ES2949946T3

ES2949946T3 - Composición inyectable para la reducción de grasa localizada sin dolor, edema ni efectos secundarios, y método para prepararla

Info

Publication number: ES2949946T3
Application number: ES18787918T
Authority: ES
Inventors: Ki Taek Lee
Original assignee: AMI PHARM CO Ltd
Current assignee: AMI PHARM CO Ltd
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2023-10-04
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: CA3031678C; JP7034497B2; AU2018256263A1; EP3479827A4; CO2019004317A2; MX384872B; US11298314B2; CN109862897B; EP3479827A1; IL266873B2; AU2018256263B2; RU2736974C1; BR112019008065A2; IL266873A; ZA201902617B; MX2019002289A; KR101887586B1; WO2018194427A1; CA3031678A1; WO2018194427A8

Abstract

La presente invención se refiere a una composición inyectable para la reducción de grasa tópica sin dolor, edema y efectos secundarios, y a un método para preparar la misma y, más específicamente, a una composición inyectable para la reducción de grasa tópica, en donde la composición inyectable contiene una mezcla particular. proporción de ácido glicocólico (o una sal del mismo) o ácido taurocólico (o una sal del mismo) y fosfatidilcolina (PPC), y por lo tanto no causa dolor, edema ni efectos secundarios, tales como necrosis de células musculares, fibroblastos, células endoteliales vasculares, además de adipocitos, anestesia de un sitio de administración, hinchazón extensa, eritema, endurecimiento, sensación anormal, nódulos, picazón, sensación de ardor, daño a los nervios y afagopraxia, y a un método para preparar la composición. Una inyección única de DCA, que se conoce como inyección existente para la reducción de grasa tópica, o una composición de una inyección de PPC mezclada con DCA como solubilizante, se acompaña de dolor y efectos secundarios, como anestesia, hinchazón extensa, edema tópico, eritema, endurecimiento, sensación anormal, nódulos, picazón, sensación de ardor y afagopraxia, debido a la necrosis necesariamente causada por la lisis incluso de fibroblastos, células endoteliales vasculares y células musculares, además de los adipocitos, por lo que los pacientes se quejan de dolor, malestar y ansiedad. y muestran un bajo cumplimiento del medicamento, pero la inyección para la reducción de grasa tópica de la presente invención tiene una composición excelente, que mejora la calidad de vida de los pacientes y aumenta el cumplimiento del medicamento ya que la preparación es segura y estable y tiene una excelente lipólisis y apoptosis adipocítica. induciendo efectos, selectivamente solo en los adipocitos, sin producir los efectos secundarios descritos anteriormente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición inyectable para la reducción de grasa localizada sin dolor, edema ni efectos secundarios, y método para prepararla

Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición útil para reducir la grasa de forma no quirúrgica sin dolor, edema ni efectos secundarios en un sujeto que tiene depósito de grasa localizada usando fosfatidilcolina farmacéuticamente activa y un método para prepararla. Más específicamente, la presente invención se refiere a una composición y preparación para reducir la grasa localizada con dolor y efectos secundarios reducidos (especialmente, necrosis de células musculares, fibroblastos y células endoteliales vasculares distintas de los adipocitos; edema; anestesia de los sitios de administración; hinchazón extensa; eritema, induración, parestesia, nódulo, prurito, sensación de ardor, lesión nerviosa o disfagia), comprendiendo la composición: (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo, en donde una relación molar de (ii) a (i) en la composición está en un intervalo de 0,7 a 3,0, un kit que comprende la mismo, un método para prepararla y un método para eliminar de manera no quirúrgica el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos usando la composición o preparación.

Antecedentes de la técnica

La presente solicitud reivindica prioridades de la solicitud de patente coreana n.° 10-2017-0051868 presentada el 2 l de abril de 2017 y solicitud de patente coreana n.° 10-2017-0146264 presentada el 3 de noviembre de 2017.

La grasa depositada localmente es una preocupación especial para muchas personas. Las personas que tienen depósitos de grasa convexos o gordos no deseados en la cara o en una parte del cuerpo pueden verse menos atractivas y parecer más viejas. Estos pueden ser causados por el envejecimiento, el estilo de vida o la predisposición genética. Para superar esto, tratamos de mejorar mediante el ejercicio y la dieta, pero el efecto de reducción de grasa es limitado.

Los procedimientos quirúrgicos típicos de cirugía plástica cosmética para reducir el depósito de grasa localizada incluyen la liposucción, lipoplastia y succión de lipoescultura, que son cirugías plásticas cosméticas que eliminan una gran cantidad de grasa. Los procedimientos cosméticos mínimamente invasivos (no quirúrgicos) son procedimientos que utilizan dispositivos médicos, mesoterapia o inyecciones fuera de indicación. Sin embargo, el procedimiento quirúrgico tarda varias semanas o meses en cicatrizar, y ciertos individuos, tales como los fumadores y diabéticos, pueden experimentar un retraso considerable en la cicatrización e incluye posibles complicaciones y riesgos, tales como efectos secundarios mortales que causan 20 muertes por cada 100.000 personas, el riesgo de anestesia general, sangrado excesivo, daño a órganos internos, infecciones bacterianas, cicatrices, hematomas, hinchazón y dolor. En el caso de métodos no quirúrgicos que son una alternativa a los mismos, existe un riesgo potencial porque la seguridad y la eficacia no están aseguradas debido a la ausencia de ensayos clínicos a gran escala que se realicen con aprobación bajo la supervisión de las autoridades sanitarias. Existe la necesidad de desarrollar nuevos fármacos clínicamente útiles que no tengan el riesgo de un procedimiento quirúrgico y no quirúrgico.

Los fármacos inyectables para la reducción de grasa localizada son inyecciones del fármaco en la capa de grasa subcutánea para inducir la pérdida de células grasas. Un ejemplo típico es la inyección de PPC. Inyección de PPC es una abreviatura de polieno fosfatidilcolina, y existen Essentiale® N i.v. desarrollado por A. Nattermann GmbH de Alemania en la década de 1950 para el tratamiento de enfermedades hepáticas y Lipostabil® N i.v. desarrollado para la prevención y el tratamiento de la embolia grasa y Lipobean® que ha sido aprobado como medicamento adyuvante para el coma hepático debido a cirrosis en la República de Corea.

Durante la prescripción de inyecciones de PPC para la prevención y el tratamiento de enfermedades hepáticas o embolia grasa, en 1988, el Dr. Sergio Maggiori, un médico italiano de la MesoTherapy Society en París, Francia, comunicó el resultado del ensayo por primera vez del tratamiento del xantelasma, una enfermedad en la que se deposita grasa amarilla en los párpados, mediante una inyección de PPC, en 1999, la Dra. Patricia G. Rittes, dermatóloga brasileña de la Sociedad Brasileña de Dermatología, anunció el resultado del ensayo de reducción de las bolsas de grasa del párpado inferior con inyección de PPC, confirmando la posibilidad de pérdida de grasa con la inyección de PPC. Desde entonces, se han publicado resultados de ensayos con respecto a la seguridad a pequeña escala y la seguridad de la inyección de PPC en grasa depositada en el abdomen, costado, muslo, submentoniana, espalda, brazo, pierna y lipoma.

La inyección de PPC es una composición en la que se mezclan un componente principal de polieno fosfatidilcolina y un agente solubilizante de ácido desoxicólico. La PPC es un fosfolípido esencial y un componente principal de la membrana biológica, y está compuesta por una estructura de cola hidrófoba en la que cinco ácidos grasos están unidos a la cabeza hidrófila de fósforo y colina en la cadena principal de carbonos de glicerol. Constituye el 55% de la membrana celular y red mitocondrial del cuerpo humano. Dado que apenas se sintetiza en el cuerpo humano, es un ingrediente esencial para ser suministrado desde el exterior del cuerpo. Está contenido en gran cantidad en la soja, huevo y similares. Y puede extraerse por métodos físicos o químicos usando ácido nucleico y purificarse con una alta pureza.

El ácido desoxicólico (DCA) es una de las sales biliares secundarias, un subproducto metabólico de las enterobacterias y se mezcla como un agente solubilizante para convertir una PPC poco soluble en una composición inyectable estable. La PPC solubilizada con el DCA se dispersa de manera estable como un sistema de micelas mixtas de menos de 10 nm. Si se inyecta sin solubilizar la PPC, no se disolverá en una molécula individual y no se obtendrá la concentración sanguínea deseada. Además, los vasos sanguíneos pueden obstruirse y puede ocurrir trombosis, por lo que la PPC no solubilizada no se usa como inyecciones. Si el fármaco no está solubilizado durante la inyección intravenosa y forma un precipitado suspendido, las partículas grandes bloquearán los vasos sanguíneos, afectarán al flujo sanguíneo de los tejidos circundantes cerca de los vasos sanguíneos bloqueados o dañarán o estimularán el tejido, produciendo prurito, dolor, convulsiones, y similares. En casos graves, puede ocurrir una embolización.

La PPC se ha considerado como un ingrediente activo de reducción de grasa basado en el hecho de que Lipostabil® N iv, una composición que comprende PPC como componente principal y DCA como agente solubilizante, se prescribe para el tratamiento de la embolia grasa, en la que tejido adiposo fluye hacia la vena causando embolia. Pero, se confirmó que el DCA mezclado como agente solubilizante en las inyecciones de PPC produce necrosis debido al efecto detergente, produciendo una disminución de los adipocitos. Así, se ha encontrado que el ingrediente activo que reduce los lípidos de las inyecciones de PPC es el DCA (Documento no de patente 1). Basándose en esto, en 2015, la FDA aprobó una inyección única de DCA, que no contiene PPC, desarrollada por Kythera Biopharmaceuticals INC, una empresa privada ubicada en los EE. UU., como un agente citolítico para mejorar la apariencia mediante la reducción de la grasa submentoniana.

Sin embargo, dado que las inyecciones de DCA solo o las inyecciones de PPC solubilizada con DCA lisan no solo los adipocitos (adipocitos 3T3L1) sino también los fibroblastos normales, células endoteliales y células del músculo esquelético de forma no selectiva, son inyecciones de lisis celular más que inyecciones de degradación de la grasa. (Documento no de patente 2).

Clínicamente, se informa que la composición, en la que están mezclados PPC y DCA, causa dolor (78,4%), hematoma (83,8%), eritema (100%), sensación de ardor (100%), edema (100%) e induración (66,7%), y se informa que la composición simple de DCA causa dolor (100%), hematoma (91,9%), eritema (100%), sensación de ardor (100%), hinchazón (100%) e induración (89,2%) (Documento no de patente 3). Además, el resultado de un ensayo clínico a gran escala de la composición simple de DCA mostró que causaba dolor (73,6%), hematoma (72,9%), edema (67,8%), anestesia (65,5%), eritema (35,3%), hinchazón (29,1%), induración (28,3%), prurito (16,3%) y nódulo (14,3%) (Documento no de patente 4). Estos casos perjudiciales son producidos por el mecanismo de acción en el que el DCA inyectado por vía subcutánea bloquea el suministro de oxígeno a las células, provocando una expansión celular inmediata y vesículas y daño a la membrana celular, produciendo necrosis de las células debido a una reacción inflamatoria rápida (Documento no de patente 5).

Cuando las células mueren in vivo, hay notables diferencias en que sea por necrosis y apoptosis. La apoptosis se refiere a la muerte activa en la que la expresión y la actividad de varios genes y proteínas están reguladas por una señal programada dentro de las células, y los apoptosomas generados a través del proceso son eliminados por fagocitosis de las células o macrófagos circundantes, y similares, de modo que no causan inflamación. Por otro lado, la necrosis es una muerte pasiva que ocurre repentinamente debido a cambios en el entorno externo, lo que conduce a la aglomeración irregular de cromosomas y la inflamación del citoplasma. Finalmente, se forman desechos celulares a través de la degradación de las células y se sabe que causan inflamación (Earnshaw, WC, Curr. Opin. Cell Biol., 7, págs. 337-343, 1995).

Por lo tanto, cuando la inyección de reducción de grasa localizada actúa como un factor de necrosis celular, la acción inflamatoria afecta al área circundante distinta del sitio objetivo en el que se administra el fármaco, por lo que también afecta a las células que están funcionando normalmente y por lo tanto son eliminadas. Para resumir estos hechos, es importante inducir de manera selectiva y altamente eficiente la lipólisis y apoptosis de adipocitos sin los efectos secundarios de las inyecciones de corrección de la apariencia ya aprobadas, tales como dolor, hinchazón, anestesia, hinchazón extensa, eritema, induración, parestesia, nódulo, prurito, sensación de ardor y necrosis de células musculares, fibroblastos y células endoteliales vasculares distintas de los adipocitos. Sin embargo, hasta la fecha no se han desarrollado estudios y formulaciones desde este punto de vista (Documento no de patente 6).

Hasta la fecha ha habido un tratamiento fuera de indicación con Lipostabil® N i.v., Essentiale® N i.v., una formulación inyectable de la composición en la que se mezclan PPC y DCA, para la reducción de grasa localizada, y Kybella (composición simple de DCA) no solo se ha investigado mucho sobre la reducción de grasa, sino que Kybella también es el primero en el mundo en recibir la aprobación de la FDA como un fármaco citolítico para mejorar la apariencia. Pero el estado de la técnica y las composiciones tienen ciertas limitaciones. Aquellos que quieren perder grasa con un tratamiento no quirúrgico se quejan de incomodidad y ansiedad, debido a los efectos secundarios causados por la composición de PPC DCA o la composición simple de DCA, tales como dolor, hinchazón, anestesia, hinchazón extensa, eritema, induración, parestesia, nódulo, prurito, sensación de ardor y necrosis de células musculares, fibroblastos y células endoteliales vasculares distintas de los adipocitos. Por estos motivos, aunque en la actualidad se ha comprobado la eficacia clínica, el cumplimiento de la medicación es bajo. Por lo tanto, en comparación con las inyecciones citolíticas actualmente disponibles, se requiere desarrollar inyecciones que no provoquen dolor e hinchazón debido a la inflamación y que disminuyan la grasa sin efectos secundarios al inducir selectivamente la apoptosis y la degradación de los adipocitos. La presente invención cumple estos requisitos.

Basándose en los hechos anteriores, los autores de la presente invención investigaron el efecto de reducción de grasa de la PPC y comunicaron los resultados del ensayo en el que la composición de PPC sola sin DCA reducía solo adipocitos por apoptosis, no por necrosis, sin afectar a los fibroblastos (Documento no de patente 7). Desde entonces, los autores de la presente invención han completado la presente invención estudiando una composición para la reducción selectiva de células grasas basada en PPC como ingrediente activo sin dolor, edema ni efectos secundarios.

(Documento no de patente 1) Rotunda AM, Suzuki H, Moy RL, Kolodney M., Detergent effects of sodium deoxycholate are a major feature of an injectable phosphatidylcholine formulation used for localized fat dissolution. Dermatol Surg 30(7):1001-8(2004)

(Documento no de patente 2) A. Gupta, Action and comparative efficacy of phosphatidylcholine formulation and isolated sodium deoxycholate for different cell type, Aest Plast Sur, 33:346-352, 2009

(Documento no de patente 3) Giovanni Salti, Phosphatidylcholine and sodum deoxycholate in the treatment of localized fat: A doube-blind, randomized study, Dermatol Surg 34:60-66, 2007

(Documento no de patente 4) Humphrey et al, ATX-101 for reduction of submental fat: A Phase III randomized controlled trial, J AM ACAD DERMATOL Vol75, No.4, 788-797, 2016

(Documento no de patente 5) Duncan, Injectable therapies for localized fat loss: state of the art, Clin Plastic Surg, 1-13, 2011

(Documento no de patente 6) Duncan, Refinement of Technique in injection lipolysis based on scientific studies and clinical evaluation, Clin Plastic Surg 36195-209 (2009)

(Documento no de patente 7) Dong-Seok Kim, Phosphatidylcholine induces apoptosis of 3T3-L1 adipocytes, Journal of biomedical science,18:91,1-7, 2011

Descripción detallada de la invención

Problema técnico

Cualquier referencia a un método de tratamiento en la solicitud debe considerarse como una referencia a una composición para usar en dicho método.

Con el fin de resolver los problemas de efectos secundarios de la inyección simple de DCA convencional o la inyección de PPC solubilizada con DCA, tales como dolor, edema y diversos efectos secundarios causados por la lisis celular no selectiva, especialmente, efectos secundarios clínicos graves causada por la necrosis de las células musculares, fibroblastos y células endoteliales vasculares distintas de los adipocitos, los autores de la presente invención llevaron a cabo un ensayo para preparar una composición inyectable segura y estable para la reducción de grasa localizada que reduce la grasa sin dolor ni edema por el mecanismo de inducir apoptosis y lipólisis en los adipocitos, y reduce selectivamente los adipocitos sin dañar los fibroblastos, las células endoteliales vasculares y las células del músculo esquelético. Como resultado, los autores de la invención han completado la presente invención después de confirmar los hechos de que la composición de la presente invención preparada añadiendo ácido taurocólico (TCA), particularmente ácido glicocólico (GCA) a la fosfatidilcolina (PPC) en una relación específica, es segura y tiene excelente estabilidad de la formulación, y no inducen necrosis celular, sino que induce la apoptosis y degradación únicamente de los adipocitos de forma selectiva.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es proporcionar una composición para reducir la grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos (edema; anestesia del sitio de administración; hinchazón extensa; eritema; induración; parestesia; nódulo; prurito; sensación de ardor; lesión nerviosa; disfagia y necrosis de células musculares, fibroblastos y células endoteliales vasculares distintas de los adipocitos), consistiendo la composición esencialmente en (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo, en donde una relación molar de (ii) a (i) en la composición está en un intervalo de 0,7 a 3,0.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una preparación para eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto, consistiendo la preparación esencialmente en (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo, en donde una relación molar de (ii) a (i) en la preparación está en un intervalo de 0,7 a 3,0.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un kit que comprende: (I) un primer envase que comprende una composición o preparación para eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, comprendiendo la composición o preparación: (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo, en donde una relación molar de (ii) a (i) en la composición o preparación está en un intervalo de 0,7 a 3,0; y (II) un dispositivo de administración capaz de administrar la composición o preparación en un sitio de depósito de grasa.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un kit que comprende: (I) un primer envase que comprende una composición o preparación para eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, comprendiendo la composición o preparación: (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo, en donde al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo está contenido con el mismo peso que la fosfatidilcolina o menos; y (II) un dispositivo de administración capaz de administrar la composición o preparación en un sitio de depósito de grasa.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un método para preparar una composición inyectable para reducir la grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos (edema; anestesia del sitio de administración; hinchazón extensa; eritema; induración; parestesia; nódulo; prurito; sensación de ardor; lesión nerviosa; disfagia; y necrosis de células musculares, fibroblastos y células endoteliales vasculares distintas de los adipocitos), comprendiendo el método las etapas de: (a) añadir al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y sal del mismo en agua para inyección, seguido de disolución mientras se agita para obtener una mezcla transparente; (b) añadir un conservante, seguido de agitación; (c) añadir fosfatidilcolina, seguido de agitación a temperatura ambiente; y (d) ajustar un volumen total de la composición con agua, seguido de agitación, en donde una relación molar de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo a la fosfatidilcolina está en un intervalo de 0,7 a 3,0.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un método para preparar una composición farmacéutica para eliminar de manera no quirúrgica el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, comprendiendo el método añadir fosfatidilcolina, y al menos uno seleccionada del grupo que consiste en de ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo,

en donde el al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo se añade con el mismo peso que la fosfatidilcolina o menos.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un método para eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de fosfatidilcolina; y al menos un agente solubilizante de fosfatidilcolina seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo, a un sujeto que tiene un depósito de grasa localizado.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un método para eliminar de forma no quirúrgica el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto que tiene depósito de grasa localizada, comprendiendo el método administrar una preparación que comprende (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un método para eliminar de forma no quirúrgica el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto, comprendiendo el método administrar una preparación que comprende (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo, al sujeto que tiene un depósito de grasa localizada, en donde una relación molar de (ii) a (i) en la preparación está en un intervalo de 0,7 a 3,0.

En una realización, la preparación comprende fosfatidilcolina en una concentración de 1,0% a aproximadamente 15,0% como una concentración de lisis de grasa.

En una realización, la preparación es una preparación inyectable. En otra realización, la preparación es una preparación inyectable para la reducción de adipocitos.

La presente invención también proporciona un método para la reducción no quirúrgica en un sujeto que tiene depósito de grasa localizada.

En una realización, el método comprende administrar una preparación que comprende al menos una composición de fosfatidilcolina que se solubiliza con ácido glicocólico o ácido aurocólico en una preparación farmacéuticamente aceptable que tiene un pH de pH 6,0 a pH 9,0.

En una realización, el procedimiento de administración comprende una inyección subcutánea.

En una realización, el depósito de grasa localizada se selecciona del grupo que consiste en hernia de grasa del párpado inferior, lipomas, lipodistrofia y depósitos de grasa asociados con la celulitis.

En una realización, el depósito de grasa se localiza debajo de los ojos, submentoniano (debajo del mentón), debajo de los brazos, en las nalgas, pantorrillas, espalda, muslos, tobillos o estómago en el sujeto.

La presente invención también proporciona un kit que comprende instrucciones escritas para usar la preparación que comprende al menos una composición de fosfatidilcolina solubilizada con ácido glicocólico o ácido taurocólico, para eliminar de manera no quirúrgica el depósito de grasa localizada en el sujeto.

Solución técnica

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición para reducir la grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos (edema; anestesia del sitio de administración; hinchazón extensa; eritema; induración; parestesia; nódulo; prurito; sensación de ardor; lesión nerviosa; disfagia; y necrosis de células musculares, fibroblastos y células endoteliales vasculares distintas de los adipocitos), comprendiendo la composición: (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo, en donde una relación molar de (ii) a (i) en la composición está en un intervalo de 0,7 a 3,0

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una preparación para eliminar depósitos de grasa localizados con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto, comprendiendo la preparación: (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo, en donde una relación molar de (ii) a (i) en la preparación está en un intervalo de 0,7 a 3,0.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un kit que comprende: (I) un primer envase que comprende una composición o preparación para eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, comprendiendo la composición o preparación: (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo, en donde una relación molar de (ii) a (i) en la composición o preparación está en un intervalo de 0,7 a 3,0; y (II) un dispositivo de administración capaz de administrar la composición o preparación en un sitio de depósito de grasa.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un kit que comprende: (I) un primer envase que comprende una composición o preparación para eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, comprendiendo la composición o preparación: (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo, en donde al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo está contenido con el mismo peso que la fosfatidilcolina o menos; y (II) un dispositivo de administración capaz de administrar la composición o preparación en un sitio de depósito de grasa.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar una composición inyectable para reducir la grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos (edema; anestesia del sitio de administración; hinchazón extensa; eritema; induración; parestesia; nódulo; prurito; sensación de ardor; lesión nerviosa; disfagia; y necrosis de células musculares, fibroblastos y células endoteliales vasculares distintas de los adipocitos), comprendiendo el método las etapas de: (a) añadir al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo en agua para inyección, seguido de disolución mientras se agita para obtener una mezcla transparente; (b) añadir un conservante, seguido de agitación; (c) añadir fosfatidilcolina, seguido de agitación a temperatura ambiente; y (d) ajustar un volumen total de la composición con agua, seguido de agitación, en donde una relación molar del al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo a la fosfatidilcolina está en un intervalo de 0,7 a 3,0.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar una composición farmacéutica para eliminar de manera no quirúrgica el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, comprendiendo el método añadir fosfatidilcolina, y al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo, en donde el al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo se añade con el mismo peso que la fosfatidilcolina o menos.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de fosfatidilcolina; y al menos un agente solubilizante de fosfatidilcolina seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo, a un sujeto que tiene un depósito de grasa localizada.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para eliminar de forma no quirúrgica el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto que tiene un depósito de grasa localizada, comprendiendo el método administrar una preparación que comprende (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para eliminar de manera no quirúrgica el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto, comprendiendo el método administrar una preparación que consiste esencialmente en (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo, al sujeto que tiene el depósito de grasa localizada, en donde una relación molar de (ii) a (i) en la preparación está en un intervalo de 0,7 a 3,0.

Términos

El término "fosfatidilcolina" en la presente invención se refiere a un compuesto de nombre IUPAC 1,2-diacil-snglicero-3-fosfocolina como un fosfolípido y se describe en esta memoria descriptiva como PPC.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un exerto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, se describen los métodos y materiales preferidos.

Tal como se usa en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tiene el significado que se le asocia al mismo en esta sección.

Los artículos "un" y "una" se utilizan en el presente documento para indicar uno o más (es decir, al menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. Por ejemplo, "un elemento" se refiere a uno o más elementos.

Cuando se hace referencia a valores medibles tales como cantidad, duración de tiempo, etc., el término "aproximadamente" se refiere a que comprende una variación de ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1% o ± 0,1% del valor especificado, porque tal variación es adecuada para realizar el método especificado.

La enfermedad o trastorno se "alivia" si se reduce la gravedad de los síntomas de la enfermedad o trastorno, la frecuencia de tales síntomas experimentados por el paciente, o ambos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido biliar" incluye ácidos esterαdicos (y/o sus aniones de ácido carboxílico) y sales de los mismos, y se encuentra en la bilis de un animal (por ejemplo, ser humano). "Ácido desoxicólico" es un tipo de sal biliar y se refiere a un compuesto con nombre IUPAC ácido (4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-dihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentanoico y se describe en esta memoria descriptiva como DCA.

El "ácido glicocólico" es un tipo de sal biliar y se refiere a un compuesto con nombre IUPAC ácido 2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-trihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentanoil]amino]acético y se describe en esta memoria descriptiva como GCA.

El "ácido taurocólico" es un tipo de sal biliar y se refiere a un compuesto con nombre IUPAC ácido 2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-trihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentanoil]amino]etanosulfónico y se describe en esta memoria descriptiva como TCA.

El "ácido cólico" es un tipo de sal biliar y se refiere a un compuesto con nombre IUPAC ácido (4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-trihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahidro-1 H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentanoico y se describe en esta memoria descriptiva como CA.

El "ácido quenodesoxicólico" es un tipo de sal biliar y se refiere a un compuesto con nombre IUPAC ácido ((4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-dihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentanoico y se describe en esta memoria descriptiva como CDCA.

El "ácido ursodesoxicólico" es un tipo de sal biliar y se refiere a un compuesto con nombre IUPAC ácido (4R)-4-[(3R,5S,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-dihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentanoico y se describe en esta memoria descriptiva como UDCA.

El "ácido glicodesoxicólico" es un tipo de sal biliar y se refiere a un compuesto con nombre IUPAC ácido 2-[[(4R)-4-[(3R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-dihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentanoil]amino]acético y se describe en esta memoria descriptiva como GDCA.

El "ácido taurodesoxicólico" es un tipo de sal biliar y se refiere a un compuesto con nombre IUPAC ácido 2-[[(4R)-4-[(3R,5R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-dihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentanoil]amino]etanosulfónico y se describe en esta memoria descriptiva como TDCA.

El "ácido hiodesoxicólico" es un tipo de sal biliar, y se refiere a un compuesto con nombre IUPAC ácido (4R)-4-[(3R,5R,6S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-3,6-dihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,6,7,8,9,U12,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentanoico y se describe en esta memoria descriptiva como HDCA.

El "ácido litocólico" es un tipo de sal biliar y se refiere a un compuesto con nombre IUPAC ácido (4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3-hidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentanoico y se describe en esta memoria descriptiva como LCA.

El "ácido tauroursodesoxicólico" es un tipo de sal biliar y se refiere a un compuesto con nombre IUPAC ácido 2-[(4R)-4-[(3R,5S,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-dihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentanoil]amino]etanosulfónico y se describe en esta memoria descriptiva como TUDCA.

El "ácido deshidrocólico" es un tipo de sal biliar y se refiere a un compuesto con nombre IUPAC ácido (4R)-4-[(5S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-dimetil-3,7,12-trioxo-1,2,4,5,6,8,9,11,14,15,16,17-dodecahidrociclopenta[a]fenantren-17-il]pentanoico y se describe en esta memoria descriptiva como DHCA.

Los términos "paciente", "sujeto", "individuo" y similares se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier animal, o una célula del mismo (tal como in vitro o in situ), que es capaz de completar los métodos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones no limitantes, el paciente, sujeto o individuo es un ser humano.

El término "composición" o "composición farmacéutica", tal como se usa en el presente documento, puede referirse a una mezcla de al menos un compuesto o composiciones utilizadas en la presente invención y otros componentes químicos, tales como cualquier vehículo, estabilizante, agente de suspensión, agente de dispersión, agente de suspensión, agente espesantes, y/o excipientes adicionales y similares. La composición farmacéutica propicia la administración del compuesto a un organismo.

Las expresiones "cantidad eficaz", "cantidad farmacéuticamente eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a la cantidad no tóxica y suficiente capaz de proporcionar los resultados biológicos deseados. El resultado puede ser una reducción y/o alivio del signo, síntoma o causa de la enfermedad, o cualquier otra alteración deseada del sistema biológico. La cantidad terapéutica apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto en la técnica usando un ensayo de rutina.

El término "eficacia", como se usa en el presente documento, puede referirse al efecto máximo (Emáx) logrado dentro del ensayo.

Como se usa en el presente documento, "material instructivo" comprende una publicación, una grabación, un diagrama o cualquier otro medio de representación que pueda usarse para transmitir la utilidad del compuesto, composición, vector o sistema de administración de la presente invención en el kit para aliviar las diversas enfermedades o trastornos a los que se hace referencia en el presente documento. De manera selectiva o alternativa, el material instructivo puede describir al menos un método para aliviar una enfermedad o trastorno en una célula o tejido de un mamífero. El material instructivo del kit de la presente invención puede adjuntarse a un envase que comprende el compuesto identificado, composición, vector o sistema de administración de la presente invención, por ejemplo, o puede enviarse con un envase que contiene un compuesto, composición, vector o sistema de administración.

