ES2969690T3 - Lactobacillus casei o Lactobacillus paracasei para su uso en el tratamiento de infecciones por Clostridium difficile - Google Patents
Lactobacillus casei o Lactobacillus paracasei para su uso en el tratamiento de infecciones por Clostridium difficile Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere al uso de cepas específicas de Lactobacillus paracasei o de una composición que comprende dichas cepas para la prevención y/o tratamiento de una condición fisiopatológica relacionada/asociada con la infección por Clostridium difficile, preferiblemente infecciones intestinales, o la denominada CD- enfermedad asociada (CDAD) o infección por CD (CDI). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Lactobacillus caseioLactobacillus paracaseipara su uso en el tratamiento de infecciones porClostridium difficile
La presente invención versa sobre una cepa bacteriana deLactobacillus caseiDG y/oLactobacillus paracaseisegún se define en la reivindicación 1, y sobre una composición que comprende dicha cepa o dichas cepas bacterianas para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una afección fisiopatológica relacionada conClostridium difficileo asociada con la misma y/o de las lesiones histológicas causadas por dicha infección porClostridium difficilesegún se define en la reivindicación 2, preferiblemente infecciones intestinales, o lo que se denomina enfermedad asociada a CD (EACD) o infección por c D (ICD).
Técnica antecedente
ElClostridium difficilees una bacteria en forma de varilla, gram-positiva, anaeróbica, formadora de esporas, diseminada de forma generalizada en la naturaleza, tanto en el subsuelo como en el tracto intestinal de mascotas.
La contaminación por este microorganismo también se produce a través de la ruta fecal-oral; en particular, las esporas ingeridas sobreviven a la barrera ácida del estómago y germinan en el colon.
En seres humanos, elClostridium difficilepuede encontrarse en aproximadamente el 3% de adultos sanos como constituyente de la flora saprofita intestinal, y en porcentajes más sustanciales, en menores por debajo de un año de edad (15-70%).
En general,Clostridium difficileno causa ningún trastorno. Sin embargo, en ciertas condiciones, puede causar diarrea de intensidad variable y, en ciertos casos, puede estar asociado con fiebre, así como un deterioro general grave del estado de salud de una persona desde un punto de vista físico, psicológico y social. De hecho, la diarrea está acompañada, a menudo, de otros síntomas graves, tales como: náusea, vómitos, malestar general, dolores, distensión abdominal y deshidratación.
En el entorno clínico, es sabido que elClostridium difficilees principalmente responsable de una forma severa de colitis, definida como colitis pseudomembranosa, caracterizada por necrosis más o menos extensa, que afecta de manera prevaleciente al recto y al colon sigmoideo, y está acompañada, a menudo, de diarrea profusa.
Una causa de preocupación en este sentido son, en particular, varias cepas deClostridium difficile,definidas como enterotoxigénicas ya que son capaces de producir enterotoxina A y/o citotoxina B. Estas toxinas son internalizadas por la mucosa intestinal, provocando la muerte celular de los enterocitos.
El espectro de lesiones histológicas varía de una forma de tipo I, caracterizada por necrosis epitelial esporádica asociada con un infiltrado inflamatorio dentro de la luz del colon, a una forma de tipo III, caracterizada por necrosis epitelial generalizada y ulceraciones cubiertas por pseudomembranas grisáceas (de ahí la expresión colitis pseudomembranosa), compuestas por mucina, neutrófilos, fibrina y restos celulares.
La severidad de la infección intestinal porClostridium difficilees variable. Los síntomas pueden variar, de hecho, desde diarrea leve a profusa (hasta 10 litros de descargas serosas al día), con megacolon tóxico, perforación intestinal, hipocalemia, hemorragia intestinal, y sepsis. La diarrea puede estar acompañada de fiebre, náusea, anorexia, malestar general, dolor, distensión abdominal y deshidratación. La diarrea puede estar asociada con moco, sangre y fiebre. Los menores son, a menudo, portadores asintomáticos. De hecho, aunque por una parte parece que se favorece la colonización por la inmadurez de la flora bacteriana intestinal, por otra parte, la falta de evolución patológica es debida a la incapacidad de la toxina para unirse a los receptores de enterocitos, que también siguen siendo inmaduros.
A menudo, la infección se manifiesta después de terapias antibióticas agresivas y se difunde comúnmente en entornos hospitalarios. La diarrea es un efecto secundario común de las terapias antibióticas, pero una vez se suspende el fármaco al final del tratamiento, normalmente se soluciona el trastorno. Sin embargo, en el caso delClostridium,la diarrea, acompañada de otros síntomas, no muestra señales de reducción o de mejora.
Entre los factores de riesgo para la infección porClostridium difficilepodemos mencionar:
• el uso de antibióticos, especialmente los de amplio espectro (es decir, los que son capaces de eliminar diversos tipos de bacterias), también durante un periodo prolongado, o asociaciones de diferentes antibióticos para curar infecciones resistentes a antibióticos;
• la necesidad de hospitalización o estancias en otras instalaciones de tratamiento;
• cirugía del aparato digestivo;
• cirugía abdominal que afecta al intestino;
• estancias en un jardín de infantes, una guardería o una residencia de ancianos;
• problemas de colon, por ejemplo, síndrome del intestino irritable o cáncer colorrectal;
• problemas de riñón;
• sistema inmune debilitado (debido a diabetes o fármacos);
• ingesta de inhibidores de bomba de protones u otros fármacos capaces de reducir la acidez gástrica, que normalmente sirve como protección contra infecciones;
• infecciones porClostridium difficileanteriores;
• edad por encima de 65 años.
En cualquier caso, el tratamiento de la infección requiere el uso de antibióticos, especialmente aquellos que tienen particularmente como objetivo esta bacteria específica.
