ES2959413T3 - Anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 citotóxico y su uso en el tratamiento o prevención del rechazo de trasplante de órganos y enfermedades autoinmunitarias - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una molécula que se une a la proteína LAG-3 y que causa el agotamiento de las células T activadas por LAG-3, particularmente dicha molécula es un anticuerpo monoclonal citotóxico anti-LAG-3 o un fragmento del mismo. También se refiere a un método para tratar o prevenir el rechazo de trasplantes de órganos o enfermedades autoinmunitarias en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 citotóxico y su uso en el tratamiento o prevención del rechazo de trasplante de órganos y enfermedades autoinmunitarias

I- Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la inmunoterapia. Más específicamente, se refiere al tratamiento o prevención del rechazo de trasplante de órganos o para tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. La invención se refiere a anticuerpos anti-LAG-3 citotóxicos o fragmentos de los mismos que se unen a la proteína LAG-3 y provocan el agotamiento de células T activadas LAG-3+.

II- Antecedentes de la invención

El gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3, CD223) se aumenta de forma regulada durante las primeras etapas de la activación de células T. La presente invención se basa en el análisis de los efectos de anticuerpos citotóxicos contra LAG-3 en rechazo agudo de aloinjerto cardíaco (estudios en animalesin vivo)y en experimentosin vitrodonde los anticuerpos monoclonales LAG-3 seleccionados son eficientes a dosis bajas (< 0,1 gg/ml) en el agotamiento de células T efectoras activadas LAG-3+.

El agotamiento selectivo de los linfocitos T activados puede representar un tratamiento de inducción inmunosupresor capaz de dar por resultado el desarrollo de células reguladoras que apoyan una supervivencia a largo plazo de órganos alogénicos en ratones y primates (1) . Esto en realidad se ha demostrado con anticuerpos anti-CD40L que agotan las células T activadasin vivoa través de un mecanismo dependiente de Fc (2) , Sin embargo, los anticuerpos anti-CD40L también se dirigen a las plaquetas activadas en humanos y afectan la estabilidad de los trombos arteriales (3) . Por lo tanto, el desarrollo de anticuerpos monoclonales contra otras moléculas específicas para activación de células T ha catalizado los intentos de lograr inmunosupresión. Una de estas moléculas es LAG-3, que involucra a clase II en células dendríticas (DC) con una alta afinidad, que permite que las DC se activen(4-6).La proteína LAG-3 se expresain vivoen linfocitos CD4 y CD8+ activados que residen en tejidos u órganos linfoides secundarios inflamados pero no en bazo, timo o sangre (7). Además, LAG-3 puede funcionar como un regulador negativo de las células T CD4 y CD8 humanas activadas al inhibir los eventos tempranos en la activación primaria (8).

WO 2004/078928 divulga métodos para la mejora de 10 la respuesta de células T reguladoras, por ejemplo, al incrementar el número de células CD223+ en una población de células T.

Monk et al, Nature Medicine, vol. 9, no. 10, 14 de septiembre de 2003 divulga el agotamiento de células T activadas por anticuerpos anti-CD40L.

Kisielow et al, European Journal of Immunology, vol. 35, no. 7, 1 Julio 2005, páginas 2081-2088 divulga que la expresión de LAG-3 en las células B se induce por las células T.

III- Breve descripción de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 citotóxico o fragmento del mismo para uso en el tratamiento o prevención del rechazo de trasplante de órganos o tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, donde este anticuerpo o fragmento del mismo comprende un fragmento Fc de subclase IgG1 o IgM humana o IgG2a murina y un fragmento Fab que se une a la proteína LAG-3, y además donde el anticuerpo o fragmento del mismo provoca el agotamiento de células T activadas LAG-3+ mediante citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).

Los anticuerpos y fragmentos de los mismos de acuerdo con la presente invención se unen a la proteína LAG-3 y provocan agotamiento de células T activadas LAG-3+. Este agotamiento se puede medir por cambios en los números de linfocitos de sangre periférica.

La presente invención también proporciona un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 citotóxico o fragmento del mismo para uso de acuerdo con la invención, donde este anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo es capaz de provocar el agotamiento de más del 30 %, preferentemente más del 50 % de células T activadas LAG-3+.

Además, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 citotóxico o fragmento del mismo para uso de acuerdo con la invención, donde el anticuerpo o fragmento del mismo donde el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo exhibe (i) más de 50 % de la actividad de CDC máxima a una concentración de mAb de menos de 0,1 gg/ml o (ii) más de 50 % de la actividad de ADCC máxima a una concentración de mAb de menos de 0,1 gg/ml. El alcance de la invención se define por las reivindicaciones anexas.

Cualquier referencia en la descripción de los métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usarse en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