Alternativamente, el material instructivo se puede enviar por separado del envase, con la intención de que el receptor use la sustancia y el compuesto (composición) conjuntamente.

La expresión "administración local" se refiere a la administración del ingrediente farmacéutico en el músculo o sitio subdérmico, o sus alrededores, del paciente por medio de vías no sistémicas. Por lo tanto, la administración local excluye la administración por vías sistémicas tales como la administración intravenosa u oral.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas propiedades y/o sustancias que son aceptables para el paciente desde un punto de vista farmacológico/toxicológico y para el químico farmacéutico fabricante desde un punto de vista físico/químico con respecto a la composición, formulación, estabilidad, aceptación del paciente y biodisponibilidad. "Vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un medio que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del(de los) ingrediente(s) activo(s) y no es tóxico para el hospedante al que se administra.

Un tratamiento "terapéutico" es un tratamiento administrado a un sujeto que presenta signos o síntomas de patología, con el fin de disminuir o eliminar esos signos o síntomas.

Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" o "tratar" se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico, es decir, un compuesto de la invención (solo o en combinación con otro agente farmacéutico), a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido aislado o línea celular de un paciente (p. ej., para diagnóstico o aplicaciones ex vivo), que tiene una afección contemplada en el presente documento, un síntoma de una afección contemplada en el presente documento o el potencial de desarrollar una afección contemplada en el presente documento, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, superar o afectar a una afección contemplada en el presente documento, los síntomas de una afección contemplada en el presente documento o el potencial de desarrollar una afección contemplada en el presente documento. Dichos tratamientos pueden adaptarse o modificarse específicamente, en función del conocimiento obtenido en el campo de la farmacología.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad de un compuesto de la invención que, cuando se administra a un paciente, mejora un síntoma de la enfermedad. La cantidad de un compuesto de la invención que constituye una "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo del compuesto, el estado de la enfermedad y su gravedad, la edad del paciente a tratar y similares. La cantidad terapéuticamente eficaz puede ser determinada de forma rutinaria por un experto en la técnica teniendo en cuenta su propio conocimiento y esta descripción.

Intervalos: a lo largo de esta descripción, se pueden presentar varios aspectos de la invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe considerarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, la descripción de un intervalo debe considerarse como que tiene todas los subintervalos posibles específicamente descritos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 debe considerarse que ha descrito específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

El término "%" utilizado en la presente invención para expresar el contenido de la composición significa el contenido de % en p/v a menos que se indique lo contrario, y significa el valor de % en p/v basado en la composición total a menos que se indique lo contrario.

En la presente invención, el símbolo T en la descripción de "al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico o ácido taurocólico y la sal del mismo/fosfatidilcolina" es una representación fraccionaria de una forma comúnmente utilizada.

En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle.

La FDA aprobó Kybella (DCA al 1,0%), un agente citolítico para mejorar la apariencia, y la composición inyectable de PPC tratada fuera de indicación (p. ej., Lipostabil, Essential, Lipobean) solubilizada con DCA, va acompañada de dolor y edema debido a reacción inflamatoria cuando aquellas se administran con el fin de reducir la grasa localizada. Además, estos son agentes citolíticos no selectivos que producen necrosis de fibroblastos, células del músculo esquelético, células endoteliales vasculares y adipocitos, y se han comunicado efectos secundarios mortales tales como necrosis en el sitio de administración, úlceras y parálisis mandibular y daño nervioso. Por esta razón, se ha advertido que no se inyecten los fármacos en las glándulas salivales, ganglios linfáticos, músculo o zonas muy próximas a estos, para evitar posibles daños en tejidos distintos de la grasa. Además, los sujetos que actualmente reciben Kybella continúan comunicando efectos secundarios tales como dolor, hinchazón, parálisis facial y necrosis de la piel.

En este sentido, los autores de la presente invención encontraron que la composición simple de PPC (5,0%) sin agente solubilizante tenía el efecto de reducción de adipocitos in vitro equivalente a Kybella (DCA al 1,0%), pero la PPC inducía selectivamente la reducción de adipocitos por el mecanismo de apoptosis y degradación, y se confirmó la posibilidad de desarrollar una composición para la reducción de grasa sin dolor, edema y efectos secundarios. Sin embargo, la PPC tiene una limitación en la producción de una composición que sea física o químicamente estable e inyectable de forma segura, porque tiene poca solubilidad. Basándose en estos antecedentes, los autores de la presente invención han estudiado una composición de agente reductor de adipocitos que contiene PPC como componente principal desde 2010. Como resultado, la PPC dispersa en el homogeneizador de alta presión mostró un efecto de reducción de adipocitos dependiente del tiempo y la concentración, pero era limitado en el uso industrial debido a la baja estabilidad.

Por esta razón, los autores de la presente invención llevaron a cabo ensayos de formulación de una manera física y química para preparar composiciones que pueden inyectar por vía subcutánea de manera segura y estable la PPC poco soluble (FIGS. 1 a 3). Este estudio se basa en la suposición de que la toxicidad puede expresarse específicamente por la actividad superficial del ácido biliar (sal). Dado que la función de actividad superficial inhibe la apoptosis y el efecto de degradación de los adipocitos inherentes a la PPC e induce la lisis celular por función de necrosis, produce la reducción de grasa localizada acompañada de dolor, edema y efectos secundarios. Por tanto, los tipos específicos de tensioactivo y su capacidad de uso (relación) producen importantes dificultades técnicas a los expertos en la técnica.

Los resultados proporcionados a continuación en los diversos ejemplos comparativos, ejemplos y ejemplos experimentales demuestran los efectos específicos inesperados de las composiciones de la presente invención. Brevemente, los autores de la presente invención seleccionaron una combinación de ácidos biliares (sal) que se encontró que no tenían ninguna reacción adversa in situ o tenían una reacción adversa leve en la evaluación de edema, lesión e inflamación in vivo entre las composiciones seleccionadas que se confirma que son aplicables industrialmente y seguras como resultado del ensayo de formulación. Entre los ácidos biliares seleccionados (sales), se seleccionaron el GCA y TCA por la selectividad de adipocitos en la evaluación de la viabilidad de adipocitos, fibroblastos, células endoteliales y células del músculo esquelético in vitro, y luego, se verificó el efecto sobre la apoptosis de adipocitos y la degradación de las composiciones de PPC solubilizadas con GCA o TCA. Además, se confirmó que la composición compleja de PPC solubilizada con GCA de la presente invención no tiene toxicidad no solo sistémica sino tampoco local. Los resultados de los ensayos clínicos de los investigadores con la presente invención demuestran el descubrimiento inesperado de que la eficacia de la composición en la reducción de grasa no es inferior a la de Kybella y que la composición no produce dolor, edema ni efectos secundarios o se reducen en 80% o más. Esto se describirá con más detalle a continuación.

Como resultado del ensayo con las sales biliares (ácido cólico (CA), ácido desoxicólico (DCA), ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA), ácido quenodesoxicólico (CDCA), ácido ursodesoxicólico (UDCA), ácido glicodesoxicólico (GDCA), ácido taurodesoxicólico (TDCA), ácido hiodesoxicólico (HDCA), ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA), ácido litocólico (LCA) y ácido deshidrocólico (DHCA) elegidos como agente solubilizante para la PPC, se confirmó que el LCA y DHCa no podían solubilizar la PPC (FIGS. 3A y 3B) y que el CA, DCA, GCA, TCA, CDCA, UDCA, GDCA, TDCA, HDCA y TUDCA solubilizan establemente la PPC en una relación molar específica o mayor (FIGS. 2A a 2J).

Se realizaron ensayos in vivo sobre inflamación, edema y lesiones con CA, DCA, GCA, TCA, CDCA, UDCA, GDCA, TDCA, HDCa y TUDCA, que son los ácidos biliares seleccionados de la formulación de ensayo. Entre los ácidos biliares, el DCA es el tensioactivo más potente y se describe que produce inflamación, hinchazón y efectos secundarios clínicos causados por la lisis celular no selectiva. Por lo tanto, los autores de la presente invención eran conscientes de que los aditivos que muestran un efecto nocivo como el DCA entre los ácidos biliares no son agentes solubilizantes adecuados porque inhiben la actividad inherente de la PPC sobre la apoptosis y degradación selectivas de los adipocitos. Entonces, primero, se realizaron inyecciones in vivo de ácidos biliares en diferentes concentraciones para investigar el edema, las lesiones cutáneas y la inflamación, que son los ejemplos dañinos representativos.

Como resultado del ensayo de edema in vivo con los ácidos biliares (FIGS. 4A a 4G), a las 2 horas después de la administración se confirmó que:

"Nada" - composición compleja de PPC (2,50-5,0%) solubilizada con GCA (1,25-2,5%) o TCA (1,25-2,5%), "Leve" - composiciones simples de PPC (1,25-10,0%), GCA (1,0%), TCA (1,0%) y TUCA (1,0%, 2,5%) y composiciones complejas de PPC (7,5%, 10,0%)+GCA (3,75%, 5,0%) y PPC (7,5%, 10,0%)+TCA (3,75%, 5,0%),

"Moderado" - composiciones simples de PPC (12,5%, 15,0%), UDCA (1,0%), GDCA (1,0%), CDCA (1,0%), CA (1,0%), GCA (2,5%, 5,0%), TCA (2,5%, 5,0%) y TUDCA (5,0%, 7,5%) y composición compleja de PPC (5,0%)+CA (2,5%), PPC (15,0%)+GCA (7,5%) y PPC (15,0%)+TCA(7,5%),

"Grave" y "extremadamente grave" - Las otras composiciones simples y composiciones complejas.

En comparación con la PPC (5,0%) solubilizada con DCA (2,2%) que muestra edema extremadamente grave, la composición compleja Pp C (2,5 - 15,0%) GCA (1,25 - 7,50%) (FIG. 4N) y la composición compleja PPC (5,0%)+GCA (2,5-7,5%) (FIG. 4P) de la presente invención es una invención sorprendente sin edema. El hallazgo sorprendente es que la extensión del edema observado con la inyección de GCA o TCA solos disminuye drásticamente en las composiciones complejas de PPC GCA y PPC TCA. Sin embargo, la composición de DCA solo o PPC al 5,0% solubilizada con 2,2% mostró un edema extremadamente grave después de la administración, lo que sugiere que el DCA tiene el efecto de inducir necrosis celular e interrumpir la degradación y apoptosis selectiva de adipocitos inherente a la PPC (FIG. 4M).

Como resultado del ensayo de lesiones cutáneas in vivo (FIGS. 5A a 5F), a las 2 horas después de la administración se confirmó que:

"Nada"- composiciones simples de PPC (1,25-15,0%), GCA (1,0%), TCA (1,0%) y TUDCA (1,0-7,5%), y composiciones complejas de PPC (2,5-10,0%)+GCA (1,25-5,0%) y PPC (5,0%)+GCA(2,5-5,0%), "Leve" - composiciones simples de HDCA (1,0%), CA (1,0%), GCA (2,5%, 5,0%) y TCA (2,5%, 5,0%) y composición compleja de PPC (15,0%)+GCA (7,5%),

"Moderada" - composiciones simples de DCA (1,0%), UDCA (1,0%), TDCA (1,0%), GDCA (1,0%), CDCA (1,0%), CA (2,5%), GCA (7,5%) y TCA (7,5%),

Estos resultados eran consistentes con el resultado del ensayo de edema y se confirmó que la inyección subcutánea de la composición compleja de PPC GCA o PPC TCA aliviaba los síntomas de la lesión en comparación con la composición simple de GCA o TCA.

Como resultado del ensayo de inflamación de HyE in vivo (FIGS. 6A a 6F), se confirmó que:

"Nada" - composiciones simples de PPC (2,5-7,5%), TUDCA (1,0-5,0%) y composiciones complejas de PPC (2,5-7,5%)+GCA (1,25-3,75%), PPC (5,0%)+GCA (2,5-7,5%), PPC (5,0%)+TCA (2,5%) y PPC (5,0%)+TUDCA (4,0%),

"Leve" - composiciones simples de PPC (10,0%, 12,5%), GCA (1,0%), TCA (1,0%) y TUDCA (7,5%) y composiciones complejas de PPC (10,0%)+GCA (5,0%), PpC (5,0%)+G^cA (10,0%),

"Moderada" - composiciones simples de PPC (15,0%), TDCA (1,0%), GDCA (1,0%), CDCA (1,0%), CA (1,0%) y GCA (2,5% y más) y TCA (2,5% y más), y composiciones complejas de Pp C(15,0%)+GCA(7,5%) y PPC(5,0%)+CA(2,5%),

Estos resultados eran consistentes con el resultado del ensayo de edema y lesión que demuestran que la toxicidad de la inyección de solo GCA o TCA no es tóxica ni se alivia cuando forma complejo con PPC, pero el DCA o sus ácidos biliares equivalentes producen dolor, edema y efectos secundarios producidos por necrosis que interrumpe la actividad inherente de la PPC de apoptosis y degradación.

Como resultado del ensayo de viabilidad de adipocitos in vitro en las composiciones de PPC solubilizadas con los agentes solubilizantes TUDCA, TCA y GCA seleccionados basándose en el ensayo de formulaciones anterior, y los resultados de los ensayos in vivo de edema, inflamación y lesión cutánea de los ácidos biliares, el grupo de composición simple de PPC, el grupo de PPC solubilizada con GCA o TCA mostró una viabilidad reducida de los adipocitos de manera dependiente del tiempo y la concentración (FIGS. 7A a 7D). Hubo un hallazgo inusual de que el TUDCA inhibe la apoptosis y la degradación de los adipocitos. En este sentido, se han publicado los resultados del estudio sobre la inhibición de la apoptosis celular de TUDCA (Andrew L.Rivard, Administraron of Tauroursodeoxycholic acid reduced apoptosis following myocardial infarction in rat, The American Journal of Chínese Medicine, Vol. 35, No. 2, 279 -295, 2007), que sugieren que la PPC actúa de manera diferente en la necrosis celular y la apoptosis.

La PPC al 5,0% sola, PPC al 5,0% GCA al 2,5% y PPC al 15,0% TCA al 7,5% mostraron actividades similares de reducción de adipocitos en el tiempo de 96 horas con DCA al 1,0%. Es decir, el grupo de PPC al 5,0% sola y PPC al 5,0% GCA al 2,5% mostró la misma viabilidad de adipocitos que Kybella (D^cA al 1,0%), que es un agente citolítico aprobado por la FDA para mejorar la apariencia, y no hubo diferencia estadísticamente significativa en el efecto de reducción de adipocitos en estos grupos experimentales (FIG.

7E). Considerados en conjunto, es importante seleccionar el agente solubilizante, el cual se selecciona para preparar PPC como una composición inyectable para reducir grasa localizada, de los ácidos biliares que son de baja toxicidad, de modo que no tengan actividad de interrupción en la apoptosis y degradación selectivas de adipocitos inherente a la PPC, con necrosis (o esta toxicidad puede ser contrarrestada por la PPC) y pueda proporcionar seguridad de la composición y estabilidad de la formulación. Es decir, se encontró sorprendentemente que debe seleccionarse un agente solubilizante sin actividad de transformación negativa (PPC DCA) o inhibición (PPC TUDCA), tal como necrosis, en el efecto de reducción de grasa inherente a la PPC.

Como resultado del ensayo de viabilidad de adipocitos in vitro de la composición simple de GCA en la relación molar mezclada para solubilizar la PPC, el GCA mostró una viabilidad de adipocitos reducida de manera dependiente del tiempo y la concentración. Y no hubo diferencia estadísticamente significativa en la viabilidad de los adipocitos entre la composición simple de PPC y la composición de PPC solubilizada con GCA (FIGS.

7F a 7H). Es decir, el efecto apoptótico de adipocitos de la composición simple de PPC y la composición de PPC solubilizada con GCA fue equivalente. Para examinar el efecto del GCA en la reducción de adipocitos en la composición de la presente invención, se observó el efecto reductor de adipocitos de la PPC con una adición creciente de GCA. Como resultado del ensayo de viabilidad de los adipocitos a las 96 horas después de la composición compleja de PPC (5,0%) solubilizada con GCA (2,5 - 8,75%) y la composición simple de PPC (5,0%), el efecto de la composición compleja de PPC (5,0%) solubilizada con g Ca (2,5 - 7,5%) no fue estadísticamente significativo en comparación con la composición simple de PPC (5,0%). Es decir, los grupos eran equivalentes en el efecto apoptótico de los adipocitos. Sin embargo, el grupo tratado con PPC (5,0%) solubilizada con GCA (8,75%) mostró una diferencia estadísticamente significativa en el efecto apoptótico de los adipocitos (Figura 7I). Estos resultados sugieren que el rendimiento positivo inherente a la PPC puede estar afectado negativamente cuando la relación molar de G^cA/PPC es de 3,04 mol/mol (PPC al 5,0% G^cA 8,75%) o más.

Según el informe anterior, se ha informado que la composición de DCA o PPC solubilizada con DCA produce efectos secundarios clínicamente mortales al lisar no solo adipocitos, sino también fibroblastos, células del músculo esquelético y células endoteliales vasculares. Como resultado de la observación de la viabilidad celular con la composición simple de PPC y la composición compleja de PPC solubilizada con GCA, se encontró sorprendentemente que PPC GCA reduce selectivamente los adipocitos, de manera diferente a PPC DCA (FIGS. 8A a 8D). La composición de la presente invención es una composición de reducción selectiva de adipocitos que produce la reducción de grasa de manera segura sin efectos secundarios mortales tales como necrosis cutánea, parálisis del nervio mandibular, disfagia, los cuales son causados por el agente citolítico comercialmente disponible Lipostabil® N, iv (PPC DCA) y Kybella i.v. (DCA).

Para evaluar si la reducción de adipocitos se debía a necrosis o apoptosis y degradación, se observó el efecto en la apoptosis de adipocitos por medio de la actividad de caspasa 3 y el efecto en la lipólisis de adipocitos a través de la liberación de glicerol.

La composición simple de PPC y la composición compleja de PPC GCA mostraron un efecto dependiente del tiempo de inducción de la actividad de caspasa-3 a un nivel considerable. Sin embargo, la composición compleja de PPC DCA inhibió la actividad de la caspasa-3 en comparación con PPC o PPC GCA. Es interesante que el DCA al 1,0% mostró cierta actividad de caspasa-3 hasta 24 horas, pero después de 48 horas la actividad de caspasa-3 volvió a los niveles previos al tratamiento. Se considera que este fenómeno se debe a que la acción contra la apoptosis celular se observa parcialmente hasta 24 horas inmediatamente después del tratamiento con la composición simple de DCA, y luego la acción se dirige a la vía de la necrosis celular por la reacción inflamatoria (FIGS. 10A y 10B).

A las 24 horas después del tratamiento, los materiales de ensayo excepto el DCA al 1,0% y PPC al 5,0% GCA al 5,0%, indujeron la secreción de glicerol de manera similar. A las 48 horas después del tratamiento, los grupos de PPC solo, PPC DCA, DCA solo y GCA solo mostraron una actividad citolítica ligeramente mayor que a las 24 horas. En particular, el grupo de PPC GCA mostró un efecto apoptótico celular mucho mayor que la composición simple de PPC (FIGS. 10C y 10D).

Como resultado, la composición simple de PPC y la composición compleja de PPC GCA contribuían al efecto específico de reducción de adipocitos debido al mecanismo de apoptosis y lipólisis diferenciado del mecanismo de necrosis de PPC DCA. Con dicho mecanismo, se encontró que cuando la composición de la presente invención se administra a la capa de grasa subcutánea, la grasa se reduce sin dolor, edema ni efectos secundarios.

Basado en el efecto de la reducción de adipocitos in vitro, los ensayos histopatológicas de HyE in vivo se realizaron con una composición simple de PPC (2,5%, 5,0%, 10,0% y 15,0%), PBS (control negativo) e Isuprel (control positivo), DCA al 1,0%, GCA al 2,5% PPC al 5,0%+DCA al 2,2%, PPC al 5,0%+HDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+UDCA al 3,0%, PPC al 5,0%+TDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+GDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+CDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+CA al 2,5%, PPC al 5,0%+TUDCA al 4,0%, PPC al 5,0%+TCA al 2,5% y PPC (2,5-10,0%)+GCA (1,25-5,0%). Como resultado, el tejido adiposo al que se había inyectado la composición simple de DCA o compleja de PPC DCA mostró una inflamación grave en la zona de administración, y la célula se disolvió por necrosis, y se indujo una destrucción notable. La composición simple de DCA mostró un nivel de inflamación grave incluso a pesar de que el DCA estaba contenido en una concentración baja del 1%, y la acción de inducción inflamatoria fue mayor que la de la composición simple de GCA. La composición compleja de PPC GCA mostró que las células grasas se hicieron más pequeñas, se observaron claramente las células apoptóticas y el adipocito se transformó en los adipocitos formados por la fusión de los adipocitos colapsados, el grado de inducción de inflamación fue bajo en todas las concentraciones tratadas y se encontró que las características morfológicas dañan únicamente la membrana del adipocito (FIG. 11A a 11D).

Considerados en conjunto los resultados del ensayo de formulaciones, los resultados del ensayo de edema, inflamación y lesión cutánea in vivo, los resultados del ensayo de viabilidad in vitro de células grasas, células musculares, fibroblastos, células endoteliales y los resultados del ensayo histopatológico de HyE de la almohadilla de grasa in vivo, la composición compleja de PPC solubilizada por GCA de la presente invención tiene una toxicidad local notablemente más baja que la composición compleja de PPC solubilizada por el producto comercializado de composición simple de DCA y de GCA. Para verificar estos resultados de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio (GLP), se realizó un estudio de toxicidad de dosis única en perros beagle calculando la dosis clínica. Como resultado, se confirmó que la composición compleja de la presente invención no era tóxica (FIGS. 12A a 12C).

Con el fin de evaluar el grado de dolor in vivo, se midieron la distancia y la velocidad de movimiento de los ratones después de la administración de cada composición experimental. Excepto para la preparación simple de PPC y las preparaciones de GCA PPC, la distancia y la velocidad de movimiento se redujeron significativamente en todos los grupos experimentales en comparación con antes de la administración. Y los resultados mostraron que la distancia y la velocidad de movimiento no cambiaron o aumentaron ligeramente en el grupo tratado con composición simple de PPC al 5,0%, PPC al 5,0% TUDCA al 4,0%, PPC al 5,0% GCA al 2,5% o PPC al 5,0% TCA al 2,5% Por otro lado, la distancia y la velocidad de movimiento se redujeron en un 20% en el grupo de ratones tratados con PPC al 5,0%+DCA al 2,2%, PPC al 5,0%+HDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+UDCA al 3,0%, PPC al 5,0%+ TDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+GDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+CDCA al 2,5% o PPC al 5,0%+CA al 2,5%, y se consideró que la actividad disminuía debido al dolor (FIGS. 13A y 13B).

Basándose en los resultados del ensayo de formulaciones, los resultados del ensayo de edema, inflamación y lesiones cutáneas in vivo, los resultados del ensayo de viabilidad de células grasas, células musculares, fibroblastos, células endoteliales in vitro, los resultados del ensayo histopatológico HyE de la almohadilla de grasa in vivo, los resultados del ensayo de toxicidad de dosis única y los resultados del ensayo de dolor, se evaluaron la seguridad y la eficacia antes y después de la administración a sujetos humanos para su validación clínica. Los resultados de los estudios clínicos de los investigadores mostraron que 12 semanas después de la inyección en la grasa submentoniana, 0,2 cc, intervalo de 1 cm, profundidad de 6 a 8 mm, total de 50 puntos, dosis de 10 ml, 6 veces a intervalos de 4 semanas, se confirmó visualmente que se redujo la grasa submentoniana (FIG. 14A). El nivel de satisfacción comunicado por el sujeto fue de 4 sobre 5, y la mejora tras la comparación con las fotografías previas a la dosis fue de 1,5 grados (FIG. 14A). Además, la grasa submentoniana se redujo en la CT en 30,36%, de 5,6 mm antes de la administración a 3,9 mm 12 semanas después de la administración final (FIG. 14B).

Seis pacientes varones y mujeres que habían recibido la composición en inyección de PPC solubilizada con DCA (productos previamente comercializados) se sometieron a una evaluación clínica del dolor, edema y efectos secundarios después de la administración de la composición inyectable de PPC solubilizada con GCA de la presente invención. Después de anestesia tópica con crema de lidocaína al 9,6% durante 30 minutos o más en sujetos que tenían experiencia con una inyección de la composición (PPC al 2,5% DCNa al 1,2%) que comprende solución salina fisiológica y Lipobean® (una inyección de PPC al 5,0% solubilizada con DCNa al 2,4%) mezclado en una relación 1:1 en abdomen y costado (intervalo de 1,5 cm, profundidad de 10 a 12 mm, 0,5 cc por punto, de 50 ml a 100 ml por administración) con una jeringa equipada con una aguja de 13 mm o en la grasa submentoniana (intervalo de 1,0 cm, profundidad de 6 a 8 mm, 0,2 cc por punto, 10 ml por administración), y se administró la composición de la presente invención (inyección de PPC al 5,0% solubilizada con GCA al 2,8% o inyección de PPC al 5,0% solubilizada con 4,0% GCA) a los sujetos con el mismo método de administración. Como resultado del ensayo, los sujetos que habían recibido la inyección de la composición de PPC solubilizada con DCNa se quejaron de dolor y edema especialmente en el momento de la administración y 10 días después de la administración, y también comunicaron lesiones cutáneas tales como eritema, hematoma, cardenales y lesiones locales tales como induración, nódulo, prurito y sensación de ardor. Sorprendentemente, sin embargo, los sujetos que recibieron las inyecciones de PPC solubilizada con el GCA de la presente invención sintieron alivio en un nivel leve, particularmente hasta el punto en que el dolor (FIG.

15A) y el edema (FIG. 15B) estuvieron sustancialmente ausentes. Es decir, la seguridad mejoró en 80% o más en comparación con el grupo que recibió la inyección de PPC solubilizada con DCA, y no se comunicaron reacciones adversas graves entre los sujetos (FIGS. 15A a 15C). Específicamente, no se observaron efectos secundarios tales como hinchazón, hematoma, cardenales, eritema, parestesia, induración, nódulo y prurito o se observaron en un nivel significativamente bajo.

Además, cuando se administró PPC solubilizada con GCA en el abdomen y el costado a 0,5 cc, intervalo de 1,5 cm, 12 mm de profundidad, 200 puntos totales, dosis de 100 ml, las lesiones cutáneas no se observaron visualmente (FIG. 16). Como se muestra en la FIG. 16, el eritema se redujo a nada o leve excepto por el cardenal producido por la propia aguja de inyección o el daño de los vasos sanguíneos causado por la lesión vascular en el momento de la inyección. Y no se observaron parestesia, hinchazón extensa, induración, parestesia, nódulo, prurito, sensación de ardor, disfagia y similares (FIG. 15C).

En resumen, la composición de la presente invención es una invención innovadora que reduce selectivamente los adipocitos con el mecanismo de apoptosis y degradación, reduce la ansiedad y el malestar del paciente, mejora el cumplimiento del paciente con los medicamentos y tiene estabilidad en la formulación. Y la composición de la presente invención no produce dolor ni edema, que es producido por la inflamación después de administrar la composición inyectable convencional de DCA o PPC solubilizada con DCA, ni hinchazón extensa, eritema, molestias como cardenales y anestesia, induración, parestesia, nódulo, prurito, sensación de ardor, lesión nerviosa y disfagia, que son producidos por la actividad citolítica no selectiva.

Por lo tanto, se proporciona una composición para reducir la grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, consistiendo esencialmente la composición en:

(i) fosfatidilcolina; y

(ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo,

en donde una relación molar de (ii) a (i) en la composición está en un intervalo de 0,7 a 3,0.

Específicamente, se proporciona una composición para reducir la grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, consistiendo esencialmente la composición en:

(i) fosfatidilcolina;

(ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo; y

(iii) agua (o agua para inyección)

La composición inyectable reductora de grasa de la presente invención se puede aplicar en una zona localizada y se aplica preferiblemente a la grasa, lipoma depositado en el abdomen, submentoniano, antebrazo, muslo, cintura, cadera, debajo de los ojos, línea del sostén, y similares, pero no limitado a ello, y se puede aplicar para mejorar las arrugas del cuello.

La composición de la presente invención se usa preferiblemente para la eliminación no quirúrgica de depósitos de grasa localizada en un sujeto. La expresión "no quirúrgico" se refiere a un procedimiento médico que no requiere una incisión.

La formulación de la composición de la presente invención no está particularmente limitada siempre que se use con el fin de reducir la grasa (en particular, reducir la grasa localizada), e incluye, por ejemplo, una inyección tal como parche, depósito, etc., y preferiblemente puede ser una composición inyectable. Es decir, la presente invención se refiere a una composición o preparación que se puede inyectar directamente en un sitio de tratamiento de un paciente que necesita eliminar grasa sin cirugía.

La composición inyectable para reducir la grasa localizada de la presente invención es una composición farmacéutica para el tratamiento de la hiperplasia del tejido adiposo o trastorno (enfermedad) hiperproliferativo, y el trastorno no está particularmente limitado siempre que se conozca en la técnica que es hiperproliferativo o hiperacumulativo de tejido adiposo de forma patológica, por ejemplo, obesidad (obesidad abdominal), escape del párpado inferior, lipoma, enfermedad de Dercum, cuello de Madelung, edema graso, nódulos piezogénicos, xantosis, distrofia grasa, acumulación de grasa asociada con celulitis, y similares, pero sin limitarse a ellos.

Los métodos de administración de la composición inyectable de la presente invención no están limitados, pero puede administrarse por un método adecuado para el paciente en vista de la gravedad de la enfermedad, la edad, sexo y otras afecciones del paciente. Dicha ruta de administración no está particularmente limitada en el método, pero preferiblemente se administra directamente a la capa de grasa subcutánea (tejido), por ejemplo, inyección múltiple, subcutánea o intradérmica a intervalos de 0,5 a 2,0 cm en el intervalo de red.

