RS65217B1 - Formulacija koja sadrži ozonizovano ulje za lečenje tumora - Google Patents

Description

Opis

Oblast primene

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na primenu formulacije koja sadrži ozonizovano ulje u prevenciji i/ili lečenju tumora, naročito malignog tumora (kancera).

Stanje tehnike

[0002] Neoplastična ćelija se razlikuje od normalne po mnogim aspektima, uključujući blokadu mitohondrijalne funkcije, koja ima za cilj inhibiciju apoptoze (spontane ćelijske smrti), što predstavlja osnovnu prepreku za razvoj kancera. Mitohondrijski blok koji se javlja u neoplastičnoj ćeliji poznat je kao Varburgov efekat.

[0003] Nedavna eksperimentalna istraživanja prikazuju da su neoplastične ćelije u svom rastu favorizovane od strane antioksidativnih molekula, ali su u suprotnosti sa prooksidantnim situacijama. Konkretno, matične ćelije kancera, koje izazivaju otpornost na hemio/radioterapiju i relapse, odlikuju se redukcionim okruženjem i stoga su veoma osetljive na citotoksične efekte oksidativnog oštećenja (Zhou i sarad., R Reactive oxygen species in normal and tumour stem cells. Adv Cancer Res.2014;122:1-67). Mitohondrije su glavni endogeni izvor oksidirajućih molekula.

[0004] Danas, povećanje oksidativnog oštećenja stoga predstavlja strategiju za terapiju kancera (Liu i sarad., 2015, Increased Oxidative Stress as a Selective Anticancer Therapy. Oxid Med Cell Longev. članak ID294303).

[0005] Učinjeni su neki pokušaji da se ozon koristi kao izvor oksidirajućih vrsta u terapiji kancera. Naročito, korišćen je ozon kao gas (Rossmann i sarad., Intraperitoneal oxidative stress in rabbits with papillomavirus-associated head and neck cancer induces tumoricidal immune response that is adoptively transferable. Clin Cancer Res.2014; 20 (16): 4289-4301)) ili kao ozonizovani vodeni rastvor injekcijom (Kuroda i sarad., The Safety and Anti-Tumor Effects of Ozonated Water in Vivo. Int J Mol Sci.2015; 16(10) :25108-25120)). Ove studije su prikazale specifične citotoksične efekte na neoplastično tkivo u odsustvu oštećenja zdravih tkiva. Međutim, postignuti terapijski efekat je bio značajan, ali prolazan.

[0006] Stoga se u oblasti oseća potreba da se obezbedi formulacija na bazi ozonizirajuće vrste za prevenciju i/ili lečenje tumora, posebno malignog tumora (kancera), koja prevazilazi nedostatke i granice formulacija iz stanja tehnike

[0007] Tehnički problem koji je u osnovi predmetnog pronalaska je prema tome kako obezbediti formulaciju koja sadrži ozonizirajuću vrstu koja je efikasna u prevenciji i/ili lečenju tumora, posebno malignog tumora (kancera), koja ima produženi terapijski efekat tokom vremena.

[0008] Maligni tumor može biti solidni tumor, na primer tumor prostate, jetre, pluća, dojke, kolorektuma, pankreasa ili velikog mozga; kutani (kožni) tumor; tumor sluzokože, na primer usta, nosa, anusa, vulve ili vagine; ili tečni tumor, kao što je hematopoetski tumor.

[0009] Posebno, tehnički problem koji je u osnovi predmetnog pronalaska je kako da se obezbedi takva formulacija koja ima terapijski efekat tokom perioda od najmanje šest meseci od završetka terapije, poželjno najmanje 5 godina.

[0010] Dalji tehnički problem koji je u osnovi predmetnog pronalaska je da se obezbedi takva formulacija koja je efikasna u sprečavanju formiranja metastaza.

[0011] Dalji tehnički problem koji je u osnovi ovog pronalaska je da se obezbedi takva formulacija koja ima veći sadržaj ozonida od oksidirajućih formulacija iz stanja tehnike koje su opisane gore (30 meq O2/kg), posebno veći od 100 meq O2/kg, još preciznije veći od 500 meq O2/kg.

[0012] Dalji tehnički problem koji je u osnovi ovog pronalaska je da se obezbedi takva formulacija koja ima visoku podnošljivost, odnosno manji broj i intenzitet neželjenih propratnih efekata u odnosu na terapije koje se trenutno koriste.

[0013] Konkretno, formulacija treba da bude u stanju da ispoljava efekat protiv kancera bez oštećenja ćelija koje nisu neoplastične, odnosno onih koje su zdrave.

[0014] Dalji tehnički problem koji je u osnovi ovog pronalaska je da se obezbedi takva formulacija koja omogućava laku personalizaciju doze.

Rezime pronalaska

[0015] Sličan problem je rešen prema pronalasku pomoću formulacije koja sadrži najmanje jedno ozonizovano ulje za primenu u prevenciji i/ili lečenju tumora, poželjno malignog tumora.

[0016] Poželjno, takva formulacija je za primenu oralnom, topikalnom primenom, injekcijom (na primer infiltracijom), inhalacijom (na primer u obliku aerosola) i njihovim kombinacijama.

[0017] Poželjno, takva formulacija je za primenu topikalnim administriranjem i/ili administriranjem injekcijom (na primer, infiltracijom).

[0018] Ozonizovano ulje ima sadržaj ozonida od 500 do 1500 meq O2/kg, poželjnije od 600 do 1400 meq O2/kg, još poželjnije od 700 do 1300 meq O2/kg.

[0019] U poželjnom tehničkom rešenju, ozonizovano ulje ima sadržaj ozonida veći od 800 i manji od 1500 meq O2/kg, poželjnije veći od 900 i manji od 1400 meq O2/kg, još poželjnije veći od 1000 i manji od 1300 meq O2/kg, najpoželjnije veći od 1100 i manji od 1200 meq O2/kg.

[0020] Sadržaj ozonida se može meriti tehnikama poznatim u ovoj oblasti, na primer metodom za određivanje peroksidnog broja koja je opisana u Uredbi (EEC) br. 2568/91 od 11. jula 1991. o karakteristikama maslinovog ulja i ulja iz ostataka od maslina i relevantnim metodama analize, Aneks III.

[0021] Poželjno, ozonizovano ulje je biljno ulje koje je podvrgnuto procesu ozoniranja, poželjnije izabrano od: suncokretovog ulja, maslinovog ulja, ulja kikirikija, arganovog ulja, ulja semenki grožđa, ulja jojobe, sojinog ulja, kukuruznog ulja, palminog ulja, ulja semena pamuka, ulja od uljane repice, kokosovog ulja, ricinusovog ulja, lanenog ulja, ulja boražine, ulje noćurka i njihovih smeša.

[0022] U skladu sa posebno poželjnim tehničkim rešenjem, ozonizovano ulje je ulje suncokretovog semena (u daljem tekstu takođe "suncokretovo ulje"), ulje semena kikirikija (u daljem tekstu takođe "ulje od kikirikija") ili njihove mešavine. U stvari, poželjno je koristiti ulje u suštini bez bilo kakve intrinzične antioksidativne aktivnosti.

[0023] Poželjno, ozonizovano ulje je u suštini bez antioksidativnih agenasa.

[0024] U skladu sa poželjnim tehničkim rešenjem, ozonizovano ulje se bira od: suncokretovog ulja, ulja od kikirikija, arganovog ulja, ulja semena grožđa, ulja jojobe, sojinog ulja, kukuruznog ulja, palminog ulja, ulja semena pamuka, ulja uljane repice, kokosovog ulja, ricinusovog ulja, ulja lanenog semena, ulja boražine, ulja noćurka i njihovih smeša, poželjnije suncokretovog ulja i/ili ulja od kikirikija.

[0025] Poželjno, ozonizovano ulje se dobija kroz proces ozonizacije koji koristi visoko prečišćen gasoviti kiseonik za uvođenje kiseonika.

[0026] Poželjno, formulacija treba da se administrira životinji ili humanom sisaru koji pati od tumora, poželjnije malignog tumora.

[0027] Poželjno, tumor je odabran od solidnog tumora, na primer tumora prostate, jetre, pluća, dojke, kolorektuma, pankreasa ili velikog mozga; kutanog (kožnog) tumora; tumora sluzokože, na primer usta, nosa, anusa, vulve ili vagine; i tečnog tumora, kao što je hematopoetski tumor.

[0028] Poželjno, gore pomenuta formulacija deluje na neoplastičnu ćeliju oksidacijom mitohondrijalnih membrana.

[0029] U skladu sa poželjnim tehničkim rešenjem, gore pomenuta formulacija je za primenu za topikalno administriranje.

[0030] Formulacija za topikalnu primenu predmet ovog pronalaska može se sastojati od prethodno navedenog najmanje jednog ozonizovanog ulja ili može da sadrži prethodno navedeno najmanje jedno ozonizovano ulje, poželjno u koncentraciji, u masenim procentima u odnosu na ukupnu masu formulacije, od 1 do 50%, još poželjnije od 2 do 20%, najpoželjnije od 3 do 15%.

[0031] U poželjnom tehničkom rešenju, formulacija za topikalnu primenu iz predmetnog pronalaska dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, kompatibilan sa ozonizovanim uljem.

[0032] Poželjno, formulacija za topikalnu upotrebu pronalaska je u obliku koji se bira između ulja, gela i emulzije, poželjnije ulja.

[0033] Gel može biti hidrogel ili lipogel.

[0034] Poželjno, hidrogel sadrži, u masenim procentima na ukupnu masu hidrogela, od 3 do 30%, poželjnije od 5 do 20%, najpoželjnije od 8 do 15% najmanje jednog ozonizovanog ulja.

[0035] Termin "hidrogel" ovde znači da je formulacija u obliku geliranog hidrofilnog rastvora u kome je ozonizovano ulje dispergovano u vodenom medijumu.

