ES2973443T3 - Polinucleótidos que codifican galactosa-1-fosfato uridililtransferasa para el tratamiento de galactosemia de tipo 1 - Google Patents

Polinucleótidos que codifican galactosa-1-fosfato uridililtransferasa para el tratamiento de galactosemia de tipo 1 Download PDF

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Abstract

La invención se refiere a la terapia con ARNm para el tratamiento de la galactosemia tipo 1 (Gal-1). Los ARNm para uso en la invención, cuando se administran in vivo, codifican galactosa-1-fosfato uridiltransferasa humana (GALT), isoformas de la misma, fragmentos funcionales de la misma y proteínas de fusión que comprenden GALT. Los ARNm de la invención se encapsulan preferiblemente en nanopartículas lipídicas (LNP) para efectuar una administración eficiente a células y/o tejidos en sujetos, cuando se administran a estos. Las terapias de ARNm de la invención aumentan y/o restauran niveles deficientes de expresión y/o actividad de GALT en sujetos. Las terapias de ARNm de la invención disminuyen aún más los niveles de metabolitos tóxicos asociados con una actividad GALT deficiente en sujetos, a saber, galactosa-1-fosfato (Gal-lP). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Polinucleótidos que codifican galactosa-1-fosfato uridililtransferasa para el tratamiento de galactosemia de tipo 1
Antecedentes
La galactosemia de tipo 1 (“G a l-I”) es un trastorno metabólico autosómico recesivo raro caracterizado por la incapacidad de metabolizar galactosa. Bosch AM.J Inherit Metab Dis.29: 516-525 (2006). Otros alias para Gal-1 son: deficiencia de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa, deficiencia de GALT y galactosemia clásica. La Gal-1 suele presentarse en recién nacidos después de la ingestión de lactosa y causa dificultades alimentarias, ictericia, hepatosplenomegalia, insuficiencia hepatocelular, hipoglucemia, disfunción tubular renal, hipotonía muscular, sepsis, cataratas y posiblemente la muerte a corto plazo. Los síntomas a largo plazo incluyen retraso mental, dispraxia verbal, anomalías motoras e hipogonadismo hipergonadotrópico. Bosch AM. J Inherit Metab Dis. 29: 516-525 (2006). Tiene una incidencia estimada de 1 en 60000, con una incidencia mayor en Europa y Estados Unidos. El tratamiento actual para Gal-1 es principalmente a través del control de la dieta para limitar el consumo de galactosa y lactosa, que se metaboliza a galactosa y glucosa, para prevenir la acumulación de galactosa. Karadag N. et al.,Clin Lab. 59:1139-1146 (2013).
El gen principal asociado con Gal-1 es la galactosa-1-fosfato uridililtransferasa ("GALT"), que tiene dos variantes (NM_000155; NM_001258332; NP_000146; NP_001245261 también denominada UDP-Glucosa-Hexosa-1-Fosfato Uridiltransferasa y Gal-1-P Uridililtransferasa). La GALT es una enzima metabólica (E.C.2.7.7.12) que desempeña un papel decisivo en la ruta de Leloir del metabolismo de la galactosa. Específicamente, la función biológica de GALT es convertir UDP-glucosa y galactosa-1-fosfato en glucosa-1-fosfato y UDP-galactosa. Timson DJ,Gene(2015) doi:10. 1016/j.gene.2015.06.077. La GALT se expresa en diversos tejidos, principalmente el hígado, se localiza en el aparato de Golgi y el citoplasma de las células, y existe como un homodímero en su forma nativa. La primera isoforma de GALT humana es 379 aminoácidos, mientras que su segunda isoforma es 270 aminoácidos. Ambas isoformas tienen cuatro sitios de unión de hierro y al menos un sitio de unión de zinc.
Una pérdida completa o parcial de la función de GALT conduce a una acumulación anormal de galactosa. Por ejemplo, se ha notificado que la pérdida de GALT conduce a niveles de galactosa superiores a 100 mg/dL en un individuo en comparación con menos de 10 mg/dL en individuos normales. El tratamiento para Gal-1 generalmente se centra en el manejo de los síntomas y la prevención de complicaciones, por ejemplo, a través de restricciones de la dieta. No existen agentes terapéuticos comerciales para tratar Gal-1, por lo tanto, existe la necesidad de una terapia mejorada para tratar Gal-1.
El documento WO 2014/144196 divulga composiciones farmacéuticas que comprenden “mezclas” de nanopartículas lipídicas y métodos relacionados para usar tales composiciones mezcladas para aportar polinucleótidos a células, tejidos u órganos diana.
El documento WO 2013/151666 se refiere a composiciones y métodos para la preparación, fabricación y uso terapéutico de polinucleótidos, transcritos primarios y moléculas de ARNm.
El documento WO 2017/191274 se refiere a un ARN que codifica una proteína terapéutica.
El documento WO 2015/074085 proporciona lípidos catiónicos ionizables para la administración de ARN.
El documento WO 2016/176330 se refiere a composiciones y métodos para inducir una respuesta inmunitaria adaptativa en un individuo.
Compendio de la invención
Basándose en la divulgación contenida en la presente memoria, la presente invención proporciona una composición que comprende (a) un ARNm que comprende un marco de lectura abierta (ORF, por sus siglas en inglés) que codifica un polipéptido de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT) y (b) un agente de administración, comprendiendo el agente de administración un compuesto que tiene la fórmula (IA):
(IA),
0 una sal o estereoisómero del mismo, en donde
1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5;
m se selecciona entre 5, 6, 7, 8 y 9;
M1 es un enlace o M';
R4 es alquilo C1-3 insustituido, o -(CH2)nQ, en donde n es 1, 2, 3, 4 o 5 y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o -NHC(O)N(R)2;
M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14 y alquenilo C2-14; cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la composición de la invención, para su uso en el tratamiento de la galactosemia de tipo 1 (Gal-1) en un individuo humano.
La presente invención se define en las reivindicaciones independientes y ciertas características opcionales de la misma se definen en las reivindicaciones dependientes. En la medida en que los términos “invención”, “ejemplo” y “realización” se usan en la presente memoria, estos términos se interpretarán de tal manera que sólo se busque protección para la invención como se reivindica.
Descripción detallada
La información técnica que se expone a continuación puede en algunos aspectos ir más allá del alcance de la invención, que está definida exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para colocar la invención real en un contexto técnico más amplio, y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados.
Cualquier referencia a métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y prácticas de métodos de diagnóstico en el cuerpo humano o animal no debe interpretarse como una reivindicación de protección para tales métodos como tales, sino que en su lugar debe interpretarse como una referencia a productos, en particular sustancias o composiciones para su uso en cualquiera de estos métodos. La presente invención proporciona agentes terapéuticos de ARNm para el tratamiento de galactosemia de tipo 1 (Gal-1), como se definen en las reivindicaciones. Los agentes terapéuticos de ARNm de la invención son particularmente adecuados para el tratamiento de Gal-1, ya que la tecnología prevé la administración intracelular de ARNm que codifica GALT seguido de la síntesisde novode la proteína GALT funcional dentro de las células diana. La presente invención presenta la incorporación de nucleótidos modificados dentro de ARNm terapéuticos para (1) minimizar la activación inmunitaria no deseada (por ejemplo, la respuesta inmunitaria innata asociada con la introducciónin vivode ácidos nucleicos ajenos) y (2) optimizar la eficiencia de traducción de ARNm a proteína. Los aspectos ejemplares de la invención presentan una combinación de modificaciones de nucleótidos para reducir la respuesta inmunitaria innata y la optimización de la secuencia, en particular, dentro del marco de lectura abierta (ORF) de ARNm terapéuticos que codifican GALT para potenciar la expresión de proteínas
En realizaciones adicionales, la tecnología terapéutica de ARNm de la presente invención también presenta la administración de ARNm que codifica GALT mediante un sistema de administración de nanopartículas lipídicas (LNP, por sus siglas en inglés). La presente invención presenta LNP basadas en lípidos ionizables novedosas, que tienen propiedades mejoradas cuando se combinan con ARNm que codifica GALT y se administranin vivo,por ejemplo, absorción celular, transporte intracelular y/o liberación endosomal o escape endosomal. Las formulaciones de LNP de la invención también demuestran inmunogenicidad reducida asociada con la administraciónin vivode LNP.
En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden un polinucleótido, es decir, un ARN mensajero (ARNm), que codifica galactosa-1-fosfato uridililtransferasa. En un aspecto adicional, la invención proporciona las composiciones de la invención para su uso en un método de tratamiento de galactosemia de tipo 1 (Gal-1) en un individuo que lo necesite mediante la administración de las mismas.
La presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un ARNm encapsulado en nanopartículas lipídicas que comprende un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT), siendo la composición adecuada para la administración a un individuo humano que necesite tratamiento para galactosemia de tipo 1 (Gal-1).
La presente divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende: (a) un ARNm que comprende (i) un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT), en donde el ORF comprende al menos una nucleobase modificada químicamente, azúcar, cadena principal, o cualquier combinación de los mismos y (ii) una región no traducida (UTR, por sus siglas en inglés) que comprende un sitio de unión de microARN (miARN); y (b) un agente de administración, siendo la composición farmacéutica adecuada para la administración a un individuo humano que necesite tratamiento para galactosemia de tipo 1 (Gal-1).
La presente divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende un ARNm que comprende un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT) humana, siendo suficiente la composición, cuando se administra a un individuo que la necesite como una dosis intravenosa única, para reducir los niveles urinarios, séricos y/o plasmáticos de: (i) galactitol al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces o al menos 50 veces en comparación con el nivel base de galactitol del individuo o un nivel de referencia de galactitol, durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas, o al menos 120 horas después de la administración, (ii) galactonato al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces o al menos 50 veces en comparación con el nivel base de galactonato del individuo o un nivel de referencia de galactonato, durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas, o al menos 120 horas después de la administración, (iii) galactosa al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces o al menos 50 veces en comparación con el nivel base de galactosa del individuo o un nivel de referencia de galactosa, durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas, o al menos 120 horas después de la administración, y/o (iv) 8-hidroxi-2-desoxiguanosina al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces o al menos 50 veces en comparación con el nivel base de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina del individuo o un nivel de referencia de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina, durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas o al menos 120 horas después de la administración.
La presente divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende un ARNm que comprende un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT) humana, siendo suficiente la composición, cuando se administra a un individuo que la necesite como una dosis intravenosa única, para reducir los niveles urinarios, séricos y/o plasmáticos de: (i) galactitol en al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% en comparación con el nivel base de galactitol del individuo o un nivel de referencia de galactitol, durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas o al menos 120 horas después de la administración, (ii) galactonato en al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% en comparación con el nivel base de galactonato del individuo o un nivel de referencia de galactonato, durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas o al menos 120 horas después de la administración, (iii) galactosa al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% en comparación con el nivel base de galactosa del individuo o un nivel de referencia de galactosa, durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas o al menos 120 horas después de la administración, y/o (iii) 8-hidroxi-2-desoxiguanosina en al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70% al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% en comparación con el nivel base de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina del individuo o un nivel de referencia de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina, durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas o al menos 120 horas después de la administración.
La presente divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende un ARNm que comprende un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa humana (GALT), siendo suficiente la composición, cuando se administra a un individuo que la necesite como una dosis intravenosa única, para reducir los niveles de galactosa-1-fosfato (Gal-1-P) de los glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés) y/o del hígado a al menos dentro de un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% del nivel fisiológico normal de Gal-1-P o un nivel de referencia de Gal-1-P en un plazo de al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas, o al menos 120 horas después de la administración.
La presente divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende un ARNm que comprende un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT) humana, siendo suficiente la composición, cuando se administra a un individuo que la necesite como una dosis intravenosa única, para: (i) mantener los niveles de actividad de GALT hepática y/o de RBC en o por encima de un nivel fisiológico de referencia durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, o al menos 72 horas, al menos 96 horas, o al menos 120 horas después de la administración, y/o (ii) mantener los niveles de actividad de GALT hepática y/o de RBC al 50% o más de un nivel de referencia de actividad de GALT hepática o de RBC durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas o al menos 96 horas después de la administración. Las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria pueden comprender además un agente de administración.
La presente divulgación proporciona un polinucleótido que comprende un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT), en donde el contenido de uracilo o timina del ORF en relación con el contenido mínimo teórico de uracilo o timina de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de GALT (%Utm o%Ttm) está entre un 100% y aproximadamente un 150%. En algunos casos, el%UTM o%Ttm está entre aproximadamente un 105% y aproximadamente un 145%, aproximadamente un 105% y aproximadamente un 140%, aproximadamente un 110% y aproximadamente un 140%, aproximadamente un 110% y aproximadamente un 145%, aproximadamente un 115% y aproximadamente un 135%, aproximadamente un 105% y aproximadamente un 135%, aproximadamente un 110% y aproximadamente un 135%, aproximadamente un 115% y aproximadamente un 145%, o aproximadamente un 115% y aproximadamente un 140%. En algunos casos, el%UTM o%Ttm está entre (i) un 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, o 123% y (ii) un 134%, 135%, 136%, 137%, 138%, 139% o 140%.
En algunos casos, el contenido de uracilo o timina en el ORF en relación con el contenido de uracilo o timina del ORF de tipo silvestre correspondiente (%U<wt o>%T<wt>) es inferior a un 100%. En algunos casos, el%UWT o%Twt es inferior a aproximadamente un 95%, inferior a aproximadamente un 90%, inferior a aproximadamente un 85%, inferior a un 80%, inferior a un 79%, inferior a un 78%, inferior a un 77%, inferior a un 76%, inferior a un 75% o inferior a un 74%. En algunos casos, el%Uwr<o>%T<wt>está entre un 68% y un 74%. En algunos casos, el contenido de uracilo o timina en el ORF es inferior a aproximadamente un 50%, inferior a aproximadamente un 40%, inferior a aproximadamente un 30%, o inferior a aproximadamente un 20% del contenido total de nucleótidos en el ORF. En algunos casos, el contenido de uracilo o timina en el ORF en relación con el contenido total de nucleótidos en el ORF (%U<tl o>%T<tl>) es inferior a aproximadamente un 20%. En algunos casos, el%UTL o%Ttl está entre aproximadamente un 13% y aproximadamente un 15%.
En algunos casos, el contenido de guanina del ORF con respecto al contenido máximo teórico de guanina de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de GALT (%G<tmx>) es inferior a un 100%, inferior a aproximadamente un 90%, inferior a aproximadamente un 85%, o inferior a aproximadamente un 80%. En algunos casos, el% Gtmx está entre aproximadamente un 69% y aproximadamente un 80%, entre aproximadamente un 70% y aproximadamente un 79%, entre aproximadamente un 70% y aproximadamente un 78%, o entre aproximadamente un 70% y aproximadamente un 77%. En algunos casos, el contenido de citosina del ORF en relación con el contenido máximo teórico de citosina de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de GALT (%C<tmx>) es inferior a un 95%. En algunos casos, el% C<tmx>está entre aproximadamente un 60% y aproximadamente un 80%, entre aproximadamente un 65% y aproximadamente un 80%, entre aproximadamente un 68% y aproximadamente un 79%, o entre aproximadamente un 70% y aproximadamente un 78%.
En algunos casos, el contenido de guanina y citosina (G/C) del ORF en relación con el contenido máximo teórico de G/C en una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de GALT (%G/C<tmx>) es al menos aproximadamente un 69%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o aproximadamente un 100%. En algunos casos, el%G/CTMX está entre aproximadamente un 80% y aproximadamente un 100%, entre aproximadamente un 85% y aproximadamente un 99%, entre aproximadamente un 90% y aproximadamente un 97%, o entre aproximadamente un 91% y aproximadamente un 95%. En algunos casos, el%G/CTMX es al menos un 2%, al menos un 3%, al menos un 4%, al menos un 5%, al menos un 6%, al menos un 7%, al menos aproximadamente un 10%, o al menos aproximadamente un 11% mayor. En algunos casos, el contenido de G/C promedio en la 3a posición de codón en el ORF es al menos un 20%, al menos un 21%, al menos un 22%, al menos un 23%, al menos un 24%, al menos un 25%, al menos un 26%, al menos un 27%, al menos un 28%, al menos un 29%, o al menos un 30% mayor que el contenido de G/C promedio en la 3a posición de codón en el ORF de tipo silvestre correspondiente.
En algunos casos, el ORF comprende además al menos un codón de baja frecuencia.
En algunos casos de los polinucleótidos divulgados en la presente memoria, (i) el ORF tiene al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 5 a 29 y 113 a 131; o (ii) el ORF tiene al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 5 a 29 y 113 a 131; o (iii) el ORF tiene al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91% al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 124 o 126; o (iv) en donde el ORF tiene al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o un 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 124 o 126. En algunos casos, el ORF comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 124 o 126.
En algunos casos, el polipéptido de GALT comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99%, o aproximadamente un 100% idéntica a (i) la secuencia de polipéptidos de GALT de tipo silvestre, isoforma 1 (SEQ ID NO: 1), o (ii) la secuencia de polipéptidos de g A lT de tipo silvestre, isoforma 2 (SEQ ID NO: 3), y en donde el polipéptido de GALT tiene actividad de galactosa-1-fosfato uridilitransferasa. En algunos casos, el polipéptido de g A lT es una variante, derivado o mutante que tiene una actividad de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa. En algunos casos, el polipéptido de GALT es una proteína de fusión de GALT. En algunos casos, la proteína de fusión de GALT comprende un resto de proteína heteróloga.
En algunos casos, la secuencia de polinucleótidos comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito.
En la composición de la invención, el polinucleótido es ARNm. En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido comprende al menos una nucleobase modificada químicamente, azúcar, cadena principal, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la al menos una nucleobase modificada químicamente se selecciona del grupo que consiste en pseudouracilo (<y>), N1-metilpseudouracilo (m1^), 2-tiouracilo (s2U), 4’- tiouracilo, 5-metilcitosina, 5-metiluracilo y cualesquiera combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la al menos una nucleobase modificada químicamente se selecciona del grupo que consiste en pseudouracilo (<y>), N1-metilpseudouracilo (<i t i>1<y>), 1-etilpseudouracilo, 2-tiouracilo (<s>2U), 4’-tiouracilo, 5-metilcitosina, 5-metiluracilo, 5-metoxiuracilo y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la al menos una nucleobase modificada químicamente es 5-metoxiuracilo. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 99% o un 100% de los uracilos son 5-metoxiuracilos. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 99% o un 100% de los uracilos o timinas están químicamente modificados. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 99% o un 100% de las guaninas están químicamente modificadas. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 99% o un 100% de las citosinas están químicamente modificadas. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 99% o un 100% de las adeninas están químicamente modificadas.
En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido comprende además un sitio de unión de micro ARN.
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende al menos dos sitios de unión de microARN (miR) diferentes.
En algunas realizaciones, el microARN se expresa en una célula inmunitaria de linaje hematopoyético o una célula que expresa TLR7 y/o TLR8 y secreta citocinas y/o quimiocinas proinflamatorias, comprendiendo el polinucleótido (por ejemplo, ARNm) una o más nucleobases modificadas.
En algunas realizaciones, el ARNm comprende al menos un primer sitio de unión de microARN de un microARN abundante en una célula inmunitaria de linaje hematopoyético y al menos un segundo sitio de unión de microARN es de un microARN abundante en células endoteliales.
En algunas realizaciones, el ARNm comprende múltiples copias de un primer sitio de unión de microARN y al menos una copia de un segundo sitio de unión de microARN.
En algunas realizaciones, el ARNm comprende primeros y segundos sitios de unión de microARN del mismo microARN.
En algunas realizaciones, los sitios de unión de microARN son de los brazos 3p y 5p del mismo microARN.
En algunas realizaciones, el sitio de unión de microARN comprende una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas de la Tabla 3 o la Tabla 4.
En algunas realizaciones, el sitio de unión de microARN se une a miR-126, miR-142, miR-144, miR-146, miR-150, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27, miR-26a, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el sitio de unión de microARN se une a miR126-3p, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-155, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el sitio de unión de microARN es un sitio de unión de miR-126. En algunas realizaciones, al menos un sitio de unión de microARN es un sitio de unión de miR-142. En algunas realizaciones, un sitio de unión de microARN es un sitio de unión de miR-126 y el segundo sitio de unión de microARN es para un microARN seleccionado del grupo que consiste en miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24 y miR-27.
En algunas realizaciones, el ARNm comprende al menos un sitio de unión de miR-126-3p y al menos un sitio de unión de miR-142-3p. En algunas realizaciones, el ARNm comprende al menos un sitio de unión de miR-142-3p y al menos un sitio de unión de 142-5p.
En algunas realizaciones, los sitios de unión de microARN se localizan en la 5’ UTR, 3’ UTR, o tanto la 5’ UTR como la 3’ UTR del ARNm. En algunas realizaciones, los sitios de unión de microARN se localizan en la 3' UTR del ARNm. En algunas realizaciones, los sitios de unión de microARN se localizan en la 5’ UTR del ARNm. En algunas realizaciones, los sitios de unión de microARN se localizan tanto en la 5’ UTR como en la 3’ UTR del ARNm. En algunas realizaciones, al menos un sitio de unión de microARN se localiza en la 3' UTR inmediatamente adyacente al codón de parada de la región codificante del ARNm. En algunas realizaciones, al menos un sitio de unión de microARN se localiza en las 70-80 bases de 3’ UTR en dirección 3' desde el codón de parada de la región codificante del ARNm. En algunas realizaciones, al menos un sitio de unión de microARN se localiza en la 5' UTR inmediatamente anterior al codón de iniciación de la región codificante del ARNm. En algunas realizaciones, al menos un sitio de unión de microARN se localiza en los 15-20 nucleótidos de 5' UTR anteriores al codón de iniciación de la región codificante del ARNm. En algunas realizaciones, al menos un sitio de unión de microARN se localiza en los 70-80 nucleótidos de 5' UTR anteriores al codón de iniciación de la región codificante del ARNm.
En algunas realizaciones, el ARNm comprende múltiples copias del mismo sitio de unión de microARN posicionadas inmediatamente adyacentes entre sí o con un espaciador de menos de 5, 5-10, 10-15 o 15-20 nucleótidos.
En algunas realizaciones, el ARNm comprende múltiples copias del mismo sitio de unión de microARN localizadas en la 3' UTR, estando el primer sitio de unión de microARN posicionado inmediatamente adyacente al codón de parada, y estando el segundo y el tercer sitios de unión de microARN posicionados 30-40 bases en dirección 3' desde el residuo más 3’ del primer sitio de unión de microARN.
En algunas realizaciones, el sitio de unión de microARN comprende una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas entre SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el sitio de unión de microARN se une a miR-142. En algunas realizaciones, el sitio de unión de microARN se une a miR-142-3p o miR-142-5p. En algunas realizaciones, el miR142 comprende la SEQ ID NO: 30.
En algunas realizaciones, el sitio de unión de microARN comprende una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas entre SEQ ID NO: 96 y SEQ ID NO: 156. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN se une a miR-126. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN se une a miR-126-3p o miR-126-5p.
En algunas realizaciones, el miR-126 comprende la SEQ ID NO: 155.
En algunas realizaciones de la invención, el ARNm comprende una 3' UTR que comprende un sitio de unión de microARN que se une a miR-142, miR-126 o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido, es decir, ARNm, comprende además una 3' UTR. En algunas realizaciones, la 3' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99%, o un 100% idéntica a una secuencia de 3' UTR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 53 a 77, 79, 97, 98, 101 a 108, 112, y 163 a 173 o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN se localiza dentro de la 3' UTR. En algunas realizaciones, la 3' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 53 a 77, 79, 97, 98, 101 a 108, 112 y 163 a 173, y cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido, es decir, ARNm, comprende además una 5' UTR. En algunas realizaciones, la 5' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99%, o aproximadamente un 100% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 35-52 y 109-111, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la 5' UTR comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 35-52, 109-111, y cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el ARNm comprende una 5' UTR que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:35.
En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido, es decir, ARNm, comprende además un casquete terminal 5'. En algunas realizaciones, el casquete terminal 5’ comprende un casquete Cap0, Cap1, ARCA, inosina, N1-metil-guanosina, 2’-fluoro-guanosina, 7-desaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azidoguanosina, Cap2, Cap4, cap 5’ metilG, o un análogo de los mismos. En algunas realizaciones, el casquete terminal 5’ comprende un Cap 1.
En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido, es decir, ARNm, comprende además una región poli-A. En algunas realizaciones, la región poli-A tiene al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80 o al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la región poli-A tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 200, de aproximadamente 20 a aproximadamente 180, de aproximadamente 50 a aproximadamente 160, de aproximadamente 70 a aproximadamente 140, o de aproximadamente 80 a aproximadamente 120 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido, es decir, ARNm, codifica un polipéptido de GALT que se fusiona con uno o más polipéptidos heterólogos. En algunas realizaciones, los uno o más polipéptidos heterólogos aumentan una propiedad farmacocinética del polipéptido de GALT. En algunas realizaciones, tras la administración de una composición de la invención a un individuo, el polinucleótido tiene (i) una semivida plasmática más larga; (ii) una expresión aumentada de un polipéptido de GALT codificado por el ORF; (iii) una frecuencia menor de traducción detenida que da como resultado un fragmento de expresión; (iv) una mayor estabilidad estructural; o (v) cualquier combinación de las mismas, en relación con un polinucleótido correspondiente que comprende las SEQ ID NOs: 2 o 4.
En algunas realizaciones, el polinucleótido, es decir, ARNm, comprende (i) un casquete terminal 5’; (ii) una 5’-UTR; (iii) un ORF que codifica un polipéptido de GALT; (iv) una 3’-UTR; y (v) una región poli-A. En algunas realizaciones, la 3’-UTR comprende un sitio de unión de miARN. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 132-150 (por ejemplo, SEQ ID NOs: 143 o 145). En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende además un casquete terminal 5’ (por ejemplo, Cap1) y una región de cola de poli-A (por ejemplo, aproximadamente 100 nucleótidos de longitud).
La presente divulgación también proporciona un método para producir el polinucleótido, es decir, ARNm, comprendiendo el método modificar un ORF que codifica un polipéptido de GALT sustituyendo al menos una nucleobase de uracilo por una nucleobase de adenina, guanina o citosina, o sustituyendo al menos una nucleobase de adenina, guanina o citosina por una nucleobase de uracilo, en donde todas las sustituciones son sustituciones sinónimas. En algunos casos, el método comprende además reemplazar al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 99%, o aproximadamente un 100% de los uracilos por 5-metoxiuracilos.
La composición de la invención comprende (a) el polinucleótido, es decir, ARNm, y (b) un agente de administración. En algunas realizaciones de la invención, el agente de administración comprende un lipidoide, un liposoma, un lipoplejo, una nanopartícula lipídica, un compuesto polimérico, un péptido, una proteína, una célula, un imitador de nanopartícula, un nanotubo o un conjugado. En algunas realizaciones de la invención, el agente de administración comprende una nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica comprende un lípido seleccionado del grupo que consiste en 3-(didodecilamino)-N1, N1,4-tridodecil-1 -piperazinaetanamina (KL10),
N1-[2-(didodecilamino)etil]-N1,N4,N4-tridodecil-1,4-piperazinadietanamina (KL22),
14,25-ditridecil-15, 18,21,24-tetraaza-octatriacontano (KL25),
1.2- dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLin-DMA),
2.2- dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (Dlin-K-DMA),
heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoato (Dlin-MC3-DMA),
2.2- dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA),
1.2- dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA), (13Z, 165Z)-N,N-dimetil-3-nonidocosa-13-16-dien-1-amina (L608),
2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA),
(2R)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2R)),
(2S)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2S)), y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica comprende Dlin-MC3-DMA.
En la composición de la invención, el agente de administración comprende un compuesto de Fórmula (IA):
0 una sal o estereoisómero del mismo, en donde
1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5;
m se selecciona entre 5, 6, 7, 8 y 9;
Mi es un enlace o M';
R4 es alquilo C1-3 insustituido, o -(CH2)nQ, en donde n es 1, 2, 3, 4 o 5 y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o -NHC(O)N(R)2;
M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14 y alquenilo C2-14, cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6.
En algunas realizaciones, la composición de la invención es una composición de nanopartículas.
En algunas realizaciones de la invención, el agente de administración comprende además un fosfolípido. En algunas realizaciones, el fosfolípido se selecciona del grupo que consiste en 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC),
1.2- dimiristoil-5n-glicero-fosfocolina (DMPC),
1.2- dioleoil-5n-glicero-3-fosfocolina (DOPC),
1.2- dipalmitoil-5n-glicero-3-fosfocolina (DPPC),
1.2- diestearoil-5n-glicero-3-fosfocolina (DSPC),
1.2- diundecanoil-5n-glicero-fosfocolina (DUPC),
1-palmitoil-2-oleoil-5n-glicero-3-fosfocolina (POPC),
1.2- di-O-octadecenil-5n-glicero-3-fosfocolina (18:0 Diether PC),
1-oleoil-2-colesterilhemisuccinoil-5n-glicero-3-fosfocolina (OChemsPC),
1-hexadecil-5n-glicero-3-fosfocolina (C16 Lyso PC),
1.2- dilinolenoil-5n-glicero-3-fosfocolina,
1.2- diaraquidonoil-5n-glicero-3-fosfocolina,
1.2- didocosahexaenoil-5n-glicero-3-fosfocolina,
1.2- dioleoil-5n-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE),
1.2- difitanoil-5n-glicero-3-fosfoetanolamina (ME 16:0 PE),
1.2- diestearoil-5n-glicero-3-fosfoetanolamina,
1.2- dilinoleoil-5n-glicero-3-fosfoetanolamina,
1.2- dilinolenoil-5n-glicero-3-fosfoetanolamina,
1.2- diaraquidonoil-5n-glicero-3-fosfoetanolamina,
1.2- didocosahexaenoil-5n-glicero-3-fosfoetanolamina,
sal sódica de 1,2-dioleoil-5n-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) (DOPG), esfingomielina, y cualesquiera mezclas de las mismas.
En algunas realizaciones, el agente de administración comprende además un lípido estructural. En algunas realizaciones, el lípido estructural se selecciona del grupo que consiste en colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brasicasterol, tomatidina, ácido ursólico, alfa-tocoferol y cualesquiera mezclas de los mismos.
En algunas realizaciones, el agente de administración comprende además un lípido de PEG. En algunas realizaciones, el lípido de PEG se selecciona del grupo que consiste en una fosfatidiletanolamina modificada con PEG, un ácido fosfatídico modificado con PEG, una ceramida modificada con PEG, una dialquilamina modificada con PEG, un diacilglicerol modificado con PEG, un dialquilglicerol modificado con PEG y cualesquiera mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el lípido de PEG tiene la fórmula:
, en donde r es un número entero entre 1 y 100. En algunas realizaciones, el lípido de PEG es el Compuesto 428.
En algunas realizaciones, el agente de administración comprende además un lípido ionizable seleccionado del grupo que consiste en
3-(didodecilamino)-N1,N1,4-tridodecil-1-piperazinaetanamina (KL10),
N1-[2-(didodecilamino)etil]-N1,N4,N4-tridodecil-1,4-piperazinadietanamina (KL22),
14,25-ditridecil-15,18,21,24-tetraaza-octatriacontano (KL25),
1.2- dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLin-DMA),
2.2- dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA),
heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoato (DLin-MC3-DMA),
2.2- dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA),
1.2- dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA),
2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA),
(2R)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2R)), y
(2S)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2S)).
En algunas realizaciones, el agente de administración comprende además un fosfolípido, un lípido estructural, un lípido de PEG, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el agente de administración comprende el Compuesto 18, DSPC, Colesterol y el Compuesto 428, por ejemplo, con una relación molar de aproximadamente 50:10:38.5:1.5.
En algunas realizaciones, la composición de la invención se formula para la administraciónin vivo.En algunas realizaciones, la composición se formula para la administración intramuscular, subcutáneo o intradérmico.
La presente divulgación proporciona además un polinucleótido que comprende un ARNm que comprende: (i) una 5' UTR, (ii) un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT) humana, en donde el ORF comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5 a 29 y 113 a 131, y (iii) una 3' UTR que comprende un sitio de unión de microARN seleccionado entre miR-142, miR-126, o una combinación de los mismos, en donde el ARNm comprende al menos una nucleobase modificada químicamente.
La presente divulgación proporciona además un polinucleótido que comprende un ARNm que comprende: (i) un casquete terminal 5’; (ii) una 5' UTR que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 35-52, 109-111, y cualquier combinación de las mismas; (iii) un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT) humana, en donde el ORF comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5 a 29 y 113 a 131, en donde el ARNm comprende al menos una nucleobase modificada químicamente seleccionada del grupo que consiste en pseudouracilo (<y>), N1-metilpseudouracilo (m1^), 1-etilpseudouracilo, 2-tiouracilo (s2U), 4’-tiouracilo, 5-metilcitosina, 5-metiluracilo, 5-metoxiuracilo, y cualquier combinación de los mismos; y (iv) una 3' UTR que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 53 a 77, 79, 97, 98, 101 a 108, 112 y 163 a 173 y cualquier combinación de las mismas; y (v) una región poli-A.
En algunos casos, el polinucleótido comprende un ORF que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre las SEQ ID NOs: 124 o 126. En algunos casos, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre las SEQ ID NOs: 143 o 145.
La presente divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido y un agente de administración. En la composición de la invención, el agente de administración es una nanopartícula lipídica que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (IA), por ejemplo, el Compuesto 18. En algunas realizaciones, el agente de administración es una nanopartícula lipídica que comprende el Compuesto 18, una sal o un estereoisómero del mismo, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica o el agente de administración comprenden el Compuesto 18, DSPC, Colesterol y el Compuesto 428, por ejemplo, con una relación molar de aproximadamente 50:10:38.5:1.5.
En un aspecto, el individuo es un individuo humano que necesita tratamiento o profilaxis para la galactosemia de tipo 1 (Gal-1).
En un aspecto, tras la administración de la composición de la invención al individuo, el ARNm tiene: (i) una semivida plasmática más larga; (ii) una expresión aumentada de un polipéptido de GALT codificado por el ORF; (iii) una frecuencia menor de traducción detenida que da como resultado un fragmento de expresión; (iv) una mayor estabilidad estructural; o (v) cualquier combinación de las mismas, en relación con un ARNm correspondiente que tiene la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID NOs: 2 o 4, y/o administrado como ARNm desnudo.
Una composición farmacéutica o un polinucleótido divulgados en la presente memoria son adecuados para la administración como una dosis unitaria única o una pluralidad de dosis unitarias únicas.
Una composición farmacéutica o un polinucleótido divulgados en la presente memoria son adecuados para reducir el nivel de uno o más biomarcadores de Gal-1 en el individuo.
En algunas realizaciones, la composición de la invención es para el uso en el tratamiento, la prevención o el retraso del comienzo de signos o síntomas de Gal-1 en el individuo. En algunas realizaciones, los signos o síntomas incluyen dificultades alimentarias, ictericia, hepatosplenomegalia, insuficiencia hepatocelular, hipoglucemia, disfunción tubular renal, hipotonía muscular, sepsis, cataratas, muerte, retraso mental, dispraxia verbal, anomalías motoras e hipogonadismo hipergonadotrópico, o una combinación de los mismos.
La presente divulgación también proporciona una célula hospedadora que comprende el polinucleótido. En algunos casos, la célula hospedadora es una célula eucariota. La presente divulgación también proporciona un vector que comprende el polinucleótido. También se proporciona un método para producir un polinucleótido que comprende sintetizar enzimática o químicamente el polinucleótido. La presente divulgación también proporciona un polipéptido codificado por el polinucleótido, una composición que comprende un polinucleótido, una célula hospedadora que comprende un polinucleótido, o un vector que comprende el polinucleótido o producido por el método divulgado en la presente memoria.
La presente divulgación también proporciona un método para expresarin vivoun polipéptido de GALT activo en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del polinucleótido, una composición que comprende un polinucleótido, una célula hospedadora que comprende un polinucleótido, 0 un vector que comprende un polinucleótido. También se proporciona un método para tratar la galactosemia de tipo 1 (Gal-1) en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz del polinucleótido, una composición que comprende un polinucleótido, una célula hospedadora que comprende un polinucleótido, o un vector que comprende el polinucleótido, en donde la administración alivia los signos o síntomas de Gal-1 en el individuo.
La presente divulgación también proporciona un método para prevenir o retrasar el comienzo de signos o síntomas de Gal-1 en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad profilácticamente eficaz del polinucleótido, una composición que comprende un polinucleótido, una célula hospedadora que comprende un polinucleótido, o un vector que comprende un polinucleótido antes de que se manifiesten los signos o síntomas de Gal-1, en donde la administración previene o retrasa el comienzo de signos o síntomas de Gal-1 en el individuo. También se proporciona un método para mejorar los signos o síntomas de Gal-1 en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz del polinucleótido, una composición que comprende un polinucleótido, una célula hospedadora que comprende un polinucleótido, o un vector que comprende un polinucleótido antes de que se manifiesten los signos o síntomas de Gal-1, en donde la administración mejora los signos o síntomas de Gal-1 en el individuo.
La presente divulgación proporciona además un método para expresar polipéptido de galactosa-1-fosfato uridilitransferasa (GALT) en un individuo humano que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición farmacéutica o un polinucleótido, por ejemplo, un ARNm, descritos en la presente memoria, en donde la composición farmacéutica o el polinucleótido son adecuados para administrarlos como una dosis única o como una pluralidad de dosis unitarias únicas al individuo.
La presente divulgación proporciona además un método para tratar, prevenir o retrasar el comienzo de signos o síntomas de galactosemia de tipo 1 (Gal-1) en un individuo humano que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición farmacéutica o un polinucleótido, por ejemplo, un ARNm, descritos en la presente memoria, en donde la administración trata, previene o retrasa el comienzo de uno o más de los signos o síntomas de Gal-1 en el individuo.
La presente divulgación proporciona además un método para el tratamiento de la galactosemia de tipo 1 (Gal-1), que comprende administrar a un individuo humano que padezca de Gal-1 una dosis intravenosa única de una composición farmacéutica o un polinucleótido descritos en la presente memoria.
La presente divulgación proporciona además un método para reducir un nivel de galactitol, galactonato, galactosa y/u 8-hidroxi-2-desoxiguanosina en orina, suero, y/o plasma en un individuo humano, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición farmacéutica o un polinucleótido, por ejemplo, un ARNm, descritos en la presente memoria, en donde la administración reduce el nivel de galactitol, galactonato, galactosa y/u 8-hidroxi-2-desoxiguanosina en orina, suero y/o plasma en el individuo. En algunos casos,
(i) el nivel de galactitol en orina, suero y/o plasma se reduce al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 100%, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces o al menos 50 veces en comparación con el nivel base de galactitol del individuo en orina, suero y/o plasma o un nivel de referencia de galactitol en orina, suero y/o plasma, durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas o al menos 120 horas después de la administración,
(ii) el nivel de galactonato en orina, suero y/o plasma se reduce al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 100%, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces o al menos 50 veces en comparación con el nivel base de galactonato del individuo en orina, suero y/o plasma o un nivel de referencia de galactonato en orina, suero y/o plasma, durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas o al menos 120 horas después de la administración,
(iii) el nivel de galactosa en orina, suero y/o plasma se reduce al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 100%, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces o al menos 50 veces en comparación con el nivel base de galactosa del individuo en orina, suero y/o plasma o un nivel de referencia de galactosa en orina, suero y/o plasma, durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas o al menos 120 horas después de la administración, y/o
(iv) el nivel de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina en orina, suero y/o plasma se reduce al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 100%, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces o al menos 50 veces en comparación con el nivel base de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina del individuo en orina, suero y/o plasma o un nivel de referencia de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina en orina, suero y/o plasma, durante al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas o al menos 120 horas después de la administración.
La presente divulgación proporciona además un método para reducir un nivel de galactosa-1-fosfato de los RBC y/o del hígado en un individuo humano, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición farmacéutica o un polinucleótido descritos en la presente memoria, en donde la administración reduce el nivel de galactosa-1-fosfato de los RBC y/o del hígado en el individuo. En algunos casos, el nivel de galactosa-1-fosfato de los RBC y/o del hígado se reduce a al menos dentro de un 20%, al menos dentro de un 30%, al menos dentro de un 40%, al menos dentro de un 50%, al menos dentro de un 60%, al menos dentro de un 70%, al menos dentro de un 80%, al menos dentro de un 90%, al menos dentro de un 95%, al menos un 100%, al menos dentro de 10 veces, al menos dentro de 5 veces, al menos dentro de 2 veces, o al menos dentro de 1.5 veces, el nivel de galactosa-1-fosfato fisiológico normal de los RBC y/o del hígado o un nivel de referencia de galactosa-1-fosfato de los RBC y/o del hígado, por ejemplo, en un plazo de al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas o al menos 120 horas después de la administración.
En algunos casos, 12 horas después de que la composición farmacéutica o el polinucleótido se administren al individuo, la actividad de GALT en el individuo se aumenta al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 100%, al menos un 150%, al menos un 200%, al menos un 300%, al menos un 400%, al menos un 500% o al menos un 600% en comparación con la actividad base de GALT del individuo.
En algunos casos, la actividad de GALT se aumenta en el hígado del individuo.
En algunos casos, la actividad de GALT aumentada persiste durante más de 24, 36, 48, 60, 72 o 96 horas.
En algunos casos, la composición farmacéutica o el polinucleótido se administran al individuo el nivel de Gal-1-P en el individuo se reduce en al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90% o un 100% en comparación con el Gal-1-P base del individuo.
En algunos casos, el nivel de Gal-1-P se reduce en los RBC y/o el hígado del individuo.
En algunos casos, después de la administración al individuo, el nivel de Gal-1-P en el individuo se reduce en comparación con el nivel base en el individuo durante al menos un día, al menos dos días, al menos tres días, al menos cuatro días, al menos cinco días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas o al menos un mes.
En algunos casos, después de la administración de la composición farmacéutica o el polinucleótido al individuo, por ejemplo, en un plazo de 24 horas, el nivel de galactitol en el individuo se reduce en al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90% o un 100% en comparación con el galactitol base del individuo.
En algunos casos, el nivel de galactitol se reduce en uno o más de los siguientes: la orina, el suero y/o el plasma del individuo.
En algunos casos, después de la administración al individuo, el nivel de galactitol en el individuo se reduce en comparación con el nivel base en el individuo durante al menos un día, al menos dos días, al menos tres días, al menos cuatro días, al menos cinco días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas o al menos un mes.
En algunos casos, después de la administración de la composición farmacéutica o el polinucleótido al individuo, por ejemplo, en un plazo de 24 horas, el nivel de galactonato en el individuo se reduce en al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90% o un 100% en comparación con el galactonato base del individuo.
En algunos casos, el nivel de galactonato se reduce en uno o más de los siguientes: la orina, el suero y/o el plasma del individuo.
En algunos casos, después de la administración al individuo, el nivel de galactonato en el individuo se reduce en comparación con el nivel base en el individuo durante al menos un día, al menos dos días, al menos tres días, al menos cuatro días, al menos cinco días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas o al menos un mes.
En algunos casos, después de la administración de la composición farmacéutica o el polinucleótido al individuo, por ejemplo, en un plazo de 24 horas, el nivel de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina en el individuo se reduce en al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90% o un 100% en comparación con la 8-hidroxi-2-desoxiguanosina base del individuo.
En algunos casos, el nivel de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina se reduce en uno o más de los siguientes: la orina, el suero y/o el plasma del individuo.
En algunos casos, después de la administración al individuo, el nivel de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina en el individuo se reduce en comparación con el nivel base en el individuo durante al menos un día, al menos dos días, al menos tres días, al menos cuatro días, al menos cinco días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas o al menos un mes.
En algunos casos, la composición farmacéutica o el polinucleótido se administran como una dosis única de menos de 1.5 mg/kg, menos de 1.25 mg/kg, menos de 1 mg/kg o menos de 0.75 mg/kg.
En algunos casos, la administración al individuo es aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente una vez cada dos semanas o aproximadamente una vez al mes.
En algunos casos, la composición farmacéutica o el polinucleótido se administran por vía intravenosa.
Breve descripción de los dibujos/figuras
LasFiguras 1A, 1B, 1C y 1Dmuestran la secuencia de proteínas (Figura 1A), la tabla con características de dominio (Figura 1B), la representación gráfica de la estructura de dominio (Figura 1C) y la secuencia de ácido nucleico (Figura 1D) de la isoforma 1 de GALT.
LasFiguras 2A, 2B, 2C y 2Dmuestran la secuencia de proteínas (Figura 2A), la tabla con características de dominio (Figura 2B), la representación gráfica de la estructura de dominio (Figura 2C) y la secuencia de ácido nucleico (Figura 2D) de la isoterma 2 de GALT.
LaFigura 3muestra métricas de uracilo (U) correspondientes a la isoterma 1 de tipo silvestre de GALT y 25 polinucleótidos de GALT optimizados en cuanto a la secuencia. La columna etiquetada "Contenido U (%)" corresponde al parámetro%UTL. La columna etiquetada "Contenido U v. WT (%)" corresponde a%UWT. La columna etiquetada "Contenido U v. Mínimo Teórico (%)" corresponde a%UTM. La columna etiquetada "Pares UU v. WT (%)" corresponde a%UUWT.
LaFigura 4muestra métricas de guanina (G) correspondientes a la isoforma 1 de tipo silvestre de GALT y 25 polinucleótidos de GALT optimizados en cuanto a la secuencia. La columna etiquetada "Contenido G (%)" corresponde a%GTL. La columna etiquetada "Contenido G v. WT (%)" corresponde a%GWT. La columna etiquetada "Contenido G v. Máximo Teórico (%)" corresponde a%GTMX.
LaFigura 5muestra métricas de citosina (C) correspondientes a la isoforma 1 de tipo silvestre de GALT y 25 polinucleótidos de GALT optimizados en cuanto a la secuencia. La columna etiquetada "Contenido C (%)" corresponde a%CTL. La columna etiquetada "Contenido C v. WT (%)" corresponde a%CWT. La columna etiquetada "Contenido C v. Máximo Teórico (%)" corresponde a%CTMX.
LaFigura 6muestra métricas de guanina más citosina (G/C) correspondientes a la isoforma 1 de tipo silvestre de GALT y 25 polinucleótidos de GALT optimizados en cuanto a la secuencia. La columna etiquetada "Contenido G/C (%)" corresponde a%G/CTL. La columna etiquetada "Contenido G/C v. WT (%)" corresponde a%G/CWT. La columna etiquetada "Contenido G/C v. Máximo Teórico (%)" corresponde a%G/CTMX.
LaFigura 7muestra una comparación entre el sesgo de composición G/C para las posiciones de codón 1, 2, 3 correspondientes a la isoforma 1 de tipo silvestre de GALT y 25 polinucleótidos de GALT optimizados en cuanto a la secuencia.
LaFigura 8Aes una transferencia Western que muestra la expresión de la proteína GALT en fibroblastos normales (GM00637) y fibroblastos de pacientes con galactosemia de tipo 1 (GM00638). La transferencia Western muestra niveles de expresión de la proteína GALT en fibroblastos normales y del paciente a los que se administró ARNm que codifica hGalt2, mGalt1 o mGalt2 ("sobreexpresado") y niveles endógenos de GALT ("endógeno"). Se usó un ARNm que codifica GFP como control.
LaFigura 8Bmuestra niveles de actividad de GALT en fibroblastos normales (GM0637) y fibroblastos de pacientes con galactosemia de tipo 1 (GM0638) después de la administración de ARNm que codifica la isoforma 1 de GALT de ratón (mGalt1) o un ARNm de control que codifica eGFP.
LaFigura 8Cmuestra fibroblastos de pacientes con galactosemia de tipo 1 cultivados en: (i) medio de cultivo que contiene glucosa (recuadro izquierdo), (ii) medio de cultivo que contiene galactosa después de la administración de ARNm que codifica el control de eGFP (recuadro central), o (iii) medio de cultivo que contiene galactosa después de la administración de ARNm que codifica la isoforma 1 de GALT de ratón (mGALT1).
LaFigura 9Aes un diagrama de diseño experimental que muestra que se administró por vía IV a ratones de tipo silvestre una dosis única de ARNm que codifica Galt1 de ratón o un ARNm de control que codifica NTFIX (Factor IX no traducido) y, después de 24 horas, se midieron la expresión y actividad de la proteína GALT en el hígado.
LaFigura 9Bmuestra la expresión de la proteína GALT en el hígado 24 horas después de una administración IV única de una dosis de 0.5 mg/kg, 1 mg/kg o 2 mg/kg de ARNm que codifica Galt1 de ratón a ratones de tipo silvestre. Como controles se utilizaron ratones a los que se administraron 0.5 mg/kg, 1 mg/kg o 2 mg/kg de ARNm que codifica NTFIX.
LaFigura 9Cmuestra la actividad de GALT en el hígado 24 horas después de una administración IV única de una dosis de 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg o 2 mg/kg de ARNm que codifica Galt l de ratón a ratones de tipo silvestre. Como control se utilizó ARNm que codifica NTFIX.
LaFigura 10Aes un diagrama de diseño experimental que muestra que se administró por vía IV a ratones de tipo silvestre una dosis única de 0.3 mg/kg de ARNm que codifica Galt1 de ratón o un ARNm de control que codifica NTFIX (factor IX no traducido) y se midió la actividad de GALT en el hígado 1 día, 3 días y 7 días después de la administración.
LaFigura 10Bmuestra la actividad de GALT en el hígado 1 día, 3 días y 7 días después de la administración de una dosis única de 0.3 mg/kg de ARNm que codifica Galt1 de ratón a ratones de tipo silvestre. Como control se utilizó ARNm que codifica NTFIX.
LaFigura 11Amuestra los niveles de expresión de proteína de GALT de ratón (mGaltl) y GALT humana (hG altl) en el hígado 24 horas después de la administración de una dosis única de 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, o 0.5 mg/kg de ARNm que codifica Galt1 de ratón o humana a ratones GALT-KO. Como control se utilizó ARNm que codifica NTFIX. Los niveles de expresión se normalizaron a la expresión de la proteína GALT en ratones de tipo silvestre (WT, por sus siglas en inglés).
LaFigura 11Bmuestra los niveles de actividad de GALT en el hígado 24 horas después de la administración de una dosis única de 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, o 0.5 mg/kg de ARNm que codifica Galt l de ratón o humana a ratones GALT-KO. Como control se utilizó ARNm que codifica NTFIX. El nivel de actividad de GALT normal en ratones de tipo silvestre (WT) se muestra para comparación.
LaFigura 11Cmuestra los niveles de galactosa-1-fosfato (Gal-1-P) en glóbulos rojos (RBC) de ratones GALT knockout (KO) medidos 24 horas después de la administración de una dosis única de 0.5 mg/kg de ARNm que codifica Galt1 de ratón o humana a los ratones KO. Como control se utilizó ARNm que codifica NTFIX.
LaFigura 11Dmuestra los niveles de galactosa-1-fosfato (Gal-1-P) en el hígado de ratones GALT knockout (KO) medidos 24 horas después de la administración de una dosis única de 0.5 mg/kg de ARNm que codifica Galt1 de ratón o humana a los ratones KO. Como control se utilizó ARNm que codifica NTFIX.
LaFigura 12Amuestra los niveles de expresión de la proteína GALT en el hígado 2, 6, 10 y 14 días después de una administración única de ARNm que codifica mGalt1 a ratones KO. La expresión se normaliza a niveles endógenos de proteína GALT en ratones WT. Como control se utilizó ARNm que codifica NTFIX.
LaFigura 12Bmuestra los niveles de actividad de GALT en el hígado 2, 6, 10 y 14 días después de una administración única de ARNm que codifica mGalt1 a ratones KO. Como controles se utilizaron ratones KO a los que se había inyectado ARNm que codifica NTFIX, y ratones de tipo silvestre (WT).
LaFigura 13Amuestra los niveles de galactosa-1-fosfato (Gal-1-P) en glóbulos rojos (RBC) antes de una administración única de ARNm que codifica mGalt1 (pretratamiento) a ratones KO. Como controles se utilizaron ratones KO a los que se había inyectado ARNm que codifica NTFIX, y ratones de tipo silvestre (WT).
LaFigura 13Bmuestra los niveles de galactosa-1-fosfato (Gal-1-P) en glóbulos rojos (RBC) 2, 6, 10 y 14 días después de una administración única de ARNm que codifica mGalt1 a ratones KO. Como controles se utilizaron ratones KO a los que se había inyectado ARNm que codifica NTFIX, y ratones de tipo silvestre (WT).
LaFigura 13Cmuestra la diferencia entre los niveles de galactosa-1-fosfato (Gal-1-P) antes del tratamiento (día 0) y después del tratamiento (2, 6, 10 y 14 días después de la administración) con una única inyección intravenosa de ARNm que codifica mGalt1. Como controles se utilizaron ratones KO a los que se había inyectado ARNm que codifica NTFIX.
LaFigura 14muestra los niveles de galactosa-1-fosfato (Gal-1-P) en el hígado 2, 6, 10 y 14 días después de una administración única de ARNm que codifica mGalt1 a ratones KO. Como controles se utilizaron ratones KO a los que se había inyectado ARNm que codifica NTFIX.
LaFigura 15Amuestra los niveles relativos de expresión de la proteína GALT (Galt/GAPDH) en ratones de tipo silvestre (CD1) 24 horas después de la administración IV de 0.5 mg/kg de constructos de ARNm modificado que codifican la Galt1 humana formulados en nanopartículas lipídicas MC3 (N=3/constructo). La expresión de proteína se determinó mediante transferencia Western.
LaFigura 15Bmuestra la actividad de GALT en ratones de tipo silvestre (CD1) 24 horas después de la administración IV de 0.5 mg/kg de constructos de ARNm modificado que codifican la Galt1 humana formulados en nanopartículas lipídicas MC3 (N=3/constructo). La actividad de GALT se determinó por HPLC.
LaFigura 15Cmuestra los niveles relativos de expresión de la proteína GALT (Galt/GAPDH) en ratones de tipo silvestre (CD1) 24 horas después de la administración IV de 0.5 mg/kg de constructos de ARNm modificado que codifican la Galt1 humana formulados en nanopartículas lipídicas de Compuesto 18 (N=3/constructo). La expresión de proteína se determinó mediante transferencia Western.
LaFigura 15Dmuestra la actividad de GALT en ratones de tipo silvestre (CD1) 24 horas después de la administración IV de 0.5 mg/kg de constructos de ARNm modificado que codifican la Galt1 humana formulados en nanopartículas lipídicas de Compuesto 18 (N=3/constructo). La actividad de GALT se determinó por HPLC. LaFigura 16muestra los niveles de expresión de la proteína GALT (relación a GAPDH) en el hígado de ratones GALT KO después de la administración de 4 dosis intravenosas en la vena caudal de 0.2 mg/kg de ARNm que codifica la GALT humana (constructo NO 12, n=8), ARNm que codifica NTFIX (control, n=8), o PBS (n=3).
LaFigura 17A,laFigura 17By laFigura 17Cmuestran los niveles de galactosa-1-fosfato (Gal-1-P) en glóbulos rojos (RBC) como un grupo (Figura 17A) y muestran el punto de datos para cada ratón (Figura 17B) y los niveles de galactosa en plasma (Figura 17C) de ratones GALT KO después de las 1a, 2a, 3a y 4a dosis intravenosas en la vena caudal de 0.2 mg/kg de ARNm que codifica GALT (constructo NO 12). Como control se utilizó ARNm que codifica NTFIX.
LaFigura 18muestra los niveles de galactosa-1-fosfato (Gal-1-P) en el hígado de ratones GALT KO después de la administración de 4 dosis intravenosas en la vena caudal de 0.2 mg/kg de ARNm que codifica la GALT humana (constructo NO 12), ARNm que codifica NTFIX (control), o PBS. También se muestran los niveles de Gal-1-P en los hígados de animales no tratados (NT).
LaFigura 19muestra una curva de supervivencia para ratones GALT KO neonatales después de la administración de una dosis intraperitoneal única de 0.5 mg/kg, 1 mg/kg o 2 mg/kg de ARNm que codifica la Galt1 humana (constructo NO 12) o ARNm de control que codifica NTFIX. Los ARNm se formularon en nanopartículas lipídicas de Compuesto 18. Se usó PBS como control.
LasFiguras 20A, 20By20Cmuestran el peso corporal en ratones GALT KO neonatales a los que se administró una dosis intraperitoneal única de 0.5 mg/kg (Figura 20A), 1 mg/kg (Figura 20B) o 2 mg/kg (Figura 20C) de ARNm que codifica la Galt1 humana (constructo NO 12) o ARNm de control que codifica NTFIX. Los ARNm se formularon en nanopartículas lipídicas de Compuesto 18. Se usó PBS como control.
Descripción detallada adicional
La presente invención proporciona agentes terapéuticos de ARNm para el tratamiento de la galactosemia de tipo 1 (Gal-1). La Gal-1 es un trastorno metabólico genético que afecta a la capacidad de metabolizar galactosa. La Gal-1 está causada por mutaciones en el gen GALT, que codifica para la enzima galactosa-1-fosfato uridilitransferasa (GALT). Sin la galactosa-1-fosfato uridilitransferasa (GALT), la ruta de Leloir del metabolismo de la galactosa se ve afectada, dando como resultado la acumulación anormal de galactosa. Los agentes terapéuticos de ARNm son particularmente adecuados para el tratamiento de la Gal-1, ya que la tecnología prevé la administración intracelular de ARNm que codifica GALT seguido de la síntesisde novode la proteína GALT funcional dentro de células diana. Después dla administración de ARNm a las células diana, la proteína GALT deseada se expresa mediante la propia maquinaria de traducción de las células y, por lo tanto, la proteína GALT completamente funcional reemplaza la proteína defectuosa o ausente.
Un reto asociado con la administración de agentes terapéuticos basados en ácidos nucleicos (por ejemplo, agentes terapéuticos de ARNm)in vivosurge de la respuesta inmunitaria innata que puede ocurrir cuando el sistema inmunitario del cuerpo se encuentra con ácidos nucleicos ajenos. Los ARNm ajenos pueden activar el sistema inmunitario mediante el reconocimiento a través de receptores de tipo toll (TLR, por sus siglas en inglés), en particular TLR7/8, que es activado por ARN monocatenario (ARNmc). En las células no inmunitarias, el reconocimiento de ARNm ajeno puede ocurrir a través del gen I inducible por ácido retinoico (RIG-I). El reconocimiento inmunitario de ARNm ajenos puede dar lugar a efectos de citocinas no deseados que incluyen la producción de interleucina-1 p (IL-1 p), la distribución del factor de necrosis tumoral a (TNF-a, por sus siglas en inglés) y una fuerte respuesta de interferón tipo I (IFN tipo I). La presente invención presenta la incorporación de diferentes nucleótidos modificados dentro de ARNm terapéuticos para minimizar la activación inmunitaria y optimizar la eficiencia de traducción de ARNm a proteína. Algunos aspectos concretos de la invención presentan una combinación de modificaciones de nucleótidos para reducir la respuesta inmunitaria innata y una optimización en cuanto a la secuencia, en particular, dentro del marco de lectura abierta (ORF) de ARNm terapéuticos que codifican GALT para potenciar la expresión de proteína.
Ciertas realizaciones de la tecnología terapéutica de ARNm de la presente invención también presentan la administración de ARNm que codifica GALT mediante un sistema de administración de nanopartículas lipídicas (LNP). Las nanopartículas lipídicas (LNP) son una plataforma ideal para la administración seguro y eficaz de ARNm a células diana. Las LNP tienen la capacidad única de aportar ácidos nucleicos mediante un mecanismo que implica absorción celular, transporte intracelular y liberación endosomal o escape endosomal. La presente invención presenta nuevas LNP basadas en lípidos ionizables combinadas con ARNm que codifica GALT que tienen propiedades mejoradas cuando se administranin vivo.Sin ceñirse a esta teoría, se cree que las nuevas formulaciones de LNP basadas en lípidos ionizables de la invención tienen propiedades mejoradas, por ejemplo, absorción celular, transporte intracelular y/o liberación endosomal o escape endosomal. Las LNP administradas por vía sistémica (por ejemplo, administración intravenosa (IV)), por ejemplo, en una primera administración, pueden acelerar el aclaramiento de las LNP inyectadas posteriormente, por ejemplo, en administraciones adicionales. Este fenómeno se conoce como aclaramiento sanguíneo acelerado (a Bc , por sus siglas en inglés) y es un reto clave, en particular, cuando se reemplazan enzimas deficientes (por ejemplo, GALT) en un contexto terapéutico. Esto se debe a que la administración repetida de agentes terapéuticos de ARNm es en la mayoría de los casos esencial para mantener los niveles necesarios de enzima en los tejidos diana en individuos (por ejemplo, individuos que padecen Gal-1). Los retos de las dosis repetidas pueden abordarse en múltiples niveles. La ingeniería de ARNm y/o la administración eficiente mediante LNP pueden dar como resultado niveles aumentados y/o una duración mejorada de la proteína (por ejemplo, GALT) que se expresa después de una primera dosis de administración, lo que a su vez, puede alargar el tiempo entre la primera dosis y las dosis posteriores. Se sabe que el fenómeno ABC es, al menos en parte, de naturaleza transitoria, resolviéndose las respuestas inmunitarias subyacentes al ABC después de un tiempo suficiente tras la administración sistémica. Como tal, el aumento de la duración de la expresión y/o actividad de la proteína después dla administración sistémico de un agente terapéutico de ARNm de la invención en un aspecto combate el fenómeno ABC. Además, las LNP pueden modificarse para evitar la detección y/o el reconocimiento inmunitarios y por lo tanto pueden evitar adicionalmente el ABC tras la administración posterior o repetida de dosis. Un aspecto ejemplar de la invención presenta nuevas LNP que han sido modificadas para tener un ABC reducido.
1. Galactosa-1-Fosfato Uridililtransferasa (GALT)
La galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT; EC 2.7.7.12) es la segunda enzima de la ruta de Leloir del metabolismo de la galactosa. La GALT cataliza la conversión de UDP-glucosa y galactosa 1-fosfato en glucosa 1-fosfato y UDP-galactosa. La GALT existe como un dímero dentro de la célula.
El problema de salud que involucra GALT más conocido es la galactosemia de tipo 1 (Gal-1), un trastorno genético autosómico recesivo en el que se metaboliza insuficiente galactosa, lo que conduce a una acumulación de galactosa en el citoplasma. Diversas proteínas variantes tienen diferentes niveles de actividad, correlacionándose la gravedad de Gal-1 con la gravedad de las mutaciones de las enzimas. Los niveles de expresión de GALT también están ligados a Gal-1. Por ejemplo, la galactosemia de Duarte es una forma más leve de Gal-1 en la que los pacientes expresan una GALT funcional, aunque a niveles más bajos debido a mutaciones que conducen a una expresión empeorada de GALT.
La secuencia codificante (CDS, por sus siglas en inglés) para la secuencia de ARNm canónica de GALT de tipo silvestre, correspondiente a la isoforma 1, se describe en la base de datos de Secuencias de Referencia de NCBI (RefSeq) con el número de entrada NM_000155 (“Homo sapiens galactose-1-phosphate uridylyltransferase (GALT), transcript variant 1, mRNA”). La secuencia de proteína canónica de GALT de tipo silvestre, correspondiente a la isoforma 1, se describe en la base de datos RefSeq con el número de entrada NP_000146 (“galactose-1-phosphate uridylyltransferase isoform 1 [Homo sapiens]”). La proteína de la isoforma 1 de GALT tiene 379 aminoácidos de longitud. Cabe señalar que las secuencias de ácido nucleico específicas que codifican la secuencia de proteína de referencia en las secuencias de Ref Seq son la secuencia codificante (CDS) como se indica en la entrada de la base de datos RefSeq respectiva.
La isoforma 2 se produce mediante corte y empalme alternativo. Las secuencias de proteína y ARNm RefSeq para la isoforma 2 de GALT son NP_001245261 y NM_001258332, respectivamente. La Ga Lt de isoforma 2 es codificada por la CDS divulgada en cada una de las entradas RefSeq de ARNm mencionadas anteriormente. El polinucleótido de isoforma 2 contiene una secuencia N terminal alternativa que codifica una GALT más corta que la isoforma 1. La proteína de la isoforma 2 de GALT tiene una longitud de 270 aminoácidos, tiene aminoácidos alternativos que corresponden a las posiciones 1-17 en la isoforma 1, y carece de los aminoácidos 18-126 de la isoforma 1.
La composición de la invención proporciona un polinucleótido (es decir, un ARN mensajero (ARNm)) que comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un marco de lectura abierta (ORF)) que codifica un polipéptido de GALT. En algunas realizaciones de la invención, el polipéptido de GALT es una proteína de la isoforma 1 o 2 de GALT de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido de GALT es una variante, un péptido o un polipéptido que contiene una sustitución, y una inserción y/o una adición, una deleción y/o una modificación covalente con respecto a una secuencia de isoforma 1 o 2 de GALT de tipo silvestre. En algunas realizaciones, se pueden añadir etiquetas de secuencia o aminoácidos a las secuencias codificadas por los polinucleótidos (por ejemplo, en los extremos N-terminal o C-terminal), por ejemplo, para localización. En algunas realizaciones, los residuos de aminoácidos localizados en las regiones carboxi, amino-terminal o interna de un polipéptido pueden suprimirse opcionalmente previendo fragmentos.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) que comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) codifica una variante de sustitución de una secuencia de isoforma 1 o 2 de GALT, que puede comprender una, dos, tres o más de tres sustituciones. En algunas realizaciones, la variante de sustitución puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. En otras realizaciones, la variante es una variante de inserción. En otras realizaciones, la variante es una variante de deleción.
Como reconocerán los expertos en la técnica, los fragmentos de proteína, dominios de proteína funcional, variantes y proteínas homólogas (ortólogos) de la isoforma 1 o 2 de GALT también se considera que están dentro del alcance de los polipéptidos de GALT. En las Figuras 1 y 2 se muestran ejemplos no limitativos de polipéptidos codificados por los polinucleótidos. Por ejemplo, la Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la isoterma 1 de tipo silvestre de GALT humana.
Ciertas composiciones y métodos presentados en esta divulgación se refieren a las secuencias de proteínas o polinucleótidos de la isoterma 1 de GALT. Un experto en la técnica entenderá que tales divulgaciones son igualmente aplicables a cualesquiera otras isotermas de GALT conocidas en la técnica.
2. Polinucleótidos y Marcos de Lectura Abierta (ORF)
La composición de la invención presenta ARNm para su uso en el tratamiento (es decir, tratamiento profiláctico y/o terapéutico) de Gal-1. Los ARNm presentados para su uso en la invención se administran a individuos y codifican la proteína galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT) humanain vivo.Por consiguiente, la invención se refiere a polinucleótidos, es decir, ARNm, que comprenden un marco de lectura abierta de nucleósidos enlazados que codifican galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT) humana, isoformas de la misma, fragmentos funcionales de la misma, y proteínas de fusión que comprenden GALT. En algunas realizaciones, se optimiza la secuencia del marco de lectura abierta. En realizaciones concretas, la composición de la invención presenta polinucleótidos optimizados en cuanto a la secuencia que comprenden nucleótidos que codifican la secuencia polipeptídica de las isoformas 1 o 2 de la GALT humana, o secuencia que tiene alta identidad de secuencia con aquellos polinucleótidos optimizados en cuanto a la secuencia.
En ciertos aspectos, la composición de la invención proporciona polinucleótidos (es decir, un ARNm) que comprenden una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica uno o más polipéptidos de GALt . En algunas realizaciones, el polipéptido de GALT codificado se puede seleccionar entre:
(i) un polipéptido de GALT de longitud completa (por ejemplo, que tenga la misma longitud o esencialmente la misma longitud que la isoforma 1 o 2 de GALT de tipo silvestre);
(ii) un fragmento funcional de cualquiera de las isoformas de GALT descritas en la presente memoria (por ejemplo, una secuencia truncada (por ejemplo, deleción de regiones carboxi, amino-terminal o interna) más corta que una de las isoformas 1 o 2 de tipo silvestre; pero conservando aún la actividad enzimática de GALT);
(iii) una variante del mismo (por ejemplo, proteínas de isoforma 1 o 2 de longitud completa o truncadas en las que se hayan reemplazado uno o más aminoácidos, por ejemplo, variantes que retengan toda o la mayor parte de la actividad de GALT del polipéptido con respecto a una isoforma de referencia (tales como cualesquiera variantes naturales o artificiales conocidas en la técnica); o
(iv) una proteína de fusión que comprende (i) una proteína de isoforma 1 o 2 de GALT de longitud completa, un fragmento funcional o una variante de la misma, y (ii) una proteína heteróloga.
En ciertas realizaciones, el polipéptido de GALT codificado es un polipéptido de GALT de mamífero, tal como un polipéptido de GALT humano, un fragmento funcional o una variante del mismo.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) aumenta los niveles de expresión de proteína GALT y/o los niveles de actividad enzimática de GALT detectables en las células cuando se introduce en esas células, por ejemplo, en al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 100%, en comparación con los niveles de expresión de proteína GALT y/o los niveles de actividad enzimática de GALT detectables en las células antes de la administración del polinucleótido. Los niveles de expresión de proteína GALT y/o la actividad enzimática de GALT se pueden medir de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, el polinucleótido se introduce en las célulasin vitro.En algunas realizaciones, el polinucleótido se introduce en las célulasin vivo.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, un ARNm) comprenden una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica una GALT humana de tipo silvestre, por ejemplo, la isoforma 1 de GALT humana de tipo silvestre (<s>E<q>ID NO: 1, véase la Figura 1) o la isoforma 2 de GALT humana de tipo silvestre (SEQ ID NO: 3, véase la Figura 2).
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de ácido nucleico optimizada en cuanto a los codones, en la que el marco de lectura abierta (ORF) de la secuencia de ácido nucleico optimizada en cuanto a los codones se obtiene de una secuencia de GALT de tipo silvestre (por ejemplo, isoformas 1 o 2 de tipo silvestre). Por ejemplo, para polinucleótidos que comprendan un ORF optimizado en cuanto a la secuencia que codifique la isoforma 2 de GALT, la secuencia de tipo silvestre correspondiente es la isoforma 2 de GALT nativa. De manera similar, para un ARNm optimizado en cuanto a la secuencia que codifique un fragmento funcional de la isoforma 1, la secuencia de tipo silvestre correspondiente es el fragmento correspondiente de la isoforma 1 de GALT.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, un ARNm) comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la isoforma 1 de GALT que tiene la secuencia de longitud completa de la isoterma 1 de GALT humana (es decir, que incluye la metionina iniciadora). En la isoforma 1 de GALT humana madura, la metionina iniciadora puede eliminarse para producir una "GALT madura" que comprenda residuos de aminoácido de 2 379 del producto traducido. Las enseñanzas de la presente divulgación dirigidas a la secuencia completa de GALT humana (aminoácidos 1-379) también son aplicables a la forma madura de GALT humana que carece de la metionina iniciadora (aminoácidos 2-379). Así, en algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, un ARNm) comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la isoforma 1 de GALT que tiene la secuencia madura de la isoforma 1 de GALT humana (es decir, que carece de la metionina iniciadora). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la isoforma 1 de GALT que tiene la secuencia de longitud completa o madura de la isoforma 1 de GALT humana se optimiza en cuanto a la secuencia.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, un ARNm) comprenden una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT mutante. En algunas realizaciones, los polinucleótidos comprenden un ORF que codifica un polipéptido de GALT que comprende al menos una mutación puntual en la secuencia de GALT y retiene la actividad enzimática de GALT. En algunas realizaciones, el polipéptido de GALT mutante tiene una actividad de GALT que es al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 100% de la actividad de GALT de la correspondiente GALT de tipo silvestre (es decir, la misma isoforma de GALT, pero sin la o las mutaciones). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) que comprende un ORF que codifica un polipéptido de GALT mutante se optimiza en cuanto a la secuencia.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT con mutaciones que no alteran la actividad enzimática de GALT. Tales polipéptidos de GALT mutantes pueden denominarse funcionalmente neutros. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un ORF que codifica un polipéptido de GALT mutante que comprende una o más mutaciones puntuales funcionalmente neutras.
En algunas realizaciones, el polipéptido de GALT mutante tiene mayor actividad enzimática de GALT que la correspondiente GALT de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido de GALT mutante tiene una actividad de GALT que es al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 100% mayor que la actividad de la correspondiente GALT de tipo silvestre (es decir, la misma isoforma de GALT, pero sin la o las mutaciones).
En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, un ARNm) comprenden una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un fragmento de GALT funcional, por ejemplo, en donde uno o más fragmentos corresponden a una subsecuencia polipeptídica de un polipéptido de GALT de tipo silvestre y retienen la actividad enzimática de GALT. En algunas realizaciones, el fragmento de GALT tiene una actividad de GALT que es al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 100% de la actividad de GALT de la correspondiente GALT de longitud completa. En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, un ARNm) que comprenden un ORF que codifica un fragmento de GALT funcional se optimizan en cuanto a la secuencia.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un fragmento de GALT que tiene mayor actividad enzimática de GALT que la correspondiente GALT de longitud completa. Así, en algunas realizaciones, el fragmento de GALT tiene una actividad de GALT que es al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 100% mayor que la actividad de GALT de la correspondiente GALT de longitud completa.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un fragmento de GALT que es al menos un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% o 25% más corto que la isoforma 1 o 2 de tipo silvestre de GALT.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT (por ejemplo, la secuencia de tipo silvestre, fragmento funcional, o variante del mismo), en donde la secuencia de nucleótidos es al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 2 o 4 (véase, por ejemplo, la serie D en las Figuras 1 y 2, respectivamente).
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT (por ejemplo, la secuencia de tipo silvestre, fragmento funcional, o variante del mismo), en donde la secuencia de nucleótidos tiene al menos un 70%, al menos un 71%, al menos un 72%, al menos un 73%, al menos un 74%, al menos un 75%, al menos un 76%, al menos un 77%, al menos un 78%, al menos un 79%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 5 a 29 y 113 a 131. Véase la Tabla 2.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT (por ejemplo, la secuencia de tipo silvestre, fragmento funcional, o variante del mismo), en donde la secuencia de nucleótidos tiene de un 70% a un 100%, de un 75% a un 100%, de un 80% a un 100%, de un 85% a un 100%, de un 70% a un 95%, de un 80% a un 95%, de un 70% a un 85%, de un 75% a un 90%, de un 80% a un 95%, de un 70% a un 75%, de un 75% a un 80%, de un 80% a un 85%, de un 85% a un 90%, de un 90% a un 95% o de un 95% a un 100% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 5 a 29 y 113 a 131. Véase la Tabla 2.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende un ORF que codifica un polipéptido de GALT (por ejemplo, la secuencia de tipo silvestre, fragmento funcional, o variante del mismo), en donde el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene de un 70% a un 100%, de un 75% a un 100%, de un 80% a un 100%, de un 85% a un 100%, de un 70% a un 95%, de un 80% a un 95%, de un 70% a un 85%, de un 75% a un 90%, de un 80% a un 95%, de un 70% a un 75%, de un 75% a un 80%, de un 80% a un 85%, de un 85% a un 90%, de un 90% a un 95% o de un 95% a un 100% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 132-150, por ejemplo, SEQ ID NOs: 143 o 145. Véase la Tabla 5.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT (por ejemplo, la secuencia de tipo silvestre, fragmento funcional, o variante del mismo), en donde la secuencia de nucleótidos es al menos un 75%, al menos un 76%, al menos un 77%, al menos un 78%, al menos un 79%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% idéntica a la secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 2 o 4 (véase, por ejemplo, la serie D en las Figuras 1 y 2, respectivamente).
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT (por ejemplo, la secuencia de tipo silvestre, fragmento funcional o variante del mismo), en donde la secuencia de nucleótidos es entre un 70% y un 90% idéntica; entre un 75% y un 85% idéntica; entre un 76% y un 84% idéntica; entre un 77% y un 83% idéntica, entre un 77% y un 82% idéntica o entre un 78% y un 81% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 2 o 4 (véase, por ejemplo, la serie D en las Figuras 1 y 2, respectivamente).
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende de aproximadamente 900 a aproximadamente 100000 nucleótidos (por ejemplo, de 900 a 1000, de 900 a 1100, de 900 a 1200, de 900 a 1300, de 900 a 1400, de 900 a 1500, de 1000 a 1100, de 1000 a 1100, de 1000 a 1200, de 1000 a 1300, de 1000 a 1400, de 1000 a 1500, de 1187 a 1200, de 1187 a 1400, de 1187 a 1600, de 1187 a 1800, de 1187 a 2000, de 1187 a 3000, de 1187 a 5000, de 1187 a 7000, de 1187 a 10000, de 1187 a 25000, de 1187 a 50 000, de 1187 a 70000, o de 1187 a 100000).
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT (por ejemplo, la secuencia de tipo silvestre, fragmento funcional, o variante del mismo), en donde la longitud de la secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) es de al menos 500 nucleótidos de longitud (por ejemplo, al menos o mayor de aproximadamente 500, 600, 700, 80, 900, 1000, 1050, 1100, 1187, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 o hasta 100000 nucleótidos, inclusive).
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT (por ejemplo, la secuencia de tipo silvestre, fragmento funcional o variante del mismo) y comprende además al menos una secuencia de ácido nucleico que no codifica, por ejemplo, un sitio de unión de microARN. En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende además una 5’-UTR (por ejemplo, seleccionada entre las secuencias de SEQ ID NOs: 35 52 y 109-1 l l ) y una 3’ UTR (por ejemplo, seleccionada entre las secuencias de SEQ ID NOs: 53 a 77, 79, 97, 98, 101 a 108, 112 y 163 a 173). En algunasrealizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 132-150, por ejemplo, SEQ ID NO: 143 o 145. En una realización adicional, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende un casquete terminal 5’ (por ejemplo, un casquete Cap0, Cap1, ARCA, inosina, N1-metil-guanosina, 2’-fluoro-guanosina, 7-desazaguanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina, 2-azidoguanosina, Cap2, Cap4, 5’ metilG, o un análogo de los mismos) y una región de cola de poli-A (por ejemplo, aproximadamente 100 nucleótidos de longitud). En una realización adicional, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una 3' UTR que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 98, 163 o 164 o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el ARNm comprende una 3' UTR que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:163. En algunas realizaciones, el ARNm comprende una 3' UTR que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:164.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) que comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT es monocatenario o bicatenario.
En algunas realizaciones, el ARNm comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica al menos un polipéptido de GALT, y puede traducirse para producir el polipéptido de GALT codificadoin vitro, in vivo, in situoex vivo.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos optimizados en cuanto a la secuencia (por ejemplo, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT (por ejemplo, la secuencia de tipo silvestre, fragmento funcional o variante del mismo), en donde el polinucleótido comprende al menos una nucleobase modificada químicamente, por ejemplo, 5-metoxiuracilo. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende además un sitio de unión de miARN, por ejemplo, un sitio de unión de miARN que se une a miR-142 y/o un sitio de unión de miARN que se une a miR-126. En la composición de la invención, el polinucleótido (es decir, un ARNm) se formula con un agente de administración que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (IA), por ejemplo, el Compuesto 18. En algunas realizaciones, el agente de administración comprende el Compuesto 18, DSPC, Colesterol y el Compuesto 428, por ejemplo, con una relación molar de aproximadamente 50:10:38.5:1.5.
3. Secuencias Señal
Los polinucleótidos (es decir, un ARNm) también pueden comprender secuencias de nucleótidos que codifiquen características adicionales que faciliten el tráfico de los polipéptidos codificados a sitios terapéuticamente relevantes. Una de tales características que ayuda en el tráfico de proteínas es la secuencia señal, o secuencia de guiado. Los péptidos codificados por estas secuencias señal son conocidos por diversos nombres, incluyendo péptidos de guiado, péptidos de tránsito y péptidos señal. En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un péptido señal enlazado operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT descrito en la presente memoria.
En algunas realizaciones, la “secuencia señal” o el “péptido señal” son un polinucleótido o polipéptido, respectivamente, que tienen de aproximadamente 9 a 200 nucleótidos (3(i) 70 aminoácidos) de longitud que, opcionalmente, se incorporan en el extremo 5’ (o N-terminal) de la región codificante o el polipéptido, respectivamente. La adición de estas secuencias da como resultado el tráfico del polipéptido codificado a un sitio deseado, tal como el retículo endoplásmico o las mitocondrias a través de una o más rutas de guiado. Algunos péptidos señal se escinden de la proteína, por ejemplo, mediante una peptidasa señal después de que las proteínas se transporten al sitio deseado.
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT, en donde la secuencia de nucleótidos comprende además una secuencia de ácido nucleico 5’ que codifica un péptido señal heterólogo.
4. Proteínas de Fusión
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) puede comprender más de una secuencia de ácido nucleico (es decir, un ORF) que codifique un polipéptido de interés. En algunas realizaciones, los polinucleótidos comprenden un solo ORF que codifica un polipéptido de GALT, un fragmento funcional o una variante del mismo. Sin embargo, en algunas realizaciones, el polinucleótido puede comprender más de un ORF, por ejemplo, un primer ORF que codifique un polipéptido de GALT (un primer polipéptido de interés), un fragmento funcional, o una variante del mismo, y un segundo ORF que exprese un segundo polipéptido de interés. En algunas realizaciones, dos o más polipéptidos de interés pueden fusionarse genéticamente, es decir, dos o más polipéptidos pueden ser codificados por el mismo ORF. En algunas realizaciones, el polinucleótido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifique un enlazador (por ejemplo, un enlazador peptídico G4S u otro enlazador conocido en la técnica) entre dos o más polipéptidos de interés.
En algunas realizaciones, un polinucleótido (es decir, un ARNm) puede comprender dos, tres, cuatro o más ORF, expresando cada uno un polipéptido de interés.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) puede comprender una primera secuencia de ácido nucleico (es decir, un primer ORF) que codifique un polipéptido de GALT y una segunda secuencia de ácido nucleico (es decir, un segundo ORF) que codifique un segundo polipéptido de interés.
5. Optimización de Secuencia de Nucleótidos que Codifica un Polipéptido de GALT
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) se optimiza en cuanto a la secuencia. En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT, una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica otro polipéptido de interés, una 5’-UTR, una 3’-UTR, un sitio de unión de microARN, una secuencia de nucleótidos que codifica un enlazador, o cualquier combinación de los mismos) que está optimizada en cuanto a la secuencia.
Una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia, por ejemplo, una secuencia de ARNm optimizada en cuanto a los codones que codifica un polipéptido de GALT, es una secuencia que comprende al menos una sustitución de nucleobase sinónima con respecto a una secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de tipo silvestre que codifica un polipéptido de GALT).
Una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia puede ser parcial o completamente diferente en cuanto a la secuencia de la secuencia de referencia. Por ejemplo, una secuencia de referencia que codifique poliserina uniformemente codificada por codones TCT puede optimizarse en cuanto a la secuencia sustituyendo un 100% de sus nucleobases (para cada codón, T en la posición 1 reemplazada por A, C en la posición 2 reemplazada por G, y T en la posición 3 reemplazada por C) para producir una secuencia que codifique poliserina que sea uniformemente codificada por codones AGC. El porcentaje de identidad de secuencia obtenido a partir de una alineación pareada global entre la secuencia de ácido nucleico de poliserina de referencia y la secuencia de ácido nucleico de poliserina optimizada en cuanto a la secuencia sería del 0%. Sin embargo, los productos proteínicos de ambas secuencias serían un 100% idénticos.
En la técnica se conocen (y se exponen posteriormente con más detalle) algunos métodos de optimización en cuanto a la secuencia (también denominados a veces optimización en cuanto a los codones), que pueden ser útiles para lograr uno o más resultados deseados. Estos resultados pueden incluir, por ejemplo, armonizar frecuencias de codones en ciertos tejidos diana y/u organismos hospedadores para garantizar el plegado adecuado; sesgar contenido de G/C para aumentar la estabilidad de ARNm o reducir estructuras secundarias; minimizar codones de repetición en tándem o pasadas base que puedan perjudicar la expresión o construcción génica; adaptar regiones de control de transcripción y traducción; insertar o eliminar secuencias de tráfico de proteínas; eliminar/agregar sitios de modificación postraduccional en una proteína codificada (por ejemplo, sitios de glicosilación); agregar, eliminar o redistribuir dominios de proteína; insertar o suprimir sitios de restricción; modificar sitios de unión de ribosomas y sitios de degradación de ARNm; ajustar tasas de traducción con el fin de permitir que los diversos dominios de la proteína se plieguen en forma adecuada; y/o reducir o eliminar estructuras secundarias problemáticas dentro del polinucleótido. Las herramientas, los algoritmos y los servicios de optimización en cuanto a la secuencia son conocidos en la técnica, y los ejemplos no limitativos incluyen los servicios de GeneArt (Life Technologies), DNA2.0 (Menlo Park CA) y/o métodos patentados.
Las opciones de codón para cada aminoácido se indican en la Tabla 1.
Tabla 1. Opciones de Codón
En algunas realizaciones, un polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT, un fragmento funcional, o una variante del mismo, teniendo el polipéptido de GALT, fragmento funcional, o una variante del mismo codificados por la secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia propiedades mejoradas (por ejemplo, en comparación con un polipéptido de GALT, fragmento funcional, o una variante del mismo codificados por una secuencia de nucleótidos de referencia que no esté optimizada en cuanto a la secuencia), por ejemplo, propiedades mejoradas relacionadas con la eficacia de expresión después de la administraciónin vivo.Tales propiedades incluyen, pero no se limitan a, mejorar la estabilidad de ácido nucleico (por ejemplo, estabilidad de ARNm), aumentar la eficacia de traducción en el tejido diana, reducir el número de proteínas truncadas expresadas, mejorar el plegado o prevenir el plegamiento erróneo de las proteínas expresadas, reducir la toxicidad de los productos expresados, reducir la muerte celular causada por los productos expresados, aumentar y/o disminuir la agregación de proteínas.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia está optimizada en cuanto a los codones para la expresión en individuos humanos, teniendo características estructurales y/o químicas que evitan uno o más de los problemas en la técnica, por ejemplo, características que son útiles para optimizar la formulación y la administración de agentes terapéuticos basados en ácido nucleico y al mismo tiempo retener la integridad estructural y funcional; superar un umbral de expresión; mejorar las tasas de expresión; la semivida y/o concentraciones de proteínas; optimizar la localización de proteínas; y evitar biorrespuestas perjudiciales tales como la respuesta inmunitaria y/o rutas de degradación.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos comprenden una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT, una secuencia de nucleótidos (es decir, un ORF) que codifica otro polipéptido de interés, una 5’-UTR, una 3’-UTR, un sitio de unión de microARN, una secuencia de ácido nucleico que codifica un enlazador, o cualquier combinación de los mismos) que está optimizada en cuanto a la secuencia según un método que comprende:
(i) sustituir al menos un codón en una secuencia de nucleótidos de referencia (por ejemplo, un ORF que codifica un polipéptido de GALT) por un codón alternativo para aumentar o disminuir el contenido de uridina para generar una secuencia modificada en cuanto a la uridina;
(ii) sustituir al menos un codón en una secuencia de nucleótidos de referencia (por ejemplo, un ORF que codifica un polipéptido de GALT) por un codón alternativo que tenga una frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos;
(iii) sustituir al menos un codón en una secuencia de nucleótidos de referencia (por ejemplo, un ORF que codifica un polipéptido de GALT) por un codón alternativo para aumentar el contenido de G/C; o
(iv) una combinación de éstos.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia (es decir, un ORF que codifica un polipéptido de GALT) tiene al menos una propiedad mejorada con respecto a la secuencia de nucleótidos de referencia.
En algunas realizaciones, el método de optimización de secuencia es multiparamétrico y comprende uno, dos, tres, cuatro o más métodos divulgados en la presente memoria y/u otros métodos de optimización conocidos en la técnica.
Las características, que pueden considerarse beneficiosas en algunas realizaciones de la invención, pueden ser codificadas por o dentro de regiones del polinucleótido y tales regiones pueden estar en dirección 5’ con respecto a, en dirección 3’ con respecto a, o dentro de la región que codifica el polipéptido de GALT. Estas regiones pueden incorporarse en el polinucleótido antes y/o después de la optimización en cuanto a la secuencia de la región codificante de proteína o el marco de lectura abierta (ORF). Los ejemplos de tales características incluyen, pero no se limitan a, regiones no traducidas (UTR), secuencias de microARN, secuencias Kozak, secuencias de oligo(dT), cola de poli-A, y etiquetas detectables y pueden incluir múltiples sitios de clonación que pueden tener reconocimiento Xbal.
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una 5' UTR, una 3' UTR y/o un sitio de unión de microARN. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende dos o más 5' UTR y/o 3' UTR, que pueden ser secuencias iguales o diferentes. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende dos o más sitios de unión de microARN, que pueden ser secuencias iguales o diferentes. Cualquier porción de la 5' UTR, la 3' UTR, y/o el sitio de unión de microARN, incluyendo ninguna, puede optimizarse en cuanto a la secuencia y puede contener independientemente una o más modificaciones estructurales o químicas diferentes, antes y/o después de la optimización en cuanto a la secuencia.
En algunas realizaciones, después de la optimización, el polinucleótido se reconstituye y se transforma en un vector tal como, pero sin limitarse a, plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. Por ejemplo, el polinucleótido optimizado puede reconstituirse y transformarse enE. coli,levadura, neurospora, maíz, drosophila, etc. químicamente competentes, en donde se producen estructuras de tipo plásmido o cromosómicas de alta copia por los métodos descritos en la presente memoria.
6. Secuencias de Nucleótidos Optimizadas en cuanto a la Secuencia que Codifican Polipéptidos de GALT
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia que codifica un polipéptido de GALT divulgado en la presente memoria. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de GALT, habiéndose optimizado el ORF en cuanto a la secuencia.
Se exponen secuencias de nucleótidos optimizadas en cuanto a la secuencia ejemplares que codifican la isoforma 1 de GALT humana como SEQ ID NOs: 5-29 (GALT-CO01, GALT-CO02, GALT-CO03, GALT-CO04, GALT-CO05, GALT-CO06, GALT-CO07, GALT-CO08, GALT-CO09, GALT-CO10, GALT-CO11, GALT-CO12, GALT-CO13, GALT-CO14, GALT-CO15, GALT-CO16, GALT-CO17, GALT-CO18, GALT-CO19, GALT-CO20, GALT-CO21, GALT-CO22, GALT-CO23, GALT-CO24, y GALT-CO25, respectivamente). En la Tabla 2 se muestran secuencias de nucleótidos optimizadas en cuanto a la secuencia ejemplares adicionales que codifican la isoforma 1 de GALT. En algunas realizaciones, las secuencias de GALT optimizadas en cuanto a la secuencia de la Tabla 2, fragmentos y variantes de las mismas se usan para poner en práctica los métodos divulgados en la presente memoria. En algunas realizaciones, las secuencias de GALT optimizadas en cuanto a la secuencia expuestas como SEQ ID NOs: 5-29 se muestran en la Tabla 2, fragmentos y variantes de las mismas se combinan con o son alternativas a las secuencias de tipo silvestre divulgadas en las Figuras 1-2.
Secuencias de nucleótidos optimizadas en cuanto a la secuencia ejemplares que codifican la isoforma 1 de GALT humana se exponen como SEQ ID NOs: 113-131 (GALT-CO26, GALT-CO27, GALT- CO28, GALT-CO29, GALT-CO30, GALT-CO31, GALT-CO32, GALT-CO33, GALT- CO34, GALT-CO35, GALT-CO36, GALT-CO37, GALT-CO38, GALT-CO39, GALT- CO40, GALT-CO41, GALT-CO42, GALT-CO43, y GALT-CO44, respectivamente). En la Tabla 2 se muestran secuencias de nucleótidos optimizadas en cuanto a la secuencia ejemplares adicionales que codifican la isoforma 1 de GALT humana. En algunas realizaciones, las secuencias de GALT optimizadas en cuanto a la secuencia expuestas como SEQ ID NOs: 113-131, o mostradas en la Tabla 2, fragmentos y variantes de las mismas se usan para poner en práctica los métodos divulgados en la presente memoria. En algunas realizaciones, las secuencias de GALT optimizadas en cuanto a la secuencia expuestas como SEQ ID NOs: 113-131, o mostradas en la Tabla 2, fragmentos y variantes de las mismas se combinan con o son alternativas a las secuencias de tipo silvestre divulgadas en las Figuras 1-2.
