KR20200086374A

KR20200086374A - Atf5 펩티드 변이체들 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200086374A
Application number: KR1020207019180A
Authority: KR
Inventors: 배리 제이 카펠; 진 메룻카; 지미 앤드류 로톨로
Original assignee: 사피엔스 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date: 2018-01-03
Filing date: 2019-01-03
Publication date: 2020-07-16
Anticipated expiration: 2039-01-03
Also published as: CA3203983A1; JP6971508B2; CN111655277A; US10525100B2; US20240181003A1; EP3737399B1; DK3737399T5; IL281316B; KR102433761B1; IL290414B1; CN113845581A; ES2960784T3; AU2019205351A1; AU2019205351B2; JP2021508503A; US20210061869A1; AU2020256311B2; US20250127849A1; PT3737399T; EP3737399A4

Abstract

절두된 ATF5 류신 지퍼 영역과, 임의선택적으로, 세포-침투성 영역을 갖는 ATF5 펩티드, 이 ATF5 펩티드를 포함하는 조성물, 그리고 이 ATF5 펩티드를 이용하여 신생종양 세포에서 세포독성을 촉진시키고, 이의 증식을 저해하는 방법들이 제공된다.

Description

ATF5 펩티드 변이체들 및 이의 용도

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2018년 1월 3일자로 제출된 미국 가특허출원 번호 62/613,083을 청구한다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포멧으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전문은 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 전술한 ASCII 사본은 2018년 12월 21일자로 생성되었으며, Sapience_003_WO1_SL.txt 이름으로 불리며, 크기는 29,385 바이트이다.

배경

활성화 전사 인자 5 (ATF5)는 염기성 류신 지퍼 단백질의 ATF/CREB (cAMP 반응 요소 결합 단백질) 패밀리 구성원이다. 정상적인 발달 뇌에서, ATF5는 신경 전구체/신경 줄기 세포에서 고도로 발현되어, 여기에서 이것은 세포 주기 출구(cell cycle exit)를 차단하고, 세포 증식을 촉진하여, 신경발생(neurogenesis) 및 아교세포생성(gliogenesis)을 억제한다. ATF5 하향 조절은 신경전구체 세포 주기 출구 및 뉴런, 성상세포 또는 희소돌기아교세포(oligodendroglia)로의 분화를 허용하는데 필요하다 (Greene 외, 2009; Sheng 외, 2010a; Sheng 외, 2010b; Arias 외, 2012).

ATF5는 신경계의 정상적인 발달에서 그 역할 외에도, 신경교종 및 기타 종양들의 생존을 촉진시키는 종양형성 인자로 또한 대두되었다. 많은 연구에서 ATF5가 교아세포종, 유방암, 췌장암, 폐암 및 결장암을 포함한 다양한 암에서 상당히 발현되며, 신경교종 세포 생존에 필수적이라는 것이 입증되었다 (Monaco 외, 2007; Sheng 외, 2010a). 신경교종의 맥락에서, ATF5의 과다발현은 질병 예후 및 생존과 역-관계에 있는데, 즉, ATF5 발현이 더 큰 신경교종 환자는 ATF5 발현이 더 낮은 환자보다 현저히 나쁜 결과를 나타낸다.

암 세포에서, 아팝토시스를 유도하는 유전자는 종종 불 활성화되거나 또는 하향-조절되는 반면, 항-아팝토시스 유전자는 종종 활성화되거나 또는 과발현된다. 이 패러다임과 일관되게, ATF5는 B-세포 백혈병 2 (Bcl-2) 및 골수성 세포 백혈병 1 (Mcl-1)을 포함한 항-아팝토시스 단백질의 전사를 상향 조절하여, 종양 세포 생존을 촉진시킨다 (Sheng 외, 2010b; Chen 외, 2012).

발명의 요약

본 발명의 주요 측면 중 일부는 아래에 요약되어 있다. 추가 측면들은 본 발명의 상세한 설명, 실시예, 도면 및 청구 범위에 기재되어 있다. 본 명세서의 각 섹션에서의 설명은 다른 섹션들과 함께 읽도록 의도된다. 또한, 본 개시의 각 섹션에서 설명된 다양한 실시예는 다양한 다른 방식으로 결합될 수 있으며, 이러한 모든 조합은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

따라서, 본 명세서는 ATF5 류신 지퍼 도메인을 포함하는 ATF5 펩티드 유도체(임의선택적으로, 이때 공작된 강화된 류신 지퍼 서열은 없으며), 상기 ATF5 펩티드를 포함하는 조성물 및 키트, 그리고 ATF5 펩티드를 이용하여 신생종양 세포에서 세포독성을 유도하거나 및/또는 이의 증식을 억제시키는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 명세서는 ST-3 류신 지퍼 서열 (서열 번호: 53)를 포함하는 ATF5 펩티드의 변이체를 제공하며, 이 변이체들은 비-보존적 아미노산 치환을 포함한다. 본 발명 이전에, 이러한 치환으로 인하여 ST-3 류신 지퍼 서열(서열 번호: 53)을 포함하는 ATF5 펩티드와 비교하였을 때, 유사하거나 또는 더 우수한 세포 독성 활성을 갖는 분자가 될 것이라고 예측하지 못했을 것이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서는 세포-침투성 ATF5 펩티드 ST-3의 변이체들을 제공하며, 이 변이체들은 ST-3과 비교하였을 때, 유사하거나 또는 더 우수한 세포 독성 활성을 갖는다.

한 측면에서, 본 발명은 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역을 포함하는 ATF5 펩티드를 제공하며, 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역은 아미노산 서열 LEGECQGLEARNRELKERAESV (서열 번호: 53)의 변이체를 포함하고, 변이체는 다음과 같이 서열 번호: 53의 하나 또는 그 이상의 위치에서 변형된다: (i) E4는 양전하 잔기로 치환되며; (ii) C5는 비-극성 잔기로 치환되며; (iii) Q6은 알라닌으로 치환되며; (iv) E9는 양전하 잔기로 치환되며; (v) R11은 음전하 잔기로 치환되며; (vi) N12는 비-극성 잔기로 치환되며; (vii) K16은 음전하 잔기로 치환되며; (viii) S21은 알라닌으로 치환된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역을 포함하는 ATF5 펩티드를 제공하며, 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역은 다음으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다:

LEGEGQGLEARNRELKERAESV (서열 번호: 54),

LEGEAQGLEARNRELKERAESV (서열 번호: 55),

LEGECQGLEARNRELKERAEAV (서열 번호: 56),

LEGECQGLEARLRELKERAESV (서열 번호: 57),

LEGECAGLEARNRELKERAESV (서열 번호: 58),

LEGRCQGLRAENRELEERAESV (서열 번호: 59),

LEGRCQGLRAELRELEERAEAV (서열 번호: 60), 그리고

LEGRAQGLRAELRELEERAEAV (서열 번호: 61).

한 구체예에서, 상기 ATF5 펩티드는 세포-침투성 영역을 더 포함하며, 이로써 상기 ATF5 펩티드는 세포-침투성 펩티드이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포-침투성 영역은 다음으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다: RQIKIWFQNRRMKWKK (서열 번호: 25), RQLKLWFQNRRMKWKK (서열 번호: 26), YGRKKRRQRRR (서열 번호: 40), 그리고 YGRKKRRQRR (서열 번호:41).

본 발명의 추가 측면은 아미노산 서열 RQIKIWFQNRRMKWKKLEGECQGLEARNRELKERAESV (서열 번호: 3)의 변이체를 포함하는 세포-침투성 ATF5 펩티드를 제공하며, 변이체는 서열 번호: 3에서 다음으로 구성된 군에서 선택된 위치에서 변형된다: (i) C21G (서열 번호: 4); (ii) C21A (서열 번호: 5); (iii) Q22A (서열 번호: 8); (iv) E20R, E25R, R27E, 그리고 K32E (서열 번호: 9); (v) N28L (서열 번호: 7); (vi) S37A (서열 번호: 6); (vii) E20R, E25R, R27E, N28L, K32E, 그리고 S37A (서열 번호: 10); 그리고 (viii) E20R, C21A, E25R, R27E, N28L, K32E, 그리고 S37A (서열 번호: 11).

특정 구체예들에서, 상기 ATF5 펩티드는 본 발명의 ATF5 펩티드의 L-아미노산 서열과 비교하여, 역전된 아미노산 서열의 D-아미노산을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 레트로 인버소 펩티드의 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역은 D-아미노산 서열 VAEAREELERLEARLGQARGEL (서열 번호: 65)을 갖는다. 특정 구체예에서, 상기 레트로 인버소(retro inverso) 펩티드는 D-아미노산 서열 VAEAREELERLEARLGQARGELKKWKMRRNQFWLKLQR (서열 번호: 14)을 포함하는 세포-침투성 ATF5 펩티드다.

일부 구체예들에서, 본 발명의 ATF5 펩티드는 연장된(extended) 류신 지퍼 영역을 포함하지 않는다.

일부 구체예들에서, 본 발명의 ATF5 펩티드는 N-말단 아세틸기 및/또는 C-말단 아미드기를 포함한다.

본 발명의 ATF5 펩티드를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 약제학적 조성물이다. 본 발명의 ATF5 펩티드, 그리고 본 발명의 ATF5 펩티드를 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 키트가 추가 제공된다.

본 발명은 신생종양 세포에서 세포독성을 촉진시키는데 사용하기 위한 용도로 본 발명의 ATF5 펩티드를 제공한다. 본 발명은 신생종양 세포의 증식 억제에 사용하기 위한 추가 용도로 본 발명의 ATF5 펩티드를 제공한다. 본 발명은 신생종양 세포에서 세포독성을 촉진시키는 방법을 추가적으로 제공하며, 상기 방법은 상기 신생종양 세포에 본 발명의 ATF5 펩티드를 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 신생종양 세포의 증식 억제 방법을 추가적으로 제공하며, 상기 방법은 상기 신생종양 세포에 본 발명의 ATF5 펩티드를 접촉시키는 것을 포함한다.

