ES2960784T3 - Variantes del péptido ATF5 y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Se proporcionan péptidos ATF5 que tienen una región de cremallera de leucina ATF5 truncada y, opcionalmente, una región de penetración celular, composiciones que comprenden los péptidos ATF5 y métodos para inhibir la proliferación y promover la citotoxicidad en una célula neoplásica usando los péptidos ATF5. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes del péptido ATF5 y usos de las mismas

Antecedentes

El factor de transcripción activador 5 (ATF5) es un miembro de la familia ATF/CREB (proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc) de proteínas básicas de cremallera de leucina. En el cerebro en desarrollo normal, ATF5 se expresa mucho en células progenitoras neurales/madre neurales donde bloquea la salida del ciclo celular y fomenta la proliferación celular, inhibiendo así la neurogénesis y la gliogénesis. La disminución de ATF5 es necesaria para permitir la salida del ciclo de las células neuroprogenitoras y la diferenciación a neuronas, astrocitos u oligodendroglía (Greeneet al.2009; Shenget al.2010a; Shenget al.2010b; Ariaset al.2012).

Además de su papel en el desarrollo normal del sistema nervioso, el ATF5 también ha surgido como un factor oncogénico que fomenta la supervivencia de gliomas y otros tumores. Varios estudios han demostrado que ATF5 se expresa mucho en una variedad de cánceres, incluidos glioblastoma, cánceres de mama, de páncreas, de pulmón y de colon, y es esencial para la supervivencia de células de glioma (Monacoet al.2007; Shenget al.2010a). En el contexto de gliomas, la sobreexpresión de ATF5 se correlaciona inversamente con el pronóstico y la supervivencia de la enfermedad, es decir, los pacientes de glioma con mayor expresión de ATF5 tienen desenlaces significativamente peores que los pacientes con menor expresión de ATF5.

En células cancerosas, los genes que inducen la apoptosis a menudo se inactivan o disminuyen, mientras que los genes antiapoptóticos se activan o se sobreexpresan con frecuencia. De acuerdo con este paradigma, ATF5 aumenta la transcripción de proteínas antiapoptóticas, incluyendo leucemia de linfocitos B 2 (Bcl-2) y leucemia de células mieloides 1 (Mcl-1), fomentando la supervivencia de células tumorales (Shenget al.,2010b; Chenet al.,2012).

Compendio de la invención

Algunos de los aspectos principales de la presente invención se resumen a continuación. Se describen aspectos adicionales en las secciones Descripción detallada de la invención, Ejemplos, Figuras y Reivindicaciones de esta divulgación. La descripción en cada sección de esta divulgación está destinada a leerse junto con las otras secciones.

Según esto, la divulgación proporciona derivados peptídicos de ATF5 que comprenden un dominio de cremallera de leucina de ATF5, opcionalmente en donde una secuencia de cremallera de leucina mejorada por modificación está ausente, composiciones y kits que comprenden los péptidos ATF5, y métodos para inducir citotoxicidad y/o inhibir la proliferación de una célula neoplásica usando los péptidos ATF5. En particular, la divulgación proporciona variantes de un péptido ATF5 que comprenden la secuencia de cremallera de leucina ST-3 (SEQ ID NO: 53), variantes que pueden comprender sustituciones de aminoácidos no conservadoras. Antes de la presente invención, no se podría haber predicho que tales sustituciones producirían moléculas que tuvieran una actividad citotóxica similar o superior, en comparación con un péptido ATF5 que comprende la secuencia de cremallera de leucina ST-3 (SEQ ID NO: 53). En algunas formas de realización, la divulgación proporciona variantes de ST-3 del péptido ATF5 que penetran en las células, variantes que tienen una actividad citotóxica similar o superior, en comparación con ST-3.

En un aspecto, la invención proporciona un péptido ATF5 que comprende una región de cremallera de leucina de ATF5 truncada, en donde la región de cremallera de leucina de ATF5 truncada comprende una variante de la secuencia de aminoácidos LEGECQGLEARNRELKERAESV (SEQ ID NO: 53), en donde la variante se modifica en una o más posiciones de SEQ ID NO: 53 como sigue: (i) E4 está sustituido con un residuo con carga positiva; (ii) C5 está sustituido con un residuo no polar; (iii) Q6 está sustituido con alanina; (iv) E9 está sustituido con un residuo con carga positiva; (v) R11 está sustituido con un residuo con carga negativa; (vi) N12 está sustituido con un residuo no polar; (vii) K16 está sustituido con un residuo con carga negativa; (viii) S21 está sustituido con alanina.

En otro aspecto, la invención proporciona un péptido ATF5 que comprende una región de cremallera de leucina de ATF5 truncada, en donde la región de cremallera de leucina de ATF5 truncada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: LEGEGQGLEARNRELKERAESV (SEQ ID NO: 54), LEGEAQGLEARNRELKERAESV (SEQ ID NO: 55),

LEGECQGLEARNRELKERAEAV (SEQ ID NO: 56),

LEGECQGLEARLRELKERAESV (SEQ ID NO: 57),

LEGECAGLEARNRELKERAESV (SEQ ID NO: 58),

LEGRCQGLRAENRELEERAESV (SEQ ID NO: 59),

LEGRCQGLRAELRELEERAEAV (SEQ ID NO: 60) y

LEGRAQGLRAELRELEERAEAV (SEQ ID NO: 61).

En una forma de realización, el péptido ATF5 comprende además una región de penetración celular, de modo que el péptido ATF5 es un péptido que penetra la célula. En algunas formas de realización, la región de penetración celular tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 25), RQLKLWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 26), YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 40), e YGRKKRRQRR (SEQ ID NO:41).

Un aspecto adicional de la invención proporciona un péptido ATF5 que penetra en las células que comprende una variante de la secuencia de aminoácidos RQIKIWFQNRRMKWKKLEGECQGLEARNRELKERAESV (SEQ ID NO: 3), en donde la variante está modificada en las posiciones de SEQ ID NO: 3 seleccionadas del grupo que consiste en: (i) C21G (SEQ ID NO: 4); (ii) C21A (SEQ ID NO: 5); (iii) Q22A (SEQ ID NO: 8); (iv) E20R, E25R, R27E y K32E (SEQ ID NO: 9); (v) N28L (SEQ ID NO: 7); (vi) S37A (SEQ ID NO: 6); (vii) E20R, E25R, R27E, N28L, K32E y S37A (SEQ ID NO: 10); y (viii) E20R, C21A, E25R, R27E, N28L, K32E y S37A (SEQ ID NO: 11).

En ciertas formas de realización, el péptido ATF5 comprende D-aminoácidos, en una secuencia de aminoácidos invertida en relación con una secuencia de L-aminoácidos de un péptido ATF5 de la invención. En una forma de realización, la región de cremallera de leucina de ATF5 truncada del péptido retroinverso tiene una secuencia de D-aminoácidos VAEAREELERLEARLGQARGEL (SEQ ID NO: 65). En una forma de realización particular, el péptido retroinverso es un péptido ATF5 que penetra en las células que comprende una secuencia de D-aminoácidos VAEAREELERLEARLGQARGELKKWKMRRNQFWLKLQR (SEQ ID NO: 14).

En algunas formas de realización, el péptido ATF5 de la invención no comprende una región de cremallera de leucina extendida.

En algunas formas de realización, el péptido ATF5 de la invención comprende un grupo acetilo N-terminal y/o un grupo amida C-terminal.

También se proporciona una composición que comprende un péptido ATF5 de la invención. En algunas formas de realización, la composición es una composición farmacéutica. Además, se proporciona un kit que comprende un péptido ATF5 de la invención y una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido ATF5 de la invención.

La invención proporciona un péptido ATF5 de la invención para su uso en fomentar la citotoxicidad en una célula neoplásica. La invención proporciona además un péptido ATF5 de la invención para su uso en inhibir la proliferación de una célula neoplásica. La invención proporciona además un método para fomentar la citotoxicidad en una célula neoplásica, el método comprende poner en contacto la célula neoplásica con un péptido ATF5 de la invención. La invención proporciona además un método para inhibir la proliferación en una célula neoplásica, el método comprende poner en contacto la célula neoplásica con un péptido ATF5 de la invención.

