ES2971659T3

ES2971659T3 - Procedimiento para la producción de una composición de células T

Info

Publication number: ES2971659T3
Application number: ES18804489T
Authority: ES
Inventors: Archana Brahmandam; Lucas James Thompson; Deborah Mortensen; Ellen Filvaroff
Original assignee: Celgene Corp; Juno Therapeutics Inc
Current assignee: Celgene Corp; Juno Therapeutics Inc
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2024-06-06
Anticipated expiration: 2038-11-01
Also published as: CN111615556A; BR112020008565A2; MX2020004239A; JP2021501607A; KR20200097253A; IL274330A; WO2019090004A1; US20210254000A1; EP3704229A1; JP7258899B2; AU2018360801A1; MA50859A; SG11202003657VA; EP3704229B1; CA3080509A1

Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para producir células T diseñadas que expresen un receptor recombinante, como para su uso en terapia celular. En algunos aspectos, los métodos proporcionados incluyen una o más etapas para incubar las células en condiciones estimulantes, introducir un polipéptido recombinante en las células mediante transducción o transfección, y/o cultivar las células en condiciones que promuevan la proliferación y/o expansión, en los que Se llevan a cabo uno o más pasos en presencia de un agente que inhibe la actividad del objetivo de rapamicina (mTOR) de los mamíferos. En algunos aspectos, el cultivo se realiza en presencia de un agente que inhibe la actividad del objetivo de rapamicina (mTOR) de los mamíferos. En algunos aspectos, los métodos proporcionados producen células T genéticamente modificadas con persistencia mejorada y/o actividad antitumoral in vivo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la producción de una composición de células T

Campo

[0001]La presente divulgación describe métodos para producir células T diseñadas que expresen un receptor recombinante, como para su uso en terapia celular. En algunos aspectos, los métodos incluyen una o más etapas para incubar las células en condiciones estimulantes, introducir un polipéptido recombinante en las células mediante transducción o transfección, y/o cultivar las células en condiciones que promuevan la proliferación y/o expansión, en los que uno o más pasos se lleva a cabo en presencia de un agente que inhibe la actividad del objetivo de rapamicina (mTOR) de los mamíferos. En algunos aspectos, el cultivo se realiza en presencia de un agente que inhibe la actividad del objetivo de rapamicina (mTOR) de los mamíferos. En algunos aspectos, los métodos producen células T genéticamente modificadas con persistencia mejorada y/o actividad antitumoralin vivo.

Antecedentes

[0002]Se encuentran disponibles varios métodos de terapia celular para tratar enfermedades y afecciones. Entre los métodos de terapia celular se encuentran métodos que involucran células inmunes, como células T, genéticamente modificadas con un receptor recombinante, como un receptor de antígeno quimérico. Se necesitan métodos mejorados para fabricar y/o diseñar dichas terapias celulares, incluso para proporcionar un proceso más eficiente y/o un producto de composición celular mejorado. Se proporcionan métodos para producir células diseñadas, células diseñadas, composiciones, kits y artículos de fabricación y métodos de tratamiento que satisfacen dichas necesidades.

[0003]El documento WO 2015/188119 A1 describe métodos de fabricación de células T para mejorar la supervivencia y la expansión in vivo.

[0004]Smith et al., 2015 describe cómo la modulación del metabolismo de las células T mediante la restricción de la glucólisis aeróbica mejora la actividad antitumoral de las células T modificadas con el receptor de antígeno quimérico (CAR).

[0005]El documento US 2013/102613 A1 describe el tratamiento del linfoma no Hodgkin o del mieloma múltiple con inhibidores de la quinasa TOR.

[0006]Brahmandam et al., 2017 describe la generación de células CAR-T mejoradas en presencia de un inhibidor de la quinasa mTOR.

Resumen

[0007]La presente invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

[0008]En particular, la presente invención proporciona un método para producir una composición de células modificadas genéticamente, comprendiendo el método:

(a) incubar, en condiciones estimulantes, una composición de entrada que comprende células T humanas primarias, comprendiendo dichas condiciones estimulantes la presencia de (i) un reactivo estimulador capaz de activar uno o más dominios de señalización intracelular de uno o más componentes de un complejo de TCR y/o uno o más dominios de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras y (ii) un agente que inhibe la actividad mTOR, en el que el agente que inhibe la actividad mTOR es 2-(3-hidroxifenil)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purin-6-carboxamida (Compuesto 63); e

(b) introducir un receptor recombinante en la composición estimulada, generando así una composición modificada que comprende células T modificadas.

[0009]La presente invención también proporciona un método para producir una composición de células diseñadas, comprendiendo el método cultivar, en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, una composición celular diseñada que comprende células T humanas primarias enriquecidas que comprenden células T diseñadas con un receptor recombinante;

en el que el agente que inhibe la actividad mTOR es 2-(3-hidroxifenil)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7Hpurin-6-carboxamida (Compuesto 63); y

en el que el método da como resultado la proliferación o expansión de células en la composición para producir una composición resultante que comprende células T modificadas genéticamente.

[0010]En ciertas formas de realización, el método comprende cultivar, en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, una composición celular diseñada que comprende células T humanas primarias enriquecidas que comprende células diseñadas con un receptor recombinante, en donde las células en la composición no han sido expuestas al agente antes de cultivarse; y en el que el método da como resultado la proliferación o expansión de las células en la composición para producir una composición resultante que comprende células T modificadas genéticamente. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, las células T primarias son células T CD4+ y/o CD8+. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la composición de células T diseñadas comprende células T CD4+ enriquecidas. En determinadas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la composición de células T modificada comprende células T CD8+ enriquecidas.

[0011]En ciertas formas de realización, el método comprende cultivar, en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, una composición celular diseñada que comprende células T humanas primarias CD4+ enriquecidas y/o CD8+ enriquecidas que comprenden células T diseñadas con un receptor recombinante; en el que el método da como resultado la proliferación o expansión de células en la composición para producir una composición de salida que comprende células T CD4+ enriquecidas y/o CD8+ enriquecidas modificadas genéticamente. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la composición de células T modificada comprende más o más de aproximadamente el 70 %, más o más de aproximadamente el 75 %, más o más de aproximadamente el 80 %, más o más de aproximadamente el 85 %, mas de o mas de aproximadamente 90 %, mas de o mas de aproximadamente 95 % o mas de o mas de aproximadamente 98 % de células T humanas primarias CD4+; y/o la composición de entrada consiste esencialmente en células T humanas primarias CD4+. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, la composición de células T diseñada comprende más o más de aproximadamente el 70 %, más o más de aproximadamente el 75 %, más o más de aproximadamente el 80 %, más o más de aproximadamente el 85 %, mas de o mas de aproximadamente 90 %, mas de o mas de aproximadamente 95 % o mas de o mas de aproximadamente 98 % de células T humanas primarias CD8+; y/o la composición de entrada consiste esencialmente en células T humanas primarias CD8+. En ciertas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la composición de células T modificada comprende más o más de aproximadamente el 70 %, más o más de aproximadamente el 75 %, más o más de aproximadamente el 80 %, más o más de aproximadamente el 85 %, mas de o mas de aproximadamente 90 %, mas de o mas de aproximadamente 95 % o mas de o mas de aproximadamente 98 % de células T humanas primarias CD4+ y CD8+; y/o la composición de entrada consiste esencialmente en células T humanas primarias CD4+ y CD8+.

[0012]En determinadas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el cultivo se lleva a cabo en presencia de una o más citoquinas. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la una o más citocinas comprenden una o más de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, G-CSF y GM-CSF. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, la una o más citocinas son citocinas recombinantes.

[0013]En ciertas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, antes del cultivo, el método comprende además: (a) incubar, en condiciones estimulantes, una composición de entrada que comprende células T primarias, comprendiendo dichas condiciones estimulantes la presencia de un reactivo estimulador capaz de activar uno o más dominios de señalización intracelular de uno o más componentes de un complejo de TCR y/o uno o más dominios de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras, generando así una composición estimulada; y (b) introducir un receptor recombinante en la composición estimulada, generando así una composición modificada que comprende células T modificadas.

[0014]En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la composición de entrada, la composición estimulada y/o la composición diseñada comprende células T CD4+ y/o CD8+ primarias. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, la composición de entrada, la composición estimulada y/o la composición diseñada comprende células T CD4+ enriquecidas. En ciertas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la composición de entrada, la composición estimulada y/o la composición diseñada comprende células T CD8+ enriquecidas.

[0015]En ciertas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados para producir una composición de células modificadas genéticamente, el método comprende: (a) incubar, en condiciones estimulantes, una composición de entrada que comprende células T humanas primarias enriquecidas en células T humanas primarias CD4+ y/o CD8+, comprendiendo dichas condiciones estimulantes la presencia de (i) un reactivo estimulador capaz de activar uno o más dominios de señalización intracelular de uno o más componentes de un complejo de TCR y/o uno o más dominios de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras y (ii) un agente que inhibe la actividad mTOR; y (b) introducir un receptor recombinante en la composición estimulada, generando así una composición modificada que comprende células T modificadas.

[0016]En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la composición de entrada, la composición estimulada y/o la composición diseñada comprende más o más de aproximadamente el 70 %, más o más de aproximadamente el 75 %, más o más de aproximadamente el 80 %, mas de o mas de aproximadamente 85 %, mas de o mas de aproximadamente 90 %, mas de o mas de aproximadamente 95 % o mas de o mas de aproximadamente 98 % de células T humanas primarias CD4+; y/o la composición de entrada consiste esencialmente en células T humanas primarias CD4+. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, la composición de entrada, la composición estimulada y/o la composición diseñada comprende más o más de aproximadamente el 70 %, más o más de aproximadamente el 75 %, más o más de aproximadamente el 80 %, mas de o mas de aproximadamente 85 %, mas de o mas de aproximadamente 90 %, mas de o mas de aproximadamente 95 % o mas de o mas de aproximadamente 98 % de células T humanas primarias CD8+; y/o la composición de entrada consiste esencialmente en células T humanas primarias CD8+. En ciertas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la composición de entrada, la composición estimulada y/o la composición diseñada comprende más o más de aproximadamente el 70 %, más o más de aproximadamente el 75 %, más o más de aproximadamente el 80 %, mas de o mas de aproximadamente 85 %, mas de o mas de aproximadamente 90 %, mas de o mas de aproximadamente 95 % o mas de o mas de aproximadamente 98 % de células T humanas primarias CD4+ y CD8+; y/o la composición de entrada consiste esencialmente en células T humanas primarias CD4+ y CD8+.

[0017]En ciertos casos de cualquiera de los métodos descritos, el agente que inhibe la actividad mTOR es una molécula pequeña, una molécula orgánica pequeña, un polinucleótido, un oligonucleótido, un ARNip o un polipéptido. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR es una pequeña molécula orgánica. En algunos casos de cualquiera de los métodos descritos, el agente que inhibe la actividad mTOR inhibe la actividad quinasa mTORC1 y/o mTORC2. En casos particulares de cualquiera de los métodos descritos, el agente que inhibe la actividad mTOR inhibe la actividad de al menos una quinasa adicional. En ciertos casos de cualquiera de los métodos descritos, al menos una quinasa adicional es PI3K. En algunos casos de cualquiera de los métodos descritos, el agente que inhibe la actividad de mTOR es BEZ235, BGT226, GDC0980, NVP-BEZ235, PF-04691502, PI-103, SAR245409, SF1126, VS5584 o XL765.

[0018]El agente que inhibe la actividad mTOR: (i) no inhibe la actividad PI3K; (ii) no inhibe de forma detectable la actividad de PI3K en la CI<50>para la actividad mTOR; y/o (iii) no inhibe de manera detectable PI3K en todas las concentraciones que inhiben de manera detectable la actividad de mTOR. El agente que inhibe la actividad mTOR inhibe la actividad quinasa mTORC1 y mTORC2. En algunos casos de cualquiera de los métodos descritos, el agente que inhibe la actividad mTOR es una pirazolopirimidina, Torin l, Torkinib, PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth), OSI-027, DS3078a o AZD8055. En casos particulares de cualquiera de los métodos descritos, el agente que inhibe la actividad mTOR inhibe selectivamente la actividad mTORC1.

[0019]En ciertos casos de cualquiera de los métodos descritos, el agente que inhibe la actividad mTOR: (i) no inhibe la actividad mTORC2; (ii) no inhibe de forma detectable la actividad de mTORC2 en la CI<50>para la actividad de mTORC1; y/o (iii) no inhibe de manera detectable mTORC2 en todas las concentraciones que inhiben de manera detectable la actividad de mTORC1. En algunos casos de cualquiera de los métodos descritos, el agente que inhibe la actividad mTOR es rapamicina, temsirolimus, everolimus, deforolimus o AZD8055.

[0020]En casos particulares de cualquiera de los métodos descritos, el agente comprende una fórmula establecida en la Fórmula I,

en la que R<1>es alquilo C<1-8>sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, R<2>es alquilo C<1-8>sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, y R<3>y R<4>son independientemente H o alquilo C<1-8>. En algunas formas de realización, el agente que inhibe la actividad mTOR es o comprende un compuesto de Fórmula (I), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR es o comprende un compuesto de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0021]En ciertos casos de cualquiera de los métodos descritos, R<1>es arilo sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, tal como fenilo sustituido. En algunos casos de cualquiera de los métodos descritos, R<2>es arilo sustituido o no sustituido y/o un fenilo sustituido o no sustituido. En algunos casos, R<2>es arilo sustituido o no sustituido, tal como fenilo sustituido o no sustituido. En casos particulares de cualquiera de los métodos descritos, los grupos que están sustituidos se sustituyen con uno o más halógenos; alquilo C<1-8>; alquenilo C<2-8>; alquinilo C<2-8>; hidroxilo; alcoxilo C<1-8>; aminado; nitro; tiol; tioéter; yo mismo; ciano; amido; fosfonato; fosfina; carboxilo; tiocarbonilo; sulfonilo; sulfonamida; cetona; aldehído; ester; carbonilo; haloalquilo; B(OH)<2>; cicloalquilo carbocíclico, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo monocíclico o policíclico condensado o no condensado; aminado; O-alquilo inferior; O-arilo, arilo; aril-alquilo inferior; CO<2>CH<3>; CONH<2>; OCH<2>CONH<2>; NH<2>; SO<2>NH<2>; OCHF<2>; CF<3>; o grupos OCF<3>. El agente que inhibe la actividad de mTOR en cualquiera de los métodos proporcionados es el Compuesto 63. El agente que inhibe la actividad de mTOR en cualquiera de los métodos proporcionados es 2-(3-hidroxifenil)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purina-6-carboxamida, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma. El agente que inhibe la actividad mTOR es

, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0022]En el presente documento se proporciona un método para producir una composición de células diseñadas, comprendiendo el método cultivar, en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, una composición celular diseñada que comprende células T humanas primarias enriquecidas que comprenden células T diseñadas con un receptor recombinante; en donde el agente que inhibe la actividad mTOR es el Compuesto 63; y en el que el método da como resultado la proliferación o expansión de células en la composición para producir una composición resultante que comprende células T modificadas genéticamente.

[0023]En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, la composición celular diseñada se cultiva en presencia de entre 500 nM y 2 jM , entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 250 nM, o entre 100 nM y 500 nM de Compuesto 63.

[0024]En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, antes del cultivo, el método comprende además: (a) incubar, en condiciones estimulantes, una composición de entrada que comprende células T primarias en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR; en el que dichas condiciones estimulantes comprenden la presencia de un reactivo estimulador capaz de activar uno o más dominios de señalización intracelular de uno o más componentes de un complejo de TCR y/o uno o más dominios de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras, generando así una composición estimulada; y en el que el agente que inhibe la actividad mTOR es el Compuesto 63; y (b) introducir un receptor recombinante en la composición estimulada, generando así una composición modificada que comprende células T modificadas.

[0025]En el presente documento se proporciona un método para producir una composición de células modificadas genéticamente, comprendiendo el método: (a) incubar, en condiciones estimulantes, una composición de entrada que comprende células T humanas primarias, comprendiendo dichas condiciones estimulantes la presencia de (i) un reactivo estimulador capaz de activar uno o más dominios de señalización intracelular de uno o más componentes de un complejo de TCR y/o uno o más dominios de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras y (ii) un agente que inhibe la actividad mTOR, en donde el agente que inhibe la actividad mTOR es Compuesto 63; y (b) introducir un receptor recombinante en la composición estimulada, generando así una composición modificada que comprende células T modificadas. En algunas formas de realización, las células T primarias están enriquecidas en células T CD4+ y/o CD8+.

[0026]En ciertas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el reactivo estimulador comprende un agente primario que se une específicamente a un miembro de un complejo de TCR, opcionalmente que se une específicamente a CD3. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el reactivo estimulador comprende además un agente secundario que se une específicamente a una molécula coestimuladora de células T, opcionalmente en donde la molécula coestimuladora se selecciona de CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 o ICOS. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, los agentes primarios y/o secundarios comprenden un anticuerpo, opcionalmente en donde el reactivo estimulador comprende la incubación con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos. En ciertas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el agente primario y/o el agente secundario están presentes en la superficie de un soporte sólido. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el soporte sólido es o comprende una perla. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, el cordón comprende un diámetro mas de o mas de aproximadamente 3,5 jm pero no más de aproximadamente 9 jm o no más de aproximadamente 8 jm o no más de aproximadamente 7 jm o no más de aproximadamente 6 jm o no más de aproximadamente 5 jm . En ciertas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el cordón comprende un diámetro de o aproximadamente 4,5 jm . En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la perla es inerte. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, la perla es o comprende una superficie de poliestireno. En determinadas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la perla es magnética o superparamagnética. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la proporción de perlas a células es de aproximadamente 4:1 a 0,25:1.

[0027]En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, la introducción comprende transducir células de la composición estimulada con un vector viral que comprende un polinucleótido que codifica el receptor recombinante. En determinadas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el vector viral es un vector retroviral. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el vector viral es un vector lentiviral o un vector gammaretroviral. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, la introducción comprende transfectar las células de la composición estimulada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica el receptor recombinante. En determinadas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el vector es un transposón, opcionalmente un transposón de La Bella Durmiente (SB) o un transposón de Piggybac.

[0028] En algunas formas de realización de los métodos proporcionados, después del cultivo, el método comprende además recolectar células de la composición resultante. Las formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados comprenden además formular células de la composición resultante para criopreservación y/o administración a un sujeto, opcionalmente en presencia de un excipiente farmacéuticamente aceptable. En determinadas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, las células de la composición resultante se formulan en presencia de un crioprotector. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el crioprotector comprende DMSO. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, las células de la composición resultante se formulan en un recipiente, opcionalmente un vial o una bolsa.

[0029] Ciertas formas de realización de los métodos proporcionados comprenden además aislar las células T CD4+ y/o CD8+ de una muestra biológica antes de la incubación. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el aislamiento comprende seleccionar células basándose en la expresión superficial de CD4 y/o CD8, opcionalmente mediante selección positiva o negativa. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, el aislamiento comprende llevar a cabo una selección basada en inmunoafinidad. En determinadas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la muestra biológica comprende células T primarias obtenidas de un sujeto. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la muestra biológica es o comprende una muestra de sangre completa, una muestra de capa leucocítica, una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), una muestra de células T no fraccionadas, una muestra de linfocitos, una muestra de glóbulos blancos, un producto de aféresis o un producto de leucoféresis.

[0030] En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, el receptor recombinante es capaz de unirse a un antígeno diana que está asociado, es específico y/o se expresa en una célula o tejido de una enfermedad, trastorno o afección. En determinadas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la enfermedad, trastorno o afección es una enfermedad o trastorno infeccioso, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria o un tumor o un cáncer. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el antígeno diana es un antígeno tumoral.

[0031] En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, el antígeno diana se selecciona entre 5T4, 8H9, integrina avb6, B7-H6, antígeno de maduración de células B (BCMA), CA9, un antígeno de cáncer de testículo, anhidrasa carbónica 9 (CAIX), CCL-1, CD19, CD20, CD22, CEA, antígeno de superficie de la hepatitis B, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, antígeno carcinoembrionario (CEA), CE7, una ciclina, ciclina A2, c-Met, antígeno dual, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa2, ephrinB2, dímeros de erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB, EGFR vIII, receptor de estrógeno, AchR fetal, receptor alfa de folato, proteína de unión a folato (FBP), FCRL5, FCRH5, receptor de acetilcolina fetal, G250/CAIX, GD2, GD3, receptor acoplado a proteína G 5D (GPRc 5d ), gp100, Her2/neu (receptor tirosina quinasa erbB2), HMW-MAA, IL-22R-alfa, receptor de IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), receptor de dominio de inserción de quinasa (kdr), cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión de células L1 (L1-cAm ), antígeno asociado al melanoma (Ma Ge )-A1, MAGE-A3, Ma Ge-A6, MART-1, mesotelina, CMV murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, NCAM, NKG2D, ligandos NKG2D, NY-ESO-1, GD2 O-acetilado (OGD2), antígeno oncofetal, antígeno de melanoma expresado preferentemente (PRAME), PSCA, receptor de progesterona, survivina, ROR1, TAG72, EGFRt, receptores de VEGF, VEGF-R2, tumor de Wilms 1 (Wt -1 ), un antígeno específico de patógeno y un antígeno asociado con una etiqueta universal.

[0032] En ciertas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el receptor recombinante es o comprende un receptor de antígeno no TCR funcional o un TCR o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el receptor recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR). En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, el receptor recombinante es un CAR anti-CD19. En determinadas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el receptor de antígeno quimérico comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno.

[0033] En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el dominio de unión al antígeno es o comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo del mismo, que opcionalmente es un fragmento de cadena única. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, el fragmento comprende regiones variables de anticuerpo unidas por un conector flexible. En determinadas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el fragmento comprende un scFv. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el receptor de antígeno quimérico comprende además un espaciador y/o una región bisagra. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, el receptor de antígeno quimérico comprende una región de señalización intracelular. En determinadas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la región de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el dominio de señalización intracelular es o comprende un dominio de señalización primario, un dominio de señalización que es capaz de inducir una señal de activación primaria en una célula T, un dominio de señalización de un receptor de células T (TCR) componente, y/o un dominio de señalización que comprende un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM). En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, el dominio de señalización intracelular es o comprende un dominio de señalización intracelular de una cadena CD3, opcionalmente una cadena CD3-zeta (CD3Z), o una porción de señalización de la misma.

[0034] En ciertas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, el receptor de antígeno quimérico comprende además un dominio transmembrana dispuesto entre el dominio extracelular y la región de señalización intracelular. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la región de señalización intracelular comprende además una región de señalización coestimuladora. En ciertas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la región de señalización coestimuladora comprende un dominio de señalización intracelular de una molécula coestimuladora de células T o una porción de señalización de la misma. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, la región de señalización coestimuladora comprende un dominio de señalización intracelular de un CD28, un 4-1BB o un ICOS o una porción de señalización del mismo. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, la región de señalización coestimuladora está entre el dominio transmembrana y la región de señalización intracelular.

[0035] En ciertas formas de realización de cualquiera de los métodos proporcionados, las células T primarias comprenden composiciones separadas de células T CD4+ enriquecidas y células T CD8+ enriquecidas, y en donde las composiciones de células T<c>D4+ enriquecidas y células T CD8+ enriquecidas se cultivan por separado. En formas de realización particulares de cualquiera de los métodos proporcionados, las células T primarias comprenden composiciones separadas de células T CD4+ enriquecidas y células T CD8+ enriquecidas, y en las que las composiciones se mezclan para cultivar las células T CD4+ enriquecidas y las células T CD8+ enriquecidas juntas.

[0036] En el presente documento se describe como parte de la divulgación una composición que comprende células diseñadas producidas mediante cualquier método proporcionado en el presente documento. En casos particulares, la composición comprendía además un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, la composición comprende un crioprotector, opcionalmente DMSO.

[0037] En el presente documento se describe como parte de la divulgación un artículo de fabricación, que comprende cualquier composición descrita en el presente documento e instrucciones para administrar la composición resultante a un sujeto. En ciertos casos, el sujeto tiene una enfermedad o afección, opcionalmente en la que el receptor recombinante reconoce específicamente o se une específicamente a un antígeno asociado con, o expresado o presente en células de la enfermedad o afección. En casos particulares, la composición de salida es una composición de células T CD4+ modificadas genéticamente. En algunos casos, la composición resultante es una composición diseñada de células T CD8+. En ciertos casos, la composición de salida es una composición diseñada de células T CD4+ y CD8+.

[0038] En el presente documento se describe como parte de la divulgación un artículo fabricado que comprende una composición de células T CD4+ modificadas genéticamente producidas mediante un método proporcionado en este documento, una composición de células T CD8+ modificadas genéticamente producidas mediante un método proporcionado en este documento, e instrucciones para administrar las células T CD4+ modificadas genéticamente y las células T CD8+ modificadas genéticamente a un sujeto. En ciertos casos, las instrucciones especifican la administración por separado de las células T CD4+ y las células T CD8+ al sujeto. En ciertos casos, las instrucciones especifican la administración de células T CD4+ y células T CD8+ al sujeto en una proporción deseada. También se describe en el presente documento como parte de la divulgación un artículo de fabricación que comprende una composición de células T CD4+ y CD8+ modificadas genéticamente producidas mediante un método proporcionado en el presente documento, e instrucciones para administrar las células T CD4+ y CD8+ modificadas genéticamente a un sujeto.

[0039] En el presente documento se describe como parte de la divulgación un método de estimulación a largo plazo para evaluar una composición celular que incluye incubar, durante un período de tiempo de al menos 10 días, una composición de entrada en condiciones para estimular una actividad dependiente de CAR en células en la composición de entrada. dicha composición de entrada contiene células T que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) que contiene un dominio de unión a antígeno extracelular que se une o reconoce específicamente un antígeno, produciendo así una composición de salida; y evaluar uno o más fenotipos o actividad de una o más células de la composición de salida.

[0040] En algunos casos, las condiciones para estimular una actividad dependiente de CAR incluyen la presencia de una molécula de unión que se une específicamente al dominio de unión a antígeno del CAR. En algunos casos, la molécula de unión está unida a un soporte. En algunos casos, el soporte es un soporte sólido. En algunos casos, el soporte sólido es la superficie de un pocillo de una microplaca o una perla. En algunos casos, el soporte sólido es una microplaca que tiene la molécula de unión unida a la microplaca, y la incubación se lleva a cabo en la microplaca. En algunos casos, el soporte sólido es una perla que tiene unida la molécula de unión, y la incubación se lleva a cabo en presencia de una pluralidad de perlas.

[0041]En algunos casos, la molécula de unión es o comprende un antígeno recombinante o una porción del mismo reconocido por el dominio de unión al antígeno. En algunos casos, el antígeno recombinante o una porción del mismo es BCMA, o es una porción del mismo reconocida por el dominio de unión al antígeno. En algunos casos, la molécula de unión es o incluye un anticuerpo antiidiotopítico o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al dominio de unión a antígeno. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno del receptor de antígeno es o comprende el anticuerpo SJ25C1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno del receptor de antígeno es o incluye el anticuerpo FMC63 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

[0042]En algunos casos, el método se lleva a cabo in vitro o ex vivo.

[0043]En algunos casos, la composición de entrada se incuba en presencia de un medio que no comprende citocinas recombinantes. En algunos casos, la incubación se lleva a cabo de forma continua o no se interrumpe durante un período de tiempo. En algunos casos, durante la incubación, las células no se vuelven a sembrar, no se cambian los medios y no se agrega la molécula de unión.

[0044]En algunos casos, el método incluye evaluar uno o más fenotipos de activación, agotamiento o estado de diferenciación de una o más células de la composición de salida. En algunos casos, el fenotipo es agotamiento y la evaluación incluye medir la expresión, opcionalmente la expresión superficial, de uno o más marcadores seleccionados de CTLA-4, FOXP3, PD-1, TIGIT, LAB-3, 2B4, BTLA, TIM3, VISTA, o CD96. En algunos casos, el fenotipo es activación y la evaluación incluye medir la expresión, opcionalmente la expresión superficial, de uno o más marcadores seleccionados de CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD71, CD154, CD40L, CD127, LAG3 o Ki67. En algunos casos, el fenotipo es un estado de diferenciación y la evaluación incluye medir uno o más marcadores seleccionados de (i) uno o más de CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, CD95 y/o (ii) uno o de CD45RA, CD27, CD28, CD62L y CCR7, opcionalmente en donde uno o más marcadores están asociados positiva o inversamente con células T de tipo ingenuo.

[0045]En algunos casos, el método incluye evaluar una o más actividades de una o más células de la composición de salida. En algunos casos, la una o más actividades comprenden una actividad dependiente de CAR, opcionalmente una actividad estimulada por antígeno. En algunos casos, la una o más actividades comprenden actividad citolítica o producción de citoquinas.

[0046]En algunos casos, el período de tiempo es al menos o al menos aproximadamente 11 días, 12 días, 13 días, 14 días o 15 días. En algunas formas de realización, el período de tiempo es o es de aproximadamente 11 días, 12 días, 13 días, 14 días o 15 días.

[0047]En algunos casos, la composición de entrada contiene células que han sido expuestas o en contacto con un agente o compuesto de prueba antes de la incubación, opcionalmente en donde la exposición o el contacto se lleva a cabo durante una o más etapas de un proceso para producir la composición de entrada que comprende las células T que expresan el CAR. En algunos casos, el método se lleva a cabo en una pluralidad de composiciones de entrada, siendo producida cada una de dichas composiciones de entrada de la pluralidad mediante un proceso diferente.

[0048]En algunos casos, el método descrito incluye además comparar el fenotipo o actividad de la composición de salida con el fenotipo o actividad de una composición de control, opcionalmente en donde la composición de control es una composición de células T que se han incubado durante al menos 10 días bajo las mismas condiciones para estimular la actividad dependiente de<c>A<r>, no habiéndose producido dicha composición de células T en presencia del agente o compuesto de prueba o habiéndose producido mediante un proceso alternativo en comparación con la composición de entrada. En algunos casos, el método incluye además identificar una composición de salida que muestra un agotamiento reducido, una activación reducida o una diferenciación disminuida, tal como en comparación con las composiciones de control. En algunos casos, la diferenciación disminuida comprende una mayor expresión de uno más de los marcadores de células T similares a los ingenuos.

Breve descripción de los dibujos

[0049]

FIGS. 1A-1D muestra gráficos que muestran los niveles de S6 fosforilado detectados en células T CD4+ y CD8+ incubadas con perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en presencia de concentraciones variables de PI-103 (FIG. 1A), Compuesto 155 (FIG. 1B), Compuesto 246 (FIG. 1C), o Compuesto 63 (FIG. 1D).

FIG. 2 muestra gráficos que muestran el porcentaje del número de células inicial para células T CD8+ (panel superior) y CD4+ (panel inferior) diseñadas que están presentes después de una incubación en un medio de control solo, o en presencia de DMSO, PI-103 o variantes. concentraciones de Compuesto 155, Compuesto 63 o Compuesto 246. Las flechas indican la dosis más alta tolerada de Compuesto 155, Compuesto 63 y Compuesto 246 que dio como resultado niveles similares de expansión de células T CD8 y CD4. Las líneas horizontales de puntos indican el 70 % de los valores medios de los medios y los controles de DMSO.

FIGS. 3A-3C muestran gráficos del metabolismo glicolítico celular en células T CD8+ entre la composición de células CAR-T anti-CD19 generada. FIG. 3A proporciona gráficos que muestran la tasa de acidificación extracelular (ECAR) en tiempo real de células CAR-T CD8+ entre células CAR-T anti-CD19 generadas por expansión en presencia de medios únicamente, DMSO, PI-103 o Compuesto 63. La FIG. 3B muestra el área bajo la curva (AUC) calculada para las tasas de ECAR (mph/min) en relación con los controles de solo medio. FIG. 3C muestra la relación máxima de explosión glucolítica de ECAR en relación con los controles de solo medio.

FIGS. 4A-4B proporcionan gráficos que muestran los resultados de los ensayos realizados en composiciones de células CAR-T anti-CD19 que se generaron mediante expansión en presencia de medios únicamente, DMSO, PI-103 o Compuesto 63. La FIG. 4A muestra la intensidad fluorescente media de la tinción con fosfo-S6 en células T CD8+ y CD4+ de las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas después del cocultivo con células K-562 irradiadas transducidas para expresar CD19 (células diana K562-CD19 irradiadas). y células que no fueron expuestas a un antígeno (sin estimulación). Los paneles superiores muestran puntos de datos individuales medidos a partir de composiciones de células separadas. Los paneles inferiores muestran valores medios /-desviación estándar. FIG. 4B proporciona gráficos que muestran la actividad citolítica de las composiciones de células CAR-T generadas cocultivadas con células diana K562-CD19 en una proporción de 3:1 o 1:1 de células efectoras a células diana. Se proporcionan como controles mediciones de composiciones de células CAR-T generadas y células K562 que expresan CD19.

FIG. 5 proporciona gráficos que muestran la secreción de TNF-alfa (panel izquierdo), IFN-gamma (panel central) e IL-2 (panel derecho), de composiciones de células CAR-T anti-CD19 que se cocultivaron con células diana K562-CD19 irradiadas. Se muestra el cambio en la producción de citoquinas observado en sobrenadantes de cocultivo de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas expandidas en presencia de PI-103, Compuesto 63 o vehículo DMSO en comparación con células expandidas solo en medio.

FIGS. 6A y 6B muestran gráficos que muestran los perfiles de citoquinas polifuncionales de células T CD8+ (FIG.

6A) y CD4+ (FIG. 6B) a partir de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas que se cocultivaron con células diana K562-CD19 irradiadas y luego se incubó más PMA/ionomicina (paneles de la izquierda) o inhibidor de Golgi (paneles de la derecha). La mayor frecuencia de células que se tiñen positivamente para diferentes combinaciones de CD107a, IFN-gamma (IFNg), IL-2, IL-17a y TNF-alfa (TNFa) en composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas se expandió en presencia de Se muestra PI-103, compuesto 63 o vehículo DMSO en comparación con células expandidas en medio únicamente.

FIGS. 7A-7D muestran gráficos que muestran la actividad de las células T a partir de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas que se expandieron en presencia de medios únicamente, DMSO, PI-103 o Compuesto 63 después de estimulaciones repetidas. FIG. 7A muestra la duplicación de la población de células T a partir de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas cocultivadas con células diana K562-CD19 irradiadas. Después de 4 rondas de reestimulación, las células T se volvieron a cultivar sin células diana el día 11. FIG. 7B muestra el área bajo la curva (AUC) calculada para duplicaciones de población en relación con los controles de solo medio. FIG. 7C muestra un gráfico que muestra la producción de TNF-alfa (TNF), IFN-gamma (IFNg) e IL-2 por células T a partir de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas después de la estimulación con un cocultivo de 16 horas con irradiados. Células diana K562-CD19 después de 4 rondas de estimulaciones repetidas con células diana K562-CD19 irradiadas. Se muestra el cambio de TNF-alfa (TNF), IFN-gamma (IFNg) e IL-2 extracelular en comparación con la condición de solo medio. FIG. 7D muestra gráficos que representan los perfiles de citoquinas polifuncionales de células T CD8+ a partir de composiciones de células<c>AR-T anti-CD19 generadas que siguieron a 4 rondas de reestimulación con células diana K562-CD19 irradiadas.

FIGS. 8A-8D muestran gráficos que muestran la actividad de las células T a partir de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas que se expandieron en presencia de medios únicamente, DMSO, PI-103 o Compuesto 63 después de la estimulación con superficie de perlas conjugadas con anticuerpo antiidiotipo específico para el CAR anti-CD19. FIG. 8A muestra los recuentos totales de células T vivas por pocillo de células T de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas cocultivadas con superficie de perlas conjugadas con el anticuerpo antiidiotipo. FIG. 8B muestra el área bajo la curva (AUC) calculada para los recuentos de células T vivas en relación con los controles de solo medio. FIG. 8C muestra un gráfico que muestra la producción de TNF-alfa (TNF), IFN-gamma (IFNg) e IL-2 por células T a partir de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas después de la estimulación con un cocultivo de 16 horas con irradiados. Células diana K562-CD19 que siguieron una incubación de 15 días con perlas conjugadas en la superficie con el anticuerpo antiidiotipo. Se muestra el cambio de TNF-alfa (TNF), IFN-gamma (IFNg) e IL-2 extracelular en comparación con la condición de solo medio. FIG. 8D muestra gráficos que representan los perfiles de citoquinas polifuncionales de células T CD8+ a partir de composiciones de células<c>AR-T anti-CD19 generadas que siguieron a una incubación de 15 días con perlas conjugadas con el anticuerpo antiidiotipo.

FIGS 9A-9C muestran gráficos que muestran los resultados de un análisis de ARN-Seq de células T CD4+ y CD8+ a partir de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas que se expandieron en presencia de medios únicamente, DMSO, PI-103 o Compuesto 63. FIG. 9A muestra gráficos de volcán que representan la expresión génica expresada diferencialmente por células T CD4+ (paneles de la izquierda), CD8+ (paneles del medio) y CD4+ y CD8+ combinadas (paneles de la derecha) a partir de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas. Se muestra la expresión genética diferencial para las células T expandidas solo en medio (fila superior), PI-103 (fila central) y el Compuesto 63 (fila inferior) en comparación con las células T expandidas con DMSO. FIG. 9B muestra un gráfico que representa el cambio de veces log2 (Log2FC) de genes expresados diferencialmente medidos en células T a partir de composiciones de células CART anti-CD19 generadas que se expandieron en presencia de PI-103 (eje X) y Compuesto 63 (eje Y) en relación con la expresión en células T a partir de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas que se expandieron en presencia de DMSO. FIG. 9C muestra una tabla y un gráfico que representan categorías de ontología genética (OG) identificadas a modo de ejemplo y sus puntuaciones Z correspondientes.

FIGS. 10A y 10B muestran gráficos que muestran la carga tumoral y la supervivencia en ratones portadores de tumores después del tratamiento con células CAR-T anti-CD19. FIG. 10A muestra gráficos que muestran la carga tumoral y la supervivencia hasta el día 80 en ratones portadores de tumores después del tratamiento con células CAR-T anti-CD19. FIG. 10B muestra un gráfico que muestra la supervivencia hasta el día 100 en ratones portadores de tumores después del tratamiento con células CAR-T anti-CD19. A ratones inmunodeficientes Nod scid gamma (NSG) se les implantaron células Raji que expresaban luciferasa de luciérnaga y no recibieron tratamiento o recibieron tratamiento con una dosis alta (paneles de la izquierda) o baja (paneles de la derecha) de células CAR-T anti-CD19 que se expandieron en presencia de DMSO o PI-103. La carga tumoral de ratones individuales medida por bioluminiscencia (paneles superiores) y las curvas de supervivencia de los grupos de tratamiento (paneles inferiores) se muestran en los tiempos indicados como se muestra en la FIG. 10A y 10B. FIGS. 11A y 11B muestran gráficos que muestran la carga tumoral y la supervivencia en ratones portadores de tumores después del tratamiento con células CAR-T anti-CD19. FIG. 11A muestra gráficos que muestran la carga tumoral y la supervivencia hasta el día 80 en ratones portadores de tumores después del tratamiento con células CAR-T anti-CD19. FIG. 10B muestra un gráfico que muestra la supervivencia hasta el día 100 en ratones portadores de tumores después del tratamiento con células CAR-T anti-CD19. A ratones inmunodeficientes NSG se les implantaron células Raji que expresaban luciferasa de luciérnaga y no recibieron tratamiento o recibieron tratamiento con una dosis alta (paneles de la izquierda) o baja (paneles de la derecha) de células CAR-T anti-CD19 que se expandieron en presencia de DMSO. o Compuesto 63. La carga tumoral de ratones individuales medida por bioluminiscencia (paneles superiores) y las curvas de supervivencia de los grupos de tratamiento (paneles inferiores) se muestran en los tiempos indicados como se muestra en la FIG. 11A y 11B.

FIGS. 12A y 12B presentan gráficos que muestran la actividad de composiciones de células T que contienen células T CAR+ anti-CD19. Las células se incubaron con perlas conjugadas con anticuerpo anti-CD19 y anti-ID durante 14 días (día 14; secundario) o no se incubaron antes de evaluar la actividad. Se muestran los resultados de un ensayo de citotoxicidad (FIG. 12A) y un ensayo de tinción interna de citoquinas (ICS) después de la exposición a células que expresan CD19 (FIG. 12B).

FIG<s>. 13A-13C presentan gráficos que muestran características de composiciones de células T que contienen células T CAR+ anti-CD19 durante o después de la incubación con perlas conjugadas con anticuerpo anti-CD19 y anti-ID durante 14 días. Se muestran los resultados de las composiciones de células T que se generaron en presencia de PI-103, Compuesto 63 o un vehículo. FIGS. 13A y 13B muestran actividad en respuesta a la exposición a células CD19 de composiciones de células T que no se incubaron (primarias) ni se incubaron durante 14 días (secundarias). Se muestran los resultados de la tinción polifuncional mediante ICS (FIG. 13A) y una actividad citolítica (FIG. 13B) después de la exposición a células que expresan CD19. FIG. 13C representa niveles de citoquina secretada del sobrenadante de composiciones celulares que contienen células que expresan CAR anti-CD19 que se incubaron en una proporción de 1:1 con células que expresan CD19 durante 20 horas. Se midieron las cantidades de IL2, TNF e IFN-gamma y se muestra el promedio de las puntuaciones escaladas para las tres citocinas.

FIG. 14 representa la expresión de la caspasa 3 intracelular proapoptótica en células CAR-T descongeladas preparadas en presencia de DMSO o Compuesto 63. Los gráficos<f>A<c>S muestran células T CD3+CAR+ viables, preparadas a partir de tres donantes diferentes.

FIG. 15 presenta un gráfico que muestra el número de células viables a lo largo del tiempo de células CAR-T preparadas en presencia de DMSO, PI103 o Compuesto 63. Los símbolos representan la media y SEM de los pocillos de cultivo de tres donantes individuales.

FIG. 16 presenta un gráfico que muestra la destrucción de células diana mediante células CAR-T descongeladas preparadas en presencia de DMSO, PI103 o Compuesto 63. Los ensayos de destrucción se establecieron directamente después de la descongelación (día 0) o al final del cultivo de estimulación con CAR (día 14) descrito en la FIG. 15. Los símbolos representan la media y el SEM de los pocillos de cultivo de tres donantes individuales. FIGS. 17A-17B presentan gráficos que muestran que las células CAR-T preparadas en presencia de PI103 o Compuesto 63 tienen perfiles de citoquinas efectoras mejorados y sostenidos. Las células CAR-T se mezclaron 1:1 (CAR-T:diana) con células diana portadoras de antígeno directamente después de la descongelación (“Primaria”, paneles superiores) o al final del cultivo de estimulación CAR como se describe en la FIG. 15 (“Secundaria”, paneles inferiores). La polifuncionalidad de las células T se evaluó mediante la expresión intracelular de las citocinas IL2, TNF e IFNg mediante FACS de células CAR-T incubadas con dianas en presencia de un inhibidor de Golgi durante 5 horas (FIG. 17A). También se midió la secreción de citocinas en sobrenadantes de cultivo de células CAR-T incubadas con dianas durante 20 horas (FIG. 17B). Los valores del ensayo se normalizaron y clasificaron mediante escalamiento de características dentro de cada cohorte de donantes.

FIG. 18 presenta los resultados de un análisis de expresión diferencial (DESeq2) de RNAseq realizado en células CAR-T CD8+ y CD4+ enriquecidas generadas en presencia de PI103 o el Compuesto 63 como se describe en la FIG. 15. Se seleccionó la expresión diferencial de genes con valor de p ajustado (p-adj) <0,1 para PI103 frente a DMSO o Compuesto 63 frente a DMSO y se muestran los valores de expresión génica de cambio de log2. Los genes expresados de forma significativamente diferencial sólo en células tratadas con PI103 se muestran con cuadrados. Los genes expresados de forma significativamente diferencial sólo en células tratadas con el Compuesto 63 se muestran con círculos. Los genes expresados en ambas composiciones de células T se muestran con diamantes. Los valores de expresión diferencial son la media de tres donantes individuales por grupo.

FIGS. 19A-19B muestran gráficos que muestran la carga tumoral y la supervivencia en ratones portadores de tumores después del tratamiento con células CAR-T anti-CD19. FIG. 19A muestra gráficos que muestran la carga tumoral en ratones después del tratamiento con una dosis alta (1 x 106 células CAR-T/ratón) o una dosis baja (2,5 x 105 células CAR-T/ratón) de células CART anti-CD19. FIG. 19B muestran gráficos que muestran la supervivencia de ratones portadores de tumores después del tratamiento con una dosis alta o una dosis baja de células CAR-T anti-CD19.

FIGS. 20A-20B muestran gráficos que muestran la carga tumoral y la supervivencia en ratones portadores de tumores después del tratamiento con células CAR-T anti-CD19. FIG. 20A muestra gráficos que muestran la carga tumoral en ratones después del tratamiento con una dosis alta (1 x 106 células CAR-T/ratón) o una dosis baja (2,5 x 105 células CAR-T/ratón) de células CART anti-CD19. FIG. 20B muestran gráficos que muestran la supervivencia de ratones portadores de tumores después del tratamiento con una dosis alta o una dosis baja de células CAR-T anti-CD19.

FIGS. 21A-21B muestran gráficos que ilustran la persistencia de células CAR-T anti-CD19 a lo largo del tiempo en sangre de ratones receptores. FIG. 21A muestra los recuentos de células T CD4+ y CD8+ el día 18, el día 25 y el día 36 después de la inyección en ratones que recibieron una dosis alta (1 x 106 células CAR-T/ratón) de células CAR-T preparadas en presencia de Dm So (D), Compuesto 63 (C) o PI103 (P). FIG. 21B muestra los recuentos de células T CD4+ y CD8+ el día 18, el día 25 y el día 36 después de la inyección en ratones que recibieron una dosis baja (2,5 x 10 x células CAR-T/ratón) de células CAR-T preparadas en presencia de DMSO. (D), Compuesto 63 (C) o PI103 (P).

Descripción detallada

Las formas de realización de la invención se describen en algunos de los casos y aspectos siguientes.

[0050]En el presente documento se describen métodos para producir una composición de células diseñadas, tales como células CD4+ y/o CD8+ diseñadas, que expresan un receptor recombinante en el que se llevan a cabo uno o más pasos del proceso, tales como incubar, estimular y/o cultivar las células en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR. En ciertos casos, la composición celular diseñada es una composición celular de células T primarias CD4+ enriquecidas o CD8+ enriquecidas que incluyen células T diseñadas con un receptor recombinante. En determinados casos, las células T son células T humanas. En algunos aspectos, el cultivo de las células, tal como para la expansión y/o proliferación de las células, se lleva a cabo en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR. En algunos casos, las células de la composición no han sido puestas en contacto, incubadas y/o expuestas al agente antes de ser cultivadas. En ciertos casos, el cultivo da como resultado la proliferación o expansión de las células en la composición para producir una composición resultante que comprende células T CD4+ y/o CD8+ modificadas genéticamente.

[0051]La fabricación de células T genéticamente modificadas, como las células CAR-T, para su uso en terapia celular implica el aislamiento de células, activación de células, transducción o ingeniería de células con un receptor recombinante y expansión de células T para dosificación clínica. Este proceso puede dar como resultado una porción del producto farmacológico de células T diseñado que, en algunos casos, puede incluir células que han sido conducidas a un estado de agotamiento terminal y/o en las que las células carecen de persistencia y/o no exhiben una eficacia óptima. En algunos casos, la multipotencia y el potencial replicativo de las células T están disminuidos. En algunos aspectos, un producto farmacológico de células T diseñado que contiene células agotadas puede, en algunos casos, limitar la eficacia potencial del producto farmacológico de células T. Se necesitan métodos alternativos para la fabricación de terapias celulares diseñadas que minimicen o reduzcan el porcentaje o el número de células que se agotan o que probablemente se agoten, carecen de persistencia y/o tienen una eficacia disminuida cuando se administran a un sujeto.

[0052]Los métodos descritos en el presente documento se basan en observaciones de que la persistencia, la falta de agotamiento y/o la eficacia de las células diseñadas, por ejemplo, células CAR-T, se mejoran fabricando o produciendo las células en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR. En algunos aspectos, el agente es un inhibidor de la diana de rapamicina en mamíferos (mTOR), tal como mTOR en mamíferos, por ejemplo, humanos. En algunos casos, el agente es específico de mTOR y no inhibe ni tiene actividad objetivo contra otras quinasas relacionadas, como una quinasa de la familia de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3-quinasa). mTOR es una quinasa conservada evolutivamente con una homología de secuencia sustancial con la familia de la fosfoinositida 3-quinasa (PI3-quinasa). A diferencia de PI3K, mTOR no es una lípido quinasa sino una proteína quinasa de serina-treonina. En las células de mamíferos, mTOR está codificado como un solo gen cuyo producto proteico envía señales a través de dos complejos distintos (mTORC1 y mTORC2). En general, se cree que mTOR regula varios procesos celulares, incluido el crecimiento y la proliferación celular. En las células T, mTOR puede activarse mediante diversos estímulos que incluyen la activación de receptores de citocinas y receptores de células T.

[0053]En algunos aspectos, los métodos divulgados se usan en conexión con un proceso mediante el cual las células T diseñadas se incuban y/o cultivan en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, que puede, en algunos aspectos, mejorar o potenciar la expansión. persistencia y/o eficacia, por ejemplo, actividad antitumoral, de las células. En algunos aspectos, se usa un agente que inhibe la actividad quinasa mTORC1 y mTORC2. En ciertos casos, el agente es un inhibidor selectivo de mTOR, por ejemplo, no inhibe una quinasa adicional, por ejemplo, PI3K. En algunos aspectos, el agente es el Compuesto 63, el Compuesto 155 o el Compuesto 246.

[0054]En algunos aspectos, los métodos divulgados producen composiciones de células que incluyen células T primarias diseñadas para expresar un receptor recombinante (“células diseñadas”), tales como para uso en terapia celular, que contienen menos células agotadas y/o menos células que muestran marcadores. o fenotipos asociados con el agotamiento en comparación con composiciones de células diseñadas que se producen mediante métodos alternativos, tales como métodos alternativos que no se llevan a cabo en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR. En casos particulares, las células modificadas genéticamente producidas mediante los métodos divulgados contienen un porcentaje aumentado de células T similares a la memoria, tales como células T de memoria de larga duración, en comparación con las células de composiciones de células modificadas genéticamente producidas mediante procesos alternativos, tales como métodos que son no se lleva a cabo en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, por ejemplo, actividad quinasa tal como la actividad quinasa mTORC1 o mTORC2. En ciertos aspectos, las células diseñadas producidas mediante los métodos divulgados están menos diferenciadas que las células diseñadas producidas mediante métodos alternativos. En algunos aspectos, los métodos divulgados producen células diseñadas con expansión, persistencia y/o actividad antitumoral mejorada o mejorada en comparación con células diseñadas que se generan mediante métodos alternativos, tales como métodos alternativos que no se llevan a cabo en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR. Por lo tanto, en algunos aspectos, los métodos divulgados pueden generar composiciones de células diseñadas con eficacia terapéutica mejorada en comparación con composiciones de células diseñadas producidas mediante métodos alternativos, tales como métodos alternativos que no se llevan a cabo en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR. En ciertos casos, los métodos divulgados pueden generar composiciones de células diseñadas con una durabilidad de respuesta clínica mejorada en comparación con composiciones de células diseñadas producidas mediante métodos alternativos. En algunos de estos casos, la comparación con un proceso alternativo es con el mismo proceso que difiere sólo en que el proceso alternativo no se lleva a cabo en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR.

[0055]Si una definición establecida en este documento es contraria o de otro modo inconsistente con una definición establecida en las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones a las que se hace referencia en este documento, prevalecerá la definición establecida en este documento.

[0056]Los títulos de las secciones utilizados en este documento tienen únicamente fines organizativos y no deben interpretarse como limitativos del tema descrito.

I. PROCESO PARA AISLAMIENTO, CULTIVO E INGENIERÍA DE CÉLULAS PARA TERAPIA CELULAR ADOPTIVA

[0057]En el presente documento se describen métodos para generar una composición de salida de células diseñadas, tales como células T CD4+ primarias diseñadas y/o células T CD8+ diseñadas, que expresan una proteína recombinante, por ejemplo, un receptor recombinante tal como un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento se usan en conexión con un proceso que incluye incubar, y/o cultivar células en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, tal como cualquiera descrito en el presente documento, por ejemplo, el Compuesto 63, para generar la composición de salida de células diseñadas. En algunos casos, los métodos se usan en conexión con un proceso que incluye cultivar una composición de células diseñadas, como en condiciones que promueven la expansión y/o proliferación, en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, como cualquiera de los descritos en el presente documento, por ejemplo, el compuesto 63, para generar la composición de salida de células diseñadas. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR inhibe la actividad de una o más quinasas adicionales. En algunos casos, el agente inhibe selectiva y/o específicamente la actividad mTOR. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR es un agente como se describe en el presente documento, tal como en la Sección II. En algunos casos, el agente inhibe la actividad de la quinasa mTOR. En ciertos casos, el agente que inhibe mTORC1 y/o mTORC2. En casos particulares, el agente es el Compuesto 63, el Compuesto 155 o el Compuesto 246. En ciertos casos, el agente es el Compuesto 63.

[0058]En algunos casos, los métodos para generar o producir células diseñadas, por ejemplo, células T CD4+ diseñadas y/o células T CD8+ diseñadas, incluyen uno o más de aislar células de un sujeto, preparar, procesar, incubar en condiciones estimulantes y/o diseñar (p. ej., transducir) las células. En algunos casos, el método incluye etapas de procesamiento llevadas a cabo en un orden en el que: las células de entrada, por ejemplo, células primarias, primero se aíslan, se seleccionan o se separan, de una muestra biológica; las células de entrada se incuban en condiciones estimulantes, se modifican con partículas de vector, por ejemplo, partículas de vector viral, para introducir un polinucleótido recombinante en las células, por ejemplo, mediante transducción o transfección; cultivar las células diseñadas, por ejemplo, células transducidas, para expandir las células; y recolectar, recoger y/o llenar un recipiente con todas o una parte de las células para formular las células en una composición de salida. En algunos casos, las células de la composición resultante generada se reintroducen en el mismo sujeto, antes o después de la criopreservación. En algunos casos, las composiciones resultantes de células modificadas genéticamente son adecuadas para su uso en una terapia, por ejemplo, una terapia celular autóloga.

[0059]En algunos casos, se realizan uno o más pasos o etapas en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, tal como cualquiera descrito en el presente documento, por ejemplo, el Compuesto 63. En algunos casos, uno o más pasos de aislamiento, enriquecimiento, incubación, ingeniería, transducción, transfección, cultivo, recolección, formulación, almacenamiento y/o criocongelación de células de las composiciones celulares se realizan en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR. En determinados casos, las células se cultivan en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR.

[0060] En algunos casos, las células modificadas genéticamente se cultivan en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, como cualquiera de los descritos en el presente documento, por ejemplo, el Compuesto 63, y, en ciertos casos, las células no han sido puestas en contacto, incubadas y/o expuestas a un agente que inhibe la actividad mTOR antes del cultivo. En algunos casos, las células de entrada, las células estimuladas y/o las células diseñadas, antes de cultivar las células para inducir o estimular su expansión o proliferación, no han sido contactadas, expuestas y/o incubadas con un agente que inhibe la actividad de mTOR. En ciertos casos, los pasos de aislar, enriquecer, incubar bajo una o más condiciones activadoras, diseñar, transducir, transfectar, formular, almacenar y/o criocongelar no se realizan en presencia de un inhibidor de mTOR.

[0061] En casos particulares, los métodos descritos se usan en relación con la generación de composiciones de salida de células que expresan un receptor recombinante a partir de una composición de células inicial y/o de entrada. En algunos casos, la composición de células es una composición de células T enriquecidas, células T CD4+ enriquecidas y/o células T CD8+ enriquecidas (en lo sucesivo también denominadas composiciones de células T enriquecidas, composiciones de células T CD4+ enriquecidas y composiciones de células T CD8+ enriquecidas, respectivamente). En ciertos casos, la composición de células T enriquecidas, células T CD4+ enriquecidas o células T CD8+ enriquecidas se cultiva en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR. En algunos casos, se cultiva una composición de células T CD4+ enriquecidas en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, tal como cualquiera descrito en el presente documento, por ejemplo, el Compuesto 63. En ciertos casos, se cultiva una composición de células T CD8+ enriquecidas en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR.

[0062] En algunos casos, los métodos descritos se usan en relación con la incubación de una composición de entrada que incluye células T primarias en condiciones de estimulación. En algunos casos, las condiciones estimulantes son o incluyen la incubación de la composición de entrada en presencia de un reactivo estimulador. En ciertos casos, el reactivo estimulador es o incluye perlas, por ejemplo, perlas paramagnéticas, con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 conjugados en superficie. En casos particulares, las células de la composición de entrada no están expuestas al agente que inhibe la actividad de mTOR antes o durante la incubación. En algunos aspectos, la incubación se realiza con una composición de entrada de células T enriquecidas, por ejemplo, células CD4+ y CD8+. En algunos casos, la composición de entrada es o incluye células T CD4+ enriquecidas. En ciertos casos, la composición de entrada es o incluye células CD8+ enriquecidas. En algunos casos, se incuban por separado composiciones separadas de células T CD4+ enriquecidas y células T CD8+, por ejemplo, de la misma muestra biológica. En algunos casos, las condiciones estimulantes de la incubación pueden ser las mismas para ambas composiciones. En ciertos casos, las condiciones de estimulación pueden ser diferentes. En ciertos casos, la incubación de una o más composiciones de entrada en condiciones estimulantes genera una o más composiciones estimuladas.

