UA123398C2 - Виділене антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує cd154, та фармацевтична композиція, яка його містить - Google Patents

Виділене антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує cd154, та фармацевтична композиція, яка його містить Download PDF

Info

Publication number
UA123398C2
UA123398C2 UAA201802170A UAA201802170A UA123398C2 UA 123398 C2 UA123398 C2 UA 123398C2 UA A201802170 A UAA201802170 A UA A201802170A UA A201802170 A UAA201802170 A UA A201802170A UA 123398 C2 UA123398 C2 UA 123398C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
beo
antigen
antibodies
zeo
Prior art date
Application number
UAA201802170A
Other languages
English (en)
Inventor
Йоган Франсон
Жослен Леу
Ґаліна Обмолова
Галина Обмолова
Аніш Сурі
Аниш Сури
Фан Тен
Алєксєй Тепляков
Алексей Тепляков
Гун Чжоу
Original Assignee
Янссен Байотек, Інк.
Янссен Байотек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Байотек, Інк., Янссен Байотек, Инк. filed Critical Янссен Байотек, Інк.
Publication of UA123398C2 publication Critical patent/UA123398C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Винахід стосується виділеного антагоністичного антитіла, або його антигензв’язуючої ділянки, яке специфічно зв’язує CD154 людини. Також винахід стосується полінуклеотиду, вектору, клітини-хазяїна, способу отримання виділеного антагоністичного антитіла, або його антигензв’язуючої ділянки, яке специфічно зв’язує CD154, імунокон’югату, фармацевтичної композиції.