Breve descripción de las figuras

Lafigura 1A-1Cmuestra las secuencias de aminoácidos de los péptidos ATF-5 NTAzip-ATF5 (SEQ ID NO: 1) (Figura 1A), ST-2 (SEQ ID NO: 2) (Figura 1B) y ST-3 (SEQ ID NO: 3) (Figura 1C). El dominio de cremallera de leucina extendido está subrayado, el dominio de penetración celular de penetratina está en cursiva y el dominio de cremallera de leucina ATF-5 está en negrita.

Lafigura 2muestra la actividadin vitrode variantes de ST-3 en las que se reemplaza la cisteína individual.

Lafigura 3muestra la actividadin vitrode variantes de ST-3 en las que se han realizado sustituciones de aminoácidos individuales.

Lafigura 4muestra la actividadin vitrode variantes de ST-3 en las que se han realizado sustituciones de múltiples aminoácidos.

Lafigura 5muestra la actividadin vitrode ST-13, una versión retroinversa de ST-11, una variante de ST-3.

Lasfiguras 6A-6Emuestran la actividadin vitrode ST-13 frente a ST-3 en células de leucemia promielocítica humana (PML, por su sigla en inglés) HL60 (Figura 6A), células de leucemia mieloide aguda (AML14 y SET2) (Figuras 6B,6C), células de melanoma (A375) (Figura 6D) y células de cáncer de mama (MCF7) (Figura 6E). Los valores de CE50 en cada tipo de célula para ST-3 y ST-13, respectivamente, fueron 19,0 pM y 4,8 pM (Figura 6A); 29,6 pM y < 1 pM (Figura 6B); 98,2 pM y 17,7 pM (Figura 6C); 21,8 pM y 1,4 pM (Figura 6D); y 52,9 pM y < 1 pM (Figura 6E).

Lasfiguras 7A-7Emuestran la actividadin vitrode ST-14 en células de leucemia promielocítica humana (PML) HL60 (Figura 7A), células de leucemia mieloide aguda (AML14) (Figura 7B), células de glioblastoma (U251) (Figura 7C), células de melanoma (A375) (Figura 7D) y células de cáncer de mama (MCF7) (Figura 7E). El valor CE50 para ST-2 y ST-14, respectivamente, fue de >300 pM y <5 pM (Figura 7A).

LasFiguras 8A-8Dmuestran que el tratamiento con ST-14 disminuye la expresión de Mcl-1, Bcl-2, BIRC5 (survivina) y ATF5. La expresión del ARN se midió por transcripción inversa reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Los niveles de expresión en células HL60 tratadas con ST-145 pM se muestran relativos a la expresión de p-actina a las 4 horas (Figura 8A) y 24 horas (Figura 8B) después del tratamiento. Los niveles de expresión en células U251 (Figura8C) y en células HL60 (Figura 8D) tratadas con ST-140, 20 o 40 pM se muestran relativos a la expresión de p-actina después de 4 horas (Figura 8C) o 24 horas (Figura 8D) de tratamiento.

Lafigura 9muestra la actividad antitumoral de las variantes de ST-3 en un modelo de tumor subcutáneo HL60. Se trataron ratones Nu/J con 25 mg/kg BID-IP (n = 6-7 por grupo).

Lasfiguras 10A-10Cmuestran la actividad antitumoral de ST-14 en un modelo de tumor subcutáneo U251. Se trataron ratones NOD/SCID con 50 mg/kg SC tres veces a la semana durante tres semanas. El volumen tumoral inicial promedio fue aproximadamente 240 mm3 Se muestran el volumen tumoral medio (Figura 10A), el porcentaje de supervivencia (Figura 10B) y los volúmenes tumorales individuales (Figura 10C). Los puntos de datos representan la media ± EEM; p<0,0001; n = número de animales vivos por grupo en cada punto temporal.

Lasfiguras 11A-11Bmuestran que la administración temprana o tardía de ST-14 tiene una actividad antitumoral significativa en células de cáncer de mama MCF7. Se trataron ratones Nu/J con 25 mg/kg SC tres veces a la semana durante tres semanas, comenzando 2 días (Figura 11A) o 59 días (Figura 11B) después de la inoculación del tumor. El volumen tumoral inicial promedio fue de aproximadamente 280-330 mm3. Inoculación: 2 x 106 células en grupos de vehículo (Figuras 11A,11B); 2 x 106 células en el grupo de ST-14 (Figura 11A); 5 x 106 células en el grupo de ST-14 (Figura 11B). Los puntos de datos representan la media ± EEM; p<0,0001.

Lafigura 12muestra la actividad antitumoral de ST-14 en un modelo de tumor subcutáneo HL60. Se trataron ratones Nu/J con 20 mg/kg SC tres veces a la semana durante tres semanas. El volumen tumoral inicial promedio fue de aproximadamente 220 mm3. Los puntos de datos representan la media ± EEM; p<0,05.

Lafigura 13muestra la actividad antitumoral de ST-14 en un modelo de tumor subcutáneo A375. Se trataron ratones NOD/SCID con 25 mg/kg SC dos veces al día durante tres semanas. El volumen tumoral inicial promedio fue de aproximadamente 250-344 mm3. Los puntos de datos representan la media ± EEM; p=0,002.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de farmacéutica, ciencia de formulación, química de proteínas, biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia de la materia.

Para que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, se definen primero determinados términos. A lo largo de la divulgación se establecen definiciones adicionales. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.

Los términos definidos inmediatamente a continuación se definen de forma más completa mediante referencia a la especificación en su totalidad.

I. Definiciones

Se debe entender que la fraseología o terminología en esta divulgación tiene como objetivo la descripción y no la limitación, de modo que los expertos en la materia interpreten la terminología o fraseología de la presente especificación a la luz de las enseñanzas y orientación.

Tal como se usan en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una” “el” y “ la” incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto determine claramente lo contrario. El término “un” (o “una”), así como los términos “uno o más” y “al menos uno” pueden usarse de manera intercambiable.

Asimismo, “y/o” se debe considerar una divulgación específica de cada uno de los dos elementos o componentes específicos con o sin el otro. Por lo tanto, se pretende que el término “y/o”, tal como se usa en una expresión tal como “A y/o B” incluya A y B, A o B, A (sola) y B (sola). Asimismo, se pretende que el término “y/o” como se usa en una frase tal como “A, B, y/o C” incluya A, B y C; A, B o C; A o B; A o C; B o C; A y B; A y C; B y C; A (sola); B (sola); y C (sola).

Cuando las formas de realización se describen con la expresión “que comprende”, se incluyen otras formas de realización análogas descritas en términos de “consiste en” y/o “consiste esencialmente en”.

Las unidades, los prefijos y los símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo, y cualquier valor individual proporcionado en el presente documento puede servir como valor extremo para un intervalo que incluye otros valores individuales proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, un conjunto de valores como 1, 2, 3, 8, 9 y 10 también es una divulgación de un intervalo de números de 1-10, de 1-8, de 3-9, etc. Del mismo modo, un intervalo divulgado es una divulgación de cada valor individual abarcado por el intervalo. Por ejemplo, un intervalo establecido de 5-10 también es una divulgación de 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud, y sus sales. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede ser interrumpido por elementos que no sean aminoácidos. Salvo cuando se indique lo contrario, por ejemplo, para las abreviaturas para los aminoácidos poco comunes o no naturales establecidos en el presente documento, las abreviaturas de tres letras y de una letra, como se usan en la técnica, se usan en el presente documento para representar residuos de aminoácidos. Salvo cuando está precedido por una “D” o en minúsculas, el aminoácido es un L-aminoácido. Los grupos o cadenas de abreviaturas de aminoácidos se usan para representar péptidos. Salvo cuando se indique específicamente, los péptidos se indican con el extremo N de la izquierda y la secuencia se escribe desde el extremo N al extremo C.

Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” abarcan también un polímero aminoacídico que se ha modificado de forma natural o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, formación de puente de lactama, glucosilación, lipidación, acetilación, acilación, amidación, fosforilación u otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje o la adición de un grupo protector. También se incluyen en la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, ácido aminoisobutírico (Aib), aminoácidos no naturales, etc.) y polipéptidos que comprenden o consisten en D-aminoácidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica. En ciertas formas de realización, los polipéptidos pueden darse como cadenas simples, dímeros covalentes o cadenas asociadas no covalentes. Los polipéptidos también pueden estar en forma cíclica. Los polipéptidos cíclicos se pueden preparar, por ejemplo, uniendo en puente grupos amino libres y carboxilo libres. La formación de los compuestos cíclicos se puede lograr mediante tratamiento con un agente deshidratante, con protección adecuada si es necesario. La reacción de cadena abierta (forma lineal) a forma cíclica puede implicar ciclación intramolecular. Los polipéptidos cíclicos también se pueden preparar mediante otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando uno o más puentes de lactama, sustitutos de enlaces de hidrógeno (Patgiriet al.2008), grapas de hidrocarburos (Schafmeisteret al.2000), grapas de triazol (Le Chevalier Isaadet al.

2009), o puentes disulfuro (Wanget al.2006). Los puentes o las grapas pueden estar separados, por ejemplo, con 3, 4, 7 u 8 aminoácidos de separación.

El término “variante” se refiere a un péptido que tiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de referencia. Las deleciones e inserciones pueden ser internas y/o en uno o más extremos. La sustitución puede incluir el remplazo de uno o más aminoácidos con un aminoácido(s) similar(es) u homólogo(s) o un aminoácido(s) diferente(s). Por ejemplo, algunas variantes incluyen sustituciones de alanina en una o más posiciones de aminoácidos. Otras sustituciones incluyen sustituciones conservadoras que tienen poco o ningún efecto sobre la carga neta general, polaridad o hidrofobicidad de la proteína. Algunas variantes incluyen sustituciones no conservadoras que cambian la carga o la polaridad del aminoácido. La sustitución puede ser con la forma L o D de un aminoácido.

Un péptido “retroinverso” tiene una secuencia de aminoácidos inversa, en relación con una secuencia de L-aminoácidos de referencia, y está compuesto de D-aminoácidos (que invierten la quiralidad del centro a de las subunidades de aminoácidos) para ayudar a mantener la topología de cadena lateral similar a la del péptido de L-aminoácidos original.

El término “sustitución conservadora” como se usa en el presente documento indica que uno o más aminoácidos son reemplazados por otro residuo biológicamente similar. Los ejemplos incluyen la sustitución de residuos de aminoácidos con características similares, por ejemplo, aminoácidos pequeños, aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos básicos, aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos aromáticos. Para más información sobre sustituciones fenotípicamente silenciosas en péptidos y proteínas, véase, por ejemplo, Bowieet. al. Science247:1306-1310 (1990). En el siguiente esquema, las sustituciones conservadoras de aminoácidos se agrupan según propiedades fisicoquímicas; I: neutros y/o hidrofílicos, II: ácidos y amidas, III: básicos, IV: hidrofóbicos, V: aminoácidos aromáticos, voluminosos.

En el siguiente esquema, las sustituciones conservadoras de aminoácidos se agrupan según propiedades fisicoquímicas; VI: neutros o hidrofóbicos, VII: ácidos, VIII: básicos, IX: polares, X: aromáticos.

Los métodos para identificar sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no afectan la función de la proteína son bien conocidos en la técnica (véase,por ejemplo,Brummellet al., Biochem.32:1180-1187 (1993); Kobayashiet al., Protein Eng.12(10):879-884 (1999); y Burkset al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.94:412-417 (1997)).

Los términos “idéntico” o porcentaje de “ identidad” en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o péptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo huecos, si es necesario) para una correspondencia máxima, sin considerar ninguna sustitución conservadora de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad se puede medir utilizando algoritmos o software de comparación de secuencias, o mediante inspección visual. Se conocen varios algoritmos y software en la técnica que pueden usarse para obtener alineamientos de secuencias de aminoácidos o nucleótidos.

Un ejemplo no limitante de un algoritmo de alineamiento de secuencias se describe en Karlinet al., Proc. Natl. Acad. Sci.,87:2264-2268 (1990), tal como se modificó en Karlinet al., Proc. Natl. Acad. Sci.,90:5873-5877 (1993), e incorporado a los programas NBLAST y XBLAST (Altschulet al., Nucleic Acids Res.,25:3389-3402 (1991)). En ciertas formas de realización, Gapped BLAST puede usarse como se describe en Altschulet al., Nucleic Acid Res.25:3389-3402 (1997). BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschulet al., Methods in Enzymology,266:460-480 (1996)), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, San Francisco del sur, California) o Megalign (DNASTAR) son programas de software adicionales disponibles al público que pueden usarse para alinear secuencias. En determinadas formas de realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina con el programa GAP en el paquete de software GCG (por ejemplo, con una matriz NWSgapdna.CMP y una ponderación del hueco de 40, 50, 60, 70 o 90 y una ponderación de la longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6). En determinadas formas de realización alternativas, el programa GAP en el paquete de software GCG, que incorpora el algoritmo de Needleman y Wunsch(J. Mol. Biol.(48):444-453 (1970)), se puede usar para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, con una matriz BLOSUM 62 o una matriz PAM250, y una ponderación de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5). Alternativamente, en ciertas formas de realización, el porcentaje de identidad entre las secuencias de nucleótidos o aminoácidos se determina usando el algoritmo de Myers y Miller(CABIOS4:11-17 (1989)). Por ejemplo, el porcentaje de identidad se puede determinar usando el programa ALIGN (versión 2.0) y usando una PAM120 con tabla de residuos, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Un experto en la materia puede determinar los parámetros apropiados para el alineamiento máximo mediante un software de alineamiento particular. En ciertas formas de realización, se usan los parámetros predeterminados del software de alineamiento. Otros recursos para calcular la identidad incluyen los métodos descritos enComputational Molecular Biology(Lesk ed., 1988);Biocomputing: Informatics and Genome Projects(Smith ed., 1993);Computer Analysis of Sequence Data, parte 1(Griffin y Griffin eds., 1994);Sequence Analysis in Molecular Biology(G. von Heinje, 1987);Sequence Analysis Primer(Gribskovet al.eds., 1991); y Carilloet al., SIAM J. Applied Math.,48:1073 (1988).

Un “polinucleótido”, como se usa en el presente documento, puede incluir uno o más “ácidos nucleicos”, “moléculas de ácido nucleico” o “secuencias de ácido nucleico”, y se refiere a un polímero de nucleótidos de cualquier longitud, e incluye ADN y ARN. Los polinucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, bases o nucleótidos modificados y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. La descripción que antecede aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en el presente documento, incluyendo ARN y ADN.

Una molécula “aislada” es una que se encuentra en una forma que no se encuentra en la naturaleza, incluidas las que se han purificado.

Un “marcador” es un compuesto detectable que se puede conjugar directa o indirectamente a una molécula, para generar una molécula “marcada”. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes), o puede detectarse indirectamente, por ejemplo, catalizando la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable (por ejemplo, un marcador enzimático) o por otros medios de detección indirecta (por ejemplo,biotinilación).

“Afinidad de unión” hace referencia en general a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula y su compañero de unión (por ejemplo, un receptor y su ligando, un anticuerpo y su antígeno, dos monómeros que formen un dímero, etc.). A menos que se indique de otro modo, tal como se usa en el presente documento, “afinidad de unión” hace referencia a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión. La afinidad de una molécula X por su compañera Y puede representarse generalmente mediante la constante de disociación (K<d>). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, que incluyen los que se describen en el presente documento. Los compañeros de unión de baja afinidad generalmente se unen lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los compañeros de unión de alta afinidad generalmente se unen más rápido y tienden a permanecer unidos por más tiempo.