[0036] Termin "lipogel" ovde znači da je formulacija u obliku geliranog lipofilnog rastvora u kome je ozonizovano ulje dispergovano u lipidnom medijumu.

[0037] U skladu sa poželjnim aspektom ovog pronalaska, topikalna primena za prevenciju i/ili lečenje tumora se izvodi topikalnom primenom formulacije na zahvaćeno tkivo, poželjno u periodu koji je duži od tri dana i kraći od šezdeset dana, poželjnije od deset do trideset dana.

[0038] Poželjno, topikalna primena formulacije se izvodi jednom ili dva puta dnevno, poželjnije dva puta dnevno.

[0039] Poželjno, topikalna primena se izvodi nanošenjem količine formulacije na zahvaćeno tkivo koja je dovoljna da pokrije neoplastičnu leziju, poželjnije dovoljna da pokrije neoplastičnu leziju i bar deo perilezijske kože.

[0040] Perilezijska koža se definiše kao kutana površina kože koja se proteže od ivice lezije do jednog centimetra od nje.

[0041] Prema poželjnom aspektu ovog pronalaska, formulacija za topikalnu primenu sadrži ozonizovano ulje koje ima sadržaj ozonida veći od 800 i manji od 1500 meq O2/kg, poželjnije veći od 900 i manji od 1400 meq O2/kg, još poželjnije veći od 1000 i manji od 1300 meq O2/kg, najpoželjnije veći od 1100 i manji od 1200 meq O2/kg.

[0042] Formulacija za topikalnu primenu je posebno indikovana za primenu u prevenciji i/ili lečenju tumora kože, kao što je na primer maligni melanom, epidermoidni karcinom bazalnih ćelija i spinocelularni epidermoidni karcinom.

[0043] Formulacija za topikalnu primenu je takođe posebno indikovana za primenu u prevenciji i/ili lečenju tumora sluzokože, na primer usta, nosa, anusa, vulve ili vagine.

[0044] U skladu sa alternativnim poželjnim tehničkim rešenjem, gore pomenuta formulacija je za primenu oralnim administriranjem.

[0045] Štaviše, nađeno je da je formulacija za oralnu primenu prema predmetnom pronalasku efikasna u sprečavanju formiranja metastaza, posebno kod radiorezistentnih subjekata.

[0046] Predmetni pronalazak se stoga dalje odnosi na formulaciju za oralnu upotrebu ovog pronalaska za primenu u prevenciji formiranja metastaza, poželjnije kod radiorezistentnih humanih ili životinjskih sisara.

[0047] Formulacija za oralnu primenu prema predmetnom pronalasku može se sastojati od prethodno navedenog najmanje jednog ozonizovanog ulja ili može da sadrži prethodno navedeno najmanje jedno ozonizovano ulje, poželjno u koncentraciji, u masenom procentu u odnosu na ukupnu masu formulacije, od 1 do 5%, još poželjnije od 2 do 3%.

[0048] Prema poželjnom aspektu, formulacija ovog pronalaska sadrži nosač, kompatibilan sa ozonizovanim uljem, poželjno u količini od 95 mas% do 99 mas%, poželjnije od 97 mas% do 98 mas%, pri čemu se procenti odnose na ukupnu masu formulacije.

[0049] U skladu sa poželjnim tehničkim rešenjem, pomenuti nosač sadrži najmanje jedan zaslađivač i vodu.

[0050] Poželjno, zaslađivač je odabran od najmanje jednog saharida, poželjnije odabran od fruktoze, glukoze, saharoze i njihovih smeša; najmanje jednog voćnog koncentrata; najmanje jednog poliola; i najmanje jednog biljnog ekstrakta, poželjnije stevije; i njihovih smeša.

[0051] U poželjnom tehničkom rešenju, nosač sadrži sirup i/ili med.

[0052] Poželjno, sirup je fruktozni sirup.

[0053] Poželjno je da je med sirovi neprerađeni med.

[0054] Nosač može dalje da sadrži jedan ili više dodatnih sastojaka odabranih od esencijalnog ulja limuna, sredstava za zakiseljavanje, monohidrata limunske kiseline, konzervansa, natrijum laktata, kalijum sorbata, natrijum benzoata, arapske gume, ksantan gume, prirodnih ili veštačkih aroma (na primer, aroma trešnje), emulgatora (polisorbat 80) i njihovih smeša.

[0055] Nosač takođe može da sadrži osmotsku vodu.

[0056] Nosač dalje može da sadrži najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0057] Poželjno, formulacija za oralnu primenu prema pronalasku je u obliku koji se bira između kapsule i napitka, poželjnije napitka, još poželjnije sirupa.

[0058] Pojam "sirup" ovde označava vodeni preparat koji sadrži najmanje jedan zaslađivač. Sirup je u tečnom obliku koji se lako dozira i ne zahteva upotrebu premaza, posebno gastrorezistentnih premaza.

[0059] Poželjno, nosač dalje sadrži lipozomalnu frakciju. Navedena lipozomalna frakcija se može povoljno koristiti za povećanje nivoa apsorpcije ozonizovanog ulja, pošto favorizuje bioraspoloživost i omogućava u većem stepenu produženo i postepeno oslobađanje aktivne komponente.

[0060] Poželjno, formulacija za oralnu primenu prema pronalasku je u obliku gastrorezistentne kapsule, na primer sa premazom na bazi silicijum dioksida.

[0061] U stvari, silicijum dioksid vrši adsorpciono dejstvo na ozonizovano ulje omogućavajući kontrolisano oslobađanje duž crevnog trakta nakon što prođe želudačnu barijeru, umesto da ostane u obliku bolusa.

[0062] U stvari, ozonizovana ulja imaju tendenciju da se u velikoj meri neutrališu u svom delovanju u jako kiseloj i samim tim redukujućoj gastričnoj sredini.

[0063] Pogodno je da formulacija za oralnu primenu koja sadrži ozonizovano ulje prema pronalasku ima visoku bioraspoloživost, stoga je u stanju da dospe u sistemsku cirkulaciju i stoga ispoljava terapijsku aktivnost u odnosu na maligni tumor. U stvari, posebna formulacija za oralnu primenu prema pronalasku, na primer u obliku sirupa, favorizuje bioraspoloživost i apsorpciju odmah nakon uzimanja, počevši od samog početnog dela digestivnog trakta, uključujući tu oralnu i sublingvalnu sluzokožu. Iz tog razloga, formulaciju za oralnu primenu prema predmetnom pronalasku karakteriše odsustvo gastrorezistentnih premaza koji bi sprečili brzu sistemsku apsorpciju.

[0064] Štaviše, formulacija za oralnu primenu prema pronalasku, koja je formulacija za brzu apsorpciju već u početnom traktu digestivnog trakta, čini primenu antioksidativnih (a samim tim i redukujućih) aditiva u svrhu očuvanja nepotrebnom. U stvari, ovi antioksidativni aditivi stupaju u interakciju sa aktivnim principom (ozon, oksidans), čime utiču na terapijska svojstva formulacije i mogućnost njene sistemske apsorpcije. Zbog toga, gore pomenute osobene karakteristike čine formulaciju prema pronalasku posebno pogodnom za indukciju sistemskih, a ne samo topikalnih efekata lečenja.

[0065] Prema poželjnom aspektu predmetnog pronalaska, oralna primena za lečenje tumora se izvodi oralnim administriranjem formulacije, poželjno u periodu dužem od tri dana i kraće od šezdeset dana, poželjnije od deset do trideset dana.

[0066] Poželjno, oralno administriranje formulacije se izvodi jednom ili dva puta dnevno, poželjnije dva puta dnevno.

[0067] Prema daljem poželjnom aspektu ovog pronalaska, oralna primena za prevenciju, posebno za prevenciju relapsa, tumora se izvodi oralnim administriranjem formulacije, poželjno u periodu dužem od tri dana i kraćem od šezdeset dana, poželjnije od deset do trideset dana.

[0068] U slučaju prevencije relapsa, administriranje formulacije je poželjno usmereno na matične ćelije, koje su posebno u vezi sa razvojem relapsa. U stvari, ove ćelije karakteriše veoma redukujuće intracelularno okruženje koje im omogućava da se odupru hemio/radioterapiji. Formulacija prema predmetnom pronalasku ima sposobnost da modifikuje ovo okruženje u oksidativno.

[0069] Poželjno, oralno administriranje formulacije se izvodi jednom ili dva puta dnevno, još poželjnije dva puta dnevno.

[0070] Prema daljem poželjnom aspektu ovog pronalaska, oralna primena za prevenciju formiranja metastaza se izvodi oralnim administriranjem formulacije, poželjno u periodu dužem od tri i kraćem od šezdeset dana, još poželjnije od deset do trideset dana.

[0071] Poželjno, oralno administriranje formulacije se izvodi jednom ili dva puta dnevno, još poželjnije dva puta dnevno.

[0072] Poželjno, oralno administriranje se izvodi administriranjem količine ozonizovanog ulja od 0.1 do 0.5 ml dnevno po kilogramu telesne težine subjekta. Ovo odgovara na primer dozi od 7-35 ml ozonizovanog ulja dnevno kod pacijenta od 70 kg telesne težine.

[0073] Još poželjnije, oralno administriranje se izvodi administriranjem količine ozonizovanog ulja od 0.2 do 0.4 ml, još poželjnije od 0.25 do 0.35 ml dnevno po kilogramu telesne težine subjekta.

[0074] Formulacija za oralnu primenu je posebno indikovana za primenu u prevenciji i/ili lečenju tečnog tumora, na primer hematopoetskog tumora.

