ES2973251T3 - Composiciones y procedimientos relacionados con construcciones de Fc modificadas genéticamente - Google Patents

Composiciones y procedimientos relacionados con construcciones de Fc modificadas genéticamente Download PDF

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Jonathan C Lansing
Daniel Ortiz
Laura Rutitzky
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Momenta Pharmaceuticals Inc
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Abstract

La presente invención se refiere a construcciones de IgG Fc diseñadas y a sus usos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos relacionados con construcciones de Fc modificadas genéticamente
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
[0001] La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional anterior de EE. UU. en tramitación del mismo solicitante con el número de serie 62/340.322, presentada el 23 de mayo de 2016, y/o de la solicitud provisional anterior de EE. UU. en tramitación del mismo solicitante con el número de serie 62/443.451, presentada el 6 de enero de 2017.
ANTECEDENTES
[0002] Las proteínas terapéuticas, por ejemplo, anticuerpos terapéuticos y proteínas de fusión Fc, se han convertido rápidamente en una clase de fármacos clínicamente importantes para pacientes con enfermedades inmunológicas e inflamatorias, cánceres e infecciones.
[0003] El documento WO 2008/151088 se refiere a moléculas biomiméticas biológicamente activas que comprenden dominios Fc de inmunoglobulina, composiciones que comprenden dichos biomiméticos y procedimientos para usar dichos biomiméticos. El documento W<o>2015/168643 describe proteínas de fusión Fc humanas poliméricas con funciones efectoras modificadas.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0004] La presente invención da a conocer una construcción de Fc que comprende:
a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A comprende un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un espaciador de glicina; y iii) B comprende un segundo monómero de dominio Fc;
b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' comprende un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un espaciador de glicina; y iii) B' comprende un cuarto monómero de dominio Fc;
c) un tercer polipéptido que comprende un quinto monómero de dominio Fc; y
d) un cuarto polipéptido que comprende un sexto monómero de dominio Fc;
en la que
cada uno de los polipéptidos primero y segundo tiene la secuencia de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID
NO: 49),
cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto tiene la secuencia de aminoácidos:
D KTHTCP PCP APELLGG PS VFLFP PKPKDTLMIS RTP EVTC V WDVSHEDP EVK FN WYV DGVEV HNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48),
[0005] B y B' se combinan para formar un primer dominio Fc, A y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y A' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc.
[0006] La presente invención también da a conocer una composición farmacéutica que comprende una construcción de Fc de la presente invención. La presente invención también da a conocer una construcción de Fc de la presente invención para usar en un procedimiento para reducir la activación de las células inmunitarias de la respuesta inmunitaria en un sujeto, para usar en un procedimiento para tratar una enfermedad autoinmunitaria, o para usar en un procedimiento para tratar la inflamación en un sujeto.
[0007] La presente invención da a conocer además un medio de cultivo celular que comprende una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que comprende:
a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A comprende un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un espaciador de glicina; y Ni) B comprende un segundo monómero de dominio Fc;
b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' comprende un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un espaciador de glicina; y iii) B' comprende un cuarto monómero de dominio Fc;
c) un tercer polipéptido que comprende un quinto monómero de dominio Fc; y
d) un cuarto polipéptido que comprende un sexto monómero de dominio Fc;
en la que
cada uno de los polipéptidos primero y segundo tiene la secuencia de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVVTLPPCRDKLT
KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL7VDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK
PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN
GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID
NO: 49),
cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto tiene la secuencia de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT
KNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48),
y
B y B' se combinan para formar un primer dominio Fc, A y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y A' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc.
[0008] La presente invención también da a conocer un procedimiento para preparar un medio de cultivo celular que comprende una población sustancialmente homogénea de la construcción de Fc de la presente invención, comprendiendo el procedimiento:
a) proporcionar células huésped en un medio de cultivo celular, en el que las células comprenden polinucleótidos que codifican cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto de la construcción de Fc de la presente invención;
b) expresar los polipéptidos en las células huésped en condiciones que permitan la formación de la construcción de Fc y la secreción en el medio de cultivo celular; y
c) recoger el medio de cultivo celular.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0009] La información técnica expuesta a continuación puede en algunos aspectos ir más allá del alcance de la presente invención, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para ubicar la invención real en un contexto técnico más amplio e ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados.
[0010] Además, las referencias a procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y procedimientos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal no deben interpretarse como una reivindicación de protección para tales procedimientos como tales, sino que, en cambio, deben interpretarse como una referencia a productos, en particular sustancias o composiciones, para su uso en cualquiera de estos procedimientos.
[0011] La presente divulgación presenta construcciones terapéuticas que contienen dominios Fc biológicamente activos. Tales construcciones pueden tener una semivida en suero y/o afinidad de unión y/o avidez deseable por los receptores Fc.
[0012] En general, la divulgación presenta construcciones de Fc que tienen 2-10 dominios Fc, por ejemplo, construcciones de Fc que tienen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dominios Fc. En algunos casos, una construcción de Fc divulgada en el presente documento incluye 2-10 dominios Fc, 2-5 dominios Fc, 2-4 dominios Fc, 2-3 dominios Fc, 3 5 dominios Fc, 2-8 dominios Fc o 2-6 dominios Fc. En algunos casos, la construcción de Fc incluye de 2-4 dominios Fc. En algunos casos, la construcción de Fc incluye 5-10 dominios Fc (por ejemplo, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9 o 5-10 dominios Fc).
[0013] En algunos casos, las construcciones (por ejemplo, construcciones de Fc que tienen 2-4 dominios Fc, por ejemplo, 2, 3 o 4 dominios Fc) y composiciones farmacéuticas homogéneas (por ejemplo, aquellas que contienen construcciones de Fc que tienen 2-4 dominios Fc, por ejemplo, 2, 3 o 4 dominios Fc) de la divulgación son útiles, por ejemplo, para reducir la inflamación en un sujeto, para promover la eliminación de autoanticuerpos en un sujeto, para suprimir la presentación de antígenos en un sujeto, para bloquear una respuesta inmunitaria, por ejemplo, bloquear una activación basada en complejos inmunitarios de la respuesta inmunitaria en un sujeto, y para tratar enfermedades inmunológicas e inflamatorias (por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias) en un sujeto. Las construcciones de Fc descritas en el presente documento se pueden usar para tratar pacientes que padecen enfermedades inmunológicas e inflamatorias sin una estimulación significativa de las células inmunitarias. En algunos casos, las construcciones (por ejemplo, construcciones de Fc que tienen 5-10 dominios Fc, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dominios Fc) y composiciones farmacéuticas homogéneas (por ejemplo, aquellas que contienen construcciones de Fc que tienen 5 10 dominios Fc), por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dominios Fc) de la divulgación son útiles, por ejemplo, para inducir la activación de células inmunitarias de la respuesta inmunitaria en un sujeto, para aumentar la fagocitosis de una célula diana (es decir, una célula cancerosa o una célula infectada) en un sujeto, y para tratar enfermedades tales como cánceres e infecciones en un sujeto.
[0014] Las propiedades de estas construcciones permiten la generación eficiente de composiciones sustancialmente homogéneas. El grado de homogeneidad de una composición influye en la farmacocinética y el rendimiento in vivo de la composición. Dicha homogeneidad en una composición es deseable para garantizar la seguridad, eficacia, uniformidad y fiabilidad de la composición. Una construcción de Fc de la divulgación puede estar en una población o composición que es sustancialmente homogénea (por ejemplo, al menos 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % homogénea).
[0015] Tal como se describe con más detalle en el presente documento, la divulgación presenta composiciones sustancialmente homogéneas que contienen construcciones de Fc que tienen todas el mismo número de dominios Fc, así como procedimientos para preparar tales composiciones sustancialmente homogéneas.
[0016] En un primer aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un espaciador de glicina; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un espaciador de glicina; y iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un quinto monómero de dominio Fc; y d) un cuarto polipéptido que incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que B y B' se combinan para formar un primer dominio Fc, A y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y A' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc. La presente invención se refiere a una construcción de Fc tal como se define en las reivindicaciones.
[0017] En algunos casos de este aspecto, cada uno de B y B' incluye las mutaciones D399K y K409D, cada uno de A y A' incluye las mutaciones S354C, T366W y E357K, y cada uno de los monómeros de dominio Fc quinto y sexto incluye las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V y K370D.
[0018] En un segundo aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un espaciador de glicina; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un espaciador de glicina; y iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un quinto monómero de dominio Fc; y d) un cuarto polipéptido que incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que A y A' se combinan para formar un primer dominio Fc, B y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y B' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc.
[0019] En algunos casos de este aspecto, cada uno de A y A' incluye las mutaciones D399K y K409D, cada uno de B y B' incluye las mutaciones S354C, T366W y E357K, y cada uno de los monómeros de dominio Fc quinto y sexto incluye las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V y K370D.
[0020] En algunos casos de los dos aspectos anteriores de la divulgación, cada uno de L y L' incluye al menos 4, 8, 12, 14, 16, 18 o 20 glicinas. En algunos casos, cada uno de L y L' incluye 4-30, 8-30 o 12-30 glicinas. En algunos casos, cada uno de L y L' comprende, consiste en o consiste esencialmente en GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27).
[0021] En algunos casos de los dos aspectos anteriores de la divulgación, A consiste en un monómero de dominio Fc. En algunos casos, B consiste en un monómero de dominio Fc. En algunos casos, A' consiste en un monómero de dominio Fc. En algunos casos, B' consiste en un monómero de dominio Fc. En algunos casos, el tercer polipéptido consiste en un monómero de dominio Fc. En algunos casos, el cuarto polipéptido consiste en un monómero de dominio Fc.
[0022] En algunos casos, uno o más de los monómeros del dominio Fc incluyen un dominio bisagra de IgG, un dominio constante de anticuerpo C<h>2 de IgG y un dominio constante de anticuerpo C<h>3 de IgG. En algunos casos, cada uno de los monómeros del dominio Fc incluye un dominio bisagra de IgG, un dominio constante de anticuerpo Ch2 de IgG y un dominio constante de anticuerpo C<h>3 de IgG. En algunos casos, cada uno de los monómeros del dominio Fc es un monómero del dominio Fc de IgG1.
[0023] En algunos casos de los dos aspectos anteriores de la divulgación, el Asp N-terminal en uno o más de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto está mutado a Gln. En algunos casos, el Asp N-terminal en cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto está mutado a Gln.
[0024] En algunos casos, uno o más de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto carecen de una lisina C-terminal. En algunos casos, cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto carece de lisina C-terminal.
[0025] En algunos casos de los dos aspectos anteriores de la divulgación, el primer polipéptido y el segundo polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos y en los que el tercer polipéptido y el cuarto polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos.
[0026] En algunos casos del primer aspecto de la divulgación, cada uno de los polipéptidos primero y segundo tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 97 %, 99 % o un 99,5 % de identidad de secuencia) con la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPC RDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID NO: 49). En algunos casos, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT KNQVSLWCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 49). En la construcción de Fc de la presente invención, cada uno de los polipéptidos primero y segundo tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49.
[0027] En algunos casos de la divulgación, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPG
(SEQ ID NO: 49) con hasta 10 (9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras).
[0028] En algunos casos del primer aspecto de la divulgación, cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 97 %, 99 % o un 99,5 % de identidad de secuencia) con la secuencia de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVS LSCAV DG FYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTP PVLDS DGS FFLVS KLTV DKS RWQQG NVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48). En algunos casos, cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVS LSCAV DG FYPS DIAVE WESNGQPENNYKTTP PVLDS DGS FFLVS KLTV DKS RWQQG NVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48). En la construcción de Fc de la presente invención, cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.
[0029] En algunos casos de la divulgación, cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQV SLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48) con hasta 10 (9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras).
[0030] En algunos casos del primer aspecto de la divulgación, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT
KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK
PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN
GKEYKCKVSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID
NO: 49),
cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia deDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT
KNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48).
[0031] En algunos casos del primer aspecto de la divulgación, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 49), con hasta 10 (9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras) y
cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48) con hasta 10 (9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras).
[0032] En algunos casos del primer aspecto de la divulgación, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia
QKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 60), y cada uno de los polipéptidos tercer y cuarto comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia deQKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT
KNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 59).
[0033] En algunos casos del segundo aspecto de la divulgación, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste o consiste esencialmente en al menos un 95 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 97 %, un 99 % o un 99,5 % de identidad de secuencia) a la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDL7VDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK
PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN
GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL7VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPG(SEQID NO: 61).
[0034] En algunos casos, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia deDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK
PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN
GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID
NO: 61).
[0035] En algunos casos de la divulgación, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 61) con hasta 10 (9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras).
[0036] En algunos casos del segundo aspecto de la divulgación, cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 97 %, 99 % o un 99,5 % de identidad de secuencia) con la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT.
KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48). En algunos casos, cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVS LSCAV DG FYPSDIAVE WESNGQ PENNYKTTP PVLDS DGS FFLVS KLTV DKS RWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48). En algunos casos, cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVSLSCAVDGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48) con hasta 10 (9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras).
[0037] En algunos casos del segundo aspecto de la divulgación, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 61), y cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT
KNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48).
[0038] En algunos casos del segundo aspecto de la divulgación, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de
QKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 62), y cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la secuencia deQKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT
KNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWOQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 59).
[0039] En otro aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un enlazador; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un enlazador; y iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un quinto monómero de dominio Fc; y d) un cuarto polipéptido que incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que B y B' se combinan para formar un primer dominio Fc, A y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y A' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, y en la que cada uno del primer polipéptido y del segundo polipéptido comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 49 y en la que cada uno del tercer polipéptido y del cuarto polipéptido comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 48.
[0040] En otro aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un enlazador; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un enlazador; y iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un quinto monómero de dominio Fc; y d) un cuarto polipéptido que incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que A y A' se combinan para formar un primer dominio Fc, B y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y B' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, y en la que cada uno del primer polipéptido y del segundo polipéptido comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 61 y en la que el tercer polipéptido y el cuarto polipéptido cada uno comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 48.
[0041] En otro aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un espaciador de glicina; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que incluye un tercer monómero de dominio Fc; y c) un tercer polipéptido que incluye un cuarto monómero de dominio Fc; en la que el primer monómero de dominio Fc y el tercer monómero de dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc.
[0042] En algunos casos de este aspecto de la divulgación, cada uno del primer y tercer monómero de dominio Fc incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el primer monómero del dominio Fc y el tercer monómero del dominio Fc, y cada uno del segundo y cuarto monómero del dominio Fc incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el segundo monómero del dominio Fc y el cuarto monómero del dominio Fc. En algunos casos, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y segundo incluye una protuberancia modificada genéticamente, y el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc tercero y cuarto incluye una cavidad modificada genéticamente.
[0043] En algunos casos de este aspecto de la divulgación, L incluye al menos 4, 8 o 12 glicinas. En algunos casos, L incluye 4-30, 8-30 o 12-30 glicinas. En algunos casos, L comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27).
[0044] En algunos casos de este aspecto de la divulgación, uno o más de A, B, el segundo polipéptido y el tercer polipéptido consisten en un monómero de dominio Fc. En algunos casos, cada uno de A, B, el segundo polipéptido y el tercer polipéptido consiste en un monómero de dominio Fc.
[0045] En algunos casos de este aspecto de la divulgación, el Asp N-terminal en uno o más de los polipéptidos primero, segundo y tercero está mutado a Gln. En algunos casos, el Asp N-terminal en cada uno de los polipéptidos primero, segundo y tercero está mutado a Gln.
[0046] En algunos casos de este aspecto de la divulgación, uno o más de los polipéptidos primero, segundo y tercero carecen de una lisina C-terminal. En algunos casos, cada uno de los polipéptidos primero, segundo y tercero carece de una lisina C-terminal.
[0047] En algunos casos de este aspecto de la divulgación, el segundo polipéptido y el tercer polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos.
[0048] En otro aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L1 es un espaciador de glicina; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; iv) L2 es un espaciador de glicina; y v) C incluye un tercer monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en la que i) A' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; ii) L1' es un espaciador de glicina; iii) B' incluye un quinto monómero de dominio Fc; iv) L2' es un espaciador de glicina; y v) C' incluye un sexto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un séptimo monómero de dominio Fc; d) un cuarto polipéptido que incluye un octavo monómero de dominio Fc; e) un quinto polipéptido que incluye un noveno monómero de dominio Fc; yf) un sexto polipéptido que incluye un décimo monómero de dominio Fc; en la que A y el séptimo monómero del dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc, B y B' se combinan para formar un segundo dominio Fc, C y el octavo monómero del dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, A' y el noveno monómero de dominio Fc se combinan para formar un cuarto dominio Fc, y C' y el décimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un quinto dominio Fc.
[0049] En algunos casos de este aspecto de la divulgación, cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y séptimo incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el primer monómero del dominio Fc y el séptimo monómero del dominio Fc, cada uno de los monómeros del dominio Fc segundo y quinto incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el segundo monómero de dominio Fc y el quinto monómero de dominio Fc, cada uno de los monómeros de dominio Fc tercero y octavo incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el tercer monómero de dominio Fc y el octavo monómero del dominio Fc; cada uno de los monómeros de dominio Fc cuarto y noveno incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el cuarto monómero de dominio Fc y el noveno monómero de dominio Fc; y cada uno de los monómeros de dominio Fc sexto y décimo incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el sexto monómero de dominio Fc y el décimo monómero de dominio Fc.
[0050] En algunos casos, el módulo de selectividad de dimerización complementario del segundo monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga negativa, el módulo de selectividad de dimerización complementario del quinto monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga positiva, el módulo de selectividad de dimerización complementario del segundo monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga positiva, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc primero, tercero, cuarto y sexto incluye una protuberancia modificada genéticamente, y el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc séptimo, octavo, noveno y décimo incluye una cavidad modificada genéticamente.
[0051] En otro aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L1 es un espaciador de glicina; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; iv) L2 es un espaciador de glicina; y v) C incluye un tercer monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en la que i) A' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; ii) L1' es un espaciador de glicina; iii) B' incluye un quinto monómero de dominio Fc; iv) L2' es un espaciador de glicina; y v) C' incluye un sexto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un séptimo monómero de dominio Fc; d) un cuarto polipéptido que incluye un octavo monómero de dominio Fc; e) un quinto polipéptido que incluye un noveno monómero de dominio Fc; y f) un sexto polipéptido que incluye un décimo monómero de dominio Fc; en la que C y C' se combinan para formar un primer dominio Fc, B y el séptimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, A y el octavo monómero del dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, B' y el noveno monómero de dominio Fc se combinan para formar un cuarto dominio Fc, y A' y el décimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un quinto dominio Fc.
[0052] En algunos casos de este aspecto de la divulgación, cada uno de los monómeros de dominio Fc tercero y sexto incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el tercer monómero del dominio Fc y el sexto monómero del dominio Fc, cada uno del monómero de dominio Fc segundo y séptimo incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el segundo monómero de dominio Fc y el séptimo monómero de dominio Fc, cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y octavo incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el octavo monómero de dominio Fc uno de los monómeros de dominio Fc quinto y noveno incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el quinto monómero de dominio Fc y el noveno monómero de dominio Fc; y cada uno de los monómeros de dominio Fc cuarto y décimo incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el cuarto monómero del dominio Fc y el décimo monómero del dominio Fc.
[0053] En algunos casos, el módulo de selectividad de dimerización complementario del tercer monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga negativa, el módulo de selectividad de dimerización complementario del sexto monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga positiva, el módulo de selectividad de dimerización complementario del tercer monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga positiva, el módulo de selectividad de cada uno de los monómeros de dominio Fc primero, segundo, cuarto y quinto incluye una protuberancia modificada genéticamente, y el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc séptimo, octavo, noveno y décimo incluye una cavidad modificada genéticamente.
[0054] En otro aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L1 es un espaciador de glicina; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; iv) L2 es un espaciador de glicina; y v) C incluye un tercer monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en la que i) A' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; ii) L1' es un espaciador de glicina; iii) B' incluye un quinto monómero de dominio Fc; iv) L2' es un espaciador de glicina; y v) C' incluye un sexto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un séptimo monómero de dominio Fc; d) un cuarto polipéptido que incluye un octavo monómero de dominio Fc; e) un quinto polipéptido que incluye un noveno monómero de dominio Fc; y f) un sexto polipéptido que incluye un décimo monómero de dominio Fc; en la que A y A' se combinan para formar un primer dominio Fc, B y el séptimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, C y el octavo monómero del dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, B' y el noveno monómero del dominio Fc se combinan para formar un cuarto dominio Fc, y C' y el décimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un quinto dominio Fc.
[0055] En algunos casos de este aspecto de la divulgación, cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y cuarto incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc, cada uno de los monómeros de dominio Fc segundo y séptimo incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el segundo monómero de dominio Fc y el séptimo monómero de dominio Fc, cada uno de los monómeros de dominio Fc tercero y octavo incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el tercer monómero de dominio Fc y el octavo monómero de dominio Fc; cada uno de los monómeros de dominio Fc quinto y noveno incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el quinto monómero de dominio Fc y el noveno monómero de dominio Fc; y cada uno de los monómeros de dominio Fc sexto y décimo incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el sexto monómero de dominio Fc y el décimo monómero de dominio Fc.
[0056] En algunos casos, el módulo de selectividad de dimerización complementario del primer monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga negativa, el módulo de selectividad de dimerización complementario del cuarto monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga positiva, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc segundo, tercero, quinto y sexto incluye una protuberancia modificada genéticamente, y el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc séptimo, octavo, noveno y décimo incluye una cavidad modificada genéticamente.
[0057] En algunos casos de construcciones de Fc que tienen cinco dominios Fc, tal como se describe en el presente documento, cada uno de L1, L2, L1' y L2' incluye al menos 4, 8 o 12 glicinas. En algunos casos, cada uno de L1, L2, L1' y L2' incluye 4-30, 8-30 o 12-30 glicinas. En algunos casos, cada uno de L1, L2, L1' y L2' comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27).
[0058] En algunos casos de construcciones de Fc que tienen cinco dominios Fc, tal como se describe en el presente documento, cada uno de A, B, C, A', B', C', el tercer polipéptido, el cuarto polipéptido, el quinto polipéptido y los seis polipéptidos consisten en un monómero de dominio Fc.
[0059] En algunos casos de construcciones de Fc que tienen cinco dominios Fc, tal como se describe en el presente documento, el Asp N-terminal en uno o más de los polipéptidos primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto está mutado a Gln. En algunos casos, el Asp N-terminal en cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto está mutado a Gln.
[0060] En algunos casos, uno o más de los polipéptidos primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto carecen de una lisina C-terminal. En algunos casos, cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto carece de una lisina C-terminal.
[0061] En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos, y los polipéptidos tercero, cuarto, quinto y sexto tienen la misma secuencia de aminoácidos.
[0062] En otro aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L1 es un enlazador; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; iv) L2 es un espaciador de glicina; v) C incluye un tercer monómero de dominio Fc; y b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en la que i) A' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; ii) L1' es un enlazador; iii) B' incluye un quinto monómero de dominio Fc; iv) L2' es un espaciador de glicina; v) C' incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc, el cuarto monómero de dominio Fc y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y el tercer monómero de dominio Fc y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc.
[0063] En algunos casos de este aspecto de la divulgación, cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y segundo incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc, cada uno de los monómeros de dominio Fc cuarto y quinto incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el cuarto monómero de dominio Fc y el quinto monómero de dominio Fc, y cada uno de los monómeros de dominio Fc tercero y sexto incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el tercer monómero de dominio Fc y el sexto monómero de dominio Fc.
[0064] En algunos casos, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y cuarto incluye una protuberancia modificada genéticamente, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc segundo y quinto incluye una cavidad modificada genéticamente, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc segundo y quinto incluye una cavidad modificada genéticamente, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc segundo y quinto incluye una cavidad modificada genéticamente, el módulo de selectividad de dimerización complementario del tercer monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga negativa, y el módulo de selectividad de dimerización complementario del sexto monómero del dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga positiva.
[0065] En algunos casos de este aspecto de la divulgación, cada uno de L2 y L2' incluye al menos 12 glicinas. En algunos casos, cada uno de L2 y<l>2' incluye 4-30, 8-30 o 12-30 glicinas. En algunos casos, cada uno de L2 y L2' comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27).
[0066] En algunos casos de este aspecto de la divulgación, cada uno de A, B, C, A', B' y C' consiste en un monómero de dominio Fc.
[0067] En algunos casos de este aspecto de la divulgación, el primer polipéptido y el segundo polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos.
[0068] En otro aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un enlazador; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un enlazador; iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; en la que el primer monómero de dominio Fc y el tercer monómero de dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc, y el segundo monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y en la que al menos uno de L y L' es un espaciador de glicina.
[0069] En algunos casos de este aspecto, cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y tercero incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero del dominio Fc y el tercer monómero del dominio Fc, y cada uno de los monómeros de dominio Fc segundo y cuarto incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el segundo monómero del dominio Fc y el cuarto monómero del dominio Fc.
[0070] En algunos casos de este aspecto, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y segundo incluye una protuberancia modificada genéticamente, y el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc tercero y cuarto incluye una cavidad modificada genéticamente .
[0071] En algunos casos de este aspecto, al menos uno de L y L' incluye al menos 4, 8 o 12 glicinas. En algunos casos, al menos uno de L y L' incluye 4-30, 8-30 o 12-30 glicinas. En algunos casos, al menos uno de L y L' comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27). En algunos casos de este aspecto, cada uno de L y L' incluye al menos 4, 8 o 12 glicinas. En algunos casos, cada uno de L y L' incluye 4-30, 8-30 o 12-30 glicinas. En algunos casos, cada uno de L y L' comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27).
[0072] En algunos casos de este aspecto, uno o más de A, B, A' y B' consisten en un monómero de dominio Fc. En algunos casos de este aspecto, cada uno de A, B, A' y B' consiste en un monómero de dominio Fc.
[0073] En algunos casos de los dos aspectos anteriores de la divulgación, el Asp N-terminal en uno o más de los polipéptidos primero y segundo está mutado a Gln. En algunos casos, el Asp N-terminal en cada uno de los polipéptidos primero y segundo está mutado a Gln.
[0074] En algunos casos de los dos aspectos anteriores de la divulgación, uno o más de los polipéptidos primero y segundos carecen de una lisina C-terminal. En algunos casos, cada uno de los polipéptidos primero y segundo carece de una lisina C-terminal.
[0075] En algunos casos, cada uno de los monómeros del dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento incluye un dominio bisagra de IgG, un dominio constante del anticuerpo C<h>2 de IgG y un dominio constante del anticuerpo 3de IgG. En algunos casos, cada uno de los monómeros del dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento es un monómero de dominio Fc de IgG1.
[0076] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un espaciador de glicina; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un espaciador de glicina; y iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un quinto monómero de dominio Fc; y d) un cuarto polipéptido que incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que B y B' se combinan para formar un primer dominio Fc, A y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y A' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc.
[0077] En algunos casos de este aspecto, cada uno de B y B' incluye las mutaciones D399K y K409D, cada uno de A y A' incluye las mutaciones S354C, T366W y E357K, y cada uno de los monómeros de dominio Fc quinto y sexto incluye las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V y K370D.
[0078] En algunos casos de este aspecto, el primer polipéptido y el segundo polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos y en la que el tercer polipéptido y el cuarto polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos en la construcción de Fc de la composición.
[0079] En algunos casos, cada uno de los polipéptidos primero y segundo tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 97 %, 99 %, o 99,5 % de identidad de secuencia) con la secuencia de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 49). En algunos casos, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT KNQVSLWCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 49). En algunos casos, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT KNQVSLWCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 49) con hasta 10 (9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras).
[0080] En algunos casos, cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 97 %, 99 % o un 99,5 % de identidad de secuencia) con la secuencia de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO : 48). En algunos casos, cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVSLSCAVDGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48). En algunos casos de la divulgación, cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVS LSCAV DG FYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTP PVLDS DGS FFLVS KLTV DKS RWQQG NVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48) con hasta a 10 (9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras).
[0081] En algunos casos de este aspecto, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 49), y cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto en la construcción de Fc en la composición comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVS LSCA V DG FYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTP PVLDS DGS FFLVS KLTV DKS RWQQG NVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48). En algunos casos, la construcción de Fc comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 49) con hasta 10 (9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras), y cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto en la construcción de Fc en la composición comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPS RDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48) con hasta 10 (9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras). En algunos casos, cualquiera de las construcciones de Fc descritas en el presente documento tiene actividad antiinflamatoria.
