ES2959633T3 - Composiciones que comprenden extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill, y sus aplicaciones médicas - Google Patents

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Abstract

Se divulga una combinación o composición de lípido de mejillón y aceite de krill, que se usa para tratar la inflamación o el dolor. También se describe un proceso para preparar aceite de krill que tiene un contenido de fosfolípidos de aproximadamente el 50 % o más. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones que comprenden extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill, y sus aplicaciones médicas
Campo
La presente divulgación se refiere en general a combinaciones de lípidos marinos. En particular, la divulgación se refiere a una combinación de lípidos obtenidos dePerna canaliculusy krill, composiciones y preparaciones que comprenden dichas combinaciones y el uso de dichas combinaciones y composiciones en terapia. La divulgación se refiere además a procedimientos para la fabricación de aceites de krill y su uso en las combinaciones y composiciones.
Antecedentes
La inflamación es una respuesta adaptativa fisiológica necesaria a lesiones e infecciones, sin la cual los humanos y los animales no podrían sobrevivir. Su función es eliminar la causa inicial de la lesión, eliminar los factores nocivos e iniciar la reparación de la estructura y función del tejido. Su fase aguda temprana se caracteriza por lo general por calor, dolor, enrojecimiento e hinchazón. El resultado habitual de la inflamación aguda es la restauración y reparación del daño; sin embargo, las respuestas inflamatorias agudas desproporcionadas y las respuestas inflamatorias crónicas a largo plazo en afecciones como la sepsis pueden ser perjudiciales.
Es importante destacar que la inflamación crónica se ha implicado ahora en la patología de un amplio número de enfermedades que afectan a todos los tejidos y órganos, incluyendo osteoartritis, artritis reumatoide, enfermedades cardiovasculares, enfermedades cerebrovasculares, enfermedades respiratorias, enfermedades autoinmunes y sarcopenia; de hecho, la inflamación crónica ha sido implicada en el propio procedimiento de envejecimiento.
Como respuesta al procedimiento inflamatorio, se ha desarrollado una variedad de fármacos, siendo los más eficaces los fármacos esteroides glucocorticoides que son capaces de suprimir la inflamación excesiva. Sin embargo, la terapia con medicamentos esteroides tiene un uso clínico generalizado limitado debido a efectos secundarios importantes y, por lo general, se limita únicamente a un uso a corto plazo. Se desarrolló una segunda clase de fármacos inflamatorios llamados fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDS), tal como el ibuprofeno, etc.; véase la tabla 1. Se reconoció que la aspirina tenía actividad antiinflamatoria y que formaba parte de esta segunda clase de fármacos antiinflamatorios. Estos fármacos eran más seguros que los esteroides y podían usarse para afecciones inflamatorias más crónicas, como la osteoartritis.
Tabla 1: Lista de fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAIDS) de uso común
(continuación)
Las prostaglandinas desempeñan un papel clave en la respuesta inflamatoria, con su presencia aumentada significativamente en el tejido inflamado, contribuyendo al dolor y la fiebre al elevar la temperatura y dilatando los vasos sanguíneos, lo que provoca enrojecimiento e hinchazón en el lugar donde se liberan. Los NSAID son inhibidores competitivos del sitio de la ciclooxigenasa-1 (COX-1) y de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y, por tanto, reducen la síntesis de prostaglandinas. Al reducir la producción de prostaglandinas, los NSAIDS ayudan a aliviar el malestar de la fiebre y reducir la inflamación y el dolor asociado. Los NSAIDS son normalmente se usan para el tratamiento de afecciones agudas y crónicas caracterizadas por dolor e inflamación, tal como osteoartritis, artritis reumatoide, dolor de cabeza, migraña y fiebre. Sin embargo, los NSAIDS también presentan problemas considerables en torno a la seguridad y puede presentar toxicidades gastrointestinales, renales y cardiovasculares. Por ejemplo, la aspirina puede causar sangrado gástrico a los pocos días de su uso y en julio de 2015, la FDA repitió una advertencia previa sobre los riesgos cardíacos de los analgésicos NSAIDS comunes, excluyendo la aspirina. Estos incluyen ibuprofeno (Advil, Motrin) y naproxeno (Aleve) y los NSAID que se venden solo con receta.
De acuerdo con lo anterior, existe la necesidad de terapias antiinflamatorias alternativas adicionales.
Sumario
Ahora se ha descubierto que ciertas combinaciones de lípidos de mejillón y aceite de krill pueden proporcionar ventajosamente un efecto inhibidor aditivo o sinérgico contra la producción o liberación de uno o más mediadores proinflamatorios implicados en el procedimiento inflamatorio. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las combinaciones de la presente divulgación pueden proporcionar nuevos tratamientos terapéuticos para trastornos caracterizados por inflamación o que tienen un componente inflamatorio. En algunas realizaciones, las combinaciones de la presente divulgación pueden proporcionar nuevos tratamientos terapéuticos para el dolor, tales como dolor asociado con inflamación. La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
De este modo, en un aspecto, se proporciona una combinación que comprende lípidos de mejillón y aceite de krill. Los lípidos del mejillón y la combinación de aceite de krill puede adaptarse para administración separada o simultánea a un sujeto. En algunas realizaciones, la combinación es una composición que comprende lípidos de mejillón y aceite de krill.
En otro aspecto, se proporciona una combinación que consiste, o que consiste esencialmente, en lípido de mejillón y aceite de krill. La combinación de lípidos de mejillón y aceite de krill puede adaptarse para administración separada o simultánea a un sujeto. En algunas realizaciones, la combinación es una composición que consiste, o que consiste esencialmente, en lípidos de mejillón y aceite de krill.
En otro aspecto, se proporciona una combinación que comprende lípidos de mejillón y aceite de krill para su uso en terapia. En algunas realizaciones, se proporciona una combinación que comprende lípidos de mejillón y aceite de krill para su uso en el tratamiento de la inflamación en un sujeto. T ambién se proporciona una combinación que comprende lípidos de mejillón y aceite de krill para su uso en el tratamiento del dolor en un sujeto. La combinación de lípidos de mejillón y aceite de krill puede adaptarse para administración separada o simultánea a un sujeto. En algunas realizaciones, la combinación es una composición que comprende lípidos de mejillón y aceite de krill.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar la inflamación en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una combinación que comprende lípido de mejillón y aceite de krill. La divulgación también proporciona un método para tratar el dolor en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a dicho sujeto una combinación que comprende lípido de mejillón y aceite de krill. La combinación de lípidos de mejillón y aceite de krill puede adaptarse para administración separada o simultánea a un sujeto. En algunas realizaciones, la combinación es una composición que comprende lípidos de mejillón y aceite de krill.
En otro aspecto, la divulgación proporciona el uso de lípidos de mejillón y aceite de krill en la fabricación de un medicamento combinado para tratar la inflamación. La divulgación también proporciona el uso de lípidos de mejillón y aceite de krill en la fabricación de un medicamento combinado para tratar el dolor. El medicamento puede adaptarse para administración separada o simultánea. En algunas realizaciones, la combinación es una composición que comprende lípidos de mejillón y aceite de krill.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un agente combinado para tratar la inflamación, comprendiendo dicha combinación lípidos de mejillón y aceite de krill. La divulgación también proporciona un agente combinado para tratar el dolor, comprendiendo dicha combinación lípidos de mejillón y aceite de krill. El lípido de mejillón y el aceite de krill pueden adaptarse para administración separada o simultánea a un sujeto. En algunas realizaciones, el agente de combinación es una composición que comprende lípido de mejillón y aceite de krill.
En algunas realizaciones, el lípido de mejillón está en forma de polvo de mejillón seco. En otras realizaciones, el lípido de mejillón está en forma de un extracto de lípido obtenido de mejillón ("extracto de lípidos de mejillón"). En aún otras realizaciones, el lípido de mejillón puede estar en forma de una combinación o composición de polvo de mejillón seco y extracto de lípidos de mejillón.
En algunas realizaciones, el aceite de krill tiene un contenido de fosfolípidos en el intervalo de aproximadamente 40 99 % p/p, y en realizaciones adicionales un contenido de fosfolípidos en el intervalo de aproximadamente 50-99 % p/p, tal como aproximadamente 60-80 % p/p.
En algunas realizaciones, las combinaciones de la divulgación pueden ser útiles en el tratamiento de uno o más trastornos en un sujeto, en las que el trastorno tiene un componente inflamatorio, y mediante el cual la inhibición de una o más moléculas proinflamatorias es terapéuticamente beneficiosa. En algunas realizaciones, las combinaciones pueden ser adecuadas para tratar uno o más trastornos crónicos.
En algunas realizaciones, tales como para su uso en el tratamiento de la inflamación crónica, las combinaciones pueden eliminar, evitar o mitigar de otro modo el alcance, la gravedad o la duración de uno o más efectos adversos asociados con los NSAIDS comúnmente disponibles.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para preparar aceite de krill que tiene un contenido de fosfolípidos de aproximadamente 50 % o más, tal como aproximadamente 60 % o más, que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto un material de alimentación de biomasa de krill con una mezcla de CO<2>y etanol, para extraer un aceite de krill; y
(b) poner en contacto dicho aceite de krill con CO<2>para extraer al menos una proporción de componentes lipídicos no polares de modo que el aceite tenga un contenido de fosfolípidos de al menos 50 % p/p.
En algunas realizaciones, el aceite de krill obtenido de este procedimiento tiene un contenido de fosfolípidos de aproximadamente 60 % p/p o mayor, tal como al menos aproximadamente 65 % p/p, o 70 % p/p, o 75 % p/p, u 80 % p/p, u 85 % p/p, o 90 % p/p.
La divulgación también se refiere a procedimientos para enriquecer el contenido de fosfolípidos de un aceite de krill.
De este modo, en un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para aumentar el contenido de fosfolípidos de un aceite de krill que tiene un contenido de fosfolípidos de menos del 50 % p/p a aproximadamente el 50 % p/p o más, que comprende la etapa de poner en contacto un aceite de krill que tiene un contenido de fosfolípidos de menos del 50 % p/p con CO<2>para eliminar selectivamente los componentes no polares del lípido.
En algunas realizaciones, el aceite de krill preliminar tiene un contenido de fosfolípidos de menor que aproximadamente 50 %, p/p, tal como menor que aproximadamente 40 %, o menor que aproximadamente 30 % p/p o 20 % p/p. En algunas realizaciones, el aceite enriquecido así obtenido tiene un contenido de fosfolípidos de al menos aproximadamente 55 % p/p, o al menos aproximadamente 60 % p/p, o al menos aproximadamente 65 % p/p o al menos aproximadamente 70 % p/p o al menos aproximadamente 75 % p/p o al menos aproximadamente 80 % p/p o al menos aproximadamente 85 % p/p o al menos aproximadamente 90 % p/p.