[0075] Štaviše, formulacija za oralnu primenu je posebno indikovana za primenu u prevenciji i/ili lečenju tumora koji utiče na unutrašnje organe, na primer debelo crevo, jetru, pankreas, pluća, dojke, prostatu i organe zaštićene krvno-moždanom barijerom (uključujući druge organe centralnog nervnog sistema, kao što su mozak i testis). U skladu sa alternativnim poželjnim tehničkim rešenjem, gore pomenuta formulacija je za primenu injekcionim administriranjem.

[0076] Formulacija injekcijom prema predmetnom pronalasku može se sastojati od prethodno navedenog najmanje jednog ozonizovanog ulja ili može da sadrži prethodno navedeno najmanje jedno ozonizovano ulje u koncentraciji, u masenim procentima u odnosu na ukupnu masu formulacije, od najmanje 90%, poželjno od najmanje 95%, najpoželjnije 99%.

[0077] U poželjnom tehničkom rešenju, formulacija putem injekcije predmet ovog pronalaska sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, kompatibilan sa ozonizovanim uljem.

[0078] Poželjno, formulacija injekcijom prema pronalasku je u obliku ulja.

[0079] U poželjnom tehničkom rešenju, formulacija putem injekcije prema pronalasku dalje sadrži najmanje jedno nejonsko površinski aktivno sredstvo.

[0080] Poželjno, površinski aktivno sredstvo je polisorbat (polioksietilen glikol sorbitan alkil estri) ili SPAN (sorbitan alkil estri).

[0081] Poželjno je da je površinski aktivno sredstvo izabrano od: Polisorbata 80 (polioksietilen (20) sorbitan monooleat), polisorbata 20 (polioksietilen (20) sorbitan monolaurat), polisorbata 40 (polioksietilen (20) sorbitan monopalmitat), polisorbata 60 (polioksietilen (20) sorbitan monostearat), sorbitan monolaurata, sorbitan monopalmitata, sorbitan monostearata, sorbitan tristearata i sorbitan monooleata i njihovih smeša, poželjnije polisorbat 80.

[0082] Zahvaljujući ovom sredstvu, moguće je ozonizovano ulje učiniti disperzibilnim u vodi, čime se sprečava mogućnost da ubrizgavanje ozonizovanog ulja intramuskularnim ili intravenskim putem dovede do komplikacija kao što je na primer plućna ili cerebralna embolija.

[0083] U poželjnom tehničkom rešenju, formulacija pronalaska putem injekcije sadrži vodu, polisorbat 80, ozonizovano ulje kikirikija ili suncokretovo ulje, natrijum hlorid.

[0084] Poželjno, injekcija je infiltracijom, fleboklizom, intravenskim, intramuskularnim, ili čak administriranjem preko port-katetera (port-à-cath).

[0085] Prema poželjnom aspektu ovog pronalaska, primena injekcijom u lečenju tumora se izvodi injektiranjem formulacije u zahvaćeno tkivo, poželjno u periodu dužem od tri dana i kraćem od šezdeset dana, poželjnije od deset do trideset dana.

[0086] Poželjno je da se injektiranje formulacije izvodi jednom ili dva puta dnevno, još poželjnije dva puta dnevno.

[0087] Poželjno, administriranje injekcijom se vrši ubrizgavanjem količine ozonizovanog ulja od 0.5 do 5 ml, poželjnije od 0.7 do 4 ml, još poželjnije od 1 do 3 ml dnevno po cm<3>neoplastične mase.

[0088] Formulacija putem injekcije je posebno indikovana za primenu u lečenju solidnog tumora, kao što je na primer tumor prostate, jetre, pluća, dojke ili kolorektalnog tumora, posebno u slučajevima kada je tumor u uznapredovalom stadijumu.

[0089] Formulacija putem injekcije prema ovom pronalasku može dalje da sadrži najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0090] Prema daljem poželjnom aspektu, formulacija prema pronalasku je za primenu inhalacijom, na primer u obliku aerosola.

[0091] Formulacija za inhalacionu primenu prema predmetnom pronalasku može se sastojati od prethodno navedenog najmanje jednog ozonizovanog ulja ili može da sadrži prethodno navedeno najmanje jedno ozonizovano ulje, poželjno u koncentraciji, u masenim procentima u odnosu na ukupnu masu formulacije, od 1 do 50%, još poželjnije od 2 do 20%, najpoželjnije od 3 do 15%.

[0092] U poželjnom tehničkom rešenju, formulacija za inhalacionu primenu predmet ovog pronalaska dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, kompatibilan sa ozonizovanim uljem.

[0093] Poželjno, formulacija za inhalaciono administriranje dalje sadrži najmanje jedno nejonsko površinski aktivno sredstvo, kao što je gore opisano.

[0094] Zahvaljujući ovom sredstvu, moguće je napraviti ozonizovano ulje koje je disperzibilno u vodi.

[0095] U poželjnom tehničkom rešenju, formulacija pronalaska za inhalaciju sadrži vodu, polisorbat 80, ozonizovano ulje kikirikija ili suncokretovo ulje, natrijum hlorid.

[0096] Formulacija za inhalacionu primenu je posebno indikovana za primenu u prevenciji i/ili lečenju tumora koji utiče na pluća (karcinom pluća) ili proksimalni deo respiratornog sistema (bronhije, grkljan, ždrelo).

[0097] Poželjno, prevencija i/ili lečenje prema predmetnom pronalasku obuhvata jedno ili više od topikalnog administriranja, oralnog administriranja, administriranja putem inhalacije i administriranja injekcijom gore pomenute formulacije.

[0098] To jest, moguće je udružiti, na primer, oralno administriranje sa topikalnim administriranjem i/ili administriranjem injekcijom.

[0099] Takođe je moguće udružiti topikalno administriranje sa administriranjem injekcijom i/ili oralnim administriranjem.

[0100] Konačno, moguće je udružiti administriranje injekcijom sa oralnom administriranjem i/ili sa topikalnim administriranjem.

[0101] Uz odgovarajuću kombinaciju navedenih postupaka administriranja, moguće je postići, na primer, remisiju tumora i prevenciju metastaza.

[0102] Gore navedene formulacije za oralnu primenu, za topikalnu primenu i putem injekcije mogu se koristiti u prevenciji i/ili lečenju tumora, i/ili u prevenciji formiranja metastaza, i/ili relapsa, istovremeno ili uzastopno.

[0103] Poželjno, formulacija se administrira u kombinaciji sa hirurškom intervencijom, poželjnije sa kriohirurškom intervencijom koja ima za cilj uklanjanje tumora, ili u kombinaciji sa kriohirurškom intervencijom.

[0104] To jest, formulacija se može administrirati oralnim putem, putem inhalacije, primeniti topikalno, injektirati ili njihovim kombinacijama, počevši od određenog dana pre hirurške ili krioterapijske intervencije i do određenog dana nakon toga. Alternativno, može se administrirati oralnim putem, putem inhalacije, topikalno, ubrizgavanjem ili njihovim kombinacijama, počevši od dana hirurške intervencije pa do određenog dana nakon toga, ili počevši od određenog dana nakon hirurške ili krioterapijske intervencije.

[0105] Poželjno je da se formulacija za oralnu primenu administrira zajedno sa radioterapijskom sesijom koja ima za cilj lečenje tumora, poželjnije kod radiorezistentnih humanih sisara ili životinja.

[0106] Formulacija za oralnu primenu može se administrirati počevši od određenog dana pre sesije radioterapije i do određenog dana nakon toga, poželjnije počevši od određenog dana pre sesije radioterapije i do početnog dana iste, još poželjnije počevši od najmanje 20 dana pre sesije radioterapije.

[0107] U stvari, pronađeno je da oralno administriranje formulacije počevši pre radioterapije inhibira formiranje metastaza kod radiorezistentnih subjekata.

[0108] Poželjno, lečenje tumora prema predmetnom pronalasku obuhvata administriranje formulacije prema pronalasku dok se ne postigne odnos U Cor/U Carr između antioksidirajućih vrsta (U Cor) i oksidirajućih vrsta (U Carr) u pacijentovoj krvi koji je između 4 i 12, poželjnije između 5 i 10, najpoželjnije između 6 i 8.

[0109] Vrednosti niže od 4, u stvari, ako su postojane tokom vremena, ukazuju na predoziranje formulacije i stoga ih treba izbegavati jer može doći do oksidativnog oštećenja u zdravim ćelijama pacijenta, sa posledičnim povećanim rizikom za pacijente od kardiovaskularnih bolesti, kao što su srčani udari i moždani udari. Vrednosti iznad 12 umesto toga ukazuju na lečenje koji nije veoma efikasno ili nije završeno.

[0110] Poželjno, lečenje tumora prema predmetnom pronalasku obuhvata administriranje formulacije prema pronalasku dok se ne postigne odnos U Cor/U Carr između antioksidirajućih vrsta (U Cor) i oksidirajućih vrsta (U Carr) u krvi pacijenta koji je niži od 7, poželjnije niži od 6, još poželjnije niži od 5.

[0111] Poželjno je da je prethodno navedeni odnos jednak ili veći od 4.

[0112] Uočeno je, naime, da se kod pacijenta koji boluje od maligne neoplazme, posebno ako je agresivna i/ili velikih dimenzija, pomenuti odnos U Cor/U Carr menja u odnosu na zdravu osobu, kod koje je normalna vrednost je 7 ± 1. Kod onkološkog pacijenta ova vrednost je znatno iznad vrednosti kod zdravih osoba i obično se nalaze vrednosti od 46 ± 7.

[0113] Početna vrednost ovog parametra je promenljiva među pacijentima i zavisi od mnogih faktora, pored prisustva tumora, uključujući ishranu, starost, način života, druge bolesti itd. Praćenje ovog parametra pre i tokom lečenja stoga omogućava postavljanje personalizovanog lečenja za pacijenta, koje omogućava da se postigne smanjenje neoplazme efikasnije uz izbegavanje predoziranja formulacijom.

