RS59019B1 - Anti csf-1r antitela - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na anti-CSF-1R antitelo, DNK koja kodira isti, ćelije domaćina koje sadrže navedenu DNK i postupke ekspresije antitela u ćeliji domaćina. Pronalazak se takođe proteže na farmaceutske kompozicije koje sadrže njihovo antitelo i upotrebu antitela, i kompozicije koje sadrže isti u tretmanu.

[0002] Fakror stimulacije kolonije 1 (CSF-1), takođe poznat kao faktor stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF), je citokin proizveden od različitih ćelija, uključujući makrofage, endotelijalne ćelije i fibroblaste. CSF-1 je sastavljen iz dva "monomerna" polipeptida, koji formiraju biološki aktivan dimerni CSF-1 protein. CSF-1 postoji u najmanje tri zrele forme zbog alternativnog splajsovanja RNK (videti, Cerretti et al., 1988, Molecular Immunology, 25:761). Tri oblika CSF-1 su prevedena iz različitih prekurzora rnRNA, koji kodiraju polipeptidne monomere od 256 do 554 aminokiselina, imajući 32 aminokiselinske signalne sekvence na amino terminusu i pretpostavljenu transmembransku regiju od približno 23 aminokiseline u blizini karboksilnog terminusa. Prekurzorski peptidi su zatim obrađeni amino terminalnim i karboksil terminalnim proteolitičkim otcepljenjima radi oslobađanja zrelog CSF-1. Ostaci 1-149 od sve tri zrele forme CSF-1 su identični i veruje se da sadrže sekvence neophodne za biološku aktivnost CSF-1. In vivo monomeri CSF-1 su glikozilovani i dimerizovani preko disulfidne veze. CSF-1 pripada grupi bioloških agonista koji promovišu produkciju krvnih ćelija. Konkretno, on deluje kao faktor rasta i diferencijacije za pretka matične ćelije koštane srži mononuklearne fagocitne loze. Dalje, CSF-1 stimuliše preživljavanje, proliferaciju i funkciju makrofaga putem specifičnog receptora na reagujućim ćelijama.

[0003] CSF-1 receptor (CSF-1R) je takođe označen kao c-fms genski produkt ili CD115. CSF-1R je 165kDa tip 1 TM glikoprotein koji pripada familiji tipa III receptora tirozinske kinaze. Pored CSF-1, strukturno slična, ali sekvenca nepovezanog molekula IL-34 je takođe pokazala da je ligand za CSF-1R (Lin, et al., 2008, Science 320:807-811). Ekspresija CSF-1R je ograničena na ćelije monocitno-makrofagne loze, i cirkulirajuće i rezidentne populacije tkiva i osteoklasta. Pored toga, eksprimira se u brojnim ćelijama ženskog reproduktivnog sistema uključujući oocite, decidualne ćelije i trofoblaste.

[0004] Vezivanje liganda CSF-1 na CSF-1 receptor rezultira u fosforilaciji receptora na jednom ili više tirozinskih ostataka, kroz delovanje domena tirozinske kinazne. Ova fosforilacija može biti otkrivena zato što su dostupna antitela koja se vežu na receptor samo posle fosforilacije (na primer Fosfo-M-CSF-Receptor (Tyr546) antitelo # 3083 iz Tehnologije signalizacije ćelije).

[0005] Ekspresija CSF-1 i CSF-1R korelira sa progresijom tumora i lošom dijagnozom kod mnogih vrsta kancera. Makrofagi povezani sa tumorom (TAMs) mogu biti glavna komponenta tumorske strome i visokih nivoa CSF-1 i CSF-1R su povezani sa visokim TAM infiltracijama i lošom prognozom u brojnim tipovima tumora.

[0006] Antitela na CSF-1R su poznata u tehnici. Sherr, C.J. et al., 1989, Blood 73:1786-1793 opisuje antitela protiv CSF-1R koja inhibiraju aktivnost CSF-1 (Sherr, C.J. et al., 1989, Blood 73:1786-1793). WO2009/026303 otkriva anti-CSF-1R antitela koja se vežu za humani CSF-1R i in vivo modele tumora miša upotrebom anti-mišjeg CSF-1R antitela. WO2011/123381 otkriva anti-CSF-1R antitela koja internaliziraju CSF-1R i imaju ADCC aktivnost. WO2011/123381 takođe otkriva in vivo modele tumora miša upotrebom anti-mišeg CSF-1R antitela. WO2011/140249 otkriva anti-CSF-1R antitela koja blokiraju vezivanje CSF-1 na CSF-1R i navodi se da su korisna u lečenju kancera. WO2009/112245 otkriva anti-CSF-1R IgG1 antitelo koje inhibira vezivanje CSF-1 na CSF-1R i navedeno je da je korisno u lečenju kancera, inflamatorne bolesti creva i reumatoidnog artritisa. WO2011/131407 otkriva anti-CSF-1R antitelo koje inhibira vezivanje CSF-1 na CSF-1R i navodi se da je korisno u lečenju gubitka kosti i kancera. WO2011/107553 otkriva anti-CSF-1R antitelo koje inhibira vezivanje CSF-1 na CSF-1R za koje se smatra da je korisno u lečenju gubitka kosti i kancera. WO2011/070024 otkriva anti-CSF-1R antitela koja se vežu na humani CSF-1R fragment delD4.

[0007] U stanju tehnike postoji potreba da se obezbede nova anti-CSF-1R antitela pogodna za terapijske prijave. Dok je terapijska prijava anti-CSF-1R antitela u lečenju određenih kancera prethodno opisana, još uvek postoji potreba da se obezbede nove terapijske prijave za takva antitela.

[0008] Termin "fibrozna bolest" se odnosi na nenormalan odgovor na zaceljivanje rana pri čemu se višak vlaknastog vezivnog tkiva formira u organu ili tkivu. Depozicija i akumulacija viška komponenti ekstracelularnog matriksa kao što su kolagen i fibronektrin, rezultira otvrdnjavanjem i ožiljcima tkiva, što na kraju može dovesti do otkazivanja organa.

[0009] Primeri fibroznih bolesti uključuju plućnu fibrozu, kao što je idiopatska plućna fibroza i cistična fibroza, fibroza bubrega, fibroza jetre, ciroza jetre, primarni sklerozni holangitis, primarna bilijarna ciroza, endomiokardialna fibroza, medijastinalna fibroza, mijelofibroza, retroperitonealna fibroza, progresivna masivna fibroza, nefrogena sistemska fibroza, Kronova bolest, keloid, infarkt miokarda, sistemska skleroza, skleroderma i artrofibroza.

[0010] Ranjavanje rezultira neposrednim odgovorom koagulacije i zgrušavanja sa razvojem privremenog ekstracelularnog matriksa (ECM). Agregacija trombocita i aktivacija pomažu u promovisanju inflamatornog odgovora karakterisanog vazodilatacijom i povećanjem propustljivosti krvnog suda, što omogućava regrutovanje različitih imunih ćelija, uključujući neutrofile, makrofage, eozinofile i limfocite. Neutrofili i makrofagi čiste ranu, čime se smanjuje rizik od infekcije i zajedno sa aktiviranim limfocitima luče različite faktore rasta i citokine koji služe za dalje pojačavanje inflamatornog odgovora. Molekuli kao što su TGFβ, PDGF, IL-13 aktiviraju makrofage i dovode do regrutacije, proliferacije i aktivacije fibroblasta na mestu rane. Aktivirani fibroblasti ili miofibroblasti, su karakterisani ekspresijom ɑ -glatko-mišićnog aktina i luče kolagen i druge komponente ECM. Aktivirani fibroblasti, kontrahuju kolagensku rešetku, povlačeći rubove rane u središte. Epitelijalne i endotelijalne ćelije proliferišu i migriraju preko privremenog matriksa da regenerišu oštećeno tkivo završavajući kompletirajuću obnovu rane.

[0011] Trajni oštećenja ili povreda tkiva ili disregulacija puta popravka dovodi do neodgovarajućeg odgovora rane. Javlja se prekomerna depozicija i hiper unakrsno povezivanje kolagena i ECM što rezultira prekomernom formacijom i otvrdnjavanjem ožiljnog tkiva umesto normalne građe tkiva.

[0012] Uzrok fibrozne bolesti može biti zavisan od uključenog organa ili tkiva i nepoznat je u nekim bolestima kao što je idiopatska plućna fibroza (IPF). Fibroza jetre i konačno ciroza su rezultat hroničnog oštećenja jetre koje je posledica izlaganja različitim faktorima, uključujući ekološke i prehrambene ili infektivne agense. Dugotrajne infekcije hepatitisa B i C mogu uzrokovati fibrozu jetre. Neprekidna konzumacija alkohola ili ishrana sa visokim sadržajem masti/šećera takođe može dovesti do ciroze jetre. Slično tome, dijabetes može oštetiti i stvoriti ožiljak bubrega dovodeći do gubitka funkcije.

[0013] IPF je jedna od sedam intersticijalnih plućnih bolesti čiji je uzrok nepoznat. Ekološki faktori kao što su izloženost zračenju ili čestice mogu igrati ulogu. Pojedinci koji puše takođe su izloženi većem riziku od ove bolesti. Jednom dijagnostikovan, životni vek pacijenata je vrlo kratak sa prosečnom stopom preživljavanja od 2-5 godina.

[0014] Tretman fibroznih bolesti obično uključuje anti-inflamatorne i imunosupresivne agense, ali oni su od male koristi za pacijenta. Nedostatak efikasnosti ovih tretmana doprineo je ponovnom razmatranju IPF-a i uopšteno, kao neprirodan odgovor na zarastanje rana, a ne na inflamatorno stanje. Pirfenidon je mali molekulski lek koji je odobren za upotrebu u lečenju IPF-a u Japanu 2008. i Evropi u 2011., što je verovatno da će delovati preko višestrukih mehanizama delovanja. Do danas nisu odobrene ciljane terapije i terapije antitelima za fibrozne indikacije.

[0015] Prema tome, trenutno postoji nezadovoljena medicinska potreba za poboljšanim tretmanom fibrozne bolesti. Na primer, za IPF postoji stopa preživljavanja od 3 godine od 50%, i stopa preživljavanja od 5 godina od samo 20%, i transplantacija je potrebna u oko 20% slučajeva.

Rezime pronalaska

[0016] U jednom aspektu obezbeđeno je njihovo anti-CSF-1R antitelo koje sadrži teški lanac, pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži najmanje jedan CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR: 4 za CDR-H1, CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR: 5 za CDR-H2 i CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR: 6 za CDR-H3, na primer pri čemu CDR-H1 je SEK ID BR: 4, CDR-H2 je SEK ID BR: 5 i CDR-H3 je SEK ID BR: 6.

[0017] U jednom aspektu, antitela prema predmetnom pronalasku sadrže laki lanac pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži najmanje jedan CDR koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO: 1 za CDR-L1, CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR: 2 za CDR-L2 i CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR: 3 za CDR-L3, na primer pri čemu CDR-L1 je SEK ID BR: 1, CDR-L2 je SEK ID BR: 2 i CDR-L3 je SEK ID BR: 3.

[0018] Antitela iz otkrića imaju visoki afinitet za CSF-1R, sposobna su blokirati vezivanje liganda za CSF-1R, ne aktiviraju se na CSF-1R i ne uzrokuju internalizaciju CSF-1R.

[0019] Otkriće se takođe proteže na polinukleotid, kao što je DNK, koji kodira antitelo ili fragment kao što je ovde opisano.

[0020] Takođe je obezbeđena ćelija domaćina koja sadrži navedeni polinukleotid.

[0021] Ovde su obezbeđene metode ekspresije njihovog antitela.

[0022] Predmetno otkriće se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže navedena antitela od njih.

[0023] U jednom izvođenju obezbeđen je metod tretmana koji obuhvata primenjivanje terapijski efikasne količine antitela ili kompozicije kao što je ovde opisano.

[0024] Predmetno otkriće se takođe proteže na antitelo ili kompoziciju prema predmetnom otkriću za upotrebu u lečenju, naročito u lečenju kancera i/ili fibrozne bolesti.

Detaljan opis pronalaska

[0025] U jednom izvođenju antitela obezbeđena predmetnim pronalaskom su sposobna blokiranju vezivanja liganda na CSF-1R. Blokiranje kao što se ovde koristi se odnosi na fizičko blokiranje, kao što je okluzija receptora, ali će takođe uključiti gde se antitelo veže na epitop koji uzrokuje, na primer, konformacijsku promenu, što znači da se prirodni ligand za receptor više ne veže (ovde se navodi kao alosterno blokiranje ili alosterna inhibicija). U jednom izvođenju antitela predmetnog otkrića vežu sve izotipe CSF-1R, na primer one sa varijacijama u ECD domenu, kao što su V23G, A245S, H247P, V279M i kombinacije od dve, tri ili četiri od navedenih varijacija.

[0026] Testovi pogodni za određivanje sposobnosti antitela da blokiraju CSF-1R su opisani ovde u Primerima. CSF-1 i IL-34 su oba liganda za CSF-1R i antitela prema pronalasku poželjno inhibiraju aktivnost i CSF-1 i IL-34 u funkcionalnom celularnom zaslonu. Antitela prema predmetnom pronalasku takođe poželjno ne uzrokuju aktivaciju CSF-1R i/ili internalizaciju CSF-1R. Antitela prema predmetnom pronalasku takođe poželjno selektivno iscrpljuju neklasičnu populaciju monocita in vivo.

[0027] Ne-klasični monociti se uopšteno odnose na monocite sa niskom ekspresijom CD14 i visokom ekspresijom CD16. Smatra se da su ova populacija monocita pre-kurzori makrofaga povezani sa tumorom.

[0028] Molekuli antitela predmetnog pronalaska pogodno imaju visok afinitet vezivanja. Afinitet može biti izmeren korišćenjem bilo koje pogodne metode poznate u struci, uključujući tehnike, kao što je npr. površinska plazmonska rezonanca, na primer tzv."BIAcore", kao što je ovde opisano u Primerima, korišćenjem izolovanog prirodnog ili rekombinantnog CSF-1R ili pogodnog fuzionog proteina/polipeptida. U jednom primeru afinitet je izmeren upotrebom rekombinantog humanog CSF-1R ekstracelularnog domena kao što je opisano ovde u Primerima. U jednom primeru korišćen rekombinantni humani CSF-1R ekstracelularni domen je monomer. Pogodno, molekuli antitela predmetnog pronalaska imaju afinitet vezivanja za izolovani humani CSF-1R od oko 1 nM ili manje od 1 nM. U jednom izvođenju molekul antitela predmetnog pronalaska ima afinitet vezivanja od oko 500 pM ili niži. U jednom izvođenju molekul antitela predmetnog pronalaska ima afinitet vezivanja od oko 250 pM ili niži. U jednom izvođenju molekul antitela predmetnog pronalaska ima afinitet vezivanja od oko 200 pM ili niži. U jednom izvođenju predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CSF-1R antitelo sa afinitetom vezivanja od oko 100 pM ili nižim. U jednom izvođenju predmetni pronalazak obezbeđuje humanizovano anti-CSF-1R antitelo sa afinitetom vezivanja od oko 100 pM ili nižim, poželjno oko 10 pM ili nižim, poželjnije oko 5 pM ili nižim. U drugom izvođenju predmetni pronalazak obezbeđuje humanizovano anti-CSF-1R antitelo sa afinitetom vezivanja od oko 100 pM ili nižim, poželjno oko 10 pM ili nižim, poželjnije oko 5 pM ili nižim.

[0029] Što je niža numerička vrednost afiniteta to je veći afinitet antitela ili fragmenta za antigen.

[0030] Humani CSF-1R kao što je korišćen ovde se odnosi na ime humanog proteina CSF-1R ili njegov biološki aktivni fragment, na primer kao što je dato u SEK ID BR: 39 ili registrovano u UniProt pod brojem P07333. Naravno, eksprimirani zreli protein ne sadrži signalnu sekvencu jer je potonji otcepljen nakon translacije.

[0031] Predmetni pronalazači su obezbedili nova anti-CSF-1R antitela, uključujući humanizovana antitela. Antitela su generisana imunizacijom pacova sa fibroblastima pacova koji su transfektovani sa vektorom izražavajući eksracelularni domen CSF-1R. Primarni skrining supernatanata za vezivanje antitela na humani CSF-1R je identifikovao oko 1000 jažica sadržavajući antitelo sa anti-CSF-1R aktivnošću. Sekundarni skrining za antitela sposobna sprečavanju vezivanja CSF-1 na humani CSF-1R je identifikovao 88 pozitivnih jažica. Tercijarni skrining za antitela sposobna sprečavanju preživljavanja primarnih humanih monocita zavisnih od CSF-1 je identifikovao 18 pozitivnih jažica. Varijabilne regije ovih 18 pozitivnih jažica su klonirane, što dovodi do uspešnog kloniranja 14 antitela, i naknadna ekspresija je obezbedila 9 himernih anti-CSF-1R antitela koja su bila izražena na dovoljnim nivoima i bila sposobna inhibiranju vezivanja CSF-1. Ovih 9 antitela su sekvencirana i pronađeno je da svi imaju jedinstvene sekvence i korišćena su za dalje istraživanje.

[0032] 9 anti-CSF-1R himernih antitela su procenjena za aktivnost blokiranja liganda i sposobnost da inhibišu preživljavanje monocita posredstvom CSF-1 i IL-34. Četiri antitela su bila prioritetna za dalju istragu zato što su pokazala potpunu inhibiciju vezivanja CSF-1 i visoke nivoe inhibicije preživljavanja monocita. Ova 4 anti-CSF-1R himerna antitela su testirana za njihovu aktivnost u brojnim in vitro testovima za procenu afiniteta, inhibiciju CSF-1 vezivanja, unakrsnu reaktivnost sa rezus majmunom, cinomolgus majmunom i pasjim CSF-1R, internalizaciju CSF-1R i aktivaciju CSF-1R. Četiri anti-CSF-1R antitela su takođe humanizovana i afinitet humanizovanih transplantata je bio izmeren. Humanizacija dva anti-CSF-1R antitela generisala je potpuno humanizovana antitela (nema prisutnih ostataka donora pacova) sa afinitetom (KD) ekvivalentnim roditeljskom himernom antitelu i Tm koja ukazuje da antitelo ima pogodnu termičku stabilnost. Nasuprot tome, druga dva humanizovana anti-CSF-1R antitela su imala smanjeni afinitet za CSF-1R, u odnosu na himerno antitelo, i Tm je bila niža. Iz tih razloga, samo potpuno humanizovani graftovi dva antitela koja zadržavaju afinitet su izraženi na većoj skali za dalju analizu.

[0033] Izvedena je dalja analiza potpuno humanizovanih graftova ova dva antitela i test inhibicije MCP-1, pri čemu je inhibicija CSF-1R signalizacije pomoću antitela koja blokira vezivanje CSF-1 uzrokovala smanjenje nivoa sekrecije MCP-1. Ovaj test iznenađujuće otkriva da potpuno humanizovani graftovi pokazuju smanjenu aktivnost u poređenju sa himernim antitelom. Serija eksperimenata na jednom od poželjnih antitela, nazvana Ab969, je izvedena da bi se otkrilo zašto potpuno humanizovani graft pokazuje ovu smanjenu aktivnost. Generisani su brojni intermedijarni humanizovani graftovi od Ab969 i testirani u testu inhibicije MCP-1. Nađeno je da graftovi koji su sadržavali varijabilni ostatak donora lakog lanca Y71 generalno pokazuju aktivnost u testu inhibicije MCP-1 koji je uporediv sa onim kod himernog Ab969. Pretpostavljeno je da je ova razlika u aktivnosti graftova različitih antitela u testu inhibicije MCP-1 bila zbog promene po stopi antitela (smanjena Ka) u poređenju sa himernim Ab969.

[0034] Poređenje analize termičke stabilnosti Ab969 sa drugim anti-CSF-1R antitelima, na pr. anti-CSF-1R antitelom Ab970, sugeriše da Ab969 može biti stabilniji.

[0035] Dalja biofizička analiza humanizovanih graftova iz Ab969 je pokazala da se neki graftovi talože kada je antitelo koncentrovano. Pokazalo se da supstitucija lizinskog ostatka na poziciji 38 u lakom lancu, na primer glutaminu, dovodi do poboljšane fizičke stabilnosti.

[0036] Prema tome, jedan graft antitela od Ab969, Ab969.g2 (takođe poznat kao Ab969, je izabran za dalje studije karakterizacije in vitro. Pored povoljnog visokog afiniteta veivanja za CSF-1R, visoka termička stabilnost i visoka fizička stabilnost antitela je pokazala dobru inhibiciju aktivacije monocita zavisnih od IL-34 i takođe je pronađeno da je sposobna vezivanju za SNP varijante od CSF-1R. Ab969.g2 je takođe korišćen za analizu farmakodinamičkih markera kod cinomolgus majmuna gde je pokazano da veže CSF-1R, blokira CSF-1 vezivanje i selektivno iscrpljuje neklasičnu populaciju monocita cinomolgus majmuna in vivo, koji su prekurzorske ćelije makrofaga povezanih sa tumorom.

[0037] Prema tome, u jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži teški lanac i/ili laki lanac, pri čemu teški lanac i/ili laki lanac sadrže najmanje jedan CDR izveden iz anti-CSF-1R antitela 969.2.

[0038] Ab969.2 je humanizovani IgG4 molekul pune dužine; laki lanac sadrži konstantnu regiju humanog kappa lanca (3A alotip) i teški lanac sadrži konstantnu regiju humanog gama-4 teškog lanca sa zglobom stabilizirajuće mutacije S241P (Angal et al., 1993). Unutar varijabilne regije lakog lanca je prisutan potencijalni motiv izomerizacije DG na spoju CDR-L2 i okvira. Sekvence Ab969.2 potpunih teških i lakih lanaca antitela su prikazane u SEK ID BRi: 27 i 19.

[0039] Ostaci u varijabilnim domenama antitela su konvencionalno numerisani prema sistemu koji je osmislio Kabat i sar., 1987. Ovaj sistem je izložen u Kabat i sar., 1987, u Sekvence proteina od imunološkog interesa, US Odelenje za zdravstvo i ljudske usluge, NIH, SAD (u daljem tekstu "Kabat et al. (supra)"). Ovaj sistem numerisanja se koristi u ovoj specifikaciji, osim gde je drugačije naznačeno.

[0040] Oznake Kabat ostataka ne odgovaraju uvek direktno sa linearnim numerisanjem ostataka aminokiseline. Aktuelna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržavati manje ili dodatne aminokiseline nego u strogom Kabatovom numerisanju koje odgovara skraćivanju ili umetanju u strukturalnu

komponentu, bilo da je to okvir ili komplementarnost određivanja regije (CDR), osnovne strukture varijabilne domene. Tačno Kabat numerisanje ostataka može biti određeno za dato antitelo poravnavanjem ostataka homologije u sekvenci antitela sa "standardnom" Kabat numerisanom slekvencom.

[0041] CDR-ovi varijabilne domene teškog lanca su smešteni na ostacima 31-35 (CDR-H1), ostacima 50-65 (CDRH2) i ostacima 95-102 (CDR-H3) prema Kabatovom sistemu numerisanja. Međutim, prema Chothia (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), petlja ekvivalentna CDR-H1 se proteže od ostatka 26 do ostatka 32.Tako, ako nije drugačije naznačeno, ’CDR-H1’ kao što se ovde koristi se odnosi na ostatke 26 do 35, kao što je opisano kombinacijom Kabatovog sistema numerisanja i definicije tzv. "Chothijine" topološke petlje.