[0063] En ciertos casos, se introduce un receptor recombinante en las células de la composición estimulada. En ciertos casos, el receptor recombinante se introduce en la célula transduciendo la composición estimulada con un vector viral. En ciertos casos, el vector viral es o incluye un polinucleótido que codifica el receptor recombinante. En algunos casos, el vector viral es un vector retroviral. En ciertos casos, el vector viral es un vector lentiviral o un vector gammaretroviral. En algunos casos, la composición estimulada incluye o contiene células T enriquecidas, por ejemplo, células CD4+ y CD8+. En algunos casos, la composición estimulada es o incluye células T c D4+ enriquecidas. En casos particulares, la composición estimulada es o incluye células CD8+ enriquecidas. En algunos casos, se diseñan por separado composiciones separadas de células T CD4+ enriquecidas y células T CD8+, por ejemplo, de la misma muestra biológica. En casos particulares, el receptor recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR). En casos particulares, el CAR es un CAR anti-CD19.

[0064] En algunos casos, se cultiva una composición de células modificadas genéticamente, por ejemplo, células transducidas o transfectadas para expresar un receptor recombinante, en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, tal como cualquiera descrito en el presente documento, por ejemplo, el Compuesto 63. En ciertos casos, el cultivo da como resultado la proliferación y/o expansión de las células en la composición, tal como para producir una composición de salida que contiene células T diseñadas. En algunos aspectos, las células de la composición no han sido expuestas, contactadas y/o incubadas con el agente que inhibe la actividad mTOR, como cualquiera de los descritos en el presente documento, por ejemplo, el Compuesto 63, antes del cultivo. En ciertos casos, las células no se incubaron, cultivaron, estimularon, diseñaron, transdujeron y/o transfectaron previamente en presencia del agente inhibidor de mTOR, tal como cualquiera de los descritos en el presente documento, por ejemplo, el Compuesto 63.

[0065] En ciertos casos, la composición de células diseñada es una composición diseñada de células T CD4+ enriquecidas. En casos particulares, la composición diseñada es una composición de células T CD8+ diseñadas. En algunos casos, los métodos descritos se usan en relación con el cultivo por separado de composiciones diseñadas separadas de células T CD4+ enriquecidas y células T CD8+ enriquecidas en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, tal como cualquiera descrito en el presente documento, por ejemplo, el Compuesto 63.

[0066]En algunos casos, el agente inhibe, reduce y/o disminuye una o más actividades asociadas con mTOR. En algunos casos, la actividad es una actividad quinasa. En algunos casos, la actividad es una actividad mTORC1 y/o mTORC2. En algunos casos, el agente se selecciona del grupo que consiste en BEZ235, BGT226, GDC0980, NVPBEZ235, PF-04691502, PI-103, SAR245409, SF1126, VS5584 o XI,765, pirazolopirimidina, Torin l, Torkinib, PP30, Ku. -0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth), OSI-027, DS3078a, AZD8055, rapamicina, temsirolimus, everolimus, deforolimus o AZD8055. En ciertos casos, el agente es el Compuesto 63, el Compuesto 155 o el Compuesto 246. En algunos casos, el agente es el Compuesto 63.

[0067]En ciertos casos, la composición de células es una composición de células T enriquecidas, células T CD4+ enriquecidas y/o células T CD8+ enriquecidas (en lo sucesivo también denominadas composiciones de células T enriquecidas, composiciones de células T CD4+ enriquecidas y composiciones de células T CD8+ enriquecidas, respectivamente). En ciertos casos, la composición de células T enriquecidas, células T CD4+ enriquecidas o células T CD8+ enriquecidas se incuba en condiciones estimulantes en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, tal como cualquiera descrito en el presente documento, por ejemplo, el Compuesto 63. En algunos casos, la composición de células T enriquecidas, células T CD4+ enriquecidas o células T CD8+ enriquecidas se modifica genéticamente, por ejemplo, se transduce o transfecta, para expresar un receptor recombinante en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, tal como cualquiera descrito en el presente documento, por ejemplo, el compuesto 63.

[0068]En algunos casos, los métodos divulgados se usan en asociación con el aislamiento, separación, selección, activación o estimulación, transducción, lavado, suspensión, dilución, concentración y/o formulación de una única composición de células T enriquecidas. En algunos casos, la composición de células T enriquecidas es una composición de células que incluyen células T CD4+ enriquecidas. En ciertos casos, la composición de células T CD4+ enriquecidas contiene al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de células T CD4+. En casos particulares, la composición de células T CD4+ enriquecidas contiene 100% de células T CD4+ o contiene aproximadamente 100 % de células T CD4+. En ciertos casos, la composición de células T enriquecidas incluye o contiene menos del 20 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD8+, y/o no contiene células T CD8+ y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD8+. En algunos casos, las poblaciones de células consisten esencialmente en células T CD4+.

[0069]En algunos casos, la composición de células T enriquecidas es una composición de células T CD8+ enriquecidas. En ciertos casos, la composición de células T CD8+ enriquecidas contiene al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99% o 99,9% de células T CD8+, o contiene aproximadamente 100% de células T CD8+. En ciertos casos, la composición de células T CD8+ enriquecidas incluye o contiene menos del 20 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD4+, y/o no contiene células T CD4+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD4+. En algunos casos, las poblaciones de células consisten esencialmente en células T CD8+.

[0070]En algunos casos, los métodos descritos se usan en relación con la generación de dos o más composiciones de salida separadas de células T enriquecidas. En algunos casos, los métodos divulgados se realizan por separado en dos o más composiciones separadas de células T enriquecidas. En ciertos casos, los métodos se pueden usar en relación con la activación y/o estimulación por separado de dos o más composiciones de células T enriquecidas; diseñar por separado dos o más composiciones de células T enriquecidas; y/o cultivar por separado dos o más composiciones de células T enriquecidas. En ciertos casos, los métodos también se pueden usar en relación con el aislamiento o selección de diferentes células de una muestra biológica para generar una composición de entrada separada de células T enriquecidas, tal como composiciones separadas de células T CD4+ enriquecidas y células T<c>D8+ enriquecidas. En casos particulares, los métodos descritos se pueden usar en relación con la recolección, recolección y/o formulación por separado de composiciones separadas de células T enriquecidas después de que las células T hayan sido incubadas, activadas, estimuladas, diseñadas, transducidas, transfectadas y/o cultivadas. En algunos casos, las dos o más composiciones separadas de células T enriquecidas incluyen una composición de células T CD4+ enriquecidas. En ciertos casos, las dos o más composiciones separadas incluyen células T CD8+. En algunos casos, las dos o más composiciones separadas incluyen una composición de células T CD4+ enriquecidas y una composición de células T CD8+ enriquecidas.

[0071]En casos particulares, las composiciones de células T enriquecidas pueden recolectarse, formularse para crioprotección, criocongelarse y/o almacenarse por debajo de 0 °C, por debajo de -20 °C o por debajo de -70 °C o -80 °C antes de, durante o después de cualquier etapa o paso del proceso para generar composiciones de salida de células T enriquecidas que expresan receptores recombinantes. En algunos casos, las células pueden almacenarse durante un período de tiempo inferior a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días, o un período de tiempo inferior a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas, o durante un período de tiempo de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas, o durante más de 8 semanas. Después del almacenamiento, las composiciones de células T enriquecidas pueden descongelarse y el procesamiento puede reanudarse desde el mismo punto del proceso. En algunos casos, las composiciones de entrada de células T enriquecidas se criocongelan y almacenan antes de su posterior procesamiento, por ejemplo, incubación en condiciones estimulantes. En casos particulares, las composiciones cultivadas y/o formuladas de células T enriquecidas se criocongelan y almacenan antes de administrarse al sujeto, por ejemplo, como una terapia celular autóloga.

[0072]En ciertos casos, se combinan composiciones celulares separadas de células T enriquecidas en una única composición. Por ejemplo, en algunos casos, una composición de células T CD4+ enriquecidas se combina con una composición de células T CD8+ enriquecidas en una única composición de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas. En ciertos casos, las composiciones separadas se originaron, por ejemplo, se aislaron, seleccionaron y/o enriquecieron inicialmente, a partir de la misma muestra biológica, tal como la misma muestra biológica obtenida, recolectada y/o tomada de un único sujeto. En algunos casos, las composiciones separadas se procesan por separado para uno o más pasos o etapas de un proceso para generar composiciones de salida, por ejemplo, un proceso en conexión con los métodos divulgados. En algunos casos, las composiciones separadas se pueden combinar en una única composición antes, durante o después de cualquier paso o etapa del proceso para generar composiciones de salida. Por lo tanto, en algunos casos, composiciones separadas de entrada, estimuladas, diseñadas, cultivadas, formuladas y/o recolectadas de células T enriquecidas de la misma muestra biológica se combinan en una sola composición y, en ciertos casos, se procesan adicionalmente como una sola composición. En ciertos casos, se combinan composiciones de salida separadas de células enriquecidas en una única composición de salida antes de administrar las células a un sujeto.

[0073]En ciertos casos, en cualquier etapa o paso del proceso, se puede muestrear o recolectar una porción de las células, por ejemplo, se pueden tomar células de la composición de células T enriquecidas mientras la composición permanece en el sistema cerrado, tal como durante la aislamiento, incubación, ingeniería, cultivo y/o formulación. En ciertos casos, dichas células pueden analizarse en busca de creadores, características o características que incluyen, entre otras, viabilidad, apoptosis, activación, estimulación, crecimiento y/o agotamiento. En algunos casos, las células se toman muestras o se recolectan mediante un proceso automatizado. mientras que la composición de células T enriquecidas permanece en el sistema cerrado. En algunos casos, el análisis de las células muestreadas o recolectadas está automatizado. En casos particulares, el análisis se realiza en un sistema cerrado en condiciones estériles.

[0074]También se describen células y composiciones preparadas mediante los métodos, incluidas composiciones y formulaciones farmacéuticas, y kits, sistemas y dispositivos para llevar a cabo los métodos. También se describen métodos para el uso de las células y composiciones preparadas mediante los métodos, incluidos métodos terapéuticos, tales como métodos para terapia celular adoptiva, y composiciones farmacéuticas para administración a sujetos.

A. Muestras y preparaciones celulares

[0075]En casos particulares, los métodos descritos se usan en relación con el aislamiento, selección y/o enriquecimiento de células de una muestra biológica para generar una o más composiciones de entrada de células enriquecidas, por ejemplo, células T. En algunos casos, los métodos divulgados incluyen el aislamiento de células o composiciones de las mismas a partir de muestras biológicas, tales como las obtenidas o derivadas de un sujeto, tal como uno que tiene una enfermedad o afección particular o que necesita una terapia celular o a la que se le aplica terapia celular. En algunos aspectos, el sujeto es un ser humano, tal como un sujeto que es un paciente que necesita una intervención terapéutica particular, tal como la terapia celular adoptiva para la cual se están aislando, procesando y/o diseñando células. Por consiguiente, las células en algunos casos son células primarias, por ejemplo, células humanas primarias. Las muestras incluyen tejido, líquido y otras muestras tomadas directamente del sujeto. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra que se procesa. Las muestras biológicas incluyen, entre otras, fluidos corporales, tales como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos, incluidas muestras procesadas derivadas de los mismos.

[0076]En algunos aspectos, la muestra es sangre o una muestra derivada de sangre, o se deriva de un producto de aféresis o leucoféresis. Las muestras ejemplares incluyen sangre entera, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, leucemia, linfoma, ganglios linfáticos, tejido linfoide asociado al intestino, tejido linfoide asociado a la mucosa, bazo, otros tejidos linfoides, hígado, pulmón, estómago, intestino, colon, riñón, páncreas, mama, hueso, próstata, cuello uterino, testículos, ovarios, amígdalas u otros órganos, y/o células derivadas de los mismos. Las muestras incluyen, en el contexto de la terapia celular, por ejemplo, terapia celular adoptiva, muestras de fuentes autólogas y alogénicas.

[0077]En algunos ejemplos, las células de la sangre circulante de un sujeto se obtienen, por ejemplo, mediante aféresis o leucoféresis. Las muestras, en algunos aspectos, contienen linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y/o plaquetas, y en algunos aspectos contienen células distintas de los glóbulos rojos y las plaquetas.

[0078]En algunos casos, las células sanguíneas extraídas del sujeto se lavan, por ejemplo, para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para etapas de procesamiento posteriores. En algunos casos, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunos casos, la solución de lavado carece de calcio y/o magnesio y/o muchos o todos los cationes divalentes. En algunos aspectos, una etapa de lavado se realiza en una centrífuga de “flujo continuo” semiautomática (p. ej., el procesador de células Cobe 2991, Baxter) según las instrucciones del fabricante. En algunos aspectos, una etapa de lavado se logra mediante filtración de flujo tangencial (TFF) según las instrucciones del fabricante. En algunos casos, las células se resuspenden en una variedad de tampones biocompatibles después del lavado, tales como, por ejemplo, PBS libre de Ca + /Mg +. En ciertos casos, se eliminan los componentes de una muestra de células sanguíneas y las células se resuspenden directamente en medios de cultivo.

[0079]En algunos casos, los métodos de preparación incluyen etapas para congelar, por ejemplo, criopreservación, las células, ya sea antes o después del aislamiento, selección y/o enriquecimiento y/o incubación para transducción e ingeniería, y/o después del cultivo y/o recolección de las células diseñadas. En algunos casos, el paso de congelación y posterior descongelación elimina los granulocitos y, hasta cierto punto, los monocitos de la población celular. En algunos casos, las células se suspenden en una solución de congelación, por ejemplo, después de una etapa de lavado para eliminar el plasma y las plaquetas. En algunos aspectos se puede utilizar cualquiera de una variedad de soluciones y parámetros de congelación conocidos. En algunos casos, las células se congelan, por ejemplo, se criocongelan o se criopreservan, en medios y/o solución con una concentración final de o de aproximadamente 12,5%, 12,0%, 11,5%, 11,0 %, 10,5 %, 10,0 %, 9,5 %, 9,0 %, 8,5 %, 8,0 %, 7,5 %, 7,0 %, 6,5 %, 6,0 %, 5,5 % o 5,0 % de DMSO, o entre 1 % y 15 %, entre 6 % y 12 %, entre 5 % y 10 %, o entre 6 % y 8 % de DMSO. En casos particulares, las células se congelan, por ejemplo, se criocongelan o se criopreservan, en medios y/o solución con una concentración final de o de aproximadamente 5,0 %, 4,5 %, 4,0 %, 3,5 %, 3,0 %, 2,5 %, 2,0 %, 1,5 %, 1,25 %, 1,0 %, 0,75 %, 0,5 % o 0,25 % HSA, o entre 0,1 % y -5 %, entre 0,25 % y 4 %, entre 0,5 % y 2 %, o entre 1 % y 2 % HSA. Un ejemplo implica el uso de PBS que contiene 20 % de DMSO y 8 % de albúmina sérica humana (HSA), u otros medios de congelación de células adecuados. A continuación, se diluye 1:1 con medio para que la concentración final de DMSO y HSA sea del 10 % y el 4 %, respectivamente. A continuación, las células generalmente se congelan hasta aproximadamente -80 °C a una velocidad de aproximadamente 1 °C por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido.

[0080]En algunos casos, el aislamiento de las células o poblaciones incluye una o más etapas de preparación y/o separación celular sin afinidad. En algunos ejemplos, las células se lavan, centrifugan y/o incuban en presencia de uno o más reactivos, por ejemplo, para eliminar componentes no deseados, enriquecer los componentes deseados, lisar o eliminar células sensibles a reactivos particulares. En algunos ejemplos, las células se separan basándose en una o más propiedades, tales como densidad, propiedades adherentes, tamaño, sensibilidad y/o resistencia a componentes particulares. En algunos casos, los métodos incluyen métodos de separación celular basados en la densidad, como la preparación de glóbulos blancos a partir de sangre periférica mediante la lisis de los glóbulos rojos y la centrifugación a través de un gradiente de Percoll o Ficoll.

[0081]En algunos casos, al menos una parte del paso de selección incluye la incubación de células con un reactivo de selección. La incubación con un reactivo o reactivos de selección, por ejemplo, como parte de métodos de selección que se pueden realizar usando uno o más reactivos de selección para la selección de uno o más tipos de células diferentes basándose en la expresión o presencia en o sobre la célula de una o más moléculas específicas, tales como marcadores de superficie, por ejemplo, proteínas de superficie, marcadores intracelulares o ácido nucleico. En algunos casos, se puede utilizar cualquier método conocido que utilice un reactivo de selección o reactivos para la separación basados en dichos marcadores. En algunos casos, el reactivo o reactivos de selección dan como resultado una separación basada en afinidad o inmunoafinidad. Por ejemplo, la selección en algunos aspectos incluye incubación con un reactivo o reactivos para la separación de células y poblaciones de células basándose en la expresión de las células o el nivel de expresión de uno o más marcadores, típicamente marcadores de superficie celular, por ejemplo, mediante incubación con un anticuerpo. o pareja de unión que se une específicamente a dichos marcadores, seguido generalmente de etapas de lavado y separación de las células que se han unido al anticuerpo o pareja de unión, de aquellas células que no se han unido al anticuerpo o pareja de unión.

[0082]En algunos aspectos de tales procesos, se mezcla un volumen de células con una cantidad de un reactivo de selección basado en afinidad deseado. La selección basada en inmunoafinidad se puede llevar a cabo usando cualquier sistema o método que dé como resultado una interacción energética favorable entre las células que se están separando y la molécula que se une específicamente al marcador en la célula, por ejemplo, el anticuerpo u otro compañero de unión en la superficie sólida, por ejemplo, partícula. En algunos casos, los métodos se llevan a cabo usando partículas tales como perlas, por ejemplo, perlas magnéticas, que están recubiertas con un agente de selección (p. ej., anticuerpo) específico para el marcador de las células. Las partículas (p. ej., perlas) se pueden incubar o mezclar con células en un recipiente, tal como un tubo o bolsa, mientras se agita o se mezcla, con una relación constante entre densidad celular y partícula (p. ej., perlas) para ayudar a promover interacciones favorecidas por energía. En otros casos, los métodos incluyen la selección de células en las que toda o una parte de la selección se lleva a cabo en la cavidad interna de una cámara centrífuga, por ejemplo, bajo rotación centrífuga. En algunos casos, la incubación de células con reactivos de selección, tales como reactivos de selección basados en inmunoafinidad, se realiza en una cámara centrífuga. En ciertos casos, el aislamiento o separación se lleva a cabo utilizando un sistema, dispositivo o aparato descrito en la solicitud de patente internacional, número de publicación W02009/072003 o US 20110003380 A1. En un ejemplo, el sistema es un sistema como se describe en la Publicación Internacional N° WO2016/073602.

[0083]En algunos casos, al realizar dichas etapas de selección o partes de las mismas (p. ej., incubación con partículas recubiertas de anticuerpos, por ejemplo, perlas magnéticas) en la cavidad de una cámara centrífuga, el usuario puede controlar ciertos parámetros, tales como el volumen de diversas soluciones, adición de solución durante el procesamiento y cronograma del mismo, lo que puede proporcionar ventajas en comparación con otros métodos disponibles. Por ejemplo, la capacidad de disminuir el volumen de líquido en la cavidad durante la incubación puede aumentar la concentración de las partículas (p. ej., reactivo de perlas) utilizadas en la selección y, por tanto, el potencial químico de la solución, sin afectar el número total de células en la cavidad. Esto a su vez puede mejorar las interacciones por pares entre las células que se procesan y las partículas utilizadas para la selección. En algunos casos, llevar a cabo la etapa de incubación en la cámara, por ejemplo, cuando está asociada con los sistemas, circuitos y control como se describe en el presente documento, permite al usuario efectuar la agitación de la solución en los momentos deseados durante la incubación, lo que también puede mejorar la interacción.

[0084]En algunos casos, al menos una parte del paso de selección se realiza en una cámara centrífuga, que incluye la incubación de células con un reactivo de selección. En algunos aspectos de dichos procesos, se mezcla un volumen de células con una cantidad de un reactivo de selección basado en afinidad deseada que es mucho menor que la que se emplea normalmente cuando se realizan selecciones similares en un tubo o recipiente para la selección del mismo número de células y/o volumen de células según las instrucciones del fabricante. En algunos casos, una cantidad de reactivo o reactivos de selección que no sea más del 5 %, no más del 10 %, no más del 15 %, no más del 20 %, no más del 25 %, no más del 50 %, no más del 60 %, no más del 70 % o no más del 80 % de la cantidad del mismo(s) reactivo(s) de selección empleado(s) para la selección de células en un tubo o recipiente de incubación para el mismo número de células y/o el Se emplea el mismo volumen de células según las instrucciones del fabricante.

[0085]En algunos casos, para la selección, por ejemplo, selección de las células basada en inmunoafinidad, las células se incuban en la cavidad de la cámara en una composición que también contiene el tampón de selección con un reactivo de selección, tal como una molécula que se une específicamente a un marcador de superficie en una célula que se desea enriquecer y/o agotar, pero no en otras células en la composición, tal como un anticuerpo, que opcionalmente está acoplado a un armazón tal como un polímero o superficie, por ejemplo, una perla, por ejemplo, perla magnética, tal como perlas magnéticas acopladas a anticuerpos monoclonales específicos para CD4 y CD8. En algunos casos, como se describe, el reactivo de selección se añade a las células en la cavidad de la cámara en una cantidad que es sustancialmente menor (p. ej., no más del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 % de la cantidad) en comparación con la cantidad del reactivo de selección que normalmente se usa o sería necesario para lograr aproximadamente la misma o similar eficiencia de selección del mismo número de células o el mismo volumen de células cuando la selección se realiza en un tubo con agitación o rotación. En algunos casos, la incubación se realiza con la adición de un tampón de selección a las células y reactivo de selección para lograr un volumen objetivo con incubación del reactivo de, por ejemplo, 10 ml a 200 ml, tal como al menos o aproximadamente al menos 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml, 100 ml, 150 ml o 200 ml. En algunos casos, el tampón de selección y el reactivo de selección se mezclan previamente antes de agregarlos a las células. En algunos casos, el tampón de selección y el reactivo de selección se añaden por separado a las células. En algunos casos, la incubación de selección se lleva a cabo con condiciones de mezcla suave periódicas, lo que puede ayudar a promover interacciones energéticamente favorecidas y, por lo tanto, permitir el uso de menos reactivo de selección general mientras se logra una alta eficiencia de selección.

[0086]En algunos casos, la duración total de la incubación con el reactivo de selección es de o desde aproximadamente 5 minutos a 6 horas, tal como de 30 minutos a 3 horas, por ejemplo, al menos o aproximadamente al menos 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos o 180 minutos.

[0087]En algunos casos, la incubación generalmente se lleva a cabo en condiciones de mezcla, tales como en presencia de hilado, generalmente a una fuerza o velocidad relativamente baja, tal como una velocidad inferior a la utilizada para sedimentar las células, tal como desde o desde aproximadamente 600 rpm a 1700 rpm (p. ej., a o alrededor de o al menos 600 rpm, 1000 rpm, o 1500 rpm o 1700 rpm), tal como a un RCF en la muestra o pared de la cámara u otro recipiente de o desde aproximadamente 80 g a 100 g (p. ej., en o alrededor de o al menos 80 g, 85 g, 90 g, 95 g o 100 g). En algunos casos, el giro se lleva a cabo utilizando intervalos repetidos de giro a una velocidad tan baja seguidos de un período de descanso, como un giro y/o descanso durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 segundos, como un giro de aproximadamente 1 o 2 segundos seguido de un descanso de aproximadamente 5, 6, 7 u 8 segundos.

[0088]En algunos casos, dicho proceso se lleva a cabo dentro del sistema completamente cerrado al que la cámara es integral. En algunos casos, este proceso (y en algunos aspectos también uno o más pasos adicionales, tal como un paso de lavado previo que lava una muestra que contiene las células, tal como una muestra de aféresis) se lleva a cabo de manera automatizada, de manera que las células, El reactivo y otros componentes se introducen y se expulsan de la cámara en los momentos apropiados y se realiza la centrifugación, para completar el paso de lavado y unión en un único sistema cerrado utilizando un programa automatizado.

[0089]En algunos casos, después de la incubación y/o mezcla de las células y el reactivo y/o reactivos de selección, las células incubadas se someten a una separación para seleccionar células basándose en la presencia o ausencia del reactivo o reactivos particulares. En algunos casos, la separación se realiza en el mismo sistema cerrado en el que se realizó la incubación de células con el reactivo de selección. En algunos casos, después de la incubación con los reactivos de selección, las células incubadas, incluidas las células a las que se ha unido el reactivo de selección, se transfieren a un sistema para la separación de las células basada en inmunoafinidad. En algunos casos, el sistema para la separación basada en inmunoafinidad es o contiene una columna de separación magnética.

[0090]Tales etapas de separación pueden basarse en una selección positiva, en la que las células que se han unido a los reactivos, por ejemplo, anticuerpo o compañero de unión, se retienen para su uso posterior, y/o selección negativa, en la que las células que no se han unido al reactivo, por ejemplo, anticuerpo o compañero de unión, se retienen. En algunos ejemplos, ambas fracciones se conservan para su uso posterior. En algunos aspectos, la selección negativa puede ser particularmente útil cuando no hay anticuerpo disponible que identifique específicamente un tipo de célula en una población heterogénea, de modo que la separación se lleva a cabo mejor basándose en marcadores expresados por células distintas a la población deseada.

[0091] En algunos casos, las etapas del proceso incluyen además la selección negativa y/o positiva de las células incubadas, tal como usar un sistema o aparato que pueda realizar una selección basada en afinidad. En algunos casos, el aislamiento se lleva a cabo mediante enriquecimiento de una población celular particular mediante selección positiva, o agotamiento de una población celular particular, mediante selección negativa. En algunos casos, la selección positiva o negativa se logra incubando células con uno o más anticuerpos u otro agente de unión que se une específicamente a uno o más marcadores de superficie expresados o (marcador+) expresados en un nivel relativamente más alto (marcador alto) en las células seleccionadas positiva o negativamente, respectivamente.

[0092] No es necesario que la separación dé como resultado un enriquecimiento o eliminación del 100% de una población celular particular o de células que expresan un marcador particular. Por ejemplo, la selección positiva o el enriquecimiento de células de un tipo particular, tales como aquellas que expresan un marcador, se refiere a aumentar el número o porcentaje de tales células, pero no necesariamente resulta en una ausencia completa de células que no expresan el marcador. Asimismo, la selección negativa, la eliminación o el agotamiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a la disminución del número o porcentaje de dichas células, pero no tiene por qué dar como resultado una eliminación completa de todas esas células.

[0093] En algunos ejemplos, se llevan a cabo múltiples rondas de etapas de separación, donde la fracción seleccionada positiva o negativamente de una etapa se somete a otra etapa de separación, tal como una selección positiva o negativa posterior. En algunos ejemplos, un único paso de separación puede agotar las células que expresan múltiples marcadores simultáneamente, como incubando células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión, cada uno específico para un marcador objetivo de selección negativa. Asimismo, se pueden seleccionar positivamente múltiples tipos de células simultáneamente incubando células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión expresados en los diversos tipos de células.

[0094] Por ejemplo, en algunos aspectos, subpoblaciones específicas de células T, tales como células positivas o que expresan altos niveles de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, c D4+, CD8+, CD45RA+ y/o CD45RO+. Las células T, se aíslan mediante técnicas de selección positiva o negativa. En algunos casos, dichas células se seleccionan mediante incubación con uno o más anticuerpos o compañeros de unión que se unen específicamente a dichos marcadores. En algunos casos, el anticuerpo o compañero de unión se puede conjugar, tal como directa o indirectamente, a un soporte sólido o matriz para efectuar la selección, tal como una perla magnética o una perla paramagnética. Por ejemplo, las células T CD3+, CD28+ se pueden seleccionar positivamente usando perlas magnéticas conjugadas con CD3/CD28 (p. ej., expansor de células T CD3/CD28 DYNABEa Ds® M-450 y/o perlas ExpACT®).

[0095] En algunos casos, las células T se separan de una muestra de PBMC mediante selección negativa de marcadores expresados en células no T, como células B, monocitos u otros glóbulos blancos, como CD14. En algunos aspectos, se usa una etapa de selección CD4+ o CD8+ para separar las células T auxiliares CD4+ y las citotóxicas CD8+. Dichas poblaciones CD4+ y CD8+ pueden clasificarse además en subpoblaciones mediante selección positiva o negativa de marcadores expresados o expresados en un grado relativamente mayor en una o más subpoblaciones de células T ingenuas, de memoria y/o efectoras.

[0096] En algunos casos, las células T CD8+ se enriquecen aún más o se agotan en células madre de memoria central, de memoria efectora y/o de memoria central ingenuas, como por ejemplo mediante selección positiva o negativa basada en antígenos de superficie asociados con la subpoblación respectiva. En algunos casos, el enriquecimiento de células T de memoria central (MTC) se lleva a cabo para aumentar la eficacia, como por ejemplo para mejorar la supervivencia, la expansión y/o el injerto a largo plazo después de la administración, lo que en algunos aspectos es particularmente sólido en dichas subpoblaciones. Véase Terakura et al., (2012) Blood. 1:72-82; Wang y cols. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. En algunos casos, la combinación de células T CD8+ enriquecidas con MTC y células T CD4+ mejora aún más la eficacia.

[0097] En algunos casos, las células T de memoria están presentes en los subconjuntos CD62L+ y CD62L- de linfocitos CD8+ de sangre periférica. Las PBMC se pueden enriquecer o agotar en fracciones CD62L-CD8+ y/o CD62L+CD8+, tal como usando anticuerpos anti-CD8 y anti-CD62L.

[0098] En algunos casos, el enriquecimiento de células T de memoria central (MTC) se basa en una expresión superficial alta o positiva de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 y/o CD 127; en algunos aspectos, se basa en la selección negativa de células que expresan o que expresan altamente CD45RA y/o granzima B. En algunos aspectos, el aislamiento de una población CD8+ enriquecida en células de TCM se lleva a cabo mediante el agotamiento de las células que expresan CD4, CD14, CD45RA, y selección positiva o enriquecimiento para células que expresan CD62L. En un aspecto, el enriquecimiento para células T de memoria central (TCM) se lleva a cabo comenzando con una fracción negativa de células seleccionadas en base a la expresión de CD4, que se somete a una selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA, y una selección positiva basada en CD62L. Dichas selecciones en algunos aspectos se llevan a cabo simultáneamente y en otros aspectos se llevan a cabo secuencialmente, en cualquier orden. En algunos aspectos, el mismo paso de selección basado en la expresión de CD4 usado en la preparación de la población o subpoblación de células T CD8+, también se usa para generar la población o subpoblación de células T CD4+, de modo que tanto las fracciones positivas como las negativas de la separación basada en CD4 se retienen y utilizan en pasos posteriores de los métodos, opcionalmente después de uno o más pasos de selección positivos o negativos adicionales. En algunos casos, la selección de la población de células T CD4+ y la selección de la población de células T CD8+ se llevan a cabo simultáneamente. En algunos casos, la población de células T CD4+ y la selección de la población de células T CD8+ se llevan a cabo secuencialmente, en cualquier orden. En algunos casos, los métodos para seleccionar células pueden incluir aquellos descritos en la Solicitud de EE. UU. publicada. N° US20170037369. En algunos casos, la población de células T CD4+ seleccionada y la población de células T CD8+ seleccionadas pueden combinarse después de la selección. En algunos aspectos, la población de células T CD4+ seleccionada y la población de células T CD8+ seleccionadas pueden combinarse en una bolsa de biorreactor como se describe en el presente documento.

[0099]En casos particulares, una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de PBMC u otros glóbulos blancos, se somete a selección de células T CD4+, donde se retienen tanto la fracción negativa como la positiva. En ciertos casos, las células T CD8+ se seleccionan de la fracción negativa. En algunos casos, una muestra biológica se somete a selección de células T CD8+, donde se retienen tanto la fracción negativa como la positiva. En ciertos casos, las células T CD4+ se seleccionan de la fracción negativa.

[0100]En un ejemplo particular, una muestra de PBMC u otra muestra de glóbulos blancos se somete a selección de células T CD4+, donde se retienen tanto la fracción negativa como la positiva. A continuación, la fracción negativa se somete a selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA o CD19, y selección positiva basada en un marcador característico de las células T de memoria central, tales como CD62L o CCR7, donde las selecciones positiva y negativa se llevan a cabo en cualquier orden.

[0101]Las células T colaboradoras CD4+ pueden clasificarse en células ingenuas, de memoria central y efectoras mediante la identificación de poblaciones celulares que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ se pueden obtener mediante métodos estándar. En algunos casos, los linfocitos T CD4+ ingenuos son células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ o CD4+. En algunos casos, las células T CD4+ de memoria central son CD62L+ y CD45RO+. En algunos casos, las células T CD4+ efectoras son CD62L- y CD45RO-.

[0102]En un ejemplo, para enriquecer células T CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales normalmente incluye anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En algunos casos, el anticuerpo o compañero de unión está unido a un soporte o matriz sólido, tal como una perla magnética o una perla paramagnética, para permitir la separación de células para una selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, en algunos casos, las células y las poblaciones de células se separan o aíslan usando técnicas de separación inmunomagnética (o magnética de afinidad) (revisadas en Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, páginas 17-25 Editado por: SA Brooks y U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, Nueva Jersey).

[0103]En algunos aspectos, la muestra incubada o composición de células que se van a separar se incuba con un reactivo de selección que contiene material pequeño, magnetizable o magnéticamente sensible, tal como partículas o micropartículas magnéticamente sensibles, tales como perlas paramagnéticas (p. ej., como Dynalbeads o MACS® beads). El material magnéticamente sensible, por ejemplo, una partícula, generalmente está unido directa o indirectamente a un compañero de unión, por ejemplo, un anticuerpo, que se une específicamente a una molécula, por ejemplo, un marcador de superficie, presente en la célula, células o población de células que se desea separar, por ejemplo, que se desea seleccionar negativa o positivamente.

[0104]En algunos casos, la partícula o perla magnética comprende un material magnéticamente sensible unido a un miembro de unión específico, tal como un anticuerpo u otro compañero de unión. Se conocen muchos materiales magnéticamente sensibles para uso en métodos de separación magnética, por ejemplo, los descritos en Molday, Patente de EE. UU. 4.452.773, y en la memoria de patente europea EP 452342 B. Partículas de tamaño coloidal, tales como las descritas en Owen, Patente de EE. UU. 4.795.698, y Liberti et al., Patente de EE. UU. También se puede utilizar la patente US 5.200.084.

[0105]La incubación generalmente se lleva a cabo en condiciones en las que los anticuerpos o compañeros de unión, o moléculas, tales como anticuerpos secundarios u otros reactivos, que se unen específicamente a dichos anticuerpos o compañeros de unión, que están unidos a la partícula o perla magnética, se unen específicamente a moléculas de la superficie de la célula si están presentes en las células dentro de la muestra.

[0106]En ciertos casos, las partículas magnéticamente sensibles están recubiertas con anticuerpos primarios u otros compañeros de unión, anticuerpos secundarios, lectinas, enzimas o estreptavidina. En ciertos casos, las partículas magnéticas se unen a las células mediante un recubrimiento de anticuerpos primarios específicos para uno o más marcadores. En ciertos casos, las células, en lugar de las perlas, se marcan con un anticuerpo primario o un compañero de unión, y luego se añaden partículas magnéticas recubiertas con un anticuerpo secundario específico del tipo celular u otro compañero de unión (p. ej., estreptavidina). En determinados casos, se utilizan partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina junto con anticuerpos primarios o secundarios biotinilados.

[0107]En algunos aspectos, la separación se logra en un procedimiento en el que la muestra se coloca en un campo magnético, y aquellas células que tienen partículas magnéticamente sensibles o magnetizables unidas a ellas serán atraídas por el imán y separadas de las células no marcadas. Para la selección positiva, se retienen las células que son atraídas por el imán; para la selección negativa, se retienen las células que no se sienten atraídas (células no marcadas). En algunos aspectos, se realiza una combinación de selección positiva y negativa durante el mismo paso de selección, donde las fracciones positivas y negativas se retienen y se procesan adicionalmente o se someten a pasos de separación adicionales.

[0108]En algunos casos, la selección basada en afinidad se realiza mediante clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). La clasificación de células activadas magnéticamente (MACS), por ejemplo, los sistemas CliniMACS, son capaces de realizar una selección de alta pureza de células que tienen partículas magnetizadas unidas a ellas. En ciertos casos, MACS funciona en un modo en el que las especies objetivo y no objetivo se eluyen secuencialmente después de la aplicación del campo magnético externo. Es decir, las células adheridas a las partículas magnetizadas se mantienen en su lugar mientras las especies no adheridas se eluyen. A continuación, una vez completado este primer paso de elución, las especies que quedaron atrapadas en el campo magnético y a las que se les impidió ser eluidas se liberan de alguna manera de manera que puedan ser eluidas y recuperadas. En ciertos casos, las células no objetivo se marcan y se agotan de la población heterogénea de células.

[0109]En algunos casos, las partículas magnéticamente sensibles se dejan adheridas a las células que posteriormente serán incubadas, cultivadas y/o diseñadas; en algunos aspectos, las partículas se dejan adheridas a las células para su administración a un paciente. En algunos casos, las partículas magnetizables o magnéticamente sensibles se eliminan de las células. Se conocen métodos para eliminar partículas magnetizables de las células e incluyen, por ejemplo, el uso de anticuerpos no marcados competitivos, partículas magnetizables o anticuerpos conjugados con conectores escindibles, etc. En algunos casos, las partículas magnetizables son biodegradables.

[0110]En algunos casos, el aislamiento y/o selección da como resultado una o más composiciones de entrada de células T enriquecidas, por ejemplo, células T CD3+, células T CD4+ y/o células T CD8+. En algunos casos, se aíslan, seleccionan, enriquecen u obtienen dos o más composiciones de entrada separadas a partir de una única muestra biológica. En algunos casos, se aíslan, seleccionan, enriquecen y/u obtienen composiciones de entrada separadas a partir de muestras biológicas separadas recolectadas, tomadas y/u obtenidas del mismo sujeto.

[0111]En ciertos casos, la una o más composiciones de entrada es o incluye una composición de células T enriquecidas que incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100% de células T CD3+. En casos particulares, la composición de entrada de las células T enriquecidas consiste esencialmente en células T CD3+.

[0112]En ciertos casos, la una o más composiciones de entrada es o incluye una composición de células T CD4+ enriquecidas que incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD4+. En ciertos casos, la composición de entrada de células T CD4+ incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD8+, y/o no contiene células T CD8+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD8+. En algunos casos, la composición de las células T enriquecidas consiste esencialmente en células T CD4+.

[0113]En ciertos casos, la una o más composiciones es o incluye una composición de células T CD8+ que es o incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD8+. En ciertos casos, la composición de células T CD8+ contiene menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD4+, y/o no contiene células T CD4+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD4+. En algunos casos, la composición de las células T enriquecidas consiste esencialmente en células T CD8+.

[0114]En algunos casos, la una o más composiciones de entrada de células T enriquecidas se congelan, por ejemplo, se criopreservan y/o se criocongelan, después del aislamiento, selección y/o enriquecimiento. En algunos casos, la una o más composiciones de entrada de congelados, por ejemplo, criopreservados y/o criocongelados, antes de cualquier etapa de incubación, activación, estimulación, ingeniería, transducción, transfección, cultivo, expansión, recolección y/o formulación de la composición de células. En casos particulares, la una o más composiciones de entrada criocongeladas se almacenan, por ejemplo, a o aproximadamente -80 °C.

B. Activación y estimulación de células

[0115]En algunos casos, los métodos descritos se utilizan en relación con la incubación de células en condiciones estimulantes. En algunos casos, las condiciones estimulantes incluyen condiciones que activan o estimulan y/o son capaces de activar o estimular una señal en la célula, por ejemplo, una célula T CD4+, tal como una señal generada a partir de un TCR y/o un correceptor. En algunos casos, las condiciones estimulantes incluyen una o más etapas de cultivo, incubación, activación, propagación de las células con y/o en presencia de un reactivo estimulador, por ejemplo, un reactivo que activa o estimula, y/o es capaz de de activar o estimular una señal en la célula. En algunos casos, el reactivo estimulador estimula y/o activa un TCR y/o un correceptor. En casos particulares, el reactivo estimulador es un reactivo descrito en la Sección I-B-1.

[0116]En ciertos casos, se incuban una o más composiciones de células T enriquecidas en condiciones estimulantes antes de modificar genéticamente las células, por ejemplo, transfectar y/o transducir la célula tal como mediante una técnica proporcionada en la Sección I-C. En casos particulares, una o más composiciones de células T enriquecidas se incuban en condiciones estimulantes después de que una o más composiciones se hayan aislado, seleccionado, enriquecido u obtenido a partir de una muestra biológica. En casos particulares, una o más composiciones son composiciones de entrada. En casos particulares, la una o más composiciones de entrada se han criocongelado y almacenado previamente, y se descongelan antes de la incubación.

[0117]En ciertos casos, la una o más composiciones de células T enriquecidas son o incluyen dos composiciones separadas, por ejemplo, composiciones de entrada separadas, de células T enriquecidas. En casos particulares, se incuban por separado dos composiciones separadas de células T enriquecidas, por ejemplo, dos composiciones separadas de células T enriquecidas seleccionadas, aisladas y/o enriquecidas a partir de la misma muestra biológica, en condiciones estimulantes. En ciertos casos, las dos composiciones separadas incluyen una composición de células T CD4+ enriquecidas. En casos particulares, las dos composiciones separadas incluyen una composición de células T CD8+ enriquecidas. En algunos casos, se incuban por separado dos composiciones separadas de células T CD4+ enriquecidas y células T CD8+ enriquecidas en condiciones estimulantes. En algunos casos, se incuba una única composición de células T enriquecidas en condiciones estimulantes. En ciertos casos, la composición única es una composición de células T CD4+ enriquecidas. En algunos casos, la composición única es una composición de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas que se han combinado a partir de composiciones separadas antes de la incubación.

[0118]En algunos casos, la composición de células T CD4+ enriquecidas que se incuba en condiciones estimulantes incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD4+. En ciertos casos, la composición de células T CD4+ enriquecidas que se incuba en condiciones estimulantes incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD8+, y/o no contiene células T CD8+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD8+.

[0119]En algunos casos, la composición de células T CD8+ enriquecidas que se incuba en condiciones estimulantes incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD8+. En ciertos casos, la composición de células T CD8+ enriquecidas que se incuba en condiciones estimulantes incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD4+, y/o no contiene células T CD4+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD4+.

[0120]En algunos casos, se combinan composiciones separadas de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas en una única composición y se incuban en condiciones estimulantes. En ciertos casos, composiciones estimuladas separadas de células T CD4+ enriquecidas y CD8+ enriquecidas se combinan en una única composición después de que se haya realizado y/o completado la incubación.

[0121]En ciertos casos, se incuban una o más composiciones de células T enriquecidas en condiciones estimulantes antes de modificar genéticamente las células, por ejemplo, transfectar y/o transducir la célula tal como mediante una técnica proporcionada en la Sección I-C. En casos particulares, una o más composiciones de células T enriquecidas se incuban en condiciones estimulantes después de que una o más composiciones se hayan aislado, seleccionado, enriquecido u obtenido a partir de una muestra biológica. En casos particulares, una o más composiciones son composiciones de entrada. En algunos casos, la una o más composiciones de entrada se han criocongelado y almacenado previamente, y se descongelan antes de la incubación.

[0122]En algunos casos, la incubación en condiciones estimulantes puede incluir cultivo, estimulación, activación, propagación, incluso mediante incubación en presencia de condiciones estimulantes, por ejemplo, condiciones diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de células. en la población, para imitar la exposición al antígeno y/o preparar las células para la ingeniería genética, tal como para la introducción de un receptor de antígeno recombinante. En casos particulares, las condiciones estimulantes pueden incluir uno o más de medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones y/o factores estimuladores, tales como citoquinas, quimiocinas, antígenos, compañeros de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes y cualquier otro agente diseñado para activar las células.

[0123]En algunos aspectos, la estimulación y/o incubación en condiciones estimulantes se lleva a cabo de acuerdo con técnicas tales como las descritas en la Patente de EE. UU. N° 6.040.177 de Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82, y/o Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.

[0124]En algunos casos, las células, por ejemplo, células T, composiciones de células y/o poblaciones celulares, tales como células T CD4+ y CD8+ o composiciones, poblaciones o subpoblaciones de las mismas, se expanden añadiendo a las células alimentadoras de la composición iniciadora del cultivo, tales como células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que no se dividen, (p. ej., de modo que la población de células resultante contenga al menos aproximadamente 5, 10, 20 o 40 o más células alimentadoras de PBMC por cada linfocito T en la población inicial a ampliar); e incubar el cultivo (p. ej., durante un tiempo suficiente para ampliar el número de células T). En algunos aspectos, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras de PBMC irradiadas con rayos gamma. En algunos casos, las PBMC se irradian con rayos gamma en el rango de aproximadamente 3000 a 3600 rads para evitar la división celular. En algunos aspectos, las células alimentadoras se añaden al medio de cultivo antes de la adición de las poblaciones de células T.

[0125]En algunos casos, las condiciones estimulantes incluyen una temperatura adecuada para el crecimiento de linfocitos T humanos, por ejemplo, al menos aproximadamente 25 grados Celsius, generalmente al menos aproximadamente 30 grados y generalmente a o aproximadamente 37 grados Celsius. En algunos casos, se produce un cambio de temperatura durante el cultivo, como de 37 grados Celsius a 35 grados Celsius. Opcionalmente, la incubación puede comprender además la adición de células linfoblastoides (LCL) transformadas con EBV que no se dividen como células alimentadoras. El LCL se puede irradiar con rayos gamma en el rango de aproximadamente 6.000 a 10.000 rads. En algunos aspectos, las células alimentadoras de LCL se proporcionan en cualquier cantidad adecuada, tal como una proporción de células alimentadoras de LCL a linfocitos T iniciales de al menos aproximadamente 10:1.

[0126]En algunos casos, se pueden obtener poblaciones de CD4+ y CD8+ que son específicas de antígeno estimulando linfocitos T ingenuos o específicos de antígeno con antígeno. Por ejemplo, se pueden generar líneas o clones de células T específicas de antígeno para antígenos de citomegalovirus aislando células T de sujetos infectados y estimulando las células in vitro con el mismo antígeno. También se pueden utilizar células T ingenuas.

[0127]En casos particulares, las condiciones estimulantes incluyen incubar y/o cultivar las células con un reactivo estimulador. En casos particulares, el reactivo estimulador es un reactivo descrito en la Sección I-B-1. En ciertos casos, el reactivo estimulador contiene o incluye una perla. En ciertos casos, el inicio o iniciación de la incubación y/o cultivo de células en condiciones estimulantes se produce cuando las células entran en contacto y/o se incuban con el reactivo estimulador. En casos particulares, las células se incuban antes, durante y/o después de la ingeniería genética de las células, por ejemplo, introduciendo un polinucleótido recombinante en la célula tal como mediante transducción o transfección.

[0128]En algunos casos, la composición de células T enriquecidas se incuba en una proporción de reactivo estimulador y/o perlas con respecto a células de aproximadamente 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,5:1, 1,25:1, 1,2: 1, 1,1:1, 1:1, 0,9:1, 0,8:1, 0,75:1, 0,67:1, 0,5:1, 0,3:1 o 0,2:1. En casos particulares, la relación de reactivo estimulador y/o perlas a células está entre 2,5:1 y 0,2:1, entre 2:1 y 0,5:1, entre 1,5:1 y 0,75:1, entre 1,25:1 y 0,8: 1, entre 1,1:1 y 0,9:1. En casos particulares, la proporción de reactivo estimulante a células es aproximadamente 1:1 o 1:1.

[0129]En casos particulares, las células no se incuban, se ponen en contacto y/o se exponen a un agente que inhibe la actividad mTOR, por ejemplo, un agente descrito en la Sección II, antes y/o durante la incubación en condiciones estimulantes.

[0130]En ciertos casos, al menos una parte de la incubación se realiza en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, por ejemplo, un agente descrito en la Sección II. En algunos casos, toda la incubación se realiza en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR.

[0131]En casos particulares, las células se incuban con el reactivo estimulador en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR es un agente descrito en la Sección II. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR también inhibe la actividad de una quinasa adicional. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR también inhibe la actividad de la fosfoinositiol-3 quinasa (PI3K). En ciertos casos, el agente inhibe selectivamente la actividad mTOR, por ejemplo, no inhibe de forma detectable la actividad PI3K y/o no inhibe la actividad PI3K en la misma medida que la actividad mTOR, en concentraciones que son suficientes para inhibir la actividad mTOR. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR inhibe la actividad quinasa. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR inhibe la actividad mTORC1 y/o mTORC2. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR inhibe la actividad de mTORC1 y mTORC2.

[0132]En algunos casos, los agentes incluyen, entre otros, PI-103, SF1126, BGT226, XI,765, PF-04691502, NVP-BEZ235, una pirazolopirimidina, Torin l, Torkinib (PP242), PP30, Ku-0063794., WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth), AZD8055, rapamicina (sirolimus), temsirolimus (CC1779), everolimus (r Ad 001), deforolimus (AP23573), AZD8055 (AstraZeneca) y OSI-027 (OSI). En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR tiene o incluye una fórmula que se proporciona en la Sección II, por ejemplo, Fórmula (I), Fórmula (II) o Fórmula (III). En algunos casos, el agente es el Compuesto 155, el Compuesto 246 o el Compuesto 63.

[0133]En ciertos casos, las células se incuban en presencia de un agente que inhibe la actividad de mTOR a una concentración que inhibe, reduce y/o disminuye la actividad de mTOR. En algunos casos, la concentración inhibe, reduce y/o disminuye una o más actividades de mTOR en aproximadamente o al menos un 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,9 %. En algunos casos, la concentración del agente no impide que las células T primarias proliferen y/o se expandan. En algunos casos, las células se incuban en presencia de entre 1 nM y 1 |jM, entre 1 nM y l00 nM, entre 50 nM y 200 nM, entre 100 nM y 250 nM, entre 200 nM y 500 nM, entre 500 nM y 1 jM , entre 1 jM y 10 jM , o entre 5 jM y 50 jM del agente que inhibe la actividad mTOR. En ciertos casos, las células se incuban en presencia de, aproximadamente o de al menos 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 500 nM, 1 jM , 5 jM , 10 jM , 25 jM , 50 jM o 100 jM del agente que inhibe la actividad mTOR.

[0134]En algunos casos, las células se incuban en presencia del Compuesto 155. En ciertos casos, las células se incuban en presencia de entre 1 nM y 1 jM , entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 200 nM, entre 100 nM y 250 nM, o entre 200 nM y 500 nM del Compuesto 155. En casos particulares, las células se incuban en presencia de, aproximadamente o al menos 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM o 500 nM del Compuesto 155.

[0135]En ciertos casos, las células se incuban en presencia del Compuesto 246. En ciertos casos, las células se incuban en presencia de entre 1 nM y 1 jM , entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 200 nM, entre 100 nM y 250 nM, o entre 200 nM y 500 nM del Compuesto 155. En ciertos casos, las células se incuban en presencia de, aproximadamente o al menos 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM o 500 nM del Compuesto 246.

[0136]En casos particulares, las células se incuban en presencia del Compuesto 63. En ciertos casos, las células se incuban en presencia de entre 1 nM y 1 jM , entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 200 nM, entre 100 nM y 250 nM, o entre 200 nM y 500 nM del Compuesto 63. En algunos casos, las células se incuban en presencia de, aproximadamente o al menos 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM o 500 nM del Compuesto 63.

[0137]En algunos casos, las composiciones o células se incuban en presencia de condiciones estimulantes o de un agente estimulante. Dichas condiciones incluyen aquellas diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de células en la población, para imitar la exposición al antígeno y/o preparar las células para la ingeniería genética, tal como para la introducción de un receptor de antígeno recombinante. A continuación se describen reactivos estimuladores ejemplares.

[0138]En algunos casos, las condiciones para la estimulación y/o activación pueden incluir uno o más de medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones y/o factores estimuladores, como citocinas, quimiocinas, antígenos, compañeros de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes y cualquier otro agente diseñado para activar las células.

[0139]En algunos aspectos, la incubación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas como las descritas en la Patente de EE. UU. N° 6.040.177 de Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, y/o Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.

[0140]En algunos casos, al menos una parte de la incubación en presencia de una o más condiciones estimulantes o agentes estimulantes se lleva a cabo en la cavidad interna de una cámara centrífuga, por ejemplo, bajo rotación centrífuga, tal como se describe en la Publicación Internacional N° WO2016/073602. En algunos casos, al menos una parte de la incubación realizada en una cámara centrífuga incluye la mezcla con un reactivo o reactivos para inducir estimulación y/o activación. En algunos casos, las células, tales como células seleccionadas, se mezclan con una condición estimulante o un agente estimulante en la cámara centrífuga. En algunos aspectos de tales procesos, se mezcla un volumen de células con una cantidad de una o más condiciones o agentes estimulantes que es mucho menor que la que se emplea normalmente cuando se realizan estimulaciones similares en una placa de cultivo celular u otro sistema.

[0141]En algunos casos, el agente estimulante se añade a las células en la cavidad de la cámara en una cantidad que es sustancialmente menor (p. ej., no más del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 % de la cantidad) en comparación con la cantidad del agente estimulante que normalmente se usa o sería necesario para lograr aproximadamente la misma o similar eficiencia de selección del mismo número de células o el mismo volumen de células. cuando la selección se realiza sin mezclar en una cámara centrífuga, por ejemplo, en un tubo o bolsa con agitación o rotación periódica. En algunos casos, la incubación se realiza con la adición de un tampón de incubación a las células y un agente estimulante para lograr un volumen objetivo con incubación del reactivo de, por ejemplo, 10 ml a 200 ml, tal como al menos o aproximadamente al menos. o aproximadamente 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml, 100 ml, 150 ml o 200 ml. En algunos casos, el tampón de incubación y el agente estimulante se mezclan previamente antes de añadirlos a las células. En algunos casos, el tampón de incubación y el agente estimulante se añaden por separado a las células. En algunos casos, la incubación estimulante se lleva a cabo con una condición de mezcla suave periódica, lo que puede ayudar a promover interacciones energéticamente favorecidas y, por lo tanto, permitir el uso de menos agente estimulante general mientras se logra la estimulación y activación de las células.

[0142]En algunos casos, la incubación generalmente se lleva a cabo en condiciones de mezcla, tales como en presencia de hilado, generalmente a una fuerza o velocidad relativamente baja, tal como una velocidad inferior a la utilizada para sedimentar las células, tal como desde o desde aproximadamente 600 rpm a 1700 rpm (p. ej., a o alrededor de o al menos 600 rpm, 1000 rpm, o 1500 rpm o 1700 rpm), tal como a un RCF en la muestra o pared de la cámara u otro recipiente de o desde aproximadamente 80 g a 100 g (p. ej., en o alrededor de o al menos 80 g, 85 g, 90 g, 95 g o 100 g). En algunos casos, el giro se lleva a cabo utilizando intervalos repetidos de giro a una velocidad tan baja seguidos de un período de descanso, como un giro y/o descanso durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 segundos, como un giro de aproximadamente 1 o 2 segundos seguido de un descanso de aproximadamente 5, 6, 7 u 8 segundos.

[0143]En algunos casos, la duración total de la incubación, por ejemplo, con el agente estimulante, está entre o entre aproximadamente 1 hora y 96 horas, 1 hora y 72 horas, 1 hora y 48 horas, 4 horas y 36 horas, 8 horas y 30 horas o 12 horas y 24 horas, tal como al menos o aproximadamente al menos 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas o 72 horas. En algunos casos, la incubación adicional es durante un tiempo entre o aproximadamente entre 1 hora y 48 horas, 4 horas y 36 horas, 8 horas y 30 horas o 12 horas y 24 horas, inclusive.

[0144]En casos particulares, las condiciones estimulantes incluyen incubar y/o cultivar una composición de células T enriquecidas con y/o en presencia de una o más citocinas. En casos particulares, la una o más citocinas son citocinas recombinantes. En algunos casos, una o más citocinas son citocinas recombinantes humanas. En ciertos casos, una o más citocinas se unen y/o son capaces de unirse a receptores que se expresan por y/o son endógenos a las células T. En casos particulares, la una o más citocinas es o incluye un miembro de la familia de citocinas del haz de 4 alfahélices. En algunos casos, los miembros de la familia de citoquinas del haz de 4-alfa-hélice incluyen, entre otros, interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 (IL-7), interleucina-9 (IL-9), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF).