En la presente invención, la expresión efecto secundario se refiere a los efectos secundarios de las preparaciones de PPC que comprenden sales biliares específicas que son conocidas o están comercialmente disponibles, en particular inyecciones de PPC solubilizada con DCA convencionales (p. ej., Lipostabil, Essential, Lipobean) o preparación simple de DCA (p. ej., Kybella) conocidas como inyecciones para reducir la grasa localizada. Y se refiere a una acción dañina para el cuerpo humano distinta de la acción principal que se espera como efecto terapéutico de los fármacos (en la presente invención, efecto reductor de grasa). Específicamente, el efecto secundario es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en edema, anestesia (especialmente anestesia de los sitios de administración), hinchazón extensa, eritema, hematoma, cardenales, induración, anomalías sensoriales, nódulos, prurito, sensación de ardor, disfagia y necrosis de células distintas de los adipocitos (células musculares, fibroblastos, células endoteliales vasculares, etc.), y similares, excepto el hematoma y cardenal producido por la propia aguja de inyección, pero no limitados a ellos. La composición inyectable para reducir la grasa localizada de la presente invención se caracteriza por que las reacciones adversas locales se alivian en un grado tal que los efectos secundarios están sustancialmente ausentes.

Como se usa en el presente documento, la expresión "alivio del dolor y los efectos secundarios" comprende el significado de que el dolor y los efectos secundarios se reducen, eliminan, están presentes en un nivel bajo (eliminados parcialmente), sustancialmente ausentes (sustancialmente eliminados), y completamente ausentes (completamente eliminados).

En la presente invención, el dolor y el edema incluyen dolor en el momento de la administración de la inyección y dolor y edema después de la administración. La presente invención se caracteriza por un dolor y edema significativamente reducidos (sustancialmente sin dolor ni edema), en contraposición a las composiciones simples de DCA o inyecciones de PPC solubilizada con DCA comercialmente disponibles convencionales, que implican dolor y edema. Estas inyecciones de PPC indoloras y sin edema se describen por primera vez en la presente invención, y en particular, se caracterizan por que no hay dolor y edema secundarios que duren más de 10 días debido a la inflamación, así como dolor primario en el momento de la inyección e inmediatamente después de la administración. En la presente invención, el significado del dolor se distingue de los síntomas producidos por la invasión de la aguja (p. ej., náuseas, cardenales por una aguja, hematoma por una aguja, hinchazón por una aguja), y significa dolor o edema (inflamación) que ha sido producido por la característica de la propia inyección simple de DCA o la composición inyectable de DCA PPC. En una realización de la presente invención, la preparación compleja de PPC GCA de la presente invención mostró, de manera única, casi ningún dolor en el momento de la inyección en comparación con la "inyección de PPC solubilizada con DCA", que está disponible comercialmente, utilizada como grupo de control (FIG. 15A). Considerando que la preparación compleja de la presente invención es similar a las preparaciones disponibles comercialmente existentes (ejemplo representativo de inyección de PPC solubilizada con DCNa) en las características de partículas (micela, tamaño de partículas, etc.) y que todas las inyecciones se administran a un pH similar al cuerpo humano, el efecto de la composición de la presente invención es difícil de predecir a partir de tecnologías previamente conocidas.

Además, la composición de la presente invención se caracteriza por producir apoptosis y lipólisis específicamente de los adipocitos. En una realización de la presente invención, la preparación compleja de PPC GCA de la presente invención no afecta sustancialmente a otras células distintas de los adipocitos tales como fibroblastos, células del músculo esquelético y células endoteliales vasculares, y se confirmó que la inducción de la apoptosis y la lipólisis era específicamente efectiva solo en adipocitos (véanse las FIGS. 8A a 8D). Este efecto es comparable a las preparaciones de PPC solubilizada con otros ácidos biliares (representativamente, preparaciones de PPC+DCA comercialmente disponibles), que producen necrosis en otras células además de los adipocitos. Primero se describe en la presente invención que posee un efecto específico de adipocitos (selectivo) cuando el GCA se mezcla con p Pc en ciertas relaciones.

Las preparaciones inyectables se preparan disolviendo los fármacos principales (PPC solubilizada con GCA en la presente invención) y, si es necesario, otros aditivos en el agua para inyección, filtrando la solución con un filtro bacteriano, esterilizando la solución, llenando la solución en un vial, ampolla o jeringa de campo libre seguido de sellado. Por lo tanto, en la preparación de inyecciones, se puede usar agua para inyección así como agua para completar la cantidad restante. El agua para inyección no está particularmente limitada siempre que sea agua destilada para inyección o una solución tampón para inyección destinada a diluir inyecciones sólidas o una solución inyectable soluble en agua. Por ejemplo, puede usarse una solución tampón de fosfato o dihidrogenofosfato de sodio (NaH₂PO₄) en un intervalo de pH de 3,5 a 7,5, solución tampón de ácido cítrico o similar. El fosfato usado en el presente documento puede estar en forma de sal de sodio o sal de potasio, o puede estar en forma de anhídrido o hidrato, y puede estar en forma de ácido cítrico o anhídrido o hidrato. Los ejemplos de agua para inyección incluyen inyección de glucosa, inyección de xilitol, inyección de D-manitol, inyección de fructosa, solución salina fisiológica, inyección de dextrano 40, inyección de dextrano 70, inyección de aminoácidos, solución de Ringer y solución de ácido láctico-Ringer, pero no se limita a estas.

En la presente invención, la fosfatidilcolina (PPC) es un fosfolípido que se encuentra ampliamente en animales, plantas, levaduras y hongos. También se denomina lecitina, polienofosfatidilcolina y 3-sn-fosfatidilcolina y tiene una estructura básica de Fórmula 1. Es un fosfolípido de membrana de los mamíferos, principalmente en el cerebro, nervios, células sanguíneas, yema de huevo y similares. En las plantas, se encuentra en la soja, semilla de girasol, germen de trigo y rara vez se encuentra en bacterias. En general, los ácidos grasos saturados están unidos a la posición 1 del glicerol, los ácidos grasos insaturados están unidos a la posición 2 y la mayoría de los grupos acilo son C12 a C22 (12 a 22 átomos de carbono).

Fórmula 1

La fosfatidilcolina de la presente invención tiene la estructura mostrada en la Fórmula 1, R1 es un ácido graso saturado o insaturado que tiene de 12 a 22 átomos de carbono, y R2 es un ácido graso saturado o insaturado que tiene de 12 a 22 átomos de carbono. El ácido graso saturado o insaturado puede estar en forma de un cadena lineal o cadena ramificada, y el ácido graso insaturado puede incluir monoinsaturado o de insaturación múltiple (p. ej., doble, triple o cuádruple). La fosfatidilcolina de la presente invención puede ser un solo compuesto o puede ser una mezcla de varios compuestos que tienen diferentes números de carbonos de los grupos acilo R1 y R2. Preferiblemente, la fosfatidilcolina de la presente invención puede tener un peso molecular de 700 g/mol a 1000 g/mol, y más preferiblemente un peso molecular de 750 g/mol a 800 g/mol.

La fosfatidilcolina de la presente invención se puede extraer de uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en diversos animales o plantas, por ejemplo, soja, semilla de girasol, germen de trigo y yema de huevo. Alternativamente, la fosfatidilcolina comercialmente disponible de la presente invención se puede comprar y usar, o se puede usar un producto preparado por un método de síntesis química conocido en la técnica.

La fosfatidilcolina de la presente invención se puede aislar preferiblemente de soja o yema de huevo. En general, la estructura típica de la fosfatidilcolina aislada de la soja es como la siguiente Fórmula 2. Y, en general, la estructura típica de la fosfatidilcolina derivada de la yema de huevo es la como se muestra a continuación en la Fórmula 3. La fosfatidilcolina utilizada en la presente invención puede ser un compuesto solo que consiste únicamente en el compuesto de la siguiente Fórmula 2 o 3, o mezclas en las que además se incluyen varios compuestos que tienen diferentes números de carbonos de los grupos acilo R1 y R2 basados en la Fórmula 1. La mezcla puede contener sustancialmente 50% en peso o más, más preferiblemente 70% en peso o más, y lo más preferiblemente 90% en peso o más del compuesto de la siguiente Fórmula 2 o 3.

Fórmula 2

Fórmula 3

Lo más preferiblemente, la fosfatidilcolina de la presente invención se puede extraer de la soja y puede ser una mezcla que contiene un compuesto que tiene una estructura como se muestra en la Fórmula 2 en una relación de 93,0% en peso o más.

En la composición inyectable para reducir la grasa localizada de la presente invención, la fosfatidilcolina está contenida en una concentración de 0,625 a 15,0% (p/v) basado en la composición total, preferiblemente contenida en una concentración de 1,25 a 12,5% (p/v), y más preferiblemente contenida en una concentración de 2,5 a 10,0% (p/v) en la composición total. Lo más preferiblemente, la fosfatidilcolina puede estar contenida en una concentración de 2,5 a 7,5% (p/v) basada en la composición total. Cuando la concentración de fosfatidilcolina es inferior a 0,625% (p/v), no hay efecto de lipólisis (véanse las FIGS. 7A a 7D). Cuando la concentración de fosfatidilcolina es superior a 15% (p/v), es inconveniente administrar múltiples dosis a la capa de grasa subcutánea debido a su alta viscosidad, y dado que se requiere un uso excesivo de agente solubilizante, se pone de manifiesto una anormalidad moderada de reacción inflamatoria y se pueden producir efectos secundarios graves tales como dolor, hinchazón e inflamación.

La composición para reducir la grasa localizada de la presente invención se caracteriza por que una relación molar de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y sal del mismo (en adelante abreviado como (ii)) a fosfatidilcolina (PPC, en lo sucesivo abreviado como (i)) está en un intervalo de 0,7 a 3,0. En otras palabras, la relación molar de (ii) a (i) puede estar en un intervalo de 0,7 a 3,0, más preferiblemente la relación molar de (ii) a (i) puede estar en un intervalo de 0,7 a 2,60, y lo más preferiblemente la relación molar de (ii) a (i) puede estar en un intervalo de 0,7 a 1,73. Cuando estos están contenidos en una relación molar (mol/mol) de menos de 0,7, es difícil formar micelas estables, lo que da como resultado poca estabilidad de la formulación. Por lo tanto, el valor límite inferior de la relación molar es preferiblemente 0,70 o más, y más preferiblemente 0,76. Cuando el valor límite superior de la relación molar es 3,04 o más, el dolor, edema y efectos secundarios se presentan de forma notable con inflamación leve o mayor, edema moderado o mayor y lesión cutánea grave o mayor, respectivamente, y limita la función inherente a la PPC, con necrosis celular en lugar de dar un efecto positivo sobre la apoptosis y la lipólisis del adipocito. A la relación molar de 3,0 o menos, estos efectos secundarios y el dolor se redujeron notablemente. Particularmente, cuando se incluyeron en la relación molar de 2,60 o menos, no se observaron edema, lesión e inflamación o se observaron síntomas leves. Clínicamente, se puede observar edema leve, pero este es un nivel sustancialmente exento de dolor y efectos secundarios y, por lo tanto, se adopta como un intervalo más preferible en la presente invención. Lo más preferiblemente, cuando la relación molar es 1,73 o menos, no se producen edema ni lesión, ni dolor clínico ni edema producidos por la inflamación.

En la presente invención, el intervalo de relaciones molares de (ii) a (i) incluye un intervalo en el que el valor límite mínimo o máximo se selecciona del grupo que consiste en el valor 0,70, 0,71, 0,72, 0,73, 0,74, 0,75, 0,76, 0,77, 0,78, 0,79, 0,80, 0,81, 0,82, 0,83, 1,09, 1,05, 1,06, 1,07, 1,08, 1,09, 1,10, 1,09, 1,08, 1,09, 1,11, 1,12, 1,13, 1,14, 1,15, 1,16, 1,17, 1,18, 1,19, 1,20, 1,21, 1,22, 1,23, 1,24, 1,25, 1,26, 1,27, 1,28, 1,29, 1,30, 1,31, 1,32, 1,33, 1,34, 1,35, 1,53, 1,54, 1,55, 1,56, 1,57, 1,58, 1,59, 1,60, 1,50, 1,54, 1,50, 1,61, 1,62, 1,63, 1,64, 1,65, 1,66, 1,67, 1,68, 1,69, 1,70, 1,71, 1,72, 1,73, 1,74, 1,75, 1,76, 1,77, 1,78, 1,79, 1,80, 1,81, 1,82, 1,83, 1,84, 1,85, 1,86, 1,87, 1,88, 1,89, 1,90, 1,91, 1,92, 1,93, 1,94, 1,95, 1,96, 1,97, 1,98, 1,99, 2,00, 2,01, 2,02, 2,03, 2,04, 2,05, 2,06, 2,07, 2,08, 2,09, 2,10, 2,11, 2,12, 2,13, 2,14, 2,15, 2,16, 2,17, 2,18, 2,19, 2,20, 2,21,2,22, 2,23, 2,22,42, 2,43, 2,44, 2,45, 2,46, 2,47, 2,48, 2,32, 2,33, 2,34, 2,62, 2,63, 2,64, 2,65, 2,66, 2,67, 2,68, 2,69, 2,70, 2,71, 2,72, 2,73, 2,50, 2,52, 2,53, 2,54, 2,55, 2,56, 2,57, 2,58, 2,59, 2,74, 2,75, 2,76, 2,77, 2,78, 2,79, 2,80, 2,81, 2,82, 2,83, 2,84, 2,85, 2,86, 2,87, 2,88, 2,89, 2,90, 2,91, 2,92, 2,93, 2,94, 2,95, 2,96, 2,99 y 3,00. Como el ejemplo más preferido de la presente invención, se puede seleccionar un valor límite de 0,76 y 1,39 entre los intervalos de relaciones molares de la presente invención descritos anteriormente. Por lo tanto, es obvio para un experto en la técnica que el intervalo de relaciones molares de 0,76 a 1,39, es decir, todos los valores en el intervalo de 0,76 o más a 1,39 o menos se pueden aplicar a la presente invención.

Específicamente, la composición para reducir la grasa localizada de la presente invención se caracteriza por contener "ácido glicocólico o una de sus sales" en la composición en una relación de mezcla específica. El ácido glicocólico es una sal biliar que tiene un peso molecular de aproximadamente 465,63 g/mol y puede describirse en el presente documento como GCA o GC. El ácido glicocólico puede usarse en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa fisiológicamente aceptable y normalmente no produce reacciones alérgicas o reacciones similares cuando se administra a seres humanos, e incluye, pero no se limita a, sal de sodio, sal de potasio o sal de amonio. Preferiblemente, la sal de ácido glicocólico de la presente invención puede ser glicocolato de sodio (GCNa).

El ácido glicocólico o su sal se puede extraer del intestino de un animal según un método conocido en la técnica, y se puede adquirir comercialmente o utilizar mediante un método de síntesis química conocido en la técnica.

Más específicamente, la relación molar mínima de GCA a PPC (GCA/PPC) para preparar una solución transparente capaz de microfiltración y con una micela mixta con un diámetro de 10 nm o menos que se puede inyectar por vía subcutánea de forma segura y estable es 0,76 (PPC al 5,0% GCA al 2,2%). A una relación molar inferior a la relación molar mínima, la estabilidad de la preparación es baja debido al fenómeno de precipitación. Por lo tanto, el ácido glicocólico o su sal puede estar contenido preferiblemente de modo que la relación molar de GCA a PPC (GCA/PPC) esté en un intervalo de 0,76 a 3,0 (^gC^adel 2,2 al 8,65% (p/v) basado en PPC al 5%), y el intervalo específico se refiere a la relación molar mencionada anteriormente. Cuando el ácido glicocólico se usa en su forma de sal, la relación molar se puede calcular preferiblemente basándose únicamente en el resto de ácido glicocólico en la sal de ácido glicocólico.

La composición para reducir la grasa localizada de la presente invención se caracteriza por contener "ácido taurocólico o una de sus sales" en la composición en una relación de mezcla específica. El ácido taurocólico es una sal biliar que tiene un peso molecular de aproximadamente 515,71 g/mol y puede describirse en el presente documento como TCA. El ácido taurocólico puede usarse en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa fisiológicamente aceptable y normalmente no produce reacciones alérgicas o reacciones similares cuando se administra a seres humanos, e incluye, pero no se limita a, sal de sodio, sal de potasio o sal de amonio. Preferiblemente, la sal de ácido glicocólico de la presente invención puede ser glicocolato de sodio (TCNa).

El ácido taurocólico o su sal se puede extraer del intestino de un animal según un método conocido en la técnica, y se puede adquirir comercialmente o utilizar mediante un método de síntesis química conocido en la técnica.

Más específicamente, la relación molar mínima de TCA a PPC (TCA/PPC) para preparar una solución transparente capaz de microfiltración y con una micela mixta con un diámetro de 10 nm o menos que se pueda inyectar por vía subcutánea de forma segura y estable es 0,78 (PPC al 5,0% TCA al 2,5%). A una relación molar inferior a la relación molar mínima, la estabilidad de la preparación es baja debido al fenómeno de precipitación. Por lo tanto, el ácido glicocólico o su sal puede estar contenido preferiblemente de modo que la relación molar de TCA a PPC (TCA/PPC) esté en un intervalo de 0,78 a 3,0 (t Ca del 2,5 al 9,57% (p/v) basado en PPC al 5%), y el intervalo específico se refiere a la relación molar mencionada anteriormente. Cuando el ácido taurocólico se usa en su forma de sal, la relación molar se puede calcular preferiblemente basándose únicamente en el resto de ácido taurocólico en la sal de ácido taurocólico.

En este punto, la al menos una (sustancia) seleccionada del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo preferiblemente está contenida en el mismo peso (o porcentaje en peso/volumen) (es decir, % en p/v)) que la fosfatidilcolina o menos. Por ejemplo, la relación en peso basada en PPC puede estar en el intervalo de 1:0,1 a 1. Específicamente, la relación en peso basada en PPC puede ser 1: 0,1, 1: 0,2, 1: 0,3, 1: 0,4, 1: 0,5 , 1: 0,6, 1: 0,7, 1: 0,8, 1: 0,9 o 1. Cuando dicha referencia de peso se aplica basada en la relación molar (relación molar GCA/PPC o relación molar TCA/PPC), la relación molar puede estar preferiblemente en el intervalo de 0,7 a 1,73, más preferiblemente de 0,76 a 1,73.

Preferiblemente, al menos una (sustancia) seleccionada del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo está en menor contenido que el peso (o porcentaje en peso/volumen (es decir, % en p/v)) de la fosfatidilcolina. Por ejemplo, la relación en peso basada en PPC puede estar en el intervalo de 1:0,1 a 0,999. Específicamente, la relación en peso basada en PPC puede ser 1: 0,1, 1: 0,2, 1: 0,3, 1: 0,4, 1: 0,5, 1: 0,6, 1: 0,7, 1: 0,8 o 1: 0,9. Cuando dicha referencia de peso se aplica basada en la relación molar (relación molar GCA/PPC o relación molar TCA/PPC), la relación molar puede estar preferiblemente en el intervalo de 0,7 o más a menos de 1,73, más preferiblemente de 0,76 o más a menos de 1,73.

Cuando el ácido glicocólico o el ácido taurocólico se usa en forma de una de sus sales, la relación en peso se puede calcular preferiblemente basándose únicamente en la relación del resto de ácido glicocólico en la sal de ácido glicocólico o la relación del resto de ácido taurocólico en el ácido taurocólico.

El al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y sales de los mismos se puede utilizar como sigue:

(A) la sustancia individual sola (ácido glicocólico, una de las sales del ácido glicocólico, ácido taurocólico, una de las sales del ácido taurocólico) puede formar complejo con la PPC, o

(B) una mezcla de GCA o sus sales; y TCA o una de sus sales (en lo sucesivo, mezcla de GCA-TCA) puede formar complejo con la PPC.

Como se describió anteriormente, la composición de la presente invención en donde el GCA, TCA o una de sus sales está contenido en una relación de mezcla específica con fosfatidilcolina (PPC), se caracteriza por ser una preparación de micelas no liposómica. Es decir, la composición de la presente invención se caracteriza por la presencia de fosfatidilcolina en forma de micelas en la composición, que es diferente a las formulaciones de PPC convencionales que utilizan un sistema de liposomas.

El GCA, TCA o sus sales están contenidos en la composición inyectable reductora de grasa de la presente invención en una dosis específica (o una relación de mezcla, relación molar) como se describió anteriormente, de modo que no solo la estabilidad de la formulación es excelente sino que también, a diferencia de los agentes solubilizantes convencionales (especialmente el desoxicolato y su tipo de sal) contenidos en la composición inyectable de PPC que producen efectos secundarios tales como necrosis de la célula acompañada de dolor corporal y edema, hematoma, anestesia, eritema, hinchazón, induración, prurito, nódulo y similares, induce una acción de lipólisis y apoptosis de adipocitos de alta eficacia junto con la PPC, de modo que el dolor y los efectos secundarios se eliminan sustancialmente, y muestra un excelente efecto en la reducción de grasa (el dolor y el edema se redujeron en 80% o más, el eritema, hematoma, induración, prurito y nódulos se redujeron en más de 80%. Por lo tanto, también es una característica de la presente invención que no está necesariamente incluido o combinado en la composición un agente antiinflamatorio y/o componente analgésico para el tratamiento del dolor por separado.

Por otro lado, la composición de la presente invención puede además comprender al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un conservante; un agente isotónico; y un regulador de pH.

Específicamente, la composición para reducir la grasa localizada de la presente invención puede comprender además preferiblemente al menos uno seleccionado de los que consisten en conservante del 0,1 al 5% (p/v), agente isotónico del 0,1 al 10% (p/v) y regulador de pH del 0,01 al 2% (p/v) basado en la composición total.

El conservante puede seleccionarse del grupo que consiste en alcohol bencílico, lidocaína, procaína y clorobutanol, pero no limitado a ellos. Más preferiblemente alcohol bencílico. El alcohol bencílico es uno de los alcoholes aromáticos y es un líquido transparente incoloro. La concentración del alcohol bencílico contenido en la composición inyectable de la presente invención puede ser preferiblemente de 0,1% (p/v) a 2% (p/v).

El agente isotónico sirve para mantener (controlar) adecuadamente la presión osmótica cuando se administra en el cuerpo la composición de la presente invención que contiene fosfatidilcolina, y también tiene un efecto secundario de estabilizar más la fosfatidilcolina en la solución. El agente isotónico puede ser un azúcar, sal o cualquier combinación o mezcla de los mismos farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de los mismos incluyen glucosa como un azúcar y cloruro sódico, cloruro de calcio, sulfato sódico, glicerina, propilenglicol, polietilenglicol de peso molecular 1000 o menos, y similares como una sal inorgánica soluble en agua. Y más preferiblemente puede ser cloruro sódico. Pueden usarse solos o en combinación de dos o más. La concentración del agente isotónico es preferiblemente de 0,1% (p/v) a 5% (p/v), y puede ajustarse a una cantidad apropiada de modo que la formulación de la solución que contiene cada una de las mezclas respectivas se convierta en una solución isotónica dependiendo del tipo, cantidad y similares de los componentes contenidos en la composición de la presente invención.

El regulador de pH de la presente invención tiene la función de controlar el pH de la preparación inyectable e incluye tanto sustancias ácidas como básicas. La sustancia ácida incluye, pero no se limita a, ácido clorhídrico, ácido acético, ácido adípico, ácido ascórbico, ascorbato sódico, etóxido sódico, ácido málico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido fumárico y ácido cítrico. La sustancia básica incluye, pero no se limita a, una base inorgánica (por ejemplo, hidróxido sódico, hidróxido de potasio, carbonato sódico, hidrogenocarbonato sódico, carbonato de magnesio, carbonato de calcio, óxido de magnesio, amoniaco, hidrotalcita sintética), una base orgánica (por ejemplo, aminoácido básico tal como lisina, arginina, etc., meglumina, etc.), y similares. En la presente invención, el regulador de pH puede incluir una sustancia ácida y una sustancia básica, respectivamente, en la composición sola, o se pueden usar dos o más de las sustancias en combinación. Más preferiblemente, el regulador de pH de la presente invención puede ser hidróxido sódico y/o ácido clorhídrico. La cantidad del regulador de pH a añadir puede variar dependiendo del tipo y la cantidad de los constituyentes de la composición de la presente invención, y es preferiblemente de 0,01% (p/v) a 1,32% (p/v), más preferiblemente de 0,01% (p/v) a 1% (p/v). La composición de la presente invención se puede proporcionar preferiblemente en el intervalo de pH 7,0 a pH 7,8, y el tipo y la cantidad del regulador de pH los puede cambiar un experto en la técnica de acuerdo con la composición específica de la solución.

Como la forma más preferida, la presente invención proporciona una composición para reducir la grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, consistiendo la composición en:

(i) fosfatidilcolina;

(ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA) o ácido taurocólico (TCA) y sus sales,

(iii) un conservante;

(iv) un agente isotónico;

(V) un regulador de pH; y

(vi) el resto agua,

en donde una relación molar de (ii) a (i) en la composición está en un intervalo de 0,7 a 3,0. Las características, contenidos, combinaciones y similares de los componentes individuales de la composición pueden entenderse con referencia a la descripción anterior.

La presente invención también proporciona una preparación para eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto, comprendiendo la preparación:

(i) fosfatidilcolina; y

en donde una relación molar de (ii) a (i) en la preparación está en un intervalo de 0,7 a 3,0.

La presente invención también proporciona una preparación para eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto, consistiendo la preparación en:

(i) fosfatidilcolina; y

La presente invención también proporciona una preparación para eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto, consistiendo la preparación esencialmente en:

(i) fosfatidilcolina;

(iii) agua (o agua para inyección)

Como la forma más preferida, la presente invención proporciona una preparación para eliminar la grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, consistiendo la preparación en:

(i) fosfatidilcolina;

(iii) un conservante;

(iv) un agente isotónico;

(V) un regulador de pH; y

(vi) el resto agua,

en donde una relación molar de (ii) a (i) en la composición está en un intervalo de 0,7 a 3,0. La composición, contenido y características de las sustancias específicas que constituyen la preparación son las mismas que las de la composición para reducir la grasa localizada.

La composición para reducir la grasa localizada de la presente invención y la preparación de la presente invención se pueden caracterizar por estar compuestas de pH 6,8 a pH 7,8.

La dosis unitaria (dosificación unitaria) de la composición o preparación de la presente invención puede ser la cantidad total de, por ejemplo, 500 ml, 400 ml, 300 ml, 200 ml, 100 ml, 90 ml , 80 ml, 70 ml, 60 ml, 50 ml, 40 ml, 30 ml, 20 ml, 10 ml, 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6, ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1 ml, 0,9 ml, 0,8 ml, 0,7 ml, 0,6 ml, 0,5 ml, 0,4 ml, 0,3 ml, 0,2 ml, 0,1 ml, 0,09 ml, 0,08 ml, 0,07 ml, 0,06 ml, 0,05 ml, 0,04 ml, 0,03 ml, 0,02 ml, 0,01 ml, 0,009 ml, 0,008 ml, 0,007 ml, 0,006 ml, 0,005 ml, 0,004 ml, 0,003 ml, 0,002 ml, 0,001 ml, 0,0009 ml, 0,0008 ml, 0,0007 ml, 0,0006 ml, 0,0005 ml, 0,0004 ml, 0,0003 ml, 0,0002 ml o 0,0001 ml a la zona afectada de los mamíferos, pero no limitada a estas. La dosis unitaria dependerá en parte de la zona objetivo, la cantidad de grasa y el resultado deseado.

Específicamente, la dosis unitaria (dosificación unitaria) de la composición o preparación de la presente invención se puede administrar en el intervalo de 0,1 ml a 500 ml, preferiblemente de 1 ml a 200 ml, más preferiblemente de 1 ml a 100 ml de la cantidad total a la zona afectada.

La composición o preparación de la presente invención se puede administrar administrando en múltiples sitios objetivo (punto) a intervalos regulares en la zona afectada con una sola administración, y la cantidad total puede referirse a la cantidad total de la dosis administrada a través de estos múltiples sitios objetivo en la administración única. El sitio objetivo se puede establecer en un intervalo de 1 a 50, preferiblemente de 2 a 30, más preferiblemente de 3 a 15, etc., para una zona afectada. Además, la composición o preparación de la presente invención comprende la administración en un sitio objetivo en una zona afectada de la administración única, y en este caso, los expertos en la técnica pueden entender bien que la cantidad total se calcula basada en la cantidad para el sitio objetivo único.

Además, la composición o preparación de la presente invención se puede administrar en un intervalo de dosificación de, pero no limitado a, 0,01-20 ml por sitio objetivo, preferiblemente 0,1-10 ml, más preferiblemente 0. 02-5 ml, lo más preferiblemente 0,1-1 ml.

La composición o preparación de la presente invención puede administrarse una o múltiples veces en el sitio objetivo. En ciertas realizaciones, una composición de la invención se administra en el sitio objetivo al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces. Una o más administraciones pueden producirse en una sola hora, día, semana, mes o año. Preferiblemente, las administraciones múltiples en un solo sitio objetivo se administran 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 o menos veces por año, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 o menos veces por mes, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 o menos veces por semana, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 o menos veces por día, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 o menos veces por hora. En ciertas realizaciones, el sujeto recibe 1-100, 2-50, 3-30, 4-20 o 5-10 administraciones en el sitio objetivo. Tales administraciones pueden producirse durante un período de 1 año, 6 meses, 5 meses, 4 meses, 3 meses, 2 meses, 1 mes, 3 semanas, 2 semanas o 1 semana o menos.

La composición o preparación de la presente invención se puede administrar en varios niveles (profundidad) debajo de la piel, incluyendo, pero no limitados a, por ejemplo, 2,5-101,6 mm (0,1-4 pulgadas), 12,7-76,2 mm (0,5-3 pulgadas), 25,4-50,8 mm (1-2 pulgadas) debajo de la piel.

