ES2970191T3 - Formulación que comprende aceite ozonizado en el tratamiento de un tumor - Google Patents

Abstract

Se describe una formulación que comprende al menos un aceite ozonizado para uso en la prevención y/o tratamiento de un tumor, preferiblemente un tumor maligno. La formulación es para uso mediante administración elegida entre oral, tópica, mediante inyección y combinaciones de las mismas. El tumor se elige entre un tumor sólido; un tumor cutáneo; un tumor de la mucosa; y un tumor líquido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación que comprende aceite ozonizado en el tratamiento de un tumor

Campo de aplicación

La presente invención se refiere a la utilización de una formulación que comprende aceite ozonizado en la prevención y/o el tratamiento de un tumor, en particular de un tumor maligno (cáncer).

Técnica anterior

La célula neoplásica difiere de la normal en muchos aspectos, entre ellos el bloqueo de la función mitocondrial, destinada a inhibir la apoptosis (muerte celular espontánea), que constituye un impedimento fundamental para el desarrollo del cáncer. El bloqueo mitocondrial que ocurre en la célula neoplásica se conoce como efecto Warburg. La investigación experimental reciente muestra que las células neoplásicas resultan favorecidas en su crecimiento por moléculas antioxidantes, pero perjudicadas por situaciones prooxidativas. En particular, las células madre cancerígenas, que dan lugar a resistencia a quimioterapia y a recaídas, se caracterizan por un medio reductor y, por lo tanto, son muy sensibles a los efectos citotóxicos del daño oxidativo (Zhou et al., Reactive oxygen species in normal and tumour stem cells. Adv. Cancer Res. 2014;122:1-67). La mitocondria es la fuente endógena principal de las moléculas oxidantes.

Actualmente, el incremento del daño oxidativo representa, por lo tanto, una estrategia para el tratamiento del cáncer (Liu et al., 2015, Increased Oxidative Stress as a Selective Anticancer Therapy. Oxid. Med. Cell Longev. artículo ID294303).

Se han realizado algunos intentos de utilizar el ozono como fuente de especies oxidantes en el tratamiento del cáncer. En particular, se ha utilizado el ozono en forma de gas (Rossmann et al., Intraperitoneal oxidative stress in rabbits with papillomavirus-associated head and neck cancer induces tumoricidal immune response that is adoptively transferable. Clin. Cancer Res. 2014; 20 (16) :4289-4301) o en forma de solución acuosa ozonizada mediante inyección (Kuroda et al., The Safety and Anti-Tumor Effects of Ozonated Waterin vivo.Int. J. Mol. Sci. 2015; 16(10):25108-25120). Estos estudios han mostrado efectos citotóxicos específicos sobre el tejido neoplásico en ausencia de daños en los tejidos sanos. Sin embargo, el efecto terapéutico obtenido, aunque significativo, es transitorio.

Por lo tanto, en el sector se percibe la necesidad de una formulación basada en especies ozonizantes para la prevención y/o el tratamiento de un tumor, en particular un tumor maligno (cáncer), que supere las desventajas y límites de las formulaciones de la técnica anterior.

Por lo tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar una formulación que comprende especies ozonizantes que resulte eficaz en la prevención y/o el tratamiento de un tumor, en particular un tumor maligno (cáncer), que presente un efecto terapéutico prolongado durante el tiempo.

El tumor maligno puede ser un tumor sólido, por ejemplo, un tumor de próstata, hígado, pulmones, mama, colorrectal, páncreas o encéfalo; un tumor cutáneo (de piel); un tumor mucoso, por ejemplo, un tumor de boca, nariz, ano, vulva o vagina, o un tumor líquido, tal como un tumor hematopoyético.

En particular, el problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar una formulación que presente un efecto terapéutico durante un tiempo mínimo de seis meses desde el final del tratamiento, preferentemente durante como mínimo 5 años.

Un problema técnico adicional que subyace a la presente invención es el de proporcionar una formulación que resulte eficaz para prevenir la formación de metástasis.

Un problema técnico adicional que subyace a la presente invención es el de proporcionar una formulación que presente un contenido más alto de ozónidos que las formulaciones oxidantes de la técnica anterior descritas anteriormente (30 meq O<2>/kg), en particular superior a 100 meq O<2>/kg, todavía más particularmente superior a 500 meq O<2>/kg.

Un problema técnico adicional que subyace a la presente invención es el de proporcionar una formulación que presente una tolerabilidad elevada, es decir, un número e intensidad inferiores de los efectos secundarios no deseados con respecto a los tratamientos utilizados actualmente.

En particular, la formulación debe ser capaz de ejercer un efecto anticáncer sin dañar las células no neoplásicas, es decir, las células sanas.

Un problema técnico adicional que subyace a la presente invención es el de proporcionar una formulación que permite una fácil personalización de la dosis.

Sumario de la invención

Un problema similar que se ha resuelto según la invención mediante una formulación que comprende por lo menos un aceite ozonizado para la utilización en la prevención y/o el tratamiento de un tumor, preferentemente un tumor maligno.

Preferentemente, dicha formulación está destinada al uso mediante la administración seleccionada de entre la administración oral, tópica, mediante inyección (por ejemplo, mediante infiltración), mediante inhalación (por ejemplo, en la forma de un aerosol), y combinaciones de las mismas.

Preferentemente, dicha formulación está destinada al uso mediante la administración tópica y/o administración mediante inyección (por ejemplo, mediante infiltración).

El aceite ozonizado presenta un contenido de ozónidos de entre 500 y 1500 meq O<2>/kg, más preferentemente de entre 600 y 1400 meq O<2>/kg, todavía más preferentemente de entre 700 y 1300 meq O<2>/kg.

En una realización preferente, el aceite ozonizado presenta un contenido de ozónidos superior a 800 e inferior a 1500 meq O<2>/kg, más preferentemente superior a 900 e inferior a 1400 meq O<2>/kg, todavía más preferentemente superior a 1000 e inferior a 1300 meq O<2>/kg, lo más preferentemente superior a 1100 e inferior a 1200 meq O<2>/kg.

El contenido de ozónidos puede medirse de acuerdo con técnicas conocidas en el campo, por ejemplo, mediante el método para determinar el número de peróxidos descrito en el Reglamento (EEC) n.° 2568/91, de 11 de julio de 1991, relativo a las características de los aceites de oliva y de los aceites de orujo de oliva, y sobre sus métodos de análisis, anexo III.

Preferentemente, el aceite ozonizado es un aceite vegetal que se ha sometido a un procedimiento de ozonización, más preferentemente seleccionado de: aceite de girasol, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de argán, aceite de semilla de pomelo, aceite de jojoba, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de palma, aceite de semilla de algodón, aceite de colza, aceite de coco, aceite de ricino, aceite de linaza, aceite de borraja, aceite de onagra y mezclas de los mismos.

Según una realización particularmente preferente, el aceite ozonizado es aceite de semilla de girasol (en lo sucesivo también denominado «aceite de girasol»), aceite de semilla de cacahuete (en lo sucesivo también «aceite de cacahuete), o mezclas de los mismos. De hecho, resulta preferente utilizar un aceite sustancialmente libre de cualquier actividad antioxidante intrínseca.

Preferentemente, el aceite ozonizado se encuentra sustancialmente libre de agentes antioxidantes.

Según una realización preferente, el aceite ozonizado se selecciona de: aceite de girasol, aceite de cacahuete, aceite de argán, aceite de semilla de pomelo, aceite de jojoba, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de palma, aceite de semilla de algodón, aceite de colza, aceite de coco, aceite de ricino, aceite de linaza, aceite de borraja, aceite de onagra y mezclas de los mismos, más preferentemente aceite de girasol y/o aceite de cacahuete.

Preferentemente, el aceite ozonizado se obtiene mediante un procedimiento de ozonización que utiliza oxígeno gaseoso altamente purificado para la introducción de oxígeno.

Preferentemente, la formulación debe administrarse en un animal mamífero o ser humano que sufre de un tumor, más preferentemente un tumor maligno.

Preferentemente, el tumor se selecciona de entre un tumor sólido, por ejemplo, un tumor de próstata, hígado, pulmones, mama, colorrectal, páncreas o encéfalo; un tumor cutáneo (de piel); un tumor mucoso, por ejemplo, de boca, nariz, ano, vulva o vagina, y un tumor líquido, tal como un tumor hematopoyético.

Preferentemente, la formulación anteriormente indicada actúa sobre la célula neoplásica mediante oxidación de las membranas mitocondriales.

Según una realización preferente, la formulación anteriormente indicada está destinada al uso mediante administración tópica.

La formulación para el uso tópico objeto del a presente invención puede consistir de lo anteriormente indicado, por lo menos un aceite ozonizado, o puede comprender lo anteriormente indicado, por lo menos un aceite ozonizado, preferentemente a una concentración, en porcentaje en peso con respecto al peso total de la formulación, de entre 1 % y 50 %, todavía más preferentemente de entre 2 % y 20 %, y lo más preferentemente de entre 3 % y 15 %.

En una realización preferente, la formulación para el uso tópico de la presente invención comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable, compatible con el aceite ozonizado.

Preferentemente, la formulación para el uso tópico de la invención se encuentra en una forma seleccionada de entre aceite, gel y emulsión, más preferentemente aceite.