[0082] En algunos casos de cualquiera de las construcciones de Fc descritas en el presente documento, uno o más de los monómeros del dominio Fc es un monómero del dominio Fc de IgG (por ejemplo, una IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgG4). En algunos casos, uno o más de los monómeros del dominio Fc es un monómero del dominio Fc de IgG que tiene hasta diez modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones de aminoácidos). En algunos casos, cada monómero del dominio Fc tiene no más de diez modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones de aminoácidos).
[0083] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un espaciador de glicina; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un espaciador de glicina; y iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un quinto monómero de dominio Fc; y d) un cuarto polipéptido que incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que A y A' se combinan para formar un primer dominio Fc, B y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y B' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc.
[0084] En algunos casos de este aspecto, cada uno de A y A' incluye las mutaciones D399K y K409D, cada uno de B y B' incluye las mutaciones S354C, T366W y E357K, y cada uno de los monómeros de dominio Fc quinto y sexto incluye las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V y K370D.
[0085] En algunos casos de este aspecto, el primer polipéptido y el segundo polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos y en la que el tercer polipéptido y el cuarto polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos en la construcción de Fc de la composición. En algunos casos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos (por ejemplo, SEQ ID NO: 49) y en la que el tercer polipéptido y el cuarto polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos (por ejemplo, SEQ iD NO: 48) en la construcción de Fc de la composición.
[0086] En algunos casos de este aspecto, cada uno de los polipéptidos primero y segundo tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 97 %, un 99 % o un 99,5 % de identidad de secuencia) con la secuencia de DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 61). En algunos casos, cada uno de los polipéptidos primero y segundo comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia deDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK
PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN
GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID
NO: 61).
[0087] En algunos casos de este aspecto, cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 97 %, 99 % o un 99,5 % de identidad de secuencia) con la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVS LSCAV DG FYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTP PVLDS DGS FFLVS KLTV DKS RWQQG NVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48). En algunos casos, cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia deDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTVRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT
KNQVSLSCAVDG FYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV DKS RWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48).
[0088] En algunos casos de este aspecto, cada uno de los polipéptidos primero y segundo en la construcción de Fc en la composición comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 61), y cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto en la construcción de Fc en la composición comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia deDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT
KNQVSLSCAVDG FYPSDIA VE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV DKS RWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48).
[0089] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un enlazador; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un enlazador; y iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un quinto monómero de dominio Fc; y d) un cuarto polipéptido que incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que B y B' se combinan para formar un primer dominio Fc, A y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y A' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, y en la que cada uno del primer polipéptido y el segundo polipéptido comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 49 y en la que cada uno del tercer polipéptido y el cuarto polipéptido comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 48.
[0090] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un enlazador; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un enlazador; y iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un quinto monómero de dominio Fc; y d) un cuarto polipéptido que incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que A y A' se combinan para formar un primer dominio Fc, B' y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y B' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, y en la que cada uno del primer polipéptido y el segundo polipéptido comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 61 y en la que cada uno del tercer polipéptido y el cuarto polipéptido comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 48.
[0091] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un espaciador de glicina; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que incluye un tercer monómero de dominio Fc; y c) un tercer polipéptido que incluye un cuarto monómero de dominio Fc; en el que el primer monómero de dominio Fc y el tercer monómero de dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc.
[0092] En algunos casos de este aspecto, cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y tercero en la construcción de Fc en la composición incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el primer monómero del dominio Fc y el tercer monómero del dominio Fc, y cada uno de los monómeros de dominio Fc segundo y cuarto en la construcción de Fc en la composición incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el segundo monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc.
[0093] En algunos casos de este aspecto, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y segundo incluye una protuberancia modificada genéticamente, y el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc tercero y cuarto incluye una cavidad modificada genéticamente.
[0094] En algunos casos de este aspecto, el segundo polipéptido y el tercer polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos.
[0095] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L1 es un espaciador de glicina; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; iv) L2 es un espaciador de glicina; y v) C incluye un tercer monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en la que i) A' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; ii) L1' es un espaciador de glicina; iii) B' incluye un quinto monómero de dominio Fc; iv) L2' es un espaciador de glicina; y v) C' incluye un sexto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un séptimo monómero de dominio Fc; d) un cuarto polipéptido que incluye un octavo monómero de dominio Fc; e) un quinto polipéptido que incluye un noveno monómero de dominio Fc; y f) un sexto polipéptido que incluye un décimo monómero de dominio Fc; en la que A y el séptimo monómero del dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc, B y B' se combinan para formar un segundo dominio Fc, C y el octavo monómero del dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, A' y el noveno monómero de dominio Fc se combinan para formar un cuarto dominio Fc, y C' y el décimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un quinto dominio Fc.
[0096] En algunos casos de este aspecto, cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y séptimo en la construcción de Fc en la composición incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el primer monómero del dominio Fc y el séptimo monómero del dominio Fc; cada uno de los monómeros de dominio Fc segundo y quinto en la construcción de Fc en la composición incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el segundo monómero de dominio Fc y el quinto monómero de dominio Fc; cada uno de los monómeros de dominio Fc tercero y octavo en la construcción de Fc de la composición incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el tercer monómero de dominio Fc y el octavo monómero de dominio Fc; cada uno de los monómeros de dominio Fc cuarto y noveno en la construcción de Fc en la composición incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el cuarto monómero del dominio Fc y el noveno monómero de dominio Fc; y cada uno de los monómeros de dominio Fc sexto y décimo en la construcción de Fc en la composición incluye un módulo de selectividad de dimerización complementario que promueve la dimerización entre el sexto monómero de dominio Fc y el décimo monómero de dominio Fc.
[0097] En algunos casos de este aspecto, el módulo de selectividad de dimerización complementario del segundo monómero del dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga negativa, el módulo de selectividad de dimerización complementario del quinto monómero del dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga positiva, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc primero, tercero, cuarto y sexto incluye una protuberancia modificada genéticamente, y el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc séptimo, octavo, noveno y décimo incluye una cavidad modificada genéticamente.
[0098] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L1 es un espaciador de glicina; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; iv) L2 es un espaciador de glicina; yv) C incluye un tercer monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en la que i) A' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; ii) L1' es un espaciador de glicina; iii) B' incluye un quinto monómero de dominio Fc; iv) L2' es un espaciador de glicina; y v) C' incluye un sexto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un séptimo monómero de dominio Fc; d) un cuarto polipéptido que incluye un octavo monómero de dominio Fc; e) un quinto polipéptido que incluye un noveno monómero de dominio Fc; yf) un sexto polipéptido que incluye un décimo monómero de dominio Fc; en la que C y C' se combinan para formar un primer dominio Fc, B y el séptimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, A y el octavo monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, B' y el noveno dominio Fc El monómero se combina para formar un cuarto dominio Fc, y A' y el décimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un quinto dominio Fc.
[0099] En algunos casos de este aspecto, cada uno de los monómeros de dominio Fc tercero y sexto en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el tercer monómero de dominio Fc y el sexto monómero de dominio Fc; cada uno de los monómeros de dominio Fc segundo y séptimo en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el segundo monómero de dominio Fc y el séptimo monómero de dominio Fc; cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y octavo en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el octavo monómero de dominio Fc; cada uno de los monómeros de dominio Fc quinto y noveno en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el quinto monómero de dominio Fc y el noveno monómero de dominio Fc; y cada uno de los monómeros de dominio Fc cuarto y décimo en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el cuarto monómero del dominio Fc y el décimo monómero del dominio Fc.
[0100] En algunos casos de este aspecto, el módulo de selectividad de dimerización complementario del tercer monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga negativa, el módulo de selectividad de dimerización complementario del sexto monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga positiva, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc primero, segundo, cuarto y quinto incluye una protuberancia modificada genéticamente, y el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc séptimo, octavo, noveno y décimo incluye una cavidad modificada genéticamente.
[0101] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L1 es un espaciador de glicina; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; iv) L2 es un espaciador de glicina; y v) C incluye un tercer monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en la que i) A' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; ii) L1' es un espaciador de glicina; iii) B' incluye un quinto monómero de dominio Fc; iv) L2' es un espaciador de glicina; y v) C' incluye un sexto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un séptimo monómero de dominio Fc; d) un cuarto polipéptido que incluye un octavo monómero de dominio Fc; e) un quinto polipéptido que incluye un noveno monómero de dominio Fc; y f) un sexto polipéptido que incluye un décimo monómero de dominio Fc; en la que A y A' se combinan para formar un primer dominio Fc, B y el séptimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, C y el octavo monómero del dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, B' y el noveno monómero del dominio Fc se combinan para formar un cuarto dominio Fc, y C' y el décimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un quinto dominio Fc.
[0102] En algunos casos de este aspecto, cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y cuarto en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc; cada uno de los monómeros de dominio Fc segundo y séptimo en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el segundo monómero de dominio Fc y el séptimo monómero de dominio Fc; cada uno de los monómeros de dominio Fc tercero y octavo en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el tercer monómero de dominio Fc y el octavo monómero de dominio Fc; cada uno de los monómeros de dominio Fc quinto y noveno en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el quinto monómero de dominio Fc y el noveno monómero de dominio Fc; y cada uno de los monómeros de dominio Fc sexto y décimo en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el sexto monómero de dominio Fc y el décimo monómero de dominio Fc.
[0103] En algunos casos de este aspecto, el módulo de selectividad de dimerización complementario del primer monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga negativa, el módulo de selectividad de dimerización complementario del cuarto monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga positiva, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc segundo, tercero, quinto y sexto incluye una protuberancia modificada genéticamente, y el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc séptimo, octavo, noveno y décimo incluye una cavidad modificada genéticamente.
[0104] En algunos casos de la composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que tiene cinco dominios Fc descritos en el presente documento, el primer polipéptido y el segundo polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos, y los polipéptidos tercero, cuarto, quinto y sexto tienen la misma secuencia de aminoácidos.
[0105] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L1 es un enlazador; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; iv) L2 es un espaciador de glicina; v) C incluye un tercer monómero de dominio Fc; y b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en la que i) A' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; ii) L1' es un enlazador; iii) B' incluye un quinto monómero de dominio Fc; iv) L2' es un espaciador de glicina; v) C' incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc, el cuarto monómero de dominio Fc y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y el tercer monómero de dominio Fc y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc.
[0106] En algunos casos de este aspecto, cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y segundo en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc; cada uno de los monómeros de dominio Fc cuarto y quinto en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el cuarto monómero de dominio Fc y el quinto monómero de dominio Fc; y cada uno de los monómeros de dominio Fc tercero y sexto en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el tercer monómero de dominio Fc y el sexto monómero de dominio Fc.
[0107] En algunos casos de este aspecto, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y cuarto incluye una protuberancia modificada genéticamente, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc segundo y quinto incluye una cavidad modificada genéticamente, el módulo de selectividad de dimerización complementario del tercer monómero del dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga negativa, y el módulo de selectividad de dimerización complementario del sexto monómero del dominio Fc incluye una sustitución de aminoácidos con carga positiva.
[0108] En algunos casos de este aspecto, el primer polipéptido y el segundo polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos.
[0109] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un enlazador; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un enlazador; iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; en la que el primer monómero de dominio Fc y el tercer monómero de dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc, y el segundo monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y en la que al menos uno de L y L' es un espaciador de glicina.
[0110] En algunos casos de este aspecto, cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y tercero en la construcción de Fc en la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el tercer monómero de dominio Fc, y cada uno de los monómeros de dominio Fc segundo y cuarto en la construcción de Fc de la composición incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el segundo monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc.
[0111] En algunos casos de este aspecto, el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc primero y segundo en la construcción de Fc en la composición incluye una protuberancia modificada genéticamente, y el módulo de selectividad de dimerización complementario de cada uno de los monómeros de dominio Fc tercero y cuarto en la construcción de Fc de la composición incluye una cavidad modificada genéticamente.
[0112] En algunos casos de este aspecto, al menos uno de L y L' en la construcción de Fc en la composición incluye al menos 4, 8 o 12 glicinas. En algunos casos, al menos uno de L y L' incluye 4-30, 8-30 o 12-30 glicinas. En algunos casos, al menos uno de L y L' comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27). En algunos casos de este aspecto, cada uno de L y L' en la construcción de Fc de la composición incluye al menos 4, 8 o 12 glicinas. En algunos casos, cada uno de L y L' incluye 4-30, 8-30 o 12-30 glicinas. En algunos casos, cada uno de L y L' comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27).
[0113] En algunos casos de este aspecto, uno o más de A, B, A' y B' en la construcción de Fc en la composición consiste en un monómero de dominio Fc. En algunos casos de este aspecto, cada uno de A, B, A' y B' consiste en un monómero de dominio Fc.
[0114] En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, uno o más de L, L', L1, L2, L1' y L2' en la construcción de Fc en la composición incluye al menos 4, 8 o 12 glicinas. En algunos casos, cada uno de L, L', L1, L2, L1' y L2' incluye al menos 4, 8 o 12 glicinas.
[0115] En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, uno o más de L, L', L1, L2, L1' y L2' en la construcción de Fc en la composición incluye 4-30, 8-30 o 12-30 glicinas. En algunos casos, cada uno de L, L', L1, L2, L1' y L2' incluye 4 30, 8-30 o 12-30 glicinas.
[0116] En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, uno o más de L, L', L1, L2, L1' y L2' en la construcción de Fc en la composición comprende, consiste en, o consiste esencialmente en, la secuencia de GGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27). En algunos casos, cada uno de L, L', L1, L2, L1' y L2' comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27).
[0117] En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, uno o más de A, B, C, A', B', C', el segundo polipéptido, el tercer polipéptido, el cuarto polipéptido, el quinto polipéptido y el sexto polipéptido en la construcción de Fc de la composición consisten en un monómero de dominio Fc. En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, cada uno de A, B, C, A', B', C', el segundo polipéptido, el tercer polipéptido, el cuarto polipéptido, el quinto polipéptido y el sexto polipéptido consisten en un monómero de dominio Fc.
[0118] En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, uno o más de los monómeros de dominio Fc en la construcción de Fc de la composición incluye un dominio bisagra de IgG, un dominio constante de anticuerpo Ch2 de IgG, y un dominio constante del anticuerpo Ch3 de IgG. En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, cada uno de los monómeros del dominio Fc incluye un dominio bisagra de IgG, un dominio constante de anticuerpo C<h>2 de IgG y un dominio constante de anticuerpo Ch3 de IgG.
[0119] En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, uno o más de los monómeros de dominio Fc en la construcción de Fc de la composición es un monómero de dominio Fc de IgG1. En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, cada uno de los monómeros del dominio Fc es un monómero de dominio Fc de IgG1.
[0120] En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, el Asp N-terminal en uno o más de los polipéptidos en la construcción de Fc en la composición está mutado a Gln. En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, el Asp N-terminal en cada uno de los polipéptidos en la construcción de Fc de la composición está mutado a Gln.
[0121] En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, uno o más de los polipéptidos en la construcción de Fc de la composición carece de una lisina C-terminal. En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, cada uno de los polipéptidos en la construcción de Fc de la composición carece de una lisina C-terminal.
[0122] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un enlazador; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un enlazador; y iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un quinto monómero de dominio Fc; y d) un cuarto polipéptido que incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que B y B' se combinan para formar un primer dominio Fc, A y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y A' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, y en la que cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto carece de lisina C-terminal.
[0123] En otro aspecto, la divulgación presenta una célula huésped que expresa dos polinucleótidos que carecen ambos del codón de lisina C-terminal, en la que el primer polinucleótido codifica cada uno de los polipéptidos primero y segundo del aspecto anterior de la divulgación y el segundo polinucleótido codifica cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto del aspecto anterior de la divulgación.
[0124] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un enlazador; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que incluye un tercer monómero de dominio Fc; y c) un tercer polipéptido que incluye un cuarto monómero de dominio Fc; en la que el primer monómero de dominio Fc y el tercer monómero de dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc, y el segundo monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y en la que cada uno de los polipéptidos primero, segundo y tercero carecen de lisina C-terminal.
[0125] En otro aspecto, la divulgación presenta una célula huésped que expresa dos polinucleótidos que carecen ambos del codón de lisina C-terminal, en la que el primer polinucleótido codifica el primer polipéptido del aspecto anterior de la divulgación y el segundo polinucleótido codifica cada uno de los polipéptidos segundo y tercero del aspecto anterior de la divulgación.
[0126] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L1 es un enlazador; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; iv) L2 es un enlazador; y v) C incluye un tercer monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en la que i) A' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; ii) L1' es un enlazador; iii) B' incluye un quinto monómero de dominio Fc; iv)<l>2' es un enlazador; y v) C' incluye un sexto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un séptimo monómero de dominio Fc; d) un cuarto polipéptido que incluye un octavo monómero de dominio Fc; e) un quinto polipéptido que incluye un noveno monómero de dominio Fc; y f) un sexto polipéptido que incluye un décimo monómero de dominio Fc; en la que A y el séptimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc, B y B' se combinan para formar un segundo dominio Fc, C y el octavo monómero del dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, A' y el noveno monómero de dominio Fc se combinan para formar un cuarto dominio Fc, y C' y el décimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un quinto dominio Fc, y en el que cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto carece de una lisina C-terminal.
[0127] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L1 es un enlazador; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; iv) L2 es un enlazador; y v) C incluye un tercer monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en la que i) A' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; ii) L1' es un enlazador; iii) B' incluye un quinto monómero de dominio Fc; iv)<l>2' es un enlazador; y v) C' incluye un sexto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un séptimo monómero de dominio Fc; d) un cuarto polipéptido que incluye un octavo monómero de dominio Fc; e) un quinto polipéptido que incluye un noveno monómero de dominio Fc; y f) un sexto polipéptido que incluye un décimo monómero de dominio Fc; en la que C y C' se combinan para formar un primer dominio Fc, B y el séptimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, A y el octavo monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, B' y el noveno monómero de dominio Fc se combinan para formar un cuarto dominio Fc, y A' y el décimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un quinto dominio Fc, en el que cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto carece de lisina C-terminal.
[0128] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L1 es un enlazador; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; iv) L2 es un enlazador; y v) C incluye un tercer monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en la que i) A' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; ii) L1' es un enlazador; iii) B' incluye un quinto monómero de dominio Fc; iv) l2' es un enlazador; y v) C' incluye un sexto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un séptimo monómero de dominio Fc; d) un cuarto polipéptido que incluye un octavo monómero de dominio Fc; e) un quinto polipéptido que incluye un noveno monómero de dominio Fc; y f) un sexto polipéptido que incluye un décimo monómero de dominio Fc; en la que A y A' se combinan para formar un primer dominio Fc, B y el séptimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, C y el octavo monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, B' y el noveno monómero de dominio Fc se combinan para formar un cuarto dominio Fc, y C' y el décimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un quinto dominio Fc, en la que cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto carece de lisina C-terminal.
[0129] En otro aspecto, la divulgación presenta una célula huésped que expresa dos polinucleótidos que carecen ambos del codón de lisina C-terminal, en la que el primer polinucleótido codifica cada uno de los polipéptidos primero y segundo de cualquiera de los tres aspectos anteriores de la divulgación, y el segundo polinucleótido codifica cada uno de los polipéptidos tercero, cuarto, quinto y sexto de cualquiera de los tres aspectos anteriores de la divulgación.
[0130] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L1 es un enlazador; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; iv) L2 es un enlazador; v) C incluye un tercer monómero de dominio Fc; y b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en la que i) A' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; ii) L1' es un enlazador; iii) B' incluye un quinto monómero de dominio Fc; iv) L2' es un enlazador; v) C' incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc, el cuarto monómero de dominio Fc y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y el tercer monómero de dominio Fc y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, en la que cada uno de los polipéptidos primero y segundo carece de una lisina C-terminal.
[0131] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un enlazador; iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un enlazador; iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; en la que el primer monómero de dominio Fc y el tercer monómero del dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc, y el segundo monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y en la que cada uno de los polipéptidos primero y segundo carece de una lisina C-terminal.
[0132] En otro aspecto, la divulgación presenta una célula huésped que expresa un polinucleótido que carece del codón de lisina C-terminal, en la que el polinucleótido codifica cada uno de los polipéptidos primero y segundo de cualquiera de los dos aspectos anteriores de la divulgación.
[0133] En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para preparar una construcción de Fc descrita en el presente documento. El procedimiento incluye: a) proporcionar una célula huésped que incluye polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la divulgación; b) expresar los polipéptidos en la célula huésped en condiciones que permitan la formación de la construcción de Fc; y c) recuperar la construcción de Fc.
[0134] En otro aspecto, la divulgación presenta una célula huésped que expresa una construcción de Fc descrita en el presente documento. La célula huésped incluye polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la divulgación, en la que los polinucleótidos se expresan en la célula huésped.
[0135] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición farmacéutica que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) o una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) y uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones farmacéuticas pueden producirse sin agregación sustancial o multimerización no deseada de construcciones de Fc.
[0136] En otro aspecto, la divulgación se refiere a reducir la activación de las células inmunitarias de la respuesta inmunitaria en un sujeto, que incluye administrar al sujeto una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) o una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc). Por consiguiente, la presente invención da a conocer una construcción de Fc de la presente invención para su uso en un procedimiento para reducir la activación de las células inmunitarias de la respuesta inmunitaria en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar dicha construcción de Fc al sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria.
[0137] En otro aspecto, la divulgación se refiere al tratamiento de la inflamación o una enfermedad inflamatoria en un sujeto, que incluye administrar al sujeto una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) o una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc). Por consiguiente, la presente invención da a conocer una construcción de Fc de la presente invención para su uso en un procedimiento para tratar la inflamación en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar dicha construcción de Fc al sujeto.
[0138] En otro aspecto, la divulgación se refiere a promover la eliminación de autoanticuerpos y/o suprimir la presentación de antígenos en un sujeto, que incluye administrar al sujeto una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) o una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc).
[0139] En algunas realizaciones, entre slas enfermedades de ejemplo que pueden tratarse mediante la administración de una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) e incluyen: artritis reumatoide (AR); lupus eritematoso sistémico (LES); vasculitis asociada a ANCA; síndrome de anticuerpos antifosfolípidos; anemia hemolítica autoinmunitaria; neuropatía desmielinizante inflamatoria crónica; eliminación de anti-alo en trasplante, “anti-self” en EICH (enfermedad de injerto contra huésped), anti-reemplazo, agentes terapéuticos de IgG, paraproteínas IgG; dermatomiositis; síndrome de Goodpasture; síndromes de hipersensibilidad tipo II dirigidos a sistemas orgánicos mediados por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, por ejemplo, síndrome de Guillain Barré, PDIC, dermatomiositis, síndrome de Felty, rechazo mediado por anticuerpos, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, colitis ulcerosa, enfermedad hepática autoinmunitaria; púrpura trombocitopenia idiopática; Miastenia gravis, neuromielitis óptica; pénfigo y otros trastornos ampollosos autoinmunitarios; Síndrome de Sjogren; citopenias autoinmunitarias y otros trastornos mediados por fagocitosis dependiente de anticuerpos; otros síndromes inflamatorios dependientes de FcR, por ejemplo, sinovitis, dermatomiositis, vasculitis sistémica, glomerulitis y vasculitis.
[0140] En otro aspecto, la divulgación presenta un medio de cultivo celular que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un espaciador de glicina; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un espaciador de glicina; y iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un quinto monómero de dominio Fc; y d) un cuarto polipéptido que incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que cada uno de los polipéptidos primero y segundo tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 49), cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPS RD E LTKNQVS LSCAV DGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTP PVLDS DGS FFLVS KLTV DKS RWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48), B y B' se combinan para formar un primer dominio Fc, A y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y A' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, cada uno de B y B' incluye las mutaciones D399K y K409D, cada uno de A y A' incluye las mutaciones S354C, T366W y E357K, y cada uno de los monómeros de dominio Fc quinto y sexto incluye las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V y<k>370D, cada uno de L y L' incluye 12-30 glicinas, y cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto carece de una lisina C-terminal.
[0141] La presente invención da a conocer un medio de cultivo celular que comprende una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que comprende: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A comprende un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un espaciador de glicina; y iii) B comprende un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' comprende un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un espaciador de glicina; y iii) B' comprende un cuarto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que comprende un quinto monómero de dominio Fc; y d) un cuarto polipéptido que comprende un sexto monómero de dominio Fc; en la que cada uno de los polipéptidos primero y segundo tiene la secuencia de aminoácidos: DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLT KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 49), cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto tiene la secuencia de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT KNQVS LSCAV DG FYPSDIAVE WESNGQ PENNYKTTP PVLDS DGS FFLVS KLTV DKS RWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48), y B y B' se combinan para formar un primer dominio Fc, A y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y A' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc.
[0142] En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para preparar un medio de cultivo celular que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, la construcción de Fc del primer aspecto de la divulgación). La presente invención también da a conocer un procedimiento para preparar un medio de cultivo celular que comprende una población sustancialmente homogénea de la construcción de Fc de la presente invención. El procedimiento de la divulgación o invención incluye: a) proporcionar células huésped en un medio de cultivo celular, en el que las células incluyen polinucleótidos que codifican cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto de una construcción de Fc (por ejemplo, la construcción de Fc del primer aspecto de la divulgación o la construcción de Fc de la presente invención); b) expresar los polipéptidos en las células huésped en condiciones que permitan la formación de la construcción de Fc y la secreción en el medio de cultivo celular; y c) recoger el medio de cultivo celular.
[0143] Además, la divulgación también presenta otro medio de cultivo celular que incluye una población sustancialmente homogénea de otras construcciones de Fc de la divulgación y procedimientos para preparar dicho medio de cultivo celular.
[0144] En algunas realizaciones, las construcciones de Fc descritas en el presente documento no incluyen una región de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, un dominio variable o una región determinante de complementariedad (CDR). En algunas realizaciones, la construcción de Fc (o un dominio Fc dentro de una construcción de Fc) se forma total o parcialmente mediante la asociación de monómeros del dominio Fc que están presentes en diferentes polipéptidos. En algunas realizaciones, las construcciones de Fc descritas en el presente documento incluyen una región de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, un dominio variable o una CDR. En determinadas realizaciones, la construcción de Fc no incluye un dominio adicional (por ejemplo, una “tailpiece” de IgM o una “tailpiece” de IgA) que promueva la asociación de dos polipéptidos. En otras realizaciones, los enlaces covalentes están presentes en la construcción de Fc solo entre dos monómeros de dominio Fc que se unen para formar un dominio Fc. En otras realizaciones, la construcción de Fc no incluye enlaces covalentes entre dominios Fc. En aún otras realizaciones, la construcción de Fc proporciona suficiente flexibilidad estructural de modo que todos o sustancialmente todos los dominios Fc en la construcción de Fc sean capaces de interactuar de manera simultánea con un receptor de Fc en una superficie celular. En una realización, los monómeros de dominio son diferentes en la secuencia primaria del tipo salvaje o entre sí en que tienen módulos de selectividad de dimerización.
[0145] Los monómeros de dominio Fc de un dominio Fc de la construcción pueden tener la misma secuencia de aminoácidos primaria. Por ejemplo, ambos monómeros de dominio Fc de un dominio Fc pueden tener el mismo módulo de selectividad de dimerización, por ejemplo, ambos monómeros de dominio Fc de un dominio Fc pueden tener mutaciones de carga inversa idénticas en al menos dos posiciones dentro del anillo de residuos cargados en la interfaz entre dominios Ch3.
[0146] En cualquiera de las construcciones de Fc divulgadas en el presente documento, los monómeros de dominio Fc de un dominio Fc de una construcción pueden tener secuencias diferentes, por ejemplo, secuencias que difieren en no más de 20 aminoácidos (por ejemplo, no más de 15, 10 aminoácidos ácidos), por ejemplo, no más de 20, 15, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 aminoácidos, entre dos monómeros de dominio Fc (es decir, entre el monómero de dominio Fc y otro monómero de la construcción de Fc). Por ejemplo, las secuencias de monómeros de dominio Fc de una construcción descrita en el presente documento pueden ser diferentes porque los módulos de selectividad de dimerización complementarios de cualquiera de las construcciones de Fc pueden incluir una cavidad modificada genéticamente en el dominio constante de anticuerpo Ch3 de uno de los monómeros de dominio y una protuberancia modificada genéticamente en el dominio constante de anticuerpo Ch3 del otro de los monómeros de dominio Fc, en el que la cavidad modificada genéticamente y la protuberancia modificada genéticamente están posicionadas para formar un par de protuberancia en cavidad de monómeros de dominio Fc.
