ES2965715T3 - Receptores de células T - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a receptores de células T (TCR) que se unen al péptido restringido a HLA-A*02 SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) derivado del producto del gen Gag del VIH, p17. Dichos TCR comprenden mutaciones no naturales dentro de los dominios variables alfa y/o beta con respecto a un TCR nativo del VIH. Los TCR de la invención poseen una afinidad, especificidad y sensibilidad inesperadamente altas por un complejo de SEQ ID NO: 1 y HLA-A*02, e impulsan una respuesta de células T particularmente potente. Dichos TCR son particularmente útiles en el desarrollo de reactivos inmunoterapéuticos solubles para el tratamiento de individuos infectados por VIH. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de células T

La presente invención se refiere a receptores de células T (TCR) que se unen al péptido restringido HLA-A*02 SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) derivado del producto génico Gag del h Iv , p17. Dichos TCR comprenden mutaciones no naturales dentro de los dominios variables alfa y/o beta en relación con un TCR nativo del HIV. Los TCR de la invención poseen una afinidad, especificidad y sensibilidad inesperadamente altas para un complejo de SEQ ID NO: 1 y h LA-A*02, e impulsan una respuesta de células T especialmente potente. Tales TCR son particularmente útiles en el desarrollo de reactivos inmunoterapéuticos solubles para el tratamiento de individuos infectados por el HIV.

Antecedentes de la invención

El virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) es el agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). El virus es un retrovirus envuelto perteneciente al grupo de los lentivirus. Los tratamientos actuales se basan en el uso de una terapia antirretrovírica combinada (ART) para controlar la infección vírica. Sin embargo, estos tratamientos son incapaces de erradicar completamente la infección debido a la integración estable de los genes víricos en los cromosomas de las células huésped, lo que conduce al rápido establecimiento de un reservorio de células T CD4+ infectadas de forma latente y de larga vida (Siliciano et al. 2003 Nat Med, 9, 727). Por lo tanto, se necesitan nuevos tratamientos que tengan el potencial de erradicar los reservorios virales y lograr una cura funcional. Las estrategias inmunoterapéuticas, y en particular las que dan lugar a la activación de las células T CD8+, representan un enfoque prometedor (Vanham et al. 2012, Retroviral 9, 72; Shan et al. 2012, Immunity 36, 491; Sloan et al. 2015, PLoS Pathog. 5;11 (11); Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5). Estos enfoques pueden combinarse con agentes de inversión de la latencia.

Se han desarrollado vacunas diseñadas para estimular la respuesta de las células T y se han utilizado en combinación con reactivos de reactivación vírica; sin embargo, hasta la fecha han demostrado ser en gran medida ineficaces, posiblemente porque los clones de células T activados son los que no han conseguido controlar el virus en primer lugar (Autran et al. 2008, AIDS 22, 1313; Schooley et al. 2012, J Infect Dis 202, 705; Casazza et al. 2013, J. Infect Dis 207, 1829). Un enfoque inmunoterapéutico alternativo involucra utilizar receptores de células T (TCR) manipulados para generar una potente respuesta inmunitaria contra las células infectadas por el HIV. En la naturaleza, las células T y los TCR suelen tener una afinidad débil por el antígeno, entre micromolar y nanomolar. La ingeniería del TCR mediante la mutación del sitio de reconocimiento del antígeno puede producir aumentos en la afinidad del antígeno que pueden conducir a una respuesta inmunitaria potenciadain vivo.En el contexto del HIV, la respuesta potenciada debería ser suficiente para erradicar el virus de las células que presentan niveles bajos de antígeno. Estos TCR modificados pueden utilizarse en aplicaciones de terapia celular con células T modificadas genéticamente (véase Vonderheide and June, 2014, Immunol Rev, 257, 7-13). Alternativamente, los TCR modificados pueden producirse como reactivos solubles con el fin de administrar agentes citotóxicos o inmunoestimulantes a las células infectadas (Lissin, et al., 2013). "High-Affinity Monocloncal T-cell receptor (mTCR) Fusions. Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals: Applications and Challenges". S. R. Schmidt, Wiley; Boulter, et al., (2003), Protein Eng 16(9): 707-711; Liddy, et al., (2012), Nat Med 8: 980-987; WO03/020763). Para que los TCR solubles se utilicen como terapéuticos, es deseable que la afinidad (K<d>) y/o la semivida de unión al antígeno sean particularmente altas, por ejemplo una K<d>en el intervalo picomolar y/o una semivida de unión de varias horas. Estas afinidades elevadas son necesarias para generar una respuesta potente contra las células diana que presentan niveles bajos de antígeno. En todas las aplicaciones que implican TCR modificados por ingeniería de afinidad, es esencial que los TCR no sólo tengan una mayor afinidad por el antígeno que el correspondiente TCR de tipo salvaje, sino que también conserven un alto nivel de especificidad por el antígeno. La pérdida de especificidad en este contexto puede provocar efectos no deseados cuando se administran estos TCR a los pacientes.

La maduración por afinidad implica por lo general que el experto tenga que identificar mutaciones específicas y/o combinaciones de mutaciones, incluyendo pero sin limitarse a sustituciones, inserciones y/o deleciones, que pueden hacerse a una secuencia de WT TCR para aumentar la fuerza de reconocimiento del antígeno. Los métodos para identificar mutaciones de un determinado TCR que confieren un potenciamiento de la afinidad son conocidos en la técnica, por ejemplo el uso de bibliotecas de visualización (Li et al., (2005) Nat Biotechnol.

23(3):349-354; Holler et al., (2000). Proc Natl Acad Sci USA; 97(10):5387-5392). Sin embargo, para producir aumentos significativos en la afinidad de un TCR dado contra una diana dada se requiere que la persona experta seleccione mutaciones específicas y/o combinaciones de mutaciones de un gran conjunto de alternativas posibles. En muchos casos puede no ser posible alcanzar la afinidad y especificidad deseadas. Las mutaciones necesarias para lograr una alta afinidad y especificidad también deben producir un TCR que pueda expresarse, replegarse y purificarse con un rendimiento razonable y que sea muy estable en su forma purificada.

La secuencia peptídica SLYNTVATL (SEQ ID NO 1) se deriva del producto génico p17 del gen Gag, uno de los nueve genes que componen el virus HIV y frente al cual se ha demostrado que las respuestas de las células T son particularmente eficaces para controlar la carga viral (Rolland et al. 2008, PLoS One, 3:e1424). El péptido (denominado en la presente memoria Gag) es presentado por el HLA-A*02 en la superficie de las células infectadas por el HIV. Por lo tanto, el complejo Gag-HLA-A*02 constituye una diana ideal para el reconocimiento basado en el TCR de las células infectadas por el HIV.

Se ha aislado un WT TCR que reconoce el complejo Gag-HLA-A*02, y se han identificado varias mutaciones dentro de la secuencia del WT TCR que dan lugar a un reconocimiento de mayor afinidad (WO06103429 y Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5). Las células T citotóxicas CD8+ transducidas con dichos TCR de afinidad potenciada fueron capaces de controlar la infección por HIVin vitroen proporciones de diana efectoras adecuadas para la terapia con células T Estos TCR fueron capaces de reconocer todos los péptidos de escape virales más comunes (Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5). Si bien estos TCR tienen utilidad en la terapia adoptiva de células T, los TCR solubles para su uso terapéutico por lo general requieren un reconocimiento de antígenos de mayor afinidad para poder reconocer células infectadas que presentan bajos niveles de epítopos.

Los inventores han encontrado inesperadamente mutantes adicionales del mismo WT TCR que pueden combinarse con una o más de las mutaciones previamente identificadas para producir TCR con propiedades particularmente adecuadas para su uso en terapéuticas basadas en TCR solubles.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse a SLYNTVATL (SEQ ID No: 1) en complejo con HLA-A*02 y que comprende un dominio variable de cadena alfa del TCR y un dominio variable de cadena beta del TCR, en el que

(i) el dominio variable de cadena alfa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 7 y el dominio variable de cadena beta comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; o

(ii) el TCR tiene al menos un 90 % de identidad con el TCR de (i) y tiene una K<d>y/o semivida de unión para el complejo de SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) con HLA-A*02 dentro del 50 % de la K<d>medida y/o semivida de unión del TCR de (i), cuando se mide utilizando resonancia de plasmón superficial en condiciones idénticas, a 25 °C y en el mismo chip SPR.

Las características preferidas de la invención se exponen en las reivindicaciones dependientes de la presente memoria. El TCR de (ii) puede tener una Kd y/o semivida de unión para el complejo de SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) con HLA-A*02 dentro del 20 % de la Kd medida y/o semivida de unión del TCR de (i), cuando se mide en condiciones idénticas, a 25 °C y en el mismo chip SPR.