Description

(54) ВИДІЛЕНЕ АНТАГОНІСТИЧНЕ АНТИТІЛО, ЯКЕ СПЕЦИФІЧНО ЗВ'ЯЗУЄ СО154, ТА
ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЯКА ЙОГО МІСТИТЬ (57) Реферат:
Винахід стосується виділеного антагоністичного антитіла, або його антигензв'язуючої ділянки, яке специфічно зв'язує СО154 людини. Також винахід стосується полінуклеотиду, вектору, клітини-хазяїна, способу отримання виділеного антагоністичного антитіла, або його антигензв'язуючої ділянки, яке специфічно зв'язує СО154, імунокон'югату, фармацевтичної композиції.
Перехресне посилання на споріднені заявки
Ця заявка заявляє про встановлення переваги щодо попередньої заявки США Мо 62/367,660, поданої 28 липня 2016 р., і попередньої заявки США Мо 62/201,150, поданої 5 серпня 2015 р., причому весь зміст вищезазначених заявок включено в цей документ у повному обсязі шляхом посилання.
Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Цей винахід стосується антитіл, які специфічно зв'язують СО154, полінуклеотидів, які кодують антитіла або фрагменти, і способів отримання й використання вищезгаданого.
Рівень техніки
СОБ154, також відомий як СО40-ліганд (СО40І), др39, ТМЕ-споріднений білок активації (ТКАР), антиген 5с8 або Т-ВАМ, являє собою тримерний трансмембранний білок надродини фактора некрозу пухлин (ТМЕ). СО154 експресується на поверхні Т-клітин СО4- залежним від активації обмеженим у часі способом. Після активації СО154 також експресується на підмножині Т-клітин СО8-, базофілах, мастоцитах, еозинофілах, клітинах-натуральних кілерах,
В-клітинах, макрофагах, дендритних клітинах і тромбоцитах. СО154 також існує у вигляді розчинної форми в крові.
СОр154 зв'язується з СО40 на антигенпрезентуючих клітинах (АРС), що призводить до різних відповідей залежно від типу клітин-мішеней. Взаємодія СО40 із СО154 має важливе значення для нормальної взаємодії Т- і В-клітин, включаючи підвищену костимуляцію, праймінг Т-клітин, виробництво цитокінів, перемикання класів антитіл і дозрівання афінності, а також виробництво антитіл і аутоантитіл.
Було продемонстровано, що руйнування шляху СО40/С0154 через блокування СО154 є корисним для лікування аутоїмунних захворювань, таких як системний червоний вовчак (СЧВ), ревматоїдний артрит (РА), розсіяний склероз (РОС), запальне захворювання кишечнику (ЗЗК), цукровий діабет | типу «Т10) і відторгнення алотрансплантата. У людей мутації в СО40 або
СОр154 призводять до синдрому гіпер-ІДМ, який характеризується відсутністю ізотипів (4 або
ІЧА (Агийо еї аї., СеїІ 72:291, 1993).
Антитіла до СО154 були описані, наприклад, у міжнародних патентних публікаціях Мо
МО1993/08207, МО1994/10308, МО01996/40918, М 01993/009812, М/О1999/051258, 3о0 МУО1995/006480, МУО1995/006481, М/01995/006666, УУО2001/002057, М/О01997/017446,
М/О1999/012566, М/О2001/068860, М/О2005/003175, УуО2006/033702, УО2006/030220,
УМО2008/118356, УМО2012/052205, УМО2012/138768, УО2012/138768, УУО2013/055745 і
МО2013/056068.
Було продемонстровано ефективність антитіл до СО154 у лікуванні аутоімунних захворювань у людей. Проте подальшому клінічному удосконаленню заважала тромбоемболія внаслідок активації тромбоцитів, яка спостерігалася під час лікування. Було продемонстровано, що причиною активації тромбоцитів антитілом до СО154 під назвою 5с8 є взаємодія з ЕсукІІа на тромбоцитах (Хіе еї а!., У Іттипої! 192:4083-4092, 2014).
Таким чином, існує потреба в додаткових антитілах до СО154 з покращеними профілями 4о безпечності й ефективності.
Суть винаходу
У винаході запропоновано антагоністичне антитіло або його антигензв'язуючу ділянку, які специфічно зв'язують СО154 людини з ЗЕО ІЮ МО: 1, які містять область, що визначає комплементарність, важкого ланцюга (НСОК) 1 із БЕО ІЮ МО: 17 (5015), НСОКЗ2 із БЕО ІЮ МО: 23 (ММІЗРІЕЄЄМТМУАОКРОС) ії НСОКЗ із БЕО ІЮ МО: 30 (ЗКУУСОІ ОХ), де необов'язково залишок 51 у НСОК'!І піддається мутації наА, С,О,Е, б, І.К, І, М, М, С, ЕР, Т або М; залишок І4 у НСОК'І піддається мутації на М, Г. або М; залишок 55 у НСОК! піддається мутації на А; залишок 53 у НСОК2 піддається мутації на А, Т або М; залишок Р4 у НСОК2 піддається мутації на М, Т, Ї 0 або Е; залишок М8 у НСОК2 піддається мутації наА, С.О, Е, Б, С, Н.І, К, І, М, О, ЕК, 5, Т, М, М/ або
У; залишок ТУ у НСОКІ2 піддається мутації наА, С,О,Е, Е, с, Н.І, К, І, М, ОС, Е, 5, Т, М, УМ або
У; залишок М10 у НОСОК піддається мутації на А, С, О,Е, Б, о, Н.І, К, І, М, О, КЕ, 5, Т, М, М або У; залишок 51 у НСОКЗ піддається мутації на А або М; залишок К2 у НСОЕЗ піддається мутації на А, 5,О абокК; і залишок І 7 у НСОКЗ піддається мутації на М.
У винаході також запропоновано виділене антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує
СО154 із БЕО ІО МО: 1, причому антитіло містить певні амінокислотні послідовності МН і МІ, як описано в цьому документі.
У винаході також запропоновано виділене антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує
СО154 із БЕО ІЮО МО: 1, причому антитіло містить певні амінокислотні послідовності НСОК'І,
НеСОК2, НСОКЗ, І СОК1, СО і СОКУ, як описано в цьому документі.
У винаході також запропоновано виділене антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує
СО154 із БЕО ІЮ МО: 1, яке містить
НСОКІ, НСОК2, НСОКЗ, ІСОК1, 1 СО2і 1 СО із ЗЕО ІО МО: 17, 23, 30, 37, 44 і 52 відповідно;
МН із ЗЕО ІО МО: 59 і МІ із ЗЕО ІЮ МО: 66; або важкий ланцюг із БЕО ІЮ МО: 80 і легкий ланцюг із ХЕО ІЮ МО: 81.
У винаході також запропоновано виділене антагоністичне антитіло або його антигензв'язуючу ділянку, які специфічно зв'язують СО154 із БЕО ІЮО МО: 1, причому СО154 являє собою гомотример, і антитіло зв'язує перший мономер СО154 у гомотримері в межах амінокислотних залишків 182-207 СО154 і другий мономер СО154 у гомотримері в межах амінокислотних залишків 176-253 СО154, де нумерація залишків відповідає 5ЕО ІЮО МО: 1.
У винаході також запропоновано імунокон'югат, який містить антитіло або антигензв'язуючу ділянку антитіла за цим винаходом, зв'язані з терапевтичним агентом або агентом для візуалізації.
У винаході також запропоновано фармацевтичну композицію, що містить антитіло за цим винаходом і фармацевтично прийнятний носій.
У винаході також запропоновано полінуклеотид, який кодує МН антитіла за цим винаходом,
МІ. антитіла за цим винаходом або МН і Мі. антитіла за цим винаходом.
У винаході також запропоновано вектор, що містить полінуклеотид за цим винаходом.
У винаході також запропоновано клітину-хазяїна, що містить вектор за цим винаходом.
У винаході також запропоновано спосіб отримання антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна за цим винаходом в умовах, за яких відбувається експресія антитіла, і виділення антитіла, виробленого клітиною-хазяїном. 3о У винаході також запропоновано спосіб лікування аутоїмунного захворювання або імуноопосередкованого запального захворювання, який включає введення терапевтично ефективної кількості виділеного антитіла за цим винаходом або фармацевтичної композиції за цим винаходом пацієнтові, який цього потребує, протягом часу, достатнього для лікування захворювання.
У винаході також запропоновано антиідіотипічне антитіло, яке зв'язується з антитілом за цим винаходом.
У винаході також запропоновано набір, який містить антитіло за цим винаходом.
Короткий опис рисунків
На Фіг. 1 продемонстровано вплив Ес-фрагмента антитіла на активацію тромбоцитів імунними комплексами (ІС) СО154 : антитіло. ІС із розчинного СО154 людини (5020154, позначеного на фігурі як 500401), і антитіла 5с8 до СО154 (ізотип ІдО1) (ІС 5с81901) активували тромбоцити, тоді як ІС із 57020154 і 5с8, клонованого на основних ланцюгах Ідс1 з пригніченою функцією Ідс15ідта, Ідс15ідта-УТЕ, Ідс25ідта або Ідс25ідта-УТЕ (5с8Ідс17, 5с8І4с12-МТЕ,
Бс81до27 або 5с819522-УТЕ відповідно), не мали ефекту. Активацію тромбоцитів оцінювали як
Фо від загального числа тромбоцитів, що експресують РАС-1 (антитіло РАС-1 специфічно розпізнає конформаційно активну форму інтегрину аІПЬВЗ3) Її СОб2р (поверхнева експресія Р- селектину). АДФ (аденозиндифосфат): позитивний контроль. ФБР (фосфатно-сольовий буферний розчин): негативний контроль. Оцінювання активації тромбоцитів виконували у п'яти донорів. Результати показані як середнє значення для кожного експерименту ж стандартне відхилення (СВ).
На Фіг. 2 продемонстровано, що імунні комплекси (ІС) із 5020154 (520401 на цій фігурі) і
Ідс25ідта/к антитіла до СО154 С4185, С41і 889, С41і 8189, С418191, С41 8199 ї С41 В150 з пригніченою ефекторною функцією не активують тромбоцити. Активацію тромбоцитів оцінювали як 95 від загального числа тромбоцитів, що експресують РАС-1 і СОба2р. ІС із 5ЄпИСО154 і 5с81дСс1 (С 5681951) активували тромбоцити. АДФ (аденозиндифосфат): позитивний контроль.
Оцінювання активації тромбоцитів виконували у п'яти донорів. Результати показані як середнє значення для кожного експерименту х стандартне відхилення (СВ).
На Фіг. 3 продемонстровано, що імунні комплекси (ІС) із 52020154 (520401) ї антитіла до ср154 С41 889 (Ідсб25ідта/к), С4І В231 (Ідс15ідта/к) і С41! В232 (ІдС15ідта/к) не активують 6о0 тромбоцити. Активацію тромбоцитів оцінювали як 95 від загального числа тромбоцитів, що експресують РАС-1 і СОб2р. ІС 5с8-ІО1 активували тромбоцити, причому активація блокувалася антитілом до ЕсуїЇІа, що вказує на те, що активація тромбоцитів ІС СО154/5с8-І9И1 опосередковується ЕсуКіІІІа, присутнім на тромбоцитах. АДФ (аденозиндифосфат): позитивний контроль. ФБР (фосфатно-сольовий буферний розчин): негативний контроль. Оцінювання активації тромбоцитів виконували у п'яти донорів. Результати показані як середнє значення для кожного експерименту х стандартне відхилення (СВ).
На Фіг. 4 продемонстровано поверхню взаємодії між СО154 і С4І! В89. Ароматичні залишки
Е55, М101 ї М102 у НСОМК? і НСОКЗ сприяють найбільшій кількості взаємодій (нумерація залишків відповідає ЗЕО ІЮ МО: 59). Легкий ланцюг С41І 889 не сприяє зв'язуванню.
На Фіг. 5 продемонстровано двовимірний графічний рисунок епітопних і паратопних залишків, ідентифікованих із кристалічної структури СО154 мавпи-ігрунки в комплексі з С4! В89.
Епітопні залишки обведені овалом, і показані паратопні залишки в НСОКІ, НСОК2 і НСОКЗ важкого ланцюга (позначені на фігурі як СОКІТ, СОК2 і СОКЗ). Антитіло зв'язується одночасно з двома мономерами СО154 А і В. Нумерація епітопних залишків відповідає СЮО154 людини (5ЕО
ІО МО: 1), а нумерація паратопних залишків відповідає варіабельній області важкого ланцюга
С41 889 (5ЕО ІО МО: 59).
На Фіг. бА продемонстровано вирівнювання залишків 1-180 СО154 людини (ЗЕО ІО МО: 1, верхній рядок) і СО154 мавпи-ігрунки (50 ІЮ МО: 2, нижній рядок), де показано, що епітопні залишки СА4ІЇ В89 між СО1514 людини й мавпи-ігрунки є консервативними. Епітопні залишки на мономері 1 СО154 підкреслено лінією, а епітопні залишки на мономері 2 підкреслено подвійною лінією.
На Фіг. 68 продемонстровано вирівнювання залишків 181-261 СО154 людини (5ЕО ІЮ МО: 1, верхній рядок) і СО154 мавпи-ігрунки (50 ІЮ МО: 2, нижній рядок), де показано, що епітопні залишки СА4ІЇ В89 між СО1514 людини й мавпи-ігрунки є консервативними. Епітопні залишки на мономері 1 СО154 підкреслено лінією, а епітопні залишки на мономері 2 підкреслено подвійною лінією.
На Фіг. 7 продемонстровано, що імунні комплекси (ІС) із 53АИСО154 (520401 на цій фігурі) і
Ідс1/к антитіла до СО154 С41! В237 не активують тромбоцити, тоді як ІС із 56пСО154 і іншого
Ідс1-антитіла 568 активують тромбоцити. Застосування одних тільки антитіл не впливало на 3о активацію тромбоцитів, що оцінювали як 95 від загального числа тромбоцитів, які експресують
РАС-1 ії СОб2р. АДФ (аденозиндифосфат): позитивний контроль. ФБР. (фосфатно-сольовий буферний розчин): негативний контроль. Оцінювання активації тромбоцитів виконували у п'яти донорів. Результати показані як середнє значення для кожного експерименту ж СВ. У кожній групі п - 4.
На Фіг. ВА продемонстровано, що імунні комплекси (ІС) із 52020154 (520401. на цій фігурі) і
С41 В119 із нефункціональним Ес активують тромбоцити ЕсукІПа-незалежним способом, тоді як
ІС із 5620154 і антитіла з доменами МН/Л// С41 8119, експресованими на Ідс1 (С41 8287), активували тромбоцити ЕсукКПа-залежним способом. АДФ (аденозиндифосфат): позитивний контроль. ФБР (фосфатно-сольовий буферний розчин): негативний контроль.
На Фіг. 88 продемонстровано, що імунні комплекси (ІС) із 52020154 (520401 на цій фігурі) і
С41 894 із нефункціональним Ес активують тромбоцити ЕсукКІПа-незалежним способом, тоді як
ІС їз 5пСО154 і антитіла з доменами МНЛ// С41/ 894, експресованими на Ідс1 (С4І 8289), активували тромбоцити ЕсукКПа-залежним способом. АДФ (аденозиндифосфат): позитивний контроль. ФБР (фосфатно-сольовий буферний розчин): негативний контроль.
На Фіг. 8С продемонстровано, що імунні комплекси (ІС) із 52020154 (520401 на цій фігурі) і
С41 В83 із нефункціональним Ес помірно активують тромбоцити, тоді як ІС із ЗЄИСО154 і антитіла з доменами МН/Л/Л С41883, експресованими на ІдсС1 (С4І 8288), активували тромбоцити
ЕсукКПа-залежним способом. АДФ (аденозиндифосфат): позитивний контроль. ФБР. (фосфатно- сольовий буферний розчин): негативний контроль. 5О Детальний опис винаходу
Усі публікації, включаючи, серед іншого, патенти й патентні заявки, наведені в цьому описі, включені в цей документ шляхом посилання так, нібито їх було викладено повністю.
Необхідно розуміти, що термінологія в цьому документі вживається виключно для опису певних варіантів втілення й не має обмежувального характеру. Якщо не вказано інше, усі технічні й наукові терміни, використані в цьому документі, мають те саме значення, яке зазвичай розуміє звичайний фахівець у галузі, до якої належить цей винахід.
У цьому винаході й у формулі винаходу форми однини включають форми множини, крім випадків, коли контекст чітко вимагає іншого тлумачення.
Незважаючи на те, що будь-які способи й матеріали, аналогічні або еквівалентні тим, які 6о описані в цьому документі, можуть бути використані на практиці для тестування цього винаходу,
у цьому документі описано ілюстративні матеріали й способи. В описі й формулі цього винаходу використовуватиметься така термінологія.
Термін «специфічне зв'язування» або «специфічно зв'язується» або «зв'язується» стосується зв'язування антитіла з антигеном або епітопом у антигені з більшою афінністю, ніж з іншими антигенами. Зазвичай антитіло зв'язується з антигеном або епітопом у антигені з константою дисоціації (Ко) приблизно 1 х 109 М або менше, наприклад приблизно 1 х 109 М або менше, приблизно 1 х 1079 М або менше, приблизно 1 х 107! М або менше або приблизно 1 х 1072 М або менше, зазвичай із Ко, що принаймні в сто разів менший, ніж його Ко зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, бичачим сироватковим альбуміном (БСА), казеїном).
Константу дисоціації можна виміряти з використанням стандартних процедур. Однак антитіла, які специфічно зв'язуються з антигеном або епітопом у антигені, можуть мати перехресну реактивність до інших споріднених антигенів, наприклад до того самого антигена від інших видів (гомологів), таких як людина або мавпа, наприклад Масаса їазсісціагі5 (яванський макак, супо),
Рап ігодіодуїех (шимпанзе, спітр) або Саййніх іасспив (ігрунка звичайна, таптозей|.
Моноспецифічне антитіло специфічно зв'язує один антиген або один епітоп, в той час як біспецифічне антитіло специфічно зв'язує два різні антигени або два різні епітопи.
Термін «нейтралізуючий», або «нейтралізує», або «нейтралізуюче антитіло», або «антагоніст антитіла», або «антагоніст», або «антагоністичний» стосується антитіла або його антигензв'язуючої ділянки, які частково або повністю інгібують біологічну активність СО154 людини. Антагоністичні антитіла можна ідентифікувати з використанням аналізів біологічної активності СЮО154, як описано в цьому документі. Антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує СЮО154 людини, може інгібувати біологічну активність СО154 людини на приблизно 20 905, 30 95, 40 95, 50 95, 60 95, 70 905, 75 95, 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95.
Термін «СО154» стосується білла СО154 людини (пСО0154) (наприклад, СЮО40Ї людини).
Амінокислотну послідовність повнорозмірного білка СО154 людини продемонстровано в ЗЕО ІЮ
МО: 1. СО0О154 людини виявляється як на клітинній мембрані у вигляді мембранного білка типу ЇЇ, так і існує у вигляді розчинної форми у плазмі. Зв'язана з мембраною форма СО154 містить залишки 1-261 із зЗЕО ІЮ МО: 1, причому трансмембранний домен знаходиться між залишками 23-46, а позаклітинний домен охоплює залишки 47-261. Розчинна форма СО154 людини
Зо (5пиСО154) утворюється шляхом протеолітичної обробки зв'язаної з мембраною форми й містить залишки 113-261 із БЕО ІО МО: 1 (амінокислотну послідовність 53АИСО154 продемонстровано в
ЗЕБЕО ІЮ МО: 4). | зв'язана з мембраною форма, і розчинна форма СО154 являють собою біологічно активні тримери. «СО154» охоплює різні форми СО154, включно з мономерною, димерною, тримерною, зв'язаною з мембраною й розчинною формами, а також природні різновиди СО154 людини. Розчинний тример СО154 людини (тример 50СО154) складається з трьох поліпептидних ланцюгів, кожен із яких має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 4.
У цьому документі термін «антитіла» вживається в широкому значенні й включає молекули імуноглобуліну, у тому числі моноклональні антитіла, у тому числі мишачі, людські, гуманізовані й химерні моноклональні антитіла, фрагменти антитіл, біспецифічні або мультиспецифічні до антитіла, димерні, тетрамерні або мультимерні антитіла, одноланцюгові антитіла, домени антитіл, і будь-яку іншу модифіковану конфігурацію молекули імуноглобуліну, яка містить сайт зв'язування з антигеном з бажаною специфічністю. «Повні молекули антитіла» складаються з двох важких ланцюгів (НС) і двох легких ланцюгів (ІС), зв'язаних між собою дисульфідними зв'язками, а також їхніх мультимерів (наприклад, (ЯМ). Кожен важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (МН) і константної області важкого ланцюга (складається з доменів СНІ, СН2 ї СНЗ). Кожен легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (МІ) ії константної області легкого ланцюга (СІ). Області МН і Мі можуть бути додатково розділені на області гіперваріабельності, які називають областями, що визначають комплементарність (СОМ), які чергуються з каркасними областями (ЕК). Кожна МН і мі. складається з трьох СОК і чотирьох сегментів ЕК, розташованих у напрямку від амінокінця до карбоксикінця в такому порядку: ЕК!Т, СОКІ1, ЕК2, СОМК2, ЕКЗ, СОКЗ і ЕКА. «Області, що визначають комплементарність (СОМК)» являють собою «антигензв'язуючі сайти» в антитілі. СОК можуть бути визначені з використанням різних термінів: (І) області, що визначають комплементарність (СОК), три у МН (НСОКІ1, НСОК2, НОСОК) і три у МІ. (СОМ,
ІСОоМ2, СО), базуються на варіабельності послідовностей (Ууи апа Кабраї, У Ехр Меа 132:211-50, 1970; Кабаї єї аЇ., Зедиєпсев ої Ргоївїн5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, Бій Ей. Рибіїс
Неанй Зегмісе, Маїййопаї! Іпбійшев ої Неанй, Веїпезаа, Ма., 1991); (ії) «гіперваріабельні області»,
НМЕК або НУ, три у МН (НІ, Н2, НЗ) і три у МІ (І 1, 12, І 3), стосуються областей варіабельних доменів антитіл, які мають гіперваріабельну структуру за визначенням Споїпіа апа І е5К (Споївпіа 6о0 апа їГе5К Мо! Віо! 196:901-17, 1987). Міжнародна база даних ІтМипосСепетісв (ІМОТ)
(пеЕр:/Ллумли ітоуї ого) пропонує стандартизовану нумерацію й визначення антигензв'язуючих сайтів. Відповідність між визначеннями СОК, НМУ і ІМОТ описана в публікації І еїтапс еї аї., Оем
Сотрагаї Іттипої! 27:55-77, 2003. Терміни «СОК», «НСОКІ1», «НСОК2», «НСОКЗ», «І СОМ», «'СОК2» і «Ї'СОКЗ» включають СОК, визначені за допомогою будь-якого зі способів, описаних вище, відповідно до Кабаї, Споїпіа або ІМСТ, якщо в описі прямо не вказано інше.
Залежно від амінокислотної послідовності константного домену важких ланцюгів імуноглобуліни можна віднести до п'яти основних класів: ІдА, ДО, ІДЕ, дос і І9М. ІдДА і до додатково поділяють на ізотипи ІдА:, ІдАг, даси, ІДС», ІдСз ії дя. Легкі ланцюги антитіл будь- якого виду хребетних тварин можна віднести до одного з двох чітко відмінних типів, а саме каппа (к) і лямбда (А), на основі амінокислотних послідовностей їхніх константних доменів.
Термін «фрагменти антитіл» або «антигензв'язуюча ділянка антитіла» стосується частини молекули імуноглобуліну, яка зберігає антигензв'язуючий сайт важких ланцюгів і/або легких ланцюгів, наприклад областей, що визначають комплементарність, важких ланцюгів (НСОК) 1, 2 і 3, областей, що визначають комплементарність, легких ланцюгів (СОМ) 1, 2 і 3, варіабельної області важкого ланцюга (МН) або варіабельної області легкого ланцюга (М). Фрагменти антитіл включають добре відомі фрагменти Раб, Е(аб)2, РО їі Рм і доменні антитіла (дАБ), що містять один домен МН. Домени МН і МІ можуть бути зв'язані один з одним за допомогою синтетичного лінкера з утворенням різних типів конструкцій одноланцюгових антитіл, де домени
МНЛ/Г спарюються внутрішньомолекулярно або міжмолекулярно в тих випадках, коли домени
МН ї МІ. експресуються окремими конструкціями одноланцюгових антитіл з утворенням сайту зв'язування одновалентного антигена, наприклад, одноланцюговим Ем (5СЕм) або димером; описані, наприклад, у міжнародній патентній публікації Мо М/01998/44001, міжнародній патентній публікації Мо М/О1988/01649; міжнародній патентній публікації Мо МУО1994/13804; міжнародній патентній публікації Ме УУО1992/01047.
Термін «моноклональне антитіло» стосується популяції антитіл, що складаються з єдиної амінокислоти в кожному важкому й кожному легкому ланцюзі, за винятком можливих добре відомих змін, таких як видалення з важкого ланцюга антитіла С-кінцевого лізину. Моноклональні антитіла зазвичай зв'язують один антигенний епітоп за винятком того, що біспецифічні моноклональні антитіла зв'язують два різні антигенні епітопи. Моноклональні антитіла можуть 3о мати гетерогенне глікозилювання в популяції антитіл. Моноклональне антитіло може бути моноспецифічним або мультиспецифічним або одновалентним, двовалентним або багатовалентним. Біспецифічне антитіло включене в термін «моноклональне антитіло». «Виділене антитіло» означає антитіло або фрагмент антитіла, який по суті не містить інших антитіл, що мають різні антигенні властивості (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язує СО154, є по суті вільним від антитіл, які специфічно зв'язують інші антигени крім СО154).
Термін «виділене антитіло» включає антитіла, виділені таким чином, що вони мають більш високий ступінь чистоти, наприклад антитіла, чисті на 80 95, 81 95, 82 95, 83 90, 84 Фо, 85 9о, 86 о, 87 95, 88 95, 89 95, 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95.
Термін «залишки Споїпіа» означає залишки МІ. і МН антитіл, пронумеровані відповідно до АЇ-
Ї агікапі (А!-І агікапі еї а!., У Мої Віо! 273:927-48, 1997).
Термін «гуманізовані антитіла» стосується антитіл, у яких антигензв'язуючі сайти отримані з видів, відмінних від людини, а каркаси варіабельної області отримані з послідовностей людського імуноглобуліну. Гуманізовані антитіла можуть включати заміщення в областях каркасів, так що каркас може не бути точною копією експресованого людського імуноглобуліну або генних послідовностей зародкової лінії.
Термін «людські антитіла» означає антитіла, що мають варіабельні області важкого й легкого ланцюгів, у яких каркас і антигензв'язуючий сайт отримані з послідовностей людського походження. Якщо антитіло містить константну область або ділянку константної області, цю константну область також отримують із послідовностей людського походження.
Людське антитіло містить варіабельні області важкого або легкого ланцюга, які «отримані 3» послідовностей людського походження, якщо варіабельні області антитіла отримують із системи, у якій використовуються гени імуноглобулінів зародкової лінії людини або перебудованих імуноглобулінів. Прикладами таких систем є бібліотеки генів людських імуноглобулінів, продемонстровані на фагові, і трансгенних тварин, відмінних від людини, наприклад мишей або щурів із локусами людського імуноглобуліну, як описано в цьому документі. «Людське антитіло» може містити амінокислотні відмінності порівняно з послідовностями імуноглобуліну зародкової лінії або перебудованого імуноглобуліну внаслідок, наприклад, природних соматичних мутацій або навмисного введення заміщень у каркас або антигензв'язуючий сайт, або в обидва. Зазвичай амінокислотна послідовність «людського во антитіла» принаймні приблизно на 80 95, 81 95, 82 95, 83 95, 84 95, 85 95, 86 95, 87 95, 88 95, 89 95,
90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 905, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентична амінокислотній послідовності, що кодується геном імуноглобуліну зародкової лінії людини або перебудованого імуноглобуліну. У деяких випадках «людське антитіло» може містити консенсусні каркасні послідовності, отримані з аналізу людської каркасної послідовності, наприклад, як описано в публікації Кпаррік еї аї!., ) Мої Віо! 296:57-86, 2000, або синтетичну НСОКЗ, введену в бібліотеки генів імуноглобулінів людини, продемонстровані на фагові, наприклад, як описано в публікації
Пі єї аї., У Мої Віо! 397:385-96, 2010 і міжнародній патентній публікації Мо УМО2009/085462.
Виділені гуманізовані антитіла є синтетичними. У той час як людські антитіла отримують із послідовностей імуноглобуліну людини, вони можуть бути отримані з використанням таких систем, як фаговий дисплей, що включає синтетичні СОК і/або синтетичні каркаси, або можуть піддаватися мутагенезу іп мій, щоб покращити властивості антитіл, що призводить до отримання антитіл, які не експресуються в репертуарі зародкової лінії людських антитіл іп мімо.
Антитіла, у яких антигензв'язуючі сайти отримано з видів не людського походження, не включені у визначення терміну «людське антитіло».
Термін «рекомбінантний» включає антитіла й інші білки, які отримують, експресують, створюють або виділяють рекомбінантними способами.
У контексті цього документа термін «епітоп» стосується частини антигена, з якою специфічно зв'язується антитіло. Епітопи зазвичай складаються з хімічно активних (наприклад, полярних, неполярних і гідрофобних) поверхневих скупчень функціональних груп, таких як амінокислоти або бічні ланцюги полісахаридів, і можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики, а також специфічні характеристики зарядів. Епітоп може складатися з суміжних іМабо несуміжних амінокислот, які утворюють конформаційну просторову одиницю. Для несуміжного епітопа амінокислоти з різних частин лінійної послідовності антигена опиняються в безпосередній близькості в З-вимірному просторі в результаті складання білкової молекули.
Термін «паратоп» означає частину антитіла, з якою специфічно зв'язується антиген.
Паратоп може мати лінійну природу або може бути переривчастий, утворений просторовим взаємозв'язком між несуміжними амінокислотами антитіла, а не лінійною низкою амінокислот.
Терміни «паратоп легкого ланцюга» і «паратоп важкого ланцюга» або «амінокислотні залишки паратопа легкого ланцюга» і «амінокислотні залишки паратопа важкого ланцюга» стосуються 3о залишків легкого ланцюга і залишків важкого ланцюга антитіла, що перебувають у контакті з антигеном, відповідно, або загалом термін «залишки паратопа антитіла» стосується тих амінокислот антитіла, які контактують з антигеном.
Термін «біспецифічний» стосується антитіла, що специфічно зв'язує два різні антигени або два різні епітопи в межах того самого антигена. Біспецифічне антитіло може мати перехресну реактивність з іншими спорідненими антигенами або може зв'язувати епітоп, спільний для двох або більше різних антигенів.
Термін «мультиспецифічний» стосується антитіла, що специфічно зв'язує принаймні два різні антигени або принаймні два різні епітопи в межах того самого антигена. Мультиспецифічне антитіло може зв'язувати, наприклад, два, три, чотири або п'ять різних антигенів або різних епітопів у межах того самого антигена. «У комбінації з» означає, що лікарські засоби або терапевтичні засоби вводять суб'єктові, наприклад людині, разом у вигляді суміші, одночасно у вигляді окремих агентів або послідовно у вигляді окремих агентів у будь-якому порядку.
Термін «біологічна активність СО154» стосується будь-якої активності, що виникає в результаті зв'язування СО154 із його рецептором СО40. Біологічна активність СО154 може являти собою, наприклад, СО154-опосередковану активацію В-клітин СО40: або дендритних клітин (ДК), або низхідну активацію сигнальних шляхів СО40. Біологічну активність СО154 можна виміряти з використанням добре відомих способів і способів, описаних у цьому документі, наприклад за допомогою вимірювання СО154-опосередкованої проліферації В-клітин або активації В-клітин шляхом оцінювання стимуляції ІСАМ-1 або підвищення продукції цитокінів В-клітинами, СО154-опосередкованої активації ДК шляхом оцінювання підвищеної поверхневої експресії СО8О і/або СО86, або секреції цитокінів клітинами ДК, або активації сигнальних шляхів СО40 шляхом оцінювання в аналізах репортерного гена, наприклад шляхом вимірювання секреції секретованої ембріональної лужної фосфатази (ЗЕАР) клітинами, які експресують 5ЕАР під керуванням МЕ-кВ-індуцибельного промотора.
Термін «вектор» означає полінуклеотид, який здатний до дублювання в біологічній системі або який можна перемістити між такими системами. Полінуклеотиди вектора, як правило, містять елементи, такі як точки початку реплікації, сигнал поліаденілювання або маркери селекції, які функціонують для полегшення дублювання або підтримання даних полінуклеотидів 6о0 у біологічній системі. Приклади таких біологічних систем можуть включати клітину, вірус,
тварину, рослину й відновлені біологічні системи, що використовують біологічні компоненти, здатні дублювати вектор. Полінуклеотид, який містить вектор, може бути молекулою ДНК або
РНК або їхнім гібридом.
Термін «експресійний вектор» означає вектор, який можна використати в біологічній системі або у відновленій біологічній системі для спрямування трансляції поліпептиду, кодованого полінуклеотидною послідовністю, присутньою в експресійному векторі.
Термін «полінуклеотид» означає молекулу, яка містить ланцюг нуклеотидів, ковалентно зв'язаних між собою цукор-фосфатним основним ланцюгом або іншим еквівалентним ковалентним хімічним зв'язком. Типовими прикладами полінуклеотидів є дво- й одноланцюгові
ДНК і РНК.
Термін «поліпептид» або «білок» означає молекулу, яка містить принаймні два амінокислотні залишки, зв'язані пептидним зв'язком з утворенням поліпептиду. Малі поліпептиди, що містять менш ніж 50 амінокислот, можна називати «пептидами».
У цьому документі вживаються загальноприйняті однолітерні або трилітерні коди амінокислот, як показано в таблиці 1.
Таблиця 1
Аргінін Її АюЮ11Ї111111111111вАССсСсСС
Аспартат/////777777777111Ї111111САБрСЇ1111111111601ссСсСсСсСсСС у
Глутамно 77777111 11111102
Пзволейцин/////7771Ї71111111111111е11 11111111
Пролін.///////7777711111Ї1111111РЮ 11111111 РССС
Композиції речовини
У цьому винаході запропоновані антагоністичні антитіла, які специфічно зв'язують СО154 із високою афінністю й ефективно нейтралізують біологічну активність СО154. Винахід грунтується, принаймні частково, на визначенні, яке суперечить існуючому розумінню того, що зв'язування антитіл, які специфічно зв'язують СО154, із ЕсукКІа на тромбоцитах, призводить до активації й агрегації тромбоцитів і подальшої тромбоемболії; у цьому винаході було виявлено, що активація тромбоцитів також залежить від епітопа СО154, з яким зв'язується антитіло. Було виявлено, що антитіла за цим винаходом, які зв'язують певний епітоп на СО154 і які здатні до взаємодії з ЕсуКіІІа, не опосередковують активацію тромбоцитів. Крім того, антитіла за цим винаходом необов'язково мають сконструйований Ес, щоб запобігти ініціюванню додаткових небажаних імуностимулюючих функцій. Таким чином, антитіла за цим винаходом можуть мати більш сприятливі профілі безпечності в клінічних умовах у порівнянні з існуючими антитілами, 3о які специфічно зв'язують СО154.
СО154 є мішенню в аутоїмунних реакціях, відторгненні трансплантата й інших імунних захворюваннях у мишей, приматів, які не являють собою людину (МНР), і в людей. У декількох клінічних дослідженнях фази ІЇ антитіла, які специфічно зв'язують СО154, продемонстрували ефективне блокування активностей СО154 іп мімо і полегшення захворювання. Антагоністи
СО154 відрізняються від усіх інших терапевтичних засобів своїм впливом на імунну відповідь; вони є єдиними терапевтичними засобами, які можуть індукувати функціональну імунологічну толерантність, що продемонстровано як у мишей, так і в мавп. У мишей практично всі моделі аутоїмунних захворювань можуть бути ефективно полегшені за допомогою антагоністів СО154 (Моеї!е єї а!., Апп М М Асай 5сі 815: 384-391, 1997; МаскКеу евї аї!., У І еиКос Віо! 63: 418-428, 1998;
МоеїІє, Адепів Асіїоп5 Зиррі 49: 17-22, 1998; Оцегада еї аї., Аппи Вем Іттипої! 22: 307-328, 2004), причому спостерігається довготривала ремісія.
У винаході запропоновано виділене антагоністичне антитіло або його антигензв'язуючу ділянку, які специфічно зв'язують СО154 із ФЕО ІЮ МО: 1.
У винаході також запропоновано виділене антагоністичне антитіло або його антигензв'язуючу ділянку, які специфічно зв'язують СО154, причому СО154 являє собою гомотример, і антитіло зв'язує перший мономер СО154 у гомотримері в межах амінокислотних залишків 182-207 СО154 і другий мономер СО154 у гомотримері в межах амінокислотних залишків 176-253 СО154, де нумерація залишків відповідає 5ЕО ІЮ МО: 1.
Прикладом такого антитіла є антитіло С4/В89. Оскільки варіабельні області антитіл
С41 8235 і С41! В236 відрізняються одним амінокислотним залишком у ГСОКа порівняно з такими в С41В89, і оскільки СА! В231 і С4/! 8232 мають ідентичні послідовності МН/ЛЛ. із СА В89, очікується, що ці антитіла також зв'язуватимуть той самий епітоп СО154, що й САІВ89.
Антитіла, які зв'язують СО154 у межах залишків 182-207 і 176-253, не здатні активувати тромбоцити, навіть якщо вони здатні взаємодіяти з ЕсукК, включно з ЕсукКІІа. Таким чином, ці антитіла можуть мати покращений профіль безпечності порівняно з іншими антагоністичними антитілами, які специфічно зв'язують СО154.
У винаході також запропоновано антагоністичне антитіло або його антигензв'язуючу ділянку, які специфічно зв'язують СО154 людини з ЗЕО ІЮ МО: 1, які містять область, що визначає комплементарність, важкого ланцюга (НСОК) 1 із БЕО ІЮ МО: 17 (5015), НСОКЗ2 із БЕО ІЮ МО: 23 (ММІЗРІЕЄЄМТМУАОКРОС) ії НСОКЗ із БЕО І МО: 30 (ЗУ ООІ ОХ), де необов'язково залишок 51 у НСОК'!І піддається мутації наА, С,О,Е, б, І.К, І, М, М, С, ЕР, Т або М; залишок І4 у НСОК'!І піддається мутації на М, Г. або М; залишок 55 у НСОК! піддається мутації на А; залишок 53 у НСОК2 піддається мутації на А, Т або М; залишок Р4 у НСОК2 піддається мутації на М, Т, Ї 0 або Е; зо залишок М8 у НСОК2 піддається мутації наА, С.О, Е, Б, б, Н.І, К, І, М, С, ЕК, 5, Т, М, УМ або
У; залишок ТУ у НСОКІ2 піддається мутації наА, С,О,Е, Е, с, Н.І, К, І, М, О, ЕК, 5, Т, М, М/ або
У; залишок М10 у НОСОК піддається мутації на А, С, О,Е, Б, о, Н.І, К, І, М, О, КЕ, 5, Т, М, М або У; залишок 51 у НСОКЗ піддається мутації на А або М; залишок К2 у НСОЕЗ піддається мутації на А, 5,О абокК; і залишок І 7 у НСОКЗ піддається мутації на М.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить область, що визначає 4о комплементарність, легкого ланцюга (СОМ) 1 із БЕО ІЮ МО: 37 (КАБОБІЗЗУІ М), ГСОК2 із БЕО
ІО МО: 44 (МАМ5І 05) і І СО із БЕО ІЮ МО: 52 (ФО5051РУМТ), де необов'язково залишок 04 у І СОКІ1 піддається мутації наА, С.О, Е, Б, с, Н.І, К, Г, М, М, Е, 5, Т, М, М або
У; залишок 55 у ЇСОКІ1 піддається мутації наА, С,О,Е, Е, с, Н.І, К, Г, М, М, с, Е, Т, М, УМ або
У; залишок 57 у ЇСОМК1 піддається мутації наА, С,О, Е, Б, б, Н.І, К, І, М, М, С, КЕ, Т, М, М/ або
У; залишок 58 у ЇЇ СОКІ1 піддається мутації наА, С,О, Е, Б, б, Н.І, К, І, М, М, С, ЕК, Т, М, М/ або
У; 5О залишок А2 у ГСОКЗ2 піддається мутації на 5; залишок МЗ у ГСОК2 піддається мутації наА, С.О, Е, Б, б, Н.І, К, ГГ, М, СО, Е, 5, Т, М, М або
У; залишок 54 у Ї СОК2 піддається мутації наА, С,О, Е, Б, б, Н.І, К, І, М, М, С, КЕ, Т, М, М/ або
У; залишок І 5 у СОК2 піддається мутації наА, С, 0, Е, Е, б, Н, І, К, М, М, С, КЕ, 5, Т, М, М або
У; залишок Об у І СОК2 піддається мутації на Е, О або М; залишок 57 у Ї/СОК2 піддається мутації наА, С,О, Е, Б, б, Н.І, К, І, М, М, С, КЕ, Т, М, М/ або
У; во залишок 53 у Г СОКЗ піддається мутації на А;
залишок 04 у Ї СОКЗ піддається мутації на М; залишок 55 у ЇЇ СОКЗ піддається мутації наА, С,О, Е, Б, б, Н.І, К, І, М, М, С, КЕ, Т, М, М/ або
У, залишок Іб у СОКЗ піддається мутації наА, С,О, Е, б, К, І, М, М, СО, Р, 5, Т або М.
Кристалічна структура комплексу антитіл С4! 889 і СО154 показала, що антитіло зв'язує
СОр154 тільки залишками МУН. Додаткові аналізи показали, що певні заміщення в СОК антитіла, показані в таблиці 19 і таблиці 20, як вказано вище, за прогнозами не впливають на загальну структуру комплексу, а, отже, і на характеристики антитіла.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить область, що визначає комплементарність, легкого ланцюга (СОМ) 1, ГСОК2 ії СОКЗ із
ЗЕО ІЮО МО: 36, 43 і 51 відповідно;
ЗЕО ІЮ МО: 37, 44 і 52 відповідно;
ЗЕО ІЮ МО: 38, 45 і 53 відповідно;
ЗЕО ІЮО МО: 39, 46 і 54 відповідно;
ЗЕО ІЮО МО: 40, 47 і 55 відповідно;
ЗЕО ІЮ МО: 41, 47 і 56 відповідно;
ЗЕО ІЮ МО: 42, 48 і 57 відповідно; 5ЕО ІЮ МО: 37, 49 і 52 відповідно; або
ЗЕО ІЮО МО: 37, 50 і 52 відповідно.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Г/СОК1, І СОК2 і І СО із
ЗЕО ІЮ МО: 37, 44 і 52 відповідно.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОКІ, НСОК2, НСОКЗ,
ІСОКІ, І СОК2ії СОКЗ із ЗЕО ІЮО МО: 17, 23, 30, 37, 44 і 52 відповідно.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОКІ, НСОК2, НСОКЗ,
ІСОКІ, І СОК2ії СОКЗ із БЕО ІЮ МО: 17, 23, 30, 37, 49 і 52 відповідно.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОКІ, НСОК2, НСОКЗ,
ІСОКІ, І СОК2ії СОКЗ із БЕО ІЮ МО: 17, 23, 30, 37, 50 і 52 відповідно.
У деяких варіантах втілення імунний комплекс антитіла за цим винаходом і розчинного
СОр154 людини (5020154) не активує тромбоцити, причому активацію тромбоцитів вимірюють за 3о експресією Р-селектину на поверхні тромбоцитів.
Активація тромбоцитів є добре відомим процесом, який перетворює гладкий неадгезивний тромбоцит на липку частку з нерівною поверхнею, яка вивільняє й експресує біологічно активні речовини й набуває здатності зв'язувати білок плазми фібриноген. Активація може також виникати в результаті фізичного подразника високої напруги зсуву рідини, наприклад, виявленого на місці критичного звуження артерій (Сиіпп еї аї., 2005, РіаїєЇїєї Рипсійоп: аззебззтепі, аіадповіх, ап ігеайтепі, Нитапа Ргев5, рр. 3-20). Активація тромбоцитів призводить до активації внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, що призводить до посилення експресії Р-селектину на поверхні тромбоцитів і збільшення афінності зв'язування фібриногену з рецепторами інтегрину саІПІЬВ3. Таким чином, активацію тромбоцитів можна виміряти шляхом вимірювання підвищеної поверхневої експресії Р-селектину або зв'язування зонд-ліганду, наприклад РАС-1, з інтегрином аїІБрВЗ на тромбоцитах із використанням, наприклад, проточної цитометрії. Антитіла за цим винаходом не активують тромбоцити людини, якщо антитіло в комплексі з 5120154 не підвищує поверхневу експресію Р-селектину або не збільшує зв'язування зонд-ліганду (наприклад, РАС-1) з інтегрином сІІЬВЗ статистично значущим чином порівняно з поверхневою експресією Р-селектину й збільшенням зв'язування зонд-ліганду (наприклад, РАС-1) з інтегрином апПрр3, індукованими 5ПСО154.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом має принаймні одну з наступних властивостей: зв'язується з СО154 із константою дисоціації (Ко) приблизно 5 х 109 М або менше за результатами вимірювання Коб із використанням системи РгоїеОп ХРЕКЗ6 за температури 25 "С у фосфатно-сольовому буферному розчині Дульбекко (ДФБР), який містить 0,03 95 полісорбату
РО і 100 мкг/мл альбуміну бичачої сироватки; інгібує опосередковану СО154 проліферацію В-клітин людини зі значенням ІСзо приблизно 2,7 х 109 М або менше; або інгібує опосередковану СО154 експресію секретованої ембріональної лужної фосфатази (ЗЕАР) під керуванням МЕ-кВ-індуцибельного інтерферон-В (ІЕМ-В) мінімального промотора в клітинах НЕК293, які стабільно експресують ЗЕАР і СО40 людини, зі значенням ІСзо приблизно 2,1 х 108 М або менше.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом зв'язує СО154 із константою бо дисоціації (Ко) приблизно 5 х 109 М або менше, приблизно 1 х 109 М або менше, приблизно 5 х
10790 М або менше, приблизно 1 х 10-79 М або менше, приблизно 5 х 10-7 М або менше або приблизно 1 х 10-! М або менше.
У деяких варіантах втілення антитіло, яке специфічно зв'язує СО154, перехресно реагує з
СОр154 Масаса їазсісціагіз (яванського макака) або з СО154 СаїцІйнгіх їасспив5 (мавпи-ігрунки).
Афінність антитіл до СО154 людини, яванського макака або мавпи-ігрунки можна визначити експериментально з використанням будь-якого відповідного способу. У таких способах можуть застосовуватися вимірювальні прилади РгоїеОп ХРЕЗ6, Віасоге 3000 або КіпЕХА, аналізи ЕГІ5А або аналізи конкурентного зв'язування, відомі фахівцям у цій галузі. Виміряна афінність конкретного антитіла до СО154 може змінюватися, якщо її вимірюють у різних умовах (наприклад, осмолярність, рівень рН). Таким чином, вимірювання афінності й інших параметрів зв'язування (наприклад, Ко, Кот, Кої) зазвичай проводять зі стандартними умовами та стандартизованим буфером, такими як буфер, описаний у цьому документі. Фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що внутрішня помилка під час вимірювання афінності, наприклад, із використанням Віасоге 3000 або Ргоїеоп (вимірюється як стандартне відхилення, СВ), зазвичай може перебувати в межах 5-33 95 для вимірювань у типових межах виявлення. Таким чином, термін «приблизно» відображає типове стандартне відхилення в аналізі. Наприклад, типове СВ для Ко 1 х 1079 М становить до 20,33 х 107 М.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом інгібує СО154-опосередковану проліферацію В-клітин людини зі значенням ІСзо приблизно 2,7 х 109 М або менше.
В аналізі проліферації В-клітин можна культивувати 1 х 105 В-клітин мигдалеподібних залоз людини зі 100 нг/мл рекомбінантного ІЇ/-21 людини, 0,5 мкг/мл тримерного рекомбінантного розчинного СО154 людини, який експресується як гібридний білок «лейцинової застібки», і антитіло до СО154 у діапазоні концентрацій 0,000064-25 мкг/мл у кінцевому об'ємі 200 мкл/ямка. Після 2 днів інкубації до культури можна додавати метил (-ЗН)-тимідин (0,5 мкКі/ямка) і після інкубування протягом однієї ночі визначати вплив антитіл на проліферацію В-клітин людини.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом інгібує індуковану СО154 експресію секретованої ембріональної лужної фосфатази (ЗЕАР) під керуванням МЕ-кВ-індуцибельного інтерферон-В (ІЕМ-В) мінімального промотора в клітинах НЕК293, які стабільно експресують зо ЗЕАР і СО40 людини, зі значенням ІСзо приблизно 2,1 х 109 М або менше.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом інгібує індуковану СО154 експресію секретованої ембріональної лужної фосфатази (ЗЕАР) під керуванням МЕ-кВ-індуцибельного
ІРМ-В мінімального промотора в клітинах НЕК293, які стабільно експресують ЗЕАР і СО40 людини, зі значенням ІСзо від приблизно 2,1 х 108 М до 5,4 х 1079 М.
Можна використовувати такі клітини, як, наприклад НЕК-Віне"м СО40. (ІпмімосСеп, м. Сан-
Дієго, штат Каліфорнія, США). СО154 людини можуть бути забезпечені у вигляді тримерного розчинного гібридного білка «лейцинової застібки» СО154. Можна виявити сигнал від секретованої лужної фосфатази й розрахувати значення ІСзхо для інгібування з використанням добре відомих способів.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом зв'язує перший мономер СО154 і другий мономер СО154 у гомотримері СО154 одночасно.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом зв'язує принаймні один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім або вісім залишків СО154 у першому мономері СО154 у межах амінокислотних залишків 182-207 СО154 із БЕО ІЮ МО: 1.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом зв'язує принаймні один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім або вісім залишків СО154 у другому мономері СО154 у межах амінокислотних залишків 176-253 СО154 із ББЕО ІЮ МО: 1.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом зв'язує залишки Е182, 5185, 0186,
А187, Р188, 5214, А215 ії К207 у першому мономері СО154, де нумерація залишків відповідає
ЗЕО ІЮО МО: 1.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом зв'язує залишки Т176, Е177, С178, 0220, 5248, Н249, 5250 і Е253 у другому мономері СО154, де нумерація залишків відповідає
ЗЕО ІЮО МО: 1.
Термін «у межах» означає, що антитіло зв'язує тільки залишки всередині інтервалів амінокислот 182-207, 176-354 або 182-207 і 176-354.
Прикладом такого антитіла є антитіло С4/В89. Оскільки варіабельні області антитіл
С41 8235 і С41! В236 відрізняються одним амінокислотним залишком у ГСОКа порівняно з такими в С41ЇВ89, і оскільки СА! В231 і С4/! 8232 мають ідентичні послідовності МН// із С41І 889, очікується, що ці антитіла також зв'язуватимуть той самий епітоп СО154, що й С4! В89.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом зв'язує СО154 людини паратопними залишками, які знаходяться у МН антитіла. «Паратопний залишок» являє собою залишок у МН або Мі антитіла, який знаходиться у межах 4 А від залишків СО154. Паратопні залишки можуть бути ідентифіковані з кристалічних структур комплексу антитіла з СО154.
Ілюстративне антитіло, яке зв'язує СО154 тільки паратопними залишками УН і в якому Мі. не контактують з антигеном, являє собою антитіло, яке містить МН і МІ. антитіла С4І В89. Оскільки варіабельні області С4/ЇВ235 і С41 8236 відрізняються одним амінокислотним залишком у
ЇСОК2О2 порівняно з такими в С41889, і оскільки С41/8231 ії С41Щ8232 мають ідентичні послідовності МНЛ/І. із СА4І В89, очікується, що ці антитіла також зв'язуватимуть СО154 тільки залишками МН. Антитіла, які зв'язують СО154 у межах залишків 182-207 або 176-354 5ЕО ІЮ
МО: 1 або залишків Е182, 5185, 0186, А187, Р188, 5214, А215 і К207 у першому мономері
С0154 і залишків Т176, Е177, С178, 0220, 5248, Н2г49, 0250 і Е253 у другому мономері СО154 у гомотримері СО154, нездатні активувати тромбоцити, навіть якщо вони здатні взаємодіяти з
ЕсукК, включно з ЕсукІа. Таким чином, ці антитіла можуть мати покращену безпечність порівняно з іншими антитілами, які специфічно зв'язують СО154.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить варіабельну область важкого ланцюга (МН) із БЕО ІЮО МО: 59, причому МН необов'язково містить одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить варіабельну область важкого ланцюга (МН) із ЗЕО ІЮ МО: 59.
Антитіло, яке містить НСОР1, НСОК2 і НСОКЗ із БЕО ІЮ МО: 17, 23 і 30 відповідно або має
НОСОК із МН із БЕО ІЮ МО: 59 або МН із 5ЕО ІО МО: 59, зв'язує СО154 тільки за допомогою УН антитіла. Таким чином, МН із ЗЕО ІЮО МО: 59 або УН, що містить НСОКІ1, НСОМ2 ї НСОКЗ із БЕО
ІЮО МО: 17, 23 і 30 відповідно, може поєднуватися з будь-якою послідовністю варіабельної області легкого ланцюга (МІ), і зв'язування отриманого антитіла з СО154 можна дослідити з використанням аналізів, описаних у цьому документі, щоб створити антитіло, яке специфічно зв'язує СО154. зо Наприклад, МН, що містить НСОКІ, НСОКЗ2 і НСОКЗ із БЕО ІЮО МО: 17, 23 ї 30 відповідно, або МН із ЗЕО ІЮО МО: 59 можна використовувати для скринінгу доменів МІ, здатних утворювати дводоменний специфічний антигензв'язуючий фрагмент, здатний зв'язуватися з СО154.
Скринінг можна здійснити за допомогою способів скринінгу фагового дисплея з використанням, наприклад, комбінаторного ієрархічного подвійного підходу, розкритого в публікації РСТ Мо
М/О1992/01047. У цьому підході використовують окрему колонію, яка містить клон Н- або І1- ланцюга, наприклад МН із БЕО ІО МО: 59, для інфікування повної бібліотеки клонів, що кодують інший ланцюг (І. або Н), і отриманий специфічний до двох ланцюгів антигензв'язуючий домен вибирають відповідно до методик фагового дисплея, як описано в цьому документі, і досліджують на його зв'язування й антагоністичну активність щодо СО154. до Альтернативно МН із ЗЕО ІО МО: 59 або МН, що містить НСОКІ, НСОК2 ї НСОКЗ із ЗЕО ІЮ
МО: 17, 23 і 30 відповідно, може поєднуватися з доменами МІ. існуючих антитіл до СО154 або антитіл до СО154, описаних у цьому документі, і отримане антитіло досліджують на його зв'язування й антагоністичну активність щодо СО154.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить варіабельну область легкого ланцюга (МІ) із БЕО ІЮО МО: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 або 73, причому МІ необов'язково містить одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із БЕО ІО МО: 59 і МІ. із
ЗЕО ІЮ МО: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 або 73.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить варіабельну область легкого ланцюга (МІ) із БЕО ІЮО МО: 66, 72 або 73, причому МІ необов'язково містить одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із БЕО ІО МО: 59 і МІ. із
ЗЕО І МО: 66.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із БЕО ІО МО: 59 і МІ. із
ЗЕО І МО: 72.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із ЗЕО ІЮ МО: 59 і МІ. із
ЗЕО І МО: 73.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить принаймні одне заміщення в області Ес, причому антитіло не активує тромбоцити людини.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом має знижене зв'язування з ЕсУуКІ,
ЕсукПа, ЕсуУвПБ, ЕсувкШа або Есук ПП.
Термін «знижене зв'язування» стосується зниженого зв'язування антитіла за цим винаходом, яке має принаймні одне заміщення в області Ес, з рецептором Есук порівняно зі зв'язуванням батьківського антитіла без заміщення з тим самим рецептором Есук. Знижене зв'язування може являти собою зв'язування, знижене принаймні приблизно в 100 разів, принаймні приблизно в 500 разів, принаймні приблизно в 1000 разів, принаймні приблизно в 5000 разів, принаймні приблизно в 10 000 разів або принаймні приблизно в 20 000 разів. На практиці антитіла, що демонструють «знижене зв'язування» з конкретним ЕсукК, належать до антитіл, які мають статистично незначущу ефекторну функцію, опосередковану конкретним
Есук.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить принаймні одне заміщення в області Ес.
У деяких варіантах втілення принаймні одне заміщення в області Ес являє собою заміщення
І234А, 1235А, п237А, Р2385, М252У, 52541, Т256Е, Н2б8А, АЗ305 або РЗ3315, де нумерація залишків відповідає індексу ЕО.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить заміщення І 234А, І 235А, 237А, Р2385, Н2б8А, АЗ305 або РЗ3315 у області Ес, де нумерація залишків відповідає індексу
ЕО.
У деяких варіантах втілення принаймні одне заміщення в області Ес являє собою заміщення
М234А, 5237А, Р2385, М252У, 52541, Т256Е Н2б8А, У3091, АЗ305 або РЗ315, де нумерація залишків відповідає індексу ЕО.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить заміщення УМ234А, 5237А,
Р2г385, Н2б8А, МЗ309І, АЗ305 і РЗ315 у області Ес, де нумерація залишків відповідає індексу Е0О.
У винаході також запропоновано антагоністичне антитіло або його антигензв'язуюча ділянку, які специфічно зв'язуються з СО154 із БЕО ІО МО: 1, що містять важкий ланцюг із БЕО ІЮ МО: 80 і легкий ланцюг із БЕО ІЮ МО: 81. зо У винаході також запропоновано антагоністичне антитіло або його антигензв'язуюча ділянку, які специфічно зв'язуються з СО154 із ЗЕО ІО МО: 1, що містять важкий ланцюг із ФЕО ІЮ МО: 82 і легкий ланцюг із БЕО ІЮ МО: 81.