IV- Descripción de las figuras

Figura 1: Expresión de ARNm de LAG-3 en aloinjerto cardíaco (A), en el bazo (B) y en ganglios linfáticos (C) . La expresión de ARNm de LAG-3 en injertos de corazón en el día 5 se midió por RT-PCR cuantitativa y se comparó con la expresión de transcritos HPRT de mantenimiento. Rechazo: aloinjerto sin tratamiento. Singénico: isoinjerto. Tolerante: aloinjerto en receptores que reciben un tratamiento tolerogénico (anticuerpos CsA+anti-CD28). *: p < 0,05 para singénico y tolerante versus rechazo. ;;Figura 2: Caracterización de anticuerpos anti-LAG-3 en un ensayo de citotoxicidad dependiente de complemento. Las células diana estimuladas con ConA se etiquetaron con 51Cr y se mezclaron con complemento de conejo y suero anti-LAG-3 (línea completa) o preinmunitario (línea punteada) a la dilución indicada. El % de actividad citotóxica se calcula como sigue: (CPM del ensayo - liberación espontánea de CPM)/CPM máxima liberada obtenida después de la lisis celular. ;Figura 3: Actividad de agotamientoin vitrode anticuerpos anti-LAG-3. Las células T del bazo se activaron durante 48 h con Con A para inducir la expresión de LAG-3 y se etiquetaron con CFSE. 105 células se inyectaron i.v. a receptores que se habían irradiado (4,5 Gy) 3 días antes. Veinticuatro horas después de la inyección, los receptores se sacrificaron y la presencia de células CFSE+ en los compartimentos CD4+ y CD8 del bazo se analizó por citometría de flujo. ;;Figura 4: Supervivencia de injerto de corazón después de la administración de anticuerpos anti-LAG-3. Los receptores de Lew.1A de corazones Lew.1W completamente alogénicos (desajuste de clase I y II) se trataron por inyecciones en los días 0 y 3 de 200 pl (línea punteada) o 600 pl (línea completa) de suero anti-LAG-3 de conejo o de 600 pl de suero preinmunitario (línea punteada). La supervivencia de injerto se evaluó por evaluación diaria de latidos del corazón. P < 0,002 para 600 pl de suero anti-LAG-3 de conejo versus suero preinmunitario. ;;Figura 5: Análisis de células infiltrantes de injerto (GIC). Las GIC se extrajeron de aloinjertos cardíacos el día 5 de receptores tratados con control o tratados con anticuerpos anti-LAG-3. Las células se contaron y se analizaron por citometría de flujo para la expresión de LAG-3. Barras blancas: número total de GIC. Barras negras: GIC LAG-3+ medidas por citometría de flujo (p < 0,01). El ARN total también se extrajo de GIC y el mensajero para INFy se cuantificó por qPCR, con respecto al nivel de expresión de HPRT (barras discontinuas; p < 0,05). ;;Figura 6: Comparación de la unión de A9H12 con el mAb 17B4 específico de LAG-3 de referencia en células LAG-3+ CHO y células T humanas activadas. ;;A)Las CHO transfectadas con hLAG-3 se disociaron del plástico de cultivo usando amortiguador Versene que contiene agente quelante de cationes, se incubaron con las concentraciones indicadas de mAb A9H12 o 17B4 durante 30 min a 4 °C, se lavaron y entonces se incubaron con un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG+M (H+L) de ratón conjugado con FITC (5 pg/ml, Coulter) durante 30 minutos a 4 °C. Después del lavado, las células se analizaron por citometría de flujo usando un FACSCanto (BD Biosciences) y los medios de intensidad de fluorescencia se graficaron como una función de la concentración de anticuerpo. ;;B) Se estimularon PBMC de un voluntario sano durante 2 días con SEB (1 pg/ml, Sigma Aldrich) para inducir la expresión de LAG-3 en células T. Las PBMC se tiñeron como anteriormente. Los datos representan un porcentaje ponderado, calculado como el porcentaje de células LAG-3+ en PBMC x media de la intensidad de fluorescencia de las células LAG-3+, graficado como una función de la concentración de anticuerpo. ;;Figura 7: Citotoxicidad dependiente de complemento inducida por mAb A9H12 LAG-3. ;A)Las células CHO transfectadas con hLAG-3 y tipo silvestre se etiquetaron con mAb anti-LAG-3 conjugado con FITC (17B4) y la expresión de LAG-3 en la superficie celular se analizó por citometría de flujo usando un FACSCanto. Las gráficas de histograma representan la intensidad de fluorescencia media de CHO wt (gris) y CHO LAG-3+ (oscuro).B)Las células CHO transfectadas con hLAG-3 y wt se lavaron en medio completo (MEM complementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10 %, FCS) y se incubaron con 0,1 pg/ml de mAb A9H12 lAG-3 o mAb de control de isotipo mIgG2a (Southern Biotechnologies) en medio completo durante 30 min a 4 °C. Las células entonces se lavaron y se incubaron en medio completo (-Complemento) o en MEM suplementado con 10 % de suero de conejo recién resuspendido (Cerdalane Inc.) (+Complemento) durante 1 hora a 37 °C. Después del lavado, las células se tiñeron con 7-AAD (Coulter Inc.) durante 15 minutos a temperatura ambiente y se analizaron inmediatamente por citometría de flujo para determinar el porcentaje de células positivas para 7-AAD que corresponden a células muertas. Los datos representan el porcentaje de células muertas en cada condición en células CHO wt y transfectadas con hLAG-3 como se indica. C) Las células CHO LAG-3+ se incubaron con las concentraciones indicadas de mAb A9H12 LAG-3 durante 30 min a 4 °C y entonces se incubaron con MEM complementado con suero de conejo al 25 % durante 1 hora a 37 °C. Después del lavado, las células se tiñeron con 7-AAD (Coulter Inc.) y se analizaron por citometría de flujo. El porcentaje de citotoxicidad específica se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula. ;;(Muerte de muestra - Muerte espontánea) x 100 ;(Muerte Máxima - Muerte Espontánea) ;donde Muerte de muestra es el porcentaje de células positivas para 7-AAD en cada condición, Muerte espontánea, el porcentaje de células positivas para 7-AAD sin mAb y Muerte máxima, el porcentaje de células positivas para 7-AAD con 10 pg/ml de mAb. ;D) Las células CHO LAG-3+ se incubaron con 0,1 pg/ml de mAb A9H12, 17B4 o 31G11 LAG-3 o con sus controles de isotipo correspondientes (IgG2a, IgG1 o IgM, respectivamente) durante 30 min a 4 °C y entonces se incubaron con MEM complementado con suero de conejo al 25 % durante 1 hora a 37 °C. La citotoxicidad específica se determinó como anteriormente con una muerte máxima que corresponde a 10 pg/ml de A9H12 (panel izquierdo) y 0,1 pg/ml de A9H12 (panel derecho) . ;E) Las PBMC se estimularon con SEB (1 pg/ml) para inducir la expresión de LAG-3 en células T y entonces se usaron como células diana en el ensayo CDC en la presencia de mAb LAG-3 A9H12 o 31G11 o sus controles de isotipo. Después de teñir las células con CD3, CD4, CD8, CD25 y 17B4 conjugados con fluorocromo, se analizó el porcentaje de células positivas para 7-AAD en las subpoblaciones de células T indicadas. Los datos representan el porcentaje de células muertas en cada población (con muerte espontánea en la ausencia de mAb que se resta). ;;Figura 8: Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos inducida por mAb A9H12 LAG-3 ;A) Las células efectoras (PBMC) se estimularon con IL-2 (100 Ul/ml, BD Biosciences) durante 1 día. Las células diana (células CHO transfectadas conhLAG-3)se etiquetaron con CFSE (un tinte vital fluorescente) y se incubaron con 1 pg/ml de A9H12, mIgG2a, 