ES2969938T3

ES2969938T3 - Incretina para tratamiento de la presión intracraneal elevada

Info

Publication number: ES2969938T3
Application number: ES21194436T
Authority: ES
Inventors: Alex Sinclair
Original assignee: Invex Therapeutics Ltd
Current assignee: Invex Therapeutics Ltd
Priority date: 2014-09-03
Filing date: 2015-08-25
Publication date: 2024-05-23
Anticipated expiration: 2035-08-25
Also published as: HRP20211634T1; LT3188747T; WO2016034851A1; US11738067B2; DK3188747T3; PT3188747T; JP2017530955A; US20210030848A1; SI3188747T1; GB201415598D0; EP3188747A1; HUE057000T2; US10835579B2; ES2894860T8; ES2894860T3; US20170232073A1; EP3188747B1; EP4000630A1; EP4000630B1; US20240000896A1

Abstract

Se proporciona una incretina, o un análogo de la misma, un agonista del receptor de incretina, un potenciador de incretina, o cualquier combinación de los mismos, para su uso en un método para reducir la presión intracraneal (PIC) elevada en un sujeto. Los métodos para reducir la PIC elevada en un sujeto pueden comprender administrar una incretina, o un análogo de la misma, un agonista del receptor de incretina, un potenciador de incretina o cualquier combinación de los mismos al sujeto. La PIC elevada puede estar asociada con hipertensión intracraneal idiopática (HII), pseudotumor cerebral secundario, hidrocefalia, hidrocefalia de presión normal, presión intracraneal elevada secundaria a un tumor cerebral, meningitis, traumatismo cerebral, lesión cerebral y trombosis de los senos venosos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Incretina para tratamiento de la presión intracraneal elevada

Campo de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento del aumento indeseable de la presión intracraneal que puede deberse a irregularidades en la secreción de líquido cefalorraquídeo (CSF) dentro/desde el cerebro. Se observa un aumento de la presión intracraneal, por ejemplo, en sujetos con hidrocefalia, hidrocefalia de presión normal, y meningitis.

Antecedentes de la invención

La presión intracraneal elevada (ICP) puede deberse a un aumento de la presión del líquido cefalorraquídeo (CSF), el líquido que rodea el cerebro y la médula espinal. Un aumento de la ICP es una afección médica grave, ya que el aumento de la presión puede provocar daños en el cerebro o la médula espinal al presionar estructuras importantes del cerebro y restringir el flujo sanguíneo al cerebro. Por tanto, se requieren tratamientos eficaces para aliviar la ICP elevada.

Una afección asociada con la ICP elevada es la IIH, también conocida como hipertensión intracraneal benigna o pseudotumor cerebral, que es una afección de etiología desconocida caracterizada por una ICP elevada y papiledema. La IIH es una condición que se encuentra en mujeres obesas (90% de las incidencias), que causa dolores de cabeza diarios incapacitantes y pérdida visual, que es severa y permanente hasta en un 25% de los casos (1). Faltan tratamientos efectivos y van desde terapias médicas no probadas hasta procedimientos quirúrgicos con morbilidad asociada y poca eficacia a largo plazo (8). Entre la población femenina obesa, la incidencia de IIH es de 20 por 100,000. En todo el mundo, el número de personas obesas se ha duplicado desde 1980, con un 22.7% de la población del Reino Unido caracterizada como obesa (índice de masa corporal (IMC)>30kg/m2) (2) y, en consonancia con la epidemia mundial de obesidad, la prevalencia de IIH se espera que aumente y, en consecuencia, contribuya con una morbilidad significativa a la población joven con obesidad.

Aunque se desconoce la etiología de la IIH, se cree que está relacionada con una dinámica alterada del CSF, con una producción aumentada de CSF en el plexo coroideo (CP) y/o drenaje restringido del CSF en el tejido de granulación aracnoideo (AGT)(3).

La revisión Cochrane de 2005 concluyó que no había pruebas suficientes para determinar qué tratamientos eran potencialmente beneficiosos y cuáles dañinos en la IIH (4); por lo tanto, no existen pautas específicas con respecto al tratamiento de la IIH. Sin embargo, por lo general, los inhibidores de la anhidrasa carbónica se han utilizado con el objetivo de reducir la ICP, aunque faltan pruebas de eficacia (5). El topiramato, un inhibidor de la anhidrasa carbónica con propiedades de pérdida de peso, ha sido evaluado en IIH y se encontró que induce la pérdida de peso, pero este ensayo es difícil de interpretar ya que no se observó ningún beneficio terapéutico en IIH por encima de la cohorte de control tratada con acetazolamida (los grados del campo visual mejoraron desde el valor inicial en ambos grupos, pero no hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos) (6).

En casos de deterioro de la visión, se utilizan técnicas quirúrgicas como la derivación del líquido cefalorraquídeo (CSF) o la fenestración de la vaina del nervio óptico para prevenir la ceguera (7). La incidencia de procedimientos de derivación de CSF para reducir la ICP está aumentando rápidamente en los Estados Unidos. En consonancia con las crecientes cifras de obesidad (7). Sin embargo, la derivación en sí está lejos de ser un tratamiento satisfactorio de la IIH y, por supuesto, es muy invasiva. A los pacientes que esperan una derivación y que sufren dolores de cabeza incapacitantes con presiones muy altas también se les puede ofrecer punciones lumbares repetidas para reducir la ICP y, por lo tanto, ofrecer un alivio sintomático.

Uno de los objetos de la presente invención es proporcionar un procedimiento para reducir la ICP elevada, tal como se observa en pacientes que padecen hidrocefalia, hidrocefalia de presión normal, o meningitis. También está entre los objetos de la presente invención obviar y/o mitigar al menos una de las desventajas mencionadas anteriormente.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, se proporciona una incretina, un agonista del receptor de incretina o cualquier combinación de estos, para su uso en un procedimiento de reducción de la presión intracraneal elevada (ICP) en un sujeto, en el que la ICP elevada a tratar está asociada con hidrocefalia, hidrocefalia de presión normal, o meningitis.

Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se plantea la hipótesis de que la activación del receptor GLP-1 en las células epiteliales del plexo coroideo puede conducir a la conversión de a Tp en AMPc, lo que a su vez conduce a la activación de la proteína quinasa A (PKA) que fosforila el intercambiador de Na+H+ dando como resultado su inhibición. Se espera que una reducción en el transporte de Na+ desde la sangre al CSF dé como resultado una reducción en el movimiento del agua y, por lo tanto, en la producción de CSF.

Por tanto, de acuerdo con la presente invención, se puede pretender que la incretina, tal como GLP-1 o análogo del mismo, un agonista del receptor de incretina o combinaciones de estos de la presente invención actúe sobre los receptores de GLP-1 que se encuentran en las células epiteliales del plexo coroideo.

Como se usa en la presente memoria, el término "GLP-1" debe entenderse que incluye un polipéptido de péptido 1 (GLP-1) similar al glucagón de origen natural y/o variantes o análogos de GLP-1 de origen natural o artificial, incluyendo pero no limitado a GLP-1 (7-36) amida y GLP-1 (7-37). El GLP-1 natural tiene una vida media relativamente corta en el plasma, ya que es susceptible a la degradación enzimática por la enzima DPP IV. Por tanto, varios análogos de GLP-1 están diseñados para tener una vida media más larga y/o ser resistentes a la degradación de DDP IV. Ejemplos de tales polipéptidos GLP-1 se describen, por ejemplo, en la publicación de patente de los Estados Unidos No 2008/0015144 y la publicación de patente de los Estados Unidos No 2011/0274747.

Los ejemplos específicos de análogos de GLP-1 incluyen Albglutide (comercializado por GSK) y Liraglutide (comercializado por Novo Nordisk)

Los agonistas del receptor de incretinas, tales como GLP-1, incluyen miméticos de las incretinas que están diseñadas para actuar de manera similar a la incretina misma. Los ejemplos de miméticos de GLP-1 incluyen exenatidas y análogos de estas. La exenatida-3, por ejemplo, está presente en las secreciones salivales de Heloderma horridum (lagarto perlado mexicano), y la exenatida-4 está presente en las secreciones salivales de Heloderm sospechosum (monstruo de Gila) (Eng, J., et al., J. Biol Chem., 265: 20259-62, 1990; Eng, J. et al., J. Biol. Chem., 267: 7402-05, 1992). Además de las exenatidas naturales, se conocen análogos de estas y pueden encontrar aplicación en la presente invención. Los análogos de exenatida se describen, por ejemplo, en los documentos WO 99/07404, WO 99/25727, WO 99/25728, WO 99/40788, WO 00/41546, WO 00/41548, WO09035540.

El término "agonista", como se usa en la presente memoria, significará un agente (por ejemplo, ligando o compuesto) que en virtud de unirse a un receptor de incretina, como el receptor de GLP-1, activa el receptor para provocar una respuesta intracelular mediada por el receptor.

Por "agonista de exenatida" se entiende un compuesto que imita los efectos de una exenatida, por ejemplo, sobre la motilidad y el vaciamiento gástricos (es decir, un compuesto que se une eficazmente al receptor en el que las exenatidas ejercen su acción sobre la motilidad y el vaciado gástricos, preferiblemente un análogo o derivado de una exenatida) o un compuesto, por ejemplo, que imita los efectos de la exenatida sobre la reducción de la ingesta de alimentos al unirse al receptor o receptores donde la exenatida causa este efecto.

Un ejemplo específico de una molécula de exenatida es la exenatida que actualmente comercializan Amylin Pharmaceuticals, Inc. y Eli Lilly and Company.

Como también se describe en el presente documento (que no forma parte de la invención), un "derivado" incluye cualquier molécula de base o análogo que tenga una modificación química dentro, unida o ligada a, o asociada con la molécula. Tales modificaciones químicas pueden incluir enlazadores internos (por ejemplo, espaciadores o inductores de estructura) o moléculas adjuntas, tales como moléculas potenciadoras del peso molecular (por ejemplo, polietilenglicol (PEG)), o moléculas dirigidas a tejidos. Se conocen en la técnica ejemplos de tales moléculas, por ejemplo, péptidos insulinotrópicos, que incluyen GLP-1 y exenatida, modificados con un grupo maleimida se describen en la patente de los Estados Unidos No 6,593,295.