La presente invención divulga TCR que poseen propiedades de unión a antígeno inesperadamente buenas, incluyendo afinidad picomolar a antígeno, una semivida de unión larga, y la capacidad de mediar una activación inmune potente, cuando se fusionan a una unidad estructural activadora, contra células infectadas por HIV que presentan niveles extremadamente bajos de antígeno, manteniendo al mismo tiempo un alto nivel de especificidad. Los TCR de la invención son particularmente adecuados para su uso como reactivos solubles de orientación en el tratamiento de individuos infectados por el HIV. En particular, las TCR de acuerdo con la invención tienen inesperadamente una alta afinidad por el antígeno en relación con el TCR Gag de tipo salvaje y una alta especificidad por el antígeno. La percepción en la técnica es que la ingeniería de las TCR para que posean una alta afinidad por el antígeno también dará lugar a TCR con una especificidad de antígeno reducida. Por ejemplo, se han asociado aumentos drásticos de la afinidad con una pérdida de especificidad antigénica en células T CD8 modificadas con el gen TCR, lo que podría dar lugar a la activación inespecífica de estas células CD8 transfectadas con el TCR (véase Zhao et al., (2007) J Immunol. 179: 5845-54; Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-31; y el documentoWO2008/038002). Adicionalmente, se ha demostrado que las TCR solubles de alta afinidad fusionados a anti-CD3 pueden perder especificidad por el antígeno cuando se utilizan a altas concentraciones (véase Liddy et al., (2012), Nat Med, 8: 180-187). Los problemas de especificidad son una consideración particular para las TCR de alta afinidad derivados de este WT TCR Gag, ya que el WT TCR tiene un amplio perfil de reconocimiento de epítopos, capaz de tolerar sustituciones de alanina simples en cualquier posición de la cadena lateral del péptido Gag e incluso de reconocer un péptido con múltiples sustituciones de alanina (Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5 y las referencias en este). Contrariamente a lo que se percibe en la técnica, los inventores han encontrado TCR mutantes que tienen tanto alta afinidad como alta especificidad, y por lo tanto son particularmente adecuados para aplicaciones clínicas.

Las secuencias del TCR definidas en la presente memoria se describen con referencia a la nomenclatura IMGT, que es ampliamente conocida y accesible para quienes trabajan en el campo del TCR. Por ejemplo, véase: LeFranc and LeFranc, (2001). "T cell Receptor Factsbook", Academic Press; Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603; Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10O; y Lefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266. En resumen, los ap TCR están formados por dos cadenas unidas por disulfuro. En general, se considera que cada cadena (alfa y beta) tiene dos dominios, a saber, un dominio variable y un dominio constante. Una corta región de unión conecta los dominios variable y constante y por lo general se considera parte de la región variable alfa. Adicionalmente, la cadena beta suele contener una corta región de diversidad junto a la región de unión, que también por lo general se considera parte de la región variable beta.

El dominio variable de cada cadena está situado N-terminalmente y comprende tres Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR) incrustadas en una secuencia marco. Las CDR comprenden el sitio de reconocimiento para la unión péptido-MHC. Existen varios genes que codifican regiones variables de cadena alfa (Va) y varios genes que codifican regiones variables de cadena beta (Vp), que se distinguen por su marco, las secuencias CDR1 y CDR2, y por una secuencia CDR3 parcialmente definida. Los genes Va y Vp se denominan en la nomenclatura IMGT con el prefijo TRAV y TRBV respectivamente (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42 54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). Asimismo, existen varios genes de unión o J, denominados TRAJ o TRBJ, para la cadena alfa y beta respectivamente, y para la cadena beta, un gen de diversidad o D denominado TRBD (Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 107-114; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 97-106; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). La enorme diversidad de cadenas de receptores de células T es el resultado de reordenamientos combinatorios entre los diversos genes V, J y D, que incluyen variantes alélicas, y de la diversidad de uniones (Arstila, et al., (1999), Science 286(5441): 958-961; Robins et al., (2009), Blood 114(19): 4099-4107). Las regiones constantes, o C, de las cadenas alfa y beta del TCR se denominan TRAC y TRBC respectivamente (Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10).

El término "TCR nativo" se utiliza como sinónimo en esta solicitud con los términos "TCR de tipo salvaje" o "WT TCR" o "TCR no mutado" para referirse a un TCR que tiene un dominio variable de cadena alfa que comprende TRAV12-2*01 con las siguientes mutaciones relativas a una secuencia TRAV12-2 canónica: V73I, Q81K y P82L basada en la numeración de SEQ ID NO 2 y la secuencia de aminoácidos CDR3 AVRTNSGYALN (SEQ ID NO: 22), y un dominio variable de cadena beta que comprende TRBV5-6*01 y la secuencia de aminoácidos CDR3 ASSDTVSYEQY (SEQ ID NO: 25). Las secuencias de aminoácidos de los dominios variables alfa y beta nativos vienen dadas por los residuos 1-112 de SEQ ID NO: 2 y los residuos 1-113 de SEQ ID NO: 3, como se muestra en la figura 1 [obsérvese que en comparación con las secuencias publicadas anteriormente (véase el documento WO06103429 y Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5), el residuo que sigue a la metionina de iniciación del TRBV se indica como ácido aspártico (D) en lugar de ácido glutámico (E). El ácido aspártico es el residuo canónico en esta posición para TRBV5-6*01 y se reintrodujo durante la ingeniería. Por una razón similar, el residuo que sigue a la metionina de iniciación de TRAV es Q en lugar de A, como se indica en la secuencia publicada anteriormente]. En las TCR de la presente invención, el residuo de metionina de iniciación en el extremo N de los dominios variables de cadena alfa y beta respectivos es opcional. Además o alternativamente, el residuo que sigue a la metionina de iniciación del dominio variable de la cadena alfa puede ser alanina (A) o glutamina (Q).

El dominio constante del WT TCR puede ser de longitud completa, o puede truncarse y/o mutarse para producir un TCR soluble. En ambos casos, pueden introducirse sustituciones de cisteína en las regiones TRAC y TRBC de forma que pueda formarse un enlace disulfuro no nativo entre cadenas. Las posiciones adecuadas para la localización de dichas sustituciones de cisteína se describen en el documento WO03020763. La figura 2 muestra las secuencias extracelulares de las cadenas alfa y beta del TCR de tipo salvaje, respectivamente, en formato soluble. SEQ ID NO: 4 es idéntica a la secuencia extracelular nativa de la cadena alfa SEQ ID NO: 2 excepto que la cisteína en la posición 48 del dominio constante se ha sustituido por treonina. El dominio constante de la cadena alfa puede estar truncado en 8 aminoácidos en su extremo C (FFpSPESS). Asimismo, SEQ ID NO: 5 es idéntica a la secuencia extracelular nativa de la cadena beta SEQ ID NO: 3 excepto que la cisteína en la posición 57 del dominio constante se ha sustituido por serina, la cisteína en la posición 75 del dominio constante se ha sustituido por alanina, y la asparagina en la posición 89 del dominio constante se ha sustituido por ácido aspártico. La TCR soluble de tipo salvaje puede utilizarse para proporcionar una referencia con la que comparar el perfil de unión de las TCR mutadas de la invención. Tales secuencias son particularmente adecuadas para su uso como TCR terapéuticos para la inmunoterapia dirigida de cánceres que presentan el complejo SLYNTVATL HLA-A*02.

En determinadas realizaciones preferidas, la secuencia de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena alfa y/o beta puede seleccionarse de las siguientes tablas, con referencia a la numeración de SEQ ID NOs: 2 y 3 respectivamente.

CDR de cadena alfa

En la presente memoria se divulga un TCR que se une a SLYNTVATL (SEQ ID No: 1) en complejo con HLA-A*02, en el que: las CDR de cadena alfa 1,2 y 3 comprenden SEQ ID NOs: 26, 27 y 22 respectivamente o SEQ ID NOs: 26, 21 y 22 respectivamente, y/o las CDR 1 ,2 y 3 de la cadena beta comprenden las SEQ ID NOs: 23, 28 y 25 respectivamente; y/o al menos una de las CDR contiene una o más sustituciones conservativas con respecto a las SEQ ID NOs: 21-23 y 25-28; y/o al menos una de las CDR contiene hasta tres sustituciones toleradas con respecto a las SEQ ID NOs: 21-23 y 25-28. Preferentemente, dichas sustituciones no cambian la afinidad de unión y/o una semivida de unión (T1^ ) en más de /- 50 %, o más preferentemente en no más de /- 20 %, en relación con el TCR no sustituido.

La secuencia de aminoácidos de la CDR3 del dominio variable de la cadena alfa puede ser idéntica a la secuencia de la CDR3 de la cadena alfa del TCR de tipo salvaje. Adicional o alternativamente, la secuencia de aminoácidos de la CDR3 del dominio variable de la cadena beta puede ser idéntica a la secuencia de la CDR3 de la cadena beta del TCR de tipo salvaje.

Como se ha indicado, en las TCR de la presente invención, el residuo de metionina de iniciación en el extremo N de los dominios variables de cadena alfa y beta respectivos es opcional. Además o alternativamente, el residuo que sigue a la metionina de iniciación del dominio variable de la cadena alfa (posición 1 en SEQ ID NO: 6 y 7) pueden ser alanina (A) o glutamina (Q).