La afinidad o avidez de una molécula por su compañero de unión se puede determinar experimentalmente utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, citometría de flujo, ensayo de inmunosorción enzimática (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA) o cinética (por ejemplo, análisis KINEXA® o BIACORE™ u OCTET®). Pueden emplearse fácilmente ensayos de unión directa, así como formatos de ensayo de unión competitiva. (Véase, por ejemplo, Berzofskyet al.,“Antibody-Antigen Interactions”en Fundamental Immunology,Paul, W.E., ed., Raven Press: Nueva York, n Y (1984); Kuby,Immunology,W.H. Freeman y Company: Nueva York, NY (1992)). La afinidad medida de una interacción de un par de unión particular puede variar si se mide en diferentes condiciones (por ejemplo, concentración de sal, pH, temperatura). Por lo tanto, las medidas de afinidad y otros parámetros de unión (por ejemplo, Kd o Kd, Kon, Koff) se realizan con soluciones estandarizadas de compañeros de unión y un tampón estandarizado, como se sabe en la técnica.

Un “agente activo” es un ingrediente destinado a proporcionar actividad biológica. El agente activo puede estar asociado con uno o más de otros ingredientes. Un agente activo que es un péptido también puede denominarse un “péptido activo”.

Una “cantidad eficaz” de un agente activo es una cantidad suficiente para llevar a cabo un fin específicamente establecido.

La expresión “composición farmacéutica” hace referencia a una preparación en forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea eficaz y que no contiene ningún componente adicional inaceptablemente tóxico para un sujeto al cual se administraría la composición. Tal composición puede ser estéril y puede comprender un soporte farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina fisiológica. Las composiciones farmacéuticas adecuadas pueden comprender uno o más de un tampón (por ejemplo, tampón acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (por ejemplo, polisorbato), un agente estabilizante (por ejemplo,poliol o aminoácido), un conservante (por ejemplo, benzoato de sodio) y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.

Un “sujeto” o “individuo” o “animal” o “paciente” o “mamífero” es cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para quien se desea el diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen humanos, animales domésticos, animales de granja, animales deportivos y animales de laboratorio, incluidos, por ejemplo, primates no humanos, caninos, felinos, porcinos, bovinos, equinos, roedores, incluyendo ratas y ratones, conejos, etc.

Los términos “inhibir”, “bloquear” y “suprimir” se usan indistintamente y se refieren a cualquier disminución estadísticamente significativa en la aparición o actividad, incluido el bloqueo completo de la aparición o actividad. Por ejemplo, “inhibición” puede referirse a una disminución de aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % en actividad o aparición. Un “ inhibidor” es una molécula, factor o sustancia que produce una disminución estadísticamente significativa en la aparición o actividad de un proceso, ruta o molécula.

Una “célula neoplásica” o “neoplasia” normalmente ha sufrido alguna forma de mutación/transformación, que genera un crecimiento anómalo en comparación con células o tejidos normales del mismo tipo. Las neoplasias incluyen irregularidades morfológicas, así como proliferación patológica. Las células neoplásicas pueden ser benignas o malignas. Las neoplasias malignas, es decir, los cánceres, se distinguen de las benignas en que demuestran la pérdida de la diferenciación y la orientación de las células, y tienen las propiedades de invasión y metástasis.

Un “tumor sólido” es una masa de células neoplásicas. Un “tumor líquido” o una “neoplasia maligna hematológica” es un cáncer de la sangre de linaje mieloide o linfoide.

II. Péptidos ATF5 y composiciones

Péptidos ATF5

ATF5 es un factor de transcripción eucariota de 282 aminoácidos con un dominio de activación ácido N-terminal y un dominio de cremallera de leucina básica C-terminal (bZIP). El dominio bZIP contiene una región de unión a ADN y una región de cremallera de leucina. La cremallera de leucina es un motivo estructural común, que normalmente tiene una leucina en cada séptimo aminoácido en el dominio de dimerización. Los factores de transcripción bZIP se homo- y/o heterodimerizan a través de sus cremalleras de leucina para unirse específicamente al ADN. El ATF5 humano, de rata y murino de tipo salvaje tiene las secuencias de aminoácidos establecidas en el número de acceso de NCBI NP_001180575, NP_758839 y NP_109618, respectivamente.

NTAzip-ATF5 (Figura 1A) es un péptido ATF5 en el que se elimina el dominio de activación N-terminal de ATF5 y el dominio de unión al ADN se reemplaza con una cremallera de leucina mejorada por modificación, es decir, una secuencia de hélice a ácida anfipática que contiene repeticiones de heptada con una leucina en cada séptimo residuo, que extiende la región de cremallera de leucina ATF5 de tipo salvaje (Angelastroet al.2003). Las moléculas de ATF5 dominante negativo que penetra las células (CP-d/n-ATF5) son versiones mejoradas de NTAzip-ATF5, que contienen un dominio de penetración celular y una secuencia de cremallera de leucina de ATF5 truncada (en relación al tipo salvaje), junto con una secuencia de cremallera de leucina extendida (documento US 2016/0046686; Karpel-Massleret al2016). Un ejemplo de una molécula CP-d/n ATF5 se muestra en lafigura 1B. Como se usa en el presente documento, las expresiones “cremallera de leucina extendida”, “extensión de cremallera de leucina” y “cremallera de leucina mejorada” se refieren a un péptido que tiene de una a cuatro heptadas de leucina, es decir, Leu-(X)6 (SEQ ID NO: 52), secuencia que no es una secuencia de cremallera de leucina ATF5 de tipo salvaje.

ST-3 (Figura 1C) es una variante de una molécula CP-d/n-ATF5 que carece de la extensión de la cremallera de leucina e induce muerte celular en células neoplásicas. Estudios anteriores demostraron que la región de cremallera de leucina mejorada es necesaria para la estabilidad y la actividad inhibidora de los inhibidores de bZIP dominantes negativos (Krylovet al.1995; Oliveet al.1997; Mollet al.2000; Acharyaet al.2006). Por lo tanto, el descubrimiento de que ST-3 conserva su capacidad de dirigirse específicamente y eliminar células neoplásicas en ausencia de una región de cremallera de leucina extendida fue inesperado.

Los presentes inventores han descubierto que las variantes no conservadoras de un péptido ATF5 que comprende la secuencia de cremallera de leucina ST-3 (SEQ ID NO: 53) inducen muerte celular en células neoplásicas. El descubrimiento de que los péptidos derivados de ATF5 de la presente invención conservan su capacidad de dirigirse específicamente y eliminar células neoplásicas con múltiples sustituciones de aminoácidos no conservadoras en la región de la cremallera de leucina ST-3 no pudo haberse predicho antes de la presente invención. Las variantes retroinversas de ST-3 no solo eran activas, sino que tenían una mayor actividad en relación con ST-3, lo que fue inesperado.

La invención proporciona péptidos ATF5 que tienen una región de cremallera de leucina de ATF5 truncada y, opcionalmente, una región de penetración celular. Los péptidos ATF5 de la invención son capaces de interferir con la actividad de ATF5 en una célula en la que se introducen. En algunas formas de realización, el péptido ATF5 puede afectar las rutas implicadas en apoptosis. La actividad de ATF5 se puede evaluar mediante cualquiera de varios ensayos conocidos en la técnica, incluidos los ensayos de eliminación celular descritos en el presente documento. La actividad de ATF5 también se puede evaluar por su capacidad para unirse al elemento de respuesta de AMPc (CRE).

La “región de cremallera de leucina de ATF5” es una secuencia truncada derivada de la región de cremallera de leucina ATF5 de tipo salvaje. El término se usa para referirse solo a la secuencia, y no necesariamente a la estructura secundaria. La región de cremallera de leucina de ATF5 truncada puede tener, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que se muestra en latabla 1. La secuencia de cremallera de leucina s T-3 (SEQ ID NO: 53) se muestra como un punto de referencia. Las sustituciones en la SEQ ID NO: 53 se muestran en negrita subrayada.

