ES2965207T3

ES2965207T3 - Anticuerpos frente a CSF-1R

Info

Publication number: ES2965207T3
Application number: ES19171833T
Authority: ES
Inventors: Graham Craggs; Karine Jeannine Madeleine Herve; Diane Marshall
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2014-08-26
Publication date: 2024-04-11
Anticipated expiration: 2034-08-26
Also published as: JP7195237B2; MX2016002166A; PE20160528A1; PT3549599T; PL3038643T3; ES2733735T3; PT3038643T; JP2016529266A; LT3038643T; PE20201067A1; AU2014314304B2; NZ717399A; TN2016000067A1; GB201315487D0; HUE064437T2; IL244043A0; SMT201900471T1; EA201690503A1; ZA201601437B; PH12016500275B1

Abstract

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-CSF-lR y a sus fragmentos de unión, al ADN que codifica el mismo, a las células huésped que comprenden dicho ADN y a métodos para expresar el anticuerpo o el fragmento de unión en una célula huésped. La presente invención también se extiende a composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo o un fragmento de unión del mismo y el uso del anticuerpo, el fragmento de unión y composiciones que los comprenden en el tratamiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos frente a CSF-1R

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-CSF-IR y a fragmentos de unión del mismo, al ADN que codifica el mismo, a células hospedadoras que comprenden dicho ADN y a métodos para expresar el anticuerpo o el fragmento de unión en una célula hospedadora. La invención también se extiende a composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo o un fragmento de unión del mismo y al uso del anticuerpo, fragmento de unión y composiciones que los comprenden en tratamiento.

El factor estimulante de colonias 1 (CSF-1), también conocido como factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), es una citocina producida por una variedad de células, incluidos macrófagos, células endoteliales y fibroblastos. El CSF-1 está compuesto por dos polipéptidos "monómeros", que forman una proteína CSF-1 dimérica biológicamente activa. El CSF-1 existe en al menos tres formas maduras debido al corte y empalme alternativo de ARN (véase Cerretti et al., 1988, Molecular Immunology, 25:761). Las tres formas de CSF-1 se traducen a partir de diferentes precursores de ARNm, que codifican monómeros polipeptídicos de 256 a 554 aminoácidos, que tienen una secuencia señal de 32 aminoácidos en el extremo amino y una supuesta región transmembrana de aproximadamente 23 aminoácidos cerca del extremo carboxilo. Los péptidos precursores se procesan posteriormente mediante escisiones proteolíticas aminoterminales y carboxiloterminales para liberar CSF-1 maduro. Los residuos 1-149 de las tres formas maduras de CSF-1 son idénticos y se cree que contienen secuencias esenciales para la actividad biológica de CSF-1.In vivo,los monómeros de CSF-1 se glicosilan y dimerizan mediante grupos de enlace disulfuro. El CSF-1 pertenece a un grupo de agonistas biológicos que promueven la producción de células sanguíneas. En concreto, actúa como factor de crecimiento y diferenciación de las células progenitoras de la médula ósea del linaje de fagocitos mononucleares. Además, el CSF-1 estimula la supervivencia, proliferación y función de los macrófagos a través de un receptor específico en las células que responden.

El receptor de CSF-1 (CSF-1R) también se conoce como producto del gen c-fms o CD115. El CSF-1R es una glicoproteína TM tipo 1 de 165 kDa que pertenece a la familia de receptores tirosina cinasa de tipo III. Además de CSF-1, también se ha demostrado que la molécula IL-34 estructuralmente similar pero sin relación de secuencia es un ligando para CSF-1R (Lin, et al., 2008, Science 320:807-811). La expresión de CSF-1R está restringida a células del linaje monocito-macrófago, poblaciones de tejido tanto circulantes como residentes, y osteoclastos. Además, se expresa en una serie de células del sistema reproductor femenino, incluidos los ovocitos, las células deciduales y los trofoblastos.

La unión del ligando CSF-1 al receptor de CSF-1 da como resultado la fosforilación del receptor en uno o más residuos de tirosina, mediante la acción del dominio tirosina cinasa. Esta fosforilación se puede detectar porque hay anticuerpos disponibles que se unen al receptor solo después de la fosforilación (por ejemplo, anticuerpo n.° 3083 del receptor fosfo-M-CSF (Tyr546) de Cell Signaling Technology).

La expresión de CSF-1 y CSF-1R se correlaciona con la progresión tumoral y un mal diagnóstico en muchos tipos de cáncer. Los macrófagos asociados a tumores (TAM) pueden ser el componente principal del estroma tumoral y los niveles altos de CSF-1 y CSF-1 R se asocian con infiltraciones altas de TAM y mal pronóstico en una serie de tipos de tumores.

Los anticuerpos frente a CSF-1R se conocen en la técnica. Sherr, CJ et al., 1989, Blood 73:1786-1793 describe anticuerpos frente a CSF-1R que inhiben la actividad de CSF-1 (Sherr, CJ et al., 1989, Blood 73:1786-1793). El documento WO2009/026303 divulga anticuerpos anti-CSF-1R que se unen a CSF-1R humano y modelosin vivode tumores de ratón que usan un anticuerpo anti-CSF-1 R de múrido. El documento WO2011/123381 divulga anticuerpos anti-CSF-1R que internalizan CSF-1R y tienen actividad ADCC. El documento WO2011/123381 también divulga modelosin vivode tumores de ratón que usan un anticuerpo anti-CSF-1R de múrido. El documento WO2011/140249 divulga anticuerpos anti-CSF-1 R que bloquean la unión de CSF-1 a CSF-1 R y se afirma que son útiles en el tratamiento del cáncer. El documento WO2009/112245 divulga un anticuerpo IgG1 anti-CSF-1R que inhibe la unión de CSF-1 a CSF-1 R y se afirma que es útil en el tratamiento del cáncer, la enfermedad inflamatoria intestinal y la artritis reumatoide. El documento WO2011/131407 divulga un anticuerpo anti-CSF-1R que inhibe la unión de CSF-1 a CSF-1R y se afirma que es útil en el tratamiento de la pérdida ósea y el cáncer. El documento WO2011/107553 divulga un anticuerpo anti-CSF-1 R que inhibe la unión de CSF-1 a CSF-1R que se cree que es útil en el tratamiento de la pérdida ósea y el cáncer. El documento WO2011/070024 divulga anticuerpos anti-CSF-1 R que se unen al fragmento delD4 de CSF-1 R humano. El documento WO2012/110360 divulga un anticuerpo monoclonal que se une al dominio similar a inmunoglobulina N-terminal del CSF1R humano. El documento WO2009/026303 divulga anticuerpos de múridos generados frente al dominio extracelular de CSF1R humano.

Existe la necesidad en la materia de proporcionar nuevos anticuerpos anti-CSF-1R adecuados para aplicaciones terapéuticas. Si bien se ha descrito previamente la aplicación terapéutica de los anticuerpos anti-CSF-1R en el tratamiento de ciertos cánceres, todavía existe la necesidad de proporcionar nuevas aplicaciones terapéuticas para tales anticuerpos.

El término "enfermedad fibrótica" se refiere a una respuesta aberrante de curación de heridas en donde se forma un exceso de tejido conectivo fibroso en un órgano o tejido. La deposición y acumulación de componentes de matriz extracelular excesivos, tales como el colágeno y la fibronectrina, dan como resultado el endurecimiento y la cicatrización de los tejidos que, en última instancia, pueden conducir a insuficiencia orgánica.

Los ejemplos de enfermedades fibróticas incluyen fibrosis pulmonar, tal como fibrosis pulmonar idiopática y fibrosis quística, fibrosis renal, fibrosis hepática, cirrosis hepática, colangitis esclerosante primaria, cirrosis biliar primaria, fibrosis endomiocárdica, fibrosis mediastínica, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal, fibrosis masiva progresiva, fibrosis sistémica nefrogénica, enfermedad de Crohn, queloides, infarto de miocardio, esclerosis sistémica, esclerodermia y artrofibrosis.

Una herida da como resultado una coagulación inmediata y una respuesta de coagulación con el desarrollo de una matriz extracelular (MEC) provisional. La agregación y activación plaquetaria ayuda a promover una respuesta inflamatoria caracterizada por vasodilatación y un aumento en la permeabilidad de los vasos sanguíneos, lo que permite el reclutamiento de una variedad de células inmunes, incluidos neutrófilos, macrófagos, eosinófilos y linfocitos. Los neutrófilos y macrófagos desbridan la herida, reduciendo así el riesgo de infección y, junto con los linfocitos activados, secretan una variedad de factores de crecimiento y citocinas que sirven para amplificar aún más la respuesta inflamatoria. Moléculas tales como TGFp, PDGF e IL-13 activan los macrófagos y conducen al reclutamiento, proliferación y activación de fibroblastos en el sitio de la herida. Los fibroblastos o miofibroblastos activados se caracterizan por la expresión de a-actina del músculo liso y secretan colágeno y otros componentes de la MEC. Los fibroblastos activados contraen la red de colágeno, arrastrando los bordes de la herida hacia el centro. Las células epiteliales y endoteliales proliferan y migran sobre la matriz temporal para regenerar el tejido dañado y completar la reparación de la herida.

Un ataque o lesión tisular persistente o una desregulación de la ruta de reparación conducen a una respuesta inapropiada a la herida. Aparece un depósito excesivo y una hiperreticulación del colágeno y la ECM, lo que da como resultado una formación excesiva y un endurecimiento del tejido cicatricial en lugar de la arquitectura tisular normal.

La causa de la enfermedad fibrótica puede depender del órgano o tejido afectado y se desconoce en algunas enfermedades tales como la fibrosis pulmonar idiopática (FPI). La fibrosis hepática y, en última instancia, la cirrosis son el resultado del daño hepático crónico sostenido por la exposición a una variedad de factores, incluidos factores ambientales y dietéticos o agentes infecciosos. Las infecciones prolongadas por hepatitis B y C pueden causar fibrosis hepática. El consumo excesivo sostenido de alcohol o una dieta alta en grasas o azúcares también puede conducir a cirrosis hepática. De manera similar, la diabetes puede dañar y cicatrizar los riñones, conduciendo a la pérdida de su función.

La FPI es una de las siete enfermedades pulmonares intersticiales cuya causa se desconoce. Los factores ambientales tales como la exposición a la radiación o las partículas pueden desempeñar un papel. Las personas que fuman también tienen un mayor riesgo de padecer esta enfermedad. Una vez diagnosticados, la esperanza de vida de los pacientes es muy corta y la tasa de supervivencia promedio es de 2-5 años.

El tratamiento de la enfermedad fibrótica suele incluir agentes antiinflamatorios e inmunosupresores, pero estos son de poco beneficio para el paciente. La falta de eficacia de estos tratamientos contribuyó a la reconsideración de la FPI, y la enfermedad fibrótica en general, como una respuesta aberrante a la cicatrización de las heridas y no como una afección inflamatoria. La pirfenidona es un fármaco de molécula pequeña que fue aprobado para su uso en el tratamiento de la FPI en Japón en 2008 y en Europa en 2011, y que probablemente funcione a través de múltiples mecanismos de acción. Hasta la fecha, no se han aprobado terapias dirigidas ni terapias con anticuerpos para indicaciones fibróticas.

Por lo tanto, actualmente existe una necesidad médica no cubierta de mejorar el tratamiento de la enfermedad fibrótica. Por ejemplo, para la FPI hay una tasa de supervivencia a 3 años del 50 % y una tasa de supervivencia a 5 años de sólo el 20 % y se requiere trasplante en aproximadamente el 20 % de los casos.

Sumario de la divulgación

En esta divulgación se proporciona un anticuerpo anti-CSF-IR o un fragmento de unión del mismo que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una de una c Dr que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO:4 para CDR- H1, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID<n>O:5 para CDR-H2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO:6 para CDR-H3, por ejemplo en donde la CDR-H1 es de SEQ ID NO:4, la CDR-H2 es de SEQ ID NO: 5 y la CDR-H3 es de SEQ ID NO: 6.

Los anticuerpos o fragmentos de unión según la presente divulgación comprenden una cadena ligera en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO:1 para CDR-L1, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID<n>O:2 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID No :3 para CDR-L3, por ejemplo en donde la Cd R-LI es de SEQ ID NO: 1, la CDR-L2 es de SEQ ID NO: 2 y la CDR-L3 es de SEQ ID NO: 3.

Los anticuerpos de la divulgación tienen una alta afinidad por CSF-1R, son capaces de bloquear la unión del ligando a CSF-1R, no activan CSF-1R y no causan la internalización de CSF-1R.

La divulgación también se extiende a un polinucleótido, tal como ADN, que codifica un anticuerpo o fragmento como se describe en el presente documento.

También se proporciona una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido.

En el presente documento se proporcionan métodos para expresar un anticuerpo o fragmento de unión del mismo.

La presente divulgación también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos.

En una realización, se proporciona un método de tratamiento que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, fragmento o composición como se describe en el presente documento.

La presente divulgación también se extiende a un anticuerpo, fragmento de unión o composición según la presente divulgación para uso en el tratamiento, particularmente en el tratamiento del cáncer y/o enfermedad fibrótica.

Detalles de la divulgación

Los anticuerpos proporcionados en el presente documento son capaces de bloquear la unión de ligando a CSF-1 R. El bloqueo, tal como se emplea en el presente documento, se refiere al bloqueo físico, tal como oclusión del receptor, pero también incluirá cuando el anticuerpo o los fragmentos se unen a un epítopo que causa, por ejemplo, un cambio conformacional que significa que el ligando natural al receptor ya no se une (denominado en el presente documento bloqueo alostérico o inhibición alostérica). En un ejemplo, los anticuerpos de la presente divulgación se unen a todos los isotipos de CSF-1R, por ejemplo aquellos con variaciones en el dominio ECD, tales como V23G, A245S, H247P, V279M y combinaciones de dos, tres o cuatro de dichas variaciones.

En los Ejemplos del presente documento se describen ensayos adecuados para determinar la capacidad de un anticuerpo para bloquear CSF-1 R. CSF-1 e IL-34 son ambos ligandos para CSF-1 R y los anticuerpos de la invención preferiblemente inhiben la actividad tanto de CSF-1 como de IL-34 en un cribado celular funcional. Preferiblemente, los anticuerpos tampoco causan la activación de CSF-1R y/o la internalización de CSF-1R. Los anticuerpos según la presente invención también preferiblemente agotan selectivamente la población no clásica de monocitosin vivo.

Los monocitos no clásicos generalmente se refieren a monocitos con baja expresión de CD14 y alta expresión de CD 16. Se cree que esta población de monocitos son precursores de macrófagos asociados a tumores.

Las moléculas de anticuerpo adecuadamente tienen una alta afinidad de unión. La afinidad se puede medir usando cualquier método adecuado conocido en la materia, incluidas técnicas tales como resonancia de plasmón superficial, por ejemplo BIAcore, como se describe en los Ejemplos en el presente documento, usando CSF-1R natural o recombinante aislado o una proteína/polipéptido de fusión adecuado. En un ejemplo, la afinidad se mide usando el dominio extracelular de CSF-1R humano recombinante como se describe en los Ejemplos del presente documento. En un ejemplo, el dominio extracelular de CSF-1R humano recombinante usado es un monómero. Adecuadamente, las moléculas de anticuerpo de la presente invención tienen una afinidad de unión por CSF-1R humano aislado de aproximadamente 1 nM o menos de 1 nM. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 500 pM o menor. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 250 pM o menor. En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 200 pM o menor. En un ejemplo, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R con una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o menor. En un ejemplo, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R humanizado con una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o menor, preferiblemente aproximadamente 10 pM o menor, más preferiblemente aproximadamente 5 pM o menor. En otro ejemplo, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R humanizado con una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o menor, preferiblemente aproximadamente 10 pM o menor, más preferiblemente aproximadamente 5 pM o menor.

Cuanto menor sea el valor numérico de la afinidad, mayor será la afinidad del anticuerpo o fragmento por el antígeno.

El CSF-1R humano como se emplea en el presente documento se refiere al nombre de proteína humana CSF-1R o un fragmento biológicamente activo de la misma, por ejemplo como se da en la SEQ ID NO: 39 o se registra en UniProt con el número P07333. Por supuesto, la proteína madura expresada no comprende la secuencia señal porque esta última se escinde postraducción.

Los presentes inventores han proporcionado nuevos anticuerpos anti-CSF-1R, incluidos anticuerpos humanizados. Los anticuerpos se generaron a partir de la inmunización de ratas con fibroblastos de rata que se transfectaron con un vector que expresaba el dominio extracelular de CSF-1 R. El cribado primario de sobrenadantes de unión de anticuerpo al CSF-1R humano identificó aproximadamente 1.000 pocillos que contenían anticuerpos con actividad anti-CSF-1R.

El cribado secundario de anticuerpos capaces de prevenir la unión de CSF-1 humano al CSF-1R humano identificó 88 pocilios positivos. El cribado terciario de anticuerpos capaces de prevenir la supervivencia dependiente de CSF-1 de monocitos primarios humanos identificó 18 pocillos positivos. Se clonaron las regiones variables de estos 18 pocillos positivos, lo que condujo a la clonación exitosa de 14 anticuerpos y la expresión posterior proporcionó 9 anticuerpos quiméricos anti-CSF-1 R que se expresaron a niveles suficientes y fueron capaces de inhibir la unión de CSF-1. Estos 9 anticuerpos se secuenciaron y se encontró que todos tenían secuencias únicas y se usaron para estudios adicionales.

Se valoró la actividad de bloqueo del ligando y la capacidad de inhibir la supervivencia de monocitos mediada por CSF-1 e IL-34 en los 9 anticuerpos quiméricos anti-CSF-1R. Se dio prioridad a cuatro de los anticuerpos para una mayor investigación porque demostraron una inhibición completa de la unión de CSF-1 y altos niveles de inhibición de la supervivencia de monocitos. Se probó la actividad de estos 4 anticuerpos quiméricos anti-CSF-1 R en varios ensayosin vitropara valorar la afinidad, la inhibición de la unión de CSF-1, la reactividad cruzada con CSF-1 R de mono Rhesus, mono cinomolgo y canino, la internalización de CSF-1R y la activación de CSF-1R. También se humanizaron los cuatro anticuerpos anti-CSF-1 R y se midió la afinidad de los injertos humanizados. La humanización de dos de los anticuerpos anti-CSF-1R generó anticuerpos completamente humanizados (sin residuos de donantes de rata presentes) con una afinidad (K<d>) equivalente al anticuerpo quimérico original y una Tm que indica que el anticuerpo tiene una estabilidad térmica adecuada. Por el contrario, los otros dos anticuerpos anti-CSF-1R humanizados tenían una afinidad reducida por CSF-1R, en relación con el anticuerpo quimérico, y la Tm era menor. Por estas razones, sólo los injertos completamente humanizados de dos de los anticuerpos que conservaban la afinidad se expresaron a mayor escala para su posterior análisis.

Se llevaron a cabo análisis adicionales de los injertos completamente humanizados de estos dos anticuerpos y un ensayo de inhibición de MCP-1, donde la inhibición de la señalización de CSF-1R por el anticuerpo que bloquea la unión de CSF-1 causó una reducción en los niveles de secreción de MCP-1. Este ensayo reveló sorprendentemente que los injertos completamente humanizados mostraban una actividad reducida en comparación con el anticuerpo quimérico. Se llevó a cabo una serie de experimentos con uno de los anticuerpos preferidos, denominado Ab969, para revelar por qué el injerto completamente humanizado exhibía esta actividad reducida. Se generaron y probaron una serie de injertos humanizados intermedios de Ab969 en el ensayo de inhibición de MCP-1. Se encontró que los injertos que contenían el residuo donante de cadena ligera variable Y71 generalmente mostraban una actividad en el ensayo de inhibición de MCP-1 comparable a la del Ab969 quimérico. Se planteó la hipótesis de que esta diferencia en la actividad de los diversos injertos de anticuerpos en el ensayo de inhibición de<m>CP-1 se debía a un cambio en la tasa de activación de anticuerpos (disminución de Ka) en comparación con el Ab969 quimérico.

