exhibieron una señal de ensayo mayor que 3 veces el promedio del control negativo.
[0271] Los anticuerpos seleccionados se clonaron como IgG2sigma/A de longitud completa. Los anticuerpos que demostraron actividad antagonista en la activación de células Ramos inducida por CD154 se seleccionaron para una caracterización adicional.
Ejemplo 4. Caracterización de los anticuerpos
[0272] Se secuenciaron varios anticuerpos anti-CD154 obtenidos a partir de fagos o animales transgénicos que expresaban loci de inmunoglobulina humana que demostraron actividad antagónica como se describe en los Ejemplos 2 y 3 y se caracterizaron adicionalmente por su unión a células cino dendríticas y humanas. las células, por su capacidad para inhibir las funciones de células B y cino dendríticas y humanas, y por las funciones efectoras de anticuerpos. Las regiones VH y VL de los anticuerpos se secuenciaron usando métodos estándar.
[0273] Tabla 2 muestra las secuencias de aminoácidos de HCDR1 de anticuerpos seleccionados.
[0274] Tabla 3 muestra las secuencias de aminoácidos de HCDR2 de anticuerpos seleccionados.
[0275] Tabla 4 muestra las secuencias de aminoácidos de HCDR3 de anticuerpos seleccionados.
[0276] Tabla 5 muestra las secuencias de aminoácidos de LCDR1 de anticuerpos seleccionados.
[0277] Tabla 6 muestra las secuencias de aminoácidos de LCDR2 de anticuerpos seleccionados.
[0278] Tabla 7 muestra las secuencias de aminoácidos de LCDR3 de anticuerpos seleccionados.
[0279] Tabla 8 muestra las secuencias de aminoácidos de VH de anticuerpos seleccionados.
[0280] Tabla 9 muestra las secuencias de aminoácidos de VL de anticuerpos seleccionados.
Tabla 2.
Figure imgf000032_0001
Tabla 3.
Figure imgf000033_0003
Tabla 4.
Figure imgf000033_0002
Tabla 5.
Figure imgf000033_0001
Tabla 6.
Figure imgf000033_0005
Tabla 7.
Figure imgf000033_0004
Tabla 8.
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Tabla 9.
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[0281] Los anticuerpos inhibieron la función tanto del CD 154 endógeno proporcionado en células Jurkat (células Jurkat D1.1 en la Tabla 10) como del trímero de CD154 humano expresado de forma recombinante (expresado como shCD154 ILZ o shCD154-his) como medido usando el ensayo del gen reportero NF-kB SEAP. Los anticuerpos inhibieron la señalización con valores de CI50 que oscilaron entre 0,08 y 21,15 nM. Los valores CI50 para anticuerpos seleccionados en el ensayo se muestran en la Tabla 10. El rango de valores CI50 en la tabla para cada anticuerpo representa los valores CI50 más bajos y más altos obtenidos de experimentos separados, mientras que el valor singular indica que el anticuerpo fue probado en un experimento, o solo se disponía de un valor CI50 válido.
Tabla 10.
Figure imgf000036_0003
[0282] La capacidad de los anticuerpos para inhibir la activación de células dendríticas se evaluó utilizando la secreción de IL-12p40 como marcador para la activación de DC. Los anticuerpos inhibieron la activación de DC inducida por CD154 endógeno proporcionado en células Jurkat con valores de CI50 que oscilaban entre 0,02 y 0,49 nM. Tabla 11 muestra los valores de CI50 para anticuerpos seleccionados en el ensayo. El rango de CI50 en la Tabla representa el valor de CI50 más bajo y más alto obtenido en experimentos separados en 2-4 donantes con 1-6 repeticiones.
Tabla 11.
Figure imgf000036_0001
[0283] La capacidad de los anticuerpos para inhibir la activación de células B humanas o cino se midió utilizando la proliferación de células B como lectura. Los anticuerpos inhibieron la proliferación inducida tanto por CD154 endógeno (células D1.1 Jurkat) como por trímero de CD154 humano recombinante (shCD 154-ILZ) con valores de CI50 que oscilaban entre 0,01 y 5,35 nM. La Tabla 12 muestra los valores CI50 para diversos anticuerpos obtenidos en el ensayo de activación de células B humanas o cyno. El rango de CI50 en la tabla representa el valor de CI50 más bajo y más alto obtenido en experimentos separados en 2-4 donantes con 1-6 repeticiones. Un valor CI50 singular en la Tabla indica la disponibilidad de un valor CI50 válido.
Tabla 12.
Figure imgf000036_0002
Ejemplo 5. Ingeniería de anticuerpos para minimizar el riesgo de modificación postraduccional
[0284] La VL del anticuerpo C4LB89 contenía un sitio de desaminación putativo en LCDR2 (N52-S53 en la cadena ligera C4LL49, SEQ ID NO: 66). Las sustituciones se hicieron individualmente para cada posición (N52S y S53T) en el VL. Las cadenas ligeras mutadas se coexpresaron con la cadena pesada parental C4LH165 (SEQ ID NO: 59) para generar anticuerpos C4LB235 y C4LB236 como IgG2sigma/K. Las secuencias de aminoácidos de LCDR2 y VL de C4LB235 y C4LB236 se muestran en la Tabla 13 y la Tabla 14, respectivamente. C4LB235 comprende los HCDR de SEQ ID NO: 17, 23 y 30, los LCDR de SEQ ID NO 37, 49 y 52, el VH de SEQ ID NO: 59 y el VL de SEQ ID NO: 72. C4LB236 comprende los HCDR de SEQ ID NO: 17, 23 y 30, LCDR de SEQ ID NO: 37, 50 y 52, VH de SEQ ID NO: 59 y VL de SEQ ID NO: 73.
Tabla 13.