[0042] CDR-ovi varijabilne domene lakog lanca su smešteni na ostacima 24-34 (CDR-L1), ostacima 50-56 (CDRL2) i ostacima 89-97 (CDR-L3) prema Kabatovom sistemu numerisanja.

[0043] Antitela za upotrebu u ovom otkriću mogu biti dobijena upotrebom bilo koje pogodne metode poznate u stanju tehnike. CSF-1R polipeptid/protein, uključujući fuzione proteine, ćelije (rekombinantne ili prirodne) koje eksprimiraju polipeptid mogu biti upotrebljeni za produkciju antitela koja specifično prepoznaju CSF-1R. Polipeptid može biti "zreli" polipeptid ili njegov biološki aktivan fragment ili derivat. Humani protein je registrovan u UniProt-u pod brojem P07333.

[0044] Polipeptidi, za upotrebu za imunizaciju domaćina, mogu biti pripremljeni postupcima dobro poznatim u stanju tehnike iz genetskim inženjeringom ćelija domaćina koje sadrže ekspresione sisteme ili mogu biti oporavljene iz prirodnih bioloških izvora. U ovoj prijavi, termin "polipeptidi" uključuje peptide, polipeptide i proteine. One se koriste naizmenično, osim ako nije drugačije naznačeno. CSF-1R polipeptid može u nekim slučajevima biti deo većeg proteina kao što je fuzionii protein na primer fuzionisan na afinitetni tag ili slično.

[0045] Antitela generisana protiv CSF-1R polipeptida mogu biti dobijena, gde je neophodna imunizacija životinje, primenjivanjem polipeptida na životinji, poželjno ne-humanoj životinji, korišćenjem dobro poznatih i rutinskih protokola, videti na primer Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Mnoge toplokrvne životinje, kao što su zečevi, miševi, pacovi, ovce, krave, kamile ili svinje mogu biti imunizovane. Međutim, miševi, zečevi, svinje i pacovi su generalno najpogodniji.

[0046] Monoklonalna antitela mogu biti pripremljena bilo kojom metodom poznatom u stanju tehnike , kao što je tehnika hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), tehnika trioma, tehnika humanog hibridoma B-ćelije(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) i tehnike EBV-hibridoma (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc.).

[0047] Antitela mogu takođe biti generisana korišćenjem metoda antitela sa jednim limfocitom sa kloniranjem i eksprimiranjem imunoglobulinske varijabilne regije cDNAa generisanih iz pojedinačnih limfocita odabranih za produkciju specifičnih antitela pomoću, na primjer, metoda opisanih u Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848; WO92/02551; WO04/051268 i

Međunarodnoj patentnoj prijavi broj WO04/106377.

[0048] Skrining za antitela može biti izveden korišćenjem testova da se izmeri vezivanje na humani CSF-1R i/ili testova da se izmeri sposobnost blokiranja vezivanja liganda na receptor. Primeri pogodnih testova su opisani u Primerima ovde.

[0049] Specifično kao što je ovde upotrebljeno se odnosi na antitelo koje samo prepoznaje antigen za koji je specifično ili antitelo koje ima značajno veći afinitet vezivanja za antigen za koji je specifično u poređenju sa vezivanjem za antigene za koje je nespecifično, na primer najmanje 5, 6, 7, 8, 9, 10 puta veći afinitet vezivanja.

[0050] Aminokiselinske sekvence i polinukleotidne sekvence određenih antitela prema ovom otkriću su obezbeđene na Slikama 1 i 2.

[0051] Ovde je otkriveno anti-CSF-1R antitelo ili njegov vezujući fragment koji sadrži teški lanac, pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži najmanje jedan CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR: 4 za CDR-H1, i CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR:5 za CDR-H2 i CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR:6 za CDR-H3. Poželjno varijabilni domen teškog lanca sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 4 za CDR-H1, sekvencu datu u SEK ID BR:5 za CDR-H2 i sekvencu datu u SEK ID BR:6 za CDR-H3.

[0052] Ovde je otkriveno anti-CSF-1R antitelo ili njegov vezujući fragment koji sadrži laki lanac, pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži najmanje jedan CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR: 1 za CDRL1, CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR:2 za CDR-L2 i CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR:3 za CDR-L3. Poželjno varijabilni domen lakog lanca sadrži sekvencu datu u SEK ID BR:1 za CDR-H1, sekvencu datu u SEK ID BR:2 za CDR-H2 i sekvencu datu u SEK ID BR:3 za CDR-H3.

[0053] Ovde je otkriveno anti-CSF-1R antitelo ili njegov vezujući fragment koji sadrži teški lanac kao što je definisano iznad i dodatno sadržavajući laki lanac pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži najmanje jedan CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR: 1 za CDR-L1, CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR:2 za CDR-L2 i CDR koji ima sekvencu datu u SEK ID BR:3 za CDR-L3. Varijabilni domen lakog lanca poželjno sadrži sekvencu datu u SEK ID BR:1 za CDR-L1, sekvencu datu u SEK ID BR:2 za CDRL2 i sekvencu datu u SEK ID BR:3 za CDR-L3.

[0054] Ovde je otkriveno izvođenje, najmanje jedna amino kiselina je zamenjena sa konzervativnom supstitucijom u jednoj ili više CDR-a izabranih iz grupe koja se sastoji nezavisno od:

bilo koje od CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3;

bilo koje od kombinacija CDR-H1 i H2, CDR-H1 i H3, CDR-H1 i L1, CDR-H1 i L2, CDR-H1 i L3, CDR-H2 i H3, CDR-H2 i L1, CDR-H2 i L2, CDR-H2 i L3, CDR-H3 i L1, CDR-H3 i L2, CDRH3 i L3, CDR-L1 i L2, CDR-L1 i L3, CDR-L2 i L3;

CDR-H1, H2 i H3, CDR-H1, H2 i L1, CDR-H1, H2 i L2, CDR-H1, H2 i L3, CDR-H2, H3 i L1, CDRH2, H3 i L2, CDR-H2, H3 i L3, CDR-H3, L1 i L2, CDR-H3, L1 i L3, CDR-L1, L2, L3;

bilo koje od kombinacija CDR-H1, H2, H3 i L1, CDR-H1, H2, H3 i L2, CDR-H1, H2, H3 i L3, CDR-H2, H3, L1 i L2, CDR-H2, H3, L2 i L3, CDR-H3, L1, L2 i L3, CDR-L1, L2, L3 i H1, CDR-L1, L2, L3 i H2, CDR-L1, L2, L3 i H3, CDR-L2, L3, H1 i H2,

CDR-H1, H2, H3, L1 i L2, CDR-H1, H2, H3, L1 i L3, CDR-H1, H2, H3, L2 i L3, CDR-L1, L2, L3, H1 i H2, CDR-L1, L2, L3, H1 i H3, CDR-L1, L2, L3, H2 i H3; i

kombinacije CDR-H1, H2, H3, L1, L2 i L3.

[0055] Ovde je otkriveno izvođenje, pri čemu domen teškog lanca otkriven ovde uključuje sekvencu sa 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije, na primer pri čemu su supstitucije u okviru.

[0056] Ovde je otkriveno izvođenje, pri čemu okvir varijabilne regije teškog lanca sadrži 1, 2, 3, ili 4 aminokiseline koje su umetnute, izbrisane, supstituisane ili kombinaciju od njih. U jednom izvođenju, supstituisana amino kiselina je odgovarajuća aminokiselina iz donorskog antitela.

[0057] Ovde je otkriveno izvođenje , pri čemu otkrivena ovde varijabilna regija lakog lanca uključuje sekvencu sa 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije, na primer pri čemu su supstitucije u okviru.

[0058] Ovde je otkriveno izvođenje, pri čemu okvir varijabilne regije lakog lanca sadrži 1, 2, 3, ili 4 amino kiseline koje su umetnute, izbrisane, supstituisane ili kombinaciju od njih. U jednom izvođenju, supstituisana amino kiselina je odgovarajuća amino kiselina iz donorskog antitela.

[0059] Ovde je otkriveno anti-CSF-1R antitelo ili njegov vezujući fragment, pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži tri CDR-a i sekvenca CDR-H1 ima najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti ili sličnosti sa sekvencom datom u SEK ID BR:4, sekvenca CDR-H2 ima najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti ili sličnosti sa sekvencom datom u SEK ID BR:5 i sekvenca CDR-H-3 ima najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti ili sličnosti sa sekvencom datom u SEK ID BR:6. Poželjno, anti-CSF-1R antitelo ili njegov vezujući fragment, dodatno sadržavajući laki lanac, pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži tri CDRa i sekvenca CDR-L1 imaju najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti ili sličnosti sa sekvencom datom u SEK ID BR:1, sekvenca CDR-L2 ima najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti ili sličnosti sa sekvencom datom u SEK ID BR:2 i sekvenca CDR-L3 ima najmanje 60% identičnosti ili sličnosti sa sekvencom datom u SEK ID BR:3.

[0060] Ovde su otkrivene varijabilne regije obezbeđene sa najmanje 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% identičnosti ili sličnosti sa ovde opisanom sekvencom varijabilne regije. U drugom izvođenju obezbeđeno je anti-CSF-1R antitelo koje se takmiči sa vezivanjem antitela ili fragmenta iz pronalaska za vezivanje na CSF-1R receptor, poželjno ekstracelularni domen CSF-1R receptora, specifičnije na CSF-1R receptor SEK ID BR:35, 36, 37, 38 i/ili 39 ili sekvencu u unosu baze podataka UniProt P07333, posebno za ekstracelularni domen CSF-1R receptora SEK ID BR: 36 ili 498 aminokiseline eksracelularne domene otkrivene u unosu baze podataka UniProt P07333 (aminokiselina 20 do 517 od P07333).

[0061] Ovde je otkriveno anti-CSF-1R antitelo koje unakrsno blokira vezivanje antitela koje sadrži 6 CDR-a datih u sekvenci SEK ID BR:1 za CDR-L1, SEK ID BR:2 za CDR-L2, SEK ID BR:3 za CDR-L3, SEK ID BR:4 za CDR-H1, SEK ID BR:5 za CDR-H2 i SEK ID BR:6 za CDR-H3, na primer sa afinitetom od 100 pM ili manje, naročito gde je unakrsno blokiranje alosterno.

[0062] Ovde je otkriveno anti-CSF-1R-antitelo ili njegov vezujući fragment koji inhibira ili se preklapa sa vezujućim CSF-1 i/ili IL-34 na ekstracelularni domen CSF-1R receptora.

[0063] Ovde je otkriveno anti-CSF-1R antitelo koje unakrsno blokira vezivanje antitela koje sadrži 6 CDR-a datih u sekvenci SEK ID BR:1 za CDR-L1, SEK ID BR:2 za CDR-L2, SEK ID BR:3 za CDR-L3, SEK ID BR:4 za CDR-H1, SEK ID BR:5 za CDR-H2 i SEK ID BR:6 za CDR-H3, na primer sa afinitetom od 100 pM ili manje, naročito gde antitelo unakrsno blokira vezivanje putem vezivanja istog epitopa kao antitela koje blokira.

[0064] Ovde je otkriveno antitelo ili njegov vezujući fragment, pri črmu je C-terminalni ostatak sekvence antitela otcepljen, na primer C-terminalni ostatak sekvence teškog lanca, na primjer terminalni lizin. U jednom izvođenju aminokiselina je otcepljena iz ovde opisane sekvence. Uopšteno, cepanje je rezultat posttranslacionih modifikacija eksprimiranog antitela ili vezujućeg fragmenta.

[0065] Ovde otkriveno anti-CSF-1R antitelo bilo kojeg od izvođenja iznad ili ispod je obezbeđeno, pri čemu C-terminalni lizin sekvence teškog lanca dat u SEK ID BR: 27 ili SEK ID BR: 29 nedostaje ili se briše. Nedostaje ili se briše C-terminalni lizin, npr. pozicija 453 SEK ID BR: 27 ili pozicija 472 od SEK ID BR: 30 može da se postigne, na primer ekspresijom anti-CSF-1R antitela u ekspresionom sistemu bez kodiranja terminalnog lizina. Alternativno delecija C-terminalnog ostatka, kao što je lizin, može biti izvršena kao post translaciona modifikacija.

[0066] U jednom izvođenju antitelo prema pronalasku je humanizovano.

[0067] Kao što se ovde koristi, termin "humanizovano antitelo" se odnosi na antitelo ili molekul antitela, pri čemu teški i/ili laki lanac sadrži jedan ili više CDR-a (uključujući, po želji, jedan ili više modifikovanih CDR-a) iz donorskog antitela (npr. mišje monoklonalno antitelo) graftovano u okviru varijabilne regije područja teškog i/ili lakog lanca akceptorskog antitela (npr. humano antitelo) (videti, npr. US 5,585,089; WO91/09967). Za pregled pogledati Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. U jednom izvođenju, umesto da se prenosi cela CDR, samo jedan ili više ostataka koji određuju specifičnost iz bilo koje od CDR-a opisane ovde, iznad su preneseni na okvir humanog antitela (videti na primer, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36:25-34). U jednom izvođenju samo ostaci za određivanje specifičnosti iz jedne ili više ovde opisanih CDR-a su preneseni na okvir humanog antitela. U drugom izvođenju, samo ostaci za određivanje specifičnosti iz svake od iznad opisanih CDR-a su preneseni na okvir humanog antitela. Kada su CDR-ovi ili ostaci koji određuju specifičnost graftovani, bilo koja odgovarajuća sekvenca okvira akceptorske varijabilne regije može biti korišćena imajući u vidu klasu/tip donora antitela iz kojeg su izvedene CDR-e, uključujući mišje, primatne i humane okvirne regije.

[0068] Pogodno, humaniziovano antitelo prema ovom pronalasku ima varijabilni domen koja obuhvata humane akceptorske okvirne regije, kao i jednu ili više CDR-a obezbeđenih ovde specifično. Tako, u jednom izvođenju je obezbeđeno humanizovano antitelo koje veže humani CSF-1R pri čemu varijabilni domen sadrži humane akceptorske okvirne regije i ne-humane donorske CDR-a.

[0069] Primeri humanih okvira koji mogu biti korišćeni u ovom pronalasku su KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY i POM (Kabat et al., supra). Na primer, KOL i NEWM mogu biti korišćeni za teški lanac, REI može biti korišćen za laki lanac, a EU, LAY i POM mogu biti korišćeni i za teški lanac i za laki lanac. Alternativno, mogu biti upotrebljene humane sekvence zametne linije; one su dostupne na: http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/

[0070] Takođe je otkriveno humanizovano antitelo, pri čemu akceptorski teški i laki lanci ne moraju nužno biti izvedeni iz istog antitela i mogu, ako se želi, sadržavati kompozitne lance koji imaju okvirne regije izvedene iz različitih lanaca.

[0071] Takođe je otkriven humani okvir koji sadrži 1, 2, 3 ili 4 supstitucije, adicije ili delecije aminokiselina, na primer 1, 2, 3 ili 4 konzervativne supstitucije ili supstitucije ostataka donora.

[0072] Takođe otkrivena sekvenca uptorebljena kao humani okvir je 80%, 85%, 90%, 95% ili više slična ili identična sekvenci otkrivenoj ovde.

[0073] Jedna takva pogodna okvirna regija za teški lanac humanizovanog antitela predmetnog pronalaska je izvedena iz humane pod-grupe VH2 sekvence 3-12-70 zajedno sa JH3 J-regijom (SEK ID BR: 33).

[0074] Prema tome, u jednom primeru je obezbeđeno humanizovano antitelo koje sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 4 za CDR-H1, sekvencu datu u SEK ID BR: 5 za CDR-H2 i sekvencu datu u SEK ID BR: 6 za CDR-H3, pri čemu je okvirna regija teškog lanca izvedena iz humane podgrupe VH3 sekvence 1-3-3-07 zajedno sa JH4.

[0075] U jednom primeru varijabilni domen teškog lanca antitela sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 23.

[0076] Pogodna okvirna regija za laki lanac humanizovanog antitela iz predmetnog pronalaska je izvedena iz humane zametne linije pod-grupe VK12-1-(1) 012 zajedno sa JK4 J-regijom (SEK ID BR: 31).

[0077] Prema tome, u jednom primeru je obezbeđeno humanizovano antitelo koje sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 1 za CDR-L1, sekvencu datu u SEK ID BR: 2 za CDR-L2 i sekvencu datu u SEK ID BR: 3 za CDR-L3, pri čemu je okvirna regija lakog lanca izvedena iz humane podgrupe VK12-1-(1) 012 plus JK4 J-regija.

[0078] U jednom primeru varijabilni domen lakog lanca antitela sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 15.

[0079] U humanizovanom antitelu, okvirne regije ne moraju imati tačno istu sekvencu kao onu iz akceptorskog antitela. Na primer, neobični ostaci mogu biti menjani u ostatke koji se češće pojavljuju za klasu ili tip tog lanca akceptora. Alternativno, izabrani ostaci u akceptorskim okvirnim regijama mogu biti menjani tako da odgovaraju ostatku nađenom na istoj poziciji u donorskom antitelu (videti Reichmann et al., 1998, Nature, 332:323-324). Takve promene treba održavati na minimumu potrebnom da se povrati afinitet donorskog antitela. Protokol za selekciju ostataka u akceptorskim okvirnim regijama koji može biti potrebno promeniti je postavljen u WO91 / 09967.

[0080] Prema tome, u jednom primeru je obezbeđeno humanizovano antitelo, pri čemu je najmanje ostatak na poziciji 78 varijabilne domene teškog lanca (Kabatovo numerisanje) ostatak donora. U jednom izvođenju je ostatak 78 varijabilne domene teškog lanca zamenjen sa alaninom.

[0081] Ostatak donora kao što je ovde upotrebljen se odnosi na ostatak koji formira ne-humano antitelo (npr. mišje antitelo) koji su donirali CDR-a.

[0082] U jednom izvođenju obezbeđeno je humanizovano antitelo pri čemu varijabilni domen teškog lanca ne sadrži bilo kakve ostatke donora.

[0083] Prema tome, u jednom primeru je obezbeđeno humanizovano antitelo, pri čemu najmanje jedan od ostataka na pozicijama 38, 71 i 87 varijabilne domene lakog lanca (Kabatovo numerisanje) su ostaci donora. U jednom izvođenju jedan od ostataka izabran od ostataka na pozicijama 38, 71 i 87 varijabilne domene lakog lanca (Kabatovo numerisanje) je ostatak donora. U jednom izvođenju dva od ostataka izabranih od ostataka na pozicijama 38, 71 i 87, na primer 38 i 71; ili 38 i 87; ili 71 i 87, varijabilne domene lakog lanca (Kabatovo numerisanje) su ostataci donora. U jednom izvođenju tri ostatka na pozicijama 38, 71 i 87 varijabilne domene lakog lanca (Kabatovo numerisanje) su ostaci donora.

[0084] Otkriven je ostatak 38 varijabilne domene lakog lanca zamenjen sa lizinom. Kao alternativa ostatak 38 varijabilne domene lakog lanca je zamenjen sa glutaminom.

[0085] Otkriveno je izvođenje pri čemu je ostatak 71 varijabilne domene lakog lanca zamenjen sa tirozinom.

[0086] Otkriveno je izvođenje pri čemu je ostatak 87 varijabilne domene lakog lanca zamenjen sa fenilalaninom.

[0087] Otkriveno je humaniziovano antitelo pri čemu samo ostatak varijabilne regije lakog lanca je ostatak donora, poželjno tirozin.

[0088] Takođe je otkriveno anti-CSF-1R antitelo ili njegov vezujući fragment koji ima teški lanac sadržavajući sekvencu varijabilne domene teškog lanca datu u SEK ID BR: 23 i laki lanac sadržavajući sekvencu varijabilne domene lakog lanca datu u SEK ID BR: 15.

[0089] U daljem aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđeno je njegovo anti-CSF-1R antitelo koje veže CSF-1R, poželjno ekstracelularni domen CSF-1R, najpoželjnije ekstracelularni domen humanog CSF-1R, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca SEK ID BR: 15 i varijabilni domen teškog lanca SEK ID BR: 23, poželjno pri čemu je antitelo monoklonalno antitelo, je antitelo od IgG1-IgG2-, IgG4-tipa, je Fab, modifikovani Fab, Fab ', modifikovani Fab', F(ab')2, Fv, antitela sa jednom domenom (npr. VH ili VL ili VHH), scFv, bi, tri ili tetra-valentna antitela, Bis-scFv, molekul sa dva pojedinačna lanca, sa tri pojedinačna lanca, sa četiri pojedinačna lanca koji su delovi antitela.

[0090] Takođe je otkrivena sekvenca antitela koja je 80% slična ili identična sekvenci otkrivenoj ovde, na primer 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% ili 99% preko dela ili celom relevantnom sekvencom. U jednom izvođenju relevantna sekvenca je SEK ID BR: 15. U jednom izvođenju relevantna sekvenca je SEK ID BR: 23.

[0091] "Identitet", kao što se ovde koristi, označava da je u bilo kojoj određenoj poziciji u poravnatim sekvencama, aminokiselinski ostatak identičan između sekvenci. "Sličnost", kao što se ovde koristi, označava da, u bilo kojoj određenoj poziciji u poravnatim sekvencama, aminokiselinski ostatak je sličnog tipa između sekvenci. Na primer, leucin može biti supstituisan izoleucinom ili valinom. Ostale aminokiseline koje često mogu biti supstituisane jedna drugom uključuju, ali nisu ograničene na:

-fenilalanin, tirozin i triptofan (aminokiseline koje imaju aromatične bočne lance);

- lizin, arginin i histidin (aminokiseline koje imaju osnovne bočne lance);

- aspartat i glutamat (aminokiseline koje imaju kisele bočne lance);

- asparagin i glutamin (aminokiseline koje imaju amidne bočne lance); i

- cistein i metionin (aminokiseline koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor). Stepeni identiteta i sličnosti mogu biti lako izračunati (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLAST™ software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J.

1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res.25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L.1997, Genome Res.7:649-656).

[0092] Ovde su otkriveni molekuli antitela koji mogu sadržavati kompletan molekul antitela koji im teške i lake lance pune dužine ili vezujući fragment od njih i mogu biti, ali nisu ograničeni na Fab, modifikovani Fab, Fab ', modifikovani Fab', F(ab')2, Fv, antitela jednog domena (npr. VH ili VL ili VHH), scFv, bi, tri ili tetravalentna antitela, Bis-scFv, molekul sa dva pojedinačna lanca, sa tri pojedinačna lanca, sa četiri pojedinačna lanca koji su delovi antitela i fragmente koji vežu epitop bilo kojeg gore navedenog (videti na primer Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Metode za stvaranje i proizvodnju ovih fragmenata antitela su dobro poznate u stanju tehnike (vidi za primer Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181). Drugi fragmenti antitela za upotrebu u ovom pronalasku uključuju Fab i Fab' fragmente opisane u Međunarodnim patentnim prijavama WO05/003169, WO05/003170 i WO05/003171. Viševalentna antitela mogu sadržavati višestruke specifičnosti, npr. bispecifične ili mogu biti monospecifične (videti za primer WO92/22853, WO05/113605, WO2009/040562 i WO2010/035012).