[0145]En algunos casos, la estimulación da como resultado la activación y/o proliferación de las células, por ejemplo, antes de la transducción.

1. Reactivos estimulantes

[0146]En algunos casos, incubar una composición de células, por ejemplo, células de entrada, en condiciones estimulantes es o incluye incubar y/o poner en contacto la composición de células enriquecidas con un reactivo estimulador que es capaz de activar y/o expandir células T. En algunos casos, el reactivo estimulador es capaz de estimular y/o activar una o más señales en las células. En algunos casos, una o más señales están mediadas por un receptor. En casos particulares, la una o más señales están o están asociadas con un cambio en la transducción de señales y/o un nivel o cantidad de mensajeros secundarios, por ejemplo, AMPc y/o calcio intracelular, un cambio en la cantidad, localización celular, confirmación, fosforilación, ubiquitinación y/o truncamiento de una o más proteínas celulares, y/o un cambio en una actividad celular, por ejemplo, transcripción, traducción, degradación de proteínas, morfología celular, estado de activación y/o división celular. En casos particulares, el reactivo estimulador activa y/o es capaz de activar uno o más dominios de señalización intracelular de uno o más componentes de un complejo de TCR y/o uno o más dominios de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras.

[0147]En ciertos casos, el reactivo estimulador contiene una partícula, por ejemplo, una perla, que está conjugada o unida a uno o más agentes, por ejemplo, biomoléculas, que son capaces de activar y/o expandir células, por ejemplo, células T. En algunos casos, uno o más agentes están unidos a una perla. En algunos casos, la perla es biocompatible, es decir, está compuesta de un material que es adecuado para uso biológico. En algunos casos, las perlas no son tóxicas para las células cultivadas, por ejemplo, células T cultivadas. En algunos casos, las perlas pueden ser cualquier partícula que sea capaz de unir agentes de una manera que permita una interacción entre el agente y una célula.

[0148]En algunos casos, un reactivo estimulador contiene uno o más agentes que son capaces de activar y/o expandir células, por ejemplo, células T, que están unidas o unidas de otro modo a una perla, por ejemplo, a la superficie de la perla. En ciertos casos, la perla es una partícula no celular. En casos particulares, la perla puede incluir una partícula coloidal, una microesfera, una nanopartícula, una perla magnética o similares. En algunos casos las perlas son perlas de agarosa. En ciertos casos, las perlas son perlas de sefarosa.

[0149]En casos particulares, el reactivo estimulador contiene perlas que son monodispersas. En ciertos casos, las perlas que son monodispersas comprenden dispersiones de tamaño que tienen una desviación estándar de diámetro de menos del 5 % entre sí.

[0150]En algunos casos, la perla contiene uno o más agentes, tales como un agente que está acoplado, conjugado o unido (directa o indirectamente) a la superficie de la perla. En algunos casos, un agente como se contempla en el presente documento puede incluir, entre otros, ARN, ADN, proteínas (p. ej., enzimas), antígenos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, carbohidratos, lípidos, lectinas o cualquier otra biomolécula con afinidad por un objetivo deseado. En algunos casos, la diana deseada es un receptor de células T y/o un componente de un receptor de células T. En ciertos casos, el objetivo deseado es CD3. En ciertos casos, la diana deseada es una molécula coestimuladora de células T, por ejemplo, CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 o ICOS. Uno o más agentes pueden unirse directa o indirectamente a la perla mediante una variedad de métodos conocidos y disponibles en la técnica. La unión puede ser covalente, no covalente, electrostática o hidrófoba y puede realizarse mediante una variedad de medios de unión, incluyendo, por ejemplo, medios químicos, medios mecánicos o medios enzimáticos. En algunos casos, una biomolécula (p. ej., un anticuerpo anti-CD3 biotinilado) puede unirse indirectamente a la perla a través de otra biomolécula (p. ej., un anticuerpo anti-biotina) que está unida directamente a la perla.

[0151]En algunos casos, el reactivo estimulador contiene una perla y uno o más agentes que interactúan directamente con una macromolécula en la superficie de una célula. En ciertos casos, la perla (p. ej., una perla paramagnética) interactúa con una célula a través de uno o más agentes (p. ej., un anticuerpo) específicos para una o más macromoléculas de la célula (p. ej., una o más proteínas de la superficie celular). En ciertos casos, la perla (p. ej., una perla paramagnética) se marca con un primer agente descrito en el presente documento, tal como un anticuerpo primario (p. ej., un anticuerpo anti-biotina) u otra biomolécula, y luego un segundo agente, tal como un secundario. Se añade un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo anti-CD3 biotinilado) u otra segunda biomolécula (p. ej., estreptavidina), mediante lo cual el anticuerpo secundario u otra segunda biomolécula se une específicamente a dichos anticuerpos primarios u otra biomolécula en la partícula.

[0152]En algunos casos, el reactivo estimulador contiene uno o más agentes (p. ej., anticuerpo) que está unido a una perla (p. ej., una perla paramagnética) y se une específicamente a una o más de las siguientes macromoléculas en una célula (p. ej., una célula T): CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54 (ICAM-1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BB (CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-gammaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL-10R, CD18/CD11a (LFA-1), CD62L (L-selectina), CD29/CD49d (VLA-4), ligando Notch (p. ej., Deltalike 1/4, Jagged 1/2, etc.), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7 y CXCR3 o fragmentos de los mismos, incluidos los ligandos correspondientes a estas macromoléculas o fragmentos de las mismas. En algunos casos, un agente (p. ej., un anticuerpo) unido a la perla se une específicamente a una o más de las siguientes macromoléculas en una célula (p. ej., una célula T): CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA y/o CD45RO.

[0153]En algunos casos, uno o más de los agentes unidos a la perla es un anticuerpo. El anticuerpo puede incluir un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal (incluidos anticuerpos de longitud completa que tienen una región Fc de inmunoglobulina), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos, diacuerpos y moléculas de cadena sencilla, así como fragmentos de anticuerpos) (p. ej., Fab, F(ab')2 y Fv). En algunos casos, el reactivo estimulador es un fragmento de anticuerpo (incluido el fragmento de unión al antígeno), por ejemplo, un Fab, Fab'-SH, Fv, scFv o fragmento (Fab')2. Se apreciará que se pueden usar regiones constantes de cualquier isotipo para los anticuerpos contemplados en el presente documento, incluidas regiones constantes IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie humana o animal (p. ej., especie murina). En algunos casos, el agente es un anticuerpo que se une y/o reconoce uno o más componentes de un receptor de células T. En casos particulares, el agente es un anticuerpo anti-CD3. En ciertos casos, el agente es un anticuerpo que se une a y/o reconoce un correceptor. En algunos casos, el reactivo estimulador comprende un anticuerpo anti-CD28. En algunos casos, la perla tiene un diámetro mayor que aproximadamente 0,001 |jm, mayor que aproximadamente 0,01 jm , mayor que aproximadamente 0,1 jm , mayor que aproximadamente 1,0 jm , mayor que aproximadamente 10 jm , mayor que aproximadamente 50 jm , mayor que aproximadamente 100 jm o mayor que aproximadamente 1000 jm y no más de aproximadamente 1500 jm . En algunos casos, la perla tiene un diámetro de aproximadamente 1,0 jm a aproximadamente 500 jm , de aproximadamente 1,0 jm a aproximadamente 150 jm , de aproximadamente 1,0 jm a aproximadamente 30 jm , de aproximadamente 1,0 jm a aproximadamente 10 jm , aproximadamente 1,0 jm a aproximadamente 5,0 jm , aproximadamente 2,0 jm a aproximadamente 5,0 jm , o aproximadamente 3,0 jm a aproximadamente 5,0 jm . En algunos casos, la perla tiene un diámetro de aproximadamente 3 jm a aproximadamente 5 jm . En algunos casos, la perla tiene un diámetro de al menos o al menos aproximadamente 0,001 jm , 0,01 jm , 0,1 jm , 0,5 jm , 1,0 jm , 1,5 jm , 2,0 jm , 2,5 jm , 3,0 jm , 3,5 jm , 4,0 jm , 4,5 jm , 5,0 jm , 5,5 jm , 6,0 jm , 6,5 jm , 7,0 jm , 7,5 jm , 8,0 jm , 8,5 jm , 9,0 m m, 9,5 jm , 10 jm , 12 jm , 14 jm , 16 jm , 18 jm o 20 jm . En ciertos casos, la perla tiene un diámetro de o aproximadamente 4,5 jm . En ciertos casos, la perla tiene un diámetro de o aproximadamente 2,8 jm .

[0154]En algunos casos, las perlas tienen una densidad superior a 0,001 g/cm3, superior a 0,01 g/cm3, superior a 0,05 g/cm3, superior a 0,1 g/cm3, superior a 0,5 g/ cm3, mayor que 0,6 g/cm3, mayor que 0,7 g/cm3, mayor que 0,8 g/cm3, mayor que 0,9 g/cm3, mayor que 1 g/cm3, mayor que 1,1 g/cm3, mayor que 1,2 g/cm3, superior a 1,3 g/cm3, superior a 1,4 g/cm3, superior a 1,5 g/cm3, superior a 2 g/cm3, superior a 3 g/cm3, superior a 4 g /cm3, o mayor que 5 g/cm3. En algunos casos, las perlas tienen una densidad de entre aproximadamente 0,001 g/cm3 y aproximadamente 100 g/cm3, aproximadamente 0,01 g/cm3 y aproximadamente 50 g/cm3, aproximadamente 0,1 g/ cm3 y aproximadamente 10 g/cm3. cm3, aproximadamente 0,1 g/cm3 y aproximadamente 0,5 g/cm3, aproximadamente 0,5 g/cm3 y aproximadamente 1 g/cm3, aproximadamente 0,5 g/cm3 y aproximadamente 1,5 g/cm3, aproximadamente 1 g/cm3 cm3 y aproximadamente 1,5 g/cm3, aproximadamente 1 g/cm3 y aproximadamente 2 g/cm3, o aproximadamente 1 g/cm3 y aproximadamente 5 g / cm3. En algunos casos, las perlas tienen una densidad de aproximadamente 0,5 g/cm3, aproximadamente 0,6 g/cm3, aproximadamente 0,7 g/cm3, aproximadamente 0,8 g/cm3, aproximadamente 0,9 g/cm3, aproximadamente 1,0 g/cm3, aproximadamente 1,1 g/cm3, aproximadamente 1,2 g/cm3, aproximadamente 1,3 g/cm3, aproximadamente 1,4 g/cm3, aproximadamente 1,5 g/cm3, aproximadamente 1,6 g/cm3, aproximadamente 1,7 g/cm3, aproximadamente 1,8 g/cm3, aproximadamente 1,9 g/cm3, o aproximadamente 2,0 g/cm3. En ciertos casos, las perlas tienen una densidad de aproximadamente 1,6 g/cm3 En casos particulares, las perlas o partículas tienen una densidad de aproximadamente 1,5 g/cm3 En ciertos casos, las partículas tienen una densidad de aproximadamente 1,3 g/cm3.

[0155]En ciertos casos, una pluralidad de perlas tiene una densidad uniforme. En ciertos casos, una densidad uniforme comprende una desviación estándar de densidad de menos del 10 %, menos del 5 % o menos del 1 % de la densidad media de las perlas.

[0156]En algunos casos, las perlas tienen un área superficial de entre aproximadamente 0,001 m2 por cada gramo de partículas (m2/g) a aproximadamente 1.000 m2/g, aproximadamente 0,010 m2/g a aproximadamente 100 m2/g, aproximadamente 0,1 m2/g a aproximadamente 10 m2/g, aproximadamente 0,1 m2/g a aproximadamente 1 m2/g, aproximadamente 1 m2/g a aproximadamente 10 m2/g, aproximadamente 10 m2/g a aproximadamente 100 m2/g, aproximadamente 0,5 m2/g a aproximadamente 20 m2/g, aproximadamente 0,5 m2/g a aproximadamente 5 m2/g, o aproximadamente 1 m2/g a aproximadamente 4 m2/g. En algunos casos, las partículas o perlas tienen un área superficial de aproximadamente 1 m2/g a aproximadamente 4 m2/g.

[0157]En algunos casos, la perla contiene al menos un material en o cerca de la superficie de la perla que puede acoplarse, unirse o conjugarse con un agente. En algunos casos, la perla tiene una superficie funcionalizada, es decir, comprende grupos funcionales que son capaces de formar un enlace covalente con una molécula de unión, por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido. En casos particulares, la perla comprende grupos carboxilo, amino, hidroxilo, tosilo, epoxi y/o clorometilo expuestos en la superficie. En casos particulares, las perlas comprenden agarosa y/o sefarosa expuestas en la superficie. En ciertos casos, la superficie de la perla comprende reactivos estimuladores unidos que pueden unirse o unirse a moléculas de unión. En casos particulares, las biomoléculas son polipéptidos. En algunos casos, las perlas comprenden proteína A, proteína G o biotina expuestas en la superficie.

[0158]En algunos casos, la perla reacciona en un campo magnético. En algunos casos, la perla es una perla magnética. En algunos casos, la perla magnética es paramagnética. En casos particulares, la perla magnética es superparamagnética. En ciertos casos, las perlas no muestran ninguna propiedad magnética a menos que estén expuestas a un campo magnético.

[0159]En casos particulares, la perla comprende un núcleo magnético, un núcleo paramagnético o un núcleo superparamagnético. En algunos casos, el núcleo magnético contiene un metal. En algunos casos, el metal puede ser, entre otros, hierro, níquel, cobre, cobalto, gadolinio, manganeso, tantalio, zinc, circonio o cualquier combinación de los mismos. En ciertos casos, el núcleo magnético comprende óxidos metálicos (p. ej., óxidos de hierro), ferritas (p. ej., ferritas de manganeso, ferritas de cobalto, ferritas de níquel, etc.), hematita y aleaciones metálicas (p. ej., CoTaZn). En algunos casos, el núcleo magnético comprende uno o más de una ferrita, un metal, una aleación metálica, un óxido de hierro o dióxido de cromo. En algunos casos, el núcleo magnético comprende hierro elemental o un compuesto del mismo. En algunos casos, el núcleo magnético comprende uno o más de magnetita (Fe304), maghemita (YFe2O3) o greigita (Fe3S4). En algunos casos, el núcleo interno comprende un óxido de hierro (p. ej., Fe3O4).

[0160]En ciertos casos, la perla contiene un núcleo magnético, paramagnético y/o superparamagnético que está cubierto por una capa o recubrimiento funcionalizado en la superficie. En algunos casos, el recubrimiento puede contener un material que puede incluir, entre otros, un polímero, un polisacárido, una sílice, un ácido graso, una proteína, un carbono, agarosa, sefarosa o una combinación de los mismos. En algunos casos, el polímero puede ser un polietilenglicol, ácido poli( láctico-co-glicólico), poliglutaraldehído, poliuretano, poliestireno o un alcohol polivinílico. En ciertos casos, el revestimiento o revestimiento exterior comprende poliestireno. En casos particulares, el revestimiento exterior está funcionalizado superficialmente.

[0161]En algunos casos, el reactivo estimulador comprende una perla que contiene un núcleo de óxido metálico (p. ej., un núcleo de óxido de hierro) y un recubrimiento, en donde el núcleo de óxido metálico comprende al menos un polisacárido (p. ej., dextrano), y en donde el recubrimiento comprende al menos un polisacárido (p. ej., aminodextrano), al menos un polímero (p. ej., poliuretano) y sílice. En algunos casos, el núcleo de óxido metálico es un núcleo de óxido de hierro coloidal. En ciertos casos, uno o más agentes incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En casos particulares, uno o más agentes incluyen un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. En algunos casos, el reactivo estimulador comprende un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD28 y un anticuerpo anti-biotina. En algunos casos, el reactivo estimulador comprende un anticuerpo anti-biotina. En algunos casos, la perla tiene un diámetro de aproximadamente 3 pm a aproximadamente 10 pm. En algunos casos, la perla tiene un diámetro de aproximadamente 3 pm a aproximadamente 5 pm. En determinados casos, la perla tiene un diámetro de aproximadamente 3,5 pm.

[0162]En algunos casos, el reactivo estimulador comprende uno o más agentes que están unidos a una perla que comprende un núcleo de óxido metálico (p. ej., un núcleo interno de óxido de hierro) y un recubrimiento (p. ej., un recubrimiento protector), en donde el recubrimiento comprende poliestireno. En ciertos casos, las perlas son perlas paramagnéticas (p. ej., superparamagnéticas) monodispersas que comprenden un núcleo de hierro paramagnético (p. ej., superparamagnético), por ejemplo, un núcleo que comprende magnetita (Fe3O4) y/o maghemita (YFe2O3) c y una capa o revestimiento de poliestireno. En algunos casos, la perla no es porosa. En algunos casos, las perlas contienen una superficie funcionalizada a la que están unidos uno o más agentes. En ciertos casos, uno o más agentes están unidos covalentemente a las perlas en la superficie. En algunos casos, uno o más agentes incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, uno o más agentes incluyen un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. En algunos casos, uno o más agentes incluyen un anticuerpo anti-CD3 y/o un anticuerpo anti-CD28, y un anticuerpo o fragmento de antígeno del mismo capaz de unirse a un anticuerpo marcado (p. ej., anticuerpo biotinilado), tal como un anticuerpo anti-CD28 marcado o un anticuerpo CD3 o anti-CD28 marcado. En ciertos casos, las perlas tienen una densidad de aproximadamente 1,5 g/cm3 y un área superficial de aproximadamente 1 m2/g a aproximadamente 4 m2/g. En casos particulares; las perlas son perlas superparamagnéticas monodispersas que tienen un diámetro de aproximadamente 4,5 pm y una densidad de aproximadamente 1,5 g/cm3. En algunos casos, las perlas son perlas superparamagnéticas monodispersas que tienen un diámetro medio de aproximadamente 2,8 mm y una densidad de aproximadamente 1,3 g/cm3.

C. Células de ingeniería

[0163]En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento se utilizan en asociación con la ingeniería de una o más composiciones de células T. En ciertos casos, la ingeniería es o incluye la introducción de un polinucleótido, por ejemplo, un polinucleótido que codifica una proteína recombinante. En casos particulares, las proteínas recombinantes son receptores recombinantes, tales como cualquiera de los descritos en la Sección II. La introducción de las moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína recombinante, tal como el receptor recombinante, en la célula se puede llevar a cabo utilizando cualquiera de varios vectores conocidos. Dichos vectores incluyen sistemas virales y no virales, incluidos sistemas lentivirales y gammaretrovirales, así como sistemas basados en transposones como PiggyBac o sistemas de transferencia de genes basados en La Bella Durmiente. Los métodos ejemplares incluyen aquellos para la transferencia de ácidos nucleicos que codifican los receptores, incluyendo vía viral, por ejemplo, retroviral o lentiviral, transducción, transposones y electroporación. En algunos casos, la ingeniería produce una o más composiciones diseñadas de células T enriquecidas.

[0164]En ciertos casos, se diseñan una o más composiciones de células T, por ejemplo, se transducen o transfectan, antes de cultivar las células, por ejemplo, en condiciones que promueven la proliferación y/o expansión, tal como mediante un método proporcionado en la Sección I-D. En casos particulares, se diseñan una o más composiciones de células T enriquecidas después de que una o más composiciones hayan sido estimuladas, activadas y/o incubadas en condiciones estimulantes. En casos particulares, una o más composiciones son composiciones estimuladas. En casos particulares, la una o más composiciones estimuladas se han criocongelado y almacenado previamente, y se descongelan antes de la ingeniería.

[0165]En ciertos casos, la una o más composiciones de células T estimuladas son o incluyen dos composiciones estimuladas separadas de células T enriquecidas. En casos particulares, se diseñan por ingeniería separada dos composiciones separadas de células T enriquecidas, por ejemplo, dos composiciones separadas de células T enriquecidas que han sido seleccionadas, aisladas y/o enriquecidas a partir de la misma muestra biológica. En ciertos casos, las dos composiciones separadas incluyen una composición de células T CD4+ enriquecidas. En casos particulares, las dos composiciones separadas incluyen una composición de células T CD8+ enriquecidas. En algunos casos, se modifican genéticamente por separado dos composiciones separadas de células T CD4+ enriquecidas y células T CD8+ enriquecidas. En algunos casos, se modifica genéticamente una única composición de células T enriquecidas. En ciertos casos, la composición única es una composición de células T CD4+ enriquecidas. En algunos casos, la composición única es una composición de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas que se han combinado a partir de composiciones separadas antes de la ingeniería.

[0166]En algunos casos, la composición de células T CD4+ enriquecidas que se modifica, por ejemplo, se transduce o transfecta, incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD4+. En ciertos casos, la composición de células T CD4+ enriquecidas que se modifica incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD8+, y/o no contiene células T CD8+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD8+.

[0167]En algunos casos, la composición de células T CD8+ enriquecidas que se modifica, por ejemplo, se transduce o transfecta, incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD8+. En ciertos casos, la composición de células T CD8+ enriquecidas que se incuba en condiciones estimulantes incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD4+, y/o no contiene células T CD4+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD4+.

[0168]En algunos casos, se combinan composiciones separadas de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas en una única composición y se modifican genéticamente, por ejemplo, se transducen o transfectan. En ciertos casos, composiciones diseñadas separadas de células T CD4+ enriquecidas y CD8+ enriquecidas se combinan en una única composición después de que se haya realizado y/o completado la ingeniería genética.

[0169]En algunos casos, la transferencia de genes se logra estimulando primero la célula, tal como combinándola con un estímulo que induce una respuesta tal como proliferación, supervivencia y/o activación, por ejemplo, medida por la expresión de una citoquina o marcador de activación, seguido de la transducción de las células activadas y la expansión del cultivo a números suficientes para aplicaciones clínicas. En ciertos casos, la transferencia genética se logra incubando primero las células en condiciones estimulantes, como por cualquiera de los métodos descritos en la Sección I-B.

[0170]En algunos casos, los métodos de ingeniería genética se llevan a cabo poniendo en contacto una o más células de una composición con una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína recombinante, por ejemplo, un receptor recombinante. En algunos casos, el contacto se puede realizar mediante centrifugación, como por ejemplo espinoculación (p. ej. inoculación centrífuga). Dichos métodos incluyen cualquiera de los descritos en la Publicación Internacional N° WO2016/073602. Las cámaras centrífugas ejemplares incluyen las producidas y vendidas por Biosafe SA, incluidas aquellas para usar con el sistema Sepax® y Sepax® 2, incluidas cámaras centrífugas A-200/F y A-200 y varios kits para usar con dichos sistemas. Se describen cámaras, sistemas e instrumentación y cuadros de procesamiento a modo de ejemplo, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N° 6.123.655, la Patente de EE. Uu . N° 6.733.433 y la solicitud de Patente de EE. UU. publicada, número de publicación: US 2008/0171951, y la publicación y solicitud de patente internacional publicada. N° WO 00/38762. Los kits de ejemplo para usar con dichos sistemas incluyen, entre otros, kits de un solo uso vendidos por BioSafe SA con los nombres de producto CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 o CS-900.2.

[0171]En algunos casos, las células no se incuban, no se ponen en contacto y/o se exponen a un agente que inhibe la actividad de mTOR, tal como un agente descrito en el presente documento, por ejemplo, en la Sección II, antes y/o durante la ingeniería.

[0172]En casos particulares, al menos una parte de la ingeniería se realiza en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, tal como un agente descrito en el presente documento, por ejemplo, un agente descrito en la Sección II. En algunos casos, todo y/o el paso de ingeniería se realiza en presencia de un agente que inhibe la actividad de mTOR.

[0173]En casos particulares, las células se modifican, por ejemplo, se transducen o transfectan, en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR es un agente descrito en el presente documento, tal como en la Sección II, por ejemplo, el Compuesto 63. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR también inhibe la actividad de una quinasa adicional. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR también inhibe la actividad de la fosfoinositiol-3 quinasa (PI3K). En ciertos casos, el agente inhibe selectivamente la actividad mTOR, por ejemplo, no inhibe de manera mensurable la actividad PI3K y/o no inhibe la actividad PI3K en la misma medida que la actividad mTOR, en concentraciones que son suficientes para inhibir la actividad mTOR. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR inhibe la actividad quinasa. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR inhibe la actividad mTORC1 y/o mTORC2. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR inhibe la actividad de mTORC1 y mTORC2.

[0174]En algunos casos, los agentes incluyen, entre otros, PI-103, SF1126, BGT226, XL765, PF-04691502, NVP-BEZ235, pirazolopirimidina, Torin l, Torkinib (PP242), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth), AZD8055, rapamicina (sirolimus), temsirolimus (CC1779), everolimus (RAD001), deforolimus (AP23573), AZD8055 (AstraZeneca) y OSI-027 (OSI). En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR tiene o incluye una fórmula que se proporciona en la Sección II, por ejemplo, Fórmula (I), Fórmula (II) o Fórmula (III). En algunos casos, el agente es el Compuesto 155, el Compuesto 246 o el Compuesto 63. En algunos casos, el agente es el Compuesto 63.

[0175]En ciertos casos, las células se diseñan en presencia de un agente que inhibe la actividad de mTOR en una concentración que inhibe, reduce y/o disminuye la actividad de mTOR. En algunos casos, la concentración inhibe, reduce y/o disminuye una o más actividades de mTOR en aproximadamente o al menos un 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,9 %. En algunos casos, la concentración del agente no impide que las células T primarias proliferen y/o se expandan. En algunos casos, las células se diseñan en presencia de entre 1 nM y 1 mM, entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 200 nM, entre 100 nM y 250 nM, entre 200 nM y 500 nM, entre 500 nM y 1 pM, entre 1 pM y 10 pM, o entre 5 pM y 50 pM del agente que inhibe la actividad mTOR. En ciertos casos, las células se diseñan en presencia de, aproximadamente o de al menos 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 500 nM, 1 pM, 5 pM, 10 pM, 25 pM, 50 pM o 100 pM del agente que inhibe la actividad mTOR.

[0176]En algunos casos, las células se diseñan en presencia del Compuesto 155. En ciertos casos, las células se diseñan en presencia de entre 1 nM y 1 pM, entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 200 nM, entre 100 nM y 250 nM, o entre 200 nM y 500 nM del Compuesto 155. En casos particulares, las células se diseñan en presencia de, aproximadamente o al menos 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM o 500 nM del Compuesto 155.

[0177]En ciertos casos, las células se diseñan en presencia del Compuesto 246. En ciertos casos, las células se diseñan en presencia de entre 1 nM y 1 pM, entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 200 nM, entre 100 nM y 250 nM, o entre 200 nM y 500 nM del Compuesto 155. En ciertos casos, las células se diseñan en presencia de, aproximadamente o al menos 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM o 500 nM del Compuesto 246.

[0178]En casos particulares, las células se diseñan en presencia del Compuesto 63. En ciertos casos, las células se diseñan en presencia de entre 1 nM y 1 pM, entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 200 nM, entre 100 nM y 250 nM, o entre 200 nM y 500 nM del Compuesto 63. En algunos casos, las células se diseñan en presencia de, aproximadamente o al menos 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM o 500 nM del Compuesto 63.

[0179]En algunos casos, el contacto se puede efectuar con centrifugación, tal como espinoculación (p. ej., inoculación centrífuga). En algunos casos, la composición que contiene células, partículas virales y reactivo se puede hacer girar, generalmente con una fuerza o velocidad relativamente baja, tal como una velocidad inferior a la utilizada para sedimentar las células, tal como desde o desde aproximadamente 600 rpm hasta 1700 rpm (p. ej., a o alrededor de o al menos 600 rpm, 1000 rpm, o 1500 rpm o 1700 rpm). En algunos casos, la rotación se lleva a cabo con una fuerza, por ejemplo, una fuerza centrífuga relativa, de o desde aproximadamente 100 g a 3200 g (p. ej., en o aproximadamente o al menos en o aproximadamente 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g o 3200 g), medido por ejemplo en una pared interna o externa de la cámara o cavidad. El término “fuerza centrífuga relativa” o RCF se entiende generalmente como la fuerza efectiva impartida sobre un objeto o sustancia (tal como una célula, muestra o sedimento y/o un punto en la cámara u otro recipiente que se está girando), en relación con la fuerza gravitacional de la Tierra, en un punto particular del espacio en comparación con el eje de rotación. El valor se puede determinar mediante fórmulas conocidas, teniendo en cuenta la fuerza gravitacional, la velocidad de rotación y el radio de rotación (distancia desde el eje de rotación y el objeto, sustancia o partícula en el que se mide el RCF).

[0180]En algunos casos, la introducción se lleva a cabo poniendo en contacto una o más células de una composición con una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína recombinante, por ejemplo, el receptor recombinante. En algunos casos, el contacto se puede realizar mediante centrifugación, como por ejemplo espinoculación (p. ej. inoculación centrífuga). Dichos métodos incluyen cualquiera de los descritos en la Publicación Internacional N° WO2016/073602. Las cámaras centrífugas ejemplares incluyen las producidas y vendidas por Biosafe SA, incluidas aquellas para usar con el sistema Sepax® y Sepax® 2, incluidas cámaras centrífugas A-200/F y A-200 y varios kits para usar con dichos sistemas. Se describen cámaras, sistemas e instrumentación y cuadros de procesamiento a modo de ejemplo, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N° 6.123.655, la Patente de EE. UU. N° 6.733.433 y la solicitud de Patente de EE. UU. publicada, número de publicación: US 2008/0171951, y la publicación y solicitud de patente internacional publicada. N° WO 00/38762. Los kits de ejemplo para usar con dichos sistemas incluyen, entre otros, kits de un solo uso vendidos por BioSafe SA con los nombres de producto CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 o CS-900.2.

[0181]En algunos casos, el sistema se incluye y/o se asocia con otra instrumentación, incluyendo instrumentación para operar, automatizar, controlar y/o monitorear aspectos de la etapa de transducción y una o más otras etapas de procesamiento realizadas en el sistema, por ejemplo, uno o más pasos de procesamiento que se pueden llevar a cabo con o en conexión con el sistema de cámara centrífuga como se describe en el presente documento o en la Publicación Internacional N° WO2016/073602. Esta instrumentación en algunos casos está contenida dentro de un cuadro. En algunos casos, la instrumentación incluye un cuadro, que incluye una carcasa que contiene circuitos de control, una centrífuga, una cubierta, motores, bombas, sensores, pantallas y una interfaz de usuario. Un dispositivo ejemplar se describe en la Patente de EE. UU. N° 6.123.655, la Patente de EE. UU. N° 6.733.433 y la Patente de EE. UU. 2008/0171951.

[0182]En algunos casos, el sistema comprende una serie de recipientes, por ejemplo, bolsas, tubos, llaves de paso, abrazaderas, conectores y una cámara centrífuga. En algunos casos, los recipientes, tales como bolsas, incluyen uno o más recipientes, tales como bolsas, que contienen las células que se van a transducir y las partículas del vector viral, en el mismo recipiente o en recipientes separados, tales como la misma bolsa o bolsas separadas. En algunos casos, el sistema incluye además uno o más recipientes, tales como bolsas, que contienen medio, tal como diluyente y/o solución de lavado, que se introduce en la cámara y/u otros componentes para diluir, resuspender y/o lavar componentes y/o composiciones durante los métodos. Los recipientes pueden conectarse en una o más posiciones en el sistema, tal como en una posición correspondiente a una línea de entrada, línea de diluyente, línea de lavado, línea de desechos y/o línea de salida.

[0183]En algunos casos, la cámara está asociada con una centrífuga, que es capaz de efectuar la rotación de la cámara, por ejemplo, alrededor de su eje de rotación. La rotación puede ocurrir antes, durante y/o después de la incubación en relación con la transducción de las células y/o en una o más de las otras etapas de procesamiento. Así, en algunos casos, uno o más de los diversos pasos de procesamiento se llevan a cabo bajo rotación, por ejemplo, con una fuerza particular. La cámara normalmente es capaz de rotación vertical o generalmente vertical, de modo que la cámara se asienta verticalmente durante la centrifugación y la pared lateral y el eje son verticales o generalmente verticales, con la(s) pared(es) de extremo horizontales o generalmente horizontales.

[0184]En algunos casos, la composición que contiene células, el vector, por ejemplo, partículas virales, y el reactivo se pueden hacer girar, generalmente con una fuerza o velocidad relativamente baja, tal como una velocidad menor que la utilizada para sedimentar las células, tal como desde o desde aproximadamente 600 rpm a 1700 rpm (p. ej., a o alrededor de o al menos 600 rpm, 1000 rpm o 1500 rpm o 1700 rpm). En ciertas ocasiones, la rotación se realiza con una fuerza, por ejemplo, una fuerza centrífuga relativa, de o desde aproximadamente 100 g a 3200 g (p. ej., en o aproximadamente o al menos en o aproximadamente 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g o 3200 g), medido por ejemplo en una pared interna o externa de la cámara o cavidad. El término “fuerza centrífuga relativa” o RCF se entiende generalmente como la fuerza efectiva impartida sobre un objeto o sustancia (tal como una célula, muestra o sedimento y/o un punto en la cámara u otro recipiente que se está girando), en relación con la fuerza gravitacional de la Tierra, en un punto particular del espacio en comparación con el eje de rotación. El valor se puede determinar mediante fórmulas conocidas, teniendo en cuenta la fuerza gravitacional, la velocidad de rotación y el radio de rotación (distancia desde el eje de rotación y el objeto, sustancia o partícula en el que se mide el RCF).

[0185]En algunos casos, durante al menos una parte de la ingeniería genética, por ejemplo, transducción, y/o posteriormente a la ingeniería genética, las células se transfieren al conjunto de bolsa del biorreactor para el cultivo de las células genéticamente modificadas, tal como para el cultivo o la expansión de la células, como se describió anteriormente.

[0186]También se describen uno o más polinucleótidos (p. ej., moléculas de ácido nucleico) que codifican receptores recombinantes, vectores para células genéticamente modificadas para expresar dichos receptores y métodos para producir las células modificadas genéticamente. En algunos casos, el vector contiene el ácido nucleico que codifica el receptor recombinante. En casos particulares, el vector es un vector viral o un vector no viral. En algunos casos, el vector es un vector viral, tal como un vector retroviral, por ejemplo, un vector lentiviral o un vector gammaretroviral.

[0187]En algunos casos, los vectores incluyen vectores virales, por ejemplo, vectores o transposones no virales retrovirales o lentivirales, por ejemplo, sistema de transposones de laBella Durmiente,vectores derivados del virus 40 de simio (SV40), adenovirus, virus adenoasociados (AAV), vectores lentivirales o vectores retrovirales, tales como vectores gamma-retrovirales, vector retroviral derivado del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMI,V), virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), virus de células madre embrionarias murinas (MESV), virus de células madre murinas (MSCV), virus formador de focos del bazo (SFFV) o virus adenoasociado (AAV).

[0188]En algunos casos, el vector viral o el ADN no viral contiene un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante heteróloga. En algunos casos, la molécula recombinante heteróloga es o incluye un receptor recombinante, por ejemplo, un receptor de antígeno, transposones SB, por ejemplo, para silenciamiento génico, transposones encerrados en la cápside, ácido nucleico bicatenario homólogo, por ejemplo, para recombinación genómica o genes indicadores. (p. ej., proteínas fluorescentes, tales como GFP) o luciferasa.

1. Partículas de vectores virales

[0189]En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a células usando partículas de virus infecciosos recombinantes, tales como, por ejemplo, vectores derivados del virus 40 de simio (SV40), adenovirus, virus adenoasociados (AAV). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a células T usando vectores lentivirales recombinantes o vectores retrovirales, como vectores gamma-retrovirales (ver, por ejemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Abril 3. doi: 10.1038/gt. 2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 noviembre 29(11): 550-557).

[0190]En algunos casos, el vector retroviral tiene una secuencia repetida terminal larga (LTR), por ejemplo, un vector retroviral derivado del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMI,V), del virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), del virus de células madre embrionarias murinas (MESV), virus de células madre murinas (MSCV), virus formador de focos de bazo (SFFV) o virus adenoasociado (AAV). La mayoría de los vectores retrovirales se derivan de retrovirus murinos. En algunos casos, los retrovirus incluyen aquellos derivados de cualquier fuente de células de ave o mamífero. Los retrovirus suelen ser anfotrópicos, lo que significa que son capaces de infectar células huésped de varias especies, incluidos los humanos. En un caso, el gen que se va a expresar reemplaza las secuencias retrovirales gag, pol y/o env. Se han descrito varios sistemas retrovirales ilustrativos (p. ej., Patentes de EE. UU. Nos 5.219.740; 6.207.453; 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, a D (1990) Human Gene Therapy 1:5-14. Scarpa y otros (1991) Virology 180:849-852, Burns y otros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. Ee . UU. 90:8033-8037 y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

[0191]Se conocen métodos de transducción lentiviral. Se describen métodos ejemplares, por ejemplo, en Wang et al. (2012) J. Inmunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; y Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.

[0192]En algunos casos, las partículas de vector viral contienen un genoma derivado de un vector basado en genoma retroviral, tal como derivado de un vector basado en genoma lentiviral. En algunos aspectos de los vectores virales divulgados, el ácido nucleico heterólogo que codifica un receptor recombinante, tal como un receptor de antígeno, tal como un CAR, está contenido y/o ubicado entre las secuencias 5'LTR y 3'LTR del genoma del vector.

[0193]En algunos casos, el genoma del vector viral es un genoma de lentivirus, tal como un genoma de VIH-1 o un genoma de VIS. Por ejemplo, se han generado vectores lentivirales atenuando múltiples genes de virulencia; por ejemplo, los genes env, vif, vpu y nef pueden eliminarse, haciendo que el vector sea más seguro para fines terapéuticos. Se conocen vectores lentivirales. Véase Naldini et al., (1996 y 1998); Zufferey y otros, (1997); Dull et al., 1998, Patente de EE. UU. Nos 6.013.516; y 5.994.136). En algunos casos, estos vectores virales están basados en plásmidos o en virus y están configurados para portar las secuencias esenciales para incorporar ácido nucleico extraño, para la selección y para la transferencia del ácido nucleico a una célula huésped. Lentivirus conocidos pueden obtenerse fácilmente de depósitos o colecciones tales como la American Type Culture Collection (“ATCC”; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110 2209), o aislarse de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles.

[0194]Los ejemplos no limitantes de vectores lentivirales incluyen aquellos derivados de un lentivirus, tales como el Virus de Inmunodeficiencia Humana 1 (VIH-1), VIH-2, un Virus de Inmunodeficiencia de Simios (VIS), el Virus Linfotrópico T Humano 1 (HTLV-1), HTLV-2 o virus de la anemia infecciosa equina (E1AV). Por ejemplo, se han generado vectores lentivirales atenuando multiplicadamente los genes de virulencia del VIH; por ejemplo, se eliminan los genes env, vif, vpr, vpu y nef, lo que hace que el vector sea más seguro para fines terapéuticos. Los vectores lentivíricos son conocidos en la técnica, véase Naldini et al., (1996 y 1998); Zufferey y otros, (1997); Dull et al., 1998, Patente de EE. UU. Nos 6.013.516; y 5.994.136). En algunos casos, estos vectores virales están basados en plásmidos o en virus y están configurados para portar las secuencias esenciales para incorporar ácido nucleico extraño, para la selección y para la transferencia del ácido nucleico a una célula huésped. Los lentivirus conocidos pueden obtenerse fácilmente de depósitos o colecciones tales como la American Type Culture Collection (“ATCC”; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209), o aislarse de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles.

[0195]En algunos casos, el vector del genoma viral puede contener secuencias de las LTR 5' y 3' de un retrovirus, tal como un lentivirus. En algunos aspectos, la construcción del genoma viral puede contener secuencias de las LTR 5' y 3' de un lentivirus, y en particular puede contener las secuencias R y U5 de la LTR 5' de un lentivirus y una 3' inactivada o autoinactivada. LTR de un lentivirus. Las secuencias LTR pueden ser secuencias LTR de cualquier lentivirus de cualquier especie. Por ejemplo, pueden ser secuencias LTR de VIH, SIV, FIV o BIV. Normalmente, las secuencias LTR son secuencias LTR de VIH.

[0196]En algunos casos, el ácido nucleico de un vector viral, como un vector viral del VIH, carece de unidades transcripcionales adicionales. El genoma del vector puede contener una LTR 3' inactivada o autoinactivada (Zufferey et al. J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J Virol 72:8150, 1998). Por ejemplo, la deleción en la región U3 de la LTR 3' del ácido nucleico usado para producir el ARN del vector viral se puede usar para generar vectores autoinactivantes (SIN). Esta deleción puede luego transferirse a la LTR 5' del<a>D<n>proviral durante la transcripción inversa. Un vector autoinactivante generalmente tiene una deleción de las secuencias potenciadoras y promotoras de la repetición terminal larga (LTR) 3', que se copia en la LTR 5' durante la integración del vector. En algunos casos, se puede eliminar suficiente secuencia, incluida la eliminación de una caja TATA, para abolir la actividad transcripcional de la LTR. Esto puede impedir la producción de ARN vectorial de longitud completa en células transducidas. En algunos aspectos, el elemento U3 de la LTR 3' contiene una deleción de su secuencia potenciadora, la caja TATA, los sitios Sp1 y NF-kappa B. Como resultado de la 3' LTR autoinactivante, el provirus que se genera después de la entrada y la transcripción inversa contiene una 5' LTR inactivada. Esto puede mejorar la seguridad al reducir el riesgo de movilización del genoma del vector y la influencia de la LTR en los promotores celulares cercanos. La LTR 3' autoinactivante puede construirse mediante cualquier método conocido en la técnica. En algunos casos, esto no afecta los títulos del vector ni las propiedades in vitro o in vivo del vector.

[0197]Opcionalmente, la secuencia U3 de la LTR 5' lentivírica se puede reemplazar con una secuencia promotora en la construcción viral, tal como una secuencia promotora heteróloga. Esto puede aumentar el título del virus recuperado de la línea celular empaquetadora. También se puede incluir una secuencia potenciadora. Puede usarse cualquier combinación de potenciador/promotor que aumente la expresión del genoma de ARN viral en la línea celular empaquetadora. En un ejemplo, se usa la secuencia potenciadora/promotora de CMV (Patente de EE. UU. N° 5.385.839 y Patente de EE. UU. N° 5.168.062).

[0198]En ciertos casos, el riesgo de mutagénesis por inserción se puede minimizar construyendo el genoma del vector retroviral, tal como el genoma del vector lentiviral, para que tenga una integración defectuosa. Se pueden seguir diversos enfoques para producir un genoma de vector no integrador. En algunos casos, se pueden diseñar mutaciones en el componente de la enzima integrasa del gen pol, de modo que codifique una proteína con una integrasa inactiva. En algunos casos, el propio genoma del vector puede modificarse para evitar la integración, por ejemplo, mutando o eliminando uno o ambos sitios de unión, o haciendo que el tracto de polipurina proximal (PPT) 3' lTr no funcional mediante eliminación o modificación. En algunos casos, se encuentran disponibles enfoques no genéticos; estos incluyen agentes farmacológicos que inhiben una o más funciones de la integrasa. Los enfoques no son mutuamente excluyentes; es decir, se puede utilizar más de uno a la vez. Por ejemplo, tanto la integrasa como los sitios de unión pueden ser no funcionales, o la integrasa y el sitio PPT pueden ser no funcionales, o los sitios de unión y el sitio PPT pueden ser no funcionales, o todos ellos pueden ser no funcionales. Dichos métodos y genomas de vectores virales son conocidos y están disponibles (ver Philpott y Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Engelman et al. J Virol 69:2729, 1995; Brown et al J Virol 73:9011 (1999); WO 2009/076524; McWilliams et al., J Virol 77:11150, 2003; Powell y Levin J Virol 70:5288, 1996).

[0199]En algunos casos, el vector contiene secuencias para la propagación en una célula huésped, tal como una célula huésped procariótica. En algunos casos, el ácido nucleico del vector viral contiene uno o más orígenes de replicación para la propagación en una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. En algunos casos, los vectores que incluyen un origen de replicación procariótico también pueden contener un gen cuya expresión confiere un marcador detectable o seleccionable tal como resistencia a fármacos.

[0200]El genoma del vector viral normalmente se construye en forma de plásmido que puede transfectarse en una línea celular productora o empaquetadora. Puede usarse cualquiera de una variedad de métodos conocidos para producir partículas retrovirales cuyo genoma contiene una copia de ARN del genoma del vector viral. En algunos casos, al menos dos componentes participan en la creación de un sistema de administración de genes basado en virus: primero, los plásmidos empaquetados, que abarcan las proteínas estructurales y las enzimas necesarias para generar una partícula de vector viral, y en segundo lugar, el propio vector viral, es decir, el material genético que se va a transferir. Se pueden introducir salvaguardias de bioseguridad en el diseño de uno o ambos componentes.

[0201]En algunos casos, el plásmido empaquetador puede contener todas las proteínas retrovirales, como las del VIH-1, distintas de las proteínas de la envoltura (Naldini et al., 1998). En otros casos, los vectores virales pueden carecer de genes virales adicionales, tales como aquellos que están asociados con la virulencia, por ejemplo, vpr, vif, vpu y nef, y/o Tat, un transactivador primario del VIH. En algunos casos, los vectores lentivirales, como los vectores lentivirales basados en el VIH, comprenden sólo tres genes del virus parental: gag, pol y rev, lo que reduce o elimina la posibilidad de reconstitución de un virus de tipo salvaje mediante recombinación.

[0202]En algunos casos, el genoma del vector viral se introduce en una línea celular empaquetadora que contiene todos los componentes necesarios para empaquetar el ARN genómico viral, transcrito a partir del genoma del vector viral, en partículas virales. Alternativamente, el genoma del vector viral puede comprender uno o más genes que codifican componentes virales además de una o más secuencias, por ejemplo, ácidos nucleicos recombinantes, de interés. Sin embargo, en algunos aspectos, para evitar la replicación del genoma en la célula diana, los genes virales endógenos necesarios para la replicación se eliminan y se proporcionan por separado en la línea celular empaquetadora.

[0203]En algunos casos, se transfecta una línea celular empaquetadora con uno o más vectores plásmidos que contienen los componentes necesarios para generar las partículas. En algunos casos, se transfecta una línea celular empaquetadora con un plásmido que contiene el genoma del vector viral, incluidas las LTR, la secuencia empaquetadora que actúa en cis y la secuencia de interés, es decir, un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno, tal como un CAR; y uno o más plásmidos auxiliares que codifican los componentes enzimáticos y/o estructurales del virus, tales como Gag, pol y/o rev. En algunos casos, se utilizan múltiples vectores para separar los diversos componentes genéticos que generan las partículas del vector retroviral. En algunos de estos casos, proporcionar vectores separados a la célula empaquetadora reduce la posibilidad de eventos de recombinación que de otro modo podrían generar virus con capacidad de replicación. En algunos casos, se puede utilizar un único vector plasmídico que tenga todos los componentes retrovirales.

[0204]En algunos casos, la partícula del vector retroviral, tal como la partícula del vector lentiviral, se pseudotipifica para aumentar la eficacia de transducción de las células huésped. Por ejemplo, una partícula de vector retroviral, tal como una partícula de vector lentiviral, en algunos casos está pseudotipada con una glicoproteína VSV-G, que proporciona una amplia gama de huéspedes celulares que amplía los tipos de células que pueden transducirse. En algunos casos, una línea celular empaquetadora se transfecta con un plásmido o polinucleótido que codifica una glicoproteína de envoltura no nativa, tal como para incluir envolturas xenotrópicas, politrópicas o anfotrópicas, tales como la envoltura del virus Sindbis, GALV o VSV-G.

[0205]En algunos casos, la línea celular empaquetadora proporciona los componentes, incluidas las proteínas estructurales y reguladoras virales, que se requieren en trans para el empaquetado del ARN genómico viral en partículas de vectores lentivirales. En algunos casos, la línea celular empaquetadora puede ser cualquier línea celular que sea capaz de expresar proteínas lentivirales y producir partículas de vectores lentivirales funcionales. En algunos aspectos, las líneas celulares empaquetadoras adecuadas incluyen 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLA (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) y Cf2Th (ATCC CRL 1430) células.

[0206]En algunos casos, la línea celular empaquetadora expresa de manera estable la proteína o proteínas virales. Por ejemplo, en algunos aspectos, se puede construir una línea celular empaquetadora que contenga los genes gag, pol, rev y/u otros genes estructurales pero sin la LTR ni los componentes empaquetadores. En algunos casos, una línea celular empaquetadora puede transfectarse transitoriamente con moléculas de ácido nucleico que codifican una o más proteínas virales junto con el genoma del vector viral que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga y/o un ácido nucleico que codifica una glicoproteína de la envoltura.

[0207]En algunos casos, los vectores virales y los plásmidos empaquetadores y/o auxiliares se introducen mediante transfección o infección en la línea celular empaquetadora. La línea celular empaquetadora produce partículas de vector viral que contienen el genoma del vector viral. Los métodos de transfección o infección son bien conocidos. Los ejemplos no limitantes incluyen fosfato cálcico, DEAE-dextrano y métodos de lipofección, electroporación y microinyección.

[0208]Cuando un plásmido recombinante y la LTR retroviral y las secuencias de empaquetado se introducen en una línea celular especial (p. ej., mediante precipitación con fosfato cálcico, por ejemplo), las secuencias de empaquetado pueden permitir que el transcrito de ARN del plásmido recombinante se empaquete en partículas virales, que luego puede ser secretada a los medios de cultivo. A continuación se recogen los medios que contienen los retrovirus recombinantes, opcionalmente se concentran y se utilizan para la transferencia de genes. Por ejemplo, en algunos aspectos, después de la cotransfección de los plásmidos empaquetadores y el vector de transferencia a la línea celular empaquetadora, las partículas del vector viral se recuperan de los medios de cultivo y se titulan mediante métodos estándar utilizados por los expertos en la técnica.

[0209]En algunos casos, se puede producir un vector retroviral, tal como un vector lentiviral, en una línea celular empaquetadora, tal como una línea celular HEK 293T ejemplar, mediante la introducción de plásmidos para permitir la generación de partículas lentivirales. En algunos casos, una célula empaquetadora se transfecta y/o contiene un polinucleótido que codifica gag y pol, y un polinucleótido que codifica un receptor recombinante, tal como un receptor de antígeno, por ejemplo, un CAR. En algunos casos, la línea celular empaquetadora se transfecta opcionalmente y/o adicionalmente con y/o contiene un polinucleótido que codifica una proteína rev. En algunos casos, la línea celular empaquetadora se transfecta opcionalmente y/o adicionalmente con y/o contiene un polinucleótido que codifica una glicoproteína de envoltura no nativa, tal como VSV-G. En algunos de estos casos, aproximadamente dos días después de la transfección de células, por ejemplo, células HEK 293T, el sobrenadante celular contiene vectores lentivirales recombinantes, que pueden ser recuperados y titulados.

[0210]Las partículas de vectores retrovirales recuperadas y/o producidas se pueden usar para transducir células diana usando los métodos descritos. Una vez en las células diana, el ARN viral se transcribe de forma inversa, se importa al núcleo y se integra de forma estable en el genoma del huésped. Uno o dos días después de la integración del ARN viral, se puede detectar la expresión de la proteína recombinante, por ejemplo, del receptor de antígeno, tal como CAR.

[0211]En algunos casos, los métodos descritos implican métodos de transducción de células poniendo en contacto, por ejemplo, incubando, una composición celular que comprende una pluralidad de células con una partícula viral. En algunos casos, las células que se van a transfectar o transducir son o comprenden células primarias obtenidas de un sujeto, tales como células enriquecidas y/o seleccionadas de un sujeto.

[0212]En algunos casos, la concentración de células a transducir de la composición es de o desde aproximadamente 1,0 x 105 células/mL a 1,0 x 108 células/mL, tal como al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente 1,0 x 105 células /mL, 5 x 105 células/mL, 1 x 106 células/mL, 5 x 106 células/mL, 1 x 107 células/mL, 5 x 107 células/mL o 1 x 108 células/mL.

[0213]En algunos casos, las partículas virales se proporcionan en una determinada proporción de copias de las partículas del vector viral o unidades infecciosas (UI) de las mismas, por el número total de células a transducir (UI/célula). Por ejemplo, en algunos casos, las partículas virales están presentes durante el contacto en o aproximadamente o al menos en o aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o 60 UI de las partículas del vector viral por una de las células.

[0214]En algunos casos, el título de partículas de vector viral está entre o entre aproximadamente 1 x 106 UI/mL y 1 x 108 UI/mL, tal como entre o entre aproximadamente 5 x 106 UI/mL y 5 x 107 UI/mL, como al menos 6 x 106 UI/mL, 7 x 106 UI/mL, 8 x 106 UI/mL, 9 x 106 UI/mL, 1 x 107 UI/mL, 2 x 107 UI/mL, 3 x 107 UI/mL, 4 x 107 UI/mL o 5 x 107 UI/mL.

[0215]En algunos casos, la transducción se puede lograr con una multiplicidad de infección (MOI) de menos de 100, tal como generalmente menos de 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 o menos.

[0216]En algunos casos, el método implica poner en contacto o incubar las células con las partículas virales. En algunos casos, el contacto dura de 30 minutos a 72 horas, tal como de 30 minutos a 48 horas, de 30 minutos a 24 horas o de 1 hora a 24 horas, tal como al menos o aproximadamente al menos 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas o más.

[0217]En algunos casos, el contacto se realiza en solución. En algunos casos, las células y las partículas virales se ponen en contacto en un volumen de o desde aproximadamente 0,5 mL a 500 mL, tal como de o desde aproximadamente 0,5 mL a 200 mL, de 0,5 mL a 100 mL, de 0,5 mL a 50 mL, de 0,5 mL a 500 mL. mL a 10 mL, 0,5 mL a 5 mL, 5 mL a 500 mL, 5 mL a 200 mL, 5 mL a 100 mL, 5 mL a 50 mL, 5 mL a 10 mL, 10 mL a 500 mL, 10 mL a 200 mL, 10 mL a 100 mL, 10 mL a 50 mL, 50 mL a 500 mL, 50 mL a 200 mL, 50 mL a 100 mL, 100 mL a 500 mL, 100 mL a 200 mL o 200 mL a 500 mL.

[0218]En ciertos casos, las células de entrada se tratan, incuban o se ponen en contacto con partículas que comprenden moléculas de unión que se unen o reconocen el receptor recombinante codificado por el ADN viral.

[0219]En algunos casos, la incubación de las células con las partículas del vector viral da como resultado o produce una composición de salida que comprende células transducidas con las partículas del vector viral.

2. Vectores no virales

[0220]En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a células T mediante electroporación(véase,por ejemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 y Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a células T mediante transposición (véase, por ejemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74 y Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Otros métodos para introducir y expresar material genético en células inmunes incluyen transfección con fosfato cálcico (p. ej., como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, NY), fusión de protoplastos, transfección mediada por liposomas catiónicos; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN con fosfato de estroncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).

[0221]Otros enfoques y vectores para la transferencia de los ácidos nucleicos que codifican los productos recombinantes son los descritos, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional, publicación número: WO2014055668 y Patente de EE. UU. número 7.446.190.

[0222]En algunos casos, las células, por ejemplo, células T, pueden transfectarse durante o después de la expansión, por ejemplo, con un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR). Esta transfección para la introducción del gen del receptor deseado se puede realizar, por ejemplo, con cualquier vector retroviral adecuado. La población de células genéticamente modificadas puede entonces liberarse del estímulo inicial (p. ej., el estímulo CD3/CD28) y estimularse a continuación con un segundo tipo de estímulo, por ejemplo, mediante un receptor introducido de novo). Este segundo tipo de estímulo puede incluir un estímulo antigénico en forma de una molécula de péptido/MHC, el ligando afín (entrecruzado) del receptor introducido genéticamente (p. ej., ligando natural de un CAR) o cualquier ligando (tal como un anticuerpo) que se une directamente dentro del marco del nuevo receptor (p. ej., reconociendo regiones constantes dentro del receptor). Véase, por ejemplo, Cheadle et al, “Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 o Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine vol. 65: 333-347 (2014).

[0223]En algunos casos, se puede usar un vector que no requiere que las células, por ejemplo, células T, estén activadas. En algunos de estos casos, las células pueden seleccionarse y/o transducirse antes de la activación. Por lo tanto, las células pueden diseñarse antes o después del cultivo de las células, y en algunos casos al mismo tiempo que o durante al menos una parte del cultivo.

[0224]En algunos aspectos, las células se modifican además para promover la expresión de citocinas u otros factores. Entre los ácidos nucleicos adicionales, por ejemplo, genes para introducción, se encuentran aquellos para mejorar la eficacia de la terapia, tal como promoviendo la viabilidad y/o función de las células transferidas; genes para proporcionar un marcador genético para la selección y/o evaluación de las células, tal como para evaluar la supervivencia o localizaciónin vivo;genes para mejorar la seguridad, por ejemplo, haciendo que la célula sea susceptible a la selección negativa in vivo como describen Lupton SD et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); y Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); véanse también las publicaciones PCT/US91/08442 y PCT/US94/05601 de Lupton et al. que describe el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de un marcador seleccionable positivo dominante con un marcador seleccionable negativo.Véase,por ejemplo, Riddell et al., Patente de EE. UU. N° 6.040.177, en las columnas 14-17.

