ES2955852T3

ES2955852T3 - Anticuerpos de unión a STEAP-1

Info

Publication number: ES2955852T3
Application number: ES18712921T
Authority: ES
Inventors: Thomas Hofer; Maximiliane Koenig; Ekkehard Moessner; Jens Niewoehner; Tina Weinzierl; Laurent Lariviere
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-04-03
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2023-12-07
Anticipated expiration: 2038-03-29
Also published as: CN110494452A; MX2019011769A; JP2020515277A; CA3055132A1; CL2019002735A1; JP7247101B2; US20200190212A1; BR112019018767A2; PE20200010A1; PH12019502274A1; MA49289A; KR102667951B1; US20220041747A1; RU2019134462A; KR20190136054A; SG11201909218RA; AU2018247767B2; CR20190430A; AU2018247767A1; RU2019134462A3

Abstract

La presente invención se refiere generalmente a anticuerpos que se unen a STEAP-1, incluidas moléculas de unión a antígeno biespecíficas, por ejemplo, para activar células T. Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican dichos anticuerpos, y a vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a métodos para producir anticuerpos y a métodos para usarlos en el tratamiento de enfermedades. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos de unión a STEAP-1

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a anticuerpos que se unen a STEAP-1, incluyendo moléculas de unión a antígeno biespecíficas, por ejemplo, para activar linfocitos T. Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican dichos anticuerpos, y a células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a procedimientos para producir los anticuerpos y a los anticuerpos para su uso en el tratamiento de enfermedades.

Antecedentes

STEAP-1 (antígeno epitelial de seis-transmembrana de la próstata 1) es una proteína de superficie celular de 339 aminoácidos que, en los tejidos normales, se expresa predominantemente en las células prostáticas. La expresión de la proteína STEAP-1 se mantiene en niveles altos en diversos estadios del cáncer de próstata, y STEAP-1 también se sobreexpresa altamente en otros cánceres humanos tales como el de pulmón y el de colon. El perfil de expresión de STEAP-1 en tejidos normales y cancerosos sugirió su uso potencial como diana terapéutica, por ejemplo para inmunoterapia. El documento Wo 2008/052187 informa de anticuerpos anti-STEAP-1 e inmunoconjugados de los mismos. En el documento WO 2014/165818 se describe un anticuerpo biespecífico STEAP-1/CD3 (scFv)².

Existe la necesidad de fármacos adicionales para tratar diversos cánceres y metástasis de cánceres en la próstata, el pulmón y el colon. En particular, los fármacos útiles para este propósito incluyen anticuerpos que se unen a STEAP-1, en particular anticuerpos biespecíficos que se unen a STEAP-1 en células diana y un antígeno activador de linfocitos T tal como CD3 en linfocitos T. La unión simultánea de un anticuerpo de este tipo a ambas de sus dianas forzará una interacción temporal entre la célula diana y el linfocito T, provocando la activación de cualquier linfocito T citotóxico y la posterior lisis de la célula diana.

Para propósitos terapéuticos, un requisito importante que deben cumplir los anticuerpos es una estabilidad suficiente tanto in vitro (para el almacenamiento del fármaco) como in vivo (después de la administración al paciente). Las modificaciones como la desamidación de asparagina, la isomerización de aspartato, la formación de succinimida y la oxidación de triptófano son degradaciones típicas de los anticuerpos recombinantes y pueden afectar tanto a la estabilidad in vitro como a las funciones biológicas in vivo.

La presente invención proporciona anticuerpos novedosos, incluyendo anticuerpos biespecíficos, que se unen a STEAP-1 y son resistentes a la degradación, por ejemplo, mediante la formación de succinimida y, por tanto, muestran una buena estabilidad. Los anticuerpos (biespecíficos) proporcionados combinan además una buena eficacia y producibilidad con una baja toxicidad y propiedades farmacocinéticas favorables.

Sumario de la invención

Los autores de la presente invención han desarrollado un anticuerpo novedoso con propiedades mejoradas e inesperadas, que se une a STEAP-1. En particular, el anticuerpo es resistente a la degradación, por ejemplo, por la formación de succinimida y, por tanto, en particular estable según se requiera para propósitos terapéuticos. Además, los autores de la invención han desarrollado moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a STEAP-1 y a un antígeno activador de linfocitos T, incorporando el novedoso anticuerpo anti-STEAP-1.

Por tanto, el anticuerpo proporcionado por la presente invención muestra una degradación de succinimida inferior a aproximadamente un 5 % después de 4 semanas a pH 7,4, 37 °C y/o una degradación de succinimida inferior a aproximadamente un 10 % después de 4 semanas a pH 6,0, 40 °C, como se determina por espectrometría de masas.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a STEAP-1, en el que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, una H^cD^r2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID ⁿO: 7, una LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y una LCDR3 de S^eQ ID NO: 9. En un modo de realización, la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG, en particular, una IgG¹. En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. En otro modo de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo de una molécula Fv, una molécula scFv, una molécula Fab y una molécula F(ab')₂. En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico.

La invención también proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, que comprende (a) un primer resto de unión a antígeno que se une a un primer antígeno, en el que el primer antígeno es STEAP-1 y el primer resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, una HCDR2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, una LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 9, y (b) un segundo resto de unión a antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno. En un modo de realización, la VH del primer resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y la VL del primer resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En un modo de realización, el segundo antígeno es CD3, en particular CD3e. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno comprende una VH que comprende una HCDR1 de SEQ ID NO: 15, una HCDR2 de SEQ ID NO: 16 y una HCDR3 de SEQ ID NO: 17, y una VL que comprende una LCDR1 de SEQ ID NO: 18, una LCDR2 de SEQ ID NO: 19 y una LCDR3 de SEQ iD NO: 20. En un modo de realización, la VH del segundo resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y la VL del segundo resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En un modo de realización, el primer y/o el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab en la que los dominios variables VL y VH o los dominios constantes CL y CH1, en particular los dominios variables VL y Vh , de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se reemplazan entre sí. En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab en la que, en el dominio constante CL, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) y, en el dominio constante CH1, el aminoácido en la posición 147 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, el primer y el segundo resto de unión a antígeno se fusionan entre sí, opcionalmente por medio de un conector peptídico. En un modo de realización, el primer y el segundo resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab y (i) el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno o bien (ii) el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un tercer resto de unión a antígeno. En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno es idéntico al primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad. En un modo de realización, el primero, el segundo y, cuando está presente, el tercer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab; y (i) el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab a extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, o bien (ii) el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc; y el tercer resto de unión a antígeno, cuando está presente, se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc. En un modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG, en particular de IgG¹. En un modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc humano. En un modo de realización, un residuo aminoacídico del dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que se puede colocar en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y un residuo aminoacídico del dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que se puede colocar la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc y/o la función efectora.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona uno o más polinucleótidos aislados que codifican un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención. La invención proporciona además una célula huésped que comprende el/los polinucleótido(s) aislado(s) de la invención. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula eucariota, en particular una célula de mamífero.

En otro aspecto se proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica que se une a STEAP-1, que comprende las etapas de a) cultivar la célula anfitriona de la invención en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y b) recuperar opcionalmente el anticuerpo.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se engloban por la invención procedimientos de uso del anticuerpo, la molécula de unión a antígeno biespecífica y la composición farmacéutica de la invención. En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo, una molécula de unión a antígeno biespecífica o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso como un medicamento. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo, una molécula de unión a antígeno biespecífica o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En un modo de realización específico, la enfermedad es cáncer.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Configuraciones ejemplares de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención. (A, D) Ilustración de la molécula "1 1 CrossMab". (B, E) Ilustración de la molécula "2+1 IgG Crossfab" con orden alternativo de los componentes Crossfab y Fab ("invertida"). (C, F) Ilustración de la molécula "2+1 IgG Crossfab". (G, K) Ilustración de la molécula "1 1 IgG Crossfab" con orden alternativo de los componentes Crossfab y Fab ("invertida"). (H, L) Ilustración de la molécula "1 1 IgG Crossfab". (I, M) Ilustración de la molécula "2+1 IgG Crossfab" con dos CrossFab. (J, N) Ilustración de la molécula "2+1 IgG Crossfab" con dos CrossFab y orden alternativo de los componentes Crossfab y Fab ("invertida"). (O, S) Ilustración de la molécula "Fab-Crossfab". (P, T) Ilustración de la molécula "Crossfab-Fab". (Q, U) Ilustración de la molécula "(Fab)²-Crossfab". (R, V) Ilustración de la molécula "Crossfab-(Fab)₂". (W, Y) Ilustración de la molécula "Fab-(Crossfab)²". (X, Z) Ilustración de la molécula "(Crossfab)²-Fab". Punto negro: modificación opcional en el dominio Fc que promueve la heterodimerización. +, --: aminoácidos de cargas opuestas introducidos opcionalmente en los dominios CH1 y CL. Las moléculas Crossfab se representan como que comprenden un intercambio de regiones VH y VL, pero, en modos de realización en los que no se introducen modificaciones de carga en los dominios CH1 y CL, pueden comprender de forma alternativa un intercambio de los dominios CH1 y CL.

Figura 2. Ilustración de las moléculas de anticuerpo biespecífico de linfocitos T (TCB) preparadas en los Ejemplos. Todas las moléculas de anticuerpo TCB analizadas se produjeron como "2+1 IgG CrossFab, invertidas" con modificaciones de carga (intercambio VH/VL en el conector de CD3, modificaciones de carga en los conectores de STEAP1, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K).

Figura 3. Análisis de secuencia de los dominios variables de vandortuzumab. (A) Predicción de posiciones de puntos calientes en la secuencia. (B) Anotación de las regiones CDR y los puntos calientes predichos en las secuencias de dominio variable de vandortuzumab.

Figura 4. Lisis mediada por linfocitos T de células LnCAP que expresan STEAP-1 después de 24 h (A) o 48 h (B), inducida por diferentes moléculas de anticuerpos TCB anti-STEAP-1 (E:T = 10:1, células efectoras PBMC humanas). Se representan triplicados con D.E.

Figura 5. Activación de Jurkat, determinada mediante luminiscencia, tras la unión simultánea de diferentes moléculas de anticuerpos TCB anti-STEAP-1 a CD3 humano en células indicadoras Jurkat-NFAT y STEAP-1 humano en células LnCAP (A) o 22Rv1 (B). La línea celular CHO-K1 negativa para STEAP-1 sirvió como control (C). Se representan triplicados con D.E.

Figura 6. Unión de moléculas de anticuerpos TCB anti-STEAP-1 a células CHO-hSTEAP1 que expresan STEAP-1 humano (A) y células Jurkat NFAT que expresan CD3 (B).

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Los términos se usan en el presente documento como se usan, en general, en la técnica, a menos que se defina de otro modo en lo que sigue.

Como se usa en el presente documento, el término "molécula de unión a antígeno" se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Los ejemplos de moléculas de unión a antígeno son inmunoglobulinas y derivados, por ejemplo, fragmentos, de las mismas.

El término "biespecífica" quiere decir que la molécula de unión a antígeno se puede unir específicamente a al menos dos determinantes antigénicos distintos. Típicamente, una molécula de unión a antígeno biespecífica comprende dos sitios de unión a antígeno, siendo cada uno específico para un determinante antigénico diferente.

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica se puede unir simultáneamente a dos determinantes antigénicos, en particular dos determinantes antigénicos expresados en dos células distintas.

El término "valente" como se usa en el presente documento indica la presencia de un número especificado de sitios de unión a antígeno en una molécula de unión a antígeno. Como tal, el término "unión monovalente a un antígeno" indica la presencia de un (y no más de un) sitio de unión a antígeno específico para el antígeno en la molécula de unión a antígeno.

Un "sitio de unión a antígeno" se refiere al sitio, es decir, uno o más residuos aminoacídicos, de una molécula de unión a antígeno que proporciona interacción con el antígeno. Por ejemplo, el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo comprende residuos aminoacídicos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Una molécula de inmunoglobulina natural típicamente tiene dos sitios de unión a antígeno, una molécula Fab típicamente tiene un único sitio de unión a antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "resto de unión a antígeno" se refiere a una molécula polipeptídica que se une específicamente a un determinante antigénico. En un modo de realización, un resto de unión a antígeno puede dirigir la entidad a la que está fijado (por ejemplo, un segundo resto de unión a antígeno) a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral que porta el determinante antigénico. En otro modo de realización, un resto de unión a antígeno puede activar la señalización a través de su antígeno diana, por ejemplo un antígeno del complejo receptor de linfocitos T. Los restos de unión a antígeno incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos como se define además en el presente documento. Los restos de unión a antígeno particulares incluyen un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende una región variable de la cadena pesada del anticuerpo y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo. En determinados modos de realización, los restos de unión a antígeno pueden comprender regiones constantes de anticuerpo, como se define además en el presente documento y es conocido en la técnica. Las regiones constantes de la cadena pesada útiles incluyen cualquiera de los cinco isotipos: a, ó, £, y o p. Las regiones constantes de la cadena ligera útiles incluyen cualquiera de los dos isotipos: ^ky ^a.

Como se usa en el presente documento, el término "determinante antigénico" es sinónimo de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (por ejemplo, un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional constituida por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un resto de unión a antígeno, formando un complejo resto de unión a antígeno-antígeno. Los determinantes antigénicos útiles se pueden encontrar, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células afectadas, en la superficie de células inmunitarias, libres en suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (MEC). Las proteínas denominadas antígenos en el presente documento (por ejemplo, STEAP-1, CD3) pueden ser cualquier forma natural de las proteínas de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos), primates no humanos (por ejemplo, macacos cangrejeros) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. En un modo de realización particular, el antígeno es una proteína humana. Cuando se hace referencia a una proteína específica en el presente documento, el término engloba la proteína no procesada "de longitud completa", así como cualquier forma de la proteína que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de la proteína, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. Una proteína humana ejemplar útil como antígeno es CD3, en particular la subunidad épsilon de CD3 (véase UniProt n.° P07766 (versión 185), NCBI RefSeq n.° NP_000724.1, Se Q ID NO: 24 para la secuencia humana; o UniProt n.° Q95LI5 (versión 69), NCBI GenBank n.° BAB71849,1, SEQ ID NO: 25 para la secuencia de macaco cangrejero [Macaca fascicularis]) o STEAP-1 (antígeno epitelial de seis-transmembrana de la próstata 1; véase UniProt n.° Q9UHE8 (versión 137); NCBI RefSeq n.° NP_036581.1, SEQ ID NO: 23 para la secuencia humana). En determinados modos de realización, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención se une a un epítopo de CD3 o STEAP-1 que se conserva entre los antígenos CD3 o STEAP-1 de diferentes especies. En modos de realización particulares, el anticuerpo o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención se une a STEAP-1 humano.

Por "unión específica" se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de las interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de un resto de unión a antígeno para unirse a un determinante antigénico específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (RPS) (analizada por ejemplo en un instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). En un modo de realización, el grado de unión de un resto de unión a antígeno a una proteína no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del resto de unión a antígeno al antígeno como se mide, por ejemplo, por RPS. <<<<<<<En determinados modos de realización, un resto de unión a antígeno que se une al antígeno, o una molécula de unión a antígeno que comprende ese resto de unión a antígeno, tiene una constante de disociación (K^d) de < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10 8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M).

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un receptor) y su compañero de unión (por ejemplo, un ligando). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, un resto de unión a antígeno y un antígeno, o un receptor y su ligando). La afinidad de una molécula X por su compañera Y se puede representar en general por la constante de disociación (K^d), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y kas, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. La afinidad se puede medir por procedimientos bien establecidos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Un procedimiento particular para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (RPS).

"Unión reducida", por ejemplo unión reducida a un receptor de Fc, se refiere a una disminución en la afinidad para la interacción respectiva, como se mide, por ejemplo, por RPS. Por claridad, el término también incluye la reducción de la afinidad hasta cero (o por debajo del límite de detección del procedimiento analítico), es decir, la anulación completa de la interacción. A la inversa, "unión incrementada" se refiere a un incremento en la afinidad de unión para la interacción respectiva.

Un "antígeno activador de linfocitos T" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico expresado en la superficie de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, que puede inducir la activación de linfocitos T tras la interacción con una molécula de unión a antígeno. Específicamente, la interacción de una molécula de unión a antígeno con un antígeno activador de linfocitos T puede inducir la activación de linfocitos T desencadenando la cascada de señalización del complejo receptor de linfocitos T. En un modo de realización particular, el antígeno activador de linfocitos T es CD3, en particular la subunidad épsilon de CD3 (véase UniProt n.° P07766 (versión 144), NCBI RefSeq n.° NP_000724,1, Se Q ID NO: 24 para la secuencia humana; o UniProt n.° Q95LI5 (versión 49), NCBI Gen Bank n.° BAB71849,1, SEQ ID NO: 25 para la secuencia de macaco cangrejero [Macaca fascicularis]).

"Activación de linfocitos T" como se usa en el presente documento se refiere a una o más respuestas celulares de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, seleccionadas de: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica y expresión de marcadores de activación. Los ensayos adecuados para medir la activación de linfocitos T son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento.

Un "antígeno de célula diana" como se usa en el presente documento se refiere a un determinante antigénico presentado en la superficie de una célula diana, por ejemplo, una célula en un tumor tal como una célula cancerosa o una célula del estroma tumoral. De acuerdo con la invención, el antígeno de célula diana es STEAP-1, en particular STEAP-1 humano.

Como se usa en el presente documento, los términos "primero", "segundo" o "tercero" con respecto a las moléculas Fab, etc., se usan por conveniencia para distinguir cuando hay más de uno de cada tipo de resto. El uso de estos términos no pretende conferir un orden u orientación específica de la molécula de unión a antígeno biespecífica a menos que así se indique explícitamente.

Por "fusionado" se quiere decir que los componentes (por ejemplo, una molécula Fab y una subunidad de dominio Fc) se unen por enlaces peptídicos, directamente o bien por medio de uno o más conectores peptídicos.

Una "molécula Fab" se refiere a una proteína que consiste en el dominio VH y CH1 de la cadena pesada (la "cadena pesada de Fab") y el dominio VL y CL de la cadena ligera (la "cadena ligera de Fab") de una inmunoglobulina.

Por molécula Fab de "entrecruzamiento" (también denominada "Crossfab") se quiere decir una molécula Fab en la que los dominios variables o los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian (es decir, se reemplazan entre sí), es decir, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta del dominio variable de la cadena ligera VL y el dominio constante de la cadena pesada 1 CH1 (VL-CH1, en sentido N a C terminal), y una cadena peptídica compuesta de la dominio variable de la cadena pesada VH y el dominio constante de la cadena ligera CL (VH-CL, en sentido N a C terminal). Por claridad, en una molécula Fab de entrecruzamiento en la que los dominios variables de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian, la cadena peptídica que comprende el dominio constante de la cadena pesada 1 CH1 se denomina en el presente documento "cadena pesada" de la molécula Fab (de entrecruzamiento). Por el contrario, en una molécula Fab de entrecruzamiento en la que los dominios constantes de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian, la cadena peptídica que comprende el dominio variable de la cadena pesada VH se denomina en el presente documento "cadena pesada" de la molécula Fab (de entrecruzamiento).

Por el contrario a esto, por una molécula Fab "convencional" se entiende una molécula Fab en su formato natural, es decir, que comprende una cadena pesada compuesta por los dominios variable y constante de la cadena pesada (VH-CH1, en sentido N a C terminal) y una cadena ligera compuesta por los dominios variable y constante de la cadena ligera (VL-CL, en sentido N a C terminal).

El término "molécula de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glucoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene un dominio variable (VH), también llamado dominio pesado variable o región variable de la cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CH1, CH₂y CH3), también llamados región constante de la cadena pesada. De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL), también llamado dominio ligero variable o región variable de la cadena ligera, seguido de un dominio constante ligero (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. eLa cadena pesada de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de cinco tipos, llamados a (IgA), 6 (IgD), £ (IgE), ^y(IgG) o |j (IgM), de los que algunos se pueden dividir además en subtipos, por ejemplo, y ¹(IgG¹), Y²(IgG²), Y3 (IgG3), Y4 (IgG4), a¹(IgA¹) y a²(IgA²). La cadena ligera de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (^k) y lambda (^y), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente en dos moléculas Fab y un dominio Fc, enlazados por medio de la región bisagra de inmunoglobulina.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales comprendidos en la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes, en general, dichas variantes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un determinante individual en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana; describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural, es decir, que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Por ejemplo, un anticuerpo aislado se puede retirar de su entorno natural. Los anticuerpos producidos de forma recombinante expresados en células huésped se consideran aislados para el propósito de la invención, ya que son anticuerpos naturales o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente por cualquier técnica adecuada. Como tales, se aíslan los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención. En algunos modos de realización, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o 99 % de pureza, como se determina, por ejemplo, por procedimientos de electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')², diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, scFv) y anticuerpos de dominio único. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')²que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. Uu . n.° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. Un anticuerpo de dominio único puede ser un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria de parte o la totalidad de un antígeno. Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, por uno o más dominios variables de anticuerpo (también llamados regiones variables de anticuerpo). En particular, un dominio de unión a antígeno comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural, en general, tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Como se usa en el presente documento en relación con secuencias de regiones variables, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

Como se usa en el presente documento, las posiciones de aminoácidos de todas las regiones y dominios constantes de la cadena pesada y ligera se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat descrito en Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) y se denomina "numeración de acuerdo con Kabat" o "numeración de Kabat" en el presente documento. Específicamente, el sistema de numeración de Kabat (véanse las páginas 647-660 de Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991)) se usa para el dominio constante de la cadena ligera CL del isotipo kappa y lambda y el sistema de numeración del índice EU de Kabat (véanse las páginas 661-723) se usa para los dominios constantes de la cadena pesada (CH1, bisagra, CH₂y CH3), lo que se aclara además en el presente documento refiriéndose a la "numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat" en este caso.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos en contacto con el antígeno ("contactos con el antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H₂, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR ejemplares en el presente documento incluyen:

a) bucles hipervariables que se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H₂) y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));

b) CDR que se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50 65 (H₂) y 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

c) contactos con antígeno que se producen en los residuos aminoacídicos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H₂) y 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); y

d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), que incluyen los residuos aminoacídicos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H₂), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).