En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos de ARNm que codifica un polipéptido de GALT comprende, del extremo 5’ al 3’:
(i) un casquete 5’ proporcionado en la presente memoria, por ejemplo, Cap1;
(ii) una 5' UTR, tal como las secuencias proporcionadas en la presente memoria, por ejemplo, SEQ ID NO: 35;
(iii) un marco de lectura abierta que codifica un polipéptido de GALT, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico optimizada en cuanto a la secuencia y que codifica GALT, expuesta como SEQ ID NOs: 5-29 y 113 131, o mostrada en la T abla 2;
(iv) al menos un codón de parada;
(v) una 3' UTR, tal como las secuencias proporcionadas en la presente memoria, por ejemplo, SEQ ID NOs: 98, 163 o 164; y
(vi) una cola de poli-A proporcionada anteriormente.
Tabla 2: Secuencias optimizadas en cuanto a la secuencia para GALT humana, isoforma 1
Las secuencias de nucleótidos optimizadas en cuanto a la secuencia divulgadas en la presente memoria son distintas de las secuencias de ácidos de nucleótidos de tipo silvestre correspondientes y de otras secuencias de nucleótidos optimizadas en cuanto a la secuencia conocidas, por ejemplo, estos ácidos nucleicos optimizados en cuanto a la secuencia tienen características de composición únicas.
En algunas realizaciones, el porcentaje de nucleobases de uracilo o timina en una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia (por ejemplo, que codifica un polipéptido de GALT, un fragmento funcional, o una variante del mismo) se modifica (por ejemplo, se reduce) con respecto al porcentaje de nucleobases de uracilo o timina en la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre de referencia. Tal secuencia se denomina secuencia modificada en cuanto al uracilo o modificada en cuanto a la timina. El porcentaje de contenido de uracilo o timina en una secuencia de nucleótidos se puede determinar dividiendo el número de uracilos o timinas en una secuencia por el número total de nucleótidos y multiplicando por 100. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia tiene un contenido de uracilo o timina menor que el contenido de uracilo o timina en la secuencia de tipo silvestre de referencia. En algunas realizaciones, el contenido de uracilo o timina en una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia es mayor que el contenido de uracilo o timina en la secuencia de tipo silvestre de referencia y aún mantiene efectos beneficiosos, por ejemplo, expresión aumentada y/o respuesta reducida del Receptor de Tipo Toll (TLR) cuando se compara con la secuencia de tipo silvestre de referencia.
El contenido de uracilo o timina de la isoforma 1 de GALT de tipo silvestre es de aproximadamente un 20%. En algunas realizaciones, el contenido de uracilo o timina de una secuencia modificada en cuanto al uracilo o en cuanto a la timina que codifica un polipéptido de GALT es inferior a un 20%. En algunas realizaciones, el contenido de uracilo o timina de una secuencia modificada en cuanto al uracilo o en cuanto a la timina que codifica un polipéptido de GALT es inferior a un 19%, inferior a un 18%, inferior a un 17%, inferior a un 16%, inferior a un 15%, inferior a un 14%, inferior a un 13%, inferior a un 12% o inferior a un 11%. En algunas realizaciones, el contenido de uracilo o timina no es inferior a un 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11% o 10%. El contenido de uracilo o timina de una secuencia divulgada en la presente memoria, es decir, su contenido total de uracilo o timina se abrevia en la presente memoria como%ÜTL<o>%T<tl>.
En algunas realizaciones, el contenido de uracilo o timina (%Utl o%Ttl) de una secuencia modificada en cuanto al uracilo o en cuanto a la timina que codifica un polipéptido de GALT está entre un 10% y un 20%, entre un 11% y un 20%, entre un 12% y un 20%, entre un 12% y un 19%, entre un 13% y un 19%, entre un 13% y un 18%, entre un 14% y un 17%, entre un 14% y un 16% o entre un 14% y un 15%.
En algunas realizaciones, el contenido de uracilo o timina (%U<tl o>%T<tl>) de una secuencia modificada en cuanto al uracilo o en cuanto a la timina que codifica un polipéptido de GALT está entre un 13% y un 16%, entre un 13% y un 15% o entre un 14% y un 15%.
En una realización concreta, el contenido de uracilo o timina (%U<tl o>%T<tl>) de una secuencia modificada en cuanto al uracilo o en cuanto a la timina que codifica un polipéptido de GALT está entre aproximadamente un 14% y aproximadamente un 15%.
Una secuencia modificada en cuanto al uracilo o en cuanto a la timina que codifica un polipéptido de GALT también se puede describir de acuerdo con su contenido de uracilo o timina en relación con el contenido de uracilo o timina en la secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre correspondiente (%U<wt o>%T<wt>), o de acuerdo con su contenido de uracilo o timina en relación con el contenido mínimo teórico de uracilo o timina de un ácido nucleico que codifica la secuencia de proteína de tipo silvestre (%Utm o%Ttm).
La expresión “contenido de uracilo o timina en relación con el contenido de uracilo o timina en la secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre” se refiere a un parámetro determinado dividiendo el número de uracilos o timinas en un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia por el número total de uracilos o timinas en la secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre correspondiente y multiplicando por 100. Este parámetro se abrevia en la presente memoria como%Uwr o%Twt.
En algunas realizaciones, el%Uwr o el%Twr de una secuencia modificada en cuanto al uracilo o en cuanto a la timina que codifica un polipéptido de GALT están por encima de un 50%, por encima de un 55%, por encima de un 60%, por encima de un 65%, por encima de un 70%, por encima de un 75%, por encima de un 80%, por encima de un 85%, por encima de un 90% o por encima de un 95%.
En algunas realizaciones, el%Uwr o el%Twr de una secuencia modificada en cuanto al uracilo o en cuanto a la timina que codifica un polipéptido de GALT están entre un 58% y un 84%, entre un 59% y un 83%, entre un 60% y un 82%, entre un 61% y un 81%, entre un 62% y un 80%, entre un 63% y un 79%, entre un 64% y un 78%, entre un 65% y un 77%, entre un 66% y un 76%, entre un 67% y un 75% o entre un 68% y un 74%.
En algunas realizaciones, el%Uwr o el%Twr de una secuencia modificada en cuanto al uracilo o en cuanto a la timina que codifica un polipéptido de GALT están entre un 66% y un 76%, entre un 66% y un 76%, entre un 67% y un 75% o entre un 68% y un 74%.
En una realización concreta, el%Uwr o el%Twr de una secuencia modificada en cuanto al uracilo o en cuanto a la timina que codifica un polipéptido de GALT están entre aproximadamente un 68% y aproximadamente un 74%.
El contenido de uracilo o timina en relación con el mínimo teórico de uracilo o timina se refiere a un parámetro determinado dividiendo el número de uracilos o timinas en una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia por el número total de uracilos o timinas en una secuencia de nucleótidos hipotética en la que todos los codones de la secuencia hipotética se reemplacen por codones sinónimos que tengan el menor contenido posible de uracilo o timina y multiplicando por 100. Este parámetro se abrevia en la presente memoria como%UTM o%Ttm.
Para el ADN se reconoce que está presente timina en lugar de uracilo, y se sustituiría T donde aparezca U. Por lo tanto, todas las divulgaciones relacionadas con, por ejemplo,%UTM,%UWT o%Utl con respecto al ARN son igualmente aplicables a%TTM,%TWT o%Ttl con respecto al ADN.
En algunas realizaciones, el%UTM de una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT está por debajo de un 300%, por debajo de un 295%, por debajo de un 290%, por debajo de un 285%, por debajo de un 280%, por debajo de un 275%, por debajo de un 270%, por debajo de un 265%, por debajo de un 260%, por debajo de un 255%, por debajo de un 250%, por debajo de un 245%, por debajo de un 240%, por debajo de un 235%, por debajo de un 230%, por debajo de un 225%, por debajo de un 220%, por debajo de un 215%, por debajo de un 200%, por debajo de un 195%, por debajo de un 190%, por debajo de un 185%, por debajo de un 180%, por debajo de un 175%, por debajo de un 170%, por debajo de un 165%, por debajo de un 160%, por debajo de un 155%, por debajo de un 150%, por debajo de un 145%, por debajo de un 140%, por debajo de un 139%, por debajo de un 138%, por debajo de un 137%, por debajo de un 136%, por debajo de un 135%, por debajo de un 134%, por debajo de un 133%, por debajo de un 132%, por debajo de un 131%, por debajo de un 130%, por debajo de un 129%, por debajo de un 128%, por debajo de un 127%, por debajo de un 126%, por debajo de un 125%, por debajo de un 124% o por debajo de un 123%.
En algunas realizaciones, el%UTM de una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT está por encima de un 100%, por encima de un 101%, por encima de un 102%, por encima de un 103%, por encima de un 104%, por encima de un 105%, por encima de un 106%, por encima de un 107%, por encima de un 108%, por encima de un 109%, por encima de un 110%, por encima de un 111%, por encima de un 112%, por encima de un 113%, por encima de un 114%, por encima de un 115%, por encima de un 116%, por encima de un 117%, por encima de un 118%, por encima de un 119%, por encima de un 120%, por encima de un 121%, por encima de un 122%, por encima de un 123%, por encima de un 124%, por encima de un 125%, o por encima de un 126%, por encima de un 127%, por encima de un 128%, por encima de un 129%, o por encima de un 130%, por encima de un 135%, por encima de un 130%, por encima de un 131%, por encima de un 132% o por encima de un 133%.
En algunas realizaciones, el%UTM de una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT está entre un 127% y un 129%, entre un 126% y un 130%, entre un 125% y un 131%, entre un 124% y un 132%, entre un 123% y un 133%, entre un 122% y un 134%, entre un 121% y un 135%, entre un 120% y 136%, entre un 119% y 137%, entre un 118% y un 138%, entre un 117% y un 139%, entre un 116% y un 140% o entre un 115% y un 141%.
En algunas realizaciones, el%UTM de una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT está entre aproximadamente un 123% y aproximadamente un 134%.
En algunas realizaciones, una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT tiene un número reducido de uracilos consecutivos con respecto a la secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre correspondiente. Por ejemplo, dos leucinas consecutivas pueden ser codificadas por la secuencia CUUUUG, que incluye un grupo de cuatro uracilos. Tal subsecuencia puede sustituirse, por ejemplo, por CUGCUC, que elimina el grupo de uracilos.
La fenilalanina puede ser codificada por UUC o UUU. Por lo tanto, incluso si las fenilalaninas codificadas por UUU se reemplazan por UUC, el codón sinónimo todavía contiene un par de uracilos (UU). Por consiguiente, el número de fenilalaninas en una secuencia establece un número mínimo de pares de uracilos (UU) que no pueden eliminarse sin alterar el número de fenilalaninas en el polipéptido codificado. Por ejemplo, si el polipéptido, por ejemplo, GALT de tipo silvestre, tiene 11, 12, 13 o 14 fenilalaninas, el número mínimo absoluto de pares de uracilos (UU) que esa secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica el polipéptido, por ejemplo, GALT de tipo silvestre, puede contener es 11, 12, 13 o 14, respectivamente.
La isoforma 1 de GALT de tipo silvestre contiene 20 pares de uracilos (UU) y cinco tripletes de uracilos (UUU). En algunas realizaciones, una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT tiene un número reducido de tripletes de uracilos (UUU) con respecto a la secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre. En algunas realizaciones, una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT contiene 5, 4, 3, 2, 1 o ningún triplete de uracilos (UUU).
En algunas realizaciones, una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT tiene un número reducido de pares de uracilos (UU) con respecto al número de pares de uracilos (UU) en la secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre. En algunas realizaciones, una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT tiene un número de pares de uracilos (UU) que corresponde al número mínimo posible de pares de uracilos (UU) en la secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre, por ejemplo, 12 pares de uracilos en el caso de la isoforma 1 de GALT de tipo silvestre.
En algunas realizaciones, una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 pares de uracilos (UU) menos que el número de pares de uracilos (UU) en la secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre. En algunas realizaciones, una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT tiene entre 9 y 19 pares de uracilos (UU).
La expresión “pares de uracilos (UU) en relación con los pares de uracilos (UU) en la secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre” se refiere a un parámetro determinado dividiendo el número de pares de uracilos (UU) en una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia por el número total de pares de uracilos (UU) en la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre correspondiente y multiplicando por 100. Este parámetro se abrevia en la presente memoria como%UUwt.
En algunas realizaciones, una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT tiene un%UUwt inferior a un 90%, inferior a un 85%, inferior a un 80%, inferior a un 75%, inferior a un 70%, inferior a un 65%, inferior a un 60%, inferior a un 65%, inferior a un 60%, inferior a un 55%, inferior a un 50%, inferior a un 40%, inferior a un 30% o inferior a un 20%.
En algunas realizaciones, una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT tiene un%UUwt entre un 40% y un 100%. En una realización concreta, una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT tiene un%UUwt entre un 45% y un 90%.
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT divulgado en la presente memoria. En algunas realizaciones, la secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT comprende al menos una nucleobase modificada químicamente, por ejemplo, 5-metoxiuracilo. En algunas realizaciones, al menos un 95% de una nucleobase (por ejemplo, uracilo) en una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT son nucleobases modificadas. En algunas realizaciones, al menos un 95% del uracilo en una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT es 5-metoxiuracilo. En algunas realizaciones, el polinucleótido que comprende una secuencia modificada en cuanto al uracilo comprende además un sitio de unión de miARN, por ejemplo, un sitio de unión de miARN que se une a miR-142 y/o un sitio de unión de miARN que se une a miR-126. En la composición de la invención, el polinucleótido que comprende una secuencia modificada en cuanto al uracilo se formula con un agente de administración que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (IA), por ejemplo, el Compuesto 18. En algunas realizaciones, el agente de administración comprende el Compuesto 18, DSPC, Colesterol y el Compuesto 428, por ejemplo, con una relación molar de aproximadamente 50:10:38.5:1.5.
En algunas realizaciones, el “contenido de guanina del ORF optimizado en cuanto a la secuencia que codifica GALT con respecto al contenido máximo teórico de guanina de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de GALT”, abreviado<coitio>%G<tmx>es de al menos un 68%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o aproximadamente un 100%. En algunas realizaciones, el%GTMx está entre aproximadamente un 68% y aproximadamente un 80%, entre aproximadamente un 69% y aproximadamente un 78%, entre aproximadamente un 70% y aproximadamente un 78%, o entre aproximadamente un 70% y aproximadamente un 77%.
En algunas realizaciones, el "contenido de citosina del ORF en relación con el contenido máximo teórico de citosina en una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de GALT", abreviado coito%Ctmx, es al menos un 68%, al menos un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o aproximadamente un 100%. En algunas realizaciones, el%CTMx está entre aproximadamente un 64% y aproximadamente un 82%, entre aproximadamente un 66% y aproximadamente un 80%, entre aproximadamente un 68% y aproximadamente un 79% o entre aproximadamente un 70% y aproximadamente un 78%.
En algunas realizaciones, el “contenido de guanina y citosina (G/C) del ORF en relación con el contenido máximo teórico de G/C en una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de GALT”, abreviado como%G/CTMX, es al menos aproximadamente un 89%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 91%, al menos aproximadamente un 95% o aproximadamente un 100%. EI%G/C<tmx>está entre aproximadamente un 80% y aproximadamente un 100%, entre aproximadamente un 85% y aproximadamente un 98%, entre aproximadamente un 90% y aproximadamente un 96% o entre aproximadamente un 91% y aproximadamente un 95%.
En algunas realizaciones, el “contenido de G/C en el ORF en relación con el contenido de G/C en el ORF de tipo silvestre correspondiente”, abreviado como%G/Cwr, es al menos un 104%, al menos un 105%, al menos un 106%, al menos un 107%, al menos un 108%, al menos un 109%, al menos un 111%, al menos un 113%, al menos un 115% o al menos un 120%.
En algunas realizaciones, el contenido de G/C promedio en la 3a posición de codón en el ORF es al menos un 20%, al menos un 21%, al menos un 22%, al menos un 23%, al menos un 24% o al menos un 25% mayor que el contenido de G/C promedio en la 3a posición de codón en el ORF de tipo silvestre correspondiente.
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de GALT, en donde el ORF se ha optimizado en cuanto a la secuencia, y en donde cada uno de los siguientes:%UTL,%UWT,%UTM,%GTL,%GWT,%GTMX,%CTL,%CWT,%CTMX,%G/CTL,%G/CWT o%G/Ctmx, solo o en una combinación de los mismos está en un intervalo entre (i) un máximo correspondiente al valor máximo (MÁX) del parámetro más aproximadamente 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 o 10 desviaciones estándar (DESV. EST.), y (ii) un mínimo correspondiente al valor mínimo (MÍN) del parámetro menos 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 o 10 desviaciones estándar (DESV. EST.).
7. Métodos para la Optimización de Secuencias
En algunas realizaciones, se optimiza la secuencia de un polinucleótido, es decir, ARNm, (que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT (por ejemplo, la secuencia de tipo silvestre, fragmento funcional o variante del mismo). Una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia (la secuencia de nucleótidos también se denomina “ácido nucleico” en la presente memoria) comprende al menos una modificación de codón con respecto a una secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre que codifica un polipéptido de GALT). Por lo tanto, en un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia, al menos un codón es diferente de un codón correspondiente en una secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre).
En general, los ácidos nucleicos optimizados en cuanto a la secuencia se generan mediante al menos una etapa que comprende sustituir codones en una secuencia de referencia por codones sinónimos (es decir, codones que codifican el mismo aminoácido). Tales sustituciones se pueden efectuar, por ejemplo, aplicando un mapa de sustitución de codones (es decir, una tabla que proporciona los codones que codificarán cada aminoácido en la secuencia optimizada en cuanto a los codones), o aplicando un conjunto de reglas (por ejemplo, si una glicina está al lado de un aminoácido neutro, la glicina sería codificada por cierto codón, pero si está al lado de un aminoácido polar, sería codificada por otro codón). Además de las sustituciones de codones (es decir, “optimización en cuanto a los codones”), los métodos de optimización en cuanto a la secuencia divulgados en la presente memoria comprenden etapas de optimización adicionales que no se dirigen estrictamente a la optimización en cuanto a los codones, tales como la eliminación de motivos perjudiciales (sustitución de motivos desestabilizadores). Las composiciones y formulaciones que comprenden estos ácidos nucleicos optimizados en cuanto a la secuencia (por ejemplo, un ARN, por ejemplo, un ARNm) pueden administrarse a un individuo que lo necesite para facilitar la expresión in vivo de GALT funcionalmente activa.
La expresión recombinante de moléculas grandes en cultivos celulares puede ser una tarea desafiante con numerosas limitaciones (por ejemplo, bajos niveles de expresión de proteínas, traducción estancada que da como resultado productos de expresión truncados, plegado erróneo de proteínas, etc.). Estas limitaciones pueden reducirse o evitarse administrando los polinucleótidos (por ejemplo, un ARN, por ejemplo, un ARNm) que codifican una GALT funcionalmente activa o composiciones o formulaciones que comprendan los mismos a un paciente que padezca de Gal-1, de modo que la síntesis y la administración del polipéptido de GALT para tratar la Gal-1 tengan lugar de forma endógena.
El cambio de un sistema de expresiónin vitro(por ejemplo, cultivo celular) a una expresiónin vivorequiere el rediseño de la secuencia de ácido nucleico que codifica el agente terapéutico. El rediseño de una secuencia génica de origen natural eligiendo diferentes codones, sin alterar necesariamente la secuencia de aminoácidos codificada, a menudo puede conducir a aumentos espectaculares en los niveles de expresión de proteínas (Gustafsson et al., 2004, Journal/Trends Biotechnol 22, 346-53). Se ha demostrado que variables tales como el índice de adaptación de codones (CAI, por sus siglas en inglés), estructuras secundarias de ARNm, secuencias reguladoras en cis, contenido de GC y muchas otras variables similares se correlacionan de alguna manera con los niveles de expresión de proteínas (Villalobos et al., 2006, "Journal/BMC Bioinformatics 7, 285). Sin embargo, debido a la redundancia del código genético, hay numerosas secuencias de ácido nucleico diferentes que pueden codificar todas el mismo agente terapéutico. Cada aminoácido está codificado por hasta seis codones sinónimos; y la elección entre estos codones influye en la expresión génica. Además, el uso de codones (es decir, la frecuencia con la que diferentes organismos usan codones para expresar una secuencia polipeptídica) difiere entre organismos (por ejemplo, la producción recombinante de anticuerpos terapéuticos humanos o humanizados tiene lugar frecuentemente en cultivos de células de hámster).
En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico de referencia puede optimizarse en cuanto a la secuencia aplicando un mapa de codones. El experto en la técnica apreciará que las bases T en los mapas de codones divulgados posteriormente están presentes en el ADN, mientras que las bases T se reemplazarían por bases U en los a Rn correspondientes. Por ejemplo, un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia divulgado en la presente memoria en forma de ADN, por ejemplo, un vector o un molde de traducción in vitro (IVT, por sus siglas en inglés), tendría sus bases T transcritas como U sobre la base de su ARNm transcrito correspondiente. A este respecto, tanto las secuencias de ADN optimizadas en cuanto a la secuencia (que comprenden T) como sus secuencias de ARN correspondientes (que comprenden U) se consideran ácidos nucleicos optimizados en cuanto a la secuencia. Un experto en la técnica también entendería que se pueden generar mapas de codones equivalentes reemplazando una o más bases por bases no naturales. Por lo tanto, por ejemplo, un codón TTC (mapa de ADN) correspondería a un codón UUC (mapa de ARN), que a su vez puede corresponder a un codón ^ ^ C (mapa de ARN en el que U se ha reemplazado por pseudouridina).
En una realización, una secuencia de referencia que codifica GALT puede optimizarse reemplazando todos los codones que codifiquen un determinado aminoácido por sólo uno de los codones alternativos proporcionados en un mapa de codones. Por ejemplo, todas las valinas en la secuencia optimizada estarían codificadas por GTG o GTC o GTT.
Pueden generarse polinucleótidos optimizados en cuanto a la secuencia usando uno o más métodos de optimización, o una combinación de los mismos. En la presente memoria se describen en detalle métodos de optimización en cuanto a la secuencia que se pueden usar para optimizar secuencias de ácidos nucleicos en cuanto a la secuencia. Esta lista de métodos no es exhaustiva ni limitativa.
Se apreciará que las reglas y los principios de diseño descritos para cada uno de los métodos de optimización en cuanto a la secuencia expuestos posteriormente se pueden combinar de muchas maneras diferentes, por ejemplo, optimización en cuanto a la secuencia de alto contenido de G/C para algunas regiones u optimización en cuanto a la secuencia de contenido de uridina para otras regiones de la secuencia de ácido nucleico de referencia, así como mutaciones de nucleótido guiadas para minimizar la estructura secundaria a lo largo de la secuencia o para eliminar motivos perjudiciales.
La elección de combinaciones potenciales de métodos de optimización en cuanto a la secuencia puede, por ejemplo, depender de la química específica utilizada para producir un polinucleótido sintético. Tal elección también puede depender de las características de la proteína codificada por el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia, por ejemplo, una secuencia completa, un fragmento funcional o una proteína de fusión que comprendan GALT, etc. En algunas realizaciones, tal elección puede depender del tejido o la célula específicos a los que vaya guiado el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia (por ejemplo, un ARNm sintético terapéutico).
Los mecanismos de combinación de los métodos de optimización en cuanto a la secuencia o las reglas de diseño derivadas de la aplicación y el análisis de los métodos de optimización pueden ser simples o complejos. Por ejemplo, la combinación puede ser:
(i)Secuencial:Cada método de optimización en cuanto a la secuencia o conjunto de reglas de diseño se aplica a una subsecuencia diferente, de la secuencia general, por ejemplo, reduciendo uridina en las posiciones de codón 1 a 30 y luego seleccionando codones de alta frecuencia para el resto de la secuencia;
(ii)Jerárquica:Se combinan de manera jerárquica y determinista varios métodos de optimización en cuanto a la secuencia o conjuntos de reglas de diseño. Por ejemplo, usar los codones más ricos en GC, rompiendo los lazos (que son comunes) eligiendo el más frecuente de esos codones.
(iii)Multifactorial/Multiparamétrica:Se utilizan técnicas de aprendizaje automático u otras técnicas de modelado para diseñar una secuencia única que satisfaga mejor múltiples requisitos superpuestos y posiblemente contradictorios. Este enfoque requeriría el uso de un ordenador que aplique una serie de técnicas matemáticas, por ejemplo, algoritmos genéticos.
En última instancia, cada uno de estos enfoques puede dar como resultado un conjunto específico de reglas que en muchos casos pueden resumirse en una tabla de codones única, es decir, una lista ordenada de codones para cada aminoácido en la proteína diana (es decir, GALT), con una regla o conjunto de reglas específicos que indican cómo seleccionar un codón específico para cada posición de aminoácido.
a. Optimización del Contenido de Uridina
La presencia de altas concentraciones locales de uridina en una secuencia de ácido nucleico puede tener efectos perjudiciales en la traducción, por ejemplo, traducción lenta o terminada prematuramente, especialmente cuando se usan análogos de uridina modificados en la producción de ARNm sintéticos. Además, el alto contenido de uridina también puede reducir la semividain vivode los ARNm sintéticos debido a la activación de TLR.
En consecuencia, una secuencia de ácido nucleico puede optimizarse en cuanto a la secuencia usando un método que comprenda al menos una etapa de optimización del contenido de uridina. Tal etapa comprende, por ejemplo, sustituir al menos un codón en el ácido nucleico de referencia por un codón alternativo para generar una secuencia modificada en cuanto a la uridina, teniendo la secuencia modificada en cuanto a la uridina al menos una de las siguientes propiedades:
(i) aumento o disminución del contenido global de uridina;
(ii) aumento o disminución del contenido local de uridina (es decir, los cambios en el contenido de uridina se limitan a subsecuencias específicas);
(iii) cambios en la distribución de uridina sin alterar el contenido global de uridina;
(iv) cambios en el agrupamiento de uridina (por ejemplo, número de grupos, ubicación de grupos o distancia entre grupos); o
(v) combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, el proceso de optimización en cuanto a la secuencia comprende optimizar el contenido global de uridina, es decir, optimizar el porcentaje de nucleobases de uridina en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia con respecto al porcentaje de nucleobases de uridina en la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, el 30% de las nucleobases pueden ser uridinas en la secuencia de referencia y el 10% de las nucleobases pueden ser uridinas en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia.
En otras realizaciones, el proceso de optimización en cuanto a la secuencia comprende reducir el contenido local de uridina en regiones específicas de una secuencia de ácido nucleico de referencia, es decir, reducir el porcentaje de nucleobases de uridina en una subsecuencia del ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia con respecto al porcentaje de nucleobases de uridina en la subsecuencia correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de referencia puede tener una región de extremo 5’ (por ejemplo, 30 codones) con un contenido local de uridina del 30%, y el contenido de uridina en esa misma región podría reducirse al 10% en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia.
En realizaciones específicas, los codones pueden reemplazarse en la secuencia de ácido nucleico de referencia para reducir o modificar, por ejemplo, el número, el tamaño, la ubicación o la distribución de grupos de uridina que podrían tener efectos perjudiciales en la traducción de proteínas. Aunque como regla general es deseable reducir el contenido de uridina de la secuencia de ácido nucleico de referencia, en ciertas realizaciones puede aumentarse el contenido de uridina, y en particular el contenido local de uridina, de algunas subsecuencias de la secuencia de ácido nucleico de referencia.
La reducción del contenido de uridina para evitar efectos adversos en la traducción se puede hacer en combinación con otros métodos de optimización divulgados aquí para lograr otros objetivos de diseño. Por ejemplo, la optimización del contenido de uridina se puede combinar con un diseño de rampa, ya que el uso de los codones más raros para la mayoría de los aminoácidos reducirá, con unas pocas excepciones, el contenido de U.
En algunas realizaciones, la secuencia modificada en cuanto a la uridina está diseñada para inducir una respuesta del Receptor de Tipo Toll (TLR) más baja en comparación con la secuencia de ácido nucleico de referencia. Varios TLR reconocen y responden a ácidos nucleicos. Se ha demostrado que el ARN(bc) bicatenario, un constituyente viral frecuente, activa el TLR3. Véase Alexopoulou et al. (2001) Nature, 413:732-738 y Wang et al. (2004) Nat. Med., 10:1366-1373. El ARN(mc) monocatenario activa el Tl R7. Véase Diebold et al. (2004) Science 303:1529-1531. Los oligonucleótidos de ARN, por ejemplo ARN con enlaces internucleotídicos de fosforotioato, son ligandos del TLR8 humano. Véase Heil et al. (2004) Science 303:1526-1529. El ADN que contiene motivos CpG no metilados, característicos del ADN bacteriano y viral, activa el TLR9. Véase Hemmi et al. (2000) Nature, 408: 740-745.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "respuesta de TLR" se define como el reconocimiento de ARN monocatenario por un receptor TLR7, y en algunasrealizacionesabarca la degradación del ARN y/o las respuestas fisiológicas causadas por el reconocimiento del ARN monocatenario por el receptor. En la técnica se conocen métodos para determinar y cuantificar la unión de un ARN a un TLR7. De manera similar, los métodos para determinar si un ARN ha desencadenado una respuesta fisiológica mediada por TLR7 (por ejemplo, secreción de citocinas) son bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, una respuesta de TLR puede estar mediada por TLR3, TLR8 o TLR9, en lugar de TLR7.
La supresión de la respuesta mediada por TLR7 se puede lograr mediante modificación de nucleósidos. El ARN experimenta más de cien modificaciones de nucleósidos diferentes en la naturaleza (véase la Base de Datos de Modificación de ARN, disponible en mods.rna.albany.edu). El ARNr humano, por ejemplo, tiene diez veces más pseudouridina (y ) y 25 veces más nucleósidos 2’-O-metilados que el ARNr bacteriano. El ARNm bacteriano no contiene modificaciones de nucleósidos, mientras que los ARNm de mamíferos tienen nucleósidos modificados tales como 5-metilcitidina (m5C), N6-metiladenosina (m6A), inosina y muchos nucleósidos 2’-O-metilados, además de N7-metilguanosina (m7G).
El uracilo y la ribosa, las dos características que definen el ARN, son tanto necesarios como suficientes para la estimulación de TLR7, y los ARN monocatenarios (ARNmc) cortos hacen de agonistas de TLR7 de una manera independiente de la secuencia, siempre que contengan varias uridinas en estrecha proximidad. Véase Diebold et al. (2006) Eur. J. Inmunol. 36:3256-3267. Por consiguiente, uno o más de los métodos de optimización divulgados en la presente memoria comprende reducir el contenido de uridina (local y/o globalmente) y/o reducir o modificar el agrupamiento de uridina para reducir o suprimir una respuesta mediada por TLR7.
En algunas realizaciones, la respuesta de TLR (por ejemplo, una respuesta mediada por TLR7) causada por la secuencia modificada en cuanto a la uridina es al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o al menos aproximadamente un 100% menor que la respuesta de TLR causada por la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunas realizaciones, la respuesta de TLR causada por la secuencia de ácido nucleico de referencia es al menos aproximadamente 1 vez, al menos aproximadamente 1.1 veces, al menos aproximadamente 1.2 veces, al menos aproximadamente 1.3 veces, al menos aproximadamente 1.4 veces, al menos aproximadamente 1.5 veces, al menos aproximadamente 1.6 veces, al menos aproximadamente 1.7 veces, al menos aproximadamente 1.8 veces, al menos aproximadamente 1.9 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces o al menos aproximadamente 10 veces mayor que la respuesta de TLR causada por la secuencia modificada en cuanto a la uridina.
En algunas realizaciones, el contenido de uridina (contenido global promedio de uridina) (absoluto o relativo) de la secuencia modificada en cuanto a la uridina es mayor que el contenido de uridina (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la secuencia modificada en cuanto a la uridina contiene al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o al menos aproximadamente un 100% más de uridina que la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En otras realizaciones, el contenido de uridina (contenido global promedio de uridina) (absoluto o relativo) de la secuencia modificada en cuanto a la uridina es menor que el contenido de uridina (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la secuencia modificada en cuanto a la uridina contiene al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o al menos aproximadamente un 100% menos de uridina que la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunas realizaciones, el contenido de uridina (contenido global promedio de uridina) (absoluto o relativo) de la secuencia modificada en cuanto a la uridina es inferior a un 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% del total de nucleobases en la secuencia modificada en cuanto a la uridina. En algunas realizaciones, el contenido de uridina de la secuencia modificada en cuanto a la uridina está entre aproximadamente un 10% y aproximadamente un 20%. En algunas realizaciones concretas, el contenido de uridina de la secuencia modificada en cuanto a la uridina está entre aproximadamente un 12% y aproximadamente un 16%.
En algunas realizaciones, el contenido de uridina de la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede medir usando una ventana deslizante. En algunas realizaciones, la longitud de la ventana deslizante es 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleobases. En algunas realizaciones, la ventana deslizante tiene más de 40 nucleobases de longitud. En algunas realizaciones, la ventana deslizante tiene 20 nucleobases de longitud. Basándose en el contenido de uridina medido con una ventana deslizante, es posible generar un histograma que represente el contenido de uridina a lo largo de la longitud de la secuencia de ácido nucleico de referencia y los ácidos nucleicos optimizados en cuanto a la secuencia.
En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar para reducir o eliminar los picos en el histograma que estén por encima o por debajo de cierto valor porcentual. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar para eliminar los picos en la representación de ventana deslizante que estén por encima de un 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% o 30% de uridina. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar para que no haya picos de más del 30% de uridina en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia, según se mide usando una ventana deslizante de 20 nucleobases. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar de modo que no más o no menos de un número predeterminado de picos en la secuencia nucleica optimizada en cuanto a la secuencia, según se mide usando una ventana deslizante de 20 nucleobases, estén por encima o por debajo de cierto valor umbral. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de referencia se puede modificar de modo que ningún pico o no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 picos en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia estén por encima de un 10%, 15%, 20%, 25% o 30% de uridina. En otra realización, el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia contiene entre 0 picos y 2 picos con contenidos de uridina de un 30% o superiores.
En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico de referencia puede optimizarse en cuanto a la secuencia para reducir la incidencia de uridinas consecutivas. Por ejemplo, dos leucinas consecutivas pueden ser codificadas por la secuencia CUUUUG, que incluiría un grupo de cuatro uridinas. Tal subsecuencia podría sustituirse por CUGCUC, lo que eliminaría eficazmente el grupo de uridinas. Por consiguiente, una secuencia nucleica de referencia puede optimizarse en cuando a la secuencia mediante la reducción o eliminación de pares de uridinas (UU), tripletes de uridinas (UUU) o cuadrupletes de uridinas (UUUU). Las combinaciones de orden superior de U no se consideran combinaciones de combinaciones de orden inferior. Por lo tanto, por ejemplo, UUUU se considera estrictamente un cuadruplete, no dos pares de U consecutivos; o UUUUUU se considera un sextuplete, no tres pares de U consecutivos, o dos tripletes de U consecutivos, etc.
En algunas realizaciones, todos los pares de uridinas (UU) y/o tripletes de uridinas (UUU) y/o cuadrupletes de uridinas (UUUU) pueden eliminarse de la secuencia de ácido nucleico de referencia. En otras realizaciones, los pares de uridinas (UU) y/o tripletes de uridinas (UUU) y/o cuadrupletes de uridinas (UUUU) se pueden reducir por debajo de cierto umbral, por ejemplo, no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 presencias en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia. En una realización concreta, el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia contiene menos de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 pares de uridinas. En otra realización concreta, el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia no contiene pares y/o tripletes de uridinas.
Los codones de fenilalanina, es decir, UUC o UUU, comprenden un par o triplete de uridinas y, por lo tanto, la optimización de la secuencia para reducir el contenido de uridina puede reducir como máximo el triplete de U de fenilalanina a un par de U de fenilalanina. En algunas realizaciones, la presencia de pares de uridinas (UU) y/o tripletes de uridinas (UUU) se refiere sólo a pares o tripletes de U no de fenilalanina. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los pares de uridinas (UU) y/o tripletes de uridinas (UUU) no de fenilalanina se pueden reducir por debajo de cierto umbral, por ejemplo, no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 presencias en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia. En una realización concreta, el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia contiene menos de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 pares y/o tripletes de uridinas no de fenilalanina. En otra realización concreta, el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia no contiene pares y/o tripletes de uridinas no de fenilalanina.
En algunas realizaciones, la reducción en combinaciones de uridina (por ejemplo, pares, tripletes, cuadrupletes) en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia se puede expresar como una reducción porcentual con respecto a las combinaciones de uridina presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia puede contener aproximadamente un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% del número total de pares de uridinas presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunas realizaciones, un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia puede contener aproximadamente un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% del número total de tripletes de uridinas presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia puede contener aproximadamente un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% del número total de cuadrupletes de uridinas presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia puede contener aproximadamente un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% del número total de pares de uridinas no de fenilalanina presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunas realizaciones, un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia puede contener aproximadamente un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% del número total de tripletes de uridinas no de fenilalanina presentes en la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunas realizaciones, el contenido de uridina en la secuencia optimizada en cuanto a la secuencia puede expresarse con respecto al contenido mínimo teórico de uridina en la secuencia. La expresión "contenido mínimo teórico de uridina" se define como el contenido de uridina de una secuencia de ácido nucleico como un porcentaje de la longitud de la secuencia después de que todos los codones de la secuencia se hayan reemplazado por codones sinónimos con el contenido de uridina más bajo. En algunas realizaciones, el contenido de uridina del ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia es idéntico al contenido mínimo teórico de uridina de la secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre). En algunos aspectos, el contenido de uridina del ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia es aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 100%, aproximadamente un 105%, aproximadamente un 110%, aproximadamente un 115%, aproximadamente un 120%, aproximadamente un 125%, aproximadamente un 130%, aproximadamente un 135%, aproximadamente un 140%, aproximadamente un 145%, aproximadamente un 150%, aproximadamente un 155%, aproximadamente un 160%, aproximadamente un 165%, aproximadamente un 170%, aproximadamente un 175%, aproximadamente un 180%, aproximadamente un 185%, aproximadamente un 190%, aproximadamente un 195% o aproximadamente un 200% del contenido mínimo teórico de uridina de la secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre).
En algunas realizaciones, el contenido de uridina del ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia es idéntico al contenido mínimo teórico de uridina de la secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre).
La secuencia de ácido nucleico de referencia (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre) puede comprender grupos de uridina que, debido a su número, tamaño, ubicación, distribución o combinaciones de los mismos, tengan efectos negativos en la traducción. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "grupo de uridina" se refiere a una subsecuencia en una secuencia de ácido nucleico de referencia o secuencia nucleica optimizada en cuanto a la secuencia con un contenido de uridina (normalmente descrito como un porcentaje) que está por encima de cierto umbral. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, si una subsecuencia comprende más de aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% de contenido de uridina, tal subsecuencia se consideraría un grupo de uridina.
Los efectos negativos de los grupos de uridina pueden ser, por ejemplo, provocar una respuesta de TLR7. Por lo tanto, en algunas implementaciones de los métodos de optimización de secuencias de ácido nucleico divulgados en la presente memoria, es deseable reducir el número de grupos, el tamaño de los grupos, la ubicación de los grupos (por ejemplo, cerca del extremo 5’ y/o 3’ de una secuencia de ácido nucleico), la distancia entre los grupos o la distribución de los grupos de uridina (por ejemplo, cierto patrón de grupos a lo largo de una secuencia de ácido nucleico, la distribución de grupos con respecto a los elementos de estructura secundaria en el producto expresado, o la distribución de grupos con respecto a la estructura secundaria de un ARNm).
En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de referencia comprende al menos un grupo de uridina, siendo dicho grupo de uridina una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia y estando el porcentaje de nucleobases de uridina totales en dicha subsecuencia por encima de un umbral predeterminado. En algunas realizaciones, la longitud de la subsecuencia es de al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 55, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 65, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 85, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 95 o al menos aproximadamente 100 nucleobases. En algunas realizaciones, la subsecuencia tiene más de 100 nucleobases de longitud. En algunas realizaciones, el umbral es un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% o 25% de contenido de uridina. En algunas realizaciones, el umbral está por encima de un 25%.
Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que comprenda A, D, G, S y R podría ser codificada por la secuencia de ácido nucleico GCU, GAU, GGU, AGU, CGU. Aunque tal secuencia no contiene ningún par, triplete o cuadruplete de uridinas, un tercio de las nucleobases serían uridinas. Tal grupo de uridina podría eliminarse usando codones alternativos, por ejemplo, usando GCC, GAC, GGC,<a>G<c>y CGC, que no contendrían uridinas.
En otras realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de referencia comprende al menos un grupo de uridina, siendo dicho grupo de uridina una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia y estando el porcentaje de nucleobases de uridina de dicha subsecuencia, según se mide usando una ventana deslizante, por encima de un umbral predeterminado. En algunas realizaciones, la longitud de la ventana deslizante es 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleobases. En algunas realizaciones, la ventana deslizante tiene más de 40 nucleobases de longitud. En algunas realizaciones, el umbral es un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% o 25% de contenido de uridina. En algunas realizaciones, el umbral está por encima de un 25%.
En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de referencia comprende al menos dos grupos de uridina. En algunas realizaciones, la secuencia modificada en cuanto a la uridina contiene menos grupos ricos en uridina que la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunas realizaciones, la secuencia modificada en cuanto a la uridina contiene más grupos ricos en uridina que la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunas realizaciones, la secuencia modificada en cuanto a la uridina contiene grupos ricos en uridina con una longitud más corta que los grupos ricos en uridina correspondientes de la secuencia de ácido nucleico de referencia. En otras realizaciones, la secuencia modificada en cuanto a la uridina contiene grupos ricos en uridina con una longitud más larga que el grupo rico en uridina correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de referencia.
Véase, Kariko et al. (2005) Immunity 23:165-175; Kormann et al. (2010) Nature Biotechnology 29:154-157; o Sahin et al. (2014) Nature Reviews Drug Discovery | AOP, publicado en línea el 19 de septiembre de 2014m doi:10.1038/nrd4278.
b. Contenido de Guanina/Citosina (G/C)
Una secuencia de ácido nucleico de referencia se puede optimizar en cuanto a la secuencia usando métodos que comprenden alterar el contenido de Guanina/Citosina (G/C) (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Tal optimización puede comprender alterar (por ejemplo, aumentar o disminuir) el contenido global de G/C (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia; introducir cambios locales en el contenido de G/C en la secuencia de ácido nucleico de referencia (por ejemplo, aumentar o disminuir la G/C en regiones o subsecuencias seleccionadas en la secuencia de ácido nucleico de referencia); alterar la frecuencia, tamaño y distribución de grupos de G/C en la secuencia de ácido nucleico de referencia, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia que codifica GALT comprende un aumento global en el contenido de G/C (absoluto o relativo) en relación con el contenido de G/C (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunas realizaciones, el aumento global en el contenido de G/C (absoluto o relativo) es de al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o al menos aproximadamente un 100%, en relación con el contenido de G/C (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia que codifica GALT comprende una disminución global en el contenido de G/C (absoluto o relativo) en relación con el contenido de G/C de la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunas realizaciones, la disminución global en el contenido de G/C (absoluto o relativo) es de al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o al menos aproximadamente un 100%, en relación con el contenido de G/C (absoluto o relativo) de la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia que codifica GALT comprende un aumento local en el contenido de Guanina/Citosina (G/C) (absoluto o relativo) en una subsecuencia (es decir, una subsecuencia modificada en cuanto a G/C) en relación con el contenido de G/C (absoluto o relativo) de la subsecuencia correspondiente en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunas realizaciones, el aumento local en el contenido de G/C (absoluto o relativo) es de al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o al menos aproximadamente un 100%, en relación con el contenido de G/C (absoluto o relativo) de la subsecuencia correspondiente en la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia que codifica GALT comprende una disminución local en el contenido de Guanina/Citosina (G/C) (absoluto o relativo) en una subsecuencia (es decir, una subsecuencia modificada en cuanto a G/C) en relación con el contenido de G/C (absoluto o relativo) de la subsecuencia correspondiente en la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunas realizaciones, la disminución local en el contenido de G/C (absoluto o relativo) es de al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o al menos aproximadamente un 100%, en relación con el contenido de G/C (absoluto o relativo) de la subsecuencia correspondiente en la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunas realizaciones, el contenido de G/C (absoluto o relativo) se aumenta o se disminuye en una subsecuencia que tiene al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 nucleobases de longitud.
En algunas realizaciones, el contenido de G/C (absoluto o relativo) se aumenta o se disminuye en una subsecuencia que tiene al menos aproximadamente 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000 nucleobases de longitud.
En algunas realizaciones, el contenido de G/C (absoluto o relativo) se aumenta o se disminuye en una subsecuencia que tiene al menos aproximadamente 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100, 7200, 7300, 7400, 7500, 7600, 7700, 7800, 7900, 8000, 8100, 8200, 8300, 8400, 8500, 8600, 8700, 8800, 8900, 9000, 9100, 9200, 9300, 9400, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900 o 10000 nucleobases de longitud.
Los aumentos o disminuciones en el contenido de G y C (absoluto o relativo) descritos en la presente memoria se pueden llevar a cabo reemplazando codones sinónimos con bajo contenido de G/C por codones sinónimos que tengan mayor contenido de G/C, o viceversa. Por ejemplo, L tiene 6 codones sinónimos: dos de ellos tienen 2 G/C (CUC, CUG), 3 tienen una sola G/C (UUG, CUU, CUA) y uno no tiene G/C (UUA). Por lo tanto, si el ácido nucleico de referencia tuviera un codón CUC en una posición determinada, el contenido de G/C en esa posición podría reducirse reemplazando CUC por cualquiera de los codones que tienen una sola G/C o el codón sin G/C.
Véanse Publicaciones de EE.UU. Nos US20140228558, US20050032730 A1; Gustafsson et al. (2012) Protein Expression and Purification 83:37-46.
c. Frecuencia de Codones - Sesgo en el Uso de Codones
Numerosos métodos de optimización en cuanto a los codones conocidos en la técnica se basan en la sustitución de codones en una secuencia de ácido nucleico de referencia por codones que tienen frecuencias más altas. Una secuencia de ácido nucleico que codifica GALT divulgada en la presente memoria puede optimizarse en cuanto a la secuencia utilizando métodos que comprenden el uso de modificaciones en la frecuencia de uso de uno o más codones en relación con otros codones sinónimos en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia con respecto a la frecuencia de uso en la secuencia no optimizada en cuanto a los codones.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “frecuencia de codones” se refiere al sesgo en el uso de codones, es decir, las diferencias en la frecuencia de presencia de codones sinónimos en el ADN/ARN codificante. De manera general se admite que las preferencias de codones reflejan un equilibrio entre sesgos mutacionales y selección natural para la optimización traduccional. Los codones óptimos ayudan a lograr velocidades de traducción más rápidas y alta precisión. Como resultado de estos factores, se espera que la selección traduccional sea más fuerte en genes altamente expresados. En el campo de la bioinformática y la biología computacional, se han propuesto y utilizado muchos métodos estadísticos para analizar el sesgo en el uso de codones. Véase, por ejemplo, Cameron & Aguadé (1998) J. Mol. Evol. 47: 268-74. Para predecir niveles de expresión génica se usan métodos tales como la 'frecuencia de codones óptimos' (Fop) (Ikemura (1981) J. Mol. Biol. 151 (3): 389-409), la Adaptación Relativa de Codones (RCA, por sus siglas en inglés) (Fox & Eril (2010) DNA Res. 17 (3): 185-96) o el 'Índice de Adaptación de Codones' (CAI, por sus siglas en inglés) (Sharp & Li (1987) Nucleic Acids Res. 15 (3): 1281-95), mientras que para medir la uniformidad en el uso de codones se usan métodos tales como el 'número efectivo de codones' (Nc) y la entropía de Shannon de la teoría de la información. Para analizar variaciones en el uso de codones entre genes se usan ampliamente métodos estadísticos multivariantes, tales como análisis de correspondencia y análisis de componentes principales (Suzuki et al. (2008) DNA Res. 15 (6): 357-65; Sandhu et al., In Silico Biol. 2008; 8(2): 187-92).
En la composición de la invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de GALT divulgado en la presente memoria (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre, una secuencia de ácido nucleico mutante, una secuencia nucleica quimérica, etc., que es un ARNm) puede optimizarse en cuanto a los codones utilizando métodos que comprenden sustituir al menos un codón en la secuencia de ácido nucleico de referencia por un codón alternativo que tenga una frecuencia de codón mayor o menor en el conjunto de codones sinónimos; teniendo el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia resultante al menos una propiedad optimizada con respecto a la secuencia de ácido nucleico de referencia.
En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 99%, o un 100% de los codones en la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica GALT se sustituyen por codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón mayor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.
En algunas realizaciones, al menos un codón en la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica GALT se sustituye por un codón alternativo que tenga una frecuencia de codón mayor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos, y al menos un codón en la secuencia de ácido nucleico de referencia se sustituye por un codón alternativo que tenga una frecuencia de codón menor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.
En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70% o al menos aproximadamente un 75% de los codones en la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica GALT se sustituyen por codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón mayor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.
En algunas realizaciones, al menos un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón mayor tiene la frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos. En otras realizaciones, todos los codones alternativos que tienen una frecuencia de codón mayor tienen la frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos.
En algunas realizaciones, al menos un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón menor tiene la frecuencia de codón más baja en el conjunto de codones sinónimos. En algunas realizaciones, todos los codones alternativos que tienen una frecuencia de codón mayor tienen la frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos.
En algunas realizaciones específicas, al menos un codón alternativo tiene la segunda frecuencia más alta, la tercera más alta, la cuarta más alta, la quinta más alta o la sexta más alta en el conjunto de codones sinónimos. En algunas realizaciones específicas, al menos un codón alternativo tiene la segunda frecuencia más baja, la tercera más baja, la cuarta más baja, la quinta más baja o la sexta más baja en el conjunto de codones sinónimos.
La optimización basada en la frecuencia de codones puede aplicarse globalmente, como se ha descrito anteriormente, o localmente a la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de GALT. En algunas realizaciones, cuando se aplica localmente, las regiones de la secuencia de ácido nucleico de referencia pueden modificarse sobre la base de la frecuencia de codones, sustituyendo la totalidad o cierto porcentaje de codones en una determinada subsecuencia por codones que tengan frecuencias mayores o menores en sus respectivos conjuntos de codones sinónimos. Así, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 99%, o un 100% de los codones en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia se sustituyen por codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón mayor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.
En algunas realizaciones, al menos un codón en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de GALT se sustituye por un codón alternativo que tenga una frecuencia de codón mayor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos, y al menos un codón en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia se sustituye por un codón alternativo que tenga una frecuencia de codón menor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.
En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70% o al menos aproximadamente un 75% de los codones en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de GALT se sustituyen por codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón mayor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.
En algunas realizaciones, al menos un codón alternativo sustituido en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de GALT y que tiene una frecuencia de codón mayor tiene la frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos. En otras realizaciones, todos los codones alternativos sustituidos en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia y que tienen una frecuencia de codón menor tienen la frecuencia de codón más baja en el conjunto de codones sinónimos.
En algunas realizaciones, al menos un codón alternativo sustituido en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de GALT y que tiene una frecuencia de codón menor tiene la frecuencia de codón más baja en el conjunto de codones sinónimos. En algunas realizaciones, todos los codones alternativos sustituidos en una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico de referencia y que tienen una frecuencia de codón mayor tienen la frecuencia de codón más alta en el conjunto de codones sinónimos.
En realizaciones específicas, un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia que codifica un polipéptido de GALT puede comprender una subsecuencia que tenga una frecuencia global de codones mayor o menor que la frecuencia global de codones en la subsecuencia correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de referencia en una ubicación específica, por ejemplo, en el extremo 5’ o el extremo 3’ del ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia, o dentro de una distancia predeterminada a esa región (por ejemplo, al menos a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 codones del extremo 5’ o extremo 3’ del ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia).
En algunas realizaciones, un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia que codifica un polipéptido de GALT puede comprender más de una subsecuencia que tenga una frecuencia global de codones mayor o menor que la frecuencia global de codones en la subsecuencia correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de referencia. Un experto en la técnica comprendería que las subsecuencias con frecuencias globales de codones mayores o menores pueden organizarse en innumerables patrones, dependiendo de si la frecuencia global de codones es mayor o menor, la longitud de la subsecuencia, la distancia entre subsecuencias, la ubicación de las subsecuencias, etc.
Véanse las patentes de EE.UU. Nos US5082767, US8126653, US7561973, US8401798; las publicaciones de EE.UU. Nos US 20080046192, US 20080076161; la Publicación Internacional No WO2000018778; Welch et al. (2009) PLoS ONE 4(9): e7002; Gustafsson et al. (2012) Protein Expression and Purification 83: 37-46; Chung et al. (2012) BMC Systems Biology 6: 134.
D. Sustitución de Motivos Desestabilizadores
Existen diversos motivos que pueden afectar a la optimización de secuencia, que entran en diversas categorías no exclusivas, por ejemplo:
(i)Motivos basados en la secuencia primaria:motivos definidos por una disposición simple de nucleótidos.
(ii)Motivos estructurales:motivos codificados por una disposición de nucleótidos que tiende a formar cierta estructura secundaria.
(iii)Motivos locales:motivos codificados en una subsecuencia contigua.
(iv)Motivos distribuidos:motivos codificados en dos o más subsecuencias inconexas.
(v)Motivos ventajosos:motivos que mejoran la estructura o función de los nucleótidos.
(vi)Motivos desventajosos:motivos con efectos perjudiciales sobre la estructura o función de los nucleótidos.
Hay muchos motivos que encajan en la categoría de motivos desventajosos. Algunos ejemplos incluyen, por ejemplo, motivos de enzimas de restricción, que tienden a ser secuencias exactas relativamente cortas, tales como los motivos de sitio de restricción paraXba1(TCTAGA),EcoRI(GAATTC),EcoRII(CCWGG, en donde W significa A o T, por los códigos de ambigüedad IUPAC), oHindIII(AAGCTT); sitios enzimáticos, que tienden a ser más largos y basados en una secuencia de consenso no exacta, tal como en la ARN polimerasa T7 (GnnnnWnCRnCTCnCnnWnD, en donde n significa cualquier nucleótido, R significa A o G, W significa A o T, D significa A o G o T, pero no C); motivos estructurales, tales como repeticiones GGGG (Kim et al. (1991) Nature 351(6324):331-2); u otros motivos tales como repeticiones de triplete CUG (Querido et al. (2014) J. Cell Sci. 124:1703-1714).
Por consiguiente, la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de GALT divulgado en la presente memoria puede optimizarse en cuanto a la secuencia utilizando métodos que comprenden sustituir al menos un motivo desestabilizador en una secuencia de ácido nucleico de referencia, y eliminar tal motivo desventajoso o reemplazarlo por un motivo ventajoso.
En algunas realizaciones, el proceso de optimización comprende identificar motivos ventajosos y/o desventajosos en la secuencia nucleica de referencia, siendo tales motivos, por ejemplo, subsecuencias específicas que pueden causar una pérdida de estabilidad en la secuencia de ácido nucleico de referencia antes de o durante el proceso de optimización. Por ejemplo, la sustitución de bases específicas durante la optimización puede generar una subsecuencia (motivo) reconocida por una enzima de restricción. Por consiguiente, durante el proceso de optimización, la aparición de motivos desventajosos se puede vigilar comparando la secuencia optimizada en cuanto a la secuencia con una biblioteca de motivos conocidos por ser desventajosos. Entonces, la identificación de motivos desventajosos podría usarse como un filtro post-hoc, es decir, para determinar si cierta modificación que potencialmente podría introducirse en la secuencia de ácido nucleico de referencia debería implementarse realmente o no.
En algunas realizaciones, la identificación de motivos desventajosos se puede usar antes de la aplicación de los métodos de optimización en cuanto a la secuencia divulgados en la presente memoria, es decir, la identificación de motivos en la secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de GALT y su reemplazo por secuencias de ácido nucleico alternativas se pueden usar como una etapa de preprocesamiento, por ejemplo, antes de la reducción de uridina.
En otras realizaciones, la identificación de motivos desventajosos y su eliminación se utiliza como una técnica de optimización en cuanto a la secuencia adicional integrada en un método de optimización de ácido nucleico multiparamétrico que comprende dos o más de los métodos de optimización en cuanto a la secuencia divulgados en la presente memoria. Cuando se usa de esta manera, un motivo desventajoso identificado durante el proceso de optimización se eliminaría, por ejemplo, sustituyendo el número más bajo posible de nucleobases con el fin de conservar lo más fielmente posible el o los principios de diseño originales (por ejemplo, baja U, alta frecuencia, etc.).
Véanse, por ejemplo, las publicaciones de EE.UU. Nos US20140228558, US20050032730 o US20140228558.
e. Optimización de Conjunto Limitado de Codones
En algunas realizaciones concretas, la optimización en cuanto a la secuencia de una secuencia de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido de GALT se puede llevar a cabo utilizando un conjunto limitado de codones, por ejemplo, un conjunto de codones en el que se use menos que el número nativo de codones para codificar los 20 aminoácidos naturales, un subconjunto de los 20 aminoácidos naturales, o un conjunto ampliado de aminoácidos que incluya, por ejemplo, aminoácidos no naturales.
El código genético es muy similar entre todos los organismos y se puede expresar en una tabla simple con 64 entradas que codificarían los 20 aminoácidos estándar involucrados en la traducción de proteínas más los codones de iniciación y de parada. El código genético es redundante, es decir, en general, más de un codón especifican cada aminoácido. Por ejemplo, el aminoácido leucina es especificado por los codones UUA, UUG, CUU, CUC, CUA o CUG, mientras que el aminoácido serina es especificado por los codones UCA, UCG, UCC, UCU, AGU o AGC (diferencia en la primera, segunda o tercera posición). Los códigos genéticos nativos comprenden 62 codones que codifican aminoácidos de origen natural. Por lo tanto, en algunas realizaciones de los métodos divulgados en la presente memoria, los conjuntos de codones optimizados (códigos genéticos) que comprenden menos de 62 codones para codificar 20 aminoácidos pueden comprender 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 o 20 codones.
En algunas realizaciones, el conjunto limitado de codones comprende menos de 20 codones. Por ejemplo, si una proteína contiene menos de 20 tipos de aminoácidos, tal proteína podría codificarse mediante un conjunto de codones con menos de 20 codones. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un conjunto de codones optimizado comprende tantos codones como diferentes tipos de aminoácidos estén presentes en la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico de referencia. En algunas realizaciones, el conjunto de codones optimizado comprende 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o incluso 1 codón.
En algunas realizaciones, al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr y Val, es decir, aminoácidos que están codificados de forma natural por más de un codón, está codificado con menos codones que el número de codones sinónimos presente en la naturaleza. Por ejemplo, en algunas realizaciones, Ala puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 3, 2 o 1 codones; Cys puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 1 codón; Asp puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 1 codón; Glu puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 1 codón; Phe puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 1 codón; Gly puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 3 codones, 2 codones o 1 codón; His puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 1 codón; Ile puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 2 codones o 1 codón; Lys puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 1 codón; Leu puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 5 codones, 4 codones, 3 codones, 2 codones o 1 codón; Asn puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 1 codón; Pro puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 3 codones, 2 codones o 1 codón; Gln puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 1 codón; Arg puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 5 codones, 4 codones, 3 codones, 2 codones o 1 codón; Ser puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 5 codones, 4 codones, 3 codones, 2 codones o 1 codón; Thr puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 3 codones, 2 codones o 1 codón; Val puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 3 codones, 2 codones o 1 codón; y Tyr puede codificarse en el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia mediante 1 codón.
En algunas realizaciones, al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr y Val, es decir, aminoácidos que están codificados de forma natural por más de un codón, está codificado por un único codón en el conjunto limitado de codones.
En algunas realizaciones específicas que no entran dentro del alcance de la invención, el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia es un ADN y el conjunto limitado de codones consiste en 20 codones, en donde cada codón codifica uno de 20 aminoácidos. En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia es un ADN y el conjunto limitado de codones comprende al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GCT, GCC, GCA y GCG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en CGT, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG; al menos un codón seleccionado entre AAT o ACC; al menos un codón seleccionado entre GAT o GAC; al menos un codón seleccionado entre TGT o TGC; al menos un codón seleccionado entre CAA o CAG; al menos un codón seleccionado entre GAA o GAG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GGT, GGC, GGA y GGG; al menos un codón seleccionado entre CAT o CAC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en ATT, ATC y ATA; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en TTA, TTG, c Tt , CTC, CTA y CTG; al menos un codón seleccionado entre AAA o AAG; un codón ATG; al menos un codón seleccionado entre TTT o TTC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en CCT, CCC, CCA y CCG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en TCT, TCC, TCA, TCG, AGT y AGC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en ACT, ACC, ACA y ACG; un codón TGG; al menos un codón seleccionado entre TAT o TAC; y al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GTT, GTC, GTA y GTG.
En la composición de la invención, el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia es un ARN (es decir, un ARNm). En algunas realizaciones de la invención, el conjunto limitado de codones consiste en 20 codones, en donde cada codón codifica uno de 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, el conjunto limitado de codones comprende al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GCU, GCC, GCA y GCG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en CGU, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG; al menos un codón seleccionado entre AAU o ACC; al menos un codón seleccionado entre GAU o GAC; al menos un codón seleccionado entre UGU o UGC; al menos un codón seleccionado entre CAA o CAG; al menos un codón seleccionado entre GAA o GAG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GGU, GGC, GGA y GGG; al menos un codón seleccionado entre CAU o CAC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en AUU, AUC y AUA; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en UUA, UUG, CUU, CUC, CUA y CUG; al menos un codón seleccionado entre AAA o AAG; un codón AUG; al menos un codón seleccionado entre UUU o UUC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en CCU, CCC, CCA y CCG; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en UCU, UCC, UCA, UCG, AGU y AGC; al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en ACU, ACC, ACA y ACG; un codón UGG; al menos un codón seleccionado entre UAU o UAC; y al menos un codón seleccionado del grupo que consiste en GUU, GUC, GUA y GUG.
En algunas realizaciones específicas, el conjunto limitado de codones se ha optimizado para la expresiónin vivode un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia (es decir, un ARNm sintético) después de la administración a un tejido o célula determinados.
En algunas realizaciones, el conjunto de codones optimizado (por ejemplo, un conjunto de 20 codones que codifica 20 aminoácidos) cumple al menos una de las siguientes propiedades:
(i) el conjunto de codones optimizado tiene un contenido de G/C promedio mayor que el conjunto de codones original o nativo; o
(ii) el conjunto de codones optimizado tiene un contenido de U promedio menor que el conjunto de codones original o nativo; o
(iii) el conjunto de codones optimizado se compone de codones con la frecuencia más alta; o,
(iv) el conjunto de codones optimizado se compone de codones con la frecuencia más baja; o,
(v) una combinación de éstas.
En algunas realizaciones específicas, al menos un codón del conjunto de codones optimizado tiene la segunda frecuencia más alta, la tercera más alta, la cuarta más alta, la quinta más alta o la sexta más alta en el conjunto de codones sinónimos. En algunas realizaciones específicas, al menos un codón del codón optimizado tiene la segunda frecuencia más baja, la tercera más baja, la cuarta más baja, la quinta más baja o la sexta más baja en el conjunto de codones sinónimos.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "conjunto de codones nativo" se refiere al conjunto de codones utilizado de forma nativa por el organismo fuente para codificar la secuencia de ácido nucleico de referencia. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "conjunto de codones original" se refiere al conjunto de codones utilizado para codificar la secuencia de ácido nucleico de referencia antes del comienzo de la optimización de secuencia, o a un conjunto de codones utilizado para codificar una variante optimizada de la secuencia de ácido nucleico de referencia al comienzo de una nueva repetición de optimización cuando la optimización de secuencia se aplica repetitiva o recursivamente.
En algunas realizaciones, un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de los codones del conjunto de codones son aquellos con la frecuencia más alta. En otras realizaciones, un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de los codones del conjunto de codones son aquellos con la frecuencia más baja.
En algunas realizaciones, un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de los codones del conjunto de codones son aquellos con el contenido de uridina más alto. En algunas realizaciones, un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de los codones del conjunto de codones son aquellos con el contenido de uridina más bajo.
En algunas realizaciones, el contenido de G/C promedio (absoluto o relativo) del conjunto de codones es un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% mayor que el contenido de G/C promedio (absoluto o relativo) del conjunto de codones original. En algunas realizaciones, el contenido de G/C promedio (absoluto o relativo) del conjunto de codones es un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% menor que el contenido de G/C promedio (absoluto o relativo) del conjunto de codones original.
En algunas realizaciones, el contenido de uracilo (absoluto o relativo) del conjunto de codones es un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% mayor que el contenido de uracilo promedio (absoluto o relativo) del conjunto de codones original. En algunas realizaciones, el contenido de uracilo (absoluto o relativo) del conjunto de codones es un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% menor que el contenido de uracilo promedio (absoluto o relativo) del conjunto de codones original.
Véanse también la publicación de solicitud de EE.UU. No 2011/0082055, y la publicación internacional No WO2000018778.
8. Caracterización de Ácidos Nucleicos Optimizados en cuanto a la Secuencia
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) que comprende un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia divulgado en la presente memoria que codifica un polipéptido de GALT se puede ensayar para determinar si al menos una propiedad de secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, estabilidad cuando se expone a nucleasas) o propiedad de expresión se ha mejorado con respecto al ácido nucleico no optimizado en cuanto a la secuencia.
Tal como se usa en la presente memoria, “propiedad de expresión” se refiere a una propiedad de una secuencia de ácido nucleico ya seain vivo(por ejemplo, eficacia de traducción de un ARNm sintético después de la administración a un individuo que lo necesite) oin vitro(por ejemplo, eficacia de traducción de un ARNm sintético ensayado en un sistema modeloin vitro).Las propiedades de expresión incluyen, pero no se limitan a, la cantidad de proteína producida por un ARNm que codifica un polipéptido de GALT después de la administración, y la cantidad de proteína soluble o de otro modo funcional producida. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos optimizados en cuanto a la secuencia divulgados en la presente memoria se pueden evaluar de acuerdo con la viabilidad de las células que expresan una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico optimizada en cuanto a la secuencia (por ejemplo, un ARN, por ejemplo, un ARNm) que codifica un polipéptido de GALT divulgado en la presente memoria.
En una realización concreta, una pluralidad de ácidos nucleicos optimizados en cuanto a la secuencia divulgados en la presente memoria (es decir, un ARNm) que contienen sustituciones de codones con respecto a la secuencia de ácido nucleico de referencia no optimizada se pueden caracterizar funcionalmente para medir una propiedad de interés, por ejemplo, una propiedad de expresión en un sistema modeloin vitrooin vivoen un tejido o célula diana.
a. Optimización de Propiedades Intrínsecas de la Secuencia de Ácido Nucleico
En algunas realizaciones, la propiedad deseada del polinucleótido en la composición de la invención es una propiedad intrínseca de la secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos (es decir, un ARNm) puede optimizarse en cuanto a la secuencia para la estabilidadin vivooin vitro.En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos puede optimizarse en cuanto a la secuencia para la expresión en un tejido o célula diana concretos. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico se optimiza en cuanto a la secuencia para aumentar su semivida plasmática evitando su degradación por endo y exonucleasas.
En otras realizaciones, la secuencia de ácido nucleico se optimiza en cuanto a la secuencia para aumentar su resistencia a la hidrólisis en solución, por ejemplo, para alargar el tiempo en que el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia o una composición farmacéutica que comprenda el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia se pueden almacenar en condiciones acuosas con degradación mínima.
En otras realizaciones, el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia puede optimizarse para aumentar su resistencia a la hidrólisis en condiciones de almacenamiento en seco, por ejemplo, para alargar el tiempo en que el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia puede almacenarse después de una liofilización con degradación mínima.
b. Secuencia de Ácido Nucleico Optimizada para la Expresión de Proteínas
En algunas realizaciones, la propiedad deseada del polinucleótido en la composición de la invención es el nivel de expresión de un polipéptido de GALT codificado por una secuencia optimizada en cuanto a la secuencia divulgada en la presente memoria. Los niveles de expresión de proteínas se pueden medir usando uno o más sistemas de expresión. La expresión puede medirse en sistemas de cultivo celular, por ejemplo, células CHO o células HEK293. La expresión puede medirse utilizando sistemas de expresiónin vitropreparados a partir de extractos de células vivas, por ejemplo, lisados de reticulocitos de conejo, o sistemas de expresiónin vitropreparados mediante el ensamblaje de componentes individuales purificados. En otros casos, la expresión de proteínas se mide en un sistemain vivo,por ejemplo, ratón, conejo, mono, etc.
Puede ser deseable la expresión de proteínas en forma de solución. Por consiguiente, una secuencia de referencia puede optimizarse en cuanto a la secuencia para producir una secuencia de ácido nucleico optimizada en cuanto a la secuencia que tenga niveles optimizados de proteínas expresadas en forma soluble. Los niveles de expresión de proteínas y otras propiedades tales como solubilidad, niveles de agregación y la presencia de productos de truncamiento (es decir, fragmentos debidos a proteólisis, hidrólisis o traducción defectuosa) pueden medirse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando electroforesis (por ejemplo, nativa o SDS-PAGE) o métodos cromatográficos (por ejemplo, HPLC, cromatografía de exclusión por tamaños, etc.).
c. Optimización de la Viabilidad del Tejido Diana o la Célula Diana
La expresión de proteínas terapéuticas heterólogas codificadas por una secuencia de ácido nucleico puede tener efectos perjudiciales en el tejido o célula diana, reduciendo el rendimiento de proteína, o reduciendo la calidad del producto expresado (por ejemplo, debido a la presencia de fragmentos de proteína o precipitación de la proteína expresada en cuerpos de inclusión), o causando toxicidad.
Por consiguiente, la optimización en cuanto a la secuencia de una secuencia de ácido nucleico divulgada en la presente memoria, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de GALT, se puede utilizar para aumentar la viabilidad de células diana que expresen la proteína codificada por el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia.
La expresión heteróloga de proteínas también puede ser perjudicial para las células transfectadas con una secuencia de ácido nucleico para trasplante autólogo o heterólogo. Por consiguiente, la optimización en cuanto a la secuencia de una secuencia de ácido nucleico divulgada en la presente memoria se puede utilizar para aumentar la viabilidad de células diana que expresen la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico optimizada en cuanto a la secuencia. Los cambios en la viabilidad celular o tisular, toxicidad y otras reacciones fisiológicas pueden medirse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
d. Reducción de la Respuesta Inmunitaria y/o Inflamatoria
En algunos casos, la administración de un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia que codifica un polipéptido de GALT o un fragmento funcional del mismo puede desencadenar una respuesta inmunitaria, que podría ser causada por (i) el agente terapéutico (por ejemplo, un ARNm que codifica un polipéptido de GALT), o (ii) el producto de expresión de tal agente terapéutico (por ejemplo, el polipéptido de GALT codificado por el ARNm), o (iv) una combinación de los mismos. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente divulgación, la optimización en cuanto a la secuencia de la secuencia de ácido nucleico (es decir, un ARNm) divulgada en la presente memoria se puede utilizar para disminuir una respuesta inmunitaria o inflamatoria desencadenada por la administración de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GALT o por el producto de expresión de GALT codificado por tal ácido nucleico.
En algunos aspectos, una respuesta inflamatoria se puede medir detectando niveles aumentados de una o más citocinas inflamatorias usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, ELISA. La expresión "citocina inflamatoria" se refiere a citocinas elevadas en una respuesta inflamatoria. Los ejemplos de citocinas inflamatorias incluyen interleucina-6 (IL-6), CXCL1 (quimiocina (motivo C-X-C) ligando 1; también conocido como GROa, interferón-Y (IFN<y>), factor de necrosis tumoral a (TNFa), proteína inducida por interferón<y>10 (IP-10), o factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF, por sus siglas en inglés). La expresión citocinas inflamatorias incluye también otras citocinas asociadas con respuestas inflamatorias conocidas en la técnica, por ejemplo, interleucina-1 (IL-1), interleucina-8 (IL-8), interleucina-12 (IL-12), interleucina-13 (Il-13), interferón a (IFN-a), etc.
9. Secuencias de Nucleótidos Modificadas que Codifican Polipéptidos de GALT
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) en la composición de la invención comprende una nucleobase modificada químicamente, por ejemplo, 5-metoxiuracilo. En algunas realizaciones, el ARNm es una secuencia modificada en cuanto al uracilo que comprende un ORF que codifica un polipéptido de GALT, comprendiendo el ARNm una nucleobase modificada químicamente, por ejemplo, 5-metoxiuracilo.
En ciertos aspectos, cuando la base de 5-metoxiuracilo se conecta a un azúcar de ribosa, como lo está en polinucleótidos, el nucleósido o nucleótido modificado resultante se denomina 5-metoxiuridina. En algunas realizaciones, el uracilo del polinucleótido es 5-metoxiuracilo a al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, a al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 99% o aproximadamente un 100%. En una realización, el uracilo del polinucleótido es 5-metoxiuracilo a al menos un 95%. En otra realización, el uracilo del polinucleótido es 5-metoxiuracilo al 100%.
En realizaciones en las que el uracilo del polinucleótido es 5-metoxiuracilo a al menos un 95%, el contenido total de uracilo se puede ajustar de manera que un ARNm proporcione niveles de expresión de proteínas adecuados, mientras que induce poca respuesta inmunitaria o no induce ninguna respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, el contenido de uracilo del ORF está entre aproximadamente un 105% y aproximadamente un 145%, aproximadamente un 105% y aproximadamente un 140%, aproximadamente un 110% y aproximadamente un 140%, aproximadamente un 110% y aproximadamente un 145%, aproximadamente un 115% y aproximadamente un 135%, aproximadamente un 105% y aproximadamente un 135%, aproximadamente un 110% y aproximadamente un 135%, aproximadamente un 115% y aproximadamente un 145%, o aproximadamente un 115% y aproximadamente un 140% del contenido mínimo teórico de uracilo en el ORF de tipo silvestre correspondiente (%U<tm>). En otras realizaciones, el contenido de uracilo del ORF está entre aproximadamente un 121% y aproximadamente un 136% o entre un 123% y un 134% del%UTM. En algunas realizaciones, el contenido de uracilo del ORF que codifica un polipéptido de GALT es aproximadamente un 115%, aproximadamente un 120%, aproximadamente un 125%, aproximadamente un 130%, aproximadamente un 135%, aproximadamente un 140%, aproximadamente un 145% o aproximadamente un 150% del%UTM. En este contexto, el término "uracilo" puede referirse a 5-metoxiuracilo y/o uracilo de origen natural.
En algunas realizaciones, el contenido de uracilo en el ORF del ARNm que codifica un polipéptido de GALT es inferior a aproximadamente un 50%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 20% o aproximadamente un 15% del contenido de nucleobase total en el ORF. En algunas realizaciones, el contenido de uracilo en el ORF está entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 20% del contenido de nucleobase total en el ORF. En otras realizaciones, el contenido de uracilo en el ORF está entre aproximadamente un 10% y aproximadamente un 25% del contenido de nucleobase total en el ORF. En una realización, el contenido de uracilo en el ORF del ARNm que codifica un polipéptido de GALT es inferior a aproximadamente un 20% del contenido de nucleobase total en el marco de lectura abierta. En este contexto, el término "uracilo" puede referirse a 5-metoxiuracilo y/o uracilo de origen natural.
En realizaciones adicionales, el ORF del ARNm que codifica un polipéptido de GALT que tiene 5-metoxiuracilo y contenido de uracilo ajustado tiene un contenido aumentado de Citosina (C), Guanina (G) o Guanina/Citosina (G/C) (absoluto o relativo). En algunas realizaciones, el aumento global en el contenido de C, G o G/C (absoluto o relativo) del ORF es de al menos aproximadamente un 2%, al menos aproximadamente un 3%, al menos aproximadamente un 4%, al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 6%, al menos aproximadamente un 7%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o al menos aproximadamente un 100%, en relación con el contenido de G/C (absoluto o relativo) del ORF de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el contenido de G, el de C o el de G/C en el ORF son inferiores a aproximadamente un 100%, inferiores a aproximadamente un 90%, inferiores a aproximadamente un 85% o inferiores a aproximadamente un 80% del contenido máximo teórico de G, C o G/C de la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre correspondiente que codifica el polipéptido de GALT (%Gtmx;%Ctmx o%G/Ctmx). En otras realizaciones, el contenido de G, el de C o el de G/C en el ORF están entre aproximadamente un 70% y aproximadamente un 80%, entre aproximadamente un 71% y aproximadamente un 79%, entre aproximadamente un 71% y aproximadamente un 78%, o entre aproximadamente un 71% y aproximadamente un 77% del%GTMX,%CTMX<o>%G/C<tmx>. En algunas realizaciones, los aumentos en el contenido de G y/o C (absoluto o relativo) descritos en la presente memoria se pueden llevar a cabo reemplazando codones sinónimos con bajo contenido de G, C o G/C por codones sinónimos que tengan mayor contenido de G, C o G/C. En otras realizaciones, el aumento en el contenido de G y/o C (absoluto o relativo) se lleva a cabo reemplazando un codón que termine con U por un codón sinónimo que termine con G o C.
En realizaciones adicionales, el ORF del ARNm que codifica un polipéptido de GALT comprende 5-metoxiuracilo y tiene un contenido de uracilo ajustado que contiene menos pares de uracilos (UU) y/o tripletes de uracilos (UUU) y/o cuadrupletes de uracilos (UUUU) que la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre correspondiente que codifica el polipéptido de GALT. En algunas realizaciones, el ORF del ARNm que codifica un polipéptido de GALT no contiene pares de uracilos y/o tripletes de uracilos y/o cuadrupletes de uracilos. En algunas realizaciones, los pares de uracilos y/o los tripletes de uracilos y/o los cuadrupletes de uracilos se
reducen por debajo de cierto umbral, por ejemplo, no más de 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19 o 20 presencias en el o Rf del ARNm que codifica el polipéptido de GALT. En una realización concreta, el ORF del ARNm que codifica el polipéptido de GALT contiene menos de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14,
13, 12, 11, 10, 9, 8 , 7, 6 , 5, 4, 3, 2 o 1 pares y/o tripletes de uracilos no de fenilalanina. En otra realización, el
ORF del ARNm que codifica el polipéptido de GALT no contiene pares y/o tripletes de uracilos no de fenilalanina.
En realizaciones adicionales, el ORF del ARNm que codifica un polipéptido de GALT comprende 5-metoxiuracilo y tiene un contenido de uracilo ajustado que contiene menos grupos ricos en uracilo que la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre correspondiente que codifica el polipéptido de GALT. En algunas realizaciones, el ORF del ARNm que codifica el polipéptido de GALT contiene grupos ricos en uracilo que son
de longitud más corta que los grupos ricos en uracilo correspondientes en la secuencia de nucleótidos de tipo
silvestre correspondiente que codifica el polipéptido de GALT.
En realizaciones adicionales, se emplean codones de menor frecuencia alternativos. Al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadament los codones en el ORF que
codifica un polipéptido de GALT del ARNm que comprende 5-metoxiuracilo se sustituyen por codones alternativos, teniendo cada codón alternativo una frecuencia de codón menor que la frecuencia de codón del
codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos. El ORF también tiene contenido de uracilo ajustado,
como se describió anteriormente. En algunas realizaciones, al menos un codón en el ORF del ARNm que
codifica el polipéptido de GALT se sustituye por un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón menor
que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos.
En algunas realizaciones, el ORF de contenido de uracilo ajustado, que codifica el polipéptido de GALT, del
ARNm que comprende 5-metoxiuracilo presenta niveles de expresión de GALT cuando se administra a una
célula de mamífero que son mayores que los niveles de expresión de GALT del ARNm de tipo silvestre correspondiente. En otras realizaciones, los niveles de expresión de GALT cuando se administra a una célula
de mamífero están aumentados en relación con un ARNm correspondiente que contiene al menos un 95% de
5-metoxiuracilo y que tiene un contenido de uracilo de aproximadamente un 160 %, aproximadamente un 170%, aproximadamente un 180%, aproximadamente un 190% o aproximadamente un 200% del mínimo teórico. En
otras realizaciones más, los niveles de expresión de GALT cuando se administra a una célula de mamífero
están aumentados en relación con un ARNm correspondiente, siendo al menos aproximadamente un 50%, al
menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%,
al menos aproximadamente un 90% o aproximadamente un 100% de los uracilos 1-metilpseudouracilo o pseudouracilos. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula de ratón, una célula de rata o
una célula de conejo. En otras realizaciones, la célula de mamífero es una célula de mono o una célula humana.
En algunas realizaciones, la célula humana es una célula HeLa, una célula fibroblasto BJ o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, la GALT se
expresa cuando el ARNm se administra a una célula de mamíferoin vivo.En algunas realizaciones, el ARNm
se administra a ratones, conejos, ratas, monos o seres humanos. En una realización, los ratones son ratones
nulos. En algunas realizaciones, el ARNm se administra a ratones en una cantidad de aproximadamente 0.01
mg/kg, aproximadamente 0.05 mg/kg, aproximadamente 0.1 mg/kg o aproximadamente 0.15 mg/kg. En
algunas realizaciones, el ARNm se administra por vía intravenosa o intramuscular. En otras realizaciones, el polipéptido de GALT se expresa cuando el ARNm se administra a una célula de mamíferoin vitro.En algunas realizaciones, la expresión se aumenta al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5
veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 500 veces, al menos aproximadamente 1500 veces o al menos aproximadamente 3000
veces. En otras realizaciones, la expresión se aumenta al menos aproximadamente un 10%, aproximadamente
un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 90% o aproximadamente un 100%.
En algunas realizaciones, el ORF de contenido de uracilo ajustado, que codifica el polipéptido de GALT, del
ARNm que comprende 5-metoxiuracilo presenta una estabilidad aumentada. En algunas realizaciones, el
ARNm presenta una estabilidad aumentada en una célula en relación con la estabilidad de un ARNm de tipo
silvestre correspondiente en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, el ARNm presenta una estabilidad aumentada que incluye resistencia a nucleasas, estabilidad térmica y/o estabilización aumentada
de la estructura secundaria. En algunas realizaciones, la estabilidad aumentada presentada por el ARNm se
mide determinando la semivida del ARNm (por ejemplo, en una muestra de plasma, suero, célula o tejido) y/o determinando el área bajo la curva (ABC) de la expresión de proteína por el ARNm a lo largo del tiempo (por ejemplo,in vitrooin vivo).Un ARNm se identifica como poseedor de una estabilidad aumentada si la semivida y/o el ABC son mayores que la semivida y/o el ABC de un ARNm de tipo silvestre correspondiente en las mismas condiciones.
En algunas realizaciones, el ARNm induce una respuesta inmunitaria detectablemente inferior (por ejemplo, innata o adquirida) en relación con la respuesta inmunitaria inducida por un ARNm de tipo silvestre correspondiente en las mismas condiciones. En otras realizaciones, el ARNm de la presente divulgación induce una respuesta inmunitaria detectablemente inferior (por ejemplo, innata o adquirida) en relación con la respuesta inmunitaria inducida por un ARNm que codifica un polipéptido de GALT, pero no comprende 5-metoxiuracilo, en las mismas condiciones, o en relación con la respuesta inmunitaria inducida por un ARNm que codifica un polipéptido de GALT y que comprende 5-metoxiuracilo, pero que no tiene un contenido de uracilo ajustado, en las mismas condiciones. La respuesta inmunitaria innata puede manifestarse por una expresión aumentada de citocinas proinflamatorias, activación de PRR intracelulares (RIG-I, MDA5, etc.), muerte celular y/o terminación o reducción en la traducción de proteínas. En algunas realizaciones, se puede medir una reducción en la respuesta inmunitaria innata mediante el nivel de expresión o actividad de los interferones de Tipo 1 (por ejemplo, IFN-a, IFN-p, IFN-k, IFN-8, IFN-e, IFN-t, IFN-w e IFN-Z) o la expresión de genes regulados por interferón tales como los receptores de tipo toll (por ejemplo, TLR7 y TLR8) y/o mediante la disminución de la muerte celular después de una o más administraciones del ARNm de la invención a una célula.
En algunas realizaciones, la expresión de interferones de Tipo-1 por una célula de mamífero en respuesta al ARNm de la presente divulgación se reduce en al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.9% o más de un 99.9% en relación con un ARNm de tipo silvestre correspondiente, un ARNm que codifica un polipéptido de GALT, pero no comprende 5-metoxiuracilo, o un ARNm que codifica un polipéptido de GALT y que comprende 5-metoxiuracilo, pero que no tiene un contenido de uracilo ajustado. En algunas realizaciones, el interferón es IFN-p. En algunas realizaciones, la frecuencia de muerte celular causada por la administración de ARNm de la presente divulgación a una célula de mamífero es un 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% o más de un 95% menor que la frecuencia de muerte celular observada con un ARNm de tipo silvestre correspondiente, un ARNm que codifica un polipéptido de GALT, pero no comprende 5-metoxiuracilo, o un ARNm que codifica un polipéptido de GALT y que comprende 5-metoxiuracilo, pero que no tiene un contenido de uracilo ajustado. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula fibroblasto BJ. En otras realizaciones, la célula de mamífero es un esplenocito. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es la de un ratón o una rata. En otras realizaciones, la célula de mamífero es la de un ser humano. En una realización, el ARNm de la presente divulgación no induce sustancialmente una respuesta inmunitaria innata de una célula de mamífero en la que se introduce el ARNm.
En algunas realizaciones, el polinucleótido es un ARNm que comprende un ORF que codifica un polipéptido de GALT, en donde el uracilo en el ARNm es 5-metoxiuracilo a al menos aproximadamente un 95%, en donde el contenido de uracilo del ORF está entre aproximadamente un 115% y aproximadamente un 135% del contenido mínimo teórico de uracilo en el ORF de tipo silvestre correspondiente, y en donde el contenido de uracilo en el ORF que codifica el polipéptido de GALT es inferior a aproximadamente un 20% del contenido total de nucleobase en el ORF. En algunas realizaciones, el ORF que codifica el polipéptido de GALT se modifica adicionalmente para aumentar el contenido de G/C del ORF (absoluto o relativo) en al menos aproximadamente un 40%, en comparación con el ORF de tipo silvestre correspondiente. En otras realizaciones más, el ORF que codifica el polipéptido de GALT contiene menos de 20 pares y/o tripletes de uracilos no de fenilalanina. En algunas realizaciones, al menos un codón en el ORF del ARNm que codifica el polipéptido de GALT se sustituye adicionalmente por un codón alternativo que tiene una frecuencia de codón menor que la frecuencia de codón del codón sustituido en el conjunto de codones sinónimos. En algunas realizaciones, la expresión del polipéptido de GALT codificado por un ARNm que comprende un ORF en donde el uracilo en el ARNm es al menos aproximadamente un 95% 5-metoxiuracilo, y en donde el contenido de uracilo del ORF está entre aproximadamente un 115% y aproximadamente un 135% del contenido mínimo teórico de uracilo en el ORF de tipo silvestre correspondiente, se aumenta al menos aproximadamente 10 veces en comparación con la expresión del polipéptido de GALT del ARNm de tipo silvestre correspondiente. En algunas realizaciones, el ARNm comprende un ORF abierto en donde el uracilo en el ARNm es al menos aproximadamente un 95% 5-metoxiuracilo, y en donde el contenido de uracilo del ORF está entre aproximadamente un 115% y aproximadamente un 135% del contenido mínimo teórico de uracilo en el ORF de tipo silvestre correspondiente, y en donde el ARNm no induce sustancialmente una respuesta inmunitaria innata de una célula de mamífero en la que se introduce el ARNm.
10. Métodos para Modificar Polinucleótidos
La composición de la invención incluye polinucleótidos modificados que comprenden un polinucleótido descrito en la presente memoria (es decir, ARNm, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT). Los polinucleótidos modificados pueden estar modificados químicamente y/o modificados estructuralmente. Cuando los polinucleótidos están modificados química y/o estructuralmente, los polinucleótidos pueden denominarse "polinucleótidos modificados".
La presente divulgación proporciona nucleósidos y nucleótidos modificados de un polinucleótido (por ejemplo, polinucleótidos de ARN, tales como polinucleótidos de ARNm) que codifica un polipéptido de GALT. Un “nucleósido” se refiere a un compuesto que contiene una molécula de azúcar (por ejemplo, una pentosa o ribosa) o un derivado de ésta en combinación con una base orgánica (por ejemplo, una purina o pirimidina) o un derivado de ésta (también denominada “nucleobase” en la presente memoria). Un “nucleótido” se refiere a un nucleósido que incluye un grupo fosfato. Los nucleótidos modificados pueden sintetizarse mediante cualquier método útil, tal como, por ejemplo, de forma química, enzimática o recombinante, para incluir uno o más nucleósidos modificados o no naturales. Los polinucleótidos pueden comprender una o varias regiones de nucleósidos enlazados. Tales regiones pueden tener enlaces de cadena principal variables. Los enlaces pueden ser enlaces fosfodiéster estándar, en cuyo caso los polinucleótidos comprenderían regiones de nucleótidos.
Los polinucleótidos modificados divulgados en la presente memoria pueden comprender diversas modificaciones distintas. En algunas realizaciones, los polinucleótidos modificados contienen una, dos o más modificaciones de nucleósido o nucleótido (opcionalmente diferentes). En algunas realizaciones, un polinucleótido modificado, introducido en una célula, puede presentar una o más propiedades deseables, por ejemplo, expresión de proteínas mejorada, inmunogenicidad reducida, o degradación reducida en la célula, en comparación con un polinucleótido no modificado.
a. Modificaciones Estructurales
En algunas realizaciones, se modifica estructuralmente un polinucleótido (es decir, un polinucleótido de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT). Tal como se usa en la presente memoria, una modificación "estructural" es una en la que dos o más nucleósidos enlazados se insertan, suprimen, duplican, invierten o aleatorizan en un polinucleótido sin una modificación química significativa de los nucleótidos mismos. Debido a que necesariamente se romperán y se reformarán enlaces químicos para efectuar una modificación estructural, las modificaciones estructurales son de naturaleza química y por lo tanto son modificaciones químicas. Sin embargo, las modificaciones estructurales darán como resultado una secuencia diferente de nucleótidos. Por ejemplo, el polinucleótido "ATCG" puede modificarse químicamente para obtener "AT-5meC-G". El mismo polinucleótido puede modificarse estructuralmente de "ATCG" a "ATCCCG". Aquí, se ha insertado el dinucleótido "CC", dando como resultado una modificación estructural del polinucleótido.
b. Modificaciones Químicas
En algunas realizaciones, los polinucleótidos en la composición de la presente invención se modifican químicamente. Tal como se usan en la presente memoria en referencia a un polinucleótido, las expresiones "modificación química" o, según sea apropiado, "químicamente modificado" se refieren a la modificación con respecto a ribonucleósidos o desoxirribonucleósidos de adenosina (A), guanosina (G), uridina (U), timidina (T) o citidina (C) en uno o más de los siguientes: su posición, patrón, porcentaje o población. En general, en la presente memoria, estas expresiones no están destinadas a referirse a las modificaciones de ribonucleótidos en restos de casquete de ARNm de extremo 5' de origen natural.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos pueden tener una modificación química uniforme de la totalidad o cualquiera del mismo tipo de nucleósido o una población de modificaciones producidas por simple titulación descendente de la misma modificación de partida en la totalidad o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, o un porcentaje medido de una modificación química de la totalidad o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, pero con incorporación aleatoria, tal como cuando todas las uridinas se reemplazan por un análogo de uridina, por ejemplo, pseudouridina o 5-metoxiuridina. En otra realización, los polinucleótidos pueden tener una modificación química uniforme de dos, tres o cuatro del mismo tipo de nucleósido a lo largo de todo el polinucleótido (tal como que todas las uridinas y todas las citidinas, etc. se modifiquen de la misma manera).
El apareamiento de bases nucleotídicas modificadas abarca no sólo los pares de bases estándar adenosinatimina, adenosina-uracilo o guanosina-citosina, sino también pares de bases formados entre nucleótidos y/o nucleótidos modificados que comprenden bases modificadas o no estándar, permitiendo la disposición de donadores de enlaces de hidrógeno y aceptores de enlaces de hidrógeno los enlaces de hidrógeno entre una base no estándar y una base estándar, o entre dos estructuras de bases no estándar complementarias. Un ejemplo de tal apareamiento de bases no estándar es el apareamiento de bases entre la inosina del nucleótido modificado y adenina, citosina o uracilo. Cualquier combinación de base/azúcar o enlazador puede incorporarse a polinucleótidos de la presente divulgación.
El experto en la técnica apreciará que, salvo que se indique lo contrario, las secuencias de polinucleótidos expuestas en la presente solicitud indicarán “T” en una secuencia de ADN representativa, pero cuando la secuencia represente ARN se deberían sustituir las "T" por "U".