Una realización adicional proporciona aceite de krill que tiene un contenido de fosfolípidos de aproximadamente 50 % p/p o mayor (por ejemplo, >60 % p/p) obtenido mediante un procedimiento de la divulgación.
Otras realizaciones adicionales proporcionan aceite de krill que tiene un contenido de fosfolípidos de aproximadamente 50 % o 60 % p/p o mayor para su uso en las combinaciones y composiciones descritas en este documento.
Figuras
La figura 1A representa gráficamente el efecto de inhibición de NO en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill, cada uno del extracto de lípidos de mejillón y el aceite de krill solo, aceite de oliva y N-(3-(Aminometil)bencil)acetamidina (1400W).
La figura 1B representa gráficamente la liberación de NO (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill, cada uno del extracto de lípidos de mejillón y el aceite de krill solo, aceite de oliva y N-(3-(Aminometil)bencil)acetamidina (1400W).
La figura 2A representa gráficamente el efecto de inhibición del TNFa en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill, cada uno del extracto de lípidos de mejillón y el aceite de krill solo, aceite de oliva y dexametasona.
La figura 2B representa gráficamente la liberación de TNFa (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill, cada uno del extracto de lípidos de mejillón y el aceite de krill solo y aceite de oliva.
La figura 3A representa gráficamente el efecto de inhibición de IL-6 en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill, cada uno del extracto de lípidos de mejillón y el aceite de krill solo, aceite de oliva y dexametasona.
La figura 3B representa gráficamente la liberación de IL-6 (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill, cada uno del extracto de lípidos de mejillón y el aceite de krill solo y aceite de oliva.
La figura 4A representa gráficamente el efecto de inhibición de PGE2 en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill, cada uno del extracto de lípidos de mejillón y el aceite de krill solo, aceite de oliva y diclofenaco.
La figura 4B representa gráficamente la liberación de PGE2 (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill, cada uno del extracto de lípidos de mejillón y el aceite de krill solo y aceite de oliva.
La figura 5A representa gráficamente la liberación de NO (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY90-LY50).
La figura 5B representa gráficamente la liberación de NO (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY50-LY10).
La figura 6A representa gráficamente la liberación de NO (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY75-LY60).
La figura 6B representa gráficamente la liberación de NO (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY60-LY45).
La figura 7 representa gráficamente el isobolograma para la inhibición sinérgica de NO mediante diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY90-LY10).
La figura 8A representa gráficamente la liberación de TNFa (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY90-LY60).
La figura 8B representa gráficamente la liberación de TNFa (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY60-LY30).
La figura 8C representa gráficamente la liberación de TNFa (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY40-LY10).
La figura 9A representa gráficamente la liberación de TNFa (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY70-LY55).
La figura 9B representa gráficamente la liberación de TNFa (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY50-LY35).
La figura 10 representa gráficamente el isobolograma para la inhibición sinérgica de TNFa mediante diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY90-LY10).
La figura 11A representa gráficamente la liberación de IL-6 (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY90-LY50).
La figura 11B representa gráficamente la liberación de IL-6 (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY50-LY10).
La figura 12A representa gráficamente la liberación de IL-6 (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY70-LY50).
La figura 12B representa gráficamente la liberación de IL-6 (%) en células RAW264.7 estimuladas con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFy) para diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY50-LY30).
La figura 13 representa gráficamente el isobolograma para la inhibición sinérgica de IL-6 mediante diversas concentraciones de combinaciones de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill (LY90-LY10).
Descripción
A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprende" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros pero sin la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.
A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la frase "que consiste esencialmente en" y variaciones tales como "consiste esencialmente en" indican que los elementos citados son esenciales, es decir elementos necesarios de la invención. La frase permite la presencia de otros elementos no mencionados que no afectan materialmente las características de la invención pero excluye elementos adicionales no especificados que afectarían a las características básicas y novedosas de la invención definida.
Las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen aspectos plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
El término "invención" incluye todas las divulgaciones, aspectos, realizaciones y ejemplos como se describen en este documento.
Como se usa en este documento, "aproximadamente" se refiere a una cantidad, valor o parámetro que puede variar hasta en un 10 %, 5 % o 2-1 % de la cantidad, valor o parámetro indicado, e incluye al menos tolerancias. aceptado dentro de la técnica. Cuando se usa en referencia a un valor de número entero establecido, "aproximadamente" puede incluir una variación de un número entero a cada lado del valor indicado, por ejemplo "50 %", puede incluir 49 % y 51 %. Al anteponer un intervalo de valores citado, se pretende aplicar tanto a los límites superior como inferior del intervalo.
A menos que el contexto indique lo contrario, las características descritas a continuación pueden aplicarse independientemente a cualquier aspecto o realización.
Como se usa en este documento, "lípido de mejillón" se refiere a un componente lipídico extraído u obtenido del mejillón de labios verdes (NZGL) (o concha verde) de Nueva Zelanda(Perna canaliculus).El lípido de mejillón puede comprender uno o más ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFA), tales como ALA, ETA, EPA y DHA, esteroles, ésteres de esterol, triglicéridos, carotenoides lipídicos no polares y otros componentes de la carne de mejillón (NZGL). El lípido de mejillón puede estar en forma de polvo de mejillón seco o de una fracción lipídica extraída de la carne de mejillón ("extracto de lípidos de mejillón"). También se prevé que el "lípido de mejillón" abarque una mezcla de polvo de mejillón y extracto de lípidos de mejillón, por ejemplo, un lípido de mejillón puede complementarse mediante la adición de polvo de mejillón o viceversa. En algunas realizaciones, el lípido de mejillón es una fracción lipídica aislada.
El polvo de lípidos de mejillón se puede preparar a partir de carne de mejillón NZGL fresca (cruda), congelada o tratada térmicamente mediante cualquier medio de secado apropiado (por ejemplo, liofilización, secado instantáneo o secado al vacío) y medios de pulverización. Además de los ácidos grasos (incluidos ALA, ETA, EPA y DHA), el polvo de mejillón obtenido secando la carne de mejillón también contendrá otros componentes potencialmente beneficiosos, incluidos minerales, aminoácidos, péptidos, proteínas y glicosaminoglicanos (por ejemplo, condroitina-4- sulfato y condroitina-6-sulfato). Se conocen en la técnica procedimientos para preparar polvo de mejillón.
El extracto de lípidos de mejillón se puede obtener a partir de carne de mejillón NZGL fresca (cruda), congelada, tratada térmicamente o seca (por ejemplo, secada por liofilización, de forma instantánea o al vacío en tambor) (por ejemplo, en forma de polvo, secada por pulverización o pulverizada) mediante cualquier método apropiado, tal como extracción con disolventes (por ejemplo, acetona o etanol; véase, por ejemplo, el documento WO2005073354 A1), tratamiento enzimático (véase, por ejemplo, el documento WO2006128244) o extracción con fluidos supercríticos. En algunas realizaciones, el extracto de lípidos de mejillón se obtiene ventajosamente mediante extracción con CO<2>supercrítico de carne de mejillón seca (por ejemplo, liofilizada) (opcionalmente estabilizada para evitar la oxidación). Un método de ejemplo para obtener extracto de lípidos de mejillón se describe en el documento WO 97/09992 A1. Se conocerán otros métodos en la técnica.
En realizaciones preferidas, los procedimientos se realizan en condiciones tales que los componentes beneficiosos, tales como los ácidos grasos, no se destruyen sustancialmente y se retienen significativamente, por ejemplo, procesamiento en frío.
Un extracto de lípidos de mejillón de ejemplo obtenido de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 97/09992 A1, también se conoce como PCSO-524® (Pharmalink International Limited, Hong Kong). PCSO-524® contiene vitamina E agregada (0,15 % p/p, agregada como conservante antioxidante) y comprende una combinación de ácidos grasos libres, triglicéridos, ésteres de esterol, lípidos no polares y carotenoides (Sinclair, A. J. et al. , 2000), y es una fuente de ácidos grasos poliinsaturados omega-3 de cadena larga, ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA), así como otros ácidos grasos de cadena larga, tales como el ácido 5,9,12,15-octadecatetraenoico, ácido 5,9,12,16-nonadecatetraenoico, ácido 7,11,14,17-eicotetraenoico y ácido 5,9,12,15,18-heneicosapentaenoico. PCSO-254® (formulado junto con aceite de oliva en forma de dosificación oral encapsulada), se comercializa bajo las marcas Lyprinol® y Omega XL®, (para consumo humano), y Antinol® (para perros y gatos).
En algunas realizaciones, el extracto de lípidos de mejillón usado en las combinaciones de la divulgación se formula con vitamina E (agregada, por ejemplo en una cantidad de aproximadamente 0.2 % p/p, o 0.15 % p/p, o 0.1 % p/p), o 0.05 % p/p o aproximadamente 0.03 % p/p o aproximadamente 0.01 % p/p). En algunas realizaciones, el lípido de mejillón se usa en forma de PCSO-254®, es decir, extracto de lípidos de mejillón que contiene 0.15 % p/p de vitamina E. En algunas realizaciones, el lípido de mejillón, que opcionalmente contiene vitamina E, se formula además con un aceite portador tal como el aceite de oliva. Si bien en algunas realizaciones el lípido de mejillón es un extracto de lípidos de mejillón y contiene vitamina E agregada, la adición de vitamina E es opcional y, de este modo, en algunas realizaciones, el extracto de lípidos de mejillón se usa puro, es decir, no contiene ningún otro ingrediente adicional, tal como la vitamina E.
Los lípidos de mejillón, en diversas formas, también pueden adquirirse de proveedores comerciales.
El aceite de krill se puede preparar a partir de cualquier especie de krill adecuada, incluyendoEuphausia superba(krill antártico),Euphausia pacifica(krill del Pacífico),Maganycitiphanes norvegica(krill del norte),Euphausia crystallorophias(krill de hielo),Euphausia frigida, Euphausia longirostris, Euphausia triacanthayEuphausia vallentini.En algunas realizaciones preferidas, el aceite de krill se obtiene deEuphausia superba.