A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.

"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste, en general, en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en el siguiente orden en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H₂(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Dichos dominios variables se denominan en el presente documento "región variable humanizada". Un anticuerpo humanizado puede comprender, opcionalmente, al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. En algunos modos de realización se sustituyen algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado por los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, de un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización. Otras formas de "anticuerpos humanizados" de acuerdo con la presente divulgación son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente con respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la divulgación, en especial con respecto a la unión a C1q y/o unión al receptor de Fc (FcR).

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Un anticuerpo humano se puede derivar de un mamífero transgénico no humano, por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo. Un anticuerpo humano también se puede derivar de una línea celular de hibridoma. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos también se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.

La "clase" de un anticuerpo o inmunoglobulina se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG¹, IgG², IgG3, IgG4 , IgA¹e IgA2. eLos dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 6, £, Y y p, respectivamente.

El término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG podrían variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente por extenderse de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, los anticuerpos producidos por células huésped pueden experimentar escisión postraduccional de uno o más, en particular uno o dos, aminoácidos del extremo C de la cadena pesada. Por lo tanto, un anticuerpo producido por una célula huésped por expresión de una molécula de ácido nucleico específica que codifica una cadena pesada de longitud completa puede incluir la cadena pesada de longitud completa, o puede incluir una variante escindida de la cadena pesada de longitud completa (también denominada en el presente documento "cadena pesada variante escindida"). Este puede ser el caso cuando los dos aminoácidos C terminales finales de la cadena pesada son glicina (G446) y lisina (K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Por lo tanto, la lisina C terminal (Lys447), o la glicina (Gly446) y lisina (K447) C terminales, de la región Fc pueden estar presentes o no. Las secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas incluyendo dominios Fc (o una subunidad de un dominio Fc como se define en el presente documento) se indican en el presente documento sin dipéptido glicina-lisina C terminal, si no se indica de otro modo. En un modo de realización de la invención, una cadena pesada que incluye una subunidad de un dominio Fc como se especifica en el presente documento, comprendida en un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención, comprende un dipéptido glicina-lisina C terminal adicional (G446 y K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización de la invención, una cadena pesada que incluye una subunidad de un dominio Fc como se especifica en el presente documento, comprendida en un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención, comprende un residuo de glicina C terminal adicional (G446, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Las composiciones de la invención, tales como las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, comprenden una población de anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención. La población de anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas puede comprender moléculas que tienen una cadena pesada de longitud completa y moléculas que tienen una cadena pesada variante escindida. La población de anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas puede consistir en una mezcla de moléculas que tienen una cadena pesada de longitud completa y moléculas que tienen una cadena pesada variante escindida, en la que al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de los anticuerpos o las moléculas de unión a antígeno biespecíficas tienen una cadena pesada variante escindida. En un modo de realización de la invención, una composición que comprende una población de anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención comprende un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende una cadena pesada que incluye una subunidad de un dominio Fc como se especifica en el presente documento con un dipéptido glicina-lisina C terminal adicional (G446 y K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización de la invención, una composición que comprende una población de anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención comprende un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende una cadena pesada que incluye una subunidad de un dominio Fc como se especifica en el presente documento con un residuo de glicina C terminal adicional (G446, numeración de acuerdo con el índice E^ude Kabat). En un modo de realización de la invención, una composición de este tipo comprende una población de anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas comprendidas de moléculas que comprenden una cadena pesada que incluye una subunidad de un dominio Fc como se especifica en el presente documento; moléculas que comprenden una cadena pesada que incluye una subunidad de un dominio Fc como se especifica en el presente documento con un residuo de glicina C terminal adicional (G446, numeración de acuerdo con el índice Eu de Kabat); y moléculas que comprenden una cadena pesada que incluye una subunidad de dominio Fc como se especifica en el presente documento con un dipéptido glicina-lisina C terminal adicional (G446 y K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD, 1991 (véase también anteriormente). Una "subunidad" de un dominio Fc como se usa en el presente documento se refiere a uno de los dos polipéptidos que forman el dominio Fc dimérico, es decir, un polipéptido que comprende regiones constantes C terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, que se pueden autoasociar de forma estable. Por ejemplo, una subunidad de un dominio Fc de IgG comprende un dominio constante CH₂de IgG y uno CH3 de IgG.

Una "modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc" es una manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de una subunidad del dominio Fc que reduce o previene la asociación de un polipéptido que comprende la subunidad del dominio Fc con un polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación que promueve la asociación como se usa en el presente documento, en particular, incluye modificaciones separadas realizadas en cada una de las dos subunidades del dominio Fc que se desean asociar (es decir, la primera y la segunda subunidad del dominio Fc), en la que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de las dos subunidades del dominio Fc. Por ejemplo, una modificación que promueve la asociación puede alterar la estructura o carga de una o ambas de las subunidades del dominio Fc para hacer que su asociación sea estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. Por tanto, se produce (hetero)dimerización entre un polipéptido que comprende la primera subunidad del dominio Fc y un polipéptido que comprende la segunda subunidad del dominio Fc, que podría ser no idéntico en el sentido de que otros componentes fusionados con cada una de las subunidades (por ejemplo, restos de unión a antígeno) no son los mismos. En algunos modos de realización, la modificación que promueve la asociación comprende una mutación aminoacídica en el dominio Fc, específicamente una sustitución aminoacídica. En un modo de realización particular, la modificación que promueve la asociación comprende una mutación aminoacídica separada, específicamente una sustitución aminoacídica, en cada una de las dos subunidades del dominio Fc.

El término "funciones efectoras" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión al receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por complejo inmunitario por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.

Como se usa en el presente documento, se considera que los términos "genomanipular, genomanipulado, genomanipulación" incluyen cualquier manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La genomanipulación incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación o del grupo de cadena lateral de aminoácidos individuales, así como combinaciones de estos enfoques.

El término "mutación aminoacídica", como se usa en el presente documento, pretende englobar sustituciones, deleciones, inserciones y modificaciones aminoacídicas. Se puede realizar cualquier combinación de sustitución, deleción, inserción y modificación para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión reducida a un receptor de Fc o asociación incrementada con otro péptido. Las deleciones e inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen deleciones e inserciones de aminoácidos amino y/o carboxiterminales. Las mutaciones aminoacídicas particulares son sustituciones aminoacídicas. Con el propósito de alterar, por ejemplo, las características de unión de una región Fc, son en particular preferentes las sustituciones aminoacídicas no conservadoras, es decir, el reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas diferentes. Las sustituciones aminoacídicas incluyen el reemplazo por aminoácidos no naturales o por derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar (por ejemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metilhistidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). Se pueden generar mutaciones aminoacídicas usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis dirigida a sitio, ^pC^r, síntesis génica y similares. Se contempla que también pueden ser útiles procedimientos de alteración del grupo de cadena lateral de un aminoácido por procedimientos distintos de genomanipulación, tales como modificación química. Se pueden usar diversas designaciones en el presente documento para indicar la misma mutación aminoacídica. Por ejemplo, se puede indicar una sustitución de prolina en la posición 329 del dominio Fc a glicina como 329G, G329, G³²⁹, P329G o Pro329Gly.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible al público tal como BLAST, BLAST-2, Clustal W, programa informático Megalign (DNASTAR) o el paquete de programas FASTA. Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa ggsearch del paquete FASTA versión 36.3.8c o posterior con una matriz de comparación BLOSUM50. El paquete de programas FASTA se creó por W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzimol. 266:227-258; y Pearson et al. (1997) Genomics 46:24-36, y está disponible al público en http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml. De forma alternativa, se puede usar un servidor público accesible en http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi para comparar las secuencias, usando el programa ggsearch (proteína global:proteína) y las opciones predeterminadas (BLOSUM50; abrir: -10; ext: -2; Ktup = 2) para garantizar que se realice una alineación global, en lugar de local. El porcentaje de identidad de aminoácidos se da en el encabezado de alineación de salida.

El término "polinucleótido" se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN derivado de virus o ADN plasmídico (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en los ácidos peptidonucleicos (APN)). El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquiera de uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.

Por molécula de ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos (parcial o sustancialmente) purificados en solución. Un polinucleótido aislado incluye una molécula polinucleotídica contenida en células que contienen normalmente la molécula polinucleotídica, pero la molécula polinucleotídica está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. Las moléculas de ARN aislado incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro, así como formas de hebra positiva y negativa, y formas bicatenarias. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma o un finalizador de la transcripción.

"Polinucleótido (o ácido nucleico) aislado que codifica [por ejemplo, un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención]" se refiere a una o más moléculas polinucleotídicas que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyendo dicha(s) molécula(s) polinucleotídica(s) en un único vector o vectores separados, y dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

El término "casete de expresión" se refiere a un polinucleótido generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y un promotor. El casete de expresión puede comprender secuencias polinucleotídicas que codifican anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de los mismos.

El término "vector" o "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN que se usa para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que se asocia de forma funcional en una célula. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. El vector de expresión de la presente divulgación comprende un casete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez que el vector de expresión está en el interior de la célula, la molécula de ácido ribonucleico o proteína que se codifica por el gen se produce por el mecanismo de transcripción y/o traducción celular. El vector de expresión de la presente divulgación puede comprender un casete de expresión que comprende secuencias polinucleotídicas que codifican anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de los mismos.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada principal y la descendencia derivada de la misma, independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar los anticuerpos o las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención. Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células HEK, células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombrar solo unas pocas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado.

Un "receptor de Fc activador" es un receptor de Fc que, tras el acoplamiento por un dominio Fc de un anticuerpo, provoca acontecimientos de señalización que estimulan a la célula portadora del receptor para que realice funciones efectoras. Los receptores de Fc activadores humanos incluyen FcYRIIIa (CD16a), FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89).

La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo inmunitario que da lugar a la lisis de células diana recubiertas de anticuerpo por células efectoras inmunitarias. Las células diana son células a las que se unen específicamente anticuerpos o derivados de los mismos que comprenden una región Fc, en general, por medio de la parte proteica que es N terminal a la región Fc. Como se usa en el presente documento, el término "ADCC reducida" se define como una reducción en el número de células diana que se lisan en un tiempo dado, a una concentración de anticuerpo dada en el medio circundante a las células diana, por el mecanismo de ADCC definido anteriormente, y/o bien un incremento en la concentración de anticuerpo en el medio circundante a las células diana, requerido para lograr la lisis de un número dado de células diana en un tiempo dado, por el mecanismo de ADCC. La reducción en la ADCC es relativa a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células huésped, usando los mismos procedimientos de producción, purificación, formulación y almacenamiento estándar (que son conocidos para los expertos en la técnica), pero que no se ha genomanipulado. Por ejemplo, la reducción en ADCC mediada por un anticuerpo que comprende en su dominio Fc una sustitución aminoacídica que reduce la ADCC es relativa a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo sin esta sustitución aminoacídica en el dominio Fc. Los ensayos adecuados para medir la ADCC son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 2006/082515 o la publicación PCT n.° WO 2012/130831).

Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene efectos adversos de una enfermedad.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En particular, el individuo o sujeto es un ser humano.

El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la composición.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural de una enfermedad en el individuo al que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante el transcurso de análisis clínicos. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorado. En algunos modos de realización, los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

Descripción detallada de los modos de realización

La invención proporciona anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a STEAP-1, en particular a STEAP-1 humano, y son resistentes a resistentes a la degradación, por ejemplo, por formación de succinimida y, por tanto, en particular estables según se requiera para propósitos terapéuticos. Además, las moléculas también tienen otras propiedades favorables para la aplicación terapéutica, por ejemplo, con respecto a la eficacia y/o seguridad, así como a la producibilidad.

Anticuerpo anti-STEAP-1

Por tanto, el anticuerpo proporcionado por la presente invención muestra una degradación de succinimida inferior a aproximadamente un 5 % después de 4 semanas a pH 7,4, 37 °C y/o una degradación de succinimida inferior a aproximadamente un 10 % después de 4 semanas a pH 6,0, 40 °C, como se determina por espectrometría de masas. En un modo de realización, el anticuerpo muestra menos de aproximadamente un 3 % de degradación de succinimida, en particular menos de aproximadamente un 1 % de degradación de succinimida, después de 4 semanas a pH 7,4, 37 °C, como se determina por espectrometría de masas. En un modo de realización, el anticuerpo muestra menos de aproximadamente un 7,5% de degradación de succinimida, en particular menos de aproximadamente un 5% de degradación de succinimida, después de 4 semanas a pH 6,0, 40 °C, como se determina por espectrometría de masas.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a STEAP-1, en el que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, una Hc Dr 2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, una LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 9.

En un modo de realización particular, el anticuerpo comprende una VH que comprende una HCDR1 de SEQ ID NO:

I, una HCDR2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 de SEQ ID NO: 6, y una VL que comprende una LCDR1 de SEQ ID NO: 7, una LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 9.

En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En un modo de realización, la VH es una VH humanizada y/o la VL es una VL humanizada. En un modo de realización, el anticuerpo comprende CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores, y comprende además una región estructural humana aceptora, por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana.

En un modo de realización, la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización, el anticuerpo comprende una secuencia de VH que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO:

I I , SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y una secuencia de VL que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14.

En determinados modos de realización, una secuencia de VH o VL que tiene al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a STEAP-1. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 11, 12 o 13 y/o se han sido sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 14. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO: 11, 12 o 13 y/o la secuencia de VL de SEQ ID NO: 14, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia.

En un modo de realización, el anticuerpo comprende una VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización, el anticuerpo comprende una secuencia de VH seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y la secuencia de VL de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización particular, el anticuerpo comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización particular, el anticuerpo comprende la secuencia de VH de SEQ ID NO: 13 y la secuencia de VL de SEQ ID No : 14.

En un modo de realización, el anticuerpo comprende una región constante humana. En un modo de realización, el anticuerpo es una molécula de inmunoglobulina que comprende una región constante humana, en particular una molécula de inmunoglobulina de clase IgG que comprende un dominio CH1, CH₂, CH3 y/o CL humano. Se dan secuencias ejemplares de dominios constantes humanos en SEQ ID NO: 39 y 40 (dominios CL kappa y lambda humanos, respectivamente) y SEQ ID NO: 41 (dominios constantes de la cadena pesada de IgG1 humana CH1-CH₂-CH3). En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende una región constante de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 40, en particular la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende una región constante de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41. En particular, la región constante de la cadena pesada puede comprender mutaciones aminoacídicas en el dominio Fc como se describe en el presente documento.

En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG, en particular, una IgG¹. En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.

En un modo de realización, el anticuerpo comprende un dominio Fc, en particular un dominio Fc de IgG, más en particular un dominio Fc de IgG1. En un modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc humano. El dominio Fc del anticuerpo puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento en relación con el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención.

En otro modo de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo de una molécula Fv, una molécula scFv, una molécula Fab y una molécula F(ab')²; en particular una molécula Fab. En otro modo de realización, el fragmento de anticuerpo es un diacuerpo, un triacuerpo o un tetracuerpo.

En otro aspecto, el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describe en las secciones a continuación.

Variantes de glucosilación

Un anticuerpo de la invención se puede alterar para incrementar o disminuir el grado en el que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se creen o se retiren uno o más sitios de glucosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el oligosacárido fijado a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se fija en general por un enlace N a Asn297 del dominio CH₂de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTEC^h15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura oligosacárida biantenaria. En algunos modos de realización se pueden preparar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

En un modo de realización se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen un oligosacárido no fucosilado, es decir, una estructura de oligosacárido que carece de fucosa fijada (directa o indirectamente) a una región Fc. Dicho oligosacárido no fucosilado (también denominado oligosacárido "afucosilado") es en particular un oligosacárido unido a N que carece de un residuo de fucosa fijado a la primera GlcNAc en el tallo de la estructura de oligosacárido biantenario. En un modo de realización se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc en comparación con un anticuerpo natural u original. Por ejemplo, la proporción de oligosacáridos no fucosilados puede ser de al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 80 % o incluso aproximadamente un 100 % (es decir, no están presentes oligosacáridos fucosilados). El porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es la cantidad (promedio) de oligosacáridos que carecen de residuos de fucosa, en relación con la suma de todos los oligosacáridos fijados a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y con alto contenido de manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2006/082515, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o en dirección 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones menores de secuencia en los anticuerpos. Dichos anticuerpos que tienen una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fc pueden tener una unión al receptor FcYRIIIa mejorada y/o una función efectora mejorada, en particular una función ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, los documentos US 2003/0157108; y US 2004/0093621.

Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos con fucosilación reducida incluyen células CHO Lec13 con insuficiente fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); documento US 2003/0157108; y documento WO 2004/056312, especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares desactivadas, tales como el gen de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO desactivadas (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004) Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y el documento WO2003/085107), o células con actividad reducida o suprimida de una proteína transportadora o de síntesis de GDP-fucosa (véanse, por ejemplo, los documentos US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282).

En otro modo de realización, las variantes de anticuerpo se proporcionan con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en los que un oligosacárido biantenario fijado a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada como se describe anteriormente. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo, por ejemplo, en Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); el documento WO 99/54342; los documentos WO 2004/065540, WO 2003/011878.

También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido fijado a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087; WO 1998/58964; y WO 1999/22764.

Variantes de anticuerpo genomanipulado con cisteína

En determinados modos de realización, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen por residuos de cisteína. En modos de realización particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos por cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan, de este modo, en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. Los anticuerpos genomanipulados con cisteína de pueden generar como se describe, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 7.521.541, 8.30.930, 7.855.275, 9.000.130 o el documento WO2016040856.

Derivados de anticuerpo

En determinados modos de realización, un anticuerpo de acuerdo con la invención se puede modificar adicionalmente para que contenga restos no proteínicos adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicolpropionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros fijados al anticuerpo puede variar y, si se fija más de un polímero, pueden ser las mismas moléculas o diferentes. En general, se puede determinar el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización en base a consideraciones que incluyen, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

En otro modo de realización se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a radiación. En un modo de realización, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células próximas al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.

Inmunoconjugados

La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-STEAP-1 de la invención conjugado (unido químicamente) a uno o más agentes terapéuticos tales como agentes citotóxicos, agentes quimioterápicos, fármacos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de las mismas) o isótopos radioactivos.

En un modo de realización, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) en el que un anticuerpo se conjuga a uno o más de los agentes terapéuticos mencionados anteriormente. El anticuerpo se conecta típicamente a uno o más de los agentes terapéuticos usando conectores. En Pharmacol Review 68:3-19 (2016) se establece una visión general de la tecnología de CAF que incluye ejemplos de agentes terapéuticos y fármacos y conectores.

En otro modo de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado a una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, que incluye, pero sin limitarse a, la cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.

En otro modo de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o un marcador de espín para tomografía por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los conjugados de un anticuerpo y un agente citotóxico se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis-(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bisdiazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (Chari et al., CancerRes. 52:127-131 (1992); patente de EE. UU. n.° 5.208.020).

Los inmunoconjugados o CAF en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, EE. UU.).

Anticuerpos multiespecíficos

En determinados modos de realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes, es decir, diferentes epítopos en diferentes antígenos o diferentes epítopos en el mismo antígeno. En determinados modos de realización, el anticuerpo multiespecífico tiene tres o más especificidades de unión. En determinados modos de realización, una de las especificidades de unión es por STEAP-1 y la otra (dos o más) especificidad es por cualquier otro antígeno. En determinados modos de realización, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos (o más) epítopos diferentes de STEAP-1. También se pueden usar anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) para localizar células o agentes citotóxicos en células que expresan STEAP-1. Los anticuerpos multiespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulinas que tienen diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)) y genomanipulación de "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168 y Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)). Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden preparar genomanipulando los efectos de dirección electrostática para preparar moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpos (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/089004); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980 y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) y el documento WO 2011/034605); usando la tecnología de cadena ligera común para eludir el problema de emparejamiento incorrecto de la cadena ligera (véase, por ejemplo, el documento WO 98/50431); usando la tecnología de "diacuerpo" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenarios (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

También se incluyen en el presente documento anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno, incluyendo, por ejemplo, "anticuerpos de tipo pulpo" o DVD-Ig (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2001/77342 y ^wO 2008/024715). Otros ejemplos de anticuerpos multiespecíficos con tres o más sitios de unión a antígeno se pueden encontrar en los documentos WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO2010/145792 y WO 2013/026831. El anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo también incluye un "FAb de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a STEAP-1 así como a otro antígeno diferente, o dos epítopos diferentes de STEAP-1 (véanse, por ejemplo, los documentos US 2008/0069820 y WO 2015/095539).