Las modificaciones de polinucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de ARN, tales como polinucleótidos de ARNm) que son útiles en las composiciones, los métodos y los procesos sintéticos de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, los siguientes nucleótidos, nucleósidos y nucleobases: 2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil)adenosina; 2-metiltio-N6-metiladenosina; 2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina; N6-glicinilcarbamoiladenosina; N6-isopenteniladenosina; N6-metiladenosina; N6-treonilcarbamoiladenosina; 1,2’-O-dimetiladenosina; 1-metiladenosina; 2’-O-metiladenosina; 2’-O-ribosiladenosina (fosfato); 2-metiladenosina; 2-metiltio-N6 isopenteniladenosina; 2-metiltio-N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina; 2’-O-metiladenosina; 2’-O-ribosiladenosina (fosfato); Isopenteniladenosina; N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina; N6,2’-O-dimetiladenosina; N6,2’-O-dimetiladenosina; N6,N6,2’-O-trimetiladenosina; N6,N6-dimetiladenosina; N6-acetiladenosina; N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina; N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina; 2-metiladenosina; 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina; 7-desaza-adenosina; Nl-metil-adenosina; N6, N6 (dimetil)adenina; N6-cis-hidroxi-isopentenil-adenosina; a-tio-adenosina; 2 (amino)adenina; 2 (aminopropil)adenina; 2 (metiltio) N6 (isopentenil)adenina; 2-(alquil)adenina; 2-(aminoalquil)adenina; 2-(aminopropil)adenina; 2-(halo)adenina; 2-(halo)adenina; 2-(propil)adenina; 2’-Amino-2’-desoxi-ATP; 2’-Azido-2’-desoxi-ATP; 2’-Desoxi-2’-a-aminoadenosina TP; 2’-Desoxi-2’-a-azidoadenosina TP; 6 (alquil)adenina; 6 (metil)adenina; 6-(alquil)adenina; 6-(metil)adenina; 7 (desaza)adenina; 8 (alquenil)adenina; 8 (alquinil)adenina; 8 (amino)adenina; 8 (tioalquil)adenina; 8-(alquenil)adenina; 8-(alquil)adenina; 8-(alquinil)adenina; 8-(amino)adenina; 8-(halo)adenina; 8-(hidroxil)adenina; 8-(tioalquil)adenina; 8-(tiol)adenina; 8-azido-adenosina; aza adenina; desaza adenina; N6 (metil)adenina; N6-(isopentil)adenina; 7-desaza-8-aza-adenosina; 7-metiladenina; 1-Desazaadenosina TP; 2’Fluoro-N6-Bz-desoxiadenosina TP; 2’-OMe-2-Amino-ATP; 2’O-metil-N6-Bz-desoxiadenosina TP; 2’-a-Etiniladenosina TP; 2-aminoadenina; 2-Aminoadenosina TP; 2-Amino-ATP; 2’-a-Trifluorometiladenosina TP; 2-Azidoadenosina TP; 2’-b-Etiniladenosina TP; 2-Bromoadenosina TP; 2’-b-Trifluorometiladenosina TP; 2-Cloroadenosina TP; 2’-Desoxi-2’,2’-difluoroadenosina TP; 2’-Desoxi-2’-amercaptoadenosina TP; 2’-Desoxi-2’-a-tiometoxiadenosina TP; 2’-Desoxi-2’-b- aminoadenosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-azidoadenosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-bromoadenosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-cloroadenosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-fluoroadenosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-yodoadenosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-mercaptoadenosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-tiometoxiadenosina TP; 2-Fluoroadenosina TP; 2-Yodoadenosina TP; 2-Mercaptoadenosina TP; 2-metoxiadenina; 2-metiltio-adenina; 2-Trifluorometiladenosina TP; 3-Desaza-3-bromoadenosina TP; 3-Desaza-3-cloroadenosina TP; 3-Desaza-3-fluoroadenosina TP; 3-Desaza-3-yodoadenosina TP; 3-Desazaadenosina TP; 4’-Azidoadenosina TP; adenosina TP 4’- carbocíclico; 4’-Etiniladenosina TP; 5’-Homo-adenosina TP; 8-Aza-ATP; 8-bromo-adenosina TP; 8-Trifluorometiladenosina TP; 9-Desazaadenosina TP; 2-aminopurina; 7-desaza-2,6- diaminopurina; 7-desaza-8-aza-2,6-diaminopurina; 7-desaza-8-aza-2-aminopurina; 2,6-diaminopurina; 7-desaza-8-aza-adenina, 7-desaza-2-aminopurina; 2-tiocitidina; 3- metilcitidina; 5-formilcitidina; 5-hidroximetilcitidina; 5-metilcitidina; N4-acetilcitidina; 2’-O-metilcitidina; 2’-O-metilcitidina; 5,2’-O-dimetilcitidina; 5-formil-2’-O-metilcitidina; Lisidina; N4,2’-O-dimetilcitidina; N4-acetil-2’-O-metilcitidina; N4-metilcitidina; N4,N4-Dimetil-2’-OMe-Citidina TP; 4-metilcitidina; 5-aza-citidina; Pseudo-iso-citidina; pirrolo-citidina; a-tio-citidina; 2-(tio)citosina; 2’-Amino-2’-desoxi-CTP; 2’-Azido-2’-desoxi-CTP; 2’-Desoxi-2’-a-aminocitidina TP; 2’-Desoxi-2’-aazidocitidina TP; 3 (desaza) 5 (aza)citosina; 3 (metil)citosina; 3-(alquil)citosina; 3-(desaza) 5 (aza)citosina; 3-(metil)citidina; 4,2’-O-dimetilcitidina; 5 (halo)citosina; 5 (metil)citosina; 5 (propinil)citosina; 5 (trifluorometil)citosina; 5-(alquil)citosina; 5-(alquinil)citosina; 5-(halo)citosina; 5-(propinil)citosina; 5-(trifluorometil)citosina; 5-bromo-citidina; 5-yodo-citidina; 5-propinil citosina; 6-(azo)citosina; 6-aza-citidina; aza citosina; desaza citosina; N4 (acetil)citosina; 1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina; 1-metil-pseudoisocitidina; 2-metoxi-5-metil-citidina; 2-metoxi-citidina; 2-tio-5-metil-citidina; 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina; 4-metoxipseudoisocitidina; 4-tio-1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina; 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina; 4-tiopseudoisocitidina; 5-aza-zebularina; 5-metil-zebularina; pirrolo-pseudoisocitidina; Zebularina; (E)-5-(2-Bromovinil)citidina TP; 2,2’-anhidro-citidina TP clorhidrato; 2’Fluor-N4-Bz-citidina TP; 2’Fluoro-N4-Acetil-citidina TP; 2’-O-Metil-N4-Acetil-citidina TP; 2’O-metil-N4-Bz-citidina TP; 2’-a-Etinilcitidina TP; 2’-a-Trifluorometilcitidina TP; 2’-b-Etinilcitidina TP; 2’-b-T rifluorometilcitidina TP; 2’-Desoxi-2’,2’-difluorocitidina TP; 2’-Desoxi-2’-amercaptocitidina TP; 2’-Desoxi-2’-a-tiometoxicitidina TP; 2’-Desoxi-2’-b-aminocitidina TP; 2’-Desoxi-2’-bazidocitidina TP; 2’-Desoxi-2’-b-bromocitidina TP; 2’-Desoxi-2’-b-clorocitidina TP; 2’-Desoxi-2’-b-fluorocitidina TP; 2’-Desoxi-2’-b-yodocitidina TP; 2’-Desoxi-2’-b-mercaptocitidina TP; 2’-Desoxi-2’-b-tiometoxicitidina TP; 2’-O-Metil-5-(1-propinil)citidina TP; 3’-Etinilcitidina TP; 4’-Azidocitidina TP; citidina TP 4’-carbocíclico; 4’-Etinilcitidina TP; 5-(1-Propinil)ara-citidina TP; 5-(2-Cloro-fenil)-2-tiocitidina TP; 5-(4-Amino-fenil)-2-tiocitidina TP; 5-Aminoalil-CTP; 5-Cianocitidina TP; 5-Etinilara-citidina TP; 5-Etinilcitidina TP; 5’-Homo-citidina TP; 5-Metoxicitidina TP; 5-Trifluorometil-Citidina TP; N4-Amino-citidina TP; N4-Benzoil-citidina TP; Pseudoisocitidina; 7-metilguanosina; N2,2’-O- dimetilguanosina; N2-metilguanosina; wiosina; 1,2’-O-dimetilguanosina; 1-metilguanosina; 2’-O-metilguanosina; 2’-O-ribosilguanosina (fosfato); 2’-O-metilguanosina; 2’-O-ribosilguanosina (fosfato); 7-aminometil-7-desazaguanosina; 7-ciano-7-desazaguanosina; Arqueosina; Metilwiosina; N2,7-dimetilguanosina; N2,N2,2’-O-trimetilguanosina; N2,N2,7-trimetilguanosina; N2,N2-dimetilguanosina; N2,7,2’-O-trimetilguanosina; 6-tio-guanosina; 7-desaza-guanosina; 8-oxo-guanosina; N1-metil-guanosina; a-tio-guanosina; 2 (propil)guanina; 2-(alquil)guanina; 2’-Amino-2’-desoxi-GTP; 2’-Azido-2’-desoxi-GTP; 2’-Desoxi-2’-a-aminoguanosina TP; 2’-Desoxi-2’-a-azidoguanosina TP; 6 (metil)guanina; 6-(alquil)guanina; 6-(metil)guanina; 6-metil-guanosina; 7 (alquil)guanina; 7 (desaza)guanina; 7 (metil)guanina; 7-(alquil)guanina; 7-(desaza)guanina; 7-(metil)guanina; 8 (alquil)guanina; 8 (alquinil)guanina; 8 (halo)guanina; 8 (tioalquil)guanina; 8-(alquenil)guanina; 8-(alquil)guanina; 8-(alquinil)guanina; 8-(amino)guanina; 8(halo)guanina; 8-(hidroxil)guanina; 8-(tioalquil)guanina; 8-(tiol)guanina; aza guanina; desaza guanina; N (metil)guanina; N-(metil)guanina; 1-metil-6-tio-guanosina; 6-metoxi-guanosina; 6-tio-7-desaza-8-azaguanosina; 6-tio-7-desaza-guanosina; 6-tio-7-metil-guanosina; 7-desaza-8-aza-guanosina; 7-metil-8- oxoguanosina; N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina; N2-metil-6-tio-guanosina; 1-Me-GTP; 2’Fluoro-N2-isobutilguanosina TP; 2’O-metil-N2-isobutil-guanosina TP; 2’-a-Etinilguanosina TP; 2’-a-Trifluorometilguanosina TP; 2’-b-Etinilguanosina TP; 2’-b-Trifluorometilguanosina TP; 2’-Desoxi-2’,2’-difluoroguanosina TP; 2’-Desoxi-2’-amercaptoguanosina TP; 2’-Desoxi-2’-a-tiometoxiguanosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-aminoguanosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-azidoguanosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-bromoguanosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-cloroguanosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-fluoroguanosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-yodoguanosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-mercaptoguanosina TP; 2’-Desoxi-2’-b-tiometoxiguanosina TP; 4’-Azidoguanosina TP; guanosina TP 4’-carbocíclico; 4’-Etinilguanosina TP; 5’-Homo-guanosina TP; 8-bromo-guanosina TP; 9-Desazaguanosina TP; N2-isobutil-guanosina TP; 1-metilinosina; Inosina; 1,2’-O-dimetilinosina; 2’-O-metilinosina; 7-metilinosina; 2’-O-metilinosina; Epoxyqueuosina; galactosil-queuosina; Manosilqueuosina; Queuosina; aliamino-timidina; aza timidina; desaza timidina; desoxi-timidina; 2’-O-metiluridina; 2-tiouridina; 3-metiluridina; 5-carboximetiluridina; 5-hidroxiuridina; 5- metiluridina; 5-taurinometil-2-tiouridina; 5-taurinometiluridina; Dihidrouridina; Pseudouridina; (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 1 -metil-3-(3-amino-5-carboxipropil)pseudouridina; 1 -metilpseudouridina; 1 -etilpseudouridina; 2’-O-metiluridina; 2’-O-metilpseudouridina; 2’-O-metiluridina; 2-tio-2’-O-metiluridina; 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 3,2’-O-dimetiluridina; 3-Metil-pseudo-Uridina TP; 4-tiouridina; 5-(carboxihidroximetil)uridina; éster metílico de 5-(carboxihidroximetil)uridina; 5,2’-O-dimetiluridina; 5,6-dihidrouridina; 5-aminometil-2-tiouridina; 5-carbamoilmetil-2’-O-metiluridina; 5-carbamoilmetiluridina; 5-carboxihidroximetiluridina; éster metílico de 5-carboxihidroximetiluridina; 5-carboximetilaminometil-2’-O-metiluridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5-Carbamoilmetiluridina TP; 5-metoxicarbonilmetil-2’-O-metiluridina; 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina; 5-metoxicarbonilmetiluridina; 5-metiluridina,), 5-metoxiuridina; 5-metil-2-tiouridina; 5-metilaminometil-2-selenouridina; 5-metilaminometil-2-tiouridina; 5-metilaminometiluridina; 5-Metildihidrouridina; 5-Ácido oxiacético- Uridina TP; 5-Ácido oxiacéticoéster metílico- Uridina TP; N1-metil-pseudo-uracilo; N1-etil-pseudo-uracilo; uridina 5-ácido oxiacético; uridina 5-ácido oxiacético éster metílico; 3-(3-Amino-3-carboxipropil)-Uridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)-2-tiouridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)-2’-O-metiluridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)uridina TP; 5-propinil uracilo; a-tio-uridina; 1 (aminoalquilamino-carboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 2(tio)-pseudouracilo 1 sustituido; 2,4-(ditio)pseudouracilo 1 sustituido; 4 (tio)pseudouracilo 1 sustituido; pseudouracilo 1 sustituido; 1-(aminoalquilamino-carboniletilenil)-2-(tio)-pseudouracilo; 1-Metil-3-(3-amino-3-carboxipropil) pseudouridina TP; 1-Metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudo-UTP; 1-Metil-pseudo-UTP; 1-Etil-pseudo-DTP; 2 (tio)pseudouracilo; 2’ desoxi uridina; 2’ fluorouridina; 2-(tio)uracilo; 2,4-(ditio)pseudouracilo; 2’ metil, 2’amino, 2’azido, 2’fluro-guanosina; 2’-Amino-2’-desoxi-UTP; 2’-Azido-2’-desoxi-UTP; 2’-Azido-desoxiuridina TP; 2’-O-metilpseudouridina; 2’ desoxi uridina; 2’ fluorouridina; 2’-Desoxi-2’-a-aminouridina TP; 2’-Desoxi-2’-a-azidouridina TP; 2-metilpseudouridina; 3 (3 amino-3 carboxipropil)uracilo; 4 (tio)pseudouracilo; 4-(tio)pseudouracilo; 4-(tio)uracilo; 4-tiouracilo; 5 (1,3-diazol-1 -alquil)uracilo; 5 (2-aminopropil)uracilo; 5 (aminoalquil)uracilo; 5 (dimetilaminoalquil)uracilo; 5 (guanidinioalquil)uracilo; 5 (metoxicarbonilmetil)-2-(tio)uracilo; 5 (metoxicarbonil-metil)uracilo; 5 (metil) 2 (tio)uracilo; 5 (metil) 2,4 (ditio)uracilo; 5 (metil) 4 (tio)uracilo; 5 (metilaminometil)-2 (tio)uracilo; 5 (metilaminometil)-2,4 (ditio)uracilo; 5 (metilaminometil)-4 (tio)uracilo; 5 (propinil)uracilo; 5 (trifluorometil)uracilo; 5-(2-aminopropil)uracilo; 5-(alquil)-2-(tio)pseudouracilo; 5-(alquil)-2,4 (ditio)pseudouracilo; 5-(alquil)-4 (tio)pseudouracilo; 5-(alquil)pseudouracilo; 5-(alquil)uracilo; 5-(alquinil)uracilo; 5-(alilamino)uracilo; 5-(cianoalquil)uracilo; 5-(dialquilaminoalquil)uracilo; 5-(dimetilaminoalquil)uracilo; 5-(guanidinioalquil)uracilo; 5-(halo)uracilo; 5-(1,3-diazol-l-alquil)uracilo; 5-(metoxi)uracilo; 5-(metoxicarbonilmetil)-2-(tio)uracilo; 5-(metoxicarbonil-metil)uracilo; 5-(metil) 2(tio)uracilo; 5-(metil) 2,4 (ditio)uracilo; 5-(metil) 4 (tio)uracilo; 5-(metil)-2-(tio)pseudouracilo; 5-(metil)-2,4 (ditio)pseudouracilo; 5-(metil)-4 (tio)pseudouracilo; 5-(metil)pseudouracilo; 5-(metilaminometil)-2(tio)uracilo; 5-(metilaminometil)-2,4(ditio)uracilo; 5-(metilaminometil)-4-(tio)uracilo; 5-(propinil)uracilo; 5-(trifluorometil)uracilo; 5-aminoalil-uridina; 5-bromo-uridina; 5-yodo-uridina; 5-uracilo; 6 (azo)uracilo; 6-(azo)uracilo; 6-aza-uridina; aliamino-uracilo; aza uracilo; desaza uracilo; N3 (metil)uracilo; P seudo-UTP-1-2-ácido etanoico; Pseudouracilo; 4-Tio-pseudo-UTP; 1-carboximetil-pseudouridina; 1 -metil-1-desaza-pseudouridina; 1-propinil-uridina; 1-taurinometil-1-metil-uridina; 1-taurinometil-4-tio-uridina; 1-taurinometil-pseudouridina; 2-metoxi-4-tio-pseudouridina; 2-tio-1-metil-1-desaza-pseudouridina; 2-tio-1-metilpseudouridina; 2-tio-5-aza-uridina; 2-tio-dihidropseudouridina; 2-tio-dihidrouridina; 2-tio-pseudouridina; 4-metoxi-2-tio-pseudouridina; 4-metoxi-pseudouridina; 4-tio-1-metil-pseudouridina; 4-tio-pseudouridina; 5-azauridina; Dihidropseudouridina; (±) 1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (2R)-1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (2S)-1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (E)-5-(2-Bromo-vinil)ara-uridina TP; (E)-5-(2- Bromo-vinil)uridina TP; (Z)-5-(2-Bromo-vinil)ara-uridina TP; (Z)-5-(2-Bromo-vinil)uridina TP; 1-(2,2,2-Trifluoroetil)-pseudo-UTP; 1-(2,2,3,3,3-Pentafluoropropil)pseudouridina TP; 1-(2,2-Dietoxietil)pseudouridina TP; 1-(2,4,6-Trimetilbencil)pseudouridina TP; 1-(2,4,6-Trimetil-bencil)pseudo-DTP; 1-(2,4,6-Trimetil-fenil)pseudo-DTP; 1-(2-Amino-2-carboxietil)pseudo-DTP; 1-(2-Amino-etil)pseudo-DTP; 1-(2-Hidroxietil)pseudouridina TP; 1-(2-Metoxietil)pseudouridina TP; 1-(3,4-Bis-trifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3,4Dimetoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3-Amino-3-carboxipropil)pseudo-DTP; 1-(3-Amino-propil)pseudo-DTP; 1-(3-Ciclopropil-prop-2-inil)pseudouridina TP; 1-(4-Amino-4-carboxibutil)pseudo-DTp; 1-(4-Aminobencil)pseudo-DTP; 1-(4-Amino-butil)pseudo-DTP; 1-(4-Amino-fenil)pseudo-DTP; 1-(4-Azidobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Bromobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Clorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Fluorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Yodobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metanosulfonilbencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metoxi-bencil)pseudo-DTP; 1-(4-Metoxi-fenil)pseudo-DTP; 1-(4-Metilbencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metil-bencil)pseudo-DTP; 1-(4-Nitrobencil)pseudouridina TP; 1 -(4-Nitrobencil)pseudo-DTP; 1(4-Nitro-fenil)pseudo-DTP; 1-(4-Tiometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Trifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Trifluorometilbencil)pseudouridina TP; 1-(5-Amino-pentil)pseudo-DTP; 1-(6-Amino-hexil)pseudo-DTP; 1,6-Dimetil-pseudo-DTP; l-[3-(2-{2-[2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionil]pseudouridina TP; 1-{3-[2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-propionil}pseudouridina TP; 1-Acetilpseudouridina TP; 1-Alquil-6-(1-propinil)-pseudo-DTP; 1-Alquil-6-(2-propinil)-pseudo-DTP; 1-Alquil-6-alil-pseudo-DTP; 1-Alquil-6-etinil-pseudo-DTP; 1-Alquil-6-homoalil-pseudo-DTP; 1-Alquil-6-vinil-pseudo-DTP; 1-Alilpseudouridina TP; 1-Aminometil-pseudo-DTP; 1-Benzoilpseudouridina TP; 1-Benciloximetilpseudouridina TP; 1-Bencilpseudo-DTP;1-Biotinil-PEG2-pseudouridina TP; 1-Biotinilpseudouridina TP; 1-Butil-pseudo-DTP; 1-Cianometilpseudouridina TP; 1-Ciclobutilmetil-pseudo-DTP; 1-Ciclobutil-pseudo-DTP; 1-Cicloheptilmetilpseudo-DTP; 1-Cicloheptil-pseudo-DTP; 1-Ciclohexilmetil-pseudo-DTP; 1-Ciclohexil-pseudo-DTP; 1-Ciclooctilmetil-pseudo-DTP; 1-Ciclooctil-pseudo-DTP; 1-Ciclopentilmetil-pseudo-DTP; 1-Ciclopentil-pseudo-DTP; 1-Ciclopropilmetil-pseudo-DTP; 1-Ciclopropil-pseudo-DTP; 1-Etil-pseudo-DTP; 1-Hexil-pseudo-DTP; 1-Homoalilpseudouridina TP; 1-Hidroximetilpseudouridina TP; 1-iso-propil-pseudo-DTP;1-Me-2-tio-pseudo-DTP; 1-Me-4-tio-pseudo-DTP; 1-Me-alfa-tio-pseudo-DTP; 1-Metanosulfonilmetilpseudouridina TP; 1-Metoximetilpseudouridina TP; 1 -Metil-6-(2,2,2-Trifluoroetil)pseudo-DTP; 1 -Metil-6-(4-morfolino)-pseudo-DTP;1-Metil-6-(4-tiomorfolino)-pseudo-DTP; 1-Metil-6-(fenil sustituido)pseudo-DTP; 1-Metil-6-amino-pseudo-DTP; 1-Metil-6-azido-pseudo-DTP; 1-Metil-6-bromo-pseudo-DTP; 1-Metil-6-butil-pseudo-DTP; 1-Metil-6-cloropseudo-DTP; 1-Metil-6-ciano-pseudo-DTP; 1-Metil-6-dimetilamino-pseudo-DTP; 1-Metil-6-etoxi-pseudo-DTP; 1-Metil-6-etilcarboxilato-pseudo-DTP; 1-Metil-6-etil-pseudo-DTP; 1-Metil-6-fluoro-pseudo-DTP; 1 -Metil-6-formil-pseudo-DTP; 1-Metil-6-hidroxiamino-pseudo-DTP; 1-Metil-6-hidroxi-pseudo-DTP; 1-Metil-6-yodopseudo-DTP; 1-Metil-6-iso-propil-pseudo-DTP; 1-Metil-6-metoxi-pseudo-DTP; 1-Metil-6-metilamino-pseudo-DTP; 1-Metil-6-fenil-pseudo-DTP; 1-Metil-6-propil-pseudo-DTP; 1-Metil-6-terc-butil-pseudo-DTP; 1 -Metil-6-trifluorometoxi-pseudo-DTP; 1-Metil-6-trifluorometil-pseudo-DTP; 1-Morfolinometilpseudouridina TP; 1-Pentilpseudo-DTP; 1-Fenil-pseudo-DTP; 1-Pivaloilpseudouridina TP; 1-Propargilpseudouridina TP; 1-Propil-pseudo-DTP; 1-propinil-pseudouridina; 1-p-tolil-pseudo-DTP; 1-terc-Butil-pseudo-DTP; 1-Tiometoximetilpseudouridina TP; 1-Tiomorfolinometilpseudouridina TP; 1-Trifluoroacetilpseudouridina TP; 1-Trifluorometil-pseudo-DTP; 1-Vinilpseudouridina TP; 2,2’-anhidro-uridina TP; 2’-bromo-desoxiuridina TP; 2’-F-5-Metil-2’-desoxi-DTP; 2’-OMe-5-Me-DTP; 2’-OMe-pseudo-DTP; 2’-a-Etiniluridina TP; 2’-a-Trifluorometiluridina TP; 2’-b-Etiniluridina TP; 2’-b-Trifluorometiluridina TP; 2’-Desoxi-2’,2’-difluorouridina TP; 2’-Desoxi-2’-a-mercaptouridina TP; 2’-Desoxi-2’-atiometoxiuridina TP; 2’-Desoxi-2’-b-aminouridina TP; 2’-Desoxi-2’-b-azidouridina TP; 2’-Desoxi-2’-bbromouridina TP; 2’-Desoxi-2’-b-clorouridina TP; 2’Desoxi-2’-b-fluorouridina TP; 2’-Desoxi-2’-b-yodouridina TP; 2’-Desoxi-2’-b-mercaptouridina TP; 2’-Desoxi-2’-b-tiometoxiuridina TP; 2-metoxi-4-tio-uridina; 2-metoxiuridina; 2’-O-Metil-5-(1-propinil)uridina TP; 3-Alquil-pseudo-DTP; 4’-Azidouridina TP; uridina TP 4’-carbocíclico; 4’-Etiniluridina TP; 5-(1-Propinil)ara-uridina TP; 5-(2-Furanil)uridina TP; 5-Cianouridina TP; 5-Dimetilaminouridina TP; 5’-Homo-uridina TP; 5-yodo-2’-fluoro-desoxiuridina TP; 5-Feniletiniluridina TP; 5-Trideuterometil-6-deuterouridina TP; 5-Trifluorometil-Dridina TP; 5-Vinilarauridina TP; 6-(2,2,2-Trifluoroetil)-pseudo-DTP; 6-(4-Morfolino)-pseudo-DTP; 6-(4-Tiomorfolino)-pseudo-DTP; 6-(Fenil Sustituido)-pseudo-DTP; 6-Amino-pseudo-DTP; 6-Azido-pseudo-DTP; 6-Bromo-pseudo-DTP; 6-Butil-pseudo-DTP; 6-Cloro-pseudo-DTP; 6-Cianopseudo-DTP; 6-Dimetilamino-pseudo-DTP; 6-Etoxi-pseudo-DTP; 6-Etilcarboxilato-pseudo-DTP; 6-Etil-pseudo-DTP; 6-Fluoro-pseudo-DTP; 6-Formil-pseudo-DTP; 6-Hidroxiamino-pseudo-DTP; 6-Hidroxi-pseudo-DTP; 6-Yodo-pseudo-DTP; 6-iso-Propil-pseudo-DTP; 6-Metoxi-pseudo-DTP; 6-Metilamino-pseudo-DTP; 6-metilpseudo-DTP; 6-fenil-pseudo-DTP; 6-Fenil-pseudo-DTP; 6-Propil-pseudo-DTP; 6-terc-Butil-pseudo-DTP; 6-Trifluorometoxi-pseudo-DTP; 6-Trifluorometil-pseudo-DTP; Alfa-tio-pseudo-DTP; Pseudouridina 1-(4-ácido metilbencenosulfónico) TP; Pseudouridina 1-(4-ácido metilbenzoico) TP; Pseudouridina TP 1-[3-(2-etoxi)]ácido propiónico; Pseudouridina TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-etoxi)-etoxi]-etoxi)-etoxi}]ácido propiónico; Pseudouridina TP 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-etoxi)-etoxi}-etoxi]-etoxi)-etoxi}]ácido propiónico; Pseudouridina TP 1-[3-{2-(2-[2-etoxi]-etoxi)-etoxi}]ácido propiónico; Pseudouridina TP 1-[3-{2-(2-etoxi)-etoxi}] ácido propiónico; Pseudouridina TP 1-ácido metilfosfónico; Pseudouridina TP 1-ácido metilfosfónico éster dietílico; Pseudo-DTP-N1-3-ácido propiónico; Pseudo-DTP-N1-4-ácido butanoico; Pseudo-DTP-N1-5-ácido pentanoico; Pseudo-DTP-N1-6-ácido hexanoico; Pseudo-DTP-N1-7-ácido heptanoico; Pseudo-DTP-N1-metil-p-ácido benzoico; Pseudo-DTP-N1-p-ácido benzoico; Wibutosina; Hidroxiwibutosina; Isowiosina; Peroxiwibutosina; hidroxiwibutosina submodificada; 4-demetilwiosina; 2,6-(diamino)purina; 1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo: 1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-1-ilo; 1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 1,3,5-(triaza)-2,6-(dioxa)-naftaleno;2 (amino)purina;2,4,5-(trimetil)fenilo;2’ metil, 2’amino, 2’azido, 2’fluro-citidina;2’metil, 2’amino, 2’azido, 2’fluro-adenina;2’metil, 2’amino, 2’azido, 2’flurouridina;2’-amino-2’-desoxirribosa; 2-amino-6-Cloro-purina; 2-aza-inosinilo; 2’- azido-2’-desoxirribosa; 2’fluoro-2’-desoxirribosa; bases 2’-fluoro-modificadas; 2’-O-metil-ribosa; 2-oxo-7-aminopiridopirimidin-3-ilo; 2-oxopiridopirimidin-3-ilo; 2-piridinona; 3 nitropirrol; 3-(metil)-7-(propinil)isocarbostirililo; 3-(metil)isocarbostirililo; 4-(fluoro)-6-(metil)bencimidazol; 4-(metil)bencimidazol; 4-(metil)indolilo; 4,6-(dimetil)indolilo; 5 nitroindol; pirimidinas 5 sustituidas; 5-(metil)isocarbostirililo; 5-nitroindol; 6-(aza)pirimidina; 6-(azo)timina; 6-(metil)-7(aza)indolilo; 6-cloro-purina; 6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2- (oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)- fenoxazin-1-ilo; 7-(aza)indolilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazinl-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-l-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)- 1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(propinil)isocarbostirililo; 7-(propinil)isocarbostirililo, propinil-7-(aza)indolilo; 7-desaza-inosinilo; 1-(aza)-2-(tio)-3- (aza)-fenoxazin-1-ilo 7-sustituido; 1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo 7-sustituido; 9-(metil)-imidizopiridinilo; Aminoindolilo; Antracenilo; bis-orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; bis-orto-sustituido-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; Difluorotolilo; Hipoxantina; Imidizopiridinilo; Inosinilo; Isocarbostirililo; Isoguanisina; purinas N2-sustituidas; N6-metil-2-amino-purina; purinas N6-sustituidas; derivado N-alquilado; Naptalenilo; Nitrobencimidazolilo; Nitroimidazolilo; Nitroindazolilo; Nitropirazolilo; Nubularina; purinas O6-sustituidas; derivado O-alquilado; orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; orto-sustituido-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; Oxoformicina TP; para-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; para-sustituido-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; Pentacenilo; Fenantracenilo; Fenilo; propinil-7-(aza)indolilo; Pirenilo; piridopirimidin-3-ilo; piridopirimidin-3-ilo, 2-oxo-7-amino-piridopirimidin-3-ilo; pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; Pirrolopirimidinilo; Pirrolopirizinilo; Estilbencilo; 1,2,4-triazoles sustituidos; Tetracenilo; Tubercidina; Xantina; Xantosina-5’-TP; 2-tio-zebularina; 5-aza-2-tio-zebularina; 7-desaza-2-amino-purina; piridin-4-ona ribonucleósido; 2-Amino-ribósido-TP; Formicina A TP; Formicina B TP; Pirrolosina TP; 2’-OH-ara-adenosina TP; 2’-OH-ara-citidina TP; 2’-OH-ara-uridina TP; 2’-OH-ara-guanosina TP; 5-(2-carbometoxivinil)uridina TP; y N6-(19-Amino-pentaoxanonadecil)adenosina TP.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) incluye una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.
En algunas realizaciones, el ARNm comprende al menos un nucleósido modificado químicamente. En algunas realizaciones el al menos un nucleósido modificado químicamente se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina (y ), 2-tiouridina (s2U), 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-desaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4- metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-azauridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina, 5-metoxiuridina, 2'-O-metil uridina, 1-metil-pseudouridina (m1Y), 1- etil-pseudouridina (e1Y), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), a-tio-guanosina, a-tio-adenosina, 5- ciano uridina, 4'-tio uridina 7-desaza-adenina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metiladenosina (m6A), y 2,6-Diaminopurina, (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-desaza-guanosina, 7-ciano-7-desaza-guanosina (preQO), 7-aminometil-7-desaza-guanosina (preQI), 7-metilguanosina (m7G), 1-metil-guanosina (m1G), 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 2,8-dimetiladenosina, 2- geraniltiouridina, 2-lisidina, 2-selenouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)-5,6-dihidrouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina, 3-metilpseudouridina, éster metílico de 5-(carboxihidroximetil)-2'-O-metiluridina, 5-aminometil-2-geraniltiouridina, 5-aminometil-2-selenouridina, 5-aminometiluridina, 5-carbamoilhidroximetiluridina, 5-carbamoilmetil-2-tiouridina, 5-carboximetil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil-2-geraniltiouridina, 5-carboximetilaminometil-2-selenouridina, 5-cianometiluridina, 5-hidroxicitidina, 5-metilaminometil-2-geraniltiouridina, 7-aminocarboxipropil-demetilwiosina, 7-aminocarboxipropilwiosina, éster metílico de 7-aminocarboxipropilwiosina, 8-metiladenosina, N4,N4-dimetilcitidina, N6-formiladenosina, N6-hidroximetiladenosina, agmatidina, N6-treonilcarbamoiladenosina cíclica, glutamil-queuosina, hidroxiwibutosina submodificada metilada, N4,N4,2'-O-trimetilcitidina, 5-metilaminometil-2-tiouridina geranilada, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina geranilada, Qbase, preQ0base, preQIbase y dos o más combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el al menos un nucleósido modificado químicamente se selecciona del grupo que consiste en pseudouridina, 1-metil-pseudouridina, 1-etilpseudouridina, 5-metilcitosina, 5-metoxiuridina y una combinación de éstas. En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) incluye una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.
(i) Modificaciones de Bases
En ciertas realizaciones, la modificación química es en nucleobases de los polinucleótidos (es decir, polinucleótido de ARNm). En algunas realizaciones, las nucleobases modificadas del polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) se seleccionan del grupo que consiste en 1-metil-pseudouridina (m1^), 1-etilpseudouridina (e1^), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), pseudouridina (y ), a-tio-guanosina y atio-adenosina. En algunas realizaciones, el polinucleótido incluye una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende pseudouridina (y ) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende 1-metil-pseudouridina (m lY). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende 1-etil-pseudouridina (e1Y). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende 1-metil-pseudouridina (m l^ ) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende 1-etil-pseudouridina (e1^) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende 2-tiouridina (s2U). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende 2-tiouridina y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende metoxi-uridina (mo5U). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende 5-metoxi-uridina (mo5U) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende 2'-O-metil uridina. En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende 2'-O-metil uridina y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende N6-metil-adenosina (m6A). En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende N6-metiladenosina (m6A) y 5-metil-citidina (m5C).
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) se modifica uniformemente (por ejemplo, se modifica completamente, se modifica en toda la secuencia) para una modificación concreta. Por ejemplo, es posible modificar uniformemente un polinucleótido con 5-metil-citidina (m5C), lo que significa que se reemplazan todos los residuos de citosina en la secuencia de ARNm por 5-metil-citidina (m5C). De manera similar, es posible modificar uniformemente un polinucleótido para cualquier tipo de residuo de nucleósido presente en la secuencia mediante el reemplazo por un residuo modificado tal como cualquiera de los expuestos anteriormente.
En algunas realizaciones, los nucleósidos modificados químicamente en el marco de lectura abierta se seleccionan del grupo que consiste en uridina, adenina, citosina, guanina y cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es una citosina modificada. Los ejemplos de nucleobases y nucleósidos que tienen una citosina modificada incluyen N4-acetil-citidina (aC4C), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo-citidina (por ejemplo, 5-yodo-citidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, 2-tiocitidina (s2C), 2-tio-5-metil-citidina.
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una uridina modificada. Los ejemplos de nucleobases y nucleósidos que tienen una uridina modificada incluyen 5-ciano uridina o 4'-tio uridina.
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una adenina modificada. Los ejemplos de nucleobases y nucleósidos que tienen una adenina modificada incluyen 7-desaza-adenina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metil-adenina (m6A) y 2,6-Diaminopurina.
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una guanina modificada. Los ejemplos de nucleobases y nucleósidos que tienen una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-desaza-guanosina, 7-ciano-7-desaza-guanosina (preQ0), 7-aminometil-7-desaza-guanosina (preQ1), 7-metil-guanosina (m7G), 1-metil-guanosina (m1G), 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina.
En algunas realizaciones, los nucleótidos modificados en cuanto a las nucleobases del polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) son 5-metoxiuridina.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) incluye una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) nucleobases modificadas.
En algunas realizaciones, al menos un 95% de un tipo de nucleobases (por ejemplo, uracilo) de un polinucleótido (es decir, un polinucleótido de ARNm que codifica GALT) son nucleobases modificadas. En algunas realizaciones, al menos un 95% del uracilo de un polinucleótido (es decir, un polinucleótido de ARNm que codifica GALT) es 5-metoxiuracilo.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) comprende 5-metoxiuridina (5mo5U) y 5-metil-citidina (m5C).
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, polinucleótido de ARNm) se modifica uniformemente (por ejemplo, se modifica completamente, se modifica en toda la secuencia) para una modificación concreta. Por ejemplo, es posible modificar uniformemente un polinucleótido con 5-metoxiuridina, lo que significa que se reemplazan sustancialmente todos los residuos de uridina en la secuencia de ARNm por 5-metoxiuridina. De manera similar, es posible modificar uniformemente un polinucleótido para cualquier tipo de residuo de nucleósido presente en la secuencia mediante el reemplazo por un residuo modificado tal como cualquiera de los expuestos anteriormente.
En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es una citosina modificada.
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es un uracilo modificado. Los ejemplos de nucleobases y nucleósidos que tienen un uracilo modificado incluyen 5-metoxiuracilo.
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una adenina modificada.
En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una guanina modificada.
En algunas realizaciones, las nucleobases, el azúcar, la cadena principal o cualquier combinación de las mismas del marco de lectura abierta que codifica un polipéptido de GAL<t>se modifican químicamente en al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 99% o un 100%.
En algunas realizaciones, los nucleósidos de uridina del marco de lectura abierta que codifica un polipéptido de GALT se modifican químicamente en al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 99% o un 100%.
En algunas realizaciones, los nucleósidos de adenosina del marco de lectura abierta que codifica un polipéptido de GALT se modifican químicamente en al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 99% o un 100%.
En algunas realizaciones, los nucleósidos de citidina del marco de lectura abierta que codifica un polipéptido de GALT se modifican químicamente en al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 99% o un 100%.
En algunas realizaciones, los nucleósidos de guanosina del marco de lectura abierta que codifica un polipéptido de GALT se modifican químicamente en al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 99% o un 100%.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos pueden incluir cualquier enlazador útil entre los nucleósidos. Los enlazadores, incluyendo modificaciones de cadena principal, que son útiles en la composición de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: 3’-alquilen fosfonatos, 3’-amino fosforamidato, cadenas principales que contienen alqueno, aminoalquilfosforamidatos, aminoalquilfosfotriésteres, boranofosfatos, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CHa)-N(CHa)-CH2-, -CH2-NH-CH2-, fosfonatos quirales, fosforotioatos quirales, cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo, metileno (metilimino), cadenas principales de metileno formacetilo y tioformacetilo, cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino, enlaces morfolino, -N(CH3)-CH2-CH2-, oligonucleósidos con enlace internucleósido heteroatómico, fosfinatos, fosforamidatos, fosforoditionatos, enlaces internucleósido de fosforotioato, fosforotioatos, fosfotriésteres, APN, cadenas principales de siloxano, cadenas principales de sulfamato, cadenas principales de sulfóxido de sulfuro y sulfona, cadenas principales de sulfonato y sulfonamida, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y tionofosforamidatos.
(ii) Modificaciones de Azúcar
Los nucleósidos y nucleótidos modificados (por ejemplo, moléculas de unidades estructurales) que pueden incorporarse en un polinucleótido (es decir, ARNm, como se describe en la presente memoria), pueden modificarse en el azúcar del ácido ribonucleico. Por ejemplo, el grupo 2' hidroxilo (OH) se puede modificar con o reemplazar por varios sustituyentes diferentes. Las sustituciones ejemplares en la posición 2’ incluyen, pero no se limitan a, H, halo, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido; ariloxi C6-10 opcionalmente sustituido; cicloalquilo C3-8 opcionalmente sustituido; cicloalcoxi C3-8 opcionalmente sustituido; ariloxi C6-10 opcionalmente sustituido; C6-10 arilo-C1-6 alcoxi opcionalmente sustituido, (heterociclil)oxi C1-12 opcionalmente sustituido; un azúcar (por ejemplo, ribosa, pentosa o cualquiera de las descritas en la presente memoria); un polietilenglicol (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR, en donde R es H o alquilo opcionalmente sustituido, y n es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 8, de 0 a 10, de 0 a 16, de 1 a 4, de 1 a 8, de 1 a 10, de 1 a 16, de 1 a 20, de 2 a 4, de 2 a 8, de 2 a 10, de 2 a 16, de 2 a 20, de 4 a 8, de 4 a 10, de 4 a 16 y de 4 a 20); ácidos nucleicos “bloqueados” (LNA, por sus siglas en inglés) en los que el 2’-hidroxilo está conectado por un puente alquileno C1-6 o heteroalquileno C1-6 al carbono 4' del mismo azúcar ribosa, en donde los puentes ejemplares incluyen puentes metileno, propileno, éter o amino; aminoalquilo, como se define en la presente memoria; aminoalcoxi, como se define en la presente memoria; amino, como se define en la presente memoria; y aminoácido, como se define en la presente memoria.
En general, el ARN incluye el grupo de azúcar ribosa, que es un anillo de 5 miembros que tiene un oxígeno.
Los nucleótidos modificados ejemplares, no limitativos, incluyen el reemplazo del oxígeno en la ribosa (por ejemplo, por S, Se o alquileno, tal como metileno o etileno); la adición de un doble enlace (por ejemplo, para reemplazar la ribosa por ciclopentenilo o ciclohexenilo); la contracción del anillo de ribosa (por ejemplo, para formar un anillo de 4 miembros de ciclobutano u oxetano); la expansión del anillo de ribosa (por ejemplo, para formar un anillo de 6 o 7 miembros que tenga un carbono o heteroátomo adicional, tal como para anhidroxol, altritol, manitol, ciclohexanilo, ciclohexenilo y morfolino, que también tiene una cadena principal de fosforamidato); formas multicíclicas (por ejemplo, triciclo; y formas "no bloqueadas", tales como ácido nucleico glicólico (GNA, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, R-GNA o S-GNA, en donde la ribosa se reemplaza por unidades de glicol unidas a enlaces fosfodiéster), ácido nucleico treósico (TNA (por sus siglas en inglés), en donde la ribosa se reemplaza por a-L-treofuranosilo- (3’—^ 2’)), y ácido peptidonucleico (APN, en donde unos enlaces 2-amino-etil-glicina reemplazan la cadena principal de fosfodiéster y ribosa). El grupo de azúcar también puede contener uno o más carbonos que posean la configuración estereoquímica opuesta a la del carbono correspondiente en la ribosa. Por lo tanto, una molécula de polinucleótido puede incluir nucleótidos que contengan, por ejemplo, arabinosa, como el azúcar. Tales modificaciones de azúcar se enseñan en las Publicaciones de Patente Internacional Nos WO2013052523 y WO2014093924.
(iii) Combinaciones de Modificaciones
Los polinucleótidos de la composición de la invención (es decir, un polinucleótido de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT o un fragmento funcional o una variante del mismo) pueden incluir una combinación de modificaciones del azúcar, la nucleobase, y/o el enlace internucleósido. Estas combinaciones pueden incluir una cualquiera o más de las modificaciones descritas en la presente memoria.
Pueden usarse combinaciones de nucleótidos modificados para formar los polinucleótidos. A menos que se indique lo contrario, los nucleótidos naturales de los polinucleótidos pueden estar completamente sustituidos por los nucleótidos modificados. Como ejemplo no limitativo, la uridina de nucleótido natural puede sustituirse por un nucleósido modificado descrito en la presente memoria. En otro ejemplo no limitativo, la uridina de nucleótido natural puede sustituirse o reemplazarse parcialmente (por ejemplo, aproximadamente un 0%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%) por al menos uno de los nucleósidos modificados divulgados en la presente memoria. Cualquier combinación de base/azúcar o enlazador puede incorporarse a los polinucleótidos y tales modificaciones se enseñan en las Publicaciones de Patente Internacional WO2013052523 y WO2014093924, y las Publicaciones de EE.UU. Nos US 20130115272 y US20150307542.
11. Regiones no T raducidas (UTR)
Las regiones no traducidas (UTR) son secciones de ácido nucleico de un polinucleótido antes de un codón de iniciación (5’ UTR) y después de un codón de parada (3’ UTR) que no se traducen. En algunas realizaciones, un polinucleótido (es decir, un ARN mensajero (ARNm)) que comprende un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de GALT comprende además UTR (por ejemplo, una 5’ UTR o fragmento funcional de la misma, una 3’ UTR o fragmento funcional de la misma, o una combinación de los mismos).
Una UTR puede ser homóloga o heteróloga con respecto a la región codificante en un polinucleótido. En algunas realizaciones, la UTR es homóloga con respecto al ORF que codifica el polipéptido de GALT. En algunas realizaciones, la UTR es heteróloga con respecto al ORF que codifica el polipéptido de GALT. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende dos o más 5' UTR o fragmentos funcionales de las mismas, cada uno de los cuales tiene las mismas o diferentes secuencias de nucleótidos. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende dos o más 3' UTR o fragmentos funcionales de las mismas, cada uno de los cuales tiene las mismas o diferentes secuencias de nucleótidos.
En algunas realizaciones, la 5’ UTR o fragmento funcional de la misma, la 3’ UTR o fragmento funcional de la misma, o cualquier combinación de los mismos se optimiza en cuanto a la secuencia.
En algunas realizaciones, la 5’ UTR o fragmento funcional de la misma, la 3’ UTR o fragmento funcional de la misma, o cualquier combinación de los mismos comprende al menos una nucleobase modificada químicamente, por ejemplo, 1-metilpseudouridina o 5-metoxiuracilo.
Las UTR pueden tener características que proporcionen un papel regulador, por ejemplo, estabilidad, localización, y/o eficiencia de traducción aumentadas o disminuidas. Un polinucleótido que comprenda una UTR puede administrarse a una célula, tejido u organismo, y una o más características reguladoras pueden medirse usando métodos de rutina. En algunas realizaciones, un fragmento funcional de una 5' UTR o 3' UTR comprende una o más características reguladoras de una 5' o 3’ UTR de longitud completa, respectivamente.
Las 5' UTR naturales tienen características que desempeñan papeles en la iniciación de la traducción. Albergan firmas como secuencias Kozak, de las que se sabe comúnmente que están involucradas en el proceso por el cual el ribosoma inicia la traducción de muchos genes. Las secuencias Kozak tienen el consenso CCR(A/G)CCAUGG, en donde R es una purina (adenina o guanina) tres bases en dirección 5' desde el codón de iniciación (AUG), que está seguido de otra 'G'. También se sabe que las 5' UTR forman estructuras secundarias que están involucradas en la unión del factor de elongación.
Adaptando por ingeniería las características que se encuentran típicamente en genes expresados abundantemente de órganos diana específicos, se pueden mejorar la estabilidad y la producción de proteínas de un polinucleótido. Por ejemplo, la introducción de 5' UTR de ARNm expresado en el hígado, tal como albúmina, amiloide A sérico, Apolipoproteína A/B/E, transferrina, alfa-fetoproteína, eritropoyetina o Factor VIII, puede mejorar la expresión de polinucleótidos en líneas celulares hepáticas o el hígado. Del mismo modo, el uso de 5’ UTR de otro ARNm específico de tejido para mejorar la expresión en ese tejido es posible para el músculo (por ejemplo, MyoD, Miosina, Mioglobina, Miogenina, Herculina), para las células endoteliales (por ejemplo, Tie-1, Cd 36), para las células mieloides (por ejemplo, C/EBP, AML1, G-CSF, GM-CSF, CD11b, m Sr , Fr-1, i-NOS), para los leucocitos (por ejemplo, CD45, c D18), para el tejido adiposo (por ejemplo, CD36, GLUT4, ACRP30, adiponectina) y para células epiteliales de pulmón (por ejemplo, SP-A/B/C/D).
En algunas realizaciones, las UTR se seleccionan de una familia de transcritos cuyas proteínas comparten una función, estructura, característica o propiedad común. Por ejemplo, un polipéptido codificado puede pertenecer a una familia de proteínas (es decir, que comparten al menos una función, estructura, característica, localización, origen o patrón de expresión), que se expresan en una célula, tejido concretos o en algún momento durante el desarrollo. Las UTR de cualquiera de los genes o ARNm pueden intercambiarse por cualquier otra UTR de la misma o diferente familia de proteínas para crear un nuevo polinucleótido.
En algunas realizaciones, la 5' UTR y la 3' UTR pueden ser heterólogas. En algunas realizaciones, la 5' UTR puede obtenerse de una especie diferente de la 3' UTR. En algunas realizaciones, la 3' UTR puede obtenerse de una especie diferente de la 5' UTR.
La Solicitud de Patente Internacional No PCT/US2014/021522 del mismo cesionario (Publicación No WO/2014/164253) proporciona un listado de UTR ejemplares que pueden utilizarse en el polinucleótido de la presente invención como regiones de flanqueo de un ORF.
Las UTR ejemplares de la solicitud incluyen, pero no se limitan a, una o más 5’ UTR y/o 3’ UTR obtenidas de la secuencia de ácido nucleico de: una globina, tal como una a- o p-globina (por ejemplo, una globina deXenopus,de ratón, de conejo o humana); una señal de iniciación de traducción Kozak fuerte; un CYBA (por ejemplo, polipéptido de citocromo b-245 a humano); una albúmina (por ejemplo, albúmina7 humana); una HSD17B4 (hidroxiesteroide (17-p) deshidrogenasa); un virus (por ejemplo, un virus del grabado del tabaco (TEV, por sus siglas en inglés), un virus de encefalitis equina venezolana (VEEV), un virus del Dengue, un citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, CMV inmediato temprano 1 (IE1, por sus siglas en inglés)), un virus de la hepatitis (por ejemplo, virus de la hepatitis B), un virus sindbis, o un virus de enanismo amarillo de la cebada PAV); una proteína de choque térmico (por ejemplo, hsp70); un factor de iniciación de traducción (por ejemplo, elF4G); un transportador de glucosa (por ejemplo, hGLUT 1 (transportador de glucosa humano 1)); una actina (por ejemplo, actina a o p humana); una GAPDH; una tubulina; una histona; una enzima del ciclo del ácido cítrico; una topoisomerasa (por ejemplo, una 5' UTR de un gen TOP que carezca del motivo 5'TOP (el tracto de oligopirimidina)); una proteína ribosómica Large 32 (L32); una proteína ribosómica (por ejemplo, proteína ribosómica humana o de ratón, tal como, por ejemplo, rps9); una ATP sintasa (por ejemplo, A<t p>5<a>1 o la subunidad p de la H+-ATP sintasa mitocondrial); una hormona de crecimiento e (por ejemplo, bovina (bGH) o humana (hGH)); un factor de elongación (por ejemplo, factor de elongación 1 a 1 (EEF1A1)); una manganeso superóxido dismutasa (MnSOD); un factor potenciador de miocitos 2A (MEF2A); una p-F1-ATPasa, una creatina cinasa, una mioglobina, un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF); un colágeno (por ejemplo, colágeno tipo I, alfa 2 (Col1A2), colágeno tipo I, alfa 1 (Col1A1), colágeno tipo V<i>, alfa 2 (Col6A2), colágeno tipo VI, alfa 1 (Col6A1)); una riboforina (por ejemplo, riboforina I (RPNI)); una proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (por ejemplo, LRP1); un factor de citocina de tipo cardiotrofina (por ejemplo, Nnt1); calreticulina (Calr); una procolágeno-lisina, 2-oxoglutarato 5-dioxigenasa 1 (Plod1); y una nucleobindina (por ejemplo, Nucb1).
En algunas realizaciones, la 5' UTR se selecciona del grupo que consiste en una 5' UTR de p-globina; una 5' UTR que contenga una señal de iniciación de traducción Kozak fuerte; una 5’ UTR de polipéptido de citocromo b-245 a (CYBA); una 5’ UTR de hidroxiesteroide (17-p) deshidrogenasa (HSD17B4); una 5’ UTR de virus del grabado del tabaco (TEV); una 5' UTR de virus de la encefalitis equina venezolana (TEEV); un marco de lectura abierta 5' proximal de ARN del virus de la rubéola (RV) que codifique proteínas no estructurales; una 5' UTR de virus del Dengue (DEN); una 5' UTR de proteína de choque térmico 70 (Hsp70); una 5' UTR de eIF4G; una 5' UTR de GLUT1; fragmentos funcionales de los mismos y cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la 3' UTR se selecciona del grupo que consiste en una 3' UTR de p-globina; una 3' UTR de CYBA; una 3' UTR de albúmina; una 3' UTR de hormona del crecimiento (GH); una 3' UTR de VEEV; una 3' UTR de virus de la hepatitis B (HBV); una 3' UTR de a-globina; una 3' UTR de DEN; una 3' UTR de virus de enanismo amarillo de la cebada PAV (BYDV-PAV); una 3' UTR de factor de elongación 1 a l (EEF1A1); una 3' UTR de manganeso superóxido dismutasa (MnSOD); una 3' UTR de subunidad p de la H(+)-ATP sintasa mitocondrial (p-mRNA); una 3' UTR de GLUT1; una 3' UTR de MEF2A; una 3' UTR de p-F1-ATPasa; fragmentos funcionales de las mismas y combinaciones de las mismas.
Pueden incorporarse a los polinucleótidos UTR de tipo silvestre obtenidas de cualquier gen o ARNm. En algunas realizaciones, una UTR puede alterarse en relación con una UTR de tipo silvestre o nativa para producir una UTR variante, por ejemplo, cambiando la orientación o ubicación de la UTR en relación con el ORF; o mediante la inclusión de nucleótidos adicionales, la deleción de nucleótidos, el intercambio o la transposición de nucleótidos. En algunas realizaciones, se pueden utilizar variantes de 5’ o 3’ UTR, por ejemplo, mutantes de UTR de tipo silvestre, o variantes en las que uno o más nucleótidos se añadan a o se eliminen de un extremo de la UTR.
Adicionalmente, se pueden usar una o más UTR sintéticas en combinación con una o más UTR no sintéticas. Véanse, por ejemplo, Mandal y Rossi, Nat. Protoc. 2013 8(3):568-82, y secuencias disponibles en www.addgene.org/Derrick _Rossi/.
Las UTR o porciones de las mismas pueden colocarse en la misma orientación que en el transcrito del que se seleccionaron o pueden alterarse en orientación o ubicación. Por lo tanto, una 5' UTR y/o 3’ UTR puede invertirse, acortarse, alargarse o combinarse con otra u otras 5' UTR o 3' UTR.
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende múltiples UTR, por ejemplo, una 5' UTR o 3' UTR doble, una triple o una cuádruple. Por ejemplo, una UTR doble comprende dos copias de la misma UTR, ya sea en serie o sustancialmente en serie. Por ejemplo, se puede usar una 3’ UTR de beta-globina doble (véase el documento US2010/0129877).
En ciertas realizaciones, los polinucleótidos de la composición de la invención comprenden una 5' UTR y/o una 3' UTR seleccionadas entre cualesquiera de las UTR divulgadas en la presente memoria. En algunas realizaciones, la 5' UTR comprende:
5’ UTR-001 (UTR en dirección 5') (GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC) (SEQ ID NO 35);
5’ UTR-002 (UTR en dirección 5') (GGGAGAUCAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC) (SEQ ID NO 36);
5’ UTR-003 (UTR en dirección 5') (véase SEQ ID NO 37);
5’ UTR-004 (UTR en dirección 5') (GGGAGACAAGCUUGGCAUUCCGGUACUGUUGGUAAAGCCACC) (SEQ ID NO 38);
5’ UTR-005 (UTR en dirección 5') (GGGAGAUCAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC) (SEQ ID NO 39);
5’ UTR-006 (UTR en dirección 5') (véase SEQ ID NO 40);
5’ UTR-007 (UTR en dirección 5') (GGGAGACAAGCUUGGCAUUCCGGUACUGUUGGUAAAGCCACC) (SEQ ID NO 41);
5’ UTR-008 (UTR en dirección 5') (GGGAAUUAACAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC) (SEQ ID NO 42);
5’ UTR-009 (UTR en dirección 5') (GGGAAAUUAGACAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC) (SEQ ID NO 43);
5’ UTR-010, en dirección 5' (GGGAAAUAAGAGAGUAAAGAACAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC) (SEQ ID NO 44);
5’ UTR-011 (UTR en dirección 5') (GGGAAAAAAGAGAGAAAAGAAGACUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC) (SEQ ID NO 45);
5’ UTR-012 (UTR en dirección 5') (GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAUAUAUAAGAGCCACC) (SEQ ID NO 46);
5’ UTR-013 (UTR en dirección 5')
(GGGAAAUAAGAGACAAAACAAGAG UAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC) (SEQ ID NO 47);
5’ UTR-014 (UTR en dirección 5')
(GGGAAAUUAGAGAGUAAAGAACAGUAAGUAGAAUUAAAAGAG CCACC) (SEQ ID NO 48);
5’ UTR-15 (UTR en dirección 5')
(GGGAAAUAAGAGAGAAUAGAAGAG UAAGAAGAAAUAUAAGAG CCACC) (SEQ ID NO 49);
5’ UTR-016 (UTR en dirección 5')
(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAG UAAGAAGAAAAUUAAGAG CCACC) (SEQ ID NO 50);
5’ UTR-017 (UTR en dirección 5'); o (GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAG UAAGAAGAAAUUUAAGAG CCACC) (SEQ ID NO 51);
5’ UTR-018 (UTR en dirección 5')5’ UTR (UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAG AG UAAGAAGAAAUAUAAGAG CCACC) (SEQ ID NO 52).
En algunas realizaciones, la 3' UTR comprende:
142-3p 3’ UTR (UTR que incluye el sitio de unión de miR142-3p) (UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUG GGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAG UGGGCGGC) (SEQ ID NO 53);
142-3p 3’ UTR (UTR que incluye el sitio de unión de miR142-3p) (UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACACAUGCUUCUUGCCCCUUG GGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAG UGGGCGGC) (SEQ ID NO 54); o
142-3p 3’ UTR (UTR que incluye el sitio de unión de miR142-3p) (UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAUG GGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAG UGGGCGGC) (SEQ ID NO 55);
142-3p 3’ UTR (UTR que incluye el sitio de unión de miR142-3p) (UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGUCCAUAAAG UAGGAAACACUACACCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGA GUGGGCGGC) (SEQ ID NO 56);
142-3p 3’ UTR (UTR que incluye el sitio de unión de miR142-3p) (UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUC CCCUUCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACACUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGA GUGGGCGGC) (SEQ ID NO 57);
142-3p 3’ UTR (UTR que incluye el sitio de unión de miR142-3p) (UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUC CCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGA GUGGGCGGC) (SEQ ID NO 58).
142-3p 3’ UTR (UTR que incluye el sitio de unión de miR142-3p) (UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUC CCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUUCCAUAAAGUAGGAAACACUACACUGA GUGGGCGGC) (SEQ ID NO 59);
3’ UTR-001 (UTR de Creatina Cinasa) (véase SEQ ID NO 60);
3’ UTR-002 (UTR de mioglobina) (véase SEQ ID NO 61);
3’ UTR-003 (UTR de a-actina) (véase SEQ ID NO 62);
3’ UTR-004 (UTR de Albúmina) (véase SEQ ID NO 63);
3’ UTR-005 (UTR de a-globina) (véase SEQ ID NO 64);
3’ UTR-006 (UTR de G-CSF) (véase SEQ ID NO 65);
3’ UTR-007 (UTR de Col1a2; colágeno, tipo I, alfa 2) (véase SEQ ID NO 66 );
3’ UTR-008 (UTR de Col6a2; colágeno, tipo VI, alfa 2) (véase SEQ ID NO 67);
3’ UTR-009 (UTR de RPN1; riboforina I) (véase SEQ ID NO 68);
3’ UTR-010 (UTR de LRP1; proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad) (véase SEQ ID NO 69);
3’ UTR-011 (UTR de Nnt1; factor 1 de citocinas de tipo cardiotrofina) (véase SEQ ID NO 70);
3’ UTR-012 (UTR de Col6a1; colágeno, tipo VI, alfa 1) (véase SEQ ID NO 71);
3’ UTR-013 (UTR de Calr; calreticulina) (véase SEQ ID NO 72);
3’ UTR-014 (UTR de Col1al; colágeno, tipo I, alfa 1) (véase SEQ ID NO 73);
3’ UTR-015 (UTR de Plod1; procolágeno-lisina, 2-oxoglutarato 5-dioxigenasa 1) (véase SEQ ID NO 74); 3’ UTR-016 (UTR de Nucb1; nucleobindina 1) (véase SEQ ID NO 75);
3’ UTR-017 (a-globina) (véase SEQ ID NO 76);
3’ UTR-018 (véase SEQ ID NO 77);
3’ UTR (variante 1 de los sitios de unión de miR142 y miR126) (UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUG GGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCCGCAUUAUUACUCACGGUACGAG UGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC) (SEQ ID NO 98)
3’ UTR (variante 2 de los sitios de unión de miR142 y miR126) (UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUG GGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCCGCAUUAUUACUCACGGUACGAG UGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC) (SEQ ID NO 163); o
3’ UTR (variante 3 del sitio de unión de miR142-3p) UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUC CCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGA GUGGGCGGC (SEQ ID NO 164).
En ciertas realizaciones, la secuencia de 5' UTR y/o 3' UTR comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99% o aproximadamente un 100% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en secuencias de 5' UTR que comprenden cualquiera de las SEQ ID NOs: 35-52 o 109-111 y/o secuencias de 3’ UTR que comprenden cualquiera de las SEQ ID NOs: 53 a 77, 79, 97, 98, 101 a 108 , 112 y 163 a 173, y cualquier combinación de las mismas.
Los polinucleótidos pueden comprender combinaciones de características. Por ejemplo, el ORF puede estar flanqueado por una 5' UTR que comprenda una señal de iniciación de traducción Kozak fuerte y/o una 3' UTR que comprenda una secuencia de oligo(dT) para la adición moldeada de una cola de poli-A. Una 5' UTR puede comprender un primer fragmento de polinucleótido y un segundo fragmento de polinucleótido de las mismas y/o diferentes u Tr (véase, por ejemplo, el documento US2010/0293625).
Pueden usarse otras secuencias que no sean UTR como regiones o subregiones dentro de los polinucleótidos. Por ejemplo, se pueden incorporar intrones o porciones de secuencias de intrones a los polinucleótidos. La incorporación de secuencias intrónicas puede aumentar la producción de proteínas, así como los niveles de expresión de polinucleótidos. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES, por sus siglas en inglés) en lugar de o además de una u Tr (véase, por ejemplo, Yakubov et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010 394(1):189- 193). En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un IRES en lugar de una secuencia de 5' UTR. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un ORF y una secuencia de cápside viral. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una 5' UTR sintética en combinación con una 3' UTR no sintética.
En algunas realizaciones, la UTR también puede incluir al menos un polinucleótido potenciador de la traducción, elemento potenciador de la traducción o elementos potenciadores de la traducción (colectivamente, "TEE", que se refiere a secuencias de ácido nucleico que aumentan la cantidad de polipéptido o proteína producidos a partir de un polinucleótido. Como ejemplo no limitativo, el TEE puede incluir los descritos en el documento US2009/0226470, y otros conocidos en la técnica. Como ejemplo no limitativo, el TEE puede estar ubicado entre el promotor de transcripción y el codón de iniciación. En algunas realizaciones, la 5' UTR comprende un TEE.
En un aspecto, un TEE es un elemento conservado en una UTR que puede promover la actividad de traducción de un ácido nucleico tal como, pero sin limitarse a, traducción dependiente del casquete o independiente del casquete.
En un ejemplo no limitativo, el TEE comprende la secuencia de TEE en la líder 5’ de la proteína del homeodominio Gtx. Véase Chappell et al., PNAS 2004 101:9590-9594.
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una o múltiples copias de un TEE. El TEE en un polinucleótido potenciador de la traducción puede estar organizado en uno o más segmentos de secuencia. Un segmento de secuencia puede albergar uno o más de los TEE proporcionados en la presente memoria, estando presente cada TEE en una o más copias. Cuando múltiples segmentos de secuencia están presentes en un polinucleótido potenciador de la traducción, pueden ser homogéneos o heterogéneos. Por lo tanto, los múltiples segmentos de secuencia en un polinucleótido potenciador de la traducción pueden albergar tipos idénticos o diferentes del TEE proporcionado en la presente memoria, un número idéntico o diferente de copias de cada uno de los TEE, y/o una organización idéntica o diferente del TEE dentro de cada segmento de secuencia. En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia de polinucleótido potenciador de la traducción. Ejemplos no limitativos de secuencias de TEE se describen en la Publicación de EE.UU. 2014/0200261.
12. Sitios de Unión de MicroARN (miARN)
Los polinucleótidos de la composición de la invención pueden incluir elementos reguladores, por ejemplo, sitios de unión de microARN (miARN), sitios de unión de factor de transcripción, secuencias y/o motivos de ARNm estructurados, sitios de unión artificiales adaptados para hacer de pseudorreceptores para moléculas de unión a ácido nucleico endógeno, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los polinucleótidos que incluyen tales elementos reguladores se denominan como que incluyen “secuencias de sensores”. Ejemplos no limitativos de secuencias de sensores se describen en la Publicación de EE.UU. 2014/0200261.
En algunas realizaciones, un polinucleótido (es decir, un ARN mensajero (ARNm)) comprende un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de interés y además comprende uno o más sitios de unión de miARN. La inclusión o incorporación de uno o varios sitios de unión de miARN proporciona la regulación de polinucleótidos y, a su vez, de los polipéptidos codificados a partir de los mismos, basándose en la expresión específica de tejido y/o específica de tipo celular de miARN de origen natural.
La presente invención también proporciona composiciones y formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos anteriormente. La formulación o composición además comprende un agente de administración.
En algunas realizaciones, la composición o formulación puede contener un polinucleótido de ARNm que comprenda una secuencia de ácido nucleico optimizada en cuanto a la secuencia divulgada en la presente memoria que codifica un polipéptido. En algunas realizaciones, la composición o formulación puede contener un polinucleótido (es decir, un ARNm), que comprende un polinucleótido (es decir, un ORF) que tiene una identidad de secuencia significativa con una secuencia de ácido nucleico optimizada en cuanto a la secuencia divulgada en la presente memoria que codifica un polipéptido. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende además un sitio de unión de miARN, por ejemplo, un sitio de unión de miARN que se une.
Un miARN, por ejemplo, un miARN de origen natural, es un ARN no codificante de 19-25 nucleótidos de longitud que se une a un polinucleótido y regula negativamente la expresión génica ya sea reduciendo la estabilidad o inhibiendo la traducción del polinucleótido. Una secuencia de miARN comprende una región "semilla", es decir, una secuencia en la región de las posiciones 2-8 del miARN maduro. Una semilla de miARN puede comprender las posiciones 2-8 o 2-7 del miARN maduro. En algunas realizaciones, una semilla de miARN puede comprender 7 nucleótidos (por ejemplo, nucleótidos 2-8 del miARN maduro), en donde el sitio complementario de la semilla en el sitio de unión de miARN correspondiente está flanqueado por una adenosina (A) opuesta a la posición 1 de miARN. En algunas realizaciones, una semilla de miARN puede comprender 6 nucleótidos (por ejemplo, nucleótidos 2-7 del miARN maduro), en donde el sitio complementario de la semilla en el sitio de unión de miARN correspondiente está flanqueado por una adenosina (A) opuesta a la posición 1 de miARN. Véase, por ejemplo, Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 2007 Jul 6;27(1 ):91-105. Se puede llevar a cabo un perfilado de miARN de las células o tejidos diana para determinar la presencia o ausencia de miARN en las células o tejidos. En algunas realizaciones, un polinucleótido (es decir, un ARN mensajero (ARNm)) comprende uno o más sitios de unión de microARN, secuencias diana de microARN, secuencias complementarias de microARN o secuencias complementarias de semilla de microARN. Tales secuencias pueden corresponder a, por ejemplo, tener complementariedad con, cualquier microARN conocido tal como los enseñados en la Publicación de EE.UU. US2005/0261218 y la Publicación de EE.UU. US2005/0059005.
Los microARN se obtienen enzimáticamente de regiones de transcritos de ARN que se pliegan sobre sí mismos para formar estructuras de horquilla cortas a menudo denominadas pre-miARN (miARN precursor). Un premiARN típicamente tiene una parte sobresaliente de dos nucleótidos en su extremo 3’, y tiene grupos 3' hidroxilo y 5' fosfato. Este ARNm precursor se procesa en el núcleo y posteriormente se transporta al citoplasma, en donde se es procesado adicionalmente por DICER (una enzima RNasa III), para formar un microARN maduro de aproximadamente 22 nucleótidos. El microARN maduro se incorpora a continuación a una partícula ribonuclear para formar el complejo de silenciamiento inducido por ARN, RISC, que media el silenciamiento génico. La nomenclatura reconocida en la técnica para los miARN maduros designa típicamente el brazo del pre-miARN del que se obtiene el miARN maduro; “5p” significa que el microARN es del brazo principal 5 de la horquilla de pre-miARN y “3p” significa que el microARN es del extremo principal 3 de la horquilla de pre-miARN. Un miR al que se haga referencia por número en la presente memoria puede referirse a cualquiera de los dos microARN maduros que se originan en brazos opuestos del mismo pre-miARN (por ejemplo, ya sea el microARN 3p o 5p). Todos los miR a los que se haga referencia en la presente memoria están destinados a incluir los brazos/secuencias tanto 3p como 5p, a menos que se especifique particularmente mediante la designación 3p o 5p.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “sitio de unión de microARN (miARN o miR)” se refiere a una secuencia dentro de un polinucleótido, por ejemplo, dentro de un ADN o dentro de un transcrito de ARN, incluyendo en la 5’ UTR y/o 3’ UTR, que tiene complementariedad suficiente con la totalidad o una región de un miARN para interactuar con, asociarse con o unirse al miARN. En algunas realizaciones, un polinucleótido que comprende un ORF que codifica un polipéptido de interés comprende además uno o más sitios de unión de miARN. En realizaciones ejemplares, una 5' UTR y/o 3' UTR del polinucleótido (es decir, un ARN mensajero (ARNm)) comprende los uno o más sitios de unión de miARN.
Un sitio de unión de miARN que tiene complementariedad suficiente con un miARN se refiere a un grado de complementariedad suficiente para facilitar la regulación mediada por miARN de un polinucleótido, por ejemplo, la represión traduccional o la degradación del polinucleótido mediadas por miARN. En aspectos ejemplares, un sitio de unión de miARN que tiene complementariedad suficiente con el miARN se refiere a un grado de complementariedad suficiente para facilitar la degradación del polinucleótido mediada por miARN, por ejemplo, la escisión del ARNm mediada por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, por sus siglas en inglés) guiado por miARN. El sitio de unión de miARN puede tener complementariedad con, por ejemplo, una secuencia de miARN de 19-25 nucleótidos de longitud, con una secuencia de miARN de 19-23 nucleótidos de longitud, o con una secuencia de miARN de 22 nucleótidos de longitud. Un sitio de unión de miARN puede ser complementario a sólo una porción de un miARN, por ejemplo, a una porción inferior a 1, 2, 3 o 4 nucleótidos de la longitud completa de una secuencia de miARN de origen natural, o a una porción menos de 1, 2, 3 o 4 nucleótidos más corta que una secuencia de miARN de origen natural. Se prefiere una complementariedad total o completa (por ejemplo, complementariedad total o complementariedad completa a lo largo de la totalidad o una parte significativa de la longitud de un miARN de origen natural) cuando la regulación deseada es la degradación del ARNm.
En algunas realizaciones, un sitio de unión de miARN incluye una secuencia que tiene complementariedad (por ejemplo, complementariedad parcial o completa) con una secuencia de semilla de miARN. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN incluye una secuencia que tiene complementariedad completa con una secuencia de semilla de miARN. En algunas realizaciones, un sitio de unión de miARN incluye una secuencia que tiene complementariedad (por ejemplo, complementariedad parcial o completa) con una secuencia de miARN. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN incluye una secuencia que tiene complementariedad completa con una secuencia de miARN. En algunas realizaciones, un sitio de unión de miARN tiene complementariedad completa con una secuencia de miARN, pero para 1, 2 o 3 sustituciones de nucleótidos, adiciones terminales y/o truncamientos.
En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN tiene la misma longitud que el miARN correspondiente. En otras realizaciones, el sitio de unión de miARN es uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce nucleótidos más corto que el miARN correspondiente en el extremo 5’, el extremo 3’, o ambos. En otras realizaciones más, el sitio de unión de microARN es dos nucleótidos más corto que el microARN correspondiente en el extremo 5’, el extremo 3’, o ambos. Los sitios de unión de miARN que son más cortos que los miARN correspondientes todavía son capaces de degradar el ARNm que incorpora uno o más de los sitios de unión de miARN o evitar la traducción del ARNm.
En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN se une al miARN maduro correspondiente que forma parte de una Dicer que contiene RISC activo. En otra realización, la unión del sitio de unión de miARN al miARN correspondiente en RISC degrada el ARNm que contiene el sitio de unión de miARN o evita que el ARNm se traduzca. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN tiene complementariedad suficiente con miARN para que un complejo RISC que comprenda el miARN escinda el polinucleótido que comprende el sitio de unión de miARN. En otras realizaciones, el sitio de unión de miARN tiene una complementariedad imperfecta, de modo que un complejo RISC que comprenda el miARN induzca inestabilidad en el polinucleótido que comprende el sitio de unión de miARN. En otra realización, el sitio de unión de miARN tiene una complementariedad imperfecta, de modo que un complejo RISC que comprenda el miARN reprima la transcripción del polinucleótido que comprende el sitio de unión de miARN.
En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce malapareamientos con respecto al miARN correspondiente.
En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN tiene al menos aproximadamente diez, al menos aproximadamente once, al menos aproximadamente doce, al menos aproximadamente trece, al menos aproximadamente catorce, al menos aproximadamente quince, al menos aproximadamente dieciséis, al menos aproximadamente diecisiete, al menos aproximadamente dieciocho, al menos aproximadamente diecinueve, al menos aproximadamente veinte, o al menos aproximadamente veintiún nucleótidos contiguos complementarios a al menos aproximadamente diez, al menos aproximadamente once, al menos aproximadamente doce, al menos aproximadamente trece, al menos aproximadamente catorce, al menos aproximadamente quince, al menos aproximadamente dieciséis, al menos aproximadamente diecisiete, al menos aproximadamente dieciocho, al menos aproximadamente diecinueve, al menos aproximadamente veinte, o al menos aproximadamente veintiún, respectivamente, nucleótidos contiguos del miARN correspondiente.
Introduciendo por ingeniería uno o más sitios de unión de miARN en un polinucleótido, el polinucleótido puede ser guiado para degradación o traducción reducida, siempre que el miARN en cuestión esté disponible. Esto puede reducir los efectos no intencionados tras la administración del polinucleótido. Por ejemplo, si un polinucleótido "o" no está destinado a ser aportado a un tejido o célula pero termina en dicho tejido o célula, entonces un miARN abundante en el tejido o célula puede inhibir la expresión del gen de interés si uno o múltiples sitios de unión del miARN se introducen por ingeniería en la 5’ UTR y/o 3’ UTR del polinucleótido. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la incorporación de uno o más sitios de unión de miARN en un ARNm de la divulgación puede reducir el riesgo de efectos no intencionados sobre la administración de moléculas de ácido nucleico y/o permitir la regulación específica de tejido de la expresión de un polipéptido codificado por el ARNm. En otras realizaciones más, la incorporación de uno o más sitios de unión de miARN en un ARNm de la divulgación puede modular las respuestas inmunitarias tras la administración de ácido nucleicoin vivo.En realizaciones adicionales, la incorporación de uno o más sitios de unión de miARN a un ARNm de la divulgación puede modular el aclaramiento sanguíneo acelerado (ABC) de compuestos que comprenden lípidos y composiciones descritas en la presente memoria.
A la inversa, pueden eliminarse sitios de unión de miARN de secuencias de polinucleótidos en las que estén presentes de forma natural con el fin de aumentar la expresión de proteínas en tejidos específicos. Por ejemplo, un sitio de unión para un miARN específico se puede eliminar de un polinucleótido para mejorar la expresión de proteínas en tejidos o células que contengan el miARN.
La regulación de la expresión en múltiples tejidos se puede lograr a través de la introducción o eliminación de uno o más sitios de unión de miARN, por ejemplo, uno o más sitios de unión de miARN distintos. La decisión de retirar o insertar un sitio de unión de miARN se puede tomar basándose en patrones de expresión de miARN y/o sus perfiles en tejidos y/o células en desarrollo y/o enfermedad. Se ha informado de la identificación de miARN, sitios de unión de miARN, y sus patrones de expresión y papeles en la biología (por ejemplo, Bonauer et al., Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand y Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras y Rao Leukemia 2012 26:404-413 (2011 Dec 20. doi:10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf et al, Cell, 2007 129: 1401-1414; Gentner y Naldini, Tissue Antigens. 2012 80:393-403 y todas las referencias en los mismos).
Los miARN y los sitios de unión de miARN pueden corresponder a cualquier secuencia conocida, incluyendo ejemplos no limitativos descritos en las publicaciones de EE.UU. Nos 2014/0200261, 2005/0261218 y 2005/0059005.
Los ejemplos de tejidos en los que se sabe que los miARN regulan el ARNm, y por lo tanto la expresión de proteínas, incluyen, pero no se limitan a, hígado (miR-122), músculo (miR-133, miR-206, miR-208), células endoteliales (miR-17-92, miR-126), células mieloides (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), tejido adiposo (let-7, miR-30c), corazón (miR-1d, miR-149), riñón (miR-192, miR-194, miR-204) y células epiteliales pulmonares (let-7, miR-133, miR-126).
Específicamente, se sabe que los miARN se expresan de forma diferencial en células inmunitarias (también llamadas células hematopoyéticas), tales como células presentadoras de antígeno (APC, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, células dendríticas y macrófagos), macrófagos, monocitos, linfocitos B, linfocitos T, granulocitos, células asesinas naturales, etc. Los miARN específicos de células inmunitarias están involucrados en la inmunogenicidad, la autoinmunidad, la respuesta inmunitaria a la infección, la inflamación, así como la respuesta inmunitaria no deseada después de la terapia génica y el trasplante de tejido/órgano. Los miARN específicos de células inmunitarias también regulan muchos aspectos del desarrollo, proliferación, diferenciación y apoptosis de células hematopoyéticas (células inmunitarias). Por ejemplo, miR-142 y miR-146 se expresan exclusivamente en células inmunitarias, particularmente abundantes en células dendríticas mieloides. Se ha demostrado que la respuesta inmunitaria a un polinucleótido se puede interrumpir añadiendo sitios de unión de miR-142 a la 3’-UTR del polinucleótido, permitiendo una transferencia génica más estable en tejidos y células. miR-142 degrada eficientemente polinucleótidos exógenos en células presentadoras de antígeno y suprime la eliminación citotóxica de células transducidas (por ejemplo, Annoni A et al., blood, 2009, 114, 5152-5161; Brown BD, et al., Nat med.2006, 12(5), 585-591; Brown BD, et al., blood, 2007, 110(13): 4144 4152).
Una respuesta inmunitaria mediada por antígeno puede referirse a una respuesta inmunitaria desencadenada por antígenos ajenos, que, cuando entran en un organismo, son procesados por las células presentadoras de antígeno y presentados en la superficie de las células presentadoras de antígeno. Las células T pueden reconocer el antígeno presentado e inducir una eliminación citotóxica de células que expresen el antígeno.
La introducción de un sitio de unión de miR-142 en la 5' UTR y/o 3' UTR de un polinucleótido puede reprimir selectivamente la expresión génica en las células presentadoras de antígeno a través de la degradación mediada por miR-142, limitando la presentación de antígeno en las células presentadoras de antígeno (por ejemplo, células dendríticas) y evitando así la respuesta inmunitaria mediada por antígeno después dla administración del polinucleótido. El polinucleótido se expresa entonces establemente en tejidos o células diana sin desencadenar la eliminación citotóxica.
En una realización, pueden introducirse por ingeniería en un polinucleótido sitios de unión para miARN que se sepa que se expresan en células inmunitarias, en particular, células presentadoras de antígeno, para suprimir la expresión del polinucleótido en células presentadoras de antígeno a través de la degradación de ARN mediada por miARN, sometiendo la respuesta inmunitaria mediada por antígeno. La expresión del polinucleótido se mantiene en células no inmunitarias donde los miARN específicos de células inmunitarias no se expresan. Por ejemplo, en algunas realizaciones, para evitar una reacción inmunogénica contra una proteína específica del hígado, se puede eliminar cualquier sitio de unión de miR-122 y se puede introducir por ingeniería un sitio de unión de miR-142 (y/o mirR-146) en la 5’ UTR y/o 3’ UTR de un polinucleótido.
Para impulsar adicionalmente la degradación y supresión selectivas en APC y macrófagos, un polinucleótido puede incluir un elemento regulador negativo adicional en la 5' UTR y/o 3' UTR, ya sea solo o en combinación con sitios de unión de miR-142 y/o miR-146. Como un ejemplo no limitativo, el elemento regulador negativo adicional es un Elemento de Descomposición Constitutivo (c De , por sus siglas en inglés).
Los miARN específicos de células inmunitarias incluyen, pero no se limitan a, hsa-let-7a-2-3p, hsa-let-7a-3p, hsa-7a-5p, hsa-let-7c, hsa-let-7e-3p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7g-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-3p, hsa-let-7i-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-1184 , hsa-let-7f-1--3p, hsa-let-7f-2--5p, hsa-let-7f-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, miR-125b-5p, miR-1279, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-132-3p, miR-132-5p, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-143-3p, miR-143-5p, miR-146a-3p, miR-146a-5p, miR-146b-3p, miR-146b-5p, miR-147a, miR-147b, miR-148a-5p, miR-148a-3p, miR-150-3p, miR-150-5p, miR-151b, miR-155-3p, miR-155-5p, miR-15a-3p, miR-15a-5p, miR-15b-5p, miR-15b-3p, miR-16-1-3p, miR-16-2-3p, miR-16-5p, miR-17-5p, miR-181a-3p, miR-181a-5p, miR-181a-2-3p, miR-182-3p, miR-182-5p, miR-197-3p, miR-197-5p, miR-21-5p, miR-21-3p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-223-3p, miR-223-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR-23b-3p, miR-23b-5p, miR-24-1-5p,miR-24-2-5p, miR-24-3p, miR-26a-1-3p, miR-26a-2-3p, miR-26a-5p, miR-26b-3p, miR-26b-5p, miR-27a-3p, miR-27a-5p, miR-27b-3p,miR-27b-5p, miR-28-3p, miR-28-5p, miR-2909, miR-29a-3p, miR-29a-5p, miR-29b-1-5p, miR-29b-2-5p, miR-29c-3p, miR-29c-5p,, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-331-5p, miR-339-3p, miR-339-5p, miR-345-3p, miR-345-5p, miR-346, miR-34a-3p, miR-34a-5p, miR-363-3p, miR-363-5p, miR-372, miR-377-3p, miR-377-5p, miR-493-3p, miR-493-5p, miR-542, miR-548b-5p, miR548c-5p, miR-548i, miR-548j, miR-548n, miR-574-3p, miR-598, miR-718, miR-935, miR-99a-3p, miR-99a-5p, miR-99b-3p y miR-99b-5p. Además, pueden identificarse nuevos miARN en células inmunitarias mediante hibridación de micromatrices y análisis de microtomos (por ejemplo, Jima DD et al., Blood, 2010, 116:e118-e127; Vaz C et al., BMC Genomics, 2010, 11,288).
Los miRNA que se sabe que se expresan en el hígado incluyen, pero no se limitan a, miR-107, miR-122-3p, miR-122-5p, miR-1228-3p, miR-1228-5p, miR-1249, miR-129-5p, miR-1303, miR-151a-3p, miR-151a-5p, miR-152, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-3p, miR-199b-5p, miR-296-5p, miR-557, miR-581, miR-939-3p y miR-939-5p. Pueden introducirse en o eliminarse de un polinucleótido sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico del hígado para regular la expresión del polinucleótido en el hígado. Los sitios de unión de miARN específico del hígado se pueden realizar por ingeniería solos o además en combinación con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) en un polinucleótido.
Los miARN que se sabe que se expresan en el pulmón incluyen, pero no se limitan a, let-7a-2-3p, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-127-3p, miR-127-5p, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-130b-3p, miR-130b-5p, miR-133a, miR-133b, miR-134, miR-18a-3p, miR-18a-5p, miR-18b-3p, miR-18b-5p, miR-24-1-5p, miR-24-2-5p, miR-24-3p, miR-296-3p, miR-296-5p, miR-32-3p, miR-337-3p, miR-337-5p, miR-381-3p y miR-381-5p. Pueden introducirse en o eliminarse de un polinucleótido sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico del pulmón para regular la expresión del polinucleótido en el pulmón. Los sitios de unión de miARN específico del pulmón se pueden realizar por ingeniería solos o además en combinación con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) en un polinucleótido.
Los miARN que se sabe que se expresan en el corazón incluyen, pero no se limitan a, miR-1, miR-133a, miR-133b, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-186-3p, miR-186-5p, miR-208a, miR-208b, miR-210, miR-296-3p, miR-320, miR-451a, miR-451b, miR-499a-3p, miR-499a-5p, miR-499b-3p, miR-499b-5p, miR-744-3p, miR-744-5p, miR-92b-3p y miR-92b-5p. Pueden introducirse en o eliminarse de un polinucleótido sitios de unión de miARN de cualquier microARN específico del corazón para regular la expresión del polinucleótido en el corazón. Los sitios de unión de miARN específico del corazón se pueden realizar por ingeniería solos o además en combinación con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) en un polinucleótido.
Los miARN que se sabe que se expresan en el sistema nervioso incluyen, pero no se limitan a, miR-124-5p, miR-125a-3p, miR-125a-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, miR-125b-5p,miR-1271-3p, miR-1271-5p, miR-128, miR-132-5p, miR-135a-3p, miR-135a-5p, miR-135b-3p, miR-135b-5p, miR-137, miR-139-5p, miR-139-3p, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-153, miR-181c-3p, miR-181c-5p, miR-183-3p, miR-183-5p, miR-190a, miR-190b, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR-30c-5p, miR-30d-3p, miR-30d-5p, miR-329, miR-342-3p, miR-3665, miR-3666, miR-380-3p, miR-380-5p, miR-383, miR-410, miR-425-3p, miR-425-5p, miR-454-3p, miR-454-5p, miR-483, miR-510, miR-516a-3p, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-571, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-7-5p, miR-802, miR-922, miR-9-3p y miR-9-5p. Los miARN enriquecidos en el sistema nervioso incluyen además aquellos expresados específicamente en neuronas, que incluyen, pero no se limitan a, miR-132-3p, miR-132-3p, miR-148b-3p, miR-148b-5p, miR-151a-3p, miR-151a-5p, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-320b, miR-320e, miR-323a-3p, miR-323a-5p, miR-324-5p, miR-325, miR-326, miR-328, miR-922 y los expresados específicamente en células gliales, que incluyen, pero no se limitan a, miR-1250, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR-219-5p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-3065-3p, miR-3065-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-338-5p y miR-657. Pueden introducirse en o eliminarse de un polinucleótido sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico del SNC para regular la expresión del polinucleótido en el sistema nervioso. Los sitios de unión de miARN específico del sistema nervioso se pueden realizar por ingeniería solos o además en combinación con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) en un polinucleótido.
Los miARN que se sabe que se expresan en el páncreas incluyen, pero no se limitan a, miR-105-3p, miR-105-5p, miR-184, miR-195-3p, miR-195-5p, miR-196a-3p, miR-196a-5p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-216a-3p, miR-216a-5p, miR-30a-3p, miR-33a-3p, miR-33a-5p, miR-375, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-493-3p, miR-493-5p y miR-944. Pueden introducirse en o eliminarse de un polinucleótido sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico del páncreas para regular la expresión del polinucleótido en el páncreas. Los sitios de unión de miARN específico del páncreas se pueden realizar por ingeniería solos o además en combinación con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) en un polinucleótido.
Los miRNA que se sabe que se expresan en el riñón incluyen, pero no se limitan a, miR-122-3p, miR-145-5p, miR-17-5p, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-20a-3p, miR-20a-5p, miR-204-3p, miR-204-5p, miR-210, miR-216a-3p, miR-216a-5p, miR-296-3p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR30c-5p, miR-324-3p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-363-3p, miR-363-5p y miR-562. Pueden introducirse en o eliminarse de un polinucleótido sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico del riñón para regular la expresión del polinucleótido en el riñón. Los sitios de unión de miARN específico del riñón se pueden realizar por ingeniería solos o además en combinación con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) en un polinucleótido.
Los miARN que se sabe que se expresan en el músculo incluyen, pero no se limitan a, let-7g-3p, let-7g-5p, miR-1, miR-1286, miR-133a, miR-133b, miR-140-3p, miR-143-3p, miR-143-5p, miR-145-3p, miR-145-5p, miR-188-3p, miR-188-5p, miR-206, miR-208a, miR-208b, miR-25-3p y miR-25-5p. Pueden introducirse en o eliminarse de un polinucleótido de la invención sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico del músculo para regular la expresión del polinucleótido en el músculo. Los sitios de unión de miARN específico del músculo se pueden realizar por ingeniería solos o además en combinación con sitios de unión de miARN de células inmunitarias (por ejemplo, APC) en un polinucleótido.
Los miARN también se expresan de forma diferencial en diferentes tipos de células, tales como, pero sin limitarse a, células endoteliales, células epiteliales y adipocitos.
Los miARN que se sabe que se expresan en células endoteliales incluyen, pero no se limitan a, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-100-3p, miR-100-5p, miR-101-3p, miR-101-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-1236-3p, miR-1236-5p, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18a-3p, miR-18a-5p, miR-19a-3p, miR-19a-5p, miR-19b-1-5p, miR-19b-2-5p, miR-19b-3p, miR-20a-3p, miR-20a-5p, miR-217, miR-210, miR-21-3p, miR-21-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p, miR-222-5p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-296-5p, miR-361-3p, miR-361-5p, miR-421, miR-424-3p, miR-424-5p, miR-513a-5p, miR-92a-1-5p, miR-92a-2-5p, miR-92a-3p, miR-92b-3p y miR-92b-5p. Se descubren muchos nuevos miARN en células endoteliales a partir de análisis de secuenciación profunda (por ejemplo, Voellenkle C et al., RNA, 2012, 18, 472-484). Pueden introducirse en o eliminarse de un polinucleótido sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico de células endoteliales para regular la expresión del polinucleótido en las células endoteliales.
Los miARN que se sabe que se expresan en células epiteliales incluyen, pero no se limitan a, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-1246, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-338-3p, miR-429, miR-451a, miR-451b, miR-494, miR-802 y miR-34a, miR-34b-5p, miR-34c-5p, miR-449a, miR-449b-3p, miR-449b-5p específicos en células epiteliales ciliadas respiratorias, familia let-7, miR-133a, miR-133b, miR-126 específicos en células epiteliales de pulmón, miR-382-3p, miR-382-5p específicos en células epiteliales renales, y miR-762 específico en células epiteliales corneales. Pueden introducirse en o eliminarse de un polinucleótido sitios de unión de miARN de cualquier miARN específico de células epiteliales para regular la expresión del polinucleótido en las células epiteliales.