Como se ha hecho notar anteriormente, la mayoría de infecciones porClostridium difficilese produce en entornos tales como, por ejemplo, hospitales y residencias de la tercera edad, en los que muchos individuos toman antibióticos y están en contacto próximo los unos con los otros. La letalidad de la infección severa porClostridium difficilees considerable, tanto como para adoptar medidas profilácticas indispensables para poner freno a la enfermedad en entornos hospitalarios.
En años recientes, diversos casos han sido tratados de manera exitosa con el procedimiento de trasplante fecal.
Recurrir a probióticos ha demostrado ser efectivo en la prevención/el tratamiento de la mayoría de tipos de diarrea, comprendiendo la inducida precisamente porClostridium difficile,mediante la inhibición competitiva de los patógenos, la estabilización de la microbiota residente y la atenuación del aumento en la permeabilidad intestinal asociada, por ejemplo, con infecciones por rotavirus.
En vista de lo anterior, se percibe con claridad la necesidad de soluciones terapéuticas nuevas y/o alternativas que puedan aliviar los síntomas asociados con las anteriores afecciones y/o curar las condiciones fisiopatológicas relacionadas con infecciones porClostridium difficile,o asociadas con las mismas, preferiblemente infecciones intestinales.
El solicitante ha descubierto en el uso de probióticos basados en cepas bacterianas específicas y, opcionalmente, levaduras y/u otros microorganismos una solución a las necesidades anteriormente descritas. En particular, la presente solución propone el uso de las especies bacterianasLactobacillus caseiDG y/oLactobacillus paracasei.
De hecho, como resultado del uso de probióticos, como se describe en detalle a continuación, se observa una inhibición delClostridium difficile,evidente sobre todo a partir de ensayos de desplazamientoin vitro.
Descripción de las figuras
La presente invención será descrita en detalle a continuación, también con la ayuda de las siguientes figuras y con ejemplos que no se pretende que tengan un carácter limitante.
En particular:
- la Figura 1A muestra los resultados de ensayos de competición de adhesión, es decir, la coincubación de células eucariotas con los probióticos y con el patógeno. Más específicamente, la figura representa gráficamente la adhesión del CDIF en términos de porcentaje de células vivas y viables adherentes después de la coincubación de células HT29 con el CDIF y con los diversos probióticos sometidos a ensayo. La Figura 1B muestra los resultados de los ensayos sobre la eliminación de patógenos adherentes, es decir, el tratamiento previo de las células eucariotas con el patógeno y la subsiguiente incubación con el probiótico. Más específicamente, la figura representa gráficamente la adhesión del CDIF en términos de porcentaje de células vivas y viables adherentes después de la incubación de células HT29 con los diferentes probióticos sometidos a ensayo, después de la prueba de provocación de las células eucariotas con el CDIF.
- la Figura 2A muestra los resultados de los ensayos de exclusión de adhesión (tratamiento previo de las células eucariotas con el probiótico BIOK+ y la subsiguiente incubación con el patógeno). Más específicamente, la figura representa gráficamente la adhesión del CDIF en términos de porcentaje de células vivas y viables adherentes después de la estimulación previa por contacto de las células HT29-MTX con el producto probiótico Bio-K+ sometido a ensayo. La Figura 2B muestra los resultados de ensayos de competición de adhesión (coincubación de las células eucariotas con el probiótico y con el patógeno). Más específicamente, la figura representa gráficamente la adhesión del CDIF en términos de porcentaje de células vivas y viables adherentes después de la coincubación de las células HT29-MTX con el CDIF y con el producto probiótico Bio-K+ sometido a ensayo. La Figura 2C muestra los resultados de los ensayos sobre la eliminación de patógenos adherentes (tratamiento previo de las células eucariotas con el patógeno y la subsiguiente incubación con el probiótico). Más específicamente, la figura representa gráficamente la adhesión del CDIF en términos de porcentaje de las células vivas y viables adherentes después de la incubación de las células HT29 con los diferentes probióticos sometidos a ensayo, después de la prueba de provocación de las células eucariotas con el CDIF.
- la Figura 3 muestra los resultados del análisis comparativo entre los resultados de los ensayos realizados con ejemplos específicos de probióticos comparados con un producto comercial conocido como Bio-K+, indicado contra la infección porClostridium difficile.
Descripción detallada
En este contexto, la definición de “probiótico” es la formulada por un grupo de expertos convocados conjuntamente en 2001 por la FAO y la OMS:“microorganismos vivos que, cuando son administrados en cantidades adecuadas, confieren un beneficio de salud para el anfitrión”.En particular, en Italia, el Ministerio de Salud ha definido a los probióticos como“microorganismos que demuestran ser capaces de ejercer funciones, una vez ingeridos en suficientes cantidades, que son beneficiosos para el cuerpo”,sustancialmente haciéndose eco de la definición de las dos organizaciones mencionadas anteriormente.
ElClostridium difficile(CD en lo que sigue) es una bacteria clínicamente responsable de diversos tipos de infecciones o enfermedades/afecciones asociadas con la misma conocidas como enfermedades asociadas a CD (EACD) o infección por CD (ICD) y que pueden estar caracterizadas por diferentes grados de severidad.
De hecho, la infección puede manifestarse como diarrea leve, pero también puede resultar en colitis pseudomembranosa, megacolon tóxico y perforación intestinal. Las manifestaciones clínicas severas, con las que hay asociado sobre todo un riesgo de mortalidad, son más frecuentes si la infección es sostenida por cepas bacterianas nuevas más virulentas.
Normalmente, la infección por CD es de origen nosocomial y también se manifiesta muy frecuentemente con un carácter epidémico.
Un primer aspecto de la presente invención versa sobre la cepa bacterianaL. caseiDG® y/o la cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 definidas en la reivindicación 1, o una composición que comprende dicha o dichas cepas bacterianas para su uso en la prevención y/o en el tratamiento de una afección fisiopatológica relacionada con la infección porClostridium difficile,o asociada con la misma, y/o de la sintomatología asociada con esa afección fisiopatológica y/o las lesiones histológicas causadas por dicha infección porClostridium difficiledefinida en la reivindicación 2, preferiblemente infecciones intestinales, o lo que se denomina enfermedad asociada a CD (EACD) o infección por CD (ICD).
Dicha enfermedad asociada conClostridium difficilees seleccionada preferiblemente entre: enterocolitis pseudomembranosa, colitis pseudomembranosa, colitis sin pseudomembranas, colitis fulminante, colitis con megacolon tóxico y perforación intestinal, colitis asociada con antibióticos, diarrea asociada con antibióticos y diarrea asociada con la infección porClostridium difficile.
Ambas cepas se aislaron y depositaron por SOFAR S.p.A. La cepa bacterianaL. caseiDG®(Lactobacillus paracaseiCNCM 1-1572) se depositó en la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes del Institute Pasteur de París con el número de depósito CNCM 1-1572. Inicialmente, la cepa tenía la designaciónLactobacillus caseiDGsub. casei.La cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 se depositó con el DSMZ con el siguiente número de acceso: DSM 26760.
Las cepas deClostridium difficilea las que se hacen referencia en este contexto, son preferiblemente las definidas como enterotoxigénicas, es decir, capaces de producir enterotoxinas/citotoxinas, tales como, por ejemplo, citotoxina B y/o enterotoxina A. En un contexto más amplio, también se considerarán cepas deC. difficileque no producen toxinas y no son patógenas y cepas nuevas emergentes, que son hipervirulentas, resistentes a antibióticos e hiperproductoras de esporas.
La administración de la cepa bacterianaL. caseiDG® y/o de la cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 o de dicha composición es preferiblemente efectiva para aliviar y/o tratar y/o curar los síntomas asociados con dichas infecciones/EACD/ICD y/o las lesiones histológicas causadas por la infección por CD o la enfermedad asociada a CD.
De hecho, las infecciones/enfermedades asociadas causadas por CD pueden caracterizarse por diferentes grados de severidad. La infección puede manifestarse como diarrea leve, pero también pueden acabar causando situaciones abdominales tales como, por ejemplo, enteropatía de pérdida de proteínas y diarrea recurrente, y situaciones extraintestinales tales como, por ejemplo, bacteremia y absceso esplénico. Las manifestaciones clínicas severas, tales como la deshidratación, hipocalemia, choque séptico, colitis pseudomembranosa, megacolon tóxico y perforación intestinal, que están asociadas sobre todo con un riesgo de mortalidad, son más frecuentes si la infección es sostenida por cepas bacterianas nuevas más virulentas.
Por lo tanto, según un aspecto preferido de la presente invención, dichos síntomas asociados con dichas infecciones/EACD/ICD se seleccionan entre: diarrea, deshidratación, colitis pseudomembranosa, enteropatías, megacolon tóxico, perforación intestinal, sepsis, hemorragia intestinal e hipocalemia.
Las lesiones histológicas son preferiblemente de tipo I y/o de tipo III.
Según un aspecto preferido de la presente invención, dicha composición comprende microorganismos adicionales, preferiblemente bacterias, preferiblemente bacterias probióticas, y/o levaduras y/u hongos.
Dichas bacterias pertenecen preferiblemente a un género seleccionado entre:Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Propionibacterium, Streptococcus, Lactococcus, Aerococcus, Enterococcusy combinaciones de los mismos; más preferiblemente, dichas bacterias pertenecen al géneroLactobacillusy/oBifidobacterium.
Según un aspecto preferido adicional de la invención, las bacterias del géneroLactobacilluspertenecen al menos a las siguientes especies:Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus aviaries, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus panis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivariusyLactobacillus sanfranciscensis.
Según una realización preferida adicional, dichas bacterias que pertenecen al géneroLactobacillusno son la cepaLactobacillus acidophilusCL 1285, ni/oLactobacillus caseiLBC80R ni/oLactobacillus rhamnosusCLR2.
Según una realización adicional de la invención, dicha cepa bacterianaL. caseiDG® y/o dicha cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 o dicha composición que comprende dicha cepa o dichas cepas comprenden, además, (son usadas en combinación con) bacterias que pertenecen al géneroLactobacillusque no son la cepaLactobacillus acidophilusCL 1285, ni/oLactobacillus caseiLBC80R ni/oLactobacillus rhamnosusCLR2.
Según un aspecto preferido adicional de la invención, las bacterias del géneroBifidobacteriumpertenecen al menos a una especie seleccionada entre:B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. longum, B. adolescentis, B. catenulatum, B. angulatum, B. asteroides, B. boum, B. choerinum, B. coryneforme, B. cuniculi, B. denticolens, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B. indicum, B. inopinatum, B. lactis, B. magnum, B. merycicum, B. minimum, B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum, B. pullorum, B. ruminantium, B. saeculare, B. subtile, B. thermacidophilum B. thermophilumyB. tsurumiense;más preferiblemente seleccionada entre:Bacillus clausii, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium Bacillus halodurans, Bacillus thuringiensis, Bacillus insolitusyBacillus marinus.
Según un aspecto preferido adicional de la invención, las bacterias del géneroPropionibacteriumpertenecen al menos a una especie seleccionada entre:P. shermanii, P. acnes, P. australiense, P. avidum, P. cyclohexanicum, P. freudenreichii, P. granulosum, P. jensenii, P. microaerophilum, P. propionicumyP. thoenii.
Según un aspecto preferido adicional de la invención, las bacterias del géneroStreptococcuspertenecen al menos a una especie seleccionada entre:Streptococcus thermophilus, Streptococcus salivarius, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus canis, Streptococcus constellatus, Streptococcus downei, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equinus, Streptococcus ferus, Streptococcus infantarius, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus milleri, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus orisratti, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus peroris, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pseudopneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus ratti, Streptococcus tigurinus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus uberis, Streptococcus vestibularis, Streptococcus viridansyStreptococcus zooepidemicus.
Según un aspecto preferido adicional de la invención, las bacterias del géneroLactococcuspertenecen al menos a una especie seleccionada entre:L. chungangensis, L. formosensis, L. fujiensis, L. garvieae, L. lactis, L. piscium, L. plantarum, L. raffinolactisyL. taiwanensis.
Según un aspecto preferido adicional de la invención, las bacterias del géneroAerococcuspertenecen al menos a una especie seleccionada entre:A. urinae, A. sanguinicola, A. christensenii, A. suis, A. urinaeequiyA. urinaehominis.
Según un aspecto preferido adicional de la invención, las bacterias del géneroEnterococcuspertenecen al menos a una especie seleccionada entre:Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus haemoperoxidus, Enterococcus hirae, Enterococcus malodoratus, Enterococcus moraviensis, Enterococcus mundtii, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus raffinosusyEnterococcus solitarius.
Según un aspecto preferido adicional de la invención, las levaduras pertenecen al géneroSaccharomyces,más preferiblemente a las especiesSaccharomyces cerevisiaey/oSaccharomyces boulardii.
Dicha cepa bacterianaL. caseiDG® y/o dicha cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o dichos microorganismos adicionales están preferiblemente vivos. En este último caso, la composición resultante también es definible como un probiótico.
Alternativamente, dicha cepa bacterianaL. caseiDG® y/o dicha cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o dichos microorganismos adicionales están muertos o tindalizados.
En una realización adicional de la presente invención, dicha cepa bacterianaL. caseiDG® y/o dicha cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o dichos microorganismos adicionales tienen la forma de un lisado y/o un extracto.
En el último caso, la composición resultante también es definible como un paraprobiótico.
Alternativamente, dicha cepa bacterianaL. caseiDG® y/o dicha cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o dichos microorganismos adicionales pueden estar presentes como un componente individual de los mismos, o varios componentes, presentes en la pared bacteriana como un exopolisacárido.
En una realización adicional de la presente descripción, la composición comprende, además, los bioproductos metabólicos generados por dicha cepa bacterianaL. caseiDG® y/o por dicha cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o por dichos microorganismos adicionales definidos como posbióticos y/o cualquier otro producto derivado de bacterias.
Por lo tanto, la composición descrita anteriormente también es definible como un probiótico o un paraprobiótico o un posbiótico, conocido o supuesto, o un componente de la pared bacteriana.
En general, dichos microorganismos también comprendidos en la composición de la presente invención son microorganismos individuales o combinaciones de cualquier especie microbiana especificada en la lista de Presunción cualificada de seguridad (QPS, por sus siglas en inglés) de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, por sus siglas en inglés).
Dicha cepa bacterianaL. caseiDG® y/o dicha cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o dichos microorganismos adicionales son capaces de sobrevivir el tránsito gastrointestinal y, por lo tanto, de alcanzar el colon vivos.
Dicha cepa bacterianaL. caseiDG® y/o dicha cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o dichos microorganismos adicionales, si están presentes, son administrados en una cantidad que varía entre mil millones y 300 mil millones (o más según la necesidad), más preferiblemente de 50-250 mil millones, incluso más preferiblemente de 75-150 mil millones de células, preferiblemente células bacterianas, por administración. En el caso de una aplicación vía enema y/o trasplante fecal, dicha cepa bacterianaL. caseiDG® y/o dicha cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o dichos microorganismos adicionales, si están presentes, son administrados en una cantidad que varía entre 100 mil millones y 300 mil millones, más preferiblemente de 150 mil millones a 250 mil millones de células, preferiblemente células bacterianas/probióticos/composición por administración/aplicación.
Según un aspecto preferido, dicha cepa bacterianaL. caseiDG® y/o dicha cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o dichos microorganismos adicionales, si están presentes, preferiblemente bacterias, se toman al menos una o dos veces al día.
En la presente invención se contemplan todas las vías de administración. La administración de dicha cepa bacterianaL. caseiDG® y/o de dicha cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o de dicha composición como se ha descrito anteriormente, es preferiblemente oral, más preferiblemente en forma de pastillas, cápsulas, comprimidos, polvo granular, cápsulas de envoltura dura, gránulos que se disuelven oralmente, bolsitas, grageas o frascos bebibles.
Alternativamente, la administración de dicha cepa bacterianaL. caseiDG® y/o de dicha cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o de dicha composición como se ha descrito anteriormente, tiene forma líquida, preferiblemente un jarabe o una bebida.
Alternativamente, se produce la administración de dicha cepa bacterianaL. caseiDG® y/o de dicha cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o de dicha composición por la adición a un alimento, preferiblemente yogur, queso o zumo de frutas.
Un aspecto adicional de la presente descripción versa sobre probióticos, preferiblemente que comprenden bacterias pertenecientes a un género seleccionado entre:Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Propionibacterium, Streptococcus, Lactococcus, Aerococcus, Enterococcusy combinaciones de los mismos, o una composición que comprende dichos probióticos, para su uso en la prevención y/o en el tratamiento de una afección fisiopatológica relacionada con la infección porClostridium difficile,o relacionada con la misma, preferiblemente infecciones intestinales, o lo que se denomina enfermedad asociada a CD (EACD), o infección por CD (ICD), en donde dicho probiótico o composición está formulado de tal forma que ejerza una acción tópica, preferiblemente mediante administración rectal, preferiblemente como un enema, preferiblemente mediante un trasplante de microbiota fecal.
Las bacterias son preferiblemente la cepa bacterianaL. caseiDG® y/o la cepa bacterianaLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o dicha composición como se ha descrito anteriormente.
Las formulaciones de probióticos o la composición como se ha descrito anteriormente comprende, además, excipientes generalmente aceptados para la producción de productos probióticos y/o farmacéuticos.
Según un aspecto preferido de la invención, las formulaciones de probióticos o de la composición comprenden, además, agentes antiapelmazantes, preferiblemente dióxido de silicio y/o estearato de magnesio.
Según un aspecto preferido de la invención, la composición comprende, además, agentes de recubrimiento, preferiblemente gelatina.
En una realización adicional de la invención, las formulaciones de probióticos o de la composición comprenden, además, vitaminas, elementos de traza, preferiblemente cinc o selenio, enzimas y/o sustancias prebióticas, preferiblemente fructooligosacáridos (FOS), galactooligosacáridos (GOS), inulina, goma guar o combinaciones de los mismos.
Según un aspecto preferido de la presente invención, las formulaciones de probióticos o de la composición pueden estar asociadas o combinadas con planteamientos terapéuticos adicionales, preferiblemente de un tipo farmacológico socioconductual, preferiblemente una dieta y/o un estilo de vida saludable.
Ejemplo
Los patógenos usados en los siguientes ejemplos se obtuvieron de la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo (ATCC, por sus siglas en inglés) y pertenecen a la siguiente cepa:Clostridium difficileATCC 43255 - VPI 10463. Las cepas sometidas a ensayo fueron las siguientes:
1)L. caseiDG®(Lactobacillus paracaseiCNCM 1-1572),
2)Lactobacillus paracaseiLPC-S01; y
3) una combinación (mezcla) en una relación 1:1 deL. caseiDG®yL. paracaseiLPC-S01.
4)L. rhamnosusATCC53103 (control positivo “comercial”)
Las cepas bacterianas fueron cultivadas en agar de Rogosa(L. caseiyL. paracasei)e infusión de corazón-cerebro (BHI, por sus siglas en inglés)(Clostridium difficile)con el objetivo de verificar la capacidad de las cepas de lactobacilos de ejercer una acción inhibidora contra el CDIF.
Ensayo de adhesión para verificar la capacidad de ejemplos de probióticos de adherirse a células epiteliales intestinales
Como ejemplo de una línea celular epitelial intestinal humana capaz de producir moco, se hizo uso de HT29-MTX-E12 (ECACC). En particular, las células fueron cultivadas hasta formar monocapas confluyentes en el Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) con una concentración elevada de glucosa. El DMEM fue complementado con 10% de suero fetal bovino con 50 pg/ml de sulfato de gentaminicina y 2 mM de L-glutamina. Se mantuvieron las células en una incubadora con 5% de CO<2>a 37°C.
Antes del ensayo de adhesión, las células se lavaron con solución salina equilibrada de Hanks, fueron tripsinizadas, resuspendidas, y contadas por medio de un hemocitómetro de un único uso para que pudiesen ser sembradas en placas de múltiples pocillos con una concentración conocida. Antes de que se llevase a cabo el ensayo de adhesión, las células fueron cultivadas durante 2 días para formar una monocapa confluyente.
El día del ensayo de adhesión, se retiró el medio gastado, la monocapa se lavó con la disolución salina (solución salina equilibrada de Hanks) y se añadió a las células el medio DMEM, sin antibióticos ni glutamina, pero complementado con suero fetal bovino al 1%. La monocapa celular fue incubada durante 1 hora a 37°C con 5% de CO<2>antes de ser puesta en contacto con las bacterias. Esta operación elimina cualquier residuo de antibiótico que podría interferir con el ensayo.
Las células fueron subsiguientemente “infectadas”, observando una MDI (multiplicidad de infección) de 1:10 (células:bacterias).
Cuarenta y ocho horas después de alcanzar la confluencia, las células se lavaron e incubaron con el medio DMEM que contiene las cepas bacterianas ejemplares (cepas individuales o cepas en combinación como se ha descrito anteriormente) con una multiplicidad de infección de 1:10 (MDI, células epiteliales:bacteria).
Se llevó a cabo la incubación durante 60 minutos a 37°C con una ligera oscilación de la placa para favorecer el contacto con las células.
Al final de la incubación, se descartó el medio de cultivo, las células se lavaron con DMEM estéril para eliminar bacterias no adherentes y las células bacterianas adherentes fueron cuantificadas por medio de un recuento microbiano viable usando disoluciones en serie sembradas en placas con medio MRS agarizado incubado a 37°C de forma anaerobia.
Ensayo de exclusión de adhesión (exclusión / preincubación)
Después de que se hubo determinado el número de células HT29 por pocillo, las cepas deL. paracaseifueron añadidas tanto de forma individual como en combinación con una relación 1:1 (la mezcla).
Las bacterias se dejaron en contacto con las células mantenidas a 37°C con una ligera oscilación durante 60 min. Al final de la incubación, se retiró el medio y las células se lavaron con medio estéril para eliminar las bacterias que no se habían adherido a la monocapa.
Entonces, se añadió el CDIF (MDI 1:10) a la monocapa y las células se incubaron durante 60 min a 37°C.
Al final de la incubación, se retiró el medio de cultivo y las bacterias no adherentes se eliminaron mediante lavado con un medio estéril.
Para cuantificar el CDIF adherente a las células HT29, las células se desprendieron, en primer lugar, y luego se lisaron y las bacterias se cuantificaron por medio de un recuento bacteriano viable después de ser sembradas sobre agar selectivo deClostridium difficileen condiciones anaerobias durante 48-72 horas a 37°C.
Se usaron como control positivo células HT29 que no habían sido preincubadas con las cepas deL. paracasei,sino más bien inoculadas con CDIF solo, mientras que como control negativo (ensayo de esterilidad) se usaron las células no incubadas con ninguna bacteria.
Ensayo de competición de adhesión (competición / coincubación)
Después de que se hubo determinado el número de células HT29-MTX por pocillo, se les añadieron las dos cepas deL. paracasei(tanto de forma individual como en combinación con una relación 1:1) simultáneamente con el CDIF. Las bacterias se añadieron con una MDI general de 1:10 y en una relación probiótico:patógeno de 1:1. Las bacterias se dejaron en contacto con las células mantenidas a 37°C con una ligera oscilación durante 60 min.
Al final de la incubación, se retiró el medio y las células se lavaron con medio estéril para eliminar las bacterias que no se habían adherido a la monocapa.
Para cuantificar el CDIF adherente a las células HT29, las células se desprendieron, en primer lugar, y luego se lisaron y las bacterias se cuantificaron por medio de un recuento bacteriano viable después de ser sembradas en agar selectivo deClostridium difficileen condiciones anaerobias durante 48-72 horas a 37°C.
Se usaron como control positivo células HT29 inoculadas con CDIF solo, mientras que se usaron como control negativo (ensayo de esterilidad) las células no incubadas con ninguna bacteria.
Ensayo de la eliminación de patógenos adherentes (desplazamiento / posincubación)
Después de que se hubo determinado el número de células HT29-MTX por pocillo, se añadió el CDIF (MDI 1:10). Las bacterias se dejaron en contacto con las células mantenidas a 37°C con una ligera oscilación durante 60 min.
Al final de la incubación, se retiró el medio y las bacterias que no se habían adherido a la monocapa se eliminaron mediante lavados retirados con medio estéril. Entonces, se añadieron las dos cepas deL. paracasei(tanto de forma individual como en combinación con una relación 1:1) en una relación de probiótico:patógeno adherente de 10:1. Las bacterias se dejaron en contacto con las células mantenidas a 37°C con una ligera oscilación durante 60 min. Al final de la incubación, se retiró el medio y las células se lavaron con medio estéril para eliminar las bacterias que no se habían adherido a la monocapa.
Para cuantificar el CDIF adherente a las células, las células se desprendieron, en primer lugar, y luego se lisaron y las bacterias se cuantificaron por medio de un recuento bacteriano viable después de ser sembradas en agar selectivo deClostridium difficileen condiciones anaerobias durante 48-72 horas a 37°C.
Como control positivo se usaron células HT29-MTX inoculadas con CDIF solo, mientras que como control negativo (ensayo de esterilidad) se usaron las células no incubadas con ninguna bacteria.
Resultados
Se resumen los resultados en las Figuras 1A y 1B y demuestran que:
1) La cepaL. caseiDG® mostró una capacidad modesta para reducir directamente la adhesión de CDIF en aproximadamente el 7% en comparación con la condición de incubación de las células con el patógeno solo, mientras que la cepaL. paracaseiLPCS01 mostró mayor efectividad en la exclusión competitiva del CDIF (22% de reducción en la adhesión). La mezcla de cepas demostró ser capaz de reforzar la capacidad de inhibición, produciendo una reducción del 31% en la adhesión del CDIF (Fig. 1A).
2) La cepaL. caseiDG® mostró (Fig. 1B) una capacidad moderada para reducir la adhesión de CDIF en aproximadamente el 27% en comparación con la condición de incubación de las células con el patógeno solo, mientras que la cepaL. paracaseiLPC-S01 mostró una efectividad significativa de “eliminación” del CDIF (75% de reducción en la adhesión).
Ejemplo 2
Las cepas ejemplares se compararon con un producto comercial previsto para el mismo fin.
El patógeno usado es la misma cepa que se usó en el ejemplo anterior.
El producto Bio-K+ comprende una mezcla de:Lactobacillus acidophilusCL 1285,L. caseiLBC80R yL. rhamnosusCLR2 con una concentración declarada de 50 mil millones UFC por frasco de 98g, por lo tanto, una concentración declarada de 5,0 * 1010 UFC/98 g (5,1 * 108 UFC/g).
El producto fue sometido a un recuento decimal en un medio selectivo (procedimiento ISTISAN 08/36) para cuantificar la concentración total real de lactobacilos. La concentración de células vivas y viables fue 1,2 * 109 UFC/g, por lo tanto, aproximadamente el doble de la concentración teórica calculada.
Ensayo de exclusión de adhesión (exclusión / preincubación)
Después de que se hubo determinado el número de células HT29 por pocillo, el producto se añadió a la monocapa según una<m>D<i>de 1:10 de patógeno/probiótico. Las bacterias se dejaron en contacto con las células mantenidas a 37°C con una ligera oscilación durante 60 min. Al final de la incubación, se retiró el medio y las células se lavaron con medio estéril para eliminar las bacterias que no se habían adherido a la monocapa. Entonces, se añadió el CDIF a la monocapa (MDI 1:10) y las células se dejaron incubando durante 60 min a 37°C.
Al final de la incubación, se retiró el medio de cultivo y las bacterias no adherentes se eliminaron lavando con medio estéril. Para cuantificar el CDIF adherente a las células HT29, las células se desprendieron y se lisaron y las bacterias se cuantificaron por medio de un recuento bacteriano viable después de sembrarse en agar selectivo de Clostridium difficile en condiciones anaerobias durante 48-72 horas a 37°C.
Se usaron como control positivo los pocillos de células HT29 no preincubadas con el producto, pero inoculadas con CDIF solo, mientras que se usaron como control negativo (ensayo de esterilidad) los pocillos de células no incubadas con ninguna bacteria.
Ensayo de competición de adhesión (competición / coincubación)
Después de que se hubo determinado el número de células HT29-MTX por pocillo, se añadió el producto simultáneamente con el CDIF. Las bacterias se añadieron según una MDI general de 1:10. Las bacterias se dejaron en contacto con las células mantenidas a 37°C con una ligera oscilación durante 60 min. Al final de la incubación, se retiró el medio y las células se lavaron con medio estéril para eliminar las bacterias que no se habían adherido a la monocapa. Para cuantificar el CDIF adherido a las células HT29, las células se desprendieron y se lisaron y las bacterias se cuantificaron por medio de un recuento bacteriano viable después de sembrarse en agar selectivo de Clostridium difficile en condiciones anaerobias durante 48-72 horas a 37°C. Se usaron como control positivo los pocillos de células HT29 inoculadas con CDIF solo, mientras que se usaron como control negativo (ensayo de esterilidad) los pocillos de células no incubadas con ninguna bacteria.
Ensayo de eliminación de patógenos adherentes (desplazamiento / posincubación)
Después de que se hubo determinado el número de células HT29-MTX por pocillo, se añadió el CDIF (MDI 1:10). Las bacterias se dejaron en contacto con las células mantenidas a 37°C con una ligera oscilación durante 60 min.
Al final de la incubación, se retiró el medio y las bacterias que no se habían adherido a la monocapa se eliminaron mediante lavados retirados con medio estéril. Entonces, el producto se añadió en una relación de bacterias/células de 10:1 como es habitual. Las bacterias se dejaron en contacto con las células mantenidas a 37°C con una ligera oscilación durante 60 min. Al final de la incubación, se retiró el medio y las células se lavaron con medio estéril para eliminar las bacterias que no se habían adherido a la monocapa. Para cuantificar el CDIF adherente a las células, las células se desprendieron y se lisaron y las bacterias se cuantificaron por medio de un recuento bacteriano viable después de sembrarse en agar selectivo de Clostridium difficile en condiciones anaerobias durante 48-72 horas a 37°C. Se usaron como control positivo los pocillos de células HT29-MTX inoculadas con CDIF solo, mientras que se usaron como control negativo (ensayo de esterilidad) los pocillos de células no incubadas con ninguna bacteria.
Resultados
Los resultados mostrados en la Fig. 2A consideran la adhesión de CDIF en términos de porcentaje de células vivas y viables que se adhieren después de la preestimulación por contacto de las células HT29-MTX con el producto probiótico sometido a ensayo. En otras palabras, cuando se asigna un valor de 100 a la adhesión de CDIF en la ausencia de estimulación por probióticos, la capacidad de inhibición de las cepas sometidas a ensayo se expresó como una reducción porcentual en la adhesión de CDIF en comparación con el control positivo.
Como puede observarse, el producto sometido a ensayo demostró ser capaz de reforzar la capacidad de inhibición produciendo, por lo tanto, una reducción muy elevada en la adhesión de CDIF, igual a 90%.
Además, se verificó la posible reducción en la adhesión de CDIF a las células HT29-MTX después de un tratamiento simultáneo de la línea celular con los probióticos y el patógeno para valorar el efecto, de haberlo, de la inhibición competitiva ejercida por los probióticos cuando están coincubados con CDIF.
Se usaron como control positivo los pocillos de células HT29 inoculadas con CDIF solo, mientras que se usaron como control negativo (ensayo de esterilidad) los pocillos de células no incubadas con ninguna bacteria.
Los resultados mostrados en la Fig. 2B consideran la adhesión de CDIF en términos de porcentaje de células vivas y viables adherentes después de la coincubación de células HT29-MTX con CDIF y con los diferentes probióticos sometidos a ensayo. Como se ha descrito anteriormente, cuando se asigna un valor de 100 a la adhesión de CDIF en la ausencia de estimulación por probióticos, la capacidad de inhibición de las cepas sometidas a ensayo se expresó como una reducción porcentual en la adhesión de CDIF en comparación con el control positivo.
Como puede observarse, el producto sometido a ensayo demostró ser capaz de reforzar la capacidad de inhibición produciendo, por lo tanto, una reducción de aproximadamente el 30% en la adhesión de CDIF.
Por último, se verificó si hubo alguna reducción en la adhesión de CDIF en las células HT29-MTX después del pretratamiento de la línea celular con el patógeno y la subsiguiente incubación con los probióticos después de la eliminación del patógeno no adherente.
Se usaron como control positivo los pocillos de células HT29 inoculadas con CDIF solo, mientras que se usaron como control negativo (ensayo de esterilidad) los pocillos de células no incubadas con ninguna bacteria.
Los resultados mostrados en la Fig. 2C consideran la adhesión de CDIF en términos de porcentaje de células vivas y viables adherentes después de la incubación de células HT29 con los diversos probióticos sometidos a ensayo, después de la prueba de provocación de las células eucariotas con el CDIF. Como se ha descrito anteriormente, cuando se asigna un valor de 100 a la adhesión de CDIF en la ausencia de estimulación por probióticos, la capacidad de inhibición de las cepas sometidas a ensayo se expresó como una reducción porcentual en la adhesión de CDIF en comparación con el control positivo.
Como puede observarse, el producto sometido a ensayo demostró una capacidad de inhibición muy modesta, produciendo, por lo tanto, una reducción de aproximadamente el 8% en la adhesión de CDIF.
La siguiente tabla resume los intervalos de recuento de CDIF obtenidos en 2 ensayos sucesivos en comparación con una carga de patógeno inicial de aproximadamente 1,0 * 106 UFC, para los 3 protocolos diferentes sometidos a ensayo.
Comparando los datos obtenidos durante el presente estudio con los relacionados con las cepasL. caseiDG®,L. paracaseiLPC-S01 y la mezcla de las 2 cepas, que fueron el objeto de investigaciones anteriores, fue posible crear el perfil mostrado a continuación:
Ensayo de exclusión de adhesión (pretratamiento de células eucariotas con los probióticos y subsiguiente incubación con el patógeno)
Ensayo de competición de adhesión (coincubación de células eucariotas con los probióticos y con el patógeno)
Ensayo de eliminación de patógenos adherentes (pretratamiento de las células eucariotas con el patógeno y subsiguiente incubación con el probiótico)
Los resultados generales mostrados en las 3 tablas demuestran que:
1) la cepaL. paracaseiLPC-S01 es la más efectiva; en particular, durante los ensayos de desplazamiento mostró una capacidad muy elevada de inhibición contra el CDIF (75%). En otras palabras, la cepaL. paracaseiLPC-S01 actúa después de la adhesión del patógeno y lo elimina, a diferencia del producto comercial sometido a ensayo, que realiza solamente una función preventiva, dado que evita que el patógeno CD se adhiera a las células; en este caso, la cepaL. paracaseiLPC-S01 sometida a ensayo también funciona cuando el patógeno CD ya es adherente; y 2) la combinación 1:1 deL. caseiDG®L. paracaseiLPC-S01 mostró un interesante efecto sinergético con respecto a la reducción en la capacidad adhesiva del CDIF con respecto a la línea celular. La combinación reveló ser ventajosa en comparación con las cepas individuales en los protocolos de pretratamiento y de coincubación mientras que, en los ensayos de desplazamiento, la cepaL. paracaseiLPC-S01 demostró ser más efectiva que la combinación de los 2 probióticos.
Claims (11)
1. Una cepa bacteriana identificada comoLactobacillus caseiDG depositada en la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes del Institute Pasteur con el número de depósito CNCM 1-1572 y/o una cepa bacteriana identificada comoLactobacillus paracaseiLPC-S01 depositada en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen con el número de depósito OSM 26760 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una afección fisiopatológica relacionada con la infección porClostridium difficileo asociada con la misma y/o de la sintomatología asociada con esa afección fisiopatológica y/o de las lesiones histológicas causadas por dicha infección porClostridium difficile.
2. Una composición que comprende la o las cepas bacterianas según la reivindicación 1 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una afección fisiopatológica relacionada con la infección porClostridium difficileo asociada con la misma y/o de la sintomatología asociada con esa afección fisiopatológica y/o de las lesiones histológicas causadas por dicha infección porClostridium difficile.
3. La o las cepas bacterianas de la composición para su uso según la reivindicación 1 o 2, en las que dicha infección porClostridium difficilees una infección intestinal.
4. La o las cepas bacterianas o la composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en las que dicha afección fisiopatológica relacionada con la infección porClostridium difficileo asociada con la misma, está seleccionada entre: enterocolitis pseudomembranosa, colitis pseudomembranosa, colitis pseudomembranosa sin pseudomembranas, colitis fulminante, colitis con megacolon tóxico y perforación intestinal, colitis asociada con antibióticos, diarrea asociada con antibióticos, diarrea asociada con infección porClostridium difficile.
5. La o las cepas bacterianas o la composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en las que dicha sintomatología asociada con dicha infección/EACD/ICDC está seleccionada entre: diarrea, deshidratación, colitis pseudomembranosa, enteropatías, megacolon tóxico, perforación intestinal, sepsis, hemorragias intestinales e hipocalemia.
6. La o las cepas bacterianas o la composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en las que dicha composición comprende microorganismos adicionales, preferiblemente bacterias, preferiblemente bacterias probióticas, y/o levaduras y/u hongos.
7. La o las cepas bacterianas o la composición para su uso según la reivindicación 6, en las que dichas bacterias pertenecen a un género seleccionado entre:Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Propionibacterium, Streptococcus, Lactococcus, Aerococcus, Enterococcusy combinaciones de los mismos; preferiblemente dichas bacterias pertenecen al géneroLactobacillusoBifidobacterium.
8. La o las cepas bacterianas o la composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en las que dichoLactobacillus caseiDG® y/o dichoLactobacillus paracaseiLPC-S01 y/o dicho cualquier microorganismo adicional son administrados en una cantidad que varía entre mil millones y 300 mil millones, preferiblemente de 50 mil millones a 250 mil millones, más preferiblemente de 75 mil millones a 150 mil millones, de células, preferiblemente células bacterianas, para cada ingesta.
9. La o las cepas bacterianas o la composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en las que dicha cepa y/o dicha composición se toman al menos una o dos veces al día.
10. La o las cepas bacterianas o la composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, formuladas para la administración oral, preferiblemente en forma de pastillas, cápsulas, comprimidos, polvo granular, opérculos, gránulos orosolubles, bolsitas, pastillas revestidas de azúcar o frascos bebibles; o en forma líquida, preferiblemente un jarabe o una bebida; o añadidas a los alimentos, preferiblemente yogur, queso o zumo de frutas.
11. La o las cepas bacterianas o la composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, formuladas para una acción tópica, preferiblemente mediante administración rectal, preferiblemente como enema, preferiblemente mediante trasplante de microbiota fecal.
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