도 1a-1c는 ATF-5 펩티드 NTAzip-ATF5 (서열 번호: 1) (도 1a), ST-2 (서열 번호: 2) (도 1b), 그리고 ST-3 (서열 번호: 3) (도 1c)의 아미노산 서열을 보여준다. 상기 연장된 류신 지퍼 도메인은 밑줄표시되며, 상기 Penetratin 세포-침투성 도메인은 이태리체로 되어 있으며, 그리고 ATF-5 류신 지퍼 도메인은 굵게 표시된다.
도 2 에서는 ST-3 변이체들의 시험관 활성을 보여주는데, 이때 단일 시스테인이 대체된다.
도 3 에서는 ST-3 변이체들의 시험관 활성을 보여주는데, 이때 단일 아미노산 치환이 있었다.
도 4 에서는 ST-3 변이체들의 시험관 활성을 보여주는데, 이때 다중 아미노산 치환이 있었다.
도 5 에서는 ST-3 변이체인 ST-11의 레트로 인버소 형태, ST-13 변이체들의 시험관 활성을 보여준다.
도 6a-6e 에서는 HL60 인간 전골수성 백혈병 세포 (PML) (도 6a), 급성 골수성 백혈병 세포 (AML14 및 SET2) (도 6b, 6c), 흑색종 세포 (A375) (도 6d), 그리고 유방암 세포 (MCF7) (도 6e)에서 ST-3에 대한 ST-13의 시험관 활성을 보여준다. ST-3 및 ST-13에 대한 각각의 세포 유형에서 EC₅₀값은 19.0μM와 4.8μM (도 6a); 29.6μM와 < 1μM (도 6b); 98.2μM와 17.7μM (도 6c); 21.8μM와 1.4μM (도 6d); 그리고 52.9μM와 < 1μM (도 6e)이었다.
도 7a-7e 에서는 HL60 인간 전골수성 백혈병 세포(PML) (도 7a), 급성 골수성 백혈병 세포(AML14) (도 7b), 교아세포종 세포(U251) (도 7c), 흑색종 세포(A375) (도 7d), 그리고 유방암 세포(MCF7) (도 7e)에서 ST-14의 시험관 활성을 보여준다. ST-2 및 ST-14에 대한 EC₅₀값은 차례로 >300μM와 <5μM (도 7a)이었다.
도 8a-8d 에서는 ST-14를 이용한 처리가 Mcl-1, Bcl-2, BIRC5 (Survivin), 그리고 ATF5의 발현을 어떻게 하향조절하는 지를 보여준다. RNA 발현은 역 전사 중합효소 쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 측정되었다. 5μM ST-14로 처리된 HL60 세포에서 발현 수준은 처리-후 4 시간 (도 8a) 및 24 시간 (도 8b) 시점에서 β-액틴 발현과 비교하여 나타낸다. 0, 20, 또는 40μM의 ST-14로 처리된 U251 세포(도 8c) 및 HL60 세포(도 8d)에서 발현 수준은 처리 후 4 시간 (도 8c) 또는 24 시간 (도 8d) 시점에서 β-액틴 발현과 비교하여 나타낸다.
도 9 에서는 HL60 피하 종양 모델에서 ST-3 변이체들의 항-종양 활성을 보여준다. Nu/J 마우스는 25mg/kg BID-IP (n = 한 집단에 6-7마리)으로 처리되었다.
도 10a-10c 에서는 U251 피하 종양 모델에서 ST-14의 항-종양 활성을 보여준다. NOD/SCID 마우스는 3주 동안 주당 3회 50mg/kg SC로 처리되었다. 평균 출발 종양 용적은 약 240mM³이었다. 평균 종양 용적 (도 10a), 생존 백분율 (도 10b), 그리고 개별 종양 용적 (도 10c)을 보여준다. 데이터 포인트는 평균 ± SEM을 나타낸다; p<0.0001; n = 각 시점에서 한 집단에 살아있는 동물의 수.
도 11a-11b 에서는 ST-14의 조기 또는 지연 투여는 MCF7 유방암 세포에서 유의적인 항-종양 활성을 갖는다는 것을 보여준다. Nu/J 마우스는 종양 접종-후 2일차(도 11a) 또는 59일차(도 11b)에 시작하여 3주 동안 주당 3회 25mg/kg SC로 처리되었다. 평균 출발 종양 용적은 약 280-330mm³이었다. 접종: 비히클 군에서 2 x 10⁶ 세포 (도 11a, 11b); ST-14 군에서 2 x 10⁶ 세포 (도 11a); ST-14 군에서 5 x 10⁶ 세포(도 11b). 데이터 포인트는 평균 ± SEM을 나타낸다; p<0.0001.
도 12 에서는 HL60 피하 종양 모델에서 ST-14의 항-종양 활성을 보여준다. Nu/J 마우스는 3주 동안 주당 3회 20mg/kg SC로 처리되었다. 평균 출발 종양 용적은 약 220mM³이었다. 데이터 포인트는 평균 ± SEM을 나타낸다; p<0.05.
도 13 에서는 A375 피하 종양 모델에서 ST-14의 항-종양 활성을 보여준다. NOD/SCID 마우스는 3주 동안 매일 2회 25mg/kg SC로 처리되었다. 평균 출발 종양 용적은 약 250-344mM³이었다. 데이터 포인트는 평균 ± SEM을 나타낸다; p=0.002.

발명의 상세한 설명

달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 약학, 제형 과학, 단백질 화학, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이며, 이들 모두 당업계의 기술 범위 안에 있다.

본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본 명세서 전반에 걸쳐 추가적인 정의가 제시된다. 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계 숙련자들에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 명세서에 제공된 임의의 제목은 본 발명의 다양한 측면 또는 구체예들을 제한하는 것이 아니며, 본 명세서를 전체적으로 참조할 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어들은 그 전체가 명세서를 참조하여 더 완전하게 정의된다.

본원에 인용된 모든 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입되어 있다. 또한, 여기에 인용되거나 또는 언급된 제품에 대한 제조업체의 지침 또는 카탈로그는 참조에 편입된다. 본 명세서에 참조에 편입된 문서 또는 그 안의 모든 교시가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 이 본문에 참조로 포함된 문서는 선행 기술로 인정되지 않는다.

I. 정의

본 명세서의 문구 또는 용어는 설명의 목적을 위한 것이지 제한하기 위한 것이 아니며, 본 명세서의 용어 또는 문구는 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 한다.

본 명세서와 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수("a", "an" 및 "the")형은 다른 명시적인 언급이 없는 한 복수 개념을 포함한다는 것으로 주지되어야 한다. 용어 "하나 또는 이상의" 및 "최소 하나의"은 물론 교환 할 수 있는 용어로 "단수 관사("a" 또는 "an") 용어를 사용할 수 있다.

더욱이, "및/또는"은 명시된 특징 또는 구성 요소의 각각의 구체적인 설명으로서 취해질 것이다. 따라서, 구절에서 사용된 용어 "및/또는", 이를 테면 "A 및/또는 B"는 "A와 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)을 포함한다. 유사하게, 구절, 이를 테면 "A, B, 및/또는 C"에 사용된 용어 "및/또는"은 A, B, 그리고 C; A, B, 또는 C; A 또는 B; A 또는 C; B 또는 C; A와 B; A와 C; B와 C; A (단독); B (단독); 그리고 C (단독)를 포함한다.

"포함하는(comprising)"이라는 언어는 구체예들이 기술되는 경우, 그렇지 않으면 "구성되는(consisting of)" 및/또는 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"으로 설명된 유사한 구체예들이 포함된다.

단위, 접두사 및 기호는

승인 양식에 표시되어 있다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하며, 본원에 제공된 임의의 개별 값은 본원에 제공된 다른 개별 값을 포함하는 범위에 대한 종점으로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 8, 9 및 10과 같은 일련의 값은 1-10, 1-8, 3-9, 등등의 숫자 범위를 나타낸다. 마찬가지로, 개시된 범위는 그 범위에 포함된 각각의 개별 값의 개시이다. 예를 들어, 명시된 5-10 범위는 또한 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 개시이다.

용어 "폴리펩티드," "펩티드," 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 중합체, 및 이의 염들을 지칭하는 것으로, 본 명세서에서 호환된다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제시된 비통상적 또는 비천연 아미노산에 대한 약어의 경우와 같이 달리 지시된 경우를 제외하고, 당업계에 사용된 3-문자 및 1-문자 약어가 본원에서 아미노산 잔기를 나타내는데 사용된다. "D" 또는 소문자가 붙은 경우를 제외하고, 아미노산은 L-아미노산이다. 아미노산 약어의 그룹 또는 스트링이 펩티드를 나타내는데 사용된다. 구체적으로 지시된 경우를 제외하고, 펩티드는 좌측이 N-말단으로 표시되고, 서열은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 기재된다.

상기 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 또한 자연적으로 또는 개입에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함하고; 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 락탐 다리 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 아실화, 아미드화, 인산화, 또는 표지 성분과의 컨쥬게이션, 또는 보호기의 추가와 같은 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산을 포괄한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 또는 그 이상의 유사체 (예를 들어, 아미노-이소부틸산(Aib), 비천연 아미노산 등을 포함) 및 D-아미노산을 포함하는 또는 이로 구성된 폴리펩티드, 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 이 정의 안에 포함된다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 단일 쇄, 공유결합 이량체, 또는 비-공유 연합된 쇄로 발생될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 환(cyclic) 형태일 수도 있다. 환형태의 폴리펩티드는 예를 들면, 자유 아미노 및 자유 카르복실기의 다리 연결에 의해 만들어질 수 있다. 환형태 화합물의 형성은 탈수제로 처리하고, 필요한 경우 적절한 보호기를 제공함으로써, 달성할 수 있다. 개방 사슬 (선형 형태)의 환형태 반응은 분자 내 고리화를 수반할 수 있다. 환형태 폴리펩티드는 당분야에 공지된 기타 방법들, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 락탐 다리, 수소 결합 대행(surrogates) (Patgiri 외, 2008), 탄화수소 스테이플 (Schafmeister 외, 2000), 트리아졸 스테이플 (Le Chevalier Isaad 외, 2009), 또는 이황화 다리 (Wang 외, 2006)에 의해 또한 만들어질 수 있다. 다리 또는 스테이플(staples)은 예를 들어, 3, 4, 7, 또는 8개 아미노산 길이로 공간적으로 떨어져 있을 수 있다.