Tabla 1

La región de cremallera de leucina puede ser una forma retroinversa. En una forma de realización, la región de cremallera de leucina retroinversa tiene una secuencia VAEAREELERLEARLGQARGEL (SEQ ID NO: 65).

Las variantes de estas secuencias también se incluyen en el ámbito de la invención. Los péptidos ATF5 de la invención pueden tener una región de cremallera de leucina de al menos aproximadamente el 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con las secuencias divulgadas en el presente documento

En formas de realización en donde el péptido ATF5 comprende una región de penetración celular, la región de penetración celular está operativamente unida a la región de cremallera de leucina de ATF5 truncada. En algunas formas de realización, la región de penetración celular está unida covalentemente a la región de cremallera de leucina de ATF5 truncada, por ejemplo, mediante un enlace peptídico, un enlace disulfuro, un enlace tioéter o un conector conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Kleinet al2014). Los conectores ejemplares incluyen, pero no están limitados a, un alquilo sustituido o un cicloalquilo sustituido. Los conectores pueden ser escindibles después de administrar el péptido. Una región de penetración celular y una región de cremallera de leucina de ATF5 unidas directamente por un enlace amida puede denominarse una “fusión”. Las fusiones pueden contener una secuencia conectora de aminoácidos entre la región de penetración celular y la región de cremallera de leucina de ATF5, como se trató anteriormente con respecto a los péptidos activos. La región de penetración celular puede unirse al extremo N o al extremo C de la región de cremallera de leucina de ATF5 truncada, o mediante una cadena lateral de residuo. La región de penetración celular y la región de cremallera de leucina de ATF5 truncada pueden tener la misma quiralidad u opuesta.

Los péptidos ATF5 de penetración celular de la invención pueden comprender cualquier combinación de dominios de cremallera de leucina ATF5 y penetrantes de células descritos en el presente documento. Se muestran ejemplos no limitantes de tales péptidos en laTabla 2. La región de penetración celular está en cursiva. Las sustituciones relativas a la secuencia ST-3 se muestran en negrita subrayada.

También se incluyen formas retroinversas de los péptidos ATF5 de la invención. En una forma de realización, el péptido ATF5 es ST-13, un péptido retroinverso que comprende una región de penetración celular y que tiene la secuencia de D-aminoácidos VAEAREELERLEARLGQARGELKKWKMRRNQFWIKIQR(SEQ ID NO: 13). En otra forma de realización, el péptido ATF5 es ST-14, un péptido retroinverso que comprende una región de penetración celular y que tiene la secuencia de D-aminoácidos VAEAREELERLEARLGQARGELKKWKMRRNQFWLKLQR(SEQ ID NO: 14). La región de penetración celular está en cursiva. Las sustituciones relativas a la secuencia ST-3 (SEQ ID NO: 3) se muestran en negrita subrayada.

Los péptidos ATF5 de la invención tienen preferentemente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 aminoácidos de longitud, incluidos los intervalos que tienen cualquiera de esas longitudes como valores extremos, por ejemplo, 22-38 aminoácidos.

Los péptidos ATF5 de la invención incluyen péptidos que tienen al menos aproximadamente el 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 9 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con las secuencias divulgadas en el presente documento.

Los péptidos ATF5 pueden tener un extremo N modificado y/o un extremo C modificado. Por ejemplo, los péptidos ATF5 pueden incluir opcionalmente un grupo acetilo N-terminal y/o un grupo amida C-terminal.

Los péptidos ATF5 de la invención pueden ser opcionalmente cíclicos. Por ejemplo, los péptidos ATF5 pueden incluir uno o más puentes de lactama. Preferentemente, pero no necesariamente, se crea un puente de lactama entre cadenas laterales separadas por cuatro residuos de aminoácidos (BxxxB). Se pueden formar puentes de lactama, por ejemplo, entre las cadenas laterales de Asp o Glu y Lys. Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos en el sitio del puente de lactama para facilitar el enlace.

Los péptidos ATF5 de la invención pueden incluir opcionalmente uno o más epítopos y/o etiquetas de afinidad, tal como para la purificación o detección. Los ejemplos no limitantes de tales etiquetas incluyen FLAG, HA, His, Myc, GST y similares. Los péptidos ATF5 de la invención pueden incluir opcionalmente uno o más marcadores.

En ciertos aspectos, la invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que comprende un péptido ATF5 de la invención, que opcionalmente comprende además uno o más soportes, diluyentes, excipientes u otros aditivos.

También están dentro del ámbito de la invención kits que comprenden los péptidos ATF5 y composiciones como se proporcionan en el presente documento y, opcionalmente, instrucciones de uso. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional, y/o uno o más agentes activos adicionales. Los kits típicamente incluyen una ficha técnica que indica el uso previsto del contenido del kit. El término “ficha técnica” incluye cualquier material escrito o grabado suministrado en o con el kit, o que acompañe de otro modo al kit.

Los péptidos ATF5 de la invención fomentan la expresión diferencial de genes de un conjunto de genes que incluyen, pero no están limitados a, genes diana de ATF5 Bcl-2, Mcl-1 y survivina. Específicamente, los péptidos ATF5 atenúan la expresión de genes diana de ATF5 asociados con la supervivencia celular, la proliferación y la plasticidad. En consecuencia, los péptidos ATF5 se pueden usar para inducir la muerte celular, disminuir la proliferación celular o activar la diferenciación celular. En ciertas formas de realización, los péptidos ATF5 de la invención se usan para inhibir la proliferación y/o para fomentar la citotoxicidad en una célula neoplásica. La proliferación y la citotoxicidad se pueden medir mediante ensayos conocidos, incluidos los ensayos de destrucción celular descritos en el presente documento.

Direccionamiento celular

Los péptidos ATF5 de la invención pueden introducirse en células diana mediante métodos conocidos en la técnica. El método de introducción elegido dependerá, por ejemplo, de la aplicación prevista.

En algunos casos, el ADN o ARN que codifica el péptido ATF5 puede administrarse y expresarse en una célula diana. La administración se puede lograr a través de cualquier vector adecuado, dependiendo de la aplicación. Los ejemplos de vectores incluyen vectores plasmídicos, cósmidos, fagos, bacterianos, de levadura y víricos preparados, por ejemplo, a partir de retrovirus, incluyendo lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados y virus con pseudotipado de envoltura. Los vectores se pueden introducir en las células, por ejemplo, usando nanopartículas, administración hidrodinámica, electroporación, sonoporación, precipitación con fosfato de calcio o polímeros catiónicos como DEAE-dextrano. Los vectores pueden formar complejos con lípidos, como encapsulados en liposomas, o asociados con agentes de condensación catiónicos.

Los péptidos ATF5 de la invención pueden administrarse a las células a través de mecanismos que explotan los receptores celulares. Los ejemplos de tales mecanismos incluyen conjugados anticuerpo-fármaco, receptores de antígenos quiméricos y secuencias de tipo RGD dirigidas a integrina. Los ejemplos de secuencias de tipo RGD incluyen GRGDS (SEQ ID NO: 72) y GRGDNP (SEQ ID NO: 73). Los péptidos ATF5 de la invención pueden comprender una o más secuencias de tipo RGD, tal como dos, tres, cuatro o cinco secuencias de tipo RGD, unidas como se describe en el presente documento o por cualquier método conocido en la técnica. La una o más secuencia(s) de tipo RGD se pueden incorporar al lado N-terminal o C-terminal de la región de cremallera de leucina de ATF5. Tales secuencias de tipo RGD también pueden estar en forma retroinversa, independientemente entre sí y de la región de cremallera de leucina de ATF5. Alternativamente, los péptidos ATF5 pueden encapsularse y administrarse a las células en vesículas, tal como exosomas o liposomas, o en micelas. Otro método para introducir péptidos ATF5 en las células es mediante ciclación, por ejemplo, utilizando grapas de hidrocarburos (Bernalet al.2007; Birdet al.2016) u otros métodos de ciclación conocidos en la técnica.