Como también se describe en el presente documento (que no forma parte de la invención), una "variante" incluye cualquier modificación de la molécula base, análogo o variante no incluida en los términos "análogo" y "derivado", como sería conocido por un experto en la técnica. Por ejemplo, las variantes pueden incluir proformas o quimeras de una molécula seleccionada. Se incluyen moléculas pequeñas en los compuestos útiles en la invención en la medida en que se unen a un receptor para GLP-1 o exenatida. No todas las moléculas de péptidos descritas como incretinas, péptido 1 similar al glucagón (GLP-1), exenatidas o análogos, derivados o variantes pueden unirse a un receptor para GLP-1, aunque todavía son útiles en la invención por en virtud de una farmacología que no depende de un receptor GLP-1 conocido. Estas moléculas aún pueden poseer las actividades biológicas deseadas descritas en la presente memoria. Otros compuestos incluyen los descritos en la patente de los Estados Unidos No 6,569,832; 6,528,486; 6,514,500; 6,458,924; 6,451,987; 6,451,974; 6,268,343.

En determinadas realizaciones de la presente invención, para evitar dudas, el análogo o agonista de GLP-1 no es un agonista del receptor 3 de tipo bombesina (BRS-3), como se describe, por ejemplo, en el documento WO07027225.

Como se mencionó anteriormente, el GLP-1 natural es susceptible de degradación por la enzima DPP IV. Por lo tanto, otra forma de mejorar la eficacia de GLP-1 es administrar un inhibidor de DDP IV.

El término "inhibidor de DPP-IV", como se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto que se une a DPP-IV e inhibe la actividad dipeptidil peptidasa de DPP-IV. El término "inhibidor selectivo de DPP-IV", como se usa en la presente memoria, se refiere a un inhibidor de DPP-IV que tiene selectividad por DPP-PV sobre peptidasas estrechamente relacionadas, como una o más de la enzima de escisión posterior a la prolina (PPCE), dipeptidil peptidasa II (DPP-II), dipeptidil peptidasa 8 (DPP-8) y dipeptidil peptidasa 9 (DPP-9).

Se describen ejemplos de inhibidores de DPP-IV en Villhauer et al., J Med Chem (2003) 46: 2774-2789, para LAF237; Ahren et al., J Clin Endocrinol Metab (2004) 89: 2078-2084; Villhauer et al., J Med Chem (2002) 45: 2362-2365 para NVP-DPP728; Ahren et al., Diabetes Care (2002) 25: 869-875 para NVP-DPP728; Peters et al., Bioorg Med Chem Lett (2004) 14: 1491-1493; Caldwell et al., Bioorg Med Chem Lett (2004) 14: 1265-1268. Edmondson et al., Bioorg Med Chem Lett (2004) 14: 5151-5155; y Abe et al., J Nat Prod (2004) 67: 999-1004. Los ejemplos específicos de inhibidores de DPP-IV incluyen, pero no se limitan a, derivados de dipéptidos o miméticos de dipéptidos tales como alaninapirrolidida, isoleucina-tiazolidida y el pseudosustrato de N-valil prolilo, 0-benzoilhidroxilamina, como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No 6,303,661. Se pueden encontrar ejemplos de inhibidores de DPP-IV en la patente de los Estados Unidos números 6,812,350, 6,803,357, 6,710,040, 6,617,340, 6,699,871, 6,573,287, 6,432,969, 6,395,767, 6,303,661,6,242,422, 6,166,063.

Se pueden encontrar más ejemplos de inhibidores de DPP-IV en las solicitudes internacionales WO 04/103993, WO 04/103276, WO 04/99134, WO 04/87053, WO 04/76434, WO 04/76433, WO 04/69162, WO 04 / 64778, WO 04/71454, WO 04/69162, WO 04/67509, WO 04/58266, WO 04/52850, WO 04/50022, WO 04/50658, WO 04/32836, WO 04/46106, WO 04/43940, WO 04/41795, WO 04/37169, WO 04/37181, WO 03/101958, WO 04/14860, WO 04/07468, WO 04/04661, WO 03/82817, WO 03/72528, WO 03/57666, WO 03/57144, WO 03/40174, WO 03/37327, WO 03/35067, WO 03/35057, WO03 / 22871, WO 03/15775, WO 03/04498, WO 03/02530, WO 03/02596, WO 03/02595, WO 03/02593, WO 03/02553, WO 03/02531, WO 03/00181, WO 03/00180, WO 03/00250, WO 02/83109, WO 02/83128, WO 02/76450, WO 02/51836, WO 02/34900, WO 01/96295, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/68603 WO 01/34594, WO00/34241, WO 00/23421, WO 99/67278, WO 99/61431, WO 98/19998, WO 97/40832.

Ejemplos de inhibidores específicos de DDP IV incluyen vildagliptina, saxagliptina, azetidina, sitagliptina, omarigliptina, alogliptina y linagliptina.

Los agentes descritos en la presente memoria pueden administrarse solos o en combinación. Además, también se pueden usar en combinación con otros agentes farmacéuticos. Los propios agentes o combinaciones de agentes pueden quedar a discreción del médico que seleccionaría las dosis utilizando su conocimiento general común y los regímenes de dosificación conocidos por un médico experto.

Cuando un compuesto de la invención se administra en terapia de combinación con uno, dos, tres, cuatro o más, preferiblemente uno o dos, preferiblemente otro agente terapéutico, los compuestos pueden administrarse simultánea o secuencialmente. Cuando se administran secuencialmente, se pueden administrar a intervalos muy cortos (por ejemplo, durante un período de 5 a 10 minutos) o en intervalos más largos (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4 o más horas de diferencia, o incluso con períodos más largos cuando sea necesario), siendo el régimen de dosificación preciso acorde con las propiedades del agente o agentes terapéuticos. Además, debe apreciarse que en una terapia de combinación, no es necesario administrar cada componente de la misma manera. Por ejemplo, una terapia puede administrarse mediante inyección y otra terapia mediante administración oral.

Los compuestos de la invención también se pueden administrar junto con tratamientos no químicos tales como radioterapia, terapia fotodinámica, terapia génica; cirugía y/o dietas controladas.

El sujeto es típicamente un animal, por ejemplo, un mamífero, especialmente un ser humano. En una realización, no se considera que el sujeto sea clínicamente obeso y/o esté siendo tratado por diabetes.

Por una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz se entiende una que es capaz de lograr la respuesta deseada, y será adjudicada, típicamente, por un médico. La cantidad requerida dependerá de uno o más de al menos el (los) compuesto(s) activo(s) en cuestión, el paciente, la condición que se desea tratar o prevenir y la formulación del orden de 1 |jg a 1 g de compuesto por kg de peso corporal del paciente que se está tratando.

En algunas realizaciones, la incretina o el agonista del receptor de incretina se administra a una dosis de al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 5 jg de compuesto por kg de peso corporal del sujeto que se está tratando. La dosis puede ser menor de 20, menor de 15 o menor de 10 jg/kg. En algunas realizaciones, la dosis es de 1 a 10, de 2 a 8 o de 3 a 6 jg/kg, por ejemplo 5 jg/kg.

En algunas realizaciones, un agonista del receptor de incretina, como una exenatida (por ejemplo, exenatida-4), se administra a una dosis de 1 a 10, de 2 a 8 o de 3 a 6 jg/kg, por ejemplo 5 jg/kg.

Asimismo, se pueden administrar diferentes regímenes de dosificación, de nuevo típicamente a discreción del médico. Los agentes pueden administrarse al menos por administración diaria, aunque los regímenes en los que el agente(s) es (o son) administrado con menos frecuencia, por ejemplo, cada dos días, semanal o quincenalmente, por ejemplo, también están incluidos en la presente invención.

Por tratamiento se entiende en la presente memoria al menos una mejora de una afección sufrida por un paciente; no es necesario que el tratamiento sea curativo (es decir, que resulte en la eliminación de la afección). De manera análoga, las referencias en la presente memoria a la prevención o profilaxis en la presente memoria no indican ni requieren la prevención completa de una afección; en cambio, su manifestación puede reducirse o retrasarse mediante profilaxis o prevención según la presente invención.

Como se describe en la presente memoria, los compuestos o sal fisiológicamente aceptable, solvato, éster u otro derivado funcional fisiológicamente aceptable de los mismos descritos en la presente memoria pueden presentarse como una formulación farmacéutica, que comprende el compuesto o sal fisiológicamente aceptable, éster u otro derivado fisiológicamente funcional del mismo, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables del mismo y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos y/o profilácticos. Cualquier vehículo es aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial para el receptor de este.

Ejemplos de sales fisiológicamente aceptables de los compuestos según la invención incluyen sales de adición de ácido formadas con ácidos carboxílicos orgánicos tales como ácidos acético, láctico, tartárico, ácidos maleico, cítrico, pirúvico, oxálico, fumárico, oxaloacético, isetiónico, lactobiónico y succínico; ácidos sulfónicos orgánicos tales como ácidos metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico y p-toluensulfónico y ácidos inorgánicos tales como ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosfórico y sulfámico.

Como también se describe en el presente documento (que no forma parte de la invención), los derivados fisiológicamente funcionales de los compuestos de la presente invención son derivados que pueden convertirse en el cuerpo en el compuesto original. Dichos derivados fisiológicamente funcionales también pueden denominarse "profármacos" o "bioprecursores". Los derivados fisiológicamente funcionales de los compuestos descritos en la presente memoria incluyen ésteres o amidas hidrolizables, particularmente ésteres, in vivo. La determinación de ésteres y amidas fisiológicamente aceptables adecuados está bien dentro de las habilidades de los expertos en la técnica. Los derivados también pueden incluir la modificación de un agente para incluir un grupo, tal como un PEG u otro grupo que pueda tener un efecto fisiológico deseable sobre el agente.

Puede ser conveniente o deseable preparar, purificar y/o manipular un solvato correspondiente de los compuestos descritos en la presente memoria, que puede usarse en cualquiera de los usos/procedimientos descritos. El término solvato se usa en la presente memoria para referirse a un complejo de soluto, tal como un compuesto o sal del compuesto, y un disolvente. Si el disolvente es agua, el solvato puede denominarse hidrato, por ejemplo monohidrato, dihidrato, trihidrato, etc., dependiendo del número de moléculas de agua presentes por molécula de sustrato.