Figure imgf000037_0002
Tabla 14.
Figure imgf000037_0001
[0285] Se analizó la capacidad de ambos anticuerpos para inhibir la proliferación de células B cino. C4LB235 mostró una potencia similar a C4LB89, mientras que C4LB236 mostró una potencia reducida en comparación con C4LB89.
Ejemplo 6. Los anticuerpos anti-CD154 silenciosos efectores no inducen la activación plaquetaria
[0286] Se han desarrollado anticuerpos anti-CD154 en la clínica con resultados positivos en pacientes con enfermedades autoinmunes, sin embargo, debido a incidentes de tromboembolismo (TE), el desarrollo clínico adicional de los anticuerpos se detuvieron. El anticuerpo 5c8 humanizado (IgG1 /k) es un anticuerpo anti-CD154 que en la clínica indujo TE (Yazdany et al., Lupus 13:377-380, 2004). Se plantea la hipótesis de que el tromboembolismo (TE) mediado por 5c8 humanizado es el resultado de la activación y agregación plaquetaria a partir de la formación de inmunocomplejos (IC) anti-CD154/CD154 de alto orden que entrecruzan las plaquetas al unir Fc al receptor plaquetario FcyRIIa. El anticuerpo 5c8 diseñado in vitro con Fc silenciado (sustitución de D265A en IgG1) que carece de unión al receptor FcyRIIa no activó las plaquetas (Xie et al., J Immunol 192:4083-4092, 2014).
[0287] Los anticuerpos anti-CD154 con unión abolida a al menos FcyRIIa y que tienen funciones efectoras reducidas pueden ser más adecuados como agentes terapéuticos con un riesgo reducido de TE.
[0288] Con ese fin, se generaron anticuerpos anti-CD154 silenciosos efectores con varias sustituciones de Fc y se ensayó su efecto sobre la activación plaquetaria.
[0289] VH y VL del anticuerpo 5c8 humanizado (Karpusas et al., Estructura 9: 321-329, 2001) se clonaron como IgG1sigma/K, IgG1sigmaYTE/K, IgG2sigma/K o IgG2sigmaYTE/K para evaluar el efecto de la Fc sobre la activación plaquetaria; los anticuerpos resultantes se denominaron 5c8IgG1sigma, 5c8IgG1sigmaYTE, Sc8IgG2sigma y 5c8IgG2sigmaYTE). IgG1sigma contiene sustituciones L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S y P331S en comparación con la IgG1 de tipo salvaje. IgG1sigmaYTE contiene sustituciones L234A, L235A, G237A, P238S, M252Y, S254T, T256E H268A, A330S y P331S. IgG2sigma contiene sustituciones V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S. IgG2sigmaYTE contiene sustituciones V234A, G237A, P238S, M252Y, S254T, T256E, H268A, V309L, A330S y P331S. La numeración de residuos es de acuerdo con el índice de la UE. Los anticuerpos con el esqueleto IgG2sigma carecen de funciones efectoras y de unión a FcyR como se describe en la patente de EE. UU. N.° 8.961.967. La sustitución YTE (M252Y, S254T, T256E) se describe en Dall'Acqua et al., J Biol Chem 281:23514-24, 2006.
[0290] Los dominios VH y VL del 5c8 humanizado se muestran en SEQ ID NO: 74 y 75, respectivamente.
SEQ ID NO: 74
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SEQ ID NO: 75
[0291] Se ensayaron 5c8IgG1sigma, 5c8IgG1sigmaYTE, 5c8IgG2sigma y Sc8IgG2sigmaYTE para determinar su efecto sobre la activación plaquetaria.
[0292] Se usó sangre de donantes humanos sanos, preseleccionada para baja respuesta a shCD154 solo. La activación plaquetaria se evaluó mediante citometría de flujo utilizando marcadores de activación plaquetaria validados PAC-1 (GPIIb/IIla activado) y CD62p (selectina P). Brevemente, se añadió sangre entera (WB) a tampón Tyrodes-HEPES modificado que contenía CaCl 2 1 mM, y se añadieron anticuerpos anti-PAC 1 y anti-CD62p con o sin anticuerpo bloqueador de FcyRIIa (clon IV.3, StemCell Technologies #60012) a la mezcla y se incubó durante 25 minutos. Se añadieron a la mezcla inmunocomplejos preformados de CD154 soluble (PeproTech, n° de cat. 310-02; SEQ ID NO: 4 o Tonbo Biosciences, n° de cat. 21 -7088)/anticuerpo en una proporción molar de 3:1 CD154:antiCD154 y incubado durante otros 20 minutos; las plaquetas se fijaron en formalina al 1 % seguido de análisis FACS. La activación plaquetaria para cada condición se evaluó como % de plaquetas seleccionadas (eventos positivos para CD61) que expresan PAC-1 y CD62p; Se capturaron y analizaron 5000 eventos de expresión de CD61 (plaquetas) para cada condición de tratamiento. Los resultados del experimento se muestran en la Figura 1. CD154/5c8IgG1 (IgG1 de tipo salvaje) IC activó las plaquetas, mientras que CD154 IC con 5c8-IgG1sigma, 5c8IgG1sigmaYTE, Sc8IgG2sigma y 5c8IgG2sigma-YTE no activó las plaquetas. La activación plaquetaria con ADP no fue inhibida por los inmunocomplejos (datos no mostrados). Ninguno de los anticuerpos solo activó las plaquetas (datos no mostrados).