La presente invención también proporciona un kit que comprende:

(I) un primer envase que comprende una composición o preparación para eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, comprendiendo la composición o preparación: (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo, en donde una relación molar de (ii) a (i) en la composición o preparación está en un intervalo de 0,7 a 3,0; y

(II) un dispositivo de administración capaz de administrar la composición o preparación a un sitio de depósito de grasa.

Como la realización más preferible, la presente invención proporciona un kit que comprende:

(I) un primer envase que comprende una composición o preparación para eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, comprendiendo la composición o preparación: (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo, en donde el al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo está contenido con el mismo peso que la fosfatidilcolina o menos; y

En el kit de la presente invención, (I) la composición o preparación contenida en el primer envase se entiende con referencia a la descripción de la composición y preparación para la reducción de grasa localizada de la presente invención descrita anteriormente. El primer envase tiene un volumen suficiente para acomodar la dosis unitaria (volumen de dosificación) de la composición o preparación de la presente invención. Por ejemplo, el primer envase puede ser apropiado para acomodar soluciones de 500 ml, 100 ml, 20 ml, 10 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml o 1 ml. En algunas realizaciones, el primer envase puede tener un volumen de 0,01 ml a aproximadamente 100 ml, de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 90 ml, de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 80 ml, de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 70 ml, de aproximadamente 2 ml a aproximadamente 60 ml, de aproximadamente 3 ml a aproximadamente 50 ml, de aproximadamente 4 ml a aproximadamente 40 ml, de aproximadamente 5 ml a aproximadamente 30 ml, de aproximadamente 6 ml a aproximadamente 20 ml, y de aproximadamente 7 ml a aproximadamente 10 ml. En una realización más preferida, el primer envase es un vial o ampolla que tiene una capacidad de volumen de aproximadamente 1 10 ml.

El kit de la presente invención comprende (II) un dispositivo de administración para administrar la composición del primer envase en el sitio de depósito de grasa. El tipo específico del dispositivo de administración no está particularmente limitado, pero puede ser preferiblemente una jeringa y/o puede incluir además otro dispositivo de administración adecuado (p. ej., un parche).

El dispositivo de administración puede tener cargada previamente la dosis unitaria de la composición o preparación de la presente invención.

El kit de la presente invención puede además comprender opcionalmente una pluralidad de envases. Por ejemplo, el kit puede comprender además una cantidad apropiada de diluyente para la dilución de la composición o formulación contenida en el primer envase y/o un segundo envase que comprende cualquier otro segundo agente. El cualquier otro segundo agente lo puede seleccionar como un componente constituyente de acuerdo con el propósito del kit una persona experta en la técnica, y el tipo del mismo no está particularmente limitado, y sus ejemplos incluyen agentes antimicrobianos, vasoconstrictores, agentes antitrombóticos, agente anticoagulante, dispersantes, antidispersantes, potenciadores de la penetración, esteroides, tranquilizantes, relajantes musculares y antidiarreicos.

El kit puede incluir una descripción escrita para usar la composición o preparación para reducir la grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos. Por consiguiente, la composición o preparación contenida en el primer envase (I) puede administrarse según la descripción escrita. La descripción escrita puede proporcionar instrucciones para usar, que pueden depender, por ejemplo, del sitio objetivo, el mamífero a tratar, el resultado deseado, la ubicación del sitio objetivo, la concentración de la solución y la cantidad de depósito de grasa. Preferiblemente, las descripciones escritas son para el tratamiento de mamíferos tales como seres humanos, perros, gatos o caballos. La descripción escrita también puede incluir información para el tratamiento de otros animales domésticos y/o animales de granja.

La descripción escrita puede incluir información sobre el uso de las composiciones de la presente invención para tratar ciertas zonas objetivo, tales como debajo de los ojos de un mamífero, submentoniano, debajo del brazo, caderas, pantorrillas, espalda, muslos, tobillos o abdomen. En ciertas realizaciones, la descripción escrita especifica instrucciones para el uso de las composiciones de la presente invención para tratar el depósito de grasa asociada con escape de grasa del párpado, lipomas, lipodistrofia, distrofia de grasa de joroba de búfalo o celulitis.

La descripción escrita puede incluir información sobre la cantidad de dilución, si es necesario, de los componentes del primer envase y/o del diluyente del segundo envase. La descripción escrita puede proporcionar información sobre la administración adecuada de la composición o preparación de la presente invención, tal como la frecuencia o dosis de administración.

El término "que comprende" se usa como sinónimo de "que contiene" o "que se caracteriza", y no excluye ingredientes o etapas adicionales que no se mencionan en las composiciones y los métodos. El término "que consiste en" excluye elementos, etapas o ingredientes adicionales que no se describen por separado. La expresión "que consiste esencialmente en" significa que en el alcance de las composiciones o métodos, la expresión incluye los materiales o etapas descritos, así como cualquier material o etapa que no afecte sustancialmente a las características básicas de las composiciones o métodos.

La presente invención proporciona un método para preparar una composición inyectable para reducir la grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, comprendiendo el método las etapas de:

(a) añadir al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo al agua para inyección, seguido de disolución mientras se agita para obtener una mezcla transparente;

(b) añadir un conservante, seguido de agitación;

(c) añadir fosfatidilcolina, seguido de agitación a temperatura ambiente; y

(d) ajustar un volumen total de la composición con agua, seguido de agitación,

en donde una relación molar del al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y la sal del mismo a la fosfatidilcolina está en un intervalo de 0,7 a 3,0.

En lo sucesivo, se describirá etapa por etapa el método para preparar una composición inyectable para reducir la grasa localizada de la presente invención.

En la etapa (a), al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y sal del mismo se añade al agua para inyección, seguido de disolución mientras se agita para obtener una mezcla sustancialmente transparente.

En este punto, la al menos una (sustancia) seleccionada del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y sus sales, y su combinación y relación de mezcla son como se describió anteriormente en la composición. En la etapa (a), opcionalmente se puede añadir previamente un regulador de pH.

La etapa (b) es una etapa de administrar un conservante. En la etapa (b), cualquiera del agente isotónico y el regulador de pH, o ambos, se pueden añadir y agitar adicionalmente. Los componentes y concentraciones de los conservantes, agentes isotónicos y regulador de pH son los mismos que los descritos anteriormente en la descripción de la composición.

En la presente invención, la agitación o mezcla se puede realizar mediante un medio de agitación conocido (agitador), y un experto en la técnica puede variar las condiciones tales como temperatura, presión, tiempo o velocidad de rotación dependiendo del tipo o características del material a introducir con el fin de mejorar la eficiencia.

En la etapa (c), se añade fosfatidilcolina a la mezcla agitada en la etapa (b), y la mezcla se agita hasta que la mezcla se solubiliza en condiciones de oscurecimiento y hermeticidad. La agitación se puede llevar a cabo con medios de agitación (agitador) conocidos en la técnica, preferiblemente de 2 a 24 horas, más preferiblemente de 5 a 15 horas. La velocidad de rotación no se limita a esto, sino que se puede realizar de 100 a 1000 rpm. A través del procedimiento anterior, la fosfatidilcolina se puede producir como partículas homogéneas que tienen un tamaño de partículas pequeño (diámetro de partículas de 2 a 10 nm, preferiblemente diámetro de partículas de 2 a 6 nm) en la composición. Si el procedimiento de agitación se realiza durante menos de 2 horas, no se pueden obtener el tamaño de partículas y la homogeneidad deseados, y si supera las 24 horas, es antieconómico para el procedimiento de producción. Los expertos en la técnica también podrán establecer diversas condiciones de procedimiento para aumentar la solubilidad del material componente, por ejemplo, para agitar el material componente en condiciones tales como presión de nitrógeno.

En la etapa (d), el volumen total se ajusta con agua y se mezcla homogéneamente. El agua se puede sustituir por agua para inyección, que es igual a la descrita anteriormente. En la etapa (d), se puede realizar la adición del regulador de pH. En esta etapa, para asegurar la estabilidad del producto de acuerdo con la distribución de la preparación para inyección, el pH se puede ajustar usando una solución ácida o un tampón (regulador de pH) tal como fosfato que se puede usar como una inyección, y se puede preparar una preparación para inyección física o químicamente estable. El tipo o la cantidad del regulador de pH que se puede usar en la presente invención son los descritos anteriormente.

Además, el método puede incluir además (e) filtrar la solución agitada en la etapa (d) para obtener un filtrado que tenga un diámetro de partículas de 2 a 10 nm de fosfatidilcolina.

La etapa (e) es una etapa de separación de las moléculas de fosfatidilcolina que tienen un diámetro de partículas de 2 a 10 nm en una alta concentración mediante filtración. La filtración se puede realizar usando medios de filtración convencionales conocidos en la técnica, y la filtración se puede realizar, por ejemplo, mediante un filtro de jeringa. El diámetro de partículas puede estar preferiblemente entre 2 y 5 nm.

Como la realización preferida, la presente invención proporciona un método para preparar una composición farmacéutica para eliminar de manera no quirúrgica el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, comprendiendo el método añadir fosfatidilcolina, y al menos uno seleccionada del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo,

en donde el al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo se añade con el mismo peso que la fosfatidilcolina o menos. Con respecto a estos ejemplos específicos, la composición específica del material, la relación de mezcla y similares se entienden con referencia a la descripción de la composición y preparación de la presente invención descritas anteriormente.

La presente invención también proporciona un método para eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de fosfatidilcolina; y al menos un agente solubilizante de fosfatidilcolina seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo, al sujeto que tiene el depósito de grasa localizada.

Es decir, en el método anterior, la fosfatidilcolina está contenida en una concentración de 0,625 a 15% (p/v) basada en la composición total en una solución inyectable farmacéuticamente aceptable (composición) para la administración de fosfatidilcolina, y preferiblemente en una concentración de 1,25 a 12,5% (p/v), y más preferiblemente en una concentración de 2,5 a 10,0% (p/v) en la composición. En este caso, la dosis unitaria de la composición para la administración de fosfatidilcolina puede ser de 500 ml, 400 ml, 300 ml, 200 ml, 100 ml, 90 ml, 80 ml, 70 ml, 60 ml, 50 ml, 40 ml, 30 ml , 20 ml, 10 ml, 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6, ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1 ml, 0,9 ml, 0,8 ml, 0,7 ml, 0,6 ml, 0,5 ml, 0,4 ml, 0,3 ml, 0,2 ml, 0,1 ml, 0,09 ml, 0,08 ml, 0,07 ml, 0,06 ml, 0,05 ml, 0,04 ml, 0,03 ml, 0,02 ml, 0,01 ml, 0,009 ml, 0,008 ml, 0,007 ml, 0,006 ml, 0,005 ml, 0,004 ml, 0,003 ml, 0,002 ml, 0,001 ml, 0,0009 ml, 0,0008 ml, 0,0007 ml, 0,0006 ml, 0,0005 ml, 0,0004 ml, 0,0003 ml, 0,0002 ml ai ^{b z .}

0,0001 ml o menos. Específicamente, la dosis unitaria (dosificación unitaria) de la composición para administrar fosfatidilcolina en la zona afectada puede ser de 0,1 ml a 500 ml, preferiblemente de 1 ml a 200 ml, y más preferiblemente de 1 ml a 100 ml del volumen total.

En el método anterior, el agente solubilizante de fosfatidilcolina y la fosfatidilcolina pueden administrarse en una relación molar (agente solubilizante/fosfatidilcolina) de 0,7 a 3,0, más preferiblemente de 0,7 a 2,60, lo más preferiblemente de 0,7 a 1,73.

La fosfatidilcolina y el agente solubilizante de fosfatidilcolina pueden administrarse simultánea o secuencialmente. Por ejemplo, cuando cada componente contenido en la composición farmacéutica de la presente invención es una composición simple, se pueden administrar simultáneamente. Si la composición no es una composición simple, un componente puede administrarse antes o después de la administración del otro componente en el plazo de unos pocos minutos. Preferiblemente, el agente solubilizante de fosfatidilcolina y la fosfatidilcolina pueden administrarse simultáneamente. Ya sea o no que cada componente se administre simultánea o secuencialmente, se prefiere que cada uno de estos componentes esté contenido en una solución inyectable farmacéuticamente aceptable (composición), y la composición que comprende cada componente no sigue necesariamente la composición de la presente invención descrita anteriormente, y puede emplearse un método en el que el resultado de la administración a un sujeto satisface la relación molar de cada componente.

En el método, al menos uno seleccionado del grupo que consiste en el agente isotónico y el regulador de pH puede administrarse simultánea o secuencialmente con la fosfatidilcolina y/o el agente solubilizante de fosfatidilcolina. Las concentraciones específicas de estos componentes y similares pueden entenderse con referencia a la descripción anterior en esta memoria descriptiva.

La administración puede ser preferiblemente una inyección directa en un sitio donde se ha producido un depósito (acumulación) de grasa localizada, y la inyección incluye preferiblemente inyección subcutánea, inyección intradérmica y similares.

El sujeto es preferiblemente un mamífero. Dichos mamíferos incluyen seres humanos o primates (p. ej., monos, chimpancés, etc.), animales domésticos (p. ej., perros, gatos, caballos, etc.), animales de granja (p. ej., cabras, ovejas, cerdos, vacas, etc.) o animales de laboratorio (p. ej., ratones, ratas, etc.). El sujeto también puede ser una célula, tejido, órgano o similar derivado de un animal. Preferiblemente, puede ser un ser humano que necesite eliminar el depósito (acumulación) de grasa localizada y la eliminación incluye fines tanto cosméticos como terapéuticos. Así pues, un ejemplo puede ser un paciente que necesite tratamiento para una afección patológica (enfermedad) debido a una deposición anormal de grasa localizada.

Por ejemplo, las composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar ciertas afecciones de la grasa en un paciente, que incluyen lipoma, prolapso, aterosclerosis, garganta de Madelung, edema labial, nódulo de fiozoospermia, cardioma amarillo, distrofia grasa y celulitis En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar afecciones de grasa en sitios tales como depósitos de grasa localizada debajo de los ojos, barbilla, brazos, caderas, pantorrillas, espalda, muslos, tobillos o abdomen de un mamífero.

El término "tratamiento" como se usa en el presente documento es un concepto que implica la inhibición, eliminación, alivio, mejora y/o prevención de una enfermedad, o síntoma o afección debido a la enfermedad.

La presente invención también se refiere a un método para reducir el depósito de grasa (especialmente grasa subcutánea) en mamíferos, en donde la presente invención se usa preferiblemente para la eliminación no quirúrgica del depósito de grasa localizada en un sujeto. Como ejemplo específico, el método no quirúrgico de la presente invención no comprende liposucción, operación lipoplástica o lipectomía subcutánea inhalada.

El método de la presente invención se caracteriza por que el dolor y los efectos secundarios se alivian (se reducen sustancialmente a un nivel de Ninguno), y se puede comprender una descripción detallada del dolor y los efectos secundarios con referencia a la descripción anterior.

Preferiblemente, presente invención proporciona un método para eliminar de forma no quirúrgica el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto que tiene un depósito de grasa localizada, comprendiendo el método administrar una preparación que comprende (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo. La preparación o composición contenida en la preparación utilizada en el presente método puede ser una composición simple o una preparación que sigue la composición de la presente invención descrita anteriormente. Como otros ejemplos, la preparación o composición contenida en la preparación no sigue necesariamente la composición de la presente invención descrita anteriormente, y se pueden emplear un método en el que el resultado de la administración a un sujeto cumpla la relación molar de (ii) a (i) de 0,7 a 3,0, preferiblemente de 0,7 a 2,60, lo más preferiblemente de 0,7 a 1,73.

Como el ejemplo preferido, la presente invención proporciona un método para eliminar de forma no quirúrgica el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto, comprendiendo el método administrar una preparación que comprende (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico, ácido taurocólico y la sal del mismo, al sujeto que tiene el depósito de grasa localizada,en donde una relación molar de (ii) a (i) en la preparación está en un intervalo de 0,7 a 3,0.

En el método anterior, la preparación se entiende en términos de composición, contenido y características, etc. con referencia a la descripción anterior en la memoria descriptiva de la presente invención, y el método para eliminar el depósito de grasa localizada de la presente invención comprende o consiste en administrar por vía tópica una dosis unitaria (cantidad total) de una o más de las composiciones o preparaciones descritas anteriormente en la memoria descriptiva de la presente invención en un sitio de depósito de grasa (zona afectada) del sujeto (mamíferos). Con respecto a la composición, la preparación y la dosis unitaria de la misma, se hará referencia a la descripción mencionada antes.

El método de la presente invención se refiere a un método para reducir el depósito de grasa subcutánea. Dichos métodos pueden comprender o consistir en administrar localmente una unidad de dosificación de una o más composiciones o preparaciones de la presente invención en un sitio de depósito de grasa en un mamífero.

La preparación se administra a un sujeto que lo necesite en una cantidad efectiva, la "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad que muestra un efecto de reducción de grasa localizada (incluido el efecto de mejora, tratamiento, prevención de la enfermedad por depósito de grasa). En general, la cantidad total administrada, la dosis unitaria y el número de tratamientos variarán dependiendo de la cantidad de grasa en el sitio objetivo, la ubicación del sitio objetivo, la forma de composición de la grasa y el resultado deseado. Generalmente, cuanto mayor sea la cantidad de grasa a tratar, mayor será la cantidad administrada. Dado que la cantidad de la composición de la presente invención que constituye la "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo del estado de la enfermedad y su gravedad, la edad del paciente a tratar, etc., la cantidad terapéuticamente eficaz no se limita a la cantidad descrita en el presente documento, y puede ser determinada de forma rutinaria por un experto en la técnica.

El método de administración anterior se entiende con referencia a la descripción anterior y, como ejemplo preferible, puede administrarse por vía percutánea o subcutánea a través de una inyección subcutánea usando una jeringa en un sitio objetivo. El sitio objetivo puede ser, por ejemplo, de 0,1 cm * 0,1 cm a aproximadamente 5 cm * 5 cm. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse en el mismo sitio objetivo, adyacente o cerca del sitio, a varios intervalos, dosis y cantidades descritas en el presente documento.

Efectos ventajosos

La composición inyectable para reducir el depósito de grasa localizada de la presente invención que comprende ácido taurocólico o ácido glicocólico (o una de sus sales) y fosfatidilcolina (PPC) en una relación de mezcla específica tiene una formulación estable y segura, y tiene un gran efecto de lipólisis específica de adipocitos y apoptosis específica de adipocitos sin necrosis de adipocitos que es producida por la preparación de PPC convencional que comprende DCA (tal como Lipostabil®) y la preparación que comprende ^dC^asolo (tal como Kybella). Por lo tanto, el efecto de reducción de adipocitos sin efectos secundarios, tales como dolor, edema, parestesia, hinchazón extensa, eritema, induración, parestesia, nódulo, prurito, sensación de ardor y necrosis de células musculares, fibroblastos y células endoteliales vasculares distintas de los adipocitos, es excelente.

Breve descripción de los dibujos

Las FIGS. 1A y 1B muestran una serie de imágenes en las que se dispersa PPC sin adición de un agente solubilizante con un agitador y un homogeneizador de alta presión. La FIG. 1A muestra las imágenes de la composición, en donde las imágenes se obtuvieron inmediatamente después de añadir solo 5% (p/v) de PPC al agua para inyección seguido de agitación durante 72 horas con un agitador, y obtenidas 1 día después de la agitación final. La FIG. 1B muestra las imágenes de composición, en donde las imágenes se obtuvieron inmediatamente después de añadir varias concentraciones (0,625% (p/v), 1,25% (p/v), 2,5% (p/v), 5,0% (p/v), 7,5% (p/v), 10,0% (p/v) desde la izquierda) de PPC al agua para inyección seguido de agitación durante 1 hora y dispersión en un homogeneizador de alta presión, y obtenidas a los 7 días y 30 días después de la preparación de la composición.

Las FIGS. 2A a 2J muestran una serie de imágenes de la composición de PPC al 5,0% solubilizada con varias concentraciones de DCA, GCA, TCA, CA, CDCA, UDCA, GDCA, TDCA, HDCA y TUDCA

que muestran la estabilidad de la formulación, en donde las imágenes se obtuvieron inmediatamente después y a los 30 días de la preparación de la composición.

La FIG. 2A muestra la propiedad de la formulación por concentración en % (p/v) de ácido desoxicólico (DCA) basado en PPC al 5% (p/v).

La FIG. 2B muestra la propiedad de la formulación por concentración en % (p/v) de ácido glicocólico (GCA) basado en PPC al 5% (p/v).

La FIG. 2C muestra la propiedad de la formulación por concentración en % (p/v) de ácido taurocólico (TCA) basado en PPC al 5% (p/v).

La FIG. 2D muestra la propiedad de la formulación por concentración en % (p/v) de ácido cólico (CA) basado en PPC al 5% (p/v).

La FIG. 2E muestra la propiedad de la formulación por concentración en % (p/v) de ácido quenodesoxicólico (CDCA) basado en P^pC al 5% (p/v).

La FIG. 2F muestra la propiedad de la formulación por concentración en % (p/v) de ácido ursodesoxicólico (UDCA) basado en PPC al 5% (p/v).

La FIG. 2G muestra la propiedad de la formulación por concentración en % (p/v) de ácido glicodesoxicólico (GDCA) basado en PPC al 5% (p/v).

La FIG. 2H muestra la propiedad de la formulación por concentración en % (p/v) de ácido taurodesoxicólico (TDCA) basado en PPC al 5% (p/v).

La FIG. 2I muestra la propiedad de la formulación por concentración en % (p/v) de ácido hiodesoxicólico (HDCA) basado en PPC al 5% (p/v).

La FIG. 2J muestra la propiedad de la formulación por concentración en % (p/v) de ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) basado en PPC al 5% (p/v).

La FIG. 3A y 3B muestran un ejemplo de ácidos biliares que no pueden solubilizar la PPC y una descripción de la preparación compleja de PPC solubilizada con varias concentraciones de GCA. La FIG. 3A muestra una imagen de la composición compleja de PPC solubilizada con ácido litocólico (LCA), y fue imposible preparar micelas mixtas. La FIG. 3B muestra una imagen de la composición compleja de PPC solubilizada con ácido deshidrocólico (DHCA), y fue imposible preparar micelas mixtas.

Las FIGS. 4A a 4Q muestran gráficos que muestran el resultado del ensayo de edema en el que se midió el nivel de edema (el espesor de patas de ratas (mm)) inmediatamente después y 1 hora y 2 horas después de inyectar 0,1 ml de una composición simple de PPC, composiciones simples de varias sales biliares (DCA, HDCA, UDCA, TDCA, G^dC^a, CDCA, CA, GCA, TCA y TUDCA), composiciones complejas de varias concentraciones de PPC solubilizada con ácido biliar (DCA, GCA, TCA, etc.) y PBS (espesor de pata de rata (mm)) en las patas de ratas. El ensayo se repitió 4 veces por tratamiento y se realizó con un calibrador. A continuación, el % se refiere a % (p/v).

La FIG. 4A muestra los resultados de comparación del edema después de inyección de varias concentraciones de composición simple de PPC (1,25-15,0%) y composición simple de DCA al 1%.

La FIG. 4B muestra los resultados de comparación del edema después de inyección de varias concentraciones de composición simple de DCA (1,0-7,5%).

La FIG. 4C muestra los resultados de comparación del edema después de inyección de varias concentraciones de composición simple de HDCA (1,0-7,5%) y composición simple de DCA al 1%.

La FIG. 4D muestra los resultados de comparación del edema después de inyección de varias concentraciones de composición simple de UDCA (1,0-7,5%) y composición simple de DCA al 1%

La FIG. 4E muestra los resultados de comparación del edema después de inyección de varias concentraciones de composición simple de TDCA (1,0-7,5%) y composición simple de DCA al 1%.

La FIG. 4F muestra los resultados de comparación del edema después de inyección de varias concentraciones de composición simple de GDCA (1,0-7,5%) y composición simple de DCA al 1%.

La FIG. 4G muestra los resultados de comparación del edema después de inyección de varias concentraciones de composición simple de CDCA (1,0-7,5%) y composición simple de DCA al 1%.

La FIG. 4H muestra los resultados de comparación del edema después de inyección de varias concentraciones de composición simple de CA (1,0-7,5%) y composición simple de DCA al 1%.

La FIG. 4I muestra los resultados de comparación del edema después de inyección de varias concentraciones de composición simple de GCA (1,0-7,5%) y composición simple de DCA al 1%.

La FIG. 4J muestra los resultados de comparación del edema después de inyección de varias concentraciones de composición simple de TCA (1,0-7,5%) y composición simple de DCA al 1%.

La FIG. 4K muestra los resultados de comparación del edema después de la inyección de varias concentraciones de composición simple de TUDC^a(1,0-7,5%) y composición simple de ^dC^aal 1%.

La FIG. 4L muestra los resultados de la comparación del edema a las 2 horas después de inyección de composición simple de PPC al 5,0% y composiciones simples de sales biliares en una concentración necesaria para solubilizar la PPC (típicamente aproximadamente 2,5%, pero es adecuado 3% para UDCD y 4% para TUDCA).

La FIG. 4M muestra los resultados de comparación del edema a las 2 horas después de inyección de composiciones simples de ácidos biliares en una concentración necesaria para solubilizar la PPC y composición compleja de PPC al 5,0% solubilizada con los ácidos biliares respectivos anteriores.

La FIG. 4N muestra los resultados de la comparación del edema después de inyección de composición compleja de PPC (2,5%-15,0%) solubilizada con varias concentraciones de GCA (1,25-7,5%) y composición simple de DCA al 1%.

La FIG. 4O muestra los resultados de la comparación del edema después de la inyección de composición compleja de PPC (2,5%-15,0%) solubilizada con varias concentraciones de TCA (1,25-7,5%) y composición simple de DCA al 1%.

La FIG. 4P muestra los resultados de comparación del edema después de inyección de una composición compleja de PPC al 5,0% solubilizada con varias concentraciones de GCA (2,5-25%).

La FIG. 4Q muestra los resultados de comparación del edema después de inyección de una composición compleja de PPC al 5,0% solubilizada con varias concentraciones de TCA (2,5-25%).

Las FIGS. 5A a 5F muestran una serie de imágenes del sitio de administración, en donde las imágenes se tomaron 2 horas después de inyectar 1,0 ml de composición simple de PPC (1,25-15,0%) y PBS (FIG. 5A), composiciones simples de varios tipos de sales biliares (DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA, CA, GCA, TCA y TUDCA) en concentraciones de 1,0-7,5% (FIG. 5B y 5C), composiciones complejas de PPC al 5,0% solubilizada con varios tipos de sales biliares (FIG. 5D), composiciones complejas de PPC (2,5-15,0%) solubilizada con GCA (1,25-7,5%) (FIG. 5E) o composiciones complejas de PPC (5,0%) solubilizada con GCA (2,5-20,0%) (FIG. 5F) en las patas de ratas. Las imágenes de las patas se tomaron utilizando una escala de 4 x 4 cm.

Las FIGS. 6A a 6F muestran una serie de imágenes de ensayo histológico. Las ratas se sacrificaron 3 horas después de inyectar 1,0 ml de composición simple de PPC (1,25-15,0%) y PBS (FIG. 6A), composición simple de varios tipos de sales biliares (Dc A, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA, CA , GCA, TCA y TUDCA) a concentraciones de 1,0-7,5% (FIG. 6B y 6C), composiciones complejas de PPC al 5,0% solubilizadas con varios tipos de sales biliares (FIG. 6D), composiciones complejas de PPC (2,5-15,0%) solubilizadas con GCA (1,25-7,5%) (FIG. 6E) o composiciones complejas de PPC (5,0%) solubilizadas con GCA (2,5-20,0%) (FIG.

6F). La zona inyectada se cortó, se fijó con formalina al 10% y luego se sometió a examen histológico usando un microscopio óptico. La tinción con H y E demuestra inflamación de las patas tratadas (aumento de 200 *).

Las FIGS. 7A a 7I muestran una serie de imágenes que demuestran la disminución de la viabilidad de los adipocitos 3T3-L1 tratados con los materiales de ensayo. La viabilidad de los adipocitos se midió mediante el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). El experimento se repitió 3 veces por tratamiento y los resultados se expresaron como el porcentaje total de células viables frente al control no tratado. A las 24 horas (FIG. 7A), 48 horas (FIG. 7B), 72 horas (FIG. 7C) y 96 horas (FIG. 7D) después del tratamiento con composición simple de PPC (0,3125-15,0%), composición compleja de PPC (0,3125-15,0%) solubilizada con Tu Dc A (0,25-12,0%), composición compleja de Pp C (0,3125-15,0%) solubilizada con Tc A (0,1563-7,5%) o composición compleja de PPC (0,3125-15,0%) solubilizada con GCA (0,1563-7,5%) en adipocitos 3T3-L1 diferenciados, se midió la viabilidad de los adipocitos.

La FIG. 7E muestra un gráfico que demuestra la viabilidad de los adipocitos a las 96 horas después del tratamiento con DCA (1,0%) y PpC (5,0%) como composiciones simples, y PPC (5,0%)+GCA (2,5%), PPC (5,0~15,0%)+TCA (2,5~7,5%) y PPC (5,0~15,0%)+TUDCA (4,0~12,0%) como composiciones complejas.

Las FIGS. 7F a 7H muestran gráficos que demuestran la viabilidad de los adipocitos a las 96 horas después del tratamiento con PPC (2,5-10,0%), DCA (1,1~4,4%) y GCA (1,25~5,0%) como composiciones simples y PPC (2,5~10,0%)+GCA (1,25~5,0%) y PPC (2,5~10,0%)+DCA (1,1~4,4%) como composiciones complejas.

La FIG. 7I muestra un gráfico que demuestra la viabilidad de los adipocitos a las 96 horas después del tratamiento con la composición simple de PPC (5,0%) y composición compleja de PPC (5,0%) solubilizada con varias concentraciones de GCA (2,5-8,75%).