[0225]En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante transposones. Los transposones (elementos transponibles) son segmentos móviles de ADN que pueden moverse de un locus a otro dentro de los genomas. Estos elementos se mueven mediante un mecanismo conservador de “cortar y pegar”: la transposasa cataliza la escisión del transposón de su ubicación original y promueve su reintegración en otras partes del genoma. Los elementos deficientes en transposasa pueden movilizarse si la transposasa la proporciona otro gen de transposasa. Por tanto, se pueden utilizar transposones para incorporar un ADN extraño en un genoma huésped sin el uso de un sistema de transducción viral. Ejemplos de transposones adecuados para su uso con células de mamíferos, por ejemplo, leucocitos primarios humanos, incluyen, entre otros, La Bella Durmiente y Piggybac.

[0226]La transfección basada en transposones es un sistema de dos componentes que consta de una transposasa y un transposón. En algunos casos, el sistema comprende un transposón diseñado para comprender un ADN extraño (también denominado aquí ADN de carga), por ejemplo, un gen que codifica un receptor recombinante, que está flanqueado por secuencias de repetición invertida/repetición directa (IR/DR) que son reconocidos por una transposasa que los acompaña. En algunos casos, un plásmido no viral codifica una transposasa bajo el control de un promotor. La transfección del plásmido en una célula huésped da como resultado una expresión transitoria de la transposasa, por lo que durante un período inicial después de la transfección, la transposasa se expresa a niveles suficientes para integrar el transposón en el ADN genómico. En algunos casos, la propia transposasa no está integrada en el ADN genómico y, por tanto, la expresión de la transposasa disminuye con el tiempo. En algunos casos, la expresión de la transposasa es expresada por la célula huésped a niveles suficientes para integrar un transposón correspondiente durante menos de aproximadamente 4 horas, menos de aproximadamente 8 horas, menos de aproximadamente 12 horas, menos de aproximadamente 24 horas, menos de aproximadamente 2 días, menos de aproximadamente 3 días, menos de aproximadamente 4 días, menos de aproximadamente 5 días, menos de aproximadamente 6 días, menos de aproximadamente 7 días, menos de aproximadamente 2 semanas, menos de aproximadamente 3 semanas, menos de aproximadamente 4 semanas, menos de aproximadamente 5 semanas, o menos de aproximadamente 8 semanas. En algunos casos, el ADN de carga que se introduce en el genoma del huésped no se elimina posteriormente del genoma del huésped, al menos porque la dosis del huésped no expresa una transposasa endógena capaz de escindir el ADN de carga.

[0227]La Bella Durmiente (SB) es un miembro sintético de la superfamilia de transposones Tc/1-mariner, reconstruido a partir de elementos latentes alojados en el genoma de los peces salmónidos. La transfección basada en transposones SB es un sistema de dos componentes que consta de una transposasa y un transposón que contiene secuencias de repetición invertida/repetición directa (IR/DR) que dan como resultado una integración precisa en un dinucleótido TA. El transposón está diseñado con un casete de expresión de interés flanqueado por IR/DR. La transposasa SB se une a sitios de unión específicos que se encuentran en el IR del transposón de La Bella Durmiente. La transposasa SB media la integración del transposón, un elemento móvil que codifica una secuencia de carga flanqueada en ambos lados por repeticiones terminales invertidas que albergan sitios de unión para la enzima catalítica (SB). La expresión estable se produce cuando SB inserta secuencias genéticas en los cromosomas de los vertebrados en un dinucleótido objetivo TA mediante un mecanismo de cortar y pegar. Este sistema se ha utilizado para diseñar una variedad de tipos de células de vertebrados, incluidos los leucocitos primarios de sangre periférica humana. En algunos casos, las células se ponen en contacto, se incuban y/o se tratan con un transposón SB que comprende un gen de carga, por ejemplo, un gen que codifica un receptor recombinante o un CAR, flanqueado por secuencias IR de SB. En casos particulares, las células que se van a transfectar se ponen en contacto, se incuban y/o se tratan con un plásmido que comprende un transposón SB que comprende un gen de carga, por ejemplo, un gen que codifica un CAR, flanqueado por secuencias IR de SB. En ciertos casos, el plásmido comprende además un gen que codifica una transposasa de SB que no está flanqueada por secuencias IR de SB.

[0228]PiggyBac (PB) es otro sistema de transposones que se puede utilizar para integrar ADN de carga en el ADN genómico de un huésped, por ejemplo, de un ser humano. La transposasa PB reconoce secuencias de repetición terminal invertida (ITR) específicas del transposón PB ubicadas en ambos extremos del transposón y mueve eficientemente el contenido de los sitios originales y los integra eficientemente en los sitios cromosómicos TTAA. El sistema de transposones PB permite que los genes de interés entre las dos ITR en el vector PB se movilicen en genomas diana. El sistema PB se ha utilizado para diseñar una variedad de tipos de células de vertebrados, incluidas células humanas primarias. En algunos casos, las células que se van a transfectar se ponen en contacto, se incuban y/o se tratan con un transposón de PB que comprende un gen de carga, por ejemplo, un gen que codifica un CAR, flanqueado por secuencias IR de PB. En casos particulares, las células que se van a transfectar se ponen en contacto, se incuban y/o se tratan con un plásmido que comprende un transposón de PB que comprende un gen de carga, por ejemplo, un gen que codifica un CAR, flanqueado por secuencias IR de PB. En ciertos casos, el plásmido comprende además un gen que codifica una transposasa SB que no está flanqueada por secuencias PB IR.

[0229]En algunos casos, los diversos elementos del transposón/transposasa empleados en los métodos en cuestión, por ejemplo, vector(es) SB o PB, pueden producirse mediante métodos estándar de escisión, ligación y clonación molecular. Un protocolo para construir los vectores en cuestión incluye los siguientes pasos. En primer lugar, los fragmentos de ácido nucleico purificados que contienen secuencias de nucleótidos componentes deseadas así como secuencias extrañas se escinden con endonucleasas de restricción de fuentes iniciales, por ejemplo, un vector que comprende el gen de la transposasa. Después se separan los fragmentos que contienen las secuencias de nucleótidos deseadas de los fragmentos no deseados de diferente tamaño usando métodos de separación convencionales, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos deseados se escinden del gel y se ligan entre sí en la configuración apropiada de modo que se produzca un ácido nucleico circular o un plásmido que contiene las secuencias deseadas, por ejemplo, secuencias correspondientes a los diversos elementos de los vectores en cuestión, como se describió anteriormente. Cuando se desea, las moléculas circulares así construidas se amplifican después en un huésped procariótico, por ejemplo,E. coli.Los procedimientos de escisión, construcción de plásmidos, transformación celular y producción de plásmidos implicados en estas etapas son bien conocidos por los expertos en la técnica y las enzimas necesarias para la restricción y la ligación están disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, R. Wu, Ed., Methods in Enzymology, Vol. 68, Academic Press, N.Y. (1979); T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor. Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); Catálogo 1982-83, New England Biolabs, Inc; Catálogo 1982-83, Bethesda Research Laboratories, Inc. Se proporciona un ejemplo de cómo construir los vectores empleados en los métodos en cuestión en la sección Experimental, más adelante. La preparación de un sistema de transposones representativo de La Bella Durmiente también se describe en los documentos WO 98/40510 y WO 99/25817).

[0230]En algunos casos, la transducción con transposones se realiza con un plásmido que comprende un gen de transposasa y un plásmido que comprende un transposón que contiene una secuencia de ADN carga que está flanqueada por secuencias de repetición invertida/repetición directa (IR/DR) que son reconocidas por transposasa. En ciertos casos, la secuencia de ADN carga codifica una proteína heteróloga, por ejemplo, un receptor de células T recombinante o un CAR. En algunos casos, el plásmido comprende transposasa y el transposón. En algunos casos, la transposasa está bajo el control de un promotor ubicuo o cualquier promotor adecuado para impulsar la expresión de la transposasa en la célula diana. Los promotores ubicuos incluyen, entre otros, EF1a, CMB, SV40, PGK1, Ubc, p-actina humana, CAG, TRE, UAS, Ac5, CaMKIIa y U6. En algunos casos, el ADN carga comprende un casete de selección que permite la selección de células con integración estable del ADN carga en el ADN genómico. Los casetes de selección adecuados incluyen, entre otros, casetes de selección que codifican un gen de resistencia a la kanamicina, un gen de resistencia a la espectinomicina, un gen de resistencia a la estreptomicina, un gen de resistencia a la ampicilina, un gen de resistencia a la carbenicilina, un gen de resistencia a la higromicina, un gen de resistencia a la bleomicina, un gen de resistencia a la eritromicina y un gen de resistencia a la polimixina B.

[0231]En algunos casos, los componentes para la transducción con un transposón, por ejemplo, plásmidos que comprenden una transposasa SB y un transposón SB, se introducen en la célula diana. Se puede emplear cualquier protocolo conveniente, donde el protocolo puede proporcionar la introducción in vitro o in vivo de los componentes del sistema en la célula diana, dependiendo de la ubicación de la célula diana. Por ejemplo, cuando la célula diana es una célula aislada, el sistema puede introducirse directamente en la célula en condiciones de cultivo celular que permitan la viabilidad de la célula diana, por ejemplo, utilizando técnicas de transformación estándar. Dichas técnicas incluyen, entre otras: infección viral, transformación, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, tecnología de pistola de partículas, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, administración de vectores virales y similares. La elección del método depende generalmente del tipo de célula que se transforma y de las circunstancias bajo las cuales se produce la transformación (es decir, in vitro, ex vivo o in vivo). Puede encontrarse una discusión general de estos métodos en Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wiley & Sons, 1995.

[0232]En algunos casos, el transposón SB y la fuente de transposasa SB se introducen en una célula diana de un organismo multicelular, por ejemplo, un mamífero o un ser humano, en condiciones suficientes para la escisión del ácido nucleico flanqueado por repetición invertida del vector que porta el transposón y posterior integración del ácido nucleico escindido en el genoma de la célula diana. Algunos casos comprenden además una etapa para garantizar que la actividad transposasa requerida esté presente en la célula diana junto con el transposón introducido. Dependiendo de la estructura del propio vector transposón, es decir, si el vector incluye o no una región que codifica un producto que tiene actividad transposasa, el método puede incluir además la introducción de un segundo vector en la célula diana que codifica la actividad transposasa requerida.

[0233]En algunos casos, la cantidad de ácido nucleico vector que comprende el transposón y la cantidad de ácido nucleico vector que codifica la transposasa que se introduce en la célula es suficiente para proporcionar la escisión e inserción deseadas del ácido nucleico transposón en el genoma de la célula diana. Como tal, la cantidad de ácido nucleico vector introducida debe proporcionar una cantidad suficiente de actividad transposasa y un número de copias suficiente del ácido nucleico que se desea insertar en la célula diana. La cantidad de ácido nucleico vector que se introduce en la célula diana varía dependiendo de la eficacia del protocolo de introducción particular que se emplea, por ejemplo, el protocolo de administración ex vivo particular que se emplea.

[0234]Una vez que el ADN del vector ha entrado en la célula diana en combinación con la transposasa necesaria, la región de ácido nucleico del vector que está flanqueada por repeticiones invertidas, es decir, el ácido nucleico del vector situado entre las repeticiones invertidas reconocidas por la transposasa de La Bella Durmiente, se escinde del vector a través de la transposasa proporcionada y se inserta en el genoma de la célula objetivo. Como tal, a la introducción del ADN del vector en la célula diana le sigue una escisión posterior mediada por transposasa y la inserción del ácido nucleico exógeno transportado por el vector en el genoma de la célula diana. En casos particulares, el vector está integrado en los genomas de al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 4 %, al menos el 5 %, al menos el 6 %, al menos el 7 %, al menos el 8 %, al menos el 9 %, al menos el 10 %, al menos el 15 % o al menos el 20 % de las células que se transfectan con el transposón SB y/o la transposasa SB. En algunos casos, la integración del ácido nucleico en el genoma de la célula diana es estable, es decir, el ácido nucleico vector permanece presente en el genoma de la célula diana durante más de un periodo de tiempo transitorio y pasa a través de una parte del material genético cromosómico a la descendencia de la célula diana.

[0235]En determinados casos, los transposones se utilizan para integrar ácidos nucleicos, es decir, polinucleótidos, de diversos tamaños en el genoma de la célula diana. En algunos casos, el tamaño del ADN que se inserta en el genoma de una célula diana utilizando los métodos en cuestión varía de aproximadamente 0,1 kb a 200 kb, de aproximadamente 0,5 kb a 100 kb, de aproximadamente 1,0 kb a aproximadamente 8,0 kb, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 200 kb, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10 kb, de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 50 kb, de aproximadamente 50 kb a aproximadamente 100 kb, o de aproximadamente 100 kb a aproximadamente 200 kb. En algunos casos, el tamaño del ADN que se inserta en el genoma de una célula diana utilizando los métodos en cuestión varía desde aproximadamente 1,0 kb hasta aproximadamente 8,0 kb. En algunos casos, el tamaño del ADN que se inserta en el genoma de una célula diana utilizando los métodos en cuestión oscila entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 200 kb. En casos particulares, el tamaño del ADN que se inserta en el genoma de una célula diana usando los métodos en cuestión varía de aproximadamente 1,0 kb a aproximadamente 8,0 kb.

D. Cultivo y/o expansión de células

[0236]En algunos casos, los métodos divulgados incluyen uno o más pasos para cultivar células, por ejemplo, cultivar células en condiciones que promuevan la proliferación y/o expansión. En algunos casos, las células se cultivan en condiciones que promueven la proliferación y/o expansión posterior a una etapa de ingeniería genética, por ejemplo, introduciendo un polipéptido recombinante en las células mediante transducción o transfección. En casos particulares, las células se cultivan después de haber sido incubadas en condiciones estimulantes y transducidas o transfectadas con un polinucleótido recombinante, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un receptor recombinante.

[0237]En ciertos casos, la una o más composiciones de células T modificadas genéticamente son o incluyen dos composiciones separadas de células T enriquecidas. En casos particulares, se cultivan por separado dos composiciones separadas de células T enriquecidas, por ejemplo, dos composiciones separadas de células T enriquecidas seleccionadas, aisladas y/o enriquecidas a partir de la misma muestra biológica, en condiciones estimulantes. En ciertos casos, las dos composiciones separadas incluyen una composición de células T CD4+ enriquecidas. En casos particulares, las dos composiciones separadas incluyen una composición de células T CD8+ enriquecidas. En algunos casos, se cultivan por separado dos composiciones separadas de células T CD4+ enriquecidas y células T CD8+ enriquecidas, por ejemplo, en condiciones que promuevan la proliferación y/o expansión. En algunos casos, se cultiva una única composición de células T enriquecidas. En ciertos casos, la composición única es una composición de células T CD4+ enriquecidas. En algunos casos, la composición única es una composición de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas que se han combinado a partir de composiciones separadas antes del cultivo.

[0238]En algunos casos, la composición de células T CD4+ enriquecidas que se cultiva, por ejemplo, en condiciones que promueven la proliferación y/o expansión, incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99.9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD4+. En algunos casos, la composición incluye al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD8+ que expresan el receptor recombinante y/o han sido transducidas o transfectadas con el polinucleótido recombinante. En ciertos casos, la composición de células T CD4+ enriquecidas que se cultiva incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD8+, y/o no contiene células T CD8+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD8+.

[0239]En algunos casos, la composición de células T CD8+ enriquecidas que se cultiva, por ejemplo, en condiciones que promueven la proliferación y/o expansión, incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99.9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD8+. En casos particulares, la composición incluye al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD8+ que expresan el receptor recombinante y/o han sido transducidas o transfectadas con el polinucleótido recombinante. En ciertos casos, la composición de células T CD8+ enriquecidas que se incuba en condiciones estimulantes incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD4+, y/o no contiene células T CD4+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD4+.

[0240]En algunos casos, se combinan composiciones separadas de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas en una única composición y se cultivan, por ejemplo, en condiciones que promuevan la proliferación y/o expansión. En ciertos casos, composiciones cultivadas separadas de células T CD4+ enriquecidas y CD8+ enriquecidas se combinan en una única composición después de que se haya realizado y/o completado el cultivo.

[0241]En algunos casos, se cultiva una composición de células T enriquecidas en condiciones que promueven la proliferación y/o expansión. En algunos casos, tales condiciones pueden diseñarse para inducir proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de células en la población. En casos particulares, las condiciones estimulantes pueden incluir uno o más de medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones y/o factores estimuladores, tales como citocinas, quimiocinas, antígenos, compañeros de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes y cualquier otro agente diseñado para promover el crecimiento, división y/o expansión de las células.

[0242]En casos particulares, las células se cultivan en presencia de una o más citocinas. En casos particulares, la una o más citocinas son citocinas recombinantes. En algunos casos, una o más citocinas son citocinas recombinantes humanas. En ciertos casos, una o más citocinas se unen y/o son capaces de unirse a receptores que se expresan por y/o son endógenos a las células T. En casos particulares, la una o más citocinas es o incluye un miembro de la familia de citocinas del haz de 4-alfa-hélice. En algunos casos, los miembros de la familia de citoquinas del haz de 4-alfa-hélice incluyen, entre otros, interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 (IL-7), interleucina-9 (IL-9), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF).

[0243]En casos particulares, las células no se incuban, se ponen en contacto y/o se exponen a un agente que inhibe la actividad mTOR, tal como un agente descrito en el presente documento, por ejemplo, en la Sección II, antes del cultivo, por ejemplo, un cultivo en condiciones que promuevan la proliferación y/o ampliación.

[0244]En ciertos casos, al menos una parte del cultivo se realiza en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, tal como un agente descrito en el presente documento, por ejemplo, en la Sección II. En algunos casos, todo y/o el cultivo completo se realiza en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR.

[0245]En casos particulares, las células se cultivan en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR es un agente descrito en el presente documento, tal como en la Sección II. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR también inhibe la actividad de una quinasa adicional. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR también inhibe la actividad de la fosfoinositiol-3 quinasa (PI3K). En ciertos casos, el agente inhibe selectivamente la actividad mTOR, por ejemplo, no inhibe de forma detectable la actividad PI3K y/o no inhibe la actividad PI3K en la misma medida que la actividad mTOR, en concentraciones que son suficientes para inhibir la actividad mTOR. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR inhibe la actividad quinasa. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR inhibe la actividad mTORC1 y/o mTORC2. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR inhibe la actividad quinasa mTORC1 y mTORC2.

[0246]En algunos casos, las células se cultivan con agentes seleccionados de PI-103, SF1126, BGT226, XL765, PF-04691502, NVP-BEZ235, pirazolopirimidina, Torin l, Torkinib (PP242), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth), AZD8055, rapamicina (sirolimus), temsirolimus (CC1779), everolimus (RAD001), deforolimus (AP23573), AZD8055 (AstraZeneca) y OSI-027. (OSI). En algunos casos, las células se cultivan con un agente que tiene o incluye una fórmula que se proporciona en la Sección II, por ejemplo, Fórmula (I), Fórmula (II) o Fórmula (III). En algunos casos, el agente es el Compuesto 155, el Compuesto 246 o el Compuesto 63.

[0247]En ciertos casos, las células se cultivan en presencia de un agente que inhibe la actividad de mTOR a una concentración que inhibe, reduce y/o disminuye la actividad de mTOR. En algunos casos, la concentración inhibe, reduce y/o disminuye una o más actividades de mTOR en aproximadamente o al menos un 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,9 %. En algunos casos, la concentración del agente no impide que las células T primarias proliferen y/o se expandan. En algunos casos, las células se cultivan en presencia de entre 1 nM y 1 |jM, entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 250 nM, entre 100 nM y 250 nM, entre 200 nM y 500 nM, entre 50 nM y 250 nM, entre 100 nM y 500 nM, entre 500 nM y 1 jM , entre 1 jM y 10 jM , o entre 5 jM y 50 jM del agente que inhibe la actividad mTOR. En ciertos casos, las células se cultivan en presencia de aproximadamente o de al menos 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 500 nM, 1 jM , 5 jM , 10 jM , 25 jM , 50 jM o 100 jM del agente que inhibe la actividad mTOR.

[0248]En algunos casos, las células se cultivan en presencia del Compuesto 155. En ciertos casos, las células se cultivan en presencia de entre 1 nM y 1 jM , entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 200 nM, entre 100 nM y 250 nM, o entre 200 nM y 500 nM del Compuesto 155. En casos particulares, las células se cultivan en presencia de, aproximadamente o al menos 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM o 500 nM del Compuesto 155.

[0249]En ciertos casos, las células se cultivan en presencia del Compuesto 246. En ciertos casos, las células se cultivan en presencia de entre 1 nM y 1 jM , entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 200 nM, entre 100 nM y 250 nM, o entre 200 nM y 500 nM del Compuesto 155. En ciertos casos, las células se cultivan en presencia de, aproximadamente o al menos 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM o 500 nM del Compuesto 246.

[0250]En casos particulares, las células se cultivan en presencia del Compuesto 63. En ciertos casos, las células se cultivan en presencia de entre 1 nM y 1 jM , entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 200 nM, entre 100 nM y 250 nM, o entre 200 nM y 500 nM del Compuesto 63. En algunos casos, las células se cultivan en presencia de, aproximadamente o al menos 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM o 500 nM del Compuesto 63.

[0251]En algunos casos, el cultivo se realiza en condiciones que generalmente incluyen una temperatura adecuada para el crecimiento de células inmunitarias primarias, tales como linfocitos T humanos, por ejemplo, al menos aproximadamente 25 grados Celsius, generalmente al menos aproximadamente 30 grados y generalmente a o aproximadamente 37 grados Celsius. En algunos casos, la composición de células T enriquecidas se incuba a una temperatura de 25 a 38 °C, tal como de 30 a 37 °C, por ejemplo, a o aproximadamente 37 °C ± 2 °C. En algunos casos, la incubación se lleva a cabo durante un período de tiempo hasta que el cultivo, por ejemplo, cultivo o expansión, dé como resultado una densidad, número o dosis de células deseada o umbral. En algunos casos, la incubación es mas de o mas de aproximadamente o dura aproximadamente 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días o más.

[0252]En casos particulares, el cultivo se realiza en un sistema cerrado. En determinados casos, el cultivo se realiza en un sistema cerrado en condiciones estériles. En casos particulares, el cultivo se realiza en el mismo sistema cerrado que uno o más pasos de los sistemas divulgados. En algunos casos, la composición de células T enriquecidas se retira de un sistema cerrado y se coloca y/o se conecta a un biorreactor para el cultivo. Ejemplos de biorreactores adecuados para el cultivo incluyen, entre otros, GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20 | 50, sistemas de biorreactor Finesse SmartRocker y sistemas de biorreactor Pall XRS. En algunos casos, el biorreactor se usa para perfundir y/o mezclar las células durante al menos una parte de la etapa de cultivo.

[0253]En algunos casos, la mezcla es o incluye balanceo y/o movimiento. En algunos casos, el biorreactor puede estar sujeto a movimientos o oscilaciones que, en algunos aspectos, pueden aumentar la transferencia de oxígeno. El movimiento del biorreactor puede incluir, entre otros, rotación a lo largo de un eje horizontal, rotación a lo largo de un eje vertical, un movimiento de balanceo a lo largo de un eje horizontal inclinado o inclinado del biorreactor o cualquier combinación de los mismos. En algunos casos, al menos una parte de la incubación se lleva a cabo mediante balanceo. La velocidad de balanceo y el ángulo de balanceo se pueden ajustar para lograr la agitación deseada. En algunos casos, el ángulo de la roca es 20°, 19°, 18°, 17°, 16°, 15°, 14°, 13°, 12°, 11°, 10°, 9°, 8°, 7°, 6 °, 5°, 4°, 3°, 2° o 1°. En ciertos casos, el ángulo de la roca está entre 6 y 16°. En otros casos, el ángulo de la roca está entre 7 y 16°. En otros casos, el ángulo de la roca está entre 8 y 12°. En algunos casos, la velocidad de la roca es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 rpm. En algunos casos, la velocidad de oscilación está entre 4 y 12 rpm, tal como entre 4 y 6 rpm, inclusive.

[0254]En algunos casos, el biorreactor mantiene la temperatura en o cerca de 37 °C y los niveles de CO2 en o cerca del 5 % con un flujo de aire constante en, aproximadamente o al menos 0,01 L/min, 0,05 L/min, 0,1 L/min, 0,2 L/min, 0,3 L/min, 0,4 L/min, 0,5 L/min, 1,0 L/min, 1,5 L/min o 2,0 L/min o más de 2,0 L/min. En ciertos casos, al menos una parte del cultivo se realiza con perfusión, tal como con una tasa de 290 ml/día, 580 ml/día y/o 1160 ml/día, por ejemplo, dependiendo del momento en relación con el inicio del cultivo y/o densidad de las células cultivadas. En algunos casos, al menos una parte de la expansión del cultivo celular se realiza con un movimiento de balanceo, tal como en un ángulo de entre 5° y 10°, tal como 6°, a una velocidad de balanceo constante, tal como una velocidad de entre 5 y 15 RPM, como 6 RMP o 10 RPM.

E. Formulación de las células

[0255]En algunos casos, los métodos divulgados para fabricar, generar o producir una terapia celular y/o células diseñadas pueden incluir la formulación de células, tal como la formulación de células diseñadas genéticamente que resultan de las etapas de procesamiento divulgadas antes o después de la incubación, la ingeniería y cultivar, y/o una o más etapas de procesamiento adicionales como se describe. En algunos casos, los métodos divulgados asociados con la formulación de células incluyen el procesamiento de células transducidas, tales como células transducidas y/o expandidas usando las etapas de procesamiento descritas anteriormente, en un sistema cerrado. En algunos casos, la dosis de células que comprenden células diseñadas con un receptor de antígeno recombinante, por ejemplo, CAR o TCR, se describe como una composición o formulación, tal como una composición o formulación farmacéutica. Dichas composiciones se pueden usar de acuerdo con los métodos descritos, tales como en la prevención o tratamiento de enfermedades, afecciones y trastornos, o en métodos de detección, diagnóstico y pronóstico.

[0256]En algunos casos, las células se procesan en uno o más pasos (p. ej., se llevan a cabo en la cámara centrífuga y/o sistema cerrado) para fabricar, generar o producir una terapia celular y/o las células diseñadas pueden incluir formulación de células, tal como formulación de células genéticamente modificadas resultantes de las etapas de procesamiento de transducción descritas antes o después del cultivo, por ejemplo, cultivo y expansión, y/o una o más etapas de procesamiento adicionales como se describe. En algunos casos, las células se pueden formular en una cantidad para administración de dosis, tal como para una administración de dosis unitaria única o administración de dosis múltiples. En algunos casos, los métodos divulgados asociados con la formulación de células incluyen el procesamiento de células transducidas, tales como células transducidas y/o expandidas usando las etapas de procesamiento descritas anteriormente, en un sistema cerrado.

[0257]En ciertos casos, se formulan una o más composiciones de células T enriquecidas. En casos particulares, se formulan una o más composiciones de células T enriquecidas después de que una o más composiciones hayan sido diseñadas y/o cultivadas. En casos particulares, una o más composiciones son composiciones de entrada. En algunos casos, la una o más composiciones de entrada se han criocongelado y almacenado previamente, y se descongelan antes de la incubación.

[0258]En algunos casos, se formulan células T, tales como células T CD4+ y/o CD8+, generadas por una o más de las etapas de procesamiento. En algunos aspectos, se fabrican, producen o generan por separado una pluralidad de composiciones, cada una de las cuales contiene una población y/o subtipos de células diferentes del sujeto, tales como para administración por separado o de forma independiente, opcionalmente dentro de un cierto período de tiempo. Por ejemplo, formulaciones separadas de células diseñadas que contienen diferentes poblaciones o subtipos de células pueden incluir células T CD8+ y CD4+, respectivamente, y/o poblaciones enriquecidas en CD8+ y CD4+, respectivamente, por ejemplo, células T CD4+ y/o CD8+, cada una de las cuales incluye individualmente células genéticamente modificadas. para expresar el receptor recombinante. En algunos casos, al menos una composición se formula con células T CD4+ modificadas genéticamente para expresar el receptor recombinante. En algunos casos, al menos una composición se formula con células T CD8+ modificadas genéticamente para expresar el receptor recombinante. En algunos casos, la administración de la dosis comprende la administración de una primera composición que comprende una dosis de células T CD8+ o una dosis de células T CD4+ y la administración de una segunda composición que comprende la otra dosis de células T CD4+ y las células T CD8+. En algunos casos, una primera composición que comprende una dosis de células T CD8+ o una dosis de células T CD4+ se administra antes de la segunda composición que comprende la otra dosis de células T CD4+ y las células T CD8+. En algunos casos, la administración de la dosis comprende la administración de una composición que comprende tanto una dosis de células T CD8+ como una dosis de células T CD4+.

[0259]En ciertos casos, la una o más composiciones de células T enriquecidas son o incluyen dos composiciones separadas, por ejemplo, composiciones separadas diseñadas y/o cultivadas, de células T enriquecidas. En casos particulares, se formulan por separado dos composiciones separadas de células T enriquecidas, por ejemplo, dos composiciones separadas de células T enriquecidas seleccionadas, aisladas y/o enriquecidas a partir de la misma muestra biológica. En ciertos casos, las dos composiciones separadas incluyen una composición de células T CD4+ enriquecidas. En casos particulares, las dos composiciones separadas incluyen una composición de células T CD8+ enriquecidas. En algunos casos, se formulan por separado dos composiciones separadas de células T CD4+ enriquecidas y células T CD8+ enriquecidas. En algunos casos, se formula una única composición de células T enriquecidas. En ciertos casos, la composición única es una composición de células T CD4+ enriquecidas. En algunos casos, la composición única es una composición de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas que se han combinado a partir de composiciones separadas antes de la formulación.

[0260]En algunos casos, se combinan composiciones separadas de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas en una única composición y se formulan. En ciertos casos, composiciones formuladas separadas de células T CD4+ enriquecidas y CD8+ enriquecidas se combinan en una única composición después de que se haya realizado y/o completado la formulación.

[0261]En algunos casos, la composición de células T CD4+ enriquecidas que se formula incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD4+. En algunos casos, la composición incluye al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100% de células T CD4+ que expresan un receptor recombinante y/o han sido transducidas o transfectadas con el polinucleótido recombinante. En ciertos casos, la composición de células T CD4+ enriquecidas que se formula incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD8+, y/o no contiene células T CD8+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD8+.

[0262]En algunos casos, la composición de células T CD8+ enriquecidas que se formula, por ejemplo, en condiciones que promueven la proliferación y/o expansión, incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD8+. En ciertos casos, la composición incluye al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD8+ que expresan el receptor recombinante y/o han sido transducidas o transfectadas con el polinucleótido recombinante. En ciertos casos, la composición de células T CD8+ enriquecidas que se incuba en condiciones estimulantes incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD4+, y/o no contiene células T CD4+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD4+.

[0263]En ciertos casos, las células formuladas son células de salida. En algunos casos, una composición formulada de células T enriquecidas es una composición de salida de células T enriquecidas. En casos particulares, las células T CD4+ formuladas y/o las células T CD8+ formuladas son las células T CD4+ y/o CD8+ de salida. En casos particulares, una composición formulada de células T CD4+ enriquecidas es una composición de salida de células T CD4+ enriquecidas. En algunos casos, una composición formulada de células T CD8+ enriquecidas es una composición de salida de células T CD8+ enriquecidas.

[0264]En algunos casos, las células se pueden formular en un recipiente, como una bolsa o un vial.

[0265]En algunos casos, las células se formulan en un tampón farmacéuticamente aceptable, que puede, en algunos aspectos, incluir un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, el procesamiento incluye el intercambio de un medio por un medio o tampón de formulación que sea farmacéuticamente aceptable o deseado para su administración a un sujeto. En algunos casos, las etapas de procesamiento pueden implicar lavar las células transducidas y/o expandidas para reemplazar las células en un tampón farmacéuticamente aceptable que puede incluir uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables opcionales. Un ejemplo de tales formas farmacéuticas, incluidos vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, puede ser cualquiera de las descritas a continuación junto con formas aceptables para administrar las células y composiciones a un sujeto. En algunos casos, la composición farmacéutica contiene las células en cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad o afección, tal como una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz.

[0266]Un “vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, entre otros, un tampón, excipiente, estabilizador o conservante.

[0267]En algunos aspectos, la elección del vehículo está determinada en parte por la célula particular y/o por el método de administración. Por consiguiente, existen diversas formulaciones adecuadas. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio y cloruro de benzalconio. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o sus mezclas están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente 0,0001 % a aproximadamente 2 % en peso de la composición total. Los vehículos se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Los vehículos farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen, entre otros: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluidos glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG).

[0268]En algunos aspectos se incluyen agentes tampón en las composiciones. Los agentes tampón adecuados incluyen, por ejemplo, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido fosfórico, fosfato de potasio y otros ácidos y sales diversos. En algunos aspectos, se usa una mezcla de dos o más agentes tampón. El agente tampón o sus mezclas están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 4 % en peso de la composición total. Se conocen métodos para preparar composiciones farmacéuticas administrables. Los métodos ejemplares se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a edición. (1 de mayo de 2005).

[0269]Las formulaciones pueden incluir soluciones acuosas. La formulación o composición también puede contener más de un ingrediente activo útil para la indicación, enfermedad o afección particular que se está tratando con las células, preferiblemente aquellas con actividades complementarias a las células, donde las respectivas actividades no se afectan adversamente entre sí. Dichos ingredientes activos están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que sean eficaces para el fin previsto. Así, en algunos casos, la composición farmacéutica incluye además otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, tales como agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, asparaginasa, busulfán, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina y/o vincristina.

[0270]En algunos casos, las composiciones se describen como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que en algunos aspectos pueden tamponarse a un pH seleccionado. Las composiciones líquidas pueden comprender vehículos, que pueden ser un disolvente o un medio dispersante que contenga, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando las células en un disolvente, tal como mezcladas con un vehículo, diluyente o excipiente adecuado tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (p. ej., metilcelulosa), agentes tampón del pH, aditivos gelificantes o mejoradores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes y/o colorantes, dependiendo de la vía de administración y la preparación. deseado. En algunos aspectos se pueden consultar los textos estándar para preparar preparativos adecuados.

[0271]Se pueden añadir diversos aditivos que mejoran la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluidos conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol y ácido sórbico. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

[0272]En algunos casos, el tampón de formulación contiene un criopreservante. En algunos casos, las células se formulan con una solución ciropreservante que contiene de 1,0 % a 30 % de solución de DMSO, tal como una solución de 5 % a 20 % de DMSO o una solución de 5 % a 10 % de DMSO. En algunos casos, la solución de criopreservación es o contiene, por ejemplo, PBS que contiene 20 % de DMSO y 8 % de albúmina sérica humana (HSA), u otros medios de congelación de células adecuados. En algunos casos, la solución criopreservante es o contiene, por ejemplo, al menos o aproximadamente un 7,5 % de DMSO. En algunos casos, los pasos de procesamiento pueden implicar lavar las células transducidas y/o expandidas para reemplazar las células en una solución criopreservante. En algunos casos, las células se congelan, por ejemplo, se criocongelan o se criopreservan, en medios y/o solución con una concentración final de o de aproximadamente 12,5 %, 12,0 %, 11,5 %, 11,0 %, 10,5 %, 10,0 %, 9,5 %, 9,0 %, 8,5 %, 8,0 %, 7,5 %, 7,0 %, 6,5 %, 6.0 %, 5,5 % o 5,0 % de DMSO, o entre 1 % y 15 %, entre 6 % y 12 %, entre 5 % y 10 %, o entre 6 % y 8 % de DMSO. En casos particulares, las células se congelan, por ejemplo, se criocongelan o se criopreservan, en medios y/o solución con una concentración final de o de aproximadamente 5,0 %, 4,5 %, 4,0 %, 3,5 %, 3,0 %, 2,5 %, 2,0 %, 1,5 %, 1,25 %, 1.0 %, 0,75 %, 0,5 % o 0,25 % HSA, o entre 0,1 % y 5 %, entre 0,25 % y 4 %, entre 0,5 % y 2 %, o entre 1 % y 2 % de HSA.

[0273]En algunos casos, la formulación se lleva a cabo usando una o más etapas de procesamiento que incluyen lavar, diluir o concentrar las células, tales como las células cultivadas o expandidas. En algunos casos, el procesamiento puede incluir dilución o concentración de las células hasta una concentración o número deseado, tal como composiciones en forma de dosis unitaria que incluyen el número de células para administración en una dosis determinada o fracción de la misma. En algunos casos, las etapas de procesamiento pueden incluir una reducción de volumen para aumentar así la concentración de células según se desee. En algunos casos, las etapas de procesamiento pueden incluir una adición de volumen para disminuir así la concentración de células según se desee. En algunos casos, el procesamiento incluye agregar un volumen de un tampón de formulación a las células transducidas y/o expandidas. En algunos casos, el volumen del tampón de formulación es de o desde aproximadamente 10 m La 1000 mL, tal como al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente o 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL. mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL o 1000 mL.

[0274]En algunos casos, dichas etapas de procesamiento para formular una composición celular se llevan a cabo en un sistema cerrado. Se pueden realizar ejemplos de tales pasos de procesamiento usando una cámara centrífuga junto con uno o más sistemas o kits asociados con un sistema de procesamiento celular, tal como una cámara centrífuga producida y vendida por Biosafe SA, incluidos aquellos para uso con los sistemas de procesamiento celular Sepax® o Sepax 2®. Un sistema y un proceso ejemplares se describen en la Publicación Internacional N° WO2016/073602. En algunos casos, el método incluye efectuar la expresión desde la cavidad interna de la cámara centrífuga de una composición formulada, que es la composición resultante de células formuladas en un tampón de formulación, tal como un tampón farmacéuticamente aceptable, en cualquiera de los casos anteriores como se describe. En algunos casos, la expresión de la composición formulada es a un recipiente, tal como los viales de los recipientes de material biomédico descritos en el presente documento, que está vinculado operativamente como parte de un sistema cerrado con la cámara centrífuga. En algunos casos, los recipientes de material biomédico están configurados para su integración y/o conexión operativa y/o están integrados o conectados operativamente a un sistema o dispositivo cerrado que lleva a cabo uno o más pasos de procesamiento. En algunos casos, el recipiente de material biomédico está conectado a un sistema en una línea de salida o posición de salida. En algunos casos, el sistema cerrado está conectado al vial del recipiente de material biomédico en el tubo de entrada. Los sistemas de cierre ejemplares para su uso con los recipientes de material biomédico descritos en el presente documento incluyen el sistema Sepax® y Sepax® 2.

[0275]En algunos casos, el sistema cerrado, tal como el asociado con una cámara centrífuga o un sistema de procesamiento celular, incluye un kit de salida de múltiples puertos que contiene un colector de tubos de múltiples vías asociado en cada extremo de una línea de tubos con un puerto al que uno o un se pueden conectar una pluralidad de recipientes para la expresión de la composición formulada. En algunos aspectos, se puede conectar de forma estéril un número o pluralidad de viales deseados a uno o más, generalmente dos o más, tales como al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más de la salida de multi-puerto. Por ejemplo, en algunos casos, uno o más recipientes, por ejemplo, recipientes de material biomédico, pueden estar unidos a los puertos, o a menos de todos los puertos. Por lo tanto, en algunos casos, el sistema puede efectuar la expresión de la composición de salida en una pluralidad de viales de los recipientes de material biomédico.

[0276]En algunos aspectos, las células se pueden expresar en uno o más de la pluralidad de recipientes de salida, por ejemplo, viales, en una cantidad para administración de dosificación, tal como para una administración de dosificación unitaria única o administración de dosificación múltiple. Por ejemplo, en algunos casos, cada uno de los viales puede contener el número de células para la administración en una dosis determinada o fracción de la misma. Por lo tanto, cada vial, en algunos aspectos, puede contener una única dosis unitaria para administración o puede contener una fracción de una dosis deseada de manera que más de uno de la pluralidad de viales, tal como dos de los viales, o 3 de los viales, juntos constituyen una dosis para la administración.

[0277]Así, los recipientes, por ejemplo, bolsas o viales, generalmente contienen las células que se van a administrar, por ejemplo, una o más dosis unitarias de las mismas. La dosis unitaria puede ser una cantidad o número de células que se van a administrar al sujeto o el doble del número (o más) de células que se van a administrar. Puede ser la dosis más baja o la dosis más baja posible de las células que se administrarían al sujeto.

[0278]En algunos casos, cada uno de los recipientes, por ejemplo, bolsas o viales, comprende individualmente una dosis unitaria de las células. Así, en algunos casos, cada uno de los recipientes comprende el mismo número de células, aproximadamente o sustancialmente el mismo. En algunos casos, cada dosis unitaria contiene al menos o aproximadamente al menos 1 x 106, 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, o 1 x 108 células modificadas, células totales, células T o PBMC. En algunos casos, el volumen de la composición celular formulada en cada recipiente, por ejemplo, bolsa o vial, es de 10 ml a 100 ml, tal como al menos o aproximadamente al menos 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml o 100 ml. En algunos casos, las células del recipiente, por ejemplo, bolsa o viales, pueden criopreservarse. En algunos casos, el recipiente, por ejemplo, viales, se puede almacenar en nitrógeno líquido hasta su uso posterior.

[0279]En algunos casos, dichas células producidas mediante el método, o una composición que comprende dichas células, se administran a un sujeto para tratar una enfermedad o afección.

F. Características ejemplares de la composición de la producción

[0280]En casos particulares, los métodos divulgados se usan en conexión con un proceso que produce o genera una o más composiciones de salida de células T enriquecidas a partir de una o más composiciones de entrada y/o de una única muestra biológica. En ciertos casos, la una o más composiciones de salida contienen células que expresan un receptor recombinante, por ejemplo, un TCR o un CAR. En algunos casos, el proceso implica una incubación, ingeniería y/o cultivo de células en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, tal como cualquiera de los descritos, por ejemplo, el Compuesto 63. En casos particulares, las células de las composiciones resultantes son adecuadas para la administración a un sujeto como terapia, por ejemplo, una terapia celular autóloga.

[0281]En algunos casos, las células de la composición resultante se diseñan para expresar un receptor recombinante mediante los métodos descritos en el presente documento, tales como los descritos anteriormente. En ciertos casos, las células de la composición resultante se diseñan para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), por ejemplo, un CAR anti-CD19.

[0282]En algunos casos, la una o más composiciones de salida es una composición de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas. En ciertos casos, la una o más composiciones de salida incluyen una composición de células T CD4+ enriquecidas. En casos particulares, la una o más composiciones de salida incluyen una composición de células T CD8+ enriquecidas. En algunos casos, la una o más composiciones de salida incluyen una composición de salida de células T CD4+ enriquecidas y una composición de salida de células T CD8+ enriquecidas.

[0283]En algunos casos, una composición de salida de células T CD4+ enriquecidas incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD4+. En ciertos casos, la composición de la producción incluye al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD4+ que expresan el receptor recombinante y/o han sido transducidas o transfectadas con el polinucleótido recombinante. En ciertos casos, la composición de salida de células T CD4+ enriquecidas incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD8+, y/o no contiene células T CD8+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD8+.

[0284]En algunos casos, una composición de salida de células T CD8+ enriquecidas incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99%, al menos 99,5%, al menos 99,9%, o en o aproximadamente el 100% de células T CD8+. En casos particulares, la composición incluye al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100% de células T CD8+ que expresan el receptor recombinante y/o han sido transducidas o transfectadas con el polinucleótido recombinante. En ciertos casos, la composición de salida de células T CD8+ enriquecidas incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD4+, y/o no contiene células T CD4+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD4+.

[0285]En ciertos casos, el proceso asociado con los métodos divulgados se compara con un proceso ejemplar y/o alternativo. En algunos casos, el proceso alternativo y/o ejemplar es similar o igual que el proceso asociado con los métodos divulgados, con la excepción de que las composiciones de células (p. ej., células de entrada, células estimuladas y/o células diseñadas que incluían células T CD4+ enriquecidas, las células T CD8+ enriquecidas y/o las células T CD4+ y CD8+ enriquecidas) no se incuban, diseñan ni cultivan en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, el Compuesto 63. En algunos casos, las células de salida del proceso alternativo ejemplar no se cultiva previamente, por ejemplo, para expandir células T diseñadas, en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, por ejemplo, el Compuesto 63. En algunos casos, las células de salida producidas por el proceso alternativo ejemplar se diseñan para expresar el mismo receptor recombinante que las células de la composición producida en asociación con los métodos descritos.

[0286]En algunos casos, uno o más genes se expresan diferencialmente por las células de la composición de salida en comparación con la expresión en células de salida de un proceso alternativo ejemplar, por ejemplo, un proceso mediante el cual las células no se cultivan en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, Compuesto 63. En algunos casos, uno o más genes están regulados negativamente en células de la composición de salida en comparación con las células de salida producidas mediante un proceso alternativo ejemplar. En algunos casos, uno o más genes asociados con la respuesta al estrés metabólico, activación de células T, vía de activación Th1 y Th2, detención del ciclo celular, biosíntesis de glucocorticoides, hematopoyesis de células madre pluripotentes, activación de células T, diferenciación de linfocitos, migración de leucocitos, tipo cisteína. La actividad inhibidora de la endopeptidasa, la progresión del ciclo celular, la respuesta a los niveles de nutrientes y la señalización del receptor del factor de crecimiento están reguladas negativamente en las células de la composición de salida en comparación con las células de salida producidas mediante el proceso alternativo ejemplar.

[0287]En ciertos casos, uno o más genes están regulados positivamente en células de la composición de salida en comparación con las células de salida producidas mediante un proceso alternativo ejemplar, tal como un proceso no llevado a cabo en presencia de un agente que inhibe mTOR, por ejemplo, el Compuesto 63. En algunos casos, uno o más genes asociados con la señalización del receptor del factor de crecimiento, oxidación de ácidos grasos, vía de señalización del receptor de citoquinas gamma común, desglicosilación de proteínas, activación de células T, diferenciación de linfocitos en la progresión del ciclo celular, vía de activación Th1 y Th2, homeostasis de esteroles, hematopoyesis a partir de células madre pluripotentes, el proceso apoptótico, la activación de células T y la activación de RAR, y la señalización mediada por iones están regulados positivamente en las células de la composición de salida en comparación con las células de salida producidas mediante el proceso alternativo ejemplar.

[0288]En algunos casos, la composición de salida contiene células, por ejemplo, células T CD4+ y/o CD8+ diseñadas para expresar un receptor recombinante, que tienen la misma o mayor respuesta a la estimulación por un antígeno, por ejemplo, un antígeno que está unido y/o reconocido por el receptor recombinante, en comparación con las células producidas mediante un proceso alternativo ejemplar, por ejemplo, un proceso en el que las células no se cultivan en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, el compuesto 63. En algunos casos, las células de la composición de salida tienen el mismo o mayor, y/o son capaces de producir el mismo o mayor aumento en el metabolismo glucolítico, actividad mTOR, producción de citoquinas, actividad citolítica, expansión y/o proliferación en respuesta. a la estimulación por el antígeno en comparación con las células de salida producidas por el proceso alternativo ejemplar.

[0289]En algunos casos, las células de salida tienen una respuesta similar con respecto a un parámetro, atributo y/o actividad a la de las células de salida producidas por un proceso ejemplar/alternativo (p. ej., un proceso en el que las células no se incuban, diseñan y/o cultivan) en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, el Compuesto 63). En algunos casos, una medición de la respuesta similar de las células de salida no es estadísticamente diferente de una medición de la respuesta de las células de salida producidas por el proceso alternativo ejemplar. En algunos casos, la medición de la respuesta similar de las células de salida está dentro del 25 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % de la medición de la respuesta de las células de salida producidas por el proceso alternativo ejemplar.

[0290]En ciertos casos, los cambios en el metabolismo celular, por ejemplo, la tasa del metabolismo glucolítico, pueden funcionar como un impulsor y/o un regulador de la función de las células inmunitarias. En algunos casos, las células de la composición de salida tienen un aumento similar en la tasa de metabolismo glicolítico mediante estimulación antigénica que las células de salida producidas mediante un proceso alternativo ejemplar (p. ej., un proceso en el que las células no se cultivan en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, el compuesto 63). En algunos casos, las células de la composición de salida tienen aproximadamente o tienen al menos un aumento del 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces en la tasa de metabolismo glucolítico en respuesta a la estimulación por un antígeno. En ciertos casos, el aumento del metabolismo glucolítico en respuesta a la estimulación del antígeno es al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 50 % o 100 % mayor que el aumento en la tasa del metabolismo glucolítico por estimulación del antígeno en las células de salida producida por el proceso alternativo ejemplar. En ciertos casos, el metabolismo glicolítico puede medirse mediante cualquier medio conocido, incluida la medición extracelular del consumo de oxígeno y la producción de ácido (ECAR).

[0291]En casos particulares, las células de la composición de salida tienen un aumento similar de actividad mTOR mediante estimulación antigénica que las células de salida producidas mediante un proceso alternativo ejemplar (p. ej., un proceso en el que las células no se cultivan en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, Compuesto 63). En algunos casos, las células de la composición de salida tienen aproximadamente o tienen al menos un aumento de 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 125 %, 150 %, 1 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces de la actividad mTOR en respuesta a la estimulación de un antígeno. En ciertos casos, el aumento de la actividad mTOR en respuesta a la estimulación antigénica es al menos un 25 %, 50 %, 75 % o 100 % mayor que el aumento en la actividad mTOR por estimulación antigénica en las células de salida producidas por el proceso alternativo ejemplar.

[0292]En ciertos casos, las células de la composición de salida tienen una producción de citoquinas similar en respuesta a la estimulación antigénica a la de las células de salida producidas mediante un proceso alternativo ejemplar (p. ej., un proceso en el que las células no se cultivan en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, compuesto 63). En algunos casos, las células de la composición de salida tienen una producción similar de una citocina, por ejemplo, TNF-alfa, IFN-gamma y/o IL-2, en respuesta a la estimulación antigénica, como las células de salida producidas mediante el proceso alternativo ejemplar. En algunos casos, las células de la composición de salida tienen aproximadamente o tienen al menos un aumento de 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 100 %, 125 %, 150 %, 1,2, 3, 4 o 5 veces en la producción de una o más citoquinas en respuesta a la estimulación por un antígeno en comparación con un proceso alternativo no llevado a cabo en presencia de un agente que inhibe mTOR, por ejemplo, el Compuesto 63. En ciertos casos, el aumento de la actividad mTOR en respuesta a la estimulación del antígeno es al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 50 % o 100 % mayor que la producción de una o más citoquinas después de la estimulación antigénica en las células de salida producidas por el proceso alternativo ejemplar. En algunos casos, la producción de una citoquina se puede medir o evaluar mediante técnicas estándar conocidas, que incluyen, entre otras, ELISA y/o métodos de detección basados en anticuerpos.

[0293]En casos particulares, las células de la composición de salida tienen una porción, porcentaje y/o cantidad de células que producen una o más citocinas en respuesta a la estimulación antigénica similar a la porción, porcentaje y/o cantidad de células de salida producidas mediante un proceso alternativo ejemplar (p. ej., un proceso en el que las células no se cultivan en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, el Compuesto 63). En ciertos casos, aproximadamente o al menos el 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de las células de la composición de salida producen una o más citoquinas, por ejemplo, TNF-alfa, IFN-gamma y/o IL-2, en respuesta a la estimulación del antígeno. En casos particulares, la porción, porcentaje y/o cantidad de células de la composición de salida que producen una o más citoquinas es aproximadamente o al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 75 %, 100 %, 125 %, 150 %, o 1,2, 3 veces, mayor que la porción, porcentaje y/o cantidad de células de salida producido por el proceso alternativo ejemplar que produce una o más citocinas. En ciertos casos, la porción, porcentaje y/o cantidad de células que producen una citocina se puede medir o evaluar mediante cualquier técnica conocida o estándar, incluidos ensayos de tinción de citoquinas intracelulares (ICS).

[0294]En casos particulares, las células de la composición de salida tienen una actividad citolítica similar hacia las células que expresan un antígeno unido y/o reconocido por el receptor recombinante (p. ej., células diana) que las células de salida producidas mediante un proceso alternativo ejemplar (p. ej., un proceso en el que las células no se incuban, diseñan y/o cultivan en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, el Compuesto 63). En algunos casos, cuando las células de la composición de salida se exponen a las células que expresan el antígeno, por ejemplo, las células diana, las células de la composición de salida matan, matan aproximadamente o matan al menos al 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de células que expresan el antígeno. En ciertos casos, las células de la composición de salida matan al menos un 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, o 1,2, 3, 4 o 5 veces más cantidad de células que expresan el antígeno, por ejemplo, células diana, que las células de salida producidas mediante un proceso alternativo ejemplar en condiciones similares o iguales.

[0295]En casos particulares, las células de la composición de salida tienen una porción, porcentaje y/o cantidad menor, reducido y/o disminuido de células que expresan uno o más marcadores de agotamiento en comparación con la porción, porcentaje y/o cantidad de las células de salida producidas mediante un proceso alternativo ejemplar (p. ej., un proceso en el que las células no se cultivan en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, el Compuesto 63). En ciertos casos, menos de o aproximadamente el 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 1 % o 0,1 % de las células de la composición de salida expresan uno o más marcadores de agotamiento. En ciertos casos, la porción, porcentaje y/o cantidad de células que expresan uno o más marcadores de agotamiento en la composición de salida es o es al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % menos que la porción, porcentaje y/o cantidad de células que expresan uno o más marcadores en una composición de salida producida mediante el proceso alternativo ejemplar. En casos particulares, uno o más marcadores de agotamiento son o incluyen CTLA-4, FOXP3, PD-1, TIGIT, L<a>B-3, 2B4, BTLA, TIM3, VISTA y/o CD96.

[0296]En diversos casos, las células de la composición de salida tienen una porción, porcentaje y/o cantidad de células inferior, reducida y/o disminuida que se diferencian en comparación con la porción, porcentaje y/o cantidad de células de salida producidas. mediante un proceso alternativo ejemplar (p. ej., un proceso en el que las células no se cultivan en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, el Compuesto 63). En ciertos casos, las células de la composición resultante están menos diferenciadas que las células producidas mediante métodos alternativos. En casos particulares, las células menos diferenciadas de la composición de salida tienen o incluyen una mayor capacidad de estimulación, activación, expansión, respuesta de citoquinas, actividad citolítica o actividad antitumoral que las células más diferenciadas producidas mediante un proceso alternativo ejemplar.

[0297]En algunos casos, los métodos descritos producen una composición de salida de células que aumentan en el número o porcentaje de células T similares a la memoria, tales como una población de células T de larga vida y menos diferenciadas, como las células T de memoria de larga vida. En algunos casos, dichas células T de memoria son células T de memoria central (Tcm) o células madre T de memoria (Tscm). En algunos casos, las células T de memoria son células T<scm>. En algunos casos, las células de la composición de salida tienen un número o porcentaje mayor o mayor de células que tienen un fenotipo similar a la memoria, como las células T de memoria de larga duración. En algunos casos, el número o porcentaje de células T similares a la memoria, tales como células T de memoria de larga duración o células madre de memoria (T<scm>), en la composición aumenta al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces., 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces en comparación con el número o porcentaje de la población correspondiente de células de salida producidas por un proceso alternativo ejemplar (p. ej., un proceso donde las células no se cultivan en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, el Compuesto 63).

[0298]En ciertos casos, las células de la composición resultante se administran a un sujeto. En algunos casos, las células de la composición resultante se administran para tratar una enfermedad o afección. En algunos casos, la enfermedad o condición es cáncer. En algunos casos, las células de las composiciones producidas se administran al sujeto, y el sujeto experimenta una reducción en las células cancerosas y/o el volumen del tumor. En algunos casos, el sujeto tiene, tiene aproximadamente o tiene al menos un 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98%, 99%, reducción del 100% de la cantidad de células cancerosas y/o reducción del tumor después de la administración de las células de la composición resultante, por ejemplo, en comparación con la cantidad de células cancerosas y/o el volumen del tumor en el sujeto antes de la administración. En algunos casos, la administración de células de la composición resultante da como resultado una reducción aumentada del volumen tumoral y/o la cantidad de células cancerosas en el sujeto en comparación con la reducción del volumen tumoral y/o la cantidad de células cancerosas en el sujeto después administración de células de salida producidas mediante un proceso alternativo ejemplar (p. ej., un proceso en el que las células no se cultivan en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, el Compuesto 63). En casos particulares, la administración de células de la composición resultante da como resultado un aumento en la reducción del volumen del tumor y/o la cantidad de células cancerosas en el sujeto de aproximadamente o al menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 125 %, 150 %, 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, de 5 veces, en comparación con la reducción del volumen tumoral y/o la cantidad de células cancerosas en el sujeto después de la administración de células producidas mediante el proceso alternativo ejemplar.