[0293] Los anticuerpos anti-CD154 C4LB5, C4LB89, C4LB94, C4LB150, C4LB189, C4LB191, C4LB199 (todos los mAb silenciosos efectores IgG2sigma) también se analizaron en un ensayo de activación de plaquetas para confirmar que los anticuerpos habían eliminado la unión a FcyRIIa y no activaban las plaquetas. La Figura 2 muestra los resultados del experimento, demostrando que los inmunocomplejos de CD154 en complejo con C4LB5, C4LB89, C4LB150, C4LB189, C4LB191 o C4LB199 no lograron activar las plaquetas. CD154/ C4LB94 IC indujo PAC-1 en plaquetas. Los resultados demuestran que los anticuerpos anti-CD154 con isotipos IgG1sigma, IgG1sigmaYTE, IgG2sigma o IgG2sigmaYTE en general pueden no activar las plaquetas y, por lo tanto, pueden tener un perfil de seguridad mejorado sobre los anticuerpos en IgG1 de tipo salvaje.
Ejemplo 7. Efecto del cambio de isotipo sobre las propiedades del anticuerpo
[0294] Se clonaron regiones variables del anticuerpo C4LB89 como isotipos IgG1sigma/K e IgG1sigmaYTE para evaluar posibles diferencias en funcionalidad y capacidad de desarrollo. Los nuevos anticuerpos se denominaron C4LB231 (IgG1sigma) y C4LB232 (IgG1sigmaYTE).
[0295] Los anticuerpos IgG1sigma e IgG1sigmaYTE resultantes se compararon con el anticuerpo original en su funcionalidad. C4LB231 y C4LB232 fueron comparables en función al C4LB89 original. Tabla 15 muestra los valores de CI50 o un rango de valores de CI50 para cada anticuerpo en los ensayos funcionales como se indica en la Tabla. El rango de CI50 en la tabla representa el valor de CI50 más bajo y más alto obtenido en experimentos con 2 a 4 donantes con 1 a 6 repeticiones. Un valor singular de CI50 en la tabla indica la disponibilidad de un valor válido de CI50.
Tabla 15.
Figure imgf000039_0001
[0296] C4LB231 y C4LB232 también se probaron para determinar su efecto sobre las plaquetas. Ni los circuitos integrados shCül54:C4LB231 ni shCD154:C4LB232 activaron las plaquetas sobre la línea de base. CD154/Sc8IgG1 IC activó las plaquetas, y la activación se bloqueó en presencia de IV.3, lo que demuestra que la activación de las plaquetas estuvo mediada por la unión de IC a FcyRIIa. Figura 3 muestra los resultados del experimento.
Ejemplo 8. Los anticuerpos anti-CD154 se unen a CD154 humano con alta afinidad
[0297] Las mediciones de afinidad se realizaron usando ProteOn como se describe en el Ejemplo 1. La tasa de activación, la tasa de desactivación y la afinidad se muestran en la Tabla 16. Los parámetros informados en esta tabla se obtuvieron a partir de un modelo de unión de Langmuir 1:1 para todas las muestras, excepto C4LB94 y C4LB150 que se ajustaron al modelo de unión de dos estados.
Tabla 16.
Figure imgf000039_0002
Ejemplo 9. Estructura cristalina de t it í CD154 en complejo con C4LB89
[0298] El epítopo del anticuerpo C4LB89 se identificó usando cristalografía de rayos X. El fragmento Fab marcado con His de C4LB89 y la forma soluble marcada con His de tití CD40L (smCD154-his) se expresaron en células HEK293 GnTI y se purificaron mediante cromatografía de exclusión por afinidad y tamaño. El complejo smCD154:C4LB89 se incubó durante la noche a 4 °C, se concentró y se separó de las especies no complejadas mediante cromatografía de exclusión por tamaño. El complejo se cristalizó por el método de difusión de vapor a partir de una solución que contenía 16 % de PEG 3350, citrato de amonio 0,2 M, MES 0,1 M, pH 6,5. Los cristales pertenecen al grupo espacial cúbico P2 1 x con dimensiones de célula unitaria de 162.1 Á. La estructura del complejo se determinó mediante el método de reemplazo molecular utilizando las estructuras cristalinas de C4LB89 Fab y CD40L (entrada 1ALY de PDB) como modelos de búsqueda.
[0299] El complejo smCD154:C4LB89 es un trímero simétrico asentado en el eje cristalográfico de 3 pliegues. C4LB89 se une a mCD154 en la interfaz entre dos subunidades en el epítopo distal de la superficie celular. El epítopo incluye 16 residuos, 8 de cada una de las dos subunidades de CD154. Los residuos del epítopo son E182, S185, Q186, A187, P188, S214, A215 y R207 en la primera subunidad CD154 y T176, F177, C178, Q220, S248, H249, G250 y F253 en la segunda subunidad CD154. La numeración de los residuos del epítopo es según el CD154 humano de longitud completa de SEQ ID NO: 1. El paratopo se define como residuos de anticuerpo dentro de 4 Á de los residuos de CD154. El paratopo C4LB89 incluye 9 residuos de la cadena pesada de C4LB89: S31 e Y32 de HCDR1, S52, 154, F55 y N57 de HCDR2 y R100, Y101 e Y102 de HCDR3. La numeración de residuos de paratopo es según C4LB89 VH de SEQ ID NO: 59. La cadena ligera no está involucrada en contactos con mCD154. Según el número de contactos, F55 en HCDR2 es un elemento clave de reconocimiento de antígenos. F55 hace contacto con los residuos de CD154 T176, F177, C178, Q220, S248, H249, G250 y F253. Los residuos de HCDR3 Y101 e Y102 también contribuyen a la unión. Figura 4 muestra los residuos de contacto de HCDR2 y HCDR3 y la falta de unión de la LC a CD154. Figura 5 muestra una caricatura de los residuos de epítopo y paratopo.
[0300] Las proteínas CD154 solubles humanas y de tití difieren únicamente en 8 residuos de aminoácidos. Todos los residuos del epítopo mCD154 C4LB89 están conservados en humanos. Por lo tanto, se espera que el epítopo se conserve entre el tití y el CD 154 humano. La alineación de las proteínas CD154 humanas y de tití de longitud completa se muestra en la Figura 6.