Comparar el análisis de estabilidad térmica de Ab969 con otros anticuerpos anti-CSF-1 R, p. ej. el anticuerpo anti-CSF-1R Ab970, sugiere que Ab969 puede ser más estable.

Análisis biofísicos adicionales de injertos humanizados de Ab969 revelaron que algunos injertos precipitaron cuando se concentró el anticuerpo. Se mostró que una sustitución del residuo de lisina en la posición 38 de la cadena ligera, por ejemplo glutamina, conduce a una estabilidad física mejorada.

Por consiguiente, se seleccionó un injerto de anticuerpo de Ab969, Ab969.g2 (también denominado Ab969), para estudios de caracterizaciónin vitroposteriores. Además de la ventajosa alta afinidad de unión a CSF-1R, alta estabilidad térmica y alta estabilidad física, el anticuerpo demostró una buena inhibición de la activación de monocitos dependiente de IL-34 y también se encontró que era capaz de unirse a variantes de SNP de CSF-1R. El Ab969.g2 también se usó para el análisis de marcadores farmacodinámicos en un mono cinomolgo, donde se mostró que se une a CSF-1R, bloquea la unión de CSF-1 y agota selectivamente la población no clásica de monocitos de mono cinomolgoin vivo,que son células precursoras de macrófagos asociados a tumores.

Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada y/o la cadena ligera comprenden al menos una CDR derivada del anticuerpo anti-CSF-1R 969.2.

El Ab969.2 es una molécula de IgG4 humanizada de longitud completa; la cadena ligera comprende una región constante de la cadena kappa humana (alotipo Km3) y la cadena pesada comprende una región constante de la cadena pesada gamma-4 humana con la mutación estabilizadora de bisagra S241P (Angalet al.,1993). Un posible motivo de isomerización de DG está presente dentro de la región variable de la cadena ligera en la unión de CDR-L2 y el marco . Las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras completas del anticuerpo completo Ab969.2 se muestran en las SEQ ID NO: 27 y 19.

Los residuos en los dominios variables de los anticuerpos se numeran convencionalmente según un sistema ideado por Kabat.et al.,1987. Este sistema está establecido en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., NIH, EE. UU. (en adelante "Kabatet al. (supra)").Este sistema de numeración se usa en la presente memoria descriptiva excepto donde se indique lo contrario.

Las designaciones de residuos de Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o más aminoácidos que en la numeración estricta de Kabat correspondientes a un acortamiento o inserción en un componente estructural, ya sea marco o región determinante de la complementariedad (CDR), de la estructura básica del dominio variable. La numeración Kabat correcta de residuos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante la alineación de residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar".

Las CDR del dominio variable de cadena pesada están localizadas en los residuos 31-35 (CDR-H1), los residuos 50 65 (CDR-H2) y los residuos 95-102 (CDR-H3) según el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, según Chothia (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), el bucle equivalente a CDR-H1 se extiende desde el residuo 26 al residuo 32. Por tanto, a menos que se indique lo contrario, 'CDR-H1' tal como se emplea en el presente documento pretende referirse a los residuos 26 a 35, como se describe mediante una combinación del sistema de numeración de Kabat y la definición de bucle topológico de Chothia.

Las CDR del dominio variable de cadena ligera están localizadas en los residuos 24-34 (CDR-L1), los residuos 50-56 (CDR-L2) y los residuos 89-97 (CDR-L3) según el sistema de numeración de Kabat.

Los anticuerpos para uso en la presente divulgación se pueden obtener usando cualquier método adecuado conocido en la materia. El polipéptido/proteína CSF-1R, que incluye proteínas de fusión, células (de forma recombinante o natural) que expresan el polipéptido, se puede usar para producir anticuerpos que reconozcan específicamente CSF-1R. El polipéptido puede ser el polipéptido "maduro" o un fragmento o derivado biológicamente activo del mismo. La proteína humana está registrada en UniProt con el número P07333.

Los polipéptidos, para su uso para inmunizar a un hospedador, pueden prepararse mediante procesos bien conocidos en la técnica a partir de células hospedadoras genéticamente modificadas que comprenden sistemas de expresión o pueden recuperarse de fuentes biológicas naturales. En la presente solicitud, el término "polipéptidos" incluye péptidos, polipéptidos y proteínas. Estos se usan indistintamente a menos que se especifique lo contrario. El polipéptido CSF-1R puede en algunos casos ser parte de una proteína más grande tal como una proteína de fusión, por ejemplo fusionada con un marcaje de afinidad o similar.

Los anticuerpos generados frente al polipéptido CSF-1R se pueden obtener, cuando es necesaria la inmunización de un animal, administrando los polipéptidos a un animal, preferiblemente un animal no humano, usando protocolos bien conocidos y de rutina, véase por ejemplo Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Se pueden inmunizar muchos animales de sangre caliente, tales como conejos, ratones, ratas, ovejas, vacas, camellos o cerdos. Sin embargo, en general los más adecuados son ratones, conejos, cerdos y ratas.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la materia, tal como la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica de EBV-hibridoma (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pág. 77-96, Alan R Liss, Inc.).

Los anticuerpos también se pueden generar usando métodos de anticuerpos de linfocitos individuales mediante la clonación y expresión de ADNc de la región variable de inmunoglobulina generados a partir de linfocitos individuales seleccionados para la producción de anticuerpos específicos mediante, por ejemplo, los métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848; los documentos WO92/02551; WO04/051268 y la solicitud de patente internacional número WO04/106377.

El cribado de anticuerpos se puede realizar usando ensayos para medir la unión al CSF-1R humano y/o ensayos para medir la capacidad de bloquear la unión del ligando al receptor. En los Ejemplos del presente documento se describen ejemplos de ensayos adecuados.

Específico como se emplea en el presente documento pretende referirse a un anticuerpo que solo reconoce el antígeno para el cual es específico o un anticuerpo que tiene una afinidad de unión significativamente mayor por el antígeno para el cual es específico en comparación con la unión a antígenos para los cuales no es específico, por ejemplo al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces mayor afinidad de unión.

Se proporcionan las secuencias de aminoácidos y las secuencias de polinucleótidos de ciertos anticuerpos según la presente divulgación en las Figuras 1 y 2.

En el presente documento se divulga un anticuerpo anti-CSF-1R o un fragmento de unión del mismo que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una de una c Dr que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-H3. Preferiblemente, el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-H3.

En el presente documento se divulga un anticuerpo anti-CSF-1R o un fragmento de unión del mismo que comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO:2 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO:3 para CDR-L3. Preferiblemente, el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO:1 para CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID NO:2 para CDR-H2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO:3 para CDR-H3.

En el presente documento se describe un anticuerpo anti-CSF-1R o un fragmento de unión del mismo que comprende una cadena pesada como se define anteriormente y que comprende adicionalmente una cadena ligera en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID<n>O:2 para CDR-L2 y una CDR que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO:3 para CDR-L3. El dominio variable de la cadena ligera comprende preferiblemente la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID n O: 2 para CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para CDR-L3.

En un ejemplo, al menos un aminoácido se reemplaza por una sustitución conservativa en una o más CDR seleccionadas del grupo que consiste independientemente en:

una cualquiera de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3;

una cualquiera de las combinaciones CDR-H1 y H2, CDR-H1 y H3, CDR-H1 y L1, CDR-H1 y L2, CDR-H1 y L3, CDR-H2 y H3, CDR-H2 y L1, CDR-H2 y L2, CDR-H2 y L3, CDR-H3 y L1, CDR-H3 y L2, CDR-H3 y L3, CDR-L1 y L2, CDR-L1 y L3, CDR-L2 y L3;

CDR-H1, H2 y H3, CDR-H1, H2 y L1, CDR-H1, H2 y L2, CDR-H1, H2 y L3, CDR-H2, H3 y L1, CDR-H2, H3 y L2, CDR-H2, H3 y L3, CDR-H3, L1 y L2, CDR-H3, L1 y L3, CDR-L1, L2, L3;

una cualquiera de las combinaciones CDR-H1, H2, H3 y L1, CDR-H1, H2, H3 y L2, CDR-H1, H2, H3 y L3, CDR-H2, H3, L1 y L2, CDR-H2, H3, L2 y L3, CDR-H3, L1, L2 y L3, CDR-L1, L2, L3 y H1, CDR-L1, L2, L3 y H2, CDR-L1, L2, L3 y H3, CDR-L2, L3, H1 y H2,

CDR-H1, H2, H3, L1 y L2, CDR-H1, H2, H3, L1 y L3, CDR-H1, H2, H3, L2 y L3, CDR-L1, L2, L3, H1 y H2, CDR-L1, L2, L3, H1 y H3, CDR-L1, L2, L3, H2 y H3; y

la combinación CDR-H1, H2, H3, L1, L2 y L3.

En un ejemplo, un dominio de la cadena pesada divulgada en el presente documento incluye la secuencia con 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas, por ejemplo en donde las sustituciones están en el marco.

En un ejemplo, el marco de la región variable de la cadena pesada comprende 1, 2, 3 o 4 aminoácidos que se han insertado, eliminado, sustituido o una combinación de los mismos. En una realización, el aminoácido sustituido es un aminoácido correspondiente del anticuerpo donante.

En un ejemplo, una región variable ligera descrita en el presente documento incluye la secuencia con 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos conservativas, por ejemplo en donde las sustituciones están en el marco.

En un ejemplo, el marco de la región variable de cadena ligera comprende 1, 2, 3 o 4 aminoácidos que han sido insertados, eliminados, sustituidos o una combinación de los mismos. En una realización, el amino sustituido es un aminoácido correspondiente de un anticuerpo donante.

En el presente documento se divulga un anticuerpo anti-CSF-1R o un fragmento de unión del mismo, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende tres CDR y la secuencia de CDR-H1 tiene al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO:4, la secuencia de CDR-H2 tiene al menos un 600 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 y la secuencia de CDR-H-3 tiene al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO:6. Preferiblemente, el anticuerpo anti-CSF-1R o fragmento de unión del mismo, comprende adicionalmente una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende tres CDR y la secuencia de CDR-L1 tiene al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90% o 95% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR-L2 tiene al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO:2 y la secuencia de CDR-L3 tiene al menos un 60 % de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO:3.

En un ejemplo, se proporciona una región variable con al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad o similitud con una secuencia de región variable divulgada en el presente documento. En otra realización se proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R que compite con la unión de un anticuerpo o fragmento de la invención por la unión al receptor CSF-1R, preferiblemente el dominio extracelular del receptor CSF-1R, más específicamente al receptor CSF-1R de SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38 y/o 39 o la secuencia en la entrada de la base de datos UniProt P07333, en particular al dominio extracelular del receptor CSF-1R de SEQ ID NO: 36 o los 498 aminoácidos del dominio extracelular divulgados en la entrada P07333 de la base de datos UniProt (aminoácidos 20 a 517 de P07333).

En un ejemplo, se proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R que bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo que comprende las 6 Cd R dadas en la secuencia SEQ ID NO:1 para CDR-L1, la SEQ ID NO:2 para CDR-L2, la s Eq ID NO:3 para CDR-L3, la SEQ ID NO:4 para CDR-H1, la SEQ ID NO:5 para CDR-H2 y la SEQ ID NO:6 para CDR-H3, por ejemplo con afinidad de 100 pM o menor, en particular en donde el bloqueo cruzado es alostérico.

En otro ejemplo, se proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R o un fragmento de unión del mismo que inhibe o se superpone con la unión de CSF-1 y/o IL-34 al dominio extracelular del receptor CSF-1R.

En un ejemplo, se proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R que bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo que comprende las 6 Cd R dadas en la secuencia SEQ ID NO:1 para CDR-L1, la SEQ ID NO:2 para CDR-L2, la s Eq ID NO:3 para CDR-L3, la SEQ ID NO:4 para CDR-H1, la SEQ ID NO:5 para CDR-H2 y la SEQ ID NO:6 para CDR-H3, por ejemplo con afinidad de 100 pM o menor, en particular, en donde el anticuerpo bloquea de forma cruzada la unión uniéndose el mismo epítopo que el anticuerpo que bloquea.

En una realización, se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión del mismo en donde se escinde un residuo C-terminal de la secuencia del anticuerpo, por ejemplo el residuo C-terminal de una secuencia de cadena pesada, por ejemplo una lisina terminal. En una realización, el aminoácido se escinde de una secuencia divulgada en el presente documento. Generalmente, la escisión es el resultado de modificaciones posteriores a la traducción del anticuerpo expresado o del fragmento de unión.

En otra realización, se proporciona el anticuerpo anti-CSF-1R de cualquiera de las realizaciones anteriores o posteriores en donde falta o está eliminada la lisina C-terminal de la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID NO: 27 o la SEQ ID NO: 29. La lisina C-terminal faltante o eliminada, p. ej., la posición 453 de la SEQ ID NO: 27 o la posición 472 de la SEQ ID NO: 30 se puede lograr, por ejemplo mediante expresión del anticuerpo anti-CSF-1R en un sistema de expresión sin codificar la lisina terminal. Como alternativa, la deleción de un residuo C-terminal, tal como lisina, puede efectuarse como una modificación postraduccional.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo o molécula de anticuerpo en donde la cadena pesada y/o ligera contiene una o más CDR (incluyendo, si se desea, una o más CDR modificadas) de un anticuerpo donante (p. ej., un anticuerpo monoclonal de múrido) injertado en un marco de región variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (p. ej., un anticuerpo humano) (véase,p.ej.los documentos US 5.585.089; WO91/09967). Para una revisión, véase Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535 539, 1998. En una realización, en lugar de transferir la CDR completa, solo uno o más de los residuos determinantes de la especificidad de una cualquiera de las CDR descritas anteriormente en el presente documento se transfieren al marco del anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods 36:25-34). En una realización, solo los residuos determinantes de la especificidad de una o más de las CDR descritas anteriormente en el presente documento se transfieren al marco del anticuerpo humano. En otra realización, solo los residuos determinantes de la especificidad de cada una de las CDR descritas anteriormente en el presente documento se transfieren al marco del anticuerpo humano. Cuando se injertan las CDR o los residuos determinantes de la especificidad, se puede usar cualquier secuencia marco de región variable aceptora apropiada teniendo en cuenta la clase/tipo del anticuerpo donante del que se derivan las CDR, incluidas las regiones marco de ratón, primate y humana.

Adecuadamente, el anticuerpo humanizado tiene un dominio variable que comprende regiones marco aceptoras humanas, así como una o más de las CDR proporcionadas específicamente en el presente documento. Por tanto, en una realización se proporciona un anticuerpo humanizado que se une a CSF-1 R humano en donde el dominio variable comprende regiones marco aceptoras humanas y CDR de donantes no humanos.

Son ejemplos de estructuras humanas que se pueden usar en la presente invención KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabatet al., supra).Por ejemplo, se pueden usar KOL y NEWM para la cadena pesada, se puede usar REI para la cadena ligera y se pueden usar EU, LAY y POM tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Como alternativa, pueden usarse secuencias de la línea germinal humana; estas están disponibles en: http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/

En un anticuerpo humanizado, no es necesario que las cadenas pesada y ligera aceptoras deriven del mismo anticuerpo y, si se desea, pueden comprender cadenas compuestas que tienen regiones marco derivadas de cadenas diferentes.

En una realización, un marco humano comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos, por ejemplo 1, 2, 3 o 4 sustituciones conservativas o sustituciones de residuos donantes.

En una realización, la secuencia empleada como marco humano es un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más similar o idéntica a una secuencia divulgada en el presente documento.

Una de tales regiones marco adecuadas para la cadena pesada del anticuerpo humanizado de la presente invención se deriva de la secuencia 3-1 2-70 del subgrupo humano VH2 junto con la región J JH3 (SEQ ID NO: 33).

Por consiguiente, en un ejemplo se proporciona un anticuerpo humanizado que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 4 para CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 5 para CDR-H2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-H3, en donde la región marco de la cadena pesada deriva de la secuencia 1-3 3-07 del subgrupo humano VH3 junto con JH4.

En un ejemplo, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 23.

Una región marco adecuada para la cadena ligera del anticuerpo humanizado de la presente invención deriva del subgrupo de la línea germinal humana VK1 2-1 -(1) 012 junto con la región J JK4 (SEQ ID NO: 31).

Por consiguiente, en un ejemplo se proporciona un anticuerpo humanizado que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2 para CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 para CDR-L3, en donde la región marco de la cadena ligera deriva del subgrupo humano VK1 2-1 -(1) 012 más la región J JK4.

En un ejemplo, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 15.

En un anticuerpo humanizado de la presente invención, no es necesario que las regiones marco tengan exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, los residuos inusuales pueden cambiarse por residuos que aparecen con más frecuencia para esa clase o tipo de cadena aceptora. Como alternativa, los residuos seleccionados en las regiones marco del aceptor se pueden cambiar para que correspondan al residuo encontrado en la misma posición en el anticuerpo donante (véase Reichmann et al., 1998, Nature, 332:323-324). Tales cambios deben mantenerse al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. Se establece un protocolo para seleccionar residuos en las regiones marco del aceptor que pueden necesitar ser cambiados en el documento WO91/09967.

Por consiguiente, en un ejemplo se proporciona un anticuerpo humanizado, en donde al menos el residuo en la posición 78 del dominio variable de la cadena pesada (numeración de Kabat) es un residuo donante. En una realización, el residuo 78 del dominio variable de la cadena pesada se reemplaza por alanina.

El residuo del donante, como se emplea en el presente documento, se refiere a un residuo del anticuerpo no humano (p. ej., anticuerpo de múrido) que donó las CDR.

En una realización, se proporciona un anticuerpo humanizado en donde el dominio variable de la cadena pesada no contiene ningún residuo del donante.

Por consiguiente, en un ejemplo se proporciona un anticuerpo humanizado, en donde al menos uno de los residuos en las posiciones 38, 71 y 87 del dominio variable de la cadena ligera (numeración de Kabat) es residuo del donante. En una realización, uno de los residuos seleccionados de los residuos en las posiciones 38, 71 y 87 del dominio variable de la cadena ligera (numeración de Kabat) es un residuo del donante. En una realización, dos de los residuos seleccionados de los residuos en las posiciones 38, 71 y 87, por ejemplo 38 y 71; o 38 y 87; o 71 y 87, del dominio variable de la cadena ligera (numeración de Kabat) son residuos del donante. En una realización, los tres residuos en las posiciones 38, 71 y 87 del dominio variable de la cadena ligera (numeración de Kabat) son residuos del donante.

En una realización, el residuo 38 del dominio variable de cadena ligera se reemplaza por lisina. En una realización alternativa, el residuo 38 del dominio variable de cadena ligera se reemplaza por glutamina.

En una realización, el residuo 71 del dominio variable de cadena ligera se reemplaza por tirosina.

En una realización, el residuo 87 del dominio variable de cadena ligera se reemplaza por fenilalanina.

En una realización, se proporciona un anticuerpo humanizado en donde sólo el residuo 71 de la región variable de cadena ligera es un residuo del donante, preferiblemente tirosina.

En una realización particular, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R o un fragmento de unión del mismo que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia del dominio variable de la cadena pesada dada en la SEQ ID NO: 23 y una cadena ligera que comprende la secuencia del dominio variable de la cadena ligera dada en la SEQ ID NO: 15.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R o un fragmento de unión del mismo que se une a CSF-1R, preferiblemente el dominio extracelular de CSF-1R, lo más preferiblemente el dominio extracelular de CSF-1R humano, en donde el anticuerpo o fragmento de unión comprende el dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 15 y el dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 23, preferiblemente en donde el anticuerpo o fragmento de unión del mismo es un anticuerpo monoclonal, es un anticuerpo del tipo IgG1, IgG2, IgG4, es un Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, VH o VL o VHH), scFv, anticuerpo bi, tri o tetravalente, bis-scFv, diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo.

En un ejemplo, una secuencia de anticuerpo que es un 80 % similar o idéntica a una secuencia divulgada en el presente documento, por ejemplo un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95%96 %, 97 %, 98%o 99% aparte o la totalidad de la secuencia relevante. En una realización, la secuencia relevante es la SEQ ID NO: 15. En una realización, la secuencia relevante es la SEQ ID NO: 23.