"변이체"란 기준 서열과 비교하였을 때, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결손, 및/또는 삽입을 갖는 펩티드를 지칭한다. 결손 및 삽입은 내부에 있거나 및/또는 하나 또는 그 이상의 말단에 있을 수 있다. 치환에는 하나 또는 그 이상의 아미노산이 유사한 또는 상동성 아미노산(들) 또는 비유사 아미노산(들)로 대체되는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 변이체들은 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 알라닌 치환을 포함한다. 기타 치환에는 당해 단백질의 전체적인 네트 하전, 극성 또는 소수성에 영향이 없거나 또는 거의 없는 보존적 치환이 포함된다. 일부 변이체들에는 당해 아미노산의 하전 또는 극성을 변화시키는 비-보존적 치환이 포함된다. 치환은 아미노산의 L-또는 D-형태로 이루어질 수 있다.

"레트로 인버소(retro inverso)" 펩티드는 기준 L-아미노산 서열과 비교하였을 때, 역전된 아미노산 서열을 갖고, 그리고 원래 L-아미노산 펩티드의 것과 유사한 측쇄 위상배치(topology)를 유지하는데 도움이 되는 D-아미노산(당해 아미노산 소단위의 α-중심 키랄성을 역전시킴)으로 구성된다.

본원에서 이용된 용어 "보존적 치환"이란 하나 또는 그 이상의 아미노산이 또다른 생물학적으로 유사한 잔기로 대체되는 것을 나타낸다. 예로는 아미노산 잔기를 유사한 특징, 가령, 작은 아미노산, 산성 아미노산, 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 소수성 아미노산, 그리고 방향족 아미노산으로의 치환을 포함한다. 펩티드 및 단백질에서 표현형적으로 침묵 치환과 관련된 추가 정보는 예를 들어, Bowie 외, Science 247:1306-1310 (1990)를 참고한다. 하기 조합에서, 아미노산의 보존적 치환은 물리화학적 성질에 의해 집단화된다; I: 중성 및/또는 친수성, II: 산성 및 아미드, III: 염기성, IV: 소수성, V: 방향족, 벌크(bulky) 아미노산.

하기 조합에서, 아미노산의 보존적 치환은 물리화학적 성질에 의해 집단화된다; VI: 중성 또는 소수성, VII: 산성, VIII: 염기성, IX: 극성, X: 방향족.

단백질 기능에 영향을 미치지 않는 보존적 뉴클레오티드 및 아미노산 치환을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(가령, Brummell 외, Biochem. 32 :1180-1187 (1993); Kobayashi 외, Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 그리고 Burks 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:412-417 (1997)).

2개 또는 그 이상의 핵산 또는 펩티드 내용에서 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율이란 서열 동일성의 일부로서 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않고, 최대 대응성을 위해 비교되고 정렬될 때 (필요한 경우, 갭을 도입), 동일하거나 특정 비율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 둘 또는 그 이상의 서열 또는 준서열을 지칭한다. 동일성 백분율은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하거나 또는 육안으로 측정할 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 얻는데 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어가 당업계에 공지되어 있다.

서열 정렬 알고리즘의 이러한 비-제한적인 한 가지 예는 Karlin 외, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268 (1990)에 기술된 알고리즘, Karlin 외., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877 (1993)에서 변형되고, 그리고 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된 (Altschul 외., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1991)) 알고리즘이다. 특정 구체예들에서, 갭이 끼어있는(Gapped) BLAST는 Altschul 외., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul 외., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California)에서 기술된 바와 같이 이용되거나, 또는 Megalign (DNASTAR)는 서열을 정렬시키는데 이용될 수 있는 추가적으로 공개적으로 이용가능한 소프트웨어다. 특정 구체예들에서, GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램을 이용하여 두 뉴클레오티드 간의 동일성 백분율이 결정된다(가령, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 90의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치 이용). 특정 대체 구체예들에서, Needleman 및 Wunsch의 알고리즘이 편입된 (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하여 두 아미노산 서열 간에 동일성 백분율을 결정할 수 있다 (가령, BLOSUM 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 그리고 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치와 1, 2, 3, 4, 5의 길이 가중치 사용). 대안으로, 특정 구체예들에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 Myers 및 Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))의 알고리즘을 이용하여 결정된다. 예를 들면, ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)을 이용하고, 그리고 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 그리고 갭 패널티 4와 함께, PAM120을 이용하여 동일성 백분율이 결정될 수 있다. 특정 정렬 소프트웨어에 의한 최대 정렬을 위한 적절한 매개변수는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 특정 구체예들에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 매개변수들이 이용된다. 동일성을 산출하는 다른 자료는 Computational Molecular Biology (Lesk ed., 1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith ed., 1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1 (Griffin and Griffin eds., 1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (G. von Heinje, 1987); Sequence Analysis Primer (Gribskov 외, eds., 1991); 그리고 Carillo 외, SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)에 기술된 방법들이 포함된다.

본원에 사용 된 "폴리뉴클레오티드"란 하나 또는 이상의 "핵산", "핵산 분자" 또는 "핵산 서열"을 포함할 수 있으며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 말하는 것으로써, DNA 및 RNA가 포함된다. 이 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소 안으로 혼입될 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에 언급 된 모든 폴리 뉴클레오티드에 적용된다.

"단리된(isolated)" 분자란 정제된 것들을 포함하여 자연에서 발견되지 않은 형태의 분자이다.

"라벨(label)"이란 "라벨된" 분자를 생성하기 위해 분자에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있는 검출 가능한 화합물이다. 상기 라벨은 자체적으로 탐지가능하거나 (가령, 방사능동위원소 라벨 또는 형광 라벨), 또는 예를 들어, 탐지가능한(가령, 효소 라벨) 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매함으로써 간접적으로 탐지되거나, 또는 다른 간접 탐지(가령, 바이오티닐화)에 의해 탐지될 수 있다.

"결합 친화력"이란 일반적으로 분자의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예를 들어, 수용체와 이의 리간드, 항체와 이의 항원, 이량체를 형성하는 2 개의 단량체 등등) 사이의 비-공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "결합 친화력"이란 결합 쌍의 구성요소들간에 1:1 상호작용을 반영한 고유한 결합 친화력을 지칭한다. 분자 X가 이의 짝 Y에 대한 친화력은 해리 상수 (K_D)로 나타낼 수 있다. 친화력은 본 명세서에서 설명된 것이 포함된 당분야에 공지된 공통적 방법들에 의해 측정될 수 있다. 낮은-친화력 파트너는 일반적으로 항원을 천천히 결합 시키며 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 높은-친화력 파트너는 일반적으로 더 빨리 결합하고, 더 오랫동안 결합을 유지하는 경향이 있다.

이의 결합 파트너에 대한 분자의 친화성 또는 결합력(avidity)은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 유동 세포 분석법, 효소-연계된 면역흡착 분석법 (ELISA), 또는 방사성 면역 분석법 (RIA), 또는 동역학(가령, KINEXA® 또는 BIACORE™ 또는 OCTET® 분석)을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 직접 결합 분석 뿐만 아니라 경쟁적 결합 분석 포멧이 바로 이용될 수 있다. (가령, Berzofsky 외, "Antibody-Antigen Interactions", in Fundamental Immunology, Paul, W. E., ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992) 참고). 특정 결합 쌍 상호작용의 측정된 친화력은 상이한 조건 (가령, 염 농도, pH, 온도) 하에서 측정될 때 가변적일 수 있다. 따라서, 친화력 및 기타 항원-결합 매개변수 (가령, K_D 또는 Kd, K_on, K_off)의 측정은 결합 파트너의 표준화된 용액 그리고 당분야에 공지된 표준화된 완충액으로 이루어진다.

"활성제"는 생물학적 활성을 제공하려는 의도의 성분이다. 상기 활성제는 하나 이상의 다른 성분과 연합될 수 있다. 펩티드인 활성제는 "활성 펩티드"로 또한 지칭될 수 있다.

활성제의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다.

용어 "약학적 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 조제물을 지칭하며, 조성물이 투여되는 대상에게 수용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다. 이러한 조성물은 멸균될 수 있고, 생리 식염수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적조성물은 하나 또는 그 이상의 완충제 (가령, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트 레이트 완충제), 계면 활성제 (가령, 폴리 소르 베이트), 안정 화제 (가령, 폴리올 또는 아미노산), 보존제 (가령, 벤조산 나트륨) 및/또는 다른 통상적인 가용화제 또는 분산제를 포함할 수 있다.

"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유 동물"은 진단, 예후 또는 치료가 필요한 임의의 대상체, 특히 포유 동물 대상체이다. 포유류 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 스포츠 동물, 및 실험실 동물, 예를 들어 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 설치류, 래트(rats) 및 마우스를 포함하는 설치류, 토끼 등을 포함한다.

용어 "저해하다", "차단하다" 및 "억제하다"는 상호 호환적으로 사용되며, 발생 또는 활동의 완전한 차단을 비롯한, 발생 또는 활동의 통계적으로 유의미한 감소를 지칭한다. 예를 들어, "저해(inhibition)"란 활성 또는 발생의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 감소를 지칭할 수 있다. "저해제(inhibitor)"는 공정, 경로 또는 분자의 발생 또는 활성을 통계적으로 유의하게 감소시키는 분자, 인자 또는 물질이다.