Los lípidos marinos contienen ácidos grasos, particularmente ácidos grasos omega-3 tales como EPA y DHA, en forma libre y de triglicéridos. De manera similar, el aceite de krill también es rico en ácidos grasos omega-3; sin embargo, el aceite de krill contiene cantidades significativas de fosfolípidos, donde los ácidos grasos están unidos a un grupo principal de fosfato a través de una unidad estructural de glicerol. Es esta forma de los ácidos grasos unida a fosfolípidos la que se absorbe más eficientemente en las membranas celulares que la forma de triglicéridos y, por lo tanto, es más fácilmente biodisponible. Los fosfolípidos típicos que se encuentran en el aceite de krill pueden incluir: fosfatidilcolina, alquilacilfosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, lisofosfatidilcolina, lisoalquilacilfosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, alquilacilfosfatidiletanolamina, cardiolipina N-acil fosfatidiletanolamina, lisofosfatidiletanolamina y lisoalquilacil fosfatidiletanolamina. El aceite de krill también contiene cantidades apreciables de astaxantina, un antioxidante que también es responsable de su color rojo.
En algunas realizaciones, el aceite de krill contiene al menos aproximadamente 1 % p/p, 5 % p/p, 10 % p/p o al menos aproximadamente 20 % p/p de fosfolípidos. En realizaciones adicionales, el aceite contiene al menos aproximadamente 25%p/p o al menos aproximadamente 30%p/p, o al menos aproximadamente 35%p/p, o al menos aproximadamente 40 % p/p, o al menos aproximadamente 45 % p/p, o al menos aproximadamente 50 % p/p, o al menos aproximadamente 55 % p/p, o al menos aproximadamente 60 % p/p, o al menos aproximadamente 65 % p/p o al menos aproximadamente 70 % p/p, o al menos aproximadamente 75 % p/p, o al menos aproximadamente 80 % p/p o al menos aproximadamente 85 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 90 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 95 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 97 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 98 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 99 % p/p de fosfolípidos. En algunas realizaciones, el aceite de krill tiene un contenido de fosfolípidos en el intervalo de aproximadamente 40-99 % p/p. En algunas realizaciones adicionales, el aceite de krill tiene un contenido de fosfolípidos en el intervalo de aproximadamente 60-99 % p/p, por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 65-90 % p/p. Como se menciona en este documento, aceite de krill "enriquecido" se refiere a aceite de krill que tiene un contenido de fosfolípidos de al menos aproximadamente 60 % p/p. El contenido de fosfolípidos se puede determinar mediante cualquier medio apropiado en la técnica, por ejemplo, análisis de 31P RMN.
Los métodos de preparación de aceite de krill, incluido el aceite de krill enriquecido en fosfolípidos, se conocen en la técnica. Por lo general, la biomasa de krill fresca, congelada y/o tratada térmicamente (por ejemplo,Euphasia superbaoEuphasia pacifica)se puede extraer usando disolventes (por ejemplo, alcoholes, tales como etanol; cetonas, tales como acetona; o dimetoxietano) y/o fluido supercrítico (por ejemplo, CO<2>). Algunos procedimientos de ejemplo no limitantes de preparación de aceite de krill se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 9,028,877, la Patente de los Estados Unidos No. 9,375,453, la Patente de los Estados Unidos No. 6,800,299, la Patente de los Estados Unidos No. 8,828,447, la Patente de los Estados Unidos No. 9,150,815, la Patente de los Estados Unidos No.
8,383,845, los documentos WO2007/123424, WO2011/050474, WO2015/104401 y WO2015/121378. También se describen métodos adicionales en este documento. El aceite de krill también se puede comprar a proveedores comerciales.
En algunas realizaciones ventajosas, el aceite de krill tiene un contenido de agua de aproximadamente 5 % p/p o menos, o aproximadamente 4, o 3, o 2 o 1, o 0.5 % p/p, o menos. En realizaciones adicionales, el aceite de krill tiene un contenido de disolvente de extracción residual de aproximadamente 5 % p/p o menos, o aproximadamente 4, o 3, o 2 o 1, o 0.5 % p/p, o menos. En realizaciones adicionales, el aceite de krill tiene un contenido de agua de aproximadamente 5 % p/p o menos, o aproximadamente 4, o 3, o 2 o 1, o 0.5 % p/p, o menos, y un contenido de disolvente de extracción residual de aproximadamente 5 % p/p o menos, o aproximadamente 4, o 3, o 2 o 1, o 0.5 % p/p, o menos. El agua y el disolvente se pueden eliminar mediante cualquier medio apropiado, tal como un calentamiento de muy corta duración o suave (por ejemplo, 30 minutos, o 1 hora, o 2 horas o 3 horas, a una temperatura de aproximadamente o menor que aproximadamente 60 °C, o 50 °C, o 40 °C, y preferiblemente de modo que la integridad de los constituyentes no se vea sustancialmente comprometida), corriente de nitrógeno o liofilización (criodesecación).
La actividad inhibidora de las combinaciones contra uno o más mediadores inflamatorios tales como óxido nitroso (NO), citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-6), prostaglandinas (por ejemplo, PG-E<2>) y TNFa, puede ser útil en el tratamiento de uno o más trastornos o síntomas en un sujeto mediante el cual la inhibición de una o más de tales moléculas es terapéuticamente beneficiosa. En particular, las combinaciones de la divulgación pueden ser útiles para tratar la inflamación aguda o crónica excesiva y/o uno o más de los síntomas asociados con la misma, tales como dolor, fiebre, enrojecimiento e hinchazón. En algunas realizaciones, las combinaciones pueden ser útiles para tratar la inflamación en trastornos en los que la patología incluye un componente inflamatorio y/o dolor asociado con dichos trastornos. Algunos ejemplos no limitantes de trastornos que incluyen un aspecto inflamatorio incluyen aterosclerosis, alergia, asma, enfermedades autoinmunes (por ejemplo, enfermedad celíaca, psoriasis, artritis reumatoide, artritis psoriásica), fibromialgia, gota, migraña, osteoartritis, colitis ulcerosa, cáncer, deterioro cognitivo, incluida la enfermedad de Alzheimer, la diabetes de tipo 2, el dolor muscular de aparición tardía (DOMS), la enfermedad de Crohn y la espondilitis anquilosante. En algunas realizaciones, las combinaciones de la divulgación pueden ser útiles para tratar el dolor articular o mejorar la movilidad articular asociada con la osteoartritis o la artritis reumatoide. En algunas realizaciones, las combinaciones de la divulgación pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos en los que la inhibición de PGE<2>puede ser beneficiosa, tales como artritis reumatoide, migraña y dolor (que puede ser dolor nociceptivo (somático o visceral) y/o dolor neuropático).
Se apreciará que las combinaciones descritas en este documento pueden adaptarse para administración separada o simultánea. Cuando se adapta para la administración simultánea, la combinación se puede proporcionar y/o administrar como una composición íntima o una mezcla que comprende tanto el extracto de lípidos de mejillón como el aceite de krill, o como formas de dosificación discretas de cada componente de la combinación. Cuando el extracto de lípidos de mejillón y el aceite de krill se proporcionan y/o administran cada uno por separado, pueden administrarse simultáneamente, uno tras otro o cada uno en un momento diferente.
En realizaciones adicionales, el lípido de mejillón y el aceite de krill pueden formularse opcionalmente, ya sea juntos o individualmente, en combinación con uno o más vehículos y/o aditivos farmacéuticamente aceptables. Algunos ejemplos de vehículos apropiados son aceites comestibles, tales como aceite de oliva, aceite de ricino, aceite de linaza, aceite de semilla de uva, aceite de pescado (por ejemplo, aceite de atún), aceite de canola, aceite vegetal, aceite de girasol, aceite de chía, aceite de soja, aceite de sésamo, aceite de algas y mezclas de los mismos. También se pueden incluir uno o más aditivos opcionales, tales como antioxidantes, vitaminas (tales como vitaminas liposolubles (A, D, E y K) o vitaminas hidrosolubles (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C), minerales dietéticos, aminoácidos, agentes enmascaradores de olores y sabores, emulsionantes, alcoholes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, etanol, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol) u otros modificadores de la viscosidad, surfactantes (por ejemplo, polisorbatos), agentes de suspensión, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, glucosa, lubricantes, aglutinantes, almidones, potenciadores de la absorción y conservantes, etc. Un portador o aditivo puede realizar una o más funciones. El lípido de mejillón y/o el aceite de krill pueden opcionalmente complementarse o combinarse adicionalmente con uno o más componentes purificados o parcialmente purificados adicionales de aceite de mejillón y krill, tales como astaxantina y ésteres de la misma, ácidos grasos (por ejemplo, EPA, DHA), ya sea en ácido libre, éster de ácido, forma de triglicérido o fosfolípido, esteroles, ésteres de esterol, aminoácidos, péptidos y proteínas, y glucosaminoglicanos (por ejemplo, sulfatos de condroitina). Opcionalmente también se pueden incorporar otros alimentos antiinflamatorios, tales como los molidos enteros o extractos de los mismos, por ejemplo, cúrcuma (curcumina), jengibre, ajo, clavo, etc.
Las combinaciones formuladas se pueden preparar según métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen la etapa de unir íntimamente el extracto de lípidos de mejillón y/o el aceite de krill con el portador, opcionalmente junto con uno o más ingredientes aditivos. Se entenderá que cualquier portador o aditivo será farmacéuticamente aceptable.
De este modo, en algunas realizaciones, el lípido de mejillón y el aceite de krill se formulan, ya sea por separado o juntos, con un aceite portador, tal como aceite de oliva. En algunas realizaciones, el aceite portador comprende desde aproximadamente 10 % p/p a aproximadamente 90 % p/p, tal como aproximadamente 20 % p/p a aproximadamente 80 % p/p de la combinación o composición. En realizaciones adicionales, el aceite portador comprende aproximadamente 25 % p/p, o aproximadamente 30 % p/p, o aproximadamente 35 % p/p, o aproximadamente 40 % p/p, o aproximadamente 45 % p/p, o aproximadamente 50 % p/p, o aproximadamente 55 % p/p, o aproximadamente 60 % p/p, o aproximadamente 65 % p/p, o aproximadamente 70 % p/p, o aproximadamente 75 % p/p de la combinación o composición. En algunas realizaciones, la proporción en peso de aceite portador a la cantidad combinada de lípido de mejillón y aceite de krill es aproximadamente 3:1, o aproximadamente 2.5:1, o aproximadamente 2:1, o aproximadamente 1.5:1, o aproximadamente 1:1, o aproximadamente 1:1.5, o aproximadamente 1:2, o aproximadamente 1:2.5 o aproximadamente 1:3.
Si bien en este documento se contempla cualquier forma de administración, tal como oral, parenteral, tópica, transdérmica o subdérmica, ventajosamente, en algunas realizaciones las combinaciones de la divulgación pueden proporcionarse y/o administrarse en una forma de dosificación oral. En algunas realizaciones, las combinaciones se pueden presentar en forma a granel, por ejemplo como líquidos, jarabes, pastas, ceras semisólidas, dispersiones, suspensiones, emulsiones (por ejemplo, agua en aceite o aceite en agua), polvos pulverizados o Polvos microencapsulados, a partir de los cuales se pueden medir dosis individuales. La medición y/o administración puede realizarse por cualquier medio, tal como cuchara o pala, jeringa, gotero o taza medidora. Las dosis medidas pueden administrarse al sujeto directamente o mezclarse, verterse o espolvorearse sobre alimentos o bebidas.