Además, un gran grupo de miARN están enriquecidos en células pluripotenciales embrionarias, controlando la autorrenovación de las células pluripotenciales, así como el desarrollo y/o la diferenciación de diversos linajes celulares, tales como células neuronales, cardiacas, células hematopoyéticas, células de la piel, células osteogénicas y células musculares (por ejemplo, Kuppusamy KT et al., Curr. Mol Med, 2013, 13(5), 757-764; Vidigal JA y Ventura A, Semin Cancer Biol. 2012, 22(5-6), 428-436; Goff LA et al., PLoS One, 2009, 4:e7192; Morin RD et al., Genome Res,2008, 18, 610-621; Yoo JK et al., Stem Cells Dev. 2012, 21(11), 2049-2057). Los miARN abundantes en células pluripotenciales embrionarias incluyen, pero no se limitan a, let-7a-2-3p, let-a-3p, let-7a-5p, let7d-3p, let-7d-5p, miR-103a-2-3p, miR-103a-5p, miR-106b-3p, miR-106b-5p, miR-1246, miR-1275, miR-138-1-3p, miR-138-2-3p, miR-138-5p, miR-154-3p, miR-154-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-290, miR-301a-3p, miR-301a-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-302b-3p, miR-302b-5p, miR-302c-3p, miR-302c-5p, miR-302d-3p, miR-302d-5p, miR-302e, miR-367-3p, miR-367-5p, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-370, miR-371, miR-373, miR-380-5p, miR-423-3p, miR-423-5p, miR-486-5p, miR-520c-3p, miR-548e, miR-548f, miR-548g-3p, miR-548g-5p, miR-548i, miR-548k, miR-5481, miR-548m, miR-548n, miR-548o-3p, miR-548o-5p, miR-548p, miR-664a-3p, miR-664a-5p, miR-664b-3p, miR-664b-5p, miR-766-3p, miR-766-Sp, miR-885-3p, miR-885-5p,miR-93-3p, miR-93-5p, miR-941,miR-96-3p, miR-96-5p, miR-99b-3p y miR-99b-5p. Muchos miARN nuevos predichos se descubren mediante secuenciación profunda en células pluripotenciales embrionarias humanas (por ejemplo, Morin RD et al., Genome Res,2008, 18, 610-621; Goff LA et al., PLoS One, 2009, 4:e7192; Bar M et al., Stem cells, 2008, 26, 2496-2505).
En algunas realizaciones, los miARN se seleccionan basándose en la expresión y abundancia en células inmunitarias del linaje hematopoyético, tales como células B, células T, macrófagos, células dendríticas y células que se sabe que expresan TLR7/TLR8 y/o son capaces de secretar citocinas tales como células endoteliales y plaquetas. En algunas realizaciones, el conjunto de miARN incluye así miR que pueden ser responsables en parte de la inmunogenicidad de estas células, y de tal manera que una incorporación de sitio miR correspondiente en polinucleótidos (es decir, ARNm) podría conducir a la desestabilización del ARNm y/o la supresión de la traducción de estos ARNm en el tipo de célula específico. Los ejemplos representativos no limitativos incluyen miR-142, miR-144, miR-150, miR-155 y miR-223, que son específicos para muchas de las células hematopoyéticas; miR-142, miR150, miR-16 y miR-223, que se expresan en células B; miR-223, miR-451, miR-26a, miR-16, que se expresan en células hematopoyéticas progenitoras; y miR-126, que se expresa en células dendríticas plasmocitoides, plaquetas y células endoteliales. Para una exposición adicional de la expresión tisular de los miR véanse, por ejemplo, Teruel-Montoya, R. et al. (2014)PLoS One9:e102259; Landgraf, P. et al. (2007)Cell129:1401-1414; Bissels, U. et al. (2009)RNA15:2375-2384. Cualquier incorporación de sitio miR en la 3’ UTR y/o 5’ UTR puede mediar tales efectos en múltiples tipos de células de interés (por ejemplo, miR-142 es abundante tanto en células B como en células dendríticas).
En algunas realizaciones, puede ser beneficioso dirigirse al mismo tipo de célula con múltiples miR e incorporar sitios de unión a cada uno de los brazos 3p y 5p si ambos son abundantes (por ejemplo, tanto miR-142-3p como miR142-5p son abundantes en células pluripotenciales hematopoyéticas). Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los polinucleótidos contienen dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) sitios de unión de miR de: (i) el grupo que consiste en miR-142, miR-144, miR-150, miR-155 y miR-223 (que se expresan en muchas células hematopoyéticas); o (ii) el grupo que consiste en miR-142, miR150, miR-16 y miR-223 (que se expresan en células B); o el grupo que consiste en miR-223, miR-451, miR-26a, miR-16 (que se expresan en células hematopoyéticas progenitoras).
En algunas realizaciones, también puede ser beneficioso combinar diversos miR para dirigirse a múltiples tipos de células de interés al mismo tiempo (por ejemplo, miR-142 y miR-126 para dirigirse a muchas células del linaje hematopoyético y células endoteliales). Así, por ejemplo, en ciertas realizaciones, los polinucleótidos comprenden dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) sitios de unión de miARN, en donde: (i) al menos uno de los miR se dirige a células del linaje hematopoyético (por ejemplo, miR-142, miR-144, miR-150, miR-155 o miR-223) y al menos uno de los miR se dirige a células dendríticas plasmocitoides, plaquetas o células endoteliales (por ejemplo, miR-126); o (ii) al menos uno de los miR se dirige a células B (por ejemplo, miR-142, miR150, miR-16 o miR-223) y al menos uno de los miR se dirige a células dendríticas plasmocitoides, plaquetas o células endoteliales (por ejemplo, miR-126); o (iii) al menos uno de los miR se dirige a células hematopoyéticas progenitoras (por ejemplo, miR-223, miR-451, miR-26a o miR-16) y al menos uno de los miR se dirige a células dendríticas plasmocitoides, plaquetas o células endoteliales (por ejemplo, miR-126); o (iv) al menos uno de los miR se dirige a células del linaje hematopoyético (por ejemplo, miR-142, miR-144, miR-150, miR-155 o miR-223), al menos uno de los miR se dirige a células B (por ejemplo, miR-142, miR150, miR-16 o miR-223) y al menos uno de los miR se dirige a células dendríticas plasmocitoides, plaquetas o células endoteliales (por ejemplo, miR-126); o cualquier otra combinación posible de las cuatro clases anteriores de sitios de unión de miR (es decir, los que se dirigen al linaje hematopoyético, los que se dirigen a células B, los que se dirigen a células hematopoyéticas progenitoras y/o los que se dirigen a células dendríticas plasmocitoides/plaquetas/células endoteliales).
En una realización, para modular las respuestas inmunitarias, los polinucleótidos pueden comprender una o más secuencias de unión de miARN que se unan a uno o más miR que se expresen en células inmunitarias convencionales o cualquier célula que exprese TLR7 y/o TLR8 y secrete citocinas y/o quimiocinas proinflamatorias (por ejemplo, en células inmunitarias de órganos linfoides periféricos y/o esplenocitos y/o células endoteliales). Ahora se ha descubierto que la incorporación a un ARNm de uno o más miR que se expresen en células inmunitarias convencionales o cualquier célula que exprese TLR7 y/o TLR8 y secrete citocinas y/o quimiocinas proinflamatorias (por ejemplo, en células inmunitarias de órganos linfoides periféricos y/o esplenocitos y/o células endoteliales) reduce o inhibe la activación de células inmunitarias (por ejemplo, activación de células B, medida por la frecuencia de células B activadas) y/o la producción de citocinas (por ejemplo, producción de IL-6, IFN-y y/o TNFa). Además, se ha descubierto ahora que la incorporación a un ARNm de uno o más miR que se expresen en células inmunitarias convencionales o cualquier célula que exprese TLR7 y/o TLR8 y secrete citocinas y/o quimiocinas proinflamatorias (por ejemplo, en células inmunitarias de órganos linfoides periféricos y/o esplenocitos y/o células endoteliales) puede reducir o inhibir una respuesta de anticuerpo antifármaco (A<d a>, por sus siglas en inglés) contra una proteína de interés codificada por el ARNm.
En otra realización, para modular el aclaramiento sanguíneo acelerado de un polinucleótido aportado en un compuesto o composición que comprende lípidos, los polinucleótidos pueden comprender una o más secuencias de unión de miR que se unan a uno o más miARN expresados en células inmunitarias convencionales o cualquier célula que exprese TLR7 y/o TLR8 y secrete citocinas y/o quimiocinas proinflamatorias (por ejemplo, en células inmunitarias de órganos linfoides periféricos y/o esplenocitos y/o células endoteliales). Se ha descubierto ahora que la incorporación a un ARNm de uno o más sitios de unión de miR reduce o inhibe el aclaramiento sanguíneo acelerado (ABC) del compuesto o composición que comprende lípidos para su uso en la administración del ARNm. Además, se ha descubierto ahora que la incorporación de uno o más sitios de unión de miR a un ARNm reduce los niveles séricos de anti-PEG anti-IgM (por ejemplo, reduce o inhibe la producción aguda de IgM que reconocen polietilenglicol (PEG) por células B) y/o reduce o inhibe la proliferación y/o activación de células dendríticas plasmocitoides después de la administración de un compuesto que comprende lípidos o una composición que comprende el ARNm.
En algunas realizaciones, las secuencias de miR pueden corresponder a cualquier microARN conocido expresado en células inmunitarias, incluyendo, pero sin limitarse a, los enseñados en la Publicación de EE.UU. US2005/0261218 y la Publicación de EE.UU. US2005/0059005. Los ejemplos no limitativos de miR expresados en células inmunitarias incluyen los expresados en células del bazo, células mieloides, células dendríticas, células dendríticas plasmocitoides, células B, células T y/o macrófagos. Por ejemplo, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24 y miR-27 se expresan en células mieloides, miR-155 se expresa en células dendríticas, células B y células T, la regulación de miR-146 está mejorada en los macrófagos tras la estimulación con TLR y miR-126 se expresa en células dendríticas plasmocitoides. En ciertas realizaciones, el o los miR se expresan abundantemente o de manera preferencial en células inmunitarias. Por ejemplo, miR-142 (miR-142-3p y/o miR-142-5p), miR-126 (miR-126-3p y/o miR-126-5p), miR-146 (miR-146-3p y/o miR-146-5p) y miR-155 (miR-155-3p y/o miR155-5p) se expresan abundantemente en células inmunitarias. Estas secuencias de microARN son conocidas en la técnica y, por lo tanto, una persona con conocimientos corrientes de la técnica puede diseñar fácilmente secuencias de unión o secuencias diana a las que estos microARN se unirán basándose en la complementariedad de Watson-Crick.
Por consiguiente, en diversas realizaciones, los polinucleótidos comprenden al menos un sitio de unión de microARN para un miR seleccionado del grupo que consiste en miR-142, miR-146, miR-155, miR-126, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24 y miR-27. En otra realización, el ARNm comprende al menos dos sitios de unión de miR para microARN expresados en células inmunitarias. En diversas realizaciones, el polinucleótido comprende 1-4, uno, dos, tres o cuatro sitios de unión de miR para microARN expresados en células inmunitarias. En otra realización, el polinucleótido comprende tres sitios de unión de miR. Estos sitios de unión de miR pueden ser para microARN seleccionados del grupo que consiste en miR-142, miR-146, miR-155, miR-126, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27 y combinaciones de los mismos. En una realización, el polinucleótido comprende dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro) copias del mismo sitio de unión de miR expresado en células inmunitarias, por ejemplo, dos o más copias de un sitio de unión de miR seleccionado del grupo de miR que consiste en miR-142, miR-146, miR-155, miR-126, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27.
En una realización, el polinucleótido comprende tres copias del mismo sitio de unión de miARN. En ciertas realizaciones, el uso de tres copias del mismo sitio de unión de miR puede presentar propiedades beneficiosas en comparación con el uso de un único sitio de unión de miARN. Ejemplos no limitativos de secuencias para 3' UTR que contienen tres sitios de unión de miARN se muestran en s Eq ID NO: 101 (tres sitios de unión de miR-142-3p) y SEQ ID NO: 103 (tres sitios de unión de miR-142-5p).
En otra realización, el polinucleótido comprende dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro) copias de al menos dos sitios de unión de miR diferentes expresados en células inmunitarias. Ejemplos no limitativos de secuencias de 3' UTR que contienen dos o más sitios de unión de miR diferentes se muestran en SEQ ID NO: 98 (un sitio de unión de miR-142-3p y un sitio de unión de miR-126-3p), SEQ ID NO: 104 (dos sitios de unión de miR-142-5p y un sitio de unión de miR-142-3p), y SEQ ID NO: 107 (dos sitios de unión de miR-155-5p y un sitio de unión de miR-142-3p).
En otra realización, el polinucleótido comprende al menos dos sitios de unión de miR para microARN expresados en células inmunitarias, siendo uno de los sitios de unión de miR para miR-142-3p. En diversas realizaciones, el polinucleótido comprende sitios de unión para miR-142-3p y miR-155 (miR-155-3p o miR-155-5p), miR-142-3p y miR-146 (miR-146-3 o miR-146-5p), o miR-142-3p y miR-126 (miR-126-3p o miR-126-5p).
En otra realización, el polinucleótido comprende al menos dos sitios de unión de miR para microARN expresados en células inmunitarias, siendo uno de los sitios de unión de miR para miR-126-3p. En diversas realizaciones, el polinucleótido comprende sitios de unión para miR-126-3p y miR-155 (miR-155-3p o miR-155-5p), miR-126-3p y miR-146 (miR-146-3p o miR-146-5p), o miR-126-3p y miR-142 (miR-142-3p o miR-142-5p).
En otra realización, el polinucleótido comprende al menos dos sitios de unión de miR para microARN expresados en células inmunitarias, siendo uno de los sitios de unión de miR para miR-142-5p. En diversas realizaciones, el polinucleótido comprende sitios de unión para miR-142-5p y miR-155 (miR-155-3p o miR-155-5p), miR-142-5p y miR-146 (miR-146-3 o miR-146-5p), o miR-142-5p y miR-126 (miR-126-3p o miR-126-5p).
En otra realización más, el polinucleótido comprende al menos dos sitios de unión de miR para microARN expresados en células inmunitarias, siendo uno de los sitios de unión de miR para miR-155-5p. En diversas realizaciones, el polinucleótido comprende sitios de unión para miR-155-5p y miR-142 (miR-142-3p o miR-142-5p), miR-155-5p y miR-146 (miR-146-3 o miR-146-5p), o miR-155-5p y miR-126 (miR-126-3p o miR-126-5p).
El miARN también puede regular procesos biológicos complejos tales como la angiogénesis (por ejemplo, miR-132) (Anand y Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176). En los polinucleótidos, pueden eliminarse o introducirse sitios de unión de miARN que estén involucrados en tales procesos, con el fin de adaptar la expresión de los polinucleótidos a tipos de células biológicamente relevantes o procesos biológicos relevantes. En este contexto, los polinucleótidos se definen como polinucleótidos auxótrofos.
En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un sitio de unión de miARN, comprendiendo el sitio de unión de miARN una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas de la Tabla 3, incluyendo una o más copias de una cualquiera o más de las secuencias de sitio de unión de miARN. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende además al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de los mismos o diferentes sitios de unión de miARN seleccionados de la Tabla 3, incluyendo cualquier combinación de éstos.
En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN se une a miR-142 o es complementario a miR-142. En algunas realizaciones, el miR-142 comprende la SEQ ID NO:30. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN se une a miR-142-3p o miR-142-5p. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miR-142-3p comprende la SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miR-142-5p comprende la SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN comprende una secuencia de nucleótidos al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 32 o la SEQ ID NO: 34.
En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN se une a miR-126 o es complementario a miR-126. En algunas realizaciones, el miR-126 comprende la SEQ ID NO:155. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN se une a miR-126-3p o miR-126-5p. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miR-126-3p comprende la SEQ ID NO: 96. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miR-126-5p comprende la SEQ ID NO: 156. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN comprende una secuencia de nucleótidos al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% idéntica a la SEQ ID NO: 96 o la SEQ ID NO: 156.
En una realización, la 3' UTR comprende dos sitios de unión de miARN, en donde un primer sitio de unión de miARN se une a miR-142 y un segundo sitio de unión de miARN se une a miR-126. En una realización específica, la unión de 3' UTR a miR-142 y miR-126 comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 98 o 163.
Tabla 3. Sitios de unión de miR-142, miR-126, y miR-142 y miR-126
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En algunas realizaciones, se inserta un sitio de unión de miARN en el polinucleótido en cualquier posición del polinucleótido (por ejemplo, la 5’ UTR y/o 3’ UTR). En algunas realizaciones, la 5’ UTR comprende un sitio de unión de miARN. En algunas realizaciones, la 3’ UTR comprende un sitio de unión de miARN. En algunas realizaciones, la 5' UTR y la 3’ UTR comprenden un sitio de unión de miARN. El sitio de inserción en el polinucleótido puede estar en cualquier lugar en el polinucleótido, siempre que la inserción del sitio de unión de miARN en el polinucleótido no afecte a la traducción de un polipéptido funcional en ausencia del miARN correspondiente; y en presencia del miARN, la inserción del sitio de unión de miARN en el polinucleótido y la unión del sitio de unión de miARN al miARN correspondiente son capaces de degradar el polinucleótido o evitar la traducción del polinucleótido.
En algunas realizaciones, se inserta un sitio de unión de miARN en al menos aproximadamente 30 nucleótidos en dirección 3' con respecto al codón de parada de un ORF en un polinucleótido que comprende el ORF. En algunas realizaciones, se inserta un sitio de unión de miARN en al menos aproximadamente 10 nucleótidos, al menos aproximadamente 15 nucleótidos, al menos aproximadamente 20 nucleótidos, al menos aproximadamente 25 nucleótidos, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 35 nucleótidos, al menos aproximadamente 40 nucleótidos, al menos aproximadamente 45 nucleótidos, al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 55 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 65 nucleótidos, al menos aproximadamente 70 nucleótidos, al menos aproximadamente 75 nucleótidos, al menos aproximadamente 80 nucleótidos, al menos aproximadamente 85 nucleótidos, al menos aproximadamente 90 nucleótidos, al menos aproximadamente 95 nucleótidos o al menos aproximadamente 100 nucleótidos en dirección 3' con respecto al codón de parada de un ORF en un polinucleótido. En algunas realizaciones, se inserta un sitio de unión de miARN en aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 90 nucleótidos, aproximadamente 30 nucleótidos a aproximadamente 80 nucleótidos, aproximadamente 40 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 60 nucleótidos, aproximadamente 45 nucleótidos a aproximadamente 65 nucleótidos en dirección 3' con respecto al codón de parada de un ORF en un polinucleótido.
En algunas realizaciones, se inserta un sitio de unión de miARN dentro de la 3' UTR inmediatamente después del codón de parada de la región codificante dentro del polinucleótido, es decir, ARNm. En algunas realizaciones, si hay múltiples copias de un codón de parada en el constructo, se inserta un sitio de unión de miARN inmediatamente después del codón de parada final. En algunas realizaciones, se inserta un sitio de unión de miARN más allá en dirección 3' con respecto al codón de parada, en cuyo caso hay bases de 3' UTR entre el codón de parada y el o los sitios de unión de miR. En algunas realizaciones, se muestran tres ejemplos no limitativos de posibles sitios de inserción para un miR en una 3' UTR en las SEQ ID NOs: 53, 54 y 108, que muestran una secuencia de 3' UTR con un sitio miR-142-3p insertado en uno de tres posibles sitios de inserción diferentes, respectivamente, dentro de la 3' UTR.
En algunas realizaciones, uno o más sitios de unión de miARN pueden colocarse dentro de la 5' UTR en uno o más posibles sitios de inserción. Por ejemplo, se muestran tres ejemplos no limitativos de posibles sitios de inserción para un miR en una 5' UTR en las SEQ ID NOs: 109, 110 y 111, que muestran una secuencia de 5' UTR con un sitio miR-142-3p insertado en uno de tres posibles sitios de inserción diferentes, respectivamente, dentro de la 5' UTR.
En una realización, un marco de lectura abierta optimizado en cuanto a los codones que codifica un polipéptido de interés comprende un codón de parada y el al menos un sitio de unión de microARN está ubicado dentro de la 3’ UTR 1-100 nucleótidos después del codón de parada. En una realización, el marco de lectura abierta optimizado en cuanto a los codones que codifica el polipéptido de interés comprende un codón de parada y el al menos un sitio de unión de microARN para un miR expresado en células inmunitarias está ubicado dentro de la 3’ UTR 30-50 nucleótidos después del codón de parada. En otra realización, el marco de lectura abierta optimizado en cuanto a los codones que codifica el polipéptido de interés comprende un codón de parada y el al menos un sitio de unión de microARN para un miR expresado en células inmunitarias está ubicado dentro de la 3’ UTR al menos 50 nucleótidos después del codón de parada. En otras realizaciones, el marco de lectura abierta optimizado en cuanto a los codones que codifica el polipéptido de interés comprende un codón de parada y el al menos un sitio de unión de microARN para un miR expresado en células inmunitarias está ubicado dentro de la 3’ UTR inmediatamente después del codón de parada, o dentro de la 3’ UTR 15-20 nucleótidos después del codón de parada o dentro de la 3’ UTR 70-80 nucleótidos después del codón de parada. En otras realizaciones, la 3' UTR comprende más de un sitio de unión de miARN (por ejemplo, 2-4 sitios de unión de miARN), pudiendo haber una región espaciadora (por ejemplo, de 10-100, 20-70 o 30-50 nucleótidos de longitud) entre cada sitio de unión de miARN. En otra realización, la 3' UTR comprende una región espaciadora entre el extremo del o de los sitios de unión de miARN y los nucleótidos de cola de poli A. Por ejemplo, una región espaciadora de 10-100, 20-70 o 30-50 nucleótidos de longitud puede estar situada entre el extremo del o de los sitios de unión de miARN y el comienzo de la cola de poli A.
En una realización, un marco de lectura abierta optimizado en cuanto a los codones que codifica un polipéptido de interés comprende un codón de iniciación y el al menos un sitio de unión de microARN está ubicado dentro de la 5’ UTR 1-100 nucleótidos antes del codón de iniciación (a 1-100 nucleótidos en dirección 5' del codón de iniciación). En una realización, el marco de lectura abierta optimizado en cuanto a los codones que codifica el polipéptido de interés comprende un codón de iniciación y el al menos un sitio de unión de microARN para un miR expresado en células inmunitarias está ubicado dentro de la 5’ UTR 10-50 nucleótidos antes del codón de iniciación (a 10-50 nucleótidos en dirección 5' del codón de iniciación). En una realización, el marco de lectura abierta optimizado en cuanto a los codones que codifica el polipéptido de interés comprende un codón de iniciación y el al menos un sitio de unión de microARN para un miR expresado en células inmunitarias está ubicado dentro de la 5’ UTR al menos 25 nucleótidos antes del codón de iniciación (al menos a 25 nucleótidos en dirección 5' del codón de iniciación). En otras realizaciones, el marco de lectura abierta optimizado en cuanto a los codones que codifica el polipéptido de interés comprende un codón de iniciación y el al menos un sitio de unión de microARN para un miR expresado en células inmunitarias está ubicado dentro de la 5’ UTR inmediatamente antes del codón de iniciación, o dentro de la 5’ UTR 15-20 nucleótidos antes del codón de iniciación o dentro de la 5’ UTR 70-80 nucleótidos antes del codón de iniciación. En otras realizaciones, la 5' UTR comprende más de un sitio de unión de miARN (por ejemplo, 2-4 sitios de unión de miARN), pudiendo haber una región espaciadora (por ejemplo, de 10-100, 20-70 o 30-50 nucleótidos de longitud) entre cada sitio de unión de miARN.
En una realización, la 3' UTR comprende más de un codón de parada, estando al menos un sitio de unión de miARN colocado en dirección 3' con respecto a los codones de parada. Por ejemplo, una 3' UTR puede comprender 1, 2 o 3 codones de parada. Los ejemplos no limitativos de codones de parada triples que se pueden usar incluyen: UGAUAAUAG, UGAUAGUAA, UAAUGAUAG, UGAUAAUAA, UGAUAGUAG, UAAUGAUGA, UAAUAGUAG, UGAUGAUGA, UAAUAAUAA, and UAGUAGUAG. Dentro de una 3' UTR, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 sitios de unión de miARN, por ejemplo, sitios de unión de miR-142-3p, pueden estar colocados inmediatamente adyacentes al o a los codones de parada o en cualquier número de nucleótidos en dirección 3' con respecto al codón de parada final. Cuando la 3' UTR comprende múltiples sitios de unión de miARN, estos sitios de unión pueden estar colocados directamente uno junto a otro en el constructo (es decir, uno después de otro) o, como alternativa, pueden estar colocados nucleótidos espaciadores entre cada sitio de unión.
En una realización, la 3' UTR comprende tres codones de parada con un único sitio de unión de miR-142-3p ubicado en dirección 3' con respecto al tercer codón de parada. Ejemplos no limitativos de secuencias de 3’ UTR que tienen tres codones de parada y un único sitio de unión de miR-142-3p ubicados en diferentes posiciones en dirección 3' con respecto al codón de parada final se muestran en las SEQ ID NOs: 58, 53, 54 y 108.
Tabla 4. 5' UTR, 3' UTR, secuencias de miR y sitios de unión de miR
Codón de parada = negrita
sitio de unión de miR 142-3p = subrayado
sitio de unión de miR 126-3p = subrayado en negrita
sitio de unión de miR 155-5p = sombreado
sitio de unión de miR 142-5p = sombreado y subrayado en negrita
En una realización, el polinucleótido comprende una 5' UTR, un marco de lectura abierta optimizado en cuanto a los codones que codifica un polipéptido de interés, una 3' UTR que comprende el al menos un sitio de unión de miARN para un miR expresado en células inmunitarias, y una región de adición de cola 3’ de nucleósidos enlazados. En diversas realizaciones, la 3' UTR comprende 1-4, al menos dos, uno, dos, tres o cuatro sitios de unión de miARN para miR expresados en células inmunitarias, preferiblemente expresados abundantemente o de manera preferencial en células inmunitarias.
En una realización, el al menos un miARN expresado en células inmunitarias es un sitio de unión de microARN miR-142-3p. En una realización, el sitio de unión de microARN miR-142-3p comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 32. En una realización, la 3' UTR del ARNm que comprende el sitio de unión de microARN miR-142-3p comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 79.
En una realización, el al menos un miARN expresado en células inmunitarias es un sitio de unión de microARN miR-126. En una realización, el sitio de unión de miR-126 es un sitio de unión de miR-126-3p. En una realización, el sitio de unión de microARN miR-126-3p comprende la secuencia mostrada en la<s>E<q>ID NO: 96. En una realización, la 3' UTR del ARNm que comprende el sitio de unión de microARN miR-126-3p comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 97.
Las secuencias ejemplares no limitativas para miR a los que se pueden unir uno o varios sitios de unión de microARN de la divulgación incluyen las siguientes: miR-142-3p (SEQ ID NO: 31), miR-142-5p (SEQ ID NO: 33), miR-146-3p (SEQ ID NO: 80), miR-146-5p (SEQ ID NO: 81), miR-155-3p (SEQ ID NO: 82), miR-155-5p (SEQ ID NO: 83), miR-126-3p (SEQ ID NO: 84), miR-126-5p (SEQ ID NO: 85), miR-16-3p (SEQ ID NO: 86), miR-16-5p (SEQ ID NO: 87), miR-21-3p (SEQ ID NO: 88), miR-21-5p (SEQ ID NO: 89), miR-223-3p (SEQ ID NO: 90), miR-223-5p (SEQ ID NO: 91), miR-24-3p (SEQ ID NO: 92), miR-24-5p (SEQ ID NO: 93), miR-27-3p (SEQ iD NO: 94) y miR-27-5p (SEQ iD NO: 95). En la técnica, por ejemplo, en la base de datos de microARN miRBase de la Universidad de Mánchester, se conocen y están disponibles otras secuencias de miR adecuadas expresadas en células inmunitarias (por ejemplo, expresadas abundantemente o de manera preferencial en células inmunitarias). Los sitios que unen cualquiera de los miR mencionados anteriormente pueden diseñarse basándose en la complementariedad de Watson-Crick con el miR, típicamente complementariedad del 100% con el miR, e insertarse en un constructo de ARNm de la divulgación como se describe en la presente memoria.
En otra realización, un polinucleótido (es decir, un ARNm, por ejemplo, su 3' UTR) puede comprender al menos un sitio de unión de miARN para reducir o inhibir de este modo el aclaramiento sanguíneo acelerado, por ejemplo, reduciendo o inhibiendo la producción de IgM, por ejemplo, contra PEG, por parte de linfocitos B y/o reduciendo o inhibiendo la proliferación y/o activación de pDC, y puede comprender al menos un sitio de unión de miARN para modular la expresión tisular de una proteína codificada de interés.
La regulación génica de miARN puede verse influida por la secuencia que rodea el miARN, tal como, pero sin limitarse a, la especie de la secuencia circundante, el tipo de secuencia (por ejemplo, heteróloga, homóloga, exógena, endógena o artificial), elementos reguladores en la secuencia circundante y/o elementos estructurales en la secuencia circundante. El miARN puede verse influido por la 5' UTR y/o la 3' UTR. Como ejemplo no limitativo, una 3' UTR no humana puede aumentar el efecto regulador de la secuencia de miARN sobre la expresión de un polipéptido de interés en comparación con una 3' UTR humana del mismo tipo de secuencia.
En una realización, otros elementos reguladores y/o elementos estructurales de la 5' UTR pueden influir en la regulación génica mediada por miARN. Un ejemplo de un elemento regulador y/o elemento estructural es un IRES (Sitio Interno de Entrada al Ribosoma) estructurado en la 5' UTR, que es necesario para la unión de factores de elongación de la traducción para iniciar la traducción de proteínas. La unión de EIF4A2 a este elemento secundariamente estructurado en la 5’-UTR es necesaria para la expresión génica mediada por miARN (Meijer HA et al., Science, 2013, 340, 82-85). Los polinucleótidos pueden incluir además esta 5' UTR estructurada con el fin de mejorar la regulación génica mediada por microARN.
Al menos un sitio de unión de miARN puede introducirse por ingeniería en la 3' UTR de un polinucleótido. En este contexto, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez o más sitios de unión de miARN se pueden introducir por ingeniería en una 3' UTR de un polinucleótido. Por ejemplo, de 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 2, o 1 sitios de unión de miARN se pueden introducir por ingeniería en la 3' UTR de un polinucleótido. En una realización, los sitios de unión de miARN incorporados a un polinucleótido pueden ser los mismos o pueden ser diferentes sitios de miARN. Una combinación de diferentes sitios de unión de miARN incorporados a un polinucleótido puede incluir combinaciones en las que se incorporen más de una copia de cualquiera de los diferentes sitios de miARN. En otra realización, los sitios de unión de miARN incorporados a un polinucleótido pueden dirigirse al mismo tejido o a diferentes tejidos en el cuerpo. Como ejemplo no limitativo, a través de la introducción de sitios de unión de miARN específicos del tejido, del tipo de células o de la enfermedad en la 3’-UTR de un polinucleótido, puede reducirse el grado de expresión en tipos de células específicos (por ejemplo, células mieloides, células endoteliales, etc.).
En una realización, un sitio de unión de miARN se puede adaptar por ingeniería cerca del extremo 5’ de la 3' UTR, aproximadamente a medio camino entre el extremo 5’ y el extremo 3’ de la 3' UTR y/o cerca del extremo 3’ de la 3' UTR en un polinucleótido. Como un ejemplo no limitativo, un sitio de unión de miARN se puede adaptar por ingeniería cerca del extremo 5’ de la 3' u Tr y aproximadamente a medio camino entre el extremo 5’ y el extremo 3’ de la 3' UTR. Como otro ejemplo no limitativo, un sitio de unión de miARN se puede adaptar por ingeniería cerca del extremo 3’ de la 3' UTR y aproximadamente a medio camino entre el extremo 5’ y el extremo 3’ de la 3' UTR. Como otro ejemplo no limitativo más, un sitio de unión de miARN se puede adaptar por ingeniería cerca del extremo 5’ de la 3' UTR y cerca del extremo 3’ de la 3' UTR.
En otra realización, una 3' UTR puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sitios de unión de miARN. Los sitios de unión de miARN pueden ser complementarios a un miARN, una secuencia de semilla de miARN y/o secuencias de miARN que flanqueen la secuencia de semilla.
En algunas realizaciones, la expresión de un polinucleótido se puede controlar incorporyo al menos una secuencia de sensores en el polinucleótido y formulyo el polinucleótido para administración. Como ejemplo no limitativo, un polinucleótido puede guiarse a un tejido o célula incorporyo un sitio de unión de miARN y formulyo el polinucleótido en una nanopartícula lipídica que comprenda un lípido ionizable, incluyendo cualquiera de los lípidos descritos en la presente memoria.
Un polinucleótido puede adaptarse por ingeniería para una expresión más guiada en tejidos, tipos de células o condiciones biológicas específicos basándose en los patrones de expresión de miARN en los diferentes tejidos, tipos de células o condiciones biológicas. A través de la introducción de sitios de unión de miARN específicos de tejido, un polinucleótido puede diseñarse para la expresión óptima de proteínas en un tejido o célula, o en el contexto de una condición biológica.
En algunas realizaciones, un polinucleótido puede diseñarse para incorporar sitios de unión de miARN que tengan un 100% de identidad con secuencias de semilla de miARN conocidas o tengan menos de un 100% de identidad con secuencias de semilla de miARN. En algunas realizaciones, un polinucleótido puede diseñarse para incorporar sitios de unión de miARN que tengan al menos: un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con secuencias de semilla de miARN conocidas. La secuencia de semilla de miARN puede estar parcialmente mutada para disminuir la afinidad de unión de miARN y como tal dar como resultado una modulación negativa reducida del polinucleótido. En esencia, el grado de apareamiento o malapareamiento entre el sitio de unión de miARN y la semilla de miARN puede hacer de reostato para ajustar más finamente la capacidad del miARN para modular la expresión de proteínas. Además, una mutación en la región no de semilla de un sitio de unión de miARN también puede afectar a la capacidad de un miARN para modular la expresión de proteínas.
En una realización, se puede incorporar una secuencia de miARN al bucle de un tallo bucle.
En otra realización, se puede incorporar una secuencia de semilla de miARN en el bucle de un tallo bucle y se puede incorporar un sitio de unión de miARN al tallo 5’ o 3’ del tallo bucle.
En una realización, un elemento potenciador de la traducción (TEE) puede incorporarse en el extremo 5' del tallo de un tallo bucle y una semilla de miARN puede incorporarse al tallo del tallo bucle. En otra realización, se puede incorporar un TEE en el extremo 5’ del tallo de un tallo bucle, se puede incorporar una semilla de miARN al tallo del tallo bucle y se puede incorporar un sitio de unión de miARN al extremo 3’ del tallo o la secuencia después del tallo bucle. La semilla de miARN y el sitio de unión de miARN pueden ser para las mismas y/o diferentes secuencias de miARN.
En una realización, la incorporación de una secuencia de miARN y/o una secuencia de TEE cambia la forma de la región de tallo bucle que puede aumentar y/o disminuir la traducción (véase, por ejemplo, Kedde et al., "A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3’ UTR controls miR-221 y miR-22 accessibility.” Nature Cell Biology. 2010).
En una realización, la 5’-UTR de un polinucleótido puede comprender al menos una secuencia de miARN. La secuencia de miARN puede ser, pero no se limita a, una secuencia de 19 o 22 nucleótidos y/o una secuencia de miARN sin la semilla.
En una realización, la secuencia de miARN en la 5' UTR se puede usar para estabilizar un polinucleótido descrito en la presente memoria.
En otra realización, una secuencia de miARN en la 5' UTR de un polinucleótido se puede usar para disminuir la accesibilidad del sitio de iniciación de traducción, tal como, pero sin limitarse a, un codón de iniciación. Véase, por ejemplo, Matsuda et al., PLoS One. 2010 11(5):e15057, que usaba oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA) antisentido y complejos de unión de exón (EJC, por sus siglas en inglés) alrededor de un codón de iniciación (-4 a 37 donde la A de los codones AUG es 1) con el fin de disminuir la accesibilidad al primer codón de iniciación (AUG). Matsuda mostró que la alteración de la secuencia alrededor del codón de iniciación con un LNA o EJC afectó a la eficiencia, longitud y estabilidad estructural de un polinucleótido. Un polinucleótido puede comprender una secuencia de miARN, en lugar de la secuencia de LNA o EJC descrita por Matsuda et al, cerca del sitio de iniciación de traducción con el fin de disminuir la accesibilidad al sitio de iniciación de traducción. El sitio de iniciación de traducción puede estar antes, después o dentro de la secuencia de miARN. Como un ejemplo no limitativo, el sitio de iniciación de traducción puede estar ubicado dentro de una secuencia de miARN tal como una secuencia de semilla o sitio de unión.
En algunas realizaciones, un polinucleótido puede incluir al menos un miARN con el fin de amortiguar la presentación de antígeno por las células presentadoras de antígeno. El miARN puede ser la secuencia de miARN completa, la secuencia de semilla de miARN, la secuencia de miARN sin la semilla, o una combinación de las mismas. Como ejemplo no limitativo, un miARN incorporado a un polinucleótido puede ser específico para el sistema hematopoyético. Como otro ejemplo no limitativo, un miARN incorporado a un polinucleótido para amortiguar la presentación de antígeno es miR-142-3p.
En algunas realizaciones, un polinucleótido puede incluir al menos un miARN con el fin de amortiguar la expresión del polipéptido codificado en un tejido o célula de interés. Como ejemplo no limitativo, un polinucleótido puede incluir al menos un sitio de unión de miR-142-3p, secuencia de semilla de miR-142-3p, sitio de unión de miR-142-3p sin la semilla, sitio de unión de miR-142-5p, secuencia de semilla de miR-142-5p, sitio de unión de miR-142-5p sin la semilla, sitio de unión de miR-146, secuencia de semilla de miR-146 y/o sitio de unión de miR-146 sin la secuencia de semilla.
En algunas realizaciones, un polinucleótido puede comprender al menos un sitio de unión de miARN en la 3' UTR con el fin de degradar selectivamente los agentes terapéuticos de ARNm en las células inmunitarias para someter reacciones inmunogénicas no deseadas causadas por la administración terapéutico. Como un ejemplo no limitativo, el sitio de unión de miARN puede hacer que un polinucleótido sea más inestable en las células presentadoras de antígeno. Los ejemplos no limitativos de estos miARN incluyen mir-142-5p, mir-142-3p, mir-146a-5p y mir-146-3p.
En una realización, un polinucleótido comprende al menos una secuencia de miARN en una región del polinucleótido que puede interactuar con una proteína de unión de ARN.
En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende (i) una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia (por ejemplo, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT (por ejemplo, la secuencia de tipo silvestre, fragmento funcional o variante del mismo) y (ii) un sitio de unión de miARN (por ejemplo, un sitio de unión de miARN que se une a miR-142) y/o un sitio de unión de miARN que se une a miR-126.
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido divulgado en la presente memoria y un sitio de unión de miARN divulgado en la presente memoria, por ejemplo, un sitio de unión de miARN que se une a miR-126, miR-142, miR-144, miR-146, miR-150, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27 o miR-26a. En algunas realizaciones, el sitio de unión de miARN se une a miR126-3p, miR-142-3p, miR-142-5p o miR-155. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido divulgado en la presente memoria y al menos dos sitios de unión de microARN diferentes, expresándose el microARN en una célula inmunitaria de linaje hematopoyético o una célula que expresa TLR7 y/o TLR8 y secreta citocinas y/o quimiocinas proinflamatorias, y comprendiendo el polinucleótido una o más nucleobases modificadas. En algunas realizaciones, la secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT comprende al menos una nucleobase modificada químicamente, por ejemplo, 5-metoxiuracilo. En algunas realizaciones, al menos un 95% de un tipo de nucleobase (por ejemplo, uracilo) en una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT son nucleobases modificadas. En algunas realizaciones, al menos un 95% del uracilo en una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT es 5-metoxiuridina. En la composición de la invención, el polinucleótido (es decir, un ARNm) se formula con un agente de administración que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (IA), por ejemplo, el Compuesto 18. En algunas realizaciones, el agente de administración comprende el Compuesto 18, DSPC, Colesterol y el Compuesto 428, por ejemplo, con una relación molar de aproximadamente 50:10:38.5:1.5.
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT divulgado en la presente memoria y un sitio de unión de miARN divulgado en la presente memoria, por ejemplo, un sitio de unión de miARN que se une a miR-142. En algunas realizaciones, la secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT comprende al menos una nucleobase modificada químicamente, por ejemplo, 5-metoxiuracilo. En algunas realizaciones, al menos un 95% de un tipo de nucleobase (por ejemplo, uracilo) en una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT son nucleobases modificadas. En algunas realizaciones, al menos un 95% del uracilo en una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT es 5-metoxiuridina. En la invención, el polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT divulgado en la presente memoria y un sitio de unión de miARN se formula con un agente de administración que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (IA).
13. 3’ UTR
En ciertas realizaciones, un polinucleótido de la composición de la presente invención (es decir, un polinucleótido de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) comprende además una 3' UTR.
3’-UTR es la sección de ARNm que sigue inmediatamente al codón de terminación de traducción y a menudo contiene regiones reguladoras que influyen de manera postranscripcional en la expresión génica. Las regiones reguladoras dentro de la 3’-UTR pueden influir en la poliadenilación, la eficiencia de traducción, la localización y la estabilidad del ARNm. En una realización, la 3’-UTR útil para la invención comprende un sitio de unión para proteínas reguladoras o microARN.
En ciertas realizaciones, la 3' UTR útil para los polinucleótidos comprende una 3' UTR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 53 a 77, 79, 97, 98, 101 a 108, 112, y 163 a 173, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la 3' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 98, 163 o 164 o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la 3' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 98. En algunas realizaciones, la 3' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 163. En algunas realizaciones, la 3' UTR comprende una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 164.
En ciertas realizaciones, la secuencia de 3' UTR útil para la invención comprende una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99% o aproximadamente un 100% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en secuencias de 3’ Ut R seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 53 a 77, 79, 97, 98, 101 a 108, 112, y 163 a 173, o cualquier combinación de las mismas.
14. Regiones que tienen un casquete 5’
La composición de la invención también incluye un polinucleótido que comprende tanto un casquete 5’ como un polinucleótido (es decir, un polinucleótido de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT).
La estructura de casquete 5’ de un ARNm natural está involucrada en la exportación nuclear, aumentyo la estabilidad del ARNm, y se une a la Proteína de Unión de Casquete (CBP, por sus siglas en inglés) de ARNm, que es responsable de la estabilidad del ARNm en la célula y la competencia de traducción a través de la asociación de CBP con la proteína de unión de poli(A) para formar la especie de ARNm cíclico maduro. El casquete además ayuda a la eliminación de intrones 5’ proximales durante el corte y empalme de ARNm.
Las moléculas de ARNm endógenas pueden dotarse de un casquete en el extremo 5’ generyo un enlace 5’-ppp-5’-trifosfato entre un residuo de casquete de guanosina terminal y el nucleótido de sentido transcrito 5’-terminal de la molécula de ARNm. Este casquete de 5’-guanilato puede entonces metilarse para generar un residuo de N7-metil-guanilato. Los azúcares ribosa de los nucleótidos transcritos terminales y/o anteterminales del extremo 5’ del ARNm pueden estar opcionalmente también 2’-O-metilados. Una eliminación de casquete 5’ a través de hidrólisis y escisión de la estructura de casquete de guanilato puede dirigirse a una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ARNm, para su degradación.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, un polinucleótido de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) incorporan un resto de casquete.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, un ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) comprenden una estructura de casquete no hidrolizable que evita la eliminación de casquete y por lo tanto aumenta la semivida del ARNm. Debido a que la hidrólisis de la estructura de casquete requiere la escisión de enlaces 5’-ppp-5’ fosforodiéster, se pueden usar nucleótidos modificados durante la reacción de formación de casquete. Por ejemplo, se puede usar una Enzima de Dotación de Casquete de Vaccinia de New Engly Biolabs (Ipswich, MA) con nucleótidos de a-tio-guanosina de acuerdo con las instrucciones del fabricante para crear un enlace de fosforotioato en el casquete 5’- ppp-5’. Pueden usarse nucleótidos de guanosina modificados adicionales tales como nucleótidos de a-metil-fosfonato y seleno-fosfato.
Las modificaciones adicionales incluyen, pero no se limitan a, 2’-O-metilación de los azúcares ribosa de nucleótidos 5’-terminales y/o 5’-anteterminales del polinucleótido (como se mencionó anteriormente) en el grupo 2’-hidroxilo del anillo de azúcar. Se pueden usar múltiples estructuras de casquete 5' distintas para generar el casquete 5’ de una molécula de ácido nucleico, tales como un polinucleótido que haga las veces de molécula de ARNm. Los análogos de casquete, que en la presente memoria también se denominan análogos de casquete sintéticos, casquetes químicos, análogos de casquete químicos o análogos de casquete estructurales o funcionales, difieren de los casquetes 5’ naturales (es decir, endógenos, de tipo silvestre o fisiológicos) en su estructura química, mientras que conservan la función de casquete. Los análogos de casquete pueden sintetizarse químicamente (es decir, no enzimáticamente) o enzimáticamente y/o enlazarse a los polinucleótidos.
Por ejemplo, el casquete Análogo de Casquete Antiinversión (ARCA, por sus siglas en inglés) contiene dos guaninas enlazadas por un grupo 5’-5’-trifosfato, en donde una guanina contiene un grupo N7 metilo, así como un grupo 3’-O-metilo (es decir, N7,3’-O-dimetil-guanosina-5’-trifosfato-5’- guanosina (m7G-3'mppp-G; que puede designarse de manera equivalente 3’ O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G). El átomo 3’-O de la otra guanina, no modificada, se enlaza al nucleótido 5’-terminal del polinucleótido dotado de casquete. La guanina N7- y 3’- ° -metilada proporciona el resto terminal del polinucleótido dotado de casquete.
Otro casquete ejemplar es mCAP, que es similar a ARCA, pero tiene un grupo 2’-O-metilo en guanosina (es decir, N7,2’-O-dimetil-guanosina-5’-trifosfato-5’-guanosina, m7Gm-ppp-G).
En algunas realizaciones, el casquete es un análogo de casquete de dinucleótido. Como ejemplo no limitativo, el análogo de casquete de dinucleótido puede modificarse en diferentes posiciones de fosfato con un grupo boranofosfato o un grupo fosforoselenoato, tal como los análogos de casquete de dinucleótido descritos en la patente de EE.UU. No US 8,519,110.
En otra realización, el casquete es un análogo de casquete en una forma de dinucleótido N7-(4-clorofenoxietilo) sustituido de un análogo de casquete conocido en la técnica y/o descrito en la presente memoria. Los ejemplos no limitativos de una forma de dinucleótido N7-(4-clorofenoxietilo) sustituido de un análogo de casquete incluyen un análogo de casquete N7-(4-clorofenoxietil)-G(5’)ppp(5’)G y un análogo de casquete N7-(4-clorofenoxietil)-m3'°G(5’)ppp(5’)G (véanse, por ejemplo, los diversos análogos de casquete y los métodos de sintetización de análogos de casquete descritos en Kore et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 201321 :4570-4574). En otra realización, un análogo de casquete es un análogo de 4-cloro/bromofenoxietilo.
Aunque los análogos de casquete permiten dotar de casquete de manera concomitante un polinucleótido o una región del mismo, en una reacción de transcripciónin vitrohasta el 20% de los transcritos pueden permanecer sin casquete. Esto, así como las diferencias estructurales de un análogo de casquete a partir de estructuras endógenas de casquete 5’ de ácidos nucleicos producidas por la maquinaria endógena de transcripción celular, puede conducir a una competencia traduccional reducida y a una estabilidad celular reducida.
Los polinucleótidos (por ejemplo, un polinucleótido que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido de GALT) también pueden dotarse de casquete después de la fabricación (ya sea por IVT o síntesis química), usyo enzimas, con el fin de generar estructuras de casquete 5’ más auténticas. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "más auténtica" se refiere a una característica que refleja o imita estrechamente, ya sea estructural o funcionalmente, una característica endógena o de tipo silvestre. Es decir, una característica “más auténtica” es más representativa de una función y/o estructura celular endógena, de tipo silvestre, natural o fisiológica en comparación con características o análogos sintéticos, etc., de la técnica anterior, o que supera a la característica endógena, de tipo silvestre, natural o fisiológica correspondiente en uno o más aspectos. Ejemplos no limitativos de estructuras de casquete 5' más auténticas son aquellas que, entre otras cosas, tienen una unión mejorada de proteínas de unión de casquete, una semivida aumentada, una sensibilidad reducida a 5’ endonucleasas y/o una eliminación de casquete 5' reducida, en comparación con las estructuras de casquete 5' sintéticas conocidas en la técnica (o con una estructura de casquete 5' de tipo silvestre, natural o fisiológica). Por ejemplo, la Enzima de Dotación de Casquete de Virus Vaccinia recombinante y la enzima 2’-O-metiltransferasa recombinante pueden crear un enlace 5’-5’-trifosfato canónico entre el nucleótido 5’-terminal de un polinucleótido y un nucleótido de casquete de guanina en donde la guanina de casquete contenga una metilación N7 y el nucleótido 5’-terminal del ARNm contenga un 2’-O-metilo. Tal estructura se denomina estructura Capí. Este casquete da como resultado una mayor competencia traduccional y estabilidad celular y una activación reducida de citocinas proinflamatorias celulares, en comparación, por ejemplo, con otras estructuras análogas de casquete 5' conocidas en la técnica. Las estructuras de casquete incluyen, pero no se limitan a, 7mG(5’)ppp(5’)N,pN2p (cap 0), 7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp (capí) y 7mG(5’)-ppp(5’)NlmpN2mp (cap 2).
Como un ejemplo no limitativo, la dotación de casquete de polinucleótidos quiméricos después de la fabricación puede ser más eficiente, ya que se pueden dotar de casquete casi el 100% de los polinucleótidos quiméricos. Esto contrasta con el 80% cuyo un análogo de casquete se enlaza a un polinucleótido quimérico en el transcurso de una reacción de transcripciónin vitro.
De acuerdo con la presente invención, los casquetes 5' terminales pueden incluir casquetes endógenos o análogos de casquete. De acuerdo con la presente invención, un casquete 5' terminal puede comprender un análogo de guanina. Los análogos de guanina útiles incluyen, pero no se limitan a, inosina, Ní-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-desaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina y 2-azidoguanosina.
15. Colas de Poli-A
En algunas realizaciones, los polinucleótidos (es decir, un polinucleótido de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) comprenden además una cola de poli-A. En realizaciones adicionales, se pueden incorporar grupos terminales en la cola de poli-A para estabilización. En otras realizaciones, una cola de poli-A comprende colas de des-3’ hidroxilo.
Durante el procesamiento de ARN, se puede añadir una cadena larga de nucleótidos de adenina (cola de poli-A) a un polinucleótido tal como una molécula de ARNm con el fin de aumentar la estabilidad. Inmediatamente después de la transcripción, el extremo 3’ del transcrito puede escindirse para liberar un 3' hidroxilo. A continuación, la poli-A polimerasa añade una cadena de nucleótidos de adenina al ARN. El proceso, denominado poliadenilación, añade una cola de poli-A que puede tener entre, por ejemplo, aproximadamente 80 y aproximadamente 250 residuos de longitud, incluyendo aproximadamente 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 o 250 residuos de longitud.
También se pueden añadir colas de poliA después de que el constructo se exporte desde el núcleo.
De acuerdo con la presente invención, los grupos terminales en la cola de poli A pueden incorporarse para estabilización. Los polinucleótidos pueden incluir colas de des-3’ hidroxilo. También pueden incluir restos estructurales o modificaciones de 2’-Ometilo como enseñaron Junjie Li, et al. (Current Biology, Vol. 15, 1501 1507, 23 de agosto de 2005).
Los polinucleótidos pueden diseñarse para codificar transcritos con estructuras de cola de poli A alternativas que incluyen ARNm de histona. De acuerdo con Norbury, “La uridilación terminal también se ha detectado en ARNm de histona dependientes de la replicación humanos. El recambio de estos ARNm se cree que es importante para la prevención de la acumulación de histona potencialmente tóxica después de la finalización o inhibición de la replicación del ADN cromosómico. Estos ARNm se distinguen por su falta de una cola de poli(A) 3’, cuya función es asumida en cambio por una estructura de tallo-bucle estable y su proteína de unión de tallobucle (SLBP, por sus siglas en inglés) cognada; esta última lleva a cabo las mismas funciones que las de PABP en los ARNm poliadenilados” (Norbury, “Cytoplasmic RNA: a case of the tail wagging the dog”, Nature Reviews Molecular Cell Biology; AOP, publicado en línea el 29 de agosto de 2013; doi:10.1038/nrm3645).
Unas longitudes de cola de poli-A únicas proporcionan ciertas ventajas a los polinucleótidos. Generalmente, la longitud de una cola de poli-A, cuyo está presente, es mayor de 30 nucleótidos de longitud. En otra realización, la cola de poli-A tiene una longitud superior a 35 nucleótidos (por ejemplo, al menos o superior a aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500 y 3000 nucleótidos).
En algunas realizaciones, el polinucleótido o una región del mismo incluyen de aproximadamente 30 a aproximadamente 3000 nucleótidos (por ejemplo, de 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 750, de 30 a 1000, de 30 a 1500, de 30 a 2000, de 30 a 2500, de 50 a 100, de 50 a 250, de 50 a 500, de 50 a 750, de 50 a 1000, de 50 a 1500, de 50 a 2000, de 50 a 2500, de 50 a 3000, de 100 a 500, de 100 a 750, de 100 a 1000, de 100 a 1500, de 100 a 2000, de 100 a 2500, de 100 a 3000, de 500 a 750, de 500 a 1000, de 500 a 1500, de 500 a 2000, de 500 a 2500, de 500 a 3000, de 1000 a 1500, de 1000 a 2000, de 1000 a 2500, de 1000 a 3000, de 1500 a 2000, de 1500 a 2500, de 1500 a 3000, de 2000 a 3000, de 2000 a 2500 y de 2500 a 3000).
En algunas realizaciones, la cola de poli-A está diseñada con relación a la longitud del polinucleótido total o la longitud de una región concreta del polinucleótido. Este diseño puede basarse en la longitud de una región codificante, la longitud de una característica o región concretas o basarse en la longitud del producto final expresado a partir de los polinucleótidos.
En este contexto, la cola de poli-A puede ser un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% mayor en longitud que el polinucleótido o la característica del mismo. La cola de poli-A también se puede diseñar como una fracción de los polinucleótidos a los que pertenece. En este contexto, la cola de poli-A puede ser un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% o más de la longitud total del constructo, una región del constructo o la longitud total del constructo menos la cola de poli-A. Además, los sitios de unión adaptados por ingeniería y la conjugación de polinucleótidos para la proteína de unión de Poli-A pueden mejorar la expresión.
Adicionalmente, múltiples polinucleótidos distintos pueden enlazarse entre sí mediante la PABP (proteína de unión de Poli-A) a través del extremo 3’ usyo nucleótidos modificados en el extremo 3’ de la cola de poli-A. Los experimentos de transfección se pueden llevar a cabo en líneas celulares relevantes y la producción de proteínas se puede ensayar por ELISA a las 12 h, 24 h, 48 h 72 h y el día 7 después de la transfección.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos están diseñados para incluir una región poliA-cu arteto G. El cuarteto G es un conjunto ordenado cíclico enlazado por hidrógeno de cuatro nucleótidos de guanina que se puede formar mediante secuencias ricas en G tanto en ADN como en ARN. En esta realización, el cuarteto G se incorpora al final de la cola de poli-A. El polinucleótido resultante se somete a ensayo para determinar su estabilidad, producción de proteínas y otros parámetros que incluyen la semivida en diversos puntos temporales. Se ha descubierto que el poliA-cuarteto G da como resultado la producción de proteína a partir de un ARNm equivalente en al menos un 75% de lo observado usyo una cola de poli-A de 120 nucleótidos sola.
16. Región de codón de iniciación
La composición de la invención también puede incluir un polinucleótido que comprenda tanto una región de codón de iniciación como el polinucleótido descrito en la presente memoria (es decir, un polinucleótido de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT). En algunas realizaciones, los polinucleótidos pueden tener regiones que sean análogas a o hagan las veces de una región de codón de iniciación.
En algunas realizaciones, la traducción de un polinucleótido puede iniciarse en un codón que no sea el codón de iniciación AUG. La traducción del polinucleótido puede iniciarse en un codón de iniciación alternativo tal como, pero sin limitarse a, ACG, AGG, AAG, CTG/CUG, GTG/GUG, ATA/AUA, ATT/AUU, TTG/UUG (véase Touriol et al. Biology of the Cell 95 (2003) 169-178 y Matsuda y Mauro PLoS ONE, 20105:11).
Como ejemplo no limitativo, la traducción de un polinucleótido comienza en el codón de iniciación alternativo ACG. Como otro ejemplo no limitativo, la traducción del polinucleótido comienza en el codón de iniciación alternativo CTG o CUG. Como otro ejemplo no limitativo más, la traducción de un polinucleótido comienza en el codón de iniciación alternativo GTG o GUG.
Se sabe que los nucleótidos que flanquean un codón que inicia la traducción, tal como, pero sin limitarse a, un codón de iniciación o un codón de iniciación alternativo, afectan a la eficiencia de la traducción, la longitud y/o la estructura del polinucleótido (véase, por ejemplo, Matsuda y Mauro PLoS ONE, 2010 5:11). El enmascaramiento de cualquiera de los nucleótidos que flanquean un codón que inicia la traducción se puede usar para alterar la posición de iniciación de la traducción, eficiencia de la traducción, longitud y/o estructura de un polinucleótido.
En algunas realizaciones, se puede usar un agente de enmascaramiento cerca del codón de iniciación o codón de iniciación alternativo con el fin de enmascarar u ocultar el codón para reducir la probabilidad de iniciación de traducción en el codón de iniciación o codón de iniciación alternativo enmascarado. Los ejemplos no limitativos de agentes de enmascaramiento incluyen polinucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) antisentido y complejos de unión de exón (EJC) (Véase, por ejemplo, Matsuda y Mauro que describen agentes de enmascaramiento de polinucleótidos de LnA y EJC (PLoS ONE, 20105:11)).
En otra realización, se puede usar un agente de enmascaramiento para enmascarar un codón de iniciación de un polinucleótido con el fin de aumentar la probabilidad de que la traducción se inicie en un codón de iniciación alternativo. En algunas realizaciones, un agente de enmascaramiento se puede usar para enmascarar un primer codón de iniciación o codón de iniciación alternativo con el fin de aumentar la posibilidad de que la traducción se inicie en un codón de iniciación o codón de iniciación alternativo en dirección 3' con respecto al codón de iniciación o codón de iniciación alternativo enmascarado.
En algunas realizaciones, un codón de iniciación o codón de iniciación alternativo puede ubicarse dentro de un complemento perfecto para un sitio de unión de miARN. El complemento perfecto de un sitio de unión de miARN puede ayudar a controlar la traducción, longitud y/o estructura del polinucleótido similar a un agente de enmascaramiento. Como un ejemplo no limitativo, el codón de iniciación o codón de iniciación alternativo se puede ubicar en el medio de un complemento perfecto para un sitio de unión de miARN. El codón de iniciación o codón de iniciación alternativo puede ubicarse después del primer nucleótido, segundo nucleótido, tercer nucleótido, cuarto nucleótido, quinto nucleótido, sexto nucleótido, séptimo nucleótido, octavo nucleótido, noveno nucleótido, décimo nucleótido, undécimo nucleótido, duodécimo nucleótido, decimotercer nucleótido, decimocuarto nucleótido, decimoquinto nucleótido, decimosexto nucleótido, decimoséptimo nucleótido, decimoctavo nucleótido, decimonoveno nucleótido, vigésimo nucleótido o vigésimo primer nucleótido.
En otra realización, el codón de iniciación de un polinucleótido se puede eliminar de la secuencia de polinucleótidos con el fin de que la traducción del polinucleótido comience en un codón que no sea el codón de iniciación. La traducción del polinucleótido puede comenzar en el codón que sigue al codón de iniciación eliminado o en un codón de iniciación o un codón de iniciación alternativo situado en dirección 3'. En un ejemplo no limitativo, el codón de iniciación ATG o AUG se elimina como los primeros 3 nucleótidos de la secuencia del polinucleótido con el fin de que la traducción se inicie en un codón de iniciación o codón de iniciación alternativo situado en dirección 3'. La secuencia del polinucleótido donde se eliminó el codón de iniciación puede comprender además al menos un agente de enmascaramiento para el codón de iniciación y/o los codones de iniciación alternativos situados en dirección 3' con el fin de controlar o intentar controlar la iniciación de la traducción, la longitud del polinucleótido y/o la estructura del polinucleótido.
17. Región de Codón de Parada
La composición de la invención también incluye un polinucleótido que comprende tanto una región de codón de parada como el polinucleótido descrito en la presente memoria (es decir, un polinucleótido de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT). En algunas realizaciones, los polinucleótidos pueden incluir al menos dos codones de parada antes de la región no traducida (UTR) 3’. El codón de parada puede seleccionarse entre TGA, TAA y TAG en el caso del ADN, o entre UGA, UAA y UAG en el caso del ARN. En algunas realizaciones, los polinucleótidos incluyen el codón de parada TGA en el caso del ADN, o el codón de parada UGA en el caso del ARN, y un codón de parada adicional. En una realización adicional, el codón de parada de adición puede ser TAA o UAA. En otra realización, los polinucleótidos incluyen tres codones de parada consecutivos, cuatro codones de parada, o más.
18. Inserciones y Sustituciones
La composición de la invención también puede incluir un polinucleótido de la presente divulgación que comprenda además inserciones y/o sustituciones.
En algunas realizaciones, la 5' UTR del polinucleótido puede reemplazarse por la inserción de al menos una región y/o serie de nucleósidos de la misma base. La región y/o serie de nucleótidos puede incluir, pero no se limita a, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 nucleótidos y los nucleótidos pueden ser naturales y/o no naturales. Como un ejemplo no limitativo, el grupo de nucleótidos puede incluir 5 8 adenina, citosina, timina, una serie de cualquiera de los otros nucleótidos divulgados en la presente memoria y/o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la 5' UTR del polinucleótido puede reemplazarse por la inserción de al menos dos regiones y/o series de nucleótidos de dos bases diferentes tales como, pero sin limitarse a, adenina, citosina, timina, cualquiera de los otros nucleótidos divulgados en la presente memoria y/o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la 5' UTR se puede reemplazar insertyo 5-8 bases de adenina e insertyo a continuación 5-8 bases de citosina. En otro ejemplo, la 5' UTR se puede reemplazar insertyo 5-8 bases de citosina e insertyo a continuación 5-8 bases de adenina.
En algunas realizaciones, el polinucleótido puede incluir al menos una sustitución y/o inserción en dirección 3' con respecto al sitio de iniciación de transcripción que pueda reconocer una ARN polimerasa. Como un ejemplo no limitativo, al menos una sustitución y/o inserción puede darse en dirección 3' con respecto al sitio de iniciación de transcripción mediante la sustitución de al menos un ácido nucleico en la región situada justo en dirección 3' con respecto al sitio de iniciación de transcripción (tal como, pero sin limitarse a, 1 a 6). Los cambios en la región de nucleótidos justo en dirección 3' con respecto al sitio de iniciación de transcripción pueden afectar a las velocidades de iniciación, aumentar los valores constantes de la reacción de nucleótido trifosfato (NTP, por sus siglas en inglés) evidente, y aumentar la disociación de los transcritos cortos del complejo de transcripción durante la transcripción inicial (Brieba et al, Biochemistry (2002) 41: 5144-5149). La modificación, sustitución y/o inserción de al menos un nucleósido puede causar una mutación silenciosa de la secuencia o puede causar una mutación en la secuencia de aminoácidos.
En algunas realizaciones, el polinucleótido puede incluir la sustitución de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12 o al menos 13 bases de guanina en dirección 3' con respecto al sitio de iniciación de transcripción.
En algunas realizaciones, el polinucleótido puede incluir la sustitución de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 bases de guanina en la región situada justo en dirección 3' con respecto al sitio de iniciación de transcripción. Como ejemplo no limitativo, si los nucleótidos en la región son GGGAGA, las bases de guanina pueden estar sustituidas por al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 nucleótidos de adenina. En otro ejemplo no limitativo, si los nucleótidos en la región son GGGAGA, las bases de guanina pueden estar sustituidas por al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 bases de citosina. En otro ejemplo no limitativo, si los nucleótidos en la región son GGGAGA, las bases de guanina pueden estar sustituidas por al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 timinas y/o cualquiera de los nucleótidos descritos en la presente memoria.
En algunas realizaciones, el polinucleótido puede incluir al menos una sustitución y/o inserción en dirección 5' con respecto al codón de iniciación. Con fines de claridad, un experto en la técnica apreciaría que el codón de iniciación es el primer codón de la región codificante de proteína, mientras que el sitio de iniciación de transcripción es el sitio donde comienza la transcripción. El polinucleótido puede incluir, pero no se limita a, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 sustituciones y/o inserciones de bases nucleotídicas. Las bases nucleotídicas pueden insertarse o sustituirse en 1, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 ubicaciones en dirección 5' con respecto al codón de iniciación. Los nucleótidos insertados y/o sustituidos pueden ser la misma base (por ejemplo, todos A o todos C o todos T o todos G), dos bases diferentes (por ejemplo, A y C, A y T, o C y T), tres bases diferentes (por ejemplo, A, C y T o A, C y T) o al menos cuatro bases diferentes.
Como ejemplo no limitativo, la base de guanina en dirección 5' con respecto a la región codificante en el polinucleótido puede estar sustituida por adenina, citosina, timina o cualquiera de los nucleótidos descritos en la presente memoria. En otro ejemplo no limitativo, la sustitución de bases de guanina en el polinucleótido puede diseñarse para dejar una base de guanina en la región situada en dirección 3' con respecto al sitio de iniciación de transcripción y antes del codón de iniciación (véase Esveltet al.Nature (2011) 472 (7344): 499 503). Como ejemplo no limitativo, pueden insertarse al menos 5 nucleótidos en 1 ubicación en dirección 3' con respecto al sitio de iniciación de transcripción, pero en dirección 5' con respecto al codón de iniciación, y los al menos 5 nucleótidos pueden ser del mismo tipo de base.
19. Polinucleótido que Comprende un ARNm que Codifica un Polipéptido de GALT
En ciertas realizaciones, un polinucleótido, es decir, una secuencia de nucleótidos de ARNm que codifica un polipéptido de GALT, comprende, del extremo 5’ al 3’:
(i) un casquete 5’ proporcionado anteriormente;
(ii) una 5' UTR, tal como las secuencias proporcionadas anteriormente;
(iii) un marco de lectura abierta que codifica un polipéptido de GALT, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico optimizada en cuanto a la secuencia que codifica GALT divulgada en la presente memoria;
(iv) al menos un codón de parada;
(v) una 3' UTR, tal como las secuencias proporcionadas anteriormente; y
(vi) una cola de poli-A proporcionada anteriormente.
En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende además un sitio de unión de miARN, por ejemplo, un sitio de unión de miARN que se une a miARN-142. En algunas realizaciones, la 5’ UTR comprende un sitio de unión de miARN.
En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptidos al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos un 84%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% idéntica a la secuencia de proteínas de una GALT de tipo silvestre (por ejemplo, isoformas 1 o 2).
En algunas realizaciones, un polinucleótido, es decir, una secuencia de nucleótidos de ARNm que codifica un polipéptido, comprende (1) un casquete 5’ proporcionado anteriormente, por ejemplo, CAP1, (2) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 143 y 145, y (3) una cola de poli-A proporcionada anteriormente, por ejemplo, una cola de poli-A de aproximadamente 100 residuos, en donde SEQ ID NO: 143 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 124, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 145 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 126, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98.
En algunas realizaciones, un polinucleótido, es decir, una secuencia de nucleótidos de ARNm que codifica un polipéptido de GALT, comprende (1) un casquete 5’ proporcionado anteriormente, por ejemplo, CAP1, (2) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 132 a 142, 144, y 146 a 150, y (3) una cola de poli-A proporcionada anteriormente, por ejemplo, una cola de poli A de ~100 residuos, en donde
SEQ ID NO: 132 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 113, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 133 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 114, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 134 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 115, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 135 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 116, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 136 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 117, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 137 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 118, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 138 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 119, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 139 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 120, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 140 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 121, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 141 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 122, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 142 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 123, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 144 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 125, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 146 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 127, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 147 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 128, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 148 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 129, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98;
SEQ ID NO: 149 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 130, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98; y
SEQ ID NO: 150 comprende, del extremo 5’ al 3’: 5’ UTR de SEQ ID NO: 35, ORF de polipéptido de GALT de SEQ ID NO: 131, y 3’ UTR de SEQ ID NO: 98.
Tabla 5 - Constructos de ARNm
Las secuencias de ARNm (ORF) adicionales usadas en los Ejemplos figuran en la Tabla 6. Tabla 6: Secuencias de ORF que Codifican Isoformas de GALT de Tipo Silvestre
20. Métodos para Producir Polinucleótidos
La presente divulgación también proporciona métodos para producir un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) o un complemento del mismo.
En algunos aspectos, un polinucleótido (por ejemplo, un ARN, por ejemplo, un ARNm) divulgado en la presente memoria,
y que codifica un polipéptido de GALT, se puede construir utilizyo transcripción in vitro. En otros aspectos, un polinucleótido (por ejemplo, un ARN, por ejemplo, un ARNm) divulgado en la presente memoria, y que codifica un polipéptido de GALT, se puede construir mediante síntesis química utilizyo un sintetizador de oligonucleótidos.
En otros aspectos, un polinucleótido (por ejemplo, un ARN, por ejemplo, un ARNm) divulgado en la presente memoria, y que codifica un polipéptido de GALT, se produce usyo una célula hospedadora. En ciertos aspectos, un polinucleótido (por ejemplo, un ARN, por ejemplo, un ARNm) divulgado en la presente memoria, y que codifica un polipéptido de GALT, se produce mediante una o más combinaciones de la IVT, síntesis química, expresión de células hospedadoras o cualesquiera otros métodos conocidos en la técnica.
Los nucleósidos de origen natural, los nucleósidos de origen no natural, o combinaciones de los mismos, pueden reemplazar total o parcialmente de forma natural los nucleósidos presentes en la secuencia de nucleótidos cyidata y pueden incorporarse a una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia (por ejemplo, un a Rn , por ejemplo, un ARNm) que codifique un polipéptido de GALT. Los polinucleótidos resultantes, por ejemplo, ARNm, pueden entonces examinarse para determinar su capacidad para producir proteínas y/o producir un resultado terapéutico.
a. Transcripción In Vitro / Síntesis Enzimática
Los polinucleótidos divulgados en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) se pueden transcribir usyo un sistema de transcripción in vitro (IVT). El sistema comprende típicamente un tampón de transcripción, nucleótidos trifosfatos (NTP), un inhibidor de ARNasa y una polimerasa. Los NTP pueden seleccionarse entre, pero no se limitan a, aquellos descritos en la presente memoria, incluyendo NTP naturales y no naturales (modificados). La polimerasa puede seleccionarse entre, pero no se limita a, ARN polimerasa T7, ARN polimerasa T3 y polimerasas mutantes tales como, pero sin limitarse a, polimerasas capaces de incorporar polinucleótidos divulgados en la presente memoria. Véase la Publicación de EE.UU. No US20130259923.
Puede usarse cualquier número de ARN polimerasas o variantes en la síntesis de los polinucleótidos. Las ARN polimerasas se pueden modificar insertyo o suprimiendo aminoácidos de la secuencia de ARN polimerasa. Como ejemplo no limitativo, la ARN polimerasa puede modificarse para que presente una capacidad aumentada para incorporar un nucleótido trifosfato 2'-modificado en comparación con una ARN polimerasa no modificada (véanse la Publicación Internacional WO2008078180 y la Patente de EE.UU. 8,101,385).
Pueden obtenerse variantes haciendo evolucionar una ARN polimerasa, optimizyo la secuencia de aminoácidos y/o ácidos nucleicos de la ARN polimerasa y/o usyo otros métodos conocidos en la técnica. Como ejemplo no limitativo, las variantes de ARN polimerasa T7 pueden hacerse evolucionar usyo el sistema de evolución dirigida continua expuesto por Esvelt et al. (Nature 472:499-503 (2011)) donde los clones de ARN polimerasa T7 pueden codificar al menos una mutación tal como, pero no limitada a, lisina en la posición 93 sustituida por treonina (K93T), I4M, A7T, E63V, V64D, A65E, D66Y, T76N, C125R, S128R, A136T, N165S, G175R, H176L, Y178H, F182L, L196F, G198V, D208Y, E222K, S228A, Q239R, T243N, G259D, M267I, G280C, H300R, D351A, A354S, E356D, L360P, A383V, Y385C, D388Y, S397R, M401T, N410S, K450R, P451T, G452V, E484A, H523L, H524N, G542V, E565K, K577E, K577M, N601S, S684Y, L699I, K713E, N748D, Q754R, E775K, A827V, D851N o L864F. Como otro ejemplo no limitativo, las variantes de ARN polimerasa T7 pueden codificar al menos una mutación como se describe en las Publicaciones de EE.UU. Nos 20100120024 y 20070117112. Las variantes de ARN polimerasa también pueden incluir, pero no se limitan a, variantes de sustitución, sustitución de aminoácidos conservativa, variantes de inserción y/o variantes de deleción.
En un aspecto, el polinucleótido puede diseñarse para ser reconocido por las ARN polimerasas de tipo silvestre o variantes. Al hacer esto, el polinucleótido puede modificarse para que contenga sitios o regiones de cambios de secuencia del polinucleótido quimérico precursor o de tipo silvestre.
Las reacciones de síntesis de polinucleótidos o ácidos nucleicos se pueden llevar a cabo por métodos enzimáticos utilizyo polimerasas. Las polimerasas catalizan la creación de enlaces de fosfodiéster entre nucleótidos en una cadena de polinucleótido o ácido nucleico. Las ADN polimerasas conocidas actualmente se pueden dividir en diferentes familias basándose en la comparación de secuencias de aminoácidos y el análisis de la estructura cristalina. La familia de ADN polimerasas I (pol I) o polimerasas A, incluyendo los fragmentos de Klenow de ADN polimerasa I deE. coli, Bacillus,ADN polimerasas deThermus aquaticus(Taq), y las ARN y ADN polimerasas T7, se encuentra entre las mejor estudiadas de estas familias. Otra familia grye es la familia de ADN polimerasas a (pol a) o polimerasas B, incluyendo todas las ADN polimerasas eucariotas replicantes y polimerasas de los fagos T4 y RB69. Aunque emplean un mecanismo catalítico similar, estas familias de polimerasas difieren en la especificidad del sustrato, la eficiencia de incorporación de análogo de sustrato, el grado y la velocidad para la extensión del cebador, el modo de síntesis de ADN, la actividad de exonucleasa y la sensibilidad contra inhibidores.
Las ADN polimerasas también se seleccionan basándose en las condiciones de reacción óptimas que requieren, tales como temperatura de reacción, pH y concentraciones de molde y cebador. A veces se emplea una combinación de más de una ADN polimerasa para conseguir el tamaño deseado del fragmento de<a>D<n>y la eficiencia de síntesis. Por ejemplo, Cheng et al. aumentan el pH, añaden glicerol y dimetil sulfóxido, disminuyen los tiempos de desnaturalización, aumentan los tiempos de extensión y utilizan una ADN polimerasa termoestable secundaria que posee una actividad de exonucleasa de 3’ a 5’ para amplificar eficazmente dianas largas de insertos clonados y ADN genómico humano (Cheng et al., PNAS 91:5695-5699 (1994)). Las ARN polimerasas de los bacteriófagos T3, T7 y SP6 se han usado ampliamente para preparar ARN para estudios bioquímicos y biofísicos. En la Publicación Internacional No WO2014028429 en tramitación se divulgan ARN polimerasas, enzimas de dotación de casquete y poli-A polimerasas.
En un aspecto, la ARN polimerasa que puede usarse en la síntesis de los polinucleótidos es una ARN polimerasa Syn5 (véase Zhu et al. Nucleic Acids Research 2013, doi:10.1093/nar/gkt1193). La ARN polimerasa Syn5 fue caracterizada recientemente a partir de cianófago marino Syn5 por Zhu et al., en donde también identificaron la secuencia promotora (véase Zhu et al. Nucleic Acids Research 2013). Zhu et al. hallaron que la ARN polimerasa Syn5 catalizaba la síntesis de ARN en un intervalo más amplio de temperaturas y salinidad en comparación con la ARN polimerasa T7. Adicionalmente, se halló que el requerimiento para el nucleótido iniciador en el promotor era menos estricto para la ARN polimerasa Syn5 en comparación con la ARN polimerasa T7, lo que hace que la ARN polimerasa Syn5 sea prometedora para la síntesis de ARN.
En un aspecto, se puede usar una ARN polimerasa Syn5 en la síntesis de los polinucleótidos descritos en la presente memoria. Como ejemplo no limitativo, se puede usar una ARN polimerasa Syn5 en la síntesis del polinucleótido que requiere un extremo 3’ preciso.
En un aspecto, se puede usar un promotor Syn5 en la síntesis de los polinucleótidos. Como ejemplo no limitativo, el promotor Syn5 puede ser 5’- ATTg Gg CACCCGTAAGGG-3’ (SEQ ID NO: 78 como describen Zhu et al. (Nucleic Acids Research 2013).
En un aspecto, se puede usar una ARN polimerasa Syn5 en la síntesis de polinucleótidos que comprenden al menos una modificación química descrita en la presente memoria y/o conocida en la técnica (véase, por ejemplo, la incorporación de pseudo-UTP y 5Me-CTP descrita en Zhu et al. Nucleic Acids Research 2013).
En un aspecto, los polinucleótidos descritos en la presente memoria se pueden sintetizar usyo una ARN polimerasa Syn5 que se haya purificado usyo el procedimiento de purificación modificado y mejorado descrito por Zhu et al. (Nucleic Acids Research 2013).
Diversas herramientas en ingeniería genética se basan en la amplificación enzimática de un gen diana que hace de molde. Para el estudio de secuencias de genes individuales o regiones específicas de interés y otras necesidades de investigación, es necesario generar múltiples copias de un gen diana a partir de una pequeña muestra de polinucleótidos o ácidos nucleicos. Tales métodos pueden aplicarse en la fabricación de los polinucleótidos. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (p Cr , por sus siglas en inglés), la amplificación por desplazamiento de hebras (SDA, por sus siglas en inglés), la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA, por sus siglas en inglés), también llamada amplificación mediada por transcripción (TMA, por sus siglas en inglés), y/o la amplificación por círculo rodante (RCA, por sus siglas en inglés) se pueden utilizar en la fabricación de una o más regiones de los polinucleótidos de la presente invención. También se usa ampliamente el ensamblaje de polinucleótidos o ácidos nucleicos mediante una ligasa.
b. Síntesis química
Pueden aplicarse métodos estándar para sintetizar una secuencia de polinucleótidos aislada que codifique un polipéptido aislado de interés, tal como un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de<g>A<l>T). Por ejemplo, se puede sintetizar un oligómero de ADN o ARN único que contenga una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a los codones que codifique el polipéptido aislado concreto. En otros aspectos, se pueden sintetizar y luego ligar varios oligonucleótidos pequeños que codifiquen porciones del polipéptido deseado. En algunos aspectos, los oligonucleótidos individuales contienen típicamente partes sobresalientes de 5’ o 3’ para el ensamblaje complementario.
Un polinucleótido divulgado en la presente memoria (por ejemplo, un ARN, por ejemplo, un ARNm) puede sintetizarse químicamente utilizyo métodos de síntesis química y sustituciones potenciales de nucleobases conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Nos WO2014093924, WO2013052523; WO2013039857, WO2012135805, WO2013151671; la Publicación de EE.UU. No US20130115272; o las Patentes de EE. Nos US8999380 o US8710200.
c. Purificación de Polinucleótidos que Codifican GALT
La purificación de los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) puede incluir, pero no se limita a, limpieza de polinucleótidos, garantía de calidad y control de calidad. La limpieza se puede realizar por métodos conocidos en la técnica tales como, pero sin limitarse a, perlas AGENCOURT® (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), perlas de poli-T, sondas de captura de oligo-T LNA™ (EXIQON® Inc., Vedbaek, Dinamarca) o métodos de purificación basados en HPLC tales como, pero sin limitarse a, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrófoba (HIC-HPLC).
El término "purificado" cuyo se usa en relación con un polinucleótido tal como un "polinucleótido purificado" se refiere a uno que está separado de al menos un contaminante. Tal como se usa en la presente memoria, un “contaminante” es cualquier sustancia que haga que otra sea no apta, impura o inferior. Por lo tanto, un polinucleótido purificado (por ejemplo, ADN y ARN) está presente en una forma o escenario diferentes de aquellos en los que se encuentra en la naturaleza, o una forma o escenario diferentes de aquellos que existían antes de someterlo a un tratamiento o un método de purificación.
En algunos casos, la purificación de un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) elimina impurezas que pueden reducir o eliminar una respuesta inmunitaria no deseada, por ejemplo, reduciendo la actividad de citocinas.
En algunos casos, el polinucleótido “o” (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) se purifica antes de la administración utilizyo cromatografía en columna (por ejemplo, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (r P-Hp LC) y HPLC de interacción hidrófoba (HIC-HPLC), o (LCMS)).
En algunos casos, el polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de un polipéptido de GALT) purificado usyo cromatografía en columna (por ejemplo, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC), HPLC de interacción hidrófoba (HIC-HPLC), o (LCMS)) presenta una expresión aumentada de la proteína GALT codificada en comparación con el nivel de expresión obtenido con el mismo polinucleótido de la presente divulgación purificado por un método de purificación diferente.
En algunos casos, un polinucleótido purificado por cromatografía en columna (por ejemplo, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC), HPLC de interacción hidrófoba (HIC-HPLC), o (LCMS)) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT que comprende una o más de las mutaciones puntuales conocidas en la técnica.
En algunos casos, el uso de polinucleótido purificado por RP-HPLC aumenta los niveles de expresión de la proteína GALT en las células cuyo se introduce en esas células, por ejemplo, en un 10-100%, es decir, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 100% con respecto a los niveles de expresión de la proteína GALT en las células antes de que se introdujera el polinucleótido purificado por RP-HPLC en las células, o después de que se introdujera un polinucleótido no purificado por RP-HPLC en las células.
En algunos casos, el uso de polinucleótido purificado por RP-HPLC aumenta los niveles de expresión de la proteína GALT funcional en las células cuyo se introduce en esas células, por ejemplo, en un 10-100%, es decir, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 100% con respecto a los niveles de expresión funcionales de la proteína GALT en las células antes de que se introdujera el polinucleótido purificado por RP-HPLC en las células, o después de que se introdujera un polinucleótido no purificado por RP-HPLC en las células.
En algunos casos, el uso de polinucleótido purificado por RP-HPLC aumenta la actividad detectable de GALT en las células cuyo se introduce en esas células, por ejemplo, en un 10-100%, es decir, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 100% con respecto a los niveles de actividad de GALT funcional en las células antes de que se introdujera el polinucleótido purificado por RP-HPLC en las células, o después de que se introdujera un polinucleótido no purificado por Rp-HPLC en las células.
En algunos casos, el polinucleótido purificado es al menos aproximadamente un 80% puro, al menos aproximadamente un 85% puro, al menos aproximadamente un 90% puro, al menos aproximadamente un 95% puro, al menos aproximadamente un 96% puro, al menos aproximadamente un 97% puro, al menos aproximadamente un 98% puro, al menos aproximadamente un 99% puro, o aproximadamente un 100% puro.
Se puede llevar a cabo una verificación de garantía de calidad y/o control de calidad usyo métodos tales como, pero sin limitarse a, electroforesis en gel, absorbancia UV, o HPLC analítica. En otros casos, el polinucleótido se puede secuenciar por métodos que incluyen, pero no se limitan a, PCR de transcriptasa inversa.
d. Cuantificación de Polinucleótidos Expresados que Codifican GALT
Los polinucleótidos (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT), sus productos de expresión, así como los productos de degradación y metabolitos, se pueden cuantificar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
En algunos casos, los polinucleótidos se pueden cuantificar en exosomas o cuyo se obtienen de uno o más fluidos corporales. Tal como se usa en la presente memoria, los “fluidos corporales” incluyen sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, líquido cefalorraquídeo (LCR), esputo, saliva, médula ósea, líquido sinovial, humor acuoso, líquido amniótico, cerumen, leche materna, líquido de lavado broncoalveolar, semen, líquido prostático, líquido preseminal o líquido preeyaculatorio, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, líquido quístico, líquido pleural y peritoneal, líquido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, líquido intersticial, menstruo, pus, sebo, vómito, secreciones vaginales, secreción mucosa, agua de las heces, jugo pancreático, fluidos de lavado de cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares, fluido de la cavidad blastocilo y sangre del cordón umbilical. Como alternativa, los exosomas pueden recuperarse de un órgano seleccionado del grupo que consiste en pulmón, corazón, páncreas, estómago, intestino, vejiga, riñón, ovario, testículo, piel, colon, mama, próstata, cerebro, esófago, hígado y placenta.
En el método de cuantificación de exosomas, se obtiene una muestra de no más de 2 mL del individuo y los exosomas se aíslan por cromatografía de exclusión por tamaños, centrifugación con gradiente de densidad, centrifugación diferencial, ultrafiltración por nanomembrana, captura inmunoabsorbente, purificación por afinidad, separación microfluídica o combinaciones de los mismos. En el análisis, el nivel o la concentración de un polinucleótido pueden ser un nivel de expresión, presencia, ausencia, truncamiento o alteración del constructo administrado. Es ventajoso correlacionar el nivel con uno o más fenotipos clínicos o con un ensayo para un biomarcador de enfermedad humana.
El ensayo puede realizarse usyo sondas específicas de constructo, citometría, qRT-PCR, PCR en tiempo real, PCR, citometría de flujo, electroforesis, espectrometría de masas, o combinaciones de los mismos, mientras que los exosomas pueden aislarse usyo métodos inmunohistoquímicos tales como métodos de ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés). Los exosomas también se pueden aislar por cromatografía de exclusión por tamaños, centrifugación con gradiente de densidad, centrifugación diferencial, ultrafiltración por nanomembrana, captura inmunoabsorbente, purificación por afinidad, separación microfluídica o combinaciones de los mismos.
Estos métodos proporcionan al investigador la capacidad de monitorizar, en tiempo real, el nivel de polinucleótidos remanentes o aportados. Esto es posible porque los polinucleótidos de la presente divulgación difieren de las formas endógenas debido a las modificaciones estructurales o químicas.
En algunos casos, el polinucleótido se puede cuantificar usyo métodos tales como, pero sin limitarse a, espectroscopia ultravioleta-visible (UV/Vis). Un ejemplo no limitativo de un espectrómetro UV/Vis es un espectrómetro NANODROP® (ThermoFisher, Waltham, MA). El polinucleótido cuantificado puede analizarse con el fin de determinar si el polinucleótido puede ser de tamaño adecuado, comprobar que no se haya producido degradación del polinucleótido. La degradación del polinucleótido se puede comprobar por métodos tales como, pero sin limitarse a, electroforesis en gel de agarosa, métodos de purificación basados en HPLC tales como, pero sin limitarse a, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrófoba (HIC-HPLC), cromatografía de líquidosespectrometría de masas (LCMS, por sus siglas en inglés), electroforesis capilar (CE, por sus siglas en inglés) y electroforesis en gel capilar (CGE, por sus siglas en inglés).
21. Formulaciones y Composiciones Farmacéuticas
La presente invención proporciona formulaciones y composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los polinucleótidos de ARNm descritos anteriormente. La formulación o composición además comprende un agente de administración.
En algunas realizaciones, la formulación o composición puede contener un polinucleótido de ARNm que comprenda una secuencia de ácido nucleico optimizada en cuanto a la secuencia divulgada en la presente memoria que codifica un polipéptido de GALT. En algunas realizaciones, la formulación o composición puede contener un polinucleótido (es decir, un ARNm), que comprende un polinucleótido (es decir, un ORF) que tiene una identidad de secuencia significativa con una secuencia de ácido nucleico optimizada en cuanto a la secuencia divulgada en la presente memoria que codifica un polipéptido de GALT. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende además un sitio de unión de miARN, por ejemplo, un sitio de unión de miARN que se une a miR-126, miR-142, miR-144, miR-146, miR-150, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27 y miR-26a.
Las formulaciones o composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente una o más sustancias activas adicionales, por ejemplo, sustancias terapéutica y/o profilácticamente activas. Las formulaciones o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser estériles y/o estar libres de pirógenos. Es posible encontrar consideraciones generales de formulación y/o producción de agentes farmacéuticos, por ejemplo, enRemington: The Science y Practice o f Pharmacy21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005. En algunas realizaciones, las composiciones se administran a seres humanos, individuos o pacientes humanos. A los efectos de la presente divulgación, la expresión “ ingrediente activo” hace referencia, en términos generales, a polinucleótidos que se han de aportar tal como se describe en la presente memoria.
Las formulaciones y composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria se pueden preparar mediante cualquier método conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, tales métodos de preparación incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/u otro u otros ingredientes accesorios y luego, si fuera necesario y/o deseable, dividir, formar y/o envasar el producto para obtener una unidad de dosis única o de dosis múltiples deseada.
Una formulación o composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación puede prepararse, envasarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria única y/o como una pluralidad de dosis unitarias únicas. Tal como se usa en la presente memoria, una “dosis unitaria” se refiere a una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosis del ingrediente activo que se administraría a un individuo y/o una fracción conveniente de tal dosis tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de tal dosis.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualesquiera ingredientes adicionales en una composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación pueden variar, dependiendo de la identidad, el tamaño y/o el estado del individuo tratado y también dependiendo de la vía por la que se haya de administrar la composición.
En algunas realizaciones, las formulaciones y composiciones descritas en la presente memoria pueden contener al menos un polinucleótido. Como ejemplo no limitativo, la formulación o composición puede contener 1, 2, 3, 4 o 5 polinucleótidos. En algunas realizaciones, las formulaciones o composiciones descritas en la presente memoria pueden comprender más de un tipo de polinucleótido. En algunas realizaciones, la formulación o composición puede comprender un polinucleótido en forma lineal y circular. En otra realización, la formulación o composición puede comprender un polinucleótido circular y un polinucleótido transcrito in vitro (IVT). En otra realización más, la formulación o composición puede comprender un polinucleótido IVT, un polinucleótido quimérico y un polinucleótido circular.
Si bien las descripciones de las formulaciones y composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria se orientan principalmente a formulaciones y composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración a seres humanos, el experto en la técnica comprenderá que tales composiciones son adecuadas, en términos generales, para la administración a cualquier otro animal, por ejemplo, a animales no humanos, por ejemplo, mamíferos no humanos.
La presente invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden un polinucleótido descrito en la presente memoria (es decir, un polinucleótido de ARNm que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT). Los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden formularse utilizyo uno o más excipientes para: (1) aumentar la estabilidad; (2) aumentar la transfección de células; (3) permitir la liberación sostenida o retardada (por ejemplo, a partir de una formulación depot del polinucleótido); (4) alterar la biodistribución (por ejemplo, guiar el polinucleótido a tipos de células o tejidos específicos); (5) aumentar la traducción de proteínas codificadasin vivo;y/o (6) alterar el perfil de liberación de proteína codificadain vivo.La formulación farmacéutica comprende además un agente de administración que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (IA), por ejemplo, el Compuesto 18. En algunas realizaciones, el agente de administración comprende el Compuesto 18, DSPC, Colesterol y el Compuesto 428, por ejemplo, con una relación molar de aproximadamente 50:10:38.5:1.5.
Un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como se usa en la presente memoria, incluye, pero no se limita a, cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión u otros vehículos líquidos, adyuvantes de dispersión o suspensión, diluentes, agentes de granulación y/o dispersión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, agentes de conservación, ligantes, lubricantes o aceite, agentes colorantes, edulcorantes o saborizantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes antimicrobianos o antifúngicos, agentes de ajuste de la osmolalidad, agentes de ajuste del pH, tampones, quelantes, cioprotectores, y/o agentes de carga, como sea adecuado para la forma de dosificación concreta deseada. En la técnica se conocen diversos excipientes para formular composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science y Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006).