El gel puede ser un hidrogel o un lipogel.

Preferentemente, el hidrogel comprende, en porcentaje en peso respecto al peso total del hidrogel, entre 3 % y 30 %, más preferentemente entre 5 % y 20 %, y lo más preferentemente entre 8 % y 15 % de por lo menos un aceite ozonizado.

El término «hidrogel» en la presente memoria se refiere a que la formulación se encuentra en la forma de una solución hidrofílica gelificada en la que el aceite ozonizado se dispersa en un medio acuoso.

El término «lipogel» en la presente memoria se refiere a que la formulación se encuentra en la forma de una solución lipofílica gelificada en la que el aceite ozonizado está dispersado en un medio lipídico.

Según un aspecto preferente de la presente invención, el uso tópico para la prevención y/o el tratamiento de un tumor se lleva a cabo mediante aplicación tópica de la formulación sobre el tejido afectado, preferentemente durante un periodo de más de tres días e inferior a sesenta días, más preferentemente de entre diez y treinta días.

Preferentemente, la aplicación tópica de la formulación se lleva a cabo una o dos veces al día, más preferentemente dos veces al día.

Preferentemente, la aplicación tópica se lleva a cabo mediante la aplicación de una cantidad de la formulación sobre el tejido afectado que resulta suficiente para cubrir la lesión neoplásica, más preferentemente suficiente para cubrir la lesión neoplásica y por lo menos parte de la piel perilesional.

Se define «piel perilesional» como la superficie cutánea que se extiende desde el borde de la lesión hasta un centímetro de ella.

Según un aspecto preferente de la presente invención, la formulación para el uso tópico comprende un aceite ozonizado que presenta un contenido de ozónidos superior a 800 e inferior a 1500 meq O<2>/kg, más preferentemente superior a 900 e inferior a 1400 meq O<2>/kg, todavía más preferentemente superior a 1000 e inferior a 1300 meq O<2>/kg, lo más preferentemente superior a 1100 e inferior a 1200 meq O<2>/kg.

La formulación para el uso tópica está particularmente indicada para la utilización en la prevención y/o el tratamiento de un tumor cutáneo, tal como, por ejemplo, el melanoma maligno, el carcinoma epidermoide de células basales y el carcinoma epidermoide espinocelular.

La formulación para el uso tópico, además, resulta particularmente indicada para el uso en la prevención y/o el tratamiento de un tumor mucoso, por ejemplo, de boca, nariz, ano, vulva o vagina.

Según una realización preferente alternativa, la formulación anteriormente indicada está destinada al uso mediante administración oral.

Además, se ha encontrado que la formulación para el uso forma de la presente invención resulta eficaz en la prevención de la formación de metástasis, en particular en sujetos radiorresistentes.

Por lo tanto, la presente invención se refiere, además, a la formulación para el uso oral de la presente invención destinado a la utilización en la prevención de la formación de metástasis, más preferentemente en un mamífero humano o animal radiorresistente.

La formulación para uso tópico objeto del a presente invención puede consistir en el aceite o aceites ozonizados anteriormente indicados, o puede comprender el aceite o aceites ozonizados anteriormente indicados, preferentemente a una concentración, en porcentaje en peso con respecto al peso total de la formulación, de entre 1 % y 5 %, todavía más preferentemente de entre 2 % y 3 %.

Según un aspecto preferente, la formulación de la presente invención comprende un vehículo, compatible con el aceite ozonizado, preferentemente en una cantidad de entre 95 % en peso y 99 % en peso, más preferentemente de entre 97 % en peso y 98 % en peso, en donde los porcentajes se refieren al peso total de la formulación.

Según una realización preferente, dicho vehículo comprende por lo menos un edulcorante y agua.

Preferentemente, el edulcorante se selecciona de por lo menos un sacárido, más preferentemente se selecciona de entre fructosa, glucosa, sacarosa y mezclas de los mismos; por lo menos un concentrado de frutas, por lo menos un poliol y por lo menos un extracto vegetal, más preferentemente estevia, y mezclas de los mismos.

En una realización preferente, el vehículo comprende un jarabe y/o miel.

Preferentemente, el jarabe es un jarabe de fructosa.

Preferentemente, la miel es miel no procesada en bruto.

El vehículo puede comprender, además, uno o más ingredientes adicionales seleccionados de entre aceite esencial de limón, acidificantes, monohidrato de ácido cítrico, agentes conservantes, lactato sódico, sorbato potásico, benzoato sódico, goma arábiga, goma xantana, saborizantes naturales o artificiales (por ejemplo, saborizante de cereza), agentes emulsionantes (polisorbato-80) y mezclas de los mismos.

El vehículo puede comprender, además, agua osmótica.

El vehículo puede comprender, además, por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Preferentemente, la formulación para el uso oral de la invención se encuentra en una forma seleccionada de entre cápsula y bebida, más preferentemente es una bebida; todavía más preferentemente, un jarabe.

El término «jarabe» en la presente memoria significa una preparación acuosa que contiene por lo menos un edulcorante. El jarabe se encuentra en una forma fluida fácilmente dosificable, y no requiere el uso de recubrimientos, en particular recubrimientos gastrorresistentes.

Preferentemente, el vehículo contiene, además, una fracción liposómica. Dicha fracción liposómica puede utilizarse ventajosamente para incrementar el nivel de absorción del aceite ozonizado, ya que favorece la biodisponibilidad y permite conseguir una liberación más prolongada y gradual del componente activo.

Preferentemente, la formulación para el uso oral de la invención se encuentra en la forma de una cápsula gastrorresistente, por ejemplo, con un recubrimiento a base de sílice.

De hecho, la sílice realiza una acción de adsorción sobre el aceite ozonizado, permitiendo una liberación controlada a lo largo del tracto intestinal después de cruzar la barrera gástrica, en lugar de permanecer en la forma de un bolo.

De hecho, los aceites ozonizados tienden a ser neutralizados en gran parte en su acción en el medio fuertemente ácido y, por lo tanto, reductor, del estómago.

Ventajosamente, la formulación para el uso oral que comprende aceite ozonizado de la invención presenta una elevada biodisponibilidad; por lo tanto, es capaz de alcanzar la circulación sistémica y, por lo tanto, ejercer la actividad terapéutica con respecto a un tumor maligno. De hecho, la formulación particular para el uso oral según la invención, por ejemplo, en la forma de jarabe, favorece la biodisponibilidad y absorción inmediatamente después de la ingesta, a partir de la parte muy inicial del tracto digestivo, incluyendo en él la mucosa oral y sublingual. Por este motivo, la formulación para el uso oral de la presente invención se caracteriza por la ausencia de recubrimientos gastrointestinales, que evitarían la absorción sistémica rápida.

Además, la formulación para el uso oral según la invención, que es una formulación de absorción rápida ya en el tracto inicial del tracto digestivo, hace innecesario el uso de aditivos antioxidantes (y, por lo tanto, reductores) con fines de conservación. De hecho, dichos aditivos antioxidantes interactúan con el principio activo (ozono, oxidante), afectando de esta manera a las propiedades terapéuticas de la formulación y a la posibilidad de su absorción sistémica. Por lo tanto, las peculiares características anteriormente indicadas hacen que la formulación según la invención resulta particularmente adecuada para la inducción de efectos curativos sistémicos y no solo tópicos.

Según un aspecto preferente de la presente invención, el uso oral para el tratamiento de un tumor se lleva a cabo mediante la administración oral de la formulación, preferentemente durante un periodo superior a tres días e inferior a sesenta días, más preferentemente de entre diez y treinta días.

Preferentemente, la administración oral de la formulación se lleva a cabo una o dos veces al día, más preferentemente dos veces al día.

Según un aspecto preferente adicional de la presente invención, el uso oral para la prevención, en particular para la prevención de recaídas, de un tumor se lleva a cabo mediante la administración oral de la formulación, preferentemente durante un periodo superior a tres días e inferior a sesenta días, más preferentemente de entre diez y treinta días.

En el caso de la prevención de recaídas, la administración de la formulación preferentemente se dirige a las células madre, que están particularmente asociadas al desarrollo de recaídas. De hecho, dichas células se caracterizan por un medio intracelular muy reductor que les permite resistir la quimioterapia/radioterapia. La formulación de la presente invención presenta la capacidad de modificar dicho medio para que sea oxidante.

Preferentemente, la administración oral de la formulación se lleva a cabo una o dos veces al día, todavía más preferentemente dos veces al día.

Según un aspecto preferente adicional de la presente invención, el uso oral para la prevención de la formación de metástasis se lleva a cabo mediante la administración oral de la formulación, preferentemente durante un periodo superior a tres días e inferior a sesenta días, más preferentemente de entre diez y treinta días.

Preferentemente, la administración oral de la formulación se lleva a cabo una o dos veces al día, todavía más preferentemente dos veces al día.

Preferentemente, la administración oral se lleva a cabo mediante la administración de una cantidad de aceite ozonizado de entre 0,1 y 0,5 ml por día por kilogramo de peso corporal del sujeto. Lo anterior corresponde, por ejemplo, a una dosis de 7 a 35 ml de aceite ozonizado por día en un paciente de 70 kg de peso corporal.