[0114] Procena oksidativnog stanja, tj. određivanje prethodno navedenog U Cor/U Carr odnosa, može se izvršiti bilo kojom metodom poznatom u ovoj oblasti, na primer pomoću FRAS testa zasnovanog na oksido-redukcionim reakcijama podloge sa gvožđem sa kvantitativnim očitavanjima apsorbancije na 505 nm nakon reakcije sa uzorkom krvi koji se ispituje. FRAS test se može izvršiti (a) za procenu antioksidirajućih vrsta metodom opisanom u Benedetti i sarad., Clin. Lab 59; 1091-1097, 2013; (b) za procenu oksidirajućih vrsta metodom opisanom u Iannitti i sarad., J. Oral Path. Medicine, doi: doi: 10.1111/j.1600-0714.2012.01143.x, 2012).

[0115] Test daje kvantifikaciju: (a) ukupnih oksidirajućih vrsta u ekvivalentima molekula vodonik peroksida (1 U Carr = 0.08 mg H2O2po 100 ml); i (b) ukupnih antioksidirajućih vrsta u ekvivalentima molekula askorbinske kiseline (1 U Cor = mikromoli/litar askorbinske kiseline). Test je neinvazivan i sprovodi se uzimanjem mikro-količine (50-100 ul) periferne venske krvi mikropunkcijom distalne digitalne kože. Moguće je koristiti testove koji su slični FRAS-u pod uslovom da su pravilno validirani i upoređeni sa njim.

[0116] Poželjno, lečenje obuhvata jednu ili više sesija lečenja, razmaknutih određenim vremenskim periodom, do stabilizacije gore pomenute željene vrednosti tokom vremena.

[0117] Ovaj specifični vremenski period može biti između 1 i 6 meseci, poželjno između 1 i 3 meseca.

[0118] Vrednost se smatra stabilnom tokom vremena kada ostaje suštinski konstantna tokom najmanje šest meseci, poželjnije najmanje godinu dana, još poželjnije najmanje dve godine, najpoželjnije najmanje tri godine.

[0119] Osoba verzirane u ovoj oblasti može da modulira dozu i trajanje lečenja, i njegovu moguću podelu na jednu ili više sesija, kako bi se postigao unapred utvrđeni cilj, na osnovu kliničke procene pacijenta sa upućivanjem na specifičnu onkološku patologiju od koje boluje.

[0120] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na prevenciju i/ili lečenje tumora, poželjno malignog tumora, koje obuhvata administriranje formulacije pema pronalasku kod humanog ili životinjskog sisara kome je to potrebno.

[0121] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na prevenciju formiranja metastaza i/ili relapsa koja obuhvata administriranje formulacije za oralnu primenu pronalaska kod humanog ili životinjskog sisara kome je to potrebno, poželjno radiorezistentnog humanog ili životinjskog sisara.

[0122] Topikalna primena ozonizovanog ulja je trenutno poznata za lečenje kožnih bolesti i/ili lezija. Konkretno, primena ozonizovanog ulja je posebno pogodna u lečenju kožnih oboljenja i infekcija, kao i kod hroničnih infekcija kožnih područja. Sada je iznenađujuće otkriveno da je ozonizovano ulje efikasno u prevenciji i lečenju gore navedenih tumora, posebno malignih tumora.

[0123] Bez želje da za ograničenjem bilo kojom teorijom, pretpostavlja se da su gasoviti ili vodeni preparati na bazi ozonizirajućih vrsta iz stanja tehnike manje efikasni od formulacije prema predmetnom pronalasku u prevenciji i/ili lečenju tumora, posebno malignih, jer gasoviti ili vodeni oblik ograničava dejstvo oksidacionog efekta na vanćelijsku sredinu: neoplastične ćelije su u stvari okružene lipofilnom membranom koja sprečava direktan ulazak gasa ili vode.

[0124] Naprotiv, formulacijom prema predmetnom pronalasku, koja sadrži ozonizovano ulje, dobijaju se efikasni i dugotrajni rezultati.

[0125] U stvari, ulje je prodiranjem u mitohondrijalne membrane neoplastične ćelije u stanju da aktivira apoptozu oksidacijom i tako izazove smrt neoplastične ćelije.

[0126] In vitro testovi prikazuju u stvari da je formulacija prema pronalasku u stanju da ispolji moćno dejstvo protiv kancera na ćelijskom nivou i da su razjasnili mehanizam delovanja formulacije prema predmetnom pronalasku, koji se zasniva na prodiranju ozonizovanog ulja u ćelijsku citoplazmu zbog svoje sposobnosti da oksiduje ćelijske membrane, uključujući plazmalemu, koja deli ćeliju od spoljašnje sredine. Jednom kada prodre u citoplazmu, ozonizovano ulje je kratko zarobljeno u vakuolama. Međutim, membrane ovih vakuola se brzo oksiduju ozonizovanim uljem, a zatim ulje difunduje u citoplazmu i tako vrši svoje dejstvo.

[0127] Formulacija prema predmetnom pronalasku se stoga karakteriše jedinstvenom sposobnošću prodiranja unutar neoplastičnih ćelija zahvaljujući oštećenju koje takođe izaziva na spoljašnjoj ćelijskoj membrani. Imajući u vidu čistoću (tj. visoku koncentraciju ozonida) i visoku stabilnost ozonizovanog ulja, a samim tim i formulaciju pronalaska, penetracija ne ugrožava prooksidativne sposobnosti koje se zatim direktno izražavaju unutarćelijski. Ovaj aspekt je specifičan po tome što druge formulacije ozonizirajućih vrsta nisu u stanju da ostvare ovaj efekat jer su neutralisane antioksidansima u vanćelijskom ili unutarćelijskom okruženju, oba posebno bogata antioksidativnim odbrambenim sredstvima, posebno u neoplastičnim matičnim ćelijama.

[0128] Kancer je sistemska bolest tela. Neoplastična masa ne može samostalno da razvije adekvatne trofičke potporne strukture za sopstveni razvoj. Stoga je karakteristika karcinoma prisustvo upadljivog infiltrata inflamatornih makrofagnih ćelija koje ga, potpuno nesposobne da se suprotstave neoplastičnom rastu, podržavaju snabdevanjem kiseonikom, metabolitima i neosudovima. Ove ćelije su definisane kao makrofagi u vezi sa tumorima. Danas stepen upale predstavlja najprediktivniji prognostički indeks nepovoljnog razvoja neoplazme. Kanceru se stoga efikasnije suprotstavlja uključivanje oralne formulacije koja je sposobna da se sistemski suprotstavi upali.

[0129] Primećeno je da formulacija prema pronalasku može da ispoljava antiinflamatorne efekte bez izazivanja imunosupresije, kao što je prikazano u in vitro i in vivo testovima.

[0130] Bez želje da postoji vezanost sa bilo kakvom teorijom, pretpostavlja se da je mehanizam koji leži u osnovi ovog fenomena inhibicija oksidativnog praska makrofaga. Makrofagi, odgovorni za nespecifični ćelijski posredovani imunitet tkiva, deluju oslobađanjem reaktivnih vrsta kiseonika i inflamatornih citokina u tkivno okruženje koje su u stanju da neutrališu bakterije ako su prisutne; u odsustvu istih, međutim, nakon aktivacije makrofaga se razvijaju inflamatorni fenomeni koji pretpostavljaju, kao u slučaju kancera, patogeni značaj. Formulacija prema pronalasku inhibira oksidativni prasak makrofaga putem negativne povratne sprege; u stvari, prisustvo vanćelijske sredine koja je već bogata ozonskim oksidirajućim vrstama blokira oslobađanje dodatnih oksidirajućih vrsta od strane makrofaga, čime se inhibira aktivacija i posledična inflamacija.

[0131] Takođe se veruje da je selektivni efekat ozonizovanog ulja prema predmetnom pronalasku, sa visokim sadržajem ozonida, ubijanja neoplastičnih ćelija, a ne normalnih diferenciranih ćelija, posledica činjenice da je mitohondrija u neoplastičnoj ćeliji neaktivna, i sa metaboličke tačke gledišta i sa stanovišta aktivacije programirane ćelijske smrti (apoptoze) intrinzičnim putem oslobađanjem citohroma i kalcijuma u citoplazmu. Ova karakteristika razlikuje neoplastičnu ćeliju od zdrave ćelije.

[0132] Mitohondrijalna membrana je uglavnom sačinjena od fosfolipida, od kojih je najvažniji kardiolipin, koji je raspoređen tako da formira tipičan lipidni dvosloj spoljašnje mitohondrijalne membrane kombinovanjem hidrofobnih repova dva molekula i uzrokovanjem da se hidrofilne glave projektuju u citoplazmatsko hidrofilno okruženje izvan mitohondrija i u hidrofilno okruženje matriksa unutar mitohondrija. Međutim, struktura kardiolipina izuzetno zavisi od njegove veze sa citohromom c, osnovnom aktivnom komponentom oksidativne fosforilacije. Kardiolipin je posebno raspoređen kako je gore opisano u prisustvu veze sa funkcionalnim citohromom c, odnosno u zdravom tkivu. Dvosloj koji formira kardiolipin je u ovom slučaju debeo, čvrst i simetričan i sa kontinuitetom hidrofilnih glava. Ovaj raspored sprečava pristup hidrofobnim repovima slobodnih radikala peroksidansa koje nosi ozonizovano ulje ovog pronalaska. Zdrava ćelija je stoga otporna na citocidne efekte ozonizovanog ulja predmetnog pronalaska (videti sliku 1a).

[0133] Nasuprot tome, u neoplastičnoj ćeliji, kardiolipin se nalazi u odsustvu funkcionalnog citohroma c. Ovo dovodi do razdvajanja hidrofobnih repova, što dovodi do istanjene membrane i praznina između hidrofilnih glava. U ovoj situaciji, slobodni radikali peroksidansa koje nosi ozonizovano ulje pronalaska imaju pristup hidrofobnim repovima i ćelija je osetljiva na citocidne efekte ozonizovanog ulja predmetnog pronalaska (videti sliku 1b).