17B4 o mlgGl durante 20 min a temperatura ambiente. Las células efectoras y células diana entonces se mezclaron en las relaciones E:T indicadas (E:T, efector:diana) y se incubaron durante 16 horas a 37 °C. Las células no adherentes y adherentes se recolectaron usando el reactivo Versene, se tiñeron con 7-AAD y se analizaron inmediatamente por citometría de flujo para determinar el porcentaje de células positivas para 7-AAD en la población positiva para CFSE. Los datos representan el porcentaje de células muertas, con la muerte celular no específica en la presencia del control de isotipo que se resta. ;B) Las células diana CHO LAG-3+ o tipo silvestre etiquetadas con CFSE se incubaron con las concentraciones indicadas de A9H12 o mIgG2a y se adicionaron PBMC estimuladas con IL-2 a una relación E:T 50:1 y se incubaron durante 16 horas a 37 °C. La muerte celular se analizó como anteriormente y los datos representan el porcentaje de células muertas en células positivas para CFSE en la presencia de A9H12 o su mAb de control de IgG2a coincidente con isotipo. ;;Figura 9: Incidencia de artritis (porcentaje de ratones que desarrollaron CIA) ;Los ratones macho DBA/1 (n = 22) se inyectaron i.d. con colágeno bovino tipo II (200 pg) emulsionado en CFA que contiene 250 pg deM. tuberculosis.;;Figura 10: Construcción del anticuerpo terapéutico IMP731 quimérico. ;;Figura 11: Plásmidos de expresión para las cadenas ligera (panel A) y pesada (panel B) IMP731. ;;Figura 12: Construcción de plásmido bi-cistrónico final usada para la transfección estable de células CHO. ;;Figura 13: Unión de IMP731 en células CHO LAG-3+ y células T humanas activadas ;A) Las CHO transfectadas con hLAG-3 se disociaron del plástico de cultivo usando amortiguador Versene que contiene agente quelante de cationes, se incubaron con las concentraciones indicadas de Ab IMP731 o su control de isotipo hlgG1 (Chemicon) durante 30 min a 4 °C, se lavaron y entonces se incubaron con un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG1 humana F(ab)'2 conjugado con FITC (5 pg/ml, SBA) durante 30 minutos a 4 °C. Después del lavado, las células se analizaron por citometría de flujo usando un FACSCanto (BD Biosciences) y los medios de intensidad de fluorescencia se graficaron como una función de la concentración de anticuerpo. ;B) Se estimularon PBMC de un voluntario sano durante 2 días con SEB (1 pg/ml, Sigma Aldrich) para inducir la expresión de LAG-3 en células T. Las PBMC se tiñeron como anteriormente. Los datos representan un porcentaje ponderado, calculado como el porcentaje de células LAG-3+ en PBMC x media de la intensidad de fluorescencia de las células LAG-3+, graficado como una función de la concentración de anticuerpo. ;;Figura 14: Citotoxicidad dependiente de complemento inducida por mAb IMP731 LAG-3 ;las células CHO transfectadas con hLAG-3 se incubaron con 1 pg/ml de Ab IMP731 o mAb de control de isotipo hlgGl (Chemicon) en medio completo (MEM complementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10 %, FCS) durante 30 min a 4 °C. Las células entonces se lavaron y se incubaron en medio completo (sin Complemento) o en MEM complementado con 25 % de suero de conejo recién resuspendido (Cerdalane Inc.) (con Complemento) durante 1 hora a 37 °C. Después del lavado, las células se tiñeron con 7-AAD (BD Biosciences) durante 15 minutos a temperatura ambiente y se analizaron inmediatamente por citometría de flujo para determinar el porcentaje de células positivas para 7-AAD que corresponden a células muertas. Los datos representan el porcentaje de células muertas en cada condición como se indica. ;;Figura 15: Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos inducida por IMP731. ;A) Las células efectoras (PBMC) se estimularon con IL-2 (100 UI/ml, BD Biosciences) durante 1 día. Las células diana (células CHO transfectadas conhLAG-3)se etiquetaron con CFSE (un tinte vital fluorescente) y se incubaron con 1 pg/ml de IMP731 o hIgGI durante 10 min a temperatura ambiente. Las células efectoras y células diana entonces se mezclaron en las relaciones E:T indicadas (E:T, efector:diana) y se incubaron durante 16 horas a 37 °C. Las células se tiñeron con 7-AAD y se analizaron inmediatamente por citometría de flujo para determinar el porcentaje de células positivas para 7-AAD en la población positiva para CFSE. Los datos representan el porcentaje de células muertas. ;B) Las células diana CHO LAG-3+ etiquetadas con CFSE se incubaron con las concentraciones indicadas de IMP731 o hlgGl y se adicionaron PBMC estimuladas con IL-2 a una relación E:T 50:1 y se incubaron durante 16 horas a 37 °C. La muerte celular se analizó como anteriormente en la población positiva para CFSE. El porcentaje de citotoxicidad específica, calculado de acuerdo con la siguiente fórmula. ;;(Muerte de muestra - Muerte espontánea) x 100 ;(Muerte Máxima - Muerte Espontánea) ;;donde Muerte de muestra es el porcentaje de células positivas para 7-AAD en cada condición, Muerte espontánea, el porcentaje de células positivas para 7-AAD sin Ab y Muerte máxima, el porcentaje de células positivas para 7-AAD con 1 pg/ml de IMP731 ;C) Las células efectoras (PBMC) se estimularon con IL-2 (100 UI/ml, BD Biosciences) durante 1 día. Las células diana (células CHO hLAG-3+ o células CHO hLAG-3) se etiquetaron con CFSE (un tinte vital fluorescente) y se incubaron con 1 pg/ml de IMP731 o hIgG1 durante 10 min a temperatura ambiente. Las células efectoras y células diana entonces se mezclaron en las relaciones E:T indicadas (E:T, efector:diana) y se incubaron durante 16 horas a 37 °C. Las células se tiñeron con 7-AAD y se analizaron inmediatamente por citometría de flujo para determinar el porcentaje de células positivas para 7-AAD en la población positiva para CFSE. Los datos representan el porcentaje de células muertas. ;V - Descripción detallada ;;En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 citotóxico o fragmento del mismo para uso en el tratamiento o prevención del rechazo de trasplante de órganos o tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, donde este anticuerpo o fragmento del mismo comprende un fragmento Fc de subclase IgG1 o IgM humana o IgG2a murina y un fragmento Fab que se une a la proteína LAG-3, y además donde el anticuerpo o fragmento del mismo provoca el agotamiento de células T activadas LAG-3+ mediante citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). ;;Los anticuerpos y fragmentos de los mismos de acuerdo con la presente invención se unen a la proteína LAG-3 y provocan agotamiento de células T activadas LAG-3+. Este agotamiento se puede medir por cambios en los números de linfocitos de sangre periférica. ;;En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 citotóxico o fragmento del mismo para uso de acuerdo con la invención, donde este anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo es capaz de provocar el agotamiento de más del 30 %, preferentemente más del 50 % de células T activadas LAG-3+. ;;En otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 citotóxico o fragmento del mismo para uso de acuerdo con la invención, donde el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo exhibe (i) más de 50 % de la actividad