Más preferentemente, la administración oral se lleva a cabo mediante la administración de una cantidad de aceite ozonizado de entre 0,2 y 0,4 ml, todavía más preferentemente de entre 0,25 y 0,35 ml por día por kilogramo de peso corporal del sujeto.

La formulación para el uso oral está particularmente indicada para el uso en la prevención y/o el tratamiento de un tumor líquido, por ejemplo, un tumor hematopoyético.

Además, la formulación para el uso oral está particularmente indicada para el uso en la prevención y/o el tratamiento de un tumor que afecta a los órganos internos, por ejemplo, el colon, hígado, páncreas, pulmones, mamas, próstata y los órganos protegidos por la barrera hematocefálica (incluyendo los demás órganos del sistema nervioso central, tales como el cerebro y los testículos). Según una realización preferente alternativa, la formulación anteriormente indicada está destinada al uso mediante administración por inyección.

La formulación mediante inyección de la presente invención puede consistir en el aceite o aceites ozonizados anteriormente indicados, o puede comprender el aceite o aceites ozonizados anteriormente indicados a una concentración, en porcentaje en peso con respecto al peso total de la formulación, de por lo menos 90 %, preferentemente de por lo menos 95 %, y lo más preferentemente de 99 %.

En una realización preferente, la formulación mediante inyección objeto de la presente invención comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, compatible con el aceite ozonizado.

Preferentemente, la formulación mediante inyección de la invención se encuentra en la forma de un aceite.

En una realización preferente, la formulación mediante inyección de la invención comprende, además, por lo menos un surfactante no iónico.

Preferentemente, el surfactante es un polisorbato (alquil-ésteres de polioxietilenglicol-sorbitán) o SPAN (alquil-ésteres de sorbitán).

Preferentemente, el surfactante se selecciona de: polisorbato-80 (monooleato de polioxietileno (20)-sorbitán), polisorbato-20 (monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán), polisorbato-40 (monopalmitato de polioxietileno (20)-sorbitán), polisorbato-60 (monoestearato de polioxietileno (20) sorbitán), monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, triestearato de sorbitán y monooleato de sorbitán, y mezclas de los mismos, más preferentemente polisorbato-80.

Gracias a la presente invención, resulta posible causar que el aceite ozonizado sea dispersable en agua, evitando de esta manera la posibilidad de que la inyección del aceite ozonizado por vía intramuscular o intravenosa lleve a complicaciones, tales como, por ejemplo, embolismo pulmonar o cerebral.

En una realización preferente, la formulación de la invención mediante inyección comprende agua, polisorbato-80, aceite de cacahuete ozonizado o aceite de girasol, y cloruro sódico.

Preferentemente, la inyección es mediante infiltración, fleboclisis, vía intravenosa, intramuscular o incluso mediante administración por puerto permanente («port-a-cath»).

Según un aspecto preferente de la presente invención, la utilización mediante inyección en el tratamiento de un tumor se lleva a cabo mediante inyección de la formulación en el tejido afectado, preferentemente durante un periodo superior a tres días e inferior a sesenta días, más preferentemente de entre diez y treinta días.

Preferentemente, la inyección de la formulación se lleva a cabo una o dos veces al día, todavía más preferentemente dos veces al día.

Preferentemente, la administración mediante inyección se lleva a cabo mediante la inyección de una cantidad de aceite ozonizado de entre 0,5 y 5 ml, más preferentemente de entre 0,7 y 4 ml, todavía más preferentemente de entre 1 y 3 ml al día por cm3 de masa neoplásica.

La formulación mediante inyección está particularmente indicada para el uso en el tratamiento de un tumor sólido, tal como, por ejemplo, un tumor de próstata, hígado, pulmón, mama o colorrectal, particularmente en los casos en que el tumor se encuentra en un estadio avanzado.

La formulación mediante inyección según la presente invención puede comprender, además, por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Según un aspecto preferente adicional, la formulación de la invención es para el uso mediante administración por inhalación, por ejemplo, en la forma de un aerosol.

La formulación para uso mediante inhalación de la presente invención puede consistir en el aceite o aceites ozonizados anteriormente indicados o puede comprender el aceite o aceites ozonizados anteriormente indicados, preferentemente a una concentración, en porcentaje en peso con respecto al peso total de la formulación, de entre 1 % y 50 %, todavía más preferentemente de entre 2 % y 20 %, lo más preferentemente de entre 3 % y 15 %.

En una realización preferente, la formulación para el uso mediante inhalación objeto de la presente invención comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable, compatible con el aceite ozonizado.

Preferentemente, la formulación para la administración mediante inhalación comprende, además, por lo menos un surfactante no iónico, tal como se ha indicado anteriormente.

Gracias a la presente invención, resulta posible causar que el aceite ozonizado sea dispersable en agua.

En una realización preferente, la formulación de la invención mediante inhalación comprende agua, polisorbato-80, aceite de cacahuete o aceite de girasol ozonizado, y cloruro sódico.

La formulación para uso mediante inhalación está particularmente indicada para el uso en la prevención y/o el tratamiento de un tumor que afecta a los pulmones (carcinoma pulmonar) o la parte proximal del sistema respiratorio (bronquios, laringe y faringe).

Preferentemente, la prevención y/o el tratamiento de la presente invención comprende uno o más de entre administración tópica, administración oral, administración por la vía de inhalación y administración mediante inyección de la formulación anteriormente indicada.

Es decir, resulta posible asociar, por ejemplo, la administración oral a la administración tópica y/o con la administración mediante inyección.

También resulta posible asociar la administración tópica a la administración mediante inyección y/o la administración oral.

Finalmente, resulta posible asociar la administración mediante inyección a la administración oral y/o a la administración tópica.

Con la asociación apropiada de los métodos anteriormente indicados de administración, resulta posible obtener, por ejemplo, tanto la remisión tumoral como la prevención de metástasis.

Las formulaciones anteriormente indicadas para el uso oral, para la utilización tópica y mediante inyección pueden utilizarse en la prevención y/o el tratamiento de tumores, y/o en la prevención de la formación de metástasis, y/o recaídas, simultánea o secuencialmente.

Preferentemente, la formulación se administra asociada a una intervención quirúrgica, más preferentemente una intervención crioquirúrgica destinada a eliminar el tumor, o asociada a una intervención crioquirúrgica.

Es decir, la formulación puede administrarse por vía oral, por vía inhalada, aplicarse tópicamente, inyectarse o combinaciones de estas vías, partiendo de un día específico antes de una intervención quirúrgica o crioterapéutica, y hasta un día específico, posteriormente. Alternativamente, puede administrarse por vía oral, por vía inhalada, aplicarse tópicamente, inyectarse o combinaciones de estas vías, desde el día de la intervención quirúrgica y hasta un día específico posteriormente, o desde un día específico después de una intervención quirúrgica o crioterapéutica.

Preferentemente, la formulación para el uso oral se administra asociada a una sesión de radioterapia destinada a tratar el tumor, más preferentemente en mamíferos humanos o animales radiorresistentes.

La formulación para el uso oral puede administrarse desde un día específico anterior a una sesión de radioterapia y hasta un día específico posteriormente; más preferentemente, desde un día específico anterior a una sesión de radioterapia y hasta el día de inicio de la misma, todavía más preferentemente desde por lo menos 20 días antes de una sesión de radioterapia.

Se ha encontrado de hecho que la administración oral de la formulación desde antes de la radioterapia inhibe la formación de metástasis en sujetos radiorresistentes.

Preferentemente, el tratamiento del tumor según la presente invención comprende la administración de la formulación de la invención hasta alcanzar una proporción U Cor/U Carr de especies antioxidantes (U Cor) a especies oxidantes (U Carr) en la sangre del paciente de entre 4 y 12, más preferentemente de entre 5 y 10, y lo más preferentemente, de entre 6 y 8.

Los valores inferiores a 4, de hecho, si persisten en el tiempo, son indicativos de una sobredosis de la formulación y, por lo tanto, se evitan ya que puede provocarse daño oxidativo en las células sanas del paciente, con un consecuente riesgo mayor para el paciente de enfermedades cardiovasculares, tales como ataques cardíacos e ictus. Los valores superiores a 12, por el contrario, son indicativos de un tratamiento que no resulta muy eficaz o que no se completa.

Preferentemente, el tratamiento de los tumores según la presente invención comprende la administración de la formulación de la invención hasta alcanzar una proporción U Cor/U Carr entre especies antioxidantes (U Cor) y especies oxidantes (U Carr) en la sangre del paciente inferior a 7, más preferentemente inferior a 6, y lo más preferentemente, inferior a 5.

Preferentemente, la proporción anteriormente indicada es igual o superior a 4.

Se ha observado, de hecho, que en el caso de un paciente que sufre de neoplasma maligno, especialmente si es agresivo y/o de grandes dimensiones, la proporción U Cor/U Carr anteriormente indicada se encuentra alterada con respecto a un individuo sano, en el que el valor normal es 7 ± 1. En un paciente oncológico, dicho valor es claramente superior a los valores de los individuos sanos y normalmente se observan valores de 46 ± 7.