Los anticuerpos multiespecíficos también se pueden proporcionar en forma asimétrica con un entrecruzamiento de dominio en una o más ramas de unión de la misma especificidad de antígeno, es decir, intercambiando los dominios VH/VL (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2009/080252 y WO 2015/150447), los dominios CH1/CL (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/080253) o las ramas de Fab completas (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2009/080251, WO 2016/016299, véase también Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 y Klein et al., MAbs 8 (2016) 1010-20). Las ramas de Fab asimétricas también se pueden genomanipular introduciendo mutaciones aminoacídicas con carga o sin carga en las interfaces de dominio para dirigir el emparejamiento de Fab correcto. Véase, por ejemplo, el documento WO 2016/172485.

Son conocidos en la técnica otros formatos moleculares diversos para anticuerpos multiespecíficos y se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106).

Un tipo particular de anticuerpos multiespecíficos, también incluidos en el presente documento, son anticuerpos biespecíficos diseñados para unirse simultáneamente a un antígeno de superficie en una célula diana, por ejemplo, una célula tumoral, y a un componente activador invariable del complejo del receptor de linfocitos T (TCR), tal como CD3, para la reorientación de linfocitos T para destruir las células diana. Por lo tanto, en determinados modos de realización, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo multiespecífico, en particular un anticuerpo biespecífico, en el que una de las especificidades de unión es para STEAP-1 y la otra es para CD3.

Los ejemplos de formatos de anticuerpos biespecíficos que pueden ser útiles para este propósito incluyen, pero no se limitan a, las moléculas denominadas "BiTE" (captadores biespecíficos de linfocitos T) en las que dos moléculas scFv se fusionan mediante un conector flexible (véanse, por ejemplo, los documentos WO2004/106381, WO2005/061547, WO2007/042261 y WO2008/119567, Nagorsen y Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)); diacuerpos (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) y derivados de los mismos, tales como diacuerpos en tándem (“TandAb”; Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 (1999)); moléculas "DART" (reorientación de doble afinidad) que se basan en el formato de diacuerpo pero cuentan con un puente disulfuro C terminal para una estabilización adicional (Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)), y los denominados triomabs, que son moléculas híbridas de IgG de ratón/rata completas (revisado en Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)). Los formatos de anticuerpos biespecíficos de linfocitos T particulares incluidos en el presente documento se describen en los documentos WO2013/026833, WO2013/026839, WO2016/020309; Bacac et al., Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498.

Moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a STEAP-1 y a un segundo antígeno

La invención también proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, es decir, una molécula de unión a antígeno que comprende al menos dos restos de unión a antígeno que se pueden unir específicamente a dos determinantes antigénicos distintos (un primer y un segundo antígeno).

De acuerdo con modos de realización particulares de la invención, los restos de unión a antígeno comprendidos en la molécula de unión a antígeno biespecífica son moléculas Fab (es decir, dominios de unión a antígeno compuestos por una cadena pesada y una ligera, comprendiendo cada una un dominio variable y uno constante). En un modo de realización, el primer y/o el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab. En un modo de realización, dicha molécula Fab es humana. En un modo de realización particular, dicha molécula Fab está humanizada. Aún en otro modo de realización, dicha molécula Fab comprende dominios constantes de la cadena pesada y ligera humanos.

Preferentemente, al menos uno de los restos de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento. Dicha modificación reduce el emparejamiento incorrecto de las cadenas pesadas y ligeras de diferentes moléculas Fab, mejorando de este modo el rendimiento y la pureza de la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención en la producción recombinante. En una molécula Fab de entrecruzamiento particular útil para la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención, los dominios variables de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab (VL y VH, respectivamente) se intercambian. Sin embargo, incluso con este intercambio de dominios, la preparación de la molécula de unión a antígeno biespecífica puede comprender determinados productos secundarios debido a la denominada interacción de tipo Bence Jones entre las cadenas pesadas y ligeras con emparejamiento incorrecto (véase Schaefer et al, p Na S, 108 (2011) 11187-11191). Para reducir además el emparejamiento incorrecto de las cadenas pesadas y ligeras de diferentes moléculas Fab y por tanto incrementar la pureza y el rendimiento de la molécula de unión a antígeno biespecífica deseada, se pueden introducir aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en los dominios CH1 y CL de la(s) molécula(s) Fab que se une(n) al primer antígeno de célula (STEAP-1) o bien de la molécula Fab que se une al segundo antígeno (por ejemplo, antígeno activador de linfocitos T tal como CD3), como se describe adicionalmente en el presente documento. Las modificaciones de carga se realizan en la(s) molécula(s) Fab convencional(es) comprendida(s) en la molécula de unión a antígeno biespecífica (tal como se muestra, por ejemplo, en las figuras 1 A-C, G-J) o bien en la(s) molécula(s) Fab de entrecruzamiento VH/VL comprendida(s) en la molécula de unión a antígeno biespecífica (tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 1 D-F, K-N) (pero no en ambas). En modos de realización particulares, las modificaciones de carga se realizan en la(s) molécula(s) Fab convencional(es) comprendida(s) en la molécula de unión a antígeno biespecífica (que en modos de realización particulares se une(n) al primer antígeno, es decir, STEAP-1).

En un modo de realización particular de acuerdo con la invención, la molécula de unión a antígeno biespecífica se puede unir simultáneamente al primer antígeno (es decir, STEAP-1) y al segundo antígeno (por ejemplo, un antígeno activador de linfocitos T, en particular CD3). En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica puede reticular un linfocito T y una célula diana uniéndose simultáneamente a STEAP-1 y a un antígeno activador de linfocitos T. En un modo de realización incluso más particular, dicha unión simultánea da como resultado la lisis de la célula diana, en particular una célula tumoral que expresa STEAP-1. En un modo de realización, dicha unión simultánea da como resultado la activación del linfocito T. En otros modos de realización, dicha unión simultánea da como resultado una respuesta celular de un linfocito T, en particular un linfocito T citotóxico, seleccionada del grupo de: proliferación, diferenciación, secreción de citocinas, liberación de moléculas efectoras citotóxicas, actividad citotóxica y expresión de marcadores de activación. En un modo de realización, la unión de la molécula de unión a antígeno biespecífica al antígeno activador de linfocitos T, en particular CD3, sin unión simultánea a STEAP-1 no da como resultado activación de linfocitos T.

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica puede redirigir la actividad citotóxica de un linfocito T hacia una célula diana. En un modo de realización particular, dicho redireccionamiento es independiente de la presentación de antígenos peptídicos mediada por MHC por la célula diana y/o la especificidad del linfocito T. En particular, un linfocito T de acuerdo con cualquiera de los modos de realización de la invención es un linfocito T citotóxico. En algunos modos de realización, el linfocito T es un linfocito T CD4+ o uno CD8+, en particular un linfocito T CD8+.

Primer resto de unión a antígeno

La molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención comprende al menos un resto de unión a antígeno, en particular una molécula Fab, que se une a STEAP-1 (primer antígeno). En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende dos restos de unión a antígeno, en particular moléculas Fab, que se unen a STEAP-1. En un modo de realización particular de este tipo, cada uno de estos restos de unión a antígeno se une al mismo determinante antigénico. En un modo de realización incluso más particular, todos estos restos de unión a antígeno son idénticos, es decir, comprenden las mismas secuencias de aminoácidos incluyendo las mismas sustituciones aminoacídicas en el dominio CH1 y CL como se describe en el presente documento (si las hay). En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende no más de dos restos de unión a antígeno, en particular moléculas Fab, que se unen a STEAP-1.

En modos de realización particulares, el/los resto(s) de unión a antígeno que se une(n) a STEAP-1 es/son una molécula Fab convencional. En dichos modos de realización, el/los resto(s) de unión a antígeno que se une(n) a un segundo antígeno es/son una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí.

En modos de realización alternativos, el/los resto(s) de unión a antígeno que se une(n) a STEAP-1 es/son una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En dichos modos de realización, el/los resto(s) de unión a antígeno que se une(n) a un segundo antígeno es/son una molécula Fab convencional.

El resto de unión a STEAP-1 puede dirigir la molécula de unión a antígeno biespecífica a un sitio diana, por ejemplo, a un tipo específico de célula tumoral que expresa STEAP-1.

El primer resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno biespecífica puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento en relación con el anticuerpo de la invención que se une a STEAP-1, a menos que sea científicamente irracional o imposible.

Por tanto, en un aspecto, la invención también proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, que comprende (a) un primer resto de unión a antígeno que se une a un primer antígeno, en el que el primer antígeno es STEAP-1 y el primer resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, una HCDR2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ⁱD NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, una LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 9, y (b) un segundo resto de unión a antígeno que se une a un segundo antígeno.

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno comprende una VH que comprende una HCDR1 de SEQ ID NO: 1, una HCDR2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 de SEQ ID NO: 6, y una VL que comprende una LCDR1 de SEQ ID NO: 7, una LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 9.

En algunos modos de realización, el primer resto de unión a antígeno es (se deriva de) un anticuerpo humanizado. En un modo de realización, la VH es una VH humanizada y/o la VL es una VL humanizada. En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno comprende CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores, y comprende además una región estructural humana aceptora, por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana.

En un modo de realización, la VH del primer resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y la VL del primer resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O: 14.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno comprende una secuencia de VH que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y una secuencia de VL que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno comprende una VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, Se Q ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno comprende una secuencia de VH seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y la secuencia de VL de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización particular, el primer resto de unión a antígeno comprende la secuencia de VH de SEQ ID NO: 13 y la secuencia de VL de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno comprende una región constante humana. En un modo de realización, el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab que comprende una región constante humana, en particular un dominio CH1 y/o CL humano. Se dan secuencias ejemplares de dominios constantes humanos en SEQ ID NO: 39 y 40 (dominios CL kappa y lambda humanos, respectivamente) y SEQ ID NO: 41 (dominios constantes de la cadena pesada de IgG¹humana CH1-CH₂-CH3). En algunos modos de realización, el primer resto de unión a antígeno comprende una región constante de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 40, en particular la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. En particular, la región constante de la cadena ligera puede comprender mutaciones aminoacídicas como se describe en el presente documento en "modificaciones de carga" y/o puede comprender deleciones o sustituciones de uno o más (en particular dos) aminoácidos N terminales si está en una molécula Fab de entrecruzamiento. En algunos modos de realización, el primer resto de unión a antígeno comprende una región constante de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia del dominio CH1 comprendida en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41. En particular, la región constante de la cadena pesada (específicamente el dominio CH1) puede comprender mutaciones aminoacídicas como se describe en el presente documento en "modificaciones de carga".

Segundo resto de unión a antígeno

La molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención comprende al menos un resto de unión a antígeno, en particular una molécula Fab, que se une a un segundo antígeno (diferente de STEAP-1).

En modos de realización particulares, el resto de unión a antígeno que se une al segundo antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En dichos modos de realización, el/los resto(s) de unión a antígeno que se une(n) al primer antígeno (es decir, STEAP-1) es/son preferentemente una molécula Fab convencional. En modos de realización donde existe más de un resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une a STEAP-1 comprendido en la molécula de unión a antígeno biespecífica, el resto de unión a antígeno que se une al segundo antígeno es preferentemente una molécula Fab de entrecruzamiento y los restos de unión a antígeno que se unen a STEAP-1 son moléculas Fab convencionales.

En modos de realización alternativos, el resto de unión a antígeno que se une a un segundo antígeno es una molécula Fab convencional. En dichos modos de realización, el/los resto(s) de unión a antígeno que se une(n) al primer antígeno (es decir STEAP-1) es/son una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En modos de realización donde existe más de un resto de unión a antígeno, en particular molécula Fab, que se une a un segundo antígeno comprendido en la molécula de unión a antígeno biespecífica, el resto de unión a antígeno que se une a STEAP-1 es preferentemente una molécula Fab de entrecruzamiento y los restos de unión a antígeno que se unen al segundo antígeno son moléculas Fab convencionales.

En algunos modos de realización, el segundo antígeno es un antígeno activador de linfocitos T (también denominado en el presente documento "resto de unión a antígeno activador de linfocitos T o molécula Fab de unión a antígeno activadora de linfocitos T"). En un modo de realización particular, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende no más de un resto de unión a antígeno que se puede unir específicamente a un antígeno activador de linfocitos T. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica proporciona unión monovalente al antígeno activador de linfocitos T.

En modos de realización particulares, el segundo antígeno es CD3, en particular CD3 humano (SEQ ID NO: 24) o CD3 de macaco cangrejero (SEQ ID NO: 25), lo más en particular CD3 humano. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno es reactivo de forma de cruzada para (es decir, se une específicamente a) CD3 humano y de macaco cangrejero. En algunos modos de realización, el segundo antígeno es la subunidad épsilon de CD3 (CD3 épsilon).

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno comprende una HCDR1 de SEQ ID NO: 15, una HCDR2 de SEQ ID NO: 16, una HCDR3 de SEQ ID NO: 17, una LCDR1 de SEQ ID NO: 18, una LCDR2 de SEQ ID NO: 19 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 20.

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno comprende una VH que comprende una HCDR1 de SEQ ID NO: 15, una HCDR2 de SEQ ID NO: 16 y una HCDR3 de SEQ ID NO: 17, y una VL que comprende una LCDR1 de SEQ ID NO: 18, una LCDR2 de SEQ ID NO: 19 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 20.

En algunos modos de realización, el segundo resto de unión a antígeno es (se deriva de) un anticuerpo humanizado. En un modo de realización, la VH es una VH humanizada y/o la VL es una VL humanizada. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno comprende CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores, y comprende además una región estructural humana aceptora, por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana.

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno comprende una secuencia de VH que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno comprende una secuencia de VL que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 22.

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno comprende una secuencia de VH que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No : 21, y una secuencia de VL que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

En un modo de realización, la VH del segundo resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y la VL del segundo resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno comprende la secuencia de VH de SEQ ID NO: 21 y la secuencia de VL de SEQ ID NO: 22.

En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno comprende una región constante humana. En un modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab que comprende una región constante humana, en particular un dominio CH1 y/o CL humano. Se dan secuencias ejemplares de dominios constantes humanos en SEQ ID NO: 39 y 40 (dominios CL kappa y lambda humanos, respectivamente) y SEQ ID NO: 41 (dominios constantes de la cadena pesada de IgG¹humana CH1-CH₂-CH3). En algunos modos de realización, el segundo resto de unión a antígeno comprende una región constante de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 40, en particular la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. En particular, la región constante de la cadena ligera puede comprender mutaciones aminoacídicas como se describe en el presente documento en "modificaciones de carga" y/o puede comprender deleciones o sustituciones de uno o más (en particular dos) aminoácidos N terminales si está en una molécula Fab de entrecruzamiento. En algunos modos de realización, el segundo resto de unión a antígeno comprende una región constante de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia del dominio CH1 comprendida en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41. En particular, la región constante de la cadena pesada (específicamente el dominio CH1) puede comprender mutaciones aminoacídicas como se describe en el presente documento en "modificaciones de carga".

En algunos modos de realización, el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab en la que los dominios variables VL y VH o los dominios constantes CL y CH1, en particular los dominios variables VL y VH, de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se reemplazan entre sí (es decir, de acuerdo con dicho modo de realización, el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento en la que los dominios variables o constantes de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se intercambian). En un modo de realización de este tipo, el primer (si el tercer, si lo hay) resto de unión a antígeno es una molécula Fab convencional.

En un modo de realización, no está presente más de un resto de unión a antígeno que se une al segundo antígeno (por ejemplo, un antígeno activador de linfocitos T tal como CD3) en la molécula de unión a antígeno biespecífica (es decir, la molécula de unión a antígeno biespecífica proporciona unión monovalente al segundo antígeno).

Modificaciones de carga

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención pueden comprender sustituciones aminoacídicas en las moléculas Fab comprendidas en las mismas que son en particular eficaces para reducir el emparejamiento incorrecto de las cadenas ligeras con las cadenas pesadas no coincidentes (productos secundarios de tipo Bence-Jones), que se pueden producir en la producción de moléculas de unión a antígeno bi/multiespecíficas basadas en Fab con un intercambio VH/VL en uno (o más, en el caso de moléculas que comprendan más de dos moléculas Fab de unión a antígeno) de sus brazos de unión (véase también la publicación PCT n.° WO2015/150447, en particular los ejemplos en la misma). La proporción de la molécula de unión a antígeno biespecífica deseada en comparación con productos secundarios no deseados, en particular productos secundarios de tipo Bence Jones que se producen en moléculas de unión a antígeno biespecíficas con un intercambio de dominios VH/VL en uno de sus brazos de unión, se puede mejorar por la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en los dominios CH1 y CL (a veces denominado en el presente documento "modificaciones de carga").

En consecuencia, en algunos modos de realización en los que el primer y el segundo resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno biespecífica son ambos moléculas Fab, y en uno de los restos de unión a antígeno (en particular el segundo resto de unión a antígeno) los dominios variables VL y VH del Fab la cadena ligera y la cadena pesada de Fab se reemplazan entre sí,

i) en el dominio constante CL del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye por un aminoácido cargado positivamente (numeración de acuerdo con Kabat) y en el que, en el dominio constante CH1 del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye por un aminoácido cargado negativamente (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat); o

ii) en el dominio constante CL del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye por un aminoácido cargado positivamente (numeración de acuerdo con Kabat) y en el que, en el dominio constante CH1 del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye por un aminoácido cargado negativamente (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

La molécula de unión a antígeno biespecífica no comprende ambas modificaciones mencionadas en i) y ii). Los dominios constantes CL y CH1 del resto de unión a antígeno que tiene el intercambio VH/VL no se reemplazan entre sí (es decir, permanecen sin intercambio).

En un modo de realización más específico,

i) en el dominio constante CL del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) y en el que, en el dominio constante CH1 del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat); o

ii) en el dominio constante CL del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) y en el que, en el dominio constante CH1 del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización de este tipo, en el dominio constante CL del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) y en el que, en el dominio constante CH1 del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización, en el dominio constante CL del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) y en el que, en el dominio constante CH1 del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización particular, en el dominio constante CL del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) y, en el dominio constante CH1 del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización más particular, en el dominio constante CL del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y, en el dominio constante CH1 del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización incluso más particular, en el dominio constante CL del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat) y, en el dominio constante CH1 del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice ^eU de Kabat).

En modos de realización particulares, si se realizan sustituciones aminoacídicas de acuerdo con los modos de realización anteriores en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 del primer resto de unión a antígeno, el dominio constante CL del primer resto de unión a antígeno es de isotipo kappa.

De forma alternativa, las sustituciones aminoacídicas de acuerdo con los modos de realización anteriores se pueden realizar en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 del segundo resto de unión a antígeno en lugar de en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 del primer resto de unión a antígeno. En dichos modos de realización particulares, el dominio constante CL del segundo resto de unión a antígeno es de isotipo kappa.

En consecuencia, en un modo de realización, en el dominio constante CL del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) y en el que, en el dominio constante CH1 del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización, en el dominio constante CL del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) y en el que, en el dominio constante CH1 del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Todavía en otro modo de realización, en el dominio constante CL del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) y, en el dominio constante CH1 del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización, en el dominio constante CL del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y, en el dominio constante CH1 del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización, en el dominio constante CL del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat) y, en el dominio constante CH1 del segundo resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización particular, la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención comprende

(a) un primer resto de unión a antígeno que se une a un primer antígeno, en el que el primer antígeno es STEAP-1 y el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 de S^eQ ID NO: 1, una HCDR2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, una LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 9, y

(b) un segundo resto de unión a antígeno que se une a un segundo antígeno, en el que segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab en la que los dominios variables VL y VH de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se reemplazan entre sí;

en la que, en el dominio constante CL del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización particular independientemente por lisina (K) o arginina (R)) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización particular independientemente por lisina (K) o arginina (R)) y, en el dominio constante CH1 del primer resto de unión a antígeno, el aminoácido en la posición 147 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Formatos de moléculas de unión a antígeno biespecíficas

Los componentes de la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la presente invención se pueden fusionar entre sí en una variedad de configuraciones. Las configuraciones ejemplares se representan en la figura 1.

En modos de realización particulares, los restos de unión a antígeno comprendidos en la molécula de unión a antígeno biespecífica son moléculas Fab. En dichos modos de realización, el primer, segundo, tercer, etc., resto de unión a antígeno se puede denominar en el presente documento como primera, segunda, tercera, etc., molécula Fab, respectivamente.

