JP2020005652A - 抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】線維性疾患に対する治療に適した新しい抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を提供する。【解決手段】ＣＳＦ−１Ｒに高い親和性を有し、ＣＳＦ−１Ｒへのリガンドの結合をブロックすることができ、ＣＳＦ−１Ｒを活性化せず、ＣＳＦ−１Ｒの内在化を引き起こさない抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体及びその結合断片、それをコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含む宿主細胞、並びに宿主細胞で抗体又は結合断片を発現させる方法を開示する。さらに、抗体又はその結合断片を含む医薬組成物並びに処置における抗体、結合断片及びそれを含む組成物の使用を開示する。【選択図】なし

Description

本発明は、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体及びその結合断片、それをコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含む宿主細胞、並びに宿主細胞で抗体又は結合断片を発現させる方法に関する。本発明は、抗体又はその結合断片を含む医薬組成物、並びに処置における抗体、結合断片及びそれを含む組成物の使用にも及ぶ。

マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）としても知られるコロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）は、マクロファージ、内皮細胞及び線維芽細胞を含む様々な細胞によって生成されるサイトカインである。ＣＳＦ−１は２つの「単量体」ポリペプチドを含み、それらは生物学的に活性である二量体のＣＳＦ−１タンパク質を形成する。ＣＳＦ−１は、選択的ＲＮＡスプライシングのために少なくとも３つの成熟形態で存在する（Ｃｅｒｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２５：７６１を参照）。ＣＳＦ−１の３つの形態は、アミノ末端に３２個のアミノ酸シグナル配列及びカルボキシル末端の近くにおよそ２３個のアミノ酸の推定上の膜貫通領域を有する、２５６から５５４個のアミノ酸のポリペプチド単量体をコードする異なるｒｎＲＮＡ前駆体から翻訳される。前駆体ペプチドは、アミノ末端及びカルボキシル末端のタンパク分解性切断によってその後処理され、成熟したＣＳＦ−１を放出する。ＣＳＦ−１の全ての３つの成熟形態の残基１〜１４９は同一であり、ＣＳＦ−１の生物学的活性のために必須の配列を含有すると考えられている。ｉｎ ｖｉｖｏでＣＳＦ−１単量体はグリコシル化され、ジスルフィド結合を介して二量体化される。ＣＳＦ−１は、血液細胞の生成を促進する一群の生物学的アゴニストに属する。具体的には、それは単核食細胞系統の骨髄前駆細胞のための増殖及び分化因子としての働きをする。さらに、ＣＳＦ−１は応答細胞上の特異的受容体を介してマクロファージの生存、増殖及び機能を刺激する。

ＣＳＦ−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）は、ｃ−ｆｍｓ遺伝子生成物又はＣＤ１１５とも呼ばれる。ＣＳＦ−１Ｒは、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼファミリーに属している１６５ｋＤａの１型ＴＭ糖タンパク質である。ＣＳＦ−１に加えて、構造的に類似しているが配列的に無関係な分子ＩＬ−３４も、ＣＳＦ−１Ｒのリガンドであることが示されている（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：８０７−８１１）。ＣＳＦ−１Ｒの発現は、循環及び常在する組織母集団である単球−マクロファージ系統の細胞、並びに破骨細胞に限定される。さらに、それは、卵母細胞、脱落膜細胞及び栄養芽細胞を含む女性生殖器系のいくつかの細胞で発現される。

ＣＳＦ−１受容体へのリガンドＣＳＦ−１の結合は、チロシンキナーゼドメインの作用を通して、１つ又は複数のチロシン残基上の受容体のリン酸化をもたらす。リン酸化の後にだけ受容体に結合する抗体が入手できるので、このリン酸化は検出することができる（例えばＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのホスホ−Ｍ−ＣＳＦ−受容体（Ｔｙｒ５４６）抗体番号３０８３）。

ＣＳＦ−１及びＣＳＦ−１Ｒの発現は、多くのがん型での腫瘍進行及び不良な診断と相関する。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は腫瘍間質の主要な構成要素である可能性があり、高レベルのＣＳＦ−１及びＣＳＦ−１Ｒはいくつかの腫瘍型で強いＴＡＭ浸潤及び不良な予後と関連する。

ＣＳＦ−１Ｒに対する抗体は、当技術分野で公知である。Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｌｏｏｄ ７３：１７８６−１７９３は、ＣＳＦ−１活性を阻害するＣＳＦ−１Ｒに対する抗体を記載する（Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｌｏｏｄ７３：１７８６−１７９３）。ＷＯ２００９／０２６３０３は、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体及び抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体を使用するｉｎ ｖｉｖｏマウス腫瘍モデルを開示する。ＷＯ２０１１／１２３３８１は、ＣＳＦ−１Ｒを内在化し、ＡＤＣＣ活性を有する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を開示する。ＷＯ２０１１／１２３３８１は、抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体を使用するｉｎ ｖｉｖｏマウス腫瘍モデルも開示する。ＷＯ２０１１／１４０２４９は、ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１の結合をブロックし、がんの処置で有益であると明記されている抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を開示する。ＷＯ２００９／１１２２４５は、ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１の結合を阻害し、がん、炎症性腸疾患及び慢性関節リウマチの処置で有益であると明記されている抗ＣＳＦ−１Ｒ ＩｇＧ１抗体を開示する。ＷＯ２０１１／１３１４０７は、ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１の結合を阻害し、骨量減少及びがんの処置で有益であると明記されている抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を開示する。ＷＯ２０１１／１０７５５３は、ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１の結合を阻害し、骨量減少及びがんの処置で有益であると考えられている抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を開示する。ＷＯ２０１１／０７００２４は、ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４に結合する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を開示する。

治療的適用に適した新しい抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を提供する必要性が当技術分野にある。ある特定のがんの処置での抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の治療的適用が以前に記載されているが、そのような抗体のために新しい治療的適用を提供する必要性がなおある。

用語「線維性疾患」は、過剰な線維結合組織が器官又は組織に形成される異常な創傷治癒応答を指す。コラーゲン及びフィブロネクチンなどの過剰な細胞外基質構成要素の沈着及び蓄積は、器官不全に最終的につながることがある組織の硬化及び瘢痕化をもたらす。

線維性疾患の例には、肺線維症、例えば特発性肺線維症及び嚢胞性線維症、腎臓線維症、肝臓線維症、肝硬変、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維化症、進行性の大規模な線維症、腎原性の全身性線維症、クローン病、ケロイド、心筋梗塞、全身性硬化症、強皮症及び関節線維症が含まれる。

創傷は即時の凝集及び凝固応答をもたらし、暫定的な細胞外基質（ＥＣＭ）の発達を伴う。血小板の凝集及び活性化は、好中球、マクロファージ、好酸球及びリンパ球を含む様々な免疫細胞の動員を可能にする血管拡張及び血管透過性の増加によって特徴付けられる炎症性応答の促進を助ける。好中球及びマクロファージは創傷を鮮創し、それによって感染症の危険を低減し、活性化リンパ球と一緒に、炎症性応答をさらに増幅する役目をする様々な増殖因子及びサイトカインを分泌する。ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１３などの分子はマクロファージを活性化し、創傷部位で線維芽細胞の動員、増殖及び活性化に導く。活性化線維芽細胞又は筋線維芽細胞は、α平滑筋アクチンの発現によって特徴付けられ、コラーゲン及び他のＥＣＭ構成要素を分泌する。活性化線維芽細胞はコラーゲン格子を収縮させ、創傷の端を中央に引き寄せる。上皮及び内皮細胞は増殖し、一時的な基質の上に移動し、負傷組織を再生させて創傷修復を完了する。

持続的な組織の傷害若しくは損傷又は修復経路の調節解除は、不適当な創傷応答につながる。コラーゲン及びＥＣＭの過剰な沈着及び高架橋が起こり、正常な組織構造の代わりに瘢痕組織の過剰な形成及び硬化をもたらす。

線維性疾患の原因は関与する器官及び組織に依存することができ、特発性肺線維症（ＩＰＦ）などの一部の疾患では未知である。肝臓線維症及び最終的に肝硬変は、環境及び食事性因子又は感染因子を含む様々な因子への曝露を通して持続する慢性肝傷害から生じる。長期のＢ型肝炎及びＣ型肝炎の感染は、肝臓線維症を引き起こす可能性がある。持続するアルコールの過剰摂取又は脂肪／糖分の高い食事も肝硬変をもたらす可能性がある。同様に、糖尿病は腎臓に損傷を与えて瘢痕化させ、機能の喪失をもたらす可能性がある。

ＩＰＦは、その原因が未知である７つの間質性肺疾患の１つである。放射線被曝又は粒子などの環境因子が一役担うことができる。喫煙者も、この疾患の危険がより高い。診断されると、患者の寿命は非常に短く、平均生存率は２〜５年である。

線維性疾患の処置は消炎剤及び免疫抑制剤を一般的に含むが、これらは患者のためにほとんど有益でない。これらの処置による効能の不足は、炎症性状態でなく創傷治癒への異常な応答として、ＩＰＦ及び線維性疾患一般の再考に寄与した。ピルフェニドンは、日本では２００８年に、欧州では２０１１年にＩＰＦ処置で使用するために承認された小分子薬であり、これは、複数の作用機構により機能する可能性がある。これまでに、線維症適応のための標的療法及び抗体療法は未だ承認されていない。

したがって、現在、線維性疾患の改善された処置へのまだ満たされていない医学的な必要性がある。例えば、ＩＰＦについては、３年生存率は５０％であり、５年生存率はわずか２０％であり、症例の約２０％で移植が必要とされる。

一態様では、重鎖を含む抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又はその結合断片が提供され、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４に記載の配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５に記載の配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６に記載の配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含み、例えば、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４であり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５であり、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号６である。

一態様では、本開示による抗体又は結合断片は軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に記載の配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に記載の配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に記載の配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含み、例えば、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１であり、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号２であり、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号３である。

開示の抗体はＣＳＦ−１Ｒに高い親和性を有し、ＣＳＦ−１Ｒへのリガンドの結合をブロックすることができ、ＣＳＦ−１Ｒを活性化せず、ＣＳＦ−１Ｒの内在化を引き起こさない。

本開示は、本明細書に記載される抗体又は断片をコードする、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドにも及ぶ。

前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供される。

抗体又はその結合断片を発現させる方法が、本明細書で提供される。

本開示は、前記抗体又はその結合断片を含む医薬組成物にも関する。

一実施形態では、本明細書に記載される抗体、断片又は組成物の治療有効量を投与するステップを含む処置方法が提供される。

本開示は、処置で、特にがん及び／又は線維性疾患の処置で使用するための、本開示による抗体、結合断片又は組成物にも及ぶ。

一実施形態では、本発明により提供される抗体は、ＣＳＦ−１Ｒへのリガンドの結合をブロックすることが可能である。本明細書で用いるブロックは、受容体を閉塞することなどの物理的なブロックを指すが、抗体又は断片が、例えば受容体に対する天然リガンドがもはや結合しないことを意味する立体配置変化を引き起こすエピトープに結合する場合も含む（本明細書においてアロステリックブロッキング又はアロステリック阻害と呼ばれる）。一実施形態では、本開示の抗体は、ＣＳＦ−１Ｒの全アイソタイプ、例えばＥＣＤドメインの変異、例えばＶ２３Ｇ、Ａ２４５Ｓ、Ｈ２４７Ｐ、Ｖ２７９Ｍ及び前記変異の２つ、３つ又は４つの組合せを有するものに結合する。

ＣＳＦ−１Ｒをブロックする抗体の能力を判定するのに適するアッセイは、本明細書の実施例に記載される。ＣＳＦ−１及びＩＬ−３４は、両方ともＣＳＦ−１Ｒのリガンドであり、本発明の抗体は、機能的細胞スクリーニングでＣＳＦ−１及びＩＬ−３４の両方の活性を好ましくは阻害する。さらに、本発明による抗体は、ＣＳＦ−１Ｒ活性化及び／又はＣＳＦ−１Ｒ内在化を好ましくは引き起こさない。さらに、本発明による抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで単球の非古典的集団を好ましくは選択的に減少させる。

非古典的な単球は、ＣＤ１４の発現が低く、ＣＤ１６の発現が高い単球を一般に指す。単球のこの集団は、腫瘍関連マクロファージの前駆体であると考えられている。

本発明の抗体分子は、好適には高い結合親和性を有する。親和性は、単離された天然若しくは組換えのＣＳＦ−１Ｒ又は適する融合タンパク質／ポリペプチドを使用する、本明細書の実施例に記載される表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡｃｏｒｅなどの技術を含む、当技術分野で公知の任意の適する方法を使用して測定することができる。一例では、親和性は、本明細書の実施例に記載の組換えヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメインを使用して測定される。一例では、使用される組換えヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメインは、単量体である。好適には、本発明の抗体分子は、単離されたヒトＣＳＦ−１Ｒに対して、約１ｎＭ又は１ｎＭ未満の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の抗体分子は、約５００ｐＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の抗体分子は、約２５０ｐＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の抗体分子は、約２００ｐＭ以下の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明は、約１００ｐＭ以下の結合親和性を有する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を提供する。一実施形態では、本発明は、約１００ｐＭ以下、好ましくは約１０ｐＭ以下、より好ましくは約５ｐＭ以下の結合親和性を有するヒト化抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、約１００ｐＭ以下、好ましくは約１０ｐＭ以下、より好ましくは約５ｐＭ以下の結合親和性を有するヒト化抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を提供する。

親和性の数値が低いほど、抗原に対する抗体又は断片の親和性が高い。

本明細書で用いられるヒトＣＳＦ−１Ｒは、ヒトタンパク質名ＣＳＦ−１Ｒ又はその生物学的活性断片、例えば配列番号３９に記載のもの又は番号Ｐ０７３３３の下でＵｎｉＰｒｏｔに登録されているものを指す。当然ながら、発現される成熟タンパク質はシグナル配列を含まないが、その理由は後者が翻訳後に切断されるからである。

本発明者らは、ヒト化抗体を含む新しい抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を提供している。抗体は、ＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメインを発現するベクターでトランスフェクトされたラット線維芽細胞によるラットの免疫化から生成された。抗体のヒトＣＳＦ−１Ｒ結合のための上清の一次スクリーニングは、抗ＣＳＦ−１Ｒ活性を有する抗体を含有するおよそ１０００個のウェルを同定した。ヒトＣＳＦ−１ＲへのヒトＣＳＦ−１結合を阻止することが可能な抗体のための二次スクリーニングは、８８個の陽性ウェルを同定した。一次ヒト単球のＣＳＦ−１依存性生存を阻止することが可能な抗体のための三次スクリーニングは、１８個の陽性ウェルを同定した。これらの１８個の陽性ウェルの可変領域をクローニングし、それは１４個の抗体のクローニングの成功につながり、以降の発現は、十分なレベルで発現してＣＳＦ−１結合を阻害することが可能であった９個のキメラ抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を提供した。これらの９個の抗体の配列決定をし、全てユニーク配列を有することが見出され、さらなる研究のために使用した。

リガンドブロッキング活性及びＣＳＦ−１及びＩＬ−３４によって媒介される単球生存を阻害する能力について、９個の抗ＣＳＦ−１Ｒキメラ抗体を評価した。抗体の４つはＣＳＦ−１結合の完全な阻害及び単球生存の高レベルの阻害を実証したので、さらなる調査のために優先した。親和性、ＣＳＦ−１結合の阻害、アカゲザル、カニクイザル及びイヌのＣＳＦ−１Ｒとの交差反応性、ＣＳＦ−１Ｒ内在化並びにＣＳＦ−１Ｒ活性化を評価するために、これらの４つの抗ＣＳＦ−１Ｒキメラ抗体をいくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでそれらの活性について試験した。４つの抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体をさらにヒト化し、ヒト化移植片の親和性を測定した。抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の２つのヒト化は、親のキメラ抗体と同等の親和性（Ｋ_Ｄ）、及び抗体が適する熱的安定性を有することを示すＴｍを有する、完全ヒト化抗体（ラットドナーの残基が存在しない）を生成した。対照的に、他の２つのヒト化抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体は、キメラ抗体と比較してＣＳＦ−１Ｒへの親和性が低減し、Ｔｍはより低かった。これらの理由から、親和性を保持した抗体の２つの完全ヒト化移植片だけを、さらなる分析のためにより大きなスケールで発現させた。

これらの２つの抗体の完全ヒト化移植片のさらなる分析を、ＣＳＦ−１結合をブロックする抗体によるＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害がＭＣＰ−１分泌レベルの低減を引き起こした、ＭＣＰ−１阻害アッセイで実行した。このアッセイは、驚くべきことに、完全ヒト化移植片がキメラ抗体と比較して低下した活性を示すことを明らかにした。完全ヒト化移植片がこの活性低下を示した理由を明らかにするために、Ａｂ９６９と名付けた好ましい抗体の１つに関する一連の実験を実行した。Ａｂ９６９のいくつかの中間体ヒト化移植片を生成し、ＭＣＰ−１阻害アッセイで試験した。可変軽鎖ドナー残基Ｙ７１を含有した移植片は、ＭＣＰ−１阻害アッセイでキメラＡｂ９６９のそれと同等の活性を一般に示すことが判明した。ＭＣＰ−１阻害アッセイでの様々な抗体移植片の活性におけるこの差は、キメラＡｂ９６９と比較した抗体のオンレートの変化（低下したＫ_ａ）によるものであると仮定した。

Ａｂ９６９の熱安定性分析と他の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体、例えば抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体Ａｂ９７０との比較は、Ａｂ９６９がより安定しているかもしれないことを示唆する。

Ａｂ９６９のヒト化移植片のさらなる生物物理分析は、抗体を濃縮したときに一部の移植片が沈殿することを明らかにした。軽鎖の３８位のリシン残基の例えばグルタミン置換が、改善された物理的安定性につながることを示した。

したがって、Ａｂ９６９の１つの抗体移植片Ａｂ９６９．ｇ２（Ａｂ９６９とも呼ぶ）を、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏでの特徴付け研究のために選択した。ＣＳＦ−１Ｒへの有利な高い結合親和性、高い熱安定性及び高い物理的安定性に加えて、この抗体はＩＬ−３４依存性単球活性化の優れた阻害を実証し、ＣＳＦ−１ＲのＳＮＰ変異体への結合が可能であることも見出された。Ａｂ９６９．ｇ２は、カニクイザルでの薬力学マーカー分析のためにも使用し、そこで、それはＣＳＦ−１Ｒに結合し、ＣＳＦ−１結合をブロックし、腫瘍関連マクロファージの前駆体細胞であるカニクイザル単球の非古典的集団をｉｎ ｖｉｖｏで選択的に減少させることが示された。

したがって、一実施形態では、本発明は、重鎖及び／又は軽鎖を含む抗体を提供し、重鎖及び／又は軽鎖は抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体９６９．２に由来する少なくとも１つのＣＤＲを含む。

Ａｂ９６９．２は、完全長ヒト化ＩｇＧ４分子である。軽鎖はヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）を含み、重鎖はヒンジ安定化突然変異Ｓ２４１Ｐを有するヒトガンマ４重鎖定常領域を含む（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。軽鎖可変領域内には、潜在的ＤＧ異性化モチーフがＣＤＲ−Ｌ２及びフレームワークの接合部に存在する。Ａｂ９６９．２完全抗体の重鎖及び軽鎖の配列は、配列番号２７及び１９で示される。

