RS64705B1 - Kompozicije koje sadrže ekstrakt lipida dagnјi i ulje krila, i nјihove medicinske primene - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na kombinacije morskih lipida. Posebno, pronalazak se odnosi na kombinaciju lipida dobijenih iz perna canaliculus i krila, kompozicije i preparate koji sadrže pomenute kombinacije i primenu navedenih kombinacija i kompozicija u lečenju. Pronalazak se dalje odnosi na procese za proizvodnju ulja krila i njihovu upotrebu u kombinacijama i kompozicijama.

STANJE TEHNIKE

[0002] Upala je neophodan fiziološki adaptivni odgovor na povrede i infekcije, bez koga ljudi i životinje ne bi mogli da prežive. Njena funkcija je da eliminiše početni uzrok povrede, ukloni štetne faktore i započne popravku strukture i funkcije tkiva. Njenu ranu akutnu fazu obično karakterišu groznica, bol, crvenilo i otok. Uobičajeni ishod akutne upale je restauracija i popravka oštećenja, međutim, nesrazmerni akutni i dugotrajni hronični inflamatorni odgovori u uslovima kao što je sepsa mogu biti štetni.

[0003] Važno je da je hronična upala sada uključena u patologiju velikog broja bolesti koje utiču na sva tkiva i organe uključujući osteoartritis, reumatoidni artritis, kardiovaskularne bolesti, cerebrovaskularne bolesti, respiratorne bolesti, autoimune bolesti i sarkopeniju; zaista, hronična upala je uključena i u sam proces starenja.

[0004] Kao odgovor na upalni proces, došlo je do razvoja niza lekova, od kojih su najefikasniji glukokortikoidni steroidni lekovi koji su sposobni da suzbiju prekomernu upalu. Međutim, terapija steroidima je ograničena u svojoj širokoj kliničkoj upotrebi zbog značajnih nuspojava i generalno je ograničena samo na kratkotrajnu upotrebu. Druga klasa inflamatornih lekova je razvijena pod nazivom nesteroidni antiinflamatorni lekovi (NSAIL) kao što je ibuprofen i sl. - videti Tabelu 1. Utvrđeno je da aspirin ima antiinflamatorno dejstvo i da je deo ove druge klase antiinflamatornih lekova. Ovi lekovi su bili bezbedniji od steroidnih lekova i mogli su se koristiti za hronična upalna stanja, kao što je osteoartritis.

Tabela 1: Spisak uobičajeno korišćenih nesteroidnih antiinflamatornih lekova (NSAIL)

[0005] Prostaglandini imaju ključnu ulogu u inflamatornom odgovoru, čije prisustvo je značajno povećano u upaljenom tkivu, doprinoseći bolovima i groznici podizanjem temperature, širenjem krvnih sudova, što izaziva crvenilo i otok na mestu na kome se oslobađaju. NSAIL su konkurentni lokalni inhibitori i ciklooksigenaze-1 (COX-1) i ciklooksigenaze-2 (COX-2), i na taj način smanjuju sintezu prostaglandina. Smanjenjem proizvodnje prostaglandina, NSAIL pomažu pri ublažavanju nelagodnosti usled groznice i smanjenju upale i bolova koji su s njima u vezi. NSAIL se obično koriste za lečenje akutnih i hroničnih stanja koje karakteriše bol i inflamacija, kao što su osteoartritis, reumatoidni artritis, glavobolja i migrena i groznica. Međutim, NSAIL takođe pokazuju značajne probleme u vezi sa bezbednošću i mogu da ispolje gastrointestinalnu, bubrežnu i kardiovaskularnu toksičnost. Na primer, aspirin može da izazove želudačno krvarenje u roku od nekoliko dana od upotrebe, a u julu 2015, FDA je ponovila prethodno upozorenje o opasnostima za srce uobičajenih NSAIL lekova protiv bolova, isključujući aspirin. To uključuje ibuprofen (Advil, Motrin) i naproksen (Aleve) i NSAIL koji se izdaju samo na recept.

[0006] Shodno tome, postoji potreba za daljim alternativnim antiinflamatornim terapijama.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0007] Sada je pronađeno da određene kombinacije lipida dagnji i ulja krila mogu povoljno da obezbede aditivni ili sinergistički inhibitorni efekat protiv proizvodnje ili oslobađanja jednog ili više proinflamatornih medijatora koji su uključeni u upalni proces. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacije predmetnog pronalaska mogu stoga da obezbede nove terapijske tretmane za poremećaje koje karakteriše upala ili koji imaju inflamatornu komponentu. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacije predmetnog pronalaska mogu da obezbede nove terapijske tretmane za bol, kao što je bol koji je u vezi sa upalom. Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.

[0008] Dakle, u jednom aspektu, obezbeđena je kombinacija koja sadrži lipid dagnji i ulje krila. Kombinacija lipida dagnji i ulja krila može biti prilagođena za odvojeno ili istovremeno administriranje subjektu. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacija je kompozicija koja sadrži lipid dagnji i ulje krila.

[0009] U drugom aspektu, obezbeđena je kombinacija koja se sastoji ili se u suštini sastoji, od lipida dagnji i ulja krila. Kombinacija lipida dagnji i ulja krila može biti prilagođena za odvojeno ili istovremeno administriranje subjektu. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacija je kompozicija koja se sastoji ili se u suštini sastoji, od lipida dagnji i ulja krila.

[0010] U drugom aspektu, obezbeđena je kombinacija koja sadrži lipid dagnji i ulje krila za upotrebu u terapiji. U nekim tehničkim rešenjima, obezbeđena je kombinacija koja sadrži lipid dagnji i ulje krila za upotrebu u lečenju upale kod subjekta. Takođe je obezbeđena kombinacija koja sadrži lipid dagnji i ulje krila za upotrebu u lečenju bola kod subjekta. Kombinacija lipida dagnji i ulja krila može biti prilagođena za odvojeno ili istovremeno administriranje subjektu. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacija je kompozicija koja sadrži lipid dagnji i ulje krila.

[0011] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja upale kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata administriranje navedenom subjektu kombinacije koja sadrži lipid dagnji i ulje krila. Pronalazak, takođe, obezbeđuje postupak lečenja bola kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata administriranje pomenutom subjektu kombinacije koja sadrži lipid dagnji i ulje krila. Kombinacija lipida dagnji i ulja krila može biti prilagođena za odvojeno ili istovremeno administriranje subjektu. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacija je kompozicija koja sadrži lipid dagnji i ulje krila.

[0012] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje primenu lipida dagnji i ulja krila u proizvodnji kombinovanog leka za lečenje upale. Pronalazak, takođe, obezbeđuje primenu lipida dagnji i ulja krila u proizvodnji kombinovanog leka za lečenje bola. Lek se može prilagoditi za odvojeno ili istovremeno administriranje/primenu. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacija je kompozicija koja sadrži lipid dagnji i ulje krila.

[0013] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje kombinovano sredstvo za lečenje upale, a navedena kombinacija sadrži lipid dagnji i ulje krila. Pronalazak, takođe, obezbeđuje kombinovano sredstvo za lečenje bola, a navedena kombinacija sadrži lipid dagnji i ulje krila.

Lipid dagnji i ulje krila mogu se prilagoditi za odvojeno ili istovremeno administriranje subjektu. U nekim tehničkim rešenjima, kombinovano sredstvo je kompozicija koja sadrži lipid dagnji i ulje krila.

[0014] U nekim tehničkim rešenjima, lipid dagnji je u obliku praha osušene dagnje. U drugim tehničkim rešenjima, lipid dagnji je u obliku lipidnog ekstrakta dobijenog iz dagnje („ekstrakt lipida dagnje”). U još daljim tehničkim rešenjima, lipid dagnji može biti u obliku kombinacije ili kompozicije praha osušene dagnje i ekstrakta lipida dagnje.

[0015] U nekim tehničkim rešenjima, ulje krila ima sadržaj fosfolipida u rasponu od oko 40-99% m/m, a u daljim tehničkim rešenjima sadržaj fosfolipida u rasponu od oko 50-99% m/m, kao što je oko 60-80% m/m.

[0016] U nekim tehničkim rešenjima, kombinacije pronalaska mogu biti korisne u lečenju jednog ili više poremećaja kod subjekta, gde poremećaj ima inflamatornu komponentu, i gde je inhibicija jednog ili više proinflamatornih molekula terapijski korisna. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacije mogu biti pogodne za lečenje jednog ili više hroničnih poremećaja.

[0017] U nekim tehničkim rešenjima, kao što je upotreba u lečenju hronične upale, kombinacije mogu eliminisati, njima zaobići ili na drugi način ublažiti obim, ozbiljnost ili trajanje jednog ili više neželjenih efekata koji su u vezi sa uobičajeno dostupnim NSAIL.

[0018] U drugom aspektu, obezbeđen je proces za pripremu ulja krila sa sadržajem fosfolipida od oko 50% ili više, kao što je oko 60% ili više, koji obuhvata korake:

(a) dovođenje u kontakt dopremljenog materijala biomase krila sa smešom CO2i etanola, da bi se ekstrahovalo ulje krila; i

(b) dovođenje u kontakt navedenog ulja krila sa CO2da bi se ekstrahovao najmanje udeo nepolarnih lipidnih komponenti tako da ulje ima sadržaj fosfolipida od najmanje 50% m/m.

[0019] U nekim tehničkim rešenjima, ulje krila dobijeno ovim procesom ima sadržaj fosfolipida od oko 60% m/m ili više, kao što je najmanje oko 65% m/m ili 70% m/m ili 75% m/m ili 80% m/m ili 85% m/m ili 90% m/m.

[0020] Pronalazak se, takođe, odnosi na postupke za obogaćivanje sadržaja fosfolipida u ulju krila.

[0021] Prema tome, u daljem aspektu, obezbeđen je proces za povećanje sadržaja fosfolipida u ulju krila koje ima sadržaj fosfolipida manji od 50% m/m do oko 50% m/m ili više, koji obuhvata korak dovođenja u kontakt ulja krila sa sadržajem fosfolipida manjim od 50% m/m sa CO2za selektivno uklanjanje nepolarnih lipidnih komponenti.

[0022] U nekim tehničkim rešenjima, početno ulje krila ima sadržaj fosfolipida manji od oko 50% m/m, kao što je manje od oko 40% ili manje od oko 30% m/m ili 20% m/m. U nekim tehničkim rešenjima, tako dobijeno obogaćeno ulje ima sadržaj fosfolipida od najmanje oko 55% m/m ili najmanje oko 60% m/m ili najmanje oko 65% m/m ili najmanje oko 70% m/m ili najmanje oko 75% m/m ili najmanje oko 80% m/m ili najmanje oko 85% m/m ili najmanje oko 90% m/m.

[0023] Dalje tehničko rešenje obezbeđuje ulje krila sa sadržajem fosfolipida od oko 50% m/m ili više, (npr. ≥60% m/m)dobijeno postupkom prema pronalasku.

[0024] Još dalja tehnička rešenja obezbeđuju ulje krila sa sadržajem fosfolipida od oko 50% ili 60% m/m ili više za upotrebu u kombinacijama i kompozicijama opisanim ovde.

SLIKE

[0025]

Slika 1A grafički prikazuje efekat inhibicije NO u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IF γ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila, za svako od ekstrakta lipida dagnji i ulja krila pojedinačno, maslinovo ulje i N- (3-(Aminometil)benzil)acetamidin (1400W).

Slika 1B grafički prikazuje oslobađanje NO (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila, za svako od ekstrakta lipida dagnji i ulja krila pojedinačno, maslinovo ulje i N-(3-(Aminometil)benzil)acetamidin (1400W).

Slika 2A grafički prikazuje efekat inhibicije TNFα u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila, za svako od ekstrakta lipida dagnji i ulja krila pojedinačno, maslinovo ulje i deksametazon.

Slika 2B grafički prikazuje oslobađanje TNFα (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila, za svako od ekstrakta lipida dagnji i ulja krila pojedinačno i maslinovo ulje.