[0134] Efikasnost formulacije ovog pronalaska može takođe zavisiti od drugih faktora kao što su njena čistoća, odsustvo antioksidanasa i njena visoka bioraspoloživost.

[0135] Konkretno, u slučaju tehničkog rešenja pronalaska koje uključuje povezivanje formulacije za oralnu primenu i formulacije za primenu putem injekcije, nađeno je da ova povezanost omogućava dobijanje direktnih citopatskih efekata infiltracijom u neoplastičnu masu, i stoga poboljšanu efikasnost.

[0136] Formulacija za oralnu primenu pronalaska, kao što je gore pomenuto, u stvari se brzo apsorbuje sistemskim putem. Ovaj aspekt predstavlja apsolutnu posebnost u odnosu na ozonizovana ulja sa niskim sadržajem ozonida koja su prisutna na tržištu koja se ne mogu sistemski apsorbovati ili su ponekad čak i u kompleksu sa antioksidansima u cilju stabilizacije i očuvanja koji utiču na njihova farmakološka dejstva.

[0137] U poželjnom tehničkom rešenju, sadržaj ozonida u ulju je veći od nivoa koji je ikada postignut u stanju tehnike (10-30 meq O2/kg ulja). Ovo ulje je posebno stabilno i snažno oksidira, naročito u intracelularnom okruženju neoplastične ćelije

[0138] Formulacija prema predmetnom pronalasku stoga omogućava stabilizaciju veoma velikih količina ozonskih oksidirajućih vrsta (ozonida) u lipofilnom kompleksu, omogućavajući im da prodru unutar neoplastične ćelije i aktiviraju na ovom mestu mehanizme autonomne ćelijske smrti (apoptoze) bez oštećenja okolnih zdravih tkiva.

[0139] Formulaciju prema predmetnom pronalasku karakteriše trajanje terapijskog efekta od najmanje šest meseci, poželjno najmanje godinu dana, poželjnije najmanje dve godine, još poželjnije najmanje tri godine, najpoželjnije najmanje pet godina.

[0140] Formulacija za oralnu primenu prema ovom pronalasku nalazi posebnu primenu u prevenciji formiranja metastaza i/ili relapsa.

[0141] Naročito, kada je oralno administriranje formulacije u vezi sa radioterapijom kod radiorezistentnih subjekata, primećeno je da je formulacija efikasna u prevenciji formiranja metastaza. U stvari, niska dostupnost kiseonika (hipoksija) je glavni mehanizam koji pokreće migraciju neoplastičnih ćelija sa primarnog mesta (metastaze). Ovde predstavljen pronalazak, povećanjem dostupnosti kiseonika na mestu primarnog tumora, inhibira aktivaciju procesa metastaziranja.

[0142] Visok sadržaj ozonida je takođe fundamentalan za personalizaciju terapijske doze. U stvari, doze leka moraju biti individualizovane na osnovu vrste subjekta koji se leči i postojeće neoplastične patologije. Širok spektar ozonida koji formulacija može da ima omogućava individualizaciju terapijske doze sa preciznošću koja nikada ranije nije bila dostignuta. Ova personalizacija se sprovodi na osnovu kvantitativne procene odnosa između oksidujućih i antioksidujućih vrsta u plazmi lečenog subjekta, kao što je ilustrovano iznad. Konačno, formulaciju prema predmetnom pronalasku karakteriše visoka podnošljivost i oskudica neželjenih nuspojava, što je veoma specifična situacija za lek koji može da ubije ćelije kancera. Ova karakteristika je usled velike razlike koja postoji između normalnih i neoplastičnih ćelija u njihovoj sposobnosti kontrastnog oksidativnog oštećenja, posebno kada se ono javlja u unutarćelijskom okruženju.

[0143] Dalje karakteristike i prednosti ovog pronalaska biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa.

Kratak opis slika

[0144]

Slika 1 prikazuje strukturu kardiolipina u normalnim ćelijama (Slika 1a) i u neoplastičnoj ćeliji (Slika 1b).

Slika 2 prikazuje rezultate in vitro ćelijskog testa za određivanje antikancerogenog efekta ozonizovanog suncokretovog ulja iz pronalaska na ćelijsku liniju A 549 kancera. Slika 2a je slika optičkog mikroskopa ćelijske linije nakon 60 minuta, 24 sata, 48 sati i 72 sata izlaganja ozonizovanom ulju suncokretovog semena prema pronalasku. Kao komparativna kontrola korišćeno je neozonizovano suncokretovo ulje. Slika 2b je slika optičkog mikroskopa koja prikazuje selektivno bojenje ćelija tripan plavim, selektivno bojenje samo mrtvih ćelija.

Slika 3 prikazuje rezultate in vitro ćelijskog testa korišćenjem normalne subćelijske i trihromne fluorescentne mikroskopije da bi se odredio mehanizam delovanja na intracelularnom nivou u neoplastičnoj ćeliji. Slika 3a prikazuje očitavanje optičkim mikroskopom ćelija ćelijske linije A549 nakon izlaganja ozonizovanom ulju suncokretovog semena prema pronalasku, u koncentraciji od 10% v/v u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagle medijumu (DMEM), tokom dva sata: detektuje se unutarćelijsko prodiranje ozonizovanog ulja u citoplazmatsko mesto (jasne reflektujuće vakuole). Kao komparativna kontrola korišćeno je neozonizovano suncokretovo ulje. Slika 3b prikazuje trihromne fluorescentne mikroskopske slike ćelija A549 ćelijske linije nakon izlaganja ozonizovanom ulju suncokretovog semena prema pronalasku u trajanju od 0, 30 minuta i 60 minuta uz bojenje. Kao komparativna kontrola korišćeno je neozonizovano suncokretovo ulje. Boje ukazuju na: (a) crveno: ozonizovano ulje; (b) plavo: jezgro; (c) zeleno: citoplazmatske strukture i naročito mitohondrije. Potvrđuje se prodiranje ulja u citoplazmatsko mesto.

Slika 4 prikazuje dodatne slike fluorescentnog mikroskopa za ćelije A549 ćelijske linije izložene kontrolnom suncokretovom ulju i ulju koje sadrži 10% i 800 ozonizovanog suncokretovog ulja sa trihromskim bojenjem sa superponiranim kanalima (spajanje). Žuta mrlja označava superponiranje između crvene i zelene. Ovo superponiranje se dešava samo u ćelijama tretiranim ozonizovanim uljem, a ne u kontroli; to ukazuje da ulje (crvena) dospeva i oštećuje mitohondrije (zelena) (Primer 3).

Slika 5 prikazuje poređenje između vrednosti vitalnosti ćelija u A549 ćelijama nakon tretmana različitim uljima prema Primeru 4.

Slika 6 prikazuje rezultate in vivo testa ćelija za određivanje antiinflamatorne moći formulacije pronalaska. Grafikon prikazuje smanjenje markera aktivacije HLAdr makrofaga kod dva subjekta tretirana sirupom prema pronalasku, mereno citofluorimetrijom.

Slika 7 je serija fotografija koje prikazuju napredak zarastanja kod mačke koja boluje od epidermoidnog nazalnog karcinoma skvamoznih ćelija nakon tretmana formulacijom prema pronalasku. Konkretno, slike prikazuju stanje mačke pre tretmana (slika 7a), 24 sata nakon intervencije (slika 7b), 72 sata nakon intervencije (slika 7c), 7 dana nakon intervencije (slika 7d), 10 dana nakon intervencije (slika 7e), i tri nedelje nakon intervencije (slika 7f) (restitutio ad integrum).

Slika 8 je serija fotografija koja prikazuje napredak zarastanja kod zeca koji boluje od ulceroznog skvamoznog karcinoma rektuma nakon tretmana formulacijom prema pronalasku i krioterapijske intervencije, pre intervencije (Slika 8a-d), 7 dana nakon intervencije (Slika 8e), 10 dana nakon intervencije (slika 8f), četiri nedelje nakon intervencije (slika 8g) (restitutio ad integrum), i sedam meseci nakon intervencije (slika 8h) (perzistencija restitutio ad integrum).

Slika 9 prikazuje rezultate testa vijabilnosti tumorskih ćelija A549 nakon izlaganja ozonizovanom ulju prema pronalasku na 700 ("OOAO 700") ili 1100 ("OOAO 1100") ozonida, administriranog pre ("PRE") ili posle ("POST") radioterapije (2Gy). OOAO povećava sposobnost zračenja da ubije neoplastične ćelije od 7 do 14 puta. Naknadni tretman sa OOAO1100 je najefikasnija terapijska situacija.

Detaljan opis pronalaska

[0145] Predmetni pronalazak će sada biti dodatno ilustrovan pomoću nekih primera tehničkih rešenja kao što je prikazano u nastavku.

PRIMER 1

Priprema formulacije u obliku sirupa

[0146] Sledeća formulacija je pripremljena u obliku sirupa:

2.5% ozonizovano ulje suncokretovog semena sa sadržajem ozonida od 700 meq O2/kg i preostalih 97.5% sadrži vodeni rastvor fruktoze, sredstvo za zakiseljavanje, monohidrat limunske kiseline, konzervanse, natrijum laktat, osmotsku vodu, kalijum sorbat, aromu trešnje, emulgator (polisorbat 80); pri čemu se navedeni procenti odnose na ukupnu masu formulacije.