[0093] Vezujući fragment antitela kao što je ovde upotrbljen se odnosi na fragment koji je sposoban da veže antigen sa afinitetom za karakterizaciju fragmenta kao specifičnog za antigen.

[0094] Ovde otkriveno antitelo prema ovom otkriću je obezbeđeno kao CSF-1R vezujući fuzioni protein antitela koji sadrži imunoglobulinski deo, na primer Fab ili Fab 'fragment, i jednu ili dve pojedinačne domene antitela (dAb) direktno ili indirektno povezane sa njima, na primjer kao što je opisano u WO2009/040562, WO2010/035012, WO2011/030107, WO2011/061492 and WO2011/086091.

[0095] Otkrivene su dve domene antitela sadržavajući fuzioni protein, na primer kao varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) uparivanjem, opciono povezane sa disulfidnom vezom.

[0096] Otkriveni su Fab ili Fab' element fuzionog proteina koji imaju istu ili sličnu specifičnost za antitelo ili antitela sa jednom domenom. U jednom izvođenju Fab ili Fab' ima različitu specifičnost za antitelo ili antitela sa jednom domenom, što znači da je fuzioni protein viševalentan. U jednom izvođenju viševalentan fuzioni protein prema predmetnom pronalasku ima mesto vezivanja albumina, na primer VH/VL par koji obezbeđuje mesto vezivanja albumina.

[0097] Otkrivene su domene konstantne regije molekule antitela, koje mogu biti izabrane imajući u vidu predloženu funkciju molekula antitela, naročito efektorske funkcije koje mogu biti tražene. Na primer, domene konstantne regije mogu biti humane IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM domene. Naročito, domene konstantne regije humane IgG mogu biti korišćene, posebno izotipovi IgG1 i IgG3 kada je molekul antitela namenjen za terapijsku upotrebu i tražene su efektorske funkcije antitela. Alternativno, IgG2 i IgG4 izotipovi mogu biti korišćeni kada je molekul antitela namenjen za terapijske svrhe i efektorske funkcije antitela nisu potrebne.

[0098] Otkriveno je antitelo koje je IgG2 ili IgG4 antitelo.

[0099] Razumljivo je da se mogu koristiti i varijante sekvence ovih domena konstantne regije. Na primer, molekuli IgG4 u kojima je serin na poziciji 241 je promenjen u prolin kao što je opisano u Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108 mogu biti korišćeni. Prema tome, u izvođenju gde je antitelo IgG4 antitelo, antitelo može uključiti mutaciju S241P.

[0100] Stručnjaku sa ovog područja tehnike će takođe biti jasno da antitela mogu biti podvrgnuta različitim posttranslacionim modifikacijama. Tip i obim ovih modifikacija često zavisi od ćelijske linije domaćina koja se koristi za ekspresiju antitela, kao i uslova kulture. Takve modifikacije mogu uključivati varijacije u glikozilaciji, oksidaciji metionina, formiranju diketopiperazina, izomerizaciji aspartata i deamidaciji asparagina. Česta modifikacija je gubitak karboksi-terminalnog bazičnog ostatka (kao što je lizin ili arginin) zbog delovanja karboksipeptidaza (kao što je opisano u Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995). Prema tome, C-terminalni lizin teškog lanca antitela može biti odsutan.

[0101] U jednom izvođenju teški lanac antitela sadrži CH1 domen, a laki lanac antitela sadrži CL domen, bilo kappa ili lambda.

[0102] U jednom izvođenju teški lanac antitela sadrži CH1 domen, CH2 domen i CH3 domen i laki lanac antitela sarži CL domen, bilo kappa ili lambda.

[0103] Antitelo obezbeđeno ovim pronalaskom ima teški lanac koji sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 27 i laki lanac koji sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 19. Takođe je obezbeđeno anti-CSF-1R antitelo u kojem su teški i laki lanci najmanje 80% (poželjno 85%, 90%, 95% ili 98%) identični ili slični teškom lancu koji sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 27 i lakom lancu koji sadrži sekvencu datu u SEK ID BR:19. U jednom izvođenju, laki lanac ima ili se sastoji od sekvence date u SEK ID BR: 19 i teški lanac ima ili se sastoji od sekvence date u SEK ID BR: 27. U drugom izvođenju, laki lanac ima ili se sastoji od sekvenc SEK ID BR: 19 i teški lanac ima ili se sastoji od sekvence SEK ID BR: 27, pri čemu aminokiselinski lizin na poziciji 453 u SEK ID BR: 27 nedostaje ili se briše.

[0104] Takođe je obezbeđena specifična regija ili epitop humanog CSF-1R koji je vezan antitelom obezbeđenim od strane predmetnog pronalaska, naročito antitelom 969.g2 koje sadrži sekvencu teškog lanca gH2 (SEK ID BR: 27) i/ili sekvencu lakog lanca gL7 (SEK ID BR: 19).

[0105] Ova specifična regija ili epitop humanog CSF-1R polipeptida može biti identifikovana bilo kojim pogodnim metodom mapiranja epitopa poznatim u stanju tehnike u kombinaciji sa bilo kojim od antitela obezbeđenim predmetnim pronalaskom. Primeri takvih metoda uključuju skrining peptida različitih dužina izvedenih iz CSF-1R za vezivanje na antitelo predmetnog pronalaska sa najmanjim fragmentom koji se može specifično vezati za antitelo sadržavajući sekvencu epitopa prepoznatog od srane antitela (na primer, peptid u regiji od oko 5 do 20, poželjno oko 7 aminokiselina u dužini). CSF-1R peptidi mogu biti proizvedeni sintetski ili proteolitičkom digestijom CSF-1R polipeptida. Peptidi koji vežu antitela mogu biti identifikovani, na primer, analizom masene spektrometrije. U drugom primeru, NMR spektroskopija ili rendgenska kristalografija mogu biti korišćene da identifikuju epitop vezan antitelom iz predmetnog pronalaska. Jednom identifikovan, epitopski fragment koji veže antitelo predmetnog pronalaska može biti upotrebljen ako je potrebno, kao imunogen da bi se dobila dodatna antitela koja vežu isti epitop.

[0106] Biološki molekuli, kao što su antitela ili fragmenti, sadrže kisele i/ili bazne funkcionalne grupe, time dajući molekulu neto pozitivan ili negativan naboj. Količina ukupnog "posmatranog" naboja će zavisiti od apsolutne aminokiselinske sekvence entiteta, lokalnog okruženja naelektrisanih grupa u 3D strukturi i uslova okruženja molekula. Izoelektrična tačka (pl) je pH kod koje određeni molekul ili rastvarač njegove pristupačne površine ne sadrži neto električni naboj. U jednom primeru, CSF-1R antitelo i fragmenti pronalaska mogu biti konstruisani tako da imaju odgovarajuću izoelektričnu tačku. Ovo može dovesti do antitela i/ili fragmenata robusnijih svojstva, naročito pogodnih profila rastvorljivosti i/ili stabilnosti i/ili poboljšanih karakteristika prečišćavanja.

[0107] Prema tome, u jednom aspektu pronalazak obezbeđuje humanizovano CSF-1R antitelo konstruisano tako da ima izoelektričnu tačku različitu od one originalno identifikovanog antitela. Antitelo može, na primer, biti konstruisano zamenom aminokiselinskog ostatka kao što je zamena kiselog aminokiselinskog ostatka sa jednim ili više baznih aminokiselinskih ostataka. Alternativno, mogu biti uvedeni baznii aminokiselinski ostaci ili mogu biti uklonjeni kiselii aminokiselinski ostaci. Alternativno, ako molekul ima neprihvatljivo visoku pl vrednost kiseli ostaci mogu biti uvedeni da smanje pl, po potrebi. Važno je da se pri manipulisanju pl mora uzeti u obzir zadržavanje željene aktivnosti antitela ili fragmenta. Tako u jednom izvođenju konstruisano antitelo ili fragment ima istu ili uglavnom istu aktivnost kao i "nemodifikovano" antitelo ili fragment.