"신생종양 세포" 또는 "신생물(neoplasm)"은 전형적으로 동일한 형태의 정상 세포 또는 조직과 비교하여, 비정상적 성장을 초래하는 일부 형태의 돌연변이/변형을 겪었다. 신생물은 형태학적 불규칙성 뿐만 아니라, 병리학적 증식을 포함한다. 신생종양 세포는 양성이거나 또는 악성일 수 있다. 악성 신생물, 즉 암은 세포의 분화 및 배향 상실을 나타내며 침습 및 전이의 특성을 갖는다는 점에서 양성과 구별된다.

"고형 종양"이란 신생종양 세포 덩어리다. "액체 종양" 또는 "혈액 악성 종양"은 골수성 또는 림프계 계통의 혈액 암이다.

II. ATF5 펩티드 및 조성물

ATF5 펩티드

ATF5는 N-말단 산성 활성화 도메인과 C-말단 염기성 류신 지퍼 (bZIP) 도메인을 갖는 282개-아미노산 진핵세포 전사 인자다. bZIP 도메인은 DNA-결합 영역과 류신 지퍼 영역을 포함한다. 상기 류신 지퍼는 공통적인 구조적 모티프로써 전형적으로 이량체화 도메인에서 매번 7번째 아미노산에 류진을 갖는다. bZIP 전사 인자는 DNA에 특이적으로 결합하기 위하여 이의 류신 지퍼를 통하여 동종-및/또는 이종(hetero)-이량체화된다. 야생형 인간, 래트, 그리고 뮤린 ATF5는 차례로 NCBI 수탁 번호. NP_001180575, NP_758839, 그리고 NP_109618로 제시된 아미노산 서열을 갖는다.

NTAzip-ATF5 (도 1a)는 상기 ATF5 N-말단 활성화 도메인이 결손되고, DNA 결합 도메인은 공작된 강화된 류신 지퍼, 가령, 매 7번째 잔기에 류신이 있는 헵타드(heptads) 반복부를 포함하는(이는 야생형 ATF5 류신 지퍼 영역까지 연장되는) 양쪽성 산성 α-나선 서열로 대체된 ATF5 펩티드이다 (Angelastro 외, 2003). 세포-침투성 우성 음성 ATF5 (CP-d/n-ATF5) 분자는 NTAzip-ATF5의 개량된 형태이며, 이것은 세포-침투성 도메인과 절두된 ATF5 류신 지퍼 서열 (야생형과 비교하여), 그리고 연장된 류신 지퍼 서열을 포함한다 (US 2016/0046686; Karpel-Massler 외, 2016). CP-d/n ATF5 분자의 예는 도 1b에 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "연장된 류신 지퍼", "류신 지퍼 연장", 및 "강화된 류신 지퍼"란 1개 내지 4개의 류신 헵타드, 가령, Leu-(X)₆ (서열 번호: 52)를 갖는 펩티드를 지칭하며, 이의 서열은 야생형 ATF5 류신 지퍼 서열이 아니다.

ST-3 (도 1c)는 상기 류신 지퍼 연장이 결여된 CP-d/n-ATF5 분자 변이체이며, 그리고 신생 종양 세포에서 세포 사멸을 유도한다. 기존 연구에서 강화된 류신 지퍼 영역은 우성-음성 bZIP 저해제의 안정성 및 저해성에 필요하다는 것이 입증되었다 (Krylov 외, 1995; Olive 외, 1997; Moll 외, 2000; Acharya 외, 2006). 따라서, ST-3이 연장된 류신 지퍼 영역 부재하에 신생종야 세포를 특이적으로 표적화하고, 이를 사멸시키는 능력을 유지한다는 발견은 예상하지 못했던 것이다.

본 발명자들은 ST-3 류신 지퍼 서열 (서열 번호: 53)을 포함하는 ATF5 펩티드의 비-보존적 변이체들이 신생종양 세포에서 세포 사멸을 유도한다는 사실을 발견하였다. 본 발명의 ATF5-유래된 펩티드가 ST-3 류신 지퍼 영역에 대한 다중 비-보존적 아미노산 치환을 가지고, 신생종양 세포를 특이적으로 표적화하고, 이를 사멸시키는 능력을 유지한다는 발견은 본 발명 이전에는 예상하지 못하였다. ST-3의 레트로 인버소 변이체들은 활성이 있었고, 뿐만 아니라 ST-3과 비교하여 증가된 활성을 보유하였는데, 이 역시 예상치 못한 것이었다.

본 발명은 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역과 임의선택적으로, 세포-침투성 영역을 갖는 ATF5 펩티드를 제공한다. 본 발명의 ATF5 펩티드는 이들이 도입되는 세포에서 ATF5 활성을 간섭할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 ATF5 펩티드는 아팝토시스가 관련된 경로에 영향을 줄 수 있다. ATF5 활성은 본원에서 기술된 세포-사멸 검정을 포함하는 당분야에 공지된 임의의 검정에 의해 평가될 수 있다. ATF5 활성은 cAMP-반응 요소 (CRE)에 결합하는 능력에 의해 또한 평가될 수 있다.

상기 "ATF5 류신 지퍼 영역"은 야생형 ATF5 류신 지퍼 영역으로부터 유래된 절두된 서열이다. 이 용어는 이 서열만을 지칭하는데 이용되며, 반드시 2차 구조를 의미하는 것은 아니다. 상기 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역은 예를 들어, 표 1에 나타낸 아미노산 서열을 보유할 수 있다. ST-3 류신 지퍼 서열 (서열 번호: 53)은 참고용으로 나타낸다. 서열 번호: 53에서 치환은 밑줄과 함께 굵게 표시된다.

상기 류신 지퍼 영역은 레트로 인버소 형태일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 레트로 인버소 류신 지퍼 영역은 서열 VAEAREELERLEARLGQARGEL (서열 번호: 65)을 갖는다.

이들 서열의 변이체들 또한 본 발명의 범위 안에 있다. 본 발명의 ATF5 펩티드는 본원에서 개시된 서열에 대하여 최소한 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성의 류신 지퍼 영역을 가질 수 있다.

상기 ATF5 펩티드가 세포-침투성 영역을 포함하는 구체예들에서, 상기 세포-침투성 영역은 상기 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역에 작동가능하도록 연계된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포-침투성 영역은 예를 들어, 펩티드 결합, 이황화 결합, 티오에테르 결합 또는 당분야에 공지된 링커를 통하여 상기 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역에 공유적으로 연계된다(가령, Klein 외, 2014 참고). 예시적인 링커는 치환된 알킬 또는 치환된 시클로알킬을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 당해 펩티드를 운반한 후, 링커는 절단될 수 있다. 세포-침투성 영역과 ATF5 류신 지퍼 영역은 아미드 결합에 의해 직접적으로 연계되는, 이를 "융합(fusion)"이라고 부를 수 있다. 융합은 상기 세포-침투성 영역과 ATF5 류신 지퍼 영역 간의 아미노산 링커 서열을 포함하는데, 이는 활성 펩티드 관련하여 상기에서 논의된 바 있다. 상기 세포-침투성 영역은 상기 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역의 N-말단 또는 C-말단에 연계되거나, 또는 잔기 측쇄를 통하여 연계될 수 있다. 상기 세포-침투성 영역과 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역은 동일한 또는 반대되는 키랄성(chirality)을 가질 수 있다.

세포-침투성 본 발명의 ATF5 펩티드는 본원에서 기술된 세포-침투성 도메인과 ATF5 류신 지퍼 도메인의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 펩티드의 예는 표 2에 나타내지만, 이에 국한되지는 않는다. 상기 세포-침투성 영역은 이태리체로 표시된다. ST-3 서열과 관련된 치환은 밑줄과 함께 굵게 표시된다.

본 발명의 ATF5 펩티드의 레트로 인버소 형태 또한 포함된다. 한 구체예에서, 상기 ATF5 펩티드는 세포-침투성 영역을 포함하고, D-아미노산 서열 V A EARE E LER LE A R LGQ AR GELKKWKMRRNQFWIKIQR (서열 번호: 13)을 갖는, 레트로 인버소 펩티드인 ST-13이다. 또다른 구체예에서, 상기 ATF5 펩티드는 세포-침투성 영역을 포함하고, D-아미노산 서열 V A EARE E LER LE A R LGQ AR GELKKWKMRRNQFW L K L QR (서열 번호: 14)을 갖는, 레트로 인버소 펩티드인 ST-14이다. 상기 세포-침투성 영역은 이태리체로 표시된다. 상기 ST-3 서열 (서열 번호: 3)과 관련된 치환은 밑줄과 함께 굵게 표시된다.

본 발명의 ATF5 펩티드는 종점으로써, 예를 들어, 22-38개 아미노산을 갖는 범위를 포함하여, 바람직하게는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59개 또는 60개 길이의 아미노산이다.

본 발명의 ATF5 펩티드는 본원에서 개시된 서열에 대하여 최소한 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 펩티드를 포함한다.

상기 ATF5 펩티드는 변형된 N-말단 및/또는 변형된 C-말단을 가질 수 있다. 예를 들어, ATF5 펩티드는 임의선택적으로 N-말단 아세틸기 및/또는 C-말단 아미드기를 포함할 수 있다.

본 발명의 ATF5 펩티드는 임의선택적으로 환형(cyclic)일 수 있다. 예를 들어, ATF5 펩티드는 하나 또는 그 이상의 락탐 다리를 포함할 수 있다. 락탐 다리는 바람직하게는 4개 아미노산(BxxxB) 길이의 공간을 두고있는 측쇄 사이에서 만들어지지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 락탐 다리는 예를 들어, Asp 또는 Glu와 Lys의 측쇄 사이에서 형성될 수 있다. 아미노산 치환은 링키지(linkage)를 촉진시키기 위하여 락탐 다리 부위에서 만들어질 수 있다.

본 발명의 ATF5 펩티드는 이를 테면, 정제 또는 탐지를 위하여 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 에피토프 및/또는 친화력 테그를 포함할 수 있다. 이러한 테그에는 FLAG, HA, His, Myc, GST, 그리고 이와 유사한 것들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 ATF5 펩티드는 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 라벨을 포함할 수 있다.