En un modo de realización, el primer y el segundo resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno biespecífica se fusionan entre sí, opcionalmente por medio de un conector peptídico. En modos de realización particulares, el primer y el segundo resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab. En un modo de realización de este tipo, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En otro modo de realización de este tipo, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. En modos de realización en los que (i) el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno o bien (ii) el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno, adicionalmente la cadena ligera de Fab del primer resto de unión a antígeno y la cadena ligera de Fab del segundo resto de unión a antígeno se pueden fusionar entre sí, opcionalmente por medio de un conector peptídico.

Una molécula de unión a antígeno biespecífica con un único resto de unión a antígeno (tal como una molécula Fab) que se puede unir específicamente a un antígeno de célula diana tal como STEAP-1 (por ejemplo, como se muestra en la figura 1A, D, G, H, K, L) es útil, en particular en casos donde se espera internalización del antígeno de célula diana después de la unión de un resto de unión a antígeno de alta afinidad. En dichos casos, la presencia de más de un resto de unión a antígeno específico para el antígeno de célula diana puede potenciar la internalización del antígeno de célula diana, reduciendo de este modo su disponibilidad.

En otros casos, sin embargo, será ventajoso tener una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprenda dos o más restos de unión a antígeno (tal como moléculas Fab) específicos para un antígeno de célula diana (véanse los ejemplos mostrados en la figura 1B, 1C, 1E, 1F, 1I, 1J, 1M o 1N), por ejemplo para optimizar la dirección al sitio diana o para permitir la reticulación de antígenos de células diana.

En consecuencia, en modos de realización particulares, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la presente invención comprende un tercer resto de unión a antígeno.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno se une al primer antígeno, es decir, STEAP-1. En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno es una molécula Fab.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno es idéntico al primer resto de unión a antígeno.

El tercer resto de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno biespecífica puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento en relación con el primer resto de unión a antígeno y/o el anticuerpo de la invención que se une a STEAP-1, a menos que sea científicamente irracional o imposible.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, una h Cd R2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, una LCD^r2 de SEQ ID NO: 8 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 9.

En un modo de realización particular, el tercer resto de unión a antígeno comprende una VH que comprende una HCDR1 de SEQ ID NO: 1, una HCDR2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 de SEQ ID NO: 6, y una VL que comprende una LCDR1 de SEQ ID NO: 7, una LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 9.

En algunos modos de realización, el tercer resto de unión a antígeno es (se deriva de) un anticuerpo humanizado. En un modo de realización, la VH es una VH humanizada y/o la VL es una VL humanizada. En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno comprende ^cD^rcomo en cualquiera de los modos de realización anteriores, y comprende además una región estructural humana aceptora, por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana.

En un modo de realización, la VH del tercer resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y la VL del tercer resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID ⁿO: 14.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno comprende una secuencia de VH que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y una secuencia de VL que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno comprende una VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, S^eQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno comprende una secuencia de VH seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y la secuencia de VL de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización particular, el tercer resto de unión a antígeno comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización particular, el tercer resto de unión a antígeno comprende la secuencia de VH de SEQ ID NO: 13 y la secuencia de VL de SEQ ID NO: 14.

En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno comprende una región constante humana. En un modo de realización, el tercer resto de unión a antígeno es una molécula Fab que comprende una región constante humana, en particular un dominio CH1 y/o CL humano. Se dan secuencias ejemplares de dominios constantes humanos en SEQ ID NO: 39 y 40 (dominios CL kappa y lambda humanos, respectivamente) y SEQ ID NO: 41 (dominios constantes de la cadena pesada de IgG¹humana CH1-CH₂-CH3). En algunos modos de realización, el tercer resto de unión a antígeno comprende una región constante de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 40, en particular la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. En particular, la región constante de la cadena ligera puede comprender mutaciones aminoacídicas como se describe en el presente documento en "modificaciones de carga" y/o puede comprender deleciones o sustituciones de uno o más (en particular dos) aminoácidos N terminales si está en una molécula Fab de entrecruzamiento. En algunos modos de realización, el tercer resto de unión a antígeno comprende una región constante de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia del dominio CH1 comprendida en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41. En particular, la región constante de la cadena pesada (específicamente el dominio CH1) puede comprender mutaciones aminoacídicas como se describe en el presente documento en "modificaciones de carga". En modos de realización particulares, el tercer y el primer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab y el tercer resto de unión a antígeno es idéntico al primer resto de unión a antígeno. Por tanto, en estos modos de realización, el primer y el tercer resto de unión a antígeno comprenden las mismas secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera y tienen la misma disposición de dominios (es decir, convencional o de entrecruzamiento)). Además, en estos modos de realización, el tercer resto de unión a antígeno comprende las mismas sustituciones aminoacídicas, si las hay, que el primer resto de unión a antígeno. Por ejemplo, las sustituciones aminoacídicas descritas en el presente documento como "modificaciones de carga" se realizarán en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 de cada uno del primer resto de unión a antígeno y el tercer resto de unión a antígeno. De forma alternativa, dichas sustituciones aminoacídicas se pueden realizar en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 del segundo resto de unión a antígeno (que en modos de realización particulares también es una molécula Fab), pero no en el dominio constante CL y el dominio constante CH1 del primer resto de unión a antígeno y el tercer resto de unión a antígeno.

Al igual que el primer resto de unión a antígeno, el tercer resto de unión a antígeno es, en particular, una molécula Fab convencional. No obstante, también se contemplan modos de realización en los que el primer y el tercer resto de unión a antígeno son moléculas Fab de entrecruzamiento (y el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab convencional). Por tanto, en modos de realización particulares, el primer y el tercer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab convencional y el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En otros modos de realización, el primer y el tercer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab de entrecruzamiento y el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab convencional.

Si está presente un tercer resto de unión a antígeno, en un modo de realización particular, el primer y el tercer resto de unión a antígeno se unen a STEAP-1 y el segundo resto de unión a antígeno se une a un segundo antígeno, en particular un antígeno activador de linfocitos T, más en particular CD3, lo más en particular CD3 épsilon.

En modos de realización particulares, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad. La primera y la segunda subunidad del dominio Fc se pueden asociar de forma estable.

La molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención puede tener diferentes configuraciones, es decir, el primer, segundo (y opcionalmente tercer) resto de unión a antígeno se pueden fusionar entre sí y al dominio Fc de diferentes formas. Los componentes se pueden fusionar entre sí directamente o, preferentemente, por medio de uno o más conectores peptídicos adecuados. Cuando la fusión de una molécula Fab es en el extremo N de una subunidad del dominio Fc, típicamente es por medio de una región bisagra de inmunoglobulina.

En algunos modos de realización, el primer y segundo resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En dichos modos de realización, el primer resto de unión a antígeno se puede fusionar en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno o al extremo N de la otra de las subunidades del dominio Fc. En dichos modos de realización particulares, dicho primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab convencional y el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En otros modos de realización de este tipo, dicha primera molécula Fab es una molécula Fab de entrecruzamiento y la segunda molécula Fab es una molécula Fab convencional.

En un modo de realización, el primer y el segundo resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab, el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica consiste esencialmente en la primera y la segunda molécula Fab, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, y la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. Dicha configuración se representa esquemáticamente en las figuras 1G y 1K (siendo el segundo dominio de unión a antígeno en estos ejemplos una molécula Fab de entrecruzamiento VH/VL). Opcionalmente, la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab y la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En otro modo de realización, el primer y segundo resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab y el primer y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc. En un modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica consiste esencialmente en la primera y la segunda molécula Fab, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la primera y la segunda molécula Fab se fusionan cada una en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc. Dicha configuración se representa esquemáticamente en las figuras 1A y 1D (en estos ejemplos con el segundo dominio de unión a antígeno siendo una molécula Fab de entrecruzamiento VH/VL y el primer resto de unión a antígeno siendo una molécula Fab convencional). La primera y la segunda molécula Fab se pueden fusionar al dominio Fc directamente o a través de un conector peptídico. En un modo de realización particular, la primera y la segunda molécula Fab se fusionan cada una al dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG¹humana, en particular donde el dominio Fc es un dominio Fc de IgGi.

En algunos modos de realización, el primer y segundo resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. En dichos modos de realización, el segundo resto de unión a antígeno se puede fusionar en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno o (como se describe anteriormente) al extremo N de la otra de las subunidades del dominio Fc. En dichos modos de realización particulares, dicho primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab convencional y el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En otros modos de realización de este tipo, dicha primera molécula Fab es una molécula Fab de entrecruzamiento y la segunda molécula Fab es una molécula Fab convencional.

En un modo de realización, el primer y el segundo resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab, el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica consiste esencialmente en la primera y la segunda molécula Fab, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, y la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o la segunda subunidad del dominio Fc. Dicha configuración se representa esquemáticamente en las figuras 1H y 1L (en estos ejemplos con el segundo dominio de unión a antígeno siendo una molécula Fab de entrecruzamiento VH/VL y el primer resto de unión a antígeno siendo una molécula Fab convencional). Opcionalmente, la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab y la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En algunos modos de realización, el tercer resto de unión a antígeno, en particular una tercera molécula Fab, se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera o segunda subunidad del dominio Fc. En dichos modos de realización particulares, dichas primera y tercera moléculas Fab son cada una una molécula Fab convencional y la segunda molécula Fab es una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En otros modos de realización de este tipo, dicha primera y tercera moléculas Fab son cada una una molécula Fab de entrecruzamiento y la segunda molécula Fab es una molécula Fab convencional.

En un modo de realización particular de este tipo, el segundo y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab. En un modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica consiste esencialmente en la primera, la segunda y la tercera molécula Fab, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, y la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y en la que la tercera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc. Dicha configuración se representa esquemáticamente en la figura 1B y 1E (en estos ejemplos, con el segundo resto de unión a antígeno siendo una molécula Fab de entrecruzamiento VH/VL, y el primer y el tercer resto de unión a antígeno siendo una molécula Fab convencional), y la figura 1J y 1N (en estos ejemplos, con el segundo resto de unión a antígeno siendo una molécula Fab convencional, y el primer y el tercer resto de unión a antígeno siendo una molécula Fab de entrecruzamiento VH/VL). La segunda y la tercera molécula Fab se pueden fusionar al dominio Fc directamente o a través de un conector peptídico. En un modo de realización particular, la segunda y la tercera molécula Fab se fusionan cada una al dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG¹humana, en particular donde el dominio Fc es un dominio Fc de IgG¹. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab y la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En otro modo de realización de este tipo, el primer y el tercer resto de unión a antígeno se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc, y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. En un modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica consiste esencialmente en la primera, la segunda y la tercera molécula Fab, el dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, y la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, y en la que la tercera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc. Dicha configuración se representa esquemáticamente en la figura 1C y 1F (en estos ejemplos, con el segundo resto de unión a antígeno siendo una molécula Fab de entrecruzamiento VH/VL, y el primer y el tercer resto de unión a antígeno siendo una molécula Fab convencional), y la figura 1I y 1M (en estos ejemplos, con el segundo resto de unión a antígeno siendo una molécula Fab convencional, y el primer y el tercer resto de unión a antígeno siendo una molécula Fab de entrecruzamiento VH/VL). La primera y la tercera molécula Fab se pueden fusionar al dominio Fc directamente o a través de un conector peptídico. En un modo de realización particular, la primera y la tercera molécula Fab se fusionan cada una al dominio Fc a través de una región bisagra de inmunoglobulina. En un modo de realización específico, la región bisagra de inmunoglobulina es una región bisagra de IgG¹humana, en particular donde el dominio Fc es un dominio Fc de IgG¹. Opcionalmente, la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab y la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab se pueden fusionar adicionalmente entre sí.

En configuraciones de la molécula de unión a antígeno biespecífica en la que una molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de cada una de las subunidades del dominio Fc a través de regiones bisagra de inmunoglobulina, las dos moléculas Fab, las regiones bisagra y el dominio Fc forman esencialmente una molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización particular, la molécula de inmunoglobulina es una inmunoglobulina de la clase IgG. En un modo de realización incluso más particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de subclase IgG¹. En otro modo de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina de subclase IgG4. En otro modo de realización particular, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana. En otros modos de realización, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina quimérica o una inmunoglobulina humanizada. En un modo de realización, la inmunoglobulina comprende una región constante humana, en particular una región Fc humana.

En alguna de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención, la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab y la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab se fusionan entre sí, opcionalmente por medio de un conector peptídico. Dependiendo de la configuración de la primera y la segunda molécula Fab, la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab se puede fusionar en su extremo C al extremo N de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab, o la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab se puede fusionar en su extremo C al extremo N de la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab. La fusión de las cadenas ligeras de Fab de la primera y la segunda molécula Fab reduce además el emparejamiento incorrecto de las cadenas pesada y ligera de Fab no coincidentes, y también reduce el número de plásmidos necesarios para la expresión de algunas de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención.

Los restos de unión a antígeno se pueden fusionar al dominio Fc o entre sí directamente o a través de un conector peptídico, que comprende uno o más aminoácidos, típicamente aproximadamente 2-20 aminoácidos. Los conectores peptídicos son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. Los conectores peptídicos no inmunógenos adecuados incluyen, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n o G4(SG4)n, "n" en general es un número entero de 1 a 10, típicamente de 2 a 4. En un modo de realización, dicho conector peptídico tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos, en un modo de realización una longitud de 5 a 100, en otro modo de realización de 10 a 50 aminoácidos. En un modo de realización, dicho conector peptídico es (GxS)n o (GxS)nGm con G = glicina, S = serina y (x = 3, n = 3, 4, 5 o 6 y m = 0, 1, 2 o 3) o (x = 4, n = 2, 3, 4 o 5 y m = 0, 1,2 o 3), en un modo de realización x = 4 y n = 2 o 3, en otro modo de realización x = 4 y n = 2. En un modo de realización, dicho conector peptídico es (G4S)₂. Un conector peptídico en particular adecuado para fusionar las cadenas ligeras de Fab de la primera y la segunda molécula Fab entre sí es (G4S)₂. Un conector peptídico ejemplar adecuado para conectar las cadenas pesadas de Fab del primer y el segundo fragmentos Fab comprende la secuencia (D)-(G4S)₂(SEQ ID NO: 37 y 38). Otro conector adecuado de este tipo comprende la secuencia (G4S)4. Adicionalmente, los conectores pueden comprender (una porción de) una región bisagra de inmunoglobulina. En particular, cuando una molécula Fab se fusiona al extremo N de una subunidad del dominio Fc, se puede fusionar por medio de una región bisagra de inmunoglobulina o una porción de la misma, con o sin un conector peptídico adicional.

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VL(2)-CH1(2)-CH₂-CH3(-CH4)), y un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(1)-CH1(1)-CH₂-CH3(-CH4)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(²)-CL(²)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(¹)-CL(¹)). En determinados modos de realización, los polipéptidos se enlazan covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(2)-CL(2)-CH₂-CH3(-CH4)), y un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(1)-CH1(1)-CH₂-CH3(-CH4)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(¹)-CL(¹)). En determinados modos de realización, los polipéptidos se enlazan covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH₂-CH3(-CH4)). En otros modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH₂-CH3(-CH4)).

En algunos de estos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido de la cadena ligera de Fab de entrecruzamiento de la segunda molécula Fab, en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(²)-c L(²)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(¹)-CL(¹)). En otros de estos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VH(2)-CL(2)-VL(1)-CL(1)), o un polipéptido en el que el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VL(¹)-CL(¹)-VH(²)-CL(²)), según sea apropiado.

La molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con estos modos de realización puede comprender además (i) un polipéptido de subunidad del dominio Fc (CH₂-CH3(-CH4)), o (ii) un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(3)-CH1(3)-CH₂-CH3(-CH4)) y el polipéptido de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (VL(3)-CL(3)). En determinados modos de realización, los polipéptidos se enlazan covalentemente, por ejemplo, por un enlace disulfuro.

En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-CH₂-CH3(-CH4)). En otros modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una subunidad del dominio Fc (VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH₂-CH3(-CH4)).

En algunos de estos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido de la cadena ligera de Fab de entrecruzamiento de la segunda molécula Fab, en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(¹)-CL(¹)). En otros de estos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1)), o un polipéptido en el que el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VL(¹)-CL(¹)-VH(²)-CL(²)), según sea apropiado.

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica no comprende un dominio Fc. En dichos modos de realización particulares, dichas primera y, si está presente, tercera moléculas Fab son cada una una molécula Fab convencional y la segunda molécula Fab es una molécula Fab de entrecruzamiento como se describe en el presente documento, es decir, una molécula Fab en la que los dominios variables VH y VL o los dominios constantes CH1 y CL de las cadenas pesada y ligera de Fab se intercambian/reemplazan entre sí. En otros modos de realización de este tipo, dicha primera y, si está presente, tercera moléculas Fab son cada una una molécula Fab de entrecruzamiento y la segunda molécula Fab es una molécula Fab convencional.

En un modo de realización de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica consiste esencialmente en el primer y el segundo resto de unión a antígeno, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en el que el primer y el segundo resto de unión a antígeno son ambos moléculas Fab y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno. Dicha configuración se representa esquemáticamente en las figuras 1O y 1S (en estos ejemplos con el segundo dominio de unión a antígeno siendo una molécula Fab de entrecruzamiento VH/VL y el primer resto de unión a antígeno siendo una molécula Fab convencional). En otro modo de realización de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica consiste esencialmente en el primer y el segundo resto de unión a antígeno, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en el que el primer y el segundo resto de unión a antígeno son ambos moléculas Fab y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno. Dicha configuración se representa esquemáticamente en las figuras 1P y 1T (en estos ejemplos con el segundo dominio de unión a antígeno siendo una molécula Fab de entrecruzamiento VH/VL y el primer resto de unión a antígeno siendo una molécula Fab convencional). En algunos modos de realización, la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, y la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un tercer resto de unión a antígeno, en particular una tercera molécula Fab, en la que dicha tercera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab. En determinados modos de realización de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica consiste esencialmente en la primera, la segunda y la tercera molécula Fab, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la primera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, y la tercera molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab. Dicha configuración se representa esquemáticamente en las figuras 1Q y 1U (en estos ejemplos, con el segundo dominio de unión a antígeno siendo una molécula Fab de entrecruzamiento VH/V ^l, y el primer y el resto de unión a antígeno siendo cada uno una molécula Fab convencional), o las figuras 1X y 1Z (en estos ejemplos, con el segundo dominio de unión a antígeno siendo una molécula Fab convencional, y el primer y el tercer resto de unión a antígeno siendo cada uno una molécula Fab de entrecruzamiento VH/VL).

En algunos modos de realización, la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, y la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un tercer resto de unión a antígeno, en particular una tercera molécula Fab, en la que dicha tercera molécula Fab se fusiona en el extremo N de la cadena pesada de Fab al extremo C de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab. En determinados modos de realización de este tipo, la molécula de unión a antígeno biespecífica consiste esencialmente en la primera, la segunda y la tercera molécula Fab, y opcionalmente uno o más conectores peptídicos, en la que la segunda molécula Fab se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, y la tercera molécula Fab se fusiona en el extremo N de la cadena pesada de Fab al extremo C de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab. Dicha configuración se representa esquemáticamente en las figuras 1R y 1V (en estos ejemplos, con el segundo dominio de unión a antígeno siendo una molécula Fab de entrecruzamiento VH/VL, y el primer y el resto de unión a antígeno siendo cada uno una molécula Fab convencional), o las figuras 1W y 1Y (en estos ejemplos, con el segundo dominio de unión a antígeno siendo una molécula Fab convencional, y el primer y el tercer resto de unión a antígeno siendo cada uno una molécula Fab de entrecruzamiento VH/VL).

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera) (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(²)-CL(²)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(¹)-CL(¹)).

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab (VL(²)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(²)-CL(²)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(¹)-CL(¹)).

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab (VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(¹)-CL(1)).

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera) (VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(²)-CL(²)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(¹)-CL(¹)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además el polipéptido de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (VL(3)-CL(3)).

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera) (VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(¹)-CL(¹)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además el polipéptido de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (VL(³)-CL(³)).

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab {VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3)}. En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VH(²)-CL(²)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(¹)-CL(¹)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además el polipéptido de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (VL^-CLp)).

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (es decir, la segunda molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab (VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(2)-CH1(2)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VL(¹)-CL(¹)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además el polipéptido de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (VL^-CLp)). En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab (es decir, la primera molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab (es decir, la tercera molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera) (VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-VL(3)-CH1(3)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VH(¹)-CL(¹)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VL^-CLp)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (VH(3)-CL(3)).

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende un polipéptido en el que la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (es decir, la primera molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (es decir, la tercera molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera) (VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-VH(3)-CL(3)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CH1(1)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VL(²)-CL(²)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab (VL(3)-CH1(3)).

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab (es decir, la tercera molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab (es decir, la primera molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región variable de la cadena pesada se reemplaza por una región variable de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VL(3)-CH1(3)-VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (VH(¹)-CL(¹)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VL(²)-CL(²)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (VH(3)-CL(3)).