Slika 3A grafički prikazuje efekat inhibicije IL-6 u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila, za svakood ekstrakta lipida dagnji i ulja krila pojedinačno, maslinovo ulje i deksametazon.

Slika 3B grafički prikazuje oslobađanje IL-6 (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila, za svako od ekstrakta lipida dagnji i ulja krila pojedinačno, i maslinovo ulje.

Slika 4A grafički prikazuje efekat inhibicije PGE2 u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila, za svako od ekstrakta lipida dagnji i ulja krila pojedinačno, maslinovo ulje i diklofenak.

Slika 4B grafički prikazuje oslobađanje PGE2 (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila, za svako od ekstrakta lipida dagnji i ulja krila pojedinačno, i maslinovo ulje.

Slika 5A grafički prikazuje oslobađanje NO (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY90-LY50).

Slika 5B grafički prikazuje oslobađanje NO (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY50-LY10).

Slika 6A grafički prikazuje oslobađanje NO (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY75-LY60).

Slika 6B grafički prikazuje oslobađanje NO (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY60-LY45).

Slika 7 grafički prikazuje izobologram za sinergističku inhibiciju NO različitim koncentracijama kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY90-LY10).

Slika 8A grafički prikazuje oslobađanje TNFα (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY90-LY60).

Slika 8B grafički prikazuje oslobađanje TNFα (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY60-LY30).

Slika 8C grafički prikazuje oslobađanje TNFα (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY40-LY10).

Slika 9A grafički prikazuje oslobađanje TNFα (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY70-LY55).

Slika 9B grafički prikazuje oslobađanje TNFα (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY50-LY35).

Slika 10 grafički prikazuje izobologram za sinergističku inhibiciju TNFα različitim koncentracijama kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY90-LY10).

Slika 11A grafički prikazuje oslobađanje IL-6 (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY90-LY50).

Slika 11B grafički prikazuje oslobađanje IL-6 (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY50-LY10).

Slika 12A grafički prikazuje oslobađanje IL-6 (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY70-LY50).

Slika 12B grafički prikazuje oslobađanje IL-6 (%) u ćelijama RAW264.7 stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFγ) za različite koncentracije kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY50-LY30).

Slika 13 grafički prikazuje izobologram za sinergističku inhibiciju IL-6 različitim koncentracijama kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila (LY90-LY10).

OPIS PRONALASKA

[0026] U celoj ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „sadrže” i varijacije kao što su „sadrži” i „koji sadrži” podrazumevaće uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva, ali ne i isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka.

[0027] U celoj ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, fraza „koji se u suštini sastoji od” i varijacije kao što je „sastoji se u suštini od” podrazumeva se da ukazuju na to da je navedeni element(i) suštinski, tj. neophodan element (neophodni elementi) pronalaska. Fraza dozvoljava prisustvo drugih nenavedenih elemenata koji ne utiču materijalno na karakteristike pronalaska, ali isključuje dodatne nespecifikovane elemente koji bi uticali na osnovne i nove karakteristike definisanog pronalaska.

[0028] Oblici jednine „a”, „an” i „the” (u engleskoj verziji) uključuju aspekte množine osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.

[0029] Pojam „pronalazak” uključuje sva stavljanja na uvid javnosti, aspekte, tehnička rešenja i primere kako je ovde opisano.

[0030] Kako se ovde koristi, „oko” se odnosi na količinu, vrednost ili parametar koji može da varira za čak 10%, 5% ili 2-1% od navedene količine, vrednosti ili parametra, i uključuje najmanje tolerancije prihvaćene u okviru tehnike. Kada se koristi u odnosu na navedenu vrednost celog broja, „oko” može da uključuje varijaciju jednog celog broja sa obe strane navedene vrednosti, na primer, „50%”, može uključivati 49% i 51%. Kada se uvode navedeni rasponi vrednosti, oni se primenjuju i na gornju i na donju granicu raspona.

[0031] Osim ako kontekst ne ukazuje drugačije, karakteristike opisane u nastavku teksta mogu se nezavisno primeniti na bilo koji aspekt ili tehničko rešenje.

[0032] Kako se ovde koristi, „lipid dagnje” se odnosi na lipidnu komponentu ekstrahovanu ili dobijenu iz novozelandske zelenouste (NZGL) (ili zelene školjke) dagnje (perna canaliculus). Lipid dagnji može da sadrži jednu ili više polinezasićenih dugolančanih masnih kiselina (PUFA), kao što su ALA, ETA, EPA i DHA, sterole, sterolne estre, trigliceride, nepolarne karotenoide lipida i druge komponente mesa (NZGL) dagnji. Lipid dagnji može biti u obliku praha osušene dagnje ili frakcije lipida ekstrahovane iz mesa dagnje („ekstrakt lipida dagnje”). Takođe je predviđeno da „lipid dagnje” obuhvata smešu praha dagnje i ekstrakta lipida dagnje, na primer, lipid dagnji može biti dopunjen dodatkom praha dagnje ili obrnuto. U nekim tehničkim rešenjima, lipid dagnji je izolovana frakcija lipida.

[0033] Prah lipida dagnji može se pripremiti od svežeg (sirovog), smrznutog ili termički obrađenog mesa NZGL dagnji bilo kojim pogodnim načinom sušenja (npr. sušenje zamrzavanjem, brzo sušenje ili sušenje u vakuumu) i sredstvima za usitnjavanje. Pored masnih kiselina (uključujući ALA, ETA, EPA i DHA) prah dagnje dobijen sušenjem mesa dagnje će, takođe, sadržati druge potencijalno korisne komponente, uključujući minerale, amino-kiseline, peptide, proteine i glikozaminoglikane (na primer, hondroitin-4-sulfat i hondroitin-6-sulfat). Postupci za pripremu praha dagnji su poznati u tehnici.

[0034] Ekstrakt lipida dagnji može se dobiti iz svežeg (sirovog), zamrznutog, termički obrađenog ili osušenog (npr. osušeno zamrzavanjem, brzim ili sušenjem u vakuum bubnju) mesa NZGL dagnji (npr. u prahu, osušeno raspršivanjem ili pulverizovano) bilo kojim pogodnim postupkom, kao npr. ekstrakcijom rastvaračem (npr. acetonom ili etanolom - vidi na primer WO2005073354 A1), enzimskom obradom (vidi na primer WO2006128244) ili superkritičnom ekstrakcijom fluidom. U nekim tehničkim rešenjima, ekstrakt lipida dagnji se povoljno dobija ekstrakcijom superkritičnim CO2iz osušenog (npr. osušenog zamrzavanjem) mesa dagnji (opciono stabilizovanog da bi se sprečila oksidacija). Primer postupka za dobijanje ekstrakta lipida dagnji je opisan u WO 97/09992 A1. Drugi postupci su poznati u tehnici.

[0035] U poželjnim tehničkim rešenjima, procesi se izvode pod takvim uslovima da korisne komponente, kao što su masne kiseline, nisu suštinski uništene i značajno se zadržavaju, na primer, hladnom obradom.

[0036] Jedan primer ekstrakta lipida dagnji dobijen u skladu sa postupkom opisanim u WO 97/09992 A1, takođe je poznat kao PCSO-524<®>(Pharmalink International Limited, Hong Kong). PCSO-524<®>sadrži dodat vitamin E (0,15% m/m, dodat kao antioksidativni konzervans) i sadrži kombinaciju slobodnih masnih kiselina, triglicerida, sterolnih estara, nepolarnih lipida i karotenoida (Sinclair, A. J. I saradnici, 2000), i izvor je dugolančanih omega-3 polinezasićenih masnih kiselina, eikozapentaenske kiseline (EPA) i dokozaheksaenske kiseline (DHA), kao i drugih dugolančanih masnih kiselina, kao što je 5,9,12,15-oktadekatetraenska kiselina, 5,9,12,16-nonadekatetraenska kiselina, 7,11,14,17-eikotetraenska kiselina i 5,9,12,15,18-heneikozapentaenska kiselina. PCSO-254<®>(formulisan zajedno sa maslinovim uljem u inkapsuliranom doznom obliku za oralnu upotrebu), prodaje se pod oznakom Lyprinol<®>i Omega XL<®>, (za humanu upotrebu) i Antinol<®>(za pse i mačke).

[0037] U nekim tehničkim rešenjima, ekstrakt lipida dagnji koji se koristi u kombinacijama pronalaska je formulisan sa vitaminom E, (dodatim, na primer, u količini od oko 0,2% m/m ili 0,15% m/m ili 0,1% m/m. ili 0,05% m/m ili oko 0,03% m/m ili oko 0,01% m/m).U nekim tehničkim rešenjima, lipid dagnji se koristi u obliku PCSO-254<®>, tj. ekstrakta lipida dagnji koji sadrži 0,15% m/m vitamina E. U nekim tehničkim rešenjima lipid dagnje, koji opciono sadrži vitamin E, dalje je formulisan sa uljem kao nosačem, kao što je maslinovo ulje. Dok je u nekim tehničkim rešenjima lipid dagnji ekstrakt lipida dagnji i sadrži dodat vitamin E, dodavanje vitamina E je opciono, i stoga, u nekim tehničkim rešenjima, ekstrakt lipida dagnji se koristi čist, tj. ne sadrži nikakve druge dodatne sastojke, kao što je vitamin E.

[0038] Lipid dagnji, u različitim oblicima, takođe se može kupiti od komercijalnih dobavljača.

[0039] Ulje krila može biti pripremljeno od bilo koje pogodne vrste krila, uključujući euphausia superba (antarktički kril), euphausia pacifica (pacifički kril), maganicytiphanes norvegica (severni kril), euphausia crystallorophias (ledeni kril), euphausia frigida, euphausia longirostris, euphausia triacantha i euphausia vallentini. U nekim poželjnim tehničkim rešenjima, ulje krila se dobija iz euphausia superba.

[0040] Morski lipidi sadrže masne kiseline, posebno omega-3 masne kiseline kao što su EPA i DHA, u slobodnom obliku i obliku triglicerida. Slično, ulje krila je takođe bogato omega-3 masnim kiselinama, međutim, ulje krila sadrži značajne količine fosfolipida, gde su masne kiseline vezane za fosfatnu grupu preko glicerolskog dela. Upravo ovaj fosfolipidno vezani oblik masnih kiselina je taj koji se efikasnije apsorbuje u ćelijske membrane nego oblik triglicerida, i samim tim je lakše bioraspoloživ. Tipični fosfolipidi koji se nalaze u ulju krila mogu da uključuju: fosfatidilholin, alkil acil fosfatidilholin, fosfatidilinozitol, fosfatidilserin, lizofosfatidilholin, lizo alkil acil fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin, alkil acil fosfatidiletanolamin, kardiolipin N-acil fosfatidiletanolamin, lizofosfatidiletanolamin i lizo alkil acil fosfatidiletanolamin. Ulje krila, takođe, sadrži značajne količine astaksantina, antioksidansa, koji je takođe odgovoran za njegovu crvenu boju.

[0041] U nekim tehničkim rešenjima, ulje krila sadrži najmanje oko 1% m/m, 5% m/m, 10% m/m ili najmanje oko 20% m/m fosfolipida. U daljim tehničkim rešenjima, ulje sadrži najmanje oko 25% m/m ili najmanje oko 30% m/m ili najmanje oko 35% m/m ili najmanje oko 40% m/m ili najmanje oko 45 % m/m ili najmanje oko 50% m/m ili najmanje oko 55% m/m ili najmanje oko 60% m/m ili najmanje oko 65% m/m ili najmanje oko 70% m/m ili najmanje oko 75% m/m ili najmanje oko 80% m/m ili najmanje oko 85% m/m fosfolipida ili najmanje oko 90% m/m fosfolipida ili najmanje oko 95 % m/m fosfolipida ili najmanje oko 97 % m/m fosfolipida ili najmanje oko 98 % m/m fosfolipida ili najmanje oko 99 % m/m fosfolipida. U nekim tehničkim rešenjima, ulje krila ima sadržaj fosfolipida u rasponu od oko 40-99% m/m. U nekim daljim tehničkim rešenjima, ulje krila ima sadržaj fosfolipida u rasponu od oko 60-99% m/m, na primer, u rasponu od oko 65-90% m/m. Kao što je ovde navedeno, „obogaćeno” ulje krila se odnosi na ulje krila koje ima sadržaj fosfolipida od najmanje oko 60% m/m. Sadržaj fosfolipida se može odrediti na bilo koji pogodan način u tehnici, na primer,<31>P NMR analizom.