Ciertos péptidos ATF5 de la presente invención comprenden un dominio de penetración celular o péptido de penetración celular (CPP, por su sigla en inglés). Las expresiones “dominio de penetración celular”, “región de penetración celular” y “péptido de penetración celular” se usan indistintamente en el presente documento.

Los CPP son péptidos cortos (típicamente, aproximadamente 6-40 aminoácidos) que pueden atravesar las membranas celulares. Muchos CPP son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica (BHE). En algunas formas de realización, el CPP tiene 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 o 39 aminoácidos de longitud, incluyendo intervalos que tienen cualquiera de esas longitudes como valores extremos, por ejemplo, 10-30 aminoácidos. Los CPP tienen la capacidad de transportar carga molecular unida covalentemente o no covalentemente, como polipéptidos, polinucleótidos y nanopartículas, a través de las membranas celulares y la BHE. La translocación puede ser endocítica o independiente de la energía (es decir, no endocítica) mediante translocación. Numerosos c Pp se describen y caracterizan en la bibliografía (véase, por ejemplo,Handbook of Cell-Penetrating Peptides(2a ed. Ulo Langel ed., 2007); Hervéet al.2008; Heitzet al.2009; Munyendoet al.2012; Zouet a l2013; Krautwaldet a l2016). Se mantiene una base de datos curada de CPP en crdd.osdd.net/raghava/cppsite (Gautamet al.2012).

Los péptidos denominados secuencias de localización nuclear (NLS) son un subconjunto de CPP. La NLS clásica contiene una región (monopartita) o dos (bipartita) de aminoácidos básicos. Las secuencias consenso de las NLS monopartitas y bipartitas clásicas son, respectivamente, K(K/R)X(K/R) (SEQ ID NO: 66) y (K/R)(K/R)X-i0-12(K/R)3/5 (SEQ ID NO: 67), donde 3/5 indica que al menos 3 de 5 aminoácidos consecutivos son lisina o arginina (Kosugiet al.

2009). Una secuencia NLS del antígeno T grande de SV40, PKKKRKV (SEQ ID NO: 36), es un ejemplo de una NLS monopartita clásica, mientras que una secuencia NLS de nucleoplasmina, KRPAATKKAGQAKKK (SEQ ID NO: 68) es un ejemplo de una NLS bipartita clásica (Langeet al.2007; Kosugiet al.2009). También hay numerosas NLS no clásicas, como las de las ribonucleoproteínas (RNP) hnRNP A1, hnRNP K y U snRNP (Mattajet al.1998).

Los ejemplos no limitantes de CPP adecuados para su uso en la presente invención incluyen péptidos derivados de proteínas, tal como del factor de transcripción de antennapedia enDrosophila(penetratina y sus derivados RL-16 y EB1) (Derossiet al.1998; Thorénet al.2000; Lundberget al.2007; Alveset al.2008); del transactivador de transcripción de VIH-1 (Tat) (Vivéset al.1997; Hallbrinket al.2001); de la glucoproteína del virus de la rabia (RVG) (Kumaret al.2007); del virus del herpes simple VP22 (Elliottet al.1997); de la protegrina antimicrobiana 1 (SynB) (Rousselleet al.2001), de la proteína potenciadora del gen de insulina de rata 1 (pIS1) (Kilket al.2001; Magzoubet al.2001); de la cadherina endotelial vascular murina (pVEC) (Elmquistet al.2001); de la calcitonina humana (hCT) (Schmidtet al.1998); y del factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF4) (Joet al.2005). Los CPP adecuados para su uso en la invención incluyen también péptidos sintéticos y quiméricos, tal como transportán (TP) y sus derivados (Poogaet al.1998; Soometset al.2000); secuencias de translocación de membrana (MTS, por su sigla en inglés) (Brodskyet al.1998; Lindgrenet al.2000; Zhaoet al.2001), tal como el péptido MPS (que también se conoce como péptido basado en la secuencia de fusión o FBP, por su sigla en inglés) (Chaloinet al.1998); el péptido basado en la señal de secuencia (SBP, por su sigla en inglés) (Chaloinet al.1997); el péptido anfifático modelo (MAP, por su sigla en inglés) (Oehlkeet al.1998; Schelleret al.1999; Hallbrinket al.2001), el péptido de translocación 2 (Tp 2, por su sigla en inglés) (Cruzet al.2013), MPG (Morriset al.1997; Kwonet al.2009), Pep-1 (Morriset al.2001; Muñoz-Morriset al.2007) y poliarginina(por ejemplo,R7-R12) (SEQ ID NO: 87) (Mitchellet al.2000; Wenderet al.2000; Futakiet al.

2001; Suzukiet al.2002). Las secuencias representativas, pero no limitantes se muestran en laTabla 3.

Tabla 3

Debido a que la función de los CPP depende de sus características físicas más que de las interacciones específicas de la secuencia, pueden tener la secuencia inversa y/o quiralidad inversa que las proporcionadas en latabla 3y/o conocidas en la técnica. Por ejemplo, las formas retroinversas de los CPP (secuencia inversa y quiralidad inversa) son adecuadas para su uso en la invención. Un ejemplo de un CPP retroinverso tiene la secuencia de D-aminoácidos KKWKMRRNQFWIKIQR (SEQ ID NO: 50). Otro ejemplo de un CPP retroinverso tiene la secuencia de D-aminoácidos KKWKMRRNQFWLKLQR (SEQ ID NO: 51). Variantes de estas secuencias con una o más adiciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos que retienen la capacidad de cruzar las membranas celulares y/o la BHE también son adecuadas para su uso en la invención. Los péptidos ATF5 de la invención pueden incluir un dominio de penetración celular que tiene al menos aproximadamente el 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %,70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con las secuencias de ejemplo proporcionadas en latabla 3. El efecto de la(s) adición(es), deleción(es) y/o sustitución(es) de aminoácidos en la capacidad del CPP para mediar la penetración celular se puede probar usando métodos conocidos en la técnica.

III. Métodos de preparación

Los péptidos ATF5 de la invención pueden sintetizarse químicamente, por ejemplo, usando síntesis de péptidos en fase sólida o síntesis de péptidos en fase solución, o una combinación de ambas. La síntesis puede ocurrir como fragmentos del péptido que posteriormente se combinan química o enzimáticamente. Los polipéptidos ATF5 de la invención pueden expresarse usando métodos recombinantes.

Por consiguiente, también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos ATF5 de la invención. Dichos ácidos nucleicos pueden construirse mediante síntesis química usando un sintetizador de oligonucleótidos. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden diseñarse en base a la secuencia de aminoácidos del péptido ATF5 deseado y la selección de esos codones que se favorecen en la célula hospedadora en la que se producirá el péptido ATF5 recombinante. Se pueden aplicar métodos estándar para sintetizar una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido ATF5 de interés.

Una vez preparado, el ácido nucleico que codifica un péptido ATF5 particular puede insertarse en un vector de expresión y unirse operativamente a una secuencia de control de expresión apropiada para la expresión del péptido en un hospedador deseado. Para obtener altos niveles de expresión del péptido ATF5, el ácido nucleico puede estar operativamente unido a o asociado con secuencias de control de expresión de la transcripción y la traducción que son funcionales en el hospedador de expresión elegido.

Cualquier experto en la materia puede emplear una amplia variedad de combinaciones de hospedador/vector de expresión. Los vectores de expresión útiles para hospedadores eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para hospedadores bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos deE. coli,incluyendo pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos de mayor gama de hospedadores, como M13, y fagos filamentosos de ADN monocatenario.