En determinados modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende un polipéptido en el que la región variable de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab (es decir, la tercera molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región variable de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab, que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab (es decir, la primera molécula Fab comprende una cadena pesada de Fab de entrecruzamiento, en la que la región constante de la cadena pesada se reemplaza por una región constante de la cadena ligera), que a su vez comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la cadena pesada de Fab de la segunda molécula Fab (VH(3)-CL(3)-VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de la primera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de la primera molécula Fab (VL(1)-CH1(1)) y el polipéptido de cadena ligera de Fab de la segunda molécula Fab (VL(²)-CL(²)). En algunos modos de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende además un polipéptido en el que la región variable de la cadena ligera de Fab de una tercera molécula Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con la región constante de la cadena pesada de Fab de una tercera molécula Fab (VL(3)-CH1(3)).

En un modo de realización, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende

a) un primer resto de unión a antígeno que se une a un primer antígeno, en el que el primer antígeno es STEAP-1 y el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 de S^eQ ID NO: 1, una HCDR2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, una LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 9;

b) un segundo resto de unión a antígeno que se une a un segundo antígeno, en el que el segundo antígeno es un antígeno activador de linfocitos T, en particular CD3, más en particular CD3 épsilon, y el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab en la que los dominios variables VL y VH o los dominios constantes CL y CH1 de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se reemplazan entre sí;

c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad; en el que

(i) el primer resto de unión a antígeno en a) se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno en b), y el segundo resto de unión a antígeno en b) se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc en c), o

(ii) el segundo resto de unión a antígeno en b) se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno en a), y el primer resto de unión a antígeno en a) se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc en c).

En un modo de realización particular, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende

a) un primer resto de unión a antígeno que se une a un primer antígeno, en el que el primer antígeno es STEAP-1 y el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 de Se Q ID NO: 1, una HCDR2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, una LCD^r2 de SEQ ID NO: 8 y un LCDR3 de SEQ ID NO: 9;

c) un tercer resto de unión a antígeno que se une al primer antígeno y es idéntico al primer resto de unión a antígeno; y

d) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad; en el que

(i) el primer resto de unión a antígeno en a) se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno en b), y el segundo resto de unión a antígeno en b) y el tercer resto de unión a antígeno en c) se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc en d), o

(ii) el segundo resto de unión a antígeno en b) se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno en a), y el primer resto de unión a antígeno en a) y el tercer resto de unión a antígeno en c) se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc en d).

En otro modo de realización, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende

c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad; en el que

(i) el primer resto de unión a antígeno en a) y el segundo resto de unión a antígeno en b) se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc en c).

En todas las diferentes configuraciones de la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención, las sustituciones aminoacídicas descritas en el presente documento, si están presentes, pueden estar en los dominios CH1 y CL del primer y (si está presente) del tercer resto de unión a antígeno/molécula Fab, o bien en los dominios CH1 y CL del segundo resto de unión a antígeno/molécula Fab. Preferentemente, están en los dominios CH1 y CL del primer y (si está presente) del tercer resto de unión a antígeno/molécula Fab. De acuerdo con el concepto de la invención, si se realizan sustituciones aminoacídicas como se describe en el presente documento en el primer (y, si está presente, el tercer) resto de unión a antígeno/molécula Fab, no se realizan dichas sustituciones aminoacídicas en el segundo resto de unión a antígeno/molécula Fab. Por el contrario, si se realizan sustituciones aminoacídicas como se describen en el presente documento en el segundo resto de unión a antígeno/molécula Fab, no se realizan dichas sustituciones aminoacídicas en el primer (y, si está presente, el tercer) resto de unión a antígeno/molécula Fab. Se realizan sustituciones aminoacídicas en particular en las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden una molécula Fab en la que los dominios constantes VL y VH1 de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se reemplazan entre sí.

En modos de realización particulares de la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención, en particular en la que se realizan sustituciones aminoacídicas como se describen en el presente documento en el primer (y, si está presente, el tercer) resto de unión a antígeno/molécula Fab, el dominio constante CL de la primera (y, si está presente, la tercera) molécula Fab es de isotipo kappa. En otros modos de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención, en particular en la que se realizan sustituciones aminoacídicas como se describen en el presente documento en el segundo resto de unión a antígeno/molécula Fab, el dominio constante CL del segundo resto de unión a antígeno/molécula Fab es de isotipo kappa. En algunos modos de realización, el dominio constante CL del primer (y, si está presente, el tercer) resto de unión a antígeno/molécula Fab y el dominio constante CL del segundo resto de unión a antígeno/molécula Fab son de isotipo kappa.

b) un segundo resto de unión a antígeno que se une a un segundo antígeno, en el que el segundo antígeno es un antígeno activador de linfocitos T, en particular CD3, más en particular CD3 épsilon, y el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab en la que los dominios variables VL y VH de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se reemplazan entre sí;

c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad;

en el que, en el dominio constante CL del primer resto de unión a antígeno en a), el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por lisina (K) o arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat) (lo más en particular por arginina (R)) y en el que, en el dominio constante CH1 del primer resto de unión a antígeno en a), el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat); y

en el que

d) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad;

en el que, en el dominio constante CL del primer resto de unión a antígeno en a) y el tercer resto de unión a antígeno en c), el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por lisina (K) o arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat) (lo más en particular por arginina (R)) y en el que, en el dominio constante CH1 del primer resto de unión a antígeno en a) y el tercer resto de unión a antígeno en c), el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat); y

en el que

a) un primer resto de unión a antígeno que se une a un primer antígeno, en el que el primer antígeno es STEAP-1 y el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 de Se Q ID NO: 1, una HCDR2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, una LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 9;

c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad;

en el que el primer resto de unión a antígeno en a) y el segundo resto de unión a antígeno en b) se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc en c).

De acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores, los componentes de la molécula de unión a antígeno biespecífica (por ejemplo, moléculas Fab, dominio Fc) se pueden fusionar directamente o a través de diversos conectores, en particular conectores peptídicos que comprenden uno o más aminoácidos, típicamente aproximadamente 2-20 aminoácidos, que se describen en el presente documento o son conocidos en la técnica. De forma adecuada, los conectores peptídicos no inmunógenos incluyen, por ejemplo, los conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n o G4(SG4)n, en los que n en general es un número entero de 1 a 10, típicamente de 2 a 4.

En un aspecto particular, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende

a) un primer y un tercer resto de unión a antígeno que se unen a un primer antígeno; en el que el primer antígeno es STEAP-1 y en el que el primer y el segundo resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab (convencional) que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14;

b) un segundo resto de unión a antígeno que se une a un segundo antígeno; en el que el segundo antígeno es CD3 y en el que el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab en la que los dominios variables VL y VH de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se reemplazan entre sí, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22;

c) un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad;

en el que

en el dominio constante CL del primer y el tercer resto de unión a antígeno en a), el aminoácido en la posición 124 se sustituye por lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat) y el aminoácido en la posición 123 se sustituye por lisina (K) o arginina (R) (numeración de acuerdo con Kabat) (lo más en particular por arginina (R)) y en el que, en el dominio constante CH1 del primer y el tercer resto de unión a antígeno en a), el aminoácido en la posición 147 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y el aminoácido en la posición 213 se sustituye por ácido glutámico (E) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat);

y en el que además

el primer resto de unión a antígeno en a) se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno en b), y el segundo resto de unión a antígeno en b) y el tercer resto de unión a antígeno en a) se fusionan cada uno en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de una de las subunidades del dominio Fc en c).

En un modo de realización de acuerdo con este aspecto de la invención, en la primera subunidad del dominio Fc, el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de triptófano (T366W) y, en la segunda subunidad del dominio Fc, el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza por un residuo de valina (Y407V) y, opcionalmente, el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza por un residuo de alanina (L368A) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización de acuerdo con este aspecto de la invención, en la primera subunidad del dominio Fc, adicionalmente se reemplaza el residuo de serina en la posición 354 por un residuo de cisteína (S354C) o se reemplaza el residuo de ácido glutámico en la posición 356 por un residuo de cisteína (E356C) (en particular el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza por un residuo de cisteína) y, en la segunda subunidad del dominio Fc, adicionalmente se reemplaza el residuo de tirosina en la posición 349 por un residuo de cisteína (Y349C) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Todavía en otro modo de realización de acuerdo con este aspecto de la invención, en cada una de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc, se reemplaza el residuo de leucina en la posición 234 por un residuo de alanina (L234A), se reemplaza el residuo de leucina en la posición 235 por un residuo de alanina (L235A) y se reemplaza el residuo de prolina en la posición 329 por un residuo de glicina (P329G) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Todavía en otro modo de realización de acuerdo con este aspecto de la invención, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG¹humana.

En un modo de realización específico particular, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 32, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 33, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 34 y un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 35. En otro modo de realización específico particular, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: ID NO: 34 y un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

En otro modo de realización específico particular, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 28, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 29, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 34 y un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 35. En otro modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: ID NO: 34 y un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

Todavía en otro modo de realización específico particular, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 30, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 61, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 34 y un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 35. En otro modo de realización específico, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: ID NO: 34 y un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

Dominio Fc

En modos de realización particulares, la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención comprende un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad. Se entiende que los rasgos característicos del dominio Fc descritos en el presente documento en relación con la molécula de unión a antígeno biespecífica se pueden aplicar igualmente a un dominio Fc comprendido en un anticuerpo de la invención.

El dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica consiste en un par de cadenas polipeptídicas que comprenden dominios de cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina. Por ejemplo, el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina G (IgG) es un dímero, del que cada subunidad comprende los dominios constantes de la cadena pesada de IgG CH₂y CH3. Las dos subunidades del dominio Fc se pueden asociar de forma estable entre sí. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención comprende no más de un dominio Fc.

En un modo de realización, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica es un dominio Fc de IgG. En un modo de realización particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG¹. En otro modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En un modo de realización más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende una sustitución aminoacídica en la posición S228 (numeración del índice EU de Kabat), en particular la sustitución aminoacídica S228P. Esta sustitución aminoacídica reduce el intercambio en el brazo Fab in vivo de los anticuerpos IgG4 (véase Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). En otro modo de realización particular, el dominio Fc es un dominio Fc humano. En un modo de realización incluso más particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG¹humana. Una secuencia ejemplar de una región Fc de IgG¹humana se da en SEQ ID NO: 36.

Modificaciones en el dominio Fc que promueven la heterodimerización

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de acuerdo con la invención comprenden diferentes restos de unión a antígeno, que se pueden fusionar a una o a la otra de las dos subunidades del dominio Fc, por tanto, las dos subunidades del dominio Fc están típicamente comprendidas en dos cadenas polipeptídicas no idénticas. La coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización dan lugar a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas en la producción recombinante, será ventajoso, por tanto, introducir en el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica una modificación que promueva la asociación de los polipéptidos deseados.

En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. El sitio de interacción proteína-proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana es en el dominio CH3 del dominio Fc. Por tanto, en un modo de realización, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc.

Existen varios enfoques para las modificaciones en el dominio CH3 del dominio Fc para garantizar la heterodimerización, que se describen bien, por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Típicamente, en todos de dichos enfoques, el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se genomanipulan ambos de manera complementaria de modo que cada dominio CH3 (o la cadena pesada que lo comprende) ya no se pueda homodimerizar consigo mismo sino que se fuerza a heterodimerizarse con el otro dominio CH3 genomanipulado de forma complementaria (de modo que el primer y segundo dominio CH3 se heterodimerizan y no se forman homodímeros entre los dos primeros o los dos segundos dominios CH3). Estos diferentes enfoques para una heterodimerización de la cadena pesada mejorada se contemplan como diferentes alternativas en combinación con las modificaciones de la cadena pesada-ligera (intercambio/reemplazo de VH y VL en un brazo de unión y la introducción de sustituciones de aminoácidos cargados con cargas opuestas en la interfase CH1/CL) en la molécula de unión a antígeno biespecífica, lo que reduce el emparejamiento incorrecto de la cadena pesada/ligera y los productos secundarios de tipo Bence Jones.

En un modo de realización específico, dicha modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc es una modificación denominada "botón en ojal", que comprende una modificación de "botón" en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de "ojal" en la otra de las dos subunidades del dominio Fc.

La tecnología de botón en ojal se describe, por ejemplo, en el documento US 5.731.168; el documento US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una cavidad ("ojal") correspondiente en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).

En consecuencia, en un modo de realización particular, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica, un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que es posicionable en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad y, en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc, un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que es posicionable la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad.

Preferentemente, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande se selecciona del grupo que consiste en arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W).

Preferentemente, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona del grupo que consiste en alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V).

La protuberancia y la cavidad se pueden preparar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica.

En un modo de realización específico, en (el dominio CH3 de) la primera subunidad del dominio Fc (la subunidad "botones") se reemplaza el residuo de treonina en la posición 366 por un residuo de triptófano (T366W), y en (el dominio CH3 de) la segunda subunidad del dominio Fc (la subunidad "ojal") se reemplaza el residuo de tirosina en la posición 407 por un residuo de valina (Y407V). En un modo de realización, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente se reemplaza el residuo de treonina en la posición 366 por un residuo de serina (T366S) y se reemplaza el residuo de leucina en la posición 368 por un residuo de alanina (L368A) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Aún en otro modo de realización, en la primera subunidad del dominio Fc, adicionalmente se reemplaza el residuo de serina en la posición 354 por un residuo de cisteína (S354C) o se reemplaza el residuo de ácido glutámico en la posición 356 por un residuo de cisteína (E356C) (en particular el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza por un residuo de cisteína) y, en la segunda subunidad del dominio Fc, adicionalmente se reemplaza el residuo de tirosina en la posición 349 por un residuo de cisteína (Y349C) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc, estabilizando adicionalmente el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

En un modo de realización particular, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W, y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A e Y407V (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización particular, el resto de unión a antígeno que se une al segundo antígeno (por ejemplo, un antígeno activador de linfocitos T) se fusiona (opcionalmente por medio del primer resto de unión a antígeno, que se une a STEAP-1 y/o a un conector peptídico) a la primera subunidad del dominio Fc (que comprende la modificación "botón"). Sin quedar vinculado a ninguna teoría, la fusión del resto de unión a antígeno que une un segundo antígeno, tal como un antígeno activador de linfocitos T, a la subunidad que contiene un botón del dominio Fc minimizará (además) la generación de moléculas de unión a antígeno que comprendan dos restos de unión a antígeno que se unen a un antígeno activador de linfocitos T (impedimento estérico de dos polipéptidos que contienen un botón).

Otras técnicas de modificación de CH3 para garantizar la heterodimerización se contemplan como alternativas de acuerdo con la invención y se describen por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

En un modo de realización, de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento EP 1870459. Este enfoque se basa en la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones de aminoácidos específicas en la interfase CH3/dominio CH3 entre las dos subunidades del dominio Fc. Un modo de realización preferente para la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención son las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en uno de los dos dominios CH3 (del dominio Fc) y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el otro de los dominios CH3 del dominio Fc (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención comprende la mutación aminoacídica T366W en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc, y adicionalmente las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención comprende las mutaciones aminoacídicas S354C, T366W en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc, o dicha molécula de unión a antígeno biespecífica comprende las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366W en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas S354C, T366S, L368A, Y407V en los dominios CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc y adicionalmente las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc (todas las numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización, de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2013/157953. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366K y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica L351D (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica L351K. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende además una mutación aminoacídica seleccionada de Y349E, Y349D y L368E (preferentemente L368E) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización, de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2012/058768. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366A, K409F. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica en la posición T411, D399, S400, F405, N390 o K392, por ejemplo, seleccionada de a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W, b) D399R, D399W, D399Y o D399K, c) S400E, S400D, S400R o S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W, e) N390R, N390K o N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366V, K409F. En otro modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366A, K409F. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende además las mutaciones aminoacídicas K392E, T411E, D399R y S400R (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización, de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2011/143545, por ejemplo, con la modificación aminoacídica en una posición seleccionada del grupo que consiste en 368 y 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización, de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2011/090762, que también usa la tecnología de botones en ojales descrita anteriormente. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366W y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407A. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366Y y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407T (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica o su dominio Fc es de la subclase IgG²y de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2010/129304.

En un modo de realización alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc por residuos aminoacídicos cargados, de modo que la formación de un homodímero se vuelva electrostáticamente desfavorable, pero la heterodimerización electrostáticamente favorable. En un modo de realización de este tipo, un primer dominio CH3 comprende la sustitución aminoacídica de K392 o N392 por un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D), preferentemente K392D o N392D) y un segundo dominio CH3 comprende la sustitución aminoacídica de D399, E356, D356 o E357 por un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, lisina (K) o arginina (R), preferentemente D399K, E356K, D356K o E357K, y más preferentemente D399K y E356K). En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende además la sustitución aminoacídica de K409 o R409 por un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D), preferentemente K409D o R409D). En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende además o de forma alternativa la sustitución aminoacídica de K439 y/o K370 por un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D)) (todas las numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Aún en otro modo de realización, de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2007/147901. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas K₂53E, D282K y K322D y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas D239K, E240K y K₂92D (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Todavía en otro modo de realización, de forma alternativa se puede usar el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2007/110205.

En un modo de realización, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas K392D y K409D y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas D356K y D399K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Modificaciones en el dominio Fc que reducen la unión al receptor de Fc y/o la función efectora

El dominio Fc confiere a la molécula de unión a antígeno biespecífica (o al anticuerpo) propiedades farmacocinéticas favorables, que incluyen una larga semivida en suero que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y a una proporción de distribución tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a dirigir de forma indeseable la molécula de unión a antígeno biespecífica (o el anticuerpo) a células que expresan receptores de Fc en lugar de a las células portadoras de antígeno preferentes. Además, la coactivación de las vías de señalización del receptor de Fc puede dar lugar a la liberación de citocinas lo que, en combinación con las propiedades activadoras de linfocitos T (por ejemplo en modos de realización de la molécula de unión a antígeno biespecífica en los que el segundo resto de unión a antígeno se une a un antígeno activador de linfocitos T) y la larga semivida de la molécula de unión a antígeno biespecífica, da como resultado una activación excesiva de receptores de citocinas y efectos secundarios graves tras la administración sistémica. La activación de células inmunitarias (portadoras del receptor de Fc) distintas de los linfocitos T puede incluso reducir la eficacia de la molécula de unión a antígeno biespecífica (en particular una molécula de unión a antígeno biespecífica en la que el segundo resto de unión a antígeno se une a un antígeno activador de linfocitos T) debido a la destrucción potencial de linfocitos T, por ejemplo, por linfocitos NK.

En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención presenta una afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG¹natural. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende dicho dominio Fc) presenta menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc, en comparación con un dominio Fc de IgG¹natural (o una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un dominio Fc de IgG¹natural), y/o menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG¹natural (o una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un dominio Fc de IgG¹natural). En un modo de realización, el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende dicho dominio Fc) no se une sustancialmente a un receptor de Fc y/o no induce función efectora. En un modo de realización particular, el receptor de Fc es un receptor de F^cy. En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente, FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. En un modo de realización, la función efectora es una o más seleccionada del grupo de CDC, ADCc , ADCP y secreción de citocinas. En un modo de realización particular, la función efectora es ADCC. En un modo de realización, el dominio Fc presenta una afinidad de unión sustancialmente similar al receptor de Fc neonatal (FcRn) en comparación con un dominio Fc de IgG¹natural. Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn cuando el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 %, en particular más de aproximadamente un 80 %, más en particular más de aproximadamente un 90 % de la afinidad de unión de un dominio Fc de IgG¹natural (o la molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un dominio Fc de IgG¹natural) por FcRn.

En determinados modos de realización, el dominio Fc se genomanipula para que tenga afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En modos de realización particulares, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o la función efectora. Típicamente, las mismas una o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc. En un modo de realización, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces. En modos de realización donde existe más de una mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por el receptor de Fc, la combinación de estas mutaciones aminoacídicas puede reducir la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 10 veces, al menos 20 veces o incluso al menos 50 veces. En un modo de realización, la molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un dominio Fc genomanipulado presenta menos de un 20 %, en particular menos de un 10 %, más en particular menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc en comparación con una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización particular, el receptor de Fc es un receptor de F^cy. En algunos modos de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En algunos modos de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor de Fc es un receptor de F^cyhumano activador, más específicamente, FcYRIIIa, F^cyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de estos receptores. En algunos modos de realización también se reduce la afinidad de unión por un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión por C1q. En un modo de realización, no se reduce la afinidad de unión por el receptor de Fc neonatal (FcRn). La unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión del dominio Fc por dicho receptor, se logra cuando el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada del dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende dicha forma no genomanipulada del dominio Fc) por FcRn. El dominio Fc, o las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención que comprenden dicho dominio Fc, puede presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En determinados modos de realización, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica se genomanipula para que tenga una función efectora reducida en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. La función efectora reducida puede incluir, pero no se limita a, una o más de las siguientes: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) reducida, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) reducida, secreción de citocinas reducida, captación de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos reducida, unión a linfocitos NK reducida, unión a macrófagos reducida, unión a monocitos reducida, unión a células polimorfonucleares reducida, señalización directa que induce apoptosis reducida, reticulación de anticuerpos unidos a diana reducida, maduración de células dendríticas reducida o activación de linfocitos T reducida. En un modo de realización, la función efectora reducida es una o más seleccionadas del grupo de CDC reducida, ADCC reducida, ADCP reducida y secreción de citocinas reducida. En un modo de realización particular, la función efectora reducida es ADCC reducida. En un modo de realización, la ADCC reducida es inferior a un 20 % de la ADCC inducida por un dominio Fc no genomanipulado (o una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un dominio Fc no genomanipulado).