"Identidad", como se usa en el presente documento, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es idéntico entre las secuencias. "Similitud", como se usa en el presente documento, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Por ejemplo, se puede sustituir la leucina por isoleucina o valina. Otros aminoácidos que a menudo pueden sustituirse entre sí incluyen, pero sin limitación:

- fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas);

- lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas);

- aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas);

- asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida); y

- cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre).

Los grados de identidad y similitud se pueden calcular fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991, el software BLAST™ disponible en NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).

Las moléculas de anticuerpo de la presente invención pueden comprender una molécula de anticuerpo completa que tiene cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o un fragmento de unión de las mismas y pueden ser, pero sin limitación, Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, VH o VL o VHH), scFv, anticuerpos bi, tri o tetravalentes, bis-scFv, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores (véanse por ejemplo Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech.

23(9):1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la materia (véase por ejemplo Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181). Otros fragmentos de anticuerpos para uso en la presente invención incluyen los fragmentos Fab y Fab' descritos en solicitudes de patente internacional WO05/003169, WO05/003170 y WO05/003171. Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades, p. ej., biespecíficos o pueden ser monoespecíficos (véanse por ejemplo los documentos WO92/22853, WO05/113605, WO2009/040562 y WO2010/035012).

El fragmento de unión de un anticuerpo tal como se emplea en el presente documento se refiere a un fragmento capaz de unirse a un antígeno con afinidad para caracterizar el fragmento como específico para el antígeno.

En una realización, el anticuerpo según la presente divulgación se proporciona como una proteína de fusión de anticuerpo de unión a CSF-1R que comprende un resto de inmunoglobulina, por ejemplo un fragmento Fab o Fab', y uno o dos anticuerpos de dominio único (dAb) ligados directa o indirectamente al mismo, por ejemplo como se describe en los documentos WO2009/040562, WO2010/035012, WO2011/030107, WO2011/061492 y WO2011/086091.

En una realización, la proteína de fusión comprende anticuerpos de dos dominios, por ejemplo como un par pesado variable (VH) y ligero variable (VL), opcionalmente ligados por un enlace disulfuro.

En una realización, el elemento Fab o Fab' de la proteína de fusión tiene la misma o similar especificidad para el anticuerpo o anticuerpos de dominio único. En una realización, el Fab o Fab' tiene una especificidad diferente al anticuerpo o anticuerpos de dominio único, es decir, la proteína de fusión es multivalente. En una realización, una proteína de fusión multivalente según la presente invención tiene un sitio de unión a albúmina, por ejemplo, un par VH/VL, que proporciona en la misma un sitio de unión a albúmina.

Los dominios de la región constante de la molécula de anticuerpo se pueden seleccionar teniendo en cuenta la función propuesta de la molécula de anticuerpo y, en particular, las funciones efectoras que pueden ser necesarias. Por ejemplo, los dominios de la región constante pueden ser dominios IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humanos. En particular, se pueden usar dominios de región constante de IgG humana, especialmente de los isotipos IgG1 e IgG3, cuando la molécula de anticuerpo está destinada a fines terapéuticos y se requieren funciones efectoras del anticuerpo. Como alternativa, se pueden usar los isotipos IgG2 e IgG4 cuando la molécula de anticuerpo está destinada a fines terapéuticos y no se requieren funciones efectoras del anticuerpo.

En una realización específica, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo IgG2 o IgG4.

Se apreciará que también se pueden usar variantes de secuencia de estos dominios de región constante. Por ejemplo, moléculas de IgG4 en que la serina en la posición 241 se ha cambiado a prolina como se describe en Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108 puede ser usado. Por consiguiente, en la realización en donde el anticuerpo es un anticuerpo IgG4, el anticuerpo puede incluir la mutación S241P.

Un experto en la materia también entenderá que los anticuerpos pueden experimentar una variedad de modificaciones postraduccionales. El tipo y el alcance de estas modificaciones a menudo dependen de la estirpe celular hospedadora usada para expresar el anticuerpo, así como de las condiciones del cultivo. Tales modificaciones pueden incluir variaciones en la glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperazina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un residuo básico carboxiterminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995). Por consiguiente, la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo puede estar ausente.

En una realización, la cadena pesada del anticuerpo comprende un dominio CH1 y la cadena ligera del anticuerpo comprende un dominio CL, ya sea kappa o lambda.

En una realización, la cadena pesada del anticuerpo comprende un dominio CH1, un dominio CH2 y un dominio CH3 y la cadena ligera del anticuerpo comprende un dominio Cl, ya sea kappa o lambda.

Un anticuerpo proporcionado por la presente invención tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 19. También se proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R o un fragmento de unión del mismo, en que las cadenas pesada y ligera son al menos un 80 % (preferiblemente 85 %, 90 %, 95 % o 98 %) idénticas o similares a una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 19. En una realización, la cadena ligera tiene o consiste en la secuencia dada en la SEQ ID NO: 19 y la cadena pesada tiene o consiste en la secuencia dada en la SEQ ID NO: 27. En otra realización, la cadena ligera tiene o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 19 y la cadena pesada tiene o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 27, en donde falta o se elimina el aminoácido lisina en la posición 453 de SEQ ID NO: 27.

La presente invención también proporciona una región específica o epítopo de CSF-1R humano que se une a un anticuerpo proporcionado por la presente invención, en particular un anticuerpo 969.g2 que comprende la secuencia de cadena pesada gH2 (SEQ ID NO: 27) y/o la secuencia de cadena ligera gL7 (SEQ ID NO: 19).

Esta región o epítopo específico del polipéptido CSF-1R humano puede identificarse mediante cualquier método de mapeo de epítopos adecuado conocido en la materia en combinación con uno cualquiera de los anticuerpos proporcionados por la presente invención. Los ejemplos de tales métodos incluyen el cribado de péptidos de longitudes variables derivados de CSF-1R para su unión al anticuerpo de la presente invención con el fragmento más pequeño que puede unirse específicamente al anticuerpo que contiene la secuencia del epítopo reconocido por el anticuerpo (por ejemplo, un péptido en la región de aproximadamente 5 a 20, preferiblemente aproximadamente 7 aminoácidos de longitud). Los péptidos CSF-1R pueden producirse sintéticamente o mediante digestión proteolítica del polipéptido CSF-1R. Los péptidos que se unen al anticuerpo pueden identificarse, por ejemplo, mediante análisis espectrométrico de masas. En otro ejemplo, se puede usar espectroscopía de RMN o cristalografía de rayos X para identificar el epítopo unido por un anticuerpo de la presente invención. Una vez identificado, el fragmento epitópico que se une a un anticuerpo de la presente invención se puede usar, si es necesario, como inmunógeno para obtener anticuerpos adicionales que se unen al mismo epítopo.

Las moléculas biológicas, tales como anticuerpos o fragmentos, contienen grupos funcionales ácidos y/o básicos, lo que le da a la molécula una carga neta positiva o negativa. La cantidad de carga global "observada" dependerá de la secuencia absoluta de aminoácidos de la entidad, el entorno local de los grupos cargados en la estructura 3D y las condiciones ambientales de la molécula. El punto isoeléctrico (pI) es el pH al cual una molécula particular o una superficie accesible al disolvente de la misma no porta carga eléctrica neta. En un ejemplo, el anticuerpo CSF-1R y los fragmentos de la invención pueden diseñarse para que tengan un punto isoeléctrico apropiado. Esto puede conducir a anticuerpos y/o fragmentos con propiedades más robustas, en particular perfiles de solubilidad y/o estabilidad adecuados y/o características de purificación mejoradas.

Por tanto, en el presente documento se divulga un anticuerpo CSF-1R humanizado diseñado para tener un punto isoeléctrico diferente al del anticuerpo identificado originalmente. El anticuerpo puede, por ejemplo, diseñarse reemplazando un residuo de aminoácido tal como reemplazando un residuo de aminoácido ácido por uno o más residuos de aminoácido básicos. Como alternativa, se pueden introducir residuos de aminoácidos básicos o se pueden eliminar residuos de aminoácidos ácidos. Como alternativa, si la molécula tiene un valor de pI inaceptablemente alto, se pueden introducir residuos ácidos para reducir el pI, según sea necesario. Es importante que al manipular el pI se tenga cuidado de conservar la actividad deseable del anticuerpo o fragmento. Por tanto, en una realización, el anticuerpo o fragmento diseñado tiene la misma o sustancialmente la misma actividad que el anticuerpo o fragmento "no modificado".

Programas tales como **ExPASY http://www.expasv.ch/tools/pi tool.html, y http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d abim/compo-p.html, pueden usarse para predecir el punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento.

Se apreciará que la afinidad de los anticuerpos proporcionados por la presente invención se puede alterar usando cualquier método adecuado conocido en la materia. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a variantes de las moléculas de anticuerpos de la presente invención que tienen una afinidad mejorada por CSF-1R. Tales variantes se pueden obtener mediante una serie de protocolos de maduración por afinidad, incluida la mutación de las CDR (Yang et al., 1995, J. Mol. Biol., 254:392-403), transposición de cadenas (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783), uso de cepas mutadoras deE. coli(Low et al., 1996, J. Mol. Biol., 250:359-368), transposición de ADN (Patten et al., 1997, Curr. Opin. Biotechnol., 8:724-733.), presentación de fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al., 1998, Nature, 391:288-291). Vaughanet al. (supra)discute estos métodos de maduración por afinidad.

Si se desea, un anticuerpo para uso en la presente invención se puede conjugar con una o más moléculas efectoras. Se apreciará que la molécula efectora puede comprender una única molécula efectora o dos o más de tales moléculas ligadas de modo que formen un único resto que se puede fijar a los anticuerpos de la presente invención. Cuando se desea obtener un fragmento de anticuerpo ligado a una molécula efectora, este puede prepararse mediante procedimientos químicos estándar o de ADN recombinante en que el fragmento de anticuerpo se liga directamente o mediante un agente de acoplamiento a la molécula efectora. Las técnicas para conjugar tales moléculas efectoras con anticuerpos son bien conocidas en la materia (véanse, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2.a ed., Robinson et al., eds., 1987, pág. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos WO93/06231, WO92/22583, WO89/00195, WO89/01476 y WO03/031581. Como alternativa, cuando la molécula efectora es una proteína o polipéptido, el enlazamiento se puede lograr usando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo como se describen en los documentos WO86/01533 y EP0392745.

El término molécula efectora como se usa en el presente documento incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polímeros sintéticos o de origen natural, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, p. ej., ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionucleidos, en particular yodo radiactivo, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores, tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse mediante espectroscopia de RMN o ESR.

Los ejemplos de moléculas efectoras pueden incluir citotoxinas o agentes citotóxicos, incluido cualquier agente que sea perjudicial para(p. ej.destruya) células. Los ejemplos incluyen combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinoides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos.

Las moléculas efectoras también incluyen, pero sin limitación, antimetabolitos(p. ej.metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes(p. ej.mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiaminaplatino (II) ((DDP) cisplatino), antraciclinas(p. ej.daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos(p. ej.dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), calicheamicinas o duocarmicinas) y agentes antimitóticos(p. ej.vincristina y vinblastina).

Otras moléculas efectoras pueden incluir radionucleidos quelados tales como 111In y 90Y, Lu177, bismuto213, californio252, iridio192 y tungsteno188/renio188; o fármacos tales como, pero sin limitación, alquilfosfocolinas, inhibidores de la topoisomerasa I, taxoides y suramina.

Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, pero sin limitación, enzimas proteolíticas, hidrolasas, liasas, isomerasas y transferasas. Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, pero sin limitación, inmunoglobulinas, toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica, una proteína tal como insulina, factor de necrosis tumoral, interferón a, interferón p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador del plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente antiangiogénico,p.ej.angiostatina o endostatina, o un modificador de la respuesta biológica tal como una linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otro factor de crecimiento e inmunoglobulinas.

Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles, por ejemplo en el diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, nucleidos radiactivos, metales emisores de positrones (para uso en tomografía por emisión de positrones) e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase en general la patente de EE. UU. n.° 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como diagnóstico.

Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina; y los nucleidos radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111In y 99Tc.

En otro ejemplo, la molécula efectora puede aumentar la vida media del anticuerpoin vivo,y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o potenciar la provisión de un anticuerpo a través de una barrera epitelial al sistema inmunológico. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina tales como los descritos en el documento WO05/117984.

En una realización, es ventajosa la vida media proporcionada por una molécula efectora que es independiente de CSF-1R.

Cuando la molécula efectora es un polímero, puede ser, en general, un polímero sintético o de origen natural, por ejemplo un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado, p. ej. un homo- o heteropolisacárido.

Los sustituyentes opcionales específicos que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi.

Los ejemplos específicos de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol), poli(propilenglicol), poli(alcohol vinílico) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido o derivados de los mismos, especialmente poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido, tal como metoxipoli(etilenglicol) o derivados de los mismos.

Los polímeros de origen natural específicos incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o derivados de los mismos.

En una realización, el polímero es albúmina o un fragmento de la misma, tal como albúmina sérica humana o un fragmento de la misma.

"Derivados", como se usa en el presente documento, pretende incluir derivados reactivos, por ejemplo grupos reactivos tiolselectivos tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar ligado directamente o a través de un segmento ligador al polímero. Se apreciará que el residuo de tal grupo formará en algunos casos parte del producto como grupo de enlace entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.

El tamaño del polímero se puede variar según se desee, pero generalmente estará en un intervalo de peso molecular promedio de 500 Da a 50.000 Da, por ejemplo de 5.000 a 40.000 Da, tal como de 20.000 a 40.000 Da. El tamaño del polímero puede seleccionarse en particular en función del uso previsto del producto, por ejemplo, la capacidad de localizarse en ciertos tejidos tales como tumores o extender la vida media circulante (para una revisión, véase Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Por tanto, por ejemplo, cuando se pretende que el producto abandone la circulación y penetre en el tejido, por ejemplo para su uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso usar un polímero de peso molecular pequeño, por ejemplo con un peso molecular de aproximadamente 5000 Da. Para aplicaciones en donde el producto permanece en circulación, puede resultar ventajoso usar un polímero de mayor peso molecular, que tenga por ejemplo un peso molecular en el intervalo de 20.000 Da a 40.000 Da.

Los polímeros adecuados incluyen un polímero de polialquileno, tal como un poli(etilenglicol) o, especialmente, un metoxipoli(etilenglicol) o un derivado del mismo, y especialmente con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 15.000 Da a aproximadamente 40.000 Da.

En un ejemplo, los anticuerpos para uso en la presente invención se fijan a restos de poli(etilenglicol) (PEG). En un ejemplo particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moléculas de<p>E<g>pueden fijarse a través de cualquier cadena lateral de aminoácido disponible o grupo funcional de aminoácido terminal localizado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Tales aminoácidos pueden aparecer naturalmente en el fragmento de anticuerpo o pueden diseñarse en el fragmento usando métodos de ADN recombinante (véanse por ejemplo los documentos US 5.219.996; US 5.667.425; WO98/25971, WO2008/038024). En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado en donde la modificación es la adición al extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la fijación de una molécula efectora. Adecuadamente, los aminoácidos adicionales forman una región bisagra modificada que contiene uno o más residuos de cisteína a los que se puede fijar la molécula efectora. Se pueden usar múltiples sitios para fijar dos o más moléculas de PEG.

Adecuadamente, las moléculas de PEG están ligadas covalentemente a través de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína localizado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula de polímero fijada al fragmento de anticuerpo modificado puede estar ligada covalentemente al átomo de azufre de un residuo de cisteína localizado en el fragmento. El grupo de enlace covalente será generalmente un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono. Cuando se usa un grupo tiol como punto de fijación, se pueden usar moléculas efectoras apropiadamente activadas, por ejemplo, derivados selectivos de tiol tales como maleimidas y derivados de cisteína. Se puede usar un polímero activado como material de partida en la preparación de fragmentos de anticuerpos modificados con polímero como se describe anteriormente. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo tiol reactivo tal como un ácido o éster a-halogenocarboxílico, p. ej. yodoacetamida, una imida, p.ej. maleimida, una vinilsulfona o un disulfuro. Tales materiales de partida se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, de Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EE. UU.) o se pueden preparar a partir de materiales de partida disponibles comercialmente usando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas de PEG particulares incluyen metoxi-PEG-amina de 20K (que se puede obtener de Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (que se puede obtener de Nektar, anteriormente Shearwater).

En una realización, el anticuerpo es un fragmento Fab modificado, un fragmento Fab' o diFab que está PEGilado, es decir, tiene PEG (poli(etilenglicol)) fijado covalentemente al mismo,p.ej.según el método divulgado en los documentos EP 0948544 o EP1090037 [véanse también "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris y S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. En un ejemplo, el PEG está fijado a una cisteína en la región de bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab modificado con<p>E<g>tiene un grupo maleimida ligado covalentemente a un único grupo tiol en una región de bisagra modificada. Un residuo de lisina puede estar ligado covalentemente al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amina del residuo de lisina puede estar fijado un polímero de metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. Por tanto, el peso molecular total del PEG fijado al fragmento Fab puede ser de aproximadamente 40.000 Da.

Las moléculas de PEG particulares incluyen 2-[3-(N-maleimido)propionamido]etilamida de lisina modificada con N,N'-bis(metoxipoli(etilenglicol) PM 20.000), también conocida como PEG2MAL40K (que se puede obtener de Nektar, anteriormente Shearwater).

Las fuentes alternativas de ligadores de PEG incluyen NOF que suministra GL2-400MA3 (en donde m en la estructura siguiente es 5) y GL2-400MA (donde m es 2) y n es aproximadamente 450:

Es decir, cada PEG tiene aproximadamente 20.000 Da.

Por tanto, en una realización, el PEG es 2,3-bis(metilpolioxietilenoxi)-1-{[3-(6-maleimido-1-oxohexil)amino]propiloxi}hexano(PEG ramificado de 2 brazos, -CH2)3NHCO(CH)2)5-MAL, Mw 40.000 conocido como SUNBRIGHT GL2-400MA3.

Otras moléculas efectoras de PEG alternativas del siguiente tipo:

En una realización, se proporciona un anticuerpo, tal como un anticuerpo de longitud completa, que está PEGilado (por ejemplo con un PEG descrito en el presente documento), fijado a través de un residuo de aminoácido cisteína en o aproximadamente en el aminoácido 226 en la cadena, por ejemplo el aminoácido 226 de la cadena pesada (por numeración secuencial).

En una realización, la presente divulgación proporciona una molécula de Fab'PEG que comprende uno o más polímeros de PEG, por ejemplo 1 o 2 polímeros tales como un polímero o polímeros de 40 kDa.

Las moléculas de Fab-PEG según la presente divulgación pueden ser particularmente ventajosas porque tienen una vida media independiente del fragmento Fc.

En una realización, se proporciona un scFv conjugado con un polímero, tal como una molécula de PEG, una molécula de almidón o una molécula de albúmina.

En una realización, el anticuerpo o fragmento se conjuga con una molécula de almidón, por ejemplo para aumentar la vida media. Los métodos de conjugación comienzan con una proteína como se describe en el documento US 8.017.739.

Una molécula indicadora tal como se emplea en el presente documento es una molécula que puede detectarse, por ejemplo, un tinte fluorescente, un radiomarcador u otra entidad detectable.

La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica las cadenas pesada y ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. Adecuadamente, la secuencia de ADN codifica la cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, por ejemplo producido mediante procesamiento químico, ADNc, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos.

Las secuencias de ADN que codifican una molécula de anticuerpo de la presente invención se pueden obtener mediante métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican parte o la totalidad de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo se pueden sintetizar según se desee a partir de las secuencias de ADN determinadas o basándose en las secuencias de aminoácidos correspondientes.

El ADN que codifica secuencias marco aceptoras está ampliamente disponible para los expertos en la materia y puede sintetizarse fácilmente basándose en sus secuencias de aminoácidos conocidas.

Se pueden usar técnicas estándares de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas pueden sintetizarse total o parcialmente usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Se pueden utilizar técnicas de mutagénesis dirigida a sitio y reacción en cadena de la polimerasa (PCR), según sea apropiado.

En la Figura 1 se proporcionan ejemplos de secuencias de ADN adecuadas.