El valor inicial de dicho parámetro es variable entre pacientes y depende de muchos factores, además de la presencia del tumor, incluyendo dieta, edad, estilo de vida, otras enfermedades, etc. Por lo tanto, el seguimiento de dicho parámetro antes y durante el tratamiento permite configurar un tratamiento personalizado para el paciente, lo que permite conseguir la reducción del neoplasma más eficazmente, evitando simultáneamente la sobredosis de la formulación.

La evaluación del estado oxidativo, es decir, la determinación de la proporción U Corr/U Carr anteriormente indicada, puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en el campo, por ejemplo, mediante el ensayo FRAS basado en reacciones de oxidorreducción de sustratos ferrosos con lecturas cuantitativas de la absorbancia a 505 nm después de la reacción con la muestra de sangre a examen. El ensayo FRAS puede llevarse a cabo (a) para la evaluación de las especies antioxidantes mediante el método descrito en Benedetti et al., Clin. Lab. 59:1091-1097, 2013; (b) para la evaluación de las especies oxidantes mediante el método descrito en Iannitti et al., J. Oral Path. Medicine, doi: 10.1111/j.1600-0714.2012.01143.x, 2012).

El ensayo proporciona la cuantificación de: (a) especies oxidantes totales en equivalentes de moléculas de peróxido de hidrógeno (1 U Carr=0,08 mg de H<2>O<2>por 100 ml), y (b) especies antioxidantes totales en equivalentes de moléculas de ácido ascórbico (1 U Cor = micromoles/litro de ácido ascórbico). El ensayo es no invasivo y se lleva a cabo extrayendo una microcantidad (50 a 100 pl) de sangre venosa periférica mediante micropunción de la piel digital distal. Es posible utilizar ensayos que son similares al ensayo FRAS con la condición de que se validen correctamente y se comparen con el mismo.

Preferentemente, el tratamiento comprende una o más sesiones de tratamiento, separadas por un periodo de tiempo específico, hasta la estabilización del valor deseado anteriormente indicado con el tiempo.

Dicho periodo de tiempo específico puede ser de entre 1 y 6 meses, preferentemente de entre 1 y 3 meses.

Se considera que el valor es estable durante el tiempo en el caso de que se mantenga sustancialmente constante durante por lo menos seis meses, más preferentemente por lo menos un año, todavía más preferentemente por lo menos dos años, y lo más preferentemente, por lo menos tres años.

Se encuentra comprendido dentro de las capacidades del experto en la materia la modulación de la dosis y la duración del tratamiento, y su posible subdivisión en una o más sesiones, para alcanzar el objetivo preestablecido, basándose en la evaluación clínica del paciente en referencia a la patología oncológica específica que sufre.

La presente invención se refiere, además, a la prevención y/o el tratamiento de un tumor, preferentemente un tumor maligno, que comprende la administración de la formulación de la invención en un mamífero animal o humano que necesita de la misma.

La presente invención se refiere, además, a la prevención de la formación de metástasis y/o recaídas, que comprende la administración de la formulación para el uso oral de la invención en un mamífero animal o humano que necesita de la misma, preferentemente un mamífero animal o humano radiorresistente.

El uso tópico de aceite ozonizado es conocido actualmente para el tratamiento de enfermedades y/o lesiones cutáneas. En particular, la utilización de aceite ozonizado resulta particularmente adecuada en el tratamiento de enfermedades e infecciones cutáneas, también con respecto a infecciones crónicas de zonas cutáneas. Ahora se ha encontrado inesperadamente que el aceite ozonizado resulta eficaz en la prevención y el tratamiento de los tumores anteriormente indicados, particularmente tumores malignos.

De esta manera, sin respaldo teórico, se plantea la hipótesis de que las preparaciones gaseosas o acuosas basadas en especies ozonizantes de la técnica anterior resultan menos eficaces que la formulación de la presente invención en la prevención y/o el tratamiento de tumores, en particular malignos, debido a que la forma gaseosa o acuosa limita la acción del efecto oxidante en el medio extracelular: las células neoplásicas, de hecho, se encuentran circundadas por una membrana lipofílica que evita la entrada directa de gas o agua.

Por el contrario, con la formulación de la presente invención, que comprende un aceite ozonizado, se obtienen resultados eficaces y duraderos.

De hecho, el aceite, mediante la penetración en las membranas mitocondriales de la célula neoplásica, es capaz de activar la apoptosis mediante oxidación y, de esta manera, la muerte de la célula neoplásica.

Los ensayosin vitromuestran, de hecho, que la formulación de la invención es capaz de ejercer un potente efecto anticáncer al nivel celular y han elucidado el mecanismo de acción de la formulación de la presente invención, que se basa en la penetración del aceite ozonizado en el citoplasma celular debido a su capacidad de oxidar las membranas celulares, incluyendo el plasmalema, que separa la célula del medio externo. Una vez ha penetrado en el citoplasma, el aceite ozonizado resulta atrapado en vacuolas durante un tiempo corto. Sin embargo, las membranas de dichas vacuolas son rápidamente oxidadas por el aceite ozonizado y, a continuación, el aceite se difunde hacia el interior del citoplasma, ejerciendo de esta manera su acción.

Por lo tanto, la formulación de la presente invención se caracteriza por una capacidad única de penetrar en el interior de las células neoplásicas gracias al daño que también induce en la membrana celular externa. Dada la pureza (es decir, la elevada concentración de ozónidos) y la elevada estabilidad del aceite ozonizado, y en consecuencia, de la formulación de la invención, la penetración no compromete las capacidades prooxidantes que a continuación se expresan directamente en el sitio intracelular. Este aspecto es peculiar en que otras formulaciones de especies ozonizantes no son capaces de presentar este efecto, ya que son neutralizadas por los antioxidantes en el medio extracelular o intracelular, ambos particularmente ricos en defensas antioxidantes, especialmente en células madre neoplásicas.

El cáncer es una enfermedad sistémica del cuerpo. La masa neoplásica no puede desarrollar independientemente estructuras de soporte trófico adecuadas para su propio desarrollo. Por lo tanto, una característica del carcinoma es la presencia de un infiltrado conspicuo de macrófagos inflamatorios que, al ser completamente incapaces de enfrentarse al crecimiento neoplásico, lo apoyan mediante el suministro de oxígeno, metabolitos y neovasos. Estas células se definen como macrófagos asociados a tumor. Actualmente, el grado de inflamación representa el índice pronóstico más predictivo del desarrollo desfavorable del neoplasma. Por lo tanto, se combate más eficazmente el cáncer con la inclusión de una formulación oral capaz de enfrentarse a la inflamación de modo sistémico.

Se ha observado que la formulación de la invención es capaz de ejercer efectos antiinflamatorios sin inducir inmunosupresión, tal como demuestran los ensayosin vitroein vivo.

Sin respaldo teórico, se ha planteado la hipótesis de que el mecanismo subyacente a este fenómeno es la inhibición del estallido oxidativo de los macrófagos. Los macrófagos, responsables de la inmunidad celular no específica de los tejidos, funciona mediante la liberación de especies reactivas de oxígeno y citoquinas inflamatorias en el medio de los tejidos, que son capaces de neutralizar bacterias en caso de estar presentes; en ausencia de las mismas, sin embargo, se desarrollan fenómenos inflamatorios tras la activación de los macrófagos, que asumen, tal como en el caso del cáncer, una importancia patogénica. La formulación de la invención inhibe el estallido oxidativo de los macrófagos mediante retroalimentación negativa; de hecho, la presencia de un medio extracelular ya rico en especies oxidantes ozónicas bloquea la liberación de especies oxidantes adicionales por los macrófagos, inhibiendo de esta manera la activación y consecuente inflamación.

También se cree que el efecto selectivo del aceite ozonizado de la presente invención, con un elevado contenido de ozónidos, de eliminación de células neoplásicas y no células diferenciadas normales, se debe al hecho de que las mitocondrias en las células neoplásicas están inactivas, tanto desde el punto de vista metabólico como desde el punto de vista de la activación de la muerte celular programada (apoptosis) por vía intrínseca mediante la liberación de citocromos y calcio en el citoplasma. Dicha característica diferencia la célula neoplásica de la célula sana.

La membrana mitocondrial está compuesta principalmente de fosfolípidos, el más importante de los cuales es la cardiolipina, que se dispone de manera que forma la típica bicapa lipídica de la membrana mitocondrial externa mediante la combinación de las colas hidrofóbicas de dos moléculas y que causa que las cabezas hidrofílicas se proyecten hacia el interior del medio hidrofílico del citoplasma en el exterior de las mitocondrias y hacia el interior del medio hidrofílico de la matriz interior de las mitocondrias. Sin embargo, la estructura de la cardiolipina es extremadamente dependiente de su enlace al citocromo c, un componente activo fundamental de la fosforilación oxidativa. La cardiolipina, en particular, se dispone tal como se ha descrito anteriormente en la presencia de un enlace con el citocromo c funcional, es decir, en un tejido sano. La bicapa formada por la cardiolipina en este caso es gruesa, compacta y simétrica y forma una continuidad con las cabezas hidrofílicas. Esta organización evita que los radicales libres peroxidantes que porta el aceite ozonizado de la presente invención accedan a las colas hidrofóbicas. Por lo tanto, la célula sana es resistente a los efectos citocidas del aceite ozonizado de la presente invención (ver la figura 1a).