[0042] Postupci za pripremu ulja krila, uključujući ulje od krila obogaćeno fosfolipidima, poznati su u tehnici. Obično, sveža, smrznuta i/ili termički obrađena biomasa krila (npr. euphasia superba ili euphasia pacifica) se može ekstrahovati pomoću rastvarača (npr. alkoholi, kao što je etanol; ketoni, kao što je aceton; ili dimetoksietan) i/ili superkritičnog fluida (npr. CO2). Neki neograničavajući primeri procesa za pripremu ulja krila su opisani u američkom patentu br.

9,028,877, američkom patentu br. 9,375,453, američkom patentu br. 6,800,299, američkom patentu br. 8,828,447, američkom patentu br. 9,150,815, američkom patentu br. 8,383,845, WO2007/123424, WO2011/050474, WO2015/104401 i WO2015/121378. Ovde su, takođe, opisani dalji postupci. Ulje krila se, takođe, može kupiti od komercijalnih dobavljača.

[0043] U nekim povoljnim tehničkim rešenjima, ulje krila ima sadržaj vode od oko 5% m/m ili manje ili oko 4 ili 3 ili 2 ili 1 ili 0,5% m/m ili manje. U nekim tehničkim rešenjima, ulje krila ima rezidualni sadržaj rastvarača za ekstrakciju od oko 5% m/m ili manje ili oko 4 ili 3 ili 2 ili 1 ili 0,5% m/m ili manje. U daljim tehničkim rešenjima, ulje krila ima sadržaj vode od oko 5% m/m ili manje ili oko 4 ili 3 ili 2 ili 1 ili 0,5% m/m ili manje, i rezidualni sadržaj rastvarača za ekstrakciju od oko 5% m/m ili manje ili oko 4 ili 3 ili 2 ili 1 ili 0,5% m/m ili manje. Voda i rastvarač mogu da se uklone na bilo koji pogodan način, kao što je veoma kratkotrajno ili blago zagrevanje (npr.30 min ili 1 sat ili 2 sata ili 3 sata, na temperaturi od oko ili manje od oko 60°C ili 50°C ili 40°C, i poželjno tako da integritet sastojaka nije suštinski ugrožen), struja azota ili liofilizacija (sušenje zamrzavanjem).

[0044] Inhibiciona aktivnost kombinacija protiv jednog ili više medijatora upale kao što su azot oksid (NO), citokini, kao što su interleukini, (npr. IL-6), prostaglandini (npr. PG-E2), i TNF α, mogu biti korisni u lečenju jednog ili više poremećaja ili simptoma kod subjekta, pri čemu je inhibicija jednog ili više takvih molekula terapijski korisna. Posebno, kombinacije pronalaska mogu biti korisne u lečenju prekomerne akutne ili hronične upale, i/ili jednog ili više simptoma koji su u vezi sa tim, kao što su bol, groznica, crvenilo i otok. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacije mogu biti korisne u lečenju upale kod poremećaja gde patologija uključuje upalnu komponentu, i/ili bol koji je u vezi sa takvim poremećajima. Neki neograničavajući primeri poremećaja koji uključuju upalni aspekt uključuju aterosklerozu, alergiju, astmu, autoimune bolesti (npr. celijakija, psorijaza, reumatoidni artritis, psorijatični artritis), fibromialgiju, giht, migrenu, osteoartritis, ulcerozni kolitis, kancer, oštećenu kognitivnu funkciju, uključujući Alchajmerovu bolest, dijabetes tipa 2, odloženi početak bolnosti mišića (DOMS), Kronovu bolest i ankilozirajući spondilitis. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacije pronalaska mogu biti korisne u lečenju bolova u zglobovima ili poboljšanju pokretljivosti zglobova u vezi sa osteoartritisom ili reumatoidnim artritisom. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacije pronalaska mogu biti korisne u lečenju poremećaja kod kojih inhibicija PGE2može biti korisna, kao što su reumatoidni artritis, migrena i bol (koji može biti nociceptivni (somatski ili visceralni) bol i/ili neuropatski bol).

[0045] Podrazumeva se da ovde opisane kombinacije mogu biti prilagođene za odvojenu ili istovremenu primenu. Tamo gde je prilagođena za istovremenu primenu, kombinacija se može obezbediti i/ili primeniti kao zajednička kompozicija ili smeša koja sadrži i ekstrakt lipida dagnji i ulje krila ili kao odvojeni dozni oblici svake komponente kombinacije. Tamo gde se ekstrakt lipida dagnji i ulje krila obezbeđuju i/ili primenjuju odvojeno, mogu se primeniti istovremeno, jedan za drugim ili svaki u različito vreme.

[0046] U daljim tehničkim rešenjima, lipid dagnji i ulje krila mogu opciono biti formulisani, bilo zajedno ili pojedinačno, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i/ili aditiva. Neki primeri pogodnih nosača su jestiva ulja, kao što su maslinovo ulje, ricinusovo ulje, laneno ulje, ulje semena grožđa, riblje ulje (na primer, ulje tune), ulje od kanole, biljno ulje, suncokretovo ulje, čija ulje, sojino ulje, susamovo ulje, ulje algi i njihove smeše. Jedan ili više opcionih aditiva, kao što su antioksidansi, vitamini (kao što su vitamini rastvorljivi u mastima (A, D, E i K) ili vitamini rastvorljivi u vodi (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C), minerali u ishrani, amino-kiseline, sredstva za maskiranje mirisa i ukusa, emulgatori, farmaceutski prihvatljivi alkoholi, (npr. etanol, glicerol, propilen glikol i polietilen glikol) ili drugi modifikatori viskoziteta, surfaktanti (npr. polisorbati), sredstva za suspendovanje, laktoza, dekstroza, saharoza, manitol, sorbitol, glukoza, lubrikansi, vezivna sredstva, skrobovi, pojačivači apsorpcije i konzervansi, itd., takođe mogu biti uključeni. Nosač ili aditiv mogu obavljati jednu ili više funkcija. Lipid dagnji i/ili ulje krila mogu opciono biti dodatno dopunjeni ili kombinovani sa jednom ili više dodatnih prečišćenih ili delimično prečišćenih komponenti lipida dagnji i ulja krila, kao što su astaksantin i njegovi estri, masne kiseline (npr. EPA, DHA), bilo u obliku slobodne kiseline, kiselinskog estra, triglicerida ili fosfolipida, sterola, sterolnih estara, amino-kiselina, peptida i proteina i glikozaminoglikana (npr. hondroitin sulfati). Ostale antiinflamatorne namirnice, kao što je cela mlevena forma ili njihovi ekstrakti, npr. kurkume, đumbira, belog luka, karanfilića, itd., mogu takođe biti opciono uključene.

[0047] Formulisane kombinacije se mogu pripremiti prema postupcima poznatim u tehnici. Takvi postupci uključuju korak bliskog dovođenja ekstrakta lipida dagnji i/ili ulja krila u vezu sa nosačem, opciono zajedno sa jednim ili više aditiva. Podrazumeva se da će svaki nosač ili aditiv biti farmaceutski prihvatljiv.

[0048] Prema tome, u nekim tehničkim rešenjima, lipid dagnji i ulje krila su formulisani, bilo odvojeno ili zajedno, sa uljem kao nosačem, kao što je maslinovo ulje. U nekim tehničkim rešenjima, ulje kao nosač sadrži od oko 10% m/m do oko 90% m/m, kao što je oko 20% m/m do oko 80% m/m kombinacije ili kompozicije. U daljim tehničkim rešenjima, ulje kao nosač sadrži oko 25% m/m ili oko 30% m/m ili oko 35% m/m ili oko 40% m/m ili oko 45% m/m ili oko 50 % m/m ili oko 55% m/m ili oko 60% m/m ili oko 65% m/m ili oko 70% m/m ili oko 75% m/m kombinacije ili kompozicije. U nekim tehničkim rešenjima, maseni odnos ulja kao nosača prema kombinovanoj količini lipida dagnji i ulja krila je oko 3:1 ili oko 2,5:1 ili oko 2:1 ili oko 1,5:1 ili oko 1:1 ili oko 1:1,5 ili oko 1:2 ili oko 1:2,5 ili oko 1:3.

[0049] Dok je ovde razmatran bilo koji oblik primene, kao što je oralni, parenteralni, topikalni, transdermalni ili subdermalni, poželjno je da u nekim tehničkim rešenjima kombinacije iz pronalaska mogu biti obezbeđene i/ili primenjene u doznom obliku za oralnu upotrebu. U nekim tehničkim rešenjima kombinacije mogu biti predstavljene u „bulk“ (voluminoznom) obliku, na primer kao tečnosti, sirupi, paste, polučvrsti voskovi, disperzije, suspenzije, emulzije (npr. voda u ulju ili ulje u vodi), pulverizovani prah ili mikrokapsulirani prah, od kojih se mogu meriti pojedinačne doze. Merenje i/ili primena može biti pomoću bilo kojeg sredstva, kao što je kašika ili merica, špric, kapaljka ili čaša za merenje. Izmerene doze se mogu administrirati subjektu direktno ili pomešati sa, sipati ili poprskati po hrani ili piću.

[0050] U drugim tehničkim rešenjima, kombinacije su povoljno predstavljene u jediničnim doznim oblicima za oralnu upotrebu, tj. fiksnom doznom obliku. Neki primeri pogodnih jediničnih doza za oralnu upotrebu obuhvataju pojedinačno upakovane ampule, tube, napunjene špriceve, kesice, žvake i kapsule (uključujući tvrde i meke gel kapsule).

[0051] Jedan primer, pogodnog jediničnog doznog oblika za oralnu upotrebu je kapsula, u obliku tvrde ili meke čaurice. Čaurica može da sadrži jedno ili više od želatina, pululana, hipromeloze, PVA kopolimera, karagenana ili druge saharidne komponente kao što su skrob ili celuloza ili njihove smeše, a može dalje da sadrži boje, sredstva za opacifikaciju, plastifikatore (npr. sorbitol, ksiloza, maltitol i glicerin), itd. Postupci za inkapsuliranje morskih ulja i lipida, kao što su lipid dagnji i ulje krila, poznati su u tehnici. Vidi na primer WO2015/121378. U nekim tehničkim rešenjima, gde je ulje krila inkapsulirano odvojeno, ulje krila može biti inkapsulirano u odsustvu opcionih dodatnih sredstava, kao što su sredstva za modifikaciju viskoziteta, to jest, punjenje kapsule se u suštini sastoji od ulja krila.

[0052] U nekim povoljnim tehničkim rešenjima, kombinacije lipida dagnji i ulja krila iz pronalaska su predstavljene u obliku meke gel kapsule, na primer, meke gel kapsule koja sadrži i lipid dagnji i ulje krila ili pojedinačne meke gel kapsule, gde su lipid dagnji i ulje krila posebno inkapsulirani, opciono zajedno sa odgovarajućim nosačima i/ili aditivima. Pogodne meke gel kapsule se mogu pripremiti od želatina (ili alternativno, izvora saharida kao što su pululan i hipromeloza), opciono sa jednim ili više plastifikatora kao što su sorbitol i glicerin (glicerol), i aditiva kao što su sredstva za bojenje i sredstva za opacifikaciju. U jednom primeru, omotač kapsule od mekog gela može da sadrži želatin i jedan ili oba od sorbitola i glicerina.