La presente invención también se refiere a un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias de ADN de la presente invención. Por consiguiente, se proporciona un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. En una realización, el vector comprende las secuencias dadas en las SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 20. Adecuadamente, el vector de clonación o expresión comprende dos secuencias de ADN que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de la molécula de anticuerpo de la presente invención, preferiblemente las SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 20, respectivamente y secuencias señal adecuadas. En un ejemplo, el vector comprende una secuencia intergénica entre las cadenas pesada y ligera (véase el documento WO03/048208).

Los expertos en la materia conocen bien los métodos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo. En este sentido se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York y al Maniatis Manual producido por Cold Spring Harbor Publishing.

También se proporciona una célula hospedadora que comprende uno o más vectores de clonación o expresión que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. Puede usarse cualquier sistema de célula hospedadora/vector adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Pueden usarse sistemas bacterianos, por ejemploE. coli,y otros sistemas microbianos o también se pueden usar sistemas de expresión de células hospedadoras eucarióticas, por ejemplo de mamífero. Las células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen células CHO, de mieloma o de hibridoma.

La presente invención también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo según la presente invención que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene un vector de la presente invención en condiciones adecuadas para conducir a la expresión de una proteína a partir del ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención y aislar la molécula de anticuerpo.

La molécula de anticuerpo puede comprender sólo un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso sólo es necesario usar una secuencia codificante de polipéptido de cadena pesada o de cadena ligera para transfectar las células hospedadoras. Para la producción de productos que comprenden cadenas pesadas y ligeras, la estirpe celular puede transfectarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Como alternativa, se puede usar un único vector, incluyendo el vector secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada.

Los anticuerpos y fragmentos según la presente divulgación se expresan a buenos niveles en las células hospedadoras. Por tanto, las propiedades de los anticuerpos y/o fragmentos de unión son adecuadas para la expresión a escala comercial.

Por tanto, se proporciona un proceso para cultivar una célula hospedadora y expresar un anticuerpo o fragmento del mismo, aislar este último y opcionalmente purificarlo para proporcionar un anticuerpo o fragmento aislado. En una realización, el proceso comprende además la etapa de conjugar una molécula efectora con el anticuerpo o fragmento aislado, por ejemplo, conjugar con un polímero de PEG, en particular como se describe en el presente documento.

En un ejemplo, se proporciona un proceso para purificar un anticuerpo (en particular un anticuerpo o fragmento según la invención) que comprende efectuar una cromatografía de intercambio aniónico en modo sin unión de tal manera que las impurezas se retengan en la columna y el anticuerpo se eluya.

En un ejemplo, la purificación emplea captura por afinidad en una columna de CSF-1R.

En un ejemplo, la purificación emplea azul de cibacrón o similar para la purificación de moléculas de fusión o conjugadas de albúmina.

Las resinas de intercambio iónico adecuadas para usar en el proceso incluyen la resina Q.FF (suministrada por GE-Healthcare). La etapa puede efectuarse, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 8.

El proceso puede comprender además una etapa de captura inicial que emplea cromatografía de intercambio catiónico, efectuada por ejemplo a un pH de aproximadamente 4 a 5, tal como 4,5. La cromatografía de intercambio catiónico puede emplear, por ejemplo, una resina tal como resina CaptoS o SP sefarosa FF (suministrada por GE-Healthcare). Luego, el anticuerpo o fragmento se puede eluir de la resina empleando una solución de sal iónica tal como cloruro de sodio, por ejemplo a una concentración de 200 mM.

Por tanto, la etapa o etapas de cromatografía pueden incluir una o más etapas de lavado, según sea apropiado.

El proceso de purificación también puede comprender una o más etapas de filtración, tal como una etapa de diafiltración.

Por tanto, en una realización se proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R o fragmento purificado, por ejemplo un anticuerpo o fragmento humanizado, en particular un anticuerpo o fragmento según la invención, sustancialmente purificado, en particular libre o sustancialmente libre de endotoxina y/o proteína o ADN de la célula hospedadora.

Forma purificada tal como se usa anteriormente pretende referirse a al menos un 90 % de pureza, tal como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % p/p o más puro.

Sustancialmente libre de endotoxina generalmente se refiere a un contenido de endotoxina de 1 UE por mg de producto de anticuerpo o menos, tal como 0,5 o 0,1 UE por mg de producto.

Sustancialmente libre de proteína o ADN de la célula hospedadora generalmente se refiere a un contenido de proteína y/o ADN de la célula hospedadora de 400 |jg por mg de producto de anticuerpo o menos, tal como 100 |jg por mg o menos, en particular 20 jg por mg, según sea apropiado.

La presente invención también proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R (o composiciones farmacéuticas que lo comprenden) según la divulgación para su uso como medicamento.

La presente invención también proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R (o composiciones farmacéuticas que lo comprenden) según la divulgación, para el tratamiento del cáncer.

La presente invención también proporciona el uso de un anticuerpo anti-CSF-1 R (o una composición farmacéutica que comprende el mismo) según la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis del cáncer.

La presente invención también proporciona un método para el tratamiento de un sujeto humano que padece o está en riesgo de padecer cáncer, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CSF-1 R según la divulgación.

El anticuerpo según la divulgación se puede usar para tratar un cáncer que se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de huesos, mieloma, cáncer colorrectal, leucemia, linfoma, cáncer de piel tal como melanoma, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer astrocítico, cáncer de endometrio, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer renal, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas y cáncer de ovario.

En una realización, el cáncer es cáncer con metástasis de cualquiera de los cánceres originales enumerados anteriormente, en particular cáncer de huesos.

Sorprendentemente se ha podido demostrar que un anticuerpo anti-CSF-1R que inhibe la actividad de CSF-1R es activo en el tratamiento de la enfermedad fibrótica. Específicamente, se ha podido demostrar que un anticuerpo anti-CSF-1R es activo en modelos animalesin vivode fibrosis pulmonar.

La presente invención también proporciona un anticuerpo anti-CSF-1R (o composiciones farmacéuticas que comprenden el mismo) según la divulgación, para el tratamiento de enfermedad fibrótica.

La presente invención también proporciona el uso de un anticuerpo anti-CSF-1 R (o una composición farmacéutica que comprende el mismo) según la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de enfermedad fibrótica.

La presente invención también proporciona un método para el tratamiento de un sujeto humano que padece o está en riesgo de padecer enfermedad fibrótica, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CSF-1R según la divulgación.

En la presente solicitud, el término "enfermedad fibrótica" incluye enfermedades que se caracterizan por una respuesta aberrante a la cicatrización de heridas en donde se forma un exceso de tejido conectivo fibroso en un órgano o tejido. Las enfermedades fibróticas ilustrativas incluyen, pero sin limitación, fibrosis pulmonar tal como fibrosis pulmonar idiopática y fibrosis quística, fibrosis renal incluyendo atrofia tubular y fibrosis intersticial, fibrosis hepática, cirrosis hepática, colangitis esclerosante primaria, cirrosis biliar primaria, fibrosis endomiocárdica, fibrosis mediastínica, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal, fibrosis masiva progresiva, fibrosis sistémica nefrogénica, enfermedad de Crohn, queloide, infarto de miocardio, esclerodermia, esclerosis sistémica y artrofibrosis.

En una realización, los anticuerpos o fragmentos según la divulgación se emplean en el tratamiento o profilaxis del cáncer o enfermedad fibrótica.

El anticuerpo según la divulgación se puede usar en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, como, por ejemplo, artritis inflamatoria, aterosclerosis, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, espondilitis reumatoide, espondilitis anquilosante, artritis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, osteoartritis, eccema, dermatitis de contacto, psoriasis, síndrome de choque tóxico, sepsis, choque séptico, choque endotóxico, asma, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, silicosis, sarcoidosis pulmonar, osteoporosis, reestenosis, lesión por reperfusión cardíaca y renal, trombosis, glomerulonefritis, diabetes, reacción de injerto contra hospedador, rechazo de aloinjerto, esclerosis múltiple, degeneración muscular, distrofia muscular, enfermedad de Alzheimer y accidente cerebrovascular.

Los anticuerpos y fragmentos según la presente divulgación se pueden emplear en tratamiento o profilaxis.

La molécula de anticuerpo de la presente invención también se puede usar en diagnóstico, por ejemplo en el diagnósticoin vivoe imagenología de estados patológicos que implican a CSF-1R.

Como los anticuerpos de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o profilaxis de una afección patológica, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende una molécula de anticuerpo de la presente invención en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, se proporciona el uso de un anticuerpo de la invención para la fabricación de un medicamento. La composición habitualmente se suministrará como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona un proceso para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende añadir y mezclar la molécula de anticuerpo de la presente invención junto con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

La molécula de anticuerpo puede ser el único ingrediente activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico. Como alternativa, el anticuerpo se puede administrar en combinación, p. ej. simultáneamente, secuencialmente o por separado, con uno o más otros ingredientes terapéuticamente activos. Según la molécula de anticuerpo en la composición farmacéutica o de diagnóstico, puede ir acompañada de otros ingredientes activos incluyendo otros ingredientes de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos frente a la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, HER-2), receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), o ingredientes que no son anticuerpos tales como imatinib, dasatinib, nioltinib, basutinib, gefitinib, erlotinib, temsirolimús, vandetanib, vemurafenib, crizotinib, vorinostat, romidepsina, bortezomib, sorafenib, sunitinib, pazopanib, regorafenib, cabozantinib, perfenidona, esteroides u otras moléculas de fármacos, en particular moléculas de fármacos cuya vida media es independiente de la unión de CSF-1R.

El ingrediente activo como se emplea en el presente documento se refiere a un ingrediente con un efecto farmacológico, tal como un efecto terapéutico, a una dosis relevante.

Las composiciones farmacéuticas comprenden adecuadamente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección específica, o para exhibir un efecto terapéutico, farmacológico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, habitualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración apropiados. Luego, tal información puede usarse para determinar dosis y vías útiles para la administración en humanos.

La cantidad terapéuticamente eficaz precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el momento y la frecuencia de administración, la combinación o combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede determinarse mediante experimentación de rutina y está a criterio del médico. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz será de 0,01 mg/kg a 500 mg/kg, por ejemplo de 0,1 mg/kg a 200 mg/kg, tal como 100 mg/kg.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis.

Las dosis terapéuticas de los anticuerpos según la presente divulgación no muestran efectos toxicológicos aparentes o limitadosin vivo.

Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación (p. ej., simultáneamente, secuencialmente o por separado) con otros agentes, fármacos u hormonas.

En una realización, los anticuerpos o fragmentos de unión según la presente divulgación se emplean con una o más opciones de tratamiento del cáncer, tales como, por ejemplo, quimioterapia, radioterapia o cirugía. Si se administra con un agente quimioterapéutico, el anticuerpo se puede administrar antes o después del agente quimioterapéutico o al mismo tiempo. Los tratamientos de quimioterapia que se pueden usar en combinación con las proteínas de unión a antígenos que se proporcionan incluyen, pero sin limitación, agentes alquilantes/que dañan el ADN (p. ej., carboplatino, cisplatino), antimetabolitos (p. ej., capecitabina, gemcitabina, 5-fluorouracilo), inhibidores mitóticos (p. ej., paclitaxel, vincristina).

Los anticuerpos que se van a usar para tratar diversas enfermedades inflamatorias se pueden usar solos o combinados con diversos otros agentes antiinflamatorios.

Los anticuerpos que se van a usa para tratar diversas enfermedades fibróticas se pueden usar solos o combinados con diversos otros agentes antifibróticos. Un ejemplo de tal agente es pirfenidona.

La dosis a la que se administra la molécula de anticuerpo de la presente invención depende de la naturaleza de la afección que se va a tratar, la gravedad de la afección presente y de si la molécula de anticuerpo se está usando de forma profiláctica o para tratar una afección existente.

La frecuencia de la dosis dependerá de la vida media de la molécula de anticuerpo y de la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una vida media corta (p. ej., de 2 a 10 horas), puede ser necesario dar una o más dosis al día. Como alternativa, si la molécula de anticuerpo tiene una vida media larga (p. ej., de 2 a 15 días) y/o un perfil farmacodinámico (PD) duradero, puede que sólo sea necesario dar una dosis una vez al día, una vez a la semana o incluso una vez cada 1 o 2 meses.

La vida media, como se emplea en el presente documento, pretende referirse a la duración de la molécula en circulación, por ejemplo en suero/plasma.

La farmacodinámica como se emplea en el presente documento se refiere al perfil y, en particular, a la duración de la acción biológica de la molécula según la presente divulgación.

El portador farmacéuticamente aceptable no debería inducir por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición y no debería ser tóxico. Pueden ser portadores adecuados macromoléculas grandes metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivos.

Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.

Los portadores farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, en tales composiciones pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tampón del pH. Tales portadores permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas y suspensiones, para que el paciente las ingiera.

Las formas adecuadas para la administración incluyen formas adecuadas para la administración parenteral, p. ej. mediante inyección o infusión, por ejemplo mediante inyección en bolo o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca, para su reconstitución antes de su uso con un líquido estéril apropiado.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales. Sin embargo, en una o más realizaciones las composiciones están adaptadas para la administración a sujetos humanos.

Adecuadamente en formulaciones según la presente divulgación, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento, por ejemplo si el pH de la formulación es 7 entonces un pI de 8-9 o superior puede ser apropiado. Aunque no se desea limitarse a ninguna teoría, se cree que esto puede proporcionar en última instancia una formulación final con estabilidad mejorada, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento permanece en solución.

En un ejemplo, la formulación farmacéutica a un pH en el intervalo de 4,0 a 7,0 comprende: de 1 a 200 mg/ml de un anticuerpo según la presente divulgación, de 1 a 100 mM de un tampón, de 0,001 a 1 % de un tensioactivo, a) de 10 a 500 mM de un estabilizador, b) de 10 a 500 mM de un estabilizador y de 5 a 500 mM de un agente de tonicidad, o c) de 5 a 500 mM de un agente de tonicidad.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse mediante cualquier serie de vías incluyendo, pero sin limitación, vía oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. También se pueden usar inyectores de chorro para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección.

La provisión directa de las composiciones generalmente se conseguirá mediante inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se procurará en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser un esquema de dosis única o un esquema de dosis múltiples.

Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, será susceptible a la degradación en el tracto gastrointestinal. Por tanto, si la composición se va a administrar por una vía que use el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes que protejan al anticuerpo de la degradación pero que liberen el anticuerpo una vez que haya sido absorbido en el tracto gastrointestinal.

Una discusión detallada sobre los portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

En una realización, la formulación se proporciona como una formulación para administraciones tópicas, incluyendo inhalación.

Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen los polvos inhalables, los aerosoles dosificadores que contienen gases propulsores o las soluciones inhalables exentas de gases propulsores. Los polvos inhalables según la divulgación que contienen la sustancia activa pueden consistir únicamente en las sustancias activas mencionadas anteriormente o en una mezcla de las sustancias activas mencionadas anteriormente con un excipiente fisiológicamente aceptable.

Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (p. ej., glucosa o arabinosa), disacáridos (p. ej., lactosa, sacarosa, maltosa), oligo- y polisacáridos (p. ej., dextranos), polialcoholes (p. ej., sorbitol, manitol, xilitol), sales (p. ej., cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos entre sí. Se usan adecuadamente mono- o disacáridos, siendo el uso de lactosa o glucosa, en particular pero no exclusivamente, en forma de sus hidratos.

Las partículas para su deposición en el pulmón requieren un tamaño de partícula menor de 10 micras, tal como de 1 a 9 micras, por ejemplo de 0,1 a 5 pm, en particular de 1 a 5 pm. El tamaño de partícula del ingrediente activo (tal como el anticuerpo o fragmento) es de primordial importancia.

Los gases propulsores que pueden usarse para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la materia. Los gases propulsores adecuados se seleccionan entre hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano y halogenohidrocarburos tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propulsores mencionados anteriormente se pueden usar solos o en mezclas de los mismos.

Son gases propulsores particularmente adecuados los derivados de alcanos halogenados seleccionados entre TG11, TG12, TG134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados anteriormente son especialmente adecuados TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y mezclas de los mismos.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor pueden contener también otros ingredientes tales como codisolventes, estabilizadores, agentes tensioactivos (tensioactivos), antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la materia.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor según la invención pueden contener hasta un 5 % en peso de sustancia activa. Los aerosoles según la invención contienen, por ejemplo, de 0,002 a 5 % en peso, de 0,01 a 3 % en peso, de 0,015 a 2 % en peso, de 0,1 a 2 % en peso, de 0,5 a 2 % en peso o de 0,5 a 1 % en peso del ingrediente activo.

Como alternativa, las administraciones tópicas al pulmón también pueden ser mediante la administración de una solución líquida o formulación de suspensión, por ejemplo empleando un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (p. ej., el nebulizador Pari LC-Jet Plus® conectado a un compresor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

El anticuerpo de la invención se puede procurar disperso en un disolvente, p. ej., en forma de una solución o suspensión. Puede suspenderse en una solución fisiológica apropiada, p. ej., solución salina u otro disolvente farmacológicamente aceptable o una solución tamponada. Las soluciones tamponadas conocidas en la materia pueden contener de 0,05 mg a 0,15 mg de edetato disódico, de 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, de 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, de 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anhidro y de 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sodio por 1 ml de agua para alcanzar un pH de aproximadamente 4,0 a 5,0. Una suspensión puede emplear, por ejemplo, anticuerpo liofilizado.

Las suspensiones terapéuticas o formulaciones en solución también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son bien conocidos en la materia e incluyen tampones (p. ej., tampón citrato, tampón fosfato, tampón acetato y tampón bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (p. ej., albúmina sérica), EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Las soluciones o suspensiones se pueden encapsular en liposomas o microesferas biodegradables. La formulación generalmente se proporcionará en una forma sustancialmente estéril empleando procesos de fabricación estériles.

Esto puede incluir producción y esterilización mediante filtración del disolvente/solución tamponada usada para la formulación, suspensión aséptica del anticuerpo en la solución de disolvente tamponada estéril y dispensación de la formulación en receptáculos estériles mediante métodos familiares para los expertos en la materias.

La formulación nebulizable según la presente divulgación se puede proporcionar, por ejemplo, como unidades de dosis única (p. ej., viales o recipientes de plástico sellados) envasadas en sobres de aluminio. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen, p.ej. de 2 ml, de disolvente/solución tampón.

Los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden ser adecuados para su provisión mediante nebulización.

También se prevé que el anticuerpo de la presente invención pueda administrarse mediante el uso de terapia génica. Para lograr esto, se introducen en un paciente secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera de la molécula de anticuerpo bajo el control de componentes de ADN apropiados, de tal manera que las cadenas de anticuerpo se expresen a partir de las secuencias de ADN y se ensamblenin situ.

En una realización, la presente divulgación comprende el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos como reactivo o diagnóstico, por ejemplo conjugados con una molécula indicadora. Por tanto, se proporciona un anticuerpo o fragmento según la divulgación que está marcado. En un aspecto, se proporciona una columna que comprende un anticuerpo o fragmento según la divulgación.

Por tanto, se proporciona un anticuerpo o fragmento anti-CSF-1R para uso como reactivo para usos tales como:

1) purificación de la proteína CSF-1R (o fragmento de unión de la misma): estando conjugada con una matriz y usada como columna de afinidad, o (como una forma modificada de anti-CSF-1R) como agente precipitante (p. ej., como una forma modificada con un dominio reconocido por otra molécula, que puede estar modificada), que opcionalmente se precipita mediante un reactivo anti-Fc)

2) detección y/o cuantificación de CSF-1R sobre células o en células, vivas o fijadas (célulasin vitroo en secciones de tejido o célula). Los usos para esto pueden incluir la cuantificación de CSF-1 R como biomarcador, para seguir el efecto del tratamiento anti-CSF-1R. Para estos fines, el candidato podría usarse en una forma modificada (p.

ej., mediante la adición de otro resto, como una proteína de fusión genética o un conjugado químico, tal como la adición de una molécula indicadora, por ejemplo, un marcaje fluorescente usado con fines de detección).