Ejemplo 10. La activación de plaquetas por anticuerpos anti-CD154 depende del epítopo
[0301] Las regiones variables de C4LB89 (VH de SEQ ID NO: 59 y VL de SEQ ID NO: 66) se clonaron como IgG1/K, dando como resultado el anticuerpo C4LB237. Se confirmó que C4LB237 retenía la unión de CD154 humano (Tabla 17) según se midió usando ProteOn como se describe en el Ejemplo 1. La afinidad de C4LB237 por CD154 humano fue de 23,6 ± 5,4 μM. El cambio de isotipo de VH/VL derivado de C4LB89 de IgG2sigma a IgG1 pareció cambiar la afinidad de unión del anticuerpo resultante.
[0302] Como se esperaba, C4LB237 se unió a FcyRIIa y FcyRIIIa humanos con una Kd de 0,994 μM y 0,146 μM, respectivamente. C4LB237 mostró una potencia comparable a la de C4LB231 y una potencia superior a la de C4LB89 en el ensayo del gen informador NF-kB SEAP cuando se usó shCD154-his para inducir la señalización (Tabla 18).
[0303] Se probó C4LB237 por su efecto sobre la activación de plaquetas. Los CI shCD154:C4LB237 no activaron las plaquetas sobre la línea de base, como se muestra en la Figura 7. Este resultado sugiere que, además de la Fc, el epítopo del anticuerpo contribuye a la capacidad o incapacidad del anticuerpo para activar las plaquetas.
Tabla 17.
Figure imgf000040_0001
Tabla 18.
Figure imgf000040_0002
Ejemplo 11. Ingeniería de mutaciones neutras en C4LB89
[0304] Los análisis de la estructura cristalina de C4LB89 en complejo con CD 154 revelaron posiciones en las CDR de C4LB89 que pueden mutarse sin afectar la estructura general del complejo y que, por lo tanto, se espera que no afecten propiedades del anticuerpo C4LB89. Estas mutaciones neutras en las CDR de cadena ligera se enumeran en la Tabla 19 y en la CDRS de cadena pesada en la Tabla 20. La numeración de los residuos que se pueden mutar se muestra tanto en las CDR individuales como en la VL o la VH. Por ejemplo, el residuo Q4 en LCDR1 de SEQ ID NO: 37 (RASQSISSYLN) puede mutarse a A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W o Y con la expectativa de que las características del anticuerpo no cambien sustancialmente. El resto correspondiente en la VL de SEQ ID NO: 66 es Q27.
[0305] Las mutaciones que se muestran en la Tabla 19 o la Tabla 20 se realizan individualmente o en combinación en C4LB89 usando métodos estándar. Los pares VH/VL resultantes se expresan y los anticuerpos mutados se aíslan y caracterizan usando los métodos descritos en este documento.
Tabla 19.
Figure imgf000041_0001
Tabla 20.
Figure imgf000041_0002
Ejemplo 12. Evaluación de la activación plaquetaria y formación de inmunocomplejos de orden superior [0306] Tras la evaluación de los datos de la estructura cristalina para la región Fab y el complejo shCD154 para C4LB231 y 5C8IgG1 experimentos anteriores con SC-HPLC y DLS así como revisión de los datos de activación plaquetaria, se planteó la hipótesis de que las ligeras diferencias en la unión de los anticuerpos anti-CD154 con el trímero shCD154 pueden facilitar la formación de complejos inmunitarios de orden superior: 1) el Fab C4LB231 se une entre 2 subunidades del trímero sCD154 mientras que el Fab 5C8 se une a 1 subunidad de sCD154, 2) el Fab C4LB231 parece ser más rígido en esta conformación que el Fab 5c83) y el ángulo de unión del anticuerpo anti-CD154 con sCD154.
[0307] Con el fin de evaluar más a fondo el papel del epítopo del anticuerpo que media en la activación plaquetaria y la formación de complejos inmunitarios de orden superior con shCD154, la VH y la VL de varios anticuerpos anti-CD154 se clonaron y expresaron como isotipos IgG2sigma e IgG1sigma silenciosos Fc o como IgG1. Los anticuerpos generados se muestran en la Tabla 21. Los ensayos de activación de plaquetas se realizaron como se describe en el Ejemplo 6. Para las evaluaciones de formación de inmunocomplejos de orden superior a través de cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC) y dispersión de luz dinámica (DLS), los anticuerpos se acomplejaron con shCD154 en proporciones molares de 1:1 (también conocido como 10:10) y 10:1 para evaluar si había diferencias dependientes de la concentración en la formación de complejos inmunitarios.
Tabla 21.
Figure imgf000042_0003
SEQ ID NO: 84 VH de C4LB119
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYYISWVRQAPGQGLEWMGAIDPYF
GYANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTGLNYGGFDYW
GQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 85 VL de C4LB119 SEQ ID NO: 86 VH de C4LB83
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATG
1PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 87 VL de C4LB83
Figure imgf000042_0001
[0308] Las características de unión y la funcionalidad de C4LB83 y C4LB119 se evaluaron usando los protocolos descritos en el Ejemplo 1 y se muestran en la Tabla 22.
Table 22.