En otras realizaciones, las combinaciones se presentan ventajosamente en formas de dosificación orales unitarias, es decir, una forma de dosificación fija. Algunos ejemplos de dosificaciones orales unitarias apropiadas incluyen ampollas, tubos, jeringas llenas, sobres, masticables y cápsulas (incluidas cápsulas de gel duras y blandas) empacados individualmente.
Un ejemplo de una forma de dosificación oral unitaria adecuada es una cápsula, en forma de cubierta dura o blanda. La cubierta puede comprender uno o más de gelatina, pululano, hipromelosa, copolímero de PVA, carragenano u otro componente sacárido tal como almidón o celulosa, o mezclas de los mismos, y puede incluir además agentes colorantes, agentes opacificantes, plastificantes (por ejemplo, sorbitol, xilosa, maltitol y glicerina), etc. Los métodos para encapsular aceites y lípidos marinos, tales como lípidos de mejillón y aceite de krill, son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento WO2015/121378. En algunas realizaciones, donde el aceite de krill se encapsula por separado, el aceite de krill se puede encapsular en ausencia de agentes adicionales opcionales, tales como agentes modificadores de la viscosidad, es decir, el relleno de la cápsula consiste esencialmente en aceite de krill.
En algunas realizaciones ventajosas, las combinaciones de lípidos de mejillón y aceite de krill de la divulgación se presentan en forma de cápsulas de gel blando, por ejemplo, una cápsula de gel blando que comprende tanto el lípido de mejillón como el aceite de krill, o cápsulas de gel blando individuales, donde los lípidos del mejillón y el aceite de krill se encapsulan por separado, opcionalmente junto con portadores y/o aditivos apropiados. Se pueden preparar cápsulas de gel blando apropiadas a partir de gelatina (o alternativamente, fuentes de sacáridos tales como pululano e hipromelosa), opcionalmente con uno o más plastificantes tales como sorbitol y glicerina (glicerol), y aditivos tales como agentes colorantes y opacificantes. En un ejemplo, la cubierta de una cápsula de gel blando puede comprender gelatina y uno o ambos de sorbitol y glicerina.
La microencapsulación es un método mediante el cual pequeñas gotas o partículas se rodean por una pared de recubrimiento o se incrustan en una matriz para formar un polvo, formando el recubrimiento o matriz una barrera funcional que evita o reduce la propensión a reacciones químicas, tales como oxidación. Además, puede desempeñar una función potencial de enmascaramiento del sabor o del olor. De este modo, en algunas realizaciones, el lípido de mejillón y/o el aceite de krill pueden microencapsularse, ya sea por separado o juntos, para formar un polvo. Los métodos de microencapsulación comúnmente usados incluyen emulsificación, secado por pulverización, liofilización, electropulverización coaxial, extrusión, coacervación, tecnología de fluidos supercríticos y polimerización in situ. Los materiales de recubrimiento incluyen polímeros naturales y sintéticos, carbohidratos (por ejemplo, almidones, glucosa), proteínas (por ejemplo, caseína, gelatina) y mezclas de los mismos. (Véase, por ejemplo, Bakry, A. M., et al, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 15, 143, 2016, y las referencias citadas en este, los documentos WO2014/170464 y WO2014/169315). El lípido de mejillón y/o el aceite de krill se pueden microencapsular con uno o más portadores o aditivos como se describió anteriormente. El polvo de lípido de mejillón y/o aceite de krill microencapsulado se puede encapsular adicionalmente, por ejemplo, en una forma de dosificación unitaria de cápsula de cáscara dura. El lípido o aceite microencapsulado en polvo se puede combinar opcionalmente con uno o más portadores o aditivos.
En algunas realizaciones, las combinaciones de la divulgación se pueden tomar con alimentos o bebidas, por ejemplo, pulverizando, agitando, mezclando u otros medios para aplicar o incorporar la combinación de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill en o sobre un alimento o bebida. De este modo, las combinaciones pueden proporcionarse en un formato para incorporarse a una bebida o producto alimenticio. En algunas realizaciones, la combinación también puede formularse en la preparación de alimentos y bebidas para proporcionar alimentos funcionales.
En algunas realizaciones, el lípido de mejillón y el aceite de krill se formulan, ya sea por separado o juntos, con un aceite portador, tal como aceite de oliva, opcionalmente con un antioxidante (por ejemplo, vitamina E).
Los sujetos que se van a tratar mediante las combinaciones de la divulgación incluyen sujetos mamíferos, tales como humanos, primates, felinos, caninos, bovinos, equinos, porcinos, leporinos, ovinos y caprinos, e incluyen animales de ganado (por ejemplo, vacas, caballos, ovejas, cerdos y cabras), animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos, conejos, cobayas) y animales salvajes cautivos. También se contemplan animales de laboratorio tales como conejos, ratones, ratas, cobayas y hámsteres, ya que pueden proporcionar un sistema de prueba conveniente.
Cualquiera de las formas de dosificación descritas anteriormente puede ser aplicable para uso humano o veterinario según corresponda.
Se pretende que una cantidad eficaz de tratamiento incluya una cantidad de la combinación que, cuando se administra según el régimen de dosificación deseado, sea conjuntamente eficaz para alcanzar al menos parcialmente el efecto terapéutico deseado, incluyendo uno o más de: aliviar, eliminar o reducir la duración, gravedad y/o frecuencia de la inflamación y/o uno o más síntomas de inflamación (por ejemplo, calor, dolor, hinchazón, enrojecimiento), prevenir o retrasar la aparición, inhibir la progresión, detener o revertir (parcial o en conjunto) el inicio o la progresión del trastorno o condición particular que se está tratando.
El médico tratante o el veterinario pueden determinar las cantidades de dosificación y los regímenes de dosificación apropiados, y pueden depender de la afección/síntomas particulares que se estén tratando, la gravedad de la afección, así como la edad general, la salud y el peso del sujeto. Las cantidades de dosificación diarias apropiadas del lípido de mejillón y/o aceite de krill pueden estar independientemente en el intervalo desde aproximadamente 10 mg a aproximadamente 10 g, por ejemplo aproximadamente 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg, 1 g , 1.1 g, 1.2g, 1.3 g, 1.4,g, 1.5 g, 1.6 g, 1.7 g, 1.8g, 1.9g, 2.0 g, 2.1 g, 2.2 g, 2.3 g, 2.4 g, 2.5 g, 2.6 g, 2.7 g, 2.8 g, 2.9 g, 3.0 g, 3.2 g 3.5 g, 3.7 g, 4.0 g, 4.5 g, 5.0 g, 5.5 g, 6.0 g, 6.5 g, 7.0 g, 7.5 g, 8.0 g, 8.5 g, 9.0 g, o aproximadamente 9.5 g. En algunas realizaciones adicionales, las dosificaciones diarias de la combinación pueden estar en el intervalo desde aproximadamente 20 mg a aproximadamente 15 g, por ejemplo, aproximadamente 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg, 1 g, 1.1 g, 1.2 g, 1.3 g, 1.4,g, 1.5 g, 1.6 g, 1.7 g, 1.8g, 1.9g, 2.0 g, 2.1 g, 2.2 g, 2.3 g, 2.4 g, 2.5 g, 2.6 g, 2.7 g, 2.8 g, 2.9 g, 3.0 g, 3.2 g 3.5 g, 3.7 g, 4.0 g, 4.5 g, 5.0 g, 5.5 g, 6.0 g, 6.5 g, 7.0 g, 7.5 g, 8.0 g, 8.5 g, 9.0g, 9.5 g, 10.0 g, 10.5 g, 11.0 g, 11.5 g, 12.0 g, 12.5 g, 13.0 g, 13.5 g, 14.0 g, o 14.5 g.
Las dosificaciones se pueden administrar convenientemente una vez al día, o las dosificaciones diarias se pueden dividir y administrar varias veces (por ejemplo, dos, tres o cuatro veces) al día. En algunas realizaciones, las combinaciones de la divulgación se pueden administrar una, dos, tres o más veces por semana, por ejemplo en días alternos. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser continuo o a largo plazo, por ejemplo, durante un período de al menos 6-12 meses o al menos 2-3 años, o continuo.
Las combinaciones de la divulgación, por ejemplo en una cualquiera de las cantidades de dosificación diaria, pueden comprender lípidos de mejillón en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 5 % a aproximadamente 95 % p/p de la cantidad total de lípidos de mejillón y aceite de krill, y comprenden aceite de krill en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 99 % a aproximadamente 1 % del total de lípidos de mejillón y aceite de krill, es decir, una proporción en peso de lípidos de mejillón a aceite de krill desde aproximadamente 5:95 a 99:1. En algunas realizaciones, las combinaciones comprenden lípidos de mejillón en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 5 % a aproximadamente 95 % p/p de la cantidad total de lípidos de mejillón y aceite de krill, y comprenden aceite de krill en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 95 % a aproximadamente 5 % del total de lípidos de mejillón y aceite de krill, es decir, una proporción en peso de lípidos de mejillón a aceite de krill desde aproximadamente 5:95 a 95:5. En algunas realizaciones, las combinaciones comprenden lípidos de mejillón en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 % p/p de la cantidad total de lípidos de mejillón y aceite de krill, y comprenden aceite de krill en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 90 % a aproximadamente 10 % p/p de lípidos de mejillón totales y aceite de krill, es decir, una proporción en peso de lípidos de mejillón a aceite de krill desde aproximadamente 10:90 a 90:10. En otras realizaciones más, las combinaciones comprenden lípidos de mejillón y aceite de krill en una proporción en peso de aproximadamente 15:85, o aproximadamente 20:80, o aproximadamente 25:75, o aproximadamente 30:70, o aproximadamente 35:65, o aproximadamente 40:60, o aproximadamente 45:55, o aproximadamente 50:50, o aproximadamente 55:45, o aproximadamente 60:40, o aproximadamente 65:35, o aproximadamente 70:30, o aproximadamente 75:25, o aproximadamente 80:20, o aproximadamente 85:15.