[0299]En casos particulares, las células de las composiciones resultantes, por ejemplo, células diseñadas que expresan un receptor recombinante, son detectables en un sujeto, por ejemplo, detectables en muestras biológicas tales como muestras de suero obtenidas de un sujeto, después de la administración. En ciertos casos, las células de la composición de salida son detectables en sujetos al menos a las 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas siguientes, o al menos a los 3, 6, 12, 18, 24, 30 o 36 meses, o al menos 1,2, 3, 4, 5 o más años después de la administración de las células de la composición de salida. En algunos casos, la administración de células de la composición de salida da como resultado una persistencia aumentada o mejoradain vivodespués de la administración en comparación con las células de salida producidas mediante un proceso alternativo ejemplar (p. ej., un proceso en el que las células no se cultivan en presencia de un agente mTOR). inhibidor, por ejemplo, el compuesto 63). En casos particulares, la administración de células de la composición de salida es detectable en un sujeto durante, aproximadamente, o durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas, o durante, aproximadamente, o durante al menos 3, 6, 12, 18, 24, 30 o 36 meses, o durante aproximadamente o durante al menos I, 2, 3 o más años más que las células de salida producidas mediante un proceso alternativo ejemplar.

[0300]En algunos casos, administrar las células de la composición de salida a un sujeto, por ejemplo, un sujeto con una enfermedad o condición tal como un cáncer, mejora la probabilidad y/o probabilidad de supervivencia. Por ejemplo, en algunos casos, las células de la composición de salida se administran a un sujeto con una enfermedad o afección, cuya probabilidad y/o probabilidad de supervivencia supera, aproximadamente o supera al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses, o más de 1, 2, 3, 4, 5, 10 o más de 10 años es al menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. En ciertos casos, la administración con las células de la composición de salida proporciona al menos un 10 %, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, o al menos una probabilidad de supervivencia 1, 2, 3, 4 o 5 veces mayor que la administración con células de salida de un proceso alternativo ejemplar (p. ej. un proceso en el que las células no se incuban, diseñan y/o cultivan en presencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, el Compuesto 63).

II. AGENTES QUE INHIBEN LA ACTIVIDAD MTOR

[0301]En algunos casos, uno o más pasos de los métodos divulgados se llevan a cabo en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR. mTOR también se conoce como objetivo de la rapamicina en mamíferos, objetivo mecanicista de la rapamicina, proteína de unión a FK506, proteína 1 asociada al complejo 12-rapamicina, proteína asociada al complejo FKBP12-rapamicina, objetivo 1 de rapamicina y FKBP12, proteína objetivo 1 de rapamicina, FRAP, FRAP1, FRAP2, RAFT1 y rApT1. En algunos aspectos, la proteína mTOR humana corresponde al N° Uniprot: P42345. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos de la proteína mTOR humana se establece en SEQ ID NO: 34. En algunos casos, un agente que inhibe la actividad de mTOR inhibe, reduce y/o disminuye, y/o es capaz de inhibir, reducir y/o disminuir al menos una actividad de mTOR. En casos particulares, un agente que inhibe la actividad mTOR inhibe, reduce y/o disminuye y/o es capaz de inhibir, reducir y/o disminuir una actividad quinasa mTOR.

[0302]En algunos aspectos, mTOR es una treonina y serina proteína quinasa conservada y pertenece a la familia de quinasas relacionadas con fosfatidilinositol-3-quinasa (PIKK). mTOR es una proteína quinasa que fosforila residuos de treonina y serina en sus sustratos. En ciertos aspectos, mTOR sirve como subunidad catalítica de dos complejos multiproteicos denominados complejo mTOR 1 (mTORC1) y complejo 2 (mTORC2). En aspectos particulares, mTORC1 y mTORC2 funcionan de forma independiente entre sí, a pesar de que, en cierto aspecto, tanto mTORC1 como mTORC2 están involucrados en la vía de señalización de fosfoinositol-3 quinasa (PI3K) y Akt. En algunos casos, un agente que inhibe la actividad mTOR inhibe, reduce y/o disminuye y/o es capaz de inhibir, reducir y/o disminuir una actividad mTORC1, por ejemplo, una actividad quinasa mTORC1 y/o una actividad mTORC2.

[0303]En algunos aspectos, mTORC1 es un complejo proteico con cinco componentes: mTOR, que es la subunidad catalítica del complejo; proteína asociada a la regulación de mTOR (Raptor); letal para mamíferos con proteína Sec138 (mLST8, también conocida como GpL); sustrato de AKT rico en prolina de 40 kDa (PRAS40); y proteína que interactúa con mTOR que contiene el dominio DEP (Deptor). En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR previene la formación y/o desestabiliza el complejo mTORC1.

[0304]En ciertos aspectos, mTORC2 comprende seis proteínas diferentes, varias de las cuales son comunes a mTORC1 y mTORC2: mTOR; compañero de mTOR insensible a rapamicina (Rictor); proteína que interactúa con la proteína quinasa activada por estrés de mamíferos (mSIN1); proteína observada con Rictor-1 (Protor-1); mLST8; y Deptor. En casos particulares, el agente que inhibe la actividad previene la formación y/o desestabiliza el complejo mTORC2.

[0305]En algunos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR es un compuesto, una molécula pequeña, por ejemplo, una molécula orgánica pequeña, un polinucleótido, un oligonucleótido, un ARNip, un polipéptido o un fragmento, isoforma, variante, análogo o derivado del mismo que inhibe, reduce, previene y/o es capaz de inhibir, reducir o prevenir, una o más actividades de mTOR. En algunos casos, el agente es una molécula pequeña. En casos particulares, el agente es una molécula pequeña con un peso molecular inferior a 10 kD, inferior a 9 kD, inferior a 8 kD, inferior a 7 kD, inferior a 6 kD, inferior a 5 kD, inferior a 4 kD, inferior a 3 kD, inferior a 2 kD, inferior a 1 kD, inferior a 0,5 kD o inferior a 0,1 kD. En algunos casos, el agente es una molécula pequeña que es o contiene ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, peptoides, carbohidratos, lípidos, componentes de los mismos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas. En la técnica se conocen bibliotecas de mezclas químicas y/o biológicas, tales como extractos de hongos, bacterias o algas, y pueden examinarse con cualquiera de los ensayos de la invención. Se pueden encontrar ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares en: (Carell et al, 1994a; Carell et al, 1994b; Cho et al, 1993; DeWitt et al, 1993; Gallop et al, 1994; Zuckermann et al, 1994).

[0306] En casos particulares, el agente que inhibe la actividad mTOR específicamente y/o selectivamente inhibe al menos una actividad mTOR. En diversos casos, ese agente que inhibe la actividad mTOR inhibe al menos una actividad de una proteína mTOR, tal como, por ejemplo, la actividad de quinasa de proteína serina/treonina en al menos uno de sus sustratos, por ejemplo, p70S6 quinasa 1, 4E-BP1., Akt y eEF2. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR se une directamente e inhibe, y/o es capaz de unirse directamente e inhibir, mTORC1, mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2. En algunos casos, la inhibición de la actividad mTOR por parte del agente es irreversible. En ciertos casos, la inhibición de la actividad mTOR por parte del agente es reversible.

[0307] En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR tiene una CI50 de menos de 500 pM, menos de 200 |jM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 1 pM, menos de 500 nM, menos de 200 nM, menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 1 nM o menos de 500 pM. En cierto casos, el agente que inhibe la actividad mTOR tiene una CI50 de entre 1 nM y 500 pM, entre 1 nM y 500 nM, entre 1 pM y 500 pM, entre 10 pM y 100 pM, entre 100 nM y 1 pM, entre 250 nM y 750 nM, entre 50 nM y 200 nM, o entre 400 nM y entre 600 nM. En algunos casos, las determinaciones de CI50 se pueden lograr usando cualquier estándar conocido y/o técnica convencional. Por ejemplo, en algunos casos, se puede determinar una CI50 midiendo la actividad de mTOR en presencia de un rango de concentraciones del inhibidor en estudio. Los valores de actividad enzimática obtenidos experimentalmente se representan entonces frente a las concentraciones de inhibidor utilizadas. La concentración del inhibidor que muestra un 50 % de actividad enzimática (en comparación con la actividad en ausencia de cualquier inhibidor) se toma como valor “CI50”. De manera análoga, pueden definirse otras concentraciones inhibidoras mediante determinaciones apropiadas de la actividad. En algunos casos, la CI50 se mide en un ensayo libre de células. En casos particulares, la CI50 se mide en un ensayo de cultivo celular. En ciertos casos, el cultivo celular es un cultivo de células T, por ejemplo, un cultivo de células T primario.

[0308] En algunos casos, la inhibición de la actividad de mTORC1 y/o mTORC2 puede determinarse mediante una reducción en la transducción de señales aguas abajo de mTORC1 y/o mTORC2. Se puede utilizar una amplia variedad de lecturas para establecer una reducción de la salida de dicha vía de señalización. Por ejemplo, en algunos casos, las lecturas ejemplares no limitantes incluyen para la actividad mTORC2 (1) una disminución en la fosforilación de Akt en residuos, incluidos, entre otros, S473 y<t>308 y/o (2) una disminución en la activación de Akt como evidenciado, por ejemplo, por una reducción de la fosforilación de sustratos de Akt que incluyen, entre otros, Fox01 y Fox03a T24/32, GSK3-beta S21/9 y TSC2 T1462. En ciertos casos, las lecturas ejemplares no limitantes de la actividad de mTORC1 incluyen una disminución en la fosforilación de moléculas de señalización aguas abajo de mTORC1, que incluyen, entre otras, S6 S240/244 ribosomal, S6K1 T389 y 4EBP1 T37/46. En ciertos casos, una lectura ejemplar de la inhibición de mTORC1 y/o mTORC2 es la inhibición de la proliferación de células cancerosas.

[0309] La medición, detección y/o evaluación de proteínas con fosforilación específica de sitio se puede realizar mediante cualquier medio conocido, incluidos, entre otros, técnicas de tinción de anticuerpos e inmunoensayos, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), resonancia de plasmones de superficie (SPR), transferencia Western o matriz de proteínas.

[0310] En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR también puede inhibir quinasas que son estructuralmente similares a mTOR y/o tienen actividades iguales o sustancialmente similares a mTOR (un paninhibidor). En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR también inhibe la actividad fosfoinositol-3 quinasa (PI3K). En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR inhibe la actividad mTORC1, la actividad mTORC2 y la actividad PI3K. En casos particulares, el agente que inhibe la actividad mTOR inhibe la actividad quinasa de mTORC1, mTORC2 y PI3K. En aspectos particulares, se puede utilizar una amplia variedad de lecturas para establecer una reducción de la actividad de PI3K. En algunos casos, dichas lecturas incluyen, entre otras, (1) una disminución en la fosforilación de Akt en los residuos, incluidos, entre otros, S473 y T308 y/o (2) una disminución en la activación de Akt como se evidencia, por ejemplo. por ejemplo, mediante una reducción de la fosforilación de sustratos de Akt que incluyen, entre otros, Fox01 y Fox03a T24/32, GSK3-beta S21/9 y TSC2 T1462, y/o (3) una reducción de la cantidad, nivel o concentración de trifosfatos de fosfatidilinositol (3,4,5) (PIP3).

[0311] En algunos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR, por ejemplo, la actividad quinasa mTORC1 y/o mTORC2, también inhibe PI3K. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR inhibe la actividad de PI3K, mTORC1 y mTORC2 con una CI50 (concentración que inhibe el 50 % de la actividad) de menos de 500 mM, menos de 200 mM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 1 pM, menos de 500 nM, menos de 200 nM, menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 1 nM o menos de 500 pM. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR inhibe la actividad de PI3K, mTORC1 y mTORC2 con una CI50 de entre 1 nM y 500 mM, entre 1 nM y 500 nM, entre 1 mM y 500 mM, entre 1 nM y 1 pM, entre 10 pM y 100 pM, entre 100 nM y 1 pM, entre 250 nM y 750 nM, entre 50 nM y 200 nM, o entre 400 nM y entre 600 nM. En algunos casos, la CI50 se mide en un ensayo libre de células. En casos particulares, la CI50 se mide en un ensayo de cultivo celular. En ciertos casos, el cultivo celular es un cultivo de células T, por ejemplo, un cultivo de células T primario. En ciertos casos, dichos agentes incluyen, entre otros, PI-103, SF1126 (Semafore), BGT226 (Novartis), XI,765 (Exelixis), PF-04691502 y NVP-BEZ235 (Novartis). En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR es PI-103, SF1126, BGT226, XI,765, PF-04691502 y NVP-BEZ235.

[0312]En algunos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR no inhibe la actividad PI3K. En ciertos casos, el agente no reduce, inhibe o disminuye de manera detectable la actividad de PI3K en la CI50 para la actividad de mTOR. En casos particulares, el agente que inhibe la actividad mTOR tiene una CI50 para la actividad PI3K que es al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 50 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 150 %, al menos 1 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces, o al menos 100 veces mayor que el CI50 para una actividad mTOR. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR inhibe, por ejemplo, inhibe selectivamente, la actividad quinasa mTORC1 y mTORC2 en relación con la actividad PI3K. En ciertos casos, el inhibidor de la actividad mTOR es una pirazolopirimidina, Torin l, Torkinib (PP242), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth) o AZD8055.

[0313]En casos particulares, el agente que inhibe la actividad de mTOR inhibe selectivamente mTORC1 con una CI50 de menos de 500 pM, menos de 200 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM, menos de 10 pM, menos de 5 pM, menos de 1 pM, menos de 500 nM, menos de 200 nM, menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 1 nM, o menos de 500 pM. En determinados casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR inhibe la actividad de mTORC1 con una CI50 de entre 1 nM y 500 pM, entre 1 nM y 500 nM, entre 1 pM y 500 pM, entre 10 pM y 100 pM, entre 100 nM y 1 pM, entre 250 nM y 750 nM, entre 50 nM y 200 nM, o entre 400 nM y entre 600 nM. En algunos casos, la CI50 se mide en un ensayo libre de células. En casos particulares, la CI50 se mide en un ensayo de cultivo celular. En ciertos casos, el cultivo celular es un cultivo de células T, por ejemplo, un cultivo de células T primario.

[0314]En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR inhibe selectivamente la actividad de mTORC1 en relación con la actividad de mTORC2 y/o PI3K. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR tiene una CI50 para la actividad PI3K que es al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 50 %. al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 150 %, al menos 1 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces, o al menos 100 veces mayor que la CI 50 para una actividad mTORC1. En algunos casos, el agente es rapamicina (sirolimus). En casos particulares, el agente es un rapalog.

[0315]En ciertos casos, el rapálogo se une y/o es capaz de unirse al dominio mTOR FRB (dominio de unión a rapamicina FKBP), está relacionado estructuralmente con la rapamicina y/o conserva las propiedades inhibidoras de mTORC1 de la rapamicina. En algunos casos, el rapalog es un éster, éter, oxima, hidrazona y/o una hidroxilamina de rapamicina, y/o es un compuesto en el que los grupos funcionales de la estructura central de la rapamicina se han modificado, por ejemplo, mediante reducción u oxidación. Las sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos también se consideran derivados de rapamicina. Los ejemplos ilustrativos de rapálogos adecuados para su uso en los métodos contemplados en el presente documento incluyen, sin limitación, temsirolimus (CC1779), everolimus (RAD001), deforolimus (AP23573), AZD8055 (AstraZeneca) y OSI-027 (OSI).

[0316]En algunos casos, el agente es una molécula que se describe en la Pub. PCT. Nos.: WO2008/051493; WO2008/051494; o WO2010/062571; y/o Patentes de EE. UU. Nos.: 7.981.893; 8.372.976; 7.968.556; 8.383.634; 8.110.578; o 8.492.381.

[0317]En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR tiene o incluye la fórmula establecida en la Fórmula (I):

Fórmula (I)

en la que R1 es alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido. o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido,

R2 es alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, y

R3 y R4 son independientemente H o alquilo C1-8.

[0318]En algunos casos, el agente que inhibe mTOR es o contiene un compuesto de Fórmula (I), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma. En algunos casos, el agente que inhibe mTOR es o contiene un compuesto de fórmula (I) en la que R1 es arilo sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, tal como fenilo sustituido. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR es o contiene un compuesto de fórmula (I) son aquellos en los que R2 es arilo sustituido o no sustituido, tal como fenilo sustituido o no sustituido. En casos particulares, el agente que inhibe mTOR es o contiene un compuesto de fórmula (I) en la que los grupos que están sustituidos están sustituidos con uno o más halógenos; alquilo C1-8; alquenilo C2-8; alquinilo C2-8; hidroxilo; alcoxilo C1-8; aminado; nitro; tiol; tioéter; yo mismo; ciano; amido; fosfonato; fosfina; carboxilo; tiocarbonilo; sulfonilo; sulfonamida; cetona; aldehído; ester; carbonilo; haloalquilo; B(OH)2; cicloalquilo carbocíclico, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo monocíclico o policíclico condensado o no condensado; aminado; O-alquilo inferior; O-arilo, arilo; aril-alquilo inferior; grupos de CO2CH3; CONH2; OCH2CONH2; NH2; SO2NH2; OCHF2; CF3; o OCF3, en los que cada uno de estos grupos está opcionalmente sustituido.

[0319]En algunos casos, el agente que tiene o incluye la fórmula expuesta en la Fórmula (I) es el Compuesto 63. En casos particulares, el agente que inhibe la actividad mTOR es el Compuesto 63. En algunos aspectos, el Compuesto 63 es 2-(3-hidroxifenil)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purin-6-carboxamida. En algunos aspectos, el agente que inhibe la actividad mTOR es 2-(3-hidroxifenil)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purin-6-carboxamida, o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato de la misma. En aspectos particulares, el Compuesto 63 tiene la fórmula:

[0320]En casos particulares, el agente que inhibe la actividad de mTOR tiene o incluye la fórmula expuesta en la Fórmula (II):

Fórmula (II)

en la que L es un enlace directo, NH u O,

Y es N o CR3,

en la que R1 es H, alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido,

R2 es H, alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, sustituido o arilo no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido,

R3 es H, alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, sustituido o heterocicloalquilo no sustituido, -NHR4 o -N(R4)2, y

R4 es en cada aparición independientemente alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido.

[0321]En algunos casos, el agente que inhibe mTOR es o contiene un compuesto de Fórmula (II), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma. En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR tiene o incluye la fórmula expuesta en la Fórmula (II) en la que R1 es arilo sustituido, tal como fenilo sustituido. En casos particulares, el agente que inhibe la actividad mTOR tiene o incluye la fórmula expuesta en la Fórmula (II) en la que Y es CH. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR tiene o incluye la fórmula expuesta en la Fórmula (II) en la que L es un enlace directo. En casos particulares, el agente que inhibe la actividad de mTOR tiene o incluye la fórmula establecida en la Fórmula (II) en la que R1 es arilo sustituido o no sustituido y R2 es alquilo C1-8 sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre alcoxi, amino, hidroxi, cicloalquilo o heterocicloalquilo.

[0322]En ciertos casos, el agente que inhibe la actividad mTOR tiene o incluye la fórmula expuesta en la Fórmula (II) en la que los grupos que están “sustituidos o no sustituidos”, cuando están sustituidos, pueden estar sustituidos con uno o más de cualquier sustituyente. Ejemplos de sustituyentes son los que se encuentran en los compuestos ejemplares y los casos descritos en el presente documento, así como halo (p. ej., cloro, yodo, bromo o flúor); alquilo C1-8; alquenilo C2-8; alquinilo C2-8; hidroxilo; alcoxilo C1-8; aminado; nitro; tiol; tioéter; yo mismo; ciano; amido; fosfonato; fosfina; carboxilo; carbamoilo; carbamato; acetal; urea; tiocarbonilo; sulfonilo; sulfonamida; sulfinilo; cetona; aldehido; ester; acetilo; acetoxi; oxígeno (=O); haloalquilo (p. ej., trifluorometilo); aminoacilo y aminoalquilo sustituidos; cicloalquilo carbocíclico, que puede ser monocíclico o policíclico fusionado o no fusionado (p. ej., ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo), o un heterocicloalquilo, que puede ser monocíclico condensado o policíclico no condensado (p. ej., pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo, furanilo o tiazinilo); arilo carbocíclico o heterocíclico, monocíclico o policíclico condensado o no condensado (p. ej., fenilo, naftilo, pirrolilo, indolilo, furanilo, tienilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazolilo, piridinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, acridinilo, pirazinilo, piridazinilo, pirimidinilo, bencimidazolilo, benzotienilo o benzofuranilo); amino (primario, secundario o terciario); -O-alquilo inferior; -O-arilo; arilo; aril-alquilo inferior; CO2CH3; CONH2; OCH2CONH2; NH2; N(alquilo ^ .4)2; NHC(O) alquilo C1.4; SO2NH2; SO2alquilo C1.4; OCHF2; CF3; OCF3; y dichos restos también pueden estar opcionalmente sustituidos por una estructura o puente de anillo condensado, por ejemplo, -OCH2O- o -O-alquileno inferior-O-. Estos sustituyentes pueden estar opcionalmente sustituidos además con un sustituyente seleccionado entre dichos grupos.

[0323]En casos particulares, el agente que tiene o incluye la fórmula expuesta en la Fórmula (II) es el Compuesto 155. En casos particulares, el agente que inhibe la actividad mTOR es el Compuesto 155. En algunos aspectos, el Compuesto 155 es 6-(4-(2H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1H-imidazo[4,5-b]pirazina-2(3H)-ona. En algunos aspectos, el agente que inhibe la actividad de mTOR es 6-(4-(2H-1,2,4-triazol-3-il)fenil)-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-1H-imidazo[4,5-b]pirazina-2(3H)-ona, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma. En aspectos particulares, el Compuesto 155 tiene la fórmula:

[0324]En casos particulares, el agente que inhibe la actividad de mTOR tiene o incluye la fórmula establecida en la Fórmula (III):

Fórmula (III)

en la que R1 es alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociclilo sustituido o no sustituido, o heterociclilalquilo sustituido o no sustituido,

R2 es H, alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociclilo sustituido o no sustituido, heterociclilalquilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido, o cicloalquilalquilo sustituido o no sustituido, y

R3 es H, o un alquilo C1-8 sustituido o no sustituido.

[0325]En algunos casos, el agente que inhibe mTOR es o contiene un compuesto de Fórmula (III), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma. En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR tiene o incluye una fórmula establecida en la Fórmula (III) en la que R1 es arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido, tal como por ejemplo, R1 es fenilo, piridilo, pirimidilo, bencimidazolilo, 1H-pirrolo[2,3-b]piridilo, indazolilo, indolilo, lhimidazo[4,5-b]piridilo, 1H-imidazo[4,5-b]piridin-2(3H)-onilo, 3H-imidazo[4,5-b]piridilo o pirazolilo, cada uno opcionalmente sustituido. En casos particulares, el agente que inhibe la actividad de mTOR tiene o incluye una fórmula establecida en la Fórmula (III) en la que R1 es fenilo sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-8 sustituido o no sustituido (para por ejemplo, metilo), heterociclilo sustituido o no sustituido (p. ej., un triazolilo o pirazolilo sustituido o no sustituido), aminocarbonilo, halógeno (p. ej., flúor), ciano, hidroxialquilo e hidroxi. En otros casos, R1 es piridilo sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-8 sustituido o no sustituido (p. ej., metilo), heterociclilo sustituido o no sustituido (p. ej., un triazolilo sustituido o no sustituido), halógeno, aminocarbonilo, ciano, hidroxialquilo (p. ej., hidroxipropilo), -OR y -NR2, en los que cada R es independientemente H, o un alquilo C1-4 sustituido o no sustituido. En algunos casos, R1 es 1H-pirrolo[2,3-b]piridilo o bencimidazolilo, opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, y -NR2, en el que R es independientemente H, o un alquilo C1-4 sustituido o no sustituido.

[0326]En algunos casos, el agente que inhibe la actividad de mTOR tiene o incluye una fórmula establecida en la Fórmula (III) en la que R1 es

en la que R es en cada aparición independientemente H, o un alquilo C1-4 sustituido o no sustituido (p. ej., metilo); R1 es en cada aparición independientemente un alquilo C1-4 sustituido o no sustituido (p. ej., metilo), halógeno (p. ej., fluoro), ciano, -OR o -NR2; m es 0-3; y n es 0-3. Se entenderá que cualquiera de los sustituyentes R' puede estar unido a cualquier átomo adecuado de cualquiera de los anillos en los sistemas de anillos fusionados.

[0327]En algunos casos de compuestos de fórmula (III), R2 es H, alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociclilo sustituido o no sustituido, alquil-heterociclilo C1-4 sustituido o no sustituido, alquil arlo C1-4 sustituido o no sustituido, o alquil-C1-4-cicloalquilo sustituido o no sustituido. Por ejemplo, R2 es H, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, ciclopentilo, ciclohexilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, (alquilo C1-4)-fenilo, (alquilo C1-4)-ciclopropilo, (alquilo C1-4)-ciclobutilo, (alquilo C1-4)-ciclopentilo, (alquilo C1-4)-ciclohexilo, (alquilo C1-4)-pirrolidilo, (alquilo C1-4)-piperidilo, (alquilo C1-4)-piperazinilo, (alquilo C1-4)-morfolinilo, (alquilo C1-4)-tetrahidrofuranilo o (alquilo C1-4)-tetrahidropiranilo, cada uno opcionalmente sustituido.

[0328]En ciertos casos, R2 es H, alquilo C1-4, (alquilo C1-4)(OR),

en donde R es en cada aparición independientemente H, o un alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, R' es en cada aparición independientemente H, -OR, ciano o un alquilo C1-8 sustituido o no sustituido, y p es 0-3.

[0329]En casos particulares, el agente que tiene o incluye la fórmula expuesta en la Fórmula (III) es el Compuesto 246. En casos particulares, el agente que inhibe la actividad mTOR es el Compuesto 246. En algunos aspectos, el Compuesto 246 es 7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-((1r,4r)-4-metoxiciclohexil)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona. En algunos aspectos, el agente que inhibe la actividad mTOR es 7-(6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-1-((1r,4r)-4metoxicidohexN)-3,4-dihidropirazino[2,3-b]pirazin-2(1H)-ona, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma. En aspectos particulares, el Compuesto 246 tiene la fórmula:

Compuesto 246

III. MÉTODOS DE ESTIMULACIÓN A LARGO PLAZO

[0330] En el presente documento se divulga un método de estimulación a largo plazo (también denominado en el presente documento método para estimulación a largo plazo) que es útil, entre otras cosas, para evaluar fenotipos, características o actividades de una composición celular, por ejemplo, una composición celular. En algunos casos, el método de estimulación a largo plazo es o incluye incubar una composición celular, por ejemplo, una composición de entrada que contiene células que expresan un receptor recombinante tal como un CAR, en condiciones para estimular una actividad dependiente del receptor recombinante (p. ej., actividad dependiente de CAR) en las células. En tales casos, una actividad dependiente del receptor recombinante es una actividad que es específica de la estimulación del receptor recombinante, por ejemplo, CAR, tal como mediante la presencia de un antígeno u otro agente reconocido por el dominio de unión al antígeno del receptor recombinante, por ejemplo, CAR, o que estimula específicamente el receptor recombinante. En algunos aspectos, la composición celular, por ejemplo, la composición de entrada contiene células T que expresan un receptor recombinante (p. ej., un CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular que se une o reconoce específicamente un antígeno. En algunos aspectos, la incubación da como resultado una composición de células T, por ejemplo, composiciones de salida, que contienen células que exhiben características de células estimuladas crónicamente o de células que tienen una exposición prolongada al antígeno.

[0331] En ciertos casos, las condiciones para estimular una actividad de receptor recombinante, por ejemplo, una actividad dependiente de CAR, incluyen incubar la composición celular, por ejemplo, la composición de entrada, con una molécula de unión, tal como una molécula de unión que se une, por ejemplo, se une específicamente, al dominio de unión al antígeno del receptor recombinante, por ejemplo, el CAR. En ciertos casos, la molécula de unión está unida a un soporte. En casos particulares, el soporte es un soporte sólido, tal como la superficie de una placa o plato de cultivo celular, un pocillo en una microplaca o la superficie de una partícula o perla. En algunos aspectos, la incubación tiene lugar o se lleva a cabo en la microplaca, una placa o plato de cultivo celular, o bien en una microplaca con moléculas de unión unidas a la superficie. En algunos aspectos, la incubación tiene lugar o se lleva a cabo en presencia de una pluralidad de partículas o perlas que contienen moléculas de unión. En ciertos aspectos, las moléculas de unión están unidas superficialmente a las perlas o partículas. En algunos casos, la incubación se realiza o lleva a cabo in vitro o ex vivo.

[0332] En diversos casos, las células, por ejemplo, células de una composición de entrada, se incuban con las moléculas de unión en presencia de un medio sin agentes adicionales que promuevan la división, el crecimiento, la expansión o la activación celular. En algunos casos, las células se incuban con las partículas durante un período de tiempo prolongado. por ejemplo, 14 días, sin manipulaciones adicionales, por ejemplo, cambios de medio, reemplazo de perlas o división o replacado de las células.

[0333] En algunos aspectos, los métodos de estimulación a largo plazo incluyen incubar una composición de entrada, por ejemplo, una composición celular que contiene una composición celular que expresa un receptor recombinante en presencia de una molécula de unión que se une o reconoce el receptor recombinante. En algunos aspectos, el período de tiempo elegido para la incubación es un momento en el que una o más funciones o actividades de las células de la composición exhiben características de células estimuladas crónicamente o células que tienen una exposición prolongada al antígeno al final o al final de la incubación. En algunos casos, la molécula de unión es un antígeno (tal como un antígeno recombinante o un fragmento del mismo) que está unido o es reconocido por el receptor recombinante. En ciertos casos, la molécula de unión es un anti-ID que se une o reconoce el receptor recombinante. En algunos casos, dichas características pueden incluir evidencia de una disminución de la viabilidad, la actividad o la persistencia o un mayor agotamiento o diferenciación.

[0334] En ciertos casos, los métodos de estimulación a largo plazo descritos en el presente documento son útiles, entre otras cosas, para identificar composiciones celulares que pueden tener características deseables cuando se administranin vivo,tales como una persistencia, viabilidad o actividad mantenida o extendida. En algunos casos, el ensayo se realiza en dos o más composiciones celulares diferentes para identificar diferencias que pueden mejorar o prolongar la persistencia, actividad o viabilidad, o disminuir el agotamiento o la diferenciación. En algunos casos, tales diferencias pueden incluir, entre otros, aspectos del proceso de fabricación, como la presencia de agentes durante uno o más pasos o procedimientos del proceso de ingeniería, por ejemplo, agentes que inhiben la actividad de la quinasa mTOR.

[0335] En casos particulares, el método de estimulación a largo plazo se realiza en dos o más composiciones celulares para identificar agentes que aumentan o mantienen la viabilidad, actividad o persistencia, o aumentan o mantienen la expresión de marcadores, por ejemplo, biomarcadores, indicativos de mayor viabilidad, actividad, o la persistencia. En ciertos casos, el método de estimulación a largo plazo se realiza en dos o más composiciones celulares para identificar diferencias en las composiciones celulares que disminuyen o previenen el agotamiento o la diferenciación (p. ej., tal como la diferenciación a un estado senescente), o disminuyen la expresión de marcadores indicativos de un aumento. agotamiento o diferenciación. En algunos casos, la molécula de unión se conjuga o se une a una superficie sólida, tal como una superficie de una placa o plato de cultivo celular. En casos particulares, las moléculas de unión están conjugadas o unidas a partículas, por ejemplo, perlas.

[0336] En ciertos casos, los métodos para la estimulación a largo plazo son o incluyen etapas para incubar las células en presencia de partículas, por ejemplo, perlas, que contienen una molécula de unión, por ejemplo, una molécula de unión que se une al receptor recombinante o lo reconoce.

[0337] En algunos casos, la molécula de unión es un antígeno, por ejemplo, un antígeno recombinante o un fragmento del mismo que es reconocido o unido por el receptor recombinante. En ciertos casos, el antígeno es un polipéptido, o una porción de un polipéptido, que está asociado con una enfermedad, por ejemplo, un cáncer. En algunos casos, el antígeno es un polipéptido, o una variante o fragmento de un polipéptido que se expresa en la superficie de una célula que está asociada con una enfermedad, por ejemplo, una célula cancerosa y/o una célula tumoral.

[0338] En algunos casos, el antígeno es o incluye integrina avp6 (integrina avb6), antígeno de maduración de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anhidrasa carbónica 9 (CA9, también conocida como CAIX o G250), un antígeno de cáncer de testículo, antígeno 1B de cáncer/testículo (CTAG, también conocido como NY-ESO-1 y LAGE-2), antígeno carcinoembrionario (CEA), una ciclina, ciclina A2, ligando de quimiocina 1 con motivo C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPG4), proteína del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), tipo III mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrina B2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrógeno, receptor tipo Fc 5 (FCRL5; también conocido como homólogo del receptor Fc 5 o FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), una proteína de unión a folato (FBP), receptor de folato alfa, gangliósido GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliósido GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipicano-3 (GPC3), receptor acoplado a proteína G 5D (GPRC5D), Her2/neu (receptor tirosina quinasa erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, melanoma humano de alto peso molecular antígeno asociado (HMW-MAA), antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno leucocitario humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Ra), receptor alfa de IL-132 (IL-13Ra2), receptor de dominio de inserción de quinasa (kdr), cadena ligera kappa, molécula de adhesión celular L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetición rica en leucina que contiene 8 miembros de la familia A (LRRC8A), Lewis Y, antígeno asociado al melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovirus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, asesino natural ligandos del miembro D del grupo 2 (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adhesión de células neurales (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno de melanoma expresado preferentemente (PRAME), receptor de progesterona, un antígeno prostático específico, antígeno de células madre prostáticas (PSCA), antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), receptor tirosina quinasa similar al receptor huérfano 1 (ROR1), survivina, glicoproteína del trofoblasto (TPBG, también conocida como 5T4), glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG72), proteína relacionada con la tirosinasa 1 (TRP1, también conocida como TYRP1 o gp75), proteína 2 relacionada con la tirosinasa (TRP2, también conocida como dopacromo tautomerasa, dopacromo delta-isomerasa o DCT), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), un antígeno específico de patógeno o expresado por patógeno, o un antígeno asociado con una etiqueta universal, y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por VIH, VHC, VHB u otros patógenos. Los antígenos a los que se dirigen los receptores en algunos casos incluyen antígenos asociados con una enfermedad maligna de células B, tales como cualquiera de varios marcadores de células B conocidos. En algunos casos, el antígeno es o incluye CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b o CD30. En algunos casos, el antígeno es o incluye BCMA, CD19, CD22 o ROR1 recombinantes.

[0339] En algunos casos, el anti-ID es un anticuerpo antiidiotipo o fragmentos de unión a antígeno que reconocen específicamente un anticuerpo diana o un fragmento de unión a antígeno (p. ej., scFv) que forma parte del dominio de unión a antígeno extracelular del receptor recombinante. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno del receptor recombinante contiene un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (p. ej., scFv) que se une a un antígeno diana, tal como un antígeno diana asociado o expresado en una célula o tejido de una enfermedad o condición, por ejemplo, cáncer. En algunos casos, el anti-ID es un anticuerpo antiidiotipo o fragmento de unión a antígeno del mismo que reconoce específicamente un anticuerpo diana o fragmento de unión a antígeno que se une a la integrina avp6 (integrina avb6), antígeno de maduración de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anhidrasa carbónica 9 (CA9, también conocido como CAIX o G250), un antígeno de cáncer de testículo, antígeno 1B de cáncer/testículo (CTAG, también conocido como NY-ESO-1 y LAGE-2), antígeno carcinoembrionario (CEA), una ciclina, ciclina A2, Ligando de quimiocina con motivo C-C 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD 171, proteoglicano de sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrógeno, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; también conocido como homólogo del receptor Fc 5 o FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), una proteína de unión a folato (FBP), receptor de folato alfa, gangliósido GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliósido GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipican-3 (GPC3), receptor acoplado a proteína G 5D (GPRC5D), Her2/neu (receptor tirosina quinasa erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb- B4), dímeros de erbB, antígeno humano asociado al melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno leucocitario humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), receptor de IL-22 alfa (IL-22Ra), receptor de IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), receptor de dominio de inserción de quinasa (kdr), cadena ligera kappa, molécula de adhesión celular L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetición rica en leucina que contiene 8 miembros de la familia A (LRRC8A), Lewis Y, antígeno asociado al melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSL<n>), c-Met, citomegalovirus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligandos del miembro D del grupo 2 natural killer (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adhesión de células neurales (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno de melanoma expresado preferentemente (PRAME), receptor de progesterona, un antígeno prostético específico, antígeno de células madre de próstata (PSCA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), receptor tirosina quinasa similar al receptor huérfano 1 (ROR1), survivina, glicoproteína del trofoblasto (TPBG, también conocida como 5T4), asociada a tumores glicoproteína 72 (TAG72), proteína relacionada con la tirosinasa 1 (TRP1, también conocida como TYRP1 o gp75), proteína relacionada con la tirosinasa 2 (TRP2, también conocida como dopacromo tautomerasa, dopacromo delta-isomerasa o DCT), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), un antígeno específico de patógeno o expresado por patógeno, o un antígeno asociado con una etiqueta universal, y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por VIH, VHC, VHB u otros patógenos. Los antígenos a los que se dirigen los receptores en algunos casos incluyen antígenos asociados con una enfermedad maligna de células B, tales como cualquiera de varios marcadores de células B conocidos. En algunos casos, el antígeno es o incluye CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b o CD30. En algunos casos, el anti-ID se une al dominio de unión al antígeno de un CAR anti-CD19.

[0340]En algunos casos, la partícula (p. ej., una perla) reacciona en un campo magnético. En algunos casos, la partícula es una partícula magnética (p. ej., una perla magnética). En algunos casos, la partícula magnética es paramagnética. En casos particulares, la partícula magnética es superparamagnética. En ciertos casos, las partículas, por ejemplo, perlas, no muestran ninguna propiedad magnética a menos que estén expuestas a un campo magnético. En algunos casos, las partículas o perlas tienen un diámetro de entre aproximadamente 1 pm y 10 pm, inclusive. En casos particulares, las partículas, por ejemplo, perlas, tienen un diámetro medio de o aproximadamente 2,8 pm. En algunos casos, las partículas, por ejemplo, perlas, tienen un diámetro de aproximadamente 4,8 pm.

[0341]En casos particulares, las células de la composición de células de entrada se incuban con la molécula de unión, por ejemplo, partículas o perlas que contienen la molécula de unión, durante, aproximadamente o durante al menos 10 días, 11 días, 12 días, 13 días. 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días o 21 días. En diversos casos, las células o composiciones de células se incuban con la molécula de unión, por ejemplo, partículas o perlas que contienen la molécula de unión, durante entre o entre aproximadamente 10 días y 21 días, 12 días y 18 días, o 14 días y 16 días. días, inclusive. En ciertos casos, las células se incuban con la molécula de unión, por ejemplo, partículas o perlas que contienen la molécula de unión, durante aproximadamente o durante al menos 14 días. En casos particulares, las células de la composición celular se incuban con la molécula de unión, por ejemplo, partículas o perlas que contienen la molécula de unión, a temperaturas superiores a la temperatura ambiente. En algunos casos, la incubación se realiza a una temperatura superior a aproximadamente 25 °C, tal como generalmente superior o superior a aproximadamente 32 °C, 35 °C o 37 °C. En algunos casos, el tratamiento, contacto o incubación se realiza a una temperatura de 37 °C ± 2°C o aproximadamente, tal como a una temperatura de 37 °C o aproximadamente.

[0342]En algunos casos, las células se incuban con la molécula de unión, por ejemplo, con partículas o perlas que contienen las moléculas de unión en presencia de un medio sin agentes adicionales que promuevan la división, el crecimiento, la expansión o la activación de las células, por ejemplo, células T. En algunos casos, las células se incuban con las moléculas de unión en ausencia de citoquinas recombinantes. En determinados casos, la incubación se realiza de forma continua y sin interrupción. En determinados casos, la incubación se realiza en condiciones estéticas. En casos particulares, la incubación se lleva a cabo sin perfusión, mezcla, balanceo o agitación. En algunos aspectos, las moléculas de unión estén presentes durante toda la duración de la incubación. En ciertos casos, las moléculas de unión no se cambian ni se reemplazan durante la incubación. Los casos particulares contemplan que dado que, en algunos aspectos, el medio no contiene ninguna citocina recombinante, y las citocinas presentes en el medio durante la incubación habrían sido producidas por las células, por ejemplo, en respuesta a una interacción entre el receptor recombinante de la célula y la molécula de unión de la partícula.

[0343]En algunos casos, la cantidad de molécula de unión, por ejemplo, la cantidad de partículas o perlas que contienen moléculas de unión, es suficiente para proporcionar entre o entre aproximadamente 1 molécula de unión y 1012 moléculas de unión por célula, tales como entre o entre aproximadamente 102 moléculas de unión y 1010 moléculas de unión, 103 moléculas de unión y 108 moléculas de unión, 104 moléculas de unión y 106 moléculas de unión, 1 molécula de unión a 102 moléculas de unión, entre 102 moléculas de unión moléculas y 103 moléculas de unión, 103 moléculas de unión y 104 moléculas de unión, 104 moléculas de unión y 105 moléculas de unión, 105 moléculas de unión y 106 moléculas de unión, 105 moléculas de unión y 106 moléculas de unión, 106 moléculas de unión moléculas y 107 moléculas de unión, 107 moléculas de unión y 108 moléculas de unión, o 109 moléculas de unión y 1010 moléculas de unión, inclusive. En algunos casos, la cantidad de moléculas de unión, por ejemplo, la cantidad de partículas o perlas que contienen moléculas de unión, es una cantidad suficiente para proporcionar entre 104 moléculas de unión y aproximadamente 106 moléculas de unión, inclusive, para cada célula. En algunos casos, la cantidad de partículas, por ejemplo, perlas, contiene aproximadamente 105 moléculas de unión para cada célula.

[0344]En algunos casos, la composición de entrada se incuba con las partículas, por ejemplo, perlas, que contienen una molécula de unión en una proporción de células totales a partículas, por ejemplo, perlas, de entre o entre aproximadamente 10:1 y 1:10, 5:1. y 1:5, 3:1 y 1:3, o 2:1 y 1:2, cada uno inclusive. En casos particulares, la relación está entre aproximadamente 1:0,2 y 1:5, inclusive. En algunos casos, la relación entre el total de células de la composición de entrada y las partículas, por ejemplo, perlas, es aproximadamente 1:1.

[0345]En algunos casos, los ensayos pueden usarse para comparar diferentes células o composiciones celulares. Por ejemplo, en algunos casos, se pueden comparar dos o más composiciones celulares que contienen cada una células que expresan el mismo receptor recombinante, por ejemplo, un mismo CAR, incubando las células con la misma molécula de unión, por ejemplo, partículas o perlas que contienen la misma molécula de unión. molécula que se une al receptor recombinante o lo reconoce. En ciertos casos, las dos o más composiciones celulares se generan en presencia de diferentes agentes, por ejemplo, agentes que inhiben la actividad de la quinasa mTOR. En casos particulares, las composiciones celulares se pueden comparar con una composición celular de control o de referencia. En algunos aspectos, las composiciones celulares de control o de referencia pueden incluir, entre otras, composiciones celulares que no se someten a ninguna incubación, composiciones celulares que no se incuban en presencia de partículas, por ejemplo, perlas, que contienen una molécula de unión, composiciones celulares que no contienen células que expresan el receptor recombinante, composiciones celulares que se generan a partir de un proceso de ingeniería diferente y/o composiciones celulares que se diseñan en presencia de un vehículo o compuesto de control.

[0346]En casos particulares, se pueden comparar dos o más composiciones celulares que contienen cada una células que expresan diferentes receptores recombinantes, por ejemplo, diferentes CAR, incubando las células con moléculas de unión, tales como partículas, por ejemplo, perlas, que contienen diferentes moléculas de unión, que se une o reconoce los diferentes receptores recombinantes.

[0347]En algunos casos, las células se evalúan en diferentes momentos durante la incubación. Por ejemplo, en algunos aspectos, un fenotipo, característica o actividad de células de una o más composiciones celulares se evalúan en un punto de tiempo intermedio, tal como un punto de tiempo que ocurre en, aproximadamente, o al menos un 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, finalización de la incubación. En determinados casos, las células se evalúan una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez veces durante la incubación. En ciertos casos, las células se evalúan siguiendo diferentes intervalos durante la incubación, tales como intervalo de, aproximadamente o al menos 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días u 8 días. En algunos casos, las células se evalúan todos los días. En algunos casos, las células se evalúan cada tres días. En determinados casos, las células se evalúan cada 7 días.

[0348]En ciertos casos, las células, por ejemplo, células de la composición de salida, se evalúan para determinar una actividad, por ejemplo, una actividad simulada de antígeno, un fenotipo o una característica. En algunos casos, la actividad estimulada por antígeno se evalúa en células de composiciones celulares durante o después del método de estimulación prolongada, por ejemplo, durante o después de la incubación con partículas, por ejemplo, perlas, que contienen moléculas de unión. En casos particulares, los resultados de la evaluación se comparan con una evaluación de la misma o similar actividad medida en células de una composición celular diferente, por ejemplo, una composición celular de control o de referencia.

[0349]En algunos casos, la actividad es una actividad estimulada por antígeno. Ejemplos particulares contemplan que la actividad de células estimuladas por antígenos, tales como células T que expresan un receptor recombinante, puede evaluarse mediante cualquiera de varias técnicas adecuadas conocidas. En algunos casos, la producción de una o más citoquinas se mide, detecta y/o cuantifica mediante tinción de citoquinas intracelulares. En algunos aspectos, la tinción de citocinas intracelulares (ICS) mediante citometría de flujo es una técnica muy adecuada para estudiar la producción de citocinas a nivel unicelular. En ciertos aspectos, la ICS es útil para detectar la producción y acumulación de citoquinas dentro del retículo endoplásmico después de la estimulación celular, tal como con una célula que expresa el antígeno o una partícula, por ejemplo, una partícula de perlas, con un antígeno conjugado, lo que permite la identificación. de poblaciones de células que son positivas o negativas para la producción de una citocina particular o para la separación de células de alta y baja producción en función de un umbral. La ICS también se puede utilizar en combinación con otros protocolos de citometría de flujo para inmunofenotipado utilizando marcadores de superficie celular, por ejemplo, CD4 o CD8, para acceder a la producción de citoquinas en un subgrupo particular de células. Otras técnicas unicelulares para medir o detectar la producción de citocinas incluyen, entre otras, ELISPOT, dilución limitante y clonación de células T.

[0350]En algunos casos, la actividad estimulada por el antígeno es la producción de una o más citocinas. Las citocinas que pueden producirse en respuesta a la estimulación antigénica pueden incluir, entre otras, IL-1, IL-1p, IL-2, sIL-2Ra, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL 27, IL-33, IL-35, TNF, TNF alfa, CXCL2, CCL2, CCL3, CCL5, CCL17, CCL24, PGD2, LTB4, interferón gamma (IFN-y), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1a, MIP-1b, Flt-3L, fractalquina y/o IL-5. En algunos casos, la una o más citoquinas son o incluyen una o más de IL-2, IFN-gamma o TNF-alfa. En algunos casos, la secreción de citocinas se evalúa midiendo, detectando o cuantificando la cantidad o concentración de citocinas extracelulares después de un cocultivo con células que expresan antígenos o después de una incubación de partículas, por ejemplo, perlas, que contienen antígeno unido o fragmentos de antígeno.

[0351] En casos particulares, la actividad estimulada por el antígeno es una actividad citolítica (citotóxica). En algunos casos, la actividad citolítica se evalúa exponiendo, incubando y/o poniendo en contacto las células de la composición, por ejemplo, células que expresan el receptor recombinante, con una célula diana que expresa el antígeno o un epítopo que es reconocido por el receptor recombinante. La actividad citolítica se puede medir midiendo directa o indirectamente el número de células diana a lo largo del tiempo. Por ejemplo, las células diana se pueden incubar con un marcador detectable antes de incubarlas con células recombinantes que expresan el receptor, tal como un marcador que es detectable cuando la célula diana se lisa, o un marcador detectable que sólo es detectable en células diana viables. Estas lecturas proporcionan directa o indirectamente el número de células diana y/o la muerte de las células diana, y pueden medirse en diferentes momentos durante el ensayo. Una reducción del número de células diana y/o un aumento de la muerte de las células diana indican la actividad citolítica de las células. Los métodos adecuados para realizar ensayos citolíticos se conocen en la técnica e incluyen, entre otros, ensayos de liberación de cromo-51, ensayos de cromo no radiactivo, ensayos de citometría de flujo que utilizan colorantes fluorescentes tales como éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE), PKH-2 y P<k>H-26.

[0352] En ciertos casos, las células, por ejemplo, células que expresan el receptor recombinante, de la composición celular se evalúan para determinar una o más características o fenotipos durante o después del ensayo, por ejemplo, durante o después de una incubación con partículas, por ejemplo, perlas, que contienen un receptor de unión. En algunos casos, una o más características o fenotipos son o se relacionan con una o más de activación, agotamiento o diferenciación. En ciertos casos, uno o más fenotipos o características se evalúan midiendo, detectando o cuantificando la presencia, ausencia, cantidad o nivel de uno o más marcadores, por ejemplo, biomarcadores.

[0353] En algunos casos, la expresión de un marcador, por ejemplo, un marcador que está asociado positiva o negativamente con activación, agotamiento o diferenciación, es o incluye evaluar, medir, determinar y/o cuantificar un nivel, cantidad o concentración de un marcador en la muestra. En ciertos casos, el marcador es un producto genético, por ejemplo, cualquier biomolécula que se ensambla, genera y/o sintetiza con información codificada por un gen, y puede incluir polinucleótidos y/o polipéptidos. En ciertos casos, el nivel, cantidad o concentración del marcador puede transformarse (p. ej., normalizarse) o analizarse directamente (p. ej., sin procesar). En algunos casos, el marcador es una proteína. En ciertos casos, el marcador es un polinucleótido, por ejemplo, un ARNm o una proteína, que está codificado por el gen.

[0354] En casos particulares, la cantidad o nivel de un marcador que es un polinucleótido se puede evaluar, medir, determinar y/o cuantificar mediante cualquier medio conocido adecuado. Por ejemplo, en algunos casos, la cantidad o nivel de un marcador polinucleotídico se puede evaluar, medir, determinar y/o cuantificar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo PCR con transcriptasa inversa (ti), p Cr digital en gotitas, PCR en tiempo real y métodos de PCR cuantitativa (incluidos, por ejemplo, TAQMAN®, baliza molecular, LIGHTUP™, SC<o>R<p>ION™, SIMPLEPROBES®; véanse, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. Nos 5.538.848; 5.925.517; 6.174.670; 6.329.144; 6.326.145 y 6.635.427); transferencia Northern; transferencia Southern, por ejemplo, de productos y derivados de transcripción inversa; métodos basados en matrices, incluidas matrices transferidas, micromatrices o matrices sintetizadas in situ; y secuenciación, por ejemplo, secuenciación por síntesis, pirosecuenciación, secuenciación didesoxi o secuenciación por ligación, o cualquier otro método conocido en la técnica, tal como se analiza en Shendure et al., Nat. Rev. Genet. 5:335-44 (2004) o Nowrousian, Euk. Cell 9(9): 1300-1310 (2010), incluidas plataformas específicas como HELICOS®, ROCHE® 454, ILLUMINA®/SOLEXA®, ABI SOLiD® y secuenciación POLONATOR®. En casos particulares, los niveles de productos genéticos de ácidos nucleicos se miden mediante qRT-PCR. En algunos casos, la qRT-PCR utiliza tres conjuntos de ácidos nucleicos para cada gen, donde los tres ácidos nucleicos comprenden un par de cebadores junto con una sonda que se une entre las regiones de un ácido nucleico objetivo donde se unen los cebadores, conocido comercialmente como ensayo TAQMAN®.

[0355] En casos particulares, la expresión de dos o más marcadores polinucleotídicos se mide o evalúa simultáneamente. En ciertos casos, una PCR múltiple, por ejemplo, una rt-PCR múltiple que evalúa, mide, determina y/o cuantifica el nivel, cantidad o concentración de dos o más productos génicos. En algunos casos, se utilizan micromatrices (p. ej., matrices estilo AFFYMETRIX®, AGILENT® e ILLu M iNA®) para evaluar, medir, determinar y/o cuantificar el nivel, cantidad o concentración de dos o más productos genéticos. En algunos casos, se usan micromatrices para evaluar, medir, determinar y/o cuantificar el nivel, cantidad o concentración de un polinucleótido de ADNc que se deriva de un producto genético de ARN.

[0356] En algunos casos, la expresión de uno o más marcadores polinucleotídicos se determina secuenciando un ARNm marcador o un polinucleótido de ADNc que se deriva del ARNm marcador. En algunos casos, la secuenciación se realiza mediante un método de secuenciación que no es de Sanger y/o una técnica de secuenciación de próxima generación (NGS). Los ejemplos de técnicas de secuenciación de próxima generación incluyen, entre otros, secuenciación masiva de firmas paralelas (MPSS), secuenciación Polony, pirosecuenciación, secuenciación con terminador de colorante reversible, secuenciación SOLiD, secuenciación de semiconductores de iones, secuenciación de nanobolas de ADN, secuenciación de molécula única con helioscopio, molécula única. secuenciación en tiempo real (SMRT), secuenciación en tiempo real de una sola molécula (RNAP) y secuenciación de ADN con nanoporos.

[0357] En casos particulares, el marcador es una proteína o un fragmento de la misma. En ciertos casos, uno o más marcadores de proteínas se miden mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Los métodos adecuados para evaluar, medir, determinar y/o cuantificar el nivel, cantidad o concentración de más o más marcadores de proteínas incluyen, entre otros, la detección con inmunoensayos, técnicas de aptámeros basados en ácidos nucleicos o basados en proteínas, HPLC (cromatografía líquida de alta precisión), secuenciación de péptidos (como secuenciación de degradación de Edman o espectrometría de masas (como MS/MS), opcionalmente acoplada a HPLC), y adaptaciones de microarrays de cualquiera de los anteriores (incluidos ácido nucleico, anticuerpo o proteína-proteína (es decir, matrices sin anticuerpos)). En algunos casos, el inmunoensayo es o incluye métodos o ensayos que detectan proteínas basándose en una reacción inmunológica, por ejemplo, detectando la unión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno a un producto génico. Los inmunoensayos incluyen, entre otros, inmunocitoquímica o inmunohistoquímica cuantitativa, ELISA (incluidos ELISA directo, indirecto, tipo sándwich, competitivo, múltiple y portátil (véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N° 7.510.687), transferencia Western (que incluye uno, dos o más transferencia dimensional u otros medios cromatográficos, incluyendo opcionalmente secuenciación de péptidos), inmunoensayo enzimático (EIA), RIA (radioinmunoensayo) y SPR (resonancia de plasmón superficial).

[0358] En algunos casos, el marcador proteico se mide, detecta o cuantifica mediante citometría de flujo. En algunos aspectos, la citometría de flujo es una tecnología biofísica basada en láser o impedancia empleada en la detección de marcadores suspendiendo células en una corriente de fluido y haciéndolas pasar a través de un aparato de detección electrónico. Los marcadores presentes en las células pueden marcarse, por ejemplo, con un anticuerpo marcado con fluorescencia para su detección mediante citometría de flujo. En algunos aspectos, la citometría de flujo se emplea para medir, detectar o cuantificar la presencia, ausencia, cantidad o nivel de un marcador presente en una población de células. En algunos aspectos, la población de células puede ser el total o el total de células viables de la composición celular o de un subconjunto de células de la composición celular, por ejemplo, células positivas para el receptor recombinante, células T CD4+ o células T CD8+.

[0359] En casos particulares, el marcador está asociado o correlacionado positivamente con la activación o un estado similar a la activación. En algunos casos, el marcador es o incluye CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD71, CD154, CD40L, CD127, LAG3 o Ki67. En algunos casos, el marcador está asociado o correlacionado positivamente con el agotamiento o una condición relacionada con el agotamiento. En casos particulares, el marcador es o incluye uno o más de CTLA-4, FOXP3, PD-1, TIGIT, LAB-3, 2B4, BTLA, TIM3, VISTA o CD96. En algunos casos, el biomarcador está asociado con la diferenciación de una célula T. En casos particulares, el marcador es o incluye uno o más de CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, CD95 y/o uno o más de CD45RA, CD27, CD28, CD62L y CCR7. En algunos casos, células, por ejemplo, células de la composición de salida, se evalúan para células que son positivas en superficie para un marcador de activación de células T seleccionado del grupo que consiste en CD45RA, CD27, CD28, CD62L y CCR7; y/o que son superficialmente negativos para un marcador seleccionado del grupo que consiste en CD25, CD45RO, CD56, KLRG1; y/o tener baja expresión de CD95; y/o son negativos para la expresión intracelular de una citoquina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IFN-y, IL-4, IL-10. En algunos, la composición de salida se evalúa para células que son CD45RA+, CD27+, CCR7+ y/o CD45RO-.