Las células hospedadoras adecuadas incluyen células procariotas, de levaduras, de insectos o eucariotas superiores bajo el control de promotores apropiados. Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo,E. colio bacilos. Se pueden establecer células eucariotas superiores o líneas celulares originarias de mamíferos, cuyos ejemplos incluyen Pichia pastoris, células 293, células COS-7, células L, células C127, células 3T3, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa y células BHK. También se pueden emplear sistemas de traducción sin células.

Ejemplos

Se hicieron y examinaron una serie de variantes para el péptido de referencia ST-3, como se describe a continuación.

Ejemplo 1. Las variantes de ST-3 con sustitución de cisteína conservadora tienen actividadin vitro

El requisito de la cisteína individual en ST-3 en la posición de aminoácido 21 para la actividad citotóxica se examinó usando un ensayo de citotoxicidad en células HL60. El residuo de cisteína está muy conservado dentro del dominio ATF5 natural, y se cree que es necesario para la homodimerización de ATF5 antes de la unión al ADN.

Las células en suspensión PML HL60 se ajustaron a una densidad de 3,5 x 103 células/pocillo en 150 pl de RPMI suero bovino fetal (SBF) al 1,5 % en una placa de 96 pocillos. Se añadió ST-3, reconstituido a una concentración de 10 mg/ml en His 20 mM, pH 7,5, a cada pocillo en un volumen de 50 pl a un intervalo de concentración final de 0-80 pM. Las células se incubaron con ST-3 durante 48 horas a 37°C. La viabilidad celular se cuantificó por citometría de flujo usando un kit de detección de apoptosis Abcam con anexina V FITC. Brevemente, las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en tampón de ensayo 1x que contenía anexina V FITC y yoduro de propidio (PI). La anexina V detecta las células apoptóticas y PI tiñe las células muertas. Después de la tinción, las células apoptóticas muestran fluorescencia verde, las células muertas muestran fluorescencia roja y verde, y las células vivas muestran poca o ninguna fluorescencia. Las células se seleccionaron para el análisis basado en la dispersión directa (FSC, por su sigla en inglés) frente a la dispersión lateral (SSC, por su sigla en inglés), y se analizaron por citómetro de flujo BD Accuri C6 Plus para detectar la unión de anexina V-FITC (Ex = 488 nm; Em = 530 nm) utilizando el detector de señal FITC y la tinción con PI mediante el detector de señal de emisión de ficoeritrina. El porcentaje de anexina Vbaja y PIbaja se cuantificó y presentó como % de viabilidad.

La ST-3 liofilizada o ST-3 con glicina (ST-4) o alanina (ST-5) sustituyendo a la cisteína en la posición de aminoácido 21 se reconstituyó recientemente en tampón histidina en una solución madre de 5 mg/ml y se añadió a las células en un intervalo de concentración final de 0-40 pM. Las células se incubaron con péptido ATF5 durante 48 horas antes de la cuantificación de la viabilidad celular. Los resultados se muestran en laFigura 2.

La actividad de ST-3 se atenúa, pero no se elimina mediante la sustitución de la cisteína en la posición 21 con alanina o glicina. Los valores observados de CE50 fueron de aproximadamente 16 pM, 35 pM y 38 pM para ST-3, ST-4 y ST-5, respectivamente. En ensayos funcionales, CE50 es la concentración que reduce una respuesta biológica en un 50 % de su máximo. En el caso de los péptidos ATF5, la CE50 se mide como la concentración que reduce la viabilidad celular en un 50 % de su máximo. La CE50 puede calcularse mediante cualquier cantidad de medios conocidos en la técnica. La sustitución de cisteína por alanina no tuvo impacto en la penetración celular. La penetración de la variante sustituida con glicina no se probó; sin embargo, según los datos para la sustitución con alanina, no se espera que la penetración celular se vea afectada.

Ejemplo 2. Las variantes de ST-3 con sustituciones no conservadoras tienen actividadin vitro

Las variantes de ST-3 tratadas en este Ejemplo se resumen en laTabla 4. ST-3 tiene una CE50 de aproximadamente 12-20 pM.

Tabla 4

| ST-11 (SEQ ID NO: 11) | E20R, C21A, E25R, R27E, N28L, K32E, S37A |_______ 4,2

Sustituciones individuales

Usando el ensayo de viabilidad de células HL60 descrito en el Ejemplo 1, se examinó la actividad citotóxica de las variantes de ST-3 que contienen sustituciones de aminoácidos no conservadoras individuales (Figura 3). La variante ST-7 tiene una sustitución de asparagina polar con leucina no polar en la posición 28 y una CE50 de aproximadamente 3 |jM. ST-8 tiene una sustitución de la glutamina polar con la alanina no polar en la posición 22 y una CE50 de aproximadamente 5 j M. Este aumento en la actividad de ST-7 y ST-8 es 3-6 veces mayor que el de ST-3. ST-6 tiene una sustitución conservadora de serina con alanina en la posición 37 y una actividad comparable a ST-3.

Sustituciones múltiples

Usando el ensayo de viabilidad de células HL60 descrito en el Ejemplo 1, se examinó la actividad citotóxica de las variantes de ST-3 que contienen múltiples sustituciones de aminoácidos no conservadoras. La variante ST-9 tiene dos residuos de ácido glutámico con carga negativa que fueron remplazados cada uno con una arginina con carga positiva, y una arginina con carga positiva y una lisina con carga positiva que fueron remplazadas con un ácido glutámico con carga negativa. (Véase, latabla 4). Estos cambios involucraron aproximadamente el 18 % de la región de cremallera de leucina de ATF5 de ST-3. La actividad de ST-9 aumentó significativamente con respecto a la de ST-3 (Figura 4). ST-9 tiene una CE50 de aproximadamente 2 j M, en comparación con aproximadamente 12-20 j M para ST-3.

ST-10 tiene las mismas cuatro sustituciones de “carga” que ST-9, junto con una sustitución no conservadora de asparagina (polar) con leucina (no polar) en la posición 28, como en ST-7, y una sustitución conservadora de serina con alanina, como en ST-6. (Véase, latabla 4). La actividad de ST-10 es comparable a la de ST-9 (Figura 4).

ST-11 tiene las mismas sustituciones que ST-10, más una sustitución de la cisteína conservada con alanina en la posición 21, como en ST-5. (Véase, latabla 4). ST-11 ha mejorado la actividad citotóxica respecto a ST-3 (Figura 4).

Ejemplo 3. Las variantes retroinversas de ST-3 tienen actividadin vitro

Se examinó la citotoxicidad de una forma retroinversa de ST-11 en el ensayo de viabilidad de células HL60 descrito en el Ejemplo 1. La variante retroinversa, ST-13, tenía una actividad comparable a ST-11 y una actividad superior a ST-3 (Figura 5).

ST-13 se examinó además en varias líneas celulares de cáncer humano, al igual que una segunda variante retroinversa, ST-14. Las células en suspensión (HL60, AML14 o SET2) se ajustaron a una densidad de 3,5 x 103 células/pocillo en 150 j l de RPMI suero bovino fetal (SBF) al 1,5 % de en una placa de 96 pocillos tratada con cultivo tisular. Se añadió el péptido ATF5, reconstituido a una concentración de 10 mg/ml en His 20 mM, pH 7,5, a cada pocillo en un volumen de 50 j l en un intervalo de concentración final de 0-80 j M. Las células se incubaron con péptido durante 48 horas a 37 °C. La viabilidad celular se cuantificó por citometría de flujo usando un kit de detección de apoptosis Abcam con anexina V FITC. Brevemente, las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en tampón de ensayo 1x que contenía anexina V FITC y yoduro de propidio (PI). Se analizaron las células con citómetro de flujo BD Accuri C6 Plus para detectar la unión a anexina V-FITC (Ex = 488 nm; Em = 530 nm) usando un detector de señal FITC, y para detectar la tinción con PI usando el detector de señal de emisión de ficoeritrina. El porcentaje de anexina Vbaja y PIbaja se cuantificó y presentó como % de viabilidad. Los valores de CE50 se calcularon utilizando GraphPad Prism v.7 XML.