Si bien las combinaciones de la divulgación pueden administrarse como la única terapia antiinflamatoria para uno o más trastornos, también pueden administrarse junto con un régimen de administración de uno o más NSAlDS, tales como celecoxib, diclofenaco, diflunisal, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, telorolaco, mefenámico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, piroxicam, sulindaco y tolmetina. En algunas realizaciones, las combinaciones de la divulgación pueden eliminar o reducir los posibles efectos adversos asociados con los NSAIDS, por ejemplo, eliminando o eliminando sustancialmente la necesidad de terapia adicional con NSAIDS, o reduciendo las cantidades de dosificación y/o la frecuencia de dosificación de los NSAIDS requeridas para lograr un efecto terapéutico beneficioso
Como se analizó anteriormente, en una o más realizaciones, el aceite de krill usado en las combinaciones divulgadas en este documento puede tener ventajosamente un contenido de fosfolípidos de al menos aproximadamente 40 % p/p, o preferiblemente al menos 50 % p/p, o superior, preferiblemente al menos aproximadamente 60 % p/p, o superior. Muchos procedimientos de la técnica anterior para extraer un aceite de krill con alto contenido de fosfolípidos (por ejemplo, más de aproximadamente 50 % o 60 % p/p) a partir de la harina de krill usan una combinación de CO<2>y CO<2>/etanol. Sin embargo, es bien sabido que cuanto mayor es el contenido de fosfolípidos de un aceite de krill, más viscoso es el aceite de krill, teniendo los aceites de krill un contenido de aproximadamente 60 % o más, por lo general, se presenta como una pasta viscosa a temperatura ambiente. Esto presenta desafíos de fabricación, particularmente a escala industrial o comercial de producción de aceite, ya que se requieren temperaturas más altas para evaporar los disolventes usados en el procedimiento de extracción del material viscoso, con lo que es más probable que se produzcan daños al aceite relacionados con el calor. Adicionalmente, se requieren mayores presiones para transferir el aceite desde los tanques de extracción a los tanques de empaque.
Un procedimiento de ejemplo de la técnica anterior se describe en el documento WO2007123424. Este documento describe un procedimiento de dos etapas, mediante el cual primero se extrae un material de alimentación con CO<2>puro para extraer únicamente lípidos neutros (es decir, triglicéridos no polares), dejando un material que, en virtud de la eliminación de los triglicéridos no polares, está enriquecido en fosfolípidos. Este material enriquecido con fosfolípidos luego se extrae con CO<2>+ s 10 % de codisolvente de etanol para extraer los fosfolípidos polares y los triglicéridos no polares restantes juntos de la biomasa alimentada de krill. Este método usa de manera ineficiente la capacidad de la planta a escala comercial, ya que durante ambas etapas del procedimiento gran parte del volumen en los extractores de alta presión se llena con proteínas no extraíbles, carbohidratos y componentes de cenizas en la biomasa de alimentación. También es fundamentalmente una operación por lotes menos eficiente (en comparación con una operación continua más eficiente), lo que puede afectar negativamente a los costes del procedimiento. Efectivamente, el enriquecimiento para proporcionar un contenido final de fosfolípidos polares en el aceite terminado se logra en la primera etapa, directamente sobre una materia prima sólida no homogénea a granel a escala industrial. Para un enriquecimiento final preciso del aceite se requiere un conocimiento previo preciso del contenido de lípidos polares y no polares del alimento sólido y de qué tan bien se extraerá cada uno posteriormente. En la práctica, la incertidumbre a escala comercial puede traducirse en un sobreenriquecimiento costoso, que luego requiere una mezcla final hasta alcanzar las especificaciones según sea necesario. Nuevamente esto impacta negativamente en la economía del procedimiento.
Los documentos US 9,735,453, US 9,078,905, US 9,028,877, US 9,320,765, y US 9,072,752 describen la extracción de krill con CO<2>o CO<2>más aproximadamente 5 % de etanol para extraer lípidos neutros (triglicéridos no polares), seguido de CO<2>/etanol al 20 % para extraer del material sólido no homogéneo a granel un aceite de krill con altas cantidades de fosfolípidos, ésteres de astaxantina y/o ácidos grasos omega-3. Estos procedimientos comparten las desventajas descritas anteriormente.
La presente divulgación ahora describe un procedimiento que, en algunas realizaciones, puede reducir, minimizar o eliminar una o más de las desventajas discutidas anteriormente cuando se prepara aceite de krill que contiene fosfolípidos alto o enriquecido de acuerdo con los métodos de la técnica anterior, particularmente en un escala industrial o comercial (por ejemplo, cuando se fabrican lotes de aceite del orden de al menos aproximadamente 50, 100, 200, 300 o 500 kg y mayores). Por lo tanto, la presente divulgación también proporciona un procedimiento para preparar aceite de krill con un contenido de fosfolípidos de al menos aproximadamente 50 % p/p, o superior, preferiblemente hasta un nivel de al menos aproximadamente 60 % p/p o superior, y un procedimiento para enriquecer un aceite con un contenido de fosfolípidos más bajo (menor que aproximadamente 50 % p/p) hasta un nivel de al menos aproximadamente 50%p/p o superior, preferiblemente hasta un nivel de al menos aproximadamente 60%p/p o superior.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un procedimiento de 2 etapas para preparar un aceite de krill que tiene un contenido de fosfolípidos de al menos aproximadamente 50 % p/p en el que una primera etapa implica extraer un primer aceite de krill, que tiene un contenido de fosfolípidos de menor que aproximadamente 50 % p/p de una biomasa de krill y luego eliminar al menos una proporción de componentes lipídicos no polares (por ejemplo, triglicéridos) del primer aceite de krill para obtener un segundo aceite de krill que esté enriquecido en fosfolípidos (es decir, que tenga un mayor contenido de fosfolípidos) en comparación con el primer aceite de krill.
En contraste con los procedimientos de la técnica anterior discutidos anteriormente, algunas realizaciones del procedimiento comienzan con una extracción no selectiva de aceite del material de alimentación de biomasa de krill. La extracción de lípidos polares (por ejemplo, fosfolípidos) y no polares (por ejemplo, triglicéridos) de la harina sólida se puede lograr usando una mezcla de CO<2>y etanol (por ejemplo, etanol azeotrópico, una mezcla de agua y etanol que comprende aproximadamente un 95 % de etanol).
En algunas realizaciones preferidas, una proporción de masa de al menos aproximadamente 15 % p/p o aproximadamente 20 % p/p de etanol en CO<2>puede usarse, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 17-22 % p/p. En realizaciones adicionales se puede usar una relación de masa de al menos aproximadamente 25 % p/p de etanol en CO<2>, tal como al menos aproximadamente 26 % p/p de etanol, o al menos aproximadamente 27 % p/p de etanol, o al menos aproximadamente 28 % p/p de etanol, o al menos aproximadamente 29 % p/p de etanol, o al menos aproximadamente 30 % p/p de etanol en CO<2>.
En algunas realizaciones, incluida una cualquiera de las otras realizaciones analizadas en este párrafo, las temperaturas de extracción son iguales o inferiores a aproximadamente 60 °C, tal como iguales o inferiores a aproximadamente 55 °C, o iguales o inferiores a aproximadamente 50 °C, o iguales o inferiores a aproximadamente 45 °C, o iguales o inferiores a 40 °C, o iguales o inferiores a 35 °C, o iguales o inferiores a 30 °C para reducir o minimizar ventajosamente el riesgo de degradación del producto. La presión de extracción se puede configurar para garantizar condiciones super, sub y/o casi críticas para la temperatura seleccionada y la proporción de CO<2>a etanol. En algunas realizaciones, la presión está en el intervalo de aproximadamente 200-350 bar, tal como aproximadamente 250-300 bar, aunque presiones más altas, por ejemplo, aproximadamente 400 bar y más, son técnicamente eficaces y también pueden usarse. En algunas realizaciones, el valor o intervalo de presión produce una densidad de disolvente adecuada para garantizar que la extracción de los lípidos no polares no se convierta en una limitación de la velocidad del procedimiento. En algunas realizaciones, las condiciones de presión de extracción se pueden ajustar a lo largo del procedimiento de extracción para moverse entre condiciones súper, sub o casi críticas. En algunas realizaciones, se usan condiciones subcríticas y/o casi críticas, cuyas condiciones variarán dependiendo de la proporción de mezcla binaria de CO<2>a etanol (o proporción de mezcla ternaria en el caso de etanol azeotrópico, que también contiene agua). Los tiempos de extracción pueden ser determinados por los expertos en la técnica y pueden depender, entre otras cosas, de las condiciones de extracción y de la optimización económica deseada. En algunas realizaciones, los tiempos de extracción suelen estar en el intervalo de aproximadamente 1-15 horas, tal como aproximadamente 2-10 horas, tal como aproximadamente 2-5 horas o aproximadamente 3-horas, o aproximadamente 4-5 horas. Esto a su vez puede depender, entre otras cosas, de la cantidad y el tamaño de las partículas del material de alimentación de biomasa. Las partículas más grandes permitirán utilizar mayores caudales de disolvente y al mismo tiempo conservarán una biomasa estática y un contacto uniforme con el disolvente. Sin embargo, una partícula más grande también presenta un mayor requisito de difusión para que el disolvente llegue al centro de las partículas, siendo necesario más disolvente. De este modo, en algunas realizaciones, el tamaño de partícula del material de alimentación es aproximadamente 1-5 mm, tal como aproximadamente 2-3 mm.
En algunas realizaciones adicionales, la presión de extracción es de aproximadamente 300 bar y la temperatura de extracción es de aproximadamente 60 °C.
La separación del aceite se puede realizar a temperaturas más bajas (por ejemplo, aproximadamente 25-35 °C) y presiones (por ejemplo, aproximadamente 25-60 bar)
El aceite extraído resultante contiene lípidos tanto polares (por ejemplo, fosfolípidos) como no polares (por ejemplo, triglicéridos), y puede tener un contenido de fosfolípidos menor que aproximadamente 50 % p/p, o menor que aproximadamente 45 % p/p, o menor que aproximadamente 40 % p/p, o menor que aproximadamente 35 % p/p, o menor que aproximadamente 30 % p/p, o menor que aproximadamente 25 % p/p, o menor que aproximadamente 20 % p/p, o menor que aproximadamente 10 % p/p.
En algunas realizaciones ventajosas, el agua y el etanol presentes en el aceite se pueden eliminar usando cualquier método apropiado, tal como evaporación al vacío (opcionalmente con calentamiento suave, por ejemplo aproximadamente 65 °C o menos), corriente de nitrógeno o liofilización. En algunas realizaciones, el aceite se somete a evaporación al vacío, opcionalmente con calentamiento suave. A esto le puede seguir además un tiempo de residencia corto (por ejemplo, 1-3 segundos) a una temperatura más alta (por ejemplo, aproximadamente 70 °C, aproximadamente 75 °C o aproximadamente 80 °C) para eliminar el agua y el codisolvente de etanol de la baja viscosidad. mezcla de lípidos polares y no polares, la alta proporción de lípidos no polares proporciona la baja viscosidad. En algunas realizaciones preferidas, las temperaturas ventajosamente no exceden aproximadamente 60 °C, durante el suave calentamiento al vacío, para evitar o minimizar la degradación de los componentes del aceite extraído. En realizaciones adicionales, las temperaturas durante el calentamiento suave al vacío no exceden ventajosamente de aproximadamente 55 °C, o aproximadamente 50 °C o aproximadamente 45 °C, o aproximadamente 40 °C, o aproximadamente 35 °C, o aproximadamente 30 °C, o aproximadamente 25 °C.
