ES2966930T3 - Uso de ligandos agonistas del receptor de IGF-2 para el tratamiento del síndrome de Angelman y el autismo - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para el tratamiento de trastornos del desarrollo neurológico, tales como el síndrome de Angelman y el autismo, que comprenden administrar a un individuo una composición que comprende un ligando agonista del receptor de IGF-2. El ligando agonista del receptor de IGF-2 puede ser IGF-2 o manosa-6-fosfato o un derivado de los mismos. También se describen composiciones que comprenden derivados de manosa-6-fosfato. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de ligandos agonistas del receptor de IGF-2 para el tratamiento del síndrome de Angelman y el autismo Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo los números de subvenciones MH065635 y MH074736 otorgadas por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud Provisional de EE. UU. no. 62/717.372, presentada el 10 de agosto de 2018.

Antecedentes de la invención

El Síndrome de Angelman (AS) es un trastorno neurológico que se produce en uno de cada aproximadamente 20.000 nacidos vivos. Las características o síntomas del AS incluyen retraso del desarrollo, falta de habla, trastornos de la marcha y del equilibrio y convulsiones. Las convulsiones epilépticas pueden ser de muchos tipos y a menudo no responden a muchos medicamentos prescritos. El AS también se asocia con deterioros cognitivos. Algunas de las características del Síndrome de Angelman se solapan con los trastornos del espectro autista, aunque las dos afecciones tienen sus propias características únicas. Actualmente, no existe una cura conocida para el AS o el autismo o no existen enfoques terapéuticos viables para mejorar los diversos síntomas asociados con estas indicaciones.

Stern S A ET AL: Society for Neuroscience Abstract Viewer and Itinerary Planner - 2013, 11 de octubre de 2013 (11-10-2013), página 1, divulga que el tratamiento sistémico de IGF-2 rescata varias deficiencias de comportamiento en un modelo de ratón de trastorno del espectro autista, incluyendo la memoria, el reconocimiento social y el comportamiento compulsivo.

Stern S A ET AL: Society for Neuroscience Abstract Viewer and Itinerary Planner, 14 de octubre de 2012 (14-10 2012), informa que el IGF-2 revierte los déficits sociales en un modelo de ratón con autismo bien establecido.Sumario de la divulgación

Obsérvese que las referencias en esta descripción a métodos de tratamiento deben interpretarse como referencias a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

La presente divulgación proporciona métodos para el tratamiento de trastornos del neurodesarrollo, tales como el Síndrome de Angelman (AS) y el autismo. El método comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento, una composición que comprende un ligando agonista del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF-2 o IGF-II), que es específico para el receptor de IGF-2, como se define en las reivindicaciones. Las composiciones comprenden, o consisten esencialmente en, una cantidad terapéuticamente efectiva de IGF-2 y/o Manosa-6-fosfato (M6P), como se define en las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. IGF-2 revierte la mayoría de los déficits de comportamiento observados en un modelo de AS en ratón.Las líneas de tiempo experimentales se muestran arriba de los gráficos. En todos los experimentos, los ratones recibieron una inyeccións.c.de vehículo o IGF-2 (f) 20 min antes del entrenamiento o ensayo. Todos los datos se expresan como media ± s.e.m. N=8-12 por grupo. Análisis de varianza bidireccional (ANOVA) seguido de pruebas post-hoc de Bonferroni. * P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.(A)Porcentaje de tiempo dedicado a congelamiento antes (antes de US) o después (después de US) de la administración de choque durante el entrenamiento de acondicionamiento de miedo contextual y en el ensayo a las 24 horas (h) después del entrenamiento (Ensayo) de ratones normales (tipo salvaje, WT), que sirvieron como controles y ratones Ube3a-/+ (modelo en ratón de AS, también denominadosratones)a los que se inyectó vehículo o IGF-2.(B)Porcentaje de preferencia de exploración para un objeto nuevo en comparación con un objeto familiar durante el reconocimiento de objeto nuevo de ratones WT y Ube3a-/+ a los que se inyectó vehículo o IGF-2, 20 min antes del entrenamiento, ensayados 4 h y 24 h después del entrenamiento.(C)Porcentaje de alternancias correctas (% Correcto) en un laberinto en Y de ratones WT y Ube3a-/+ a los que se inyectó vehículo o IGF-2 antes del ensayo (Ensayo).(D)Latencia para caerse de un rodillo giratorio por ratones WT y Ube3a-/+ a los que se inyectó vehículo o IGF-2, 20 min antes del Ensayo, y ensayados de nuevo 3 y 7 días después.(E)Tiempo dedicado a enterrar canicas por ratones WT y Ube3a/+ a los que se inyectó vehículo o IGF-2, 20 min antes del Ensayo.(F)Tiempo transcurrido en el centro de un campo abierto por ratones WT y Ube3a-/+ después de una inyección de vehículo o IGF-2 administrada 20 min antes del Ensayo. Las barras para cada conjunto de izquierda a derecha son: WT Vehículo, WT IGF-2, Ube3a-/+ Vehículo, y Ube3a-/+ IGF-2.

Figura 2. Caracterización de marcadores bioquímicos de hipocampo dorsal (dHC) en ratones AS en comparación con compañeros de camada WT.Análisis de transferencia Western de extractos de proteína de hipocampo completos recogidos de ratones Ube3a-/+ y compañeros de camada WT de 8 semanas de edad no entrenados (denominados sin tratamiento). Cada valor relativo se normalizó frente a la p-actina detectada en la misma transferencia (utilizada como control de carga). Todos los datos se expresan como la media ± s.e.m. y se normalizan al valor medio de ratones WT sin tratamiento. N=4 por grupo. Pruebas de t independientes. *P<0,05, **P<0,01.

Figura 3. Caracterización de marcadores bioquímicos de la corteza prefrontal media (mPFC) en ratones AS en comparación con compañeros de camada WT.Análisis de transferencia Western de extractos de proteína de hipocampo completos recogidos de la mPFC de ratones Ube3a-/+ y compañeros de camada WT de 8 semanas de edad sin tratamiento (controles no entrenados). Cada valor relativo se normalizó frente a la pactina detectada en la misma transferencia, que se utilizó como control de carga. Todos los datos se expresan como la media ± s.e.m. y se normalizan al valor medio de ratones WT sin tratamiento. N=4 por grupo. Pruebas de t independientes. *P<0,05, **P<0,01.

Figura 4. Curva de respuesta a la dosis del efecto de IGF2R.L1 (L1) (M6P) sobre nOR en ratones normales (tipo salvaje, WT).La línea de tiempo experimental se muestra arriba de los gráficos. Los datos se expresan como la media ± s.e.m. N=4 por grupo. Análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de pruebas posthoc de Bonferroni. *P<0,05, **P<0,0l. Se inyectó s.c. a ratones WT diferentes dosis de IGF2R.L1 (L1) 20 min antes del entrenamiento en nOR. Los gráficos muestran el porcentaje de preferencia de exploración para el objeto nuevo en comparación con el objeto familiar en la prueba realizada a las 4 h y 24 h después del entrenamiento.

Figura 5. M6P revierte los déficits cognitivos y motores en ratones AS.Las líneas de tiempo experimentales se muestran arriba de los gráficos. En todos los experimentos, los ratones recibieron una inyección s.c. de vehículo o 850 pg/Kg de M6P (IGF-2R.L1 o L1) (í) 20 min antes del entrenamiento o ensayo. (A) Porcentaje de preferencia de exploración para un objeto nuevo en comparación con un objeto familiar durante el paradigma nOR de ratones WT (Control) y Ube3a-/+ (AS) a los que se inyectó vehículo o IGF-2R.L1 20 min antes del entrenamiento, y ensayados a las 4 h y 24 h después del entrenamiento. N=4 /grupo. Los datos se expresan como la media ± s.e.m. Análisis bidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de pruebas post-hoc de Bonferroni. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. (B) Porcentaje de alternancias correctas (% Correcto) en un laberinto en Y de ratones WT y AS a los que se inyectó vehículo o M6P antes del ensayo (Ensayo). Los datos se expresan como la media (± s.e.m.). (C) Puntuaciones de acoplamiento de extremidad posterior de ratones WT y AS a los que se inyectó vehículo o IGF-2R.L1, 20 min antes del Ensayo. Las puntuaciones declaspingde las extremidades posteriores (distonía sostenida en las extremidades al suspender al animal de la cola) se miden y expresan como sigue: si las extremidades posteriores se despliegan consistentemente hacia fuera, lejos del abdomen, se le asigna una puntuación de 0. Si una extremidad posterior se retrae hacia el abdomen durante más del 50 % del tiempo suspendido, recibe una puntuación de 1. Si ambas extremidades posteriores se retraen parcialmente hacia el abdomen durante más del 50 % del tiempo suspendido, recibe una puntuación de 2. Si sus extremidades posteriores están completamente retraídas y en contacto con el abdomen durante más del 50 % del tiempo suspendido, recibe una puntuación de 3. Los datos se expresan en puntuaciones. B y C: N=8-14 por grupo. Análisis bidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de pruebas post-hoc de Tukey. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