PRIMER 2

In vitro test ćelija karcinoma

[0147] Ozonizovano ulje suncokretovog semena sa sadržajem ozonida od 700 meq O2/kg je analizirano na visoko nediferenciranim i agresivnim ćelijama humanog karcinoma pluća (ćelijska linija A549). Kao komparativna kontrola korišćeno je neozonizovano ulje semenki suncokreta. Tretman se sastojao od kontakta ćelija sa uljem tokom dva sata, nakon čega je usledilo ispiranje. Eksperiment je ponovljen u četiri primerka. Ćelije koje nisu tretirane ili tretirane neozonizovanim uljem suncokretovog semena brzo su rasle dostižući konfluenciju u ploči za rast nakon 72 h. Ćelije tretirane uljem prema pronalasku prikazale su poteškoće u rastu u prva 24 sata, nakon čega su brzo podlegle ćelijskoj smrti koja je kulminirala u 72 sata nestankom sloja za rast ćelija i samim prisustvom mrtvih ćelija i difuznih apoptotičkih tela u supernatantu. Na slici 2a prikazani su rezultati dobijeni u eksperimentu.

[0148] Smrt ćelija tretiranih ozonizovanim uljem takođe je demonstrirana selektivnim bojenjem tripan plavim prema standardnom protokolu u sektoru (slika 2b).

[0149] Konkretno, ćelije linije A549 su zasejane u tikvici od 75 cm<2>za ćelijske kulture i tretirana ozonizovanim uljem semena suncokreta (General Service, Španija) u koncentraciji od 10% v/v u DMEM-u. Kontrola je izvršena tretiranjem A549 ćelija u tikvici od 75 cm<2>suncokretovim uljem (EMI) u istoj koncentraciji. Četiri sata nakon tretmana, alikvot ćelija je uzet iz svake tikvice, stavljen na mikroskopsko staklo i obojen tripan plavim, kako su izvestili Strober i sarad. (Strober W., Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 2 novembar 2015.;111:A3.B.1-3).

PRIMER 3

Mehanizam delovanja na intracelularnom nivou u neoplastičnoj ćeliji

[0150] Dinamika kojom proizvod pronalaska izaziva smrt ćelija kancera ispitana je uz pomoć normalne subćelijske i trihromne fluorescentne mikroskopije u kojoj je jezgro obojeno u plavo, mitohondrije i ćelijske membrane u zeleno, ulje suncokretovog semena i ozonizovano ulje u crveno.

[0151] 8×10<4>ćelija A549 linije je zasejano na mikroskopsko pokrovno staklo (20 × 20 mm). Sledećeg dana ćelije su tretirane ozonizovanim suncokretovim uljem (sadržaj ozonida jednak 700 meq O2/kg) (General Service, Španija) u različitim koncentracijama (10% i 800 v/v u DMEM-u) dva sata. Kontrola je vršena korišćenjem neozonizovanog suncokretovog ulja (EMI Supermercati, Italija) u istoj koncentraciji kao tretman i u istom vremenskom trajanju. Slika 3a prikazuje unutarćelijsku penetraciju u citoplazmatsko mesto 10% v/v ozonizovanog ulja (čiste reflektujuće vakuole).

[0152] Da bi se uklonila ulja, posle 24 sata ćelije su isprane rastvorom koji sadrži 0.1% Nonidet P-40 (Sigma-Aldrich, Milano, Italija) u PBS-u (fosfatom puferovani fiziološki rastvor, Euroclone, Milano, Italija) i zatim sa samim PBS-om. Nakon ispiranja, ćelije su fiksirane sa 4% paraformaldehida u trajanju od 10 minuta na 37°C i na kraju obojene sa DIoC6, Nil crvenom, rodaminom i DAPI, kako navodi Chen i sarad., Tarnowski i sarad., Koning i sarad., Johnson i sarad. (Chen W i sarad., A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J Microbiol Methods. April 2009; 77(1):41-7; Tarnowski BI i sarad, DAPI as a useful stain for nuclear quantitation. Biotech Histochem.1991;66(6):297-302.; Koning AJ i sarad., DiOC6 staining reveals organelle structure and dynamics in living yeast cells. Cell Motil Cytoskeleton. 1993;25(2):111-28; Johnson LV i sarad., Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123. Proc Natl Acad Sci USA. Februar 1980;77(2):990-4).

[0153] Primećeno je da je neozonizovano suncokretovo ulje samo minimalno prodrlo u ćelije (citoplazmu) gde je podeljeno u male dobro definisane vakuole. Nasuprot tome, ozonizovano ulje je obilno prodrlo u citoplazmu, verovatno zbog svoje posebne sposobnosti da oksiduje ćelijske membrane uključujući plazmalemu koja deli ćeliju od spoljašnje sredine. Jednom kada je prodrlo u citoplazmu, ozonizovano ulje je u početku bilo zarobljeno u vakuolama; međutim, membrane ovih vakuola su brzo oksidovale i ulje je difundovalo u citoplazmu stvarajući crveni oreol koji je bio superponiran na zelenu boju membrana i unutarćelijskih organela (mitohondrija). Rezultati u odnosu na 10% v/v ozonizovanog ulja prikazani su na slici 3b.

[0154] Ovi događaji su kulminirali nakon 24 sata i bili su praćeni smrću ćelija tretiranih uljem prema pronalasku. Stoga je očigledno da ozonizovano ulje pronalaska prodire u neoplastične ćelije gde stvara citoplazmatsko oksidativno oštećenje. Organela koja je najosetljivija na ovaj događaj je mitohondrija. Oksidacija mitohondrijalnih membrana neoplastične ćelije može da aktivira apoptozu i samim tim smrt neoplastične ćelije.

[0155] Stanje mitohondrijalne funkcije u ćelijama tretiranim ozonizovanim uljem je zatim analizirano procenom oslobađanja kalcijuma iz mitohondrija korišćenjem crvenog fluorohroma (rodamin 2) kao direktnog indikatora oštećenja mitohondrija.

[0156] Krajnja tačka je merena u A549 neoplastičnim ćelijama tretiranim suncokretovim uljem (kontrola) ili ozonizovanim uljem u dozi od 10% v/v i 80% v/v u odnosu na medijum za kulturu. Utvrđeno je povećanje oslobađanja intracitoplazmatskog kalcijuma u jednoj dozi u zavisnosti od količine korišćenog ozonizovanog ulja.

[0157] Zatim je izvršeno selektivno bojenje mitohondrijalnih membrana pomoću zelene boje (DiOC6) kojom se verifikuje varijacija intenziteta signala u kontroli u odnosu na ćelije tretirane ozonizovanim uljem. Primećeno je značajno smanjenje intenziteta signala u citoplazmi (gde se nalaze mitohondrije) u ćelijama tretiranim ozonizovanim uljem; ovaj rezultat ukazuje na oštećenje mitohondrijalne membrane izazvano tretmanom ozonizovanim uljem. Velike citoplazmatske lipidne vakuole su takođe primećene u tretiranim ćelijama. Ove vakuole sadrže oksidovane lipide koje ćelija ne kataboliše, koja stoga poprima izgled 'penušave ćelije' što karakteriše ćelije koje ne mogu da katabolišu lipide zbog visokog nivoa oštećenja mitohondrija. Prisustvo takvih vakuola u ćelijama tretiranim ozonizovanim uljem je stoga dodatni dokaz da se dejstvo formulacije prema pronalasku sprovodi prvenstveno i direktno na mitohondrijalnoj membrani.

[0158] Zatim je izvršeno digitalno superponiranje slika analizirajući oslobađanje unutarćelijskog kalcijuma i oštećenje mitohondrijalne membrane (Slika 4). Slike dobijaju žutu mrlju koja proizilazi iz gotovo savršenog superponiranja crvene i zelene. Ovaj rezultat ukazuje da unutarćelijski kalcijum (crveno) oslobađaju upravo mitohondrijalne (zeleno) membrane oštećene ozonizovanim uljem. U stvari, ovo superponiranje (žuta mrlja) ne postoji u kontrolnim ćelijama gde mitohondrijalne membrane nisu oštećene i stoga su obojene zeleno i gde mitohondrije ne oslobađaju kalcijum.

[0159] Ovaj rezultat prikazuje kako je mehanizam terapijskog dejstva formulacije pronalaska intracelularna indukcija mitohondrijalnog oštećenja sa posledičnom aktivacijom unutrašnje ćelijske apoptoze.

PRIMER 4

Uporedni testovi različitih ulja na vijabilnost ćelija

[0160] Izvršen je uporedni eksperiment da bi se procenila posebnost dejstva ulja formulacije prema predmetnom pronalasku u odnosu na druga ozonizovana ulja.

[0161] A549 ćelije anaplastičnog karcinoma su uzgajane u prisustvu različitih ozonizovanih ulja sa niskim sadržajem ozonida ili ulja prema predmetnom pronalasku na 700 ("OOAO 700") i 1100 meq O2/kg ("OOAO 1100"); njihova sposobnost da izazovu ćelijsku smrt je procenjena vitalnim bojenjem kristalno ljubičastom, prema sledećem protokolu.

[0162] Ćelije A549 linije su zasejane u ploče sa ravnim dnom sa 96 mikro-bunarčića pri gustini od 6×10<3>ćelija po bunarčiću u 100 µl DMEM medijuma za kultivaciju (Sigma-Aldrich, Milano, Italija). Sledećeg dana, 10 µl ozonizovanog suncokretovog ulja (General Service, Španija) je dodato u svaki bunarčić i ćelije su inkubirane na 37°C u CO2inkubatoru tokom 24 sata. Kontrola je vršena korišćenjem suncokretovog ulja (EMI Supermercati, Italija) u istoj koncentraciji kao tretman i u istom vremenskom trajanju. Posle inkubacije, ćelije su prvobitno isprane rastvorom koji sadrži 0.1% Nonidet P-40 (Sigma-Aldrich, Milano, Italija) u PBS-u (Euroclone, Milano, Italija), a zatim sa PBS-om. Vijabilnost ćelija je procenjena bojenjem kristalno ljubičastom bojom kako izveštavaju Feoktistova i sarad, Crystal Violet Assay for Determining Viability of Cultured Cells. Cold Spring Harb Protoc.; 2016(4) :pdb.prot087379]. Rezultati su očitani na fotometru za mikroploče (Multiskan FC, Thermo Scientific) na talasnoj dužini od 570 nm.