En algunas realizaciones, el contenido volátil residual (agua y etanol) después de la evaporación es aproximadamente o menor que aproximadamente 3 % p/p, ya que esto puede minimizar la posibilidad de que el etanol y el agua residuales afecten negativamente a la separación de los lípidos en la etapa posterior de enriquecimiento. En realizaciones adicionales, el contenido volátil residual es aproximadamente o menor que aproximadamente 2.5 % p/p, o aproximadamente o menor que aproximadamente 2.0 % p/p, o aproximadamente o menor que aproximadamente 1.5 % p/p, o aproximadamente o menor que aproximadamente 1.0 % p/p, o menor que aproximadamente 0.5 % p/p, o menor que aproximadamente 0.3 % p/p, o menor que aproximadamente 0.1 % p/p.
En esta fase, después de la evaporación, debido a la presencia de los componentes lipídicos no polares, el aceite todavía es fluido y puede analizarse fácilmente, por ejemplo, para el contenido de fosfolípidos y/o ácidos grasos omega-3. Esto es importante ya que se requiere un análisis preciso para calcular el grado de enriquecimiento deseado y, por tanto, el contenido de fosfolípidos del aceite final logrado en la siguiente etapa. En particular, cuando se desea un alto contenido final de fosfolípidos, el sobreenriquecimiento (es decir, una mayor eliminación de lípidos no polares), incluso por márgenes pequeños, puede conducir a problemas de procesamiento debido a una viscosidad excesiva. El aceite evaporado se puede mezclar completamente para asegurar la homogeneidad, opcionalmente después de transferirlo a tanques de producto intermedio. Opcionalmente, el aceite se puede calentar suavemente (por ejemplo, a una temperatura menor que o aproximadamente 60 °C, 55 °C, o aproximadamente 50 °C o aproximadamente 45 °C, o aproximadamente 40 °C, o aproximadamente 35 °C, o aproximadamente 30 °C, o aproximadamente 25 °C) para ayudar a mantener un material fluido y homogéneo para el análisis. La naturaleza menos viscosa del aceite no enriquecido obtenido mediante la extracción de CO<2>/EtOH en la primera etapa en comparación con la biomasa sólida en masa de la primera etapa usada en los procedimientos de la técnica anterior discutidos anteriormente, puede, en algunas realizaciones, permitir ventajosamente un análisis de composición más preciso ya que la homogeneidad en masa puede lograrse más fácilmente. En algunas realizaciones, esto puede evitar, minimizar o reducir ventajosamente el sobreenriquecimiento de fosfolípidos en la posterior extracción selectiva de lípidos no polares, que de otro modo podría dar como resultado un producto sólido indeseablemente viscoso o inamovible.
La segunda etapa del procedimiento implica la extracción preferida o selectiva de los lípidos no polares (triglicéridos) del aceite obtenido en la primera etapa. Si el aceite no enriquecido obtenido en la primera etapa de extracción ha sido transferido a tanques intermedios, se devuelve a la instalación de extracción. El aceite se somete además a extracción con CO<2>, en algunas realizaciones preferidas en condiciones supercríticas, por ejemplo, a o más de aproximadamente 300 bar y a aproximadamente 60 °C, para extraer selectivamente los lípidos no polares (triglicéridos). En algunas realizaciones, la extracción puede comenzar con una presión más baja y luego aumentarse gradualmente hasta el nivel deseado (por ejemplo, aproximadamente 300 bar). Los lípidos no polares (triglicéridos) se pueden extraer progresivamente, enriqueciendo así el refinado restante, hasta que se consiga el objetivo de composición requerido, por ejemplo un contenido de fosfolípidos de al menos aproximadamente 50 % p/p, o al menos aproximadamente 55 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 60 % p/p de fosfolípidos o al menos aproximadamente 65 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 70 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 75 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 80 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 85 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 90 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 95 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 97 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 98 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 99 %, p/p de fosfolípidos.
En algunas realizaciones, una vez que se ha extraído la cantidad requerida de lípido no polar para lograr el nivel deseado de enriquecimiento de fosfolípidos, despresurizar parcialmente el recipiente de extracción permite que la presión restante ayude en la descarga del refinado ahora enriquecido (y más viscoso) según sea necesario. El drenaje de aceite enriquecido de alta viscosidad se puede tolerar en mayor medida drenando desde un extractor todavía parcialmente presurizado. De esta manera, se pueden transferir materiales extremadamente viscosos para su posterior mezcla y formulación.
En una o más realizaciones, el procedimiento puede permitir un procesamiento semicontinuo, con recipientes de extracción individuales que se cambian en una rotación continua, pero uno a la vez mientras otros recipientes de extracción continúan funcionando. De esta manera, se puede evitar detenerse para cambiar varios lotes de extractores.
En otras realizaciones, la segunda etapa descrita en este documento se puede usar para enriquecer el contenido de fosfolípidos de cualquier aceite de krill que tenga un contenido de fosfolípidos menor que aproximadamente el 50 %, p/p, con el fin de obtener un aceite de krill que tenga un contenido de fosfolípidos. de al menos aproximadamente 50 % p/p.
En algunas realizaciones, el aceite de krill de partida tiene un contenido de fosfolípidos de aproximadamente 45%p/p o menos, o aproximadamente 40 % p/p o menos, o aproximadamente 35 % p/p o menos, o aproximadamente 30 % p/p o menos, o aproximadamente 25 % p/p o menos, o aproximadamente 20 % p/p o menos, o aproximadamente 10 % p/p, o menos. En algunas realizaciones, el aceite enriquecido final puede tener un contenido de fosfolípidos de al menos aproximadamente 55 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 60 % p/p de fosfolípidos o al menos aproximadamente 65 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 70 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 75 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 80 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 85 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 90 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 95 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 97 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 98 % p/p de fosfolípidos, o al menos aproximadamente 99 %, p/p de fosfolípidos.
En algunas realizaciones, el aceite de krill enriquecido tiene un contenido de agua final de aproximadamente 5 % p/p o menos, o aproximadamente 4, o 3, o 2 o 1, o 0.5 % p/p, o menos. En algunas realizaciones, el aceite de krill tiene un contenido de disolvente de extracción residual de aproximadamente 5 % p/p o menos, o aproximadamente 4, o 3, o 2 o 1, o 0.5 % p/p, o menos. En realizaciones adicionales, el aceite de krill tiene un contenido de agua de aproximadamente 5 % p/p o menos, o aproximadamente 4, o 3, o 2 o 1, o 0.5 % p/p, o menos, y un contenido de disolvente de extracción residual de aproximadamente 5 % p/p o menos, o aproximadamente 4, o 3, o 2 o 1, o 0.5 % p/p, o menos. En aún otras realizaciones, el krill enriquecido tiene un contenido de disolvente residual (agua y etanol) del 5 % p/p o menos, o aproximadamente 4, o 3, o 2 o 1.5, o 1, o 0.5, o 0.3 o 0.1 % p/p, o menos.
En otras realizaciones más, el aceite de krill enriquecido final tiene un contenido de fosfolípidos de al menos aproximadamente 60 % p/p de fosfolípidos y un contenido de disolvente residual de aproximadamente 3 % p/p o menos.
Otras realizaciones relacionadas con el aceite de krill como se describe en este documento también pueden, según corresponda, aplicarse al aceite de krill producido mediante el procedimiento de la divulgación.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de ilustrar algunas realizaciones de la divulgación y no pretenden limitar la generalidad descrita anteriormente en este documento.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Preparación de aceite de Krill fosfolípido al 62 % p/p
1. Extracción de aceite de krill a partir de harina de krill.
La harina de krill se extrajo con CO<2>/etanol (proporción de alimentación de etanol a harina de krill de aproximadamente 3.0-3.5: 1 p/p), con una fracción de masa de etanol en el intervalo de aproximadamente 17-22 % p/p, a una temperatura de 60 °C y una presión de 300 bar. La extracción en la fase de etanol/CO<2>tuvo una duración entre 10 y 15 horas. La mezcla de aceite extraído/CO<2>/EtOH se separó a una presión de 45 bar y 25 °C.
Se mezclaron varios lotes de aceite obtenidos mediante este método para obtener un aceite de krill que contenía componentes tanto polares como no polares y que tenía un contenido de fosfolípidos de aproximadamente el 42 % (véase la tabla 1-1 a continuación).
Tabla 1-1: Análisis de PL por 31P RMN en una muestra de aceite de krill
(continuación)
2. Extracción selectiva de triglicéridos del aceite de krill obtenido de la etapa 1.
Se cargaron 5.9 kg de aceite de krill de alimentación (que tenía la composición establecida en la tabla 1-1 anterior) directamente en un único recipiente de extracción de 10.7 L (diámetro de 155 mm). El material de alimentación se extrajo con CO<2>a una temperatura de 60 °C y una presión de 300 bar.
Se recuperaron extractos, que contenían principalmente triglicéridos, y eran significativamente menos viscosos que el aceite de krill de alimentación que se cargó en el recipiente de extracción.
El procedimiento de despresurización del recipiente de extracción se inició una vez que la masa total de material extraído alcanzó el 97 % de la cantidad teórica de material que se podía extraer. La instalación se despresurizó a una tasa de rampa constante durante un período de 15 minutos de 300 a 100 bar, continuando la circulación de CO<2>, aunque al 50 % del caudal de extracción. Durante este tiempo, la temperatura medida a la salida del extractor se redujo de la temperatura de funcionamiento de 60 °C a 50 °C. Luego se volvió a despresurizar el extractor de 100 a 75 bar durante un período de otros 15 minutos sin que la bomba estuviera en funcionamiento. A continuación se vació el contenido del recipiente de separación.
Mientras el recipiente de extracción todavía estaba a la temperatura de procesamiento y 75 bar de presión, el recipiente se vació de su contenido de aceite de krill enriquecido desde la base del recipiente extractor muy por debajo del nivel de la superficie del refinado, evitando así la pérdida de CO<2>a alta presión con drenando el aceite refinado. La recuperación del aceite enriquecido tomó aproximadamente una hora y en ese tiempo la presión del recipiente disminuyó de 75 a 54 bar a medida que el CO<2>restante en el recipiente de extracción se expandió para ocupar el espacio previamente ocupado por el aceite refinado.