En la Tabla 1 se muestran cavidades y protuberancias modificadas genéticamente a modo de ejemplo. En otros casos, los módulos de selectividad de dimerización complementarios incluyen un aminoácido cargado negativamente (sustituido) modificado genéticamente en el dominio constante de anticuerpo C<h>3 de uno de los monómeros de dominio y un aminoácido cargado positivamente (sustituido) modificado genéticamente en el dominio constante de anticuerpo C<h>3 del otro de los monómeros de dominio Fc, en el que el aminoácido cargado negativamente y el aminoácido cargado positivamente están posicionados para promover la formación de un dominio Fc entre monómeros de dominio complementario. En las Tablas 2A-2C se muestran cambios de aminoácidos complementarios de ejemplo.
[0147] La divulgación también presenta una composición farmacéutica que incluye una población sustancialmente homogénea de cualquier construcción de Fc descrita en el presente documento. En un caso, una jeringa o vial estéril calificado para uso farmacéutico contiene una composición farmacéutica en la que el principio activo único o principal es una población sustancialmente homogénea de cualquiera de las construcciones de Fc descritas en el presente documento. La composición farmacéutica puede incluir uno o más principios inactivos, por ejemplo seleccionados entre sales, detergentes, tensioactivos, agentes de carga, polímeros, conservantes y otros excipientes farmacéuticos.
[0148] En otro aspecto, la presente divulgación da a conocer una composición farmacéutica que incluye cualquiera de las construcciones de Fc descritas en el presente documento. Por consiguiente, la presente invención da a conocer una composición farmacéutica que comprende la construcción de Fc, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
[0149] En algunas realizaciones, la construcción de Fc se forma, al menos en parte, mediante la asociación de monómeros de dominio Fc que están presentes en diferentes polipéptidos. En determinadas realizaciones, la construcción de Fc se forma mediante la asociación de monómeros de dominio Fc que están presentes en diferentes polipéptidos. En estas realizaciones, la construcción de Fc no incluye un dominio adicional que promueva la asociación de dos polipéptidos (por ejemplo, una “tailpiece” de IgM o una “tailpiece” de IgA). En otras realizaciones, los enlaces covalentes (por ejemplo, puentes disulfuro) están presentes solo entre dos monómeros de dominio Fc que se unen para formar un dominio Fc. En otras realizaciones, la construcción de Fc no incluye enlaces covalentes (por ejemplo, puentes disulfuro) entre dominios Fc. En aún otras realizaciones, la construcción de Fc proporciona suficiente flexibilidad estructural de modo que todos o sustancialmente todos los dominios Fc en la construcción de Fc sean capaces de interactuar simultáneamente con un receptor Fc en una superficie celular. En ciertos ejemplos de cualquiera de estas realizaciones, la construcción de Fc incluye al menos dos dominios Fc unidos a través de un enlazador (por ejemplo, un espaciador de aminoácidos flexible).
[0150] En otro aspecto, la divulgación presenta composiciones y procedimientos para promover la dimerización selectiva de monómeros de dominio Fc. La divulgación incluye un dominio Fc en el que los dos monómeros de dominio Fc incluyen mutaciones idénticas en al menos dos posiciones dentro del anillo de residuos cargados en la interfaz entre los dominios constantes de anticuerpo C<h>3. La divulgación también incluye un procedimiento para fabricar dicho dominio Fc, que incluye introducir módulos de selectividad de dimerización complementarios que tienen mutaciones idénticas en dos secuencias de monómeros de dominio Fc en al menos dos posiciones dentro del anillo de residuos cargados en la interfaz entre los dominios constantes de anticuerpo Ch3. La interfaz entre los dominios constantes de anticuerpo C<h>3 consiste en un parche hidrofóbico rodeado por un anillo de residuos cargados. Cuando un dominio constante de un anticuerpo C<h>3 se junta con otro, estos residuos cargados se emparejan con residuos de carga opuesta. Al invertir la carga de ambos miembros de dos o más pares complementarios de residuos, los monómeros de dominio Fc mutados siguen siendo complementarios a los monómeros de dominio Fc de la misma secuencia mutada, pero tienen una menor complementariedad con los monómeros de dominio Fc sin esas mutaciones. En este caso, los módulos de selectividad de dimerización idénticos promueven la homodimerización. Dichos dominios Fc incluyen monómeros de dominio Fc que contienen los mutantes dobles K409D/D399K, K392D/D399K, E357K/K370E, D356K/K439D, K409E/D399K, K392E/D399K, E357K/K370D o D356K/K439E. En otro caso, un dominio Fc incluye monómeros de dominio Fc que incluyen mutantes cuádruples que combinan cualquier par de mutantes dobles, por ejemplo, K409D/D399K/E357K/K370E.
[0151] En otro caso, además de los módulos de selectividad de dimerización idénticos, los monómeros de dominio Fc del dominio Fc incluyen módulos de selectividad de dimerización complementarios que tienen mutaciones no idénticas que promueven la asociación específica (por ejemplo, cavidad y protuberancia modificadas genéticamente). Como resultado, los dos monómeros de dominio Fc incluyen dos módulos de selectividad de dimerización y siguen siendo complementarios entre sí, pero tienen una complementariedad disminuida con otros monómeros de dominio Fc. Este caso promueve la heterodimerización entre un dominio Fc que contiene una cavidad y un monómero de dominio Fc que contiene una protuberancia. En un ejemplo, los módulos de selectividad de dimerización complementarios que tienen mutaciones no idénticas en residuos de pares cargados de ambos monómeros de dominio Fc se combinan con una protuberancia en un monómero de dominio Fc y una cavidad en el otro monómero de dominio Fc.
[0152] En cualquiera de las construcciones de Fc descritas en el presente documento, se entiende que el orden de los monómeros de dominio Fc es intercambiable. Por ejemplo, en un polipéptido que tiene la fórmula A-L-B, el extremo carboxilo de A puede unirse al extremo amino de L, que a su vez está unido en su extremo carboxilo al extremo amino de B. Alternativamente, el extremo carboxilo de B puede unirse al extremo amino de L, que a su vez está unido en su extremo carboxilo al extremo amino de C. Ambas configuraciones están abarcadas por la fórmula A-L-B.
Definiciones:
[0153] Tal como se usa en el presente documento, el término "monómero de dominio Fc" se refiere a una cadena polipeptídica que incluye al menos un dominio bisagra y un segundo y tercer dominios constantes de anticuerpo (Ch2 y C<h>3) o fragmentos funcionales de los mismos (por ejemplo, fragmentos que son capaces de (i) dimerizar con otro monómero de dominio Fc para formar un dominio Fc y (ii) unirse a un receptor de Fc). El monómero de dominio Fc puede ser cualquier isotipo de anticuerpo de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgE, IgM, IgA o IgD (por ejemplo, IgG). Además, el monómero de dominio Fc puede ser un subtipo de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgG4) (por ejemplo, IgG1). Un monómero de dominio Fc no incluye ninguna porción de una inmunoglobulina que sea capaz de actuar como una región de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, un dominio variable o una región determinante de complementariedad (CDR). Los monómeros de dominio Fc pueden contener hasta diez cambios con respecto a una secuencia de monómero de dominio Fc de tipo salvaje (por ejemplo, sustituciones, adiciones o eliminaciones de 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 aminoácidos) que alteran la interacción entre un dominio Fc y un receptor de Fc. Se conocen en la técnica ejemplos de cambios adecuados.
[0154] Tal como se usa en el presente documento, el término "dominio Fc" se refiere a un dímero de dos monómeros del dominio Fc que es capaz de unirse a un receptor de Fc. En el dominio Fc de tipo salvaje, los dos monómeros de dominio Fc se dimerizan mediante la interacción entre los dos dominios constantes del anticuerpo C<h>3, así como uno o más enlaces disulfuro que se forman entre los dominios bisagra de los dos monómeros del dominio Fc dimerizantes.
[0155] En la presente divulgación, el término "construcción de Fc" se refiere a cadenas polipeptídicas asociadas que forman dominios Fc como se describe en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que contiene tres dominios Fc). Las construcciones de Fc descritas en el presente documento pueden incluir monómeros de dominio Fc que tienen secuencias iguales o diferentes. Por ejemplo, una construcción de Fc puede tener tres dominios Fc, dos de los cuales incluyen monómeros de dominio Fc derivados de IgG1 o de IgG1, y un tercero que incluye monómeros de dominio Fc derivados de IgG2 o de IgG2. En otro ejemplo, una construcción de Fc puede tener tres dominios Fc, dos de los cuales comprenden un "par de protuberancia en cavidad" y el tercero no comprende un "par de protuberancia en cavidad". En la presente divulgación, un dominio Fc no incluye una región variable de un anticuerpo, por ejemplo, Vh, Vl, CDR o HVR. Un dominio Fc forma la estructura mínima que se une a un receptor de Fc, por ejemplo, FcyRI, FcyRlla, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIMb, FcyRIV. En algunas realizaciones, las construcciones de Fc descritas en el presente documento no incluyen una región de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, un dominio variable o una región determinante de complementariedad (CDR). En algunas realizaciones, las construcciones de Fc descritas en el presente documento incluyen una región de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, un dominio variable o una CDR.
[0156] Tal como se usa en el presente documento, el término "dominio constante de anticuerpo" se refiere a un polipéptido que corresponde a un dominio de región constante de un anticuerpo (por ejemplo, un dominio constante de anticuerpo Cl, un dominio constante de anticuerpo Ch1, un dominio constante de anticuerpo Ch2 o un dominio constante de anticuerpo Ch3).
[0157] Tal como se usa en el presente documento, el término "promover" significa estimular y favorecer, por ejemplo, favorecer la formación de un dominio Fc a partir de dos monómeros de dominio Fc que tienen mayor afinidad de unión entre sí que con otros monómeros de dominio Fc distintos. Tal como se describe en el presente documento, dos monómeros de dominio Fc que se combinan para formar un dominio Fc pueden tener modificaciones de aminoácidos compatibles (por ejemplo, protuberancias y cavidades modificadas genéticamente) en la interfaz de sus respectivos dominios constantes de anticuerpos Ch3. Las modificaciones de aminoácidos compatibles promueven o favorecen la interacción selectiva de tales monómeros de dominio Fc entre sí con respecto a otros monómeros de dominio Fc que carecen de tales modificaciones de aminoácidos o con modificaciones de aminoácidos incompatibles. Esto tiene lugar porque, debido a las modificaciones de aminoácidos en la interfaz de los dos dominios constantes del anticuerpo Ch3 que interactúan, los monómeros del dominio Fc tienen una mayor afinidad entre sí que hacia otros monómeros del dominio Fc que carecen de modificaciones de aminoácidos.
[0158] Tal como se usa en el presente documento, el término "un módulo de selectividad de dimerización" se refiere a una secuencia del monómero del dominio Fc que facilita el emparejamiento favorecido entre dos monómeros de dominio Fc. Los módulos de selectividad de dimerización "complementarios" son módulos de selectividad de dimerización que promueven o favorecen la interacción selectiva de dos monómeros de dominio Fc entre sí. Los módulos de selectividad de dimerización complementaria pueden tener secuencias iguales o diferentes. En el presente documento se describen módulos de selectividad de dimerización complementarios de ejemplo.
[0159] Tal como se usa en el presente documento, el término "cavidad modificada genéticamente" se refiere a la sustitución de al menos uno de los residuos de aminoácidos originales en el dominio constante del anticuerpo C<h>3 por un residuo de aminoácido diferente que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo de aminoácido original, creando así una cavidad tridimensional en el dominio constante del anticuerpo Ch3. La expresión "residuo de aminoácido original" se refiere a un residuo de aminoácido de origen natural codificado por el código genético de un dominio constante de anticuerpo Ch3 de tipo salvaje.
[0160] Tal como se usa en el presente documento, el término "protuberancia modificada genéticamente" se refiere a la sustitución de al menos uno de los residuos de aminoácidos originales en el dominio constante del anticuerpo C<h>3 por un residuo de aminoácido diferente que tiene un volumen de cadena lateral mayor que el residuo de aminoácido original, creando así una protuberancia tridimensional en el dominio constante del anticuerpo Ch3. La expresión "residuos de aminoácidos originales" se refiere a residuos de aminoácidos de origen natural codificados por el código genético de un dominio constante de anticuerpo C<h>3 de tipo salvaje .
[0161] Tal como se usa en el presente documento, el término "par de protuberancia en cavidad" describe un dominio Fc que incluye dos monómeros de dominio Fc, en donde el primer monómero del dominio Fc incluye una cavidad modificada genéticamente en su dominio constante de anticuerpo C<h>3, mientras que el segundo monómero del dominio Fc incluye una protuberancia modificada genéticamente en su dominio constante de anticuerpo C<h>3. En un par de protuberancia en cavidad, la protuberancia modificada genéticamente en el dominio constante del anticuerpo C<h>3 del primer monómero del dominio Fc se coloca de manera que interactúe con la cavidad modificada genéticamente del dominio constante del anticuerpo Ch3 del segundo monómero del dominio Fc sin perturbar significativamente la asociación normal del dímero en la interfaz del dominio constante del anticuerpo inter-CH3.
[0162] Tal como se usa en el presente documento, el término "dominio Fc heterodímero" se refiere a un dominio Fc que se forma mediante la heterodimerización de dos monómeros de dominio Fc, en la que los dos monómeros de dominio Fc contienen diferentes mutaciones de carga inversa (ver, por ejemplo, mutaciones en la Tabla 2A) que promueven la formación favorable de estos dos monómeros de dominio Fc. Tal como se muestra en las FIGS. 1 y 2, en una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc, un dominio Fc "tallo" carboxilo terminal y dos dominios Fc "rama" amino terminal, cada uno de los dominios Fc "rama" amino terminal puede ser un dominio Fc heterodimérico (también llamado un "dominio Fc heterodimérico de rama") (por ejemplo, un dominio Fc heterodimérico formado por los monómeros de dominio Fc 106 y 114 o los monómeros de dominio Fc 112 y 116 en la Figura 1; un dominio Fc heterodimérico formado por los monómeros de dominio Fc 206 y 214 o monómeros de dominio Fc 212 y 216 en la Figura 2).
[0163] Tal como se usa en el presente documento, el término "dominio Fc homodimérico" se refiere a un dominio Fc que se forma mediante la homodimerización de dos monómeros de dominio Fc, en la que los dos monómeros de dominio Fc contienen las mismas mutaciones de carga inversa (ver, por ejemplo, las mutaciones en las Tablas 2B y 2C). Tal como se muestra en las FIGS. 1 y 2, en una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc, un dominio Fc "tallo" carboxilo terminal y dos dominios Fc "rama" amino terminal, el dominio Fc "tallo" carboxilo terminal puede ser un dominio Fc homodimérico (también llamado "dominio Fc homodimérico de tallo") (por ejemplo, un dominio Fc homodimérico formado por los monómeros de dominio Fc 104 y 110 en la FIG. 1; un dominio Fc homodimérico formado por los monómeros de dominio Fc 204 y 210 en la FIG. 2).
[0164] Tal como se usa en el presente documento, el término "módulo de selectividad heterodimerizante" se refiere a protuberancias modificadas genéticamente, cavidades modificadas genéticamente y ciertas sustituciones de aminoácidos de carga inversa que se pueden realizar en los dominios constantes del anticuerpo C<h>3 de los monómeros del dominio Fc para promover una heterodimerización favorable de dos monómeros de dominio Fc que tienen módulos de selectividad heterodimerizantes compatibles. Los monómeros del dominio Fc que contienen módulos de selectividad heterodimerizantes pueden combinarse para formar un dominio Fc heterodimérico. En las Tablas 1 y 2A se muestran ejemplos de módulos de selectividad heterodimerizantes.
[0165] Tal como se usa en el presente documento, el término "módulo de selectividad homodimerizante" se refiere a mutaciones de carga inversa en un monómero del dominio Fc en al menos dos posiciones dentro del anillo de residuos cargados en la interfaz entre dominios C<h>3 que promueven la homodimerización del monómero del dominio Fc para formar un dominio Fc homodimérico. En las Tablas 2B y 2C se muestran ejemplos de módulos de selectividad homodimerizantes.
[0166] Tal como se usa en el presente documento, el término "unido" se usa para describir la combinación o unión de dos o más elementos, componentes o dominios proteicos, por ejemplo, polipéptidos, mediante medios que incluyen conjugación química, medios recombinantes y enlaces químicos, por ejemplo, enlaces disulfuro y enlaces amida. Por ejemplo, se pueden unir dos polipéptidos individuales para formar una estructura proteica contigua mediante conjugación química, un enlace químico, un enlazador peptídico o cualquier otro medio de enlace covalente. En algunas realizaciones, un primer monómero del dominio Fc se une a un segundo monómero del dominio Fc mediante un enlazador peptídico, en el que el extremo N del enlazador peptídico se une al extremo C del primer monómero del dominio Fc a través de un enlace químico, por ejemplo, un enlace peptídico, y el extremo C del enlazador peptídico se une al extremo N del segundo monómero del dominio Fc a través de un enlace químico, por ejemplo, un enlace peptídico. En otras realizaciones, el extremo N de un péptido de unión a albúmina se une al extremo C del dominio constante del anticuerpo C<h>3 de un monómero del dominio Fc por medio de un enlazador de la misma manera que se mencionó anteriormente.
[0167] Tal como se usa en el presente documento, el término "asociado" se usa para describir la interacción, por ejemplo, enlace de hidrógeno, interacción hidrófoba o interacción iónica, entre polipéptidos (o secuencias dentro de un único polipéptido) de manera que los polipéptidos (o secuencias dentro de un único polipéptido) se colocan para formar una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc). Por ejemplo, en algunas realizaciones, cuatro polipéptidos, por ejemplo, dos polipéptidos que incluyen cada uno dos monómeros de dominio Fc y dos polipéptidos que incluyen cada uno un monómero de dominio Fc, se asocian para formar una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc (por ejemplo, tal como se representa en las Figuras 1 y 2). Los cuatro polipéptidos pueden asociarse a través de sus respectivos monómeros de dominio Fc. La asociación entre polipéptidos no incluye interacciones covalentes.
[0168] Tal como se usa en el presente documento, el término "enlazador" se refiere a una unión entre dos elementos, por ejemplo, dominios proteicos. Un enlazador puede ser un enlace covalente o un espaciador. El término "enlace" se refiere a un enlace químico, por ejemplo, un enlace amida o un enlace disulfuro, o cualquier tipo de enlace creado a partir de una reacción química, por ejemplo, conjugación química. El término "espaciador" se refiere a un resto (por ejemplo, un polímero de polietilenglicol (PEG)) o una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una secuencia de 3-200 aminoácidos, 3-150 aminoácidos, 3-100 aminoácidos, 3-60 aminoácido, 3-50 aminoácido, 3-40 aminoácido, 3-30 aminoácido, 3-20 aminoácido, 3-10 aminoácido, 3-8 aminoácido, 3-5 aminoácido, 4-30 aminoácido, 5-30 aminoácidos, 6-30 aminoácidos, 8-30 aminoácidos, 10-20 aminoácidos, 10-30 aminoácidos, 12-30 aminoácidos, 14-30 aminoácidos, 20-30 aminoácidos, 15 (secuencia de 25 aminoácidos, 15-30 aminoácidos, 18-22 aminoácidos y 20-30 aminoácidos) que se produce entre dos polipéptidos o dominios polipeptídicos para proporcionar espacio y/o flexibilidad entre los dos polipéptidos o dominios polipeptídicos. Un espaciador de aminoácidos es parte de la secuencia primaria de un polipéptido (por ejemplo, unido a los polipéptidos o dominios polipeptídicos espaciados a través de la cadena principal del polipéptido). La formación de enlaces disulfuro, por ejemplo, entre dos regiones bisagra o dos monómeros de dominio Fc que forman un dominio Fc, no se considera un enlazador.
[0169] Tal como se usa en el presente documento, el término "espaciador de glicina" se refiere a un enlazador que contiene sólo glicinas que une dos monómeros de dominio Fc en serie en tándem. Un espaciador de glicina puede contener al menos 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 glicinas (por ejemplo, 4-30, 8-30, 12-30, 12-50, 12-100 o 12- 200 glicinas; por ejemplo, 12-30, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 glicinas). En algunas realizaciones, un espaciador de glicina comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27).
[0170] Tal como se usa en el presente documento, el término "péptido de unión a albúmina" se refiere a una secuencia de aminoácidos de 12 a 16 aminoácidos que tiene afinidad y funciona para unirse a la albúmina sérica. Un péptido de unión a albúmina puede ser de diferentes orígenes, por ejemplo, humano, ratón o rata. En algunas realizaciones de la presente divulgación, se fusiona un péptido de unión a albúmina al extremo C terminal de un monómero de dominio Fc para aumentar la semivida en suero de la construcción de Fc. Se puede fusionar un péptido de unión a albúmina, directamente o mediante un enlazador, al extremo N o C terminal de un monómero de dominio Fc.
[0171] Tal como se usa en el presente documento, el término "péptido de purificación" se refiere a un péptido de cualquier longitud que puede usarse para la purificación, aislamiento o identificación de un polipéptido. Se puede unir un péptido de purificación a un polipéptido para ayudar a purificar el polipéptido y/o aislar el polipéptido a partir de, por ejemplo, una mezcla de lisado celular. En algunas realizaciones, el péptido de purificación se une a otro resto que tiene una afinidad específica por el péptido de purificación. En algunas realizaciones, dichos restos que se unen de manera específica al péptido de purificación se unen a un soporte sólido, tal como una matriz, una resina o microesferas de agarosa. En el presente documento se describen con más detalle ejemplos de péptidos de purificación que pueden unirse a una construcción de Fc.
[0172] Tal como se usa en el presente documento, el término "multímero" se refiere a una molécula que incluye al menos dos construcciones de Fc asociadas descritas en el presente documento.
[0173] Tal como se usa en el presente documento, el término "región de reconocimiento de antígeno" se refiere a las partes de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo que son responsables del reconocimiento y la unión de un anticuerpo a un antígeno. La región de reconocimiento de antígeno incluye los dominios variables de las cadenas ligera y pesada (Fab), que incluyen las regiones determinantes complementarias (CDR, por ejemplo, CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 y CDR H3) y regiones estructurales (FR).
[0174] Tal como se usa en el presente documento, la frase "activación de células inmunitarias de la respuesta inmunitaria" se refiere a una respuesta inmunitaria que se induce o activa mediante la unión de un complejo inmunitario o una construcción de Fc a un receptor de Fcy (FcyR) (por ejemplo, un FcyR activador, por ejemplo, FcyRI, FcyRIIa, FcyRllc, FcyRIIIa o FcyRIIIb) en una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria (por ejemplo, un monocito)). Un complejo inmunitario es un complejo antígeno-anticuerpo formado a partir de la unión de un anticuerpo a un antígeno. Un complejo inmunitario a menudo tiene múltiples dominios Fc, que agregan FcyR e inhiben o activan procesos celulares que desempeñan funciones críticas en la inflamación, la infección y otras enfermedades. En algunas realizaciones, las construcciones de Fc de la divulgación son capaces de unirse a FcyR e inducir la señalización de FcyR activador (por ejemplo, FcyRI, FcyRIIa, FcyRllc, FcyRIIIa o FcyRIIIb) en células inmunitarias (por ejemplo, un monocito). La medición de ciertos eventos de señalización aguas abajo, tales como la fosforilación de quinasa (por ejemplo, fosforilación de Syk) y la entrada de calcio en la célula que expresa FcyR, se pueden usar para detectar la activación de células inmunitarias de una respuesta inmunitaria causada por la unión de un complejo inmunitario o una construcción de Fc. Por ejemplo, la activación de células inmunitarias de la respuesta inmunitaria se induce si el nivel de fosforilación de quinasa (por ejemplo, fosforilación de Syk) o el nivel de entrada de calcio en la célula es al menos 5 veces, por ejemplo, 5-100 veces (por ejemplo, 5-100, 10-95, 15-90, 20-85, 25-80, 30-75, 35-70, 40-65, 45-60 o 50-55 veces; por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 veces) mayor que el nivel de fosforilación de quinasa (por ejemplo, fosforilación de Syk) o la entrada de calcio en la célula sin ninguna activación por el complejo inmunitario o la construcción de Fc.
[0175] Tal como se usa en el presente documento, el término "fagocitosis" se refiere a una forma de endocitosis, en la que una célula, a menudo un fagocito (por ejemplo, un monocito), engulle otra célula, una partícula o un patógeno (por ejemplo, un microbio o un parásito) para formar un fagosoma. En el sistema inmunológico, la fagocitosis es un mecanismo importante utilizado para eliminar células enfermas (por ejemplo, una célula cancerosa, una célula infectada o una célula muerta), patógenos y restos celulares. Una célula que está destinada a ser fagocitada por otra célula (por ejemplo, un fagocito (por ejemplo, un monocito)) se denomina célula diana. Por ejemplo, una célula inmunitaria (por ejemplo, un monocito) activada por la unión de una construcción de Fc de la divulgación a los FcyR (por ejemplo, FcyRI, FcyRIIa, FcyRllc, FcyRIIIa o FcyRIIIb) en la célula inmunitaria puede fagocitar una célula diana, que puede ser una célula cancerosa o una célula infectada en un sujeto.
[0176] Tal como se usa en el presente documento, "aumentar" o "incrementar" la fagocitosis de una célula diana se refiere al aumento de la fagocitosis inducida por la unión de una construcción de Fc de la divulgación a los FcyR (por ejemplo, FcyRI, FcyRIIa, FcyRllc, FcyRIIIa o FcyRIIIb) en una célula inmunitaria (por ejemplo, un monocito) en relación con el nivel de fagocitosis que se produce sin la inducción de la construcción de Fc. Por ejemplo, la fagocitosis de una célula diana aumenta si el nivel de fagocitosis es al menos del 10 %, por ejemplo, del 10 al 100 % (por ejemplo, del 10 al 100 %, del 15 al 95 %, del 20 al 90 %, del 25 al 85 %, 30-80 %, 35-75 %, 40-70 %, 45-65 %, o 50-60 %; por ejemplo, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) superior al nivel de fagocitosis que se produce sin la inducción de la construcción de Fc.
[0177] Tal como se usa en el presente documento, el término "tratar el cáncer" se refiere a un tratamiento terapéutico del cáncer en un sujeto. Un tratamiento terapéutico ralentiza la progresión del cáncer, mejora el resultado del sujeto y/o elimina el cáncer.
[0178] Tal como se usa en el presente documento, el término "tratar una infección" se refiere a un tratamiento terapéutico de una infección en un sujeto. Un tratamiento terapéutico ralentiza la progresión de la infección, mejora el resultado del sujeto y/o elimina la infección.
[0179] Tal como se usa en el presente documento, el término "infección" se refiere a la invasión de las células, tejidos y/u órganos de un sujeto por un patógeno, tal como bacterias, virus, hongos, helmintos, protozoos, artrópodos y otros microbios, parásitos y gusanos. En algunas realizaciones, el patógeno puede crecer, multiplicarse y/o producir toxinas en las células, tejidos y/u órganos del sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto puede desarrollar una reacción negativa (es decir, una reacción alérgica o una respuesta inmunitaria) al patógeno. Ejemplos de infecciones incluyen, pero sin limitación, una infección bacteriana, una infección viral, una infección por hongos, una infección por helmintos y una infección por protozoos.
[0180] Tal como se usa en el presente documento, el término "infección bacteriana" se refiere a una infección causada por una o más bacterias. Los ejemplos de bacterias que causan infecciones son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, bacterias del géneroStreptococcus(por ejemplo,Streptococcus pyogenes),bacterias del géneroEscherichia(por ejemplo, Escherichia coli), bacterias del géneroVibrio(por ejemplo,Vibrio cholerae),bacterias del géneroEnteritis(por ejemplo,Enteritis salmonella)y bacterias del géneroSalmonella(por ejemplo,Salmonella typhi).