Dentro del alcance de la invención están las variantes fenotípicamente silenciosas de cualquier TCR de la invención divulgada en la presente memoria. Como se utiliza en la presente memoria, el término "variantes fenotípicamente silentes" se entiende que se refiere a un TCR que incorpora uno o más cambios aminoacídicos adicionales, incluidas sustituciones, inserciones y deleciones, además de los expuestos anteriormente, cuyo TCR tiene un fenotipo similar al TCR correspondiente sin dicho(s) cambio(s). A efectos de la presente solicitud, el fenotipo del TCR comprende la afinidad de unión al antígeno (K<d>y/o semivida de unión) y la especificidad del antígeno. Una variante fenotípicamente silente puede tener una Kd y/o una semivida de unión para el SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) Complejo HLA-A*02 dentro del 50%, o más preferentemente dentro del 20%, de la Kd medida y/o semivida de unión del TCR correspondiente sin dicho(s) cambio(s), cuando se mide en condiciones idénticas (a 25°C y en el mismo chip SPR). Las condiciones adecuadas se describen en el ejemplo 3. La especificidad del antígeno se define más adelante. Como es sabido para los expertos en la técnica, puede ser posible producir TCR que incorporen cambios en los dominios variables de los mismos en comparación con los detallados anteriormente sin alterar la afinidad de la interacción con el complejo de SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) con HLA-A*02. En particular, tales mutaciones silenciosas pueden incorporarse en partes de la secuencia que se sabe que no intervienen directamente en la unión al antígeno (por ejemplo, las regiones marco o partes de las CDR que no entran en contacto con el antígeno peptídico). Tales variantes triviales se incluyen en el ámbito de esta invención. Como es sabido en la técnica, pueden incorporarse otros cambios de aminoácidos por razones tales como la mejora de la estabilidad y/o la capacidad de fabricación.

Pueden realizarse cambios adicionales o alternativos de aminoácidos para reducir el potencial de inmunogenicidadin vivo.Tales mutaciones se incluyen en el ámbito de la invención siempre que sean fenotípicamente silentes

Las variantes fenotípicamente silenciosas pueden producirse incorporando una o más sustituciones conservadoras y/o una o más sustituciones toleradas. Por sustituciones toleradas se entienden aquellas sustituciones que no entran en la definición de conservadoras que se ofrece a continuación, pero que, no obstante, son fenotípicamente silenciosas. Por sustituciones conservadoras se entienden las sustituciones de uno o más aminoácidos por aminoácidos alternativos que comparten propiedades similares. El experto sabe que diversos aminoácidos tienen propiedades similares y, de este modo, son "conservadores". Uno o más de estos aminoácidos de una proteína, polipéptido o péptido pueden sustituirse a menudo por otro u otros de dichos aminoácidos sin eliminar una actividad deseada de dicha proteína, polipéptido o péptido. De este modo, los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina pueden sustituirse a menudo entre sí (aminoácidos con cadenas laterales alifáticas). De estas posibles sustituciones se prefiere que la glicina y la alanina se utilicen para sustituirse entre sí (ya que tienen cadenas laterales relativamente cortas) y que la valina, la leucina y la isoleucina se utilicen para sustituirse entre sí (ya que tienen cadenas laterales alifáticas más grandes que son hidrofóbicas). Otros aminoácidos que a menudo pueden sustituirse entre sí son: fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos con cadenas laterales aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos con cadenas laterales básicas); aspartato y glutamato (aminoácidos con cadenas laterales ácidas); asparagina y glutamina (aminoácidos con cadenas laterales amidas); y cisteína y metionina (aminoácidos con cadenas laterales azufradas). Debe apreciarse que las sustituciones de aminoácidos dentro del ámbito de la presente invención pueden realizarse utilizando aminoácidos naturales o no naturales. Por ejemplo, se contempla en la presente memoria que el grupo metilo de una alanina pueda sustituirse por un grupo etilo, y/o que puedan realizarse cambios menores en el esqueleto peptídico. Se utilicen o no aminoácidos naturales o sintéticos, se prefiere que sólo estén presentes los L-aminoácidos.

Por lo tanto, la presente invención se extiende a un TCR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad, tal como 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad, con un TCR en el que el dominio variable alfa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 6 y 7, y el dominio variable beta comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

La "identidad", tal como se conoce en la técnica, es la relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, determinada mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, identidad también significa el grado de parentesco de secuencia entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según el caso, determinado por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. Aunque existen un número de métodos para medir la identidad entre dos secuencias polipeptídicas o dos secuencias polinucleotídicas, los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad están codificados en programas informáticos. Los programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN y FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)).

Se puede utilizar un programa como el programa CLUSTAL para comparar secuencias de aminoácidos. Este programa compara secuencias de aminoácidos y encuentra la alineación óptima insertando espacios en una u otra secuencia según convenga. Es posible calcular la identidad o similitud de aminoácidos (identidad más conservación del tipo de aminoácido) para una alineación óptima. Un programa como BLASTx alineará el tramo más largo de secuencias similares y asignará un valor al ajuste. De este modo, es posible obtener una comparación en la que se encuentren varias regiones de similitud, cada una con una puntuación diferente. La presente invención contempla ambos tipos de análisis de identidad.

El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos se determina alineando las secuencias para una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir brechas en la primera secuencia para una mejor alineación con la secuencia) y comparando los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones correspondientes. El "mejor alineamiento" es un alineamiento de dos secuencias que da como resultado el mayor porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se determina por el número de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos en las secuencias comparadas (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones * 100).

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse utilizando un algoritmo matemático conocido para los expertos en la técnica. Un ejemplo de algoritmo matemático para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 modificado como en Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Los programas NBLAST and XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 han incorporado un algoritmo de este tipo. Se pueden realizar búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a moléculas de ácidos nucleicos. Se pueden realizar búsquedas de proteínas BLAST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas de proteínas para su uso en la invención. Para obtener alineaciones separadas con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, PSI-Blast puede utilizarse para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre moléculas (Id.). Al utilizar los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo de algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers and Miller, CABIOS (1989). El programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias CGC, ha incorporado un algoritmo de este tipo. Otros algoritmos para el análisis de secuencias conocidos en la técnica son ADVANCE y ADAM, descritos en Torellis y Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci, 10 :3-5 y FASTA descritos en Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y la velocidad de la búsqueda.

Las mutaciones, incluidas las sustituciones conservadoras y toleradas, las inserciones y las deleciones, pueden introducirse en las secuencias proporcionadas utilizando cualquier método apropiado, incluidos, pero no se limitan a, los basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la clonación basada en enzimas de restricción o los procedimientos de clonación independiente de ligadura (LIC). Estos métodos se detallan en muchos de los textos estándar de biología molecular. Para más detalles sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la clonación basada en enzimas de restricción, véase Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a Ed.) CSHL Press. Se encontrará más información sobre los procedimientos de clonación independiente de ligadura (LIC) en Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6. Las secuencias TCR proporcionadas por la invención pueden obtenerse a partir de síntesis en estado sólido, o cualquier otro método apropiado conocido en la técnica.

Los TCR de la invención tienen la propiedad de unir el SLYNTVATL (SEQ ID No: 1) con HLA-A*02. Se ha descubierto que los TCR de la invención son altamente específicos para este epítopo en relación con otros epítopos irrelevantes y, de este modo, son especialmente adecuados como vectores diana para la administración de agentes terapéuticos o marcadores detectables a células y tejidos que presenten esos epítopos. La especificidad en el contexto de los TCR de la invención se refiere a su capacidad para reconocer células diana HLA-A*02 que son antígeno positivas, mientras que tienen una capacidad mínima para reconocer células diana HLA-A*02 que son antígeno negativas.

La especificidad puede medirsein vitro,por ejemplo, en ensayos celulares como los descritos en el ejemplo 5. Para comprobar la especificidad, los TCR pueden estar en forma soluble y/o expresarse en la superficie de las células T El reconocimiento puede determinarse midiendo el nivel de activación de células T en presencia de un TCR de la invención y células diana. El reconocimiento mínimo de células diana antígeno negativas se define como un nivel de activación de células T inferior al 20 %, preferentemente inferior al 10 %, preferentemente inferior al 5 %, y más preferentemente inferior al 1 %, del nivel producido en presencia de células diana antígeno positivas, cuando se mide en las mismas condiciones y a una concentración de TCR terapéuticamente relevante. Para los TCR solubles de la invención, una concentración terapéuticamente relevante puede definirse como una concentración de TCR de 10-9 M o inferior, y/o una concentración de hasta 100, preferentemente hasta 1000, veces mayor que el valor EC<50>correspondiente. Las células positivas al antígeno pueden obtenerse mediante péptidopulsación utilizando una concentración de péptido adecuada para obtener un bajo nivel de presentación del antígeno (por ejemplo, 10-9 M de péptido, como se describe en Bossi et al., (2013) Oncoimmunol. 1;2 (11) :e26840) o, pueden presentar de forma natural dicho péptido. Preferentemente, las células antígeno negativas son células humanas.