抗体可変ドメイン中の残基は、従来通りにＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７によって考案されたシステムに従って番号付けされる。このシステムは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（以降、「Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記）」）に示される。他に示される場合を除き、この番号付けシステムが本明細書で使用される。

Ｋａｂａｔの残基呼称は、アミノ酸残基の直線的番号付けと必ずしも直接的に対応しない。実際の直線的アミノ酸配列は、基本的可変ドメイン構造のフレームワークであるか又は相補性決定領域（ＣＤＲ）であるかにかかわらず、構造成分の短縮又はそれへの挿入に対応する厳密なＫａｂａｔ番号付けより少ないか又は追加のアミノ酸を含有する可能性がある。所与の抗体のための残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、「標準」のＫａｂａｔ番号付け配列との抗体配列中の相同性残基の整列によって決定することができる。

重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ．及びＬｅｓｋ、Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６、９０１−９１７（１９８７））によると、ＣＤＲ−Ｈ１に相当するループは残基２６から残基３２まで延びている。したがって特記しない限り、本明細書に用いられる「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔ番号付け系及びＣｈｏｔｈｉａのトポロジーループ定義の組合せによって記載されるように、残基２６〜３５を指すものとする。

軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。

本開示に使用する抗体は、当技術分野で公知の任意の適する方法を使用して得ることができる。融合タンパク質を含むＣＳＦ−１Ｒポリペプチド／タンパク質、ポリペプチドを発現する細胞（組換え又は天然の）は、ＣＳＦ−１Ｒを特異的に認識する抗体を生成するために使用することができる。ポリペプチドは、「成熟した」ポリペプチド又は生物学的に活性であるその断片若しくは誘導体であってもよい。ヒトタンパク質は、番号Ｐ０７３３３の下でＵｎｉＰｒｏｔに登録されている。

宿主を免疫化するために使用するポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から当技術分野で周知であるプロセスによって調製することができるか、又は天然の生物学的供給源からそれらを回収することができる。本出願では、用語「ポリペプチド」は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む。これらは、特に明記しない限り互換的に使用される。一部の場合には、ＣＳＦ−１Ｒポリペプチドは、例えば親和性タグ又は類似のものに融合している融合タンパク質などのより大きなタンパク質の一部であってもよい。

ＣＳＦ−１Ｒポリペプチドに対して生成される抗体は、動物の免疫化が必要な場合には、周知の及び慣例的なプロトコールを使用して動物に、好ましくはヒト以外の動物にポリペプチドを投与することによって得ることができる（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（ｅｄ．），４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８６を参照する）。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタなどの多くの温血動物を免疫化することができる。しかし、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが一般的に最も適する。

モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えばハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，７７−９６，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）によって調製することができる。

例えばＢａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８４３−７８４８；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ０４／０５１２６８及び国際特許出願番号ＷＯ０４／１０６３７７に記載される方法によって特異抗体の生成のために選択される単一リンパ球から生成される免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニング及び発現させることによって、単一リンパ球抗体法を使用して抗体を生成することもできる。

抗体のためのスクリーニングは、ヒトＣＳＦ−１Ｒへの結合を測定するアッセイ及び／又は受容体へのリガンド結合をブロックする能力を測定するアッセイを使用して実施することができる。適するアッセイの例は、本明細書の実施例に記載される。

本明細書で用いられる特異的とは、それが特異的である抗原を認識するだけである抗体、又は、それが非特異的である抗原への結合と比較してそれが特異的である抗原に有意により高い結合親和性、例えば少なくとも、５、６、７、８、９、１０倍より高い結合親和性を有する抗体を指すものとする。

本開示によるある特定の抗体のアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列は、図１及び２に提供される。

本発明の一態様では、抗体は、重鎖を含む抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又はその結合断片であり、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４に記載の配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５に記載の配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６に記載の配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む。好ましくは、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４に記載の配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５に記載の配列、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６に記載の配列を含む。

本発明の第２の態様では、抗体は、軽鎖を含む抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又はその結合断片であり、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に記載の配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に記載の配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に記載の配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む。好ましくは、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号１に記載の配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号２に記載の配列、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号３に記載の配列を含む。

一実施形態では、本発明の抗体は、上記の重鎖及びさらに軽鎖を含む抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又はその結合断片であり、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に記載の配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に記載の配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に記載の配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む。好ましくは、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に記載の配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に記載の配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に記載の配列を含む。

一実施形態では、独立して以下：
ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３のいずれか１つ；
組合せＣＤＲ−Ｈ１とＨ２、ＣＤＲ−Ｈ１とＨ３、ＣＤＲ−Ｈ１とＬ１、ＣＤＲ−Ｈ１とＬ２、ＣＤＲ−Ｈ１とＬ３、ＣＤＲ−Ｈ２とＨ３、ＣＤＲ−Ｈ２とＬ１、ＣＤＲ−Ｈ２とＬ２、ＣＤＲ−Ｈ２とＬ３、ＣＤＲ−Ｈ３とＬ１、ＣＤＲ−Ｈ３とＬ２、ＣＤＲ−Ｈ３とＬ３、ＣＤＲ−Ｌ１とＬ２、ＣＤＲ−Ｌ１とＬ３、ＣＤＲ−Ｌ２とＬ３；
ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２とＨ３、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２とＬ１、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２とＬ２、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２とＬ３、ＣＤＲ−Ｈ２、Ｈ３とＬ１、ＣＤＲ−Ｈ２、Ｈ３とＬ２、ＣＤＲ−Ｈ２、Ｈ３とＬ３、ＣＤＲ−Ｈ３、Ｌ１とＬ２、ＣＤＲ−Ｈ３、Ｌ１とＬ３、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３のいずれか１つ；
組合せＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３とＬ１、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３とＬ２、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３とＬ３、ＣＤＲ−Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１とＬ２、ＣＤＲ−Ｈ２、Ｈ３、Ｌ２とＬ３、ＣＤＲ−Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２とＬ３、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＨ１、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＨ２、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＨ３、ＣＤＲ−Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１とＨ２、
ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１とＬ２、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１とＬ３、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ２とＬ３、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１とＨ２、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１とＨ３、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ２とＨ３のいずれか１つ；及び
組合せＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２とＬ３
からなる群から選択される１つ又は複数のＣＤＲで、少なくとも１つのアミノ酸が保存的置換によって置き換えられる。

一実施形態では、本明細書に開示される重鎖のドメインは、１、２、３又は４つの保存的アミノ酸置換を有する、例えば置換がフレームワーク内にある配列を含む。

一実施形態では、重鎖可変領域のフレームワークは、挿入された、削除された、置換された又はそれらの組合せである、１、２、３又は４つのアミノ酸を含む。一実施形態では、置換されたアミノ酸は、ドナー抗体からの対応するアミノ酸である。

一実施形態では、本明細書に開示される軽鎖可変領域は、１、２、３又は４つの保存的アミノ酸置換を有する、例えば置換がフレームワーク内にある配列を含む。

一実施形態では、軽鎖可変領域のフレームワークは、挿入された、削除された、置換された又はそれらの組合せである、１、２、３又は４つのアミノ酸を含む。一実施形態では、置換されたアミノ酸は、ドナー抗体からの対応するアミノ酸である。

本発明の一態様では、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又はその結合断片が提供され、重鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ−Ｈ１の配列は配列番号４に記載の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲ−Ｈ２の配列は配列番号５に記載の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲ−Ｈ３の配列は配列番号６に記載の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性又は類似性を有する。好ましくは、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又はその結合断片は軽鎖をさらに含み、軽鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ−Ｌ１の配列は配列番号１に記載の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲ−Ｌ２の配列は配列番号２に記載の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲ−Ｌ３の配列は配列番号３に記載の配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する。

一実施形態では、可変領域は、本明細書で開示される可変領域配列との少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性又は類似性が与えられる。別の実施形態では、ＣＳＦ−１Ｒ受容体、好ましくはＣＳＦ−１Ｒ受容体の細胞外ドメイン、より具体的には配列番号３５、３６、３７、３８及び／若しくは３９のＣＳＦ−１Ｒ受容体又はＵｎｉＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０７３３３の配列、特に配列番号３６のＣＳＦ−１Ｒ受容体の細胞外ドメイン又はＵｎｉＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０７３３３で開示される細胞外ドメインの４９８アミノ酸（Ｐ０７３３３のアミノ酸２０〜５１７）への結合のために、本発明の抗体又は断片の結合と競合する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が提供される。

一実施形態では、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１の、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２の、ＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３の、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４の、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５の、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６の配列に記載の６つのＣＤＲを含む抗体の結合を交差ブロックする、例えば１００ｐＭ以下の親和性を有し、特に交差ブロッキングがアロステリックである、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が提供される。

別の実施形態では、ＣＳＦ−１Ｒ受容体の細胞外ドメインへのＣＳＦ−１及び／又はＩＬ−３４の結合を阻害するか又はそれと重なる、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又はその結合断片が提供される。

一実施形態では、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１の、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２の、ＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３の、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４の、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５の、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６の配列に記載の６つのＣＤＲを含む抗体の結合を交差ブロックする、例えば１００ｐＭ以下の親和性を有し、特に抗体が、それがブロックする抗体と同じエピトープに結合することによって結合を交差ブロックする、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が提供される。

一実施形態では、抗体配列のＣ末端残基、例えば重鎖配列のＣ末端残基、例えば末端のリシンが切断される、抗体又はその結合断片が提供される。一実施形態では、アミノ酸は、本明細書に開示される配列から切断される。一般に、切断は、発現される抗体又は結合断片の翻訳後修飾から生じる。

別の実施形態では、配列番号２７又は配列番号２９に記載の重鎖配列のＣ末端リシンが欠落しているか又は欠失されている、上又は下の実施形態のいずれかの抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が提供される。欠落しているか又は欠失されているＣ末端リシン、例えば配列番号２７の４５３位又は配列番号３０の４７２位は、例えば末端のリシンをコードすることのない発現系での抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の発現によって達成することができる。或いは、リシンなどのＣ末端残基の欠失は、翻訳後修飾として実行することができる。

一実施形態では、本発明による抗体又は結合断片はヒト化される。

本明細書で使用されるように、用語「ヒト化抗体」は、アクセプター抗体（例えばヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークに移植されたドナー抗体（例えばマウスモノクローナル抗体）からの１つ又は複数のＣＤＲ（所望により、１つ又は複数の改変ＣＤＲを含む）を重鎖及び／又は軽鎖が含有する、抗体又は抗体分子を指す（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照）。レビューについては、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９，１９９８を参照する。一実施形態では、全体のＣＤＲが移されるのではなく、本明細書の上記のＣＤＲのいずれか１つからの特異性決定残基の１つ又は複数だけがヒト抗体フレームワークに移される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：２５−３４を参照する）。一実施形態では、本明細書の上記のＣＤＲの１つ又は複数からの特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移される。別の実施形態では、本明細書の上記のＣＤＲの各々からの特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移される。ＣＤＲ又は特異性決定残基を移植するとき、マウス、霊長類及びヒトのフレームワーク領域を含む、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／型に関係する、任意の適当なアクセプター可変領域フレームワーク配列を使用することができる。

好適には、本発明によるヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域及び本明細書に具体的に提供されるＣＤＲの１つ又は複数を含む可変ドメインを有する。したがって、一実施形態では、可変ドメインがヒトアクセプターフレームワーク領域及びヒト以外のドナーＣＤＲを含む、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合するヒト化抗体が提供される。

本発明で使用することができるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭである（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，上記）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖のために使用することができ、ＲＥＩは軽鎖のために使用することができ、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖及び軽鎖の両方のために使用することができる。或いは、ヒト生殖細胞系配列を使用することができる。これらは、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／で入手できる。

本発明のヒト化抗体では、アクセプターの重鎖及び軽鎖は同じ抗体に由来する必要があるとは限らず、所望により、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含むことができる。

一実施形態では、ヒトフレームワークは、１、２、３又は４つのアミノ酸置換、付加又は欠失、例えばドナー残基の１、２、３又は４つの保存的な置換又は置換を含む。

一実施形態では、ヒトフレームワークとして用いられる配列は、本明細書に開示される配列と８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上類似しているか又は同一である。

本発明のヒト化抗体の重鎖のためのそのような適するフレームワーク領域の１つは、ＪＨ３ Ｊ領域と一緒のヒトサブグループＶＨ２配列３−１ ２−７０に由来する（配列番号３３）。

したがって、一例では、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４に記載の配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５に記載の配列、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６に記載の配列を含み、重鎖フレームワーク領域はＪＨ４と一緒のヒトサブグループＶＨ３配列１−３ ３−０７に由来する、ヒト化抗体が提供される。

一例では、抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号２３に記載の配列を含む。

本発明のヒト化抗体の軽鎖に適したフレームワーク領域は、ＪＫ４ Ｊ領域と一緒のヒト生殖細胞系サブグループＶＫ１ ２−１−（１）Ｏ１２に由来する（配列番号３１）。

したがって、一例では、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に記載の配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に記載の配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に記載の配列を含み、軽鎖フレームワーク領域はヒトサブグループＶＫ１ ２−１−（１）Ｏ１２プラスＪＫ４ Ｊ領域に由来する、ヒト化抗体が提供される。

一例では、抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号１５に記載の配列を含む。

本発明のヒト化抗体では、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のそれらと正確に同じ配列を有する必要はない。例えば、通常でない残基は、そのアクセプター鎖のクラス又は型のより頻繁に出現する残基に変えることができる。或いは、アクセプターフレームワーク領域で選択される残基は、それらがドナー抗体の同じ位置で見出される残基に対応するように変えることができる（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２４を参照する）。そのような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最小限に保つべきである。変える必要があるかもしれないアクセプターフレームワーク領域の残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７に示されている。

したがって、一例では、重鎖の可変ドメインの少なくとも７８位の残基（Ｋａｂａｔ番号付け）がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される。一実施形態では、重鎖可変ドメインの残基７８は、アラニンで置き換えられる。

本明細書で用いられるドナー残基とは、ＣＤＲを提供したヒト以外の抗体（例えばマウス抗体）からの残基を指す。

一実施形態では、重鎖可変ドメインがいかなるドナー残基も含有しないヒト化抗体が提供される。

したがって、一例では、軽鎖の可変ドメインの３８、７１及び８７位の残基（Ｋａｂａｔ番号付け）の少なくとも１つがドナー残基である、ヒト化抗体が提供される。一実施形態では、軽鎖の可変ドメインの３８、７１及び８７位の残基（Ｋａｂａｔ番号付け）から選択される残基の１つはドナー残基である。一実施形態では、軽鎖の可変ドメインの３８、７１及び８７位の残基（Ｋａｂａｔ番号付け）から選択される残基の２つ、例えば３８及び７１位、又は３８及び８７位、又は７１及び８７位の残基はドナー残基である。一実施形態では、軽鎖の可変ドメインの３８、７１及び８７位の３つの残基（Ｋａｂａｔ番号付け）は、ドナー残基である。

一実施形態では、軽鎖可変ドメインの残基３８は、リシンで置き換えられる。代替実施形態では、軽鎖可変ドメインの残基３８は、グルタミンで置き換えられる。

一実施形態では、軽鎖可変ドメインの残基７１は、チロシンで置き換えられる。

一実施形態では、軽鎖可変ドメインの残基８７は、フェニルアラニンで置き換えられる。

一実施形態では、軽鎖可変領域の残基７１だけがドナー残基、好ましくはチロシンである、ヒト化抗体が提供される。

特定の実施形態では、本発明は、配列番号２３に記載の重鎖可変ドメイン配列を含む重鎖、及び配列番号１５に記載の軽鎖可変ドメイン配列を含む軽鎖を有する、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又はその結合断片を提供する。

本発明のさらなる態様では、ＣＳＦ−１Ｒ、好ましくはＣＳＦ−１Ｒの細胞外ドメイン、最も好ましくはヒトＣＳＦ−１Ｒの細胞外ドメインに結合する、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又はその結合断片が提供され、抗体又は結合断片は配列番号１５の軽鎖可変ドメイン及び配列番号２３の重鎖可変ドメインを含み、好ましくは抗体又はその結合断片はモノクローナル抗体であり、ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−、ＩｇＧ４型の抗体であり、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二、三若しくは四価の抗体、ビス−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディである。

一実施形態では、本開示は、本明細書に開示される配列と８０％類似するか又は同一である、例えば関連する配列の一部又は全体にわたって８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似するか又は同一である抗体配列を提供する。一実施形態では、関連する配列は、配列番号１５である。一実施形態では、関連する配列は、配列番号２３である。

本明細書で使用されるように、「同一性」は、整列させた配列中の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。本明細書で使用されるように、「類似性」は、整列させた配列中の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似の型であることを示す。例えば、イソロイシン又はバリンのためにロイシンを置換することができる。お互いのためにしばしば置換することができる他のアミノ酸には、限定されずに以下のものが含まれる：
− フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
− リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
− アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
− アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
− システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）。同一性及び類似性の程度は、容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ１，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１，ＮＣＢＩから入手できるＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．及びＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２。Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．及びＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）。

本発明の抗体分子は、完全長重鎖及び軽鎖又はその結合断片を有する完全な抗体分子を含むことができ、限定されずにＦａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えばＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二、三又は四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であってもよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９号）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ ２（３号），２０９−２１７を参照する）。これらの抗体断片を作製及び製造する方法は、当技術分野で周知である（例えばＶｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６：１６５−１８１を参照する）。本発明で使用するための他の抗体断片には、国際特許出願ＷＯ０５／００３１６９、ＷＯ０５／００３１７０及びＷＯ０５／００３１７１に記載されるＦａｂ及びＦａｂ’断片が含まれる。多価抗体は、複数の特異性、例えば二重特異性を含むことができるか、又は単一特異的であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２及びＷＯ２０１０／０３５０１２を参照する）。

本明細書で用いられる抗体の結合断片は、その断片を抗原に特異的であると特徴付ける親和性で抗原に結合することが可能な断片を指す。

一実施形態では、本開示による抗体は、例えば全て参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０４０５６２、ＷＯ２０１０／０３５０１２、ＷＯ２０１１／０３０１０７、ＷＯ２０１１／０６１４９２及びＷＯ２０１１／０８６０９１に記載されている通り、免疫グロブリン部分、例えばＦａｂ又はＦａｂ’断片及び直接的又は間接的にそれに連結される１つ又は２つの単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を含むＣＳＦ−１Ｒ結合抗体融合タンパク質として提供される。

一実施形態では、融合タンパク質は、例えばジスルフィド結合によって任意選択で連結される、重鎖可変（ＶＨ）及び軽鎖可変（ＶＬ）対形成として２つのドメイン抗体を含む。

一実施形態では、融合タンパク質のＦａｂ又はＦａｂ’エレメントは、単一ドメイン抗体（単数又は複数）への同じであるか又は類似の特異性を有する。一実施形態では、Ｆａｂ又はＦａｂ’は単一ドメイン抗体（単数又は複数）への異なる特異性を有する、すなわち融合タンパク質は多価性である。一実施形態では、本発明による多価融合タンパク質はアルブミン結合部位を有する、例えばその中のＶＨ／ＶＬ対はアルブミン結合部位を提供する。

存在するならば、本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、抗体分子の提案された機能、及び特に必要とされることがあるエフェクター機能に関して選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってもよい。特に、抗体分子が治療的使用を目的とし、抗体エフェクター機能が必要とされるときは、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを使用することができる。或いは、抗体分子が治療目的のためであり、抗体エフェクター機能が必要とされないときは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。