Se apreciará que los agentes de la presente invención pueden existir en diversas formas estereoisoméricas y los compuestos de la presente invención como se definieron anteriormente incluyen todas las formas estereoisoméricas y mezclas de estas, incluyendo enantiómeros y mezclas racémicas. La presente invención incluye dentro de su alcance el uso de cualquier forma estereoisomérica o mezcla de estereoisómeros, incluidos los enantiómeros individuales de los compuestos de fórmulas (I) o (II), así como mezclas total o parcialmente racémicas de dichos enantiómeros.

Los compuestos de la presente invención pueden prepararse usando reactivos y técnicas fácilmente disponibles en la técnica.

Las formulaciones farmacéuticas incluyen aquellas adecuadas para administración oral, tópica (incluyendo dérmica, bucal y sublingual), rectal o parenteral (incluyendo subcutánea, intradérmica, intramuscular e intravenosa), nasal y pulmonar, por ejemplo, por inhalación. La administración nasal y/o bucal puede ser particularmente preferida en ciertas realizaciones. La formulación puede, cuando sea apropiado, presentarse convenientemente en unidades de dosificación discretas y puede prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Los procedimientos típicamente incluyen la etapa de asociar un compuesto activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos y luego, si es necesario, dar forma al producto en la formulación deseada.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral en las que el vehículo es un sólido se presentan más preferiblemente como formulaciones de dosis unitarias tales como bolos, cápsulas o comprimidos que contienen cada uno una cantidad predeterminada de compuesto activo. Se puede preparar una tableta por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada un compuesto activo en una forma fluida tal como un polvo o gránulos opcionalmente mezclados con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, agente lubricante, agente tensioactivo o agente dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando un compuesto activo con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden estar opcionalmente revestidos y, si no están revestidos, opcionalmente pueden estar marcados. Las cápsulas pueden prepararse llenando un compuesto activo, ya sea solo o mezclado con uno o más ingredientes accesorios, en las cubiertas de las cápsulas y luego sellándolas de la manera habitual. Los cachés son análogos a las cápsulas en las que un compuesto activo junto con cualquier ingrediente o ingredientes accesorios se sellan en un sobre de papel de arroz. También se puede formular un compuesto activo como gránulos dispersables, que pueden, por ejemplo, suspenderse en agua antes de la administración o espolvorearse sobre los alimentos. Los gránulos se pueden envasar, por ejemplo, en un sobre. Las formulaciones adecuadas para administración oral en las que el vehículo es un líquido pueden presentarse como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua.

Las formulaciones para administración oral incluyen formas de dosificación de liberación controlada, por ejemplo, tabletas en las que un compuesto activo se formula en una matriz de control de liberación apropiada, o se recubre con una película de control de liberación adecuada. Tales formulaciones pueden ser particularmente convenientes para uso profiláctico.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración rectal en las que el vehículo es un sólido se presentan más preferiblemente como supositorios de dosis unitaria. Los vehículos adecuados incluyen manteca de cacao y otros materiales comúnmente usados en la técnica. Los supositorios se pueden formar convenientemente mediante la mezcla de un compuesto activo con el vehículo o vehículos ablandados o fundidos seguido de enfriamiento y conformación en moldes.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones o suspensiones estériles de un compuesto activo en vehículos acuosos u oleaginosos.

Las preparaciones inyectables pueden adaptarse para inyección en bolo o infusión continua. Tales preparaciones se presentan convenientemente en envases de dosis unitaria o multidosis que se sellan después de la introducción de la formulación hasta que se requieran para su uso. Alternativamente, un compuesto activo puede estar en forma de polvo que está constituido con un vehículo adecuado, tal como agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. La vía de administración inyectable particularmente preferida en determinadas realizaciones puede incluir la administración intraarterial, tal como a través de las arterias carótidas y/o ventrales, o la administración intraventricular y/o intratecal a los ventrículos cerebrales o mediante una punción lumbar. La administración cerca del sitio de acción o del líquido que se lleva al cerebro puede resultar ventajosa. Puede ser posible utilizar incretinas, como GLP-1, incluso cuando son susceptibles de degradación por las enzimas DPP IV en tales situaciones. En ciertas realizaciones de la presente invención, puede ser deseable que los tratamientos previstos por la presente invención traten sustancialmente la IPC elevada y no tengan un efecto fuera del cerebro.

Un compuesto activo también se puede formular como preparaciones de depósito de acción prolongada, que se pueden administrar mediante inyección intramuscular o mediante implantación, por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular, o en el intestino, por ejemplo, las preparaciones de depósito pueden incluir, por ejemplo, materiales poliméricos o hidrófobos adecuados o resinas de intercambio iónico. Tales formulaciones de acción prolongada son particularmente convenientes para la administración profiláctica y/o prolongada.

Las formulaciones adecuadas para la administración pulmonar a través de la cavidad bucal se presentan de tal manera que las partículas que contienen un compuesto activo y deseablemente tienen un diámetro en el intervalo de 0.5 a 7 micrómetros se administran en el árbol bronquial del receptor.

Como una posibilidad, tales formulaciones están en forma de polvos finamente triturados que pueden presentarse convenientemente en una cápsula perforable, adecuadamente de, por ejemplo, gelatina, para uso en un dispositivo de inhalación, o alternativamente como una formulación autopropulsada que comprende un compuesto activo, un propulsor líquido o gaseoso adecuado y opcionalmente otros ingredientes tales como un tensioactivo y/o un diluyente sólido. Los propulsores líquidos adecuados incluyen propano y los clorofluorocarbonos, y los propulsores gaseosos adecuados incluyen dióxido de carbono. También se pueden emplear formulaciones autopropulsadas en las que se dispensa un compuesto activo en forma de gotitas de solución o suspensión.

Tales formulaciones autopropulsadas son análogas a las conocidas en la técnica y pueden prepararse mediante procedimientos establecidos. Adecuadamente, se presentan en un recipiente provisto de una válvula de funcionamiento manual o automático que tiene las características de pulverización deseadas; ventajosamente, la válvula es de tipo medido que suministra un volumen fijo, por ejemplo, de 25 a 100 microlitros, en cada operación de esta.

Como posibilidad adicional, un compuesto activo puede estar en forma de solución o suspensión para su uso en un atomizador o nebulizador mediante el cual se emplea una corriente de aire acelerada o agitación ultrasónica para producir una fina niebla de gotitas para inhalación.

Las formulaciones adecuadas para la administración nasal incluyen preparaciones generalmente similares a las descritas anteriormente para la administración pulmonar. Cuando se distribuyen, estas formulaciones deberían tener deseablemente un diámetro de partícula en el intervalo de 10 a 200 micrómetros para permitir la retención en la cavidad nasal; esto se puede lograr mediante, según sea apropiado, el uso de un polvo de un tamaño de partícula adecuado o la elección de una válvula apropiada. Otras formulaciones adecuadas incluyen polvos gruesos que tienen un diámetro de partícula en el rango de 20 a 500 micrómetros, para administración por inhalación rápida a través del pasaje nasal desde un recipiente cerca de la nariz, y gotas nasales que comprenden de 0.2 a 5% p/v de un compuesto activo en solución o suspensión acuosa u oleosa. De particular relevancia para la presente invención es la capacidad de un agonista de GLP-1 administrado por vía intranasal para alcanzar el cerebro y el CSF en altas concentraciones (20), (37). Por tanto, en determinadas realizaciones preferidas de la presente invención, el agente o agentes de la invención se pueden administrar por vía nasal.

Debe entenderse que además de los ingredientes portadores antes mencionados, las formulaciones farmacéuticas descritas anteriormente pueden incluir uno o más ingredientes portadores adicionales apropiados, tales como diluyentes, tampones, agentes aromatizantes, aglutinantes, agentes tensoactivos, espesantes, lubricantes, conservantes (incluidos antioxidantes) y similares, y sustancias incluidas con el fin de hacer que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, tampón fosfato 0.1 M y preferiblemente 0.05 M o solución salina al 0.8%. Además, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluidos medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactato o aceites fijos. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares.

Las formulaciones adecuadas para la formulación tópica se pueden proporcionar, por ejemplo, como geles, cremas o ungüentos. Tales preparaciones pueden aplicarse directamente o transportarse sobre un soporte adecuado, como un vendaje, gasa, malla o similar, que puede aplicarse en y sobre el área a tratar.

Las formulaciones terapéuticas para uso veterinario pueden estar convenientemente en forma de polvo o concentrado líquido. De acuerdo con la práctica estándar de formulación veterinaria, los excipientes convencionales solubles en agua, tales como lactosa o sacarosa, pueden incorporarse a los polvos para mejorar sus propiedades físicas. Por tanto, los polvos particularmente adecuados de esta invención comprenden del 50 al 100% p/p preferiblemente del 60 al 80% p/p del ingrediente(s) activo(s) y 0 a 50% p/p y preferiblemente 20 a 40% p/p de excipientes veterinarios convencionales. Estos polvos pueden añadirse a los piensos para animales, por ejemplo, mediante una premezcla intermedia, o diluirse en el agua de bebida de los animales.

Los concentrados líquidos de esta invención contienen adecuadamente el compuesto o un derivado o sal de este y pueden incluir opcionalmente un solvente miscible en agua veterinariamente aceptable, por ejemplo polietilenglicol, propilenglicol, glicerol, glicerol formal o tal disolvente mezclado con hasta 30% v/v de etanol. Los concentrados líquidos se pueden administrar al agua de bebida de los animales.