[0360] En algunos casos, las células de una composición de células de salida muestran características de células que han experimentado una estimulación prolongada o crónica después del método de estimulación a largo plazo, por ejemplo, después de una incubación con las partículas, por ejemplo, perlas, que contienen una molécula de unión. En algunos casos, las células que expresan el receptor recombinante de una composición celular, por ejemplo, una composición celular de referencia o de control, muestran características de células que han experimentado una estimulación prolongada o crónica después del ensayo, por ejemplo, después de una incubación con las partículas, por ejemplo, perlas que contienen una molécula de unión.

IV. RECEPTORES RECOMBINANTES

[0361] En algunos casos, las células que se tratan, procesan, modifican y/o producen mediante los métodos descritos en el presente documento contienen o expresan, o están diseñadas para contener o expresar, una proteína recombinante, tal como un receptor recombinante, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR). En ciertos casos, los métodos descritos en el presente documento producen y/o son capaces de producir células, o poblaciones o composiciones que contienen y/o se enriquecen para células, que están diseñadas para expresar o contener una proteína recombinante. En algunos casos, las células T CD4+, o poblaciones o composiciones de células T CD4+, se tratan, procesan, diseñan y/o producen.

[0362] En algunos casos, las células incluyen uno o más ácidos nucleicos introducidos mediante ingeniería genética y, por lo tanto, expresan productos recombinantes o genéticamente modificados de dichos ácidos nucleicos. En algunos casos, la transferencia de genes se logra estimulando primero las células, tal como combinándolas con un estímulo que induce una respuesta tal como proliferación, supervivencia y/o activación, por ejemplo, medida por la expresión de una citoquina o marcador de activación seguido de la transducción de las células activadas y la expansión del cultivo a números suficientes para aplicaciones clínicas.

[0363] Las células generalmente expresan receptores recombinantes, tales como receptores de antígenos que incluyen receptores de antígenos no TCR funcionales, por ejemplo, receptores de antígenos quiméricos (CAR), y otros receptores de unión a antígeno tales como receptores de células T transgénicas (TCR). También entre los receptores se encuentran otros receptores quiméricos.

A. Receptores de antígenos quiméricos

[0364] En algunos casos de los métodos y usos divulgados, los receptores quiméricos, tales como receptores de antígenos quiméricos, contienen uno o más dominios que combinan un dominio de unión a ligando (p. ej., anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que proporciona especificidad para un antígeno deseado (p. ej., antígeno tumoral) con dominios de señalización intracelular. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular es una porción del dominio intracelular activador, tal como un dominio activador de células T, que proporciona una señal de activación primaria. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular contiene o contiene adicionalmente un dominio de señalización coestimulador para facilitar las funciones efectoras. En algunos casos, los receptores quiméricos, cuando se modifican genéticamente en células inmunes, pueden modular la actividad de las células T y, en algunos casos, pueden modular la diferenciación u homeostasis de las células T, dando como resultado células genéticamente modificadas con mayor longevidad, supervivencia y/o persistenciain vivo.tales como para uso en métodos de terapia celular adoptiva.

[0365] Los receptores de antígenos ejemplares, incluidos los CAR, y los métodos para diseñar e introducir dichos receptores en las células incluyen los descritos, por ejemplo, en las publicaciones de solicitudes de patente internacionales números WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 Números de publicación de solicitudes de Patente de EE. UU. US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes de EE. UU. Nos.: 6.451.995. 7.446.190. 8.252.592. 8.339.645. 8.398.282. 7.446.179.

6.410.319. 7.070.995. 7.265.209. 7.354.762. 7.446.191. 8.324.353 y 8.479.118, y solicitud de patente europea número EP2537416, y/o los descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 abril; 3(4): 388-398; Dávila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle y col., Curr. Opinion. Immunol, octubre de 2012; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 18 de marzo de 2012 (2): 160-75. En algunos aspectos, los receptores de antígenos incluyen un CAR como se describe en la Patente de EE. UU. n°: 7.446.190 y los descritos en la publicación de solicitud de patente internacional n°: WO/2014055668 A1. Los ejemplos de CAR incluyen CAR como se describe en cualquiera de las publicaciones antes mencionadas, tales como WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, Patente de EE. UU. N°: 7,446,190, Patente de EE. UU. N°: 8,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang y cols. (2012) J. Inmunother. 35(9): 689-701; y Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177). Véase también WO2014031687, US 8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, Patente de EE. UU. N°: 7.446.190 y Patente de EE. UU. N°: 8.389.282.

[0366] Los receptores quiméricos, tales como CAR, generalmente incluyen un dominio de unión a antígeno extracelular, tal como una porción de una molécula de anticuerpo, generalmente una región de cadena pesada variable (V<h>) y/o una región de cadena ligera variable (V<l>) del anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo scFv.

[0367] En algunos casos, el antígeno al que se dirige el receptor es un polipéptido. En algunos casos, es un carbohidrato u otra molécula. En algunos casos, el antígeno se expresa o se sobreexpresa selectivamente en células de la enfermedad o afección, por ejemplo, células tumorales o patógenas, en comparación con células o tejidos normales o no diana. En otros casos, el antígeno se expresa en células normales y/o se expresa en células modificadas genéticamente.

[0368] En algunos casos, el antígeno es o incluye integrina avp6 (integrina avb6), antígeno de maduración de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anhidrasa carbónica 9 (CA9, también conocida como CAIX o G250), un antígeno de cáncer de testículo, antígeno 1B de cáncer/testículo (CTAG, también conocido como NY-ESO-1 y LAGE-2), antígeno carcinoembrionario (CEA), una ciclina, ciclina A2, ligando de quimiocina 1 con motivo C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPG4), proteína del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), tipo III mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrina B2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrógeno, receptor tipo Fc 5 (FCRLS; también conocido como Homólogo del receptor Fc 5 o FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), una proteína de unión a folato (FBP), receptor de folato alfa, gangliósido GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliósido GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipicano-3 (GPC3), receptor acoplado a proteína G 5D (GPRCSD), Her2/neu (receptor tirosina quinasa erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, melanoma humano de alto peso molecular antígeno asociado (HMW-MAA), antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno leucocitario humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Ra), receptor alfa de IL-132 (IL-13Ra2), receptor de dominio de inserción de quinasa (kdr), cadena ligera kappa, molécula de adhesión celular L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetición rica en leucina que contiene 8 miembros de la familia A (LRRC8A), Lewis Y, antígeno asociado al melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovirus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligandos del miembro D del grupo 2 asesino natural (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adhesión de células neurales (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno de melanoma expresado preferentemente (PRAME), receptor de progesterona, un antígeno prostático específico, antígeno de células madre prostáticas (PSCA), antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), receptor tirosina quinasa similar al receptor huérfano 1 (ROR1), survivina, glicoproteína del trofoblasto (TPBG, también conocida como ST4), glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG72), proteína relacionada con la tirosinasa 1 (TRP1, también conocida como TYRP1 o gp75), proteína 2 relacionada con la tirosinasa (TRP2, también conocida como dopacromo tautomerasa, dopacromo delta-isomerasa o DCT), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), un antígeno específico de patógeno o expresado por patógeno, o un antígeno asociado con una etiqueta universal, y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por VIH, VHC, VHB u otros patógenos. Los antígenos a los que se dirigen los receptores en algunos casos incluyen antígenos asociados con una enfermedad maligna de células B, tales como cualquiera de varios marcadores de células B conocidos. En algunos casos, el antígeno es o incluye CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b o CD30.

[0369]En algunos casos, el antígeno es o incluye un antígeno específico de patógeno o expresado por patógeno. En algunos casos, el antígeno es un antígeno viral (tal como un antígeno viral de VIH, VHC, VHB, etc.), antígenos bacterianos y/o antígenos parasitarios. Los antígenos a los que se dirigen los receptores en algunos casos incluyen antígenos asociados con una enfermedad maligna de células B, tales como cualquiera de varios marcadores de células B conocidos. En algunos casos, el antígeno al que se dirige el receptor es CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b o CD30.

[0370]En algunos casos, el antígeno o el dominio de unión a antígeno es CD19. En algunos casos, el scFv contiene una Vh y una Vl derivadas de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico para CD19. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a CD19 es un anticuerpo derivado de ratón como FMC63 y SJ25C1. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano, por ejemplo, como se describe en la publicación de Patente de EE. UU. N° US 2016/0152723.

[0371]El término “anticuerpo” en el presente documento se utiliza en el sentido más amplio e incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, incluidos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos funcionales (de unión a antígeno), incluidos fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), regiones variables de cadena pesada (Vh) capaces de unirse específicamente al antígeno, fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla, incluidos fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) y fragmentos de anticuerpos de dominio único (p. ej., sdAb, sdFv, nanocuerpo). El término abarca formas genéticamente modificadas y/o modificadas de otro modo de inmunoglobulinas, tales como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados, multiespecíficos, por ejemplo, biespecíficos o triespecíficos, anticuerpos, diacuerpos, tricuerpos y tetracuerpos, di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem. A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término “anticuerpo” abarca fragmentos de anticuerpos funcionales del mismo, también denominados en el presente documento “fragmentos de unión a antígeno”. El término también abarca anticuerpos intactos o de longitud completa, incluidos anticuerpos de cualquier clase o subclase, incluidas IgG y sus subclases, IgM, IgE, IgA e IgD.

[0372]Los términos “región determinante de complementariedad” y “CDR”, sinónimos de “región hipervariable” o “HVR”, se conocen en la técnica para referirse a secuencias no contiguas de aminoácidos dentro de regiones variables de anticuerpos, que confieren especificidad al antígeno y/o o afinidad vinculante. En general, hay tres CDR en cada región variable de cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) y tres CDR en cada región variable de cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). Se sabe en la técnica que “regiones estructurales” y “FR” se refieren a las porciones no CDR de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. En general, hay cuatro FR en cada región variable de cadena pesada de longitud completa (FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4), y cuatro FR en cada región variable de cadena ligera de longitud completa (FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4).

[0373]Los límites precisos de la secuencia de aminoácidos de una CDR o FR determinada se pueden determinar fácilmente utilizando cualquiera de varios esquemas bien conocidos, incluidos los descritos por Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeración “Kabat”); Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273.927-948 (esquema de numeración “Chothia”); MacCallum y col., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), “Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol.262, 732-745.” (esquema de numeración “Contacto”); Lefranc MP et al., “ IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, enero de 2003; 27 (1): 55-77 (esquema de numeración “ IMGT”); Honegger A y Plückthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 8 de junio de 2001; 309 (3):657-70, (esquema de numeración “Aho”); y Martin et al., “Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm," PNAS, 1989, 86(23):9268-9272, (esquema de numeración “AbM”).

[0374]Los límites de una CDR o FR determinada pueden variar según el esquema utilizado para la identificación. Por ejemplo, el esquema Kabat se basa en alineamientos estructurales, mientras que el esquema Chothia se basa en información estructural. La numeración de los esquemas de Kabat y Chothia se basa en las longitudes de secuencia de las regiones de anticuerpos más comunes, con inserciones acomodadas por letras de inserción, por ejemplo, “30a”, y deleciones que aparecen en algunos anticuerpos. Los dos esquemas colocan ciertas inserciones y eliminaciones (“ indeles”) en diferentes posiciones, lo que resulta en una numeración diferencial. El esquema de contacto se basa en el análisis de estructuras cristalinas complejas y es similar en muchos aspectos al esquema de numeración de Chothia. El esquema AbM es un compromiso entre las definiciones de Kabat y Chothia basado en el utilizado por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular.

[0375] La Tabla 1,a continuación, enumera límites de posición ejemplares de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 y CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 identificados por los esquemas Kabat, Chothia, AbM y Contact, respectivamente. Para CDR-H1, la numeración de residuos se enumera utilizando los esquemas de numeración de Kabat y Chothia. Los FR están ubicados entre los CDR, por ejemplo, con FR-L1 ubicado antes de CDR-L1, FR-L2 ubicado entre CDR-L1 y CDR-L2, FR-L3 ubicado entre CDR-L2 y CDR-L3 y así sucesivamente. Cabe señalar que debido a que el esquema de numeración de Kabat que se muestra coloca inserciones en H35A y H35B, el final del bucle Chothia CDR-H1 cuando se numera usando la convención de numeración de Kabat que se muestra varía entre H32 y H34, dependiendo de la longitud del bucle.

Tabla 1.Límites de los CDR según varios esquemas de numeración.

[0376]Por lo tanto, a menos que se especifique lo contrario, una “CDR” o “región determinante complementaria”, o CDR especificadas individuales (p. ej., CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), de un anticuerpo determinado o región del mismo, tal como una región variable del mismo, debe entenderse que abarca una (o la región determinante complementaria específica) como se define por cualquiera de los esquemas antes mencionados, u otros esquemas conocidos. Por ejemplo, cuando se establece que una CDR particular (p. ej., una CDR-H3) contiene la secuencia de aminoácidos de una CDR correspondiente en una secuencia de aminoácidos de la región Vh o Vl dada, se entiende que tal CDR tiene una secuencia de la CDR correspondiente (p. ej., CDR-H3) dentro de la región variable, como se define por cualquiera de los esquemas antes mencionados, u otros esquemas conocidos. En algunos casos, se especifican secuencias de CDR específicas. Se describen secuencias de CDR ejemplares de anticuerpos divulgados utilizando diversos esquemas de numeración, aunque se entiende que un anticuerpo puede incluir CDR como se describe según cualquiera de los otros esquemas de numeración antes mencionados u otros esquemas de numeración conocidos por un experto en la técnica.

[0377]Asimismo, a menos que se especifique lo contrario, una FR o FR(es) individual(es) especificada(s) (p. ej., FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4), de un anticuerpo determinado o región del mismo, tal como una variable región del mismo, debe entenderse que abarca una (o la región marco específica) como se define por cualquiera de los esquemas conocidos. En algunos casos, se especifica el esquema para la identificación de una CDR, FR o FR o CDR particular, tal como la CDR definida por el método Kabat, Chothia, AbM o Contact, u otros esquemas conocidos. En otros casos, se proporciona la secuencia de aminoácidos particular de una CDR o FR.

[0378]El término “región variable” o “dominio variable” se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que participa en la unión del anticuerpo al antígeno. Las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera (V<h>y V<l>, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres CDR. (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., WH Freeman and Co., página 91 (2007). Un único dominio Vh o Vl puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se puede aislar usando un dominio V<h>o V<l>de un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una biblioteca de dominios V<l>o V<h>complementarios, respectivamente Véase, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993);Clarkson y otros, Nature 352:624-628 (1991).

[0379]Entre los anticuerpos incluidos en los CAR divulgados se encuentran fragmentos de anticuerpos. Un “fragmento de anticuerpo” o “fragmento de unión a antígeno” se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; regiones variables de cadena pesada (Vh), moléculas de anticuerpos de cadena sencilla tales como scFv y anticuerpos de dominio único que comprenden únicamente la región V<h>; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno en los CAR divulgados es o comprende un fragmento de anticuerpo que comprende una región de cadena pesada variable (V<h>) y una cadena ligera variable (V<l>). En casos particulares, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos monocatenarios que comprenden una región variable de cadena pesada (Vh) y/o una región variable de cadena ligera (Vl), tales como scFv.

[0380] En algunos casos, el scFv se deriva de FMC63. FMC63 generalmente se refiere a un anticuerpo IgG1 monoclonal de ratón generado contra células Nalm-1 y-16 que expresan CD19 de origen humano (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). En algunos casos, el anticuerpo FMC63 comprende CDRH1 y H2 expuestos en SEQ ID NOS: 39 y 40, respectivamente, y CDRH3 expuesto en SEQ ID NO: 41 o 55 y CDRL1 expuesto en Se Q ID NO: 36 y conjunto CDRL2. indicado en SEQ ID NO: 37 o 56 y CDRL3 establecido en S<e>Q ID NO: 38 o 35. En algunos casos, el anticuerpo FMC63 comprende la región variable de cadena pesada (V<h>) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y la región variable de cadena ligera (V<l>) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43.

[0381] En algunos casos, el scFv comprende una cadena ligera variable que contiene la secuencia CDRL1 de SEQ ID NO:36, una secuencia CDRL2 de SEQ ID NO:37 y una secuencia CDRL3 de SEQ ID NO:38 y/o una cadena pesada variable que contiene una secuencia CDRH1 de SEQ ID NO:39, una secuencia CDRH2 de SEQ ID NO:40 y una secuencia CDRH3 de SEQ ID NO:41. En algunos casos, el scFv comprende una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO:42 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO:43. En algunos casos, las cadenas pesada y ligera variables están conectadas mediante un conector. En algunos casos, el enlazador se establece en SEQ ID NO:57. En algunos casos, el scFv comprende, en orden, un V<h>, un conector y un V<l>. En algunos casos, el scFv comprende, en orden, un Vl, un conector y un Vh. En algunos casos, el scFv está codificado por una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:58 o una secuencia que exhibe al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:58. En algunos casos, el scFv comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:44 o una secuencia que exhibe al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:44.

[0382] En algunos casos, el scFv se deriva de SJ25C1. SJ25C1 es un anticuerpo IgG1 monoclonal de ratón generado contra células Nalm-1 y-16 que expresan CD19 de origen humano (Ling, NR, et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). En algunos casos, el anticuerpo SJ25C1 comprende CDRH1, H2 y H3 expuestos en SEQ ID NOS: 48-50, respectivamente, y secuencias CDRL1, L2 y L3 expuestos en SEQ ID NOS: 45-47, respectivamente. En algunos casos, el anticuerpo SJ25C1 comprende la región variable de cadena pesada (Vh) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 y la región variable de cadena ligera (Vl) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.

[0383] En algunos casos, el scFv comprende una cadena ligera variable que contiene la secuencia CDRL1 de SEQ ID NO:45, una secuencia CDRL2 de SEQ ID NO:46 y una secuencia CDRL3 de SEQ ID NO:47 y/o una cadena pesada variable que contiene una secuencia CDRH1 de SEQ ID NO:48, una secuencia CDRH2 de SEQ ID NO:49 y una secuencia CDRH3 de SEQ ID NO:50. En algunos casos, el scFv comprende una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO:51 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO:52. En algunos casos, la cadena pesada variable y la cadena ligera variable están conectadas mediante un conector. En algunos casos, el enlazador se establece en SEQ ID NO:53. En algunos casos, el scFv comprende, en orden, una Vh, un conector y una Vl. En algunos casos, el scFv comprende, en orden, una Vl, un conector y una Vh. En algunos casos, el scFv comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:54 o una secuencia que exhibe al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:54.

[0384] En algunos casos, el antígeno o el dominio de unión a antígeno es BCMA. En algunos casos, el scFv contiene una V<h>y una V<l>derivadas de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico de BCMA. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a BCMA es o contiene una V<h>y una V<l>de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo establecido en las solicitudes de patente internacionales, número de publicación WO 2016/090327 y WO 2016/090320.

[0385] En algunos casos, el antígeno o el dominio de unión a antígeno es GPRCSD. En algunos casos, el scFv contiene una V<h>y una V<l>derivadas de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico de GPRCSD. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a GPRCSD es o contiene una V<h>y una V<l>de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo establecido en las solicitudes de patente internacionales, número de publicación WO 2016/090329 y WO 2016/090312.

[0386] En algunos casos, el antígeno es CD20. En algunos casos, el scFv contiene una Vh y una Vl derivadas de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico para CD20. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a CD20 es un anticuerpo que es o deriva de Rituximab, tal como Rituximab scFv.

[0387] En algunos casos, el antígeno es CD22. En algunos casos, el scFv contiene una V<h>y una V<l>derivadas de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico para CD22. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a CD22 es un anticuerpo que es o deriva de m971, tal como m971 scFv.

[0388] En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunos aspectos, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene el anticuerpo o fragmento y un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento incluye un scFv.

[0389] En algunos casos, la porción de anticuerpo del receptor recombinante, por ejemplo, CAR, incluye además al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, tal como una región bisagra, por ejemplo, una región bisagra de IgG4, y/o un CH1/CL y/o o región Fc. En algunos casos, la región o porción constante es de una IgG humana, tal como IgG4 o IgG1. En algunos aspectos, la porción de la región constante sirve como región espadadora entre el componente de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, scFv, y el dominio transmembrana. El espaciador puede tener una longitud que proporcione una mayor capacidad de respuesta de la célula después de la unión al antígeno, en comparación con la ausencia del espaciador. Los espaciadores ejemplares incluyen, entre otros, los descritos en Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, publicación de solicitud de patente internacional número WO2014031687, Patente de EE. UU. n.° 8.822.647 o solicitud publicada N° US2014/0271635.

[0390] En algunos casos, la región o porción constante es de una IgG humana, tal como IgG4 o IgG1. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia ESKYGPPCPPCP (establecida en SEQ ID NO: 1) y está codificado por la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: NO: 3. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 4. En algunos casos, la región o porción constante es de IgD. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 5. En algunos casos, el espaciador tiene una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 3, 4 o 5. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NOS: 25-33. En algunos casos, el espaciador tiene una secuencia de aminoácidos que presenta al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOS: 25-33.

[0391] En algunos casos, el receptor de antígeno comprende un dominio intracelular unido directa o indirectamente al dominio extracelular. En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye un dominio transmembrana que une el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende un ITAM. Por ejemplo, en algunos aspectos, el dominio de reconocimiento de antígeno (p. ej., dominio extracelular) generalmente está unido a uno o más componentes de señalización intracelular, tales como componentes de señalización que imitan la activación a través de un complejo de receptor de antígeno, tal como un complejo de TCR, en el caso de un CAR, y/o señal a través de otro receptor de la superficie celular. En algunos casos, el receptor quimérico comprende un dominio transmembrana unido o fusionado entre el dominio extracelular (p. ej., scFv) y el dominio de señalización intracelular. Así, en algunos casos, el componente de unión al antígeno (p. ej., anticuerpo) está unido a uno o más dominios de señalización transmembrana e intracelular.

[0392] En un caso, se usa un dominio transmembrana que está asociado naturalmente con uno de los dominios en el receptor, por ejemplo, CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se selecciona o modifica mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de proteínas de membrana de superficie iguales o diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.

[0393] El dominio transmembrana en algunos casos deriva de una fuente natural o sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio en algunos aspectos deriva de cualquier proteína transmembrana o unida a membrana. Las regiones transmembrana incluyen aquellas derivadas de (es decir, comprenden al menos la(s) región(es) transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, c D9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativamente, el dominio transmembrana en algunos casos es sintético. En algunos aspectos, el dominio transmembrana sintético comprende residuos predominantemente hidrófobos tales como leucina y valina. En algunos aspectos, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. En algunos casos, el enlace se realiza mediante enlazadores, espaciadores y/o dominio(s) transmembrana. En algunos aspectos, el dominio transmembrana contiene una porción transmembrana de CD28.

[0394] En algunos casos, el dominio extracelular y el dominio transmembrana pueden estar unidos directa o indirectamente. En algunos casos, el dominio extracelular y la transmembrana están unidos mediante un espaciador, como cualquiera de los descritos en el presente documento. En algunos casos, el receptor contiene una porción extracelular de la molécula de la que se deriva el dominio transmembrana, tal como una porción extracelular CD28.

[0395] Entre los dominios de señalización intracelular se encuentran aquellos que imitan o se aproximan a una señal a través de un receptor de antígeno natural, una señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor coestimulador y/o una señal a través de un receptor coestimulador solo. En algunos casos, está presente un conector oligo o polipeptídico corto, por ejemplo, un conector de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, tal como uno que contiene glicinas y serinas, por ejemplo, doblete glicina-serina, y forma un enlace entre los dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplasmática del CAR.

[0396] En algunos aspectos, la activación de las células T se describe como mediada por dos clases de secuencias de señalización citoplásmica: aquellas que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplásmica primaria) y aquellas que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplásmica secundaria). En algunos aspectos, el CAR incluye uno o ambos de dichos componentes de señalización.

[0397] El receptor, por ejemplo, el CAR, generalmente incluye al menos uno o varios componentes de señalización intracelular. En algunos aspectos, el CAR incluye una secuencia de señalización citoplásmica primaria que regula la activación primaria del complejo TCR. Las secuencias de señalización citoplasmáticas primarias que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores o ITAM. Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplasmáticas primarias incluyen aquellas derivadas de la cadena CD3 zeta, FcR gamma, CD3 gamma, CD3 delta y CD3 épsilon. En algunos casos, las moléculas de señalización citoplasmática en el CAR contienen un dominio de señalización citoplasmática, una porción del mismo o una secuencia derivada de CD3 zeta.

[0398] En algunos casos, el receptor incluye un componente intracelular de un complejo de TCR, tal como una cadena CD3 de TCR que media la activación y citotoxicidad de las células T, por ejemplo, la cadena zeta de CD3. Por tanto, en algunos aspectos, la porción de unión a antígeno está unida a uno o más módulos de señalización celular. En algunos casos, los módulos de señalización celular incluyen dominio transmembrana de CD3, dominios de señalización intracelular de CD3 y/u otros dominios transmembrana de CD3. En algunos casos, el receptor, por ejemplo, CAR, incluye además una porción de una o más moléculas adicionales tales como el receptor Fc y, c D8, CD4, CD25 o CD16. Por ejemplo, en algunos aspectos, el CAR u otro receptor quimérico incluye una molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3-Z) o receptor Fc y y CD8, CD4, CD25 o CD16.

[0399] En algunos casos, tras la ligación del CAR u otro receptor quimérico, el dominio citoplasmático o dominio de señalización intracelular del receptor activa al menos una de las funciones o respuestas efectoras normales de la célula inmunitaria, por ejemplo, células T diseñadas para expresar el CAR. Por ejemplo, en algunos contextos, el CAR induce una función de una célula T, como la actividad citolítica o la actividad T auxiliar, como la secreción de citocinas u otros factores. En algunos casos, se usa una porción truncada de un dominio de señalización intracelular de un componente receptor de antígeno o molécula coestimuladora en lugar de una cadena inmunoestimuladora intacta, por ejemplo, si transduce la señal de la función efectora. En algunos casos, el dominio o dominios de señalización intracelular incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de células T (TCR) y, en algunos aspectos, también las de correceptores que en el contexto natural actúan en concierto con tales receptores para iniciar la transducción de señales después de la interacción con el receptor de antígeno.

[0400] En el contexto de un TCR natural, la activación completa generalmente requiere no sólo señalización a través del TCR, sino también una señal coestimuladora. Por lo tanto, en algunos casos, para promover la activación completa, también se incluye en el CAR un componente para generar una señal secundaria o coestimuladora. En otros casos, el CAR no incluye un componente para generar una señal coestimuladora. En algunos aspectos, un CAR adicional se expresa en la misma célula y proporciona el componente para generar la señal secundaria o coestimuladora.

[0401] En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular de una molécula coestimuladora de células T. En algunos casos, el CAR incluye un dominio de señalización y/o una porción transmembrana de un receptor coestimulador, como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. En algunos aspectos, un mismo CAR incluye tanto el componente activador como el coestimulador. En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular derivado de una molécula coestimuladora de células T o una variante funcional de la misma, tal como entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, la molécula coestimuladora de células T es CD28 o 41Bb .

[0402] En algunos casos, el dominio activador está incluido dentro de un CAR, mientras que el componente coestimulador lo proporciona otro CAR que reconoce otro antígeno. En algunos casos, los CAR incluyen CAR activadores o estimuladores,<c>A<r>coestimuladores, ambos expresados en la misma célula (ver WO2014/055668). En algunos aspectos, las células incluyen uno o más CAR estimuladores o activadores y/o un CAR coestimulador. En algunos casos, las células incluyen además CAR inhibidores (iCAR, véase Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (diciembre de 2013), como un CAR que reconoce un antígeno distinto del asociado con y/o específico para la enfermedad o afección mediante la cual una señal de activación suministrada a través del CAR dirigido a la enfermedad se reduce o inhibe mediante la unión del CAR inhibidor a su ligando, por ejemplo, para reducir los efectos fuera del objetivo.

[0403] En algunos casos, los dos receptores inducen, respectivamente, una señal activadora y una inhibidora a la célula, de modo que la ligación de uno de los receptores a su antígeno activa la célula o induce una respuesta, pero la ligación del segundo receptor inhibidor a su antígeno induce una señal que suprime o amortigua esa respuesta. Algunos ejemplos son combinaciones de CAR activadores y CAR inhibidores (iCAR). Tal estrategia puede usarse, por ejemplo, para reducir la probabilidad de efectos no deseados en el contexto en el que el CAR activador se une a un antígeno expresado en una enfermedad o afección pero que también se expresa en células normales, y el receptor inhibidor se une a un antígeno separado que se expresa en las células normales pero no en las células de la enfermedad o afección.

[0404] En algunos aspectos, el receptor quimérico es o incluye un CAR inhibidor (p. ej., iCAR) e incluye componentes intracelulares que amortiguan o suprimen una respuesta inmune, tal como una respuesta promovida por ITAM y/o coestimulación en la célula. Ejemplos de tales componentes de señalización intracelular son los que se encuentran en moléculas de puntos de control inmunológico, incluidos los receptores PD-1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, PGE2, receptores de adenosina EP2/4, incluido A2AR. En algunos aspectos, la célula diseñada incluye un CAR inhibidor que incluye un dominio de señalización de, o derivado de dicha molécula inhibidora, de manera que sirve para amortiguar la respuesta de la célula, por ejemplo, la inducida por un CAR activador y/o coestimulador.

[0405]En ciertos casos, el dominio de señalización intracelular comprende una transmembrana CD28 y un dominio de señalización unido a un dominio intracelular CD3 (p. ej., CD3-zeta). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende dominios coestimuladores c D28 y CD137 (4-1BB, TNFRSF9) quiméricos, unidos a un dominio intracelular CD3 zeta.

[0406]En algunos casos, el CAR abarca uno o más, por ejemplo, dos o más, dominios coestimuladores y un dominio de activación, por ejemplo, un dominio de activación primario, en la porción citoplasmática. Los CAR ejemplares incluyen componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 y 4-1BB.

[0407]En algunos casos, el receptor de antígeno incluye además un marcador y/o células que expresan el CAR u otro receptor de antígeno incluye además un marcador sustituto, tal como un marcador de superficie celular, que puede usarse para confirmar la transducción o ingeniería de la célula para expresar el receptor. En algunos aspectos, el marcador incluye todo o parte (p. ej., forma truncada) de CD34, un NGFR o receptor del factor de crecimiento epidérmico, tal como una versión truncada de dicho receptor de superficie celular (p. ej., EGFRt). En algunos casos, el ácido nucleico que codifica el marcador está unido operativamente a un polinucleótido que codifica una secuencia conectora, tal como una secuencia conectora escindible, por ejemplo, T2A. Por ejemplo, un marcador, y opcionalmente una secuencia conectora, puede ser cualquiera de los descritos en la solicitud de patente publicada N° WO2014031687. Por ejemplo, el marcador puede ser un EGFR truncado (tEGFR) que está, opcionalmente, unido a una secuencia conectora, tal como una secuencia conectora escindible T2A.

[0408]Un polipéptido ejemplar para un EGFR truncado (p. ej., EGFRt) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o 16 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7 o 16. Una secuencia conectora T2A ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6 o 17 o una secuencia de aminoácidos que presenta al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con SEQ ID NO: 6 o 17.

[0409]En algunos casos, el marcador es una molécula, por ejemplo, una proteína de la superficie celular, que no se encuentra de forma natural en las células T o que no se encuentra de forma natural en la superficie de las células T, o una porción de las mismas. En algunos casos, la molécula es una molécula no propia, por ejemplo, proteína no propia, es decir, una que no es reconocida como “propia” por el sistema inmunológico del huésped al que se transferirán adoptivamente las células.

[0410]En algunos casos, el marcador no cumple ninguna función terapéutica y/o no produce ningún efecto distinto del de usarse como marcador para ingeniería genética, por ejemplo, para seleccionar células diseñadas con éxito. En otros casos, el marcador puede ser una molécula terapéutica o una molécula que de otro modo ejerza algún efecto deseado, tal como un ligando para una célula que se encontrará in vivo, tal como una molécula coestimuladora o de punto de control inmunológico para mejorar y/o amortiguar las respuestas de las células. tras la transferencia adoptiva y el encuentro con el ligando.

[0411]En algunos casos, los CAR se denominan CAR de primera, segunda y/o tercera generación. En algunos aspectos, un CAR de primera generación es aquel que únicamente proporciona una señal inducida por la cadena CD3 tras la unión al antígeno; en algunos aspectos, un<c>A<r>de segunda generación es uno que proporciona tal señal y señal coestimuladora, tal como una que incluye un dominio de señalización intracelular de un receptor coestimulador tal como CD28 o CD137; en algunos aspectos, un CAR de tercera generación es aquel que incluye múltiples dominios coestimuladores de diferentes receptores coestimuladores.

[0412]Por ejemplo, en algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, tal como un scFv, específico para un antígeno que incluye cualquiera de los descritos, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de CD28 o una variante funcional del mismo. y un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de CD28 o una variante funcional del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o una variante funcional del mismo. En algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, tal como un scFv, específico para un antígeno que incluye cualquiera de los descritos, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de CD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio intracelular. dominio de señalización que contiene una porción de señalización de 4-1BB o variante funcional del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o variante funcional del mismo. En algunos de tales casos, el receptor incluye además un espaciador que contiene una porción de una molécula de Ig, tal como una molécula de Ig humana, tal como una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4, tal como un espaciador sólo de bisagra.

[0413]En algunos casos, el dominio transmembrana del receptor recombinante, por ejemplo, el CAR, es o incluye un dominio transmembrana de CD28 humano (p. ej., número de acceso P01747.1) o variante del mismo, tal como un dominio transmembrana que comprende la secuencia de amino ácidos establecidos en SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con SEQ ID NO: 8; en algunos casos, la porción del receptor recombinante que contiene el dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos o aproximadamente 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con la misma.

[0414]En algunos casos, el componente o componentes de señalización intracelular del receptor recombinante, por ejemplo, el CAR, contiene un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD28 humano o una variante funcional o porción del mismo, tal como un dominio con una sustitución de LL por GG en las posiciones 186-187 de una proteína c D28 nativa. Por ejemplo, el dominio de señalización intracelular puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10 u 11 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con SEQ ID NO: 10 u 11. En algunos casos, el dominio intracelular comprende un dominio de señalización coestimuladora intracelular de 4-1BB (p. ej. (n.° de acceso Q07011.1) o variante funcional o porción del mismo, tal como la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con SEQ ID NO: 12.

[0415]En algunos casos, el dominio de señalización intracelular del receptor recombinante, por ejemplo, el CAR, comprende un dominio de señalización estimulador de CD3 zeta humano o una variante funcional del mismo, tal como un dominio citoplásmico de 112 AA de la isoforma 3 de CD3Z humano (N° de registro: P20963.2) o un dominio de señalización CD3 zeta como se describe en la Patente de EE. UU. n°: 7.446.190 o la Patente de EE. u U. N° 8.911.993. Por ejemplo, en algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 13, 14 o 15 o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con SEQ ID NO: 13, 14 o 15.

[0416]En algunos aspectos, el espaciador contiene solo una región bisagra de una IgG, tal como solo una bisagra de IgG4 o IgG1, tal como el espaciador solo bisagra expuesto en SEQ ID NO: 1. En otros casos, el espaciador es o contiene una Bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra derivada de IgG4, opcionalmente unida a dominios CH2 y/o CH3. En algunos casos, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4, unida a los dominios CH2 y CH3, tal como se establece en SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo, una bisagra de IgG4. bisagra, unida a un dominio CH3 únicamente, tal como se establece en SEQ ID NO: 3. En algunos casos, el espaciador es o comprende una secuencia rica en glicina-serina u otro conector flexible tal como conectores flexibles conocidos.

[0417]Por ejemplo, en algunos casos, el CAR incluye un anticuerpo tal como un fragmento de anticuerpo, incluyendo scFv, un espaciador, tal como un espaciador que contiene una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como una región bisagra y/o una o más regiones constantes de una molécula de cadena pesada, tal como un espaciador que contiene bisagra de Ig, un dominio transmembrana que contiene todo o una parte de un dominio transmembrana derivado de CD28, un dominio de señalización intracelular derivado de CD28 y un dominio de señalización zeta de CD3. En algunos casos, el CAR incluye un anticuerpo o fragmento, como scFv, un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagras de Ig, un dominio transmembrana derivado de CD28, un dominio de señalización intracelular derivado de 4-1BB, y un dominio de señalización derivado de CD3 zeta.

[0418]Los marcadores sustitutos ejemplares pueden incluir formas truncadas de polipéptidos de la superficie celular, tales como formas truncadas que no son funcionales y no transducen o no son capaces de transducir una señal o una señal normalmente transducida por la forma de longitud completa del polipéptido de la superficie celular y/o no son o no son capaces de internalizar. Polipéptidos de superficie celular truncados ejemplares que incluyen formas truncadas de factores de crecimiento u otros receptores tales como un receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano truncado (tHER2), un receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado (tEGFR, secuencia EGFRt ejemplar expuesta en 7 o 16) o un antígeno de membrana específico a próstata (PSMA) o forma modificada del mismo. EGFRt puede contener un epítopo reconocido por el anticuerpo cetuximab (Erbitux®) u otro anticuerpo terapéutico anti-EGFR o molécula de unión, que puede usarse para identificar o seleccionar células que han sido diseñadas para expresar la construcción EGFRt y una proteína exógena codificada, y/o eliminar o separar células que expresan la proteína exógena codificada. Véase la Patente de EE. UU. N° 8.802.374 y Liu et al., Nature Biotech. 2016 abril; 34(4): 430-434). En algunos aspectos, el marcador, p. ej. marcador sustituto, incluye todo o parte (p. ej., forma truncada) de CD34, un NGFR, un CD19 o un CD19 truncado, por ejemplo, un CD19 no humano truncado o un receptor del factor de crecimiento epidérmico (p. ej., EGFRt). En algunos casos, el marcador es o comprende una proteína fluorescente, tal como proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), tal como GFP súper plegada (sfGFP), proteína fluorescente roja (RFP), tal como tdTomato., mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed o DsRed2, proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente verde azul (BFP), proteína fluorescente azul mejorada (EBFP) y proteína fluorescente amarilla (YFP), y variantes de las mismas, incluidas variantes de especies, variantes monoméricas y variantes optimizadas con codones y/o mejoradas de las proteínas fluorescentes. En algunos casos, el marcador es o comprende una enzima, tal como una luciferasa, el gen lacZ deE. coli,fosfatasa alcalina, fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP), cloranfenicol acetil transferasa (CAT). Los genes indicadores emisores de luz a modo de ejemplo incluyen luciferasa (luc), p-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), p-glucuronidasa (GUS) o variantes de los mismos.

[0419]En algunos casos, el marcador es un marcador de selección. En algunos casos, el marcador de selección es o comprende un polipéptido que confiere resistencia a agentes o fármacos exógenos. En algunos casos, el marcador de selección es un gen de resistencia a los antibióticos. En algunos casos, el marcador de selección es un gen de resistencia a los antibióticos que confiere resistencia a los antibióticos a una célula de mamífero. En algunos casos, el marcador de selección es o comprende un gen de resistencia a puromicina, un gen de resistencia a higromicina, un gen de resistencia a blasticidina, un gen de resistencia a neomicina, un gen de resistencia a geneticina o un gen de resistencia a zeocina o una forma modificada del mismo.

[0420]En algunos casos, el ácido nucleico que codifica el marcador está unido operativamente a un polinucleótido que codifica una secuencia conectora, tal como una secuencia conectora escindible, por ejemplo, una T2A. Por ejemplo, un marcador, y opcionalmente una secuencia enlazadora, puede ser cualquiera de los descritos en la Pub. p Ct . N° WO2014031687.

[0421]En algunos casos, las moléculas de ácido nucleico que codifican dichas construcciones de CAR incluyen además una secuencia que codifica un elemento de salto ribosómico T2A y/o una secuencia EGFRt, por ejemplo, cadena abajo de la secuencia que codifica el CAR. En algunos casos, la secuencia codifica un elemento de salto ribosomal T2A establecido en SEQ ID NO: 6 o 17, o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con SEQ ID NO: 6 o 17. En algunos casos, las células T que expresan un receptor de antígeno (p. ej., CAR) también se puede generar para expresar un EGFR truncado (EGFRt) como un epítopo de selección no inmunogénico (p. ej., mediante la introducción de una construcción que codifica CAR y EGFRt separados por un interruptor de ribosoma T2A para expresar dos proteínas de la misma construcción), que luego puede usarse como marcador para detectar dichas células (ver, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N° 8.802.374). En algunos casos, la secuencia codifica una secuencia EGFRt expuesta en SEQ ID NO: 7 o 16, o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7 o 16. En algunos casos, el péptido, tal como T2A, puede hacer que el ribosoma se salte (salto del ribosoma) la síntesis de un enlace peptídico en el extremo C de un elemento 2A, lo que lleva a la separación entre el final de la secuencia 2A y el siguiente péptido aguas abajo(ver,por ejemplo, deFelipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) y deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). Se conocen muchos elementos 2A. Ejemplos de secuencias 2A que se pueden usar en los métodos y ácidos nucleicos divulgados en el presente documento, sin limitación, secuencias 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 21), virus de la rinitis equina A (E2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 20), virus Thesea asigna (T2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 6 o 17), y teschovirus-1 porcino (P2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 18 o 19) como se describe en la Publicación de Patente de EE. UU. N °20070116690.

[0422]En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor recombinante, por ejemplo, el receptor de antígeno quimérico (CAR) contiene una secuencia señal que codifica un péptido señal. Los ejemplos ejemplares no limitantes de péptidos señal incluyen, por ejemplo, el péptido señal de cadena alfa GMCSFR expuesto en s Eq ID NO: 62 y codificado por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 61, el péptido señal CD8 alfa expuesto en SEQ ID NO: 60, o el péptido señal CD33 expuesto en SEQ ID NO: 59.

[0423]Los receptores recombinantes, tales como CAR, expresados por las células administradas al sujeto generalmente reconocen o se unen específicamente a una molécula que se expresa, está asociada con y/o es específica para la enfermedad o afección o las células de la misma que se están tratando. Tras la unión específica a la molécula, por ejemplo, antígeno, el receptor generalmente suministra una señal inmunoestimuladora, tal como una señal transducida por iTa M, al interior de la célula, promoviendo así una respuesta inmune dirigida a la enfermedad o afección. Por ejemplo, en algunos casos, las células expresan un CAR que se une específicamente a un antígeno expresado por una célula o tejido de la enfermedad o afección o asociado con la enfermedad o afección.

B. TCR

[0424]En algunos casos, se describen células diseñadas, como células T, que expresan un receptor de células T (TCR) o una porción de unión a antígeno del mismo que reconoce un epítopo peptídico o un epítopo de células T de un polipéptido diana, como un antígeno de un tumor, proteína viral o autoinmune.

[0425]En algunos casos, un “receptor de células T” o “TCR” es una molécula que contiene cadenas a y p variables (también conocidas como TCR ay TCRp, respectivamente) o cadenas y y 6 variables (también conocidas como TCRa y TCRp, respectivamente), o porciones de unión a antígeno del mismo, y que es capaz de unirse específicamente a un péptido unido a una molécula de MHC. En algunos casos, el TCR está en forma ap. Normalmente, los TCR que existen en formas ap y y6 son generalmente estructuralmente similares, pero las células T que los expresan pueden tener ubicaciones o funciones anatómicas distintas. Un TCR se puede encontrar en la superficie de una célula o en forma soluble. Generalmente, un TCR se encuentra en la superficie de las células T (o linfocitos T), donde generalmente es responsable de reconocer los antígenos unidos a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

[0426]A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término “TCR” abarca TCR completos así como porciones de unión a antígeno o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunos casos, el TCR es un TCR intacto o de longitud completa, incluidos los TCR en forma ap o forma<y>6. En algunos casos, el TCR es una porción de unión a antígeno que es menor que un TCR de longitud completa pero que se une a un péptido específico unido en una molécula de MHC, como por ejemplo se une a un complejo MHC-péptido. En algunos casos, una porción o fragmento de unión a antígeno de un TCR puede contener sólo una porción de los dominios estructurales de un TCR de longitud completa o intacto, pero aún así es capaz de unirse al epítopo peptídico, tal como el complejo MHC-péptido, al que se une el antígeno. Se une TCR completo. En algunos casos, una porción de unión al antígeno contiene los dominios variables de un TCR, tales como la cadena a variable y la cadena p variable de un TCR, suficientes para formar un sitio de unión para unirse a un complejo MHC-péptido específico. Generalmente, las cadenas variables de un TCR contienen regiones determinantes de complementariedad implicadas en el reconocimiento del péptido, MHC y/o complejo MHC-péptido.

[0427]En algunos casos, los dominios variables del TCR contienen bucles hipervariables o regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que generalmente son los principales contribuyentes al reconocimiento del antígeno y a las capacidades y especificidad de unión. En algunos casos, una CDR de un TCR o una combinación de los mismos forma todo o sustancialmente todo el sitio de unión al antígeno de una molécula de TCR determinada. Las diversas CDR dentro de una región variable de una cadena de TCR generalmente están separadas por regiones estructurales (FR), que generalmente muestran menos variabilidad entre las moléculas de TCR en comparación con las CDR (véase, por ejemplo, Jores et al., Proc. Nat'l Acad Sci. EE. UU. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988; véase también Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). En algunos casos, CDR3 es la principal CDR responsable de la unión o especificidad del antígeno, o es la más importante entre las tres CDR en una región variable de TCR determinada para el reconocimiento de antígeno y/o para la interacción con la porción peptídica procesada del complejo de péptido-MHC. En algunos contextos, la CDR1 de la cadena alfa puede interactuar con la parte N-terminal de ciertos péptidos antigénicos. En algunos contextos, la CDR1 de la cadena beta puede interactuar con la parte C-terminal del péptido. En algunos contextos, CDR2 contribuye más fuertemente o es la CDR principal responsable de la interacción o el reconocimiento de la porción MHC del complejo MHC-péptido. En algunos casos, la región variable de la cadena p puede contener una región hipervariable adicional (CDR4 o HVR4), que generalmente está implicada en la unión del superantígeno y no en el reconocimiento del antígeno (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).

[0428]En algunos casos, un TCR también puede contener un dominio constante, un dominio transmembrana y/o una cola citoplasmática corta (véase, por ejemplo, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3a edición, Current Biology Publications), pág. 4:33, 1997). En algunos aspectos, cada cadena del TCR puede poseer un dominio variable de inmunoglobulina N-terminal, un dominio constante de inmunoglobulina, una región transmembrana y una cola citoplasmática corta en el extremo Cterminal. En algunos casos, un TCR está asociado con proteínas invariantes del complejo CD3 implicadas en la mediación de la transducción de señales.

[0429]En algunos casos, una cadena de TCR contiene uno o más dominios constantes. Por ejemplo, la porción extracelular de una cadena de TCR determinada (p. ej., cadena a o cadena p) puede contener dos dominios similares a inmunoglobulinas, tales como un dominio variable (p. ej., Va o Vp; típicamente los aminoácidos 1 a 116). basado en la numeración de Kabat Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5a ed.) y un dominio constante (p. ej., dominio constante de cadena a o Ca, típicamente posiciones 117 a 259 de la cadena según la numeración de Kabat o dominio constante de la cadena p o Cp, típicamente posiciones 117 a 295 de la cadena según Kabat) adyacente a la membrana celular. Por ejemplo, en algunos casos, la porción extracelular del TCR formada por las dos cadenas contiene dos dominios constantes proximales a la membrana y dos dominios variables distales a la membrana, cada uno de los cuales contiene CDR. El dominio constante del TCR puede contener secuencias de conexión cortas en las que se encuentra un residuo de cisteína forma un enlace disulfuro, uniendo así las dos cadenas del TCR. En algunos casos, un TCR puede tener un residuo de cisteína adicional en cada una de las cadenas a y p, de modo que el TCR contenga dos enlaces disulfuro en los dominios constantes.

[0430]En algunos casos, las cadenas de TCR contienen un dominio transmembrana. En algunos casos, el dominio transmembrana está cargado positivamente. En algunos casos, la cadena TCR contiene una cola citoplasmática. En algunos casos, la estructura permite que el TCR se asocie con otras moléculas como CD3 y sus subunidades. Por ejemplo, un TCR que contiene dominios constantes con una región transmembrana puede anclar la proteína en la membrana celular y asociarse con subunidades invariantes del complejo o aparato de señalización CD3. Las colas intracelulares de las subunidades de señalización de CD3 (p. ej., cadenas CD3<y>, CD38, CD3<e>y CD3Z) contienen uno o más motivos de activación de inmunorreceptores basados en tirosina o ITAM que están involucrados en la capacidad de señalización del complejo TCR.

[0431]En algunos casos, el TCR puede ser un heterodímero de dos cadenas a y p (u opcionalmente<y>y 8) o puede ser una construcción de TCR de cadena sencilla. En algunos casos, el TCR es un heterodímero que contiene dos cadenas separadas (cadenas a y p o cadenas<y>y 8) que están unidas, como por un enlace disulfuro o enlaces disulfuro.

[0432]En algunos casos, el TCR puede generarse a partir de una secuencia o secuencias de TCR conocidas, tales como secuencias de cadenas Va,p, para las cuales está fácilmente disponible una secuencia codificante de longitud sustancialmente completa. Son bien conocidos los métodos para obtener secuencias de TCR de longitud completa, incluidas secuencias de la cadena V, a partir de fuentes celulares. En algunos casos, los ácidos nucleicos que codifican el TCR se pueden obtener de una variedad de fuentes, tales como mediante la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ácidos nucleicos que codifican el TCR dentro o aislados de una célula o células determinadas, o la síntesis de secuencias de ADN de TCR disponibles públicamente.

[0433]En algunos casos, el TCR se obtiene de una fuente biológica, tal como de células tales como células T (p. ej., células T citotóxicas), hibridomas de células T u otra fuente disponible públicamente. En algunos casos, las células T pueden obtenerse a partir de células aisladasin vivo.En algunos casos, el TCR es un TCR seleccionado tímicamente. En algunos casos, el TCR es un TCR restringido a neoepítopos. En algunos casos, las células T pueden ser un hibridoma o un clon de células T cultivadas. En algunos casos, el TCR o su porción de unión a antígeno o su fragmento de unión a antígeno se pueden generar sintéticamente a partir del conocimiento de la secuencia del TCR.

[0434]En algunos casos, el TCR se genera a partir de un TCR identificado o seleccionado a partir del cribado de una biblioteca de TCR candidatos frente a un antígeno polipeptídico diana, o un epítopo de célula T diana del mismo. Las bibliotecas de TCR pueden generarse mediante amplificación del repertorio de Va y Vp de células T aisladas de un sujeto, incluidas células presentes en PBMC, bazo u otro órgano linfoide. En algunos casos, las células T pueden amplificarse a partir de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). En algunos casos, se pueden generar bibliotecas de TCR a partir de células T CD4+ o CD8+. En algunos casos, los TCR pueden amplificarse a partir de una fuente de células T de un sujeto normal o sano, es decir, bibliotecas de TCR normales. En algunos casos, los TCR pueden amplificarse a partir de una fuente de células T de un sujeto enfermo, es decir, bibliotecas de TCR enfermos. En algunos casos, se utilizan cebadores degenerados para amplificar el repertorio de genes de Va y Vp, por ejemplo, mediante RT-PCR en muestras, como células T, obtenidas de humanos. En algunos casos, las bibliotecas scTv se pueden ensamblar a partir de bibliotecas Va y Vp ingenuas en las que los productos amplificados se clonan o ensamblan para separarlos mediante un conector. Dependiendo de la fuente del sujeto y de las células, las bibliotecas pueden ser específicas del alelo HLA. Alternativamente, en algunos casos, las bibliotecas de TCR pueden generarse mediante mutagénesis o diversificación de una molécula de TCR original o de soporte. En algunos aspectos, los TCR están sujetos a evolución dirigida, tal como mediante mutagénesis, por ejemplo, de la cadena a o p. En algunos aspectos, se alteran residuos particulares dentro de las CDR del TCR. En algunos casos, los TCR seleccionados pueden modificarse mediante maduración por afinidad. En algunos casos, se pueden seleccionar células T específicas de antígeno, por ejemplo, mediante cribado para evaluar la actividad de CTL contra el péptido. En algunos aspectos, los TCR, por ejemplo, presentes en las células T específicas de antígeno, pueden seleccionarse, por ejemplo, mediante actividad de unión, por ejemplo, afinidad o avidez particular por el antígeno.

[0435]En algunos casos, el TCR o su porción de unión a antígeno es uno que ha sido modificado o diseñado. En algunos casos, se utilizan métodos de evolución dirigida para generar TCR con propiedades alteradas, como con mayor afinidad por un complejo MHC-péptido específico. En algunos casos, la evolución dirigida se logra mediante métodos de presentación que incluyen, entre otros, presentación en levadura (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci EE. UU., 97, 5387-92), presentación en fagos (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), o presentación en células T (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84). En algunos casos, los enfoques de visualización implican diseñar o modificar un TCR conocido, principal o de referencia. Por ejemplo, en algunos casos, se puede usar un TCR de tipo salvaje como plantilla para producir TCR mutagenizados en los que uno o más residuos de las CDR están mutados, y mutantes con una propiedad alterada deseada, tal como mayor afinidad por una propiedad deseada. antígeno diana, se seleccionan.

[0436]En algunos casos, los péptidos de un polipéptido diana para su uso en la producción o generación de un TCR de interés son conocidos o pueden identificarse fácilmente. En algunos casos, los péptidos adecuados para su uso en la generación de TCR o porciones de unión a antígeno se pueden determinar basándose en la presencia de un motivo restringido por HLA en un polipéptido diana de interés, tal como un polipéptido diana que se describe a continuación. En algunos casos, los péptidos se identifican utilizando modelos de predicción por computadora disponibles. En algunos casos, para predecir los sitios de unión del MHC clase I, tales modelos incluyen, entre otros, ProPredl (Singh y Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237, y SYFPEITHI (ver Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007). En algunos casos, el epítopo restringido al MHC es HLA-A0201, que se expresa en aproximadamente el 39-46 % de todos los caucásicos y, por lo tanto, representa un epítopo adecuado. elección del antígeno MHC para su uso en la preparación de un TCR u otra molécula de unión a péptido MHC.

[0437]Se conocen los motivos de unión de HLA-A0201 y los sitios de escisión para proteosomas e inmuneproteosomas utilizando modelos de predicción por computadora. Para predecir los sitios de unión del MHC de clase I, dichos modelos incluyen, entre otros, ProPredl (descrito con más detalle en Singh y Raghava, ProPred: predict of HLA-DR junction sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-12372001) y SYFPEITHI (véase Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. en Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-932007).

[0438]En algunos casos, el TCR o su porción de unión a antígeno puede ser una proteína natural producida de forma recombinante o una forma mutada de la misma en la que se han alterado una o más propiedades, tales como la característica de unión. En algunos casos, un TCR puede derivar de una de varias especies animales, tales como humanos, ratones, ratas u otros mamíferos. Un TCR puede estar unido a células o en forma soluble. En algunos casos, para los fines de los métodos descritos, el TCR está en forma unida a células expresada en la superficie de una célula.

[0439]En algunos casos, el TCR es un TCR completo. En algunos casos, el TCR es una porción de unión a antígeno. En algunos casos, el TCR es un TCR dimérico (dTCR). En algunos casos, el TCR es un TCR de cadena única (sc-TCR). En algunos casos, un dTCR o scTCR tiene las estructuras descritas en los documentos WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186.

[0440]En algunos casos, el TCR contiene una secuencia correspondiente a la secuencia transmembrana. En algunos casos, el TCR contiene una secuencia correspondiente a secuencias citoplasmáticas. En algunos casos, el TCR es capaz de formar un complejo de TCR con CD3. En algunos casos, cualquiera de los TCR, incluido un dTCR o scTCR, puede unirse a dominios de señalización que producen un TCR activo en la superficie de una célula T. En algunos casos, el TCR se expresa en la superficie de las células.

[0441]En algunos casos, un dTCR contiene un primer polipéptido en el que una secuencia correspondiente a una secuencia de la región variable de la cadena a de TCR está fusionada al extremo N de una secuencia correspondiente a una secuencia extracelular de la región constante de la cadena a de TCR, y un segundo polipéptido en el que una secuencia correspondiente a una secuencia de la región variable de la cadena p de TCR se fusiona al extremo N de una secuencia correspondiente a una secuencia extracelular de la región constante de la cadena p de TCR, estando unidos los polipéptidos primero y segundo mediante un enlace disulfuro. En algunos casos, el enlace puede corresponder al enlace disulfuro entre cadenas nativo presente en los TCR ap diméricos nativos. En algunos casos, los enlaces disulfuro entre cadenas no están presentes en un TCR nativo. Por ejemplo, en algunos casos, se pueden incorporar una o más cisteínas en las secuencias extracelulares de la región constante del par de polipéptidos dTCR. En algunos casos, puede ser deseable un enlace disulfuro tanto nativo como no nativo. En algunos casos, el TCR contiene una secuencia transmembrana para anclarse a la membrana.