У винаході також запропоновано антагоністичне антитіло або його антигензв'язуюча ділянку, які специфічно зв'язуються з СО154 із БЕО ІО МО: 1, що містять важкий ланцюг із БЕО ІО МО: 83 і легкий ланцюг із зЕО ІЮ МО: 81.
ЗЕО ІЮ МО: 80 (МН С41Ї В89 на ІдсС15ідта: С4І! В231 НС)
ОМОЇ МОБСАЕУККРОББЗУКУЗСКАВЗОС,СТЕЗЗУИІЗУМУВОАРИСИЇ ЕМ МСУМЗРІЄМТММАОК
ЕОСАМТІТАОЕЗТОТАМУМЕЇ 551 В5ЕОТАУУУСАВЗАУМООЇ ОММУСОСТІ МТГУЗЗАБВТКОаРЗМЕРІ А
РЗБКЗТЗаатАА ас УКОМЕРЕРУТУБУУМЗИАІ ТЗаМНТЕРАМІ О550І 51 55УУТУРБЗЗБІ СТО
ТМІСМУМНКРУЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕААСАЗЗУНІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУМУМ
РУ5АЕОРЕУКЕМУ УМрИамМЕМНМАКТКРАЕЕОУМЗТУАМУБМІ ТМ НОМУ МЕОКЕМКОСКУЗМКАЇ РО
ЗІЕКТІЗКАКИОРАВЕРОМУУТІ РРОЗВЕЕМТКМОМ5І ТС УКЕЕМРЗОІАМЕМ ЕЗМООРЕММУКТТРРМІ. розравзгЕвгУЗкІі ТМоКЗАМОСС,ММЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКОБІ 5І РОК
ЗЕО ІО МО: 81 (легкий ланцюг СА В89 і С4І В231)
РІОМТО5РБЗБІ БАБМаОВМТІТ СААБЗОБІЗЗМ ММУМООКРИКАРКІ І МУМАМІ.
ОоБамМРЗАЕЗИаЗаБатоОгТІ ТІ ОРЕОБАТУМСОО5ОБІРМ ТЕО, ТКМУЕІКАТУМААРБЗМУРІЕРР
ЗРЕОЇ КБатАЗУМСТ ЇЇ ММЕМРАЕАКМОМ КМОМАЇ О5аМЗОЕЗМТЕООЗКОБЗТУБІ 55ТІ ТІ КАВУ
ЕКНКУМУМАСЕМТНОаІ 55РУТКЗЕМАСЕС
ЗЕО ІЮ МО: 82 (МН С41 В89 на ІдсС15ідтамтЕ)
ОМОЇ МОБСАЕУККРОББЗУКУЗСКАВЗОС,СТЕЗЗУИІЗУМУВОАРИСИЇ ЕМ МСУМЗРІЄМТММАОК
ЕОСАМТІТАОЕЗТОТАМУМЕЇ 551 В5ЕОТАУУУСАВЗАУМООЇ ОММУСОСТІ МТГУЗЗАБВТКОаРЗМЕРІ А
РЗБКЗТЗаатАА ас УКОМЕРЕРУТУБУУМЗИАІ ТЗаМНТЕРАМІ О550І 51 55УУТУРБЗЗБІ СТО
ТМІСМУМНКРУЬМТКМОККУМЕРКЗСОКТНТСРРОРАРЕААСАЗ5ОУН ЕРРКРКОТІ МІТВЕРЕМТСУММУ
РУ5АЕОРЕУКЕМУ УМрИамМЕМНМАКТКРАЕЕОУМЗТУАМУБМІ ТМ НОМУ МЕОКЕМКОСКУЗМКАЇ РО
ЗІЕКТІЗКАКИОРАВЕРОМУУТІ РРОЗВЕЕМТКМОМ5І ТС УКЕЕМРЗОІАМЕМ ЕЗМООРЕММУКТТРРМІ. розравзгЕвгУЗкІі ТМоКЗАМОСС,ММЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКОБІ 5І РОК
ЗЕО І МО: 83 (МН СА В89 на ІдсСг25ідта)
ОМОЇ МОБСАЕУККРОББЗУКУЗСКАВЗОС,СТЕЗЗУИІЗУМУВОАРИСИЇ ЕМ МСУМЗРІЄМТММАОК
ЕОСАМТІТАОЕЗТОТАМУМЕЇ 551 В5ЕОТАУУУСАВЗАУМООЇ ОММУСОСТІ МТГУЗЗАБВТКОаРЗМЕРІ А 6о РОЗА5ЗТЗЕБЗТААЇ СІ УКОМЕРЕРУТУБМУМЗИаАГТЗОМНТЕРАМІ О55ОИ1 51 55 УРЗЗМЕИаТтО
ТУТСММОНКРОЬМТКМОКТУЕВКССУМЕСРРОРАРРАААЗЗУНБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМУТСУУМОМ5
АЕОРЕМОЄМУ УМрамЕМНМАКТКРАЄЕЄЕОЕМЗТЕВУУМУІ ТМ НОБУЛ МСОКЕУКСКУЗМКаї РЕ
КТІЗКТКОаОРАБЕРОММУТІ РРОВЕЕМТКМОМУБІ ТС УК ЕУРБОІАМЕМЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ 05 равгг кі УрКЗАМООСММУЕЗСЗУМНЕАЇ НМНУТОК5БІ 5І РОК
Імунні ефекторні властивості антитіл за цим винаходом можна посилювати або пригнічувати через Ес-модифікації за допомогою методик, відомих фахівцям у цій галузі. Наприклад, Ес- ефекторні функції, такі як зв'язування С1д, комплементзалежна цитотоксичність (СОС), антитілозалежна клітинноопосередкована цитотоксичність (АЮСС), фагоцитоз, негативна регуляція рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В-клітинного рецептора; ВСК) тощо можна реалізувати й/або контролювати шляхом модифікацій залишків у Ес, що відповідає за ці види активності. Наприклад, в антитіла за цим винаходом можуть бути введені Ес-заміщення
М234А/5237А/Р2385, М234АК237А/Н2680, Н2гб8АЛ/ЗОЗ9І /АЗ3305/Р331 або
М234А/5237А/Р2385/Н268АЛ/ЗОЗІ /АЗ3305/Р3315 (міжнародна патентна публікація Мо
УМО11/066501) або І 234А/ 235А/4237А/Р2385/Н26ВА/АЗЗОБ/РЗЗ15.
Зв'язування антитіл за цим винаходом із ЕСукКІ, ЕсукКПа, ЕсСУКкІВ, ЕсукШа і ЕсуУКкПЬ можна оцінити з використанням рекомбінантних розчинних форм або пов'язаних із клітиною форм рецепторів Есу. Наприклад, вимірювання прямого або непрямого, тобто конкурентного, зв'язування, можуть бути застосовані для оцінки відносних показників афінності й авідності антитіл за цим винаходом до різних ЕсуК. В ілюстративному аналізі зв'язування досліджуваного антитіла з розчинним сук, іммобілізованим на планшеті, оцінюють із використанням конкурентного зв'язування між 1 мкг/мл біотинільованого ІдсС1 людини й серійними розведеннями досліджуваного антитіла, попередньо введеного в комплекс із антигеном.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом має знижену антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АЗКЦ), антитілозалежний клітинний фагоцитоз (АЗКФ) і/або комплементзалежну цитотоксичність (КЗЦ). «Антитілозалежна клітинна цитотоксичність», «антитілозалежна клітинноопосередкована цитотоксичність» або «АЗКЦ» є механізмом індукції загибелі клітин, який залежить від взаємодії покритих антитілами клітин-мішеней з ефекторними клітинами, які мають літичну активність, такими як природні клітини-кілери, моноцити, макрофаги й нейтрофіли, через Ес-гамма- 3о рецептори (ЕБсукК), що експресуються на ефекторних клітинах. Наприклад, НкК-клітини експресують рецептор ЕсукКІШа, тоді як моноцити експресують рецептори ЕсукКІ, ЕсуКІ! і
ЕсукШа. Для оцінки активності АЗКЦ антитіл за цим винаходом антитіло можна додавати до клітин-мішеней у комбінації з імунними ефекторними клітинами, які можуть бути активовані комплексами антиген-антитіло, що призводить до цитолізу клітини-мішені. Зазвичай цитоліз виявляють за вивільненням із лізованих клітин мітки (наприклад, радіоактивних субстратів, флуоресцентних барвників або природних внутрішньоклітинних білків). Приклади ефекторних клітин для таких аналізів включають мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК) і ПК- клітини. Приклади клітин-мішеней включають клітини 01.1 дигкаї (АТОСФ СКІ -10915 мМ) або Т- клітини, що експресують СО154. «Антитілозалежний клітинний фагоцитоз» (АЗКФ) стосується механізму видалення покритих антитілами клітин-мішеней шляхом поглинання фагоцитарними клітинами, такими як макрофаги або дендритні клітини. АЗКФ можна оцінити з використанням як ефекторних клітин макрофагів, отриманих із моноцитів, а як клітин-мішеней -- клітин 01.1 дигКкаї, що експресують СО154, створених із можливістю експресії зеленого флуоресцентного білка (СЕР) або іншої міченої молекули. Співвідношення ефекторні клітини : клітини-мішені може становити, наприклад, 4: 1.
Ефекторні клітини можна інкубувати з клітинами-мішенями протягом 4 годин із досліджуваним антитілом до СО154 або без нього. Після інкубації клітини можна відокремити з використанням акутази. Макрофаги можуть бути ідентифіковані з використанням антитіл до СО11Б ї СО14, зв'язаних із флуоресцентною міткою, а відсоток фагоцитозу можна визначати на основі 90 флуоресценції СЕР у макрофагах СО11-С014: з використанням стандартних способів. «Комплементзалежна цитотоксичність» або «КЗЦ» стосується механізму індукції загибелі клітин, у якому Ес-ефекторний домен антитіла, зв'язаного з мішенню, зв'язується з компонентом
С14 комплементу й активує його, що, у свою чергу, активує каскад комплементу, призводячи до загибелі клітини-мішені. Активація комплементу може також призвести до відкладення компонентів комплементу на поверхні клітини-мішені, що полегшує АЗКЦ шляхом зв'язування рецепторів комплементу (наприклад, СКЗ) на лейкоцитах. КЗЦ клітин, що експресують СО154, можна виміряти, наприклад, шляхом висівання клітин «игКкаї у відповідне середовище, додавання до суміші антитіл до СО154 з наступним додаванням об'єднаної людської сироватки.
Після періоду інкубації відсоткову долю (95) лізованих клітин можна визначити як 95 клітин, во забарвлених йодидом пропідію, в аналізі РАС5З із використанням стандартних способів.
Терміни «знижена АЗКЦ», «знижена КЗЦ» і «знижена АЗКФ» стосуються індукованої антитілом АЗКЦ, КЗЦ і/або АЗКФ, що є статистично незначущими в стандартних аналізах, у яких вимірюють АЗКЦ, КЗЦ і/або АЗКФ, таких як аналізи, описані в цьому документі, і в аналізах, описаних у патенті США Мо 8,871,204.
Антитіла за цим винаходом з бажаною афінністю й профілем нейтралізації, можна вибрати з бібліотек різновидів або фрагментів шляхом пенінгу («просіювання») із СО154 людини або
СО0154 мавпи-ігрунки й необов'язково шляхом додаткового дозрівання афінності антитіла. В ілюстративному циклі пенінгу фагові бібліотеки можна піддавати пенінгу з СО154 мавпи-ігрунки.
Альтернативно антитіла за цим винаходом можна створювати шляхом імунізації мишей за допомогою СО154 людини, або СО154 мавпи-ігрунки, або обома, і проводити скринінг гібридом на зв'язування з СЮО154 людини й подальше оцінювання антагоністичних властивостей антитіл із використанням способів, описаних у цьому документі.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом конкурує за зв'язування з СО154 з антитілом, яке містить УН із ЕО ІЮ МО: 59 і МІ із БЕО ІЮ МО: 66.
Конкуренцію між специфічним зв'язуванням із СО154 антитіл за цим винаходом, які містять певні послідовності МН і Мі, можна досліджувати іп міто з використанням добре відомих способів. Наприклад, зв'язування антитіла, міченого МНЗ-естером М5О Зийо-Тад м, із СЮО154 за присутності неміченого антитіла можна оцінити за допомогою аналізів ЕГІ5А або Віоасоге, або, щоб продемонструвати конкуренцію з антитілами за цим винаходом, можна використати проточну цитометрію. Антитіло конкурує за зв'язування з СО154 з еталонним антитілом (тобто антитілом, яке містить МН із БЕО ІЮ МО: 59 і МІ із БЕО ІО МО: 66), якщо антитіло інгібує зв'язування еталонного антитіла з СО154 на 80 95 або більше, наприклад на 85 95 або більше, 90 95 або більше або 95 95 або більше.
У деяких варіантах втілення МН із БЕО ІЮ МО: 59 можна об'єднувати з МІ. будь-якого з антитіл до СО154, описаних у міжнародних патентних публікаціях Мо УМО1993/08207,
МУО1994/10308, М/01996/40918, М/01993/009812, М/01999/051258, МО01995/006480,
МУО1995/006481, МуУО1995/006666, УМ/О2001/002057, М/01997/017446, МО01999/012566,
МО2001/068860, УУО2005/003175, М/О2006/033702, МО2006/030220, МО2008/118356,
УМО2012/052205, МО2012/138768, УМО2012/138768, УМО2013/055745 і УМ/О2013/056068, для 3о створення антагоністичного антитіла до СО154. Зв'язувальну й антагоністичну активність отриманих антитіл можна дослідити з використанням аналізів і протоколів, описаних у цьому документі.
У винаході також запропоновано антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує СО154 із
ЗЕО ІЮ МО: 1, що містить НСОКІ, НОСОК? і НСОКЗ із
ЗЕО ІЮО МО: 16, 22 і 29 відповідно;
ЗЕО ІЮ МО: 17, 23 і 30 відповідно;
ЗЕО ІЮО МО: 16, 24 і 31 відповідно;
ЗЕО ІЮО МО: 18, 25 і 32 відповідно;
ЗЕО ІЮО МО: 19, 26 і 33 відповідно; до 5ЕО ІЮ МО: 20, 27 і 34 відповідно; або
ЗЕО ІЮ МО: 21, 28 і 35 відповідно.
У винаході також запропоновано антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує СО154 із
ЗЕО ІЮ МО: 1, що містить НСОКІ, НОСОК? і НСОКЗ із
ЗЕО ІЮО МО: 16, 22 і 29 відповідно;
ЗЕО ІЮ МО: 17, 23 і 30 відповідно;
ЗЕО ІЮО МО: 16, 24 і 31 відповідно;
ЗЕО ІЮО МО: 18, 25 і 32 відповідно;
ЗЕО ІЮО МО: 19, 26 і 33 відповідно; 5ЕО ІЮ МО: 20, 27 і 34 відповідно; або
ЗЕО ІЮ МО: 21, 28 і 35 відповідно і СОМ, І СОК2 ії СО із
ЗЕО ІЮО МО: 36, 43 і 51 відповідно;
ЗЕО ІЮ МО: 37, 44 і 52 відповідно;
ЗЕО ІЮ МО: 38, 45 і 53 відповідно;
ЗЕО ІЮО МО: 39, 46 і 54 відповідно;
ЗЕО ІЮО МО: 40, 47 і 55 відповідно;
ЗЕО ІЮ МО: 41, 47 і 56 відповідно;
ЗЕО ІЮ МО: 42, 48 і 57 відповідно; 5ЕО ІЮ МО: 37, 49 і 52 відповідно; або
ЗЕО ІЮО МО: 37, 50 і 52 відповідно.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОК1, НСОК2 ії НСОКЗ із 5ЕО ІО МО: 16, 22 і 29 відповідної І СОР1, 1 СОР2 і СО із БЕО ІЮ МО: 36, 43 і 51 відповідно; або МН із БЕО ІЮО МО: 58 і МІ із БЕО ІЮО МО: 65.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОК1, НСОК2 ії НСОКЗ із 5ЕО ІО МО: 17, 23 і 30 відповідно і ГСОК1, СОК2іІ СОР із БЕО ІЮ МО: 37, 44 і 52 відповідно; або МН із БЕО ІЮО МО: 59 і МІ із БЕО ІЮ МО: 66.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОК1, НСОК2 ії НСОКЗ із 5ЕО ІО МО: 16, 24 і 31 відповідно і ГСОК1, СОК2іІ СОР із БЕО ІЮО МО: 38, 45 і 53 відповідно; або МН із БЕО ІЮО МО: 60 і МІ із БЕО ІЮО МО: 67.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОК1, НСОК2 ії НСОКЗ із 5ЕО ІО МО: 18, 25 і 32 відповідно і ГСОК1, СОК2іІ СОР із БЕО ІЮО МО: 39, 46 і 54 відповідно; або МН із БЕО ІО МО: 61 і МІ із БЕО ІО МО: 68.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОК1, НСОК2 ії НСОКЗ із 5ЕО ІО МО: 19, 26 і 33 відповідно і ГСОК1, СОК2іІ СОР із БЕО ІЮО МО: 40, 47 і 55 відповідно; або МН із БЕО ІЮО МО: 62 і МІ із БЕО ІЮО МО: 69.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОКІ, НСОК2 ії НСОКЗ із 5ЕО ІЮО МО: 20, 27 і 34 відповідно і ГСОК1, СОК2іІ СОР із БЕО ІЮО МО: 41, 47 і 56 відповідно; або МН із БЕО ІЮО МО: 63 і МІ із БЕО ІЮО МО: 70.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОКІ, НСОК2 ії НСОКЗ із 5ЕО ІО МО: 21, 28 і 35 відповідно і ГСОК1, СОК2іІ СОР із БЕО ІЮО МО: 42, 48 і 57 відповідно; або МН із БЕО ІЮО МО: 64 і МІ із БЕО ІЮ МО: 71.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОК1, НОСОК і НСОКЗ із 5ЕО ІО МО: 17, 23 і 30 відповідно і ГСОК1, СОК2іІ СОР із БЕО ІЮО МО: 37, 49 і 52 відповідно; або МН із БЕО ІЮО МО: 59 і МІ із БЕО ІЮО МО: 72.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОК1, НСОК2 ії НСОКЗ із
ЗЕО ІО МО: 17, 23 і 30 відповідно і ГСОК1, СОК2 і СОР із БЕО ІЮО МО: 37, 50 і 52 відповідно; або МН із БЕО ІЮО МО: 59 і МІ із БЕО ІЮО МО: 73.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН і МІ, причому МН містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 58, 59, 60, 61, 62, 63 або 64. 3о У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН і МІ, причому МІ. містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 або 73.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із БЕО ІЮО МО: 58, 59, 60, 61,62,63 або 64 і МІ із БЕО ІЮ МО: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 або 73.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить амінокислотні послідовності
НСОВР1, НСОР2 ії НСОКЗ МН із 5ЕО ІО МО: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 або 73 і амінокислотні послідовності Ї/СОКІ1, І СОК2 й СОКЗ МІ із БЕО ІЮ МО: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 або 73, де
СОБЕ визначені відповідно до Кабаї, Споїпіа і/або ІМОТ.
Різновиди антитіл за цим винаходом, які містять амінокислотні послідовності МН або Мі, наведені в таблиці 8, таблиці 9 і таблиці 14, перебувають у межах обсягу цього винаходу. до Наприклад, різновиди можуть містити одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень у МН і/або Мі, які не чинять негативного впливу на властивості антитіла. У деяких варіантах втілення ідентичність послідовності може становити приблизно 90 95, 91 95, 92 95, 93
Фо, 94 95, 95 90, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 амінокислотної послідовності МН або Мі за цим винаходом.
Відсоток ідентичності між двома послідовностями залежить від кількості ідентичних положень, загальних для послідовностей (тобто 95 ідентичності - кількість ідентичних положень / загальна кількість положень х 100), з урахуванням кількості гепів і довжини кожного гепу, який необхідно ввести для оптимального вирівнювання двох послідовностей. 5О Відсоток ідентичності між двома амінокислотними послідовностями можна визначити з використанням алгоритму Е. Меуег5 і МУ. МіШег (Сотриї. Аррі. Віовсі., 4:11-17 (1988)), який був введений у програму АГІСМ (версія 2.0) з використанням таблиці «ваги» залишків РАМ120, штрафу за продовження гепу 12 і штрафу за геп 4. Крім того, відсоток ідентичності між двома амінокислотними послідовностями можна визначити з використанням алгоритму Меедіетап і ууип5сй, описаного в публікації (9). Мої. Вісі. 48:444-453 (1970)), який був уведений у програму
САР у програмному забезпеченні СО (доступне за інтернет-адресою ПИр:// м/м/м/ дсд сот), з використанням матриці Віо55!цт 62 або матриці РАМ250О і «вагою» гепу 16, 14, 12, 10, 8, 6, або 4 і «вагою» за продовження гепу 1, 2, 3, 4, 5 або 6.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить УН, що є принаймні на 90 95, 6о0 90 90, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МН із БЕО ІЮ МО:
58, 59, 60, 61, 62, 63 або 64, причому антитіло демонструє одну або більше з наступних властивостей: імунний комплекс антитіла й 5пС0О0154 не активує тромбоцити, причому активацію тромбоцитів вимірюють за експресією Р-селектину на поверхні тромбоцитів; зв'язується з СО154 із константою дисоціації (Ко) приблизно 5 х 109 М або менше за результатами вимірювання Ко із використанням системи РгоїеОп ХРЕЗ6 відповідно до плану експерименту, описаного в розділі «Вимірювання афінності» у прикладі 1; інгібує опосередковану СО154 проліферацію В-клітин людини зі значенням ІСзо приблизно 2,7 х 109 М або менше; або інгібує опосередковану СО154 експресію секретованої ембріональної лужної фосфатази (ЗЕАР) під керуванням МЕ-кВ-індуцибельного інтерферон-В (ІЕМ-В) мінімального промотора в клітинах НЕК293, які стабільно експресують ЗЕАР і СО40 людини, зі значенням ІСзо приблизно 2,1 х 108 М або менше.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Мі, що є принаймні на 90 95, 90 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МІ. із БЕО ІЮ МО: 65, 66,67, 68, 69, 70, 71, 72 або 73, причому антитіло демонструє одну або більше з наступних властивостей: імунний комплекс антитіла й 5пС0154 не активує тромбоцити, причому активацію тромбоцитів вимірюють за експресією Р-селектину на поверхні тромбоцитів; зв'язується з СО154 із константою дисоціації (Ко) приблизно 5 х 109 М або менше за результатами вимірювання Ко із використанням системи РгоїеОп ХРЕЗ6 відповідно до плану експерименту, описаного в розділі «Вимірювання афінності» у прикладі 1; інгібує опосередковану СО154 проліферацію В-клітин людини зі значенням ІСзо приблизно 2,7 х 109 М або менше; або інгібує опосередковану СО154 експресію секретованої ембріональної лужної фосфатази (ЗЕАР) під керуванням МЕ-кВ-індуцибельного інтерферон-В (ІЕМ-В) мінімального промотора в клітинах НЕК293, які стабільно експресують ЗЕАР і СО40 людини, зі значенням ІСзо приблизно 2,1 х 108 М або менше.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить УН, що є принаймні на 90 95, 3о0 90 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МН із БЕО ІЮ МО: 58, 59, 60, 61, 62, 63 або 64, і МІ що є принаймні на 90 95, 90 95, 92 о, 93 Фо, 94 95, 95 У, 96 бо, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МІ із БЕО ІО МО: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 або 73, причому антитіло демонструє одну або більше з наступних властивостей: імунний комплекс антитіла й 5пС0О0154 не активує тромбоцити, причому активацію тромбоцитів вимірюють за експресією Р-селектину на поверхні тромбоцитів; зв'язується з СО154 із константою дисоціації (Ко) приблизно 5 х 109 М або менше за результатами вимірювання Ко із використанням системи РгоїеОп ХРЕЗ6 відповідно до плану експерименту, описаного в розділі «Вимірювання афінності» у прикладі 1; інгібує опосередковану СО154 проліферацію В-клітин людини зі значенням ІСзо приблизно до 2,7 х 109 М або менше; або інгібує опосередковану СО154 експресію секретованої ембріональної лужної фосфатази (ЗЕАР) під керуванням МЕ-кВ-індуцибельного інтерферон-В (ІЕМ-В) мінімального промотора в клітинах НЕК293, які стабільно експресують ЗЕАР і СО40 людини, зі значенням ІСзо приблизно 2,1 х 108 М або менше.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН, що є принаймні на 90 95, 91 95,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МН із БЕО ІЮ МО: 58.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить УН, що є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МН із ЗЕО ІЮ МО: 59.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить УН, що є принаймні на 90 95, 91 95,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МН із БЕО ІЮ МО: бо.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить УН, що є принаймні на 90 95, 91 95,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МН із БЕО ІЮ МО: 61.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить УН, що є принаймні на 90 95, 91 95,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МН із БЕО ІЮ МО: 62.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить УН, що є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 90, 94 9, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МН із ЗЕО ІЮ МО: 63.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить УН, що є принаймні на 90 95, 9195,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МН із БЕО ІЮ МО: 64.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Мі., що є принаймні на 90 95, 91 95,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною Мі. із ФЕО ІЮ МО: 65.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Мі, що є принаймні на 90 95, 91 95,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною Мі. із ФЕО ІЮ МО: 66.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Мі, що є принаймні на 90 95, 91 95,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 905, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МІ. із БЕО ІЮО МО: 67.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Мі, що є принаймні на 90 95, 91 95,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною Мі. із ФЕО ІЮ МО: 68.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Мі, що є принаймні на 90 95, 91 95,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною Мі. із ФЕО ІЮ МО: 69.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Мі, що є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 9, 94 90, 95 95, 96 905, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МІ. із ЗЕО ІЮ МО: 70.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Мі, що є принаймні на 90 95, 91 95,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною Мі. із ФЕО ІЮ МО: 71.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Мі., що є принаймні на 90 95, 91 95,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною Мі. із ФЕО ІЮ МО:
Зо 72.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Мі, що є принаймні на 90 95, 91 95,92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною Мі. із ФЕО ІЮ МО: 73.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із БЕО ІО МО: 58 і МІ. із
ЗЕО ІО МО: 65, причому УН, МІ. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із БЕО ІО МО: 59 ії МІ. із
ЗЕО ІЮО МО: 66, причому УН, МІ. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, до п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із БЕО ІЮ МО: 60 їі МІ. із
ЗЕО ІО МО: 67, причому МН, МІ. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із БЕО ІО МО: 61 ї МІ. із
ЗЕО ІЮО МО: 68, причому УН, МІ. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень. 5О У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із БЕО ІО МО: 62 ії МІ. із
ЗЕО ІО МО: 69, причому УН, М. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із БЕО ІО МО: 63 і МІ. із
ЗЕО ІЮО МО: 70, причому МН, Мі. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із ЗЕО ІО МО: 64 і МІ. із
ЗЕО ІО МО: 71, причому МН, М. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири,
п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із БЕО ІО МО: 59 і МІ. із
ЗЕО ІО МО: 72, причому МН, МІ. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить МН із БЕО ІО МО: 59 і МІ. із
ЗЕО ІО МО: 73, причому МН, МІ. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить амінокислотні послідовності
НСОК1, НСОМ2, НСОКЗ, СОМ, І СОК2 і СО, наведені в таблиці 8, таблиці 9 і таблиці 14, або їхні консервативні модифікації, причому антитіла зберігають бажані функціональні властивості антагоністичних антитіл, що специфічно зв'язують СО154.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОК1, НСОК2 і НСОКЗ із
ЗЕО ІЮО МО: 16, 22 і 29 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОК1, НСОК2 ії НСОКЗ із
ЗЕО ІЮ МО: 17, 23 і 30 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОКІ, НСОК2 ії НСОКЗ із
ЗЕО ІЮО МО: 16, 24 і 31 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОК1, НСОК2 ії НСОКЗ із
ЗЕО ІЮО МО: 18, 25 і 32 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОК1, НСОК2 ії НСОКЗ із
ЗЕО ІЮО МО: 19, 26 і 33 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОК1, НСОК2 і НСОКЗ із
ЗЕО ІЮО МО: 20, 27 і 34 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить НСОК1, НСОК2 ії НСОКЗ із
ЗЕО ІЮО МО: 21, 28 і 35 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Ї/СОК1, І СОК2 і І СО із зо ЗЕО ІЮО МО: З6, 43 і 51 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Г/СОК1, І СОК2 і І СО із
ЗЕО ІЮО МО: 37, 44 і 52 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Г/СОК1, І СОК2 і І СО із
ЗЕО ІЮО МО: 38, 45 і 53 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Ї/СОК1, І СОК2 ії І СОКЗ із
ЗЕО ІЮО МО: 39, 46 і 54 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Г/СОК1, І СОК2 і І СО із
ЗЕО ІЮО МО: 40, 47 і 55 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Ї/СОК1, І СОК2 і І СО із до ЗЕО ІЮО МО: 41, 47 і 56 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Г/СОК1, І СОК2 і І СО із
ЗЕО ІО МО: 42, 48 і 57 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить Г/СОК1, І СОК2 і І СО із
ЗЕО ІЮО МО: 37, 49 і 52 відповідно і їхні консервативні модифікації.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить ЇСОК1, І СОК2 ії І СОКЗ із
ЗЕО ІЮО МО: 37, 50 і 52 відповідно і їхні консервативні модифікації.
Антитіла за цим винаходом, що містять певні послідовності НСОКІ, НСОК2, НСОКЗ,
ІГСОК1, І СО2ії СОКЗ і їхні консервативні модифікації, демонструють одну або більше з наступних властивостей: імунний комплекс антитіла й 5пС0О0154 не активує тромбоцити, причому активацію тромбоцитів вимірюють за експресією Р-селектину на поверхні тромбоцитів; зв'язуються з СО154 із константою дисоціації (Ко) приблизно 5 х 109 М або менше за результатами вимірювання Ко із використанням системи РгоїеОп ХРЕЗ6 відповідно до плану експерименту, описаного в розділі «Вимірювання афінності» у прикладі 1; інгібують опосередковану СО154 проліферацію В-клітин людини зі значенням ІСвхо приблизно 2,7 х 109 М або менше; або інгібують опосередковану СО154 експресію секретованої ембріональної лужної фосфатази (ЗЕАР) під керуванням МЕ-кВ-індуцибельного інтерферон-В (ІЕМ-В) мінімального промотора в клітинах НЕК293, які стабільно експресують ЗЕАР і СО40 людини зі значенням ІСзо приблизно бо 2,1 х 108 М або менше.
Термін «консервативна модифікація» стосується модифікацій амінокислот, які не мають значущого впливу або які не змінюють характеристики зв'язування антитіла, що містить амінокислотні послідовності. Консервативні модифікації включають амінокислотні заміщення, додавання й делеції. Консервативні заміщення являють собою такі заміщення, у яких амінокислота замінюється амінокислотним залишком з аналогічним бічним ланцюгом.
Сімейства амінокислотних залишків, які мають подібні бічні ланцюги, є добре визначеними й включають амінокислоти з кислими бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту), основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, цистеїн, серин, треонін, тирозин, триптофан), ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, фенілаланін, триптофан, гістидин, тирозин), аліфатичними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, серин, треонін), амідними (наприклад, аспарагін, глутамін), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та сірковмісними бічними ланцюгами (цистеїн, метіонін). Крім того, будь-який нативний залишок у поліпептиді також можна замістити аланіном, як описано вище, для аланін- сканувального мутагенезу (Масі еппап еї аї!., Асі Рпузіої. Зсапа. Зиррі. 643:55-67, 1998; Зазакі еї а!., Аду. Віорпув. 35:1-24, 1998). Амінокислотні заміщення в антитілах винаходу можуть бути виконані добре відомими способами, наприклад шляхом ПЛР-мутагенезу (патент США Мо 4,683,195). Альтернативно, бібліотеки різновидів можна отримувати з використанням відомих способів, наприклад із використанням випадкових (ММК) або невипадкових кодонів, наприклад рУК-кодонів, які кодують 11 амінокислот (Аа, Суб, Ав5р, Сім, СУ, Гуз, Ап, Аго, Зег, Туг, Тгр).
Характеристики отриманих різновидів антитіл можна визначити з використанням аналізів, описаних у цьому документі.
Хоча варіанти втілення, проілюстровані в цих прикладах, містять пари варіабельних областей, одну з важкого ланцюга й одну з легкого ланцюга, фахівцеві в цій галузі буде зрозуміло, що альтернативні варіанти втілення можуть містити єдину варіабельну область важкого або легкого ланцюга. Єдину варіабельну область можна використовувати для скринінгу на варіабельні домени, здатні формувати специфічний щодо двох доменів антигензв'язуючий 3о фрагмент, який здатен, наприклад, специфічно зв'язуватися з СО154. Скринінг можна здійснити за допомогою способів скринінгу фагового дисплея з використанням, наприклад, комбінаторного ієрархічного подвійного підходу, розкритого в міжнародній патентній публікації
Мо М/О1992/01047, як описано в цьому документі.
Антитіла за цим винаходом можна створювати з використанням різноманітних методик.
Наприклад, для створення моноклональних антитіл можна використовувати гібридомний спосіб
Копіег апа Міївівєїп, Майте 256:495, 1975. У гібридомному способі мишу або іншу тварину- хазяїна, таку як хом'як, щур або мавпа, імунізують за допомогою СО154 людини, мавпи-ігрунки або яванського макака або фрагментами СО154, наприклад розчинними формами СО154, із подальшим злиттям клітин селезінки імунізованих тварин із мієломними клітинами з використанням стандартних способів для отримання гібридомних клітин (содіподо, Мопосіопаї
Апіїродієв: Рііпсірієє апа Ргасіїсе, рр.59-103 (Асадетіс Ргез5, 1986)). Проводять скринінг колоній, що утворюються з одиночних імморталізованих гібридомних клітин, на продукування антитіл із бажаними властивостями, такими як специфічність зв'язування, перехресна реактивність (або їх відсутність) і афінність до антигена.
Для отримання антитіл за цим винаходом можна використовувати різноманітних тварин- хазяїнів. Наприклад, для створення антитіл можна використовувати мишей лінії Ваїр/с.
Антитіла, отримані в мишах Ваїр/с і інших тваринах, відмінних від людини, можна гуманізувати з використанням різноманітних технологій для створення більшої кількості послідовностей, подібних до людських. Типові методики гуманізації, включаючи відбір каркасів людських акцепторів, є відомими і включають СОК-щеплення (патент США Мо 5,225,539), БОК-щеплення (патент США Мо 6,818,749), технологію зміни поверхні (Раїїп, Мої Іттипої 28:489--499, 1991), зміну поверхні залишків, що визначають специфічність (ЗОК) (публікація патенту США Мо 20100261620), адаптації для людини (або адаптація до каркаса людського походження) (публікація патенту США Мо 052009/0118127), супергуманізації (патент США Мо 7,709,226) і керованої селекції (О5Боцгп еї а! (2005) Меїштоаз 36:61-68, 2005; патент США Мо 5,565,332). У цих способах СОР вихідних антитіл переносять на людські каркаси, які можуть бути вибрані на основі їхньої загальної гомології з батьківськими каркасами, грунтуючись на інформації про довжину, гомологію або канонічну структуру СОК каркаса, або їх комбінацію.
Гуманізовані антитіла можна додатково оптимізувати для покращення їхньої селективності 6о0 або афінності до бажаного антигена шляхом включення змінених залишків підтримки каркаса для збереження афінності зв'язування (зворотні мутації) за допомогою методик, таких як ті, що розкриті й описані в міжнародній патентній публікації Мо М/090/007861 і в міжнародній патентній публікації Мо М/092/22653, або шляхом введення різновидів у будь-яку з СОК для покращення, наприклад, афінності антитіла.
Трансгенних мишей, що несуть людські локуси імуноглобулінів (Ід) у своєму геномі, можна використовувати для генерування людських антитіл проти білка-мішені, і це описано, наприклад, у міжнародній патентній публікації Мо УМО90/04036, патенті США Мо 6150584, міжнародній патентній публікації Мо Уу/О99/45962, міжнародній патентній публікації Мо
УМО02/066630, міжнародній патентній публікації Мо УУО02/43478, І опрега єї а! (1994) Маїшге 368:856-9; Стееп єї а! (1994) Маїште Сепеї. 7:13-21; Стеєп а даКороміїз (1998) Ехр. Меа. 188:483-95; І опрега апа Низлаг (1995) Іпії. Нем. Іттипої. 13:65-93; Вгиддетапп еї аї (1991) Єиг.
У. Іттипої. 21:1323-1326; Ріпм/Іа еї а! (1996) Маї. Віоїесппої. 14:845-851; Мепае? еї а! (1997)
Маї. Сепеї. 15:146-156; Стееп (1999) 9. Іттипої. Меїнодв 231:11-23; Мапд еї а! (1999) Сапсег
Вез. 59:1236-1243; Вгйддетапп апа Таизвзід (1997) Сицт. Оріп. Віоїеснпої. 8:455-458; міжнародній патентній публікації Ме УМО02/043478). Ендогенні локуси імуноглобулінів у таких мишей можна зруйнувати або видалити, і можна вставити в геном миші принаймні один повний або частковий локус людського імуноглобуліну з використанням гомологічної або негомологічної рекомбінації з використанням трансхромосом або з використанням мінігенів. Для отримання людських антитіл, спрямованих проти вибраного антигена, з використанням технології, описаної вище, можна залучати такі компанії, як Кедепегоп (пНру// млумж гедепегоп сот), Наібоиг
Апіїродієв (пИруу/ млуму Нагрошигапіїродієє сот), Ореп МопосіопаІ ТесПппоіоду, Іпс. (ОМТ) (пЕр:// млим! отійпс пе), КуМар (пНр-// ммлу Кутар сот), Тгіаппі (пКр:// млум піаппі сот) і
Арієехів (пИр:// м/мли аріехібв сот).
Людські антитіла можна вибирати з бібліотеки фагового дисплея, де фаг сконструйовано для експресії імуноглобулінів людини або їхніх ділянок, таких як Раб, одноланцюгові антитіла (5сЕм) або неспарені або спарені варіабельні області антитіл (КпаррікК еї аї!., У.Мої! Віої 296:57- 86, 2000; Ктерз еї аї., У Іттипої Меїйп 254:67-84,2001; Мацдпап еї аї., Маїшге Віоїесппоіоду 14:309-314, 1996; ЗНевів єї а!., РІТА5 (О5А) 95:6157-6162, 1998; Ноодепроот апа УУіпівг, У Мої
Віо! 227:381,1991; Маїкз еї аї., У Мої Віо! 222:581, 1991). Антитіла згідно з винаходом можна зо виділити, наприклад, із бібліотеки фагового дисплея, що експресує варіабельні області важкого й легкого ланцюгів антитіла як гібридні білки з білком оболонки ріхХ бактеріофага, як описано в публікації пі еї аїЇ. 9 Мої! Віої 397:385-96, 2010 і міжнародній патентній публікації Мо
УМОо09/085462). Можна провести скринінг бібліотек на зв'язування фага з СЮО154 людини, мавпи- ігрунки й/"або яванського макака, а отримані позитивні клони можна додатково охарактеризувати, виділити Бар із лізатів клонів і експресувати як повнорозмірні дос. Такі способи з використанням фагового дисплея для виділення людських антитіл описані, наприклад, у патентах США Мо 5,223,409; 5,403,484; і 5,571,698 авторів І адпег єї а!.; патентах
США Мо 5,427,908 ії 5,580,717 авторів Юомжег єї а); патентах США Мо 5,969,108 і 6,172,197 авторів МсеСанйегіу єї а!.; і патентах США Мо 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 і 6,593,081 авторів СгіййН5 еї аї.
Підготовку імуногенних антигенів і отримання моноклонального антитіла можна виконати з використанням будь-якого відповідного способу, такого як отримання рекомбінантного білка.
Імуногенні антигени можна вводити тварині у формі очищеного білка або сумішей білків, включаючи цілі клітини або екстракти клітин або тканин, або антиген можна отримати де помо у тілі тварини з нуклеїнових кислот, що кодують указаний антиген або його ділянку.
Антитіла за цим винаходом можуть бути людськими або гуманізованими.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить каркас УН, отриманий із гена зародкової лінії людини МНІ 1-69, МНА4 4-39, МНІ 1-02 або МН4А 4-59.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом містить каркас Мі, отриманий із гена зародкової лінії люодини МКІМ ВЗ, МКІ 012 або МІ З ЗК.
Антитіла за цим винаходом можуть бути антитілами типу ІдА, дО, І9ЗЕ, дос або Ідм. Антитіла за цим винаходом можуть бути антитілами типу Ідс1, Іде2, Іде, досі.
Антитіла за цим винаходом можуть бути додатково сконструйовані для створення модифікованого антитіла з аналогічними або зміненими властивостями порівняно з батьківським антитілом. В антитілах за цим винаходом можуть бути сконструйовані УН, МІ, МУНі
МІ, константні області, каркас МН, каркас МІ. або всі без винятку з шести СОК.
Антитіла за цим винаходом можуть бути сконструйовані шляхом СОК-щеплення. Одну або більше СОК-послідовностей антитіла за цим винаходом можна прищепити до різних послідовностей каркаса. СОМ-щеплення можуть бути виконані з використанням способів, 6о0 описаних у цьому документі. У деяких варіантах втілення антитіла за цим винаходом містять
МН, яка містить НОСКІ із ЗЕО ІЮ МО: 16, 17, 18, 19, 20 або 21, НСОК?2 із ЗЕО ІО МО: 22, 23, 24, 25, 26, 27 або 28, НСОКЗ із БЕО ІЮ МО: 29, 30, 31, 32, 33, 34 або 35 і МІ, яка містить І! СОКІ із
ЗЕО ІО МО: 36, 37, 38, 39, 40, 41 або 42, | СОР2 із ЗЕО ІО МО: 43, 44, 45, 6, 47, 48, 49 або 50 іМабо І СОМКЗ із БЕО ІО МО: 51, 52, 53, 54, 55, 56 або 57, причому каркас МН отримано не з
МНІ 1-69, МНА 4-39, МНІ 1-02 або МН4А 4-59, а каркас Мі отримано не з МКІМ ВЗ, МКІ 012 або МІ З ЗЕ. Каркасні послідовності, які слід використовувати, можуть бути отримані з публічних баз даних ДНК або опублікованих посилань, які включають послідовності генів антитіл зародкової лінії. Наприклад, ДНК зародкової лінії й кодовані білкові послідовності для гена варіабельної області легкого й важкого ланцюгів людини можна знайти в базі даних міжнародної інформаційної системи ІМСОСТО), Іпіегпайопа! ІтМипосСепетісв іптогтайноп 5зузіетФ пНру/ млимі-ітді огуд. Каркасні послідовності, які можуть бути використані для заміни існуючих каркасних послідовностей у антитілах за цим винаходом, являють собою ті, що демонструють найвищу відсоткову ідентичність до С4! 85, С41889, С41894, С41 8150, С41 В189, С4їІ В191,
С41 8199, С4І В231, С41і В232, С41 ВЗ35 і С41! В256.
Каркасні послідовності батьківських і сконструйованих антитіл можуть бути додатково модифіковані, наприклад шляхом зворотних мутацій, для відновлення й/або покращення зв'язування отриманого антитіла з антигеном, як описано, наприклад, у патенті США Мо 6,180,370. Каркасні послідовності батьківських і сконструйованих антитіл можуть бути додатково модифіковані шляхом мутації одного або декількох залишків у межах каркасної області, або навіть у межах однієї або декількох областей СОК для видалення Т-клітинних епітопів, щоб таким чином знизити потенційну імуногенність антитіла. Цей підхід також називається «деїімунізацією» і більш докладно описаний у публікації патенту США Мо 20030153043.
Залишки СОР антитіл за цим винаходом можуть бути піддані мутації для покращення однієї або більше властивостей зв'язування антитіла, що становить інтерес. Для введення мутації (-їй) може бути здійснений сайт-спрямований мутагенез або ПЛР-опосередкований мутагенез, і вплив на зв'язування антитіла або іншу функціональну властивість, що становить інтерес, може бути оцінений у аналізах іп міо або іп мімо, як описано в цьому документі й запропоновано в прикладах. Прикладами заміщень, які можуть бути введені, є консервативні модифікації, як описано вище. Крім того, зазвичай змінюється не більш ніж один, два, три, чотири або п'ять
Зо залишків у області СОМ.
Для модуляції періоду напівжиття антитіла в антитілі за цим винаходом можуть бути виконані заміщення Ес. Наприклад, для подовження періоду напівжиття отриманого антитіла може бути введене одне або більше заміщень М252У, 52541 і Т256Е (ПаїГАсдпца еї аї.,.У Віо|!
Спет 281:23514--240, 2006).
Крім того, антитіла за цим винаходом можна модифікувати після трансляції за допомогою таких способів, як глікозилювання, ізомеризація, деглікозилювання або ковалентна модифікація, що не зустрічається в природі, наприклад доповнення функціональними групами поліетиленгліколю (пегілювання) і ліпідизація. Такі модифікації можуть відбуватись іп мімо або іп міо. Наприклад, для покращення фармакокінетичних профілів антитіл такі антитіла згідно з винаходом можна кон'югувати з поліетиленгліколем (ПЕГілювати). Кон'югацію можна здійснити за допомогою методів, відомих фахівцям у цій галузі. Було продемонстровано, що кон'югація терапевтичних антитіл із ПЕГ покращує фармакодинаміку без погіршення функції (Кпідй еї аї.,
Ріаїеївїв5 15:409-18, 2004; І еопо еї аї., СуїюкКіпе 16:106-19, 2001; Мапа еї аї., Ргоївїп Епд. 16:761- 70, 2003).
Антитіла або їхні фрагменти за цим винаходом, модифіковані для підвищення стабільності, селективності, перехресної реактивності, афінності, імуногенності або іншої бажаної біологічної або біофізичної властивості, перебувають у рамках цього винаходу. Стабільність антитіла залежить від низки факторів, включаючи (1) пакування ядра окремих доменів, що впливає на їхню внутрішню стабільність, (2) взаємодії на межі поділу між білками, які впливають на спарювання НС і с, (3) запас полярних і заряджених залишків, (4) мережу водневих зв'язків полярних і заряджених залишків; і (5) розподіл поверхневих зарядів і полярних залишків серед інших внутрішньо- й міжмолекулярних сил (Умопп еї аї., У Мої Віо! 305:989-1010, 2001). Залишки, які мають потенціал для дестабілізації структур, можна ідентифікувати на основі кристалічної структури антитіла або, у певних випадках, молекулярного моделювання, а вплив залишків на стабільність антитіла можна проаналізувати шляхом створення й оцінки різновидів, які несуть мутації в ідентифікованих залишках. Одним зі шляхів підвищення стабільності антитіла є підвищення середньої точки температурного переходу (Тт), яку вимірюють за допомогою диференціальної скануючої калориметрії (ДСК). Загалом Т т білка корелює з його стабільністю й зворотно корелює з його схильністю до розгортання й денатурації в розчині й процесами во деградації, які залежать від схильності білка до розгортання (Кеттеїе еї а!., Віорнагтт 13:36-46,
2000). У ряді досліджень виявлено кореляцію між розподілом за фізичною стабільністю композицій, виміряною як термічна стабільність за допомогою ДСК, і фізичною стабільністю, виміряною за допомогою інших способів (Сиріа єї аіЇ., ААРЗ Ріагтоесі 5Е8, 2003; 7папо еї аї., у
Ріпапт 5сі 93:3076-89, 2004; Маа еї аї., Ійї ) Рнапт 140:155-68, 1996; Веди-Адао еї аї., Рнагтт
Ве5 21:1353-61, 2004; Неттеїе єї аЇ., Рпапт Нев5 15:200-8, 1997). Дослідження композицій показують, що Тт Рар впливає на довготривалу фізичну стабільність відповідного тАБ.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом являє собою біспецифічне антитіло.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом являє собою мультиспецифічне антитіло.
Моноспецифічні антитіла, які специфічно зв'язують СО154 за цим винаходом, можуть бути сконструйовані у формі біспецифічних антитіл, які також включено в обсяг цього винаходу.
Області МІ і/або МН антитіл згідно з винаходом можна сконструювати з використанням опублікованих способів у формі одноланцюгових біспецифічних антитіл, таких як структури конструкцій Тападре (міжнародна патентна публікація Мо УУМО1999/57150; публікація патенту
США Мо 2011/0206672) або у формі біспецифічних 5сЕМ5, таких як структури, розкриті в патенті
США Мо 5,869,620; міжнародній патентній публікації Мо М/О1995/15388, міжнародній патентній публікації Мо ММО1997/14719 або міжнародній патентній публікації Мо УМО2011/036460.
Області МІ. і/або МН антитіл згідно з винаходом можна сконструювати у формі біспецифічних повнорозмірних антитіл, де кожне плече антитіла зв'язує певний антиген або епітоп. Такі біспецифічні антитіла можна створити шляхом модуляції взаємодій СНЗ між важкими ланцюгами двох антитіл з отриманням біспецифічних антитіл з використанням методик, таких як ті, що описані в патенті США Мо 7,695,936; міжнародній патентній публікації Мо М/О2004/111233; публікації патенту США Мо 2010/0015133; публікації патенту США Мо 2007/0287170; міжнародній патентній публікації Ме УМО2008/119353; публікації патенту США Мо 2009/0182127; публікації патенту США Мо 2010/0286374; публікації патенту США Мо 2011/0123532; міжнародній патентній публікації Ме УУО2011/131746; міжнародній патентній публікації Ме УМО2011/143545; або публікації патенту США Мо 2012/0149876.
Наприклад, біспецифічні антитіла можна отримувати іп мйго у безклітинному середовищі шляхом введення асиметричних мутацій у області СНЗ двох моноспецифічних гомодимерних 3о антитіл і утворення біспецифічного гетеродимерного антитіла 3 двох батьківських моноспецифічних гомодимерних антитіл у відновних умовах, щоб забезпечити ізомеризацію дисульфідного зв'язку відповідно до способів, описаних у міжнародній патентній публікації Мо
ММО2011/131746. У способах конструюють два моноспецифічні двовалентні антитіла так, щоб вони мали певні заміщення в домені СНЗ, які сприяють стабільності гетеродимера; антитіла інкубують разом у відновних умовах, необхідних для забезпечення ізомеризації дисульфідного зв'язку в залишках цистеїну в шарнірній ділянці; таким чином створюють біспецифічне антитіло шляхом обміну Рар-плечей. Умови інкубації оптимально можуть бути відновлені до невідновних.
Прикладами відновлювальних агентів, що можуть використовуватися, є 2-меркаптоетиламін (2-
МЕА), дитіотреїтол (ОТТ), дитіоеритритол (ОТЕ), глутатіон, трис(2-карбоксіетилуфосфін (ТСЕР), | -цистеїн і бета-меркаптоетанол, переважно відновлювальний агент вибирають із групи, що складається з: 2-меркаптоетиламіну, дитіотреїтолу й трис(2-карбоксіетилуфосфіну. Наприклад, можна використовувати інкубування протягом принаймні 90 хв за температури принаймні 20 С за присутності принаймні 25 мМ 2-МЕА або за присутності принаймні 0,5 мМ дитіотреїтолу за рн у діапазоні 5-8, наприклад за рН 7,0 або за рн 7,4.
Прикладами мутацій в області СНЗ, які можна використовувати в першому важкому ланцюзі й у другому важкому ланцюзі біспецифічного антитіла, є К409Е і/або Е4051.
Додатковими біспецифічними структурами, у які можна вбудувати області МІ і/або УН антитіл за цим винаходом, є, наприклад, імуноглобуліни з подвійним варіабельним доменом (0МО) (міжнародна патентна публікація Мо УМО2009/134776) або структури, які включають 5О різноманітні димеризаційні домени для поєднання двох плечей антитіла з відмінною специфічністю, такі як «лейцинова застібка» або колагенові димеризаційні домени (міжнародна патентна публікація Мо ММО2012/022811, патент США Мо 5,932,448; патент США Мо 6,833,441). рМО -- це повнорозмірні антитіла, які містять важкий ланцюг зі структурою МНІ1-лінкер-МН2-
СН і легкий ланцюг зі структурою МІ 1--лінкер-мі 2-Сї|: де лінкер є необов'язковим.
У винаході також запропоновано антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує СО154 із
ЗБЕО ІЮО МО: 1, що має певні послідовності МН і МІ, причому МН антитіла кодується першим полінуклеотидом, а Мі. антитіла кодується другим синтетичним полінуклеотидом. Полінуклеотид може являти собою комплементарну дезоксинуклеїнову кислоту (КДНК) і може бути кодон- оптимізованим для експресії у відповідному хазяїні. Оптимізація кодонів є добре відомою 6о технологією.
У деяких варіантах втілення полінуклеотиди, які кодують МН або Мі антитіла за цим винаходом, містять послідовності ЗЕО ІЮО МО: 76, 77, 78 або 79.
ЗЕО І МО: 76 (які кодують УН С41 В231) вАСАТССАаЙАтТадссСсАаасласссСсАассАаассталаСсассАаасатаваСспАСсА,сАатаАсо
АТСсСАССТОаТоСааССАаССАсСАаСАТСАаСАаСтТАССТаААСТОсаСТАТСсАС,ССАсСАдасоСаИо
ААдсСасССсСССААдаСтТастаАТСТАСТАСаССААСАаСсСТаСАаАассос,аСатассСАаСАСАТТО дассасласавастСааСАСССАСТТСАСССТаАССАТСАССАЛЬССССТОаСА,аСсоСсадасАСТТо асССАССТАСТАСТОаОССА,ССАсСАаа,аСсаАСАасСАТоСССТаЧАССТТоСсасСАа,аааСАССААСата
САДАТСАДдСИ
ЗЕО І МО: 77 (які кодують МІ. С4І В231) сасатосаастестасАа,атстасоасСаААдаТаААпАААССсСааСАаСАаСаТаААвпата тостТасСсААДСЬЯССАСОССОСОЯаСааСАССттСАаСАастТАСсааСАтоАаСстТасва т сСадСАаассссСА саАсАассасставААтТавАаАтТавасТавАТСАассСССАТСТТСИ,аСААСАССААСТАСаСССАС
АААТТССАСОСССА,АаТаАССАТСАССЯССпАСаАаАаСАССАаСАССассСтТАСАТОаСпСААСТа дасаласстасспвАаСсаАдапАСАсСсассататАСТАСТаСасСАаААаССааТАСТАСсасцАС ставАСсСтТАСТОССсСаСсСсАаа,асасАссстаатсАассататостот
ЗЕО І МО: 78 (які кодують УН С41 В191)
САсатасластастасАааХлаСсаассастасатасаастастасааттасосассаААсата
ААпАААсСтасСасСАасАтТаАдАдаататСсТасСсАлсасСАасаасСТАСАССТТСАСССАСТАСТ
АСАТОСАСТОСС ТаОСОССАСОЕССССАСасСсАса!аАСтацсААатТаватаваАСааТТСААССССА
АСсАдаСс,аасСаАСАССААСс,аваСасССАСаАААТТоСАсаасАапАаТаАССАТаАСССасаАСАССА
ВСАТСАаСАССасСсСтТАСАТаСвААСсТтаАсСсСсвастасрасаАаСаАСаАСАССассаТатАССАСТ стасСАдададасассвсАааставоСааСАТСТСТТоОАСТАСТОСОчСсССсСсАасааСАСсоСстастах сА;аататосА9ас
ЗЕО І МО: 79 (які кодують МІ. С4І В191) дастТАсСасдасталсссХасосссссАассататсататтостаасСсСАаАСсСасСсСАаСАТСА сстатлдабааСаАСААлаСтавасСопАСАААТАСОЯТатоСстТапААССАССАСААдаССсСвасСАцА сссссатастаатаАТСстТАССАааАсСасАладаасоСАаасаасСАтоссСадаАаАттСАаса всАаСААСсАааСааСААСАССасСсАСССаАССАТтсАаСааСАСССАсасСсАтааАаСсадаос вСАСТАСТАСТОССАССОССТОСсСАСсАас,САа,САссатаста товсаса,аавАааСАССАдасСтТаАСо стаста
У винаході також запропоновано виділений полінуклеотид, який кодує будь-які варіабельні області важкого ланцюга антитіла, варіабельні області легкого ланцюга антитіла, важкі ланцюги антитіла й/або легкі ланцюги антитіла за цим винаходом. Певні типові полінуклеотиди розкрито в цьому документі, однак інші полінуклеотиди, які, враховуючи виродженість генетичного коду або переваги кодонів у цій системі експресії, кодують антитіла згідно з винаходом, також перебувають в рамках цього винаходу. Прикладами полінуклеотидів є, наприклад, полінуклеотиди, які мають послідовності, наведені в ХЕО ІЮ МО: 76, 77, 78 І 79. Полінуклеотидні послідовності, що кодують МН або МУ. (або їхній фрагмент) антитіла за цим винаходом, можна функціонально пов'язати з одним або декількома регуляторними елементами, такими як промотор і енхансер, що забезпечує експресію нуклеотидної послідовності в призначеній для цього клітині-хазяїні. Полінуклеотидом може бути кДНК.
У винаході також запропоновано вектор, що містить полінуклеотид за цим винаходом. Такі вектори можуть бути плазмідними векторами, вірусними векторами, векторами для експресії бакуловірусів, векторами на основі транспозона або будь-якими іншими векторами, придатними для введення синтетичного полінуклеотиду цього винаходу в певний організм або генетичне середовище за допомогою будь-яких засобів. Наприклад, полінуклеотиди, що кодують варіабельні області легкого й/або важкого ланцюгів антитіла за цим винаходом, необов'язково зв'язані з константними областями, вставляють у експресійні вектори. Легкі й важкі ланцюги можуть бути клоновані в однакові або різні експресійні вектори. Сегменти ДНК, що кодують ланцюги імуноглобулінів, можуть бути функціонально пов'язані з регуляторними послідовностями в експресійному (-их) векторі (-ах), що забезпечують експресію поліпептидів імуноглобуліну. Такі регуляторні послідовності включають сигнальні послідовності, промотори (наприклад, природні або гетерологічні промотори), елементи-енхансери й послідовності завершення транскрипції, і їх вибирають, щоб вони були сумісними з клітиною-хазяїном, вибраною для експресії антитіла. Після введення вектора у відповідного хазяїна цього хазяїна утримують в умовах, що підходять для високого рівня експресії білків, які кодуються введеними полінуклеотидами.
Відповідні експресійні вектори звичайно здатні до реплікації в організмах-хазяїнах як 6о0 епісоми або як невід'ємна частина хромосомної ДНК хазяїна. Звичайно експресійні вектори містять селективні маркери, наприклад, резистентності до ампіциліну, резистентності до гігроміцину, резистентності до тетрацикліну, резистентності до канаміцину або резистентності до неоміцину, щоб дозволити виявлення клітин, трансформованих бажаними послідовностями
ДНК.
Відповідні промотори й енхансерні елементи відомі в цій галузі. Для експресії в еукаріотичній клітині типові промотори включають промотор і енхансерний елемент гена легкого іМабо важкого ланцюга імуноглобуліну; безпосередній ранній промотор цитомегаловірусів; промотор тимідинкінази вірусу простого герпесу; ранній і пізній промотори 5М40; промотор, присутній у довгих кінцевих повторах ретровірусу; промотор металотіонеїну-І миші; і різноманітні відомі в цій галузі тканиноспецифічні промотори. Вибір відповідного вектора й промотора перебуває в межах рівня звичайного фахівця у цій галузі.