[0181] Tal como se usa en el presente documento, el término "infección viral" se refiere a una infección causada por uno o más virus. Los ejemplos de virus que causan infecciones son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, virus de la familia Retroviridae (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)), virus de la familia Adenoviridae (por ejemplo, adenovirus), virus en la familia Herpesviridae (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2), virus de la familia Papillomaviridae (por ejemplo, virus del papiloma humano (VPH)), virus de la familia Poxviridae (por ejemplo, viruela), virus de la familia Picornaviridae (por ejemplo, virus de la hepatitis A, poliovirus, rinovirus), virus de la familia Hepadnaviridae (por ejemplo, virus de la hepatitis B), virus de la familia Flaviviridae (por ejemplo, virus de la hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental), virus de la familia Togaviridae (por ejemplo, virus de la rubéola), virus de la familia Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe), virus de la familia Filoviridae (por ejemplo, virus del ébola, virus de Marburg) y virus de la familia Paramyxoviridae (por ejemplo, virus del sarampión, virus de las paperas).
[0182] Tal como se usa en el presente documento, el término "infección por hongos o fúngica" se refiere a una infección causada por uno o más hongos. Los ejemplos de hongos que causan infecciones son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, hongos del géneroAspergillus(por ejemplo,Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. terreus, A. niger, A. candidus, A. clavatus, A. ochraceus),hongos del géneroCandida(por ejemplo,Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis),hongos del géneroCryptococcus(por ejemplo,Cryptococcus neoformans)y hongos del géneroFusarium(por ejemplo,Fusarium solani, F. verticillioides, F. oxysporum).
[0183] Tal como se usa en el presente documento, el término "infección helmíntica" se refiere a una infección causada por uno o más helmintos. Ejemplos de helmintos incluyen, pero sin limitación, tenias (cestodos), lombrices intestinales (nematodos), duelas (trematodos) y monogeneos.
[0184] Tal como se usa en el presente documento, el término "infección por protozoos" se refiere a una infección causada por uno o más protozoos. Los ejemplos de protozoos incluyen, pero sin limitación, protozoos del géneroEntamoeba(por ejemplo,Entamoeba histolytica),protozoos del géneroPlasmodium(por ejemplo,Plasmodium falciparum, P. malariae),protozoos del géneroGiardia(por ejemplo,Giardia lamblia)y protozoos del géneroTrypanosoma(por ejemplo,Trypanosoma brucei).
[0185] Tal como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" se refiere a un oligonucleótido, o nucleótido, y fragmentos o partes del mismo, y a ADN o ARN de origen genómico o sintético, que puede ser monocatenario o bicatenario, y representa la cadena de sentido o antisentido. Un único polinucleótido se traduce en un único polipéptido.
[0186] Tal como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" describe un polímero único en el que los monómeros son residuos de aminoácidos que están unidos entre sí a través de enlaces amida. Se pretende que un polipéptido abarque cualquier secuencia de aminoácidos, ya sea de origen natural, recombinante o producida sintéticamente.
[0187] Tal como se usa en el presente documento, el término "posiciones de aminoácidos" se refiere a los números de posición de aminoácidos en una proteína o dominio proteico. Las posiciones de aminoácidos para anticuerpos o construcciones de Fc se numeran utilizando el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., ed. 5, 1991).
[0188] Tal como se usa en el presente documento, el término "modificación de aminoácidos" se refiere a una alteración de una secuencia polipeptídica del dominio Fc que, en comparación con una secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de Fc de tipo salvaje, no mutada o no modificada) puede tener un efecto sobre las propiedades farmacocinéticas (PK) y/o farmacodinámicas (PD), semivida sérica, funciones efectoras (por ejemplo, lisis celular (por ejemplo, toxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)), fagocitosis (por ejemplo, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y/o citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDCC)), activación inmunitaria y activación de células T), afinidad por los receptores Fc (por ejemplo, receptores Fc-gamma (FcyR) (por ejemplo, FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32), FcyRIIb (CD32), FcyRIIIa (CD16a) y/o FcyRIIIb (CD16b)), receptores Fc-alfa (FcaR), receptores Fc-épsilon (F<ce>R), y/o al receptor Fc neonatal (FcRn)), afinidad por las proteínas involucradas en la cascada de complemento (por ejemplo, C1q), modificaciones postraduccionales (por ejemplo, glicosilación, sialilación), propiedades de agregación (por ejemplo, la capacidad de formar dímeros (por ejemplo, homodímeros y/o heterodímeros) y/o multímeros), y las propiedades biofísicas (por ejemplo, altera la interacción entre Ch1 y Cl, altera la estabilidad y/o altera la sensibilidad a la temperatura y/o el pH) de una construcción de Fc, y puede promover una mayor eficacia del tratamiento de enfermedades inmunológicas e inflamatorias, cánceres e infecciones. Una modificación de aminoácidos incluye sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos. En algunos casos, una modificación de aminoácido es la modificación de un único aminoácido. En otros casos, la modificación de aminoácidos es la modificación de múltiples (por ejemplo, más de uno) aminoácidos. La modificación de aminoácidos puede comprender una combinación de sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos. En la descripción de las modificaciones de aminoácidos se incluyen alteraciones genéticas (es decir, ADN y ARN), tales como mutaciones puntuales (por ejemplo, el intercambio de un solo nucleótido por otro), inserciones y eliminaciones (por ejemplo, la adición y/o eliminación de uno o más nucleótidos) de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Fc.
[0189] En ciertos casos, al menos uno (por ejemplo, uno, dos o tres) dominio Fc dentro de una construcción de Fc incluye una modificación de aminoácido. En algunos casos, al menos un dominio Fc incluye una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o veinte o más) modificaciones de aminoácidos. En algunos casos, el al menos un dominio Fc incluye no más de dieciséis modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, no más de una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciséis modificaciones de aminoácidos). En algunos casos, el monómero de dominio Fc incluye no más de diez modificaciones de aminoácidos. En algunos casos, el monómero de dominio Fc incluye no más de 12 modificaciones de aminoácidos. En algunos casos, el monómero de dominio Fc incluye no más de 14 modificaciones de aminoácidos.
[0190] Tal como se usa en el presente documento, el término "porcentaje (%) de identidad" se refiere al porcentaje de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de una secuencia candidata, por ejemplo, la secuencia de un monómero del dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento que son idénticos a los residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de una secuencia de referencia, por ejemplo, la secuencia de un monómero del dominio Fc de tipo salvaje, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad (es decir , se pueden introducir espacios en una o ambas secuencias candidata y de referencia para una alineación óptima y las secuencias no homólogas se pueden ignorar para fines de comparación). La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad se puede lograr de varias maneras que están dentro de los conocimientos de la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente, tal como software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluido cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan. En algunas realizaciones, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o ácido nucleico) de una secuencia candidata determinada con o frente una secuencia de referencia determinada (que alternativamente puede expresarse como una secuencia candidata determinada que tiene o incluye un cierto porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o de ácido nucleico) con o frente a una secuencia de referencia determinada) se calcula de la siguiente manera:
100 x (fracción de A/B)
donde A es el número de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) puntuados como idénticos en el alineamiento de la secuencia candidata y la secuencia de referencia, y donde B es el número total de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en la secuencia de referencia. En algunas realizaciones donde la longitud de la secuencia candidata no es igual a la longitud de la secuencia de referencia, el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos (o ácido nucleico) de la secuencia candidata con la secuencia de referencia no sería igual al porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos (o ácido nucleico) de la secuencia de referencia con la secuencia candidata.
[0191] En realizaciones particulares, una secuencia de referencia alineada para comparación con una secuencia candidata puede mostrar que la secuencia candidata exhibe del 50%al 100%de identidad (por ejemplo, del 50%al 100 %, del 60 % al 100 %, del 70 % al 100 %, del 80 % al 100 %, del 90 % al 100 %, del 92 % al 100 %, del 95 % al 100 %, del 97 % al 100 %, del 99 % al 100 % o del 99,5 % al 100 % de identidad), en todo el longitud de la secuencia candidata o una porción seleccionada de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) contiguos de la secuencia candidata. La longitud de la secuencia candidata alineada con fines de comparación es al menos el 30 %, por ejemplo, al menos el 40 %, por ejemplo, al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Cuando una posición en la secuencia candidata está ocupada por el mismo residuo de aminoácido (o ácido nucleico) que la posición correspondiente en la secuencia de referencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición.
[0192] En algunos casos, un monómero de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) puede tener una secuencia que es al menos un 95 % idéntica (por ejemplo, al menos un 97 %, 99 %, o 99,5 % idéntica) a la secuencia de un monómero de dominio Fc de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 42). En algunos casos, un monómero de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) puede tener una secuencia que es al menos 95 % idéntica (por ejemplo, al menos 97 %, 99 % o 99,5 % idéntica) a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 44, 46, 48 y 50-53. En ciertos casos, un monómero de dominio Fc en la construcción de Fc puede tener una secuencia que es al menos 95 % idéntica (por ejemplo, al menos 97 %, 99 % o 99,5 % idéntica) a la secuencia de SEQ ID NO: 48, 52 y 53.
[0193] En algunos casos, el monómero de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene múltiples dominios Fc) puede tener una secuencia con hasta 10 (por ejemplo, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras). En algunos casos, el al menos un dominio Fc incluye no más de dieciséis modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, no más de una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o dieciséis modificaciones de aminoácidos).
[0194] En algunos casos, un polipéptido que tiene dos monómeros de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, los polipéptidos 102 y 108 en la FIG. 1; los polipéptidos 202 y 208 en la FIG.
2) puede tener una secuencia que es al menos un 95 % idéntica (por ejemplo, al menos un 97 %, 99 % o 99,5 % idéntica) a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 43, 45, 47 y 49. En ciertos casos, un polipéptido que tiene dos monómeros de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento puede tener una secuencia que es al menos un 95 % idéntica (por ejemplo, al menos un 97 %, 99 % o 99,5 % idéntica) a la secuencia de SEQ ID NO: 49.
[0195] En algunos casos, un espaciador entre dos monómeros de dominio Fc puede tener una secuencia que es al menos un 75 % idéntica (por ejemplo, 75 %, 77 %, 79 %, 81 %, 83 %, 85 %, 87 %, 89 %, 91 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 %, 99,5 % o 100 % idéntica) a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-36 (por ejemplo, SEQ ID NO: 17, 18, 26 y 27) que se describen con más detalle en el presente documento.
[0196] Tal como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a un vehículo que incluye los componentes celulares necesarios, por ejemplo, orgánulos, necesarios para expresar proteínas a partir de sus correspondientes ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos normalmente se incluyen en vectores de ácidos nucleicos que pueden introducirse en la célula huésped mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica (transformación, transfección, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, etc.). Una célula huésped puede ser una célula procariota, por ejemplo, una célula bacteriana, o una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero (por ejemplo, una célula CHO). Tal como se describe en el presente documento, se usa una célula huésped para expresar uno o más polipéptidos que codifican dominios deseados que a continuación pueden combinarse para formar una construcción de Fc deseada.
[0197] Tal como se usa en el presente documento, el término "composición farmacéutica" se refiere a una formulación medicinal o farmacéutica que contiene un principio activo, así como uno o más excipientes y diluyentes para permitir que el principio activo sea adecuado para el procedimiento de administración. La composición farmacéutica de la presente divulgación incluye componentes farmacéuticamente aceptables que sean compatibles con la construcción de Fc. La composición farmacéutica suele estar en forma acuosa para administración intravenosa o subcutánea.
[0198] Tal como se usa en el presente documento, una "población sustancialmente homogénea" de polipéptidos o de una construcción de Fc es aquella en la que al menos el 50 % de los polipéptidos o construcciones de Fc en una composición (por ejemplo, un medio de cultivo celular o una composición farmacéutica) tienen el mismo número de dominios Fc, según lo determinado mediante electroforesis en gel SDS no reductor o cromatografía de exclusión por tamaño. Se puede obtener una población sustancialmente homogénea (por ejemplo, una población que es al menos 85 %, 90 % o 95 % homogénea) de polipéptidos o de una construcción de Fc antes de la purificación, o después de la purificación de la Proteína A o la Proteína G, o después de cualquier Cromatografía de afinidad específica de Fab o Fc únicamente. En diversas realizaciones, al menos el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % u 85 % de los polipéptidos o construcciones de Fc en la composición tienen el mismo número de dominios Fc. En otras realizaciones, hasta el 85 %, 90 %, 92 % o 95 % de los polipéptidos o construcciones de Fc en la composición tienen el mismo número de dominios Fc.
[0199] Tal como se usa en el presente documento, el término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente o diluyente en una composición farmacéutica. El portador farmacéuticamente aceptable debe ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no ser perjudicial para el receptor. En la presente divulgación, el portador farmacéuticamente aceptable debe proporcionar una estabilidad farmacéutica adecuada a la construcción de Fc. La naturaleza del portador difiere según el modo de administración. Por ejemplo, para la administración oral, se prefiere un portador sólido; para la administración intravenosa, generalmente se usa un portador de solución acuosa (por ejemplo, WFI y/o una solución tamponada).
[0200] Tal como se usa en el presente documento, "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad, por ejemplo, dosis farmacéutica, eficaz para inducir un efecto biológico deseado en un sujeto o paciente o para tratar a un paciente que tiene una afección o trastorno descrito en el presente documento. También debe entenderse en el presente documento que una "cantidad terapéuticamente eficaz" puede interpretarse como una cantidad que proporciona un efecto terapéutico deseado, ya sea tomada en una dosis o en cualquier dosificación o vía, tomada sola o en combinación con otros agentes terapéuticos.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0201] La figura 1 es una ilustración de construcciones de Fc (construcción de Fc 1, construcción de Fc 2 o construcción de Fc 3) que contienen tres dominios Fc formados a partir de cuatro polipéptidos. El primer polipéptido (102) contiene un monómero de dominio Fc (104) que contiene diferentes aminoácidos cargados en la interfaz Ch3-Ch3 que la secuencia del monómero de dominio Fc de tipo salvaje unida en una serie en tándem con un monómero de dominio Fc que contiene protuberancias (106). El segundo polipéptido (108) contiene un monómero de dominio Fc (110) que contiene diferentes aminoácidos cargados en la interfaz Ch3-Ch3 que la secuencia del monómero de dominio Fc de tipo salvaje unida en una serie en tándem con otro monómero de dominio Fc (112) que contiene protuberancias. Los polipéptidos tercero y cuarto (114 y 116, respectivamente) contienen cada uno un monómero de dominio Fc que contiene una cavidad.
La figura 2 es una ilustración de una construcción de Fc (construcción de Fc 4) que contiene tres dominios Fc formados a partir de cuatro polipéptidos. El primer polipéptido (202) contiene un monómero de dominio Fc (204) que contiene diferentes aminoácidos cargados en la interfaz Ch3-Ch3 que la secuencia de monómero de dominio Fc de tipo salvaje unida en una serie en tándem con otro monómero de dominio Fc (206) que contiene diferentes aminoácidos cargados y una protuberancia. El segundo polipéptido (208) contiene un monómero de dominio Fc (210) que contiene diferentes aminoácidos cargados en la interfaz Ch3-Ch3 que la secuencia de monómero de dominio Fc de tipo salvaje unida en una serie en tándem con otro monómero de dominio Fc (212) que contiene diferentes aminoácidos cargados y una protuberancia. Los polipéptidos tercero y cuarto (214 y 216, respectivamente) contienen cada uno un monómero de dominio Fc que contiene diferentes aminoácidos cargados y una cavidad.
La Figura 3 muestra la identificación de Ser O-xilosilada en el enlazador de la construcción de Fc 2 (SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 18)) mediante LC-MS/MS.
La Figura 4 muestra la abundancia de O-xilosilación del enlazador en una construcción de Fc que tiene dos dominios Fc (la construcción de Fc mostrada en la Figura 13) según se determina mediante LC-MS/MS.
La figura 5 muestra la formación de especies de Fc monoméricas a partir de las construcciones de Fc 2 y 4 tras el almacenamiento a 45 °C según lo determinado por CE-SDS.
La Figura 6 muestra los productos de proteólisis de la construcción de Fc 2 tras dos semanas de almacenamiento a 45 °C, según lo determinado por LC-MS.
La Figura 7 muestra los productos de proteólisis de la construcción de Fc 4 tras dos semanas de almacenamiento a 45 °C según lo determinado por LC-MS.
La Figura 8 muestra la inhibición de la liberación de IL-8 por células THP-1 por la construcción de Fc 2 con longitudes de enlazador variables.
La Figura 9 muestra la inhibición del flujo de calcio en neutrófilos por la construcción de Fc 2 con longitudes de enlazador variables.
La figura 10 muestra la distribución de tamaños mediante SDS-PAGE no reductora de la construcción de Fc 2 y la construcción de Fc 4 en medios no purificados.
La figura 11 muestra la expresión y el ensamblaje de la construcción de Fc 2 ("Con orientación de las interacciones electrostáticas") y otra construcción de Fc que tiene tres dominios Fc pero sin mutaciones de orientación de interacciones electrostáticas en las subunidades "tallo" ("Sin orientación de las interacciones electrostática").
La figura 12 muestra que la eliminación de la lisina C-terminal para generar la construcción de Fc 2 no indujo citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) in vitro.
La figura 13 es una ilustración de una construcción de Fc que contiene dos dominios Fc formados a partir de tres polipéptidos.
La figura 14 es una ilustración de una construcción de Fc que contiene cinco dominios Fc formados a partir de seis polipéptidos (Fc5X).
La figura 15 es una ilustración de una construcción de Fc que contiene cinco dominios Fc formados a partir de seis polipéptidos (Fc5Y).
La figura 16 es una ilustración de una construcción de Fc que contiene cinco dominios Fc formados a partir de seis polipéptidos (Fc5Y-invertido).
La figura 17 es una ilustración de una construcción de Fc que contiene tres dominios Fc formados a partir de dos polipéptidos.
La figura 18 muestra los niveles de plaquetas comparando IVIG, Construcción 2 y Construcción 4 en un modelo de PTI crónica.
La figura 19 muestra los niveles de plaquetas comparando IVIG, Construcción 2 y Construcción 4 en un modelo de PTI crónica.
La figura 20 muestra los niveles de plaquetas comparando IVIG, Construcción 2 y Construcción 4 en un modelo de PTI crónica.
La figura 21 muestra la distribución de tamaños mediante SDS-PAGE no reductora de la Construcción de Fc 4 purificada (centro) y la Construcción X1 purificada (derecha). Los patrones de peso molecular se muestran a la izquierda.
La figura 22 muestra el comportamiento farmacocinético durante 24 horas para la construcción 4 (cuadrados negros con línea continua) y la construcción X1 (círculos no rellenos con líneas discontinuas).
La figura 23 muestra el comportamiento farmacocinético durante 12 horas para la construcción 4 (cuadrado negro con línea continua) y la construcción X1 (círculos no rellenos con líneas discontinuas).
La Figura 24 muestra la construcción 4 dosificada terapéuticamente en un modelo de artritis inducida por anticuerpos contra colágeno (CAIA,collagen antibody-induced arthritis)el día 6 a 50 mg/kg (triángulos negros, línea negra continua), 25 mg/kg (cuadrados negros, línea negra punteada) o 12,5 mg/kg (círculos negros, línea discontinua negra). Se dosificó un volumen equivalente de solución salina (ejes grises, línea gris continua) el día 6 como control del vehículo. La media y el error estándar de la media se muestran para cada punto temporal.
La figura 25 que compara la eficacia de la construcción 4 (AA: cuadrados negros, línea continua) o solución salina (círculos grises, línea de puntos y guiones) dosificada profilácticamente a 100 mg/kg el día 1 en un modelo de artritis inducida por anticuerpos contra colágeno (CAIA). Se dosificó un volumen equivalente de solución salina (círculos grises, línea de puntos y guiones) el día 1. La media y el error estándar de la media se muestran para cada punto temporal.
La Figura 26 muestra la distribución de tamaños mediante SDS-PAGE no reductora de medios depurados obtenidos de la expresión de la Construcción 4 (SIF) y el mutante Construcción 4-FcyRIIb+.
La Figura 27 muestra la unión relativa a los receptores de Fc gamma de un control de IgG1, la Construcción 4 (SIF3) y el mutante Construcción 4-FcyRIIb+ (FcfRIIB+).
La Figura 28 muestra la expresión superficial de CD86 en células dendríticas derivadas de monocitos (moDC). La Figura 29 muestra la expresión superficial de CD86 en células dendríticas derivadas de monocitos (moDC).
DESCRIPCIÓN MÁS DETALLADA
[0202] Las proteínas terapéuticas que incluyen dominios Fc de IgG se pueden usar para tratar la inflamación y enfermedades inmunológicas e inflamatorias, cánceres e infecciones. La presente divulgación presenta composiciones y procedimientos para preparar construcciones de Fc que contienen dominios Fc (por ejemplo, construcciones de Fc que tienen 2-10 dominios Fc, por ejemplo, construcciones de Fc que tienen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dominios Fc). Las construcciones de Fc descritas en el presente documento facilitan la preparación de composiciones farmacéuticas homogéneas incorporando características estructurales (por ejemplo, espaciadores de glicina) que mejoran significativamente el resultado de fabricación.
[0203] Por consiguiente, la divulgación presenta composiciones farmacéuticas que incluyen una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc). La homogeneidad es un aspecto importante de una composición farmacéutica ya que influye en la farmacocinética y el rendimiento in vivo de la composición. Tradicionalmente, en la fabricación de productos farmacéuticos, existe el problema de la heterogeneidad del producto que puede deberse a varios factores dependiendo de cómo se produzca el producto. Por ejemplo, el producto farmacéutico puede sufrir escisión aleatoria del producto, proteólisis, degradación y/o agregación, asociación de subunidades fuera de la diana y/o plegamiento ineficaz de proteínas. Diferentes organismos que tienen diferentes procesos biosintéticos o maquinarias celulares que se utilizan para producir el producto farmacéutico también pueden causar heterogeneidad en el producto. A menudo, el cultivo inicial que contiene el producto farmacéutico deseado necesita someterse a un riguroso proceso de purificación para producir una composición menos heterogénea que contenga el producto farmacéutico.
[0204] La divulgación presenta, en un aspecto, construcciones de Fc que tienen características estructurales que mejoran significativamente la eficiencia de plegado de las construcciones de Fc y minimizan la asociación fuera de la diana de las subunidades, lo que conduce a composiciones farmacéuticas que contienen estas construcciones de Fc con alta homogeneidad. Tener un alto grado de homogeneidad garantiza la seguridad, eficacia, uniformidad y fiabilidad de la composición farmacéutica. Tener un alto grado de homogeneidad también minimiza la posible agregación o degradación del producto farmacéutico causada por materiales no deseados (por ejemplo, productos de degradación y/o productos agregados o multímeros), así como también limita los efectos secundarios adversos y fuera de la diana causados por los materiales no deseados.
[0205] Tal como se describe en detalle en el presente documento, la divulgación presenta composiciones sustancialmente homogéneas que contienen construcciones de Fc que tienen todas el mismo número de dominios Fc, así como procedimientos para preparar tales composiciones sustancialmente homogéneas.
[0206] Las construcciones de Fc descritas en el presente documento incluyen espaciadores de glicina entre dominios Fc. Tal como es bien conocido en la técnica, los enlazadores que contienen tanto serinas como glicinas proporcionan flexibilidad estructural en una proteína y se usan comúnmente para unir dos polipéptidos. Hemos observado a través de experimentación (véase el ejemplo 4) que los enlazadores que contienen tanto serinas como glicinas experimentan O-glicosilación (por ejemplo, O-xilosilación) en múltiples serinas en el enlazador y proteólisis en el lado N-terminal de la serina. Nuestro objetivo era optimizar la secuencia y la longitud del enlazador para mejorar aún más la homogeneidad de las construcciones de Fc. Se construyeron construcciones de Fc en las que todos los enlazadores dentro de las construcciones son espaciadores de glicina que tienen solo glicinas (por ejemplo, al menos 12 glicinas, por ejemplo, 12-30 glicinas; por ejemplo, 20 glicinas, SEQ ID NO: 27). Tener todos los espaciadores de glicina en las construcciones de Fc mejoró aún más la homogeneidad de las construcciones de Fc eliminando la O-glicosilación en las serinas y también disminuyendo la tasa de proteólisis de las construcciones (véase el ejemplo 4). En consecuencia, se pudo lograr una población sustancialmente más homogénea de construcciones de Fc utilizando espaciadores de todo glicina en las construcciones de Fc.
[0207] La homogeneidad es el resultado de los componentes de la construcción de Fc. Por ejemplo, en un primer enfoque ("enfoque (a)"), se puede utilizar la incorporación de enlazadores que contienen sólo glicinas para unir monómeros del dominio Fc. Tal como se observó mediante experimentación, los espaciadores con todo glicina (por ejemplo, al menos 12 glicinas, por ejemplo, 12-30 glicinas; SEQ ID NO: 27) en una construcción de Fc no sufren O-glicosilación y son menos susceptibles a la proteólisis como en comparación con los enlazadores tradicionales que incluyen serinas y glicinas (véase el ejemplo 4).
[0208] Además, en otro enfoque ("enfoque (b)"), se mejora la homogeneidad de una composición que contiene una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) mediante la eliminación de lisinas C-terminales. Estos residuos de lisina C-terminal están altamente conservados en las inmunoglobulinas de muchas especies y la maquinaria celular puede eliminarlos total o parcialmente durante la producción de proteínas. La eliminación de las lisinas C-terminales en las construcciones de Fc de la divulgación mejora la uniformidad de la composición resultante y logra una preparación de construcciones de Fc más homogénea (véase el ejemplo 8 ). Por ejemplo, en algunos casos de construcciones de Fc descritas en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc), se elimina el codón de la lisina C-terminal, generando así construcciones de Fc que tienen polipéptidos sin residuos de lisina C-terminal y una población homogénea resultante.
[0209] Un enfoque adicional ("enfoque (c)") para mejorar la homogeneidad de una composición que contiene una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc), utilizó dos conjuntos de módulos de selectividad heterodimerizantes: (i) módulos de selectividad heterodimerizantes que tienen diferentes mutaciones de carga inversa y (ii) módulos de selectividad heterodimerizantes que tienen cavidades y protuberancias modificadas genéticamente. Hemos observado mediante experimentación, por ejemplo, véase el ejemplo 6 , que cuando se intenta formar un dominio Fc heterodimérico en una construcción de Fc, tener tanto (i) como (ii) mejora aún más la homogeneidad de la composición farmacéutica producida al reducir la asociación no controlada de monómeros del dominio Fc y, por lo tanto, oligómeros y multímeros indeseables. En ejemplos particulares, se puede producir un monómero del dominio Fc que contiene (i) al menos una mutación de carga inversa y (ii) al menos una cavidad modificada genéticamente o al menos una protuberancia modificada genéticamente, y se combinará selectivamente con otro monómero del dominio Fc que contiene (i) al menos una mutación de carga inversa y (ii) al menos una protuberancia modificada genéticamente o al menos una cavidad modificada genéticamente para formar un dominio Fc. En otro ejemplo, se puede producir un monómero de dominio Fc que contiene la mutación de carga inversa K370D y cavidades modificadas genéticamente Y349C, T366S, L368A e Y407V y otro monómero del dominio Fc que contiene la mutación de carga inversa E357K y protuberancias modificadas genéticamente S354C y T366W y se combinarán selectivamente para formar un dominio Fc.
[0210] Tal como se describe con más detalle en el presente documento, se puede lograr una composición sustancialmente homogénea que contiene una construcción de Fc de la divulgación (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) utilizando espaciadores con todo glicina entre dos monómeros de dominio Fc en la construcción de Fc (enfoque (a)), utilizando los polipéptidos que carecen de las lisinas en el extremo C-terminal en la construcción de Fc (enfoque (b)), y/o utilizando dos conjuntos de módulos de selectividad heterodimerizantes ((i) módulos de selectividad heterodimerizantes que tienen mutaciones de carga inversa diferentes y (ii) módulos de selectividad heterodimerizantes que tienen cavidades y protuberancias modificadas genéticamente) para promover la formación de un dominio Fc heterodimérico por algunos monómeros de dominio Fc en la construcción de Fc (enfoque (c)).
[0211] En algunos casos, se puede lograr una composición sustancialmente homogénea que contiene una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) mediante el enfoque (a).
[0212] En algunos casos, se puede lograr una composición sustancialmente homogénea que contiene una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) mediante el enfoque (b).
[0213] En algunos casos, se puede lograr una composición sustancialmente homogénea que contiene una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) mediante el enfoque (c).
[0214] En algunos casos, se puede lograr una composición sustancialmente homogénea que contiene una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) mediante una combinación de los enfoques (a) y (b).