[0108] Programi kao što su * ExPASYhttp://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html, i http://www.iut-arles.up.univmrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html, mogu biti korišćeni za predviđanje izoelektrične tačke antitela ili fragmenta. ;[0109] Podrazumeva se da se afinitet antitela obezbeđenih ovim pronalaskom može biti izmenjen korišćenjem bilo koje pogodne metode poznate u stanju tehnike. Ovaj pronalazak se zbog toga takođe odnosi na varijante molekula antitela ovog pronalaska, koji imaju poboljšani afinitet za CSF-1R. Takve varijante mogu biti dobijene brojnim protokolima za sazrevanje afiniteta, uključujući mutiranje CDR-a (Yang et al., 1995, J. Mol. Biol., 254:392-403), mešanje lanca (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783), upotrebu mutatornih sojeva E. koli (Low et al., 1996, J. Mol. Biol., 250:359-368), mešanje DNK (Patten et al., 1997,Curr. Opin. Biotechnol., 8:724-733), prikaz faga (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) i seksualnog PCR (Crameri et al., 1998, Nature, 391:288-291). Vaughan et al. (supra) razmatra ove metode sazrevanja afiniteta. ;[0110] Ako se želi, antitelo za upotrebu u ovom pronalasku može biti konjugovano na jedan ili više molekula efektora. Podrazumieva se da molekul efektora može sadržavati jedan efektorski molekul ili dva ili više takvih molekula tako povezanih da formiraju jedan deo koji može biti pripojen na antitela predmetnog pronalaska. Tamo gde se želi dobiti fragment antitela vezan na efektorski molekul, to može biti pripremljeno standardnim hemijskim ili rekombinantnim DNA postupcima u kojima je fragment antitela direktno vezan ili preko agensa za pripajanje na efektorski molekul. Tehnike za konjugovanje takvih efektorskih molekula na antitela su dobro su poznate u stanju tehnike (videti, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 i Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Pojedini hemijski postupci uključuju, na primer, one opisane u WO93/06231, WO92/22583, WO89/00195, WO89/01476 and WO03/031581. Alternativno, kada je efektorski molekul protein ili polipeptid, vezivanje se može postići postupcima rekombinantne DNA, na primer kao što je opisano u WO86/01533 i EP0392745. ;[0111] Termin efektorski molekul kao što se ovde koristi uključuje, na primer, antineoplastične agense, lekove, toksine, biološki aktivne proteine, na primer enzime, druga antitela ili fragmente antitela, sintetske ili prirodne polimere, nukleinske kiseline i fragmente od njih, npr. DNK, RNK i fragmente od njih, radionuklide, naročito radiojodide radioizotope, helirane metale, nanočestice i reporterske grupe, kao što su fluorescentna jedinjenja ili jedinjenja koja mogu biti detektovana putem NMR ili ESR spektroskopije. ;[0112] Primeri efektorskih molekula mogu uključiti citotoksine ili citotoksične agense, uključujući bilo koji agens koji je štetan za (npr. ubija) ćelije. Primeri uključuju kombrestatine, dolastatine, epotilone, staurosporin, maitansinoide, spongistatine, rizoksin, halihondrine, roridine, hemiasterline, taksol, citohalasin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i analoge ili homologe od njih. ;[0113] Efektorski molekuli takođe uključuju, ali nisu ograničene na, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilirajuće agense (npr. mehlortamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cis-dihlorodiamin platinu (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr. daunorubicin (bivši daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr. daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, antramicin (AMC), kaliheamicine ili duokarmicine) i anti-mitotičke agense (npr. vinkristin i vinblastin). ;[0114] Druge efektorski molekuli mogu uključiti helirane radionuklide kao što su<111>In i<90>Y, Lu<177>, Bizmut<213>, Kalifornium<252>, Iridium<192>i Volfram<188>/ Renijum<188>; ili lekove kao što su, ali nisu ograničeni na, alkilfosfoholine, inhibitore topoizomeraze l, taksoide i suramin. ;[0115] Drugi efektorski molekuli uključuju proteine, peptide i enzime. Enzimi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, proteolitičke enzime, hidrolaze, lijaze, izomeraze, transferaze. Proteini, polipeptidi i peptidi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, imunoglobuline, toksine kao što su abrin, ricin A, pseudomonas egzotoksin, ili difterijski toksin, protein kao što je insulin, faktor nekroze tumora, ɑ -interferon, β -interferon, faktor rasta nerva, faktor rasta izveden iz trombocita ili tkivni plazminogeni aktivator, trombotski agens ili anti-angiogeni agens, npr. angiostatin ili endostatin, ili modifikator biološkog odgovora kao što je limfokin, interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), faktor rasta nerva (NGF) ili drugi faktor rasta i imunoglobulinie ;[0116] Drugi efektorski molekuli mogu uključiti korisne detektabilne supstance, na primer u dijagnostici. Primeri supstanci koje se mogu detektovati uključuju različite enzime, prostetske grupe, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale, bioluminiscentne materijale, radioaktivne nuklide, metale koji emituju pozitron (za upotrebu u pozitronskoj emisionoj tomografiji) i neradioaktivne paramagnetske metalne jone. Videti uopšteno U.S. Patent No. 4 ,741,900 za metalne jone koji mogu biti konjugovani na antitela za upotrebu kao dijagnostici. Pogodni enzimi uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, betagalaktozidazu ili acetilholinesterazu; pogodne prostetske grupe uključuju streptavidin, avidin i biotin; pogodni fluorescentni materijali uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid i fikoeritrin; pogodni luminiscentni materijali uključuju luminol; pogodni bioluminiscentni materijali uključuju luciferazu, luciferin i ekvorin; i pogodni radioaktivni nuklidi uključuju<125>I,<131>I,<111>In i<99>Tc. ;[0117] U drugom primeru efektorski molekul može povećati poluvreme raspada antitela in vivo, i/ili smanjiti imunogenost antitela i/ili povećati isporuku antitela preko epitelijalne barijere za imuni sistem. Primeri pogodnih efektorskih molekula ovog tipa uključuju polimere, albumin, proteine za vezivanje albumina ili jedinjenja koja vežu albumin, kao što su ona opisana u WO05/117984. ;[0118] U jednom izvođenju obezbeđeno poluvreme raspada pomoću efektorskog molekula koji je nezavisan od CSF-1R je povoljno. ;[0119] Kada je efektorski molekul polimer, on može generalno biti sintetski ili prirodni polimer koji se javlja, kao na primer opciono supstituisani pravi ili razgranati lanac polialkilena, polialkenilenski ili polioksialkilenski polimer ili razgranati ili nerazgranati polisaharid, npr. homo- ili hetero- polisaharid. ;[0120] Specifični opcioni supstituenti koji mogu biti prisutni na iznad spomenutim sintetskim polimerima uključuju jednu ili više hidroksi, metil ili metoksi grupa. ;[0121] Specifični primeri sintetskih polimera uključuju opciono supstituisani pravi ili razgranati lanac poli(etilenglikola), poli(propilenglikol)poli(vinilalkohola) ili derivate od njih, posebno opciono supstituisani poli(etilenglikol), kao što je metoksipoli(etilenglikol) ili derivati od njih. ;[0122] Specifični prirodni polimeri koji se javljaju prirodno uključuju laktozu, amilozu, dekstran, glikogen ili derivate od njih. ;0123] U jednom izvođenju polimer je albumin ili njegov fragment, kao što je humani serum albumin ili njegov fragment. ;[0124] "Derivati" kako se ovde koriste uključuju reaktivne derivate, na primer tiol-selektivne reaktivne grupe kao što su maleimidi i slično. Reaktivna grupa može biti vezana direktno ili preko veznog segmenta na polimer. Podrazumeva se da će ostatak takve grupe u nekim slučajevima biti deo produkta kao vezujuća grupa između fragmenta antitela i polimera. ;[0125] Veličina polimera može varirati po želji, ali će uopšteno biti u rasponu prosečne molekularne težine od 500Da do 50000Da, na primer od 5000 do 40000Da, kao što je od 20000 do 40000Da. Veličina polimera može biti naročito izabrana na osnovu nameravane upotrebe produkta, na primer sposobnosti da se lokalizuje na određena tkiva, kao što su tumori ili produženo poluvreme raspada (za pregled videti Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Tako, na primer, kada je produkt namenjen da napusti cirkulaciju i prodre u tkivo, na primer za upotrebu u lečenju tumora, može biti korisno upotrebiti polimer male molekulske težine, na primer sa molekulskom težinom od oko 5000Da. Za primene gde produkt ostaje u cirkulaciji, može biti korisno upotrebiti polimer veće molekulske težine, na primer koji ima molekulsku težinu u rasponu od 20000Da do 40000Da. ;[0126] Pogodni polimeri uključuju polialkilenski polimer, kao što je poli(etilen-glikol) ili, posebno, metoksipoli(etilenglikol) ili derivate od njih, i naročito sa molekulskom težinom u rasponu od oko 15000Da do oko 40000Da. ;[0127] U jednom primeru antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku su pripojena na poli(etilenglikol) (PEG) ostatke. U jednom konkretnom primeru antitelo je fragment antitela i PEG molekuli mogu biti pripojeni preko bilo kojeg dostupnog bočnog lanca amino kiseline ili terminalnih funkcionaknih grupa ;amino kiseline smeštenih u fragmentu antitela, na primer bio koje slobodne amino, tiolne, hidroksilne ili karboksilne grupe. Takve amino kiseline se mogu prirodno pojaviti u fragmentu antitela ili mogu biti ugrađene u fragment korišćenjem metoda rekombinantne DNK (videti na primer US 5,219,996; US 5,667,425; WO98/25971, WO2008/038024). U jednom primeru molekul antitela predmetnog pronalaska je modifikovani Fab fragment pri čemu je modifikacija dodatak na C-terminalni kraj njegovog teškog lanca jedne ili više aminokiselina kako bi se omogućilo pripajanje efektorskog molekula. Pogodno, dodatne amino kiseline formiraju modifikovanu zglobnu regiju koja sadrži jedan ili više cisteinskih ostataka na koje može biti pripojen efektorski molekul. Višestruka mesta mogu biti korišćena za pripoj dva ili više PEG molekula. ;[0128] Pogodni PEG molekuli su kovalentno povezani preko tiol grupe najmanje jednog cisteinskog ostatka lociranog u fragmentu antitela. Svaki molekul polimera pripojen na modifikovani fragment antitela može biti kovalentno vezan atom sumpora cisteinskog ostatka lokalizovan u fragmentu. Kovalentna veza će uopšteno biti disulfidna veza ili, konkretno, veza sumpor-ugljenik. Tamo gde je tiolna grupa korišćena kao tačka pripajanja, mogu se koristiti odgovarajuće aktivirani molekuli, na primer tiol selektivni derivati kao što su maleimidi i derivati cisteina. Aktivirani polimer može biti korišćen kao polazni materijal u pripremi fragmenata antitela modifikovanih polimerom kao što je opisano iznad. Aktivirani polimer može biti bilo koji polimer koji sadrži tiol reaktivnu grupu kao što je ɑ -halokarboksilna kiselina ili ester, npr. jodoacetamid, imid, npr. maleimid, vinil sulfon ili disulfid. Takvi početni materijali mogu biti dobijeni komercijalno (na primer od Nektar, ranije Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) ili mogu biti pripremljeni iz komercijalno dostupnih početnih materijala korišćenjem uobičajenih hemijskih postupaka. Određeni PEG molekuli uključuju 20K metoksi-PEG-amin (koji se može dobiti od Nektar, ranije Shearwater; Rapp Polymere; i SunBio) i M-PEG-SPA (koji se može dobiti iz Nektara, ranije Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) ili se mogu pripremiti iz komercijalno dostupnih početnih materijala upotrebom uobičajenih hemijskih postupaka. Određeni PEG molekuli uključuju 20K metoksi-PEG-amin (koji se može dobiti od Nektar, ranije Shearwater; Rapp Polymere; i SunBio) i M-PEG-SPA (koji se može dobiti iz Nektara, ranije Shearwater). ;[0129] Otkriven je modifikovani Fab fragment, Fab' fragment ili diFab koji je PEGiliran, tj. ima PEG (poli(etilenglikol)) kovalentno pripojen na njega, npr. prema metodi otkrivenoj u EP 0948544 ili EP1090037 [takođe videti Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. U jednom primeru PEG je pripojen za cistein u zglobnoj regiji. U jednom primeru, PEG modifikovani Fab fragment ima maleimidnu grupu kovalentno vezanu na jednu tiolnu grupu u modifikovanoj zglobnoj regiji. Lizinski ostatak može biti kovalentno vezan za maleimidnu grupu, i na svaku od aminskih grupa na lizinskom ostatku može biti pripojen metoksipoli(etilenglikol)polimer koji ima molekulsku težinu od približno 20.000Da. Ukupna molekulska težina PEG pripojenog na Fab fragment može zbog toga biti približno 40.000Da. ;[0130] Određeni PEG molekul uključuju 2-[3-(N-maleimido)propionamido]etil amid od N, N'-bis(metoksipoli(etilenglikol) MW 20,000) modifikovanog lizina, takođe poznatog kao PEG2MAL40K (može se dobiti od Nektar, ranije Shearwater). ;[0131] Alternativni izvori PEG linkera uključuju NOF koji snabdeva GL2-400MA3 (pri čemu je m u strukturi ispod 5) i GL2-400MA (pri čemu m je 2) i n je približno 450: ;;; ;;; m je 2 ili 5 ;;[0132] To znači da je svaki PEG oko 20.000Da. ;[0133] Tako u jednom izvođenju PEG je 2,3-Bis(metilpolioksietilen-oksi)-1-{[3-(6-maleimido-1-oksoheksil)amino]propiloksi} heksan (2 ogranka razgranata PEG, -CH2)3NHCO(CH2)5-MAL, Mw 40.000 poznat kao tzv. "SUNBRIGHT GL2-400MA3". ;[0134] Dalji alternativni PEG efektorski molekuli sledećeg tipa: ; ;;; [0135] U jednom izvođenju je obezbeđeno antitelo, kao što je antitelo pune dužine, koje je PEGilirano (na primer sa ovde opisanim PEG), pripojeno preko aminokiselinskog ostatka cisteina na ili oko amino kiseline 226 u lancu, na primer aminokiseline 226 teškog lanca (uzastopnim numerisanjem). ;[0136] U jednom izvođenju ovo otkriće obezbeđuje Fab'PEG molekul koji sadrži jedan ili više PEG polimera, na primer 1 ili 2 polimera kao što je polimer 40kDa ili polimeri. ;[0137] Fab-PEG molekuli prema ovom otkriću mogu biti naročito povoljni u tome što imaju poluvreme raspada nezavisno od Fc fragmenta. ;[0138] U jednom izvođenju obezbeđen je scFv konjugovan na polimer, kao što je PEG molekul, molekul skroba ili molekul albumina. ;[0139] U jednom izvođenju antitelo ili fragment je konjugovan na molekul skroba, na primer da poveća poluvreme raspada. Metode konjugovanja počinju na proteinu kao što je opiasno u US 8,017,739. ;[0140] Molekul reporter, kao što je ovde upotrebljen, je molekul koji je sposobanda bude otkriven, na primer fluorescentna boja, radioaktivni obeleživač ili drugi entitet koji se može detektovati. ;[0141] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovanu sekvencu DNK koja kodira teški i laki lanac(e) molekula antitela predmetnog pronalaska. Pogodno, DNK sekvenca kodira teški ili laki lanac molekula antitela predmetnog pronalaska. DNK sekvenca predmetnog pronalaska može sadržavati sintetsku DNK, na primer proizvedenu hemijskom obradom, cDNA, genomsku DNK ili bilo koju kombinaciju od njih. ;[0142] DNK sekvence koje kodiraju molekul antitela predmetnog pronalaska mogu biti dobijene metodama dobro poznatim stručnjacima sa ovog područja tehnike. Na primer, DNK sekvence kodirajući za deo ili sve teške i lake lance antitela mogu biti sintetizovane po želji iz određenih DNK sekvenci ili na osnovu odgovarajućih sekvenci amino kiselina. ;[0143] DNK koja kodira za okvirne sekvence akceptora je široko dostupna stručnjacima sa ovog područja tehnike i može biti lako sintetizovana na osnovu njihovih poznatih aminokiselinskih sekvenci. ;[0144] Standardne tehnike molekularne biologije mogu biti korišćene za pripremu DNK sekvenci koje kodiraju za molekul antitela predmetnog pronalaska. Željene DNK sekvence mogu biti sintetizovane u potpunosti ili delimično korišćenjem tehnika sinteze oligonukleotida. Mogu biti korišćene tehnike mestom usmerena mutageneza i reakcija lančane polimerizacije (PCR) po potrebi. ;[0145] Primeri pogodnih DNK sekvenci su prikazani na Slici 1. ;[0146] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na vektor kloniranja ili ekspresije koji sadrži jednu ili više DNK sekvenci iz predmetnog pronalaska. Prema tome, obezbeđen je vektor kloniranja ili ekspresije koji sadrži jednu ili više DNK sekvenci koje kodiraju antitelo predmetnog pronalaska. U jednom izvođenju vektor sadrži sekvence date u SEK ID BR: 28 i SEK ID BR: 20. Povoljno, kloniranje ili ekspresija vektora sadrži dve sekvence DNK, koje kodiraju laki lanac i teški lanac molekula antitela predmetnog pronalaska, poželjno SEK ID br: 28 i SEK ID BR: 20, redom i pogodne signalne sekvence. U jednom primeru vektor sadrži intergensku sekvencu između teških i lakih lanaca (videti WO03/048208). ;[0147] Opšte metode sa kojima vektori mogu biti konstruisani, metode transfekcije i metode kulture su dobro poznate stručnjacima sa ovog područja tehnike. U tom smislu, upućuje se na "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing. ;[0148] Takođe je obezbeđena ćelija domaćina koja sadrži jedan ili više vektora za kloniranje ili ekspresiju sadržavajući jednu ili više DNK sekvenci koje kodiraju antitelo predmetnog pronalaska. Može biti korišćen bilo koji pogodan sistem ćelija domaćina/vektor za ekspresiju DNK sekvenci koje kodiraju molekul antitela predmetnog pronalaska. Bakterijski, na primer E. koli, i drugi mikrobni sistemi mogu biti korišćeni i ili eukariotski, na primer sisara, ekspresioni sistemi ćelije domaćina takođe mogu biti upotrebljeni. Pogodne ćelije domaćina sisara uključuju CHO, ćelije mijeloma ili hibridoma. ;[0149] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za produkciju molekula antitela prema predmetnom pronalasku obuhvatajući kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži vektor predmetnog pronalaska pod pogodnim uslovima za vođenje ekspresije proteina iz DNK koja kodira molekul antitela predmetnog pronalaska, i izolovanje molekula antitela. ;[0150] Takođe je otkriven molekul antitela koji može sadržavati samo polipeptid teškog ili lakog lanca, u kojem slučaju se za transfekciju ćelija domaćina treba koristiti samo sekvenca koja kodira teški lanac ili laki lanac polipeotida. Za produkciju produkata koji sadrže i teške i lake lance, ćelijska linija može biti transfektovana sa dva vektora, prvi vektor koji kodira laki lanac polipeptida i drugi vektor koji kodira teški lanac polipeptida. Alternativno, može biti korišćen jedan vektor, vektor koji uključuje sekvence koje kodiraju laki lanac i teški lanac polipeptida. ;[0151] Antitela i fragmenti prema ovom otkriću su izraženi na dobrim nivoima iz ćelija domaćina. Prema tome, svojstva antitela i/ili fragmenti vezivanja su pogodni za ekspresiju na komercijalnoj skali. ;[0152] Tako postoji postupak za kultivisanje ćelije domaćina i ekspresije antitela ili njegovog fragmenta, izolovanje potonjeg i opciono prečišćavanje istog da se obezbedi izolovano antitelo ili fragment. U jednom izvođenju postupak dalje obuhvata korak konjugovanja efektorskog molekula na izolovanom antitelu ili fragmentu, na primer konjugovanje na PEG polimeru, naročito kao što je ovde opisano. ;[0153] U jednom izvođenju obezbeđen je postupak za prečišćavanje antitela (naročito antitela ili fragmenta prema pronalasku) obuhvatajući izvođenje hromatografije anjonske izmene u ne-vezujućem načinu takvom da su nečistoće zadržane na koloni i antitelo je eluirano. ;[0154] U jednom izvođenju prečišćavanje koristi afinitetno hvatanje na CSF-1R koloni. ;[0155] U jednom izvođenju prečišćavanje koristi cibakron plavo ili slično za prečišćavanje fuzije albumina ili konjugata molekula. ;[0156] Pogodne smole za jonsku izmenu za upotrebu u postupku uključuju smolu Q.FF (dobavljena od strane tzv. "GE-Healthcare"). Korak može, na primer biti izveden na pH oko 8. ;[0157] Postupak može dalje sadržavati početni korak hvatanja primenom hromatografije sa katjonskom izmenom, izveden na primer na pH od oko 4 do 5, kao što je 4.5. Hromatografija sa izmenom katjona može, na primer, upotrebiti smolu kao što je tzv. "CaptoS" smola ili SP sefaroza FF (isporučena od strane tzv. "GE-Healthcare"). Antitelo ili fragment može zatim biti eluiran iz smole upotrebom jonskog rastvora soli kao što je natrijum hlorid, na primer u koncentraciji od 200 mM. ;[0158] Prema tome korak ili koraci hromatografije mogu takođe uključiti jedan ili više koraka ispiranja, prema potrebi. ;[0159] Postupak prečišćavanja može takođe sadržavati jedan ili više koraka filtracije, kao što je korak diafiltracije. ;[0160] Tako je u jednom izvođenju obezbeđeno prečišćeno anti-CSF-1R antitelo ili fragment, na primer humanizovano antitelo ili fragment, naročito antitelo ili fragment, prema pronalasku, u suštini prečišćenog od, naročito bez ili u suštini bez endotoksina i/ili proteina ćelije domaćina ili DNK. ;[0161] Prečišćeni oblik, kako je korišćen supra, je namenjen da se odnosi na najmanje 90% čistoće, kao što su 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% w/w ili više čistoće. ;[0162] Suštinski, bez endotoksina, je uopšteno namenjen da se odnosi na sadržaj endotoksina od 1 EU po mg produkta antitela ili manje, kao što je 0.5 ili 0.1 EU po mg produkta. ;[0163] Suštinski bez proteina ćelija domaćina ili DNK je uopšteno namenjena da se odnosi na protein ćelije domaćina i/ili sadržaj DNK 400 µg po mg produkta antitela ili manje, kao što je 100 µg po mg ili manje, naročito 20 µg po mg, prema potrebi. ;[0164] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje anti-CSF-1R antitelo (ili farmaceutske kompozicije koje sadrže isto) prema otkriću za upotrebu kao leka. ;[0165] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje anti-CSF-1R antitelo (ili farmaceutske kompozicije koje sadrže isto) prema otkriću, za lečenje kancera. ;[0166] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu anti-CSF-1R antitela (ili farmaceutske kompozicije koja sadrži isto) prema otkriću u proizvodnji leka za lečenje ili profilaksu kancera. ;[0167] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metod za lečenje humanog subjekta koji pati od ili koji je pod rizikom od kancera, metod koji se sastoji od primenjivanja na subjektu efikasne količine anti-CSF-1R antitela prema otkriću. ;[0168] Antitelo prema otkriću može biti korišćeno za lečenje kancera koji je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, kancera prostate, kancera kostiju, mijeloma, kolorektalnog kancera, leukemije, limfoma, kancera kože kao što je melanom, kancera jednjaka, kancera želuca, astrocitnog kancera, kancera endometrijuma, kancera grlića maternice, kancera mokraćne bešike, kancera bubrega, kancera pluća, kancera jetre, kancera štitne žlezde, kancera glave i vrata, kancera gušterače i kancera jajnika. ;[0169] U jednom izvođenju kancer je metastazirani kancer iz bilo kojeg od gore navedenih izvornih karcinoma, naročito kancera kostiju. ;[0170] Iznenađujuće smo bili u stanju da pokažemo da je anti-CSF-1R antitelo koje inhibira aktivnost CSF-1R aktivno u lečenju fibroznih bolesti. Specifično, mi smo bili u stanju da pokažemo da je anti-CSF-1R antitelo aktivno u in vivo životinjskim modelima plućne fibroze. ;[0171] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje anti-CSF-1R antitelo (ili farmaceutske kompozicije koje sadrže isto) prema otkriću, za lečenje fibroznih bolesti. ;[0172] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu anti-CSF-1R antitela (ili farmaceutske kompozicije koja sadrži isto) prema otkriću u proizvodnji leka za lečenje ili profilaksu fibrozne bolesti. ;[0173] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metod za lečenje humanog subjekta koji pati od ili koji je pod rizikom od fibrozne bolesti, metod koji se sastoji od primenjivanja na subjektu efikasne količine anti-CSF-1R antitela prema otkriću. ;[0174] U ovoj patentnoj prijavi, termin "fibrozna bolest" uključuje bolesti koje su karakterisane nenormalnim odgovorom na zarastanje rana pri čemu se višak vlaknastog vezivnog tkiva formira u organu ili tkivu. Ilustrativne fibrozne bolesti uključuju, ali nisu ograničene na plućnu fibrozu kao što je idiopatska plućna fibroza i cistična fibroza, fibrozu bubrega uključujući tubularnu atrofiju i intersticijalnu fibrozu, fibrozu jetre, cirozu jetre, primarni sklerozirajući holangitis, primarnu bilijarnu cirozu, endomiokardijalnu fibrozu, medijastinalnu fibrozu, mijelofibrozu, retroperitonealnu fibrozu, progresivnu masivnu fibrozu, nefrogenu sistemsku fibrozu, Kronovu bolest, keloid, infarkt miokarda, sklerodermiju, sistemsku sklerozu, artrofibrozu. ;[0175] U jednom izvođenju, antitela ili fragmenti prema otkriću se koriste u lečenju ili profilaksi kancera ili fibrozne bolesti. ;[0176] Antitelo prema otkriću može biti korišćeno u lečenju inflamatornih bolesti, kao što su, na primer, inflamatorni artritis, ateroskleroza, multipla skleroza, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, ulcerozni kolitis, reumatoidni spondilitis, ankilozirajući spondilitis, artritis, psorijazni artritis, reumatoidni artritis, osteoartritis, ekcem, kontaktni dermatitis, psorijaza, sindrom toksičnog šoka, sepsa, septički šok, endotoksični šok, astma, hronična inflamatorna bolest pluća, silikoza, plućna sarkoidoza, osteoporoza, restenoza, srčana i renalna reperfuziona povreda, tromboza, glomerulonefritis, dijabetes, reakcija grafta protiv domaćina, odbacivanje alografta, multipla skleroza, degeneracija mišića, mišićna distrofija, Alchajmerova bolest i moždani udar. ;[0177] Antitela i fragmenti prema ovom otkriću mogu biti upotrebljeni u lečenju ili profilaksi. ;[0178] Molekul antitela predmetnog pronalaska može biti takođe korišćen u dijagnozi, na primer u dijagnozi in vivo slikovnom prikazu bolesnih stanja koja uključuju CSF-1R. ;[0179] Kako su antitela predmetnog pronalaska korisna u lečenju i/ili profilaksi patološkog stanja, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku ili dijagnostičku kompoziciju koja sadrži molekul antitela predmetnog pronalaska u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom., razblaživačem ili nosačem. Prema tome, obezbeđena je upotreba antitela iz pronalaska za proizvodnju leka. Kompozicija će obično biti dostavljena kao deo sterilne farmaceutske kompozicije koja će normalno uključiti farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska može dodatno sadržavati farmaceutski prihvatljiv adjuvant. ;[0180] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za pripremu farmaceutske ili dijagnostičke kompozicije obuhvatajući dodavanje i mešanje molekula antitela predmetnog pronalasa zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom, razblaživačem ili nosačem. ;[0181] Molekul antitela može biti jedini aktivni sastojak u farmaceutskoj ili dijagnostičkoj kompoziciji. Alternativno, antitelo može biti primenjeno u kombinaciji, npr. istovremeno, uzastopno ili odvojeno, sa jednim ili više drugih terapijski aktivnih sastojaka. Prema molekulu antitela u farmaceutskoj ili dijagnostičkoj kompoziciji mogu biti popraćeni i drugi aktivni sastojci, uključujući druge sastojke antitela, na primer porodicu receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR, HER-2), receptore faktora rasta vaskularnog endotela (VEGFR), antitela receoptora faktora rasta izvedenih iz trombocita (PDGFR), ili sastojke koji nisu antitela kao što su imatinib, dasatinib, nioltinib, basutinib, gefitinib, erlotinib, temsirolimus, vandetanib, vemurafenib, krizotinib, vorinostat, romidepsin, bortezomib, sorafenib, sunitinib, pazopanib, regorafenib, kabozantinib, Perfenidon, steroidi ili drugi molekuli leka, naročito molekuli leka čije je poluvreme raspada nezavisao od vezivanja CSF-1R. ;[0182] Aktivni sastojak kao što je ovde upotrebljen se odnosi na sastojak sa farmakološkim efektom, kao što je terapijski efekat, u relevantnoj dozi. ;[0183] Farmaceutske kompozicije pogodno obuhvataju terapijski efikanu količinu antitela pronalaska. Termin "terapijski efikasna količina" kao što se ovde koristi se odnosi na količinu terapijskog agensa potrebnu da se leči, ublaži ili spreči ciljana bolest ili stanje, ili da se pokaže otkriveni terapijski, farmakološki ili ;preventivni efekat. Za bilo koje antitelo, terapijski efikasna količina može biti procenjena u početku ili u testovima ćelijske kulture ili na životinjskim modelima, obično kod glodara, zečeva, pasa, svinja ili primata. Životinjski model može takođe biti korišćen da se odredi odgovarajući raspon koncentracije i put primene. Takve informacije zatim mogu biti upotrebljene za određivanje korisnih doza i puteva za primenu kod ljudi. ;[0184] Precizna terapijski efikasna količina za humani subjekt će zavisiti od težine stanja bolesti, opšteg zdravlja subjekta, starosti, težine i pola subjekta, ishrane, vremena i učestalosti davanja, kombinacije(a) lekova, osetljivosti reakcije i tolerancije/odgovora na terapiju. Ova količina može biti određena rutinskim eksperimentisanjem i nalazi se u okviru procene kliničara. Uopšteno, terapijski efikasna količina će biti od 0.01 mg/kg do 500 mg/kg, na primer 0.1 mg/kg do 200 mg/kg, kao što je 100 mg/kg. ;[0185] Farmaceutske kompozicije mogu biti pogodno predstavljene u jediničnim doznim oblicima koji sadrže prethodno određenu količinu aktivnog agensa iz pronalaska po dozi. ;[0186] Terapiske doze antitela prema ovom otkriću ne pokazuju očigledne ili ograničene toksikološke efekte in vivo. ;[0187] Kompozicije mogu biti primenjene na pacijentu pojedinačno ili mogu biti primenjene u kombinaciji (npr. istovremeno, uzastopno ili odvojeno) sa drugim agensima, lekovima ili hormonima. ;[0188] U jednom izvođenju, antitela ili vezujući fragmenti prema ovom otkriću su upotrebljeni sa jednom ili više drugih mogućnosti lečenja kancera, kao što su, na primer, hemoterapija, radioaterapija ili hirurgija. Ako se primenjuje sa hemoterapijom, antitelo može biti primenjeno pre ili posle hemoterapijskog agensa ili u isto vreme. Hemoterapijski tretmani koji mogu biti korišćeni u kombinaciji sa antigen vezujućim proteinima koji se obezbeđuju uključuju, ali nisu ograničeni na agense za alkilovanje/oštećenje DNK (npr. Karboplatin, cisplatin), antimetabolite (npr. kapecitabin, gemcitabin, 5-fluorouracil), inhibitore mitoze (npr. paklitaksel, vinkristin). ;[0189] Antitela koja se koriste za lečenje raznih inflamatornih bolesti mogu biti korišćena sama ili u kombinaciji sa različitim drugim antiinflamatornim agensima. ;[0190] Antitela koja se koriste za lečenje raznih fibroznih bolesti mogu biti korišćena sama ili u kombinaciji sa raznim drugim anti-fibroznim agensima. Primer takvog agensa je Perfedidon. ;[0191] Doza u kojoj se primenjuje molekul antitela predmetnog pronalaska zavisi od prirode stanja koje treba biti lečeno, ozbiljnosti prisutnog stanja i od toga da li se molekul antitela koristi profilaktički ili za lečenje postojećeg stanja. ;[0192] Učestalost doze će zavisiti od poluvremena raspada molekula antitela i trajanja njegovog efekta. Ako molekul antitela ima kratko poluvreme raspda (npr. 2 do 10 sati), može biti neophodno dati jednu ili više doza dnevno. Alternativno, ako molekul antitela ima dugo poluvreme raspada (npr. 2 do 15 dana) i/ili dugotrajni profil farmakodinamike (PD), može biti potrebno dati dozu samo jednom dnevno, jednom nedeljno ili čak jednom svakog 1 ili 2 meseca. ;[0193] Poluvreme raspada kao što je upotrebljeno ovde, je namenjeno da se odnosi na trajanje molekula u cirkulaciji, na primer u serumu/plazmi. ;[0194] Farmakodinamika kao što se ovde koristi se odnosi na profil i naročito trajanje biološkog dejstva molekula prema ovom otkriću. ;[0195] Farmaceutski prihvatljivi nosač ne bi trebao sam indukovati produkciju antitela štetnih za pojedinačno primanje kompozicije i ne bi trebao biti toksičan. Pogodni nosači mogu biti veliki, polako metabolizovani makromolekuli kao što su proteini, polipeptidi, lipozomi, polisaharidi, polimlečne kiseline, poliglikolne kiseline, polimerne amino kiseline, kopolimeri aminokiseline i inaktivne čestice virusa. ;[0196] Mogu biti korišćene farmaceutski prihvatljive soli, na primer soli mineralne kiseline, kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati i sulfati, ili soli organskih kiselina, kao što su acetati, propionati, malonati i benzoati. ;[0197] Farmaceutski prihvatljivi nosači u terapijskim kompozicijama mogu dodatno sadržavati tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, glicerol i etanol. Dodatno, pomoćne supstance, kao što su agensi za vlaženje ili emulgovanje ili pH puferujuće supstance, mogu biti prisutne u takvim kompozicijama. Takvi nosači omogućuju da farmaceutske kompozicije budu formulisane u obliku tableta, pilula, dražeja, kapsula, tečnosti, gelova, sirupa, gustih suspenzija i suspenzija za gutanje od strane pacijenta. ;[0198] Pogodni oblici za primenu uključuju oblike pogodne za parenteralnu primenu, npr. injekcijom ili infuzijom, na primer bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Kada je produkt namenjen za injekciju ili infuziju, može biti u obliku suspenzije, rasrvora ili emulzije u uljanom ili vodenom nosaču i može sadržavati formulacione agense, kao što su agensi za suspendovanje, konzervisanje, stabilizaciju i/ili disperziju. Alternativno, molekul antitela može biti u suvom obliku, za rekonstituciju pre upotrebe sa odgovarajućom sterilnom tečnošću. ;[0199] Jednom formulisane kompozicije pronalaska mogu biti primenjene direktno na subjektu. Subjekti koji se leče mogu biti životinje. Međutim, u jednom ili više izvođenja kompozicije su prilagođene za davanje humanim subjektima. ;[0200] Pogodno u formulacijama prema ovom otkriću, pH konačne formulacije nije sličan vrednosti izoelektrične tačke antitela ili fragmenta, na primer ako je pH formulacije 7, tada pl(izoelektrična tačka) od 8-9 ili iznad može biti prikladna. Iako se ne želi da bude vezano teorijom, smatra se da ovo može na kraju obezbediti konačnu formulaciju sa poboljšanom stabilnošću, na primer antitelo ili fragment ostaje u rastvoru. ;[0201] U jednom primeru farmaceutska formulacija na pH u rasponu od 4.0 do 7.0 sadrži: 1 do 200 mg/mL antitela prema ovom otkriću, 1 do 100 mM pufera, 0.001 do 1% surfaktanta, a) 10 do 500 mM stabilizatora, b) 10 do 500 mM stabilizatora i 5 do 500 mM agensa za toničnost, ili c) 5 do 500 mM agensa za toničnost. ;[0202] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu biti primenjivane bilo kojim brojem puteva uključujući, ali ne ograničavajući se na, oralne, intravenozne, intramuskularne, intra-arterijske, intramedularne, intratekalne, intraventrikularne, transdermalne, transkutane (na primer, videti W098/20734), subkutane, intraperitonealne, intranazalne, enteralne, topikalne, sublingvalne, intravaginalne ili rektalne puteve. Hiposrejevi se takođe mogu upotrebiti za davanje farmaceutskih kompozicija pronalaska. Obično, terapijske kompozicije mogu biti pripremljene kao injekcije, i kao tečni rastvori ili suspenzije. Takođe mogu biti pripremljene čvrste forme pogodne za u rastvor, ili u suspenziju, tečnim nosačima pre injekcije. ;[0203] Direktna isporuka kompozicija će se uopšteno postići injekcijom, subkutano, intraperitonealno, intravenozno ili intramuskularno, ili dostaviti u intersticijalni prostor tkiva. Kompozicije takođe mogu biti davane u leziju. Doziranje može biti raspored pojedinačne doze ili raspored višestrukih doza. ;[0204] Podrazumeva se da će aktivni sastojak u kompoziciji biti molekul antitela. Kao takav, biće osetljiv na razgradnju u gastrointestinalnom traktu. Prema tome, ako kompozicija treba biti primenjena putem gastrointestinalnog trakta, kompozicija će morati sadržavati agense koji štite antitelo od razgradnje, ali koji oslobađaju antitelo kada se apsorbuje iz gastrointestinalnog trakta. ;[0205] Otvorena diskusija o farmaceutski prihvatljivim nosačima je dostupna u Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J.1991). ;[0206] U jednom izvođenju formulacija je obezbeđena kao formulacija za topikalno davanje, uključujući inhalaciju. ;[0207] Pogodni inhalacioni preparati uključuju inhalacione prahove, aerosole za doziranje koji sadrže propelantne gasove ili inhalacione rastvore bez propelantnih gasova. Inhalacioni prahovi prema otkriću koji sadrže aktivnu supstancu mogu sadržavati isključivo iznad navedene aktivne supstance ili smešu iznad navedenih aktivnih supstanci sa fiziološki prihvatljivim ekscipijentom. ;[0208] Ovi inhalacioni prahovi mogu uključivati monosaharide (npr. glukozu ili arabinozu), disaharide (npr. laktozu, saharozu, maltozu), oligo- i polisaharide (npr. dekstrane), polialkohole (npr. sorbitol, manitol, ksilitol), soli (npr. natrijum hlorid, kalcijum karbonat) ili smeše od njih jedne sa drugima. Pogodno se upotrebljavaju mono- ili disaharidi, upotreba laktoze ili glukoze, naročito ali ne isključivo u obliku njihovih hidrata. ;[0209] Čestice za taloženje u plućima zahtevaju veličinu čestica manju od 10 mikrona, kao što je 1-9 mikrona, na primer od 0.1 do 5 µm, naročito od 1 do 5 µm. Veličina čestica aktivnog sastojka (kao što je antitelo ili fragment) je od primarne važnosti. ;[0210] Propelantni gasovi koji mogu biti upotrebijeni za pripremu inhalacionih aerosola su poznati u stanju tehnike. Pogodni propelantni gasovi su izabrani između ugljovodonika kao što su n-propan, n-butan ili izobutan i halougljovodonici kao što su hlorisani i/ili fluorisani derivati metana, etana, propana, butana, ciklopropana ili ciklobutana. Iznad navedeni propelantni gasovi mogu biti korišćeni sami ili u smešama od njih. ;[0211] Naročito pogodni propelantni gasovi su halogenizovani derivati alkana izabrani između TG11, TG12, TG134a i TG227. Iznad navedeni halogenizovani ugljovodonici, TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetan) i TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropan) i smeše od njih su naročito pogodni. ;[0212] Propelantni gas koji sadrži inhalacione aerosole može takođe sadržavati i druge sastojke kao što su korastvarači, stabilizatori, površinski aktivni agensi (surfaktanti), antioksidanti, lubrikanti i sredstva za podešavanje pH. Svi ovi sastojci su poznati u stanju tehnike. ;[0213] Propelantni gas koji sadrži inhalacione aerosole prema pronalasku može sadržavati do 5% po težini aktivne supstance. Aerosoli prema pronalasku sadrže, na primer, 0.002 do 5% po težini, 0.01 do 3% po težini, 0.015 do 2% po težini, 0.1 do 2 % po težini, 0.5 do 2% ili 0.5 do 1% po težini aktivnog sastojka. ;[0214] Alternativno, topikalna primena u pluća može takođe biti primenom tečnog rastvora ili formulacije suspenzije, na primer upotrebom uređaja kao što je nebulizator, na primer, nebulizator povezan sa kompresorom (npr. tzv. "Pari LC-Jet Plus(R)" nebulizator povezan sa kompresorom tzv. "Pari Master(R)" proizveden od strane Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.). ;[0215] Antitelo prema pronalasku može biti dostavljeno dispergovano u rastvaraču, npr. u obliku rastvora ili suspenzije. Može biti suspendovano u odgovarajućem fiziološkom rastvoru, npr. rastvoru soli ili drugom farmakološki prihvatljivom rastvaraču ili puferisanom rastvoru. Puferisani rastvori poznati u stanju tehnike mogu sadržavati 0.05 mg do 0.15 mg dinatrijum edetata, 8.0 mg do 9.0 mg NaCl, 0.15 mg do 0.25 mg polisorbata, 0.25 mg do 0.30 mg anhidrovane limunske kiseline, i 0.45 mg do 0.55 mg natrijum citrata po 1 ml vode tako da se postigne pH od oko 40 do 50. Suspenzija može koristiti, na primer, liofilizovano antitelo. ;[0216] Terapijske suspenzije ili formulacije rastvora mogu takođe sadržavati jedan ili više ekscipijenata. Ekscipijenti su dobro poznati u stanju tehnike i uključuju pufere (npr. Citratni pufer, fosfatni pufer, acetatni pufer i bikarbonatni pufer), amino kiseline, ureu, alkohole, askorbinsku kiselinu, fosfolipide, proteine (npr. serumski albumin), EDTA, natrijum hlorid, lipozome, manitol, sorbitol i glicerol. Rastvori ili suspenzije mogu biti inkapsulirani u lipozome ili biorazgradive mikrosfere. Formulacija će uopšteno biti obezbeđena u suštinski sterilnom obliku koristeći postupke sterilne proizvodnje. ;[0217] Ovo može uključiti produkciju i sterilizaciju filtracijom puferiranog rastvarača/rastvora korišćenog za formulaciju, aseptičku suspenziju antitela u sterilnom puferisanom rastvoru rastvarača, i doziranje formulacije u sterilne posude metodama poznatim prosečnom stručnjaku u stanju tehnike. ;[0218] Formulacija za raspršivanje prema predmetnom pronalasku može biti obezbeđena, na primer, kao jedinice pojedinične doze (npr. hermetički zatvorene plastične posude ili bočice) pakovane u omotima od folije. Svaka bočica sadrži jediničnu dozu u zapremini, npr. 2 mL, rastvarača /rastvora pufera. ;[0219] Antitela koja su ovde opisana mogu biti pogodna za isporuku putem nebulizacije. ;[0220] Takođe je predviđeno da antitelo predmetnog pronalaska može biti primenjeno upotrebom genske terapije. Da bi se to postiglo, sekvence DNK koje kodiraju teške i lake lance molekula antitela pod kontrolom odgovarajućih komponenti DNK se uvode u pacijenta tako da se lanci antitela eksprimiraju iz sekvenci DNK i sastavljaju in situ. ;[0221] U jednom izvođenju ovo otkriće obuhvata upotrebu antitela ili fragmenata od njih kao reagensa ili dijagnoze, na primer konjugovanih na reporter molekul. Prema tome, obezbeđeno je antitelo ili fragment prema otkriću ;koje je označeno. U jednom aspektu obezbeđena je kolona koja sadrži antitelo ili fragment prema otkriću. ;[0222] Prema tome, obezbeđeno je anti-CSF-1R antitelo ili fragment za upotrebu kao reagens za takve upotrebe kao: ;;1) prečišćavanje CSF-1R proteina (ili njegovog vezujućeg fragmenta)-koji je konjugovan na matriks i upotrebljen kao afinitet kolone, ili (kao modifikovani oblik anti-CSF-1R) kao agens za precipitaciju (npr. kao oblik modifikovan sa domenom prepoznatom od strane drugog molekula, koji može biti modifikovan), koji je opciono precipitiran sa anti-Fc reagensom) ;2) otkrivanje i/ili kvantifikacija CSF-1R na ćelijama ili u ćelijama, živim ili fiksiranim (ćelije in vitro ili u tkivu ili sekcijama ćelija). Upotreba za ovo može uključiti kvantifikaciju CSF-1R kao biomarkera, kako bi se pratio efekat anti-CSF-1R tretmana. Za ove svrhe, kandidat može biti korišćen u modifikovanom obliku (npr. dodatkom drugog ostatka, kao što je genetski fuzioni protein ili hemijski konjugat, kao što je dodavanje reporter molekula, na primer fluorescentne oznake koja se koristi u svrhu otkrivanja). ;3) prečišćavanje ili sortiranje ćelija koje nose CSF-1R obeleženih sa vezivanjem za kandidat modifikovan na načine prikazane u (1) i (2). ;;[0223] Sadržavajući u kontekstu ove specifikacije je namenjen značenju uključujući. ;[0224] Gde je tehnički odgovarajuće, izvođenja pronalaska mogu biti kombinovana. ;[0225] Izvođenja su ovde opisana kao da sadrže određene karakteristike /elemente. Otkriće se takođe proteže na odvojena izvođenja koja se sastoje ili suštinski sastoje od navedenih karakteristika/elemenata. ;[0226] Svako izvođenje koje je ovde specifično i eksplicitno navedeno može da bude osnova za odricanje od odgovornosti, bilo samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više daljih izvođenja. ;[0227] Ovaj pronalazak je dalje opisan kao ilustracija samo u sledećim primerima, koji se odnose na sledeće Slike: ;;Slika 1A do 1F prikazuje određene sekvence amino kiselina i polinukleotida. ;;Slika 2A i 2B prikazuje poravnanje određenih sekvenci. ;;Slika 3 prikazuje sekvencu humanog CSF-1R ekstracelularnog domena kodiranog pomoću polinukleotida upotrebljenog za transfekciju ćelija i ekspresiju proteina na površini ćelije. Ove ćelije su zatim upotrebljene za imunizaciju životinja domaćina. ;;Slika 4 prikazuje inhibiciju vezivanja CSF-1 na THP-1 ćelije pomoću antitela Ab969. ;;Slika 5a prikazuje inhibiciju preživljavanja pod kontrolom CSF-1 i proliferaciju sa primarnim humanim monocitima pomoću antitela Ab969. ;;Slika 5b prikazuje inhibiciju preživljavanja pod kontrolom IL-34 i proliferaciju sa primarnim humanim monocitima pomoću antitela Ab969. ;;Slika 6 prikazuje inhibiciju preživljavanja pod kontrolom CSF-1 i proliferaciju sa primarnim monocitima miša pomoću antitela Ab535. ;;Slika 7 prikazuje nivoe CSF-1R ćelijske površine na THP-1 ćelijama inkubiranim sa Ab969, humanim CSF-1 i kontrolom izotipa. ;;Slika 8 prikazuje relativni nivo CSF-1R ćelijske površine na THP-1 ćelijama tretiranim sa Ab969 u poređenju sa kontrolom izotipa. ;;Slika 9 prikazuje nivoe CSF-1R ćelijske površine na RAW264.7 ćelijama inkubiranim sa Ab 535, CSF-1 i kontrolom izotipa. ;;Slika 10 prikazuje relativni nivo CSF-1R ćelijske površine na RAW264.7 ćelijama tretiranim sa Ab535 u poređenju sa kontrolom izotipa. ;;Slika 11 prikazuje nivo CSF-1R fosforilacije na HEK293F ćelijama transfektovanim sa CSF-R nakon stimulacije sa CSF-1 ili tretimana sa Ab969. ;Slika 12 prikazuje nivo sekrecije MCP-1 iz primarnih humanih monocita kada su inkubirani sa Ab969 i sa CSF-1. Slika 13 prikazuje efekat na inhibiciju preživljavanja monocita posredovanu CSF-1 sa humanizovanim antitelom 969.g5 u poređenju sa himernim Ab969g0. ;Slika 14 prikazuje efekat na inhibiciju preživljavanja monocita posredovanu CSF-1 različitim humanizovanim graftovima antitela od Ab969. ;Slika 15a prikazuje koncentraciju CSF-1 u uzorcima seruma uzetim od cinomolgus majmuna tretiranim sa jednom intravenskom dozom od 7 mg/kg Ab969.g2. ;Slika 15b prikazuje koncentraciju CSF-1 u uzorcima seruma uzetim od cinomolgus majmuna tretiranim sa jednom intravenskom dozom od 1.5 mg/kg Ab969.g2. ;Slika 15c prikazuje efekat primenjivanja antitela Ab969.g2 na cinomolgus majmunima u dozama od 7 mg/kg i 1.5 mg/kg na cirkulišuće ne-klasične monocite u različitim vremenskim tačkama. ;Slika 16 prikazuje antitumorski efekat antitela Ab535 u odnosu na kontrolno antitelo, pozitivnu kontrolu i kontrolu nosača u imunodeficijentnim golim miševima koji nose subkutane transplantate ksenografta MCF-7 humanog kancera dojke. ;Slika 17 antitumorsku efekasnost antitela Ab535 u odnosu na kontrolno antitelo, pozitivnu kontrolu i kontrolu nosača u ortotopskom modelu PC-3 kancera prostate. ;Slika 18a prikazuje efekat tretmana indukovane fibroze pluća bleomicinom sa Ab535 na koncentraciju kolagena BALF u poređenju na kontrolu izotipa. ;Slika 18b prikazuje efekat tretmana indukovane fibroze pluća bleomicinom sa Ab535 na fibroznu patologiju uzoraka pluća izmeren pomoću tzv. Ashcroftovog rezultata u poređenju na kontrolu izotipa. ;Slika 18c prikazuje efekat tretmana indukovane fibroze pluća bleomicinom sa Ab535 na koncentraciju albumina u serumu u poređenju na kontrolu izotipa. ;Slika 18d prikazuje broj makrofaga u BAL tečnosti miševa iz ispitivanja indukovane fibroze pluća bleomicinom i pokazuje da tretman indukovane fibroze pluća bleomicinom sa Ab535 smanjuje broj makrofaga u BAL tečnosti u poređenju sa kontrolom izotopa tretiranih životinja. Podatak prikazan kao srednja vrednost ± SEM; * označava značajnu razliku od izotipa fiziološkog rastvora; # označava značajnu razliku od miševa tretiranih bleomicinom koji su dozirani sa kontrolom izotipa antitela (p <0.05)