En un modo de realización, la mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o la función efectora es una sustitución aminoacídica. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de E233, L234, L235, N297, P331 y P329 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización más específico, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de L234, L235 y P329 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En algunos modos de realización, el dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A y L235A (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG¹, en particular, un dominio Fc de IgG¹humana. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329. En un modo de realización más específico, la sustitución aminoacídica es P329A o P329G, en particular P329G (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 y otra sustitución aminoacídica en una posición seleccionada de E233, L234, L235, N297 y P331 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización más específico, la otra sustitución aminoacídica es E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En modos de realización particulares, el dominio Fc comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones P329, L234 y L235 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En modos de realización más particulares, el dominio Fc comprende las mutaciones aminoacídicas L234A, ^l235A y P329G ("P329G LALA", "PGLALA" o "LALAPG"). Específicamente, en modos de realización particulares, cada subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración del índice EU de Kabat), es decir, en cada una de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza el residuo de leucina en la posición 234 por un residuo de alanina (L234A), se reemplaza el residuo de leucina en la posición 235 por un residuo de alanina (L235A) y se reemplaza el residuo de prolina en la posición 329 por un residuo de glicina (P329G) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG¹, en particular, un dominio Fc de IgG¹humana. La combinación "P329G LALA" de sustituciones aminoacídicas suprime casi completamente la unión al receptor de Fcy (así como al complemento) de un dominio Fc de IgG¹humana, como se describe en la publicación PCT n.° WO 2012/130831. El documento WO 2012/130831 también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades, tales como unión al receptor de Fc o funciones efectoras.

Los anticuerpos contra IgG4 presentan afinidad de unión reducida por receptores de Fc y funciones efectoras reducidas en comparación con anticuerpos contra IgG¹. Por tanto, en algunos modos de realización, el dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención es un dominio Fc de IgG4, en particular un dominio Fc de IgG4 humana. En un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en la posición S228, específicamente la sustitución aminoacídica S228P (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). Para reducir además su afinidad de unión por un receptor de Fc y/o su función efectora, en un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición L235, específicamente la sustitución aminoacídica L235E (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329, específicamente la sustitución aminoacídica P329G (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización particular, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones S228, L235 y P329, específicamente las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y P329G (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). Dichos mutantes del dominio Fc de IgG4 y sus propiedades de unión al receptor de Fcy se describen en la publicación PCT n.° WO 2012/130831.

En un modo de realización particular, el dominio Fc que presenta afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG¹natural, es un dominio Fc de IgG¹humana que comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y opcionalmente P329G, o un dominio Fc de IgG4 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y opcionalmente P329G (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En determinados modos de realización se ha eliminado la N-glucosilación del dominio Fc. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc comprende una mutación aminoacídica en la posición N297, en particular una sustitución aminoacídica que reemplaza asparagina por alanina (N297A) o ácido aspártico (N297D) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Además de los dominios Fc descritos anteriormente en el presente documento y en la publicación PCT n.° WO 2012/130831, los dominios Fc con unión al receptor de Fc y/o función efectora reducidas también incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de dominio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se pueden preparar dominios Fc mutantes por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios de nucleótidos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación.

La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (RPS) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. De forma alternativa, la afinidad de unión de los dominios Fc o las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un dominio Fc por los receptores de Fc se puede evaluar usando líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK humanos que expresan el receptor de FcYlIIa.

La función efectora de un dominio Fc, o una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un dominio Fc, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. Los ejemplos de ensayos in vitro para valorar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); la patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayos no radioactivos (véanse, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc., Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)).

Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar la actividad ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

En algunos modos de realización se reduce la unión del dominio Fc a un componente del complemento, específicamente a C1q. En consecuencia, en algunos modos de realización en los que el dominio Fc se genomanipula para que tenga una función efectora reducida, dicha función efectora reducida incluye una CDC reducida. Se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si el dominio Fc, o la molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende el dominio Fc, se puede unir a C1q y, por tanto, tiene actividad CDC. Véanse, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

También se pueden realizar determinaciones de unión a FcRn y eliminación/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); documento WO 2013/120929).

Polinucleótidos

La invención proporciona además polinucleótidos aislados que codifican un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención.

Los polinucleótidos que codifican los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención se pueden expresar como un único polinucleótido que codifica todo el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica o como múltiples (por ejemplo, dos o más) polinucleótidos que se coexpresan. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan se pueden asociar a través de, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica funcional. Por ejemplo, la porción de la cadena ligera de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica se puede codificar por un polinucleótido separado de la porción del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende la cadena pesada del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica. Cuando se coexpresen, los polipéptidos de la cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de la cadena ligera para formar el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica. En otro ejemplo, la porción del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende una de las dos subunidades del dominio Fc y opcionalmente (parte de) una o más moléculas Fab se podría codificar por un polinucleótido separado de la porción del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende la otra de las dos subunidades del dominio Fc y opcionalmente (parte de) una molécula Fab. Cuando se coexpresan, las subunidades del dominio Fc se asociarán para formar el dominio Fc.

En determinados modos de realización, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otros modos de realización, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm). El ARN de la presente invención puede ser monocatenario o bicatenario.

Procedimientos recombinantes

Los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención se pueden obtener, por ejemplo, por síntesis peptídica en estado sólido (por ejemplo, síntesis en fase sólida de Merrifield) o producción recombinante. Para la producción recombinante, uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica (fragmento), por ejemplo, como se describe anteriormente, se aíslan e insertan en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho polinucleótido se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales. Los polinucleótidos de la invención pueden estar comprendidos en un vector, preferentemente un vector de expresión. Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica (fragmento) junto con señales de control transcripcional/traduccional apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación genética. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); y Ausubel et al., C^urrentP^rotocolsIⁿM^olecularB^iology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o puede ser un fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que el polinucleótido que codifica el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica (fragmento) (es decir, la región codificante) se clona en asociación funcional con un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o la traducción. Como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, si está presente, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, finalizadores de la transcripción, intrones, regiones no traducidas 5' y 3' y similares, no es parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes pueden estar presentes en una única construcción polinucleotídica, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones polinucleotídicas separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una región codificante única o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector puede codificar uno o más polipéptidos, que se separan pos- o cotraduccionalmente en las proteínas finales por medio de escisión proteolítica. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico divulgado en el presente documento puede codificar regiones codificantes heterógenas, fusionadas o bien no fusionadas a un polinucleótido que codifica el anticuerpo o molécula de unión al antígeno biespecífica (fragmento) de la invención, o una variante o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, sin limitación, elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo. Una asociación funcional es cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de modo que coloca la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la(s) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado con la misma) se "asocian de forma funcional" si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión del producto génico ni interfiere con la capacidad del molde de ADN para transcribirse. Por tanto, una región promotora se asociaría de forma funcional con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor puede efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores, operadores, represores y señales de finalización de la transcripción, se pueden asociar de forma funcional con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de célula. Los promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción se divulgan en el presente documento. Una variedad de regiones de control de la transcripción son conocidas para los expertos en la técnica. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción, que funcionan en células de vertebrado, tales como, pero sin limitarse a, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (por ejemplo, el promotor temprano inmediato, conjuntamente con intrón-A), virus de simio 40 (por ejemplo, el promotor temprano) y retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovina y p-globina de conejo, así como otras secuencias que pueden controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos tisulares, así como promotores inducibles (por ejemplo, promotores inducibles de tetraciclinas). De forma similar, una variedad de elementos de control de la traducción son conocidos para los expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, sitios de unión a ribosomas, codones de iniciación y finalización de la traducción y elementos derivados de sistemas víricos (en particular, un sitio de entrada al ribosoma interno o IRES, también denominado secuencia CITE). El casete de expresión también puede incluir otros rasgos característicos tales como un origen de replicación y/o elementos de integración cromosómica tales como repeticiones terminales largas (RTL) retrovíricas o repeticiones terminales invertidas (RTI) víricas adenoasociadas (VAA).

Se pueden asociar regiones codificantes de polinucleótido y ácidos nucleico con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, si se desea la secreción del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica, el ADN que codifica una secuencia señal se puede colocar anterior al ácido nucleico que codifica un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención o un fragmento del mismo. De acuerdo con la hipótesis de la señal, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido señal o una secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura después de que se haya iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la técnica saben que los polipéptidos secretados por células de vertebrado, en general, tienen un péptido señal fusionado con el extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido traducido para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. Se puede usar el péptido señal natural, por ejemplo, un péptido señal de la cadena pesada o la cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad para dirigir la secreción del polipéptido que está asociado de forma funcional con él. De forma alternativa, se puede usar un péptido señal de mamífero heterólogo, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, se puede sustituir la secuencia líder natural por la secuencia líder del activador tisular del plasminógeno (TPA) humano o pglucuronidasa de ratón.

El ADN que codifica una secuencia de proteína corta que se podría usar para facilitar la purificación posterior (por ejemplo, un marcador de histidina) o ayudar a marcar el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica se puede incluir dentro o en los extremos del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica (fragmento) que codifica el polinucleótido.

En otro modo de realización se proporciona una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos de la invención. Los polinucleótidos de la invención pueden estar comprendidos en uno o más vectores. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento en relación con polinucleótidos y vectores, respectivamente. En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado o transfectado con) uno o más vectores que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención. Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier clase de sistema celular que se puede genomanipular para generar un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención o fragmentos del mismo. Las células huésped adecuadas para replicar y para soportar la expresión de anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas son bien conocidas en la técnica. Dichas células se pueden transfectar o transducir según sea apropiado con el vector de expresión particular y se pueden cultivar grandes cantidades de células que contienen vectores para sembrar fermentadores a gran escala para obtener cantidades suficientes del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica para aplicaciones clínicas. Las células huésped adecuadas incluyen microorganismos procariotas, tales como E. coli, o diversas células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos en bacterias, en particular cuando no es necesaria la glucosilación. Después de la expresión, se puede aislar el polipéptido a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente. Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano.

Véanse Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), y Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006).

Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos (glucosilados) también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar junto con células de insecto, en particular, para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas). También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas de células de mamífero que se adapten al cultivo en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293T como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de Sertoli de ratón (linfocitos TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL3A), células de pulmón humano (W138), células de hígado humano (Hep G2), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI (como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC5 y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO dhfr-(Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); y líneas de células de mieloma tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de proteínas, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, células de levadura, células de insecto, células bacterianas y células vegetales, por nombrar solo unas pocas, pero también células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado. En un modo de realización, la célula huésped es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (HEK) o una célula linfoide (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20).

Las tecnologías estándar son conocidas en la técnica para expresar genes exógenos en estos sistemas. Las células que expresan un polipéptido que comprende la cadena pesada o bien la ligera de un dominio de unión a antígeno tal como un anticuerpo se pueden genomanipular para expresar también la otra de las cadenas de anticuerpo de modo que el producto expresado es un anticuerpo que tiene tanto una cadena pesada como una ligera.

En un modo de realización se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica, como se proporciona en el presente documento, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica, y recuperar el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la célula huésped (o medio de cultivo de célula huésped).

Los componentes de la molécula de unión a antígeno biespecífica (o el anticuerpo) de la invención se pueden fusionar genéticamente entre sí. La molécula de unión a antígeno biespecífica se puede diseñar de modo que sus componentes se fusionen directamente entre sí o indirectamente a través de una secuencia conectora. La composición y longitud del conector se pueden determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y se pueden someter a prueba para determinar su eficacia. En el presente documento se proporcionan ejemplos de secuencias conectoras entre diferentes componentes de moléculas de unión a antígeno biespecíficas. También se pueden incluir secuencias adicionales para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la fusión si se desea, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas.

El anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención comprenden en general al menos una región variable del anticuerpo que se puede unir a un determinante antigénico. Las regiones variables pueden formar parte de y derivarse de anticuerpos naturales o no naturales y fragmentos de los mismos. Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los anticuerpos no naturales se pueden construir usando síntesis peptídica en fase sólida, se pueden producir de forma recombinante (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.186.567) o se pueden obtener, por ejemplo, cribando colecciones combinatorias que comprenden cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (véase, por ejemplo, la patente de EE. u U. n.° 5.969.108 concedida a McCafferty).

Se puede usar cualquier especie animal de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio de unión a antígeno o región variable en el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecíficas de la invención. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, dominios de unión a antígeno o regiones variables no limitantes útiles en la presente invención pueden ser de origen murino, de primate o humano. Si el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica está destinada para uso humano, se puede usar una forma quimérica de anticuerpo en la que las regiones constantes del anticuerpo proceden de un ser humano. También se puede preparar una forma humanizada o completamente humana del anticuerpo de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.565.332 concedida a Winter). La humanización se puede lograr por diversos procedimientos incluyendo, pero sin limitarse a (a) injertar las CDR no humanas (por ejemplo, anticuerpo donante) en regiones estructurales y constantes humanas (por ejemplo, anticuerpo receptor) con o sin retención de los residuos estructurales cruciales (por ejemplo, los que son importantes para conservar buena afinidad de unión a antígeno o funciones de anticuerpo), (b) injertar solo las regiones determinantes de especificidad (SDR o a-CDR; los residuos cruciales para la interacción anticuerpo-antígeno) no humanas en regiones estructurales y constantes humanas, o (c) trasplantar todos los dominios variables no humanos, pero "enmascararlos" con una sección similar a humana por reemplazo de residuos de superficie. Los anticuerpos humanizados y los procedimientos de preparación de los mismos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.os 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describen el injerto de regiones determinantes de la especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe el "rebamizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describen el "reordenamiento de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cáncer, 83:252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección guiada" para el reordenamiento de FR). Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véanse, por ejemplo, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci., 13:1619-1633 (2008)); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véanse, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997); y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen, en general, en van Dijk y van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) y Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos inalterados o anticuerpos inalterados con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que remplazan los locus de inmunoglobulina endógena o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos se han inactivado, en general, los locus de inmunoglobulina endógena. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429 que describe la tecnología HuMab®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE® y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VelociMouse®. Las regiones variables humanas de anticuerpos inalterados generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.

También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véanse, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boemer et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Los anticuerpos humanos generados por medio de la tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

También se pueden generar anticuerpos humanos por aislamiento a partir de colecciones de anticuerpos humanos, como se describe en el presente documento.

Se pueden aislar anticuerpos cribando colecciones combinatorias para detectar los anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Los procedimientos para cribar colecciones combinatorias se revisan, por ejemplo, en Lerner et al. en Nature Reviews 16:498-508 (2016). Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para detectar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Frenzel et al. en mAbs 8:1177-1194 (2016); Bazan et al. en Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012) y Zhao et al. en Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016), así como en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y en Marks y Bradbury en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003).

En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que a continuación se pueden cribar para detectar fagos de unión a antígeno como se describe en Winter et al. en Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994). Los fagos típicamente presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad con respecto al inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio indiferenciado (por ejemplo, de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al. en EMBO Journal, 12: 725-734 (1993). Finalmente, también se pueden preparar colecciones indiferenciadas sintéticamente clonando segmentos del gen V no reordenados de células madre, y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro, como se describe en Hoogenboom y Winter en Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos con anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: las patentes de EE. UU. n.os 5.750.373; 7.985.840; 7.785.903 y 8.679.490, así como las publicaciones de patentes de EE. UU. n.os 2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 y 2007/0292936. Otros ejemplos de procedimientos conocidos en la técnica para cribar colecciones combinatorias para detectar anticuerpos con una actividad o actividades deseadas incluyen presentación en ribosomas y ARNm, así como procedimientos para presentación y selección de anticuerpos en bacterias, células de mamífero, células de insecto o células de levadura. Se revisan los procedimientos para presentación en la superficie de levaduras, por ejemplo, en Scholler et al. en Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012) y en Cherf et al. en Methods in Molecular Biology 1319:155-175 (2015), así como en Zhao et al. en Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012). Se describen los procedimientos para la presentación en ribosomas, por ejemplo, en He et al. en Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997) y en Hanes et al. en PNAS 94:4937-4942 (1997).

Los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas preparadas como se describe en el presente documento se pueden purificar mediante técnicas conocidas en la técnica tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como carga neta, hidrofobia, hidrofilia, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. Para la purificación por cromatografía de afinidad se puede usar un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se une el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica. Por ejemplo, para la purificación por cromatografía de afinidad de anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención, se puede usar una matriz con proteína A o proteína G. Se pueden usar la cromatografía de afinidad con proteína A o G y la cromatografía de exclusión por tamaño secuenciales para aislar un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica esencialmente como se describe en los ejemplos. Se puede determinar la pureza del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica por cualquiera de una variedad de procedimientos analíticos bien conocidos, incluyendo electroforesis en gel, cromatografía de líquidos de alta presión y similares.

Ensayos

Los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención se pueden identificar, cribar o caracterizar por sus propiedades físicas/químicas y/o sus actividades biológicas mediante diversos ensayos conocidos en la técnica.

Ensayos de afinidad

La afinidad del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica por un receptor de Fc o un antígeno diana se puede determinar, por ejemplo, por resonancia de plasmón superficial (RPS), usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores o proteínas diana tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. De forma alternativa, la unión de anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas para diferentes receptores o antígenos diana se puede evaluar usando líneas celulares que expresan el receptor o antígeno diana particular, por ejemplo por citometría de flujo (FACS). En lo que sigue se describe un modo de realización ilustrativo y ejemplar específico para medir la afinidad de unión.

De acuerdo con un modo de realización, se mide K^dpor resonancia de plasmón superficial usando una máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C.

Para analizar la interacción entre la porción Fc y los receptores de Fc, se captura el receptor de Fc recombinante con marca His por un anticuerpo anti-Penta-His (Qiagen) inmovilizado en chips CM5 y se usan las construcciones biespecíficas como analitos. En resumen, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el anticuerpo anti-Penta-His con acetato de sodio 10 mM, pH 5,0, a 40 |jg/ml antes de la inyección a un caudal de 5 jl/m in para lograr aproximadamente 6500 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del ligando, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Posteriormente, se captura el receptor de Fc durante 60 s a 4 o 10 nM. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones seriadas por cuadruplicado del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica (intervalo entre 500 nM y 4000 nM) en HBS-EP (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) a 25 °C a un caudal de 30 jl/m in durante 120 s.

Para determinar la afinidad por el antígeno diana, se capturan los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas por un anticuerpo específico anti-Fab humano (GE Healthcare) que se inmoviliza en una superficie de chip de sensor CM5 activado como se describe para el anticuerpo anti-Penta-His. La cantidad final de proteína acoplada es de aproximadamente 12.000 UR. Los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas se capturan durante 90 s a 300 nM. Se pasan los antígenos diana a través de cubetas de lectura durante 180 s a un intervalo de concentración de 250 a 1000 nM con un caudal de 30 jl/min. Se monitoriza la disociación durante 180 s.

Se corrigen las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida en la cubeta de lectura de referencia. Se usó la respuesta en situación de equilibrio para derivar la constante de disociación Kd por ajuste de curva no lineal de la isoterma de unión de Langmuir. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kdis) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (programa informático de evaluación BIACORE ® T100 versión 1.1.1) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (Kd) como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).

Ensayos de actividad

Se puede medir la actividad biológica de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas (o anticuerpos) de la invención por diversos ensayos como se describe en los ejemplos. Las actividades biológicas pueden incluir, por ejemplo, la inducción de proliferación de linfocitos T, la inducción de señalización en linfocitos T, la inducción de expresión de marcadores de activación en linfocitos T, la inducción de secreción de citocinas por linfocitos T, la inducción de lisis de células diana, tales como células tumorales, y la inducción de remisión tumoral y/o la mejora de la supervivencia.

Composiciones, formulaciones y vías de administración

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos a continuación. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

Se divulga además un procedimiento de producción de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención en una forma adecuada para su administración in vivo, comprendiendo el procedimiento (a) obtener un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la invención, y (b) formular el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, con lo que se formula una preparación de anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica para su administración in vivo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica disuelto o dispersado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son en general no tóxicas para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, es decir, no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción indeseable cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica y opcionalmente un ingrediente activo adicional será conocida para los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990. Además, para su administración en animales (por ejemplo, seres humanos), se entenderá que las preparaciones deben cumplir normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según se requiera por la Oficina de Normas biológicas de la FDA o las autoridades correspondientes en otros países. Las composiciones preferentes son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, antioxidantes, proteínas, fármacos, estabilizantes de fármacos, polímeros, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, tintes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como se conocerá por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.

Un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional.

Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

Las composiciones parenterales incluyen las diseñadas para administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para inyección, los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológica. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De forma alternativa, los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes del uso. Se preparan soluciones inyectables estériles incorporando los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados a continuación, según se requiera. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los procedimientos preferentes de preparación son técnicas de secado al vacío o liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de un medio líquido previamente filtrado estéril del mismo. El medio líquido se debe tamponar de forma adecuada si es necesario y el diluyente líquido se debe volver isotónico en primer lugar antes de la inyección con solución salina o glucosa suficiente. La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas se debe mantener al mínimo a un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Znproteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener compuestos que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano o similares. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleatos de etilo o triglicéridos, o liposomas.

Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a ed. Mack Printing Company, 1990). Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Se puede conseguir la absorción prolongada de una composición inyectable por el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.

Además de las composiciones descritas previamente, los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas también se pueden formular como una preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención se pueden fabricar por medio de procesos de mezclado, disolución, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o coadyuvantes fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.

Los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que retienen sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteínica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre.

Procedimientos y composiciones terapéuticos

Se puede usar cualquiera de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención en procedimientos terapéuticos. Se pueden usar anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención como agentes inmunoterápicos, por ejemplo, en el tratamiento de cánceres.

Para su uso en procedimientos terapéuticos, los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención se formularían, dosificarían y administrarían de una manera consecuente con una buena práctica médica. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los médicos.

En un aspecto, se proporcionan anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporcionan anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En determinados modos de realización, se proporcionan anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento. En un modo de realización, la invención proporciona un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita. En determinados modos de realización, la invención proporciona un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica. En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un modo de realización particular, la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. La divulgación también proporciona un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención para su uso en la inducción de lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral. La divulgación proporciona además un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica para su uso en un procedimiento de inducción de lisis de una célula diana, en particular una célula tumoral, en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica para inducir la lisis de una célula diana. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un mamífero, preferentemente un ser humano.

En determinados modos de realización, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo, en particular cáncer. Los ejemplos no limitantes de cánceres incluyen cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de huesos y cáncer de riñón. Otros trastornos de proliferación celular que se pueden tratar usando un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, neoplasias localizadas en el(los)/la(s): abdomen, hueso, mama, aparato digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroidea), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, aparato genital femenino, piel, tejidos blandos, bazo, región torácica y sistema urogenital. También se incluyen afecciones o lesiones precancerosas y metástasis de cáncer. En determinados modos de realización, el cáncer se elige del grupo que consiste en cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de próstata. En un modo de realización, el cáncer es cáncer de próstata. Un experto en la técnica reconoce fácilmente que, en muchos casos, el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica puede no proporcionar una cura, sino que puede proporcionar solo un beneficio parcial. En algunos modos de realización, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por tanto, en algunos modos de realización, una cantidad del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz". El sujeto, paciente o individuo que necesita tratamiento es típicamente un mamífero, más específicamente un ser humano.

En algunos modos de realización, una cantidad eficaz de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención se administra a una célula. En otros modos de realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención se administra a un individuo para el tratamiento de una enfermedad.

Para la prevención o tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la vía de administración, el peso corporal del paciente, el tipo de anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica, la gravedad y evolución de la enfermedad, si el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, intervenciones terapéuticas previas o coincidentes, la anamnesis y respuesta del paciente al anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica y el criterio del médico especialista. El médico responsable para la administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los ingrediente(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto individual. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada.

El anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 μg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica puede ser una dosis inicial candidata para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 μg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosis ejemplar del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica estaría en el intervalo de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 microgramo/kg de peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg de peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable de los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg peso corporal, etc., en base a los números descritos anteriormente. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar intermitentemente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal manera que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte o, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo o molécula de unión a antígeno específica). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. La progresión de este tratamiento se monitoriza fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención se usarán en general en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Para su uso para tratar o prevenir un estado de enfermedad, los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención, o composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran o se aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, especialmente en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.

Para la administración sistémica, se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. A continuación se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentraciones en circulación que incluya la CI⁵⁰como se determina en cultivo celular.

Se puede usar dicha información para determinar con más exactitud dosis útiles en seres humanos.

También se pueden estimar dosificaciones iniciales a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos en base a los datos en animales.

La cantidad y el intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles en plasma de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas que sean suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosificaciones de paciente habituales para administración por inyección varían de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg/día, típicamente de aproximadamente 0,5 a 1 mg/kg/día. Se pueden lograr niveles plasmáticos terapéuticamente eficaces administrando dosis múltiples cada día. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por HPLC.

En casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas puede no estar relacionada con la concentración en plasma.

Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación excesiva.

Una dosis terapéuticamente eficaz de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención proporcionará en general un beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad y la eficacia terapéutica de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos habituales en cultivos celulares o animales experimentales. Se pueden usar ensayos de cultivo celular y estudios con animales para determinar la DL⁵⁰(la dosis letal para un 50 % de una población) y la DE⁵⁰(la dosis terapéuticamente eficaz en un 50 % de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se puede expresar como la proporción DL⁵⁰/DE⁵⁰. Son preferentes anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas que presenten índices terapéuticos grandes. En un modo de realización, el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de acuerdo con la presente invención presenta un índice terapéutico alto. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios con animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificaciones adecuado para su uso en seres humanos. Preferentemente, la dosificación se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE⁵⁰con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo, la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, la afección del sujeto y similares. La formulación exacta, vía de administración y dosificación se pueden elegir por el médico individual en vista de la afección del paciente (véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1, p. 1).

El médico especialista para pacientes tratados con anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención sabrá cómo y cuándo finalizar, interrumpir o ajustar la administración debido a toxicidad, disfunción orgánica y similares. A la inversa, el médico especialista también sabrá ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluyendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el abordaje del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección que se va a tratar, con la vía de administración y similares. La gravedad de la afección, por ejemplo, se puede evaluar, en parte, por procedimientos de evaluación de pronóstico estándar. Además, la dosis y quizás la frecuencia de dosis también variarán de acuerdo con la edad, peso corporal y respuesta del paciente individual.

Otros agentes y tratamientos

Los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes en el tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. El término "agente terapéutico" engloba cualquier agente administrado para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier ingrediente activo adecuado para la indicación particular que se está tratando, preferentemente el que tiene actividades complementarias que no se ven afectadas de forma adversa entre sí. En determinados modos de realización, un agente terapéutico adicional es un agente inmunomodulador, un agente citostático, un inhibidor de la adhesión celular, un agente citotóxico, un activador de la apoptosis celular o un agente que incrementa la sensibilidad de las células por los inductores apoptóticos. En un modo de realización particular, el agente terapéutico adicional es un agente antineoplásico, por ejemplo, un alterador de los microtúbulos, un antimetabolito, un inhibidor de topoisomerasas, un intercalador de ADN, un agente alquilante, un tratamiento hormonal, un inhibidor de cinasas, un antagonista de receptores, un activador de la apoptosis de células tumorales o un agente antiangiogénico.

Dichos otros agentes están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica usada, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas se usan en general en las mismas dosificaciones y con vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empírica/clínicamente como apropiada.

Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma composición o en composiciones separadas) y la administración separada, caso en el que se puede producir la administración del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención antes de, simultáneamente a y/o después de la administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante. También se pueden usar los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención en combinación con radioterapia.

Artículos de fabricación

En un aspecto de la divulgación se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o de otro modo terapéutico. El artículo de fabricación puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFi), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Procedimientos y composiciones para diagnóstico y detección

Cualquiera de los anticuerpos anti-STEAP-1 de la invención pueden ser útiles para detectar la presencia de STEAP-1 en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en el presente documento engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En determinados modos de realización, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como un tejido de la próstata.

En un aspecto de la divulgación se proporciona un anticuerpo anti-STEAP-1 de la invención para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En otro aspecto de la divulgación se proporciona un procedimiento de detección de la presencia de STEAP-1 en una muestra biológica. Dichos procedimientos pueden comprender poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-STEAP-1 de la invención en condiciones propicias para la unión del anticuerpo anti-STEAP-1 a STEAP-1, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-STEAP-1 y STEAP-1. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo. También se puede usar un anticuerpo anti-STEAP-1 de la invención para seleccionar sujetos idóneos para el tratamiento con un anticuerpo anti-STEAP-1, por ejemplo, donde STEAP-1 es un biomarcador para la selección de pacientes.

Los trastornos ejemplares que se pueden diagnosticar usando un anticuerpo de la invención incluyen cáncer, en particular cáncer de próstata.

Los anticuerpos anti-STEAP-1 de la invención se pueden marcar. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

Secuencias de aminoácidos

Ejemplos

Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente. Ejemplo 1

Generación de construcciones y herramientas

Técnicas de ADN recombinante

Se usaron procedimientos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La información general con respecto a las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina humana se proporciona en: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

Síntesis génica

Se generaron segmentos de genes deseados, cuando se requirió, por PCR usando moldes apropiados o bien se sintetizaron por Geneart AG (Ratisbona, Alemania) a partir de oligonucleótidos sintéticos y productos de PCR por síntesis génica automatizada. Se clonaron los segmentos génicos flanqueados por sitios de escisión de endonucleasas de restricción singulares en vectores de clonación/secuenciación estándar. Se purificó el ADN plasmídico a partir de bacterias transformadas y se determinó la concentración por espectroscopia UV. Se confirmó la secuencia de ADN de los fragmentos génicos subclonados por secuenciación de ADN. Se diseñaron segmentos génicos con sitios de restricción adecuados para permitir la subclonación en los respectivos vectores de expresión. Se diseñaron todas las construcciones con una secuencia de ADN del extremo 5' que codifica un péptido líder que se dirige a proteínas para su secreción en células eucariotas.

Secuenciación de ADN

Se determinaron secuencias de ADN por secuenciación de doble hebra.

Clonación de anticuerpos biespecíficos de linfocitos T (TCB) anti-STEAP1/anti-CD3

Se usaron los dominios variables de vandortuzumab para la generación de diversas variantes de anticuerpos biespecíficos de linfocitos T (TCB) específicos para STEAP1. Para la generación de los respectivos plásmidos de expresión se usaron las secuencias de región variable de vandortuzumab (SEQ ID NO: 10 y 14) o variantes de las mismas y se subclonaron en marco con las respectivas regiones constantes que están preinsertadas en el respectivo vector de expresión de mamífero receptor. Se muestra una ilustración esquemática de las moléculas resultantes en la figura 2.

Preparación de anticuerpos biespecíficos de linfocitos T (TCB) anti-STEAP1/anti-CD3

Se prepararon las siguientes moléculas, las ilustraciones esquemáticas de las mismas se proporcionan en la figura 2 :

A. Molécula A: 2+1 IgG CrossFab “invertido” (conector de CD3 C terminal a conector de STEAP1), con modificaciones de carga (intercambio VH/VL en el conector de CD3, modificación de carga en el conector de STEAP1) (SEQ ID NO: 26, 27, 34 y 35)

B. Molécula B: 2+1 IgG CrossFab “invertido” (conector de CD3 C terminal a conector de STEAP1), con modificaciones de carga (intercambio VH/VL en el conector de CD3, modificación de carga en el conector de STEAP1; mutación D100aE en ambos restos de unión de STEAP1) (SEQ ID NO: 28, 29, 34 y 35)

C. Molécula C: 2+1 IgG CrossFab “invertido” (conector de CD3 C terminal a conector de STEAP1), con modificaciones de carga (intercambio VH/VL en el conector de CD3, modificación de carga en el conector de STEAP1; mutación D100bE en ambos restos de unión de STEAP1) (SEQ ID NO: 30, 31, 34 y 35)

D. Molécula D: 2+1 IgG CrossFab “invertido” (conector de CD3 C terminal a conector de STEAP1), con modificaciones de carga (intercambio VH/VL en el conector de CD3, modificación de carga en el conector de STEAP1; mutaciones D100aE/D100bE en ambos restos de unión de STEAP1) (SEQ ID NO: 32, 33, 34 y 35)

La expresión de las moléculas mencionadas anteriormente fue fomentada por un promotor MPSV quimérico o bien por un promotor CMV. La poliadenilación se fomentó por una secuencia señal poliA sintética localizada en el extremo 3' de CDS. Además, cada vector contenía una secuencia OriP de VEB para la replicación autosómica.

Para la producción de todas las construcciones, se cotransfectaron las células HEK₂93-EBNA que crecían en suspensión con los vectores de expresión respectivos usando polietilenimina como reactivo de transfección. Como tal, para la producción de todas las construcciones "2+1 IgG CrossFab", se cotransfectaron los vectores de expresión correspondientes en una proporción 1:2:1:1 ("vector cadena pesada (VH-CH1-VL-CH1-CH₂-CH3)”: "vector cadena ligera (VL-CL)": "vector cadena pesada (VH-CH1-CH₂-CH3)": "vector cadena ligera (VH-CL)").

Se cultivaron células HEK₂93 EBNA en suspensión en medio de cultivo Excell sin suero que contenía L-glutamina 6 mM y 250 mg/l de G418. Para la producción en matraces rotatorios de 600 ml (volumen de trabajo máx. de 400 ml), se sembraron 600 millones de células HEK₂93 EBNA 24 horas antes de la transfección. Antes de la transfección, se centrifugaron las células durante 5 min por 210 x g y se reemplazó el sobrenadante por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Se mezclaron los vectores de expresión en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 400 μg de ADN. Después de la adición de 1080 μl de solución PEI (2,7 μg/ml), se agitó en vórtex el medio durante 15 s y posteriormente se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Después de esto, se mezclaron las células con la solución de ADN/PEI, se transfirieron a un matraz rotatorio de 600 ml y se incubaron durante 3 horas a 37 °C en una estufa de incubación con una atmósfera humidificada de CO²al 5 %. Después de esta etapa de incubación, se añadieron 360 ml de medio Excell que contenía L-glutamina 6 mM, 5 g/l de Pepsoy y VPA 1,0 mM y se cultivaron las células durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadió Feed 7 al 7 %. Después de un cultivo de 7 días, se recogió el sobrenadante para la purificación por centrifugación durante 20-30 min a 3600 x g (centrífuga Sigma 8K), se filtró la solución en condiciones estériles (filtro de 0,22 μm) y se añadió acida de sodio hasta una concentración final de 0,01 % (p/v) y se mantuvo a 4 °C.

Todas las moléculas se purificaron a partir de los sobrenadantes de cultivo celular por cromatografía de afinidad con proteína A, seguido de una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño. Para la cromatografía de afinidad, se cargó sobrenadante en una columna de proteína A HiTrap HP (VC = 5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 25 ml de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5. Se retiró la proteína no unida lavando con al menos 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5. Se eluyó proteína diana en 6 volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM, pH 3,0. Se neutralizó la solución de proteína añadiendo 1/10 de volumen de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. Para el análisis en proceso después de la cromatografía con proteína A, se analizaron la pureza y el peso molecular de las moléculas en las fracciones individuales por SDS-PAGE en ausencia de un agente reductor y se tiñeron con Coomassie (InstantBlue™ de Expedeon). Se usó el sistema en gel NuPAGE® Pre-Cast (Bis-Tris al 4-12 %, Invitrogen, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se concentraron las fracciones seleccionadas de la proteína diana y se filtraron antes de su carga en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,0, Tween20 al 0,01 %.

Se determinó la concentración de proteína de las muestras de proteínas purificadas mediante la densidad óptica (DO) a 280 nm usando el coeficiente de extinción molar que se calculó sobre la base de la secuencia de aminoácidos. Además, se realizó un análisis por espectrometría de masas de todas las moléculas para confirmar su identidad.

Generación de una línea celular CHO-K1 que expresa STEAP1

Se subclonó un gen que codifica STEAP1 humano de longitud completa en un vector de expresión de mamífero.

Se transfectó el plásmido en células CHO-K1 (ATCC CRL-9618) usando el reactivo Lipofectamine LTX de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, n.° 15338100). Se mantuvieron las células CHO positivas para STEAP1 transfectadas de manera estable en medio DMEM/F-12 (Gibco, n.° 11320033) complementado con suero fetal bovino al 10 % (Gibco, n.° 16140063) y suplemento GlutaMAX al 1 % (Gibco; n.° 31331-028). Dos días después de la transfección, se añadió puromicina (Invivogen; n.° ant-pr-1) a 6 μg/ml y se cultivaron las células durante varios pases. Después de la selección inicial, se clasificaron las células con la mayor expresión de STEAP1 en la superficie celular mediante el clasificador de células BD FACSAria II (BD Biosciences) y se cultivaron para establecer clones celulares estables. Se confirmaron el nivel de expresión y la estabilidad mediante análisis FACS usando vandortuzumab e anti-IgG humano de cabra específico para Fc gamma conjugado con PerCP (Jackson ImmunoResearch, n.° 109-126-097) como anticuerpo secundario durante un período de 4 semanas.

Ejemplo 2

Generación y caracterización de variantes de secuencia basadas en vandortuzumab

Análisis de secuencia de vandortuzumab

Las modificaciones como la desamidación de asparagina, la isomerización de aspartato, la formación de succinimida y la oxidación de triptófano son degradaciones típicas de los anticuerpos recombinantes y pueden afectar tanto a la estabilidad in vitro como a las funciones biológicas in vivo. Se realizó un análisis computacional de las secuencias CDR de vandortuzumab (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 7, 8 y 9, de acuerdo con Kabat) para detectar la presencia de potenciales patrones de secuencias de aminoácidos que son propensos a la isomerización de aspartato, la desamidación de asparagina o la formación de succinimida. Además, se analizaron las regiones CDR para detectar la presencia de triptófanos que tienen el potencial de oxidarse. Como se muestra en la figura 3 , el análisis de las secuencias de vandortuzumab reveló puntos calientes potenciales en las regiones CDR de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera.

Generación de variantes de la secuencia de vandortuzumab (moléculas B-D)

Para preparar un anticuerpo anti-STEAP1 con una formación mínima de iso-aspartato y succinimida y una estabilidad óptima, se generaron varias variantes de la secuencia de vandortuzumab con una secuencia de HCDR3 modificada. En particular, se reemplazaron los residuos de aspartato en la posición 100a y 100b (numeración de acuerdo con Kabat) por glutamato ya sea individualmente o en combinación (SEQ ID NO: 4, 5 y 6) y se generaron los plásmidos resultantes (SEQ ID NO: 28, 29, 34 y 35 (mutación D100aE, Molécula B); SEQ ID N^o: 30, 31, 34 y 35 (mutación D100bE, Molécula C); SEQ ID n O: 32-35 (mutaciones D100aE/D100bE, Molécula D)) para la expresión de las moléculas de anticuerpos TCB respectivas.

Prueba de degradación química

Para confirmar que las mutaciones introducidas eliminan el punto caliente previsto en HCDR3, incrementan la estabilidad y evitan la pérdida de potencia de unión de los anticuerpos anti-STEAP1, todas las construcciones (Moléculas A-D) se dividieron en dos alícuotas, se volvieron a tamponar en His/HisCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 o en PBS, pH 7,4, respectivamente, y se incubaron a 40 °C (His/NaCl) o 37 °C (PBS). Además, se almacenó una muestra de control a -80 °C. La incubación a pH 7,4 refleja la exposición de la molécula a la situación en el plasma sanguíneo y permite sacar conclusiones sobre la estabilidad de la molécula in vivo. Por el contrario, las formulaciones de tampones con pH reducido (aquí pH 6) son más adecuadas para el almacenamiento a largo plazo de construcciones basadas en anticuerpos y las pruebas de estrés en estas condiciones son predictivas del período de validez de una molécula.

Después de un período de incubación de 28 días, se analizaron las muestras y se compararon en cuanto a la potencia de unión (concentración activa relativa) de los restos de unión a STEAP1. Este análisis se realizó indirectamente por espectrometría de masas y un ELISA basado en células.

Caracterización de las Moléculas A-D estresadas por espectrometría de masas

Para identificar la degradación de proteínas inducida por estrés en las posiciones predichas dentro de las CDR de vandortuzumab y variantes de las mismas, se realizó espectrometría de masas de las Moléculas A-D. Se desnaturalizaron 80 μg de muestras de proteínas estresadas y de referencia y se redujeron durante 1 h en 124,5 μl de Tris 100 mM, clorhidrato de guanidinio 5,6 M, TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina 10 mM (Pierce Protein Biology Products), pH 6,0 a 37 °C. Se cambió el tampón por cloruro de histidina 20 mM, TCEP 0,5 mM, pH 6,0 en columnas de desalinización Zeba Spin de 0,5 ml (Pierce Protein Biology Products). Se digirieron las muestras de proteínas durante la noche a 37 °C después de la adición de 0,05 μg de tripsina (Promega) por μg de proteína en un volumen final de 140 μl. Se detuvo la digestión mediante adición de 7 μl de solución de ácido fórmico (FA) al 10 %.

Se almacenaron las muestras digeridas a -80 °C hasta su uso. El análisis se realizó mediante UHPLC-MS/MS usando un UPLC nanoAcquity (Waters) y un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific).

Se inyectaron aproximadamente 2,4 μg de proteína de fusión digerida en 5 μl.

Se realizó la separación cromatográfica por fase inversa en una columna Acquity BEH300 C18, 1 x 150 mm, 1,7 μm, 300 A (Waters) usando un caudal de 60 μl/min. Las fases móviles A y B contenían ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en agua de grado UPLC y acetonitrilo, respectivamente. Se usó una temperatura de columna de 50 °C y se aplicó un gradiente de 1 % a 40 % de fase móvil B durante 90 min. Se usó el Orbitrap Fusion en el modo dependiente de datos. Los ajustes esenciales de EM fueron: ionización (voltaje de pulverización: 3,6 kV, tubo de transferencia de iones: 250 °C, vaporizador: 100 °C), EM completa (AGC: 2 x 105, resolución: 12 x 104, intervalo m/z: 300-2000, tiempo máximo de inyección: 100 ms); EM/EM (AGC: 1 x 104, tiempo máximo de inyección: 100 ms, anchura de aislamiento: 2 Da). Se fijó la energía de colisión normalizada en un 35 %.