[0215] En algunos casos, se puede lograr una composición sustancialmente homogénea que contiene una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) mediante una combinación de los enfoques (a) y (c).
[0216] En algunos casos, se puede lograr una composición sustancialmente homogénea que contiene una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) mediante una combinación de los enfoques (b) y (c).
[0217] En algunos casos, se puede lograr una composición sustancialmente homogénea que contiene una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) mediante una combinación de enfoques (a), (b) y (c).
[0218] En algunos casos, para mejorar aún más la homogeneidad de la composición farmacéutica que contiene una construcción de Fc descrita en el presente documento, el Asp N-terminal en uno o más de los polipéptidos en la construcción de Fc de la composición está mutado a Gln. En algunos casos de una composición que incluye una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc descrita en el presente documento, el Asp N-terminal en cada uno de los polipéptidos en la construcción de Fc de la composición está mutado a Gln.
[0219] Además, en las construcciones de Fc de la divulgación (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc), la longitud de los enlazadores que unen los monómeros de dominio Fc influye en la eficacia del plegado de las construcciones de Fc. En algunos casos, se puede usar un enlazador que tiene al menos 4, 8 o 12 glicinas (por ejemplo, 4-30, 8-30, 12-30 glicinas; SEQ ID NO: 26 y 27) para unir monómeros de dominio Fc en construcciones de Fc de la divulgación.
I. Monómeros de dominio Fc
[0220] Un monómero de dominio Fc incluye un dominio bisagra, un dominio constante de anticuerpo C<h>2 y un dominio constante de anticuerpo Ch3. El monómero del dominio Fc puede ser del isotipo de anticuerpo de inmunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgA o IgD. El monómero de dominio Fc también puede ser de cualquier isotipo de anticuerpo de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgG4). Los monómeros de dominio Fc también pueden ser híbridos, por ejemplo, con la bisagra y Ch2 de IgG1 y Ch3 de IgA, o con la bisagra y Ch3 de IgG1, pero Ch3 de IgG3. Un dímero de monómeros del dominio Fc es un dominio Fc (definido con más detalle en el presente documento) que puede unirse a un receptor de Fc, por ejemplo, FcYRllla, que es un receptor ubicado en la superficie de los leucocitos. En la presente divulgación, el dominio constante del anticuerpo C<h>3 de un monómero de dominio Fc puede contener sustituciones de aminoácidos en la interfaz de los dominios constantes de anticuerpo Ch3-Ch3 para promover su asociación entre sí. En otras realizaciones, un monómero de dominio Fc incluye un resto adicional, por ejemplo, un péptido de unión a albúmina o un péptido de purificación, unido al extremo N o C terminal. En la presente divulgación, un monómero de dominio Fc no contiene ningún tipo de región variable de anticuerpo, por ejemplo, Vh, Vl, una región determinante de complementariedad (CDR) o una región hipervariable (HVR). El monómero del dominio Fc puede ser de diferentes orígenes, por ejemplo, humano, ratón o rata.
[0221] En algunos casos, un monómero de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) puede tener una secuencia que es al menos un 95 % idéntica (por ejemplo, al menos 97 %, 99 %, o 99,5 % idéntica) a la secuencia de un monómero de dominio Fc de tipo salvaje (SEQ ID NO: 42). En algunos casos, un monómero de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en una secuencia que es la secuencia de un monómero de dominio Fc de tipo salvaje (SEQ ID NO: 42) con hasta 10 (9, 8 , 7, 6 , 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras). En algunos casos, un monómero de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) puede tener una secuencia que es al menos un 95 % idéntica (por ejemplo, al menos 97 %, 99 % o 99,5 % idéntica) a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 44, 46, 48 y 50-53 (ver Ejemplo 1, Tablas 4 y 5). En algunos casos, un monómero de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) puede tener una secuencia que es la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 44, 46, 48 y 50- 53 (ver Ejemplo 1, Tablas 4 y 5) con hasta 10 (9, 8 , 7, 6 , 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras). En ciertos casos, un monómero de dominio Fc en la construcción de Fc puede tener una secuencia que es al menos un 95 % idéntica (por ejemplo, al menos 97 %, 99 % o 99,5 % idéntica) a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 48, 52 y 53. En ciertos casos, un monómero de dominio Fc en la construcción de Fc puede tener una secuencia que es la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 48, 52 y 53 con hasta 10 (por ejemplo, 9, 8 , 7, 6 , 5, 4, 3, 2 o 1) modificaciones de aminoácidos individuales (por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras).
SEQ ID NO: 42: secuencia de aminoácidos del monómero de dominio Fc de lgG1 humana de tipo salvajeDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWW DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW3QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 44DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQV CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 46DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSEQ ID NO: 48DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSEQ ID NO: 50DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKHSK AKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 51DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT1SK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO: 52DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT1SK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSEQ ID NO : 53DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
II. Dominios Fc
[0222] Tal como se define en el presente documento, un dominio Fc incluye dos monómeros del dominio Fc que se dimerizan mediante la interacción entre los dominios constantes del anticuerpo C<h>3. En la presente divulgación, un dominio Fc no incluye una región variable de un anticuerpo, por ejemplo, V<h>, V<l>, CDR o HVR. Un dominio Fc forma la estructura mínima que se une a un receptor Fc, por ejemplo, receptores Fc-gamma (es decir, receptores de Fcy (FcyR)), receptores de Fc-alfa (es decir, receptores de Fca (FcaR)), receptores de Fc-épsilon (es decir, receptores de Fce (FcgR)) y/o el receptor de Fc neonatal (FcRn). En algunas realizaciones, un dominio Fc de la presente divulgación se une a un receptor de Fcy (por ejemplo, FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32), FcyRIIb (CD32), FcyRIIIa (CD16a), FcyRIIIb (CD16b)) y/o FcyRIV y/o el receptor de Fc neonatal (FcRn).
[0223] En cualquiera de las construcciones de Fc descritas en el presente documento, la modificación de aminoácidos puede alterar la afinidad de unión a uno o más receptores de Fc. En algunos casos, la modificación del aminoácido es S267E/L328F. En algunas realizaciones, el receptor de Fc es FcyRIIb. En algunos casos, la modificación descrita en el presente documento aumenta la afinidad por el receptor FcyRIIb. En algunos casos, la modificación S267E/L328F aumenta la afinidad de unión a FcyRIIb.
III. Módulos de selectividad de dimerización
[0224] En la presente divulgación, un módulo de selectividad de dimerización es la parte del monómero del dominio Fc que facilita el emparejamiento preferido de dos monómeros del dominio Fc para formar un dominio Fc. De manera específica, un módulo de selectividad de dimerización es la parte del dominio constante del anticuerpo Ch3 de un monómero del dominio Fc que incluye sustituciones de aminoácidos situadas en la interfaz entre los dominios constantes del anticuerpo C<h>3 interactuantes de dos monómeros de dominio Fc. En un módulo de selectividad de dimerización, las sustituciones de aminoácidos hacen favorable la dimerización de los dos dominios constantes del anticuerpo C<h>3 como resultado de la compatibilidad de los aminoácidos elegidos para esas sustituciones. La formación final del dominio Fc favorecido es selectiva sobre otros dominios Fc que se forman a partir de monómeros del dominio Fc que carecen de módulos de selectividad de dimerización o con sustituciones de aminoácidos incompatibles en los módulos de selectividad de dimerización. Este tipo de sustitución de aminoácidos se puede realizar usando técnicas de clonación molecular convencionales bien conocidas en la técnica, tales como la mutagénesis QuikChange®.
[0225] En algunos casos, un módulo de selectividad de dimerización incluye una cavidad modificada genéticamente (descrita más detalladamente en el presente documento) en el dominio constante del anticuerpo C<h>3. En otros casos, un módulo de selectividad de dimerización incluye una protuberancia modificada genéticamente (descrita más detalladamente en el presente documento) en el dominio constante del anticuerpo Ch3. Para formar selectivamente un dominio Fc, dos monómeros de dominio Fc con módulos de selectividad de dimerización compatibles, por ejemplo, un dominio constante de anticuerpo Ch3 que contiene una cavidad modificada genéticamente y el otro dominio constante de anticuerpo Ch3 que contiene una protuberancia modificada genéticamente, se combinan para formar una pareja de protuberancia en cavidad de monómeros del dominio Fc. Las protuberancias modificadas genéticamente y las cavidades modificadas genéticamente son ejemplos de módulos de selectividad heterodimerizantes, que se pueden preparar en los dominios constantes del anticuerpo Ch3 de monómeros de dominio Fc para promover una heterodimerización favorable de dos monómeros de dominio Fc que tienen módulos de selectividad heterodimerizantes compatibles.
[0226] En otros casos, un monómero del dominio Fc con un módulo de selectividad de dimerización que contiene sustituciones de aminoácidos cargados positivamente y un monómero del dominio Fc con un módulo de selectividad de dimerización que contiene sustituciones de aminoácidos cargados negativamente pueden combinarse selectivamente para formar un dominio Fc a través de la orientación de las interacciones electrostáticas favorable (descrita más adelante en el presente documento) de los aminoácidos cargados. En algunos casos, un monómero del dominio Fc puede incluir una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos con carga positiva y carga negativa: K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D y K439E. En un ejemplo, un monómero del dominio Fc que contiene una sustitución de aminoácidos con carga positiva, por ejemplo, D356K o E357K, y un monómero del dominio Fc que contiene una sustitución de aminoácidos con carga negativa, por ejemplo, K370D o K370E, pueden combinarse selectivamente para formar un monomero de Fc. dominio a través de la orientación de las interacciones electrostáticas favorable de los aminoácidos cargados. En otro ejemplo, un monómero del dominio Fc que contiene E357K y un monómero del dominio Fc que contiene K370D pueden combinarse selectivamente para formar un dominio Fc a través de la orientación de las interacciones electrostáticas favorable de los aminoácidos cargados. En algunos casos, se pueden usar sustituciones de aminoácidos de carga inversa como módulos de selectividad heterodimerizantes, en los que dos monómeros de dominio Fc que contienen sustituciones de aminoácidos de carga inversa diferentes, pero compatibles, se combinan para formar un dominio Fc heterodimérico. Los módulos de selectividad de dimerización específicos se enumeran además, sin limitación, en las Tablas 1 y 2A que se describen más adelante.
[0227] En otros casos, dos monómeros de dominio Fc incluyen módulos de selectividad homodimerizantes que contienen mutaciones de carga inversa idénticas en al menos dos posiciones dentro del anillo de residuos cargados en la interfaz entre dominios Ch3. Los módulos de selectividad homodimerizantes son sustituciones de aminoácidos de carga inversa que promueven la homodimerización de monómeros del dominio Fc para formar un dominio Fc homodimérico. Al invertir la carga de ambos miembros de dos o más pares complementarios de residuos en los dos monómeros del dominio Fc, los monómeros del dominio Fc mutados permanecen complementarios a los monómeros del dominio Fc de la misma secuencia mutada, pero tienen una menor complementariedad con los monómeros del dominio Fc sin esas mutaciones. En un caso, un dominio Fc incluye monómeros del dominio Fc que incluyen los mutantes dobles K409D/D399K, K392D/D399K, E357K/K370E, D356K/K439D, K409E/D399K, K392E/D399K, E357K/K370D o D356K/K439E. En otro caso, un dominio Fc incluye monómeros del dominio Fc que incluyen mutantes cuádruples que combinan cualquier par de mutantes dobles, por ejemplo, K409D/D399K/E357K/K370E. En las Tablas 2B y 2C se muestran además ejemplos de módulos de selectividad homodimerizantes.
[0228] Un monómero de dominio Fc no modificado puede ser un monómero de dominio Fc humano de origen natural o un monómero de dominio Fc humano WT. Un monómero de dominio Fc puede ser un monómero de dominio Fc humano de origen natural que comprende una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3; o una variante del mismo que tiene hasta 16 (por ejemplo, hasta 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16) modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, modificaciones de un aminoácido individual) para acomodar o promover la dimerización dirigida. En algunos casos, el dominio Fc incluye al menos una modificación de aminoácidos, en la que las modificaciones de aminoácidos alteran uno o más de (i) la afinidad de unión a uno o más receptores de Fc, (ii) funciones efectoras, (iii) el nivel de sulfatación del dominio Fc, (iv) semivida, (v) resistencia a proteasas, (vi) estabilidad del dominio Fc y/o (vii) susceptibilidad a la degradación (por ejemplo, en comparación con el dominio Fc no modificado). En casos adicionales, un monómero de dominio Fc que contiene (i) al menos una mutación de carga inversa y (ii) al menos una cavidad modificada genéticamente o al menos una protuberancia modificada genéticamente, puede combinarse selectivamente con otro monómero de dominio Fc que contiene (i) al menos una mutación de carga inversa y (ii) al menos una protuberancia modificada genéticamente o al menos una cavidad modificada genéticamente para formar un dominio Fc. Por ejemplo, un monómero de dominio Fc que contiene la mutación de carga inversa K370D y cavidades modificadas genéticamente Y349C, T366S, L368A e Y407V y otro monómero de dominio Fc que contiene la mutación de carga inversa E357K y protuberancias modificadas genéticamente S354C y T366W pueden combinarse selectivamente para formar un dominio Fc. En algunos casos, el dominio Fc incluye no más de 16 modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, no más de 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 modificaciones de aminoácidos en el dominio CH3).
[0229] La formación de dichos dominios Fc se promueve mediante las sustituciones de aminoácidos compatibles en los dominios constantes del anticuerpo Ch3. Dos módulos de selectividad de dimerización que contienen sustituciones de aminoácidos incompatibles, por ejemplo, ambos contienen cavidades modificadas genéticamente, ambos contienen protuberancias modificadas genéticamente o ambos contienen los mismos aminoácidos cargados en la interfaz Ch3-Ch3, no promoverán la formación de un dominio Fc heterodimérico.
[0230] Además, otros procedimientos usados para promover la formación de dominios Fc con monómeros de dominio Fc definidos incluyen, sin limitación, el enfoque l UZ-Y (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. WO2011034605) que incluye la fusión C-terminal de a- hélices de monómero de una cremallera de leucina a cada uno de los monómeros del dominio Fc para permitir la formación de heterodímeros, así como el enfoque del cuerpo del dominio modificado genéticamente por intercambio de cadena (SEED) (Davis et al., Protein Eng Des Sel. 23:195-202, 2010) que genera un dominio Fc con monómeros del dominio Fc heterodiméricos, incluyendo cada uno de los cuales segmentos alternos de secuencias de Ch3 de IgA e IgG.
VII. Cavidades modificadas genéticamente y protuberancias modificadas genéticamente
[0231] Carter y colaboradores (Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-612, 1996; Atwell et al., Protein Eng. 9:617-612, 1996; Atwell et a l . al., J Mol Biol. 270:26-35, 1997; Merchant et al., Nat Biotechnol. 16:677-681, 1998) describen el uso de cavidades modificadas genéticamente y protuberancias modificadas genéticamente o la estrategia “botón en ojal” (knob-into-hole). La interacción de botón y ojal favorece la formación de heterodímeros, mientras que la interacción botón-botón y ojal-ojal dificultan la formación de homodímeros debido al choque estérico y la eliminación de interacciones favorables. La técnica de "botón en ojal" también se describe en la patente de Estados Unidos No.
5.731.168.
[0232] En la presente divulgación, se utilizan cavidades modificadas genéticamente y protuberancias modificadas genéticamente en la preparación de las construcciones de Fc descritas en el presente documento. Una cavidad modificada genéticamente es un vacío que se crea cuando un aminoácido original en una proteína se reemplaza por un aminoácido diferente que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño. Una protuberancia modificada genéticamente es una protuberancia que se crea cuando un aminoácido original en una proteína se reemplaza por un aminoácido diferente que tiene un volumen de cadena lateral mayor. De manera específica, el aminoácido que se reemplaza está en el dominio constante del anticuerpo C<h>3 de un monómero del dominio Fc y está implicado en la dimerización de dos monómeros de dominio Fc. En algunos casos, se crea una cavidad modificada genéticamente en un dominio constante del anticuerpo C<h>3 para acomodar una protuberancia modificada genéticamente en otro dominio constante del anticuerpo C<h>3, de manera que ambos dominios constantes del anticuerpo C<h>3 actúan como módulos de selectividad de dimerización (por ejemplo, módulos de selectividad heterodimerizantes) (descritos anteriormente) que promueven o favorecen la dimerización de los dos monómeros del dominio Fc. En otros casos, se crea una cavidad modificada genéticamente en un dominio constante de anticuerpo C<h>3 para acomodar mejor un aminoácido original en otro dominio constante de anticuerpo Ch3. Aún en otros casos, se crea una protuberancia modificada genéticamente en un dominio constante de anticuerpo Ch3 para formar interacciones adicionales con aminoácidos originales en otro dominio constante de anticuerpo Ch3.
[0233] Se puede construir una cavidad modificada genéticamente reemplazando aminoácidos que contienen cadenas laterales más grandes, tales como tirosina o triptófano, por aminoácidos que contienen cadenas laterales más pequeñas, tales como alanina, valina o treonina. De manera específica, algunos módulos de selectividad de dimerización (por ejemplo, módulos de selectividad heterodimerizantes) (descritos con detalle más arriba) contienen cavidades modificadas genéticamente, tales como la mutación Y407V, en el dominio constante del anticuerpo Ch3. De manera similar, se puede construir una protuberancia modificada genéticamente reemplazando aminoácidos que contienen cadenas laterales más pequeñas por aminoácidos que contienen cadenas laterales más grandes. De manera específica, algunos módulos de selectividad de dimerización (por ejemplo, módulos de selectividad heterodimerizantes) (descritos con detalle más arriba) contienen protuberancias modificadas genéticamente, tales como la mutación T366W, en el dominio constante del anticuerpo C<h>3. En la presente divulgación, las cavidades modificadas genéticamente y las protuberancias modificadas genéticamente también se combinan con la modificación genética de enlaces disulfuro entre dominios Ch3 para mejorar la formación de heterodímeros. En un ejemplo, un monómero del dominio Fc que contiene las cavidades modificadas genéticamente Y349C, T366S, L368A e Y407V puede combinarse selectivamente con otro monómero del dominio Fc que contiene protuberancias modificadas genéticamente S354C y T366W para formar un dominio Fc. En otro ejemplo, un monómero de dominio Fc que contiene la cavidad modificada genéticamente Y349C y el monómero de dominio Fc que contiene la protuberancia modificada genéticamente S354C se pueden combinar selectivamente para formar un dominio Fc. Otras cavidades modificadas genéticamente y protuberancias modificadas genéticamente, en combinación con la modificación genética de enlaces disulfuro o cálculos estructurales (HA-TF mixtos) se incluyen, sin limitación, en la Tabla 1.
Tabla 1
Dominio constante de Dominio constante de
Estrategia anticuerpo CH Referencia<3>de anticuerpo CH<0>de
[0234] Se puede lograr la sustitución de un residuo de aminoácido original en el dominio constante del anticuerpo C<h>3 por un residuo de aminoácido diferente alterando el ácido nucleico que codifica el residuo de aminoácido original. El límite superior para el número de residuos de aminoácidos originales que se pueden reemplazar es el número total de residuos en la interfaz de los dominios constantes del anticuerpo C<h>3, dado que todavía se mantiene una interacción suficiente en la interfaz.
. ren ac n e as n eraccones eec ros cas
[0235] La orientación de las interacciones electrostáticas es la utilización de interacciones electrostáticas favorables entre aminoácidos con carga opuesta en péptidos, dominios proteicos y proteínas para controlar la formación de moléculas proteicas de orden superior. En la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2014-0024111 se describe un procedimiento para utilizar efectos de orientación de las interacciones electrostáticas para alterar la interacción de dominios de anticuerpos para reducir la formación de homodímeros a favor de la formación de heterodímeros en la generación de anticuerpos biespecíficos.
[0236] En la presente divulgación, se utiliza la orientación de las interacciones electrostáticas para controlar la dimerización de monómeros del dominio Fc y la formación de construcciones de Fc. En particular, para controlar la dimerización de monómeros del dominio Fc usando orientación de las interacciones electrostáticas, uno o más residuos de aminoácidos que forman la interfaz Ch3-Ch3 se reemplazan por residuos de aminoácidos cargados positiva o negativamente de manera que la interacción se vuelve electrostáticamente favorable o desfavorable dependiendo de los aminoácidos cargados específicos introducidos. En algunos casos, un aminoácido cargado positivamente en la interfaz, tal como lisina, arginina o histidina, se reemplaza por un aminoácido cargado negativamente, tal como ácido aspártico o ácido glutámico. En otros casos, un aminoácido cargado negativamente en la interfaz se reemplaza por un aminoácido cargado positivamente. Los aminoácidos cargados pueden introducirse en uno de los dominios constantes del anticuerpo Ch3 que interactúan, o en ambos. Al introducir aminoácidos cargados en los dominios constantes del anticuerpo C<h>3 que interactúan, se crean módulos de selectividad de dimerización (descritos más arriba) que pueden formar selectivamente dímeros de monómeros del dominio Fc controlados por los efectos de orientación de las interacciones electrostáticas resultantes de la interacción entre aminoácidos cargados.
[0237] En algunas realizaciones, para crear un módulo de selectividad de dimerización que incluye cargas inversas que pueden formar selectivamente dímeros de monómeros de dominio Fc controlados por los efectos de la orientación de las interacciones electrostáticas, los dos monómeros de dominio Fc pueden formarse selectivamente mediante heterodimerización u homodimerización.
Heterodimerización de monómeros de dominio Fc
[0238] La heterodimerización de monómeros del dominio Fc se puede promover introduciendo mutaciones diferentes, pero compatibles, en los dos monómeros del dominio Fc, tales como los pares de residuos de carga incluidos, sin limitación, en la Tabla 2A. En algunas realizaciones, un monómero del dominio Fc puede incluir una de las siguientes sustituciones de aminoácidos con carga positiva y carga negativa: D356K, D356R, E357K, E357R, K370D, K370E, K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D y K439E. En un ejemplo, un monómero del dominio Fc que contiene una sustitución de aminoácidos con carga positiva, por ejemplo, D356K o E357K, y un monómero del dominio Fc que contiene una sustitución de aminoácidos con carga negativa, por ejemplo, K370D o K370E, pueden combinarse selectivamente para formar un monomero de dominio Fc a través de una orientación de las interacciones electrostáticas favorable de los aminoácidos cargados. En otro ejemplo, un monómero del dominio Fc que contiene E357K y un monómero del dominio Fc que contiene K370D pueden combinarse selectivamente para formar un dominio Fc mediante orientación de las interacciones electrostáticas favorable de los aminoácidos cargados.
[0239] Por ejemplo, en una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc, dos de los tres dominios Fc pueden formarse mediante la heterodimerización de dos monómeros de dominio Fc, tal como lo promueven los efectos de orientación de interacciones electrostáticas. Un "dominio Fc heterodimérico" se refiere a un dominio Fc que se forma mediante la heterodimerización de dos monómeros de dominio Fc, en el que los dos monómeros de dominio Fc contienen diferentes mutaciones de carga inversa (módulos de selectividad heterodimerizantes) (ver, por ejemplo, mutaciones en la Tabla 2A) que promueven la formación favorable de estos dos monómeros del dominio Fc. Tal como se muestra en las FIGS. 1 y 2, en una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc, un dominio Fc "tallo" carboxilo terminal y dos dominios Fc "rama" amino terminal, cada uno de los dominios Fc "rama" amino terminal puede ser un dominio Fc heterodimérico (también llamado un "dominio Fc heterodimérico de rama") (por ejemplo, un dominio Fc heterodimérico formado por los monómeros de dominio Fc 106 y 114 o los monómeros de dominio Fc 112 y 116 en la Figura 1; un dominio Fc heterodimérico formado por los monómeros de dominio Fc 206 y 214 o los monómeros de dominio Fc 212 y 216 en la Figura 2). Un dominio Fc heterodimérico de rama puede formarse mediante un monómero de dominio Fc que contiene E357K y otro monómero de dominio Fc que contiene K370D.
Tabla 2A
Homodimerización de monómeros del dominio Fc
[0240] La homodimerización de monómeros del dominio Fc se puede promover introduciendo las mismas mutaciones de orientación de las interacciones electrostáticas (módulos de selectividad homodimerizantes) en ambos monómeros del dominio Fc de forma simétrica. En algunos casos, dos monómeros de dominio Fc incluyen módulos de selectividad homodimerizantes que contienen mutaciones de carga inversa idénticas en al menos dos posiciones dentro del anillo de residuos cargados en la interfaz entre dominios Ch3. Al invertir la carga de ambos miembros de dos o más pares complementarios de residuos en los dos monómeros del dominio Fc, los monómeros del dominio Fc mutados permanecen complementarios a los monómeros del dominio Fc de la misma secuencia mutada, pero tienen una menor complementariedad con los monómeros del dominio Fc sin esas mutaciones. Las mutaciones de orientación de las interacciones electrostáticas que pueden introducirse en un monómero del dominio Fc para promover su homodimerización se muestran, sin limitación, en las Tablas 2B y 2C. En un caso, un dominio Fc incluye dos monómeros del dominio Fc, cada uno de los cuales incluye los mutantes de doble carga inversa (Tabla 2B), por ejemplo, K409D/D399K. En otro caso, un dominio Fc incluye dos monómeros del dominio Fc, cada uno de los cuales incluye mutantes inversos cuádruples (Tabla 2C), por ejemplo, K409D/D399K/K370D/E357K.
[0241] Por ejemplo, en una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc, uno de los tres dominios Fc puede formarse mediante la homodimerización de dos monómeros del dominio Fc, tal como lo promueven los efectos de orientación de interacciones electrostáticas. Un "dominio Fc homodimérico" se refiere a un dominio Fc que se forma mediante la homodimerización de dos monómeros de dominio Fc, en el que los dos monómeros de dominio Fc contienen las mismas mutaciones de carga inversa (véanse, por ejemplo, mutaciones en las Tablas 2B y 2C). Tal como se muestra en las FIGS. 1 y 2, en una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc, un dominio Fc "tallo" carboxilo terminal y dos dominios Fc "rama" amino terminal, el dominio Fc "tallo" carboxilo terminal puede ser un dominio Fc homodimérico (también llamado "dominio Fc homodimérico de tallo") (por ejemplo, un dominio Fc homodimérico formado por los monómeros de dominio Fc 104 y 110 en la FIG. 1; un dominio Fc homodimérico formado por los monómeros de dominio Fc 204 y 210 en la FIG. 2). Un dominio Fc homodimérico de tallo puede estar formado por dos monómeros de dominio Fc que contienen cada uno los mutantes dobles K409D/D399K.
Tabla 2B
Tabla 2C
VI. Enlazadores
[0242] En la presente divulgación, se usa un enlazador para describir un enlace o conexión entre polipéptidos o dominios proteicos y/o restos no proteicos asociados. En algunos casos, un enlazador es un enlace o conexión entre al menos dos monómeros de dominio Fc, para los cuales el enlazador conecta el extremo C terminal del dominio constante del anticuerpo Ch3 de un primer monómero del dominio Fc con el extremo N terminal del dominio bisagra de un segundo monómero del dominio Fc, de modo que los dos monómeros de dominio Fc estén unidos entre sí en serie en tándem. En otros casos, un enlazador es un enlace entre un monómero del dominio Fc y cualquier otro dominio proteico que esté unido al mismo. Por ejemplo, un enlazador puede unir el extremo C terminal del dominio constante del anticuerpo Ch3 de un monómero del dominio Fc al extremo N terminal de un péptido de unión a albúmina.
[0243] Un enlazador puede ser un enlace covalente simple, por ejemplo, un enlace peptídico, un polímero sintético, por ejemplo, un polímero de polietilenglicol (PEG), o cualquier tipo de enlace creado a partir de una reacción química, por ejemplo, conjugación química. En el caso de que un enlazador sea un enlace peptídico, el grupo ácido carboxílico en el extremo C terminal de un dominio de proteína puede reaccionar con el grupo amino en el extremo N terminal de otro dominio de proteína en una reacción de condensación para formar un enlace peptídico. De manera específica, el enlace peptídico se puede formar a partir de medios sintéticos a través de una reacción de química orgánica convencional bien conocida en la técnica, o mediante producción natural a partir de una célula huésped, en donde una secuencia de polinucleótidos que codifica las secuencias de ADN de ambas proteínas, por ejemplo, dos monómeros de dominio Fc, en serie en tándem, puede transcribirse y traducirse directamente en un polipéptido contiguo que codifica ambas proteínas mediante las maquinarias moleculares necesarias, por ejemplo, ADN polimerasa y ribosoma, en la célula huésped.