특정 측면들에서, 본 발명은 조성물, 가령, 본 발명의 ATF5 펩티드를 포함하고, 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 운반체, 희석제, 부형제, 또는 다른 첨가제들을 더 포함하는 약제학적 조성물이다.

본원에서 제공된 상기 ATF5 펩티드 및 조성물을 포함하고, 임의선택적으로, 사용 지침이 포함된 키트 또한 본 발명의 범위 안에 있다. 상기 키트는 최소한 하나의 추가 시약, 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가 활성제를 더 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 당해 키트 내용물의 의도된 용도를 명시한 라벨을 포함한다. 용어 "라벨"은 당해 키트 상에 또는 당해 키트와 함께 공급되는, 또는 그렇지 않으면 키트에 수반된 임의의 기재된 또는 기록된 물질을 포함한다.

본 발명의 ATF5 펩티드는 ATF5 표적 유전자 Bcl-2, Mcl-1, 그리고 Survivin를 포함하나, 이에 국한되지 않은 일련의 유전자의 차등 발현을 촉진시킨다. 구체적으로, 상기 ATF5 펩티드는 세포 생존, 증식, 그리고 가소성(plasticity)과 연합된 ATF5 표적 유전자의 발현을 녹-다운시킨다. 따라서, 상기 ATF5 펩티드는 세포 사멸을 유도하고, 세포 증식을 감소시키거나, 또는 세포 분화를 활성화시키는데 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 ATF5 펩티드는 신생종양 세포에서 증식을 저해하고 및/또는 세포독성을 촉진시키는데 이용된다. 증식 및 세포독성은 본원에서 기술된 세포 사멸 검증을 비롯한 공지의 검정에 의해 측정될 수 있다.

세포 표적화

본 발명의 ATF5 펩티드는 당분야에 공지된 방법에 의해 표적 세포 안으로 도입될 수 있다. 상기 도입 방법은 예를 들면, 의도된 적용에 따라 달라질 수 있다.

일부 경우에서, 상기 ATF5 펩티드를 인코딩하는 DNA 또는 RNA가 표적 세포 안으로 운반되고, 이 안에서 발현될 수 있다. 운반은 적용에 따라 임의의 적절한 벡터를 통하여 이루어질 수 있다. 벡터의 예로는 플라스미드, 코스미드, 파아지, 박테리아, 효모 및 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합 바이러스 및 외피-위형(pseudotyped) 바이러스를 포함하는 레트로바이러스로부터 제조된 벡터가 포함된다. 벡터는 예를 들어, 나노입자, 유체역학적 전달, 전기천공, 소노포레이션(sonoporation), 인산 칼슘 침전 또는 DEAE-덱스트란과 같은 양이온 성 중합체를 사용하여 세포로 도입될 수 있다. 벡타는 리포좀에 캡슐화되거나 또는 양이온성 축합제와 관련된 지질과 복합체화될 수 있다.

본 발명의 ATF5 펩티드는 세포 반응을 이용하는 기전을 통하여 세포 안으로 전달될 수 있다. 이러한 기전의 예는 항체-약물 콘쥬게이트, 키메라 항원 수용체 및 인테그린-표적화, RGD-유사 서열을 포함한다. RGD-유사 서열의 예로는 GRGDS (서열 번호: 72) 및 GRGDNP (서열 번호: 73)을 포함한다. 본 발명의 ATF5 펩티드는 본원에 기술된 또는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 하나 또는 그 이상의 RGD-유사 서열, 이를 테면, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 RGD-유사 서열을 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 RGD-유사 서열(들)은 상기 ATF5 류신 지퍼 영역의 N-말단 또는 C-말단 측면에 통합될 수 있다. 이러한 RGD-유사 서열들은 서로 독립적으로, 그리고 상기 ATF5 류신 지퍼 영역과 독립적으로 레트로 인버소 형태가 될 수 있다. 대안으로, ATF5 펩티드는 엑소좀, 또는 리포좀과 같은 소포 또는 미셀(micelles)에 포집되어, 세포로 전달될 수 있다. ATF5 펩티드를 세포로 도입시키는 또다른 방법은 예를 들면 탄화수소 스테이플을 통한 고리화 (Bernal 외, 2007; Bird 외, 2016) 또는 당분야에 공지된 다른 고리화 방법에 의해 이루어진다.

본 발명의 특정 ATF5 펩티드는 세포-침투성 도메인 또는 세포-침투성 펩티드 (CPP)를 포함한다. 용어 "세포-침투성 도메인", "세포-침투성 영역", 및 "세포-침투성 펩티드"는 본원에서 호환사용된다.

CPPs는 세포 막을 가로지를 수 있는 짧은 (전형적으로 약 6-40개의 아미노산) 펩티드다. 많은 CPPs들이 혈관-뇌 장벽(BBB)을 가로지를 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 CPP는 종점으로써, 예를 들어, 10-30개 아미노산을 갖는 범위를 포함한, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38개 또는 39개 길이의 아미노산이다. CPPs는 세포막 및 BBB를 가로 질러 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 나노입자와 같은 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된 분자 카고(cargo)를 수송하는 능력을 갖는다. 전위(translocation)는 전위를 통해 엔도사이토시스이거나, 또는 에너지-독립존적 (즉, 비-엔도사이토시스성)일 수 있다. 다수의 CPPs가 문헌에 기술되며, 특징화되었다 (가령, Handbook of Cell-Penetrating Peptides (2d ed. Ulo Langel ed., 2007);

외, 2008; Heitz 외, 2009; Munyendo 외, 2012; Zou 외, 2013; Krautwald 외, 2016 참고). CPP의 선별된 데이터베이스는 crdd.osdd.net/raghava/cppsite에서 유지된다. (Gautam 외, 2012).

핵 국소화 서열 (NLSs)로 지칭되는 펩티드는 CPPs의 부분집합이다. 고전적 NLS는 염기성 아미노산의 1 개 (단일분자) 또는 2 개 (이분자) 영역을 함유한다. 고전적인 단일분자 및 이분자 NLSs의 콘센수스(consensus) 서열은 차례로 K(K/R)X(K/R) (서열 번호: 66) 및 (K/R)(K/R)X_10-12(K/R)_3/5 (서열 번호: 67)이며, 여기에서 3/5는 5개 연속 아미노산중 최소한 3개는 리신 또는 아르기닌임을 나타낸다 (Kosugi 외, 2009). SV40 거대 T 항원의 NLS 서열, PKKKRKV (서열 번호: 36)은 고전적인 단일분자 NLS의 예가 되며, 한편 핵플라스민의 NLS 서열, KRPAATKKAGQAKKK (서열 번호: 68)은 고전적인 이분자 NLS의 예가된다 (Lange 외, 2007; Kosugi 외, 2009). 다수의 비-고전적인 NLSs이 또한 있는데, 이를 테면, 리보핵 단백질 (RNPs) hnRNP A1, hnRNP K, 그리고 U snRNP이 있다 (Mattaj 외, 1998).

본 발명에 사용에 적합한 CPPs의 비-제한적인 예로는 단백질, 이를 테면, 초파리(Drosophila) 안테나페디아 전사 인자 (Penetratin 및 이의 유도체 RL-16 및 EB1) (Derossi 외, 1998;

외, 2000; Lundberg 외, 2007; Alves 외, 2008); from HIV-1 전사의 트란스-활성인자 (Tat) (

외, 1997;

외, 2001); 광견병 바이러스 당단백질 (RVG) (Kumar 외, 2007); 헤르페스 단순체 바이러스 VP22 (Elliott 외, 1997); 항균 프로테그린 1 (SynB) (Rousselle 외, 2001), 래트 인슐린 1 유전자 강화제 단백질 (pIS1) (Kilk 외, 2001; Magzoub 외, 2001); 뮤린 맥관 내피 캐드해린 (pVEC) (Elmquist 외, 2001); 인간 칼시토닌 (hCT) (Schmidt 외, 1998); 그리고 섬유아세포 성장 인자 4 (FGF4) (Jo 외, 2005)와 같은 단백질로부터 유래된 펩티드다. 본 발명에 사용하기에 적합한 CPPs에는 합성 그리고 키메라 펩티드, 이를 테면 Transportan (TP) 및 이의 유도체 (Pooga 외, 1998; Soomets 외, 2000); 막 전위(translocating) 서열 (MTSs) (Brodsky 외, 1998; Lindgren 외, 2000; Zhao 외, 2001), 이를 테면, MPS 펩티드 (일명 융합 서열-기반의 펩티드 또는 FBP) (Chaloin 외, 1998); 서열 신호-기반 펩티드 (SBP) (Chaloin 외, 1997); 모델 양쪽성 펩티드 (MAP) (Oehlke 외, 1998; Scheller 외, 1999;

외, 2001), 전위(translocating) 펩티드 2 (TP2) (Cruz 외, 2013), MPG (Morris 외, 1997; Kwon 외, 2009), Pep-1 (Morris 외, 2001;

외, 2007), 그리고 폴리-아르기닌 (가령, R₇-R₁₂) (서열 번호: 87) (Mitchell 외, 2000; Wender 외, 2000; Futaki 외, 2001; Suzuki 외, 2002)을 또한 포함한다. 대표적인 그러나, 비-제한적인 서열은 표 3에 나타낸다.

CPPs의 기능은 서열-특이적 상호 작용보다는 이의 물리적 특성에 의존하기 때문에, 이들은 표 3에 제공되고 및/또는 당업계에 공지된 바와 같이 역 서열 및/또는 역 키랄성을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 CPPs의 레트로 인버소 형태 (역 서열 및 역 키랄성)는 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 레트로 인버소 CPP의 한 예는 D-아미노산 서열 KKWKMRRNQFWIKIQR (서열 번호: 50)을 갖는다. 레트로 인버소 CPP의 또다른 예는 D-아미노산 서열 KKWKMRRNQFWLKLQR (서열 번호: 51)을 갖는다. 세포 막 및/또는 BBB를 가로지르는 능력을 유지하고, 하나 또는 그 이상의 아미노산 추가, 결손, 및/또는 치환을 갖는 이들 서열의 변이체들이 또한 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 본 발명의 ATF5 펩티드는 표 3에서 제공되는 예시적인 서열에 대하여 최소한 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 세포-침투성 도메인을 또한 포함한다. 세포 침투성을 중재하는 CPP의 능력에 있어서 아미노산 추가(들), 결손(들), 및/또는 치환(들)의 효과는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 테스트될 수 있다.