Además, las células adherentes A375, MCF7, U251, DU145, U87 y A549 se ajustaron a una densidad de 3,5 x 103 células/pocillo en 200 j l de medio el día -1. El día 0, se eliminaron los medios y se repusieron con 150 j l de medios frescos, y las células se trataron con el péptido ATF5 como se describe. Después de una incubación de 48 horas a 37 °C, se recogieron las células flotantes, las células adherentes se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, por su sigla en inglés), se disociaron de la placa con 50 j l de tripsina al 2,5 % a temperatura ambiente y se combinaron con células flotantes. La viabilidad celular se determinó como se describió anteriormente para las células en suspensión o por ensayo MTT (células MCF7). Alternativamente, las células se eliminaron suavemente de la placa de cultivo celular después de la tripsinización con tripsina al 2,5 %, y la viabilidad celular se cuantificó mediante citometría de flujo usando un kit de detección de apoptosis Abcam con anexina V FITC, como se describió anteriormente.

PBMC y BMMC se cultivaron en las condiciones descritas anteriormente para células en suspensión.

Tanto ST-13 (Figuras 6A-6E) como ST-14 (Figuras 7A-7E;Tabla 5) mostraron una actividad citotóxica significativa en una amplia gama de tipos de células tumorales; ST-14 también fue citotóxico en células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por su sigla en inglés) y células mononucleares de médula ósea (BMMC, por su sigla en inglés) (Tabla 5).

Tabla 5

Se midió la expresión del ARN de ATF5 y proteínas reguladoras de apoptosis, Mcl-1, Bcl-2 y survivina, en relación con la expresión de p-actina en células HL60 después del tratamiento con ST-14. Brevemente, se sembraron 8 x 105 células en suspensión HL60 en una placa de 6 pocillos y se trataron con ST101 0 jM , 5 jM , 20 jM o 40 jM durante 4 o 24 horas. Las células se centrifugaron a 1200 rpm durante 7,5 minutos, y los sedimentos se lavaron con 750 j l de H2O sin DNasa ni RNasa para eliminar el medio residual. El ARN se extrajo con el kit Quick-RNA™ MiniPrep Plus (Zymo Research, n.° de cat. R1054) según las instrucciones del fabricante y se eluyó con 55pl de H2 O. Se secuenció el ARN (200 ng) en SYBR™ Gold E-Gel prefabricado de Invitrogen al 2 % (Thermo Fisher Scientific, n.° de cat. G401002) para evaluar la calidad del ARN. El ADNc se sintetizó usando la mezcla maestra SuperScript™ IV VILO de Invitrogen con la enzima ezDNAse™ (Thermo Fisher Scientific, n.° de cat. 11766050) según el protocolo del fabricante con la siguiente modificación: el ADNc se extendió a 56 °C en lugar de 50 °C. Se establecieron controles de temperatura menor a TA para descartar contaminación por ADNg. El ADNc se amplificó utilizando cebadores específicos de genes (Tabla 6) y la ADN polimerasa KOD Xtreme™ Hot Start (Millipore Sigma, n.° de cat.: 71975-3). Se añadió igual cantidad de ARN a cada reacción. Todos los productos de PCR se ejecutaron con E-Gel con bromuro de etidio al 2 % prefabricado de Invitrogen (Thermo Fisher Scientific). La expresión génica se comparó con p-actina usando el software BioRad ImageLab.

Tabla 6

La exposición a ST-14 produjo una expresión reducida de Mcl-1, Bcl2 y BIRC5 (survivina), relativa la expresión de pactina (Figuras 8A-8D).

Ejemplo 4. Las variantes de ST-3 tienen actividadin vivo

Se examinó el efecto de ST-3 y tres variantes en el volumen tumoral en un modelo de tumor subcutáneo de HL60. Brevemente, se implantaron 5 x 106 células HL60, suspendidas 1:1 en Matrigel, mediante inyección subcutánea en la axila de ratones NU/J. La administración se inició el día 2 después de la inoculación del tumor, con un volumen tumoral promedio que oscila de 144-176 mm3. Los péptidos ATF5 se administraron a una dosis de 25 mg/kg mediante inyección intraperitoneal (IP) dos veces al día. Todas las variantes evaluadas redujeron el volumen del tumor en relación con el vehículo, con la variante retroinversa, ST-13, que muestra la mayor actividad antitumoral (Figura 9).

Se examinó el efecto de ST-14 en el volumen tumoral en modelos tumorales usando células de glioblastoma U251, células de cáncer de mama MCF7, células de leucemia promielocítica HL60 y células de melanoma A375. Brevemente, se implantaron 5 x 106 células, suspendidas 1:1 en Matrigel, mediante inyección subcutánea en la axila de ratones NU/J (para células MCF7 y HL60) o ratones NOD/SCID (para células U251 y A375).

Para tumores de células U251, se inició la administración el día 2 después de la inoculación tumoral, con un volumen tumoral promedio de alrededor de 240 mm3. ST-14 se administró a una dosis de 50 mg/kg mediante inyección subcutánea (SC) tres veces a la semana durante tres semanas. ST-14 redujo significativamente el volumen tumoral (Figuras 10A, 10C) y aumentó la supervivencia (Figuras 10B-10C) en relación con el vehículo. Se lograron resultados similares con una dosis de 25 mg/kg de ST-14.

Para los tumores de células MCF7, examinamos el efecto de la administración inmediata y la administración diferida. En el experimento de administración inmediata, la administración se inició el día 2 después de la inoculación tumoral (2 x 106 células), con un volumen tumoral promedio de aproximadamente 280-330 mm3. Se administró ST-14 a una dosis de 25 mg/kg mediante inyección SC tres veces a la semana durante tres semanas. En el experimento de administración diferida, la dosificación se inició el día 59 después de la inoculación tumoral (vehículo: 2 x 106 células; grupo de tratamiento: 5 x 106 células). El volumen tumoral se controló durante 92 días después de la inoculación. En los grupos de tratamiento inmediato y diferido, ST-14 redujo significativamente el volumen tumoral en relación con el vehículo durante la duración del control (Figuras 11A-11B).

Para tumores de células HL60, se inició la administración el día 2 después de la inoculación tumoral, con un volumen tumoral promedio de alrededor de 220 mm3. Se administró ST-14 a una dosis de 20 mg/kg mediante inyección SC tres veces a la semana durante tres semanas. ST-14 redujo significativamente el volumen tumoral en relación con el vehículo (Figura 12).

Para tumores de células A375, se inició la administración el día 2 después de la inoculación tumoral, con un volumen tumoral promedio de alrededor de 250-344 mm3. Se administró ST-14 a una dosis de 25 mg/kg mediante inyección SC dos veces al día durante tres semanas. ST-14 redujo significativamente el volumen tumoral en relación con el vehículo (Figura 13).

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La presente invención se describe adicionalmente mediante las siguientes reivindicaciones.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido del factor de transcripción activador 5 (ATF5) que comprende una región de cremallera de leucina de At F5 truncada, en donde la región de cremallera de leucina de ATF5 truncada tiene una secuencia de D-aminoácidos VAEAREELERLEARLGQARGEL (SEQ ID NO: 65).

2. El péptido ATF5 según la reivindicación 1 que comprende una secuencia de D-aminoácidos VAEAREELERLEARLGQARGELKKWKMRRNQFWLKLQR (SEQ ID NO: 14), en donde el péptido ATF5 es un péptido de penetración celular.

3. El péptido ATF5 según la reivindicación 1, en donde el péptido no comprende una región de cremallera de leucina extendida.

4. El péptido ATF5 según la reivindicación 1, en donde el péptido comprende un grupo acetilo N-terminal y/o un grupo amida C-terminal.

5. Una composición que comprende el péptido ATF5 según la reivindicación 1.

6. La composición según la reivindicación 5, que es una composición farmacéutica.

7. Un kit que comprende el péptido ATF5 según la reivindicación 1.