具体的な実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４抗体である。

これらの定常領域ドメインの配列変異体を使用することもできることが理解される。例えば、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３０：１０５−１０８に記載されるように、２４１位のセリンがプロリンに変化しているＩｇＧ４分子を使用することができる。したがって、抗体がＩｇＧ４抗体である実施形態では、抗体は突然変異Ｓ２４１Ｐを含むことができる。

抗体が様々な翻訳後修飾を受けることができることも、当業者に理解される。これらの修飾の型及び程度は、抗体を発現させるために使用される宿主細胞系及び培養条件にしばしば依存する。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミドの変形を含めることができる。高頻度の修飾は、カルボキシペプチダーゼ作用によるカルボキシ末端塩基性残基（リシン又はアルギニンなど）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７０５：１２９−１３４、１９９５に記載される）。したがって、抗体重鎖のＣ末端のリシンは、不在であってもよい。

一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖はカッパ又はラムダのＣＬドメインを含む。

一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、抗体軽鎖はカッパ又はラムダのＣＬドメインを含む。

本発明により提供される抗体は、配列番号２７に記載の配列を含む重鎖及び配列番号１９に記載の配列を含む軽鎖を有する。重鎖及び軽鎖は、配列番号２７に記載の配列を含む重鎖及び配列番号１９に記載の配列を含む軽鎖に少なくとも８０％（好ましくは８５％、９０％、９５％又は９８％）同一であるか又は類似している、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又はその結合断片も提供される。一実施形態では、軽鎖は、配列番号１９に記載の配列を有するか又はそれからなり、重鎖は、配列番号２７に記載の配列を有するか又はそれからなる。別の実施形態では、軽鎖は、配列番号１９の配列を有するか又はそれからなり、重鎖は、配列番号２７の配列を有するか又はそれからなり、配列番号２７の４５３位のアミノ酸リシンは欠落又は欠失している。

本発明は、本発明によって提供される抗体、特に重鎖配列ｇＨ２（配列番号２７）及び／又は軽鎖配列ｇＬ７（配列番号１９）を含む抗体９６９．ｇ２が結合する、ヒトＣＳＦ−１Ｒの特異的領域又はエピトープも提供する。

ヒトＣＳＦ−１Ｒポリペプチドのこの特異的領域又はエピトープは、本発明によって提供される抗体のいずれか１つと組み合わせた、当技術分野で公知の任意の適するエピトープマッピング方法によって同定することができる。そのような方法の例は、ＣＳＦ−１Ｒに由来する様々な長さのペプチドを、抗体によって認識されるエピトープの配列を含有する、抗体に特異的に結合することができる最小断片による本発明の抗体への結合についてスクリーニングすることを含む（例えば、長さが約５〜２０個、好ましくは約７個のアミノ酸の領域のペプチド）。ＣＳＦ−１Ｒペプチドは、合成的に、又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドのタンパク消化によって生成することができる。抗体に結合するペプチドは、例えば質量分析によって同定することができる。別の例では、本発明の抗体が結合するエピトープを同定するために、ＮＭＲ分光法又はＸ線結晶学を使用することができる。同定されると、必要ならば、本発明の抗体に結合するエピトープ断片は、同じエピトープに結合する追加の抗体を得るための免疫原として使用することができる。

生体分子、例えば抗体又は断片は、酸性及び／又は塩基性の官能基を含有し、それによってネットで正又は負の電荷を分子に与える。全体の「観察される」電荷の量は、実体の絶対的アミノ酸配列、３Ｄ構造での荷電基の局所の環境及び分子の環境条件に依存する。等電点（ｐＩ）は、特定の分子又はその溶媒アクセサブル表面がネットの電荷を有しないｐＨである。一例では、本発明のＣＳＦ−１Ｒ抗体及び断片は、適当な等電点を有するように操作することができる。これは、より頑強な特性、特に適する溶解性及び／又は安定性プロファイル及び／又は改善された精製特性を有する抗体及び／又は断片をもたらすことができる。

したがって一態様では、本発明は、当初同定された抗体の等電点と異なる等電点を有するように操作されるヒト化ＣＳＦ−１Ｒ抗体を提供する。この抗体は、例えば、アミノ酸残基を置き換えることによって、例えば酸性アミノ酸残基を１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基で置き換えることによって操作することができる。或いは、塩基性アミノ酸残基を導入することができるか、又は酸性アミノ酸残基を取り除くことができる。或いは、分子が容認できないほど高いｐＩ値を有する場合は、必要に応じてｐＩを下げるために酸性残基を導入することができる。ｐＩを操作するときには、抗体又は断片の望ましい活性を保持するように注意しなければならないことが重要である。したがって一実施形態では、操作された抗体又は断片は、「未改変の」抗体又は断片と同じか又は実質的に同じ活性を有する。

抗体又は断片の等電点を予測するために、^＊＊ＥｘＰＡＳＹ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ、及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｔ−ａｒｌｅｓ．ｕｐ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｗ３ｂｂ／ｄ＿ａｂｉｍ／ｃｏｍｐｏ−ｐ．ｈｔｍｌなどのプログラを使用することができる。

本発明により提供される抗体の親和性は、当技術分野で公知の任意の適する方法を使用して変更することができることが理解される。したがって、本発明は、ＣＳＦ−１Ｒへの改善された親和性を有する本発明の抗体分子の変異体にも関する。そのような変異体は、ＣＤＲを突然変異させること（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３）、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のミューテーター株の使用（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：３５９−３６８）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８：７２４−７３３）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６，７７−８８，１９９６）及び有性ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８−２９１）を含むいくつかの親和性成熟プロトコールによって得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（上記）は、親和性成熟のこれらの方法を議論する。

所望により、本発明で使用するための抗体は、１つ又は複数のエフェクター分子（単数又は複数）にコンジュゲートされてもよい。したがって、エフェクター分子は、単一のエフェクター分子を、又は本発明の抗体に付着することができる単一部分を形成するように連結される２つ以上のそのような分子を含むことができることが理解される。エフェクター分子に連結される抗体断片を得るのが望まれる場合、これは、抗体断片が直接的に又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結される標準の化学的又は組換えＤＮＡ方法によって調製することができる。そのようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートする技術は、当技術分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．，１９８７，６２３−５３；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３、６７−１２３を参照する）。特定の化学的方法には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３／０３１５８１に記載されるものが含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合は、結合は組換えＤＮＡ方法、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載される方法を使用して達成することができる。

本明細書で使用される用語エフェクター分子には、例えば、抗腫瘍剤、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば酵素、他の抗体若しくは抗体断片、合成された若しくは天然に存在する重合体、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子及びレポーター基、例えば蛍光性化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出することができる化合物が含まれる。

エフェクター分子の例には、細胞に有害である（例えば殺傷性の）任意の薬剤を含む細胞毒素又は細胞傷害剤を含めることができる。例には、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステルリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン、及びその類似体又は相同体が含まれる。

エフェクター分子には、限定されずに、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロルエタミン、チオテパ（thioepa）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアミシン又はデュオカルマイシン）、及び有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も含まれる。

他のエフェクター分子には、キレート化放射性核種、例えば^１１１Ｉｎ及び^９０Ｙ、Ｌｕ^１７７、ビスマス^２１３、カリホルニウム^２５２、イリジウム^１９２及びタングステン^１８８／レニウム^１８８、又は、限定されずに、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物が含まれてもよい。

他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素が含まれる。目的の酵素には、限定されずに、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、転移酵素が含まれる。目的のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、限定されずに、免疫グロブリン、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素、タンパク質、例えばインスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子又は組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓性の薬剤又は抗血管新生薬剤、例えばアンギオスタチン若しくはエンドスタチン、又は生物学的応答修飾因子、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）又は他の増殖因子及び免疫グロブリンが含まれる。

他のエフェクター分子には、例えば診断で有益な検出可能な物質が含まれてもよい。検出可能な物質の例には、様々な酵素、接合団、蛍光性材料、発光性材料、生物発光材料、放射性核種、陽電子放射金属（陽電子放射断層撮影用）及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。診断薬として使用するための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては、一般に、米国特許第４，７４１，９００号を参照する。適する酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適する接合団には、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが含まれ；適する蛍光性材料には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが含まれ；適する発光性材料にはルミノールが含まれ；適する生物発光材料には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含まれ；適する放射性核種には、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ及び^９９Ｔｃが含まれる。

別の例では、エフェクター分子はｉｎ ｖｉｖｏで抗体の半減期を増加させること、及び／又は抗体の免疫原性を低減すること、及び／又は上皮障壁越しの免疫系への抗体の送達を増強することができる。このタイプの適するエフェクター分子の例には、重合体、アルブミン、アルブミン結合性タンパク質又はアルブミン結合性化合物、例えばＷＯ０５／１１７９８４に記載されているものが含まれる。

一実施形態では、ＣＳＦ−１Ｒから独立してエフェクター分子により提供される半減期は、有利である。

エフェクター分子が重合体である場合は、それは一般に、合成であるか又は天然に存在する重合体、例えば任意選択で置換された直鎖若しくは分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレン重合体又は分枝状若しくは非分枝状の多糖、例えばホモ若しくはヘテロ多糖であってもよい。

前述の合成重合体に存在することができる具体的な任意選択の置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が含まれる。

合成重合体の具体例には、任意選択で置換された直鎖又は分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に任意選択で置換されたポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が含まれる。

具体的な天然に存在する重合体には、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体が含まれる。

一実施形態では、重合体は、ヒト血清アルブミン又はその断片などの、アルブミン又はその断片である。

本明細書で使用される「誘導体」は、反応性誘導体、例えばマレイミドなどのチオール選択的反応性基を含むものとする。反応性基は、直接的に又はリンカーセグメントを通して重合体に連結することができる。そのような基の残基は、一部の場合には抗体断片と重合体の間の連結基として生成物の一部を形成することが理解される。

重合体のサイズは所望により変更することができるが、一般には５００Ｄａから５００００Ｄａ、例えば５０００から４００００Ｄａ、例えば２００００から４００００Ｄａの平均分子量範囲内である。重合体サイズは、特に生成物の使用目的、例えば腫瘍などのある特定の組織に局在化させるか又は循環半減期を延長する能力に基づいて選択することができる（レビューについては、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照する）。したがって、例えば腫瘍の処置で使用するために、例えば、生成物が循環を離れ、組織を透過することを意図する場合は、小分子量、例えばおよそ５０００Ｄａの分子量の重合体を使用することが有利なことがある。生成物が循環中に残る適用のためには、より高い分子量、例えば２００００Ｄａから４００００Ｄａの範囲内の分子量を有する重合体を使用することが有利なことがある。

適する重合体には、ポリアルキレン重合体、例えばポリ（エチレングリコール）又は、特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体、特に約１５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲内の分子量を有するものが含まれる。

一例では、本発明で使用するための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着させる。１つの特定の例では、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端のアミノ酸官能基、例えば任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を通して付着させることができる。そのようなアミノ酸は抗体断片に天然に存在してもよく、又は組換えＤＮＡ方法を使用して断片に組み入れられてもよい（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照する）。一例では、本発明の抗体分子は、改変がエフェクター分子の付着を可能にするためのその重鎖のＣ末端への１つ又は複数のアミノ酸の付加である、改変Ｆａｂ断片である。好適には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子を付着させることができる１つ又は複数のシステイン残基を含有する改変ヒンジ領域を形成する。２つ以上のＰＥＧ分子を付着させるために、複数の部位を使用することができる。

好適には、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を通して共有結合する。改変抗体断片に付着する各重合体分子は、断片に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合することができる。共有結合は、一般にジスルフィド結合又は、特に硫黄炭素結合である。チオール基が付着点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばチオール選択的誘導体、例えばマレイミド及びシステイン誘導体を使用することができる。上記の重合体改変抗体断片の調製では、出発材料として活性化重合体を使用することができる。活性化重合体は、チオール反応性基、例えばハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドを含有する任意の重合体であってもよい。そのような出発材料は市販されている（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、元Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）か、又は従来の化学的方法を使用して市販の出発材料から調製することができる。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、元Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）、及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、元Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）が含まれる。

一実施形態では、抗体は改変されたＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片又はｄｉＦａｂであり、それはペグ化されている、すなわち、例えばＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７に開示される方法によりそれに共有結合されるＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する［「ポリエチレングリコールの化学的、生物工学的及び生物医学的適用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，「ポリエチレングリコールの化学的及び生物学的適用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，１９９７，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ及び「バイオメディカルサイエンスのためのバイオコンジュゲーションによるタンパク質のカップリング技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」，１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ ａｎｄ Ａ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００２，５４：５３１−５４５も参照する］。一例では、ＰＥＧはヒンジ領域のシステインに付着させる。一例では、ＰＥＧ改変Ｆａｂ断片は、改変ヒンジ領域の単一のチオール基に共有結合しているマレイミド基を有する。リシン残基をマレイミド基に共有結合することができ、リシン残基のアミン基の各々には、およそ２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）重合体を付着させることができる。したがって、Ｆａｂ断片に付着するＰＥＧの全分子量は、およそ４０，０００Ｄａであってもよい。

特定のＰＥＧ分子には、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、元Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ２０，０００）改変リシンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドが含まれる。

ＰＥＧリンカーの代替供給源には、ＧＬ２−４００ＭＡ３（下の構造でｍは５である）及びＧＬ２−４００ＭＡ（ｍは２である）を供給し、ｎはおよそ４５０であるＮＯＦが含まれる：

すなわち、各ＰＥＧは、約２０，０００Ｄａである。

したがって一実施形態では、ＰＥＧは、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２−４００ＭＡ３として知られる、２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−｛［３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル）アミノ］プロピルオキシ｝ヘキサン（２アーム分枝状ＰＥＧ、−ＣＨ_２）_３ＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_５−ＭＡＬ、Ｍｗ４０，０００である。

さらなる代替ＰＥＧエフェクター分子は、以下の型のものである：

一実施形態では、鎖の中のアミノ酸２２６、例えば重鎖のアミノ酸２２６（逐次的番号付けによる）あたりのシステインアミノ酸残基を通して付着している、ペグ化された（例えば本明細書に記載のＰＥＧで）完全長抗体などの抗体が提供される。

一実施形態では、本開示は、１つ又は複数のＰＥＧ重合体、例えば１つ又は２つの重合体、例えば４０ｋＤａの重合体（単数又は複数）を含むＦａｂ’ＰＥＧ分子を提供する。

本開示によるＦａｂ−ＰＥＧ分子は、それらがＦｃ断片とは無関係な半減期を有するという点で特に有利であるかもしれない。

一実施形態では、重合体、例えばＰＥＧ分子、デンプン分子又はアルブミン分子にコンジュゲートされるｓｃＦｖが提供される。

一実施形態では、抗体又は断片は、例えば半減期を増加させるためにデンプン分子にコンジュゲートされる。タンパク質にデンプンをコンジュゲートする方法は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，０１７，７３９に記載される。

本明細書に用いられるレポーター分子は、検出することが可能である分子、例えば蛍光色素、放射標識又は他の検出可能な実体である。

本発明は、本発明の抗体分子の重鎖及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列も提供する。好適には、ＤＮＡ配列は、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードする。本発明のＤＮＡ配列は、合成ＤＮＡ、例えば化学的プロセシングによって生成されるもの、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はそれらの任意の組合せを含むことができる。

本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の一部又は全体をコードするＤＮＡ配列は、所望により決定されたＤＮＡ配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づいて合成することができる。

アクセプターフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者に広く利用でき、それらの公知のアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。

本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製するために、分子生物学の標準の技術を使用することができる。オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、所望のＤＮＡ配列を完全に又は一部合成することができる。適宜、部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することができる。

適するＤＮＡ配列の例を、図１に提供する。

本発明は、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターにも関する。したがって、本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターが提供される。一実施形態では、ベクターは、配列番号２８及び／又は配列番号２０に記載の配列を含む。好適には、クローニング又は発現ベクターは、本発明の抗体分子の軽鎖及び重鎖、好ましくはそれぞれ配列番号２８及び配列番号２０、並びに適するシグナル配列をコードする２つのＤＮＡ配列を含む。一例では、ベクターは、重鎖及び軽鎖の間の遺伝子間配列を含む（ＷＯ０３／０４８２０８を参照する）。

ベクターを構築することができる一般方法、トランスフェクション方法及び培養方法は、当業者に周知である。これに関しては、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって作成されたＭａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌを参照する。

本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために、任意の適する宿主細胞／ベクター系を使用することができる。細菌、例えば大腸菌、及び他の微生物系を使用することができ、又は真核生物、例えば哺乳動物の宿主細胞発現系を使用することもできる。適する哺乳動物の宿主細胞には、ＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が含まれる。

本発明は、本発明による抗体分子の生成のための方法であって、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現を導くのに適する条件下で本発明のベクターを含有する宿主細胞を培養するステップと、抗体分子を単離するステップとを含む方法も提供する。

抗体分子は重鎖又は軽鎖ポリペプチドだけを含むことができ、その場合には、宿主細胞をトランスフェクトするために重鎖又は軽鎖ポリペプチドのコード配列だけを使用する必要がある。重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物の生成のために、細胞系を２つのベクターでトランスフェクトすることができ、第１のベクターは軽鎖ポリペプチドをコードし、第２のベクターは重鎖ポリペプチドをコードする。或いは、単一のベクターを使用することができ、ベクターは軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。

本開示による抗体及び断片は、宿主細胞から優れたレベルで発現される。したがって、抗体及び／又は結合断片の特性は、商業スケールでの発現に適する。

したがって、宿主細胞を培養して抗体又はその断片を発現させ、後者を単離し、それを任意選択で精製して単離された抗体又は断片を提供する方法が提供される。一実施形態では、この方法は、単離された抗体又は断片にエフェクター分子をコンジュゲートする、例えばＰＥＧ重合体、特に本明細書に記載のものにコンジュゲートするステップをさらに含む。

一実施形態では、抗体（特に本発明による抗体又は断片）を精製するための方法であって、不純物がカラムに保持され、抗体が溶出される非結合モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを実施するステップを含む方法が提供される。

一実施形態では、精製は、ＣＳＦ−１Ｒカラムの上での親和性捕捉を用いる。

一実施形態では、精製は、アルブミン融合又はコンジュゲート分子の精製のためにシバクロンブルー又は類似のものを用いる。

この方法で使用するのに適するイオン交換樹脂には、Ｑ．ＦＦ樹脂（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから供給される）が含まれる。ステップは、例えば、約８のｐＨで実施することができる。

この方法は、例えば約４〜５のｐＨ、例えば４．５で実施される陽イオン交換クロマトグラフィーを用いる初期捕捉ステップをさらに含むことができる。陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えばＣａｐｔｏＳ樹脂又はＳＰセファロースＦＦ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給される）などの樹脂を用いることができる。次に抗体又は断片は、塩化ナトリウムなどのイオン性塩溶液を例えば２００ｍＭの濃度で用いて樹脂から溶出することができる。

したがって、適宜、クロマトグラフのステップ（単数又は複数）は、１回又は複数回の洗浄ステップを含むことができる。

精製方法は、ダイアフィルトレーションステップなどの１つ又は複数の濾過ステップを含むこともできる。

したがって一実施形態では、実質的に精製された形態の、特にエンドトキシン及び／又は宿主細胞タンパク質若しくはＤＮＡが含まれないか又は実質的に含まれない、精製された抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又は断片、例えばヒト化抗体又は断片、特に本発明による抗体又は断片が提供される。

上で使用される精製形態は、少なくとも９０％の純度、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９ｗ／ｗ％又はそれ以上の純度を指すものとする。