Sledeći preparati su procenjeni u odnosu na kontrolu koja nije tretirana ili tretirana neozonizovanim suncokretovim uljem: VO3 aktivni sprej (Benedetti & Co Biosolutions Srl, Breša, Italija), ozonizovano maslinovo ulje (Vegetal Progress Srl, Torino, Italija), EMI suncokretovo ulje (EMI Supermercati, Italija), krem ulje Ozone Elite (ECS Elitegroup), krem ulje Ozonia 10 (Innovares Srl, Italija), maslinovo ulje O3 Tu Piel (Qualified naturopath, UK), ulje Ozofarm (Ozofarm, Parma, Italija) , ulje prema pronalasku pri OOAO 700 i OOAO 1100.

[0163] Dobijeni rezultati su prikazani na Slici 5, ukazujući za svaki preparat na količinu još vijabilnih ćelija nakon tretmana (procenat u odnosu na netretiranu kontrolu, 100% vijabilnost). Svi eksperimenti su replicirani 8 puta.

[0164] Dobijeni rezultati prikazuju da se preživljavanje ćelija smanjuje u prisustvu ozonizovanih ulja u odnosu na kontrole. Međutim, nijedan od ozonizovanih uljnih preparata iz stanja tehnike nije u stanju da smanji procenat preživelih ćelija ispod 20%. Jedini preparati koji mogu da postignu ovaj rezultat su OOAO 700 i OOAO 1100. U stvari, procenat preživelih ćelija je samo 6.78% u OAOAO 700, a minimalna zabeležena vrednost opada za 2.7% u slučaju OOAO 1100.

PRIMER 5

Određivanje antiinflamatorne moći ozonizovanog ulja na bazi ulja

[0165] Procenjena je antiinflamatorna moć ozonizovanog sirupa na bazi ulja iz Primera 1 in vivo procenom na uporedni način u vremenima T0 (pre administriranja formulacije pronalaska) i T1 (na kraju studije) subpopulacija limfocita kod dva lečena dobrovoljca, protočnom citofluorimetrijom. Ispitanici (oba zdrava i sa telesnom težinom 70 kg, 54 godine starosti) su lečeni 2.5% ozonizovanim sirupom tokom 1 nedelje u dozi od 12 ml dva puta dnevno između obroka. Proinflamatorna aktivacija makrofaga i limfocita je procenjena u perifernoj krvi pre i posle tretmana pomoću citofluorimetrije. Dobijeni rezultati prikazani su na Slici 6 koja prikazuje dijagram rasejanja distribucije leukocita prema obeležavanju sa CD38 (marker leukocita, vertikalna osa) i sa HLAdr (marker aktivacije makrofaga, horizontalna osa). Slika pokazuje značajno smanjenje T1 u odnosu na T0 markera aktivacije makrofaga (HLAdr) (strelica); umesto toga nije primećena promena u subpopulacijama limfocita odgovornim za zaštitni imunitet.

[0166] Ovi rezultati prikazuju da je predmetna formulacija sposobna da ispoljava antiinflamatorne efekte bez izazivanja imunološke supresije.

PRIMER 6

Tretiranje diferenciranih humanih keratinocita

[0167] Da bi se procenila bezbednost pomenute formulacije i njena nesposobnost da izazove citopatske efekte u zdravim ćelijama, humani diferencirani keratinociti su tretirani ozonizovanim uljem suncokretovog semena (700 meq O2/kg) prema eksperimentalnim protokolima koji su već opisani u Primerima 2 i 3. Rezultati su ispitani 48 i 72 sata bez detektovanja bilo kakve promene u vijabilnosti ćelije ili bilo kakvog prisustva citopatskih efekata.

[0168] Takođe je procenjena bezbednost formulacije in vivo kod dva dobrovoljca (iz primera 5) tretirana sirupom, analizirajući tradicionalne hemijske parametre krvi: uočeno je odsustvo bilo kakve promene u bazalnom fiziološkom stanju.

PRIMER 7

PRIMER 7

In vivo klinički slučaj

[0169] In vivo eksperimentisanje je zatim sprovedeno na životinji kako bi se proverilo da li se terapijski efekti primećeni u eksperimentalnim modelima koji su do sada opisani mogli preneti na in vivo situacije. Saosećajni tretmani su sprovedeni pod veterinarskom kontrolom kod životinja obolelih od teških spontanih onkoloških bolesti za koje ne postoje terapije sa priznatom efikasnošću. Neki primeri dobijenih rezultata navedeni su u nastavku.

[0170] SLUČAJ 1. Mužjak star 8 godina sa histološki potvrđenim skvamoznim epidermoidnim nazalnim karcinomom (Slika 7a). Ovaj karcinom je poznat po svojoj agresivnosti i brzom razvoju kod ove životinje tako da obično zahteva hitnu eutanaziju iste. Informisani o brzoj evoluciji bolesti, o lokalnim i sistemskim nuspojavama i troškovima radioterapije, o „razarajućim” efektima „konvencionalne” operacije, vlasnici su se opredelili za administriranje ozonizovanog ulja infiltracijom, oralnim putem i lokalnom primenom.

Protokol korišćen u ovom kliničkom slučaju je bio:

Infiltracija OOAO 700 (700 meq O2/kg), 1 ml po sesiji (4 sesije, 1 sesija svakih 5 dana za ukupno 4 sesije) u više topikalnih injekcija (6 po sesiji) u neoplastičnu masu, na zahvaćenom delu, tokom 20 dana. Oralno administriranje, počevši od istog dana prve infiltracije, ozonizovanog suncokretovog ulja (700 meq O2/kg, "OOAO 700"), u dozi od 5 kapi ujutru i uveče u vlažnoj hrani kojom se ispitanik obično hranio (konzerva ili vreća vlažne hrane za odrasle mačke) tokom 21 dana. Lokalno na deo koji je zahvaćen lezijama primenjena je velika količina OOAO 700 suncokretovog ulja dva puta dnevno, počevši od istog dana prve infiltracije, dovoljna da se potpuno pokrije, uključujući i perilezijsku kožu, nanošenje koje je ponavljano tokom 21 dan.

[0171] 24 sata nakon početka lečenja konstatovana je pojava nekroze područja gde je bila prisutna neoplazma (slika 7b).

[0172] Posle 72 sata, kraste su omekšale i vlasnik ih je lako mogao ukloniti (slika 7c).

[0173] Posle sedam dana kraste su potpuno eliminisane. Veliki ulkus je opstao na mestu kontakta sonde sa kožom nosa (slika 7d).

[0174] Posle 10 dana zabeleženo je skoro potpuno zarastanje ulkusa uz neoepitelizaciju celog vrha nosa (Slika 7e).

[0175] Krajem treće nedelje došlo je do potpunog "restitutio ad integrum" površine vrha nosa. Vlasnici su, s obzirom na očigledno stanje dobrobiti subjekta, odlučili da prekinu svu terapiju (Slika 7f).

[0176] Terapija je na taj način prekinuta, životinja je stavljena na posmatranje 8 meseci, a da nije bilo relapsa neoplastične bolesti koja je stoga iskorenjena. Do danas, posle više od deset meseci, subjekt je odličnog zdravlja i ne pokazuje znake ponovnog rasta tumora. Vlasnici prijavljuju potpuni povratak normalnom životu bez ikakvog olfaktornog deficita.

PRIMER 8

Drugi In vivo klinički slučaj

[0177] SLUČAJ 2. Zec star 5 godina sa histološki potvrđenim akvamoznim ulcerativnim karcinomom rektuma (slika 8a). Lezija je bila visoko maligna, pod inflamacijom i krvarila je.

[0178] Uzevši u obzir osetljivost oblasti i hirurški rizik od fekalne inkontinencije, odlučeno je da se izvrši kriohirurgija sa protektivnom primenom zdrave regije sa ozonizovanim uljem.

[0179] Pre intervencije 7 dana započet je oralni unos 5 kapi ozonizovanog suncokretovog ulja (OOAO 700, 700 meq O2/kg) ujutru i uveče što je nastavljeno do 10 dana nakon krioterapije. Na dan intervencije priprema subjekta je izvršena premazivanjem veoma pažljivo uljem cele zahvaćene oblasti (slika 8b), tako da se potpuno prekrije zahvaćena oblast, uključujući perilezionu kožu. Infiltracija je takođe izvršena nakon intervencije (OOAO 700, 1 ml po sesiji u višestrukim topikalnim injekcijama u neoplastičnu masu, kako je već opisano u primeru 1) na zahvaćenu oblast. Na slici 8c je prikazano izvršenje operacije dok je na slici 8d prikazano potpuno zamrzavanje neoformacije. Topikalno administriranje i oralno administriranje su nastavljeni do 10 dana nakon intervencije. Sedmog dana nakon intervencije se i dalje beleži prisustvo nekrotičnog materijala i oblast je je i dalje izgledala hiperemično (slika 8e). Deset dana posle intervencije, nije bilo nekrotičnog materijala, a edem dela i okolnog neovaskularizovanog inflamatornog oreola je bio vidljivo smanjen (slika 8f). Dvadeset osmog dana nakon intervencije, primećen je potpuni restitutio ad integrum oblasti zahvaćene neoplazmom (slika 8g).

[0180] Do danas (11 meseci kasnije) nisu prisutni znaci lokalnog ponovnog rasta ili metastaze i subjekt ne prikazuje nikakve probleme tokom defekacije ili uriniranja (slika 8h).