A la inversa, en la célula neoplásica, se encuentra cardiolipina en ausencia de citocromo c funcional. Ello resulta en una separación de las colas hidrofóbicas, dando lugar a una membrana adelgazada y huecos entre las cabezas hidrofílicas. En esta situación, los radicales libres peroxidantes que porta el aceite ozonizado de la invención tienen acceso a las colas hidrofóbicas y la célula es sensible a los efectos citocidas del aceite ozonizado de la presente invención (ver la figura 1 b).

La eficacia de la formulación de la presente invención puede depender, además, de otros factores, tales como su pureza, la ausencia de antioxidantes y su elevada biodisponibilidad.

En particular, en el caso de la realización de la invención, que implica la asociación de la formulación para el uso oral y la formulación para el uso mediante inyección, se ha encontrado que esta asociación permite obtener efectos citopáticos directos mediante infiltración en la masa neoplásica y, por lo tanto, una eficacia mejorada.

La formulación para uso oral de la invención, tal como se ha mencionado anteriormente, de hecho resulta rápidamente absorbida por la vía sistémica. Dicho aspecto representa una peculiaridad absoluta con respecto a los aceites ozonizados con bajo contenido en ozónidos presentes en el mercado, que no son capaces de ser absorbidos sistémicamente o que en ocasiones incluso se acomplejan con antioxidantes con el fin de estabilizarlos y conservar sus efectos farmacológicos.

En una realización preferente, el contenido de ozónidos en el aceite es superior a los niveles nunca alcanzados en la técnica anterior (10 a 30 meq de O<2>/kg de aceite). Este aceite es particularmente estable y un potente oxidante, especialmente en el medio intracelular de la célula neoplásica.

Por lo tanto, la formulación de la presente invención permite estabilizar cantidades muy elevadas de especies oxidantes ozonizantes (ozónidos) en un complejo lipofílico, permitiendo que penetre en el interior de la célula neoplásica y active en este sitio los mecanismos de muerte celular autónoma (apoptosis) sin dañar los tejidos sanos circundantes.

La formulación de la presente invención se caracteriza por una duración del efecto terapéutico de por lo menos seis meses, preferentemente de por lo menos un año, más preferentemente de por lo menos dos años, todavía más preferentemente de por lo menos tres años y lo más preferentemente de por lo menos cinco años.

La formulación para el uso oral de la presente invención encuentra uso particular en la prevención de la formación de metástasis y/o recaídas.

En particular, en el caso de que la administración oral de la formulación esté asociada a radioterapia en sujetos radiorresistentes, se observa que la formulación resulta eficaz en la prevención de la formación de metástasis. De hecho, la baja disponibilidad de oxígeno (hipoxia) es el mecanismo principal que induce la migración de células neoplásicas desde el sitio primario (metástasis). La invención presentada en el presente documento, mediante incremento de la disponibilidad del oxígeno en el sitio del tumor primario, inhibe la activación del proceso de metastización.

El contenido elevado de ozónidos también resulta fundamental para la personalización de la dosis terapéutica. De hecho, las dosis de fármaco deben individualizarse basándose en el tipo de sujeto tratado y la patología neoplásica existente. El amplio abanico de ozónidos que hace posible la formulación permite individualizar la dosis terapéutica con una precisión nunca alcanzada anteriormente. Esta personalización se lleva a cabo basándose en la evaluación cuantitativa de la proporción entre especies oxidantes y antioxidantes en el plasma del sujeto tratado, tal como se ha ilustrado anteriormente. Finalmente, la formulación de la presente invención se caracteriza por una elevada tolerabilidad y escasez de efectos secundarios no deseados, una situación muy especial para un fármaco capaz de matar células cancerosas. Esta característica se debe a la gran diferencia que existe entre las células normales y neoplásicas en su capacidad de enfrentarse al daño oxidativo, especialmente cuando ocurre en el medio intracelular.

A partir de la descripción detallada, posteriormente, resultarán evidentes características y ventajas adicionales de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la estructura de la cardiolipina en las células normales (figura 1a) y en una célula neoplásica (figura 1b).

La figura 2 muestra los resultados de un ensayo celularin vitropara determinar el efecto anticáncer de un aceite de semilla de girasol ozonizado de la invención sobre una línea celular de cáncer A549. La figura 2a es una imagen de microscopía óptica de la línea celular tras 60 min, 24 horas, 48 horas y 72 horas de exposición al aceite de semilla de girasol ozonizado de la invención. Como control comparativo se utilizó aceite de semilla de girasol no ozonizado. La figura 2b es una imagen de microscopía óptica que muestra la tinción celular selectiva con azul tripán, una tinción selectiva de solo células muertas.

La figura 3 muestra los resultados de un ensayo celularin vitroen que se utiliza microscopía de fluorescencia subcelular y tricrómica normal para determinar el mecanismo de acción al nivel intracelular en la célula neoplásica. La figura 3a muestra un escaneo de microscopía óptica de células de la línea celular A549 tras la exposición al aceite de semilla de girasol ozonizado de la invención, a una concentración de 10 % v/v en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) durante dos horas: se detectó la penetración intercelular del aceite ozonizado en el sitio citoplasmático (vacuolas reflectantes claras). Como control comparativo se utilizó aceite de semilla de girasol no ozonizado. La figura 3b muestra las imágenes de microscopía de fluorescencia tricrómica de células de la línea celular A549 tras la exposición al aceite de semilla de girasol ozonizado de la invención durante 0, 30 y 60 minutos con tinción. Como control comparativo se utilizó aceite de semilla de girasol no ozonizado. Las tinciones indican: (a) rojo: aceite ozonizado; (b) azul: núcleo; (c) verde: estructuras citoplasmáticas y específicamente, mitocondrias. Se confirmó la penetración del aceite en el sitio citoplasmático.

La figura 4 muestra imágenes adicionales de microscopía de fluorescencia de células de la línea celular A549 expuestas a un aceite de girasol de control y un aceite que contiene 10 % y 800 ozónidos de aceite de girasol ozonizado con tinción tricrómica con canales superpuestos (fusión). La tinción amarilla indica la superposición entre rojo y verde. Dicha superposición ocurre únicamente en células tratadas con aceite ozonizado y no en el control; indica que el aceite (rojo) alcanza y daña las mitocondrias (verde) (Ejemplo 3).

La figura 5 muestra una comparación entre los valores de viabilidad celular de células A549 tras el tratamiento con diferentes aceites según el Ejemplo 4.

La figura 6 muestra los resultados de un ensayo celularin vivopara determinar el poder antiinflamatorio de la formulación de la invención. El gráfico muestra la reducción del marcador de activación macrofágica HLAdr en dos sujetos tratados con el jarabe de la invención, medida mediante citofluorimetría.

La figura 7 es una serie de fotografías que muestra el progreso de la curación de un gato que sufre de carcinoma nasal epidermoide de células escamosas tras el tratamiento con la formulación de la invención. En particular, las figuras muestran el estado del gato antes del tratamiento (figura 7a), 24 horas después de la intervención (figura 7b), 72 horas después de la intervención (figura 7c), 7 días después de la intervención (figura 7d), 10 días después de la intervención (figura 7e) y tres semanas después de la intervención (figura 7f) (restitución al estado original).

La figura 8 es una serie de fotografías que muestra el progreso de curación de un conejo que sufre de carcinoma rectal escamosa ulcerosa tras el tratamiento con la formulación de la invención e intervención crioterapéutica, antes de la intervención (figura 8a-d), 7 días después de la intervención (figura 8e), 10 días después de la intervención (figura 8f), cuatro semanas después de la intervención (figura 8g) (restitución del estado original) y siete meses después de la intervención (figura 8h) (persistencia de la restitución al estado original).

La figura 9 muestra los resultados del ensayo de viabilidad de células tumorales A549 tras la exposición al aceite ozonizado de la invención con 700 («OOAO 700») o 1100 («OOAO 1100») ozónidos, administradas antes («PRE») o después («POST») de la radioterapia (2 Gy). OOAO incrementó la capacidad de la radiación de matar las células neoplásicas entre 7 y 14 veces. El postratamiento con OOAO1100 es la situación terapéutica más eficaz.

Descripción detallada de la invención

A continuación, se ilustra adicionalmente la presente invención mediante algunos ejemplos de realización, tal como se muestran a continuación.

EJEMPLO 1

Preparación de la formulación en la forma de un jarabe.

La formulación siguiente se preparó en la forma de un jarabe:

2,5 % de aceite de semilla de girasol ozonizado con un contenido de ozónidos igual a 700 meQ O<2>/kg y comprendiendo el 97,5 % restante una solución acuosa de fructosa, acidificador, monohidrato de ácido cítrico, agentes conservantes, lactato sódico, agua osmótica, sorbato potásico, saborizante de cereza, agente emulsionante (polisorbato-80), en el que dichos porcentajes se refieren al peso total de la formulación.

EJEMPLO 2

Ensayoin vitrode células de carcinoma.