[0053] Mikrokapsulacija je postupak kojim su sitne kapljice ili čestice okružene zidom premaza ili su ugrađene u matricu da bi se formirao prah, pri čemu premaz ili matriks formiraju funkcionalnu barijeru kojom se izbegava ili smanjuje sklonost ka hemijskim reakcijama, kao što je oksidacija. Pored toga, može imati potencijalnu ulogu u maskiranju ukusa ili mirisa. Stoga, u nekim tehničkim rešenjima, lipid dagnji i/ili ulje krila mogu biti mikrokapsulirani, bilo odvojeno ili zajedno, da bi se formirao prah. Uobičajeni postupci mikrokapsuliranja uključuju emulzifikaciju, sušenje raspršivanjem, sušenje zamrzavanjem, koaksijalni elektrosprej, ekstruziju, koacervaciju, tehnologiju superkritičnog fluida i in situ polimerizaciju. Materijali za oblaganje uključuju prirodne i sintetičke polimere, ugljene hidrate (npr. skrob, glukozu), proteine (npr. kazein, želatin) i njihove smeše. (Videti, na primer, Bakry, A. M., i saradnici, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 15, 143, 2016, i reference koje su tamo citirane, WO2014/170464 i WO2014/169315). Lipid dagnji i/ili ulje krila mogu biti mikrokapsulirani sa jednim ili više nosača ili aditiva kao što je gore opisano. Mikrokapsulirani prah lipida dagnji i/ili ulja krila može se dalje inkapsulirati, na primer u jediničnom doznom obliku kapsule sa tvrdom čauricom. Mikrokapsulirani lipid ili ulje u prahu mogu se opciono kombinovati sa jednim ili više nosača ili aditiva.

[0054] U nekim tehničkim rešenjima, kombinacije iz pronalaska se mogu uzimati sa hranom ili pićima, na primer prskanjem, mešanjem, mućkanjem ili drugim načinima nanošenja ili uključivanja kombinacije ekstrakta lipida dagnji i ulja krila u ili na hranu ili piće. Stoga, kombinacije mogu biti obezbeđene u formatu za inkorporaciju u ili na piće ili hranu. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacija se, takođe, može formulisati u pripremi hrane i pića kako bi se obezbedila funkcionalna hrana.

[0055] U nekim tehničkim rešenjima, lipid dagnji i ulje krila su formulisani, bilo odvojeno ili zajedno, sa uljem kao nosačem, kao što je maslinovo ulje, opciono sa antioksidansom (npr. vitamin E).

[0056] Subjekti koje treba tretirati kombinacijama pronalaska obuhvataju subjekte sisare, kao što su ljudi, primati, mačke, psi, goveda, kopitari, svinje, zečeve, ovce i koze, i uključuju stoku (npr. krave, konji, ovce, svinje i koze), domaće (kućne) životinje (npr. psi, mačke, zečevi, zamorci) i divlje životinje u zatočeništvu. Laboratorijske životinje kao što su zečevi, miševi, pacovi, zamorci i hrčci su, takođe, razmatrani jer mogu da obezbede pogodan sistem za testiranje.

[0057] Bilo koji od gore opisanih doznih oblika može biti primenljiv za humanu ili veterinarsku upotrebu prema potrebi.

[0058] Efikasna količina za lečenje treba da uključi količinu kombinacije koja je, kada se primenjuje prema željenom režimu doziranja, zajedno efikasna da se barem delimično postigne željeni terapijski efekat, uključujući jedno ili više od: ublažavanje, eliminisanje ili smanjenje trajanja ozbiljnosti i/ili učestalosti upale i/ili jednog ili više simptoma upale (npr. groznice, bola, otoka, crvenila), sprečavanje ili odlaganje početka, inhibiranje progresije ili zaustavljanje ili reverziju (delimičnu ili potpunu) početka ili progresije određenog poremećaja ili stanja koje se leči.

[0059] Odgovarajuće količine doziranja i režime doziranja može odrediti lekar koji prisustvuje ili veterinar, i mogu zavisiti od posebnog stanja/simptoma koji se leče, težine stanja kao i opšte starosti, zdravlja i mase subjekta. Odgovarajuće dnevne doze lipida dagnji i/ili ulja krila mogu nezavisno da budu u rasponu od oko 10 mg do oko 10 g, na primer oko 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 1 g, 1,1 g, 1,2 g, 1,3 g, 1,4, g, 1,5 g, 1,6 g, 1,7 g, 1,8 g, 1,9 g, 2,0 g, 2,1 g, 2,2 g, 2,3 g, 2,4 g, 2,5 g, 2,6 g, 2,7 g, 2,8 g, 2,9 g, 3,0 g, 3,2 g 3,5 g, 3,7 g, 4,0 g, 4,5 g, 5,0 g, 5,5 g, 6,0 g, 6,5 g, 7,0 g, 7,5 g, 8,0 g, 8,5 g, 9,0 g ili oko 9,5 g. U nekim daljim tehničkim rešenjima, dnevne doze kombinacije mogu biti u rasponu od oko 20 mg do oko 15 g, na primer, oko 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg 1 g, 1,2 g, 1,3 g, 1,4, g, 1,5 g, 1,6 g, 1,7 g, 1,8 g, 1,9 g, 2,0 g, 2,1 g, 2,2 g, 2,3 g, 2,4 g, 2,5 g, 2,6 g, 2,7 g, 2,8 g, 2,9 g, 3,0 g, 3,2 g, 3,5 g, 3,7 g, 4,0 g, 4,5 g, 5,0 g, 5,5 g, 6,0 g, 6,5 g, 7,0 g, 7,5 g, 8,0 g, 8,5 g, 9,5 g, 9,0 g 10,0 g, 10,5 g, 11,0 g, 11,5 g, 12,0 g, 12,5 g, 13,0 g, 13,5 g, 14,0 g ili 14,5 g.

[0060] Doze se mogu prikladno administrirati jednom dnevno ili se dnevne doze mogu podeliti i administrirati više puta (npr. dva, tri ili četiri puta) dnevno. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacije pronalaska mogu se administrirati jedan, dva, tri ili više puta nedeljno, na primer u naizmeničnim danima. U nekim tehničkim rešenjima, tretman može biti kontinuiran ili dugotrajan, na primer, tokom perioda od najmanje 6-12 meseci ili najmanje 2-3 godine ili trajan.

[0061] Kombinacije pronalaska, na primer u bilo kojoj od dnevnih količina doze, mogu da sadrže lipid dagnji u količini u rasponu od oko 5% do oko 95% m/m od ukupne količine ukupnog lipida dagnji i ulja krila, i sadrže ulje krila u količini u rasponu od oko 99% do oko 1% ukupnog lipida dagnji i ulja krila, to jest, maseni odnos lipida dagnji prema ulju krila od oko 5:95 do 99:1. U nekim tehničkim rešenjima kombinacije sadrže lipid dagnji u količini u rasponu od oko 5% do oko 95% m/m ukupne količine ukupnog lipida dagnji i ulja krila, i sadrže ulje krila u količini u rasponu od oko 95 % do oko 5% ukupnog lipida dagnji i ulja krila, to jest, maseni odnos lipida dagnji prema ulju krila od oko 5:95 do 95:5. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacije sadrže lipid dagnji u količini u rasponu od oko 10% do oko 90% m/m ukupne količine ukupnog lipida dagnji i ulja krila, i sadrže ulje krila u količini u rasponu od oko 90 % do oko 10% m/m ukupnog lipida dagnji i ulja krila, to jest, maseni odnos lipida dagnji prema ulju krila od oko 10:90 do 90:10. U još daljim tehničkim rešenjima, kombinacije sadrže lipid dagnji prema ulju krila u masenom odnosu od oko 15:85 ili oko 20:80 ili oko 25:75 ili oko 30:70 ili oko 35:65 ili oko 40:60 ili oko 45:55 ili oko 50:50 ili oko 55:45 ili oko 60:40 ili oko 65:35 ili oko 70:30 ili oko 75:25 ili oko 80:20 ili oko 85:15.

[0062] Dok se kombinacije iz pronalaska mogu davati kao jedina antiinflamatorna terapija za bilo koji jedan ili više poremećaja, one se takođe mogu primenjivati u kombinaciji sa režimom primene jednog ili više NSAIL, kao što su celekoksib, diklofenak, diflunisal, etodolak, fenoprofen, flurbiprofen, ibuprofen, indometacin, ketoprofen, telorolak, mefenamik, meloksikam, nabumeton, naproksen, oksaprozin, piroksikam, sulindak i tolmetin. U nekim tehničkim rešenjima, kombinacije pronalaska mogu eliminisati ili smanjiti potencijalne štetne efekte koji su u vezi sa NSAIL, na primer, eliminisanjem ili suštinskim eliminisanjem potrebe za dodatnom terapijom NSAIL ili smanjenjem doznih količina i/ili učestalosti doziranja NSAIL-a potrebnih za postizanje povoljnog terapijskog efekta.

[0063] Kao što je gore razmatrano, u jednom ili više tehničkih rešenja, ulje krila koje se koristi u kombinacijama koje su ovde stavljene na uvid javnosti može povoljno da ima sadržaj fosfolipida od najmanje oko 40% m/m/ ili poželjno najmanje 50% m/m ili više, poželjno najmanje oko 60% m/m ili više. Mnogi dosadašnji postupci za ekstrakciju visokog fosfolipidog (npr. više od oko 50% ili 60% m/m) ulja krila iz krilovog brašna koristi kombinaciju CO2i CO2/etanol. Međutim, dobro je poznato da što je veći sadržaj fosfolipida u ulju krila, to je ulje krila viskoznije, pri čemu ulja krila sa sadržajem od oko 60% ili više tipično predstavljaju viskoznu pastu na sobnoj temperaturi. Ovo predstavlja izazove u proizvodnji, posebno u industrijskom ili komercijalnom obimu proizvodnje ulja, jer su potrebne više temperature da bi se rastvarači koji se koriste u procesu ekstrakcije uparili iz viskoznog materijala, pri čemu je veća verovatnoća da će doći do oštećenja ulja usled toplote. Osim toga, tada su potrebni povećani pritisci za prenošenje ulja iz rezervoara za ekstrakciju u rezervoare za pakovanje.

[0064] Jedan primer postupka iz prethodnog stanja tehnike je opisan u WO2007123424. Ovaj dokument opisuje proces u dva koraka, pri čemu se dopremljeni materijal prvo ekstrahuje čistim CO2da se ekstrahuju samo neutralni lipidi (tj. nepolarni trigliceridi), ostavljajući za sobom materijal koji je, zahvaljujući uklanjanju nepolarnih triglicerida, obogaćen fosfolipidima. Ovaj materijal obogaćen fosfolipidima se zatim ekstrahuje sa CO2+ ≥ 10 % korastvarača etanola za ekstrakciju polarnih fosfolipida i preostalih nepolarnih triglicerida zajedno iz dopremljene biomase krila. Ovaj postupak neefikasno koristi kapacitet postrojenja u komercijalnom obimu, pošto je tokom obe faze procesa veliki deo zapremine u ekstraktorima visokog pritiska ispunjen proteinima, ugljenim hidratima i komponentama pepela koji se ne mogu ekstrahovati iz dopremljene biomase. Takođe je u suštini manje efikasan rad u serijama (u poređenju sa efikasnijim kontinuiranim radom), što može negativno uticati na troškove procesa. Efikasno, obogaćivanje za isporuku konačnog polarnog sadržaja fosfolipida u gotovom ulju se postiže u prvom koraku, direktno na „bulk“ (voluminoznom) nehomogenom čvrstom sirovom materijalu u industrijskom obimu. Precizno prethodno znanje o ulju je da se ulja krila sa sadržajem od oko 60% ili više obično predstavljaju kao viskozna pasta na temperaturi okoline. Ovo predstavlja izazove u proizvodnji, posebno u industrijskom ili komercijalnom obimu proizvodnje ulja, jer su potrebne više temperature da bi se rastvarači koji se koriste u procesu ekstrakcije isparili iz viskoznog materijala, pri čemu je veća verovatnoća da će doći do oštećenja ulja usled toplote. Pored toga, tada su potrebni povećani pritisci za prenošenje ulja iz rezervoara za ekstrakciju u rezervoare za pakovanje.