Descripción detallada

La presente invención se describirá ahora con más detalle a modo de ejemplo y con referencia a las figuras que muestran:

La figura 1 es un diagrama que representa las posibles rutas del GLP-1 desde el intestino hasta el plexo coroideo. El GLP-1 es secretado por las células L en respuesta a los nutrientes en el intestino. El GLP-1 se difunde a través de la lámina basal y entra en los capilares o activa el nervio vago. Una vez en el torrente sanguíneo, el GLP-1 podría transportarse directamente al plexo coroideo donde se uniría a los receptores GLP-1 en la superficie basal de las células epiteliales del plexo coroideo. Alternativamente, la señal puede transmitirse a través del nervio vago que hace sinapsis con el núcleo del tracto solitario (NTS). Las neuronas del NST también producen GLP-1 y sus fibras se proyectan a áreas del cerebro, incluido el hipotálamo, que están en contacto con el ventrículo y el CSF. Por lo tanto, el GLP-1 puede secretarse en el CSF, lo que le permite unirse a los receptores de GLP-1 en la superficie apical de las células epiteliales del plexo coroideo. Célula En - célula endotelial, célula CPe - célula epitelial del plexo coroideo;

La figura 2 es una representación esquemática de la influencia del GLP-1 en la homeostasis de fluidos. (A) En el túbulo proximal del riñón, la unión de GLP-1 al GLP-1R estimula la conversión de ATP en AMPc por la adenilato ciclasa. El AMPc activa la proteína quinasa A (PKA) que fosforila el intercambiador de Na+ H+ dando como resultado su inhibición. Esto evita la reabsorción de Na+ del lumen del túbulo proximal al torrente sanguíneo. (B) Se plantea la hipótesis de que el GLP-1 tiene un efecto similar en el plexo coroideo como el GLP-1R está presente en las células epiteliales del plexo coroideo. Una reducción en el transporte de Na+ desde la sangre al CSF daría como resultado una reducción en el movimiento del agua y la producción de CSF;

La figura 3 muestra los efectos de la exenatida-4 sobre los niveles intracelulares de Na+ en explantes de plexo coroideo de rata. Los niveles intracelulares de Na+ se observaron utilizando verde de sodio (iNa+) (tecnologías de vida). Brevemente, los explantes de plexo coroideo de rata se incubaron con iNa+ durante 30 minutos antes del tratamiento con CSF artificial (sin tratamiento) o CSF artificial Exenatida-4 durante 3 horas. La intensidad de la fluorescencia se correlaciona directamente con la cantidad de Na+ intracelular. Hubo un mayor número de células epiteliales del plexo coroideo fluorescentes intensas sin tratamiento (A) en comparación con el tratamiento con Exenatida-4 (B). Esto sugiere que el transporte de Na+ al interior de la célula se redujo, posiblemente a través de la inhibición del intercambiador de Na+/H+ mediada por Exenatida-4. (C) La contratinción con DAPI, un marcador nuclear, demuestra que el N+ es intracelular;

La figura 4 muestra el receptor de GLP-1 y la tinción de NA+K+ATPasa en el plexo coroideo. Imagen representativa de GLP-1R (imagen roja izquierda) y Na+K+ATPasa (imagen verde central) en el plexo coroideo. Se observó tinción con GLP-1R en el citoplasma de las células epiteliales del plexo coroideo. GLP-1R también estaba presente en la superficie apical como lo indica la colocalización con Na+K+ATPasa - imagen de la mano derecha. Se utilizó DAPI (azul) como marcador nuclear genérico;

La figura 5 muestra los efectos de la localización del receptor de GLP-1 después de la estimulación con un agonista de GLP-1. Imágenes representativas de tinción de GLP-1R (verde) en explantes de plexo coroideo tratados con CSF artificial (aCSF), Exenatida-4 (agonista de GLP-1R) y Exenatida-9 (antagonista de GLP-1R) durante los períodos de tiempo indicados. En aCSF (A, B) GLP-1R se observó tinción en todo el citoplasma de las células epiteliales del plexo coroideo, con una mayor intensidad de tinción en la superficie apical y en la unión entre las células (punta de flecha blanca). Con la adición de Exenatida-9 (C), la tinción positiva de GLP-1R se restringió a la membrana apical después de 15 minutos. (D) La tinción positiva para GLP-1R no pareció estar localizada en la membrana basal de las células epiteliales del plexo coroideo o en las células endoteliales (flechas blancas). (E) Quince minutos de tratamiento con Exenatida-4 también provocaron la reubicación del GLP-1R a la superficie apical de las células epiteliales del plexo coroideo. Sin embargo, a los 30 minutos, el receptor se internalizó (F). Se utilizó DAPI (azul) como marcador nuclear genérico, barra de escala - 20 pm;

La Figura 6 muestra un gráfico que muestra los niveles de AMPc en el tejido del plexo coroideo después de la estimulación con un agonista de GLP-1 y otros agentes. Histograma de la media ±<s>E<m>de los niveles de AMPc en explantes de plexo coroideo en los 3 grupos. Los niveles normales de AMPc observados con aCSF aumentaron después de la adición de Exenatida-4 (agonista de GLP-1R) durante 3 horas. La forskolina, un activador de la adenilato ciclasa, actuó como control positivo de los niveles de AMPc;

La figura 7 muestra la expresión de ARNm y proteína de GLP-1R en el hipotálamo, la glándula pituitaria, el hígado y el plexo coroideo de rata. (A) Los niveles de ARNm de GLP-1R se determinaron mediante QPCR y se compararon con un gen de referencia (18S). El histograma representa la media de ± SEM de la expresión de ARNm de GLP-1R (unidades arbitrarias). Se detectaron niveles altos de ARNm de GLP-1R en el hipotálamo donde el GLP-1 tiene la mayor parte de su acción, y la pituitaria mostró una expresión mínima de ARNm de GLP-1R. También se detectó ARNm de GLP-1R en el plexo coroideo. (B) Análisis de transferencia Western de los niveles de proteína GLP-1R que muestra una sola banda observada a 53kDa. Se observaron niveles altos de proteína GLP-1R en el hipotálamo y niveles más bajos en la glándula pituitaria y el plexo coroideo. Estos estudios demuestran que el plexo coroideo expresa ARNm y proteína de GLP-1R;

La figura 8 muestra el cambio en la expresión de GLP-1R después de la estimulación con agonista en explantes de coroides de rata. (A) El histograma representa la media de ± SEM del cambio de veces en el ARNm de GLP-1R desde el valor inicial. Los niveles de ARNm de GLP-1R aumentaron en los explantes del plexo coroideo después de 3 horas de tratamiento y luego volvieron a los niveles basales a las 6 horas. (B) El histograma representa la media de ± SEM de los niveles de proteína GLP-1R en comparación con la p-actina (unidades arbitrarias). Los niveles de proteína GLP-1R también se elevaron a las 3 y 6 horas.

La figura 9 muestra el cambio en GLP-1R en células CPe en comparación con los explantes de plexo coroideo. (A) El histograma representa la media de ± SEM del cambio de veces en el ARNm de GLP-1R de los explantes del plexo coroideo a las células CPe (B) es un análisis de transferencia Western de los niveles de proteína GLP-1R. Se mostraron niveles más altos de ARNm y proteína de GLP-1R en las células CPe en comparación con los explantes del plexo coroideo;

La figura 10 muestra el efecto de Exenatida-4 sobre los niveles de AMPc y la actividad Na+K+-ATPasa en células CPe. (A) El histograma representa el cambio de veces en los niveles de AMPc en comparación con el control. La forskolina se utilizó como control positivo. La exenatida-4 aumentó significativamente los niveles de AMPc en las células CPe en comparación con el control. (B) La actividad de Na+K+-ATPasa se midió determinando la concentración de fosfato inorgánico generado por la hidrólisis de ATP que era sensible a la ouabaína (un inhibidor de Na+K+-ATPasa). En estos estudios, las células CPe de rata primarias, cultivadas como una monocapa en insertos de membrana permeable, se trataron durante 30 minutos con aCSF (n = 5) o Exenatida-4 100nM (n = 6), en presencia o ausencia de Ouabaína 1mM. El histograma representa la actividad ± SEM de Na+K+-ATPasa sensible a ouabaína (% de cambio con respecto al control). La exenatida-4 redujo significativamente (** P <0.01) la actividad de Na+K+-ATPasa en el plexo coroideo en comparación con el control;

La figura 11 muestra el efecto de Exenatida-4 sobre la presión intracraneal (ICP) en ratas conscientes. A las ratas se les colocó un perno de presión de ICP epidural 2 días antes de las mediciones de ICP. Se registró un valor inicial antes de que las ratas recibieran una inyección subcutánea de solución salina (n = 6) o 20 pg/kg de Exenatida-4 (n = 7). (A) Trazas de ICP de solución salina (azul) y tratamiento con Exenatida-4 (rojo). Los picos en la traza representan cuando el animal se está moviendo (*) y el registro correcto de la ICP se determinó por la respuesta a la compresión de la vena yugular. (B) Gráfico de líneas que muestra el cambio porcentual desde el valor inicial ± SEM después del tratamiento con solución salina o Exenatida-4 medido cada 5 minutos durante 60 minutos. Exenatida-4 redujo significativamente la presión en comparación con la solución salina dentro de los 10 minutos posteriores al tratamiento y duró los 60 minutos completos. ** P <0.01, **** P <0.0001.

La figura 12 es un histograma que muestra el efecto de dosis bajas de Exenatida-4 sobre ICP. Se realizaron registros de la ICP de la ICP inicial, 30 y 60 minutos después del tratamiento. El histograma muestra el cambio porcentual en la ICP desde el valor inicial ± SEM con 1 pg/kg (n = 4), 3 pg/kg (n = 5) y 5 pg/kg (n = 4) Exenatida-4 a los 30 minutos y 60 minutos después del tratamiento; y

La figura 13 es un gráfico de líneas que muestra el efecto de dosis bajas de Exenatida-4 sobre ICP durante un período de 24 horas. El gráfico muestra el cambio porcentual desde el valor inicial ± SEM después del tratamiento con 5 pg/kg de Exenatida-4 medido durante un período de 24 horas.

Ejemplo 1

La dinámica desordenada del CSF es la base de la etiología de la IIH. La secreción de CSF del plexo coroideo (CP) es un factor clave en la regulación de la ICP y está controlada por una serie de canales iónicos, principalmente el intercambiador basal de Na+/H+ (10) que impulsa el transporte de sodio (Na+) al epitelio CP y es el paso limitante de la velocidad de la bomba apical de Na+K+ ATPasa que bombea Na+ hacia los ventrículos, creando un gradiente osmótico para conducir agua al CSF (11,12). La secreción de CSF es totalmente inhibida por la ouabaína, un inhibidor de la ATPasa Na+K+, y se reduce significativamente por la inhibición del intercambiador Na+/H+ (10;13-15). Existe una escasez de investigación sobre los mecanismos que controlan la secreción de CSF.