III. 제조 방법

본 발명의 ATF5 펩티드는 예를 들어, 고형-상(phase) 펩티드 합성 또는 용액-상(phase) 펩티드 합성, 또는 이 둘 모두의 조합을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 합성은 후속적으로 화학적 또는 효소적으로 조합되는 펩티드의 단편을 만들 수 있다. 본 발명의 ATF5 폴리펩티드는 재조합적 방법을 이용하여 발현될 수 있다.

따라서, 본 발명의 ATF5 펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 또한 제공한다. 이러한 핵산은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 화학적 합성에 의해 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 목적하는 ATF5 펩티드의 아미노산 서열 및 재조합 ATF5 펩티드가 생성될 숙주 세포에서 선호되는 코돈의 선택에 기초하여 설계될 수있다. 관심대상 ATF5 펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 합성하기 위해 표준 방법이 적용될 수 있다.

일단 제조되면, 특정 ATF5 펩티드를 인코딩하는 핵산은 발현 벡터에 삽입될 수 있고, 원하는 숙주에서 펩티드의 발현에 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. ATF5 펩티드의 높은 발현 수준을 수득하기 위해, 핵산은 선택된 발현 숙주에서 기능하는 전사 및 해독 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되거나 또는 회합될 수 있다.

광범위한 발현 숙주/벡터 조합은 당업계에 공지된 임의의 사람에게 사용될 수 있다. 진핵 생물 숙주에 유용한 발현 벡터는 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 사이토메갈로 바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터는 pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체를 비롯한 대장균(E. coli) 유래의 플라스미드와 같은 공지된 박테리아 플라스미드, M13과 같은 더 넓은 숙주 범위 플라스미드 및 필라멘트성 단일-가닥 DNA 파아지를 포함한다.

적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터의 제어 하에 원핵 생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵 생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 대장균(E. coli) 또는 바실리를 포함한다. 고차원 진핵 세포 또는 포유동물 기원의 세포주가 확립될 수 있으며, 이의 예로는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 293 세포, COS-7 세포, L 세포, C127 세포, 3T3 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포 및 BHK가 포함된다. 무-세포 해독 시스템도 사용될 수 있다.

실시예

본 발명의 구체예들은 본 발명의 방법을 다음의 비-제한적인 실시예들을 참조하여 추가로 정의될 수 있다. 본 개시의 범위를 벗어나지 않으면서, 재료 및 방법 모두에 대한 많은 변형이 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 참조 펩티드 ST-3에 대한 다수의 변이체들이 하기에서 기술된 바와 같이 만들어지고, 검사되었다.

실시예 1. 시험관 활성을 갖는, 보존된 시스테인 치환을 갖는 ST-3 변이체들

세포독성 활성을 위하여 ST-3의 아미노산 위치 21에서 단일 시스테인 요구성은 HL60 세포에서 세포독성 검정을 이용하여 검사되었다. 시스테인 잔기는 고유한 ATF5 도메인 안에서 상당히 보존되며, 그리고 DNA 결합 전, ATF5의 동종이량체화를 위해 요구되는 것으로 간주된다.

HL60 PML 현탁 세포는 96개 웰 배양 접시에서 150μL의 RPMI + 1.5% 태아 소 혈청(FBS)에서 웰당 3.5 x 10³세포의 밀도로 설정되었다. 20mM His, pH 7.5에서 10mg/mL 농도에서 재구성된 ST-3은 최종 농도 범위 0-80μM가 되도록 50μL 용적으로 각 웰에 추가되었다. 세포는 ST-3와 함께 48 시간 동안 37℃에서 항온처리되었다. 세포 생존력은 Abcam Annexin V FITC 아팝토시스 탐지 키트를 이용하여 유동세포측정에 의해 정량화되었다. 간략하게 설명하자면, 세포를 PBS로 세척하고, Annexin V FITC 및 프로피디움 요오드화물 (PI)을 포함하는 1x 검정 완충액에 재현탁시켰다. Annexin V는 아팝토시스 세포를 탐지하고, 그리고 PI는 죽은 세포를 착색시킨다. 착색 후, 아팝토시스 세포는 녹색 형광을 나타내고, 죽은 세포는 적색 및 녹색 형광을 나타내고, 살아있는 세포는 형광을 나타내지 않거나, 또는 거의 나타내지 않는다. 전방 산란(FSC) 대. 측면 산란(SSC)에 근거한 분석으로 세포들이 선별되었으며, 피코에리틴 방출 신호 탐지기에 의해 FITC 신호 탐지기 및 PI 착색을 이용하여 Annexin V-FITC 결합 (Ex = 488 nm; Em = 530 nm)을 탐지하기 위하여, BD Accuri C6 Plus 유동세포측정기에 의해 분석되었다 Annexin V^낮음(low) 및 PI^낮음(low) 의 백분율을 정량화시키고, 생존능%로 나타냈다.

동결건조된 ST-3 또는 아미노산 위치 21에서 시스테인 대신 글리신 (ST-4) 또는 알라닌 (ST-5) 으로 대체된 ST-3은 5mg/mL의 원액에 히스티딘 완충액에서 새로 재구성되고, 0-40μM의 최종 농도 범위에서 세포에 추가되었다. 세포는 ATF5 펩티드와 함께 48 시간 동안 항온처리된 후, 세포 생존능에 대하여 정량화되었다. 결과는 도 2에 나타낸다.

ST-3 활성은 감쇠되었지만, 위치 21에서 시스테인이 알라닌 또는 글리신으로 치환됨으로써 제거되지는 않았다. ST-3, ST-4, 그리고 ST-5에 대한 관찰된 EC₅₀ 값은 차례로 대략적으로 16μM, 35μM, 그리고 38μM이었다. 기능적 검정에서, EC₅₀은 최대 반응의 50%로 생물학적 반응이 감소되는 농도다. ATF5 펩티드의 경우, EC₅₀은 세포 생존능이 이의 최대치에서 50% 감소된 농도로 측정된다. EC₅₀ 은 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 산출될 수 있다. 시스테인을 알라닌으로 치환하여도 세포 침투에 영향을 주지 않았다. 글리신-치환된 변이체의 침투는 시험되지 않았지만; 그러나, 알라닌 치환에 대한 데이터에 기초하여, 세포 침투는 영향을 받지 않을 것으로 예상된다.

실시예 2. 시험관 활성을 갖는, 비-보존된 시스테인 치환을 갖는 ST-3 변이체들

본 실시예에서 논의되는 ST-3 변이체들은 표 4에 요약된다. ST-3는 약 12-20μM의 EC₅₀을 갖는다.

단일 치환

실시예 1에서 기술된 HL60 세포 생존능을 이용하여, 우리는 단일 비-보존적 아미노산 치환을 함유하는 ST-3 변이체들의 세포독성 활성을 검사하였다 (도 3). 변이체 ST-7의 위치 28에서 극성 아스파라진이 비-극성 류신으로의 치환을 갖고, 이의 EC₅₀은 대략적으로 3μM이다. 변이체 ST-8의 위치 22에서 극성 글루타민이 비-극성 알라닌으로의 치환을 갖고, 이의 EC₅₀은 대략적으로 5μM이다. ST-7 및 ST-8의 활성 증가는 ST-3보다 3-6배 더 크다. ST-6은 위치 37에서 세린이 알라닌으로 보존 치환되었으며, 이는 ST-3의 활성에 필적하는 활성을 갖는다.

다중 치환

실시예 1에서 기술된 HL60 세포 생존능을 이용하여, 우리는 다중 비-보존적 아미노산 치환을 함유하는 ST-3 변이체들의 세포독성 활성을 검사하였다. 변이체 ST-9는 양으로 하전된 아르기닌으로 각각 대체된 2개의 음으로 하전된 글루탐산 잔기, 그리고 음으로 하전된 글루탐산으로 각각 대체된 양으로 하전된 아르기닌 및 양으로 하전된 리신을 갖는다. (표 4 참고) 이러한 변화는 ST-3의 ATF5 류신 지퍼 영역의 약 18%가 연루되었다. ST-9의 활성은 ST-3의 활성보다 현저히 증가했다(도 4). ST-9의 EC₅₀는 대략적으로 2μM인데, 이는 ST-3의 약 12-20μM과 비교되었다.

ST-10은 ST-9와 동일한 4개의 "전하(charge)" 치환을 갖고, ST-7과 같이 위치 28에서 아스파라진(극성)이 류신 (비-극성)으로 치환되는 비-보존적 치환과, ST-6과 같이 세린이 알라닌으로 치환된 보존적 치환을 함께 갖는다. (표 4 참고) ST-10의 활성은 ST-9의 활성에 필적한다 (도 4).

ST-11은 ST-10과 동일한 치환과 함께, ST-5와 같이 위치 21에서 보존된 시스테인에 대하여 알라닌 치환을 추가로 갖는다. (표 4 참고) ST-11은 ST-3보다 휠씬 개선된 세포독성 활성을 갖는다 (도 4).

실시예 3. 레트로 인버소 ST-3 변이체들은 시험관 활성을 갖는다

실시예 1에서 기술된 HL60 세포 생존능 검정에서 ST-11의 레트로 인버소 형태에 대한 세포독성을 우리는 검사하였다. 상기 레트로 인버소 변이체, ST-13은 ST-11에 필적하는 활성, 그리고 ST-3보다는 우수한 활성을 가졌다 (도 5).