[0244] En el caso de que un enlazador sea un polímero sintético, por ejemplo, un polímero de PEG, el polímero puede funcionalizarse con grupos funcionales químicos reactivos en cada extremo para reaccionar con los aminoácidos terminales en los extremos de conexión de dos proteínas.
[0245] En el caso de que un enlazador (excepto el enlace peptídico mencionado anteriormente) se prepare a partir de una reacción química, se pueden unir grupos funcionales químicos, por ejemplo, amina, ácido carboxílico, éster, azida u otros grupos funcionales comúnmente utilizados en la técnica, de manera sintética al extremo C terminal de una proteína y al extremo N terminal de otra proteína, respectivamente. Los dos grupos funcionales pueden entonces reaccionar a través de medios de química sintética para formar un enlace químico, conectando así las dos proteínas. Dichos procedimientos de conjugación química son rutinarios para los expertos en la técnica.
Espaciador
[0246] En la presente divulgación, un enlazador entre dos monómeros de dominio Fc puede ser un espaciador de aminoácidos que incluye 3-200 aminoácidos (por ejemplo, 3-200, 3-180, 3-160, 3-140, 3-120, 3-100, 3-90, 3-80, 3-70, 3-60, 3-50, 3-45, 3-40, 3-35, 3-30, 3-25, 3-20, 3-15, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-200, 5-200, 6-200, 7-200, 8 200, 9-200, 10-200, 15-200, 20-200, 25-200, 30-200, 35-200, 40-200, 45-200, 50-200, 60-200, 70-200, 80-200, 90 200, 100-200, 120-200, 140-200, 160-200 o 180-200 aminoácidos) (por ejemplo, 3-150, 3-100, 3-60, 3-50, 3- 40, 3-30, 3-20, 3-10, 3-8, 3-5, 4-30, 5-30, 6-30, 8-30, 10-20, 10-30, 12-30, 14-30, 20-30, 15-25, 15-30, 18-22 y 20-30 aminoácidos). En algunos casos, un enlazador entre dos monómeros de dominio Fc es un espaciador de aminoácidos que contiene al menos 12 aminoácidos, tales como 12-200 aminoácidos (por ejemplo, 12 -200 , 12-180, 12-160, 12 140, 12 -120, 12-100, 12-90, 12-80, 12-70, 12-60, 12-50, 12-40, 12-30, 12-20, 12-19, 12-18, 12-17, 12-16, 12-15, 12 14 o 12-13 aminoácidos) (por ejemplo, 14-200, 16-200, 18-200, 20-200, 30-200, 40-200, 50-200, 60-200, 70-200, 80 200, 90-200, 100-200, 120-200, 140-200, 160-200, 180-200 o 190-200 aminoácidos) (por ejemplo, 3-150, 3-100, 3-60, 3-50, 3-40, 3-30, 3-20, 3-10, 3-8, 3-5, 4-30, 5-30, 6-30, 8 -30, 10-20, 10-30, 12-30, 14-30, 20-30, 15-25, 15-30, 18-22 y 20-30 aminoácidos). En algunos casos, un enlazador entre dos monómeros de dominio Fc es un espaciador de aminoácidos que contiene de 12 a 30 aminoácidos (por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 aminoácidos). Los espaciadores peptídicos adecuados son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, enlazadores peptídicos que contienen residuos de aminoácidos flexibles, tales como glicina y serina. En ciertos casos, un espaciador puede contener motivos, por ejemplo, motivos múltiples o repetidos, de GS, GGS, GGGGS (SEQ ID NO: 1), G<g>S<g>(SEQ ID NO: 2) o S<g>G<g>(SEQ ID NO: 3). En ciertos casos, un espaciador puede contener de 2 a 12 aminoácidos que incluyen motivos de GS, por ejemplo, GS, GSGS (SEQ ID NO: 4), GSGSGS (SEQ ID NO: 5), GSGSGSGS (SEQ ID NO: 6 ), GSGSGSGSGS. (SEQ ID NO: 7), o GSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 8 ). En ciertos otros casos, un espaciador puede contener de 3 a 12 aminoácidos, incluidos motivos de GGS, por ejemplo, GGS, GGSGGS (SEQ ID NO: 9), GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 10) y GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11). En aún otros casos, un espaciador puede contener de 4 a 20 aminoácidos, incluidos motivos de GGSG (SEQ ID NO: 2), por ejemplo, GGSGGGSG (SEQ ID NO: 12), GGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 13), GGSGGGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 13), NO: 14), o GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 15). En otros casos, un espaciador puede contener motivos de GGGGS (SEQ ID NO: 1), por ejemplo, GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 16) o GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 17). En ciertos casos, un espaciador es SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 18).
[0247] En algunos casos, un espaciador entre dos monómeros de dominio Fc contiene sólo residuos de glicina, por ejemplo, al menos 4 residuos de glicina (por ejemplo, 4-200, 4-180, 4-160, 4-140, 4-40, 4 -100, 4-90, 4-80, 4-70, 4-60, 4-50, 4-40, 4-30, 4-20, 4-19, 4-18, 4-17, 4-16, 4-15, 4-14, 4-13, 4-12, 4-11,4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6 o 4-5 residuos de glicina) (por ejemplo, 4-200, 6-200, 8-200, 10-200, 12-200, 14-200, 16-200, 18-200, 20-200, 30-200, 40-200, 50-200, 60-200, 70-200, 80-200, 90-200, 100-200, 120-200, 140-200, 160-200, 180-200, 190-200 o 20 residuos de glicina). En ciertos casos, un espaciador tiene de 4 a 30 residuos de glicina (por ejemplo, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 residuos de glicina). En algunas realizaciones, un espaciador que contiene solo residuos de glicina puede no estar glicosilado (por ejemplo, glicosilación ligada a O, también denominada O-glicosilación) o puede tener un nivel disminuido de glicosilación (por ejemplo, un nivel disminuido de O-glicosilación) (por ejemplo, un nivel disminuido de O-glicosilación con glicanos, tales como xilosa, manosa, ácidos siálicos, fucosa (Fuc) y/o galactosa (Gal) (por ejemplo, xilosa)) en comparación con, por ejemplo, un espaciador que contiene uno o más residuos de serina (por ejemplo, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ iD NO: 18)) (ver Ejemplo 4).
[0248] En algunas realizaciones, un espaciador que contiene solo residuos de glicina puede no estar O-glicosilado (por ejemplo, O-xilosilación) o puede tener un nivel disminuido de O-glicosilación (por ejemplo, un nivel disminuido de 0 - xilosilación) en comparación con, por ejemplo, un espaciador que contiene uno o más residuos de serina (por ejemplo, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 18)).
[0249] En algunas realizaciones, un espaciador que contiene solo residuos de glicina puede no experimentar proteólisis o puede tener una tasa de proteólisis disminuida en comparación con, por ejemplo, un espaciador que contiene uno o más residuos de serina (por ejemplo, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ iD NO: 18)) (ver Ejemplo 4).
[0250] En ciertos casos, un espaciador puede contener motivos de GGGG (SEQ ID NO: 19), por ejemplo, GGGGGGGG (SEQ ID NO: 20), GGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 21), GGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 22), oGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 23). En ciertos casos, un espaciador puede contener motivos de GGGGG (SEQ ID NO:24), por ejemplo, GGGGGGGGGG (SEQ ID NO:25) o GGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:26). En ciertos casos, un espaciador es GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27).
[0251] En otros casos, un espaciador también puede contener aminoácidos distintos de glicina y serina, por ejemplo, GENLYFQSGG (SEQ ID NO: 28), SACYCELS (SEQ ID NO: 29), RSIAT (SEQ ID NO: 30), RPACKIPNDLKQKVMNH (SEQ ID NO: 31), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (SEQ ID NO: 32), AAANSSIDLISVPVDSR (SEQ ID NO: 33), o GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGSGGGS (SEQ ID NO: 34).
[0252] En ciertos casos en la presente divulgación, se usa un espaciador peptídico de 12 o 20 aminoácidos para conectar dos monómeros del dominio Fc en serie en tándem (por ejemplo, polipéptidos 102 y 108 en la FlG. 1 ; polipéptidos 202 y 208 en la FlG. 2), los espaciadores peptídicos de 12 y 20 aminoácidos que consisten en las secuencias GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 35) y SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 18), respectivamente. En otros casos, se puede utilizar un espaciador peptídico de 18 aminoácidos que consiste en la secuencia GGSGGGSGGGSGGGSGGS (SEQ ID NO: 36).
[0253] En algunos casos, un espaciador entre dos monómeros de dominio Fc comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que es al menos un 75 % idéntica (por ejemplo, al menos 77 %, 79 %, 81 %, 83 %, 85 %, 87 %, 89 %, 91 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o 99,5 % idéntica) a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 1- 36 descritas anteriormente. En ciertos casos, un espaciador entre dos monómeros de dominio Fc comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que es al menos un 80 % idéntica (por ejemplo, al menos un 82 %, 85 %, 87 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 99 % o 99,5 % idéntica) a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 17, 18, 26 y 27. En ciertos casos, un espaciador entre dos monómeros de dominio Fc comprende, consiste en o consiste esencialmente en una secuencia que es al menos 80 % idéntica (por ejemplo, al menos 82 %, 85 %, 87 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 99 % o 99,5 %) a la secuencia de SEQ ID NO: 18 o 27. En ciertos casos, un espaciador entre dos monómeros del dominio Fc comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-36 descritas anteriormente.
VII. Péptidos de unión a proteínas séricas
[0254] La unión a péptidos de proteínas séricas puede mejorar la farmacocinética de productos farmacéuticos proteicos y, en particular, las construcciones de Fc descritas en el presente documento pueden fusionarse con péptidos de unión a proteínas séricas.
[0255] Tal como ejemplo, los péptidos de unión a albúmina que se pueden usar en los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento son generalmente conocidos en la técnica. En una realización, el péptido de unión a albúmina incluye la secuencia DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 37). En algunas realizaciones, el péptido de unión a albúmina tiene una secuencia que es al menos 80 % idéntica (por ejemplo, 80 %, 90 % o 100 % idéntica) a la secuencia de SEQ ID NO: 37.
[0256] En la presente divulgación, los péptidos de unión a albúmina pueden unirse al extremo N o C terminal de ciertos polipéptidos en la construcción de Fc. En una realización, un péptido de unión a albúmina puede unirse al extremo C terminal de uno o más polipéptidos en las construcciones de Fc 1-4 (FIGS. 1 y 2). En otra realización, se puede fusionar un péptido de unión a albúmina al extremo C terminal del polipéptido que codifica dos monómeros de dominio Fc unidos en serie en tándem en las construcciones de Fc 1-4 (por ejemplo, polipéptidos 102 y 108 en la Figura 1 y polipéptidos 202 y 208 en la Figura 2). En aún otra realización, se puede unir un péptido de unión a albúmina al extremo C terminal del monómero de dominio Fc (por ejemplo, monómeros de dominio Fc 114 y 116 en la Figura 1; monómeros de dominio Fc 214 y 216 en la Figura 2) que está unido al segundo monómero del dominio Fc en el polipéptido que codifica los dos monómeros de dominio Fc unidos en serie en tándem. Los péptidos de unión a albúmina pueden fusionarse genéticamente a construcciones de Fc o unirse a construcciones de Fc mediante medios químicos, por ejemplo, conjugación química. Si se desea, se puede insertar un espaciador entre la construcción de Fc y el péptido de unión a albúmina. Sin estar vinculado a una teoría, se espera que la inclusión de un péptido de unión a albúmina en una construcción de Fc de la divulgación pueda conducir a una retención prolongada de la proteína terapéutica a través de su unión a la albúmina sérica.
VIII. Construcciones de Fc
[0257] En general, la divulgación presenta construcciones de Fc que tienen dominios Fc (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc). Estos pueden tener mayor afinidad de unión y/o avidez que un único dominio Fc de tipo salvaje para un receptor Fc, por ejemplo, FcyRIIIa. La divulgación describe procedimientos de modificación de aminoácidos en la interfaz de dos dominios constantes de anticuerpos Ch3 que interactúan, de modo que los dos monómeros de dominio Fc de un dominio Fc formen selectivamente un dímero entre sí, evitando así la formación de multímeros o agregados no deseados. Una construcción de Fc incluye un número par de monómeros del dominio Fc, formando cada par de monómeros del dominio Fc un dominio Fc. Una construcción de Fc incluye, como mínimo, un dominio Fc funcional formado a partir de un dímero de dos monómeros del dominio Fc. En algunas realizaciones, las construcciones de Fc descritas en el presente documento no incluyen una región de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, un dominio variable (por ejemplo, Vh, Vl, una región hipervariable (HVR)) o una región determinante de complementariedad (CDR). En algunas realizaciones, las construcciones de Fc descritas en el presente documento incluyen una región de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, un dominio variable (por ejemplo, Vh, Vl, un HVR) o una CDR.
[0258] Se puede formar una construcción de Fc que contiene tres dominios Fc a partir de cuatro polipéptidos (FIGS. 1 y 2 ). El primer y segundo polipéptidos (por ejemplo, los polipéptidos 102 y 108 en la FIG. 1 ; los polipéptidos 202 y 208 en la FIG. 2) pueden ser iguales o diferentes, al igual que el tercer y cuarto polipéptidos (por ejemplo, los polipéptidos 114 y 116 en la FIG. 1; polipéptidos 214 y 216 en la Figura 2). En la Fig. 1, el primer y el segundo polipéptido codifican ambos dos monómeros de dominio Fc (por ejemplo, monómeros de dominio Fc 104, 106, 110 y 112) conectados mediante un enlazador en serie en tándem, en la que un monómero de dominio Fc contiene sustituciones de aminoácidos cargados en el dominio constante del anticuerpo C<h>3 (por ejemplo, monómeros de dominio Fc 104 y 110), mientras que el otro monómero de dominio Fc contiene una protuberancia en el dominio constante del anticuerpo Ch3 (porr ejemplo, monómeros de dominio Fc 106 y 112). Los polipéptidos tercero y cuarto codifican ambos un monómero de dominio Fc con una cavidad (por ejemplo, monómeros de dominio Fc 114 y 116). Se puede formar un dominio Fc homodimérico de tallo combinando los monómeros de dominio Fc 104 y 110, cada uno de los cuales contiene las mismas mutaciones de carga inversa en su dominio constante del anticuerpo Ch3 (por ejemplo, cada uno de los monómeros de dominio Fc 104 y 110 contiene D399K y K409D. Un primer dominio Fc heterodimérico de rama se puede formar combinando los monómeros de dominio Fc 106 y 114 (por ejemplo, el monómero de dominio Fc 106 contiene protuberancias modificadas genéticamente S354C y T366W, y el monómero de dominio Fc 114 contiene cavidades modificadas genéticamente Y349C, T366S, L368A e Y409V). Un segundo dominio Fc heterodimérico puede formarse combinando los monómeros de dominio Fc 112 y 116 (por ejemplo, el monómero de dominio Fc 112 contiene protuberancias modificadas genéticamente S354C y T366W, y el monómero de dominio Fc 116 contiene cavidades modificadas genéticamente Y349C, T366S, L368A e Y409V).
[0259] En la FIG. 2, el primer y el segundo polipéptido codifican ambos dos monómeros del dominio Fc (por ejemplo, monómeros de dominio Fc 204, 206, 210 y 212) conectados mediante un enlazador en serie en tándem, en la que un monómero del dominio Fc contiene sustituciones de aminoácidos cargados en el dominio constante del anticuerpo C<h>3 (por ejemplo, monómeros de dominio Fc 204 y 210), mientras que el otro monómero de dominio Fc contiene una protuberancia y sustituciones de aminoácidos cargados en el dominio constante del anticuerpo C<h>3 (por ejemplo, monómeros de dominio Fc 206 y 212). Los polipéptidos tercero y cuarto codifican ambos un monómero de dominio Fc con una cavidad y sustituciones de aminoácidos cargados (por ejemplo, monómeros de dominio Fc 214 y 216). Se puede formar un dominio Fc homodimérico de tallo combinando los monómeros de dominio Fc 204 y 210, cada uno de los cuales contiene las mismas mutaciones de carga inversa en su dominio constante del anticuerpo C<h>3 (por ejemplo, cada uno de los monómeros de dominio Fc 204 y 210 contiene D399K y K409D. Se puede formar un primer dominio Fc heterodimérico de rama combinando los monómeros de dominio Fc 206 y 214 (por ejemplo, el monómero de dominio Fc 206 contiene las protuberancias modificadas genéticamente S354C y T366W y la mutación de carga inversa E357K, y el monómero de dominio Fc 214 contiene las cavidades modificadas genéticamente Y349C, T366S, L368A, y Y409V y mutación de carga inversa K370D). Se puede formar un segundo dominio Fc heterodimérico combinando los monómeros de dominio Fc 212 y 216 (por ejemplo, el monómero de dominio Fc 212 contiene las protuberancias modificadas genéticamente S354C y T366<w>y la mutación de carga inversa E357K, y el monómero de dominio Fc 216 contiene las cavidades modificadas genéticamente Y349C, T366S, L368A e Y409V y la mutación de carga inversa K370D).
[0260] En casos adicionales, un monómero de dominio Fc que contiene (i) al menos una mutación de carga inversa y (ii) al menos una cavidad modificada genéticamente o al menos una protuberancia modificada genéticamente, puede combinarse selectivamente con otro monómero de dominio Fc que contiene (i) al menos una mutación de carga inversa y (ii) al menos una protuberancia modificada genéticamente o al menos una cavidad modificada genéticamente para formar un dominio Fc. Por ejemplo, un monómero de dominio Fc que contiene la mutación de carga inversa K370D y las cavidades modificadas genéticamente Y349C, T366S, L368A e Y407V y otro monómero de dominio Fc que contiene la mutación de carga inversa E357K y las protuberancias modificadas genéticamente S354C y T366<w>pueden combinarse selectivamente para formar un dominio Fc.
[0261] En algunos casos, en una construcción de Fc que incluye: a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que i) A incluye un primer monómero de dominio Fc; ii) L es un enlazador; y iii) B incluye un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que i) A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; ii) L' es un enlazador; y iii) B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye un quinto monómero de dominio Fc; y d) un cuarto polipéptido que incluye un sexto monómero de dominio Fc; en la que B y B' se combinan para formar un primer dominio Fc, A y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y A' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc. Ejemplos de algunos mutaciones de aminoácidos que pueden incorporarse en los monómeros del dominio Fc en la construcción de Fc se muestran en las Tablas 3A-3D. En algunos casos, cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto en la construcción de Fc carece de una lisina C-terminal. En algunos casos, el Asp N-terminal en cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto en la construcción de Fc está mutado a Gln. En algunos casos, cada uno de L y L' comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27).
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[0262] En algunos casos, una construcción de Fc contiene dos dominios Fc formados a partir de tres polipéptidos. El primer polipéptido contiene dos monómeros de dominio Fc unidos en serie en tándem unidos mediante un enlazador (por ejemplo, un espaciador de glicina; SEQ ID NO: 26 y 27), y el segundo y tercer polipéptidos contienen un monómero de dominio Fc. El segundo y tercer polipéptidos pueden ser el mismo polipéptido o pueden ser polipéptidos diferentes. La figura 13 representa un ejemplo de dicha construcción de Fc. El primer polipéptido (1302) contiene dos monómeros de dominio Fc (1304 y 1306) unidos en serie en tándem mediante un enlazador (por ejemplo, un espaciador de glicina; SEQ ID NO: 26 y 27). Ambos monómeros de dominio Fc 1304 y 1306 contienen protuberancias modificadas genéticamente en los dominios constantes del anticuerpo Ch3. Los polipéptidos segundo y tercero (1308 y 1310) contienen cada uno un monómero de dominio Fc que tiene cavidades modificadas genéticamente en el dominio constante del anticuerpo C<h>3. Uno de los monómeros del dominio Fc (1304) en el primer polipéptido forma un primer dominio Fc heterodimérico con el segundo polipéptido (1308), mientras que el otro monómero de dominio Fc (1306) en el primer polipéptido forma un segundo dominio Fc heterodimérico con el tercer polipéptido. (1310). El segundo y tercer polipéptidos no están unidos ni unidos entre sí. La interfaz de Ch3-Ch3 de protuberancia en cavidad modificada genéticamente favorece la formación de heterodímeros de monómeros de dominio Fc y previene la formación incontrolada de multímeros no deseados. En algunos casos, cada uno de los monómeros de dominio Fc puede contener además mutaciones de carga inversa para promover la heterodimerización. Por ejemplo, el monómero de dominio Fc 1304 que tiene protuberancias modificadas genéticamente y mutaciones de carga inversa (por ejemplo, E357K) puede formar favorablemente un dominio Fc heterodimérico con el monómero de dominio Fc 1308 que tiene cavidades modificadas genéticamente y mutaciones de carga inversa (por ejemplo, K370D).
[0263] En aun otros casos, las construcciones de Fc pueden contener cinco dominios Fc formados a partir de seis polipéptidos. En las FIGS. 14 y 15 se representan dos ejemplos. Si bien estas construcciones de Fc representadas constan de seis polipéptidos, cuatro de los polipéptidos pueden codificarse por el mismo ácido nucleico y los dos polipéptidos restantes también pueden codificarse por el mismo ácido nucleico. Como resultado, estas construcciones de Fc pueden producirse mediante la expresión de dos ácidos nucleicos en una célula huésped adecuada.
[0264] La FIG. 14 es una ilustración de una construcción de Fc que contiene cinco dominios Fc formados a partir de seis polipéptidos. El primer y segundo polipéptido (1402 y 1410) contienen cada uno tres monómeros de dominio Fc (1404, 1406, 1408 y 1412, 1414, 1416, respectivamente) unidos en una serie en tándem mediante un enlazador (por ejemplo, un espaciador de glicina; SEQ DNI: 26 y 27). De manera específica, en el polipéptido 1402 o 1410, un primer monómero de dominio Fc que contiene protuberancias (1404 o 1412) está conectado a un segundo monómero de dominio Fc que contiene diferentes aminoácidos cargados en la interfaz C<h>3-C<h>3 (1406 o 1414) a la secuencia de tipo salvaje, que está conectado a un tercer monómero de dominio Fc que contiene protuberancias (1408 o 1416). Los monómeros de dominio Fc 1406 y 1414 pueden contener cada uno las mismas mutaciones de carga inversa (por ejemplo, D399K/K409D) que promueven la formación de un dominio Fc homodimérico. Los polipéptidos tercero a sexto (1418, 1420, 1422 y 1424) contienen cada uno un monómero de dominio Fc que contiene una cavidad y forman un dominio Fc heterodimérico con cada uno de los monómeros de dominio Fc 1404, 1408, 1412 y 1416, respectivamente. En algunos casos, cada uno de los monómeros de dominio Fc 1404, 1408, 1412, 1416, 1418, 1420, 1422 y 1424 puede contener además mutaciones de carga inversa para promover la heterodimerización. Por ejemplo, el monómero de dominio Fc 1408 que tiene protuberancias modificadas genéticamente y mutaciones de carga inversa (por ejemplo, E357K) puede formar favorablemente un dominio Fc heterodimérico con el monómero de dominio Fc 1420 que tiene cavidades modificadas genéticamente y mutaciones de carga inversa (por ejemplo, K370D).
[0265] La FIG. 15 es una ilustración de una construcción de Fc que contiene cinco dominios Fc formados a partir de seis polipéptidos. El primer y segundo polipéptido (1502 y 1510) contienen cada uno tres monómeros de dominio Fc (1504, 1506, 1508 y 1512, 1514, 1516, respectivamente) unidos en una serie en tándem mediante un enlazador (por ejemplo, un espaciador de glicina; SEQ ID NO: 26 y 27). De manera específica, en el polipéptido 1502 o 1510, un primer monómero de dominio Fc que contiene protuberancias (1504 o 1512) está conectado a un segundo monómero de dominio Fc que contiene protuberancias (1506 o 1514), que está conectado a un tercer monómero de dominio Fc que contiene diferentes aminoácidos cargados en la interfaz Ch3-Ch3 (1508 o 1516) a la secuencia de tipo salvaje. Los monómeros de dominio Fc 1508 y 1516 pueden contener cada uno las mismas mutaciones de carga inversa (por ejemplo, D399K/K409D) que promueven la formación de un dominio Fc homodimérico. Los polipéptidos tercero a sexto (1518, 1520, 1522 y 1524) contienen cada uno un monómero de dominio Fc que contiene una cavidad y forman un dominio Fc heterodimérico con cada uno de los monómeros de dominio Fc 1504, 1506, 1512 y 1514, respectivamente. En algunos casos, cada uno de los monómeros del dominio Fc 1504, 1506, 1512, 1514, 1518, 1520, 1522 y 1524 puede contener además mutaciones de carga inversa para promover la heterodimerización. Por ejemplo, el monómero de dominio Fc 1504 que tiene protuberancias modificadas genéticamente y mutaciones de carga inversa (por ejemplo, E357K) puede formar favorablemente un dominio Fc heterodimérico con el monómero de dominio Fc 1518 que tiene cavidades modificadas genéticamente y mutaciones de carga inversa (por ejemplo, K370D).
[0266] La FIG. 16 es una ilustración de otra construcción de Fc que contiene cinco dominios Fc formados a partir de seis polipéptidos. El primer y segundo polipéptido (1602 y 1610) contienen cada uno tres monómeros de dominio Fc (1604, 1606, 1608 y 1612, 1614, 1616, respectivamente) unidos en una serie en tándem mediante un enlazador (por ejemplo, un espaciador de glicina; SEQ ID NO: 26 y 27). De manera específica, en el polipéptido 1602 o 1610, un primer monómero de dominio Fc que contiene diferentes aminoácidos cargados en la interfaz C<h>3-C<h>3 (1604 o 1612) está conectado a un segundo monómero de dominio Fc que contiene protuberancias (1606 o 1614), que está conectado a un tercer monómero de dominio Fc que contiene protuberancias (1608 o 1616), que la secuencia de tipo salvaje. Los monómeros de dominio Fc 1604 y 1612 pueden contener cada uno las mismas mutaciones de carga inversa (por ejemplo, D399K/K409D) que promueven la formación de un dominio Fc homodimérico. Los polipéptidos tercero a sexto (1618, 1620, 1622 y 1624) contienen cada uno un monómero de dominio Fc que contiene una cavidad y forman un dominio Fc heterodimérico con cada uno de los monómeros de dominio Fc 1606 , 1608, 1614 y 1616, respectivamente. En algunos casos, cada uno de los monómeros del dominio Fc 1606, 1608, 1614, 1616, 1618, 1620, 1622 y 1624 puede contener además mutaciones de carga inversa para promover la heterodimerización. Por ejemplo, el monómero de dominio Fc 1608 que tiene protuberancias modificadas genéticamente y mutaciones de carga inversa (por ejemplo, E357K) puede formar favorablemente un dominio Fc heterodimérico con el monómero de dominio Fc 1620 que tiene cavidades modificadas genéticamente y mutaciones de carga inversa (por ejemplo, K370D).
[0267] En otro caso, se puede formar una construcción de Fc que contiene dos o más dominios Fc a partir de dos polipéptidos que tienen la misma secuencia primaria. Una construcción de este tipo puede formarse a partir de la expresión de una única secuencia polipeptídica en una célula huésped. En la FIG. 17 se representa un ejemplo. En este ejemplo, un único ácido nucleico es suficiente para codificar una construcción de Fc que contiene tres dominios Fc. Se permite que dos monómeros de dominio Fc que son parte del mismo polipéptido formen un dominio Fc heterodimérico mediante la inclusión de un enlazador flexible de longitud y flexibilidad suficientes. Este mismo polipéptido también contiene un tercer monómero de dominio Fc unido mediante un enlazador flexible (por ejemplo, un espaciador de glicina; SEQ ID NO: 26 y 27). Este tercer monómero de dominio Fc (1708) es capaz de unirse a otro monómero de dominio Fc (1716) para formar un dominio Fc homodimérico y producir la construcción de Fc en forma de Y representada en la FIG. 17. La formación de dominios Fc se puede controlar mediante el uso de módulos de selectividad de dimerización, tal como también se representa en la FIG. 17. En algunos casos, cada uno de los monómeros de dominio Fc 1704, 1706, 1712 y 1714 puede contener además mutaciones de carga inversa para promover la heterodimerización. Por ejemplo, el monómero de dominio Fc 1704 que tiene protuberancias modificadas genéticamente y mutaciones de carga inversa (por ejemplo, E357K) puede formar favorablemente un dominio Fc heterodimérico con el monómero de dominio Fc 1706 que tiene cavidades modificadas genéticamente y mutaciones de carga inversa (por ejemplo, K370D).