[0065] Jedan primer postupka iz prethodnog stanja tehnike je opisan u WO2007123424. Ovaj dokument opisuje proces u dva koraka, pri čemu se dopremljeni materijal prvo ekstrahuje čistim CO2da se ekstrahuju samo neutralni lipidi (tj. nepolarni trigliceridi), ostavljajući za sobom materijal koji je, zahvaljujući uklanjanju nepolarnih triglicerida, obogaćen fosfolipidima. Ovaj materijal obogaćen fosfolipidima se zatim ekstrahuje sa CO2+ ≥ 10 % korastvarača etanola za ekstrakciju polarnih fosfolipida i preostalih nepolarnih triglicerida zajedno iz dopremljene biomase krila. Ovaj postupak neefikasno koristi kapacitet postrojenja u komercijalnom obimu, pošto je tokom obe faze procesa veliki deo zapremine u ekstraktorima visokog pritiska ispunjen proteinima, ugljenim hidratima i komponentama pepela koji se ne mogu ekstrahovati iz dopremljene biomase. Takođe je u suštini manje efikasan rad u serijama (u poređenju sa efikasnijim kontinuiranim radom), što može negativno uticati na troškove procesa. Efikasno, obogaćivanje za isporuku konačnog polarnog sadržaja fosfolipida u gotovom ulju se postiže u prvom koraku, direktno na „bulk“ (voluminoznom) nehomogenom čvrstom sirovom materijalu u industrijskom obimu. Precizno prethodno poznavanje sadržaja polarnih i nepolarnih lipida u čvrstom punjenju, kao i toga koliko dobro će svaki naknadno ekstrahovati neophodno je za precizno konačno obogaćivanje ulja. U praksi, neizvesnost na komercijalnom nivou može da se pretvori u skupo prekomerno obogaćivanje, što onda zahteva konačno mešanje nazad u specifikaciju prema potrebi. Ovo opet negativno utiče na ekonomičnost procesa.

[0066] US 9,735,453, US 9,078,905, US 9,028,877, US 9,320,765, i US 9,072,752 opisuju ekstrakciju krila sa CO2ili CO2plus približno 5% etanola za ekstrakciju neutralnih (nepolarnih triglicerida) lipida, a zatim CO2/∼ 20% etanola za ekstrakciju iz voluminoznog nehomogenog čvrstog materijala ulja krila sa visokim količinama fosfolipida, astaksantinskih estara i/ili omega-3 masnih kiselina. Ovi procesi dele gore opisane nedostatke.

[0067] Predmetni pronalazak sada opisuje proces koji, u nekim tehničkim rešenjima, može smanjiti, svesti na minimum ili eliminisati jedan ili više nedostataka koji su gore razmatrani kada se priprema visoko ili obogaćeno fosfolipidno ulje krila u skladu sa prethodnim postupcima, posebno u industrijskim ili komercijalnim razmerama (npr. kada se proizvode serije ulja reda veličine od najmanje 50, 100, 200, 300 ili 500 kg i više). Prema tome, predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje proces za pripremu ulja krila sa sadržajem fosfolipida od najmanje oko 50% m/m ili više, poželjno do nivoa od najmanje oko 60% m/m ili više, i proces za obogaćivanje ulja sa nižim sadržajem fosfolipida (manje od oko 50% m/m)do nivoa od najmanje oko 50% m/m ili više, poželjno do nivoa od najmanje oko 60% m/m ili više.

[0068] U nekim tehničkim rešenjima, pronalazak obezbeđuje proces u dva koraka za pripremu ulja krila sa sadržajem fosfolipida od najmanje oko 50% m/m, pri čemu prvi korak uključuje ekstrakciju prvog ulja krila, sa sadržajem fosfolipida manjim od oko 50 % m/m iz biomase krila i zatim uklanjanjem najmanje proporcije nepolarnih lipidnih komponenti (npr. triglicerida) iz prvog ulja krila da bi se dobilo drugo ulje krila koje je obogaćeno fosfolipidima (tj. koje ima veći sadržaj fosfolipida) u poređenju sa prvim uljem krila.

[0069] Za razliku od prethodnih postupaka o kojima se raspravljalo u prethodnom tekstu, neka tehnička rešenja procesa počinju neselektivnom ekstrakcijom ulja iz dopremljenog materijala biomase krila. Ekstrakcija i polarnih (npr. fosfolipidi) i nepolarnih (npr. trigliceridi) lipida iz čvrstog dopremeljenog brašna mogu se dobiti upotrebom mešavine CO2i etanola (npr. azeotropni etanol – smeša vode i etanola koja sadrži oko 95% etanola).

[0070] U nekim poželjnim tehničkim rešenjima, maseni odnos od najmanje oko 15% m/m ili oko 20% m/m etanola u CO2može se koristiti, na primer u rasponu od oko 17-22 % m/m. U daljim tehničkim rešenjima, maseni odnos od najmanje oko 25% m/m etanola u CO2može se koristiti, kao što je korišćenje najmanje oko 26% m/m etanola ili najmanje oko 27% m/m etanola ili najmanje oko 28% m/m etanola ili najmanje oko 29% m/m etanola ili najmanje oko 30% m/m etanola u CO2.

[0071] U nekim tehničkim rešenjima, uključujući bilo koje od drugih tehničkih rešenja razmatranih u ovom paragrafu, temperature ekstrakcije su na ili ispod oko 60 °C, kao što je na ili ispod oko 55 °C ili na ili ispod oko 50 °C ili na ili ispod oko 45 °C ili na ili ispod 40 °C ili na ili ispod 35 °C ili na ili ispod 30 °C da bi se povoljno smanjio ili sveo na minimum rizik od degradacije proizvoda. Pritisak ekstrakcije se može podesiti da obezbedi super-, pod- i/ili blizu kritičnih uslova za izabranu temperaturu i odnos CO2i etanola. U nekim tehničkim rešenjima, pritisak je u rasponu od oko 200-350 bara, kao što je oko 250-300 bara, iako su viši pritisci, npr.400 bara i više, tehnički efikasni i takođe se mogu koristiti. U nekim tehničkim rešenjima, vrednost pritiska ili raspon proizvodi adekvatnu gustinu rastvarača kako bi se osiguralo da ekstrakcija nepolarnih lipida ne postane ograničavajuća brzina za proces. U nekim tehničkim rešenjima, uslovi pritiska ekstrakcije mogu se podesiti tokom procesa ekstrakcije da bi se kretali između super-, pod- ili blizu kritičnih uslova. U nekim tehničkim rešenjima, koriste se podkritični i/ili blizu kritični uslovi, za koje će uslovi varirati u zavisnosti od binarnog odnosa smeše CO2i etanola (ili odnosa ternarne smeše u slučaju azeotropnog etanola, koji takođe sadrži vodu). Vremena ekstrakcije mogu odrediti stručnjaci u tehnici i ona mogu zavisiti, između ostalog, od uslova ekstrakcije i željene ekonomske optimizacije. U nekim tehničkim rešenjima, vremena ekstrakcije su obično u rasponu od oko 1-15 sati, kao što je oko 2-10 sati, kao što je oko 2-5 sati ili oko 3-6 sati ili oko 4-5 sati. Ovo zauzvrat može zavisiti od, između ostalog, količine i veličine čestica materijala dopremljene biomase. Veće čestice će omogućiti korišćenje većih brzina protoka rastvarača uz zadržavanje statične biomase i ravnomernog kontakta sa rastvaračem. Međutim, veća čestica takođe predstavlja povećanu potrebu za difuzijom da bi rastvarač stigao do centra čestica, pri čemu je potrebno više rastvarača. Prema tome, u nekim tehničkim rešenjima, veličina čestica materijala za punjenje je oko 1-5 mm, kao što je oko 2-3 mm.

[0072] U nekim daljim tehničkim rešenjima, pritisak ekstrakcije je oko 300 bara, a temperatura ekstrakcije je oko 60°C.

[0073] Odvajanje ulja se može obaviti na nižim temperaturama (npr. oko 25-35°C) i pritiscima (npr. oko 25-60 bara)

[0074] Dobijeno ekstrahovano ulje sadrži i polarne (npr. fosfolipide) i nepolarne (npr. trigliceride) lipide, i može imati sadržaj fosfolipida manji od oko 50% m/m ili manji od oko 45% m/m ili manji od oko 40% m/m ili manji od oko 35% m/m ili manji od oko 30% m/m ili manji od oko 25% m/m ili manji od oko 20% m/m ili manji od oko 10% m/m.

[0075] U nekim povoljnim tehničkim rešenjima, voda i etanol prisutni u ulju mogu se zatim ukloniti bilo kojim pogodnim postupkom, kao što je uparavanje pod vakuumom (opciono uz blago zagrevanje, npr, na oko 65°C ili manje), strujom azota ili liofilizacijom. U nekim tehničkim rešenjima, ulje se podvrgava uparavanju pod vakuumom, opciono uz blago zagrevanje. Ovo dalje može biti praćeno kratkim vremenom boravka (npr, 1-3 sekundi) na višoj temperaturi (npr. oko 70°C, oko 75°C ili oko 80°C) da bi se uklonila voda i etanol korastvarač iz smeše polarnih i nepolarnih lipida niskog viskoziteta, a visok udeo nepolarnih lipida daje nizak viskozitet. U nekim poželjnim tehničkim rešenjima, poželjno je da temperature ne prelaze oko 60°C tokom blagog zagrevanja pod vakuumom, da bi se izbegla ili minimizirala degradacija komponenti ekstrahovanog ulja. U daljim tehničkim rešenjima, temperature tokom blagog zagrevanja pod vakuumom povoljno ne prelaze oko 55°C ili oko 50°C ili oko 45°C ili oko 40°C ili oko 35°C ili oko 30°C ili oko 25°C.

[0076] U nekim tehničkim rešenjima, rezidualni sadržaj isparljivih materija (voda i etanol) nakon isparavanja je oko ili manji od oko 3% m/m, pošto ovo može da minimizira mogućnost da zaostali etanol i voda negativno utiču na odvajanje lipida u kasnijem koraku obogaćivanja. U daljim tehničkim rešenjima, sadržaj zaostalih isparljivih materija je oko ili manji od oko 2,5% m/m ili oko ili manji od oko 2,0% m/m ili oko ili manji od oko 1,5% m/m ili oko ili manji od oko 1,0% m/m ili manje od oko 0,5% m/m ili manje od oko 0,3% m/m ili manje od oko 0,1% m/m.

[0077] U ovoj fazi, nakon uparavanja, zbog prisustva nepolarnih lipidnih komponenti, ulje je i dalje tečno i može se lako analizirati, npr, na sadržaj fosfolipida i/ili omega-3 masnih kiselina. Ovo je važno jer je potrebna precizna analiza da bi se izračunao željeni stepen obogaćivanja, a time i sadržaj fosfolipida u konačnom ulju koji se postiže u sledećem koraku. Posebno, tamo gde je poželjan konačni visoki sadržaj fosfolipida, prekomerno obogaćivanje (tj. dalje uklanjanje nepolarnih lipida), čak i sa malim marginama može dovesti do problema u procesu obrade zbog prevelikog viskoziteta. Upareno ulje se može temeljno izmešati da bi se obezbedila homogenost, opciono nakon transfera u rezervoare za međuproizvode. Opciono, ulje se može lagano zagrejati (npr, na temperaturi nižoj od ili oko 60°C, 55°C ili oko 50°C ili oko 45°C ili oko 40°C ili oko 35°C ili oko 30°C ili oko 25°C) da pomogne u održavanju tečnog i homogenog materijala za analizu. Manje viskozna priroda neobogaćenog ulja dobijenog u prvom koraku CO2/ EtOH ekstrakcije u poređenju sa biomasom u voluminoznom stanju u prvom koraku koja se koristi u procesima prethodnog stanja tehnike koji su gore razmatrani, može, u nekim tehničkim rešenjima, povoljno da omogući precizniju analizu kompozicije jer se homogenost mase može lakše postići. U nekim tehničkim rešenjima, ovo može povoljno da izbegne, svede na minimum ili na drugi način smanji prekomerno obogaćivanje fosfolipida u naknadnoj selektivnoj ekstrakciji nepolarnih lipida, što bi inače moglo da dovede do neželjenog viskoznog ili nepokretnog čvrstog proizvoda.