ST-13은 제2의 레트로 인버소 변이체, ST-14와 같이, 다양한 인간 암 세포주에서 추가 검사하였다. 현택 세포(HL60, AML14, 또는 SET2)는 조직 배양-처리된 96개 웰 배양 접시에서 150μL의 RPMI + 1.5% 태아 소 혈청(FBS)에서 웰당 3.5 x 10³ 세포의 밀도로 설정되었다. 20mM His, pH 7.5에서 10mg/mL 농도에서 재구성된 ATF5 펩티드는 최종 농도 범위 0-80μM가 되도록 50μL 용적으로 각 웰에 추가되었다. 세포는 펩티드와 함께 48 시간 동안 37℃에서 항온처리되었다. 세포 생존력은 Abcam Annexin V FITC 아팝토시스 탐지 키트를 이용하여 유동세포측정에 의해 정량화되었다. 간략하게 설명하자면, 세포를 PBS로 세척하고, Annexin V FITC 및 프로피디움 요오드화물 (PI)을 포함하는 1x 검정 완충액에 재현탁시켰다. Annexin V-FITC 결합 (Ex = 488 nm; Em = 530 nm)을 탐지하기 위하여 FITC 신호 탐지기를 이용하고, PI 착색을 탐지하기 위하여 피코에리틴 방출 신호 탐지기를 이용하여, BD Accuri C6 Plus 유동세포측정기에 의해 세포들이 분석되었다 Annexin V^낮음(low) 및 PI^낮음(low) 의 백분율을 정량화시키고, 생존능%로 나타냈다. EC₅₀ 값은 GraphPad Prism v.7 XML을 이용하여 산출되었다.

추가적으로, 흡착성 A375, MCF7, U251, DU145, U87, 그리고 A549 세포는 -1일차에 200μL의 배지에서 웰당 3.5 x 10³ 세포의 밀도로 설정되었다. 0일 차에, 배지를 제거하였고, 150μL의 새로운 배지로 보충되었으며, 세포는 기술된 바와 같이, ATF5 펩티드로 처리되었다. 37℃에서 48-시간 항온 처리후, 부유(floating) 세포를 수집하고, 흡착성 세포는 Dulbecco의 인산염 완충된 염수(DPBS)로 세척하였고, RT에서 50μL 2.5% 트립신을 이용하여 배양접시로부터 떼어내고, 그리고 부유 세포와 복합시켰다. 세포 생존능은 현탁 세포에 대하여 상기에서 설명된 바와 같이, 또는 MTT 검정(MCF7 세포)에 의해 결정되었다. 대안으로, 세포는 2.5% 트립신으로 트립신처리 후, 세포 배양 플레이트로부터 부드럽게 제거되었으며, 그리고 세포 생존능은 상기에서 기술된 바와 같이, Abcam Annexin V FITC 아팝토시스 탐지 키트를 이용하여 유동 세포측정에 의해 정량화되었다.

PBMC 및 BMMC는 현탁 세포에 대하여 상기에서 기술된 조건하에서 배양되었다.

ST-13 (도 6a-6e) 및 ST-14 (도 7a-7e; 표 5)는 광범위한 유형의 종양 세포에서 유의적인 세포독성 활성을 나타내었고; ST-14는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 골수 단핵 세포(BMMC)에서 또한 세포독성이었다 (표 5).

우리는 ATF5 및 아팝토시스 조절 단백질, Mcl-1, Bcl-2, 그리고 Survivin의 RNA 발현을 ST-14로 처리 후, HL60 세포에서 β-액틴 발현과 비교하여 측정하였다. 간략하게 설명하자면, 8 x 10⁵ HL60 현탁 세포는 6-웰 플레이트에 도말하고, 0μM, 5μM, 20μM, 또는 40μM ST101으로 4 시간 또는 24 시간 동안 처리하였다. 세포는 1,200 rpm에서 7.5분간 원심분리시키고, 펠렛은 750μl DNAse-RNAse-없는 H₂O로 세척하여 잔류 배지를 제거하였다. RNA는 Quick-RNA™ MiniPrep Plus 키트 (Zymo Research Cat. #R1054)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 추출되었고, 55μl H₂O으로 용리되었다. RNA (200 ng)는 Invitrogen 사전-주조(pre-cast) 2% SYBR™ Gold E-Gel (Thermo Fisher Scientific Cat. #G401002)에서 실행시켜 RNA 질을 평가하였다. cDNA는 Invitrogen SuperScript™ IV VILO Master Mix 및 ezDNAse™ Enzyme (Thermo Fisher Scientific Cat. #11766050)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 더하여, 다음과 같이 수정하여 합성되었다: cDNA은 50℃가 아닌 56℃에서 연장되었다. Minus RT 대조군은 gDNA 오염을 배제하기 위하여 설정되었다. cDNA는 유전자-특이적 프라이머 (표 6) 및 KOD Xtreme™ Hot Start DNA 중합효소 (Millipore Sigma Cat. #71975-3)를 이용하여 증폭되었다. 동량의 RNA가 각 반응에 추가되었다. 모든 PCR 산물은 Invitrogen 사전-주조 2% 에티디움 브롬화물E-Gel (Thermo Fisher Scientific)에서 실행되었다. 유전자 발현은 BioRad ImageLab 소프트웨어를 이용하여 β-액틴에 비교하였다.

ST-14 노출은 β-액틴 발현에 비교하여 Mcl-1, Bcl2, 그리고 BIRC5 (Survivin)의 발현을 감소시켰다 (도 8a-8d).

실시예 4. ST-3 변이체들은 생체내 활성을 갖는다

우리는 HL60 피하 종양 모델에서 종양 용적에 대한 ST-3 및 3가지 변이체들의 효과를 검사하였다. 간략하게 설명하자면, 5 x 10⁶ HL60 세포를 Matrigel에 1:1로 현탁시키고, NU/J 마우스의 겨드랑이로 피하 주사를 통하여 삽입하였다. 투여는 종양 접종 후 2일차에 시작되었고, 이때 종양 평균 용적 범위는 144-176mM³이었다. ATF5 펩티드는 25mg/kg의 투여량으로 하루에 2회 복강(IP) 주사를 통하여 투여하였다. 모든 테스트된 변이체들은 비히클과 비교하여 종양 용적을 감소시켰으며, 상기 레트로 인버소 변이체, ST-13은 최대 항-종양 활성을 보여주었다 (도 9).

우리는 U251 교아세포종 세포, MCF7 유방암 세포, HL60 전골수성 백혈병 세포, 그리고 A375 흑색종 세포를 이용한 종양 모델에서 종양 용적에서 ST-14의 효과를 검사하였다. 간략하게 설명하자면, 5 x 10⁶ HL60 세포를 Matrigel에 1:1로 현탁시키고, NU/J 마우스(MCF7 및 HL60 세포의 경우) 또는 NOD/SCID 마우스(U251 및 A375 세포의 경우)의 겨드랑이로 피하 주사를 통하여 삽입하였다.

U251 세포 종양의 경우, 투여는 종양 접종 후 2일차에 시작되었고, 종양 평균 용적 범위는 약 240mM³이었다. ST-14는 50mg/kg의 투여량으로 3주 동안 주당 3회 피하 (SC) 주사를 통하여 투여되었다. ST-14는 비히클과 비교하여 종양 용적을 유의적으로 감소시켰고 (도 10a, 10c), 생존을 증가시켰다 (도 10b-10c). 25mg/kg ST-14의 투여에서도 유사한 결과를 얻었다.

MCF7 세포 종양의 경우, 우리는 즉각적인 투여와 지연 투여의 영향을 검사하였다. 즉각적인 투여 실험에서, 투여는 종양 접종(2 x 10⁶ 세포) 후 2일차에 시작되었고, 종양 평균 용적 범위는 약 280-330mM³이었다. ST-14는 25mg/kg의 투여량으로 3주 동안 주당 3회 SC 주사를 통하여 투여되었다. 지연 투여 실험에서, 투여는 종양 접종 후 59일차에 시작되었다(비히클: 2 x 10⁶ 세포; 처리군: 5 x 10⁶ 세포). 종양 용적은 접종-후 92일 동안 모니터되었다. 즉각 처리군과 지연 처리군 모두에서, ST-14는 모니터링하는 동안 비히클과 비교하여 종양 용적을 상당히 감소시켰다 (도 11a-11b).

HL60 세포 종양의 경우, 투여는 종양 접종 후 2일차에 시작되었고, 종양 평균 용적 범위는 약 220mM³이었다. ST-14는 20mg/kg의 투여량으로 3주 동안 주당 3회 SC 주사를 통하여 투여되었다. ST-14는 비히클과 비교하여 종양 용적을 유의적으로 감소시켰다 (도 12).

A375 세포 종양의 경우, 투여는 종양 접종 후 2일차에 시작되었고, 종양 평균 용적 범위는 약 250-344mM³이었다. ST-14는 25mg/kg의 투여량으로 3주 동안 매일 2회 SC 주사를 통하여 투여되었다. ST-14는 비히클과 비교하여 종양 용적을 유의적으로 감소시켰다 (도 13).

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본 발명은 다음의 청구 범위에 의해 추가로 설명된다.