Una vez finalizada la descarga de aceite enriquecido, se observó que algo de aceite de krill enriquecido quedaba en el recipiente de extracción en el distribuidor y en la superficie del fondo del recipiente, lo que se estimó en menos del 2 % de la masa total de aceite enriquecido. A escala comercial, el aceite restante se recupera en el siguiente lote de aceite de krill para ese extractor.
Antes del análisis de astaxantina y fosfolípidos, el aceite enriquecido se calentó en un horno a 55 °C, durante 1 hora. Esto permitió que la muestra fuera lo suficientemente fluida para agitarla y lograr una muestra homogénea para el análisis.
La tabla 1-2 resume la masa y los contenidos de fosfolípidos (PL) y astaxantina (Asta) para los aceites de alimentación, extraídos y enriquecidos. Se coextrajo muy poco fosfolípido (<1 g/100 g de extracto) y astaxantina (<2 mg/100 g de extracto). En general, la masa de extracto obtenida del procedimiento de enriquecimiento fue el 98 % del extracto teórico requerido para un enriquecimiento del 62 % de fosfolípidos.
Tabla 1-2: Sumario del contenido de fosfolípidos (PL) y astaxantina (Asta)
Las tablas 1-3 y 1-4 resumen el contenido composicional del aceite enriquecido.
Tabla 1-3: Análisis de PL por 31P RMN en una muestra de aceite de krill
Tabla 1-4: Análisis GC de ácidos grasos
(continuación)
Ejemplo 2 -Se preparó extracto de lípidos de mejillón según el documento WO97/09992 y se usó en forma de PCSO-524® (Pharmalink International Limited, Hong Kong). Se preparó aceite de krill mediante el procedimiento del ejemplo 1, que tenía el contenido de composición establecido en las tablas 1-3 y 1-4 anteriores.
Preparación de la muestra
Se prepararon muestras frescas diariamente. Las muestras se mezclaron por inversión antes del muestreo. Las muestras se pesaron en tubos de centrífuga de 1.5 mL y se llevaron a 100 mg/mL con etanol para preparar la solución madre. Las mezclas de solución madre se prepararon pesando los aceites en la proporción correcta y luego completando hasta la concentración con etanol. Se realizaron diluciones en serie de la solución madre en etanol. Luego, las diluciones en serie se diluyeron (1 en 100) en medio de cultivo celular antes de agregarlas a las células (por triplicado) con una dilución final de 1 en 10. Esto resultó en una concentración etanoica del 0.1 % para todas las dosis y controles. El aceite de krill contenía aproximadamente un 62 % p/p de fosfolípidos. Se usó extracto de lípidos de mejillón en forma de PCSO-524®.
Las abreviaturas usadas para presentar los resultados se establecen en la tabla 2-1 a continuación:
Tabla 2-1: Abreviaturas
Ensayos
La actividad antiinflamatoria se determinó en macrófagos murinos estimulados con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFNy), células RAW264.7 cultivadas en medios de cultivo celular estándar e incubadas con LPS e IFNy en presencia o ausencia de diferentes compuestos/extractos de prueba y controles positivos. La producción de mediadores inflamatorios, incluidos NO, PGE<2>y LTB<4>, citocinas TNFa e IL-6, se midió mediante métodos establecidos usando kits comerciales. Cada muestra se analizó con al menos 3 concentraciones (usando 3 réplicas, la concentración máxima fue 100 |ig/ml)(n=9), con controles internos relevantes (Tabla 2-2). La citotoxicidad de cada muestra también se determinó mediante el ensayo MTT. No se detectó citotoxicidad para ninguna concentración probada.
Los parámetros de ensayo para cada ensayo se resumen en la tabla 2-2. Brevemente, para realizar el ensayo antiinflamatorio, las células RAW264.7 cultivadas se contaron y se sembraron (0.8X105 células/pocillo) en placas de 96 pocillos y se incubaron durante el tiempo de siembra indicado. Luego se aspiró el medio y se reemplazó con medio nuevo seguido de la adición de los compuestos de prueba. Los compuestos se incubaron durante 1 h antes de la adición del estimulante. Luego se incubaron las placas durante entre 4 y 18 h y se analizó el sobrenadante para determinar el mediador de interés; la viabilidad celular restante se determinó por MTT.
Los controles positivos se seleccionaron en función de su uso generalizado en ensayos similares, incluida la N-(3-(aminometil)bencil)acetamidina (1400 W), un inhibidor de unión lenta y estrecha de la óxido nítrico sintasa inducible (¡NOS) (Garvey, E. P., et al, J Biol Chem, 1997, 21:272(8):4959-63, y dexametasona, un inhibidor de citocinas comúnmente utilizado. El diclofenaco es un agente antiinflamatorio no esteroideo común y un conocido inhibidor de la ciclooxigenasa (COX) que produce PGE2.
Tabla 2-2: - Parámetros del ensayo
Resultados
1. Ensayo de óxido nítrico
El NO es un metabolito radical, que se ha demostrado que tiene numerosas funciones fisiológicas tanto como molécula de señalización como agente tóxico en la inflamación (Coleman, 2001). El NO se deriva de la oxidación de L-arginina por tres tipos de óxido nítrico sintasas (NOS); las formas constitutivas, NOS neuronal y NOS endotelial, y la forma inducible, iNOS, descrita originalmente en macrófagos murinos (Nathan & Xie, 1994; Stuehr & Marietta, 1985). La forma inducible se activa continuamente una vez expresada y, por lo tanto, está regulada a nivel de transcripción por NF-kB, estimulada por moléculas inflamatorias como LPS e IFN-a. La producción de NO por iNOS experimenta un retraso de horas antes de que NO se produzca en niveles sostenidos mucho más altos (nM) (Nathan y Xie, 1994). La forma inducible de NOS probablemente esté implicada en la inflamación y, debido a los niveles más altos de NO producido, se evalúa más fácilmentein vitro.
El NO es una molécula de señalización inusual. Como no existe un receptor específico en la superficie celular para el NO, este ingresa a las células de manera indiscriminada, donde el efecto depende del tipo de célula y de la concentración de NO, produciendo de este modo una amplia gama de respuestas fisiológicas. El NO provoca un aumento de la permeabilidad vascular, vasodilatación y generación de radicales que provocan daño tisular y eliminan patógenos (Guzik, Korbut and Adamek-Guzik, 2003). Estos cambios fisiológicos están asociados con la inflamación con un aumento del flujo sanguíneo, lo que permite que más células inmunes ingresen al tejido afectado, destruyendo así el patógeno.
Los resultados del ensayo de inhibición de NO se representan en las figuras 1A y 1B y en la tabla 2-3.
Tabla 2-3: IC<50>para la inhibición de NO
2. Factor de necrosis tumoral alfa
TNFa es una proteína de señalización celular (citocina) implicada principalmente en la respuesta inflamatoria de fase aguda. Los macrófagos son la principal fuente de TNFa, aunque muchos otros tipos de células, tales como los linfocitos CD4+, pueden liberarlo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos, mastocitos, eosinófilos y neuronas. TNFa se produce mediante la activación de MAPK y NF-kB. Actúa aumentando su propia producción y la de otras citoquinas inflamatorias tales como la interleucina-1 beta (IL-1P). El TNFa induce fiebre, muerte celular apoptótica, caquexia, inflamación e inhibe la tumorigénesis y la replicación viral. El TNFa está implicado en muchas enfermedades, entre ellas sepsis, lesiones traumáticas, isquemia, asma, quemaduras, síndrome del intestino irritable, enfermedad de Alzheimer, cáncer, depresión mayor, artritis y esclerosis múltiple (Cairns, Panacek, Harken and Banerjee, 2000; Dowlati et al., 2010; Swardfager et al., 2010).
Los resultados del ensayo de inhibición de TNFa se representan en las figuras 2A y 2B y en la tabla 2-4.
Tabla 2-4: IC<50>ara la inhibición de TNFa
3. Interleucina-6
Al igual que TNFa, la IL-6 se considera una citocina proinflamatoria. La IL-6 es secretada por células T y macrófagos que estimulan una respuesta inmune. IL-6 es responsable del aumento de la producción de neutrófilos en la médula ósea. Apoya el crecimiento de las células B y es antagonista de la diferenciación de las células T en células T reguladoras. Es capaz de cruzar la barrera hematoencefálica e iniciar la síntesis de PGE<2>en el hipotálamo, cambiando así el punto de ajuste de la temperatura corporal (Banks, Kastin and Gutiérrez, 1994).
Los resultados del ensayo de inhibición de IL-6 se representan en las figuras 3A y 3B y en la tabla 2-5.
Tabla 2-5: IC<50>para inhibición de IL-6
4. Prostaglandina E<2>
La prostaglandina E<2>(PGE<2>) es uno de los mediadores lipídicos producidos a partir del ácido araquidónico (AA) por la acción de la enzima ciclooxigenasa (COX) y participa en la inducción de pirexia, sensación de dolor e inflamación. La aspirina y los fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAIDS) inhiben la biosíntesis de prostanoides (incluida la PGE<2>), lo que produce efectos antipiréticos, analgésicos y antiinflamatorios (Kawahara, K., et al, 2015, y Kawabata, A., 2011).
Los resultados se representan en las figuras 4A y 4B y en la tabla 2-6.
Tabla 2-6: IC<50>para inhibición de PG-E<2>
Sumario de Resultados
Se demostró que el extracto de lípidos de mejillón y el aceite de krill en este sistema de ensayo a las concentraciones probadas inhiben individualmente NO, TNFa e IL-6, pero no PGE<2>.
La combinación de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill fue más eficaz que el extracto de lípidos de mejillón o el aceite de krill solo para inhibir NO, TNFa e IL-6. En el ensayo PGE<2>, ni el extracto de lípidos de mejillón ni el aceite de krill por sí solos demostraron actividad inhibidora, pero en combinación demostraron inhibición.
Ejemplo 3: Sinergia
Se preparó extracto de lípidos de mejillón según el documento WO97/09992 y se usó en forma de PCSO-524®. Se preparó aceite de krill mediante el procedimiento del ejemplo 1, que tenía el contenido de composición establecido en las tablas 1-3 y 1-4 anteriores.
Muestras, preparación y combinación.
Se mezclaron muestras madre de PCSO-524® y aceite de krill con alto contenido de fosfolípidos mediante inversión antes del muestreo experimental. Las muestras se pesaron en tubos de centrífuga de 15 ml y se llevaron a 100 mg/ml con etanol para preparar la solución madre. Las mezclas se prepararon mezclando los aceites diluidos en la proporción correcta. Se realizaron diluciones seriadas en etanol. Las diluciones en serie se diluyeron luego (1 en 100) en medio de cultivo celular antes de agregarlas a las células (por triplicado) con un final 1 en 10 diluciones. Esto resultó en una concentración etanoica del 0.1 % para todas las dosis y controles. Estas dosis se prepararon diariamente. La tabla 3 1 muestra las abreviaturas usadas para cada muestra.