[0268] En algunos casos, uno o más polipéptidos Fc en una construcción de Fc (por ejemplo, construcción de Fc 1-3 en la Figura 1; construcción de Fc 4 en la Figura 2) carecen de un residuo de lisina C-terminal. En algunos casos, todos los polipéptidos Fc en una construcción de Fc carecen de un residuo de lisina C-terminal. En algunos casos, la ausencia de una lisina C-terminal en uno o más polipéptidos Fc en una construcción de Fc puede mejorar la homogeneidad de una población de una construcción de Fc (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc), por ejemplo, una población de una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc que es sustancialmente homogénea (ver Ejemplo 8 ). En un ejemplo, el residuo de lisina C-terminal en un polipéptido Fc que tiene la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 43 y 44 (ver Ejemplo 1, Tabla 6 ) puede eliminarse para generar un polipéptido Fc correspondiente que no contiene un residuo de lisina C-terminal.
[0269] En algunos casos, uno o más polipéptidos Fc en una construcción de Fc incluyen las mutaciones S267E/L328F. En algunos casos, la construcción de Fc es la construcción de Fc 4 y la construcción incluye las mutaciones S267E/L328F. Esta mutación aumenta la afinidad de unión de la construcción de Fc a FcYRIIb.
[0270] En algunos casos, un monómero de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) puede tener una secuencia que es al menos un 95 % idéntica (por ejemplo, al menos 97 %, 99 %, o 99,5 % idéntica) a la secuencia de un monómero de dominio Fc de tipo salvaje (por ejemplo, SEQ ID NO: 42). En algunos casos, un monómero de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) puede tener una secuencia que es al menos un 95 % idéntica (por ejemplo, al menos 97 %, 99 % o 99,5 % idéntica) a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 44, 46, 48 y 50-53. En ciertos casos, un monómero de dominio Fc en la construcción de Fc puede tener una secuencia que es al menos un 95 % idéntica (por ejemplo, al menos 97 %, 99 % o 99,5 % idéntica) a la secuencia de SEQ ID No : 48, 52, y 53.
[0271] En algunos casos, un polipéptido que tiene dos monómeros de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, polipéptidos 102 y 108 en la FIG. 1; polipéptidos 202 y 208 en la FIG.2) puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en de una secuencia que es al menos un 95 % idéntica (por ejemplo, al menos 97 %, 99 % o 99,5 % idéntica) a la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 43, 45, 47 y 49 (ver Ejemplo 1, Tabla 6 ). En ciertos casos, un polipéptido que tiene dos monómeros de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en una secuencia que es al menos un 95 % idéntica (por ejemplo, al menos un 97 %, 99 % o 99,5 % idéntica) a la secuencia de SEQ ID NO: 49. En algunos casos, las mutaciones de aminoácidos en un polipéptido que tiene dos monómeros de dominio Fc en una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, polipéptidos 102 y 108 en la FIG. 1; polipéptidos 202 y 208 en la Figura 2) tienen lugar sólo en los monómeros del dominio Fc (por ejemplo, monómeros de dominio Fc 104, 106, 110 y 112 en la Figura 1; monómeros de dominio Fc 204, 206, 210 y 212 en la Figura 2) y no tienen lugar en el espaciador. Por ejemplo, en los polipéptidos mostrados en la Tabla 8 , se pueden realizar mutaciones de aminoácidos adicionales en los monómeros de dominio Fc que comprenden, consisten o consisten esencialmente en las secuencias de SEQ ID NO: 50-53, mientras que los espaciadores que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 18, 26 y 27 no cambian.
[0272] En algunos casos, el Asp N-terminal en uno o más de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto en una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, polipéptidos 102, 108, 114 y 116 en la FIG.
1; 202, 208, 214 y 216 en la Figura 2) pueden mutarse a Gln. En algunos casos, el Asp N-terminal en cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto en una construcción de Fc descrita en el presente documento está mutado a Gln. En otros casos, una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc) puede incluir uno o más monómeros del dominio Fc que tienen Asp N-terminal mutado a Gln. En algunos casos, la mutación de Asp N-terminal a Gln en uno o más de los polipéptidos primero, segundo, tercero y cuarto en una construcción de Fc descrita en el presente documento puede mejorar la homogeneidad de una población de una construcción de Fc (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc), por ejemplo, una población de una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc que es sustancialmente homogénea. Por ejemplo, la Tabla 4 muestra secuencias de aminoácidos de los polipéptidos primer, segundo, tercer y cuarto que tienen Asp N-terminal mutado a Gln en una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc.
IX. Células huésped y producción de proteínas.
[0273] En la presente divulgación, una célula huésped se refiere a un vehículo que incluye los componentes celulares necesarios, por ejemplo, orgánulos, necesarios para expresar los polipéptidos y construcciones descritos en el presente documento a partir de sus correspondientes ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden incluirse en vectores de ácidos nucleicos que pueden introducirse en la célula huésped mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica (transformación, transfección, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, etc.). Las células huésped pueden ser de origen mamífero, bacteriano, fúngico o insecto. Las células huésped de mamífero incluyen, pero sin limitación, CHO (o cepas celulares derivadas de CHO, por ejemplo, CHO-K1, CHO-DXB11 CHO-DG44), células huésped murinas (por ejemplo, NS0, Sp2/0), VERY, HEK (por ejemplo, HEK293), BHK, HeLa, COS, MOCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7O3O y HsS78Bst. También se pueden elegir células huésped que modulen la expresión de las construcciones proteicas, o modifiquen y procesen el producto proteico de la forma específica deseada. Las diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación postraduccional de productos proteicos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas huéspedes apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína expresada.
[0274] Para la expresión y secreción de productos proteicos a partir de sus correspondientes construcciones de plásmido de ADN, las células huésped pueden transfectarse o transformarse con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados conocidos en la técnica, incluyendo promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, y marcadores seleccionables. Se conocen en la técnica procedimientos para la expresión de proteínas terapéuticas. Véase, por ejemplo, Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.) Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press; 2a ed. Edición de 2004 (20 de julio de 2004); Vladimir Voynov y Justin A. Caravella (eds.) Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2da ed. Edición de 2012 (28 de junio de 2012).
X. Purificación
[0275] Una construcción de Fc puede purificarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica de purificación de proteínas, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad (por ejemplo, afinidad por proteína A) y cromatografía en columna de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Por ejemplo, una construcción de Fc puede aislarse y purificarse seleccionando y combinando adecuadamente columnas de afinidad, tales como una columna de Proteína A con columnas de cromatografía, filtración, ultrafiltración y/o procedimientos de precipitación salian y diálisis (ver, por ejemplo, Process Scale Purification of Antibodies, Uwe Gottschalk (ed.) John Wiley & Sons, Inc., 2009, y Subramanian (ed.) Antibodies-Volume I-Production and Purification, Kluwer Academic/Plenum Publishers, Nueva York (2004)).
[0276] En algunos casos, una construcción de Fc se puede conjugar con uno o más péptidos de purificación para facilitar la purificación y el aislamiento de la construcción de Fc a partir de, por ejemplo, una mezcla de lisados de células completas. En algunas realizaciones, el péptido de purificación se une a otro resto que tiene una afinidad específica por el péptido de purificación. En algunas realizaciones, dichos restos que se unen de manera específica al péptido de purificación se unen a un soporte sólido, tal como una matriz, una resina o microesferas de agarosa. Ejemplos de péptidos de purificación que pueden unirse a una construcción de Fc incluyen, pero sin limitación, un péptido de hexahistidina, un péptido f La G, un péptido myc y un péptido de hemaglutinina (HA). Un péptido de hexahistidina (HHHHHH (SEQ ID NO: 38)) se une a una columna de afinidad de agarosa funcionalizada con níquel con afinidad micromolar. En algunas realizaciones, un péptido FLAG incluye la secuencia DYKDDDDK (SEQ ID NO: 39). En algunas realizaciones, un péptido FLAG incluye múltiplos enteros de la secuencia DYKDDDDK en series en tándem, por ejemplo, 3xDYKDDDDK. En algunas realizaciones, un péptido myc incluye la secuencia EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 40). En algunas realizaciones, un péptido myc incluye múltiplos enteros de la secuencia EQKLISEEDL en series en tándem, por ejemplo, 3xEQKLISEEDL. En algunas realizaciones, un péptido HA incluye la secuencia YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 41). En algunas realizaciones, un péptido HA incluye múltiplos enteros de la secuencia YPYDVPDYA en series en tándem, por ejemplo, 3xYPYDVPDYa . Los anticuerpos que reconocen de manera específica y se unen al péptido de purificación Fl a G, myc o HA son bien conocidos en la técnica y, a menudo, están disponibles comercialmente. Puede usarse un soporte sólido (por ejemplo, una matriz, una resina o microesferas de agarosa) funcionalizado con estos anticuerpos para purificar una construcción de Fc que incluye un péptido FLAG, myc o HA.
[0277] Para las construcciones de Fc, se puede emplear cromatografía en columna de proteína A como proceso de purificación. Los ligandos de la proteína A interactúan con las construcciones de Fc a través de la región Fc, lo que hace que la cromatografía de la proteína A sea un proceso de captura altamente selectivo que es capaz de eliminar la mayoría de las proteínas de la célula huésped. En la presente divulgación, las construcciones de Fc se pueden purificar usando cromatografía en columna de Proteína A tal como se describe en el ejemplo 2.
XI. Composiciones/preparaciones farmacéuticas
[0278] La divulgación presenta composiciones farmacéuticas que incluyen una o más construcciones de Fc descritas en el presente documento. En una realización, una composición farmacéutica incluye una población sustancialmente homogénea de construcciones de Fc. En diversos ejemplos, la composición farmacéutica incluye una población sustancialmente homogénea de cualquiera de las construcciones de Fc 1-4.
[0279] Una construcción de proteína terapéutica, por ejemplo, una construcción de Fc descrita en el presente documento (por ejemplo, una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc), de la presente divulgación se puede incorporar en una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas que incluyen proteínas terapéuticas se pueden formular mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. La composición farmacéutica se puede administrar por vía parenteral en forma de una formulación inyectable que incluye una solución o suspensión estéril en agua u otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede formular combinando adecuadamente la construcción de Fc con vehículos o medios farmacéuticamente aceptables, tales como agua estéril para inyección (WFI,water forinjection),solución salina fisiológica, emulsionante, agente de suspensión, tensioactivo, estabilizador, diluyente, aglutinante, excipiente, seguido de la mezcla en una forma de dosis unitaria requerida para las prácticas farmacéuticas generalmente aceptadas. La cantidad de principio activo incluida en las preparaciones farmacéuticas es tal que se proporciona una dosis adecuada dentro del intervalo designado.
[0280] La composición estéril para inyección se puede formular de acuerdo con prácticas farmacéuticas convencionales usando agua destilada para inyección como vehículo. Por ejemplo, se puede usar solución salina fisiológica o una solución isotónica que contiene glucosa y otros suplementos, tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio, como solución acuosa para inyección, opcionalmente en combinación con un agente solubilizante adecuado, por ejemplo, alcohol, tal como etanol y polialcohol, tal como propilenglicol o polietilenglicol, y un tensioactivo no iónico, tal como polisorbato 80 ™, HCO-50 y similares comúnmente conocidos en la técnica. Los procedimientos de formulación para productos proteicos terapéuticos se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, Banga (ed.) Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing and Delivery Systems (2a ed.) Taylor & Francis Group, Cr C Press (2006).
XII. Dosificación
[0281] Las composiciones farmacéuticas se administran de una manera compatible con la formulación posológica y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz para dar como resultado una mejora o remediación de los síntomas. Las composiciones farmacéuticas se administran en una variedad de formas de dosificación, por ejemplo, formas de dosificación intravenosa, formas de dosificación subcutánea, formas de dosificación oral, tales como soluciones ingeribles y cápsulas de liberación de fármacos, y similares. La dosis adecuada para cada sujeto individual depende de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración y el estado del paciente. Generalmente, las proteínas recombinantes se dosifican a 1-200 mg/kg, por ejemplo, 1-100 mg/kg, por ejemplo, 20-100 mg/kg. Por consiguiente, será necesario que un proveedor de atención médica adapte y titule la dosis y modifique la ruta de administración según sea necesario para obtener el efecto terapéutico óptimo.
XIII. Indicaciones
[0282] Las composiciones farmacéuticas de la divulgación (por ejemplo, aquellas que contienen construcciones de Fc que tienen 2, 3 o 4 dominios Fc) son útiles para reducir la inflamación en un sujeto, para promover la eliminación de autoanticuerpos en un sujeto, para suprimir la presentación de antígenos en un sujeto, para reducir la respuesta inmunitaria, por ejemplo, para bloquear la activación basada en complejos inmunitarios de la respuesta inmunitaria en un sujeto, y para tratar afecciones o enfermedades inmunológicas e inflamatorias en un sujeto. Las afecciones y enfermedades de ejemplo incluyen artritis reumatoide (AR); lupus eritematoso sistémico (LES); vasculitis asociada a ANCA; síndrome de anticuerpos antifosfolípidos; anemia hemolítica autoinmunitaria; neuropatía desmielinizante inflamatoria crónica; eliminación de anti-alo en trasplante, “anti-self” en EICH (enfermedad de injerto contra huésped), anti-reemplazo, agentes terapéuticos de IgG, paraproteínas IgG; dermatomiositis; síndrome de Goodpasture; síndromes de hipersensibilidad tipo II dirigidos a sistemas orgánicos mediados por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, por ejemplo, síndrome de Guillain Barré, PDIC, dermatomiositis, síndrome de Felty, rechazo mediado por anticuerpos, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, colitis ulcerosa, enfermedad hepática autoinmunitaria; púrpura trombocitopenia idiopática; Miastenia gravis, neuromielitis óptica; pénfigo y otros trastornos ampollosos autoinmunitarios; Síndrome de Sjogren; citopenias autoinmunitarias y otros trastornos mediados por fagocitosis dependiente de anticuerpos; otros síndromes inflamatorios dependientes de FcR, por ejemplo, sinovitis, dermatomiositis, vasculitis sistémica, glomerulitis y vasculitis.
[0283] En algunos casos, las composiciones farmacéuticas de la divulgación que contienen construcciones de Fc que tienen 5-10 dominios Fc también son útiles, por ejemplo, para inducir la activación de células inmunitarias de la respuesta inmunitaria en un sujeto, para aumentar la fagocitosis de una célula diana (es decir, una célula cancerosa o una célula infectada) en un sujeto, y para tratar enfermedades, tales como cánceres e infecciones en un sujeto. Las construcciones de Fc y las composiciones farmacéuticas homogéneas de la divulgación pueden unirse a receptores Fcy activadores (por ejemplo, FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIc, FcyRIIIa y FcyRIIIb) para inducir una respuesta inmunitaria. Las construcciones de Fc y las composiciones farmacéuticas homogéneas de la divulgación pueden activar la fosforilación de Syk y el flujo de calcio de los monocitos THP-1 primarios. Los monocitos activados y sus macrófagos diferenciados tienen la capacidad de fagocitar o matar células diana. Por lo tanto, la divulgación proporciona construcciones de Fc para su uso en procedimientos de tratamiento que pueden usarse para tratar sujetos que padecen enfermedades y trastornos, tales como cánceres e infecciones. En algunas realizaciones, las construcciones de Fcy las composiciones farmacéuticas homogéneas descritas en el presente documento se pueden administrar a un sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz para fagocitar o destruir células cancerosas o células infectadas en el sujeto.
[0284] Los cánceres que son susceptibles de tratamiento según los procedimientos de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer de recto, cáncer del sistema respiratorio, cáncer del sistema urinario, cáncer de la cavidad bucal, cáncer de piel, leucemia, sarcoma, carcinoma, carcinoma de células basales, linfoma no Hodgkin, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL), mieloma múltiple (MM), eritroleucemia, carcinoma de células renales, astrocitoma, oligoastrocitoma, cáncer de vías biliares, coriocarcinoma, cáncer del SNC, cáncer de laringe, cáncer de pulmón de células pequeñas, adenocarcinoma, carcinoma de células gigantes (o avenoides), carcinoma de células escamosas, linfoma anaplásico de células grandes, cáncer de pulmón de células no pequeñas, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer neuroectodérmico, glioblastoma, carcinoma de mama, melanoma, cáncer de tumor miofibroblástico inflamatorio y cáncer de tumor de tejidos blandos.
[0285] Las infecciones que son susceptibles de tratamiento según los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, una infección bacteriana, una infección viral, una infección fúngica, una infección helmíntica y una infección por protozoos.
[0286] Los ejemplos de bacterias que causan infecciones son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, bacterias del géneroStreptococcus(por ejemplo,Streptococcus pyogenes),bacterias del géneroEscherichia(por ejemplo,Escherichia coli),bacterias en el géneroVibrio(por ejemplo,Vibrio cholerae),bacterias del géneroEnteritis(por ejemplo,Enteritis salmonella)y bacterias del géneroSalmonella(por ejemplo,Salmonella typhi).
[0287] Los ejemplos de virus que causan infecciones son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, virus de la familia Retroviridae (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)), virus de la familia Adenoviridae (por ejemplo, adenovirus ), virus de la familia Herpesviridae (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2), virus de la familia Papillomaviridae (por ejemplo, virus del papiloma humano (VPH)), virus de la familia Poxviridae (por ejemplo, viruela), virus de la familia Picornaviridae (por ejemplo, virus de la hepatitis A, poliovirus, rinovirus), virus de la familia Hepadnaviridae (por ejemplo, virus de la hepatitis B), virus de la familia Flaviviridae (por ejemplo, virus de la hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental), virus de la familia Togaviridae (por ejemplo, virus de la rubéola), virus de la familia Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe), virus de la familia Filoviridae (por ejemplo, virus del ébola, virus de Marburg) y virus de la familia Paramyxoviridae (por ejemplo, virus del sarampión, virus de las paperas ).
[0288] Los ejemplos de hongos que causan infecciones son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, hongos del géneroAspergillus(por ejemplo,Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. terreus. A. niger, A. candidus, A. clavatus, A. ochraceus),hongos del géneroCandida(por ejemplo,Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis),hongos del géneroCryptococcus(por ejemplo,Cryptococcus neoformans)y hongos del géneroFusarium(por ejemplo,Fusarium solani, F. verticillioides, F. oxysporum).
[0289] Los ejemplos de helmintos incluyen, pero sin limitación, tenias (cestodos), lombrices intestinales (nematodos), duelas (trematodos) y monogeneos.
[0290] Los ejemplos de protozoos incluyen, pero sin limitación, protozoos del géneroEntamoeba(por ejemplo, Entamoeba histolytica), protozoos del géneroPlasmodium(por ejemplo,Plasmodium falciparum, P. malariae),protozoos del géneroGiardia(por ejemplo,Giardia lamblia)y protozoos del géneroTrypanosoma(por ejemplo,Trypanosoma brucei).
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Diseño de construcciones de Fc
[0291] De manera deseable, las construcciones de Fc están diseñadas para aumentar las eficiencias de plegado, para minimizar la asociación incontrolada de subunidades, que pueden crear oligómeros y multímeros de alto peso molecular no deseados, y para generar composiciones que sean sustancialmente homogéneas. Con estos objetivos en mente, diseñamos cuatro construcciones de Fc (FIGS. 1 y 2), incluyendo cada una de las cuales un polipéptido largo que incluye dos monómeros de dominio Fc separados por un espaciador (polipéptidos 102 y 108 en la FIG. 1 y polipéptidos 202 y 208 en la FIG. 2) y un polipéptido corto que incluye un único monómero de dominio Fc (polipéptidos 114 y 116 en la F<i>G. 1 y polipéptidos 214 y 216 en la FIG. 2). Cada uno se basa en la secuencia de Fc de IgG1, con la inclusión de cavidades modificadas genéticamente, protuberancias modificadas genéticamente y/o modificaciones de orientación de interacciones electrostáticas para controlar el ensamblaje de los polipéptidos. Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos largos y cortos se optimizaron para su expresión en células de mamíferos y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.4. Las construcciones de plásmido de ADN se transfectaron mediante liposomas en células 293 de riñón embrionario humano (HEK). Se usaron un total de ocho construcciones de plásmidos de ADN para ensamblar cuatro construcciones de Fc, teniendo cada una de las cuales tres dominios Fc.
[0292] Para cada construcción de Fc, los polipéptidos largos y cortos, cuando se coexpresan, producen una molécula ramificada que contiene tres dominios Fc, con los monómeros Fc C-terminales de los polipéptidos largos asociándose de manera específica entre sí para formar un dominio Fc C-terminal y con los monómeros Fc N-terminales de los polipéptidos largos asociándose de manera específica con los polipéptidos cortos para formar dos dominios Fc N-terminales. Las construcciones de Fc 1-4 y su diseño se describen en la Tabla 5 y las FIGS. 1 y 2.
[0293] Las secuencias utilizadas en cada construcción de Fc se muestran en la Tabla 6. La Tabla 7 a continuación resume adicionalmente las características de los polipéptidos largos y cortos en cada una de las construcciones 1-4.
Tabla 5
Tabla 7
[0294] Cada uno de los polipéptidos largos 102 y 108 en las construcciones de Fc 1-3 (FIG. 1) y los polipéptidos largos 202 y 208 en la construcción de Fc 4 (FIG. 2) contiene dos monómeros de dominio Fc unidos en serie en tándem mediante un espaciador. La Tabla 8 a continuación proporciona las secuencias de los monómeros del dominio Fc en los polipéptidos largos y los espaciadores en las construcciones de Fc 1-4.
Tabla 8
Ejemplo 2. Expresión de construcciones de Fc
[0295] Las proteínas expresadas se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo celular mediante cromatografía en columna de afinidad basada en proteína A, usando una columna Poros MabCapture A (LifeTechnologies). Las construcciones de Fc capturadas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (lavado bajo en sal) y se eluyeron con glicina 100 mM, pH 3. El eluato se neutralizó rápidamente mediante la adición de TRIS 1 M, pH 7,4 y se filtró de forma estéril a través de un filtro de 0,2 pm.
[0296] Las proteínas se fraccionaron adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico usando resina Poros XS (Applied Biosciences). La columna se preequilibró con MES 50 mM, pH 6 (tampón A), y la muestra se eluyó con un gradiente escalonado usando MES 50 mM, cloruro de sodio 400 mM, pH 6 (tampón B) como tampón de elución.
[0297] Después del intercambio iónico, la fracción objetivo se intercambió en tampón por tampón PBS usando un cartucho de membrana de poliéter sulfona (PES) de corte de 10 kDa en un sistema de filtración de flujo tangencial. Las muestras se concentraron a aproximadamente 30 mg/ml y se filtraron de forma estéril a través de un filtro de 0,2 pm.
Ejemplo 3. Ensayos experimentales utilizados para caracterizar las construcciones de Fc
Cromatografía líquida-MS/MS de péptidos y glicopéptidos
[0298] Las proteínas se diluyeron a 1 pg/pl en guanidina 6 M (Sigma). Se añadió ditiotreitol (DTT) hasta una concentración de 10 mM, para reducir los enlaces disulfuro en condiciones desnaturalizantes a 65 °C durante 30 min. Después de enfriar en hielo, las muestras se incubaron con yodoacetamida (IAM) 30 mM durante 1 hora en la oscuridad para alquilar (carbamidometilar) los tioles libres. A continuación, se dializó la proteína a través de una membrana de 10 kDa en tampón de bicarbonato de amonio 25 mM (pH 7,8) para eliminar IAM, DTT y guanidina. La proteína se digirió con tripsina en un Barocycler (NEP 2320; Pressure Biosciences, Inc.). La presión se cicló entre 20.000 psi y la presión ambiente a 37 °C durante un total de 30 ciclos en 1 h. El análisis LC-MS/MS de los péptidos se realizó en un sistema de cromatografía Ultimate 3000 (Dionex) y un espectrómetro de masas Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific). Los péptidos se separaron en una columna BEH PepMap (Waters) usando FA al 0,1 % en agua y FA al 0,1 % en acetonitrilo como fases móviles. El péptido enlazador individualmente xilosilado se dirigió sobre la base del ion doblemente cargado (z=2) m/z 842,5 con una anchura de aislamiento de cuadrupolo de ± 1,5 Da.
Espectrometría de masas intacta
[0299] La proteína se diluyó hasta una concentración de 2 pg/pl en el tampón de ejecución que consistía en 78,98 % de agua, 20 % de acetonitrilo, 1 % de ácido fórmico (FA) y 0,02 % de ácido trifluoroacético. La separación por cromatografía de exclusión por tamaño se realizó en dos Zenix-C SEC-300 (Sepax Technologies, Newark, DE) de 2,1 x 350 mm en tándem para una longitud total de columna de 700 mm. Las proteínas se eluyeron de la columna SEC usando el tampón de ejecución descrito anteriormente a un caudal de 80 pl/min. Los espectros de masas se adquirieron en un espectrómetro de masas QSTAR Elite (Applied Biosystems) Q-ToF operado en modo positivo. Las masas neutras bajo las fracciones de tamaño individuales se desconvolucionaron utilizando la deconvolución de pico bayesiano sumando los espectros en todo el ancho del pico cromatográfico.
Ensayo de electroforesis capilar-dodecilsulfato de sodio (CE-SDS)
[0300] Las muestras se diluyeron hasta 1 mg/ml y se mezclaron con el tampón desnaturalizante HT Protein Express (PerkinElmer). La mezcla se incubó a 40 °C durante 20 min. Las muestras se diluyeron con 70 pl de agua y se transfirieron a una placa de 96 pocillos. Las muestras se analizaron mediante un instrumento Caliper GXII (PerkinElmer) equipado con HT Protein Express LabChip (PerkinElmer). Se utilizó la intensidad de fluorescencia para calcular la abundancia relativa de cada variante de tamaño.
SDS-PAGE no reductora
[0301] Las muestras se desnaturalizaron en tampón de muestra Laemmli (SDS al 4 %, Bio-Rad) a 95 °C durante 10 min. Las muestras se procesaron en un gel sin manchas Criterion TGX (poliacrilamida al 4-15 %, Bio-Rad). Las bandas de proteínas se visualizaron mediante iluminación UV o tinción con azul de Coommassie. Se tomaron imágenes de los geles mediante el sistema de imágenes ChemiDoc MP (Bio-Rad). La cuantificación de bandas se realizó utilizando el software Imagelab4.0.1 (Bio-Rad).
Citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)
[0302] Se evaluó la CDC mediante un ensayo colorimétrico en el que se recubrieron células Raji (ATCC) con Rituximab diluido en serie, construcción de Fc 4 o IVIg. Se añadió complemento de suero humano (Quidel) a todos los pocillos al 25 % v/v y se incubó durante 2 horas a 37 °C. Las células se incubaron durante 12 h a 37 °C después de la adición del reactivo de proliferación celular WST-1 (Roche Applied Science). Las placas se colocaron en un agitador durante 2 minutos y se midió la absorbancia a 450 nm.
Ejemplo 4. O-glicosilación y proteólisis de residuos de serina enlazadores
O-glicosilación en residuos de serina enlazadores
[0303] Tal como se describe en el Ejemplo 1, diseñamos las construcciones de Fc para aumentar las eficiencias de plegado, minimizar la asociación incontrolada de subunidades y generar composiciones para uso farmacéutico que sean sustancialmente homogéneas. En un esfuerzo por lograr estos objetivos, investigamos diferentes enlazadores entre los dos monómeros de dominio Fc en el polipéptido largo (102 y 108 en la Figura 1; 202 y 208 en la Figura 2). La construcción de Fc 1 y la construcción de Fc 2 tienen cada una un enlazador de serina-glicina (SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 18)) entre los dos monómeros del dominio Fc en el polipéptido largo.
[0304] Cuando la construcción de Fc 2, que contiene el enlazador SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 18) entre los dos monómeros de dominio Fc en el polipéptido largo, se analizó mediante LC-MS/MS de péptidos, se observó O-xilosilación (FIG. 3 ). Sin embargo, como los fragmentos y2 a y9 no contienen xilosa, la quinta serina en el enlazador no está O-xilosilada. Puede haber múltiples sitios que estén O-xilosilados, pero cada péptido solo está O-xilosilado una vez. El alcance y la ubicación de esta modificación postraduccional pueden depender tanto de la secuencia como del sistema de expresión.