Las incretinas, principalmente el péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) y el polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP) se secretan predominantemente desde el intestino delgado distal en respuesta a una comida. El GLP-1 [GLP-1 (7-37)] es un péptido hormonal de 30 aminoácidos producido por el procesamiento postraduccional del proglucagón en las células L del intestino distal y las células alfa en el páncreas y el núcleo del tracto solitario en el tallo cerebral. El GLP-1, que estimula la liberación de insulina y la proliferación de las células beta pancreáticas, reduce la glucosa en sangre en los diabéticos y también promueve la saciedad y la pérdida de peso (9; 16). El GLP-1 activo se degrada rápidamente (vida media <3 minutos) por la dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4) a sus metabolitos inactivos. Las estrategias terapéuticas incluyen inhibidores de agonistas de DDP-4 o GLP-1 (por ejemplo, liraglutida y exenatida-4) y se utilizan actualmente para tratar la diabetes y la obesidad.

Si bien se sabe que los efectos de las incretinas se reducen en pacientes obesos no diabéticos (17), existe un debate sobre si esto se debe a una actividad alterada o niveles reducidos de secreción de GLP-1. Varios estudios han encontrado niveles más bajos de estimulación postcomida con GLP-1 en los obesos (18; 19) y una correlación negativa con el peso (17). Después de la pérdida de peso, los niveles de GLP-1 medidos durante 3 horas se recuperan parcialmente (19). Las terapias con incretinas también se asocian y se utilizan terapéuticamente para impulsar la pérdida de peso (9).

El GLP-1 envía señales de forma centralizada principalmente a través del GLP-1R, un receptor de proteína acoplado a G expresado en tipos de células seleccionados dentro de la glándula pituitaria, el hipotálamo, el hipocampo, la corteza olfativa, los órganos circunventriculares y, curiosamente, el plexo coroideo (19). El GLP-1 atraviesa la barrera hematoencefálica (20), sin embargo, las vías por las que el GLP-1 secretado por el intestino ejerce efectos centrales son objeto de debate: 1) unión a aferentes vagales o 2) a través de la barrera hematoencefálica (21) (figura 1). El nervio vago también puede estimular la producción de GLP-1 en el núcleo del tracto solitario con una red densa y extendida de fibras de GLP-1 que llegan a los ventrículos y al CSF (22).

Es relevante para la presente invención el hallazgo de que el GLP-1 tiene efectos sobre la secreción renal de sodio, reduciendo la resorción de sodio y aumentando la diuresis (23-26). El GLP-1 media la mayoría de sus acciones a través de su receptor específico (GLP-1R) (27), cuya activación estimula el AMPc (28). En el túbulo proximal del riñón, se ha demostrado que el GLP-1 actúa a través de un mecanismo dependiente de la proteína quinasa A (PKA) que reduce significativamente la resorción de sodio en el intercambiador N+/H+ (29; 30). Las acciones diuréticas de las incretinas han llevado a la sugerencia de su uso como agentes antihipertensivos (30) y varios ensayos clínicos activos están estudiando esto (ClinicalTrials.gov Identifier; NCT01755572 y NCT00696982). Es de interés el papel de la inflamación en la modulación del sistema de incretinas renales (3; 31; 32).

La generación de CSF por el plexo coroideo es impulsada por la secreción epitelial de sodio por la Na+/K+ ATPasa en un mecanismo análogo al de un túbulo proximal renal invertido. Sugerimos que de manera similar a la modulación renal de la diuresis y la absorción de sodio por incretinas, la secreción de sodio del plexo coroideo también puede ser modulada por incretinas. Sugerimos que la activación del receptor GLP-1, con el consecuente aumento intracelular de AMPc y PKA que a su vez fosforila y consecuentemente inhibe el intercambiador basal N+/H+ y así impidiendo la generación de Na+K+ATPasa del CSF (figura 2). En apoyo de esto, se proporcionan datos que demuestran que la exenatida-4 (un análogo de GLP-1) puede reducir el sodio intracelular, potencialmente a través de la inhibición del intercambiador N+/H+ (figura 3). También mostramos la colocalización de la expresión de GLP-1R y Na+K+ATPasa en el plexo coroideo - ver figura 4. Curiosamente, notamos efectos clínicamente beneficiosos sobre la ICP en pacientes con IIH tratados con diuréticos como furosemida. El tratamiento de explantes de plexo coroideo con un agonista de GLP-1, exenatida-4, dio como resultado la estimulación del receptor de GLP-1 y niveles aumentados de AMPc (ver figuras 5 y 6), que apoyan la hipótesis de cómo los agentes de la presente invención pueden funcionar para dar como resultado una disminución en la ICP elevada a través de una reducción en la producción de CSF por las células del plexo coroideo.

Las incretinas, tales como GLP-1, agonistas de GLP-1 y/o inhibidores de DPP IV pueden probarse por su uso potencial en el tratamiento de la ICP elevada. La evaluación directa de la ICP puede ser evaluada por<l>P. Sin embargo, las medidas de LP de la presión del CSF son limitadas, ya que solo reflejan una instantánea de la presión del CSF, que se sabe que varía durante el día. La técnica de imagen no invasiva, la elastografía por RM (MRE) proporciona una indicación de la ICP basada en la distensibilidad cerebral. El cumplimiento evalúa la rigidez del tejido cerebral (33). En consecuencia, la ICP elevada refleja una mayor rigidez (34). Se basa en las vibraciones mecánicas del cerebro a través de un controlador externo y la detección del movimiento del cerebro en sincronía con un controlador externo. Esta técnica se desarrolló originalmente para detectar un mayor cumplimiento como marcador de fibrosis hepática. Esta técnica no invasiva puede evaluar directamente la biomecánica del tejido cerebral y proporcionar una indicación general de la distensibilidad cerebral, un marcador de la ICP (35; 36). Los resultados son más análogos a los de una prueba de infusión de CSF (una prueba útil pero invasiva para controlar la ICP en la IIH) y, por lo tanto, un marcador valioso de la ICP. Las imágenes se pueden realizar en una resonancia magnética y las imágenes se pueden analizar e interpretar.

No es posible la evaluación directa de la tasa de secreción de CSF. Sin embargo, es posible utilizar un bioensayo que mida la tasa de secreción de CSF en un modelo de cultivo celular funcional de secreción de CSF utilizando células primarias del epitelio del plexo coroideo humano (CPe) (ScienCell Research Laboratories, San Diego, Estados Unidos). Las células se cultivan en una monocapa sobre un soporte de membrana de filtro que crea una barrera funcional para modelar la secreción de CSF (38). El bioensayo se puede validar mediante la confirmación de la funcionalidad de la barrera (resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y la identificación de proteínas de unión por inmunohistoquímica). Se puede realizar una validación adicional mediante incubación con<g>LP-1 (o exenatida-4, un agonista del receptor de GLP-1), exenatida 9-39 (un antagonista del receptor de GLP-1) y Ouabaína/Acetazolamida (inhibidores de la secreción de CSF). La tasa de secreción de CSF se puede cuantificar mediante el cambio en la luminosidad de FITC-dextrano a lo largo del tiempo. Se puede agregar FITC-dextrano (67 kDa) a cualquier lado de la monocapa celular (cámaras apical y basolateral). Como es impermeable a la monocapa celular, cualquier cambio en la fluorescencia en la cámara apical se debe a la secreción de líquido de la monocapa hacia la cámara apical (38).

Ejemplo 2

En el presente estudio utilizamos modelos in vitro para evaluar la localización y distribución del GLP-1R en el plexo coroideo y determinar los efectos de la estimulación del GLP-1R sobre la secreción de CSF. Además, realizamos estudios in vivo para evaluar los efectos de los agonistas de GLP-1 sobre la ICP. Al explorar el papel del GLP-1 en la regulación de la ICP, podemos determinar una nueva diana terapéutica para el tratamiento de la IIH y otras afecciones caracterizadas por un aumento de la ICP.

Materiales y métodos

Reactivos

Exenatida-4 (agonista de GLP-1R), fragmento de exenatida (Exenatida-9, antagonista de GLP-1R), Ouabain (inhibidor específico de Na+K+ATPasa), 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX; inhibidor de fosfodiesterasa) y forskolina (activador de adenilato ciclasa) se adquirieron de Sigma-Aldrich.

El inhibidor de proteína quinasa miristoilado (PKI)-(14-22)-amida (inhibidor de proteína quinasa A [PKA]) se adquirió de Merck Chemicals. Los anticuerpos primarios para la detección y localización de la proteína GLP-1R y la caracterización de las células epiteliales del plexo coroideo (CPe) incluyeron anticuerpos contra GLP-1R (conejo, ab39072, Abcam), transtiretina (TTR; oveja, ab9015, Abcam), Na+K+ ATPasa (conejo, ab76020, Abcam), zona occludens-1 (ZO-1; conejo, 61-7300, Life Technologies), acuaporina 1 (AQP1; conejo, AB3065, Abcam) y p-actina (ratón, A5441, Sigma Aldrich). Para la inmunohistoquímica, los anticuerpos secundarios marcados con Alexa Fluor® se adquirieron de Life Technologies y para la tgransferencia western, se adquirió un anticuerpo secundario conjugado con HRP de Cell Signaling Technology. Los reactivos de cultivo celular eran de Life Technologies o Sigma-Aldrich y, a menos que se especifique, todos los demás productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich. Para los procedimientos quirúrgicos, el midazolam se compró a B. Braun y la fluanisona y el fentanilcitrato de la farmacia danesa.