Se aplicó el mapeo de péptidos para cuantificar los niveles de desamidación, isomerización y oxidación de los puntos calientes previstos (N53 (HCDR2), N97 (HCDR3), D100a (HCDR3) y W50 (LCDR2) (numeración de acuerdo con Kabat)) para las Moléculas A-D.

En los péptidos que albergan la región HCDR3, no se detectó desamidación ni formación de succinimida en la posición N97 en ninguna de las Moléculas A-D, en ninguna de las condiciones (datos no mostrados). Sin embargo, la exposición a estrés a pH 6 dio como resultado diferentes niveles de degradación del aspartato en el mismo péptido HCDR3 que también alberga el aspartato 100a del punto caliente previsto. Se detectaron diferentes niveles de formación de succinimida e iso-aspartato después de 4 semanas en His/NaCl pH 6,0 a 40 °C en los respectivos péptidos tripsínicos de las cuatro moléculas sometidas a prueba (tabla 1). Después de la exposición a estrés a pH 6,0, los niveles totales más altos se detectaron en la Molécula A. La introducción de la mutación de D100a^E100a en Molécula B, así como D100b^E100b en la Molécula C dio lugar a disminuciones significativas del nivel de succinimida. Sin embargo, la combinación de ambas mutaciones (D100aE / D100bE) (Molécula D) redujo fuertemente los niveles de succinimida hasta el 3 %, una cantidad insignificante para este largo período de exposición al estrés. Además, no se detectó iso-aspartato en la Molécula D. Los resultados indican que tanto los aspartatos (D100a y D100b) en la Molécula A como cualquiera de los aspartatos (D100a o D100b) en las Moléculas C o B contribuyen a los niveles totales de succinimida e iso-aspartato encontrados después del estrés. Además, no se detectó ninguna degradación de proteínas en absoluto en la HCDR3 de la Molécula D después de la exposición al estrés a pH 7,4, lo que confirma la integridad de esta variante de secuencia recién diseñada.

Tabla 1. Cuantificación relativa de la degradación de proteínas en HCDR3.

* Posiciones mutadas en negrita y subrayadas

El análisis del péptido que alberga la posición N53 en la cadena pesada (HCDR2) del conector de STEAP1 reveló en todas las construcciones un pequeño incremento de la desamidación de N53 después de 4 semanas en PBS, pH 7,4 a 37 °C, mientras que no se detectó ningún incremento significativo a pH 6 (tabla 2). La oxidación de W50 (LCDR2) estuvo por debajo del 2 % para todas las muestras (tabla 3). En consecuencia, no se realizaron optimizaciones de moléculas con respecto a estos supuestos puntos calientes.

Tabla 2. Cuantificación relativa de la degradación de proteínas en la posición N53 (HCDR2).

* Posición del punto caliente previsto N53 en negrita y subrayada

Tabla 3. Cuantificación relativa de la degradación de proteínas en la posición W50 (LCDR2).

* Posición del punto caliente previsto W50 en negrita y subrayada

Caracterización de la potencia de unión después del estrés usando un ELISA basado en células

Para cuantificar la reducción en la potencia de unión causada por 1 -4 semanas de estrés a pH 7,4 o 6,0, se empleó un ELISA basado en células usando células CHO-K1 que expresan STEAP1 humano de manera estable. Para este ELISA basado en células, se sembraron 10.000 células por pocillo de una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 18 h a 37 °C, CO²al 5 %. Se eliminó el sobrenadante usando un lavador automatizado (BIOTEK) y se añadieron a cada pocillo 100 μl de una serie de diluciones (10 μM a 30 nM) de construcciones de anticuerpos en medio de crecimiento. Después de 1 h de incubación a 4 °C, se vaciaron los pocillos y se añadieron 100 μl de glutaraldehído al 0,05 % en PBS durante 10 min a TA. Después de 4 lavados con PBS/Tween20 al 0,025 % (PBST), se añadieron 100 μl de HRP anti-IgG humano (Jackson) diluido 1:20.000 en tampón de bloqueo (Roche) y se incubaron las placas durante 1 h a temperatura ambiente (TA). Se lavaron los pocillos 6 veces con PBST y se generó la señal usando 100 μl de TMB por pocillo, se detuvo la reacción después de 10 minutos con 50 μl de HCl 1 M y se midió la absorbancia a 450 nm. Los datos (tabla 4 ) se expresaron como "% de unión", dividiendo la CE50 de unión de la muestra estresada por la de la muestra no tratada multiplicado por 100.

Dado que todos los anticuerpos TCB sometidos a prueba comprenden dos fracciones de unión a STEAP1 por molécula y considerando que la afinidad de la unión monovalente a STEAP1 está en el intervalo de 40-60 nM, es concebible que en este ELISA solo se puedan detectar moléculas con dos restos de unión a STEAP1 funcionales. Por el contrario, se supone que las moléculas con solo un resto de unión a STEAP1 funcional se eliminan durante las etapas de lavado descritas en este protocolo. Por lo tanto, el porcentaje acumulado de pérdida de unión para las moléculas con niveles elevados de succinimida es mayor que la degradación de proteína detectada en HCDR3 (Moléculas A-C).

Tabla 4. Cuantificación de la potencia de unión de proteínas a STEAP1 después de 28 días a 40 °C, pH 6.

Caracterización bioquímica de las variantes de anticuerpos TCB basadas en vandortuzumab (Moléculas A-D)

Para caracterizar y comparar sus propiedades bioquímicas y biofísicas, se analizaron todos los anticuerpos TCB con nuevas variantes de secuencia de anticuerpos anti-STEAP-1 (Moléculas B-D) y se compararon con el anticuerpo TCB que alberga la secuencia de vandortuzumab (Molécula A). Los resultados se resumen en la tabla 5 :

Cromatografía de interacción hidrófoba (HIC)

Se determinó la hidrofobia aparente inyectando 20 μg de muestra en una columna HIC-Ether-5PW (Tosoh) equilibrada con fosfato de sodio 25 mM, sulfato de amonio 1,5 M, pH 7,0. Se realizó la elución con un gradiente lineal de 0 a 100 % de tampón B (fosfato sódico 25 mM, pH 7,0) en 60 minutos. Se compararon los tiempos de retención con estándares de proteína con hidrofobia conocida.

Estabilidad térmica

Se prepararon las muestras a una concentración de 1 mg/ml en histidina/clorhidrato de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, se transfirieron a una placa óptica de 384 pocillos por centrifugación a través de una placa de filtro de 0,4 μm y se cubrieron con aceite de parafina. El radio hidrodinámico se mide repetidamente mediante dispersión de luz dinámica en un lector de placas DynaPro (Wyatt) mientras se calientan las muestras a una tasa de 0,05 °C/min desde 25 °C hasta 80 °C.

Cromatografía de afinidad por FcRn

Se expresó, purificó y biotiniló el FcRn como se describe (Schlothauer et al., MAbs (2013) 5(4), 576-86). Para el acoplamiento, se añadió el receptor preparado a estreptavidina-sefarosa (GE Healthcare). Se empaquetó la matriz de FcRn-sefarosa resultante en una carcasa de columna. Se equilibró la columna con ácido 2-(N-morfolina)-etanosulfónico (MES) 20 mM, NaCl 140 mM, pH 5,5 (eluyente A) a un caudal de 0,5 ml/min. Se diluyeron 30 μg de muestras de anticuerpo en una proporción de volumen de 1:1 con el eluyente A y se aplicaron a la columna de FcRn. Se lavó la columna con 5 volúmenes de columna de eluyente A, seguido de elución con un gradiente lineal de 20 a 100 % de Tris/HCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 8,8 (eluyente B) en 35 volúmenes de columna. Se realizó el análisis con un horno de columna a 25 °C. Se monitorizó el perfil de elución mediante medición continua de la absorbancia a 280 nm. Se compararon los tiempos de retención con estándares de proteína con afinidades conocidas.

Cromatografía de afinidad por heparina

Se determinó la afinidad por la heparina inyectando 30-50 μg de muestra en una columna TSKgel Heparin-5PW (Tosoh) equilibrada con Tris 50 mM, pH 7,4. Se realizó la elución con un gradiente lineal de 0 a 100 % de tampón B (Tris 50 mM, NaCl 1 M, pH 7,4 mM) en 37 minutos. Se compararon los tiempos de retención con estándares de proteína con afinidades conocidas.

No se encontraron diferencias significativas entre ninguno de los TCB con nuevas variantes de secuencia de anticuerpos anti-STEAP-1 sometidos a prueba (Moléculas B-D) y la molécula que alberga la secuencia de vandortuzumab (Molécula A) con respecto a todas las propiedades biofísicas y bioquímicas sometidas a prueba (tabla 5 ). Todas las muestras mostraron solo agregación y fragmentación marginales tras el estrés, lo que respalda que las pérdidas de actividad observadas después de la exposición al estrés a pH 6 (Moléculas A-C) se deben a la degradación química de proteínas en las posiciones identificadas en la región HCDR3.

Tabla 5. Propiedades biofísicas y bioquímicas de las variantes sometidas a prueba.

nd: no determinada

Ejemplo 3

Caracterización funcional de variantes de anticuerpos TCB anti-STEAP-1

Lisis tumoral mediada por linfocitos T, inducida por variantes de anticuerpos TCB anti-STEAP-1

Se evaluó la destrucción de linfocitos T mediada por diferentes variantes de anticuerpos TCB anti-STEAP-1 (Moléculas A-D) en células LnCAP que expresan STEAP-1. Se usaron leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) humana como células efectoras y se detectó la destrucción a las 24 h y 48 h de incubación con los anticuerpos biespecíficos. Se recogieron células diana adherentes con tripsina/EDTA, se lavaron y se sembraron en placas a una densidad de 30.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos de fondo plano. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche. Se prepararon PBMC mediante centrifugación por densidad en Histopaque de preparaciones enriquecidas de linfocitos de sangre heparinizada obtenidas de donantes humanos sanos. Se diluyó la sangre recién obtenida con PBS estéril y se colocó en una capa sobre un gradiente de Histopaque (Sigma, n.° H8889). Después de la centrifugación (450 x g, 30 minutos, temperatura ambiente), se desechó el plasma por encima de la interfase que contenía los PBMC y se transfirieron los PBMC a un nuevo tubo Falcon que se llenó posteriormente con 50 ml de PBS. Se centrifugó la mezcla (400 x g, 10 minutos, temperatura ambiente), se desechó el sobrenadante y se lavó el sedimento de PBMC dos veces con PBS estéril (etapas de centrifugación 350 x g, 10 minutos). La población de PBMC resultante se contó automáticamente (ViCell) y se almacenó en un medio RPMI1640 que contenía FCS al 10 % y L-alanil-L-glutamina al 1 % (Biochrom, K0302) a 37 °C, CO²al 5 % en incubadora celular hasta su uso posterior (no más de 24 h).

Para el ensayo de destrucción, se añadieron los anticuerpos a las concentraciones indicadas (intervalo de 0,01 μM a 1 μM por triplicado). Se añadieron PBMC a células diana a una proporción E:T final de 10:1. Se evaluó la destrucción de células diana después de 24 h y 48 h de incubación a 37 °C, CO²al 5 % por cuantificación de liberación de LDH en sobrenadantes celulares por células apoptóticas/necróticas (kit de detección de LDH, Roche Applied Science, n.° 11 644 793 001). Se logró la lisis máxima de las células diana (= 100 %) por incubación de células diana con Triton X-100 al 1 %. Lisis mínima (= 0 %) se refiere a células diana coincubadas con células efectoras sin construcción biespecífica. Los resultados después de 24 h (figura 4A) y 48 h (figura 4B) muestran que la lisis tumoral mediada por linfocitos T se induce de forma similar por las moléculas analizadas y que la modificación del conector de STEAP-1 en las Moléculas B-D no afecta negativamente la potencia de destrucción de las moléculas.

Activación de linfocitos T inducida por variantes de anticuerpos TCB anti-STEAP-1 (ensayo de activación en Jurkat-NFAT)

Se evaluó la capacidad de las variantes de anticuerpos TCB anti-STEAP-1 para inducir activación de células efectoras mediada por CD3 tras la unión simultánea a CD3 y a STEAP-1 humano en células, usando cocultivos de células diana positivas para antígenos tumorales (LnCAP, 22RV1) y células indicadoras Jurkat-NFAT (una línea celular indicadora de leucemia linfocítica aguda humana que expresa CD3 con un promotor NFAT, GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega n.° CS176501). Tras la unión simultánea de la molécula TCB al antígeno s TeAP-1 humano (expresado en células tumorales) y al antígeno CD3 (expresado en células indicadoras Jurkat-NFAT), se activa el promotor NFAT y da lugar a la expresión de luciferasa de luciérnaga activa. La intensidad de la señal de luminiscencia (obtenida tras la adición del sustrato de luciferasa) es proporcional a la intensidad de la activación y señalización de CD3. Para el ensayo se recogieron células tumorales humanas y se determinó la viabilidad usando ViCell. Se sembraron en placas 20.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos de paredes blancas y fondo plano (Greiner bio-one, n.° 655098) y se añadió los anticuerpos diluidos o el medio (para controles) (intervalo de 2,6 μM a 200 nM).

Posteriormente, se recogieron células indicadoras Jurkat-NFAT y se evaluó la viabilidad usando ViCell. Se resuspendieron las células en medio de cultivo celular y se añadieron a células tumorales para obtener una relación efector-diana (E:T) final de 5:1 y un volumen final de 100 μl por pocillo. Se incubaron las células durante 6 h a 37 °C en una estufa de incubación humidificada. Al final del tiempo de incubación, se añadieron 100 μl/pocillo de solución ONE-Glo (Promega; volumen 1:1 de ONE-Glo y medio de ensayo por pocillo) a los pocillos y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente en oscuridad. Se detectó luminiscencia usando el lector WALLAC Victor3 ELISA (PerkinElmer2030), 5 s/pocillo como tiempo de detección.

Como se muestra en la figura 5 , todas las moléculas de anticuerpo TCB anti-STEAP-1 evaluadas inducen reticulación de linfocitos T por medio de CD3 y, posteriormente, activación de linfocitos T en células LnCAP (figura 5A) y 22Rv1 (figura 5B) que expresan STEAP1. En células CHO-K1 negativas para STEAP1 (figura 5C) no se puede observar activación de linfocitos T.

Unión de variantes de anticuerpos TCB anti-STEAP-1 a células que expresan STEAP-1 y CD3

Se analizó la unión de variantes de anticuerpos TCB anti-STEAP-1 (Moléculas A-D) usando células CHO-hSTEAP1 que expresan STEAP-1 (una línea celular epitelial derivada del ovario de hámster que se transfectó para sobreexpresar de forma estable STEAP-1 humano) y células indicadoras Jurkat-NFAT que expresan CD3 (Promega, n.° CS176501).

En resumen, se recogieron las células CHO-hSTEAP1 adherentes usando tampón de disociación celular (Gibco, n.° 13151014), se contaron, se comprobó la viabilidad y se resuspendieron a 2 x 106 células/ml en tampón FACS (100 μl de PBS, BSA al 0,1 %). También se recogieron las células en suspensión Jurkat, se contaron y se comprobó su viabilidad. Se incubaron 100 μl de suspensión celular (que contenía 0,2 x 106 células) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo durante 30 min a 4 °C con concentraciones crecientes de anticuerpos TCB anti-STEAP-1 (31 μM a 1000 nM), se lavaron dos veces con PBS frío que contiene BSA al 0,1 % (tampón FACS), se reincubaron durante 30 min más a 4 °C con anticuerpo secundario anti-IgG humana específico del fragmento F^cyde cabra AffiniPure F(ab')₂conjugado con Alexa Fluor 647 prediluido 1:50 (Jackson ImmunoResearch Lab, Alexa Fluor 647, n.° 109-606-008, diluciones en tampón FACS) y se lavó dos veces con PBS frío con BSA al 0,1 %.

Se resuspendieron las células teñidas en 100 μl de tampón FACS que contenía paraformaldehído al 2 % y se incubaron durante 30 min a 4 °C para fijar la tinción. Finalmente, se centrifugaron las células durante 4 min a 350 x g y 4 °C, se descartaron los sobrenadantes y se resuspendieron los sedimentos celulares en 200 μl de tampón FACS. Se analizó la tinción mediante FACS usando un FACS Canto II (software FACS Diva). Se obtuvieron las curvas de unión usando GraphPadPrism6 (figura 6A, unión a células ACHO-hSTEAP1, figura 6B, unión a células Jurkat).

Como se muestra en la figura 6 , todas las moléculas de anticuerpo TCB anti-STEAP-1 evaluadas muestran una unión dependiente de la concentración a células CHO humanas que expresan STEAP-1 humano (figura 6A) y a CD3 humano expresado en células Jurkat NFAT (figura 6B), lo que indica que la modificación del conector de STEAP-1 en las Moléculas B-D no afecta negativamente a su unión a STEAP-1 en las células.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une a STEAP-1, en el que el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, una HCDR2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N^o: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, una LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 9.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la VH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y la VL comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo de una molécula Fv, una molécula scFv, una molécula Fab y una molécula F(ab')².

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo es una IgG, en particular un anticuerpo IgG¹.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico.

6. Una molécula de unión a antígeno biespecífica, que comprende

(a) un primer resto de unión a antígeno que se une a un primer antígeno,

en el que el primer antígeno es STEAP-1 y el primer resto de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 de SEQ ID NO: 1, una H^cDR2 de SEQ ID NO: 2 y una HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una región determinante de complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 de SEQ ID NO: 7, una LCDR2 de SEQ ID NO: 8 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 9, y

(b) un segundo resto de unión a antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno.

7. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 6, en la que la VH del primer resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 y la VL del primer resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

8. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 6 o 7, en la que el segundo antígeno es CD3, en particular CD3s.

9. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 9, en la que el segundo resto de unión a antígeno comprende una VH que comprende una HCDR1 de SEQ ID NO: 15, una HCDR2 de SEQ ID NO: 16 y una HCDR3 de SEQ ID NO: 17, y una VL que comprende una LCDR1 de SEQ ID NO: 18, una LCDR2 de SEQ ⁱD NO: 19 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 20; y opcionalmente la VH del segundo resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, y la VL del segundo resto de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

10. La molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que

(i) el primer y/o el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab;

(ii) el segundo resto de unión a antígeno es una molécula Fab en la que los dominios variables VL y VH o los dominios constantes CL y CH1, en particular los dominios variables VL y VH, de la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab se reemplazan entre sí; y/o

(iii) el primer resto de unión a antígeno es una molécula Fab en la que, en el dominio constante CL, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H), numeración de acuerdo con Kabat, y el aminoácido en la posición 123 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H), numeración de acuerdo con Kabat, y en el dominio constante CH1, el aminoácido en la posición 147 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D), numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat, y el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D), numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat.

11. La molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en la que (i) el primer y el segundo resto de unión a antígeno se fusionan entre sí, opcionalmente por medio de un conector peptídico; y/o

(ii) el primer y el segundo resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab y (a) el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno o bien (b) el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno.

12. La molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, que comprende un tercer resto de unión a antígeno, en la que opcionalmente el tercer resto de unión a antígeno es idéntico al primer resto de unión a antígeno.

13. La molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, que comprende un dominio Fc compuesto de una primera y una segunda subunidad; opcionalmente

en la que el primero, el segundo y, cuando está presente, el tercer resto de unión a antígeno son cada uno una molécula Fab;

y en la que (i) el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab a extremo N de la cadena pesada de Fab del primer resto de unión a antígeno y el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc, o bien (ii) el primer resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la cadena pesada de Fab del segundo resto de unión a antígeno y el segundo resto de unión a antígeno se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la primera subunidad del dominio Fc; y en la que el tercer resto de unión a antígeno, cuando está presente, se fusiona en el extremo C de la cadena pesada de Fab al extremo N de la segunda subunidad del dominio Fc.

14. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 13, en la que

(i) el dominio Fc es un dominio Fc de IgG, en particular de IgG¹;

(ii) el dominio Fc es un dominio Fc humano;

(iii) un residuo aminoacídico del dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que se puede colocar en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y un residuo aminoacídico del dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que se puede colocar la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad; y/o

(iv) el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc y/o la función efectora.

15. Uno o más polinucleótidos aislados que codifican el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. Una célula huésped que comprende el/los polinucleótido(s) de la reivindicación 15.

17. Un procedimiento de producción de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica que se une a STEAP-1, que comprende las etapas de a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 16 en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica y b) opcionalmente recuperar el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica.

18. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. El anticuerpo o molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o la composición farmacéutica de la reivindicación 18

(i) para su uso como un medicamento;

(ii) para su uso en el tratamiento de una enfermedad; o

(iii) para su uso en el tratamiento de una enfermedad, en el que la enfermedad es cáncer.