Tabla 3-1: Abreviaturas de nombres de muestra
Ensayos
La actividad antiinflamatoria se determinó en macrófagos murinos estimulados con lipopolisacárido (LPS) e interferón y (IFNy), células RAW264.7 cultivadas en medios de cultivo celular estándar (DMEM, suero bovino fetal al 5 %) e incubados en presencia o ausencia de diferentes compuestos/extractos de prueba y controles. La producción de mediadores inflamatorios, incluido el NO, las citoquinas TNFa e IL-6, se midió mediante métodos establecidos usando kits ELISA comerciales (los proveedores se enumeran en
la tabla 3-2). Cada muestra se analizó con al menos 6 concentraciones (usando 3 réplicas, la concentración máxima fue de 100 |ig/mL) (n=9), con controles internos relevantes (que se muestran en
la tabla 3-2). La citotoxicidad de cada muestra analizada se determinó mediante el ensayo MTT. No se detectó citotoxicidad para ninguna concentración probada.
Los parámetros de ensayo para cada ensayo se resumen en
Tabla 3-2. Brevemente, para los ensayos de NO, TNFa e IL-6, las células RAW264.7 cultivadas se contaron y se sembraron (0.8 x 105 células/pocillo) en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 48 h. Luego se aspiró el medio y se reemplazó con medio nuevo seguido de la adición de los compuestos de prueba. Los compuestos se incubaron durante 1 h antes de la adición del estimulante. Luego, las placas se incubaron durante 18 h y el sobrenadante se analizó para determinar el mediador de interés; la viabilidad celular restante se determinó mediante MTT.
Los controles positivos se seleccionaron en función de su uso generalizado en ensayos similares, incluida la N-(3-(aminometil)bencil)acetamidina (1400 W), un inhibidor de unión lenta y estrecha de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). (Garvey et al., 1997) y dexametasona, un inhibidor de citocinas de uso común.
Tabla 3-2: Ensayos antiinflamatorios y controles positivos
Cálculos de sinergia
El sinergismo se expresa como un índice de combinación. El índice de combinación de sinergismo (CI) y el isobolograma IC50. Las ponderaciones se calcularon usando el software Compsyn. La curva dosis-respuesta generada en Graphpad Prism se transformó en 10 puntos que representan la curva. Estos 10 puntos luego se ingresaron en el programa Compsyn que generó una curva para ajustarse a los puntos de datos. Este método era preferible para replicar fielmente la curva dosis-respuesta completa en el programa de sinergia. Luego se usó la curva de ajuste de Compsyn para los cálculos de sinergia. El patrón de sinergia en el intervalo probado se puede observar con un isobolograma, que representa la contribución relativa de cada componente a la actividad en el IC50. Se traza una línea recta entre los dos fármacos que se mezclan (Biavatti, 2009). Los valores debajo de la línea indican sinergia, sobre la línea se considera aditivo y por encima de la línea es antagónico.
Resultados
1. Ensayo de óxido nítrico
Se analizaron las combinaciones para determinar si demostraban una inhibición sinérgica en la molécula de señalización inflamatoria NO. Las combinaciones se probaron primero en incrementos del 10 %. La combinación más activa observada fue LY60. Luego se probaron incrementos adicionales del 5 % aproximadamente LY60.
Las curvas de respuesta a la dosis de las combinaciones probadas LY90-LY10 se representan en las figuras 5A, 5B, 6A y 6B. Los valores de IC50 para la inhibición de NO y el índice de combinación se presentan en las tablas 3-3 y 3 4. Un índice de combinación menor que 1 indica sinergia. El isobolograma para los incrementos del 10 % se muestra en la figura 7.
Tabla 3.3: Valores de IC5Q para la inhibición de NO délas combinaciones LY90 a LY10
Tabla 3-4:IC5Q (CI)e índice de combinación para la inhibición de NO de las combinaciones LY75a LY45
2. ensayo de TNFa
Las combinaciones se analizaron para determinar si demostraban una inhibición sinérgica de la citocina inflamatoria TNFa. Las combinaciones se probaron primero en incrementos del 10 %. La combinación más activa observada fue LY50. Luego se probaron incrementos adicionales del 5 % alrededor de LY50.
Las curvas de respuesta a la dosis de las combinaciones probadas LY90-LY10 se representan en las figuras 8A, 8B, 8C, 9A y 9B. Los valores de IC50 para la inhibición del TNFa y el índice de combinación se presentan en las tablas 3 5 y 3-6. Un índice de combinación menor que 1 indica sinergia. El isobolograma para los incrementos del 10 % se muestra en la figura 10.
Tabla 3-5: Valores de ICso (Cl) para la inhibición de TNF
*- no e s p o sibl e re 3 Nza r un a esti mador
Tabla 3-6: IC50 y Cl para LY75 - LY45 (n=9}
3. ensayo de IL-6
Las combinaciones se analizaron para determinar si demostraban una inhibición sinérgica en la citocina inflamatoria IL-6. Las combinaciones se probaron primero en incrementos del 10 %. La combinación más activa observada fue LY60. Luego se probaron incrementos adicionales del 5 % alrededor de LY60.
Las curvas de respuesta a la dosis de las combinaciones probadas LY90-LY10 se representan en las figuras 11A, 11B, 12A y 12B. Los valores de IC50 para la inhibición de IL-6 y el índice de combinación se presentan en las tablas 3-7 y 3-8. Un índice de combinación menor que 1 indica sinergia. El isobolograma para los incrementos del 10 % se muestra en la figura 13.
Se demostró en este sistema de ensayo que el extracto de lípidos de mejillón y el aceite de krill, usados en combinación, cumplen los criterios matemáticos de sinergia en la inhibición de NO, TNFa e IL-6.
Ejemplo 4: estudio de pacientes
A los pacientes que padecían una variedad de dolores/afecciones inflamatorias se les administró una combinación de extracto de lípidos de mejillón (en forma de PCSO-542) y aceite de krill (61 % de PL) en una proporción de PCSO-542 a aceite de krill de 75:25, en forma de cápsula. La composición de dichas cápsulas se presenta en la tabla 4-1.
Tabla 4-1: Com osición de cá sulas de mezcla de aceites de 150 m
Por lo general la dosificación osciló entre 2-8 cápsulas por día, en una, dos o tres dosificaciones. Antes de comenzar el tratamiento con la combinación, los pacientes por lo general habían estado tomando uno o más NSAIDS, incluidos el paracetamol o el ibuprofeno, para controlar el dolor. Los resultados se muestran en la tabla 4-2.
Tabla 4-2: Sumario de los resultados de los pacientes
continuación
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Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Una combinación que comprende extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill, en la que la combinación está adaptada para administración separada o simultánea, en la que el extracto de lípidos de mejillón se obtiene dePerna canaliculus,y en la que la proporción en peso de extracto de lípidos de mejillón a aceite de krill está en el intervalo de 5:95 a 99:1.
2. La combinación según la reivindicación 1 en forma de una composición que comprende extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill.
3. La combinación según la reivindicación 1 o 2, en la que el aceite de krill tiene un contenido de fosfolípidos de al menos aproximadamente 40 % p/p, o al menos aproximadamente 50 % p/p, o al menos aproximadamente 60 % p/p.
4. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el aceite de krill tiene un contenido de agua de aproximadamente 5 % p/p o menos, o aproximadamente 3 % p/p o menos, o aproximadamente 1 % p/p o menos; y/o
un contenido de disolvente de extracción de aproximadamente 5 % p/p o menos, o aproximadamente 3 % p/p o menos, o aproximadamente 1 % p/p o menos.
5. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la proporción en peso de extracto de lípidos de mejillón a aceite de krill está en el intervalo de aproximadamente 5:95 a 95:5, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 10:90 a 90:10, tal como aproximadamente 10:90, o aproximadamente 15:85, o aproximadamente 20:80, o aproximadamente 25: 75, o aproximadamente 30:70, o aproximadamente 35:65, o aproximadamente 40:60, o aproximadamente 45:55, o aproximadamente 50:50, o aproximadamente 55:45, o aproximadamente 60:40, o aproximadamente 65:35, o aproximadamente 70:30, o aproximadamente 75:25, o aproximadamente 80:20, o aproximadamente 85:15, o aproximadamente 90:10.
6. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en forma de dosificación unitaria oral.
7. La combinación según la reivindicación 6, en la que la forma de dosificación unitaria oral es una cápsula de gel blando.
8. La combinación según la reivindicación 6 o 7, en la que la forma de dosificación unitaria oral comprende desde aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1.0 g de extracto de lípidos de mejillón; y/o
desde aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1.0 g de aceite de krill.
9. La combinación según la reivindicación 8, en la que la forma de dosificación unitaria oral comprende aproximadamente 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg o aproximadamente 1.0 g de extracto de lípidos de mejillón; y/o
aproximadamente 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg o 1.0 g de aceite de krill.
10. La combinación según la reivindicación 9, en la que la forma de dosificación unitaria oral comprende desde aproximadamente 10 mg a aproximadamente 500 mg de extracto de lípidos de mejillón; y/o desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 500 mg de aceite de krill.
11. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la forma de dosificación unitaria oral comprende aproximadamente 10-500 mg de la combinación de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill.
12. La combinación según la reivindicación 11, en la que la forma de dosificación unitaria oral comprende aproximadamente 50-300 mg de la combinación de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill.
13. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende además uno o más portadores y/o aditivos farmacéuticamente aceptables.
14. La combinación según la reivindicación 13, que comprende un aceite portador y opcionalmente un antioxidante.
15. La combinación según la reivindicación 14, en la que el aceite portador es aceite de oliva.
16. La combinación según la reivindicación 14 o 15, en la que el aceite portador comprende desde aproximadamente 10 % p/p a aproximadamente 90 % p/p de la composición total.
17. La combinación según la reivindicación 14 o 15, en la que la proporción en peso de aceite portador a la cantidad combinada de extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill es desde aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:3.
18. La combinación según la reivindicación 13, en la que el uno o más aditivos se seleccionan entre antioxidantes, vitamina A, vitamina D, vitamina E y vitamina K.
19. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 que consiste o consiste esencialmente en extracto de lípidos de mejillón y aceite de krill.
20. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 para su uso en el tratamiento de la inflamación en un sujeto.
21. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 para su uso en el tratamiento del dolor en un sujeto.
22. La combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 para su uso en el tratamiento del dolor articular o la mejora de la movilidad articular asociada con la osteoartritis o la artritis reumatoide en un sujeto.
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