Фахівцеві в цій галузі відома значна кількість відповідних векторів і промоторів; багато з них є комерційно доступними для отримання рекомбінантних конструкцій, що є предметом обговорення. Наступні вектори пропонуються як приклад. Бактеріальні: рВ5, рпадезстгірі,
Рзіх174, рВіпезогірі ЗК, рВ5 К5, рМНва, рМНі1вба, рМН1ва, речНа4ва (5ігагадепе, м. Ла-Хойя, штат
Каліфорнія, США); ртТгс99А, рккК223-3, ркК233-3, роОкК540 ії ркІТ5 (РПпаптасіа, м. Упсала,
Швеція). Еукаріотичні: рУм пео, рем2гсаї, рос44, РХК1, рбоО (5ігагадепе) ремКкЗ, рвРУ, рм5 і ром. (Рпаптасіа).
У винаході також запропоновано клітину-хазяїна, що містить один або більше векторів за цим винаходом. Термін «клітина-хазяїн» стосується клітини, у яку ввели вектор. Зрозуміло, що термін «клітина-хазяїн» призначений для позначення не тільки конкретної клітини, що є предметом обговорення, але й потомства такої клітини, а також стабільної клітинної лінії, утвореної з конкретної клітини, що є предметом обговорення. Оскільки в наступних поколіннях можуть відбутися деякі модифікації внаслідок або мутації, або впливів навколишнього середовища, таке потомство може не бути ідентичним вихідній клітині, але все ще буде включене в рамки терміна «клітина-хазяїн», що використовується в цьому документі. Такі клітини-хазяїни можуть бути еукаріотичними клітинами, прокаріотичними клітинами, рослинними клітинами або клітинами архей.
Прикладами прокаріотичних клітин-хазяїнів є ЕвсПегісніа соїї, бацили, такі як Васійи5 вив, 3о і інші ентеробактерії, такі як ЗаІтопеїа, Зеїтайа і різноманітні види Рхейдотопавх. Для експресії також підходять інші мікроорганізми, такі як дріжджі. Прикладами відповідних дріжджових клітин- хазяїнів є засспаготусез (наприклад, 5. сегемівзіає) і Ріспіа. Типовими еукаріотичними клітинами є клітини ссавців, комах, птахів або інші клітини тваринного походження. Еукаріотичні клітини ссавців включають імморталізовані клітинні лінії, такі як гібридоми або лінії клітин мієломи, такі як мишачі клітинні лінії «Р2/0 (Американська колекція типових культур (АТСС), м. Манассас, штат Вірджинія, США СКІ-1581), М50О (Європейська колекція культур клітин (ЕСАСС), м.
Солеобері, графство Вілтшир, Великобританія, ЕСАСС Мо 85110503), РО (АТСС СКІ -1646) і
А9д653 (АТОС СВІ -1580). Типовою лінією клітин мієломи людини є 0266 (АТТС СЕ-ТІВ-196).
Інші придатні клітинні лінії включають отримані з яєчника китайського хом'яка (СНО), такі як
СНО-КІТ5М (Гопла Віоіодіс5, м. Вокерсвіль, штат Меріленд, США), СНО-КІ! (АТСС СНІ -61) або раї.
У винаході також запропоновано спосіб отримання антитіла за цим винаходом, який включає культивування клітини-хазяїна за цим винаходом в умовах, за яких відбувається експресія антитіла, і виділення антитіла, виробленого клітиною-хазяїном. Способи отримання антитіл і їхнього очищення добре відомі в цій галузі. Після синтезу (або хімічного, або рекомбінантного) цілі антитіла, їхні димери, окремі легкі й/або важкі ланцюги або інші фрагменти антитіла, такі як МН й/або Мі,, можна очистити відповідно до стандартних процедур, включаючи преципітацію сульфатом амонію, афінні колонки, колонкову хроматографію, очищення високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ), гель-електрофорез тощо (див. загалом
Зсорев5, Ргоїєїп Ригіїйсайоп (брііпдег-Мегіад, М.М., (1982)). Антитіло, яке є предметом обговорення, може бути по суті чистим, наприклад, чистим на принаймні від приблизно 80 95 до 85 95, чистим на принаймні від приблизно 85 95 до 90 95, чистим на принаймні від приблизно 90
Фо до 95 95, чистим на принаймні від приблизно 98 95 до 99 95 або більше, наприклад вільним від забруднюючих речовин, таких як клітинний детрит, макромолекули тощо, крім антитіла, яке є предметом обговорення.
У винаході також запропоновано спосіб отримання антагоністичного антитіла, яке специфічно зв'язує СО154 із БЕО ІЮ МО: 1, який включає: вбудовування в експресійний вектор першого полінуклеотиду, що кодує МН антитіла, і другого полінуклеотиду, що кодує Мі. антитіла; 6о0 трансформацію клітини-хазяїна за допомогою експресійного вектора;
культивування клітини-хазяїна в культуральному середовищі в умовах, за яких МІ їі УНН експресуються й формують антитіло; і виділення антитіла з клітини-хазяїна або культурального середовища.
Полінуклеотиди, які кодують певні послідовності МН або Мі за цим винаходом, можна вбудовувати у вектори з використанням стандартних способів молекулярної біології.
Трансформацію клітини-хазяїна, культивування, експресію антитіла й очищення виконують із використанням добре відомих способів.
Способи лікування
Антагоністичні антитіла за цим винаходом, які специфічно зв'язують СО154, наприклад антитіла С4І! В5, С41 В89, С41! В94, С41 8150, С4І В189, С41 8191, С41 8199, С41 В231, С41 В232,
С41 В35 і С4І! В236, можна використовувати для лікування й/або профілактики будь-якого стану або захворювання, для яких антагонізм впливів СО154 може бути терапевтично ефективним і може зменшувати симптоми захворювання. Приклади включають лікування алергічних, аутоїмунних, онкологічних, трансплантаційних, РТПХ, запальних і інших станів, особливо тих станів, де терапевтично бажаними є індукція толерантності й/або пригнічення гуморального імунітету. Захворювання, які можна лікувати антитілами за цим винаходом, являють собою імуноопосередковані запальні захворювання або аутоїмунні захворювання, такі як артрит, системний червоний вовчак (СЧВ), запальне захворювання кишечнику, трансплантація, трансплантація нирок, трансплантація шкіри, трансплантація кісткового мозку, реакція «трансплантат проти хазяїна» (РТПХ), імунна тромбоцитопенічна пурпура (ІТП), розсіяний склероз, тиреоїдит, цукровий діабет І типу або атеросклероз.
Крім простого блокування взаємодій СО154-С040, терапія антитілами до СО154 призводить до стимулювання імунологічної толерантності (согдоп еї аї., Оіабе(ез 47: 1199-1206, 1988);
Маткеєз еї аї., ГТгапзріапіайоп 64: 329-335, 1997; Уагміпеп еї аї., Тгапзріапіайоп 76: 1375-1379, 2003; Ойегада еї аї!., Віоса 102: 1920-1926, 2003; ЕРпеїа еї аї., У Іттипоїнег 26: 72-84, 2003;
ЕЇІвїег єї аї., Тгап5ріапіайоп 72: 1473-1478, 2001; Вепаа еї аї., Сеї! Тгапзріапіайоп 11: 715-720, 2002; МеКкепПе апа букКе5, Аппиа! гемієм ої тедісіпе 2001. 52: 353-370; Сатігапі еї аї.,
Ткапзріапіайноп 73: 453-461, 2002).
У винаході також запропоновано спосіб лікування імуноопосередкованого запального 3о0 захворювання або аутоїмунного захворювання, який включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла за цим винаходом суб'єктові, який цього потребує, протягом часу, достатнього для лікування імуноопосередкованого запального захворювання або аутоімунного захворювання.
У винаході також запропоновано спосіб лікування артриту, який включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла за цим винаходом суб'єктові, який цього потребує, протягом часу, достатнього для лікування артриту.
У деяких варіантах втілення артрит являє собою ювенільний артрит, ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит, синдром Рейтера, анкілозивний спондилоартрит або подагричний артрит.
У винаході також запропоновано спосіб лікування вовчака, який включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла за цим винаходом суб'єктові, який цього потребує, протягом часу, достатнього для лікування вовчака.
У деяких варіантах втілення вовчак являє собою системний червоний вовчак (СЧВ) або шкірний червоний вовчак (ШЧВ).
У деяких варіантах втілення суб'єкт має вовчаковий нефрит.
У винаході також запропоновано спосіб лікування запального захворювання кишечнику, який включає введення терапевтично ефективної кількості антитіла за цим винаходом суб'єктові, який цього потребує, протягом часу, достатнього для лікування запального захворювання кишечнику.
У деяких варіантах втілення запальне захворювання кишечнику являє собою хворобу Крона.
У деяких варіантах втілення запальне захворювання кишечнику являє собою виразковий коліт.
Терміни «лікування» або «лікувати» стосуються терапевтичного лікування. Особи, які потребують лікування, включають тих суб'єктів, у кого вже діагностовано порушення або симптом порушення. Суб'єкти, яких можна лікувати, також включають тих, хто схильний або вразливий до порушення, із тих, у кого порушення підлягає профілактиці. Сприятливі або бажані клінічні результати включають полегшення симптомів, зменшення ступеня захворювання, стабілізацію (тобто відсутність погіршення) стану захворювання, затримку або вповільнення прогресування захворювання, покращення або тимчасове полегшення стану захворювання й ремісію (часткову або повну), які можна виявити або не можна виявити. Сприятливий клінічний 6о0 результат у суб'єкта, який отримав лікування, включає, наприклад, зниження проліферації В-
клітин або дендритних клітин, зниження рівня запальних цитокінів, молекул адгезії, протеаз, імуноглобулінів (у тих випадках, коли клітина-носій СО40 є В-клітиною), їх комбінацій, збільшення продукування протизапальних білків, зменшення кількості аутореактивних клітин, збільшення імунної толерантності, інгібування виживання аутореактивних клітин і/або зменшення одного або більше симптомів, опосередкованих стимулюванням СО154 клітин, що експресують СО40.
Клінічну відповідь можна оцінити з використанням скринінгових методик, таких як магнітно- резонансна томографія (МРТ), рентгенографічна візуалізація, комп'ютерна томографія (КТ), проточна цитометрія або аналіз сортування клітин з активованою флуоресценцією (БАС5), гістологічне дослідження, макропатологічне дослідження, біохімічне дослідження крові, включаючи, серед іншого, зміни, які виявляються за допомогою аналізів ЕГІ5А, ІА, хроматографії тощо.
Приклади антитіл, які можна використовувати в способах за цим винаходом, включають області МН, МІ, НОСОК і/або І СОК, які показано в таблиці 2, таблиці 3, таблиці 4, таблиці 5, таблиці 6, таблиці 7, таблиці 8, таблиці 9, таблиці 13 і таблиці 14, і антитіла С4! В5, С41І В89,
С41 894, С41 В150, С4І В189, С41 В191, С41І В199, С41 В231, С41І В232, С41 В35 і С41 В236.
Способи цього винаходу можна використовувати для лікування суб'єктів, які належать до будь-якої класифікації тварин. Приклади суб'єктів, яких можна лікувати, включають ссавців, таких як люди, гризуни, собаки, кішки й свійські тварини.
Антитіла за цим винаходом можуть бути корисні у виготовленні лікарського засобу для такого лікування, де лікарський засіб готують для введення в дозах, визначених у даному документі.
Антитіла за цим винаходом можна вводити в комбінації з другим терапевтичним агентом.
Другий терапевтичний агент може бути будь-яким відомим видом терапії аутоімунних і запальних захворювань, включно з будь-яким агентом або комбінацію агентів, які, як відомо, придатні або які використовувалися або наразі використовуються для лікування аутоімунних і запальних захворювань. Такі види терапії і терапевтичних агентів включають хірургічне втручання або проведення хірургічної процедури (наприклад, спленектомії, лімфаденектомії, тиреоїдектомії, плазмаферезу, лейкофорезу, трансплантації клітин, тканини або органа, 3о процедур на кишечнику, перфузії органів тощо), променеву терапію, терапію стероїдними терапевтичними засобами й нестероїдними терапевтичними засобами, гормональну терапію, терапію цитокінами, терапію дерматологічними агентами (наприклад, агентами для місцевого застосування, що використовуються для лікування захворювань шкіри, таких як алергія, контактний дерматит і псоріаз), імунодепресивну терапію й іншу терапію протизапальними моноклональними антитілами.
Другий терапевтичний агент може являти собою кортикостероїд, протималярійний лікарський засіб, імунодепресант, цитотоксичний лікарський засіб або В-клітинний модулятор.
У деяких варіантах втілення другий терапевтичний агент являє собою преднізон, преднізолон, метилпреднізолон, дефлазкорт, гідроксихлорохін, азатіоприн, метотрексат, циклофосфамід, мікофенолат мофетилу (ММЕ), мікофенолат натрію, циклоспорин, лефлуномід, такролімус, КІТОХАМО (ритуксимаб) або ВЕМІ У5ТАФ (белімумаб).
У деяких варіантах втілення антитіла за цим винаходом вводять у комбінації з другим терапевтичним агентом. Ілюстративні другі терапевтичні агенти являють собою кортикостероїди, нестероїдні протизапальні препарати (НПЗП), саліцилати, гідроксихлорохін, сульфасалазин, цитотоксичні лікарські засоби, імунодепресанти, імуномодулюючі антитіла, метотрексат, циклофосфамід, мізорибін, хлорамбуцил, циклоспорин, такролімус (ЕК5БОб;
РгосгайтМ), мікофенолат мофетилу й азатіоприн (б-меркаптопурин), сиролімус (рапаміцин), дезоксиспергуалін, лефлуномід і його малононітриламідні аналоги; антитіла до СТІ А4 і злиття
Ід, стимулюючі антитіла до В-лімфоцитів (наприклад, ГММРНОЗТАТ-ВТМ) і злиття СТІ А4-І9 (ВГуб-Ід), антитіла до СО80О, антитіла до Т-клітин, такі як антитіло до СОЗ (ОКТЗ), антитіло до
СО4, кортикостероїди, такі як, наприклад, клобетазол, галобетазол, гідрокортизон, триамцинолон, бетаметазон, флуоцинол, флуоцинонід, преднізон, преднізолон, метилпреднізолон; нестероїдні протизапальні препарати (НПЗП), такі як, наприклад, сульфасалазин, лікарські засоби, що містять мезаламін (відомі як агенти 5-АБА), целекоксиб, диклофенак, етодолак, фенопрофен, флурбіпрофен, ібупрофен, кетопрофен, меклофамат, мелоксикам, набуметон, напроксен, оксапрозин, піроксикам, рофекоксиб, саліцилати, суліндак і толметин; інгібітори фосфодіестерази-4, антитіла до ТМЕБс КЕМІСАОЕФ (інфліксимаб),
ЗІМРОМІФ (голімумаб) і НОМІКАФ (адалімумаб), талідомід або його аналоги, такі як леналідомід.
Антитіла за цим винаходом можна вводити в комбінації з другим терапевтичним агентом одночасно, послідовно або окремо.
Ефективність лікування РА може бути оцінена з використанням ефективності, яка вимірюється за клінічними відповідями, критеріями, визначеними Американською колегією ревматологів, критеріями, визначеними Європейською протиревматичною лігою або іншими критеріями. Див., наприклад, Реї5оп еї аї. (1995) Агпйгйі5 КПпеит. 38 : 727-35 і мап Севіеї еї аї. (1996) Аййітйй5 Апецт. 39: 34-40.
Введення/фармацевтичні композиції
У винаході запропоновано фармацевтичні композиції, які містять антагоністичні антитіла, що специфічно зв'язують СО154 за цим винаходом, і фармацевтично прийнятний носій. Для терапевтичного застосування антитіла за цим винаходом можна отримати у вигляді фармацевтичних композицій, що містять ефективну кількість антитіла як активного інгредієнта у фармацевтично прийнятному носії. Термін «носій» означає розріджувач, ад'ювант, наповнювач або носій, з яким вводять активну сполуку. Такі носії можуть бути рідинами, такими як вода й олії, у тому числі олії з нафти, тваринного, рослинного або синтетичного походження, такі як арахісова олія, соєва олія, мінеральна олія, кунжутна олія тощо. Наприклад, можна використовувати 0,4 95 фізіологічний розчин і 0,3 95 гліцин. Ці розчини повинні бути стерильними й не містити жодних твердих частинок. Їх можна стерилізувати за допомогою загальноприйнятих, добре відомих способів стерилізації (наприклад, шляхом фільтрації).
Композиції можуть містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, необхідні для наближення до фізіологічних умов, такі як агенти, що коригують рН, і буферні агенти, стабілізуючі агенти, загущувачі, ковзні агенти й барвники тощо. Концентрація молекул або антитіл згідно з цим винаходом у такій фармацевтичній композиції може змінюватися в широких межах, тобто від менш ніж приблизно 0,5 95, звичайно до принаймні приблизно 1 95, навіть до 5
Фо, 10 905, 15 95, 20 95, 25 95, 30 905, 35 905, 40 95, 45 95 або 50 95 за масою, і буде вибрана в першу чергу виходячи з необхідної дози, об'ємів рідини, в'язкості тощо залежно від вибраного конкретного способу введення. Відповідні носії й композиції включно з іншими білками людини, наприклад сироватковим альбуміном людини, описані, наприклад, у публікації Кетіпдіоп: Те
Зсієпсе апа Ргасіїсе ої Рпаптасу, 215 Едйоп, Теоу, О.В. єйд., Ііріпсоїй УМПШатв апа УМіКінв, зо РПйЙааеє!рніа, РА 2006, Рап 5, Рнпнаптасешііса! Мапитасіигіпа рр 691-1092, див. особливо рр. 958- 989.
Спосіб введення антитіл за цим винаходом у способах винаходу може бути будь-яким відповідним способом, таким як парентеральне введення, наприклад внутрішньошкірне, внутрішньом'язове, внутрішньоочеревинне, внутрішньовенне або підшкірне, через слизові оболонки (пероральне, інтраназальне, інтравагінальне, ректальне), або іншими засобами, визнаними фахівцями й добре відомими в цій галузі.
Антитіла за цим винаходом можна вводити суб'єктові будь-яким відповідним способом, наприклад парентерально шляхом внутрішньовенної (в/в) інфузії або болюсної ін'єкції, внутрішньом'язово або підшкірно, або внутрішньоочеревинно. Внутрішньовенну (в/в) інфузію до можна, наприклад, вводити протягом 15, 30, 60, 90, 120, 180 або 240 хвилин або впродовж 1, 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 годин.
Доза, яку вводять суб'єктові з імуноопосередкованим запальним захворюванням або аутоїмунним захворюванням, таким як ревматоїдний артрит, є достатньою, щоб полегшити або принаймні частково зупинити захворювання, що підлягає лікуванню («терапевтично ефективна кількість»), і може іноді становити від 0,005 мг/кг до приблизно 100 мг/кг, наприклад від приблизно 0,05 мг/кг до приблизно 20 мг/кг, або від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 20 мг/кг, або від приблизно 1 мг до приблизно 20 мг/кг, або приблизно 4 мг/кг, приблизно 8 мг/кг, приблизно 16 мг/кг або приблизно 24 мг/кг, або, наприклад, приблизно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 мг/кг, але може бути навіть вищою, наприклад приблизно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або 100 мг/кг.
Можна також вводити фіксовану одиничну дозу, наприклад 50, 100, 200, 500 або 1000 мг, або доза може грунтуватися на площі поверхні тіла пацієнта, наприклад становити 500, 400, 300, 250, 200 або 100 мг/м-. Зазвичай для лікування імуноопосередкованого запального захворювання, такого як ревматоїдний артрит, можна вводити від 1 до 8 доз (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8), але можна вводити 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше доз.
Введення антитіл за цим винаходом можна повторювати через один день, два дні, три дні, чотири дні, п'ять днів, шість днів, один тиждень, два тижні, три тижні, один місяць, п'ять тижнів, шість тижнів, сім тижнів, два місяці, три місяці, чотири місяці, п'ять місяців, шість місяців або довше. Повторні курси лікування також можливі як довготривале введення. Повторне введення во може бути в тій самій дозі або в іншій дозі. Наприклад, антитіла за цим винаходом можна вводити в дозі 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 5 мг/кг, 8 мг/кг або 16 мг/кг з інтервалом один тиждень протягом 8 тижнів з наступним введенням у дозі 8 мг/кг або 16 мг/кг кожні два тижні протягом додаткових 16 тижнів з наступним введенням у дозі 8 мг/кг або 16 мг/кг кожні чотири тижні шляхом внутрішньовенної інфузії.
Антитіла за цим винаходом можуть бути запропоновані як підтримувальна терапія, яку вводять, наприклад, один раз на тиждень впродовж періоду 6 місяців або більше.
Наприклад, антитіла за цим винаходом можуть бути забезпечені у вигляді добової дози в кількості приблизно 0,1-100 мг/кг, наприклад 0,5,0,9,1,0,1,1,1,5,2,3,4,5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 або 100 мг/кг на добу принаймні в один із днів 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 або 40 або, альтернативно, принаймні в один із тижнів 1, 2, З, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 після початку лікування (або в будь-якій комбінації перерахованого) із використанням одноразових або розділених доз кожні 24, 12, 8, 6, 4 або 2 години (або будь-якої комбінації перерахованого).
Антитіла за цим винаходом можна також вводити профілактично з метою зниження ризику розвитку імуноопосередкованого запального захворювання аутоїмунного захворювання, такого як артрит або ревматоїдний артрит, і/або затримки початку імуноопосередкованого запального захворювання аутоїмунного захворювання.
Таким чином, фармацевтичну композицію за цим винаходом для внутрішньом'язової ін'єкції можна приготувати так, щоб вона містила 1 мл стерильної буферної води й приблизно від 1 нг до приблизно 100 мг/кг, наприклад від приблизно 50 нг до приблизно 30 мг/кг, або більш переважно від приблизно 5 мг до приблизно 25 мг/кг антитіла за цим винаходом.
Наприклад, для введення пацієнтові з масою 80 кг можна приготувати фармацевтичну композицію з антитілами за цим винаходом для внутрішньовенної інфузії, яка містить приблизно 200 мл стерильного розчину Рінгера й від приблизно 8 мг до приблизно 2400 мг, від приблизно 400 мг до приблизно 1600 мг або від приблизно 400 мг до приблизно 800 мг антитіл за цим винаходом. Способи приготування композицій, які вводять парентерально, добре відомі й детальніше описані, наприклад, у «Кетіпдіоп'є РПагтасешііса! Зсіепсе», 15Іп еа., Маск
Зо Рибіїзпіпда Сотрапу, Еавіоп, РА. «Терапевтично ефективна кількість» антитіл за цим винаходом, що є ефективною для лікування імуноопосередкованого запального захворювання або аутоіїмунного захворювання, може бути визначена за допомогою стандартних методів дослідження. Наприклад, як допоміжний засіб для визначення оптимальних діапазонів дозування можна додатково використати аналізи іп міо. Необов'язково, дози антитіл за цим винаходом, що можуть бути ефективними для лікування імуноопосередкованого запального захворювання або аутоімунного захворювання, такого як артрит або ревматоїдний артрит, можна визначити шляхом введення антитіл відповідним тваринним моделям, відомим у цій галузі. Вибір конкретної ефективної дози можуть визначити фахівці в цій галузі (наприклад, шляхом клінічних досліджень) з урахуванням декількох чинників. Такі чинники включають захворювання, яке потрібно лікувати або попередити, пов'язані симптоми, маса тіла пацієнта, імунний статус пацієнта і інші фактори, відомі фахівцям у цій галузі. Точна доза для застосування в композиції буде також залежати від шляху введення й тяжкості захворювання, і її необхідно підбирати відповідно до оцінки лікаря, який проводить лікування, а також обставин для кожного пацієнта. Ефективні дози можна екстраполювати з кривих «доза-відповідь», отриманих із дослідних систем іп міто або тваринних моделей випробування. Антитіла згідно з винаходом можна тестувати на їхню ефективність і ефективну дозу з використанням будь-якої моделі, описаної в цьому документі.
Антитіла за цим винаходом можна ліофілізувати для зберігання й відновлювати у відповідному носії перед використанням. Доведено, що ця методика є ефективною під час використання звичайних білкових препаратів, і можна використовувати добре відомі методики ліофілізації й відновлення.
Антиідіотипічні антитіла
У цьому винаході запропоновано антиідіотипічне антитіло, яке зв'язується з антитілом за цим винаходом.
У винаході також запропоновано антиідіотипічне антитіло, яке специфічно зв'язує антитіло, що містить МН із БЕО ІО МО: 58 і МІ. із БЕО ІЮ МО: 65.
У винаході також запропоновано антиідіотипічне антитіло, яке специфічно зв'язує антитіло, що містить МН із БЕО ІО МО: 59 і МІ. із БЕО ІЮ МО: 66.
У винаході також запропоновано антиідіотипічне антитіло, яке специфічно зв'язує антитіло, 6о що містить МН із БЕО ІО МО: 60 ї МІ. із БЕО ІЮ МО: 67.
У винаході також запропоновано антиідіотипічне антитіло, яке специфічно зв'язує антитіло, що містить МН із БЕО ІО МО: 61 ї МІ. із БЕО ІЮ МО: 68.
У винаході також запропоновано антиідіотипічне антитіло, яке специфічно зв'язує антитіло, що містить МН із БЕО ІО МО: 62 і МІ із ЗЕО ІО МО: 69.
У винаході також запропоновано антиідіотипічне антитіло, яке специфічно зв'язує антитіло, що містить МН із БЕО ІО МО: 63 їі МІ. із БЕО ІЮ МО: 70.
У винаході також запропоновано антиідіотипічне антитіло, яке специфічно зв'язує антитіло, що містить МН із БЕО ІО МО: 64 і МІ. із БЕО ІЮ МО: 71.
У винаході також запропоновано антиідіотипічне антитіло, яке специфічно зв'язує антитіло, що містить МН із БЕО ІО МО: 59 і МІ. із БЕО ІЮ МО: 72.
У винаході також запропоновано антиідіотипічне антитіло, яке специфічно зв'язує антитіло, що містить МН із БЕО ІО МО: 59 і МІ. із БЕО ІЮ МО: 73.
Антиідіотипічне (14) антитіло являє собою антитіло, яке розпізнає антигенні детермінанти (наприклад, паратоп або СОЕК) антитіла. Іа-антитіло може бути блокувальним щодо антигена або неблокувальним. Антиген-блокувальне Ід-антитіло можна використовувати для виявлення вільного антитіла в зразку (наприклад, антитіла до СО154 за цим винаходом, описаного в цьому документі). Неблокувальне 4 можна використовувати для виявлення сумарних антитіл (вільного, частково зв'язаного з антигеном або повністю зв'язаного з антигеном) у зразку. Іа- антитіло можна отримати шляхом імунізації тварини оантитілом, до якого готували антиідіотипічне антитіло.
Антиідіотипічне антитіло можна також використовувати як імуноген для індукування імунної відповіді в іншої тварини, з отриманням так званого антитіла до антиідіотипічного антитіла.
Антитіло до антиідіотипічного антитіла може бути епітопно ідентичним вихідному тАб, що індукує антиіїдіотипічне антитіло. Таким чином, завдяки використанню антитіл до ідіотипічних детермінант тАб можливо ідентифікувати інші клони, що експресують антитіла з ідентичною специфічністю. Антиідіотипічні антитіла можна змінювати (таким чином отримуючи різновиди антиідіотипічних антитіл) і/або дериватизувати за допомогою будь-якої відповідної методики, як описано в тексті цього документа щодо антитіл, які специфічно зв'язують антитіла НІ А-ОВ.
Імунокон'югати 3о Термін «імунокон'югат» стосується антитіла за цим винаходом, кон'югованого з однією або більше гетерологічних молекул.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом кон'юговане з одним або більше цитотоксичних агентів. Прикладами таких цитотоксичних агентів є хіміотерапевтичні агенти або лікарські засоби, агенти, що інгібують ріст, токсини (наприклад, білкові токсини, ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження або їхні фрагменти) і радіоактивні ізотопи.
У деяких варіантах втілення імунокон'югат являє собою кон'югат антитіло-лікарський засіб (АОС), у якому антитіло за цим винаходом кон'юговане з одним або більше лікарськими засобами, такими як, майтанзиноїд (див., наприклад, патент США Мо 5,208,020, 5,416,06)); ауристатин, наприклад фрагменти лікарського засобу монометилауристатину ОЕ і ОЕ (ММАЕ і
ММАР) (див., наприклад, патенти США Мо 5,635,483, 5,780,588, і 7,498,298), доластатин, каліхеаміцин або їхні похідні (див., наприклад, патенти США Мо 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 і 5,877,296; Ніптап еї а!., (1993) Сапсег Вез 53:3336- 3342; і І оде еї а1І.(1998) Сапсег Рез 58:2925-2928); антрациклін, наприклад дауноміцин або доксорубіцин (див., наприклад, Кгаїх сеї аї!., (2006) Сштепі Мед. Снет 13:477-523; Уентеєу вї аї., (2006) Віоогдапіс 5 Мей Спет І ейегв 16:358-362; Тогдом вї аї., (2005) Віосопі Снет 16:717-721;
Маду еї аї!., (2000) Ргос Маї! Асад бсі ОБА 97:829-834; Биромснік еї аї, Віоогду. 5 Мед. Спет.
Ї енегв 12: 1529-1532 (2002); Кіпд еї аї., (2002) У Мей Снпет 45:4336-4343; і патент США Мо 6,630,579), метотрексат, віндезин, таксан, такий як доцетаксел, паклітаксел, ларотаксел, тезетаксел і ортатаксел.
У деяких варіантах втілення імунокон'югат містить антитіло за цим винаходом, кон'юговане з ферментативно активним токсином або його фрагментом, таким як дифтерійний ланцюг А, активні фрагменти дифтерійного токсину, що не зв'язуються, ланцюг А екзотоксину (із
Рзейдотопах аегидіпоза), ланцюг А рицину, ланцюг А абрину, ланцюг А модецину, альфа- сарцин, білки АІешигйев Тогаї, білки діантину, білки Рпуїіаса атегісапа (РАРІ, РАРІЇ ї РАР-5), інгібітор із Мотогаїіса спагапійа, курцин, кротин, інгібітор із Зараопагіа онйісіпаїї5, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трикотецени.
У деяких варіантах втілення антитіло за цим винаходом кон'юговане з радіоактивним атомом з утворенням радіокон'югата. Для одержання радіокон'югатів існує низка радіоактивних 6о ізотопів. Приклади включають Аї211, 1131, 1125, 90, Ке186, Ке188, 5іт153, Ві212, РЗ32, РЬ212 і радіоактивні ізотопи І и. У разі використання радіокон'югата для виявлення він може містити радіоактивний атом для сцинтиграфічних досліджень, наприклад, їс99т або 1123, або спінову мітку для ядерно-магнітно-резонансної (ЯМР) томографії (також відомої як магнітно-резонансна томографія, МРТ), таку як йод-123, йод-131, індій-! І. фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, гадоліній, марганець або залізо
Кон'югати антитіла за винаходом і цитотоксичного агента одержують із використанням низки біфункціональних білок-зв'язувальних агентів, таких як М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)- пропіонат (5РОР), сукцинімідил-4-(М-малеімідометил) циклогексан-1-карбоксилат (ЗМСС) імінотіолан (ІТ), біфункціональних похідних імідоестерів (таких як диметиладипімідат НО), активних естерів (таких як дисукцинімідил суберат), альдегідів (таких як глутаральдегід), біс- азидо-сполук (таких як біс (п-азидобензоїл) гександіамін), похідних біс-діазонію (таких як біс-(п- діазонійбензоїл)-етилендіамін), діїзоціанатів (таких як толуол 2,6-діїзоціанат) і біс-активних сполук фтору (таких як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Наприклад, рициновий імунотоксин можна одержати так, як описано в публікації Мйена еї а!., (1987) Зсієпсе 238: 1098. Мічена вуглецем-14. І-ізотіоціанатбензил-З3-метилдіетилентриамінпентаоцтова кислота (МХ-ЮОТРА) є прикладом хелатного агента для кон'югування радіонуклеотиду з антитілом. Див., наприклад,
УМ094/11026. Лінкер може бути представлений «розщеплюваним лінкером», що полегшує вивільнення цитотоксичного лікарського засобу в клітині. Наприклад, можна використовувати лінкер, нестійкий до дії кислоти, лінкер, чутливий до дії пептидази, фотолабільний лінкер, диметиловий лінкер або дисульфід-вмісний лінкер (Спагі єї аї!., (1992) Сапсег Вез 52: 127-131; патент СШАМо 5,208,020).
Імунокон'югати або АЮС можуть бути отримані за допомогою реагентів, що сприяють утворенню перехресного зв'язку, таких як ВМР5, ЕМО5, СМВ5, НВМУ5, І С-5МОС, МВ5, МРВН,
ЗВАР, 5ІА, ЗІАВ, ЗМОС, ЗМРВ, ЗМРН, сульфо-ЕМО5, сульфо-СМВ5, сульфо-КМИ5, сульфо-
МВ5, сульфо-5ІАВ, сульфо-5МСОС, сульфо-5МРВ і ЗУ (сукцинімідил-(4- вінілсульфон)бензоат), які доступні в продажу (наприклад, від компанії Ріегсе Віоїесппо!оду, Іпс., м. Рокфорд, штат Іллінойс, США).
У винаході також запропоновано імунокон'югат, що містить антитіло, яке специфічно зв'язує
СО154 із БЕО ІО МО: 1 за цим винаходом, зв'язаний із терапевтичним агентом або агентом для 3о візуалізації.
Додаткові варіанти втілення винаходу
Нижче наведені деякі додаткові варіанти втілення винаходу відповідно до розкриття, наведеного в іншому місці цього опису. Наведені вище особливості варіантів втілення винаходу, які описані як такі, що відносяться до винаходу, розкритого в цьому документі, також відносяться до всіх без винятку цих додаткових пронумерованих варіантів втілення. 1) Виділене антагоністичне антитіло або його антигензв'язуюча ділянка, які специфічно зв'язують СО154 із БЕО ІЮ МО: 1, які містять область, що визначає комплементарність, важкого ланцюга (НСОК) 1 із ЗЕО ІЮ МО: 17 (5015), НСОР2 із ЗЕО ІЮ МО: 23 (М/ІЗРІЕЄЄМТМУАОКЕОВ) і НСОКЗ із ЗЕО І МО: 30 (ЗЕУУСОІ ОХ), де необов'язково до а) залишок 51 у НСОК'І піддається мутації наА, С,О,Е, б, І, К, ГГ, М, М, О, Е, Т або М; р) залишок І4 у НСОК'І піддається мутації на М, Г. або М; с) залишок 55 у НСОК! піддається мутації на А; а) залишок 53 у НСОКІЗ піддається мутації на А, Т або М; е) залишок РА у НСОКІ піддається мутації на М, Т, Ї 0 або Е;
І залишок М8 у НСОКЗ2 піддається мутації на А, С,О,Е, Б, б, Н.І, К, І, М, 0, м, 5, Т, М, М або У; 9) залишок ТУ у НСОКЗ2 піддається мутації наА, С,О,Е, Б, б, Н.І, К, І, М, О, РЕ, 5, Т, М, М або У;
Р) залишок М10 у НСОКЗ2 піддається мутації наА, С.О, Е, Б, б, Н.І, К, Г, М, О, КЕ, 5, Т, М, М або У; ї) залишок 51 у НСОКЗ піддається мутації на А або М;
Ї) залишок К2 у НСОКЗ піддається мутації на А, 5,О абокК; і
К) залишок І7 у НСОКЗ піддається мутації на М. 2) Антитіло за п. 1, яке містить область, що визначає комплементарність, легкого ланцюга (СОР) 1 із БЕО ІЮ МО: 37 (КАБОБІЗЗМІ М), І СОК2 із ЗЕО ІЮО МО: 44 (МАМ5І 05) і І СОКЗ із
ЗЕО ІЮ МО: 52 (ФО5ОБІРМ/Т), де необов'язково а) залишок 04 у І! СОК!1 піддається мутації на А, С, ОЮ, Е, Б, б, Н.І, К, І, М, М, К, 5, Т, М, М/ або У; р) залишок 55 у Ї СОК!1 піддається мутації на А, С.О, Е, Б, б, Н.І, К.Г, М, М, 0, Є, Т, М, М бо або У;
Зо с) залишок 57 у ЇСОК!І піддається мутації на А, С.О, Е, Б, б, Н.І, К, ГГ, М, М, 0, К, Т, М, М або У; а) залишок 58 у ЇСОКІ піддається мутації на А, С.О, Е, Б, б, Н.І, К, І, М, М, О, ЕК, Т, М, М або У; е) залишок А2 у І СОКЗ2 піддається мутації на 5;
І) залишок МЗ у І! СОК2 піддається мутації на А, С.О, ЕЕ, ГЕ, с, Н.І, К, І, М, 0, Р, 5, Т, М, М або У; 9) залишок 54 у ЇСОК2 піддається мутації на А, С.О, Е, Б, б, Н.І, К, І, М, М, О, КЕ, Т, М, М або У;
Р) залишок І 5 у І СОК2 піддається мутації на А, С, ОЙ, Е, ГЕ, б, Н.І, К, М, М, О, КЕ, 5, Т, М, М або У; ї) залишок Об у І СОКЗ2 піддається мутації на Е, О або М; ) залишок 57 у СОК2 піддається мутації наА, С,О,Е, Е, б, Н.І, К, І, М, М, О, К, Т, М, М або У;
К) залишок 53 у І СОКЗ піддається мутації на А;
І) залишок 04 у І СОКЗ піддається мутації на М; т) залишок 55 у І СОКЗ піддається мутації наА, С,О,Е, Б, С, Н.І, К, І, М, М, О, В, Т, М, М або Х; і п) залишок Іб у | СОКЗ піддається мутації наА, С,О,Е, с, К, І, М, М, О, КЕ, 5, Т, М. 3) Антитіло за варіантом втілення 1 або 2, яке містить НСОК!І1 із БЕО ІЮ МО: 17 (5УІ5),
НСОКО із БЕО ІЮО МО: 23 (ММІЗРІЕЄЄМТМУАОКРОС), НСОКЗ із БЕО ІЮО МО: 30 (ЗКУ У),
ІЇСОК із ЗЕО ІО МО: 37 (КАБОБІЗЗМУІ М), І СОК2 із ЗЕО ІЮ МО: 44 (МХАМ5І О5) і І СОКЗ із ЗЕО
ІО МО: 52 (0О05ОБІРМ/Т). 4) Антитіло за будь-яким із варіантів втілення 1-3, яке містить а) МН із ЗЕО ІО МО: 59 і МІ із ЗЕО ІЮ МО: 66; або р) важкий ланцюг із БЕО ІО МО: 80 і легкий ланцюг із БЕО ІЮ МО: 81. 5) Виділене антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує розчинний СО154 людини (5пСО154) із ЗЕО ІЮ МО: 4. б) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-5, яке містить принаймні одне
Зо заміщення в області Ес. 7) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-6, яке не активує людські тромбоцити. 8) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-7, яке зв'язується з 5ПСО154 із константою дисоціації Ко приблизно 5 х 109 М або менше, приблизно 1 х 109 М або менше, приблизно 5 х 10-79 М або менше, приблизно 1 х 10-79 М або менше, приблизно 5 х 10-7! М або менше, або приблизно 1 х 10-! М або менше за результатами вимірювання Ко із використанням системи РгоїеОп ХРЕЗ6 відповідно до плану експерименту, описаного в розділі «Вимірювання афінності» у прикладі 1. 9) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-8, яке інгібує опосередковану 4о 5пСО154 проліферацію В-клітин людини зі значенням ІСво від приблизно 7,0 х 1071 М до приблизно 6 х 1079 М. 10) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-9, яке інгібує опосередковану 50154 експресію секретованої ембріональної лужної фосфатази (ЗЕАР) під керуванням МЕ- кВ-індуцибельного інтерферон-В (ІРМ-В) мінімального промотора в клітинах НЕК293, які стабільно експресують ЗЕАР і СО40 людини зі значенням ІСхо приблизно 2,1 х 108 М або менше. 11) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-10, яке конкурує за зв'язування з 5пСО154 з антитілом, яке містить варіабельну область важкого ланцюга (МН) і варіабельну область легкого ланцюга (М), причому МН містить послідовність ЗЕО ІЮО МО: 59 їі МІ. містить послідовність ЗЕО ІЮ МО: 66. 12) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-11, яке містить амінокислотні послідовності областей, що визначають комплементарність, важкого ланцюга (НСОК) 1 (НСОКІ1), 2 (НСОК2) і З (НСОКЗ) із МН із 5ЕО ІЮО МО: 58, 59, 60, 61, 62, 63 або 64, які необов'язково містять одне, два або три консервативні амінокислотні заміщення в НСОКІ,
НОСОК і/або НСОМКЗ, причому НОСОК визначені відповідно до Кабаї, Споїпіа або ІМСОТ. 13) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-12, яке містить амінокислотні послідовності областей, що визначають комплементарність, легкого ланцюга (СОМ) 1 (СОМ), 2 СсОК2) із (І СОКЗ) із МН із ЗЕО ІЮ МО: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 або 73, які необов'язково містять одне, два або три консервативні амінокислотні заміщення в ЇСОКІ, ЇСОКа2 і/або во ІГСОМЗ, причому І СОК визначені відповідно до Кабаї, Споїпіа або ІМСОТ.
14) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-13, яке містить амінокислотні послідовності НСОР1, НСОНР2 і НСОВЗ із: а) ЗЕО ІЮО МО: 16, 22 і 29 відповідно і їхні консервативні модифікації;
В) ЗЕО ІЮО МО: 17, 23 і 30 відповідно і їхні консервативні модифікації; с) ЗЕО ІЮ МО: 16, 24 і 31 відповідно і їхні консервативні модифікації; 9) 5ЕО ІЮО МО: 18, 25 і 32 відповідно і їхні консервативні модифікації; е) ЗЕО ІЮО МО: 19, 26 і 33 відповідно і їхні консервативні модифікації;
У 5ЕО ІЮ МО: 20, 27 і 34 відповідно і їхні консервативні модифікації; або 9) ЗЕО ІО МО: 21, 28 і 35 відповідно і їхні консервативні модифікації. 15) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-10, яке містить амінокислотні послідовності /СОР1, І СОК2 і СОМ із: а) ЗЕО ІО МО: З6, 43 і 51 відповідно і їхні консервативні модифікації;
В) ЗЕО ІО МО: 37, 44 і 52 відповідно і їхні консервативні модифікації; с) ЗЕО ІЮ МО: 38, 45 і 53 відповідно і їхні консервативні модифікації; 9) 5ЕО ІЮО МО: 39, 46 і 54 відповідно і їхні консервативні модифікації; е) ЗЕО ІЮО МО: 40, 47 і 55 відповідно і їхні консервативні модифікації;
У 5ЕО ІО МО: 41, 47 і 56 відповідно і їхні консервативні модифікації; 9) ЗЕО ІЮО МО: 42, 48 і 57 відповідно і їхні консервативні модифікації;
Р 5ЕО ІО МО: 37, 49 і 52 відповідно і їхні консервативні модифікації; або ї) ЗЕО ІО МО: 37, 50 і 52 відповідно і їхні консервативні модифікації. 16) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-15, яке містить НСОКІ1, НОСОК? і
НСОВЗ із: а) ЗЕО ІЮО МО: 16, 22 і 29 відповідно;
Б) 5ЕО ІЮ МО: 17, 23 і 30 відповідно; с) ЗЕО ІЮ МО: 16, 24 і 31 відповідно; 9) 5ЕО ІО МО: 18, 25 і 32 відповідно; е) ЗЕО ІЮО МО: 19, 26 і 33 відповідно;
У 5ЕО ІЮО МО: 20, 27 і 34 відповідно; або 9) ЗЕО ІЮО МО: 21, 28 і 35 відповідно. зо 17) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-16, яке містить ЇСОК1, І СОК2 і
ІСОВЗ із: а) ЗЕО ІЮО МО: 36, 43 і 51 відповідно;
В) ЗЕО ІЮО МО: 37, 44 і 52 відповідно; с) ЗЕО ІЮ МО: 38, 45 і 53 відповідно; 9) 5ЕО ІЮО МО: 39, 46 і 54 відповідно; е) ЗЕО ІЮО МО: 40, 47 і 55 відповідно;
І) 5ЕО ІО МО: 41, 47 і 56 відповідно; 9) ЗЕО ІЮО МО: 42, 48 і 57 відповідно;
Р) 5ЕО ІО МО: 37, 49 і 52 відповідно; або до ї) ЗЕО ІО МО: 37, 50 і 52 відповідно. 18) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-17, яке містить НСОКІ1, НОСОК? і
НСОВЗ із БЕО ІЮ МО: 16, 22 і 29 відповідно І СОР1, І СО2 і СО із БЕО ІЮ МО: З6, 43 і 51 відповідно. 19) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-17, яке містить НСОКІ1, НОСОК? і
НСОВЗ із БЕО ІЮ МО: 17, 23 і 30 відповідно і ГСОР1, І СОР2 і СО із БЕО ІЮО МО: 37, 44 і 52 відповідно. 20) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-17, яке містить НСОКІ1, НОСОК? і
НСОВЗ із БЕО ІЮ МО: 16, 24 і 31 відповідно СОР1, І СОР2 і СО із БЕО ІЮ МО: 38, 45 і 53 відповідно. 5О 21) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-17, яке містить НСОКІ1, НОСОК? і
НСОВЗ із БЕО ІЮ МО: 18, 25 і 32 відповідно СОР1, І СОР2 ії СО із БЕО ІЮ МО: 39, 46 і 54 відповідно. 22) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-17, яке містить НСОКІ1, НОСОК? і
НСОВЗ із БЕО ІЮ МО: 19, 26 і 33 відповідно І СОРБ1, 1. СОК2іЇ СОМ із БЕО ІО МО: 40, 47 і 55 відповідно. 23) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-17, яке містить НСОКІ1, НОСОК? і
НСОВЗ із БЕО ІЮ МО: 20, 27 і 34 відповідно і Г/СОР1, І СОР2 і СО із БЕО ІЮО МО: 41, 47 і 56 відповідно.
24) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-17, яке містить НСОКІ1, НОСОК? і
НСОВЗ із БЕО ІЮ МО: 21, 28 і 35 відповідно СОР1, І СОР2 і СО із БЕО ІЮ МО: 42, 48 і 57 відповідно. 25) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-17, яке містить НСОКІ1, НОСОК? і
НСОВЗ із БЕО ІЮ МО: 17, 23 і 30 відповідно СОР1, І СОР2 і СО із БЕО ІЮ МО: 37, 49 і 52 відповідно. 26) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-17, яке містить НСОКІ1, НОСОК? і
НСОВЗ із БЕО ІЮ МО: 17, 23 і 30 відповідно І СОРБ1, 1. СОК2 і СОР із БЕО ІО МО: 37, 50 і 52 відповідно. 277) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-26, яке містить МН, що є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 905, 96 95, 97 90, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною МН із БЕО
ІО МО: 58, 59, 60, 61, 62, 63 або 64. 28) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-27, яке містить Мі, що є принаймні на 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 905, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичною Мі із БЕО
ІО МО: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 або 73. 29) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-28, яке містить МН із БЕО ІЮ МО: 58 і Мі їз БЕО ІО МО: 65, причому МН, МІ. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень. 30) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1--28, яке містить МН із БЕО ІО МО: 59 і Мі їз БЕО ІЮО МО: 66, причому МН, МІ. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень. 31) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1--28, яке містить МН із БЕО ІО МО: 60 і Мі їз БЕО ІО МО: 67, причому МН, МІ. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень. 32) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1--28, яке містить МН із БЕО ІО МО: 61 і Мі їз БЕО ІЮО МО: 68, причому МН, МІ. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, зо чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень. 33) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1--28, яке містить МН із БЕО ІО МО: 62 і Мі їз БЕО ІО МО: 69, причому МН, МІ. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень. 34) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1--28, яке містить МН із БЕО ІЮ МО: 63 і Мі їз БЕО ІО МО: 70, причому МН, МІ. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень. до 35) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1--28, яке містить МН із БЕО ІО МО: 64 і Мі їз БЕО ІО МО: 71, причому МН, МІ. або і МН, і МІ. необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень. 36) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1--28, яке містить МН із БЕО ІО МО: 59 і МІ із БЕО ІЮ МО: 72, причому МН, МІ. або і МН, і МІ. разом необов'язково містять одне, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень. 37) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1--28, яке містить МН із БЕО ІО МО: 59 і Мі їз БЕО ІО МО: 73, причому МН, МІ. або ї МН, їі М необов'язково містять одне, два, три, 5О чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять або п'ятнадцять амінокислотних заміщень. 38) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-37, яке містить принаймні одне заміщення в області Ес. 39) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-38, у якому принаймні одне заміщення в області Ес являє собою заміщення 1 234А, І 235А, 5237А, Р2385, Н2б8А, АЗЗ3О05 і
РЗ315, де нумерація залишків відповідає індексу ЕО. 40) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-38, у якому принаймні одне заміщення в області Ес являє собою заміщення М234А, 5237А, Р2385, Н2б8А, М309І, АЗЗО5 і
РЗ315, де нумерація залишків відповідає індексу Є.
41) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-40, яке належить до ізотипу ЇДдДС1,
ІЧО2, ІдДЗ або Ідса4. 42) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-41, у якому всі паратопні залишки антитіла знаходяться у МН. 43) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-42, яке одночасно зв'язує перший мономер СО154 і другий мономер СО154 у розчинному тримері СО154 людини. 44) Антитіло за варіантом втілення 43, яке зв'язує принаймні один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім або вісім залишків СО154 у першому мономері СО154 у межах амінокислотних залишків 182-207 СО154 із БЕО ІЮ МО: 1, де нумерація залишків відповідає ЗЕО ІЮ МО: 1. 45) Антитіло за варіантом втілення 43 або 44, яке зв'язує принаймні один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім або вісім залишків СО154 у другому мономері СО154 у межах амінокислотних залишків 176-253 СО154 із БЕО ІЮ МО: 1, де нумерація залишків відповідає ЗЕО ІЮ МО: 1. 46) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 43-45, яке зв'язує залишки Е182, 5185, 0186, А187, Р188, 5214, А215 і К207 у першому мономері СО154, де нумерація залишків відповідає ЗЕО ІЮ МО: 1. 47) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 43-46, яке зв'язує залишки Т176,
Е177, С178, 0220, 5248, Н2г49, 5250 і Е353 у другому мономері СО154, де нумерація залишків відповідає ЗЕО ІЮ МО: 1. 48) Біспецифічна молекула, яка містить антитіло або його антигензв'язуючу ділянку за будь- яким одним із варіантів втілення 1-47, зв'язані з другою антигензв'язуючою молекулою, яка має відмінну специфічність зв'язування. 49) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-47 або біспецифічна молекула за п. 48, які а) не активують тромбоцити людини в імунному комплексі з 5ЄИСО154; р) зв'язуються з 5пСО154 із константою дисоціації Ко приблизно 5 х 109 М або менше; с) інгібують опосередковану 5пСО154 проліферацію В-клітин людини; або а) інгібують біологічну активність СО154 в аналізі репортерного гена, МЕ-кВ-5ЕАР. 50) Імунокон'югат, який містить антитіло або його антигензв'язуючу ділянку за будь-яким одним із варіантів втілення 1-47, зв'язані з терапевтичним агентом або з агентом для 3о візуалізації. 51) Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за будь-яким із варіантів втілення 1-47 і фармацевтично прийнятний носій. 52) Полінуклеотид, який кодує МН антитіла, МІ. антитіла або МН антитіла і Мі. антитіла за будь-яким одним із варіантів втілення 1-47. 53) Вектор, який містить полінуклеотид за варіантом втілення 52. 54) Клітина-хазяїн, яка містить вектор за варіантом втілення 53. 55) Спосіб отримання антитіла, який включає культивування клітини-хазяїна за варіантом втілення 54 в умовах, за яких відбувається експресія антитіла, і виділення антитіла, виробленого в клітині-хазяїні. 56) Антитіло за будь-яким із варіантів втілення 1-47 або фармацевтична композиція за варіантом втілення 51 для застосування в лікуванні аутоїмунного захворювання або імуноопосередкованого запального захворювання. 57) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-47 для застосування в лікуванні артриту, системного червоного вовчака (СЧВ), запального захворювання кишечнику, трансплантації, трансплантації нирок, трансплантації шкіри, трансплантації кісткового мозку, реакції «трансплантат проти хазяїна» (РТПХ), імунної тромбоцитопенічної пурпури (ІТП), розсіяного склерозу, тиреоїдиту, цукрового діабету І типу або атеросклерозу. 58) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-47 для застосування в лікуванні ревматоїдного артриту. 59) Антитіло за будь-яким із варіантів втілення 1-47 для застосування в лікуванні вовчака. 60) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-47 для застосування в лікуванні під час трансплантації. 61) Антитіло за будь-яким одним із варіантів втілення 1-47 для застосування в лікуванні запального захворювання кишечнику. 62) Антитіло за будь-яким із варіантів втілення 1-47 для застосування за будь-яким із варіантів втілення 56-61 у комбінації з другим терапевтичним агентом. 63) Антитіло за варіантом втілення 62, у якому другий терапевтичний агент являє собою нестероїдні протизапальні препарати (НПЗП), саліцилати, гідроксихлорохін, сульфасалазин, кортикостероїди, цитотоксичні лікарські засоби, імунодепресанти й/або антитіла.
У винаході також запропоновано виділене антитіло або його антигензв'язуючу ділянку, які специфічно зв'язують СО154 людини з ЗЕО ІЮ МО: 1, які містять область, що визначає комплементарність, важкого ланцюга (НСОК) 1 із БЕО ІЮ МО: 17 (5015), НСОКЗ2 із БЕО ІЮ МО: 23 (ММІЗРІЕЄЄМТММАОКеОС), НСОКЗ із ЗЕО ІЮ МО: 30 (ЗЕУМУСОІ р), область, що визначає комплементарність, легкого ланцюга (СОК) 1 із БЕО ІО МО: 37 (КАБОБІЗЗУІ М), ГСОК2 із БЕО
ІО МО: 44 (МАМ5І 05) і І СОЗ із БЕО ІЮ МО: 52 (Ф0О05051РУМТ).
У винаході також запропоновано виділене антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує розчинний СО154 людини (5ПСО154) із БЕО ІЮО МО: 4, що містить НСОК'І із БЕО ІЮ МО: 17 (5015), НОСОК? із 5ЕБЕО ІЮО МО: 23 (М5РІЄЄМТМУАОКЕОС), НСОКЗ із ЗЕО ІЮ МО: 30 (ЗКУ ОМ), СОМ із БЕО ІЮ МО: 37 (КАБОБІЗЗУІ М), СОМ із БЕО ІЮО МО: 44 (УАМ5І О5) і
ІЇСОКЗ із БЕО ІО МО: 52 (ФО5ОБІРУМТ).
У деяких варіантах втілення антитіло містить МН із БЕО ІО МО: 59 і МІ із БЕО ІО МО: 66.
У деяких варіантах втілення антитіло зв'язується з 5ПСО154 із константою дисоціації Ко приблизно 5 х 109 М або менше, приблизно 1 х 109 М або менше, приблизно 5 х 10-79 М або менше, приблизно 1 х 1079 М або менше, приблизно 5 х 10-" М або менше, або приблизно 1 х 10-7 М або менше за результатами вимірювання Ко із використанням системи РгоївеОп ХРЕЗб відповідно до плану експерименту, описаного в розділі «Вимірювання афінності» у прикладі 1.
У деяких варіантах втілення антитіло інгібує опосередковану 51ПСО154 проліферацію В- клітин людини зі значенням ІСзо від приблизно 7,0 х 107! М до приблизно 6 х 1079 М.
У деяких варіантах втілення антитіло інгібує опосередковану 5пС0154 експресію секретованої ембріональної лужної фосфатази (ЗЕАР) під керуванням МЕ-кВ-індуцибельного інтерферон-В (ІЕМ-В) мінімального промотора в клітинах НЕК293, які стабільно експресують
ЗЕАР і СО40 людини зі значенням ІСзо приблизно 2,1 х 108 М або менше.
У деяких варіантах втілення антитіло належить до ізотипу ЇДО1 і порівняно з ЇДС1 дикого типу необов'язково містить у важкому ланцюзі заміщення 1 234А, І 235А, з237А, Р2385, Н2б8А,
АЗ305 і РЗ3315.
У деяких варіантах втілення антитіло містить МН із БЕО ІЮО МО: 591 МІ із БЕО ІЮ МО: 66 і належить до ізотипу їдсС1 і порівняно з ЇдДс1 дикого типу необов'язково містить у важкому ланцюзі заміщення І 234А, І 235А, (з237А, Р2385, Н2б8А, АЗ305 і РЗ3315. зо У деяких варіантах втілення антитіло містить МН із БЕО ІЮО МО: 591 МІ із БЕО ІЮ МО: 66 і належить до ізотипу Ідс1/к і порівняно з ЇДО1 дикого типу містить у важкому ланцюзі заміщення
ІЇ234А, 1235А, 5237А, Р2385, Н2б68А, АЗ305 і РЗ3315.
У деяких варіантах втілення антитіло належить до ізотипу Ідса2 і порівняно з ЇдДб2 дикого типу необов'язково містить у важкому ланцюзі заміщення М234А, з237А, Р2г385, Н2б8А, УЗО9І,
АЗ305 і РЗ3315.
У деяких варіантах втілення антитіло містить МН із БЕО ІЮО МО: 591 МІ із БЕО ІЮ МО: 66 і належить до ізотипу Ідсаг/к і порівняно з ЇдД02 дикого типу містить у важкому ланцюзі заміщення
М2З34А, с237А, Р2г385, Н2б8А, УЗ09І, АЗ305 і РЗ3315.
У деяких варіантах втілення антитіло містить важкий ланцюг (НС) із «ЕО ІЮ МО: 80 і легкий 4о ланцюг (І.С) із ЕО ІЮ МО: 81.
У деяких варіантах втілення антитіло містить важкий ланцюг (НС) із «ЕО ІЮ МО: 80 і легкий ланцюг (І.С) із ЕО ІЮ МО: 81.
У деяких варіантах втілення антитіло являє собою біспецифічне антитіло.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування аутоіїмунного захворювання.