Slika 19 prikazuje slike histopatološke analize pluća iz kontrole fiziološkog rastvora, bleomicina plus kontrola izotipa i bleomicina plus Ab535 tretiranih životinja.

Slika 20a prikazuje efekat tretmana ADA-deficijentnih miševa sa indukovanom fibrozom pluća sa Ab535 na BALF koncentraciju kolagena u poređenju na tretman sa kontrolom izotipa.

Slika 20b prikazuje efekat tretmana ADA-deficijentnih miševa sa indukovanom fibrozom pluća sa Ab535 na fibroznu patologiju uzoraka pluća izmerenu pomoću tzv. Ashcroftovog rezultata u poređenju na tretman sa kontrolom izotipa.

Slika 20c prikazuje efekat tretmana ADA-deficijentnih miševa sa indukovanom fibrozom pluća sa Ab535 na koncentraciju albumina u serumu u poređenju na tretman sa kontrolom izotipa.

Slika 20d prikazuje broj makrofaga u BAL tečnosti miševa iz ADA deficijentnog modela fibroze pluća i pokazuje da tretman ADA-deficijentnih miševa sa indukovnom fibrozom pluća sa Ab535 smanjuje broj makrofaga u BAL tečnosti.

Slika 21 prikazuje reprezentativne slike histopatološke analize pluća od normalnih miševa (ADA ) i ADA-deficijentnih miševa sa indukovanom fibrozom pluća (ADA-) oba tretirana sa kontrolom izotopa ili Ab535.

PRIMERI

Primer 1 - Generisanje anti-CSF-1R antitela

Imunizacija:

[0228] Ženke tzv. "Sprague Dawley" laboratorijskog albino pacova su imunizovane sa singenskim RFL6 fibroblastima pacova koji su prolazno transfektovani sa vektorom koji eksprimira humani CSF-1R ekstracelularni domen povezan na glikozilfosfatidil-inozitol (GPI) anchor. Slika 3 prikazuje SEK ID BR: 39 koji je sekvenca CSF-1R humane ekstracelularne domene korišćena u imunizaciji pacova.

[0229] Pacovi su primili pet potkožnih supkutanih imunizacija u intervalima od tri nedelje 3-9x10<6>transfektovanih ćelija po životinji. Freundov kompletni adjuvant (50% u PBS-u) je injektiran na susednom mestu sa prvom ćelijskom imunizacijom. Dve nedelje nakon konačne imunizacije, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i slezene su sakupljene.

Primarni skrining supernatanata antitela

[0230] Supernatanti antitela su inicijalno ispitivani na njihovu sposobnost da vežu humani CSF-1R eksprimiran na transfektovanim HEK293 ćelijama pomoću tehnologije fluorescentne mikrovolumenske analize (FMAT).

[0231] Približno 1000 jažica sa anti-CSF-1R reaktivnošću su identifikovane u primarnom FMAT snimku od 600 x 96-jažičnih ploča. Ukupno, su pregledane približno 3x10<8>B ćelije (splenociti pacova) za produkciju CSF-1R vezujućih antitela sa FMAT.

Sekundarni skrining supernatanata antitela

[0232] Osmišljen je test za srednju propusnost da bi se identifikovale FMAT-pozitivne jažice koje su sadržavale neutralizirajuću anti-CSF-1R aktivnost, tj. antitela koja imaju sposobnost da spreče vezivanje humanog CSF-1 na humani CSF-1R receptor. Supernatanti antitela su inkubirani sa CSF-1R eksprimirajući THF-1 ćelije pre inkubacije sa humanim CSF-1. Nivo vezivanja CSF-1 na THP-1 ćelije je izmeren protočnom citometrijom upotrebom anti-CSF-1 poliklonalnog antitela. Irelevantni supernatanti antitela su korišćeni kao negativne kontrole.

[0233] Sekundarni ekran je primenjen na supernatantima iz 779 jažica antitela i 88 ovih jažica je pokazalo detektabilnu aktivnost blokiranja CSF-1.

Tercijarni skrining supernatanata antitela

[0234] Supernatanti antitela koji su pokazali neutralizirajuću aktivnost u sekundarnom snimku su testirani na njihovu sposobnost da spreče preživljavanje primarnih humanih monocita zavisnih od CSF-1. Monociti su prečišćeni iz humane krvi i 1x10<4>ćelija inkubiranih sa svakim supernatantom antitela u prisustvu 20 ng/ml humanog CSF-1. Nakon 72-časovne inkubacije, broj živih monocita je izmeren tzv. "CellTiter Glo" testom.

[0235] Tercijarni snimak je primenjen na supernatante iz 59 jažica antitela identifikovanih u sekundarnom snimku, i 18 jažica je pokazalo sposobnost da se smanji preživljavanje monocita posredstvom CSF-1.

Kloniranje varijabilnih regija antitela i ponovna analiza aktivnosti blokiranja

[0236] Kloniranje varijabilne regije (V-regija) je pokušano iz 18 jažica antitela koje pokazuju neutralizirajuću aktivnost CSF-1. Teške i lake imunoglobulinske V-regije su pojačane pomoću RT-PCR korišćenjem prajmera specifičnih za konstantne regije antitela pacova i redundantni set prajmera koji se vezuje za sekvence koje kodiraju imunoglobulinske vodeće peptide pacova. Geni V-regija su dobijeni iz 14 antitela i klonirani u teške i lake lance humane IgG4 ekspresione vektore.

[0237] Parovi vektora antitela su prolazno transfektovani u HEK293F ćelije i kondicionirani medijum je testiran za CSF-1 neutralizirajuću aktivnost na THP-1 ćelijama (kao što je opisano iznad). Devet antitela je imalo kapacitet da delimično ili potpuno inhibira vezivanje CSF-1 u poređenju sa kontrolisanim kondicioniranim medijumom.

Analiza sekvence od devet neutralizirajućih anti-CSF-1R antitela

[0238] Devet neutralizirajućih antitela je sekvencirano da se proceni raznovrsnost sekvenci. Svih devet antitela su bila jedinstvena. Ova antitela su klonirana i eksprimirana za dalje profilisanje ispitivanja.

Primer 2 - In vitro svojstva anti-humanog CSF-1R himernog Ab969 i anti-mišjeg CSF-1R Ab535

i) Izražavanje himernog Ab969

[0239] Varijabilne regije devet neutralizirajućih antitela identifikovanih u Primeru 1 su klonirane u odvojene vektore ekspresije teškog i lakog lanca i izražene su kao humana antitela IgG4 pune dužine.

[0240] Geni VH su klonirani u vektor pVhg4FL (V19H), koji sadrži DNK kodirajući prirodnu vodeću sekvencu i konstantnu regiju humanog gama-4 teškog lanca sa mutacijom stabilizirajućeg zgloba S241P. VL geni (kappa) su klonirani u vektor pKH10.1 (V4L), koji sadrži DNK kodirajući prirodnu vodeću sekvencu i konstantnu regiju humanog kappa lanca (Km3 alotip).

[0241] Antitela su izražena prolaznom ko-transfekcijom podudarajućih parova vektora teškog i lakog lanca u CHO-K1 ćelije. Prečišćavanje antitela u PBS pH 7.4 je izvedeno tako da je nivo agregata u finalnoj pripremi bio manji od 1%.

[0242] Panel od devet antitela uključuje antitelo označeno antitelo 969. Himerno antitelo koje sadrži varijabilne regije pacova i konstantnu regiju humanog gama-4 teškog lanca i konstantnu regiju humanog kappa lanca se odnosi na antitelo 969 ili antitelo 969cHcL ili antitelo 969.g0 u sledećim primerima.

ii) Test blokiranja liganda

[0243] Kapacitet svakog od devet antitela da inhibira vezivanje CSF-1 na THP-1 ćelije je procenjen protočnom citometrijom. THP-1 ćelije su inkubirane sa svakim antitelom na 0.5, 0.125, 0.031, 0.0078 i 0.00195µg/ml tokom 30 minuta. Irelevantno IgG4 antitelo je služilo kao kontrola izotipa. Posle ispiranja, ćelije su inkubirane sa 0.5µg/ml humanog CSF-1 tokom 30 minuta. Nakon daljeg ispiranja, vezani CSF-1 je detektovan uzastopnom inkubacijom sa biotinilovanim anti-CSF-1 antitelom i Alexa488-konjugovanim streptavidinom. Ligand vezan na receptor je izmeren protočnom citometrijom i grafički je prikazan srednji intenzitet fluorescencije (MFI).

[0244] Ovaj test je identifikovao četiri antitela, uključujući Ab969, koja su bila superiornija u odnosu na preostala testirana antitela, pokazujući potpunu inhibiciju vezivanja CSF-1 na koncentraciji 31.3ng/ml. Rezultati za Ab969 su prikazani u Slici 4.

iii) Inhibicija preživljavanja monocita posredstvom CSF-1- i IL-34

Anti-humani CSF-1R

[0245] Prečišćena anti-humana CSF-1R antitela su testirana za njihov kapacitet da inhibiraju preživljavanje i proliferaciju primarnih humanih monocita zasnovanih na CSF-1 i IL-34. U svakom testu, mitogen (CSF-1 ili IL-34) je korišćen na koncentraciji koja je dala maksimalnu stimulaciju monocita.

[0246] Humane PBMC-e su pripremljene iz sveže humane pune krvi na tzv. "Ficoll" gradijentu i monociti su prečišćeni negativnom selekcijom. Monociti su inkubirani sa 0.25 µg/ml antitela i 20 ng/ml CSF-1 tokom 72 sata, i relativni broj varijabilnih ćelija je određen korišćenjem tzv. "CellTiter Glo" analize. Očitavanje luminescencije korelira sa brojem živih ćelija. Rezultati su prikazani na Slici 5a.

[0247] Humane PBMC-e su pripremljene iz sveže humane pune krvi na na tzv. "Ficoll" gradijentu i monociti su pročišćeni negativnom selekcijom. Monociti su inkubirani sa 0.25 µg/ml antitela i 20 ng/ml IL-34 tokom 72 sata, i relativni broj živih ćelija je određen korišćenjem tzv. "CellTiter Glo" analize. Očitavanje luminescencije korelira sa brojem živih ćelija. Rezultati su prikazani na Slici 5b.

[0248] Četiri antitela, uključujući Ab969, su pokazala superiornu inhibiciju preživljavanja monocita u poređenju sa preostalim antitelima za stimulaciju CSF-1 (Slika 5a) i IL-34 (Slika 5b), u skladu sa njihovim aktivnostima blokiranja liganda.