Se sometió a ensayo un aceite de semilla de girasol ozonizado con un contenido de ozónidos igual a 700 meq O<2>/kg en células de carcinoma pulmonar humano altamente no diferenciado y agresivo. Como control comparativo se utilizó aceite de semilla de girasol no ozonizado. El tratamiento consistía en el contacto de las células con el aceite durante dos horas, seguido de lavado. Se repitió el experimento por cuadruplicado. Las células no tratadas o tratadas con aceite de semilla de girasol no ozonizado rápidamente crecieron hasta alcanzar la confluencia en la placa de cultivo tras 72 h. Las células tratadas con el aceite de la invención mostraron una dificultad para crecer durante las primeras 24 horas, después de las cuales experimentaron rápidamente la muerte celular, culminando a las 72 horas con la desaparición del lecho de crecimiento celular y la mera presencia de células muertas y cuerpos apoptóticos difusos en el sobrenadante. La figura 2a muestra los resultados obtenidos en un experimento.

La muerte de las células tratadas con aceite ozonizado también se demostró mediante la tinción selectiva con azul tripán de acuerdo con un protocolo estándar en el sector (figura 2b).

En particular, las células de la línea A549 se sembraron en un matraz de 75 cm2 para cultivo celular y se trataron con aceite de girasol ozonizado (General Service, España) a una concentración de 10 % v/v en DMEM. El control se llevó a cabo mediante tratamiento de las A549 en un matraz de 75 cm2 con aceite de girasol (EMI) a la misma concentración. Cuatro horas después del tratamiento, se extrajo de cada matraz una alícuota de células, se aplicaron sobre un portaobjetos de microscopía y se tiñeron con azul tripán, tal como informan Strober et al. (Strober W., Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr. Protoc. Immunol. 2015 Nov 2; 111:).

EJEMPLO 3

Mecanismo de acción a nivel intracelular en la célula neoplásica.

La dinámica con la que el producto de la invención induce la muerte de las células cancerosas se examinó mediante microscopía de fluorescencia subcelular y tricrómica normal en la que el núcleo se tiñó de azul, las mitocondrias y las membranas celulares en verde, y el aceite de semilla de girasol y el aceite ozonizado en rojo.

Se sembraron 8x104 células de la línea A549 en un cubreobjetos de microscopía (20x20 mm). Al día siguiente, las células se trataron con aceite de girasol ozonizado (contenido de ozónidos igual a 700 meq O<2>/kg) (General Service, España) a diferentes concentraciones (10 % y 800 v/v en DMEM) durante dos horas. El control se llevó a cabo utilizando aceite de girasol no ozonizado (EMI Supermercati, Italia) a la misma concentración que el tratamiento y durante el mismo tiempo. La figura 3a muestra la penetración intracelular en el sitio citoplasmático del aceite ozonizado al 10 % v/v (vacuolas reflectantes claras).

Con el fin de eliminar los aceites, tras 24 horas las células se lavaron con una solución que contenía 0,1 % de Nonidet P-40 (Sigma-Aldrich, Milan, Italia) en PBS (solución salina tamponada con fosfato, por sus siglas en inglés, Euroclone, Milan, Italia) y posteriormente con PBS solo. Tras los lavados, las células se lavaron con paraformaldehído al 4 % durante 10 minutos a 37 °C y finalmente se tiñeron con DIoC6, rojo Nilo, rodamina y DAPI, tal como informan Chen et al., Tarnowski et al., Koning et al., Johnson et al. (Chen W et al., A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Methods. 2009 Apr; 77(1):41-7; Tarnowski BI et al., DAPI as a useful stain for nuclear quantitation. Biotech. Histochem. 1991;66(6):297-302.; Koning AJ et al., DiOC6 staining reveals organelle structure and dynamics in living yeast cells. Cell Motil. Cytoskeleton. 1993;25(2) :111-28; Johnson LV et al., Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980 Feb;77(2):990-4).

Se observó que el aceite de semillas de girasol no ozonizado solo penetró mínimamente en las células (citoplasma), en donde se compartimentaliza en pequeñas vacuolas bien definidas. A la inversa, el aceite ozonizado ha penetrado abundantemente en el citoplasma, probablemente debido a su peculiar capacidad de oxidar las membranas celulares, incluyendo el plasmalema que separa la célula del medio externo. Una vez ha penetrado en el citoplasma, el aceite ozonizado inicialmente resulta atrapado en vacuolas; sin embargo, las membranas de estas vacuolas resultan rápidamente oxidadas y el aceite se difunde en el citoplasma mediante la generación de un halo rojo que estaba superpuesto sobre el verde de las membranas y los orgánulos intracelulares (mitocondria). Los resultados respecto a aceite ozonizado al 10 % v/v se informan en la figura 3b.

Estos sucesos culminaron a las 24 horas y les siguió la muerte de las células tratadas con el aceite de la invención. Por lo tanto, resulta evidente que el aceite ozonizado de la invención penetra en el interior de las células neoplásicas, en donde genera daño oxidativo citoplasmático. El orgánulo más sensible a dicho suceso es la mitocondria. La oxidación de las membranas mitocondriales de la célula neoplásica es capaz de activar la apoptosis y, por lo tanto, la muerte de la célula neoplásica.

El estado de la función mitocondrial en células tratadas con aceite ozonizado seguidamente se analizó mediante evaluación de la liberación de calcio por las mitocondrias, utilizando fluorocromo rojo (rodamina-2) como indicador directo del daño mitocondrial.

El punto final se midió en células neoplásicas A549 tratadas con aceite de girasol (control) o con aceite ozonizado a la dosis de 10 % v/v y 80 % v/v con respecto al medio de cultivo. Se detectó un incremento de la liberación de calcio intracitoplasmático en una sola dosis dependiendo de la cantidad de aceite ozonizado utilizada.

A continuación, se llevó a cabo la tinción selectiva de las membranas mitocondriales mediante tinción verde (DiOC6), verificando la variación de la intensidad de la señal en el control con respecto a las células tratadas con aceite ozonizado. Se observó una reducción marcada de la intensidad de la señal en el citoplasma (en donde se localizan las mitocondrias) en las células tratadas con aceite ozonizado; este resultado es indicativo de daños en la membrana mitocondrial inducidos por el tratamiento con aceite ozonizado. Se observaron, además, grandes vacuolas lipídicas citoplasmáticas en las células tratadas. Dichas vacuolas contienen lípidos oxidados que no son catabolizados por la célula, que, por lo tanto, adquiere la apariencia de una «célula espumosa», que caracteriza las células que no pueden metabolizar lípidos debido al elevado nivel de daño mitocondrial. La presencia de dichas vacuolas en las células tratadas con aceite ozonizado, por lo tanto, es evidencia adicional de que la acción de la formulación de la invención se ejerce preferente y directamente sobre la membrana mitocondrial.

A continuación, se llevó a cabo la superposición digital de las imágenes que analizan la liberación del calcio intracelular y el daño en las membranas mitocondriales (figura 4). Las imágenes adquirieron una tinción amarilla que deriva de la superposición prácticamente perfecta de rojo y verde. Dicho resultado indica que el calcio intracelular (rojo) resulta liberado precisamente por las membranas mitocondriales (verdes) dañadas por el aceite ozonizado. De hecho, dicha superposición (tinción amarilla) no existe en las células de control, en las que las membranas mitocondriales no resultan dañadas y, por lo tanto, están teñidas en verde y en donde las mitocondrias no liberan nada de calcio.

Este resultado demuestra cómo el mecanismo de acción terapéutica de la formulación de la invención es la inducción intracelular de un daño mitocondrial con la consecuente activación de la apoptosis celular intrínseca.

EJEMPLO 4

Ensayos comparativos del efecto de diferentes aceites sobre la viabilidad celular.

Se llevó a cabo un experimento comparativo para evaluar la peculiaridad del efecto del aceite de la formulación de la presente invención en comparación con otros aceites ozonizados.

Se cultivaron células de carcinoma anaplásico A549 en la presencia de diversos aceites ozonizados de bajo contenido en ozónidos o de aceites de la presente invención con 700 («OOAO 700») y 110 meq O<2>/kg («OOAO 1100»), su capacidad de inducir la muerte celular se evaluó mediante tinción vital con violeta cristal, de acuerdo con el protocolo siguiente.

Las células de la línea A549 se sembraron en placas de fondo plano de 96 micropocillos a una densidad de 6x103 células por pocillo en 100 pl de medio de cultivo DMEM (Sigma-Aldrich, Milan, Italia). Al día siguiente, se añadieron 10 pl de aceite de girasol ozonizado (General Service, España) a cada pocillo y las células se incubaron a 37 °C en un incubador de CO<2>durante 24 horas. El control se llevó a cabo utilizando aceite de girasol (EMI Supermercati, Italia) a la misma concentración que el tratamiento y durante el mismo tiempo. Tras la incubación, las células se lavaron inicialmente con una solución que contenía 0,1 % de Nonidet P-40 (Sigma-Aldrich, Milan, Italia) en PBS (Euroclone, Milan, Italia) y posteriormente con PBS. Se evaluó la viabilidad celular mediante tinción con violeta cristal tal como informan Feoktistova et al., Crystal Violet Assay for Determining Viability of Cultured Cells. Cold Spring Harb. Protoc.; 2016(4):pdb.prot087379]. Los resultados se leyeron en un fotómetro de microplaca (Multiskan FC, Thermo Scientific) a una longitud de onda de 570 nm.