Figure imgf000042_0002
Métodos
SE-HPLC
[0309] Inmunocomplejos de anticuerpos que se muestra en la Tabla 21 y shCD154 marcado con Alexafluo-448 se prepararon en una proporción molar de anticuerpo:shCD154 de 1:1 y 10:1 en 110 μL de 1xPBS y se incubaron a 37 °C durante 30 min. Se inyectaron 100 μL de cada muestra en la columna (Agilent, sistema 1100/1200) para cada ejecución, que contenía 5 μg de AF488 marcado con shCD154 y 15 μg (proporción 1:1), o 150 μg (10:1 proporción) de mAb anti-CD154. El peso molecular se calculó en base al tiempo de retención de los estándares (Bio-Rad). La relación entre el peso molecular y el tiempo de retención de la proteína satisface la ecuación:
Figure imgf000043_0001
donde M es el peso molecular, T es el tiempo de retención y b y c son constantes. Se obtuvo una curva lineal de log(M) y T a partir del cromatograma SE-HPLC estándar mediante ajuste por mínimos cuadrados, con R2 = 0,9928.
DLS
[0310] La medición de DLS se basa en principios de dispersión de luz y movimiento molecular o browniano. El movimiento browniano, un comportamiento típico de las moléculas en solución, hace que la luz dispersada esté tanto dentro como fuera de fase, lo que da como resultado interferencias constructivas y destructivas. El resultado es que la intensidad de la luz dispersada fluctúa con el tiempo. Durante el análisis DLS o QELS (dispersión de luz cuasi eléctrica), esta fluctuación dependiente del tiempo en la intensidad de la luz dispersada es capturada por un contador de fotones rápido. Las fluctuaciones son directamente proporcionales a la velocidad de difusión. La resolución de los datos de correlación utilizando la ecuación de Stokes-Einstein produce el radio hidrodinámico. A diferencia de SEC-MALS, o SEC, donde la resolución de la muestra puede distinguir entre monómero y dímero, DLS solo puede resolver especies que están separadas por un factor de tamaño de ~4, por lo tanto, el monómero y el tetrámero comenzarán a resolverse; sin embargo, monómero a dímero no lo hará, pero informará un promedio ponderado de la mezcla.
Ecuación de Stokes-Einstein: Rh = kT/6nr|D; donde
D = coeficiente de difusión,
k = constante de Boltzmann
T = temperatura
r| = viscosidad
[0311] Se prepararon anticuerpos solos a 10 μm o inmunocomplejos de anticuerpos que se muestran en la Tabla 21 y shCDl54 a concentraciones molares de anticuerpo 10:1 o 10:10:shCD154 (anticuerpo 10 μM con shCD154 1 μM o 10 μM) en PBS. Todas las muestras se prepararon en viales de vidrio con insertos de viales (vidrio desactivado de 250 μl con pies de polímero, Agilent Cat N.° 5181-8872), y se agregaron muestras en el siguiente orden: PBS, mAb, shCD154. Las muestras se mezclaron con un vórtex suave y luego se incubaron a TA, con balanceo (Mezclador Nutating (VWR) ~30 rev/min durante aproximadamente 23 h. Si era necesario, los anticuerpos primero se concentraron usando métodos estándar.
[0312] Tamaños de partículas y distribución de especies en todos las muestras se determinaron en un instrumento DynaPro Plate Reader DLS (Wyatt Technologies Corporation) a 23 °C. La consistencia de DLS se validó primero usando BSA (datos no mostrados). Las mediciones se realizaron introduciendo 30 ml de muestra en cada uno de los 3 pocillos para (mediciones por triplicado). Las mediciones DLS se adquirieron en un lector de placas DynaPro. Se realizaron veinte adquisiciones de 5 segundos en cada muestra, y el instrumento ajustó automáticamente la potencia del láser. Los parámetros utilizados para el análisis de datos incluyeron una viscosidad a 23 °C para PBS de 1,019 cP y un valor de índice de refracción a 589 nm y 23 °C para PBS de 1,333. El programa utilizó un modelo de proteína globular. Las señales se dividieron en picos, donde Pico1 fue 0,1-10 nm, Pico2 fue 10-100 nm, Pico3 fue 100-1000 nm y Pico4 fue 1000-5000 nm. Se observaron los precipitados visibles (si se formaron) en la muestra. El análisis de datos se realizó utilizando el software Dynamics (Wyatt Technology Inc.). Se generaron gráficos de porcentaje de masa frente a radio de especie (Rh). Se calcularon y registraron el radio máximo, la polidispersidad, el porcentaje de masa y el porcentaje de intensidad.
Resultados
Activación de plaquetas
[0313] Se evaluó la capacidad de los inmunocomplejos de shCD 154 y anticuerpos expresados como Fc silent IgG2sigma o IgG1sigma, o como IgG1 de tipo salvaje para activar plaquetas. El anticuerpo 5c8 clonado en varios andamios de IgG se usó como control. La Figura 3 muestra que los inmunocomplejos 5c8IgG1 :shCD154 activaron las plaquetas de manera dependiente de FcyRIIa, ya que un anticuerpo anti-FcyRIIa inhibía la activación plaquetaria mediada por 5c8IgG1. Las regiones 5c8 VH/VL clonadas en Fc silencioso efector, IgG1sigma o IgG2sigma perdieron su capacidad para activar plaquetas (Figura 1). Estos resultados son consistentes con lo descrito anteriormente. Sin embargo, inesperadamente, los experimentos realizados en el Ejemplo 10 demostraron que los inmunocomplejos con el anticuerpo IgG1 de tipo salvaje (C4LBB237:shCD154) no activaron las plaquetas (Figura 7), lo que provocó más estudios sobre la posible dependencia del epítopo de la activación plaquetaria.
[0314] Las regiones VH/VL de 4 anticuerpos distintos se clonaron como IgG2sigma, IgG1sigma o IgG1 de tipo salvaje para evaluar el efecto del epítopo y/o Fc en la activación de plaquetas así como en la formación de inmunocomplejos de orden superior. Contrariamente a lo que se ha descrito anteriormente en la literatura, se encontró que la activación plaquetaria estaba mediada en algunos casos por el epítopo del anticuerpo independientemente del entrecruzamiento mediado por FcyRIIa.