[0078] Drugi korak procesa uključuje poželjnu ili selektivnu ekstrakciju nepolarnih (trigliceridnih) lipida iz ulja dobijenog u prvom koraku. Ako je neobogaćeno ulje dobijeno prvim korakom ekstrakcije prebačeno u međurezervoar, vraća se u postrojenje za ekstrakciju. Ulje se dalje podvrgava CO2ekstrakciji, u nekim poželjnim tehničkim rešenjima u superkritičnim uslovima, npr, na pritisku od oko 300 bara ili većem i na oko 60 °C, kako bi se selektivno ekstrahovali nepolarni (trigliceridi) lipidi. U nekim tehničkim rešenjima, ekstrakcija može da počne sa nižim pritiskom, a zatim da se on postepeno povećava do željenog nivoa (npr. oko 300 bara). Nepolarni (trigliceridni) lipidi mogu se progresivno ekstrahovati, obogaćujući tako preostali rafinat, sve dok se ne postigne željeni cilj kompozicije, na primer, sadržaj fosfolipida od najmanje oko 50% m/m ili najmanje oko 55% m/m fosfolipida ili najmanje oko 60% m/m, fosfolipida ili najmanje oko 65% m/m fosfolipida ili najmanje oko 70% m/m fosfolipida ili najmanje oko 75% m/m fosfolipida ili najmanje oko 80% m/m fosfolipida ili najmanje oko 85% m/m fosfolipida ili najmanje oko 90% m/m fosfolipida ili najmanje oko 95% m/m fosfolipida ili najmanje oko 97% m/m fosfolipidi ili najmanje oko 98% m/m fosfolipida ili najmanje oko 99% m/m fosfolipida.

[0079] U nekim tehničkim rešenjima, kada se ekstrahuje potrebna količina nepolarnog lipida da bi se postigao željeni nivo obogaćivanja fosfolipidima, delimično smanjenje pritiska u sudu za ekstrakciju omogućava preostalom pritisku da pomogne u ispuštanju sada obogaćenog (i viskoznijeg) rafinata po potrebi. Ispuštanje obogaćenog ulja visokog viskoziteta može se tolerisati u većoj meri ispuštanjem iz ekstraktora koji je još uvek pod delimičnim pritiskom. Na ovaj način se izuzetno viskozni materijali mogu preneti za dalje mešanje i formulaciju.

[0080] U jednom ili više tehničkih rešenja, proces može omogućiti polukontinuiranu obradu, sa pojedinačnim sudovima za ekstrakciju koji se menjaju u kontinualnoj rotaciji, ali jedan po jedan, dok drugi sudovi za ekstrakciju nastavljaju da rade. Na ovaj način se može izbeći zaustavljanje radi promene serija višestrukog ekstraktora.

[0081] U drugim tehničkim rešenjima, drugi korak koji je ovde opisan može se koristiti za obogaćivanje sadržaja fosfolipida u bilo kom ulju krila koje ima sadržaj fosfolipida manji od oko 50% m/m, kako bi se dobilo ulje krila sa sadržajem fosfolipida od najmanje oko 50% m/m.

[0082] U nekim tehničkim rešenjima, početno ulje krila ima sadržaj fosfolipida od oko 45% m/m ili manje, ili oko 40% m/m ili manje, ili oko 35% m/m ili manje, ili oko 30% m/m ili manje, ili oko 25% m/m ili manje, ili oko 20% m/m ili manje, ili oko 10% m/m ili manje. U nekim tehničkim rešenjima, konačno obogaćeno ulje može imati sadržaj fosfolipida od najmanje oko 55% m/m fosfolipida ili najmanje oko 60% m/m fosfolipida ili najmanje oko 65% m/m fosfolipida ili najmanje oko 70% m/m fosfolipida ili najmanje oko 75% m/m fosfolipida ili najmanje oko 80% m/m fosfolipida ili najmanje oko 85% m/m fosfolipida ili najmanje oko 90% m/m fosfolipida ili najmanje oko 95% m/m fosfolipida ili najmanje oko 97% m/m fosfolipida ili najmanje oko 98% m/m fosfolipida ili najmanje oko 99% m/m fosfolipida.

[0083] U nekim tehničkim rešenjima, obogaćeno ulje krila ima konačni sadržaj vode od oko 5% m/m ili manje, ili oko 4 ili 3 ili 2 ili 1 ili 0,5% m/m ili manje. U nekim tehničkim rešenjima, ulje krila ima rezidualni sadržaj rastvarača za ekstrakciju od oko 5% m/m ili manje, ili oko 4 ili 3 ili 2 ili 1 ili 0,5% m/m ili manje. U daljim tehničkim rešenjima, ulje krila ima sadržaj vode od oko 5% m/m ili manje, ili oko 4 ili 3 ili 2 ili 1 ili 0,5% m/m ili manje, i rezidualni sadržaj rastvarača za ekstrakciju od oko 5% m/m ili manje, ili oko 4 ili 3 ili 2 ili 1 ili 0,5% m/m ili manje. U daljim tehničkim rešenjima, obogaćeni kril ima rezidualni sadržaj rastvarača (voda i etanol) od 5% m/m ili manje, ili oko 4 ili 3 ili 2 ili 1,5 ili 1 ili 0,5 ili 0,3 ili 0,1 % m/m ili manje.

[0084] U dodatnim tehničkim rešenjima, konačno obogaćeno ulje krila ima sadržaj fosfolipida od najmanje oko 60% m/m fosfolipida, i rezidualni sadržaj rastvarača od oko 3% m/m ili manje.

[0085] Druga tehnička rešenja koja se odnose na ulje krila kao što je ovde opisano, mogu takođe, prema potrebi, da se primenjuju na ulje krila proizvedeno postupkom iz predmetnog pronalaska.

[0086] Sledeći primeri su dati u svrhu prikaza nekih tehničkih rešenja pronalaska i nisu namenjeni da ograniče opštost koja je prethodno opisana.

PRIMERI

Primer 1 - Priprema ulja krila sa 62% m/m fosfolipida

1. Ekstrakcija ulja krila iz krilovog brašna

[0087] Krilovo brašno je ekstrahovano sa CO2/etanol (odnos dopremanja etanola i krilovog brašna oko 3,0-3,5 : 1 m/m), sa masenim udelom etanola u rasponu od oko 17-22% m/m, na temperaturi od 60°C i pritisku od 300 bara. Etanol/CO2faza ekstrakcije je trajala između 10 i 15 sati. Smeša ekstrahovano ulje/CO2/EtOH je odvojena pod pritiskom od 45 bara i na 25°C.

[0088] Nekoliko serija ulja dobijenih ovim postupkom je pomešano da bi se dobilo ulje krila koje sadrži i polarne i nepolarne komponente i sa sadržajem fosfolipida od oko 42% (videti tabelu 1-1 u daljem tekstu).

Tabela 1-1:<31>P NMR analiza FL u uzorku ulja krila

2. Selektivna ekstrakcija triglicerida iz ulja krila dobijenog iz koraka 1.

[0089] 5,9 kg dopremljenog ulja krila (sa sastavom kako je navedeno u Tabeli 1-1 iznad) ubačeno je direktno u jedan sud za ekstrakciju od 10,7 L (prečnik 155 mm). Dopremljeni materijal je ekstrahovan sa CO2na temperaturi od 60°C i pri pritisku od 300 bara.

[0090] Ekstrakti, koji su uglavnom sadržali trigliceride, dobijeni su i bili su znatno manje viskozni od dopremljenog ulja krila koje je napunjeno u sud za ekstrakciju.

[0091] Proces smanjenja pritiska u sudu za ekstrakciju je započeo kada je ukupna masa ekstrahovanog materijala dostigla 97% teorijske količine materijala koja se mogla ekstrahovati. U postrojenju je smanjivan pritisak konstantnom brzinom pumpanja u periodu od 15 minuta od 300 do 100 bara sa nastavljanjem cirkulacije CO2, iako pri 50% protoka ekstrakcije. Za to vreme, izmerena temperatura na izlazu ekstraktora smanjena je sa radne temperature od 60°C na 50°C. Pritisak u ekstraktoru je zatim dodatno smanjen sa 100 na 75 bara u periodu od narednih 15 minuta bez rada pumpe. Nakon toga, sadržaj suda za odvajanje je ispražnjen.

[0092] Dok je sud za ekstrakciju još bio na temperaturi obrade i pritisku od 75 bara, iz suda je ispražnjen njegov sadržaj obogaćenog ulja krila sa dna suda za ekstrakciju znatno ispod nivoa površine rafinata, čime je izbegnut gubitak CO2visokog pritiska sa ispuštanjem rafinisanog ulja. Dobijanje obogaćenog ulja trajalo je oko sat vremena i za to vreme pritisak u sudu se smanjio sa 75 na 54 bara kako se preostali CO2u sudu za ekstrakciju širio da bi zauzeo prostor koji je ranije zauzimalo rafinisano ulje.

[0093] Po završetku ispuštanja obogaćenog ulja, primećeno je da je nešto obogaćenog ulja krila ostalo u sudu za ekstrakciju na distribucionoj i donjoj površini posude, što je procenjeno na manje od 2% ukupne mase obogaćenog ulja. U komercijalnim razmerama, svako takvo preostalo ulje se vraća u sledeću seriju ulja krila za taj ekstraktor.

[0094] Pre analize astaksantina i fosfolipida, obogaćeno ulje je zagrevano u rerni na 55°C tokom 1 sata. Ovo je omogućilo da uzorak bude dovoljno tečan za mešanje da bi se postigao homogen uzorak za analizu.

[0095] Tabela 1-2 sumira masu i sadržaj fosfolipida (FL) i astaksantina (Asta) za dopremno, ekstrahovano i obogaćeno ulje. Veoma malo fosfolipida (<1g/100g ekstrakta) i astaksantina (<2mg/100g ekstrakta) je koekstrahovano. Sve u svemu, masa ekstrakta dobijenog procesom obogaćivanja bila je 98% teorijskog ekstrakta potrebnog za obogaćivanje na 62% fosfolipida.

Tabela 1-2: Rezime sadržaja fosfolipida (FL) i astaksantina (Asta)

[0096] Tabele 1-3 i 1-4 sumiraju sastav obogaćenog ulja

Tabela 1-3:<31>P NMR analiza FL u uzorku ulja krila

Tabela 1-4: GC analiza masnih kiselina

Primer 2 -

[0097] Ekstrakt lipida dagnji pripremljen je prema WO97/09992 i koristi se u obliku PCSO-524<®>(Pharmalink International Limited, Hong Kong). Ulje krila je pripremljeno postupkom iz Primera 1, sa sadržajem kompozicije kao što je navedeno u Tabelama 1-3 i 1-4 iznad.

Priprema uzorka

[0098] Sveži uzorci su pripremani svakodnevno. Uzorci su pomešani inverzijom pre uzorkovanja. Uzorci su izmereni u epruvetama za centrifugiranje od 1,5 mL i dovedeni do 100 mg/mL sa etanolom da bi se pripremio osnovni materijal. Osnovne smeše su pripremljene merenjem ulja u ispravnom odnosu i zatim dovođenjem do koncentracije etanolom. Serijska razblaženja osnovnog rastvora su napravljena u etanolu. Serijska razblaženja su zatim razblažena (1 u 100) u medijumu ćelijske kulture pre nego što su dodata ćelijama (u tri primerka) sa konačnim razblaženjima 1 u 10. Ovo je rezultiralo etanskom koncentracijom od 0,1% za sve doze i kontrole. Ulje krila je sadržalo približno 62% m/m fosfolipida. Ekstrakt lipida dagnji je korišćen u obliku PCSO-524<®>.