Las FIGS. 8A a 8D muestran una serie de imágenes que demuestran la disminución de la viabilidad de las células del músculo esquelético (FIG. 8A), fibroblastos normales (FIG. 8B), células endoteliales vasculares (FIG. 8C) y adipocitos 3T3-L1 (FIG. 8D) tratados con composición simple de PPC al 5,0% y composiciones complejas de PPC solubilizada con ácidos biliares (PPC al 5,0%+GCA al 2,5%, PPC al 5,0%+TCA al 2,5%, PPC al 5,0%+TUDCA al 4,0%, PPC al 5,0%+DCA al 2,2%, PPC al 5,0%+HDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+UDCA al 3,0%, PPC al 5,0%+TDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+GDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+CDCA al 2,5% y PPC al 5,0%+CA al 2,5%). La viabilidad de las células se midió mediante el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). El experimento se repitió 3 veces por tratamiento y los resultados se expresaron como el porcentaje total de células viables frente al control no tratado.

Las FIGS. 9A y 9B muestran el estado antes (FIG. 9A) y después (FIG. 9B) de la diferenciación de los adipocitos 3T3-L1. La diferenciación de los adipocitos precursores de 3T3-L1 (imagen de la izquierda) se indujo utilizando un medio de diferenciación. Los adipocitos diferenciados (imagen de la derecha) se tiñeron usando el método de tinción con rojo aceite y se tiñeron con un aumento de 200X.

Las FIGS. 10A a 10D muestran una serie de imágenes que demuestran el resultado de que la composición inyectable de la presente invención tiene específicamente efecto de apoptosis, no necrosis de adipocitos, por medio del ensayo de actividad de caspasa 3 y los efectos de lipólisis por medio de la medición de la liberación de glicerol.

Las FIGS. 10A y 10B muestran el resultado de la actividad de caspasa 3. Los adipocitos 3T3-L1 se sembraron en placas a 1 * 105 células en cada pocillo y las preparaciones contenían PPC al 5,0%, PPC al 5,0%+DCA al 2,2%, PPC al 5,0%+GCA al 2,5%, PPC al 5,0%+GCA al 5,0%, DCA al 1,0% o GCA (1,0~5,0%) y control de PBS se incubaron durante 0-48 horas a 37°C (repetido 3 veces). Luego, se midió el resultado a una longitud de onda de 405 nm con un espectrofotómetro, después de 24 horas (FIG. 10A) y de 48 horas (FIG. 10B).

Las FIGS. 10C y 10D muestran el resultado de la liberación de glicerol. El tratamiento de cada material de ensayo se llevó a cabo de la misma manera que en las FIGS. 10A y 10B. Los adipocitos tratados con el material se cultivaron a 37°C durante 0-48 horas para inducir la lipólisis. Después de incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, se midió la DO570 con un espectrofotómetro (repetido 3 veces).

Las FIGS. 11A a 11D muestran las imágenes que demuestran los cambios histológicos observados en la almohadilla de grasa del ratón al que se administró el material de ensayo. La FIG. 11A muestra el resultado de la inyección de composición simple de PPC (2,5-15,0%).

La FIG. 11B muestra el resultado de la inyección de PBS, Isuprel o DCA al 1,0% como composiciones simples y PPC al 5,0%+DCA al 2,2%, PPC al 5,0%+CDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+HDCA al 2,5% o PPC al 5,0%+UDCA al 3,0% como composiciones complejas.

La FIG. 11C muestra el resultado de la inyección de PPC al 5,0%+GDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+TDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+CA al 2,5%, PPC al 5,0%+GCA al 2,5%, PPC al 5,0%+TCA al 2,5% o PPC al 5,0% TUDCA al 4,0% como composiciones complejas.

La FIG. 11D muestra el resultado de la inyección de PBS, PPC al 5,0% o GCA al 2,5% como composiciones simples y PPC (2,5~10,0%) GCA (1,25~5,0%) como composiciones complejas.

Después de la inyección, se hizo una incisión en el tejido adiposo del sitio de administración. El tejido cortado se fijó con formaldehído, se impregnó en bloques de parafina y luego se fragmentó sobre un portaobjetos. Se observaron necrosis tisular, apoptosis y degradación mediante tinción con HyE.

Las FIGS. 12A a 12C muestran las imágenes de los resultados de la administración subcutánea de una dosis única de la composición compleja de PPC GCA a un perro, beagle, con el fin de observar la reacción tóxica. Después de 14 días de la administración, se llevó a cabo la autopsia para el examen histopatológico y se tomaron imágenes después de la tinción con HyE.

La FIG. 12A muestra el resultado del grupo de administración de dosis baja (composición compleja de PPC (90 mg/kg) GCA (50,4 mg/kg), la FIG. 12b muestra el resultado del grupo de administración de dosis media (composición compleja de PPC (180 mg/kg) GCA (100,8 mg/kg), y la FIG. 12C muestra los resultados del grupo de administración de dosis alta (composición compleja de PPC de (360 mg/kg) GCA (201,6 mg/kg)) para los beagle hembras y machos.

Las FIGS. 13A y 13B muestran los resultados de evaluar el grado de inducción de dolor in vivo midiendo la distancia de movimiento (cm) y la velocidad de movimiento (cm/s) de animales de experimentación. Específicamente, se inyectaron 100 μl de cada material de ensayo en la almohadilla de las patas de las ratas y se observó edema. Como resultado, se confirmó que el edema más grave se observó a las 2 horas después de la inyección, y este punto de tiempo se fijó para el dolor máximo. El movimiento antes y después de la inyección del material de ensayo se comparó mediante la distancia y el tiempo. El movimiento antes y después de la inyección se midió usando el sistema Noldus Video T raking y se comparó con la distancia de movimiento (FIG. 13^a) y la velocidad de movimiento (FIG. 13B).

La FIG. 14A y 14B muestran los resultados de eficacia de la reducción de la grasa submentoniana en el sujeto que recibió la composición compleja de PPC solubilizada con el GCA de la presente invención. Después de la anestesia tópica con pomada de lidocaína al 9,6% en el sitio de administración (submentoniano), se inyectaron 10 ml de la composición inyectable compleja de PPC al 5,0% GCA al 2,8% (PPC 500 mg Gc A 280 mg) 6 veces en intervalos de 4 semanas en la grasa submentoniana (total de 50 puntos, 0,2 cc por punto, intervalo de 1,0 cm, una profundidad de 6-8 mm y usando una aguja de inyección de 30 G de 13 mm). Después de 12 semanas, se tomaron las series de imágenes. FIG. 14A es la imagen tomada por un método de fotografía clínica estándar, y la FIG. 14B es la serie de imágenes que muestran una reducción en el espesor de la grasa submentoniana en la TC.

Las FIGS. 15A a 15C muestran el resultado que compara el dolor, edema y los ejemplos dañinos después de administrar la composición compleja de PPC solubilizada con GCA a 6 sujetos que habían experimentado la inyección de la composición inyectable de PPC solubilizada con DCA. Los materiales de ensayo eran 10 ml de solución en la que se diluyó Lipobean i.v. (PPC 50,0 mg DCNa 24,0 mg en 1 ml) con solución salina inyectable al 0,9% en una relación de 1:1 (es decir, PPC 25,0 mg+DCNa 12,0 mg), 10 ml de PPC al 5,0% solubilizada con GCA al 2,8% (PPC 50,0 mg+GCA 28,0 mg en 1 ml) y 10 ml de PPC al 5,0% solubilizada con GCA al 4,0% (PPC 50,0 mg+GCA 40,0 mg en 1 ml). Cada material de ensayo se inyectó en la grasa submentoniana (total de 50 puntos, 0,2 cc por punto, intervalo de 1,0 cm, una profundidad de 6-8 mm y una aguja de inyección 30 G de 13 mm), y los cuestionarios se realizaron en los tiempos de 1, 3, 7 y 10 días después de la administración de cada material.

La FIG. 15A muestra el grado de dolor medido con VAS de dolor de 100 mm, la FIG. 15B muestra el grado de edema según la escala de grado de edema (0: no-0 mm, 1: leve-2 mm, 2: moderado-4 mm, 3: grave-6 mm, 4: extremadamente grave-8 mm)), y la FIG. 15C muestra los ejemplos dañinos que incluyen hinchazón extensa, hematoma, cardenales, eritema, nódulo y prurito en el sitio de administración de 5 grados (0: ausente, 1: leve, 2: moderado, 3: grave, 4: extremadamente grave).

La FIG. 16 muestra las imágenes que comparan la lesión cutánea (eritema, cardenal y hematoma) tras la administración de la solución en la que se diluyó Lipobean i.v. (PPC 50,0 mg+DCNa 24,0 mg en 1 ml) con solución salina inyectable al 0,9% en una relación 1:1 (es decir, PPC 25,0 mg DCNa 12,0 mg en 1 ml de la solución) o composición compleja de PPC solubilizada con GCA (PPG 50 mg GCA 40 mg en 1 ml). Después de la anestesia tópica con pomada de lidocaína al 9,6% en el sitio de administración (debajo del mentón) durante 30 minutos, se administraron 50 ml de cada material de ensayo en la capa de grasa subcutánea del costado (total de 100 puntos, 0,5 cc por punto, intervalo de 1,5 cm, una profundidad de 10-12 mm, y utilizando una aguja de inyección 30 G de 13 mm). Las imágenes se tomaron 2 días después de la administración. En el sitio de administración de la preparación inyectable de PPC solubilizada con DCA, se observaron lesiones cutáneas tales como eritema, cardenal y hematoma a lo largo de la región de dispersión del fármaco. Sin embargo, la preparación inyectable compuesta compleja de PPC solubilizada con GCA de la presente invención mostró solo hematoma y cardenal causados por la invasión de la aguja.

Modo de llevar a cabo la invención

En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, los siguientes ejemplos son simplemente para ilustrar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.

Material

Los materiales añadidos a la preparación de las composiciones inyectables de la presente invención y las composiciones comparativas son los siguientes:

Fosfatidilcolina (PPC, S-100, LIPOID GmbH, 784 g/mol basado en oleoil-linoleoil-glicero-fosfocolina), ácido cólico (ácido glicocólico, CA, pharm de Nueva Zelanda), ácido desoxicólico (DCA, Sigma-Aldrich), desoxicolato de sodio (DCNa, Pham de Nueva Zelanda), ácido glicocólico (GCA, Pham de Nueva Zelanda), glicocolato de sodio (GCNa, Pham de Nueva Zelanda), ácido taurocólico (TCA, Sigma-Aldrich), taurocolato de sodio (TCNa, Pham de Nueva Zelanda), ácido quenodesoxicólico (CDCA, Sigma-Aldrich), ácido urosodesoxicólico (UDCA, Sigma-Aldrich), ácido glicodesoxicólico (GDCA, Sigma-Aldrich), ácido taurodesoxicólico (TDCA, Sigma-Aldrich), ácido hiodesoxicólico (HDCA, Sigma-Aldrich), ácido litocólico (LCA, Sigma-Aldrich), ácido dihidrocólico (DHCA, Sigma-Aldrich), ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA, Tokyo Chemical Industry), alcohol bencílico (Sigma-Aldrich, 0,9% en p/v), cloruro de sodio (Sigma-Aldrich, 0,44% en p/v), hidróxido de sodio (Sigma-Aldrich, 0,04-0,76% en p/v), ácido clorhídrico (Sigma-Aldrich, 0,001-0,6% en p/v) y agua para inyección. De los materiales añadidos, el agente isotónico (cloruro de sodio) se usó de tal manera que se añadió junto con alcohol bencílico en los ejemplos y ejemplos comparativos.

Dispositivos de análisis

Los dispositivos utilizados en el análisis de las composiciones inyectables de la presente invención y las composiciones comparativas son los siguientes.

El tamaño de partículas se midió utilizando un analizador de tamaño de nanopartículas (Microtrac Wave, MICROTRACT, EE. UU.). La separación de capas debido a la precipitación se observó con una cámara (Nikkon, D5200, lente AF-P DX NiKKOR 18-55 mm f/3,5-5,6G v R). La transparencia se midió utilizando un espectrofotómetro (CM-3600d, KONICA MINOLTA, JAPÓN). El pH se midió con un medidor de pH (ST3100, OHAUS, ALEMANIA), y la isotonicidad se midió con un medidor de presión osmótica (Vapro 5600, Elitech Group, Tokio, Japón) y la viscosidad se analizó con un viscosímetro (Digital Viscometer CL- 2, CAS, Corea).

Las composiciones de la presente invención (ejemplos) y las composiciones comparativas (ejemplos comparativos) como preparación a base de PPC para reducir la grasa localizada según el tipo de agente solubilizante se prepararon como sigue. En lo que sigue, el % de la composición significa % (p/v).

Ejemplo comparativo 1: Preparaciones inyectables simples de PPC

La composición simple de fosfatidilcolina sin agente solubilizante (concentración de PPC 0,313 ~ 15,0%) se preparó como sigue. Usando un homogeneizador de alta presión, se prepararon composiciones inyectables que comprendían PPC 3,125 mg (0,3125%), 6,25 mg (0,625%), 12,5 mg (1,25%), 25,0 mg (2,5%), 50,0 mg (5,0%), 75,0 mg (7,5%), 100,0 mg (10,0%), 125,0 mg (12,5%) o 150,0 mg (15,0%), respectivamente, y alcohol bencílico 9 mg (0,9%) en 1 ml. Y los resultados representativos de estas se muestran en la Tabla 1 a continuación. En lo sucesivo, el % en p/v de la composición se expresa como %.

El método de preparación específico es el siguiente. El tanque de preparación lavado y esterilizado se cargó con el agua para inyección (a temperatura ambiente) y se añadieron fosfatidilcolina (PPC) y alcohol bencílico, y la mezcla se agitó a 200 RPM durante 2 horas en condiciones de presión de nitrógeno, oscurecimiento y temperatura ambiente. Una vez finalizada la agitación, la mezcla se transfirió a un homogeneizador de ultra alta presión (Nano Disperser NLM100, Ilshin Autoclave, Corea) con presión de nitrógeno. Se llevó a cabo una homogeneización (dispersión) a ultra alta presión a 843,7 kg/cm2 (12.000 psi) durante 7 ciclos, y las partículas se pulverizaron finamente. Después, se ajustó el pH. Después de la filtración a través de un filtro de 0,2 μm, el vial se llenó y se selló.

Tabla. 1 Preparaciones simples inyectables de PPC dispersas con homogeneizador de alta presión

_________

Como se muestra en la FIG. 1A, la composición de PPC al 5,0% sin el agente solubilizante tenía un aspecto turbio inmediatamente después de agitar durante 24 a 72 horas. A 1 día después de la agitación final, la composición tenía una estabilidad de formulación mala debido a que el PPC no se dispersaba en el agua para inyección y el uso industrial era limitado. Además, como se muestra en la FIG. 1B y la Tabla 1, la descripción de la composición en la que se dispersó de 0,625 a 10,0% de PPC con un homogeneizador de alta presión sin la adición de un agente solubilizante presentó una ligera turbidez o turbidez dependiendo de la concentración, y el tamaño de partículas era de sistema de liposomas de 17,16 ± 5,88 a 16,69 ± 4,51 nm, y se dispersó de forma inestable. Como resultado de la observación de las propiedades a los 30 días después de la preparación, se confirmó que la PPC precipitaba y no se dispersaba en el agua para inyección a una concentración de 2,5% o más y no era adecuada como preparación inyectable industrial debido a la baja estabilidad de la formulación. (FIG. 1B)

Con el fin de obtener una composición inyectable de una solución transparente de una estructura de micelas en la que la PPC se dispersara de manera estable en un tamaño de partículas de 10 nm o menos, se preparó una composición compleja de PPC por solubilización con varios ácidos biliares (BA) tales como DCA, ^cA, G^cA, TCA, c Dc A, UDCA, GDCA, TDCA, HDCA, LCA, DHCA y TUDCA en diversas concentraciones. Y sus composiciones se muestran en detalle en los siguientes Ejemplos comparativos y Ejemplos.

Ejemplo comparativo 2: Preparaciones inyectables de PPC solubilizada con DCA

Como se muestra en la Tabla 2 a continuación, se prepararon composiciones a base de fosfatidilcolina (PPC al 5,0%) solubilizada con ácido desoxicólico (DCA), el mismo que la composición de la formulación Lipostabil® previamente conocida y similares, mediante la adición de 50,0 mg de p Pc (5,0%) y 10,0 mg (1,0%), 15,0 mg (1,5%), 20,0 mg (2,0%), 21,0 mg (2,1%), 22,0 mg (2,2%), 23,0 mg (2,3%), 24,0 mg (2,4%), 25,0 mg (2,5%) o 30,0 mg (3,0%) de DCA respectivamente, y la adición de 9 mg de alcohol bencílico (0,9%) en 1 ml. Específicamente, el agua para inyección se puso en el tanque de preparación que se había limpiado y esterilizado (temperatura ambiente) y se añadió hidróxido de sodio al agua para inyección. Luego se añadieron ácido desoxicólico y alcohol bencílico, se agitaron y disolvieron. Luego, se le añadió fosfatidilcolina y la mezcla se agitó a 200 RPM durante aproximadamente 24 horas con oscurecimiento, sellado, temperatura ambiente (25°C) y presión de nitrógeno. Una vez completada la agitación, se ajustó el pH (si era necesario, con hidróxido de sodio o ácido clorhídrico adicional) y se filtró a través de un filtro de 0,2 μm, y se cargó en el vial y se selló. La Tabla 2 muestra las propiedades de la preparación inyectable de PPC solubilizada con varias concentraciones de DCA.

La estabilidad de la formulación de la preparación inyectable de PPC solubilizada con ácido desoxicólico (DCA) se evaluó inmediatamente después de la preparación y 30 días después de la preparación (después de reposar a temperatura ambiente), y los resultados de la evaluación se muestran en la FIG. 2A. Se observó una formulación farmacéutica estable cuando se añadió DCA al 2,1% o más para PPC al 5%, y la composición mostró propiedades de solución transparente (clara) (Ejemplos Comparativos 2-4 a 2-9). En los Ejemplos Comparativos 2-1 a 2-3 se observó una formulación inestable debido al fenómeno de precipitación. Basándose en la comparación anterior, se concluyó que la preparación inyectable estable se puede preparar al 2,1% o más de ^dC^abasado en PPC al 5%. Particularmente, en los Ejemplos comparativos 2-1 a 2-3, el tamaño de partículas de fosfatidilcolina era de 50,80 ± 330,0 nm a 39,60 ± 26,14 nm, y se formó como una emulsión inestable o estructura liposómica que no es una estructura micelar. En los ejemplos comparativos 2-4 a 2-9, se formaron estructuras de micelas de 10 nm o menos. Como se describió anteriormente, una composición que tiene una relación molar de DCA a PPC (DCA/PPC) de menos de 0,87 se consideró que era inadecuada para la preparación inyectable porque no se produjo una formulación sustancialmente estable.

Ejemplo 1: Preparación de preparaciones inyectables de PPC solubilizada con GCA

Como se muestra en las Tablas 3 y 4 a continuación, se prepararon composiciones basadas en fosfatidilcolina (PPC) solubilizada con ácido glicocólico (GCA) añadiendo 50,0 mg de PPC (5,0%) y 10,0 mg (1,0%), 15,0 mg (1,5%), 20,0 mg (2,0%), 21,0 mg (2,1%), 22,0 mg (2,2%), 23,0 mg (2,3%), 24,0 mg (2,4%), 25,0 mg (2,5%), 26,0 mg (2,6%), 27,0 mg (2,7%), 28,0 mg (2,8%), 29,0 mg (2,9%), 30,0 mg (3,0%), 35,0 mg (3,5%), 40,0 mg (4,0%) o 45,0 mg (4,5%) de DCA respectivamente, y añadiendo 9 mg de alcohol bencílico (0,9%) en 1 ml. Específicamente, el agua para inyección se puso en el tanque de preparación que se había limpiado y esterilizado (temperatura ambiente) y se añadió hidróxido de sodio (0,04-0,72%) al agua para inyección. Luego se añadieron ácido glicocólico y alcohol bencílico, se agitaron y disolvieron. Luego, se le añadió fosfatidilcolina y la mezcla se agitó a 200 RPM durante aproximadamente 24 horas con oscurecimiento, sellado, temperatura ambiente (25°C) y presión de nitrógeno. Una vez completada la agitación, se ajustó el pH (si era necesario, con hidróxido de sodio o ácido clorhídrico al 0,001-0,6% adicional) y se filtró a través de un filtro de 0,2 um, y se cargó en el vial y se selló. Las Tablas 3 y 4 muestran las propiedades de la preparación inyectable de PPC solubilizada con varias concentraciones de GCA.

La estabilidad de la formulación de las composiciones inyectables de PPC solubilizada con ácido glicocólico (GCA) en las Tablas 3 y 4 se evaluó inmediatamente después de la preparación y 30 días después de la preparación (almacenamiento refrigerado). Los resultados de la evaluación se muestran en la FIG. 2B. Cuando se añadió GCA al 2,2% o más para PPC al 5,0%, se confirmó que la formulación era estable y que la composición mostraba propiedades de solución transparente (clara) (Ejemplos 1-1 a 1-12). En los Ejemplos comparativos 1-1 a 1-4, se confirmó que la formulación no era estable debido al fenómeno de precipitación. Los ejemplos 1-1 a 1-3 estaban ligeramente turbios inmediatamente después de la preparación, pero después de la filtración con un filtro de 0,2 μm, mostraron una propiedad transparente y, por lo tanto, se confirmó que podían usarse como preparación para inyección. Como resultado, se concluyó que se pueden hacer preparaciones inyectables estables con un GCA al 2,2% o más basado en PPC al 5,0%. El tamaño de partículas de las composiciones de los Ejemplos comparativos 1-1 a 1-4 estaba en un intervalo de 198,2 ± 721,0 nm a 28,2 ± 11,35 nm, es decir, la composición se dispersa como emulsión inestable o liposoma, por lo que se consideró que una no se produjo una formulación sustancialmente estable y no era adecuada para la preparación inyectable. Aparte de eso, las composiciones complejas de PPC (Ejemplos 1-1 a 1-12) con adición de GCA al 2,2% o más (relación molar GCA/PPC de 0,76 o más) estaban compuestas por una estructura de micela con un tamaño de 10 nm o menos y las composiciones complejas de PPC (Ejemplos 1-7 a 1-12) con adición de GCA al 2,8% o más (relación molar GCA/PPC de 0,97 o más) estaban compuestas por estructuras de micelas con un tamaño de 5 nm o menos y se encontró que eran adecuadas para la preparación inyectable.

Dado que la viscosidad de la composición compleja de PPC solubilizada con GCA aumenta en proporción con la concentración de PPC, se realizó un ensayo de viscosidad en varias composiciones. Específicamente, se investigaron las características de la composición compleja de PPC (2,5 ~ 20,0%) solubilizada con GCA (1,4 ~ 11,2%) y la composición compleja de PPC al 5,0% solubilizada con GCA (4,2 ~ 12,6%) basado en la concentración de GCA de 2,8% en la que la PPC al 5,0% se dispersa con un tamaño de partículas de 5 nm o menos. Se midieron 500 ml de cada una de las composiciones anteriores a temperatura ambiente (25°C) durante 3 minutos a 60 RPM después de montar el husillo N.° 1. Como resultado del ensayo, se confirmó que el tamaño de partículas era de 4,23 ± 1,69 a 1,37 ± 0,530 nm, y la transparencia (660 nm) se midió como 99,11 ± 0,77%. La Tabla 5 muestra las características de viscosidad de las preparaciones inyectables de PPC solubilizada con varias concentraciones de GCA. Basándose en la siguiente Tabla 5, se confirmó que cuando la PPC supera el 15% (p/v), es inadecuada para la administración debido a la alta viscosidad.

Tabla. 5

Ejemplo 2: Preparación de preparaciones inyectables de PPC solubilizada con TCA.

Como se muestra en las Tablas 6 y 7 a continuación, se prepararon composiciones basadas en fosfatidilcolina (PPC) solubilizada con ácido taurocólico (TCA) añadiendo 50,0 mg de PPC (5,0%) y 10,0 mg (1,0%), 15,0 mg (1,5%), 20,0 mg (2,0%), 21,0 mg (2,1%), 22,0 mg (2,2%), 23,0 mg (2,3%), 24,0 mg (2,4%), 25,0 mg (2,5%), 26,0 mg (2,6%), 27,0 mg (2,7%), 28,0 mg (2,8%), 29,0 mg (2,9%), 30,0 mg (3,0%), 35,0 mg (3,5%), 40,0 mg (4,0%) o 45,0 mg (4,5%) de TCA respectivamente, y añadiendo 9 mg de alcohol bencílico (0,9%) en 1 ml. El método de preparación específico es el mismo que el del Ejemplo 1 mencionado anteriormente. Las tablas 6 y 7 muestran las características de la preparación inyectable de PPC solubilizada con varias concentraciones de TCA.

La estabilidad de la formulación de las composiciones inyectables de PPC solubilizada con ácido taucólico (TCA) en las Tablas 6 y 7 se evaluó inmediatamente después de la preparación y 30 días después de la preparación (almacenamiento refrigerado), y los resultados de la evaluación se muestran en la FIG. 2C. Cuando se añadió TCA al 2,5% o más con respecto a PPC al 5,0%, se confirmó que la formulación era estable y que la composición mostraba propiedades de solución transparente (clara) (Ejemplos 2-1 a 2-9). En los Ejemplos comparativos 2-1 a 2-7, se confirmó que la formulación no era estable debido al fenómeno de precipitación. Los ejemplos 2-1 estaban ligeramente turbios inmediatamente después de la preparación, pero después de la filtración con un filtro de 0,2 μm, mostraron una propiedad transparente y, por lo tanto, se confirmó que podían usarse como preparación para inyección. Como resultado, se concluyó que se pueden hacer preparaciones inyectables estables con un TCA al 2,5% o más basado en PPC al 5,0%. El tamaño de partículas de las composiciones de los Ejemplos comparativos 2-1 a 2-7 estaba en un intervalo de 139,6 ± 126,14 nm a 146,1 ± 2908 nm, es decir, la composición se dispersa como emulsión inestable o liposoma, por lo que se consideró que no se producía una formulación sustancialmente estable y no era adecuada para la preparación inyectable. Aparte de eso, las composiciones complejas de PPC (Ejemplos 2-1 a 2-9) con adición de TCA al 2,5% o más (relación molar TCA/PPC de 0,78 o más) estaban compuestas por una estructura de micela con un tamaño de 10 nm o menos y las composiciones complejas de PPC (Ejemplos 2-4 a 2-9) con adición de TCA al 2,8% o más (relación molar TCA/PPC de 0,88 o más) estaban compuestas por estructuras de micelas con un tamaño de 5 nm o menos y se encontró que eran adecuadas para la preparación inyectable.

Ejemplo comparativo 3: Preparaciones inyectables de PPC solubilizada con CA

Como se muestra en la Tabla 8 a continuación, se prepararon composiciones basadas en fosfatidilcolina (PPC) solubilizada con ácido cólico (CA) añadiendo 50,0 mg de PPC (5,0%) y 10,0 mg (1,0%), 15,0 mg (1,5%), 20,0 mg (2,0%), 21,0 mg (2,1%), 22,0 mg (2,2%), 23,0 mg (2,3%), 24,0 mg (2,4%), 25,0 mg (2,5%) o 30,0 mg (3,0%) de CA respectivamente, y añadiendo 9 mg de alcohol bencílico (0,9%) en 1 ml. El método de preparación específico es el mismo que el del Ejemplo 1 mencionado anteriormente.

La estabilidad de la formulación de las composiciones inyectables de PPC solubilizada con ácido cólico (CA) en las Tablas 8 se evaluó inmediatamente después de la preparación y 30 días después de la preparación (almacenamiento refrigerado), y los resultados de la evaluación se muestran en la FIG. 2D. Cuando se añadió CA al 2,2% o más con respecto a la PPC al 5,0%, se confirmó que la formulación era estable y que la composición mostraba propiedades de solución transparente (clara) (Ejemplos comparativos 3-5 a 3-9). En los Ejemplos comparativos 3-1 a 3-4, se confirmó que la formulación no era estable debido al fenómeno de precipitación. El ejemplo comparativo 3-5 era casi transparente inmediatamente después de la preparación y después de la filtración con un filtro de 0,2 μm, mostró una propiedad transparente. Como resultado, se concluyó que se pueden hacer preparaciones inyectables estables con CA al 2,2% o más basado en PPC al 5,0%. El tamaño de partículas de las composiciones de los Ejemplos comparativos 3-1 a 3-4 estaba en un intervalo de 50,80 ± 330 nm a 583,00 ± 293 nm, es decir, la composición se dispersa como emulsión inestable o liposoma, pero los Ejemplos comparativos 3-5 a 3-9 estaban compuestos por una estructura de micelas con un tamaño de 10 nm o menos. Como se ha descrito anteriormente, se consideró que no se producía una formulación sustancialmente estable en la composición que tenía una relación molar CA/PPC inferior a 0,88, y no era adecuada para la preparación inyectable.

Ejemplo comparativo 4: Preparaciones inyectables de PPC solubilizada con CDCA

Como se muestra en la Tabla 9 a continuación, se prepararon composiciones basadas en fosfatidilcolina (PPC) solubilizada con ácido quenodesoxicólico (CDCA) añadiendo 50,0 mg de PPC (5,0%) y 10,0 mg (1,0%), 15,0 mg (1,5%), 20,0 mg (2,0%), 21,0 mg (2,1%), 22,0 mg (2,2%), 23,0 mg (2,3%), 24,0 mg (2,4%), 25,0 mg (2,5%) o 30,0 mg (3,0%) de CDCA respectivamente, y añadiendo 9 mg de alcohol bencílico (0,9%) en 1 ml. El método de preparación específico es el mismo que el del Ejemplo 1 mencionado anteriormente.