Los diluentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio o de sodio, fosfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, fosfato de sodio, lactosa, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Los agentes de granulación y/o dispersión ejemplares incluyen, pero no se limitan a, almidones, almidones pregelatinizados, o almidón microcristalino, ácido algínico, goma guar, agar, poli(vinil-pirrolidona), (providona), poli(vinil-pirrolidona) reticulada (crospovidona), celulosa, metilcelulosa, carboximetil celulosa, carboximetil celulosa sódica reticulada (croscarmelosa), silicato de aluminio y magnesio (VEEGUM®), laurilsulfato sódico, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Los agentes tensioactivos y/o emulsionantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, emulsionantes naturales (por ejemplo, goma arábiga, agar, ácido algínico, alginato de sodio, tragacanto, chondrux, colesterol, xantano, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, grasa de lana, colesterol, cera y lecitina), ésteres de ácidos grasos de sorbitán (por ejemplo, monooleato de polioxietileno sorbitán [TWEEn®80], monopalmitato de sorbitán [SPAN®40], monooleato de glicerilo, ésteres de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol (por ejemplo, CREMOPHOR®), éteres de polioxietileno (por ejemplo, éter laurílico de polioxietileno [b R|J®30]), PLUORINC®F 68, POLOXAMER®l88, etc. y/o combinaciones de los mismos.
Los agentes ligantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, almidón, gelatina, azúcares (por ejemplo, sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melaza, lactosa, lactitol, manitol), aminoácidos (por ejemplo, glicina), gomas naturales y sintéticas (por ejemplo, goma arábiga, alginato de sodio), etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa, etc., y combinaciones de los mismos.
La oxidación es una ruta de degradación potencial para ARNm, especialmente para formulaciones de ARNm líquidas. Con el fin de evitar la oxidación, se pueden añadir antioxidantes a las formulaciones. Los antioxidantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, alcohol bencílico, hidroxianisol butilado, m-cresol, metionina, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de sodio o de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, etc. y combinaciones de los mismos.
Los agentes quelantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en inglés), ácido cítrico monohidrato, edetato disódico, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato sódico, ácido tartárico, edetato trisódico, etc., y combinaciones de los mismos.
Los agentes antimicrobianos o antifúngicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potasio o de sodio, sorbato de potasio o de sodio, propionato de sodio, ácido sórbico, etc., y combinaciones de los mismos.
Los agentes de conservación ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, beta-caroteno, ácido cítrico, ácido ascórbico, hidroxianisol butilado, etilendiamina, laurilsulfato sódico (SLS, por sus siglas en inglés), lauril éter sulfato sódico (SLES, por sus siglas en inglés), etc., y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el pH de las soluciones de polinucleótidos se mantiene entre pH 5 y pH 8 para mejorar la estabilidad. Los tampones ejemplares para controlar el pH pueden incluir, pero no se limitan a, fosfato de sodio, citrato de sodio, succinato de sodio, histidina (o histidina-HCl), malato de sodio, carbonato de sodio, etc., y/o combinaciones de los mismos.
Los agentes lubricantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, laurilsulfato de sodio o de magnesio, etc., y combinaciones de los mismos.
La formulación o composición farmacéutica descrita en la presente memoria puede contener un crioprotector para estabilizar un polinucleótido descrito en la presente memoria durante la congelación. Los crioprotectores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, manitol, sacarosa, trehalosa, lactosa, glicerol, dextrosa, etc., y combinaciones de los mismos.
La formulación o composición farmacéutica descrita en la presente memoria puede contener un agente de carga en formulaciones de polinucleótidos liofilizados para producir una torta "farmacéuticamente elegante", estabilizar los polinucleótidos liofilizados durante el almacenamiento a largo plazo (por ejemplo, 36 meses). Los agentes de carga ejemplares de la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a, sacarosa, trehalosa, manitol, glicina, lactosa, rafinosa, y combinaciones de los mismos.
La formulación o composición farmacéutica comprende además un agente de administración. El agente de administración de la presente divulgación puede incluir, sin limitación, liposomas, nanopartículas lipídicas, lipidoides, polímeros, lipoplejos, microvesículas, exosomas, péptidos, proteínas, células transfectadas con polinucleótidos, hialuronidasa, imitadores de nanopartículas, nanotubos, conjugados, y combinaciones de los mismos.
22. Agentes de Administración
a. Compuesto Lipídico
La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas con propiedades ventajosas. Las composiciones lipídicas descritas en la presente memoria pueden usarse ventajosamente en composiciones de nanopartículas lipídicas para la administración de agentes terapéuticos y/o profilácticos, por ejemplo, ARNm, a células u órganos de mamífero. Por ejemplo, los lípidos descritos en la presente memoria tienen poca o ninguna inmunogenicidad. Por ejemplo, los compuestos lipídicos divulgados en la presente memoria tienen una inmunogenicidad menor en comparación con un lípido de referencia (por ejemplo, MC3, KC2 o DLinDMA). Por ejemplo, una formulación que comprende un lípido divulgado en la presente memoria y un agente terapéutico o profiláctico, por ejemplo, ARNm, tiene un índice terapéutico aumentado en comparación con una formulación correspondiente que comprende un lípido de referencia (por ejemplo, MC3, KC2, o DLinDMA) y el mismo agente terapéutico o profiláctico.
En particular, la presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden:
(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT; y (b) un agente de administración.
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el agente de administración comprende un compuesto lipídico que tiene la Fórmula (I)
( I )
en donde
Ri se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR”, -YR”, y -R”M’R’;
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 insustituido, en donde Q se selecciona entre un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NRg)N(R)2, -N(R)C(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NRg)N(R)2, -N(OR)C(=CHRg)N(R)2, -C(=NRg)N(R)2, -C(=NRg)R, -C(O)N(R)OR, y -C(R)N(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona, independientemente, entre 1, 2, 3, 4 y 5;
cada R5 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R’)-, -N(R’)C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR’)O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo C3-6 y heterociclo;
R9 se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO2, alquilo C1-6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C2-6, carbociclo C3-6 y heterociclo;
cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H;
cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14;
cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12;
cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sus sales o estereoisómeros.
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R*YR”, -YR”, y -R”M’R’;
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 insustituido, en donde Q se selecciona entre un carbociclo, heterociclo, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, y -C(R)N(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona, independientemente, entre 1, 2, 3, 4 y 5;
cada R5 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; M y M' se seleccionan, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R’)-, -N(R’)C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR’)O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H;
cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sales o estereoisómeros de los mismos, en donde los grupos alquilo y alquenilo pueden ser lineales o ramificados.
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales, cuyo R4 es -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, o -CQ(R)2, entonces (i) Q no es -N(R)2 cuyo n es 1,2, 3, 4 o 5, o (ii) Q no es un heterocicloalquilo de 5, 6 o 7 miembros cuyo n es 1 o 2.
En otras realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
Ri se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR”, -YR”, y -R”M’R’;
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y Ci-6 alquilo insustituido, en donde Q se selecciona entre un carbociclo C3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NRg)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NRg)N(R)2, -N(OR)C(=CHRg)N(R)2, -C(=NRg)N(R)2, -C(=NRg)R, -C(O)N(R)OR, y un heterocicloalquilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O y S que está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre oxo (=O), OH, amino, y alquilo C1-3, y cada n se selecciona, independientemente, entre 1, 2, 3, 4 y 5;
cada R5 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R’)-, -N(R’)C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR’)O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo C3-6 y heterociclo;
R9 se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO2, C1-6 alquilo, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C2-6, carbociclo C3-6 y heterociclo;
cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y
m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sus sales o estereoisómeros.
En otras realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R*YR”, -YR”, y -R”M’R’;
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 insustituido, en donde Q se selecciona entre un carbociclo C3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno más heteroátomos seleccionados entre N, O y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, y un heterocicloalquilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O y S que está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre oxo (=O), OH, amino, y alquilo C<i -3>, y cada n se selecciona, independientemente, entre 1, 2, 3, 4 y 5;
cada R5 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R’)-, -N(R’)C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR’)O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y
m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sus sales o estereoisómeros.
En otras realizaciones más que no entran dentro del alcance de la invención, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR”, -YR”, y -R”M’R’;
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 insustituido, en donde Q se selecciona entre un carbociclo C3-6, un heterociclo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NRg)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)<n>(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR) C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, y -C(=NR9)N(R)2, y cada n se selecciona, independientemente, entre 1, 2, 3, 4 y 5; y, cuyo Q es un heterociclo de 5 a 14 miembros y (i) R4 es -(CH2)nQ en donde n es 1 o 2, o (ii) R4 es -(CH2)nCHQR en donde n es 1, o (iii) R4 es -CHQR, y -CQ(R)2, entonces Q es, bien un heteroarilo de 5 a 14 miembros, bien un heterocicloalquilo de 8 a 14 miembros; cada R5 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R’)-, -N(R’)C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR’)O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo C3-6 y heterociclo;
R9 se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO2, alquilo C1-6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C2-6, carbociclo C3-6 y heterociclo;
cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C<1-18>, alquenilo C<2-18>, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y
m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sus sales o estereoisómeros.
En otras realizaciones más que no entran dentro del alcance de la invención, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R*YR”, -YR”, y -R”M’R’;
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 insustituido, en donde Q se selecciona entre un carbociclo C3-6, un heterociclo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona, independientemente, entre 1,2, 3, 4 y 5; y, cuyo Q es un heterociclo de 5 a 14 miembros y (i) R4 es -(CH2)nQ en donde n es 1 o 2, o (ii) R4 es -(CH2)nCHQR en donde n es 1, o (iii) R4 es -CHQR, y -CQ(R)2, entonces Q es, bien un heteroarilo de 5 a 14 miembros, bien un heterocicloarilo de 8 a 14 miembros;
cada R5 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R’)-, -N(R’)C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR’)O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y
m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sus sales o estereoisómeros.
En otras realizaciones más que no entran dentro del alcance de la invención, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR”, -YR”, y -R”M’R’;
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 insustituido, en donde Q se selecciona entre un carbociclo C3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR^R, -C(O)N(R)OR, y -C(=NRg)N(R)2, y cada n se selecciona, independientemente, entre 1, 2, 3, 4 y 5;
cada R5 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R’)-, -N(R’)C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR’)O-, -S(O)2-, S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
R8 se selecciona del grupo que consiste en carbociclo C3-6 y heterociclo;
Rg se selecciona del grupo que consiste en H, CN, NO2, alquilo C1-6, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, alquenilo C2-6, carbociclo C3-6 y heterociclo;
cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y
m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sus sales o estereoisómeros.
En otras realizaciones más que no entran dentro del alcance de la invención, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R*YR”, -YR”, y -R”M’R’;
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, y alquilo C1-6 insustituido, en donde Q se selecciona entre un carbociclo C3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno más heteroátomos seleccionados entre N, O y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona, independientemente, entre 1, 2, 3, 4 y 5;
cada R5 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R’)-, -N(R’)C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR’)O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12;
cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y
m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sus sales o estereoisómeros.
En otras realizaciones más que no entran dentro del alcance de la invención, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR”, -YR”, y -R”M’R’;
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C2-14, alquenilo C2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 es -(CH2)nQ o -(CH2)nCHQR, en donde Q es -N(R)2, y n se selecciona entre 3, 4 y 5;
cada R5 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; M y M' se seleccionan, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R’)-, -N(R’)C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR’)O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 alquenilo C3-14; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 alquenilo C1-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y
m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sus sales o estereoisómeros.
En otras realizaciones más que no entran dentro del alcance de la invención, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R*YR”, -YR”, y -R”M’R’;
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C2-14, alquenilo C2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 es -(CH2)nQ o -(CH2)nCHQR, en donde Q es -N(R)2, y n se selecciona entre 3, 4 y 5;
cada R5 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R6 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R<7>se selecciona del grupo que consiste en alquilo C<1-3>, alquenilo C<2-3>, y H;
cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C<1-3>, alquenilo C<2-3>y H; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C1-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y
m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sus sales o estereoisómeros.
En otras realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-30, alquenilo C5-20, -R*YR”, -YR”, y -R”M'R';
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, en donde Q es -N(R)2, y n se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5;
cada R5 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H; cada R6 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-,-N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C1-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y
m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sus sales o estereoisómeros.
En otras realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, otro subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye aquellos en los cuales
R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R*YR”, -YR”, y -R”M'R';
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-14, alquenilo C2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo;
R4 se selecciona del grupo que consiste en -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, en donde Q es -N(R)2, y n se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5;
cada R<5>se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C<1-3>, alquenilo C<2-3>, y H; cada R<6>se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C<1-3>, alquenilo C<2-3>, y H;
M y M' se seleccionan, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
R7 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3, y H;
cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y C3-14 alquenilo; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C1-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada X se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en F, Cl, Br y I; y
m se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13,
o sus sales o estereoisómeros.
Un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye los de Fórmula (IA):
0 una sal o estereoisómero de los mismos, en donde 1 selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5; m se selecciona entre 5, 6, 7, 8 y 9; M1 es un enlace o M'; R4 es alquilo C1-3 insustituido, o -(CH2)nQ, en donde Q es OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NRg)N(R)2, -NHC(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloarilo; M y M' se seleccionan, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S- un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14 y alquenilo C2-14. La composición de la invención comprende un agente de administración que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (IA), o una sal o estereoisómero del mismo, en donde
1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5; m se selecciona entre 5, 6, 7, 8 y 9;
M1 es un enlace o M';
R4 es alquilo C1-3 insustituido, o -(CH2)nQ, en donde n es 1, 2, 3, 4 o 5 y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o -NHC(O)N(R)2;
M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14 y alquenilo C2-14; cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H;
cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y C3-14 alquenilo; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y C2-12 alquenilo; cada Y es independientemente un carbociclo C<3-6>.
Un subconjunto de compuestos de Fórmula (I) incluye los de Fórmula (II):
0 una sal o estereoisómero de los mismos, en donde 1 selecciona entre 1,2, 3, 4 y 5; M1 es un enlace o M'; R4 es alquilo C1-3 insustituido, o -(CH2)nQ, en donde n es 2, 3 o 4, y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NRg)N(R)2, -NHC(=CHRg)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroarilo o heterocicloarilo; M y M' se seleccionan, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14 y alquenilo C2-14. En algunas realizaciones, la composición de la invención comprende un agente de administración que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (II), o una sal o estereoisómero del mismo, en donde 1 se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5;
M1 es un enlace o M';
R4 es alquilo C1-3 insustituido, o -(CH2)nQ, en donde n es 2, 3 o 4 y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o -NHC(O)N(R)2; M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y
R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14 y alquenilo C2-14. En algunas realizaciones, la composición de la invención comprende un agente de administración que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (I Ia),
o una sal del mismo, en donde R4 es como se ha descrito anteriormente.
En algunas realizaciones, la composición de la invención comprende un agente de administración que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (I Ib),
o una sal del mismo, en donde R4 es como se ha descrito anteriormente.
En algunas realizaciones, la composición de la invención comprende un agente de administración que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (I Ic),
o una sal del mismo, en donde R4 es como se ha descrito anteriormente.
En algunas realizaciones, la composición de la invención comprende un agente de administración que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (I Ie),
(IIe),
o una sal del mismo, en donde R4 es como se ha descrito anteriormente.
En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IIa), (IIb), (IIc) o (IIe) comprende un R4 que se selecciona entre -(CH2)nQ y -(CH2)nCHQR, en donde Q, R y n son como ha definido anteriormente.
En algunas realizaciones, Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o -NHC(O)N(R)2.
El compuesto de Fórmula (I) puede ser un compuesto de Fórmula (IId),
o una sal del mismo, en donde R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C5-14 y alquenilo C5-14, n se selecciona entre 2, 3 y 4, y R', R”, R5, R6, y m son como se ha definido anteriormente. En algunos aspectos del compuesto de Fórmula (IId), R2 es alquilo C8. En algunos aspectos del compuesto de Fórmula (IId), R3 es alquilo C5-C9. En algunos aspectos del compuesto de Fórmula (IId), m es 5, 7 o 9. En algunos aspectos del compuesto de Fórmula (IId), cada R5 es H. En algunos aspectos del compuesto de Fórmula (IId), cada R6 es H.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición lipídica (por ejemplo, una nanopartícula lipídica (LNP)) que comprende: (1) un compuesto que tiene la Fórmula (I); (2) opcionalmente un lípido auxiliar (por ejemplo, un fosfolípido); (3) opcionalmente un lípido estructural (por ejemplo, un esterol); y (4) opcionalmente un conjugado lipídico (por ejemplo, un lípido de PEG). En realizaciones ejemplares, la composición lipídica (por ejemplo, LNP) comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido de GALT, por ejemplo, un polinucleótido encapsulado en la misma.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “alquilo” o “grupo alquilo” significa un hidrocarburo saturado lineal o ramificado que incluye uno o más átomos de carbono (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más átomos de carbono).
La notación “alquilo C1-14” significa un hidrocarburo saturado lineal o ramificado que incluye 1-14 átomos de carbono. Un grupo alquilo puede estar opcionalmente sustituido.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “alquenilo” o “grupo alquenilo” significa un hidrocarburo lineal o ramificado que incluye dos o más átomos de carbono (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o más átomos de carbono) y al menos un doble enlace.
La notación “alquenilo C2-14” significa un hidrocarburo lineal o ramificado que incluye 2-14 átomos de carbono y al menos un doble enlace. Un grupo alquenilo puede incluir uno, dos, tres, cuatro o más dobles enlaces. Por ejemplo, un C18 alquenilo puede incluir uno o más dobles enlaces. Un grupo C18 alquenilo que incluye dos dobles enlaces puede ser un grupo linoleilo. Un grupo alquenilo puede estar opcionalmente sustituido.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “carbociclo” o “grupo carbocíclico” significa un sistema mono- o multicíclico que incluye uno o más anillos de átomos de carbono. Los anillos pueden ser anillos de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince miembros.
La notación “carbociclo C3-6” significa un carbociclo que incluye un único anillo que tiene 3-6 átomos de carbono. Los carbociclos pueden incluir uno o más dobles enlaces y pueden ser aromáticos (por ejemplo, grupos arilo). Los ejemplos de carbociclos incluyen grupos ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, fenilo, naftilo y 1,2-dihidronaftilo. Los carbociclos pueden estar opcionalmente sustituidos.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "heterociclo" o "grupo heterocíclico" significa un sistema mono- o multicíclico que incluye uno o más anillos, en donde al menos un anillo incluye al menos un heteroátomo. Los heteroátomos pueden ser, por ejemplo, átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre. Los anillos pueden ser anillos de tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce miembros. Los heterociclos pueden incluir uno o más dobles enlaces y pueden ser aromáticos (por ejemplo, grupos heteroarilo). Los ejemplos de heterociclos incluyen grupos imidazolilo, imidazolidinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, pirazolidinilo, pirazolilo, isoxazolidinilo, isoxazolilo, isotiazolidinilo, isotiazolilo, morfolinilo, pirrolilo, pirrolidinilo, furilo, tetrahidrofurilo, tiofenilo, piridinilo, piperidinilo, quinolilo e isoquinolilo. Los heterociclos pueden estar opcionalmente sustituidos.
Tal como se usa en la presente memoria, un “grupo biodegradable” es un grupo que puede facilitar un metabolismo más rápido de un lípido en un individuo. Un grupo biodegradable puede ser, pero no se limita a, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo.
Tal como se usa en la presente memoria, un “grupo arilo” es un grupo carbocíclico que incluye uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen grupos fenilo y naftilo.
Tal como se usa en la presente memoria, un “grupo heteroarilo” es un grupo heterocíclico que incluye uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen pirrolilo, furilo, tiofenilo, imidazolilo, oxazolilo y tiazolilo. Tanto los grupos arilo como los heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos. Por ejemplo, M y M' pueden seleccionarse del grupo no limitativo que consiste en fenilo, oxazol y tiazol opcionalmente sustituidos. En las fórmulas de la presente memoria, M y M' pueden seleccionarse, independientemente, de la lista de grupos biodegradables anterior.
Los grupos alquilo, alquenilo y ciclilo (por ejemplo, carbociclilo y heterociclilo) pueden estar opcionalmente sustituidos, a menos que se especifique lo contrario. Los sustituyentes opcionales pueden seleccionarse del grupo que consiste en, pero sin limitarse a, un átomo halógeno (por ejemplo, un grupo cloruro, bromuro, fluoruro, yoduro), un ácido carboxílico (por ejemplo, -C(O)OH), un alcohol (por ejemplo, un hidroxilo, -OH), un éster (por ejemplo, -C(O)OR o -OC(O)R), un aldehído (por ejemplo, -C(O)H), un carbonilo (por ejemplo, -C(O)R, como alternativa representado por C=O), un haluro de acilo (por ejemplo, -C(O)X, en donde X es un haluro seleccionado entre bromuro, fluoruro, cloruro y yoduro), un carbonato (por ejemplo, -OC(O)OR), un alcoxy (por ejemplo, -OR), un acetal (por ejemplo, -C(OR)2R” “, en donde cada OR son grupos alcoxi que pueden ser iguales o diferentes y R” “ es un grupo alquilo o alquenilo), un fosfato (por ejemplo, P(O)43-), un tiol (por ejemplo, -SH), un sulfóxido (por ejemplo, -S(O)R), un ácido sulfínico (por ejemplo, -S(O)OH), un ácido sulfónico (por ejemplo, -S(O)2OH), un tial (por ejemplo, -C(S)H), un sulfato (por ejemplo, S(O)42-), un sulfonilo (por ejemplo, -S(O)2-), una amida (por ejemplo, -C(O)NR2, o -N(R)C(O)R), un azido (por ejemplo, -N3), un nitro (por ejemplo, -NO2), un ciano (por ejemplo, -CN), un isociano (por ejemplo, -NC), un aciloxi (por ejemplo, -OC(O)R), un amino (por ejemplo, -NR2, -Nr H, o -NH2), un carbamoilo (por ejemplo, -OC(O)NR2, -OC(O)NRH, o -0 c (O)NH2), una sulfonamida (por ejemplo, -S(O)2NR2, -S(O)2NRH, -S(O)2NH2, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)S(O)2H, o -N(H)S(O)2H), un grupo alquilo, un grupo alquenilo, y un grupo ciclilo (por ejemplo, carbociclilo o heterociclilo).
En cualquiera de los anteriores, R es un grupo alquilo o alquenilo, como se define en la presente memoria. Los propios grupos sustituyentes pueden estar además sustituidos con, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituyentes como se define en la presente memoria. Por ejemplo, un grupo C1-6 alquilo puede estar sustituido adicionalmente con uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituyentes como se describe en la presente memoria.
Los compuestos de una cualquiera de las Fórmulas (I), (IA), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) y (IIe) incluyen una o más de las siguientes características cuyo sea aplicable.
En algunos casos, R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, en donde Q se selecciona entre un carbociclo C3-6, heterociclo aromático o no aromático de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O, S y P, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, y -C(R)N(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente entre 1, 2, 3, 4 y 5.
En otros casos, R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, en donde Q se selecciona entre un carbociclo C3-6, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -C(R)N(R)2C(O)OR, y un heterocicloalquilo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O y S que está sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre oxo (=O), OH, amino, y alquilo C1-3, y cada n se selecciona independientemente entre 1, 2, 3, 4 y 5.
En otro caso, R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, en donde Q se selecciona entre un carbociclo C3-6, un heterociclo de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -C(R)N(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente entre 1,2, 3, 4 y 5; y, cuyo Q es un heterociclo de 5 a 14 miembros y (i) R4 es -(CH2)nQ en donde n es 1 o 2, o (ii) R4 es -(C^)nCHQR en donde n es 1, o (iii) R4 es -CHQR, y -CQ(R)2, entonces Q es, bien un heteroarilo de 5 a 14 miembros, bien un heterocicloalquilo de 8 a 14 miembros.
En otro caso, R4 se selecciona del grupo que consiste en un carbociclo C3-6, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, en donde Q se selecciona entre un carbociclo C3-5, un heteroarilo de 5 a 14 miembros que tiene uno más heteroátomos seleccionados entre N, O y S, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -C(R)N(R)2C(O)OR, y cada n se selecciona independientemente entre 1, 2, 3, 4 y 5.
En otro caso, R4 es C1-4 alquilo insustituido, por ejemplo, metilo insustituido.
En ciertos casos, la divulgación proporciona un compuesto que tiene la Fórmula (I), en donde R4 es -(CH2)nQ o -(CH2)nCHQR, en donde Q es -N(R)2, y n se selecciona entre 3, 4 y 5.
En ciertos casos, la divulgación proporciona un compuesto que tiene la Fórmula (I), en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, y -CQ(R)2, en donde Q es -N(R)2, y n se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5.
En ciertos casos, la divulgación proporciona un compuesto que tiene la Fórmula (I), en donde R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en C2-14 alquilo, alquenilo C2-14, -R*YR”, -Yr ”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo, y R4 es -(CH2)nQ o -(CH2)nCHQR, en donde Q es -N(R)2, y n se selecciona entre 3, 4 y 5.
En ciertos casos, R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C2-14, alquenilo C2-14, -R*YR”, -YR”, y -R*OR”, o R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo.
En algunos casos, R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C5-20 y alquenilo C5-20.
En otro caso, R1 se selecciona del grupo que consiste en -R*YR”, -YR”, y -R”M'R'.
En ciertos casos, R1 se selecciona entre -R*YR” y -YR”. En algunas realizaciones, Y es un grupo ciclopropilo. En algunos casos, R* es alquilo Cs o Cs alquenilo. En ciertos casos, R" es alquilo C3-12. Por ejemplo, R” puede ser alquilo C3. Por ejemplo, R” puede ser alquilo C4-8 (por ejemplo, C4, C5, C6, C7 o alquilo Cs).
En algunos casos, R1 es C5-20 alquilo. En algunos casos, R1 es alquilo alquilo C6. En algunos casos, R1 es alquilo Cs. En otros casos, R1 es alquilo C9. En cierto caso, R1 es C14 alquilo. En otros casos, R1 es C1S alquilo.
En algunos casos, R1 es alquenilo C5-20. En cierto caso, R1 es alquenilo C18. En algunos casos, R1 es linoleilo.
En ciertos casos, R1 es ramificado (por ejemplo, decan-2-ilo, undecan-3-ilo, dodecan-4-ilo, tridecan-5-ilo, tetradecan-6-ilo, 2-metilundecan-3-ilo, 2-metildecan-2-ilo, 3-metilundecan-3-ilo, 4-metildodecan-4-ilo o heptadeca-9-ilo). En ciertos casos, R1 es
En ciertos casos, Ri es alquilo C5-20 o alquenilo C5-20 insustituidos. En ciertos casos, R' es alquilo C5-20 o alquenilo C5-20 sustituidos (por ejemplo, sustituidos con un carbociclo C3-6 tal como 1 -ciclopropilnonilo).
En otros casos, R1 es -R”M'R'.
En algunos casos, R' se selecciona entre -R*YR” y -YR”. En algunos casos, Y es cicloalquilo C3-8. En algunos casos, Y es arilo C6-10. En algunos casos, Y es un grupo ciclopropilo. En algunos casos, Y es un grupo ciclohexilo. En ciertos casos, R* es alquilo C1.
En algunos casos, R” se selecciona del grupo que consiste en alquilo C3-12 y alquenilo C3-12. En algunos casos, R” adyacente a Y es alquilo C1. En algunos casos, R” adyacente a Y es alquilo C4-9 (por ejemplo, alquilo C4, C5, C6, C7 o C8 o C9).
En algunos casos, R' se selecciona entre alquilo C4 y alquenilo C4. En ciertos casos, R' se selecciona entre alquilo C5 y alquenilo C5. En algunos casos, R' se selecciona entre alquilo C6 y alquenilo C6. En algunos casos, R' se selecciona entre alquilo C7 y alquenilo C7. En algunos casos, R' se selecciona entre alquilo C9 y alquenilo C9.
En otros casos, R' se selecciona entre alquilo C11 y alquenilo C11. En otros casos, R' se selecciona entre alquilo C12, alquenilo C12, alquilo C13, alquenilo C13, alquilo C14, alquenilo C14, alquilo C15, alquenilo C15, alquilo C16, alquenilo C16, alquilo C17, alquenilo C17, alquilo C18 y alquenilo C18. En ciertos casos, R' es ramificado (por ejemplo, decan-2-ilo, undecan-3-ilo, dodecan-4-ilo, tridecan-5-ilo, tetradecan-6-ilo, 2-metilundecan-3-ilo, 2-metildecan-2-ilo, 3-metilundecan-3-ilo, 4-metildodecan-4-ilo o heptadeca-9-ilo). En ciertos casos, R' es
En ciertos casos, R' es alquilo C1-18 insustituido. En ciertos casos, R' es alquilo C1-18 sustituido (por ejemplo, alquilo C1-15 sustituido con un carbociclo C3-6, tal como 1-ciclopropilnonilo).
En algunos casos, R” se selecciona del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14. En algunos casos, R” es alquilo C3, alquilo C4, alquilo C5, alquilo C6, alquilo C7 o alquilo C8. En algunos casos, R” es alquilo C9, alquilo C10, alquilo C11, alquilo C12, alquilo C13 o alquilo C14.
En algunos casos, M' es -C(O)O-. En algunos casos, M' es -OC(O)-.
En otros casos, M' es un grupo arilo o un grupo heteroarilo. Por ejemplo, M' puede seleccionarse del grupo que consiste en fenilo, oxazol y tiazol.
En algunos casos, M es -C(O)O-. En algunos casos, M es -OC(O)-. En algunos casos, M es -C(O)N(R')-. En algunos casos, M es -P(O)(OR')O-.
En otros casos, M es un grupo arilo o un grupo heteroarilo. Por ejemplo, M puede seleccionarse del grupo que consiste en fenilo, oxazol y tiazol.
En algunos casos, M es igual que M'. En otros casos, M es diferente de M'.
En algunos casos, cada R5 es H. En ciertos casos de este tipo, cada R6 es también H.
En algunos casos, R7 es H. En otros casos, R7 es alquilo C1-3 (por ejemplo, metilo, etilo, propilo o i-propilo). En algunos casos, R2 y R3 son independientemente alquilo C5-14 o alquenilo C5-14.
En algunos casos, R2 y R3 son iguales. En algunos casos, R2 y R3 son alquilo C8. En ciertos casos, R2 y R3 son alquilo C2. En otros casos, R2 y R3 son alquilo C3. En algunas realizaciones, R2 y R3 son alquilo C4. En ciertos casos, R2 y R3 son alquilo C5. En otros casos, R2 y R3 son alquilo C6. En algunos casos, R2 y R3 son alquilo C7. En otros casos, R2 y R3 son diferentes. En ciertos casos, R2 es alquilo C8. En algunos casos, R3 es alquilo C1-7 (por ejemplo, alquilo C1, C2, C3, C4, C5, C6 o C7) o C9.
En algunos casos, R7 y R3 son H.
En ciertos casos, R2 es H.
En algunos casos, m es 5, 7 o 9.
En algunos casos, R4 se selecciona entre -(CH2)nQ y -(CH2)nCHQR.
En algunos casos, Q se selecciona del grupo que consiste en -OR, -OH, -O(CH2)nN(R)2, -OC(O)R, -CX3, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(H)(R), -C(R)N(R)2C(O)OR, un carbociclo y un heterociclo.
En ciertos casos, Q es -OH.
En ciertos casos, Q es un heteroarilo de 5 a 10 miembros sustituido o insustituido, por ejemplo, Q es un imidazol, una pirimidina, una purina, 2-amino-1,9-dihidro-6H-purin-6-ona-9-ilo (o guanin-9-ilo), adenin-9-ilo, citosin-1-ilo o uracil-1-ilo. En ciertos casos, Q es un heterocicloalquilo sustituido de 5 a 14 miembros, por ejemplo, sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre oxo (=O), OH, amino y alquilo C1-3. Por ejemplo, Q es 4- metilpiperazinilo, 4-(4-metoxibencil)piperazinilo, o isoindolin-2-il-1,3-diona.
En ciertos casos, Q es un arilo C6-10 insustituido o sustituido (tal como fenilo) o cicloalquilo C3-6.
En algunos casos, n es 1. En otros casos, n es 2. En casos adicionales, n es 3. En ciertos otros casos, n es 4. Por ejemplo, R4 puede ser -(CH2)2OH. Por ejemplo, R4 puede ser -(CH2)3OH. Por ejemplo, R4 puede ser -(CH2)4OH. Por ejemplo, R4 puede ser bencilo. Por ejemplo, R4 puede ser 4-metoxibencilo.
En algunos casos, R4 es un carbociclo C3-6. En algunos casos, R4 es un cicloalquilo C3-6. Por ejemplo, R4 puede ser ciclohexilo opcionalmente sustituido con, por ejemplo, OH, halo, alquilo C1-6, etc. Por ejemplo, R4 puede ser 2-hidroxiciclohexilo.
En algunos casos, R es H.
En algunos casos, R es alquilo C1-3 insustituido o alquenilo C2-3 insustituido. Por ejemplo, R4 puede ser -CH2CH(OH)CH3 o -CH2CH(OH)CH2CH3.
En algunos casos, R es alquilo C1-3 sustituido, por ejemplo, CH2OH. Por ejemplo, R4 puede ser -CH2CH(OH)CH2OH.
En algunos casos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo. En algunos casos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo aromático o no aromático de 5 a 14 miembros que tiene uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O, S y P. En algunos casos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un carbociclo C3-20 opcionalmente sustituido (por ejemplo, carbociclo C3-18, carbociclo C3-15, carbociclo C3-12 o carbociclo C3-10), bien aromático, bien no aromático. En algunos casos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un carbociclo C3-6. En otros casos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un carbociclo C6, tal como un grupo ciclohexilo o fenilo. En ciertos casos, el heterociclo o carbociclo C3-6 está sustituido con uno o más grupos alquilo (por ejemplo, en el mismo átomo de anillo o en átomos de anillo adyacentes o no adyacentes). Por ejemplo, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, pueden formar un grupo ciclohexilo o fenilo que lleva una o más sustituciones de alquilo C5. En ciertos casos, el heterociclo o carbociclo C3-6 formado por R2 y R3 se sustituye con grupos carbociclo. Por ejemplo, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, pueden formar un grupo ciclohexilo. En algunos casos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un carbociclo C7-15, tal como un grupo cicloheptilo, ciclopentadecanilo o naftilo.
En algunos casos, R4 se selecciona entre -(CH2)nQ y -(CH2)nCHQR. En algunos casos, Q se selecciona del grupo que consiste en -OR, -OH, -O(CH2)nN(R)2, -OC(O)R, -CX3, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(H)(R), y un heterociclo. En otros casos, Q se selecciona del grupo que consiste en un imidazol, una pirimidina y una purina.
En algunos casos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un heterociclo o carbociclo. En algunos casos, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, forman un carbociclo C3-6, tal como un grupo fenilo. En ciertos casos, el heterociclo o carbociclo C3-6 está sustituido con uno o más grupos alquilo (por ejemplo, en el mismo átomo de anillo o en átomos de anillo adyacentes o no adyacentes). Por ejemplo, R2 y R3, junto con el átomo al que están unidos, pueden formar un grupo fenilo que lleva una o más sustituciones de alquilo C5.
En las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación, el compuesto de Fórmula (I) puede seleccionarse del grupo que consiste en:
(Compuesto 9),
(Compuesto 12),
,
(Compuesto 32),
(Compuesto 39),
(Compuesto 40),
,
,
(Compuesto 56),
(Compuesto 60),
ompueso ,
(Compuesto 77),
(Compuesto 95),
(Compuesto 99),
(Compuesto 124),
(Compuesto 125),
,
(Compuesto 137),
,
(Compuesto 148),
,
ompueso ,
,
(Compuesto 173),
,
ompueso ,
(Compuesto 192),
,
,
(Compuesto 216),
,
En otros casos, el compuesto de Fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en el Compuesto 1 -Compuesto 147, o una sal o estereoisómeros de los mismos.
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, se proporcionan lípidos ionizables que incluyen un resto de piperazina central.
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el agente de administración comprende un compuesto lipídico que tiene la Fórmula (III)
A1 y A2 se seleccionan, independientemente, entre CH o N;
Z es CH2 o no está presente, representyo las líneas discontinuas (1) y (2) cada una un enlace único cuyo Z es CH2; y no estyo presentes las dos líneas discontinuas (1) y (2) cuyo Z no está presente;
R1, R2, R3, R4 y R5 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R”MR', -R*YR”, -YR”, y -R*OR”;
cada M se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
X1, X2 y X3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en un enlace, -CH2-, -(CH2)2-, -CHR-, -CHY-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-CH2-, -CH2-C(O)-, -C(O)O-CH2-, -OC(O)-CH2-, -CH2-C(O)O-, -CH2-OC(O)-, -CH(OH)-, -C(S)-, y -CH(SH)-;
cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3 y un carbociclo C3-6; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12, alquenilo C2-12, y H; y cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-12 y alquenilo C3-12, en donde, cuyo el anillo .entonces
i) al menos uno de X1, X2 y X3 no es -CH2-; y/o
ii) al menos uno de R1, R2, R3, R4 y R5 es -R”MR'.
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el compuesto es de cualquiera de las Fórmulas (IMa1 )-(II Ia6):
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, los compuestos de Fórmula (III) o cualquiera de (M!a1 )-(IMa6) incluyen una o más de las siguientes características cuyo sean aplicables.
En algunas realizaciones, el anillo A es
En algunas realizaciones, el anillo
En algunas realizaciones, el anillo
En algunas realizaciones, el anillo
En algunas realizaciones, el anillo
En algunas realizaciones, el anillo
en donde el anillo, en el que el átomo de N está conectado con X2.
En algunas realizaciones, Z es CH2.
En algunas realizaciones, Z no está presente.
En algunas realizaciones, al menos uno de Ai y A2 es N.
En algunas realizaciones, cada uno de Ai y A2 es N.
En algunas realizaciones, cada uno de Ai y A2 es CH.
En algunas realizaciones, Ai es N y A2 es CH.
En algunas realizaciones, Ai es CH y A2 es N.
En algunas realizaciones, al menos uno de X1, X2 y X3 no es -CH2-. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, X1 no es -CH2-. En algunas realizaciones, al menos uno de X1, X2 y X3 es -C(O)-.
En algunas realizaciones, X2 es -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-CH2-, -CH2-C(O)-, -C(O)O-CH2-, -OC(O)-CH2, -CH2-C(O)O-, o -CH2-OC(O)-.
En algunas realizaciones, X3 es -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-CH2-, -CH2-C(O)-, -C(O)O-CH2-, -OC(O)-CH2-, -CH2-C(O)O-, o -CH2-OC(O)-. En otras realizaciones, X3 es -CH2-.
En algunas realizaciones, X3 es un enlace o -(CH2)2 -.
En algunas realizaciones, R1 y R2 son iguales. En ciertas realizaciones, R1, R2 y R3 son iguales. En algunas realizaciones, R4 y R5 son iguales. En ciertas realizaciones, R1, R2, R3, R4 y R5 son iguales.
En algunas realizaciones, al menos uno de R1, R2, R3, R4 y R5 es -R”MR'. En algunas realizaciones, al menos uno de R1, R2, R3, R4 y R5 es -R”MR'. Por ejemplo, al menos uno de R1, R2 y R3 puede ser -R”MR', y/o al menos uno de R4 y R5 es -R”MR'. En ciertas realizaciones, al menos una M es -C(O)O-. En algunas realizaciones, cada M es -C(O)O-. En algunas realizaciones, al menos una M es -OC(O)-. En algunas realizaciones, cada M es -OC(O)-. En algunas realizaciones, al menos una M es -OC(O)O-. En algunas realizaciones, cada M es -OC(O)O-. En algunas realizaciones, al menos una R” es alquilo C3. En ciertas realizaciones, cada R” es alquilo C3. En algunas realizaciones, al menos una R” es alquilo C5. En ciertas realizaciones, cada R” es alquilo C5. En algunas realizaciones, al menos una R” es alquilo C6. En ciertas realizaciones, cada R” es alquilo C6. En algunas realizaciones, al menos una R” es alquilo C7. En ciertas realizaciones, cada R” es alquilo C7. En algunas realizaciones, al menos una R' es alquilo C5. En ciertas realizaciones, cada R' es alquilo C5. En otras realizaciones, al menos una R' es alquilo C1. En ciertas realizaciones, cada R' es alquilo C1. En algunas realizaciones, al menos una R' es alquilo C2. En ciertas realizaciones, cada R' es alquilo C2.
En algunas realizaciones, al menos uno de R1, R2, R3, R4 y R5 es alquilo C12. En ciertas realizaciones, cada uno de R1, R2, R3, R4 y R5 es alquilo C12. En ciertas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
ompueso ,
(Compuesto 241),
ompuesto 245,
ompuesto 277,
(Compuesto 283),
(Compuesto 284),
(Compuesto 288),
(Compuesto 297),
(Compuesto 302),
(Compuesto 307),
(Compuesto 316), ),
ompuesto 324,
ompuesto 333,
.
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el agente de administración comprende el Compuesto 236.
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el agente de administración<comprende un compuesto que tiene la Fórmula (IV)>
Ai y A2 se seleccionan cada uno independientemente entre CH o N y al menos uno de Ai y A2 es N;
Z es CH2 o no está presente, representyo las líneas discontinuas (1) y (2) cada una un enlace único cuyo Z es CH2; y no estyo presentes las dos líneas discontinuas (1) y (2) cuyo Z no está presente;
Ri, R2, R3, R4 y R5 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C6-20 y C6-20 alquenilo;
en donde, cuyo el anillo .entonces
i) R1, R2, R3, R4 y R5 son iguales, en donde R1 no es alquilo C12, alquilo C18 ni alquenilo C18;
ii) sólo uno de R1, R2, R3, R4 y R5 se selecciona entre alquenilo C6-20;
iii) al menos uno de R1, R2, R3, R4 y R5 tiene un número diferente de átomos de carbono que al menos otro de R1, R2, R3, R4 y R5;
iv) R1, R2 y R3 se seleccionan entre alquenilo C6-20, y R4 y R5 se seleccionan entre alquilo C6-20; o v) R1, R2 y R3 se seleccionan entre alquilo C6-20, y R4 y R5 se seleccionan entre alquenilo C6-20.
Los compuestos de Fórmula (IV) o (IVa) incluyen una o más de las siguientes características cuyo sean aplicables.
En algunas realizaciones, Z es CH2.
En algunas realizaciones, Z no está presente.
En algunas realizaciones, al menos uno de A 1 y A2 es N.
En algunas realizaciones, cada uno de A 1 y A2 es N.
En algunas realizaciones, cada uno de A 1 y A2 es CH.
En algunas realizaciones, A1 es N y A2 es CH.
En algunas realizaciones, A<1>es CH y A<2>es N.
En algunas realizaciones, Ri, R2, R3, R4 y R5 son iguales y no son alquilo C12, alquilo C18 ni alquenilo C18. En algunas realizaciones, Ri, R2, R3, R4 y R5 son iguales y son alquilo C9 o alquilo C14.
En algunas realizaciones, sólo uno de R1, R2, R3, R4 y R5 se selecciona entre alquenilo C6-20. En ciertas realizaciones de este tipo, R1, R2, R3, R4 y R5 tienen el mismo número de átomos de carbono. En algunas realizaciones, R4 se selecciona entre alquenilo C5-20. Por ejemplo, R4 puede ser alquenilo C12 o alquenilo C18.
En algunas realizaciones, al menos uno de R1, R2, R3, R4 y R5 tiene un número diferente de átomos de carbono que al menos otro de R1, R2, R3, R4 y R5.
En ciertas realizaciones, R1, R2 y R3 se seleccionan entre alquenilo C6-20, y R4 y R5 se seleccionan entre alquilo C6-20. En otras realizaciones, R1, R2 y R3 se seleccionan entre alquilo C6-20, y R4 y R5 se seleccionan entre alquenilo C6-20. En algunas realizaciones, R1, R2 y R3 tienen el mismo número de átomos de carbono, y/o R4 y R5 tienen el mismo número de átomos de carbono. Por ejemplo, R1, R2 y R3, o R4 y R5, pueden tener 6, 8, 9, 12, 14 o 18 átomos de carbono. En algunas realizaciones, R1, R2 y R3, o R4 y R5, son alquenilo C18 (por ejemplo, linoleilo). En algunas realizaciones, R1, R2 y R3, o R4 y R5, son grupos alquilo que incluyen 6, 8, 9, 12 o 14 átomos de carbono.
En algunas realizaciones, R1 tiene un número diferente de átomos de carbono que R2, R3, R4 y R5. En otras realizaciones, R3 tiene un número diferente de átomos de carbono que R1, R2, R4 y R5. En realizaciones adicionales, R4 tiene un número diferente de átomos de carbono que R1, R2, R3 y R5.
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
,
,
ompuesto .
En otras realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el agente de administración comprende un compuesto que tiene la Fórmula (V)
(V),
o sus sales o estereoisómeros, en donde
A3 es CH o N;
A4 es CH2 o NH; y al menos uno de A3 y A4 es N o NH;
Z es CH2 o no está presente, representyo las líneas discontinuas (1) y (2) cada una un enlace único cuyo Z es CH2; y no estyo presentes las dos líneas discontinuas (1) y (2) cuyo Z no está presente;
R1, R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R”MR', -R*YR”, -YR”, y -R*OR”;
cada M se selecciona, independientemente, entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
X1 y X2 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en -CH2-, -(CH2)2-, -CHR-, -CHY-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-CH2-, -CH2-C(O)-, -C(O)O-CH2-, -OC(O)- CH2-, -CH2-C(O)O-, -CH2-OC(O)-, -CH(OH)-, -C(S)-, y -CH(SH)-;
cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3 y un carbociclo C3-6; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12, alquenilo C2-12, y H; y cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-12 y alquenilo C3-12.
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el compuesto es de Fórmula (Va):
Los compuestos de Fórmula (V) o (Va) incluyen una o más de las siguientes características cuyo sean aplicables.
En algunas realizaciones, Z es CH2.
En algunas realizaciones, Z no está presente.
En algunas realizaciones, al menos uno de A3 y A4 es N o NH.
En algunas realizaciones, A3 es N y A4 es NH.
En algunas realizaciones, A3 es N y A4 es CH2.
En algunas realizaciones, A3 es CH y A4 es NH.
En algunas realizaciones, al menos uno de X1 y X2 no es -CH2-. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, X1 no es -CH2-. En algunas realizaciones, al menos uno de X1 y X2 es -C(O)-.
En algunas realizaciones, X2 es -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-CH2-, -CH2-C(O)-, -C(O)O-CH2-, -OC(O)-CH2-, -CH2-C(O)O-, o -CH2-OC(O)-.
En algunas realizaciones, R1, R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C5-20 y alquenilo C5-20. En algunas realizaciones, R1, R2 y R3 son iguales. En ciertas realizaciones, R1, R2 y R3 son alquilo C6, C9, C12, o C14. En otras realizaciones, R1, R2 y R3 son alquenilo C18. Por ejemplo, R1, R2 y R3 pueden ser linoleilo.
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
ompueso ,
(Compuesto 272),
ompuesto .
En otras realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el agente de administración comprende un compuesto que tiene la Fórmula (VI):
A6 y A7 se seleccionan cada uno independientemente entre CH o N, en donde al menos uno de A6 y A7 es N; Z es CH2 o no está presente, representyo las líneas discontinuas (1) y (2) cada una un enlace único cuyo Z es CH2; y no estyo presentes las dos líneas discontinuas (1) y (2) cuyo Z no está presente;
X4 y X5 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en -CH2-, -(CH2)2-, -CHR-, -CHY-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)-CH2-, -CH2-C(O)-, -C(O)O-CH2-, -OC(O)-CH2-, -CH2-C(O)O-, -CH2-OC(O)-, -CH(OH)-, -C(S)-, y -CH(SH)-;
R1, R2, R3, R4 y R5 se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C5-20, alquenilo C5-20, -R”MR', -R*YR”, -YR”, y -R*OR”;
cada M se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo;
cada Y es independientemente un carbociclo C3-6;
cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3 y un carbociclo C3-6; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12, alquenilo C2-12, y H; y cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-12 y alquenilo C3-12.
En algunas realizaciones, R1, R2, R3, R4 y R5 se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C6-20 y alquenilo C6-20.
En algunas realizaciones, R1 y R2 son iguales. En ciertas realizaciones, R1, R2 y R3 son iguales. En algunas realizaciones, R4 y R5 son iguales. En ciertas realizaciones, R1, R2, R3, R4 y R5 son iguales.
En algunas realizaciones, al menos uno de R1, R2, R3, R4 y R5 es alquilo C9-12. En ciertas realizaciones, cada uno de R1, R2, R3, R4 y R5 es, independientemente, alquilo C9, C12 o C14. En ciertas realizaciones, cada uno de R1, R2, R3, R4 y R5 es alquilo C9.
En algunas realizaciones, A<6>es N y A<7>es N. En algunas realizaciones, A<6>es CH y A<7>es N.
En algunas realizaciones, X4 es -CH2- y X5 es -C(O)-. En algunas realizaciones, X4 y X5 son -C(O)-.
En algunas realizaciones, cuyo A6 es N y A7 es N, al menos uno de X4 y X5 no es -CH2-, por ejemplo, al menos
uno de X4 y X5 es -C(O)-. En algunas realizaciones, cuyo A6 es N y A7 es N, al menos uno de R1, R2, R3, R4 y
R5 es -R”MR'.
En algunas realizaciones, al menos uno de Ri, R2, R3, R4 y R5 no es -R”MR'.
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el compuesto es
(Compuesto 299).
En otras realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el agente de administración comprende
un compuesto que tiene la fórmula:
(Compuesto 342).
Los restos de amina de los compuestos lipídicos divulgados en la presente memoria pueden protonarse en
ciertas condiciones. Por ejemplo, el resto de amina central de un lípido de acuerdo con la Fórmula (I) se protona típicamente (es decir, se carga positivamente) a un pH por debajo del pKa del resto amino y sustancialmente
no se carga a un pH por encima del pKa. Tales lípidos pueden denominarse aminolípidos ionizables.
En la composición de la invención, el aminolípido ionizable es un compuesto de fórmula (IA), por ejemplo, el Compuesto 18.
En algunas realizaciones, la cantidad del aminolípido ionizable, es decir, el compuesto de Fórmula (IA), varía
de aproximadamente un 1% en moles a un 99% en moles en la composición lipídica.
En una realización, la cantidad del aminolípido ionizable, es decir, el compuesto de Fórmula (IA), es al menos aproximadamente un 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% en moles en la composición lipídica.
En una realización, la cantidad del aminolípido ionizable, es decir, el compuesto de Fórmula (IA), varía de aproximadamente un 30% en moles a aproximadamente un 70% en moles, de aproximadamente un 35% en
moles a aproximadamente un 65% en moles, de aproximadamente un 40% en moles a aproximadamente un
60% en moles, y de aproximadamente un 45% en moles a aproximadamente un 55% en moles en la composición lipídica.
En una realización específica, la cantidad del aminolípido ionizable, es decir, el compuesto de Fórmula (IA), es aproximadamente un 50% en moles en la composición lipídica.
Además de los aminolípidos ionizables divulgados en la presente memoria, por ejemplo, el compuesto de
Fórmula (I), la composición lipídica de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria
puede comprender componentes adicionales tales como fosfolípidos, lípidos estructurales, lípidos de PEG, y
cualquier combinación de los mismos.
b. Componentes Adicionales en la Composición Lipídica
(i) Fosfolípidos
La composición lipídica de la composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede comprender
uno o más fosfolípidos, por ejemplo, uno o más fosfolípidos saturados o (poli)insaturados o una combinación
de los mismos. En general, los fosfolípidos comprenden un resto de fosfolípido y uno o más restos de ácido
graso.
Un resto de fosfolípido puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo no limitativo que consiste en fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, 2-lisofosfatidilcolina y una esfingomielina.
Un resto de ácido graso puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo no limitativo que consiste en ácido láurico, ácido mirístico, ácido miristoleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolénico, ácido erúcico, ácido fitanoico, ácido araquídico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido behénico, ácido docosapentanoico y ácido docosahexaenoico.
Algunos fosfolípidos concretos pueden facilitar la fusión a una membrana. Por ejemplo, un fosfolípido catiónico puede interactuar con uno o más fosfolípidos cargados negativamente de una membrana (por ejemplo, una membrana celular o intracelular). La fusión de un fosfolípido a una membrana puede permitir que uno o más elementos (por ejemplo, un agente terapéutico) de una composición que contenga lípidos (por ejemplo, LNP) pasen a través de la membrana permitiendo, por ejemplo, la administración de los uno o más elementos a un tejido diana.
También se contemplan especies de fosfolípidos no naturales que incluyen especies naturales con modificaciones y sustituciones que incluyen ramificación, oxidación, ciclización y alquinos. Por ejemplo, un fosfolípido puede funcionalizarse con o reticularse a uno o más alquinos (por ejemplo, un grupo alquenilo en el que uno o más dobles enlaces se reemplacen por un triple enlace). En condiciones de reacción apropiadas, un grupo alquino puede experimentar una cicloadición catalizada por cobre tras la exposición a una azida. Tales reacciones pueden ser útiles en la funcionalización de una bicapa lipídica de una composición de nanopartículas para facilitar la permeación de membrana o el reconocimiento celular o en la conjugación de una composición de nanopartículas con un componente útil tal como un resto de guiado o formación de imágenes (por ejemplo, un colorante).
Los fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, glicerofosfolípidos tales como fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatidigliceroles y ácidos fosfatidicos. Los fosfolípidos también incluyen fosfoesfingolípidos, tales como la esfingomielina. Los ejemplos de fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes:
ı84
En ciertas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención es un análogo o una variante de DSPC. En ciertas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención es un compuesto de Fórmula (IX):
o su sal, en donde:
cada R1 es independientemente alquilo opcionalmente sustituido; u opcionalmente dos R1 están unidos con los átomos intermedios para formar carbociclilo monocíclico opcionalmente sustituido o heterociclilo monocíclico opcionalmente sustituido; u opcionalmente tres R1 están unidos con los átomos intermedios para formar carbociclilo bicíclico opcionalmente sustituido o heterociclilo bicíclico opcionalmente sustituido;
n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
m es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
<L>2<—R>2
Y ^<l>2-<r>2
A es de la fórmula: o
cada caso de L2 es independientemente un enlace o alquileno C1-6 opcionalmente sustituido, en donde una unidad de metileno del alquileno C1-6 opcionalmente sustituido se reemplaza opcionalmente por -O-, -N(RN)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O-, o -NRNC(O)N(RN)-;
cada caso de R2 es independientemente alquilo C1-30 opcionalmente sustituido, alquenilo C1-30 opcionalmente sustituido, o alquinilo C1-30 opcionalmente sustituido; opcionalmente en donde una o más unidades de metileno de R2 se reemplazan independientemente por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido -N(RN)-, -O , -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-,-NRNC(O)-, -NR<n>C(O)N(R<n>)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<n>)-, -NRNC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NRN)-, -C(=NRN)N(RN)-, -NRNC(=NRN)-, -NRnC(=NRn)N(Rn)-, -C(S)-, -C(S)N(RN)-, -NRNC(S)-, -NRNC(S)N(RN)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(RN)S(O)-, -S(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)N(RN)-, -OS(O)N(R<n>)-, -N(R<n>)S(O)O-, -S(O)2-, -N(R<n>)S(O)2-, -S(O)2N(Rn)-, -N(Rn)S(O)2N(Rn)-, -OS(O)2N(Rn)-, o -N(Rn)S(O)2O-;
cada caso de RN es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno;
el Anillo B es carbociclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y
p es 1 o 2;
siempre que el compuesto no sea de la fórmula:
en donde cada caso de R2 es independientemente alquilo insustituido, alquenilo insustituido o alquinilo insustituido.
Modificaciones de Cabeza de Fosfolípido
En ciertas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención comprende una cabeza de fosfolípido modificada (por ejemplo, un grupo colina modificado). En ciertas realizaciones, un fosfolípido con una cabeza modificada es DSPC, o un análogo de la misma, con una amina cuaternaria modificada. Por ejemplo, en realizaciones de Fórmula (IX), al menos uno de R1 no es metilo. En ciertas realizaciones, al menos uno de R1 no es hidrógeno o metilo. En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX) es de una de las siguientes fórmulas:
o su sal, en donde:
cada t es independientemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
cada u es independientemente 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10; y
cada v es independientemente 1, 2 o 3;
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX) es de una de las siguientes fórmulas:
o su sal.
En ciertas realizaciones, un compuesto de Fórmula (IX) es uno de los siguientes:
(Compuesto 403)
),
o su sal.
En ciertas realizaciones, un compuesto de Fórmula (IX) es de Fórmula (IX-a):
o su sal.
En ciertas realizaciones, los fosfolípidos útiles o potencialmente útiles en la presente invención comprenden un núcleo modificado. En ciertas realizaciones, un fosfolípido con un núcleo modificado descrito en la presente memoria es DSPC, o un análogo de la misma, con una estructura de núcleo modificada. Por ejemplo, en ciertas realizaciones de Fórmula (IX-a), el grupo A no es de la siguiente fórmula:
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX-a) es de una de las siguientes fórmulas:
o su sal.
En ciertas realizaciones, un compuesto de Fórmula (IX) es uno de los siguientes:
o sus sales.
En ciertas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención comprende un resto cíclico en lugar del resto glicérido. En ciertas realizaciones, un fosfolípido útil en la presente invención es DSPC, o un análogo de la misma, con un resto cíclico en lugar del resto glicérido. En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX) es de Fórmula (IX-b):
o su sal.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX-b) es de Fórmula (IX-b-1):
o su sal, en donde:
w es 0, 1, 2 o 3.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX-b) es de Fórmula (IX-b-2):
o su sal.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX-b) es de Fórmula (IX-b-3):
o su sal.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX-b) es de Fórmula (IX-b-4):
o su sal.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX-b) es uno de los siguientes:
o sus sales.
Modificaciones de Cola de Fosfolípido
En ciertas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención comprende una cola modificada. En ciertas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención es DSPC, o un análogo de la misma, con una cola modificada. Como se describe en la presente memoria, una "cola modificada" puede ser una cola con cadenas alifáticas más cortas o más largas, cadenas alifáticas con ramificación introducida, cadenas alifáticas con sustituyentes introducidos, cadenas alifáticas en las que uno o más metilenos se reemplazan por grupos cíclicos o heteroatómicos, o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el compuesto de (IX) es de Fórmula (IX-a), o una sal del mismo, en donde al menos un caso de R2 es cada caso de R2 es alquilo C1-30 opcionalmente sustituido, en donde una o más unidades de metileno de R2 están reemplazadas independientemente por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, -N(RN)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -NRnC(O)N(Rn)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRnC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NRn)-, -C(=NRn)N(Rn)-, -NRnC(=NRn)-, -NR<n>C(=NR<n>)N(R<n>)-, -C(S)-, -C(S)N(R<n>)-, -NR<n>C(S)-, -NR<n>C(S)N(R<n>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(RN)S(O)-, -S(O)N(R<n>)-, -N(R<n>)S(O)N(R<n>)-, -OS(O)N(R<n>)-, -N(R<n>)S(O)O-, -S(O)2-, -N(Rn)S(O)2-, -S(O)2N(Rn)-, -N(Rn)S(O)2N(Rn)-, -OS(O)2N(Rn)-, o -N(Rn)S(O)2O-.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX) es de Fórmula (IX-c):
(IX-c),
o su sal, en donde:
cada x es independientemente un número entero entre 0-30, inclusive; y
cada caso de G se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, -N(RN)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -NR<n>C(O)N(R<n>)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NRN)-, -C(=NRN)N(RN)-, -NRNC(=NRN)-, -NRnC(=NRn)N(Rn)-, -C(S)-, -C(S)N(Rn)-, -NRnC(S)-, -NRnC(S)N(Rn)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(RN)S(O)-, -S(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)N(RN)-, -OS(O)N(RN)-, -N(RN)S(O)O-, -S(O)2-, -N(Rn)S(O)2-, -S(O)2N(Rn)-, -N(Rn)S(O)2N(Rn)-, -OS(O)2N(Rn)-, o -N(Rn)S(O)2O- . Cada posibilidad representa una realización separada.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX-c) es de Fórmula (IX-c-1):
cada caso de v es independientemente 1, 2 o 3.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX-c) es de Fórmula (IX-c-2):
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX-c) es de la siguiente fórmula:
o su sal.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX-c) es el siguiente:
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX-c) es de Fórmula (IX-c-3):
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX-c) es de las siguientes fórmulas:
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (IX-c) es el siguiente:
o su sal.
En ciertas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención comprende un resto de fosfocolina modificado, en donde la cadena de alquilo que enlaza la amina cuaternaria al grupo fosforilo no es etileno (por ejemplo, n no es 2). Por lo tanto, en ciertas realizaciones, un fosfolípido útil o potencialmente útil en la presente invención es un compuesto de Fórmula (IX), en donde n es 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un compuesto de Fórmula (IX) es de una de las siguientes fórmulas:
o su sal.
En ciertas realizaciones, un compuesto de Fórmula (IX) es uno de los siguientes:
(Compuesto 411)
ompues o , o sus sales.
(ii) Lípidos Alternativos
En ciertas realizaciones, se usa un lípido alternativo en lugar de un fosfolípido. Los ejemplos no limitativos de tales lípidos alternativos incluyen los siguientes:
La composición lipídica de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede comprender uno o más lípidos estructurales. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “lípido estructural” se refiere a esteroles y también a lípidos que contienen restos de esterol.
La incorporación de lípidos estructurales en la nanopartícula lipídica puede ayudar a mitigar la agregación de otros lípidos en la partícula. Los lípidos estructurales se pueden seleccionar del grupo que incluye, pero no se limita a, colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brasicasterol, tomatidina, tomatina, ácido ursólico, alfa-tocoferol, hopanoides, fitosteroles, esteroides, y mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el lípido estructural es un esterol. Tal como se define en la presente memoria, "esteroles" son un subgrupo de esteroides que consisten en alcoholes esteroideos. En ciertas realizaciones, el lípido estructural es un esteroide. En ciertas realizaciones, el lípido estructural es un colesterol. En ciertas realizaciones, el lípido estructural es un análogo de colesterol. En ciertas realizaciones, el lípido estructural es alfa-tocoferol. Los ejemplos de lípidos estructurales incluyen, pero no se limitan a, los siguientes:
En una realización, la cantidad del lípido estructural (por ejemplo, un esterol tal como colesterol) en la composición lipídica de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria varía de aproximadamente un 20% en moles a aproximadamente un 60% en moles, de aproximadamente un 25% en moles a aproximadamente un 55% en moles, de aproximadamente un 30% en moles a aproximadamente un 50% en moles o de aproximadamente un 35% en moles a aproximadamente un 45% en moles.
En una realización, la cantidad del lípido estructural (por ejemplo, un esterol tal como colesterol) en la composición lipídica divulgada en la presente memoria varía de aproximadamente un 25% en moles a aproximadamente un 30% en moles, de aproximadamente un 30% en moles a aproximadamente un 35% en moles o de aproximadamente un 35% en moles a aproximadamente un 40% en moles.
En una realización, la cantidad del lípido estructural (por ejemplo, un esterol tal como colesterol) en la composición lipídica divulgada en la presente memoria es aproximadamente un 24% en moles, aproximadamente un 29% en moles, aproximadamente un 34% en moles o aproximadamente un 39% en moles.
En algunas realizaciones, la cantidad del lípido estructural (por ejemplo, un esterol tal como colesterol) en la composición lipídica divulgada en la presente memoria es al menos aproximadamente un 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60% en moles.
(iv) Lípidos de Polietilenglicol (PEG)
La composición lipídica de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede comprender uno o más lípidos de polietilenglicol (PEG).
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "lípido de PEG" se refiere a lípidos modificados con polietilenglicol (PEG). Los ejemplos no limitativos de lípidos de PEG incluyen fosfatidiletanolamina y ácido fosfatídico modificados con PEG, conjugados de PEG-ceramida (por ejemplo, PEG-CerC14 o PEG-CerC20), dialquilaminas modificadas con PEG y 1,2-diaciloxipropan-3-aminas modificadas con PEG. Tales lípidos también se denominan lípidos PEGilados. Por ejemplo, un lípido de PEG puede ser PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC o un lípido de PEG-DSPE.
En algunas realizaciones, el lípido de PEG incluye, pero no se limita a, 1,2-dimiristoil-sn-glicerol metoxipolietilenglicol (PEG-DMG), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)] (PEG-DSPE), PEG-diesteril glicerol (PEG-DSG), PEG-dipalmetoleilo, PEG-dioleilo, PEG-diestearilo, PEG-diacilglicamida (PEG-DAG), PEG-dipalmitoil fosfatidiletanolamina (PEG-DPPE), o PEG-1,2-dimiristiloxipropil-3-amina (PEG-c-DMA).
En una realización, el lípido de PEG se selecciona del grupo que consiste en una fosfatidiletanolamina modificada con PEG, un ácido fosfatídico modificado con PEG, una ceramida modificada con PEG, una dialquilamina modificada con PEG, un diacilglicerol modificado con PEG, un dialquilglicerol modificado con PEG, y mezclas de los mismos.
En algunas realizaciones, el resto lipídico de los lípidos de PEG incluye aquellos que tienen longitudes de aproximadamente C14 a aproximadamente C22, preferiblemente de aproximadamente C14 a aproximadamente C16. En algunas realizaciones, un resto de PEG, por ejemplo un mPEG-NH2, tiene un tamaño de aproximadamente 1000, 2000, 5000, 10000, 15000 o 20 000 dáltones. En una realización, el lípido de PEG es PEG2k- DMG.
En una realización, las nanopartículas lipídicas descritas en la presente memoria pueden comprender un lípido de PEG que sea un PEG no difusible. Los ejemplos no limitativos de PEG no difusibles incluyen PEG-DSg y PEG-DSPE.
En la técnica se conocen lípidos de PEG, tales como los descritos en la Patente de EE.UU. NO 8158601 y la Publicación Internacional NO WO 2015/130584 A2.
En general, algunos de los otros componentes lipídicos (por ejemplo, lípidos de PEG) de diversas fórmulas, descritos en la presente memoria, pueden sintetizarse como se describe en la Solicitud de Patente Internacional NO PCT/US2016/000129, presentada el 10 de diciembre de 2016, titulada “Compositions y Methods for Delivery of Therapeutic Agents,”.
El componente lipídico de una composición de nanopartículas lipídicas puede incluir una o más moléculas que comprenden polietilenglicol, tales como PEG o lípidos modificados con PEG. Tales especies pueden denominarse como alternativa lípidos PEGilados. Un lípido de PEG es un lípido modificado con polietilenglicol. Un lípido de PEG puede seleccionarse del grupo no limitativo que incluye fosfatidiletanolaminas modificadas con PEG, ácidos fosfatídicos modificados con PEG, ceramidas modificadas con PEG, dialquilaminas modificadas con PEG, diacilgliceroles modificados con PEG, dialquilgliceroles modificados con PEG, y mezclas de los mismos. Por ejemplo, un lípido de PEG puede ser PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC o un lípido de PEG-DSPE.
En algunas realizaciones, los lípidos modificados con PEG son una forma modificada de PEG DMG. El PEG-DMG tiene la siguiente estructura:
En una realización, los lípidos de PEG útiles en la presente invención pueden ser lípidos PEGilados descritos en la Publicación Internacional NO WO 2012099755. Cualquiera de estos lípidos de PEG ejemplares descritos en la presente memoria puede modificarse para que comprenda un grupo hidroxilo en la cadena de PEG. En ciertas realizaciones, el lípido de PEG es un lípido de PEG-OH. Como se define en líneas generales en la presente memoria, un “ lípido de PEG-OH” (también denominado en la presente memoria “lípido hidroxi-PEGilado”) es un lípido PEGilado que tiene uno o más grupos hidroxilo (-OH) en el lípido. En ciertas realizaciones, el lípido de PEG-OH incluye uno o más grupos hidroxilo en la cadena de PEG. En ciertas realizaciones, un lípido de PEG-OH o hidroxi-PEGilado comprende un grupo -OH en el extremo de la cadena de PEG. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.
En ciertas realizaciones, un lípido de PEG útil en la presente invención es un compuesto de Fórmula (VII). En la presente memoria se proporcionan compuestos de Fórmula (VII):
(VII),
o sus sales, en donde:
R3 es -ORO
RO es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, o un grupo protector de oxígeno;
r es un número entero entre 1 y 100, inclusive;
L1 es alquileno C1-10 opcionalmente sustituido, en donde al menos un metileno del alquileno C1-10 opcionalmente sustituido se reemplaza independientemente por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, -O-, -N(RN)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O-, o -NR<n>C(O)N(R<n>)- ;
D es un resto obtenido por química clic o un resto escindible en condiciones fisiológicas;
m es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
A es de la fórmula:
cada caso de L2 es independientemente un enlace o alquileno C1-6 opcionalmente sustituido, en donde una unidad de metileno del alquileno C1-6 opcionalmente sustituido se reemplaza opcionalmente por -O-, -N(RN)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRnC(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(Rn)-, -NRnC(O)O-, o -NRnC(O)N(Rn)-;
cada caso de R2 es independientemente alquilo C1-30 opcionalmente sustituido, C1-30 alquenilo opcionalmente sustituido, o C1-30 alquinilo opcionalmente sustituido; opcionalmente en donde una o más unidades de metileno de R2 se reemplazan independientemente por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, -N(RN)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -NRNC(O)N(RN)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NRn)-, -C(=NRn)N(Rn)-, -NRnC(=NRn)-, -NRnC(=NRn)N(Rn)-, -C(S)-, -C(S)N(RN)-, -NR<n>C(S)-, -NR<n>C(S)N(R<n>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(RN)S(O)-, -S(O)N(Rn)-, -N(Rn)S(O)N(Rn)-, -OS(O)N(Rn)-, -N(Rn)S(O)O-, -S(O)2-,-N(Rn)S(O)2-, -S(O)2N(Rn)-, -N(Rn)S(O)2N(Rn)-, -OS(O)2N(Rn)-, o -N(Rn)S(O)2O-;
cada caso de RN es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno;
el Anillo B es carbociclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y
p es 1 o 2.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (VII) es un lípido de PEG-OH (es decir, R3 es -ORO y RO es hidrógeno). En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (VII) es de Fórmula (VII-OH):
(VII-OH),
o su sal.
En ciertas realizaciones, D es un resto obtenido por química clic (por ejemplo, triazol). En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (VII) es de Fórmula (VII-a-1) o (VII-a-2):
(VII-a-1) (VII-a-2),
o su sal.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (VII) es de una de las siguientes fórmulas:
o su sal, en donde
s es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (VII) es de una de las siguientes fórmulas:
o su sal.
En ciertas realizaciones, un compuesto de Fórmula (VII) es de una de las siguientes fórmulas:
o su sal.
En ciertas realizaciones, un compuesto de Fórmula (VII) es de una de las siguientes fórmulas:
ompues o ,
o su sal.
En ciertas realizaciones, D es un resto escindible en condiciones fisiológicas (por ejemplo, éster, amida, carbonato, carbamato, urea). En ciertas realizaciones, un compuesto de Fórmula (VII) es de Fórmula (VII-b-1) o (VII-b-2):
(VII-b-1) (VII-b-2),
o su sal.
En ciertas realizaciones, un compuesto de Fórmula (VII) es de Fórmula (VII-b-1-OH) o (VII-b-2-OH):
(VII-b-1-OH) (VII-b-2-OH),
o su sal.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (VII) es de una de las siguientes fórmulas:
En ciertas realizaciones, un compuesto de Fórmula (VII) es de una de las siguientes fórmulas:
o su sal.
En ciertas realizaciones, un compuesto de Fórmula (VII) es de una de las siguientes fórmulas:
o su sal.
En ciertas realizaciones, un compuesto de Fórmula (VII) es de una de las siguientes fórmulas:
o sus sales.
En ciertas realizaciones, un lípido de PEG útil en la presente invención es un ácido graso PEGilado. En ciertas realizaciones, un lípido de PEG útil en la presente invención es un compuesto de fórmula (VIII). En la presente memoria se proporcionan compuestos de Fórmula (VIII):
(VIII),
o sus sales, en donde:
R3 es -ORO;
RO es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de oxígeno;
r es un número entero entre 1 y 100, inclusive;
R5 es alquilo C10-40 opcionalmente sustituido, alquenilo C10-40 opcionalmente sustituido, o alquinilo C10-40 opcionalmente sustituido; y, opcionalmente, uno o más grupos de metileno de R5 se reemplazan por carbociclileno opcionalmente sustituido, heterociclileno opcionalmente sustituido, arileno opcionalmente sustituido, heteroarileno opcionalmente sustituido, -N(RN)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -NRNC(O)N(RN)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NRN)-, -C(=NRN)N(RN)-, -NRnC(=NRn)-, -NRnC(=NRn)N(Rn)-, -C(S)-, -C(S)N(Rn)-, -NRnC(S)-, -NRnC(S)N(Rn)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(RN)S(O)-, -S(O)N(Rn)-, -N(Rn)S(O)N(Rn)-, -OS(O)N(RN)-, -N(Rn)S(O)O-, -S(O)2-, -N(Rn)S(O)2-, -S(O)2N(Rn)-, -N(Rn)S(O)2N(Rn)-, -OS(O)2N(Rn)-, o -N(Rn)S(O)2O-; y
cada caso de RN es independientemente hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido o un grupo protector de nitrógeno.
En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula (VIII) es de Fórmula (VIII-OH):
O
hoV ^ o) ^ r5
(VIII-OH),
o su sal. En algunas realizaciones, r es 45.
En ciertas realizaciones, un compuesto de Fórmula (VIII) es de una de las siguientes fórmulas:
(Compuesto 426),
o su sal. En algunas realizaciones, r es 45.
En otras realizaciones más, el compuesto de Fórmula (VIII) es:
(Compuesto 427), o su sal.
En una realización, el compuesto de Fórmula (VIII) es
(Compuesto 428).
En una realización, la cantidad de lípido de PEG en la composición lipídica de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria varía de aproximadamente un 0.1% en moles a aproximadamente un 5% en moles, de aproximadamente un 0.5% en moles a aproximadamente un 5% en moles, de aproximadamente un 1 % en moles a aproximadamente un 5% en moles, de aproximadamente un 1.5% en moles a aproximadamente un 5% en moles, de aproximadamente un 2% en moles a aproximadamente un 5% en moles, de aproximadamente un 0.1% en moles a aproximadamente un 4% en moles, de aproximadamente un 0.5% en moles a aproximadamente un 4% en moles, de aproximadamente un 1% en moles a aproximadamente un 4% en moles, de aproximadamente un 1.5% en moles a aproximadamente un 4% en moles, de aproximadamente un 2% en moles a aproximadamente un 4% en moles, de aproximadamente un 0.1% en moles a aproximadamente un 3% en moles, de aproximadamente un 0.5% en moles a aproximadamente un 3% en moles, de aproximadamente un 1% en moles a aproximadamente un 3% en moles, de aproximadamente un 1.5% en moles a aproximadamente un 3% en moles, de aproximadamente un 2% en moles a aproximadamente un 3% en moles, de aproximadamente un 0.1% en moles a aproximadamente un 2% en moles, de aproximadamente un 0.5% en moles a aproximadamente un 2% en moles, de aproximadamente un 1% en moles a aproximadamente un 2% en moles, de aproximadamente un 1.5% en moles a aproximadamente un 2% en moles, de aproximadamente un 0.1% en moles a aproximadamente un 1.5% en moles, de aproximadamente un 0.5% en moles a aproximadamente un 1.5% en moles, o de aproximadamente un 1% en moles a aproximadamente un 1.5% en moles.
En una realización, la cantidad de lípido de PEG en la composición lipídica divulgada en la presente memoria es de aproximadamente un 2% en moles. En una realización, la cantidad de lípido de PEG en la composición lipídica divulgada en la presente memoria es de aproximadamente un 1.5% en moles.
En una realización, la cantidad de lípido de PEG en la composición lipídica divulgada en la presente memoria es al menos aproximadamente un 0.1,0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 o 5% en moles.
En algunos aspectos, la composición lipídica de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria no comprende un lípido de PEG.
(v) Otros Aminolípidos Ionizables
La composición lipídica de la composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede comprender uno o más aminolípidos ionizables además de un lípido de acuerdo con la Fórmula (I), (III), (IV), (V) o (VI). Los lípidos ionizables se pueden seleccionar del grupo no limitativo que consiste en 3-(didodecilamino)-N1,N1,4-tridodecil-1-piperazinaetanamina (KL10),
N1-[2-(didodecilamino)etil]-N1,N4,N4-tridodecil-1,4-piperazinadietanamina (KL22),
14,25-ditridecil-15, 18,21,24-tetraaza-octatriacontano (KL25),
1.2- dilinoleiloxi-N, N-dimetilaminopropano (DLin-DMA),
2.2- dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA),
heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoato (DLin-MC3-DMA),
2.2- dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA),
1.2- dioleiloxi-N, N-dimetilaminopropano (DODMA), (13Z, 165Z)-N, N-dimetil-3-nonidocosa-13-16-dien-1 -amina (L608),
2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA),
(2R)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-l-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2R)), y
(2S)-2-({8-[(3p)-colest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-l-iloxi]propan-1-amina (Octil-CLinDMA (2S)). Además de éstos, un aminolípido ionizable también puede ser un lípido que incluya un grupo amina cíclica.
Los lípidos ionizables también pueden ser los compuestos divulgados en la Publicación Internacional NO WO 2017/075531 A1. Por ejemplo, los aminolípidos ionizables incluyen, pero no se limitan a:
y cualquier combinación de los mismos.
Los lípidos ionizables también pueden ser los compuestos divulgados en la Publicación Internacional NO WO 2015/199952 A1. Por ejemplo, los aminolípidos ionizables incluyen, pero no se limitan a:
y cualquier combinación de los mismos.
Los lípidos ionizables pueden incluir además, pero no se limitan a:
y cualquier combinación de los mismos.
(vi) Otros Componentes de la Composición Lipídica
La composición lipídica de una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede incluir uno o más componentes además de los descritos anteriormente. Por ejemplo, la composición lipídica puede incluir una o más moléculas potenciadoras de la permeabilidad, carbohidratos, polímeros, agentes alteradores de la superficie (por ejemplo, tensioactivos) u otros componentes. Por ejemplo, una molécula potenciadora de la permeabilidad puede ser una molécula descrita por la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. NO 2005/0222064. Los carbohidratos pueden incluir azúcares simples (por ejemplo, glucosa) y polisacáridos (por ejemplo, glucógeno y derivados y análogos del mismo).
Un polímero puede incluirse en y/o usarse para encapsular, o encapsular parcialmente, una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria (por ejemplo, una composición farmacéutica en forma de nanopartículas lipídicas). Un polímero puede ser biodegradable y/o biocompatible. Un polímero puede seleccionarse entre, pero no está limitado a, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poliestirenos, poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos.
El intervalo de la relación entre la composición lipídica y el polinucleótido puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 60:1 (peso/peso).
En algunas realizaciones, la relación entre la composición lipídica y el polinucleótido puede ser aproximadamente 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 36:1, 37:1, 38:1, 39:1, 40:1, 41:1, 42:1, 43:1, 44:1, 45:1, 46:1, 47:1, 48:1, 49:1, 50:1, 51:1, 52:1, 53:1, 54:1, 55:1, 56:1, 57:1, 58:1, 59:1 o 60:1 (peso/peso). En algunas realizaciones, la relación peso/peso de la composición lipídica con respecto al polinucleótido que codifica un agente terapéutico es aproximadamente 20:1 o aproximadamente 15:1.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede contener más de un polipéptido. Por ejemplo, una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede contener dos o más polinucleótidos (por ejemplo, ARN, por ejemplo, ARNm).
En una realización, las nanopartículas lipídicas descritas en la presente memoria pueden comprender polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) en una relación en peso de lípido: polinucleótido de 5:1, 10:1, 15:1,20:1, 25:1, 30:1, 35:1,40:1, 45:1, 50:1, 55:1,60:1 o 70:1, o un intervalo o cualquiera de estas relaciones tales como, pero sin limitarse a, de 5:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 30:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 35:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 40:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 45:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 55:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 60:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 70:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 15:1 de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 30:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 35:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 40:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 45:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 55:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 60:1, de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 70:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 30:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 35:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 40:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 45:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 55:1, de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 60:1 o de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 70:1.
En una realización, las nanopartículas lipídicas descritas en la presente memoria pueden comprender el polinucleótido en una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a 2 mg/ml, tal como, pero sin limitarse a, 0.1 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.9 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.1 mg/ml, 1.2 mg/ml, 1.3 mg/ml, 1.4 mg/ml, 1.5 mg/ml, 1.6 mg/ml, 1.7 mg/ml, 1.8 mg/ml, 1.9 mg/ml, 2.0 mg/ml o mayor de 2.0 mg/ml.
(vii) Composiciones de Nanopartículas
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria pueden formularse como nanopartículas lipídicas (LNP). Por consiguiente, la presente divulgación también proporciona composiciones de nanopartículas que comprenden (i) una composición lipídica que comprende un agente de administración tal como el compuesto de Fórmula (I) o (III) como se describe en la presente memoria, y (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido de GALT. En tal composición de nanopartículas, la composición lipídica divulgada en la presente memoria puede encapsular el polinucleótido que codifica un polipéptido de GAL<t>.
Las composiciones de nanopartículas se realizan típicamente con un tamaño en el orden de micrómetros o menor y pueden incluir una bicapa lipídica. Las composiciones de nanopartículas abarcan nanopartículas lipídicas (LNP), liposomas (por ejemplo, vesículas lipídicas) y lipoplejos. Por ejemplo, una composición de nanopartículas puede ser un liposoma que tenga una bicapa lipídica con un diámetro de 500 nm o menos.
Las composiciones de nanopartículas incluyen, por ejemplo, nanopartículas lipídicas (LNP), liposomas y lipoplejos. En algunas realizaciones, las composiciones de nanopartículas son vesículas que incluyen una o más bicapas lipídicas. En ciertas realizaciones, una composición de nanopartículas incluye dos o más bicapas concéntricas separadas por compartimentos acuosos. Las bicapas lipídicas pueden funcionalizarse y/o reticularse entre sí. Las bicapas lipídicas pueden incluir uno o más ligyos, proteínas o canales.
Las composiciones de nanopartículas de la presente divulgación comprenden al menos un compuesto de acuerdo con la Fórmula (I), (III), (IV), (V), o (VI). Por ejemplo, la composición de nanopartículas puede incluir uno o más de los Compuestos 1-147, o uno o más de los Compuestos 1-342. Las composiciones de nanopartículas también pueden incluir otros diversos componentes. Por ejemplo, la composición de nanopartículas puede incluir otro u otros lípidos además de un lípido de acuerdo con la Fórmula (I), (III), (IV), (V) o (VI), tal como (i) al menos un fosfolípido, (ii) al menos un lípido estructural, (iii) al menos un lípido de PEG, o (iv) cualquier combinación de los mismos. La inclusión de lípidos estructurales puede ser opcional, por ejemplo, cuyo se usan lípidos de acuerdo con la Fórmula (III) en las composiciones de nanopartículas lipídicas.
En algunas realizaciones, la composición de la invención es una composición de nanopartículas que comprende un compuesto de Fórmula (IA) (por ejemplo, Compuestos 18, 25, 26 o 48).
En algunas realizaciones, la composición de la invención es una composición de nanopartículas que comprende una composición lipídica que consiste en, o que consiste esencialmente en, un compuesto de Fórmula (IA) (por ejemplo, Compuestos 18, 25, 26 o 48). En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas comprende una composición lipídica que consiste en, o que consiste esencialmente en, un compuesto de Fórmula (IA) (por ejemplo, Compuestos 18, 25, 26 o 48) y un fosfolípido (por ejemplo, DSPC).
En una realización, una nanopartícula lipídica comprende un lípido ionizable, un lípido estructural, un fosfolípido y ARNm. En algunas realizaciones, la LNP comprende un lípido ionizable, un lípido modificado con PEG, un esterol y un lípido estructural. En algunas realizaciones, la LNP tiene una proporción molar de aproximadamente un 20-60% de lípido ionizable: aproximadamente un 5-25% de lípido estructural: aproximadamente un 25-55% de esterol; y aproximadamente un 0.5-15% de lípido modificado con PEG. En algunas realizaciones, la LNP comprende una proporción molar de aproximadamente un 50% de lípido ionizable, aproximadamente un 1.5% de lípido modificado con PEG, aproximadamente un 38.5% de colesterol y aproximadamente un 10% de lípido estructural. En algunas realizaciones, la LNP comprende una proporción molar de aproximadamente un 55% de lípido ionizable, aproximadamente un 2.5% de lípido de PEG, aproximadamente un 32.5% de colesterol y aproximadamente un 10% de lípido estructural. En algunas realizaciones, el lípido ionizable es un aminolípido ionizable y el lípido estructural es un lípido neutro, y el esterol es un colesterol. En algunas realizaciones, la LNP tiene una relación molar de 50:38.5:10:1.5 de lípido ionizable: colesterol: DSPC: lípido de PEG. En algunas realizaciones, el lípido ionizable es el Compuesto 18, y el lípido de PEG es el Compuesto 428.
En algunas realizaciones, la LNP tiene una relación molar de 50:38.5:10:1.5 de Compuesto 18: Colesterol: Fosfolípido: Compuesto 428. En algunas realizaciones, la LNP tiene una relación molar de 50:38.5:10:1.5 de Compuesto 18: Colesterol: DSPC: Compuesto 428.
En algunas realizaciones, la LNP tiene un valor de polidispersidad de menos de 0.4. En algunas realizaciones, la LNP tiene una carga neutra neta a un pH neutro. En algunas realizaciones, la LNP tiene un diámetro medio de 50-150 nm. En algunas realizaciones, la LNP tiene un diámetro medio de 80-100 nm.
Tal como se define en líneas generales en la presente memoria, el término "lípido" se refiere a una molécula pequeña que tiene propiedades hidrófobas o anfifílicas. Los lípidos pueden ser de origen natural o sintéticos. Los ejemplos de clases de lípidos incluyen, pero no se limitan a, grasas, ceras, metabolitos que contienen esterol, vitaminas, ácidos grasos, glicerolípidos, glicerofosfolípidos, esfingolípidos, sacarolípidos, y policétidos, y lípidos de prenol. En algunos casos, las propiedades anfifílicas de algunos lípidos los conducen a formar liposomas, vesículas o membranas en medios acuosos.
En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica (LNP) puede comprender un lípido ionizable. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "lípido ionizable" tiene su significado habitual en la técnica y puede referirse a un lípido que comprenda uno o más restos cargados. En algunas realizaciones, un lípido ionizable puede estar cargado positivamente o estar cargado negativamente. Un lípido ionizable puede estar cargado positivamente, en cuyo caso puede denominarse “ lípido catiónico”. En ciertas realizaciones, una molécula de lípido ionizable puede comprender un grupo amina, y puede denominarse aminolípido ionizable. Tal como se usa en la presente memoria, un "resto cargado" es un resto químico que lleva una carga electrónica formal, por ejemplo, monovalente (+1 o -1), divalente (+2 o -2), trivalente (+3 o -3), etc. El resto cargado puede ser aniónico (es decir, cargado negativamente) o catiónico (es decir, cargado positivamente). Los ejemplos de restos cargados positivamente incluyen grupos amina (por ejemplo, aminas primarias, secundarias y/o terciarias), grupos amonio, grupo piridinio, grupos guanidina y grupos imidizolio. En una realización concreta, los restos cargados comprenden grupos amina. Los ejemplos de grupos cargados negativamente o precursores de los mismos incluyen grupos carboxilato, grupos sulfonato, grupos sulfato, grupos fosfonato, grupos fosfato, grupos hidroxilo y similares. La carga del resto cargado puede variar, en algunos casos, con las condiciones ambientales, por ejemplo, los cambios en el pH pueden alterar la carga del resto y/o provocar que el resto se cargue o descargue. En general, la densidad de carga de la molécula se puede seleccionar como se desee.
Debe entenderse que las expresiones "carga" o "resto cargado" no se refieren a una "carga negativa parcial" o "carga positiva parcial" en una molécula. A las expresiones "carga negativa parcial" y "carga positiva parcial" se les da su significado ordinario en la técnica. Una "carga negativa parcial" puede resultar cuyo un grupo funcional comprende un enlace que se polariza de tal manera que la densidad de electrones se atrae hacia un átomo del enlace, creyo una carga negativa parcial en el átomo. Las personas con conocimientos corrientes en la técnica reconocerán, en general, los enlaces que pueden llegar a polarizarse de esta manera.
En algunas realizaciones, el lípido ionizable es un aminolípido ionizable, a veces denominado en la técnica “ lípido catiónico ionizable”. En una realización, el aminolípido ionizable puede tener una cabeza hidrófila cargada positivamente y una cola hidrófoba que estén conectadas a través de una estructura enlazadora.
Además de éstos, un lípido ionizable también puede ser un lípido que incluya un grupo amina cíclica.
En una realización, el lípido ionizable puede seleccionarse de, pero sin limitarse a, un lípido ionizable descrito en las Publicaciones Internacionales NOs WO2013086354 y WO2013116126.
En otra realización más, el lípido ionizable puede seleccionarse de, pero sin limitarse a, la fórmula CLI-CLXXXXII de la Patente de EE.UU. NO 7,404,969.
En una realización, el lípido puede ser un lípido escindible tal como los descritos en la Publicación Internacional NO WO2012170889. En una realización, el lípido puede sintetizarse mediante métodos conocidos en la técnica y/o como se describe en la Publicación Internacional NO WO2013086354.
Las composiciones de nanopartículas pueden caracterizarse por diversos métodos. Por ejemplo, se puede usar microscopía (por ejemplo, microscopía electrónica de transmisión o microscopía electrónica de barrido) para examinar la morfología y distribución de tamaños de una composición de nanopartículas. Se pueden usar dispersión dinámica de luz o potenciometría (por ejemplo, valoraciones potenciométricas) para medir potenciales zeta. La dispersión dinámica de luz también puede utilizarse para determinar tamaños de partícula. También se pueden usar instrumentos tales como el Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, Reino Unido) para medir múltiples características de una composición de nanopartículas, tales como tamaño de partícula, índice de polidispersidad y potencial zeta.
El tamaño de las nanopartículas puede ayudar a contrarrestar reacciones biológicas tales como, pero sin limitarse a, inflamación, o puede aumentar el efecto biológico del polinucleótido.
Tal como se usan en la presente memoria, "tamaño" o "tamaño medio" en el contexto de composiciones de nanopartículas se refieren al diámetro medio de una composición de nanopartículas.
En una realización, el polinucleótido que codifica un polipéptido de GALT se formula en nanopartículas lipídicas con un diámetro de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nm, tal como, pero sin limitarse a, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nm aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 100 nm y/o aproximadamente 90 a aproximadamente 100 nm.
En una realización, las nanopartículas tienen un diámetro de aproximadamente 10 a 500 nm. En una realización, la nanopartícula tiene un diámetro superior a 100 nm, superior a 150 nm, superior a 200 nm, superior a 250 nm, superior a 300 nm, superior a 350 nm, superior a 400 nm, superior a 450 nm, superior a 500 nm, superior a 550 nm, superior a 600 nm, superior a 650 nm, superior a 700 nm, superior a 750 nm, superior a 800 nm, superior a 850 nm, superior a 900 nm, superior a 950 nm o superior a 1000 nm.
En algunas realizaciones, la dimensión más grye de una composición de nanopartículas es 1 pm o más corta (por ejemplo, 1 pm, 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm o más corta).
Una composición de nanopartículas puede ser relativamente homogénea. Puede usarse un índice de polidispersidad para indicar la homogeneidad de una composición de nanopartículas, por ejemplo, la distribución de tamaños de partícula de la composición de nanopartículas. Un índice de polidispersidad pequeño (por ejemplo, inferior a 0.3) generalmente indica una distribución estrecha de tamaños de partícula. Una composición de nanopartículas puede tener un índice de polidispersidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 0.25, tal como 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06 , 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24 o 0.25. En algunas realizaciones, el índice de polidispersidad de una composición de nanopartículas divulgada en la presente memoria puede ser de aproximadamente 0.10 a aproximadamente 0.20.
Puede usarse el potencial zeta de una composición de nanopartículas para indicar el potencial electrocinético de la composición. Por ejemplo, el potencial zeta puede describir la carga superficial de una composición de nanopartículas. Las composiciones de nanopartículas con cargas relativamente bajas, positivas o negativas, son generalmente deseables, ya que las especies más altamente cargadas pueden interactuar de manera no deseable con células, tejidos y otros elementos en el cuerpo. En algunas realizaciones, el potencial zeta de una composición de nanopartículas divulgada en la presente memoria puede ser de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 0 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente -5 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente -5 mV a aproximadamente 0 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 5 mV, de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 15 mV, o de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 10 mV.