Антитіло є придатним для застосування в терапії наприклад для лікування імуноопосередкованого запального захворювання.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування артриту.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування системного червоного вовчака.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування запального захворювання кишечнику.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування під час трансплантації.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування під час трансплантації нирок.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування під час трансплантації шкіри.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування під час 6о0 трансплантації кісткового мозку.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування реакції «трансплантат проти хазяїна».
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування імунної тромбоцитопенічної пурпури.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування розсіяного склерозу.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування тиреоїдиту.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування цукрового діабету І типу.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування атеросклерозу.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування ревматоїдного артриту.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування хвороби Крона.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування виразкового коліту.
Антитіло є придатним для застосування в терапії, наприклад для лікування запального захворювання кишечнику, у комбінації з другим терапевтичним агентом.
Цей винахід далі буде описаний з посиланням на наступні специфічні необмежуючі приклади.
Приклад 1. Матеріали й способи
Створення використовуваних білків
Як сигнали ендогенного СО154 у вигляді тримера багатьма способами експресували рекомбінантний СО154 з отриманням функціонального рекомбінантного тримера. Розчинний с0р154 людини (52020154; 5ЕО ІЮО МО: 4), розчинний СО154 Саййнгіх їЇасспив (ігрунки звичайної; у цьому документі називається мавпою-ігрункою) (5т7С0154; 5ЕБО ІЮ МО: 5) або розчинний
СО0154 Масаса гїазсісціагі5 (яванського макака, у цьому документі називається супо) (з5сСО154;
ЗЕО ІЮ МО: 6) клонували й експресували як злиття з Нізб (5ЕО ІЮ МО: 10) (520ИСО154-Нів, 5ЕО ІЮ
МО: 7; з5тСО154-пі5, БЕО ІЮ МО: 8; 5еСбО154-пі5, БЕО ІЮО МО: 9) або як злиття з «лейциновою застібкою» (1.7) (5ЕО ІЮ МО: 11) (56иСО154-І,7, 5ЕО ІЮ МО: 12; 5тСО154-І.,7, 5ЕО ІЮ МО: 13; 5сеСб0р154-І7, ЗЕО ІО МО: 14). Клонування, експресію й очищення білків здійснювали стандартними способами. | злиття Ні, і злиття І/Л7 були переважно тримерами. 5тСО154 і 5тСО154-ІІ7 піддавали біотинілуванню за допомогою набору Е2-Гіпк "мМ у о-МН5-Ї С-Віоїіп апа
І абеїїпд Кі (Тпегто, номер за каталогом 21327), успішність біотинілування аналізували за допомогою аналізів НАВА-авідин (Тпегто, номер за каталогом 46610) і Осіеєї. У деяких аналізах використовували клітини, що експресують СО40 людини (ЗЕО ІО МО: 15). У деяких аналізах використовували клітини 01.1 дигкаї (АТОСФ СІ -10915 м), які ендогенно експресують СО154 людини.
СО154 людини; ЗЕО ІЮО МО: 1
МІЕТУМОТЗРАБЗААТИаїЇ РІЗМКІЕЄММІ СТУМЕСТОМІСЗАГЕАММІ НАВІОКІЕСЕВМІ НЕСЕМЕМКТ
ІОВСМТСОЕВБІ БІ МСЕБЕІКЗОРЕСЕУКОІМІ МКЕЕТККЕМЗЕРЕМОКаВОМРОЇІААНМІЗЕАЗЗКТТОМ
ГОМАЕКИамУУТМ5ММІ МТ ЕМаКОЇ ТУКВОДІ УМІМАОМТЕСЗМАЕАЗЗОАРРНЕЇАБІ СІ КОРОВЕЕНВІЇ.
ГАААМТНЗЗАКРОСООЗВІНІ СОМЕЕГОРЕАБМЕУММТОРєРЗОУЗНОИтТаТагтТеаИн кі.
СОр154 мавпи-ігрунки; ЗЕО ІЮ МО: 2
МІЕТИМОРУРАЗААТаРРУЗМКІЕММІ СТУМРИТОМІСЗАЇ ЕАММІ НАВІОКІЄСЕВМІ НЕСЕМЕМК
ТІЮОВСМТОСЕНВБІ ІІ МСЕБЕІКЗОРЕСЕМКОІМІ МКЕЕКККЕМЗЕЕМОКаромМРОІААНМІЗЕАЗОКТТ5
М'ОМЖМАЕКИаУУТМ5ММІ МТ ЕМаКОЇ ТУКАОСІ УМІМАОМТЕСЗМАЕАЗЗОАРРЇАБІ СІ КРРМАБЕНВІ
Г'/АААМТНЗЗАКРОСООЗІНІ ООІРЕ ОРСАЗМЕМММТОРєРзЗОУНОТагТтРеаИи кі.
СО154 яванського макака; ЗЕО ІЮО МО: З
МІЕТУМОРОЗРАЗААТаЇ РУИВМКІЄЕММІ ІТІРІТОМІСЗАЇ ЕАММІ НАВІГОКІЕСЕВМІ НЕСЕМЕМКТ
ІОВСМТСОЕВ5БІ БІ МСЕЕІКЗОРЕСЕУКОІМІ МКЕЕКККЕМЗРЕМОКаромМРОІААНМІЗЕАЗЗКТТ У
ГОМАЕКИамУУТМ5ММІ МТ ЕМаКОЇ ТУКВОДІ УМІМАОМТЕСЗМАЕАЗЗОАРРНЕЇАБІ СІ КОРОВЕЕНВІЇ.
ГАААМТНЗЗАКРОСООЗВІНІ СОМЕЕГОРОАБМЕУМММТОРЗОУЗНОИаИтТагТеЕаИТмни кі. 5пСО0154; 5ЕО І МО: 4
МОКаромРОІААНМІЗЕАЗЗКТТ ЗМІ ОМАЕКИаМУТМОММІ МТ ЕМаКОЇ ТУКВОСІ УМІМАОМТЕ
СЗМАЕА5ЗЗОАРРЕЇАБІ СІ КОРОВЕЕВІ ЇЇ ВААМТНЗЗАКРОС,ООБІНІ ЧадаСауМЕЕГОРСАЗБМЕУММУТОРБ
ОУЗнНатавЕтТЗЕац кі 5тСО154; 5ЕО І МО: 5
МОКаромРОІААНМІЗЕАЗЗКТТ ЗМІ ОМАЕКИ УМ ТМЗММІ МТ ЕМОаКОЇ ТУКВОСДІ УМІМАОМТЕ
СЗМАЕА5ЗЗОАРРЕЇАБІ СІ КРРМАРЕВІЇ ВААМТНЗЗАКРОСООЗБІНІ Оат!геЕ ОРСАБМЕУММУТОРБ 6о ОУЗнНатавЕтТЗЕац кі
Зб
5себ0р154; 5ЕО І МО: 6
МОКаромРОІААНМІЗЕАЗЗКТТ ЗМІ ОМАЕКИаМУТМОММІ МТ ЕМаКОЇ ТУКВОСІ УМІМАОМТЕ
СЗМАЕА5ЗЗОАРРЕЇАБІ СІ КОРОВЕЕВІ ЇЇ ВААМТНЗЗАКРОС,ООБІНІ ЧааМЕЕ ОРАБЗМЕММУТОРБ
ОУЗнНатавЕтТЗЕац кі 5пСО154-пів; БЕО ІО МО: 7 азннннннасазмокКкаромРОІААНМІЗЕАЗОЗКТТОМІ ОММАЕКОаМУТМММІ МТ ЕМИКОСТУ
КОСІ УМІМАОМТЕСЗМАЕАЗЗОАРЕНЕЇАБІ СІ КОРЕВЕЕВІШІ ВААМТНЗЗАКРОСООБІНІ СМЕЕЇ.
ОРСОАБМЕМММТОРЗзЗОМЗНОИатаИавгтТеаци кі. 5тСОр154-пів; БЕО І МО: 8 азннннннасазмокКкаромРОІААНМІЗЕАЗОЗКТТОЗМІ ОСММАЕКОаМУТМММІ МТ ЕМИКОСТУ
КВОСІ УМІМАОМТЕСЗМАЕАЗЗОАРЕНЕЇАБІ СІ КРРМАБРЕВІЇЇ ВААМТНЗЗАКРОССООЗІНІ СИІЕЕГО
РОАБМЕУМУТОРЗОУЗНОТагтТеЕаИтт кі. 5с00154-пі5; БЕО І МО: 9 азннннннасазмокКкаромРОІААНМІЗЕАЗОЗКТТОМІ ОММАЕКОаМУТМММІ МТ ЕМИКОСТУ
КВОСІ УМІМАОМУТЕСЗМАЕАЗЗОАРЕНЕЇАБІ СІ КОРЕВЕЕВІШ ВААМТНЗЗАКРОСООБІНІ ИМЕЕЇ.
ОРСОАБМЕМММТОРЗзЗОМЗНОИатаИавгтТеаци кі.
Нізб; БЕО І МО: 10
НнНннННН
І/2; ЗЕОІЮ МО: 11
АМКОЇЕОКІЕБЇЇ ЗКІМНІЕМЕІЇАВІККИОСЕ В
5пСО154 -І,/7; 5ЕО І МО: 12 аЗнНННННасаЗАМКОЇЕОКІЕБЇЇ ЗКІМНІЕМЕІАВІККІСЕВнНСОСССИЗМОКаТромРОІААНМІЗЕА
ЗЗКТТЗМІ ОМАЕКИамМУ ТМОММІ МТ ЕМаКОЇ ТУКВОСІ УМІМАОМТЕСЗМАЕАЗЗОАРНЕЇІАБІ СІ КОР
САРЕВІШ ВААМТНЗЗАКРОСООБІНІ ау ЕЕГОРАЗБМЕУММУТОРБОУЗНОТаЕТЗЕИ КІ. 5тСО154 -ІІ, 7; 5ЕО ІЮ МО: 13 аВнНННННасаЗАМКОЇЕОКІЕБЇЇ ЗКІМНІЕМЕІАВІККІСЕВнНСОССССЗМОКаромРОІААНМІЗЕА
ЗЗКТТЗМІ ОМАЕКИамМУ ТМОММІ МТ ЕМаКОЇ ТУКВОСІ УМІМАОМТЕСЗМАЕАЗЗОАРНЕЇАБІ СІ КРР
МАРЕВІ ВААМТНЗЗАКРОСООБІНІ СОІРЕГ ОРСАЗМЕУММТОРЗОУЗНИТИагТтЕаТп кі 5сеС0154-ІІ, 7; 5ЕО ІЮ МО: 14 3о0 аВнНННННасаЗАМКОЇЕОКІЕБЇЇ ЗКІМНІЕМЕІАВІККІСЕВнНСОССССЗМОКаромРОІААНМІЗЕА
ЗЗКТТЗМІ ОМАЕКИамМУ ТМОММІ МТ ЕМаКОЇ ТУКВОСІ УМІМАОМТЕСЗМАЕА5ЗЗОАРРНЇІАБІ СІ КОР
САРЕВІШ ВААМТНЗЗАКРОСООБІНІ ау ЕЕГОРАЗБМЕУММУТОРБОУЗНОТаЕТЗЕИ КІ. людський СО40; 5ЕО ІЮ МО: 15 тупрідсміждсінампрерріастекду пздссзісадардакімзасіейеїтесірсдезеПатмпгеїспаДнКусарпідігда
Ккаїзеісісеедм псізеасезсміпгзсзраїдукадіагтузаїісерсрудіївзпуиззатекспруизсеїкамуддадіпкідумисар дапгаммірітдйНтаймімікКкмиакКріпКарпрКаердеїіпірадірдзпіааруденННасархідедакКезвгізудета
Вимірювання афінності
Вимірювання афінності за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (РЕ) виконували з використанням системи РгоїеОп ХРЕЗ6 (ВіоКад). Поверхню біосенсора готували шляхом з'єднання антитіла до людського до (Ес) (аскзоп номер за каталогом 109-005-098) із модифікованою поверхнею альгінатного полімерного шару сенсорного чипа ГРХ (ВіоКай номер за каталогом 176-5011) із використанням інструкцій виробника щодо хімічного амінозв'язування.
Іммобілізували приблизно 4700 ОВ (одиниць відповіді) досліджуваного антитіла. Експерименти з дослідження кінетики виконували за температури 25 "С у рухомому буфері (ДФБР ж 0,03 95 полісорбату Р2О ж 100 мкг/мл БСА). Для проведення експериментів з дослідження кінетики захоплювали 100 ОВ антитіл з наступними введеннями аналітів (52ИСО154-пі5 і 5тС0154-Пі5) у концентраціях у діапазоні від 0,391 нМ до 100 нМ (у серійних 4-кратних розведеннях). Фазу асоціації відстежували протягом З хвилин за швидкості 50 мкл/хв, а потім протягом 15 хвилин буферного потоку (фаза дисоціаці). Поверхню чипа відновлювали двома 18-секундними 5о0 імпульсами зі 100 мМ НзРОх (5ідта, номер за каталогом 7961) за швидкості 100 мкл/хв.
Зібрані дані обробляли за допомогою програмного забезпечення РгоїеОп Мападег. Спочатку дані коригували для фону з використанням відстані між точками. Потім виконували подвійне віднімання еталонних даних з використанням ін'єкції буфера замість ін'єкцій аналіту. Кінетичний аналіз даних проводили з використанням моделі зв'язування Ленгмюра 1: 1.
СОр154-індукована активація клітин лінії Като5
Здатність антитіл до СО154 інгібувати активацію клітин лінії Катоб5 оцінювали з використанням СО54 як маркера клітинної активації. Клітини Катоз (клітини лімфоми Беркітта,
АТССФО СТІ -1596 М), які зберігали відповідно до протоколу постачальника, висівали в 96-ямкові планшети з у-подібним дном у концентрації 2,0 х 105 клітин/'ямка у повне середовище для 6о0 культивування в об'ємі 100 мкл/ямка. Досліджувані антитіла в концентраціях 0,2, 2 або 20 мкг/мл попередньо інкубували з 40 нг/мл 5тСО154-пі5 протягом 1 год за кімнатної температури (КТ), а потім додавали до клітин. Планшет покривали й інкубували протягом ночі (37 "С, 5 905 бО-2). Наступного дня аналітичний планшет центрифугували й видаляли відпрацьоване середовище для обробки. Отриманий клітинний осад промивали холодним ФБР/2 95 фетальної бичачої сироватки (ФБС), а потім клітини забарвлювали антитілом до СО54, міченим фікоеритрином (ФЕ) (ІСАМ-1), або відповідним ізотипним контролем протягом 1 год за 4 "с.
Клітини промивали холодним ФБР/2 95 ФБС, ресуспендували в 100 мкл/ямка холодного ФБР/2 до ФБС, і за допомогою проточного цитометра вимірювали флуоресцентний сигнал (жовтий канал). Визначали, що антитіла є антагоністами, якщо вони відповідали таким критеріям: 90 ефективності порівняно з антитілом 5С8 перевищує 5 95 ефективності 5С8, де 95 ефективності стосується нормалізованого відсоткового інгібування порівняно з 5С8 у найвищій дослідженій концентрації.
Аналіз репортерного гена МЕ-КкВ-5ЕАР
Здатність антитіл до СО154 інгібувати індуковані СО154 низхідні шляхи сигналізації СО40 оцінювали з використанням клітин НЕК-ВіІце "м 2О40І. (Іпмімодеп), сконструйованих для експресії людського СО40 і трансфікованих репортерним геном секретованої ембріональної лужної фосфатази (ЗЕАР) під керуванням МЕ-кВ-індуцибельного промотора (ІЕМ-В мінімального промотора). Клітини стимулювали за допомогою СО154 людини або яванського макака або клітинами УигКкаї. Клітини НЕК-ВіІсе м 20401. зберігали відповідно до протоколу постачальника, і всі аналізи активності виконували в середовищі ОМЕМ з додаванням 10 95 інактивованої нагріванням фетальної бичачої сироватки й 1Х глутамаксу. Клітини висівали в 96-ямкові планшети для культивування тканин зі щільністю клітин 2,5 або 5 х 1027 клітин на ямку в об'ємі 100 мкл і інкубували протягом ночі (37 "С, 5 956 СО»). Наступного дня 4-кратні розчини 5пПСО154-
Ні5 або 5пС0154-ІІ,7 або клітини 01.1 дигКаї попередньо інкубували з 4-кратними розчинами антитіл до СО154 (у відповідних концентраціях) у співвідношенні 1 : 1 з отриманням 2-кратних розчинів сумішей попередніх комплексів СО154 : антитіло. Суміші СО154 : антитіло інкубували за КТ протягом 1 год, тоді як суміш 01.1 дигКкаї : тАБб інкубували за 37 "С і 5 95 СО» протягом 1 год. Наприкінці періоду інкубації попереднього комплексу до 96-ямкових аналітичних планшетів, що містили клітини НЕК-Вісе м СО40І., додавали 100 мкл/ямка 2-кратних розчинів попереднього 3о комплексу; кінцевий аналітичний об'єм становив 200 мкл/ямка з кінцевими концентраціями ср154 80 нг/мл 5пСО154-НІі5, або 40 нг/мл 5пСО154-І17, або 2,5-6,0 х 107 клітин 01.1 Уигкаї.
Після періоду обробки тривалістю 16-24 год (37 "С, 5 95 СО-2) супернатанти аналізували на активність фосфатази (ЗЕАР) шляхом вимірювання поглинання (650 нм) 40 мкл/ямка супернатантів, які інкубували з 160 мкл/'ямка ОШШАМТІ-ВіІце м (Іпмімодеп) за 37 "С протягом 30-- бо.
Аналіз активації дендритних клітин, опосередкованої клітинами Уигкаї
Здатність антитіл до СО154 інгібувати активацію ДК, опосередковану клітинами игкаї, оцінювали шляхом вимірювання зниженої продукції різних цитокінів дендритними клітинами.
Моноцити людини (Віоіодіс зресіаціев5) культивували з 50 нг/мл 1-4 і ЗМ-С5Е протягом шести до днів. На 3-й день до клітин додавали свіже середовище (з ІЇ/-4 і ЗМ-С5Е). На 6-й день у клітинних аналізах використовували незрілі ДК (НнДК) (СОтТая СО 1 низький (50833). 2,5 х 105 клітин 0Б1.1 дигкаї (опромінених за 1000 рад) інкубували з 0,000064-25 мкг/мл мкг/мл антитіла до
СО0154 протягом 15-20 хвилин, а потім культивували спільно з 2,5 х 107 НДК у кінцевому об'ємі 200 мкл/ямка у 96-ямковому круглодонному планшеті. Після 48-годинної інкубації супернатанти збирали для аналізу цитокінів.
Аналіз активації В-клітин, опосередкованої клітинами Уигкаї
Здатність антитіл до СО154 інгібувати активацію В-клітин, опосередковану клітинами Уигкаї, оцінювали шляхом визначення впливу антитіл на проліферацію В-клітин. 1 х 105 клітин 01.1
УчгКкаї (опромінених за 5000 рад) культивували спільно з 1 х 105 В-клітин мигдалеподібних залоз людини за присутності 1-21 (100 нг/мл) і 0,0077 нг/мл-15 мкг/мл антитіл до СО154 у кінцевому об'ємі 200 мкл/ямка у 96-ямковому круглодонному планшеті. Після 2 днів інкубації до культури додавали метил (-ЗН)-тимідин (0,5 мкКі/ямка), і після інкубування протягом однієї ночі визначали проліферацію В-клітин людини.
Аналіз активації В-клітин, опосередкованої СО154
Здатність антитіл до СО154 інгібувати активацію В-клітин, опосередковану рекомбінантним
СО154, оцінювали на В-клітинах людини або яванського макака. 1 х 105 В-клітин мигдалеподібних залоз людини або клітин селезінки яванського макака культивували з 100 нг/мл гпІС-21, 0,5 мкг/мл 5пСО154-ІІ 2 і 0,0077 нг/мл-15 мкг/мл антитіл до СО154 у кінцевому об'ємі 200 мкл/ямка у 96-ямковому круглодонному планшеті. Після 2 днів інкубації до культури додавали метил (-ЗН)-тимідин (0,5 мкКі/ямка), і після інкубування протягом однієї ночі визначали проліферацію В-клітин людини.
Приклад 2. Виділення антитіл до СО154 із бібліотек фагового дисплея
Еабр, що зв'язують СО154, вибирали з бібліотек фагового дисплея де помо ріхХ, як описано в
ЗПі єї аї., У Мої Віої 397:385-96, 2010; міжнародній патентній публікації Ме УУО2009/085462; публікації патенту США Мо И52010/0021477). Коротко, бібліотеки створювали шляхом диверсифікації каркасів людського походження, де гени ІЗНМ1-69701, М3НМЗ3-23701 і ІНМ5- 51701 зародкової лінії МН рекомбінували з людським мінігеном ІЗНО-4 через петлю НЗ, їі гени 012 (С0КМ1-39701), І 6 І12КМ3-11701), А27 (П02КМ3-20701) ії ВЗ (ІСКМ4-1701) людської зародкової лінії МіКарра рекомбінували з мінігеном ІЇЗКО-1 для складання повних доменів МН і Мі. Для диверсифікації вибрали положення варіабельних областей важких і легких ланцюгів навколо петель НІ, Н2, 11,12 і І 3, які відповідають положенням, визначеним як ті, що часто контактують із білювими й пептидними антигенами. Відмінність послідовності в обраних положеннях обмежувалася залишками, які зустрічаються в кожному положенні в сімействах генів ІСНМ або
ІСІ М зародкової лінії відповідних генів І2ЕНМ або ІСІМ. Відмінність на петлі НЗ3 створювали з використанням короткої та середньої синтетичних петель довжиною 7-14 амінокислот. Розподіл амінокислот на НЗ створили з метою імітації варіації амінокислот, яку спостерігали в людських антитілах. Розробку бібліотеки докладно описано в Пі єї аїЇ., ) Мої! Віої 397:385-96, 2010.
Каркаси, які використовували для створення бібліотек, назвали відповідно до генів МН і МІ. людської зародкової лінії, з яких вони походять. Для створення 12 унікальних комбінацій МН : МІ. для експериментів пенінгу проти 5тСО154 або клітин, що експресують повнорозмірний СО154 яванського макака, три бібліотеки важких ланцюгів об'єднували з чотирма легкими ланцюгами зародкової лінії або бібліотеками легких ланцюгів зародкової лінії.
Проводили пенінг бібліотек або щодо повнорозмірного СО154 яванського макака (5ЕО ІЮ
МО: 3), що стабільно експресується в клітинах СНО, або щодо біотинільованого й небіотинільованого 5ітСО154 (5ЕО ІЮ МО: 5). Після декількох раундів пенінгу проводили аналіз
ЕГІЗА з поліклональними фагами з використанням як антигенів 5120154 для визначення специфічного збагачення окремих експериментів пенінгу. Фаг, зібраний у тих експериментах пенінгу, які продемонстрували збагачення агентів зв'язування з 5тСО154, піддавали 3о додатковому скринінгу з моноклональними Еар за допомогою аналізу ЕГІ5А, у якому як агенти зв'язування з небіотинільованим 5тСО154, безпосередньо нанесеним на планшет, використовували Рар-білки, експресовані з окремих Рар-клонів. Рар-клони з сигналом зв'язування, який у чотири рази перевищував негативні контрольні Раб, відбирали для скринінгу в повному форматі Іде. Вибрані Раб клонували в основний ланцюг Ідс25ідта/карра і додатково характеризували з використанням для зв'язування клітин 01.1 ЧигКкаї. ІдсС2г5ідта має нефункціональний Ес і порівняно з ІдДе2 дикого типу містить заміщення М234А, 5237А, Р2385,
Н2б8А, УЗО09І,, АЗ3305 і РЗ3315. Ідо25ідта описано в патенті США Мо 8,961,967.
Приклад 3. Створення антитіл до СО154 у щурів
Антитіла до СО154 створювали з використанням трансгенних щурів, що експресують локуси імуноглобуліну людини, Отпікакя»; ОМтТ, Іпс. Ендогенні локуси імуноглобуліну людини в
ОтпікКакю замінюють людськими локусами Ідк і ДА, і химерний локус (ЯН людини/щура з сегментами М, 0 і У людського походження зв'язують із локусом Сн щура. Локус ІДН містить 22 людські Мн, усі людські сегменти О ії Ун у природній конфігурації, зв'язані з локусом Сн щура.
Створення і характеризацію ОтпікКаке описано в О5роп, еї а. у) Іттипої! 190: 1481-1490, 2013; 1 міжнародній патентній публікації Мо УМО2014/093908.
ОтпікКак» імунізували з використанням 5720154 відповідно до протоколу повторної імунізації з введенням у множину місць (КІММ5). Після 45-денного режиму імунізації в усіх чотирьох щурів збирали лімфатичні вузли й використовували для отримання гібридом.
Супернатанти гібридоми в 96б-ямкових планшетах піддавали скринінгу шляхом аналізу зв'язування ЕГІЗА для ідентифікації тАб, які демонструють зв'язування з 510154, із яких були вибрані супернатанти гібридоми, для яких сигнал у аналізі в З рази перевищував середнє значення негативного контрольного зразка.
Вибрані антитіла клонували як повнорозмірні Ідс25ідта/А. Антитіла, які демонстрували антагоністичну активність щодо індукованої СО154 активації клітин Като5, відбирали для додаткового визначення характеристик.
Приклад 4. Визначення характеристик антитіл
Декілька антитіл до СО154, отриманих із фагового дисплея або трансгенних тварин, які експресують людські імуноглобулінові локуси, що продемонстрували антагоністичну активність, як описано в прикладах 2 і 3, піддавали секвенуванню й додатковій характеризації щодо їхнього во зв'язування з дендритними клітинами людини і яванського макака, щодо їхньої здатності інгібувати функції дендритних і В-клітин людини і яванського макака й щодо ефекторних функцій антитіла. Області МН і МІ антитіл піддавали секвенуванню з використанням стандартних способів.
У таблиці 2 показані амінокислотні послідовності НСОКІ вибраних антитіл.
У таблиці З показані амінокислотні послідовності НСОК2 вибраних антитіл.
У таблиці 4 показані амінокислотні послідовності НСОКЗ вибраних антитіл.
У таблиці 5 показані амінокислотні послідовності Ї/СОМК1 вибраних антитіл.
У таблиці 6 показані амінокислотні послідовності І СОК2 вибраних антитіл.
У таблиці 7 показані амінокислотні послідовності | СОКЗ вибраних антитіл.
У таблиці 8 показані амінокислотні послідовності МН вибраних антитіл.
У таблиці 9 показані амінокислотні послідовності МІ. вибраних антитіл.
Таблиця 2 . нНСОВІ1 дентифкатор тло БЕСТО МО: с41-85 ЗУАЇ5 сС4і 889 УСІ с4цвод ЗУАЇ5
С41 8150 5УЗЕУМС
С41 8189 АУМІН
С41 8191 рУМІН
С41 8199 ЗЕМУМО
Таблиця З . неова2 дентиркатортв 777 Послідовність ІБЕО1ОМО:
Сс41 85 СПРІЕЄСТАМУАДОКЕОС
С41 889 МПОРІГЄЯМТМУАОКЕОС с41 во СІБРУИГОМТММАОКРОС
С41 8150 5І Уа УУМРБОЇ КО
С41 8189 ВІМРОБОСТОМАСОВРОС
С41 В191 ВЕМРМЗаЮтТМОАОКЕОС
С41 8199 СІМ55ОСТУУМРБІ КО
Таблиця 4 нсОовВЗ
С41 85 САБУМООРАЕМЕОСУ
С41 889 ВУХО ру
С41 894 рТОМУУСАЕМІ СУ
С41 8150 г ОогатттОоМЕрн
С41 8189 румуУраваУгарсуУма рми
С41 8191 ЕСЕГАСІЕЕОУ
С41 8199 лмСатТтоУгрУ
Таблиця 5 . І СОВІ ідентифікатор ТЛ 8ЕСТО МО:
С41 85 КОБОЗМІАЗЗММЕМЕЇ А
С41 889 ВАБОБІ5ЗБОМІ М
С41 894 КОБОЗМІ У55ММКММІ А
С41 8150 5аОЕГСООКЕАС
С41 8189 заркісркУумс
С41 8191 заркісркум
С4І В199 заркіаркЕдс
Таблиця 6 . сова ідентифікатор ТЛ 8ЕСТО МО:
Сл В5 ЗАБТВЕ5
С4І 889 ХАМ5ІО5
СА 894 УАБТВЕ5
СІ В150 ОЄЕМКАРБ
С41 8189 ООВКАР5
СА В191 ООВКАРБ
С41 8199 ОРОКАРБ
Таблиця 7 . ІГсОоВЗ ідентифікатор тА 8ЕОТО МО:
Сс4185 ООАУТТРЕТ
С41 В89 ОО5О5ІРМТ
С41 В94 ООХУУ5ТРІТ
С41 8150 ОАМ/О5ОТАМ
С41 8189 ОАМОБОТУМ
С41 8191 ОАМ/О557ТУМ
С41 В199 ОА ОБМТУМ
Таблиця 8
Ідентифікатор
ОМОІЇ МО5БСАЕУККРОАЗЗУКУЗСКАБЗОСОТЕЗ5УАІВММ
СА В5 сані? ВОАРСОСІ-ЕМУМОСИПРІЕЄТАМУАОКРОСВУТІТАОЕВТІ ра
ЗТАУМЕЇ 55І ВБЕОТАУУУСАВОАЗУМ ОС РАЕМЕВ УМ вості УТтУ55
ОМОГ МО5БОАЕУККРОЗЗУКУЗСКАВИа СТЕМИ
ВОАРООСІ ЕМ/МОУМІЗРІЕЄОМТМУАОКЕОСВМТІТАОЕ5
Сл! В89 СЯЦНІв5 |ТеТАУМЕЇ 551 В5ЕОТАУУУСАВОВУУ СО ОУМСОСТІ ССЗ і УтУ55
ОМОІЇ МО5БСАЕУККРОАЗЗУКУЗСКАБЗОСОТЕЗ5УАІВММ са Ве4 са не9 ВОАРООС ЕМ/МОСІЗРУГЯМТМУАОКЕОСВМТІТАОЕ
ЗТЗТАМУМЕЇ 55І ВЗЕОТАМУУСАВОТОаМ/УОАЕМІ ОМ вості УТтУ55
ОГОГОЕБОРОЇ УКРОЗЕТІ 5І ТСТУЗОО5І55УЕУМОМ
ІВОРРООСІ ЕМ/ЛИабвІ УУЗО5ЗТУУМРІЗІ КОВАТМО5УМТ5
Сі В150 СЯЦН2гоО1 ОО |КТОЕБІМІМ5УТААОТАУУУСАВІ ОЇ СТТТОУРОНМУСОЇ С стІУТУ55
С41 8189 С41Н240 |ОМОГМО5ОАЕУККРОАБУКУЗСКАВаИУ ТЕДАУМІНУМ
А
ВОАРОСИЇ ЕУМаВІМРОЗСИаС ТОМАОВЕОСОВУТМТНО
ТЗІЗТАММЕЇІ 5ВІ В5ООТАМЕМСАВНОМУМУразамЕарРв сууа румсоаттУтУзо
ОМОЇ МО5БСАЕУККРЕАЗМКУЗСКАБОаМТЕТОМУМІНМ М
ВОАРОСИЇ ЕМ МавВЕМРЯЗОЮТМСАОКеОосеУТМТВО
Са ВВ Са1Нга2 1 Т8ІЗТАУМЕЇ ТВІ ВЗООТАУУНСАВЕС ЕІ АСІЕРОУМУС | ССЗ
ОоатУТУБо
ОМОГ ОЕЗаРИЇ МКРБЗЕТІ І ТТ УБарбіЗЗЕ УМ
ВОРРОКОаЇ СОУуУУасСІМБастуУММРБІ КЗАМТІЗУОТК
Са 8199 СЯ1Н25О ОО МОвВІКІ РЕУТААОТАУУУСАВІ МІ СТТТОУРОУМСО | С стМТУ55
Таблиця 9
Ідентифікатор й
РІММТО5РОБІ АУ5І ЕВАТІМСКОЗБЗОБМІ АБЗММЕМЕЇ.
С4І в5 СА 18 АМУООКРООРРКИ ІМЗАЗТАЕЗОаУРОВЕЗОаЗОЗИТО 65
ЕТТІЗВ ОАЕОМАУУУСООСАМТТРЕТРСОСТКМЕЇїК
РІОМТО5РББІ БАБМаОАМТІТ СВАБОБІЗЗМІ МУ МО
С4і вВ89 Са 49 КРОКАРКІ ПУМАМ5І ОБаУРЗАЕЗОЗаБЗаИтогтіІ ТІ
ГОРЕОРАТУУСООЗОБІРМТЕСОСТКУЄБК
РІММТО5РОБІ АУ5І ЕВАТІМСКООБМІ МЗ5ММКММІ.
С4і во4 РНУОІ2 АМУООКРООРРКО ММ АЗТАВЕЗаУРОВЕЗОаЗОВИТО 67
ЕТТІЗБІ ОАЕОМАУУМСОСМУЗТРСТЕСОСТКМБЇїК
ЗУЕГ ТОРРІУБУЗРООТАБІТОЗИаОрЕЇ ЧаОКЕАСУУООК
Са41 8150 Са 82 РИОБРМІ МІМОЕМКАРБЗИаЇРЕВНЕЗИаЗМЗОИМТАТІ ТІЗИТт
ОАМОЕАОУУСОАМОЗОТАМЕСОДаткітмІ.
ЗУЕГ ТОРРОУБУЗРООТАЗУТОЗООКІ аОКУУСМУМОВ
С4і 8189 Са 1116 КРЕООБРМІ МІМОСАКА РБИІРЕВЕЗИаЗМЗОИМТАТІ ТІБС
ТОАІСЕАОУУСОАУ ОС ТУМгСс НаИткітМІ.
ЗУЕГ ТОРРІУБУЗРООТАВІТОЗООКІ СИОКУУБУМНОК
Са 8191 ІАРІ 39 РИОБРМІ МІМООВКАРБИа РЕВНЕЗИаЗМЗОИМТАТІ ТІЗИТ 70
ОАМОЕАОУУСОАМ оОЗЗТУМгСсаатТКкІтМІ.
ЗУЕГ ТОРРІУБУЗРООТУВІТОЗООЮКІ ЧаОКЕАСУМООК
С4і 8199 Са 1 125 РИОБРУУМІМОВОКАРБЗаИаІРЕНЕЗаЗТООИМТтАТІ ТІЗИТ 71
ОАМОЕАОУУСОАдМ ОЗ МТУМгсааткі тм.
Антитіла інгібували функцію як ендогенного СО154, забезпеченого на клітинах ЧУигкаї (клітини 01.1 дигкаї у таблиці 10), так і рекомбінантно експресованого тримера СО154 людини (експресований як 50С0154-І,/7 або 5пС0154-Ннів) за результатами вимірювання в аналізі репортерного гена МЕ-кВ 5ЕАР. Антитіла інгібували передавання сигналів зі значеннями ІСво у діапазоні 0,08-21,15 нМ. Значення ІСзхо для вибраних антитіл в аналізі наведено в таблиці 10.
Діапазон значень ІСво для кожного антитіла в таблиці представляє найнижчі й найвищі значення
ІСво, отримані в різних експериментах, тоді як єдине значення вказує на те, що антитіло досліджували в одному експерименті або що доступне було тільки одне дійсне значення ІСво.
Таблиця 10 ав ГГ 2ле-3461 х Для індукування сигналінгу використовували формат СО154
Здатність антитіл інгібувати активацію дендритних клітин оцінювали як описано вище, з використанням секреції ІІ -12р40 як маркера активації ДК. Антитіла інгібували активацію ДК, індуковану ендогенним СО154, забезпеченим на клітинах Уигкаї, зі значеннями ІСзхо у діапазоні 0,02-0,49 нМ. У таблиці 11 показано значення ІСзхо в аналізі для вибраних антитіл. Діапазон значень ІСхо у таблиці представляє найнижче й найвище значення ІСво, отримані в окремих експериментах у 1-6 повторах серед 2--4 донорів.
Таблиця 11 й Аналіз активації дендритних клітин, опосередкованої клітинами
Здатність антитіл інгібувати активацію В-клітин людини або яванського макака вимірювали з використанням показників В-клітинної проліферації. Антитіла інгібували проліферацію, індуковану як ендогенним СО154 (клітини 01.1 дигКаї), так і рекомбінантним тримером СО154 людини (50С20154-ІЇ 2), зі значеннями Со у діапазоні 0,01-5,35 НМ. У таблиці 12 продемонстровані значення ІСво для різних антитіл, отримані в аналізі активації В-клітин людини або яванського макака. Діапазон значень ІСво у таблиці представляє найнижче й найвище значення ІСво, отримані в окремих експериментах у 1-6 повторах серед 2-4 донорів.
Єдине значення ІСзхо у таблиці вказує на те, що доступне тільки одне дійсне значення ІСзво.
Таблиця 12 дентидікаторттяь кни ТЯ зона, БІБ яв яння ПОБИВ клнн клітини людини " людини " яванського макака " саві5о | 7777 027-081.1717171нв | 777777 л1ий-ЯолсСсСсС
Саві89, | 047-065 7777777нв// | 777 4935-56 савіяї | 7777 0,64-ї00 7 17171717171нв/ | 777 025-036 Щ.-:ЖБЙЙ Г саві99,....777 |. 004-027. | 77 нв | 189-231 щ РНЯЮ нв: не виконували х Для індукування сигналінгу використовували формат СО154/джерело В-клітин
Приклад 5. Конструювання антитіл для мінімізації ризику післятрансляційної модифікації
Область Мі антитіла С4ЇВ89 містила ймовірний сайт дезамінації у ЇСОМК2 (М52-553 у легкому ланцюзі С41 149, 5ЕО ІЮО МО: 66). Заміщення виконували окремо в кожній позиції (М525 і 55371) у МІ. Мутовані легкі ланцюги були експресовані спільно з батьківським важким ланцюгом
С41! НІ65 (56О ІО МО: 59) з отриманням антитіл С4І 8235 і С4І! 8236 у вигляді І(дДо25ідта/к.
Амінокислотні послідовності І. СОК2 і Мі. у С4І В235 і С41! В236 показані в таблиці 13 і таблиці 14 відповідно. С4Ї В235 містить НСОК із БЕО ІЮО МО: 17, 23130, І СОК із БЕО ІО МО: 37, 49 і 52, МН із ЗЕО ІЮ МО: 59 і МІ із ЗЕО ІО МО: 72. С4І В236 містить НСОЕК із ЗЕО ІО МО: 17,23і30, 1. СО із ЗЕО ІЮ МО: 37, 50 і 52, МН із БЕО ІО МО: 59 і МІ. із БЕО ІО МО: 73.
Таблиця 13
Таблиця 14
РІОМТО5РББІ БАБМОаОВАМТІТ СВАБОБІЗЗМІ.
МУУООКРОКАРКІ ПУМАБЗБІ ОБаУРЗАЕБИа5
Са! В235 Сал16о С5СТОЕТІ ТІЗ8ІОРЕОРАТУУСООЗОВІРМУТЕ| 0727 сСОоатТкМвїК
РІОМТО5РББІ БАБМОаОВАМТІТ СВАБОБІЗЗМІ.
МУУООКРОКАРКІ ПУМАМТІ ОБаУРЗАЕБИа5
Са Вб сале! О5СТОЕТІ ТІЗВІОРЕОРАТУУСОООВІРМУТЕ С сСОоатТкМвїК
Обидва антитіла досліджували на їхню здатність інгібувати проліферацію В-клітин яванського макака. Антитіло С4ІЇ В235 продемонструвало аналогічну ефективність із СА! В89, тоді як антитіло С4І В236 продемонструвало знижену ефективність порівняно з С4їІ В89.
Приклад 6. Антитіла до СО154 з відключеною ефекторною функцією не індукують активацію тромбоцитів
Були розроблені антитіла до СО154 з позитивними клінічними результатами у пацієнтів з аутоїмунними захворюваннями, однак через випадки тромбоемболії (ТЕ) подальша клінічна розробка антитіл була зупинена. Гуманізоване антитіло 5с8 (ІдсС1/к) являє собою антитіло до
СО154, яке в клінічних умовах індукувало ТЕ (Уадапу єї аї.,, Гириє 13:377-380, 2004).
Передбачається, що тромбоемболія (ТЕ), опосередкована гуманізованим антитілом 5с8, є результатом активації й агрегації тромбоцитів через утворення високовпорядкованих імунних комплексів (ІС) «антитіло до СО154/С0154», які поперечно зшивають тромбоцити шляхом зв'язування Ес з рецептором ЕсукКІІа тромбоцитів. В умовах іп міго сконструйоване антитіло 5с8 з пригніченим Ес (заміщення 0265А в Ід) із відсутністю зв'язування з рецептором ЕсукКПа не активувало тромбоцити (Хіє еї аї!., У Іттипої! 192:4083-4092, 2014).
Таким чином, антитіла до СО154 з вимкненим зв'язуванням з принаймні ЕсуКІа і зниженими ефекторними функціями, можуть бути більш придатними як терапевтичний засіб зі зменшеним 3о ризиком розвитку ТЕ.
З цією метою були створені антитіла до СО154 без ефекторної функції з різними заміщеннями Ес, і вони були досліджені щодо їхнього впливу на активацію тромбоцитів.
МН і МІ. гуманізованого антитіла 5с8 (Кагризаз єї аї!., бігисішиге 9: 321-329, 2001) клонували як
Ідс15ідта/к, (дсС15ідтамуТЕ/к, Ідс2г5ідта/к або Ідсг2г5ідтамиТЕ/к, щоб оцінити вплив Ес на активацію тромбоцитів; отримані антитіла назвали 5свідсівідта, 5св8іІдс15ідтамтТЕ, 5свідо2г5ідта і 5свІдс25ідтамтТЕ). Ідс15ідта порівняно з ЇДС1 дикого типу містить заміщення
ІЇ234А, І 235А, 5237А, Р2385, Н2б8А, АЗ305 і РЗ315. Ідс15ідтамтТЕ містить заміщення І 234А,
ІЇ235А, 05237А, Р2385, М252У, 5254Т, Т256Е Н2бВА, АЗ305 і РЗ315. Ідб2г5ідта містить заміщення М234А, 5237А, Р2385, Н2б8ВА, М3091І, АЗ305 і РЗ315. Ідс25ідтамТЕ містить заміщення М234А, 05237А, Р2385, М252У, 5254Т, Т256Е, Н2б8А, М3091, АЗЗ305 і РЗ315.
Нумерація залишків відповідає індексу Е). В антитілах з основним ланцюгом Ідс25ідта відсутні ефекторні функції й зв'язування з ЕсукК, як описано в патенті США Мо 8,961,967. Заміщення УТЕ (М252У, 5254Т, Т256Е) описані в баіІГАсдца еї аї., У Віої Спет 281:23 514-24, 2006.
Домени МН і Мі. гуманізованого 5с8 показані в ЗЕО ІЮ МО: 74 і 75 відповідно.
ЗЕО І МО: 74 дудімдздаємукрдаазукізсКказду пзуутумукдардачіемжмідеіпропдаїпіпекік5Каїйїмакзавіаутеї!55ік5е діамуусігзадтатавзмдадімім55
ЗЕО ІЮ МО: 75 дімндз5раїізм5рдегаїїзстаздгу555іузутпмудакрадрркіїїКуазпівездуранзазазагйнніввзмереагагууса пмеїррнадакіеїк 5свідс15ідта, 5свідс15ідтахмТЕ, 5с8Ідс25ідта і 5св8іІдс25ідтахуТЕ досліджували щодо їхнього впливу на активацію тромбоцитів.
Використовували кров від здорових донорів, попередньо відібрану через низьку відповідь на 5пСО154. Активацію тромбоцитів оцінювали за допомогою проточної цитометрії з використанням перевірених маркерів активації тромбоцитів РАС-1 (активований ОРІЇБЛІа) і бСОбгр (Р-селектин). Якщо коротко, цільну кров (М/В) додавали до модифікованого буфера
Тугоде5-НЕРЕЗ, який містив 1 мМ Сасі», і до суміші додавали антитіла до РАСІ і до СОб2гр з
ЕсукКПа-блокувальним антитілом (клон ІМ.3, їетсеї! ТесппоЇодіє5, номер за каталогом 60012) або без нього та інкубували протягом 25 хвилин. До суміші додавали попередньо утворені імунні комплекси розчинного СО154 (РергоТесі, номер за каталогом 310-02; ЗЕО ІЮ МО: 4 або
Топро Віозсіепсе5, номер за каталогом 21-7088)/антитіла у молярному співвідношенні З : 1
СОр154 : антитіло до СО154 і інкубували ще протягом 20 хвилин; тромбоцити фіксували в 1 95 формаліні, після чого виконували аналіз ГАС5. Активацію тромбоцитів для кожного стану оцінювали як 95 стробованих тромбоцитів (СО61-позитивних подій), що експресують РАС-1 і
СОрб2р; Для кожного стану лікування реєстрували й аналізували 5000 подій експресії СОб61 (тромбоцити). Результати експерименту показані на Фіг. 1. ІС СО154/5с819с1 (901 дикого типу) активував тромбоцити, тоді як ІС СО154 із 5с8-Ідс15ідта, 5свідс15ідтамтЕ, 5св8Ідс25ідта і
Бсвідс25ідта-уУТЕ не активували тромбоцити. Імунні комплекси не інгібували активацію тромбоцитів АДФ (дані не показані). Жодне з антитіл саме по собі не активувало тромбоцити (дані не показані). 3о0 Антитіла до СО154 С4185, С41889, С41894, С41 8150, С41І В189, С41І В191, С41 8199 (усі тАр з вимкненою ефекторною функцією Ідо25ідта) також досліджували в аналізі активації тромбоцитів для підтвердження того, що в цих антитілах було вимкнене зв'язування з ЕсуКІІа і що вони не активують тромбоцити. На Фіг. 2 показані результати експерименту, який демонструє, що імунним комплексам СО154 у сукупності з СА! В5, С4! В89, С41! В150, СА! В189,
С418191 або С4іЩ8199 не вдалося активувати тромбоцити. Комплекс СО154/С41 894 ІС індукував РАС-1 на тромбоцитах. Результати демонструють, що антитіла до СО154 з ізотипами
Ідс15ідта, ІдсівзідтахжєТЕ, ІдбсСгзідта або ІдсСг2гз5ідтахжєТЕ по суті можуть не активувати тромбоцити й тому можуть мати покращений профіль безпечності порівняно з антитілами Ідс1 дикого типу.
Приклад 7. Вплив перемикання ізотипів на властивості антитіл
Варіабельні області антитіла С4І В89 клонували як ізотипи Ідс15ідта/к і Ідс15ідтамтТЕ для оцінки можливих відмінностей у функціональності й можливості проведення розробки. Нові антитіла назвали С41 В231 (Ідс15ідта) і С4І! В232 (ІдсС15ідтамтТЕ).
Отримані антитіла ІдсСтівзідта і ІдстівзідтахжтТЕ порівнювали за функціональністю з батьківським антитілом. Функціонально С41І В231 і С4І! В232 були порівнянними з батьківським
СА 889. У таблиці 15 показані значення ІСхо або діапазон значень ІСхо для кожного антитіла у функціональних аналізах, зазначених у таблиці. Діапазон значень ІСхо у таблиці представляє найнижче й найвище значення ІСво, отримані в експериментах у 1-6 повторах серед 2-4 донорів. Єдине значення ІСзхо у таблиці вказує на те, що доступне тільки одне дійсне значення
ІСво.
Таблиця 15
Для індукування сигналінгу
Аналіз використовували формат сО15А Са В231 Са В232
Аналіз репортерного гена МЕ-
Аналіз репортерного гена МЕ- Й Ш
КВ ЗЕАР; ІСоо (НМ) 5пСО0154-ІІ 7 1,21 1,25-1,45
Аналіз репортерного гена МЕ- ще
КВ ЗЕАР: ІСео (НМ 5пСОр154-Нів 2,15 1,77-1,99
Аналіз активації дендритних клітин, опосередкованої Ш Ш клітинами Уиткає І. -12р40 ІСво 01.1 уиткаї 0,02-0,04 0,03-0,03 (НМ)
ІСво (НМ) проліферації В-клітин | ду 1 Уиткаї 0,01--0,01 0,01--0,01 людини
ІСво (НМ) проліферації В-клітин | нср154-17 0,38-0,67 0,42--0,74 людини
ІСво (НМ) проліферації В-клітин Й Ш Ш яванського макака 5пСО0154-ІІ 7 0,25-0,55 0,20-0,55
Також досліджували вплив С41Ї8231 і С4/! 8232 на тромбоцити. Ані імунний комплекс 5пСОр154 : С41 В231, ані ІС 5пиС0154 : С4| В232 не активували тромбоцити вище вихідного рівня.
ІС СО154/5с819С1 активував тромбоцити, і активація була заблокована за присутності ІМ.3, що демонструє, що активація тромбоцитів була опосередкована зв'язуванням ІС з ЕсуКІПа. На фіг. З показані результати експерименту.
Приклад 8. Антитіла до СО154 зв'язують СЮО154 людини з високою афінністю
Вимірювання афінності виконували з використанням системи РгоїеОп, як описано в прикладі 1. Значення швидкості асоціації, швидкості дисоціації й афінності показані в таблиці 16.
Параметри, зазначені в цій таблиці, були отримані з використанням моделі зв'язування
Ленгмюра 1 : 1 для всіх зразків, крім С4І 894 і С41І В150, які підганяли з використанням моделі зв'язування двох станів.
Таблиця 16 ка (1/Мо) ка (1/с) Ко (М)
С41 В5 5,7/ОЕ - 05 1,78Е - 04 З12Е-10
С41 89 1,61Е - 06 З,80Е - 04 2,39Е-10
С41 94 1,58Е - 06 3,29Е - 03 2,09Е - 09
С41 8150 2,27Е 4 06 б.17Е - 03 2,712Е-09
С41 8189 3,55Е - 05 2,06Е - 04 5,81Е-10
С41 8191 5,62Е - 06 1,76Е - 04 З,1ЗЕ - 11
С41 8199 1,60Е - 06 4,04Е - 04 2,53Е-10
Приклад 9. Кристалічна структура СО154 мавпи-ігрунки в комплексі з СА! В89
Епітоп антитіла С41889 ідентифікували за допомогою рентгенівської кристалографії.
Мічений гістидином Бар-фрагмент С41 В89 і мічену гістидином розчинну форму СО40І. мавпи- ігрунки (5тС0154-пі5) експресували в клітинах НЕК293 СОпТіІ і очищали з використанням афінної хроматографії й гель-проникаючої хроматографії. Комплекс 5тСО0154 : С41І В89 інкубували протягом ночі за 4 "С, концентрували й відокремлювали від молекул, що не ввійшли до комплексу з використанням гель-проникаючої хроматографії. Комплекс кристалізували пародифузійним способом із розчину, який містив 16 95 ПЕГ 3350, 0,2 М цитрату амонію, 0,1 М
МЕ5, рН 6,5. Кристали належать до кубічної просторової групи Р2:13 з розмірами елементарної комірки 162,1 А. Структуру комплексу визначали згідно зі способом молекулярного заміщення з використанням як пошукових моделей кристалічних структур С4І В89 Раб і СО401І (у базі даних білків РОВ зареєстровано як 1АЇ Х).
Комплекс 5тСО0154 : С4| В89 є симетричним тримером, розташованим на кристалографічній
З-кратній осі. С4/ 889 зв'язує тСО154 на межі поділу між двома субодиницями на епітопі,
віддаленому від клітинної поверхні. Епітоп включає 16 залишків, по 8 із кожної з двох субодиниць СО154. Епітопні залишки являють собою Е182, 5185, 0186, А187, Р188, 5214, А215 і К207 у першій субодиниці СО154 і Т176, Е177, С178, 0220, 5248, Н2г49, 5250 і 253 у другій субодиниці СО154. Нумерація залишків епітопа відповідає повнорозмірному СО154 людини із 5ЕО ІЮ МО: 1. Паратоп визначається як залишки антитіла в межах 4 А від залишків СО154.
Паратоп С41 В89 включає 9 залишків із важкого ланцюга С41! 889: 531 і 32 із НСОК'І, 552, ІБ54,
Е55 і М57 із НСОКЗ2 ї К100, М101 ї У102 із НСОКЗ. Нумерація паратопних залишків відповідає МН
С41889 із 5БО ІО МО: 59. Легкий ланцюг не залучений до контактування з тоО154.
Грунтуючись на кількості контактів, Е55 у НСОВБ2 є ключовим елементом розпізнавання антигена. Е55 здійснює контакт із СО154-залишками Т176, Е177, С178, 0220, 5248, Н2г49, 5250 і
Е253. НСОВЗ-залишки М101 ії М102 також сприяють зв'язуванню. На Фіг. 4 показані контактні залишки НСОК2 ї НСОКЗ і відсутність зв'язування І С із СО154. На Фіг. 5 показаний графічний рисунок епітопних і паратопних залишків.
Розчинні білюии СО154 людини й мавпи-ігрунки відрізняються лише 8 амінокислотними залишками. Усі епітопні залишки тСО154 С4і889 у людини є консервативними. Тому очікується, що епітоп є консервативним між СО154 мавпи-ігрунки і людини. Вирівнювання повнорозмірних білків СЮО154 людини й мавпи-ігрунки продемонстроване на Фіг. 6.
Приклад 10. Активація тромбоцитів антитілами до СО154 залежить від епітопа
Варіабельні області С4ЇВ89 (МН із 5ЗЕО ІО МО: 59 і Мі із БЕО ІЮ МО: 66) клонували як
ІЧе1/к, отримуючи антитіло С4І! В237. За результатами вимірювання з використанням системи
РгоїеОп, як описано в прикладі 1, було підтверджено, що С41І В237 підтримує зв'язування СО154 людини (таблиця 17). Афінність С4Ї В237 до СО154 людини становила 23,6 х 5,4 пМ. Здається, що перемикання отриманих із С4І В89 ізотипів МН//І з Ідс25ідта на Ідс1 змінює афінність зв'язування отриманого антитіла.
Як очікувалось, С4ІЇ В237 зв'язував людські ЕсуКіІІа і ЕсукКІПШа зі значенням Ко 0,994 мкМ і 0,146 мкМ відповідно. С4І В237 продемонстрував ефективність, порівнянну з С41 В231 і більшу, ніж у С41! В89, у аналізі репортерного гена МЕ-кВ ЗЕАР за використання 5пСО154-Нів для індукування сигналінгу (таблиця 18).
С4і 8237 досліджували щодо його впливу на активацію тромбоцитів. ІС 5пиС0154:С41І В237 3о не активували тромбоцити вище вихідного рівня, як показано на Фіг. 7. Цей результат свідчить про те, що на додаток до Ес епітоп антитіла сприяє здатності або нездатності антитіла активувати тромбоцити.
Таблиця 17
Таблиця 18 95 95 ДІ
Приклад 11. Конструювання нейтральних мутацій на С4І! 889
Аналізи кристалічної структури С4! 889 у комплексі з СО154 виявили положення в СОК
С41 В89, які можуть піддаватися мутації без впливу на загальну структуру комплексу й тому, як очікується, не впливають на властивості антитіла С41І В89. Ці нейтральні мутації в СОК легкого ланцюга наведені в таблиці 19, мутації в СОК важкого ланцюга наведені в таблиці 20.
Нумерацію залишків, які можуть піддаватися мутації, показано як на окремих СОК, так і на МІ або УН. Наприклад, залишок 04 на І СОКІ із БЕО ІЮ МО: 37 (КАБОЗБІЗБЗУЇІ М) може піддаватися мутації на А, С.О, Е, ГЕ, б, Н, І, К, Ї, М, М, ЕК, 5, Т, М, М/ або У із очікуванням того, що характеристики антитіла по суті не змінюються. Відповідним залишком у Мі із «ЕО ІЮ МО: 66 є
О27.
Мутації, наведені в таблиці 19 або таблиці 20, виконані окремо або в комбінації на С41 В89 із використанням стандартних способів. Отримані пари МН/Л// являють собою експресовані й піддані мутації антитіла, виділені й охарактеризовані з використанням способів, описаних у цьому документі.
Таблиця 19 залишок Залишок МІ.
І сСОоВ Са 889 І СОвВ СА В89 (ЗЕО ІО МО: 66) Можливі заміщення
С41 89
А, С, р, Е, Е, а, Н, Ї, К, І, М, М, В, З, т, (ВАВОБІЗВУНМ), 57 530 А, С,0,Е, Рг, с, Н.І, К, І М, М, О, В,
Т, М, М, У
А, С, р, Е, Е, а, Н, Ї, К, І, М, М, О, В, тиму
А, С, р, Е, Е, а, Н, Ї, К, І, М, О, В, 5, ту
А, С,0,Е, Рг, с, Н.І, К, І М, М, О, В, (МАМ5І О5) А, С,0,Е, Р, а, Н.І, К, М, М, О, А, 5,
І 5 І 54 ТММ, ХУ 706 | о556ЮЩ Е ВМ
А, С, р, Е, Е, а, Н, Ї, К, І, М, М, О, В, тиму
ІСОКЗ із БЕО ІО МО: 52
А, С, р, Е, Е, а, Н, Ї, К, І, М, М, О, В, 16 | 194 |А,С,0,Е,С,К І, М,М, ОВ, 5 ТМ
Таблиця 20
Положення
Залишок залишків МН
Нео сС41 889 несОоВ ФЕО ІЮ МО: Можливі заміщення слівве | БО : 59)
С41 89
НСОВІ1 5ЕО ІО МО: 17 А, С, р, Е, с, Ї, К, С, М, М, О, В, Т, У (5УСІВ)
М.С ОЕ
М8 М57 А, С, р, Е, Е, а, Н, Ї, К, І, М, О, В, З, т,
НОСОК? із БЕО ІО МО: 23 М, М, У (МІ5РІГЄВМТММАОКРЕОС) А, С,.0,Е, Р, Са, Н.І, К, І, М, М, О, В, 5, т9 58
М, М, У
А, С, р, Е, Е, а, Н, Ї, К, І, М, О, В, З, т,
НСОВЗ із ЗЕО ІЮ МО: 30 (6ВУУСО ОХ) втоо А, 5 ОК ї705
Приклад 12. Оцінювання активації тромбоцитів і утворення імунних комплексів вищого порядку
Після оцінки даних кристалічної структури для області Раб і комплексу 5ПИСО154 для ранніх експериментів С41! В231 ії 5С81Ідс1 із використанням методів ЗС-НРІ С і 0 5, а також аналізу даних активації тромбоцитів, було висловлено припущення, що невеликі відмінності у зв'язуванні антитіл до СО154 з тримером 5120154 можуть сприяти формуванню імунних комплексів вищого порядку: 1) ар С4І В231 зв'язується між 2 субодиницями тримера 520154, тоді як баб 5С8 зв'язує 1 субодиницю 5020154, 2) Бар С41І В231 виглядає більш стійким у цій конформації, ніж Раб 5с8, 3) і кут зв'язування антитіла до СО154 із 500154.
Для додаткової оцінки ролі епітопа антитіла в опосередкуванні активації тромбоцитів і формування імунних комплексів вищого порядку з 5ПСО154 клонували МН і Мі. різних антитіл до
СОр154 і експресували як ізотипи Ідс25ідта і Ідс15ідта з нефункціональним Ес або як ІдС1.
Створені антитіла показані в таблиці 21. Аналізи активації тромбоцитів проводили, як описано в прикладі 6. Для оцінки утворення імунних комплексів вищого порядку шляхом гель-проникаючої високоефективної рідинної хроматографії (ГП-ВЕРХ) і динамічного розсіювання світла (05) антитіла вводили в комплекс зі 50СО154 у молярних співвідношеннях 1 : 1 (також відповідає 10: 10) ї 10 : 1, щоб оцінити, чи існують залежні від концентрацій відмінності в утворенні імунних комплексів.
Таблиця 21 59 84 85 савєт 7355 ло 5 00661 67
ІЧе1о: Ідс15ідта
ЗЕО І МО: 84 МН із С4І В119
ОМОЇ МОБСАЕУККРОБЗУКУЗСКАВОСИТЕЗБУМІЗМУВОАРОСИЇ ЕМ МаАІЮРУБГамМАМУАОК
ЕОСАМТІТАОЕЗТОЗТАММЕЇ 551 В5ЕОТАУУУСАВТаї МУсИагримаосаті мтУ55
ЗЕО І МО: 85 МІ із С4І! В119 еімидзраївізрдегаїїзстаздзуиз5зуіамудакрддарпіїудазпгашіранзазазаанніззіередтамуусддгвпмрі наддікмеїК
ЗЕО І МО: 86 МН із С4І! В83
ОМОЇ МОБСАЕУККРОЗБЗУКУЗСКАВИИТЕЗЗУАІЗУМУУВОАРОССЇ ЕМ МСУМПРІЄЕМТММАОКЕ
ОС АМТІТАОЕЗТЗТАММЕЇ 551 В5ЕОТАМУМСАВЕКОЕВНСОУТКІ ОМУУСОСТІ МТУ
ЗЕО І МО: 87 МІ із С4І! В83
РІОМТО5РББІ БАБМАО ВМТ СВАБОБІММУ МУ МООКРОКАРКІ ІП ІМААББІ О5БаУРЗАЕбИа5 азатТОоРТТІЗЗІ ОРЕОРАТУУСООЗЕЗЕРУТРаОСТКМЕїК
Характеристики зв'язування й функціональні характеристики СА! В83 і С4І В119 оцінювали з використанням протоколів, описаних у прикладі 1; вони наведені в таблиці 22.
Таблиця 22
Аналіз активації
Антитіло Ка (1/Мс) ка (1/с) Ко (М) В-клітин, ІСво (нм) У «5пСО154-ІІ 7-індукована активація В-клітин людини. Діапазон представляє найнижче й найвище значення ІСво, отримані в окремих експериментах у 2 донорів 3о0
Способи
ГП-ВЕРХ
Їмунні комплекси з антитіл, показаних у таблиці 21, і 5пСО154, міченого АїЇІехайПно-448, отримували в молярному співвідношенні антитіло 5п0С01541:1110 :1 у 110 мкл 1 х ФБР і інкубували за 37 "С протягом 30 хв. У колонку (система Адіепі, 1100/1200) для кожного експерименту вводили по 100 мкл кожного зразка, який містив 5 мкг 53пСО154, міченого АЕ488, і 15 мкг (співвідношення 1 : 1), або 150 мкг (співвідношення 10 : 1) тАб до СО154. Молекулярну масу розраховували на основі часу утримування стандартних зразків (Віо-Кай). Зв'язок між молекулярною масою й часом утримування білка задовольняє рівнянню: од (М)-65-ст, де М -- це молекулярна маса, Т -- час утримування, б і с -- константи. Лінійну криву ІОдДд(М) і
Т отримували зі стандартних хроматограм ГП-ВЕРХ відповідно до моделі найменших квадратів, де К2 - 0,9928. рІ 5
Вимірювання 05 грунтується на принципах розсіювання світла й молекулярному або броунівському русі. Броунівський рух - типова поведінка молекул у розчині -- спричиняє розсіювання світла як у фазі, так і поза нею, що призводить до конструктивних і деструктивних інтерференцій. У результаті інтенсивність розсіяного світла з часом коливається. Під час аналізу ОСІ 5 або ОЕЇ 5 (квазіелектричне розсіювання світла) це залежне від часу коливання інтенсивності розсіяного світла реєструється лічильником швидких фотонів. Коливання є прямо пропорційними швидкості дифузії. Аналіз даних кореляції з використанням рівняння Стокса --
Ейнштейна дозволяє отримати гідродинамічний радіус. На відміну від гель-проникаючої хроматографії з багатокутним розсіюванням лазерного світла (ЗЕС-МАЇ 5) або 5ЕС, де аналіз зразка може розрізнити мономер і димер, 05 дозволяє розрізняти тільки ті молекули, які розділені коефіцієнтом розміру «- 4, тому розрізнятися почнуть мономер і тетрамер; проте мономер і димер не розрізнятимуться, але буде повідомлятися середньозважене значення суміші.
Рівняння Стокса -- Ейнштейна: Кь - КТ/бппо; де
Ор - коефіцієнт дифузії,
К - константа Больцмана,
Те температура, 3о п: в'язкість
Антитіла окремо (10 мкМ) або імунні комплекси антитіл, показаних у таблиці 21, і 5600154 отримували в молярних концентраціях антитіло : 5020154 10: 1 або 10: 10 (10 мкМ антитіла й або 1 мкМ або 10 мкм 5пС0154) у ФБР. Усі зразки готували в скляних флаконах із вкладками у флакони (250 мкл деактивованого скла з полімерними ніжками, Адіїепі, номер за каталогом 5181-8872), і зразки додавали в наступному порядку: ФБР, тАб, 5пСО154. Зразки перемішували обережними вихровими рухами, потім інкубували за кімнатної температури зі струшуванням (змішувач Миїайпод Міхег (МИ/К), - 30 об/хв протягом приблизно 23 год. За потреби антитіла спочатку концентрували з використанням стандартних способів.
Розподіл розмірів частинок і молекул у всіх зразках визначали на приладі ЮупаРго Ріаїе
Кеадег 0 5 (Уууай Тесппоїодіез Согрогайоп) за температури 23 "С. Узгодженість ОІ 5 спочатку підтверджували з використанням БСА (дані не показані). Виміри проводили шляхом введення
ЗО мкл зразка в кожну з З лунок (для трьох повторів). Вимірювання ОЇ 5 виконували за допомогою спектрофотометра для планшетів ЮОупаРго. Для кожного зразка виконували двадцять 5-секундних реєстрацій даних, причому потужність лазера регулювалася приладом автоматично. Параметри, які використовувалися для аналізу даних, включали в'язкість за 23 "С для ФБР 1,019 сП і значення показника заломлення за 589 нм і 23 "С для ФБР 1,333. У програмі використовувалася глобулярна модель білка. Сигнали об'єднувалися в піки, де пік 1 становив 0,1-10 нм, пік 2 становив 10-100 нм, пік З становив 100-1000 нм і пік 4 становив 1000-5000 нм.
У зразку спостерігався видимий осад (якщо утворювався). Аналіз даних виконували з використанням програмного забезпечення Юупатіся (Мууай Тесппоіоду Іпс.). Були побудовані графіки відношення маси у відсотках до радіусу молекули (КП). Обчислювали й реєстрували радіус піка, полідисперсність, відсоткову масу й відсоткову інтенсивність.
Результати
Активація тромбоцитів
Оцінювали здатність імунних комплексів 5пСО154 і антитіл, які експресуються як Ідо25ідта або Ідсівідта з нефункціональним Ес або як ІДС! дикого типу, активувати тромбоцити.
Антитіло 5068, клоноване на різних каркасах (дб, використовували як контроль. На Фіг. З показано, що імунні комплекси 5с8Ідсе1 : 5пСО0154 активували тромбоцити ЕсукПа-залежним способом, оскільки антитіло до ЕсукКПа оінгібувало 5с8Ідс1-опосередковану активацію бо тромбоцитів. Області МН/Л/Л. у 5с8, клоновані в Ідс15ідта або ІдсС2в5ідта з Ес з відсутніми 5О0 ефекторними функціями, втратили свою здатність активувати тромбоцити (Фіг. 1). Ці результати узгоджуються з тим, що було описано раніше. Однак несподівано експерименти, проведені в прикладі 10, показали, що імунні комплекси з антитілом Ідс1 дикого типу (С4І ВВ237 : 53пиСО154), не активували тромбоцити (Фіг. 7), що спонукало до подальших досліджень можливої епітопної залежності активації тромбоцитів.
Області МНЛ/. 4 різних антитіл клонували як Ідс25ідта, Ідс15ідта або Ідс1 дикого типу, щоб оцінити вплив епітопа й/або Ес на активацію тромбоцитів, а також на формування імунних комплексів вищого порядку. Попри те, що було описано в літературі раніше, було виявлено, що активація тромбоцитів у деяких випадках опосередкована епітопом антитіла незалежно від
ЕсукКПа-опосередкованого поперечного зшивання.
На Фіг. 84А, Фіг. 88 і Фіг. 8С показані сумарні дані аналізів. Імунні комплекси антитіл С4І! В119 (Фі. 8А) і С41894 (Фіг. 88) з нефункціональним Ес активували тромбоцити в ЕсугкІа- незалежний спосіб, оскільки попереднє блокування антитілом до ЕсукКіІїа не інгібувало активацію тромбоцитів. ІС з антитілом С41 883, також з нефункціональним Ес, помірно активували тромбоцити (Фіг. 8С). ІС з антитілами з ідентичними доменами УНЛ/Л/,, клонованими на 901 дикого типу, у кожному випадку активували тромбоцити ЕсукКіІІа-опосередкованим способом (С41І 8278 на Фіг. вА, С41! В289 на Фіг. 88 і С4І! В288 на Фіг. 8С). Таким чином, було ідентифіковано декілька антитіл, які опосередковували активацію тромбоцитів, незважаючи на наявність нефункціонального Ес. Було ідентифіковано одну пару доменів МН//, яка не опосередковувала активацію тромбоцитів на Ідс1: ані на «мовчазному» (С41І В231) ані на дикого типу (С4І В237). Ці дані показують, що епітоп антитіла відіграє роль у опосередкуванні агрегації тромбоцитів.
Утворення імунних комплексів вищого порядку
ГП-ВЕРХ і рі 5 використовували для подальшої оцінки наявності утворення імунних комплексів вищого порядку й приблизного розміру цих імунних комплексів між антитілами до
СО154, показаними в таблиці 21, і 53пИСО154. Оскільки 5пСО154 у розчині є тримером, очікувана стехіометрія антитіло : тример 5ПСО154 у розчині становить З : 1. Для ГП-ВЕРХ: важчі, а, отже, більші імунні комплекси мали би коротший час утримування, тоді як легші, а, отже, менші імунні комплекси мали би триваліший час утримування, за винятком дуже великих імунних комплексів, зо які не можуть елююватися з колонки й підтверджуються низьким 906 відновлення. Для 0 5: більше значення радіусу (КП) означає більший імунний комплекс. Планшетні методики ОРІ 5 не можуть розрізняти мономери, димери, тримери й тетрамери ІдсС. Таким чином, отримані значення Кії будуть середньозваженими для мономера - тетрамера, тому значення Кі, більш наближені до 6,5, можуть представляти розчини ІттАбБ, що містять молекули вищого порядку, зазвичай димери. Якщо зв'язування тАб із 5020154 є стехіометричним, можуть бути присутніми дві молекули: комплекс З : 1 (ї 500 кДа) і незв'язане антитіло (ї 150 кДа), що відповідає значенням КП - 8,8 нм і 5-6,5 нм для комплексу З : 1 і вільного тАб відповідно.
Жодна з методик не може точно визначити молекулярну масу імунних комплексів, але може визначити порівняльні розміри. У таблиці 23 показана залежність часу утримування й гідродинамічних радіусів для приблизних молекулярних мас.
Таблиця 23 - Приблизна ГП-ВЕРХ, час | 0-5, гідродинамічний
Імунний комплекс радіус молекулярна маса (кДа)| утримування (хв) (нм) порядку рІ 5
Розміри тАБ за відсутності СО154 і імунних комплексів антитіло : 51ИСО154 оцінювали в умовах, коли комплекси антитіло : 561ИСО154 утворювалися за надлишку антитіла (молярне співвідношення 10 : 1) і в еквівалентній концентрації (молярне співвідношення 1 : 1). В умовах надлишку антитіла антитіло зазвичай насичує сайти СО154 з утворенням імунного комплексу, і спостерігається присутність надлишку незв'язаного антитіла. В умовах еквівалентної концентрації вільне антитіло або вільний 5пПСО154 відсутні. Значення Кі, отримані для кожного тА за відсутності 5020154 і за присутності 5АИСО154 у молярних співвідношеннях 10:11 і 10: 10, показані в таблиці 24.
Типове тАБ з номінальною молекулярною масою (ММ) 150 кДа має значення Ки 5,0-6,5 нм.
Димери дос, які часто спостерігаються під час гель-проникаючої хроматографії, не можуть бути розрізнені за допомогою планшетних методик 05. Отримані значення КП будуть середньозваженими для мономера - тетрамера, тому значення Ки, більш наближені до 6,5, можуть представляти розчини тАб, що містять молекули вищого порядку, зазвичай димери.