3) purificación o clasificación de células portadoras de CSF-1R marcadas mediante unión a candidato modificado mediante las formas ejemplificadas en (1) y (2). Cualquier referencia a un método de tratamiento practicado en el cuerpo humano o animal debe interpretarse como sustancias y composiciones para uso en tal tratamiento. La presente invención se describe con más detalle solo a modo de ilustración en los siguientes ejemplos, que se refieren a las siguientes figuras:

Figura 1A a 1Fmuestran ciertas secuencias de aminoácidos y polinucleótidos.

Figura 2A y 2Bmuestran alineamientos de ciertas secuencias.

Figura 3muestra la secuencia del dominio extracelular de CSF-1R humano codificado por un polinucleótido empleado para transfectar células y expresar la proteína sobre la superficie de la célula. Luego, estas células se emplearon para inmunizar a los animales hospedadores.

Figura 4muestra la inhibición de la unión de CSF-1 a células THP-1 mediante el anticuerpo Ab969.

Figura 5amuestra la inhibición de la supervivencia y proliferación impulsadas por CSF-1 por monocitos primarios humanos mediante el anticuerpo Ab969.

Figura 5bmuestra la inhibición de la supervivencia y proliferación impulsadas por IL-34 por monocitos primarios humanos mediante el anticuerpo Ab969.

Figura 6muestra la inhibición de la supervivencia y proliferación impulsadas por CSF-1 por monocitos primarios de múridos mediante el anticuerpo Ab535.

Figura 7muestra los niveles de CSF-1 R de la superficie celular en células THP-1 incubadas con Ab969, CSF-1 humano y un control de isotipo.

Figura 8muestra el nivel relativo de CSF-1R de la superficie celular en células THP-1 tratadas con Ab969 en comparación con un control de isotipo.

Figura 9muestra los niveles de CSF-1 R de la superficie celular en células RAW264.7 incubadas con Ab 535,

CSF-1 y un control de isotipo.

Figura 10muestra el nivel relativo de CSF-1 R de la superficie celular en células RAW264.7 tratadas con Ab535 en comparación con un control de isotipo.

Figura 11muestra el nivel de fosforilación de CSF-1R en células HEK293F transfectadas con CSF-R tras la estimulación con CSF-1 o el tratamiento con Ab969.

Figura 12muestra el nivel de secreción de MCP-1 de monocitos primarios humanos cuando se incuban con Ab969 y con CSF-1.

Figura 13muestra el efecto sobre la inhibición de la supervivencia de monocitos mediada por CSF-1 mediante el anticuerpo humanizado 969.g5 en comparación con el Ab969.g0 quimérico.

Figura 14muestra el efecto sobre la inhibición de la supervivencia de monocitos mediada por CSF-1 mediante varios injertos de anticuerpos humanizados de Ab969.

Figura 15amuestra la concentración de CSF-1 en muestras de suero tomadas de monos cinomolgos tratados con una dosis intravenosa única de 7 mg/kg de Ab969.g2.

Figura 15bmuestra la concentración de CSF-1 en muestras de suero tomadas de monos cinomolgos tratados con una dosis intravenosa única de 1,5 mg/kg de Ab969.g2.

Figura 15cmuestra el efecto de la administración del anticuerpo Ab969.g2 a monos cinomolgos en dosis de 7 mg/kg y 1,5 mg/kg en monocitos no clásicos circulantes en diferentes puntos temporales.

Figura 16muestra el efecto antitumoral del anticuerpo Ab535 frente a un anticuerpo de control, un control positivo y el control del vehículo en ratones desnudos inmunodeficientes portadores de trasplantes subcutáneos del xenoinjerto de cáncer de mama humano MCF-7.

Figura 17muestra la eficacia antitumoral del anticuerpo Ab535 frente a un anticuerpo de control, un control positivo y el control del vehículo en un modelo PC-3 de cáncer de próstata ortotópico.

Figura 18amuestra el efecto del tratamiento de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina con Ab535 sobre la concentración de colágeno de BALF en comparación con un control de isotipo.

Figura 18bmuestra el efecto del tratamiento de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina con Ab535 sobre la patología fibrótica de muestras de pulmón medida mediante la puntuación de Ashcroft en comparación con un control de isotipo.

Figura 18cmuestra el efecto del tratamiento de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina con Ab535 sobre la concentración de albúmina en el suero en comparación con un control de isotipo.

Figura 18del número de macrófagos en el líquido BAL de ratones de un estudio de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina y muestra que el tratamiento de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina con Ab535 reducía el número de macrófagos en el líquido BAL en comparación con los animales tratados con control de isotipo. Los datos se muestran como medias ± EEM; * designa una diferencia significativa con respecto al isotipo salino; # designa una diferencia significativa con respecto a los ratones tratados con bleomicina a los que se les dosificó anticuerpo de control de isotipo (p < 0,05)Figura 19imágenes representativas del análisis histopatológico de pulmones de animales tratados con control de solución salina, bleomicina más control de isotipo y bleomicina más Ab535.

Figura 20amuestra el efecto del tratamiento de ratones con deficiencia de ADA con fibrosis pulmonar inducida con Ab535 sobre la concentración de colágeno de BALF en comparación con el tratamiento con el control de isotipo.

Figura 20bmuestra el efecto del tratamiento de ratones con deficiencia de ADA con fibrosis pulmonar inducida con Ab535 sobre la patología fibrótica de muestras de pulmón medida mediante la puntuación de Ashcroft en comparación con el tratamiento con el control de isotipo.

Figura 20cmuestra el efecto del tratamiento de ratones con deficiencia de ADA con fibrosis pulmonar inducida con Ab535 sobre la concentración de albúmina en el suero en comparación con el tratamiento con el control de isotipo.

Figura 20dmuestra la cantidad de macrófagos en el líquido BAL de ratones de un modelo de fibrosis pulmonar con deficiencia de ADA y muestra que el tratamiento de ratones con deficiencia de ADA con fibrosis pulmonar inducida con Ab535 reducía la cantidad de macrófagos en el líquido BAL.

Figura 21muestra imágenes representativas del análisis histopatológico de pulmones de ratones normales (ADA+) y ratones con deficiencia de ADA con fibrosis pulmonar inducida (ADA-), ambos tratados con control de isotipo o Ab535.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Generación de un anticuerpo anti-CSF-1R

Inmunización:

Se inmunizaron ratas Sprague Dawley hembra con fibroblastos de rata RFL6 singénicos que habían sido transfectados transitoriamente con un vector que expresaba el dominio extracelular de CSF-1R humano ligado a un ancla de glicosilfosfatidilinositol (GPI). La Figura 3 muestra la SEQ ID NO: 39 que es la secuencia del dominio extracelular de CSF-1R humano usada en la inmunización de ratas.

Las ratas recibieron cinco inmunizaciones subcutáneas a intervalos de tres semanas de 3-9*106 células transfectadas por animal. Se inyectó adyuvante completo de Freund (50 % en PBS) en un sitio adyacente a la primera inmunización celular. Dos semanas después de la inmunización final, se recolectaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y bazos.

Cribado primario de sobrenadantes de anticuerpos

Inicialmente se cribó la capacidad de los sobrenadantes de anticuerpos para unirse al CSF-1R humano expresado en células HEK293 transfectadas mediante tecnología de ensayo de microvolúmenes de fluorescencia (FMAT).

Se identificaron aproximadamente 1000 pocillos con reactividad anti-CSF-IR en un cribado de FMAT primario de placas de 600 * 96 pocillos. En total, se cribó en aproximadamente 3*108 células B (esplenocitos de rata) la producción de anticuerpos de unión a CSF-1R mediante FMAt .

Cribado secundario de sobrenadantes de anticuerpos

Seideó un ensayo de rendimiento medio para identificar pocilios positivos para FMAT que contenían actividad anti-CSF-1R neutralizante, es decir, anticuerpos que tienen la capacidad de prevenir la unión del CSF-1 humano al receptor CSF-1R humano. Los sobrenadantes de anticuerpos se incubaron con células THP-1 que expresan CSF-1R antes de la incubación con CSF-1 humano. El nivel de unión de CSF-1 a células THP-1 se midió mediante citometría de flujo usando un anticuerpo policlonal anti-CSF-1. Se usaron sobrenadantes de anticuerpos irrelevantes como controles negativos.

El cribado secundario se aplicó a los sobrenadantes de 779 pocillos de anticuerpos y 88 de estos pocillos demostraron actividad bloqueante de CSF-1 detectable.

Cribado terciario de sobrenadantes de anticuerpos

Se probó la capacidad de los sobrenadantes de anticuerpos que habían mostrado actividad neutralizante en el cribado secundario para prevenir la supervivencia de monocitos primarios humanos dependiente de CSF-1. Los monocitos se purificaron de sangre humana y se incubaron 1*104 células con cada sobrenadante de anticuerpo en presencia de 20 ng/ml de CSF-1 humano. Después de 72 horas de incubación, se midió el número de monocitos viables mediante el ensayo CellTiter Glo.

El cribado terciario se aplicó a los sobrenadantes de 59 de los pocillos de anticuerpos identificados en el cribado secundario y 18 pocillos demostraron capacidad para reducir la supervivencia de monocitos mediada por CSF-1.

Clonación de regiones variables de anticuerpos y reanálisis de la actividad bloqueante

Se intentó clonar la región variable (región V) a partir de los 18 pocillos de anticuerpos que demuestran actividad neutralizante del CSF-1. Las regiones V de inmunoglobulina pesada y ligera se amplificaron mediante RT-PCR usando cebadores específicos para las regiones constantes de anticuerpos de rata y un conjunto de cebadores redundantes que se aparea con secuencias que codifican péptidos líderes de inmunoglobulina de rata. Los genes de las regiones V se recuperaron de 14 anticuerpos y se clonaron en vectores de expresión de IgG4 humana de cadena pesada y ligera.

Se transfectaron transitoriamente pares de vectores de anticuerpos en células HEK293F y se probó en el medio acondicionado la actividad neutralizante de CSF-1 en células THP-1 (como se describió anteriormente). Nueve de los anticuerpos tenían la capacidad de inhibir parcial o totalmente la unión de CSF-1 en comparación con el medio acondicionado de control.

Análisis de secuencia de nueve anticuerpos neutralizantes anti-CSF-1R.

Los nueve anticuerpos neutralizantes se secuenciaron para valorar la diversidad de secuencias. Los nueve anticuerpos eran únicos. Estos anticuerpos se clonaron y expresaron para estudios de perfiles adicionales.

Ejemplo 2 - Propiedades in vitro de Ab969 quimérico anti-CSF-IR humano y de Ab535 anti-CSF-IR de múrido

i) Expresión de Ab969 quimérico

Las regiones variables de los nueve anticuerpos neutralizantes identificados en el Ejemplo 1 se clonaron en vectores de expresión de cadenas pesadas y ligeras separados y se expresaron como anticuerpos IgG4 humanos de longitud completa.

Los genes VH se clonaron en el vector pVhg4FL(V19H), que contiene ADN que codifica una secuencia líder natural y la región constante de la cadena pesada gamma-4 humana con la mutación estabilizadora de bisagra S241P. Los genes VL (kappa) se clonaron en el vector pKH10.1 (V4L), que contiene ADN que codifica una secuencia líder natural y la región constante de la cadena kappa humana (alotipo Km3).

Los anticuerpos se expresaron mediante cotransfección transitoria de pares de vectores de cadena pesada y ligera coincidentes en células CHO-K1. La purificación de los anticuerpos en PBS pH 7,4 se efectuó de modo que el nivel de agregado en la preparación final fuera menor de 1 %.

El panel de nueve anticuerpos incluía un anticuerpo denominado anticuerpo 969. El anticuerpo quimérico que comprende las regiones variables de rata y la región constante de la cadena pesada gamma-4 humana y la región constante de cadena kappa humana se denomina anticuerpo 969 o anticuerpo 969cHcL o anticuerpo 969.g0 en los siguientes ejemplos.

ii) Ensayo de bloqueo de ligando

Se valoró la capacidad de cada uno de los nueve anticuerpos para inhibir la unión de CSF-1 a células THP-1 mediante citometría de flujo. Se incubaron células THP-1 con cada anticuerpo a 0,5, 0,125, 0,031, 0,0078 y 0,00195 pg/ml durante 30 minutos. Un anticuerpo IgG4 irrelevante sirvió como control de isotipo. Después del lavado, las células se incubaron con 0,5 pg/ml de CSF-1 humano durante 30 minutos. Después de un lavado adicional, se detectó el CSF-1 unido mediante incubación secuencial con anticuerpo anti-CSF-1 biotinilado y estreptavidina conjugada con Alexa488. El ligando unido al receptor se midió mediante citometría de flujo y se representó la intensidad de fluorescencia media (IFM).

Este ensayo identificó cuatro anticuerpos, incluyendo Ab969, que eran superiores a los anticuerpos restantes probados, demostrando una inhibición completa de la unión de CSF-1 a una concentración de 31,3 ng/ml. Los resultados para Ab969 se muestran en la Figura 4.

iii) Inhibición de CSF-1-ysupervivencia de monocitos mediada por IL-34

Anti-CSF-IR humano:

Se probó la capacidad de los anticuerpos anti-CSF-1 R humano purificados para inhibir la supervivencia y proliferación de monocitos primarios humanos impulsadas por CSF-1 e IL-34. En cada ensayo, se usó el mitógeno (CSF-1 o IL-34) a una concentración que proporcionara la máxima estimulación de los monocitos.

Se prepararon PBMC humanas a partir de sangre entera humana fresca en un gradiente de Ficoll y los monocitos se purificaron mediante selección negativa. Los monocitos se incubaron con 0,25 pg/ml de anticuerpo y 20 ng/ml de CSF-1 durante 72 horas y se determinó el número relativo de células viables mediante análisis CellTiter Glo. La lectura de luminiscencia se correlaciona con el número de células viables. Los resultados se muestran en la Figura 5a.

Se prepararon PBMC humanas a partir de sangre entera humana fresca en un gradiente de Ficoll y los monocitos se purificaron mediante selección negativa. Los monocitos se incubaron con 0,25 pg/ml de anticuerpo y 20 ng/ml de IL-34 durante 72 horas y se determinó el número relativo de células viables mediante análisis CellTiter Glo. La lectura de luminiscencia se correlaciona con el número de células viables. Los resultados se muestran en la Figura 5b.

Cuatro de los anticuerpos, incluyendo Ab969, demostraron una inhibición superior de la supervivencia de los monocitos en comparación con los anticuerpos restantes para la estimulación tanto de CSF-1 (Figura 5a) como de IL-34 (Figura 5b), según sus actividades de bloqueo de ligando.

Anti-CSF-1R de ratón:

Se purificaron monocitos CD11b+ primarios de múridos a partir de bazos de ratón. Luego, los monocitos se incubaron con una titulación de CSF-1 de múrido (mCSF-1) durante 24 horas. La liberación de MCP-1 en el medio celular se midió mediante ELISA y se demostró una liberación dependiente de la dosis de MCP-1 por mCSF-1. En un brazo separado del estudio, se añadieron 10 pg/ml de Ab535 anti-CSF-1R de múrido junto con la titulación de mCSF-1. Ab535 inhibió completamente la liberación de MCP-1 a todas las concentraciones de CSF-1 analizadas (Figura 6).

El ensayo de liberación de MCP-1 se efectuó usando monocitos primarios de múridos con una concentración constante de CSF-1 de 100 ng/ml y una titulación de Ab535. Se demostró una inhibición dependiente de la dosis de la liberación de MCP-1 y se calculó una CI50. Se determinó que la CI50 media de Ab535 de dos experimentos independientes era 8,08 ng/ml.

Conclusión: el tratamiento de monocitos de múrido con CSF-1 causaba una liberación dependiente de la dosis de MCP-1, que era completamente inhibida por el tratamiento con 10 pg/ml de Ab535. Ab535 inhibe la liberación de MCP-1 impulsada por CSF-1 de monocitos de múrido de una manera dependiente de la dosis, con una CI50 media de 8,08 ng/ml (n= 2). Este valor de CI50 es similar al exhibido por los anticuerpos anti-CSF-1 R humano.

iv) Afinidad

Se probó la capacidad de los anticuerpos para unirse a CSF-1R en un ensayo BIAcore midiendo la cinética de unión a una proteína de fusión de CSF-1R/Fc recombinante purificada.

El formato del ensayo era la captura de los anticuerpos anti-CSF-1R mediante anticuerpos anti-IgG,F(ab')2 humana inmovilizada, luego una titulación de hCSF-1 R/Fc sobre la superficie capturada. Se efectuó BIA (Análisis de Interacción Biomolecular) usando un BIAcore 3000 (GE Healthcare Bio-Sciences Ab). Todos los experimentos se efectuaron a 25 °C. Se inmovilizó un fragmento F(ab')2 de anticuerpo de cabra anti-IgG,F(ab')2 humana de Affinipure específico de fragmento (Jackson ImmunoResearch) en un chip sensor CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences AB) mediante química de acoplamiento de aminas hasta un nivel de ~5000 unidades de respuesta (UR). Se usó tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %, GE Healthcare Bio-Sciences AB) como tampón de procesamiento con un caudal de 10 pl/min. Se efectuó una inyección de un anticuerpo anti-CSF-1R para dar un nivel de captura de aproximadamente 100 UR en el anticuerpo anti-IgG,F(ab)2, humana inmovilizada.

Se pasó CSF-1R/Fc humana recombinante (R&D Systems) sobre el anticuerpo anti-CSF-1R capturado a 5 nM a un caudal de 30 ul/min durante 5 min y luego se aumentó el caudal a 100 ul/min durante 30 min para la fase de disociación. La inyección a 5 nM se efectuó dos veces junto con un control de tampón correspondiente. Estos sensogramas se usaron para generar la tasa de disociación. Se tituló CSF-1 R/Fc humana recombinante sobre el anticuerpo anti-CSF-1R capturado desde 2,5 nM a un caudal de 30 ul/min durante 5 min seguido de una fase de disociación de 10 min. Estos sensogramas se usaron para generar la tasa de asociación. La superficie se regeneró a un caudal de 10 ul/min mediante una inyección de 10 ul de HCl 40 mM seguida de una inyección de 5 ul de NaOH 10 mM. Las curvas de unión sustraídas del fondo con doble referencia se analizaron usando el software BIAevaluation (versión 4.1) siguiendo procedimientos estándares. Los parámetros cinéticos se determinaron a partir del algoritmo de ajuste.

Tres de los cuatro anticuerpos probados exhibían afinidades (K<d>) de menos de 10 pM. Esto se compara favorablemente con el reactivo paralelo anti-CSF-1R de múrido, Ab535. Los resultados para Ab969 y Ab553 se muestran en laTabla 1.

Tabla 1:

La afinidad de los anticuerpos también se midió mediante un ensayo celular usando células THP-1. Los anticuerpos se marcaron directamente con colorante fluorescente Alexa-488 y la afinidad se midió mediante citometría de flujo cuantitativa. Un análisis BIAcore adicional confirmó que la conjugación fluorescente de los anticuerpos no alteraba la afinidad hacia la proteína CSF-1R recombinante. Los resultados se muestran en laTabla 2.

Los valores de afinidad absoluta derivados de las dos metodologías son diferentes, y esta diferencia se observa habitualmente cuando se comparan los dos sistemas. Sin embargo, el método basado en células demostró que los anticuerpos se unen a CSF-1R con alta afinidad.

Tabla 2

v) Inhibición de la unión de CSF-1 (CI50)

Se analizaron cuatro anticuerpos midiendo su potencia relativa para inhibir la unión de CSF-1 a células THP-1. Los cuatro anticuerpos exhibían una potente inhibición de la unión de CSF-1 con valores de CI50 de menos de 5 ng/ml (~30 pM) en este formato de ensayo.

Tabla 3

vi) Reactividad cruzada de anticuerpos

Se probó en cuatro anticuerpos la reactividad cruzada con CSF-1R de mono Rhesus, mono cinomolgo y canino de longitud completa. Los cuatro anticuerpos se unían al CSF-1R de Rhesus y cinomolgo, además del CSF-1R humano, demostrando una unión clara significativamente por encima del nivel del control de isotipo.