En algunas realizaciones, el potencial zeta de las nanopartículas lipídicas puede ser de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 30 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 0 mV a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 30 mV de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 20 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 30 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 60 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 30 mV a aproximadamente 40 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 100 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 90 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 80 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 70 mV, de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 60 mV y de aproximadamente 40 mV a aproximadamente 50 mV. En algunas realizaciones, el potencial zeta de las nanopartículas lipídicas puede ser de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 50 mV, de aproximadamente 15 mV a aproximadamente 45 mV, de aproximadamente 20 mV a aproximadamente 40 mV y de aproximadamente 25 mV a aproximadamente 35 mV. En algunas realizaciones, el potencial zeta de las nanopartículas lipídicas puede ser de aproximadamente 10 mV, aproximadamente 20 mV, aproximadamente 30 mV, aproximadamente 40 mV, aproximadamente 50 mV, aproximadamente 60 mV, aproximadamente 70 mV, aproximadamente 80 mV, aproximadamente 90 mV y aproximadamente 100 mV.
La expresión “eficiencia de encapsulación” de un polinucleótido describe la cantidad del polinucleótido que está encapsulado por o asociado de otro modo con una composición de nanopartículas después de la preparación, con relación a la cantidad inicial proporcionada. Tal como se usa en la presente memoria, "encapsulación" puede referirse a una caja, confinamiento, contorno o encajamiento completos, sustanciales o parciales.
La eficiencia de encapsulación es deseablemente alta (por ejemplo, cercana al 100%). La eficiencia de encapsulación se puede medir, por ejemplo, comparyo la cantidad del polinucleótido en una solución que contenga la composición de nanopartículas antes y después de romper la composición de nanopartículas con uno o más disolventes o detergentes orgánicos.
Se puede usar la fluorescencia para medir la cantidad de polinucleótido libre en una solución. Para las composiciones de nanopartículas descritas en la presente memoria, la eficiencia de encapsulación de un polinucleótido puede ser al menos un 50%, por ejemplo, un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. En algunas realizaciones, la eficiencia de encapsulación puede ser al menos un 80%. En ciertas realizaciones, la eficiencia de encapsulación puede ser al menos un 90%.
La cantidad de un polinucleótido presente en una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria puede depender de múltiples factores tales como el tamaño del polinucleótido, la diana deseada y/o la aplicación, u otras propiedades de la composición de nanopartículas, así como de las propiedades del polinucleótido.
Por ejemplo, la cantidad de un ARNm útil en una composición de nanopartículas puede depender del tamaño (expresado como longitud, o masa molecular), la secuencia y otras características del ARNm. Las cantidades relativas de un polinucleótido en una composición de nanopartículas también pueden variar.
Las cantidades relativas de la composición lipídica y el polinucleótido presente en una composición de nanopartículas lipídicas de la presente divulgación pueden optimizarse de acuerdo con consideraciones de eficacia y tolerabilidad. Para composiciones que incluyen un ARNm como polinucleótido, la relación N:P puede servir como una métrica útil.
Como la relación N:P de una composición de nanopartículas controla tanto la expresión como la tolerabilidad, son deseables composiciones de nanopartículas con bajas relaciones N:P y fuerte expresión. Las relaciones N:P varían de acuerdo con la relación de lípidos a ARN en una composición de nanopartículas.
En general, se prefiere una relación N:P más baja. Los uno o más ARN, lípidos y cantidades de los mismos se pueden seleccionar para proporcionar una relación N:P de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 30:1, tal como 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 12:1, 14:1, 16:1, 18:1, 20:1, 22:1, 24:1, 26:1, 28:1 o 30:1. En ciertas realizaciones, la relación N:P puede ser de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1. En otras realizaciones, la relación N:P es de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 8:1. En ciertas realizaciones, la relación N:P está entre 5:1 y 6:1. En un aspecto específico, la relación N:P es aproximadamente 5.67:1.
Además de proporcionar composiciones de nanopartículas, la presente divulgación también proporciona métodos para producir nanopartículas lipídicas que comprenden encapsular un polinucleótido. Tal método comprende utilizar cualquiera de las composiciones farmacéuticas divulgadas en la presente memoria y producir nanopartículas lipídicas de acuerdo con métodos de producción de nanopartículas lipídicas conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Wang et al. (2015) “Delivery of oligonucleotides con lipid nanopartcles” Adv. Drug Deliv. Rev. 87:68-80; Silva et al. (2015) “Delivery Systems for Biopharmaceuticals. Part I: Nanoparticles y Microparticles” Curr. Pharm. Technol. 16 : 940-954; Naseri et al. (2015) “Solid Lipid Nanoparticles y Nanostructured Lipid Carriers: Structure, Preparation y Application” Adv. Pharm. Bull. 5:305-13; Silva et al. (2015) “Lipid nanoparticles for the delivery of biopharmaceuticals” Curr. Pharm. Biotechnol. 16:291-302, y las referencias allí citadas.
23. Otros Agentes de Administración
a. Liposomas, Lipoplejos y Nanopartículas Lipídicas
Las composiciones o formulaciones de la presente divulgación pueden comprender un agente de administración, por ejemplo, un liposoma, un lipoplejo, una nanopartícula lipídica, o cualquier combinación de los mismos. Los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) se pueden formular usyo uno o más liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas. Pueden utilizarse liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas para mejorar la eficacia de la producción de proteínas dirigida por polinucleótidos, dado que estas formulaciones pueden aumentar la transfección celular mediante el polinucleótido y/o aumentar la traducción de la proteína codificada. Los liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas también pueden utilizarse para aumentar la estabilidad de los polinucleótidos.
Los liposomas son vesículas preparadas artificialmente que pueden componerse principalmente de una bicapa lipídica y pueden usarse como un vehículo de administración para la administración de formulaciones farmacéuticas. Los liposomas pueden ser de diferentes tamaños. Una vesícula multilaminar (MLV, por sus siglas en inglés) puede tener cientos de nanómetros de diámetro, y puede contener una serie de bicapas concéntricas separadas por compartimentos acuosos estrechos. Una vesícula unicelular pequeña (SUV, por sus siglas en inglés) puede ser menor de 50 nm de diámetro, y una vesícula unilaminar grye (LUV, por sus siglas en inglés) puede tener entre 50 y 500 nm de diámetro. El diseño de liposomas puede incluir, pero no se limita a, opsoninas o ligyos para mejorar la unión de liposomas a tejido no sano o para activar acontecimientos tales como, pero no limitados a, endocitosis. Los liposomas pueden contener un valor de pH bajo o alto con el fin de mejorar la administración de las formulaciones farmacéuticas.
La formación de liposomas puede depender de la formulación farmacéutica atrapada y los ingredientes liposómicos, la naturaleza del medio en el que las vesículas lipídicas se dispersan, la concentración eficaz de la sustancia atrapada y su potencial toxicidad, cualesquiera procesos adicionales involucrados durante la aplicación y/o la administración de las vesículas, el tamaño óptimo, la polidispersidad y la vida útil de almacenamiento de las vesículas para la aplicación prevista, y la reproducibilidad lote a lote y el incremento secuencial de la producción de productos liposómicos eficientes y seguros, etc.
Como ejemplo no limitativo, pueden prepararse liposomas tales como las vesículas de membrana sintética mediante los métodos, aparatos y dispositivos descritos en las Publicaciones de EE.UU. NOs US20130177638, US20130177637, US20130177636, US20130177635, US20130177634, US20130177633, US20130183375, US20130183373 y US20130183372. En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden encapsularse mediante el liposoma y/o pueden estar contenidos en un núcleo acuoso que luego puede encapsularse mediante el liposoma como se describe en, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales NOs WO2012031046, WO2012031043, WO2012030901, WO2012006378 y WO2013086526; y las Publicaciones de EE.UU. NOs US20130189351, US20130195969 y US20130202684.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden formularse en una emulsión de aceite en agua catiónica donde la partícula de emulsión comprenda un núcleo de aceite y un lípido catiónico que pueda interactuar con el polinucleótido anclyo la molécula a la partícula de emulsión. En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria se pueden formular en una emulsión de agua en aceite que comprenda una fase hidrófoba continua en la que se disperse la fase hidrófila. Pueden producirse emulsiones ejemplares mediante los métodos descritos en las Publicaciones Internacionales NOs WO2012006380 y WO201087791.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden formularse en un complejo lípido-policatión. La formación del complejo lípido-policatión se puede lograr mediante métodos como los descritos en, por ejemplo, la Publicación de Ee .UU. NO US20120178702. A modo de ejemplo no limitativo, el policatión puede incluir un polipéptido o un péptido catiónico tales como, pero no limitados a, polilisina, poliornitina y/o poliarginina y los péptidos catiónicos descritos en la Publicación Internacional NO WO2012013326 o la Publicación de EE.UU. NO US20130142818.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden formularse en una nanopartícula lipídica (LNP) tal como las descritas en las Publicaciones Internacionales NOs WO2013123523, WO2012170930, WO2011127255 y WO2008103276; y la Publicación de EE.UU. NO US20130171646.
Las formulaciones de nanopartículas lipídicas típicamente comprenden uno o más lípidos. En algunas realizaciones, el lípido es un lípido ionizable (por ejemplo, un aminolípido ionizable), a veces denominado en la técnica “lípido catiónico ionizable”. En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas lipídicas comprenden además otros componentes, incluyendo un fosfolípido, un lípido estructural y una molécula capaz de reducir la agregación de partículas, por ejemplo, un PEG o un lípido modificado con PEG.
Los lípidos ionizables ejemplares incluyen, pero sin limitarse a, cualquiera de los Compuestos 1 -342 divulgados en la presente memoria, DLin-MC3-DMA (MC3), Dlin-DMA, DLenDMA, Dlin-D-DMA, Dlin-K-DMA, Dlin-M-C2-DMA, Dlin-K-DMA, Dlin-KC2-DMA, Dlin-KC3-DMA, Dlin- KC4-DMA, Dlin-C2K-DMA, Dlin-MP-DMA, DODMA, 98N12-5, C12-200, Dlin-C- DAP, Dlin-DAC, DLinDAP, DlinAP, Dlin-EG-DMA, Dlin-2-DMAP, KL10, KL22, KL25, Octil-CLinDMA, Octil-CLinDMA (2R), Octil-CLinDMA (2S) y cualquier combinación de los mismos. Otros lípidos ionizables ejemplares incluyen (13Z, 16Z)-N, N-dimetil-3-nonildocosa-13, 16-dien-l-amina (L608), (20Z,23Z)-N,N-dimetilnonacosa-20,23-dien-10-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimemilhexacosa-17,20-dien-9-amina, (16Z, 19Z)-N5N- dimetilpentacosa-16, 19-dien-8-amina, (13Z, 16Z)-N,N-dimetildocosa-13, 16-dien-5- amina, (12Z, 15Z)-N,N-dimetilhenicosa-12, 15-dien-4-amina, (14Z, 17Z)-N,N- dimetiltricosa-14, 17-dien-6-amina, (15Z, 18Z)-N,N-dimetiltetracosa-15, 18-dien-7- amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptacosa-18,21-dien-10-amina, (15Z, 18Z)-N,N-dimetiltetracosa-15, 18-dien-5-amina, (14Z, 17z)-N,N-dimetiltricosa-14, 17-dien-4- amina, (19Z,22Z)-N,N-dimeihiloctacosa-19,22-dien-9-amina, (18Z,21Z)-N,N- dimetilheptacosa-18,21-dien-8-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetilhexacosa-17,20-dien-7- amina, (16Z, 19Z)-N,N-dimetilpentacosa-16, 19-dien-6-amina, (22Z,25Z)-N,N-dimetilhentriaconta-22,25-dien-10-amina, (21Z,24Z)-N,N-dimetiltriaconta-21,24- dien-9-amina, (18Z)-N,N-dimetilheptacos-18-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilhexacos- 17-en-9-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimetiloctacosa-19,22-dien-7-amina, N,N- dimetilheptacosan-10-amina, (20Z,23Z)-N-etil-N-metilnonacosa-20,23-dien-10-amina, 1-[(11Z,14Z)-l-nonilicosa-11,14-dien-l-il]pirrolidina, (20Z)-N,N- dimetilheptacos-20-en-10-amina, (15Z)-N,N-dimetil eptacos-15-en-10-amina, (14Z)- N,N-dimetilnonacos-14-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilnonacos-17-en-10-amina, (24Z)-N,N-dimetiltritriacont-24-en-10-amina, (20Z)-N,N-dimetilnonacos-20-en-10- amina, (22Z)-N,N-dimetilhentriacont-22-en-10-amina, (16Z)-N,N-dimetil pentacos-16-en-8-amina, (12Z, 15Z)-N,N-dimetil-2-nonilhenicosa-12, 15-dien-1-amina, N,N- dimetil-1 -[(1 S,2R)-2-octilciclopropil] eptadecan-8-amina, 1-[(1S,2R)-2-hexilciclopropil]-N,N-dimetilnonadecan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]nonadecan-10-amina, N,N-dimetil-21-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]henicosan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciclopropil]metil}ciclopropil]nonadecan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]hexadecan-8-amina,N,N-dimetil-[(1R,2S)-2- undeci Iciclopropil]tetradecan-5-amina, N,N-dimetil-3-{7-[(1S,2R)-2-octilciclopropil]heptil}dodecan-1-amina, 1-[(1R,2S)-2-heptilciclopropil]-N,N-dimetiloctadecan-9-amina, 1-[(1S,2R)-2-decilciclopropil ]-N,N-dimetil pentadecan-6- amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-octilciclopropil ]pentadecan-8-amina, R-N,N- dimetil-1-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-l-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, S-N,N- dimetil-l-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1{2-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]-1-[(octiloxi)metil]etil}pirrolidina, (2S)-N,N- dimetil-1-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1 -iloxi]-3-[(5Z)-oct-5-en-1 -iloxi ]propan-2-amina, 1-{2-[(9<z>, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]-1-[(octiloxi)metil]etil}azetidina, (2S)-1-(hexiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, (2S)-1-(heptiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(noniloxi)-3-[(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-[(9Z)-octadec-9-en-1 -iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina; (2S)-N,N-dimetil-1 -[(6<z>, 9Z, 12Z)-octadeca-6,9, 12-trien-1 -iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-[(11Z, 14Z)-icosa-11, 14-dien-l-iloxi]-N,N-dimetil-3-(pentiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-(hexiloxi)-3-[(11Z, 14z)-icosa-11, 14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1 -iloxi]-N,N-dimetil-3-( octiloxi)propan-2-amina, 1-[(13Z, 16Z)-docosa-13, 16-dien-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-( octiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-[(13Z, 16Z)-docosa-13, 16-dien-1-Noxi]-3-(hexiloxi)-N,N-dimetNpropan-2-amina, (2S)-1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-3-(hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina,1-[(9Z)-hexadec-9-en-l-iloxi ]-N,N-dimetil-3-(octNoxi)propan-2-amina, (2R)-N,N-dimetil-H(1-metoiloctil)oxi]-3-[(9Z, 12Z) octadeca-9,12-dien-l-iloxi]propan-2-amina, (2<r>)-1-[(3, 7-dimetiloctil)oxi ]-N,N dimetil-3-[(9Z, 12z)-octadeca-9, 12-dien-l-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1- (octiloxi)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciclopropil]metil}ciclopropil]octil}oxi)propan-2-amina, N,N-dimetil-1-{[8-(2-oclilciclopropil)octil]oxi}-3-(octiloxi)propan-2-amina, y (11E,20Z,23Z)-N,N-dimetilnonacosa-11,20,2-trien-10-amina, y cualquier combinación de los mismos.
Los fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, glicerofosfolípidos tales como fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatidigliceroles y ácidos fosfatidicos. Los fosfolípidos también incluyen fosfoesfingolípidos, tales como la esfingomielina. En algunas realizaciones, los fosfolípidos son DLPC, DMPC, DOPC, DPPC, DSPC, DUPC, 18:0 Diéter PC, DLnPC, DAPC, DHAPC, DOPE, 4ME 16:0 PE, DSPE, DLPE, D1nPE, DAPE, DRAPE, DOPG, y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los fosfolípidos son MPPC, MSPC, PMPC, Ps Pc , SMPC, SPPC, DRAPE, DOPG y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la cantidad de fosfolípidos (por ejemplo, DSPC) en la composición lipídica varía de aproximadamente un 1% en moles a aproximadamente un 20% en moles.
Los lípidos estructurales incluyen esteroles y lípidos que contienen restos de esterol. En algunas realizaciones, los lípidos estructurales incluyen colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brasicasterol, tomatidina, tomatina, ácido ursólico, alfa- tocoferol y mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el lípido estructural es colesterol. En algunas realizaciones, la cantidad de los lípidos estructurales (por ejemplo, colesterol) en la composición lipídica varía de aproximadamente un 20% en moles a aproximadamente un 60% en moles.
Los lípidos modificados con PEG incluyen fosfatidiletanolamina y ácido fosfatídico modificados con PEG, conjugados de PEG-ceramida (por ejemplo, PEG-CerC14 o PEG-CerC20), dialquilaminas modificadas con PEG y 1,2-diaciloxipropan-3-aminas modificadas con PEG. Tales lípidos también se denominan lípidos PEGilados. Por ejemplo, un lípido de PEG puede ser PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG DMPE, PEG-DPPC o un lípido de PEG-DSPE. En algunas realizaciones, el lípido de PEG es 1,2-dimiristoil-sn-glicerol metoxipolietilenglicol (PEG-DMG), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)] (PEG-Ds PE), PEG-diesteril glicerol (PEG-DSG), PEG-dipalmetoleilo, PEG- dioleilo, PEG-diestearilo, PEG-diacilglicamida (PEG-DAG), PEG-dipalmitoil fosfatidiletanolamina (PEG-DPPE), o PEG-1,2-dimiristiloxipropil-3-amina (PEG-c-DMA). En algunas realizaciones, el resto de PEG tiene un tamaño de aproximadamente 1000, 2000, 5000, 10000, 15000 o 20 000 dáltones. En algunas realizaciones, la cantidad de lípido de PEG en la composición lipídica varía de aproximadamente un 0% en moles a aproximadamente un 5% en moles.
En algunas realizaciones, las formulaciones de LNP descritas en la presente memoria pueden comprender adicionalmente una molécula potenciadora de la permeabilidad. En la Publicación de EE.UU. NO US20050222064 se describen moléculas potenciadoras de la permeabilidad no limitativas.
Las formulaciones de LNP pueden contener además un conjugado de fosfato. El conjugado de fosfato puede aumentar los tiempos de circulaciónin vivoy/o aumentar la administración guiado de la nanopartícula. Los conjugados de fosfato se pueden producir mediante los métodos descritos en, por ejemplo, la Publicación Internacional NO WO2013033438 o la Publicación de EE.UU. NO US20130196948. La formulación de LNP también puede contener un conjugado de polímero (por ejemplo, un conjugado soluble en agua) como se describe en, por ejemplo, las Publicaciones de EE.UU. NOs US20130059360, US20130196948 y US20130072709.
Las formulaciones de LNP pueden comprender un conjugado para mejorar la administración de nanopartículas en un individuo. Además, el conjugado puede inhibir el aclaramiento fagocítico de las nanopartículas en un individuo. En algunas realizaciones, el conjugado puede ser un “auto”péptido diseñado a partir de la proteína de membrana humana CD47 (por ejemplo, las “auto”partículas descritas por Rodriguez et al, Science 2013 339, 971-975). Tal como muestran Rodriguez et al., los autopéptidos retrasaron el aclaramiento de nanopartículas mediado por macrófagos, lo cual mejoró la administración de las nanopartículas.
Las formulaciones de LNP pueden comprender un vehículo de carbohidratos. A modo de ejemplo no limitativo, el vehículo de carbohidratos puede incluir, pero no se limita a, un material similar a glucógeno o fitoglucógeno modificado con anhídrido, octenil succinato de fitoglucógeno, beta-dextrina de fitoglucógeno, beta-dextrina de fitoglucógeno modificada con anhídrido (por ejemplo, la Publicación Internacional NO WO2012109121).
Las formulaciones de LNP pueden revestirse con un tensioactivo o polímero para mejorar la administración de la partícula. En algunas realizaciones, las LNP pueden revestirse con un revestimiento hidrófilo, tal como, pero no limitado a, revestimientos de PEG y/o revestimientos que tengan una carga superficial neutra como se describe en la Publicación de EE.UU. NO US20130183244.
Las formulaciones de LNP se pueden adaptar por ingeniería para alterar las propiedades superficiales de las partículas de manera que las nanopartículas lipídicas puedan penetrar la barrera mucosa como se describe en la patente de EE.UU. NO 8,241,670 o la Publicación Internacional NO WO2013110028.
Las LNP adaptadas por ingeniería para penetrar la mucosa pueden comprender un material polimérico (es decir, un núcleo polimérico) y/o un conjugado de polímero y vitamina y/o un copolímero tribloque. El material polimérico puede incluir, pero no se limita a, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poli(estirenos), poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos.
La LNP adaptada por ingeniería para penetrar la mucosa puede incluir también agentes que modifiquen la superficie tales como, pero no limitados a, polinucleótidos, proteínas aniónicas (por ejemplo, albúmina de suero bovino), tensioactivos (por ejemplo, tensioactivos catiónicos tales como, por ejemplo, bromuro de dimetildioctadecil- amonio), azúcares o derivados de azúcares (por ejemplo, ciclodextrina), ácidos nucleicos, polímeros (por ejemplo, heparina, polietilenglicol y poloxámero), agentes mucolíticos (por ejemplo, N-acetilcisteína, artemisa, bromelaína, papaína, clerodendrum, acetilcisteína, bromhexina, carbocisteína, eprazinona, mesna, ambroxol, sobrerol, domiodol, letosteína, estepronina, tiopronina, gelsolina, timosina p4 dornasa alfa, neltenexina, erdosteína) y diversas ADNasas, incluyendo rhADNasa.
En algunas realizaciones, las LNP que penetran la mucosa pueden ser una formulación hipotónica que comprenda un revestimiento que potencie la penetración de la mucosa. La formulación puede ser hipotónica para el epitelio al cual se aporta. Pueden encontrarse ejemplos no limitativos de formulaciones hipotónicas en, por ejemplo, la Publicación Internacional NO WO2013110028.
En algunas realizaciones, el polinucleótido descrito en la presente memoria se formula como un lipoplejo, tal como, sin limitación, el sistema ATUPLEXTM, el sistema DACC, el sistema DBTC y otra tecnología de ARNiplipoplejo de Silence Therapeutics (Londres, Reino Unido), STEMFECTTM de STe Mg ENT® (Cambridge, MA), y administración de ácidos nucleicos no guiado y guiado basado en polietilenimina (PEI) o protamina (Aleku et al. Cancer Res. 2008 68:9788-9798; Strumberg et al. Int J Clin Pharmacol Ther 20l2 50:76-78; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1360-1370; Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344; Kaufmann et al. Microvasc Res 2010 80:286-293Weide et al. J Immunother. 2009 32:498-507; Weide et al. J Immunother. 2008 31: 180-188; Pascola Expert Opin. Biol. Ther. 4: 1285- 1294; Fotin-Mleczek et al., 2011 J. Immunother. 34: 1-15; Song et al., Nature Biotechnol. 2005, 23 :709-717; Peer et al., Proc Natl Acad Sci U S A 20076;104:4095-4100; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132).
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria se formulan como una nanopartícula lipídica sólida (SLN, por sus siglas en inglés), que puede ser esférica con un diámetro medio entre 10 y 1000 nm. La SLN posee una matriz central lipídica sólida que puede solubilizar moléculas lipófilas y puede estabilizarse con tensioactivos y/o emulsionantes. Ejemplos de SLN pueden ser los descritos en la Publicación Internacional NO WO2013105101.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden formularse para liberación controlada y/o administración guiado. Tal como se usa en la presente memoria, “liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéutica que se ajusta a un patrón concreto de liberación para lograr un resultado terapéutico. En una realización, los polinucleótidos se pueden encapsular en un agente de administración descrito en la presente memoria y/o conocido en la técnica para la liberación controlada y/o la administración guiado. Tal como se usa en la presente memoria, el término "encapsular" significa encerrar, rodear o encajar. La encapsulación puede ser sustancial, completa o parcial. La expresión "sustancialmente encapsulado" significa que al menos más de un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o más de un 99% de la composición farmacéutica o compuesto puede estar encerrado, rodeado o encajado dentro del agente de administración. “Encapsulación parcial” significa que menos de 10, 10, 20, 30, 40, 50, o menos, de la composición farmacéutica o compuesto puede estar encerrado, rodeado o encajado dentro del agente de administración.
Ventajosamente, la encapsulación puede determinarse mediante una medición del escape o la actividad de la composición farmacéutica o compuesto de la invención utilizyo fluorescencia y/o micrografía electrónica. Por ejemplo, al menos un 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9 o más de un 99% de
la composición farmacéutica o compuesto de la invención está encapsulado en el agente de administración.
En algunas realizaciones, la formulación de liberación controlada de polinucleótido puede incluir al menos un revestimiento de liberación controlada (por ejemplo, OPADRY®, EUDRAGIT Rl®, EUDRAGIT RS® y
derivados de celulosa tales como dispersiones acuosas de etilcelulosa (AQUACOAT® y SURELEASE®)). En
algunas realizaciones, la formulación de liberación controlada de polinucleótido puede comprender un sistema
de polímeros como se describe en la Publicación de EE.UU. NO US20130130348, o un PEG y/o derivado de
polímero relacionado con PEG como se describe en la Patente de EE.UU. NO 8,404,222.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden encapsularse en una nanopartícula terapéutica, denominados en la presente memoria "polinucleótidos de nanopartícula terapéutica". Las nanopartículas terapéuticas se pueden formular mediante métodos descritos en, por ejemplo,
las Publicaciones Internacionales NOs WO2010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723 y WO2012054923; y las Publicaciones de EE.UU. NOs US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286, US20120288541, US20120140790, US20130123351 y US20130230567; y las Patentes de EE.UU. NOs 8,206,747, 8,293,276, 8,318,208 y 8,318,211.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de nanopartícula terapéutica puede formularse para una liberación
sostenida. Tal como se usa en la presente memoria, "liberación sostenida" hace referencia a una composición farmacéutica o compuesto que se ajusta a una velocidad de liberación a lo largo de un período específico de
tiempo. El período de tiempo puede incluir, pero no se limita a, horas, días, semanas, meses y años. Como
ejemplo no limitativo, la nanopartícula de liberación sostenida de los polinucleótidos descritos en la presente
memoria se puede formular como se divulga en la Publicación Internacional NO WO2010075072 y las Publicaciones de EE.UU. NOs US20100216804, US20110217377, US20120201859 y US20130150295.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de nanopartícula terapéutica se puede formular para que sea
específico de la diana, tal como los descritos en las Publicaciones Internacionales NOs WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 y WO2011084518; y las Publicaciones de EE.UU. NOs US20100069426, US20120004293 y US20100104655.
Las LNP pueden prepararse usyo mezcladores o micromezcladores microfluídicos. Los mezcladores microfluídicos ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, un micromezclador interdigital de ranura que
incluye, pero no se limita a, los fabricados por Microinnova (Allerheiligen bei Wildon, Austria) y/o un micromezclador en espina de pescado al tresbolillo (SHM, por sus siglas en inglés) (véanse Zhigaltsevet al.,
“Bottom-up design y synthesis of limit size lipid nanoparticle systems con aqueous y triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing,” Langmuir 28:3633-40 (2012); Belliveau et al., “Microfluidic synthesis of highly
potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA,” Molecular Therapy-Nucleic Acids. 1:e37
(2012); Chen et al., “Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation,” J. Am. Chem. Soc. 134(16):6948-51 (2012)). Los micromezcladores ejemplares
incluyen un Mezclador Microestructurado Interdigital de Ranura (SIMM- V2, por sus siglas en inglés), un Micromezclador Interdigital de Ranura Estándar (SSIMM, por sus siglas en inglés) o Caterpillar (CPMM) o
Impinging-jet (IJMM) del Institut for Mikrotechnik Mainz GmbH, Mainz Alemania). En algunas realizaciones, los
métodos para producir LNP que utilizan SHM comprenden además la mezcla de al menos dos corrientes de
entrada, en donde la mezcla se produce mediante advección caótica inducida por microestructura (MICA, por
sus siglas en inglés). De acuerdo con este método, las corrientes de fluido fluyen a través de canales presentes
en un patrón de espina de pescado, lo que provoca un flujo rotacional y pliega los fluidos unos alrededor de
otros. Este método también puede comprender una superficie para mezclar fluidos, en donde la superficie
cambia de orientación durante la ciclación de fluido. Los métodos para generar LNP usyo SHM incluyen los
descritos en las Publicaciones de EE.UU. NOs US20040262223 y US20120276209.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria se pueden formular en nanopartículas lipídicas utilizyo tecnología microfluídica (véase Whitesides, George M., “The Origins y the
Future of Microfluidics,” Nature 442: 368-373 (2006); y Abraham et al., “Chaotic Mixer for Microchannels,”
Science 295: 647-651 (2002)). En algunas realizaciones, los polinucleótidos pueden formularse en nanopartículas lipídicas usyo un chip de micromezclador tal como, pero sin limitarse a, los de Harvard
Apparatus (Holliston, MA) o Dolomite Microfluidics (Royston, Reino Unido). Un chip de micromezclador puede
utilizarse para mezclar rápidamente dos o más corrientes de fluido con un mecanismo de separación y recombinación.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden formularse en nanopartículas lipídicas con un diámetro de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, tal como,
pero sin limitarse a, aproximadamente 1 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamen aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamen aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamen aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 10 nm, aproximadamente 5 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 30 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 40 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 60 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 70 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 10 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 40 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 60 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 60 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 80 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 70 a aproximadamente 100 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 90 nm, aproximadamente 80 a aproximadamente 100 nm y/o aproximadamente 90 a aproximadamente 100 nm.
En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas pueden tener un diámetro de aproximadamente 10 a 500 nm. En una realización, la nanopartícula lipídica puede tener un diámetro superior a 100 nm, superior a 150 nm, superior a 200 nm, superior a 250 nm, superior a 300 nm, superior a 350 nm, superior a 400 nm, superior a 450 nm, superior a 500 nm, superior a 550 nm, superior a 600 nm, superior a 650 nm, superior a 700 nm, superior a 750 nm, superior a 800 nm, superior a 850 nm, superior a 900 nm, superior a 950 nm o superior a 1000 nm.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos se pueden aportar usyo LNP más pequeñas. Tales partículas pueden comprender un diámetro de menos de 0.1 pm hasta 100 nm, tal como, pero sin limitarse a, menos de 0.1 pm, menos de 1.0 pm, menos de 5 pm, menos de 10 pm, menos de 15 um, menos de 20 um, menos de 25 um, menos de 30 um, menos de 35 um, menos de 40 um, menos de 50 um, menos de 55 um, menos de 60 um, menos de 65 um, menos de 70 um, menos de 75 um, menos de 80 um, menos de 85 um, menos de 90 um, menos de 95 um, menos de 100 um, menos de 125 um, menos de 150 um, menos de 175 um, menos de 200 um, menos de 225 um, menos de 250 um, menos de 275 um, menos de 300 um, menos de 325 um, menos de 350 um, menos de 375 um, menos de 400 um, menos de 425 um, menos de 450 um, menos de 475 um, menos de 500 um, menos de 525 um, menos de 550 um, menos de 575 um, menos de 600 um, menos de 625 um, menos de 650 um, menos de 675 um, menos de 700 um, menos de 725 um, menos de 750 um, menos de 775 um, menos de 800 um, menos de 825 um, menos de 850 um, menos de 875 um, menos de 900 um, menos de 925 um, menos de 950 um o menos de 975 um.
Las nanopartículas y micropartículas descritas en la presente memoria pueden adaptarse geométricamente por ingeniería para modular la respuesta inmunitaria y/o de los macrófagos. Las partículas adaptadas geométricamente por ingeniería pueden tener formas, tamaños y/o cargas superficiales variadas para incorporar los polinucleótidos descritos en la presente memoria para un administración guiado tal como, pero sin limitarse a, administración pulmonar (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional NO WO2013082111). Otras características físicas de las partículas adaptadas geométricamente por ingeniería pueden incluir, pero no se limitan a, fenestraciones, brazos en ángulo, asimetría y rugosidad de la superficie, carga que puede alterar las interacciones con células y tejidos.
En algunas realizaciones, las nanopartículas descritas en la presente memoria son nanopartículas no detectables (stealth) o nanopartículas no detectables específicas de la diana, tales como, pero no limitadas a, las descritas en la Publicación de EE.UU. NO US20130172406. Las nanopartículas no detectables o no detectables específicas de la diana pueden comprender una matriz polimérica, que puede comprender dos o más polímeros tales como, pero no limitados a, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, poliésteres, polianhídridos, poliéteres, poliuretanos, polimetacrilatos, poliacrilatos, policianoacrilatos o combinaciones de los mismos.
b. Lipidoides
Las composiciones o formulaciones de la presente divulgación pueden comprender un agente de administración, por ejemplo, un lipidoide. Los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) se pueden formular con lipidoides. Pueden prepararse complejos, micelas, liposomas o partículas que contengan estos lipidoides y por lo tanto para lograr un administración eficaz del polinucleótido, según se juzga por la producción de una proteína codificada, después de la inyección de una formulación de lipidoide a través de vías de administración localizadas y/o sistémicas. Los complejos de lipidoides de polinucleótidos se pueden administrar por diversos medios que incluyen, pero no se limitan a, las vías intravenosa, intramuscular o subcutánea.
La síntesis de lipidoides se describe en la bibliografía (véanse Mahon et al., Bioconjug. Chem. 201021:1448-1454; Schroeder et al., J Intern Med. 2010267:9-21; Akinc et al., Nat Biotechnol. 200826:561-569; Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2010 107:1864-1869; Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2011 108:12996-3001).
Las formulaciones con los diferentes lipidoides, que incluyen, pero no se limitan a, clorhidrato de penta[3-(1-laurilaminopropionil)]-trietilentetramina (TETA-5LAP; también conocido como 98N12-5, véase Murugaiah et al., Analytical Biochemistry, 401 :61 (2010)), C12-200 (incluyendo derivados y variantes), y MD1, se pueden ensayar en cuanto a la actividadin vivo.El lipidoide "98N12-5" lo divulgaron Akinc et al., Mol Ther. 200917:872-879. El lipidoide “Cl2-200” lo divulgaron Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2010 107:1864-1869 y Liu y Huang, Molecular Therapy. 2010669-670.
En una realización, los polinucleótidos descritos en la presente memoria se pueden formular en un lipidoide aminoalcohólico. Los lipidoides aminoalcohólicos se pueden preparar mediante los métodos descritos en la Patente de EE.UU. NO 8,450,298.
Las formulaciones de lipidoides pueden incluir partículas que comprendan, bien 3 o 4, bien más componentes además de polinucleótidos. Se describen lipidoides y formulaciones de polinucleótidos que comprenden lipidoides en la Publicación Internacional NO WO 2015051214.
c. Hialuronidasa
Los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) e hialuronidasa para inyección (por ejemplo, inyección intramuscular o subcutánea). La hialuronidasa cataliza la hidrólisis de hialuronano, que es un constituyente de la barrera intersticial. La hialuronidasa disminuye la viscosidad del hialuronano, aumentyo así la permeabilidad tisular (Frost, Expert Opin. Drug Deliv. (2007) 4:427-440). Como alternativa, la hialuronidasa puede usarse para aumentar el número de células expuestas a los polinucleótidos administrados por vía intramuscular o subcutánea.
d. Imitadores de Nanopartículas
Los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) pueden encapsularse dentro de y/o absorberse en un imitador de nanopartículas. Un imitador de nanopartículas puede imitar organismos o partículas con función de administración tales como, pero sin limitarse a, patógenos, virus, bacterias, hongos, parásitos, priones y células. Como un ejemplo no limitativo, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden encapsularse en una partícula no viral que pueda imitar la función de administración de un virus (véanse, por ejemplo, la Publicación Internacional NO WO2012006376 y las Publicaciones de EE.UU. NOs US20130171241 y US20130195968).
e. Nanotubos
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) unidos o enlazados de otro modo a (por ejemplo, a través de fuerzas estéricas, iónicas, covalentes y/u otras fuerzas) al menos un nanotubo, tal como, pero sin limitarse a, nanotubos de roseta, nanotubos de roseta que tienen bases gemelas con un enlazador, nanotubos de carbono y/o nanotubos de carbono de pared única. Se describen nanotubos y formulaciones de nanotubos que comprenden un polinucleótido en, por ejemplo, la Publicación Internacional NO WO2014152211.
f. Nanopartículas Autoensambladas o Macromoléculas Autoensambladas
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) en nanopartículas autoensambladas, o macromoléculas anfifílicas (AM, por sus siglas en inglés) para la administración. Las AM comprenden polímeros anfifílicos biocompatibles que tienen una cadena principal de azúcar alquilada enlazada de manera covalente a poli(etilenglicol). En solución acuosa, las<a>M se autoensamblan para formar micelas. Se describen nanopartículas autoensambladas de ácido nucleico en la Solicitud Internacional NO PCT/US2014/027077, y se describen AM y métodos para formar AM en la Publicación de EE.UU. NO US20130217753.
g. Nanopartículas Inorgánicas, Nanopartículas Semiconductoras y Metálicas
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) en nanopartículas inorgánicas, o nanopartículas dispersables en agua que comprenden un material semiconductor o metálico. Las nanopartículas inorgánicas pueden incluir, pero no se limitan a, sustancias de arcilla que son hinchables en agua. Las nanopartículas dispersables en agua pueden ser nanopartículas hidrófobas o hidrófilas. Como un ejemplo no limitativo, las nanopartículas inorgánicas, semiconductoras y metálicas se describen en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. NOs 5,585,108 y 8,257,745; y las Publicaciones de EE.UU. NOs US20120228565, US 20120265001 y US 20120283503.
h. Selladores Quirúrgicos: Geles e Hidrogeles
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de Ga l T) en un sellador quirúrgico. Se describen selladores quirúrgicos tales como geles e hidrogeles en la Solicitud Internacional NO PCT/US2014/027077.
i. Formulaciones en Suspensión
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) en suspensiones. En algunas realizaciones, las suspensiones comprenden un polinucleótido, depósitos de aceite inmiscibles en agua, tensioactivos y/o cotensioactivos y/o codisolventes. Las suspensiones se pueden formar preparyo primero una solución acuosa de un polinucleótido y una fase a base de aceite que comprenda uno o más tensioactivos y luego mezclyo las dos fases (acuosa y a base de aceite).
Los aceites ejemplares para formulaciones en suspensión pueden incluir, pero no se limitan a, aceite de sésamo y Miglyol (que comprende ésteres de ácidos grasos caprílicos y cápricos obtenidos de aceite de coco y de palmiste saturados, y glicerina o propilenglicol), aceite de maíz, aceite de soja, aceite de cacahuete, cera de abejas y/o aceite de semilla de palma. Los tensioactivos ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, Cremophor, polisorbato 20, polisorbato 80, polietilenglicol, transcutol, Capmul®, labrasol, miristato de isopropilo y/o Span 80. En algunas realizaciones, las suspensiones pueden comprender codisolventes que incluyen, pero no se limitan a, etanol, glicerol y/o propilenglicol.
En algunas realizaciones, las suspensiones pueden proporcionar la modulación de la liberación de los polinucleótidos en el entorno circundante por difusión desde un depósito inmiscible con agua seguida de una resolubilización en un entorno circundante (por ejemplo, un entorno acuoso).
En algunas realizaciones, los polinucleótidos se pueden formular de manera que, tras la inyección, se forme espontáneamente una emulsión (por ejemplo, cuyo se aporta a una fase acuosa), que puede proporcionar una relación de área superficial a volumen alta para la liberación de polinucleótidos de una fase oleosa a una fase acuosa. En algunas realizaciones, el polinucleótido se formula en una nanoemulsión, que puede comprender un núcleo hidrófobo líquido rodeado por o revestido con una capa de lípido o tensioactivo. Se describen nanoemulsiones ejemplares y sus preparaciones en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. NO 8,496,945.
j. Cationes y Aniones
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) y un catión o anión, tal como Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg2+ y combinaciones de los mismos. Las formulaciones ejemplares pueden incluir polímeros y un polinucleótido complejado con un catión metálico como se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.Uu . NOs 6,265,389 y 6,555,525. En algunas realizaciones, las nanopartículas catiónicas pueden contener una combinación de cationes divalentes y monovalentes. La administración de polinucleótidos en nanopartículas catiónicas o en uno o más depósitos que comprendan nanopartículas catiónicas puede mejorar la biodisponibilidad de polinucleótidos al actuar como depósitos de acción prolongada y/o reducir la velocidad de degradación por nucleasas.
k. Nanopartículas y Micropartículas moldeadas
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GAL<t>) en nanopartículas moldeadas en varios tamaños, formas y química. Por ejemplo, las nanopartículas y/o micropartículas pueden producirse utilizyo la tecnología PRINT® de LIQUIDA TECHNOLOGIES® (Morrisville, NC) (por ejemplo, Publicación International NO WO2007024323).
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) se formulan en micropartículas. Las micropartículas pueden contener un núcleo del polinucleótido y una corteza de un polímero biocompatible y/o biodegradable, incluyendo, pero sin limitarse a, poli (a-hidroxi ácido), un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, un poliortoéster y un polianhídrido. La micropartícula puede tener superficies adsorbentes para adsorber polinucleótidos. Las micropartículas pueden tener un diámetro de al menos 1 micra a al menos 100 micras (por ejemplo, al menos I micra, al menos 10 micras, al menos 20 micras, al menos 30 micras, al menos 50 micras, al menos 75 micras, al menos 95 micras y al menos 100 micras). En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación son microemulsiones que comprenden micropartículas y polinucleótidos. Ejemplos de micropartículas, microemulsiones y sus preparaciones se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU.<n>O<s>8,460,709, 8,309,139 y 8,206,749; las Publicaciones de EE.UU. NOs US20130129830, US2013195923 y US20130195898; y la Publicación Internacional NO WO2013075068.
l. NanoCamisas y NanoLiposomas
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) en nanocamisas(NanoJackets)y nanoliposomas de Keystone Nano (State College, PA). Las nanocamisas están hechas de materiales que se encuentran de forma natural en el cuerpo, incluyendo calcio, fosfato, y también pueden incluir una pequeña cantidad de silicatos. Las nanocamisas pueden tener un tamaño que varía de 5 a 50 nm.
Los nanoliposomas están hechos de lípidos tales como, pero no limitados a, lípidos que existen de forma natural en el cuerpo. Los nanoliposomas pueden tener un tamaño que varía de 60-80 nm. En algunas realizaciones, los polinucleótidos divulgados en la presente memoria se formulan en un nanoliposoma tal como, pero sin limitarse a, nanoliposomas de ceramida.
m. Células o Minicélulas
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) que se transfectanex vivoa células, que se trasplantan posteriormente a un individuo. Las formulaciones basadas en células del polinucleótido divulgado en la presente memoria se pueden usar para asegurar la transfección celular (por ejemplo, en el soporte celular), alterar la biodistribución del polinucleótido (por ejemplo, guiyo el soporte celular a tipos de tejidos o células específicos), y/o aumentar la traducción de proteína codificada.
Las células ejemplares incluyen, pero no se limitan a, glóbulos rojos, virosomas y células electroporadas (véanse, por ejemplo, Godfrin et al., Expert Opin Biol Ther. 201212:127-133; Fang et al., Expert Opin Biol Ther.
2012 12:385-389; Hu et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2011 108:10980-10985; Lund et al., Pharm Res. 2010 27:400-420; Huckriede et al., J Liposome Res. 2007; 17:39-47; Cusi, Hum Vaccin. 20062:1-7; de Jonge et al., Gene Ther. 2006 13:400-411).
En la técnica se conocen diversos métodos que son adecuados para la introducción de ácido nucleico en una célula, incluyendo técnicas mediadas de forma viral y no viral. Los ejemplos de técnicas mediadas de forma no viral típicas incluyen, pero no se limitan a, electroporación, transferencia mediada por fosfato de calcio, nucleofección, sonoporación, choque térmico, magnetofección, transferencia mediada por liposomas, microinyección, transferencia mediada por microproyectiles (nanopartículas), transferencia mediada por polímeros catiónicos (DEAE-dextrano, polietilenimina, polietilenglicol (PEG) y similares) o fusión celular.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden aportarse en partículas similares a virus (VLP, por sus siglas en inglés) sintéticas, sintetizadas por métodos como los descritos en las Publicaciones Internacionales NOs WO2011085231 y WO2013116656; y la Publicación de EE.UU. NO 20110171248.
La técnica de sonoporación, o sonicación celular, es el uso de sonido (por ejemplo, frecuencias ultrasónicas) para modificar la permeabilidad de la membrana plasmática celular. Se sabe que los métodos de sonoporación aportan ácidos nucleicosin vivo(Yoon y Park, Expert Opin Drug Deliv. 20107:321-330; Postema y Gilja, Curr Pharm Biotechnol. 2007 8:355-361; Newman y Bettinger, Gene Ther. 2007 14:465-475; Publicaciones de EE.UU. NOs US20100196983 y US20100009424).
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden aportarse por electroporación. Se sabe que las técnicas de electroporación aportan ácidos nucleicosin vivoy clínicamente (Yre et al., Curr Gene Ther. 2010 10:267-280; Chiarella et al., Curr Gene Ther. 2010 10:281-286; Hojman, Curr Gene Ther. 2010 10:128-138). Los dispositivos de electroporación los venden muchas empresas en todo el mundo, incluyendo, pero sin limitarse a, BTX® Instruments (Holliston, MA) (por ejemplo, el AgilePulse In Vivo System) e Inovio (Blue Bell, PA) (por ejemplo, el dispositivo de administración intramuscular Inovio SP-5P o el dispositivo de administración intradérmico CELLECTRA® 3000).
En algunas realizaciones, las células se seleccionan del grupo que consiste en células de mamífero, células bacterianas, células vegetales, microbianas, de algas y fúngicas. En algunas realizaciones, las células son células de mamífero, tales como, pero sin limitarse a, células humanas, de ratón, de rata, de cabra, de caballo, de conejo, de hámster o de vaca. En una realización adicional, las células pueden ser de una línea celular establecida, que incluye, pero no se limita a, HeLa, NS0, SP2/0, KEK 293T, Vero, Caco, Caco-2, MDCK, COS-1, COS-7, K562, Jurkat, CHO-K1, DG44, CHOK1SV, CHO-S, Huvec, CV-1, Huh-7, NIH3T3, HEK293, 293, A549, HepG2, IMR-90, MCF-7, U-20S, Per.C6, SF9, SF21 o células de Ovario de Hámster Chino (CHO, por sus siglas en inglés).
En ciertas realizaciones, las células son células fúngicas, tales como, pero sin limitarse a, células de Chrysosporium, células de Aspergillus, células de Trichoderma, células de Dictyostelium, células de Cyida, células de Saccharomyces, células de Schizosaccharomyces y células de Penicillium.
En ciertas realizaciones, las células son células bacterianas tales como, pero sin limitarse a, células de E. coli, B. subtilis o BL21. Las células primarias y secundarias que se han de transfectar se pueden obtener de diversos tejidos e incluyen, pero no se limitan a, todos los tipos de células que se puedan mantener en cultivo. Las células primarias y secundarias incluyen, pero no se limitan a, fibroblastos, queratinocitos, células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales mamarias, células epiteliales intestinales), células endoteliales, células gliales, células neurales, elementos formados de la sangre (por ejemplo, linfocitos, células de médula ósea), células musculares y precursores de estos tipos de células somáticas. Las células primarias también se pueden obtener de un donante de la misma especie o de otra especie (por ejemplo, ratón, rata, conejo, gato, perro, cerdo, vaca, ave, oveja, cabra, caballo).
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria en minicélulas bacterianas. Como ejemplo no limitativo, las minicélulas bacterianas pueden ser las descritas en la Publicación Internacional NO WO2013088250 o la Publicación de EE.UU. NO US20130177499.
n. Composiciones Semisólidas
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) en una matriz hidrófoba para formar una composición semisólida o similar a una pasta. Como ejemplo no limitativo, la composición semisólida o similar a una pasta puede producirse mediante los métodos descritos en la Publicación Internacional NO WO201307604.
o. Exosomas
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) en exosomas, que se pueden cargar con al menos un polinucleótido y aportarse a células, tejidos y/u organismos. Como ejemplo no limitativo, los polinucleótidos pueden cargarse en exosomas como los descritos en la Publicación Internacional NO WO2013084000.
p. Administración Basado en Seda
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) formulados para la administración basado en seda. El sistema de administración basado en seda puede formarse poniendo en contacto una solución de fibroína de seda con un polinucleótido descrito en la presente memoria. Como un ejemplo no limitativo, un sistema de administración basado en seda de liberación sostenida y métodos para producir tal sistema se describen en la Publicación de EE.UU. nro US20130177611.
q. Lípidos de Aminoácidos
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) que son una formulación con un lípido de aminoácidos. Los lípidos de aminoácidos son compuestos lipófilos que comprenden un residuo de aminoácido y una o más colas lipófilas. En la Patente de EE.UU. NO 8,501,824 se describen ejemplos no limitativos de lípidos de aminoácidos y métodos para producir lípidos de aminoácidos. Las formulaciones de lípidos de aminoácidos pueden aportar un polinucleótido en una forma liberable que comprende un lípido de aminoácidos que se une a y libera los polinucleótidos. Como un ejemplo no limitativo, la liberación de los polinucleótidos descritos en la presente memoria puede proporcionarse mediante un enlazador lábil al ácido como los descritos en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. NOs 7,098,032, 6,897,196, 6,426,086, 7,138,382, 5,563,250 y 5,505,931.
r. Microvesículas
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) en una formulación de microvesículas. Las microvesículas ejemplares incluyen las descritas en la Publicación de EE.UU. NO US20130209544. En algunas realizaciones, la microvesícula es una microvesícula mediada por ARRDC1 (ARMM) como se describe en la Publicación Internacional NO WO2013119602.
s. Complejos Interpolielectrolíticos
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) en un complejo interpolielectrolítico. Los complejos interpolielectrolíticos se forman cuyo se complejan polímeros de carga dinámica con una o más moléculas aniónicas. En la patente de EE.UU. NO 8,524,368 se describen ejemplos no limitativos de polímeros de carga dinámica y complejos interpolielectrolíticos y métodos para producir complejos interpolielectrolíticos.
t. Sistemas Poliméricos Cristalinos
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) en sistemas poliméricos cristalinos. Los sistemas poliméricos cristalinos son polímeros con restos cristalinos y/o unidades terminales que comprenden restos cristalinos. En la patente de EE.UU. NO 8,524,259 se describen polímeros ejemplares.
u. Polímeros, Nanopartículas Biodegradables y Nanopartículas de Núcleo-Cubierta
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) y un polímero natural y/o sintético. Los polímeros incluyen, pero no se limitan a, polietenos, polietilenglicol (PEG), poli(l-lisina) (PLL), PEG injertado en PLL, lipopolímero catiónico, lipopolímero catiónico biodegradable, polietilenimina (PEI), poli(alquileniminas) ramificadas reticuladas, un derivado de poliamina, un poloxámero modificado, polímero biodegradable elástico, copolímero biodegradable, copolímero de poliéster biodegradable, copolímero de poliéster biodegradable, copolímeros multibloque, ácido poli[a-(4-aminobutil]-L-glicólico) (PAGA, por sus siglas en inglés), copolímeros multibloque catiónicos reticulados biodegradables, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli(etilen imina), poli(éster de serina), poli(L-lactida-co-L-lisina), poli (éster de 4-hidroxi-L-prolina), polímeros que contienen amina, polímeros de dextrano, derivados de polímero de dextrano o combinaciones de los mismos.
Los polímeros ejemplares incluyen formulaciones de DYNAMIC POLYCONJUGATE® (Arrohead Research Corp., Pasadena, CA) de MIr Us® Bio (Madison, WI) y Roche Madison (Madison, WI), formulaciones de polímero PHASERXTM tales como, sin limitación, SMARTT POLYMER TECHNOLOGY™ (PHASERX®, Seattle, WA), DMRI/DOPE, poloxámero, coadyuvante VAXFECTIN® de Vical (San Diego, CA), quitosán, ciclodextrina de Calyo Pharmaceuticals (Pasadena, CA), dendrímeros y polímeros de poli(ácido láctico-coglicólico) (PLGA, por sus siglas en inglés). Polímeros RONDELTM (Administración de Nanopartículas de Oligonucleótido/ARNi) (Arrohead Research Corporation, Pasadena, CA) y polímeros cobloque sensibles al pH tales como PHASERX® (Seattle, WA).
Las formulaciones de polímero permiten una liberación sostenida o retardada del polinucleótido (por ejemplo, después de la inyección intramuscular o subcutánea). El perfil de liberación alterado para el polinucleótido puede dar como resultado, por ejemplo, la traducción durante un periodo de tiempo prolongado de una proteína codificada. La formulación de polímero también se puede usar para aumentar la estabilidad del polinucleótido. Las formulaciones de liberación sostenida pueden incluir, pero no se limitan a, microesferas de PLGA, acetato de vinil etileno (EVAc, por sus siglas en inglés), poloxámero, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA), selladores quirúrgicos tales como polímeros de fibrinógeno (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL), selladores basados en PEG, y COSEAL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL).
Como un ejemplo no limitativo, se puede formular ARNm modificado en microesferas de PLGA preparyo las microesferas de PLGA con velocidades de liberación ajustables (por ejemplo, días y semanas) y encapsulyo el ARNm modificado en las microesferas de PLGA mientras se mantiene la integridad del ARNm modificado durante el proceso de encapsulación. Los EVAc son polímeros biocompatibles, no biodegradables, que se usan ampliamente en aplicaciones de implantes de liberación sostenida preclínicas (por ejemplo, productos de liberación prolongada Ocusert, un inserto oftálmico de pilocarpina para glaucoma, o progestasert, un dispositivo intrauterino de progesterona de liberación sostenida; sistemas de administración transdérmico Testoderm, Duragesic y Selegiline; catéteres). El poloxámero F-407 NF es un copolímero tribloque tensioactivo no iónico, hidrófilo, de polioxietileno-polioxipropileno-polioxietileno que tiene una baja viscosidad a temperaturas inferiores a 5 °C y forma un gel sólido a temperaturas superiores a 15 °C.
Como un ejemplo no limitativo, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden formularse con el compuesto polimérico de PEG injertado con PLL como se describe en la Patente de EE.UU. NO 6, 177,274. Como otro ejemplo no limitativo, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden formularse con un copolímero bloque tal como un copolímero bloque de PLGA-PEG (véanse, por ejemplo, la publicación de EE.UU. NO US20120004293 y las Patentes de EE.UU. NOs 8,236,330 y 8,246,968), o un copolímero bloque de PLGA-PEG-PLGA (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. NO 6,004,573).
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden formularse con al menos un polímero que contenga amina tal como, pero sin limitarse a, polilisina, polietilenimina, dendrímeros de poli(amidoamina), poli(amina-co-ésteres) o combinaciones de los mismos. En las Patentes de EE.UU. NOs 8,460,696, 8,236,280, por ejemplo, se describen polímeros de poliamina ejemplares y su uso como agentes de administración.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden formularse en un lipopolímero catiónico biodegradable, un polímero biodegradable, o un copolímero biodegradable, un copolímero de poliéster biodegradable, un polímero de poliéster biodegradable, un copolímero biodegradable lineal, PAGA, un copolímero multibloque catiónico reticulado biodegradable o combinaciones de los mismos como se describe en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. NOs 6,696,038, 6,517,869, 6,267,987, 6,217,912, 6,652,886, 8,057,821 y 8,444,992; las Publicaciones de EE.UU. NOs US20030073619, US20040142474, US20100004315, US2012009145 y US20130195920; y las Publicaciones Internacionales NOs WO2006063249 y WO2013086322.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden formularse en o con al menos un polímero de ciclodextrina como se describe en la Publicación de EE.UU. NO US20130184453. En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden formularse en o con al menos un polímero de unión catiónica reticulado como se describe en las Publicaciones Internacionales NOs WO2013106072, WO2013106073 y WO2013106086. En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden formularse en o con al menos un polímero de albúmina PEGilado como se describe en la Publicación de EE.UU. NO US20130231287.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos divulgados en la presente memoria pueden formularse como una nanopartícula utilizyo una combinación de polímeros, lípidos y/u otros agentes biodegradables, tales como, pero sin limitarse a, fosfato de calcio. Los componentes pueden combinarse en una arquitectura de núcleocubierta, híbrida y/o capa por capa, para permitir el ajuste fino de la nanopartícula para la administración (Wang et al., Nat Mater. 20065:791-796; Fuller et al., Biomaterials. 200829:1526-1532; DeKoker et al., Adv Drug Deliv Rev. 2011 63:748-761; Endres et al., Biomaterials. 2011 32:7721-7731; Su et al., Mol Pharm. 2011 Jun 6;8(3):774-87). Como un ejemplo no limitativo, la nanopartícula puede comprender una pluralidad de polímeros tales como, pero sin limitarse a, polímeros hidrófilos-hidrófobos (por ejemplo, PEG-PLGA), polímeros hidrófobos (por ejemplo, PEG) y/o polímeros hidrófilos (Publicación Internacional NO WO20120225129).
El uso de nanopartículas de núcleo-cubierta se ha centrado adicionalmente en un enfoque de alto rendimiento para sintetizar núcleos de nanogel reticulados catiónicos y diversas cubiertas (Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2011 108:12996-13001). La complejación, la administración y la intemalización de las nanopartículas poliméricas pueden controlarse con precisión alteryo la composición química en los componentes tanto de núcleo como de cubierta de la nanopartícula. Por ejemplo, las nanopartículas de núcleo-cubierta pueden aportar eficientemente ARNip a hepatocitos de ratón después de que unan de manera covalente colesterol a la nanopartícula.
En algunas realizaciones, se puede usar un núcleo lipídico hueco que comprenda una capa de PLGA media y una capa lipídica neutra externa que contenga PEG para aportar los polinucleótidos como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas pueden comprender un núcleo de los polinucleótidos divulgados en la presente memoria y una cubierta de polímero, que se utiliza para proteger los polinucleótidos en el núcleo. La cubierta de polímero puede ser cualquiera de los polímeros descritos en la presente memoria y conocidos en la técnica. La cubierta de polímero puede usarse para proteger los polinucleótidos en el núcleo.
Nanopartículas de núcleo-cubierta para su uso con los polinucleótidos descritos en la presente memoria se describen en la Patente de EE.UU. NO 8,313,777 o la Publicación Internacional NO WO2013124867.
v. Péptidos y Proteínas
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALt ), formulados con péptidos y/o proteínas para aumentar la transfección de células por el polinucleótido, y/o para alterar la biodistribución del polinucleótido (por ejemplo, guiándolo a tipos de tejidos o células específicos), y/o aumentar la traducción de la proteína codificada (por ejemplo, Publicaciones Internacionales NOs WO2012110636 y WO2013123298. En algunas realizaciones, los péptidos pueden ser los descritos en las patentes de EE.Uu . NOs US20130129726, US20130137644 y US20130164219.
w. Conjugados
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT), enlazados de manera covalente a un soporte o grupo de guiado, o que incluyen dos regiones codificantes que juntas producen una proteína de fusión (por ejemplo, que lleva un grupo de guiado y una proteína o péptido terapéuticos) como un conjugado. El conjugado puede ser un péptido que dirija selectivamente la nanopartícula a neuronas en un tejido u organismo o ayude a cruzar la barrera hematoencefálica.
Los conjugados incluyen una sustancia de origen natural, tal como una proteína (por ejemplo, seralbúmina humana (HSA, por sus siglas en inglés), lipoproteína de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés), lipoproteína de alta densidad (HDL, por sus siglas en inglés) o globulina); un carbohidrato (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosán, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); o un lípido. El ligyo también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético, un oligonucleótido (por ejemplo, un aptámero). Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen poliaminoácido que es una polilisina (PLL), ácido poli L-aspártico, ácido poli L-glutámico, copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactida-co-glicolida), copolímero de éter divinílicoanhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA, por sus siglas en inglés), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida, o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrímera, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido alfa helicoidal.
En algunas realizaciones, el conjugado puede hacer las veces de un soporte para el polinucleótido divulgado en la presente memoria. El conjugado puede comprender un polímero catiónico tal como, pero no limitado a, poliamina, polilisina, polialquilenimina y polietilenimina, que se puede injertar con poli (etilenglicol). Se describen conjugados ejemplares y sus preparaciones en la Patente de EE.UU. NO 6,586,524 y la Publicación de EE.UU. NO US20130211249.
Los conjugados también pueden incluir grupos de guiado, por ejemplo, un agente de guiado a una célula o tejido, por ejemplo, una lectina, glucoproteína, lípido o proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que se una a un tipo de célula especificado tal como una célula de riñón. Un grupo de guiado puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glucoproteína, proteína tensioactiva A, carbohidrato de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, manosa multivalente de N-acetil-glucosamina, fucosa multivalente, poliaminoácidos glucosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina, un péptido RGD, un imitador de péptido RGD o un aptámero.
Los grupos de guiado pueden ser proteínas, por ejemplo, glucoproteínas, o péptidos, por ejemplo, moléculas que tengan una afinidad específica por un coligyo, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo que se una a un tipo de célula especificado tal como una célula endotelial o célula ósea. Los grupos de guiado también pueden incluir hormonas y receptores hormonales. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetilgalactosamina, manosa multivalente de N-acetil-glucosamina, fructosa multivalente o aptámeros. El ligyo puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, o un activador de la p38 MAP cinasa.
El grupo de guiado puede ser cualquier ligyo que sea capaz de guiar a un receptor específico. Los ejemplos incluyen, sin limitación, folato, GalNAc, galactosa, manosa, manosa-6P, apatámeros, ligyos receptores de integrina, ligyos receptores de quimiocina, transferrina, biotina, ligyos receptores de serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, LDL y ligyos HDL. En realizaciones concretas, el grupo de guiado es un aptámero. El aptámero puede estar sin modificar o tener cualquier combinación de modificaciones divulgadas en la presente memoria. Como un ejemplo no limitativo, el grupo de guiado puede ser un conjugado de unión al receptor de glutatión (GR, por sus siglas en inglés) para la administración guiado a través de la barrera sangre-sistema nervioso central como se describe en, por ejemplo, la Publicación de EE.UU. NO US2013021661012.
En algunas realizaciones, el conjugado puede ser un conjugado de biomolécula-polímero sinérgico, que comprenda un sistema de liberación continua de acción prolongada para proporcionar una mayor eficacia terapéutica. El conjugado de biomolécula-polímero sinérgico puede ser los descritos en la Publicación de EE.UU. NO US20130195799. En algunas realizaciones, el conjugado puede ser un conjugado de aptámero como se describe en la Publicación de Patente Internacional NO WO2012040524. En algunas realizaciones, el conjugado puede ser un conjugado de polímero que contenga amina como se describe en la Patente de EE.UU. NO 8,507,653. En algunas realizaciones, los polinucleótidos se pueden conjugar con SMARTT POLYMER TECHNOLOGY® (PHASERX®, Inc. Seattle, WA).
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria se conjugan de manera covalente con un polipéptido que penetre en las células, que también puede incluir una secuencia señal o una secuencia de guiado. Los conjugados pueden diseñarse para que tengan estabilidad aumentada, y/o transfección celular aumentada; y/o biodistribución alterada (por ejemplo, guiados a tipos de tejidos o células específicos).
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden conjugarse con un agente para mejorar la administración. En algunas realizaciones, el agente puede ser un monómero o polímero tal como un monómero de guiado o un polímero que tenga bloques de guiado como se describe en la Publicación Internacional NO WO2011062965. En algunas realizaciones, el agente puede ser un agente de transporte acoplado de manera covalente a un polinucleótido como se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. NOs 6,835.393 y 7,374,778. En algunas realizaciones, el agente puede ser un agente potenciador del transporte de barrera de membrana tal como los descritos en las Patentes de EE.UU. NOs 7,737,108 y 8,003,129.
x. Microórganos
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) en un microórgano que puede entonces expresar un polipéptido codificado de interés en una formulación terapéutica de larga duración. Microórganos y formulaciones ejemplares se describen en la Publicación Internacional NO WO2014152211.
y. Pseudoviriones
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones de la presente divulgación comprenden los polinucleótidos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT) en pseudoviriones (por ejemplo, pseudoviriones desarrollados por Aura Biosciences, Cambridge, MA).
En algunas realizaciones, el pseudovirión usado para aportar los polinucleótidos puede obtenerse de virus tales como, pero sin limitarse a, herpes y papilomavirus como se describe en, por ejemplo, las Publicaciones de EE.UU. NOs US20130012450, US20130012566, US21030012426 y US20120207840; y la Publicación Internacional NO WO2013009717.
El pseudovirión puede ser una partícula similar a un virus (VLP) preparada por los métodos descritos en las Publicaciones de EE.UU. NOs US20120015899 y US20130177587, y las Publicaciones Internacionales NOs WO2010047839, WO2013116656, WO2013106525 y WO2013122262. En un aspecto, la VLP puede ser bacteriófagos MS, Qp, R17, fr, GA, Sp, MI, I, MXI, NL95, AP205, f2, PP7, y los virus de plantas Virus de la arruga del nabo (TCV, por sus siglas en inglés), Virus de enanismo ramificado del tomate (TBSV, por sus siglas en inglés), Virus del mosaico sureño de la judía (SBMV, por sus siglas en inglés) y miembros del género Bromovirus que incluyen Virus del moteado del haba, Virus del mosaico del bromo, Virus del moteado amarillo de la cassia, Virus del moteado clorótico del caupí (CCMV, por sus siglas en inglés), Virus de las motas amarillas del melyrium y Virus latente de la belleza de primavera. En otro aspecto, la VLP puede obtenerse del virus de la gripe como se describe en la Publicación de EE.UU. NO US20130177587 y la Patente de EE.UU. NO 8,506,967. En un aspecto, la VLP puede comprender una molécula B7-l y/o B7-2 anclada a una membrana lipídica o al exterior de la partícula tal como se describe en la Publicación Internacional NO WO2013116656. En un aspecto, la VLP puede obtenerse de norovirus, proteína VP6 recombinante de rotavirus o VP2/VP6 de doble capa tal como la VLP descrita en la Publicación Internacional NO WO2012049366.
En algunas realizaciones, el pseudovirión puede ser una partícula similar al virus del papiloma humano como se describe en la Publicación Internacional NO WO2010120266 y la Publicación de EE.UU. NO US20120171290. En algunas realizaciones, la partícula similar a virus (VLP) puede ser una partícula autoensamblada. En un aspecto, los pseudoviriones pueden ser nanopartículas obtenidas de viriones como se describe en las Publicaciones de EE.UU. NOs US20130116408 y US20130115247; y la Publicación Internacional NO WO2013119877.
Ejemplos no limitativos de formulaciones y métodos para formular los polinucleótidos descritos en la presente memoria también se proporcionan en la Publicación Internacional NO WO2013090648.
24. Aclaramiento Sanguíneo Acelerado
La divulgación proporciona compuestos, composiciones y métodos de uso de los mismos para reducir el efecto del ABC sobre un agente activo administrado repetidamente tal como un agente biológicamente activo. Como será fácilmente evidente, reducir o eliminar completamente el efecto del ABC sobre un agente activo administrado aumenta efectivamente su semivida y por lo tanto su eficacia.
En algunas realizaciones, la expresión reducir el ABC se refiere a cualquier reducción en el ABC en comparación con una LNP que induzca ABC de control de referencia positivo tal como una LNP de MC3. Las LNP que inducen ABC provocan una reducción en los niveles circulantes de un agente activo tras una segunda o posterior administración dentro de un plazo de tiempo dado. Por lo tanto, una reducción en el ABC se refiere a un menor aclaramiento del agente circulante tras una segunda o posterior dosis de agente, en relación con una LNP estándar. La reducción puede ser, por ejemplo, al menos un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 100%. En algunas realizaciones, la reducción es de un 10-100%, 10-50%, 20-100%, 20-50%, 30-100%, 30-50%, 40%-100%, 40-80%, 50-90% o 50-100%. Como alternativa, la reducción en el ABC puede caracterizarse como al menos un nivel detectable de agente circulante después de una segunda o posterior administración o al menos un aumento de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces el agente circulante en relación con el agente circulante después de la administración de una LNP estándar. En algunas realizaciones la reducción es de 2-100 veces, 2-50 veces, 3-100 veces, 3 50 veces, 3-20 veces, 4-100 veces, 4-50 veces, 4-40 veces, 4-30 veces, 4-25 veces, 4-20 veces, 4-15 veces, 4- 10 veces, 4-5 veces, 5 -100 veces, 5-50 veces, 5-40 veces, 5-30 veces, 5-25 veces, 5-20 veces, 5-15 veces 5- 10 veces, 6-100 veces, 6-50 veces, 6-40 veces, 6-30 veces, 6-25 veces, 6-20 veces, 6-15 veces, 6-10 veces, 8-100 veces, 8-50 veces, 8-40 veces, 8-30 veces, 8-25 veces, 8-20 veces, 8-15 veces, 8-10 veces, 10-100 veces, 10-50 veces, 10-40 veces, 10-30 veces, 10-25 veces, 10-20 veces, 10-15 veces, 20-100 veces, 20-50 veces, 20-40 veces, 20-30 veces o 20-25 veces.
La divulgación proporciona compuestos que comprenden lípidos y composiciones que son menos propensos al aclaramiento y por lo tanto tienen una semivida más largain vivo.Éste es particularmente el caso en el que las composiciones están destinadas a la administración repetida, incluida la administración crónica, e incluso más particularmente en el que tal administración repetida se produce en un plazo de días o semanas.
Significativamente, estas composiciones son menos propensas a o eluden por completo el fenómeno observado del aclaramiento sanguíneo acelerado (ABC). El ABC es un fenómeno en el que ciertos agentes administrados exógenamente se eliminan rápidamente de la sangre tras la segunda y posteriores administraciones. Este fenómeno se ha observado, en parte, para diversas composiciones que contienen lípidos incluyendo, pero sin limitarse a, agentes lipidados, liposomas u otros vehículos de administración basados en lípidos, y agentes encapsulados en lípidos. Hasta ahora, la base del ABC se ha entendido poco y en algunos casos se ha atribuido a una respuesta inmunitaria humoral y, en consecuencia, las estrategias para limitar su impactoin vivo,particularmente en un entorno clínico, han permanecido difíciles de conseguir.
Esta divulgación proporciona compuestos y composiciones que son menos propensos, si es que son propensos, al ABC. En algunos aspectos importantes, tales compuestos y composiciones son compuestos o composiciones que comprenden lípidos. Los compuestos o composiciones que contienen lípidos de esta divulgación, sorprendentemente, no experimentan ABC tras la segunda y posteriores administracionesin vivo.Esta resistencia al ABC hace que estos compuestos y composiciones sean particularmente adecuados para uso repetidoin vivo,incluyendo para uso repetido dentro de periodos cortos de tiempo, incluyendo días o 1-2 semanas. Esta estabilidad y/o semivida mejorada se debe, en parte, a la incapacidad de estas composiciones para activar células B1a y/o B1b y/o células B convencionales, pDC y/o plaquetas.
Por lo tanto, esta divulgación proporciona una elucidación del mecanismo subyacente del aclaramiento sanguíneo acelerado (ABC). Se ha hallado, de acuerdo con esta divulgación y las invenciones proporcionadas en la presente memoria, que el fenómeno del ABC, al menos en lo que se refiere a lípidos y nanopartículas lipídicas, está mediado, al menos en parte, por una respuesta inmunitaria innata que involucra células B1a y/o B1b, pDC y/o plaquetas. Las células B1a son normalmente responsables de la secreción de anticuerpos naturales, en forma de IgM circulante. Esta IgM es polirreactiva, lo que significa que es capaz de unirse a diversos antígenos, aunque con una afinidad relativamente baja para cada uno.
Se ha hallado de acuerdo con la invención que algunos agentes lipidados o formulaciones que comprenden lípidos tales como nanopartículas lipídicas administradasin vivodesencadenan y están sujetas al ABC. Ahora se ha encontrado de acuerdo con la invención que tras la administración de una primera dosis de la LNP, una o más células involucradas en la generación de una respuesta inmunitaria innata (denominadas en la presente memoria sensores) se unen a tal agente, se activan, y después inician una cascada de factores inmunitarios (denominados en la presente memoria efectores) que promueven el ABC y la toxicidad. Por ejemplo, las células B1a y B1b pueden unirse a LNP, activarse (solas o en presencia de otros sensores tales como pDC y/o efectores tales como IL6) y secretar IgM natural que se une a la LNP. La IgM natural preexistente en el individuo también puede reconocer y unirse a la LNP, desencadenyo de este modo la fijación del complemento. Después de la administración de la primera dosis, la producción de IgM natural comienza en el plazo de 1-2 horas después de la administración de la LNP. Típicamente, alrededor de 2-3 semanas después la IgM natural está eliminada del sistema debido a la semivida natural de la IgM. La IgG natural se produce comenzyo aproximadamente 96 horas después de la administración de la LNP. El agente, cuyo se administra en un entorno inexperto, puede ejercer sus efectos biológicos de manera relativamente libre de trabas por la IgM natural producida después de la activación de las células B1a o células B1b o IgG natural. La IgM natural y la IgG natural son no específicas y por lo tanto son distintas de la IgM anti-PEG y la IgG anti-PEG.
Aunque el solicitante no está limitado por el mecanismo, se propone que las LNP desencadenan el ABC y/o la toxicidad a través de los siguientes mecanismos. Se cree que cuyo se administra una LNP a un individuo, la LNP se transporta rápidamente a través de la sangre al bazo. Las LNP pueden encontrarse con células inmunitarias en la sangre y/o el bazo. Se desencadena una respuesta inmunitaria innata rápida en respuesta a la presencia de la LNP dentro de la sangre y/o el bazo. El solicitante ha demostrado en la presente memoria que en un plazo de horas después de la administración de una LNP varios sensores inmunitarios han reaccionado a la presencia de la LNP. Estos sensores incluyen, pero no se limitan a, células inmunitarias involucradas en la generación de una respuesta inmunitaria, tales como células B, pDC y plaquetas. Los sensores pueden estar presentes en el bazo, tal como en la zona marginal del bazo y/o en la sangre. La LNP puede interactuar físicamente con uno o más sensores, que pueden interactuar con otros sensores. En tal caso, la LNP está interactuyo directa o indirectamente con los sensores. Los sensores pueden interactuar directamente entre sí en respuesta al reconocimiento de la LNP. Por ejemplo, muchos sensores están situados en el bazo y pueden interactuar fácilmente entre sí. Como alternativa, uno o más de los sensores pueden interactuar con LNP en la sangre y activarse. El sensor activado puede interactuar entonces directamente con otros sensores o indirectamente (por ejemplo, a través de la estimulación o producción de un mensajero tal como una citocina, por ejemplo, IL6).
En algunas realizaciones, la LNP puede interactuar directamente con y activar cada uno de los siguientes sensores: pDC, células B1a, células B1b y plaquetas. Estas células pueden interactuar entonces directa o indirectamente entre sí para iniciar la producción de efectores que finalmente conducen al ABC y/o la toxicidad asociados con dosis repetidas de LNP. Por ejemplo, el solicitante ha demostrado que la administración de LNP conduce a la activación de pDC, agregación y activación de plaquetas y activación de células B. En respuesta a la LNP, las plaquetas también se agregan y se activan y se agregan con células B. Las células pDC se activan. Se ha hallado que la LNP interactúa con la superficie de las plaquetas y las células B de manera relativamente rápida. El bloqueo de la activación de uno cualquiera o una combinación de estos sensores en respuesta a la LNP es útil para amortiguar la respuesta inmunitaria que normalmente ocurriría. Este amortiguamiento de la respuesta inmunitaria da como resultado la evitación del ABC y/o la toxicidad.
Los sensores una vez activados producen efectores. Un efector, tal como se usa en la presente memoria, es una molécula inmunitaria producida por una célula inmunitaria, tal como una célula B. Los efectores incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulina tal como IgM natural e IgG natural y citocinas tales como IL6. Las células B1a y B1b estimulan la producción de IgM naturales en un plazo de 2-6 horas después de la administración de una LNP. La IgG natural puede detectarse en un plazo de 96 horas. Los niveles de IL6 aumentan en un plazo de varias horas. La IgM y la IgG naturales circulan en el cuerpo durante varios días a varias semanas. Durante este tiempo, los efectores circulantes pueden interactuar con LNP recién administradas, activyo esas LNP para su eliminación por el cuerpo. Por ejemplo, un efector puede reconocer y unirse a una LNP. La región Fe del efector puede ser reconocida por y desencadenar la absorción de la LNP decorada por el macrófago. Los macrófagos se transportan entonces al bazo. La producción de efectores por sensores inmunitarios es una respuesta transitoria que se correlaciona con el tiempo observado para el ABC.
Si la dosis administrada es la segunda o posterior dosis administrada, y si tal segunda o posterior dosis se administra antes de que la IgM y/o IgG naturales inducidas previamente se eliminen del sistema (por ejemplo, antes del período de tiempo de 2-3 ventanas), entonces tal segunda o posterior dosis se convierte en diana de la IgM natural y/o IgG natural o Fc circulantes que desencadenan la activación de la vía del complemento alternativa y es eliminada en sí misma rápidamente. Cuyo se administran LNP después de que los efectores hayan desaparecido del cuerpo o se hayan reducido en número, no se observa ABC.
Por lo tanto, es útil de acuerdo con aspectos de la invención inhibir la interacción entre las LNP y uno o más sensores, inhibir la activación de uno o más sensores por las LNP (directa o indirecta), inhibir la producción de uno o más efectores, y/o inhibir la actividad de uno o más efectores. En algunas realizaciones, la LNP está diseñada para limitar o bloquear la interacción de la LNP con un sensor. Por ejemplo, la LNP puede tener un PC y/o p Eg alterado para evitar interacciones con sensores. Como alternativa o adicionalmente, se puede usar un agente que inhiba las respuestas inmunitarias inducidas por las LNP para lograr uno cualquiera o más de estos efectos.
También se ha determinado que las células B convencionales también están involucradas en el ABC. Específicamente, tras la primera administración de un agente, las células B convencionales, denominadas en la presente memoria CD19(+), se unen al agente y reaccionan contra el mismo. Sin embargo, a diferencia de las células B1a y B1b, las células B convencionales son capaces de montar primero una respuesta de IgM (que comienza alrededor de 96 horas después de la administración de las LNP), seguida de una respuesta de IgG (que comienza alrededor de 14 días después de la administración de las LNP) concomitante con una respuesta de memoria. Por lo tanto, las células B convencionales reaccionan contra el agente administrado y contribuyen a la IgM (y eventualmente IgG) que media el ABC. La IgM y la IgG son típicamente IgM anti-PEG e IgG anti-PEG.
Se contempla que, en algunos casos, la mayor parte de la respuesta de ABC esté mediada a través de células B1a y respuestas inmunitarias mediadas por B1a. Se contempla además que, en algunos casos, la respuesta de ABC esté mediada tanto por IgM como por IgG, mediyo tales efectos tanto las células B convencionales como las células B1a. En otros casos más, la respuesta de ABC está mediada por moléculas de IgM naturales, algunas de las cuales son capaces de unirse a IgM natural, que puede ser producida por células B1a activadas. Las IgM naturales pueden unirse a uno o más componentes de las LNP, por ejemplo, unirse a un componente de fosfolípido de las LNP (tal como unirse al resto PC del fosfolípido) y/o unirse a un componente de lípido de PEG de las LNP (tal como unirse a PEG-DMG, en particular, unirse al resto PEG de P<e>G-DMG). Puesto que B1a expresa CD36, para el que la fosfatidilcolina es un ligyo, se contempla que el receptor CD36 pueda mediar en la activación de las células B1a y, por tanto, en la producción de IgM natural. En otros casos más, la respuesta de ABC está mediada principalmente por células B convencionales.
Se ha hallado de acuerdo con la invención que el fenómeno de ABC puede reducirse o suprimirse, al menos en parte, a través del uso de compuestos y composiciones (tales como agentes, vehículos de administración y formulaciones) que no activan las células B1a. Los compuestos y composiciones que no activan las células B1a pueden denominarse en la presente memoria compuestos y composiciones inertes para B1a. Se ha hallado además de acuerdo con la invención que el fenómeno de ABC puede reducirse o suprimirse, al menos en parte, a través del uso de compuestos y composiciones que no activan las células B convencionales. Los compuestos y composiciones que no activan las células B convencionales pueden, en algunas realizaciones, denominarse en la presente memoria compuestos y composiciones inertes para CD19. Por lo tanto, en algunas realizaciones proporcionadas en la presente memoria, los compuestos y las composiciones no activan las células B1a y no activan las células B convencionales. Los compuestos y composiciones que no activan las células B1a ni las células B convencionales pueden, en algunas realizaciones, denominarse en la presente memoria compuestos y composiciones inertes para B1a/CD19.
Estos mecanismos subyacentes no se entendieron hasta ahora, y tampoco se apreció el papel de las células B1a y B1b y su interacción con las células B convencionales en este fenómeno.
En consecuencia, esta divulgación proporciona compuestos y composiciones que no promueven el ABC. Éstos pueden caracterizarse además como no capaces de activar células B1a y/o B1b, plaquetas y/o pDC, y opcionalmente también células B convencionales. Estos compuestos (por ejemplo, agentes, incluyendo agentes biológicamente activos tales como agentes profilácticos, agentes terapéuticos y agentes de diagnóstico, vehículos de administración, incluyendo liposomas, nanopartículas lipídicas, y otras estructuras de encapsulación basadas en lípidos, etc.) y composiciones (por ejemplo, formulaciones, etc.) son particularmente deseables para aplicaciones que requieren administración repetida, y en particular administraciones repetidas que se producen dentro de períodos de tiempo cortos (por ejemplo, en el plazo de 1-2 semanas). Este es el caso, por ejemplo, si el agente es un agente terapéutico basado en ácido nucleico que se proporciona a un individuo a intervalos regulares muy próximos. Los hallazgos proporcionados en la presente memoria pueden aplicarse a éstos y otros agentes que se administren de manera similar y/o que estén sujetos a un ABC.
De particular interés son los compuestos que comprenden lípidos, partículas que comprenden lípidos, y composiciones que comprenden lípidos, ya que se sabe que son propensos al ABC. Tales compuestos, partículas y composiciones que comprenden lípidos se han usado ampliamente como agentes biológicamente activos o como vehículos de administración para tales agentes. Por lo tanto, la capacidad de mejorar la eficacia de tales agentes, ya sea reduciendo el efecto del ABC en el propio agente o en su vehículo de administración, es beneficiosa para una amplia variedad de agentes activos.
También se proporcionan en la presente memoria composiciones que no estimulan o potencian una reacción de fase aguda (ARP, por sus siglas en inglés) asociada con la administración de dosis repetidas de uno o más agentes biológicamente activos.
La composición, en algunos casos, puede no unirse a IgM, incluyendo, pero sin limitarse a, IgM natural.
La composición, en algunos casos, puede no unirse a una proteína de fase aguda tal como, pero sin limitarse a, proteína C reactiva.
La composición, en algunos casos, puede no desencadenar una respuesta inmunitaria mediada por CD5(+). Tal como se usa en la presente memoria, una respuesta inmunitaria mediada por CD5(+) es una respuesta inmunitaria que está mediada por células B1a y/o B1b. Tal respuesta puede incluir una respuesta de ABC, una reacción de fase aguda, inducción de IgM y/o IgG naturales, y similares.
La composición, en algunos casos, puede no desencadenar una respuesta inmunitaria mediada por CD19(+). Tal como se usa en la presente memoria, una respuesta inmunitaria mediada por CD19(+) es una respuesta inmunitaria que está mediada por células B CD19(+), CD5(-) convencionales. Tal respuesta puede incluir inducción de IgM, inducción de IgG, inducción de células B de memoria, una respuesta de ABC, una respuesta de anticuerpo antifármaco (ADA, por sus siglas en inglés) que incluye una respuesta antiproteína en la que la proteína puede estar encapsulada dentro de una LNP, y similares.
Las células B1a son un subconjunto de células B involucradas en la inmunidad innata. Estas células son la fuente de IgM circulante, denominada anticuerpo natural o anticuerpo sérico natural. Los anticuerpos IgM naturales se caracterizan por tener una afinidad débil por varios antígenos y, por lo tanto, se denominan "poliespecíficos" o "polirreactivos", lo que indica su capacidad para unirse a más de un antígeno. Las células B1a no pueden producir IgG. Adicionalmente, no se transforman en células de memoria y por lo tanto no contribuyen a una respuesta inmunitaria adaptativa. Sin embargo, son capaces de secretar IgM tras la activación. La IgM secretada se elimina típicamente en un plazo de aproximadamente 2-3 semanas, momento en el que el sistema inmunitario se vuelve relativamente inexperto para el antígeno administrado previamente. Si el mismo antígeno se presenta después de este período de tiempo (por ejemplo, aproximadamente 3 semanas después de la exposición inicial), el antígeno no se elimina rápidamente. Sin embargo, significativamente, si el antígeno se presenta dentro de ese período de tiempo (por ejemplo, en un plazo de 2 semanas, incluyendo en un plazo de 1 semana, o en un plazo de días), entonces el antígeno se elimina rápidamente. Este retraso entre dosis consecutivas ha hecho que ciertos agentes terapéuticos o de diagnóstico que contienen lípidos no sean adecuados para su uso.
En humanos, las células B1a son CD19(+), CD20(+), CD27(+), CD43(+), CD70(-) y CD5(+). En ratones, las células B1a son CD19(+), CD5(+), y la isoforma B220(+) de células B CD45. Es la expresión de CD5 la que típicamente distingue las células B1a de otras células B convencionales. Las células B1a pueden expresar altos niveles de CD5, y sobre esta base pueden distinguirse de otras células B-1 tales como las células B-1b que expresan niveles bajos o indetectables de CD5. CD5 es una glucoproteína de superficie celular pan-T. Las células B1a también expresan CD36, también conocida como translocasa de ácido graso. CD36 es un miembro de la familia de receptores depuradores de clase B. CD36 puede unirse a muchos ligyos, incluyendo lipoproteínas de baja densidad oxidadas, lipoproteínas nativas, fosfolípidos oxidados y ácidos grasos de cadena larga.
Las células B1b son otro subconjunto de células B involucradas en la inmunidad innata. Estas células son otra fuente de IgM natural circulante. Varios antígenos, incluyendo PS, son capaces de inducir inmunidad independiente de células T a través de la activación de B1 b. La regulación de CD27 está típicamente mejorada en las células B1b en respuesta a la activación del antígeno. De manera similar a las células B1a, las células B1 b se localizan típicamente en ubicaciones específicas del cuerpo tales como el bazo y la cavidad peritoneal y están en muy baja abundancia en la sangre. La IgM natural secretada por B1b se elimina típicamente en un plazo de aproximadamente 2-3 semanas, momento en el que el sistema inmunitario se vuelve relativamente inexperto para el antígeno administrado previamente. Si el mismo antígeno se presenta después de este período de tiempo (por ejemplo, aproximadamente 3 semanas después de la exposición inicial), el antígeno no se elimina rápidamente. Sin embargo, significativamente, si el antígeno se presenta dentro de ese período de tiempo (por ejemplo, en un plazo de 2 semanas, incluyendo en un plazo de 1 semana, o en un plazo de días), entonces el antígeno se elimina rápidamente. Este retraso entre dosis consecutivas ha hecho que ciertos agentes terapéuticos o de diagnóstico que contienen lípidos no sean adecuados para su uso.
En algunas realizaciones es deseable bloquear la activación de las células B1a y/o B1b. Una estrategia para bloquear la activación de las células B1a y/o B1b implica determinar qué componentes de una nanopartícula lipídica promueven la activación de las células B y neutralizar esos componentes. Se ha descubierto en la presente memoria que al menos el PEG y la fosfatidilcolina (PC, por sus siglas en inglés) contribuyen a la interacción con otras células y/o la activación de las células B1a y B1b. El PEG puede desempeñar un papel en la promoción de la agregación entre las células B1 y las plaquetas, lo que puede conducir a la activación. La PC (un lípido auxiliar en las LNP) también está involucrada en la activación de las células B1, probablemente a través de la interacción con el receptor CD36 en la superficie de las células B. Numerosas partículas tienen alternativas a lípidos de PEG, se han diseñado y ensayado lípidos sin PEG y/o sustitutivos de PC (por ejemplo, ácido oleico o análogos del mismo). El solicitante ha establecido que la sustitución de uno o más de estos componentes dentro de una LNP que de otro modo promovería el ABC tras la administración repetida es útil para prevenir el ABC al reducir la producción de IgM natural y/o la activación de células B. Por lo tanto, la invención abarca LNP que tienen ABC reducido como resultado de un diseño que elimina la inclusión de desencadenantes de células B.
Otra estrategia para bloquear la activación de células B1a y/o B1b implica el uso de un agente que inhiba las respuestas inmunitarias inducidas por LNP. Estos tipos de agentes se exponen posteriormente con más detalle. En algunas realizaciones, estos agentes bloquean la interacción entre las células B1a/B1b y la LNP o plaquetas o pDC. Por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo u otro agente de unión que bloquee físicamente la interacción. Un ejemplo de esto es un anticuerpo que se una a CD36 o CD6. El agente también puede ser un compuesto que evite o impida que la célula B1a/B1b señalice una vez activada o antes de la activación. Por ejemplo, es posible bloquear uno o más componentes en la cascada de señalización B1a/B1b los resultados de la interacción de células B con LNP u otras células inmunitarias. En otras realizaciones, el agente puede actuar sobre uno o más efectores producidos por las células B1 a/B1 b después de la activación. Estos efectores incluyen, por ejemplo, IgM natural y citocinas.
Se ha demostrado de acuerdo con aspectos de la invención que cuyo la activación de células pDC se bloquea, la activación de células B en respuesta a LNP se reduce. Por lo tanto, con el fin de evitar el ABC y/o la toxicidad, puede ser deseable prevenir la activación de pDC. De manera similar a las estrategias expuestas anteriormente, la activación de células pDC puede bloquearse mediante agentes que afecten a la interacción entre pDC y LNP y/o células B/plaquetas. Como alternativa, para evitar el ABC pueden usarse junto con la LNP agentes que actúen sobre las pDC para bloquear su capacidad de activarse o sobre sus efectores.
Las plaquetas también pueden desempeñar un papel importante en el ABC y la toxicidad. Muy rápidamente después de administrarse una primera dosis de LNP a un individuo, las plaquetas asociadas con la LNP se agregan y se activan. En algunas realizaciones, es deseable bloquear la agregación y/o activación de plaquetas. Una estrategia para bloquear la agregación y/o activación de plaquetas implica determinar qué componentes de una nanopartícula lipídica promueven la agregación y/o activación de plaquetas y neutralizar esos componentes. Se ha descubierto en la presente memoria que al menos el PEG contribuye a la agregación, activación y/o interacción con otras células de las plaquetas. Numerosas partículas tienen alternativas a lípidos de PEG y se han diseñado y ensayado alternativas sin PEG. El solicitante ha establecido que la sustitución de uno o más de estos componentes dentro de una LNP que de otro modo promovería el ABC tras la administración repetida es útil para prevenir el ABC al reducir la producción de IgM natural y/o la agregación de plaquetas. Por lo tanto, la invención abarca LNP que tienen ABC reducido como resultado de un diseño que elimina la inclusión de desencadenantes de plaquetas. Como alternativa, para evitar el ABC pueden usarse junto con la LNP agentes que actúen sobre las plaquetas para bloquear su actividad una vez activadas o sobre sus efectores.
(i) Medición de la Actividad de ABC y actividades relacionadas
Diversos compuestos y composiciones proporcionados en la presente memoria, incluyendo las LNP, no promueven la actividad de ABC tras la administraciónin vivo.Estas LNP pueden caracterizarse y/o identificarse a través de cualquiera de varios ensayos, tales como, pero sin limitarse a, los descritos posteriormente, así como cualquiera de los ensayos divulgados en la sección de Ejemplos, incluida la subsección de métodos de los Ejemplos.
Los métodos implican administrar una LNP sin producir una respuesta inmunitaria que promueva el ABC. Una respuesta inmunitaria que promueva el ABC implica la activación de uno o más sensores, tales como células B1, pDC, o plaquetas, y uno o más efectores, tales como IgM natural, IgG natural o citocinas tales como IL6. Por lo tanto, la administración de una LNP sin producir una respuesta inmunitaria que promueva el ABC implica como mínimo la administración de una LNP sin una activación significativa de uno o más sensores y producción significativa de uno o más efectores. Significativa utilizado en este contexto se refiere a una cantidad que conduciría a la consecuencia fisiológica de un aclaramiento sanguíneo acelerado de la totalidad o parte de una segunda dosis con respecto al nivel de aclaramiento sanguíneo esperado para una segunda dosis de una LNP que desencadene un ABC. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria se debería amortiguar de manera que el ABC observado después de la segunda dosis sea menor que el que se hubiera esperado para una LNP que desencadene un ABC.