エンドトキシンを実質的に含まないとは、１ｍｇの抗体生成物につき１ＥＵ又はそれ以下、例えば１ｍｇの生成物につき０．５又は０．１ＥＵのエンドトキシン含有量を一般に指すものとする。

宿主細胞タンパク質又はＤＮＡを実質的に含まないとは、適宜、抗体生成物１ｍｇにつき４００μｇ又はそれ以下、例えば１ｍｇにつき１００μｇ以下、特に１ｍｇにつき２０μｇの宿主細胞タンパク質及び／又はＤＮＡ含有量を一般に指すものとする。

本発明は、医薬用の本開示による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体（又はそれを含む医薬組成物）も提供する。

本発明は、がんの処置のための本開示による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体（又はそれを含む医薬組成物）も提供する。

本発明は、がんの処置又は予防のための医薬の製造における、本開示による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体（又はそれを含む医薬組成物）の使用も提供する。

本発明は、がんを患っているか又はその危険があるヒト対象の処置のための方法であって、本開示による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の有効量を対象に投与するステップを含む方法も提供する。

本開示による抗体は、乳がん、前立腺がん、骨がん、骨髄腫、結腸直腸がん、白血病、リンパ腫、黒色腫などの皮膚がん、食道がん、胃がん、星状細胞がん、子宮体がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、肺がん、肝がん、甲状腺がん、頭頚部がん、膵がん及び卵巣がんからなる群から選択されるがんを処置するために使用することができる。

一実施形態では、がんは、上記の元のがんのいずれか、特に骨がんからの転移がんである。

驚くべきことに、ＣＳＦ−１Ｒ活性を阻害する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が線維性疾患の処置で活性であることを実証することができた。具体的には、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が肺線維症のｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルで活性であることを実証することができた。

本発明は、線維性疾患の処置のための本開示による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体（又はそれを含む医薬組成物）も提供する。

本発明は、線維性疾患の処置又は予防のための医薬の製造における、本開示による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体（又はそれを含む医薬組成物）の使用も提供する。

本発明は、線維性疾患を患っているか又はその危険があるヒト対象の処置のための方法であって、本開示による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の有効量を対象に投与するステップを含む方法も提供する。

本出願では、用語「線維性疾患」は、過剰な線維結合組織が器官又は組織に形成される創傷治癒への異常な応答によって特徴付けられる疾患を含む。例示的な線維性疾患には、限定されずに、肺線維症、例えば特発性肺線維症及び嚢胞性線維症、尿細管萎縮及び間質性線維症を含む腎臓線維症、肝臓線維症、肝硬変、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維化症、進行性の大規模な線維症、腎原性の全身性線維症、クローン病、ケロイド、心筋梗塞、強皮症、全身性硬化症及び関節線維症が含まれる。

一実施形態では、本開示による抗体又は断片は、がん又は線維性疾患の処置又は予防で用いられる。

本開示による抗体は、炎症性疾患など、例えば、炎症性関節炎、アテローム硬化症、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、リウマチ様脊椎炎、強直性脊椎炎、関節炎、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチ、骨関節炎、湿疹、接触性皮膚炎、乾癬、毒性ショック症候群、敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、喘息、慢性肺炎症性疾患、ケイ肺症、肺サルコイドーシス、骨粗しょう症、再狭窄、心臓及び腎臓再かん流損傷、血栓症、糸球体腎炎、糖尿病、移植片対宿主反応、同種異系移植片拒絶反応、多発性硬化症、筋変性、筋ジストロフィー、アルツハイマー病及び脳卒中の処置で使用することができる。

本開示による抗体及び断片は、処置又は予防で用いることができる。

本発明の抗体分子は、診断で、例えばＣＳＦ−１Ｒが関与する疾患状態のｉｎ ｖｉｖｏ診断及び画像化で使用することもできる。

本発明の抗体は病態の処置及び／又は予防で有益であるので、本発明は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体の１つ又は複数と一緒に本発明の抗体分子を含む医薬用又は診断用の組成物も提供する。したがって、医薬の製造のための本発明の抗体の使用が提供される。組成物は、薬学的に許容される担体を通例含む、無菌の医薬組成物の一部として通常供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントをさらに含むことができる。

本発明は、医薬用又は診断用の組成物の調製のための方法であって、本発明の抗体分子を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体の１つ又は複数と一緒に加えて混合するステップを含む方法も提供する。

抗体分子は、医薬用又は診断用の組成物で唯一の有効成分であってもよい。或いは、抗体は、１つ又は複数の他の治療活性成分と組合せて、例えば同時、逐次的又は別々に投与することができる。したがって、医薬用又は診断用の組成物中の抗体分子には、他の有効成分、例えば他の抗体成分、例えば表皮成長因子受容体ファミリー（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２）、血管内皮細胞成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）抗体）、又は非抗体成分、例えばイマチニブ、ダサチニブ、ニオルチニブ、バスチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、テムシロリムス、バンデタニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ボリノスタット、ロミデプシン、ボルテゾミブ、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、ピルフェニドン（perfenidone）、ステロイド若しくは他の薬物分子、特に半減期がＣＳＦ−１Ｒ結合と無関係である薬物分子が伴うことができる。

本明細書で用いる有効成分とは、関連する用量で治療効果などの薬理効果を有する成分を指す。

医薬組成物は、好適には本発明の抗体の治療有効量を含む。本明細書で使用される用語「治療有効量」は、標的の疾患又は状態を処置、改善若しくは予防するのに必要な、又は検出可能な治療的、薬理学的若しくは予防的効果を表すのに必要な治療剤の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイで、又は動物モデル、通常齧歯動物、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類で最初に推定することができる。動物モデルは、適当な濃度範囲及び投与経路を決定するために用いることもできる。そのような情報は、ヒトでの投与のための有益な用量及び経路を判断するために次に用いることができる。

ヒト対象のための正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の健康状態、対象の齢、体重及び性別、食事、投与の時期及び頻度、薬物組合せ（単数又は複数）、反応感度並びに療法への耐容性／応答による。この量は慣例的な実験によって判定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療有効量は０．０１ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇ、例えば１００ｍｇ／ｋｇである。

医薬組成物は、１用量につき本発明の活性薬剤の所定量を含有する単位用量形態で便利に提供することができる。

本開示による抗体の治療用量は、ｉｎ ｖｉｖｏで明らかな毒作用を示さないか又は限定された毒作用しか示さない。

組成物は、患者に個々に投与することができるか、又は他の薬剤、薬物若しくはホルモンと組み合わせて（例えば、同時、逐次的又は別々に）投与することができる。

一実施形態では、本開示による抗体又は結合断片は、１つ又は複数の他のがん処置選択肢、例えば化学療法、放射線療法又は手術と一緒に用いられる。化学療法薬と一緒に投与される場合は、抗体は化学療法剤の前若しくは後に、又は同時に投与することができる。提供される抗原結合タンパク質と併用することができる化学療法薬には、限定されずに、アルキル化／ＤＮＡ傷害剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン）、代謝拮抗薬（例えば、カペシタビン、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル）、有糸分裂阻害剤（例えば、パクリタキセル、ビンクリスチン）が含まれる。

様々な炎症性疾患を処置するために使用される抗体は、単独で使用すること又は様々な他の抗炎症剤と組み合わせることができる。

様々な線維性疾患を処置するために使用される抗体は、単独で使用すること又は様々な他の抗線維症剤と組み合わせることができる。そのような薬剤の例は、ピルフェニドン（perfedidone）である。

本発明の抗体分子が投与される用量は、処置される状態の性質、存在する状態の重症度、及び抗体分子が予防的に使用されるか又は既存の状態を処置するために使用されるかによる。

投与頻度は、抗体分子の半減期及びその効果持続期間による。抗体分子が短い半減期（例えば２〜１０時間）を有する場合は、１日に１回又は複数回の用量を与える必要があるかもしれない。或いは、抗体分子が長い半減期（例えば２〜１５日間）及び／又は持続性の薬力学（ＰＤ）プロファイルを有する場合は、１日に１回、１週に１回、又は１若しくは２カ月おきに１回さえも、投薬量を与える必要があるだけかもしれない。

本明細書に用いられる半減期とは、循環、例えば血清／血漿中の分子の持続期間を指すものとする。

本明細書に用いられる薬力学とは、本開示による分子の生物学的作用のプロファイル、特に持続期間を指す。

薬学的に許容される担体は、組成物を受ける個体に有害な抗体の生成をそれ自体誘導するべきでなく、毒性であるべきでない。適する担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体及び不活性ウイルス粒子などの大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子であってもよい。

薬学的に許容される塩、例えば鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩、又は有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩を使用することができる。

治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含有することができる。さらに、補助的物質、例えば湿潤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝物質が、そのような組成物中に存在してもよい。そのような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤及び懸濁剤として製剤化することを可能にする。

投与のための適する形態には、非経口投与、例えば注射又は注入、例えばボーラス注射又は連続的注入によるものに適する形態が含まれる。生成物が注射又は注入のためである場合は、それは油性又は水性のビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンの形態をとることができ、それは懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤化薬剤を含有することができる。或いは、抗体分子は、使用前に適当な無菌液体によって再構成するために、乾燥した形態であってもよい。

製剤化されると、本発明の組成物は対象に直接的に投与することができる。処置対象は、動物であってもよい。しかし、１つ又は複数の実施形態では、組成物はヒト対象への投与のために適合させられる。

好適には、本開示による製剤では、最終製剤のｐＨは抗体又は断片の等電点の値に類似せず、例えば製剤のｐＨが７であるならば、８〜９又はそれ以上のｐＩが適当であるかもしれない。理論に束縛されることを欲しないが、これは、改善された安定性を有する、例えば抗体又は断片が溶液状態のままである最終製剤を最終的に提供することができると考えられる。

一例では、４．０〜７．０の範囲のｐＨの医薬製剤は、１〜２００ｍｇ／ｍＬの本開示による抗体、１〜１００ｍＭのバッファー、０．００１〜１％の界面活性剤、ａ）１０〜５００ｍＭの安定剤、ｂ）１０〜５００ｍＭの安定剤及び５〜５００ｍＭの等張化剤、又はｃ）５〜５００ｍＭの等張化剤を含む。

本発明の医薬組成物は、限定されずに、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、クモ膜下、心室内、経真皮、経皮（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、腟内又は直腸経路を含む任意の数の経路によって投与することができる。本発明の医薬組成物を投与するために、ハイポスプレーを使用することもできる。一般的に、治療組成物は、液体溶液又は懸濁液の注射剤として調製することができる。注射前の液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に適する固体形態を調製することもできる

組成物の直接送達は、皮下、腹腔内、静脈内若しくは筋肉内への注射によって一般に達成されるか、又は組織の間質空間に送達される。組成物を病変に投与することもできる。投薬処置は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであってもよい。

組成物中の有効成分が抗体分子であることが理解される。このように、それは胃腸管での分解に感受性である。したがって、組成物が胃腸管を使う経路によって投与される場合は、組成物は、抗体を分解から保護するが、それが胃腸管から吸収されたならば抗体を放出する薬剤を含有する必要がある。

薬学的に許容される担体の完全な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手できる。

一実施形態では、製剤は吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。

適する吸入可能な調製物には、吸入可能な粉末、噴射ガスを含有する計量エアゾール又は噴射ガスを含まない吸入可能な溶液が含まれる。活性物質を含有する開示による吸入可能な粉末は、上述の活性物質だけ、又は上述の活性物質と生理的に許容される賦形剤との混合物だけからなることができる。

これらの吸入可能な粉末は、単糖（例えばグルコース又はアラビノース）、二糖（例えばラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えばデキストラン）、多価アルコール（例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、又はこれらのお互いの混合物を含むことができる。好適には単糖又は二糖が使用され、ラクトース又はグルコースは、特に、しかし限定することなくそれらの水和物の形態で使用される。

肺での沈着のための粒子は、１０ミクロン未満、例えば１〜９ミクロン、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍの粒径を必要とする。有効成分（抗体又は断片など）の粒径が第一に重要である。

吸入可能なエアゾールを調製するために使用することができる噴射用ガスは、当技術分野で公知である。適する噴射用ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタンなどの炭化水素並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化及び／又はフッ化誘導体などのハロ炭化水素の中から選択される。上述の噴射用ガスはそれ自体で、又はそれらの混合物で使用することができる。

特に適する噴射用ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上述のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）及びそれらの混合物が特に適する。

噴射用ガスを含有する吸入可能なエアゾールは、助溶剤、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、滑沢剤及びｐＨを調整する手段などの他の成分を含有することもできる。全てのこれらの成分は、当技術分野で公知である。

本発明による噴射剤ガスを含有する吸入可能なエアゾールは、最高５重量％の活性物質を含有することができる。本発明によるエアゾールは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％又は０．５〜１重量％の有効成分を含有する。

或いは、肺への局所投与は、例えば、ネブライザーなどの機器、例えば圧縮器に接続されたネブライザー（例えば、Ｐａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．が製造したＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮器に接続されたＰａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）ネブライザー）を用いる、液体溶液又は懸濁液製剤の投与によることもできる。

本発明の抗体は、溶媒に分散させて、例えば溶液又は懸濁液の形態で送達することができる。それは、適当な生理溶液、例えば食塩水又は他の薬理的に許容される溶媒又は緩衝溶液に懸濁させることができる。当技術分野で公知である緩衝溶液は、約４．０〜５．０のｐＨを達成するように、１ｍｌの水につき０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有することができる。懸濁液は、例えば、凍結乾燥された抗体を用いることができる。

治療的な懸濁液又は液体製剤は、１つ又は複数の賦形剤を含有することもできる。賦形剤は当技術分野で周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール及びグリセロールを含む。溶液又は懸濁液は、リポソーム又は生分解性マイクロスフェアに封入されてもよい。製剤は、無菌製造方法を用いて実質的に無菌の形態で一般に提供される。

これは、製剤のために使用される緩衝溶媒／溶液の生成及び濾過滅菌、無菌緩衝溶媒溶液中での抗体の無菌的懸濁、並びに当業者におなじみの方法による無菌容器への製剤の小分けを含むことができる。

本開示による噴霧可能な製剤は、例えばホイルエンベロープに詰め込まれた単一の用量単位（例えば、密封プラスチック容器又はバイアル）として提供することができる。各バイアルは、例えば２ｍＬ量の溶媒／溶液緩衝液中に、単位用量を含有する。

本明細書に開示される抗体は、噴霧療法による送達に適することができる。

本発明の抗体が遺伝子療法を用いて投与できることも想定される。これを達成するために、抗体鎖がｉｎ ｓｉｔｕでＤＮＡ配列から発現されて組み立てられるように、適当なＤＮＡ構成要素の制御下の抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列が患者に導入される。

一実施形態では、本開示は、例えばレポーター分子にコンジュゲートされた試薬又は診断法としての、抗体又はその断片の使用を含む。したがって、標識されている、本開示による抗体又は断片が提供される。一態様では、本開示による抗体又は断片を含むカラムが提供される。

このように、以下のような用途のための試薬として使用するための抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又は断片が提供される：
１）ＣＳＦ−１Ｒタンパク質（又はその結合断片）の精製−基質にコンジュゲートされて、親和性カラムとして、又は（抗ＣＳＦ−１Ｒの改変形態として）抗Ｆｃ試薬によって任意選択で沈殿される、沈殿剤（例えば、改変されてもよい別の分子によって認識されるドメインで改変される形態として）として使用される
２）生きているか又は固定された細胞上又は細胞中のＣＳＦ−１Ｒの検出及び／又は数量化（ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は組織中又は細胞切片中の細胞）。これのための用途には、抗ＣＳＦ−１Ｒ処置の効果を追跡するためのバイオマーカーとしてのＣＳＦ−１Ｒの数量化を含めることができる。これらの目的のために、候補は改変形態で使用されてもよい（例えば、遺伝子融合タンパク質又は化学的コンジュゲートとして別の部分の付加、例えばレポーター分子、例えば検出目的で使用される蛍光性タグの付加による）。
３）（１）及び（２）で例示される方法によって改変される候補への結合によって標識されるＣＳＦ−１Ｒを有する細胞の精製又は選別。

本明細書との関連で、含む（comprise）とは含む（include）ことを意味するものとする。

技術的に適当な場合、本発明の実施形態は組み合わせることができる。

実施形態は、ある特定の特徴／要素を含むものとして本明細書に記載される。本開示は、前記特徴／要素からなるか又は本質的にそれからなる別個の実施形態にも及ぶ。

特許及び出願などの技術的参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に具体的及び明示的に列挙されるいかなる実施形態も、単独で又は１つ又は複数のさらなる実施形態と一緒に放棄の基礎を形成する。

本発明は、以下の図を参照する以下の実施例で単なる例示としてさらに記載される。

ある特定のアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を示す図である。 ある特定のアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を示す図である。 ある特定のアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を示す図である。 ある特定のアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を示す図である。 ある特定のアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を示す図である。 ある特定のアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を示す図である。 ある特定の配列のアラインメントを示す図である。 ある特定の配列のアラインメントを示す図である。 細胞をトランスフェクトして細胞の表面でタンパク質を発現させるために用いられるポリヌクレオチドによってコードされる、ヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメインの配列を示す図である。宿主動物を免疫化するために、これらの細胞を次に用いた。 抗体Ａｂ９６９によるＴＨＰ−１細胞へのＣＳＦ−１結合の阻害を示す図である。 抗体Ａｂ９６９による一次ヒト単球によるＣＳＦ−１駆動型の生存及び増殖の阻害を示す図である。 抗体Ａｂ９６９による一次ヒト単球によるＩＬ−３４駆動型の生存及び増殖の阻害を示す図である。 抗体Ａｂ５３５による一次マウス単球によるＣＳＦ−１駆動型の生存及び増殖の阻害を示す図である。 Ａｂ９６９、ヒトＣＳＦ−１及びアイソタイプ対照とインキュベートしたＴＨＰ−１細胞上の細胞表面ＣＳＦ−１Ｒのレベルを示す図である。 アイソタイプ対照と比較してＡｂ９６９で処置したＴＨＰ−１細胞上の細胞表面ＣＳＦ−１Ｒの相対レベルを示す図である。 Ａｂ５３５、ＣＳＦ−１及びアイソタイプ対照とインキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞上の細胞表面ＣＳＦ−１Ｒのレベルを示す図である。 アイソタイプ対照と比較してＡｂ５３５で処置したＲＡＷ２６４．７細胞上の細胞表面ＣＳＦ−１Ｒの相対レベルを示す図である。 ＣＳＦ−１による刺激又はＡｂ９６９による処置の後のＣＳＦ−ＲでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞上のＣＳＦ−１Ｒリン酸化のレベルを示す図である。 Ａｂ９６９と及びＣＳＦ−１とインキュベートしたときの、一次ヒト単球からのＭＣＰ−１分泌のレベルを示す図である。 キメラＡｂ９６９．ｇ０と比較したヒト化抗体９６９．ｇ５によるＣＳＦ−１媒介単球生存の阻害に及ぼす効果を示す図である。 Ａｂ９６９の様々なヒト化抗体移植片によるＣＳＦ−１媒介単球生存の阻害に及ぼす効果を示す図である。 ７ｍｇ／ｋｇのＡｂ９６９．ｇ２の単一の静脈内用量で処置したカニクイザルから採取した血清試料中のＣＳＦ−１の濃度を示す図である。 １．５ｍｇ／ｋｇのＡｂ９６９．ｇ２の単一の静脈内用量で処置したカニクイザルから採取した血清試料中のＣＳＦ−１の濃度を示す図である。 異なる時点における循環非古典的単球に及ぼす７ｍｇ／ｋｇ及び１．５ｍｇ／ｋｇの投薬量でのカニクイザルへの抗体Ａｂ９６９．ｇ２の投与の効果を示す図である。 ヒト乳がん異種移植片ＭＣＦ−７の皮下移植を有する免疫不全ヌードマウスにおける対照抗体、陽性対照及びビヒクル対照と対比した抗体Ａｂ５３５の抗腫瘍効果を示す図である。 同所性前立腺がんモデルＰＣ−３における対照抗体、陽性対照及びビヒクル対照と対比した抗体Ａｂ５３５の抗腫瘍効能を示す図である。 アイソタイプ対照と比較したＢＡＬＦコラーゲン濃度に及ぼすＡｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置の影響を示す図である。 アイソタイプ対照と比較したＡｓｈｃｒｏｆｔスコアによって測定した肺試料の線維性病状に及ぼすＡｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置の影響を示す図である。 アイソタイプ対照と比較した血清中アルブミン濃度に及ぼすＡｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置の影響を示す図である。 ブレオマイシン誘導肺線維症研究からのマウスのＢＡＬ液中のマクロファージ数であり、Ａｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置が、アイソタイプ対照処置動物と比較してＢＡＬ液中のマクロファージ数を低減したことを示す図である。データは平均±ＳＥＭで示す；^＊は、食塩水アイソタイプとの有意差を表す；＃は、アイソタイプ対照抗体を投与したブレオマイシン処置マウスとの有意差を表す（ｐ≦０．０５） 食塩水対照、ブレオマイシンプラスアイソタイプ対照及びブレオマイシンプラスＡｂ５３５処置動物からの肺の組織病理学的分析の代表的画像を示す図である。 アイソタイプ対照処置と比較したＢＡＬＦコラーゲン濃度に及ぼす誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置の影響を示す図である。 アイソタイプ対照処置と比較したＡｓｈｃｒｏｆｔスコアによって測定した肺試料の線維性病状に及ぼす誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置の影響を示す図である。 アイソタイプ対照処置と比較した血清中アルブミン濃度に及ぼす誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置の影響を示す図である。 肺線維症のＡＤＡ欠損モデルからのマウスのＢＡＬ液中のマクロファージ数を示し、誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置が、ＢＡＬ液中のマクロファージ数を低減したことを示す図である。 両方ともアイソタイプ対照又はＡｂ５３５で処置した正常なマウス（ＡＤＡ＋）及び誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウス（ＡＤＡ−）からの肺の組織病理学的分析の代表的画像を示す図である。