La estabilidad de la formulación de las composiciones inyectables de PPC solubilizada con ácido quenodesoxicólico (CDCA) en las Tablas 9 se evaluó inmediatamente después de la preparación y 30 días después de la preparación (almacenamiento refrigerado), y los resultados de la evaluación se muestran en la FIG. 2E. Cuando se añadió CDCA al 2,2% o más con respecto a la PPC al 5,0%, se confirmó que la formulación era estable y que la composición mostraba propiedades de solución transparente (clara) (Ejemplos comparativos 4-5 a 4-9). En los Ejemplos comparativos 4-1 a 4-4, se confirmó que la formulación no era estable debido al fenómeno de precipitación. Como resultado, se concluyó que se pueden hacer preparaciones inyectables estables con CA al 2,2% o más basado en PPC al 5,0%. El tamaño de partículas de las composiciones de los Ejemplos comparativos 4-1 a 4-4 estaba en un intervalo de 80,05 ± 280,0 nm a 35,73 ± 0,830 nm, es decir, la composición se dispersa como emulsión inestable o liposoma, pero los Ejemplos comparativos 4-5 a 4-9 estaban compuestos por una estructura de micelas con un tamaño de 10 nm o menos. Como se ha descrito anteriormente, se consideró que no se producía una formulación sustancialmente estable en la composición que tenía una relación molar CDCA/PPC inferior a 0,89, y no era adecuada para la preparación inyectable.

Ejemplo comparativo 5: Preparaciones inyectables de PPC solubilizada con UDCA

Como se muestra en la Tabla 10 a continuación, se prepararon composiciones basadas en fosfatidilcolina (PPC) solubilizada con ácido ursodesoxicólico (UDCA) añadiendo 50,0 mg de PPC (5,0%) y 10,0 mg (1,0%), 15,0 mg (1,5%), 25,0 mg (2,5%), 26,0 mg (2,6%), 27,0 mg (2,7%), 28,0 mg (2,8%), 29,0 mg (2,9%) o 30,0 mg (3,0%) de UDCA respectivamente, y añadiendo 9 mg de alcohol bencílico (0,9%) en 1 ml. El método de preparación específico es el mismo que el del Ejemplo 1 mencionado anteriormente.

La estabilidad de la formulación de las composiciones inyectables de PPC solubilizada con ácido ursodesoxicólico (UDCA) en las Tablas 10 se evaluó inmediatamente después de la preparación y 30 días después de la preparación (almacenamiento refrigerado), y los resultados de la evaluación se muestran en la FIG. 2F. Cuando se añadió UDCA al 2,7% o más con respecto a la PPC al 5,0%, se confirmó que la formulación era estable y que la composición mostraba propiedades de solución transparente (clara) (Ejemplos comparativos 5-6 a 5-9). En los Ejemplos comparativos 5-1 a 5-5, se confirmó que la formulación no era estable debido al fenómeno de precipitación. El ejemplo comparativo 5-6 era casi transparente inmediatamente después de la preparación y después de la filtración con un filtro de 0,2 μm, mostró una propiedad transparente. Como resultado, se concluyó que se pueden hacer preparaciones inyectables estables con UDCA al 2,7% o más basado en PPC al 5,0%. El tamaño de partículas de las composiciones de los Ejemplos comparativos 5 1 a 5-5 estaba en un intervalo de 289,0 ± 265,0 nm a 42,42 ± 250 nm, es decir, la composición se dispersa como emulsión inestable o liposoma, pero los Ejemplos comparativos 5-6 a 5-9 estaban compuestos por una estructura de micelas con un tamaño de 10 nm o menos. Como se ha descrito anteriormente, se consideró que no se producía una formulación sustancialmente estable en la composición que tenía una relación molar UDCA/PPC inferior a 1,12, y no era adecuada para la preparación inyectable.

Ejemplo comparativo 6: Preparaciones inyectables de PPC solubilizada con GDCA

Como se muestra en la Tabla 11 a continuación, se prepararon composiciones basadas en fosfatidilcolina (PPC) solubilizada con ácido glicodesoxicólico (GDCA) añadiendo 50,0 mg de PPC (5,0%) y 10,0 mg (1,0%), 15,0 mg (1,5%), 20,0 mg (2,0%), 21,0 mg (2,1%), 22,0 mg (2,2%), 23,0 mg (2,3%), 24,0 mg (2,4%), 25,0 mg (2,5%) o 30,0 mg (3,0%) de GDCA respectivamente, y añadiendo 9 mg de alcohol bencílico (0,9%) en 1 ml. El método de preparación específico es el mismo que el del Ejemplo 1 mencionado anteriormente.

La estabilidad de la formulación de las composiciones inyectables de PPC solubilizada con ácido glicodesoxicólico (GDCA) en las Tablas 11 se evaluó inmediatamente después de la preparación y 30 días después de la preparación (almacenamiento refrigerado), y los resultados de la evaluación se muestran en la FIG. 2G. Cuando se añadió GDCA al 2,4% o más con respecto a la PPC al 5,0%, se confirmó que la formulación era estable y que la composición mostraba propiedades de solución transparente (clara) (Ejemplos comparativos 6-7 a 6-9). En los Ejemplos comparativos 6-1 a 6-6, se confirmó que la formulación no era estable debido al fenómeno de precipitación. El ejemplo comparativo 6-7 era casi transparente inmediatamente después de la preparación y después de la filtración con un filtro de 0,2 μm, mostró una propiedad transparente. Como resultado, se concluyó que se pueden hacer preparaciones inyectables estables con GDCA al 2,4% o más basado en PPC al 5,0%. El tamaño de partículas de las composiciones de los Ejemplos comparativos 6 1 a 6-6 estaba en un intervalo de 204,4 ± 1880 nm a 134,8 ± 680,1 nm, es decir, la composición se dispersa como emulsión inestable o liposoma, pero los Ejemplos comparativos 6-7 a 6-9 estaban compuestos por una estructura de micelas con un tamaño de 10 nm o menos. Como se ha descrito anteriormente, se consideró que no se producía una formulación sustancialmente estable en la composición que tenía una relación molar GDCA/PPC inferior a 0,87, y no era adecuada para la preparación inyectable.

Ejemplo comparativo 7: Preparaciones inyectables de PPC solubilizada con TDCA

Como se muestra en la Tabla 12 a continuación, se prepararon composiciones basadas en fosfatidilcolina (PPC) solubilizada con ácido taurodesoxicólico (TDCA) añadiendo 50,0 mg de PPC (5,0%) y 10,0 mg (1,0%), 15,0 mg (1,5%), 20,0 mg (2,0%), 21,0 mg (2,1%), 22,0 mg (2,2%), 23,0 mg (2,3%), 24,0 mg (2,4%), 25,0 mg (2,5%) o 30,0 mg (3,0%) de TDCA respectivamente, y añadiendo 9 mg de alcohol bencílico (0,9%) en 1 ml. El método de preparación específico es el mismo que el del Ejemplo 1 mencionado anteriormente.

La estabilidad de la formulación de las composiciones inyectables de PPC solubilizadas con ácido taurodesoxicólico (TDCA) en las Tablas 12 se evaluó inmediatamente después de la preparación y 30 días después de la preparación (almacenamiento refrigerado), y los resultados de la evaluación se muestran en la FIG. 2H. Cuando se añadió TDCA al 2,3% o más con respecto a la PPC al 5,0%, se confirmó que la formulación era estable y que la composición mostraba propiedades de solución transparente (clara) (Ejemplos comparativos 7-6 a 7-9). En los Ejemplos comparativos 7-1 a 7-5, se confirmó que la formulación no era estable debido al fenómeno de precipitación. El ejemplo comparativo 7-6 era casi transparente inmediatamente después de la preparación y después de la filtración con un filtro de 0,2 μm, mostró una propiedad transparente. Como resultado, se concluyó que se pueden hacer preparaciones inyectables estables con TDCA al 2,3% o más basado en PPC al 5,0%. El tamaño de partículas de las composiciones de los Ejemplos comparativos 7 1 a 7-5 estaba en un intervalo de 185,1 ± 1834 nm a 123,5 ± 72,0 nm, es decir, la composición se dispersa como emulsión inestable o liposoma, pero los Ejemplos comparativos 7-6 a 7-9 estaban compuestos por una estructura de micelas con un tamaño de 10 nm o menos. Como se ha descrito anteriormente, se consideró que no se producía una formulación sustancialmente estable en la composición que tenía una relación molar TDCA/PPC inferior a 0,74, y no era adecuada para la preparación inyectable.

Ejemplo comparativo 8: Preparaciones inyectables de PPC solubilizada con HDCA

Como se muestra en la Tabla 13 a continuación, se prepararon composiciones basadas en fosfatidilcolina (PPC) solubilizada con ácido hiodesoxicólico (HDCA) añadiendo 50,0 mg de PPC (5,0%) y 10,0 mg (1,0%), 15,0 mg (1,5%), 20,0 mg (2,0%), 21,0 mg (2,1%), 22,0 mg (2,2%), 23,0 mg (2,3%), 24,0 mg (2,4%), 25,0 mg (2,5%) o 30,0 mg (3,0%) de HDCA respectivamente, y añadiendo 9 mg de alcohol bencílico (0,9%) en 1 ml. El método de preparación específico es el mismo que el del Ejemplo 1 mencionado anteriormente.

La estabilidad de la formulación de las composiciones inyectables de PPC solubilizada con ácido hiodesoxicólico (HDCA) en las Tablas 13 se evaluó inmediatamente después de la preparación y 30 días después de la preparación (almacenamiento refrigerado), y los resultados de la evaluación se muestran en la FIG. 2I. Cuando se añadió TDCA al 2,3% o más con respecto a la PPC al 5,0%, se confirmó que la formulación era estable y que la composición mostraba propiedades de solución transparente (clara) (Ejemplos comparativos 8-6 a 8-9). En los Ejemplos comparativos 8-1 a 8-5, se confirmó que la formulación no era estable debido al fenómeno de precipitación. El ejemplo comparativo 8-6 era casi transparente inmediatamente después de la preparación y después de la filtración con un filtro de 0,2 μm, mostró una propiedad transparente. Como resultado, se concluyó que se pueden hacer preparaciones inyectables estables con HDCA al 2,3% o más basado en PPC al 5,0%. El tamaño de partículas de las composiciones de los Ejemplos comparativos 8 1 a 8-5 estaba en un intervalo de 537,2 ± 320 nm a 81,65 ± 24,30 nm, es decir, la composición se dispersa como emulsión inestable o liposoma, pero los Ejemplos comparativos 8-6 a 8-9 estaban compuestos por una estructura de micelas con un tamaño de 10 nm o menos. Como se ha descrito anteriormente, se consideró que no se producía una formulación sustancialmente estable en la composición que tenía una relación molar HDCA/PPC inferior a 0,95, y no era adecuada para la preparación inyectable.

Los hallazgos inusuales eran que la composición compleja de PPC solubilizada con HDCA estaba turbia cuando se almacenaba en frío (4 ~ 8°C) y cambiaba a una solución transparente a temperatura ambiente. Se ha concluido que la composición compleja de PPC HDCA tiene poca estabilidad de la formulación durante el almacenamiento refrigerado y debe almacenarse a temperatura ambiente durante mucho tiempo. Sin embargo, se consideró que el HDCA no era un agente solubilizante adecuado para el control de calidad de la composición compleja de PPC debido al aumento de lisofosfatidilcolina que produce hemólisis cuando la PPC HDCA se almacena a temperatura ambiente durante mucho tiempo.

Ejemplo comparativo 9: Preparaciones inyectables de PPC solubilizada con TUDCA

Como se muestra en la Tabla 14 a continuación, se prepararon composiciones basadas en fosfatidilcolina (PPC) solubilizada con ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) añadiendo 50,0 mg de PPC (5,0%) y 10,0 mg (1,0%), 15,0 mg (1,5%), 20,0 mg (2,0%), 25,0 mg (2,5%), 30,0 mg (3,0%), 35,0 mg (3,5%), 40,0 mg (4,0%), 45,0 mg (4,5%) o 50,0 mg (5,0%) de TUDCA respectivamente, y añadiendo 9 mg de alcohol bencílico (0,9%) en 1 ml. El método de preparación específico es el mismo que el del Ejemplo 1 mencionado anteriormente.

La estabilidad de la formulación de las composiciones inyectables de PPC solubilizada con ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) en las Tablas 14 se evaluó inmediatamente después de la preparación y 30 días después de la preparación (almacenamiento refrigerado), y los resultados de la evaluación se muestran en la FIG. 2J. Cuando se añadió TUDCA al 4,0% o más con respecto a la PPC al 5,0%, se confirmó que la formulación era estable y que la composición mostraba propiedades de solución transparente (clara) (Ejemplos comparativos 9-7 a 9-9). En los Ejemplos comparativos 9-1 a 9-6, se confirmó que la formulación no era estable debido al fenómeno de precipitación. Como resultado, se concluyó que se pueden hacer preparaciones inyectables estables con TUDCA al 4,0% o más basado en PPC al 5,0%. El tamaño de partículas de las composiciones de los Ejemplos comparativos 9-1 a 9-6 estaba en un intervalo de 86,30 ± 850 nm a 22,8 ± 0,980 nm, es decir, la composición se dispersa como emulsión inestable o liposoma, pero los Ejemplos comparativos 9-7 a 9-9 estaban compuestos por una estructura de micelas con un tamaño de 10 nm o menos. Como se ha descrito anteriormente, se consideró que no se producía una formulación sustancialmente estable en la composición que tenía una relación molar TUDCA/PPC inferior a 1,29, y no era adecuada para la preparación inyectable.

La tabla 15 a continuación muestra las relaciones molares mínimas más preferidas de varios ácidos biliares (BA) a PPC (BA/PPC) entre las relaciones molares preferidas de BA/PPC requeridas para preparar composiciones inyectables de PPC como se describe en los Ejemplos comparativos 1 a 9 y el Ejemplo 1 y 2. Las sales biliares (BA) que se pueden utilizar para preparar composiciones inyectables estables de soluciones transparentes en las que la PPC se dispersa en una estructura de micelas con un tamaño de 10 nm o menos en condiciones de frío y temperatura ambiente son ácido desoxicólico (DCA), ácido cólico (CA), ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA), ácido quenodesoxicólico (CDCA), ácido ursodesoxicólico (UDCA), ácido glicodesoxicólico (GDCA), ácido taurodesoxicólico (TDCA) y ácido taurousodesoxicólico (TUDCA), y en condiciones de temperatura ambiente es el ácido hiodesoxicólico (HDCA). En las relaciones molares mínimas mencionadas anteriormente, estas solubilizan la PPC para que se disperse como estructura de micelas de una solución transparente estable. La relación molar mínima BA/PPC más preferible para solubilizar la PPC con los ácidos biliares (BA) es 0,92 ± 0,17. Es decir, la relación molar mínima BA/PPC más preferible es de 0,74 a 1,29, como se muestra en la Tabla 15 a continuación. Con el fin de solubilizar la PPC al 5%, el BA se debe mezclar en al menos 2,49 ± 0,56% (p/v).

Ejemplo comparativo 10: Preparaciones inyectables de PPC solubilizada con LCA

Se prepararon composiciones basadas en fosfatidilcolina (PPC al 5,0%) solubilizada con ácido litocólico (LCA) al 3,0% (p/v) mediante el mismo método que el del Ejemplo 1 mencionado anteriormente.

Sin embargo, como se muestra en la FIG. 3A, el ácido litocólico (LCA) presentó propiedad turbia y de precipitación debido al fenómeno de gelificación cuando la PPC se solubilizó en hidróxido de sodio.

Ejemplo comparativo 11: Preparaciones inyectables de PPC solubilizada con DHCA

Se prepararon composiciones basadas en fosfatidilcolina (PPC al 5,0%) solubilizadas con ácido dihidrocólico (DHCA) al 2,5%, 3,0%, 4,0% o 5,0% mediante el mismo método que el del Ejemplo 1 mencionado anteriormente. Sin embargo, como se muestra en la FIG. 3B, el ácido dihidrocólico (DHCA) presentaba propiedad turbia y precipitación cuando se ajustó el pH después de solubilizar la PPC con hidróxido de sodio, por lo que no era adecuado para la composición inyectable.

Ejemplo comparativo 12 a 30: Preparación de composiciones simples de PPC, simples de BA y complejas de PPC+BA

Las composiciones inyectables de ácido desoxicólico (DCA) solo (Ejemplo comparativo 12), ácido cólico (CA) solo (Ejemplo comparativo 13), ácido glicocólico (GCA) solo (Ejemplo comparativo 14), ácido taurocólico (TCA) solo (Ejemplo comparativo 15), ácido quenodesoxicólico (CDCA) (Ejemplo comparativo 16), ácido ursodesoxicólico (UDCA) solo (Ejemplo comparativo 17), ácido glicodesoxicólico (GDCA) solo (Ejemplo comparativo 18), ácido taurodesoxicólico (TDCA) solo (Ejemplo comparativo 19), ácido hiodesoxicólico (HDCA) solo (Ejemplo comparativo 20) y ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) solo (Ejemplo comparativo 21) en diversas concentraciones (1,0 a 7,5% (p/v), y similares) se prepararon como composiciones simples. Específicamente, la composición se preparó añadiendo 10,0 mg (1,0%), 25,5 mg (2,5%), 50,0 mg (5,0%) o 75,5 mg (7,5%) de ácido biliar, respectivamente, y 9 mg (0,9%) de alcohol bencílico. El procedimiento era que el agua para inyección se puso en el tanque de preparación que se había limpiado y esterilizado (temperatura ambiente) y se añadió hidróxido de sodio al agua para inyección. Después se añadieron, agitaron y disolvieron los ácidos biliares (sales) y el alcohol bencílico. Después, se agitó a 200 RPM durante aproximadamente 2 horas con oscurecimiento, sellado, temperatura ambiente (25°C) y presión de nitrógeno. Una vez completada la agitación, se ajustó el pH y se filtró a través de un filtro de 0,2 μm, y se cargó en el vial y se selló.

Además, se prepararon composiciones simples de PPC de diversas concentraciones [(PPC al 1,25%, 2,50%, 5,0%, 7,5%, 10,0%, 12,5% y 15,0%) (Ejemplo comparativo 22)]. El método de preparación específico es el mismo que el del Ejemplo comparativo 1.

Y se prepararon PPC al 5,0% DCA al 2,2% (Ejemplo comparativo 23), PPC al 5,0% HDCA al 2,5% (Ejemplo comparativo 24), PPC al 5,0% UDCA al 3,0% (Ejemplo comparativo 25), PPC al 5,0%+TDCA al 2,5% (Ejemplo comparativo 26), PPC al 5,0%+GDCA al 2,5% (Ejemplo comparativo 27), PPC al 5,0%+CDCA al 2,5%(Ejemplo comparativo 28), PPC al 5,0%+CA al 2,5% (Ejemplo comparativo 29) y PPC al 5,0% TUDCA al 4,0% (Ejemplo comparativo 30) como composiciones complejas. El método de preparación específico es el mismo que el del Ejemplo comparativo 2 a 9.

Ejemplo 3 y 4: Preparación de composiciones complejas de PPC solubilizada con GCA o TCA

Se prepararon las composiciones de PPC+GCA [(PPC al 2,5%+GCA al 1,25%, PPC al 5,0%+GCA al 2,5%, PPC al 7,5%+GCA al 3,75%, PPC al 10,0%+GCA al 5,0%, PPC al 15,0%+GCA al 7,5%, PPC al 5,0%+GCA al 5,0%, PPC al 5,0%+GCA al 7,5%, PPC al 5,0%+GCA al 10,0%, PPC al 5,0%+GCA al 15,0%, PPC al 5,0%+GCA al 20,0% y PPC al 5,0%+GCA al 25,0%), (Ejemplo 3 )] y PPC+TCA [(PPC al 2,5%+TCA al 1,25%, PPC al 5,0%+TCA al 2,5%, PPC al 7,5%+TCA al 3,75%, PPC al 10,0%+TCA al 5,0%, PPC al 15,0%+TCA al 7,5%, PC 5,0%+TCA al 5,0%, PPC al 5,0%+TCA al 7,5%, PPC al 5,0%+TCA al 10,0%, PPC al 5,0%+TCA al 15,0%, PPC al 5,0%+TCA al 20,0% y PPC al 5,0%+TCA al 25,0%), (Ejemplo 4 )]. El método de preparación específico es el mismo que el del Ejemplo 1 y 2.

Ejemplo de ensayo 1: La comparación de efectos secundarios (inflamación, edema y lesión cutánea)

La composición simple de fosfatidilcolina (PPC) de varias concentraciones (Ejemplo comparativo 22), ácido biliar (BA), composición simple (Ejemplo comparativo 12 a 21), composición compleja de p Pc solubilizada con DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, C^dCA o CA (Ejemplo comparativo 23 a 29), y la composición compleja de PPC solubilizada con GCA o TCA (Ejemplo 3 y 4) se ensayaron en relación con el edema, lesión cutánea e inflamación.

La inflamación, el edema y las lesiones cutáneas locales o extensas en el sitio de administración son los efectos secundarios locales típicamente observados de la composición inyectable simple de DCA convencionalmente bien conocida y utilizada (tal como Kybella) o la composición inyectable de PPC (tal como, Lipostabil, Lipobean, etc.). Los siguientes resultados muestran los resultados de edema, inflamación y lesiones cutáneas para la inyección subcutánea de una composición simple de ácidos biliares (sal), composiciones simples de PPC y una composición compleja de PPC solubilizada con ácido biliar in vivo. A partir de los siguientes resultados, se observó que las composiciones inyectables de PPC solubilizada con GCA, TCA o TUDCA en una relación molar particular no producían sustancialmente inflamación ni edema o aliviados en un 80%. Dichos resultados eran hallazgos impredecibles a partir de la evaluación de la eficacia de sustancias individuales. Los siguientes métodos de ensayo y resultados se describen a continuación. En lo que sigue, el % de la composición significa % (p/v).

1-1: Edema de pata de rata

Para evaluar el grado de edema, cada composición de ensayo descrita anteriormente se inyectó en la pata de las ratas. Específicamente, se compraron ratas macho Sprague Dawley (6 semanas de edad) y se usaron después de una semana de adaptación. Las ratas (peso corporal: 170 ~ 200 g) se seleccionaron aleatoriamente y se midió el grosor de la pata de la rata con un calibrador antes de la administración de las composiciones de ensayo. Con el fin de observar el edema, se administraron 0,1 ml de PBS y de las diversas composiciones de ensayo en las patas de las ratas. Las mediciones del volumen de la pata se realizaron con un calibrador inmediatamente antes de la inyección, inmediatamente después de la inyección y 1 o 2 horas después de la inyección. Además, cuando se midió el grosor, se observó la lesión cutánea del sitio de la inyección fotografiando la planta de la pata (usando una escala de 4 * 4 cm).

El grado de edema se evaluó como de 0 a 4 grados. Se evaluó el grado de edema inmediatamente después de la inyección y 1 o 2 horas después de la inyección en comparación con antes de la inyección, en el que los grados eran sin edema en absoluto [-, (el grado de hinchazón era de 0% en comparación con antes de la inyección)] , edema leve [+, (el grado de hinchazón era de 1-20% en comparación con antes de la inyección)], edema moderado [++, (el grado de hinchazón era de 20-40% en comparación con antes de la inyección)], edema grave [+++, (el grado de hinchazón era de 40-60% en comparación con antes de la inyección)], y edema extremadamente grave [++++, (el grado de hinchazón era de 60% o más en comparación con antes de la inyección)].

Los resultados de la evaluación del edema 2 horas después de la administración (cuando el edema es más grave) de la composición simple de PPC (PPC al 1,25%, 2,50%, 5,0%, 7,5%, 10,0%, 12,5% o 15,0%) fueron como se muestra en la siguiente Tabla 16, en que el grado "leve" se extendía de PPC del 1,25% al 10,0%, el grado "moderado" se mostraba en PPC al 12,5% y 15,0%. El edema a las 2 horas después de la administración de DCA al 1,0% aumentó a "grave" (FIG. 4A). En conclusión, la composición simple de PPC mostró un edema dependiente de la concentración a concentración alta, pero la composición simple de PPC al 15%, que es la concentración más alta, indujo un edema de grado significativamente menor que el de DCA al 1,0%.

Tabla. 16

Los resultados de la evaluación del edema 2 horas después de la administración de diversas concentraciones de ácidos biliares (1,0%, 2,5%, 5,0%, 7,5%), cuando el edema era más grave, fueron los que se muestran en la siguiente Tabla 17 en la que el grado "leve" se mostró en TUDCA al 1,0%, 2,5%, G^cA al 1,0% y TCA al 1,0%, el grado "moderado" se mostró en UDCA al 1,0%, GDCA al 1,0%, CA al 1,0%, GCA al 2,5~5,0%, TCA al 2,5~5,0%, TUDCA al 5,0~7,5% y las diversas concentraciones restantes de ácidos biliares mostraron edema "grave" y "extremadamente grave" (FIGS. 4B a 4K).

Tabla. 17

Específicamente, como se muestra en los resultados del ensayo de viabilidad de adipocitos in vitro descrito a continuación, la PPC al 5% mostró una capacidad de reducir adipocitos que es equivalente a la de DCA 10 Comparando los resultados basados en una concentración de 2,5% de ácidos biliares que normalmente y habitualmente se requiere para solubilizar la PPC al 5%, el grado de edema fue "leve" en TUDCA, "moderado" en GCA y TCA, "grave" en HDCA, TDCA, GDCA y CA, y "extremadamente grave" en DCA, UDCA, CDCA a las 2 horas después de la administración, como se muestra en la Tabla 17. La FIG. 4L muestra los resultados de comparar el edema a las 2 horas después de la inyección de una composición simple de PPC al 5,0%, composiciones simples de cada ácido biliar en una concentración requerida para solubilizar la PPC al 5,0% (generalmente aproximadamente 2,5%, pero es adecuado 3% para UDCA, 4% para TUDCA) o PBS, y el resultado fue similar al de la Tabla 17.

A este respecto, con el fin de confirmar el grado de inflamación de las composiciones complejas de PPC solubilizadas con varios ácidos biliares, se comparó el grado de edema a las 2 horas después de la administración de la composición compleja de PPC al 5,0% solubilizada con cada ácido biliar. Como se muestra en la Tabla 18, se confirmó que GCA, TCA y TUDCA "no mostraban edema", CA lo mostraba "moderado" y HDCA, UDCA, TDCA, GDCA y CDCA lo mostraban "grave" (FIG. 4M).

Tabla. 18

Un hallazgo sorprendente fue que el grado de edema inducido por las composiciones simples de GCA (2,5%), TCA (2,5%) y TUDCA (5,0%) era moderado (Tabla 17), pero el grado de edema inducido por la composición compleja de PPC al 5,0% solubilizada con ^gC^a(2,5%), T^cA (2,5%) y TUDCA (4,0%) se redujo a nada o leve (FIG. 4M).

Con el fin de observar el edema según los cambios de concentración, se comparó el grado de edema dependiente del tiempo de las composiciones complejas de PPC solubilizada con GCA o TCA. Como resultado, se confirmó que las composiciones complejas correspondientes a PPC al 2,5-5,0% "no mostraron edema", las composiciones complejas correspondientes a PPC al 7,5-10,0% lo mostraron "leve" y las composiciones complejas correspondientes a PPC al 15,0% lo mostraron "moderado" a las 2 horas después de la administración, como se muestra en la Tabla 19 y 20 (FIGS. 4N a 4O).

Tabla. 19

Tabla. 20

En la composición compleja de PPC solubilizada con ácidos biliares, el tiempo de preparación para obtener una solución transparente estable se acorta a medida que se aumenta la concentración de los ácidos biliares que se van a añadir. Por esta razón, se evaluó el edema con composiciones en las que se aumenta la concentración de GCA o TCA capaz de solubilizar la PPC al 5,0%. Los materiales de ensayo eran composiciones complejas de PPC al 5,0% mezclada con GCA o TCA respectivamente al 2,5%, 5,0%, 7,5%, 10,0%, 5,0%, 20,0% o 25,0%. Como se muestra en la Tabla 21 y la Tabla 22, la relación molar preferida de GCA/PPC sin edema o edema leve era de 2,60 mol/mol o menos, y en la relación molar de 3,47 mol/mol o menos del valor anterior, el edema era leve y moderado, y se mostró edema grave en la relación molar de más de 3,47 mol/mol. Además, la relación molar preferida de TCA/PPC sin edema o con edema leve era 2,35 mol/mol o menos, y en la relación molar de 3,13 mol/mol o menos del valor anterior, el edema era leve y moderado, y se mostró edema grave en la relación molar de más de 3,13 mol/mol (FIG. 4P y 4Q).

Tabla. 21

+

Tabla. 22

Considerados juntos los resultados del ensayo de edema in vivo , la composición simple de PPC al 1,25-10,0% mostró edema "leve" 2 horas después de la administración, cuando el edema era más grave, como se muestra en la Tabla 16 a 22 y la FIG. 4 (FIG. 4A a 4Q). De los ácidos biliares (BA) seleccionados para solucionar la limitación de uso industrial debido a la baja estabilidad de formulación de la composición simple de PPC, el DCA al 2,5%, UDCA al 2,5%, CDCA al 2,5%, HDCA al 2,5%, TDCA al 2,5%, GDCA al 2,5% y CA al 2,5% mostraron edema "grave" y "extremadamente grave", y el GCA al 2,5%, TCA al 2,5% y TUDCA al 5,0% mostraron edema "moderado". Pero, la composición compleja de PPC al 5,0% solubilizada con GCA, TCA o TUDCA "no" mostró edema o era "leve". Como resultado de la observación de cambios en el edema según las concentraciones y la cantidad de mezcla, la composición compleja de PPC al 2,5-10,0% solubilizada con GCA o TCA al 1,25-5,0% "no" mostró edema o era "leve". La relación molar GCA/PPC de 3,47 mol/mol o menos, preferiblemente 2,60 mol/mol o menos, y la relación molar TCA/PPC de 3,13 mol/mol o menos, preferiblemente 2,35 mol/mol o menos "no” mostraron edema o era "leve". Según los resultados de estudios previos y los resultados in vitro del ensayo de viabilidad de adipocitos (véase el ensayo 2 descrito a continuación), se descubrió que TUDCA no es un agente solubilizante adecuado debido al efecto de inhibición de la apoptosis, que es el mecanismo de lisis de adipocitos de la PPC.