Для тАбБ за відсутності СО154: очікувані значення Ки 5,5-6,3 нм спостерігалися для всіх тА, крім С4І! В287 і С4І! В234, де значення Ку» відповідно 6,9 і 7,1 нм свідчили про те, що ці антитіла мають властиві їм тенденції агрегації.
Значення Ки для комплексів антитіло : 53ПИСО154, утворених у співвідношенні 10 : 1, по суті були меншими ніж приблизно 8,8 нм, що вказує на стехіометричний комплекс З : 1 без утворення імунних комплексів вищого порядку, за винятком 5с8Ідс25ідта (С4І В71) і С4І! 8234 (значення Кь 8,9 і 9,3 нм відповідно), що вказує на формування імунних комплексів вищого порядку.
Підвищення концентрації 53АИСО154 до 10 мкМ призводило до утворення імунних комплексів антитіло : 5пИСО154 зі збільшеним КП порівняно з комплексами з 1 мкМ СО154 (співвідношення антитіло : СО154 10 : 1). Деякі з комплексів антитіло : 50С0154 продемонстрували гетерогенність з присутніми високомолекулярними вторинними молекулами у діапазоні 7-25 Фо від загальної маси. Значення Кі для ІС С41І В71, 5С8ІдДС1, С4І! В89, С4І В119, С41 В94, С41І В234 і
С4і 8289 становили відповідно 22,1, 615, 56,3, 45,0, 18,3, 18,7 і 19,6 нм. Крім того, С4! В89,
С41і8119, С41883, С41і 8228 також утворювали молекули 9000-4000, а С41889 і С41 8119 утворювали осад, що вказує на дуже великі імунні комплекси. Молекули з КИ близько 12 нм зазвичай відповідають масі - 1000 кДа, тому ці тАб за вказаних умов утворюють дуже великі імунні комплекси з СО154.
Таблиця 24
Б ре фо» ро» ро нн""'ШШЮНИИШОООВВВВВИВИВОЛБЛТИИИТИИТЬИЬЛТЬЬТИТИТЬЦОИОСЬТЬЬТ ТВВВЛЛОЛЬОООЛІЖПМІЛІИВВВВВВВТОТИТОООТИ
Сава Моб! | 77617 1777111774 | 77177798 2щ нп"?"'НнІТШИТЇФЬИІООЛІОЛТООМЛМІЦЦБІББіІБІИНННВІВВВВВВВВВЛТОВВВВВИТНЬЬЙКОТТОТОТТ
Савіт9 Мосго///// | 63 2 щ | 80 5 ющЩ | 5бЗрі
Савг87 Моб! | 7/7169 2 щЩщф| 82 9 | 1298 нн"н"'ШІСТИЬИЙИИЛОЛОЛЛВОВООВЬЛИПЇПТТИТИОТИТОЦИТЦЛДТОЛОООЛОВОИВИВИВИВТВЛОВЛВЛВЛВЛВЛВЛВЛВЛВЛВЛОВЛОЛТЛТЛТЛВОТЛОТЛОТВЛТОТВИТОТЛИТОТВИТЛОТЛОТОТЛОТЛИТУТЛИТИТМЛМУ
Савв3 0 Мос2о7/////// | 77/76 77777177 61111111 145.(3632)ЩГ
Сава Моб! | 77617177 66 777 |Ї777171111098 нп"н"'нЧІІИИЬИЦЙВІЛІИИЛТЬЬЬНЬИЬТНТНЬНЬТЬТЬТЬТЬТЬНТИХЬЬОСИХШХТИЬТОЗІІИЙИШШИВВТТТ
Саве4 /0 Мос2ої7////// | 617 1777168 ...77745 2 щЩ х Співвідношення антитіло : 50СО0154
Значення Кі вторинних молекул були включені в круглі дужки, якщо 95 мас. становив 2 25 905 рр: розчин з осадом
ІЧе2о0: ІдДс25ідта
ІЧОе1о: ІдДс15ідта
ГП-ВЕРХ
У таблиці 25 показано час утримування, швидкість відновлення й розрахункову молекулярну масу (ММ) антитіл до СО154 окремо і в імунному комплексі з 50ИСО154, отримані в аналізах ГП-
ВЕРХ. Типове антитіло має ММ приблизно 150 кДа, а тример 5пСО154 має ММ приблизно 50 3о кДа. Таким чином, комплекс тАр : тример 50СО0154 зі стехіометрією З : 1 має очікувану молекулярну масу ММ приблизно 500 кДа.
Таблиця 25 (С4І-В71) 11710117 628171 7348 177 909727 | 15382 ни шнишш
САВАУЄ дві 555 2----- в ----в 119 лося 1771111689911 17977 1987 792 ншш ншш 77777719 ншш 77777719 ншш ншш 111111111логт1 1711111 653 1 7958 | 985 2 щ | 12176) «тА: 0154) "к Коефіцієнт відновлення « 50 90
Антитіла з ідентичними УНЛ/І. розбиті на групи, розділені порожніми рядками
ІЧе2о0: ІдДс25ідта
ІЧОе1о: ІдДс15ідта
Усі антитіла утворювали імунний комплекс із 5пСО154. С41 8231, С41І 8237, С41 8290,
С41 8287 (усі ІДс15ідта) утворювали імунний комплекс із 520154 і елюювалися за 7,0 хв, проте
С41і 8290 ії С4! В287 мали нижчий 95 відновлення в умовах співвідношення 1 : 1 порівняно з умовами 10 : 1, тоді як С4і В231 і С4! 8237 мали вищий 95 відновлення (» 80 95). С4! В289 (91), С41 8234 (ІдсС15ідта), 5свідсі5зідта (С41 871) і С41 8894 (Ідб25ідта) елюювалися раніше за 6,2-6,5 хв, що вказує на утворення більш великих комплексів, ніж із вищезгаданими тАр. 5с8ІД1 мало широкий пік у очікуваний час утримування для імунного комплексу З : 1 тАб з тример 5020154, однак широкий пік і нижчий рівень відновлення (56 95 за умови співвідношення 1 : 1) вказують на те, що можуть утворюватися імунні комплекси вищого порядку, які можуть або взаємодіяти з колонкою або не надходити до неї. С4І! В89 і С4І В119 (обидва Ідс2г5ідта) утворювали комплекс із 520ИСО154 і елюювалися з широким піком і дуже низьким відновленням (6-17 956 за умови співвідношення 1 : 1), імовірно, через утворення великих комплексів, які не надходили в колонку. Загалом антитіла на основі ізотипів І(у25ідта утворювали більші імунні комплекси порівняно з антитілами на основі Ідс15ідта або Ідс1.
У таблиці 26 показані зведені дані характеристик антитіл. У цілому, дані активації тромбоцитів, дані ГП-ВЕРХ і 0 5 разом вказують на те, що активація тромбоцитів не повністю пов'язана з активним Ес. Дані показують, що антитіла з нефункціональним Ес, такі як І(дс15ідта й І(до25ідта, здатні утворювати імунні комплекси більшого розміру, тобто більші, ніж очікуваний комплекс З : 1 тАБ з тримером 5пСО154, і що деякі антитіла з нефункціональним Ес здатні активувати тромбоцити. Дані підтверджують висновок про те, що як домени УНЛ/!. (наприклад, епітоп, з яким зв'язується антитіло), так і утворення імунних комплексів вищого порядку сприяють активації тромбоцитів.
Таблиця 26 дтиваця З |томбоцитів не
Антитіло | Ізотип тромбоцитів як залежить від Те 5с8ІдДв20 .
ГБО СЛИНИ ННЯ НОСЕЧНИ ПОС НОСИ НОЄУН обсвідсто Постої НОЇ 777717 Її оБсвдс!ї осі! | Так | Ні | 69 | 73 | 83 | 196 г
Сава Мдбгої Ні | 77777777 | 64 1 62 |585,40827| бір
СаВ23і Мостої Ні 77777777 | 770 | 70 | 82 | 105 саівоз7 пост | 2323203 2351 55333170 1701 74198 шини п я Я ПОЛЯ ПОЛОН ПОН НО
Са1ві19 Мобго| Так. | Так. | 807 | 96; | 80 | 56Зр
Са1В290 МПосіої 7777777 77717171 1170 1 70 | 83 | 153 ши п я ПО ПОЛЯ ПОННЯ ПОН НО савовв Пост 1700 так 3133 ні 31 74 1 761 661 109 ши п я ПО ПОЛЯ ПОЛЯ ПО НО
Саїве4 Мдбго| Так | Так. | 60 | 60 | 69 | 45 сацвоза Пост! 3011 1 651 631 93 5318371 х Співвідношення антитіло : 50СО0154 "к Оцінювання з використанням експресії РАС-1 або СОб2р зу5 відновлення в ГП-ВЕРХ « 50 905
Значення Кі вторинних молекул були включені, якщо 95 мас становив 2 25 965 р: розчин з осадом
ІЧе2о0: ІдДс25ідта
ІЧОе1о: ІдДс15ідта
Перелік послідовностей «1105 бапввеп Віобесі, Іпс.
Екгапввоп, Сопап
Теч, Сосеї1уп
Обто1оуа, Са1ііпа
Зирі, Апізп
Тепуд, Еапд
Теріуакоу, А1їехеу а2апоч, Нопд «120» Антитіла до С0154 і способи їх застосування «1305 ОВІ5БОбВШОРСТ «1405 Перевідступлення прав «1415 04.08.2016 «1505 62201150 «1515 05.08.2015 «1505 62367660 «1515 28.07.2016 «1605 87 «1705» РабепсІп, версія 3.5 «2105 1 «2115 261 «2125 РЕТ «213» Ното варієпе «4005 1
Меє І1ї1е біч ТБг Тук Авп о біп Тс бБег Рго Агку бек Аїа Аїа ТЕ с01Уу 1 5 10 15
Теч Рго Іїе бек Меє Ппу5 Іїе Роре Меє Тук ІТеч Ге ТБПг Уа1! РоПе Гей
Зо 20 25 Зо
Іїе Тпг сіп Меє І1їе сСіу бек Аїа Гей Рпе Аїа Уаі1і Тугє Іеч Ні5 Агд 35 40 45
Агуд Геч Авр о Гпув І1їе біп АБр біц Агуд Авп Геч Нів бі АБр Ре Уаї 5о0 ів) бо
Рпе Меє Ппув ТПг І1їе біп Аку Суб АвБп ТПг сіу бій Агуд бБег Іеч 5ег 65 70 75 80
Теч Ггеч Авп Сув сі сії І1їе Ппуб5 бек біп Рпе біц сіу Рпе Уа1ї! Гув5 85 90 95
АвБр Іїе Меє Геї АБп Гуз біч біч ТБЕ пуб пуб бій АвБп бек Рое січ 100 105 110
Меє біп Гуз біу АвБр біп Абп Рго сіп І1їе Аза Аза Ніб5з Уаії І1е 5бег 115 120 125 біч Аза бек бек пуб ТПг Тбг бек Маі ІТеч біп Тер Аїа сії Ппув5 с1УуУ 130 135 140
Туг Тук Трг Меб бЗег Авп Авп Пец Уа! Тбг Теч Сі Авп Сіу Ппув Сіп 145 150 155 160
Теч Тс Уаі пу Акуд сіп сіу Геч Тук Тук Іїе Туг Аїа сбіп Уа1і Тс 165 170 175
Рпе Суб Бек АБп Агу бі Аза бег бек біп Аїа Рго Рбе І1їе Аза 5ег 180 185 190
Теч Сув Пец пуб бек Рго сіу Аку Рре біцп Агу І1е Гей Гей Агуд Аза 195 200 205
Аза АвБп о ТПг Нів бек бек Аза їу5 Рго Сув сіу сбіп біп бек І1е Нів 210 215 220 їеч біу біу Уа1і Рпе сій їец сСіп Рго сСіу Аїа бЗег Уа1і Рре Уа1і Авп 225 230 235 240
Уаї ТЬЕ АБвр Рго бек біп Уа1і! Бек Нів сбіу ТБ біу Ропе Трг бек Ріе 245 250 255 біу Печ Геч пуб Гей
Зо 260 «2105 2 «2115 261 «2125 РЕТ «213» Сазі1іїєбйгіх Ззасспи5 «4005 2
Меє І1їе біч ТБг Тук Авп о біп Рго Уаі Рго Аку бек Аїа Аїа ТЕ с01Уу 1 5 10 15
Ркго Ркго УМаії бек Меє Гуз Іїе Рпе Меє Тук Гечп Геч ТПг Уаї Роіе Іеч 20 25 Зо
І1їе Трг Сіп Меє Іїе Ссіу бег Аза Гей Рпе Аїа Уа1ї Туг Іеч Нів Агуд 35 40 45
Агуд Геч Авр о Гпув І1їе біп АБр біц Агуд Авп Геч Нів бі АБр Ре Уаї 5о0 ів) бо
Рпе Меє Ппув ТПг І1їе біп Аку Суб АвБп ТПг сіу бій Агуд бБег Іеч 5ег 65 70 75 80
Теч Ггеч Авп Сув сі сії І1їе Ппуб5 бек біп Рпе біц сіу Рпе Уа1ї! Гув5 85 90 95
АвБр Іїе Меє Геї АБп Гуз біч біч пуб пуб пуб бі АвБп бек Рое січ 100 105 110
Меє Сіп Пув біу Авр Сіп Авп Рго Сіп І1їе Аїа Аїа Нів Уаі І1їе 5ег 115 120 125 біч Аза бек бек пуб ТПг Тбг бек Маі ІТеч біп Тер Аїа сії Ппув5 с1УуУ 130 135 140
Тук Тук Тік Меєс бек Абп Абп Гец Уа! ТПг Геч бій АБп біу пу5 сіп 145 150 155 160
Теч Тс Уаі пу Акуд сіп сіу Геч Тук Тук Іїе Туг Аїа сбіп Уа1і Тс 165 170 175
Рпе Суб Бек АБп Агу бі Аза бег бек біп Аїа Рго Рбе І1їе Аза 5ег 180 185 190 6о Теч Сув Пец пуб Рго Рго АБп Акуд Роре біцп Агу І1е Гей Гей Агуд Аза 195 200 205
Аза АвБп о ТПг Нів бек бек Аза їу5 Рго Сув сіу сбіп біп бек І1е Нів 210 215 220
Теч біу біу Іїе Рпе сії Геї біп Ркро біу Аза бек Уаі Рпе Уа1ї АБп 65 225 230 235 240
Уаї ТЬЕ АБвр Рго бек біп Уа1і! Бек Нів сбіу ТБ біу Ропе Трг бек Ріе 245 250 255 біу Печ Геч пуб Гей
«2105 З «2115 261 «2125 РЕТ «213» Масаса БГазсісціагсів «4005 З
Меє І1їе біч ТБг Тук Авп о біп Рго Бек Рго Аку бек Аїа Аїа Тс с01Уу 1 5 10 15
Теч Рко Уаі Акуд Меє Ппу5 Іїе Ріре Меє Тук ІТеч Ге ТПг Іїе Рбе Гей 20 25 Зо
Іїе Тпг сіп Меє І1їе сСіу бек Аїа Гей Рпе Аїа Уаі1і Тугє Іеч Ні5 Агд 35 40 45
Агуд Геч Авр о Гпув І1їе біп АБр біц Агуд Авп Геч Нів бі АБр Ре Уаї 5о0 ів) бо
Рпе Меє Пцув ТіПг І1їе Сбіп Агуд Суб Авп Тс о біу бі Агд бек Іеч бег 65 70 75 80
Теч Ггеч Авп Сув сі сії І1їе Ппуб5 бек біп Рпе біц сіу Рпе Уа1ї! Гув5 85 90 95
АвБр Іїе Меє Геї АБп Гуз біч біч пуб пуб пуб бі АвБп бек Рое січ 100 105 110
Меє біп Гуз біу АвБр біп Абп Рго сіп І1їе Аза Аза Ніб5з Уаії І1е 5бег 115 120 125 біч Аза бек бек пуб ТПг Тбг бек Маі ІТеч біп Тер Аїа сії Ппув5 с1УуУ 130 135 140
Туг Тук Трг Меб бЗег Авп Авп Пец Уа! Тбг Теч Сі Авп Сіу Ппув Сіп 145 150 155 160
Теч Тс Уаі пу Акуд сіп сіу Геч Тук Тук Іїе Туг Аїа сбіп Уа1і Тс 165 170 175
Рпе Суб Бек АБп Агу бі Аза бег бек біп Аїа Рго Рбе І1їе Аза 5ег
Зо 180 185 190
Теч Сув Пец пуб бек Рго сіу Аку Рре біцп Агу І1е Гей Гей Агуд Аза 195 200 205
Аза АвБп о ТПг Нів бек бек Аза їу5 Рго Сув сіу сбіп біп бек І1е Нів 210 215 220 їеч біу біу Уа1і Рпе сій їец сСіп Рго сСіу Аїа бЗег Уа1і Рре Уа1і Авп 225 230 235 240
Уаї ТЬЕ АБвр Рго бек біп Уа1і! Бек Нів сбіу ТБ біу Ропе Трг бек Ріе 245 250 255 біу Печ Геч пуб Гей 260 «2105 4 «2115 149 «2125 РЕТ «213» Ното 5арієпь «4005 4
Меє біп Гуз біу АвБр біп Абп Рго сіп І1їе Аза Аза Ніб5з Уаії І1е 5бег 1 5 10 15 біч Аза бек бек пуб ТПг Тбг бек Маі ІТеч біп Тер Аїа сії Ппув5 с1УуУ 20 25 Зо
Туг Тук Трг Меб бЗег Авп Авп Пец Уа! Тбг Теч Сі Авп Сіу Ппув Сіп 35 40 45
Теч Тс Уаі пу Акуд сіп сіу Геч Тук Тук Іїе Туг Аїа сбіп Уа1і Тс 5о0 ів) бо
Рпе Суб Бек АБп Агу бі Аза бег бек біп Аїа Рго Рбе І1їе Аза 5ег 65 70 75 80
Теч Сув Пец пуб бек Рго сіу Аку Рре біцп Агу І1е Гей Гей Агуд Аза 85 90 95
Аза АвБп о ТПг Нів бек бек Аза їу5 Рго Сув сіу сбіп біп бек І1е Нів 100 105 110 6о їеч біу біу Уа1і Рпе сій їец сСіп Рго сСіу Аїа бЗег Уа1і Рре Уа1і Авп 115 120 125
Уаї ТЬЕ АБвр Рго бек біп Уа1і! Бек Нів сбіу ТБ біу Ропе Трг бек Ріе 130 135 140 біу Печ Геч пуб Гей 65 145 «2105 15 «2115 149 «2125 РЕТ
«213» Сазі1іїєбйгіх Ззасспи5 «4005 55
Меє біп Гуз біу АвБр біп Абп Рго сіп І1їе Аза Аза Ніб5з Уаії І1е 5бег 1 5 10 15 біч Аза бек бек пуб ТПг Тбг бек Маі ІТеч біп Тер Аїа сії Ппув5 с1УуУ 20 25 Зо
Тук Тук Тік Меєс бек Абп Абп Гец Уа! ТПг Геч бій АБп біу пу5 сіп 35 40 45
Теч Тс Уаі пу Акуд сіп сіу Геч Тук Тук Іїе Туг Аїа сбіп Уа1і Тс 5о0 ів) бо
Рпе Суб Бек АБп Агу бі Аза бег бек біп Аїа Рго Рбе І1їе Аза 5ег 65 70 75 80
Теч Сув Пец пуб Рго Рго АБп Акуд Роре біцп Агу І1е Гей Гей Агуд Аза 85 90 95
А1їа Авп Трг Нів бЗег бек Аїа їув Рго Сув СсСіу Сіп сСіп бег І1е Нів 100 105 110
Теч біу біу Іїе Рпе сії Геї біп Ркро біу Аза бек Уаі Рпе Уа1ї АБп 115 120 125
Уаї ТЬЕ АБвр Рго бек біп Уа1і! Бек Нів сбіу ТБ біу Ропе Трг бек Ріе 130 135 140 біу Печ Геч пуб Гей 145 «2105 6 «2115 149 «2125 РВТ «213» Масаса БГазсісціагсів «4005 6
Меє біп Гуз біу АвБр біп Абп Рго сіп І1їе Аза Аза Ніб5з Уаії І1е 5бег 1 5 10 15 зо біч Аїа бек бЗег Пув Тіпг Тпг бЗег Уаі1і Іїеч Сіп Тер Аїа січ Пув С1У 20 25 Зо
Тук Тук Тік Меєс бек Абп Абп Гец Уа! ТПг Геч бій АБп біу пу5 сіп
Теч Тс Уаі пу Акуд сіп сіу Геч Тук Тук Іїе Туг Аїа сбіп Уа1і Тс 35 5о0 ів) бо
Рпе Суб Бек АБп Агу бі Аза бег бек біп Аїа Рго Рбе І1їе Аза 5ег 65 70 75 80
Теч Сув Пец пуб бек Рго сіу Аку Рре біцп Агу І1е Гей Гей Агуд Аза 85 90 95 40 А1їа Авп Трг Нів бЗег бек Аїа їув Рго Сув СсСіу Сіп сСіп бег І1е Нів 100 105 110
Теч біу сбіу Уаі Рпе сії Геї біп Ркро біу Аза бек Уаі Рпе Уа1ї АБп 115 120 125
Уаї ТЬЕ АБвр Рго бек біп Уа1і! Бек Нів сбіу ТБ біу Ропе Трг бек Ріе 45 130 135 140 біу Печ Геч пуб Гей 145 «2105 7 «2115 161 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» Гібридний білок 5пСр154-Нів-мітка «4005 17 сбіу бЗег Нів Нів Нів Нів Нів Нів Сіу сіу Сіу бЗег Меє сіп Пув С1У 1 5 10 15
АвБр о біп Абп Рго біп Іїе Аїа Аза Ні5 Уаі! Іїе Бек сії Аза бек 5ег 20 25 Зо
Туз ТПг ТЕ бек Уаі Ге сіп Тгр Аїа біч Гуз біу Тук Тук Тпгс Меє 6о 35 40 45 век Авп АБп Тез УМаі! ТБг ІТеч біц Авп сіу пуб біп Геї Тс Уаї Гуз 5о0 ів) бо
Агуд біп сіу Геч Тук Тук Іїе Туг Аїа сбіп Уаі! ТПг Рре Су5 бек АБп 65 70 75 80 65 Ага біч Аїа бек бЗег біп А1їа Рго Рре І1їе Аїа бег Іеч Сув Іеч Пув 85 90 95
Бек Рго біу Аку Рбе біц Агуд І1їе Гей Гей Агуд Аїа Аїа АБп Тік Ні 100 105 110
Зек Бек Аїа пуб Рго Суз біу біп біп бек Іїе Ні Іеч біу сіу Уаї 115 120 125
Рпе січ Геї біп Ргкро біу Аза бек Уаі Рпе Уаі АБп Уаі! Тс АБр Рго 130 135 140
Зек біп УМаії бек Ні біу Тбг біу Рре ТПг бек Рре сіу Геч Іеч Гуз 145 150 155 160
Теч «2105 8 «2115 161 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» Гібридний білок 5пСр154-Нів-мітка «4005 8 біу бек Нібв Нів Ні Ні Нів Нів біу біу біу бек Меє сіп пув5 с1Уу 1 5 10 15
АвБр о біп Абп Рго біп Іїе Аїа Аза Ні5 Уаі! Іїе Бек сії Аза бек 5ег
Зо 20 Пув ТЬг Тпг о бег Уаі ес біп Тер Аїа січ пув сС1у Тує Туг Тпг Меє век Авп АБп Тез УМаі! ТБг ІТеч біц Авп сіу пуб біп Геї Тс Уаї Гуз 5о0 ів) бо
Агуд біп сіу Геч Тук Тук Іїе Туг Аїа сбіп Уаі! ТПг Рре Су5 бек АБп 25 65 70 75 80
Агуд бій Аза бек бек біп Аїа Рго Рпе Іїе Аїа Бек Геч Су5 Іеч Гуз 85 90 95
Рго Рго АБп Аку Рбе біц Агу І1е Гей Гей Агуд Аїа Аїа АБп Тік Ні 100 105 110 зо бек бег Аїа Пув Рго Сув Сіу біп Сіп бег І1е Нів Іеч Сіу сС1у І1е 115 120 125
Рпе січ Геї біп Ргкро біу Аза бек Уаі Рпе Уаі АБп Уаі! Тс АБр Рго 130 135 140
Зек біп УМаії бек Ні біу Тбг біу Рре ТПг бек Рре сіу Геч Іеч Гуз 35 145 150 155 160
Теч «2105 19 «2115 161 40 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» Гібридний білок 5сСср154-Нів-мітка «4005 19 45 сбіу бЗег Нів Нів Нів Нів Нів Нів Сіу сіу Сіу бЗег Меє сіп Пув С1У 1 5 10 15
АвБр о біп Абп Рго біп Іїе Аїа Аза Ні5 Уаі! Іїе Бек сії Аза бек 5ег 20 25 Зо
Туз ТПг ТЕ бек Уаі Ге сіп Тгр Аїа біч Гуз біу Тук Тук Тпгс Меє 35 40 45 век Авп АБп Тез УМаі! ТБг ІТеч біц Авп сіу пуб біп Геї Тс Уаї Гуз 5о0 ів) бо
Агуд біп сіу Геч Тук Тук Іїе Туг Аїа сбіп Уаі! ТПг Рре Су5 бек АБп 65 70 75 80
Ага біч Аїа бек бЗег біп А1їа Рго Рре І1їе Аїа бег Іеч Сув Іеч Пув 85 90 95
Бек Рго біу Аку Рбе біц Агуд І1їе Гей Гей Агуд Аїа Аїа АБп Тік Ні 100 105 110
Зек Бек Аїа пуб Рго Суз біу біп біп бек Іїе Ні Іеч біу сіу Уаї 6о 115 120 125
Рпе січ Геї біп Ргкро біу Аза бек Уаі Рпе Уаі АБп Уаі! Тс АБр Рго 130 135 140
Зек біп УМаії бек Ні біу Тбг біу Рре ТПг бек Рре сіу Геч Іеч Гуз 145 150 155 160 65 Теч «2105 10 «2115 6
«2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» Мітка Нівб «4005 10
Нів Нів Нів Нів Нів Нів 1 5 «2105 11 «2115 33 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» Мітка ІІй «4005 11
Акад Меє Пув біп І1е біц Авр Пув І1е біц бій І1їе еп бек Пув І1є 1 5 10 15
Тук Нів Іїе біп АБп біц Іїе Аза Аку Іїе Пу5 КГуб5 Іеч Іїе с1іу сіц
Зо
АгкЧ 20 «2105 12 «2115 198 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 25 «220» «223» Гібридний білок 5ПС0Р154-1І12 «4005 12 біу бек Нібв Нів Ні Ні Нів Ні біу біу біу бек Акуд Меє ПпувБ сіп 1 5 10 15 зо Іїе біч Авр Пув І1їе Сіц Сі Іїе Гей бек Пу5 І1е Туг Нів І1е Січ 20 25 Зо
АБп бі Іїе Аза Аку І1їе Гуз Туз Ге Іїе сіу сії Акуд сіу б1іу б1Уу
Бек Меє сіп пу5 біу АБр біп АбБп Рго сбіп Іїе Аїа Аза Ніз Уаії Те 35 5о0 ів) бо
Зек бі Аїа бек бек Гу5 ТПг ТрПг бек Уаі Геї сбіп Тер Аїа січ Гуз 65 70 75 80 біу Тук Тук ТПг Меє Бек АБп АБп Теч Уа! Тс Ге бій Ав5п с1іу ГПув 85 90 95 40 біп Ге Тпг о Уа1ї Ппув Агд біп сС1іу їечп Туг Туг І1е Туг Аїа Сіп Уа1 100 105 110
ТПЕ Ре Сув бек АБп Агуд бід Аза бек бек біп Аза Рго Рбе Іїе Аза 115 120 125
Ззек Геч Сув Геч Гув5 бек Рго біу Акуд Рпе сій Агуд І1їе Іеч Іеч Агд 45 130 135 140
Аза Аза АБп о ТіПг Нів бек бек Аза пуб Рго Сув сіу біп сбіп бек І1е 145 150 155 160
Нів Геч сіу біу Маії Рпе біц Гей сбіп Рго сіу Аїа бек Уаі! Ріе Уаї 165 170 175
Авп оуа1і Трг Авр о Рго бек біп Уа1і бЗег Нів Ссіу Тпг с1іу Рпе Трг бег 180 185 190
Рпе сіу Геч ІГеч ГУув5 Іеч 195 «2105 13 «2115 198 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» Гібридний білок 5юптС0Р154-1129 бо «4005 13 біу бек Нібв Нів Ні Ні Нів Ні біу біу біу бек Акуд Меє ПпувБ сіп 1 5 10 15
Іїе бі АБр Гпу5 Іїе бічп бічЧ Іїе Гей бек пуб Іїе Тугє Ні5 Іїе січ 20 25 Зо 65 АБп біч І1е А1їа Агуд І1їе Пу5 Пув їеч І1їе СсС1у бі Акд Сіу сС1у С1у 35 40 45
Бек Меє сіп пу5 біу АБр біп АбБп Рго сбіп Іїе Аїа Аза Ніз Уаії Те 5о0 ів) бо
Зек бі Аїа бек бек Гу5 ТПг ТрПг бек Уаі Геї сбіп Тер Аїа січ Гуз 65 70 75 80 біу Тук Тук ТПг Меє Бек АБп АБп Теч Уа! Тс Ге бій Ав5п с1іу ГПув 85 90 95 біп еп ТП Уаі Пу5 Акуд біп б1іу Теч Туг Туг Іїе Тук Аза сіп Уаї 100 105 110
ТПЕ Ре Сув бек АБп Агуд бід Аза бек бек біп Аза Рго Рбе Іїе Аза 115 120 125
Ззек Геч Сув Геч Куб Рго Рго АБп Акуд Рпре сій Агуд І1їе Іеч Іеч Агд 130 135 140
Аза Аза АБп о ТіПг Нів бек бек Аза пуб Рго Сув сіу біп сбіп бек І1е 145 150 155 160
Нів Геч сіу біу Іїе Рпе біц Гей сбіп Рго сіу Аїа бек Уаі! Ріе Уаї 165 170 175
Авп оуа1і Трг Авр о Рго бек біп Уа1і бЗег Нів Ссіу Тпг с1іу Рпе Трг бег 180 185 190
Рпе сіу Геч ІГеч ГУув5 Іеч 195 «2105 14 «2115 198 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» Гібридний білок 5сС0154-112 «4005 14 біу бек Нібв Нів Ні Ні Нів Ні біу біу біу бек Акуд Меє ПпувБ сіп 1 5 10 15
Іїе бі АБр Гпу5 Іїе бічп бічЧ Іїе Гей бек пуб Іїе Тугє Ні5 Іїе січ 20 25 Зо зо АБп біч І1е А1їа Агуд І1їе Пу5 Пув їеч І1їе СсС1у бі Акд Сіу сС1у С1у
Бек Меє сіп пу5 біу АБр біп АбБп Рго сбіп Іїе Аїа Аза Ніз Уаії Те 5о0 ів) бо
Зек бі Аїа бек бек Гу5 ТПг ТрПг бек Уаі Геї сбіп Тер Аїа січ Гуз 35 65 70 75 80 біу Тук Тук ТПг Меє Бек АБп АБп Теч Уа! Тс Ге бій Ав5п с1іу ГПув 85 90 95 біп еп ТП Уаі Пу5 Акуд біп б1іу Теч Туг Туг Іїе Тук Аза сіп Уаї 100 105 110 40 Трг Рпе Сув бек Авп Агуд Січ Аїа бег бег Сіп Аїа Рго Рбе Ії1е Аїа 115 120 125
Ззек Геч Сув Геч Гув5 бек Рго біу Акуд Рпе сій Агуд І1їе Іеч Іеч Агд 130 135 140
Аза Аза АБп о ТіПг Нів бек бек Аза пуб Рго Сув сіу біп сбіп бек І1е 45 145 150 155 160
Нів Геч сіу біу Маії Рпе біц Гей сбіп Рго сіу Аїа бек Уаі! Ріе Уаї 165 170 175
Авп оУа1і ТПг АБвБр о Рго бек біп Уа! бек Ніб сіу ТПг сіу Рре ТПг 5ег 180 185 190
Рпе сіу їеч їеч Пув Іеч 195 «2105 15 «2115 277 «2125 РЕТ «213» Ното варієпе «4005 15
Меє Уаії Агу їеч Ркго Гей біп Суб Уа1і Геї Ткр бі1у Сув Іеч Іеч Торг 1 5 10 15
Аа Уа1 Ні Рго бій Ргро Рго Тбйг Аза Суб Агуд січ Ппув біп Тук Іеч 6о 20 25 Зо
І1їе АвБп Бек біп Сув Сув бек Ге Суб біп Рго сіу сіп Гу5 Іеч Уаї 35 40 45 век Авр Суб ТПг біп Ре ТПг біц ТБ бій Суб Геч Рго Сув бі1у січ 5о0 ів) бо 65 бек біц Рре Геч Авр ТПг Тер Авп Агуд біц ТБг Нів Сув Нів Сіп Нів 65 70 75 80
Туз Тук Сув Авр Рго Ав5п Геч сбіу Іечп Агку Уаі біп біп Пув5 с1у Тс 85 90 95
Бек бі ТПг АБр Тс І1їе Суб5 ТПг Сув біц бі с1іу Тер Нів Су5 Тс 100 105 110
Ззек бічш Аїа Сув біш бек Сув Уаії Гей Ніб Агкуд Бек Сув бек Рго б1у 115 120 125
Рпе сіу Маї Ппу5 біп Іїе Аїа ТБг сіу Уа! бек А5р ТПг І1їе Су5 січ 130 135 140
Рго Сув Рго Маі біу Рбе Рібе бег Авзп Уа! бек Бек Аїа Роре біч Гуз 145 150 155 160
Сув Нів Рго Тер ТПг Бек Сув бії ТБ Гуз АБр о Гец Уаї Уа1і сіп сіп 165 170 175
Аа сіу ТПг АБп оГпуб5 ТБ Авр оУаі! Уаї Суб сіу Рго сбіп АБр Агу Іеч 180 185 190
Агуд Аїа Гечш Уаії УМаї Іїе Рго Іїе Іїе Рпе сіу Іїе Геї Рбе Аза І1е 195 200 205 їеч Ге Уаії ес Ууа1ї Рре І1їе Пує Пув Уа1 Аїа Ппу5 Пув Рго Тис Ап 210 215 220
Туз Аза Рго Нів Рго пуб біп бій Рго біп бічЧ І1їе Авп Рре Рго Ар 225 230 235 240
Авр Геч Рго сіу бек АБп Тйг Аза Аза Рго Уаі сіп сії ТіПг Іецч Нів 245 250 255 біу Сув біп Рго Уаі ТПг сіп сії АвБр біу їув біц бег Агуд І1е бБег 260 265 270
Уаї біп бічЧ Агкудуд сіп 275 «2105 16 «2115 5 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205
Зо «223» НСрВІ1 «4005 16 зек Туг Аїа І1е 5ег 1 5 «2105 17 «2115 5 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНеоерВІ1 «4005 17 зек Тук б1у І1е 5ег 1 5 «2105 18 «2115 7 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНеоерВІ1 «4005 18
Зег Туг бЗег Рре Туг Тгр С1Уу 1 5 «2105 19 «2115 5 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНеоерВІ1 «4005 19
Аза Тугк Ту Ше Ні бо 1 5 «2105 20 «2115 5 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 65 «220» «223» нНеоерВІ1 «4005 20
Авр Туг Ту Ше Ні
1 5 «2105 21 «2115 7 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНСрвВІ1 «4005 21
Зек Рпе І1їе Тугє Тує Тгр б1Уу 1 5 «2105 22 «2115 17 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «220» «223» нНСсрв2 «4005 ЩД 22 біу І1їе Іїе Рго Іїе Рбе сіу Тс Аза АБп Туг Аїа біп Пу5 Рпе сіп 1 5 10 15 с1у «2105 23 «2115 17 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНСсрв2 «4005 23
Тер І1е бек Рго Іїе Рпе сіу Авп ТПг А5п Туг Аїа біп Гуз Рое сіп
Зо 1 5 10 15 свіу «2105 24 «2115 17 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНСсрв2 «4005 24 с1у І1е бек Рго Тугк Рре біу Авп ТП Авп Туг Аїа Сіп Ппу5 Роре сіп 1 5 10 15 свіу «2105 25 «2115» 16 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНСсрв2 «4005 25
Зек Геч Туг Тугк бек біу бек Тс Тук Тук Авп Рго Бек Геч Гув 5ег 1 5 10 15 «2105 26 «2115 17 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНСсрв2 «4005 26 6о Акад І1е Авп Рго Авр бек біу біу ТЬг Авр Туг Аїа сСіп Агу Рре сСіп 1 5 10 15 свіу «2105 27 65 «2115 17 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205
«223» нНСсрв2 «4005 27
Агуд Рпе АбБп о Рго АБп бек біу АБр ТрПг Авп сіу Аза сіп пув5 Рое сіп 1 5 10 15 с1у «2105 28 «2115 16 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНСсрв2 «4005 28
Сув І1е Тук бек бек сіу сіу ТП Тук Тук АБп Рго бек Геч пуб бБег 1 5 10 15 «2105 29 «2115 14 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «220» «223» нНСрвЗ «4005 29 біу Аїа бек Уаі Тер Авр сіу Рго Аїа біп Уаї Робе Авр Туг 1 5 10 «2105 30 «2115 9 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205
Зо «223» НСрВЗ «4005 30 ек Акуд Туг Тук бі1у АБр ТІеч Авр Туг 1 5 «2105 31 «2115 12 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНСрвЗ «4005 31
АвБр ТП сіу Тер Маі біу Аїа Рпе Тук Геч Авр Туг 1 5 10 «2105 32 «2115 12 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНСрвЗ «4005 32 їеч біп Гец біу Тпг Тбг Топ Авр о Тує Рре Ар Нів 1 5 10 «2105 33 «2115 20 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНСрвЗ «4005 33
АвБр Тер АвБп о Туг Тугк АБр біу бек біу Тук Рпе сіу Рго сіу Тук Туг 6о 1 5 10 15 сбіу Геч Авр Уаї! 20 «2105 34 «2115 11 65 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНСрвЗ
«4005 34 біч бі1у біц Геш Аїа сіу Іїе Рбе Роре Ар Туг 1 5 10 «2105 35 «2115 12 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» нНСрвЗ «4005 35
Теч Тер Пец сіу ТПг Тбг Тс АБр Тук Ропе Ар Туг 1 5 10 «2105 36 «2115 17 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» псрвІ1 «4005 36
Туз бек бек біп бек Уаі Геї Аза бек бек АБп АБп біц Авп Роре Гей 1 5 10 15
Аза «2105 37 «2115 11 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» псрвІ1 6) «4005 37
Агуд Аза Бек біп бек І1е бек бек Туг Геч Авп 1 5 10 «2105 38 «2115 17 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» псрвІ1 «4005 38
Туз бек бек біп бек Уа1ї Геї Тугк бек бек АБп АвБп о Пуб Авп Тукг Гей 1 5 10 15
Аза «2105 39 «2115 11 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» псрвІ1 «4005 39
Бек біу АБр біп Іеч біу Авр пуб Рпе Аїа Сув 1 5 10 «2105 40 «2115 11 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» псрвІ1 «4005 40 6о бек біу Авр Пув їеч біу Авр Пув Туг Уа1 Сув 1 5 10 «2105 41 «2115 11 «212» РВТ 65 «213» Штучна послідовність «2205 «223» псрвІ1 «4005 41
Зек біу АБр Гу Іеч біу АвБр Пу5 Тук Уа1ї бБег 1 5 10 «2105 42 «2115 11 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» ІСсовВІ1 «4005 42 бек біу Авр Пув їеч біу Авр Пув Ріре А1їа Сув 1 5 10 «2105 43 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» ІСОрВ2 «4005 43 зек Аза бБег ТПг Агку бі 5ег 1 5 «2105 44 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» ІСОрВ2 «4005 44
Тук А1їа АБп бек ІТеч біп 5бег 1 5 зо «2105 45 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» ІСсОрВ2 «4005 45
Тер А1їа бек ТПг Агу бі 5бег 1 5 «2105 46 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» ІСОрВ2 «4005 46 біп бічЧ Авп пуб Агуд Рго бБег 1 5 «2105 47 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» ІСОрВ2 «4005 47 біп Авр Агу Гуз Агу Рго бег 1 5 «2105 48 «2115 7 «2125 РЕТ бо «213» Штучна послідовність «220» «223» ІСОрВ2 «4005 48 біп АвБр Авр пуб Агуд Рго бБег 65 1 5 «2105 49 «2115 7 «2125 РЕТ
«213» Штучна послідовність «223» ІСОрВ2 «4005 49
Туг А1їа бЗег бБег Іеч Сіп 5ег 1 5 «2105 50 «2115 7 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» ІСОрВ2 «4005 50
Тук А1їа АБп ТПг Іеч біп 5бег 1 5 «2105 51 «2115 39 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» ГСоРВЗ3 «4005 51 біп біп Аза Тук ТПг Тс Рго Рое ТЕбг 1 5 «2105 52 «2115 39 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220»
Зо «223» ІСсОоВЗ3 «4005 Д ТЯ52 біп біп бек Авр бек Іїе Рго Тгр Тс 1 5 «2105 53 «2115 9 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» ГСоРВЗ3 «4005 53 біп біп Тук Тук Бек ТПг Рго Іеч Тс 1 5 «2105 554 «2115 39 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» ГСоРВЗ3 «4005 54 біп Аїа Тгр Авр бег Авр ТПг Аїа Уаї 1 5 «2105 (555 «2115 39 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» ГСоРВЗ3 «4005 55 біп Азїа Тер Авр бек сіу ТПг Уа1ї Уаї 6о 1 5 «2105 56 «2115 39 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 65 «2205 «223» ГСоРВЗ3 «4005 56 біп Азїа Тер Авр бек Бек ТПг Уа1ї Уаї
1 5 «2105 157 «2115 39 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» ТСРВЗ «4005 57 біп Азїа Тер Авр бек А5п ТПг Уа1ї Уаї 1 5 «2105 158 «2115 123 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» УНН Сс4185 «4005 58 біп Уаі біп Ге Уаі! сіп Бек сбі1іу Аїа біч Уаії Ппу5з пуб Рго сіу бБег 1 5 10 15
Зек Уаї ПЦув Ма1ї бЗег Сув Пув Аїа бЗег біу біу Тпг Ріре бег бег Туг 20 25 Зо
Аза І1їе Бек Тер Маі Аку біп Азїа Рго сбіу сбіп сіу Геч сії Ткр Меє 35 40 45
Сіу бі1у Іїе Іїе Рго Іїе Рбе сіу Тс Аза АБп Туг Аїа біп Пув Роіе 5о0 ів) бо біп бі1у Акуд Уа! ТПпг Іїе ТПг Аза АБр бі бег Трг бег ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Меє біп Іеч бек бек Гей Агуд бек бі АБр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95 зо А1ї1а Агу б1іу А1їа бЗег Уа1і Тер Авр сСіу Рго Аїа біц Уа1і Рпре Авр Туг 100 105 110
Тер б1у біп біу ТБг Теч Уа! Трг Уа1ї Бек бБег 115 120 «2105 59 «2115 118 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН сС41889 «4005 59 біп Уаі біп Ге Уаі! сіп Бек сбі1іу Аїа біч Уаії Ппу5з пуб Рго сіу бБег 1 5 10 15
Зек Уа1ї Ппув Ма1ії бек Сув Туз Аза бек сіу сіу ТПг Рре бег бек Туг 20 25 Зо с1у І1е бек Тер Уаі Акд біп Аїа Рго сСіу біп с1у еп січ Тгр Меє 35 40 45 біу Ткр І1їе бек Рго Іїе Рбе сіу АБп ТБПг АБп Туг Аїа біп Пув Робе 5о0 ів) бо біп бі1у Акуд Уа! ТПпг Іїе ТПг Аза АБр бі бег Трг бег ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Меє біп Іеч бек бек Гей Агуд бек бі АБр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Агуд Бек Агуд Тує Тук біу АБр Гец Авр Туг Тер сіу сіп б1у ТЕбг 100 105 110
Те Уа1 Трг Уаї Бек бег 115 «2105 60 «2115 121 «2125 РЕТ бо «213» Штучна послідовність «2205 «223» УН сС41894 «4005 60 біп Уаі біп Ге Уаі! сіп Бек сбі1іу Аїа біч Уаії Ппу5з пуб Рго сіу бБег 65 1 5 10 15
Зек Уа1ї Ппув Ма1ії бек Сув Туз Аза бек сіу сіу ТПг Рре бег бек Туг 20 25 Зо
Аза І1їе Бек Тер Маі Аку біп Азїа Рго сбіу сбіп сіу Геч сії Ткр Меє
35 40 45 біу бі1у І1їе бек Рго Тук Ррбе сіу АБп ТБПг АБп Туг Аїа біп Пув Робе 5о0 ів) бо біп бі1у Акуд Уа! ТПпг Іїе ТПг Аза АБр бі бег Трг бег ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Меє біп Іеч бек бек Гей Агуд бек бі АБр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Агуд Авр Тс біу Тер Уаі! біу Аїа Рпе Тук Геї АБр Тугє Тгр б1У 100 105 110 біп біу Тпг Ге Уа1і Трг Уа1ї бег бег 115 120 «2105 661 «2115 122 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН сС418150 «4005 61 біп Те біп Гей сіп сій Бек біу Рко біу Теч Уаі Пу5 Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Ге бек ІТеч Тбг Суб ТрПг Уаі! бек сіу сіу бек І1е бек бек Туг 20 25 Зо
Зек Рпе Туг Тгр біу Тгрр Іїе Аку біп Рго Рго сіу сбіп сі1у Іеч січ 35 40 45
Тер І1е сб1і1у бек ІТеч Тукг Тук бек сіу Бек ТПг Тук Тук АБп Рго 5бег 5о0 ів) бо
Теч пувз бек Агуд Аїа ТПг Меє бек Уаі! УМаї! ТПг бек Ппу5з ТПг біп Робе 65 70 75 80 зек Геч АБп Геї АБп бек Уа! ТПг Аза Аза А5р ТПг Аїа Уаї1ї Тугє Туг
Зо 85 90 95
Сув Аїа Акуд Гей сбіп Гечп сіу Тбг ТБ ТБЕ Авр о Тує Рре Авр Ні Тгр 100 105 110 біу біп біу ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї бек б5ег 115 120 «2105 62 «2115 129 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» УН сС418189 «4005 62 біп Уаі біп Ге Уаі! сіп Бек сі1іу Аїа бічп Уа! пу5з Ппу5з Рго сіу Аза 1 5 10 15
Зек Уа1ї Ппув Маї бек Сув Туз Аза бек сіу Тук ТПг Рре Аза Аза Туг 20 25 Зо
Тук І1е Ніб5 Тер Уаі Аку біп Аза Рго сіу сіп сіу Іеч біч Ткр Меє 35 40 45 біу Акуд Іїе Авп Рго Авр Бек сіу біу ТБг АБр Туг Аїа біп Акд Робе 5о0 ів) бо біп б1у Агу Уа1і ТП Мес ТП Агуд Авр Того бес І1е бег Тіг Аїа Туг 65 70 75 80
Меє біп Іеч бек Акуд Гей Агуд бек АвБр АБр Тс Аза Уаї Рпе Тук Сув 85 90 95
Аза Агуд Авр оТгр АБп о Тує Туг АБр о біу бек сіу Тук Ррое с1у Рго б1Уу 100 105 110
Тук Тук біу Іеч АБр Уа! Тер сіу сіп сіу Тбг ТП Уа! ТБг Уаї 5ег 115 120 125 зекг бо «2105» 63 «2115 120 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 65 «223» МН с418191 «4005 63 біп Уаі біп Ге Уаі! сіп Бек сі1іу Аїа бічп Уа! пу5з Ппу5з Рго сіу Аза 1 5 10 15
Зек Меє Ппув Маії бек Сув Туз Аза бек сіу Тук ТПг Рре ТПг АБр Туг 20 25 Зо
Тук І1е Ніб5 Тер Уаі Агу біп Аза Рго сіу сіп сіу Іезч бічп Тгкр Уаї 35 40 45 біу Акуд Ррбе Авп Рго А5п Бек біу АБр ТПг АБп о біу Аїа біп Пув Робе 5о0 ів) бо біп бі1у Акуд Уаі Тпг Меє Трбг Агу АвБр Тс бег І1е бег ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Меє біч ІТеч ТБг Аку Гей Агуд бБег Авр АБр Тс Аза Уаї Тукс Нів Сув 85 90 95
Аза Акгуд бій сіу біз Те Аза біу Іїе Рпе Рпе А5зр Тугє Тгр б1у біп 100 105 110 біу ТЕ Гей Уа! ТПг Уаї бек 5ег 115 120 «2105» 64 «2115 122 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» УН Сс418199 «4005 64 біп Уаі біп Гей сіп сій Бек біу Рко біу Теч Уаі Пу5 Рго бек сій 1 5 10 15
ТПЕ Ге бек ІГеч Тбг Суб ТрПг Уа1! бек сіу АБр бек І1е бек бек Ре 20 25 Зо
Іїе Тугк Туг Тер біу Ткрр І1їе Аку біп Рго Рго сіу Ппув5 біу Теч Авр
Тер Ма1 б1у Сув І1їе Туг бек бек сіу сіу ТП Тук Тук АБп Рго 5бег 5о0 ів) бо зо Геч Ппув бек Акд Уа1! Трг І1їе бЗег Уа1і Авр ТПг бЗег Пув Авп Сіп Рре 65 70 75 80
Зек Геч Ппув Геч Рго бек Уаі! ТПг Аза Аза А5р ТПг Аїа Уаї1ї Тугє Туг 85 90 95
Сув Аїа Акуд Гей Тер Геч сіу ТП ТБ ТБЕ Авр о Тує Рре Авр Тукг Тгр 35 100 105 110 біу біп біу ТПг Гей Уа1! ТПг Уаї бек б5ег 115 120 «2105 655 «2115 113 40 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» У сС4185 «4005 65 45 Авр І1е Уа1ї Меє Трг біп бЗег Рго Авр бек Іеч Аїа Уа1 бек Іеєч С1Уу 1 5 10 15 біч Акуд Аза Тбг Іїе А5п о Сув пуб бек бек біп бек Уаі Ге Аза бБег 20 25 Зо век Авп АБп бій АБп Рбе Теч Аза Тер Туг сбіп сіп Пув Рго біу біп 35 40 45
Ркго Ркго Пув Геч Іеч І1їе Туг бек Аза бек ТПг Агкуд сії бек біу Уаї 5о0 ів) бо
Рго АБр Агу Роре бек біу бек біу бек біу ТПг Авр Рре ТПг Іеч Тс 65 70 75 80
І1їе бег бЗег Гец Сіп Аїа бій Ар Уаі Аїа Уа1і Туг Туг Сув сбіп сіп 85 90 95
Аза Тук ТПг Тбг Рго Роре ТПг Рбе біу біп сіу ТпПг Ппув Уа1і січ Іе 100 105 110
Тув бо «2105 66 «2115 107 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність 65 «220» «223» УТ с41889 «4005 66
АБр Іїе сбіп Меє ТПг о біп бек Рго бек бек Гечс Бек Аїа бек Уаі б1Уу
1 5 10 15
АвБр Акуд Уа1і Тс І1е Тс Суз Агу Аза бек біп Бек І1їе бек бек Туг 20 25 Зо
Теч АБп Тер Тук біп сбіп Пув Рго біу Гуз Аза Рго Пу5з Геч Геч Ше 35 40 45
Тук Тук Аїа АБп бек Ге біп бек сіу Уа1і Ркго бек Агу Ропе бесг с01УуУ 5о0 ів) бо
Бек сіу Бек біу ТБг АБр Рпе ТПг Гец ТПг Іїе бБег бек Іеч біп Рго 65 70 75 80 біч Авр Рпе Аїа ТпПг Туг Туг Сув біп СсСіп бек Авр бег І1е Рго Тгр 85 90 95
ТЕ Рбе бі1у біп біу Тпйг Ппуз Уаі сі ІШе Гув 100 105 «2105 67 «2115 113 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» У с41894 «4005 67
АвБр Іїе Уа1і Меє ТП біп бек Рго Авр бек Гечш Аза Уаії бек Іеч С1Уу 1 5 10 15 біч Акуд Аза Тбг Іїе А5п о Сув пуб бек бек біп бек Уаії Геч Тукгк бБег 20 25 Зо век Авп АБп о ГПув АБп о Туг Теч Аза Тер Тук біп сіп Пув Рго біу біп
Рго Ркго Пув Тез Іеч Іїе Туг Тер Аза бек ТПг Акуд бій бек біу Уаї 5о0 ів) бо
Рго АБр Агу Роре бек біу бек біу бек біу ТПг Авр Рре ТПг Іеч Тс
Зо 65 70 75 80
І1їе Бек Бек Геч біп Аїа бічЧ Авр Уаі Аїа Уа1і Туг Тугк Сув біп сбіп 85 90 95
Тугк Тугк бек ТПг Рго Тец ТПг Рпе сіу сіп сіу Тс Гуз Уаі біч Іе 100 105 110 35 цув «2105 68 «2115 106 «2125 РЕТ до «213» Штучна послідовність «2205 «223» У сС418150 «4005 68
Ззек Тук бі Геї ТП біп Рго Рго бек Уа! бек Уа1і Бек Рго б1іу біп 45 1 5 10 15
ТПг Аза бек І1їе ТБг Суб бек біу Авр січ Геї сі1у АБр Гуз Робе Аїа 20 25 Зо
Сув Ткр Тук біп біп пуб Рго сіу біп бек Ргко Уаі Ге Уаі Іїе Тгр 35 40 45 біп бій Авп Гуз Агу Рго бек СсС1іу І1е Рго бі Агуд Рбе бег Сіу 5ег 5о0 ів) бо
АБп бек сіу АБп ТПг Аза Тс Те Трг Іїе бек сіу ТПг сіп А1їа Меє 65 70 75 80
АвБр січ Аза АБр Тук Тук Суб біп Аїа Тер Авр бБег АБр ТПг Аїа Уаї 85 90 95
Рпе сіу сіу сіу ТП Гу5 Теч ТБПг Уаї Гец 100 105 «2105 69 «2115 106 бо «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» У Сс418189 «4005 69 65 бек Туг біш Пец ТЬг біп Рго Рго бЗег Уа1і бЗег Уа1і бЗег Рго Сс1у біп 1 5 10 15
ТПг Аза бек УМаі! ТБг Суб бек біу Авр Пув Геї сі1у АБр Гу5 Тук Уаї 20 25 Зо
Сув Тер Тук біп Акуд пуб Рго біу біп бек Ргко Уаі Ге Уаі Ше Туг 35 40 45 біп АБр Агуд Пуб Агуд Рго бек біу І1е Рго біЧ Аку Рре бек сіу бБег 5о0 ів) бо
АБп бек сіу АБп ТПг Аза Тс Те Трг Іїе бек сіу ТПг сіп Азїа І1е 65 70 75 80
АвБр січ Аза АБр Тук Тук Суб біп Аїа Тер Азр Бек сіу ТіПг Уаї Уаї 85 90 95
Рпе сіу Акуд сіу ТП Гу5 Теч ТіПг Уаї Гец 100 105 «2105 70 «2115 106 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» У сС418191 «4005 70
Ззек Тук бі Геї ТП біп Рго Рго бек Уа! бек Уа1і Бек Рго б1іу біп 1 5 10 15
Трг Аза бег І1їе Трг Сув бЗег Сбіу Авр Пув їеч Сіу Авр Пув Туг Уаї1 20 25 Зо ек Тер АБп Нів біп Гуз Рго біу біп бек Рго Уаі Геч МУаї І1е Туг 35 40 45 біп АБр Агуд Пуб Агуд Рго бек біу І1е Рго біЧ Аку Рре бек сіу бБег 5о0 ів) бо
АБп бек сіу АБп ТПг Аза Тс Те Трг Іїе бек сіу ТПг сіп А1їа Меє 65 70 75 80
АвБр січ Аза АБр Тук Тук Суб біп Аїа Тер Авр бБег бек ТПг Уаї Уаї 85 90 95 зо Рпе Ссіу сіу біу ТЬг Пув Геч Тпг Уаі1ї Іеч 100 105 «2105 71 «2115 106 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» У сС418199 «4005 71
Ззек Тук бі Геї ТП біп Рго Рго бек Уа! бек Уа1і Бек Рго б1іу біп 1 5 10 15
ТПг Маї бек Іїе ТБг Суб бек біу Авр Пув5 Геч сі1у АБр Гуз Рое Аїа 20 25 Зо
Сув Тер Тук біп сбіп пуб Рго біу біп бек Ргко Уаі Уаії Уаі Ше Туг 35 40 45 біп АвБр Авр оГуб Агуд Рго бек біу І1їе Рго біЧ Агку Рре бек сіу бБег 5о0 ів) бо
ТПг Бек біу АБп Тйг Аза ТрПг Гей ТПпг Іїе Бек сіу Тс біп Аїа Меє 65 70 75 80
АвБр січ Аза АБр Тук Тук Суб біп Аїа Тер Авр бБег АБп ТПг Уаї Уаї 85 90 95
Рпе сіу сіу сіу ТП Гу5 Теч ТБПг Уаї Гец 100 105 «2105 72 «2115 107 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» УТ або С418235 «4005 72 6о Авр І1е біп Меє Трг біп бЗег Рго бЗег бек Іеч бег Аїа бек Уа1і С1Уу 1 5 10 15
АвБр Акуд Уа1і Тс І1е Тс Суз Агу Аза бек біп Бек І1їе бек бек Туг 20 25 Зо
Теч АБп Тер Тук біп сбіп Пув Рго біу Гуз Аза Рго Пу5з Геч Геч Ше 65 35 40 45
Тугк Тук Аїа бек бек Ге біп бек сіу Уа1і Ркго бек Агу Робе бесг с01УуУ 5о0 ів) бо
Бек сіу Бек біу ТБг АБр Рпе ТПг Гец ТПг Іїе бБег бек Іеч біп Рго
65 70 75 80 біч А5р Рпе Аза ТПг Туг Туг Суб біп біп бек АвБр бег І1е Рго Тгр 85 90 95
ТЕ Рбе бі1у біп біу Тпйг Ппуз Уаі сі ІШе Гув 100 105 «2105 73 «2115 107 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» У с418в236 «4005 73
АБр Іїе сбіп Меє ТПг о біп бек Рго бек бек Гечс Бек Аїа бек Уаі б1Уу 1 5 10 15
Авр Агу Ма1і Тпг І1е Тпг о Сув Агу Аїа бек Сіп бек І1е бег бег Туг
Зо
Теч АБп Тер Тук біп сбіп Пув Рго біу Гуз Аза Рго Пу5з Геч Геч Ше
Тук Тук Аїа АБп Тйг Ге бсіп бек сіу Уа1і Ркго бек Агу Ропе бесг с01УуУ 20 5о0 ів) бо
Бек сіу Бек біу ТБг АБр Рпе ТПг Гец ТПг Іїе бБег бек Іеч біп Рго 65 70 75 80 біч А5р Рпе Аза ТПг Туг Туг Суб біп біп бек АвБр бег І1е Рго Тгр 85 90 95 25 Тіг Рпе сіу біп сіу ТП Ппув Уа1ї січ І1е Був 100 105 «2105 174 «2115 118 «2125 РЕТ 10) «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН 5с8 «4005 174 біп Уаі біп Ге Уаі! сіп Бек сі1іу Аїа біп Уа! Уаії Пу5 Рго сіу Азїа 35 1 5 10 15
Зек Уа1ї Ппув Геч бек Сув Туз Аза бек сіу Тук Іїе Рре ТПг бек Туг 20 25 Зо
Тук Меє Тук Тер Уа! їувз біп Аза Рго сіу сіп сіу Іеч біч Ткр Іе 35 40 45 40 сбі1у бій І1е Авп Рго бЗег Авп Сіу Авр ТіПг Авп Рре Авп січ Пув Рре 5о0 ів) бо
Туз бек Ппув Аїа ТпПг Геї Тс УМаії АБр Гуз бег Аїа бег ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Меє біп Іеч бек бек Гей Агуд бек бі АБр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 45 85 90 95
ТПг Агуд бек Авр біу Агуд Авп Авр Меє Авр бег Тгр біу біп б1іу Тр 100 105 110
Печ Уаї ТП Уаї Бек 5ег 115 «2105 75 «2115 111 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» У 5с8 «4005 75
АвБр Іїе Уа1і Геї ТП біп бек Рго Аїа ТПг Гей бБег Уаії бек Рго б1Уу 1 5 10 15 біч Аку Аза Тбг Іїе Бек Суб Агу Азїа бек біп Акуд Уаї бек Бек бБег 6о 20 25 Зо
ТПг Тугк бек Тук Меєсє Ніб Тер Тук біп сбіп Пув Рго біу біп Рго Рго 35 40 45
Тув Теч Геч Іїе Пув Тугк Аїа Бек АБп ІТечп біч бек біу Уаі Рго Аза 5о0 ів) бо 65 Ага Рпе бЗег біу бЗег біу бЗег біу Трг Авр Ріре ТпПг Іеч ТПг І1е 5бег 65 70 75 80
Зек Уаії сії Рго біц АвБр Ропе Аза ТПг Туг Туг Суб біп Нівз бек Тгр 85 90 95 біч І1їе Рго Рго ТПг Рре сіу біу біу ТБ Ппувз Ге бі Іїе Гув5 100 105 110 «2105 76 «2115 321 9) «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» кДнНкК УНН Сс418231 «4005 76 часаєссада Сдасссадад ссссадсадс сЕдадсусса дсдсдддсда сачадедасс бо ассассеєдеЕсС дддссадсса дадсассадс адсвєассєда асєддсаєса дсадаадссс 120 часааддссс ссаадссудсеЕ даєсвассас дссаасадсс єЄдсададсудд сдсдсссадс 180 ачасєсадсу дсадсуддсєсс судсассуас Сєсасссєда ссаєссадса сссдсадсесс 240 чаччасеєссу ссассвасса ссдссадса адсдасадса єсссссддас сЕєссуддссад 300 дасассаадд єддаааєссаа д 321 «2105 77 «2115 354 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» кДнНК МІ Сс418231 «4005 77 саддесссадс єддсдсадес сЄддсдссдаа дсЕдаадааас ссддсадсад сдєЕдааддеЕд бо
Есссдсааудд ссадсудсуд сассеєссадс адсбасудса Єсадссдуддс ссудасаддес 120 ссаддасадд дсссддааєд дасдддасєдда ассадсссса ссЕссддсаа сассаастас 180 чдсссадааасє Сссадддсад адєдассаєс ассудссудасу ададсассад сассудссвас 240 асудчаассуда дсадсссдсу дадсчадчдас ассудссуєдеЕ асвассдсдс садаадсс9д 300
Бассасуддсу ассєдчдчасса ссддддссад дадасасссєддч Єсассуєдес сесе 354 «2105 78
Зо «2115 387 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» кДнНК УНН С418191 «4005 78 саддсдсадс єддсдсадад сддсдсссад деЕдсадссдуд Єдсадесєда сдссдаадед бо аачааассєд дсудссадсає дааддсдссс сдсааддсса дсуддссасас сЕссассддас 120
Бассасасєсс ассудддсєдсу ссаддсссса ддссаддчас єЄдчааєсдуадє доаочасуадеЕєсс 180 аассссааса дсуддсдасас саасуддсдсс садаааєссс адддсададс дассаєдасс 240 сдддасасса дсассадсас сдсссасаєбд даасєдассс ддседсудвад и сдасдасасс 300 чЧсессдєдеЕасс ассдсдссад ачадчддсчдад сєддссудса ЄСсСЕсСсСЄєсСЧда свеассоддуодес 360 садддсассс ЕддЕдасадс деЕссадс 387 «2105 79 «2115 318 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» кДнНК МІ СсС418191 «4005 179 адссасдадс СЄдасссадсс ссссадсуєд Єссуєдессс ссдудссадас сдссадсаєс бо асссдсадсу дсдасаадсЕ дддсдасааа сасуєдсссеЕ ддаассасса даадсссуддес 120 сададссссуд Едссддедає срассаддас сддаададдс ссадсддсає ссссдадада 180
ЕсСсадсудса дсаасадсуд саасассусс ассссдасса єсадсудсас ссаддссаєд 240 часчадудссуд ассасвассуд ссаддсссуду дасадсадса ссусУудЕдЧЕсЄ соддсуададасєс 300 ассаадссда ссдєдсед 318 «2105 80 «2115 448 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність бо «220» «223» УН С41889 РІ шАр на Ідсівідтшта «4005 80 біп Уаі біп Ге Уаі! сіп Бек сбі1іу Аїа біч Уаії Ппу5з пуб Рго сіу бБег 1 5 10 15 65 Зек Уаї ПЦув Ма1ї бЗег Сув Пув Аїа бЗег біу біу Тпг Ріре бег бег Туг 20 25 Зо біу І1е бек Тер Уаі Аку сіп Аза Рго біу біп біу Ге бі Тер Меє 35 40 45 біу Ткр І1їе бек Рго Іїе Рбе сіу АБп ТБПг АБп Туг Аїа біп Пув Робе 5о0 ів) бо біп бі1у Акуд Уа! ТПпг Іїе ТПг Аза АБр бі бег Трг бег ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Меє біп Іеч бек бек Гей Агуд бек бі АБр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Агуд Бек Агуд Тує Тук біу АБр Гец Авр Туг Тер сіу сіп б1у ТЕбг 100 105 110
Теч Уаі ТЕ Уа1! бек Бек Аїа бек ТП Гуз біу Рго бек Уаі Рпре Рго 115 120 125
Теч Аза Рго бек бек Пув Бек ТПг бек біу біу ТбПг Аза Аза Геч Сс1Уу 130 135 140
Сув ТГеч Уаії пуб Авр Тук Рре Рго бій Рго Уа! Трг Уаї бек Тер АБп 145 150 155 160 бек біу Аїа Гец ТіЬг бек Сіу Ма1і Нів Тпг Ріре Рго А1їа Уаі1і Іеч сСіп 165 170 175
Зек Бек сіу Геч Тук бек ТГеч бек бек Уа1і Уа1і ТПг Уа1ї Рго бек 5ег 180 185 190
Ззек Геч сіу ТПг біп ТБ Тук Іїе Суб Авп Уаі АвБп Нів пуб Рго 5ег 195 200 205
Авп оТпк пуб Ма1ії АБр оГув5 Гуз Уаії біц Рго Пув Бек Сув АБр Гу5 ТЕГ 210 215 220
Нів ТП Суб Рго Рго Субв Рго Аїа Рго сі Аїа Аїа біу Аза бек 5бег 225 230 235 240
Уаї Рре Те Робе Рго Рго пуб Рго Пуб АБр ТПг Іечп Меєсє І1їе бег Агд 245 250 255
ТПЕ Ркго біп УМаії ТБг Сув Уаії Уа1і Уаії Авр Уаі бек Аїа біч АБр Рго 260 265 270 біч Уаії пуб Рпе Абзп Тер Туг Маі АБр біу Уаі! біч Уаї Ніб5 Ап Аза
Зо 275 280 285
Туз ТВ Мпув Рго Акд бій біз біп Тук АБвБп о бег ТПг Туг Акуд Уа1ї Уаї 290 295 300
Зек Уаії Гечш ТПг Уаї Іеч Ні біп Авр Тер Геч Ап сіу Ппув бі Туг 305 310 315 320
Туз Сув пуб Уа1! Бек Ап Пув Аза ІТечй Рго бег бек Іїе бій пуб ТПг 325 330 335
Іїе Бек Ппув Аїа Гуз біу біп Рго Акуд бі Рго сіп Уа1ї Тугє ТіПг Іеч 340 345 350
Рго Рго Бек Аку біп біч Месє ТБг пуб Авп о біп Уа1і! Бек Геч ТіПг Сув 355 360 365
Теч Уаі Ппув сіу Рпе Туг Рго бек АБр І1ї1е Аїа Уаі біц Тер січ бБег 370 375 З8о
АБп осіу біп Рго бі АБп АБп Тук Гпу5 Тс Тбг Рго Рго Уаі1ї Іеч Ар 385 390 395 400 век Авр сіу бек Рібе Робе Теч Тук бек пуб Геч ТПг Уа1і АБр Гув5 б5ег 405 410 415
Агуд Тер біп біп сб1у АБп Уа! Рібе бек Суб бек Уаі1і Меє Ніб5 січ Аїа 420 425 430
Теч Ніб Ап Нів Тук ТПг біп пуб бек ТГеч бек Гей бек Рго сіу ГПув 435 440 445 «2105 81 «2115 214 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Легкий ланцюг С41І889 «4005 81
АБр Іїе сбіп Меє ТПг о біп бек Рго бек бек Гечс Бек Аїа бек Уаі б1Уу 1 5 10 15 6о Авр Агу Ма1і Тпг І1е Тпг о Сув Агу Аїа бек Сіп бек І1е бег бег Туг 20 25 Зо
Теч АБп Тер Тук біп сбіп Пув Рго біу Гуз Аза Рго Пу5з Геч Геч Ше 35 40 45
Тук Тук Аїа АБп бек Ге біп бек сіу Уа1і Ркго бек Агу Ропе бесг с01УуУ 65 5о0 ів) бо
Бек сіу Бек біу ТБг АБр Рпе ТПг Гец ТПг Іїе бБег бек Іеч біп Рго 65 70 75 80 біч А5р Рпе Аза ТПг Туг Туг Суб біп біп бек АвБр бег І1е Рго Тгр
85 90 95
ТПЕ Ррпе бі1у біп біу ТБ пу Уаі сіш Іїе Гу5 Агку Тс Уаі Аза Аза 100 105 110
Рго Бек Маі Роре Іїе Робе Рго Рго бек Авр сії сбіп Геч Гу5 бек б1у 115 120 125
ТПг Аїа бек Уаії Уаї Суб Пец Гей Абзп Ап Рре Туг Рго Агу біч Аїа 130 135 140
Туз Уаі біп Тер пуб Уа1і АБр АБп Аза Тез біп бек біу Ап бек сіп 145 150 155 160 біч бек Уаі ТП сій сбіп Авр бек Куб Авр бег ТПг Тукг бек Геч бБег 165 170 175 ек ТПЕ Геї ТіПг Ге бек Гуз Аза Авр Тук січ пуб Нів пуб МУМаї Туг 180 185 190
Аа Сув сії Ма1ї ТП Ні біп біу Пец бек бек Рго Уа1і ТПг Пув5 б5ег 195 200 205
Рпе Абп Агуд сіу біч Сув 210 «2105 82 «2115 448 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» УН С41889 РІ шАр на ІдсівідштаутиеЕ «4005 82 біп Уаї біп Ге Уа1ї сСіп бек с1у Аїа січ Уа1ї Ппу5 Пув Рго Сіу бег 1 5 10 15
Зек Уа1ї Ппув Ма1ії бек Сув Туз Аза бек сіу сіу ТПг Рре бег бек Туг 20 25 Зо біу І1е бек Тер Уаі Аку сіп Аза Рго біу біп біу Ге бі Тер Меє
Зо 35 40 45 біу Ткр І1їе бек Рго Іїе Рбе сіу АБп ТБПг АБп Туг Аїа біп Пув Робе 5о0 ів) бо біп бі1у Акуд Уа! ТПпг Іїе ТПг Аза АБр бі бег Трг бег ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Меє біп Іеч бек бек Гей Агуд бек бі АБр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Агуд Бек Агуд Тує Тук біу АБр Гец Авр Туг Тер сіу сіп б1у ТЕбг 100 105 110
Теч Уаі ТЕ Уа1! бек Бек Аїа бек ТП Гуз біу Рго бек Уаі Рпре Рго 115 120 125
Теч Аза Рго бек бек Пув Бек ТПг бек біу біу ТбПг Аза Аза Геч Сс1Уу 130 135 140
Сув ТГеч Уаії пуб Авр Тук Рре Рго бій Рго Уа! Трг Уаї бек Тер АБп 145 150 155 160 бек біу Аїа Гец ТіЬг бек Сіу Ма1і Нів Тпг Ріре Рго А1їа Уаі1і Іеч сСіп 165 170 175
Зек Бек сіу Геч Тук бек ТГеч бек бек Уа1і Уа1і ТПг Уа1ї Рго бек 5ег 180 185 190
Ззек Геч сіу ТПг біп ТБ Тук Іїе Суб Авп Уаі АвБп Нів пуб Рго 5ег 195 200 205
Авп оТпк пуб Ма1ії АБр оГув5 Гуз Уаії біц Рго Пув Бек Сув АБр Гу5 ТЕГ 210 215 220
Нів ТП Суб Рго Рго Субв Рго Аїа Рго сі Аїа Аїа біу Аза бек 5бег 225 230 235 240
Уаї Рре Те Робе Рго Рго пуб Рго Пуб АБр ТПг Іеч Туг І1їе ТБг Агд 245 250 255 біч Рко біц Уаі! ТпПг Суб Уа1і Уаї УМаі АБр Уа! бек Аїа бій Авр Рго 260 265 270 біч Уаії пуб Рпе Абзп Тер Туг Маі АБр біу Уаі! біч Уаї Ніб5 Ап Аза 6о 275 280 285
Туз ТВ Мпув Рго Акд бій біз біп Тук АБвБп о бег ТПг Туг Акуд Уа1ї Уаї 290 295 300
Зек Уаії Гечш ТПг Уаї Іеч Ні біп Авр Тер Геч Ап сіу Ппув бі Туг 305 310 315 320 65 Туз Сув пуб Уа1! Бек Ап Пув Аза ІТечй Рго бег бек Іїе бій пуб ТПг 325 330 335
Іїе Бек Ппув Аїа Гуз біу біп Рго Акуд бі Рго сіп Уа1ї Тугє ТіПг Іеч 340 345 350
Рго Рго Бек Аку біп біч Месє ТБг пуб Авп о біп Уа1і! Бек Геч ТіПг Сув 355 360 365
Теч Уаі Ппув сіу Рпе Туг Рго бек АБр І1ї1е Аїа Уаі біц Тер січ бБег 370 375 З8о
АБп осіу біп Рго бі АБп АБп Тук Гпу5 Тс Тбг Рго Рго Уаі1ї Іеч Ар 385 390 395 400 век Авр сіу бек Рібе Робе Теч Тук бек пуб Геч ТПг Уа1і АБр Гув5 б5ег 405 410 415
Агуд Тер біп біп сб1у АБп Уа! Рібе бек Суб бек Уаі1і Меє Ніб5 січ Аїа 420 425 430
Теч Ніб Ап Нів Тук ТПг біп пуб бек ТГеч бек Гей бек Рго сіу ГПув 435 440 445 «2105 83 «2115 444 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» УН С41889 РІ шАр на Ідс25відтша «4005 83 біп Уаї біп Ге Уа1ї сСіп бек с1у Аїа січ Уа1ї Ппу5 Пув Рго Сіу бег 1 5 10 15
Зек Уа1ї Ппув Ма1ії бек Сув Туз Аза бек сіу сіу ТПг Рре бег бек Туг 20 25 Зо біу І1е бек Тер Уаі Аку сіп Аза Рго біу біп біу Ге бі Тер Меє біу Ткр І1їе бек Рго Іїе Рбе сіу АБп ТБПг АБп Туг Аїа біп Пув Робе 5о0 ів) бо біп бі1у Акуд Уа! ТПпг Іїе ТПг Аза АБр бі бег Трг бег ТПг Аза Туг 65 70 75 80 зо Меє біп Іеч бек бек Гей Агуд бек бі АБр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Агуд Бек Агуд Тує Тук біу АБр Гец Авр Туг Тер сіу сіп б1у ТЕбг 100 105 110
Теч Уаі ТЕ Уа1! бек Бек Аїа бек ТП Гуз біу Рго бек Уаі Рпре Рго 35 115 120 125
Теч Аза Рго Суб Бек Агуд Бек ТПг бек біц бек ТПг Аза Аза Геч Сс1Уу 130 135 140
Сув ТГеч Уаії пуб Авр Тук Рре Рго бій Рго Уа! Трг Уаї бек Тер АБп 145 150 155 160 40 бек біу Аїа Гец ТіЬг бек Сіу Ма1і Нів Тпг Ріре Рго А1їа Уаі1і Іеч сСіп 165 170 175
Зек Бек сіу Геч Тук бек ТГеч бек бек Уа1і Уа1і ТПг Уа1ї Рго бек 5ег 180 185 190
АвБп о Рпе сіу ТПг біп ТБ Тук ТБ Суб Авп о Уа1і Абвр о Нів пуб Рго 5ег 45 195 200 205
Авп оТпк пуб Ма1ії АБр оГув5 ТВ Уаі! біц Агуд пуб Сув Сув Ма1ї біч Сув 210 215 220
Рго Рго Сув Рго Аїа Рго Рго Аіїа Аїа Азїа бБег бек УМаі! Рібе Іеч Ре 225 230 235 240
Ркго Ркго Пув Рго Гуз АБр ТПг Гей Меє Іїе Бек Агу ТПг Рго біч Уаї 245 250 255
ТПг Сув Маії УМаї Уаії АвБр Уа! бек Аїа сії АБр Рго біп Уаії біп Ріре 260 265 270
АвБп Тер Тук Уаі АБр біу Маії біч Уаі Ніб5 АвБп Аза Пуб5 ТПг пув Рего 275 280 285
Агуд бій бій біп Рбе АБп бек Тйг Рре Акуд Уа1! Уа1ї Бек Уаї Іеч ТЕбг 290 295 300
Уаї Іеч Нібз біп Авр Тер Гечп Аб5п сіу Ппув бі Тук Гув Суб Пув Уаї 305 310 315 320 6о век Авп Ппув біу Геї Рго бек бек Іїе бій пуб ТПг Іїе бек Гу5 Тс 325 330 335
Туз біу біп Рго Акуд бій Рго біп Маі! Тук ТБг Ге Рго Рго бБег Аг4д 340 345 350 біч біц Меє Тпг пуб Абп о біп Маї бек Теч ТБбг Суб Геч Уа1і Ппу5 с1У 65 355 360 365
Рпе Туг Рго бек АБр Іїе Аїа Уаі сій Тер бій Бек АБп біу біп Рго 370 375 З8о біч АвБп о Авп о Тук пуб Тбг ТБ Рго Рго Меєсє Іец Авр бег Авр сіу бБег
385 390 395 400
Рпе Рпе Геч Тугк бек Гувз ТГеч ТБПг Уаі Авр ПувБ бБег Агуд Тгр біп сбіп 405 410 415 біу АБп Уаії Рпе бек Суб Бек УМаі Меє Ні5 біц Аза Гей Нібв Ап Нів 420 425 430
Тук Тс біп Гуз бек Теч бек Гей бек Рго сіу Пув 435 440 «2105 84 «2115 119 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН С418119 «4005 84 біп Уаї біп Ге Уа1ї сСіп бек с1у Аїа січ Уа1ї Ппу5 Пув Рго Сіу бег 1 5 10 15
Зек Уа1ї Ппув Ма1ії бек Сув Туз Аза бек сіу сіу ТПг Рре бег бек Туг
Зо
Туг І1е бек Тгр Уаі Агу біп Аза Рго сіу сіп сіу Іеч біч Ткр Меє 20 35 40 45 біу Аїа Іїе Авр Рго Тук Ррбе сіу Тук Аїа АБп Туг Аїа біп Пув Роіе 5о0 ів) бо біп бі1у Акуд Уа! ТПпг Іїе ТПг Аза АБр бі бег Трг бег ТПг Аза Туг 65 70 75 80 25 Меє біп Іеч бек бек Гей Агуд бек бі АБр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Аку Тс сіу Геї АБп Тук біу біу Рпре Авзр Туг Тгр сб1у біп б1Уу 100 105 110
ТВгЕ Ген Уаї! Трг Уаї бег 5ег
Зо 115 «2105 85 «2115 107 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» У СсС418119 «4005 85 біч Іїе Уаії Гей ТПг сіп Бек Рго Аїа ТПг Іец бек Гец бек Рго с1у 1 5 10 15 біч Акуд Аза Тбг Гей бек Сув Агу Азїа бек біп бек Уаії бек бек Туг 20 25 Зо
Теч Аїа Тер Тук біп сбіп Пув Рго біу біп Аїа Рго Акд Гец Ге Ше 35 40 45
Тук АБр Аїа бек АБп Агуд Аза ТПпг сіу І1їе Рго Аїа Агку Робе бесє с01УуУ 5о0 ів) бо
Бек сіу Бек біу ТБг АБр Рпе ТПг Гец ТПг Іїе бБег бек Іеч Січ Рго 65 70 75 80 біч АвБр Рпе Аїа Уа1і Туг Тугк Суб біп біп Агкуд бек АбБп Тер Рго Гей 85 90 95
Тіг Рпе сіу біп сіу ТП Ппув Уа1ї січ І1е Був 100 105 «2105 86 «2115 121 «2125 РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН Сс41883 «4005 86 біп Уаі біп Ге Уаі! сіп Бек сбі1іу Аїа біч Уаії Ппу5з пуб Рго сіу бБег 6о 1 5 10 15
Зек Уа1ї Ппув Ма1ії бек Сув Туз Аза бек сіу сіу ТПг Рре бег бек Туг 20 25 Зо
Аза І1їе Бек Тер Маі Аку біп Азїа Рго сбіу сбіп сіу Геч сії Ткр Меє 35 40 45 65 сіу Тер І1їе І1е Рго І1е Рпе СсС1іу Авп Трг Авп Туг Аїа сіп Пув Рре 5о0 ів) бо біп бі1у Акуд Уа! ТПпг Іїе ТПг Аза АБр бі бег Трг бег ТПг Аза Туг 65 70 75 80
Меє біп Іеч бек бек Гей Агуд бек бі АБр ТПг Аза Уаї Тук Тук Сув 85 90 95
Аза Акуд бій Ппув АБр о Робе Агу біу Тук ТПг пуб Геї АБр Тує Тгр б1Уу 100 105 110 біп біу Тпг Ге Уа1і Трг Уа1ї бег бег 115 120 «2105 87 «2115 107 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205» «223» У сС41883 «4005 87
АБр Іїе сбіп Меє ТПг о біп бек Рго бек бек Гечс Бек Аїа бек Уаі б1Уу 1 5 10 15
АБр Акуд Уа1і Тс І1е Тс Су5з Агуд Аза бек біп бек Іїе АБп АБп Тгр
Теч АБп Тер Тук біп сбіп Пув Рго біу Гуз Аза Рго Пу5з Геч Геч Ше 20 Туг Аїа Аїа бег бЗег Пеш Сіп бег СсСіу Уа1і Рго бег Агуд Рбе бек С1Уу 60
Бек сіу Бек біу ТБг АБр Рпе ТПг Гец ТПг Іїе бБег бек Іеч біп Рго 65 70 75 8о біч АвБр Рпе Аза ТПг Туг Тугк Суб біп біп бек Роре бек Рпе Рго Туг 25 85 90 95
ТЕ Рбе бі1у біп біу Тпйг Ппуз Уаі сі ІШе Гув