[0315] La Figura 8A , la Figura 8B y la Figura 8C muestran el resumen de los análisis. Los inmunocomplejos de anticuerpos silenciosos Fc C4LB119 (Figura 8A) y C4LB94 (Figura 8B) activaron las plaquetas de manera independiente de FcyRIIa, ya que el bloqueo previo con un anticuerpo anti-FcyRIIa no logró inhibir la activación de las plaquetas. IC de C4LB83, también un anticuerpo silencioso Fc, plaquetas moderadamente activadas (Figura 8C). IC de anticuerpos con dominios VH/VL idénticos clonados en IgG1 de tipo salvaje en cada caso activó plaquetas en forma mediada por FcyRIIa (C4LB278 en la Figura 8A, C4LB289 en la Figura 8B y C4LB288 en la Figura 8C). Por lo tanto, se identificaron varios anticuerpos que mediaban en la activación plaquetaria a pesar de tener una Fc silenciosa. Se identificó un par de dominios VH/VL que no mediaba en la activación de plaquetas en IgG1 silenciosa (C4LB231) ni de tipo salvaje (C4LB237). Estos datos demuestran que el epítopo del anticuerpo desempeña un papel en la mediación de la agregación plaquetaria.
Formación de inmunocomplejos de orden superior
[0316] Se usaron SE-HPLC y DLS para evaluar adicionalmente la presencia de formación de complejos inmunitarios de orden superior y el tamaño aproximado de estos complejos inmunitarios entre los anticuerpos anti-CD154 mostrados en la Tabla 21 y shCD154. Como shCD154 es un trímero en solución, la estequiometría esperada del trímero anticuerpo:shCD154 en solución es 3:1. Para SE-HPLC, los inmunocomplejos más pesados y, por lo tanto, más grandes tendrían tiempos de retención más cortos, mientras que los inmunocomplejos más livianos y, por lo tanto, más pequeños tendrían tiempos de retención más largos, con la excepción de los inmunocomplejos muy grandes que no pueden eluirse de la columna y se evidencian por baja % recuperación. Para DLS, cuanto mayor sea el valor del radio (Rh), mayor será el complejo inmunitario. Las técnicas de placa DLS no pueden resolver los monómeros, dímeros, trímeros y tetrámeros de IgG. Por lo tanto, los valores de Rh obtenidos serán un promedio ponderado de monómero - tetrámero, por lo tanto, los valores de Rh que están más cerca de 6,5 podrían representar soluciones de mAb que contienen especies de orden superior, típicamente dímero. Cuando la unión de mAb a shCD154 es estequiométrica, pueden estar presentes dos especies: el complejo 3:1 (~500 kDa) y el anticuerpo no unido (~ 150 kDa) que corresponde a valores de Rh de ~8,8 nm y 5-6,5 nm para el 3: 1 mAb complejo y libre respectivamente. Ninguna técnica puede determinar exactamente el peso molecular de los inmunocomplejos, pero puede permitir tamaños comparativos. La Tabla 23 muestra la relación del tiempo de retención y los radios hidrodinámicos con los pesos moleculares aproximados.
Tabla 23.
Figure imgf000044_0001
DLS
[0317] Se evaluaron los mAb en ausencia de CD154 y los tamaños del complejo inmune anticuerpo:shCD154 en condiciones en las que se formaron complejos anticuerpo:shCD154 por encima del anticuerpo (proporción molar 10:1) y en una concentración equivalente (relación molar 1:1). En las condiciones en las que el anticuerpo está en exceso, el anticuerpo normalmente satura los sitios CD154 para formar el complejo inmunitario y hay un exceso de anticuerpo no unido. A una concentración equivalente, no hay presente ningún anticuerpo libre ni shCD154 libre. Los valores de Rh obtenidos para cada mAb en ausencia de sh CD154 y en presencia de sh CD154 en proporciones molares de 10:1 y 10:10 se muestran en la Tabla 24.
[0318] Un mAb típico con un PM nominal de 150 kDa produce un valor Rh de 5,0-6,5 nm. Los dímeros de IgG, que a menudo se observan durante la cromatografía de exclusión por tamaño, no se pueden resolver mediante técnicas DLS en placa. Los valores de Rh obtenidos serán un promedio ponderado de monómero - tetrámero, por lo tanto, los valores de Rh más cercanos a 6,5 podrían representar soluciones de mAb que contienen especies de orden superior, típicamente dímero.
[0319] Para mAb en ausencia de CD154, se observaron valores de Rh esperados de 5,5-6,3 nm para todos los mAb excepto C4LB287 y C4LB234, con valores de Rh de 6,9 y 7,1 nm, respectivamente, lo que sugiere que estos anticuerpos tienen una agregación inherente tendencias.
[0320] Los valores de Rh para los complejos anticuerpo:shCD154 formados en una proporción de 10:1 fueron generalmente inferiores a aproximadamente 8,8 nm, lo que indica el complejo estequiométrico 3:1 sin formación de inmunocomplejos de orden superior, excepto para 5c8IgG2sigma (C4LB71) y C4LB234 (valores de Rh 8,9 y 9,3 nm respectivamente), lo que indica que se formaron inmunocomplejos de orden superior.