例１−抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の生成
免疫化：
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーに連結したヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメインを発現するベクターで一時的にトランスフェクトさせた同系ＲＦＬ６ラット線維芽細胞で、雌ＳＤラットを免疫化した。図３は、ラットの免疫化で使用したヒトＣＳＦ−１Ｒ細胞外ドメイン配列である配列番号３９を示す。

ラットは、３週間隔で１動物につき３〜９×１０^６個のトランスフェクション細胞の５回の皮下免疫化を受けた。最初の細胞免疫化の隣接部位に、フロイント完全アジュバント（ＰＢＳ中５０％）を注射した。最終免疫化の２週後に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び脾臓を収集した。

抗体上清の一次スクリーニング
抗体上清は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞上で発現されたヒトＣＳＦ−１Ｒに結合するそれらの能力について、蛍光微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ）によって最初にスクリーニングした。

６００×９６ウェルプレートの一次ＦＭＡＴスクリーニングで、抗ＣＳＦ−１Ｒ反応性を有するおよそ１０００ウェルが同定された。合計で、およそ３×１０^８個のＢ細胞（ラット脾細胞）をＦＭＡＴによってＣＳＦ−１Ｒ結合抗体の生成についてスクリーニングした。

抗体上清の二次スクリーニング
中和抗ＣＳＦ−１Ｒ活性を含有したＦＭＡＴ陽性ウェル、すなわちヒトＣＳＦ−１Ｒ受容体へのヒトＣＳＦ−１結合を阻止する能力を有する抗体を同定するように、中間スループットアッセイを考案した。ヒトＣＳＦ−１とのインキュベーションの前に、ＣＳＦ−１Ｒを発現するＴＨＰ−１細胞と抗体上清をインキュベートした。ＴＨＰ−１細胞へのＣＳＦ−１結合のレベルは、抗ＣＳＦ−１ポリクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーによって測定した。無関係の抗体上清を、陰性対照として使用した。

７７９個の抗体ウェルの上清に二次スクリーニングを適用し、これらのウェルの８８個は検出可能なＣＳＦ−１ブロッキング活性を実証した。

抗体上清の三次スクリーニング
二次スクリーニングで中和活性を示していた抗体上清を、一次ヒト単球のＣＳＦ−１依存性生存を阻止するそれらの能力について試験した。ヒト血液から単球を精製し、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＣＳＦ−１の存在下で１×１０^４個の細胞を各抗体上清とインキュベートした。７２時間のインキュベーションの後、生存可能な単球の数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイによって測定した。

二次スクリーニングで同定された５９個の抗体ウェルの上清に三次スクリーニングを適用し、１８個のウェルはＣＳＦ−１媒介単球生存を低減する能力を実証した。

抗体可変領域のクローニング及びブロッキング活性の再分析
ＣＳＦ−１中和活性を実証した１８個の抗体ウェルから、可変領域（Ｖ領域）のクローニングを試みた。ラット抗体定常領域に特異的なプライマー及びラット免疫グロブリンリーダーペプチドをコードする配列にアニールする冗長なプライマーセットを用いて、重鎖及び軽鎖の免疫グロブリンＶ領域をＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。Ｖ領域遺伝子は１４個の抗体から回収し、重鎖及び軽鎖のヒトＩｇＧ４発現ベクターにクローニングした。

抗体ベクター対をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一時的にトランスフェクトし、ＴＨＰ−１細胞上のＣＳＦ−１中和活性について馴化培地を試験した（上記の通り）。抗体の９つは、対照の馴化培地と比較してＣＳＦ−１結合を部分的又は完全に阻害する能力を有していた。

９つの中和抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の配列分析
配列多様性を評価するために、９つの中和抗体で配列決定をした。全ての９つの抗体は特異であった。さらなるプロファイリング研究のために、これらの抗体をクローニングし、発現させた。

例２−抗ヒトＣＳＦ−１ＲキメラＡｂ９６９及び抗マウスＣＳＦ−１Ｒ Ａｂ５３５のｉｎ ｖｉｔｒｏ特性
ｉ）キメラＡｂ９６９の発現
例１で同定された９つの中和抗体の可変領域を別々の重鎖及び軽鎖発現ベクターにクローニングし、完全長ヒトＩｇＧ４抗体として発現させた。

天然のリーダー配列をコードするＤＮＡ及びヒンジ安定化突然変異Ｓ２４１Ｐを有するヒトガンマ−４重鎖定常領域を含有するベクターｐＶｈｇ４ＦＬ（Ｖ１９Ｈ）に、ＶＨ遺伝子をクローニングした。天然のリーダー配列をコードするＤＮＡ及びヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）を含有するベクターｐＫＨ１０．１（Ｖ４Ｌ）に、ＶＬ遺伝子（カッパ）をクローニングした。

マッチングさせた重鎖及び軽鎖ベクター対のＣＨＯ−Ｋ１細胞への一時的同時トランスフェクションによって、抗体を発現させた。最終調製物中の凝集体のレベルが１％未満であるように、ＰＢＳ ｐＨ７．４に抗体を精製した。

９つの抗体のパネルは、抗体９６９と命名した抗体を含んでいた。ラット可変領域及びヒトガンマ−４重鎖定常領域及びヒトカッパ鎖定常領域を含むキメラ抗体は、以下の例では抗体９６９又は抗体９６９ｃＨｃＬ又は抗体９６９．ｇ０と呼ぶ。

ｉｉ）リガンドブロッキングアッセイ
ＴＨＰ−１細胞へのＣＳＦ−１結合を阻害する９つの抗体の各々の能力は、フローサイトメトリーによって評価した。ＴＨＰ−１細胞は、０．５、０．１２５、０．０３１、０．００７８及び０．００１９５μｇ／ｍｌで各抗体と３０分間インキュベートした。無関係なＩｇＧ４抗体は、アイソタイプ対照の役目をした。洗浄後、細胞を３０分間、０．５μｇ／ｍｌヒトＣＳＦ−１とインキュベートした。さらなる洗浄の後、ビオチン化抗ＣＳＦ−１抗体及びＡｌｅｘａ４８８コンジュゲートストレプトアビジンとの逐次的なインキュベーションによって、結合したＣＳＦ−１を検出した。受容体結合リガンドをフローサイトメトリーによって測定し、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をプロットした。

このアッセイでは、試験した残りの抗体より優れ、濃度３１．３ｎｇ／ｍｌでＣＳＦ−１結合の完全な阻害を実証した、Ａｂ９６９を含む４つの抗体が同定された。Ａｂ９６９の結果は、図４に示す。

ｉｉｉ）ＣＳＦ−１及びＩＬ−３４によって媒介される単球生存の阻害
抗ヒトＣＳＦ−１Ｒ：
一次ヒト単球のＣＳＦ−１及びＩＬ−３４駆動型の生存及び増殖を阻害するそれらの能力について、精製された抗ヒトＣＳＦ−１Ｒ抗体を試験した。各アッセイで、単球の最大刺激を与える濃度でマイトジェン（ＣＳＦ−１又はＩＬ−３４）を使用した。

フィコール勾配上でヒトＰＢＭＣを新鮮なヒト全血から調製し、単球を負の選択によって精製した。単球を０．２５μｇ／ｍｌの抗体及び２０ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１と７２時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ分析を用いて生存可能な細胞の相対数を判定した。発光の読出しは、生存可能な細胞数と相関する。結果は図５ａに示す。

フィコール勾配上でヒトＰＢＭＣを新鮮なヒト全血から調製し、単球を負の選択によって精製した。単球を０．２５μｇ／ｍｌの抗体及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３４と７２時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ分析を用いて生存可能な細胞の相対数を判定した。発光の読出しは、生存可能な細胞数と相関する。結果は図５ｂに示す。

それらのリガンドブロッキング活性と同調して、Ａｂ９６９を含む抗体の４つは、ＣＳＦ−１（図５ａ）及びＩＬ−３４（図５ｂ）刺激に関して残りの抗体と比較して単球生存の優れた阻害を実証した。

抗マウスＣＳＦ−１Ｒ：
一次マウスＣＤ１１ｂ^＋単球をマウス脾臓から精製した。次に、単球を２４時間、漸増量のマウスＣＳＦ−１（ｍＣＳＦ−１）とインキュベートした。細胞培地へのＭＣＰ−１の放出をＥＬＩＳＡによって測定し、ｍＣＳＦ−１によるＭＣＰ−１の用量依存的放出が実証された。研究の別の群では、１０μｇ／ｍｌの抗マウスＣＳＦ−１Ｒ Ａｂ５３５を漸増量のｍＣＳＦ−１と一緒に加えた。ＭＣＰ−１の放出は、試験したＣＳＦ−１の全ての濃度でＡｂ５３５によって完全に阻害された（図６）。

１００ｎｇ／ｍｌの一定濃度のＣＳＦ−１及び漸増量のＡｂ５３５で一次マウス単球を使用して、ＭＣＰ−１放出アッセイを実施した。ＭＣＰ−１放出の用量依存的阻害が実証され、ＩＣ_５０を計算した。２つの独立した実験からのＡｂ５３５の平均ＩＣ_５０は、８．０８ｎｇ／ｍｌと決定された。

結論：ＣＳＦ−１によるマウス単球の処置はＭＣＰ−１の用量依存的放出を引き起こし、それは１０μｇ／ｍｌのＡｂ５３５による処置によって完全に阻害された。Ａｂ５３５はＣＳＦ−１駆動型のマウス単球からのＭＣＰ−１放出を用量依存的に阻害し、平均ＩＣ_５０は８．０８ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝２）である。このＩＣ_５０値は、抗ヒトＣＳＦ−１Ｒ抗体によって表されるものに類似している。

ｉｖ）親和性
精製された組換えＣＳＦ−１Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質への結合動態の測定によるＢＩＡｃｏｒｅアッセイで、ＣＳＦ−１Ｒに結合するそれらの能力について抗体を試験した。

アッセイフォーマットは、固定化された抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の捕捉と、次に捕捉された表面でのｈＣＳＦ−１Ｒ／Ｆｃの滴定であった。ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）を使用して、ＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。全ての実験は、２５℃で実施した。アミンカップリング化学により、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）の上に、Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を約５０００応答単位（ＲＵ）のレベルまで固定化した。ランニングバッファーとして、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）を１０μｌ／分の流量で使用した。固定化された抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）_２の上でおよそ１００ＲＵの捕捉レベルを与えるために、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の注入を実施した。

組換えヒトＣＳＦ−１Ｒ／Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を５ｎＭで捕捉された抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の上に３０μｌ／分の流量で５分間流し、その後解離段階のために流量を１００μｌ／分に３０分間増加させた。対応する緩衝液対照とともに、５ｎＭでの注入を２回実施した。これらのセンサーグラムは、解離速度を生成するために使用した。捕捉された抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体上で、３０μｌ／分の流量で５分間、組換えヒトＣＳＦ−１Ｒ／Ｆｃを２．５ｎＭから滴定し、その後１０分間の解離段階が続いた。これらのセンサーグラムは、結合速度を生成するために使用した。４０ｍＭ ＨＣｌの１０μｌ注入と続いて１０ｍＭ ＮａＯＨの５μｌ注入によって、表面を１０μｌ／分の流量で再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．１）を標準の手順に従って使用して、二重参照バックグラウンド補正結合曲線を分析した。動力学的パラメータは、フィッティングアルゴリズムから判定した。

４つの試験抗体のうちの３つは、１０ｐＭ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）を示した。これは、抗マウスＣＳＦ−１Ｒ並行試薬、Ａｂ５３５と比較して有利である。Ａｂ９６９及びＡｂ５５３の結果を、表１に示す。

抗体の親和性は、ＴＨＰ−１細胞を使用した細胞ベースのアッセイによっても測定した。Ａｌｅｘａ−４８８蛍光色素で抗体を直接的に標識し、定量的フローサイトメトリーによって親和性を測定した。追加のＢＩＡｃｏｒｅ分析は、抗体の蛍光コンジュゲーションが組換えＣＳＦ−１Ｒタンパク質への親和性を変化させないことを確認した。結果を、表２に示す。

２つの方法論から導かれる絶対的親和性値は異なり、この差は２つの系を比較したときに通常観察される。しかし、細胞ベースの方法は、抗体が高い親和性でＣＳＦ−１Ｒに結合することを実証した。

ｖ）ＣＳＦ−１結合の阻害（ＩＣ_５０）
ＴＨＰ−１細胞へのＣＳＦ−１結合を阻害するそれらの相対力価を測定することによって、４つの抗体を分析した。このアッセイフォーマットで、全ての４つの抗体はＣＳＦ−１結合の強力な阻害を示し、ＩＣ_５０値は５ｎｇ／ｍｌ未満（約３０ｐＭ）であった。

ｖｉ）抗体交差反応性
アカゲザル、カニクイザル及びイヌ完全長ＣＳＦ−１Ｒでの交差反応性について、４つの抗体を試験した。全ての４つの抗体はヒトＣＳＦ−１Ｒに加えてアカゲザル及びカニクイザルのＣＳＦ−１Ｒに結合し、アイソタイプ対照のレベルより有意に高い明らかな結合を実証した。

ｖｉｉ）ＣＳＦ−１Ｒ内在化
Ａｂ９６９：
ＴＨＰ−１細胞を０、０．５、２、４、２４及び４８時間、Ａｂ９６９とインキュベートした。細胞は、それぞれ陽性及び陰性対照としての役目をしたヒトＣＳＦ−１及びアイソタイプ対照によっても処置した。各時点で、細胞表面ＣＳＦ−１Ｒのレベルをフローサイトメトリーによって測定した（図７）。アイソタイプ対照と比較してＡｂ９６９で処置した細胞上の細胞表面ＣＳＦ−１Ｒの相対レベルを計算したものを、図８に示す。

組換えＣＳＦ−１によるＴＨＰ−１細胞の処置は、細胞表面ＣＳＦ−１Ｒのレベルの急速で持続する減少を引き起こした。天然のリガンドはその同族受容体に結合し、リガンド−受容体複合体の内在化を促進する。

全４８時間の過程を通して、未処置及びアイソタイプ対照処置ＴＨＰ−１細胞と比較して、Ａｂ９６９で処置したＴＨＰ−１細胞は、より高いレベルの細胞表面ＣＳＦ−１Ｒ発現を示した。このデータは、Ａｂ９６９によるＴＨＰ−１細胞の処置が、処置から最高４８時間後まで細胞表面発現ｈＣＳＦ−１Ｒの内在化を引き起こさないことを強く示唆する。

ＣＳＦ−１で処置した細胞を除いては、時間が経過するに従い、未処置及び処置ＴＨＰ−１細胞上の細胞表面発現ＣＳＦ−１Ｒの注目すべき増加があった。これは、４８時間の実験期間中の細胞増殖期間中の発現の変化が原因かもしれず、ストレス応答である可能性がある。

Ａｂ９６９が受容体の内在化を強化しないというさらなる証拠を提供するために、さらにＴＨＰ−１細胞系が生理的に関連しないという可能性を排除するために、一次ヒト単球を内在化アッセイでも使用した。このアッセイからのデータは、Ａｂ９６９が健康な一次ヒト単球の上で細胞表面ＣＳＦ−１Ｒの急速な内在化を引き起こさないことも実証した。

Ａｂ５３５：
マウス白血病単球／マクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７は、高レベルのマウスＣＳＦ−１Ｒ（ｍＣＳＦ−１Ｒ）を発現し、抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体Ａｂ５３５が受容体の内在化を導き出すことができるかどうかについて試験するのに適する細胞ベースの系を代表する。

ＲＡＷ２６４．７細胞を０、０．５、２、４、２４及び４８時間、Ａｂ５３５とインキュベートした。細胞は、それぞれ陽性及び陰性対照としての役目をしたヒトＣＳＦ−１及びアイソタイプ対照によっても処置した。各時点で、細胞表面ＣＳＦ−１Ｒのレベルをフローサイトメトリーによって測定した（図９）。アイソタイプ対照と比較した細胞表面ＣＳＦ−１Ｒの相対レベルを計算したものを、図１０に示す。

データは、組換えＣＳＦ−１によるＴＨＰ−１細胞の処置は、細胞表面ＣＳＦ−１Ｒのレベルの急速で持続する減少を引き起こしたことを示す。

未処置及びアイソタイプ対照処置細胞に対して、２時間ヒトＣＳＦ−１で処置したＲＡＷ２６４．７細胞で、細胞表面ｍＣＳＦ−１Ｒレベルの明らかな低減が観察された。この低減は、４８時間の研究の間ずっと維持される。これは、ヒトＣＳＦ−１がｍＣＳＦ−１Ｒの内在化を誘発することを実証し、受容体内在化の監視のための実験系を確認する。

全４８時間の過程を通して、未処置及びアイソタイプ対照処置細胞と比較して、Ａｂ５３５で処置したＲＡＷ２６４．７細胞は、類似したレベルの細胞表面ｍＣＳＦ−１Ｒを示した。抗体によって媒介される受容体内在化はこの時間枠内で起こることが予想されるので、このデータはＡｂ５３５がｍＣＳＦ−１Ｒの内在化を誘発しないことを強く示唆する。