Claims (20)

100 105 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ зо
1. Виділене антагоністичне антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка, яке специфічно зв'язує СО0154 людини із ЗЕО ІЮО МО: 1, яке містить область, що визначає комплементарність, важкого ланцюга (НСОК)Х НСОКІ із 5ЕБЕО ІЮ МО: 17 (55015), НОСОК? із 5ЕБЕО ІЮ МО: 23 (/МІ5РІЕЄЄМТМУАОКРЕОС) і НСОКЗ із БЕО ІЮО МО: 30 (ЗЕУУООІ ОХ), та область, що визначає комплементарність, легкого ланцюга (СОМ): СОМ 1, І СОМ2 та І СОКЗ із: а) ЗЕО ІЮО МО: 37, 44 і 52 відповідно; Б) ЗЕО ІЮО МО: 37, 49 і 52 відповідно; або с) ЗЕО ІЮ МО: 37, 50 і 52 відповідно.
2. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 1, яке містить НСОКІ із БЕО ІЮО МО: 17 4о (5015), НСОК2 із 5ЕБЕО ІЮО МО: 23 (УМІЗРІЕЄМТМУАОКЕеОС), НСОКЗ із 5ЕБЕО ІЮО МО: 30 (ЗКУ ОМ), СОК із БЕО ІЮО МО: 37 (КАБОЗІЗЗУІ М), І СОК2 із БЕО ІЮО МО: 44 (МАМ5І О5) і ІГСОКЗ із БЕО ІЮ МО: 52 (Ф0505ІРУМТ).
3. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 1, в якому СО154 являє собою гомотример, і антитіло зв'язує перший мономер СО154 у гомотримері в межах амінокислотних залишків 182- 207 С0154 і другий мономер СО154 у гомотримері в межах амінокислотних залишків 176-253 СО154, де нумерація залишків відповідає 5ЕО ІЮ МО: 1.
4. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 3, яке зв'язує залишки Е182, 5185, 0186, А187, Р1І88, 5214, А215 і К207 у першому мономері СО154, де нумерація залишків відповідає ЗЕОІЮ МО: 1. 5О
5. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 3, яке зв'язує залишки Т176, Е177, С178, 0220, 5248, Н249, 5250 і Е353 у другому мономері СО154, де нумерація залишків відповідає ЗЕОІЮ МО: 1.
6. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 1, яке містить варіабельну область важкого ланцюга (УН), яка щонайменше на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 95 ідентична ЗЕО ІО МО: 59.
7. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 6, яке містить варіабельну область легкого ланцюга (МІ), яка щонайменше на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 95 ідентична ЗЕО ІО МО: 66, 72 або 73.
8. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 7, яке містить Мі із БЕО ІЮ МО: 66, 72 або бо 73.
9. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 8, яке містить МН із БЗЕО ІЮО МО: 59 ії МІ. із ЗЕО ІЮ МО: 66.
10. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 8, яке містить МН із БЕО ІЮ МО: 59 і Мі. із ЗЕО ІЮ МО: 72.
11. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 9, яке містить МН із БЕО ІЮ МО: 59 і МІ. із ЗЕО ІЮ МО: 73.
12. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за будь-яким з пп. 1-2 та 6-11, яке являє собою ізотип ЇДС1, Ідс2, ІЧО3З або Ідсаі.
13. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 12, яке містить щонайменше одну заміну в Ес-області, причому щонайменше одна заміна в Есо-області являє собою заміну І 234А, І 235А, б237А, Р2385, М252У, 52541, Т256Е, Н2б8А, АЗ305 або РЗ315, де нумерація залишків відповідає індексу ЕБИО.
14. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 13, яке містить заміну І234А, І235А, 0237А, Р2385, Н2б8А, АЗ305 і РЗ315 в Ес-області, причому нумерація залишків відповідає індексу ЕО.
15. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 12, яке містить щонайменше одну заміну в Ес-області, в якому щонайменше одна заміна в Ес-області являє собою заміну М234А, 5237А, Р2385, М252У, 52541, Т256Е, Н2б8А, М3091, АЗЗО5 або РЗ315, де нумерація залишків відповідає індексу ЕБИО.
16. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 15, яке містить заміну М234А, 5237А, Р2г385, Н2б8А, М3091, АЗ305 і РЗ315 в Ес-області, де нумерація залишків відповідає індексу
Е).
17. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 12, яке містить важкий ланцюг (НО) і легкий ланцюг (І С) із ЗЕО ІЮ МО: а) 80 і 81 відповідно; р) 82 і 81 відповідно; або с) 83 і 81 відповідно.
18. Виділене антагоністичне антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка, яке специфічно зв'язує СО154 із БЕО ІО МО: 1, яке містить: а) НСОКІ, НСОК2, НСОКЗ, І СОК1І, І СОК2 і СО із 5БЕО ІЮ МО: 17, 23, 30, 37, 44 і 52 відповідно; Зо Б) МН із БЕО ІО МО: 59 і МІ із БЕО ІЮ МО: 66; або с) важкий ланцюг із 5ЕО ІО МО: 80 і легкий ланцюг із зХЕО ІЮ МО: 81.
19. Полінуклеотид, який кодує МН антитіла з БЕО ІО МО: 59 і МІ антитіла з БЕО ІЮ МО: 66, 72 або 73.
20. Полінуклеотид, який містить полінуклеотидну послідовність із ЗЕО ІЮ МО: 76 або 77.
21. Полінуклеотид, який кодує МН антитіла з 5ЕО ІЮО МО: 59 і МІ антитіла з БЕО І МО: 66.
22. Вектор, що містить полінуклеотид за пп. 19, 20 або 21.
23. Клітина-хазяїн, яка містить вектор за п. 22.
24. Спосіб отримання виділеного антагоністичного антитіла, або його антигензв'язуючої ділянки, яке специфічно зв'язує СО154 із БЕО ІЮО МО: 1, який включає культивування клітини-хазяїна за до п. 23 в умовах, за яких відбувається експресія антитіла, і виділення антитіла, виробленого клітиною-хазяїном.
25. Виділене антагоністичне антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка, яке специфічно зв'язує СО154 із БЕО ІЮО МО: 1, яке містить а) НСОКІ1, НСОК2 і НСОКЗ із ЗЕО ІЮ МО: 17, 231 30 відповідно і ГСОК1, 1 СОК2іІ СОКЗ із 5ЕО ІО МО: 37, 49 і 52 відповідно; або Б) МН із ЗЕО ІО МО: 59 і МІ із БЕО ІО МО: 72.
26. Виділене антагоністичне антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка, яке специфічно зв'язує СО154 із ФЕО ІЮО МО: 1, яке містить а) НСОКІ, НСОМ2 і НСОЗ із БЕО ІЮ МО: 17, 231 30 відповідно і ГСОК1, 1 СОК2іІ СОКЗ із 5БЕО ІЮО МО: 37, 50 і 52 відповідно; або Б) МН із ЗЕО ІО МО: 59 і МІ із БЕО ІЮО МО: 73.
27. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за будь-яким з пп. 25-26, яке являє собою ізотип ЇДС1, Ідс2, ІЧО3З або Ідсаі.
28. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 27, яке містить щонайменше одну заміну в Ес-області, в якому щонайменше одна заміна в Ес-області являє собою заміну І234А, І 235А, б237А, Р2385, М252У, 52541, Т256Е, Н2б8А, АЗ305 або РЗ315, де нумерація залишків відповідає індексу ЕБИО.
29. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 28, яке містить заміну І234А, І235А, 0237А, Р2385, Н2б8А, АЗ305 і РЗ315 в Ес-області, причому нумерація залишків відповідає індексу ЕО.
30. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 27, яке містить щонайменше одну заміну в бо Ес-області, в якому щонайменше одна заміна в Ес-області являє собою заміну М234А, 5237А,
Р2г385, М252У, 5254Т, Т256Е, Н268А, М3091Ї, АЗ305 або РЗ315, де нумерація залишків відповідає індексу ЕБИО.
31. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за п. 30, яке містить заміну М234А, 5237А, Р2385, Н2б8А, М3091, АЗ305 і РЗ315 в Ес-області, де нумерація залишків відповідає індексу
ЕО.
32. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за будь-яким з пп. 1-2, 6-18 і 25-31, яке є мультиспецифічним.
33. Антитіло, або його антигензв'язуюча ділянка за будь-яким з пп. 1-2, 6-18 і 25-31, яке має щонайменше одну з таких властивостей: а) імунний комплекс антитіла й розчинного СО154 людини (5020154) не активує тромбоцити, причому активацію тромбоцитів вимірюють за експресією Р-селектину на поверхні тромбоцитів; Б) зв'язується з СО154 із константою дисоціації (Ко) приблизно 5х109 М або менше за результатами вимірювання Ко із використанням системи РгоїеОп ХРЕЗ6б за 25 "С у фосфатно- сольовому буферному розчині Дульбекко, який містить 0,03 95 полісорбату Р20 ї 100 мкг/мл альбуміну бичачої сироватки; с) інгібує опосередковану СО154 проліферацію В-клітин людини зі значенням ІС5о приблизно 2,1х109 М або менше; або а) інгібує опосередковану СО154 експресію секретованої ембріональної лужної фосфатази (ЗЕАР) під керуванням ме кВ'індуцивельного інтерферон-В (ІЕМ-Д) мінімального промогора в клітинах НЕК293, які стабільно експресують ЗЕАР і СО40 людини зі значенням ІС5о приблизно 2,1х108 М або менше.
34. Імунокон'югат, який містить антитіло, або його антигензв'язуючу ділянку за будь-яким з пп. 1- 2, 6-18 і 25-31, зв'язане з терапевтичним агентом або візуалізуючим агентом.
35. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло, або його антигензв'язуючу ділянку, за будь-яким з пп. 1-2, 6-18 і 25-33, або імунокон'югат за п. 34 і фармацевтично прийнятний носій. Ччг і - 100 - Е за-
її . ОВ Е 8о . Щ Собор о 70 . ШІ РАС-1 (а ро І ш 50 б 40. . .
ї . . х 30.
с . : 5 20 . . -ай 5 а . й . ; я : | КК шк КЗ шо о ВИ НИК ННЯ де о Фе
Е. ; Я я с « у пн и кон мкс є а Фо ке я я «у -о 5 Ко, се а Я «я 5
Фіг ЩЕ РАС-1 Ж 1004 ше що 90 і І о Щевсуй
ЕН. С ВО хе 70- 5 5 во т ї ! ж 50 ж 4 .
о . Во 20 . ОА ЛК ЛА, ЛА ЛА А АК 9 з о" Фо си Ко ке, Ко м о ОК А КК а о А А А Я , о «
Фіг З з ше Щ РАС їх їв ц с 80 . 0 сОов2 70 о й й в ,
т- бо хо 50 Ї з іще Й ЩІ Й й й що ЩО Ве | Су их 5 жиснни л л Лс
ФМ М о о 2 « Ф Я Ку сх Ф ю
Фо
Щ. що сі ; Зі зе Б - с осн МЕ кош й 5 є Се о» М де Во, ше - з ж б ВЕ нн В МО ВВ в:
з ї. у В я ї | Де ше Ши ше с Ен і. СО ШИ: о й м ше Ше ОХ. ат а нерв я вх У в х "оонех 1 : а е пох КЗ Я З ЗО В . ж В Ж ше ШЕ їй, я ша де КЗ а сс Мох ч Ок МЕ а З т. КО НК КЕ КК о Ж с іа СК а и Що Оу ЕМ я Коня ЕКО КИЙ х ; Е я . . щі ОК В КУ КК УК
00. в 1-7 0 їх ш Фіг З конання у кож мчч ре пе з я інн А доня Ка Е ї С Ше КО ження ке о кл ! "Є т ш- о г і і 5 2 щ і. ек : 7 й з й з, К207. | ІА 253. --е : м Ка Зм СЯ рі ри ШИ нн Моно гй щЕ те Щ Ще иттвау т КА) і м фам Кз ще ше у і Іа ; ві 220 З Е і ще Н Ї | і ша КЕ в паній : і кл 22 З І і Її й й й З ї й нення : ії Ше Й 102 й р тео Н У скл Ше Її ік у ІК й й Ї і І
ЦИ. Е ж ! й п оміб2 К-К 5214). ЇХ 6250; Я й і чо З іт ї Ми ва ше ; і А 250
- . | і в бу Й щі 3 К Ка дже ке і і Це Це ге я Я Н РК ткхожх ший і ! 10 іє те г ж че : Т; що Н Е Б : , : КД мит Ти» Е щк ' й я -- З КЕ Те й 4 Н я У: | Е Є ща б ! їй Я Н В: Н і І ; ; К- даю : Кк Ще щ
-. сн | чо вач Н Ко сх ще овібо у 5185) є55 | "8248. . | шк одне А З Я. ж, у нин х поняннях й і Я я ка ; в АТ ткж ! ПИ Е й т і Й ' и я ; ох тент : З Е С : Е : (а й ї М ; 5 і МО и хх 4, | і ок ях Кк т ; 2 т й Н нн у й м ОДИН ! 178 Сл шт У ЦІ я і ! 5 скддсттени 531 к ква с і щи тн Щ ; деоккююкккнюс ! їх А187 іч Ср р ще З ТМ. м З той 3 ї Е ; З і і сонкккюююніия ше 177 / Х кет те дек, і ау С З В і я шві сек г а діння з З й: | 4 і 88 | т 6 й я гй Х В здо де К 1 ) ось » їі і жк ще одно м.002020А я персетеееетеееесееттеетттесетнт сх і іч Б і й Х ше
Фе БА і: 7 в МЕ ГП урим За и НК В МИ ЛюЮщиНнИ ВІВ машинок БК -- хх ерк зи ки иа ж чан ак Ви НК ККУ Кв у ана отьшоя Мавпи-сіттенки мМІЕТУЮМОВУрвВЕДАЛОСрОИСУВМИ ТЕМУ мали ЗтАКОУНКИ МІВ КОЖ КК КОМ Ка КІЕМУБО У ж ЕК ЕНН А НЕ НН ЕЕ ЕЕ к г З их в 2 ви течіях ЖЖ жу Ю их М Ж Тихе ЮК ВЕУ ТУ Как хв У МТ КЗ людини КІ гоМмізВАиВУХНиК КТС жк У А друк кв ти, г жука ех т пох ут ХхуУХа Хіт ти «хто Кут т жнавпи-іїгоунвки ЕІ ТОоМІСсВБАСКАХХНиКОрКТВОВеМЕВ Ж ж Ж ЖжЖжЖ ЖЖ жи жжЖжЖжжЖж Ж жЖжЖжжжиЖЕЕж -х -ож ке Її Кк 5 режи щш Тер туз аку г У Як т о п ие о ов В ММ п а код од и ся МКУ НН а и и КЕ чен ИН НВ Б 0 - сл сетер сова пери имеук ох СЮ СУ КЗ су тю У мавпезігоУнКкИи ВПЗЕМЕМКтТіІснСМІСеКии Москві Ж ЖЖ ож ж Ж ж ж ожож ж ж Ж ж ж ж ж ож ож ж ж ж ж ж ж ж ж щі отак, щі Же МІ у Ух ше я пе г ту Мтш ие т дич Кум г СН х -- ТІ ЦК І Б КВ г ЕК ЗКУ ХОМ У КМ КАЗКА КУКА М САУ Ка КК кет ЯК ха х щ й ДУМ и Уж Уфа у ою АВ ВВ Ви Кит т ВМ ДОК их вам, Мр ТЕСТЯ ММ ща: г ТТ ЕК м Не су Е еВ в КМ АК УМ ЖнКи Хм У М Ма МЕ КАК КІ КМ Ак -ехи ж ххх жк жхож ож жо Ж ж ж сжскож ж ж х оту жошот о хо взокя ККУ тт ЩА мок опоІЧУ ТІВ ОТП Тит Ук пли рхя ху КВ ЗІ і АКА М З сла ККУ ПУ АК К я я А ККІХ
Мвт. Я сккууртти 0 Ж КВ ОВО жд ку нм Ноя ета КІ Мавпи-їгГрунки Ко и това ки и М В ЕК НА Я Ма ке З У ке В кв в зн в ЗВ В В Ко В Я Ж М С СВ ВСЯ «во от АХ по Туди зт ттт пед р и у т пт ЗИ МУ ТЕ залах М Ку ХХ як кам | кХ Здуття уріхути т УМГ жу УМлІщ узи т кр усу у мавпи-їррунки БОУТСЕМОКи УК ОУ ТС Ж Ж й ЖоЖ ок ОК Ж Ж Ж ЗК Ж ож ЖОфОЖ Ж ОЖ Ж Зк Жде ож ож ож ОЖ ЖЖ
Фк 6 що 219 Мавпизігрунки КАБАРЕ ТАВЕСЬКееМАКЕАТІ МАМ жжжжЕЖЕЖЕАЖЖЖКЮВЖ Ж ЖЖ гії 240 Мавпи-ігрунки тнОЗАКРОМОВІНЬСОТКЕТОРОАБУКУМ ЖокОЖОК Ж Ж ХО Ж ОК Ж КОЖ Ж КК Ж Ж ЖЖ ЖЖ Ж Ж ЖЖ ЖЖ КІ зві пПюДИНИе УторезУЗиоТОоКтаКсвеК Мавпи-ігрунки УТОРЕОУБНСТОЕТЕЕСЬСКИ. І "ккакихажювьки ВЖК Фо 100 щ ШІ РАС-!
5. 80 І ЩЕ Собор (в) хх . в то ! їв во во.
Ж .
40 . щ Е 5 30 -
-к . сі-- Її - ши за ді: М шо: ШО шо» Ме миши НА о А и І и Я ж лк Ше чу Фе с
UAA201802170A 2015-08-05 2016-08-04 Виділене антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує cd154, та фармацевтична композиція, яка його містить UA123398C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562201150P 2015-08-05 2015-08-05
US201662367660P 2016-07-28 2016-07-28
PCT/US2016/045574 WO2017024146A1 (en) 2015-08-05 2016-08-04 Anti-cd154 antibodies and methods of using them