Anti-mišji CSF-1R:

[0249] Primarni mišji CD11b<+>monociti su prečišćeni iz mišjih slezena. Monociti su zatim inkubirani tokom 24 sata sa titracijom mišjeg CSF-1 (mCSF-1). Oslobađanje MCP-1 u ćelijski medijum je izmereno pomoću ELIZA testa i oslobađanje zavisno od doze MCP-1 pomoću mCSF-1 je prikazano. U odvojenoj "ruci" istraživanja, 10 µg/ml antimišjeg CSF-1R Ab535 je dodato zajedno sa titracijom mCSF-1. Oslobađanje MCP-1 je potpuno inhibirano sa Ab535 pri svim koncentracijama testiranog CSF-1 (Slika 6).

[0250] MCP-1 test oslobađanja je izveden korišćenjem primarnih mišjih monocita sa konstantnom koncentracijom CSF-1 od 100 ng/ml i titracijom Ab535. Prikazana je inhibicija oslobađanja MCP-1 zavisna od doze i izračunata IC50. Srednja vriednost IC50od Ab535 iz dva nezavisna eksperimenta je određena kao 8.08 ng/ml.

[0251] Zaključak: tretman mišjih monocita sa CSF-1 je prouzrokovao zavisno od doze oslobađanje MCP-1, koji je potpuno inhibiran tretmanom sa 10 µg/ml Ab535. Ab535 inhibira CSF-1 vođen oslobađanjem MCP-1 iz mišjih monocita u zavisnosti od doze, sa srednjom vrednošću IC50od 8.08 ng/ml (n=2). Ova vriednost IC50je slična onoj koja je prikazana sa anti-humanim-CSF-1R antitelima.

iv) Afinitet

[0252] Antitela su testirana na njihovu sposobnost da vežu CSF-1R u tzv. "BIAcore" testu merenjem kinetike vezivanja na prečišćeni rekombinantni CSF-IR/Fc fuzioni protein.

[0253] Format testa je bio hvatanje anti-CSF-1R antitela sa imobilisanim anti-humanim IgG, F(ab')2, zatim titracijom hCSF-1R/Fc preko zarobljene površine. BIA (Biamolecular Interaction Analysis) je izvedena upotrbom tzv. "BIAcore 3000" (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Svi eksperimenti su izvedeni na 25°C. Tzv. "Affinipure" F(ab')2fragment kozjeg antihumamog IgG, F(ab')2specifičnog fragmenta (Jackson ImmunoResearch) je bio imobilisan na CM5 senzorskom čipu (GE Healthcare Bio-Sciences AB) putem hemije aminskog spajanja do nivoa od ∼5000 jedinica odgovora (RU). HBS-EP pufer (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfaktant P20, GE Healthcare Bio-Sciences AB) je korišćen kao pufer za izvođenje sa brzinom protoka od 10 µl/min. Izvedena je injekcija anti-CSF-1R antitela kako bi se dobio nivo hvatanja od približno 100 RU na imobilisanom anti-humanom IgG, F(ab)2.

[0254] Rekombinantni humani CSF-IR/Fc (R&D Sistemi) je propušten preko zarobljenog anti-CSF-1R antitela na 5 nM pri brzini protoka od 30ul/min tokom 5 min, zatim je brzina protoka povećana na 100 ul/min tokom 30 min za fazu disocijacije. Injekcija na 5 nM je izvedena dva puta zajedno sa odgovarajućom kontrolom pufera. Ovi senzogrami su korišćeni za generisanje brzine disocijacije.

Rekombinantni humani CSF-1R/Fc je titriran preko zarobljenog anti-CSF-1R antitela od 2.5 nM pri brzini protoka od 30 ul/min tokom 5 minuta praćen sa 10 minuta faze disocijacije. Ovi senzogrami su korišćeni za generisanje brzine asocijacije. Površina je regenersana pri brzini protoka od 10 ul/min sa 10 ul injekcije od 40 mM HCl, nakon čega je usliedila injekcija od 5ul od 10 mM NaOH. Krivulje vezivanja dvostrukog referentnog pozadinskog oduzimanja su analizirane korišćenjem BIAevaluacije softvera (verzija 4.1) prateći standardne postupke. Kinetički parametri su određeni iz algoritma za podešavanje.

[0255] Tri od četiri testirana antitela su pokazala afinitete (KD) manje od 10 pM. Ovo se može uporediti povoljno sa paralelnim reagensom anti-mišjeg-CSF-1R, Ab535. Rezultati za Ab969 i Ab553 su prikazani u Tabeli 1.

Tabela 1:

[0256] Afinitet antitela je takođe meren testom baziranom na ćelijama korišćenjem THP-1 ćelije. Antitela su direktno obeležena sa fluorescentnom bojom tzv. "Alexa-488" i afinitet izmeren kvantitativnom protočnom citometrijom. Dodatna tzv. "BIAcore" analiza je potvrdila da fluorescentna konjugacija antitela nije promenila afinitet prema rekombinantnom CSF-1R proteinu. Rezultati su prikazani u Tabeli 2.

[0257] Apsolutne vrednosti afiniteta dobijene putem dve metodologije su različite, i ova razlika je obično opažena kada se uporede dva sistema. Međutim, metoda bazirana na ćeliji je pokazala da se antitela vezuju za CSF-1R sa visokim afinitetom.

Tabela 2

v) Inhibicija vezivanja CSF-1 (IC50)

[0258] Četiri antitela su analizirana merenjem njihove relativne snage u inhibiranju vezivanja CSF-1 na THP-1 ćelije. Sva četiri antitela su pokazala snažnu inhibiciju vezivanja CSF-1 sa IC50vrednostima manjim od 5 ng/ml (~30 pM) u ovom formatu testa.

Tabela 3

vi) Unakrsna-reaktivnost antitela

[0259] Četiri antitela su testirana za unakrsnu reaktivnost sa rezus majmunom, cinomolgus majmunom i psećim pune dužine CSF-1R. Sva četiri antitela su vezana uz rezus i cinomolgus CSF-1R pored humanog CSF-1R, pokazujući jasno vezivanje značajno iznad nivoa kontrole izotipa.

Tabela 4

vii) CSF-1R internalizacija

Ab969:

[0260] Ćelije THP-1 su inkubirane sa Ab969 tokom 0, 0.5, 2, 4, 24 i 48 sati. Ćelije su takođe tretirane sa humanim CSF-1 i kontrolom izotipa koji su služili kao pozitivne i negativne kontrole respektivno. U svakoj vremenskoj tački, nivo CSF-1R ćelijske površine je izmeren protočnom citometrijom (Slika 7). Relativni nivo CSF-1R ćelijske površine tretiran sa Ab969 u poređenju sa kontrolom izotipa je izračunat i prikazan na Slici 8.

[0261] Tretman THP-1 ćelija sa rekombinantnim CSF-1 je izazvao brzo i kontinuirano smanjenje nivoa ćelijske površine CSF-1R; prirodni ligand se veže na svoj srodni receptor i pokreće internalizaciju kompleksa ligand-receptor.

[0262] THP-1 ćelije tretirane sa Ab969 su pokazale više nivoe ekspresije CSF-1R na ćelijskoj površini u poređenju sa netretiranim i tretiranim THP-1 ćelijama kontrole izotipa tokom celog 48 časovnog trajanja. Ovi podaci snažno sugerišu da tretman THP-1 ćelija sa Ab969 ne uzrokuje internalizaciju ćelijske površine izražene hCSF-1R sve do 48 sati nakon tretmana.

[0263] Kako je vreme napredovalo, došlo je do značajnog povećanja na ćelijskoj površini eksprimiranog CSF-1R na netretiranim i tretiranim THP-1 ćelijama, sa izuzetkom ćelija tretiranim sa CSF-1. Ovo može biti posledica promene ekspresije tokom perioda rasta ćelija preko 48-časovnog perioda eksperimenta i potencijalno može biti odgovor na stres.

[0264] Da bi se obezbedio dodatni dokaz da Ab969 ne potencira internalizaciju receptora, i takođe isključuje mogućnost da THP-1 ćelijska linija nije fiziološki relevantna, primarni humani monociti su takođe korišćeni u testu internalizacije. Podaci iz ovog testa su takođe pokazali da Ab969 ne uzrokuje brzu internalizaciju na ćelijskoj površini CSF-1R na zdravim primarnim humanim monocitima.

Ab535:

[0265] Ćelijska linija mišeg leukemijskog monocita/makrofaga RAW264.7 eksprimira visoke nivoe mišjeg CSF-1R (mCSF-1R) i predstavlja pogodan sistem baziran na ćeliji za ispitivanje da li anti-mišje CSF-1R antitelo Ab535 može izazvati internalizaciju receptora.

[0266] RAW264.7 ćelije su inkubirane sa Ab535 tokom 0, 0.5, 2, 4, 24 i 48 sati. Ćelije su takođe tretirane sa humanim CSF-1 i kontrolom izotipa koji su služili kao pozitivna i negativna kontrola respektivno. U svakoj vremenskoj tački, nivo CSF-1R ćelijske površine je izmeren protočnom citometrijom (Slika 9). Relativni nivo CSF-1R ćelijske površine u poređenju sa kontrolom izotipa je izračunat i prikazan na Slici 10.

[0267] Podaci pokazuju da je tretman THP-1 ćelija sa rekombinantnim CSF-1 uzrokovao brzo i kontinuirano smanjenje nivoa CSF-1R ćelijske površine.

[0268] Jasno smanjenje nivoa mCSF-1R ćelijske površine je opaženo na RAW264.7 ćelijama tretiranim sa humanim CSF-1 tokom 2 sata u odnosu na netretirane i izotipski kontrolne tretirane ćelije. Ovo smanjenje se održava tokom svih 48 sati proučavanja. Ovo pokazuje da humani CSF-1 izaziva internalizaciju mCSF-1R i potvrđuje eksperimentalni sistem za praćenje internalizacije receptora.

[0269] RAW264.7 ćelije tretirane sa Ab535 pokazuju slične nivoe mCSF-1R ćelijske površine u poređenju sa netretiranim i izotipski kontrolnim tretiranim ćelijama tokom celog trajanja od 48 sati. Kao internalizacija receptora posredovanog antitelom, što bi se očekivalo da će se dogoditi unutar ovog vremenskog okvira, ovi podaci snažno sugerišu da Ab535 ne pokreće internalizaciju mCSF-1R.

[0270] U cilju da se obezbedi dalji dokaz da Ab535 ne potencira internalizaciju receptora, primarni mišji CD11b<+>monociti-makrofagi su korišćeni u testu internalizacije. Ovi rezultati su takođe pokazali da tretman mišjih monocitamakrofaga sa Ab535 ne uzrokuje internalizaciju ćelijske površine izražene mCSF-1R sve do 24 sata posle tretmana.

viii) Activacija CSF1-R

[0271] CSF-1 se veže na CSF-1R, uzrokujući formiranje receptorskih dimera, koji aktiviraju brzu receptorsku fosforilaciju dovodeći domene kinaze zajedno u neposrednu blizinu. Ovo kasnije dovodi do internalizacije receptora i aktivacije nekoliko dobro opisanih puteva transdukcije signala, uključujući put Ras-MAPK. Moguće je da anti-CSF-1R antitelo može izazvati grupisanje receptora i potstaknuti nizvodnu kaskadnu signalizaciju. Ovo može biti nepoželjno svojstvo za antitelo koje bi trebalo da inhibira signalizaciju receptora, tako da je agonizam receptora pomoću Ab969 testiran korišćenjem dva nezavisna in vitro formata testa.

[0272] U prvom formatu testa, antitela su inkubirana sa ćelijama transfektovanim sa humanim CSF-1R pune dužine i fosforilacijom receptora i nizvodnom transdukcijom signala molekula praćenih Vestern blot tehnikom.

[0273] Ćelijska linija THP-1 predstavlja polaznu tačku za praćenje statusa aktivacije CSF-1R. Međutim, nivo ekspresije CSF-1R u ovoj ćelijskoj liniji je relativno nizak, što otežava izvođenje biohemijske analize. Zbog toga je osmišljen eksperimentalni sistem tako da nivo fosforilacije CSF-1R može biti čvrsto otkriven. Fosforilacija CSF-1R može biti detektovana u dva tirozinska ostatka, Y723 i Y809. Dodatno, fosforilacija p44/42 MAPK (Erk1/2) na T202 i Y204 je merena kao nezavisno očitavanje aktivnosti CSF-1R. Stimulacija sa CSF-1 je uključena kao pozitivna kontrola u svim eksperimentima.

[0274] Ćelije HEK293F su transfektovane sa plazmidnim vektorom koji eksprimira CSF-1R pune dužne. Nakon 24-časovne inkubacije u uslovima bez seruma, ćelije su stimulisane sa 100 µg/ml do 0.001 µg/ml titracije Ab969g0 tokom 5 minuta. Ćelije su takođe tretirane sa 500 ng/ml rekombinantnog CSF-1 da se obezbedi pozitivna kontrola. Netretirane ćelije su uključene kao negativna kontrola. Proteinski lizati iz tretiranih i netretiranih ćelija su bili odvojeni pomoću SDS-poliakrilamidne elektroforeze i blotirani u nitrocelulozu. Vestern imunoblotovanje je izvedeno korišćenjem antitela na fosfo-Y723 CSF-1R (Cell Signaling Technology # 3151), fosfo-Y809 (Cell Signaling Technology # 3154), ukupnog CSF-1R (Cell Signaling Technology # 3152) i fosfo-ERK1/2 ( p44/42 MAPK) (Cell Signaling Technology-Tehnologija signaliziranja ćelija # 5301).

[0275] Nestimulisane HEK293F ćelije transfektovane sa CSF-1R- su pokazale niski bazalni nivo fosforilacije CSF-1R. Stimulacija ćelija sa CSF-1 je rezultirala u

nivou fosforilacije CSF-1R na ostacima Y723 i Y809 lako opaženim pomoću Vestern blot analize (Slika 11). Takođe je postojala jasna stimulacija ERK1/2 fosforilacije nakon tretmana CSF-1. Tretman transfektovanih HEK293F ćelija sa antitelom Ab969g0 nije stimulisao fosforilaciju CSF-1R ili potencirao aktivaciju ERK1/2.

[0276] U drugom testu, antitelo Ab969 (monomerno i unakrsno-vezano) je inkubirano sa primarnim humanim monocitima i sekrecija MCP-1 je korišćena kao marker aktivacije CSF-1R. CSF-1 tretman humanih monocita dovodi do oslobađanja monocitnog hemoatraktantnog proteina-1 (MCP-1). Ako anti-CSF-1R antitela imaju sposobnost da aktivišu CSF-1R receptor na monocitima, očekuje se da će doći do oslobađanja MCP-1.

[0277] Biohemijski testovi opisani prethodno su koristili samo monomerno anti-CSF-1R antitelo. Međutim, moguće je da unakrsno-vezani IgG1 ima povećani kapacitet da dovede molekule CSF-1R u neposrednu blizinu i aktivira fosforilaciju tirozina i nizvodno signaliziranje. Da bi se ovo procenilo, takođe je izveden MCP-1 test korišćenjem Ab969.g0 koji je bio unakrsno vezan sa anti-humanim-Fc antitelom.

[0278] Humani monociti su pripremljeni iz humane pune krvi kao što sledi: 60-100 ml humane pune krvi je sakupljeno u BD Vakutejner 10 ml litijum heparina 171 IU epruvete. Krv je podeljena u 3-4 tzv." Leucosep Ficoll" epruvete (Greiner Bio-One) i dopunjena sa PBS-om. Epruvete su centrifugirane na 1000 g, 20°C tokom 10 minuta bez kočnice, i sakupljen je PBMC sloj. Ćelije su peletirane, i monociti su zatim izolovani korišćenjem pozitivne selekcije humanih CD14 zrnaca (Miltenyi Biotec 130-050-201) prema protokolu proizvođača. Antitelo Ab969.g0 je unakrsno povezano dodavanjem kozjeg anti-humanog IgG Fc antitela (R&D Systems G-102-C) u odnosu 2:1 Ab969.g0:Fc. Monociti su bili zasejani na 20.000 ćelija po jažici u medijumu u prisustvu doze titracije antitela Ab969.g0 ili unakrsno vezanog Ab969.g0 (serije razblaženja pola loga sadržavajući 16 koncentracija, maksimalno 10 µg/ml). Kontrolne jažice nisu sadržavale antitela, u prisustvu i odsustvu 100 ng/ml CSF-1, i u prisustvu i odsustvu antihumanog-Fc antitela (u istoj koncentraciji kao što je prisutan u najvišoj koncentraciji antitela Ab969.g0 (5 µg/ml)). Ćelije su inkubirane tokom 24 sata, ploče su centrifugirane do peletiranih ćeliija, a supernatant je sakupljen. Tajni MCP-1 je meren pomoću MSD (K151AYB-2) prema protokolu proizvođača.

[0279] Rezultat eksperimenta je prikazan na Slici 12. Nije utvrđeno povećanje nivoa MCP-1 za bilo koji tretman Ab969.g0, bilo u monomernom ili unakrsno vezanom formatu; koncentracija MCP-1 u medijumu tretiranih ćelija je identična netretiranim ćelijama. Kao što se očekivalo, ćelije tretirane sa CSF-1 su dale značajno i reproducibilno povećanje u nivoima MCP-1.

Primer 3 - Humanizacija antitela 969 i selekcija humaniziovnog transplantata-grafta

[0280] Četiri anti-CSF-1R antitela su izabrana za humanizaciju na osnovu njihovog afiniteta i svojstava izmerenih u Primeru 2.

i) Generisanje humaniziovanih graftova

[0281] Antitela 969 i 970 su humanizovana graftovanjem CDR-a iz V-regija antitela pacova u okvirne V-regije antitela humane zametne linije.

[0282] CDR-a graftovani od donora na akceptorsku sekvencu su definisani od strane Kabata (Kabat et al., 1987), sa izuzetkom CDR-H1 gde je korišćena kombinovana tzv. "Chothia/Kabat" definicija (videti Adair et al., 1991 Humanised antibodies. WO91/09967).

[0283] Humana V-regija VK1 2-1-(1)012 plus JK4 J-regija (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) je izabrana kao akceptor za CDRe lakog lanca. Humana V-regija VH23-12-70 plus JH3 J-regija (V BASE, http://vbase.mrccpe. cam.ac.uk/) je izabrana kao akceptor za CDR-a teškog lanca.

[0284] Brojni okvirni ostaci iz V-regija pacova su zadržani u humanizovanim sekvencama, kao što je prikazano u Tabeli 1.

[0285] Geni koji kodiraju inicijalne humanizovane sekvence V-regije lakog i teškog lanca, nazvani gL1 i gH1, respektivno, su dizajnirani i konstruisani automatizovanim pristupom sinteze. Dalje varijante V-regija lakog i teškog lanca su stvorene modifikovanjem gL1 i gH1 gena putem oligonukleotid-usmerene mutageneze.

[0286] Geni VK (gL1 do gL9) su klonirani u ekspresioni vektor pKH10.1 humanog lakog lanca, koji sadrži DNK koja kodira konstantnu regiju humanog Kappa lanca (Km3 alotip). Geni VH (gH1 i gH2) su klonirani u ekspresioni vektor pVhy4P FL humanog gama-4 teškog lanca, koji sadrži DNK koja kodira konstantnu regiju humanog gama-4 teškog lanca sa stabilizirajućom mutacijom zgloba S241P (Angal et al., 1993, Mol Immunol.30:105-8). Različite kombinacije plazmida koji kodiraju varijantu lakih i teških lanaca su ko-transfektovane u HEK293F, što rezultira ekspresijom humanizovanih, rekombinantnih 969 antitela.

[0287] Ostala tri anti-CSF-1R antitela su takođe humanizovana obezbeđivanjem konzervativnog grafta koji sadrži brojne ostatke donora u teškim i lakim lancima predviđenim da budu važni i potpuno humanizovani graft koji ne sadrži ostatke donora.

ii) Afinitet humanizovanih antitela

[0288] Svaki humanizovani graft je procenjen za (i) afinitet vezivanja na humani CSF-1R pomoću tzv. "BIAcore" i (ii) temperature topljenja (Tm) izmerenom Termofluor analizom , oba u odnosu na roditeljsko himerno antitelo. Veruje se da temperatura topljenja obezbeđuje ranu indikaciju stabilnosti molekula antitela, pri čemu nestabilna antitela obično pokazuju Tm manju od 75.0°C.

[0289] Graftovi koji predstavljaju faze humanizacije Ab969 su prikazani u Tabeli 5. Tabela 5 takođe pokazuje himerno antitelo Ab696 (969cHcL). Konzervativni graft (969gH1gL1) je pokazao konstantu afiniteta (KD) od 2.4 pM, tako da nije bilo vidljivog gubitka afiniteta u poređenju sa himernim antitelima pacova (969cHcL). Tm konzervativnog grafta 969 gH1gL1 je bila 78.8°C i prema tome iznad granične vrednosti od 75.0°C. Supstitucija ostatka donora A78 za V78 u teškom lancu kako bi se proizveo 969 gH2gL1 nije smanjila afinitet antitela (KD= 2.3 pM). Nakon postepene supstitucije K38, Y71 i F87 ostataka donora, na Q38, F71 i Y87 respektivno, nisu primećene promene u afinitetu. Konačni humanizovani graft 969gH2gL8 koji ne sadrži ostatke donora je pokazao afinitet sličan roditeljskom himernom antitelu (4.1 pM).

Tabela 5

[0290] Ab969 poseduje potencijalni DG izomerizacioni motiv na spoju CDR-L2 i okvira. Ovaj ostatak asparaginske kiseline na mestu DG u graftovima 969gH2gL7 i 969gH2gL8 je mutiran u serin da se dobije inertna SG sekvenca. Afinitet prema CSF-1R je izmeren pomoću tzv. "BIAcore" i nije detektovan nikakav vidljivi gubitak afiniteta (Tabela 6). Pored toga, konačni 969H2gL7 (SG) i 969gH2gL8 (SG) graftovi su zadržali visoku Tm od 80.5°C i 79.9°C respektivno.

Tabela 6

[0291] Humanizacija Ab969 i jednog drugog anti-CSF-1R antitela Ab970 je generisala potpuno humanizovana antitela (nema prisutnih ostataka donora pacova) sa afinitetom (KD) ekvivalentnim roditeljskom himernom antitelu i Tm koja je dala početno predviđanje stabilnosti molekula. Potpuno humanizovana verzija Ab969 (969gH2gL8 SG)) je preimenovana u Ab969.g5. Odavde će himerna verzija Ab969 biti označena kao Ab969.g0.

[0292] Afinitet prečišćenih himernih i humanizovanih graftova Ab969 antitela prema rekombinantnom CSF-1R je ponovo meren korišćenjem tzv. "BIAcore" analize. Prethodni tzv. "BIAcore" eksperimenti izvedeni tokom procesa humanizacije su sprovedeni koristeći supernatante sirove ćelije radije od prečišćenog antitela. Otkriveno je blago smanjenje afiniteta, pri čemu su vrednosti KDpovećane od približno 4 pM do 5 pM.