(ii) Ensayo de activación de B1a o B1b
Ciertas composiciones proporcionadas en esta divulgación no activan células B, tales como células B1a o B1b (CD19+ CD5+) y/o células B convencionales (CD19+ CD5-). La activación de células B1a, células B1b o células B convencionales se puede determinar de varias maneras, algunas de las cuales se proporcionan posteriormente. La población de células B puede proporcionarse como poblaciones de células B fraccionadas o poblaciones no fraccionadas de esplenocitos o células mononucleares de sangre periférica (PBMC). En este último caso, la población celular puede incubarse con la LNP de elección durante un período de tiempo, y luego cosecharse para un análisis adicional. Como alternativa, el sobrenadante se puede cosechar y analizar.
(iii) Mejora de la regulación de la expresión de la superficie celular del marcador de activación
La activación de células B1a, células B1b o células B convencionales se puede demostrar como expresión aumentada de marcadores de activación de células B que incluyen marcadores de activación tardía tales como CD86. En un ensayo no limitativo ejemplar, se proporcionan células B no fraccionadas como una población de esplenocitos o como una población de PBMC, se incuban las mismas con una LNP de elección durante un período de tiempo concreto, y luego se tiñen para un marcador de células B estándar tal como CD19 y para un marcador de activación tal como CD86, y se analizan usyo, por ejemplo, citometría de flujo. Un control negativo adecuado implica incubar la misma población con medio, y luego realizar las mismas etapas de tinción y visualización. Un aumento en la expresión de CD86 en la población de ensayo en comparación con el control negativo indica la activación de células B.
(iv) Liberación de citocinas proinflamatorias
La activación de células B también se puede evaluar mediante ensayo de liberación de citocinas. Por ejemplo, la activación puede evaluarse a través de la producción y/o secreción de citocinas tales como IL-6 y/o TNF-alfa tras la exposición con LNP de interés.
Tales ensayos pueden realizarse usyo ensayos de secreción de citocinas rutinarios bien conocidos en la técnica. Un aumento en la secreción de citocinas es indicativo de activación de células B.
(v) Unión/asociación de LNP a y/o absorción de LNP por células B
La asociación o unión de LNP a células B también se puede usar para evaluar una LNP de interés y para caracterizar adicionalmente tal LNP. La asociación/unión y/o absorción/internalización se pueden evaluar usyo una LNP marcada de manera detectable, tal como marcada de manera fluorescente, y rastreyo la ubicación de tal LNP en o sobre células B después de diversos períodos de incubación.
La invención contempla además que las composiciones proporcionadas en la presente memoria puedan ser capaces de evadir el reconocimiento o la detección y opcionalmente la unión por mediadores de<a>B<c>situados aguas abajo tales como IgM circulante y/o mediadores de reacción de fase aguda tales como proteínas de fase aguda (por ejemplo, proteína C-reactiva (CRP, por sus siglas en inglés)).
(vi) Métodos de uso para reducir el ABC
También se proporcionan en la presente memoria métodos para aportar LNP, que pueden encapsular un agente tal como un agente terapéutico, a un individuo sin promover el ABC.
En algunas realizaciones que no entran dentro del alcance de la invención, el método comprende administrar cualquiera de las LNP descritas en la presente memoria, que no promueven el ABC, por ejemplo, no inducen la producción de IgM natural que se una a las LNP, no activan las células B1a y/o B1b. Tal como se usa en la presente memoria, una LNP que "no promueve el ABC" se refiere a una LNP que no induce respuestas inmunitarias que conducirían a un ABC sustancial o que induce un nivel sustancialmente bajo de respuestas inmunitarias que no es suficiente para conducir a un ABC sustancial. Una LNP que no induce la producción de IgM naturales que se unan a la LNP se refiere a LNP que, bien no inducen ninguna IgM natural que se una a las LNP, bien inducen un nivel sustancialmente bajo de las moléculas de IgM natural, que es insuficiente para conducir a un ABC sustancial. Una LNP que no activa las células B1a y/o B1b se refiere a LNP que no inducen ninguna respuesta de las células B1a y/o B1b para producir IgM natural que se una a las LNP, o que inducen un nivel sustancialmente bajo de respuestas de B1a y/o B1b, que es insuficiente para conducir a un ABC sustancial.
En algunas realizaciones, las expresiones no activan y no inducen la producción son una reducción relativa a un valor o condición de referencia. En algunas realizaciones, el valor o condición de referencia es la cantidad de activación o inducción de la producción de una molécula tal como IgM por una LNP estándar tal como una LNP de MC3. En algunas realizaciones, la reducción relativa es una reducción de al menos un 30%, por ejemplo, al menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. En otras realizaciones, las expresiones no activan células tales como células B y no inducen la producción de una proteína tal como IgM pueden referirse a una cantidad indetectable de las células activas o la proteína específica.
(vii) Efectos sobre las plaquetas y toxicidad
La invención se basa además en parte en la elucidación del mecanismo subyacente de la toxicidad limitante de dosis asociada con la administración de LNP. Tal toxicidad puede implicar coagulopatía, coagulación intravascular diseminada (CID, también denominada coagulopatía de consumo), ya sea aguda o crónica, y/o trombosis vascular. En algunos casos, la toxicidad limitante de dosis asociada con las LNP es la reacción de fase aguda (APR) o la pseudoalergia relacionada con la activación del complemento (CARPA, por sus siglas en inglés).
Tal como se usa en la presente memoria, coagulopatía se refiere a un aumento de la coagulación (coagulación de la sangre)in vivo.Los hallazgos comunicados en esta divulgación concuerdan con tal aumento de la coagulación y proporcionan significativamente una mejor comprensión del mecanismo subyacente. La coagulación es un proceso que implica una serie de factores y tipos de células diferentes, y hasta ahora la relación entre y la interacción de las LNP y las plaquetas no se ha entendido a este respecto. Esta divulgación proporciona pruebas de tal interacción y también proporciona compuestos y composiciones que están modificados para tener un efecto plaquetario reducido, incluyendo asociación plaquetaria reducida, agregación plaquetaria reducida, y/o agregación plaquetaria reducida. La capacidad de modular, incluyendo preferiblemente modular negativamente, tales efectos plaquetarios puede reducir la incidencia y/o gravedad de la coagulopatía después de la administración de LNP. Esto, a su vez, reducirá la toxicidad relacionada con tales LNP, permitiendo así dosis más altas de LNP y, lo que es importante, su carga que se ha de administrar a pacientes que la necesitan.
CARPA es una clase de toxicidad inmunitaria aguda manifestada en reacciones de hipersensibilidad (HSR, por sus siglas en inglés), que pueden ser desencadenadas por nanomedicinas y productos biológicos. A diferencia de las reacciones alérgicas, la CARPA típicamente no involucra IgE, sino que surge como consecuencia de la activación del sistema del complemento, que es parte del sistema inmunitario innato que mejora las capacidades del cuerpo para eliminar patógenos. Una o más de las siguientes vías, la vía clásica del complemento (CP, por sus siglas en inglés), la vía alternativa (AP, por sus siglas en inglés) y la vía de lectina (LP, por sus siglas en inglés), pueden estar involucradas en la CARPA. Szebeni, Molecular Immunology, 61: 163-173 (2014).
La vía clásica es desencadenada por la activación del complejo C1, que contiene. C1q, C1r, C1s, o C1qr2s2. La activación del complejo C1 ocurre cuyo C1q se une a IgM o IgG complejada con antígenos, o cuyo C1q se une directamente a la superficie del patógeno. Tal unión conduce a cambios conformacionales en la molécula de C1q, lo que conduce a la activación de C1r, que, a su vez, escinde C1s. El componente C1r2s2 ahora separa C4 y luego C2, produciendo C4a, C4b, C2a y C2b. C4b y C2b se unen para formar la vía clásica C3-convertasa (complejo C4b2b), que promueve la escisión de C3 en C3a y C3b. C3b se une entonces a la C3 convertasa para formar la C5 convertasa (complejo C4b2b3b). La vía alternativa se activa continuamente como resultado de la hidrólisis espontánea de C3. El factor P (properdina) es un regulador positivo de la vía alternativa. La oligomerización de la properdina estabiliza la C3 convertasa, que puede entonces escindir mucho más C3. Las moléculas de C3 pueden unirse a superficies y reclutar más actividad de B, D y P, conduciendo a la amplificación de la activación del complemento.
La reacción de fase aguda (APR) es una respuesta inmunitaria innata sistémica compleja para prevenir la infección y eliminar patógenos potenciales. Numerosas proteínas están involucradas en la APR y la proteína C-reactiva es una bien caracterizada.
Se ha hallado, de acuerdo con la invención, que ciertas LNP son capaces de asociarse físicamente con las plaquetas casi inmediatamente después de la administraciónin vivo, mientras que otras LNP no se asocian con las plaquetas en absoluto o sólo a niveles de fondo. Significativamente, aquellas LNP que se asocian con plaquetas también aparentemente estabilizan los agregados de plaquetas que se forman después. El contacto físico de las plaquetas con ciertas LNP se correlaciona con la capacidad de tales plaquetas para permanecer agregadas o para formar agregados continuamente durante un periodo de tiempo prolongado después de la administración. Tales agregados comprenden plaquetas activadas y también células inmunitarias innatas tales como macrófagos y células B.
25. Métodos de Uso
Los polinucleótidos, composiciones farmacéuticas y formulaciones descritos en la presente memoria se utilizan en la preparación, fabricación y uso terapéutico para tratar y/o prevenir enfermedades, trastornos o estados relacionados con GALT.
Los polinucleótidos, composiciones farmacéuticas y formulaciones pueden usarse en métodos para reducir los niveles de galactosa en un individuo que lo necesite. Por ejemplo, la divulgación proporciona un método para aliviar los síntomas de Gal-1 en un individuo que comprende la administración de una composición o formulación que comprenden un polinucleótido que codifica GALT a ese individuo (por ejemplo, un ARNm que codifica un polipéptido de GALT).
Los polinucleótidos, composiciones farmacéuticas y formulaciones se pueden usar para reducir el nivel de un metabolito asociado con Gal-1 (por ejemplo, el sustrato o producto, es decir, galactosa), comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad eficaz de un polinucleótido que codifica un polipéptido de GALT.
La presente invención proporciona las composiciones de la invención, para su uso en el tratamiento de la galactosemia de tipo 11 (Gal-1) en un individuo humano. En algunas realizaciones, la administración de una cantidad eficaz de una composición de la invención reduce los niveles de un biomarcador de Gal-1, por ejemplo, galactosa-1-fosfato, galactosa, galactitol, galactonato, 8-hidroxi-2-desoxiguanosina, y/o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la administración de la composición de la invención da como resultado la reducción del nivel de uno o más biomarcadores de Gal-1, por ejemplo, galactosa-1-fosfato, galactitol, galactonato, 8-hidroxi-2-desoxiguanosina y/o galactosa, en un corto período de tiempo (por ejemplo, en aproximadamente 6 horas, en aproximadamente 8 horas, en aproximadamente 12 horas, en aproximadamente 16 horas, en aproximadamente 20 horas o en aproximadamente 24 horas) después de la administración de la composición de la invención.
La terapia de sustitución es un tratamiento potencial para Gal-1. Por lo tanto, en ciertos aspectos, los polinucleótidos, por ejemplo, ARNm, divulgados en la presente memoria comprenden una o más secuencias que codifican un polipéptido de GALT que es adecuado para su uso en la terapia de sustitución génica para Gal-1. En algunas realizaciones, la composición de la invención trata una falta de GALT o de actividad de GALT, o una actividad de GALT disminuida o anormal en un individuo proporcionyo un polinucleótido, es decir, un ARNm, que codifica un polipéptido de GALT al individuo. En algunas realizaciones, el polinucleótido está optimizado en cuanto a la secuencia. En algunas realizaciones, el polinucleótido (es decir, un ARNm) comprende una secuencia de ácido nucleico (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT, estyo el ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia, por ejemplo, mediante una modificación de su contenido en G/C, uridina o timidina, y/o el polinucleótido comprende al menos un nucleósido modificado químicamente. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende un sitio de unión de miARN, por ejemplo, un sitio de unión de miARN que se une a miARN-142 y/o un sitio de unión de miARN que se une a miARN-126.
En algunas realizaciones, la administración de la composición de la invención a un individuo da como resultado una disminución de la galactosa en las células a un nivel al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o hasta un 100% más bajo que el nivel observado antes de la administración de la composición o formulación.
En algunas realizaciones, la administración de la composición de la invención da como resultado la expresión de GALT en células del individuo. En algunas realizaciones, la administración de la composición de la invención da como resultado un aumento de la actividad enzimática y/o la expresión de GALT en el individuo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la administración de una composición o formulación que comprende un ARNm que codifica un polipéptido de GALT a un individuo da como resultado un aumento de la actividad enzimática y/o la expresión de GALT en al menos algunas células de un individuo.
En algunas realizaciones, la administración de la composición que comprende un ARNm que codifica un polipéptido de GALT a un individuo da como resultado un aumento de la actividad enzimática y/o la expresión de GALT en células sujetas a un nivel de al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o hasta un 100% o más del nivel de actividad y/o expresión esperado en un individuo normal, por ejemplo, un ser humano que no padezca Gal-1.
En algunas realizaciones, la administración de la composición de la invención da como resultado la expresión de la proteína GALT en al menos algunas de las células de un individuo que persiste durante un período de tiempo suficiente para permitir que se produzca un metabolismo significativo de galactosa.
En algunas realizaciones, la expresión del polipéptido codificado está aumentada. En algunas realizaciones, el polinucleótido aumenta los niveles de actividad enzimática y/o la expresión de GALT en las células cuyo se introduce en esas células, por ejemplo, en al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o hasta un 100% con respecto al nivel de actividad enzimática y/o la expresión de GALT en las células antes de que el polipéptido se introduzca en las células.
En algunas realizaciones, el método o uso comprende administrar un polinucleótido, por ejemplo, ARNm, que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene similitud de secuencia con un polinucleótido seleccionado del grupo de SEQ ID NOs: 5 a 29 y 113 a 131, por ejemplo, 124 o 126 (véase la Tabla 2) o un polinucleótido seleccionado del grupo de SEQ ID NOs: 132 a 150, por ejemplo, 143 o 145 (véase la Tabla 5), codificyo el polinucleótido un polipéptido de GALT.
Otros aspectos de la presente divulgación se refieren al trasplante de células que contienen polinucleótidos a un individuo mamífero. La administración de células a individuos mamíferos es conocida por las personas con conocimientos corrientes de la técnica e incluye, pero no se limita a, implantación local (por ejemplo, administración tópica o subcutánea), administración a órganos o inyección sistémica (por ejemplo, inyección intravenosa o inhalación), y la formulación de células en vehículos farmacéuticamente aceptables.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) utilizados en las composiciones de la invención comprenden una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT divulgado en la presente memoria y un sitio de unión de miARN divulgado en la presente memoria, por ejemplo, un sitio de unión de miARN que se une a miR-142 y/o un sitio de unión de miARN que se une a miR-126. En algunas realizaciones, la secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT comprende al menos una nucleobase modificada químicamente, por ejemplo, 5-metoxiuracilo. En algunas realizaciones, al menos un 95% de un tipo de nucleobase (por ejemplo, uracilo) en una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT son nucleobases modificadas. En algunas realizaciones, al menos un 95% del uracilo en una secuencia modificada en cuanto al uracilo que codifica un polipéptido de GALT es 5-metoxiuridina. En la composición de la invención, el polinucleótido (es decir, ARNm) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT divulgado en la presente memoria y un sitio de unión de miARN se formula con un agente de administración que comprende, por ejemplo, un compuesto que tiene la Fórmula (IA), por ejemplo, el Compuesto 18. En algunas realizaciones, el agente de administración comprende el Compuesto 18, DSPC, Colesterol y el Compuesto 428, por ejemplo, con una relación molar de aproximadamente 50: 10:38.5: 1.5.
El experto en la técnica apreciará que la eficacia terapéutica de un fármaco o un tratamiento de la presente invención se puede caracterizar o determinar midiendo el nivel de expresión de una proteína codificada (por ejemplo, enzima) en una muestra o en muestras tomadas de un individuo (por ejemplo, de un individuo de ensayo preclínico (roedor, primate, etc.) o de un individuo clínico (humano). Asimismo, la eficacia terapéutica de un fármaco o un tratamiento de la presente invención se puede caracterizar o determinar midiendo el nivel de actividad de una proteína codificada (por ejemplo, enzima) en una muestra o en muestras tomadas de un individuo (por ejemplo, de un individuo de ensayo preclínico (roedor, primate, etc.) o de un individuo clínico (humano). Además, la eficacia terapéutica de un fármaco o un tratamiento de la presente invención se puede caracterizar o determinar midiendo el nivel de un biomarcador apropiado en una o más muestras tomadas de un individuo. Los niveles de proteína y/o biomarcadores se pueden determinar después de la administración con una dosis única de un agente terapéutico de ARNm de la invención o se pueden determinar y/o seguir en varios puntos de tiempo después de la administración con una dosis única o se pueden determinar y/o seguir a lo largo de un curso de tratamiento, por ejemplo, un tratamiento de dosis múltiples.
Gal-1 está asociada con una capacidad empeorada para convertir UDP-glucosa y galactosa-1-fosfato en glucosa-1-fosfato y UDP-galactosa. Por consiguiente, los pacientes con Gal-1 muestran comúnmente altos niveles de galactosa-1-fosfato en su sangre.
Gal-1 es un trastorno metabólico autosómico recesivo caracterizado por la incapacidad de convertir UDP-glucosa y galactosa-1-fosfato en glucosa-1-fosfato y UDP-galactosa. Por consiguiente, los pacientes con Gal-1 pueden ser portadores asintomáticos del trastorno o padecer los diversos síntomas asociados con la enfermedad. Los pacientes con Gal-1 muestran generalmente altos niveles de galactosa-1-fosfato, galactosa, 8-hidroxi-2-desoxiguanosina y/o galactitol y galactonato (producidos por vías alternativas cuyo el metabolismo de la galactosa está empeorado) en su plasma, suero, glóbulos rojos (RBC), orina y/o tejido (por ejemplo, hígado). A menos que se especifique lo contrario, los métodos de tratamiento de individuos humanos o pacientes con Gal-1 divulgados en la presente memoria incluyen el tratamiento tanto de portadores asintomáticos como de los individuos con niveles anormales de biomarcadores, por ejemplo, galactosa-1-fosfato, galactosa, galactitol, galactonato y/u 8-hidroxi-2-desoxiguanosina.
Niveles de Expresión de Proteína GALT
La divulgación presenta la medición, determinación y/o seguimiento del o de los niveles de expresión de la proteína galactosa-I-fosfato uridililtransferasa (GALT) en un individuo, por ejemplo, en un animal (por ejemplo, roedores, primates y similares) o en un individuo humano. Los animales incluyen animales normales, sanos o de tipo silvestre, así como modelos animales para su uso en la comprensión de la galactosemia de tipo 1 (Gal-1) y tratamientos de la misma. Los modelos animales ejemplares incluyen modelos de roedores, por ejemplo, ratones deficientes en GALT también denominados ratones GALT.
Los niveles de expresión de la proteína GALT se pueden medir o determinar mediante cualquier método reconocido en la técnica para determinar niveles de proteína en muestras biológicas, por ejemplo, a partir de muestras de sangre o una biopsia con aguja. El término "nivel" o "nivel de una proteína", tal como se usan en la presente memoria, preferiblemente significan el peso, la masa o la concentración de la proteína dentro de una muestra o un individuo. El experto en la técnica entenderá que la muestra puede someterse, por ejemplo, a cualquiera de los siguientes procedimientos: purificación, precipitación, separación, por ejemplo, centrifugación y/o HPLC, y posteriormente someterse a la determinación del nivel de la proteína, por ejemplo, usyo análisis de masa y/o espectrométrico. En casos ejemplares, se puede usar un ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) para determinar los niveles de expresión de proteínas. En otros casos ejemplares, se pueden usar la purificación de proteínas, la separación y la LC-MS como un medio para determinar el nivel de una proteína. En algunas realizaciones, una terapia de ARNm de la invención (por ejemplo, una dosis intravenosa única) da como resultado niveles aumentados de expresión de la proteína GALT en el tejido hepático del individuo (por ejemplo, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces mayores y/o aumentados a al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 75%, un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 100% de los niveles normales) durante al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, al menos 60 horas, al menos 72 horas, al menos 84 horas, al menos 96 horas, al menos 108 horas, al menos 122 horas después de la administración de una dosis única de la terapia de ARNm.
Actividad de la Proteína GALT
En pacientes con Gal-1, la actividad enzimática de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT) está reducida en comparación con un nivel de actividad fisiológica normal. Algunos aspectos adicionales de la divulgación presentan la medición, determinación y/o seguimiento del o de los niveles de actividad (es decir, el o los niveles de actividad enzimática) de la proteína GALT en un individuo, por ejemplo, en un animal (por ejemplo, roedor, primate y similares) o en un individuo humano. Los niveles de actividad pueden medirse o determinarse mediante cualquier método reconocido en la técnica para determinar niveles de actividad enzimática en muestras biológicas. La expresión “nivel de actividad” o “nivel de actividad enzimática”, tal como se usa en la presente memoria, significa preferiblemente la actividad de la enzima por volumen, masa o peso de la muestra o proteína total dentro de una muestra. En casos ejemplares, el “nivel de actividad” o “nivel de actividad enzimática” se describe en términos de unidades por mililitro de fluido (por ejemplo, fluido corporal, por ejemplo, suero, plasma, orina y similares) o se describe en términos de unidades por peso de tejido o por peso de proteína (por ejemplo, proteína total) dentro de una muestra. Las unidades ("U") de actividad enzimática se pueden describir en términos de peso o masa de sustrato hidrolizado por unidad de tiempo. En ciertos casos, la actividad de GALT se describe en términos de U/ml de plasma o U/mg de proteína (tejido), en donde las unidades ("U") se describen en términos de nmoles de sustrato hidrolizados por hora (o nmol/h).
En ciertas realizaciones, una terapia de ARNm de la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una dosis de ARNm eficaz para dar como resultado al menos 5 U/mg, al menos 10 U/mg, al menos 20 U/mg, al menos 30 U/mg, al menos 40 U/mg, al menos 50 U/mg, al menos 60 U/mg, al menos 70 U/mg, al menos 80 U/mg, al menos 90 U/mg, al menos 100 U/mg o al menos 150 U/mg de actividad de GALT en tejido (por ejemplo, hígado) entre 6 y 12 horas, o entre 12 y 24, entre 24 y 48, o entre 48 y 72 horas después de la administración (por ejemplo, a las 48 o a las 72 horas después de la administración).
En realizaciones ejemplares, una terapia de ARNm de la invención presenta una composición farmacéutica que comprende una dosis intravenosa única de ARNm que da como resultado los niveles de actividad descritos anteriormente. En otra realización, una terapia de ARNm de la invención presenta una composición farmacéutica que se puede administrar en múltiples dosis intravenosas unitarias únicas de ARNm que mantienen los niveles de actividad descritos anteriormente.
Biomarcadores de GALT
Algunos aspectos adicionales de la divulgación presentan la determinación del nivel (o los niveles) de un biomarcador, por ejemplo, galactosa-1-fosfato, galactosa, galactitol, galactonato y/u 8-hidroxi-2-desoxiguanosina, determinado (o determinados) en una muestra en comparación con un nivel (por ejemplo, un nivel de referencia) del mismo u otro biomarcador en otra muestra, por ejemplo, del mismo paciente, de otro paciente, de un control y/o del mismo o diferentes puntos de tiempo, y/o un nivel fisiológico, y/o un nivel elevado, y/o un nivel suprafisiológico, y/o un nivel de un control. El experto en la técnica estará familiarizado con los niveles fisiológicos de los biomarcadores, por ejemplo, los niveles en animales normales o de tipo silvestre, individuos normales o sanos, y similares, en particular, el o los niveles característicos de los individuos que están sanos y/o tienen un funcionamiento normal. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “nivel elevado” significa cantidades mayores que las encontradas normalmente en un animal preclínico normal o de tipo silvestre o en un individuo normal o sano, por ejemplo, un individuo humano. Tal como se usa en la presente memoria, el término “suprafisiológico” significa cantidades mayores que las encontradas normalmente en un animal preclínico normal o de tipo silvestre o en un individuo normal o sano, por ejemplo, un individuo humano, que producen opcionalmente una respuesta fisiológica significativamente mejorada. Tal como se usan en la presente memoria, el término "comparar" o "comparado con" preferiblemente significan la comparación matemática de los dos o más valores, por ejemplo, de los niveles del o de los biomarcadores. Por lo tanto, será fácilmente evidente para el experto en la técnica si uno de los valores es superior, inferior o idéntico a otro valor o grupo de valores si al menos dos de tales valores se comparan entre sí. Comparar o comparación con pueden estar en el contexto, por ejemplo, de comparar con un valor de control, por ejemplo, en comparación con un nivel de Gal-1-P de referencia en glóbulos rojos (RBC) y/o tejido (por ejemplo, hígado), un nivel de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina en suero, plasma y/u orina, un nivel de galactosa en plasma sanguíneo, suero y/u orina, un nivel de galactitol en orina, suero y/o plasma, y/o un nivel de galactonato de referencia en orina, suero y/o plasma en dicho individuo antes de la administración (por ejemplo, en una persona que padezca Gal-1) o en un individuo normal o sano. Comparar o comparación con pueden también estar en el contexto, por ejemplo, de comparar con un valor de control, por ejemplo, en comparación con un nivel de excreción de referencia de galactosa-1-fosfato en los RBC y/o tejido (por ejemplo, hígado), galactosa en plasma, suero y/u orina, galactitol en orina, suero y/o plasma, 8-hidroxi-desoxiguanosina en suero, plasma y/u orina, y/o galactonato en orina, suero y/o plasma en dicho individuo antes de la administración (por ejemplo, en una persona que padezca Gal-1) o en un individuo normal o sano.
Tal como se usa en la presente memoria, un "control" es preferiblemente una muestra de un individuo en el que se conoce el estado de Gal-1 de dicho individuo. En una realización, un control es una muestra de un paciente sano. En otra realización, el control es una muestra de al menos un individuo que tiene un estado de Gal-1 conocido, por ejemplo, un estado de Gal-1 grave, leve o saludable, por ejemplo, un paciente de control. En otra realización, el control es una muestra de un individuo que no está siendo tratado por Gal-1. En otra realización adicional más, el control es una muestra de un único individuo o un conjunto de muestras de diferentes individuos y/o muestras tomadas del o de los individuos en diferentes puntos de tiempo.
El término "nivel" o "nivel de un biomarcador", tal como se usan en la presente memoria, preferiblemente significan la masa, peso o concentración de un biomarcador dentro de una muestra o un individuo. Los biomarcadores incluyen, por ejemplo, galactosa-1-fosfato (por ejemplo, niveles de referencia en RBC: 5-49 |jg/g de hemoglobina (<1 mg/dL)), galactitol (por ejemplo, niveles de referencia de excreción en orina en individuos de 18 años o mayores: <13 mmol/mol de creatinina), galactonato (por ejemplo, niveles de referencia de excreción en orina: no detectables), galactosa (por ejemplo, niveles de referencia en suero: < 4-5 mg/dL) y/u 8-hidroxi-2-desoxiguanosina (por ejemplo, niveles de referencia en suero: aproximadamente 0.25 ng/mL). El experto en la técnica entenderá que en ciertas realizaciones la muestra puede someterse, por ejemplo, a uno o más de los siguientes procedimientos: purificación de sustancias, precipitación, separación, por ejemplo, centrifugación y/o HPLC y posteriormente someterse a la determinación del nivel del biomarcador, por ejemplo, usyo análisis espectrométrico de masas. En ciertas realizaciones, se puede usar LC-MS como un medio para determinar el nivel de un biomarcador.
La expresión “determinar el nivel” de un biomarcador, tal como se usa en la presente memoria, puede significar métodos que incluyan cuantificar una cantidad de al menos una sustancia en una muestra de un individuo, por ejemplo, en un fluido corporal del individuo (por ejemplo, suero, plasma, orina, RBC, linfa, heces, etc.) o en un tejido del individuo (por ejemplo, hígado, corazón, bazo, riñón, etc.).
La expresión “nivel de referencia”, tal como se usa en la presente memoria, puede referirse a niveles (por ejemplo, de un biomarcador) en un individuo antes de la administración de una terapia de ARNm de la invención (por ejemplo, en una persona que padezca Gal-1) o en un individuo normal o sano.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “ individuo normal” o “individuo sano” se refiere a un individuo que no padece síntomas asociados con Gal-1. Además, se considerará que un individuo es normal (o está sano) si no tiene mutación de las porciones o dominios funcionales del gen de galactosa-1-fosfato -359 -econd- 359 -ncy- 359 -nsferase (GAL<t>) y/o no tiene mutación del gen de GALT que dé como resultado una reducción o deficiencia de la enzima GALT (también conocida como galactosa-1-fosfato- 359 -econd- 359 -ncy- 359 -nsferase) o la actividad de la misma, dyo como resultado síntomas asociados con Gal-1. Dichas mutaciones se detectarán si una muestra del individuo se somete a un ensayo genético para tales mutaciones de GALT. Una muestra de un individuo sano se puede usar como una muestra de control, o se usa el valor conocido o estyarizado para el nivel de biomarcador de muestras de individuos sanos o normales como un control.
En algunos casos, comparar el nivel del biomarcador en una muestra de un individuo que necesita tratamiento para Gal-1 o en un individuo que está siendo tratado para Gal-1 con un nivel de control del biomarcador comprende comparar el nivel del biomarcador en la muestra del individuo (que necesita tratamiento o que está siendo tratado para Gal-1) con un nivel base o de referencia, en donde, si un nivel del biomarcador en la muestra del individuo (que necesita tratamiento o que está siendo tratado para Gal-1) es elevado, está aumentado o es superior en comparación con el nivel base o de referencia, esto es indicativo de que el individuo padece Gal-1 y/o necesita tratamiento; y/o en donde, si un nivel del biomarcador en la muestra del individuo (que necesita tratamiento o que está siendo tratado para Gal-1) está disminuido o es inferior en comparación con el nivel base, esto es indicativo de que el individuo no padece, que está siendo tratado con éxito para Gal-1, o que no necesita tratamiento para Gal-1. Cuanto más fuerte sea la reducción (por ejemplo, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces menor y/o al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, o al menos un 100% de reducción) del nivel de un biomarcador, por ejemplo, galactosa-1-fosfato, galactosa, galactitol, galactonato y/u 8-hidroxi-2-desoxiguanosina, dentro de cierto período de tiempo, por ejemplo, en el plazo de 6 horas, en el plazo de 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas o 72 horas, y/o durante un tiempo determinado, por ejemplo, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas, 144 horas 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses, etc., tanto más éxito tendrá una terapia, tal como, por ejemplo, una terapia de ARNm de la invención (por ejemplo, una dosis única o un régimen múltiple).
Una reducción de al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos un 100% o más del nivel de biomarcador, en particular, en fluido corporal (por ejemplo, plasma, suero, glóbulos rojos (RBC), orina, por ejemplo, sedimento urinario) o en uno o más tejidos en un individuo (por ejemplo, hígado), por ejemplo, galactosa-1-fosfato, galactosa, galactitol, galactonato y/u 8-hidroxi-2-desoxiguanosina, en un plazo de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más días después de la administración es indicativa de una dosis adecuada para el tratamiento exitoso de Gal-1, en donde la reducción, tal como se usa en la presente memoria, preferiblemente significa que el nivel de biomarcador determinado al final de un período de tiempo especificado (por ejemplo, después de la administración, por ejemplo, de una dosis intravenosa única) se compara con el nivel del mismo biomarcador determinado al comienzo de dicho período de tiempo (por ejemplo, antes de la administración de dicha dosis). Los periodos de tiempo ejemplares incluyen 12, 24, 48, 72, 96, 120 o 144 horas después de la administración, en particular 24, 48, 72 o 96 horas después de la administración.
Una reducción sostenida en los niveles de sustrato (por ejemplo, biomarcadores tales como galactosa-1-fosfato, galactosa, galactitol, galactonato y/u 8-hidroxi-2-desoxiguanosina) es particularmente indicativa de la dosificación terapéutica de ARNm y/o regímenes de administración exitosos para el tratamiento de Gal-1. Tal reducción sostenida puede denominarse en la presente memoria “duración” del efecto. En realizaciones ejemplares, una reducción de al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, o al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99%, al menos aproximadamente un 100% o más del nivel de biomarcador, en particular, en un fluido corporal (por ejemplo, plasma, suero, RBC, orina, por ejemplo, sedimento urinario) o en uno o más tejidos en un individuo (por ejemplo, hígado), por ejemplo, galactosa-1-fosfato, galactosa, galactitol, galactonato y/u 8-hidroxi-2-desoxiguanosina, en un plazo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más días después de la administración es indicativa de un enfoque terapéutico exitoso. En realizaciones ejemplares, se prefiere la reducción sostenida en los niveles de sustrato (por ejemplo, biomarcador) en una o más muestras (por ejemplo, fluidos y/o tejidos). Por ejemplo, las terapias de ARNm que dan como resultado una reducción sostenida en galactosa-1-fosfato, galactosa, galactitol, galactonato y/u 8-hidroxi-2-desoxiguanosina (como se define en la presente memoria), opcionalmente en combinación con una reducción sostenida de dicho biomarcador en al menos un tejido, preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco o más tejidos, son indicativas de un tratamiento exitoso.
En algunas realizaciones, una dosis única de una terapia de ARNm de la invención es de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.8 mpk. De aproximadamente 0.3 a aproximadamente 0.7 mpk, de aproximadamente 0.4 a aproximadamente 0.8 mpk, o de aproximadamente 0.5 mpk. En otra realización, una dosis única de una terapia de ARNm de la invención es inferior a 1.5 mpk, inferior a 1.25 mpk, inferior a 1 mpk o inferior a 0.75 mpk.
26. Composiciones y Formulaciones para el Uso
Ciertos aspectos de la invención, como se definen por las reivindicaciones, están dirigidos a composiciones o formulaciones que comprenden cualquiera de los polinucleótidos divulgados anteriormente.
En algunas realizaciones, la composición o formulación de la invención comprende:
(29) un polinucleótido (es decir, un ARNm) que comprende una secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a la secuencia (es decir, un ORF) que codifica un polipéptido de GALT (por ejemplo, la secuencia de tipo silvestre, fragmento funcional, o variante del mismo), en donde el polinucleótido comprende al menos una nucleobase modificada químicamente, por ejemplo, 5-metoxiuracilo (por ejemplo, en donde al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 99% o un 100% de los uracilos son 5-metoxiuracilos), y en donde el polinucleótido comprende además un sitio de unión de miARN, por ejemplo, un sitio de unión de miARN que se une a miR-142 (por ejemplo, un sitio de unión de miR-142-3p o miR-142-5p) y/o un sitio de unión de miARN que se une a miR-126 (por ejemplo, un sitio de unión de miR-126-3p o miR-126-5p); y
(ii) un agente de administración que comprende un compuesto que tiene la Fórmula (IA), por ejemplo, el Compuesto 18. En algunas realizaciones, el agente de administración es una nanopartícula lipídica que comprende el Compuesto 18. En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica o el agente de administración comprenden el Compuesto 18, DSPC, Colesterol y el Compuesto 428, por ejemplo, con una relación molar de aproximadamente 50:10:38.5:1.5.
En algunas realizaciones, el contenido de uracilo o timina del ORF en relación con el contenido mínimo teórico de uracilo o timina de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de GALT (%Utm o%Ttm), está entre aproximadamente un 100% y aproximadamente un 150%.
Los polinucleótidos, composiciones o formulaciones se pueden usar para tratar y/o prevenir enfermedades, trastornos o estados relacionados con GALT, por ejemplo, Gal-1.
27. Formas de Administración
Los polinucleótidos, composiciones farmacéuticas y formulaciones descritos anteriormente pueden administrarse por cualquier vía que conduzca a un resultado terapéuticamente eficaz. Éstas incluyen, pero no se limitan a, enteral (en el intestino), gastroenteral, epidural (en la duramadre), oral (a través de la boca), transdérmica, peridural, intracerebral (en el cerebro), intracerebroventricular (en los ventrículos cerebrales), epicutánea (aplicación sobre la piel), intradérmica, (en la piel misma), subcutánea (bajo la piel), administración nasal (a través de la nariz), intravenosa (en una vena), bolo intravenoso, goteo intravenoso, intraarterial (en una arteria), intramuscular (en un músculo), intracardiaca (en el corazón), infusión intraósea (en la médula ósea), intratecal (en el canal espinal), intraperitoneal, (infusión o inyección en el peritoneo), infusión intravesical, intravítrea, (a través del ojo), inyección intracavernosa (en una cavidad patológica) intracavitaria (en la base del pene), administración intravaginal, intrauterina, administración extraamniótica, transdérmica (difusión a través de la piel intacta para distribución sistémica), a través de la mucosa (difusión a través de una membrana mucosa), transvaginal, insuflación (inhalación), sublingual, sublabial, enema, colirio (sobre la conjuntiva), en gotas óticas, auricular (en o a través del oído), bucal (dirigida hacia la mejilla), conjuntival, cutánea, dental (a un diente o dientes), electro-ósmosis, endocervical, endosinusal, endotraqueal, extracorpórea, hemodiálisis, infiltración, intersticial, intraabdominal, intraamniótica, intraarticular, intrabiliar, intrabronquial, intrabursal, intracartilaginosa (dentro de un cartílago), intracaudal (dentro de la cola de caballo), intracisternal (dentro de la cisterna magna cerebelomedular), intracorneal (dentro de la córnea), dental intracornal, intracoronaria (dentro de las arterias coronarias), intracorporus cavernosum (dentro de los espacios dilatables de los cuerpos cavernosos del pene), intradiscal (dentro de un disco), intraductal (dentro de un conducto de una glándula), intraduodenal (dentro del duodeno), intradural (dentro o debajo de la dura), intraepidérmica (a la epidermis), intraesofágica (al esófago), intragástrica (dentro del estómago), intragingival (dentro de las encías), intraileal (dentro de la porción distal del intestino delgado), intralesional (dentro de o introducidos directamente en una lesión localizada), intraluminal (dentro de un lumen de un tubo), intralinfática (dentro de la linfa), intramedular (dentro de la cavidad medular de un hueso), intrameníngea (dentro de las meninges), intraocular (dentro del ojo), intraovárica (dentro del ovario), intrapericárdica (dentro del pericardio), intrapleural (dentro de la pleura), intraprostática (dentro de la glándula prostática), intrapulmonar (dentro de los pulmones o sus bronquios), intrasinal (dentro de los senos nasales o periorbitarios), intraespinal (dentro de la columna vertebral), intrasinovial (dentro de la cavidad sinovial de una articulación), intratendinosa (dentro de un tendón), intratesticular (dentro del testículo), intratecal (dentro del líquido cefalorraquídeo a cualquier nivel del eje cerebroespinal), intratorácica (dentro del tórax), intratubular (dentro de los túbulos de un órgano), intratimpánica (dentro del aurus media), intravascular (dentro de un vaso o vasos), intraventricular (dentro de un ventrículo), iontoforesis (por medio de corriente eléctrica donde iones de sales solubles migran a los tejidos del cuerpo), irrigación (bañar o limpiar heridas abiertas o cavidades corporales), laríngea (directamente sobre la laringe), nasogástrica (a través de la nariz y al estómago), técnica de vendaje oclusivo (administración por vía tópica que luego se cubre con un vendaje que ocluye la zona), oftálmica (al ojo externo), orofaríngea (directamente a la boca y faringe), parenteral, percutánea, periarticular, peridural, perineural, periodontal, rectal, respiratoria (dentro del tracto respiratorio mediante inhalación oral o nasal para efecto local o sistémico), retrobulbar (detrás de la protuberancia o detrás del globo ocular), intramiocárdica (entryo en el miocardio), tejido blyo, subaracnoidea, subconjuntival, submucosal, tópica, transplacentaria (a través de o por la placenta), transtraqueal (a través de la pared de la tráquea), transtimpánica (por o a través de la cavidad timpánica), ureteral (al uréter), uretral (a la uretra), vaginal, bloqueo caudal, diagnóstico, bloqueo nervioso, perfusión biliar, perfusión cardiaca, fotoféresis o espinal. En realizaciones específicas, las composiciones pueden administrarse de una manera que les permita atravesar la barrera hematoencefálica, la barrera vascular u otra barrera epitelial. En algunas realizaciones, una formulación para una vía de administración puede incluir al menos un ingrediente inactivo.
Los polinucleótidos (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT o un fragmento funcional o una variante del mismo) pueden aportarse a una célula desnudos. Tal como se usa en la presente memoria, “desnudos” se refiere a aportar polinucleótidos libres de agentes que promuevan la transfección. Los polinucleótidos desnudos pueden aportarse a la célula utilizyo vías de administración conocidas en la técnica y descritas en la presente memoria.
Los polinucleótidos (por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de GALT o un fragmento funcional o una variante del mismo) se pueden formular, usyo los métodos descritos en la presente memoria. Las formulaciones pueden contener polinucleótidos, que pueden ser modificados y/o no modificados. Las formulaciones pueden incluir además, pero no se limitan a, agentes de penetración celular, un vehículo farmacéuticamente aceptable, un agente de administración, un polímero bioerosionable o biocompatible, un disolvente, y un depósito de administración de liberación sostenida. Los polinucleótidos formulados pueden aportarse a la célula utilizyo vías de administración conocidas en la técnica y descritas en la presente memoria.
Una composición farmacéutica para administración parenteral puede comprender al menos un ingrediente inactivo. Cualquiera o ninguno de los ingredientes inactivos utilizados puede haber sido aprobado por la US Food y Drug Administration (FDA). Una lista no exhaustiva de ingredientes inactivos para uso en composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluye ácido clorhídrico, manitol, nitrógeno, acetato de sodio, cloruro de sodio e hidróxido de sodio.
Es posible formular preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones oleaginosas o acuosas inyectables estériles, de acuerdo con la técnica conocida utilizyo agentes de dispersión, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluentes y/o disolventes parenteralmente aceptables no tóxicos, por ejemplo, una solución en 1,3-butanodiol. Entre los disolventes y vehículos aceptables que pueden emplearse se encuentran agua, solución de Ringer, U.S.P., y solución isotónica de cloruro de sodio. Los aceites fijos estériles se emplean de manera convencional como medio disolvente o de suspensión. Para este fin, se puede utilizar cualquier aceite fijo suave, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Pueden utilizarse ácidos grasos, tales como ácido oleico, en la preparación de inyectables. La formulación estéril también puede comprender coadyuvantes tales como anestésicos locales, agentes de conservación y agentes tampón.
Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias y/o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se puedan disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
Las formulaciones inyectables pueden ser para inyección directa en una zona de un tejido, órgano y/o individuo. Como un ejemplo no limitativo, puede inyectarse directamente una formulación en un tejido, órgano y/o individuo mediante inyección intramiocárdica en la zona isquémica. (Véase, por ejemplo, Zangi et al. Nature Biotechnology 2013).
Para prolongar el efecto de un ingrediente activo, frecuentemente es deseable ralentizar la absorción del ingrediente activo de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante la utilización de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con poca solubilidad en agua. Entonces, la velocidad de absorción del fármaco depende de su velocidad de disolución, la cual, a su vez, puede depender del tamaño de los cristales y de la forma cristalina. Por ejemplo, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se producen por medio de la formación de matrices de microcápsulas del fármaco en polímeros biodegradables tales como poliláctido-poliglicólido. Según la relación de fármaco a polímero y la naturaleza del polímero concreto empleado, es posible controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones de depósito inyectables se preparan atrapyo el fármaco en liposomas o microemulsiones que sean compatibles con tejidos corporales.
28. Kits y Dispositivos
a. Kits
La divulgación proporciona diversos kits para utilizar de manera conveniente y/o efectiva los nucleótidos de la presente divulgación. Típicamente, los kits comprenderán números y/o cantidades suficientes de componentes para permitir que un usuario realice múltiples tratamientos de uno o más individuos y/o para llevar a cabo múltiples experimentos.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona kits que comprenden las moléculas (polinucleótidos) de la divulgación.
Dichos kits pueden ser para la producción de proteínas, comprendiendo un primer polinucleótido que comprende una región traducible. El kit puede comprender además el envase e instrucciones y/o un agente de administración para formar una composición de formulación. El agente de administración puede comprender una solución salina, una solución tamponada, un lipidoide o cualquier agente de administración divulgado en la presente memoria.
La solución tampón puede incluir cloruro de sodio, cloruro de calcio, fosfato y/o EDTA. La solución tampón puede incluir, pero no se limita a, solución salina, solución salina con calcio 2 mM, sacarosa al 5%, sacarosa al 5% con calcio 2 mM, manitol al 5%, manitol al 5% con calcio 2 mM, lactato de Ringer, cloruro de sodio, cloruro de sodio con manosa y calcio 2 mM (véase, por ejemplo, la Publicación de EE.UU. NO 20120258046). Las soluciones tampón pueden precipitarse o liofilizarse. La cantidad de cada componente puede variarse para permitir formulaciones tampón simples o salinas con mayor concentración compatibles y reproducibles. Los componentes también pueden variarse para aumentar la estabilidad del ARN modificado en la solución tampón en un período de tiempo y/o en diversas condiciones. En un aspecto, la presente divulgación proporciona kits para la producción de proteínas, que comprenden: un polinucleótido que comprende una región traducible, proporcionado en una cantidad eficaz para producir una cantidad deseada de una proteína codificada por la región traducible cuyo se introduce en una célula diana; un segundo polinucleótido que comprende un ácido nucleico inhibidor, proporcionado en una cantidad eficaz para inhibir sustancialmente la respuesta inmunitaria innata de la célula; y el envase e instrucciones.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona kits para la producción de proteínas, que comprenden un polinucleótido que comprende una región traducible, presentyo el polinucleótido degradación por una nucleasa celular reducida, y el envase e instrucciones.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona kits para la producción de proteínas, que comprenden un polinucleótido que comprende una región traducible, presentyo el polinucleótido degradación por una nucleasa celular reducida, y una célula de mamífero adecuada para la traducción de la región traducible del primer ácido nucleico.
b. Dispositivos
La presente divulgación proporciona dispositivos que pueden incorporar polinucleótidos que codifican polipéptidos de interés. Estos dispositivos contienen en una formulación estable los reactivos para sintetizar un polinucleótido en una formulación disponible para aportarla inmediatamente a un individuo que la necesite, tal como un paciente humano.
Se pueden emplear dispositivos para la administración para aportar los polinucleótidos de la presente divulgación de acuerdo con regímenes de dosificación única, múltiple o dividida enseñados en la presente memoria. Tales dispositivos se enseñan, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud Internacional NO WO2013151666.
Se contemplan métodos y dispositivos conocidos en la técnica para la administración múltiple a células, órganos y tejidos para su uso junto con los métodos y composiciones divulgados en la presente memoria. Estos incluyen, por ejemplo, aquellos métodos y dispositivos que tienen múltiples agujas, dispositivos híbridos que emplean, por ejemplo, lúmenes o catéteres, así como dispositivos que utilizan mecanismos impulsados por radiación, calor o corriente eléctrica.
De acuerdo con la presente divulgación, estos dispositivos de administración múltiple pueden utilizarse para aportar las dosis únicas, múltiples o divididas contempladas en la presente memoria. Tales dispositivos se enseñan, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud Internacional NO WO2013151666.
El polinucleótido se puede administrar por vía subcutánea o intramuscular a través de al menos 3 agujas a tres sitios diferentes, opcionalmente adyacentes, simultáneamente o dentro de un período de 60 minutos (por ejemplo, administración a 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sitios simultáneamente o dentro de un período de 60 minutos).
c. Métodos y Dispositivos que utilizan catéteres y/o lúmenes
Se pueden emplear métodos y dispositivos que usen catéteres y lúmenes para administrar los polinucleótidos de la presente divulgación en un programa de dosificación única, múltiple o dividida. Tales métodos y dispositivos se describen en la Publicación de Solicitud Internacional NO WO2013151666.
d. Métodos y Dispositivos que utilizan corriente eléctrica
Se pueden emplear métodos y dispositivos que utilizan corriente eléctrica para aportar los polinucleótidos de la presente divulgación de acuerdo con los regímenes de dosificación única, múltiple o dividida que se enseñan en la presente memoria. Tales métodos y dispositivos se describen en la Publicación de Solicitud Internacional NO WO2013151666.
29. Definiciones
Para que la presente divulgación se pueda entender más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Tal como se usan en esta solicitud, excepto que se disponga expresamente lo contrario en la presente memoria, cada uno de los siguientes términos tendrá el significado expuesto posteriormente. A lo largo de toda la solicitud se exponen definiciones adicionales.
La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en, o es relevante de otro modo para, un producto o proceso dados. La invención incluye realizaciones en las que más de uno o la totalidad de los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son relevantes de otro modo para, un producto o proceso dados.
En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen las referencias a plurales a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Los términos "un" (o "uno/a"), así como las expresiones "uno/a o más" y "al menos uno/a" se pueden utilizar de manera intercambiable en la presente memoria. En ciertos aspectos, el término "un" o "una" significa "único" o "única". En otros aspectos, el término "un" o "una" incluye "dos o más" o "múltiples".
Además, “y/o”, cuyo se usa en la presente memoria, se debe considerar como divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro o la otra. Por lo tanto, se pretende que el término “y/o”, tal como se usa en una expresión tal como “A y/o B” en la presente memoria, incluya “A y B”, “A o B”, “A” (solo) y “B” (solo). Asimismo, se pretende que el término "y/o", tal como se usa en una expresión tal como "A, B y/o C", abarque cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por una persona con conocimientos corrientes de la técnica con la que está relacionada esta divulgación. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine y Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell y Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry Y Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en esta divulgación.
Dondequiera que se describan aspectos en la presente memoria con la expresión "que comprende", también se proporcionan aspectos por lo demás análogos descritos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".
Las unidades, los prefijos y los símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Cuyo se menciona un intervalo de valores, se debe entender que cada valor entero intermedio, y cada fracción del mismo, entre los límites superior e inferior mencionados de ese intervalo también se divulgan específicamente, junto con cada subintervalo entre tales valores. Los límites superior e inferior de cualquier intervalo pueden independientemente incluirse en o excluirse del intervalo, y cada intervalo en el que se incluyan cualquiera de los dos, ninguno o ambos límites también está comprendido dentro de la invención. Cuyo un valor se menciona explícitamente, debe entenderse que los valores que son aproximadamente la misma cantidad o suma que el valor mencionado también están dentro del alcance de la invención. Cuyo se divulga una combinación, cada subcombinación de los elementos de esa combinación también se divulga específicamente y está dentro del alcance de la invención. A la inversa, cuyo se divulgan individualmente diferentes elementos o grupos de elementos, también se divulgan combinaciones de los mismos. Cuyo se divulga cualquier elemento de una invención como que tiene una pluralidad de alternativas, también se divulgan con ello ejemplos de esa invención en los que cada alternativa se excluye por separado o en cualquier combinación con las otras alternativas; más de un elemento de una invención puede tener tales exclusiones, y con ello se divulgan todas las combinaciones de elementos que tienen tales exclusiones.
Se hace referencia a los nucleótidos por sus códigos de letra única comúnmente aceptados. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3'. En la presente memoria, se hace referencia a las nucleobases por sus símbolos de una letra comúnmente conocidos recomendados por la Biochemical Nomenclature Commission (Comisión de Nomenclatura Bioquímica) IUPAC-IUB. Por consiguiente, A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina, T representa timina, U representa uracilo.
En la presente memoria, se hace referencia a los aminoácidos ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por sus símbolos de una letra recomendados por la Biochemical Nomenclature Commission IUPAC-IUB. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi.
Aproximadamente: El término "aproximadamente" tal como se usa en conexión con un valor numérico a lo largo de toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones indica un intervalo de precisión, familiar y aceptable para un experto en la técnica, tal intervalo de precisión es ± 10%.
Cuyo se proporcionan intervalos, se incluyen los extremos. Además, a menos que se indique lo contrario, o sea evidente de otro modo por el contexto y la comprensión de una persona con conocimientos corrientes de la técnica, los valores que se expresan como intervalos pueden adoptar cualquier valor o subintervalo específicos dentro de los intervalos expuestos en diferentes realizaciones de la invención, hasta una décima parte de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Administrado en combinación:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "administrado en combinación" o "administración combinada" significa que dos o más agentes se administran a un individuo al mismo tiempo o dentro de un intervalo tal que pueda haber una superposición de un efecto de cada agente sobre el paciente. En algunas realizaciones, se administran en el plazo de aproximadamente 60, 30, 15, 10, 5 0 1 minutos entre sí. En algunas realizaciones, las administraciones de los agentes están espaciadas suficientemente próximas entre sí para conseguir un efecto combinatorio (por ejemplo, sinérgico).
Sustitución de aminoácidos:La expresión "sustitución de aminoácidos" se refiere a reemplazar un residuo de aminoácido presente en una secuencia precursora o de referencia (por ejemplo, una secuencia de GALT de tipo silvestre) por otro residuo de aminoácido. Un aminoácido puede estar sustituido en una secuencia precursora o de referencia (por ejemplo, una secuencia polipeptídica de GALT de tipo silvestre), por ejemplo, a través de síntesis química de péptidos o a través de métodos recombinantes conocidos en la técnica. Por consiguiente, una referencia a una "sustitución en la posición X" se refiere a la sustitución de un aminoácido presente en la posición X por un residuo de aminoácido alternativo. En algunos aspectos, los patrones de sustitución pueden describirse de acuerdo con el esquema AnY, en el que A es el código de una sola letra correspondiente al aminoácido presente de forma natural u original en la posición n, e Y es el residuo de aminoácido sustituyente. En otros aspectos, los patrones de sustitución pueden describirse de acuerdo con el esquema An (YZ), en el que A es el código de una sola letra correspondiente al residuo de aminoácido que sustituye al aminoácido presente de forma natural u original en la posición X, e Y y Z son residuos de aminoácido sustituyentes alternativos.
En el contexto de la presente divulgación, las sustituciones (aunque se denominen sustitución de aminoácidos) se llevan a cabo a nivel de ácido nucleico, es decir, la sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido alternativo se lleva a cabo sustituyendo el codón que codifica el primer aminoácido por un codón que codifica el segundo aminoácido.
Animal:Tal como se usa en la presente memoria, el término “animal” hace referencia a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, “animal” se refiere a seres humanos, en cualquier etapa del desarrollo. En algunas realizaciones, “animal” se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa del desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado, un primate o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces y gusanos. En algunas realizaciones, el animal es un animal transgénico, un animal con modificación genética o un clon.
Aproximadamente:Tal como se usa en la presente memoria, el término “aproximadamente”, según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En ciertas realizaciones, el término “aproximadamente” se refiere a un intervalo de valores que se encuentra dentro de un 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia indicado, a menos que se indique lo contrario, o resulte evidente lo contrario a partir del contexto (salvo que tal número supere el 100% de un valor posible).
Asociado con:Tal como se usa en la presente memoria con respecto a una enfermedad, la expresión "asociado con" significa que el síntoma, medición, característica o estado en cuestión está vinculado al diagnóstico, desarrollo, presencia o evolución de esa enfermedad. Como asociación puede, pero no necesita, estar ligada causativamente a la enfermedad. Por ejemplo, los síntomas, secuelas, o cualesquiera efectos que provoquen una disminución en la calidad de vida de un paciente de Gal-1 se consideran asociados con Gal-1 y se pueden tratar, mejorar o prevenir administryo los polinucleótidos de la presente divulgación a un individuo que lo necesite.
Cuyo se usan con respecto a dos o más restos, las expresiones "asociado con", "conjugado", "enlazado", "unido" y "atado", cuyo se usan con respecto a dos o más restos, significan que los restos están físicamente asociados o conectados entre sí, ya sea directamente o a través de uno o más restos adicionales que sirven de agente de enlace, para formar una estructura que es suficientemente estable para que los restos permanezcan físicamente asociados en las condiciones en las que se usa la estructura, por ejemplo, condiciones fisiológicas. Una "asociación" no necesita ser estrictamente a través de un enlace químico covalente directo. También puede sugerir un enlace iónico o de hidrógeno o una conectividad basada en hibridación suficientemente estable para que las entidades "asociadas" permanezcan físicamente asociadas.
Bifuncional: Tal como se usa en la presente memoria, el término "bifuncional" se refiere a cualquier sustancia, molécula o resto que sea capaz de o que mantenga al menos dos funciones. Las funciones pueden afectar el mismo resultado o un resultado diferente. La estructura que produce la función puede ser la misma o una diferente. Por ejemplo, los ARN modificados bifuncionales de la presente divulgación pueden codificar un péptido de GALT (una primera función), mientras que aquellos nucleósidos que comprenden el ARN codificante son, por sí mismos, capaces de prolongar la semivida del ARN (segunda función). En este ejemplo, la administración del ARN modificado bifuncional a un individuo -372 -econd- 372 -nc a partir de una proteína -372 -econd- 372 -ncy produciría no sólo un péptido o molécula de proteína que puede mejorar o tratar una enfermedad o estados, sino que también mantendría un ARN modificado en cuanto a la población, presente en el individuo durante un período de tiempo prolongado. En otros aspectos, un ARNm modificado bifuncional puede ser una molécula quimérica que comprenda, por ejemplo, un ARN que codifique un péptido de GALT (una primera función) y una segunda proteína ya sea fusionada a la primera proteína o coexpresada con la primera proteína.
Biocompatible:Tal como se usa en la presente memoria, el término “biocompatible” significa compatible con células, tejidos, órganos o sistemas vivos, que presenta poco o ningún riesgo de lesión, toxicidad o rechazo por el sistema inmunitario.
Biodegradable:Tal como se usa en la presente memoria, el término "biodegradable" significa capaz de descomponerse en productos inocuos por la acción de seres vivos.
Biológicamente activo:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier sustancia que tiene actividad en un sistema biológico y/u organismo. Por ejemplo, se considera biológicamente activa una sustancia que, cuyo se administra a un organismo, tiene un efecto biológico en ese organismo. En realizaciones concretas, un polinucleótido de la presente divulgación puede considerarse biológicamente activo si incluso una parte del polinucleótido es biológicamente activa o imita una actividad considerada biológicamente relevante.
Quimera:Tal como se usa en la presente memoria, "quimera" es una entidad que tiene dos o más partes o regiones incongruentes o heterogéneas. Por ejemplo, una molécula quimérica puede comprender una primera parte que comprenda un polipéptido de GALT, y una segunda parte (por ejemplo, fusionada genéticamente a la primera parte) que comprenda una segunda proteína terapéutica (por ejemplo, una proteína con una actividad enzimática distinta, un resto de unión de antígeno, o un resto capaz de prolongar la semivida plasmática de GALT, por ejemplo, una región Fc de un anticuerpo).
Optimización en cuanto a la secuencia:La expresión “optimización en cuanto a la secuencia” se refiere a un proceso o serie de procesos mediante los cuales las nucleobases en una secuencia de ácido nucleico de referencia se reemplazan por nucleobases alternativas, dyo como resultado una secuencia de ácido nucleico con propiedades mejoradas, por ejemplo, expresión de proteína mejorada o inmunogenicidad disminuida.
En general, el objetivo en la optimización en cuanto a la secuencia es producir una secuencia de nucleótidos sinónima que codifique la misma secuencia de polipéptidos codificada por la secuencia de nucleótidos de referencia. Por lo tanto, no hay sustituciones de aminoácidos (como resultado de una optimización en cuanto a los codones) en el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos optimizada en cuanto a los codones con respecto al polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de referencia.
Sustitución de codones: Las expresiones "sustitución de codones" o "reemplazo de codones" en el contexto de
la optimización en cuanto a la secuencia se refieren al reemplazo de un codón presente en una secuencia de ácido nucleico de referencia por otro codón. Un codón puede sustituirse en una secuencia de ácido nucleico de referencia, por ejemplo, a través de síntesis química de péptidos o a través de métodos recombinantes conocidos en la técnica. Por consiguiente, las referencias a una "sustitución" o "reemplazo" en una determinada ubicación en una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, un ARNm) o dentro de una determinada región o subsecuencia de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, un ARNm) se refieren a la sustitución de un codón en tal ubicación o región por un codón alternativo.
Tal como se usan en la presente memoria, las expresiones "región codificante" y "región que codifica" y variantes gramaticales de las mismas se refieren a un Marco de Lectura Abierta (ORF) en un polinucleótido que tras la expresión produce un polipéptido o proteína.
Compuesto:Tal como se usa en la presente memoria, el término "compuesto" está destinado a incluir todos los estereoisómeros e isótopos de la estructura representada. Tal como se usa en la presente memoria, el término "estereoisómero" significa cualquier isómero geométrico (por ejemplo, isómero cis y trans), enantiómero o diastereómero de un compuesto. La presente divulgación abarca cualesquiera y todos los estereoisómeros de los compuestos descritos en la presente memoria, incluyendo formas estereoméricamente puras (por ejemplo, geométricamente puras, enantioméricamente puras o diastereoméricamente puras) y mezclas enantioméricas y estereoisoméricas, por ejemplo, racematos. Las mezclas enantioméricas y estereoméricas de compuestos y los medios para resolverlos en sus enantiómeros o estereoisómeros componentes son bien conocidos. “Isótopos” hace referencia a átomos que tienen el mismo número atómico, pero diferentes números másicos que resultan de un número diferente de neutrones en los núcleos. Por ejemplo, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio. Además, un compuesto, sal o complejo de la presente divulgación pueden prepararse en combinación con moléculas de disolvente o de agua para formar solvatos e hidratos mediante métodos de rutina.
Poner en contacto:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "poner en contacto" significa establecer una conexión física entre dos o más entidades. Por ejemplo, poner en contacto una célula de mamífero con una composición de nanopartículas significa que se hace que la célula de mamífero y una nanopartícula compartan una conexión física. Los métodos para poner en contacto células con entidades externas tantoin vivocomoex vivoson bien conocidos en las técnicas biológicas. Por ejemplo, la puesta en contacto de una composición de nanopartículas y una célula de mamífero dispuesta dentro de un mamífero se puede realizar por diversas vías de administración (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intradérmica y subcutánea) y puede involucrar diversas cantidades de composiciones de nanopartículas. Además, una composición de nanopartículas puede entrar en contacto con más de una célula de mamífero.
Sustitución de aminoácidos conservativa:Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es aquella en la que el residuo de aminoácido en una secuencia de proteínas se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácido con cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina o histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina o cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina o triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano o histidina). Por lo tanto, si un aminoácido en un polipéptido se reemplaza por otro aminoácido de la misma familia de cadenas laterales, la sustitución de aminoácidos se considera conservativa. En otro aspecto, una serie de aminoácidos puede reemplazarse de manera conservativa por una serie estructuralmente similar que difiera en orden y/o composición de los miembros de la familia de cadenas laterales.
Sustitución de aminoácidos no conservativa:Las sustituciones de aminoácidos no conservativas incluyen aquellas en las que (i) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva (por ejemplo, Arg, His o Lys) sustituye a o está sustituido por un residuo electronegativo (por ejemplo, Glu o Asp), (ii) un residuo hidrófilo (por ejemplo, Ser o Thr) sustituye a o está sustituido por un residuo hidrófobo (por ejemplo, Ala, Leu, Ile, Phe o Val), (iii) una cisteína o prolina sustituye a o está sustituida por cualquier otro residuo, o (iv) un residuo que tiene una cadena lateral hidrófoba o aromática voluminosa (por ejemplo, Val, His, Ile o Trp) sustituye a o está sustituido por otro que tiene una cadena lateral más pequeña (por ejemplo, Ala o Ser) o que no tiene cadena lateral (por ejemplo, Gly).
Otras sustituciones de aminoácidos pueden ser identificadas fácilmente por trabajadores con conocimientos corrientes. Por ejemplo, para el aminoácido alanina, se puede tomar una sustitución de cualquiera de las siguientes: D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteína y D-cisteína. Para la lisina, un reemplazo puede ser uno cualquiera de los siguientes: D-lisina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornitina o D-ornitina. En general, las sustituciones en regiones funcionalmente importantes de las que puede esperarse que induzcan cambios en las propiedades de polipéptidos aislados son aquellas en las que (i) un residuo polar, por ejemplo, serina o treonina, sustituye a (o se sustituye por) un residuo hidrófobo, por ejemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina o alanina; (ii) un residuo de cisteína sustituye a (o se sustituye por) cualquier otro residuo; (iii) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisina, arginina o histidina, sustituye a (o se sustituye por) un residuo que tiene una cadena lateral electronegativa, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico; o (iv) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, sustituye a (o se sustituye por) otro que no tiene tal cadena lateral, por ejemplo, glicina. La probabilidad de que una de las sustituciones no conservativas anteriores pueda alterar propiedades funcionales de la proteína también se correlaciona con la posición de la sustitución con respecto a las regiones funcionalmente importantes de la proteína: algunas sustituciones no conservativas pueden, en consecuencia, tener poco o ningún efecto sobre propiedades biológicas.
Conservado:Tal como se usa en la presente memoria, el término "conservado" se refiere a nucleótidos o residuos de aminoácidos de una secuencia de polinucleótidos o secuencia de polipéptidos, respectivamente, que son aquellos que se producen sin alterar en la misma posición de dos o más secuencias que se comparan. Los nucleótidos o aminoácidos que están relativamente conservados son aquellos que están conservados entre secuencias más relacionadas que los nucleótidos o aminoácidos que aparecen en otra parte de las secuencias.
En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están “completamente conservadas” si son un 100% idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están “altamente conservadas” si son al menos un 70% idénticas, al menos un 80% idénticas, al menos un 90% idénticas o al menos un 95% idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están “altamente conservadas” si son aproximadamente un 70% idénticas, aproximadamente un 80% idénticas, aproximadamente un 90% idénticas, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 98% o aproximadamente un 99% idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son al menos un 30% idénticas, al menos un 40% idénticas, al menos un 50% idénticas, al menos un 60% idénticas, al menos un 70% idénticas, al menos un 80% idénticas, al menos un 90% idénticas o al menos un 95% idénticas entre sí. En algunas realizaciones, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son aproximadamente un 30% idénticas, aproximadamente un 40% idénticas, aproximadamente un 50% idénticas, aproximadamente un 60% idénticas, aproximadamente un 70% idénticas, aproximadamente un 80% idénticas, aproximadamente un 90% idénticas, aproximadamente un 95% idénticas, aproximadamente un 98% idénticas o aproximadamente un 99% idénticas entre sí. La conservación de la secuencia puede aplicarse a toda la longitud de un polinucleótido o polipéptido o puede aplicarse a una porción, región o característica del mismo.
Liberación controlada:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéutica que se ajusta a un patrón concreto de liberación para lograr un resultado terapéutico.
Cíclico o Ciclizado:Tal como se usa en la presente memoria, el término "cíclico" se refiere a la presencia de un bucle continuo. Las moléculas cíclicas no necesitan ser circulares, sólo estar unidas para formar una cadena no rota de subunidades. Las moléculas cíclicas tales como el ARN modificado por ingeniería o ARNm de la presente invención pueden ser unidades individuales o multímeros o comprender uno o más componentes de una estructura compleja o de orden superior.
Citotóxico:Tal como se usa en la presente memoria, "citotóxico" se refiere a matar o provocar un efecto perjudicial, tóxico o mortal sobre una célula (por ejemplo, una célula de mamífero (por ejemplo, una célula humana)), bacteria, virus, hongo, protozoo, parásito, prión o una combinación de los mismos.
Aportar.Tal como se usa en la presente memoria, el término "aportar" significa proporcionar una entidad a un destino. Por ejemplo, aportar un polinucleótido a un individuo puede implicar administrar una composición de nanopartículas que incluye el polinucleótido al individuo (por ejemplo, por una vía intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea). La administración de una composición de nanopartículas a un mamífero o célula de mamífero puede implicar poner en contacto una o más células con la composición de nanopartículas.
Agente de administración:Tal como se usa en la presente memoria, "agente de administración" se refiere a cualquier sustancia que facilite, al menos en parte, la administraciónin vivo, in vitrooex vivode un polinucleótido a células diana.
Desestabilizado:Tal como se usan en la presente memoria, el término "desestabilizar" o "región desestabilizante" significan una región o molécula que es menos estable que una forma inicial, de tipo silvestre o nativa de la misma región o molécula.
Diastereómero:Tal como se usa en la presente memoria, el término "diastereómero" significa estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí y no son superponibles entre sí.
D igerir:Tal como se usa en la presente memoria, el término "digerir" significa separar en piezas o componentes más pequeños. Cuyo se hace referencia a polipéptidos o proteínas, la digestión da como resultado la producción de péptidos.
Distal:Tal como se usa en la presente memoria, el término "distal" significa situado lejos del centro o lejos de un punto o región de interés.
Dominio:Tal como se usa en la presente memoria, al hacer referencia a polipéptidos, el término "dominio" se refiere a un motivo de un polipéptido que tiene una o más características o propiedades funcionales o estructurales identificables (por ejemplo, capacidad de unión, servir de sitio para interacciones entre proteínas).
Régimen de dosificación:Tal como se usa en la presente memoria, un “régimen de dosificación” o un “régimen de dosificación” es un programa de administración o régimen de tratamiento, profilaxis o cuidados paliativos determinado por el médico.
Cantidad eficaz:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "cantidad eficaz" de un agente es esa cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, por ejemplo, resultados clínicos, y, como tal, una "cantidad eficaz" depende del contexto en el que se esté aplicyo. Por ejemplo, en el contexto de la administración de un agente que trata una deficiencia de proteína (por ejemplo, una deficiencia de GALT), una cantidad eficaz de un agente es, por ejemplo, una cantidad de ARNm que exprese suficiente GALT para mejorar, reducir, eliminar o prevenir los síntomas asociados con la deficiencia de GALT, en comparación con la gravedad del síntoma observado sin la administración del agente. La expresión "cantidad eficaz" puede usarse indistintamente con "dosis eficaz", "cantidad terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéuticamente eficaz".
Enantiómero:Tal como se usa en la presente memoria, el término "enantiómero" significa cada forma ópticamente activa individual de un compuesto de la invención, que tiene una pureza óptica o un exceso enantiomérico (determinado por métodos estándar en la técnica) de al menos un 80% (es decir, al menos un 90% de un enantiómero y como máximo un 10% del otro enantiómero), al menos un 90% o al menos un 98%.
Encapsular.Tal como se usa en la presente memoria, el término "encapsular" significa encerrar, rodear o encajar.
Eficiencia de encapsulación:Tal como se usa en la presente memoria, “eficiencia de encapsulación” se refiere a la cantidad de un polinucleótido que se convierte en parte de una composición de nanopartículas, en relación con la cantidad total inicial de polinucleótido utilizada en la preparación de una composición de nanopartículas. Por ejemplo, si se encapsulan 97 mg de polinucleótido en una composición de nanopartículas de un total de 100 mg de polinucleótido inicialmente proporcionado a la composición, la eficiencia de encapsulación se puede indicar como del 97%. Tal como se usa en la presente memoria, "encapsulación" puede referirse a una caja, confinamiento, contorno o encajamiento completos, sustanciales o parciales.
Señal de escisión de proteína codificada:Tal como se usa en la presente memoria, "señal de escisión de proteína codificada" se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica una señal de escisión de proteína.
Adaptado, introducido o modificado por ingeniería:Tal como se usa en la presente memoria, las realizaciones de la divulgación están "adaptadas por ingeniería", “introducidas por ingeniería” o "modificadas por ingeniería" cuyo están diseñadas para tener una característica o propiedad, ya sea estructural o química, que varía desde un punto de partida, tipo silvestre o molécula nativa.
Administración mejorado:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "administración mejorado" significa administración de una mayor cantidad (por ejemplo, al menos 1.5 veces más, al menos 2 veces más, al menos 3 veces más, al menos 4 veces más, al menos 5 veces más, al menos 6 veces más, al menos 7 veces más, al menos 8 veces más, al menos 9 veces más, al menos 10 veces más) de un polinucleótido por una nanopartícula a un tejido diana de interés (por ejemplo, hígado de mamífero) en comparación con el nivel de administración de un polinucleótido por una nanopartícula de control a un tejido diana de interés (por ejemplo, MC3, KC2, o DLinDMA). El nivel de administración de una nanopartícula a un tejido concreto puede medirse comparyo la cantidad de proteína producida en un tejido con el peso de dicho tejido, comparyo la cantidad de polinucleótido en un tejido con el peso de dicho tejido, comparyo la cantidad de proteína producida en un tejido con la cantidad de proteína total en dicho tejido, o comparyo la cantidad de polinucleótido en un tejido con la cantidad de polinucleótido total en dicho tejido. Se entenderá que la administración mejorado de una nanopartícula a un tejido diana no necesita determinarse en un individuo que esté siendo tratado, puede determinarse en un sustituto tal como un modelo animal (por ejemplo, un modelo de rata).
Exosoma:Tal como se usa en la presente memoria, "exosoma" es una vesícula secretada por células de mamífero o un complejo involucrado en la degradación de ARN.
Expresión:Tal como se usa en la presente memoria, la "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los siguientes acontecimientos: (1) producción de un molde de ARNm a partir de una secuencia de ADN (por ejemplo, mediante transcripción); (2) procesamiento de un transcrito de ARNm (por ejemplo, mediante corte y empalme, edición, formación de casquete 5' y/o procesamiento de extremo 3'); (3) traducción de un ARNm a un polipéptido o proteína; y (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.
Ex Vivo: Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "exvivo"hace referencia a acontecimientos que ocurren fuera de un organismo (por ejemplo, animal, planta o microbio o célula o tejido de los mismos). Los acontecimientosex vivopueden tener lugar en un entorno mínimamente alterado con respecto a un entorno natural (por ejemplo,in vivo).
Característica:Tal como se usa en la presente memoria, una “característica” se refiere a una característica, una propiedad o un elemento distintivo. Las "características", cuyo se hace referencia a polipéptidos, están definidas como componentes bien determinados de una molécula basados en secuencias de aminoácidos. Las características de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la presente divulgación incluyen manifestaciones superficiales, forma conformacional local, pliegues, bucles, semibucles, dominios, semidominios, sitios, extremos o cualquier combinación de los mismos.
Formulación:Tal como se usa en la presente memoria, una "formulación" incluye al menos un polinucleótido y uno o más de los siguientes: un vehículo, un excipiente y un agente de administración.
Fragmento:Un "fragmento", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una porción. Por ejemplo, los fragmentos de proteínas pueden comprender polipéptidos obtenidos por digestión de proteína de longitud completa aislada de células cultivadas. En algunas realizaciones, un fragmento es una subsecuencia de una proteína de longitud completa (por ejemplo, GALT) en la que se han suprimido las subsecuencias N-terminal y/o C-terminal y/o internas. En algunos aspectos preferidos de la presente divulgación, los fragmentos de una proteína de la presente divulgación son fragmentos funcionales.
Funcional:Tal como se usa en la presente memoria, una molécula biológica "funcional" es una molécula biológica en una forma en la que presenta una propiedad y/o actividad por la cual se caracteriza. Por lo tanto, un fragmento funcional de un polinucleótido de la presente divulgación es un polinucleótido capaz de expresar un fragmento de GALT funcional. Tal como se usa en la presente memoria, un fragmento funcional de GALT se refiere a un fragmento de GALT de tipo silvestre (es decir, un fragmento de cualquiera de sus isoformas de origen natural), o un mutante o variante del mismo, conservyo el fragmento al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90% o al menos aproximadamente un 95% de la actividad biológica de la proteína de longitud completa correspondiente.
Enfermedad Asociada a GALT:Tal como se usan en la presente memoria, las expresiones "enfermedad asociada a GALT" o "trastorno asociado a GALT" se refieren a enfermedades o trastornos, respectivamente, que resultan de una actividad anormal de GALT (por ejemplo, disminución de la actividad o aumento de la actividad). Como ejemplo no limitativo, la galactosemia de tipo 1 es una enfermedad asociada a GALT. En la técnica se conocen numerosas variantes clínicas de galactosemia de tipo 1. Véase, por ejemplo, http:// omim. org/entry/606999.
Las expresiones “actividad enzimática de GALT”, “actividad de GALT”, “actividad de UDP-glucosa-hexosa-1-fosfato uridililtransferasa” y “actividad de Gal-1-P uridililtransferasa” se usan indistintamente en la presente divulgación y se refieren a la capacidad de GALT para convertir UDP-glucosa y galactosa-1-fosfato en glucosa-1-fosfato y UDP-galactosa como parte de la ruta de Leloir. Por consiguiente, un fragmento o variante que conserva o que tiene actividad enzimática de GALT o actividad de GALT se refiere a un fragmento o variante que tiene actividad enzimática medible para catalizar la conversión de UDP-glucosa y galactosa-1-fosfato en glucosa-1-fosfato y UDP-galactosa.
Lípido auxiliar.Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “lípido auxiliar” se refiere a un compuesto o molécula que incluye un resto lipídico (para inserción en una capa lipídica, por ejemplo, bicapa lipídica) y un resto polar (para interacción con solución fisiológica en la superficie de la capa lipídica). Típicamente, el lípido auxiliar es un fosfolípido. Una función del lípido auxiliar es “complementar” el aminolípido y aumentar la fusogenicidad de la bicapa y/o ayudar a facilitar el escape endosomal, por ejemplo, de ácido nucleico aportado a células. También se cree que los lípidos auxiliares son un componente estructural clave para la superficie de la LNP.
Homología:Tal como se usa en la presente memoria, el término “homología” se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. Generalmente, el término "homología" implica una relación evolutiva entre dos moléculas. Por lo tanto, dos moléculas que sean homólogas tendrán un ancestro evolutivo común. En el contexto de la presente invención, el término homología abarca tanto la identidad como la similitud.
En algunas realizaciones, las moléculas poliméricas se consideran "homólogas" entre sí si al menos un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de los monómeros de la molécula son idénticos (exactamente el mismo monómero) o son similares (sustituciones conservativas). El término "homólogo" hace referencia, necesariamente, a una comparación entre al menos dos secuencias (secuencias de polinucleótidos o polipéptidos).
Identidad: Tal como se usa en la presente memoria, el término "identidad" se refiere a la conservación general de monómeros entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de polinucleótidos (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de polinucleótido se puede realizar, por ejemplo, alineyo las dos secuencias con el fin de una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de ácido nucleico para su alineación óptima, y se pueden ignorar las secuencias no idénticas a los efectos de la comparación). En ciertas realizaciones, la longitud de una secuencia alineada a efectos comparativos es al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o un 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Luego, se comparan los nucleótidos en posiciones de nucleótido correspondientes. Cuyo una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta la cantidad de huecos y la longitud de cada hueco que sea necesario introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse mediante el uso de un algoritmo matemático. Cuyo se comparan el ADN y el ARN, timina (T) y uracilo (U) pueden considerarse equivalentes.
Se encuentran disponibles programas desoftwareadecuados de diversas fuentes y para la alineación de secuencias tanto de nucleótidos como de proteínas. Un programa adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es bl2seq, parte del paquete BLAST de programas disponibles en el sitio web<b>L<a>ST del Centro Nacional para la Información Biotecnológica del gobierno de los EE.UU. (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Bl2seq realiza una comparación entre dos secuencias usyo, bien el algoritmo BLASTN, bien el algoritmo BLASTp . BLASTN se usa para comparar secuencias de ácido nucleico, mientras que BLASTP se usa para comparar secuencias de aminoácidos. Otros programas adecuados son, por ejemplo, Needle, Stretcher, Water, o Matcher, parte del paquete EMBOSS de programas de bioinformática y también disponibles en el Instituto Europeo de Bioinformática (EBI, por sus siglas en inglés) en www.ebi.ac.uk/Tools/psa.
Las alineaciones de secuencia pueden realizarse usyo métodos conocidos en la técnica tales como MAFFT, Clustal (ClustalW, Clustal X o Clustal Omega), MUSCLE, etc.
Diferentes regiones dentro de una única secuencia diana de polinucleótidos o polipéptidos que se alinea con una secuencia de referencia de polinucleótidos o polipéptidos pueden tener cada una sus propios porcentajes de identidad de secuencia. Cabe señalar que el valor del porcentaje de identidad de secuencia se redondea al décimo más cercano. Por ejemplo, 80.11, 80.12, 80.13 y 80.14 se redondean hacia abajo a 80.1, mientras que 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 y 80.19 se redondean hacia arriba a 80.2. También cabe señalar que el valor de longitud será siempre un número entero.
En ciertos aspectos, se calcula el porcentaje de identidad “%ID” de una primera secuencia de aminoácidos (o secuencia de ácido nucleico) con respecto a una segunda secuencia de aminoácidos (o secuencia de ácido nucleico) como%ID = 100 x (Y/Z), en donde Y es la cantidad de residuos de aminoácidos (o nucleobases) calificados como parejas idénticas en la alineación de la primera y la segunda secuencias (alineadas mediante inspección visual o un programa de alineación de secuencias concreto) y Z es la cantidad total de residuos en la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es mayor que la de la segunda secuencia, el porcentaje de identidad de la primera secuencia con respecto a la secuencia - 382 -econdd será mayor que el porcentaje de identidad de la segunda secuencia con respecto a la primera secuencia.
Un experto en la técnica apreciará que la generación de una alineación de secuencias para el cálculo de un porcentaje de identidad de secuencia no se limita a comparaciones binarias entre secuencias impulsadas exclusivamente por datos de secuencias primarios. Se apreciará también que esas alineaciones de secuencias se pueden generar mediante la integración de datos de secuencias con datos provenientes de fuentes heterogéneas tales como datos estructurales (por ejemplo, estructuras de proteínas cristalográficas), datos funcionales (por ejemplo, ubicación de mutaciones) o datos filogenéticos. Un programa adecuado que integra datos heterogéneos para generar una alineación de secuencias múltiples es T-Coffee, disponible en www.tcoffee.org y disponible de manera alternativa, por ejemplo, en el EBI. Se apreciará también que la alineación final usada para calcular el porcentaje de identidad de secuencia se puede seleccionar y organizar ya sea automática o manualmente.
Respuesta inmunitaria: La expresión "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígeno, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citocinas y complemento) que da como resultado daño selectivo a, destrucción de o eliminación del cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales. En algunos casos, la administración de una nanopartícula que comprende un componente lipídico y un agente terapéutico encapsulado puede desencadenar una respuesta inmunitaria, que puede ser causada por (i) el agente terapéutico encapsulado (por ejemplo, un ARNm), (ii) el producto de expresión de tal agente terapéutico encapsulado (por ejemplo, un polipéptido codificado por el ARNm), (iii) el componente lipídico de la nanopartícula, o (iv) una combinación de los mismos.
Respuesta inflamatoria:“Respuesta inflamatoria” se refiere a respuestas inmunitarias que involucran sistemas de defensa específicos y no específicos. Una reacción específica del sistema de defensa es una reacción específica del sistema inmunitario a un antígeno. Los ejemplos de reacciones específicas del sistema de defensa incluyen respuestas de anticuerpos. Una reacción del sistema de defensa no específica es una respuesta inflamatoria mediada por leucocitos generalmente incapaces de memoria inmunológica, por ejemplo, macrófagos, eosinófilos y neutrófilos. En algunos aspectos, una respuesta inmunitaria incluye la secreción de citocinas inflamatorias, dyo como resultado niveles elevados de citocinas inflamatorias.
Citocinas inflamatorias:La expresión "citocina inflamatoria" se refiere a citocinas que están elevadas en una respuesta inflamatoria. Los ejemplos de citocinas inflamatorias incluyen interleucina-6 (IL-6), CXCL1 (quimiocina (motivo C-X-C) ligyo 1; también conocido como GROa, interferón-Y (IFNy), factor de necrosis tumoral a (TNFa), proteína inducida por interferón y 10 (IP-10), o factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). La expresión citocinas inflamatorias incluye también otras citocinas asociadas con respuestas inflamatorias conocidas en la técnica, por ejemplo, interleucina-1 (IL-1), interleucina-8 (IL-8), interleucina-12 (IL-12), interleucina-13 (11-13), interferón a (IFN-a), etc.
In Vitro:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión"in vitro"hace referencia a acontecimientos que ocurren en un entorno artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o en un recipiente de reacción, en un cultivo celular, en una placa de Petri, etc. y no dentro de un organismo (por ejemplo, animal, planta o microbio).
In Vivo:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión"in vivo"hace referencia a acontecimientos que ocurren dentro de un organismo (por ejemplo, animal, planta o microbio o célula o tejido de los mismos).
Variantes de inserción y de deleción:"Variantes de inserción", cuyo se refiere a polipéptidos, son las que tienen uno o más aminoácidos insertados de manera inmediatamente adyacente a un aminoácido en una posición concreta en una secuencia nativa o de partida. "Inmediatamente adyacente" a un aminoácido significa conectado al grupo funcional, bien alfa-carboxi, bien alfa-amino, del aminoácido. "Variaciones de deleción", cuyo se refiere a polipéptidos, son las que tienen uno o más aminoácidos eliminados en la secuencia de aminoácidos nativa o de partida. Por lo común, las variantes de deleción tendrán uno o más aminoácidos suprimidos en una región concreta de la molécula.
Intacto:Tal como se usa en la presente memoria, en el contexto de un polipéptido, el término "intacto" significa que conserva un aminoácido que corresponde a la proteína de tipo silvestre, por ejemplo, que no muta o sustituye el aminoácido de tipo silvestre. A la inversa, en el contexto de un ácido nucleico, el término "intacto" significa que conserva una nucleobase que corresponde al ácido nucleico de tipo silvestre, por ejemplo, que no muta o sustituye la nucleobase de tipo silvestre.
Aminolípido ionizable:La expresión “aminolípido ionizable” incluye aquellos lípidos que poseen una, dos, tres o más cadenas de alquilos grasos o ácidos grasos y un grupo de cabeza amino titulable por pH (por ejemplo, un grupo de cabeza alquilamino o dialquilamino). Un aminolípido ionizable está típicamente protonado (es decir, cargado positivamente) a un pH inferior a la pKa del grupo de cabeza amino y sustancialmente no tiene carga a un pH superior a la pKa. Tales aminolípidos ionizables incluyen, pero no se limitan a, Dlin-MC3-DMA (MC3) y (13Z, 165z )-N, N-dimetil-3-nonidocosa-13-16-dien-l amina (L608).
Aislado:Tal como se usa en la presente memoria, el término "aislado" hace referencia a una sustancia o entidad que ha sido separada de al menos algunos de los componentes con los cuales estaba asociada (ya sea en la naturaleza o en un escenario experimental). Las sustancias aisladas (por ejemplo, polinucleótidos o polipéptidos) pueden tener niveles variables de pureza en referencia a las sustancias de las que se han aislado. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden ser separadas de al menos aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 90% o más de los otros componentes con los cuales estaban inicialmente asociadas. En algunas realizaciones, las sustancias aisladas son más de aproximadamente un 80%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 91%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 93%, aproximadamente un 94%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 98%, aproximadamente un 99% o más de aproximadamente un 99% puras. Tal como se usa en la presente memoria, una sustancia es "pura” si se encuentra sustancialmente libre de otros componentes.
Sustancialmente aislado: Con "sustancialmente aislado" quiere decirse que el compuesto está sustancialmente separado del entorno en el cual se formó o se detectó. Una separación parcial puede incluir, por ejemplo, una composición enriquecida en el compuesto de la presente divulgación. La separación sustancial puede incluir composiciones que contengan al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% en peso del compuesto de la presente divulgación o una sal del mismo.
Un polinucleótido, vector, polipéptido, célula o cualquier composición divulgados en la presente memoria que estén "aislados" son un polinucleótido, vector, polipéptido célula o composición en una forma que no se encuentra en la naturaleza. Los polinucleótidos, vectores, polipéptidos o composiciones aislados incluyen aquellos purificados hasta un grado en el que ya no están en una forma en la que se encuentran en la naturaleza. En algunos aspectos, un polinucleótido, vector, polipéptido o composición aislados son sustancialmente puros.
Isómero:Tal como se usa en la presente memoria, el término "isómero" significa cualquier tautómero, estereoisómero, enantiómero o diastereómero de cualquier compuesto de la divulgación. Se reconoce que los compuestos de la divulgación pueden tener uno o más centros quirales y/o enlaces dobles y, por lo tanto, existir como estereoisómeros, tal como isómeros de doble enlace (es decir, isómeros geométricos E/Z) o diastereómeros (por ejemplo, enantiómeros (es decir, (+) o (-)) o isómeros cis/trans). De acuerdo con la divulgación, las estructuras químicas representadas en la presente memoria, y por lo tanto los compuestos de la divulgación, abarcan todos los estereoisómeros correspondientes, es decir, tanto la forma estereoméricamente pura (por ejemplo, geométricamente pura, enantioméricamente pura, o diastereoméricamente pura) como las mezclas enantioméricas y estereoisoméricas, por ejemplo, racematos. Las mezclas enantioméricas y estereoisoméricas de los compuestos de la divulgación pueden resolverse típicamente en sus enantiómeros o estereoisómeros componentes por métodos bien conocidos, tales como cromatografía de gases en fase quiral, cromatografía líquida de alto rendimiento en fase quiral, cristalización del compuesto como un complejo de sal quiral, o cristalización del compuesto en un disolvente quiral. Los enantiómeros y estereoisómeros también se pueden obtener a partir de intermediarios, reactivos y catalizadores estéreo o enantioméricamente puros mediante métodos sintéticos asimétricos bien conocidos.
Enlazador:Tal como se usa en la presente memoria, un "enlazador" se refiere a un grupo de átomos, por ejemplo, 10-1000 átomos, y puede componerse de los átomos o grupos tales como, pero sin limitarse a, carbono, amino, alquilamino, oxígeno, azufre, sulfóxido, sulfonilo, carbonilo e imina. El enlazador puede unirse a un nucleósido o nucleótido modificado en la nucleobase o el resto de azúcar en un primer extremo, y a una carga útil, por ejemplo, un agente detectable o terapéutico, en un segundo extremo. El enlazador puede ser de longitud suficiente como para no afectar a la incorporación en una secuencia de ácido nucleico. El enlazador puede usarse para cualquier propósito útil, tal como para formar multímeros de polinucleótidos (por ejemplo, a través del enlace de dos o más moléculas de polinucleótidos quiméricos o polinucleótidos IVT) o conjugados de polinucleótidos, así como para administrar una carga útil, como se describe en la presente memoria. Los ejemplos de grupos químicos que pueden incorporarse al enlazador incluyen, pero no se limitan a, alquilo, alquenilo, alquinilo, amido, amino, éter, tioéter, éster, alquileno, heteroalquileno, arilo o heterociclilo, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido, como se describe en la presente memoria. Los ejemplos de enlazadores incluyen, pero no se limitan a, alcanos insaturados, polietilenglicoles (por ejemplo, unidades monoméricas de etilenglicol o propilenglicol, por ejemplo, dietilenglicol, dipropilenglicol, trietilenglicol, tripropilenglicol, tetraetilenglicol, o tetraetilenglicol), y polímeros de dextrano y derivados de los mismos. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, restos escindibles dentro del enlazador, tales como, por ejemplo, un enlace disulfuro (-S-S-) o un enlace azo (-N=N-), que puede escindirse usyo un agente reductor o fotólisis. Los ejemplos no limitativos de un enlace selectivamente escindible incluyen un enlace amido que puede escindirse, por ejemplo, mediante el uso de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, por sus siglas en inglés), u otros agentes reductores, y/o fotólisis, así como un enlace éster que puede escindirse, por ejemplo, mediante hidrólisis ácida o básica.
Métodos de administración:Tal como se usa en la presente memoria, "métodos de administración" puede incluir métodos intravenosos, intramusculares, intradérmicos, subcutáneos u otros métodos para aportar una composición a un individuo. Un método de administración puede seleccionarse para guiar la administración (por ejemplo, para aportar específicamente) a una región o sistema específicos de un cuerpo.
Modificado:Tal como se usa en la presente memoria, "modificado" se refiere a un estado o estructura cambiados de una molécula de la divulgación. Las moléculas se pueden modificar de muchas maneras incluyendo química, estructural y funcionalmente. En algunas realizaciones, las moléculas de ARNm de la presente divulgación se modifican mediante la introducción de nucleósidos y/o nucleótidos no naturales, por ejemplo, en lo que se refiere a los ribonucleótidos naturales A, U, G y C. Los nucleótidos no canónicos tales como las estructuras de casquete no se consideran "modificados" aunque difieran de la estructura química de los ribonucleótidos A, C, G, U.