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA123398C2 true UA123398C2 (uk) 2021-03-31

Family

ID=57944010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201802170A UA123398C2 (uk) 2015-08-05 2016-08-04 Виділене антагоністичне антитіло, яке специфічно зв'язує cd154, та фармацевтична композиція, яка його містить

Country Status (26)

Country Link
US (2) US10669343B2 (uk)
EP (1) EP3331563B1 (uk)
JP (2) JP7049988B2 (uk)
KR (1) KR20180030917A (uk)
CN (2) CN114605549A (uk)
AU (1) AU2016301361B2 (uk)
BR (1) BR112018002319A2 (uk)
CA (1) CA2994825A1 (uk)
CL (1) CL2018000298A1 (uk)
CO (1) CO2018001256A2 (uk)
EA (1) EA201890434A1 (uk)
EC (1) ECSP18008922A (uk)
ES (1) ES2944982T3 (uk)
GT (1) GT201800034A (uk)
HK (1) HK1256804A1 (uk)
IL (2) IL293065A (uk)
MA (1) MA45573A (uk)
MX (1) MX2018001522A (uk)
MY (1) MY188405A (uk)
NI (1) NI201800017A (uk)
PE (1) PE20180802A1 (uk)
PH (1) PH12018500203B1 (uk)
SG (1) SG10201913275QA (uk)
SV (1) SV2018005624A (uk)
UA (1) UA123398C2 (uk)
WO (1) WO2017024146A1 (uk)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108350005B (zh) 2015-08-05 2024-02-06 卫材R&D管理有限公司 用于制备均一低聚物的手性试剂
EA201890434A1 (ru) * 2015-08-05 2018-10-31 Янссен Байотек, Инк. Антитела к cd154 и способы их применения
CN108473561B (zh) 2015-11-27 2022-12-16 埃博灵克斯股份有限公司 抑制cd40l的多肽
WO2020068723A1 (en) * 2018-09-24 2020-04-02 Janssen Biotech, Inc. Method of providing safe administration of an anti-cd154 antibody
BR112021026410A2 (pt) * 2019-07-01 2022-02-08 Tonix Pharma Ltd Anticorpos anti-cd154 e usos dos mesmos
KR20210006301A (ko) * 2019-07-08 2021-01-18 주식회사 프로젠 신규 융합단백질 및 그의 용도
WO2021154530A1 (en) * 2020-01-27 2021-08-05 Vanderbilt University Human anti-dengue antibodies and methods of use therefor
CA3186256A1 (en) * 2020-07-28 2022-02-03 Yoon Aa Choi Anti-lilrb1 antibody and uses thereof
EP4382537A4 (en) * 2021-07-30 2025-07-23 Seoul Nat Univ R&Db Foundation ANTI-CD154 ANTIBODY AND ITS USE
CN115586338A (zh) * 2022-09-20 2023-01-10 杭州赛基生物科技有限公司 用于检测可溶性细胞因子受体的试剂盒及其制备方法
AU2024262779A1 (en) * 2023-04-28 2025-12-11 Fortvita Biologics Inc. Anti-cd40l antibody and use thereof in treatment of human autoimmune diseases

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US226A (en) 1837-06-03 Samuel goss
US541606A (en) 1895-06-25 Sealed package
US7709A (en) 1850-10-08 Chas S Gaylord Improved spring-grapple
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
WO1988001649A1 (en) 1986-09-02 1988-03-10 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
KR100283541B1 (ko) 1991-10-25 2001-03-02 크리스토퍼 엘. 와이트, 스코트 지. 홀퀴스트, 스티븐 엘. 말라스카 신규 사이토킨
US5474771A (en) 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
PT1696031E (pt) 1991-12-02 2010-06-25 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
ATE240394T1 (de) 1992-10-23 2003-05-15 Immunex Corp Methoden zur herstellung löslicher, oligomerer proteine
DE69303494T2 (de) 1992-11-13 1997-01-16 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
JP3720353B2 (ja) 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
WO1995006666A1 (en) 1993-09-02 1995-03-09 Trustees Of Dartmouth College Anti-gp39 antibodies and uses therefor
ATE179616T1 (de) 1993-09-02 1999-05-15 Dartmouth College Verfahren zur verlaengerter unterdrueckung der humoralen immunitaet
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
MX9709447A (es) 1995-06-07 1998-02-28 Immunex Corp Nueva muteina cd4ol.
WO1997014719A1 (en) 1995-10-16 1997-04-24 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US6440418B1 (en) 1995-11-07 2002-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies
NL1003537C2 (nl) 1996-07-08 1998-01-12 Holland Railconsult B V Werkwijze voor het vervaardigen van een gebogen beglazing.
EA002549B1 (ru) 1997-05-17 2002-06-27 Байоджен, Инк. Применение блокатора связывания cd40:cd154 для предотвращения противоадаптивных иммунных реакций, в частности отторжения трансплантата
WO1998052976A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
HUP0101689A3 (en) 1998-04-03 2004-08-30 Trustees Of Darmouth College H Use of anti-gp39 antibodies for treatment and/or reversal of lupus and associated kidney disease
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
US6818749B1 (en) 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
GB9915653D0 (en) 1999-07-06 1999-09-01 Bruce Terry Hose clamp
DE60035057T2 (de) 1999-10-04 2008-01-31 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville CD40 Antagonist zur Behandlung von Psoriasis
ES2274823T3 (es) 1999-12-29 2007-06-01 Immunogen, Inc. Agentes cototoxicos que comprenden doxorrubicinas y daunorrubicinas y su utilizacion terapeutica.
US20030103978A1 (en) * 2000-02-23 2003-06-05 Amgen Inc. Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
GB0006398D0 (en) 2000-03-16 2000-05-03 Novartis Ag Organic compounds
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
IL155977A0 (en) 2000-11-30 2003-12-23 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
US7495090B2 (en) 2002-05-23 2009-02-24 The Regents Of The University Of California Nucleic acids encoding chimeric CD154 polypeptides
WO2004111233A1 (ja) 2003-06-11 2004-12-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の製造方法
DE602004029252D1 (de) 2003-06-13 2010-11-04 Biogen Idec Inc Aglycosyl-anti-cd154 (cd40-ligand) antikörper und deren verwendungen
EP3434275A1 (en) 2003-11-06 2019-01-30 Seattle Genetics, Inc. Assay for cancer cells based on the use of auristatin conjugates with antibodies
CZ200755A3 (cs) 2004-07-26 2007-04-11 Biogen Idec Ma Inc. Peptidy protilátek anti-CD154
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
EP1851245B1 (en) 2005-01-26 2012-10-10 Amgen Fremont Inc. Antibodies against interleukin-1 beta
CN101198698B (zh) 2005-03-31 2014-03-19 中外制药株式会社 通过调节多肽缔合制备多肽的方法
WO2006125201A2 (en) * 2005-05-19 2006-11-23 Centocor, Inc. Anti-biotin-pegylated-mcp-1 mutein antibodies, compositions, methods and uses
US8114964B2 (en) 2005-05-19 2012-02-14 Centocor, Inc. Anti-MCP-1 antibodies, compositions, methods and uses
WO2007110205A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
CL2007002567A1 (es) 2006-09-08 2008-02-01 Amgen Inc Proteinas aisladas de enlace a activina a humana.
KR101120699B1 (ko) 2006-11-20 2012-03-22 나노스텔라 인코포레이티드 금속 나노입자를 함유하는 불균질 촉매의 제조방법
SG196697A1 (en) 2007-03-22 2014-02-13 Biogen Idec Inc Binding proteins, including antibodies, antibody derivatives and antibody fragments, that specifically bind cd154 and uses thereof
CN104497143B (zh) 2007-03-29 2020-08-25 健玛保 双特异性抗体及其制造方法
US8748356B2 (en) 2007-10-19 2014-06-10 Janssen Biotech, Inc. Methods for use in human-adapting monoclonal antibodies
JP2011507519A (ja) 2007-12-19 2011-03-10 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド ｐＩＸ又はｐＶＩＩへの融合を介したヒトデノボｐＩＸファージディスプレイライブラリの設計及び作製、ベクター、抗体、及び方法
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
JP5646457B2 (ja) 2008-04-29 2014-12-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
JP2012505654A (ja) 2008-10-14 2012-03-08 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗体をヒト化及び親和性成熟する方法
AU2010245011B2 (en) 2009-04-27 2015-09-03 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
SI2506871T1 (sl) 2009-11-30 2016-12-30 Janssen Biotech, Inc. Mutanti Fc protitelesa z odstranjenimi efektorskimi funkcijami
US20110206672A1 (en) 2010-02-25 2011-08-25 Melvyn Little Antigen-Binding Molecule And Uses Thereof
JP6040148B2 (ja) 2010-04-20 2016-12-07 ゲンマブ エー／エス ヘテロ二量体抗体Ｆｃ含有タンパク質およびその産生方法
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
US8795950B2 (en) 2010-06-30 2014-08-05 Jonghan Choi Method of improving print performance in flexographic printing plates
EP2420253A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Leadartis, S.L. Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain
EP2444101A1 (en) 2010-10-21 2012-04-25 Universitätsklinikum Freiburg Selective targeting of the CD40L/Mac-1 interaction by small peptide inhibitors and its use for the treatment of inflammation and atherogenesis
US20140121123A1 (en) * 2010-10-29 2014-05-01 Kevin Caili Wang Methods for diversifying antibodies, antibodies derived therefrom and uses thereof
PL2635607T3 (pl) 2010-11-05 2020-05-18 Zymeworks Inc. Projekt stabilnego przeciwciała heterodimerowego z mutacjami w domenie FC
CA2822366A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Janssen Biotech, Inc. Active protease-resistant antibody fc mutants
EP2681242B1 (en) 2011-03-01 2018-01-24 Amgen Inc. Sclerostin and dkk-1 bispecific binding agents
WO2012138768A2 (en) 2011-04-04 2012-10-11 Trustees Of Dartmouth College Anti-cd154 antibodies having impaired fcr binding and/or complement binding properties and the use thereof in immune therapies
KR20220116585A (ko) 2011-10-11 2022-08-23 비엘라 바이오, 인크. Cd40l 특이적 tn3 유래 스카폴드 및 이의 사용 방법
SMT202000091T1 (it) 2011-10-13 2020-05-08 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidi anticorpali che antagonizzano cd40l
AU2013267161A1 (en) 2012-05-31 2014-11-20 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind PD-L1
SG11201504676VA (en) 2012-12-14 2015-07-30 Omt Inc Polynucleotides encoding rodent antibodies with human idiotypes and animals comprising same
EA201890434A1 (ru) * 2015-08-05 2018-10-31 Янссен Байотек, Инк. Антитела к cd154 и способы их применения
US10651781B2 (en) 2017-08-24 2020-05-12 Corning Incorporated Glass roof shingle

Also Published As

Publication number Publication date
US11421037B2 (en) 2022-08-23
BR112018002319A2 (pt) 2018-12-11
MX2018001522A (es) 2018-03-15
GT201800034A (es) 2019-09-26
SV2018005624A (es) 2018-09-25
AU2016301361B2 (en) 2022-06-16
PE20180802A1 (es) 2018-05-09
KR20180030917A (ko) 2018-03-26
SG10201913275QA (en) 2020-02-27
IL256997B (en) 2022-06-01
JP2018522562A (ja) 2018-08-16
AU2016301361A1 (en) 2018-02-08
PH12018500203B1 (en) 2023-02-22
MY188405A (en) 2021-12-08
CN114605549A (zh) 2022-06-10
CN107921128A (zh) 2018-04-17
US10669343B2 (en) 2020-06-02
MA45573A (fr) 2019-05-15
PH12018500203A1 (en) 2018-07-30
JP2022058414A (ja) 2022-04-12
ES2944982T3 (es) 2023-06-27
EP3331563B1 (en) 2023-04-19
CN107921128B (zh) 2022-04-26
EP3331563A4 (en) 2019-09-04
NI201800017A (es) 2018-08-24
JP7049988B2 (ja) 2022-04-07
EA201890434A1 (ru) 2018-10-31
NZ739597A (en) 2021-03-26
US20200317794A1 (en) 2020-10-08
IL293065A (en) 2022-07-01
WO2017024146A1 (en) 2017-02-09
US20170037136A1 (en) 2017-02-09
CO2018001256A2 (es) 2018-05-10
IL256997A (en) 2018-03-29
CA2994825A1 (en) 2017-02-09
EP3331563A1 (en) 2018-06-13
ECSP18008922A (es) 2018-04-30
HK1256804A1 (zh) 2019-10-04
CL2018000298A1 (es) 2018-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5179474B2 (ja) 拮抗性抗ヒトｃｄ４０モノクローナル抗体
CA2795279C (en) Antibodies to cd122
KR100191152B1 (ko) Cd4 특이적 재조합 항체
JP2021184731A (ja) Ｃｄ１２７に対する抗体
EP1871807B1 (en) Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof
SK18122002A3 (sk) Protilátky proti ľudskému MCP-1
TR201807983T4 (tr) İnsanlaştırılmış anti-CXCR5 antikorları, deriveleri ve kullanımları.
JP2022058414A (ja) 抗ｃｄ１５４抗体及びこれを使用する方法
JP2010518873A (ja) アンタゴニスト抗ｏｘ４０抗体および炎症性疾患および自己免疫性疾患の処置におけるその使用
MX2011000616A (es) Composiciones y metodos de uso para anticuerpos terapeuticos.
NZ729478A (en) Antibodies and chimeric antigen receptors specific for cd19
KR20240128709A (ko) 신규한 항-tslp 항체
AU2001283903A1 (en) Antibodies to human MCP-1
UA128549C2 (uk) Антитіло до ctla-4 та його застосування
JP7747645B2 (ja) グリピカン－３（ｇｐｃ３）を標的化する抗体及びキメラ抗原受容体並びにその使用方法
CA2759942A1 (en) Composition and methods of use for therapeutic antibodies specific for the il-12 receptore betai subunit
JP2024503396A (ja) Ｃｄ４７と特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント
JP2024503394A (ja) ４－１ｂｂと特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント
JP6996825B2 (ja) 修飾ＣκおよびＣＨ１ドメイン
CN121181697A (zh) 靶向gpa33的抗原结合蛋白及其用途