Tabela 7

iii) Inhibicija preživljavanja monocita posredstvom CSF-1 pomoću Ab969.g0 i Ab969.g5

[0293] CSF-1 je potreban za aktivaciju i preživljavanje monocita u kulturi; ako se CSF-1 ukloni, monociti se brzo podvrgavaju apoptozi. Izrađen je test koji je koristio MCP-1 (monocitni hemotaktički protein-1; takođe poznat kao CCL2, hemokin C-C motiv ligand 2) kao očitavanje. Posle stimulacije CSF-1, humani monociti izlučuju MCP-1, koji može biti detektovan u ćelijskim supernatantima pomoću ELIZA testa, obično 24 sata nakon stimulacije. Inhibicija CSF-1R signaliziranja pomoću antitela koja blokiraju vezivanje CSF-1 uzrokuje smanjenje sekrecije MCP-1.

[0294] Humane PBMC-e su pripremljene iz sveže humane pune krvi na tzv. "Ficoll" gradijentu i CD14<+>monociti su prečišćeni pozitivnom selekcijom. Ukupno je inkubirano 2x10<4>monocita sa serijama polu-log razblaženja od 10 µg/ml na 0.35 pg/ml antitela u prisustvu 100 ng/ml humanog CSF-1 tokom 24 sata. Kontrole koje obuhvataju "bez antitela, bez CSF-1" i "bez antitela, sa CSF-1" su uključene da bi se obezbedile minimalne i maksimalne vrednosti oslobađanja MCP-1. Nakon 24 časova inkubacije, ćelije su peletirane centrifugiranjem i supernatant je sakupljen. Koncentracija MCP-1 je izmerena upotrebom Humanog CCL2/MCP-1 DuoSet ELIZA (R&D Sistems DY279) prateći uputstva proizvođača.

[0295] Od sada se test naziva " test inhibicije MCP-1".

[0296] Test inhibicije MCP-1 je upotrebljen da se uporedi aktivnost humanizovanog 969.g5 sa himernim Ab969.g0. Pet nezavisnih testova su izvedeni korišćenjem četiri različita donora monocita. U svim testovima, humanizovani graft Ab969.g5 pokazuje neočekivano značajno nižu aktivnost u poređenju sa roditeljskim himernim antitelom 969.g0. Pojedinačni reprezentativni eksperiment je prikazan je na Slici 13. Srednja vrednost IC50za 969.g0 u testu monocita je bila 24.6 ng/ml, u poređenju sa 333.0 ng/ml za 969.g5. Ovo ukazuje na 13.5-struko smanjenje snage antitela kada su oba antitela upoređena korišćenjem ovog formata testa.

[0297] Serije eksperimenata su izvedene korišćenjem Ab969 da bi se otkrilo zašto humanizovano antitelo pokazuje smanjenu aktivnost u testu inhibicije MCP-1. Podaci ukazuju na to da je gubitak aktivnosti Ab969.g5 uočen u testu inhibicije MCP-1 bio zbog redosleda u kojem su antitelo i ligand dodati na ciljne ćelije. Aktivnost i Ab969.g0 i Ab969.g5 je smanjena kada je primenjen kompetitivni format testa, ali još važnije, detektovana je veća razlika u njihovoj aktivnosti blokiranja. Da analiziramo da li bi niže "po stopi" humanizovano Ab969 moglo biti odgovorno za smanjenje snage izvršena je tzv. "BIAcore" analiza. Ovi podaci su identifikovali da, dok su KDod Ab969.g0 i Ab969.g5 bili slični, Kaje bio niži za Ab969.g5, na 1.57x10<6>M<-1>s<-1>u poređenju sa 2.16x10<6>M<-1>s<-1>za 969.g0 (videti Tabelu 5). U kompetitivnom testu, gde se CSF-1 i anti-CSF-1R antitelo takmiče za vezivanje na isti receptor, sporija stopa antitela može dovesti do smanjene aktivnosti blokiranja ako je stopa za ligand takođe visoka i ligand je prisutan u visokoj koncentraciji. Poznato je da humani CSF-1 ima naročito visoku stopu na 2.19x10<6>M<-1>s<-1>, slično antitelima, i test je izveden sa visokom koncentracijom CSF-1 (250 ng/ml).

[0298] Da bi se obezbedili dodatni dokazi da je smanjenje aktivnosti blokiranja od 969.g5 nastalo usled urođenog svojstva antitela, razvijen je ELIZA test koji meri vezivanje CSF-1 na CSF-1R. Ovaj metod je odavde nazvan "ELIZA test blokiranja liganda". Ovaj test je izveden korišćenjem kompetitivnog vezivanja, gde su CSF-1 i antitelo prethodno pomešani pre aplikacije na ploču-vezani CSF-1R. Test je takođe izveden da bi se procenio uticaj koncentracije CSF-1 na aktivnost antitela.

[0299] Kada je IC50od 969.g0 i 969.g5 izmeren u ELIZA testu za blokiranje liganda korišćenjem CSF-1 koncentracije od 1 ng/ml, čini se da oba antitela imaju sličnu aktivnost sa IC50od 12.83 ng/ml naspram 19.65 ng/ml respektivno. Kada je u testu korišćena koncentracija od 10 ng/ml CSF-1, IC50oba Ab969.g0 i Ab969.g5 je povećana, ali još važnije, razlika između njih se povećala dalje do 79.29 ng/ml u odnosu na 268.10 ng/ml, respektivno. Trend je nastavljen u testu korišćenjem 100 ng/ml CSF-1, gde su Ab969.g0 i Ab969.g5 dali IC50vrednosti od 828.70 ng/ml, i 3947.00ng/ml respektivno. Kompetitivni test pokazuje da je Ab969.g5 manje aktivan od Ab969.g0 pri blokiranju vezivanja CSF-1 na CSF-1R. Ovo smanjenje u snazi postaje sve izraženije sa povećanjem koncentracije CSF-1.

iv) Identifikacija humanizovanih graftova Ab 969 sa aktivnošću ekvivalentnom himernom Ab 969 u MCP-1 testu inhibicije

[0300] Panel Ab969 humanizovanih graftova je pripremljen prolaznom ekspresijom tako da in vitro aktivnost može biti upoređena (Tabela 8). Odgovarajuće himerno antitelo (Ab969.g0) i potpuno humanizovani graft (Ab969.g5) su takođe uključeni u prolaznu ekspresiju tako da direkno poređenje karakteristika antitela može biti napravljeno unutar iste serije.

Tabela 8:

[0301] In vitro aktivnost svakog antitela je testirana u testu inhibicije MCP-1. Izabran je oblik testa koji koristi titraciju CSF-1 sa jednom koncentracijom antitela, pošto format omogućuje brzi skrining velikog broja ploča antitela i ističe bilo koju diferencijalno blokirajuću aktivnost CSF-1R. U ovom testu, detektovano je dozno zavisno oslobađanje MCP-1 iz primarnih humanih monocita i relativna sposobnost svakog antitela da blokira aktivnost CSF-1R merena koncentracijom CSF-1 gde je oslobođen MCP-1. Monociti su zasejani u 20.000 ćelija po jažici u medijumu u prisustvui titracije rekombinantnog humanog CSF-1 (2-struka serija razblaženja koja sadrži 18 koncentracija, maksimalno 500 ng/ml). Dodata je pojedinačna doza od 1 µg/ml antitela. Ćelije su inkubirane tokom 24 sata i sakupljen je supernatant. Sekretovani MCP-1 je izmeren ELIZA testom. Test inhibicije MCP-1 je pokazao da antitela Ab969.g2 i Ab969.g7 zadržavaju visoku aktivnost blokiranja CSF-1R, pri čemu oba entiteta mogu potpuno inhibirati sekreciju MCP-1 kada je CSF-1 dodat monocitima u koncentraciji većoj od 100 ng/ml (Slika 14). U ovom testu, detektovan je jasan gubitak aktivnosti za Ab969.g5, koji je mogao inhibirati samo sekreciju MCP-1 sve do CSF-1 koncentracije od 10 ng/ml. Slično, antitelo Ab969.g9 je pokazalo smanjenu aktivnost blokiranja CSF-1R u poređenju sa Ab969.g2 i Ab969.g7.

[0302] IC50izabranih humanizovanih graftova Ab969 je izmerena u MCP-1 testu da bi se obezbedila detaljnija procena njihove relativne sposobnosti da inhibiraju CSF-1posredovanu aktivaciju monocita. Smatralo se da je važno proceniti aktivnost antitela korišćenjem nekoliko različitih donora bez udruživanja monocita iz mešovitih izvora.

Tabela 9 prikazuje IC50vrednosti antitela akumuliranih iz testova izvedenih na Ab969 korišćenjem 6 različitih donora.

[0303] Oba Ab969.g2 i Ab969.g7 humanizovani graftovi pokazuju relativnu IC50koja je uporediva sa himernim antitelom Ab969g0. U potpunom kontrastu, Ab969.g5, pokazuje mnogo manju snagu u testu (srednji himerni/graft IC50odnos od 19.6).

Tabela 9:

v) Afinitet humanizovanog panela antitela Ab696

[0304] Afinitet svakog grafta humanizovanog antitela Ab969 i roditeljskog himernog antitela je izmeren pomoću tzv. "BIAcore" (Tabela 10) gde su izvedena tri nezavisna eksperimenta i izračunate srednje vrednosti. Podaci pokazuju da afinitet (KD) ne izgleda da se menja tokom procesa humanizacije od himernog molekula (Ab969.g0) do "potpuno humanizovanog" antitela Ab969.g5. Međutim, antitelo "po stopi" se smanjuje kada se humanizacija nastavi izvan Ab969.g2 grafta; i Ab969.g4 i Ab969.g5 poseduju niže vrednosti Kanego prethodni graftovi. Pored toga, Kaza Ab969.g5 je niži od Ab969.g4, potencijalno ukazujući da mutacija mesta izomerizacije DG na SG još dalje smanjuje po-stopi antitelo.

Tabela 10

Zaključci:

[0305] Testiranje panela humanizovanih graftova Ab969 u nekoliko testova je pokazalo da tirozinski ostatak na poziciji 71 (npr. Y71) unutar lakog lanca poboljšava aktivnost antitela. Supstitucija Y71 za npr. fenilalanin dovodi do smanjenje stope antitela (smanjenog Ka) u odnosu na roditeljski himerni molekul. Ovo rezultira u smanjenoj sposobnosti antitela da blokira vezivanje CSF-1 na CSF-1R, otkriveno u testu koji prati aktivnost CSF-1R u primarnim humanim monocitima (MCP-1 test inhibicije).

Primer 4 - Molekularna stabilnost humanizovanog Ab696 panela

i) Termička stabilnost

[0306] Termička stabilnost (izmerena kao temperatura topljenja, Tm) je određena sa dve nezavisne metode; jedna metoda prati odvijanje pomoću vezivanja fluorescentne boje na izložene hidrofobne površine (Termofluor metoda), a druga kalorimetrijom (DSC), ortogonalnom tehnikom.

[0307] Tmizmerena sa Termofluorom za različite graftove antitela 969 (u PBS pH 7.4) je rezimirana u Tabeli 11.

Tabela 11

[0308] Sveukupno, Fab 'Tmkao što je izmereno pomoću Termofluora sugeriše da je većina 969 graftova termički stabilnija od kontrole IgG4.

ii) Efekat koncentracije uzorka na sklonost agregacije

[0309] Kao prediktor stabilnosti uzoraka tokom skladištenja, proučavan je efekat koncentracije antitela na stabilnost u PBS-u pH 7.4.

Eksperiment 1:

[0310] Antitela su koncentrovana do >10 mg/ml i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 5 dana. Odmah nakon koncentracije (To) 969.g7 je izgledalo mutno i 969.g8 je izgledalo blago opalescentno. Nasuprot tome, uzorak 969.g5 je procenjen da je jasan vizuelnom inspekcijom. Nakon 5 dana inkubacije na sobnoj temperaturi uzorak 965.g5 je ostao bistar, dok je agregacija 969.g7 i 969.g8 dalje napredovala, pri čemu je svaki pokazivao težak precipitat.

[0311] Iz ove studije je bilo moguće rangirati uzorke prema redosledu otpornosti na agregaciju u ovim uslovima kako sledi: 969.g5 > 969.g8 > 969g7.

Eksperiment 2:

[0312] Pre koncentracije, sva tri uzorka antitela su očišćena vizuelnim pregledom, uz izuzetak 969.g6 (4.68 mg/ml) koji je izgledao opalescentno. Nakon koncentracije do 16 mg/ml, zabeležena je precipitacija 969.g6. nakon 24 sata čuvanja na sobnoj temperaturi i 4°C. Međutim, oba 969.g1 i 969.g4 ostaju vidljivo jasni. Posle 5 dana dalje inkubacije, velike čestice su bile očigledne za uzorak 969.g1 na sobnoj temperaturi i na 4°C. Nije primećena agregacija za uzorak 969.g4 ni na sobnoj temperaturi ni na 4° C, kako je procenjeno vizuelnom inspekcijom.

[0313] Iz ove studije je bilo je moguće pokazati da 969.g6 ima neku nestabilnost agregacije kada se čuva na niskoj koncentraciji (4.68 mg/ml) u PBS- pH 7.4. Dalje, ova precipitacija je pogoršana daljom koncentracijom antitela.

Koncentrovani 969.g1 je pokazao sporiju brzinu agregacije, dok je koncentrovani 969.g4 ostao stabilan do 5 dana na obe temperature čuvanja. Redosled stabilnosti prema agregaciji je prema tome bio: 969.g4 > 969.g1 > 969.g6.

Eksperiment 3: Antitela 969.g2, 969.g5, 969.g7 i 969.g9

[0314] Analiza je izvedena na uzorcima odmah nakon koncentracije (To), posle inkubacije preko noći i 5 dana nakon koncentracije. Svi uzorci su bili bistri vizuelnom inspekcijom pre koncentracije i nije bilo dokaza o formiranju čestica. Odmah nakon koncentracije do 23.07 mg/ml, uzorak 969.g7 je pokazao precipitaciju kao što je prethodno uočeno u eksperimentu 1. Primećena je blaga opalescencija sa 969.g9, koja je postala vidljivija nakon 24 sata čuvanja na sobnoj temperaturi ili 4°C. Svih ostalih 969 graftova su izgledali bistro vizuelnom inspekcijom odmah nakon koncentracije.

[0315] Posle 21 dana inkubacije nije bilo dalje vidljive promene od one opažene posle inkubacije preko noći na sobnoj temperaturi; oba 969.g7 i 969.g9 graftovi su agregirani kao rezultat koncentrovanja uzoraka, dok za ostale uzorke nije bilo očigledne vidljive agregacije.

[0316] Sveukupno, uzorak 969.g2 je pokazao je najmanju tendenciju agregacije kao rezultat povećanja koncentracije. Ovo je takođe bilo u korelaciji sa najvišom Tm izmerenom pomoću Termofluora.

[0317] Zaključak: Tokom ekspresije i prečišćavanja humanizovanog Ab969 panela, postalo je očigledno da povećanje koncentracije antitela iznad 10 mg/ml dovodi do brzog taložena nekih humanizovanih graftova antitela. Specifično, Ab969.g1, Ab969.g6 i Ab969.g7 su formirali precipitat, dok Ab969.g2, Ab969.g4 i Ab969.g5 nisu. Ovi podaci pokazuju da supstitucija lizinskog ostatka na poziciji 38 (K38) unutar lakog lanca za glutamin poboljšava stabilnost antitela kada je koncentrovan iznad 10 mg/ml.

Primer 5 In vitro Analiza Ab969.g2

i) Sekvenca Ab969.g2

[0318] Ab969.g2 sadrži graft gL7 lakog lanca i graft gH2 teškog lanca. Poravnanja sekvenci V-regije antitela pacova (donora) sa sekvencama V-regije humane zametne linije (akceptor) su prikazana na Slikama 2A i 2B, zajedno sa konačnim humanizovanim sekvencama za graft gL7 lakog lanca i graft gH2 teškog lanca.

[0319] Ostaci okvira teškog lanca u graftu gH2 su svi iz gena humane zametne linije. Glutaminski ostatak u poziciji 1 humanog okvira teškog lanca je zamenjen sa glutaminskom kiselinom (E1) kako bi se poboljšala ekspresija i prečišćavanje homogenog produkta, npr. konverzijom Glutamina u piroGlutamat na N-terminusu antitela i fragmenata antitela.

[0320] Ostaci okvira lakog lanca u graftu gL7 su svi iz humanog gena zametne linije, sa iuzetkom ostatka 71 (Kabat numerisanje), gde je zadržan ostatak donora Tirozina. Zadržavanje ovog ostatka je obezbedilo poboljšanu snagu humanizovanog antitela kao što je prikazano u Primeru 3.

ii) Inhibicija IL-34 zavisne humane aktivacije monociita

[0321] Aktivnost Ab969.g2 u poređenju sa 969.g0 je procenjena u IL-34 zavisnom humanom testu monocita. Eksperiment je izveden korišćenjem dva odvojena donora monocita i srednje IC50za inhibiciju posredovanu IL-34 izračunatu stimulaciju monocita (Tabela 12). Nije bilo značajne razlike u IC50između Ab969.g2 i Ab969.g0.

[0322] Primarni humani monociti su bili zasejani na 20.000 ćelija po jažici u prisustvu 100 ng/ml rekombinantnog humanog IL-34 i titracijom doze anti-CSF-1R antitela (serije polu-log razblaženja koje sadrže 16 koncentracija, maksimalno 10 µg/ml). Ćelije su inkubirane tokom 24 sata i sakupljen je supernatant. Sekretirani MCP-1 je meren pomoću ELIZA testa (R&D sistemi DY279). Grafikon prikazuje procenat inhibicije produkcije MCP-1 u poređenju sa kontrolom samo za CSF-1.

Tabela 12

[0323] Postoje četiri ne-sinonimna jednonukleotidna polimorfizma (SNPi) locirana unutar ligand-vezujuće domene humanog CSF-1R gena koja su prijavljena u humanoj populaciji. Ovi SNP-i su V32G, A245S, H247P i V279M (Slika 1F).

Svaka varijanta SNP humanog CSF-1R je generisana i stabilno eksprimirana u ćeliskim linijama. Vezivanje Ab969.g2 na svaki SNP je potvrđeno protočnom citometrijom.

Primer 6 Analiza farmakodinamičkog markera kod cinomolgus majmunima

[0324] Izvedena je farmakokinetička/farmakodinamička (PK/PD) studija sa humanizovanim monoklonalnim anti-CSF-1R antitelom 969.g2 da bi se pokazala farmakološka aktivnost antitela u ne-humanom primatu (cinomolgus majmunu). Grupe od tri cinomolgus majmuna su dozirane intravenozno sa jednom dozom od 7 mg/kg (Grupa 1) ili 1.5 mg/kg (Grupa 2) 969.g2 antitela. Antitelo se dobro podnosilo bez štetnih kliničkih znakova. Uzorci seruma su uzeti u više vremenskih tačaka tokom 25-dnevnog istraživanja.

[0325] Koncentracija seruma od 969.g2 je izmerena sa ELIZA testom i izvedena je farmakokinetička analiza (Tabela 13). PK parametri su izračunati pomoću tzv. "WinNonlin softvera".

t1/2je poluvreme raspada antitela u serumu.

Cmaxje maksimalna koncentracija antitela u serumu.

AUC je površina ispod krive (integralna kriva koncentracija-vreme) i daje indikaciju ukupne izloženosti leku.

Klirens je zapremina plazme očišćena od leka po jedinici vremena.

Vol. Dist. je zapremina distribucije, prividna zapremina u kojoj je lek distribuiran.

[0326] Postojala je dobra korelacija između opaženih i predviđenih vrednosti (životinja 2 je bila izuzetak i smatrala se nepredvidivom). Cmaxje bila proporcionalna dozi; AUC je bila veća od proporcionalne doze, što ukazuje na sporiji klirens pri većoj dozi. Većina od 969.g2 je detektovana u serumu.

Tabela 13

[0327] Primarni put za klirens CSF-1 je kroz vezivanje na njegov srodni receptor, CSF-1R. Očekuje se da će blokada vezivanja CSF-1 na CSF-1R povećati serumsku koncentraciju CSF-1, ali sprečiti receptorski posredovan klirens; fenomen koji je opažen u mišjim modelima. Prema tome, povećanje koncentracije CSF-1 u serumu je farmakodinamički marker angažovanja i inhibicije CSF-1R.

[0328] Obe doze 969.g2 potstakle su brzu i značajnu akumulaciju serumskog CSF-1. Efekat je bio zavisan od doze, pri čemu je doza od 7 mg/kg dala maksimalnu koncentraciju CSF-1 približno 10 puta veću od doze od 1.5 mg/kg. Farmakokinetički/farmakodinamički odnos je primećen sa normalizacijom nivoa CSF-1 nakon uklanjanja antitela. Nivoi CSF-1 su se vratili na početnu vrednost do kraja ispitivanja za obe tretirane grupe. Rezultati su prikazani na Slikama 15a i 15b.

[0329] Slika 15a prikazuje koncentraciju CSF-1 u uzorcima seruma uzetim od cinomolgus majmuna koji su tretirani sa jednom intravenskom dozom od 7 mg/kg Ab969.g2. Koncentracija CSF-1 u serumu je izmerena u dva nezavisna testa. Grafikon prikazuje srednju koncentraciju CSF-1 za tri životinje u Grupi 1 (7 mg/kg) sa standardnom greškom (kvadrati). Takođe je prikazana srednja serumska koncentracija Ab969.g2 (krugovi).

[0330] Slika 15b prikazuje koncentraciju CSF-1 u uzorcima seruma uzetim od cinomolgus majmuna koji su tretirani sa jednom intravenskom dozom od 1.5 mg/kg Ab969.g2. Koncentracija CSF-1 u serumu je merena u dva nezavisna testa. Grafikon prikazuje srednju koncentraciju CSF-1 za tri životinje u Grupi 2 (1.5 mg/kg) sa standardnom greškom (kvadrati). Takođe je prikazana srednja serumska koncentracija Ab969.g2 (krugovi).

[0331] Postoje dve glavne populacije cirkulišućih humanih monocita i monocita cinomolgus majmuna; (i) CD14+ CD16- "klasični" monociti i (ii) CD14 CD16 "ne-klasični" ili "rezidentni" monociti. Mišji modeli su pokazali da su rezidentni makrofagi tkiva, uključujući TAM-ove, izvedeni iz ne-klasične populacije monocita. Pore toga, ne-klasični monociti su izvedeni iz dalje diferencijacije klasične populacije monocita. Cirkulišuće populacije monocita kod cinomolgus majmunima dozirane sa 969.g2 su praćene pomoću četverobojne protočne citometrije cele krvi. Protočna citometrija je izvedena upotrebom anti-cino-CD45-PerCP, anti-human-HLA-DR-APC, anti-human-CD14-FITC (My4 klon) i anti-human-CD16-PE (3G8 klon) antitela. Ulazi su podešeni primenom odgovarajuće kontrole izotipa za svako antitelo. Klasični monociti su definisani kao CD45<+>HLA-DR<+>CD14<+>CD16-. Ne-klasični monociti su definisani kao CD45<+>HLA-DR<+>CD14<+>CD16<+>.