1-2: Medición de la lesión cutánea (eritema)

Con el fin de observar casos dañinos relacionados con la piel después de la inyección de las composiciones de ensayo, se observaron las lesiones en la piel fotografiando la planta de las patas de las ratas (usando una escala de 4 cm * 4 cm) cuando se mide el grosor de la pata en el ejemplo de ensayo 1-1. Los grados de lesión cutánea se evaluaron como de 0 a 4 grados. Los grados de lesión cutánea inmediatamente después de la inyección y 1 o 2 horas después de la inyección se evaluaron en comparación con antes de la inyección, donde los grados se definieron como sin eritema (-), eritema muy leve [(apenas identificable visualmente), leve (+)], eritema marcado (moderado, +), eritema levemente grave (grave, ++) y eritema grave (extremadamente grave, +++).

En primer lugar, no había nada de eritema en todos los grupos de concentración de la composición simple de PPC (1,25-15,0%) como se muestra en la Tabla 23 (FIG. 5A).

Tabla 23

A continuación, los resultados de lesión cutánea de las composiciones simples de varias concentraciones (BA al 1,0%, 2,5%, 5,0% y 7,5%) fueron, como se muestra en la Tabla 24, que el DCA, HDCA, UDCA, GDCA, TDCA y CDCA al 2,5% o más, y el CA al 5,0% o más mostraron eritema grave y extremadamente grave. Y se confirmó que el GCA y TCA al 5,0% o menos no mostraban eritema o era leve, y TUDCA no mostraba eritema (FIG. 5B y 5C).

Tabla. 24

Los resultados de lesiones cutáneas de las composiciones complejas de PPC al 5,0% solubilizada con varios ácidos biliares fueron, como se muestra en la Tabla 25, que la composición compleja de PPC al 5,0% solubilizada con DCA, HDCA, UDCA o CDCA mostraba eritema grave, la composición compleja de PPC al 5,0% solubilizada con TDCA, GDCA o CA mostraba eritema moderado, y la composición compleja de PPC al 5,0% solubilizada con GCA, TCA y TUDCA no mostraba eritema 2 horas después de la administración (FIG.

5D).

Tabla. 25

| | | | | |

Con el fin de observar la lesión según el cambio de concentración, se comparó el grado de lesión con varias concentraciones de la composición compleja de PPC solubilizada con GCA. Como se muestra en la Tabla 26, no se observaron lesiones con PPC al 10,0% GCA al 5,0% o menos, y se observaron lesiones leves en PPC al 15,0% GCA al 7,5% (FIG. 5E).

Tabla. 26

Se evaluaron las lesiones para composiciones de mayor concentración de GCA capaces de solubilizar la PPC al 5,0%. Como se muestra en la Tabla 27, la relación molar preferible de GCA/PPC sin lesión o leve era 2,60 mol/mol o menos, y la lesión era grave o extremadamente grave con una relación molar de 3,47 mol/mol o más (FIG. 5F).

Tabla. 27

Considerados juntos los resultados del ensayo de lesión in vivo , como se muestra en la Tabla 23 a 27 y la FIG. 5, la composición simple de PPC al 1,25-10,0% no mostraba lesión. De los ácidos biliares (BA) seleccionados para solucionar la limitación de uso industrial debido a la baja estabilidad de formulación de la composición simple de PPC, el DCA al 2,5%, UDCA al 2,5%, CDCA al 2,5%, HDCA al 2,5%, TDCA al 2,5%, GDCA al 2,5% y CA al 5,0% o más mostraban lesión "grave" y "extremadamente grave", y el GCA y TCA al 5,0% o menos no mostraban lesión o mostraban lesión leve, y TUDCA no mostraba lesión. En el caso de las composiciones complejas de PPC al 5,0% solubilizada con ácidos biliares adicionales, las composiciones complejas de PPC al 5,0% solubilizada con DCA, HDCA, UDCA o CDCA mostraban lesión grave, las composiciones complejas de PPC al 5,0% solubilizada con TDCA, GDCA o CA mostraban lesión moderada, pero las composiciones complejas de PPC al 5,0% solubilizada con GCA, TCA o TUDCA no mostraban lesión. Como los resultados de la lesión cambian según la concentración y la cantidad de mezcla, la composición compleja de PPC al 2,5-10,0% solubilizada con GCA al 1,25-5,0% no mostraba lesión, la composición compleja de PPC al 15,0% solubilizada con GCA al 7,5% mostraba lesión leve. Además, se confirmó que la relación molar GCA/PPC de 2,60 mol/mol o menos no mostraba lesión o mostraba lesión leve.

1-3: El ensayo histológico de tinción HyE (inflamación)

Las ratas se sacrificaron 3 horas después de completar los Ejemplos de ensayo 1-1 y 1-2 para evaluar el grado de inflamación después de la inyección de las composiciones de ensayo. Los tejidos de la zona inyectada se diseccionaron, se fijaron con formalina al 10%, luego se preparó el espécimen y se capturaron imágenes usando un microscopio óptico. El grado de inflamación se evaluó como sigue.

La ausencia de inflamación (-) indica que los tejidos funcionales tales como las glándulas sudoríparas, los vasos sanguíneos y el tejido adiposo están bien mantenidos y no son visibles células inflamatorias. Leve (+) indica que la forma de los tejidos funcionales (glándulas sudoríparas, vasos sanguíneos, tejido adiposo, etc.) está bien mantenida y aparecen células inflamatorias con poca frecuencia. Moderado (++) indica que la morfología de los tejidos funcionales (glándulas sudoríparas, vasos sanguíneos, tejido adiposo, etc.) está alterada y aparecen células inflamatorias en los tejidos. Grave (+++) indica que la morfología de los tejidos funcionales está alterada y las células inflamatorias aumentan, y las células inflamatorias tales como neutrófilos, células mononucleares y similares migran a los tejidos alrededor de los vasos sanguíneos.

Extremadamente grave (+++) indica que la morfología del tejido funcional está alterada por el edema y la inflamación, y las células inflamatorias tales como neutrófilos, células mononucleares y similares no solo aumentan sino que también se propagan a la dermis papilar y obviamente se observa daño tisular.

En primer lugar, como resultados de la evaluación de la inflamación para todas las concentraciones de composiciones simples de PPC (1,25-15,0%), PPC al 2,50-7,50% "no" mostraba inflamación, PPC al 10,0-12,5% mostraba inflamación "leve" y PPC al 15,0% mostraba "moderada", como se muestra en la siguiente Tabla 28 (FIG. 6A).

Tabla. 28

A continuación, como resultados de la evaluación de la inflamación para ácidos biliares de diversas concentraciones (BA al 1,0%, 2,5%, 5,0% y 7,5%), el DCA, HDCA y UDCA al 1,0% o más mostraron inflamación grave y extremadamente grave, el TDCA, GDCA, CDCA y CA al 2,5% o más mostraron inflamación grave y extremadamente grave. Y el GCA y TCA al 2,5% o más mostraron inflamación moderada, y la concentración alta de TUDCA solo mostró inflamación leve (FIG. 6B y 6C).

Tabla. 29

Con el fin de ensayar el grado de inflamación de las composiciones complejas de PPC solubilizada con ácidos biliares, se prepararon composiciones complejas de PPC al 5,0% solubilizada con varios ácidos biliares y se midió la inflamación. Como se muestra en la Tabla 29, las composiciones complejas de PPC solubilizada con DCA, HDCA UDCA o CDCA mostraron "extremadamente grave", las composiciones complejas de PPC solubilizada con TDCA o GDCA mostraron "grave", y la composición compleja de PPC solubilizada con CA mostró "moderada". Por otro lado, la composición compleja de PPC solubilizada con GCA, TCA o TUDCA únicamente no mostró inflamación. Y fueron hallazgos sorprendentes que la composición simple de GCA al 2,5% y TCA al 2,5% mostraron inflamación moderada, pero las composiciones complejas de PPC al 5,0% solubilizada con GCA al 2,5% o TCA al 2,5% no mostraron inflamación (FIG. 6D).

Con el fin de examinar el grado de inflamación según el cambio de concentración, se comparó el grado de inflamación de varias composiciones complejas de PPC solubilizada con GCA. Como resultado, PPC al 7,5% GCA al 3,75% o menos "no" mostró inflamación, PPC al 10,0% GCA al 5,0% mostró inflamación leve y PPC al 15,0% GCA al 7,50% mostró inflamación moderada (FIG. 6E).

Con el fin de examinar el grado de inflamación según el aumento en la cantidad de mezcla de agente solubilizante, se prepararon composiciones que comprendían una mayor concentración de GCA capaz de solubilizar la PPC al 5,0% y se evaluó la inflamación. Como se muestra en la Tabla. 28, la relación molar preferible de GCA/PPC que no muestra inflamación o muestra inflamación leve era 3,47 mol/mol o menos, y se confirmó que la relación molar de 3,47 mol/mol o más mostraba una inflamación extremadamente grave (FIG. 6F).

El resumen de los resultados del ensayo in vivo de edema, lesión e inflamación causados por inyección subcutánea para reducir la grasa localizada es el siguiente. Con el fin de preparar PPC al 5,0%, que tiene una eficacia reductora de adipocitos equivalente al DCA al 1,0%, como composición estable, los ácidos biliares deben mezclarse en una concentración de 2,5% en general, pero se confirmó que el DCA, HDCA, UDCA, TDCA, GDCA, CDCA y CA producían edema grave y extremadamente grave y lesiones causadas por inflamación en una concentración del 2,5%. Además, las composiciones complejas de PPC al 5,0% formuladas con los ácidos biliares antes mencionados inducían dolor y edema significativos. Por lo tanto, esos ácidos biliares no eran adecuados como agentes solubilizantes para ser incorporados en la composición inyectable reductora de grasa localizada basada en PPC de la presente invención. Por otro lado, las preparaciones de GCA PPC y las preparaciones de TCA PPC no producían dolor, edema ni lesiones, y estos hallazgos eran hallazgos increíbles que eran impredecibles a partir de la composición simple de PPC, GCA o TCA.

En resumen, se encontró que las preparaciones de complejo GCA PPC y las preparaciones de complejo de TCA PPC de la presente invención tienen preferiblemente una relación molar de ácido biliar a PPC (es decir, relación molar ^gC^a/PPC o relación molar TCA/PPC) de 0,7 a 3,0. Cuando la relación molar (mol/mol) era inferior a 0,7, la estabilidad de la formulación disminuía debido a que la formación de micelas estables era difícil. Por lo tanto, es preferible tener una relación molar de al menos 0,7 o más, más preferiblemente, cuando la relación molar es de 0,76 o más, es más ventajosa en términos de estabilidad y tiempo de procedimiento. Cuando la relación molar excedía de 3,04, se inducían considerablemente efectos secundarios tales como inflamación, edema y lesiones cutáneas, y aumentaba la posibilidad de necrosis en lugar de producir un efecto positivo sobre la apoptosis y la lipólisis de los adipocitos. A una relación molar de 3,0 o menos, tales efectos secundarios y dolor se reducían significativamente. En particular, cuando la relación molar era 2,60 o menos dentro del intervalo anterior, los efectos secundarios y el dolor se reducían sustancialmente a ninguno de tales efectos secundarios y dolor. Lo más preferiblemente, cuando la relación molar era 1,73 o menos, se confirma que se producía una excelente composición reductora de grasa exenta de toda inflamación, edema y lesión. Los resultados de la confirmación del dolor se describen adicionalmente en los siguientes ejemplos de ensayo.

Además, se confirmó que es más ventajoso en términos de dolor, edema y efectos secundarios que el contenido absoluto de PPC sea preferiblemente del 12,5% (p/v) o menos, y más preferiblemente del 10,0% (p/v) o menos en la composición total.

Ejemplo de ensayo 2: La comparación del efecto reductor de células

2-1: La comparación del efecto reductor de adipocitos (3T3-L1)

Se realizaron ensayos para comparar la actividad reductora de adipocitos de la composición simple de PPC y la composición de PPC solubilizada con ácidos biliares. Se usaron líneas de adipocitos 3T3L-1 diferenciadas para observar la actividad de reducción de adipocitos, y la viabilidad celular se controló mediante el ensayo MTT. Los siguientes resultados se obtuvieron comparando la viabilidad de los adipocitos para cada material de ensayo. Específicamente, la composición mixta de TUDCA, GCA o TCA, que eran agentes solubilizantes seleccionados de los resultados del ensayo in vivo, con PPC afectó a la viabilidad de los adipocitos en el siguiente resultado del ensayo in vitro con una relación de mezcla inesperada, y los siguientes datos demuestran tal descubrimiento inesperado. Los materiales y métodos empleados en los siguientes experimentos se describen a continuación. En lo que sigue, el % de la composición se refiere a % (p/v).

Los métodos de ensayo específicos son los siguientes. Se cultivaron adipocitos 3T3-L1 diferenciados hasta 85-92% de confluencia celular. Las células se trataron con cada una de las siguientes composiciones de ensayo y se cultivaron a 37°C durante 0 a 96 horas: PPC (PPC al 0,3125%, 0,625%, 1,25%, 2,5%, 5,0%, 7,5%, 10,0%, 15,0%), composición simple de DCA (DCA al 1,0%, 1,1%, 2,2%), composición simple de GCA (GCA al 1,25%, 2,5%, 5,0%), composición compleja de PPC solubilizada con g Ca (PPC al 0,3125%+GCA al 0,1563%, PPC al 0,625%+GCA al 0,3125%, PPC al 1,25% GCA al 0,625%, PPC al 2,5%+GCA al 1,25%, PPC al 5,0%+GCA al 2,5%, PPC al 7,5%+GCA al 3,75%, PPC al 10,0%+GCA al 5,0%, PPC al 15,0%+GCA al 7,5%, PPC al 5,0%+GCA, al 3,75%, PPC al 5,0%+GCA al 5,0%, PPC al 5,0%+GCA al 6,25%, PPC al 5,0%+GCA al 7,5%, PPC al 5,0%+GCA al 8,75%), composición compleja de PPC solubilizada con TCA (PPC al 0,3125%+TCA al 0,1563%, PPC al 0,625%+TCA al 0,3125%, PPC al 1,25% TCA al 0,625%, PPC al 2,5%+TCA al 1,25%, PPC al 5,0%+TCA al 2,5%, PPC al 7,5%+TCA al 3,75%, PPC al 10,0%+TCA al 5,0%, PPC al 15,0%+TCA al 7,5%), composición compleja de PPC solubilizada con TUDCA (PPC al 0,3125%+TUDCA 0,25%, PPC al 0,625%+TUDCA al 0,5%, PPC al 1,25% TUDCA al 1,0%, PPC al 2,5%+TUDCA al 2,0%, PPC al 5,0%+TUDCA al 4,0%, PPC al 7,5%+TUDCA al 6,0%, PPC al 10,0%+TUDCA al 8,0%, PPC al 15,0%+TUDCA al 12,0%), composición compleja de PPC solubilizada con DCA (PPC al 2,5%+DCA al 1,1%, PPC al 5,0%+DCA al 2,2%, PPC al 10,0%+DCA al 4,4%) o composición compleja de PPC solubilizada con otros ácidos biliares (PPC al 5,0%+HDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+UDCA al 3,0%, PPC al 5,0%+TDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+GDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+CDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+CA al 2,5%). Las células se lavaron dos veces con PBS, se trataron con reactivo MTT (50 j l ) y se dejaron a 37°C durante 2 horas. Después de eliminar el líquido sobrenadante, los cristales de formazán MTT se disolvieron en DMSO y se midió la absorbancia a 540 nm utilizando un lector de microplaca.

Como resultado, como se muestra en las FIGS. 7A a 7D, la composición simple de PPC y la composición compleja de PPC GCA presentaron una actividad reductora de adipocitos similar en una forma dependiente del tiempo y la concentración. Y la composición de PPC TCA mostró un efecto reductor de adipocitos más bajo que la composición simple de ^pP^cy de PPC GCA en la misma concentración. Sin embargo, el tratamiento con la composición de PPC TUDCA no disminuyó la viabilidad de los adipocitos (FIGS. 7A a 7D).

Además, como se muestra en la FIG. 7E, la composición simple de PPC al 5,0%, PPC al 5,0% GCA al 2,5% y PPC al 15,0% TCA al 7,5% mostraron una actividad reductora de adipocitos similar a la de la composición simple de DCA al 1,0% a las 96 horas. Es decir, las preparaciones con la misma actividad reductora de adipocitos que Kybella (DCA al 1,0%) aprobada por la FDA como un agente de lisis celular que mejora la apariencia eran composición simple de PPC al 5,0% y composición compleja de PPC al 5,0% GCA al 2,5% y mayor. No había diferencia estadísticamente significativa entre esos grupos de ensayo (FIG. 7E).

La composición simple de PPC mostró efecto reductor de adipocitos dependiente del tiempo y la concentración y la composición compleja de PPC GCA mostró un efecto similar a la misma concentración (esto significa grupos de ensayo con la misma concentración de PPC). En comparación, PPC TCA mostró un efecto reductor de adipocitos más bajo a la misma concentración, lo que sugiere que el TCA inhibe el efecto reductor de adipocitos de la PPC. Debido a esto, la formulación de “PPC TCA” debe considerarse en dosis muy altas para lograr el efecto reductor de adipocitos similar al de los productos comerciales existentes. Es decir, como se muestra en la FIG. 7E, con el fin de obtener el efecto reductor de adipocitos similar al de una preparación existente tal como Kybella (DCA al 1,0%), es necesario que la preparación de PPC TCA se aplique a un nivel de PPC al 15,0% TCA al 7,5%. Pero, la composición de PPC al 15% solubilizada con TCA al 7,5% tiene el problema de que es difícil administrar dosis múltiples con una aguja de inyección de 30G debido a una alta viscosidad de 20 cP o más. En resumen, se considera que la preparación de "PPC TCA" tiene algunas ventajas en términos de efectos secundarios. Sin embargo, considerando la viabilidad económica industrial y otras preocupaciones adicionales relacionadas con la administración de dosis altas, las preparaciones de "PPC GCA" son superiores a las preparaciones de "PPC TCA".

Además, se encontró que la PPC solubilizada con TUDCA no tiene efecto reductor de adipocitos incluso en concentraciones altas, lo que también era el caso con dosis muy altas (PPC 15% TUDCA 12%). Por lo tanto, se observó que TUDCA inhibía la apoptosis y la degradación de los adipocitos. En este sentido, se han comunicado estudios sobre la inhibición de la apoptosis celular por TUDCA (Andrew L.Rivard, Administration of Tauroursodeoxycholic acid reduced apoptosis after myocardial infarction in rat, The American Journal of Chínese Medicine, Vol. 2, 279-295, 2007). Estos resultados sugieren que la PPC tiene un efecto diferente sobre la reducción de adipocitos dependiendo de la selección del agente solubilizante y puede actuar de manera diferente sobre la necrosis celular y la apoptosis.

Con respecto a la composición compleja de PPC solubilizada con GCA (PPC GCA), que se seleccionó preferiblemente del resultado de los ensayos anteriores, y la composición compleja de PPC solubilizada con DCA (PPC DCA), es decir un producto comercial existente, se observó el efecto del GCA y DCA seleccionados como agentes solubilizantes sobre la actividad reductora de adipocitos además de la actividad reductora de adipocitos de la propia composición simple de PPC. Los resultados del ensayo se muestran en las FIGS. 7F a 7H. Después de 96 horas, PPC sola y PPC GCA mostraron un nivel similar de efecto reductor de adipocitos a la misma concentración (esto significa grupos de ensayo con la misma concentración de PPC), pero GCA solo mostró un efecto reductor de adipocitos más bajo que PPC GCA.

La PPC DCA mostró mayor efecto reductor de adipocitos a la misma concentración en comparación con PPC sola, y mostró mayor efecto reductor de adipocitos que DCA solo (FIGS. 7F a 7H), pero como se muestra en el siguiente Ejemplo de ensayo 2-3, dicho efecto se atribuyó a la necrosis celular (FIGS. 10A y 10B). Además, HDCA, UDCA, CDCA, TDCA, GDCA y CA, que son otros ácidos biliares que se ha encontrado que son tóxicos similares al DCA en los ejemplos de ensayo anteriores (es decir, en ensayos de edema, lesiones e inflamación después de inyección subcutánea in vivo), también se encontró que tenían el efecto de disminuir los adipocitos de una manera que inducía la necrosis celular en lugar de apoptosis y degradación de los adipocitos, que son mecanismos inherentes de la PPC (FIG. 8D). Por lo tanto, estos tipos de ácidos biliares no son agentes solubilizantes adecuados porque producen dolor, edema y efectos secundarios, aunque el efecto reductor de adipocitos puede parecer algo elevado.

La relación molar mínima de GCA a PPC (GCA/PPC) requerida para preparar micelas mixtas transparentes de PPC que sean establemente inyectables es 0,76 mol/mol, y requiere 12 horas o más de agitación y 2 días del tiempo de trabajo. Por esta razón, aumentar la cantidad que se introduce de GCA puede acortar el tiempo de fabricación. Sin embargo, las dosis excesivas de aditivo pueden conducir a efectos negativos en la actividad farmacológica inherente a la PPC de apoptosis y degradación de adipocitos, así como en la seguridad, por lo que se fijó la concentración de PPC (5,0%) y se aumentó la concentración de GCA (2,5%-8,75%) para observar los efectos en la reducción de adipocitos.

Como resultado, como se muestra en la FIG. 7I, cuando se compararon la composición simple de PPC al 5,0% y la composición compleja de PPC GCA, no había diferencia estadísticamente significativa en la viabilidad de los adipocitos entre los grupos de ensayo cuando la relación molar de GCA a PPC (GCA/PPC) era de 2,60 mol/mol (PPC al 5,0% GCA al 7,50%) o menos, y había diferencia estadísticamente significativa en la viabilidad de los adipocitos entre los grupos experimentales cuando la relación molar de GCA a PPC (GCA/PPC) era de 3,04 mol/mol (PPC al 5,0% GCA al 8,75%) o más. Es decir, cuando la relación molar GCA/PPC es de 3,04 mol/mol (PPC al 5,0% GCA al 8,75%) o más, aumenta la posibilidad de efectos adversos en la actividad positiva inherente a la PPC.

2-2: La comparación de la viabilidad de adipocitos, fibroblastos, células de músculo esquelético y células endoteliales vasculares con la composición compleja de PPC solubilizada con ácidos biliares_ La especificidad de adipocitos de la presente invención

Según los informes anteriores, se ha comunicado que el DCA o la composición de PPC solubilizada con DCA produce efectos secundarios clínicos graves debido a la lisis no solo de adipocitos, sino también de fibroblastos, células del músculo esquelético y células endoteliales vasculares. En este sentido, se evaluó el efecto de la composición compleja de PPC GCA de la presente invención.

El método y los materiales específicos del ensayo fueron los siguientes:

La viabilidad celular se midió mediante el ensayo MTT a las 72 horas después de tratar adipocitos 3T3-L1, fibroblastos normales, células del músculo esquelético y células endoteliales con composiciones complejas de PPC (PPC al 5,0%+GCA al 2,5%, PPC al 5,0%+TCA al 2,5%, PPC al 5,0%+TUDCA al 4,0%, PPC al 5,0%+DCA al 2,2%, PPC al 5,0%+HDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+UDCA al 3,0%, PPC al 5,0% TDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+GDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+CDCA al 2,5% o PPC al 5,0%+CA al 2,5) respectivamente, y los resultados se calcularon como el porcentaje total de células viables en comparación con el grupo de control no tratado.

El adipocito 3T3-L1 (ATCC) se cultivó en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 μg/ml en condiciones de CO₂al 5% y 37°C. La diferenciación de adipocitos se continuó durante 2 o 4 días hasta que la confluencia celular alcanzó 100%, y la diferenciación se indujo durante 3 días en medio DMEM que contenía insulina 1 ug/ml, metil-isobutil-xantina 500 μM y dexametasona 250 nM (los adipocitos prediferenciación y posdiferenciación se muestran en las FIGS. 9A y 9B). Posteriormente, el medio se reemplazó por medio DMEM que contenía insulina 1 ug/ml (Sigma), y el medio de cultivo se mantuvo y se cambió cada 2 a 3 días hasta alcanzar el máximo grado de diferenciación. Si tardaba más de 7 días, las células se mantenían en medio de cultivo DMEM normal hasta el inicio de los ensayos. Después de 72 horas de incubación con los materiales de ensayo de tratamiento, la solución de MTT se diluyó a 1 mg/ml en PBS y se añadieron 50 μl de solución de MTT (Sigma) a los pocillos de los que se había extraído cada medio de cultivo. Después de incubar las células durante 3 horas en condiciones de 37°C y CO₂al 5%, se separó la solución de MTT. Después de disolver mediante tratamiento de 200 μl de DMSO (Sigma), se realizó el ensayo MTT (medido a 570 nm).

Los fibroblastos (CCD-986sk, fibroblasto humano, basado en el pase n.° 2) se cultivaron hasta 85% de confluencia, y luego se separó el medio de cultivo (IMDM, FBS al 10%, mezcla de antibióticos al 1%). Después de mezclar y tratar el material de ensayo en un nuevo medio de cultivo, el medio de cultivo se separó en el tiempo de tratamiento predeterminado y se realizó el ensayo MTT (medición a 570 nm).

Las células del músculo esquelético (C2C12; miocito de ratón, basado en el pase n.° 2) se cultivaron hasta 80% de confluencia, y luego se separó el medio de cultivo (DMEM, FBS al 10%, mezcla de antibióticos al 1%). Y las células se cultivaron durante 4 días en DMEM que contenía suero de caballo al 2%. La forma alargada de las células se observó al 80% o más, y los materiales de ensayo se mezclaron y trataron en un nuevo medio de cultivo, el medio de cultivo se separó en el tiempo de tratamiento predeterminado y se realizó el ensayo MTT (medición a 570 nm).

Las células endoteliales vasculares (HUVEC: endotelio humano, basado en el pase n.° 3) se dejaron a temperatura ambiente durante 1 día en una placa de cultivo recubierta con gelatina al 1%. Luego, el medio de cultivo (EGM-Plus, FBS al 10%, mezcla de antibióticos al 1%) se separó después de cultivar hasta 80% de confluencia en la placa de cultivo recubierta. Después de mezclar y tratar los materiales de ensayo en un nuevo medio de cultivo, el medio de cultivo se separó en el tiempo de tratamiento predeterminado y se realizó el ensayo MTT (medido a 570 nm). (Nota: Descartar si las células pasan el pase n.° 6 o más).

Como resultado de observar la viabilidad de varias células, como se muestra en las FIGS. 8A a 8D, se encontró que las composiciones complejas de PPC solubilizada con GCA o TCA reducían selectivamente solo los adipocitos a diferencia de las composiciones complejas de PPC solubilizadas con DCA, UDCA, HDCA, CDCA, TDCA, GDCA o CA. Esto sugiere que cuando la composición de la presente invención, PPC GCA, se aplica a una persona real, puede reducir específicamente solo los adipocitos sin afectar negativamente a los tejidos humanos alrededor de los adipocitos.

2-3: El ensayo de actividad de caspasa 3

El ensayo de actividad de caspasa 3 se realizó con los materiales de ensayo para determinar si la muerte celular en el resultado del ensayo MTT se debía a necrosis o apoptosis. La caspasa 3 aumenta específicamente cuando se produce apoptosis y es un marcador de apoptosis. Se utilizó el kit de ensayo de caspasa 3 (Colorimétrico) de Abcam de acuerdo con el manual del fabricante, y el método del ensayo fue el siguiente: se distribuyeron 1 * 105 células de adipocitos 3T3-L1 en cada pocillo y se trataron con preparaciones que comprendían PPC al 5,0%, PPC al 5,0%+DCA al 2,2%, PPC al 5,0%+GCA al 2,5%, PPC al 5,0%+GCA al 5,0%, DCA al 1,0%, GCA al 1,0% o GCA al 5,0% y PBS, seguido de incubación durante 0-48 horas a 37°C. A continuación, las células se trataron con 50 ul de tampón de lisis celular (Tris-HCl 10 mM, NaH₂PO₄/ NaHPO₄10 mM, pH 7,5, NaCl 130 mM, Triton X-100 al 1% y pirofosfato de sodio 10 mM) y se dejaron a 4°C durante 10 min. El líquido sobrenadante se recogió mediante centrifugación a 1000 X rpm durante 1 minuto y la cuantificación de proteínas se realizó mediante el método BCA. Se añadieron a cada muestra 50 ul de tampón de reacción (HEPES 4 mM, pH 7,5, glicerol al 10%, ditiotreitol 2 mM) y 0,5 ul de DEVD-p-NA 4 mM y se hizo reaccionar a 37°C durante 1 hora. Luego se midió la longitud de onda con una espectrofluorometría a 405 nm.

Como resultado, como se muestra en las FIGS. 10A y 10B, el PBS no indujo actividad de caspasa-3 en adipocitos. La composición simple de PPC y la composición compleja de PPC GCA mostraron un efecto dependiente del tiempo de inducción de la actividad de caspasa-3 a un nivel considerable. Sin embargo, la composición compleja de PPC DCA inhibió la actividad de la caspasa-3 en comparación con PPC o PPC GCA. Es interesante que el DCA al 1,0% mostró cierta actividad de caspasa-3 hasta 24 horas, pero después de 48 horas la actividad de caspasa-3 volvió a los niveles previos al tratamiento. Este fenómeno se considera que se debe a la acción de la apoptosis celular hasta 24 horas después del tratamiento con la composición simple de DCA, y luego a una reacción en la que las células se vuelven necróticas por la reacción inflamatoria posterior. La actividad de caspasa-3 se observó en el grupo tratado con GCA, pero no hubo cambios dependientes del tiempo o de la concentración. Por otro lado, se confirmó que la actividad de caspasa-3 se mostró que era alta en la preparación compleja de GCA PPC de manera dependiente del tiempo y la concentración. Cuando se mezcló PPC con d Ca , la actividad de caspasa-3, que es inducida por la composición simple de PPC, se redujo significativamente. Estos resultados indican que el efecto específico de la apoptosis de la composición simple de PPC es inhibido por el DCA, y que la preparación de p Pc con adición de DCA induce más necrosis de adipocitos que está relacionada con la inflamación y similares.