PRIMER 9

Slučaj 3

Klinički slučaj kod ljudi

[0181] Ženski pacijent starosti 93 godine sa histopatološki potvrđenim malignim spino-ćelijskim epidermoidnim karcinomom. Neoplazma je bila locirana na skalpu u parietalnoj regiji i imala je karakter izrazito invaazivne i brze progresije ab initio. Zapravo, moždani omotač je bio zahvaćena za samo nekoliko nedelja sa posledičnom parietalnom osteolizom. Neoplazma je brzo nastavila da progredira penetrirajući unutar lobanje i približavajući se arahnoidi. Ovi podaci su demonstrirani kompjuterizovanom aksijalnom tomografijom. Ovi podaci su demonstrirani kompjuterizovanom aksijalnom tomografijom. Neoplazma se spolja pojavila u značajnoj veličini tako da je prekrila ceo svod lobanje sa primetnim ne samo endofitskim (unutar lobanje) već i egzofitnim (izbočenje neoplastične mase van lobanje). Neoplazma je izgledala visoko maligno okarakterisana visokim nivoom anaplazije, brze progresije, prisustvom neoplastičnih ulkusa značajne veličine, primetnim zapaljenjem perilezijskih ivica i potpunim odsustvom fenomena reparacije granulomatoznog tkiva u oblastima koje okružuju neoplastični ulkus. Pacijent je patio i bio pod temperaturom.

[0182] Bez mogućnosti da se interveniše hirurški usled proširenja neoplastične mase i starosti subjekta, odlučeno je da se interveniše regionalnom paliativnom radioterapijom sa 8 sesija od 2 Gy svaka. Iz direktnog iskustva, očekivalo se da ovaj pristup bude samo palijativan od strane involviranih radioterapeuta, kako ovaj tip kancera veoma malo reaguje na radioterapiju. Stoga je odlučeno da se upotrebi ozonizovano suncokretovo ulje pri 1100 ozonida ("OAOO 1100") lokalnom primenom na karcinomatozni ulkus.

[0183] Stoga, nastao je problem u vezi trenutka primene OAOO 1100 u odnosu na radioterapiju, naime da li proizvod mora da se primeni pre ili nakon tretmana gama zračenjem. U ovu svrhu, in vitro eksperiment je sproveden u kojem su anaplastične ćelije A549 karcinoma izložene jonizujućem zračenju (2 Gy) i pod uslovima pre tretmana i posle tretmana sa OOAO 1100 i OOAO 700 (ozonizovano suncokretovo ulje pri 700 ozonida). Preživljavanje ćelija je stoga procenjeno uporedno pomoću testa sa kristal ljubičastom u odnosu na kontrolne ćelije koje su izložene zračenju ali nisu tretirane ozonizovanim uljem suncokreta. Eksperiment je ponovljen 16 puta u višestrukoj ploči za ukupno 48 eksperimenata (3 eksperimentalna uslova x 16 replikata). Rezultati koji su dobijeni su prikazani na slici 9.

[0184] Dobijeni rezultati su ukazivali na snažni radiosensitizirajući efekat od OOAO 700 i čak više od OOAO 1100. Maksimalni efekat koji je utvrđen je bio od OOAO 1100 kada je administriran nakon izlaganja gama zracima. Sa mehanističke tačke gledišta, ovaj efekt je u skladu sa aktivacijom intrinzičke mitohondrijalne apoptoze koja se aktivira ozonizovanim uljem u ćelijama koje su bile podvrgnute genotoksičnom oštećenju zračenjem. Stoga je odlučeno da se koristi OOAO 1100 u režimu nakon lečenja, tj. na kraju svake sesije radioterapijom. Stoga, na kraju prve sesije radioterapijom, OOAO 1100, geliran na 4°C, je postavljen na neoplastičnu leziju pomoću staklenog postavljača i ulkus je prekriven gazom i hidrofobnim zavojem.

[0185] Lečenje je nastavljeno tokom ukupno 8 uzastopnih sesija sa intervalom od 2 dana između svake od njih. Medikacija sa OOAO 1100 je obnovljena na kraju svake sesije. Dakle, OOAO 1100 je ostavljen na mestu da deluje tokom 48 sati tokom intervalnih perioda između sesija.

[0186] Makroskopska analiza je jasno prikazala snašno smanjenje veličine neoplastične mase i u smislu njene amplitude i dubine. Takođe je primećeno formiranje granulacionog tkiva za reparaciju na marginama lezije.

[0187] Radioterapija je tada prekinuta i nastavljen je samo topikalni tretman sa OOAO 1100. Nakon toga, neoplazma nije nastavila da raste, već je nastavila svoju regresiju.

[0188] Ovi podaci potkrepljuju specifično inhibitorno dejstvo OOAO 1100 na tumor i u odsustvu tretmana zračenjem. Na kraju praćenja, ostala je samo meka krasta od eksudativnog materijala koji je rezultat kolikativne nekroze neoplastičnog tkiva.

[0189] Da bi se proverilo da li je topikalna primena OOAO 1100 imala sistemski efekat na oksidativnu ravnotežu, izvršena je analiza slobodnih radikala u krvnoj plazmi pre (T0) početka lečenja sa OOAO 1100 i na njegovom kraju (T1) korišćenjem Fras-a (Free Radical Analysis, Fras 4 Evolvo, H&D, Parma Italija)). U T0 parametri su dramatično izmenjeni sa posebno niskom vrednošću oksidacione vrste, koja iznosi 38 U carr (normalni opseg 250-280). Paralelno, antioksidansi su snažno povećani sa vrednošću od 8318 U cor (normalni opseg 2200-2800). Balans antioksidans/oksidans (odnos U cor/U carr) je bio 219 (normalni opseg 7-10). Ovi rezultati pokazuju da prisustvo neoplastičnih masa značajne veličine implicira snažno smanjenje nivoa sistemskog oksidativnog oštećenja. U T1, vrednosti se menjaju na sledeći način: 201 U carr, 7544 U cor, 37 U cor/U carr. Stoga je primećeno povećanje od 530% oksidirajućih vrsta, 13% smanjenje antioksidanasa, 583% smanjenje odnosa U cor/U carr. Ove vrednosti ukazuju na to da je regresija neoplastične mase u vezi sa varijacijom oksidativne ravnoteže izazvanom lečenjem sa OOAO.

[0190] Na kraju lečenja zdravstveno stanje pacijenta je bilo dobro i nije više patio niti imao temperaturu. Neželjeni efekti, subjektivni i objektivni, koji se mogu dovesti u vezu sa lečenjem sa OOAO 1100 ili izlaganjem terapiji zračenjem, nikada nisu utvrđeni tokom lečenja.

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Formulacija koja sadrži najmanje jedno ozonizovano ulje za primenu u prevenciji i/ili lečenju tumora, poželjno malignog tumora, pri čemu navedeno najmanje jedno ozonizovano ulje ima sadržaj ozonida od 500 do 1500 meq O2/kg.

2. Formulacija za primenu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je navedena formulacija za primenu administracijom odabranom od oralne, topikalne, injekcijom, inhalacijom i njihovom kombinacijom.

3. Formulacija za primenu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu navedeno najmanje jedno ozonizovano ulje ima sadržaj ozonida od 600 do 1400 meq O2/kg, poželjno od 700 do 1300 meq O2/kg.

4. Formulacija za primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu navedeno ozonizovano ulje je biljno ulje koje je podvrgnuto procesu ozonizacije, poželjno odabrano od: suncokretovog ulja, maslinovog ulja, kikirikijevog ulja, arganovog ulja, ulja semenki grožđa, jojoba ulja, ulja semena soje, ulja kukuruza, palminog ulja, ulja semena pamuka, ulja semena uljane repice, kokosovog ulja, ricinusovog ulja, ulja semena lana, ulja boražine, ulja noćurka, i njihovih smeša, poželjno suncokretovo ulje.

5. Formulacija za primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je navedeni tumor odabran od solidnog tumora; tumora kože; mukoznog tumora; i tečnog tumora.

6. Formulacija za primenu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za primenu topikalnim administriranjem, koja poželjno sadrži, u masenim procentima u odnosu na ukupnu masu formulacije, od 1 do 50%, poželjnije od 2 do 20%, čak poželjnije od 3 do 15% navedenog najmanje jednog ozonizovanog ulja.

7. Formulacija za primenu prema patentnom zahtevu 6, u obliku odabranom od ulja, gela, i emulzije, poželjno ulja.

8. Formulacija za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za primenu oralnim administriranjem, koja poželjno sadrži, u masenim procentima u odnosu na ukupnu masu formulacije, od 1 do 5%, poželjnije od 2 do 30, navedenog najmanje jednog ozonizovanog ulja.

9. Formulacija za primenu prema patentnom zahtevu 8, koja sadrži nosač kompatibilan sa navedenim najmanje jednim ozonizovanim uljem, poželjno u količini, u masenim procentima u odnosu na ukupnu masu formulacije, od 95 do 99%, poželjnije od 97 do 98%.

10. Formulacija za primenu prema patentnom zahtevu 8 ili 9, pri čemu navedeni nosač sadrži najmanje jedan zaslađivač i vodu.

11. Formulacija za primenu prema patentnom zahtevu 10, u obliku odabranom od kapsule i napitka, poželjno napitka, poželjnije sirupa.

12. Formulacija za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za primenu administriranjem injekcijom, pri čemu se poželjno sastoji od navedenog najmanje jednog ozonizovanog ulja.

13. Formulacija za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 za primenu inhalacionim administriranjem, pri čemu poželjno navedena formulacija dalje sadrži najmanje jedan nejonski surfaktant.

14. Formulacija za primenu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13, pri čemu lečenje tumora obuhvata administriranje navedene formulacije dok se ne postigne U Cor/U Carr odnos između 4 i 12, poželjno između 5 i 10, poželjnije između 6 i 8, između anti-oksidujuće vrste (U Cor) i oksidujuće vrste (U Carr) u krvi pacijenta.