[0099] Skraćenice koje se koriste za predstavljanje rezultata su navedene u tabeli 2-1 u daljem tekstu:

Tabela 2-1: Skraćenice

Testovi

[0100] Anti-inflamatorna aktivnost je određena u mišjim makrofagima stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFNγ), ćelije RAW264.7 kultivisane u standardnim medijumima ćelijske kulture i inkubirane sa LPS i IFNγ u prisustvu ili odsustvu različitih testiranih jedinjenja/ekstrakata i pozitivne kontrole. Proizvodnja inflamatornih medijatora, uključujući NO, PGE2i LTB4, citokina TNFα i IL-6, merena je utvrđenim postupcima korišćenjem komercijalnih kompleta. Svaki uzorak je testiran sa najmanje 3 koncentracije (koristeći 3 ponavljanja, maksimalna koncentracija je bila 100µg/ml) (n=9), sa relevantnim internim kontrolama (Tabela 2-2). Citotoksičnost svakog uzorka je, takođe, određena MTT testom. Ni za jednu testiranu koncentraciju nije utvrđena citotoksičnost.

[0101] Parametri testa za svaki test su rezimirani u Tabeli 2-2. Ukratko, da bi se izvršio antiinflamatorni test, kultivisane ćelije RAW264.7 su izbrojane i postavljene (0,8 x 10<5>ćelija/bunarić) u ploče sa 96 bunarića i inkubirane tokom naznačenog vremena zasejavanja. Medijum je zatim aspiriran i zamenjen svežim medijumom nakon čega je usledilo dodavanje testiranih jedinjenja. Jedinjenja su inkubirana 1 sat pre dodavanja stimulansa. Ploče su zatim inkubirane između 4-18 sati i supernatant je analiziran na medijator od interesa, a preostala vijabilnost ćelija je određena pomoću MTT.

[0102] Pozitivne kontrole su odabrane na osnovu njihove široke upotrebe u sličnim testovima, uključujući N-(3-(Aminometil)benzil)acetamidin (1400W), inhibitor sporog, čvrstog vezivanja inducibilne sintaze azot-oksida (iNOS) (Garvey, E. P., i saradnici, J Biol Chem, 1997, 21:272(8):4959-63) i deksametazon, najčešće korišćeni inhibitor citokina. Diklofenak je uobičajeno nesteroidno antiinflamatorno sredstvo i poznati inhibitor ciklooksigenaze (COX) koja proizvodi PGE2.

Tabela 2-2: - Parametri testa

Rezultati

1. Test azotnog oksida

[0103] NO je radikalni metabolit, za koji se pokazalo da ima brojne fiziološke funkcije i kao signalni molekul i kao toksično sredstvo u inflamaciji (Coleman, 2001). NO se dobija oksidacijom L-arginina pomoću tri vrste sintaza azot oksida (NOS); konstitutivnih oblika, neuronske NOS i endotelne NOS, i inducibilnog oblika, iNOS, prvobitno opisanog u mišjim makrofagima (Nathan & Xie, 1994; Stuehr & Marietta, 1985). Inducibilni oblik se neprekidno aktivira kada se jednom eksprimira, i stoga je regulisan na nivou transkripcije pomoću NF-κB, stimulisan inflamatornim molekulima kao što su LPS i IFN-γ. Proizvodnja NO od strane iNOS-a doživljava sate kašnjenja pre nego što se NO počne proizvoditi u mnogo višim (nM) održivim nivoima (Nathan & Xie, 1994). Inducibilni oblik NOS je najverovatnije uključen u upalu a zbog viših nivoa proizvedenog NO lakše se procenjuje in vitro.

[0104] NO je neuobičajen signalni molekul. Pošto ne postoji specifični receptor na ćelijskoj površini za NO, on ulazi u ćelije neselektivno, gde efekat zavisi od tipa ćelije i koncentracije NO, stvarajući tako širok spektar fizioloških odgovora. NO izaziva povećanu vaskularnu permeabilnost, vazodilataciju i stvaranje radikala što uzrokuje oštećenje tkiva i eliminiše patogene (Guzik, Korbut i Adamek-Guzik, 2003). Ove fiziološke promene su povezane sa upalom sa povećanim protokom krvi, omogućavajući većem broju imunih ćelija da uđu u zahvaćeno tkivo i na taj način unište patogen.

[0105] Rezultati za test inhibicije NO prikazani su na slikama 1A i 1B i tabeli 2-3

Tabela 2-3: IC50 za NO inhibiciju

2. Faktor nekroze tumora-alfa

[0106] TNFα je ćelijski signalni protein (citokin) uključen uglavnom u inflamatorni odgovor akutne faze. Makrofagi su glavni izvor TNFα, iako ga mogu osloboditi mnogi drugi tipovi ćelija kao što su CD4+ limfociti, prirodne ćelije ubice (NK), neutrofili, mastociti, eozinofili i neuroni. TNFα se proizvodi aktivacijom MAPK i NF-κB. Deluje na povećanje sopstvene proizvodnje i proizvodnje drugih inflamatornih citokina kao što je interleukin-1 beta (IL-1β). TNFα izaziva groznicu, apoptotičku smrt ćelija, kaheksiju, upalu i inhibira tumorgenezu i replikaciju virusa. TNFα je uključen u mnoga oboljenja, uključujući sepsu, traumatske povrede, ishemiju, astmu, opekotine, sindrom iritabilnog kolona, Alchajmerovu bolest, kancer, tešku depresiju, artritis i multiplu sklerozu (Cairns, Panacek, Harken, & Banerjee, 2000; Dowlati i saradnici, 2010; Swardfager i saradnici, 2010).

[0107] Rezultati za test inhibicije TNFa prikazani su na slikama 2A i 2B i u Tabeli 2-4.

Tabela 2-4: IC50 za inhibiciju TNFα

3. Interleukin-6

[0108] Kao i TNFα, IL-6 se smatra proinflamatornim citokinom. IL-6 luče T ćelije i makrofagi koji stimulišu imuni odgovor. IL-6 je odgovoran za povećanu proizvodnju neutrofila u koštanoj srži. Podržava rast B ćelija i antagonističan je prema diferencijaciji T ćelija u regulatorne T ćelije. Sposoban je da pređe krvno-moždanu barijeru i pokrene sintezu PGE2u hipotalamusu, čime se menja podešena temperatura tela (Banks, Kastin i Gutierrez, 1994).

[0109] Rezultati testa inhibicije IL-6 prikazani su na slikama 3A i 3B i u Tabeli 2-5

Tabela 2-5: IC50 za inhibiciju IL-6

4. Prostaglandin E2

[0110] Prostaglandin E2(PGE2) je jedan od lipidnih medijatora proizvedenih iz arahidonske kiseline (AA) dejstvom enzima ciklooksigenaze (COX) i uključen je u izazivanje pireksije, osećaja bola i upale. Aspirin i nesteroidni antiinflamatorni lekovi (NSAIL) inhibiraju biosintezu prostanoida (uključujući PGE2), što rezultira antipiretičkim, analgetskim i antiinflamatornim efektima (Kawahara, K., i saradnici, 2015, i Kawabata, A., 2011).

[0111] Rezultati su prikazani na slikama 4A i 4B i u Tabeli 2-6.

Tabela 2-6: IC50 za PG-E2 Inhibiciju

Rezime rezultata

[0112] Ekstrakt lipida dagnji i ulje krila su prikazani u ovom sistemu testiranja u koncentracijama koje su testirane da pojedinačno inhibiraju NO, TNFα i IL-6, ali ne i PGE2.

[0113] Kombinacija ekstrakta lipida dagnji i ulja krila bila je efikasnija od bilo kog ekstrakta lipida dagnji ili ulja krila pojedinačno u inhibiciji NO, TNFα i IL-6. U PGE2testu, ni ekstrakt lipida dagnji ni ulje krila sami po sebi nisu pokazali inhibitornu aktivnost, ali su u kombinaciji pokazali inhibiciju.

Primer 3 - Sinergija

[0114] Ekstrakt lipida dagnji pripremljen je prema WO97/09992 i koristi se u obliku PCSO-524<®>. Ulje krila je pripremljeno postupkom iz Primera 1, sa sadržajem kompozicije kao što je navedeno u Tabelama 1-3 i 1-4 iznad.

Uzorci, priprema i kombinacija

[0115] Osnovni uzorci PCSO-524<®>i visoko fosfolipidno ulje krila pomešani su inverzijom pre eksperimentalnog uzorkovanja. Uzorci su izmereni u epruvetama za centrifugiranje od 15 mL i dovedeni do 100 mg/mL sa etanolom da bi se pripremio osnovni materijal. Smeše su pripremljene mešanjem razblaženih ulja u pravilnom odnosu. Serijska razblaženja su napravljena u etanolu. Serijska razblaženja su zatim razblažena (1 u 100) u medijumu ćelijske kulture pre nego što su dodata ćelijama (u tri primerka) sa konačnim razblaženjima 1 u 10. Ovo je rezultiralo etanskom koncentracijom od 0,1% za sve doze i kontrole. Ove doze su svakodnevno pripremane sveže. Tabela 3-1 prikazuje skraćenice korišćene za svaki uzorak.

Tabela 3-1: Skraćenice naziva uzorka

Testovi

[0116] Anti-inflamatorna aktivnost je određena u mišjim makrofagima stimulisanim lipopolisaharidom (LPS) i interferonom γ (IFNi), ćelije RAW264.7 kultivisane u standardnoj podlozi za ćelijsku kulturu (DMEM, fetalni goveđi serum 5%) i inkubirane u prisustvu ili odsustvu različitih testiranih jedinjenja/ekstrakata i kontrole. Proizvodnja inflamatornih medijatora, uključujući NO, citokina TNFα i IL-6, merena je utvrđenim postupcima korišćenjem komercijalnih ELISA kompleta (dobavljači su navedeni u

Tabeli 3-2). Svaki uzorak je testiran sa najmanje 6 koncentracija (koristeći 3 ponavljanja, maksimalna koncentracija je bila 100µg/mL) (n=9), sa relevantnim internim kontrolama (prikazanim u

Tabeli 3-2). Citotoksičnost svakog testiranog uzorka određena je MTT testom. Ni za jednu testiranu koncentraciju nije utvrđena citotoksičnost.

[0117] Parametri testa za svaki test su rezimirani u

Tabeli 3-2. Ukratko, za testove NO, TNFα i IL-6 kultivisane ćelije RAW264.7 su izbrojane i postavljene na pločice (0,8×10<5>ćelija/bunarić) u ploče sa 96 bunarića i inkubirane 48 sati. Medijum je zatim aspiriran i zamenjen svežim medijumom nakon čega je usledilo dodavanje testiranih jedinjenja. Jedinjenja su inkubirana 1 sat pre dodavanja stimulansa. Ploče su zatim inkubirane između 18 sati i supernatant je analiziran na medijator od interesa, a preostala vijabilnost ćelija je određena pomoću MTT.

[0118] Pozitivne kontrole su odabrane na osnovu njihove široke upotrebe u sličnim testovima, uključujući N-(3-(Aminometil)benzil)acetamidin (1400W), inhibitor sporog, čvrstog vezivanja inducibilne sintaze azot-oksida (iNOS) (Garvey i saradnici, 1997), i deksametazon, često korišćeni inhibitor citokina.

Tabela 3-2: Anti-inflamatorni testovi i pozitivne kontrole

Izračunavanje sinergije

[0119] Sinergizam se izražava kao kombinovani indeks. Kombinovani indeks (CI) sinergizma i ponderi IC50 izobolograma su izračunati korišćenjem Compsyn softvera. Kriva odgovora na dozu generisana u Graphpad Prism-u je transformisana u 10 tačaka koje predstavljaju krivu. Ovih 10 tačaka je zatim uneto u Compsyn program koji je napravio krivu tako da odgovara tačkama podataka. Ovaj postupak je bio poželjniji za blisko repliciranje kompletne krive odgovora na dozu u sinergijskom programu. Compsyn prilagođena kriva je zatim korišćena za proračune sinergije. Obrazac u sinergiji u testiranom rasponu može se posmatrati pomoću izobolograma, koji grafički prikazuje relativni doprinos svake komponente za aktivnost pri IC50. Postoji ravna linija između dva leka koja se mešaju (Biavatti, 2009). Vrednosti ispod linije ukazuju na sinergiju, na liniji se smatraju aditivnim, a iznad linije antagonističkim.