Se evaluaron las preparaciones siguientes con respecto al control no tratado o tratado con aceite de girasol no ozonizado: pulverización activa VO3 (Benedetti & Co Biosolutions Srl, Brescia, Italy), aceite de oliva ozonizado (Vegetal Progress Srl, Turin, Italia), aceite de girasol EMI (EMI Supermercati, Italia), aceite en crema Ozone Elite (ECS Elitegroup), aceite en crema Ozonia 10 (Innovares Srl, Italia), aceite de oliva O3 Tu Piel (Qualified naturopath, Reino Unido), aceite Ozofarm (Ozofarm, Pariría, Italia), aceite de la invención OOAO 700 y OOAO 1100.

Los resultados obtenidos se informan en la figura 5, que indica para cada preparación la cantidad de células todavía viables tras el tratamiento (porcentaje con respecto al control no tratado, viabilidad de 100 %). Todos los experimentos se replicaron 8 veces.

Los resultados obtenidos indican que la supervivencia celular se reduce en la presencia de aceites ozonizados en comparación con los controles. Sin embargo, ningunas de las preparaciones de aceite ozonizado de la técnica anterior es capaz de reducir el porcentaje de células supervivientes hasta un nivel inferior a 20 %. Las únicas preparaciones capaces de conseguir dicho resultado eran OOAO 700 y OOAO 1100. De hecho, el porcentaje de células supervivientes es de solo 6,78 % en OAOO 700 y el valor observado mínimo cae a 2,7 % en el caso de OOAO 1100.

EJEMPLO 5

Determinación del poder antiinflamatorio del jarabe ozonizado a base de aceite.

El poder antiinflamatorio del jarabe ozonizado a base de aceite del Ejemplo 1 se evaluóin vivomediante evaluación de modo comparativo en los tiempos T0 (antes de la administración de la formulación de la invención) y T1 (al final del estudio), las subpoblaciones linfocitarias en dos voluntarios tratados, mediante citofluorimetría de flujo. Los sujetos (ambos sanos y de 70 kg de peso corporal, 54 años de edad) se trataron con jarabe ozonizado al 2,5 % durante 1 semana a una dosis de 12 ml dos veces al día entre comidas. Se evaluó la activación proinflamatoria de los macrófagos y linfocitos en sangre periférica antes y después del tratamiento mediante citofluorimetría. Los resultados obtenidos se informan en la figura 6, que muestra un gráfico de dispersión de la distribución de los leucocitos según el marcado con CD38 (marcador leucocitario, eje vertical) y con HLAdr (marcador de activación macrofágica, eje horizontal). La figura indica la marcada reducción en T1 con respecto a T0 de los marcadores de activación macrofágica (HLAdr) (flecha); no se observó ningún cambio, por el contrario, en las subpoblaciones de linfocitos responsables de la inmunidad protectora.

Estos resultados indican que la formulación en cuestión es capaz de ejercer efectos antiinflamatorios sin inducir supresión inmunitaria.

EJEMPLO 6

Tratamiento de queratinocitos humanos diferenciados.

Con el fin de evaluar la seguridad de la formulación en cuestión y su incapacidad de inducir efectos citopáticos en células sanas, se trataron queratinocitos diferenciados humanos con aceite de semilla de girasol ozonizado (700 meq O<2>/kg) de acuerdo con los protocolos experimentales ya descritos en los Ejemplos 2 y 3. Los resultados se examinaron a las 48 y 72 horas sin detectar ninguna alteración de la viabilidad celular o la presencia de ningún efecto citopático.

También se evaluó la seguridad de la formulaciónin vivoen los dos voluntarios (del Ejemplo 5) tratados con el jarabe, analizando los parámetros clásicos de bioquímica sanguínea: se observó la ausencia de cualquier alteración del estado fisiológico basal.

EJEMPLO 7

Caso clínicoin vivo.

A continuación, se llevó a cabo experimentaciónin vivoen el animal para verificar si los efectos terapéuticos observados en los modelos experimentales descritos hasta ahora eran transferibles a situacionesin vivo.Se llevaron a cabo tratamientos paliativos bajo control veterinario en los animales que sufrían de enfermedades oncológicas espontáneas graves para las que no existen tratamientos de eficacia reconocida. Se informa posteriormente de algunos ejemplos de los resultados obtenidos.

CASO 1. Gato macho de 8 años de edad con carcinoma nasal epidermoide de células escamosas histológicamente confirmado (figura 7a). Este carcinoma es conocido por su agresividad y su rápido desarrollo en este animal, por lo que normalmente requiere una eutanasia rápidamente. Al estar informados de la rápida evolución de la enfermedad, sobre los efectos secundarios locales y sistémicos y los costes de la radioterapia, sobre los efectos «de demolición» de una cirugía «convencional», los propietarios optaron por la administración mediante infiltración, por vía oral y mediante aplicación local del aceite ozonizado.

El protocolo seguido en el presente caso clínico fue el siguiente:

Infiltración de OOAO 700 (700 meq O<2>/kg), 1 ml por sesión (4 sesiones, 1 sesión cada 5 días para un total de 4 sesiones) en múltiples inyecciones tópicas (6 por sesión) en la masa neoplásica, en la parte afectada, durante 20 días. La administración oral, desde el mismo día de la primera infiltración, de aceite de girasol ozonizado (700 meq O<2>/kg, «OOAO 700») a la dosis de 5 gotas por la mañana y por la tarde en el alimento húmedo con el que se alimentaba habitualmente el sujeto (lata o bolsa de alimento húmedo para gatos adultos) durante 21 días. Localmente en la parte afectada por las lesiones, se aplicó una cantidad generosa de aceite de girasol OOAO 700 dos veces al día, desde el mismo día de la primera infiltración, suficiente para cubrirlas completamente, incluyendo la piel perilesional; se repitió dicha aplicación durante 21 días.

Veinticuatro horas después del inicio del tratamiento, se advirtió la aparición de necrosis en la zona en que estaba presente el neoplasma (figura 7b).

T ras 72 horas, las costras se habían reblandecido y podían ser fácilmente eliminadas por el propietario (figura 7c).

Tras siete días, las costras se habían eliminado por completo. Persistió una úlcera grande en el punto de contacto de la sonda con la piel de la nariz (figura 7d).

Tras 10 días, se observó que la úlcera se había curado prácticamente por completo, con neoepitelización de toda la punta de la nariz (figura 7e).

Al final de la tercera semana, había tenido lugar una «restitución íntegra» completa de la superficie de la punta de la nariz. Los propietarios, dado el aparente estado de bienestar del sujeto, decidieron detener todo tratamiento (figura 7f).

De esta manera, se interrumpió el tratamiento, y el animal sometido a observación durante 8 meses sin encontrar ninguna recaída de la enfermedad neoplásica, que por lo tanto había sido erradicada. Hasta la fecha, tras más de diez meses, el sujeto se encuentra en excelente estado de salud y no muestra ningún signo de nuevo crecimiento tumoral. Los propietarios informan de una vuelta completa a la vida normal sin ningún déficit olfativo.

EJEMPLO 8

Segunda caso clínicoin vivo.

CASO 2 Conejo de 5 años de edad con carcinoma rectal ulceroso de células escamosas histológicamente confirmado (figura 8a). La lesión era altamente maligna, inflamada y sangrante.

Dada la delicadez de la zona y el riesgo quirúrgico de incontinencia fecal, se decidió realizar criocirugía con el uso protector de la zona sana con aceite ozonizado.

Antes de la intervención, se iniciaron 7 días de ingesta oral de 5 gotas de aceite de girasol ozonizado (OOAO 700, 700 meq O<2>/kg) por la mañana y por la tarde, que se continuaron hasta 10 días después de la crioterapia. El día de la intervención, se llevó a cabo la preparación del sujeto mediante engrasado muy cuidadoso de toda la zona afectada con aceite (figura 8b), de manera que se cubriese por completo la zona afectada, incluyendo la piel perilesional. También se llevó a cabo una infiltración después de la intervención (OOAO 700, 1 ml por sesión en múltiples inyecciones tópicas en la masa neoplásica, tal como ya se ha descrito en el Ejemplo 1) sobre la zona afectada. La figura 8c muestra la ejecución de la cirugía, mientras que la figura 8d muestra la congelación completa de la neoformación. La aplicación tópica y la administración oral se continuaron hasta 10 días después de la intervención. El séptimo día después de la intervención, todavía se advirtió la presencia de material necrótico y la zona aparentemente todavía era hiperémica (figura 8e). Diez días después de la intervención, no había material necrótico y el edema de la parte y el halo inflamatorio neovascularizado circundante se habían reducido visiblemente (figura 8f). El día vigésimo octavo después de la intervención, se observó la restitución a la integridad completa de la zona afectada por el neoplasma (figura 8g).

Hasta la fecha (11 meses después) no se observan signos de nuevo crecimiento local o metástasis y el sujeto no muestra ningún problema durante la defecación o la micción (figura 8h).

EJEMPLO 9

Caso 3

Caso clínico humano.