Ａｂ５３５が受容体内在化を強化しないというさらなる証拠を提供するために、一次マウスＣＤ１１ｂ^＋単球−マクロファージを内在化アッセイで使用した。これらの結果も、Ａｂ５３５によるマウス単球−マクロファージの処置が、処置から最高２４時間後まで細胞表面発現ｍＣＳＦ−１Ｒの内在化を引き起こさないことを証明した。

ｖｉｉｉ）ＣＳＦ１−Ｒ活性化
ＣＳＦ−１はＣＳＦ−１Ｒに結合して受容体二量体の形成を引き起こし、それはキナーゼドメインを近接させることによって急速な受容体リン酸化を誘発する。これはその後、受容体内在化、及びＲａｓ−ＭＡＰＫ経路を含むいくつかのよく特徴付けられたシグナル伝達経路の活性化につながる。抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が受容体クラスタリングを導き出し、下流のシグナル伝達カスケードを誘発することができるかもしれない。これは受容体シグナル伝達を阻害するべきである抗体にとって望ましくない特性であるかもしれないので、Ａｂ９６９による受容体アゴニズムを２つの独立したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイフォーマットを使用して試験した。

第１のアッセイフォーマットでは、ヒト完全長ＣＳＦ−１Ｒでトランスフェクトした細胞と抗体をインキュベートし、受容体及び下流シグナル伝達分子のリン酸化をウエスタンブロット法によって監視した。

ＴＨＰ−１細胞系は、ＣＳＦ−１Ｒの活性化状態を監視するための出発点であった。しかし、この細胞系でのＣＳＦ−１Ｒの発現レベルは比較的低く、生化学的分析の実施を困難にしている。したがって、ＣＳＦ−１Ｒリン酸化のレベルを強力に検出することができるように、実験系を考案した。ＣＳＦ−１Ｒのリン酸化は、２つのチロシン残基、Ｙ７２３及びＹ８０９で検出することができる。さらに、Ｔ２０２及びＹ２０４でのｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）のリン酸化を、ＣＳＦ−１Ｒ活性の独立した読出しとして測定した。ＣＳＦ−１による刺激は、陽性対照として全ての実験に含まれた。

ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、完全長ＣＳＦ−１Ｒを発現するプラスミドベクターでトランスフェクトした。無血清条件で２４時間のインキュベーションの後、細胞をＡｂ９６９．ｇ０の１００μｇ／ｍｌ〜０．００１μｇ／ｍｌの漸増量で５分間刺激した。細胞は、陽性対照を提供するために、５００ｎｇ／ｍｌの組換えＣＳＦ−１でも処置した。未処置の細胞は、陰性対照として含まれた。処置した及び未処置の細胞からのタンパク質溶解物をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって分離し、ニトロセルロースの上へブロットした。ホスホＹ７２３ ＣＳＦ−１Ｒ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 番号３１５１）、ホスホＹ８０９（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 番号３１５４）、全ＣＳＦ−１Ｒ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 番号３１５２）及びホスホＥＲＫ１／２（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 番号５３０１）に対する抗体を使用して、ウエスタンイムノブロッティングを実施した。

刺激されていないＣＳＦ−１ＲでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、低い基礎レベルのＣＳＦ−１Ｒリン酸化を示した。ＣＳＦ−１による細胞の刺激は、残基Ｙ７２３及びＹ８０９でウエスタンブロット分析によって容易に観察されたＣＳＦ−１Ｒリン酸化のレベルをもたらした（図１１）。ＣＳＦ−１処置の結果、ＥＲＫ１／２リン酸化の明らかな刺激もあった。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｆ細胞の抗体Ａｂ９６９．ｇ０による処置は、ＣＳＦ−１Ｒのリン酸化を刺激せず、ＥＲＫ１／２活性化を強化しなかった。

第２のアッセイでは、抗体Ａｂ９６９（単量体及び架橋）を一次ヒト単球とインキュベートし、ＭＣＰ−１分泌をＣＳＦ−１Ｒ活性化のマーカーとして使用した。ヒト単球のＣＳＦ−１処置は、それらに単球化学誘引タンパク質−１（ＭＣＰ−１）を放出させる。抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が単球の上でＣＳＦ−１Ｒ受容体を活性化する能力を有するならば、ＭＣＰ−１の放出が起こると予想される。

以前に記載した生化学的アッセイは、単量体の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体だけを使用した。しかし、架橋ＩｇＧ１が、ＣＳＦ−１Ｒ分子を近接させてチロシンリン酸化及び下流シグナル伝達を誘発する増強された能力を有するかもしれない。これを評価するために、抗ヒトＦｃ抗体と架橋させたＡｂ９６９．ｇ０を使用したＭＣＰ−１アッセイも実施した。

ヒト単球は、以下の通りにヒト全血から調製した：６０〜１００ｍｌのヒト全血を、ＢＤバキュテーナー１０ｍｌヘパリンリチウム１７１ ＩＵ管に収集した。血液を３〜４本のＬｅｕｃｏｓｅｐフィコール管（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）に分け、ＰＢＳをつぎ足した。管をブレーキなしで１０分間、２０℃において１０００ｇで遠心分離し、ＰＢＭＣ層を収集した。細胞をペレットにし、次に製造業者のプロトコールに従って正選択ヒトＣＤ１４ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０−０５０−２０１）を使用して単球を単離した。２：１のＡｂ９６９．ｇ０：Ｆｃの比でヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｇ−１０２−Ｃ）を加えることによって、抗体Ａｂ９６９．ｇ０を架橋させた。抗体Ａｂ９６９．ｇ０又は架橋Ａｂ９６９．ｇ０の漸増用量の存在下の培地に、１ウェルにつき細胞数２０，０００で単球を播種した（最大１０μｇ／ｍｌの１６濃度を含む半対数希釈系列）。１００ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１の存在下及び非存在下で、並びに抗ヒトＦｃ抗体（抗体Ａｂ９６９．ｇ０の最高濃度で存在するのと同じ濃度で（５μｇ／ｍｌ））の存在下及び非存在下で、対照ウェルは抗体を含有しなかった。細胞を２４時間インキュベートし、プレートを遠心して細胞をペレットにし、上清を収集した。分泌されたＭＣＰ−１は、製造業者のプロトコールに従ってＭＳＤ（Ｋ１５１ＡＹＢ−２）によって測定した。

実験の結果は、図１２に示す。単量体であれ架橋フォーマットであれ、Ａｂ９６９．ｇ０処置のいずれでもＭＣＰ−１レベルの増加は検出されなかった。処置細胞の培地中のＭＣＰ−１の濃度は、未処置の細胞と同一であった。予想された通り、ＣＳＦ−１で処置した細胞はＭＣＰ−１レベルの有意で再現性のある増加を与えた。

例３−抗体９６９のヒト化とヒト化移植片の選択
例２で測定されたそれらの親和性及び特性に基づき、ヒト化について４つの抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を選択した。

ｉ）ヒト化移植片の生成
ヒト生殖細胞系抗体Ｖ領域フレームワークの上へラット抗体Ｖ領域からのＣＤＲを移植することによって、抗体９６９及び９７０をヒト化した。

Ｃｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔ定義の組合せを使用したＣＤＲ−Ｈ１を除いては、ドナーからアクセプター配列に移植されたＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７）によって規定される通りである（Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＷＯ９１／０９９６７を参照）。

ヒトＶ領域ＶＫ１ ２−１−（１）Ｏ１２プラスＪＫ４ Ｊ領域（Ｖ ＢＡＳＥ、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、軽鎖ＣＤＲのためのアクセプターとして選択した。ヒトＶ領域ＶＨ２ ３−１ ２−７０プラスＪＨ３ Ｊ領域（Ｖ ＢＡＳＥ、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を、重鎖ＣＤＲのためのアクセプターとして選択した。

表１に示すように、ラットＶ領域からのいくつかのフレームワーク残基は、ヒト化配列で保持された。

それぞれｇＬ１及びｇＨ１と命名した初期ヒト化軽鎖及び重鎖Ｖ領域配列をコードする遺伝子を、自動化合成アプローチによって設計、構築した。オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発によってｇＬ１及びｇＨ１遺伝子を改変することによって、軽鎖及び重鎖Ｖ領域の両方のさらなる変異体を作製した。

ヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含有するヒト軽鎖発現ベクターｐＫＨ１０．１に、ＶＫ遺伝子（ｇＬ１からｇＬ９まで）をクローニングした。ヒトガンマ−４重鎖定常領域をヒンジ安定化突然変異Ｓ２４１Ｐと一緒にコードするＤＮＡを含有するヒトガンマ−４重鎖発現ベクターｐＶｈγ４Ｐ ＦＬに、ＶＨ遺伝子（ｇＨ１及びｇＨ２）をクローニングした（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−８）。変異体軽鎖及び重鎖をコードするプラスミドの異なる組合せをＨＥＫ２９３Ｆに同時トランスフェクトさせ、ヒト化組換え９６９抗体の発現をもたらした。

重要であると予測される重鎖及び軽鎖のいくつかのドナー残基を含有する保存的移植片並びにドナー残基を含有しない完全ヒト化移植片を提供することによって、他の３つの抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体もヒト化した。

ｉｉ）ヒト化抗体の親和性
各ヒト化移植片は、（ｉ）ＢＩＡｃｏｒｅによるヒトＣＳＦ−１Ｒへの結合親和性、及び（ｉｉ）ＴｈｅｒｍｏＦｌｕｏｒ分析によって測定する融点（Ｔｍ）について、両方とも親のキメラ抗体と比較して評価した。融点は抗体分子の安定性の初期の指標を提供すると考えられ、不安定な抗体は一般的に７５．０℃未満のＴｍを示す。

Ａｂ９６９のヒト化の段階を表す移植片を、表５に示す。表５は、Ａｂ６９６のキメラ抗体（９６９ｃＨｃＬ）も示す。保存的移植片（９６９ｇＨ１ｇＬ１）は２．４ｐＭの親和定数（Ｋ_Ｄ）を示したので、キメララット抗体（９６９ｃＨｃＬ）と比較して親和性の明らかな減少はなかった。９６９ｇＨ１ｇＬ１保存的移植片のＴｍは７８．８℃であり、したがって７５．０℃の閾値の上であった。９６９ｇＨ２ｇＬ１を生成する重鎖のＶ７８のためのＡ７８ドナー残基の置換は、抗体親和性（Ｋ_Ｄ＝２．３ｐＭ）を低減しなかった。それぞれＱ３８、Ｆ７１及びＹ８７へのＫ３８、Ｙ７１及びＦ８７ドナー残基の段階的置換の結果、親和性の変化は観察されなかった。ドナー残基を含有していない最終ヒト化移植片９６９ｇＨ２ｇＬ８は、親のキメラ抗体と類似の親和性を示した（４．１ｐＭ）。

Ａｂ９６９は、ＣＤＲ−Ｌ２とフレームワークの接合点に潜在的ＤＧ異性化モチーフを所有する。９６９ｇＨ２ｇＬ７及び９６９ｇＨ２ｇＬ８移植片中のこのＤＧ部位アスパラギン酸残基は、不活性のＳＧ配列を与えるためにセリンに突然変異させた。ＣＳＦ−１Ｒへの親和性はＢＩＡｃｏｒｅによって測定し、親和性の明らかな減少は検出されなかった（表６）。さらに、最終９６９Ｈ２ｇＬ７（ＳＧ）及び９６９ｇＨ２ｇＬ８（ＳＧ）移植片は、それぞれ８０．５℃及び７９．９℃の高いＴｍを保持した。

Ａｂ９６９及び他の１つの抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体Ａｂ９７０のヒト化は、親のキメラ抗体と同等の親和性（Ｋ_Ｄ）、及び分子安定性の初期予測を与えるＴｍを有する、完全ヒト化抗体（ラットドナーの残基は存在しない）を生成した。Ａｂ９６９の完全ヒト化バージョン（９６９ｇＨ２ｇＬ８ＳＧ）は、Ａｂ９６９．ｇ５と改名した。これ以降、Ａｂ９６９のキメラバージョンは、Ａｂ９６９．ｇ０と呼ぶ。

ＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して、Ａｂ９６９抗体の精製されたキメラ及びヒト化移植片の組換えＣＳＦ−１Ｒへの親和性を再び測定した。ヒト化工程の間に実施された以前のＢＩＡｃｏｒｅ実験は、精製された抗体ではなく未精製の細胞上清を使用して実行された。親和性のわずかな低減が検出され、Ｋ_Ｄ値はおよそ４ｐＭから５ｐＭに増加した。

ｉｉｉ）Ａｂ９６９．ｇ０及びＡｂ９６９．ｇ５によるＣＳＦ−１媒介単球生存の阻害
培養中の単球の活性化及び生存のために、ＣＳＦ−１が必要とされる。ＣＳＦ−１が除去されると、単球はアポトーシスを速やかに受ける。読出しとしてＭＣＰ−１（単球化学走性タンパク質−１；別名ＣＣＬ２、ケモカインＣ−Ｃモチーフリガンド２）を使用したアッセイを考案した。ＣＳＦ−１刺激の結果、ヒト単球はＭＣＰ−１を分泌し、それは一般的に刺激の２４時間後にＥＬＩＳＡによって細胞上清中に検出することができる。ＣＳＦ−１結合をブロックする抗体によるＣＳＦ−１Ｒシグナル伝達の阻害は、ＭＣＰ−１分泌の低減を引き起こす。

フィコール勾配上でヒトＰＢＭＣを新鮮なヒト全血から調製し、ＣＤ１４^＋単球を正の選択によって精製した。合計２×１０^４個の単球を、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＣＳＦ−１の存在下で２４時間、１０μｇ／ｍｌ〜０．３５ｐｇ／ｍｌの抗体の半対数希釈系列とインキュベートした。最小及び最大のＭＣＰ−１放出値を提供するために、「抗体、ＣＳＦ−１を含まない」及び「抗体を含まず、ＣＳＦ−１を含む」対照が含まれた。２４時間のインキュベーションの後、遠心分離によって細胞をペレットにし、上清を収集した。製造業者の使用説明書に従ってヒトＣＣＬ２／ＭＣＰ−１ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＹ２７９）を使用して、ＭＣＰ−１の濃度を測定した。

ここから、アッセイは「ＭＣＰ−１阻害アッセイ」と呼ぶ。

ヒト化９６９．ｇ５の活性をキメラＡｂ９６９．ｇ０と比較するために、ＭＣＰ−１阻害アッセイを使用した。単球の異なる４種のドナーを使用して、５つの独立したアッセイを実施した。全てのアッセイで、Ａｂ９６９．ｇ５ヒト化移植片は、親のキメラ抗体９６９．ｇ０と比較して予想外の有意により低い活性を示した。単一の代表的実験を、図１３に示す。単球アッセイでの９６９．ｇ０の平均ＩＣ_５０は、９６９．ｇ５の３３３．０ｎｇ／ｍｌと比較して２４．６ｎｇ／ｍｌであった。これは、このアッセイフォーマットを使用して両方の抗体を比較したときの、抗体力価の１３．５分の１の減少を示す。

ＭＣＰ−１阻害アッセイでヒト化抗体が低下した活性を示した理由を明らかにするために、Ａｂ９６９を使用して一連の実験を実施した。データは、ＭＣＰ−１阻害アッセイで観察されたＡｂ９６９．ｇ５の活性低下が、抗体及びリガンドを標的細胞に加えた順序によることを示唆した。競合アッセイフォーマットを適用したとき、Ａｂ９６９．ｇ０及びＡｂ９６９．ｇ５の両方の活性は低下したが、より重要なことに、それらのブロッキング活性のより大きな差が検出された。ヒト化Ａｂ９６９のより低い「オンレート」が力価の低下の原因であるかどうか分析するために、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を実施した。これらのデータは、Ａｂ９６９．ｇ０及びＡｂ９６９．ｇ５のＫ_Ｄは類似していたが、Ｋａは９６９．ｇ０の２．１６×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１と比較して、Ａｂ９６９．ｇ５で１．５７×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１とより低かった（表５を参照する）。競合アッセイでは、ＣＳＦ−１及び抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が同じ受容体への結合に関して競合する場合、リガンドのオンレートも高く、リガンドが高い濃度で存在するならば、より遅い抗体オンレートはブロッキング活性の低下をもたらすかもしれない。ヒトＣＳＦ−１は抗体と同様に２．１９×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の特に高いオンレートを有することが知られており、アッセイは高いＣＳＦ−１濃度（２５０ｎｇ／ｍｌ）で実施した。

９６９．ｇ５のブロッキング活性の低下が抗体の生来の特性に起因したというさらなる証拠を提供するために、ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１の結合を測定するＥＬＩＳＡを開発した。この方法は、ここから「ＥＬＩＳＡリガンドブロッキングアッセイ」と呼ぶ。このアッセイは、プレートに結合したＣＳＦ−１Ｒに加える前にＣＳＦ−１及び抗体をプレミックスした競合的結合を使用して実施した。このアッセイは、抗体活性に及ぼすＣＳＦ−１濃度の影響を評価するためにも実行した。

１ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１濃度を使用してリガンドブロッキングＥＬＩＳＡで９６９．ｇ０及び９６９．ｇ５のＩＣ_５０を測定したとき、両方の抗体はそれぞれ１２．８３ｎｇ／ｍｌ対１９．６５ｎｇ／ｍｌのＩＣ_５０で類似の活性を有するようであった。アッセイで１０ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１の濃度を使用したとき、Ａｂ９６９．ｇ０及びＡｂ９６９．ｇ５のＩＣ_５０は増加したが、より重要なことに、それらの間の差はそれぞれ７９．２９ｎｇ／ｍｌ対２６８．１０ｎｇ／ｍｌにさらに増加した。この傾向は１００ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１を使用したアッセイで続き、Ａｂ９６９．ｇ０及びＡｂ９６９．ｇ５はそれぞれ８２８．７０ｎｇ／ｍｌ及び３９４７．００ｎｇ／ｍｌのＩＣ_５０値を与えた。競合アッセイは、ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１結合のブロッキングにおいて、Ａｂ９６９．ｇ５がＡｂ９６９．ｇ０より活性が低いことを実証する。力価のこの低減は、ＣＳＦ−１の濃度が増加するに従ってより顕著になる。

ｉｖ）ＭＣＰ−１阻害アッセイでのキメラＡｂ９６９と同等の活性を有するＡｂ９６９のヒト化移植片の同定
ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を比較することができるように、一時的な発現によって一群のＡｂ９６９ヒト化中間体移植片を調製した（表８）。同じバッチの中で抗体特性の直接比較ができるように、対応するキメラ抗体（Ａｂ９６９．ｇ０）及び完全ヒト化移植片（Ａｂ９６９．ｇ５）も一時的発現に含まれた。

各抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は、ＭＣＰ−１阻害アッセイで試験した。そのフォーマットは大きな抗体群の急速スクリーニングを可能にし、いかなる差別的ＣＳＦ−１Ｒブロッキング活性も強調するので、単一の抗体濃度によるＣＳＦ−１滴定を用いるアッセイフォーマットを選択した。このアッセイでは、一次ヒト単球からのＭＣＰ−１の用量依存的放出が検出され、ＣＳＦ−１Ｒ活性をブロックする各抗体の相対能力は、ＭＣＰ−１が放出された場合のＣＳＦ−１の濃度によって測定した。漸増量の組換えヒトＣＳＦ−１存在下の培地に、１ウェルにつき細胞数２０，０００で単球を播種した（最大５００ｎｇ／ｍｌの１８濃度を含む２倍希釈系列）。１μｇ／ｍｌ抗体の単一の用量を加えた。細胞を２４時間インキュベートし、上清を収集した。分泌されたＭＣＰ−１は、ＥＬＩＳＡによって測定した。ＭＣＰ−１阻害アッセイは抗体Ａｂ９６９．ｇ２及びＡｂ９６９．ｇ７が高いＣＳＦ−１Ｒブロッキング活性を保持し、両方の実体は、１００ｎｇ／ｍｌを超える濃度でＣＳＦ−１を単球に加えたときにＭＣＰ−１分泌を完全に阻害することが可能なことを明らかにした（図１４）。このアッセイでは、活性の明らかな減少がＡｂ９６９．ｇ５について検出され、それは１０ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１濃度までＭＣＰ−１分泌を阻害することができただけである。同様に、抗体Ａｂ９６９．ｇ９は、Ａｂ９６９．ｇ２及びＡｂ９６９．ｇ７と比較して低下したＣＳＦ−１Ｒブロッキング活性を示した。

ＣＳＦ−１媒介単球活性化を阻害するそれらの相対能力のより完全な評価を提供するために、選択されたＡｂ９６９ヒト化移植片のＩＣ_５０をＭＣＰ−１アッセイで測定した。混合した供給源からの単球をプールせずにいくつかの異なるドナーを使用して抗体活性を評価することが重要であると考えられた。表９は、異なる６種のドナーを使用してＡｂ９６９で実施したアッセイから蓄積された抗体のＩＣ_５０値を示す。

Ａｂ９６９．ｇ２及びＡｂ９６９．ｇ７の両ヒト化移植片は、キメラＡｂ９６９．ｇ０抗体と同等である相対ＩＣ_５０を示す。極めて対照的に、Ａｂ９６９．ｇ５はアッセイで大いに低い力価を示す（１９．６の平均キメラ／移植片ＩＣ_５０比）。

ｖ）ヒト化Ａｂ６９６抗体群の親和性
各Ａｂ９６９ヒト化抗体移植片及び親のキメラ抗体の親和性をＢＩＡｃｏｒｅによって測定し（表１０）、そこでは３つの独立した実験を実行して、平均値を計算した。データは、親和性（Ｋ_Ｄ）が、キメラ分子（Ａｂ９６９．ｇ０）から「完全ヒト化」抗体Ａｂ９６９．ｇ５まで、ヒト化の過程で変化しないようであることを示す。しかし、ヒト化がＡｂ９６９．ｇ２移植片を越えて進行するとき、抗体「オンレート」は減少する。Ａｂ９６９．ｇ４及びＡｂ９６９．ｇ５の両方は、前の移植片より低いＫ_ａ値を有する。さらに、Ａｂ９６９．ｇ５のＫ_ａはＡｂ９６９．ｇ４より低く、ＳＧへのＤＧ異性化部位の突然変異がなおさらに抗体オンレートを低減することを潜在的に示す。

結論：
いくつかのアッセイでの一群のＡｂ９６９ヒト化移植片の試験は、軽鎖の中の７１位のチロシン残基（例えばＹ７１）が抗体の活性を改善することを明らかにした。例えばＹ７１のフェニルアラニンでの置換は、親のキメラ分子と比較して抗体オンレートの低減（Ｋ_ａの減少）をもたらす。これは、一次ヒト単球でのＣＳＦ−１Ｒの活性を監視するアッセイ（ＭＣＰ−１阻害アッセイ）で明らかにされた、ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１結合をブロックする抗体の能力の低下をもたらす。

例４−ヒト化Ａｂ６９６群の分子安定性
ｉ）熱安定性
熱安定性（融点Ｔｍで測定される）は、２つの独立した方法によって判定した。１つの方法は、露出した疎水性表面への蛍光色素の結合によるアンフォールディングを監視し（Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ方法）、他は熱量測定（ＤＳＣ）、直交技術による。

抗体９６９の様々な移植片（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中）についてＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒによって測定したＴ_ｍを、表１１に要約する。

全体として、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒで測定したＦａｂ’Ｔ_ｍは、ほとんどの９６９移植片がＩｇＧ４対照より熱的に安定していることを示唆する。

ｉｉ）凝集傾向に及ぼす試料濃度の影響
保存中の試料の安定性の予測因子として、ＰＢＳ ｐＨ７．４中の安定性に及ぼす抗体濃度の影響を調べた。

実験１：
抗体を１０ｍｇ／ｍｌ超に濃縮し、室温で５日間インキュベートした。濃縮直後（Ｔ_０）に、９６９．ｇ７は濁っているようであり、９６９．ｇ８はわずかに乳白色に見えた。対照的に、９６９．ｇ５試料は、目視検査によって透明であると判断された。室温で５日間のインキュベーションの後、９６５．ｇ５試料は透明なままであったが、９６９．ｇ７及び９６９．ｇ８の凝集はさらに進行し、各々重い沈殿物を示した。

この研究から、以下の通りにこれらの条件での凝集抵抗性の順に試料をランク付けすることが可能であった：９６９．ｇ５＞９６９．ｇ８＞９６９ｇ７。

実験２：
濃縮の前に、乳白色に見える９６９．ｇ６（４．６８ｍｇ／ｍｌ）を除いて、全ての３つの抗体試料は目視検査で透明であった。１６ｍｇ／ｍｌへの濃縮の結果、室温及び４℃の両方で２４時間の保存の後に９６９．ｇ６の沈殿が注目された。しかし、９６９．ｇ１及び９６９．ｇ４の両方は目視で透明のままだった。５日間のさらなるインキュベーションの後、室温及び４℃の両方において試料９６９．ｇ１で大きな粒子が明白であった。目視検査によって判断された通り、室温又は４℃において試料９６９．ｇ４で凝集は観察されなかった。

この研究から、ＰＢＳ ｐＨ７．４に低い濃度（４．６８ｍｇ／ｍｌ）で保存したときに、９６９．ｇ６が多少の凝集不安定性を有したことを示すことが可能であった。さらに、この沈殿は、さらなる抗体濃縮によって悪化した。濃縮した９６９．ｇ１はより遅い速度の凝集を示したが、濃縮した９６９．ｇ４はいずれの保存温度でも５日間まで安定したままだった。したがって、凝集安定性の順序は、以下の通りであった：９６９．ｇ４＞９６９．ｇ１＞９６９．ｇ６。

実験３：抗体９６９．ｇ２、９６９．ｇ５、９６９．ｇ７及び９６９．ｇ９
濃縮直後（Ｔ_０）、一晩のインキュベーションの後及び濃縮から５日後に、試料分析を実施した。全ての試料は濃縮前に目視検査で透明であり、粒子形成の証拠はなかった。２３．０７ｍｇ／ｍｌへの濃縮の直後に、９６９．ｇ７試料は、実験１で以前に観察された沈殿を示した。９６９．ｇ９でわずかな乳白光が観察され、それは室温又は４℃で２４時間の保存の後により目立つようになった。他の９６９移植片の全ては、濃縮直後に目視検査によって透明に見えた。

２１日間のインキュベーションの後、室温で一晩のインキュベーションの後に観察されたものからのさらなる可視的変化はなかった。試料を濃縮した結果として９６９．ｇ７及び９６９．ｇ９移植片は凝集したが、他の試料については明らかな可視的凝集はなかった。

全体として、濃度を増加させた結果として、９６９．ｇ２試料は最少の凝集傾向を示した。これは、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒによって測定された最も高いＴ_ｍとも相関した。

結論：ヒト化Ａｂ９６９群の発現及び精製の間、１０ｍｇ／ｍｌを超えて抗体濃度を増加させることが、一部のヒト化抗体移植片の急速な沈殿をもたらすことが明らかになった。具体的には、Ａｂ９６９．ｇ１、Ａｂ９６９．ｇ６及びＡｂ９６９．ｇ７は沈殿物を形成し、Ａｂ９６９．ｇ２、Ａｂ９６９．ｇ４及びＡｂ９６９．ｇ５は沈殿物を形成しなかった。このデータは、軽鎖中の３８位リシン残基（Ｋ３８）のグルタミンでの置換が、１０ｍｇ／ｍｌを超えて濃縮したときに抗体安定性を向上させることを示す。

例５ Ａｂ９６９．ｇ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析
ｉ）Ａｂ９６９．ｇ２の配列
Ａｂ９６９．ｇ２は、ｇＬ７軽鎖移植片及びｇＨ２重鎖移植片を含有する。ラット抗体（ドナー）Ｖ領域配列とヒト生殖細胞系（アクセプター）Ｖ領域配列とのアラインメントを、軽鎖移植片ｇＬ７及び重鎖移植片ｇＨ２の最終ヒト化配列と一緒に図２Ａ及び２Ｂに示す。

移植片ｇＨ２の重鎖フレームワーク残基は、全てヒト生殖細胞系遺伝子に由来する。例えば抗体及び抗体断片のＮ末端でのピログルタミン酸へのグルタミンの変換によって均質生成物の発現及び精製を改善するために、ヒト重鎖フレームワークの１位のグルタミン残基をグルタミン酸（Ｅ１）で置き換えた。

ドナー残基チロシンが保持された残基７１（Ｋａｂａｔ番号付け）を除いて、移植片ｇＬ７の軽鎖フレームワーク残基は全てヒト生殖細胞系遺伝子に由来する。この残基の保持は、例３に示すようにヒト化抗体の向上した力価を提供した。

ｉｉ）ＩＬ−３４依存性ヒト単球活性化の阻害
ＩＬ−３４依存性ヒト単球アッセイで、９６９．ｇ０と比較したＡｂ９６９．ｇ２の活性を評価した。２つの別々の単球ドナーを使用して実験を実施し、ＩＬ−３４媒介単球刺激の阻害の平均ＩＣ_５０を計算した（表１２）。Ａｂ９６９．ｇ２とＡｂ９６９．ｇ０の間にＩＣ_５０の有意差はなかった。

１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−３４及び抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の漸増用量の存在下で、１ウェルにつき細胞数２０，０００で一次ヒト単球を播種した（最大１０μｇ／ｍｌの１６種の濃度を含む半対数希釈系列）。細胞を２４時間インキュベートし、上清を収集した。分泌されたＭＣＰ−１は、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＹ２７９）によって測定した。グラフは、ＣＳＦ−１のみの対照と比較したＭＣＰ−１生成の阻害百分率を示す。

ｉｉｉ）ヒトＣＳＦ−１ＲのＳＮＰへのＡｂ９６９．ｇ２の結合
ヒト母集団で報告された、ヒトＣＳＦ−１Ｒ遺伝子のリガンド結合ドメインに位置する４つの非同義の一塩基多型（ＳＮＰ）がある。これらのＳＮＰは、Ｖ３２Ｇ、Ａ２４５Ｓ、Ｈ２４７Ｐ及びＶ２７９Ｍである（図１Ｆ）。ヒトＣＳＦ−１Ｒの各ＳＮＰ変異体を生成し、細胞系で安定して発現させた。各ＳＮＰへのＡｂ９６９．ｇ２の結合は、フローサイトメトリーによって確認した。

例６ カニクイザルでの６つの薬力学的マーカー分析
ヒト以外の霊長類（カニクイザル）で抗体の薬理活性を実証するために、ヒト化モノクローナル抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体９６９．ｇ２による薬物動態学的／薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）研究を実施した。３匹のカニクイザルの群に、７ｍｇ／ｋｇ（第１群）又は１．５ｍｇ／ｋｇ（第２群）の９６９．ｇ２抗体の単一用量を静脈内投与した。抗体は、有害な臨床徴候がなく、良好な耐容性を示した。２５日間の研究全体で複数の時点に血清試料を採取した。

９６９．ｇ２の血清中濃度をＥＬＩＳＡによって測定し、薬物動態学的分析を実施した（表１３）。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを使用してＰＫパラメータを計算した。
ｔ_１／２は、血清中の抗体の半減期である。
Ｃ_ｍａｘは、血清中の抗体のピーク濃度である。
ＡＵＣは曲線下面積（濃度−時間曲線の積分）であり、薬物への全曝露の指標を提供する。
クリアランスは、単位時間あたりの薬物が取り除かれた血漿の容積である。
Ｖｏｌ．Ｄｉｓｔ．は分布容積であり、薬物が分配される見掛け容積のことである。

観察値及び予測値の間に優れた相関があった（動物２は例外で、外れ値とみなされる）。Ｃ_ｍａｘは、用量に比例した。ＡＵＣは用量比例項より大きく、より高い用量でより遅いクリアランスを示した。大多数の９６９．ｇ２は、血清で検出された。

ＣＳＦ−１のクリアランスの一次経路はその同族受容体ＣＳＦ−１Ｒへの結合を通すものである。ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１結合の遮断は、受容体媒介クリアランスの阻止を通してＣＳＦ−１の血清中濃度を増加させると予想され；この現象はマウスモデルで観察された。したがって、血清中のＣＳＦ−１濃度の増加は、ＣＳＦ−１Ｒの関与及び阻害の薬力学的マーカーである。

９６９．ｇ２の両方の用量は、血清中のＣＳＦ−１の急速でかなりの蓄積を煽った。この影響は用量依存性であり、７ｍｇ／ｋｇ用量は１．５ｍｇ／ｋｇ用量よりおよそ１０倍高いピークＣＳＦ−１濃度を与えた。抗体のクリアランスの後に続くＣＳＦ−１レベルの標準化で、薬物動態学的／薬力学的関係が観察された。両処置群について、研究の終りまでにＣＳＦ−１レベルはベースラインに戻った。結果を、図１５ａ及び１５ｂに示す。

図１５ａは、７ｍｇ／ｋｇのＡｂ９６９．ｇ２の単一の静脈内用量で処置したカニクイザルから採取した血清試料中のＣＳＦ−１の濃度を示す。ＣＳＦ−１の血清中濃度は、２つの独立したアッセイで測定した。グラフは、第１群（７ｍｇ／ｋｇ）の３匹の動物についてＣＳＦ−１の平均濃度を標準誤差（四角）と一緒に示す。Ａｂ９６９．ｇ２の平均血清中濃度（丸）も示す。

図１５ｂは、１．５ｍｇ／ｋｇのＡｂ９６９．ｇ２の単一の静脈内用量で処置したカニクイザルから採取した血清試料中のＣＳＦ−１の濃度を示す。ＣＳＦ−１の血清中濃度は、２つの独立したアッセイで測定した。グラフは、第２群（１．５ｍｇ／ｋｇ）の３匹の動物についてＣＳＦ−１の平均濃度を標準誤差（四角）と一緒に示す。Ａｂ９６９．ｇ２の平均血清中濃度（丸）も示す。

ヒト及びカニクイザルの循環単球の２つの主要な集団がある；（ｉ）ＣＤ１４＋ＣＤ１６−「古典的」単球及び（ｉｉ）ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋「非古典的」又は「レジデント」単球。マウスモデルは、ＴＡＭを含むレジデント組織マクロファージが非古典的単球集団に由来することを実証した。さらに、非古典的単球は、古典的単球集団のさらなる分化に由来する。９６９．ｇ２を投与したカニクイザルの循環単球集団は、全血の４色フローサイトメトリーによって監視した。フローサイトメトリーは、抗ｃｙｎｏ−ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ、抗ヒト−ＨＬＡ−ＤＲ−ＡＰＣ、抗ヒト−ＣＤ１４−ＦＩＴＣ（Ｍｙ４クローン）及び抗ヒト−ＣＤ１６−ＰＥ（３Ｇ８クローン）抗体を使用して実施した。各抗体の適当なアイソタイプ対照を使用してゲートを設定した。古典的単球は、ＣＤ４５^＋ＨＬＡ−ＤＲ^＋ＣＤ１４^＋ＣＤ１６⁻と規定した。非古典的単球は、ＣＤ４５^＋ＨＬＡ−ＤＲ⁻ ＣＤ１４⁻ ＣＤ１６^＋と規定した。

９６９．ｇ２の両方の用量は、研究の第１週全体において非古典的ＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋単球の段階的な消失を煽った。非古典的単球のほとんど完全な消失は、７ｍｇ／ｋｇ用量によって引き起こされた。７ｍｇ／ｋｇ及び１．５ｍｇ／ｋｇ用量による非古典的単球の低減は４日目の時点でピークに達したようであり、数は１１日目までに正常に戻った。結果を図１５ｃに示す。棒グラフは、研究全体の時点（０、１、４、１８及び２５日目（Ｄ））での非古典的ＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋循環単球の平均数を標準誤差と一緒に示す。血清ＣＳＦ−１の平均濃度も、標準誤差とプロットする。

この例は、（ｉ）抗体９６９．ｇ２はカニクイザルでＣＳＦ−１Ｒに結合してＣＳＦ−１結合をブロックすることが可能なことを確認し、（ｉｉ）ヒト以外の霊長動物モデルで抗体９６９．ｇ２の薬理活性を実証し、（ｉｉｉ）抗体９６９．ｇ２がｉｎ ｖｉｖｏでカニクイザル単球の非古典的集団を選択的に減少させることを実証し−単球集団は腫瘍関連マクロファージの前駆体であると考えられている、（ｉｖ）血清ＣＳＦ−１濃度は９６９．ｇ２活性を測定するためのバイオマーカーとして適することを実証した。

例７：ＭＣＦ−７乳がん異種移植片の増殖の阻害
抗体９６９．ｇ２は、マウスＣＳＦ−１Ｒに結合することができない。したがって、がん及び線維症を処置するＡｂ９６９．ｇ２の有用性を示すために、抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体Ａｂ５３５を使用してｉｎ ｖｉｖｏマウス研究を実行した。いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で、Ａｂ５３５はＡｂ９６９．ｇ２と同等の特性及び活性を有することが示された。

Ａｂ５３５は、例２ ｉｉｉ）のＣＳＦ−１媒介単球生存を阻害すること、例２ ｉｖ）の同等の親和性を有すること、及び例２ ｖｉｉ）のＣＳＦ−１Ｒ内在化を誘発しないことが示された。

Ａｂ５３５に関するｉｎ ｖｉｖｏ研究として、ｉｎ ｖｉｖｏのＭＣＦ−７乳がん異種移植片モデルを以下の通りに実行した：

この研究では、ヒト乳がん異種移植片ＭＣＦ−７の皮下移植片を有する免疫不全ヌードマウスにおける、対照抗体、陽性対照及びビヒクル対照と対比した、皮下投与（ｓ．ｃ．）された抗体Ａｂ５３５の治療効力を測定した。腫瘍増殖阻害は、治療パラメータとして使用した。ヒト乳がんＭＣＦ−７は、免疫不全雌ＮＭＲＩ：ｎｕ／ｎｕマウスで皮下異種移植モデルとして使用した。ＭＣＦ−７細胞系は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＵＳＡ）の腫瘍バンクから得た。実験的使用のために、細胞をＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ＦＣＳでｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。亜集密培養から細胞を採取し、マウスの皮下に接種した。触知可能な腫瘍サイズ（４〜１０ｍｍ）で、処置を開始した。試験化合物及びビヒクル対照を、１週に３回皮下投与した。陽性対照は、２４、３３及び４０日目に、１日に１回静脈内投与した。注入量は、注射時の体重に個々に調整した。腫瘍直径は、カリパスで週３回測定した。腫瘍体積は、Ｖ＝（長さ×（幅）２）／２により計算した。相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の計算のために、各測定日の体積を最初の処置日と関係づけた。各測定日に、群ごとの中央及び平均の腫瘍体積、加えてパーセントで表した処置対対照（Ｔ／Ｃ）中央値を計算した。