Rezultati

1. Test azotnog oksida

[0120] Kombinacije su analizirane da bi se utvrdilo da li pokazuju sinergističku inhibiciju na inflamatornom signalnom molekulu NO. Kombinacije su prvo testirane u povećanjima od 10%.

Najaktivnija primećena kombinacija bila je LY60. Zatim su testirana dodatna povećanja od 5% oko LY60.

[0121] Krive odgovora na dozu testiranih kombinacija LY90-LY10 su prikazane na slikama 5A, 5B, 6A i 6B. IC50vrednosti za inhibiciju NO i kombinovani indeks su predstavljeni u Tabelama 3-3 i 3-4. Kombinovani indeks manji od 1 ukazuje na sinergiju. Izobologram za povećanje od 10% je prikazan na slici 7.

Tabela 3-3: IC50 vrednosti za inhibiciju NO kombinacija LY90-LY10

Tabela 3-4: IC50 (CI) i kombinovani indeks za inhibiciju NO kombinacija LY75 do LY45

2. TNFα test

[0122] Kombinacije su analizirane da bi se utvrdilo da li pokazuju sinergističku inhibiciju inflamatornog citokina TNFα. Kombinacije su prvo testirane u povećanjima od 10%. Najaktivnija primećena kombinacija bila je LY50. Dodatna povećanja od 5% su zatim testirana oko LY50.

[0123] Krive doze odgovora testiranih kombinacija LY90-LY10 su prikazane na slikama 8A, 8B, 8C, 9A i 9B. IC50vrednosti za inhibiciju TNFα i kombinovani indeks su predstavljeni u Tabelama 3-5 i 3-6. Kombinacioni indeks manji od 1 ukazuje na sinergiju. Izobologram za povećanje od 10% je prikazan na slici 10.

Tabela 3-5: IC50 vrednosti za TNF inhibiciju

*- nije moguća procena

Tabela 3-6: IC50 i CI za LY70-LY35 (n=9)

3. IL-6 test

[0124] Kombinacije su analizirane da bi se utvrdilo da li pokazuju sinergističku inhibiciju inflamatornog citokina IL-6. Kombinacije su prvo testirane u inkrementima od 10%. Najaktivnija primećena kombinacija bila je LY60. Zatim su testirani dodatni inkrementi od 5% oko LY60.

[0125] Krive odgovora na dozu testiranih kombinacija LY90-LY10 su prikazane na slikama 11A, 11B, 12A i 12B. IC50vrednosti za inhibiciju IL-6 i kombinovani indeks su predstavljene u Tabelama 3-7 i 3-8. Kombinovani indeks manji od 1 ukazuje na sinergiju. Izobologram za povećanje od 10% je prikazan na slici 13.

Tabela 3-7: IC50 vrednosti za IL-6 inhibiciju (n=3)

Tabela 3-8: IC50 i kombinovani indeks za IL-6 inhibiciju

Rezime rezultata

[0126] Ekstrakt lipida dagnji i ulje krila, korišćeni u kombinaciji, pokazali su se u ovom sistemu ispitivanja da ispunjavaju matematičke kriterijume za sinergiju u inhibiciji NO, TNFα i IL-6.

Primer 4 - Studija sa pacijentima

[0127] Pacijentima koji pate od raznih bolova / upalnih stanja administrirana je kombinacija ekstrakta lipida dagnji (u obliku PCSO-542) i ulja krila (61% FL) u odnosu PCSO-542 prema ulju krila od 75:25, u obliku kapsula. Sastav navedenih kapsula je predstavljen u Tabeli 4-1.

Tabela 4-1: Sastav kapsula sa smešom ulja od 150 mg

[0128] Doziranje se obično kretalo od 2-8 kapsula dnevno, preko jedne, dve ili tri doze. Pre početka lečenja kombinacijom, pacijenti su obično uzimali jedan ili više NSAIL, uključujući paracetamol ili ibuprofen, za ublažavanje bolova. Rezultati su prikazani u tabeli 4-2.

Tabela 4-2: Rezime rezultata pacijenata

Reference

[0129]

Biavatti, M. W. (2009). „Sinergija: stara mudrost, nova paradigma za farmakoterapiju“ (Synergy: an old wisdom, a new paradigm for pharmacotherapy). Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 45(3), 371-378.

Cairns, C. B., Panacek, E. A., Harken, A. H., & Banerjee, A. (2000). „Od klupe do kreveta: Faktor nekroze tumora - alfa: Od upale do reanimacije“ (Bench to bedside: Tumor necrosis factor-alpha: From inflammation to resuscitation). Academic Emergency Medicine, 7(8), 930-941.

Coleman, J. W. (2001). „Azot oksid u imunitetu i upalama“ (Nitric oxide in immunity and inflammation). Int Immunopharmacol, 1(8), 1397-1406.

Dowlati, Y., Herrmann, N., Swardfager, W., Liu, H., Sham, L., Reim, E. K., & Lanctot, K. L. (2010). „Meta analiza citokina kod teške depresije“ (A Meta-Analysis of Cytokines in Major Depression). Biological Psychiatry, 67(5), 446-457. doi:10.1016/j.biopsych.2009.09.033

Garvey, E. P., Oplinger, J. A., Furfine, E. S., Kiff, R. J., Laszlo, F., Whittle, B. J. R., & Knowles, R. G. (1997). „1400Wje spor, čvrsto vezujući i visoko selektivni inhibitor inducibilne sintaze azot-oksida in vitro i in vivo“ (1400W is a slow, tight binding, and highly selective inhibitor of inducible nitric-oxide synthase in vitro and in vivo). Journal of Biological Chemistry, 272(8), 4959-4963.

Guzik, T. J., Korbut, R., & Adamek-Guzik, T. (2003). „Azot oksid i superoksid u regulaciji upala i imuniteta“ (Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation). J Physiol Pharmacol, 54(4), 469-487.

Kawabata, A., (2011). „Prostaglandin E2 i bol – ažuriranje“ (Prostaglandin E2 and Pain -An Update). Biol Pharm Bull, 34(8), 1170-1173

Kawahara, K. (2015). „Upala izazvana prostaglandinom E2: Relevantnost receptora prostaglandina E“ (Prostaglandin E2-induced inflammation: Relevance of prostaglandin E receptors). Biochim Biophys Acta, 1851 (4), 414-421

Nathan, C., & Xie, Q. W. (1994). „Sintaze azotnog oksida: uloge, problemi i kontrole“ (Nitric oxide synthases: roles, tolls, and controls). Cell, 78(6), 915-918.

Sinclair, A. J., Murphy, K. J. and Li, D. (2000) „Pregled morskih lipida „Uvid u novosti i lipidnu kompoziciju Liprinola“ (Marine lipids overview „News insights and lipid composition of Lyprinol). Allerg Immunol (Paris) 32(7), 261-271

Stuehr, D. J., & Marietta, M. A. (1985). „Biosinteza nitrata kod sisara: mišji makrofagi proizvode nitrit i nitrat kao odgovor na lipopolisaharid escherichia coli“ (Mammalian nitrate biosynthesis: mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide). Proc Natl Acad Sci U S A, 82(22), 7738-7742. Swardfager, W., Lanctot, K., Rothenburg, L., Wong, A., Cappell, J., & Herrmann, N. (2010). „Meta-analiza citokina kod Alchajmerove bolesti“ (A Meta-Analysis of Cytokines in Alzheimer’s Disease). Biological Psychiatry, 68(10), 930-941.

Claims (22)

Patentni zahtevi

1. Kombinacija koja sadrži ekstrakt lipida dagnji i ulje krila, pri čemu je kombinacija prilagođena za odvojenu ili istovremenu primenu, pri čemu se ekstrakt lipida dagnji dobija od perna canaliculus, i pri čemu je maseni odnos ekstrakta lipida dagnji prema ulju krila u rasponu od 5:95 do 99:1.

2. Kombinacija prema patentnom zahtevu 1 u obliku kompozicije koja sadrži ekstrakt lipida dagnji i ulje krila.

3. Kombinacija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu ulje krila ima sadržaj fosfolipida od najmanje oko 40% m/m ili najmanje oko 50% m/m ili najmanje oko 60% m/m.

4. Kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, pri čemu ulje krila ima sadržaj vode od oko 5% m/m ili manje, ili oko 3% m/m ili manje, ili oko 1% m/m ili manje; i/ili

sadržaj rastvarača za ekstrakciju od oko 5% m/m ili manje, ili oko 3% m/m ili manje, ili oko 1% m/m ili manje.

5. Kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, pri čemu je maseni odnos ekstrakta lipida dagnji prema ulju krila u rasponu od oko 5:95 do 95:5, poželjno u rasponu od oko 10:90 do 90:10, kao što je, oko 10:90 ili oko 15:85 ili oko 20:80 ili oko 25:75 ili oko 30:70 ili oko 35:65 ili oko 40:60 ili oko 45:55 ili oko 50:50 ili oko 55:45 ili oko 60:40 ili oko 65:35 ili oko 70:30 ili oko 75:25 ili oko 80:20 ili oko 85:15 ili oko 90:10.

6. Kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5 u oralnom jediničnom doznom obliku.

7. Kombinacija prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je oralni jedinični dozni oblik meka gel kapsula.

8. Kombinacija prema patentnom zahtevu 6 ili 7, pri čemu oralni jedinični dozni oblik sadrži od oko 10 mg do oko 1,0 g ekstrakta lipida dagnji; i/ili

od oko 10 mg do oko 1,0 g ulja krila.

9. Kombinacija prema patentnom zahtevu 8, pri čemu oralni jedinični dozni oblik sadrži oko 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg ili oko 1,0 g ekstrakta lipida dagnji; i/ili

oko 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg ili 1,0 g ulja krila.

10. Kombinacija prema patentnom zahtevu 9, pri čemu oralni jedinični dozni oblik sadrži od oko 10 mg do oko 500 mg ekstrakta lipida dagnji; i/ili

od oko 10 mg do oko 500 mg ulja krila.

11. Kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, pri čemu oralni jedinični dozni oblik sadrži oko 10-500 mg kombinacije ekstrakta lipida dagnji i ulja krila.

12. Kombinacija prema patentnom zahtevu 11, pri čemu oralni jedinični dozni oblik sadrži oko 50-300 mg kombinacije ekstrakta lipida dagnji i ulja krila.

13. Kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, koja dalje sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i/ili aditiva.

14. Kombinacija prema patentnom zahtevu 13, koja sadrži ulje kao nosač i opciono antioksidans.

15. Kombinacija prema patentnom zahtevu 14, pri čemu ulje kao nosač je maslinovo ulje.

16. Kombinacija prema patentnom zahtevu 14 ili 15, pri čemu ulje kao nosač sadrži od oko 10% m/m do oko 90% m/m ukupne kompozicije.

17. Kombinacija prema patentnom zahtevu 14 ili 15, pri čemu je maseni odnos ulja kao nosača prema kombinovanoj količini ekstrakta lipida dagnji i ulja krila od oko 3:1, do oko 1:3.

18. Kombinacija prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je jedan ili više aditiva izabrano od antioksidanasa, vitamina A, vitamina D, vitamina E i vitamina K.

19. Kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-18 koja se sastoji ili se u suštini sastoji od ekstrakta lipida dagnji i ulja krila.

20. Kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-19 za primenu u lečenju upala kod subjekta.

21. Kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-19 za primenu u lečenju bola kod subjekta.

22. Kombinacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-19 za primenu u lečenju bolova u zglobovima ili poboljšanju pokretljivosti zglobova u vezi sa osteoartritisom ili reumatoidnim artritisom kod subjekta.