Figura 6. PnM6P revierte los déficits motores y de memoria en ratones AS.Las líneas de tiempo experimentales se muestran arriba de los gráficos. En todos los experimentos, los ratones recibieron una inyección s.c. de vehículo o 850 pg/Kg de fosfonato-M6P (PnM6P) llamado IGF-2R.L2 (o L2) (í) 20 min antes del entrenamiento o el ensayo. (A) Porcentaje de preferencia de exploración para un objeto nuevo en comparación con un objeto familiar durante el paradigma nOR de ratones WT (Control) y Ube3a-/+ (AS) a los que se inyectó vehículo o L2 antes del entrenamiento, y ensayados a las 4 h, 24 h y 5 días (5d) después del entrenamiento. N=4/grupo. Los datos se expresan como el % media ± s.e.m. (B). Latencia para caer de un rodillo giratorio por ratones WT (control) y AS a los que se inyectó vehículo o L2, 20 min antes del Ensayo (Ensayol), y ensayados de nuevo dos días después (Ensayo2). Los datos se expresan en segundos (s). (C) Puntuaciones declaspingde las extremidades posteriores de ratones WT y AS a los que se inyectó vehículo o L2 antes del Ensayo. B y C: N=3-4 por grupo. Los datos se expresan en puntuaciones de las extremidades posteriores. Análisis bidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de pruebas post-hoc de Bonferroni. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

Descripción de la divulgación

La presente invención proporciona composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, tales como Síndrome de Angelman (AS) y trastorno del espectro autista (ASD). Las composiciones y métodos se refieren a ligandos del receptor de IGF-2, como se define en las reivindicaciones.

El término "tratamiento" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a la reducción o retraso en uno o más síntomas o características asociadas con la presencia de la afección particular que se está tratando, p. ej., síndrome de Angelman. El tratamiento no significa la curación completa. Por ejemplo, el tratamiento del AS en la presente divulgación significa reducir o inhibir uno o más síntomas asociados con el AS.

El término “cantidad terapéuticamente efectiva” tal y como se usa en la presente memoria es la cantidad suficiente para lograr, en una dosis única o múltiples, el propósito previsto del tratamiento. Por ejemplo, una cantidad efectiva para tratar el AS es una cantidad suficiente para aliviar uno o más síntomas del AS. Los síntomas que se alivian con el tratamiento pueden incluir uno o más de los hitos del desarrollo, habla, habilidades intelectuales, movimiento (caminar y balancearse), comportamiento social y epilepsia. La cantidad exacta deseada o requerida variará dependiendo del modo de administración, las características específicas del paciente y similares. Las cantidades efectivas apropiadas pueden ser determinadas por un experto en la técnica (tal como un médico) con el beneficio de la presente divulgación.

Cuando en esta divulgación se proporciona un rango de valores, debe entenderse que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior entre el límite superior y el inferior de ese rango, y cualquier otro valor intermedio en ese rango establecido está englobado en la invención, a no ser que se indique claramente otra cosa. Los límites superiores e inferiores de estos rangos más pequeños pueden estar incluidos de manera independiente en los rangos más pequeños englobados en la divulgación.

Tal y como se usan en esta divulgación, las formas singulares incluyen las formas plurales y viceversa, a no ser que el contexto indique claramente lo contrario.

Esta divulgación describe los efectos de los ligandos agonistas del receptor de IGF-2 en trastornos del neurodesarrollo como el Síndrome de Angelman (AS). En un aspecto, esta divulgación proporciona un método de tratamiento de un trastorno del neurodesarrollo tal como síndrome de Angelman o autismo mediante la administración a un sujeto que necesita tratamiento, de una composición que comprende uno o más ligandos agonistas del receptor de IGF-2. En esta divulgación, los términos "individuo" y "sujeto" pueden usarse indistintamente. El sujeto puede ser cualquier sujeto animal, tal como un ser humano, un animal de laboratorio, o cualquier otro animal. En una realización, el ligando agonista del receptor de IGF-2 es específico para el receptor de iGF-2 y no es un ligando para otros receptores relacionados con IGF-2 (tales como receptores de IGF-1 o insulina). Por ejemplo, el ligando agonista (también denominado en la presente memoria agente) puede ser una manosa modificada (tal como, por ejemplo, M6P), una M6P modificada (p. ej., un derivado de M6P), IGF-2, o un IGF-2 modificado o cualquier producto químico o péptido que se una al receptor de IGF-2 y active su respuesta celular. Los derivados de fosfonato y sulfonato de M6P son conocidos en la técnica (Patente de EE. UU. No.

6.140.307 de Ferguson).

Además, también se puede usar IGF-2 con sustituciones de aminoácidos tales como Leu 27 humano (Armitaj et al., Neuroscience, 2010 oct 27; 170(3): 722-30).

Las modificaciones en M6P (también referidos en la presente memoria como derivados de M6P) incluyen modificaciones en el carbono 1 y/o carbono 6 de la manosa. Los ejemplos de derivados incluyen ejemplos en los que el carbono 1 se funcionaliza con un grupo alcoxi (p. ej., metoxi, etoxi y similares) o un alquino y el carbono 6 se funcionaliza con un fosfonato, un éster etílico, un malonato de metilo, un ácido fosfónico, un carboxilato o un malonato. En diversos ejemplos, el carbono 1 se funcionaliza con un alcoxi (p. ej., un metoxi) y el carbono 6 se funcionaliza con un fosfonato (denominado en la presente memoria L2), un éster etílico (denominado en la presente memoria L3), un malonato de metilo (denominado en la presente memoria L4), un ácido fosfónico (denominado en la presente memoria L5), un carboxilato (p. ej., la sal sódica de un carboxilato) (denominado en la presente memoria L6), o un malonato (denominado en la presente memoria L7) y el carbono 1 se funcionaliza con alquino y el carbono 6 se funcionaliza con un ácido fosfónico (denominado L8) o un fosfonato (denominado L9). Las estructuras para M6P y sus derivados enumerados anteriormente se muestran a continuación: (obsérvese que solo el compuesto L2 es parte de la presente invención)

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El ligando agonista puede unirse al receptor de IGF-2 con una afinidad similar a la del IGF-2 o M6P. Se sabe que el IGF-2 se une a su receptor con una Kd de aproximadamente 40-60 nM (Williams et al., Science, 2012 nov 30, 338 (6111): 1209-1213) y M6P se une al receptor de IGF-2 con una afinidad que puede ser de aproximadamente 1 nM o aproximadamente 1 pM (dependiendo de a cuál de los dos sitios conocidos se une) (Olson et al., J. Biol., Chem. 2004 ago 6;279(32):34000-9. Epub 200428 de mayo).

En general, una dosis terapéutica del ligando del receptor de IGF-2 para la presente divulgación está en el rango de aproximadamente 1 a 10.000 microgramos/kg de peso corporal. El IGF-2 se puede usar a aproximadamente 1 a 500 pg/kg de peso corporal y todos los valores y rangos entre los mismos. Por ejemplo, el IGF-2 se puede usar a 1 a 500 pg/kg, 1 a 100 pg/kg, 1 a 50 pg/kg, 10 a 500 pg/kg, 10 a 100 pg/kg, 10 a 50 pg/kg de peso corporal. En una realización, el IGF-2 se puede usar a 10 a 45 pg/kg administrados por vía subcutánea. En realizaciones específicas, el IGF-2 puede usarse a 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 y 500 pg/kg de peso corporal.