Tabla 4

vii) Intemalización de CSF-1R

Ab969:

Se incubaron células THP-1 con Ab969 durante 0, 0,5, 2, 4, 24 y 48 horas. Las células también se trataron con CSF-1 humano y un control de isotipo que servían como control positivo y negativo respectivamente. En cada punto temporal, el nivel de CSF-1R en la superficie celular se midió mediante citometría de flujo (Figura 7). Se calculó el nivel relativo de CSF-1R en la superficie celular de las células tratadas con Ab969 en comparación con el control de isotipo y se muestra en la Figura 8.

El tratamiento de células THP-1 con CSF-1 recombinante causaba una disminución rápida y sostenida en el nivel de CSF-1R en la superficie celular; el ligando natural se une a su receptor afín e impulsa la internalización del complejo ligando-receptor.

Las células THP-1 tratadas con Ab969 exhibían niveles más altos de expresión de CSF-1R en la superficie celular en comparación con las células THP-1 no tratadas y tratadas con control de isotipo durante todo el transcurso de las 48 horas. Estos datos sugieren fuertemente que el tratamiento de células THP-1 con Ab969 no causa la internalización del hCSF-1 R expresado en la superficie celular hasta 48 horas después del tratamiento.

A medida que avanzaba el tiempo, hubo un aumento notable en el CSF-1R expresado en la superficie celular en las células THP-1 no tratadas y tratadas, con la excepción de las células tratadas con CSF-1. Esto podría deberse a cambios de expresión durante el período de crecimiento celular durante el periodo de tiempo de 48 horas del experimento y podría ser potencialmente una respuesta al estrés.

Para proporcionar más evidencias de que Ab969 no potencia la internalización del receptor y también descartar la posibilidad de que la estirpe celular THP-1 no sea fisiológicamente relevante, también se usaron monocitos primarios humanos en un ensayo de internalización. Los datos de este ensayo también demostraban que Ab969 no causa una internalización rápida del CSF-1R de la superficie celular en monocitos primarios humanos sanos.

Ab535:

La estirpe celular de monocitos/macrófagos leucémicos de ratón RAW264.7 expresa altos niveles de CSF-1R de múrido (mCSF-1R) y representa un sistema celular adecuado para probar si el anticuerpo anti-CSF-1R de múrido Ab535 puede provocar la internalización del receptor.

Se incubaron células RAW264.7 con Ab535 durante 0, 0,5, 2, 4, 24 y 48 horas. Las células también se trataron con CSF-1 humano y un control de isotipo que servían como control positivo y negativo respectivamente. En cada punto temporal, el nivel de CSF-1R en la superficie celular se midió mediante citometría de flujo (Figura 9). Se calculó el nivel relativo de CSF-1R en la superficie celular en comparación con el control de isotipo y se muestra en laFigura 10.

Los datos muestran que el tratamiento de células THP-1 con CSF-1 recombinante causaba una disminución rápida y sostenida en el nivel de CSF-1R en la superficie celular.

Se observó una clara reducción de los niveles de mCSF-1R en la superficie celular en células RAW264.7 tratadas con CSF-1 humano durante 2 horas en relación con las células no tratadas y las tratadas con control de isotipo. Esta reducción se mantiene durante las 48 horas del estudio. Esto demuestra que el CSF-1 humano provoca la internalización de mCSF-1R y valida el sistema experimental para monitorizar la internalización del receptor.

Las células RAW264.7 tratadas con Ab535 exhiben niveles similares de mCSF-1R en la superficie celular en comparación con las células no tratadas y las tratadas con control de isotipo durante todo el transcurso de tiempo de 48 horas. Como se esperaría que la internalización del receptor mediada por anticuerpos ocurriera dentro de este período de tiempo, estos datos sugieren firmemente que Ab535 no desencadena la internalización de mCSF-1 R.

Para proporcionar más evidencia de que Ab535 no potencia la internalización del receptor, se usaron monocitosmacrófagos CD11 b+ primarios de múridos en un ensayo de internalización. Estos resultados también demostraron que el tratamiento de monocitos-macrófagos de ratón con Ab535 no causa la internalización de mCSF-1 R expresado en la superficie celular hasta 24 horas después del tratamiento.

viii) Activación de CSF1-R

CSF-1 se une a CSF-1R, causando la formación de dímeros de receptores, lo que desencadena una rápida fosforilación del receptor al poner en estrecha proximidad los dominios de cinasa. Posteriormente, esto conduce a la internalización del receptor y a la activación de varias rutas de transducción de señales bien caracterizadas, incluyendo la ruta de Ras-MAPK. Es posible que un anticuerpo anti-CSF-1R pueda provocar la agrupación de receptores y desencadenar una cascada de señalización posterior. Esta puede ser una propiedad no deseada para un anticuerpo que debería inhibir la señalización del receptor, por lo que se probó el agonismo del receptor por Ab969 usando dos formatos de ensayoin vitroindependientes.

En el primer formato de ensayo, los anticuerpos se incubaron con células transfectadas con CSF-1R humano de longitud completa y la fosforilación del receptor y las moléculas de transducción de señales posteriores se monitorizaron mediante transferencia Western.

La estirpe celular THP-1 representaba un punto de partida para monitorizar el estado de activación de CSF-1R. Sin embargo, el nivel de expresión de CSF-1R en esta estirpe celular es relativamente bajo, lo que dificulta efectuar análisis bioquímicos. Por lo tanto, se ideó un sistema experimental para poder detectar de forma robusta el nivel de fosforilación de CSF-1 R. La fosforilación de CSF-1R se puede detectar en dos residuos de tirosina, Y723 e Y809. Además, se midió la fosforilación de p44/42 MAPK (Erk1/2) en T202 e Y204 como una lectura independiente de la actividad de CSF-1R. La estimulación con CSF-1 se incluyó como control positivo en todos los experimentos.

Se transfectaron células HEK293F con un vector plásmido que expresaba CSF-1R de longitud completa. Después de 24 horas de incubación en condiciones exentas de suero, las células se estimularon con una titulación de 100 pg/ml a 0,001 pg/ml de Ab969.g0 durante 5 minutos. Las células también se trataron con 500 ng/ml de CSF-1 recombinante para proporcionar un control positivo. Las células no tratadas se incluyeron como control negativo. Los lisados de proteínas de células tratadas y no tratadas se separaron mediante electroforesis con SDS-poliacrilamida y se transfirieron a nitrocelulosa. Se efectuó inmunotransferencia Western usando anticuerpos frente a fosfo-Y723 CSF-1 R (Cell Signaling Technology n.° 3151), fosfo-Y809 (Cell Signaling Technology n.° 3154), CSF-1R total (Cell Signaling Technology n.° 3152) y fosfo-ERK1/2 (p44/42 MAPK) (Cell Signaling Technology n.° 5301).

Las células HEK293F transfectadas con CSF-1R no estimuladas exhibían un nivel basal bajo de fosforilación de CSF-1R. La estimulación de células con CSF-1 daba como resultado un nivel de fosforilación de CSF-1 R en los residuos Y723 e Y809 que se observó fácilmente mediante análisis de transferencia Western (Figura 11). También había una clara estimulación de la fosforilación de ERK1/2 tras el tratamiento con CSF-1. El tratamiento de las células HEK293F transfectadas con el anticuerpo Ab969.g0 no estimulaba la fosforilación de CSF-1R ni potenciaba la activación de ERK1/2.

En un segundo ensayo, se incubó el anticuerpo Ab969 (monomérico y reticulado) con monocitos primarios humanos y se usó la secreción de MCP-1 como marcador de activación de CSF-1R. El tratamiento con CSF-1 de monocitos humanos causa que liberen proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1). Si los anticuerpos anti-CSF-1R tienen la capacidad de activar el receptor CSF-1R en los monocitos, se esperaría que ocurriera una liberación de MCP-1.

Los ensayos bioquímicos descritos anteriormente usaban únicamente anticuerpo anti-CSF-1R monomérico. Sin embargo, es posible que una IgG1 reticulada tenga una capacidad potenciada para poner en estrecha proximidad las moléculas de CSF-1R y desencadenar la fosforilación de tirosina y la señalización posterior. Para valorar esto, el ensayo de MCP-1 también se efectuó usando Ab969.g0 que se había reticulado con un anticuerpo anti-Fc humano.

Se prepararon monocitos humanos a partir de sangre completa humana de la siguiente manera: se recogieron 60-100 ml de sangre completa humana en tubos BD Vacutainer de 10 ml de heparina de litio de 171 UI. La sangre se dividió en 3-4 tubos Leucosep Ficoll (Greiner Bio-One) y se rellenó con PBS. Los tubos se centrifugaron a 1000 g, 20 °C durante 10 minutos sin freno y se recogió la capa de PBMC. Se sedimentaron las células y luego se aislaron los monocitos usando perlas CD14 humanas de selección positiva (Miltenyi Biotec 130-050-201) según el protocolo del fabricante. El anticuerpo Ab969.g0 se reticuló añadiendo anticuerpo de cabra anti-Fc de IgG humano (R&D Systems G-102-C) a una relación de 2:1 de Ab969.g0:Fc. Se sembraron monocitos a razón de 20.000 células por pocillo en medio en presencia de una titulación de dosis de anticuerpo Ab969.g0 o Ab969.g0 reticulado (serie de diluciones semilogarítmicas que comprende 16 concentraciones, máximo 10 pg/ml). Los pocillos de control no contenían anticuerpos, en presencia y ausencia de 100 ng/ml de CSF-1, y en presencia y ausencia de anticuerpo anti-Fc humano (a la misma concentración que la presente en la concentración superior de anticuerpo Ab969.g0 (5 pg /ml)). Las células se incubaron durante 24 horas, las placas se centrifugaron para sedimentar las células y se recogió el sobrenadante. La MCP-1 secretada se midió mediante MSD (K151AYB-2) según el protocolo del fabricante.

El resultado del experimento se muestra en la Figura 12. No se detectó ningún aumento en los niveles de MCP-1 para ninguno de los tratamientos con Ab969.g0, ya sea en formato monomérico o reticulado; la concentración de<m>CP-1 en el medio de las células tratadas era idéntica a la de las células no tratadas. Como se esperaba, las células tratadas con CSF-1 daban un aumento significativo y reproducible de los niveles de MCP-1.

Ejemplo 3 - Humanización del anticuerpo 969 y selección de injerto humanizado

Se seleccionaron cuatro anticuerpos anti-CSF-1R para la humanización basándose en su afinidad y propiedades medidas en el Ejemplo 2.

i) Generación de injertos humanizados

Los anticuerpos 969 y 970 se humanizaron injertando las CDR de las regiones V del anticuerpo de rata en marcos de la región V del anticuerpo de línea germinal humana.

Las CDR injertadas del donante a la secuencia aceptora son como las define Kabat (Kabatet al.,1987), con la excepción de CDR-H1 donde se usa la definición combinada de Chothia/Kabat (véase Adair et al., 1991 Humanised antibodies. WO91/09967).

La región V humana VK1 2-1 -(1) 012 más la región J JK4 (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) se eligió como aceptora de las CDR de cadena ligera. La región V humana VH2 3-1 2-70 más la región J JH3 (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) se eligió como aceptora de las CDR de cadena pesada.

Una serie de residuos de marco de las regiones V de rata se retuvieron en las secuencias humanizadas, como se muestra en la Tabla 1.

Los genes que codifican las secuencias iniciales de las regiones V de las cadenas ligera y pesada humanizadas, denominados gL1 y gH1, respectivamente, se diseñaron y construyeron mediante un enfoque de síntesis automatizada. Se crearon variantes adicionales de las regiones V de las cadenas ligera y pesada modificando los genes gL1 y gH1 mediante mutagénesis dirigida a oligonucleótidos.

Los genes VK (gL1 a gL9) se clonaron en el vector de expresión de cadena ligera humana pKH10.1, que contiene ADN que codifica la región constante de la cadena kappa humana (alotipo Km3). Los genes de VH (gH1 y gH2) se clonaron en el vector de expresión de la cadena pesada gamma-4 humana pVhy4P FL, que contiene ADN que codifica la región constante de la cadena pesada gamma-4 humana con la mutación estabilizadora de bisagra S241P (Angal et al., 1993, Mol Immunol. 30:105-8). Se cotransfectaron diferentes combinaciones de plásmidos que codifican las variantes de cadenas ligeras y pesadas en HEK293F, lo que dio como resultado la expresión de anticuerpos 969 recombinantes humanizados.

Los otros tres anticuerpos anti-CSF-1R también se humanizaron proporcionando un injerto conservador que contenía una serie de residuos del donante en las cadenas pesada y ligera que se predijo que eran importantes y un injerto completamente humanizado que no contenía residuos del donante.

ii) Afinidad de los anticuerpos humanizados

Se valoró cada injerto humanizado en cuanto a (i) afinidad de unión al CSF-1R humano mediante BIAcore y (ii) temperatura de fusión (Tm) medida mediante análisis ThermoFluor, ambos en relación con el anticuerpo quimérico original. Se cree que la temperatura de fusión proporciona una indicación temprana de la estabilidad de una molécula de anticuerpo, mostrando típicamente los anticuerpos inestables una Tm menor de 75,0 °C.

Los injertos que representan las etapas de humanización de Ab969 se muestran enTabla 5.La Tabla 5 también muestra el anticuerpo quimérico de Ab696 (969cHcL). El injerto conservador (969gH1gL1) exhibía una constante de afinidad (K<d>) de 2,4 pM, por lo que no había pérdida aparente de afinidad en comparación con el anticuerpo quimérico de rata (969cHcL). La Tm del injerto conservador 969gH1gL1 era de 78,8 °C y, por lo tanto, por encima del valor umbral de 75,0 °C. La sustitución del residuo del donante A78 por V78 en la cadena pesada para producir 969gH2gL1 no reducía la afinidad del anticuerpo (K<d>= 2,3 pM). Tras la sustitución gradual de los residuos del donante K38, Y71 y F87 por Q38, F71 e Y87 respectivamente, no se observaron cambios en la afinidad. El injerto humanizado final 969gH2gL8 que no contenía residuos del donante exhibía una afinidad similar al anticuerpo quimérico original (4,1 pM).

Tabla 5

Ab969 posee un potencial motivo de isomerización DG en la unión de CDR-L2 y el marco. Este residuo de ácido aspártico del sitio DG en los injertos 969gH2gL7 y 969gH2gL8 se mutó a serina para dar una secuencia SG inerte. BIAcore midió la afinidad hacia CSF-1R y no se detectó ninguna pérdida aparente de afinidad (Tabla 6). Además, los injertos finales 969H2gL7(SG) y 969gH2gL8(SG) retenían una Tm elevada de 80,5 °C y 79,9 °C respectivamente.

Tabla 6

La humanización de Ab969 y otro anticuerpo anti-CSF-1 R, Ab970, generaba anticuerpos completamente humanizados (sin residuos de donantes de rata presentes) con afinidad (K<d>) equivalente al anticuerpo quimérico original y una Tm que daba una predicción inicial de la estabilidad de la molécula. La versión completamente humanizada de Ab969 (969gH2gL8 s G)) pasó a llamarse Ab969.g5. De ahora en adelante, la versión quimérica de Ab969 se denominará Ab969.g0.

La afinidad de los injertos quiméricos y humanizados purificados de anticuerpos Ab969 hacia CSF-1R recombinante se midió nuevamente mediante análisis BIAcore. Los experimentos BIAcore anteriores efectuados durante el proceso de humanización se llevaron a cabo usando sobrenadantes de células brutos en lugar de anticuerpos purificados. Se detectó una ligera reducción en la afinidad, aumentando los valores de K<d>de aproximadamente 4 pM a 5 pM.

Tabla 7

iii) Inhibición de la supervivencia de monocitos mediada por CSF-1 por Ab969.g0 y Ab969.g5

Se requiere CSF-1 para la activación y supervivencia de los monocitos en cultivo; si se retira el CSF-1, los monocitos experimentan rápidamente apoptosis. Se ideó un ensayo que usaba MCP-1 (proteína quimiotáctica de monocitos-1; también conocida como CCL2, ligando 2 del motivo C-C de quimiocina) como lectura. Tras la estimulación con CSF-1, los monocitos humanos secretan MCP-1, que puede detectarse en los sobrenadantes de células mediante un ELISA, típicamente 24 horas después de la estimulación. La inhibición de la señalización de CSF-1R por anticuerpos que bloquean la unión de CSF-1 causa una reducción en la secreción de MCP-1.

Se prepararon PBMC humanas a partir de sangre entera humana fresca en un gradiente de Ficoll y monocitos CD14+ purificados por selección positiva. Un total de 2*10<4>monocitos se incubaron con una serie de diluciones semilogarítmicas de 10 pg/ml a 0,35 pg/ml de anticuerpo en presencia de 100 ng/ml de CSF-1 humano durante 24 horas. Se incluyeron controles que comprendían "sin anticuerpo, sin CSF-1" y "sin anticuerpo, con CSF-1" para proporcionar valores mínimos y máximos de liberación de MCP-1. Después de la incubación de 24 horas, las células se sedimentaron mediante centrifugación y se recogió el sobrenadante. La concentración de MCP-1 se midió usando el ELISA Human CCL2/MCP-1 DuoSet (R&D Systems DY279) siguiendo las instrucciones del fabricante.

De ahora en adelante, el ensayo se denominará "ensayo de inhibición de MCP-1".

Se empleó el ensayo de inhibición de MCP-1 para comparar la actividad de 969.g5 humanizado con Ab969.g0 quimérico. Se efectuaron cinco ensayos independientes usando cuatro donantes diferentes de monocitos. En todos los ensayos, el injerto humanizado Ab969.g5 exhibía una actividad significativamente menor inesperada en comparación con el anticuerpo quimérico original 969.g0. Un único experimento representativo se muestra en laFigura 13. La CI50 media para 969.g0 en el ensayo de monocitos era de 24,6 ng/ml, en comparación con 333,0 ng/ml para 969.g5. Esto indica una disminución de 13,5 veces en la potencia del anticuerpo cuando se comparan ambos anticuerpos usando este formato de ensayo.

Se efectuaron una serie de experimentos usando Ab969 para revelar por qué el anticuerpo humanizado exhibía una actividad reducida en el ensayo de inhibición de MCP-1. Los datos sugerían que la pérdida de actividad de Ab969.g5 observada en el ensayo de inhibición de MCP-1 se debía al orden en que se añadieron el anticuerpo y el ligando a las células diana. La actividad de Ab969.g0 y Ab969.g5 se reducía cuando se aplicaba un formato de ensayo competitivo, pero lo que es más importante, se detectaba un diferencial mayor en su actividad de bloqueo. Para analizar si una menor "tasa de asociación" de Ab969 humanizado podría ser responsable de la reducción de la potencia, se efectuó un análisis BIAcore. Estos datos habían identificado que, mientras que las K<d>de Ab969.g0 y Ab969.g5 eran similares, la Ka era menor para Ab969.g5, en 1,57*10<6>M'V en comparación con 2,16*10<6>M'V para 969.g0 (véase laTabla 5). En un ensayo competitivo, donde CSF-1 y el anticuerpo anti-CSF-1 R compiten por la unión al mismo receptor, una tasa de asociación del anticuerpo más lenta podría dar como resultado una actividad de bloqueo reducida si la tasa de asociación del ligando también es alta y el ligando está presente en una alta concentración. Se sabe que el CSF-1 humano tiene una tasa de asociación particularmente alta de 2,19 * 10<6>M'V<1>, similar a los anticuerpos, y el ensayo se efectuó con una concentración alta de CSF-1 (250 ng/ml).

Para proporcionar más evidencias de que la reducción en la actividad de bloqueo de 969.g5 era debida a una propiedad innata del anticuerpo, se desarrolló un ELISA que mide la unión de CSF-1 a CSF-1 R. A partir de ahora este método se denominará "ensayo ELISA de bloqueo del ligando". Este ensayo se efectuó usando unión competitiva, donde el CSF-1 y el anticuerpo se mezclaron previamente antes de su aplicación al CSF-1 R unido a la placa. El ensayo también se llevó a cabo para valorar la influencia de la concentración de CSF-1 sobre la actividad de los anticuerpos.