[0332] Obe doze 969.g2 su pokrenule postepeno osiromašenje ne-klasičnih CD14<+>CD16<+>monocita tokom prve nedelje istraživanja. Skoro totalno osiromašenje ne-klasičnih monocita je uzrokovano dozom od 7 mg/kg. Čini se da je ne-klasična redukcija monocita sa dozom od 7 mg/kg i 1.5 mg/kg bila najviša na vremenskoj tački 4 dana, a brojevi se vraćaju u normalu sa 11. –tim danom. Rezultati su prikazani na slici 15c. Bar grafikoni pokazuju srednji broj cirkulišućih ne-klasičnih CD14<+>CD16<+>monocita u vremenskim tačkama tokom istraživanja (dani (D) 0, 1, 4, 18 i 25) sa standardnom greškom. Srednja koncentracija CSF-1 u serumu je takođe iscrtana sa standardnom greškom.

[0333] Ovaj primer je potvrdio da je (i) antitelo 969.g2 sposobno da vezuje CSF-1R i blokira vezivanje CSF-1 u cinomolgus majmunu, (ii) pokazao je farmakološku aktivnost antitela 969.g2 u modelu ne-humanih primata, (iii) pokazao je da antitelo 969.g2 selektivno iscrpljuje ne-klasičnu populaciju monocita cinomolgus majmuna in vivo -populaciju monocita za koju se veruje da su prekurzori makrofaga povezani sa tumorom, i (iv) da je serumska koncentracija CSF-1 pogodna kao biomarker za merenje aktivnosti 969.g2.

Primer 7: Inhibicija rasta MCF-7 ksenografta karcinoma dojke

[0334] Antitelo 969.g2 nije sposobno za vezivanje na mišji CSF-1R. Prema tome, in vivo studije na mišu su izvedene upotrebom anti-mišjeg CSF-1R antitela Ab535 da se pokaže korisnost Ab969.g2 za lečenje kancera i fibroze. Pokazano je da Ab535 ima uporediva svojstva i aktivnost sa Ab969.g2 u brojnim in vitro eksperimentima.

[0335] Pokazano je da Ab535 inhibira preživljavanje monocita posredstvom CSF-1 u Primeru 2 iii), ima uporediv afinitet u Primeru 2 iv) i ne pokreće internalizaciju CSF-1R u Primeru 2 vii).

[0336] Kao in vivo istraživanje na Ab535 izveden je in vivo MCF-7 model ksenografta karcinoma dojke kao što sledi: Studija je merila terapijsku efikasnost antitela Ab535, davanog subkutano (s.c.), u odnosu na kontrolno antitelo, pozitivnu kontrolu i kontrolu nosača u imunodeficijentnim golim miševima koji nose subkutane transplantate ksenografta MCF-7 humanog kancera dojke. Inhibicija rasta tumora je korišćena kao terapijski parametar. Humani kancer dojke MCF-7 je korišćen kao model supkutane ksenotransplantacije u imunodeficijentnim ženkama NMRI: nu/nu miševa. Ćelijska linija MCF-7 je dobijena iz banke tumora Nacionalnog instituta za kancer (SAD). Za eksperimentalnu upotrebu, ćelije su kultivisane in vitro u RPMI 1640 medijumu 10% FCS. Ćelije su uzete iz subkonfluentnih kultura i potkožno inokulirane u miševe. Nakon opipljive veličine tumora (4-10 mm) započelo je lečenje. Testna jedinjenja i kontrola nosača su dati s.c. tri puta nedeljno. Pozitivna kontrola je primenjivana intravenski jednom dnevno na 24, 33 i 40 dana. Zapremine injekcije su individualno prilagođene telesnoj težini u trenutku ubrizgavanja. Prečnici tumora su mereni tri puta nedeljno sa nonijusom. Zapremine tumora su izračunate prema V = (dužina x (širina) 2)/2. Za izračunavanje relativne zapremine tumora (RTV), zapremine na svaki dan merenja su se odnosile na dan prvog tretmana. Na svaki dan merenja su izračunate srednje i srednje zapremine tumora po grupi i takođe srednje tretirane za kontrolu (T/C) vrednosti u procentima.

[0337] Rezultati su prikazani na Slici 16. Ab535 je pokazao antitumorski efekat zavisan od doze. Obe doze kontrolnog mišjeg IgG antitela nisu izazvale inhibiciju rasta tumora. Relativne zapremine tumora su bile uporedive sa kontrolom nosača i pozitivna kontrola je izazvala inhibiciju rasta tumora.

[0338] Zaključak: testirano antitelo Ab535 je izazvalo statički značajan antitumorski efekat kod ksenografta MCF-7 humanog kancera dojke pri najvećoj dozi (30 mg/kg/dan).

Primer 8: Inhibicija rasta PC-3 ortotopskog kancera prostate

[0339] Antitumorska i antimetastatska efikasnost antitela Ab535 je takođe testirana pomoću ortotopskog modela kancera prostate PC-3 in vivo. Linija ćelija PC-3 je genetski izmenjena da bi se kontinuirano eksprimirala luciferaza koja dozvoljava in vivo analizu bioluminiscencije, što omogućava praćenje rasta tumora in vivo i izvođenje ex vivo analize metastaze u odabranim organima.

[0340] Istraživanje se sastojalo od 6 eksperimentalnih grupa, od kojih je svaka sadržavala ili 11 (Grupa 5) ili 12 (sve ostale Grupe) muške NMRI golih miševa nakon randomizacije (nasumičnog biranja). Na dan 0, PC-3 ćelije su ortotopski implantirane u prostatu svih učestvujućih muških NMRI golih miševa. Trećeg dana, početak rasta tumora je potvrđen in vivo bioluminiscentnim slikanjem. Osmog dana, izvedeno je drugo in vivo bioluminiscentno slikanje i životinje koje nose tumor su nasumično podeljene u šest grupa prema rezultatima snimanja, tako da je srednji intenzitet bioluminiscencije i prema tome veličina tumora slična u svakoj Grupi. Sedećeg dana (dan 9) započela je terapija. Životinje iz grupe 2 i 3 su primile 30 i 10 mg/kg kontrolnog antitela, respektivno, 3x nedeljno s.c. do 42 dana. Životinje tretiranih grupa 4 i 5 su primile su 30 i 10 mg/kg antitela Ab535, respektivno, 3x nedeljno s.c. do 42 dana. Životinje iz Grupe 1 su predstavljale kontrolni nosač i primiljeni nosač (PBS) 3x nedeljno s.c. do 42 dana. Životinje iz Grupe 6 su predstavljale Pozitivnu kontrolu i primile 360 mg/kg kontrolne i.v. jednom nedeljno tokom četiri nedelje (u danima 10, 17, 24 i 31). Za vreme toka istrživanja , rast ortotopski implantiranih PC-3 tumora je praćen in vivo na dane 3, 8 (randomizacija-nasumično), 15, 22, 29, 36 i 43 korišćenjem bioluminiscentnog slikanja.

[0341] Na kraju istraživanja izvedena je nekropsija-utvrđivanje uzroka smrti. Određena je težina i zapremina primarnog tumora. Izabrani organi (jetra, slezena i pluća) su sakupljeni, deo od svakog fiksiran u formalinu i ostatak analiziran s obzirom na uzorak metastaze putem bioluminiscencentnog snimanja korišćenjem in vitro testa luciferaze. Dodatno, femur iz jedne noge i isti deo lumbalnog dela kičme je sakupljen za analiziranje uzorka metastaze u kostima korišćenjem in vitro testa luciferaze.

[0342] In vivo signal bioluminiscencije je sastavljen od primarnog tumora i metastaza (snimanje celog tela). Na osnovu ovih podataka može biti izračunata kriva rasta tumora za sve grupe (Slika 17). Razvoj tumora je bio homogen unutar svih ispitivanih grupa do nasumučnog biranja i početka terapije. U nastavku, kontrolna grupa nosača 1 kao i dve kontrolne grupe antitela RTE11 grupe 2 i 3 su pokazale regularan rast tumora. Za pozitivnu kontrolu (Grupa 6) može se primetiti vrlo značajno smanjenje rasta tumora izmereno in vivo na 43.dan. Antitelo Ab535, primenjeno u koncentraciji od 30 ili 10 mg/kg, respektivno (grupe 4 i 5), je dovelo je do značajnog smanjenja rasta tumora kada je praćeno korišćenjem in vivo bioluminiscentnog slikanja.

[0343] Zapremine primarnog tumora i vlažne težine su određene za vreme nekropsije 44. dana. Pozitivna kontrola (grupa 6) je dovela do vrlo značajnog smanjenja i zapremine i težine primarnog tumora. Antitelo Ab535 je primenjeno na 30 mg/kg (Grupa 4), pa se može primetiti značajno smanjenje i zapremine i težine primarnog tumora. Kada je Ab535 primenjen u koncentraciji od 10 mg/kg (Grupa 5), smanjenje zapremine tumora je bilo primetno, ali manje nego što je prikazano u Grupi 4. Nije bilo značajne antitumorske efikasnosti u slučaju kontrolnog antitela.

[0344] Koristeći tehniku bioluminiscentnog slikanja, aktivnosti luciferaze primarnog tumora su izmerene nakon nekropsije. Dobijeni rezultati su poređeni sa rezultatima nalaza nekropsije i krive rasta in vivo. Pozitivna kontrola (Grupa 6) dovela je do vrlo značajnog smanjenja aktivnosti luciferaze primarnog tumora. Antitelo Ab535, primenjeno na 30 mg/kg (Grupa 4), je dovelo do značajnog smanjenja aktivnosti luciferaze primarnog tumora, dok je smanjenje bilo manje, kada je Ab535 primenjeno na 10 mg/kg (Grupa 5). Nije pronađeno značajno smanjenje aktivnosti luciferaze za kontrolno antitelo.

[0345] Nekoliko dodatnih organa (jetra, slezena, pluća, butna kost –femur i deo lumbalnog dela kičme) su analizirani korišćenjem ex vivo bioluminiscentne tehnike snimanja. U slučaju pozitivne kontrole, značajno smanjenje aktivnosti luciferaze moglo se pokazati za femur i lumbalni deo kičme, dok je smanjenje signala bilo samo ispod značaja u slučaju jetre i slezene. U slučaju antitela Ab535, primenjenog na 30 mg/kg (Grupa 4), smanjenje aktivnosti luciferaze bilo je značajno za jetru i primetno za sve druge organe. Kontrolno antitelo (Grupe 2 i 3) nije dovelo do smanjenja aktivnosti luciferaze u svim testiranim organima.

[0346] U zaključku, značajna antitumorska efikasnost se može pokazati za antitelo Ab535 u ovom tumorskom modelu, kombinovana sa primetnom antimetastatskom efikasnošću.

Primer 9: Efekat anti-CSF-1R antitela indukovanog Bleomicinom u in vivo modelu plućne fibroze

[0347] Bleomicin je antibiotik koji je prvo izolovan iz tzv. "Streptomyces verticillatus" i koristi se kao hemoterapeutik za različite vrste kancera. Model bleomicina fibroze pluća je dobro uspostavljen model i korišćen je u suštini kao što je opisano u Madtes, DK et al, 1999, Am J Respir Cell Mol Biol, 20, 924-34. Detaljan protokol se može se naći u sledećoj referenci Morschl, E., Molina, J. G., Volmer, J., Mohsenin, A., Pero, R. S., Hong, J. S., Kheradmand, F., Lee, J. J. and Blackburn, M. R. (2008), A3 signaliziranje adenozin receptora utiče na upalu pluća i fibrozu. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.39: 697-705.

[0348] Svi korišćeni miševi su bili divlji tip C57Blk6 ženki miševa (20 g) kupljeni od Harlan Labs. Upotrebljeno je intra-trahealno (IT) smanjivanje ubrizgavanja gde su miševi anestezirani sa avertinom i izvedena je traheostomija da bi se uvelo doziranje od 3.5 jedinične doze bleomicina u 50 ml fiziološkog rastvora ili 50 µl samog fiziološkog rastvora kao kontrola. Tretman na ovaj način dovodi do inflamatorne faze koja je maksimalna 7. dan nakon izlaganja bleomicinu i fibrozne faze koja je maksimalna 21. dana nakon izlaganja. Ispitivan je efekat antitela Ab535 gde je antitelo dozirano samo u fibroznoj fazi modela i primenjivano je subkutano na 30 mg/kg, tri puta tnedeljno od 9-21 dan. Životinje su žrtvovane 21. dana, i očitavanja su uključivala histopatološku analizu pluća, BAL (bronhoalveolarno ispiranje) celularnost tečnosti i merenje rastvorljivog kolagena u BAL tečnosti. Histolopatološka analiza je sprovedena da bi se utvrdilo oštećenje pluća korišćenjem modifikovanog Ashcroftovog sistema bodovanja da bi se odredila ozbiljnost fibroze pluća (Hubner RH et al, 2008, Biotechniques 44: 507-17). Isečena pluća su naduvana sa 10% formalinom do 25 cm pritiska i obrađena kroz serije alkohola i ksilena, ugrađenih u parafin i sekcije tkiva deparafinisane pre obrade i bojenja sa Masonovim trihromom.

[0349] Količina rastvorljivog kolagena u BAL tečnosti je procenjena korišćenjem komercijalno dostupnog seta tzv. "Sircol testa" prema uputstvima proizvođača.

[0350] Efekat na populaciju makrofaga u BAL tečnosti je određen korišćenjem pripravaka citospina. Alikvoti BAL ćelija su okrenuti na mikroskopskim slajdovima, obojeni sa tzv. "Diff-Quick" i makrofagi su brojeni.

[0351] Nađeno je da terapijski tretman sa anti-CSF-1R antitelom, Ab535, sa doziranjem započetim 9. dana, rezultirao značajno smanjenom fibrozom pluća indukovan bleomicinom. I ozbiljnost i obim fibroze bili su značajno smanjeni. Tretirani miševi imali su smanjenu produkciju kolagena, poboljšanu fibroznu patologiju i poboljšanu zaštitu plućne barijere.

[0352] Slika 18a pokazuje da tretman bleomicinom indukovane fibroze pluća sa Ab535 smanjuje koncentraciju BALF kolagena u poređenju sa tretmanom sa kontrolom izotipa.

[0353] Slika 18b pokazuje da tretman bleomicinom indukovane fibroze pluća sa Ab535 smanjuje Ashcroftov rezultat uzoraka u poređenju sa tretmanom sa kontrolom izotipa, što pokazuje da su miševi tretirani sa Ab535 imali poboljšanu fibroznu patologiju.

[0354] Slika 18c pokazuje da tretman bleomicinom indukovane fibroze pluća sa Ab535 smanjuje koncentraciju albumina u serumu u poređenju sa tretmanom sa kontrolom izotipa, što pokazuje da je poboljšana vaskularna permeabilnost miševa tretiranih sa Ab535.

Tretman miševa sa indukovanom fibrozom pluća sa Ab535

[0355] Slika 19 prikazuje reprezentativne slike histopatološke analize pluća iz kontrole fiziološkog rastvora, kontrole bleomicina plus izotip i životinja tretiranih sa bleomicinom plus Ab535. Životinje tretirane sa Ab535 imale su značajno smanjenu fibrozu pluća u poređenju sa kontrolom izotipa, životinja tretiranih bleomicinom.

Primer 10. Efekat anti-CSF-1R antitela na mišji model plućne fibroze sa deficijentnom adenozin deaminazom

[0356] Adenozin je snažan signalnalizirajući nukleozid, čiji se nivoi povećavaju kada ćelije trpe stres ili su oštećene, i nastaju široki rasponi odgovora kada adenozin -angažuje svoje specifične G protein spregnute receptore. Adenozinska deaminaza (ADA) je enzim purinski katabolizam koji pretvara adenozin u inozin. Generisani su ADA nokaut miševi za koje se pokazalo da imaju povišene nivoe adenozina u serumu, kao i u tkivima kao što su bubreg, jetra i pluća. (Blackburn, MR et al, 1998, J Biol Chem, 273(9): 5093-5100). Ovi miševi pokazuju svojstva hronične bolesti pluća kao što je alveolarno oštećenje, inflamacija disajnih puteva i prekomerna produkcija sluzi koja je povezana sa povišenim nivoima adenozina u plućima (Blackburn MR et al, 2000, J Exp Med, 192: 159-70). Efekti su takvi da miševi umiru u staroasti od tri nedelje zbog respiratornog poremećaja. Primena egzogene ADA korišćenjem niske doze, režim smanjuje nivoe adenozina i produžuje životni vek ovih miševa omogućujući razvoj modela plućne fibroze (Chunn JL et al, 2005, J Immunol 175: 1937-46, Pedrosa M et al, 2011, PLoS One, 6(7): e22667). U ovom modelu, hronično povećanje nivoa adenozina je povezano sa povećanjem pro-fibroznih medijatora uključujući TGFh-1 u plućima, povećanim taloženjem kolagena u plućnom tkivu i povećanom fibroznom patologijom pluća. Da bi se istražio efekat molekula sa anti-fibroznim potencijalom, ADA-deficijentni miševi su održavani na niskoj dozi egzogenog ADA režima tokom nekoliko nedelja, a zatim je zaustavljen ADA tretman i primenjen je potencijalni antifibrozni agens.

[0357] Efekat anti-CSF-1R antitela Ab535 je ispitan u ADA modelu plućne fibroze nokaut miša. U ovom modelu, miševi sa nedostatkom enzima su održavani na ADA enzimskoj terapiji od prvog dana do 21. dana posle rođenja. Pripremljen je ADA-polietilen glikol (PEG) konjugat (Young HW et al, 2004, J Immunol 173: 1380-89) i intramuskularne injekcije su primenjene u postnatalnim danima 1, 5, 9, 13 i 17 (0.625, 1.25, 2.5, 2.5 i 2.5 jedinice, respektivno), praćene sa 5 jedinica ubrizganih intraperitonealno 21. dana. Posle 21. dana nije primenjen nijedan enzim. Ab535 je doziran subkutano sa 30 mg/kg, u zapremini od 100µl tri puta nedeljno od 25 dana (post-natalno) sve dok životinje nisu žrtvovane 42. dana.

[0358] Životinje su žrtvovane 42. dana, a očitavanja su uključivala histopatološku analizu pluća, celularnost BAL tečnosti i kvantifikaciju rastvorljivog kolagena u BAL tečnosti. Sprovedena je histopatološka analiza da bi se utvrdilo oštećenje pluća korišćenjem modifikovanog Ashcroftovog sistema bodovanja za određivanje ozbiljnosti fibroze pluća (Hubner et al, 2008, Biotechniques 44: 507-17). Pluća su naduvana sa 10% formalinom do 25 cm pritiska i obrađena kroz seriju alkohola i ksilena, ugrađena u parafin i sekcije tkiva de-parafinisana pre obrade i bojenja sa Masonovim trihromom.

[0359] Količina rastvorljivog kolagena u BAL tečnosti je takođe procenjena korišćenjem komercijalno dostupnog seta tzv. "Sircol" testa prema uputstvima proizvođača.

[0360] Efekat na populaciju makrofaga u BAL tečnosti je određen korišćenjem pripravaka citospina. Alikvoti BAL ćelija su centrifugirani na slajdovima mikroskopa, obojeni sa tzv. "Diff-Quick" i makrofagi izbrojani.

[0361] Nađeno je da terapijski tretman sa anti-CSF-1R antitelom Ab535 značajno smanjuje fibrozu pluća kod miševa sa nedostatkom ADA. Tretirani miševi su imali smanjenu produkciju kolagena, poboljšanu fibroznu patologiju i poboljšanu funkciju i zaštitu plućne barijere.

[0362] Slika 20a pokazuje da tretman ADA-deficijentnih miševa sa indukovanom fibrozom pluća sa Ab535 smanjuje koncentraciju BALF kolagena u poređenju na tretman sa kontrolom izotipa.

[0363] Slika 20b pokazuje da tretman ADA-deficijentnih miševa sa indukovanom fibrozom pluća sa Ab535 smanjuje Ashcroftov rezultat uzoraka u poređenju na tretman sa kontrolom izotipa, što pokazuje da miševi tretirani sa Ab535 imaju poboljšanu fibroznu patologiju.

[0364] Slika 20c pokazuje da tretman ADA-deficijentnih miševa sa indukovanom fibrozom pluća sa Ab535 smanjuje koncentraciju albumina u serumu u poređenju na tretman sa kontrolom izotipa, što pokazuje da je poboljšana vaskularna permeabilnost miševa tretiranih sa Ab535.

[0365] Slika 20d pokazuje da tretman ADA-deficijentnih miševa sa indukovanom fibrozom pluća primajući Ab535 ima smanjen broj makrofaga u BAL tečnosti.

[0366] Slika 21 prikazuje reprezentativne slike histopatološke analize pluća normalnih miševa (ADA ) i ADA-deficijentnih miševa sa indukovanom fibrozom pluća (ADA-), obe tretirane sa kontrolom izotipa ili Ab535. U ADA-miševima, životinje tretirane sa Ab535 su imale značajno smanjenu fibrozu pluća u poređenju sa kontrolom izotipa.

[0367] Prema tome, u dva mišja modela plućne fibroze je pokazano da tretman sa anti-CSF-1R antitelom može efikasno lečiti fibroznu bolest.

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Anti-CSF-1R antitelo koje ima teški lanac, sadržavajući sekvencu datu u SEK ID BR: 27 i laki lanac koji sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 19.

2. Anti-CSF-1R antitelo prema patentnom zahtevu 1, imajući efektor ili molekul reporter pripojen na njega.

3. Anti-CSF-1R antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, imajući afinitet vezivanja za humani CSF-1R od 10 pM ili manji od 10 pM.

4. Izolovana sekvenca DNK koja kodira teški i laki lanac (e) antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3.

5. Vektor kloniranja ili ekspresije koji sadrži jednu ili više sekvenci DNK prema patentnom zahtevu 4.

6. Vektor prema patentnom zahtevu 5, pri čemu vektor sadrži sekvence date u SEK ID BR: 28 i SEK ID BR: 20.

7. Ćelija domaćina, sadržavajući jedan ili više vektora za kloniranje ili ekspresiju prema patentnom zahtevu 6.

8. Postupak za produkciju antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3, obuhvatajući kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 7 i izolovanje antitela.

9. Farmaceutska kompozicija, sadržavajući antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom, razblaživačem ili nosačem; pri čemu farmaceutska kompozicija opciono sadrži druge aktivne sastojke.

10. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3 ili kompozicija prema patentnom zahtevu 11, za upotrebu kao lek.

11. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3 ili kompozicija prema patentnom zahtevu 11 za lečenje ili profilaksu kancera ili fibrozne bolesti.

12. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, pri čemu je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, kancera prostate, kancera kostiju, kolorektalnog kancera, leukemije, limfoma, kancera kože, kancera jednjaka, kancera želuca, astrocitnog kancera, kancera endometrijuma, kancera grlića materice, kancera mokraćne bešike, kancera bubrega, kancera pluća, kancera jetre, kancera štitne žlezde, kancera glave i vrata, kancera gušterače i kancera jajnika.

13. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, pri čemu je fibrozna bolest izabrana iz grupe koju čine fibroza pluća kao što je idiopatska fibroza pluća i cistična fibroza, fibroza bubrega, ciroza jetre, endomiokardijalna fibroza, medijastinalna fibroza, mijelofibroza, retroperitonealna fibroza, progresivna masivna fibroza, nefrogena sistemska fibroza, Kronova bolest, keloid, infarkt miokarda, sklerodermija i artrofibroza.