結果を図１６に示す。Ａｂ５３５は、用量依存的抗腫瘍効果を示した。対照マウスＩｇＧ抗体の両方の投薬量は、腫瘍増殖阻害を誘導しなかった。相対腫瘍体積はビヒクル対照と同等であり、陽性対照は腫瘍増殖阻害を引き起こした。

結論：試験抗体Ａｂ５３５は、最高用量（３０ｍｇ／ｋｇ／日）において、ヒト乳がん異種移植片ＭＣＦ−７で統計的に有意な抗腫瘍効果を誘導した。

例８：ＰＣ−３正常位前立腺がんの増殖阻害
正常位前立腺がんモデルＰＣ−３を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体Ａｂ５３５の抗腫瘍及び転移抑制効力も試験した。ルシフェラーゼを連続的に発現してｉｎ ｖｉｖｏ生物発光画像分析を可能にするようにＰＣ−３細胞系を遺伝子改変し、これはｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍増殖を監視すること及び選択された器官でｅｘ ｖｉｖｏ転移分析を実施することを可能にした。

この研究は、無作為化の後に各々１１匹（第５群）又は１２匹（全ての他の群）の雄ＮＭＲＩヌードマウスを含有する、６つの実験群からなった。０日目に、全ての参加した雄ＮＭＲＩヌードマウスの前立腺に、ＰＣ−３細胞を正常位に移植した。３日目に、腫瘍増殖の開始をｉｎ ｖｉｖｏ生物発光画像化を介して検証した。８日目に、第２のｉｎ ｖｉｖｏ生物発光画像化を実施し、平均生物発光強度、したがって腫瘍サイズが各群で類似するように、画像化の結果に従って担がん動物を６つの群に無作為化した。翌日（９日目）、療法を開始した。第２群及び第３群の動物には、それぞれ３０及び１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体を４２日目まで週３回皮下投与した。第４及び第５の処置群の動物には、それぞれ３０及び１０ｍｇ／ｋｇの抗体Ａｂ５３５を４２日目まで週３回皮下投与した。第１群の動物はビヒクル対照を表し、ビヒクル（ＰＢＳ）を４２日まで週３回皮下投与した。第６群の動物は陽性対照を表し、３６０ｍｇ／ｋｇの対照を４週間にわたって週１回（１０、１７、２４及び３１日目）静脈内投与した。研究期間中、３、８（無作為化）、１５、２２、２９、３６及び４３日目に生物発光画像化を使用して、正常位移植されたＰＣ−３腫瘍増殖をｉｎ ｖｉｖｏで監視した。

研究終了時に検死を実施した。原発腫瘍の重量及び体積を判定した。選択した器官（肝臓、脾臓及び肺）を収集し、各々の一部をホルマリンで固定し、残りは、ｉｎ ｖｉｔｒｏルシフェラーゼアッセイを使用する生物発光画像化を通して転移パターンに関して分析した。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏルシフェラーゼアッセイを使用して骨で転移パターンを分析するために、片方の脚からの大腿骨及び腰椎の同じ一部を収集した。

ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光シグナルは、原発腫瘍及び転移の両方を含んでいた（全身画像化）。これらのデータに基づいて、全ての群について腫瘍増殖曲線を計算することができた（図１７）。無作為化及び療法の開始まで、腫瘍の発達は全ての試験群で均一であった。以降では、ビヒクル対照の第１群並びに２つの対照抗体ＲＴＥ１１の第２及び第３群は、規則的な腫瘍増殖を示した。陽性対照（第６群）では、４３日目にｉｎ ｖｉｖｏで測定された腫瘍増殖の非常に有意な低減を観察することができた。それぞれ３０又は１０ｍｇ／ｋｇで投与された（第４群及び第５群）抗体Ａｂ５３５は、ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光画像化を使用して監視したときに腫瘍増殖の有意な低減をもたらした。

４４日目の検死中に、原発腫瘍の体積及び湿重量を判定した。陽性対照（第６群）は、原発腫瘍の体積及び重量の両方の非常に有意な低減をもたらした。抗体Ａｂ５３５を３０ｍｇ／ｋｇ（第４群）で投与すると、原発腫瘍の体積及び重量の両方の有意な低減を観察することができた。Ａｂ５３５を１０ｍｇ／ｋｇ（第５群）で投与したとき、腫瘍体積の低減は注目に値したが、この低減は第４群が示したものより小さかった。対照抗体の場合には、有意な抗腫瘍効力を観察することができなかった。

生物発光画像化技術を使用して、検死後に原発腫瘍ルシフェラーゼ活性を測定した。得られた結果は、検死所見及びｉｎ ｖｉｖｏ増殖曲線の結果と同等であった。陽性対照（第６群）は、原発腫瘍のルシフェラーゼ活性の非常に有意な低減をもたらした。３０ｍｇ／ｋｇ（第４群）で投与された抗体Ａｂ５３５は、原発腫瘍ルシフェラーゼ活性の有意な低減をもたらしたが、Ａｂ５３５を１０ｍｇ／ｋｇ（第５群）で投与したときの低減はより小さかった。対照抗体でルシフェラーゼ活性の有意な低減を見出すことはできなかった。

いくつかの追加の器官（肝臓、脾臓、肺、大腿骨及び腰椎の一部）を、ｅｘ ｖｉｖｏの生物発光画像化技術を用いて分析した。陽性対照の場合には、大腿骨及び腰椎についてルシフェラーゼ活性の有意な低減を示すことができたが、肝臓及び脾臓の場合にはシグナル低減はわずかに有意性に届かなかった。３０ｍｇ／ｋｇ（第４群）で投与された抗体Ａｂ５３５の場合には、ルシフェラーゼ活性の低減は肝臓で有意であり、全ての他の器官では注目に値した。対照抗体（第２群及び第３群）は、試験した全ての器官でルシフェラーゼ活性のいかなる低減ももたらさなかった。

結論として、この腫瘍モデルで抗体Ａｂ５３５の有意な抗腫瘍効力を注目すべき転移抑制効力と一緒に実証することができた。

例９：肺線維症のブレオマイシン誘導ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の効果
ブレオマイシンはストレプトミセス・ベルチシラタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ）から最初に単離された抗生物質であり、様々ながんのための化学療法薬として使用されている。肺線維症のブレオマイシンモデルは確立されたモデルであり、本質的にＭａｄｔｅｓ、ＤＫ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０，９２４−３４に記載されているように使用された。詳細なプロトコールは、以下の参考文献Ｍｏｒｓｃｈｌ，Ｅ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ｊ．Ｇ．，Ｖｏｌｍｅｒ，Ｊ．，Ｍｏｈｓｅｎｉｎ，Ａ．，Ｐｅｒｏ，Ｒ．Ｓ．，Ｈｏｎｇ、Ｊ．Ｓ．，Ｋｈｅｒａｄｍａｎｄ，Ｆ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．及びＢｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｍ．Ｒ．（２００８）、Ａ３ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９：６９７−７０５に見出すことができる。

使用した全てのマウスは、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓから購入した野生型Ｃ５７Ｂｌｋ６雌マウス（２０ｇ）であった。気管内（ＩＴ）カットダウン点滴注入を使用し、そこでは、５０μｌの食塩水中の３．５単位用量のブレオマイシン又は対照として５０μｌの食塩水を単独で注入するために、マウスにアバーティンで麻酔をかけ、気管開口形成術を実施した。この方法での処置は、ブレオマイシン曝露後７日目にピークに到達する炎症段階、及び曝露後２１日目に最大である線維症段階をもたらす。抗体Ａｂ５３５の効果を調査し、そこでは、抗体をモデルの線維症段階だけで投与し、３０ｍｇ／ｋｇを９日目から２１日目まで１週につき３回皮下投与した。２１日目に動物を屠殺し、読出しは肺の組織病理学的分析、ＢＡＬ（気管支肺胞洗浄）液細胞性及びＢＡＬ液中の可溶性コラーゲンの測定を含んだ。肺線維症の重症度を判定するための改変Ａｓｈｃｒｏｆｔスコアリング系を使用して肺傷害を評価するために、組織病理学的分析を実行した（Ｈｕｂｎｅｒ ＲＨ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４４：５０７−１７）。切除した肺を１０％ホルマリンで２５ｃｍ圧まで膨張させ、アルコール及びキシレンの系を通して処理し、パラフィンに包埋し、Ｍａｓｓｏｎのトリクロームによる処理及び染色の前に組織切片からパラフィンを除去した。

市販のＳｉｒｃｏｌアッセイキットを製造業者の使用説明書に従って使用して、ＢＡＬ液中の可溶性コラーゲンの量を調べた。

ＢＡＬ液中のマクロファージ集団に及ぼす影響を、サイトスピン調製物を使用して判定した。ＢＡＬ細胞の一定分量を顕微鏡スライドの上で遠心し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋで染色し、マクロファージを計数した。

９日目に投与を開始した抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体、Ａｂ５３５による治療的処置は、ブレオマイシン誘導肺線維症を大きく低減することが判明した。線維症の重症度及び範囲は、有意に低減された。処置マウスはコラーゲン産生が低減され、線維性病状が改善され、肺障壁保護が改善された。

図１８ａは、Ａｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置が、アイソタイプ対照による処置と比較してＢＡＬＦコラーゲン濃度を低減したことを示す。

図１８ｂは、Ａｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置が、アイソタイプ対照による処置と比較して試料のＡｓｈｃｒｏｆｔスコアを低減したことを示し、したがってそれは、Ａｂ５３５で処置したマウスの線維性病状が改善されたことを示す。

図１８ｃは、Ａｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置が、アイソタイプ対照による処置と比較して血清中アルブミン濃度を低減したことを示し、したがってそれは、Ａｂ５３５で処置したマウスの血管透過性が改善されたことを示す。

図１９は、食塩水対照、ブレオマイシンプラスアイソタイプ対照及びブレオマイシンプラスＡｂ５３５処置動物からの肺の組織病理学的分析の代表的画像を示す。Ａｂ５３５で処置した動物は、アイソタイプ対照、ブレオマイシン処置動物と比較して、肺線維症が大いに低減した。

例１０．肺線維症のアデノシンデアミナーゼ欠損マウスモデルにおける抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の効果
アデノシンは強力なシグナル伝達ヌクレオシドであり、そのレベルは細胞がストレスを受けるか又は傷害を受けるときに増加し、アデノシンがその特異的Ｇタンパク質結合受容体と係合するときに多種多様な応答が起こる。アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）は、アデノシンをイノシンに変換するプリン異化作用酵素である。ＡＤＡノックアウトマウスが作製され、血清並びに腎臓、肝臓及び肺などの組織でのアデノシンレベルの増加を有することが示された（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，ＭＲ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７３（９）：５０９３−５１００）。これらのマウスは、肺でのアデノシンレベルの増加と関連する、慢性肺疾患、例えば肺胞破壊、気道炎症及び過剰な粘液生成の特徴を示す（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ＭＲ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９２：１５９−７０）。影響は、マウスが呼吸窮迫により３週齢までに死ぬというようなものである。低用量レジメンを用いた外因性ＡＤＡの投与は、アデノシンレベルを低減し、これらのマウスの寿命を延長し、肺線維症モデルの開発を可能にする（Ｃｈｕｎｎ ＪＬ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５：１９３７−４６、Ｐｅｄｒｏｓａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，６（７号）：ｅ２２６６７）。このモデルでは、アデノシンレベルの慢性的上昇は、肺でのＴＧＦ□を含む線維症促進媒介物の増加、肺組織でのコラーゲン沈着の増加及び線維性肺病状の増加と関連する。抗線維症能力を有する分子の効果を調査するために、ＡＤＡ欠損マウスを数週間低用量外因性ＡＤＡレジメンで維持し、その後ＡＤＡ処置を停止し、潜在的抗線維症剤を投与する。

抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体Ａｂ５３５の効果を、肺線維症のＡＤＡノックアウトマウスモデルで調査した。このモデルでは、酵素欠損マウスを生後１日目から２１日目までＡＤＡ酵素療法で維持した。ＡＤＡ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲートを調製し（Ｙｏｕｎｇ ＨＷ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３：１３８０−８９）、出生後の１、５、９、１３及び１７日目に筋注を投与し（それぞれ０．６２５、１．２５、２．５、２．５及び２．５単位）、続いて２１日目に腹腔内に５単位を注射した。２１日目から後に、さらなる酵素は投与しなかった。２５日目（出生後）から４２日目に動物を屠殺した日まで週３回、１００μｌの容量でＡｂ５３５を３０ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。

４２日目に動物を屠殺し、読出しは肺の組織病理学的分析、ＢＡＬ液細胞性及びＢＡＬ液中の可溶性コラーゲンの定量を含んだ。肺線維症の重症度を判定するための改変Ａｓｈｃｒｏｆｔスコアリング系を使用して肺傷害を評価するために、組織病理学的分析を実行した（Ｈｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４４：５０７−１７）。切除した肺を１０％ホルマリンで２５ｃｍ圧まで膨張させ、アルコール及びキシレンの系を通して処理し、パラフィンに包埋し、Ｍａｓｓｏｎのトリクロームによる処理及び染色の前に組織切片からパラフィンを除去した。

市販のＳｉｒｃｏｌアッセイキットを製造業者の使用説明書に従って使用して、ＢＡＬ液中の可溶性コラーゲンの量も調べた。

ＢＡＬ液中のマクロファージ集団に及ぼす影響を、サイトスピン調製物を使用して判定した。ＢＡＬ細胞の一定分量を顕微鏡スライドの上で遠心し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋで染色し、マクロファージを計数した。

抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体Ａｂ５３５による治療的処置は、ＡＤＡ欠損マウスで肺線維症を有意に低減することが判明した。処置マウスはコラーゲン産生が低減され、線維性病状が改善され、肺障壁の機能及び保護が改善された。

図２０ａは、誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置が、アイソタイプ対照処置と比較してＢＡＬＦコラーゲン濃度を低減したことを示す。

図２０ｂは、誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置が、アイソタイプ対照による処置と比較して試料のＡｓｈｃｒｏｆｔスコアを低減したことを示し、したがってそれは、Ａｂ５３５で処置したマウスの線維性病状が改善されたことを示す。

図２０ｃは、誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置が、アイソタイプ対照による処置と比較して血清中アルブミン濃度を低減したことを示し、したがってそれは、Ａｂ５３５で処置したマウスの血管透過性が改善されたことを示す。

図２０ｄは、Ａｂ５３５を投与される誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスの処置が、ＢＡＬ液中のマクロファージ数を低減したことを示す。

図２１は、両方ともアイソタイプ対照又はＡｂ５３５で処置した正常なマウス（ＡＤＡ＋）及び誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウス（ＡＤＡ−）からの肺の組織病理学的分析の代表的画像を示す。ＡＤＡ−マウスでは、Ａｂ５３５で処置した動物は、アイソタイプ対照と比較して肺線維症が大いに低減した。

したがって、肺線維症の２つのマウスモデルにおいて、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体による処置が線維性疾患を効果的に処置することができることが示された。

Claims (34)

1. 重鎖を含む抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体であって、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４に記載の配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５に記載の配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６に記載の配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む上記抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
2. 重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４に記載の配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５に記載の配列、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６に記載の配列を含む、請求項１に記載の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
3. 軽鎖を含む抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体であって、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に記載の配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に記載の配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に記載の配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む上記抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
4. 軽鎖をさらに含み、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に記載の配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に記載の配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に記載の配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、請求項１又は請求項２に記載の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
5. 軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に記載の配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に記載の配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に記載の配列を含む、請求項４に記載の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
6. 重鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ−Ｈ１の配列は配列番号４に記載の配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲ−Ｈ２の配列は配列番号５に記載の配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲ−Ｈ３の配列は配列番号６に記載の配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
7. 軽鎖をさらに含み、軽鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ−Ｌ１の配列は配列番号１に記載の配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲ−Ｌ２の配列は配列番号２に記載の配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲ−Ｌ３の配列は配列番号３に記載の配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する、請求項６に記載の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
8. 重鎖が、配列番号２３に記載の配列を含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
9. 軽鎖が、配列番号１５に記載の配列を含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
10. 抗体分子が、完全長重鎖及び軽鎖又はその断片を有する完全な抗体分子からなる群から選択される、例えばＦａｂ、改変Ｆａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖ断片を含む群から選択される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
11. 配列番号２３に記載の配列を含む重鎖及び配列番号１５に記載の配列を含む軽鎖を有する、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
12. 軽鎖の可変ドメインが、請求項１１に記載の抗体の軽鎖可変ドメインと少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、重鎖の可変ドメインが、請求項１１に記載の抗体の重鎖可変ドメインと少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
13. 配列番号２７に記載の配列を含む重鎖及び配列番号１９に記載の配列を含む軽鎖を有する、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
14. 重鎖及び軽鎖が、請求項１３に記載の抗体の対応する重鎖及び軽鎖と少なくとも８０％同一又は類似である、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
15. それに付着したエフェクター又はレポーター分子を有する、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
16. １０ｐＭ又は１０ｐＭ未満のヒトＣＳＦ−１Ｒへの結合親和性を有する、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
17. ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２、ＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６の配列に記載の６つのＣＤＲを含む抗体の結合を交差ブロックする、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
18. 抗体が、それがブロックする抗体と同じエピトープに結合することによって結合を交差ブロックする、請求項１７に記載の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体。
19. 請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列。
20. 請求項１９に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクター。
21. 配列番号２８及び／又は配列番号２０に記載の配列を含む、請求項２０に記載のベクター。
22. 請求項２１に記載の１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞。
23. 請求項２２に記載の宿主細胞を培養して抗体を単離することを含む、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体の生成のための方法。
24. 請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体の１つ又は複数と一緒に含む医薬組成物。
25. 他の有効成分をさらに含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
26. 医薬として使用するための請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体又は請求項２４若しくは２５に記載の組成物。
27. がんの処置のための請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体又は請求項２４若しくは２５に記載の組成物。
28. 線維性疾患の処置のための請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体又は請求項２４若しくは２５に記載の組成物。
29. がんの治療又は予防のための医薬の製造における請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体又は請求項２４若しくは２５に記載の組成物の使用。
30. 線維性疾患の治療又は予防のための医薬の製造における請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗体又は請求項２４若しくは２５に記載の組成物の使用。
31. がんを患っているか又はその危険があるヒト対象の処置のための方法であって、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又は請求項２４若しくは２５に記載の組成物の有効量を対象に投与するステップを含む上記方法。
32. 線維性疾患を患っているか又はその危険があるヒト対象の処置のための方法であって、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又は請求項２４若しくは２５に記載の組成物の有効量を対象に投与するステップを含む上記方法。
33. がんが、乳がん、前立腺がん、骨がん、結腸直腸がん、白血病、リンパ腫、皮膚がん、食道がん、胃がん、星状細胞がん、子宮体がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、肺がん、肝がん、甲状腺がん、頭頚部がん、膵がん及び卵巣がんからなる群から選択される、請求項２７に記載の使用のための抗体、請求項２９に記載の使用又は請求項３１に記載の方法。
34. 線維性疾患が、肺線維症、例えば特発性肺線維症及び嚢胞性線維症、腎臓線維症、肝硬変、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維化症、進行性の大規模な線維症、腎原性の全身性線維症、クローン病、ケロイド、心筋梗塞、強皮症及び関節線維症からなる群から選択される、請求項２８に記載の使用のための抗体、請求項３０に記載の使用又は請求項３２に記載の方法。