de GDC máxima a una concentración de mAb de menos de 0,1 pg/ml o (ii) más de 50 % de la actividad de ADCC máxima a una concentración de mAb de menos de 0,1 pg/ml. ;;El gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3, CD223) se aumenta de forma regulada durante las primeras etapas de la activación de células T. La presente invención se basa en el análisis de los efectos de anticuerpos citotóxicos contra LAG-3 en rechazo agudo de aloinjerto cardíaco y en artritis reumatoide (estudios en animales in vivo) y en experimentos in vitro donde los anticuerpos monoclonales LAG-3 seleccionados son eficientes a dosis bajas (< 0,1 pg/ml) en el agotamiento de células T efectoras activadas LAG-3+. ;;El trasplante alogénico de corazón heterotópico completamente vascularizado se realizó en ratas a través de una barrera de desajuste de MHC completo (LEW.1W en LEW.1A). Los receptores recibieron dos inyecciones (día 0 y 3) de anticuerpos dirigidos al dominio extrabucle de LAG-3 o anticuerpos de control. Se probaron la supervivencia de injerto, histología, transcritos de ARNm y alorreactividad de los linfocitos. ;;En primer lugar, se observó que las moléculas de ARNm de LAG-3 se acumulan en aloinjertos cardíacos que experimentan rechazo, pero no en órganos linfoides periféricos. La administración de anticuerpos anti-LAG-3 inhibió la infiltración de injerto por células mononucleares efectoras y prolongó la supervivencia de aloinjerto de 6 días en receptores tratados con anticuerpos de control a una mediana de 27 días. ;;Se encontró que las células que expresan LAG-3 se infiltran en aloinjertos de corazón rechazados y que dirigirse a LAG-3 usando anticuerpos citotóxicos como monoterapia de inducción retrasa el rechazo agudo al reducir la infiltración de injerto por células T y monocitos. ;;Los experimentos que muestran que los cursos cortos de terapia con anticuerpos CD40L pueden lograr supervivencia de injerto a largo plazo en ratones y primates se han interpretado inicialmente como un efecto del bloqueo de coestimulación. Sin embargo, Monk et al. (2) mostraron que gran parte de la eficacia de la terapia anti-CD40L no se deriva del bloqueo de coestimulación, sino de la destrucción de células T activadas. El resultado es una purga selectiva de células T potencialmente agresivas que han experimentado antígeno. ;;La artritis inducida por colágeno (CIA) es un modelo animal bien descrito para artritis reumatoide. La artritis inducida por colágeno es una enfermedad autoinmunitaria inducible en ratas, ratones y primates por inmunización con colágeno heterólogo tipo II. La patología articular resultante se asemeja a la artritis reumatoide con proliferación sinovial, infiltración celular, erosión de cartílago y resorción ósea en los casos más severos (12). ;;Usando protocolos de inmunización particulares, los primeros estudios han establecido una jerarquía de capacidad de respuesta a CIA vinculada al haplotipo H-2, con H-2A (por ejemplo, ratones DBA/1) que es la mayoría y H-2b (por ejemplo, ratones C57BL/6) entre las cepas menos sensibles. Sin embargo, algunos estudios han mostrado que la capacidad de respuesta a CIA puede estar menos restringida por el MHC clase II de lo que se pensaba anteriormente y puede ser tan dependiente de las condiciones de inmunización (13) . La variedad de colágeno tipo II (CII) de diferentes especies y la preparación de adyuvante completo de Freund (CFA) con diferentes concentraciones deMycobacterium tuberculosisfueron parámetros importantes para el desarrollo de artritis. Inglis et al. han mostrado que CII de pollo, pero no bovino, fue capaz de inducir la enfermedad en ratones C57BL/6, con una incidencia de 50 % a 75 %. Esto contrasta con los ratones DBA/1, en los cuales todos los CII bovinos, de ratón y de pollo indujeron enfermedad, con una incidencia de 80 % a 100 %. El fenotipo de artritis fue más leve en ratones C57BL/6 que en ratones DBA/1, con menos hinchazón y un incremento más gradual en la puntuación clínica (14) . Además, los ratones machos se prefieren con frecuencia para los estudios de CIA, ya que la incidencia de artritis es algo mayor en ratones machos que en hembras. ;;En ratones, CIA se induce por una inyección i.d. de colágeno tipo II (CII) en la presencia de CFA, usualmente seguida de una inyección de refuerzo i.p. de CII, sin adyuvante, 21 días después. ;;Sin embargo, se han reportado variaciones para casi todos los aspectos del procedimiento de inmunización e incluso en la cepa DBA/1 altamente susceptible el tiempo de inicio, severidad e incidencia de CIA puede ser variable (13, 15). ;Ya se han descrito anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, como los mAb de TNFa en artritis reumatoide. Por definición, LAG-3 (gen 3 de activación de linfocitos) es un marcador para células T efectoras recientemente activadas. El agotamiento de estas células T LAG-3+ efectoras conducirá a una inmunosupresión dirigida (es decir, solo se suprimen las células T activadas, no todas las células T como con los corticoides o ciclosporina). Esta inmunosupresión muy específica debe conducir a índices terapéuticos más altos en comparación con los agentes inmunosupresores clásicos o con anticuerpos terapéuticos (por ejemplo, Humira, Remicade) o receptores solubles (por ejemplo, Enbrel) que bloquean TNFa. Por lo tanto, LAG-3 es un objetivo prometedor disponible para un enfoque de mAb de agotamiento terapéutico para eliminar células T efectoras activadas auto-reactivas. ;;Los anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 citotóxicos o fragmentos de los mismos para uso de acuerdo con la presente invención provocan agotamiento de más de 30 %, preferentemente más de 50 % de células T activadas LAG-3+. ;;Los anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 citotóxicos o fragmentos de los mismos para uso de acuerdo con la invención comprenden anticuerpos con una IgG2a murina o una región Fc de IgG 1 o IgM humana que proporciona fuertes propiedades de CDC o ADCC. ;;Los anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 citotóxicos o fragmentos de los mismos para uso de acuerdo con la presente invención exhiben (i) más de 50 % de la actividad de CDC máxima a una concentración de mAb de menos de 0,1 gg/ml y/o (ii) más de 50 % de la actividad de ADCC máxima a una concentración de mAb de menos de 0,1 gg/ml. ;;Los anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 citotóxicos para uso de acuerdo con la presente invención, que provocan agotamiento de células T activadas LAG-3+, se pueden producir por métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. ;;Los anticuerpos generados contra polipéptidos CD223 se pueden obtener al administrar, en particular por inyección directa, polipéptidos CD223 a un animal, preferentemente un no humano. El anticuerpo obtenido de esta forma se unirá entonces a los polipéptidos CD223 en sí. De esta manera, incluso una secuencia que codifica para solo un fragmento del polipéptido CD223 se puede usar para generar anticuerpos que se unen al polipéptido CD223 nativo completo. ;;Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas de células continuas. Los ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (9), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (10). ;;Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena individual (Patente de Estados Unidos Núm. ;4,946,778) se pueden usar fácilmente para producir anticuerpos de cadena individual contra polipéptidos CD223. Además, se pueden usar ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados contra polipéptidos CD223 inmunogénicos. ;Un primer anticuerpo monoclonal adecuado para uso de acuerdo con la presente invención, llamado A9H12, se produce por el hibridoma depositado en la CNCM el 27 de abril de 2007 bajo el número de acceso CNCM I-3755. ;;Un segundo anticuerpo monoclonal adecuado para uso de acuerdo con la presente invención, llamado 31G11, se produce por el hibridoma depositado en la CNCM el 27 de abril de 2007 bajo el número de acceso CNCM I-3756. ;;La invención se refiere a anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 citotóxicos o fragmentos de los mismos para uso en el tratamiento o prevención del rechazo de trasplante de órganos o para tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, donde este anticuerpo o fragmento del mismo comprende un fragmento Fc de subclase IgG1 o IgM humana o IgG2a murina y un fragmento Fab que se une a la proteína LAG-3, y además donde el anticuerpo o fragmento del mismo provoca el agotamiento de células T activadas LAG-3+ mediante citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). (ADCC), como se define en las reivindicaciones anexas. ;;El rechazo de trasplante de órganos se refiere al injerto de un órgano en un huésped alogénico. Puede ser útil para tratar organismos que padecen condiciones que por como resultado una población de células T anormalmente alta o actividad de células T perjudicial, por ejemplo, rechazo de injerto mediado por células T hospedadoras, enfermedad de injerto versus hospedador y enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias mediadas por células T tal como artritis reumatoide, diabetes tipo 1, esclerosis muscular, etc. ;;Las enfermedades autoinmunitarias son enfermedades en las cuales el propio sistema inmunitario del sujeto reacciona contra las células del sujeto. Las enfermedades autoinmunitarias que son susceptibles a los tratamientos de acuerdo con la presente invención incluyen anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, síndrome de Goodpasture, pénfigo vulgar, fiebre reumática aguda, crioglobulinemia esencial mixta, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus dependiente de insulina, artritis reumatoide, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, miastenia gravis y esclerosis múltiple. ;;Ejemplo 1: Células LAG-3 positivas dirigidas con anticuerpos citotóxicos ;;Materiales y métodos ;;Animales y trasplantes ;;Las ratas congénicas macho Lewis.1W (LEW.1W, haplotipo RT1U) y Lewis.1A (LEW. 1A, haplotipo RT1a) de ocho a 12 semanas de edad (Centre d'Elevage Janvier, Le Genest-Saint-Isle, Francia), difirieron en toda su región de MHC. El trasplante de corazón heterotópico LEW.1W se realizó como se describió previamente (11) . ;;La supervivencia de injerto se evaluó por palpación a través de la pared abdominal. ;;Anticuerpos anti-LAG-3 ;;Un péptido sintético que corresponde al dominio extrabucle de la proteína LAG-3 de rata (No. de acceso NCBI DQ438937; péptido DQPASIPALDLLQGMPSTRRHPPHR) se enlazó a ovoalbúmina y se usó para inmunizar dos conejos. Los sueros preinmunitarios e inmunitarios, recolectados el día 63 después de la 4a inmunización, se analizaron por ELISA en inmunógeno y péptido y por citometría de flujo en células de bazo de rata activadas con Con-A. Los sueros preinmunitarios fueron negativos en ambos ensayos. Los sueros inmunitarios mezclados presentaron un título (dilución para señal de 50 %) de 1/60000 por ELISA y de 1/1000 por FACS, y presentaron una especificidad para células T activadas. ;;Ensayo de citotoxicidad dependiente de complemento ;;La citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por complemento se probó usando sueros de conejo contra células T Lewis 1A en un ensayo de liberación de 51Cr. Un total de 2x106 células T Lewis 1A se etiquetaron con 30 pCi de 51Cr durante 90 min a 37 °C en RPMI (GIBCO) con FCS al 10 %. Después de tres lavados, las células T se distribuyeron en 96 placas con fondo en V y se incubaron con complemento de conejo y diluciones en serie de suero de conejo inactivado por calor. Después de 4 h a 37 °C, se midió la liberación de 51Cr en los sobrenadantes usando un contador de centelleo. La citotoxicidad específica se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: (liberación experimental - liberación espontánea) x 100/(liberación máxima - liberación espontánea). ;;Citotoxicidad inducida por anticuerposin vivo;;La actividad citotóxica de anticuerpos anti-LAG-3 contra células LAG-3+ se evaluóin vivo.Los esplenocitos LEW.1W activados con ConA (48 h) se etiquetaron con CFSE y se transfirieron (108 células) a receptores LEW.1 A irradiados (4,5 Gy, día -3), junto con anticuerpos anti-LAG-3. El día 1, los receptores se sacrificaron y la presencia de células positivas para CFSE se evaluó por citometría de flujo en órganos linfoides y en la sangre. ;;Inmunotinción ;;Las muestras de injerto se incrustaron en Tissue Tek (OCT Compound, Torrance, CA, EUA), se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido, se cortaron en secciones de 5 gm y se fijaron en acetona. La actividad de biotina endógena se bloqueó usando el sistema de bloqueo de biotina Dako (Dako, Trappes, Francia). Las secciones entonces se etiquetaron por una revelación de inmunoperoxidasa indirecta de tres pasos. El área de cada sección de tejido etiquetada con inmunoperoxidasa infiltrada por células se determinó por análisis morfométrico cuantitativo. Las células teñidas positivamente en cada portaobjetos se contaron por análisis morfométrico usando el análisis de conteo de puntos (14) con una cuadrícula cuadrada de 121 intersecciones en el ocular del microscopio. En resumen, el porcentaje del área de cada sección de injerto ocupada por células de una especificidad antigénica particular (infiltrado de área) se calculó como sigue: [número de células positivas bajo la intersección de cuadrícula/(número total de intersecciones de cuadrícula = 121)] x 100. Las secciones de injerto se examinaron a un aumento de x400. La precisión de la técnica es proporcional al número de puntos contados. Por lo tanto, para mantener un SE de <10 %, se contaron 15 campos para cada sección etiquetada. Los resultados se expresan como el porcentaje del área de la sección de tejido infiltrada por leucocitos (determinado con etiquetado OX1, OX30) y la composición fenotípica del infiltrado y subpoblaciones que se relacionan con el porcentaje de leucocitos totales y se expresan como el porcentaje de leucocitos. ;;Tinción de extracción de células infiltrantes de injerto ;;Los corazones dilacerados se digirieron con colagenasa D (2 mg/ml; Boehringer Mannheim) durante 10 min a 37 °C. Entonces, las células se recolectaron por extracción a través de una malla de acero inoxidable. La suspensión resultante entonces se clarificó por aislamiento de Ficoll. ;;RT-PCR cuantitativa ;;La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó en un sistema de detección de secuencia GenAmp 7700 de Applied Biosystems usando reactivos centrales de PCR SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los siguientes oligonucleótidos se usaron en este estudio: LAG- 3 de rata: cebador superior es 5'-ATATGAATTCACAGAGGAGATGAGGCAG-3' y el cebador inferior es 5'-ATATGAATTCTCCTGGTCAGAGCTGCCT-3'. INF-g de rata: cebador superior es 5'-TGGATGCTATGGAAGGAAAGA-3' y el cebador inferior es 5'-GATTCTGGTGACAGCTGGTG-3'. HPRT de rata: cebador superior es 5'-CCTTGGTCAAGCAGTACAGCC-3’ y cebador inferior es 5'- TTCGCTGATGACACAAACATGA-3'. Se amplificó una cantidad constante de ADNc que corresponde a la transcripción inversa de 100 ng de ARN total en 25 gl de mezcla de PCR que contiene 300 nM de cada cebador; dATP, dGTP, dCTP 200 gM; dUTP 400 gM; MgCl<2>3 mM; 0,25 U de uracil-N-glicosilasa; 0,625 U de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. La mezcla se sometió a 40 ciclos de amplificación. Los datos de PCR en tiempo real se graficaron como la señal de fluorescencia ARn versus el número de ciclo. Los valores de ARn se calcularon por el software de detección de secuencias Applied Biostystems 7700 usando la fórmula: ARn = (Rn+) - (RNn ■), donde Rn+ es la señal de fluorescencia del producto en un momento dado, Rn- es la señal de fluorescencia media durante los ciclos 3-13 y referida como la línea base. El valor de Ct se define como el número de ciclo en el cual ARn cruza un umbral. El umbral se establece por arriba de la fluorescencia de fondo para intersectar la porción exponencial de la curva de amplificación de una reacción positiva. El Ct es inversamente proporcional a la cantidad logarítmica de plantilla dentro de la PCR. ;;Análisis estadísticos ;;La significancia estadística se evaluó usando la prueba aa Mann-Whitney para la comparación de dos grupos. La supervivencia de injerto se evaluó por análisis de Kaplan-Meier usando la prueba de rango logarítmico. ;;Resultados ;;Expresión de ARNm de LAG-3 en aloinjerto rechazado y órganos linfoides ;LAG-3 se expresa por células T activadas en tejidos y órganos linfoides inflamados (7) . A fin de ver si LAG-3 también se expresa en aloinjertos rechazados, se analizaron los injertos de corazones de receptores de ratas LEW.1W a LEW.1A el día 5 (el rechazo se presenta el día 6) . El ARN mensajero para LAG-3 se analizó y comparó con aloinjertos que recibieron un regimiento inductor de tolerancia (anticuerpos anti-CD28 CSA, como se describe (16)) y con isoinjertos. Los aloinjertos rechazados presentaron una acumulación de 7 veces y 25 veces de ARNm de LAG-3 en comparación con los injertos tolerados y singénicos, respectivamente (FIGURA 1A). Esta acumulación no se detectó en los ganglios linfáticos (FIGURA 1B) o en el bazo de los receptores de rechazo (FIGURA 1C). ;;Mecanismo de acción de anticuerpos anti-LAG-3 ;;Se produjeron anticuerpos anti-LAG-3 en conejos por inmunización con un péptido sintético del extra-bucle del dominio N-terminal tipo Ig de LAG-3, implicado en la interacción de LAG-3 con clase II (ref PNAS Huard 1997) . El suero postinmunitario, así como la fracción de IgG, tiñó < 1 % de las células de bazo de rata y 40 % de las células de bazo de rata activadas durante 48 h con ConA, PMA ionomicina o PHA. El suero preinmunitario fue negativo (datos no mostrados). A fin de caracterizar el efecto de anticuerpos anti-LAG-3 en células LAG-3+, se ensayóin vitrola citotoxicidad dependiente de complemento y ADCC. El quince % de las células de bazo activadas con ConA se lisaron en el ensayo de citotoxicidad dependiente de complemento (FIGURA 2). Dado que solo 40 % de las células diana activadas con ConA expresaron LAG-3, este ensayo reveló que aproximadamente 37 % de las células de bazo LAG-3+ presentes en la preparación se lisaronin vitrocomo resultado de la activación de complemento. ;;In vivo,la actividad de agotamiento de anticuerpos anti-LAG-3 se estimó al medir el destino de células T activadas etiquetadas con CFSE transferidas de manera adoptiva a receptores de rata irradiados. Un día después de la inyección de dosis terapéuticas de suero inmunitario anti-LAG-3, solo se pudo recuperar la mitad de la cantidad de células CFSE+/CD4+ y CFSE+/CD8+ del bazo, en comparación con inyecciones similares de suero preinmunitario (FIGURA 3). ;Los anticuerpos anti-LAG-3 retrasan el rechazo de aloinjerto de corazón ;;A partir de las observaciones farmacocinéticas preliminares, se establecieron que dos inyecciones i.v. de 600 gl de suero de conejo anti-LAG-3 en los días 0 y 3 dieron por resultado el mantenimiento de la actividad de unión anti-LAG-3 en el suero del receptor durante al menos 2 semanas. Este tratamiento retrasó el rechazo de aloinjerto cardíaco de 6 días en receptores no tratados y tratados con control a una mediana de 27 días. Todos los receptores, sin embargo, finalmente rechazaron su injerto dentro de 10 semanas (FIGURA 4). En el día 5, los injertos de receptores tratados con control se infiltraron fuertemente por células T activadas y este infiltrado fue menos importante en receptores tratados con anti-LAG-3. La infiltración por células CD25+ y células NK, sin embargo, no se modificó por el tratamiento. Puesto que los anticuerpos anti-LAG-3 no reconocen LAG-3 en inmunohistología, la expresión de LAG-3 por células infiltrantes de injerto (GIC) se analizó por citometría de flujo después de la extracción. Se pudo recuperar un promedio de 8,5 106 ± 0,76 GIC de los injertos rechazados de control. De los aloinjertos de corazón de receptores tratados con anti-LAG-3, solo se pudieron recuperar 3,16 ± 0,44 106 GIC (n = 3; p < 0,005). Las GIC contuvieron 41,17 ± 1 % de células LAG-3+ en los controles (es decir, 3,5 106 células) versus 22,2 ± 0,9 % en los animales tratados (es decir, 0,7 106 células; n = 3; p < 0,0005; FIGURA 5). El análisis de la transcripción de ARNm reforzó estas observaciones de que la infiltración de injerto de corazón por células mononucleares se redujo puesto que se midió cuatro veces menos moléculas de ARNm de INFy en injertos tratados (FIGURA 5) . ;;Los anticuerpos anti-LAG-3 inhiben el rechazo de retraso de aloinjerto de corazón agudo en curso ;;A fin de investigar si los anticuerpos anti-LAG-3 pueden servir como tratamiento de un rechazo agudo de aloinjerto en curso, se injertaron corazones LEW.1W en receptores alogénicos LEW.1A que se mantuvieron sin tratar durante 3 o 4 días. En ese momento, los receptores recibieron una inyección de 600 microlitros de suero de conejo de control o anti-LAG-3. Los receptores tratados con control rechazaron los aloinjertos el día 5, en tanto que los receptores tratados con anticuerpos anti-LAG-3 rechazaron solo el día 11 (tabla 1) • ;;Tabla 1 ;; ;;; Tabla 1: Los receptores de injerto de corazón se trataron el día 3 o 4 con anticuerpos de control o anti-LAG-3. El rechazo se monitoreó por palpación diaria de corazón. ;Ejemplo 2: Generación de nuevos mAb hLAG-3 de alta afinidad ;;Materiales y métodos ;;Los ratones se inmunizaron 3 veces con células CHO transfectadas con hLAG-3 (107 células, inyección intraperitoneal), seguido por una inyección i.v. de refuerzo con 10 gg de IMP321, la proteína recombinante