Cuando se midió la CI50 de 969.g0 y 969.g5 en el ELISA de bloqueo de ligando usando una concentración de CSF-1 de 1 ng/ml, ambos anticuerpos parecían tener una actividad similar con una CI50 de 12,83 ng/ml frente a 19,65 ng/ml respectivamente. Cuando se usó una concentración de 10 ng/ml de CSF-1 en el ensayo, la CI50 tanto de Ab969.g0 como de Ab969.g5 aumentaba, pero lo más importante es que el diferencial entre ellas aumentaba aún más hasta 79,29 ng/ml frente a 268,10 ng/ml respectivamente. La tendencia continuaba en un ensayo que usaba 100 ng/ml de CSF-1, donde Ab969.g0 y Ab969.g5 daban valores de CI50 de 828,70 ng/ml y 3947,00 ng/ml respectivamente. Un ensayo competitivo demuestra que Ab969.g5 es menos activo que Ab969.g0 para bloquear la unión de CSF-1 a CSF-1R. Esta reducción de la potencia se vuelve más pronunciada a medida que aumenta la concentración de CSF-1.

iv) Identificación de injertos humanizados de Ab 969 con actividad equivalente a Ab 969 quimérico en el ensayo de inhibición de MCP-1

Se preparó un panel de injertos intermedios humanizados de Ab969 mediante expresión transitoria para que pudiera compararse la actividadin vitro(Tabla 8). El anticuerpo quimérico correspondiente (Ab969.g0) y el injerto completamente humanizado (Ab969.g5) también se incluyeron en la expresión transitoria para poder hacer una comparación directa de las características de los anticuerpos dentro del mismo lote.

Tabla 8:

La actividadin vitrode cada anticuerpo se probó en el ensayo de inhibición de MCP-1. Se eligió el formato de ensayo que usa una titulación de CSF-1 con una única concentración de anticuerpo, ya que el formato permite el cribado rápido de un gran panel de anticuerpos y resalta cualquier actividad de bloqueo diferencial de CSF-1 R. En este ensayo, se detectó una liberación dependiente de la dosis de MCP-1 de los monocitos primarios humanos y se midió la capacidad relativa de cada anticuerpo para bloquear la actividad de cSF-IR mediante la concentración de CSF-1 donde se liberó MCP-1. Se sembraron monocitos a razón de 20.000 células por pocillo en medio en presencia de una titulación de CSF-1 humano recombinante (serie de diluciones dobles que comprende 18 concentraciones, máximo 500 ng/ml). Se añadió una dosis única de 1 pg/ml de anticuerpo. Las células se incubaron durante 24 h y se recogió el sobrenadante. La MCP-1 secretada se midió mediante ELISA. El ensayo de inhibición de MCP-1 reveló que los anticuerpos Ab969.g2 y Ab969.g7 retenían una alta actividad bloqueante de CSF-1R, y ambas entidades eran capaces de inhibir completamente la secreción de MCP-1 cuando se añadía CSF-1 a los monocitos a una concentración mayor de 100 ng/ml (Figura 14). En este ensayo, se detectó una clara pérdida de actividad para Ab969.g5, que sólo podía inhibir la secreción de MCP-1 hasta una concentración de CSF-1 de 10 ng/ml. De manera similar, el anticuerpo Ab969.g9 exhibía una actividad de bloqueo de CSF-1 R reducida en comparación con Ab969.g2 y Ab969.g7.

La CI50 de injertos humanizados de Ab969 seleccionados se midió en el ensayo de MCP-1 para proporcionar una valoración más exhaustiva de su capacidad relativa para inhibir la activación de monocitos mediada por CSF-1. Se consideró importante valorar la actividad de los anticuerpos usando varios donantes diferentes sin agrupar monocitos de fuentes mixtas. LaTabla 9muestra valores de CI50 de los anticuerpos acumulados a partir de ensayos efectuados en Ab969 usando 6 donantes diferentes.

Tanto el injerto humanizado Ab969.g2 como Ab969.g7 exhiben una CI50 relativa que es comparable con el anticuerpo quimérico Ab969.g0. En marcado contraste, Ab969.g5 exhibe mucha menos potencia en el ensayo (relación media de CI50 quimérica/injerto) de 19,6).

v) Afinidad del panel de anticuerpos Ab696 humanizados

La afinidad de cada injerto de anticuerpo humanizado Ab969 y el anticuerpo quimérico original se midió mediante BIAcore (Tabla 10) donde se llevaron a cabo tres experimentos independientes y se calcularon los valores medios. Los datos muestran que la afinidad (K<d>) no parece cambiar durante el proceso de humanización desde la molécula quimérica (Ab969.g0) hasta el anticuerpo "completamente humanizado" Ab969.g5. Sin embargo, la "tasa de asociación" de anticuerpos disminuye cuando la humanización avanza más allá del injerto Ab969.g2; tanto Ab969.g4 como Ab969.g5 poseen valores de Ka más bajos que los injertos anteriores. Además, la Ka para Ab969.g5 es menor que Ab969.g4, lo que potencialmente indica que la mutación del sitio de isomerización de DG a SG reduce aún más la tasa de asociación del anticuerpo.

Tabla 10:

Conclusiones:

Las pruebas de un panel de injertos humanizados de Ab969 en varios ensayos revelaban que el residuo de tirosina en la posición 71 (p. ej., Y71) dentro de la cadena ligera mejoraba la actividad del anticuerpo. Sustitución de Y71 por p.ej. una fenilalanina da como resultado una reducción de la tasa de asociación de anticuerpos (disminución de Ka) en relación con la molécula quimérica original. Esto da como resultado una capacidad reducida del anticuerpo para bloquear la unión de CSF-1 a CSF-1R, revelada en un ensayo que monitoriza la actividad de CSF-1R en monocitos primarios humanos (ensayo de inhibición de MCP-1).

Ejemplo 4 - Estabilidad molecular del panel de Ab696 humanizado.

i) Estabilidad térmica

La estabilidad térmica (medida como temperatura de fusión, Tm) se determinó mediante dos métodos independientes; un método monitoriza el desplegamiento mediante la unión de tinte fluorescente a superficies hidrofóbicas expuestas (método Thermofluor), el otro mediante calorimetría (DSC), una técnica ortogonal.

Tm medido por Thermofluor para diversos injertos de anticuerpo 969 (en PBS pH 7,4) se resume en la Tabla 11.

Tabla 11

En general, la Tm de Fab' medida por Thermofluor sugiere que la mayoría de los injertos de 969 son térmicamente más estables que el control de IgG4.

ii) El efecto de la concentración de la muestra sobre la propensión a la agregación

Como predictor de la estabilidad de las muestras durante el almacenamiento, se estudió el efecto de la concentración de anticuerpos sobre la estabilidad en PBS pH 7,4.

Experimento 1:

Los anticuerpos se concentraron a >10 mg/ml y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 días. Inmediatamente después de la concentración (T0) 969.g7 aparecía turbio y 969.g8 aparecía ligeramente opalescente. Por el contrario, la muestra de 969.g5 se consideró transparente mediante inspección visual. Después de 5 días de incubación a temperatura ambiente, la muestra de 965.g5 permaneció transparente, mientras que la agregación de 969.g7 y 969.g8 había avanzado aún más, exhibiendo cada uno un precipitado pesado.

A partir de este estudio, fue posible clasificar las muestras en orden de resistencia a la agregación en estas condiciones de la siguiente manera: 969.g5 > 969.g8 > 969g7.

Experimento 2:

Antes de la concentración, las tres muestras de anticuerpos eran transparentes mediante inspección visual con la excepción de 969,g6 (a 4,68 mg/ml) que aparecía opalescente. Tras la concentración a 16 mg/ml, se observó una precipitación de 969,g6 después de 24 horas de almacenamiento tanto a temperatura ambiente como a 4 °C. Sin embargo, tanto 969.g1 como 969.g4 permanecían visiblemente transparentes. Después de 5 días de incubación adicional, se evidenciaron partículas grandes en la muestra de 969.g1 tanto a temperatura ambiente como a 4 °C. No se observó agregación en la muestra de 969.g4 ni a temperatura ambiente ni a 4 °C, considerado por inspección visual.

A partir de este estudio fue posible demostrar que 969.g6 tenía cierta inestabilidad de agregación cuando se almacenaba a baja concentración (4,68 mg/ml) en PBS pH 7,4. Además, esta precipitación se vio exacerbada por una mayor concentración de anticuerpos. El 969.g1 concentrado mostraba una tasa de agregación más lenta, mientras que el 969.g4 concentrado permanecía estable hasta 5 días a cualquier temperatura de almacenamiento. Por lo tanto, el orden de estabilidad a la agregación era: 969.g4 > 969.g1 > 969.g6.

Experimento 3: Anticuerpos 969.g2, 969.g5, 969.g7 y 969.g9

El análisis se efectuó en las muestras inmediatamente después de la concentración (T0), después de una incubación durante la noche y 5 días después de la concentración. Todas las muestras eran transparentes mediante inspección visual antes de la concentración y no había evidencia de formación de partículas. Inmediatamente después de la concentración a 23,07 mg/ml, la muestra de 969.g7 mostraba precipitación como se había observado previamente en el experimento 1. Se observó una ligera opalescencia con 969.g9, que se hizo más notoria después de 24 horas de almacenamiento a temperatura ambiente o a 4 °C. Todos los otros injertos de 969 aparecían transparentes mediante inspección visual inmediatamente después de la concentración.

Después de 21 días de incubación no había más cambios visibles con respecto a los observados después de la incubación durante la noche a temperatura ambiente; tanto los injertos 969.g7 como 969.g9 agregaban como resultado de la concentración de las muestras, mientras que no había agregación visible obvia para las otras muestras.

En general, la muestra de 969.g2 mostraba la menor tendencia a agregarse como resultado del aumento de la concentración. Esto también se correlacionaba con la Tm más alta medida por Thermofluor.

Conclusión: Durante la expresión y purificación del panel de Ab969 humanizado, se hizo evidente que el aumento de la concentración de anticuerpos por encima de 10 mg/ml daba como resultado una rápida precipitación de algunos injertos de anticuerpos humanizados. Específicamente, Ab969.g1, Ab969.g6 y Ab969.g7 formaban precipitado, mientras que Ab969.g2, Ab969.g4 y Ab969.g5 no lo hacían. Estos datos indican que la sustitución del residuo de lisina en la posición 38 (K38) dentro de la cadena ligera por glutamina mejora la estabilidad del anticuerpo cuando se concentra por encima de 10 mg/ml.

Ejemplo 5 - Análisis in vitro de Ab969.g2

i) Secuencia de Ab969.g2

Ab969.g2 contiene el injerto de cadena ligera gL7 y el injerto de cadena pesada gH2. Los alineamientos de las secuencias de la región V del anticuerpo de rata (donante) con las secuencias de la región V de la estirpe germinal humana (aceptor) se muestran en las Figuras 2A y 2B, junto con las secuencias humanizadas finales para el injerto de cadena ligera gL7 y el injerto de cadena pesada gH2.

Los residuos del marco de la cadena pesada en el injerto gH2 provienen todos del gen de la estirpe germinal humana. El residuo de glutamina en la posición 1 del marco de la cadena pesada humana se reemplazó por ácido glutámico (E1) para mejorar la expresión y purificación de un producto homogéneo, p. ej. mediante la conversión de glutamina en piroglutamato en el extremo N de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos.

Los residuos del marco de la cadena ligera en el injerto gL7 provienen todos del gen de la estirpe germinal humana, con la excepción del residuo 71 (numeración de Kabat), donde se retenía el residuo de tirosina del donante. La retención de este residuo proporcionaba una potencia mejorada del anticuerpo humanizado como se muestra en el Ejemplo 3.

ii) Inhibición de la activación de monocitos humanos dependiente de IL-34

La actividad de Ab969.g2 en comparación con 969.g0 se valoró en el ensayo de monocitos humanos dependiente de IL-34. El experimento se efectuó usando dos donantes de monocitos separados y se calculó la CI50 media para la inhibición de la estimulación de monocitos mediada por IL-34 (Tabla 12). No había diferencias significativas en la CI50 entre Ab969.g2 y Ab969.g0.

Se sembraron monocitos primarios humanos a razón de 20.000 células por pocillo en presencia de 100 ng/ml de IL-34 humana recombinante y una titulación de dosis de anticuerpo anti-CSF-1R (serie de dilución semilogarítmica que comprende 16 concentraciones, máximo 10 pg/ml). Las células se incubaron durante 24 horas y se recogió el sobrenadante. La MCP-1 secretada se midió mediante ELISA (R&D Systems DY279). El gráfico muestra el porcentaje de inhibición de la producción de MCP-1 en comparación con el control de solo CSF-1.

Tabla 12

iii) Unión de Ab969.g2 a SNP de CSF-1R humano

Hay cuatro polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) no sinónimos localizados dentro del dominio de unión al ligando del gen Cs F-1R humano que se han reseñado en la población humana. Estos SNP son V32G, A245S, H247P y V279M (Figura 1F). Cada variante de SNP de CSF-1R humano se generó y expresó de manera estable en estirpes celulares. La unión de Ab969.g2 a cada SNP se confirmó mediante citometría de flujo.

Ejemplo 6 - Análisis de marcadores farmacodinámicos en mono cinomolgo

Se efectuó un estudio farmacocinético/farmacodinámico (PK/PD) con el anticuerpo monoclonal humanizado anti-CSF-1R 969.g2 para demostrar la actividad farmacológica del anticuerpo en un primate no humano (mono cinomolgo). A grupos de tres monos cinomolgos se les dosificó por vía intravenosa una dosis única de 7 mg/kg (Grupo 1) o 1,5 mg/kg (Grupo 2) de anticuerpo 969.g2. El anticuerpo fue bien tolerado sin signos clínicos adversos. Se tomaron muestras de suero en múltiples puntos temporales a lo largo de los 25 días del estudio.

La concentración sérica de 969,g2 se midió mediante ELISA y se efectuó un análisis farmacocinético (Tabla 13). Los parámetros PK se calcularon usando el software WinNonlin.

ti/2 es la vida media del anticuerpo en suero.

Cmáx es la concentración máxima de anticuerpos en suero.

AUC es el área bajo la curva (la integral de la curva de concentración-tiempo) y proporciona una indicación de la exposición total al fármaco.

El aclaramiento es el volumen de plasma del que se elimina el fármaco por unidad de tiempo.

Vol. dist. es el volumen de distribución, el volumen aparente en que se distribuye un fármaco.

Había una buena correlación entre los valores observados y predichos (el animal 2 fue una excepción y se consideró un valor atípico). Cmáx era proporcional a la dosis; el AUC era mayor que la dosis proporcional, lo que indica un aclaramiento más lento con la dosis más alta. La mayoría de 969.g2 se detectó en el suero.

Tabla 13

La vía principal para el aclaramiento del CSF-1 es mediante la unión a su receptor afín, CSF-1 R. Se espera que el bloqueo de la unión de CSF-1 a CSF-1R aumente la concentración sérica de CSF-1 mediante la prevención del aclaramiento mediado por el receptor; un fenómeno que se ha observado en modelos de múrido. Por lo tanto, un aumento en la concentración sérica de CSF-1 es un marcador farmacodinámico de la participación e inhibición de CSF-1R.

Ambas dosis de 969,g2 promovían una acumulación rápida y significativa de CSF-1 sérico. El efecto dependía de la dosis, con la dosis de 7 mg/kg dando una concentración pico de CSF-1 aproximadamente 10 veces mayor que la dosis de 1,5 mg/kg. Se observó una relación farmacocinética/farmacodinámica con la normalización de los niveles de CSF-1 después del aclaramiento del anticuerpo. Los niveles de CSF-1 volvían al valor basal al final del estudio para ambos grupos de tratamiento. Los resultados se muestran en lasFiguras 15ay15b.

LaFigura 15amuestra la concentración de CSF-1 en muestras de suero tomadas de monos cinomolgos tratados con una dosis intravenosa única de 7 mg/kg de Ab969.g2. La concentración sérica de CSF-1 se midió en dos ensayos independientes. El gráfico muestra la concentración media de CSF-1 para los tres animales del Grupo 1 (7 mg/kg) con error estándar (cuadrados). También se muestra la concentración sérica media de Ab969.g2 (círculos).

LaFigura 15bmuestra la concentración de CSF-1 en muestras de suero tomadas de monos cinomolgos tratados con una dosis intravenosa única de 1,5 mg/kg de Ab969.g2. La concentración sérica de CSF-1 se midió en dos ensayos independientes. El gráfico muestra la concentración media de CSF-1 para los tres animales del Grupo 2 (1,5 mg/kg) con error estándar (cuadrados). También se muestra la concentración sérica media de Ab969.g2 (círculos).

Hay dos poblaciones principales de monocitos humanos y de mono cinomolgo circulantes; (i) monocitos CD14+ CD16-'clásicos' y (ii) monocitos CD14+ CD16+ 'no clásicos' o 'residentes'. Los modelos de múrido han demostrado que los macrófagos tisulares residentes, incluyendo los TAM, derivan de la población de monocitos no clásica. Además, los monocitos no clásicos derivan de una mayor diferenciación de la población de monocitos clásicos. Las poblaciones de monocitos circulantes en monos cinomolgos dosificados con 969,g2 se monitorizaron mediante citometría de flujo de cuatro colores de sangre total. La citometría de flujo se efectuó usando anticuerpos anti-CD45-PerCP cinomolgo, anti-HLA-DR-APC humano, anti-CD14-FITC humano (clon My4) y anti-CD16-PE humano (clon 3G8). Las ventanas se establecieron usando el control de isotipo apropiado para cada anticuerpo. Los monocitos clásicos se definieron como CD45+ HLA-DR+ CD14+ CD16\ Los monocitos no clásicos se definieron como CD45+ HLA-DR+ CD14+ CD16+.

Ambas dosis de 969.g2 provocaron un agotamiento gradual de monocitos CD14+ CD16+ no clásicos durante la primera semana del estudio. El agotamiento casi total de monocitos no clásicos fue causada por la dosis de 7 mg/kg. La reducción de monocitos no clásicos por dosis de 7 mg/kg y 1,5 mg/kg parecía alcanzar su punto máximo en el punto temporal del día 4, y las cifras volvieron a la normalidad en el día 11. Los resultados se muestran en la Figura 15c. Los gráficos de barras muestran el número medio de monocitos CD14+ CD16+ no clásicos circulantes en puntos temporales a lo largo del estudio (días (D) 0, 1,4, 18 y 25) con error estándar. La concentración sérica media de CSF-1 también se representa con error estándar.

Este ejemplo (i) confirmaba que el anticuerpo 969.g2 era capaz de unirse a CSF-1R y bloquear la unión de CSF-1 en el mono cinomolgo, (ii) demostraba la actividad farmacológica del anticuerpo 969.g2 en un modelo de primate no humano, (iii) demostraba que el anticuerpo 969.g2 agotaba selectivamente la población no clásica de monocitos de mono cinomolgoin vivo- la población de monocitos que se cree que son precursores de macrófagos asociados a tumores, y (iv) confirmaba que la concentración sérica de CSF-1 era adecuada como biomarcador para medir la actividad de 969.g2.

Ejemplo 7: Inhibición del crecimiento del xenoinjerto de cáncer de mama MCF-7

El anticuerpo 969.g2 no es capaz de unirse al CSF-1 R de ratón. Por consiguiente, se llevaron a cabo estudiosin vivoen ratones usando un anticuerpo anti-CSF-1R de múrido Ab535 para mostrar la utilidad de Ab969.g2 para tratar el cáncer y la fibrosis. Se ha mostrado que Ab535 tiene propiedades y actividad comparables a Ab969.g2 en una serie de experimentosin vitro.

Se ha mostrado que Ab535 inhibe la supervivencia de monocitos mediada por CSF-1 en el Ejemplo 2 iii), tiene una afinidad comparable en el Ejemplo 2 iv) y no desencadena la internalización de CSF-1 R en el Ejemplo 2 vii).