La especificidad puede referirse además, o alternativamente, a la capacidad de un TCR de unirse a el complejo SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) con HLA-A*02 y no a un panel de complejos alternativos péptido-HLA. Preferentemente, los complejos alternativos péptido-HLA comprenden HLA-A*02. Esto puede determinarse, por ejemplo, mediante el método Biacore del ejemplo 3. Los péptidos alternativos pueden compartir un bajo nivel de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y puede presentarse de forma natural. Preferentemente, los péptidos alternativos se presentan en la superficie de células derivadas de tejidos humanos normales, (es decir, células no infectadas por el HIV). La unión al complejo SLYNTVATL-HLA-A*02 puede ser al menos 2 veces mayor que a otros complejos HLA peptídicos presentados de forma natural, más preferentemente al menos 10 veces, o al menos 50 veces o al menos 100 veces mayor, incluso más preferentemente al menos 400 veces mayor.

Un enfoque alternativo o adicional para determinar la especificidad del TCR puede ser identificar el motivo de reconocimiento peptídico del TCR utilizando mutagénesis secuencial, por ejemplo, escaneo de alanina. Este enfoque se describe con más detalle en los documentos Cameron et al., (2013), Sci Transl Med. 2013 Ago 7; 5 (197): 197ra103y WO2014096803.

Los TCR de la invención pueden unirse adicionalmente a complejos que contengan variantes de escape natural de SEQ ID NO: 1 presentado por HLA-A*02. Las variantes de escape del péptido SLYNTVATL se han aislado de pacientes con SIDA e incluyen las siguientes (Sewell et al., (1997) Eur J Immunol. 27: 2323-2329):

SLFNTVATL (SEQ ID NO: 20)

SLFNTVAVL (SEQ ID NO: 21)

SLSNTVATL (SEQ ID NO: 22)

SSFNTVATL (SEQ ID NO: 23)

SLLNTVATL (SEQ ID NO: 24)

SLYNTIATL (SEQ ID NO: 25)

SLYNTIAVL (SEQ ID NO: 26)

SLFNTIATL (SEQ ID NO: 27)

SLFNTIAVL (SEQ ID NO: 28)

SLFNFVATL (SEQ ID NO: 29)

Determinados TCR de la invención pueden tener un perfil de seguridad ideal para su uso como reactivos terapéuticos. En este caso, los TCR pueden estar en forma soluble y preferentemente fusionados a un efector inmunitario. Un perfil de seguridad ideal significa que, además de demostrar una buena especificidad, los TCR de la invención pueden haber superado otras pruebas preclínicas de seguridad. Ejemplos de tales pruebas incluyen ensayos de sangre total para confirmar una liberación mínima de citocinas en presencia de sangre total y, por tanto, un bajo riesgo de causar un síndrome potencial de liberación de citocinasin vivo,y pruebas de alorreactividad para confirmar un bajo potencial de reconocimiento de tipos alternativos de HLA.

Determinados TCR solubles de la invención pueden ser susceptibles de purificación de alto rendimiento. Por alto rendimiento se entiende un rendimiento superior al 1 %, o más preferentemente superior al 10 %.

Los TCR de la invención pueden tener una K<d>para el complejo de menos de 100 nM, por ejemplo de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 1 pM y/o tener una semivida de unión (T1^ ) para el complejo en el intervalo de aproximadamente 1 min a aproximadamente 50 h o más. Determinados TCR de la invención pueden tener una K<d>para el complejo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 300 pM. Determinados TCR de la invención pueden tener una K<d>para el complejo de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 200 pM. Los TCR de la invención pueden tener una semivida de unión (T1^ ) para el complejo en el intervalo desde aproximadamente 1 min a aproximadamente 50 h o más (tal como 100 h), desde aproximadamente 30 min a aproximadamente 50 h o más (como 100 h), o desde aproximadamente 6 h a aproximadamente 50 h o más (tal como 100 h). Todos estos TCR son muy adecuados para su uso como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico cuando se acoplan a un marcador detectable o a un agente terapéutico. Determinados TCR de la invención pueden ser adecuados para aplicaciones de terapia adoptiva, tales TCR pueden tener una K<d>para el complejo de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 100 nM, y/o una semivida de unión para el complejo de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 12 minutos.

Determinados TCR preferidos son capaces de generar una respuesta de células T altamente potentein vitrocontra células positivas al antígeno, en particular aquellas células que presentan bajos niveles de antígeno típicos de las células CD4 infectadas por el HIV. Tales TCR pueden estar en forma soluble y unidos a un efector inmunitario como un anticuerpo anti-CD3. La respuesta de las células T que se mide puede ser la liberación de marcadores de activación de células T, como el interferón y o la Granzima B, o la destrucción celular, u otras medidas de activación de células T conocidas para los expertos en la técnica. Preferentemente, una respuesta altamente potente es aquella con un valor EC50 en el intervalo pM, por ejemplo 100 pM o inferior, preferentemente 50 pM o inferior, por ejemplo entre 50 pM y 1 pM.

Determinados TCR preferidos de la invención tienen una afinidad de unión y/o una semivida de unión para el complejo SLYNTVATL-HLA-A*02 sustancialmente superior a la del TCR nativo. El aumento de la afinidad de unión de un TCR nativo a menudo reduce la especificidad del TCR para su ligando péptido-MHC, y esto se demuestra en Zhao et al., (2007) J.Immunol, 179:9, 5845-5854. Sin embargo, estos TCR de la invención siguen siendo específicos para el complejo SLYNTVATL -HLA-A*02, a pesar de tener una afinidad de unión sustancialmente mayor que el TCR nativo.

La afinidad de unión (inversamente proporcional a la constante de equilibrio K<d>) y la semivida de unión (expresada como T1^ ) pueden determinarse utilizando el método de resonancia de plasmón superficial (BIAcore) y/o el método del octeto del ejemplo 3 de la presente memoria. Se apreciará que la duplicación de la afinidad de un TCR resulta en la reducción a la mitad de la K<d>. T1^ se calcula como In2 dividido por la tasa de desactivación (koff). Por lo tanto, la duplicación de T ^ se traduce en una reducción a la mitad de koff. Los valores de K<d>y koff para los TCR se miden normalmente para las formas solubles del TCR, es decir, aquellas formas truncadas para eliminar los residuos del dominio citoplasmático y transmembrana. Preferentemente, la afinidad de unión o la semivida de unión de un TCR dado se mide varias veces, por ejemplo 3 o más veces, utilizando el mismo protocolo de ensayo y se toma una media de los resultados.

Para su uso como agente diana para la administración de agentes terapéuticos a la célula presentadora de antígeno, el TCR puede estar en forma soluble (es decir, sin dominios transmembrana o citoplasmáticos). Para la estabilidad, los TCR de la invención, y preferentemente los TCR ap heterodiméricos solubles, pueden tener un enlace disulfuro introducido entre residuos de los respectivos dominios constantes, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 03/020763. Uno o ambos de los dominios constantes extracelulares presentes en un heterodímero ap de la invención pueden estar truncados en la terminación C o en las terminaciones C, por ejemplo en hasta 15, o hasta 10 o hasta 8 o menos aminoácidos. Para su uso en terapia adoptiva, un TCR ap heterodimérico puede, por ejemplo, transfectarse como cadenas de longitud completa que tengan dominios citoplasmáticos y transmembrana. Los TCR para su uso en terapia adoptiva pueden contener un enlace disulfuro correspondiente al que se encuentra en la naturaleza entre los respectivos dominios constantes alfa y beta, adicional o alternativamente puede estar presente un enlace disulfuro no nativo.

Los TCR de la invención pueden ser ap heterodímeros. Los TCR de la invención pueden estar en formato de cadena sencilla. Los formatos de cadena sencilla incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos TCR ap de los tipos Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp, Va-L-Vp-Cp, Va-Ca-L-Vp-Cp o Vp-Cp-L-Va-Ca, en los que Va y Vp son regiones variables a y p del TCR respectivamente, Ca y Cp son regiones constantes a y p del TCR respectivamente, y L es una secuencia enlazante (Weidanz et al., (1998) J Immunol Methods. 1;221(1-2):59-76; Epel et al., (2002), Cancer Immunol Immunother. 51(10):565-73; WO 2004/033685; WO9918129). Uno o ambos dominios constantes pueden ser de longitud completa, o pueden estar truncados, y/o contener mutaciones. En determinadas realizaciones, los TCR de cadena sencilla de la invención pueden tener un enlace disulfuro introducido entre los residuos de los respectivos dominios constantes, como se describe en el documento WO 2004/033685. Los TCR de cadena sencilla se describen con más detalle en los documentos WO2004/033685; WO98/39482; WO01/62908; Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76; Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759 4763; Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819-829).

Como será obvio para los expertos en la técnica, puede ser posible truncar las secuencias proporcionadas en el extremo C y/o extremo N de las mismas, en 1, 2, 3, 4, 5 o más residuos, sin afectar sustancialmente a las características de unión del TCR. La presente invención abarca todas estas variantes triviales.

Los TCR heterodiméricos alfa-beta de la invención suelen comprender una secuencia de dominio constante TRAC de cadena alfa y/o una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 de cadena beta. Las secuencias de dominio constante de las cadenas alfa y beta pueden modificarse por truncamiento o sustitución para eliminar el enlace disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2. La(s) secuencia(s) de dominio constante de cadena alfa y/o beta también puede(n) modificarse mediante la sustitución de residuos de cisteína por Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBC1 o TRBC2, formando dichas cisteínas un enlace disulfuro entre los dominios constantes alfa y beta del TCR.

TRBC1 o TRBC2 pueden incluir además una mutación de cisteína a alanina en la posición 75 del dominio constante y una mutación de asparagina a ácido aspártico en la posición 89 del dominio constante. El dominio constante puede contener adicional o alternativamente otras mutaciones, sustituciones o deleciones relativas a las secuencias TRAC y/o TRBC1/2 nativas. El término TRAC y TRBC1/2 engloba variantes polimóficas naturales, por ejemplo N a K en la posición 4 de TRAC (Bragado et al Int Immunol. 1994 Feb;6(2):223-30).

Los TCR de la invención pueden visualizarse en partículas y dichas partículas pueden incluirse dentro de una biblioteca de partículas. Tales partículas incluyen, pero no se limitan a, fagos, ribosomas de levadura o células de mamífero. Los métodos de producción de tales partículas y bibliotecas son conocidos en la técnica (por ejemplo, véanse los documentos WO2004/044004; WO01/48145, Chervin et al. (2008) J. Immuno. Methods 339.2: 175 184).

En otro aspecto, la presente invención proporciona ácido nucleico que codifica un TCR de la invención y/o una molécula de fusión TCR-anti-CD3 de la invención. El ácido nucleico puede ser ADNc. La invención puede proporcionar ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de cadena a de un TCR de la invención. La invención puede proporcionar ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un dominio variable de cadena p de un t Cr de la invención. El ácido nucleico puede ser de origen no natural y/o purificado y/o manipulado. Por ejemplo, el ácido nucleico puede estar optimizado en codones para un sistema de expresión concreto.

En otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende ácido nucleico de la invención. Preferentemente, el vector es un vector de expresión de TCR.

La invención también proporciona una célula que alberga (a) un vector de expresión de un TCR que comprende un ácido nucleico de la invención en un único marco de lectura abierto, o dos marcos de lectura abiertos distintos que codifican la cadena alfa y la cadena beta respectivamente; o (b) un primer vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR de la invención, y un segundo vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR de la invención. Estas células son especialmente útiles en la terapia adoptiva. Las células de la invención pueden ser aisladas y/o recombinantes y/o de origen no natural y/o de ingeniería.

Dado que los TCR de la invención tienen utilidad en la terapia adoptiva, la invención incluye una célula aislada, no natural y/o purificada y/o modificada por ingeniería, especialmente una célula T, que presenta un TCR de la invención. Puede proporcionarse una población ampliada de células T que presenten un TCR de la invención. Existen un número de métodos adecuados para la transfección de células T con ácido nucleico (tales como ADN, ADNc o ARN) que codifica los TCR de la invención (véase, por ejemplo Robbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-6131). Las células T que expresan los TCR de la invención serán adecuadas para su uso en el tratamiento de la infección por HIV basado en la terapia adoptiva. Como sabrán los expertos en la técnica, existen un número de métodos adecuados para llevar a cabo la terapia adoptiva (véase, por ejemplo Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).

Los TCR solubles de la invención son útiles para administrar marcadores detectables o agentes terapéuticos a células presentadoras de antígenos y tejidos que contienen células presentadoras de antígenos. Por lo tanto, pueden estar asociados (covalentemente o de otro modo) con un marcador detectable (para fines de diagnóstico en el que el TCR se utiliza para detectar la presencia de células que presentan el complejo SLYNTVATL-HLA-A2); un agente terapéutico; o una unidad estructural modificadora de Pk .

Ejemplos de moléculas modificadoras de la PK incluyen, pero no se limitan a, PEG (Dozier et al., (2015) Int J Mol Sci. Oct 28; 16(10):25831-64 y Jevsevar et al., (2010) Biotechnol J.Ene;5(1):113-28), PAS (Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel. Aug;26 (8):489-501), albúmina (Dennis et al., (2002) J Biol Chem. Sep 20;277(38):35035-43) y/o polipéptidos no estructurados (Schellenberger et al., (2009) Nat Biotechnol. Dic;27(12):1186-90).

Los marcadores detectables con fines de diagnóstico incluyen, por ejemplo, marcadores fluorescentes, radiomarcadores, enzimas, sondas de ácido nucleico y reactivos de contraste.

Los agentes terapéuticos que pueden asociarse a los TCR de la invención incluyen inmunomoduladores, compuestos radiactivos, enzimas (perforina, por ejemplo) o agentes quimioterapéuticos (cis-platino, por ejemplo). Para garantizar que los efectos tóxicos se ejercen en el lugar deseado, la toxina podría estar dentro de un liposoma unido al TCR, de forma que el compuesto se libere lentamente. Esto evitará efectos dañinos durante el transporte en el cuerpo y garantizará que la toxina tenga el máximo efecto tras la unión del TCR a las células presentadoras de antígeno pertinentes.

Otros agentes terapéuticos adecuados incluyen:

• agentes citotóxicos de moléculas pequeñas, es decir, compuestos con capacidad para matar células de mamíferos que tienen un peso molecular inferior a 700 Daltons. Estos compuestos también podrían contener metales tóxicos capaces de tener un efecto citotóxico. Además, debe entenderse que estos agentes citotóxicos de moléculas pequeñas también incluyen profármacos, es decir, compuestos que se descomponen o se convierten en condiciones fisiológicas para liberar agentes citotóxicos. Ejemplos de tales agentes incluyen cis-platino, derivados de maytansina, raquelmicina, calicheamicina, docetaxel, etopósido, gemcitabina, ifosfamida, irinotecán, melfalán, mitoxantrona, sorfimer sódicofotofrina II, temozolomida, topotecán, glucuronato de trimetreato, auristatina E vincristina y doxorrubicina;

• citotoxinas peptídicas, es decir, proteínas o fragmentos de las mismas con capacidad para matar células de mamíferos. Por ejemplo, ricina, toxina diftérica, exotoxina bacteriana A de pseudomonas, DNasa y RNasa;

• los radionucleidos, es decir, los isótopos inestables de elementos que se desintegran con la emisión simultánea de una o más partículas a, p o rayos y. Por ejemplo, yodo 131, renio 186, indio 111, itrio 90, bismuto 210 y 213, actinio 225 y astatina 213; pueden utilizarse agentes quelantes para facilitar la asociación de estos radionucleidos a los TCR de alta afinidad, o a los multímeros de los mismos;

• inmunoestimulantes, es decir, moléculas efectoras inmunitarias que estimulan la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, citocinas tales como la IL-2 y el IFN-y,

• Superantígenos y mutantes de los mismos;

• Fusiones TCR-HLA, por ejemplo, fusión a un complejo péptido-HLA, en el que dicho péptido se deriva de un patógeno humano común, tal como el virus de Epstein Barr (VEB);

• quimiocinas tales como la IL-8, el factor plaquetario 4, la proteína estimulante del crecimiento del melanoma, etc;

• anticuerpos o fragmentos de los mismos, incluidos anticuerpos anti-células T o determinantes de células NK (por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28 o anti-CD16);

• andamiajes proteínicos alternativos con características de unión similares a las de los anticuerpos

• activadores del complemento;

• dominios proteicos xenogénicos, dominios proteicos alogénicos, dominios proteicos víricos/bacterianos, péptidos víricos/bacterianos.

Una realización preferida es proporcionada por un TCR de la invención asociado (generalmente por fusión a un N o extremo C o N de la cadena alfa o beta) con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento funcional o variante de dicho anticuerpo anti-CD3. En la presente memoria, el término "anticuerpo" abarca tales fragmentos y variantes, incluidas las variantes humanizadas. Algunos ejemplos de anticuerpos anti-CD3 son, pero no se limitan a, OKT3, UCHT-1, BMA-031 y 12F6. Los fragmentos y variantes/análogos de anticuerpos que son adecuados para su uso en las composiciones y métodos en la presente memoria descritos incluyen minicuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')<2>, fragmentos dsFv y scFv, Nanocuerpos™ (estos constructos, comercializados por Ablynx (Bélgica), comprenden un dominio pesado variable de inmunoglobulina única sintética derivado de un camélido (por ejemplo, camello o llama) y anticuerpos de dominio (Domantis (Bélgica), que comprenden un dominio pesado variable de inmunoglobulina única madurado por afinidad o un dominio ligero variable de inmunoglobulina) o andamiajes proteínicos alternativos que presentan características de unión similares a las de los anticuerpos, como Affibodies (Affibody (Suecia), que comprende un andamiaje de proteína A diseñado) o Anticalina(Pieris (Alemania), que comprende anticalinas diseñadas), por citar sólo algunos.

La unión del TCR y el anticuerpo anti-CD3 puede ser directa o indirecta a través de una secuencia enlazante. Las secuencias enlazantes suelen ser flexibles, ya que están formadas principalmente por aminoácidos tales como la glicina, la alanina y la serina, que no tienen cadenas laterales voluminosas que puedan restringir la flexibilidad. Las longitudes utilizables u óptimas de las secuencias enlazantes se determinan fácilmente. A menudo, la secuencia enlazante tendrá menos de aproximadamente 12, tal como menos de 10, o desde 2-10 aminoácidos de longitud. Los enlazantes adecuados que pueden utilizarse en los TCR de la invención incluyen, pero no se limitan a: GGGGS (SEQ ID No: 12), GGGSG (SEQ ID No: 13), GGSGG (SEQ ID No: 14), GSGGG (SEQ ID No: 15), GSGGGP (SEQ ID No: 16), GGEPS (SEQ ID No: 17), GGEGGGP (SEQ ID No: 18), y GGEGGGSEGGGGS (SEQ ID No: 19) (como se describe en el documento WO2010/133828).

La invención también proporciona una molécula de fusión TCR-anti-CD3 en la que el dominio variable de cadena alfa comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID No: 6, o SEQ ID No: 7, y la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 8, y en el que el anticuerpo anti-CD3 está unido covalentemente al extremo N o al extremo C de la cadena beta del TCR mediante una secuencia enlazante seleccionada de SEQ ID NOs: 12-19. Dichas cadenas alfa y beta pueden comprender además una región constante truncada que tenga un enlace disulfuro no nativo. A continuación se presentan determinadas realizaciones preferidas de tales moléculas de fusión TCR-anti-CD3:

Para algunos fines, los TCR de la invención pueden agregarse en un complejo que comprenda varios TCR para formar un complejo TCR multivalente. Existen un número de proteínas humanas que contienen un dominio de multimerización que puede utilizarse en la producción de complejos TCR multivalentes. Por ejemplo, el dominio de tetramerización de p53 que se ha utilizado para producir tetrámeros de fragmentos de anticuerpos scFv que mostraron una mayor persistencia sérica y una tasa de desactivación significativamente menor en comparación con el fragmento scFv monomérico (Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392). La hemoglobina también tiene un dominio de tetramerización que podría utilizarse para este tipo de aplicación. Un complejo TCR multivalente puede tener potenciada capacidad de unión para el complejo SLYNTVATL-HLA-A2 en comparación con un heterodímero no multimérico de tipo salvaje o receptor de células T de la invención. Tales complejos TCR multivalentes son particularmente útiles para rastrear o dirigir células que presentan antígenos particularesin vitrooin vivo,y también son útiles como productos intermedios para la producción de otros complejos TCR multivalentes que tengan tales usos.

Como es bien conocido en la técnica, los TCR pueden estar sujetos a modificaciones postraduccionales. La glucosilación es una de estas modificaciones, que comprende la unión covalente de oligosacáridos a aminoácidos definidos de la cadena del TCR. Por ejemplo, los residuos de asparagina o de serina/treonina son lugares bien conocidos para la fijación de oligosacáridos. El estado de glucosilación de una proteína concreta depende de un número de factores, como la secuencia de la proteína, su conformación y la disponibilidad de determinadas enzimas. Por otra parte, el estado de glucosilación (es decir, el tipo de oligosacárido, la unión covalente y el número total de uniones) puede influir en la función de las proteínas. Por lo tanto, cuando se producen proteínas recombinantes, a menudo es deseable controlar la glucosilación. La glucosilación controlada se ha utilizado para mejorar las terapias basadas en anticuerpos. (Jefferis R., Nat Rev Drug Discov. 2009 Mar;8(3):226-34.). Para los TCR solubles de la invención, la glucosilación puede controlarse in vivo, utilizando líneas celulares particulares, por ejemplo, o in vitro, mediante modificación química. Tales modificaciones son deseables, ya que la glucosilación puede mejorar la farmacocinética, reducir la inmunogenicidad e imitar más de cerca una proteína humana nativa (Sinclair AM and Elliott S., Pharm Sci. 2005 Ago; 94(8):1626-35).

Para su administración a pacientes, los TCR de la invención (preferentemente asociados con una etiqueta o agente terapéutico detectable o expresados en una célula T transfectada), las moléculas de fusión TCR-anti-CD3 o las células de la invención pueden proporcionarse en una composición farmacéutica junto con uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los TCR terapéuticos o de imagen, o las células, de acuerdo con la invención se suministrarán normalmente como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede presentarse en cualquier forma adecuada (dependiendo del método deseado de administración al paciente). Puede suministrarse en forma de dosificación unitaria, generalmente se suministrará en un envase sellado y puede suministrarse como parte de un kit. Normalmente (aunque no necesariamente), un kit de este tipo incluye instrucciones de uso. Puede incluir una pluralidad de dichas formas farmacéuticas unitarias.

La composición farmacéutica puede adaptarse para su administración por cualquier vía adecuada, tal como la parenteral (incluidas la subcutánea, la intramuscular o la intravenosa), la enteral (incluidas la oral o la rectal), la inhalatoria o la intranasal. Tales composiciones pueden prepararse por cualquier método conocido en la técnica de la farmacia, por ejemplo mezclando el principio activo con el(los) portador(es) o el(los) excipiente(s)en condiciones estériles.

de la presente invención pueden variar entre amplios límites, dependiendo de la enfermedad o trastorno que se va a tratar, la edad y afección del individuo que se va a tratar, etc. un intervalo de dosis adecuado para un TCR soluble de la invención asociado con un anticuerpo anti-CD3 puede estar entre 25 ng/kg y 50 pg/kg. Un médico determinará en última instancia las dosificaciones adecuadas que deben utilizarse.

Los TCR, las composiciones farmacéuticas, los vectores, los ácidos nucleicos y las células de la invención pueden proporcionarse en forma sustancialmente pura, por ejemplo al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % puros.

La invención también proporciona:

• una molécula de fusión TCR, TCR-anti-CD3, ácido nucleico o célula de la invención para su uso en medicina,

• una molécula de fusión TCR, TCR-anti-CD3, ácido nucleico o célula de la invención para su uso en un método de tratamiento de la infección por HIV o SIDA en un sujeto humano.

Las características preferidas de cada aspecto de la invención son las mismas que para cada uno de los otros aspectosmutatis mutandis.Los documentos del estado de la técnica mencionados en la presente memoria se incorporan en la máxima medida permitida por la ley.

Descripción de las figuras

Figura 1 - proporciona la secuencia de aminoácidos de la parte extracelular de la cadena alfa y beta de un TCR Gag de tipo salvaje.

Figura 2 - proporciona la secuencia de aminoácidos de la versión soluble de la cadena alfa y beta del TCR Gag de tipo salvaje.

Figura 3 - proporciona secuencias de aminoácidos de dominios variables mutados de la cadena alfa del TCR

Figura 4 - proporciona la secuencia de aminoácidos de los dominios variables mutados de la cadena beta del TCR

Figura 5 - proporciona las secuencias de aminoácidos de la cadena alfa de las moléculas de fusión TCR anti-CD3.

Figura 6 - proporciona la secuencia de aminoácidos de la cadena beta de las moléculas de fusión TCR anti-CD3.

Figura 7 - proporciona datos celulares que demuestran la potencia de las moléculas de fusión TCR anti-CD3

Figura 8 - datos celulares que demuestran la especificidad de las moléculas de fusión TCR anti-CD3

Figura 9 - proporciona datos celulares que demuestran la sensibilidad de las moléculas de fusión TCR anti-CD3

La invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Expresión, replegado y purificación de TCR solubles

Método

Las secuencias de ADN que codifican las regiones extracelulares alfa y beta de los TCR solubles de la invención se clonaron por separado en plásmidos de expresión basados en pGMT7 utilizando métodos estándar (como se describe en Sambrook, et al. Clonación molecular. Vol. 2. (1989) Nueva York: Cold spring harbour laboratory press). Los plásmidos de expresión se transformaron por separado en la cepa Rosetta de E.coli(BL21 pLysS), y se cultivaron colonias individuales resistentes a la ampicilina a 37 °C en medio TYP (+ ampicilina 100 pg/ml) hasta una OD<600>de -0,6-0,8 antes de inducir la expresión de la proteína con 0,5 mM de IPTG. Las células se recogieron por centrifugación tres horas después de la inducción. Las pellas celulares se lisaron con el reactivo de extracción de proteínas BugBuster (Merck Millipore) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las pellas de cuerpos de inclusión se recuperaron por centrifugación. Las pellas se lavaron dos veces en tampón Tritón (Tris-HCl 50 mM pH 8,1, 0,5 % de Triton-X100, NaCl 100 mM, NaEDTA 10 mM) y finalmente se resuspendieron en tampón sin detergentes (Tris-HCl 50 mM pH 8,1, NaCl 100 mM, NaEDTA 10 mM). El rendimiento proteico del cuerpo de inclusión se cuantificó solubilizando con guanidina-HCl 6 M y midiendo laOD<280>. A continuación, se calculó la concentración de proteínas mediante el coeficiente de extinción. La pureza del cuerpo de inclusión se midió solubilizando con urea 8M y cargando ~2 pg en SDS-PAGE al 4-20 % en condiciones reductoras. A continuación se estimó o calculó la pureza mediante un programa informático de densitometría (Chemidoc, Biorad). Los cuerpos de inclusión se almacenaron a 4 °C a corto plazo y a -20 °C o -70 °C a largo plazo.

Para el replegamiento del TCR soluble, los cuerpos de inclusión que contenían cadenas a y p se mezclaron primero y se diluyeron en 10 ml de tampón de solubilización/desnaturalización (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris HCl 50 mM pH 8,1, NaCl 100 mM, E<d>T<a>10 mM, DTT 20 mM) seguido de incubación durante 30 min a 37 °C. Luego se inició el replegamiento mediante dilución adicional en 1 litro de tampón de replegamiento (Tris 100 mM, pH 8,1, L-arginina HCL 400 mM, EDTA 2 mM, urea 4 M, clorhidrato de cisteamina 10 mM y diclorhidrato de cistamina 2,5 mM) y la solución se mezcló bien. La mezcla replegada se dializó contra 10 L de H<2>O durante 18-20 horas a 5 °C ± 3 °C. Transcurrido este tiempo, el tampón de diálisis se sustituyó dos veces por 10 mM Tris pH 8,1 (10 L) y la diálisis continuó durante otras 15 horas. A continuación, la mezcla se filtró a través de filtros de celulosa de 0,45 |jm.

La purificación de los TCR solubles se inició aplicando el replegamiento dializado a una columna de intercambio aniónico POROS® 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM en Tris 20 mM, pH 8,1, en 50 volúmenes de columna usando un purificador Akta® (GE Healthcare). Los picos de las fracciones TCR se identificaron mediante SDS PAGE antes de agruparse y concentrarse. A continuación, la muestra concentrada se aplicó a una columna de filtración en gel Superdex® 75HR (GE Healthcare) preequilibrada en tampón PBS de Dulbecco. Los picos de las fracciones TCR se agruparon y concentraron y se calculó el rendimiento final del material purificado.

Ejemplo 2 - Expresión, replegamiento y purificación de moléculas de fusión TCR anti-CD3 solubles

La preparación de fusiones solubles de TCR anti-CD3 se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1, excepto que la cadena beta de TCR se fusionó mediante un enlazante a un anticuerpo de cadena sencilla anti-CD3. Además, se realizó una etapa de intercambio catiónico durante la purificación tras el intercambio aniónico. En este caso, las fracciones pico procedentes del intercambio aniónico se diluyeron 20 veces en 20mM MES (pH6,5) y se aplicaron a una columna de intercambio catiónico POROS® 50HS. La proteína ligada se eluyó con un gradiente de NaCl 0-500 mM en MES 20 mM Las fracciones de pico se agruparon y ajustaron a Tris 50 mM pH 8,1, antes de concentrarse y aplicarse directamente a la matriz de filtración en gel como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 3 - Caracterización de la unión a antígeno de moléculas de fusión TCR anti-CD3 solubles

El análisis de unión se llevó a cabo mediante resonancia de plasmón superficial, utilizando un instrumento BIAcore 3000 o BIAcore T200. Las moléculas HLA-A*02 de clase I biotiniladas se volvieron a plegar con el péptido de interés y se purificaron utilizando métodos conocidos en la técnica (O'Callaghan et al. (1999). Anal Biochem 266(1): 9-15; Garboczi, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89(8): 3429-3433). Los monómeros de péptido-HLA biotinilados se inmovilizaron en chips sensores CM-5 acoplados a estreptavidina. Todas las mediciones se realizaron a 25°C en tampón PBS de Dulbecco, suplementado con 0,005 % de P20.

Las constantes de unión de equilibrio se determinaron utilizando diluciones seriadas de fusiones solubles TCR / TCR anti-CD3 inyectadas a un caudal constante de 30 ul min-1 sobre una celda de flujo recubierta con ~200 unidades de respuesta (RU) de complejo péptido-HLA-A*02. Las respuestas de equilibrio se normalizaron para cada concentración restando la respuesta del tampón en una celda de flujo de control que contenía un péptido-HLA irrelevante. El valor Kd se obtuvo mediante ajuste de curva no lineal utilizando el software Prism y la isoterma de unión de Langmuir, unida = C*Máx/(C KD), donde "unida" es la unión de equilibrio en RU a la concentración inyectada de TCR / TCR anti-CD3 C y Máx es la unión máxima.

Para las interacciones de alta afinidad, los parámetros de unión se determinaron mediante un análisis cinético de ciclo único. Se inyectaron cinco concentraciones diferentes de fusión TCR anti-CD3 sobre una celda de flujo recubierta con ~100 - 200 RU del complejo péptido-HLA utilizando un caudal de 50-60 j l min-1. Por lo general, se inyectaban 60-200 j l de fusión TCR anti-CD3 a una concentración máxima de 100-300 nM, y se utilizaban diluciones sucesivas de 2 veces para las otras cuatro inyecciones. Se inyectó primero la concentración más baja. Para medir la fase de disociación se inyectó entonces tampón hasta que se produjo > 10 % de disociación, por lo general después de 1 - 3 horas. Los parámetros cinéticos se calcularon utilizando el software BIAevaluation®. La fase de disociación se ajustó a una única ecuación de decaimiento exponencial que permite calcular la semivida. La constante de equilibrio Kd se calculó a partir de koff/kon.

Resultados

Los parámetros de unión (constante de disociación (Kd) y semivida (T1/2)) de dos TCR mutantes de la invención fusionados a anti-CD3 se muestran en la siguiente tabla. El valor Kd de una forma soluble del TCR no mutado, sin anti-CD3, se determinó previamente como 85 nM (los documentos WO2006103429 y Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5).

Ejemplo comparativo

El mutante previamente conocido de mayor afinidad del WT TCR (denominado a11b6, (Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5)) se preparó como fusión anti-CD3 y se evaluó su unión en las mismas condiciones que m121 y m134. En este caso, la afinidad de unión (Kd) se calculó en 360 pM y la semivida en 3,5 h.

Estos resultados demuestran que los TCR mutantes de la invención tienen una afinidad inesperadamente alta y una semivida de unión larga para el complejo SLYNTVATL-HLA-A*02, en comparación con el WT TCR, y otras variantes de alta afinidad divulgadas previamente, lo que los hace particularmente adecuados para su uso como agentes terapéuticos solubles para redirigir una respuesta de células T contra células infectadas por el HIV que presentan niveles bajos del complejo SLYNTVATL-HLA-A*02.

Ejemplo 4 - Potente redirección de células T contra células que presentan el complejo SLYNTVATL-HLA-A*02 mediante moléculas de fusión TCR anti-CD3

La capacidad de las fusiones de TCR anti-CD3 de la invención para generar una respuesta potente de células T en presencia de células que presentan el complejo SLYNTVATL-HLA-A*02 se investigó mediante un ensayo ELISPOT, con secreción de IFNy como lectura de la activación de células T.

Los ensayos se llevaron a cabo utilizando el kit de ensayo IFNy ELISPOT (BD Biosciences, cat no 551849), según las indicaciones del fabricante. Como células diana se utilizaron células T2 (American Type Culture Collection) pulsadas con el péptido SLYNTVATL 1nM, y se sembraron a razón de 5*10<4>células/pocillo en 50 pl. A continuación, se agregaron concentraciones valoradas de fusiones TCR-anti CD3 a concentraciones finales de 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 nM en 50 pl. Las células efectoras (células T CD8+) de las PBMC de los donantes se aislaron mediante separación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (Lymphoprep, Nycomed Pharma AS), utilizando Lymphoprep (Axis-Shields, No. de Cat. NYC-1114547) y tubos Leucosep (Greiner, No. de Cat. 227290). Las células T CD8+ se enriquecieron a partir de PBMC mediante selecciones negativas utilizando inmunodepleción por microesferas magnéticas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (MACS, Miltenyi Biotec). Las células efectoras se sembraron a 8*10<4>células/pocillo en 50 pl. El volumen final de cada pocillo se completó hasta 200 pl con tampón de ensayo (10 % de FCS, 88 % de RPMI, 1 % de glutamina, 1 % de penicilina/estreptomicina).

Las placas se incubaron durante 18-20 h a 37 °C y 5 % de CO2 y se cuantificaron tras el desarrollo utilizando un lector ELISpot automatizado (Immunospot Series 5 Analyzer, Cellular Technology Ltd).

Se agregaron células diana que presentaban un péptido irrelevante como control negativo en presencia de efectores y fusión 1 nM TCR-anti CD3. Se prepararon muestras de control adicionales con células efectoras más células diana y efectoras solas. Los datos se analizaron con el programa Prism 5.0 (GraphPad, Software) para calcular los valores EC50

Resultados

La figura 7 muestra las curvas de respuesta producidas por m121 y m134. Los valores EC50 derivados de las curvas figuran en la siguiente tabla

Ejemplo comparativo

El mutante previamente conocido de mayor afinidad del WT TCR (denominado a11b6, (Varela-Rohena et al. 2008, Nat Med, 14(12):1390-5)) se preparó como una fusión anti-CD3 y se determinó el valor EC50 al mismo tiempo y en condiciones idénticas a las de m121 y m134 anteriores. El valor EC50 para a11b6 se calculó en 135 pM.

Estos datos demuestran que las fusiones TCR-anti CD3 de la invención son, inesperadamente, altamente potentes para redirigir las células T contra las células que presentan el complejo SLYNTVATL-HLA-A*02, y por lo tanto son ideales como reactivos terapéuticos para dirigirse a las células infectadas por el HIV que presentan bajos niveles del complejo SLYNTVATL-HLA-A*02.

Ejemplo 5 - Redirección específica de células T mediante fusiones TCR anti-CD3

La especificidad de las fusiones TCR-anti CD3 se evaluó mediante el ensayo IFNy ELISPOT utilizando líneas celulares de cáncer humano antígeno-negativas, HLA-A*02-positivas, como células diana (células de melanoma Mel526 (Thymed) y células de cáncer de vejiga J82 (American Type Culture Collection)). Los ensayos se llevaron a cabo siguiendo el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 4. Se utilizaron diversas concentraciones de fusiones TCR anti-CD3, como se indica en la figura 8.

Resultados

Los datos presentados en la figura 8 indican que los bajos niveles de activación inespecífica de células T sólo podían detectarse a altas concentraciones de fusiones TCR-anti CD3, es decir, al menos 1000 veces mayores que los valores EC50, y fuera del rango terapéutico esperado (mayor que 10'9M). Por lo tanto, los TCR de la invención tienen un nivel inesperadamente alto de especificidad de diana.

Ejemplo 6 - La redirección de células T por fusiones TCR anti-CD3 se produce incluso a bajas concentraciones de péptidos

Para determinar la sensibilidad de las fusiones TCR anti-CD3 de la invención al complejo HLA peptídico, se llevaron a cabo experimentos de titulación peptídica utilizando células T2 pulsadas con diversas concentraciones de péptido. La activación de células T se determinó utilizando el mismo procedimiento IFNy ELISPOT descrito en el ejemplo 4. Las fusiones TCR anti-CD3 se utilizaron a una concentración de 1 nM. Las concentraciones de péptidos se indican en la figura 9.

Resultados

Los datos presentados en la figura 9 demuestran que las fusiones TCR anti-CD3 son sensibles a concentraciones nanomolares bajas de péptido cargado exógenamente. Se ha demostrado en la técnica que la pulsación de células T2 a concentraciones de péptido de 10-9 M da lugar a un número bajo de epítopos por célula (>50) y corresponde al número de epítopos presentados en la superficie de las células cancerosas (Bossi et al. Oncoimmunology, 2013, 2(11): e26840); por lo tanto, los TCR de la invención son inesperadamente muy sensibles a las células que presentan un número muy bajo de epítopos. Este alto nivel de sensibilidad puede facilitar la eliminación de reservorios de células infectadas por el virusin vivo.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES 1. Un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse a SLYNTVATL (SEQ ID No: 1) en complejo con HLA-A*02 y que comprende un dominio variable de cadena alfa del TCR y un dominio variable de cadena beta del TCR, en el que (i) el dominio variable de cadena alfa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 7 y el dominio variable de cadena beta comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; o (ii) el TCR tiene al menos un 90 % de identidad con el TCR de (i) y tiene una K<d>y/o semivida de unión para el complejo de SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) con HLA-A*02 dentro del 50 % de la Kd medida y/o semivida de unión del TCR de (i), cuando se mide utilizando resonancia de plasmón superficial en condiciones idénticas, a 25 °C y en el mismo chip SPR.
2. 2. Un TCR según la reivindicación 1, en el que el TCR de (ii) tiene una K<d>y/o semivida de unión para el complejo de SLYNTVATL (SEQ ID NO: 1) y HLA-A*02 dentro del 20 %, de la Kd medida y/o semivida de unión del TCR de (i), cuando se mide en condiciones idénticas, a 25 °C y en el mismo chip SPR.
3. 3. Un TCR según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que, en el dominio variable de cadena alfa, la secuencia de residuos de aminoácidos 28-33, 51-56 y 91-101 se selecciona entre las siguientes con referencia a la numeración de SEQ ID NO: 2:
4. 4. Un TCR según cualquier reivindicación precedente, en el que, en el dominio variable de cadena beta, la secuencia de residuos de aminoácidos 28-32, 50-55 y 93-103 se selecciona entre las siguientes con referencia a la numeración de SEQ ID NO: 3:
5. 5. Un TCR según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que el dominio variable de cadena alfa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NOs: 6 o 7, y el dominio variable de cadena beta comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con SEQ ID NO: 8.
6. 6. Un TCR según cualquier reivindicación precedente, que es un heterodímero alfa-beta, que tiene una secuencia de dominio constante de cadena alfa TRAC y una secuencia de dominio constante de cadena beta TRBC1 o TRBC2, opcionalmente en el que las secuencias de dominio constante de cadena alfa y beta se modifican por truncamiento o sustitución para suprimir el enlace disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2, además, opcionalmente, las secuencias de dominio constante de cadena alfa y beta se modifican mediante sustitución de residuos de cisteína por Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBC1 o TRBC2, formando dichas cisteínas un enlace disulfuro entre los dominios constantes alfa y beta del TCR.
7. 7. Un TCR según cualquier reivindicación precedente, que está en formato de cadena sencilla del tipo Va-L-Vb, Vb-L-Va, Va-Ca-L-Vb, Va-L-Vb-Cb, Va-Ca-L-Vb-Cb o Vb-Cb-L-Va-Ca en el que Va y Vb son regiones variables alfa y beta del TCR respectivamente, Ca y Cb son regiones constantes alfa y beta del TCR respectivamente, y L es una secuencia enlazante.
8. 8. Un TCR según cualquier reivindicación precedente, que está asociado con un marcador detectable, un agente terapéutico o una unidad estructural modificadora de PK.9
9. 9. Un TCR según la reivindicación 8, que está asociado con un anticuerpo anti-CD3 unido covalentemente al C- o extremo N de la cadena alfa o beta del TCR, opcionalmente a través de una secuencia enlazante, opcionalmente en el que la secuencia enlazante se selecciona del grupo que consiste en GGGGS (SEQ ID NO: 12), GGGSG (SEQ ID NO: 13), GGSGG (SEQ ID NO: 14), GSGGG (SEQ ID NO: 15), GSGGGP (SEQ ID NO: 16), GGEPS (SEQ ID NO: 17), GGEGGGP (SEQ ID NO: 18), y GGEGGGSEGGGGS (SEQ ID NO: 19).
10. 10. Una molécula de fusión TCR-anti-CD3 en la que el dominio variable de cadena alfa comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 6 o 7 y el dominio variable de cadena beta comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, y en el que el anticuerpo anti-CD3 está unido covalentemente al extremo N o al extremo C de la cadena beta del t Cr mediante una secuencia enlazante seleccionada de SEQ ID NOs: 12-19.
11. 11. Una molécula de fusión TCR-anti-CD3 que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena alfa de SEQ ID NO: 9 o 10, y una secuencia de aminoácidos de cadena beta de SEQ ID NO: 11.
12. 12. Ácido nucleico que codifica una cadena TCR alfa y/o una cadena TCR beta según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y/o molécula de fusión TCR-anti-CD3 según la reivindicación 10 o la reivindicación 11.
13. 13. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 12.
14. 14. Una célula que alberga (a) un vector de expresión del TCR que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 12 en un único marco de lectura abierto, o dos marcos de lectura abiertos distintos que codifican la cadena alfa y la cadena beta respectivamente; o (b) un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un segundo vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
15. 15. Una célula aislada o no natural, especialmente una célula T, que presenta un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
16. 16. Una composición farmacéutica que comprende un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una molécula de fusión TCR-anti-CD3 de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, o una célula según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, junto con uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
17. 17. El TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o molécula de fusión TCR-anti-CD3 de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, o ácido nucleico de la reivindicación 12, o célula de la reivindicación 14 o la reivindicación 15 para su uso en medicina, en un sujeto humano.
18. 18. El TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o molécula de fusión TCR-anti-CD3 de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, o ácido nucleico de la reivindicación 12, o célula de la reivindicación 14 o reivindicación 15 para su uso en un método de tratamiento de la infección por HIV o AIDS en un sujeto humano.