<110> SAPIENCE THERAPEUTICS, INC. <120> ATF5 PEPTIDE VARIANTS AND USES THEREOF <130> SAPIENCE.003.WO1 <140> <141> <150> 62/613,083 <151> 2018-01-03 <160> 87 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Leu Glu Gln Arg Ala Glu Glu Leu Ala Arg Glu Asn Glu Glu Leu Leu 1 5 10 15 Glu Lys Glu Ala Glu Glu Leu Glu Gln Glu Asn Ala Glu Leu Glu Gly 20 25 30 Glu Cys Gln Gly Leu Glu Ala Arg Asn Arg Glu Leu Arg Glu Arg Ala 35 40 45 Glu Ser Val Glu Arg Glu Ile Gln Tyr Val Lys Asp Leu Leu Ile Glu 50 55 60 Val Tyr Lys Ala Arg Ser Gln Arg Thr Arg Ser Ala 65 70 75 <210> 2 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Leu Glu Gln Arg Ala Glu Glu Leu Ala Arg Glu Asn Glu Glu Leu Leu 20 25 30 Glu Lys Glu Ala Glu Glu Leu Glu Gln Glu Asn Ala Glu Leu 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Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Ser Lys Lys Lys Lys Thr Lys Val 1 5 <210> 46 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 47 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ala Lys Lys Ile Leu 20 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Pro Leu Ile Tyr Leu Arg Leu Leu Arg Gly Gln Phe 1 5 10 <210> 49 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 49 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Gln Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Gln <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(16) <223> D-amino acid <400> 50 Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Ile Lys Ile Gln Arg 1 5 10 15 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(16) <223> D-amino acid <400> 51 Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Leu Lys Leu Gln Arg 1 5 10 15 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(7) <223> Any amino acid <400> 52 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 53 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Glu or any positively charged amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Cys or any non-polar amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gln or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Glu or any positively charged amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Arg or any negatively charged amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Asn or any non-polar amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Lys or any negatively charged amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ser or Ala <400> 53 Leu Glu Gly Xaa Xaa Xaa Gly Leu Xaa Ala Xaa Xaa Arg Glu Leu Xaa 1 5 10 15 Glu Arg Ala Glu Xaa Val 20 <210> 54 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Leu Glu Gly Glu Gly Gln Gly Leu Glu Ala Arg Asn Arg Glu Leu Lys 1 5 10 15 Glu Arg Ala Glu Ser Val 20 <210> 55 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Leu Glu Gly Glu Ala Gln Gly Leu Glu Ala Arg Asn Arg Glu Leu Lys 1 5 10 15 Glu Arg Ala Glu Ser Val 20 <210> 56 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Leu Glu Gly Glu Cys Gln Gly Leu Glu Ala Arg Asn Arg Glu Leu Lys 1 5 10 15 Glu Arg Ala Glu Ala Val 20 <210> 57 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Leu Glu Gly Glu Cys Gln Gly Leu Glu Ala Arg Leu Arg Glu Leu Lys 1 5 10 15 Glu Arg Ala Glu Ser Val 20 <210> 58 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Leu Glu Gly Glu Cys Ala Gly Leu Glu Ala Arg Asn Arg Glu Leu Lys 1 5 10 15 Glu Arg Ala Glu Ser Val 20 <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Leu Glu Gly Arg Cys Gln Gly Leu Arg Ala Glu Asn Arg Glu Leu Glu 1 5 10 15 Glu Arg Ala Glu Ser Val 20 <210> 60 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Leu Glu Gly Arg Cys Gln Gly Leu Arg Ala Glu Leu Arg Glu Leu Glu 1 5 10 15 Glu Arg Ala Glu Ala Val 20 <210> 61 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Leu Glu Gly Arg Ala Gln Gly Leu Arg Ala Glu Leu Arg Glu Leu Glu 1 5 10 15 Glu Arg Ala Glu Ala Val 20 <210> 62 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Leu Glu Gly Arg Leu Gln Gly Leu Arg Ala Glu Leu Arg Glu Leu Glu 1 5 10 15 Glu Arg Ala Glu Ala Val 20 <210> 63 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Leu Glu Gly Arg Leu Ala Gly Leu Arg Ala Glu Leu Arg Glu Leu Glu 1 5 10 15 Glu Arg Ala Glu Ala Val 20 <210> 64 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Leu Glu Gly Arg Ala Ala Gly Leu Arg Ala Glu Leu Arg Glu Leu Glu 1 5 10 15 Glu Arg Ala Glu Ala Val 20 <210> 65 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(22) <223> D-amino acid <400> 65 Val Ala Glu Ala Arg Glu Glu Leu Glu Arg Leu Glu Ala Arg Leu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Arg Gly Glu Leu 20 <210> 66 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Lys or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Lys or Arg <400> 66 Lys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 67 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(2) <223> Lys or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(14) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(14) <223> This region may encompass 10-12 residues <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(19) <223> Lys or Arg <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 67 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Val Pro Thr Leu Lys 1 5 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Lys Leu Pro Val Met 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 73 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Gly Arg Gly Asp Asn Pro 1 5 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 74 atggatgatg atatcgccgc gc 22 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 75 gaagcatttg cggtggacga tg 22 <210> 76 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 76 atggcgcacg ctggg 15 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 77 cttgtggccc agataggcac c 21 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 78 gcccagactc acatcaccaa gtg 23 <210> 79 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 79 atgtttggcc tcaaaagaaa cgcgg 25 <210> 80 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 80 tcttattaga tatgccaaac cagctcctac tcc 33 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 81 atgtcactcc tggcgaccct 20 <210> 82 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 gcagctacgg gtcctctgg 19 <210> 83 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 atgcacctgc agcccg 16 <210> 84 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 cgcgcagttg cccatgg 17 <210> 85 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 atgggtgccc cgacgttg 18 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 tcaatccatg gcagccagct g 21 <210> 87 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> This sequence may encompass 7-12 residues <400> 87 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10

Claims

한 측면에서, 본 발명은 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역을 포함하는 ATF5 펩티드에 있어서, 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역은 아미노산 서열 LEGECQGLEARNRELKERAESV (서열 번호: 53)의 변이체를 포함하고, 변이체는 다음과 같이 서열 번호: 53의 하나 또는 그 이상의 위치에서 변형되는, 펩티드:
i. E4는 양전하 잔기로 치환되며;
ii. C5는 비-극성 잔기로 치환되며;
iii. Q6은 알라닌으로 치환되며;
iv. E9는 양전하 잔기로 치환되며;
v. R11은 음전하 잔기로 치환되며;
vi. N12는 비-극성 잔기로 치환되며;
vii. K16은 음전하 잔기로 치환되며;
viii. S21은 알라닌으로 치환된다.
절두된 ATF5 류신 지퍼 영역을 포함하는 ATF5 펩티드에 있어서, 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역은 다음으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 펩티드: LEGEGQGLEARNRELKERAESV (서열 번호: 54), LEGEAQGLEARNRELKERAESV (서열 번호: 55), LEGECQGLEARNRELKERAEAV (서열 번호: 56), LEGECQGLEARLRELKERAESV (서열 번호: 57), LEGECAGLEARNRELKERAESV (서열 번호: 58), LEGRCQGLRAENRELEERAESV (서열 번호: 59), LEGRCQGLRAELRELEERAEAV (서열 번호: 60), 그리고 LEGRAQGLRAELRELEERAEAV (서열 번호: 61).
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 세포-침투성 영역을 더 포함하며, ATF5 펩티드는 세포-침투성 ATF5 펩티드인, ATF5 펩티드.
청구항 3에 있어서, 세포-침투성 영역은 다음으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는, 세포-침투성 ATF5 펩티드: RQIKIWFQNRRMKWKK (서열 번호: 25), RQLKLWFQNRRMKWKK (서열 번호: 26), YGRKKRRQRRR (서열 번호: 40), 그리고 YGRKKRRQRR (서열 번호: 41).
아미노산 서열 RQIKIWFQNRRMKWKKLEGECQGLEARNRELKERAESV (서열 번호: 3)의 변이체를 포함하는 세포-침투성 ATF5 펩티드에 있어서, 변이체는 서열 번호: 3에서 다음으로 구성된 군에서 선택된 위치에 변형된, 펩티드:
i. C21G (서열 번호: 4);
ii. C21A (서열 번호: 5);
iii. Q22A (서열 번호: 8);
iv. E20R, E25R, R27E, 그리고 K32E (서열 번호: 9);
v. N28L (서열 번호: 7);
vi. S37A (서열 번호: 6);
vii. E20R, E25R, R27E, N28L, K32E, 그리고 S37A (서열 번호: 10); 그리고
viii. E20R, C21A, E25R, R27E, N28L, K32E, 그리고 S37A (서열 번호: 11).
절두된 ATF5 류신 지퍼 영역을 포함하고, 이 펩티드는 임의의 전술한 청구항의 아미노산 서열과 비교하여 역전된 아미노산 서열에서 D-아미노산을 포함하는, ATF5 펩티드.
청구항 6에 있어서, 절두된 ATF5 류신 지퍼 영역은 D-아미노산 서열 VAEAREELERLEARLGQARGEL (서열 번호: 65)을 갖는 ATF5 펩티드.
청구항 7에 있어서, D-아미노산 서열 VAEAREELERLEARLGQARGELKKWKMRRNQFWLKLQR (서열 번호: 14)을 포함하며, ATF5 펩티드는 세포-침투성 펩티드인, ATF5 펩티드.
임의의 전술한 항에 있어서, 펩티드는 연장된 류신 지퍼 영역을 포함하지 않은, ATF5 펩티드.
임의의 전술한 항에 있어서, 펩티드는 N-말단 아세틸기 및/또는 C-말단 아미드기를 포함하는, ATF5 펩티드.
임의의 전술한 항에 따른 ATF5 펩티드를 포함하는 조성물.
청구항 11에 있어서, 약제학적 조성물인 조성물.
청구항 1 내지 10중 임의의 한 항에 따른 ATF5 펩티드를 포함하는 키트.
청구항 1 내지 10중 임의의 한 항에 따른 ATF5 펩티드를 포함하는 핵산 분자.
신생종양 세포에서 세포독성을 촉진시키는 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 1 내지 10중 임의의 한 항에 따른 ATF5 펩티드를 당해 신생종양 세포에 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
신생종양 세포의 증식을 저해시키는 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 1 내지 10중 임의의 한 항에 따른 ATF5 펩티드를 당해 신생종양 세포에 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
신생종양 세포에서 세포독성을 촉진시키는 용도의 청구항 1 내지 10중 임의의 한 항에 따른 ATF5 펩티드.
신생종양 세포의 증식을 저해시키는 용도의 청구항 1 내지 10중 임의의 한 항에 따른 ATF5 펩티드.