Como estudioin vivode Ab535, se llevó a cabo el modelo de xenoinjerto de cáncer de mama MCF-7in vivode la siguiente manera:

El estudio medía la eficacia terapéutica del anticuerpo Ab535, administrado por vía subcutánea (s.c.), frente a un anticuerpo de control, un control positivo y el control del vehículo en ratones desnudos inmunodeficientes portadores de trasplantes subcutáneos del xenoinjerto de cáncer de mama humano MCF-7. Se usó la inhibición del crecimiento tumoral como parámetro terapéutico. El cáncer de mama humano MCF-7 se usó como modelo de xenotrasplante subcutáneo en ratones hembra NMREnu/nu inmunodeficientes. La estirpe celular MCF-7 se obtuvo del banco de tumores del Instituto Nacional del Cáncer (EE. UU.). Para uso experimental, se cultivaron célulasin vitroen medio RPMI 1640 10 % de FCS. Se tomaron células de cultivos subconfluentes y se inocularon por vía subcutánea en ratones. Cuando el tamaño del tumor fue palpable (4-10 mm) se inició el tratamiento. Los compuestos de prueba y el control del vehículo se procuraron s.c. tres veces por semana. El control positivo se administró por vía intravenosa una vez al día los días 24, 33 y 40. Los volúmenes de inyección se ajustaron individualmente al peso corporal en el momento de la inyección. Los diámetros de los tumores se midieron tres veces por semana con un calibre. Los volúmenes de los tumores se calcularon según V = (largo x (ancho)2)/2. Para el cálculo del volumen relativo del tumor (VRT), los volúmenes de cada día de medición se relacionaron con el día del primer tratamiento. En cada día de medición, se calcularon la mediana y la media de los volúmenes tumorales por grupo y también la mediana de los valores de tratado a control (T/C) en porcentaje.

Los resultados se muestran enFigura 16.Ab535 mostraba un efecto antitumoral dependiente de la dosis. Ambas dosificaciones del anticuerpo IgG de ratón de control no inducían una inhibición del crecimiento tumoral. Los volúmenes tumorales relativos eran comparables con el control del vehículo y el control positivo causaba la inhibición del crecimiento tumoral.

Conclusión: el anticuerpo de prueba Ab535 inducía un efecto antitumoral estadísticamente significativo en el xenoinjerto de cáncer de mama humano MCF-7 a la dosis más alta (30 mg/kg/día).

Ejemplo 8: Inhibición del crecimiento del cáncer de próstata ortotópico PC-3

Se probó también la eficacia antitumoral y antimetastásica del anticuerpo Ab535 usando un modelo de cáncer de próstata ortotópico PC-3in vivo.La estirpe celular PC-3 fue alterada genéticamente para expresar continuamente luciferasa permitiendo el análisisin vivode imagenología de bioluminiscencia, que permitió monitorizar el crecimiento del tumor in vivo y efectuar análisisex vivode metástasis en órganos seleccionados.

El estudio consistía en 6 grupos experimentales, cada uno de los cuales contenía 11 (Grupo 5) o 12 (todos los demás grupos) ratones macho desnudos NMRI después de la aleatorización. El día 0, se implantaron ortotópicamente células PC-3 en la próstata de todos los ratones macho desnudos NMRI participantes. El día 3, se verificó el inicio del crecimiento tumoral mediante imagenología de bioluminiscenciain vivo.El día 8, se efectuó una segunda imagenología de bioluminiscencia in vivo y los animales con tumores se aleatorizaron en seis grupos según los resultados de la imagenología, de tal modo que la intensidad media de la bioluminiscencia y, por tanto, el tamaño del tumor fuera similar en cada grupo. Al día siguiente (día 9), se inició la terapia. Los animales de los Grupos 2 y 3 recibían 30 y 10 mg/kg de Anticuerpo de Control, respectivamente, 3 veces por semana s.c. hasta el día 42. Los animales de los Grupos de Tratamiento 4 y 5 recibían 30 y 10 mg/kg de anticuerpo Ab535, respectivamente, 3 veces por semana s.c. hasta el día 42. Los animales del Grupo 1 representaban el Control de Vehículo y recibían Vehículo (PBS) 3 veces por semana s.c. hasta el día 42. Los animales del Grupo 6 representaban el Control Positivo y recibían 360 mg/kg de control i.v. una vez por semana durante cuatro semanas (los días 10, 17, 24 y 31). Durante el transcurso del estudio, se monitorizó el crecimiento de los tumores PC-3 implantados ortotópicamentein vivolos días 3, 8 (aleatorización), 15, 22, 29, 36 y 43 usando imagenología de bioluminiscencia.

Se efectuó una necropsia al final del estudio. Se determinaron el peso y el volumen del tumor primario. Se recogieron órganos seleccionados (hígado, bazo y pulmón), una porción de cada uno se fijó en formalina y el resto se analizó con respecto al patrón de metástasis mediante imagenología de bioluminiscencia usando un ensayoin vitrode luciferasa. Además, se recogieron el fémur de una pata y la misma porción de la columna lumbar para analizar el patrón de metástasis en los huesos usando el ensayoin vitrode luciferasa.

La señal de bioluminiscenciain vivoestaba compuesta tanto por tumor primario como por metástasis (imagenología de todo el cuerpo). Basándose en estos datos, se podía calcular una curva de crecimiento tumoral para todos los grupos (Figura 17). El desarrollo del tumor era homogéneo en todos los grupos de estudio hasta la aleatorización y el inicio de la terapia. A continuación, el Grupo de Control de Vehículo 1 así como los dos Grupos 2 y 3 de Anticuerpo de Control RTE11 mostraban un crecimiento tumoral regular. Se pudo observar una reducción muy significativa del crecimiento tumoralin vivoel día 43 para el control positivo (Grupo 6). El anticuerpo Ab535, administrado a 30 o 10 mg/kg, respectivamente (Grupos 4 y 5), conducía a una reducción significativa del crecimiento tumoral cuando se monitorizaba mediante imagenología de bioluminiscenciain vivo.

Los volúmenes de los tumores primarios y los pesos húmedos se determinaron durante la necropsia el día 44. El control positivo (Grupo 6) conducía a una reducción muy significativa tanto del volumen como del peso del tumor primario. Se administró el anticuerpo Ab535 a 30 mg/kg (Grupo 4), se pudo observar una reducción significativa tanto del volumen como del peso del tumor primario. Cuando se administró Ab535 a 10 mg/kg (Grupo 5), la reducción del volumen del tumor era notable pero menor que la mostrada por el Grupo 4. No se pudo observar eficacia antitumoral significativa en el caso del Anticuerpo de Control.

Usando la técnica de imagenología por bioluminiscencia, se midieron las actividades de luciferasa del tumor primario después de la necropsia. Los resultados obtenidos eran comparables a los resultados de los hallazgos de la necropsia y a la curva de crecimientoin vivo.El control positivo (Grupo 6) conducía a una reducción muy significativa de la actividad de la luciferasa del tumor primario. El anticuerpo Ab535, administrado a 30 mg/kg (Grupo 4), conducía a una reducción significativa de la actividad de la luciferasa del tumor primario, mientras que la reducción era menor cuando Ab535 se administró a 10 mg/kg (Grupo 5). No se pudo encontrar una reducción significativa de la actividad luciferasa para el Anticuerpo de Control.

Se analizaron varios órganos adicionales (hígado, bazo, pulmón, fémur y una parte de la columna lumbar) usando la técnica de imagenología de bioluminiscencia ex vivo. En el caso del control positivo, se pudieron mostrar reducciones significativas de la actividad de la luciferasa en el fémur y la columna lumbar, mientras que la reducción de la señal era ligeramente menor que la significativa en el caso del hígado y el bazo. En el caso del anticuerpo Ab535, administrado a 30 mg/kg (Grupo 4), la reducción de la actividad de la luciferasa era significativa para el hígado y notable para todos los demás órganos. El Anticuerpo de Control (grupos 2 y 3) no conducía a ninguna reducción de la actividad de la luciferasa en todos los órganos probados.

En conclusión, se pudo demostrar una eficacia antitumoral significativa para el anticuerpo Ab535 en este modelo tumoral, combinada con una notable eficacia antimetastásica.

Ejemplo 9: Efecto del anticuerpo anti-CSF-IR en un modelo in vivo de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina

La bleomicina es un antibiótico aislado por primera vez deStreptomyces verticillatusy se ha usado como quimioterapéutico para diversos cánceres. El modelo de fibrosis pulmonar con bleomicina es un modelo bien establecido y se usó esencialmente como se describe en Madtes, DK et al, 1999, Am J Respir Cell Mol Biol, 20, 924 34. El protocolo detallado se puede encontrar en la siguiente referencia. Morschl, F., Molina, J. G., Volmer, J., Mohsenin, A., Pero, R. S., Hong, J. S., Kheradmand, F., Lee, J. J. y Blackburn, M. R. (2008), A3 adenosine receptor signaling influences pulmonary inflammation and fibrosis. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 39: 697-705.

Todos los ratones usados eran ratones hembra C57Blk6 de tipo silvestre (20 g) adquiridos en Harlan Labs. Se usó una instilación intratraqueal (IT) directa en donde los ratones se anestesiaron con avertina y se efectuó una traqueotomía para instilar una dosis de 3,5 unidades de bleomicina en 50 pl de solución salina o 50 pl de solución salina sola como control. El tratamiento de esta manera conduce a una fase inflamatoria que alcanza su punto máximo el día 7 después de la exposición a la bleomicina y una fase fibrótica que alcanza su máximo el día 21 después de la exposición. Se investigó el efecto del anticuerpo Ab535 cuando el anticuerpo se dosificó solo en la fase fibrótica del modelo y se administró por vía subcutánea a 30 mg/kg, tres veces por semana desde el día 9 al 21. Los animales se sacrificaron el día 21 y las lecturas incluían análisis histopatológico de los pulmones, celularidad del líquido BAL (lavado broncoalveolar) y la medición de colágeno soluble en el líquido BAL. Se realizó un análisis histopatológico para calificar el daño pulmonar usando un sistema de puntuación de Ashcroft modificado para determinar la gravedad de la fibrosis pulmonar. Hubner RH et al, 2008, Biotechniques 44: 507-17). Los pulmones extirpados se inflaron con formalina al 10 % hasta una presión de 25 cm y se procesaron a través de una serie de alcoholes y xileno, se embebieron en parafina y las secciones de tejido se desparafinaron antes del procesamiento y la tinción con tricrómico de Masson.

La cantidad de colágeno soluble en el líquido BAL se valoró usando un kit de ensayo Sircol disponible comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante.

El efecto sobre la población de macrófagos en el líquido BAL se determinó usando preparaciones de Cytospin. Se centrifugaron alícuotas de células BAL en portaobjetos de microscopio, se tiñeron con Diff-Quick y se contaron los macrófagos.

Se encontró que el tratamiento terapéutico con el anticuerpo anti-CSF-1 R, Ab535, con la dosificación iniciada el día 9, daba como resultado una fibrosis pulmonar inducida por bleomicina muy reducida. Tanto la gravedad como el alcance de la fibrosis se redujeron significativamente. Los ratones tratados reducían la producción de colágeno, mejoraban la patología fibrótica y mejoraban la protección de la barrera pulmonar.

LaFigura 18amuestra que el tratamiento de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina con Ab535 reducía la concentración de colágeno de BALF en comparación con el tratamiento con el control de isotipo.

LaFigura 18bmuestra que el tratamiento de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina con Ab535 reducía la puntuación de Ashcroft de las muestras en comparación con el tratamiento con el control de isotipo, lo que muestra por tanto que los ratones tratados con Ab535 habían mejorado la patología fibrótica.

LaFigura 18cmuestra que el tratamiento de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina con Ab535 reducía la concentración de albúmina en el suero en comparación con el tratamiento con el control de isotipo, lo que muestra por tanto que la permeabilidad vascular de los ratones tratados con Ab535 mejoró.

LaFigura 19muestra imágenes representativas del análisis histopatológico de pulmones de animales tratados con control de solución salina, bleomicina más control de isotipo y bleomicina más Ab535. Los animales tratados con Ab535 tenían una fibrosis pulmonar muy reducida en comparación con los animales de control de isotipo tratados con bleomicina.

Ejemplo 10. Efecto del anticuerpo anti-CSF-1R en un modelo de fibrosis pulmonar en ratón con deficiencia de adenosina desaminasa

La adenosina es un potente nucleósido de señalización, cuyos niveles aumentan cuando las células sufren estrés o están dañadas y se produce una amplia variedad de respuestas cuando la adenosina interactúa con sus receptores acoplados a proteína G específicos. La adenosina desaminasa (ADA) es una enzima del catabolismo de las purinas que convierte la adenosina en inosina. Se han generado ratones con desactivación génica de ADA y se ha mostrado que tienen niveles elevados de adenosina en el suero y en tejidos como el riñón, el hígado y el pulmón (Blackburn, Mr et al., 1998, J Biol Chem, 273(9): 5093-5100). Estos ratones exhiben características de enfermedad pulmonar crónica, tales como destrucción alveolar, inflamación de las vías respiratorias y producción excesiva de moco, que se asocian con niveles elevados de adenosina en el pulmón (Blackburn MR et al., 2000, J Exp Med, 192: 159-70). Los efectos son tales que los ratones mueren a las tres semanas de edad debido a dificultad respiratoria. La administración de ADA exógena usando un régimen de dosis bajas reduce los niveles de adenosina y extiende el tiempo de vida de estos ratones, lo que permite desarrollar un modelo de fibrosis pulmonar (Chunn JL et al., 2005, J Immunol 175: 1937 46, Pedrosa M et al, 2011, PLoS One, 6(7): e22667). En este modelo, la elevación crónica de los niveles de adenosina se asocia con un aumento de mediadores profibróticos, incluyendo el TGFD-1 en los pulmones, un aumento de la deposición de colágeno en el tejido pulmonar y un aumento de la patología pulmonar fibrótica. Para investigar el efecto de las moléculas con potencial antifibrótico, los ratones con deficiencia de Ad a se mantienen con un régimen de dosis bajas de ADA exógena durante varias semanas, luego se detiene el tratamiento con ADA y se administra el potencial agente antifibrótico.

Se investigó el efecto del anticuerpo anti-CSF-1 R Ab535 en el modelo de fibrosis pulmonar en ratón con desactivación génica para ADA. En este modelo, los ratones con deficiencia de enzima se mantuvieron con terapia con enzima ADA desde el día 1 hasta el día 21 después del nacimiento. Se preparó un conjugado de ADA-polietilenglicol (PEG) (Young HW et al, 2004, J Immunol 173: 1380-89) y se administraron inyecciones intramusculares los días posnatales 1, 5, 9, 13 y 17 (0,625, 1,25, 2,5, 2,5 y 2,5 unidades respectivamente), seguidas de 5 unidades inyectadas por vía intraperitoneal el día 21. No se administraron más enzimas después del día 21. Ab535 se dosificó por vía subcutánea a 30 mg/kg, en un volumen de 100 pl tres veces/semana desde el día 25 (posnatal) hasta que los animales fueron sacrificados el día 42.

Los animales se sacrificaron el día 42 y las lecturas incluían análisis histopatológico de los pulmones, celularidad del líquido BAL y cuantificación de colágeno soluble en el líquido BAL. Se realizó un análisis histopatológico para calificar el daño pulmonar usando un sistema de puntuación de Ashcroft modificado para determinar la gravedad de la fibrosis pulmonar (Hubner et al, 2008, Biotechniques 44: 507-17). Los pulmones extirpados se inflaron con formalina al 10 % hasta una presión de 25 cm y se procesaron a través de una serie de alcoholes y xileno, se embebieron en parafina y las secciones de tejido se desparafinaron antes del procesamiento y la tinción con tricrómico de Masson.

La cantidad de colágeno soluble en el líquido BAL también se valoró usando un kit de ensayo Sircol disponible comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se encontró que el tratamiento terapéutico con el anticuerpo anti-CSF-1 R Ab535 reducía significativamente la fibrosis pulmonar en ratones con deficiencia de ADA. Los ratones tratados reducían la producción de colágeno, mejoraban la patología fibrótica y mejoraban la función y protección de la barrera pulmonar.

LaFigura 20amuestra que el tratamiento de ratones con deficiencia de ADA con fibrosis pulmonar inducida con Ab535 reducía la concentración de colágeno de BALF en comparación con el tratamiento con el control de isotipo.

LaFigura 20bmuestra que el tratamiento de ratones con deficiencia de ADA con fibrosis pulmonar inducida con Ab535 reducía la puntuación de Ashcroft de las muestras en comparación con el tratamiento con el control de isotipo, lo que muestra por tanto que los ratones tratados con Ab535 habían mejorado la patología fibrótica.

LaFigura 20cmuestra que el tratamiento de ratones con deficiencia de ADA con fibrosis pulmonar inducida con Ab535 reducía la concentración de albúmina en el suero en comparación con el tratamiento con el control de isotipo, lo que muestra por tanto que la permeabilidad vascular de los ratones tratados con Ab535 mejoró.

LaFigura 20dmuestra que el tratamiento de ratones con deficiencia de ADA con fibrosis pulmonar inducida que recibían Ab535 reducía el número de macrófagos en el líquido BAL

LaFigura 21muestra imágenes representativas del análisis histopatológico de pulmones de ratones normales (ADA+) y ratones con deficiencia de ADA con fibrosis pulmonar inducida (ADA-), ambos tratados con control de isotipo o Ab535. En los ratones ADA-, los animales tratados con Ab535 tenían una fibrosis pulmonar muy reducida en comparación con el control de isotipo.

Por consiguiente, se ha mostrado en dos modelos de fibrosis pulmonar en ratones que el tratamiento con un anticuerpo anti-CSF-1R puede tratar eficazmente la enfermedad fibrótica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CSF-IR o fragmento de unión del mismo que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO:23 y en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO:15.

2. El anticuerpo anti-CSF-1R o fragmento de unión del mismo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es una molécula de anticuerpo completa que comprende cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o es un fragmento de unión del anticuerpo, en donde el fragmento de unión comprende un fragmento Fab, Fab' modificado, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.

3. El anticuerpo anti-CSF-1R o fragmento de unión del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo es un fragmento de unión que comprende un dominio constante de cadena pesada CH1 y un dominio constante de cadena ligera CL.

4. El anticuerpo anti-CSF-1 R según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO:27 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO:19, en donde la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo está ausente.

5. El anticuerpo anti-CSF-1R o fragmento de unión del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene un efector o una molécula indicadora unida al mismo.

6. Una primera secuencia de ADN aislada que codifica la cadena pesada y una segunda secuencia de ADN aislada que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector de clonación o expresión que comprende la primera secuencia de ADN aislada que codifica la cadena pesada y la segunda secuencia de ADN aislada que codifica la cadena ligera según la reivindicación 6.

8. Un primer vector de clonación o expresión que comprende la primera secuencia de ADN aislada que codifica la cadena pesada y un segundo vector de clonación o expresión que comprende la segunda secuencia de ADN aislada que codifica la cadena ligera según la reivindicación 6.

9. Un vector según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde el vector comprende las secuencias proporcionadas en las SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:16.

10. Una célula hospedadora que comprende los vectores de clonación o expresión según la reivindicación 7 o la reivindicación 8.

11. Un proceso in vitro para la producción del anticuerpo o fragmento de unión del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 9 y aislar el anticuerpo o fragmento de unión del mismo.

12. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición farmacéutica según la reivindicación 12, que comprende adicionalmente otros ingredientes activos.

14. Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición según la reivindicación 12 o 13 para uso como medicamento.

15. Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición según la reivindicación 12 o 13 para uso en el tratamiento del cáncer.

16. Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición según la reivindicación 12 o 13, para uso en el tratamiento de enfermedades fibróticas.

17. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo para su uso según la reivindicación 15, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de huesos, cáncer colorrectal, leucemia, linfoma, cáncer de piel, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer astrocítico, cáncer de endometrio, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas y cáncer de ovario.

18. El anticuerpo o fragmento de unión del mismo para su uso según la reivindicación 16, en donde la enfermedad fibrótica se selecciona del grupo que consiste en fibrosis pulmonar tal como fibrosis pulmonar idiopática y fibrosis quística, fibrosis renal, cirrosis hepática, fibrosis endomiocárdica, fibrosis mediastínica, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal, fibrosis masiva progresiva, fibrosis sistémica nefrogénica, enfermedad de Crohn, queloides, infarto de miocardio, esclerodermia y artrofibrosis.