[0305] Asimismo, se observó O-xilosilación en una construcción de Fc que tenía dos dominios Fc (la construcción de Fc mostrada en la Figura 13) que contenía el mismo enlazador (SG3)5 (Figura 4). Se observó modificación en múltiples sitios, con hasta dos modificaciones de xilosa en cada enlazador. Además, el nivel de modificación fue variable entre lotes.
[0306] Después de observar O-xilosilación en residuos de serina en el enlazador serina-glicina, investigamos enlazadores alternativos que contenían solo residuos de glicina para optimizar adicionalmente la secuencia del enlazador y mejorar la homogeneidad de la construcción de Fc. Como resultado, se seleccionó un espaciador totalmente de glicina para su uso en la construcción de Fc 3 y la construcción de Fc 4. La construcción de Fc 3 tiene un espaciador totalmente de glicina de 15 unidades (GGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 26)) entre los dos monómeros de dominio Fc en el polipéptido largo. La construcción de Fc 4 tiene un espaciador totalmente de glicina de 20 unidades (GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 27)) entre los dos monómeros de dominio Fc en el polipéptido largo.
Proteólisis en residuos de serina enlazadores
[0307] En algunas realizaciones, se encontró que las construcciones de Fc experimentaban proteólisis en los enlazadores tras la incubación a 45 °C en solución salina tamponada con fosfato, generando productos Fc monoméricos. La tasa de formación de monómero en la construcción de Fc 2 (que contiene el enlazador SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG en cada uno de los polipéptidos 102 y 108) fue más rápida que en la construcción de Fc 4 (que contiene el espaciador totalmente de glicina GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG en cada uno de los polipéptidos 202 y 208) (Figura 5), lo que indica que el espaciador totalmente de glicina es menos susceptible a la proteólisis. Se encontró que este efecto es general entre construcciones de Fc ramificadas que tienen tres dominios Fc para múltiples longitudes de enlazador; los espaciadores totalmente de glicina se proteolizaron más lentamente que los enlazadores de serina-glicina (Tabla 9).
Tabla 9
[0308] Además, los análisis por espectrometría de masas de los productos Fc monoméricos en la construcción de Fc 2 , con un enlazador (SG3)5 en cada uno de los polipéptidos 102 y 108, demostraron que los productos dominantes se escindieron en el lado N-terminal de la serina, siendo todas menos las primeras serinas susceptibles a la proteólisis (FIG. 6 ). Por el contrario, los productos de escisión de la construcción de Fc 4, con un espaciador G20 en cada uno de los polipéptidos 202 y 208, no mostraron una fuerte especificidad por ningún residuo espaciador particular (FIG. 7). En conjunto, estos resultados indicaron que el espaciador totalmente de glicina tenía una menor susceptibilidad a la proteólisis. Para limitar la proteólisis, se puede usar un espaciador sin serina, tal como el espaciador G20 usado en la construcción de Fc 4. El uso de dicho espaciador de glicina mejora sustancialmente la homogeneidad de la composición final de la construcción de Fc.
Ejemplo 5. Optimización de la longitud del enlazador
[0309] Para optimizar aún más la homogeneidad, se exploró la longitud del enlazador preparando variaciones en la secuencia de la construcción de Fc 2 en la que el enlazador (SG3)5 se reemplazó por un espaciador Ge, G15 o G20. Los análisis mediante ensayos in vitro indicaron que la longitud del enlazador afectaba a la actividad biológica, presumiblemente al alterar la capacidad de la construcción de Fc para interactuar con los receptores Fcy.
[0310] Se encontró que la inhibición de la liberación de IL-8 por células THP-1 estimulada por IgG unida a placa dependía de la longitud del enlazador (FIG. 8 ). La inhibición a concentraciones bajas de construcción de Fc siguió el orden G8 < G15 < G20, teniendo la construcción Fc 2 un espaciador G20 que inhibía más fuertemente la liberación de IL-8 por las células THP-1.
[0311] Además, se descubrió que la inhibición del flujo de calcio en los neutrófilos dependía de la longitud del enlazador (FIG. 9). La inhibición siguió el orden G8 < G15 < G20, teniendo la construcción Fc 2 el espaciador G20 que exhibe la mayor inhibición del flujo de calcio en los neutrófilos.
Ejemplo 6. Optimización de la heterodimerización mediante tecnología “botón en ojal” (Knob-into-Hole)
[0312] Los plásmidos que expresan los polipéptidos largos y cortos de la construcción de Fc 2 (polipéptidos 102, 108, 114 y 116 en la Figura 1) o polipéptidos largos y cortos de la construcción de Fc 4 (polipéptidos 202, 208, 214 y 216 en la Figura 2) fueron transfectados en células HEK293. Después de siete días en cultivo, las células se depuraron mediante centrifugación y los sobrenadantes del medio sin procesar se separaron mediante SDS-PAGE no reductora (FIG. 10). El análisis densitométrico de las bandas de proteínas visualizadas reveló que la construcción de Fc 2 que tiene tres dominios Fc y la construcción de Fc 4 que tiene tres dominios Fc (Fc3) se expresaban en niveles similares. Sin embargo, las construcciones para la construcción de Fc 2 expresaron niveles significativamente más altos de especies contaminantes de dímero (Fc2) (FIG. 10). Ambos conjuntos de construcciones expresaron niveles similares de la especie monomérica (Fc1). Las bandas adicionales presentes en la imagen representan componentes del medio que están presentes en controles transfectados simulados.
[0313] Estos resultados indican que tener mutaciones de orientación de interacciones electrostáticas que promueven la heterodimerización y mutaciones de “botón en ojal” que promueven la heterodimerización en las subunidades de "rama" (por ejemplo, monómeros de dominio Fc 106, 114, 112 y 116 en la FIG. 1; monómeros de dominio Fc 206, 214, 212 y 216 en la Figura 2) mejora la formación de un dominio Fc heterodimérico en una construcción de Fc, optimiza el ensamblaje de una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc y mejora la homogeneidad de la composición que contiene la construcción de Fc.
Ejemplo 7. Orientación de interacciones electrostáticas para el control de la homodimerización
[0314] Para minimizar la asociación fuera de registro de subunidades, que genera oligómeros y multímeros de alto peso molecular no deseados, se introdujeron mutaciones que favorecen la heterodimerización (por ejemplo, “botones y ojales”) en las subunidades de "rama" (por ejemplo, monómeros de dominio Fc 106, 112, 114 y 116 en la Figura 1; monómeros de dominio Fc 206, 212, 214 y 216 en la Figura 2). Estas sustituciones de aminoácidos conservan la atracción de las subunidades de “botones” (por ejemplo, los monómeros de dominio Fc 106 y 112 en la Figura 1; los monómeros de dominio Fc 206 y 212 en la Figura 2) para las homólogos de los “ojales” (por ejemplo, los monómeros de dominio Fc 114 y 116 en la Figura 1; monómeros de dominio Fc 214 y 216 en la Figura 2) y al mismo tiempo dificultan la asociación entre las subunidades de “botones”. Debido a que las mutaciones de los “botones” también inhiben el ensamblaje con secuencias de Fc de tipo salvaje, se cuestiona la necesidad de incluir mutaciones adicionales para reducir aún más la afinidad de las subunidades de Fc "tallo" (por ejemplo, los monómeros de dominio Fc 104 y 110 en la Figura 1; los monómeros de dominio Fc 204 y 210 en la Figura 2) para las subunidades de "rama" de “botones” y “ojales”. Para abordar esta cuestión, se generó un polipéptido largo de construcción de Fc que contenía una secuencia de monómero de dominio Fc de tipo salvaje en la subunidad de "tallo" carboxilo terminal y un monómero de dominio Fc que portaba mutaciones de “botón” en la subunidad de "rama" amino terminal. El polipéptido corto correspondiente fue el monómero de dominio Fc que portaba mutaciones de “ojal”. Esta construcción de Fc se basa en las secuencias de los polipéptidos en la construcción de Fc 2, pero tiene una secuencia de monómero de dominio Fc de tipo salvaje en la subunidad de "tallo" carboxilo terminal en cada uno de los polipéptidos largos.
[0315] Se cotransfectaron células HEK293 con plásmidos que expresaban la construcción de Fc 2 (que tiene mutaciones de orientación de interacciones electrostáticas homodimerizantes en el monómero de dominio Fc en la subunidad de "tallo" carboxilo terminal en cada uno de los polipéptidos largos; véanse las Tablas 5 y 6 en el Ejemplo 1), o una construcción de Fc basada en la construcción de Fc2 en la que el monómero de dominio Fc en la subunidad de "tallo" carboxilo terminal en cada uno de los polipéptidos largos se reemplazó por una secuencia de monómero de dominio Fc de tipo salvaje (SEQ ID NO: 42) (tal como se describió anteriormente). Después de siete días en cultivo, las células se depuraron mediante centrifugación y los sobrenadantes del medio sin procesar se separaron mediante SDS-PAGE no reductora. Las imágenes de proteínas teñidas revelaron que la construcción de Fc sin mutaciones de orientación de interacciones electrostáticas en las subunidades de "tallo" (etiquetadas como "Sin orientación de interacciones electrostáticas" (carriles 1-3) en la Figura 11) contenía niveles mucho más altos de monómero (Fc1) y dímero (Fc2) que la homóloga de construcción de Fc 2 (etiquetada "Con orientación de interacciones electrostáticas" (carriles 4 y 5) en la FIG. 11). Además, se puede detectar un número mucho mayor de bandas de mayor peso molecular que el trímero (carriles 1-3 en la Figura 11).
[0316] Estos resultados confirman que tener mutaciones de orientación de interacciones electrostáticas que promueven la homodimerización en las subunidades de "tallo" (por ejemplo, monómeros de dominio Fc 104 y 110 en la Figura 1; monómeros de dominio Fc 204 y 210 en la Figura 2) mejora aún más la formación de un dominio Fc homodimérico en la construcción de Fc, optimiza el ensamblaje de una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc y mejora la homogeneidad de la composición que contiene la construcción de Fc.
Ejemplo 8. Optimización de la homogeneidad de la composición mediante la eliminación de residuos de lisina C-terminal
[0317] El residuo de lisina C-terminal de las inmunoglobulinas está altamente conservado en muchas especies. En algunos casos, la maquinaria celular elimina las lisinas C-terminales de los polipéptidos durante la producción de proteínas. Nuestro objetivo era mejorar aún más la uniformidad de las construcciones de Fc en la composición y lograr una composición más homogénea que contenga una construcción de Fc descrita en el presente documento eliminando la lisina C-terminal de cada uno de los polipéptidos en la construcción de Fc. La construcción de Fc 2 no contiene ningún residuo de lisina C-terminal ni en sus polipéptidos largos (102 y 108; véase el Ejemplo 1, Tablas 5-7; Figura 1) ni en sus polipéptidos cortos (114 y 116). La figura 12 muestra que la eliminación de la lisina C-terminal para generar la construcción de Fc 2 no indujo citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) in vitro. Por tanto, mediante la eliminación del residuo de lisina C-terminal, pudimos mejorar la homogeneidad de la composición farmacéutica de la construcción Fc sin desencadenar efectos secundarios inmunológicos adversos.
Ejemplo 9. Eficacia de construcciones de Fc en un modelo de púrpura trombocitopénica idiopática crónica (PTI)
[0318] Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 que pesaban 18-22 gramos de Charles River Labs y se utilizaron en los estudios después de una semana de aclimatación. Los ratones se trataron ip con anticuerpo c D41 anti-ratón de rata (anti-CD41; 1,5 pg/ratón) durante 4 días. Se administraron solución salina, IgIV, construcción 2 y construcción 4 por vía intravenosa una o dos horas después de la tercera inyección de anticuerpo el día 3. Los niveles de plaquetas se midieron el día 5, 24 horas después de la cuarta inyección de anticuerpo anti-CD41, en sangre extraída mediante sangrado submandibular.
[0319] Se realizaron múltiples estudios que comparaban la Construcción 2 y la Construcción 4 en el modelo ITP (FIG.
18, FIG. 19 y 20). En los tres estudios, la construcción 4 mostró mayor eficacia que la construcción 2 en dosis de 0,1 g/kg.
Ejemplo 10. Comportamiento farmacocinético de la construcción 4 en comparación con construcciones de multímero de Fc
[0320] Se generaron multímeros de Fc tal como se describe en Strome et al, US 2010/0239633 A1; Jain et al, Arthritis Res. Ther. 14, R192 (2012). De manera específica, el Fc de IgG1 de tipo salvaje se fusionó en el extremo C terminal con una secuencia bisagra de IgG2 (construcción X1). La construcción del plásmido de ADN se transfectó mediante liposomas en células HEK293. Después de siete días en cultivo, las células se depuraron mediante centrifugación.
[0321] Las proteínas expresadas se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo celular mediante cromatografía en columna de afinidad basada en proteína A, usando una columna Poros MabCapture A. Las construcciones capturadas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (lavado bajo en sal) y se eluyeron con glicina 100 mM, pH 3. El eluato se neutralizó rápidamente mediante la adición de TRIS 1 M, pH 7,4 y se filtró de forma estéril a través de un filtro de 0,2 pm.
[0322] Las proteínas se fraccionaron adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico usando resina Poros XS. La columna se preequilibró con MES 50 mM, pH 6 (tampón A), y la muestra se diluyó en el tampón de equilibrio antes de cargarla. La muestra se eluyó usando un gradiente de múltiples etapas con MES 50 mM, cloruro de sodio 400 mM, pH 6 (tampón B) como tampón de elución. Las etapas del gradiente incluyeron 0-40 % B para 2 volúmenes de columna (CV) para eliminar especies de bajo peso molecular, una etapa mantenida en 40 % B (4 CV), seguido de 40-80 % B (4 CV) para aislar las especies objetivo y, a continuación, se aumentó linealmente hasta 100 % B. Todas las fracciones que contenían proteínas se cribaron mediante cromatografía analítica de exclusión por tamaño y los componentes se cuantificaron mediante absorbancia a 280 nm. Se combinaron fracciones con no más del 8 % de contenido total de Fc (aproximadamente 50 kDa) más dímero de Fc (aproximadamente 100 kDa) para producir el multímero de Fc purificado.
[0323] Después del intercambio iónico, la fracción objetivo se intercambió de tampón por tampón PBS usando un cartucho de membrana de poliéter sulfona (PES) de corte de 30 kDa en un sistema de filtración de flujo tangencial. Las muestras se concentraron hasta aproximadamente 30 mg/ml y se filtraron de forma estéril a través de un filtro de 0,2 pm.
[0324] Las distribuciones de peso molecular de la Construcción 4 y la Construcción X1 se compararon mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (FIG. 21). La construcción 4 se compone principalmente de una especie de ~150 kDa (tres dominios Fc). Por el contrario, la Construcción X1 se compone de múltiples especies que van desde -100 kDa (dos dominios Fc) con numerosas bandas por encima de 250 kDa y sin ningún componente único mayoritario.
[0325] A ratones hembra C57BL/6 (n = 15, 8 semanas de edad) se les administró por vía intravenosa (i.v.) 0,1 g/kg de cada uno de la construcción X1 o la construcción 4. Se recogió sangre (25 pl) de la vena submandibular y se procesó para suero. Se hicieron sangrar cinco ratones por grupo en puntos de tiempo alternos hasta el día 5, mientras que para todos los puntos de tiempo restantes se hicieron sangrar los quince ratones en cada grupo. Los puntos de tiempo recopilados incluyeron 15 y 30 min; 1, 2, 4, 6, 8 y 24 horas; 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 21 y 24 días. Las concentraciones séricas del multímero de Fc se determinaron mediante un ELISA anti-IgG humana con un anticuerpo de detección específico de Fc.
[0326] Tal como se demuestra en la FIG. 22, los niveles séricos de la construcción X1 son más bajos que los de la construcción 4 en la mayoría de los puntos temporales, aunque las curvas se cruzan brevemente entre los días 3 y 5. En la FIG. 22, la construcción 4 se muestra con cuadrados negros y líneas continuas, y la construcción X1 se muestra con círculos no rellenos y líneas discontinuas. En la FIG. 23 se muestra una expansión de los puntos de tiempo temprano con la construcción 4 (cuadrado negro con línea continua) y la construcción X1 (círculos no rellenos con líneas discontinuas).
Ejemplo 11. Eficacia de la construcción de Fc en un modelo de artritis inducida por anticuerpos contra colágeno (CAIA)
[0327] A ratones macho C57BL/6 se les inyectó i.p. un cóctel de anticuerpos monoclonales artritogénicos de cuatro anticuerpos contra el colágeno II (ArthritoMab, MDBiosciences; 8 mg). El día 4, a los animales se les inyectó i.p. lipopolisacárido (100 |jg). A los animales se les administró por vía intravenosa vehículo o compuesto de prueba en un solo día que oscilaba entre el día 1 y el día -14 (los días se numeraron omitiendo el cero). Los parámetros de puntuación clínica fueron los siguientes: 0 = normal, sin hinchazón, enrojecimiento ni distorsión; completa flexibilidad articular. 1 = artritis leve: hinchazón y/o distorsión leve; completa flexibilidad articular. 2 = artritis moderada: hinchazón y/o distorsión moderada; reducción de la flexibilidad de las articulaciones o de la fuerza de agarre. 3 = artritis grave: hinchazón y/o distorsión grave; flexibilidad articular o fuerza de agarre muy reducidas. 4 = articulaciones anquilosadas; falta de flexibilidad articular y movimiento gravemente afectado; moribundo. Los animales fueron sacrificados después de 12 días.
[0328] La Figura 24 es un gráfico que compara la eficacia de la construcción 4 dosificada terapéuticamente en un modelo de artritis inducida por anticuerpos contra colágeno (CAIA) el día 6 a 50 mg/kg (triángulos negros, línea negra continua), 25 mg/kg (cuadrados negros, línea negra continua) o 12,5 mg/kg (círculos negros, línea negra discontinua). Se dosificó un volumen equivalente de solución salina (ejes grises, línea gris continua) el día 6 como control del vehículo. La media y el error estándar de la media se muestran para cada punto temporal.
[0329] La dosificación profiláctica en el modelo CAIA se realizó con 100 mg/kg de construcción 4 el día 1 (FIG. 25). El control del vehículo (solución salina) se dosificó sólo el día 1.
[0330] La Figura 25 es un gráfico que compara la eficacia de la construcción 4 (AA: cuadrados negros, línea continua) o solución salina (círculos grises, línea de puntos y guiones) dosificada profilácticamente a 100 mg/kg el día 1 en un modelo de artritis inducida por anticuerpos contra colágeno (CAIA). Se dosificó un volumen equivalente de solución salina (círculos grises, línea de puntos y guiones) el día 1. Se muestran la media y el error estándar de la media para cada punto temporal.
[0331] Se descubrió que la construcción 4 reducía la gravedad de la enfermedad en comparación con el control del vehículo cuando se dosificó terapéuticamente (FIG. 24) o profilácticamente (FIG. 25).
Ejemplo 12. Mejora de la unión de la construcción de Fc a FcyRIIb
[0332] Se ha demostrado previamente que las mutaciones S267E /L328F mejoran significativa y de manera específica la unión de IgG1 al receptor FcyRllb (Chu et al. Molecular Immunology 45 (2008) pág. 3926-3933). Las mutaciones S267E/L328F se incorporaron en el esqueleto de la Construcción 4 (SIF). Este mutante de la Construcción 4-FcyRIIb+ se expresa y ensambla bien (ver Figura 26) (SIF: construcción 4; FcyRllb+: mutante de la Construcción 4-FcyRllb+). La Figura 26 es una imagen de los resultados de las electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio no reducido para los medios depurados obtenidos a partir de la expresión transitoria de la Construcción 4 (SIF) y el mutante de la Construcción 4-FcyRllb+. Los plásmidos que codifican las cadenas larga y corta de la construcción 4-FcyRllb se transfectaron en células HEK293 en proporciones 1/1 (p/p) o 2/1.
[0333] La unión del mutante de la Construcción 4-FcyRllb+ al receptor inhibidor FcyRllb se mejoró enormemente en comparación con el control de la Construcción 4 (SIF3) (aumento de más de 300 veces en la unión). Por el contrario, la unión al FcyRlla activador no se ve relativamente afectada, mientras que la unión a FcyRIIIa se reduce (ver Figura 27).
[0334] La figura 27 son gráficos que resumen los resultados de experimentos que comparan la unión a receptores Fc gamma de un control IgG1, la Construcción 4 y el mutante Construcción 4-FcyRllb+. La unión relativa se midió utilizando ensayos competitivos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de resolución temporal basados en células (CisBio Bioassays, Bedford, MA). Los resultados se expresan como valores de EC50, lo que indica la concentración de probando necesaria para desplazar un anticuerpo marcado con fluorescencia unido al receptor Fc gamma de la superficie celular específico. Cuanto mayor sea el número, menor será la unión o afinidad.
Ejemplo 13. Inhibición de la activación de células dendríticas derivadas de monocitos (moDC)
[0335] El mutante de construcción 4-FcyRllb+ potencia enormemente la activación de células dendríticas derivadas de monocitos (moDC). Las células dendríticas (DC), que son la población más importante de células presentadoras de antígenos profesionales, procesan el material antigénico y lo presentan en la superficie celular con el objetivo de iniciar respuestas de células T. Los FcyR pueden desempeñar un papel importante en la regulación de la función de moDC. La participación de complejos inmunológicos de los FcyR activadores puede desencadenar la maduración y activación de moDC humanas inmaduras. Por el contrario, la participación del FcyRllb inhibidor puede suprimir la maduración y la activación (Boruchov AM et al. J Clin Invest. 2005 115(10)). Anteriormente habíamos demostrado que las construcciones de Fc pueden inhibir la maduración y activación de moDC (Ortiz et al Sci Transl Med 2016 y ver figura 3). Por otro lado, las construcciones de Fc (por ejemplo, Construcción 4/SIF3) con las mutaciones FcyRIIb+ pueden potenciar significativamente la activación de moDC en respuesta a la exposición a un sustituto del complejo inmunitario, tal como lgG1 unida a placa (FIG. 28). La incubación con la construcción 4-FcYRIIb+ solo no induce la activación de moDC (FIG. 29).
[0336] Se generaron moDC humanas inmaduras a partir de monocitos CD14+ seleccionados negativamente en presencia de 100 ng/ml de GM-CSF y 50 ng/ml de IL-4. Las CD recolectadas se incubaron con PBS, anticuerpo anti-CD32a IV.3, Construcción 4 (SIF3) o Construcción 4-FcyRllb+ a 37 °C durante 20 minutos en medio. Después del bloqueo, la suspensión celular se transfirió a las placas recubiertas con IgG1 y se añadió un medio adicional suplementado con GM-CSF e IL-4. Después de una incubación de 48 horas, se recogieron células ligeramente adherentes lavando las placas dos veces con PBS enfriado con hielo. Las células recolectadas se tiñeron con Abs anti-HLA-DR FITC y anti-CD86-PE Cy7. Las células se analizaron con un software FACSCanto (BD) y FlowJo (TreeStar).
[0337] Figura 28: La construcción 4 inhibe la activación de moDC mediante IgG unida a la placa, mientras que la construcción 4-FcyRIIb+ mejora la activación. Los histogramas representativos muestran la expresión superficial de CD86 en moDC que se cultivaron en placas no tratadas como controles negativos (UT) o se trataron previamente durante 20 minutos con un anticuerpo que bloquea FcyRlla activador (IV.3), con la Construcción 4 o con concentraciones crecientes de la Construcción 4-FcyRIIB+. A continuación, las células tratadas se transfirieron a placas que contenían IgG1 inmovilizada (PB IgG). El tratamiento con factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) se utilizó como control positivo. La expresión superficial de CD86 se evaluó mediante citometría de flujo. Los histogramas de la expresión de CD86 se controlaron utilizando células no estimuladas como control. El porcentaje de células positivas para CD86 para las condiciones de tratamiento se representa en el eje y.
[0338] Figura 29: La construcción 4-FcyRllb+ no induce por sí sola la activación de moDC, pero sí mejora la activación mediante IgG unida a la placa. Los histogramas representativos muestran la expresión superficial de CD86 en moDC que se cultivaron en placas sin tratar como controles negativos (UT) o se trataron previamente durante 20 minutos con la Construcción 4-FcyRIIB+ y a continuación se transfirieron a placas sin tratar (FcyRIIb+ solo). Las MoDC pretratadas con PBS (PB IgG), con un anticuerpo que bloquea el FcyRlla activador (IV.3) o con la construcción 4-FcyRIIB+ (FcgRllb+) se transfirieron a placas que contenían IgG1 inmovilizada. La expresión superficial de CD86 se evaluó mediante citometría de flujo. Los histogramas de la expresión de CD86 se controlaron utilizando células no estimuladas como control. El porcentaje de células positivas para CD86 para las condiciones de tratamiento se representa en el eje y.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Construcción de Fc que comprende:
a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que
i) A comprende un primer monómero de dominio Fc;
ii) L es un espaciador de glicina; y
iii) B comprende un segundo monómero de dominio Fc;
b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que
i) A' comprende un tercer monómero de dominio Fc;
ii) L' es un espaciador de glicina; y
iii) B' comprende un cuarto monómero de dominio Fc;
c) un tercer polipéptido que comprende un quinto monómero de dominio Fc; y
d) un cuarto polipéptido que comprende un sexto monómero de dominio Fc;
en la que
cada uno de los polipéptidos primero y segundo tiene la secuencia de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAV
EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGG
GGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL
TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPG (SEQ ID NO: 49),
cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto tiene la secuencia de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPFLLGGPSVFl FPPKPKDTIMISRTPFVTCVWDVSHFDPFVKFNWYVDGVFVHNAKTKPRFFQYNST
YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAV
EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:
48).
y
B y B' se combinan para formar un primer dominio Fc, A y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y A' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc.
2. Composición farmacéutica que comprende la construcción de Fc de la reivindicación 1.
3. Construcción de Fc de la reivindicación 1 para su utilización en un procedimiento para reducir la activación de las células inmunitarias de la respuesta inmunitaria en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar dicha construcción de Fc al sujeto.
4. Construcción de Fc de la reivindicación 1 para su utilización en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.
5. Construcción de Fc de la reivindicación 1 para su utilización en un procedimiento de tratamiento de la inflamación en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar dicha construcción de Fc al sujeto.
6. Medio de cultivo celular que comprende una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc que comprende:
a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que
i) A comprende un primer monómero de dominio Fc;
ii) L es un espaciador de glicina; y
iii) B comprende un segundo monómero de dominio Fc;
b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que
i) A' comprende un tercer monómero de dominio Fc;
ii) L' es un espaciador de glicina; y
iii) B' comprende un cuarto monómero de dominio Fc;
c) un tercer polipéptido que comprende un quinto monómero de dominio Fc; y
d) un cuarto polipéptido que comprende un sexto monómero de dominio Fc;
en la que
cada uno de los polipéptidos primero y segundo tiene la secuencia de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPELIGGPSVFLFPPKPKDTIMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAV
EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSISPGKGGGGGGGG
GGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL
TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPG (SEQ ID NO: 49),
cada uno de los polipéptidos tercero y cuarto tiene la secuencia de aminoácidos:
DKTHTCPPCPAPFLLGGPSVFl FPPKPKDTIMISRTPFVTCVWDVSHFDPFVKFNWYVDGVFVHNAKTKPRFFQYNST
YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAV
EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:
48),
y
B y B' se combinan para formar un primer dominio Fc, A y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y A' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc.
7. Medio de cultivo celular de la reivindicación 6, en el que la población sustancialmente homogénea de la construcción de Fc es al menos un 85 % homogénea.
8. Procedimiento para preparar un medio de cultivo celular que comprende una población sustancialmente homogénea de la construcción de Fc de la reivindicación 1, comprendiendo el procedimiento:
a) proporcionar células huésped en un medio de cultivo celular, en el que las células comprenden polinucleótidos que codifican cada uno de los polipéptidos primero, segundo, tercer y cuarto de la reivindicación 1;
b) expresar los polipéptidos en las células huésped en condiciones que permitan la formación de la construcción de Fc y la secreción en el medio de cultivo celular; y
c) recoger el medio de cultivo celular.
9. Procedimiento de la reivindicación 8, en el que la población sustancialmente homogénea de la construcción de Fc es al menos un 85 % homogénea.
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