Animales experimentales

Para el trabajo in vitro, se utilizaron 150-200 g de ratas hembra Sprague-Dawley (Charles River) en la Universidad de Birmingham de acuerdo con la Ley de Procedimientos Científicos y de Animales de 1986, autorizada por el Ministerio del Interior del Reino Unido y aprobada por la Ética de la Universidad de Birmingham. Comité. Para los estudios in vivo, que se llevaron a cabo en Rigshospitalet-Glostrup, se alojaron ratas hembra Sprague-Dawley (Taconic) de 200 a 300 g en grupos de 4, mantenidas en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con acceso libre a alimentos y agua. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Inspección de Experimentos con Animales de Dinamarca (número de licencia 2014-15-0201-00256). Después de los tratamientos y procedimientos quirúrgicos, las ratas fueron monitoreadas diariamente para detectar cualquier efecto adverso (es decir, piloerección, pérdida de peso severa, anillos de porfirina alrededor de los ojos y comportamiento anormal). Solo una rata tuvo que ser sacrificada debido a una infección posoperatoria del SNC (grupo de solución salina).

Cultivo de células CPe primario

El tejido del plexo coroideo de los ventrículos lateral y cuarto se disecó y se incubó con una solución de tripsina al 0,25% durante 2,5 horas a 4°C seguido de 30 minutos a 37°C. La digestión con tripsina se detuvo mediante la adición de suero de ternero recién nacido y la suspensión celular se centrifugó a 20 g durante 10 minutos. Las células se resuspendieron en DMEM/F12 suplementado con FBS al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, L-glutamina 4 mM, hidrocortisona 200 ng/ml, selenito sódico 5 ng/ml y EGF 10 ng/ml. Se utilizó arabinósido de citosina 20 pM durante los primeros 4 días en cultivo para limitar el crecimiento de fibroblastos (Gath et al., 1997). Inicialmente, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos revestida con laminina y se dejaron crecer durante 2 días antes de transferirlas a placas de 96 pocillos revestidas con laminina o inserciones de 12 pocillos (Greiner Bio-One Ltd). El día 4, el medio se reemplazó con DMEM/F12 suplementado con FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1% y se cambió cada 2-3 días. Después de alcanzar la confluencia, se privó de suero a las células CPe durante 3 días antes del comienzo de los estudios (entre los días 10-14).

Explantes de plexo coroideo

El plexo coroideo de los ventrículos laterales se disecó y se colocó en CSF artificial (aCSF; 118mM NaCl, 22mM NaHCO3, 1.45mM K2HPO4, 1mM MgSO4, 1mM CaCh y glucosa 10mM). Para evaluar los efectos de Exenatida-4 sobre la localización de GLP-1R dentro de la célula, los explantes se incubaron con aCSF que contenía 100nM Exenatida-9 durante 15 minutos o 100nM Exenatida-4 durante 15 y 30 minutos. A continuación, los explantes se fijaron y tiñeron siguiendo el protocolo que se describe a continuación. Para determinar los efectos de Exenatida-4 sobre la expresión de ARNm de GLP-1R y los niveles de proteína, los explantes se incubaron con aCSF que contenía 100nM Exenatida-4 durante 3 y 6 horas, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C.

Tinción inmunofluorescente

Para la tinción de secciones de tejido de cerebro de rata, las ratas se sacrificaron y se perfundieron inmediatamente por vía transcardial con PBS 10 mM, pH 7.4 (PBS) seguido de paraformaldehído al 4% (Alfa Aesar) en PBS. Los cerebros se fijaron durante la noche a 4°C, se crioprotegieron mediante inmersión secuencial en sacarosa al 10%, 20% y 30% en PBS a 4°C, se incrustaron en OCT (Fisher Scientific) y se cortaron secciones coronales de 15 pm de espesor en un criostato (Bright Instruments), montados en portaobjetos de microscopio cargados y almacenados a -20°C hasta su uso. Las secciones se lavaron primero en PBST (PBS que contenía 0.3% de Tween20), se bloquearon en PBST que contenía 2% de albúmina de suero bovino (BSA) y 15% de suero de cabra normal (NGS) durante 20 minutos a temperatura ambiente, y luego se incubó con el anticuerpo primario (PBST con 2% de BSA) a 4°C durante la noche. Después de lavar en PBST, las secciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad con el anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 488 apropiado diluido en PBST que contenía 2% de BSA y 1.5% de NGS. Finalmente, las secciones se lavaron en PBST antes de montarlas en Vectashield que contenía la tinción nuclear DAPI (Vector Laboratories).

Para el marcaje por fluorescencia de explantes de plexo coroideo y células CPe, las células se fijaron primero en PBS que contenía PFA al 2% y glucosa al 2% durante 20 minutos a temperatura ambiente, se lavaron en PBS y luego se permeabilizaron con metanol durante 6 minutos a temperatura ambiente. Las células se tiñeron usando la misma técnica descrita anteriormente, excepto que se sustituyó PBST por PBS.

Las células teñidas y las secciones se observaron bajo un microscopio confocal UV Zeiss LSM 510 (Carl Zeiss) y se tomaron múltiples imágenes de pila Z.

Reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR)

Para los estudios de qPCR, se diseccionaron el hipotálamo, la hipófisis anterior y el plexo coroideo, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Se cultivaron cultivos primarios de células CPe en insertos de 12 pocillos hasta la confluencia. El ARN total se extrajo utilizando el kit de extracción de ARN total de mamíferos GenElute (Sigma-Aldrich) y se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se transcribió de forma inversa a ADN complementario (ADNc) utilizando un kit de transcripción inversa de alta capacidad de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Technologies). Se utilizaron ensayos de expresión génica Taqman (Life Technologies) para evaluar la expresión de GLP-1R (número de ensayo Rn00562406_m1). La subunidad ribosómica 18S se utilizó como referencia endógena (4319413E) y las muestras se analizaron por triplicado. El número de ciclo en el que la muestra en particular cruzó ese umbral (Ct) se usó para determinar los niveles de expresión génica y ACt se calculó como la diferencia entre el Ct (gen de interés) y el Ct (referencia endógena).

Transferencia Western

Se diseccionaron el hipotálamo, la hipófisis y el plexo coroideo, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Los tejidos se homogeneizaron en tampón de lisis enfriado con hielo (Tris-HCl 20mM pH 7.4, NaCl 150mM, EDTA 1 mM, Eg Ta 0.5mM, inhibidor de proteasa que contenía NP-40 al 1%) y se centrifugaron a 13,000 g para eliminar los restos celulares. Se cultivaron células CPe en inserciones de 12 pocillos hasta la confluencia. Los lisados de células y tejidos (3 pg de proteína) se separaron en un gel de SDS-PAGE al 8%. Las proteínas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y posteriormente se bloquearon con leche desnatada en polvo al 5% en TBST (TBS pH 7.4 con 0.5% Tween20) durante 1 hora a temperatura ambiente antes de la incubación con los anticuerpos GLP-1R o p-actina diluidos en leche/TBST durante la noche a 4°C. Después de lavar en TBST, las membranas se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con HRP diluido en leche/TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas se detectaron usando reactivos ECL (Amersham) y se revelaron sobre una película.

Ensayo de AMPc

El efecto de Exenatida-4 en la vía de señalización de GLP-1R aguas abajo se evaluó midiendo los niveles de AMPc en células CPe usando el sistema de inmunoensayo enzimático (EIA) de Amersham AMPc Biotrak (RPN 225, GE Healthcare Life Sciences). Se cultivaron células CPe en una placa de 96 pocillos y el día del experimento se incubaron en aCSF suplementado con IBMX 1mM que contenía; Exenatida-4 100nM (n = 8) o forskolina 100nM (control positivo; n = 5) durante 30 minutos a 37°C. Posteriormente, las células se lisaron y se detectaron AMPc de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayo de actividad de Na+K+ ATPasa

El efecto de Exenatida-4 sobre la actividad de Na+K+ ATPasa en el plexo coroideo se evaluó mediante la medición colorimétrica del fosfato liberado de ATP con el uso de un kit de ensayo de fosfato (ab65622, Abcam); definiéndose la actividad de Na+K+ ATPasa como la porción de fosfato producida que es sensible a Ouabain. Las células CPe se incubaron con aCSF durante 1 hora a 37°C antes de la incubación en aCSF conteniendo; 100nM Exenatida-4 (n = 7), 5|jM PKI-16-22-amida (n = 8), 100nM Exenatida-4 5|jM PKI-16-22-amida (n = 8); en presencia y ausencia de 1mM Ouabain durante 30 minutos a 37°C. A continuación, las células se lisaron en hielo y se centrifugaron a 13,000 g para eliminar los restos celulares. El fosfato se midió según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las muestras se añadieron a la mezcla de reacción y se incubaron a temperatura ambiente durante 60 minutos antes de leer la placa a 690nm. La actividad de Na+K+ ATPasa se calculó como la diferencia entre la cantidad de fosfato producido en presencia y ausencia de Ouabain para cada tratamiento.

Implantación de un perno de presión epidural

Este procedimiento y su validación fueron publicados recientemente como un trabajo metodológico y contiene todos los detalles técnicos y quirúrgicos (Uldall et al, 2014). En resumen, se anestesiaron ratas (inyección subcutánea de 2.7 ml/kg que contenía 1.25mg/ml de midazolam, 2.5mg/ml de fluanisona y 0.079mg/ml de fentanilcitrato). La rata se colocó en un marco estereotáctico (David Kopf Instruments) y se realizó una incisión en la línea media de 2 cm en la parte superior del cráneo y se expuso el hueso retrayendo la piel y el tejido blando. Se utilizó un taladro dental para inducir 4 agujeros de trépano en el cráneo; se perforó cuidadosamente un gran orificio para exponer la duramadre y permitir la colocación del perno de presión epidural (C313G-3UP, PlasticsOne), con el corte de la cánula para que quede al nivel de la base del pedestal. Los otros 3 orificios más pequeños se utilizaron para colocar tornillos de anclaje en el cráneo. El perno de presión epidural y los tornillos de anclaje se colocaron y alinearon con la superficie interior del cráneo y se aseguraron con cemento de resina dental (Clearfil SA Cement, RH Dental). El perno de presión epidural y el transductor (DTX-Plus™, Argon Medical Devices) se conectaron luego mediante un tubo de polietileno lleno de agua esterilizada, asegurando la ausencia de burbujas de aire.