[0442]En algunos casos, un dTCR contiene una cadena a de TCR que contiene un dominio a variable, un dominio a constante y un primer motivo de dimerización unido al extremo C del dominio a constante, y una cadena p de TCR que comprende un dominio p variable, un dominio p constante y un primer motivo de dimerización unido al extremo C del dominio p constante, en el que el primer y segundo motivos de dimerización interactúan fácilmente para formar un enlace covalente entre un aminoácido en el primer motivo de dimerización y un aminoácido en el segundo motivo de dimerización que une la cadena a de TCR y la cadena p de TCR.

[0443]En algunos casos, el TCR es un scTCR. Normalmente, se puede generar un scTCR utilizando métodos conocidos. Véase, por ejemplo, Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (EE. UU.) 89, 4759 (1992); Wülfing, C. y Plückthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (EE. UU.) 903830 (1993); PCT publicadas internacionalmente Nos. WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; y Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996). En algunos casos, un scTCR contiene un enlace entre cadenas disulfuro no nativo introducido para facilitar la asociación de las cadenas de TCR (véase, por ejemplo, la publicación internacional PCT N° WO 03/020763). En algunos casos, un scTCR es un TCR truncado sin enlaces disulfuro en el que cremalleras de leucina heterólogas fusionadas a sus extremos C facilitan la asociación de cadenas (véase, por ejemplo, la publicación PCT internacional N° WO99/60120). En algunos casos, un scTCR contiene un dominio variable a de TCR unido covalentemente a un dominio variable p de TCR mediante un conector peptídico (véase, por ejemplo, la publicación PCT internacional N° WO99/18129).

[0444]En algunos casos, un scTCR contiene un primer segmento constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región variable de la cadena a de TCR, un segundo segmento constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de región variable de la cadena p de TCR fusionada al extremo N de un secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena p de TCR, y una secuencia conectora que une el extremo C del primer segmento al extremo N del segundo segmento.

[0445]En algunos casos, un scTCR contiene un primer segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena a fusionada al extremo N de una secuencia de dominio constante extracelular de cadena a, y un segundo segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena p fusionada al extremo N de una secuencia constante extracelular de cadena p y una secuencia transmembrana, y, opcionalmente, una secuencia conectora que une el extremo C terminal del primer segmento al extremo N terminal del segundo segmento.

[0446]En algunos casos, un scTCR contiene un primer segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena p de TCR fusionada al extremo N de una secuencia de dominio constante extracelular de cadena p, y un segundo segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena a fusionada al extremo N de una secuencia constante extracelular de cadena a y de una secuencia transmembrana, y, opcionalmente, una secuencia conectora que une el extremo C terminal del primer segmento al extremo N terminal del segundo segmento.

[0447]En algunos casos, el conector de un scTCR que une el primer y segundo segmento de TCR puede ser cualquier conector capaz de formar una única cadena polipeptídica, conservando al mismo tiempo la especificidad de unión de TCR. En algunos casos, la secuencia conectora puede, por ejemplo, tener la fórmula -P-AA-P- en la que P es prolina y AA representa una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos son glicina y serina. En algunos casos, el primer y segundo segmento están emparejados de modo que las secuencias de la región variable de los mismos estén orientadas para dicha unión. Por lo tanto, en algunos casos, el conector tiene una longitud suficiente para abarcar la distancia entre el extremo C del primer segmento y el extremo N del segundo segmento, o viceversa, pero no es demasiado largo para bloquear o reducir la unión del scTCR. al ligando objetivo. En algunos casos, el conector puede contener de 10 a 45 aminoácidos o de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 aminoácidos, tal como de 10 a 30 aminoácidos o de 26 a 41 residuos de aminoácidos, por ejemplo, 29, 30, 31 o 32 aminoácidos. En algunos casos, el conector tiene la fórmula PGGG-(SGGGG)5-P- en la que P es prolina, G es glicina y S es serina (SEQ ID NO:28). En algunos casos, el conector tiene la secuencia GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO:29).

[0448]En algunos casos, el scTCR contiene un enlace disulfuro covalente que une un residuo de la región de inmunoglobulina del dominio constante de la cadena a a un residuo de la región de inmunoglobulina del dominio constante de la cadena p. En algunos casos, el enlace disulfuro entre cadenas en un TCR nativo no está presente. Por ejemplo, en algunos casos, se pueden incorporar una o más cisteínas en las secuencias extracelulares de la región constante del primer y segundo segmento del polipéptido scTCR. En algunos casos, puede ser deseable un enlace disulfuro tanto nativo como no nativo.

[0449]En algunos casos de un dTCR o scTCR que contiene enlaces disulfuro entre cadenas introducidos, los enlaces disulfuro nativos no están presentes. En algunos casos, una o más de las cisteínas nativas que forman enlaces disulfuro intercatenarios nativos se sustituyen por otro residuo, tal como por una serina o alanina. En algunos casos, se puede formar un enlace disulfuro introducido mutando residuos distintos de cisteína en el primer y segundo segmento a cisteína. Se describen ejemplos de enlaces disulfuro no nativos de un TCR en la publicación PCT internacional N° WO2006/000830.

[0450]En algunos casos, el TCR o fragmento de unión a antígeno del mismo muestra una afinidad con una constante de unión en equilibrio para un antígeno diana de entre o entre aproximadamente 10-5 y 10-12 M y todos los valores y rangos individuales en el mismo. En algunos casos, el antígeno diana es un complejo o ligando MHC-péptido.

[0451]En algunos casos, el ácido nucleico o los ácidos nucleicos que codifican un TCR, tal como las cadenas a y p, pueden amplificarse mediante PCR, clonación u otros medios adecuados y clonarse en un vector o vectores de expresión adecuados. El vector de expresión puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado y puede usarse para transformar o transfectar cualquier huésped adecuado. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para propagación y expansión o para expresión o ambas, tales como plásmidos y virus.

[0452]En algunos casos, el vector puede ser un vector de la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, California), la serie pET (Novagen, Madison, Wisconsin), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), o la serie pEX (Clontech, Palo Alto, California). En algunos casos, también se pueden utilizar vectores bacteriófagos, tales como<á>G10, AGT11, AZaplI (Stratagene), AEMBL4 y ANM1149. En algunos casos, se pueden usar vectores de expresión de plantas e incluyen pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). En algunos casos, los vectores de expresión animal incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). En algunos casos, se utiliza un vector viral, tal como un vector retroviral.

[0453]En algunos casos, los vectores de expresión recombinantes se pueden preparar usando técnicas de ADN recombinante estándar. En algunos casos, los vectores pueden contener secuencias reguladoras, tales como codones de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, que son específicos del tipo de huésped (p. ej., bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir el vector, como apropiado y teniendo en cuenta si el vector está basado en ADN o ARN. En algunos casos, el vector puede contener un promotor no nativo unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR o la porción de unión al antígeno (u otra molécula de unión al péptido MHC). En algunos casos, el promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, tal como un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor SV40, un promotor RSV y un promotor que se encuentra en la repetición terminal larga de la célula madre murina. virus. También se contemplan otros promotores conocidos.

[0454]En algunos casos, para generar un vector que codifica un TCR, las cadenas a y p se amplifican por PCR a partir de ADNc total aislado de un clon de células T que expresa el TCR de interés y se clonan en un vector de expresión. En algunos casos, las cadenas a y p se clonan en el mismo vector. En algunos casos, las cadenas a y p se clonan en vectores diferentes. En algunos casos, las cadenas a y p generadas se incorporan a un vector retroviral, por ejemplo, lentiviral.

V. COMPOSICIONES, FORMULACIONES Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN

[0455]En algunos casos, las composiciones de salida de células T enriquecidas producidas mediante los métodos descritos en el presente documento, tales como los descritos en la Sección I, se administran como una terapia celular, por ejemplo, una terapia celular adoptiva. En casos particulares, una o más composiciones celulares, por ejemplo, composiciones de células de salida descritas en el presente documento, se administran como terapia celular. En algunos casos, se describen métodos de terapia adoptiva con células T, por ejemplo, en la publicación de solicitud de Patente de EE. UU. N° 2003/0170238 de Gruenberg et al; Patente de EE. UU. N° 4.690.915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). Véase, por ejemplo, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Dávila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.

[0456]En ciertos casos, los métodos descritos en el presente documento producen una única composición de salida de células T enriquecidas a partir de células de entrada aisladas, seleccionadas y/o enriquecidas a partir de una única muestra biológica que se administra como terapia celular. En casos particulares, la composición de salida única es una composición de células T CD4+ enriquecidas. En ciertos casos, la composición de salida única es una composición de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas. En algunos casos, los métodos descritos en el presente documento producen dos o más composiciones de salida de una única fuente, por ejemplo, una muestra biológica y/o composiciones de entrada aisladas, seleccionadas o enriquecidas a partir de una muestra biológica, que se administran a un sujeto. En algunos casos, las dos o más composiciones de salida se administran al sujeto por separado. En ciertos casos, se combinan las dos o más composiciones de salidas en una única composición y se administran al sujeto. En ciertos casos, las dos o más composiciones de salida incluyen una composición de salida de células T CD4+ enriquecidas. En casos particulares, las dos o más composiciones de salida incluyen una composición de salida de células T CD8+ enriquecidas.

[0457]En algunos casos, una composición de salida de células T CD4+ enriquecidas que se administra a un sujeto incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD4+. En ciertos casos, la composición de la producción incluye al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD4+ que expresan el receptor recombinante y/o han sido transducidas o transfectadas con el polinucleótido recombinante. En ciertos casos, la composición de salida de células T CD4+ enriquecidas que se administra al sujeto incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos de 10 %, menos de 5 %, menos de 1 %, menos de 0,1 % o menos de 0,01 % de células T CD8+, y/o no contiene células T CD8+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD8+.

[0458]En algunos casos, una composición de salida de células T CD8+ enriquecidas que se administra a un sujeto incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD8+. En casos particulares, la composición incluye al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5%, al menos 99,9%, o en o aproximadamente el 100% de células T CD8+ que expresan el receptor recombinante y/o han sido transducidas o transfectadas con el polinucleótido recombinante. En ciertos casos, la composición de salida de células T CD8+ enriquecidas que se administra al sujeto incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD4+, y/o no contiene células T CD4+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD4+.

[0459]La enfermedad o afección que se trata puede ser cualquiera en la que la expresión de un antígeno esté asociada y/o implicada en la etiología de una enfermedad o trastorno, por ejemplo, causa, exacerba o de otro modo está implicada en dicha enfermedad, afección o trastorno. Las enfermedades y afecciones ejemplares pueden incluir enfermedades o afecciones asociadas con malignidad o transformación de células (p. ej., cáncer), enfermedad autoinmune o inflamatoria, o una enfermedad infecciosa, por ejemplo, causada por un patógeno bacteriano, viral u otro patógeno. Antígenos ejemplares, que incluyen antígenos asociados con diversas enfermedades y afecciones que pueden tratarse, se describen anteriormente. En casos particulares, el receptor de antígeno quimérico o TCR transgénico se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad o afección.

[0460]Entre las enfermedades, afecciones y trastornos se encuentran tumores, incluidos tumores sólidos, neoplasias malignas hematológicas y melanomas, e incluidos tumores localizados y metastásicos, enfermedades infecciosas, tales como infección con un virus u otro patógeno, por ejemplo, VIH, VHC, VHB, CMV, VPH y enfermedades parasitarias, y enfermedades autoinmunes e inflamatorias. En algunos casos, la enfermedad, trastorno o afección es un tumor, cáncer, malignidad, neoplasia u otra enfermedad o trastorno proliferativo. Dichas enfermedades incluyen, entre otras, leucemia, linfoma, por ejemplo, leucemia mieloide (o mielógena) aguda (LMA), leucemia mieloide (o mielógena) crónica (LMC), leucemia linfocítica (o linfoblástica) aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células peludas (LCP), linfoma linfocítico pequeño (LLP), linfoma de células del manto (LCM), linfoma de la zona marginal, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin (LH), linfoma no Hodgkin (LNH), linfoma anaplásico de células grandes (LACG), linfoma folicular, linfoma folicular refractario, linfoma difuso de células B grandes (LDCBG) y mieloma múltiple (MM). En algunos casos, la enfermedad o afección es una neoplasia maligna de células B seleccionada entre leucemia linfoblástica aguda (LLA), LLA en adultos, leucemia linfoblástica crónica (LLC), linfoma no Hodgkin (LNH) y linfoma difuso de células B grandes (LDCBG). En algunos casos, la enfermedad o afección es LNH y el LNH se selecciona del grupo que consiste en LNH agresivo, linfoma difuso de células B grandes (LDCBG), NOS (de novo y transformado de indolente), linfoma mediastínico primario de células B grandes (LMPCBG), linfoma de células B grandes rico en células T/histocitos (TCHRBCL, por sus siglas en inglés), linfoma de Burkitt, linfoma de células del manto (LCM) y/o linfoma folicular (LF), opcionalmente, linfoma folicular de grado 3B (LF3B). En algunos aspectos, el receptor recombinante, tal como un CAR, se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad o afección o expresado en células del entorno de una lesión asociada con la enfermedad maligna de células B. Los antígenos a los que se dirigen los receptores en algunos casos incluyen antígenos asociados con una enfermedad maligna de células B, tales como cualquiera de varios marcadores de células B conocidos. En algunos casos, el antígeno al que se dirige el receptor es CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b o CD30, o combinaciones de los mismos.

[0461]En algunos casos, la enfermedad o afección es un mieloma, como un mieloma múltiple. En algunos aspectos, el receptor recombinante, tal como un CAR, se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad o afección o expresado en células del entorno de una lesión asociada con el mieloma múltiple. Los antígenos a los que se dirigen los receptores en algunos casos incluyen antígenos asociados con el mieloma múltiple. En algunos aspectos, el antígeno, por ejemplo, el segundo antígeno o el antígeno adicional, tal como el antígeno específico de la enfermedad y/o el antígeno relacionado, se expresa en mieloma múltiple, tal como el antígeno de maduración de células B (BCMA), la clase de receptor acoplado a proteína G. C grupo 5 miembro D (GPRC5D), CD38 (ADP ribosa hidrolasa cíclica), CD138 (syndecan-1, syndecan, SYN-1), CS-1 (CS1, CD2 subconjunto 1, CRACC, SLAMF7, CD319 y 19A24), BAFF-R, TACI y/o FcRH5. Otros antígenos de mieloma múltiple ejemplares incluyen CD56, TIM-3, CD33, CD123, CD44, CD20, CD40, CD74, CD200, EGFR, p2-Microglobulina, HM1.24, IGF-1R, IL-6R, TRAIL-R1 y el receptor de activina tipo IIA (ActRIIA). Véase Benson y Byrd, J. Clin. Oncol. (2012) 30(16): 2013-15; Tao y Anderson, Bone Marrow Research (2011): 924058; Chu et al., Leukemia (2013) 28(4):917-27; Garfall y col., Discov Med. (2014) 17(91):37-46. En algunos casos, los antígenos incluyen los presentes en tumores linfoides, mieloma, linfoma asociado al SIDA y/o linfoproliferaciones postrasplante, tales como CD38. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos dirigidos contra dichos antígenos son conocidos e incluyen, por ejemplo, los descritos en la Patente de EE. UU. N° 8.153.765; 8.603477, 8.008.450; Pub de EE. UU. N° US20120189622 o US20100260748; y/o Publicaciones Internacionales PCT Nos. WO2006099875, WO2009080829 o WO2012092612 o WO2014210064. En algunos casos, dichos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (p. ej., scFv) están contenidos en anticuerpos multiespecíficos, receptores quiméricos multiespecíficos, tales como CAR multiespecíficos y/o células multiespecíficas.

[0462]En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección infecciosa, tal como, entre otras, infecciones virales, retrovirales, bacterianas y protozoarias, inmunodeficiencia, citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), adenovirus, Poliomavirus BK. En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección autoinmunitaria o inflamatoria, tal como artritis, por ejemplo, artritis reumatoide (AR), diabetes tipo I, lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, esclerodermia, tiroides autoinmune. enfermedad de Graves, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, asma y/o una enfermedad o afección asociada con el trasplante.

[0463]En algunos casos, el antígeno asociado con la enfermedad o trastorno se selecciona entre integrina avp6 (integrina avb6), antígeno de maduración de células B (BCMA), B7-H6, anhidrasa carbónica 9 (CA9, también conocida como CAIX o G250), un antígeno de cáncer de testículo, un antígeno de cáncer/testículo 1B (CTAG, también conocido como NY-ESO-1 y LAGE-2), un antígeno carcinoembrionario (CEA), una ciclina, ciclina A2, ligando de quimiocina 1 con motivo C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, proteína del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína del factor de crecimiento epidérmico truncado (tEGFR), mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrógeno, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; también conocido como homólogo del receptor Fc 5 o FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), una proteína de unión a folato (FBP), receptor de folato alfa, receptor de acetilcolina fetal, gangliósido GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliósido GD3, glicoproteína 100 (gp100), Her2/neu (receptor tirosina quinasa erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros de erbB, antígeno humano asociado al melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno leucocitario humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), Receptor alfa de IL-22 (IL-22Ra), Receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Ra2), Receptor de dominio de inserción de quinasa (kdr), cadena ligera kappa, molécula de adhesión celular L1 (L1CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, repetición rica en leucina que contiene 8 miembros de la familia A (LRRC8A), Lewis Y, antígeno asociado al melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, Ma Ge-A6, mesotelina, c-Met, citomegalovirus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligandos del miembro D (NKG2D) del grupo 2 natural killer, melan A (MART-1), molécula de adhesión de células neurales (NCAM), oncofetal antígeno, antígeno de melanoma expresado preferentemente (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostático específico, antígeno de células madre de próstata (PSCA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), receptor tirosina quinasa similar al receptor huérfano 1 (ROR1), survivina, glicoproteína del trofoblasto (TPBG también conocido como 5T4), glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG72), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), un antígeno específico de patógeno, o un antígeno asociado con una etiqueta universal, y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por VIH, VHC, VHB u otros patógenos. Los antígenos a los que se dirigen los receptores en algunos casos incluyen antígenos asociados con una enfermedad maligna de células B, tales como cualquiera de varios marcadores de células B conocidos. En algunos casos, el antígeno al que se dirige el receptor es CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b o CD30. En algunos casos, el antígeno es un antígeno específico de patógeno. En algunos casos, el antígeno es un antígeno viral (tal como un antígeno viral de VIH, VHC, VHB, etc.), antígenos bacterianos y/o antígenos parasitarios.

[0464]En algunos casos, la terapia celular, por ejemplo, terapia de células T adoptivas, se lleva a cabo mediante transferencia autóloga, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir del sujeto que va a recibir la terapia celular, o de una muestra derivada de tal sujeto. Por lo tanto, en algunos aspectos, las células se derivan de un sujeto, por ejemplo, un paciente, que necesita un tratamiento y las células, después del aislamiento y el procesamiento, se administran al mismo sujeto.

[0465]En algunos casos, la terapia celular, por ejemplo, terapia de células T adoptivas, se lleva a cabo mediante transferencia alogénica, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir de un sujeto distinto de un sujeto que va a recibir o que finalmente recibe la célula. terapia, por ejemplo, un primer sujeto. En tales casos, las células se administran luego a un sujeto diferente, por ejemplo, un segundo sujeto, de la misma especie. En algunos casos, el primer y el segundo sujeto son genéticamente idénticos. En algunos casos, el primer y el segundo sujeto son genéticamente similares. En algunos casos, el segundo sujeto expresa la misma clase o supertipo HLA que el primer sujeto.

[0466]Las células, por ejemplo, células modificadas genéticamente generadas mediante un método descrito en la Sección I, pueden administrarse mediante cualquier medio adecuado. En casos particulares, las células de dos o más composiciones de salida separadas, por ejemplo, composiciones de células T enriquecidas producidas mediante los métodos descritos en la Sección I, se combinan en una única composición de células que se van a administrar. En ciertos casos, las células de composiciones de salida separadas se administran cada una por separado al sujeto. En ciertos casos, las células T CD4+ se administran por separado de las células T CD8+.

[0467]En algunos casos, las células pueden administrarse mediante infusión en bolo, mediante inyección, por ejemplo, inyecciones intravenosas o subcutáneas, inyección intraocular, inyección periocular, inyección subretiniana, inyección intravítrea, inyección transeptal, inyección subescleral, inyección intracoroidea, inyección intracameral, inyección subconjetiva, inyección subconjuntival, inyección sub-Tenon, inyección retrobulbar, inyección peribulbar o administración yuxtaescleral posterior. En algunos casos, se administran por vía parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. En algunos casos, una dosis determinada se administra mediante una única administración en bolo de las células. En algunos casos, se administra mediante múltiples administraciones en bolo de las células, por ejemplo, durante un período de no más de 3 días, o mediante administración de infusión continua de las células. En algunos casos, la administración de la dosis celular o cualquier terapia adicional, por ejemplo, la terapia de depleción de linfocitos, la terapia de intervención y/o la terapia combinada, se lleva a cabo mediante administración ambulatoria.

[0468]Para la prevención o tratamiento de una enfermedad, la dosificación adecuada puede depender del tipo de enfermedad a tratar, del tipo de células o receptores recombinantes, de la gravedad y curso de la enfermedad, de si las células se administran con fines preventivos o terapéuticos, previa terapia, la historia clínica del sujeto y la respuesta a las células, y el criterio del médico tratante. En algunos casos, las composiciones y células se administran adecuadamente al sujeto de una sola vez o a lo largo de una serie de tratamientos.

[0469]En algunos casos, las células se administran como parte de un tratamiento combinado, tal como simultáneamente o secuencialmente con, en cualquier orden, otra intervención terapéutica, tal como un anticuerpo o una célula modificada genéticamente o un receptor o agente, tal como un agente citotóxico o terapéutico. En algunos casos, las células se coadministran con uno o más agentes terapéuticos adicionales o en conexión con otra intervención terapéutica, ya sea simultánea o secuencialmente en cualquier orden. En algunos contextos, las células se coadministran con otra terapia lo suficientemente cerca en el tiempo como para que las poblaciones de células mejoren el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. En algunos casos, las células se administran antes de uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunos casos, las células se administran después de uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunos casos, uno o más agentes adicionales incluyen una citoquina, tal como IL-2, por ejemplo, para mejorar la persistencia. En algunos casos, los métodos comprenden la administración de un agente quimioterapéutico.

[0470]En algunos casos, los métodos comprenden la administración de un agente quimioterapéutico, por ejemplo, un agente quimioterapéutico acondicionador, por ejemplo, para reducir la carga tumoral antes de la administración.

[0471]Preacondicionar a los sujetos con terapias de inmunodepleción (p. ej., linfodepleción) en algunos aspectos puede mejorar los efectos de la terapia celular adoptiva (TCA).

[0472]Por lo tanto, en algunos casos, los métodos incluyen administrar un agente acondicionador previo, tal como un agente linfodeplector o quimioterapéutico, tal como ciclofosfamida, fludarabina o combinaciones de los mismos, a un sujeto antes del inicio de la terapia celular. Por ejemplo, al sujeto se le puede administrar un agente acondicionador previo al menos 2 días antes, tal como al menos 3, 4, 5, 6 o 7 días antes, del inicio de la terapia celular. En algunos casos, al sujeto se le administra un agente de precondicionamiento no más de 7 días antes, tal como no más de 6, 5, 4, 3 o 2 días antes del inicio de la terapia celular.

[0473]En algunos casos, el sujeto está precondicionado con ciclofosfamida en una dosis entre o entre aproximadamente 20 mg/kg y 100 mg/kg, tal como entre o entre aproximadamente 40 mg/kg y 80 mg/kg. En algunos aspectos, el sujeto está precondicionado con o con aproximadamente 60 mg/kg de ciclofosfamida. En algunos casos, la ciclofosfamida se puede administrar en una dosis única o se puede administrar en una pluralidad de dosis, como por ejemplo diariamente, cada dos días o cada tres días. En algunos casos, la ciclofosfamida se administra una vez al día durante uno o dos días. En algunos casos, cuando el agente linfodeplector comprende ciclofosfamida, al sujeto se le administra ciclofosfamida en una dosis entre o entre aproximadamente 100 mg/m2 y 500 mg/m2, tal como entre o entre aproximadamente 200 mg/m2 y 400 mg/m2, o 250 mg/m2 y 350 mg/m2, inclusive. En algunos casos, al sujeto se le administran aproximadamente 300 mg/m2 de ciclofosfamida. En algunos casos, la ciclofosfamida se puede administrar en una dosis única o se puede administrar en una pluralidad de dosis, como por ejemplo diariamente, cada dos días o cada tres días. En algunos casos, la ciclofosfamida se administra diariamente, tal como durante 1 a 5 días, por ejemplo, durante 3 a 5 días. En algunos casos, al sujeto se le administran aproximadamente 300 mg/m2 de ciclofosfamida, diariamente durante 3 días, antes del inicio de la terapia celular.

[0474]En algunos casos, cuando el agente linfodeplector comprende fludarabina, al sujeto se le administra fludarabina en una dosis entre o entre aproximadamente 1 mg/m2 y 100 mg/m2, tal como entre o entre aproximadamente 10 mg/m2 y 75 mg/m2, 15 mg/m2 y 50 mg/m2, 20 mg/m2 y 40 mg/m2, o 24 mg/m2 y 35 mg/m2, inclusive. En algunos casos, al sujeto se le administran aproximadamente 30 mg/m2 de fludarabina. En algunos casos, la fludarabina se puede administrar en una dosis única o se puede administrar en una pluralidad de dosis, como por ejemplo diariamente, cada dos días o cada tres días. En algunos casos, la fludarabina se administra diariamente, por ejemplo, durante 1 a 5 días, por ejemplo, durante 3 a 5 días. En algunos casos, al sujeto se le administran aproximadamente 30 mg/m2 de fludarabina, diariamente durante 3 días, antes del inicio de la terapia celular.

[0475]En algunos casos, el agente linfodeplector comprende una combinación de agentes, tal como una combinación de ciclofosfamida y fludarabina. Por lo tanto, la combinación de agentes puede incluir ciclofosfamida en cualquier dosis o esquema de administración, como los descritos anteriormente, y fludarabina en cualquier dosis o esquema de administración, como los descritos anteriormente. Por ejemplo, en algunos aspectos, al sujeto se le administran 60 mg/kg (~2 g/m2) de ciclofosfamida y de 3 a 5 dosis de 25 mg/m2 de fludarabina antes de la primera dosis o de la siguiente.

[0476]Después de la administración de las células, en algunos casos se mide la actividad biológica de las poblaciones de células modificadas genéticamente, por ejemplo, mediante cualquiera de varios métodos conocidos. Los parámetros a evaluar incluyen la unión específica de una célula T natural o modificada u otra célula inmunitaria al antígeno, in vivo, por ejemplo, mediante imágenes, o ex vivo, por ejemplo, mediante ELISA o citometría de flujo. En ciertos casos, la capacidad de las células diseñadas para destruir células diana se puede medir usando cualquier método conocido adecuado, tal como ensayos de citotoxicidad descritos, por ejemplo, en Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702. (2009) y Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). En ciertos casos, la actividad biológica de las células se mide analizando la expresión y/o secreción de una o más citoquinas, tales como CD107a, IFNy, IL-2 y TNF. En algunos aspectos, la actividad biológica se mide evaluando el resultado clínico, tal como la reducción de la carga 0 la carga tumoral.

[0477]En ciertos casos, las células diseñadas se modifican aún más de diversas formas, de modo que se aumenta su eficacia terapéutica o profiláctica. Por ejemplo, el CAR o TCR modificado expresada por la población se puede conjugar directa o indirectamente a través de un conector a un resto diana. Se conoce la práctica de conjugar compuestos, por ejemplo, CAR o TCR, con restos diana. Véase, por ejemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995), y la Patente de EE. UU. 5.087.616.

[0478]En algunos casos, se administra una dosis de células a sujetos de acuerdo con los métodos divulgados y/o con los artículos de fabricación o composiciones divulgados. En algunos casos, el tamaño o el momento de las dosis se determina en función de la enfermedad o afección particular del sujeto. En algunos casos, el tamaño o el momento de las dosis para una enfermedad particular en vista de la descripción proporcionada se puede determinar empíricamente.

[0479]En algunos casos, la dosis de células comprende entre o aproximadamente 2 x 105 de células/kg y o aproximadamente 2 x 106 de células/kg, tal como entre o aproximadamente 4 x 105 de células/kg y en o aproximadamente 1 x 106 de células/kg o entre en o aproximadamente 6 x 105 de células/kg y en o aproximadamente 8 x 105 de células/kg. En algunos casos, la dosis de células comprende no más de 2 x 105 de las células (p. ej., que expresan antígenos, tales como células que expresan CAR) por kilogramo de peso corporal del sujeto (células/kg), tal como no más de en o alrededor de 3 x 105 células/kg, no más de o alrededor de 4 x 105 células/kg, no más de o alrededor de 5 x 105 células/kg, no más de o alrededor de 6 x 105 células/kg, no más de 7 x 105 células/kg o aproximadamente, no más de 8 x 105 células/kg o aproximadamente, no más de 9 x 105 células/kg o aproximadamente, no más de 9 x 105 células/kg o aproximadamente aproximadamente 1 x 106 células/kg, o no más de 2 x 106 células/kg o aproximadamente. En algunos casos, la dosis de células comprende al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 2 x 105 de las células (p. ej., que expresan antígenos, tales como células que expresan CAR) por kilogramo de peso corporal del sujeto (células/kg), tal como al menos o al menos aproximadamente o a o aproximadamente 3 x 105 células/kg, al menos o al menos aproximadamente o a o aproximadamente 4 x 105 células/kg, al menos o al menos aproximadamente o a o aproximadamente 5 x 105 células/kg, al menos o al menos aproximadamente o en o aproximadamente 6 x 105 células/kg, al menos o al menos aproximadamente o en o aproximadamente 7 x 105 células/kg, al menos o al menos aproximadamente o en o aproximadamente 8 x 105 células/kg, al menos o al menos aproximadamente o en o aproximadamente 9 x 105 células/kg, al menos o al menos aproximadamente o en o aproximadamente 1 x 106 células/kg, o en al menos o al menos aproximadamente o en o aproximadamente 2 x 106 células/kg.

[0480]En ciertos casos, las células, o poblaciones individuales de subtipos de células, se administran al sujeto en un intervalo de aproximadamente un millón a aproximadamente 100 mil millones de células y/o esa cantidad de células por kilogramo de peso corporal, tal como, por ejemplo, de 1 millón a aproximadamente 50 mil millones de células (p. ej., aproximadamente 5 millones de células, aproximadamente 25 millones de células, aproximadamente 500 millones de células, aproximadamente 1 mil millones de células, aproximadamente 5 mil millones de células, aproximadamente 20 mil millones de células, aproximadamente 30 mil millones de células, aproximadamente 40 mil millones células, o un rango definido por dos cualesquiera de los valores anteriores), tal como aproximadamente 10 millones a aproximadamente 100 mil millones de células (p. ej., aproximadamente 20 millones de células, aproximadamente 30 millones de células, aproximadamente 40 millones de células, aproximadamente 60 millones de células, aproximadamente 70 millones de células, alrededor de 80 millones de células, alrededor de 90 millones de células, alrededor de 10 mil millones de células, alrededor de 25 mil millones de células, alrededor de 50 mil millones de células, alrededor de 75 mil millones de células, alrededor de 90 mil millones de células, o un rango definido por dos de los valores anteriores), y en algunos casos alrededor de 100 millones de células a alrededor de 50 mil millones de células (p. ej., alrededor de 120 millones de células, alrededor de 250 millones de células, alrededor de 350 millones de células, alrededor de 450 millones de células, alrededor de 650 millones de células, alrededor de 800 millones de células, alrededor de 900 millones de células, alrededor de 3 mil millones de células, alrededor de 30 mil millones de células, alrededor de 45 mil millones de células) o cualquier valor entre estos rangos y/o por kilogramo de peso corporal. Las dosis pueden variar dependiendo de los atributos particulares de la enfermedad o trastorno y/o del paciente y/u otros tratamientos.

[0481]En algunos casos, la dosis de células es una dosis plana de células o una dosis fija de células de modo que la dosis de células no está ligada ni basada en el área de superficie corporal o el peso de un sujeto.

[0482]En algunos casos, por ejemplo, cuando el sujeto es un ser humano, la dosis incluye menos de aproximadamente 13108 células que expresan el receptor recombinante total (p. ej., CAR), células T o células mononucleares de sangre periférica (PBMC), por ejemplo, en el rango de aproximadamente 1 x 106 a 1 x 108 de dichas células, tales como 2 x 106,

5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, o 1 x 108 o el total de dichas células, o el rango entre dos cualesquiera de los valores anteriores.

En algunos casos, cuando el sujeto es un ser humano, la dosis incluye entre aproximadamente 1 x 106 y 3 x 108 células totales que expresan el receptor recombinante (p. ej., CAR), por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 x 107 a 2 x 108 de dichas células, como 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 o 1,5 x 108 en total de dichas células, o el rango entre dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, al paciente se le administran múltiples dosis, y cada una de las dosis o la dosis total puede estar dentro de cualquiera de los valores anteriores. En algunos casos, la dosis de células comprende la administración de desde o desde aproximadamente 1 x 105 a 5 x 108 células T totales que expresan receptores recombinantes o células T totales, 1 x 105 a 1 x 108 células T que expresan receptores recombinantes totales o células T totales, de o desde aproximadamente 5 x 105 a 1 x 107 células T que expresan receptores recombinantes totales o células T totales, o de o de aproximadamente 1 x 106 a 1 x 107 células T totales que expresan receptores recombinantes o células T totales, cada una inclusive.

[0483]En algunos casos, las células T de la dosis incluyen células T CD4+, células T CD8+ o células T CD4+ y CD8+.

[0484]En algunos casos, por ejemplo, cuando el sujeto es humano, las células T CD8+ de la dosis, incluso en una dosis que incluye células T CD4+ y CD8+, incluyen entre aproximadamente 1 x 106 y 1 x 108 receptores recombinantes totales

(p. ej., CAR) que expresan células CD8+, por ejemplo, en el rango de aproximadamente 5 x 106 a 1 x 108 de dichas células, tales células 1 x 107, 2,5 x 107, 5 x 107, 7,5 x 107 o 1 x 108 total de dichas células, o valores anteriores. En algunos casos, al paciente se le administran múltiples dosis, y cada una de las dosis o la dosis total puede estar dentro de cualquiera de los valores anteriores. En algunos casos, la dosis de células comprende la administración de desde o desde aproximadamente 1 x 107 a 0,75 x 108 células T CD8+ que expresan receptores recombinantes totales, 1 x 107 a 2,5 x 107 células T CD8+ que expresan receptores recombinantes totales células, de o desde aproximadamente 1 x 107 a 0,75 x 108 células T c D8+ que expresan el receptor recombinante total, cada una inclusive. En algunos casos, la dosis de células comprende la administración de o aproximadamente 1 x 10', 2,5 x 107, 5 x 1077,5 x 107 o 1 x 108 células T CD8+ que expresan el receptor recombinante total.

[0485]En algunos casos, la dosis de células, por ejemplo, células T que expresan receptores recombinantes, se administra al sujeto como una dosis única o se administra sólo una vez dentro de un período de dos semanas, un mes, tres meses, seis meses, 1 año o más.

[0486]En el contexto de la terapia celular adoptiva, la administración de una “dosis” dada abarca la administración de la cantidad o número de células dado como una composición única y/o administración única ininterrumpida, por ejemplo, como una inyección única o infusión continua, y también abarca la administración de la cantidad o número de células dado como una dosis dividida o como una pluralidad de composiciones, proporcionadas en múltiples composiciones o infusiones individuales, durante un período de tiempo específico, tal como durante no más de 3 días. Por tanto, en algunos contextos, la dosis es una administración única o continua del número especificado de células, administrada o iniciada en un único momento. En algunos contextos, sin embargo, la dosis se administra en múltiples inyecciones o infusiones durante un período de no más de tres días, tal como una vez al día durante tres días o durante dos días o mediante múltiples infusiones durante un período de un solo día.

[0487]Así, en algunos aspectos, las células de la dosis se administran en una única composición farmacéutica. En algunos casos, las células de la dosis se administran en una pluralidad de composiciones, que contienen colectivamente las células de la dosis.

[0488]En algunos casos, el término “dosis dividida” se refiere a una dosis que se divide para administrarse durante más de un día. Este tipo de dosificación está abarcado por los presentes métodos y se considera una dosis única.

[0489]Por tanto, la dosis de células puede administrarse como una dosis dividida, por ejemplo, una dosis dividida administrada a lo largo del tiempo. Por ejemplo, en algunos casos, la dosis puede administrarse al sujeto durante 2 días o durante 3 días. Los métodos ejemplares para la dosificación dividida incluyen administrar el 25 % de la dosis el primer

día y administrar el 75%restante de la dosis el segundo día. En otros casos, el 33%de la dosis podrá administrarse el primer día y el 67 % restante el segundo día. En algunos aspectos, el 10 % de la dosis se administra el primer día, el 30 % de la dosis se administra el segundo día y el 60 % de la dosis se administra el tercer día. En algunos casos, la dosis dividida no se distribuye en más de 3 días.

[0490]En algunos casos, las células de la dosis se pueden administrar mediante la administración de una pluralidad de composiciones o soluciones, tales como una primera y una segunda, opcionalmente más, conteniendo cada una algunas células de la dosis. En algunos aspectos, la pluralidad de composiciones, cada una de las cuales contiene una población y/o subtipos de células diferentes, se administran por separado o de forma independiente, opcionalmente dentro de un cierto período de tiempo. Por ejemplo, las poblaciones o subtipos de células pueden incluir células T CD8+ y CD4+, respectivamente, y/o poblaciones enriquecidas en CD8+ y CD4+, respectivamente, por ejemplo, células T CD4+ y/o CD8+, incluyendo cada una individualmente células diseñadas genéticamente para expresar el receptor recombinante. En algunos casos, la administración de la dosis comprende la administración de una primera composición que comprende una dosis de células T CD8+ o una dosis de células T CD4+ y la administración de una segunda composición que comprende la otra dosis de células T CD4+ y las células T CD8+.

[0491]En algunos casos, la administración de la composición o dosis, por ejemplo, la administración de la pluralidad de composiciones celulares, implica la administración de las composiciones celulares por separado. En algunos casos, las composiciones celulares son composiciones de salida separadas producidas mediante los métodos descritos en la Sección I. En algunos aspectos, las administraciones separadas se llevan a cabo simultáneamente o secuencialmente, en cualquier orden. En algunos casos, la dosis comprende una primera composición y una segunda composición, y la primera composición y la segunda composición se administran con un intervalo de 0 a 12 horas, un intervalo de 0 a 6 horas o un intervalo de 0 a 2 horas. En algunos casos, el inicio de la administración de la primera composición y el inicio de la administración de la segunda composición se llevan a cabo con no más de 2 horas, no más de 1 hora, o no más de 30 minutos de diferencia, no más de 15 minutos, con no más de 10 minutos o no más de 5 minutos de diferencia. En algunos casos, el inicio y/o finalización de la administración de la primera composición y el inicio y/o finalización de la administración de la segunda composición se llevan a cabo en no más de 2 horas, no más de 1 hora o no más de 30 minutos. de separación, con no más de 15 minutos, no más de 10 minutos o no más de 5 minutos de diferencia.

[0492]En alguna composición, la primera composición, por ejemplo, la primera composición de la dosis, comprende células T CD4+. En alguna composición, la primera composición, por ejemplo, la primera composición de la dosis, comprende células T CD8+. En algunos casos, la primera composición se administra antes de la segunda composición.

[0493]En algunos casos, la dosis o composición de células incluye una proporción definida o objetivo de células T CD4+ que expresan un receptor recombinante con respecto a células T CD8+ que expresan un receptor recombinante y/o de células T CD4+ con respecto a células T CD8+, cuya proporción es opcionalmente de aproximadamente 1:1 o está entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 3:1, tal como aproximadamente 1:1. En algunos aspectos, la administración de una composición o dosis con la proporción diana o deseada de diferentes poblaciones celulares (tal como la proporción CD4+:CD8+ o la proporción CAR+CD4+:CAR+CD8+, por ejemplo, 1:1) implica la administración de una composición de células que contiene una de las poblaciones y luego administración de una composición celular separada que comprende la otra de las poblaciones, donde la administración es en o aproximadamente en la proporción objetivo o deseada. En algunos aspectos, la administración de una dosis o composición de células en una proporción definida conduce a una mejor expansión, persistencia y/o actividad antitumoral de la terapia con células T.

[0494]En algunos casos, el sujeto recibe múltiples dosis, por ejemplo, dos o más dosis o múltiples dosis consecutivas, de las células. En algunos casos, se administran dos dosis a un sujeto. En algunos casos, el sujeto recibe la dosis consecutiva, por ejemplo, la segunda dosis, se administra aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 días después de la primera dosis. En algunos casos, se administran múltiples dosis consecutivas después de la primera dosis, de modo que se administran una dosis o dosis adicionales después de la administración de la dosis consecutiva. En algunos aspectos, el número de células administradas al sujeto en la dosis adicional es igual o similar a la primera dosis y/o dosis consecutiva. En algunos casos, la dosis o dosis adicionales son mayores que las dosis anteriores.

[0495]En algunos aspectos, el tamaño de la primera dosis y/o dosis consecutiva se determina basándose en uno o más criterios tales como respuesta del sujeto al tratamiento previo, por ejemplo, quimioterapia, carga de enfermedad en el sujeto, tal como carga tumoral, volumen, tamaño, o grado, extensión o tipo de metástasis, estadio y/o probabilidad o incidencia de que el sujeto desarrolle resultados tóxicos, por ejemplo, CRS, síndrome de activación de macrófagos, síndrome de lisis tumoral, neurotoxicidad y/o una respuesta inmune del huésped contra las células y/o receptores recombinantes que se estén administrando.

[0496]En algunos aspectos, el tiempo entre la administración de la primera dosis y la administración de la dosis consecutiva es de aproximadamente 9 a aproximadamente 35 días, de aproximadamente 14 a aproximadamente 28 días o de 15 a 27 días. En algunos casos, la administración de la dosis consecutiva se produce en un momento de más de aproximadamente 14 días después y menos de aproximadamente 28 días después de la administración de la primera dosis. En algunos aspectos, el tiempo entre la primera dosis y la consecutiva es de unos 21 días. En algunos casos, se administran una dosis o dosis adicionales, por ejemplo, dosis consecutivas, después de la administración de la dosis consecutiva. En algunos aspectos, la dosis o dosis consecutivas adicionales se administran al menos aproximadamente 14 y menos de aproximadamente 28 días después de la administración de una dosis anterior. En algunos casos, la dosis adicional se administra menos de aproximadamente 14 días después de la dosis anterior, por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 días después de la dosis anterior. En algunos casos, no se administra ninguna dosis menos de aproximadamente 14 días después de la dosis anterior y/o no se administra ninguna dosis más de aproximadamente 28 días después de la dosis anterior.

[0497]En algunos casos, la dosis de células, por ejemplo, células que expresan receptores recombinantes, comprende dos dosis (p. ej., una dosis doble), que comprende una primera dosis de células T y una dosis consecutiva de células T, en donde una o ambas de la primera dosis y la segunda dosis comprenden la administración de la dosis dividida de células T.

[0498]En algunos casos, la dosis de células es generalmente lo suficientemente grande como para ser eficaz a la hora de reducir la carga de enfermedad.

[0499]En algunos casos, las células se administran en una dosis deseada, que en algunos aspectos incluye una dosis o número deseado de células o tipos de células y/o una proporción deseada de tipos de células. Por lo tanto, la dosificación de células en algunos casos se basa en un número total de células (o número por kg de peso corporal) y una proporción deseada de las poblaciones o subtipos individuales, tal como la proporción de CD4+ a CD8+. En algunos casos, la dosificación de células se basa en un número total deseado (o número por kg de peso corporal) de células en las poblaciones individuales o de tipos de células individuales. En algunos casos, la dosificación se basa en una combinación de tales características, tales como un número deseado de células totales, una proporción deseada y un número total deseado de células en las poblaciones individuales.

[0500]En algunos casos, las poblaciones o subtipos de células, tales como células T CD8+ y CD4+, se administran en o dentro de una diferencia tolerada de una dosis deseada de células totales, tal como una dosis deseada de células T. En algunos aspectos, la dosis deseada es un número deseado de células o un número deseado de células por unidad de peso corporal del sujeto al que se administran las células, por ejemplo, células/kg. En algunos aspectos, la dosis deseada es igual o superior a un número mínimo de células o un número mínimo de células por unidad de peso corporal. En algunos aspectos, entre las células totales, administradas a la dosis deseada, las poblaciones o subtipos individuales están presentes en o cerca de una proporción de producción deseada (tal como una proporción de CD4+ a CD8+), por ejemplo, dentro de una cierta diferencia tolerada o error de tal relación.

[0501]En algunos casos, las células se administran en o dentro de una diferencia tolerada de una dosis deseada de una o más de las poblaciones individuales o subtipos de células, tal como una dosis deseada de células T CD4+ y/o una dosis deseada de células T células T CD8+. En algunos aspectos, la dosis deseada es un número deseado de células del subtipo o población, o un número deseado de dichas células por unidad de peso corporal del sujeto al que se administran las células, por ejemplo, células/kg. En algunos aspectos, la dosis deseada es igual o superior a un número mínimo de células de la población o subtipo, o un número mínimo de células de la población o subtipo por unidad de peso corporal.

[0502]Por lo tanto, en algunos casos, la dosificación se basa en una dosis fija deseada de células totales y una proporción deseada, y/o basándose en una dosis fija deseada de uno o más, por ejemplo, cada uno de los subtipos o subpoblaciones individuales. Por lo tanto, en algunos casos, la dosificación se basa en una dosis fija o mínima deseada de células T y una proporción deseada de células T CD4+ a CD8+, y/o se basa en una dosis fija o mínima deseada de CD4+ y/o células T CD8+.

[0503]En algunos casos, las células se administran en o dentro de un rango tolerado de una proporción de producción deseada de múltiples poblaciones o subtipos de células, tales como células o subtipos T<c>D4+ y CD8+. En algunos aspectos, la proporción deseada puede ser una proporción específica o puede ser una variedad de proporciones. por ejemplo, en algunos casos, la proporción deseada (p. ej., proporción de células T CD4+ a CD8+) está entre o aproximadamente 5:1 y aproximadamente 5:1 (o mayor que aproximadamente 1:5 y menor que aproximadamente 5:1).

5:1), o entre o aproximadamente 1:3 y aproximadamente 3:1 (o mayor que aproximadamente 1:3 y menor que aproximadamente 3:1), tal como entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:5 (o mayor que aproximadamente 1:5 y menor que aproximadamente 2:1, tal como aproximadamente 5:1, 4,5:1, 4:1, 3,5:1, 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,9:1, 1,8:1, 1,7:1, 1,6:1, 1,5:1, 1,4:1, 1,3:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1, 1:1,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4, 1:1,5, 1:1,6, 1:1,7, 1:1,8, 1:1,9: 1:2, 1:2,5, 1:3, 1:3,5, 1:4, 1:4,5 o 1:5. En algunos aspectos, la diferencia tolerada está dentro de aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 3 %, aproximadamente el 4 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 % de la proporción deseada, incluido cualquier valor entre estos rangos. En ciertos casos, las composiciones de células T CD4+ enriquecidas y células T CD8+ enriquecidas son combinados en la proporción deseada y administrados al sujeto como una composición de una sola célula. En casos particulares, las composiciones de células T CD4+ enriquecidas y células T CD8+ enriquecidas se administran como composiciones separadas en la proporción deseada.

[0504]En casos particulares, los números y/o concentraciones de células se refieren al número de células que expresan receptores recombinantes (p. ej., CAR). En otros casos, los números y/o concentraciones de células se refieren al número o concentración de todas las células, células T o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) administradas.

[0505]En algunos aspectos, el tamaño de la dosis se determina basándose en uno o más criterios tales como respuesta del sujeto al tratamiento previo, por ejemplo, quimioterapia, carga de enfermedad en el sujeto, tal como carga tumoral, volumen, tamaño o grado, extensión, o tipo de metástasis, estadio y/o probabilidad o incidencia de que el sujeto desarrolle resultados tóxicos, por ejemplo, CRS, síndrome de activación de macrófagos, síndrome de lisis tumoral, neurotoxicidad y/o una respuesta inmune del huésped contra las células y/o receptores recombinantes que están siendo administrado.

[0506]En algunos casos, los métodos también incluyen la administración de una o más dosis adicionales de células que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) y/o terapia de agotamiento linfoide, y/o se repiten una o más etapas de los métodos. En algunos casos, la una o más dosis adicionales son iguales a la dosis inicial. En algunos casos, la una o más dosis adicionales son diferentes de la dosis inicial, por ejemplo, más altas, tales como 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces., 9 veces o 10 veces o más mayor que la dosis inicial, o menor, como por ejemplo, mayor, como 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces o más menos que la dosis inicial. En algunos casos, la administración de una o más dosis adicionales se determina basándose en la respuesta del sujeto al tratamiento inicial o cualquier tratamiento previo, la carga de la enfermedad en el sujeto, tal como la carga tumoral, el volumen, el tamaño o el grado, la extensión o el tipo. de metástasis, estadio y/o probabilidad o incidencia de que el sujeto desarrolle resultados tóxicos, por ejemplo, CRS, síndrome de activación de macrófagos, síndrome de lisis tumoral, neurotoxicidad y/o una respuesta inmune del huésped contra las células y/o receptores recombinantes que se administran.

VI. ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN

[0507]También se divulgan artículos de fabricación y kits que contienen células diseñadas que expresan un receptor recombinante producido mediante los métodos divulgados en el presente documento, tales como los métodos descritos en el presente documento, tales como en la Sección I, por ejemplo, las composiciones resultantes de las células, y opcionalmente instrucciones de uso, por ejemplo., instrucciones para administrar las células diseñadas a un sujeto, tal como mediante métodos descritos en el presente documento, tal como en la Sección III.

[0508]En algunos casos, en el presente documento se divulgan artículos de fabricación y/o kits que incluyen una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las células diseñadas aquí descritas, e instrucciones para su administración a un sujeto para tratar una enfermedad o afección. En algunos casos, las instrucciones pueden especificar algunos o todos los elementos de los métodos para administrar las células que se divulgan en el presente documento. En algunos casos, las instrucciones especifican instrucciones particulares para la administración de las células para terapia celular, por ejemplo, dosis, momento, selección y/o identificación de sujetos para la administración y condiciones para la administración. En algunos casos, los artículos de fabricación y/o kits comprenden además un agente para la terapia de depleción linfoide y, opcionalmente, incluyen además instrucciones para administrar la terapia de depleción linfoide. En algunos casos, las instrucciones pueden incluirse como una etiqueta o prospecto que acompaña a las composiciones para su administración.

[0509]En algunos casos, el artículo de fabricación puede tener un recipiente, opcionalmente un vial, que contiene una composición de células T CD4+ enriquecidas que expresan un receptor recombinante. En algunos casos, el artículo de fabricación o kit comprende opcionalmente un segundo recipiente, opcionalmente un segundo vial, que contiene una composición de células T CD8+ enriquecidas que expresan un receptor recombinante. En algunos casos, se incluye un crioprotector con las células. En algunos aspectos, el recipiente es un vial o una bolsa. En algunos casos, el recipiente contiene una composición de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas.

[0510]En algunos casos, la composición de células T CD4+ enriquecidas dentro del recipiente incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD4+. En ciertos casos, la composición del recipiente incluye al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD4+ que expresan el receptor recombinante y/o han sido transducidas o transfectadas con el polinucleótido recombinante. En ciertos casos, la composición de células T CD4+ enriquecidas dentro del recipiente incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD8+, y/o no contiene células T CD8+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD8+.

[0511]En algunos casos, la composición de células T CD8+ enriquecidas dentro del recipiente incluye al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD8+. En casos particulares, la composición con el recipiente al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99,5 %, al menos 99,9 %, o en o aproximadamente el 100 % de células T CD8+ que expresan el receptor recombinante y/o han sido transducidas o transfectadas con el polinucleótido recombinante. En ciertos casos, la composición de salida de células T CD8+ enriquecidas que se administra al sujeto incluye menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos menos del 10 %, menos del 5 %, menos del 1 %, menos del 0,1 % o menos del 0,01 % de células T CD4+, y/o no contiene células T CD4+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD4+.

[0512]En algunos casos, las instrucciones especifican la dosis de células que se van a administrar. Por ejemplo, en algunos casos, la dosis especificada en las instrucciones incluye células que expresan un receptor recombinante total (p. ej., CAR) entre aproximadamente 1 x 106 y 3 x 108, por ejemplo, en el rango de aproximadamente 1 x 107 a 2 x 108 de dichas células, como 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 o 1,5 x 108 en total de dichas células, o el rango entre dos cualesquiera de los valores anteriores. En algunos casos, al paciente se le administran múltiples dosis, y cada una de las dosis o la dosis total puede estar dentro de cualquiera de los valores anteriores.

[0513]En algunos casos, el recipiente tal como el vial comprende más de o más de aproximadamente 103106 células T o células T que expresan receptores recombinantes, más o más de aproximadamente 15 x 106 células T o células T recombinantes que expresan receptores, mayor que o más que aproximadamente 25 x 106 células T o células T que expresan receptores recombinantes. En algunos aspectos, el vial comprende entre aproximadamente 10 millones de células por ml y aproximadamente 70 millones de células por ml, entre aproximadamente 10 millones de células por ml y aproximadamente 50 millones de células por ml, entre aproximadamente 10 millones de células por ml y aproximadamente 25 millones de células por ml, entre aproximadamente 10 millones de células por ml y aproximadamente 15 millones de células por ml, 15 millones de células por ml y aproximadamente 70 millones de células por ml, entre aproximadamente 15 millones de células por ml y aproximadamente 50 millones de células por ml, entre aproximadamente 15 millones de células por ml y aproximadamente 25 millones de células por ml, entre aproximadamente 25 millones de células por ml y aproximadamente 70 millones de células por ml, entre aproximadamente 25 millones de células por ml y aproximadamente 50 millones de células por ml, y entre aproximadamente 50 millones de células por ml y aproximadamente 70 millones de células por ml.

[0514]En algunos casos, la pluralidad de viales o pluralidad de células o dosis unitaria de células especificadas para la administración, colectivamente, comprende una dosis de células que comprende de o desde aproximadamente 1 x 105 a 5 x 108 células T totales que expresan receptores recombinantes o células T totales, 1 x 105 a 1 x 108 células T que expresan receptores recombinantes totales o células T totales, de o desde aproximadamente 5 x 105 a 1 x 107 células T que expresan receptores recombinantes totales o células T totales, o de o de aproximadamente 1 x 106 a 1 x 107 células T totales que expresan receptores recombinantes o células T totales, cada una inclusive. En algunos aspectos, el artículo comprende una o más dosis unitarias de las células T CD4+ y CD8+ o de las células T con receptor+ CD4+ y células T con receptor+ CD8+, en donde la dosis unitaria comprende entre al menos 1 x 107 y al o aproximadamente aproximadamente 2 x 108 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 5 x 107 y aproximadamente 1,5 x 108 células T que expresan receptores recombinantes, en o aproximadamente 5 x 107 células T que expresan receptores recombinantes, en o aproximadamente 1 x 108 células T que expresan receptores recombinantes, o en o alrededor de 1,5 x 108 células T que expresan receptores recombinantes, opcionalmente en donde la información en el artículo especifica la administración de una o de una pluralidad de dosis unitarias y/o un volumen correspondiente a tal una o pluralidad de dosis unitarias. En algunos casos, el artículo comprende una o más dosis unitarias de células T CD8+, en donde la dosis comprende entre o aproximadamente 5 x 106 y aproximadamente 1 x 108 células T CD8+ que expresan receptores recombinantes, la dosis comprende entre en o aproximadamente 1 x 107 y en o aproximadamente 0,75 x 108 células T CD8+ que expresan receptores recombinantes, la dosis comprende en o aproximadamente 2,5 x 107 células T CD8+ que expresan receptores recombinantes, o la dosis comprende en o aproximadamente 5 x 107 células T CD8+ que expresan receptores recombinantes, o la dosis comprende en o aproximadamente 0,75 x 108 células T CD8+ que expresan receptores recombinantes, opcionalmente en donde la información en el artículo especifica la administración de una o de una pluralidad de dosis unitarias y/o un volumen correspondiente a tal una o varias dosis unitarias. En algunos casos, las células del artículo, en conjunto, comprenden una dosis de células que comprenden no más de 1 x 108 células T totales que expresan receptores recombinantes o células T totales, no más de 1 x 107 células T totales que expresan receptores recombinantes células T totales, no más de 0,5 x 107 células T totales que expresan receptores recombinantes o células T totales, no más de 1 x 106 células T totales que expresan receptores recombinantes o células T totales, no más de 0,5 x 106 células T totales que expresan receptores recombinantes o células T totales.