M6P y los derivados de M6P se pueden usar a desde aproximadamente 1 hasta 2.000 pg/kg de peso corporal y todos los valores y rangos entre los mismos. Por ejemplo, M6P se puede usar a de 1 a 2.000 pg/kg, 1 a 1.500 pg/kg, 1 a 1.000 pg/kg, 1 a 500 pg/kg, 1 a 100 pg/kg, 10 a 2.000 pg/kg, 10 a 1.500 pg/kg, 10 a 1.000 pg/kg, 10 a 500 pg/kg, y 10 a 100 pg/kg, 50 a 2.000 pg/kg, 50 a 1.500 pg/kg, 50 a 1.000 pg/kg, 50 a 500 pg/kg, y 50 a 100 pg/kg de peso corporal y todos los valores entre los rangos mencionados anteriormente. En una realización, se pueden usar M6P o derivados a 850 pg/kg administrados por vía subcutánea. En una realización, se pueden usar M6P o derivados a 100 a 1.000 pg/kg. En realizaciones específicas, M6P se puede usar a 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750 y 2.000 pg/kg de peso corporal. Además, basándose en los datos proporcionados en la presente memoria en animales, un experto en la técnica puede obtener la dosificación humana relevante para M6P e IGF-2. La guía para tales conversiones es conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Nair et al., J. Basic Clin. Pharma., v 7(2), marzo 2016-mayo 2016; 27-31).

M6P puede estar presente en la forma del ácido fosfórico libre o una monosal o disal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal como, por ejemplo, como la sal de sodio, calcio, magnesio o bario. También se puede proporcionar como un compuesto que contiene M6P del cual se puede liberar in vivo, o se puede proporcionar como un precursor del cual se puede producir in vivo. Los derivados de M6P también pueden estar presentes (cuando sea aplicable (p. ej., L3, L7 y L8)) como ácidos libres o como sales de los mismos (p. ej., sales monosódicas o disódicas de los mismos).

En un aspecto, esta divulgación proporciona un método para el tratamiento de trastornos del neurodesarrollo caracterizados por retrasos del desarrollo en el habla y el movimiento, discapacidad intelectual, convulsiones en aproximadamente la edad de niño pequeño, y comportamientos inusuales y/o comportamientos repetitivos tales como aleteo de la mano. Los ejemplos de tales trastornos del neurodesarrollo incluyen el síndrome de Angelman y los trastornos del espectro autista.

El Síndrome de Angelman es un trastorno neurogenético caracterizado por retraso intelectual y del desarrollo. El AS está causado por la mutación de la ubiquitina ligasa E3 Ube3A. Los síntomas del Síndrome de Angelman pueden incluir: retrasos en el desarrollo tales como falta de gateo o balbuceo a los 6 a 12 meses, desarrollo mental atenuado, ausencia o habla mínima, ataxia (incapacidad para moverse, caminar o equilibrio adecuado), movimientos rígidos o sacudidos (p. ej., aleteo de manos), hiperactividad, temblor en los brazos y piernas, sonrisa y risa frecuentes, ataques de risa inapropiada, dientes ampliamente separados, una personalidad feliz y excitable, epilepsia, una anomalía electroencefalográfica con ondas y picos ralentizados y hendidos, convulsiones que suelen comenzar a los 2 a 3 años de edad y pueden estar acompañadas mioclono y ausencia atípica, convulsiones parciales con desviación ocular y vómitos, una cabeza pequeña que es notablemente plana en la espalda (microbraquiocefalia), ojos cruzados (estrabismo), empuje de la lengua y trastornos de succión/deglución, lengua que sobresale, comportamientos excesivos de masticación/llevarse objetos a la boca, reflejos tendinosos profundos hiperactivos de la extremidad inferior, marcha de base amplia con tobillos pronados o posicionados en valgo, sensibilidad aumentada al calor, caminar con los brazos en el aire, fascinación con el agua o artículos arrugados tales como algunos papeles o plásticos, obesidad en niños mayores, estreñimiento, una mandíbula inferior que sobresale, pigmentación ligera del cabello, la piel y los ojos (hipopigmentación), babeo frecuente, prognatismo, problemas de alimentación y/o hipotonía troncal durante la infancia, y/o escoliosis. Los síntomas no suelen ser evidentes al nacer y a menudo son evidentes en primer lugar como retrasos en el desarrollo, tales como un fracaso para gatear o balbucear entre las edades de 6 a 12 meses, así como la ralentización del crecimiento de la cabeza antes de la edad de 12 meses. Los individuos con Síndrome de Angelman también pueden sufrir de alteraciones del sueño que incluyen dificultad para iniciar y mantener el sueño, latencia prolongada del sueño, vigilia prolongada después del inicio del sueño, alto número de despertares nocturnos y tiempo total de sueño reducido, enuresis, bruxismo, terrores del sueño, sonambulismo, hipercinesia nocturna y ronquidos.

La gravedad de los síntomas para el AS puede medirse clínicamente (Williams et al., American Journal of Medical Genetics 2005 140A; 413-8) y también puede llevarse a cabo la cuantificación de la gravedad de diferentes síntomas (Lossie et al., Journal of Medical Genetics 2001, 38; 834-845; Ohtsuka et al., Brain and Development 2005, 27; 95-100). Esto puede incluir el grado de capacidad del lenguaje, grado de movilidad independiente, frecuencia y gravedad de las convulsiones, capacidad para comprender el lenguaje, adquisición de habilidades motoras, parámetros de crecimiento. Se puede utilizar un procedimiento de cribado para pacientes con sospecha de síndrome de Angelman que cuantifica la gravedad de 22 criterios distintos (Lossie et al., Journal of Medical Genetics 2001, 38). Otras mediciones de la gravedad del AS incluyen métodos psicométricos para distinguir el grado de retraso del desarrollo con respecto al logro del desarrollo psicomotor, habilidades visuales, interacciones sociales basadas en eventos no verbales, habilidades de lenguaje expresivo, habilidades de lenguaje receptivo y deterioro del habla. Se puede medir el grado de alteraciones de la marcha y del movimiento, así como la capacidad de atención y el grado de anomalías del EEG (Williams et al., American Journal of Medical Genetics 2005 140A; 413-8). A la edad apropiada, también se pueden usar pruebas de capacidad intelectual, tales como el Ensayo de Inteligencia Breve de Kaufman 2 (KBlT-2; Kaufman y Kaufman, Circle Pines, MN: American Guidance Services; 2004). Se puede usar una o más de las características anteriores para evaluar la efectividad del tratamiento con las presentes composiciones.

En una realización, los protocolos de valoración para evaluar el efecto del tratamiento incluyen examen neurológico y neurovisual y la evaluación de la función motora (p. ej., Escala de Medición de la Función Motora Gruesa), cognitiva (p. ej., Escala de Desarrollo Mental de Griffiths y Escala de Uzgiris-Hunt y pruebas de memoria de trabajo espacial); adaptativa (p. ej., Escala de Comportamiento Adaptativo de Vineland); comunicación (p. ej., Inventario de Desarrollo Comunicativo de MacArthur-Bates y grabaciones de vídeo de expresión verbal de los niños), aspectos de comportamiento (p. ej., Escala IPDDAG) y aspectos neurovisuales como se describe en Micheletti et al., (Ital J Pediatr. 2016; 42(1): 91).

Los trastornos del espectro autista (ASD) se caracterizan por una discapacidad compleja del desarrollo que interfiere con el desarrollo normal del cerebro, impactando particularmente en la interacción social y las habilidades de comunicación. Típicamente, aparece durante los primeros tres años de vida. Los individuos autistas tienen dificultades en la comunicación verbal y no verbal, interacciones sociales y actividades de ocio o juego. El deterioro en la interacción social varía desde la dificultad para iniciar y mantener la interacción, la capacidad deteriorada para reconocer y experimentar emociones, y la dificultad para procesar y apreciar los sentimientos de los demás. Los déficits de comunicación varían entre individuos autistas, con algunos individuos autistas que tienen formas de comunicación severamente limitadas a individuos que tienen habilidades lingüísticas significativas. Los comportamientos repetitivos y estereotipados incluyen rituales complejos, dificultad para adaptarse al cambio y movimientos inusuales como aleteo de manos. Algunos comportamientos característicos que pueden ser útiles para diagnosticar el autismo incluyen falta o retraso en el lenguaje hablado, uso repetitivo del lenguaje o gestos motores (aleteo de manos o giro de objetos), poco o ningún contacto ocular, fijación persistente en ciertos objetos, y falta de interés en socializar.

La administración de IGF-2, modificaciones de IGF-2 (p. ej., análogos de IGF-2), M6P o sus derivados se puede iniciar tan pronto como se hace el diagnóstico. La frecuencia y la duración del tratamiento se pueden determinar monitorizando uno o más síntomas de AS o ASD. El tratamiento puede continuarse tanto tiempo como sea necesario, incluyendo días, meses o años. El tratamiento puede continuarse incluso después de que los síntomas hayan remitido o ya no sean medibles.

Los agentes de la presente divulgación pueden proporcionarse en composiciones farmacéuticas para administración combinándolos con cualquier vehículo, excipiente y/o estabilizante farmacéuticamente aceptable adecuado. Se pueden encontrar ejemplos de vehículos, excipientes y estabilizantes farmacéuticamente aceptables enRemington: The Science and Practice of Pharmacy(2005) 2 la Edición, Filadelfia, PA. Lippincott Williams & Wilkins. Por ejemplo, M6P se puede usar como una suspensión o solución. Los vehículos adecuados incluyen excipientes o estabilizantes que no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; tonificantes tales como trehalosa y cloruro de sodio; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; tensioactivo tal como polisorbato; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como Tween o polietilenglicol (PEG). Las composiciones farmacéuticas pueden contener del 0,01 al 99 % en peso por volumen o en peso por peso del material activo (p. ej., M6P o derivado de la misma o IGF-2 o modificación (p. ej., análogos de IGF-2) del mismo).

La administración de las presentes composiciones se puede llevar a cabo utilizando cualquier vía de administración adecuada conocida en la técnica. Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar a través de la vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, oral, tópica o por inhalación. Las composiciones pueden administrarse parenteralmente o entéricamente. En una realización, las composiciones de la presente divulgación se pueden administrar por vía oral, tal como, por ejemplo, en forma de un comprimido, cápsula, píldora, polvo, pasta, gránulos, elixir, solución, suspensión, dispersión, gel, jarabe o cualquier otra forma que se pueda ingerir. La M6P y/o derivados de la misma y/o IGF-2 y/o modificaciones (p. ej., análogos de IGF-2) del mismo se pueden administrar a través de liposomas, micropartículas, microcápsulas. Las composiciones pueden introducirse como una administración única o como múltiples administraciones o pueden introducirse de una manera continua durante un período de tiempo. Por ejemplo, la o las administraciones pueden ser un número preespecificado de administraciones o administraciones diarias, semanales o mensuales, que pueden ser continuas o intermitentes, según sea clínicamente necesario y/o esté terapéuticamente indicado.

En una realización, el ligando del receptor de IGF-2 es el único componente activo. Por componente activo se entiende que es el único componente en la composición que se une específicamente al receptor de IGF-2. El ligando del receptor de IGF-2 puede ser IGF-2, modificaciones (p. ej., análogos de IGF-2) del mismo, o M6P u otros derivados de M6P. En una realización, la M6P o su derivado es el único componente activo. En una realización, la M6P o su derivado no está unido (p. ej., no está unido covalentemente ni directamente ni a través de un conector) a ningún otro resto y no actúa como un vehículo para ningún otro resto o agente. Según la presente invención, el derivado de M6P es L2.

En un aspecto, esta divulgación proporciona derivados de M6P y composiciones que comprenden derivados de manosa. Los derivados de M6P se pueden hacer realizando química en el carbono 1 y/o carbono 6 de la M6P. En la técnica se conocen diversos métodos para realizar química en el carbono 1 y/o carbono 6 de hexosas. Los ejemplos de derivados de M6P incluyen, pero no se limitan a, fosfonato (L2), éster etílico (L3), malonato de metilo (L4), ácido fosfónico (L5), carboxilato (L6), malonato (L7), alquino (L8) y profármaco de alquino (L9). Según la invención, el compuesto es L2. En una realización, esta invención proporciona una composición que comprende L2.

Los siguientes ejemplos se proporcionan como ejemplos ilustrativos y no pretenden ser restrictivos de ninguna manera.

Ejemplo 1 (Ejemplo de referencia)

Modelo de ratón utilizado:los ratones se obtuvieron criando ratones macho mutantes (B6.129S7-Ube3atm1Alb/J) que portaban una mutación de inactivación génica de Ube3A (ubiquitina proteína ligasa E3A) impresa paternalmente (pedida a Jackson labs www.jax.org; stock no. 016590), con ratones normales hembra C57BL/6J. Se criaron ratones heterocigotos hembra con ratones C57BL/6J macho; la progenie de este cruce son machos heterocigotos (transmisión materna), hembras heterocigotas (transmisión materna), machos de tipo salvaje y hembras de tipo salvaje. Esta progenie se utilizó para estudios bioquímicos y de comportamiento. Estos ratones se denominan en la presente memoria ratones y sus compañeros de camada normales ratones de tipo salvaje (WT) o ratones de control.

Tratamiento:inyección subcutánea(s.c.)de IGF-2, o solución de control del vehículo, 20 minutos antes de iniciar los procedimientos de comportamiento.

Resultados:

El IGF-2 revierte la memoria deteriorada y las respuestas motoras, así como los comportamientos repetitivos en un ratón AS.

Como medidas de aprendizaje/respuestas cognitivas, que se sabe que están alteradas en el Síndrome de Angelman (AS), se ensayaron diferentes tipos de memorias aversivas y no aversivas. Se encontró que los ratones AS exhiben un déficit robusto tanto en formas aversivas (condicionamiento de miedo contextual; CFC) como no aversivas (reconocimiento de objeto nuevo; nOR) de memoria a largo plazo. Específicamente, en el paradigma CFC, se entrenaron ratones para asociar una cámara (contexto) con un choque aversivo del pie. Se inyectó IGF-2 o solución de vehículo 20 minutos antes del entrenamiento. Ensayamos la retención de memoria un día después (un tiempo que se usa para medir la memoria a largo plazo) colocando los ratones de nuevo en la misma cámara y midiendo su comportamiento relacionado con el miedo (congelación). Encontramos que, mientras que los ratones compañeros de camada WT (controles) a los que se inyectó solución de control (vehículo) tenían una memoria fuerte, evidenciada por una respuesta de congelación robusta, los ratones AS a los que se inyectó vehículo mostraron un comportamiento de congelación significativamente menor, indicando un déficit en la retención de memoria a largo plazo (Figura 1A). Por el contrario, los ratones AS tratados con IGF-2 mostraron una congelación similar y, por lo tanto, una retención de memoria similar a la de los ratones control, lo que indica que el IGF-2 revirtió completamente el deterioro de la memoria de los ratones AS.

Encontramos resultados similares con la prueba de nOR de memoria no aversiva. Esta tarea es una prueba validada para la memoria de reconocimiento, y se basa en la tendencia espontánea de los roedores a pasar más tiempo explorando un objeto nuevo que uno familiar. Los ratones se expusieron a dos objetos idénticos en una nueva arena, y se midió el tiempo dedicado a explorar cada objeto. Posteriormente, 4 h y 24 h después de la primera experiencia, los ratones fueron devueltos a la misma arena, pero esta vez uno de los objetos fue reemplazado por un objeto nuevo, y se midió el tiempo dedicado a explorar ambos objetos. Cuando se ensayaron 4 h después del entrenamiento, como se esperaba, los ratones de control pasaron un porcentaje significativamente mayor de tiempo explorando el objeto nuevo, indicativo de memoria para el primer objeto. Por el contrario, los ratones AS no mostraron tal preferencia, y pasaron el mismo tiempo explorando ambos objetos, revelando deterioro de la memoria (Figura 1B). La inyección de IGF-2 revirtió completamente los déficits de memoria de los ratones AS como se muestra por su preferencia significativa por el objeto nuevo. Además, aunque tanto los ratones control como los ratones AS mostraron una disminución significativa de la retención de memoria cuando se ensayaron 24 h después del entrenamiento, ambos grupos de ratones tratados con IGF-2 tenían una preferencia significativa por un objeto nuevo, lo que indica que la capacidad del IGF-2 para revertir el déficit de memoria a largo plazo observado en AS es persistente.

Para valorar las estrategias exploratorias y la memoria de trabajo, empleamos un paradigma de alternancia espontánea usando un laberinto en Y de tres brazos. Encontramos que los ratones de control a los que se inyectó vehículo (WT) alternaban su exploración entre los tres brazos, mientras que los ratones AS a los que se inyectó vehículo alternaban más entre los brazos visitados recientemente antes de explorar un brazo no visitado, de una manera repetitiva (Figura 1C). Por el contrario, los ratones AS tratados con IGF-2, 20 min antes de la exposición al laberinto en Y, tenían una estrategia exploratoria similar a la de los ratones control, lo que indica que el IGF-2 revierte el comportamiento repetitivo e inflexible observado en estos ratones.

El AS también está asociado con deterioros motores robustos, que, de nuevo, se reproducen en los ratones AS. La coordinación y la capacidad motoras se evalúan de manera fiable en ratones colocándolos en un rodillo giratorio de aceleración (prueba de RotaRod). En esta prueba, se observó un déficit robusto en la capacidad motora en ratones AS tratados con vehículo en comparación con ratones control WT (Figura 1D). Sin embargo, los AS tratados con IGF-2 mostraron una mejora significativa en la capacidad motora en el RotaRod, y, de hecho, sus latencias de caída volvieron a niveles similares a las de los ratones de control normales.

También observamos una diferencia significativa en el comportamiento mostrado por los ratones AS en comparación con los compañeros de camada WT de control en la prueba de enterramiento de canicas. Cuando se colocan en una jaula doméstica vacía con lecho y canicas, los ratones normales típicamente se involucran en una cantidad modesta de comportamiento de enterramiento. En comparación con estos ratones de control, los ratones AS mostraron niveles extremadamente bajos de enterramiento, mostrando una reducción significativa tanto en el tiempo dedicado al enterramiento (Figura 1E) como en la cantidad de canicas enterradas. Sin embargo, el tratamiento con IGF-2 rescató los déficits de los ratones AS, que mostraron entonces niveles similares de enterramiento que los ratones normales.

Para medir el efecto del IGF-2 sobre el comportamiento similar a la ansiedad, empleamos campo abierto y se midió la entrada central (que mide el comportamiento de ansiedad): no se encontró ningún efecto del tratamiento con IGF-2 en ratones AS, que permanecieron alterados en comparación con el comportamiento de ratones normales (Figura 1F).

La caracterización bioquímica del hipocampo y la corteza prefrontal media en condiciones basales muestra anomalías en marcadores de la ruta de IGF-2, plasticidad y metabolismo.Realizamos un análisis de transferencia western para comparar los niveles de proteína en dos regiones cerebrales importantes para el aprendizaje y la memoria y las funciones ejecutoras, el hipocampo dorsal (dHC) y la corteza prefrontal media (mPFC) de ratones AS adultos y compañeros de camada WT en condiciones basales (permanecieron en la jaula de origen). Encontramos evidencias de alteraciones significativas en las clases de marcadores críticos para el metabolismo de la glucosa, plasticidad, función de las neuronas inhibidoras y vías de IGF-2 en el hipocampo dorsal (dHC) y la corteza prefrontal media (mPFC). Específicamente, valoramos extractos de proteína completa y sinaptoneurosomal (fracción sináptica) en AS y compañeros de camada WT para comparar los niveles de expresión de: i) Ig F-2 e IGF-2R, ii) mTOR y fosfo-mTOR, ULK-1 y fosfo-ULK-1; iii) plasticidad de neuronas excitadoras (Arc/Arg3.1, GluA1, GluA2), iv) marcadores de neuronas inhibidoras (GAD67), y v) metabolismo de glucosa/energía (LDHB, MCT1, MCT4, MCT2, GLUT1, GLUT3, pAMPK).

Los análisis llevados a cabo hasta ahora indican que, en comparación con los compañeros de camada WT, los ratones AS tienen alteraciones en los mecanismos de IGF-2/IGF-2R, plasticidad y metabolismo de glucosa en ambas regiones cerebrales. Específicamente, como se muestra en las Figuras 2 (dHC) y 3 (mPFC), los ratones AS tienen una disminución significativa en GAD67 en el dHC, lo que sugiere alteraciones en las neuronas inhibidoras. El dHC en AS también tiene una disminución significativa en la enzima metabólica lactato deshidrogenasa B (LDHB) y un aumento significativo en GLUT3, así como una fuerte tendencia de incremento de GLUT1 total, endotelial y astrocítico, lo que sugiere que el metabolismo de la glucosa en ratones AS está significativamente alterado. La subunidad del receptor AMPA, GluA2, mostró una tendencia de reducción robusta, pero no alcanzó niveles significativos. Es probable que el aumento del número de muestras revele un déficit significativo. Los niveles de IGF-2, receptor de IGF-2, subunidad de receptor AMPA GluA1, gen relacionado con plasticidad Arc/Arg3.1, proteína PSD95 enriquecida sinápticamente, pULK y los transportadores de monocarboxilato MCT1, MCT4 y MCT2 no se alteraron en condiciones basales en el dHC de ratones AS.

En la mPFC (Fig. 3) hay alteraciones más significativas en la ruta de IGF-2, con un aumento significativo de la forma madura de IGF-2 y una disminución significativa de pro-IGF-2 en el extracto de proteína total, mientras que las fracciones sinaptoneurosomales muestran una disminución dramática de una forma madura de IGF-2 y una fuerte tendencia hacia la reducción de proIGF-2 (forma inmadura) en los ratones AS en comparación con los ratones normales. Los niveles del receptor de IGF-2 no se ven afectados en la mPFC de ratones AS. Las fracciones sinaptoneurosomales también revelaron una disminución significativa del gen inmediato temprano relacionado con la plasticidad, Arc/Arg 3.1, y también hay disminuciones significativas en GluA2, pero no en GluA1. De manera similar al dHC, se encontró una disminución significativa del nivel de LDHB y una fuerte tendencia a una disminución en GLUT3 en la mPFC de ratones AS. Los niveles del marcador inhibidor neuronal GAD67 se redujeron parcialmente en la mPFC, pero todavía no alcanzaban valores estadísticamente significativos. Además, los niveles de pAMPK, PSD95, pULK y transportadores de monocarboxilato MCT1, MCT4 y MCT2 no se alteraron en la mPFC de ratones AS.

Ejemplo 2 (Ejemplo de referencia)

Este ejemplo demuestra que la administración sistémica de manosa-6-fosfato (M6P) revierte el déficit de memoria en el modelo de ratón de Síndrome de Angelman. Primero, probamos diferentes concentraciones de M6P para el efecto sobre la mejora de la memoria en ratones normales. Los resultados se muestran en la Figura 4. IGF2R.L1 es M6P.

Además, encontramos que M6P administrada sistémicamente en ratones que modelan el síndrome de Angelman (ratones Ube3a-/+, ratones AS) revierte sus deficiencias de memoria (Figura 5).

Específicamente, usamos el paradigma de reconocimiento de objeto nuevo (nOR) en ratones para valorar la memoria episódica no aversiva. En esta tarea, se usa la preferencia innata por la novedad del roedor. Durante el entrenamiento, se permite al ratón explorar 2 objetos idénticos. El día de la prueba, uno de los objetos de entrenamiento se reemplaza con un objeto nuevo. Debido a que los ratones tienen una preferencia innata por la novedad, si el ratón reconoce el objeto familiar, pasará más tiempo en el objeto nuevo.

Una inyección s.c. de M6P revirtió el deterioro de memoria de los ratones AS. Como se representa en la Figura 5A, el ensayo a las 4 h después del entrenamiento con nOR reveló que, mientras que los ratones control (compañeros de camada de tipo salvaje, WT) a los que se inyectó solución de control (vehículo) tenían una fuerte memoria, los ratones AS a los que se inyectó vehículo mostraron deterioros significativos de la memoria, confirmando sus déficits de memoria establecidos. La inyección de M6P antes del entrenamiento revertió los déficits de memoria en ratones AS, que, de hecho, tenían niveles de retención de memoria similares a los de los ratones WT control. Cuando se ensayaron a las 24 horas después del entrenamiento, los ratones tanto WT como AS mostraron una retención de memoria significativa, mientras que los ratones WT y AS a los que se inyectó vehículo se olvidaron (Figura 5A).

Como se indicó anteriormente, los ratones AS muestran déficits en las estrategias exploratorias/memoria de trabajo, medidas con un paradigma de alternancia espontánea en un laberinto en Y de tres brazos. La inyección de IGF-2R.L1 (M6P), en comparación con la inyección del vehículo, revirtió completamente el déficit (Figura 5B). El AS también está asociado con deterioros motores, que se reproducen en los ratones AS. Una prueba utilizada para valorar problemas motores es elclaspingde las extremidades posteriores, que se observa en modelos de ratones en los que los sistemas motores están deteriorados, incluyendo en enfermedades neurodegenerativas del sistema motor. Esta prueba revela elclaspingde las patas y una postura similar a la de un murciélago en ratones con déficits motores cuando se suspenden por la cola en lugar de una respuesta de flexión. Como se muestra en la Figura 5C, los ratones AS a los que se inyectó vehículo mostraron una respuesta declaspingsignificativa de las extremidades posteriores en comparación con los ratones de control WT. La inyección de IGF-2R.L1 en ratones AS redujo significativamente elclaspingde las extremidades posteriores, por lo tanto, revirtió su déficit.

Ejemplo 3

Probamos una M6P modificada: un fosfonato-M6P (PnM6P) llamado IGF-2R.L2 (o L2). Como se representa en la Figura 6, L2, inyectado a 850 pg/kg, revirtió significativamente el déficit de ratones AS en nOR y mejoró significativamente la retención de memoria de nOR en ratones WT a las 4 horas después del entrenamiento (Figura 6A). A las 24 horas después del entrenamiento, los ratones tanto WT como AS a los que se inyectó L2 mostraron una memoria significativa en comparación con los grupos a los que se inyectó vehículo. Cuando se volvieron a ensayar a las 5 horas después del entrenamiento (ensayo 5d) ninguno de los grupos (a los que se inyectó vehículo o L2) mostró memoria significativa, aunque los controles de WT mostraron una fuerte tendencia hacia la mejora de la memoria, que puede llegar a ser significativa cuando se incluya un mayor número de sujetos por grupo.

L2 también revirtió los déficits motores de ratones AS como se reveló por la prueba RotaRod (descrita en 0034). Mientras que los ratones AS a los que se inyectó vehículo mostraron un déficit significativo en la capacidad motora en comparación con los ratones de control WT (Figura 6B), los ratones AS a los que se inyectó L2 mejoraron significativamente su capacidad motora en el RotaRod, y, de hecho, sus latencias de caída volvieron a niveles similares a los de los ratones de control WT (Figura 6B).

La inyección de L2 revirtió los déficits motores según se midió mediante elclaspingde las extremidades posteriores. Mientras que los ratones AS a los que se inyectó vehículo mostraron una puntuación significativamente alta declaspingde las extremidades posteriores en comparación con los ratones de control a los que se inyectó vehículo, los ratones AS a los que se inyectó L2 volvieron a los niveles de control de su comportamiento declaspingde las extremidades posteriores (Fig. 6C).

Ejemplo 4

Este ejemplo describe la síntesis y caracterización de derivados de M6P.

Procedimientos sintéticos generales

Todas las reacciones se llevaron a cabo en material de cristal secado con llama o secado en horno bajo una presión positiva de nitrógeno o argón con agitación magnética, a menos que se afirme lo contrario. Se obtuvieron diclorometano anhidro (CH2Cb), éter dietílico (Et2O), 1,4-dioxano, tetrahidrofurano (THF), tolueno (PhMe) yN,N-dimetilformamida (DMF) haciendo pasar el disolvente a través de columnas de alúmina activada en material de cristal secado con llama. Se usaron otros disolventes y reactivos como se obtuvieron de vendedores comerciales (Acros Organics, AK Scientific, Alfa Aesar, Chem-Impex International, Combi-Blocks, Sigma-Aldrich, Strem Chemicals, Synthonix, Tokyo Chemical Industry Co.) a menos que se describa lo contrario. Se realizó cromatografía en capa fina (TLC) para monitorizar la reacción usando placas de vidrio de gel de sílice 60 prerecubiertas con indicador fluorescente F254 (Millipore Sigma) y se visualizaron mediante bloqueo de luz ultravioleta (A= 254 nm) o mediante tinción con solución acuosa de permanganato de potasio (KMnO<4>), solución acuosa ácida de molibdato amónico de cerio (IV) (CAM), solución etanólica ácida de p-anisaldehído, o solución butanólica de ninhidrina, seguido por calentamiento suave con una pistola de calor. La cromatografía en columna ultrarrápida se realizó a temperatura ambiente bajo presión de nitrógeno con gel de sílice (60 Á, 40-63 pm, Silicycle o Merck) usando columnas de vidrio o un Teledyne Isco MPLC CombiF/asfr® Rf+. Los espectros de resonancia magnética nuclear de protones (<1>H RMN) se registraron en un espectrómetro Bruker Avance III HD de 400 MHz equipado con una CryoProbe™ a 25 °C, se reportan en partes por millón (ppm, escala 8) campo abajo del tetrametilsilano (TMS, 8= 0 ppm), y se referencian internamente a las resonancias de protio residuales del disolvente de RMN (CDCb: 7,26 [CHCb], CD3OD: 4,87 [MeOH], D2O: 3,31 [H2O], C<6>D<6>: 7,16 [C<6>H<6>], (CD<3>)<2>SO: 2,50 [(CH<3>)<2>SO]). Se registraron espectros de resonancia magnética nuclear de carbono-13 (<13>C{<1>H} RMN) con protones desacoplados en un espectrómetro Bruker Avance III HD de 400 MHz equipado con una CryoProbe™ a 25 °C, se reportan en partes por millón (ppm, escala 8) campo abajo de tetrametilsilano (TMS, 8 = 0 ppm), y se referencian internamente a la línea central de resonancias de carbono-13 del disolvente de RMN (CDCb: 77,36 [CHCb], CD3OD: 49,00 [MeOH], (CD<3>)<2>SO: 39,52 [(CH<3>)<2>SO]). Se registraron espectros de resonancia magnética nuclear de fósforo-31 (<31>P{<1>H} RMN) con protones desacoplados en un espectrómetro Bruker Avance III HD de 400 MHz equipado con una CryoProbe™ a 25 °C, se reportan en partes por millón (ppm, escala 8) campo abajo del ácido fosfórico (H3PO4, 8 = 0), y se referencian externamente a una solución estándar de fosfato de trifenilo (0,0485Men CDCb, 8 = -17,7 ppm). Los datos reportados se representan como: desplazamiento químico en partes por millón (ppm, escala 8) (integración, multiplicidad, constantes de acoplamientoJen Hz, asignación de átomos). Las multiplicidades se abrevian como: s, singlete; d, doblete; t, triplete; q, cuartete; quint, quintete; sext, sextete; hept, heptete; br, ancho; m, multiplete; o combinaciones de los mismos. La espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) se llevó a cabo usando un espectrómetro de masas-cromatografía líquida (LC/MS) de tiempo de vuelo (TOF) de masa precisa Agilent 6224 en combinación con métodos de ionización química a presión atmosférica (APCI) o de ionización por electropulverización (ESI). Los espectros de infrarrojos con transformada de Fourier (FT-IR) se registraron en un espectrómetro Thermo Scientific Nicolet 6700 FT-IR referenciado a un estándar de poliestireno. Las señales se reportan como frecuencia de absorción en números de onda (cirr<1>) con descriptores abreviados como: w, débil; m, medio; s, fuerte, br, ancho. La purificación por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se realizó en un LC Agilent 1260 Infinity II con una columna semipreparativa de fase inversa (RP) Phenomenex (OOD-4439-E0 Gemini, fase C18, tamaño de partícula de 3 pm, tamaño de poro de 110 Á) con un caudal de 8 mL/min y mezclas de disolventes de ácido fórmico (FA) al 0,1 % en (A) acetonitrilo (grado HPLC) y (B) agua (grado HPLC). Las mediciones de rotación óptica se registraron en un polarímetro Jasco P-2000 con un modulador de celda de Faraday en Vidrio Flint, una fuente de luz de lámpara de sodio y un detector de tubo fotomultiplicador (PMT). Las rotaciones específicas se calcularon basándose en la ecuación [a] = (100^a)/(/*c) donde la concentracióncestá en g/100 mL y la longitud de la trayectoria/está en decímetros. Las rotaciones específicas calculadas se reportan como valores sin unidades y se representan como: rotación específica [a]DT(cconcentración, disolvente), donde la temperaturaTestá en °C y D representa la longitud de onda de monitor de línea D de sodio (589 nm).

Síntesis y caracterización de compuestos

Síntesis de L2

6-O-Trifenilmetil-a-D-manopiranósido de metilo (2)

El tritil éter2se preparó siguiendo procedimientos publicados modificados (Traboni et al.,ChemistrySelect2017, 2, 4906-4911; Tennant-Eyles et al., J.Tetrahedron: Asymmetry2000,11,231-243). A una mezcla de metil-a-D-manopiranósido (5,02 g, 25,8 mmoles, 1,0 equiv) y cloruro de tritilo (7,91 g, 28,4 mmoles, 1,1 equiv) se le añadió piridina (5,2 mL, 64,6 mmoles, 2,5 equiv). La mezcla de reacción se calentó hasta 100 °C y se agitó durante 30 min. Después de 30 min, la pasta viscosa resultante se disolvió en CH2Cl2 por ultrasonicación a 40 °C. La solución se lavó con cloruro de amonio acuoso saturado (2*), se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró a presión reducida. El residuo bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna (acetato de etilo/ hexanos del 50 % al 100 %) para proporcionar2(11,0 g, 25,2 mmoles, 98 %) como una espuma blanca. Los espectros de RMN coinciden con los reportados en la bibliografía (Traboni et al.,ChemistrySelect2017,2,4906-4911; Tennant-Eyles et al., J.Tetrahedron: Asymmetry2000, 11, 231-243).<1>H RMN (400 MHz, CDCb) 8 7,48 - 7,28 (15H, m), 4,72 (1H, d,J= 1,6 Hz), 3,92 (1H, m), 3,82 - 3,63 (3H, m), 3,50 - 3,39 (2H, m), 3,38 (3H, s), 2,73 (1H, m), 2,54 (1H, m), 2,27 (1H, m).<13>C RMN (101 MHz, CDCla) 8143,9, 128,9, 128,3, 127,5, 100,9, 87,7, 72,0, 70,64, 70,59, 70,1, 65,2, 55,3.

2,3,4-Tri-O-bencil-a-D-manopiranósido de metilo (4)

Se preparó éter bencílico3según un procedimiento publicado modificado (Hofmann et al.,Carbohydr. Res.

2015,412,34-42). Se disolvió tritil éter2(2,01 g, 4,61 mmoles) en DMF anhidro (115 mL) y a esta solución se añadió por porciones una suspensión de NaH (al 60 % en aceite mineral, 14,8 g, 371 mmoles, 7,2 equiv) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 10 min a 0 °C y a esta mezcla se le añadió lentamente cloruro de bencilo (39,1 g, 309 mmoles, 6,0 equiv) y la suspensión se agitó durante 5 min a 0°C, después se calentó hasta rt y se agitó durante 16 h. Se inactivó la mezcla de reacción con agua y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró a presión reducida para proporcionar3como un aceite amarillo viscoso, que se utilizó directamente en el siguiente procedimiento.

El alcohol4se preparó según un procedimiento publicado modificado (Jaramillo et al.,J. Org. Chem.1994, 59, 3135-3141). Se disolvió éter bencílico3en MeOH-CH<2>Cl<2>(2:1, 6 mL) y se añadió p-TsOH hasta pH < 4. La mezcla de reacción se agitó a rt durante 20 h, después se neutralizó con Et3N y se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en CH<2>Cl<2>y se lavó con agua destilada y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna (acetato de etilo/hexanos del 30 % al 60 %) para producir alcohol4(0,90 g, 1,94 mmoles, 42 %) como un jarabe amarillo claro. Los espectros de RMN coinciden con los reportados en la bibliografía (Norberg et al.,Carbohydr. Res.2017,452,35-42). 1H RMN (CDCb, 400 MHz) 87,41 - 7,30 (15H, m), 4,97 (1H, d,J= 10,9 Hz), 4,81 (1H, d,J= 12,3 Hz), 4,75 - 4,65 (5H, m), 3,99 (1H, ap. t,J= 9,4 Hz), 3,92 (1H, dd,J= 9,4, 2,9 Hz), 3,90 -3,84 (1H, m), 3,83 - 3,76 (2H, m), 3,68 - 3,62 (1H, m), 3,33 (3H, s), 2,00 (1H, ap. t,J= 6,4 Hz). 13C RMN (101 MHz, CDCb) 8138,8, 138,7, 138,6, 128,70, 128,68, 128,67, 128,3, 128,1, 128,0, 127,9, 99,6, 80,5, 75,5, 75,2, 75,0, 73,2, 72,5, 72,4, 62,7, 55,1. HRMS (APCI/LC-TOF) m/z: [M NH4]+ Calcd para C28H32O6 482,2537; Encontrado 482,2533.

2,3,4-Tri-0-bencil-6-desoxi-6-dietoxifosfinilmetileno-a-D-manopiranósido de metilo (7)

El aldehído5se preparó según un procedimiento general para la oxidación de alcoholes primarios (Tojo et al.,Oxidation of alcohols to aldehydes and ketones: a guide to current common practice.Springer Science & Business Media: 2006). Se preparó una solución de4(0,334 g, 0,72 mmoles, 0,4 M) en DMSO anhidro (1,8 mL) bajo nitrógeno. A esta solución se le añadió Et3N (1,0 mL, 7,2 mmoles, 10 equiv) y la mezcla de reacción se enfrió hasta 0 °C en un baño de agua helada y se agitó. A esta solución se añadió gota a gota una solución de complejo de trióxido de azufre-piridina (0,347 g, 2,2 mmoles, 3,0 equiv) en DMSO (1 mL) a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó hasta temperatura ambiente y se agitó durante 20 h. La solución se diluyó con CH<2>Cl<2>y se lavó con agua destilada, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida para dar5como un aceite amarillo. El aceite se filtró sobre un tapón de sílice y se usó directamente en el siguiente procedimiento.

El fosfonato7se preparó según un procedimiento publicado modificado (Vidil et al.,Eur. J Org. Chem.1999, 447-450). A una suspensión de NaH (al 60 % en aceite mineral, 37,8 mg, 0,945 mmoles, 2,2 equiv) en tolueno anhidro (2 mL) se añadió gota a gota metilendifosfonato de tetraetilo (0,27 mL, 1,08 mmoles, 2,5 equiv) y se agitó durante 30 min a rt. Se añadió gota a gota una solución de5en tolueno anhidro (5 mL) a esta mezcla bajo nitrógeno y se agitó a rt durante 2 h. La mezcla de reacción se diluyó con CH2Cl2 y se inactivó con agua destilada. La capa orgánica se extrajo con CH2Cl2 (3*), se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna (acetato de etilo/hexanos del 40 % al 100 %) para proporcionar7como un jarabe incoloro (162 mg, 0,272 mmoles, 62 %). Los espectros de RMN coinciden con los reportados en la bibliografía (Vidil et al.,Eur. J Org. Chem.1999, 447-450). [a]D20 = 40,4(c= 1,01, CHCb). 1H RMN (CDCb, 400 MHz) 87,39 - 7,27 (15H, m), 6,96 (1H, ddd,J= 22,1, 17,2, 4,3 Hz), 6,12 (1H, ddd,J= 21,2, 17,5, 1,8 Hz), 4,88 y 4,59 (2H, AMq,J= 10,6 Hz), 4,77 y 4,70 (2H, ABq, J = 12,4 Hz), 4,73 (1H, s), 4,63 (2H, s), 4,14 - 4,03 (5H, m), 3,90 (1H, dd,J= 9,3, 3,0 Hz), 3,81 - 3,77 (1H, m), 3,72 (1H, t,J= 9,5 Hz), 3,29 (3H, s), 1,31 (6H, t,J= 7,1 Hz). 13C RMN (CDCb, 101 MHz) 8148,4 (d,J= 5,8 Hz), 138,7, 138,5, 138,3, 128,7, 128,4, 128,14, 128,05, 127,9, 118,3 (d,J= 188,2 Hz), 99,6, 80,4, 78,5 (d,J= 1,9 Hz), 75,7, 75,0, 73,2, 72,7, 71,5 (d,J= 21,5 Hz), 62,1 (dd,J= 5,8, 1,3 Hz), 55,3, 16,7. 31P RMN (162 MHz, CDCb) 818,3. FT-IR (sin disolvente, cm'1 : v(C-H) = 2.982 (m), v(P=O) = 1.253 (s), v(P-O-C) = 1.024 (s), v(P-O-C) = 969 (m).

2,3,4-Tri-0-bencil-6-desoxi-6-dMsopropiloxicarboniloxi-metil-fosfinilmetileno-o-D-manopiranosido de metilo (10)

El ácido fosfónico8se preparó según un procedimiento publicado (Vidil et al.,Eur. J Org. Chem.1999, 447-450). A una solución de7(0,146 g, 0,245 mmoles, 1 equiv) en CH3CN anhidro (5,6 mL) bajo nitrógeno se añadieron piridina (31 pL, 0,392 mmoles, 1,6 equiv) y bromuro de trimetilsililo (0,32 mL, 2,45 mmoles, 10 equiv) con agitación a temperatura ambiente. Después de 2 h, la mezcla de reacción se enfrió hasta 0 °C y se añadió piridina (51 pl, 0,634 mmoles, 2,6 equiv) y H2O (185 pl, 10,3 mmoles, 42 equiv), después se calentó hasta rt y se agitó. Después de 2 h, la mezcla de reacción se diluyó con CH2Cl2 y HCl 2M(4 mL) y H2O (4 mL). La capa orgánica se extrajo con CH2O 2, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida para rendir8como un aceite marrón. El residuo bruto se usó directamente en el siguiente procedimiento.

El fosfonato10se preparó siguiendo un procedimiento modificado (Graham et al., (2017). Publicación de Solic. de Patente Internacional No. WO2017/87256). Una mezcla de8en CH3CN anhidro bajo nitrógeno se trató con DIPEA (0,480 mL, 2,76 mmoles, 9,9 equiv), TBAB (93,1 mg, 0,289 mmoles, 1,0 equiv), y carbonato de clorometil isopropilo (0,30 mL, 2,24 mmoles, 8,1 equiv), después se calentó hasta 60 °C. Después de agitar durante 16 h, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El residuo bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna (acetato de etilo/hexanos del 30 % al 100 %) para rendir10como un aceite incoloro (116 mg, 0,150 mmoles, 54 %). TLC (EtOH/EtOAc/hexanos 1,5:1,5:7): Rf = 0,49. 1H RMN (CDCb, 400 MHz) 87,40 - 7,29 (15H, m), 7,10 (1H, ddd,J= 24,5, 17,2, 3,8 Hz), 6,40 - 6,17 (1H, m), 5,80 - 5,65 (6H, m), 4,81 - 4,59 (7H, m), 4,22 -4,14 (1H, m), 3,91 (1H, dd,J= 9,3, 3,1 Hz), 3,83 - 3,78 (1H, m), 3,74 (1H, t,J= 9,5 Hz), 3,30 (3H, s), 1,32 - 1,29 (12H, m). 13C RMN (CDCb, 101 MHz) 8 153,5, 138,7, 138,5, 138,3, 128,8, 128,7, 128,6, 128,2, 128,1, 127,9, 99.7, 84,5 (d,J= 5,7 Hz), 84,4 (d,J= 6,8 Hz), 80,5, 78,3 (d,J= 2,1 Hz), 75,8, 75,0, 73,5 (d,J= 3,5 Hz), 73,3, 72.7, 71,3 (d,J= 22,3 Hz), 55,3. 31P RMN (162 MHz, CDCb) 826,3.

6-Desoxi-6-diisopropiloxicarboniloxi-metil-fosfinilmetil-a-D-manopiranosido de metilo (L2)

10 L2

La etapa final en la síntesis deL2se realizó según un procedimiento de hidrogenación publicado (Jeanjean et al.,Bioorg. Med Chem. Lett.2008,18,6240-6243). En un vial secado en horno, se secó10(36,0 mg, 0,047, 1 equiv) y se desgasificó a alto vacío. A esto se añadió Pd/C al 10 % (36,6 mg, 0,344 mmoles, 7,4 equiv) y se aclaró con CH2Ch (2 mL) y EtOH (2 mL). La mezcla de reacción se purgó por debajo de la superficie con N2 durante 1 min. La mezcla de reacción se desgasificó a continuación a presión reducida y la atmósfera se reemplazó por H2 (5x). La mezcla de reacción se agitó vigorosamente bajo H2 durante 4 h, después de lo cual la mezcla de reacción se desgasificó a presión reducida y se rellenó con N2 (5x). La mezcla de reacción se diluyó con CH2Cl2 (2 mL) y se filtró sobre un tapón de celite húmedo. La capa orgánica filtrada se concentró a presión reducida y el residuo bruto se purificó por HPLC (40 % a 85 % [H2O FA al 0,1 %]: [CH3CN FA al 0,1 %],tR(L2) = 7,00 min) para proporcionarL2(10,1 mg, 0,020 mmoles, 43 %) como un sólido blanco. Todas las constantes de acoplamiento de<13>C-<31>P están en el rango estándar de valores (Buchanan et al.,Can. J Chem.

1976,54,231-237).<1>H RMN (400 MHz, CDCb) 85,68 (2H, dd,J= 20,5 Hz,J= 5,3 Hz, H8), 5,65 (2H, dd,J= 18,3 Hz,J= 5,4 Hz, H8'), 4,93 (2H, hept,J= 6,3 Hz, H10), 4,68 (1H, s, H1), 3,95 - 3,86 (1H, br, H5), 3,74 (1H, m, H2), 3,58 (2H, m, H3, H4), 3,35 (3H, s, OCH3), 3,22 - 3,07 (1H, m, OH), 2,95 (2H, m, 2 * OH), 2,27 - 2,07 (2H, m), 2,06 - 1,86 (2H, m, H6, H6” H7, H7'), 1,32 (12H, d,J= 6,2 Hz, H11).<13>C RMN (101 MHz, CDCb) 8153,6 (d,J= 3,7 Hz, C9), 101,2 (s, C1), 84,5 (d,J= 6,3 Hz, C8), 84,3 (d,J= 6,3 Hz, C8'), 73,7 (d,J= 3,2 Hz, C10), 72,0 (s, C2), 70,9 (d,J= 16,1 Hz, C5), 70,6 (s), 70,5 (s, C3, C4), 55,3 (s, OCH3), 23 ,8 (d,J= 4,5 Hz, C6), 22,4 (s, C11), 21,7 (d,J= 142,3 Hz, C7).<31>P RMN (162 MHz, CDCb) 834,4. FT-IR (sin disolvente, cm<' 1>): v(O-H) = 3.409 (br), v(C-H) = 2.923 (m), v(C=O) = 1.760 (s), v(P=O) = 1.269 (s). LR-MS (ESI-) calcd para [M HCOO]-: 549,2; encontrado: 549,2.

Aunque la presente invención se ha descrito a través de realizaciones ilustrativas, la modificación de rutina será evidente para los expertos en la técnica y se pretende que tales modificaciones estén dentro del alcance de esta divulgación.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES 1. Un ligando agonista para el receptor de IGF-2 para su uso en el tratamiento de un trastorno del neurodesarrollo (ND) seleccionado del grupo que consiste en Síndrome de Angelman (AS) y trastorno del espectro autista (ASD), comprendiendo el tratamiento administrar a un sujeto que ha sido diagnosticado con un n D una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del ligando agonista para el receptor de IGF-2, en donde el ligando agonista para el receptor de IGF-2 es: una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. 2. El ligando agonista para el receptor de IGF-2 para su uso de la reivindicación 1, en donde el tratamiento del ND comprende aliviar: (i) uno o más de los retrasos en el desarrollo del habla, capacidad intelectual, movimiento y comportamiento social; y/o (ii) epilepsia.
3. 3. El ligando agonista para el receptor de IGF-2 para su uso de la reivindicación 1, en donde L2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en una cantidad en el rango de 1 a 2.000 pg/kg de peso corporal, preferiblemente de 1 a 500 pg/kg de peso corporal.
4. 4. El ligando agonista para el receptor de IGF-2 para su uso de la reivindicación 1, en donde L2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, no está conjugado con otro resto.
5. 5. El ligando agonista para el receptor de IGF-2 para su uso de la reivindicación 1, en donde L2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es el único agente en la composición que se une específicamente al receptor de IGF-2.
6. 6. El ligando agonista para el receptor de IGF-2 para su uso de la reivindicación 1, en donde la composición consiste esencialmente en: i) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; e ii) IGF-2.
7. 7. Un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el compuesto es L2:
8. 8. Una composición que comprende el compuesto de la reivindicación 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. 9. El ligando agonista para el receptor de IGF-2 para su uso de la reivindicación 3, en donde L2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, no está conjugado con otro resto, y opcionalmente en donde L2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es el único agente en la composición que se une específicamente al receptor de IGF-2.
10. 10. El ligando agonista para el receptor de IGF-2 para su uso de la reivindicación 2, en donde L2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en una cantidad en el rango de 1 a 2.000 pg/kg de peso corporal, preferiblemente de 1 a 500 pg/kg de peso corporal.
11. 11. El ligando agonista para el receptor de IGF-2 para su uso de la reivindicación 2, en donde L2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, no está conjugado con otro resto.
12. 12. El ligando agonista para el receptor de IGF-2 para su uso de la reivindicación 2, en donde L2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es el único agente en la composición que se une específicamente al receptor de IGF-2.
13. 13. El ligando agonista para el receptor de IGF-2 para su uso de la reivindicación 6, en donde L2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en una cantidad en el rango de 1 a 2.000 pg/kg de peso corporal, preferiblemente de 1 a 500 pg/kg de peso corporal.
14. 14. El ligando agonista para el receptor de IGF-2 para su uso de la reivindicación 6, en donde L2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, no está conjugado con otro resto.