hLAG-31G de grado clínico. Tres días después del refuerzo, los esplenocitos se fusionaron con el compañero de fusión X63.AG8653 para producir células de hibridoma. Los sobrenadantes de hibridomas se examinaron para su unión específica (análisis FACS) en células CHO transfectadas con hLAG-3 versus células CHO tipo silvestre (wt). ;;Se seleccionó un anticuerpo IgG2a murino (580.1E9H3A9H12, llamado A9H12), se subclonó para producir una línea de células estable y se caracterizó adicionalmente por su potencia para agotar células LAG-3+ a través de CDC (citotoxicidad dependiente de complemento) y ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo), dado que se conoce que la región Fc de IgG2a murina es el isotipo Fc más eficiente en ratones para suministrar estas actividades, incluso en células heterólogas (es decir, células CHO o PBMC humanas). De manera similar, también se seleccionó un segundo anticuerpo de IgM (31G11E8, llamado 31G11). ;;Resultados ;;La unión dependiente de dosis de A9H12 se comparó primero con el mAb 17B4 específico de LAG-3 de referencia en células CHO transfectadas con hLAG-3 y en células T humanas activadasin vitroLAG-3+ (FIGURA 6). A9H12 mostró una mayor unión que el mAb de referencia 17B4 en ambos tipos de células. Por ejemplo, se observó una unión significativa de A9H12 a células T humanas activadas con una concentración tan baja como 0,01 gg/ml. ;;Para las pruebas de CDC, las células diana usadas en este ensayo fueron células CHO LAG-3+ en comparación con las células CHO wt (FIGURA 7A) . Ambos tipos de células se incubaron durante 1 hora a 37 °C con A9H12, su mAb de control negativo de IgG2a coincidente de isotipo murino, 31G11, su control negativo de IgM coincidente de isotipo murino o el mAb 17B4 (IgG 1) de referencia y suero de conejo que contiene complemento activo. Entonces, se valoró la viabilidad celular usando 7-amino-actinomicina D (7-AAD), un tinte fluorescente que etiqueta células que han perdido su integridad membranosa, un fenómeno que apareció rápidamente después de la muerte. El porcentaje de células CHO positivas para 7-AAD (es decir, células diana muertas) se determinó por análisis de citometría de flujo. A9H12 mostró una actividad citotóxica potente y específica en este ensayo de CDC, aniquilando solo células<c>H<o>LAG-3+ en la presencia de complemento (FIGURA 7B). El Ab anti-LAG-3 se tituló hacia abajo para determinar la eficacia del anticuerpo para activar CDC a baja concentración de anticuerpo. A9H12 indujo eficientemente la aniquilación de células CHO LAG-3+ a una concentración tan baja como 0,01 gg/ml (FIGURA 7C). El anticuerpo IgG 117B4 también se analizó en este ensayo y no tuvo efecto (FIGURA 7D, panel izquierdo), que muestra que no todos los mAb LAG-3 pueden inducir citotoxicidad en este bioensayo. Como se observó con A9H12, el segundo mAb específico de LAG-331G11 también indujo la aniquilación de células CHO LAG-3+ (FIGURA 7D, panel derecho). ;;El bioensayo de CDC también se realizó en PBMC estimuladas con el superantígeno SEB. La citotoxicidad de A9H12 y 31G11 se analizó en células T CD4+ auxiliares y CD8+ citotóxicas tanto activadas (específicamente, células CD25+/LAG-3+) como no activadas (específicamente, células CD25-/LAG-3~). Solo las células T CD4+ y CD8 activadas se aniquilaron específicamente por A9H12 y 31G11 (FIGURA 7E), que muestra que las células T humanas activadas son susceptibles a la aniquilación específica de A9H12 o 31G11 en presencia de complemento. ;;Para las pruebas de ADCC, las PMBC se estimularon durante un día con IL-2 para que sirvieran como células efectoras y las células CHO LAG-3+ se etiquetaron con el tinte vital CFSE para que sirvieran como células diana. En la presencia de A9H12, las PBMC fueron capaces de aniquilar un porcentaje significativo de células CHO LAG-3+ y este efecto se incrementó con el número de células efectoras (FIGURA 8A). En la presencia de 17B4, solo un pequeño porcentaje de células diana se aniquiló incluso a una alta relación E:T (FIGURA 8A), que muestra que no todos los mAb LAG-3 pueden inducir citotoxicidad en este bioensayo. El mAb A9H12 LAG-3 se tituló hacia abajo para determinar la eficacia del anticuerpo para inducir ADCC a baja concentración de anticuerpo. A9H12 indujo eficientemente la aniquilación de células CHO LAG-3+ a una concentración tan baja como 0,01 gg/ml (FIGURA 8B). ;;Ejemplo 3: Prueba de agotamiento de anticuerpos LAG-3 en un modelo de ratón con artritis inducida por colágeno ;Materiales y métodos ;;Animales y materiales;;Los ratones macho DBA/1 (H_i), de 8-10 semanas de edad, se obtuvieron de Janvier Laboratories. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los lineamientos locales. Se compró BovineCII (cartílago articular) de BioCol. El adyuvante de Freund incompleto se proporcionó por Sigma.M. tuberculosismuerta por calor H37Ra se compró de Difco Laboratories. ;inducción de artritis inducida por colágeno (CIA) ;;La inducción y valoración de CIA se realizaron como se describió previamente en dos publicaciones (13, 15) . El adyuvante de Freund completo se preparó al mezclar 100 mg deMycobacterium tuberculosismuerta por calor en 13,3 ml de IFA (concentración final 7,5 mg/ml). La CII bovina se disolvió a 3 mg/ml en ácido acético 10 mM durante la noche a 4 °C. Se formó una emulsión al mezclar 2 volúmenes de CII con 1 volumen de CFA. La solución de CII y la emulsión con CFA siempre estuvieron recién preparadas. Los ratones macho DBA/1 se inyectaron de manera intradérmica en la base de la cola con un total de 100 gl de emulsión que contiene 200 gg de CII y 250 gg deM. tuberculosisel día 1 (D1). La inyección se repitió el día 21 (D21) . Como control, tres ratones se inyectaron con la emulsión de CFA sin CII. ;;Valoración clínica de artritis ;;Los ratones se examinaron para signos de artritis tres veces a la semana a partir del día 22. La severidad de enfermedad se determinó con el siguiente sistema de puntuación para cada extremidad: puntuación 0 = normal; puntuación 1 = hinchazón de la almohadilla plantar o articulación; puntuación 2 = hinchazón de la almohadilla plantar y 1 o 2 articulaciones; puntuación 3 = hinchazón de la almohadilla plantar y 3 o 4 articulaciones; puntuación 4 = hinchazón de la almohadilla plantar y todas las articulaciones. Cada pata se calificó y las 4 puntuaciones se sumaron de tal forma que la puntuación máxima posible fue de 16 por ratón. La incidencia se expresó como el porcentaje de ratones con una puntuación de artritis > 1. ;;Resultados ;;CIA se indujo por inyecciones i.d. de colágeno bovino tipo II (CII) emulsionado en CFA que contiene 250 p.g. de M.tuberculosis.Después de una inyección, 4 de 22 ratones habían desarrollado artritis en D21. Dos semanas después de la segunda inyección, en D35, 80-9 0% de los ratones habían desarrollado signos clínicos de artritis (FIGURA 9) . Los ratones exhibieron puntuaciones clínicas que cubren el intervalo completo de respuestas de 1 a 16 con algunas extremidades que muestran hinchazón severa de la almohadilla plantar, articulación de tobillo/muñeca y dedos (tabla 2). Ninguno de los animales de control (inyectados con CFA sin CII) desarrolló signos de artritis (datos no mostrados). ;;Tabla 2 ;;; ;;; Tabla 2: Puntuaciones clínicas medias (± SEM) durante 55 días. Los ratones macho DBA/1 (n = 10) se inyectaron i.d. con colágeno bovino tipo II (200 mg) emulsionado en CEA que contiene 250 mg de M.tuberculosisen D1 y D21. ;;Los resultados muestran que con el protocolo de CIA usado, es posible obtener un alto porcentaje (80-90 %) de ratones que desarrollan signos de artritis. Este protocolo experimental proporciona un modelo para evaluar el efecto terapéutico de agotamiento de anticuerpos LAG-3 (específicos para LAG-3 de ratón) en enfermedades autoinmunitarias. ;;200 gg del mAb LAG-3 de agotamiento (A9H12 o 31G11) se inyectan i.p. o i.v. el día 15 y 25. Se trata tanto de una disminución significativa en la incidencia de artritis como de una disminución significativa de las puntuaciones clínicas medias. ;;Ejemplo 4: Citotoxicidad dependiente de complemento (GDC) y citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) inducida por IMP731 ;Materiales y métodos ;;Se ha mostrado que un nuevo mAb murino con propiedades de agotamiento, A9H12, también reconoce células LAG-3+ de babuino y macaco con alta avidez y se había elegido como el mAb terapéutico de agotamiento principal (ImmuTuneIMP731). ;;A9H12 se ha quimerizado con una región Fc de IgG 1 humana usando modificación genética estándar y protocolos de PCR, para dar CDC (citotoxicidad dependiente de complemento) y ADCC (citotoxicidad dependiente de complemento). ;Las secuencias de ADNc de VH y VL A9H12 derivadas de ARNm de células de hibridoma A9H12 se fusionaron en la dirección 5’ de los dominios de IgG1 CHI-bisagra-CH2-CH3 humanos y cadenas Ckappa, respectivamente (FIGURA 10) ;;Las dos cadenas quiméricas de IMP731 ligera y pesada se clonaron independientemente en plásmidos de expresión separados (FIGURA 11 panel A y B, respectivamente) bajo el control del promotor PGK (o SRalfa en otra construcción, no mostrada). Estos 2 plásmidos se cotransfectaron (transfección transitoria) juntos en células CHO y IMP731 se purificó a partir del sobrenadante de cultivo el día 2 o 3 mediante al usar captura por afinidad en columna de proteína A y elución a pH 3. Después de la neutralización con Tris-HCl, el anticuerpo IMP731 purificado se probó en experimentos de CDC y ADCC para su capacidad para aniquilar células diana LAG-3+. ;;Las dos cadenas ligera y pesada de IMP731 entonces se clonaron junto con el promotor de PGK (o SRalfa, no mostrado) en una situación de cabeza a cola para la expresión coordinada de las dos cadenas de IMP731 desde el mismo sitio de integración (FIGURA 12). Este plásmido de expresión de IMP731 bi-cistrónico se usó para transfección estable y selección de células CHO-S de alta productividad (por ejemplo, más de 20 picogramos de proteína IMP731 por millón de células CHO-S por día) usando concentraciones crecientes de higromicina en medio libre de suero. ;;Resultados ;;La unión dependiente de dosis de IMP731 se valoró primero en células CHO transfectadas con hLAG-3 (FIGURA 13A) y en células T humanas activadasin vitroLAG-3+ (FIGURA 13B) . IMP731 mostró una unión significativa en ambos tipos de células con una concentración tan baja como 0,01 gg/ml para células T activadas. ;;Para las pruebas de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), las células diana usadas en este ensayo fueron células CHO LAG-3+ (FIGURA 14) . Las células se incubaron con IMP731 o su control negativo de IgG1 coincidente de isotipo humano y entonces con suero de conejo que contiene complemento activo durante 1 hora a 37 °C. Entonces se valoró la viabilidad celular usando 7-amino-actinomicina D (7-AAD) .7-AAD es un tinte fluorescente que etiqueta células que han perdido su integridad membranosa, un fenómeno que apareció rápidamente después de la muerte. El porcentaje de células CHO positivas para 7-AAD (es decir, células diana muertas) se determinó por análisis de citometría de flujo. IMP731 mostró una actividad citotóxica potente y específica en este ensayo de CDC, aniquilando solo células CHO LAG-3+ en la presencia de complemento (FIGURA 14). ;;Para pruebas de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), las PMBC se estimularon durante un día con IL-2 para que sirvieran como células efectoras y las células CHO LAG-3+ se etiquetaron con el tinte vital CFSE para que sirvieran como células diana. En la presencia de IMP731, las PBMC fueron capaces de aniquilar un alto porcentaje de células CHO LAG-3+ (FIGURA 15A) . El Ab IMP731 LAG-3 se tituló hacia abajo para determinar la eficacia del anticuerpo para inducir ADCC a baja concentración de anticuerpo. IMP731 indujo significativamente la aniquilación de células CHO LAG- 3+ a una concentración tan baja como 0,01 gg/ml (FIGURA 15B). Las células LAG-3+ pero no LAG-3 se aniquilaron por la adición de IMP731 en este ensayo (FIGURA 15C). ;;Parecía que las actividades de unión y funcional de IMP371 fueron similares al mAb murino A9H12 de origen producido por células de hibridoma. ;;Referencias ;;1. Waldmann H. The new immunosuppression: just kill the T cell. Nat Med 2003; 9 (10): 1259. ;2. Monk NJ, Hargreaves RE, Marsh JE, et al. Fc- dependent depletion of activated T cells occurs through CD40L- specific antibody rather than costimulation blockade. Nat Med 2003; 9 (10): 1275. ;3. Andre P, Prasad KS, Denis CV, et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin—dependent mechanism. Nat Med 2002; 8 (3): 247. ;4. 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Hiroaki et al, A tumor necrosis factor receptor loop peptide mimic inhibits bone destruction to the same extent as anti tumor necrosis factor monoclonal ntibody in lurine collagen-induced arthritis. arthritis & Rheumatism. 2007; 56(4): 1164 1174. *

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 citotóxico o fragmento del mismo para uso en el tratamiento o prevención del rechazo de trasplante de órganos o tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, donde este anticuerpo o fragmento del mismo comprende un fragmento Fc de subclase IgG1 o IgM humana o IgG2a murina y un fragmento Fab que se une a la proteína LAG-3, y donde el anticuerpo o fragmento del mismo provoca el agotamiento de células T activadas LAG-3+ mediante citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).

2. Un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 citotóxico o fragmento del mismo para uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el agotamiento de células T activadas LAG-3+ se mide por cambios en los números de linfocitos de sangre periférica.

3. Un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 citotóxico o fragmento del mismo para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde este anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo es capaz de provocar el agotamiento de más del 30 %, preferentemente más del 50 % de células T activadas LAG-3+.

4. Un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 citotóxico o fragmento del mismo para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo exhibe (i) más de 50 % de la actividad de CDC máxima a una concentración de mAb de menos de 0,1 gg/ml o (ii) más de 50 % de la actividad de ADCC máxima a una concentración de mAb de menos de 0,1 gg/ml.