La señal de presión se visualizó y registró utilizando Perisoft v.2.5.5 (Perimed). La señal de la ICP correcta se confirmó por la elevación transitoria de la ICP después de la compresión de la vena yugular. Cuando se completó el procedimiento de registro de la ICP, se cerró el perno de presión epidural con una tapa a prueba de mordidas (303DCFTX2, PlasticsOne) y se dejó que la rata se recuperara.

Grabaciones de ICP y tratamiento Exendin-4

Para realizar grabaciones en animales conscientes, las ratas se sedaron con midazolam (inyección subcutánea de 2.5 mg/kg) y el transductor se conectó al perno de presión epidural. A continuación, la rata se colocó en una jaula de infusión (Instech Laboratories), que tenía un brazo de palanca giratoria para garantizar un movimiento sin obstáculos. La señal de ICP se confirmó de nuevo mediante compresión de la vena yugular como se describió anteriormente. Se registró una lectura de ICP inicial estable durante 30 minutos antes de que las ratas recibieran una inyección subcutánea de 0.5ml de solución salina (n = 6) o Exenatida-4 (20jg/kg; n=7). Se registró la ICP durante 60 minutos más.

Análisis estadístico

Los valores se representaron como media y error estándar de la media (SEM). Los datos se analizaron utilizando el software GraphPad Prism. La prueba no paramétrica de Kruskall-Wallis se utilizó para las comparaciones entre 3 o más grupos (experimentos de qPCR, análisis de transferencia Western, niveles de AMPc, ensayo de fosfato), y fue seguida por la prueba no paramétrica de Mann-Whitney (de dos colas) con el ajuste apropiado para comparaciones múltiples (Bonferroni). Se utilizó ANOVA bidireccional para la comparación de la ICP entre dos grupos durante un período de tiempo. Los valores se consideraron estadísticamente significativos cuando los valores de P fueron *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001, ****P <0.0001.

Resultados

Expresión de ARNm de GLP-1R y niveles de proteínas en el plexo coroideo

La expresión de ARNm de GLP-1R y los niveles de proteína se determinaron en explantes de plexo coroideo y se compararon con tejidos cerebrales positivos para GLP-1R. Como era de esperar, la expresión de ARNm de GLP-1R estaba presente en niveles altos en el hipotálamo y solo niveles bajos en la pituitaria (figura 7A). El ARNm de GLP-1R se expresó en el plexo coroideo. Los resultados de los análisis de transferencia Western de explantes de plexo coroideo apoyaron estos hallazgos y demostraron la presencia de una única banda de 53kDa correspondiente al peso molecular esperado para GLP-1R (figura 7B).

El efecto de Exenatida-4 sobre la localización de GLP-1R, la expresión de ARNm y los niveles de proteínas.

Para determinar la distribución celular de GLP-1R en el plexo coroideo y el efecto de Exenatida-4 (agonista de GLP-1R) y Exenatida-9 (antagonista competitivo de GLP-1R que restringe la internalización de GLP-1R) tratamiento, los explantes del plexo coroideo se inmunotiñeron con un anticuerpo específico para GLP-1R. La tinción positiva para GLP-1R se localizó predominantemente dentro del citoplasma, así como en la superficie apical y en los contactos célula a célula de las células CPe. Después del tratamiento con Exenatida-9 y Exenatida-4 durante 15 minutos, el receptor se restringió predominantemente a la superficie apical de las células CPe con una tinción citoplasmática mínima detectada. Además, después de 30 minutos de tratamiento con Exenatida-4, la mayor parte de la tinción positiva para GLP-1R se había trasladado de nuevo al citoplasma y también se pudo observar en el lado basolateral de las células CPe.

El tratamiento con Exenatida-4 durante 3 horas mostró aumentos significativos (P <0.05) en los niveles de ARNm y proteína de GLP-1R en explantes de plexo coroideo en comparación con aCSF (figura 8A-B). Después de 6 horas de tratamiento con Exenatida-4, el ARNm de GLP-1R había vuelto a los niveles basales, sin embargo, la proteína GLP-1R aún permanecía alta.

Caracterización de cultivos de células CPe primarias

Para investigar más a fondo el papel de GLP-1R en el plexo coroideo, se aislaron células CPe y se hicieron crecer en cultivo. Para confirmar la identidad de las células CPe primarias, se caracterizaron usando anticuerpos contra proteínas específicas que se sabe están presentes en las células CPe y luego se compararon con células CPe in vivo. Se detectó transtiretina (TTR), un transportador de tiroxina y retinol A que se localiza específicamente en las células CPe tanto en el plexo coroideo como en las células CPe cultivadas. TTR estaba presente dentro del citoplasma, con tinción más intensa en el área perinuclear. La ATPasa Na+K+, el principal impulsor del transporte de Na+ desde las células CPe al CSF, se localizó en la superficie apical del plexo coroideo y se cultivaron células CPe. La proteína de unión estrecha, ZO-1, se detectó en las células epiteliales del tejido del plexo coroideo y se detectó claramente en contactos de célula a célula in vitro. La tinción positiva de AQP1 estaba presente en la superficie apical de las células CPe in vivo, un patrón similar al de la Na+K+ ATPasa. Es interesante observar que in vitro, la intensidad de la inmunotinción de AQP1 de la superficie celular no fue homogénea y algunas células mostraron una mayor intensidad de tinción en comparación con otras. El GLP-1R se observó principalmente en el citoplasma y la superficie apical de las células CPe in vivo e in vitro. El ARNm y la proteína de GLP-1R también se expresaron en las células CPe y fueron más altos que en los explantes de plexo coroideo de tejido completo (figura 9).

El efecto de Exenatida-4 sobre los niveles de AMPc y la actividad de Na+K+ ATPasa

Para investigar los efectos de Exenatida-4 sobre la activación de GLP-1R en el plexo coroideo, se evaluaron los niveles de AMPc en cultivos de células CPe. El tratamiento con Exenatida-4 condujo a un aumento de 2 veces en AMPc, que fue significativamente diferente (P <0.01) en comparación con el valor inicial (figura 10A).

Para investigar el papel de la vía de señalización del GLP-1R en la secreción de CSF, se evaluó la actividad de Na+K+ ATPasa (un marcador de la secreción de CSF) en cultivos de células CPe. El tratamiento con exenatida-4 redujo significativamente (P <0.05) los niveles de producción de fosfato específico de Na+K+ ATPasa (39.3 ± 9.4% del control) en comparación con el control (figura 10B). Además, un inhibidor de PKA pudo abolir la reducción de Exenatida-4 en la actividad de Na+K+ ATPasa.

El tratamiento con exenatida-4 reduce la IPC en ratas conscientes

Para establecer si los agonistas de GLP-1 eran capaces de modular la IPC, se midió la IPC antes y después de una inyección subcutánea de solución salina o Exenatida-4 en ratas adultas sanas conscientes. Los registros de la IPC realizados antes de la inyección debían establecer un valor inicial, seguido de un registro continuo hasta 60 minutos después de la inyección. En la figura 11A se muestran ejemplos de las trazas. A los 10 minutos de la inyección subcutánea de Exenatida-4, la IPC se redujo significativamente en comparación con las ratas tratadas con solución salina (reducción desde el valor inicial de 60.6 ± 4.9% (p <0.0001)) (figura 11B). Además, la ICP permaneció significativamente más baja durante el resto del registro (60 minutos) con la mayor disminución en la ICP de 58.3 ± DE 5.0% del valor inicial (a los 35 minutos después de la inyección).

Se realizaron registros de la IPC de la IPC inicial 30 y 60 minutos después del tratamiento con 1 pg/kg (n = 4), 3|jg/kg (n = 5) y 5jg/kg (n = 4). Como se muestra en la figura 12, las tres dosis de Exenatida-4 redujeron la PIC desde el valor inicial, con 5|jg/kg mostrando la mayor reducción. Además, a 5|jg/kg, la IPC permaneció reducida durante un período de 24 horas (figura 13).

Discusión

Se ha demostrado por primera vez que el agonista de GLP-1R Exenatida-4 es capaz de reducir la ICP en ratas conscientes. Los resultados descritos anteriormente sugieren que las propiedades reductoras de la ICP de la exenatida-4 se producen a través de una secreción reducida de CSF en el plexo coroideo, demostrado por la reducción de la actividad de la ATPasa Na+K+ en las células CPe. Se cree que la modulación de exenatida-4 de la producción de CSF actúa a través de la vía de señalización GLP-1R/AMP<c>/<p>K<a>.

Los datos anteriores apoyan la hipótesis de que las moléculas, incluidas las integrinas, tales como GLP-1, antagonistas de GLP-1 y/o inhibidores de DPP IV, pueden ser útiles para reducir la IPC en pacientes con IIH y/u otras afecciones asociadas con la IPC.

Referencias

(1) Corbett JJ, Savino PJ, Thompson HS, Kansu T, Schatz NJ, Orr LS et al. Visual-Loss in Pseudo-Tumor Cerebri -Follow-Up of 57 Patients from 5 to 41 Years and A Profile of 14 Patients with Permanent Severe Visual-Loss. Archives of Neurology 1982;39(8):461-74.

(2) World Health Organization. Global Database on Body Mass Index. 2013. 19-9-0013. Ref Type: Online Source (3) Sinclair AJ, Ball AK, Burdon MA, Clarke CE, Stewart PM, Cumow SJ et al. Exploring the pathogenesis of IIH: An inflammatory perspective. Journal of Neuroimmunology 2008;201:212-20.

(4) Lueck C, Mcllwaine G. Interventions for idiopathic intracranial hypertension. Cochrane Database of Systematic Reviews 2005;(3).

(5) Ball A, Howman A. A randomised controlled trial of treatment for idiopathic intracranial hypertension. Journal of Neurology 2010;1-8.

(6) Celebisoy N, Gokcay F, Sirin H, Akyurekli O. Treatment of idiopathic intracranial hypertension: topiramate vs acetazolamide, an open-label study. Acta Neurologica Scandinavica 2007;116(5):322-7.

(7) Curry WT, Butler WE, Barker FG. Rapidly rising incidence of cerebrospinal fluid shunting procedures for idiopathic intracranial hypertension in the United States, 1988-2002. Neurosurgery 2005;57(1):97-107.