[0321] El aumento de la concentración de shCD154 a 10 mM dio como resultado inmunocomplejos de anticuerpo:shCD154 con Rh elevado en comparación con los complejos con 1 mM de CD 154 (proporción de anticuerpo:CD154 10:1). Algunos de los complejos anticuerpo:shCD154 demostraron heterogeneidad con especies secundarias de alto peso molecular presentes que oscilaban entre el 7 y el 25 % de la masa total. Los valores de C4LB71, 5C8IgG1, C4LB89, C4LB119, C4LB94, C4LB234 y C4LB289 IC Rh fueron 22,1, 615, 56,3, 45,0, 18,3, 18,7 y 19,6 nm respectivamente. Además, C4LB89, C4LB119, C4LB83, C4LB228 también formaron especies de 900-4000 nm, y C4LB89 y C4LB119 formaron precipitados que indicaban inmunocomplejos muy grandes. Las especies cercanas a los 12 nm Rh normalmente corresponden a una masa de -1000 kDa, por lo que estos mAb forman inmunocomplejos muy grandes con CD154 en estas condiciones.
Tabla 24.
Figure imgf000045_0001
SE-HPLC
[0322] La Tabla 25 muestra el tiempo de retención, la tasa de recuperación y el peso molecular estimado (MW) de los anticuerpos anti-CD154 solos y en inmunocomplejos con shCD154 obtenidos de los análisis de SE-HPLC. Un anticuerpo típico tiene un PM de aproximadamente 150 Kd y el trímero shCD154 tiene un PM de aproximadamente 50 kDa. Por lo tanto, un complejo de trímero mAb:shCD154 con estequiometría 3:1 tiene un PM esperado de aproximadamente 500 kDa.
Tabla 25.
Figure imgf000046_0001
[0323] Todos los anticuerpos formaron un inmunocomplejo con shCD154. C4LB231, C4LB237, C4LB290, C4LB287 (todos IgG1sigma) formaron un complejo inmunitario con sCD154 y eluyeron a los 7,0 min; sin embargo, C4LB290 y C4LB287 tuvieron un porcentaje de recuperación más bajo en la condición 1:1 en comparación con la condición 10:1, mientras que C4LB231 y C4LB237 tuvieron un porcentaje más alto recuperaciones (> 80 %). C4LB289 (IgG1), C4LB234 (IgG1sigma), 5c8IgG1sigma (C4LB71) y C4LBB94 (IgG2sigma) eluyeron antes a los 6,2 a 6,5 min, lo que indica que se formaron complejos más grandes que con los mAbs antes mencionados. Sc8IgG1 tuvo un pico amplio en el tiempo de retención esperado para el complejo inmunitario trímero 3:1 mAb:shCD154, sin embargo, el pico amplio y la recuperación más baja (56 % en la condición 1:1) indicaron que se pueden haber formado complejos inmunitarios de orden superior que pueden han interactuado o no han entrado en la columna. C4LB89 y C4LB119 (ambos IgG2sigma) formaron un complejo con shCD154 y eluyeron con un pico amplio y una recuperación muy baja (6-17 % en la condición 1:1), probablemente debido a la formación de grandes complejos que no entraron en la columna. En general, los anticuerpos sobre los isotipos IgG2sigma formaron complejos inmunitarios más grandes en comparación con los anticuerpos sobre IgG1sigma o IgG1.
[0324] La Tabla 26 muestra un resumen de las características de los anticuerpos. En general, los datos de activación de plaquetas, los datos de SE-HPLC y DLS juntos indican que la activación de plaquetas no se atribuye completamente a una Fc activa. Los datos indican que los anticuerpos con Fc silencioso, como IgG1sigma e IgG2sigma, son capaces de formar complejos inmunitarios de mayor tamaño que el complejo trímero shCD154 3:1 mAb esperado y que algunos anticuerpos con Fc silencioso son capaces de activar plaquetas. Los datos respaldan la conclusión de que tanto los dominios VH/VL (p. ej., el epítopo al que se une el anticuerpo) como la formación de complejos inmunitarios de orden superior contribuyen a la activación plaquetaria.
Tabla 26.
Figure imgf000047_0001

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo antagonista aislado o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al CD154 humano de SEQ ID NO:1, que comprende un HCDR1 de SEQ ID NO: 17 (Sy G iS), un HCDR2 de SEQ ID NO: 23 (WISPIFGNTNYAQKFQG), un HCDR3 de SEQ ID NO: 30 (SRYYGDLDY), un LCDR1 de SEQ ID NO: 37 (RASQSISSYLN), un LCDR2 de SEQ ID NO: 44 (YANSLQS), SEQ ID NO: 49 (YASSLQS), o SEQ ID NO: 50 (YANTLQS), y un LCDR3 de SEQ ID NO: 52 (QQSDSIPWT).
2. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende el HCDR1 de SEQ ID NO: 17 (SYGIS), el HCDR2 de SEQ ID NO: 23 (WISPIFGNTNYAQKFQG), el HCDR3 de SEQ ID NO: 30 (SRYYGDLDY), el LCDR1 de SEQ ID NO: 37 (RASQSISSYLN), el LCDR2 de SEQ ID NO: 44 (YANSLQS) y el LCDR3 de SEQ ID NO: 52 (QQSDSIPWT).
3. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende el HCDR1 de SEQ ID NO: 17 (SYGIS), el HCDR2 de SEQ ID NO: 23 (WISPIFGNTNYAQKFQG), el HCDR3 de SEQ ID NO: 30 (SRYYGDLDY), el LCDR1 de SEQ ID NO: 37 (RASQSISSYLN), el LCDR2 de SEQ ID NO: 49 (YASSLQS) y el LCDR3 de SEQ ID NO: 52 (QQSDSIPWT).
4. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende el HCDR1 de SEQ ID NO: 17 (SYGIS), el HCDR2 de SEQ ID NO: 23 (WISPIFGNTNYAQKFQG), el HCDR3 de SEQ ID NO: 30 (SRYYGDLDY), el LCDR1 de SEQ ID NO: 37 (RASQSISSYLN), el LCDR2 de SEQ ID NO: 50 (YANTLQS) y el LCDR3 de SEQ ID NO: 52 (QQSDSIPWT).
5. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo tiene al menos una de las siguientes propiedades:
a) un complejo inmune del anticuerpo y CD154 humano soluble (shCD154) no activa las plaquetas, en donde la activación de las plaquetas se mide mediante la expresión superficial de P-selectina en las plaquetas;
b) se une a CD154 con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 5 x 10-9 M o menos, cuando la Kd se mide utilizando el sistema ProteOnXPR36 a 25 °C en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contiene polisorbato P20 al 0,03 % y 100 μg/ml de albúmina de suero bovino;
c) inhibe la proliferación de células B humanas mediada por CD154 con un valor CI50 de aproximadamente 2,7 x 10-9 M o menos; o
d) inhibe la expresión mediada por CD154 de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el promotor mínimo de interferón-p (IFN-p) enlazable a NF-kB en células HEK293 que expresan de forma estable SEAP y CD40 humano con un valor CI50 de aproximadamente 2,1 x 10-8 M o menos.
6. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 59, comprendiendo opcionalmente la VH uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones de aminoácidos, y una región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 66, 72 o 73, comprendiendo opcionalmente la VL uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones de aminoácidos, opcionalmente de modo que el anticuerpo comprenda
a) la VH de SEQ ID NO: 59 y la VL de SEQ ID NO: 66;
b) la VH de SEQ ID NO: 59 y el VL de SEQ ID NO: 72; o
c) la VH de SEQ ID NO: 59 y la VL de SEQ ID NO: 73.
7. El anticuerpo o la parte de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el anticuerpo es IgG 1, IgG2, IgG3 o isotipo IgG4, que comprende opcionalmente al menos una sustitución en una región Fc, preferentemente,
a) la al menos una sustitución en la región Fc es una sustitución L234A, L235A, G237A, P238S, M252Y, S254T, T256E, H268A, A330S o P331S, donde la numeración de los residuos es según el índice UE, opcionalmente de manera que el anticuerpo comprende sustituciones L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S o P331S en la región Fc, donde la numeración de los residuos es según el índice UE;
b) la al menos una sustitución en la región Fc es una sustitución V234A, G237A, P238S, M252Y, S254T, T256E, H268A, V309L, A330S o P331S, en la que la numeración de residuos está de acuerdo con el índice UE, opcionalmente tal que el anticuerpo comprende sustituciones V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S y P331S en la región Fc, en las que la numeración de los residuos es según el índice UE; o
c) el anticuerpo comprende una cadena pesada (HC) y una cadena ligera (LC) de SEQ ID NO:
i) 80 y 81, respectivamente;
ii) 82 y 81, respectivamente; o
iii) 83 y 81, respectivamente.
8. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo es multiespecífico.
9. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende
a) el HCDR1, el HCDR2, el HCDR3, el LCDR1, el LCDR2 y el LCDR3 de SEQ ID NO: 17, 23, 30, 37, 44 y 52, respectivamente;
b) el VH de SEQ ID NO: 59 y el VL de SEQ ID NO: 66; o
c) la cadena pesada de SeQ ID NO: 80 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 81.
10. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo o la parte de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 unido a un agente terapéutico o un agente de formación de imágenes.
11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o la parte de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el inmunoconjugado de la reivindicación 10 y un vehículo farmacéuticamente aceptado.
12. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo o la parte de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, preferiblemente un polinucleótido:
(i) que codifica la secuencia de aminoácidos VH del anticuerpo de SEQ ID NO: 59 y las secuencias de aminoácidos VL del anticuerpo seleccionadas de el grupo que consta de SEQ ID NO: 66, 72 y 73; o
(ii) que comprende la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 76 y 77.
13. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 12.
14. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 13.
15. Un método para producir un anticuerpo antagonista aislado o una parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD154 de SEQ ID NO:1, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 14 en condiciones en las que se expresa el anticuerpo y recuperar el anticuerpo producido por la célula huésped.
16. Una composición que comprende el anticuerpo aislado o la parte de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el inmunoconjugado de la reivindicación 10, o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para uso en terapia, como en el tratamiento de una enfermedad autoinmune o una enfermedad inflamatoria mediada por el sistema inmunitario, en donde se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado o la composición farmacéutica a un paciente que lo necesita durante un tiempo suficiente para tratar la enfermedad autoinmune o la enfermedad inflamatoria mediada por el sistema inmunitario, opcionalmente en donde:
a) la enfermedad inflamatoria mediada o la enfermedad autoinmune es artritis, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad inflamatoria intestinal, trasplante, trasplante de riñón, trasplante de piel, trasplante de médula ósea, enfermedad de injerto contra huésped (EICH), trombocitopenia inmunitaria (TPI), esclerosis múltiple, tiroiditis, diabetes de tipo I o aterosclerosis, en la que además opcionalmente la artritis es artritis reumatoide, artritis juvenil, artritis psoriásica, síndrome de Reiter, espondilitis anquilosante o artritis gotosa;
b) la enfermedad autoinmune o la enfermedad inflamatoria inmunomediada es lupus;
c) la enfermedad autoinmune o la enfermedad inflamatoria inmunomediada es un trasplante;
d) la enfermedad autoinmune o la enfermedad inflamatoria inmunomediada es la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), además, opcionalmente, en la que la EII es la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa; y/o e) el uso comprende además administrar un segundo agente terapéutico, opcionalmente, en donde el segundo agente terapéutico son fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), salicilatos, hidroxicloroquina, sulfasalazina, corticosteroides, fármacos citotóxicos, fármacos inmunosupresores y/o anticuerpos.
17. Un anticuerpo anti-idiotípico que se une al anticuerpo o la parte de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
18. Un kit que comprende el anticuerpo o la parte de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que opcionalmente comprende además reactivos para detectar el anticuerpo y las instrucciones de uso.
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