2-4: El ensayo de lipólisis

El ensayo de actividad de glicerol se realizó con los materiales de ensayo para determinar si la muerte celular en el ensayo MTT se debía a necrosis o lipólisis. El glicerol es un marcador específico que aumenta cuando la grasa se descompone. Se utilizó el kit de ensayo de lipólisis de Abcam (Colorimétrico) según el manual del fabricante, y el método del ensayo fue el siguiente: se distribuyeron 1 * 105 células de adipocitos 3T3-L1 en cada pocillo y se trataron con preparaciones que comprendían PPC al 5,0%, PPC al 5,0%+DCA al 2,2%, PPC al 5,0%+GCA al 2,5%, PPC al 5,0%+GCA al 5,0%, DCA al 1,0%, GCA al 1,0% o GCA al 5,0% y PBS, seguido de incubación durante 0-48 horas a 37°C. Y luego se indujo la lisis. Los 30 ul de tampón de ensayo de lipólisis (NaCl 137 mM, KCl 5 mM, NaHCOa 4,2 mM, CaCb 1,3 mM, KH₂PO40,5 mM, MgCb 0,5 mM, MgSO₄0,5 mM, glucosa 5 mM, Hepes 20 mM (pH 7,4), BSA al 1%, Isoproterenol 1uM) se añadieron al medio de cultivo ajustando el volumen total a 50 ul, y se incubó durante 20 minutos. Después de añadirle el complejo de ensayo de glicerol (50 μl), la solución se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La absorbancia se midió a DO 570 (usando la curva de calibración para la determinación absoluta).

Como resultado, como se muestra en las FIGS. 10C y 10D, el PBS no indujo la secreción de glicerol en los adipocitos. A las 24 horas, a excepción del DCA al 1,0% y PPC al 5,0% GCA al 5,0%, los materiales de ensayo indujeron de manera similar la secreción de glicerol. A las 48 horas, los grupos de PPC sola, PPC DCA, DCA solo y GCA solo mostraron una actividad citolítica ligeramente mayor que la de las 24 horas. En particular, el grupo de PPC GCA mostró un efecto apoptótico celular mucho mayor que la composición simple de PPC.

Ejemplo de ensayo 3: La evaluación de la eficacia y efectos secundarios de preparaciones inyectables en un modelo de obesidad en ratones inducido por una dieta alta en grasas.

Se compraron ratones macho C57BL/6 (4 semanas de edad). Se les proporcionó una dieta alta en grasas (Dieta de investigación, 60% kcal de lípidos) para hacerlos muy obesos durante 12 semanas. Posteriormente, se administraron composiciones simples de PPC (2,5%, 5,0%, 10,0% y 15,0%), PBS (control negativo), Isuprel (control positivo), DCA al 1,0% y ^gC^aal 2,5%, y composiciones complejas de PPC al 5,0% DCA al 2,2%, PPC al 5,0%+HDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+UDCA al 3,0%, PPC al 5,0%+TDCA al 2,5, PPC al 5,0%+GDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+CDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+CA al 2,5%, PPC al 5,0% TUDCA al 4,0%, PPC al 5,0% TCA al 2,2% y PPC (2,5~10,0%) GCA (1,25~5,0%) directamente en el tejido graso de la región inguinal (tejido graso subcutáneo) del modelo de obesidad en ratones inducida por una dieta alta en grasas, respectivamente, y se observó la reducción de grasa in vivo. Cada material de ensayo se administró una vez. Se inyectaron por vía subcutánea 0,2 ml de cada material de ensayo en la almohadilla de grasa inguinal de los ratones. Finalmente, los ratones se sacrificaron a los 8 días después de la inyección. La almohadilla de grasa inguinal de los ratones sacrificados se diseccionó y la grasa subcutánea se separó rápidamente y se fijó en solución de formaldehído al 4%. Después de la fijación, la almohadilla de grasa se lavó y se deshidrató, se trató con solución de parafina para hacer un bloque de parafina, se tiñó con hematoxilina y eosina y se observó con un microscopio óptico.

Primero, en el tejido en el que se inyectó la composición simple de PPC, se inducía la apoptosis y degradación de adipocitos de una manera dependiente de la concentración en un intervalo de concentración de 2,5% a 10%, y el tamaño de los adipocitos en el tejido graso se reducía. Algunos de los adipocitos reducidos estaban pegados entre sí, la región de células muertas era clara y los adipocitos parecían agrandados debido a la fusión de los adipocitos degradados. Con una concentración del 15,0%, no sólo se reducía el adipocito, sino que también se confirmó el desarrollo de macrófagos alrededor de los adipocitos (FIG. 11A).

A continuación, en el caso de las composiciones complejas de PPC solubilizada por ácidos biliares, se observó claramente la apoptosis de adipocitos, se mostraron adipocitos pequeños y la fagocitosis mediada por macrófagos era evidente alrededor de los adipocitos en los tejidos grasos a los que se inyectaron las composiciones complejas de PPC solubilizada con DCA, CDCA, HDCA, UDCA, GDCA, TDCA o CA. En los tejidos grasos en los que se inyectó Isuprel, el grupo de control negativo, se redujo el tamaño de los adipocitos, se observó la configuración de apoptosis celular y se observó la infiltración de células distintas de los adipocitos para el aclaramiento de la célula apoptótica. En los tejidos grasos en los que se inyectó composición simple de DCA o las composiciones de PPC solubilizada con DCA, se indujo una inflamación grave en el sitio de administración de las composiciones, y la célula se lisó por necrosis, y se indujo una destrucción notable. La composición simple de ^dC^amostró inflamación grave incluso aunque el DCA estuviera contenido en una concentración baja del 1%, y la acción de inducción de inflamación fue mayor que la de la composición simple de PPC y las composiciones complejas de PPC GCA. Relativamente, los tejidos grasos en los que se inyectó PBS (control negativo) o PPC al 5,0% TUDCA al 4,0% tenían un borde de membrana celular claro y una forma celular bien formada, y los tejidos consistían únicamente en adipocitos. En los tejidos grasos en los que se inyectó PPC al 5,0% TCA al 2,5%, el tamaño de los adipocitos se redujo en conjunto y se observó infiltración de células distintas de los adipocitos para el aclaramiento de las células apoptóticas en una zona pequeña. En los tejidos grasos en los que se inyectó la PPC al 5,0% GCA al 2,5% de la presente invención, no se indujo inflamación, se redujo el tamaño de los adipocitos, la región de apoptosis era clara y los adipocitos parecían agrandados debido a la fusión de los adipocitos degradados (FIGS. 11b y 11C).

Como se muestra en la FIG. 11D, como resultado de examinar el efecto de la composición compleja de PPC GCA de la presente invención no solo los adipocitos sino también en la dermis y la epidermis después de la inyección en una almohadilla de grasa de una rata, después de inyección de PBS, los tejidos dérmicos y epidérmicos estaban bien conservados y no había células inflamatorias tales como neutrófilos. Y había un límite de membrana celular claro y una forma celular bien formada en los tejidos grasos, y los tejidos grasos consistían solo en adipocitos. Después de inyección de la composición simple de PPC al 5,0%, los tejidos dérmicos y epidérmicos estaban bien conservados y no había células inflamatorias tales como neutrófilos. En el tejido graso, el tamaño de los adipocitos se redujo y algunas de las membranas celulares se degradaron y algunos adipocitos parecían agrandarse debido a la fusión de los adipocitos degradados. Después de inyección de la composición compleja de PPC al 2,5%+GCA al 1,25%, los tejidos dérmicos y epidérmicos estaban bien conservados y no había células inflamatorias tales como neutrófilos. En el tejido graso, el tamaño de los adipocitos se redujo y algunas de las membranas celulares se degradaron y algunos adipocitos parecían agrandarse debido a la fusión de los adipocitos degradados. Después de inyección de la composición compleja de PPC al 5,0%+GCA al 2,5%, los tejidos dérmicos y epidérmicos estaban bien conservados y no había células inflamatorias tales como neutrófilos. En el tejido graso, el tamaño de los adipocitos se redujo, y la región de apoptosis era clara, y algunos adipocitos parecían agrandarse debido a la fusión de los adipocitos degradados. Después de inyección de la composición compleja de PPC al 10,0% GCA al 5,0%, los tejidos dérmicos y epidérmicos estaban levemente dañados y había algunas células inflamatorias y se observó un ligero edema. En el tejido graso, el tamaño de los adipocitos se redujo y hubo fagocitosis de macrófagos en la región de apoptosis y restos de ácido nucleico debido a la apoptosis, y algunos adipocitos parecían estar agrandados debido a la fusión de los adipocitos degradados. Después de inyección de la composición simple de GCA al 2,5%, los tejidos dérmicos y epidérmicos estaban levemente dañados y había células inflamatorias dispersadas tales como neutrófilos y similares, por lo que se observaba claramente inflamación. Y había un límite de membrana celular claro y una forma celular bien formada en los tejidos grasos, y los tejidos grasos consistían solo en adipocitos. A partir de los resultados anteriores, se confirmó que las reacciones inflamatorias en los adipocitos, dermis y epidermis eran inducidas más significativamente cuando se trataba con la composición simple de GCA que las preparaciones complejas de GCA y PPC.

En resumen, en el tejido graso en el que se inyectó composición simple de DCA o compleja de PPC solubilizada con DCA, HDCA, u Dc A, CDCA, TDCA, Gd Ca o CA, se indujo inflamación grave en el sitio de administración y las células se lisaron por necrosis y se indujo una destrucción significativa. Sin embargo, en el tejido graso en el que se inyectó la composición compleja de PPC GCA de la presente invención, el tamaño del adipocito se redujo y la región de apoptosis estaba clara. Y algunos adipocitos se hicieron más grandes debido a la fusión de adipocitos degradados. Aunque la inflamación dependiente de la concentración fue ligeramente inducida, aparecieron características morfológicas de daño a la membrana de adipocitos.

Ejemplo de ensayo 4: La evaluación de la toxicidad de las preparaciones inyectables de PPC solubilizada con GCA

Los efectos tóxicos de la preparación inyectable de PPC al 5,0% solubilizada con GCA al 2,8% se evaluaron con una sola administración subcutánea a perros beagle. Específicamente, se verificó el número de tatuajes de todos los animales y se midió su estado general, peso corporal y temperatura corporal a su llegada. Durante 12 días de cuarentena y período de adaptación después de la llegada, se observaron síntomas generales una vez al día, se midió el peso corporal una vez por semana y se verificó el estado de salud de los animales al final de la cuarentena y el período de adaptación. Después de terminarse el período de cuarentena y adaptación, un macho y una hembra del grupo de control y dos machos y dos hembras de cada grupo de ensayo se separaron en función del peso corporal. Los animales de ensayo eran un total de 14 perros beagle (macho: 5 ~ 6 meses, 7,05 ~ 8,16 kg / hembra: 5 ~ 6 meses, 5,83 ~ 7,14 kg) en cada uno de 7 perros machos y 7 hembras, y las dosis de administración por animal individual se calcularon basándose en el peso corporal el día de la administración, y la nuca se depiló antes de la administración. Los materiales de ensayo se administraron por vía subcutánea en el lado izquierdo y derecho de la nuca usando una jeringa desechable (10 ml, 23G). Los grupos de ensayo se establecieron como grupo de dosis baja (dosis: PPC 90 mg/kg GCA 50,4 mg/kg, cantidad de inyección: 1,8 ml/kg, cantidad máxima de inyección por sitio: 0,8 ml/sitio), grupo de dosis media (dosis: PPC 180 mg/kg+GCA 100,8 mg/kg, cantidad de inyección: 3,6 ml/kg, cantidad máxima de inyección por sitio: 1,6 ml/sitio), grupo de dosis alta (dosis: PPC 360 mg/kg+GCA 201,6 mg/kg, cantidad de inyección: 7,2 ml/kg, cantidad máxima de inyección por sitio: 3,2 ml/sitio) y grupo de control (solución salina, cantidad de inyección: 7,2 ml/kg, cantidad máxima de inyección por sitio: 3,2 ml/sitio). Los resultados detallados de los ensayos se describen a continuación.

1) La presencia o ausencia de muerte; durante el período de ensayo, no se observaron muertes en ninguno de los grupos de ensayo y control.

2) Síntomas generales; durante el período de ensayo, no se observaron síntomas en ninguno de los grupos de ensayo y control.

3) Cambio de peso; durante el período de ensayo, no se observaron cambios anormales en ninguno de los grupos de ensayo y control.

4) Autopsia; no se observaron cambios anormales en ninguno de los grupos de ensayo y de control.

5) Examen histopatológico; Se observó un grado pequeño o leve de inflamación granulomatosa en los tejidos subcutáneos de los grupos de dosis alta de machos y hembras (véanse las FIGS. 12A a 12C). Como se describió anteriormente, se observó inflamación muy leve solo en el grupo de dosis alta al que se inyectó la preparación inyectable de la presente invención. Sin embargo, desde el punto de vista del establecimiento de la concentración de la dosis adecuada tras la administración a seres humanos y otros animales, dicho grado de inflamación puede considerarse sin efectos secundarios.

Ejemplo de ensayo 5: La comparación del dolor in vivo

Los siguientes resultados se obtuvieron evaluando el grado de dolor inducido por una composición simple de DCA, GCA o PPC y una composición compleja de PPC solubilizada con ácido biliar midiendo la distancia de movimiento y la velocidad de movimiento del animal in vivo. En lo que sigue, el % de la composición significa % (p/v).

Específicamente, se observó edema después de inyectar 100 ul de composición simple (DCA al 1,0%, PPC al 5,0% o GCA al 2,5%) o composición compleja (PC al 5,0%+DCA al 2,2%, PPC al 5,0% HDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+UDCA al 3,0%, PPC al 5,0%+TDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+GDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+CDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+CA al 2,5%, PPC al 5,0%+GCA al 2,5%, PPC al 5,0% TCA al 2,5% o PPC al 5,0% TUDCA al 4,0%) en la pata del ratón. Después de confirmar que el edema era máximo 2 horas después de la administración, se compararon la distancia de movimiento (cm) y la velocidad de movimiento (cm/s) durante 5 minutos utilizando el sistema Noldus Video Traking.

Como se muestra en las FIGS. 13A y 13B, la distancia de movimiento y la velocidad de movimiento del grupo de composición simple de PPC al 5,0%, PPC al 5,0%+TUDCA al 4,0%, PPC al 5,0%+GCA al 2,5% y PPC al 5,0%+TCA al 2,5% no cambió o aumentó ligeramente. Por otro lado, la distancia de movimiento y la velocidad de movimiento del grupo de PC al 5,0%+DCA al 2,2%, PPC al 5,0%+HDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+UDCA al 3,0%, PPC al 5,0%+TDCA al 2,5%, PPC al 5,0%+GDCA al 2,5%, PPC al 5,0% CDCA al 2,5% y PPC al 5,0% CA al 2,5% se redujo en aproximadamente 20%, y se consideró que estos resultados se debían a la disminución de la actividad debido al dolor. Esto sugiere que la preparación inyectable de la presente invención es significativamente menos dolorosa (sustancialmente sin dolor) que los productos comerciales existentes.

Ejemplo de ensayo 6: La evaluación clínica de las composiciones de PPC solubilizada con GCA

6-1: La evaluación clínica con respecto a la eficacia de la reducción de grasa

Entre las composiciones de la presente invención, la composición inyectable de PPC al 5,0% solubilizada con GCA al 2,8% se administró a pacientes que tenían depósito de grasa submentoniana localizada. Específicamente, después de anestesia tópica con crema de lidocaína al 9,6% durante 30 minutos o más, se cargó una jeringa de 5 cc con una aguja de inyección de 30G de 13 mm y la composición se inyectó 6 veces a intervalos de 4 semanas en la grasa submentoniana (un total de 50 puntos, 0,2 cc por punto y total de 10 ml, intervalo de 1,0 cm y a 6-8 mm de profundidad). Después de 12 semanas, se evaluaron fotografías clínicas estándar, imágenes de TC (tomografía computarizada), las mejoras comunicadas por los investigadores, las mejoras comunicadas por los sujetos y la satisfacción de los sujetos.

Las fotografías clínicas se tomaron antes y 12 semanas después de la administración final, y la vista en perspectiva frontal izquierda, vista en perspectiva derecha y los lados izquierdo y derecho de los sujetos se fotografiaron en las siguientes condiciones: En las fotografías frontales, el sujeto miraba a la cámara en una postura en la que el plano horizontal de Frankfort, que es el plano donde se unen el trago de ambas orejas del sujeto y la parte más baja del paladar orbitario, era horizontal. En las fotografías de vista en perspectiva, después de girar el cuerpo del sujeto 45 grados, el sujeto miraba a la cámara en una postura en la que la cara estaba posicionada para estar en línea con la punta de la nariz y el borde de la bola, y el plano horizontal Frankfort era horizontal. En las fotografías laterales, el cuerpo del sujeto se giró 90 grados desde la posición frontal para estar alineado con la punta de la nariz y la barbilla. En este punto, se confirmó que las cejas opuestas no eran visibles y que la postura era correcta para que el cuerpo no se inclinara hacia un lado, se doblara o se estirara. Y luego el sujeto miraba a la cámara en una postura en la que la línea que conectaba la parte posterior del sujeto y la parte posterior de la cabeza se ajustaba para que fuera vertical y el plano horizontal de Frankfort era horizontal. La cámara utilizada para fotografiar fue una cámara Nikon DSLR D5200 con una lente de enfoque corto de 60 mm.

Las imágenes de TC se tomaron antes y 12 semanas después de la última administración, y se midieron el grosor y el área de la grasa submentoniana. El sujeto sufría al tragar saliva según manifestó mientras yacía cómodamente después de llevar puesta la parte superior y la cinta de la cabeza especificadas.

Las imágenes de TC se tomaron antes y 12 semanas después de la administración final, y se midieron el grosor y el área de la grasa submentoniana. El sujeto evitó tragar saliva según lo manifestado mientras yacía cómodamente después de usar la parte superior y la cinta de cabeza especificadas. En ese momento, la almohada para las imágenes por TC era del tipo CUELLO y la cabeza del sujeto estaba fijada a la línea de guía láser que pasaba por la frente, nariz, mentón y mitad de la clavícula. Los parámetros de generación de imágenes de la TC fueron el intervalo de exploración (desde el canal auditivo hasta la parte inferior de la clavícula), corte (5,0 mm), FOV con piel, tamaño de matriz 512x512, tiempo de rotación de 0,5 s y colimación de haz 64x0,6 mm. El dispositivo era de GE Medical Systems y la imagen se analizó con Xelis 1.06.0 BN 63D de Infinity.

La eficacia clínica de la composición inyectable de la presente invención se muestra bien en las FIGS. 16A y 16B. La FIG. 14A es una fotografía que muestra una imagen clínica de un sujeto antes de la administración y 12 semanas después de la administración final, en donde la composición compleja de PPC solubilizada con GCA de la presente invención se administró 6 veces a intervalos de 4 semanas en una dosis de 0,2 cc por punto, total de 50 puntos, total de 10 ml al sujeto, y se observó la reducción de la grasa submentoniana incluso a simple vista. El nivel de satisfacción comunicado por el sujeto fue de 4 sobre 5, y la mejora evaluada tras comparar las imágenes de antes de la administración fue de 1,5 grados. Es interesante que el sujeto era un paciente que había recibido previamente una composición inyectable de PPC solubilizada con DCNa (disponible comercialmente como Lipobean i.v.), y el sujeto describió una sorpresa significativa de que las composiciones de la presente invención eran indoloras tras la administración, inmediatamente después de la administración y con el tiempo.

Además, la FIG. 14B muestra el resultado de la evaluación cuantitativa de la cantidad de reducción de grasa depositada localmente por TC. El grosor de la grasa submentoniana preplatismal ubicada 3 cm por debajo del punto final mandibular del plano sagital de la TC que pasa por el mentón medio se redujo en un 30,36%, de 5,6 mm antes de la administración a 3,9 mm después de 12 semanas de la administración final.

6-2: La evaluación clínica con respecto al dolor, edema y efectos secundarios

Seis pacientes varones y mujeres que habían recibido la composición en inyección de PPC solubilizada con DCA (productos previamente comercializados) se sometieron a una evaluación clínica del dolor, edema y efectos secundarios después de la administración de la composición inyectable de PPC solubilizada con GCA de la presente invención. Específicamente, después de la anestesia tópica con crema de lidocaína al 9,6% durante 30 minutos o más, se administraron 10 ml de las composiciones de la presente invención (preparación inyectable de PPC al 5,0% solubilizada con GCA 2,8% (la relación molar de ^gC^aa PPC es 0,97) o preparación inyectable de PPC al 5,0% solubilizada con GCA 4,0% (la relación molar de GCA a PPC es 1,39)) a los sujetos que habían recibido 10 ml de composición en la que Lipobean i.v. (5 ml) se diluyó con solución salina inyectable (5 ml) en una relación de 1:1 (es decir, PPC al 2,5%+DCNa al 1,2%) con jeringas cargadas con aguja de inyección 30G de 13 mm en abdomen y costado (intervalo de 1,5 cm, profundidad de 10-12 mm, 0,5 cc por punto y total de 50 ml a 100 ml por administración) o en la grasa submentoniana (intervalo de 1,0 cm, profundidad de 6-8 mm, 0,2 cc por punto y un total de 10 ml por administración), con los mismos métodos de administración. Después de la administración, los sujetos recibieron un cuestionario, una regla de 10 cm y bolígrafos de aceite azul para la evaluación del dolor por VAS (escala visual analógica), y se evaluaron el dolor, edema, hinchazón, hematoma, cardenal, eritema, anestesia, induración, parestesia, nódulo y prurito tras la administración, 1,3, 7 y 10 días después de la administración. El dolor se evaluó utilizando una regla de 10 cm y un bolígrafo planetario con una línea de 10 cm de largo para registrar la ausencia de dolor en el extremo izquierdo y el dolor más intenso imaginable en el extremo derecho. En el caso de edema e hinchazón, después de presionar el sitio de administración y el otro sitio usando la regla de 10 cm mientras se mira en el espejo, el sujeto registró como 0. Nada, 1. Leve (2 mm o menos), 2. Moderado (2-4 mm), 3. Grave (4-6 mm) y 4. Extremadamente grave (6-8 mm). En el caso de hematoma, cardenal y eritema, el sujeto registró el grado como 0. Nada, 1. Leve, 2. Moderado, 3. grave y 4. Extremadamente grave al comparar con las imágenes de ejemplo adjuntas. En el caso de anestesia, induración, parestesia, nódulo y prurito que son síntomas subjetivos, el sujeto registró el grado como 0. Nada, 1. Leve, 2. Moderado, 3. Grave y 4. Extremadamente grave, después de presionar todo el sitio de administración.

Como se muestra en la FIG. 15 (FIGS. 15C) y la FIG. 16, los sujetos que habían recibido la administración de la composición inyectable de PPC solubilizada con DCNa se quejaron particularmente de dolor y edema en el momento de la administración y 10 días después de la administración, y el sujeto comunicó lesiones en la piel como eritema, hematoma y cardenal, y acontecimientos adversos localizados tales como induración, nódulo, prurito y sensación de ardor. Sin embargo, sorprendentemente, los sujetos que recibieron la administración de preparados inyectables de PPC solubilizada con GCA de la presente invención mostraron niveles leves, prácticamente ausentes, de dolor (FIG. 15A) y edema (FIG. 15B), especialmente. En particular, como se muestra en la FIG. 15A, es muy inusual que la composición compleja de PPC GCA de la presente invención no produzca casi dolor incluso en el momento de la inyección. Teniendo en cuenta los hechos de manera integral de que la preparación inyectable de PPC solubilizada con DCNa (una sal sódica de DCA), que es una preparación convencional y se usó como ejemplo comparativo, tiene características de partículas similares (micelas, tamaño de partículas, etc.) a las composiciones de la presente invención, y aquellas preparaciones inyectables se administran a un pH similar al del cuerpo humano, tal efecto de la composición de la presente invención es un efecto único que es difícil de predecir a partir de técnicas previamente conocidas.

Además, como se muestra en la FIG. 16, el hematoma y eritema producidos por los materiales de ensayo se redujeron después de la administración de la composición de la presente invención a un nivel leve o nulo excepto por el cardenal producido por la propia aguja de inyección o el hematoma producido por el daño vascular en el momento de la inyección. Específicamente, como se muestra en la FIG. 15C, no hubo efectos secundarios de lesiones nerviosas tales como anestesia, hinchazón extensa, hematoma causado por fármacos, cardenal, eritema, induración, parestesia, nódulo, prurito, sensación de ardor (calor), disfagia y similares. Teniendo en cuenta el resultado del ensayo de toxicidad in vivo, in vitro y de dosis única, pueden demostrarse clínicamente la apoptosis de adipocitos y los efectos de degradación de grasas de las composiciones de PPC solubilizada con GCA en seres humanos con seguridad y alta eficacia.

Aplicabilidad industrial

La presente invención se refiere a una composición útil para reducir la grasa de forma no quirúrgica sin dolor, edema ni efectos secundarios en un sujeto que tiene depósito de grasa localizada usando fosfatidilcolina farmacéuticamente activa y un método para prepararla. Más específicamente, una composición y preparación para reducir la grasa localizada con dolor y efectos secundarios reducidos (especialmente, necrosis de células musculares, fibroblastos y células endoteliales vasculares distintas de los adipocitos; edema; anestesia de los sitios de administración; hinchazón extensa; eritema; induración; parestesia; nódulo; prurito; sensación de ardor; lesión nerviosa; o disfagia), comprendiendo la composición: (i) fosfatidilcolina; y (ii) al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y sus sales, en donde una relación molar de (ii) a (i) en la composición está en un intervalo de 0,7 a 3,0, un kit que comprende la misma, un método para prepararla y un método para eliminar de manera no quirúrgica el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos usando la composición o preparación. Se informa que las composiciones simples de ácido desoxicólico (DCA) o las composiciones complejas de fosfatidilcolina (PPC) y ácido desoxicólico (DCA), las preparaciones inyectables convencionales para reducir la grasa localizada, inducen efectos secundarios producidos por necrosis de adipocito y la citólisis de fibroblastos, células endoteliales y células del músculo esquelético tales como anestesia, hinchazón extensa, hematoma causado por fármacos, cardenales, eritema, induración, parestesia, nódulo, prurito, sensación de ardor (calor), disfagia y similares. Sin embargo, dado que la preparación inyectable para reducir la grasa localizada de la presente invención reduce la grasa localizada al inducir selectivamente la lipólisis y la apoptosis solo de adipocitos, la composición de la presente invención no solo muestra un efecto significativo en la reducción de los adipocitos, sino que también demuestra una reducción significativa del dolor y de los efectos secundarios que acompañan a las composiciones inyectables citolíticas convencionales. Por lo tanto, se mejora notablemente el cumplimiento de la medicación de los sujetos y, en última instancia, se mejora la calidad de vida de los sujetos que quieren reducir la grasa localizada. Por lo tanto, la aplicabilidad industrial es alta.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para usar en la reducción o eliminación de grasa localizada con dolor y efectos secundarios reducidos, consistiendo esencialmente la composición en:

(i) fosfatidilcolina; y

2. La composición para uso según la reivindicación 1, en donde el efecto secundario es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en necrosis de células musculares, fibroblastos y células endoteliales vasculares distintas de los adipocitos; edema; anestesia de los sitios de administración; hinchazón extensa; eritema; induración; parestesia; nódulo; prurito; sensación de ardor; lesión nerviosa; y disfagia.

3. La composición para uso según la reivindicación 1 o 2, en donde la relación molar de (ii) a (i) en la composición está en un intervalo de 0,7 a 2,6.

4. La composición para uso según cualquier reivindicación precedente, en donde la fosfatidilcolina está contenida en la composición en una concentración de 0,625 a 15% (p/v), o de 1,25 a 12,5% (p/v).

5. La composición para uso según cualquier reivindicación precedente, en donde la sal es sal de sodio, sal de potasio o sal de amonio.

6. La composición para uso según cualquier reivindicación precedente, en donde la composición comprende además al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un conservante; un agente isotónico; y un regulador de pH.

7. La composición para uso según cualquier reivindicación precedente, en donde la composición es para reducir o eliminar de manera no quirúrgica el depósito de grasa localizada en un sujeto.

8. La composición para uso según cualquier reivindicación precedente, en donde la composición es una composición inyectable.

9. La composición para uso según cualquier reivindicación precedente, en donde el pH de la composición está en un intervalo de 6,8 a 7,8.

10. Un kit que comprende:

(I) un primer envase que comprende una composición para usar según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para reducir o eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, y (II) un dispositivo de administración capaz de administrar la composición o preparación en un sitio de depósito de grasa.

11. El kit para uso según la reivindicación 10, en donde el dispositivo de administración está precargado con la composición.

12. El kit para uso según la reivindicación 10 u 11, en donde el kit comprende una descripción escrita para usar la composición para reducir o eliminar el depósito de grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos en un sujeto.

13. El kit para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde en la composición está contenido el al menos uno seleccionado del grupo que consiste en ácido glicocólico (GCA), ácido taurocólico (TCA) y sal del mismo con el mismo peso que la fosfatidilcolina o menos.

14. Un método para preparar una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para reducir o eliminar la grasa localizada con un dolor y efectos secundarios reducidos, en donde la composición es una composición inyectable, comprendiendo el método las etapas de:

(b) añadir un conservante y, opcionalmente, un agente isotónico, seguido de agitación;

(c) añadir fosfatidilcolina, seguido de agitación a temperatura ambiente; y

15. El método según la reivindicación 14, en donde el conservante es alcohol bencílico.