(8) Sinclair AJ, Kuruvath S, Sen D, Nightingale PG, Burdon MA, Flint G. Is cerebrospinal fluid shunting in idiopathic intracranial hypertension worthwhile? A 10-year review. Cephalalgia 2011;31(16):1627-33.

(9) Astrup A, Rossner S, Van Goal L, Rissanen A, Niskanen L, Al Hakim M et al. Effects of liraglutide in the treatment of obesity: a randomised, doubleblind, placebo-controlled study. Lancet 2009;374(9701):1606-16.

(10) Murphy VA, Johanson CE. Alteration of Sodium-Transport by the Choroid-Plexus with Amiloride. Biochimica et Biophysica Acta 1989;979(2):187-92.

(11) Amin MS, Reza E, Wang H, Leenen FH. Sodium Transport in the Choroid Plexus and Salt-Sensitive Hypertension. Hypertension 2009;54(4):860-U359.

(12) Speake T, Whitwell C, Kajita H, Majid A, Brown PD. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microscopy Research and Technique 2001;52(1):49-59.

(13) Davson H, Segal MB. Effects of Some Inhibitors and Accelerators of Sodium Transport on Turnover of Na-22 in Cerebrospinal Fluid and Brain. Journal of Physiology-London 1970;209(1):131-&.

(14) Welch K. Secretion of Cerebrospinal Fluid by Choroid Plexus of Rabbit. American Journal of Physiology 1963;205(3):617-&.

(15) Zeuthen T, Wright EM. Electrogenic Na+-K+ Pump in Choroid-Plexus. Biochimica et Biophysica Acta 1978;511(3):517-22.

(16) Campbell JE, Drucker DJ. Pharmacology, Physiology, and Mechanisms of Incretin Hormone Action. Cell Metabolism 2013;17(6):819-37.

(17) Muscelli E, Mari A, Casolaro A, Camastra S, Seghieri G, Gastaldelli A et al. Separate impact of obesity and glucose tolerance on the incretin effect in normal subjects and type 2 diabetic patients. Diabetes 2008;57(5):1340-8.

(18) Carr RD, Larsen MO, Jelic K, Lindgren O, Vikman J, Holst JJ et al. Secretion and Dipeptidyl Peptidase-4-Mediated Metabolism of Incretin Hormones after a Mixed Meal or Glucose Ingestion in Obese Compared to Lean, Nondiabetic Men. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2010;95(2):872-8.

(19) Verdich C, Toubro S, Buemann B, Madsen JL, Holst JJ, Astrup A. The role of postprandial releases of insulin and incretin hormones in meal-induced satiety - effect of obesity and weight reduction. International Journal of Obesity 2001;25(8):1206-14.

(19) Alvarez E, Roncero I, Chowen JA, Thorens B, Blazquez E. Expression of the glucagon-like peptide-1 receptor gene in rat brain. Journal of Neurochemistry 1996;66(3):920-7.

(20) Banks WA, During MJ, Niehoff ML. Brain uptake of the glucagon-like peptide-1 antagonist exendin (9-39) after intranasal administration. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2004;309(2):469-75.

(21) Lockie SH. Glucagon-Like Peptide-1Receptor in the Brain: Role in Neuroendocrine Control of Energy Metabolism and Treatment Target for Obesity. Journal of Neuroendocrinology 2013;25(7):597-604.

(22) Larsen PJ, TangChristensen M, Holst JJ, Orskov C. Distribution of glucagon-like peptide-1 and other preproglucagon-derived peptides in the rat hypothalamus and brainstem. Neuroscience 1997;77(1):257-70.

(23) Gutzwiller JP, Tschopp S, Bock A, Zehnder CE, Huber AR, Kreyenbuehl M et al. Glucagon-like peptide 1 induces natriuresis in healthy subjects and in insulin-resistant obese men. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2004;89(6):3055-61.

(24) Gutzwiller JP, Hruz P, Huber AR, Hamel C, Zehnder C, Drewe J et al. Glucagon-like peptide-1 is involved in sodium and water homeostasis in humans. Digestion 2006;73(2-3):142-50.

(25) TangChristensen M, Larsen PJ, Goke R, FinkJensen A, Jessop DS, Moller M et al. Central administration of GLP-1-(7-36) amide inhibits food and water intake in rats. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology 1996;271(4):R848-R856.

(26) von Websky K, Reichetzeder C, Hocher B. Physiology and pathophysiology of incretins in the kidney. Current Opinion in Nephrology and Hypertension 2014;23(1):54-60.

(27) Wei Y, Mojsov S. Tissue-Specific Expression ofthe Human Receptor for Glucagon-Like Peptide-I - Brain, Heart and Pancreatic Forms Have the Same Deduced AminoAcid-Sequences. Febs Letters 1995;358(3):219-24.

(28) Gallwitz B, Witt M, Folsch UR, Creutzfeldt W, Schmidt WE. Binding-Specificity and Signal-Transduction of Receptors for Glucagon-Like Peptide-1(7-36) Amide and Gastric-Inhibitory Polypeptide on Rinm5F Insulinoma Cells. Journal of Molecular Endocrinology 1993;10(3):259-68.

(29) Carraro-Lacroix LR, Malnic G, Girardi ACC. Regulation of Na+/H+ exchanger NHE3 by glucagon-like peptide 1 receptor agonist exendin-4 in renal proximal tubule cells. American Journal of Physiology-Renal Physiology 2009;297(6):F1647-F1655.

(30) Crajoinas RO, Oricchio FT, Pessoa TD, Pacheco BP, Lessa LM, Malnic G et al. Mechanisms mediating the diuretic and natriuretic actions of the incretin hormone glucagon-like peptide-1. American Journal of Physiology-Renal Physiology 2011;301(2):F355-F363.

(31) Edwards LJ, Sharrack B, Ismail A, Tench CR, Gran B, Dhungana S et al. Increased levels of interleukins 2 and 17 in the cerebrospinal fluid of patients with idiopathic intracranial hypertension. Am J Clin Exp Immunol 2013;2(3):234-44.

(32) Stefanovic V, Ardaillou N, Vlahovic P, Placier S, Ronco P, Ardaillou R. Interferon-Gamma Induces Dipeptidylpeptidase-lv Expression in Human Glomerular Epithelial-Cells. Immunology 1993;80(3):465-70.

(33) Schregel K, Wuerfel E, Garteiser P, Gemeinhardt I, Prozorovski T, Aktas O et al. Demyelination reduces brain parenchymal stiffness quantified in vivo by magnetic resonance elastography. Proc Natl Acad Sci U S A 2012 April 24;109(17):6650-5.

(34) Alperin N, Ranganathan S, Bagci A, Adams D, Ertl-Wagner B, Saraf-Lavi E et al. MRI Evidence of Impaired CSF Homeostasis in Obesity-Associated Idiopathic Intracranial Hypertension. American Journal of Neuroradiology 2013;34(1):29-34.

(35) Freimann FB, Streitberger KJ, Klatt D, Lin K, McLaughlin J, Braun J et al. Alteration of brain viscoelasticity after shunt treatment in normal pressure hydrocephalus. Neuroradiology 2012 March;54(3):189-96.

(36) Streitberger KJ, Wiener E, Hoffmann J, Freimann FB, Klatt D, Braun J et al. In vivo viscoelastic properties of the brain in normal pressure hydrocephalus. NMR Biomed 2011 May;24(4):385-92.

(37) Nakazato 2011; Development of the novel delivery system of GLP-1 administration for the treatment of diabetes mellitus. Japanese Journal of Clinical Medicine [2011, 69(5):918-922]

(38) Baehr, Reichel et al 2006: Choroid plexus epithelial monolayers - a cell culture model from porcine brain; Cerebrospinal Fluid Res. 2006; 3: 13; Pgs 1-14.

(39) Gath U, Hakvoort A, Wegener J, Decker S, Galla HJ; Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. Eur J Cell Biol. 1997 Sep;74(1):68-78.

(40) Uldall M, Juhler M, Skjolding AD, Kruuse C, Jansen-Olesen I, Jensen R. A novel method for longterm monitoring of intracranial pressure in rats. J Neurosci Methods. 2014 Apr 30; 227:1-9.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una incretina, un agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos, para su uso en un procedimiento para reducir la presión intracraneal elevada (ICP) en un sujeto, en el que la ICP elevada a tratar está asociada con hidrocefalia, hidrocefalia de presión normal, o meningitis.

2. La incretina, agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos para el uso según la reivindicación 1, en el que la incretina, el agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos da como resultado una reducción en el transporte de Na+ hacia las células epiteliales del plexo coroideo desde la sangre y una reducción en la producción de CSF.

3. La incretina, agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos para el uso según cualquier reivindicación anterior en el que la incretina, es GLP-1, GLP-1(7-36) amida o GLP-1 (7-37).

4. La incretina, agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos para el uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el agonista del receptor de incretina es un mimético de GLP-1, opcionalmente una exenatida, tales como exenatida 3 o exenatida 4.

5. La incretina, agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos para el uso según la reivindicación 4, en el que el agonista del receptor de incretina es un mimético de GLP-1 y el mimético de GLP-1 es exenatida.

6. La incretina, agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos para el uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el procedimiento comprende la administración nasal o bucal.

7. La incretina, agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el procedimiento comprende la administración inyectable, tal como administración intraarterial o intraventricular y/o intratecal a los ventrículos cerebrales o mediante punción lumbar.

8. La incretina, agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos para el uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el procedimiento comprende administrar la incretina, el agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos, en una dosis de 1 a 10 pg/kg, tal como a una dosis de 2 a 8 pg/kg, o de 3 a 6 pg/kg, o 5 pg/kg.

9. La incretina, agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el procedimiento comprende administrar la incretina, el agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos, a una dosis de menos de 20 pg/kg, o menos de 15 pg/kg, o menos de 10 pg/kg.

10. La incretina, agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el procedimiento comprende administrar la incretina, agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos, a una dosis de al menos 5 pg/kg.

11. La incretina, agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos para el uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el procedimiento comprende administrar la incretina, el agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos, mediante administración al menos diaria, tal como mediante administración semanal.

12. La incretina, agonista del receptor de incretina, o cualquier combinación de estos, para el uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el sujeto es un ser humano.