Moco:Tal como se usa en la presente memoria, "moco" se refiere a la sustancia natural que es viscosa y comprende glucoproteínas de mucina.
Composición de nanopartículas:Tal como se usa en la presente memoria, una “composición de nanopartículas” es una composición que comprende uno o más lípidos. Las composiciones de nanopartículas se realizan típicamente con un tamaño en el orden de micrómetros o menor y pueden incluir una bicapa lipídica. Las composiciones de nanopartículas abarcan nanopartículas lipídicas (LNP), liposomas (por ejemplo, vesículas lipídicas) y lipoplejos. Por ejemplo, una composición de nanopartículas puede ser un liposoma que tenga una bicapa lipídica con un diámetro de 500 nm o menos.
De origen natural:Tal como se usa en la presente memoria, “de origen natural” significa que existe en la naturaleza sin ayuda artificial.
Vertebrados no humanos:Tal como se usa en la presente memoria, un "vertebrado no humano" incluye todos los vertebrados excepto Homo sapiens, incluyendo especies silvestres y domesticadas. Los ejemplos de vertebrados no humanos incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, tales como alpaca, banteng, bisonte, camello, gato, ganado, ciervo, perro, asno, gayal, cabra, cobaya, caballo, llama, mula, cerdo, conejo, reno, oveja, búfalo de agua y yak.
Secuencia de ácido nucleico:Las expresiones "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de polinucleótidos" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de ácido nucleico contigua. La secuencia puede ser ADN o ARN monocatenario o bicatenario, por ejemplo, un ARNm.
La expresión “ácido nucleico”, en su sentido más amplio, incluye cualquier compuesto y/o sustancia que comprenda un polímero de nucleótidos. Estos polímeros a menudo se denominan polinucleótidos. Los ácidos nucleicos o polinucleótidos ejemplares de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos treonucleicos (ATN), ácidos nucleicos glicólicos (ANG), ácidos peptidonucleicos (APN), ácidos nucleicos bloqueados (LNA (por sus siglas en inglés), inclusive LNA con una configuración p-D-ribo, a-LNA con una configuración a-L-ribo (un diastereómero de LNA), 2'-amino-LNA con una funcionalización 2'-amino, y 2'-amino-a-LNA con una funcionalización 2'-amino), ácidos nucleicos etilénicos (ANE), ácido nucleicos ciclohexenílicos (ANCe) o híbridos o combinaciones de los mismos.
La expresión “secuencia de nucleótidos que codifica” se refiere a la secuencia codificante de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARNm o ADN) que codifica un polipéptido. La secuencia codificante puede incluir además señales de iniciación y terminación enlazadas operativamente a elementos reguladores que incluyen una señal promotora y de poliadenilación que puede guiar la expresión en las células de un individuo o mamífero a quien se le administre el ácido nucleico. La secuencia codificante puede incluir además secuencias que codifiquen péptidos señal.
No intencionado:Tal como se usa en la presente memoria, "no intencionado" se refiere a cualquier efecto no intencionado sobre una cualquiera o más dianas, genes o transcritos celulares.
Marco de lectura abierta:Tal como se usa en la presente memoria, "marco de lectura abierta" u "ORF" se refiere a una secuencia que no contiene un codón de parada en un marco de lectura dado.
Enlazado operativamente:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “enlazado operativamente” se refiere a una conexión funcional entre dos o más moléculas, constructos, transcriptos, entidades, restos o similares.
Opcionalmente sustituido:En la presente memoria, una expresión con la forma “X opcionalmente sustituido” (por ejemplo, alquilo opcionalmente sustituido) está destinada a ser equivalente a “X, estyo X opcionalmente sustituido” (por ejemplo, “alquilo, estyo dicho alquilo opcionalmente sustituido”). No está destinada a significar que la característica “X” (por ejemplo, alquilo) de por sí sea opcional.
Parte:Tal como se usa en la presente memoria, una "parte" o "región" de un polinucleótido se define como cualquier porción del polinucleótido que sea menor que la longitud total del polinucleótido.
P ac ien te :Tal como se usa en la presente memoria, "paciente" se refiere a un individuo que puede buscar o necesitar tratamiento, requiere tratamiento, está recibiendo tratamiento, recibirá tratamiento, o un individuo que está bajo cuidado por un profesional cualificado para una enfermedad o estado concretos. En algunas realizaciones, el tratamiento es necesario, requerido o recibido para prevenir o disminuir el riesgo de desarrollar una enfermedad aguda, es decir, es un tratamiento profiláctico.
Farmacéuticamente aceptable: La expresión "farmacéuticamente aceptable" se utiliza en la presente memoria para hacer referencia a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen criterio médico, son adecuados para utilizarse en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin un exceso de toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, de forma proporcional a una relación riesgo/beneficio razonable.
Excipientes farmacéuticamente aceptables:La expresión “excipiente farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier ingrediente distinto de los compuestos descritos en la presente memoria (por ejemplo, un vehículo capaz de suspender o disolver el compuesto activo) y que tiene las propiedades de ser sustancialmente no tóxico y no inflamatorio en un paciente. Los excipientes pueden incluir, por ejemplo: antiadherentes, antioxidantes, ligantes, revestimientos, adyuvantes de compresión, desintegrantes, colorantes (colores), emolientes, emulsionantes, cargas (diluentes), revestimientos o formadores de película, aromas, fragancias, agentes deslizantes (mejoradores de flujo), lubricantes, agentes de conservación, tintas de impresión, sorbentes, agentes de suspensión o dispersión, edulcorantes y aguas de hidratación. Los excipientes ejemplares incluyen, pero no se limitan a: hidroxitolueno butilado (BHT, por sus siglas en inglés), carbonato de calcio, fosfato de calcio (dibásico), estearato de calcio, croscarmelosa, polivinilpirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, lactosa, estearato de magnesio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulosa, metilparabeno, celulosa microcristalina, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, povidona, almidón pregelatinizado, propilparabeno, palmitato de retinilo, goma laca, dióxido de silicio, carboximetilcelulosa sódica, citrato sódico, glicolato sódico de almidón, sorbitol, almidón (maíz), ácido esteárico, sacarosa, talco, dióxido de titanio, vitamina A, vitamina E, vitamina C y xilitol.
Sales farmacéuticamente aceptables:La presente divulgación también incluye sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en la presente memoria. Tal como se usa en la presente memoria, "sales farmacéuticamente aceptables" hace referencia a derivados de los compuestos divulgados en los que se modifica el compuesto precursor convirtiendo un resto básico o ácido existente en su forma de sal (por ejemplo, haciendo reaccionar el grupo base libre con un ácido orgánico adecuado). Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Las sales de adición ácida representativas incluyen sales acetato, de ácido acético, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, de ácido bencenosulfónico, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptonato, hexanoato, bromhidrato, clorhidrato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como cationes de amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos, incluyendo, pero sin limitarse a, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente divulgación incluyen las sales no tóxicas convencionales del compuesto precursor formadas, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente divulgación se pueden sintetizar a partir del compuesto precursor que contiene un resto ácido o básico mediante métodos químicos convencionales. En general, tales sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas de ácido o base libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o el ácido apropiados en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos; en general, se usan medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Se encuentran listas de sales adecuadas enRemington’s Pharmaceutical Sciences,17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418,Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, y Use,P.H. Stahl y C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCR, 2008, y Berge et al.,Journal of Pharmaceutical Science,66, 1-19 (1977).
Solvato farmacéuticamente aceptable:La expresión "solvato farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en la presente memoria, significa un compuesto de la divulgación en donde se incorporan moléculas de un disolvente adecuado en el entramado cristalino. Un disolvente adecuado es fisiológicamente tolerable en la dosis administrada. Por ejemplo, los solvatos se pueden preparar por cristalización, recristalización o precipitación a partir de una solución que incluya disolventes orgánicos, agua o una mezcla de los mismos. Ejemplos de disolventes adecuados son etanol, agua (por ejemplo, mono-, di- y trihidratos), N-metilpirrolidinona (NMP), dimetilsulfóxido (DMSO), N,N'-dimetilformamida (DMF), N,N'-dimetilacetamida (D<m>AC), 1,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1H)-pirimidinona (DMPU), acetonitrilo (I), propilenglicol, acetato de etilo, alcohol bencílico, 2-pirrolidona, benzoato de bencilo y similares. Cuyo el disolvente es agua, el solvato se denomina “hidrato".
Farmacocinética: Tal como se usa en la presente memoria, “farmacocinética” se refiere a una cualquiera o más propiedades de una molécula o compuesto en lo que se refiere a la determinación del destino de sustancias administradas a un organismo vivo. La farmacocinética se divide en varias áreas que incluyen el grado y velocidad de absorción, distribución, metabolismo y excreción. Esto se conoce comúnmente como ADME en donde: (A) la absorción es el proceso de una sustancia que entra en la circulación sanguínea; (D) la distribución es la dispersión o diseminación de sustancias a través de los fluidos y tejidos del cuerpo; (M) el metabolismo (o biotransformación) es la transformación irreversible de compuestos precursores en metabolitos hijos; al(E) la excreción (o eliminación) se refiere a la eliminación de las sustancias del cuerpo. En casos raros, algunos fármacos se acumulan irreversiblemente en el tejido corporal.
Fisicoquímico:Tal como se usa en la presente memoria, "físicoquímico" significa o se refiere a una propiedad física y/o química.
Polinucleótido:El término “polinucleótido”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, incluyendo ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de los mismos, o mezclas de los mismos. Este término se refiere a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, el término incluye ácido desoxirribonucleico ("ADN") de cadena triple, doble y simple, así como ácido ribonucleico ("ARN") de cadena triple, doble y simple. También incluye formas modificadas, por ejemplo, mediante alquilación, y/o mediante formación de casquetes, y formas no modificadas del polinucleótido. Más particularmente, el término "polinucleótido" incluye polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonuleótidos (que contienen D-ribosa), incluyendo ARNt, ARNr, ARNh, ARNip y ARNm, ya sea empalmados o no, cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un glucósido N o C de una base pirimidina o purina, y otros polímeros que contienen estructuras principales no nucleotídicas, por ejemplo, poliamida (por ejemplo, ácidos peptidonucleicos (APN) y polímeros de polimorfolino, y otros polímeros sintéticos de ácido nucleico específico de secuencia, siempre que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita el apareamiento de bases y el apilamiento de bases, tales como los que se encuentran en el ADN y ARN. En aspectos concretos, el polinucleótido comprende un ARNm. En otro aspecto, el ARNm es un ARNm sintético. En algunos aspectos, el ARNm sintético comprende al menos una nucleobase no natural. En algunos aspectos, todas las nucleobases de cierta clase han sido reemplazadas por nucleobases no naturales (por ejemplo, todas las uridinas en un polinucleótido divulgado en la presente memoria pueden reemplazarse por una nucleobase no natural, por ejemplo, 5-metoxiuridina). En algunos aspectos, el polinucleótido (por ejemplo, un ARN sintético o un ADN sintético) comprende sólo nucleobases naturales, es decir, A (adenosina), G (guanosina), C (citidina) y T (timidina) en el caso de un ADN sintético, o A, C, G y U (uridina) en el caso de un ARN sintético
El experto en la técnica apreciará que las bases T en los mapas de codones divulgados en la presente memoria están presentes en el ADN, mientras que las bases T se reemplazarían por bases U en los ARN correspondientes. Por ejemplo, una secuencia codón-nucleótido divulgada en la presente memoria en forma de ADN, por ejemplo, un vector o un molde de traducción in vitro (IVT), tendría sus bases T transcritas como U basándose en su correspondiente ARNm transcrito. A este respecto, tanto las secuencias de ADN optimizadas en cuanto a los codones (que comprenden T) como sus secuencias de ARNm correspondientes (que comprenden U) se consideran secuencias de nucleótidos optimizadas en cuanto a los codones de la presente invención. Un experto en la técnica también entendería que se pueden generar mapas de codones equivalentes reemplazyo una o más bases por bases no naturales. Por lo tanto, por ejemplo, un codón TTC (mapa de ADN) correspondería a un codón UUC (mapa de ARN), que a su vez correspondería a un codón Y^C (mapa de ARN en el que U se ha reemplazado por pseudouridina).
Se forman pares de bases A-T y G-C estándar en condiciones que permiten la formación de enlaces de hidrógeno entre el N3-H y el C4-oxi de timidina y el N1 y el C6-NH2, respectivamente, de adenosina y entre el C2-oxi, N3 y el C4-NH2, de citidina y el C2-NH2, N'-H y el C6-oxi, respectivamente, de guanosina. Así, por ejemplo, la guanosina (2-amino-6-oxi-9-p-D-ribofuranosil-purina) puede modificarse para formar isoguanosina (2-oxi-6-amino-9-p-D-ribofuranosil-purina). Tal modificación da como resultado una base de nucleósido que ya no formará eficazmente un par de bases estándar con citosina. Sin embargo, la modificación de la citosina (1 -p-D-ribofuranosil-2-oxi-4-amino-pirimidina) para formar isocitosina (1-p-D-ribofuranosil-2-amino-4-oxipirimidina) da como resultado un nucleótido modificado que no formará efectivamente un par de bases con guanosina, sino que formará un par de bases con isoguanosina (Patente de EE.UU. NO 5,681,702 a Collins et al.). La isocitosina está disponible en Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.); la isocitidina puede prepararse por el método descrito por Switzer et al. (1993) Biochemistry 32:10489-10496 y las referencias citadas en el mismo; la 2'-desoxi-5-metil-isocitidina puede prepararse por el método de Tor et al., 1993, J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467 y las referencias citadas en el mismo; y los nucleótidos de isoguanina pueden prepararse usyo el método descrito por Switzer et al., 1993, supra, y Mantsch et al., 1993, Biochem. 14:5593-5601, o mediante el método descrito en la Patente de EE.UU. NO 5,780,610 a Collins et al. Otros pares de bases no naturales pueden sintetizarse mediante el método descrito en Piccirilli et al., 1990, Nature 343 :33-37, para la síntesis de 2,6-diaminopirimidina y su complemento (1-metilpirazolo-[4,3] pirimidina-5,7-(4H,6H)-diona. Se conocen otras unidades de nucleótidos modificadas de este tipo que forman pares de bases únicos, tales como las descritas en Leach et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683 y Switzer et al., supra.
Polipéptido: Los términos "polipéptido", “péptido”y “proteína” se usan indistintamente en la presente memoria y hacen referencia a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede comprender aminoácidos modificados. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcado. La definición también incluye, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (lo que incluye, por ejemplo, aminoácidos no naturales tales como homocisteína, ornitina, pacetilfenilalanina, D aminoácidos y creatina), así como otras modificaciones conocidas en la técnica.
El término, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a proteínas, polipéptidos y péptidos de cualquier tamaño, estructura o función. Los polipéptidos incluyen productos de polinucleótidos codificados, polipéptidos de origen natural, polipéptidos sintéticos, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los que anteceden. Un polipéptido puede ser un monómero o puede ser un complejo multimolecular, tal como un dímero, trímero o tetrámero. También pueden comprender polipéptidos monocatenarios o multicatenarios. Con la mayor frecuencia, se encuentran enlaces disulfuro en polipéptidos multicatenarios. El término polipéptido también puede aplicarse a polímeros de aminoácidos, en los cuales uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural. En algunas realizaciones, un "péptido" puede tener una longitud inferior o igual a 50 aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud.
Variante de polipéptido:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "variante de polipéptido" se refiere a moléculas que difieren en su secuencia de aminoácidos de una secuencia nativa o de referencia. Las variantes de secuencia de aminoácidos pueden poseer sustituciones, deleciones y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos, en comparación con una secuencia nativa o de referencia. Normalmente, las variantes poseerán al menos aproximadamente un 50% de identidad, al menos aproximadamente un 60% de identidad, al menos aproximadamente un 70% de identidad, al menos aproximadamente un 80% de identidad, al menos aproximadamente un 90% de identidad, al menos aproximadamente un 95% de identidad, al menos aproximadamente un 99% de identidad con una secuencia nativa o de referencia. En algunas realizaciones, éstas serán al menos aproximadamente un 80% o al menos aproximadamente un 90% idénticas a una secuencia nativa o de referencia.
Polipéptido por unidad de fármaco(PUD, por sus siglas en inglés): Tal como se usa en la presente memoria, un PUD o producto por unidad de fármaco se define como una porción subdividida de una dosis diaria total, normalmente 1 mg, pg, kg, etc., de un producto (tal como un polipéptido) medida en un fluido o tejido corporal, normalmente definida en concentración tal como pmol/mL, mmol/mL, etc. dividida por la medida en el fluido corporal.
Prevenir:Tal como se usa en la presente memoria, el término “prevenir” se refiere a retrasar parcial o completamente el comienzo de una infección, enfermedad, trastorno y/o estado; retrasar parcial o completamente el comienzo de uno o más síntomas, características o manifestaciones clínicas de una infección, enfermedad, trastorno y/o estado concretos; retrasar parcial o completamente el comienzo de uno o más síntomas, características o manifestaciones de una infección, enfermedad, trastorno y/o estado concretos; retrasar parcial o completamente la evolución de una infección, una enfermedad concreta, un trastorno y/o un estado; y/o disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la infección, la enfermedad, el trastorno y/o el estado.
Proliferar:Tal como se usa en la presente memoria, el término "proliferar" significa crecer, extenderse o aumentar o hacer que crezca, se extienda o aumente rápidamente. "Proliferativo" significa que tiene la capacidad de proliferar. "Antiproliferativo" significa que tiene propiedades contrarias o inapropiadas a las propiedades proliferativas.
Profiláctico:Tal como se usa en la presente memoria, "profiláctico" se refiere a un curso de acción o terapéutico utilizado para prevenir la propagación de la enfermedad.
Profilaxis:Tal como se usa en la presente memoria, una “profilaxis” se refiere a una medida tomada para mantener la salud y prevenir la propagación de una enfermedad. "Una inmunoprofilaxis" se refiere a una medida para producir inmunidad activa o pasiva para prevenir la propagación de una enfermedad.
Sitio de escisión de proteína:Tal como se usa en la presente memoria, "sitio de escisión de proteína" se refiere a un sitio en el que puede realizarse una escisión controlada de la cadena de aminoácidos por medios químicos, enzimáticos o fotoquímicos.
Señal de escisión de proteína:Tal como se usa en la presente memoria, “señal de escisión de proteína” se refiere a al menos un aminoácido que señala o marca un polipéptido para la escisión.
P ro te ín a de in te rés :Tal como se usan en la presente memoria, las expresiones “proteínas de interés” o “proteínas deseadas” incluyen las proporcionadas en la presente memoria y fragmentos, mutantes, variantes y alteraciones de las mismas.
Proximal: Tal como se usa en la presente memoria, el término “proximal” significa situado más cerca del centro o de un punto o región de interés.
Pseudouridina:Tal como se usa en la presente memoria, pseudouridina (y ) se refiere al isómero de glucósido C del nucleósido uridina. Un análogo de “pseudouridina” es cualquier modificación, variante, isoforma o derivado de pseudouridina. Por ejemplo, los análogos de pseudouridina incluyen, pero no se limitan a, 1-carboximetil-pseudouridina, 1-propinil-pseudouridina, 1-taurinometil-pseudouridina, l-taurinometil-4-tiopseudouridina, 1-metilpseudouridina (m1ψ ), l-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4ψ ), 4-tio-1 -metil- pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3ψ ), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-desaza-pseudouridina, 2-tio-l-metil-1-desazapseudouridina, dihidropseudouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi- pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, Nl-metil-pseudouridina, l-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3ψ ), y 2'-O-metil-pseudouridina (ψm).
Purificado:Tal como se usan en la presente memoria, “purificar”, “purificado”, “purificación” significan hacer sustancialmente puro o dejar libre de componentes no deseados, contaminación de material, mezcla o imperfección.
Secuencia de Ácido Nucleico de Referencia:Las expresiones “secuencia de ácido nucleico de referencia” o “ácido nucleico de referencia” o “secuencia de nucleótidos de referencia” o “secuencia de referencia” se refieren a una secuencia de ácido nucleico de partida (por ejemplo, un ARN, por ejemplo, una secuencia de ARNm) que puede optimizarse en cuanto a la secuencia. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de referencia es una secuencia de ácido nucleico de tipo silvestre, un fragmento o una variante de la misma. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de referencia es una secuencia de ácido nucleico previamente optimizada en cuanto a la secuencia.
Sales:En algunos aspectos, la composición farmacéutica para la administración divulgada en la presente memoria comprende sales de algunos de sus constituyentes lipídicos. El término "sal" incluye cualquier complejo aniónico y catiónico. Los ejemplos no limitativos de aniones incluyen aniones inorgánicos y orgánicos, por ejemplo, fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, oxalato (por ejemplo, hemioxalato), fosfato, fosfonato, fosfato de hidrógeno, fosfato de dihidrógeno, óxido, carbonato, bicarbonato, nitrato, nitrito, nitruro, bisulfito, sulfuro, sulfito, bisulfato, sulfato, tiosulfato, sulfato de hidrógeno, borato, formato, acetato, benzoato, citrato, tartrato, lactato, acrilato, poliacrilato, fumarato, maleato, itaconato, glicolato, gluconato, malato, myelato, tiglato, ascorbato, salicilato, polimetacrilato, perclorato, clorato, clorito, hipoclorito, bromato, hipobromito, yodato, un alquilsulfonato, un arilsulfonato, arsenato, arsenita, cromato, dicromato, cianuro, cianato, tiocianato, hidróxido, peróxido, permanganato, y mezclas de los mismos.
Muestra:Tal como se usa en la presente memoria, el término "muestra" o "muestra biológica" se refieren a un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (por ejemplo, fluidos corporales, que incluyen, pero no se limitan a, sangre, mucosa, fluido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre del cordón amniótico, orina, fluidos vaginales y semen). Una muestra puede incluir además un producto de homogeneización, material lisado o un extracto preparados a partir de un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de los mismos, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, plasma, suero, líquido espinal, fluido linfático, las secciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos. Una muestra se refiere además a un medio, tal como un gel o caldo de nutrientes, que puede contener componentes celulares, tales como proteínas o moléculas de ácido nucleico.
Secuencia señal:Tal como se usan en la presente memoria, las expresiones “secuencia señal”, “péptido señal” y “péptido de tránsito” se usan indistintamente y se refieren a una secuencia que puede guiar el transporte o localización de una proteína a una determinada organela, compartimento celular o exportación extracelular. Las expresiones abarcan tanto el polipéptido de secuencia señal como la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia señal. Por lo tanto, las referencias a una secuencia señal en el contexto de un ácido nucleico se refieren de hecho a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de secuencia señal.
Ruta de transducción de señales:Una "ruta de transducción de señales" se refiere a la relación bioquímica entre diversas moléculas de transducción de señales que desempeñan un papel en la transmisión de una señal desde una porción de una célula a otra porción de una célula. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "receptores de superficie celular" incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de tal señal a través de la membrana plasmática de una célula.
S im ilitud :Tal como se usa en la presente memoria, el término "similitud" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de polinucleótidos (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. El cálculo del porcentaje de similitud de moléculas poliméricas entre sí se puede realizar de la misma manera que un cálculo del porcentaje de identidad, excepto que el cálculo del porcentaje de similitud tiene en cuenta sustituciones conservativas como se entiende en la técnica.
Dosis unitaria única: Tal como se utiliza en la presente memoria, una "dosis unitaria única" es una dosis de cualquier agente terapéutico administrado en una dosis/en un momento/por una única vía/por un único punto de contacto, es decir, un acontecimiento de administración único.
Dosis dividida:Tal como se utiliza en la presente memoria, una "dosis dividida" es la división de una dosis unitaria única o de una dosis diaria total en dos o más dosis.
Administración específico:Tal como se usan en la presente memoria, las expresiones "administración específico", "aportar específicamente" o "que aporta específicamente" significan la administración de una mayor cantidad (por ejemplo, al menos 1.5 veces más, al menos 2 veces más, al menos 3 veces más, al menos 4 veces más, al menos 5 veces más, al menos 6 veces más, al menos 7 veces más, al menos 8 veces más, al menos 9 veces más, al menos 10 veces más) de un polinucleótido por una nanopartícula a un tejido diana de interés (por ejemplo, hígado de mamífero) en comparación con un tejido no intencionado (por ejemplo, bazo de mamífero). El nivel de administración de una nanopartícula a un tejido concreto puede medirse comparyo la cantidad de proteína producida en un tejido con el peso de dicho tejido, comparyo la cantidad de polinucleótido en un tejido con el peso de dicho tejido, comparyo la cantidad de proteína producida en un tejido con la cantidad de proteína total en dicho tejido, o comparyo la cantidad de polinucleótido en un tejido con la cantidad de polinucleótido total en dicho tejido. Por ejemplo, para el guiado renovascular, se proporciona específicamente un polinucleótido a un riñón de mamífero en comparación con el hígado y el bazo si se aporta a un riñón una cantidad 1.5, 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces o 20 veces mayor de polinucleótido por 1 g de tejido en comparación con la aportada al hígado o al bazo después de la administración sistémica del polinucleótido. Se entenderá que la capacidad de una nanopartícula de aportar específicamente a un tejido diana no necesita determinarse en un individuo que esté siendo tratado, puede determinarse en un sustituto tal como un modelo animal (por ejemplo, un modelo de rata).
Estable:Tal como se usa en la presente memoria, "estable" se refiere a un compuesto que es lo suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción, y en algunos casos apto para formularlo en un agente terapéutico eficaz.
Estabilizado:Tal como se usa en la presente memoria, los términos "estabilizar", "estabilizado" o "región estabilizada" significan hacer o volverse estable.
Estereoisómero:Tal como se usa en la presente memoria, el término "estereoisómero" se refiere a todas las posibles formas isoméricas diferentes, así como conformacionales, que un compuesto puede poseer (por ejemplo, un compuesto de cualquier fórmula descrita en la presente memoria), en particular todas las posibles formas estereoquímica y conformacionalmente isoméricas, todos los diastereómeros, enantiómeros y/o conformadores de la estructura molecular básica. Algunos compuestos de la presente invención pueden existir en diferentes formas tautoméricas, estyo todas estas últimas incluidas dentro del alcance de la presente invención.
Individuo:Con “sujeto” o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero" quiere decirse cualquier individuo, particularmente un individuo mamífero, para el que se desea un diagnóstico, pronóstico o terapia. Los individuos mamíferos incluyen, pero no se limitan a, humanos, animales domésticos, animales de granja, animales de zoológico, animales deportivos, animales mascota tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas; primates tales como simios, monos, orangutanes y chimpancés; cánidos tales como perros y lobos; felinos tales como gatos, leones y tigres; équidos tales como caballos, asnos y cebras; osos, animales para alimentos tales como vacas, cerdos y ovejas; ungulados tales como ciervos y jirafas; roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y cobayas; y así sucesivamente. En ciertas realizaciones, el mamífero es un individuo humano. En otras realizaciones, el individuo es un paciente humano. En una realización concreta, un individuo es un paciente humano que necesita tratamiento.
Sustancialmente:Tal como se usa en la presente memoria, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de presentar el alcance o grado total, o casi total, de una característica o propiedad de interés. Una persona con conocimientos corrientes de la técnica biológica comprenderá que las características biológicas y químicas en raras ocasiones, si es que ocurre, se completan y/o llegan a completarse o logran o evitan un resultado absoluto. El término "sustancialmente" se utiliza en la presente memoria, por lo tanto, para reflejar la posible falta de compleción inherente a muchas características biológicas y químicas.
Sustancialmente igual:Tal como se usa en la presente memoria en lo que se refiere a las diferencias de tiempo entre dosis, la expresión significa más/menos un 2%.
Sustancialmente simultáneo: Tal como se usa en la presente memoria y en lo que se refiere a una pluralidad
de dosis, la expresión significa en el plazo de 2 segundos.
Que padece:Un individuo que "padece" una enfermedad, trastorno y/o estado ha sido diagnosticado y/o presenta uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno y/o estado.
Propenso a:Un individuo que es “propenso a” una enfermedad, trastorno y/o estado no ha sido diagnosticado y/o no puede presentar síntomas de la enfermedad, trastorno y/o estado, pero alberga una propensión a desarrollar una enfermedad o sus síntomas. En algunas realizaciones, un individuo que es propenso a una enfermedad, trastorno y/o estado (por ejemplo, Gal-1) puede caracterizarse por uno o más de los siguientes: (1) una mutación genética asociada con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o estado; (2) un polimorfismo genético asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o estado; (3) expresión y/o actividad aumentadas y/o disminuidas de una proteína y/o un ácido nucleico asociados con la enfermedad, trastorno y/o estado; (4) hábitos y/o estilos de vida asociados con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o estado; (5) un historial familiar de la enfermedad, trastorno y/o estado; y (6) exposición a y/o infección con un microbio asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o estado. En algunas realizaciones, un individuo que es propenso a una enfermedad, trastorno y/o estado desarrollará la enfermedad, trastorno y/o estado. En algunas realizaciones, un individuo que es propenso a una enfermedad, trastorno y/o estado no desarrollará la enfermedad, trastorno y/o estado.
Liberación sostenida:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "liberación sostenida" hace referencia a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéuticos que se ajusta a una velocidad de liberación en un período específico de tiempo.
Sintético:El término "sintético" significa producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. La síntesis de polinucleótidos u otras moléculas de la presente divulgación puede ser química o enzimática.
Células diana:Tal como se usa en la presente memoria, "células diana" se refiere a una cualquiera o más células de interés. Las células pueden encontrarsein vitro, in vivo, in situo en el tejido u órgano de un organismo. El organismo puede ser un animal, por ejemplo, un mamífero, un ser humano, un individuo o un paciente.
Tejido diana:Tal como se usa en la presente memoria, "tejido diana" se refiere a uno cualquiera o más tipos de tejido de interés en los que la administración de un polinucleótido daría como resultado un efecto biológico y/o farmacológico deseado. Los ejemplos de tejidos diana de interés incluyen tejidos, órganos y sistemas específicos o grupos de los mismos. En aplicaciones concretas, un tejido diana puede ser un hígado, un riñón, un pulmón, un bazo o un endotelio vascular en vasos (por ejemplo, intracoronario o intrafemoral). Un "tejido no intencionado" se refiere a uno cualquiera o más tipos de tejido en los que la expresión de la proteína codificada no da como resultado un efecto biológico y/o farmacológico deseado.
La presencia de un agente terapéutico en un tejido no intencionado puede ser el resultado de: (i) la fuga de un polinucleótido desde el sitio de administración a un tejido periférico o a un tejido no intencionado distante a través de la difusión o a través del torrente sanguíneo (por ejemplo, un polinucleótido destinado a expresar un polipéptido en un determinado tejido alcanzaría el tejido no intencionado y el polipéptido se expresaría en el tejido no intencionado); o (ii) la fuga de un polipéptido después de la administración de un polinucleótido que codifique tal polipéptido a un tejido periférico o a un tejido no intencionado distante a través de la difusión o a través del torrente sanguíneo (por ejemplo, un polinucleótido expresaría un polipéptido en el tejido diana, y el polipéptido se difundiría al tejido periférico).
Secuencia de guiado:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “secuencia de guiado” se refiere a una secuencia que puede guiar el transporte o localización de una proteína o polipéptido.
Extremo:Tal como se usan en la presente memoria, los términos "extremos" o "extremo", en referencia a polipéptidos, se refieren a un extremo de un péptido o polipéptido. Tal extremo no se limita únicamente al sitio inicial o final del péptido o polipéptido, sino que puede incluir aminoácidos adicionales en las regiones terminales. Las moléculas basadas en polipéptidos de la divulgación pueden caracterizarse como poseedoras tanto de un extremo N (terminado en un aminoácido con un grupo amino libre (NH2)) como de un extremo C (terminado en un aminoácido con un grupo carboxilo libre (COOH)). En algunos casos, las proteínas de la divulgación se componen de múltiples cadenas de polipéptidos reunidas por enlaces disulfuro o por fuerzas no covalentes (multímeros, oligómeros). Estos tipos de proteínas tendrán múltiples extremos N y C. Como alternativa, los extremos de los polipéptidos pueden modificarse de manera que comiencen o terminen, según sea el caso, con un resto no basado en polipéptidos, tal como un conjugado orgánico.
Agente terapéutico:La expresión "agente terapéutico" se refiere a un agente que, cuyo se administra a un individuo, tiene un efecto terapéutico, diagnóstico y/o profiláctico, y/o produce un efecto farmacológico y/o biológico deseado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un ARNm que codifica un polipéptido de GALT puede ser un agente terapéutico.
Cantidad terapéuticamente eficaz: Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” significa una cantidad de un agente que se ha de aportar (por ejemplo, ácido nucleico, fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico, agente profiláctico, etc.) que es suficiente, cuyo se administra a un individuo que padece o es propenso a una infección, enfermedad, trastorno y/o estado, para tratar, mejorar síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retrasar el comienzo de la infección, enfermedad, trastorno y/o estado.
Resultado terapéuticamente eficaz:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “resultado terapéuticamente eficaz” significa un resultado que es suficiente, en un individuo que padece o es propenso a una infección, enfermedad, trastorno y/o estado, para tratar, mejorar síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retrasar el comienzo de la infección, enfermedad, trastorno y/o estado.
Dosis diaria total:Tal como se utiliza en la presente memoria, una "dosis diaria total" es una cantidad dada o prescrita en un período de 24 h. La dosis diaria total puede administrarse como una dosis unitaria única o como una dosis dividida.
Factor de transcripción:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "factor de transcripción" se refiere a una proteína de unión de ADN que regula la transcripción de<a>D<n>en ARN, por ejemplo, mediante activación o represión de la transcripción. Algunos factores de transcripción efectúan la regulación de transcripción solos, mientras que otros actúan en conjunto con otras proteínas. Algún factor de transcripción puede tanto activar como reprimir la transcripción en ciertas condiciones. En general, los factores de transcripción se unen a una o más secuencias diana específicas altamente similares a una secuencia de consenso específica en una región reguladora de un gen diana. Los factores de transcripción pueden regular la transcripción de un gen diana solos o en un complejo con otras moléculas.
Transcripción:Tal como se usa en la presente memoria, el término “transcripción” se refiere a métodos para producir ARNm (por ejemplo, una secuencia o molde de ARNm) a partir de ADN (por ejemplo, un molde o secuencia de ADN).
Transfección:Tal como se usa en la presente memoria, "transfección" se refiere a la introducción de un polinucleótido (por ejemplo, ácidos nucleicos exógenos) en una célula en la que se expresa un polipéptido codificado por el polinucleótido (por ejemplo, ARNm) o el polipéptido modula una función celular (por ejemplo, ARNip, miARN). Tal como se usa en la presente memoria, "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a la traducción de un polinucleótido (por ejemplo, un ARNm) a un polipéptido o proteína y/o modificación postraduccional de un polipéptido o proteína. Los métodos de transfección incluyen, pero no se limitan a, métodos químicos, tratamientos físicos y lípidos catiónicos o mezclas.
Tratar, tratamiento, terapia:Tal como se usan en la presente memoria, los términos "tratar" o "tratamiento" o "terapia" se refieren a mitigar parcial o completamente, mejorar, aliviar, retrasar el comienzo de, inhibir la evolución de, reducir la gravedad de, y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, por ejemplo, galactosemia de tipo 1. Por ejemplo, "tratar" la galactosemia de tipo 1 puede referirse a disminuir los síntomas asociados con la enfermedad, prolongar la esperanza de vida (aumentar la tasa de supervivencia) de los pacientes, reducir la gravedad de la enfermedad, prevenir o retrasar el comienzo de la enfermedad, etc. El tratamiento puede administrarse a un individuo que no presente signos de una enfermedad, trastorno y/o estado y/o a un individuo que presente sólo signos tempranos de una enfermedad, trastorno y/o estado con el propósito de disminuir el riesgo de que se desarrolle patología asociada con la enfermedad, trastorno y/o estado.
Sin modificar.Tal como se usa en la presente memoria, "sin modificar" se refiere a cualquier sustancia, compuesto o molécula antes de ser cambiados de alguna manera. Sin modificar puede referirse, pero no siempre se refiere, al tipo silvestre o la forma nativa de una biomolécula. Las moléculas pueden experimentar una serie de modificaciones, por lo que cada molécula modificada puede servir de molécula de partida "sin modificar" para una modificación posterior.
Uracilo:El uracilo es una de las cuatro nucleobases en el ácido nucleico de ARN, y está representado por la letra U. El uracilo puede unirse a un anillo de ribosa o, más específicamente, una ribofuranosa a través de un enlace p-Ni-glucosídico para producir el nucleósido uridina. El nucleósido uridina también se abrevia comúnmente de acuerdo con el código de una letra de su nucleobase, es decir, U. Por lo tanto, en el contexto de la presente divulgación, cuyo un monómero en una secuencia de polinucleótidos es U, tal U se designa indistintamente como un "uracilo" o una "uridina".
Contenido de uridina:Las expresiones "contenido de uridina" o "contenido de uracilo" son intercambiables y se refieren a la cantidad de uracilo o uridina presente en una determinada secuencia de ácido nucleico. El contenido de uridina o el contenido de uracilo pueden expresarse como un valor absoluto (número total de uridina o uracilo en la secuencia) o relativo (porcentaje de uridina o uracilo con respecto al número total de nucleobases en la secuencia de ácido nucleico).
Secuencia Modificada en cuanto a la Uridina: La expresión “secuencia modificada en cuanto a la uridina” se refiere a un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia (por ejemplo, una secuencia de ARNm sintético) con un contenido de uridina global o local diferente (contenido de uridina mayor o menor) o con diferentes patrones de uridina (por ejemplo, distribución en gradiente o agrupamiento) con respecto al contenido de uridina y/o los patrones de uridina de una secuencia de ácido nucleico cyidata. En el contenido de la presente divulgación, las expresiones "secuencia modificada en cuanto a la uridina" y "secuencia modificada en cuanto al uracilo" se consideran equivalentes e intercambiables.
Un "codón alto en uridina" se define como un codón que comprende dos o tres uridinas, un "codón bajo en uridina" se define como un codón que comprende una uridina, y un "codón sin uridina" es un codón sin ninguna uridina. En algunas realizaciones, una secuencia modificada en cuanto a la uridina comprende sustituciones de codones altos en uridina por codones bajos en uridina, sustituciones de codones altos en uridina por codones sin uridina, sustituciones de codones bajos en uridina por codones altos en uridina, sustituciones de codones bajos en uridina por codones sin uridina, sustitución de codones sin uridina por codones bajos en uridina, sustituciones de codones sin uridina por codones altos en uridina, y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, un codón alto en uridina se puede reemplazar por otro codón alto en uridina. En algunas realizaciones, un codón bajo en uridina se puede reemplazar por otro codón bajo en uridina. En algunas realizaciones, un codón sin uridina se puede reemplazar por otro codón sin uridina. Una secuencia modificada en cuanto a la uridina puede estar enriquecida con uridina o enrarecida en cuanto a la uridina.
Enriquecido con uridina:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "enriquecido con uridina" y las variantes gramaticales se refieren al aumento en el contenido de uridina (expresado en valor absoluto o como un valor porcentual) en un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia (por ejemplo, una secuencia de ARNm sintético) con respecto al contenido de uridina de la secuencia de ácido nucleico cyidata correspondiente. El enriquecimiento con uridina puede implementarse sustituyendo codones en la secuencia de ácido nucleico cyidata por codones sinónimos que contengan menos nucleobases de uridina. El enriquecimiento con uridina puede ser global (es decir, relativo a toda la longitud de una secuencia de ácido nucleico cyidata) o local (es decir, relativo a una subsecuencia o región de una secuencia de ácido nucleico cyidata).
Enrarecido en cuanto a la uridina:Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "enrarecido en cuanto a la uridina" y las variantes gramaticales se refieren a una disminución en el contenido de uridina (expresada en valor absoluto o como un valor porcentual) en un ácido nucleico optimizado en cuanto a la secuencia (por ejemplo, una secuencia de ARNm sintético) con respecto al contenido de uridina de la secuencia de ácido nucleico cyidata correspondiente. El enrarecimiento en cuanto a la uridina puede implementarse sustituyendo codones en la secuencia de ácido nucleico cyidata por codones sinónimos que contengan menos nucleobases de uridina. El enrarecimiento en cuanto a la uridina puede ser global (es decir, relativo a toda la longitud de una secuencia de ácido nucleico cyidata) o local (es decir, relativo a una subsecuencia o región de una secuencia de ácido nucleico cyidata).
Variante:El término variante tal como se usa en la presente divulgación se refiere tanto a variantes naturales (por ejemplo, polimorfismos, isoformas, etc.) como a variantes artificiales en las que se ha eliminado al menos un residuo de aminoácido en una secuencia nativa o de partida (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre) y se ha insertado un aminoácido diferente en su lugar en la misma posición. Estas variantes se pueden describir como "variantes de sustitución". Las sustituciones pueden ser simples, en donde sólo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, en donde se han sustituido dos o más aminoácidos en la misma molécula. Si se insertan o se suprimen aminoácidos, la variante resultante sería una “variante de inserción” o una “variante de deleción”, respectivamente.
31. Equivalentes y Alcance
Los expertos en la técnica reconocerán o podrán determinar, usyo solamente la experimentación de rutina, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de acuerdo con la invención descritas en la presente memoria. No se pretende limitar el alcance de la presente invención a la descripción anterior, sino que dicho alcance se establece en las reivindicaciones adjuntas.
En las reivindicaciones, los artículos tales como "un", "una", "el" y "la" pueden significar uno/a o más de uno/a, a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran cumplidas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son relevantes de otro modo para, un producto o proceso dados, a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en, o es relevante de otro modo para, un producto o proceso dados. La invención incluye realizaciones en las que más de uno o la totalidad de los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son relevantes de otro modo para, un producto o proceso dados.
Cabe señalar también que la expresión "que comprende" está destinada a ser abarcativa y permite, pero no exige, la inclusión de elementos o etapas adicionales. Cuyo se utiliza en la presente memoria la expresión "que comprende", se abarca y se divulga también la expresión "que consta de".
Cuyo se proporcionan intervalos, se incluyen los extremos. Además, se debe entender que, a menos que se indique lo contrario, o sea evidente de otro modo por el contexto y la comprensión de una persona con conocimientos corrientes de la técnica, los valores que se expresan como intervalos pueden adoptar cualquier valor o subintervalo específicos dentro de los intervalos expuestos en las diferentes realizaciones de la invención, hasta una décima parte de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
No se pretende que los encabezados de tablas y secciones sean limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Síntesis de Polinucleótido Quimérico
A. Ruta del trifosfato
Dos regiones o partes de un polinucleótido quimérico pueden unirse o ligarse usyo química de trifosfato. De acuerdo con este método, una primera región o parte de 100 nucleótidos o menos puede sintetizarse químicamente con un monofosfato en 5' y 3'desOH terminal u OH bloqueado. Si la región tiene una longitud mayor de 80 nucleótidos, se puede sintetizar como dos cadenas para la ligación.
Si la primera región o parte se sintetiza como una región o parte modificada en forma no posicional mediante transcripciónin vitro(IVT), puede seguir la conversión del monofosfato 5' con una posterior formación de casquete del extremo 3'. Los grupos protectores de monofosfato se pueden seleccionar entre cualesquiera de los conocidos en la técnica.
La segunda región o parte del polinucleótido quimérico se puede sintetizar usyo ya sea síntesis química o métodos de IVT. Los métodos de IVT pueden incluir una ARN polimerasa que puede utilizar un cebador con un casquete modificado. Como alternativa, puede sintetizarse químicamente y acoplarse a la región o parte de IVT un casquete de hasta 80 nucleótidos.
Cabe señalar que, para los métodos de ligación, la ligación con ADN ligasa T4 seguida de un tratamiento con ADNasa debería evitar la concatenación fácilmente.
No es necesario fabricar el polinucleótido quimérico completo con una cadena principal de fosfato-azúcar. Si una de las regiones o partes codifica un polipéptido, entonces tal región o parte puede comprender una cadena principal de fosfato-azúcar.
La ligación puede entonces realizarse usyo cualquier química clic conocida, química ortoclic, solulink, u otras químicas de bioconjugado conocidas por los expertos en la técnica.
B. Vía sintética
El polinucleótido quimérico puede elaborarse mediante una serie de segmentos de partida. Tales segmentos incluyen:
(a) un segmento en 5' protegido y con casquete que comprende un OH en 3' normal (SEG. 1)
(b) un segmento de trifosfato en 5' que puede incluir la región codificante de un polipéptido y que comprende un OH en 3' normal (SEG. 2)
(c) el segmento de monofosfato en 5' para el extremo 3' del polinucleótido quimérico (por ejemplo, la cola) que comprende cordicepina o carece de OH en 3' (SEG.3)
Tras la síntesis (química o por IVT), el segmento 3 (SEG. 3) puede tratarse con cordicepina y luego con pirofosfatasa para crear el monofosfato en 5'.
El segmento 2 (SEG. 2) puede entonces ligarse al SEG. 3 usyo ARN ligasa. El polinucleótido ligado puede entonces purificarse y tratarse con pirofosfatasa para escindir el difosfato. El constructo SEG.2-SEG. 3 tratado se purifica a continuación y el SEG. 1 se liga al extremo 5'. Se puede realizar una etapa de purificación adicional del polinucleótido quimérico.
Cuyo el polinucleótido quimérico codifica un polipéptido, los segmentos ligados o unidos pueden representarse como: 5' UTR (SEG. 1), marco de lectura abierta u ORF (SEG. 2) y 3' UTR+PoliA (SEG. 3).
Los rendimientos de cada etapa pueden ser de hasta un 90-95%.
Ejemplo 2
PCR para la producción de ADNc
Los procedimientos de PCR para la preparación de ADNc pueden llevarse a cabo mediante el uso de 2x KAPA HIFI™ HotStart ReadyMix de Kapa Biosystems (Woburn, MA). Este sistema incluye 2x KAPA ReadyMix 12.5 |jl; cebador directo ( l0 jM ) 0.75 jl; cebador inverso (10 jM ) 0.75 jl; molde ADNc-100 ng; y dH20 diluido hasta 25.0 jl. Las condiciones de la reacción de PCR pueden ser: a 95 °C durante 5 minutos y 25 ciclos de 98 °C durante 20 segundos, luego 58 °C durante 15 segundos, luego 72 °C durante 45 segundos, luego 72 °C durante 5 minutos, luego 4 °C hasta la finalización.
El cebador inverso de la presente divulgación puede incorporar un poli-T120 para una poli-A120 en el ARNm. Se pueden usar otros cebadores inversos con tractos de poli(T) más largos o más cortos para ajustar la longitud de la cola de poli(A) en el ARNm polinucleotídico.
La reacción puede limpiarse usyo el microkit de PCR PURELINK™ de Invitrogen (Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (hasta 5 jg). Las reacciones más gryes requerirán una limpieza con un producto de mayor capacidad. Después de la limpieza, el ADNc puede cuantificarse usyo el NANODROP™ y analizarse mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ADNc sea del tamaño esperado. Luego, el ADNc puede exponerse para un análisis de secuenciación antes de proceder a la reacción de transcripciónin vitro.
Ejemplo 3
Transcripción in vitro (IVT)
Las reacciones de transcripciónin vitropueden generar polinucleótidos que contienen polinucleótidos modificados uniformemente. Tales polinucleótidos modificados uniformemente pueden comprender una región 0 una parte de los polinucleótidos de la divulgación. La mezcla de nucleótido trifosfato (NTP) de entrada se puede hacer usyo NTP naturales y no naturales.
Una reacción de transcripciónin vitrotípica puede incluir lo siguiente:
1 Molde de ADNc - 1.0 jg
2 10x tampón de transcripción (Tris-HCl 400 mM pH 8.0, MgCh 190 mM, DTT 50 mM, espermidina 10 mM) -2.0 j l
3 NTP a medida (cada uno 25 mM) - 7.2 j l
4 Inhibidor de ARNasa - 20 U
5 ARN polimerasa T7 - 3000 U
6 dH20 - hasta 20.0 j l e
7 Incubación a 37 °C durante 3h-5h.
La mezcla de IVT bruta puede almacenarse a 4 °C durante la noche para una limpieza al día siguiente. Luego puede usarse 1 U de ADNasa libre de ARNasa para digerir el molde original. Después de 15 minutos de incubación a 37 °C, puede purificarse el ARNm mediante el uso del kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este kit puede purificar hasta 500 jg de ARN después de la limpieza, el ARN puede cuantificarse mediante el uso del NanoDrop y analizarse mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ARN tenga el tamaño adecuado y que no se haya producido degradación alguna del ARN.
Formación Enzimática de Casquetes
La formación de casquetes en un polinucleótido se puede realizar con una mezcla que incluye: ARN IVT 60 |jg-180 |jg y dH20 hasta 72 jl. La mezcla puede incubarse a 65 °C durante 5 minutos para desnaturalizar al ARN y después puede transferirse inmediatamente a hielo.
El protocolo puede implicar entonces la mezcla de 10x tampón de formación de casquetes (Tris-HCl (pH 8.0) 0.5 M, KCl 60 mM, MgCb) 12.5 mM (10.0 jl); GTP 20 mM (5.0 jl); S-adenosil metionina 20 mM (2,5 jl); inhibidor de ARNasa (100 U); 2'-O-metiltransferasa (400U); enzima de dotación de casquete de Vaccinia (guanilil transferasa) (40 U); dH20 (hasta 28 jl); e incubación a 37 °C durante 30 minutos para 60 jg de ARN o hasta 2 horas para 180 jg de Ar N.
Luego puede purificarse el polinucleótido mediante el uso del kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la limpieza, el ARN puede cuantificarse con el NANODROP™ (ThermoFisher, Waltham, MA) y analizarse mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ARN tenga el tamaño adecuado y que no se haya producido degradación alguna del ARN. El producto de ARN también se puede secuenciar ejecutyo una PCR de transcripción inversa para generar el ADNc para la secuenciación.
Ejemplo 5
Reacción de Adición de Cola de PoliA
Sin un poli-T en el ADNc, debe llevarse a cabo una reacción de adición de cola de poli-A antes de limpiar el producto final. Esto puede realizarse mezclyo ARN IVT con casquetes (100 jl); inhibidor de ARNasa (20 U); 10x tampón de adición de cola (Tris-HCl 0.5 M (pH 8.0), NaCl 2.5 M, MgCb 100 mM) (12.0 jl); ATP 20 mM (6.0 jl); poli-A polimerasa (20 U); hasta 123.5 j l de dH20 e incubación a 37 °C durante 30 minutos. Si la cola de poli-A ya se encuentra en el transcrito, entonces se puede omitir la reacción de adición de cola y proceder directamente a la limpieza con el kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) (hasta 500 jg). La poli-A polimerasa es, en algunos casos, una enzima recombinante expresada en levadura.
Debe entenderse que la procesividad o integridad de la reacción de adición de cola de poli A no siempre da como resultado una cola de poli A de tamaño exacto. Por ende, las colas de poli A de aproximadamente entre 40-200 nucleótidos, por ejemplo, aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 150-165, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 o 165, se encuentran dentro del alcance de la invención.
Ejemplo 6
Casquetes 5' Naturales y Análogos de Casquetes 5'
La formación de casquetes 5' en polinucleótidos puede llevarse a cabo de manera concomitante durante la reacción de transcripciónin vitroutilizyo los siguientes análogos químicos de casquete de ARN para generar la estructura de casquete 5'-guanosina de acuerdo con los protocolos del fabricante: 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5') G [el casquete ARCA]; G(5')ppp(5')A; G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')A; m7G(5')ppp(5')G (New Engly BioLabs, Ipswich, Ma ). La formación de casquetes 5' en el ARN modificado puede llevarse a cabo después de la transcripción usyo una Enzima de Dotación de Casquete de Virus Vaccinia para generar la estructura “Cap 0”: m7G(5')ppp(5')G (New Engly BioLabs, Ipswich, MA). La estructura de Cap 1 se puede generar utilizyo tanto la Enzima de Dotación de Casquete de Virus Vaccinia como una 2'-O metil-transferasa para generar: m7G(5')ppp(5')G-2'-O-metilo. La estructura de Cap 2 se puede generar a partir de la estructura de Cap 1, seguida por la 2'-O-metilación del nucleótido 5'-antepenúltimo utilizyo una 2'-O metil-transferasa. La estructura de Cap 3 se puede generar a partir de la estructura de Cap 2, seguida por la 2'-O-metilación del nucleótido 5'-preantepenúltimo utilizyo una 2'-O metil-transferasa. Las enzimas pueden obtenerse de una fuente recombinante.
Cuyo se transfectan a células de mamífero, los ARNm modificados pueden tener una estabilidad de entre 12 18 horas, o superior a 18 horas, por ejemplo, 24, 36, 48, 60, 72 o más de 72 horas.
Ejemplo 7
Ensayos de Formación de Casquetes
A. Ensayo de Expresión de Proteínas
Los polinucleótidos que codifican un polipéptido que contiene cualquiera de los casquetes expuestos en la presente memoria se pueden transfectar a células en concentraciones iguales. Transcurridas 6 , 12, 24 y 36 horas después de la transfección, la cantidad de proteína secretada en el medio de cultivo puede ensayarse mediante ELISA. Los polinucleótidos sintéticos que secretan mayores niveles de proteína al medio corresponderían a un polinucleótido sintético con una estructura de Cap más traduccionalmente competente. B. Síntesis de Análisis de Pureza
Los polinucleótidos que codifican un polipéptido que contiene cualquiera de los casquetes expuestos en la presente memoria se pueden comparar en cuanto a la pureza utilizyo electroforesis en gel de agarosa-urea desnaturalizante o análisis por HPLC. Los polinucleótidos con una bya consolidada única por electroforesis corresponden al producto de mayor pureza en comparación con los polinucleótidos con múltiples byas o byas rayadas. Los polinucleótidos sintéticos con un único pico de HPLC también corresponderían a un producto de mayor pureza. La reacción de formación de casquetes con mayor eficacia proporcionaría una población de polinucleótidos más pura.
C. Análisis de Citocina
Los polinucleótidos que codifican un polipéptido que contiene cualquiera de los casquetes expuestos en la presente memoria se pueden transfectar a células en múltiples concentraciones. Transcurridas 6, 12, 24 y 36 horas después de la transfección, la cantidad de citocinas proinflamatorias tales como TNF-alfa e IFN-beta secretadas en el medio de cultivo puede ensayarse mediante ELISA. Los polinucleótidos que dan como resultado la secreción de niveles más altos de citocinas proinflamatorias en el medio corresponderían a polinucleótidos que contienen una estructura de casquete de activación inmunitaria.
D. Eficacia de Reacción de Formación de Casquetes
Los polinucleótidos que codifican un polipéptido que contiene cualquiera de los casquetes expuestos en la presente memoria se pueden analizar en cuanto a la eficacia de la reacción de formación de casquetes por LC-MS después del tratamiento con nucleasa. El tratamiento con nucleasa de los polinucleótidos con casquete produciría una mezcla de nucleótidos libres y la estructura de casquete de 5'-5-trifosfato con casquete detectable por LC-MS. La cantidad de producto con casquete en los espectros LC-MS se puede expresar como un porcentaje de polinucleótidos totales de la reacción y correspondería a la eficacia de la reacción de formación de casquetes. La estructura de casquete con mayor eficacia de reacción de formación de casquetes tendría una mayor cantidad de producto con casquetes por LC-MS.
Ejemplo 8
Electroforesis en Gel de Agarosa de ARN Modificado o Productos de PCR RT
Los polinucleótidos individuales (200-400 ng en un volumen de 20 j l ) o productos de PCR de transcripción inversa (200-400 ng) pueden cargarse en un pocillo en un E-Gel de agarosa al 1.2% no desnaturalizante (Invitrogen, Carlsbad, CA) y someterse durante 12-15 minutos, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Ejemplo 9
Datos Espectrales UV y Cuantificación de ARN Modificado con Nanodrop
Pueden utilizarse polinucleótidos modificados en tampón TE (1 j l ) para lecturas de absorbancia de UV Nanodrop para cuantificar el rendimiento de cada polinucleótido a partir de una reacción de transcripciónin vitroo síntesis química.
Ejemplo 10
Formulación de ARNm Modificado Utilizyo Lipidoides
Los polinucleótidos pueden formularse para experimentosin vitromezclyo los polinucleótidos con el lipidoide en una proporción establecida antes de la adición a células. La formulaciónin vivopuede requerir la adición de ingredientes adicionales para facilitar la circulación por el cuerpo. Para ensayar la capacidad de estos lipidoides para formar partículas adecuadas para el trabajoin vivo,se puede utilizar como punto de partida un proceso de formulación estándar utilizado para formulaciones de ARNip-lipidoide. Después de la formación de la partícula, se puede añadir polinucleótido y dejar que éste se integre en el complejo. La eficacia de encapsulación puede determinarse mediante el uso de ensayos de exclusión de colorante estándar.
Ejemplo 11
Método de Rastreo para la Expresión de Proteínas
A. Ionización por Electrospray
Una muestra biológica que puede contener proteínas codificadas por un polinucleótido administrado al individuo puede prepararse y analizarse de acuerdo con el protocolo del fabricante para ionización por electrospray (ESI, por sus siglas en inglés) usyo 1, 2, 3 o 4 analizadores de masa. Una muestra biológica también puede analizarse usyo un sistema de espectrometría de masas ESI en tándem.
Los patrones de fragmentos de proteína, o proteínas completas, pueden compararse con controles conocidos para una proteína dada y la identidad puede determinarse por comparación.
B. Desorción/Ionización Láser Asistida por Matriz
Una muestra biológica que puede contener proteínas codificadas por uno o más polinucleótidos administrados al individuo puede prepararse y analizarse de acuerdo con el protocolo del fabricante para la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI, por sus siglas en inglés).
Los patrones de fragmentos de proteína, o proteínas completas, pueden compararse con controles conocidos para una proteína dada y la identidad puede determinarse por comparación.
C. Cromatografía líquida-Espectrometría de Masas-Espectrometría de Masas
Una muestra biológica, que puede contener proteínas codificadas por uno o más polinucleótidos, se puede tratar con una enzima tripsina para digerir las proteínas contenidas en la misma. Los péptidos resultantes pueden analizarse por cromatografía líquida-espectrometría de masas-espectrometría de masas (LC/MS/MS). Los péptidos se pueden fragmentar en el espectrómetro de masas para producir patrones de diagnóstico que se pueden emparejar con bases de datos de secuencias de proteínas mediante algoritmos informáticos. La muestra digerida puede diluirse para lograr 1 ng o menos de material de partida para una proteína dada. Las muestras biológicas que contienen un fondo de tampón simple (por ejemplo, agua o sales volátiles) son susceptibles de digestión directa en solución; los fondos más complejos (por ejemplo, detergente, sales no volátiles, glicerol) requieren una etapa de limpieza adicional para facilitar el análisis de la muestra.
Los patrones de fragmentos de proteína, o proteínas completas, pueden compararse con controles conocidos para una proteína dada y la identidad puede determinarse por comparación.
Ejemplo 12
Síntesis de ARNm que Codifica GALT
Se sintetizan y caracterizan polinucleótidos optimizados en cuanto a la secuencia que codifican polipéptidos de GALT, es decir, SEQ ID NOs: 1 o 3, como se describe en los Ejemplos 1 a 11. Se prepararon ARNm que codifican ambas isoformas de GALT humanas para los Ejemplos descritos posteriormente, y se sintetizaron y caracterizaron los mismos como se describe en los Ejemplos 1 a 11.
Se puede construir un ARNm que codifique GALT humana, por ejemplo, usyo la secuencia de ORF proporcionada en la SEQ ID NO: 2 o 4. La secuencia de ARNm incluye regiones UTR tanto 5' como 3' (véanse, por ejemplo, las SEQ ID NOs: 52 y 77, respectivamente). En un constructo, las secuencias de 5' UTR y 3' UTR son la s Eq ID NO: 52 y las SEQ ID NOs: 77 o 98, respectivamente (véase la Tabla 5). 5 'UTR
TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAÍíCTAATflOGACTCA'CTATAGGGAAA
: e : : n O: t:
3 ’ [JTR
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La secuencia de ARNm de GALT se preparó como ARNm modificado. Específicamente, durante la traducciónin vitro,se puede generar ARNm modificado usyo 5-metoxi-UTP para asegurar que los ARNm contengan 5-metoxi-uridina al 100% en lugar de uridina. Además, el ARNm de GALT se puede sintetizar con un cebador que introduzca una cola de poli-A, y se genera una estructura de Cap 1 en ambos ARNm utilizyo la Enzima de Dotación de Casquete de Virus Vaccinia y una 2'-O metil-transferasa para generar: m7G(5')ppp(5')G-2'-O-metilo.
Ejemplo 13
Detección de la Expresión de GALT EndógenaIn Vitro
La expresión de GALT se caracteriza en diversas líneas celulares obtenidas tanto de ratones como de fuentes humanas. Se cultivan células en condiciones estándar y se obtienen extractos celulares colocyo las células en tampón de lisis. Con fines de comparación, también se preparan controles apropiados. Para analizar la expresión de GALT, a partir de las células ensayadas se preparan muestras de lisado, que se mezclan con tampón de carga de muestra de dodecilsulfato de litio y se someten a análisis de transferencia Western estándar. Para la detección de GALT, el anticuerpo utilizado es un anticuerpo anti-GALT comercial. Para la detección de un control de carga, el anticuerpo usado es anticitrasa sintasa (policlonal de conejo; PA5-22126; Thermo-Fisher Scientific®). Para examinar la localización de GALT endógena, se realiza un análisis de inmunofluorescencia en células. La expresión de GALT se detecta usyo un anti-GALT comercial. La localización de organelas específicas puede detectarse con productos comerciales existentes. Por ejemplo, las mitocondrias se pueden detectar usyo Mitotracker, y el núcleo se puede teñir con DAPI. El análisis de imágenes se realiza en un sistema de formación de imágenes Zeiss ELYRA.
La expresión de GALT endógena se puede usar como base para determinar los cambios en la expresión de GALT que resultan de la transfección con ARNm que comprenden ácidos nucleicos que codifican GALT.
Ejemplo 14
Expresión In Vitro de GALT en Células HeLa
Para medir la expresión in vitro de GALT humana en células HeLa, estas células se siembran en placas de 12 pocillos (BD Biosciences, San José, EE.UU.) un día antes de la transfección. Las formulaciones de ARNm que comprenden GALT humana o un control de GFP se transfectan usyo 800 ng de ARNm y 2 pL de Lipofectamina 2000 en 60 pL de OPTI-MEM por pocillo y se incuban.
Después de 24 horas, las células de cada pocillo se lisan usyo una cantidad uniforme de tampón de lisis. Se utilizan controles apropiados. Las concentraciones de proteína de cada uno se determinan usyo un ensayo de BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para analizar la expresión de GALT, se preparan cargas iguales de cada lisado (24 pg) en un tampón de carga, que se someten a análisis de transferencia Western estándar. Para la detección de GALT, se utiliza un anticuerpo anti-GALT comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 15
Actividad de GALT In Vitro en Células HeLa
Se realiza un ensayo de actividad de GALT in vitro para determinar si la GALT expresada de manera exógena después de la introducción de ARNm que comprende una secuencia de GALT está activa.
A. Ensayo de Expresión
Las células HeLa se transfectan con formulaciones de ARNm que comprenden GALT humana o un control de GFP. Las células se transfectan con lipofectamina 2000 y se lisan como se ha descrito en el Ejemplo 14 anterior. También se preparan controles apropiados.
B. Ensayo de Actividad
Para evaluar si la GALT exógena puede funcionar, se realiza un ensayo de actividadin vitrousyo lisados de células HeLa transfectadas como fuente de actividad enzimática. Para empezar, el lisado es sustrato de GALT mezclado. La reacción se detiene añadiendo 100 g/L de TCA y con formación de vórtice. Los tubos de reacción se centrifugan a continuación a 13000 g durante 1 min, y el sobrenadante se analiza para detectar la presencia de productos enzimáticos marcados resultantes de la actividad de GALT utilizyo separación y cuantificación basadas en HPLC. Específicamente, se analizan 20 pL de cada sobrenadante de reacción de actividad usyo un sistema de HPLC equipado con una bomba cuaternaria, un muestreador múltiple, un compartimento de columna termostática, una columna de HPLC Poroshell EC-C18 120 y un detector radiométrico controlado por el sistema de datos de cromatografía OpenLAB, todos utilizados de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes.
Ejemplo 16
Medición de la ExpresiónIn Vitrode GALT en Células
Se examinan células de individuos normales y pacientes con galactosemia de tipo 1 para determinar su capacidad para expresar GALT exógena. Las células se transfectan con formulaciones de ARNm que comprenden GALT humana, GALT de ratón, o un control de GFP mediante electroporación usyo un protocolo estándar. Cada constructo se ensaya por separado. Después de la incubación, las células se lisan y la concentración de proteínas en cada lisado se mide usyo un ensayo adecuado, por ejemplo, mediante ensayo de BCA. Para analizar la expresión de GALT, se preparan cargas iguales de cada lisado en un tampón de carga, que se someten a análisis de transferencia Western estándar. Para la detección de GALT, se usa un anti-GALT. Para la detección de un control de carga, el anticuerpo usado es anticitrasa sintasa (policlonal de conejo; MA5-17625; Pierce®).
Ejemplo 17
MediciónIn Vitrode la Actividad de GALT en Lisados
A. Expresión
Se cultivan células de individuos humanos normales y pacientes con galactosemia de tipo 1. Las células se transfectan con formulaciones de ARNm que comprenden GALT humana, GALT de ratón, o un control de GFP mediante electroporación usyo un protocolo estándar.
B. Ensayo de Actividad
Para evaluar si la GALT exógena funciona, se realiza un ensayo de actividadin vitrousyo lisados de células transfectadas como fuente de actividad enzimática. El lisado que contiene proteína GALT expresada se incuba con sustrato de GALT marcado, y la actividad de GALT se cuantifica midiendo los niveles de productos marcados que resultan de la actividad enzimática de GALT.
Ejemplo 18
Expresión de GALTIn Vivoen Modelos Animales
Para evaluar la capacidad de los ARNm que contienen GALT de facilitar la expresión de GALTin vivo,se introduce ARNm que codifica GALT humana en ratones C57B/L6. A los ratones C57B/L6 se les inyecta por vía intravenosa, bien ARNm de control (NT-FIX), bien ARNm de GALT humana. El ARNm se formula en nanopartículas lipídicas para su administración a los ratones. Los ratones se sacrifican después de 24 o 48 horas y los niveles de proteína GALT en lisados hepáticos se determinan por electroforesis capilar (CE). La expresión de citrato sintasa se examina para su uso como un control de carga. Para las inyecciones de NT-FIX de control, se ensayan 4 ratones para cada punto de tiempo. Para las inyecciones de ARNm de GALT humana, se ensayaron 6 ratones para cada punto de tiempo. Se espera que el tratamiento con ARNm que codifica GALT induzca de forma fiable la expresión de GALT.
Ejemplo 19
Constructos Mutantes y Quiméricos de GALT Humana
Un polinucleótido de la presente divulgación puede comprender al menos una primera región de nucleósidos enlazados que codifican GALT humana, que puede construirse, expresarse y caracterizarse de acuerdo con los ejemplos anteriores. De manera similar, la secuencia de polinucleótidos puede contener una o más mutaciones que dan como resultado la expresión de una GALT con actividad aumentada o disminuida. Además, la secuencia de polinucleótidos que codifica GALT puede ser parte de un constructo que codifique una proteína de fusión quimérica.
Ejemplo 20
Producción de composiciones de nanopartículas
A. Producción de composiciones de nanopartículas
Las nanopartículas se pueden hacer con procesos de mezcla tales como microfluídica y mezcla de unión en T de dos corrientes de fluido, una de las cuales contiene el polinucleótido y la otra tiene los componentes lipídicos. Las composiciones lipídicas se preparan combinyo un aminolípido ionizable divulgado en la presente memoria, por ejemplo, un lípido de acuerdo con la Fórmula (I) tal como el Compuesto 18 o un lípido de acuerdo con la Fórmula (III) tal como el Compuesto 236, un fosfolípido (tal como DOPE o DSPC, obtenible de Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), un lípido de PEG (tal como 1,2-dimiristoil-sn-glicerol metoxipolietilenglicol, también conocido como PEG-DMG, obtenible de Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), y un lípido estructural (tal como colesterol, obtenible de Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania, o un corticosteroide (tal como prednisolona, dexametasona, prednisona e hidrocortisona), o una combinación de los mismos) en concentraciones de aproximadamente 50 mM en etanol. Las soluciones se deben refrigerar para almacenamiento a, por ejemplo, -20 °C. Los lípidos se combinan para producir relaciones molares deseadas y se diluyen con agua y etanol hasta una concentración final de lípidos de entre aproximadamente 5.5 mM y aproximadamente 25 mM.
Las composiciones de nanopartículas que incluyen un polinucleótido y una composición lipídica se preparan combinyo la solución lipídica con una solución que incluye las relaciones peso:peso de polinucleótido en la composición lipídica a polinucleótido entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 50:1. La solución lipídica se inyecta rápidamente usyo un sistema basado en microfluido NanoAssemblr con caudales entre aproximadamente 10 ml/min y aproximadamente 18 ml/min en la solución de polinucleótido para producir una suspensión con una relación de agua a etanol entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 4:1.
Para composiciones de nanopartículas que incluyen un ARN, las soluciones del ARN en concentraciones de 0.1 mg/ml en agua desionizada se diluyen en tampón de citrato de sodio 50 mM a un pH entre 3 y 4 para formar una solución madre.
Las composiciones de nanopartículas pueden procesarse por diálisis para eliminar etanol y lograr intercambio de tampón. Las formulaciones se dializan dos veces contra solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés), pH 7.4, a volúmenes 200 veces mayores que el del producto primario utilizyo casetes Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) con un límite de peso molecular de 10 kD. La primera diálisis se lleva a cabo a temperatura ambiente durante 3 horas. Las formulaciones se dializan después durante una noche a 4 °C. La suspensión de nanopartículas resultante se filtra a través de filtros estériles de 0.2 pm (Sarstedt, Numbrecht, Alemania) a frascos de vidrio y se sella con cierres de fijación por presión. Generalmente se obtienen soluciones de composición de nanopartículas de 0.01 mg/ml a 0.10 mg/ml.
El método descrito anteriormente induce la nanoprecipitación y la formación de partículas. Pueden usarse procesos alternativos que incluyen, pero no se limitan a, unión en T e inyección directa, para lograr la misma nanoprecipitación.
B. Caracterización de composiciones de nanopartículas
Se puede usar un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, Reino Unido) para determinar el tamaño de partícula, el índice de polidispersidad (PDI, por sus siglas en inglés) y el potencial zeta de las composiciones de nanopartículas en 1xPBS para determinar el tamaño de partícula y PBS 15 mM para determinar el potencial zeta.
Se puede usar espectroscopía ultravioleta-visible para determinar la concentración de un polinucleótido (por ejemplo, ARN) en composiciones de nanopartículas. Se añaden 100 pL de la formulación diluida en 1xPBS a 900 pL de una mezcla 4:1 (v/v) de metanol y cloroformo. Después de mezclar, el espectro de absorbancia de la solución se registra, por ejemplo, entre 230 nm y 330 nm en un espectrofotómetro D<u>800 (Beckman Coulter, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). La concentración de polinucleótido en la composición de nanopartículas puede calcularse basándose en el coeficiente de extinción del polinucleótido usado en la composición y en la diferencia entre la absorbancia a una longitud de onda de, por ejemplo, 260 nm y el valor base a una longitud de onda de, por ejemplo, 330 nm.
Para composiciones de nanopartículas que incluyen un ARN, se puede usar un ensayo de ARN QUANT-IT™ RIBOGRE<e>N® (Invitrogen Corporation Carlsbad, CA) para evaluar la encapsulación de un ARN por la composición de nanopartículas. Las muestras se diluyen hasta una concentración de aproximadamente 5 pg/mL en una solución tampón de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.5). Se transfieren 50 pL de las muestras diluidas a una placa de 96 pocillos de poliestireno y se añaden a los pocillos, bien 50 pL de tampón de TE, bien 50 pL de una solución de Triton X-100 al 2%. La placa se incuba a una temperatura de 37 °C durante 15 minutos. Se diluye el reactivo RIBOGREEN® 1:100 en tampón de TE y se añaden 100 pL de esta solución a cada pocillo. La intensidad de fluorescencia puede medirse usyo un lector de placas de fluorescencia (Wallac Victor 1420 Multilablel Counter; Perkin Elmer, Waltham, MA) a una longitud de onda de excitación de, por ejemplo, aproximadamente 480 nm y una longitud de onda de emisión de, por ejemplo, aproximadamente 520 nm. Los valores de fluorescencia del blanco de reactivo se restan de los de cada una de las muestras y el porcentaje de ARN libre se determina dividiendo la intensidad de fluorescencia de la muestra intacta (sin adición de Triton X-100) por el valor de fluorescencia de la muestra entorpecida (causada por la adición de Triton X-100).
En la Tabla 7 a continuación se presentan formulaciones ejemplares de las composiciones de nanopartículas. El término "Compuesto" se refiere a un lípido ionizable tal como MC3, Compuesto 18 o Compuesto 236. “Fosfolípido” puede ser DSPC o DOPE. “Lípido de PEG” puede ser PEG-DMG o Compuesto 428.
Tabla 7. Formulaciones Ejemplares de Nanopartículas
Ejemplo 21
Expresión, Actividad y Función de la Proteína GALTIn Vitroen Fibroblastos de Pacientes con Galactosemia
La expresión de la proteína GALT se determinó para fibroblastos normales (GM00637) y fibroblastos de pacientes con galactosemia de tipo 1 (GM00638) después de la transfección de ARNm que codifica la isoforma 2 de GALT humana (hGalt2; Constructo NO 23), la isoforma 1 de GALT de ratón (mGaltl; Constructo NO 21), la isoforma 2 de GALT de ratón (mGalt2; Constructo NO 24) o GFP de control a las células. La expresión de la proteína GALT se determinó mediante análisis de transferencia Western (Abeam, AB178406). La actividad enzimática de GALT (pM/min/pg de proteína) se determinó mediante un ensayo basado en HPLC como se ha descrito previamente en Lindhout M, et al.,Clínica chimica Acta,411(13-14):980-983, 2010. La transfección de ARNm que codifica mGaltl dio como resultado una sobreexpresión de GALT tanto en fibroblastos normales (GM00637) como en fibroblastos de pacientes con galactosemia de tipo 1 (GM00638) (Figura 8A). La actividad de GALT se detectó por HPLC tanto en fibroblastos normales como en fibroblastos de pacientes a los que se administró ARNm que codifica mGaltl (Figura 8B).
Como se muestra en laFigura 8C, los fibroblastos de galactosemia de tipo 1 (GM00638) proliferaron normalmente en medio que contenía glucosa (Figura 8C, recuadro izquierdo). Sin embargo, los fibroblastos de pacientes a los que se administró eGFP de control murieron en 5 días cuyo se cultivaron en medio que contenía galactosa (Figura 8C, recuadro central). La administración de ARNm que codifica mGaltl rescató parcialmente (aproximadamente un 50%) la muerte inducida por galactosa en los fibroblastos aislados de pacientes con galactosemia(Figura 8C, recuadro derecho).
Ejemplo 22
Expresión y Actividad de la Proteína GALTIn Vivoen Ratones de Tipo Silvestre a los que se Administró ARNm que Codifica mGalt1
Se midieron la actividad de GALT y la expresión de proteína en el hígado 24 horas después de una administración única de ARNm modificado con 1-metil-pseudouridina que codifica Galtl de ratón (mGaltl; Constructo NO 21) o ARNm de control que codifica NTFIX (Factor iX no traducido; Constructo NO 22) formulados en nanopartículas lipídicas (MC3) a ratones de tipo silvestre (Figura 9A). Las dosis únicas se administraron como inyecciones intravenosas de 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg y 2 mg/kg. La administración de ARNm modificado que codifica mGaltl dio como resultado un aumento dependiente de la dosis en la expresión (Figura 9B) y la actividad (Figura 9C) de la proteína GALT en el hígado de ratones de tipo silvestre.
En un estudio adicional, se administró a ratones de tipo silvestre ARNm modificado con 1 -metil-pseudouridina que codifica mGaltl o ARNm de control que codifica NTFIX formulados en nanopartículas lipídicas (MC3) como una inyección intravenosa única de 0.3 mg/kg, y se midió la actividad de GALT en el hígado 1 día, 3 días y 7 días después de la administración (Figura 10A). La actividad enzimática de GALT se determinó mediante un ensayo basado en HPLC. Se detectó actividad de GALT elevada en el hígado 1, 3 y 7 días después de una inyección intravenosa única de ARNm modificado que codifica mGaltl a 0.3 mg/kg (Figura 10B). Estos resultados muestran que la actividad de GALT seguía siendo elevada (aproximadamente un 10%) en el hígado al menos 1 semana después de una administración única de ARNm modificado que codifica mGaltl.
Ejemplo 23
Expresión, Actividad y Función de la Proteína GALTIn Vivoen Ratones GALT Knock-out a los que se Administró ARNm que Codifica mGaltl o hGaltl
Expresión de proteína GALT, actividad de GALT y nivel de biomarcador (Gal-1-P) en el hígado, así como nivel de biomarcador (Gal-1-P) en glóbulos rojos, de ratones GALT knock-out (ratones KO) medidos 24 horas después de la administración intravenosa (IV) de ARNm modificado con 1-metil-pseudouridina que codifica Galt1 de ratón (Constructo NO 21) y la isoforma 1 de GALT humana (hGalt1; Constructo NO 20) o ARNm de control que codifica NTFIX (Factor IX no traducido; Constructo NO 22) formulados en nanopartículas lipídicas (MC3). La expresión y la actividad de la proteína GALT se determinaron 24 horas después de la administración de una dosis IV única de 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg o 0.5 mg/kg de ARNm modificado. Se determinaron los niveles de galactosa-1-fosfato (Gal-1-P) en el hígado y los glóbulos rojos (RBC) para muestras tomadas 24 horas después de la administración de una dosis IV única de 0.5 mg/kg de ARNm modificado usyo cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS, por sus siglas en inglés) como se ha descrito previamente (Chen J et al.,Clinical Chemistry,48(4):604-12, 2002).
Una administración IV única de ARNm modificado que codifica, bien mGalt, bien hGalt, dio como resultado la expresión dependiente de la dosis de la proteína GALT en hígados de ratones KO (Figura 11 A). La expresión de la proteína GALT se normalizó a la expresión de la proteína GALT endógena en ratones de tipo silvestre. En la dosis de 0.5 mg/kg, el ARNm modificado que codifica mGalt dio como resultado una expresión de la proteína GALT en ratones KO que estaba cerca (aproximadamente un 80-90%) del nivel endógeno de expresión de la proteína GALT en ratones de tipo silvestre. La actividad de GALT se correlacionó con los niveles de expresión de proteína (Figura 11B). En ratones GALT knock-out, la administración de la dosis de 0.5 mg/kg de ARNm modificado que codifica, bien mGalt, bien hGalt, redujo los niveles de galactosa-1-fosfato en los glóbulos rojos en aproximadamente un 80% en comparación con el control (Figura 11C) y en el hígado en aproximadamente un 80% en comparación con el control (Figura11D) a las 24 horas.
Ejemplo 24
DuraciónIn Vivode la Expresión, Actividad y Función de la Proteína GALT en Ratones GALT Knock-out a los que se Administró una Dosis Única de ARNm que Codifica mGaltl
La expresión de proteína GALT, la actividad de GALT y el nivel de biomarcador (Gal-1-P) en el hígado, así como el nivel de biomarcador (Gal-1-P) en glóbulos rojos, de ratones GALT knock-out (ratones KO, machos) se midieron 2, 6, 10 y 14 días después de la administración intravenosa (IV) de ARNm modificado con 1-metilpseudouridina que codifica Galtl de ratón (mGaltl; Constructo NO 21) o ARNm de control que codifica NTFIX (Factor IX no traducido; Constructo NO 22) formulados en nanopartículas lipídicas (MC3). La expresión de la proteína GALT en el hígado en cada punto de tiempo se determinó mediante transferencia Western, y la actividad enzimática de GALT se determinó mediante un ensayo basado en HPLC (los mismos métodos que se describen en el Ejemplo 21). Los niveles de galactosa-1-fosfato en el hígado y los glóbulos rojos se midieron para cada punto de tiempo usyo GC-MS (el mismo método que se describe en el Ejemplo 23).
La expresión de la proteína GALT en ratones KO en relación con la expresión de la proteína GALT endógena en ratones WT se muestra en laFigura 12A. La expresión de la proteína GALT en ratones KO a los que se administró ARNm que codifica GALT fue la más alta dos días después de la inyección (aproximadamente un 59.7% de niveles Wt endógenos), pero la proteína GALT se detectó todavía 14 días después de la inyección (aproximadamente un 7% de niveles WT endógenos) (Figura 12A). Los niveles de expresión de proteína se correlacionaban con la actividad de GALT. La actividad de GALT en el hígado se detectó al menos 10 días después de una inyección única de ARNm de GALT en ratones KO (Figura 12B).
Se observó una disminución significativa en los niveles de galactosa-1-fosfato (Gal-1-P) en los glóbulos rojos (RBC) de ratones GALT KO dos semanas después de una única inyección intravenosa de ARNm que codifica GALT. Antes de la administración de ARNm que codifica GALT, los niveles de Gal-1-P en los RBC de ratones KO no tratados fueron similares(Figura 13A). Después de la administración de una dosis única de ARNm que codifica GALT, los niveles de Gal-1-P en ratones KO disminuyeron, mientras que los niveles de Gal-1-P en ratones KO a los que se administró ARNm de control permanecieron elevados(Figura 13B). En ratones KO a los que se administró ARNm de GALT, se observó una reducción de hasta el 70% en galactosa-1-fosfato en los glóbulos rojos alrededor del día 6(Figura 13C). Los niveles de Gal-1-P permanecieron más bajos en ratones tratados con ARNm de GALT en comparación con ratones de control de ARNm de NTFIX a los 14 días.
Los niveles de Gal-1-P en el hígado disminuyeron en un 60% en ratones GALT KO a los que se administró ARNm de GALT, y Gal-1-P se mantuvo en niveles bajos en estos ratones en comparación con los niveles de Gal-1-P en ratones de control durante al menos 14 días(Figura 14). Estos resultados indicaron que una dosis única de ARNm que codifica GALT puede disminuir los niveles de Gal-1-P en los RBC y el hígado de ratones KO durante al menos dos semanas.
Ejemplo 25
Expresión y Actividad de la Proteína GALT en Ratones de Tipo Silvestre a los que se Administró una Dosis Única de ARNm que Codifica Galt1 Humana
La expresión de la proteína GALT y la actividad de GALT en el hígado se midieron 24 horas después de una administración única de ARNm modificado con 5-metoxiuridina que codifica Galt1 humana (hGalt1) (Constructos NOs 1-19), ARNm modificado con 1-metil-pseudouridina que codifica Galt l humana (hGalt1) (hGALT1-ModRNA, constructo NO 20), ARNm modificado con 1-metil-pseudouridina que codifica Galt1 de ratón (mGalt1) (mGALT1-ModRNA, constructo NO 21) o ARNm de control que codifica NTFIX (factor IX no traducido) (Constructo NO 22) formulados en nanopartículas lipídicas MC3 a ratones CD1 de tipo silvestre (n=3/grupo). Los constructos se muestran en laTabla 8.
Tabla 8. Constructos de ARNm modificado que incluyen ORF que codifican GALT humana o de ratón (cada uno de los constructos NO 1 a NO 21 comprende un casquete terminal Cap1 5' y una región de PoliA terminal 3')
La dosis única se administró como una inyección de 0.5 mg/kg en la vena caudal. La expresión de la proteína GALT se determinó mediante transferencia Western, y la actividad enzimática de GALT se determinó mediante un ensayo basado en HPLC (los mismos métodos que se describen en el Ejemplo 21). Los resultados para cada ratón se muestran en laTabla 9(expresión de proteína) y laTabla 10(actividad).
Tabla 9: Expresión de Proteína GALT para Constructos de ARNm que Codifican GALT
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La administración de los ARNm modificados que codifican hGaltl dio como resultado un aumento de la expresión y actividad de la proteína GALT en el hígado de ratones de tipo silvestre. La expresión de proteína para cada constructo correspondió al nivel de actividad de GALT, teniendo los constructos NO 12 y No 14 la expresión(Figura.15A)y la actividad(Figura. 15B)de proteína GALT más altas.
En un estudio adicional, la expresión de la proteína GALT y la actividad de GALT en el hígado se midieron 24 horas después de una administración única de ARNm modificado con 5-metoxiuridina que codifica Galt1 humana (hGalt1) (constructos NO 12 y NO 14, respectivamente), ARNm modificado con 1-metil-pseudouridina que codifica Galt1 humana (hGalt1) (Constructo NO 20), o ARNm de control que codifica NTFIX (Factor IX no traducido, Constructo NO 22) formulados en nanopartículas lipídicas del Compuesto 18 a ratones CD1 de tipo silvestre (n=3/grupo). La dosis única se administró como una inyección de 0.5 mg/kg en la vena caudal. Ambos constructos NO 12 y NO 14 tenían una expresión(Figura 15C)y una actividad(Figura 15D)de proteína mayores que el constructo que codifica hGalt1 (Constructo NO 20). La expresión y el nivel de actividad de la proteína GALT con el constructo NO 12 fueron mayores que con el constructo NO 14. El Constructo NO 12 se utilizó para los estudios descritos posteriormente en los Ejemplos 27-28.
Ejemplo 26
Estudio de Eficacia de Dosis Múltiples de ARNm que Codifica Galt1 Humana en Ratones GALT KO
Se midieron la expresión de la proteína GALT y los niveles de biomarcador (Gal-1-P) en glóbulos rojos (RBC), y el hígado de ratones GALT knock-out (ratones KO, macho y hembra) 24 horas después de la última administración intravenosa en la vena caudal de ARNm modificado con 5-metoxiuridina que codifica Galt1 humana (hGalt1) (Constructo NO 12) o ARNm de control que codifica NTFIX (Factor IX no traducido, Constructo NO 22) formulados en nanopartículas lipídicas del Compuesto 18. Se administró a ratones GALT KO (n=8/grupo) ARNm de hGaltl a 0.2 mg/kg cada dos semanas durante 4 dosis. La expresión de la proteína GALT en el hígado en cada punto de tiempo se determinó mediante transferencia Western, y se midieron los niveles de Gal-1-P en RBC e hígado para cada punto de tiempo usyo GC-MS (los mismos métodos que se describen en el Ejemplo 24).
Después de 4 dosis, la administración de ARNm que codifica hGaltl dio como resultado un aumento de la expresión de la proteína GALT en el hígado de ratones GALT KO en comparación con los controles de PBS y ARNm de NTFIX(Figura 16). También, la administración del ARNm que codifica hGaltl dio como resultado niveles más bajos de Gal-1-P y galactosa en RBC o plasma de ratones GALT KO después de cada una de las 4 dosis en comparación con los controles de PBS y ARNm de NTFIX(Figuras 17A, 17B y 17C). La administración de ARNm de hGaltl dio como resultado una reducción de aproximadamente el 70% en Gal-1-P en RBC de ratones KO en comparación con PBS, y una reducción de aproximadamente el 50% en Gal-1-P en RBC de ratones KO en comparación con ARNm de NTFIX. El análisis de significación estadística para los datos de la Figura 17B se presenta en laTabla 11.
Tabla 11: Resumen de Significación Estadística
La administración de ARNm que codifica hGaltl a ratones KO también redujo los niveles de Gal-1-P en el hígado(Figura 18).
Ejemplo 27
Estudio de Rescate en Ratones Neonatales KO a los que se Administró ARNm que Codifica hGalt1
La supervivencia y el peso corporal para ratones GALT KO neonatales (n=8-16 grupo) después de la administración de una dosis intraperitoneal única de 0.5 mg/kg, 1 mg/kg o 2 mg/kg de ARNm modificado con 5-metoxiuridina que codifica hGalt1 (Constructo NO 12) o ARNm de control que codifica NTFIX se determinó durante al menos 21 días. El ARNm se formuló en nanopartículas lipídicas del Compuesto 18. Se usó PBS como control.
La administración de una dosis única de ARNm que codifica hGalt1 prolongó la supervivencia de los ratones GALT KO neonatos en comparación con los controles de una manera dependiente de la dosis(Figura 19). La administración de una dosis única del ARNm de hGalt1 también aumentó el peso corporal en neonatos GALT KO en comparación con los controles con cada dosis ensayada, es decir, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg y 2 mg/kg(Figuras 20A-C).

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una composición que comprende (a) un ARNm que comprende un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT) y (b) un agente de administración, en donde el agente de administración comprende un compuesto que tiene la fórmula (IA):
  2. l se selecciona entre 1, 2, 3, 4 y 5; m se selecciona entre 5, 6, 7, 8 y 9; M1 es un enlace o M'; R4 es alquilo C1-3 insustituido, o -(CH2)nQ, en donde n es 1, 2, 3, 4 o 5 y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o -NHC(O)N(R)2; M y M' se seleccionan independientemente entre -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, un grupo arilo y un grupo heteroarilo; y R2 y R3 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en H, alquilo C1-14 y alquenilo C2-14; cada R se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-3, alquenilo C2-3 y H; cada R' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-18, alquenilo C2-18, -R*YR”, -YR”, y H; cada R” se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C3-14 y alquenilo C3-14; cada R* se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en alquilo C1-12 y alquenilo C2-12; cada Y es independientemente un carbociclo C3-6; 2. La composición de la reivindicación 1, en donde el compuesto es de Fórmula (II):
  3. o una sal o estereoisómero del mismo, en donde R4 es alquilo C1-3 insustituido, o -(CH2)nQ, en donde n es 2, 3 o 4 y Q es OH, -NHC(S)N(R)2, o -NHC(O)N(R)2. 3. La composición de la reivindicación 1, en donde el compuesto es de Fórmula (IIa), (IIb), (IIc), o (IIe):
  4. 4. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el compuesto es el Compuesto 18,
    una sal o un estereoisómero del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
  5. 5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el agente de administración comprende además un fosfolípido, un lípido estructural y un lípido de PEG, o cualquier combinación de los mismos.
  6. 6. La composición de la reivindicación 5, en donde: (a) el fosfolípido se selecciona del grupo que consiste en: 1.2- dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC) 1.2- dimiristoil-sn-glicero-fosfocolina (DMPC), 1.2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1.2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1.2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1.2- diundecanoil-sn-glicero-fosfocolina (DUPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1.2- di-O-octadecenil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 Diether PC), 1-oleoil-2-colesterilhemisuccinoil-sn-glicero-3-fosfocolina (OChemsPC), 1-hexadecil-sn-glicero-3-fosfocolina (C16 Lyso PC), 1.2- dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1.2- diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1.2- didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1.2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1.2- difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ME 16:0 PE), 1.2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1.2- dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1.2- dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1.2- diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1.2- didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, sal sódica de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) (DOPG), esfingomielina, y cualesquiera mezclas de las mismas; y/o (b) el lípido estructural se selecciona del grupo que consiste en colesterol, fecosterol, sitosterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol, brasicasterol, tomatidina, ácido ursólico, alfa-tocoferol y cualesquiera mezclas de los mismos.
  7. 7. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el ARNm comprende: (i) un casquete 5' terminal; (ii) una región no traducida (UTR) 5'; (iii) un marco de lectura abierta (ORF) que codifica un polipéptido de galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (GALT) humana, en donde el ORF tiene al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 5 a 29; (iv) una 3' UTR, y (v) una cola de poli-A.
  8. 8. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el ORF tiene al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 5 a 29.
  9. 9. La composición según la reivindicación 7, en donde el contenido de uracilo en el ORF está entre un 127% y un 129%, entre un 126% y un 130%, entre un 125% y un 131%, entre un 124% y un 132%, entre un 123% y un 133%, entre un 122% y un 134%, entre un 121% y un 135%, entre un 120% y un 136%, entre un 119% y un 137%, entre un 118% y un 138%, entre un 117% y un 139%, entre un 116% y un 140% o entre un 115% y un 141% del mínimo teórico.
  10. 10. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la 5' UTR comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 35.
  11. 11. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde el ARNm comprende el sitio de unión de miR-142-3p, en donde el sitio de unión de miR-142-3p comprende SEQ ID NO: 32.
  12. 12. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde el casquete terminal 5' es Cap1.
  13. 13. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde la cola de poli-A tiene una longitud de 80 a 250 residuos, opcionalmente 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 o 250 residuos de longitud.
  14. 14. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, siendo la composición una composición de nanopartículas.
  15. 15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para su uso en el tratamiento de galactosemia de tipo 1 (Gal-1) en un individuo humano.
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