Una paciente de 93 años de edad con carcinoma epidermoide espinocelular maligno confirmado histopatológicamente. El neoplasma se localizaba en el cuero cabelludo de la zona parietal y mostraba características de extrema invasividad y rápida progresión desde el inicio. De hecho, la caja cerebral resultó invadida en solo unas pocas semanas, con la consecuente osteolisis parietal. El neoplasma continuó rápidamente su progresión, penetrando en el interior del cráneo y aproximándose al aracnoide. Estos datos se obtuvieron mediante tomografía axial computarizada. El neoplasma apareció en el exterior, de tamaño considerable, suficiente para cubrir la bóveda craneal completa con crecimiento notable no solo endofítico (dentro del cráneo) sino también exofítico (protrusión en el exterior del cráneo de la masa neoplásica). El neoplasma presentaba la apariencia de elevada malignidad, caracterizada por un nivel elevado de anaplasia, progresión rápida, presencia de úlceras neoplásicas de tamaño significativo, una inflamación notable de los márgenes perilesionales y total ausencia de fenómenos de reparación a partir de tejido granulomatoso en las zonas circundantes a la úlcera neoplásica. El paciente sufría y presentaba fiebre.

Debido a que no podía intervenirse quirúrgicamente debido a la extensión de la masa neoplásica y la edad avanzada del sujeto, se decidió intervenir con radioterapia paliativa regional, con 8 sesiones de 2 Gy cada una. A partir de la experiencia directa, los radioterapéuticas implicados esperaban que este enfoque fuese puramente paliativo, ya que este tipo de cáncer es muy poco sensible a la radioterapia. Por lo tanto, se decidió utilizar aceite de girasol ozonizado con 1100 ozónidos («OAO<o>1100») mediante aplicación local en la úlcera carcinomatosa.

Por lo tanto, apareció el problema del momento de aplicación de OAOO 1100 con respecto a la radioterapia; es decir, si el producto debía aplicarse antes o después del tratamiento con radiación gamma. Con este fin, se llevó a cabo un experimentoin vitroen el que se expusieron células de carcinoma A549 anaplásicas a radiaciones ionizantes (2 Gy) tanto bajo condiciones de pretratamiento como de postratamiento con OOAO 1100 y OOAO 700 (aceite de girasol ozonizado con 700 ozónidos). A continuación, se evaluó comparativamente la supervivencia celular mediante la prueba del violeta cristal con respecto a células de control expuestas a radiación, pero no tratadas con aceite de girasol ozonizado. El experimento se replicó 16 veces en multiplaca para un total de 48 experimentos (3 condiciones experimentales x16 réplicas). Los resultados obtenidos se proporcionan en la figura 9.

Los resultados obtenidos indicaron un fuerte efecto radiosensibilizador de OOAO 700 y todavía superior de OOAO 1100. El efecto máximo observado fue el de OOAO 1100 al administrarlo después de la exposición a rayos gamma. Desde un punto de vista de mecanismo, dicho efecto concuerda con la activación de la apoptosis mitocondrial intrínseca activada por el aceite ozonizado en células que han experimentado daño de radiación genotóxico. Por lo tanto, se decidió utilizar OOAO 1100 en un régimen post-tratamiento, es decir, al final de cada sesión de radioterapia. Por lo tanto, al final de la primera sesión de radioterapia, se aplicó OOAO 1100, gelificado a 4 °C, sobre la lesión neoplásica mediante un depositador de vidrio y se recubrió la úlcera con gasa y vendaje hidrofóbico.

Se continuó el tratamiento a lo largo de un total de 8 sesiones consecutivas con un intervalo de 2 días entre cada una de ellas. La medicación con OOAO 1100 se renovó al final de cada sesión. Por lo tanto, se dejó que OOAO 1100 actuase durante 48 horas durante los intervalos entre sesiones.

El análisis macroscópico mostró claramente una fuerte reducción del tamaño de la masa neoplásica tanto en términos de su amplitud como de su profundidad. Se observó, además, la formación de tejido de granulación de reparación en los márgenes de la lesión.

A continuación, se detuvo la radioterapia y se continuó con solo el tratamiento tópico con OOAO 1100. Posteriormente, el neoplasma no reinició el crecimiento, sino que continuó su regresión.

Estos datos apoyan el efecto inhibitorio específico de OOAO 1100 del tumor, también en ausencia de tratamiento de radiación. Al final del seguimiento, solo persistía una costra blanda de material exudativo resultante de la necrosis colicuativa del tejido neoplásico.

Con el fin de verificar si la aplicación tópica de OOAO 110 había presentado un efecto sistémico sobre el equilibrio oxidativo, se llevó a cabo un análisis de radicales libres del plasma sanguíneo antes (T0) del inicio del tratamiento con OOAO 1100 y al final del mismo (T1) utilizando FRAS (por sus siglas en inglés, análisis de radicales libres, FRAS 4 Evolvo, H&D, Parma, Italia). En T0, los parámetros estaban drásticamente alterados, con un valor de especies oxidantes particularmente bajo, es decir, de 38 U carr (intervalo normal: 250 a 280). En paralelo, los antioxidantes estaban fuertemente incrementados, con un valor de 8318 U cor (intervalo normal: 2200-2800). El equilibrio antioxidante/oxidante (proporción U cor/U carr), por lo tanto, era de 219 (intervalo normal: 7 a 10). Estos resultados demuestran que la presencia de masas neoplásicas de tamaño significativo implica la fuerte reducción del nivel de daño oxidativo sistémico. En T1, los valores cambiaron de la manera siguiente: 201 U carr, 7544 U cor, 37 U/cor/U carr. Por lo tanto, se observó un incremento de 530 % de las especies oxidantes, una reducción de 13 % de los antioxidantes y una reducción de 583 % de la proporción U cor/U carr. Dichos valores indican que la regresión de la masa neoplásica está relacionada con la variación del equilibrio oxidativo inducida por el tratamiento con OOAO.

Al final del tratamiento, el estado de salud del paciente era bueno, y ya no sufría ni presentaba fiebre. No se encontraron en ningún momento durante el tratamiento efectos no deseables, tanto subjetivos como objetivos, que puedan relacionarse con el tratamiento con OOAO 1100 o la exposición a terapia de radiación.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   i.Formulación que comprende por lo menos un aceite ozonizado para la utilización y/o el tratamiento de un tumor, preferentemente un tumor maligno, en donde dicho aceite o aceites ozonizados presentaban un contenido de ozónidos de entre 500 y 1500 meq O<2>/kg.
2. 2. Formulación para la utilización según la reivindicación 1, en donde dicha formulación está destinada al uso mediante administración seleccionada de entre oral, tópica, mediante inyección, mediante inhalación y combinaciones de las mismas.
3. 3. Formulación para la utilización según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho aceite o aceites ozonizados presentan un contenido de ozónidos de entre 600 y 1400 meq O<2>/kg, preferentemente de entre 700 y 1300 meq O<2>/kg.
4. 4. Formulación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho aceite ozonizado es un aceite vegetal que se ha sometido a un procedimiento de ozonización, preferentemente seleccionado de entre: aceite de girasol, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de argán, aceite de semilla de pomelo, aceite de jojoba, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de palma, aceite de semilla de algodón, aceite de colza, aceite de coco, aceite de ricino, aceite de linaza, aceite de borraja, aceite de onagra y mezclas de los mismos, preferentemente aceite de girasol.
5. 5. Formulación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho tumor se selecciona de entre un tumor sólido, un tumor cutáneo, un tumor mucoso y un tumor líquido.
6. 6. Formulación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la utilización mediante administración tópica, que preferentemente comprende, en porcentaje en peso con respecto al peso total de la formulación, entre 1 % y 50 %, más preferentemente entre 2 % y 20 %, todavía más preferentemente entre 3 % y 15 % de dicho aceite o aceites ozonizados.
7. 7. Formulación para la utilización según la reivindicación 6, en una forma seleccionada de entre aceite, gel y emulsión, preferentemente aceite.
8. 8. Formulación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la utilización mediante administración oral, que preferentemente comprende, en porcentaje en peso con respecto al peso total de la formulación, entre 1 % y 5%, más preferentemente entre 2 % y 3 %, de dicho aceite o aceites ozonizados.
9. 9. Formulación para la utilización según la reivindicación 8, que comprende un vehículo compatible con dicho aceite o aceites ozonizados, preferentemente en una cantidad, en porcentaje en peso con respecto al peso total de la formulación, entre 95 % y 99 %, más preferentemente entre 97 % y 98 %.
10. 10. Formulación para la utilización según la reivindicación 8 o 9, en donde dicho vehículo comprende por lo menos un edulcorante y agua.
11. 11. Formulación para la utilización según la reivindicación 10, en una forma seleccionada de entre cápsula y bebida, preferentemente una bebida, más preferentemente un jarabe.
12. 12. Formulación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la utilización mediante administración mediante inyección, que preferentemente consiste en dicho aceite o aceites ozonizados.
13. 13. Formulación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la utilización mediante administración por inhalación, preferentemente en donde dicha formulación comprende, además, por lo menos un surfactante no iónico.
14. 14. Formulación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el tratamiento de un tumor comprende la administración de dicha formulación hasta alcanzar una proporción U Cor/U Carr de especies antioxidantes (U Cor) a especies oxidantes (U Carr) en la sangre del paciente de entre 4 y 12, preferentemente de entre 5 y 10, más preferentemente de entre 6 y 8.