[0515]En algunos casos, las instrucciones pueden especificar el régimen de dosificación y el momento de la administración. Por ejemplo, en algunos casos, las instrucciones pueden especificar la administración al sujeto de múltiples dosis, por ejemplo, dos o más dosis, de las células. En algunos casos, las instrucciones especifican el momento de las dosis múltiples, por ejemplo, la segunda dosis se administra aproximadamente a los 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 días después de la primera dosis; y/o la cantidad de dosificación en cada dosis.

[0516]En algunos casos, el artículo de fabricación o kit comprende una composición de células T CD4+ enriquecidas que expresan un receptor recombinante, e instrucciones para administrar, a un sujeto que tiene una enfermedad o afección, toda o una parte de la composición de células T CD4+ enriquecidas y administrar además células T CD8+ que expresan un receptor recombinante. En algunos casos, las instrucciones especifican la administración de células T CD4+ antes de administrar las células T CD8+. En algunos casos, las instrucciones especifican la administración de células T CD8+ antes de administrar las células T CD4+. En algunos casos, el artículo de fabricación o kit comprende una pluralidad de células T CD8+ que expresan un receptor recombinante e instrucciones para administrar, a un sujeto que tiene una enfermedad o afección, la totalidad o una parte de la pluralidad de células T CD8+ y células T CD4+ que expresan un receptor recombinante. En algunos casos, las instrucciones especifican el régimen de dosificación y el momento de la administración de las células.

[0517]En algunos aspectos, las instrucciones especifican la administración de todas o una parte de las células T CD4+ y de todas o una parte de las células T CD8+ con un intervalo de 0 a 12 horas, un intervalo de 0 a 6 horas o un intervalo de 0 a 2 horas. En algunos casos, las instrucciones especifican administrar las células T CD4+ y las células T CD8+ no más de 2 horas, no más de 1 hora, no más de 30 minutos, no más de 15 minutos, no más de 10 minutos o no más de 5 minutos de diferencia.

[0518]En algunos casos, las instrucciones especifican la dosis o el número de células o tipos de células y/o una proporción de tipos de células, por ejemplo, poblaciones o subtipos individuales, tales como la proporción de CD4+ a CD8+. En algunos casos, las poblaciones o subtipos de células, como las células T CD8+ y CD4+. Por ejemplo, en algunos casos, las instrucciones especifican que las células se administran en o dentro de un rango tolerado de una proporción de producción de múltiples poblaciones o subtipos de células, tales como células o subtipos T CD4+ y CD8+, de entre al o aproximadamente 5:1 y aproximadamente 5:1 (o mayor que aproximadamente 1:5 y menos de aproximadamente 5:1), o entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 3:1 (o mayor que aproximadamente 1: 3 y menos de aproximadamente 3:1), tal como entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:5 (o mayor que aproximadamente 1:5 y menos de aproximadamente 2:1, tal como aproximadamente 5:1, 4,5:1, 4:1, 3,5:1, 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,9:1, 1,8:1, 1,7:1, 1,6:1, 1,5:1, 1,4:1, 1,3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1: 2, 1:2,5, 1:3, 1:3,5, 1:4, 1:4,5 o 1:5. En ciertos casos, las instrucciones especifican que las composiciones de células T CD4+ enriquecidas y células T CD8+ enriquecidas se combinan en la proporción deseada y se administran al sujeto como una composición de una sola célula. En casos particulares, las instrucciones especifican que las composiciones de células T CD4+ enriquecidas y las células T CD8+ enriquecidas se administran como composiciones separadas en la proporción deseada. En algunos aspectos, la diferencia tolerada está dentro de aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 % de la proporción deseada, incluido cualquier valor entre estos rangos.

VII. DEFINICIONES

[0519]A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos, notaciones y otros términos o terminología técnicos y científicos utilizados en este documento pretenden tener el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece el tema reivindicado. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en el presente documento para mayor claridad y/o para una fácil referencia, y la inclusión de tales definiciones en el presente documento no necesariamente debe interpretarse en el sentido de representar una diferencia sustancial sobre lo que generalmente se entiende en la técnica.

[0520]Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos y no están limitados a una longitud mínima. Los polipéptidos, incluidos los receptores proporcionados y otros polipéptidos, por ejemplo, conectores o péptidos, pueden incluir residuos de aminoácidos que incluyen residuos de aminoácidos naturales y/o no naturales. Los términos también incluyen modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, sialilación, acetilación y fosforilación. En algunos aspectos, los polipéptidos pueden contener modificaciones con respecto a una secuencia nativa o natural, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagénesis dirigida, o pueden ser accidentales, como mediante mutaciones de huéspedes que producen las proteínas o errores debidos a la amplificación por PCR.

[0521]Como se usa en el presente documento, un “sujeto” es un mamífero, tal como un ser humano u otro animal, y típicamente es un ser humano. En algunas formas de realización, el sujeto, por ejemplo, el paciente, a quien se administra el agente o agentes, células, poblaciones celulares o composiciones, es un mamífero, típicamente un primate, tal como un ser humano. En algunas formas de realización, el primate es un mono o un simio. El sujeto puede ser hombre o mujer y puede tener cualquier edad adecuada, incluidos sujetos infantiles, juveniles, adolescentes, adultos y geriátricos. En algunas formas de realización, el sujeto es un mamífero no primate, tal como un roedor.

[0522]Como se usa en el presente documento, “tratamiento” (y variaciones gramaticales del mismo tales como “tratar” o “tratamiento”) se refiere a una mejora o reducción completa o parcial de una enfermedad o condición o trastorno, o un síntoma, efecto o resultado adverso, o fenotipo asociado. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, entre otros, prevenir la aparición o recurrencia de la enfermedad, aliviar los síntomas, disminuir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir la metástasis, disminuir la tasa de progresión de la enfermedad, mejorar o paliar el estado de la enfermedad y remisión o mejor pronóstico. Los términos no implican la curación completa de una enfermedad ni la eliminación completa de ningún síntoma o efecto sobre todos los síntomas o resultados.

[0523] Como se utiliza en el presente documento, “retrasar el desarrollo de una enfermedad” significa diferir, obstaculizar, retardar, estabilizar, suprimir y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (como el cáncer). Este retraso puede ser de diferentes duraciones, dependiendo de la historia de la enfermedad y/o del individuo que está siendo tratado. En algunas formas de realización, un retraso suficiente o significativo puede, de hecho, abarcar la prevención, en el sentido de que el individuo no desarrolla la enfermedad. Por ejemplo, un cáncer en etapa avanzada, como el desarrollo de metástasis, puede retrasarse.

[0524] “Prevenir”, como se utiliza en el presente documento, incluye proporcionar profilaxis con respecto a la aparición o recurrencia de una enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no ha sido diagnosticado con la enfermedad. En algunas formas de realización, las células y composiciones proporcionadas se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para retardar la progresión de una enfermedad.

[0525] Como se usa en el presente documento, “suprimir” una función o actividad es reducir la función o actividad en comparación con las mismas condiciones excepto por una condición o parámetro de interés, o alternativamente, en comparación con otra condición. Por ejemplo, las células que suprimen el crecimiento tumoral reducen la tasa de crecimiento del tumor en comparación con la tasa de crecimiento del tumor en ausencia de las células.

[0526] Una “cantidad eficaz” de un agente, por ejemplo, una formulación, células o composición farmacéutica, en el contexto de la administración, se refiere a una cantidad eficaz, en dosis/cantidades y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado deseado, tal como como resultado terapéutico o profiláctico.

[0527] Una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica o células, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado, tal como para el tratamiento de una enfermedad, afección, o trastorno, y/o efecto farmacocinético o farmacodinámico del tratamiento. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto, y las poblaciones de células administradas. En algunas formas de realización, los métodos proporcionados implican administrar las células y/o composiciones en cantidades eficaces, por ejemplo, cantidades terapéuticamente eficaces.

[0528] Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, pero no necesariamente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz. En el contexto de una menor carga tumoral, la cantidad profilácticamente eficaz en algunos aspectos será mayor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

[0529] El término “aproximadamente”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al rango de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido por el experto en este campo técnico. La referencia a “acerca de” un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) formas de realización que están dirigidas a ese valor o parámetro per se.

[0530] Tal como se utilizan en este documento, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ella” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, “un” o “una” significa “al menos uno” o “uno o más”.

[0531] A lo largo de esta divulgación, varios aspectos de la materia reivindicada se presentan en un formato de rango. Debe entenderse que la descripción en formato de rango es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible en el alcance de la materia reivindicada. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un rango ha revelado específicamente todos los subrangos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese rango. Por ejemplo, cuando se proporciona un rango de valores, se entiende que cada valor intermedio, entre el límite superior e inferior de ese rango y cualquier otro valor declarado o intermedio en ese rango declarado está abarcado dentro de la materia reivindicada. Los límites superior e inferior de estos rangos más pequeños pueden incluirse independientemente en los rangos más pequeños, y también están abarcados dentro del objeto reivindicado, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el rango indicado. Cuando el rango indicado incluye uno o ambos límites, los rangos que excluyen uno o ambos límites incluidos también se incluyen en la materia reivindicada. Esto se aplica independientemente de la amplitud del rango.

[0532] Como se usa en el presente documento, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos, sustancias o compuestos, incluidas las células. Puede ser una solución, una suspensión, un líquido, un polvo, una pasta, acuosa, no acuosa o cualquier combinación de los mismos.

[0533] Como se usa en el presente documento, “enriquecimiento” cuando se refiere a uno o más tipos de células o poblaciones de células particulares, se refiere a aumentar el número o porcentaje del tipo de células o población, por ejemplo, en comparación con el número total de células o el volumen de la composición o en relación con otros tipos de células, tal como mediante selección positiva basada en marcadores expresados por la población o célula, o mediante selección negativa basada en un marcador no presente en la población celular o célula que se va a agotar. El término no requiere la eliminación completa de otras células, tipos de células o poblaciones de la composición y no requiere que las células así enriquecidas estén presentes en o incluso cerca del 100 % en la composición enriquecida.

[0534] Como se usa en el presente documento, una afirmación de que una célula o población de células es “positiva” para un marcador particular se refiere a la presencia detectable sobre o dentro de la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la presencia de expresión en superficie detectada mediante citometría de flujo, por ejemplo, tiñendo con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detectando dicho anticuerpo, en donde la tinción es detectable mediante citometría de flujo a un nivel sustancialmente por encima de la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente o control de activación de fluorescencia menos uno (FMO) en condiciones por lo demás idénticas y/o en un nivel sustancialmente similar al de las células que se sabe que son positivas para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente superior al de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.

[0535] Como se usa en el presente documento, una afirmación de que una célula o población de células es “negativa” para un marcador particular se refiere a la ausencia de una presencia detectable sustancial sobre o dentro de la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la ausencia de expresión en superficie detectada mediante citometría de flujo, por ejemplo, tiñendo con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detectando dicho anticuerpo, en donde la tinción no se detecta mediante citometría de flujo a un nivel sustancialmente superior a la tinción detectada realizando el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente o un control de activación de fluorescencia menos uno (FMO) en condiciones por lo demás idénticas, y/o a un nivel sustancialmente inferior que el de las células que se sabe que son positivas para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente similar en comparación con el de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.

[0536] El término “vector”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está unido. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos operativamente. Estos vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión”.

IX. EJEMPLOS

[0537] Los siguientes ejemplos se incluyen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Determinación de dosis de inh ib idor de quinasa mTOR para cultivos de células T humanas primarias

[0538] El efecto de la dosis de inhibidores de la quinasa mTOR ejemplares en células T humanas primarias se evaluó mediante el seguimiento de la inhibición de la proteína ribosómica S6.

[0539] Se aislaron células T CD4+ y CD8+ mediante enriquecimiento basado en inmunoafinidad a partir de muestras de leucoféresis de sujetos donantes humanos. Se mezclaron células T CD4+ y CD8+ aisladas 1:1 y se estimularon con perlas magnéticas anti-CD3/anti-CD28 en presencia de concentraciones crecientes de un inhibidor de la quinasa mTOR, PI-103, Compuesto 155, Compuesto 63 o Compuesto 246. Los cultivos de células T se incubaron durante la noche (aproximadamente 16 horas) a 37 °C. Después de la incubación en presencia de PI-103, Compuesto 155, Compuesto 63 o Compuesto 246, se evaluó la fosforilación de S6 intracelular de las células T y se tiñeron conjuntamente para determinar la expresión superficial de CD4 o CD8, mediante citometría de flujo.

[0540] Los resultados se muestran en las FIGS. 1A-D. Todos los inhibidores de la quinasa mTOR evaluados inhibieron la fosforilación de S6 en células T CD4+ y CD8+. Las CI50 para la inhibición de la fosforilación de S6 en las células T por PI-103, el Compuesto 155, el Compuesto 63 y el Compuesto 246 fueron aproximadamente 100 nM, 100 nM, 500 nM y 500 nM, respectivamente. La CI50 en células T CD4+ y CD8+ se muestra en la Tabla E1.

Ejemplo 2: Evaluación de la expansión de células T después de la incubación en presencia de un inhibidor de la quinasa mTOR

[0541]Se aislaron composiciones separadas de células CD4+ y CD8+ a partir de muestras de leucoféresis humana mediante enriquecimiento basado en inmunoafinidad y se criocongelaron. Las células CD4+ y CD8+ de las composiciones se descongelaron y activaron posteriormente cultivando por separado las células en condiciones estimulantes en presencia de perlas magnéticas anti-CD3/anti-CD28 e IL-2, IL-7 y/o IL-15 recombinantes durante aproximadamente 20 horas. A continuación, las células se transdujeron con un vector viral que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-CD19. Después de la transducción, las células CD4+ y CD8+ se incubaron por separado en presencia de un inhibidor de la quinasa mTOR, ya sea el Compuesto 155, el Compuesto 63 o el Compuesto 246, en diversas concentraciones. Para los controles, las células se incubaron solo con medio, vehículo DMSO o con PI-103 200 nM. La incubación se llevó a cabo a 37 °C durante aproximadamente 8 días después de la descongelación con un cambio de medio, momento en el cual se volvieron a agregar los compuestos. a los medios de cultivo en la misma concentración.

[0542]En laFIG. 2se muestra el porcentaje de células T CD8+ y CD4+ al final del proceso en comparación con la cantidad de células sembradas para cultivo después de la transducción. El límite para seleccionar una dosis tolerada se fijó en el 70 % de los valores medios de los medios y los controles de DMSO. La dosis más alta tolerada del Compuesto 155, el Compuesto 63 y el compuesto 246 que dio como resultado niveles similares de expansión de células T CD8 y CD4 como se observó en el grupo de control del vehículo, fue 100 nM, 1 pM y 100 nM, respectivamente.

Ejemplo 3: Evaluación funcional de células T transducidas con receptor de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR) expandidas en presencia de un inhibidor de la quinasa mTOR

[0543]Se aislaron composiciones separadas de células CD4+ y CD8+ de tres donantes humanos, se activaron y se transdujeron con un vector viral que codifica un CAR anti-CD19 sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2. Después de la transducción, las células T CD4+ y CD8+ derivadas de cada donante se incubaron por separado durante 8 días en presencia de un inhibidor de la quinasa mTOR para expandir las células T sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2, excepto en presencia de Pl-103200 nM, Compuesto 631 pM, o con vehículo DMSO o controles solo de medio. A continuación, las células T CD4+ y CD8+ de cada donante se recolectaron, formularon y criocongelaron por separado. Las células T CD4+ y CD8+ criocongeladas se descongelaron, se lavaron para eliminar el compuesto y luego se combinaron células del mismo donante en una proporción de 1:1 de células T CD4+/CAR+ viables a células T CD8+/CAR+ viables para producir una composición de células CAR-T anti-CD19 expandida que contiene células T CD4+ y CD8+. Se evaluaron las actividades funcionales de las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas.

Metabolismo glicolítico

[0544]Los cambios en el metabolismo glucolítico celular en respuesta a la estimulación del receptor de células T (TCR) se midieron en células CAR-T CD8+ a partir de la composición de células CAR-T anti-CD19 generada antes de combinarlas con células T CD4+. El metabolismo glicolítico se evaluó midiendo la tasa de acidificación extracelular (ECAR) en células CAR-T CD8+ en tiempo real con un bioanalizador de flujo extracelular (Seahorse Bioanalyzer, Agilent Technologies). Las mediciones iniciales de ECAR se tomaron de células CAR-T CD8+ cultivadas a partir de la composición de células CAR-T anti-CD19 generada. Después de la tercera medición de ECAR (aproximadamente 20 minutos después del ensayo), se agregaron al cultivo perlas magnéticas anti-CD3/anti-CD28. Se determinó el área bajo la curva (AUC) para las tasas de ECAR (mpH/min) de 0 a 76 minutos del ensayo y la relación máxima de explosión glucolítica de ECAR en relación con los controles de medios (n = 3 donantes).

[0545]Como se muestra en laFIG. 3A,la estimulación con perlas anti-CD3/anti-CD28 aumentó el ECAR en células CAR-T CD8+ entre todas las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas. Se observó una tendencia hacia una explosión glucolítica mejorada tras la estimulación por TCR de CD8+ CAR-T entre células CAR-T anti-CD19 generadas por expansión en presencia del Compuesto 63 mediante el AUC de ECAR (FIG. 3B) o la relación de ECAR (FIG. 3C) relativa. al control de medios en cada uno de los 3 donantes.

Señalización CAR en células CAR-T expandidas

[0546]La señalización dependiente de antígeno de las células CAR-T entre las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas se evaluó mediante el seguimiento de la activación de fosfo-S6. Se cocultivaron células de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas, expandidas en presencia de medio únicamente, vehículo DMSO, PI-103 o Compuesto 63, con células K562 irradiadas transducidas para expresar CD19 (células diana K562-CD19) a una proporción de 1:1. Después de 20 horas, se evaluaron las células para determinar la fosforilación de S6 intracelular y se tiñeron conjuntamente para determinar la expresión superficial de CD4 o CD8, mediante citometría de flujo.

[0547]Como se muestra en laFIG. 4A,después de la estimulación con células que expresan antígeno, se observaron niveles más altos de fosfo-S6 en células T CD4+ y CD8+ entre cada una de las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas en comparación con las células que no fueron estimuladas con antígeno. La tinción con fosfo-S6 fue similar en las células T CD4+ y CD8+ entre las composiciones que se expandieron en presencia de PI-103 o el Compuesto 63 en comparación con las composiciones de control que se expandieron solo con vehículo o medio DMSO. Estos resultados son consistentes con el hallazgo de que las células expandidas en presencia de inhibidores de la quinasa mTOR conservan la actividad de señalización de la quinasa mTOR normal después de la eliminación del inhibidor.

Actividad citolítica

[0548]Para evaluar la actividad citolítica, las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas se cultivaron conjuntamente con células diana K562-CD19 en una proporción de 3:1 o 1:1 de células efectoras a células diana. Las células diana se marcaron con NucLight Red (NLR) para permitir el seguimiento mediante microscopía fluorescente. Como control negativo, las células diana K562-CD19 se cultivaron solas o se cultivaron conjuntamente con células T CD4+ y CD8+ que no expresaban un CAR anti-CD19. La actividad de destrucción se evaluó midiendo la pérdida de células diana viables después de 80 horas, según lo determinado por una señal fluorescente roja (usando el sistema de análisis de células vivas INCUCYTE®, Essen Bioscience). La muerte celular se cuantificó como la inversa del área bajo la curva en función de la cantidad de células diana viables a lo largo del tiempo.

[0549]Como se muestra en laFIG. 4B,las células que se expandieron en presencia de PI-103 o el Compuesto 63 mostraron una actividad citolítica similar a la de las células de control que se expandieron solo con vehículo o medio DMSO. Estos resultados indican que la función de destrucción de células diana se mantuvo en las células T que se habían expandido en presencia de inhibidores de la quinasa mTOR.

Medición de citocinas

[0550]Para medir las citoquinas después de la estimulación con antígeno, las células de las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas se cultivaron conjuntamente con células diana K562-CD19 irradiadas o células diana parentales K562 en una proporción de células efectoras:diana de 1:1. Después de un cultivo nocturno (~16 horas), se recogieron los sobrenadantes del cultivo celular y se midió la producción de citocinas TNF-alfa, IFN-gamma e IL-2 utilizando un ensayo Luminex Multiplex. El cambio en la producción de citoquinas observado en sobrenadantes de cocultivo se determinó a partir de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas expandidas en presencia de PI-103, Compuesto 63 o vehículo DMSO en comparación con células expandidas solo en medio.

[0551]Como se muestra en laFIG. 5,se detectó la producción de TNF-alfa, IFN-gamma e IL-2 a partir de células T cocultivadas con células que expresan antígenos. Las células de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas que se expandieron en presencia de PI-103 o Compuesto 63 mostraron mejoras en la producción de citoquinas en comparación con las células de control, particularmente con respecto a la producción de IFN-gamma, que mejoró en las células expandidas con PI-103 o Compuesto 63.

[0552]Las citoquinas intracelulares, CD107a, IFN-gamma (IFNy), IL-2, IL-17a y TNF-alfa (TNFa), en células T cocultivadas que se dividieron en dos grupos y se incubaron adicionalmente durante 5 horas con PMA/Ionomicina y un inhibidor de Golgi o un inhibidor de Golgi solo. La acumulación de citocinas intracelulares se expresó como un cambio en la frecuencia de las células positivas para citocinas de los controles de solo medio. Las células T CD8+ (FIG. 6A) y las células T CD4+ (FIG. 6B) que se expandieron con PI-103 o el Compuesto 63 exhibieron una frecuencia aumentada de ciertos perfiles de citoquinas polifuncionales en comparación con las células de control (perfiles encuadrados en lasFIGS.

6A y 6B).En particular, las células T CD8+ exhibieron un perfil polifuncional aumentado de células CD107a+IFNY+TNFa+ después de la reestimulación con PMA/ionomicina y un inhibidor de Golgi, y un perfil polifuncional aumentado de CD107a+IFNY+IL-2+ células después de la incubación con un inhibidor de Golgi solo (FIG. 6a). En las células CD4+, se observó un perfil polifuncional aumentado de las células CD107a+IFNY+TNFa+ después del tratamiento con PMA/ionomicina y un inhibidor de Golgi, o un inhibidor de Golgi solo, mientras que los perfiles polifuncionales de las células CD107a+IFNY+IL-2+TNFa+ aumentaron después de la reestimulación con PMA/ionomicina y un inhibidor de Golgi, y los perfiles polifuncionales de las células CD107a+IFNy+ aumentaron después de la incubación con un inhibidor de Golgi solo (FIG. 6B).

Estimulación en serie

[0553]La capacidad de las células para expandirseex vivodespués de estimulaciones repetidas en algunos aspectos puede indicar la capacidad de las células CAR-T para persistir (p. ej., después de la activación inicial) y/o es indicativa de la funciónin vivo(Zhao et al. (2015) Cancer Cell, 28:415-28). Para evaluar la función de las células en un ensayo de estimulación en serie, las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas se incubaron con células diana K562-CD19 irradiadas. Cada 3-4 días, se recolectaron, contaron y reestimularon células T con nuevas células objetivo utilizando las mismas condiciones de cultivo después de restablecer el número de células a la densidad de siembra inicial para cada ronda. Después de cuatro rondas de reestimulación, las células T se volvieron a cultivar durante 4 días adicionales sin más reestimulación con células diana. Se determinaron las duplicaciones de la población (FIG. 7A) y el área bajo las curvas (AUC) en función de las duplicaciones de la población con el tiempo en relación con el a Uc de las células expandidas solo con medio (FIG. 7B).

[0554]Como se muestra en laFIG.7A,el número de células T que expresan CAR anti-CD19 aumentó en este ensayo, lo que coincide con la capacidad de estas células para proliferar en presencia de células que expresan CD19. Como se muestra a partir del cambio en el AUC de las duplicaciones de población, las células T de composiciones de células T con CAR anti-CD19 generadas que se habían expandido con el Compuesto 63 tenían un AUC promedio mayor en comparación con las células T expandidas con PI-103 o vehículo DMSO (FIG. 7B). Esta observación indica que la presencia del Compuesto 63 durante la expansión de las células CAR-T apoya la expansión sostenida y la supervivencia de las células T incluso después de una estimulación antigénica repetida.

[0555]Para evaluar la actividad tras una estimulación secundaria adicional, se recolectaron células CAR-T el día 11 después de la reestimulación en serie y se estimularon con células diana K562-CD19 irradiadas en una proporción efector:diana de 1:1 durante aproximadamente 16 horas. Se recogió el sobrenadante y se midió la producción de citoquinas TNF-alfa, IFN-gamma e IL-2 usando un ensayo Luminex Multiplex sustancialmente como se describió anteriormente. Se determinó y se muestra el cambio en la producción de citocinas observado en sobrenadantes de cocultivo a partir de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas expandidas en presencia de PI-103, Compuesto 63 o vehículo DMSO en comparación con células expandidas solo en medio. en laFIG. 7C.La evaluación de los perfiles de citoquinas polifuncionales de las células el día 11, después de la incubación con un inhibidor de Golgi durante 4 horas sustancialmente como se describió anteriormente, mostró un perfil de citoquinas polifuncionales CD8+ aumentado de las células CD107a+IFNy+ (FIG. 7D).

[0556]La capacidad de las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas que se expandieron en presencia de inhibidores de mTOR para retener la capacidad mejorada de citoquinas y la supervivencia a través de la exposición sostenida al antígeno es consistente con una resistencia al agotamiento funcional.

Expansión específica para automóviles

[0557]La capacidad de las células para expandirse después de la estimulación del CAR se evaluó incubando células de las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas con superficie de perlas conjugadas con un anticuerpo antiidiotipo específico para el CAR anti-CD19. Las perlas conjugadas con anticuerpo antiidiotipo se incubaron con células en una proporción de perlas:célula de 1:1 en pocillos de vasos de expansión G-rex de 24 pocillos (Argos Technologies) durante 15 días. El total de células T vivas por pocillo se determinó contando las células en los cultivos cada 5 días (FIG.

8A). El área media bajo la curva (AUC) en función del número de células T a lo largo del tiempo se calculó en relación con el AUC de las células expandidas solo con medio (FIG. 8B).

[0558]Como se muestra en laFIG. 8A,la estimulación de células con perlas conjugadas con anticuerpo antiidiotípico dio como resultado una expansión inicial seguida de una disminución en el número de células. Las células T de composiciones de células T CAR anti-CD19 generadas que se habían expandido previamente con el Compuesto 63 o PI-103 tenían un AUC media mayor en comparación con las células T previamente expandidas con vehículo DMSO (FIG.

8B). Los resultados indican que la presencia de un inhibidor de la quinasa mTOR durante la expansión favorece una mayor expansión y supervivencia después de una única estimulación específica de CAR.

[0559]La respuesta de citoquinas secundarias después de la estimulación con células que expresan antígenos se evaluó en células CAR-T recolectadas el día 11 después de la expansión con perlas conjugadas con anticuerpo antiidiotipo. Las células estimuladas con anticuerpo antiidiotipo se incubaron con células diana K562-CD19 irradiadas en una proporción efector:diana de 1:1 durante aproximadamente 16 horas. Se recogió el sobrenadante y se midió la producción de citoquinas TNF-alfa, IFN-gamma e IL-2 usando un ensayo Luminex Multiplex sustancialmente como se describió anteriormente. El cambio en la producción de citocinas observado en sobrenadantes de cocultivo se determinó a partir de composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas expandidas en presencia de PI-103, Compuesto 63 o vehículo DMSO en comparación con células expandidas solo en medio. Como se muestra en laFIG. 8C,las células T de composiciones de células T con CAR anti-CD19 generadas que se habían expandido previamente con el Compuesto 63 o PI-103 exhibieron una producción secundaria de citoquinas mejorada después de la estimulación posterior con antígeno. Además, algunas células derivadas de donantes que fueron diseñadas y expandidas con el Compuesto 63 exhibieron una mayor frecuencia de células T CD8+ que eran células CD107a+IFNY+ en el día 11, según lo determinado mediante tinción con citoquinas intracelulares después de la incubación con un inhibidor de Golgi durante 4 horas sustancialmente como se describe anteriormente (FIG. 8d ). Ejemplo 4: Análisis de expresión génica de células T CD4+ y CD8+ diseñadas expandidas en presencia de un inhibidor de la quinasa mTOR

[0560]La expresión génica entre células de las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas descritas en el Ejemplo 2, generadas expandiendo las células en presencia de PI-103, Compuesto 63, vehículo DMSO o medios únicamente, se evaluó mediante secuenciación de ARN (ARN-Seq). El ARN se extrajo de composiciones generadas a partir de tres donantes en cada condición de expansión y ARN-Seq realizó una evaluación del transcriptoma completo. Se determinaron los valores de FPKM y FPKQ; Los valores de FPKQ se transformaron logarítmicamente (log2). La expresión génica se determinó comparando perfiles de expresión de células CD4+, CD8+ o CD4+/CD8+ combinadas entre las células de las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas que se expandieron en presencia de solo medio, PI-103 o Compuesto 63 en comparación con las células expandidas con vehículo DMSO. Se identificaron productos genéticos que eran diferentes entre cada grupo basándose en el análisis de un gráfico de volcán imponiendo un límite de FDR < 10 % entre las dos condiciones.

[0561]Como se muestra en los gráficos de volcanes en laFIG. 9A, se identificó una expresión genética significativamente cambiada entre las células T CD4+ y/o CD8+ expandidas en presencia de PI-103 o Compuesto 63, con genes regulados negativamente representados a la izquierda del punto medio (“0”) de cada gráfico y genes regulados positivamente representados a la derecha del punto medio.

[0562]La expresión de cada gen expresado diferencialmente en células expandidas con PI-103 o Compuesto 63 se representó como el cambio de Log 2 en comparación con la expresión en células expandidas con DMSO. Como se muestra en laFIG. 9B, se identificó una relación lineal entre la expresión de los genes expresados diferencialmente en células expandidas con PI-103 o el Compuesto 63, lo que indica una fuerte correlación positiva entre la expresión de los genes expresados diferencialmente en células expandidas con PI-103 y células expandidas con el Compuesto 63 (R2 = 0,9).

[0563]Se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento ontológico de los genes expresados diferencialmente para identificar categorías de ontología genética (OG), basadas en reguladores transcripcionales de genes expresados diferencialmente que se activaron o inhibieron en comparación con la expresión en células expandidas con vehículo DMSO. Las puntuaciones de TZ del regulador transcripcional se calcularon basándose en la concordancia de las direcciones del efecto transcripcional esperado en cada red reguladora en relación con los efectos transcripcionales observados en células expandidas con PI-103 o Compuesto 63. LaFIG. 9Cenumera categorías OG identificadas a modo de ejemplo, definidas por el miembro regulador de cada grupo, en relación con sus puntuaciones Z correspondientes.

Ejemplo 5: Evaluación de la carga tumoral y la supervivencia en un modelo de xenoinjerto tumoral después de la administración de células CAR-T expandidas en presencia de un inhibidor de la quinasa mTOR

[0564]Se evaluaron los efectos antitumorales de las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas por expansión en presencia de PI-103, Compuesto 63 o medios únicamente como se describe en el Ejemplo 2. El modelo de ratón con xenoinjerto tumoral se generó implantando ratones inmunodeficientes nod scid gamma (NSG) con 0,5 * 106 células Raji (una línea celular tumoral de linfocitos B humanos inmortalizados que expresa CD19), a las que se les permitió injertarse. Las células Raji se transfectaron con luciferasa de luciérnaga para facilitar la detección mediante imágenes de bioluminiscencia. Después de siete días, los ratones no recibieron tratamiento, recibieron vehículo DMSO o una dosis baja (0,25 x 106) o una dosis alta (1,0 x 106) de células T CAR+ de las composiciones de células CAR-T anti-CD19 generadas. La carga tumoral se evaluó mediante bioluminiscencia semanalmente o cada 10 días. ;;[0565]El tratamiento de ratones con tumores con dosis baja o alta de células CAR-T mejoró la carga tumoral y la supervivencia en comparación con ningún tratamiento o vehículo DMSO. Se observó una carga tumoral reducida después de la administración de una dosis baja o alta de células CAR-T de una composición de células CAR-T anti-CD19 que se había expandido en presencia de PI-103 (FIG. 10A, paneles superiores) o Compuesto 63 (FIG. 11A, paneles superiores) en comparación con el vehículo DMSO. Los ratones portadores de tumores a los que se les administró una dosis baja o alta de células CAR-T que se habían expandido previamente en presencia de PI-103 o el Compuesto 63 también mostraron una supervivencia sustancialmente mejorada en comparación con los ratones portadores de tumores a los que se les administraron células CAR-T expandidas con el Vehículo DMSO (FIGS. 10Ay11A,paneles inferiores). Los ratones portadores de tumores a los que se les administró la dosis alta de células CAR-T expandidas en presencia del Compuesto 63 mostraron una supervivencia del 100 % durante al menos 80 días después del implante de células tumorales.FIGS.;10B y 11Bmuestran resultados de supervivencia de ratones portadores de tumores en momentos posteriores hasta 100 días después del implante de células tumorales después del tratamiento con células CAR-T expandidas en presencia de PI-103 o Compuesto 63, respectivamente; los resultados fueron consistentes con el efecto de las células producidas en presencia del Compuesto 63, lo que resultó en un rendimiento mejorado de las células CAR-T administradas. Los resultados indican que una composición de células CAR-T producida en presencia de un inhibidor de la quinasa mTOR, como el Compuesto 63, muestra un rendimiento mejorado en ensayos in vivo. La eliminación mejorada del tumor y la supervivencia en el modelo in vivo son consistentes con una mejora cualitativa del estado y/o función de las células c AR-T que se logró mediante la inhibición de la señalización de mTOR durante la generación de células CAR-T. ;;Ejemplo 6: Ensayo in vitro para la estimulación crónica de células T CAR+ utilizando perlas conjugadas antiidiotipo;;[0566]Se aislaron composiciones separadas de células CD4+ y CD8+ de donantes humanos, se estimularon mediante activación con perlas magnéticas anti-CD3/anti-CD28 y se transdujeron con un vector viral que codifica un CAR anti-CD19 que tiene un scFv derivado de FMC63. Después del cultivo en condiciones para expandir las células, las composiciones de células T que contenían células T CD4+ y CD8+ modificadas genéticamente de cada donante se recolectaron, formularon y criocongelaron por separado. Las células T CD4+ y CD8+ criocongeladas se descongelaron y formularon en una proporción de 1:1 de células T CD4+ y CD8+ del mismo donante para generar una composición de células T que contenía células T CAR+. Se incubaron perlas conjugadas con anticuerpo anti-idiotipo (ID) contra el CAR anti-CD19 con células en una proporción de perlas:célula de 1:1 durante 14 días. ;;[0567]La respuesta secundaria de las células CAR-T recolectadas el día 14 después de la estimulación específica de CAR con perlas conjugadas anti-ID (día 14; secundaria) se evaluó después de la estimulación con células diana que expresan el antígeno K562-CD19 en una proporción efector-diana de 1:1 (para evaluar los niveles de citoquinas) o 3:1 (para evaluar la actividad citolítica). La respuesta primaria de las células T de la composición de células T que no se habían incubado con las perlas conjugadas anti-ID también se determinó mediante estimulación similar con células que expresan antígenos (Día 0; “primaria”). Para evaluar la actividad citolítica, las células diana se marcaron con NucLight Red (NLR) para permitir el seguimiento mediante microscopía fluorescente. La actividad de destrucción se evaluó midiendo la pérdida de células diana viables durante 72 horas, según lo determinado por la pérdida de señal fluorescente a lo largo del tiempo mediante microscopía de fluorescencia cinética (usando el sistema de análisis de células vivas INCUCYTE®, Essen Bioscience). El índice de destrucción se determinó como la inversa del área bajo la curva (AUC) para la fluorescencia objetivo a lo largo del tiempo. Los niveles de citoquinas intracelulares de IL-2 y TNF-alfa se evaluaron mediante citometría de flujo en células T cocultivadas después de la incubación en presencia de un inhibidor de Golgi. ;;[0568]Como se muestra en laFIG. 12A,la destrucción de células diana por una composición de células T que contiene células T CAR+ recogidas después de estimulación específica de CAR durante 14 días con perlas conjugadas anti-ID se redujo en comparación con la actividad citolítica de células T CAR+ que no se sometieron a estimulación específica de CAR previa. Los niveles de citoquinas intracelulares de IL-2 y TNF-alfa también se redujeron en células T CAR+ que habían recibido estimulación específica de CAR a largo plazo con las perlas conjugadas anti-ID (FIG. 12B). Estos resultados son consistentes con una observación de que la estimulación específica del CAR a largo plazo, como mediante la incubación con perlas conjugadas anti-ID durante 14 días, conduce a una estimulación crónica del CAR y a la pérdida de la función sostenida. ;;[0569]El ensayo de estimulación crónica descrito anteriormente se usó para evaluar los efectos de PI-103 o Compuesto 63 sobre la mejora de la función de las células T CAR+ después de una estimulación a largo plazo. Se generaron composiciones de células T CAR+ anti-CD19 como se describió anteriormente, excepto en presencia de PI-103, Compuesto 63 o un control de vehículo a partir del inicio de la estimulación. Las células de cada composición de células CAR-T generada se incubaron con perlas paramagnéticas conjugadas con anti-ID en una proporción de perlas a células de 1:1 durante 14 días. ;;[0570]Se evaluó la respuesta primaria de las composiciones de células CAR-T en el momento de la descongelación (sin estimulación con perlas conjugadas anti-ID) o la respuesta secundaria de las composiciones CAR-T estimuladas con CAR (después de 14 días de estimulación específica de CAR con perlas conjugadas anti-ID) después de la estimulación. con células que expresan antígenos. Se cultivaron composiciones de células CAR-T 1:1 con células que expresan el antígeno K562-CD19 en presencia de un inhibidor de Golgi, y se evaluó la producción de citocinas polifuncionales mediante citometría de flujo después de la tinción con citocinas intracelulares para IL-2, IFN-gamma y TNF-alfa. Se determinó una puntuación polifuncional a partir de niveles acumulativos de citocinas determinados en células CD8+ después de que los datos se normalizaron mediante escalamiento dentro de cohortes de donantes(FIG. 13A). Se determinó el total de citocinas IL-2, TNF e IFN-gamma secretadas a partir del sobrenadante de cultivos celulares de cocultivos después de 20 horas de incubación con células diana, y se calculó el promedio de las puntuaciones escaladas para las tres citocinas como se muestra en laFIG. 13A. Como se muestra en laFIG. 13A,PI-103 o el Compuesto 63 dieron como resultado respuestas primarias o secundarias mejoradas basadas en la capacidad de las composiciones de células CAR-T para producir citocinas. También se observaron mejoras en la respuesta citolítica primaria o secundaria, después del cocultivo con células diana en una proporción de células efectoras:diana de 3:1 como se describió anteriormente, entre las composiciones de células T producidas en presencia de PI-103 o Compuesto 63 (FIG. 13B y 13C). ;;[0571]Estos resultados demuestran la utilidad de los ensayos de estimulación crónica para evaluar composiciones de células CAR-T, incluidas diferentes composiciones de células CAR-T producidas en diferentes condiciones o en presencia de PI-103 o Compuesto 63 u otros agentes, por su capacidad para exhibir supervivencia a largo plazo y/o mantenimiento de la función después de la estimulación crónica de células CAR-T, como puede ocurrir después de una exposición prolongada al antígeno in vivo. ;;Ejemplo 7: Evaluación funcional de células T transducidas con receptor de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR) preparadas en presencia de un inhibidor de la cinasa mTOR;;[0572]El impacto de la presencia de un inhibidor de la mTOR quinasa durante la producción celular se evaluó más a fondo en un proceso de ingeniería de células T en el que las poblaciones de células T CD4+ y CD8+ se enriquecieron por separado y luego se mezclaron y procesaron juntas en una única composición. Las etapas de procesamiento incluyen aquellas de estimulación, transducción con un vector que codifica un receptor de antígeno quimérico y expansión. ;;[0573]Se seleccionaron composiciones separadas de células CD4+ y CD8+ a partir de PBMC aisladas de una muestra de leucoféresis del mismo donante humano mediante selección basada en inmunoafinidad, y las composiciones celulares seleccionadas se criocongelaron. Las composiciones separadas de células T CD4+ y CD8+ se descongelaron posteriormente y se mezclaron en una proporción de 1:1 de células T CD4+ viables a células T CD8+ viables. En este estudio, las poblaciones mixtas de células CD4+ y CD8+ se incubaron en presencia del Compuesto 63, PI103 o ningún inhibidor (control de vehículo DMSO) comenzando con el inicio de la estimulación. Con más detalle, la composición mixta de células T CD4+ y CD8+ se estimuló (en presencia o ausencia de un inhibidor, como se indica) en presencia de perlas paramagnéticas recubiertas de poliestireno con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos durante entre 18 y 20 minutos. ;30 horas, y luego se transdujeron con un vector lentiviral que codifica un CAR anti-CD19. El CAR contenía un dominio de unión al antígeno scFv específico para CD19 (derivado de FMC63), una región transmembrana CD28, una región de señalización coestimuladora 4-1BB y un dominio de señalización intracelular derivado de CD3-zeta. A continuación, las células se expandieron en presencia de citocinas normalmente durante aproximadamente 6 a 7 días. Comenzando con la estimulación y durante la duración del proceso, los medios contenían DMSO (control del vehículo), PI103 2 pM o Compuesto 63 1 pM. El control del vehículo contenía DMSO en un volumen que coincidía con el de las muestras tratadas con inhibidor de mTOR. Las células expandidas fueron criopreservadas. Para la evaluación, las células CAR-T criopreservadas se descongelaron y lavaron antes de la evaluación en medios de ensayo sin citocinas de apoyo y sin inhibidor ni vehículo. ;;[0574]Las células se evaluaron mediante citometría de flujo para determinar los niveles de los marcadores de la superficie celular y los niveles del marcador proapoptótico, caspasa 3 intracelular. En laFIG. 14.Como se muestra, se observó que las células CAR-T preparadas en presencia del Compuesto 63 tenían niveles reducidos del marcador proapoptótico, caspasa 3 intracelular. ;;[0575]Los atributos funcionales de las células CAR-T generadas se evaluaron en un ensayo de estimulación en serie mediante la incubación del anticuerpo de células CAR-T generado conjugado con perlas. El anticuerpo anti-CAR era un anticuerpo antiidiotípico que reconocía el scFv del CAR derivado de FMC63. Las células CAR-T descongeladas se mezclaron con perlas específicas de CAR, se sembraron en placas y se incubaron durante 14 días. Cada 3-4 días se contaron las células T. Como se muestra en laFIG. 15,las células c AR-T generadas preparadas en presencia de PI103 o Compuesto 63 mostraron una expansión mejorada después de la reestimulación. ;;[0576]La actividad citolítica de las células CAR-T generadas se evaluó cultivando las células CAR-T generadas, ya sea recién descongeladas o en el día 14 de la reestimulación desde arriba, con células diana que expresan CD19 en una proporción de efector a diana de 3:1. La muerte de las células diana se cuantificó a lo largo del tiempo. Se determinó el área de crecimiento de células tumorales bajo la curva (AUC) de la señal a lo largo del tiempo para cada concentración. Se calculó un índice de destrucción como la inversa del área bajo la curva de crecimiento de células tumorales (1/AUC). Las células CAR-T que se habían generado en un proceso en presencia de PI103 o el Compuesto 63 exhibieron una destrucción de células diana mejorada (FIG. 16) en comparación con las células CAR-T preparadas en presencia de DMSO. ;;[0577]Los niveles de citocinas intracelulares se controlaron en células de cocultivos incubadas con células CAR-T generadas recién descongeladas o células CAR-T después de una reestimulación secundaria con células diana que expresan CD19. Las células CAR-T se incubaron con células que expresan el objetivo en presencia de un inhibidor de Golgi durante 5 horas. Se determinó la expresión intracelular de IL-2, TNF-alfa e IFN-gamma y se calculó una puntuación polifuncional seleccionando células CAR-T acumulativas positivas para IL-2 y cualquier combinación de IFN-gamma y TNF-alfa. Como se muestra en laFIG. 17A,las células CAR-T preparadas en presencia de PI103 o el Compuesto 63 exhibieron perfiles de citoquinas efectoras polifuncionales mejorados en los subconjuntos CD8+ y CD4+ después de la estimulación primaria o secundaria (FIG. 17A)en comparación con las células CAR-T preparadas en presencia de DMSO. Las células CAR-T generadas también se cultivaron con células que expresan el antígeno CD19 durante 20 horas y se evaluaron los niveles de IL-2, TNF-alfa e IFN-gamma en sobrenadantes de cultivos celulares mediante ELISA. Las células CAR-T generadas con PI103 o el Compuesto 63 exhibieron niveles aumentados de citoquinas secretadas en los sobrenadantes (FIG. 17B). ;;[0578]En conjunto, estos resultados son consistentes con la observación de que la presencia de PI103 y el Compuesto 63 durante un proceso para producir células CAR-T a partir de una población mixta de células T CD4+ y CD8+ mejora la función y actividad de las células CAR-T. ;;Ejemplo 8: Análisis de expresión génica de células CAR-T preparadas en presencia de un inhibidor de la quinasa mTOR;;[0579]La expresión génica entre las células de las composiciones que contienen células CAR-T anti-CD19 (preparadas en presencia de DMSO, PI-103 o el Compuesto 63 como se describe en el Ejemplo 7) se evaluó mediante análisis de expresión diferencial (DESeq2) de ARN-Seq. RNA-seq se realizó en las muestras de ADN complementario (ADNc) preparadas a partir del ARN aislado de las células CAR-T. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para los conjuntos de datos de RNA-seq, generados a partir de recuentos normalizados de DESeq2. Los análisis de expresión diferencial a nivel genético se realizaron en R (versión 3.4) utilizando el paquete DESeq2 (versión 1.16.1) comparando muestras tratadas con el compuesto con el control DMSO, controlando los donantes. Antes del análisis de expresión diferencial, el conjunto de genes se filtró para excluir genes con recuentos cero en todas las muestras. Los genes expresados diferencialmente (DE) se identificaron imponiendo un límite de cambio de log2 de 0,5 y un límite de tasa de descubrimiento falso (FDR) ajustado de Benjamini-Hochberg de 0,1. Se observaron perfiles de expresión genética tanto superpuestos como no superpuestos en composiciones que contenían células CAR-T. preparado en presencia de PI103 o Compuesto 63 (FIG. 18). ;;Ejemplo 9: Evaluación de la carga tumoral y la supervivencia en un modelo de xenoinjerto tumoral después de la administración de células CAR-T preparadas en presencia de un inhibidor de la quinasa mTOR;;[0580]Los efectos antitumorales de las composiciones de células CAR-T anti-CD19 preparadas en presencia de DMSO, PI-103 o el Compuesto 63 como se describe en el Ejemplo 7 se evaluaron in vivo. El modelo de ratón con xenoinjerto tumoral se generó implantando ratones inmunodeficientes nod scid gamma (NSG) con 0,5 * 106 células Raji (una línea celular tumoral de linfocitos B humanos inmortalizados que expresa CD19), a las que se les permitió injertarse. Las células Raji se transfectaron con luciferasa de luciérnaga para facilitar la medición de la carga tumoral mediante imágenes de bioluminiscencia. Después de siete días, los ratones no recibieron tratamiento o recibieron tratamiento con una dosis baja (0,25 x 106) o una dosis alta (1,0 x 106) de células T CAR+ anti-CD19 preparadas en presencia de DMSO (vehículo) o DMSO. y un inhibidor de la quinasa mTOR. La carga tumoral y la mortalidad se evaluaron semanalmente.

[0581]Se observó que las composiciones de células CAR-T anti-CD19 que, por separado, se habían preparado a partir de células de tres donantes humanos diferentes, en un proceso que incluía la presencia de DMSO, tenían efectos antitumorales demostrables en los animales de este estudio, en comparación con animales no tratados, presentando los animales tratados una mortalidad reducida. Los resultados de células preparadas a partir de un donante compatible se muestran en lasFIGS. 19A-By20A-20B.Se observó que la inclusión del Compuesto 63 inhibidor de la quinasa mTOR (en comparación con la ausencia del inhibidor, es decir, vehículo DMSO) en el proceso utilizado para generar las células CAR-T daba como resultado una mejora de las respuestas antitumorales in vivo en animales en este estudio. Se muestran resultados ejemplares en lasFIGS. 20A y 20B.Se observaron resultados sustancialmente similares con células CAR-T generadas a partir de otro donante. Los resultados que comparan las células CAR-T generadas en presencia o ausencia del inhibidor PI103 se muestran en (FIGS. 19A y 19B). Para las células CAR-T generadas a partir de otro donante, se observaron efectos antitumorales comparables para las células producidas en presencia de PI103 y para las células producidas en ausencia de inhibidor (vehículo DMSO).

Ejemplo 10: Evaluación de la persistencia de las células CAR-T in vivo

[0582]La presencia y el número de células CAR-T anti-CD19 se evaluaron en la sangre de los animales después de la administración de composiciones que contenían las células que se habían preparado en presencia de PI-103, Compuesto 63 o ningún inhibidor, como se describe en el Ejemplo 7 a los animales. Se utilizó el modelo de xenoinjerto de tumor de linfoma CD19+ de Raji Burkitt descrito en el Ejemplo 9. Los ratones no recibieron ningún tratamiento o recibieron tratamiento con una dosis baja (0,25 x 106) o una dosis alta (1,0 x 106) de las respectivas composiciones de células T CAR+ anti-CD19. La carga tumoral y la mortalidad se evaluaron cada 7 a 10 días.

[0583]Los ratones se sangraron los días 18, 25 y 36 después de la infusión, y se evaluó mediante citometría de flujo la presencia de células T CAR+ CD4+ o células T CAR+ CD8+ circulantes en sangre periférica. Se observó que la inclusión del Compuesto 63 o PI103 durante la preparación de las células CAR-T del mismo donante compatible como se describe en el Ejemplo 10 daba como resultado un mayor número de células CAR+ T con el tiempo, consistente con una interpretación de que el uso de los inhibidores durante la producción de las composiciones celulares dio como resultado una mayor exposición, tal como debido a una mayor expansión o persistencia, de las células in vivo, después de la administración en este modelo de tumor animal (FIGs .21A y 21B). Se observaron resultados sustancialmente similares con células CAR-T generadas a partir de un segundo donante.

SECUENCIAS

[0584]

Continuación

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una composición de células modificadas genéticamente, comprendiendo el método:

(a) incubar, en condiciones estimulantes, una composición de entrada que comprende células T humanas primarias, comprendiendo dichas condiciones estimulantes la presencia de (i) un reactivo estimulante capaz de activar uno o más dominios de señalización intracelular de uno o más componentes de un complejo de TCR y/o uno o más dominios de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras y (ii) un agente que inhibe la actividad mTOR, en donde el agente que inhibe la actividad mTOR es 2-(3-hidroxifenil)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purin-6-carboxamida (Compuesto 63); e

2. El método de la reivindicación 1, que comprende incubar adicionalmente las células diseñadas, en donde la incubación comprende la presencia del agente que inhibe la actividad mTOR, produciendo así una composición de salida, opcionalmente en donde:

(a) la incubación adicional se lleva a cabo en presencia de una o más citocinas recombinantes; y/o

(b) la incubación adicional comprende el cultivo en condiciones que den como resultado la proliferación o expansión de las células en la composición.

3. Un método para producir una composición de células diseñadas, comprendiendo el método cultivar, en presencia de un agente que inhibe la actividad mTOR, una composición celular diseñada que comprende células T humanas primarias enriquecidas que comprenden células T diseñadas con un receptor recombinante;

en el que el agente que inhibe la actividad mTOR es 2-(3-hidroxifenil)-9-(2-isopropilfenil)-8-oxo-8,9-dihidro-7H-purin-6-carboxamida (Compuesto 63); y

4. El método de la reivindicación 3, en el que, antes del cultivo, el método comprende además:

(a) incubar, en condiciones estimulantes, una composición de entrada que comprende células T primarias en presencia del agente que inhibe la actividad mTOR; en el que dichas condiciones estimulantes comprenden la presencia de un reactivo estimulador capaz de activar uno o más dominios de señalización intracelular de uno o más componentes de un complejo de TCR y/o uno o más dominios de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras, generando así una composición estimulada; e

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que las células T primarias son células T CD4+ y/o CD8+.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que:

(a) la composición de células T modificada comprende células T CD4+ enriquecidas; o

(b) la composición de células T modificada comprende células T CD8+ enriquecidas.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en el que el cultivo se lleva a cabo en presencia de una o más citoquinas recombinantes.

8. El método de la reivindicación 2 o 7, en el que la una o más citocinas recombinantes comprende una o más de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, G-CSF, y GM-CSF, opcionalmente en donde la una o más citocinas recombinantes comprenden una o más de IL-2, IL-7 e IL-15.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en el que, antes del cultivo, el método comprende además:

(a) incubar, en condiciones estimulantes, una composición de entrada que comprende células T primarias, comprendiendo dichas condiciones estimulantes la presencia de un estimulante reactivo capaz de activar uno o más dominios de señalización intracelular de uno o más componentes de un complejo TCR y/o uno o más dominios de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras, generando así una composición estimulada; y

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 9, en el que:

(a) la composición de entrada, la composición estimulada y/o la composición diseñada comprende células T CD4+ y/o CD8+ primarias; y/o

(b) en el que la composición de entrada, la composición estimulada y/o la composición diseñada comprende células T CD4+ enriquecidas.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 9 y 10, en el que la composición de entrada, la composición estimulada y/o la composición diseñada comprende células T CD8+ enriquecidas.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 9 y 10, en el que:

(a)

(i) la composición de entrada, la composición estimulada y/o la composición diseñada comprende más de o más de aproximadamente el 70 %, más de o más de aproximadamente el 75 %, más de o más de aproximadamente el 80 %, más de o más de aproximadamente el 85 %, más de o más de aproximadamente el 90 %, más de o más de aproximadamente el 95 % o más de o más de aproximadamente 98 % de células T humanas primarias CD4+; y/o

(ii) la composición de entrada consiste esencialmente en células T humanas primarias CD4+; y/o

(b)

(i) la composición de entrada, la composición estimulada y/o la composición diseñada comprende más de o más de aproximadamente el 70 %, más de o más de aproximadamente el 75 %, más de o más de aproximadamente el 80 %, más de o más de aproximadamente el 85 %, más de o más de aproximadamente el 90 %, más de o más de aproximadamente el 95 % o más de o más de aproximadamente el 98 % de células T humanas primarias CD8+; y/o

(ii) la composición de entrada consiste esencialmente en células T humanas primarias CD8+.

13. El método de la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que el agente que inhibe la actividad mTOR es el Compuesto 63 y la composición celular diseñada se cultiva en presencia de entre 500 nM y 2 pM, entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 250 nM, o entre 100 nM y 500 nM del Compuesto 63.

14. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el agente que inhibe la actividad mTOR es el Compuesto 63 y la composición celular diseñada se incuba en presencia de entre 500 nM y 2 pM, entre 1 nM y 100 nM, entre 50 nM y 250 nM, o entre 100 nM y 500 nM del Compuesto 63.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 9-14, en el que el reactivo estimulador comprende un agente primario que se une específicamente a un miembro de un complejo de TCR, opcionalmente en el que:

(a) el agente primario se une específicamente a CD3;

y/o

(b) el reactivo estimulador comprende además un agente secundario que se une específicamente a una molécula coestimuladora de células T, opcionalmente en donde la molécula coestimuladora se selecciona de CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 e ICOS;

y/o

(c) los agentes primarios y/o secundarios comprenden un anticuerpo, opcionalmente en donde el reactivo estimulador comprende la incubación con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos; opcionalmente en donde el agente primario y/o agente secundario están presentes en la superficie de un soporte sólido, opcionalmente en donde el soporte sólido es o comprende una perla.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 9-15, en el que la introducción comprende transducir células de la composición estimulada con un vector viral que comprende un polinucleótido que codifica el receptor recombinante; opcionalmente en donde el vector viral es un vector retroviral; opcionalmente en donde el vector viral es un vector lentiviral o un vector gammaretroviral.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-16, en el que el método comprende además recolectar células de la composición de salida; opcionalmente comprende además formular células de la composición resultante para criopreservación y/o administración a un sujeto, opcionalmente en presencia de un excipiente farmacéuticamente aceptable.

18. El método de cualquiera de 1-2 y 9-17, que comprende además aislar las células T CD4+ y/o CD8+ de una muestra biológica antes de la incubación; opcionalmente en donde la muestra biológica es o comprende una muestra de sangre completa, una muestra de capa leucocitaria, una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), una muestra de células T no fraccionadas, una muestra de linfocitos, una muestra de glóbulos blancos, un producto de aféresis o un producto de leucoféresis.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que:

(a) el receptor recombinante es capaz de unirse a un antígeno diana que está asociado, es específico y/o se expresa en una célula o tejido de una enfermedad, trastorno, o condición; opcionalmente en donde la enfermedad, trastorno o afección es una enfermedad o trastorno infeccioso, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria, un tumor o un cáncer; opcionalmente en donde el antígeno diana es un antígeno tumoral; y/o

(b) en el que el receptor recombinante es o comprende un receptor de antígeno no TCR funcional o un TCR o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y/o

(c) el receptor recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR).