ES2979220T3 - Constructos quiméricos de anticuerpos/receptores de células T y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

La presente solicitud proporciona construcciones quiméricas de anticuerpo-TCR que comprenden una fracción de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno diana fusionado a un TCRM capaz de reclutar al menos un módulo de señalización asociado a TCR. También se proporcionan métodos para elaborar y utilizar estas construcciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Constructos quiméricos de anticuerpos/receptores de células T y usos de los mismos

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente solicitud reivindica prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 62/245.944, presentada el 23 de octubre de 2015, la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 62/304.918, presentada el 7 de marzo de 2016, la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 62/345.649, presentada el 3 de junio de 2016, y la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 62/369.694, presentada el 1 de agosto de 2016.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a constructos quiméricos de anticuerpos/receptores de células T y usos de los mismos, incluyendo el tratamiento y diagnóstico de enfermedades.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La inmunidad mediada por células T es un proceso adaptativo de desarrollo de linfocitos T específicos de antígeno (Ag) para eliminar virus, infecciones bacterianas, parasitarias o células malignas. También puede implicar el reconocimiento aberrante del antígeno propio, lo que lleva a enfermedades inflamatorias autoinmunes. La especificidad de Ag de los linfocitos T se basa en el reconocimiento a través del receptor de células T (TCR) de péptidos antigénicos únicos presentados por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en células que presentan Ag (APC) (Broere, et al., Principles of Immunopharmacology, 2011). Cada linfocito T expresa un TCR único en la superficie celular como resultado de la selección del desarrollo tras la maduración en el timo. El TCR se presenta en dos formas: como heterodímero ap o como heterodímero<y>§. Las células T expresan o la forma ap o la forma<y>§ del TCR en la superficie celular. Las cuatro cadenas, a/p/Y/6, tienen una estructura extracelular característica que consiste en un dominio N-terminal similar a una "región variable de inmunoglobulina" altamente polimórfico y un segundo dominio similar a una "región constante de inmunoglobulina". Cada uno de estos dominios tiene un puente disulfuro intradominio característico. La región constante está próxima a la membrana celular, seguida de un péptido conector, una región transmembrana y una cola citoplasmática corta. El enlace covalente entre las 2 cadenas del TCR heterodimérico está formado por el residuo de cisteína situado dentro de la secuencia del péptido conector corta que une por puente el dominio constante extracelular y la región transmembrana, que forma un enlace disulfuro con el residuo de cisteína de la cadena del TCR emparejada en la posición correspondiente (The T cell Receptor Factsbook, 2001).

Los TCR ap y y§ se asocian con las proteínas CD3 unidas a la membrana no polimórficas para formar el complejo funcional octamérico TCR-CD3, que consiste en el heterodímero TCR y tres módulos de señalización diméricos, CD38/e, CD3y/£ yCD3^/Z o Z/r|. Los residuos ionizables en el dominio transmembrana de cada subunidad forman una red polar de interacciones que mantienen unido el complejo. Para la activación de células T, las regiones variables N-terminales del TCR reconocen el complejo péptido/MHC presentado en la superficie de la célula diana, mientras que las proteínas CD3 participan en la transducción de señales (Call et al., Cell. 111(7):967-79, 2002; The T cell Receptor Factsbook, 2001).

El TCR ap, también denominado TCR convencional, se expresa en la mayoría de los linfocitos y consiste en las cadenas a y p polimórficas glicosiladas. Diferentes TCR ap pueden discriminar entre diferentes péptidos incrustados en las superficies de las moléculas del MHC II (expresadas principalmente en las superficies de las células APC) y MHC I (expresadas en todas las células nucleadas), cuyas dimensiones y formas son relativamente constantes. El TCR y6, aunque estructuralmente similar al TCR ap, reconoce antígenos portadores de carbohidratos, nucleótidos o fósforo de forma independiente de la presentación del MHC (The T cell Receptor Factsbook, 2001; Girardi et al., J Invest. Dermatol. 126(1):25-31, 2006; Hayes etal., Immunity. 16(6):827-38, 2002).

Las proteínas de la superficie celular constituyen sólo una pequeña fracción de las proteínas celulares y la mayoría de estas proteínas no son específicas de tumores. En cambio, las proteínas asociadas a tumores mutadas u oncogénicas son típicamente de localización intracelular, nuclear, citoplasmática o secretora. La mayoría de las proteínas intracelulares se exponen en la superficie celular como parte de un proceso normal de catabolismo proteico y presentación por las moléculas del MHC. Las proteínas intracelulares son degradadas habitualmente por el proteasoma o endo/lisosomas, y los fragmentos peptídicos específicos resultantes se unen a moléculas del MHC de clase I/II. Estos complejos péptido/MHC se muestran en la superficie celular, donde proporcionan dianas para el reconocimiento de células T a través de la interacción péptido/MHC TCR (Scheinberg et al., Oncotarget. 4(5):647-8, 2013; Cheever et al., Clin. Cancer Res. 15(17):5323-37, 2009).

En las dos últimas décadas, los avances fundamentales en inmunología y biología tumoral, combinados con la identificación de un gran número de antígenos tumorales, han llevado a un progreso significativo en el campo de la inmunoterapia basada en células. La terapia con células T ocupa un amplio espacio en el campo de la inmunoterapia basada en células, con el objetivo de tratar el cáncer mediante la transferencia a los pacientes de células T autólogas y expandidas ex vivo, y ha dado lugar a algunas respuestas antitumorales notables (Blattman et al., Science.

305(5681):200-5, 2004). Por ejemplo, la administración de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de origen natural expandidos ex vivo mediaron una tasa de respuesta objetiva que variaba entre el 50 y el 70% en pacientes con melanoma, incluyendo tumores invasivos voluminosos en múltiples localizaciones que incluían hígado, pulmón, tejidos blandos y cerebro (Rosenberg et al., Nat. Rev. Cancer. 8(4):299-308, 2008; Dudley ME et al., J Clin. Oncol.

23(10):2346-57, 2005).

Una limitación importante para la aplicación generalizada de la terapia de TIL es la dificultad para generar células T humanas con potencial antitumoral. Como enfoque alternativo, pueden introducirse TCR exógenos de alta afinidad en células T autólogas normales de los pacientes mediante manipulación de células T. Se ha demostrado que la transferencia adoptiva de estas células en pacientes linfo-deplecionados media en la regresión del cáncer en cánceres como el melanoma, el carcinoma colorrectal y el sarcoma sinovial (Kunert R et al., Front. Immunol. 4:363, 2013). Un reciente ensayo clínico de fase I que usa<t>C<r>anti NY-ESO-1 contra el sarcoma sinovial informó de una tasa de respuesta global del 66% y se logró una respuesta completa en uno de los pacientes que recibieron la terapia con células T (Robbins PF et al., Clin. Cancer Res. 21(5): 1019-27, 2015).

Una de las ventajas de la terapia de células T con manipuladas con TCR es que puede dirigirse a toda la variedad de posibles proteínas intracelulares específicas del tumor, que se procesan y se administran a la superficie celular mediante la presentación del MHC. Además, el TCR es muy sensible y puede activarse con sólo unas pocas moléculas antigénicas de péptido/MHC, que a su vez pueden desencadenar una respuesta citolítica de células T, incluyendo la secreción de citoquinas, la proliferación de células T y la citólisis de células diana definidas. Por lo tanto, en comparación con las terapias con anticuerpos o moléculas pequeñas, las células T manipuladas con TCR son especialmente valiosas por su capacidad para destruir células diana con muy pocas copias de antígenos intracelulares diana (Kunert R et al., Front. Immunol. 4:363, 2013).

Sin embargo, a diferencia de los anticuerpos terapéuticos, que se descubren principalmente a través de tecnologías de hibridoma o de visualización, la identificación de TCR específicos de dianas requiere el establecimiento de clones de TCR específicos de péptido diana/MHC a partir de células T de pacientes y el cribado de la combinación de cadena a-p correcta que tenga la afinidad óptima de unión al antígeno diana. Muy a menudo, después de la clonación del TCR a partir de células T de pacientes, se emplea la presentación en fagos/levaduras para mejorar aún más la afinidad de unión a la diana del TCR. Todo el proceso requiere experiencia en muchas áreas y requiere mucho tiempo (Kobayashi E et al., Oncoimmunology. 3(1):e27258, 2014). Las dificultades en el proceso de descubrimiento del TCR han impedido en gran medida la aplicación generalizada de la terapia de células T manipuladas con TCR. También se ha visto obstaculizada por la toxicidad relacionada con el tratamiento, en particular con TCR contra antígenos que se sobreexpresan en células tumorales pero que también se expresan en células sanas, o con TCR que reconocen complejos péptido/MHC no diana (Rosenberg SA et al., Science. 348(6230):62-8, 2015).

En los últimos años se ha desarrollado un enfoque diferente para acoplar células T para inmunoterapia contra el cáncer dirigida. Este nuevo enfoque se denomina terapia con células T receptoras de antígenos quiméricos (CAR-T). Combina la exquisita especificidad de direccionamiento de los anticuerpos monoclonales con la potente citotoxicidad y la persistencia a largo plazo proporcionada por las células T citotóxicas. Un CAR se compone de un dominio extracelular que reconoce un antígeno de la superficie celular, una región transmembrana y un dominio de señalización intracelular. El dominio extracelular consiste en las regiones variables de unión al antígeno de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal fusionadas en un fragmento variable de cadena sencilla (scFv). El dominio de señalización intracelular contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM), como los de CD3Z o FcRy, y uno o más dominios de señalización coestimuladores, como los de CD28, 4-1BB u OX40 (Barrett DM et al., Annu. Rev. Med. 65:333-47, 2014; Davila ML et al., Oncoimmunology. 1(9):1577-1583, 2012). La unión de antígenos diana por CARs injertados en la superficie de una célula T puede desencadenar funciones efectoras de células T independientes de la interacción del complejo TCR-péptido/MHC. Por tanto, las células T equipadas con CARs pueden ser redirigidas para que ataquen a una amplia variedad de células, incluyendo aquellas que no coinciden con el tipo de MHC de los TCRs en las células T pero que expresan los antígenos de la superficie de la célula diana. Este enfoque supera las limitaciones del reconocimiento del TCR restringido al MHC y evita que el tumor escape a través de deficiencias en la presentación del antígeno o la expresión de moléculas del MHC. Los ensayos clínicos han demostrado una actividad antitumoral clínicamente significativa de la terapia CAR-T en el neuroblastoma (Louis CU et al., Blood. 118(23):6050-6056, 2011), B-ALL (Maude, SL, et al., New England Journal of Medicine 371: 16:1507-1517, 2014), CLL (Brentjens, RJ, et al. Blood 118:18:4817-4828, 2011), y linfoma de células B (Kochenderfer, JN, et al. Blood 116:20:4099-4102, 2010). En un estudio, se notificó una tasa de remisión completa del 90% en 30 pacientes con B-ALL tratados con terapia CD19-CAR T (Maude, SL, et al., supra).

La mayoría, si no todos, los CAR estudiados hasta ahora se han dirigido a antígenos tumorales con alta expresión de la superficie celular. Para dirigirse a antígenos tumorales de bajo número de copias en la superficie celular y antígenos tumorales intracelulares, que representan el 95% de todos los antígenos específicos de tumores conocidos, es necesario desarrollar terapias de células manipuladas más potentes y eficaces (Cheever, et al., Clin. Cancer Res. 15(17):5323-37, 2009).

Se han realizado varios intentos para manipular moléculas receptoras quiméricas que tengan especificidad de anticuerpo con funciones efectoras de receptor de células T. Consultar, por ejemplo, Kuwana, Y, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 149(3):960-968, 1987; Gross, G, etal., Proc. Natl. Acad Sci. USA. 86: 10024-10028, 1989; Gross, G & Eshhar, Z, FASEB J 6(15):3370-3378, 1992; Patentes de Estados Unidos N° 7,741,465. Hasta la fecha, ninguno de estos receptores quiméricos ha sido adoptado para uso clínico, y se necesitan nuevos diseños de receptores quiméricos anticuerpo-TCR con expresión y funcionalidad mejoradas en células T humanas.

La EP 0 340 793 A2, titulada "endowing cells with antibody specificity", describe "pares de genes recombinantes que dotan a las células mononucleares, principalmente a varias células de tipo linfocito, de especificidad de tipo anticuerpo".

Xiufeng Wu et al. (2015), titulado "Protein design of lgG/TCR chimeras for the co-expression of Fab-like moieties within bispecific antibodies" describe la generación de moléculas quiméricas "IgG_TCRs".

La WO 2007/034489, titulada "inmunogenic fragments of T-cell receptor constant domains and peptides derived therefrom", describe "un dominio constante aislado del receptor de células T y ^ péptidos derivados de los mismos y constructos recombinantes que codifican los mismos".

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto. La presente solicitud se refiere a un constructo (como un constructo aislado) que comprende una fracción de anticuerpo (como un módulo de unión a antígeno tipo Fab) fusionada a un módulo receptor de células T (dicho constructo también se denomina en la presente "molécula quimérica de anticuerpo-TCR" o "abTCR"), tal como se define en las reivindicaciones. La invención es una molécula quimérica de anticuerpo-receptor de células T (TCR) (abTCR) que se une específicamente a un antígeno diana, que comprende: (a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo V<h>y C<h>1 y un primer dominio de receptor de células T (TCRD) que comprende un primer dominio transmembrana de una primera subunidad de TCR, en donde la primera cadena polipeptídica carece de dominios variables y constantes de la primera subunidad de TCR; y (b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpos Vl y Cl y un segundo TCRD que comprende un segundo dominio transmembrana de una segunda subunidad de TCR, en donde la segunda cadena polipeptídica carece de dominios variables y constantes de la segunda subunidad de TCR, en donde los dominios Vh y Ch1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios Vl y Cl del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno diana, en donde el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular o un complejo que comprende un péptido y una proteína del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), en donde (i) la primera subunidad de TCR es una cadena a de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena p de TCR; (ii) la primera subunidad de TCR es una cadena p de TCR y la segunda subunidad de TCR es una cadena a de TCR; (iii) la primera subunidad de TCR es una cadena<y>de TCR y la segunda subunidad de TCR es una cadena 6 de TCR o (iv) la primera subunidad de TCR es una cadena 6 de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena<y>de TCR, y en donde la primera TCRD y la segunda TCRD forman un módulo receptor de células T (TCRM) que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR.

En otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican la primera y la segunda cadenas polipeptídicas del abTCR de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona un complejo que comprende el abTCR de la invención y por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD36<e>, CD3<ye>, y ZC

En otro aspecto, la invención proporciona una célula efectora que presenta en su superficie el abTCR de la invención o el complejo de la invención, o que comprende el ácido o los ácidos nucleicos de la invención, en donde la célula efectora se modifica para que bloquee o disminuya la expresión de una primera subunidad de TCR endógena y/o una segunda subunidad de TCR endógena. En un aspecto alternativo, la invención proporciona una célula efectora que presenta en su superficie el abTCR de la invención o el complejo de la invención, o que comprende el o los ácidos nucleicos de la invención, y en donde la célula efectora no expresa la primera subunidad del TCR y/o la segunda subunidad del TCR.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para matar una célula diana que presenta un antígeno diana, en donde el método comprende poner en contacto la célula diana in vitro con la célula efectora de la invención, en donde el abTCR se une específicamente al antígeno diana.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el abTCR de la invención, el o los ácidos nucleicos de la invención, o la célula efectora de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, el abTCR comprende un módulo de unión a antígeno similar a Fab que se une específicamente a un antígeno diana y un módulo receptor de células T (TCRM) capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo que comprende un péptido y una proteína del MHC (como una proteína de MHC de clase I o una proteína de MHC de clase II). En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR (como un abTCR aislado) que se une específicamente a un antígeno diana, en donde el abTCR comprende: a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo V<h>y C<h>1 y un primer dominio de receptor de células T (TCRD) que comprende un primer dominio transmembrana de una primera subunidad de TCR; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpos Vl y Cl y un segundo TCRD que comprende un segundo dominio transmembrana de una segunda subunidad de<t>C<r>, en donde los dominios V<h>y C<h>1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios V<l>y C<l>del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, y en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un módulo receptor de células T (TCRM) que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab comprende un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio C<h>1 de la primera cadena polipeptídica y un residuo en el dominio C<l>de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer conector peptídico entre el primer dominio de unión a antígeno y el primer TCRD. En algunas realizaciones, la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo conector peptídico entre el segundo dominio de unión a antígeno y el segundo TCRD. En algunas realizaciones, el primer conector peptídico y/o el segundo conector peptídico tienen, individualmente, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en proteínas, hidratos de carbono y lípidos. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, R<o>R1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo que comprende un péptido y una proteína del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente, el primer TCRD comprende además un primer péptido de conexión o fragmento del mismo de una subunidad de TCR N-terminal al primer dominio transmembrana, el segundo TCRD comprende además un segundo péptido de conexión o fragmento del mismo de una subunidad de TCR N-terminal al segundo dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el TCRM comprende un enlace disulfuro entre un residuo en el primer péptido de conexión y un residuo en el segundo péptido de conexión. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular de TCR que comprende una secuencia intracelular de TCR C-terminal al primer dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular de TCR que comprende una secuencia intracelular de TCR C-terminal al segundo dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el abTCR se une al antígeno diana con una constante de disociación de equilibrio (Kd) de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 500 nM. En algunas realizaciones, el módulo de señalización asociado al TCR se selecciona del grupo que consiste en CD38<e>, CD3<ye>, y ZC

En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización intracelular coestimuladora C-terminal al primer dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización intracelular coestimuladora C-terminal al segundo dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido de señalización N-terminal al primer dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido de señalización N-terminal al segundo dominio de unión a antígeno.

En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente donde el antígeno diana es un complejo que comprende un péptido y una proteína del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, VIH-1 y PSA.

De acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente, a) la primera subunidad de TCR es una cadena a de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena p de TCR; b) la primera subunidad de TCR es una cadena p de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena a de TCR; c) la primera subunidad de TCR es una cadena y de TCR y, y la segunda subunidad de TCR es una cadena 8 de TCR o; o d) la primera subunidad de TCR es una cadena 8 de TCR o, y la segunda subunidad de TCR es una cadena y de TCR, como se define en las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente, se proporciona un ácido nucleico que codifica la primera y la segunda cadenas polipeptídicas del abTCR.

En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente, se proporciona un complejo que comprende el abTCR y por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38<e>, CD3<ye>, y ZC En algunas realizaciones, el complejo<es un octámero que comprende el CD38e, CD3ye, y>ZZ-

En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente, se proporciona una célula efectora que presenta en su superficie el abTCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la célula efectora comprende un ácido nucleico que codifica el abTCR. En algunas realizaciones, la célula efectora no expresa la primera subunidad del TCR y/o la segunda subunidad del TCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, a) la primera subunidad de TCR es TCRy y la segunda subunidad de TCR es TCRS; o b) la primera subunidad de TCR es TCRS y la segunda subunidad de TC<r>es TCR<y>; y la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, a) la primera subunidad de TCR es TCRy y la segunda subunidad de TCR es TCRS; o b) la primera subunidad de TCR es TCRS y la segunda subunidad de TCR es TCR<y>; y la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora se modifica para bloquear o disminuir la expresión de una primera subunidad de TCR endógena y/o una segunda subunidad de TCR endógena. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la primera subunidad de TCR es TCRa y la segunda subunidad de TCR es TCRp; o b) la primera subunidad de TCR es TCRp y la segunda subunidad de TCR es TCRa; y la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de TCRa y/o TCRp. En algunas realizaciones, a) la primera subunidad de TCR es TCRy y la segunda subunidad de TCR es TCRS; o b) la primera subunidad de TCR es TCRS y la segunda subunidad de TCR es TCRy; y la célula efectora es una célula T y§ modificada para bloquear o disminuir la expresión de TCR<y>y/o TCRS.

En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente, se proporciona una célula efectora que presenta en su superficie el abTCR, en donde la célula efectora es una célula T. En algunas realizaciones, la célula T se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente, se proporciona una célula efectora que presenta en su superficie el abTCR, en donde la célula efectora comprende a) un primer vector que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR bajo el control de un primer promotor y b) un segundo vector que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR bajo el control de un segundo promotor.

En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente, se proporciona una célula efectora que presenta en su superficie el abTCR, en donde la célula efectora comprende un vector que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR bajo el control de un primer promotor; y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR bajo el control de un segundo promotor.

En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente, se proporciona una célula efectora que presenta en su superficie el abTCR, en donde la célula efectora comprende un vector que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR, en donde la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico están bajo el control de un único promotor.

En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente, se proporciona una célula efectora que presenta en su superficie el abTCR, en donde la expresión de la primera cadena polipeptídica del abTCR es más de dos veces diferente que la expresión de la segunda cadena polipeptídica del abTCR.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para matar una célula diana que presenta un antígeno diana, que comprende poner en contacto la célula diana in vitro con una célula efectora que expresa un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente, en donde el abTCR se une específicamente al antígeno diana.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica un abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una célula efectora que expresa un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una célula efectora que expresa un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente para su uso en un método de tratamiento de cáncer o infección viral en un individuo que lo necesita que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de los métodos de tratamiento de una enfermedad asociada a un antígeno diana descritos anteriormente, la enfermedad asociada al antígeno diana es cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma adrenocortical, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, colangiocarcinoma, cánceres colorrectales, cáncer esofágico, glioblastoma, glioma, carcinoma hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de páncreas, feocromocitoma, plasmocitoma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, sarcoma, cáncer de estómago, cáncer de útero y cáncer de tiroides. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada al antígeno diana es una infección vírica. En algunas realizaciones, la infección viral está provocada por un virus seleccionado del grupo que consiste en Citomegalovirus (CMV), Virus de Epstein-Barr (EBV), Virus de la Hepatitis B (VHB), herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV), virus del papiloma humano (HPV), virus del molusco contagioso (MCV), virus de la leucemia de células T humanas I (HTLV-1), VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) y virus de la hepatitis C (VHC).

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada a antígeno diana en un individuo con necesidad de ello que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica.

En la presente se describe un método de enriquecer una población celular heterogénea para una célula efectora que expresa un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente, en donde el método comprende a) poner en contacto la población celular heterogénea con un ligando que comprende el antígeno diana o uno o más epítopos contenidos en el mismo para formar complejos de la célula efectora unidos al ligando; y b) separar los complejos de la población celular heterogénea, generando de este modo una población celular enriquecida para la célula efectora.

En algunas realizaciones, se proporciona una biblioteca de ácidos nucleicos que comprende secuencias que codifican una pluralidad de abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR (como abTCR aislados) descritos anteriormente.

En la presente se describe un método de cribado de una biblioteca de ácidos nucleicos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente para secuencias que codifican abTCR específicos para un antígeno diana, que comprende: a) introducir la biblioteca de ácidos nucleicos en una pluralidad de células, de tal manera que los abTCR se expresen en la superficie de la pluralidad de células; b) incubar la pluralidad de células con un ligando que comprende el antígeno diana o uno o más epítopos contenidos en el mismo; c) recoger las células unidas al ligando; y d) aislar las secuencias que codifican los abTCR de las células recogidas en el paso c), identificando de este modo abTCR específicos para el antígeno diana.

También se describen métodos para elaborar cualquiera de los constructos descritos en la presente, artículos de fabricación y kits que son adecuados para los métodos descritos en la presente. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1A muestra una representación esquemática de los varios diseños de constructo abTCR (abTCR-3, abTCR-4, abTCR-5 y abTCR-6).

La FIG. 1B muestra variaciones contempladas de los diseños de constructo abTCR.

La FIG. 2 muestra un modelo convencional para el ensamblaje del complejo TCR-CD3.

La FIG. 3 muestra análisis de transferencia Western de lisados de células J.RT3-T3.5 o Jurkat transducidas individualmente con constructos de abTCR-3, -4, -5, -6, o -6MD que tienen una fracción de unión anti-AFP158/HLA*02:01, teñidos con anticuerpos anti-FLAG (subunidades quiméricas derivadas de TCRa y TCR<y>) o anti-HA (subunidades quiméricas derivadas de TCRp y TCR5).

La FIG. 4A muestra un análisis de citometría de flujo de la expresión CD3<e>de superficie en células J.RT3-T3.5 transducidas individualmente con constructos de abTCR-3, -4, -5, -6, o -6MD que tienen una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01; las células se tiñeron con anticuerpo anti-CD3£.

La FIG. 4B muestra un análisis de citometría de flujo de la unión de tetrámeros AFP158/HLA-A*02:01 de superficie en células J.RT3-T3.5 transducidas individualmente con constructos de abTCR-3, -4, -5, -6, o -6MD que tienen una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01; las células se tiñeron con tetrámeros AFP158/HLA-A*02:01 marcados con ficoeritrina (PE).

La FIG. 4C muestra un análisis de citometría de flujo de la unión del anticuerpo antiidiotipo de superficie en células J.RT3-T3.5 transducidas individualmente con constructos de abTCR-3, -4, -5, -6 o -6MD que tienen una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01 reconocida por el anticuerpo; las células se tiñeron con anticuerpo antiidiotipo contra la fracción de unión anti-AFP158/HLA-A *02:01 de los constructos de abTCR.

La FIG. 5A muestra un análisis de citometría de flujo de la unión de anticuerpos anti-TCRa/p de superficie en células Jurkat transducidas individualmente con constructos de abTCR-3, -4, -5, -6 o -6MD que tienen una fracción de unión anti AFP158/HLA-A*02:01; las células se tiñeron con anticuerpos anti-TCRa/p.

La FIG. 5B muestra un análisis de citometría de flujo de la unión de tetrámeros AFP158/HLA-A*02:01 de superficie en células Jurkat transducidas individualmente con constructos de abTCR-3, -4, -5, -6 o -6MD que tienen una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01; las células se tiñeron con tetrámeros AFP158/HLA-A*02:01 marcados con PE.

La FIG. 5C muestra un análisis de citometría de flujo de la unión del anticuerpo antiidiotipo de superficie en células Jurkat transducidas individualmente con constructos de abTCR-3, -4, -5, -6, o -6MD que tienen una fracción de unión anti AFP158/HLA-A*02:01 reconocida por el anticuerpo; las células se tiñeron con anticuerpo antiidiotipo contra la fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01 de los constructos de abTCR.

La FIG. 6 muestra el análisis de citometría de flujo de la coexpresión de CD3e con quimeras abTCR en células J.RT3-T3.5 transducidas individualmente con constructos de abTCR-6 o abTCR-6MD que tienen una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01; las células se tiñeron conjuntamente con anticuerpo anti-CD3£ y tetrámeros AFP158/HLA-A *02:01.

La FIG. 7A muestra el análisis de citometría de flujo de linfocitos de sangre periférica transducidos con abTCR; las células se transdujeron con un constructo abTCR-6MD que tenía una fracción de unión anti AFP158/HLA-A*02:01 y se tiñeron conjuntamente con anticuerpo anti-CD4, anticuerpo anti-CD8 y tetrámeros AFP158/HLA-A*02:01. El recuadro de puntos indica la puerta de población de tetrámeros* para las células mostradas en el gráfico CD4/CD8 de la FIG. 7B.

La FIG. 7B muestra el análisis de citometría de flujo de la expresión de CD4 y CD8 en linfocitos de sangre periférica que o se transdujeron de manera simulada o se transdujeron con un constructo abTCR-6MD que tiene una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A *02:01 y se tiñeron conjuntamente con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8; la expresión de CD4 y CD8 se muestra para células no bloqueadas (2 paneles superiores) o células bloqueadas con tetrámero+ (panel inferior).

La FIG. 8 muestra un análisis de transferencia Western de la asociación de cadenas abTCR exógenas con el complejo CD3; se hicieron lisados de digitonina a partir de células T primarias que se transdujeron de manera simulada o con abTCR-6MD con una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01; los lisados o inmunoprecipitados anti-FLAG se sometieron a transferencia con anticuerpos anti-FLAG, anti-CD38, anti-CD3£, anti-CD3Y o anti-CD3Z. La FIG. 9A muestra la eficacia de transducción en células T primarias después de que se transducen con un CAR o un abTCR-6MD, teniendo ambos los mismos dominios variables de la fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01; las células se tiñeron con tetrámeros AFP158/HLA-A*02:01 marcados con PE.

La FIG. 9B muestra la destrucción de las líneas celulares cancerosas HepG2, SK-HEP-1 y SK-HEP-1-AFP-MG, mediada por células T transducidas o con un CAR o constructo abTCR-6MD, ambos con los mismos dominios variables de la fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01.

La FIG. 10 muestra el análisis de citometría de flujo de la desgranulación de células T transducidas con abTCR después del cocultivo con células diana; las células T se transdujeron o con un CAR o un abTCR-6MD, ambos teniendo los mismos dominios variables de la fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01. Se muestra la tinción de las células transducidas con tetrámeros AFP158/HLA-A*02:01, anticuerpo anti-CD8 o anticuerpo anti-CD107a después del cocultivo con células diana HepGG, SK-HEP-1 y SK-HEP-1-a Fp-MG.

La FIG. 11A muestra el nivel de secreción de un panel de citoquinas por células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, teniendo ambas los mismos dominios variables de fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01, después del cocultivo con células HepG2.

La FIG. 11B muestra el nivel de secreción de un panel de citoquinas por células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, teniendo ambos los mismos dominios variables de fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01, cocultivados con células SK-HEP-1 o SK-HEP-1-AFP-MG.

Las FIGS. 12A-12H muestran análisis de citometría de flujo de células T transducidas para la producción de citoquinas con o sin la presencia de células cancerosas diana; las células T se transdujeron o con un CAR o un abTCR-6MD, teniendo ambos los mismos dominios variables de fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01, cocultivadas con células SK-HEP-1, SK-HEP-1-AFP-MG, o HepG2; las células se cotiñeron posteriormente con tetrámeros AFP158/HLA-A*02:01 marcados con PE, anticuerpo anti-CD4 y uno de anticuerpo anti-TNF-a (12A y 12B), anticuerpo anti-IFNY (12C y 12D), anticuerpo anti-IL-2 (12E y 12F), o anticuerpo anti-IL-6 (12G y 12H). Las poblaciones mostradas se bloquearon en células tetrámero* AFP158/HLA-A*02:01.

La FIG. 13 muestra la activación específica de la expresión de citoquinas en células T CD4+ transducidas con un abTCR anti-AFP158 e incubadas con líneas celulares cancerosas positivas o negativas para la expresión de AFP. La FIG. 14 muestra el análisis de citometría de flujo de los marcadores de agotamiento de células T PD-1, LAG-3 y TIM-3 en células T transducidas por CAR o abTCR, ambas con los mismos dominios variables de fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01, tras la exposición a células diana positivas o negativas para el antígeno.

La FIG. 15 muestra el análisis por citometría de flujo de los marcadores de diferenciación de células T CD28, CCR7 y granzima B en células T transducidas con CAR o abTCR, ambas con los mismos dominios variables de fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01, tras la exposición a células diana positivas o negativas para el antígeno. Las FIGS. 16A-16C muestran la caracterización de células T transducidas con un abTCR-6MD anti-AFP158/HLA-A*02:01 o un abTCR-7 anti-AFP158/HLA-A*02:01, teniendo ambos los mismos dominios variables de la fracción de unión anti-AFP158/HLA-A *02:01. La FIG. 16A muestra el crecimiento celular de las células T transducidas. La FIG. 16B muestra el análisis de transferencia Western para la expresión de abTCR-6MD y abTCR-7 en células T usando un anticuerpo anti-FLAG para detectar los constructos marcados con FLAG. La tinción para CD3Z se incluyó como control de carga. La FIG. 16C muestra la destrucción de células SK-HEP-1 y SK-HEP-1-AFP-MG mediada por células T transducidas con abTCR-6MD o abTCR-7.

La FIG. 17 muestra la destrucción de las líneas celulares cancerosas JeKo-1, IM9, THP-1 y Jurkat, mediada por células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, ambas teniendo los mismos dominios variables de fracción de unión anti-CD19.

Las FIG. 18A y 18B muestran el nivel de secreción de un panel de citoquinas por células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, ambos con los mismos dominios variables de fracción de unión anti-CD19, cocultivados con líneas celulares JeKo-1, IM9, THP-1 o Jurkat.

La FIG. 19 muestra la activación específica de la diana de la expresión de citoquinas en células T CD4+ transducidas con un abTCR anti-CD19 e incubadas con líneas celulares cancerosas positivas o negativas para la expresión de CD19.

La FIG. 20 muestra el análisis de citometría de flujo de los marcadores de diferenciación de células T CD28, CCR7 y granzima B en células T transducidas por CAR o abTCR, teniendo ambas los mismos dominios variables de fracción de unión anti-CD19, tras la exposición a células diana positivas o negativas para el antígeno.

La FIG. 21 muestra la proliferación de células T CD4+ o CD8+ transducidas con CAR o abTCR, ambos receptores quiméricos teniendo los mismos dominios variables de fracción de unión anti-CD19, durante la exposición a células diana positivas para el antígeno, según se evalúa por dilución del colorante del día 2 al día 3 después del inicio de la exposición.

La FIG. 22 muestra la internalización de receptores quiméricos en células T transducidas por CAR o abTCR, ambos receptores quiméricos teniendo los mismos dominios variables de fracción de unión anti-CD19, en los puntos temporales indicados, según se evalúa mediante análisis de citometría de flujo de células teñidas para receptores quiméricos de superficie con un anticuerpo antiidiotipo dirigido a la fracción de unión anti-CD19.

Las FIGS. 23A y 23B muestran la caracterización de células T transducidas con un abTCR (abTCR-6MD anti-CD19) o cTCR (anti-CD19-cTCR), teniendo ambos los mismos dominios variables de fracción de unión anti-CD19. La FIG. 23A muestra el crecimiento celular de las células T de abTCR y cTCR. La FIG. 23B muestra la destrucción de la línea celular cancerosa positiva para CD19 Nalm-6 mediada por células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con abTCR o cTCR.

La FIG. 24 muestra la destrucción de las líneas celulares cancerosas IM9, Colo205, MDA-231, MCF7, JeKo-1, Raji, Hep1 y Jurkat, mediada por células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con un CAR (#35 CAR) o un abTCR-6MD (#35 abTCR), teniendo ambas los mismos dominios variables de fracción de unión anti-NY-ESO-1.

La FIG. 25A muestra un análisis de citometría de flujo de la expresión de CD3 y CD56 en un subconjunto de células NKT purificadas a partir de PBMC humanas.

La FIG. 25B muestra el nivel de secreción de citoquinas IL-2, GM-CSF, IFNy, y TNFa por células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con un abTCR-6MD que tiene una fracción de unión anti-CD19, cocultivadas con líneas celulares Raji o Raji-CD19ko. Los controles incluyeron células T transducidas de manera simulada o transducidas con abTCR solas, y células Raji o Raji-CD19ko solas.

La FIG. 26A muestra un análisis de citometría de flujo de la expresión de CD25 y CD4 en un subconjunto de células Treg purificadas a partir de PBMC humanas.

La FIG. 26B muestra el nivel de secreción de citoquinas IL-2, GM-CSF, IFN<y>y TNFa por células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con un abTCR-6MD que tiene una fracción de unión anti-CD19, cocultivadas con líneas celulares Raji o Raji-CD19ko.

La FIG. 27 muestra la destrucción de las líneas celulares cancerosas HepG2, SK-Hep1, y SK-Hep1-AFP MG, mediada por células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con abTCRs que tienen varios dominios CH1 de inmunoglobulina, cada uno con la misma molécula de unión anti-AFP.

La FIG. 28 muestra una representación esquemática de los varios diseños de constructos de abTCR que contienen uno o más dominios coestimuladores (abTCR-6M-1, abTCR-6M-2, abTCR-6M-3, abTCR-6M-4, abTCR-6M-5, abTCR-6M-6, abTCR-6M-7, abTCR-6M-8).

La FIG. 29 muestra la destrucción de las líneas celulares cancerosas HepG2, SK-Hep1, y SK-Hep1-AFP MG, mediada por células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con varios abTCR que tienen uno o más dominios coestimuladores C-terminales, teniendo cada uno la misma fracción de unión anti-AFP. La FIG. 30 muestra el nivel de secreción de citoquinas IL-2, GM-CSF, IFNy y TNFa por células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con varios abTCR que tienen uno o más dominios coestimuladores C-terminales, teniendo cada uno la misma fracción de unión anti-AFP, cocultivadas con líneas celulares SK-Hep1 o SK-Hep1-AFP MG.

La FIG. 31 muestra la destrucción de las líneas celulares cancerosas Raji, Raji-CD19ko y JeKo-1, mediada por células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con varios abTCR que tienen uno o más dominios coestimuladores C-terminales, cada uno con la misma fracción de unión anti-CD19.

La FIG. 32 muestra el nivel de secreción de citoquinas IL-2, GM-CSF, IFNy, y TNFa por células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con varios abTCR que tienen uno o más dominios coestimuladores C-terminales, cada uno con la misma fracción de unión anti-CD19, cocultivadas con células Raji, Raji-CD19ko, o JeKo-1.

La FIG. 33 muestra el cambio de peso corporal a lo largo del tiempo en un modelo de xenoinjerto de ratón subcutáneo de SK-HEP-1-AFP-MG tratado con inyección intravenosa de células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con un abTCR-6MD que tiene una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01. La FIG. 34A muestra el crecimiento tumoral en un modelo de ratón subcutáneo de SK-HEP-1-AFP MG tratado con inyección intravenosa de células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con un abTCR-6MD que tiene una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01.

La FIG. 34B muestra el crecimiento tumoral en un modelo de ratón subcutáneo de SK-HEP-1-AFP-MG sin tratamiento o con una única inyección intratumoral de células T transducidas con un abTCR-6MD que tiene una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01 cuando el volumen tumoral medio alcanzó 300 mm3.

La FIG. 35 muestra el crecimiento tumoral en ratones con xenoinjerto intravenoso de Raji informadoras tratados con células T transducidas con varios abTCR anti-CD19 (clones 5, 5-3, 5-9 y 5-14). Como controles se incluyeron células T transducidas de manera simulada y sin tratamiento con células T.

La FIG. 36 muestra el nivel sérico de IL-2, IFN-y, TNF-a, e IL-10 en ratones con xenoinjerto de Raji inyectados con células T transducidas de manera simulada o células T transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, ambas con los dominios variables de fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13.

La FIG. 37 muestra la cuantificación del crecimiento tumoral en ratones con xenoinjerto de Raji informador tratados con células T transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, ambos con los dominios variables de fracción de unión anti CD19 del clon 5-13. Se incluyeron como controles células T transducidas de manera simulada.

La FIG. 38 muestra resultados de imagenología para bioluminiscencia derivada de tumor en ratones con xenoinjerto de Raji informador tratados con células T transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, teniendo ambos los dominios variables de fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13. Se incluyeron como controles células T transducidas de manera simulada. El mapa térmico convertido a escala de grises indica el total de fotones por segundo en la ubicación de los tumores, que aparecen como puntos oscuros superpuestos en las imágenes de ratón.

La FIG. 39 muestra la cuantificación del crecimiento tumoral en ratones con xenoinjerto de Raji reintroducido con células tumorales 7 semanas después de la implantación inicial de células tumorales y el tratamiento con células T transducidas con el clon 5-13 anti-CD19 abTCR-6MD. Se incluyeron como controles células T transducidas de manera simulada.

La FIG. 40 muestra el crecimiento tumoral en ratones con xenoinjerto intravenoso de NALM-6 informador tratados con células T transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, teniendo ambos los dominios variables de fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13. Se incluyeron como controles células T transducidas de manera simulada, sin tratamiento con células T. Como controles se incluyeron células T transducidas de manera simulada y ningún tratamiento con células T.

La FIG. 41 muestra el nivel sérico deIL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-<y>y TNF-a en ratones xenoinjertados NALM-6 inyectados con células transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, ambos con los dominios variables del fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13. Se incluyeron como controles células T transducidas de manera simulada y ningún tratamiento con células T.

La FIG. 42 muestra la cantidad de células T positivas para receptores quiméricos en sangre de ratones con xenoinjerto de NALM-6 inyectados con células transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, ambos con los dominios variables de fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13, a los 7 y 13 días después del tratamiento. La FIG. 43 muestra análisis de citometría de flujo para células tumorales en sangre de ratones con xenoinjerto de NALM-6 inyectados con células transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, ambos teniendo los dominios variables de fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13, a los 13 días después del tratamiento.

La FIG.44 muestra análisis de citometría de flujo para células tumorales en médula ósea de ratones con xenoinjerto de NALM-6 inyectados con células transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, ambos teniendo los dominios variables de fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13, a los 13 días después del tratamiento.

La FIG. 45 muestra el análisis de citometría de flujo para la expresión de PD-1 en células T CD3+ que son CD4+ o CD8+ en sangre de ratones con xenoinjerto de NALM-6 inyectados con células transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, teniendo ambos los dominios variables de fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13.

La FIG. 46 muestra un análisis de citometría de flujo para la expresión de PD-1 en células T CD3+ que son CD4+ o CD8+ en médula ósea de ratones con xenoinjerto de NALM-6 inyectados con células transducidas con un CAR o un abTCR-6MD, teniendo ambos los dominios variables de fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud proporciona una constructo quimérico aislado de anticuerpo/receptor de células T (denominado en la presente "abTCR") que comprende a) una fracción de anticuerpo, que se une específicamente a un antígeno diana; y b) un módulo de receptor de células T (TCRM) capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones.

En la presente se describen una serie de constructos quiméricos de anticuerpos/TCR nuevos y sintéticos que combinan la especificidad y afinidad de unión de nuestros mAbs similares a TCR, así como mAbs convencionales, con la potencia citotóxica específica de diana y la activación controlada que ofrecen los TCR. Las células T primarias transducidas para que expresen abTCRs mostraron una expresión superficial eficiente y la formación de complejos de señalización estables de tipo TCR en asociación con moléculas CD3 endógenas. Cuando se manipularon en células T, los abTCR dotaron a las células T de una potente citotoxicidad contra células tumorales portadoras de la diana tanto in vitro como in vivo, tanto en configuraciones dependientes del MHC (antígeno peptídico/ MHC) como independientes del MHC (antígeno de la superficie celular). Se observó una activación específica de la diana en múltiples subconjuntos de células T diferentes transducidas para que expresasen un abTCR, incluyendo células T CD4+, células T CD8+, células T asesinas naturales (NKT) y células T reguladoras (Treg). Además, se descubrió que los abTCR que incluían secuencias coestimuladoras intracelulares funcionaban tan bien, y en algunos casos mejor, que los abTCR correspondientes sin ninguna secuencia coestimuladora.

A pesar del notable potencial curativo demostrado con la terapia de células T CAR, los ensayos clínicos siguen desencadenando acontecimientos adversos graves que se asocian a la liberación excesiva de citoquinas y a la proliferación incontrolada de células T. Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que los abTCRs pueden ser regulados por la maquinaria natural que controla la activación del TCR, requiriendo el ensamblaje con un complejo CD3 endógeno para activar la destrucción mediada por células T, y pueden por tanto evitar ser activados constitutivamente. Hemos descubierto que las células T transducidas con constructos de abTCR expresan niveles más bajos de citoquinas (por ejemplo, IL-2) y marcadores de agotamiento de células T (por ejemplo, PD-1, TIM3 y LAG1) que las células T transducidas con receptores de antígenos quiméricos (CAR) correspondientes que llevan las mismas regiones variables de anticuerpos, a la vez que tienen una potencia equivalente en la destrucción de células cancerosas. Por tanto, esta estrategia proporciona una ventaja técnica significativa sobre el uso de CARs, produciendo células T cuya señalización citotóxica responde a mecanismos reguladores endógenos de las células T y que tienen el potencial de persistir funcionalmente más tiempo in vivo. Al combinar la unión exquisitamente optimizada de los anticuerpos monoclonales a antígenos específicos, como antígenos de la superficie celular o complejos péptido/MHC, con la capacidad del receptor de células T de participar en complejos de señalización endógenos para activar las células inmunitarias, la invención permite el direccionamiento altamente específico y potente de antígenos de la superficie celular con bajo número de copias, así como de antígenos intracelulares o secretados a través de complejos péptido/MHC.

La presente solicitud proporciona por tanto un abTCR (como un abTCR aislado) que comprende una fracción de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno diana y un TCRM capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. Consultar la FIG. 1A para diseños de constructo abTCR ejemplares.

En otro aspecto, se proporcionan uno o más ácidos nucleicos que codifican un abTCR, como se define en las reivindicaciones.

En otro aspecto más, se proporciona un complejo (denominado en la presente "complejo abTCR-CD3") que comprende un abTCR y por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR. El complejo puede ser un octámero que comprende los cuatro dímeros abTCR, CD38<e>, CD3<ye>, y ZC También se proporciona una célula efectora, como una célula T, que expresa o está asociada con un abTCR o un complejo abTCR-CD3.

En otro aspecto más, se proporciona una composición que comprende un abTCR. La composición puede ser una composición farmacéutica que comprende un abTCR o una célula efectora que expresa o está asociada con el abTCR (por ejemplo una célula T que expresa un abTCR).

También se proporcionan métodos para elaborary usar un abTCR (o células que expresan o están asociadas con un abTCR) con propósitos de tratamiento, así como kits y artículos de fabricación útiles para dichos métodos. Además, se proporcionan métodos para tratar una enfermedad usando un abTCR (o células que expresan o están asociadas con un abTCR).

Definiciones

Como se usa en la presente, "tratamiento" o "tratar" es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. A efectos de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: aliviar uno o más síntomas resultantes de la enfermedad, disminuir la extensión de la enfermedad, estabilizar la enfermedad (por ejemplo, prevenir o retrasar el empeoramiento de la enfermedad), prevenir o retrasar la propagación (por ejemplo, metástasis) de la enfermedad, prevenir o retrasar la recurrencia de la enfermedad, retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad, mejorar el estado de la enfermedad, proporcionar una remisión (parcial o total) de la enfermedad, disminuir la dosis de uno o más de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad, aumentar o mejorar la calidad de vida, aumentar la ganancia de peso y/o prolongar la supervivencia. También se entiende por "tratamiento" la reducción de las consecuencias patológicas de la enfermedad (como, por ejemplo, el volumen tumoral en el cáncer). Las composiciones farmacéuticas para su uso en los métodos de la invención contemplan cualquiera de uno o más de estos aspectos del tratamiento.

Los términos "recurrencia", "recaída" o "recaído" se refieren a la reaparición de un cáncer o enfermedad después de la evaluación clínica de la desaparición de la enfermedad. Un diagnóstico de metástasis distante o recurrencia local puede considerarse una recaída.

El término "refractario" o "resistente" se refiere a un cáncer o enfermedad que no ha respondido al tratamiento.

"Activación", como se usa en la presente en relación con las células T, se refiere al estado de una célula T que ha sido suficientemente estimulada para inducir una proliferación celular detectable. La activación también puede asociarse con la producción inducida de citoquinas y funciones efectoras detectables.

El término "anticuerpo" o "fracción de anticuerpo" incluye anticuerpos de longitud completa y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Un anticuerpo de longitud completa comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas son responsables de la unión al antígeno. La región variable en ambas cadenas contiene generalmente tres giros altamente variables denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) (las CDR de cadena ligera (LC) incluyendo LC-CDR1, LC CDR2, y LC-CDR3, las CDR de cadena pesada (HC) incluyendo HC-CDR1, HC-CDR2, y H<c>CDR3). Los límites de CDR para los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno divulgados en la presente pueden definirse o identificarse mediante las convenciones de Kabat, Chothia o Al-Lazikani (Al-Lazikani 1997; Chothia 1985; Chothia 1987; Chothia 1989; Kabat 1987; Kabat 1991). Lastres CDR de las cadenas pesadas o ligeras se interponen entre tramos flanqueantes conocidos como regiones marco (FR), que están más conservadas que las CDR y forman un andamiaje para sostener los giros hipervariables. Las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera no intervienen en la unión al antígeno, pero presentan varias funciones efectoras. Los anticuerpos se asignan a clases basadas en la secuencia de aminoácidos de la región constante de su cadena pesada. Las cinco clases o isotipos principales de anticuerpos son IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que se caracterizan por la presencia de cadenas pesadas a, 8, £,<y>y M, respectivamente. Varias de las principales clases de anticuerpos se dividen en subclases, como lgG1 (cadena pesada y1 ), lgG2 (cadena pesada y2), lgG3 (cadena pesada<y>3), lgG4 (cadena pesada<y>4), lgA1 (cadena pesada a1) o lgA2 (cadena pesada a2).

El término "fragmento de unión a antígeno", como se usa en la presente, se refiere a un fragmento de anticuerpo que incluye, por ejemplo, un diacuerpo, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento Fv estabilizado por disulfuro (dsFv) un (dsFv)2, un dsFv biespecífico (dsFv-dsFv'), un diacuerpo estabilizado por disulfuro (diacuerpo ds), una molécula de anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un dímero de scFv (diacuerpo bivalente), un anticuerpo multiespecífico formado a partir de una porción de un anticuerpo que comprende una o más CDR, un anticuerpo de dominio único camelizado, un nanocuerpo, un anticuerpo de dominio, un anticuerpo de dominio bivalente o cualquier otro fragmento de anticuerpo que se une a un antígeno pero no comprende una estructura de anticuerpo completa. Un fragmento de unión a antígeno es capaz de unirse al mismo antígeno al que se une el anticuerpo parental o un fragmento de anticuerpo parental (por ejemplo, un scFv parental). Un fragmento de unión a antígeno puede comprender una o más CDR de un anticuerpo humano particular injertadas en una región marco de uno o más anticuerpos humanos diferentes.

Un "módulo de unión a antígeno tipo Fab" se refiere a una fracción de anticuerpo que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en donde la primera y la segunda cadenas polipeptídicas comprenden un dominio de anticuerpo V<l>, un dominio de anticuerpo C<l>, un dominio de anticuerpo V<h>y un dominio de anticuerpo C<h>1. Los dominios de anticuerpos V<l>y C<l>pueden estar en una cadena con los dominios de anticuerpo V<h>y Ch1 en la otra cadena, o los dominios de anticuerpos Vl y Ch1 pueden estar en una cadena con los dominios de anticuerpos Vh y Cl en la otra cadena. La primera y la segunda cadenas polipeptídicas pueden estar unidas por un enlace disulfuro.

Como se usa en la presente, una primera fracción de anticuerpo "compite" por la unión a un antígeno diana con una segunda fracción de anticuerpo cuando la primera fracción de anticuerpo inhibe la unión al antígeno diana de la segunda fracción de anticuerpo en por lo menos un 50% (como por lo menos un 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%) en presencia de una concentración equimolar de la primera fracción de anticuerpo, o viceversa. En la publicación de PCT N° WO 03/48731 se describe un proceso de alto rendimiento para "agrupar" anticuerpos basándose en su competencia cruzada.

Como se usa en la presente, el término "se une específicamente" o "es específico para" se refiere a interacciones mensurables y reproducibles, como la unión entre una diana y un anticuerpo o fracción de anticuerpo, que es determinante de la presencia de la diana en presencia de una población heterogénea de moléculas, incluidas moléculas biológicas. Por ejemplo, una fracción de anticuerpo que se une específicamente a una diana (que puede ser un epítopo) es una fracción de anticuerpo que se une a la diana con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que sus uniones a otras dianas. Una fracción de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno puede reaccionar con uno o más determinantes antigénicos del antígeno (por ejemplo, un antígeno de la superficie celular o un complejo péptido/proteína de MHC) con una afinidad de unión que es por lo menos aproximadamente 10 veces superior a su afinidad de unión para otras dianas.

El término "receptor de células T", o "TCR", hace referencia a un receptor heterodimérico compuesto por cadenas ap o y6 que se emparejan en la superficie de una célula T. Cada cadena a,p, y y 6 se compone de dos dominios de tipo lg: un dominio variable (V) que confiere el reconocimiento del antígeno a través de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), seguido de un dominio constante (C) que está anclado a la membrana celular por un péptido de conexión y una región transmembrana (TM). La región TM se asocia con las subunidades invariantes del aparato de señalización de CD3. Cada uno de los dominios V tiene tres CDR. Estas CDR interactúan con un complejo entre un péptido antigénico unido a una proteína codificada por el complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) (Davis y Bjorkman (1988) Nature, 334, 395-402; Davis et al. (1998) Annu Rev Immunol, 16, 523-544; Murphy (2012), xix, 868 p.).

El término "módulo de señalización asociado a TCR" se refiere a una molécula que tiene un motivo de activación citoplasmático basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM) que forma parte del complejo TCR-CD3. Los módulos de señalización asociados a TCR incluyen CD3ye, CD36e, y ZZ.

El término "módulo" cuando se refiere a una proteína o porción de una proteína significa que la proteína o porción de la proteína comprende una pluralidad de cadenas polipeptídicas (por ejemplo, una proteína dimérica o porción de una proteína dimérica). La pluralidad de cadenas polipeptídicas puede estar enlazada, como mediante un conector (por ejemplo, un conector peptídico) o un enlace químico (por ejemplo, un enlace peptídico). Se entiende que un "módulo" incluye porciones estructural y/o funcionalmente relacionadas de uno o más polipéptidos que componen la proteína. Por ejemplo, un módulo transmembrana de un receptor dimérico puede referirse a las porciones de cada cadena polipeptídica del receptor que abarcan la membrana. Un módulo también puede referirse a porciones relacionadas de una única cadena polipeptídica. Por ejemplo, un módulo transmembrana de un receptor monomérico puede referirse a porciones de la cadena polipeptídica única del receptor que abarcan la membrana.

El término "módulo receptor de células T", o "TCRM", se refiere a un heterodímero que comprende secuencias derivadas de un receptor de células T. El TCRM comprende dominios transmembrana del receptor de células T, y puede comprender además la totalidad o una parte de péptidos conectores del receptor de células T y/o dominios intracelulares.

Un constructo "aislado" (como un abTCR), como se usa en la presente, se refiere a un constructo que (1) no está asociado con proteínas que se encuentran en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o, (4) no se produce en la naturaleza.

El término "ácido nucleico aislado", como se usa en la presente, se pretende que se refiera a un ácido nucleico de origen genómico, ADNc, sintético o alguna combinación de los mismos, que, en virtud de su origen, el "ácido nucleico aislado" (1 ) no está asociado con la totalidad o una parte de un polinucleótido en el que el "ácido nucleico aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está enlazado operativamente a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no se encuentra en la naturaleza como parte de una secuencia mayor.

Como se utiliza en la presente, el término "CDR" o "región determinante de la complementariedad" se refiere a los sitios de combinación de antígenos no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Estas regiones particulares han sido descritas por Kabat et al., J. Biol. Chem.

252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); de Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); y Maccallum et al., J. Mol. Biol.

262:732-745 (1996), donde las definiciones incluyen solapamientos o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. No obstante, la aplicación de cualquiera de las dos definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o de anticuerpos injertados o variantes de los mismos se entiende dentro del alcance del término como se define y usa en la presente. Los residuos de aminoácidos que abarcan las CDR definidas por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a continuación en la Tabla 1 a modo de comparación.

TABLA 1: DEFINICIONES DE CDR

Kabat1 Chothia1 MacCallum3

Vh CDR1 31-35 26-32 30-35

Vh CDR2 50-65 53-55 47-58

Vh CDR3 95-102 96-101 93-101

Vl CDR1 24-34 26-32 30-36

Vl CDR2 50-56 50-52 46-55

V<l>CDR3 89-97 91-96 89-96

1La numeración de los residuos sigue la nomenclatura de Kabat et al., supra

2La numeración de los residuos sigue la nomenclatura de Chothia et al., supra

3La numeración de los residuos sigue la nomenclatura de MacCallum et al., supra

El término "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten una actividad biológica de esta invención (consultar la Patente de Estados Unidos N° 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

El término "semisintético" en referencia a un anticuerpo o fracción de anticuerpo significa que el anticuerpo o fracción de anticuerpo tiene una o más secuencias de origen natural y una o más secuencias de origen no natural (es decir, sintéticas).

El término "totalmente sintético" en referencia a un anticuerpo o una fracción de anticuerpo significa que el anticuerpo o la fracción de anticuerpo tiene emparejamientos de marco Vh/Vl fijos, en su mayoría o todos de origen natural, pero secuencias de origen no natural (es decir, sintéticas) de las 6 CDR de las cadenas tanto pesada como ligera. Las CDR de origen no natural incluyen las que comprenden secuencias CDR humanas modificadas, como secuencias CDR modificadas por sustituciones conservadoras de aminoácidos o residuos de cisteína introducidos.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable (HVR) del receptor se sustituyen por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo o primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y capacidad de anticuerpo deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los giros hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, consultar Jones et al., Nature 321:522- 525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

"Homología" se refiere a la similitud de secuencia o identidad de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácidos, por ejemplo, si una posición en cada una de dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces las moléculas son "homólogas" en esa posición. El "porcentaje de homología" o "porcentaje de identidad de secuencia" entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas multiplicado por 100, considerando cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones de dos secuencias coinciden o son homólogas, entonces las dos secuencias son homólogas en un 60%. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN ATTGCC y TATGGC comparten un 50% de homología. Por lo general, la comparación se realiza cuando se alinean dos secuencias para obtener la máxima homología. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que están dentro de la capacidad de la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente como software BLAST, BlAST-2, ALIGN, Megalign (d Na STAR), o MUSCLE. Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros adecuados para medir la alineación, incluyendo los algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias que se están comparando. Sin embargo, a efectos de la presente, los valores del % de identidad de secuencias de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias MUSCLE (Edgar, R.C., Nucleic Acids Research 32(5): 1792-1797, 2004; Edgar, R.C., BMC Bioinformatics 5(1): 113, 2004).

El "dominio Ch1" de una IgG humana (también denominado dominio "C1" o "H1") se extiende habitualmente desde aproximadamente el aminoácido 118 hasta aproximadamente el aminoácido 215 (sistema de numeración de EU).

A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas unas de otras y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede contener en alguna versión un intrón o intrones.

El término "enlazado operativamente" se refiere al enlace funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que da como resultado a la expresión de esta última. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico está enlazada operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está enlazado operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Por lo general, las secuencias de ADN enlazadas operativamente son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, se encuentran en el mismo marco de lectura.

El término "promotor inducible" se refiere a un promotor cuya actividad puede regularse añadiendo o eliminando una o más señales específicas. Por ejemplo, un promotor inducible puede activar la transcripción de un ácido nucleico enlazado operativamente en un conjunto específico de condiciones, por ejemplo, en presencia de un agente inductor que activa el promotor y/o alivia la represión del promotor.

Una "cantidad eficaz" de un abTCR o de una composición que comprende un abTCR como se divulga en la presente es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito específicamente establecido. Una "cantidad eficaz" puede determinarse empíricamente y por métodos conocidos relacionados con el propósito declarado.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un abTCR o composición que comprende un abTCR como se divulga en la presente, eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un individuo. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz de un abTCR o de una composición que comprenda un abTCR como se divulga en la presente puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño o el peso del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que un abTCR o una composición que comprenda un abTCR como se divulga en la presente pueda impedir el crecimiento y/o matar células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. La cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una cantidad inhibidora del crecimiento. La cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una cantidad que mejore la supervivencia libre de progresión de un paciente. En el caso de una enfermedad infecciosa, como una infección vírica, la cantidad terapéuticamente eficaz de un abTCR o de una composición que comprenda un abTCR como se divulga en la presente puede reducir el número de células infectadas por el patógeno; reducir la producción o liberación de antígenos derivados del patógeno; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la propagación del patógeno a células no infectadas; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más síntomas asociados con la infección. La cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una cantidad que prolongue la supervivencia de un paciente.

Como se usa en la presente, por "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente compatible" se entiende un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, por ejemplo, el material puede incorporarse en una composición farmacéutica administrada a un paciente sin provocar ningún efecto biológico indeseable significativo o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición en la que está contenido. Los portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables han cumplido preferiblemente las normas requeridas de pruebas toxicológicas y de fabricación y/o están incluidos en la Guía de Ingredientes Inactivos elaborada por la U.S. Food and Drug administration.

Se entiende que las realizaciones de la invención descritas en la presente incluyen "que consisten" y/o "que consisten esencialmente en" realizaciones.

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro de la presente incluye (y describe) variaciones que están dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Como se usa en la presente, la referencia a "no" un valor o parámetro generalmente significa y describe "distinto de" un valor o parámetro. Por ejemplo, el método no se usa para tratar el cáncer de tipo X significa que el método se usa para tratar el cáncer de tipos distintos de X.

Como se usan en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "o" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Constructos quiméricos de anticuerpos/receptores de células T

La presente invención se refiere a un anticuerpo/receptorde células T quimérico específico de antígeno diana (abTCR) que se une específicamente a un antígeno diana (como un antígeno de la superficie celular o un complejo péptido/MHC) y es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR (como CD38<e>,<c>D3<ye>, o ZZ), como se define en las reivindicaciones. El abTCR comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, por ejemplo, mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, el abTCR es un heterodímero que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas por al menos un enlace disulfuro. La especificidad del abTCR deriva de una fracción de anticuerpo que confiere especificidad de unión al antígeno diana. En algunas realizaciones, la fracción de anticuerpo es un módulo de unión a antígeno tipo Fab que comprende los dominios de anticuerpo V<h>, C<h>1, V<l>y C<l>. La capacidad del abTCR para reclutar un módulo de señalización asociado al TCR deriva de un módulo receptor de células T (TCRM). El TCRM comprende el módulo transmembrana de un TCR (como un apTCR o un y§TCR). En algunas realizaciones, el TCRM comprende además uno o ambos péptidos conectores o fragmentos de los mismos de un TCR. En algunas realizaciones, el módulo transmembrana y los péptidos conectores o fragmentos de los mismos se derivan del mismo tipo de TCR (ap o<y>§). En algunas realizaciones, el módulo transmembrana se deriva de un TCR ap y los péptidos o fragmentos de conexión del mismo se derivan de un TCR y§, o el módulo transmembrana se deriva de un TCR y§ y los péptidos o fragmentos de conexión del mismo se derivan de un TCR ap. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular. En algunas realizaciones, uno o más de los por lo menos un dominio intracelular del abTCR comprende una secuencia del dominio intracelular de un TCR. En algunas realizaciones, uno o más del por lo menos un dominio intracelular del abTCR comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T. La secuencia de señalización coestimuladora puede ser una porción del dominio intracelular de una molécula coestimuladora incluyendo, por ejemplo, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, antígeno-1 asociado a función linfocitaria (L<f>A-1), C<d>2, CD7, LIGHT, NKG2C,<b>7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83, y similares. En algunas realizaciones, la fracción de anticuerpo está contenida en un dominio extracelular del abTCR. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además uno o más conectores peptídicos entre la fracción de anticuerpo y el TCRM para optimizar la longitud del dominio extracelular. En algunas realizaciones, la referencia a un módulo de unión a antígeno (como un módulo de unión a antígeno tipo Fab) que se une específicamente a un antígeno diana significa que el módulo de unión a antígeno se une al antígeno diana con a) una afinidad que es por lo menos aproximadamente 10 (incluyendo por ejemplo por lo menos aproximadamente cualquiera de 1o, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000 o más) veces su afinidad de unión para otras moléculas; o b) una Kd de no más de aproximadamente 1/10 (por ejemplo, de no más de aproximadamente 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/75, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750, 1/1000 o menos) veces su Kd de unión a otras moléculas. La afinidad de unión puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica, como ELISA, análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o ensayo de radioinmunoprecipitación (RIA). La Kd puede determinarse por métodos conocidos en la técnica, como el ensayo de resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando, por ejemplo, instrumentos Biacore, o el ensayo de exclusión cinética (KinExA) utilizando, por ejemplo, instrumentos Sapidyne.

Los constructos de abTCR contemplados incluyen, por ejemplo, abTCR que se unen específicamente a antígenos de la superficie celular y abTCR que se unen específicamente a complejos péptido/MHC presentados en la superficie celular.

En algunas realizaciones, el abTCR comprende un módulo de unión a antígeno tipo Fab que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende un dominio de anticuerpo Vh y un dominio de anticuerpo Ch1 y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende un dominio de anticuerpo V<l>y un dominio de anticuerpo C<l>, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el primer dominio de unión a antígeno comprende el dominio de anticuerpo Vh aminoterminal al dominio de anticuerpo Ch1 y/o el segundo dominio de unión a antígeno comprende el dominio de anticuerpo V<l>aminoterminal al dominio de anticuerpo C<l>. En algunas realizaciones, hay un conector peptídico entre los dominios de anticuerpos Vl y Cl y/o un conector peptídico entre los dominios de anticuerpos Vh y C<h>1. En algunas realizaciones, todas las CDR del dominio de anticuerpo V<l>y del dominio de anticuerpo V<h>se derivan de la misma fracción de anticuerpo. En algunas realizaciones, el dominio de anticuerpo Vl y el dominio de anticuerpo V<h>comprenden las CDR de anticuerpo derivadas de más de una fracción de anticuerpo. En algunas realizaciones, el dominio de anticuerpo V<l>comprende las CDR de anticuerpo derivadas de un dominio de anticuerpo V<h>y/o el dominio de anticuerpo Vh comprende las CDR de anticuerpo derivadas de un dominio de anticuerpo Vl. En algunas realizaciones, el dominio de anticuerpo V<l>comprende regiones marco derivadas de un anticuerpo y una o más CDR derivadas de otro anticuerpo y/o el dominio de anticuerpo V<h>comprende regiones marco derivadas de un anticuerpo y una o más CDR derivadas de otro anticuerpo. En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, por ejemplo, mediante una unión covalente (por ejemplo, péptido u otra unión química) o no covalente. En algunas realizaciones, el primero y el segundo dominios de unión a antígeno están enlazados por un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, el primero y el segundo dominios de unión a antígeno están enlazados por un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio C<h>1 y un residuo en el dominio C<l>. En algunas realizaciones, el dominio Ch1 se deriva de una cadena pesada de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA (por ejemplo, IgA1 o IgA2), IgD, IgM o IgE, opcionalmente humana. En algunas realizaciones, el dominio Ch1 comprende (como consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 39 y 60- 69). En algunas realizaciones, el dominio Ch1 es una variante que comprende una o más modificaciones (por ejemplo, sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos) en comparación con la secuencia de la que se deriva. En algunas realizaciones, el dominio Cl se deriva de una cadena ligera kappa o lambda, opcionalmente humana. En algunas realizaciones, el dominio C<l>comprende (como consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41. En algunas realizaciones, el dominio C<l>es una variante que comprende una o más modificaciones (por ejemplo, sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos) en comparación con la secuencia de la que se deriva. En algunas realizaciones, los dominios Ch1 y/o C<l>comprenden una o más modificaciones que no alteran sustancialmente sus afinidades de unión entre sí. En algunas realizaciones, los dominios Ch1 y/o Cl comprenden una o más modificaciones que aumentan sus afinidades de unión entre sí y/o introducen un enlace disulfuro de origen no natural. En algunas realizaciones, los dominios Ch1 y C<l>comprenden una modificación de perilla-en-agujero (consultar, por ejemplo, Carter P. J Immunol Methods. 248:7-15, 2001). En algunas realizaciones, los dominios C<h>1 y C<l>se modifican mediante dirección electrostática para mejorar su asociación entre sí (consultar, por ejemplo, la WO2006106905 y Gunasekaran K, et al. J Biol Chem. 285:19637-46, 2010). En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o completamente sintético.

En algunas realizaciones, la fracción de anticuerpo (por ejemplo, el módulo de unión a antígeno tipo Fab) es semisintética, comprendiendo secuencias completamente humanas y una o más regiones sintéticas. En algunas realizaciones, la fracción de anticuerpo es semisintética, comprendiendo una V<l>totalmente humana y una V<h>semisintética que comprende regiones FR1, HC-CDR1, FR2, HC-CDR2, FR3 y FR4 totalmente humanas y una HC-CDR3 sintética. En algunas realizaciones, la Vh semisintética comprende una HC-CDR3 completamente sintética que tiene una secuencia de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 (como aproximadamente cualquiera de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25) aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, la Vh semisintética o la HC-CDR3 sintética se obtiene a partir de una biblioteca semisintética (como una biblioteca humana semisintética) que comprende regiones HC-CDR3 totalmente sintéticas que tienen una secuencia de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 (como, por ejemplo, cualquiera de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25) aminoácidos de longitud, en donde cada aminoácido de la secuencia se selecciona aleatoriamente de entre los aminoácidos humanos estándar, menos la cisteína. En algunas realizaciones, la HC-CDR3 sintética tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 19 (por ejemplo, aproximadamente cualquiera de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19) aminoácidos. En algunas realizaciones, la fracción de anticuerpo es semisintética y comprende una V<L>semisintética y una V<H>semisintética. En algunas realizaciones, la fracción de anticuerpo es completamente sintética, comprendiendo anticuerpos con emparejamientos de marco V<H>/V<L>humanos fijos, pero secuencias aleatorias y sintéticas para las 6 CDR de las cadenas pesada y ligera.

En algunas realizaciones la fracción de anticuerpo (por ejemplo, módulo de unión a antígeno tipo Fab) comprende secuencias CDR específicas derivadas de una o más fracciones de anticuerpo (como un anticuerpo monoclonal) o ciertas variantes de tales secuencias que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos en las secuencias variantes no reducen sustancialmente la capacidad de la fracción de anticuerpo para unirse al antígeno diana. También se contemplan las alteraciones que mejoran sustancialmente la afinidad de unión al antígeno diana o afectan a alguna otra propiedad, como la especificidad y/o la reactividad cruzada con variantes relacionadas del antígeno diana.

El TCRM comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio receptor de células T (TCRD) que comprende un primer dominio transmembrana y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo TCRD que comprende un segundo dominio transmembrana. El primer dominio transmembrana es el dominio transmembrana de una primera subunidad de TCR y/o el segundo dominio transmembrana es el dominio transmembrana de una segunda subunidad de TCR. En algunas realizaciones, la primera subunidad de TCR es una cadena a de TCR (por ejemplo, N° de Registro de Genbank: CCI73895), y la segunda subunidad de TCR es una cadena p de TCR (por ejemplo, N° de Registro de Genbank: CCI73893). En algunas realizaciones, la primera subunidad de TCR es una cadena p de TCR y la segunda subunidad de TCR es una cadena a de TCR. En algunas realizaciones, la primera subunidad de TCR es una cadena<y>de TCR y (por ejemplo, N° de Registro de Genbank: AGE91788), y la segunda subunidad de TCR es una cadena 6 de TCR (por ejemplo, N° de Registro de Genbank: AAQ57272). En algunas realizaciones, la primera subunidad de TCR es una cadena 6 de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena y de TCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominio transmembrana comprenden (como consisten en), individualmente, un dominio transmembrana contenido en una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 77-80. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominios transmembrana comprende (como consiste en), individualmente, cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1-4. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer péptido de conexión aminoterminal al dominio transmembrana y/o el segundo TCRD comprende además un segundo péptido de conexión aminoterminal al dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el primer péptido de conexión comprende la totalidad o una parte del péptido de conexión de la primera subunidad de TCR y/o el segundo péptido de conexión comprende la totalidad o una parte del péptido de conexión de la segunda subunidad de TCR. En algunas realizaciones, el primer dominio transmembrana y el primer péptido de conexión se derivan de diferentes subunidades del TCR y/o el segundo dominio transmembrana y el segundo péptido de conexión se derivan de diferentes subunidades del TCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptido de conexión comprende (como consiste en), individualmente, un péptido de conexión o fragmento del mismo contenido en una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 77-80. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptido de conexión comprende (como consiste en), individualmente, cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 5 12. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular de TCR carboxiterminal al primer dominio transmembrana y/o el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular TCR carboxi-terminal al segundo dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el primer dominio intracelular TCR comprende todo o una parte del dominio intracelular de la primera subunidad de TCR y/o el segundo dominio intracelular TCR comprende todo o una parte del dominio intracelular de la segunda subunidad de TCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominios intracelulares de TCR comprenden, individualmente, todo o una parte de un dominio intracelular contenido en cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 77-80. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominio intracelular del TCR comprende, individualmente, cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 13-14. En algunas realizaciones, el primer TCRD es un fragmento de la primera subunidad de TCR y/o el segundo TCRD es un fragmento de la segunda cadena de TCR. En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, por ejemplo, mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, el primer y el segundo TCRD están enlazados por un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, el primer y el segundo TCRD están enlazados por un enlace disulfuro entre un residuo en el primer péptido de conexión y un residuo en el segundo péptido de conexión. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD3s/e, CD3y/£ y Z/Z. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar cada uno de CD3S/<e>,<c>D3<y>/£ y Z/Z para formar un complejo de abTCR-CD3 octamérico (es decir, promueve la formación del complejo abTCR-CD3).

En algunas realizaciones, el abTCR es una molécula que comprende una fusión de la primera cadena polipeptídica de la fracción de anticuerpo (por ejemplo, módulo de unión a antígeno tipo Fab) aminoterminal a la primera cadena polipeptídica del TCRM, formando de este modo una primera cadena polipeptídica del abTCR, y una fusión de la segunda cadena polipeptídica de la fracción de anticuerpo aminoterminal a la segunda cadena polipeptídica del TCRM, formando de este modo una segunda cadena polipeptídica del abTCR. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer conector peptídico entre la primera cadena polipeptídica de la fracción de anticuerpo y la primera cadena polipeptídica del TCRM y/o un segundo conector peptídico entre la segunda cadena polipeptídica de la fracción de anticuerpo y la segunda cadena polipeptídica del TCRM. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo conector peptídico tiene entre aproximadamente 5 y aproximadamente 70 (como aproximadamente cualquiera de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 70, incluyendo cualquier rango entre estos valores) aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica del abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o la segunda cadena polipeptídica del abTCR comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptido señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica del abTCR comprende además un primer dominio intracelular accesorio carboxi-terminal al primer dominio transmembrana y/o la segunda cadena polipeptídica del abTCR comprende además un segundo dominio intracelular accesorio carboxi-terminal al segundo dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominio intracelular accesorio comprende un dominio coestimulador del TCR. En algunas realizaciones, el dominio costimulador del TCR comprende toda o una parte de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominios intracelulares accesorios comprenden una etiqueta de epítopo. En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas del abTCR están enlazadas, por ejemplo, mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o enlace no covalente. En algunas realizaciones, el abTCR es un heterodímero.

En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad que se expresa en una célula enferma. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo que comprende un péptido y una proteína del MHC. Los complejos péptido/MHC incluyen, por ejemplo, un complejo presentado en superficie que comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a la enfermedad expresado en una célula enferma y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el antígeno asociado a la enfermedad de longitud completa no se expresa normalmente en la superficie de la célula enferma (por ejemplo, el antígeno asociado a la enfermedad es una proteína intracelular o secretada). En algunas realizaciones, la enfermedad es cáncer y el antígeno asociado a la enfermedad es un antígeno asociado a tumor expresado en una célula cancerosa. En algunas realizaciones, el antígeno asociado al tumor es una oncoproteína. En algunas realizaciones, la oncoproteína es el resultado de una mutación en un protooncogén, y la oncoproteína comprende un neoepítopo que comprende la mutación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular asociado a tumor (por ejemplo, una oncoproteína que comprende un neoepítopo). En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo que comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a un tumor (por ejemplo, una oncoproteína que comprende un neoepítopo) que normalmente no se expresa en la superficie de una célula cancerosa (por ejemplo, un tumor intracelular o secretado).

antígeno asociado) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, la enfermedad es una infección vírica y el antígeno asociado a la enfermedad es un antígeno asociado al virus expresado en una célula infectada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno asociado al virus de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo que comprende un péptido derivado de un antígeno asociado al virus que normalmente no se expresa en la superficie de una célula infectada por el virus (por ejemplo, un antígeno asociado al virus intracelular o secretado) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el constructo abTCR se une al antígeno diana con una Kd entre aproximadamente 0,1 pM y aproximadamente 500 nM (como aproximadamente cualquiera de 0.1 pM, 1.0 pM, 10 pM, 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, o 500 nM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores).

En algunas realizaciones, el abTCR comprende una fracción de anticuerpo (por ejemplo, módulo de unión a antígeno tipo Fab) que se une específicamente a un antígeno de la superficie celular, en donde el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. La unión específica a un antígeno completo, por ejemplo, un antígeno de la superficie celular, se denomina a veces "unión no restringida al MHC".

En algunas realizaciones, el abTCR comprende una fracción de anticuerpo (por ejemplo, un módulo de unión a antígeno tipo Fab) que se une específicamente a un complejo que comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, y PSA. La unión específica a un complejo que comprende un péptido y una proteína del MHC se denomina a veces "unión restringida al MHC".

En algunas realizaciones, el abTCR comprende una fracción de anticuerpo (por ejemplo, un módulo de unión a antígeno de tipo Fab) que se une específicamente a un complejo que comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a enfermedad (como un antígeno asociado a tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC de clase I, en donde la proteína del MHC de clase I es HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, o HLA-G. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A, HLA-B o HLA-C. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-B. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-C. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A01, HLA-A02, HLA-A03, HLA-A09, HLA-A10, HLA-A11, HLA-A19, HLA-A23, HLA-A24, HLA-A25, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A29, HLA-A30, HLA-A31, HLA-A32, HLA-A33, HLA-A34, HLA-A36, HLA-A43, HLA-A66, HLA-A68, HLA-A69, HLA-A74, o HLA-A80. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A02. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es cualquiera de las HLA-A*02:01-555, como HLA-A*02:01, HLA-A*02:02, HLA-A*02:03, HLA-A*02:04, HLA-A*02:05, HLA-A*02:06, HLA-A*02:07, HLA-A*02:08, HLA-A*02:09, HLA-A*02:10, HLA-A*02:11, HLA-A*02:12, HLA-A*02:13, HLA-A*02:14, HLA-A*02:15, HLA-A*02:16, HLA-A*02:17, HLA-A*02:18, HLA-A*02:19, HLA-A*02:20, HLA-A*02:21, HLA-A*02:22, o HLA-A*02:24. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A*02:01.

En algunas realizaciones, el abTCR comprende una fracción de anticuerpo (por ejemplo, un módulo de unión a antígeno de tipo Fab) que se une específicamente a un complejo que comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC de clase II, en donde la proteína del MHC de clase II es HLA-DP, HLA-DQ o HLA-DR. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase II es HLA-DP. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase II es HLA-DQ. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase II es HLA-DR.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporciona un abTCR (como un abTCR aislado) que comprende a) un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente a un antígeno diana, y b) un TCRM capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. El módulo de unión a antígeno de tipo Fab comprende un dominio de anticuerpo V<h>, un dominio de anticuerpo C<h>1 , un dominio de anticuerpo Vl y un dominio de anticuerpo Cl. En algunas realizaciones, el dominio Ch1 se deriva de una cadena pesada de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), opcionalmente humana. En algunas realizaciones, el dominio Ch1 es una variante que comprende una o más modificaciones (por ejemplo, sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos) en comparación con la secuencia de la que deriva. En algunas realizaciones, el dominio C<l>se deriva de una cadena ligera kappa o lambda, opcionalmente humana. En algunas realizaciones, el dominio C<l>es una variante que comprende una o más modificaciones (por ejemplo, sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos) en comparación con la secuencia de la que deriva. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. El TCRM comprende los dominios transmembrana de un TCR, como un apTCR o un y§TCR. En algunas realizaciones, el TCRM comprende además los péptidos de conexión o fragmentos de los mismos de un TCR, como un apTCR o un<y>§TCR. En algunas realizaciones, los dominios transmembrana y los péptidos de conexión se derivan de un apTCR o un y^TCR. En algunas realizaciones, los dominios transmembrana se derivan de un apTCR y los péptidos de conexión se derivan de un Y5TCR, o los dominios transmembrana se derivan de un<y>§TCR y los péptidos de conexión se derivan de un apTCR. En algunas realizaciones, el TCRM comprende además por lo menos una parte de un dominio extracelular del TCR. En algunas realizaciones, el TCRM comprende además por lo menos un dominio intracelular del TCR que comprende una secuencia de un dominio intracelular del TCR. En algunas realizaciones, el TCRM comprende fragmentos de las subunidades del TCR. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, c D30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno de tipo Fab comprende un enlace disulfuro y/o el TCRM comprende un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab comprende un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio Ch1 y un residuo en el dominio C<l>y/o el TCRM comprende un enlace disulfuro entre un residuo en el primer péptido de conexión y un residuo en el segundo péptido de conexión. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38/£, CD3y/£ y Z/C En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un conector peptídico entre el módulo de unión a antígeno tipo Fab y el TCRM. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado víricamente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo V<h>y C<h>1 y un primer TCRD que comprende el dominio transmembrana de una primera subunidad de TCR; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende los dominios de anticuerpos Vl y Cl y un segundo TCRD que comprende el dominio transmembrana de una segunda subunidad de TCR, en donde los dominios V<h>y C<h>1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios Vl y Cl del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, la primera subunidad de TCR es una cadena a de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena p de TCR. En algunas realizaciones, la primera subunidad de TCR es una cadena p de TCR la segunda subunidad de TCR es una cadena a de TCR. En algunas realizaciones, la primera subunidad de TCR es una cadena<y>de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena 8 de TCR. En algunas realizaciones, la primera subunidad de TCR es una cadena 8 de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena<y>de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además el péptido conector o un fragmento del mismo de la primera subunidad de TCR y/o el segundo TCRD comprende además el péptido conector o un fragmento del mismo de la segunda subunidad de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la primera subunidad del TCR y/o el segundo TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la segunda subunidad de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular del TCR y/o el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular del TCR. En algunas realizaciones, el primer dominio intracelular del TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la primera subunidad del TCR y/o el segundo dominio intracelular del TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la segunda subunidad del TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD es un fragmento de la primera subunidad de TCR y/o el segundo TCRD es un fragmento de la segunda cadena de TCR. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, C<d>3<o>, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38e, CD3ye y ZZ. En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un primer conector peptídico entre el primer dominio de unión a antígeno y el primer TCRD y/o un segundo conector peptídico entre el segundo dominio de unión a antígeno y el segundo TCRD. En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, por ejemplo, mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCRD y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio de anticuerpo Ch1 en el primer dominio de unión a antígeno y un residuo en el dominio de anticuerpo Cl en el segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el dominio Ch1 se deriva de una cadena pesada de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), opcionalmente humana. En algunas realizaciones, el dominio Ch1 es una variante que comprende una o más modificaciones (por ejemplo, sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos) en comparación con la secuencia de la que deriva. En algunas realizaciones, el dominio C<l>se deriva de una cadena ligera kappa o lambda, opcionalmente humana. En algunas realizaciones, el dominio C<l>es una variante que comprende una o más modificaciones (por ejemplo, sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos) en comparación con la secuencia de la que deriva. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo Vh y Ch1 y un primer TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena a de TCR; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo Vl y Cl y un segundo TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena p de TCR, en donde los dominios Vh y Ch1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios Vl y Cl del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena a de TCR y/o el segundo TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena p del TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena a de TCR y/o el segundo TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena p del TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular del TCR y/o el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular del TCR. En algunas realizaciones, el primer dominio intracelular del TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena a de TCR y/o el segundo dominio intracelular TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena p del TCR. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38e, CD3ye y ZC En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un primer conector peptídico entre el primer dominio de unión a antígeno y el primer TCRD y/o un segundo conector peptídico entre el segundo dominio de unión a antígeno y el segundo TCRD. En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, por ejemplo, mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCRD y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio de anticuerpo C<h>1 en el primer dominio de unión a antígeno y un residuo en el dominio de anticuerpo C<l>en el segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC de superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO1I, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es la HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo Vh y Ch1 y un primer TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena p de TCR; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende los dominios de anticuerpo V<l>y C<l>y un segundo TCR<d>que comprende el dominio transmembrana de una cadena a de TCR, en donde los dominios Vh y Ch1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios Vl y Cl del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena p del TCR y/o el segundo TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena a de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena p del TCR y/o el segundo TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena a de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular del TCR y/o el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular del TCR. En algunas realizaciones, el primer dominio intracelular del TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena p del TCR y/o el segundo dominio intracelular TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena a de TCR. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, C<d>3<o>, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38e, CD3ye y ZC En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un primer conector peptídico entre el primer dominio de unión a antígeno y el primer TCRD y/o un segundo conector peptídico entre el segundo dominio de unión a antígeno y el TCRD. En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, por ejemplo, mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas a través de a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión de la primera TCRD y un residuo en el péptido de conexión de la segunda TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio de anticuerpo C<h>1 en el primer dominio de unión a antígeno y un residuo en el dominio de anticuerpo C<l>en el segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC de superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo V<h>y C<h>1 y un primer TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena<y>de TCR; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende los dominios de anticuerpos V<l>y C<l>y un segundo TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena 8 de TCR, en donde los dominios Vh y Ch1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios Vl y Cl del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en done el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena y de TCR y/o el segundo TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena 8 de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena<y>de TCR y/o el segundo TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena 8 de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular del TCR y/o el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular del TCR. En algunas realizaciones, el primer dominio intracelular del TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena y del TCR y/o el segundo dominio intracelular del TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena 8 del TCR. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), o X40, Cd 3o, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38<e>, CD3<ye>y ZZ. En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un primer conector peptídico entre el primer dominio de unión a antígeno y el primer TCRD y/o un segundo conector peptídico entre el segundo dominio de unión a antígeno y el segundo TCRD. En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, por ejemplo, mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCRD y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio de anticuerpo C<h>1 en el primer dominio de unión a antígeno y un residuo en el dominio de anticuerpo C<l>en el segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC de superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende los dominios de anticuerpos Vh y Ch1 y un primer TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena 8 del TCR; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende los dominios de anticuerpos V<l>y C<l>y un segundo TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena<y>del TCR, en donde los dominios V<h>y C<h>1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios V<l>y C<l>del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a<t>C<r>, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena 8 de TCR y/o el segundo TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena y de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena 8 de TCR y/o el segundo TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena<y>de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular del TCR y/o el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular del TCR. En algunas realizaciones, el primer dominio intracelular de TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena 8 de TCR y/o el segundo dominio intracelular de TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena y de TCR. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por<lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38e, CD3ye y>ZZ-<En>algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un primer conector peptídico entre el primer dominio de unión a antígeno y el primer TCRD y/o un segundo conector peptídico entre el segundo dominio de unión a antígeno y el segundo TCRd . En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, por ejemplo, mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión dela primer TCRD y un residuo en el péptido conector del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio de anticuerpo Ch1 en el primer dominio de unión a antígeno y un residuo en el dominio de anticuerpo Cl en el segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo Vh y Ch1 y un primer TCRD que comprende un dominio transmembrana que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpos Vl y Cl y un segundo TCRD que comprende un dominio transmembrana que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4, en donde los dominios V<h>y C<h>1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios V<l>y C<l>del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno de tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer péptido de conexión o fragmento del mismo de una primera subunidad de TCR y/o el segundo TCRD comprende además un segundo péptido de conexión o fragmento del mismo de una segunda subunidad de TCR, en donde el primer y/o segundo péptido de conexión comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 5-12. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular del TCR y/o el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular del TCR, en donde el primer y/o el segundo dominios intracelulares del TCR comprenden (como consisten en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 13-14. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende a) por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptido señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización<asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38e, CD3ye y>ZZ-<En algunas realizaciones, el TCRM>promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un primer conector peptídico entre el primer dominio de unión a antígeno y el primer TCRD y/o un segundo conector peptídico entre el segundo dominio de unión a antígeno y el segundo TCRD. En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, por ejemplo, mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCRD y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio de anticuerpo Ch1 en el primer dominio de unión a antígeno y un residuo en el dominio de anticuerpo Cl en el segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRA<m>E, EBV-LMP2A, HIV-1 y pSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un primer dominio de unión a antígeno que comprende los dominios de anticuerpo V<h>y C<h>1, y un primer TCRD que comprende un péptido de conexión que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 5-12 y un dominio transmembrana que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un segundo dominio de unión a antígeno que comprende los dominios de anticuerpos V<L>y C<L>y un segundo TCRD que comprende un péptido de conexión que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 5-12 y un dominio transmembrana que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-4; en donde los dominios Vh y Ch1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios Vl y Cl del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular de TCR y/o el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular de TCR, en donde el primer y/o segundo dominios intracelulares de TCR comprenden (como consisten en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 13-14. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las s Eq ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38<e>, CD3/<e>y ZZ En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCRD y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio de anticuerpo Ch1 en el primer dominio de unión a antígeno y un residuo en el dominio de anticuerpo C<l>en el segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona entre el grupo formado por una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado por un virus. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRA<m>E, EBV-LMP2A, HIV-1, y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxilo, un primer dominio de unión a antígeno y un primer TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxilo, un segundo dominio de unión a antígeno y un segundo TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; en donde el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende a) por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD3S<e>, CD3<ye>y ZZ. En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCRD y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre residuos en los dominios de anticuerpo Ch1 y Cl en el módulo de unión a antígeno tipo Fab. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es<h>LA-A. En algunas, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HlA-A*02:01.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxilo, un primer dominio de unión a antígeno y un primer TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxilo, un segundo dominio de unión a antígeno y un segundo TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18; en donde el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado,quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende a) por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD3Se, CD3<ye>y ZZ. En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCRD y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre residuos en los dominios de anticuerpo C<h>1 y C<l>en el módulo de unión a antígeno tipo Fab. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es el HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxilo, un primer dominio de unión a antígeno y un primer TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxilo, un segundo dominio de unión a antígeno y un segundo TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20; en donde el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende a) por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD3Se, CD3ye y ZZ. En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCRD y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre residuos en los dominios de anticuerpo Ch1 y Cl en el módulo de unión a antígeno tipo Fab. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxilo, un primer dominio de unión a antígeno y un primer TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxilo, un segundo dominio de unión a antígeno y un segundo TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22; en donde el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende a) por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (por ejemplo, que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (por ejemplo, que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ I<d>NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38e, CD3ye y ZC En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCRD y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre residuos en los dominios de anticuerpo C<h>1 y C<l>en el módulo de unión a antígeno tipo Fab. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-Aes HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un complejo que comprende un péptido AFP y una proteína del MHC I que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, c D30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un complejo que comprende un péptido AFP y una proteína del MHC I que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, c D30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un complejo que comprende un péptido AFP y una proteína del MHC I que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), Ox 40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un complejo que comprende un péptido AFP y una proteína del MHC I que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40,<c>D30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un complejo que comprende un péptido AFP y una proteína del MHC I que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, c D30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un complejo que comprende un péptido AFP y una proteína del MHC I que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, c D30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un complejo que comprende un péptido AFP y una proteína del MHC I que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, c D30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente un complejo que comprende un péptido AFP y una proteína del MHC I, que comprende un módulo de unión a antígeno que comprende un dominio de anticuerpo Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38, o una variante de la misma que tiene por lo menos aproximadamente un 95% (por ejemplo, por lo menos aproximadamente cualquiera de un 96%, 97%, 98% o 99%) de identidad de secuencia, y un dominio de anticuerpo V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40, o una variante de la misma que tiene por lo menos aproximadamente un 95% (por ejemplo, por lo menos aproximadamente cualquiera de un 96%, 97%, 98% o 99%) de identidad de secuencia, como se define en las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente CD19 que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente CD19 que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente CD19 que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que reconoce específicamente CD19 que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente que reconoce específicamente CD19 que comprende un módulo de unión a antígeno que comprende un dominio de anticuerpo Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45, o una variante de la misma que tiene por lo menos aproximadamente un 95% (por ejemplo por lo menos aproximadamente cualquiera de un 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia, y un dominio de anticuerpo V<l>que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46, o una variante de la misma que tiene por lo menos aproximadamente un 95% (por ejemplo por lo menos aproximadamente cualquiera de un 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia, como se define en las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente que reconoce específicamente CD19 que comprende un módulo de unión a antígeno que comprende un dominio de anticuerpo Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45, o una variante de la misma que tiene por lo menos aproximadamente un 95% (por ejemplo por lo menos aproximadamente cualquiera de un 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia, y un dominio de anticuerpo V<l>que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57, o una variante de la misma que tiene por lo menos aproximadamente un 95% (por ejemplo por lo menos aproximadamente cualquiera de un 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia, como se define en las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente que reconoce específicamente CD19 que comprende un módulo de unión a antígeno que comprende un dominio de anticuerpo V<h>que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58, o una variante de la misma que tiene por lo menos aproximadamente un 95% (por ejemplo por lo menos aproximadamente cualquiera de un 96%, 97%, 98%, o 99%), y un dominio de anticuerpo Vl que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57, o una variante de la misma que tiene por lo menos aproximadamente un 95% (por ejemplo por lo menos aproximadamente cualquiera de un 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia, como se define en las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente que reconoce específicamente CD19 que comprende un módulo de unión a antígeno que comprende un dominio de anticuerpo Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59, o una variante de la misma que tiene por lo menos aproximadamente un 95% (por ejemplo por lo menos aproximadamente cualquiera de un 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia, y un dominio de anticuerpo V<l>que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57, o una variante de la misma que tiene por lo menos aproximadamente un 95% (por ejemplo por lo menos aproximadamente cualquiera de un 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia, como se define en las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente que reconoce específicamente un complejo que comprende un péptido NY-ESO-1 157-165 y una proteína del MHC I que comprende un módulo de unión a antígeno que comprende un dominio de anticuerpo V<h>que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 72, o una variante de la misma que tiene por lo menos aproximadamente un 95% (por ejemplo por lo menos aproximadamente cualquiera de un 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia, y un dominio de anticuerpo V<l>que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 73, o una variante de la misma que tiene por lo menos aproximadamente un 95% (por ejemplo por lo menos aproximadamente cualquiera de un 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad de secuencia, como se define en las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, se proporciona un abTCR que comprende un primer módulo de unión a antígeno que compite por la unión a un antígeno diana con un segundo módulo de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente. En algunas realizaciones, el primer módulo de unión a antígeno se une al mismo epítopo, o sustancialmente al mismo, que el segundo módulo de unión a antígeno. En algunas realizaciones, la unión del primer módulo de unión a antígeno al antígeno diana inhibe la unión del segundo módulo de unión a antígeno al antígeno diana en por lo menos aproximadamente un 70% (como en por lo menos aproximadamente cualquiera de un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%), o viceversa. En algunas realizaciones, el primer módulo de unión a antígeno y el segundo módulo de unión a antígeno compiten entre sí para unirse al antígeno diana, es decir, cada uno del primer y el segundo módulos de unión a antígeno compite con el otro para unirse al antígeno diana.

En algunas realizaciones, se proporciona un complejo que comprende un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente y por lo menos un módulo de señalización seleccionado del grupo que consiste en CD38e, CD3ye y ZZ. En algunas realizaciones, el complejo comprende cada uno de CD3ó£, CD3ye y ZC Por tanto,<en algunas realizaciones, se proporciona un complejo que comprende el abTCR, CD3ó£, CD3y£ y>ZZ-

Los diferentes aspectos se analizan en varias secciones a continuación con más detalle.

Ácidos nucleicos

También se contemplan moléculas de ácido nucleico que codifican los abTCR. En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente, se proporciona un ácido nucleico (o un conjunto de ácidos nucleicos) que codifica el abTCR.

La presente invención también proporciona vectores en los que se inserta un ácido nucleico de la presente invención.

En breve resumen, la expresión de un abTCR por un ácido nucleico que codifica el abTCR puede lograrse insertando el ácido nucleico en un vector de expresión apropiado, de tal manera que el ácido nucleico esté enlazado operativamente a elementos reguladores 5' y 3', incluyendo por ejemplo un promotor (por ejemplo, un promotor específico de linfocitos) y una región no traducida (UTR) 3'. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en células huésped eucariotas. Los vectores de clonación y expresión típicos contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de inicio y promotores útiles para regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada.

Los ácidos nucleicos de la presente invención también pueden usarse para la inmunización con ácidos nucleicos y la terapia génica, usando protocolos estándar de administración de genes. Los métodos para la administración de genes son conocidos en la técnica. Consultar, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466. En algunas realizaciones, la invención proporciona un vector de terapia génica.

El ácido nucleico puede clonarse en varios tipos de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico puede clonarse en un vector que incluye, entre otros, un plásmido, un fagémido, un derivado de fago, un virus animal y un cósmido. Los vectores de interés particular incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación.

Además, el vector de expresión puede proporcionarse a una célula en forma de vector viral. La tecnología de vectores virales es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus útiles como vectores incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en por lo menos un organismo, una secuencia promotora, sitios de endonucleasas de restricción convenientes, y uno o más marcadores seleccionables (consultar, por ejemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; y Patente de Estados Unidos N° 6,326,193).

Se han desarrollado una serie de sistemas basados en virus para la transferencia de genes a células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de administración de genes. Un gen seleccionado puede insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales mediante técnicas conocidas en la técnica. A continuación, el virus recombinante puede aislarse y administrarse a células del sujeto, ya sea in vivo o ex vivo. En la técnica se conocen una serie de sistemas retrovirales. En algunas realizaciones, se usan vectores de adenovirus. En la técnica se conocen una serie de vectores de adenovirus. En algunas realizaciones, se usan vectores de lentivirus. Los vectores derivados de retrovirus, como el lentivirus, son herramientas adecuadas para lograr la transferencia de genes a largo plazo, ya que permiten la integración estable y a largo plazo de un transgén y su propagación en células hijas. Los vectores lentivirales tienen la ventaja añadida sobre los vectores derivados de onco-retrovirus, como los virus de la leucemia murina, de que pueden transducir células no proliferantes, como los hepatocitos. También tienen la ventaja añadida de su baja inmunogenicidad.

Elementos promotores adicionales, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia del inicio transcripcional. Típicamente, se localizan en la región de 30-110 bp en sentido ascendente del sitio de inicio, aunque recientemente se ha demostrado que varios promotores contienen también elementos funcionales en sentido descendente del sitio de inicio. El espaciado entre los elementos promotores frecuentemente es flexible, de tal manera que la función promotora se mantiene cuando los elementos se invierten o se desplazan unos respecto a otros. En el promotor de la timidina quinasa (tk), el espaciado entre los elementos promotores puede aumentarse hasta 50 bp antes de que comience a disminuir la actividad.

Un ejemplo de promotor adecuado es la secuencia promotora temprana inmediata del citomegalovirus (CMV). Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte capaz de impulsar altos niveles de expresión de cualquier secuencia polinucleotídica operativamente enlazada a la misma. Otro ejemplo de promotor adecuado es el Factor de Crecimiento de Elongación-1a (EF-1a). Sin embargo, también pueden usarse otras secuencias promotoras constitutivas, entre las que se incluyen el promotor temprano del virus simio 40 (SV40), el virus del tumor mamario de ratón (MMTV), el promotor de la repetición terminal larga (LTR) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el promotor de MoMuLV, un promotor del virus de la leucemia aviar, un promotor temprano inmediato del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, así como promotores de genes humanos como, pero no limitados a, el promotor de la actina, el promotor de la miosina, el promotor de la hemoglobina y el promotor de la creatina quinasa.

Además, la invención no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. Los promotores inducibles también se contemplan como parte de la invención. El uso de un promotor inducible proporciona un interruptor molecular capaz de activar la expresión de la secuencia polinucleotídica a la que está enlazado operativamente cuando se desea dicha expresión, o desactivar la expresión cuando no se desea la expresión. Los sistemas promotores inducibles ejemplares para su uso en células eucariotas incluyen, entre otros, elementos regulados por hormonas (por ejemplo, ver Mader, S. y White, J. H. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607), elementos regulados por ligandos sintéticos (ver, por ejemplo, Spencer, D. M. et al 1993) Science 262: 1019-1024) y elementos regulados por radiación ionizante (ver, por ejemplo, Manome, Y. et al. (1993) Biochemistry 32: 10607-10613; Datta, R. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1014-10153). En Gingrich et al. (1998) Annual Rev. Neurosci 21:377-405 se revisan sistemas de promotores inducibles ejemplares adicionales para su uso en sistemas de mamíferos in vitro o in vivo.

Un sistema promotor inducible ejemplar para su uso en la presente invención es el sistema Tet. Tales sistemas se basan en el sistema Tet descrito por Gossen et al. (1993). Un polinucleótido de interés puede estar bajo el control de un promotor que comprende uno o más sitios de operador Tet (TetO). En estado inactivo, el represor Tet (TetR) se unirá a los sitios TetO y reprimirá la transcripción desde el promotor. En estado activo, por ejemplo, en presencia de un agente inductor como la tetraciclina (Tc), la anhidrotetraciclina, la doxiciclina (Dox) o un análogo activo de los mismos, el agente inductor provoca la liberación del TetR del TetO, permitiendo de este modo que tenga lugar la transcripción. La doxiciclina es un miembro de la familia de las tetraciclinas de antibióticos que tiene el nombre químico 1-dimetilamino-2,4a,5,7,12-pentahidroxi-11-metil-4,6-dioxo-1,4a,11,11a,12,12a-hexahidrotetraceno-3-carboxamida.

Un TetR puede estar optimizado por codón para la expresión en células de mamífero, por ejemplo, células murinas o humanas. La mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un codón debido a la degeneración del código genético, permitiendo variaciones sustanciales en la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico dado sin ninguna alteración en la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico. Sin embargo, muchos organismos presentan diferencias en el uso de codones, también conocido como "sesgo de codones" (es decir, sesgo para el uso de un codón o codones particulares para un aminoácido dado). El sesgo de codón se correlaciona a menudo con la presencia de una especie predominante de ARNt para un codón en particular, lo que a su vez aumenta la eficiencia de la traducción del ARNm. Por consiguiente, una secuencia de codificación derivada de un organismo particular (por ejemplo, un procariota) puede adaptarse para su expresión mejorada en un organismo diferente (por ejemplo, un eucariota) mediante la optimización de codones.

Otras variaciones específicas del sistema Tet incluyen los siguientes sistemas "Tet-O ff' y "Tet On". En el sistema Tet-Off, la transcripción es inactiva en presencia de Tc o Dox. En ese sistema, una proteína transactivadora controlada por tetraciclina (tTA), que se compone de TetR fusionado al dominio transactivador fuerte de VP16 del virus del Herpes simple, regula la expresión de un ácido nucleico diana que está bajo control transcripcional de un elemento promotor sensible a tetraciclina (TRE). El TRE se compone de concatámeros de secuencia de TetO fusionados a un promotor (normalmente la secuencia promotora mínima derivada del promotor inmediato-temprano del citomegalovirus humano (hCMV)). En ausencia de Tc o Dox, la tTA se une al TRE y activa la transcripción del gen diana. En presencia de Tc o Dox, la tTA no puede unirse al TRE y la expresión del gen diana permanece inactiva.

Por el contrario, en el sistema Tet-On, la transcripción es activa en presencia de Tc o Dox. El sistema Tet-On se basa en un transactivador inverso controlado por tetraciclina, rtTA. Al igual que la tTA, el rtTA es una proteína de fusión compuesta por el represor TetR y el dominio de transactivación VP16. Sin embargo, un cambio de cuatro aminoácidos en la fracción de unión al ADN del TetR altera las características de unión del rtTA, de tal manera que sólo puede reconocer las secuencias de tetO en el TRE del transgén diana en presencia de Dox. Por tanto, en el sistema Tet-On, la transcripción del gen diana regulado por TRE es estimulada por rtTA sólo en presencia de Dox.

Otro sistema promotor inducible es el sistema represor lac de E. coli. (Consultar, Brown et al., Cell 49:603-612 (1987). El sistema represor lac funciona regulando la transcripción de un polinucleótido de interés enlazado operativamente a un promotor que comprende el operador lac (lacO). El represor lac (lacR) se une a LacO, impidiendo por tanto la transcripción del polinucleótido de interés. La expresión del polinucleótido de interés se induce mediante un agente inductor adecuado, por ejemplo, isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG).

Para evaluar la expresión de un polipéptido o porciones del mismo, el vector de expresión que se va a introducir en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen informador, o ambos, para facilitar la identificación y selección de células expresantes de la población de células que se pretende transfectar o infectar mediante vectores virales. En otros aspectos, el marcador seleccionable puede transportarse en un fragmento separado de ADN y usarse en un procedimiento de cotransfección. Tanto los marcadores seleccionables como los genes informadores pueden flanquearse con secuencias reguladoras apropiadas para permitir la expresión en las células huésped. Los marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, como neo y similares.

Los genes informadores se usan para identificar células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen informador es un gen que no está presente en el organismo o tejido receptor ni es expresado por él y que codifica un polipéptido cuya expresión se manifiesta por alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, la actividad enzimática. La expresión del gen informador se evalúa en un momento adecuado después de haber introducido el ADN en las células receptoras. Los genes informadores adecuados pueden incluir genes que codifican luciferasa, p-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína verde fluorescente (por ejemplo, Ui-Tel et al., 2000 FEES Letters 479: 79-82). Los sistemas de expresión adecuados son bien conocidos y pueden prepararse usando técnicas conocidas u obtenerse comercialmente. En general, se identifica como el promotor el constructo con la región flanqueante 5' mínima que muestra el nivel de expresión más alto del gen informador. Estas regiones promotoras pueden vincularse aun gen informador y usarse para evaluar la capacidad de los agentes para modular la transcripción impulsada por el promotor.

En algunas realizaciones, se proporciona ácido nucleico que codifica un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el abTCR comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico está localizada en un primer vector y la segunda secuencia de ácido nucleico está localizada en un segundo vector. En algunas realizaciones, la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico se localizan en el mismo vector. Los vectores pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en vectores de expresión de mamíferos y vectores virales (como los derivados de retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y lentivirus). En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un primer promotor y la segunda secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un segundo promotor. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen la misma secuencia. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen secuencias diferentes. En algunas realizaciones, la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico se expresan como un único transcrito bajo el control de un único promotor en un vector multicistrónico (como un vector bicistrónico). Consultar, por ejemplo, Kim, JH, et al., PLoS One 6(4):e18556, 2011. En algunas realizaciones, el primer, el segundo y/o el único promotores son inducibles. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico tiene un nivel de expresión en una célula huésped (como una célula T) que es aproximadamente el mismo que el nivel de expresión de la segunda secuencia de ácido nucleico en la célula huésped. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico tiene un nivel de expresión en una célula huésped (como una célula T) que es por lo menos aproximadamente dos (como por lo menos aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5, o más) veces el nivel de expresión de la segunda secuencia de ácido nucleico en la célula huésped. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico tiene un nivel de expresión en una célula huésped (como una célula T) que no es más de aproximadamente 1/2 (como no más de aproximadamente cualquiera de 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 o menos) veces el nivel de expresión de la segunda secuencia de ácido nucleico en la célula huésped. La expresión puede determinarse a nivel de ARNm o de proteínas. El nivel de expresión de ARNm puede determinarse midiendo la cantidad de ARNm transcrito a partir del ácido nucleico usando varios métodos conocidos, como transferencia Northern, RT-PCR cuantitativa, análisis de micromatrices y similares. El nivel de expresión de proteínas puede medirse usando métodos conocidos, incluyendo tinción inmunocitoquímica, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), análisis de transferencia Western, ensayos luminiscentes, espectrometría de masas, cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía líquida de alta presión-espectrometría de masas en tándem, y similares.

Por tanto, en algunas realizaciones, se proporciona ácido nucleico que codifica un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR, y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR, en donde la primera secuencia de ácido nucleico se encuentra en un primer vector (como un vector lentiviral) y está enlazada operativamente a un primer promotor, y la segunda secuencia de ácido nucleico se encuentra en un segundo vector (como un vector lentiviral) y está enlazada operativamente a un segundo promotor. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen la misma secuencia. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen secuencias diferentes. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo promotor son inducibles. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico tiene un nivel de expresión en una célula huésped (como una célula T) que es aproximadamente el mismo que el nivel de expresión de la segunda secuencia de ácido nucleico en la célula huésped. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico tiene un nivel de expresión en una célula huésped (como una célula T) que es por lo menos aproximadamente dos (como por lo menos cualquiera de 2, 3, 4, 5 o más) veces el nivel de expresión de la segunda secuencia de ácido nucleico en la célula huésped. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico tiene un nivel de expresión en una célula huésped (como una célula T) que no es más de aproximadamente 1/2 (como no más de aproximadamente cualquiera de 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 o menos) veces el nivel de expresión de la segunda secuencia de ácido nucleico en la célula huésped. En algunas realizaciones,el primer y el segundo vectores son vectores virales (como vectores lentivirales).

En algunas realizaciones, se proporciona un vector (como un vector lentiviral) que comprende ácido nucleico que codifica un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente que comprende a) un primer promotor enlazado operativamente a una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR; y b) un segundo promotor enlazado operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen la misma secuencia. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen secuencias diferentes. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo promotor son inducibles. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico tiene un nivel de expresión en una célula huésped (como una célula T) que es aproximadamente el mismo que el nivel de expresión de la segunda secuencia de ácido nucleico en la célula huésped. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico tiene un nivel de expresión en una célula huésped (como una célula T) que es por lo menos aproximadamente dos (como por lo menos aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5, o más) veces el nivel de expresión de la segunda secuencia de ácido nucleico en la célula huésped. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico tiene un nivel de expresión en una célula huésped (como una célula T) que no es más de aproximadamente 1/2 (como no más de aproximadamente cualquiera de 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 o menos) veces el nivel de expresión de la segunda secuencia de ácido nucleico en la célula huésped. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral (como un vector lentiviral).

En algunas realizaciones, se proporciona un vector (como un vector lentiviral) que comprende ácido nucleico que codifica un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR; y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR; en donde la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico están bajo el control de un único promotor. En algunas realizaciones, el promotor está enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRE<s>) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que une el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor está enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que une el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral (como un vector lentiviral).

Los métodos para introducir y expresar genes en una célula son conocidos en la técnica. En el contexto de un vector de expresión, el vector puede introducirse fácilmente en una célula huésped, por ejemplo, una célula de mamífero, bacteria, levadura o insecto, mediante cualquier método de la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión puede transferirse a una célula huésped mediante medios físicos, químicos o biológicos.

Los métodos físicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen la precipitación de fosfato de calcio, la lipofección, el bombardeo de partículas, la microinyección, la electroporación y similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Consultar, por ejemplo, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). La introducción de un polinucleótido en una célula huésped puede llevarse a cabo mediante transfección con fosfato cálcico.

Los métodos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula huésped incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores virales, y especialmente los vectores retrovirales, se han convertido en el método más ampliamente usado para insertar genes en células de mamíferos, por ejemplo humanas. Otros vectores virales pueden derivarse de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple 1 , adenovirus y virus adenoasociados, y similares. Consultar, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.350.674 y 5.585.362.

Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen sistemas de dispersión coloidal, como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal ejemplar para su uso como vehículo de administración in vitro e in vivo es un liposoma (por ejemplo, una vesícula de membrana artificial).

En el caso de que se use un sistema de administración no viral, un vehículo de administración ejemplar es un liposoma. Se contempla el uso de formulaciones lipídicas para la introducción de los ácidos nucleicos en una célula huésped (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado a un lípido. El ácido nucleico asociado a un lípido puede estar encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, intercalado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, unido a un liposoma mediante una molécula de enlace que esté asociada tanto al liposoma como al oligonucleótido, atrapado en un liposoma, formando un complejo con un liposoma, dispersado en una solución que contenga un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como suspensión en un lípido, contenido o formando complejo con una micela, o asociado de otro modo con un lípido. Las composiciones asociadas a lípidos, lípidos/ADN o lípidos/vectores de expresión no se limitan a ninguna estructura particular en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de bicapa, como micelas, o con una estructura "colapsada". También pueden estar simplemente entremezclados en una solución, formando posiblemente agregados que no son uniformes ni en tamaño ni forma. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos de origen natural o sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotitas grasas que se producen de manera natural en el citoplasma, así como la clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.

Independientemente del método usado para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula huésped o exponer de otro modo una célula al inhibidor, para confirmar la presencia de la secuencia de ADN recombinante en la célula huésped, pueden realizarse una variedad de ensayos. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos "biológicos moleculares" bien conocidos por los expertos en la técnica, como transferencia Southern y Northern, RT-PCR y PCR; ensayos "bioquímicos", como la detección de la presencia o ausencia de un péptido particular, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISAs y transferencias Western) o por ensayos descritos en la presente para identificar agentes incluidos dentro del alcance de la invención.

Células efectoras de abTCR

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora (como una célula T) que presenta en su superficie un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la célula efectora comprende un ácido nucleico que codifica el abTCR, en donde el abTCR se expresa a partir del ácido nucleico y se localiza en la superficie de la célula efectora. En algunas realizaciones, el abTCR se expresa exógenamente y se combina con la célula efectora. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora. En algunas realizaciones, la célula efectora no expresa las subunidades TCR de las que derivan los TCRD del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap y los TCRD de la abTCR introducida comprenden secuencias derivadas de las cadenas 8 y<y>del TCR, o la célula T es una célula T<y>8 y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se modifica para bloquear o disminuir la expresión de una o ambas subunidades del TCR endógenas del que derivan los TCRD del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y p del TCR y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR, o la célula efectora es una célula T y8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas<y>y 8 del TCR y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas y y 8 del TCR. Las modificaciones de las células para alterar la expresión génica incluyen cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la interferencia de ARN (por ejemplo, ARNip, ARNhcm ARNmi), edición de genes (por ejemplo inactivación de genes basada en CRISP o TALEN), y similares. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora (como una célula T) que comprende un ácido nucleico que codifica un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente, en donde el abTCR se expresa a partir del ácido nucleico y se localiza en la superficie de la célula efectora. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el abTCR comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico se localiza en un primer vector y la segunda secuencia de ácido nucleico se localiza en un segundo vector. En algunas realizaciones, la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico se localizan en el mismo vector. Los vectores pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en vectores de expresión de mamíferos y vectores virales (como los derivados de retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes y lentivirus). En algunas realizaciones, uno o más de los vectores se integran en el genoma huésped de la célula efectora. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un primer promotor y la segunda secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un segundo promotor. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen la misma secuencia. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen secuencias diferentes. En algunas realizaciones, el primer y el segundo ácido nucleico están bajo el control de un de un único promotor. En algunas realizaciones, el primero, segundo y/o único promotores son inducibles. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica es aproximadamente la misma que la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica es de por lo menos aproximadamente dos (como por lo menos aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5 o más) veces la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica no es más de aproximadamente 1/2 (por ejemplo, no más de aproximadamente cualquiera de 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 o menos) veces la expresión de la segunda cadena polipeptídica. La expresión puede determinarse a nivel de ARNm o de proteínas. El nivel de expresión de ARNm puede determinarse midiendo la cantidad de ARNm transcrito a partir del ácido nucleico usando varios métodos bien conocidos, como transferencia Northern, RT-PCR cuantitativa, análisis de micromatrices y similares. El nivel de expresión de proteína puede medirse por métodos conocidos, que incluyen la tinción inmunocitoquímica, el ensayo inmunoenzimático (ELISA), el análisis de transferencia Western, los ensayos luminiscentes, la espectrometría de masas o la cromatografía líquida de alta resolución, la cromatografía líquida de alta presión-espectrometría de masas en tándem, y similares. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

Por tanto, en algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente, en donde la célula efectora de abTCR comprende a) un primer ácido nucleico que comprende un primer promotor enlazado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR y b) un segundo ácido nucleico que comprende un segundo promotor enlazado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa del primer ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa del segundo ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen la misma secuencia. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen secuencias diferentes. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo promotor son inducibles. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica es aproximadamente la misma que la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica es por lo menos aproximadamente dos (por ejemplo, por lo menos aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5 o más) veces la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica no es más de aproximadamente 1/2 (como no más de cualquiera de aproximadamente 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 o menos) veces la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la célula efectora no expresa las subunidades de TCR de las que derivan los TCRD del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap y los TCRDs del abTCR introducidas comprenden secuencias derivadas de las cadenas 8 y<y>del TCR, o la célula efectora es una célula<y>8 T y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se modifica para bloquear o disminuir la expresión de una o ambas subunidades de TCR endógenas de las que derivan los TCRD del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula ap T modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y p del TCR y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR o la célula efectora es una célula T<y>8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas<y>y 8 del TCR o y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas y y 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral (como un vector lentiviral) integrado en el genoma huésped de la célula efectora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente, en donde la célula efectora de abTCR comprende a) un primer vector que comprende un primer promotor enlazado operativamente a una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR y b) un segundo vector que comprende un segundo promotor enlazado operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en done el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen la misma secuencia. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen secuencias diferentes. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo promotor son inducibles. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica es aproximadamente la misma que la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica es por lo menos aproximadamente dos (como por lo menos aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5 o más) veces la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica no es más de aproximadamente 1/2 (como no más de aproximadamente cualquiera de 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 o menos) veces la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la célula efectora no expresa las subunidades de TCR de las que derivan los TCRD del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas 8 y y del TCR, o la célula efectora es una célula T y8 y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se modifica para bloquear o disminuir la expresión de una o ambas subunidades del TCR endógenas de las que se derivan los TCRD del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y p del TCR y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR, o la célula efectora es una célula T<y>8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas<y>y 8 del TCR y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas<y>y 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora. En algunas realizaciones, el primer y el segundo vectores son vectores virales (como vectores lentivirales) integrados en el genoma huésped de la célula efectora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente, en donde la célula efectora de abTCR comprende un vector que comprende a) un primer promotor enlazado operativamente a una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR y b) un segundo promotor enlazado operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen la misma secuencia. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen secuencias diferentes. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo promotor son inducibles. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica es aproximadamente la misma que la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica es por lo menos aproximadamente dos (como por lo menos aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5 o más) veces la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica no es más de aproximadamente 1/2 (como no más de aproximadamente cualquiera de 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 o menos) veces la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la célula efectora no expresa las subunidades de TCR de las que derivan los TCRD del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas 8 y<y>del TCR, o la célula efectora es una célula T<y>8 y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se modifica para bloquear o disminuir la expresión de una o ambas subunidades del TCR endógenas de las que se derivan los TCRD del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y p del TCR y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR, o la célula efectora es una célula T<y>8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 8 del TCR y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas<y>y 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora. En algunas realizaciones, el primer y el segundo vectores son vectores virales (como vectores lentivirales) integrados en el genoma huésped de la célula efectora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente, en donde la célula efectora de abTCR comprende un vector lentiviral integrado en el genoma huésped que comprende a) un primer promotor enlazado operativamente a una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR y b) un segundo promotor enlazado operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen la misma secuencia. En algunas realizaciones, el primer y el segundo promotores tienen secuencias diferentes. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo promotor son inducibles. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica es aproximadamente la misma que la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica es por lo menos aproximadamente dos (como por lo menos aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5 o más) veces la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la expresión de la primera cadena polipeptídica no es más de aproximadamente 1/2 (como no más de aproximadamente cualquiera de 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 o menos) veces la expresión de la segunda cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, la célula efectora no expresa las subunidades de TCR de las que derivan los TCRD del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas 8 y y del TCR, o la célula efectora es una célula T y8 y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se modifica para bloquear o disminuir la expresión de una o ambas subunidades del TCR endógenas de las que se derivan los TCRD del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y p del TCR y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR, o la célula efectora es una célula T y8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 8 del TCR y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas<y>y 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se modifica para bloquear o disminuir la expresión de una o ambas cadenas de TCR endógenas. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente, en donde la célula efectora de abTCR comprende un vector que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR, en donde la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico están bajo el control de un único promotor, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el promotor está enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A autoescindible (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor está enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IREs ) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, la célula efectora no expresa las subunidades del TCR de las que derivan los TCRD del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas 8 y y del TCR, o la célula efectora es una célula T y8 y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se modifica para bloquear o disminuir la expresión de una o ambas subunidades del TCR endógenas de las que derivan los TCRD del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y p del TCR y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR o la célula efectora es una célula T y8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas<y>y 8 del TCR o y los TCRDs del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas<y>y 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral (como un vector lentiviral) integrado en el genoma huésped de la célula efectora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente, en donde la célula efectora de abTCR comprende un vector lentiviral integrado en el genoma huésped que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR, en donde la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico están bajo el control de un único promotor, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómica interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, la célula efectora no expresa las subunidades TCR a partir de las que se derivan los TCRDs del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas 8 y y del TCR, o la célula efectora es una célula T y8 y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se modifica para bloquear o disminuir la expresión de una o ambas de las subunidades del TCR endógenas de las que se derivan los TCRD del abTCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y p del TCR y los TCRD del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas a y p del TCR o la célula efectora es una célula T<y>8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas<y>y 8 del TCR o y los TCRDs del abTCR introducido comprenden secuencias derivadas de las cadenas<y>y 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un primer dominio de unión a antígeno y un primer TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un segundo dominio de unión a antígeno y un segundo TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; en donde el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende a) por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38e, CD3ye y ZZ. En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IREs ) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRa Me , EBV-LMP2A, HIV-1, y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-Aes la HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>§. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un primer dominio de unión a antígeno y un primer TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17; y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un segundo dominio de unión a antígeno y un segundo TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18; en donde el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende a) por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD3S<e>, CD3ye y ZC En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IREs ) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRA<m>E, EBV-LMP2A, HIV-1 y P<s>A. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>§. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un primer dominio de unión a antígeno y un primer TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19; y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un segundo dominio de unión a antígeno y un segundo TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20; en donde el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende a) por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD3S<e>, CD3<ye>y ZZ. En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IREs ) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que une el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRA<m>E, EBV-LMP2A, HIV-1 y P<s>A. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>6 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 6 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un primer dominio de unión y un primer TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21; y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un segundo dominio de unión a antígeno y un segundo TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22; en donde el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende a) por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD36e, CD3ye y ZZ. En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRE<s>) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado por un virus. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRA<m>E, EBV-LMP2A, HIV-1 y P<s>A. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>6 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas<y>y 6 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica del abTCR que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica del abTCR que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IREs ) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y§. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y/o p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica del abTCR que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica del abTCR que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IREs ) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y§. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y/o p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica del abTCR que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica del abTCR que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un ARN único bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y6. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y/o p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica del abTCR que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29 y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica del abTCR que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y6 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas<y>y 6 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica del abTCR que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31 y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica del abTCR que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y el conector de ácido nucleico se enlazan operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotores inducible. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y§ modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 5 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica del abTCR que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33 y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica del abTCR que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>§ modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 5 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica del abTCR que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35 y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica del abTCR que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>6 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas<y>y 6 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica del abTCR que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42 y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica del abTCR que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>6 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 6 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica del abTCR que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42 y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica del abTCR que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A, o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>6 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas<y>y 6 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica del abTCR que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55 y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica del abTCR que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IREs ) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y6 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 6 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula efectora de abTCR (como una célula T) que expresa en su superficie un abTCR que comprende a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica del abTCR que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56 y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica del abTCR que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54, en donde la primera cadena polipeptídica se expresa de la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda cadena polipeptídica se expresa de la segunda secuencia de ácido nucleico para formar el abTCR, y en donde el abTCR se localiza en la superficie de la célula efectora, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico con el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, hay un promotor enlazado operativamente al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico, y hay un conector de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en un sitio de entrada ribosómico interno (IREs ) y un ácido nucleico que codifica un péptido 2A de autoescisión (como P2A, T2A, E2A o F2A) que enlaza el extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico al extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben como un único ARN bajo el control del promotor. En algunas realizaciones, el promotor es inducible. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>6 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 6 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

La célula efectora de abTCR puede tener una menor tasa de internalización del receptor quimérico en comparación con una célula efectora de CAR correspondiente (como una célula efectora que presenta en su superficie un CAR que comprende la fracción de anticuerpo del abTCR, por ejemplo, un CAR que comprende un scFv que comprende los dominios variables de anticuerpo del abTCR) cuando se compara en condiciones similares. Por ejemplo, la célula efectora del abTCR tiene una tasa menor de internalización del receptor quimérico en comparación con la célula efectora del CAR correspondiente tras la estimulación dependiente del antígeno diana de las células efectoras del receptor quimérico en condiciones similares. La célula efectora de abTCR puede tener menos de aproximadamente el 50% (como menos de aproximadamente cualquiera de un 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5%, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de internalización abTCR aproximadamente 90 minutos después de la estimulación con el antígeno diana del abTCR. En algunas realizaciones, la célula efectora de abTCR es una célula T de abTCR.

Una célula efectora de abTCR puede tener una menor tasa y/o incidencia de agotamiento en comparación con una célula efectora de CAR correspondiente (como una célula efectora que presenta en su superficie un CAR que comprende la fracción de anticuerpo del abTCR) cuando se compara en condiciones similares. El agotamiento de las células efectoras puede determinarse por cualquier medio conocido en la técnica, como por ejemplo midiendo el nivel de expresión de marcadores de agotamiento, incluyendo, sin limitación, PD-1, TIM-3 y LAG-3. Por ejemplo, la célula efectora de abTCR tiene un nivel de expresión inferior de uno o más marcadores de agotamiento (como PD-1, TIM-3 o LAG-3) en comparación con la célula efectora de CAR correspondiente después de la estimulación dependiente del antígeno diana de las células efectoras receptoras quiméricas en condiciones similares. La célula efectora de abTCR puede tener una menor tasa de incidencia de ser positiva para uno o más marcadores de agotamiento (como PD-1, TIM-3 o LAG-3) en comparación con la célula efectora CAR correspondiente tras la estimulación dependiente del antígeno diana de las células efectoras de receptores quiméricos en condiciones similares. La célula efectora de abTCR puede tener una tasa de incidencia inferior a aproximadamente el 50% (como menos de aproximadamente cualquiera del 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1%, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) para ser positiva para uno o más marcadores de agotamiento (como PD-1, TIM-3 o LAG-3) tras la estimulación con el antígeno diana del abTCR. En algunas realizaciones, la célula efectora de abTCR es una célula T de abTCR. La tasa de incidencia puede calcularse por cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, cuantificando el porcentaje de células efectoras de receptor quimérico positivas para un marcador de agotamiento en una población de células efectoras de receptor quimérico, en donde el porcentaje de células positivas para el marcador de agotamiento es la tasa de incidencia.

La célula efectora de abTCR puede tener una menor tasa y/o incidencia de diferenciación terminal en comparación con una célula efectora de CAR correspondiente (como una célula efectora que presenta en su superficie un CAR que comprende la fracción de anticuerpo del abTCR) cuando se compara en condiciones similares. La diferenciación terminal puede determinarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, como midiendo el nivel de expresión de marcadores de diferenciación, incluyendo, sin limitación, CD28, CCR7 y granzima B. Por ejemplo, la célula efectora de abTCR puede tener un nivel de expresión inferior de uno o más marcadores de diferenciación terminales (como granzima B) y/o una mayor expresión de uno o más marcadores de diferenciación no terminales (como CD28 o CCR7) en comparación con la célula efectora de CAR correspondiente en condiciones similares. La célula efectora de abTCR puede tener una menor tasa de incidencia de ser positiva para uno o más marcadores de diferenciación terminales (como la granzima B) y/o una mayor tasa de incidencia de ser positiva para uno o más marcadores de diferenciación no terminales (como CD28 o CCR7) en comparación con la célula efectora de CAR correspondiente en condiciones similares. La célula efectora de abTCR puede tener una tasa de incidencia de menos de aproximadamente el 50% (como menos de aproximadamente cualquiera del 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 , 1%, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ser positiva para uno o más marcadores de diferenciación terminales (como granzima B) y/o una tasa de incidencia de más de aproximadamente el 10% (como más de aproximadamente cualquiera del 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o 95%, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ser positiva para uno o más marcadores de diferenciación no terminales (como CD28 o CCR7) después de la estimulación con el antígeno diana del abTCR. En algunas realizaciones, la célula efectora de abTCR es una célula T de abTCR. La tasa de incidencia puede calcularse mediante cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, cuantificando el porcentaje de células efectoras de receptor quimérico positivas para un marcador de diferenciación terminal en una población de células efectoras de receptor quimérico, en donde el porcentaje de células positivas para el marcador de diferenciación terminal es la tasa de incidencia.

La célula efectora de abTCR puede tener una mayor tasa de proliferación en comparación con una célula efectora de CAR correspondiente (como una célula efectora que presenta en su superficie un CAR que comprende la fracción de anticuerpo del abTCR) cuando se compara en condiciones similares. La proliferación puede determinarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, como midiendo la dilución del colorante. En algunas realizaciones, la célula efectora de abTCR es una célula T de abTCR.

Preparación de abTCR

En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente, la fracción de anticuerpo es un módulo de unión a antígeno tipo Fab que comprende secuencias de un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab comprende dominios Vh, Ch1, Vl y Cl del anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse, por ejemplo, usando métodos de hibridoma, como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975) y Sergeeva etal., Blood, 117(16):4262-4272.

En un método de hibridoma, típicamente se inmuniza un hámster, ratón u otro animal huésped apropiado con un agente inmunizante para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. El agente inmunizante puede incluir un polipéptido o una proteína de fusión de la proteína de interés, o un complejo que comprenda por lo menos dos moléculas, como un complejo que comprenda un péptido y una proteína del MHC. Generalmente, se usan linfocitos de sangre periférica ("P<b>L") si se desean células de origen humano, o células de bazo o de ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humano. Luego, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, como el polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Consultar, por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (Nueva York: Academic Press, 1986), págs. 59-103. Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, en particular células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contenga preferiblemente una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), que impide el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas pueden fusionarse eficientemente, soportar una expresión estable de alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas pueden ser líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma humano-ratón para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. Kozbor, J Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: Nueva York, 1987) págs. 51-63.

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma puede ensayarse luego para detectar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma puede determinarse por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Tales técnicas y ensayos son conocidos en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de haber identificado las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse por métodos estándar. Goding, supra. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, el Medio de Eagle Modificado de Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o líquido de ascitis mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

En algunas realizaciones, de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente, la fracción de anticuerpo es un módulo de unión a antígeno tipo Fab que comprende secuencias de un clon seleccionado entre una biblioteca de fracciones de anticuerpos (como una biblioteca de fagos que presente fragmentos de scFv o Fab). El clon puede identificarse seleccionando bibliotecas combinatorias de fragmentos de anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, en la técnica se conocen una variedad de métodos para generar bibliotecas de presentación de fagos y cribado de dichas bibliotecas en busca de anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Tales métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001) y descritos adicionalmente, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et a, Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003); Sidhu et al., J.

Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

En ciertos métodos de presentación de fagos, los repertorios de genes Vh y Vl se clonan por separado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de fagos, que luego pueden examinarse en busca de fagos de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994). Los fagos muestran típicamente fragmentos de anticuerpos, ya sea como fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) o como fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad contra el inmunógeno sin necesidad de construir hibridomas. Alternativamente, el repertorio virgen puede clonarse (por ejemplo, a partir de humanos) para proporcionar una única fuente de anticuerpos frente a una amplia variedad de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización, como se describe en Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Por último, las bibliotecas vírgenes también pueden elaborarse sintéticamente clonando segmentos del gen V no reordenados de células madre, y usando cebadores de PCR que contengan secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y lograr el reordenamiento in vitro, como se describe en Hoogenboom y Winter, J Mal. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de Patente que describen bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la Patente de Estados Unidos N° 5.750.373, y las Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, y 2009/0002360.

El módulo de unión a antígeno de tipo Fab puede prepararse usando presentación en fagos para cribar bibliotecas para anticuerpos específicos del antígeno diana (como un complejo péptido/MHC de clase I/II o un antígeno de la superficie celular). La biblioteca puede ser una biblioteca de presentación en fagos de scFv humanos que tenga una diversidad de por lo menos 1 x 109 (como por lo menos cualquiera de 1x109, 2.5x109, 5x109, 7.5x109, 1x1010, 2.5x1010, 5x1010, 7.5x1010, o 1x1011) fragmentos únicos de anticuerpos humanos. La biblioteca puede ser una biblioteca humana virgen construida a partir de ADN extraído de PBMC humanas y bazos de donantes sanos, que abarque todas las subfamilias de cadenas pesadas y ligeras humanas. La biblioteca puede ser una biblioteca humana virgen construida a partir de ADN extraído de PBMC aisladas de pacientes con varias enfermedades, como pacientes con enfermedades autoinmunes, pacientes con cáncer y pacientes con enfermedades infecciosas. La biblioteca puede ser una biblioteca humana semisintética, en donde la CDR3 de cadena pesada está completamente aleatorizada, con todos los aminoácidos (a excepción de la cisteína) con la misma probabilidad de estar presentes en cualquier posición dada (consultar, por ejemplo, Hoet, R.M. et al., Nat. Biotechnol. 23(3):344-348, 2005). La CDR3 de cadena pesada de la biblioteca humana semisintética puede tener una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 24 (como aproximadamente cualquiera de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24) aminoácidos. La biblioteca puede ser una biblioteca de presentación en fagos completamente sintética. La biblioteca puede ser una biblioteca de presentación en fagos no humana.

Los clones de fagos que se unen al antígeno diana con alta afinidad pueden seleccionarse por unión iterativa del fago al antígeno diana, que está unido a un soporte sólido (como, por ejemplo, perlas para la adsorción en solución o células de mamífero para la adsorción celular), seguido de la eliminación de los fagos no unidos y por elución del fago unido específicamente. En un ejemplo de adsorción en solución, el antígeno diana puede biotinilarse para inmovilizarlo en un soporte sólido. El antígeno diana biotinilado se mezcla con la biblioteca de fagos y un soporte sólido, como Dynabeads M-280 conjugadas con estreptavidina, y luego se aíslan los complejos antígeno diana-fagoperla. Luego, se eluyen los clones de fagos unidos y se usan para infectar una célula huésped adecuada, como E. coli XL1 -Blue, para su expresión y purificación. En un ejemplo de adsorción celular, se mezclan células T2 (una línea celular de linfoblastos HlA-A*02:01 con deficiencia de t Ap ) cargadas con un péptido AFP con la biblioteca de fagos, tras lo cual se recogen las células y se eluyen los clones unidos, que se usan para infectar una célula huésped adecuada para su expresión y purificación. La adsorción puede realizarse para múltiples rondas (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más) con adsorción de solución, adsorción de células o una combinación de ambas, para enriquecer los clones de fagos que se unen específicamente al antígeno diana. Los clones de fagos enriquecidos pueden analizarse para determinar la unión específica al antígeno diana por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo por ejemplo ELISA y FACS.

Anticuerpos humanos y humanizados

Las fracciones de anticuerpos de abTCR pueden ser humanas o humanizadas. Las formas humanizadas de fracciones de anticuerpos no humanas (por ejemplo, murinas) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2, scFv u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que típicamente contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Las fracciones de anticuerpos humanizadas incluyen inmunoglobulinas humanas, cadenas de inmunoglobulina, o fragmentos de las mismas (anticuerpo receptor) en los que los residuos de una CDR del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata o conejo que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos del marco Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Las fracciones de anticuerpos humanizadas también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en la fracción de anticuerpo receptora ni en las secuencias CDR o de estructura importadas. En general, la fracción de anticuerpo humanizada puede comprender sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. Consultar, por ejemplo, Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

Generalmente, una fracción de anticuerpo humanizada tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en ella de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan a menudo residuos de "importación", que se toman típicamente de un dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Wintery colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), mediante la sustitución de secuencias CDRs o CDR de roedores por las secuencias correspondientes de una fracción de anticuerpo humana. Por consiguiente, tales fracciones de anticuerpo "humanizadas" son fracciones de anticuerpo (Patente de Estados Unidos N° 4.816.567), en donde se ha sustituido una cantidad sustancialmente inferior a un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, las fracciones de anticuerpos humanizadas son típicamente fracciones de anticuerpos humanas en las que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

Como alternativa a la humanización, pueden generarse fracciones de anticuerpos humanas. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada de anticuerpos (JH) en ratones quiméricos y mutantes de la línea germinal tiene como resultado la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulinas de la línea germinal humana a dichos ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el desafío con antígenos. Consultar, por ejemplo, Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol, 7:33 (1993); Patentes de Estados Unidos N° 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669; 5.545.807; y la WO 97/17852. Alternativamente, pueden elaborarse anticuerpos humanos introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. Tras el desafío, se observa una producción de anticuerpos humanos que se asemeja muy estrechamente a la observada en los humanos en todos los aspectos, incluyendo la reorganización de genes, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016, y Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).

Los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante células B activadas in vitro (consultar las Patentes de Estados Unidos 5.567.610 y 5.229.275) o usando varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo las bibliotecas de presentación en fagos. Hoogenboom y Winter, J Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J Mol. Biol., 222:581 (1991). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner et al., J Immunol., 147(1): 86-95 (1991).

Variantes

En algunas realizaciones, se contemplan variantes de secuencias de aminoácidos de las fracciones de anticuerpos proporcionadas en la presente. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de la fracción de anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácidos de una fracción de anticuerpo pueden prepararse introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica la fracción de anticuerpo, o por síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de la fracción de anticuerpo. Para llegar al constructo final puede realizarse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución, siempre que el constructo final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

En algunas realizaciones, se proporcionan variantes de fracciones de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis sustitucional incluyen los HVR y los FR. Pueden introducirse las sustituciones de aminoácidos en una fracción de anticuerpo de interés y los productos se analizan para una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno retenida/mejorada o inmunogenicidad disminuida.

En la Tabla 1 a continuación se muestran las sustituciones conservadoras.

TABLA 1: SUSTITUCIONES CONSERVADORAS

Los aminoácidos pueden agruparse en diferentes clases de acuerdo con las propiedades comunes de las cadenas laterales:

a. hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

b. hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

c. ácidos: Asp, Glu;

d. básicos: His, Lys, Arg;

e. residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

f. aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Una variante sustitutiva ejemplar es una fracción de anticuerpo madurada por afinidad, que puede generarse convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración por afinidad basadas en presentación en fagos. Brevemente, se mutan uno o más residuos de CDR y las fracciones de anticuerpos variantes se presentan en fagos y se analizan para una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión). Pueden realizarse alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en los HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad de la fracción de anticuerpo. Tales alteraciones pueden realizarse en los "puntos calientes" de los HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutaciones con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (consultar, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o residuos determinantes de la especificidad (SDR), probándose la afinidad de unión de la V<h>o V<l>variantes resultantes. La maduración por afinidad mediante la construcción y reselección a partir de bibliotecas secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N<j>, (2001)).

En la maduración por afinidad, la diversidad puede introducirse en los genes variables elegidos para la maduración mediante cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR propensa a errores, transposición de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una biblioteca secundaria. A continuación, se examina la biblioteca para identificar cualquier variante de fracción de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica enfoques dirigidos por HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Los residuos de HVR implicados en la unión al antígeno pueden identificarse específicamente, por ejemplo, usando mutagénesis de barrido de alanina o modelado. A menudo se apunta en particular a CDR-H3 y CDR-L3.

Pueden producirse sustituciones, inserciones o deleciones dentro de uno o más HVR siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad de la fracción de anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, en los HVR pueden realizarse alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se indica en la presente) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión. Tales alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" o SDR de los HVR. En algunas realizaciones de las secuencias Vh y Vl variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterado o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

Un método útil para la identificación de residuos o regiones de una fracción de anticuerpo que pueden ser objetivo de mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina", como se describe en Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido cargado neutra o negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si se ve afectada la interacción de la fracción de anticuerpo con el antígeno. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las localizaciones de los aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Alternativa o adicionalmente, puede determinarse una estructura cristalina de un complejo de fracción de anticuerpo y antígeno para identificar los puntos de contacto entre la fracción de anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y residuos colindantes pueden ser objetivos o eliminarse como candidatos para la sustitución. Pueden examinarse las variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasequencia de uno o varios residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen una fracción de anticuerpo con un residuo N-terminal de metionilo. Otras variantes de inserción de la fracción de anticuerpo incluyen la fusión en el extremo N- o C-terminal de la fracción de anticuerpo con una enzima (por ejemplo, para a De PT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero de la fracción de anticuerpo.

Derivados

En algunas realizaciones, puede modificarse adicionalmente un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente para que contenga fracciones no proteínicas adicionales conocidas en la técnica y fácilmente disponibles. Las fracciones adecuadas para la derivatización del abTCR incluyen pero no se limitan a no se limitan a polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitativos de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (u homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en el agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al abTCR puede variar, y si hay más de un polímero unido, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o el tipo de polímeros usados para la derivatización pueden determinarse basándose en consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones particulares del abTCR que deben mejorarse, si el derivado del abTCR se usará en una terapia en condiciones definidas, etc.

En algunas realizaciones, se proporcionan conjugados de un abTCR y una fracción no proteínica que pueden calentarse selectivamente mediante exposición a radiación. La fracción no proteínica puede ser un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan las células ordinarias, pero que calientan la fracción no proteínica a una temperatura a la que se destruyen las células proximales a la fracción no proteínica de abTCR.

Preparación de células efectoras de abTCR

La presente invención proporciona en un aspecto células efectoras (como linfocitos, por ejemplo células T) que expresan un abTCR, como se define en las reivindicaciones. En la presente se describen métodos ejemplares de preparación de células efectoras (como células T) que expresan los abTCR (células efectoras de abTCR, como células T de abTCR).

Una célula efectora de abTCR (como una célula T de abTCR) puede generarse introduciendo uno o más ácidos nucleicos (incluyendo por ejemplo un vector lentiviral) que codifican un abTCR (como cualquiera de los abTCR descritos en la presente) que se une específicamente a un antígeno diana (como un antígeno asociado a una enfermedad) en la célula efectora. La introducción de uno o más ácidos nucleicos en la célula efectora puede realizarse usando técnicas conocidas en la técnica, como las descritas en la presente para los Ácidos Nucleicos. En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR (como las células T de abTCR) de la invención son capaces de replicarse in vivo, dando como resultado una persistencia a largo plazo que puede llevar al control sostenido de una enfermedad asociada con la expresión del antígeno diana (como el cáncer o la infección vírica).

En algunas realizaciones, la invención se refiere a una célula T modificada genéticamente que expresa un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente para su uso en el tratamiento de un paciente que tiene o corre el riesgo de desarrollar cáncer o infección vírica, usando infusión de linfocitos. En algunas realizaciones, en el tratamiento se usa la infusión de linfocitos autólogos. Las PBMC autólogas se recogen de un paciente que necesita tratamiento y las células T se activan y se expanden usando los métodos descritos en la presente y conocidos en la técnica y luego se infunden de nuevo en el paciente.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula T que expresa un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente (también denominada en la presente "célula T de abTCR"). Las células T de abTCR de la invención pueden experimentar una expansión robusta de células T in vivo y pueden establecer células de memoria específicas del antígeno diana que persisten a niveles altos durante un periodo de tiempo prolongado en sangre y médula ósea. En algunas realizaciones, las células T de abTCR de la invención infundidas a un paciente pueden eliminar células presentadoras de antígeno diana, como células cancerosas o infectadas viralmente presentadoras de antígeno diana, in vivo en pacientes que tienen una enfermedad asociada a antígeno diana que es refractaria por lo menos a un tratamiento convencional.

Antes de la expansión y modificación genética de las células T, se obtiene una fuente de células T de un sujeto. Las células T pueden obtenerse de varias fuentes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre de cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un foco de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. Puede usarse cualquier número de líneas de células T disponibles en la técnica. Las células T pueden obtenerse de una unidad de sangre recogida de un sujeto mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica, como la separación de Ficoll™. Las células de la sangre circulante de un individuo pueden obtenerse por aféresis. El producto de aféresis contiene típicamente linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. Las células recogidas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción plasmática y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. Las células pueden lavarse con solución salina tamponada con fosfato (PBS). la solución de lavado puede carecer de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos cationes divalentes, si no de todos. Como podrán apreciar fácilmente los expertos en la técnica, un paso de lavado puede llevarse a cabo por métodos conocidos en la técnica, como usando una centrifugadora semiautomática de "flujo continuo" (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, el Baxter CytoMate o el Haemonetics Cell Saver 5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras el lavado, las células pueden volver a suspenderse en una variedad de tampones biocompatibles, como PBS libre de Ca2+, libre de Mg2+, PlasmaLyte A u otras soluciones salinas con o sin tampón. Alternativamente, pueden eliminarse los componentes indeseables de la muestra de aféresis y volver a suspender las células directamente en medios de cultivo.

Las células T pueden aislarse de linfocitos de sangre periférica lisando los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, por centrifugación a través de un gradiente de PERCOLL™ o por elutriación centrífuga a contracorriente. Puede aislarse adicionalmente una subpoblación específica de células T, como células T CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y CD45RO+, mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células T se aíslan mediante incubación con perlas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 (es decir, 3 x 28), como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un periodo de tiempo suficiente para la selección positiva de las células T deseadas. El periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 30 minutos, el periodo de tiempo puede variar de 30 minutos a 36 horas o más (incluyendo todos los intervalos entre estos valores). El periodo de tiempo puede ser de por lo menos una, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. El período de tiempo puede ser de 10 a 24 horas. El período de tiempo de incubación puede ser de 24 horas. Para el aislamiento de células T de pacientes con leucemia, el uso de tiempos de incubación más largos, como 24 horas, pueden aumentar el rendimiento celular. Los tiempos de incubación más largos pueden usarse para aislar células T en cualquier situación en la que haya pocas células T en comparación con otros tipos celulares, como en el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a partir de tejido tumoral o de individuos inmunocomprometidos. Además, el uso de tiempos de incubación más largos puede aumentar la eficacia de la captura de células T CD8+. Por tanto, simplemente acortando o alargando el tiempo durante el que se permite que las células T se unan a las perlas de CD3/CD28 y/o aumentando o disminuyendo la proporción de perlas con respecto a las células T, pueden seleccionarse preferiblemente subpoblaciones de células T al inicio del cultivo o en otros momentos durante el proceso. Además, aumentando o disminuyendo la proporción de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, pueden seleccionarse preferiblemente subpoblaciones de células T a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros puntos temporales deseados. El experto en la técnica reconocerá que en el contexto de esta invención también pueden usarse múltiples rondas de selección. Puede ser deseable realizar el procedimiento de selección y usar las células "no seleccionadas" en el proceso de activación y expansión. Las células "no seleccionadas" también pueden someterse a rondas de selección adicionales.

El enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa puede lograrse con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas negativamente. Un método es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que usa un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer las células CD4+ por selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales incluye típicamente anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. Puede ser deseable enriquecer o seleccionar positivamente las células T reguladoras que típicamente expresan CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ y FoxP3+. Alternativamente, las células T reguladoras pueden agotarse mediante perlas conjugadas anti-CD25 u otros métodos de selección similares.

Para el aislamiento de una población deseada de células mediante selección positiva o negativa, puede variarse la concentración de células y superficie (por ejemplo, partículas como perlas). Puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que las pelas y las células se mezclan entre sí (es decir, aumentar la concentración de células), para asegurar el máximo contacto de células y perlas. Por ejemplo, se usa una concentración de aproximadamente 2.000 millones de células/ml. Puede usarse una concentración de aproximadamente 1000 millones de células/ml. Puede usarse una concentración de más de aproximadamente 100 millones de células/ml. Puede usarse una concentración de células de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. Puede utilizarse una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. Puede usarse una concentración de aproximadamente 125 o 150 millones de células/ml. El uso de concentraciones altas puede aumentar el rendimiento celular, la activación celular y la expansión celular. Además, el uso de concentraciones celulares altas permite la captura más eficaz de las células que pueden expresar débilmente los antígenos diana de interés, como células T CD28-negativas, o de muestras en las que hay muchas células tumorales presentes (es decir, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Tales poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficiente de células T CD8+ que normalmente tienen una expresión más débil de CD28.

Las células T pueden obtenerse de un paciente directamente después del tratamiento. A este respecto, se ha observado que después de ciertos tratamientos contra el cáncer, en particular tratamientos con fármacos que dañan el sistema inmunitario, poco después del tratamiento durante el periodo en el que los pacientes normalmente se estarían recuperando del tratamiento, la calidad de las células T obtenidas puede ser óptima o mejorada para su capacidad de expansión ex vivo. De igual manera, después de la manipulación ex vivo usando los métodos descritos en la presente, estas células pueden encontrarse en un estado preferente para el injerto y la capacidad de expansión ex vivo mejorados. Por tanto, se contempla recoger células sanguíneas, incluyendo células T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Además, pueden usarse la movilización (por ejemplo, movilización con GM-CSF) y los regímenes de acondicionamiento para crear una condición en un sujeto en la que se favorezca la repoblación, recirculación, regeneración y/o expansión de tipos celulares concretos, especialmente durante un periodo de tiempo definido después de la terapia. Los tipos de células ilustrativos incluyen las células T, las células B, las células dendríticas y otras células del sistema inmunitario.

Ya sea antes o después de la modificación genética de las células T para que expresen un abTCR deseable, las células T pueden activarse y expandirse generalmente usando métodos como los descritos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; y la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 20060121005.

En general, las células T de la invención se expanden por contacto con una superficie que tiene adherido a la misma un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de las células T. En particular, las poblaciones de células T pueden estimularse, por ejemplo, por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de la proteína quinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se usa un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Para estimular la proliferación de células T CD4+ o células T CD8+, un anticuerpo anti-<c>D3 y un anticuerpo anti-CD28. Ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 se incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besangon, Francia) pueden usarse al igual que otros métodos comúnmente conocidos en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

La preparación de células efectoras de abTCR puede dar como resultado un agotamiento mínimo o sustancialmente nulo de las células efectoras de abTCR. Por ejemplo, la preparación da como resultado que se agoten menos de aproximadamente el 50% (como menos de aproximadamente cualquiera del 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 o 5%) de las células efectoras de abTCR. El agotamiento de las células efectoras puede determinarse por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo cualquier medio descrito en la presente.

La preparación de células efectoras de abTCR puede dar como resultado una diferenciación terminal mínima o sustancialmente nula de las células efectoras de abTCR. Por ejemplo, la preparación da como resultado que menos de aproximadamente el 50% (como menos de aproximadamente cualquiera del 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5%) de las células efectoras de abTCR se diferencien terminalmente. La diferenciación de las células efectoras puede determinarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo cualquiera de los medios descritos en la presente.

La preparación de células efectoras de abTCR puede dar como resultado una internalización mínima o sustancialmente nula de los abTCR en las células efectoras de abTCR. Por ejemplo, la preparación da como resultado que se internalicen menos del 50% (por ejemplo, menos del 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 o 5%) de los abTCR en las células efectoras de abTCR. La internalización de los abTCR en células efectoras de abTCR puede determinarse por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo cualquier medio descrito en la presente.

Modificación genética

En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR (como células T de abTCR) de la invención se generan transduciendo células efectoras (como células T preparadas por los métodos descritos en la presente) con un vector viral que codifica un abTCR como se describe en la presente. Los sistemas de administración de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados después de la administración a la célula efectora. Para una revisión de los procedimientos de terapia génica, consultar Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11: 167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1 154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1994). En algunas realizaciones, el vector viral es un vector lentiviral, y la célula efectora de abTCR comprende el vector lentiviral integrado en el genoma de la célula efectora de abTCR. En algunas realizaciones, la célula efectora de abTCR es una célula T de abTCR que comprende el vector lentiviral integrado en su genoma.

En algunas realizaciones, la célula efectora de abTCR es una célula T modificada para bloquear o disminuir la expresión de una o ambas cadenas endógenas de TCR. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la célula efectora de abTCR es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y p del TCR, o la célula efectora de abTCR es una célula T y6 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 6 del TCR. Las modificaciones de las células para alterar la expresión génica incluyen cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, interferencia de ARN (por ejemplo, ARNip, ARNhc, ARNmi), edición génica (por ejemplo, desactivación génica basada en CRISPR o TALEN) y similares.

En algunas realizaciones, las células T de abTCR con expresión reducida de una o ambas cadenas de TCR endógenas de la célula T se generan usando el sistema CRISPR/Cas. Para una revisión del sistema CRISPR/Cas de edición de genes, consultar por ejemplo Jian W & Marraffini LA, Annu. Rev. Microbial. 69, 2015; Hsu PD et al., Cell, 157(6):1262-1278, 2014; y O'Connell MR et al., Nature 516: 263-266, 2014. En algunas realizaciones, las células T de abTCR con expresión reducida de una o ambas cadenas endógenas de TCR de la célula T se generan usando edición del genoma basada en TALEN.

Enriquecimiento

En la presente se describe un método de enriquecimiento de una población celular heterogénea para una célula efectora de abTCR de acuerdo con cualquiera de las células efectoras de abTCR descritas en la presente.

Puede enriquecerse una subpoblación específica de células efectoras de abTCR (como células T de abTCR) que se unen específicamente a un antígeno diana mediante técnicas de selección positiva. Por ejemplo, las células efectoras de abTCR (como las células T de abTCR) se enriquecen mediante incubación con perlas conjugadas con el antígeno diana durante un periodo de tiempo suficiente para la selección positiva de las células efectoras de abTCR deseadas. El periodo de tiempo puede ser de aproximadamente 30 minutos. El periodo de tiempo puede variar entre 30 minutos y 36 horas o más (incluyendo todos los intervalos entre estos valores). El periodo de tiempo puede ser de por lo menos una, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. El período de tiempo puede ser de 10 a 24 horas. El período de tiempo de incubación puede ser de 24 horas. Para el aislamiento de las células efectoras de abTCR presentes a niveles bajos en la población celular heterogénea, el uso de tiempos de incubación más largos, como 24 horas, puede aumentar el rendimiento celular. Pueden usarse tiempos de incubación más largos para aislar células efectoras de abTCR en cualquier situación donde hay pocas células efectoras de abTCR en comparación con otros tipos celulares. El experto en la técnica reconocerá que en el contexto de esta invención también pueden usarse múltiples rondas de selección.

Para el aislamiento de una población deseada de células efectoras de abTCR mediante selección positiva, puede variarse la concentración de células y superficie (por ejemplo, partículas como perlas). Puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que las perlas y las células se mezclan entre sí (es decir, aumentar la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de células y perlas. Por ejemplo, se usa una concentración de aproximadamente 2.000 millones de células/ml. Puede usarse una concentración de aproximadamente 1.000 millones de células/ml. Puede usarse una concentración de más de aproximadamente 100 millones de células/ml. Puede usarse una concentración de células de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. Puede usarse una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. Puede usarse una concentración de aproximadamente 125 o aproximadamente 150 millones de células/ml. El uso de concentraciones altas puede aumentar el rendimiento celular, la activación celular y la expansión celular. Además, el uso de concentraciones celulares altas permite una captura más eficaz de las células efectoras de abTCR que pueden expresar débilmente el abTCR.

El enriquecimiento puede dar como resultado un agotamiento mínimo o sustancialmente nulo de las células efectoras de abTCR. Por ejemplo, el enriquecimiento da como resultado que se agoten menos de aproximadamente un 50% (como menos de cualquiera de aproximadamente un 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5%) de las células efectoras de abTCR. El agotamiento de las células efectoras puede determinarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo cualquier medio descrito en la presente.

El enriquecimiento puede dar como resultado una diferenciación terminal mínima o sustancialmente nula de las células efectoras de abTCR. Por ejemplo, el enriquecimiento da como resultado que se diferencien terminalmente menos de aproximadamente el 50% (como menos de cualquiera del 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5%) de las células efectoras de abTCR. La diferenciación de células efectoras puede determinarse por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo cualquiera de los medios descritos en la presente.

El enriquecimiento puede dar como resultado una internalización mínima o sustancialmente nula de los abTCR en las células efectoras de abTCR. Por ejemplo, el enriquecimiento da como resultado que se internalicen menos de aproximadamente el 50% (como menos de cualquiera del 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5%) de los abTCR en las células efectoras de abTCR. La internalización de los abTCR en células efectoras de abTCR puede determinarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo cualquier medio descrito en la presente.

El enriquecimiento puede dar como resultado un aumento de la proliferación de las células efectoras de abTCR. Por ejemplo, el enriquecimiento da como resultado un aumento de por lo menos aproximadamente el 10% (como por lo menos cualquiera del 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000% o más) en el número de células efectoras de abTCR después del enriquecimiento.

Por tanto, se describe un método de enriquecimiento de una población celular heterogénea para células efectoras de abTCR que expresan un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana que comprende: a) poner en contacto la población celular heterogénea con un ligando que comprenda el antígeno diana o uno o más epítopos contenidos en el mismo para formar complejos que comprendan la célula efectora de abTCR unida al ligando; y b) separar los complejos de la población celular heterogénea, generando de este modo una población celular enriquecida para las células efectoras de abTCR. El ligando puede inmovilizarse en un soporte sólido. El soporte sólido puede ser particulado (como perlas). El soporte sólido puede ser una superficie (como el fondo de un pocillo). El ligando puede marcarse con una etiqueta. La etiqueta puede ser una molécula fluorescente, una etiqueta de afinidad o una etiqueta magnética. El método puede comprender además eluir las células efectoras de abTCR del ligando y recuperar el eluido.

Cribado de bibliotecas

Para aislar constructos de abTCR candidatos específicas para un antígeno diana, puede exponerse una biblioteca de abTCR, por ejemplo células que expresan una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de abTCR, a un ligando que comprende el antígeno diana o uno o más epítopos contenidos en el mismo, seguido del aislamiento de los miembros de afinidad de la biblioteca que se unen específicamente al ligando. El ligando puede inmovilizarse en un soporte sólido. El soporte puede ser la superficie de perlas, placas de microtitulación, inmunotubos o cualquier material conocido en la técnica útil para tales propósitos. La interacción puede tener lugar en solución sobre dianas de ligando etiquetado (por ejemplo, ligando biotinilado). El procedimiento puede incluir uno o más pasos de lavado para eliminar los miembros inespecíficos y no reactivos de la biblioteca (adsorción). Para purificar los complejos en solución, pueden capturarse o por inmovilización o por centrifugación. Los miembros de afinidad pueden capturarse en un ligando soluble biotinilado, seguido de la inmovilización del complejo de afinidad (miembro de afinidad y ligando) en perlas de estreptavidina. El soporte sólido puede ser una perla. Las perlas pueden incluir, por ejemplo, perlas magnéticas (por ejemplo, de Bangs Laboratories, Polysciences inc., Dynal Biotech, Miltenyi Biotech o Quantum Magnetic), perlas no magnéticas (por ejemplo, Pierce y Upstate technology), perlas monodispersas (por ejemplo, Dynal Biotech y Microparticle Gmbh) y perlas polidispersas (por ejemplo, Chemagen). En la bibliografía se ha descrito exhaustivamente el uso de perlas magnéticas (Uhlen, M, et al (1994) en Advances in Biomagnetic Separation, BioTechniques press, Westborough, MA). Los miembros de afinidad pueden purificarse mediante selección positiva. Los miembros de afinidad pueden purificarse mediante selección negativa para eliminar los miembros no deseados de la biblioteca. Los miembros de afinidad pueden purificarse mediante pasos tanto de selección positiva como negativa.

En general, las técnicas usadas para preparar los constructos de la biblioteca se basarán en técnicas de ingeniería genética conocidas. A este respecto, las secuencias de ácido nucleico que codifican los abTCRs a expresar en la biblioteca se incorporan a vectores de expresión apropiados para el tipo de sistema de expresión que se vaya a usar. Los vectores de expresión apropiados para su uso en la presentación en células, como células CD3+, son bien conocidos y se describen en la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión es un vector viral, como un vector lentiviral.

En algunas realizaciones, se proporciona una biblioteca de ácidos nucleicos que comprende secuencias que codifican una pluralidad de abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente. En algunas realizaciones, la biblioteca de ácidos nucleicos comprende vectores virales que codifican la pluralidad de abTCR. En algunas realizaciones, los vectores virales son vectores lentivirales.

En la presente se describe un método de cribado de una biblioteca de ácidos nucleicos de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente para secuencias que codifican abTCR específicos para un antígeno diana, que comprende: a) introducir la biblioteca de ácidos nucleicos en una pluralidad de células, de tal manera que los abTCR se expresen en la superficie de la pluralidad de células; b) incubar la pluralidad de células con un ligando que comprende el antígeno diana o uno o más epítopos contenidos en el mismo; c) recoger células unidas al ligando; y d) aislar secuencias que codifican los abTCR de las células recogidas en el paso c), identificando de este modo los abTCR específicos para el antígeno diana. El método puede comprender además uno o más pasos de lavado. El uno o más pasos de lavado pueden llevarse a cabo entre los pasos b) y c). La pluralidad de células puede ser una pluralidad de células CD3+. El ligando puede inmovilizarse en un soporte sólido. El soporte sólido puede ser una perla. La recogida de las células unidas al ligando puede comprender eluir las células del ligando unido al soporte sólido y recoger el eluido. El ligando puede marcarse con una etiqueta. La etiqueta puede ser una molécula fluorescente, una etiqueta de afinidad o una etiqueta magnética. La recogida de células unidas al ligando puede comprender aislar complejos que comprenden las células y el ligando marcado. Las células pueden disociarse de los complejos.

Proteínas del MHC

Las proteínas del MHC de clase I son una de las dos clases principales de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (la otra es el MHC de clase II) y se encuentran en casi todas las células nucleadas del cuerpo. Su función es mostrar fragmentos de proteínas del interior de la célula a las células T; las células sanas serán ignoradas, mientras que las células que contengan proteínas extrañas o mutadas serán atacadas por el sistema inmunitario. Como las proteínas del MHC de clase I presentan péptidos derivados de proteínas citosólicas, la vía de presentación del MHC de clase I se denomina a menudo vía citosólica o endógena. Las moléculas del MHC de clase I se unen a péptidos generados principalmente a partir de la degradación de proteínas citosólicas por el proteasoma. A continuación, el complejo MHC I:péptido se inserta en la membrana plasmática de la célula. El péptido se une a la parte extracelular de la molécula del MHC de clase I. Por tanto, la función del MHC de clase I es presentar proteínas intracelulares a las células T citotóxicas (CTL). Sin embargo, el MHC de clase I también puede presentar péptidos generados a partir de proteínas exógenas, en un proceso conocido como presentación cruzada.

Las proteínas del MHC de clase I consisten en dos cadenas polipeptídicas, a y p2-microglobulina (p2M). Las dos cadenas están enlazadas de manera no covalente mediante la interacción de la p2M y el dominio a3. Sólo la cadena a es polimórfica y está codificada por un gen de HLA, mientras que la subunidad p2M no es polimórfica y está codificada por el gen de p-2 microglobulina. El dominio a3 abarca la membrana plasmática e interactúa con el correceptor CD8 de las células T. La interacción a3-CD8 mantiene la molécula del MHC I en su sitio mientras que el receptor de células T (TCR) de la superficie de la célula T citotóxica se une a su ligando heterodímero a1-a2 y comprueba la antigenicidad del péptido acoplado. Los dominios a l y a2 se pliegan para formar un surco para que se unan los péptidos. Las proteínas del MHC de clase I se unen a péptidos de 8-10 aminoácidos de longitud.

Las moléculas del MHC de clase II son una familia de moléculas que normalmente sólo se encuentran en las células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas, los fagocitos mononucleares, algunas células endoteliales, las células epiteliales tímicas y las células B. Los antígenos presentados por los péptidos de clase II derivan de proteínas extracelulares (no citosólicas como en la clase I); por lo tanto, la vía de presentación de antígenos dependiente del MHC de clase II se denomina vía endocítica o exógena. La carga de una molécula del MHC de clase II se produce por fagocitosis; las proteínas extracelulares se endocitan, se digieren en los lisosomas y los fragmentos peptídicos epitópicos resultantes se cargan en moléculas del MHC de clase II antes de su migración a la superficie celular.

Al igual que las moléculas del MHC de clase I, las moléculas de clase II también son heterodímeros, pero en este caso consisten en dos péptidos homogéneos, una cadena a y p. La subdesignación a1, a2, etc. se refiere a dominios separados dentro del gen de HLA; cada dominio está codificado habitualmente por un exón diferente dentro del gen, y algunos genes tienen dominios adicionales que codifican secuencias líder, secuencias transmembrana, etc.

Como el surco de unión a antígenos de las moléculas del MHC de clase II está abierto en ambos extremos, mientras que el surco correspondiente de las moléculas de clase I está cerrado en cada extremo, los antígenos presentados por las moléculas del MHC de clase II son más largos, generalmente entre 15 y 24 residuos de aminoácidos de largo.

Los genes del antígeno leucocitario humano (HLA) son las versiones humanas de los genes del MHC. Las tres proteínas principales del MHC de clase I en humanos son HLA-A, HLA-B y HLA-C, mientras que las 3 secundarias son HLA-E, HLA-F y HLA-G. Las tres proteínas principales del MHC de clase II implicadas en la presentación de antígenos en humanos son HLA-DP, HLDA-DQ y HlA-Dr , mientras que las otras proteínas del MHC de clase II, HLA-DM y HLA-DO, están implicadas en el procesamiento interno y la carga de antígenos. La HLA-A se encuentra entre los genes humanos con la secuencia de codificación de evolución más rápida. En diciembre de 2013, se conocían 2432 alelos HLA-A que codifican 1740 proteínas activas y 117 proteínas nulas. El gen de HLA-A se localiza en el brazo corto del cromosoma 6 y codifica el componente de mayor tamaño, la cadena a, de la HLA-A. La variación de la cadena a de la HLA-A es clave para la función de la HLA. Esta variación promueve la diversidad genética en la población. Como cada HLA tiene una afinidad diferente por péptidos de ciertas estructuras, una mayor variedad de HLA significa una mayor variedad de antígenos a 'presentar' en la superficie celular, lo que aumenta la probabilidad de que un subconjunto de la población sea resistente a cualquier invasor extraño. Esto disminuye la probabilidad de que un único patógeno tenga la capacidad de acabar con toda la población humana. Cada individuo puede expresar hasta dos tipos de HLA-A, uno de cada uno de sus padres. Algunos individuos heredarán el mismo HLA-A de ambos padres, lo que disminuye su diversidad individual de HLA; sin embargo, la mayoría de los individuos recibirán dos copias diferentes de HLA-A. Este mismo patrón se sigue para todos los grupos de HLA. En otras palabras, una persona sólo puede expresar uno o dos de los 2.432 alelos de HLA-A conocidos.

Todos los alelos reciben por lo menos una clasificación de cuatro dígitos, por ejemplo, HLA-A*02:12. La A significa a qué gen de HLA pertenece el alelo. Hay muchos alelos de HLA-A, por lo que la clasificación por serotipos simplifica la categorización. El siguiente par de dígitos indica esta asignación. Por ejemplo, HLA-A*02:02, HLA-A*02:04 y HLA-A *02:324 son todos miembros del serotipo A2 (designado por el prefijo *02). Este grupo es el principal factor responsable de la compatibilidad de HLA. Todos los números posteriores a éste no pueden determinarse por serotipado y se designan mediante secuenciación genética. El segundo conjunto de dígitos indica qué proteína de HLA se produce. Se asignan por orden de descubrimiento y en diciembre de 2013 se conocían 456 proteínas de HLA-A02 diferentes (nombres asignados de HLA-A*02:01 a HLA-A*02:456). El nombre de HLA más corto posible incluye estos dos detalles. Cada extensión más allá de eso significa un cambio de nucleótido que puede o no cambiar la proteína.

En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab se une específicamente a un complejo que comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a enfermedad (como un antígeno asociado a tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC de clase I, en donde la proteína del MHC de clase I es HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F o HLA-G. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A, HLA-B o HLA-C. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-B. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-C. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A01, HLA-A02, HLA-A03, HLA-A09, HLA-A10, HLA-A11, HLA-A19, HLA-A23, HLA-A24, HLA-A25, HLA-A26, HLA-A28, HLA-A29, HLA-A30, HLA-A31, HLA-A32, HLA-A33, HLA-A34, HLA-A36, HLA-A43, HLA-A66, HLA-A68, HLA-A69, HLA-A74, o HLA-A80. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A02. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es una cualquiera de HLA-A*02:01-555, como HLA-A*02:01, HLA-A*02:02, HLA-A*02:03, HLA-A*02:04, HLA-A*02:05, HLA-A*02:06, HLA-A*02:07, HLA-A*02:08, HLA-A*02:09, HLA-A*02:10, HLA-A*02:11, HLA-A*02:12, HLA-A*02:13, HLA-A*02:14, HLA-A*02:15, HLA-A*02:16, HLA-A*02:17, HLA-A*02:18, HLA-A*02:19, HLA-A*02:20, HLA-A*02:21, HLA-A*02:22, o HLA-A*02:24. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A*02:01. HLA-A*02:01 se expresa en el 39-46% de todos los caucásicos, y por lo tanto representa una elección adecuada de proteína del MHC de clase I para su uso en la presente invención.

En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab se une específicamente a un complejo que comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a enfermedad (como un antígeno asociado a tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC de clase II, en donde la proteína del MHC de clase II es HLA-DP, HLA-DQ o HLA-DR. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase II es HLA-DP. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase II es HLA-DQ. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase II es HLA-DR.

Los péptidos adecuados para su uso en la generación de módulos de unión a antígeno tipo Fab pueden determinarse, por ejemplo, basándose en la presencia de motivos de unión a HLA (como HLA-A*02:01) y sitios de escisión para proteasomas e inmunoproteasomas usando modelos de predicción por ordenador conocidos por los expertos en la técnica. Para predecir sitios de unión a MHC, tales modelos incluyen, pero no se limitan a, ProPred1 (descrito con más detalle en ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. B iO iNfOr MATICS 17(12):1236-1237, 2001), y SYFPEITHI (consultar Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93, 2007).

Una vez que se han identificado los péptidos apropiados, la síntesis peptídica puede realizarse de acuerdo con protocolos bien conocidos por los expertos en la técnica. Debido a su tamaño relativamente pequeño, los péptidos de la invención pueden sintetizarse directamente en solución o sobre un soporte sólido de acuerdo con las técnicas convencionales de síntesis de péptidos. En el mercado hay disponibles varios sintetizadores automáticos que pueden usarse de acuerdo con protocolos conocidos. La síntesis de péptidos en fase de solución se ha convertido en un procedimiento bien establecido para la producción a gran escala de péptidos sintéticos y, como tal, es un método alternativo adecuado para preparar los péptidos (ver, por ejemplo, Solid Phase Peptide Synthesis de John Morrow Stewart y Martin et al. Application of Almez-mediated Amidation Reactions to Solution Phase Peptide Synthesis, Tetrahedron Letters Vol. 39, páginas 1517-1520, 1998).

Composiciones farmacéuticas

También se proporcionan en la presente composiciones farmacéuticas (también denominadas en la presente formulaciones) que comprenden un abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, un ácido nucleico que codifica un abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, o una célula efectora de abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la composición es una composición de células efectoras de abTCR que comprende una célula efectora (como una célula T) que presenta en su superficie un abTCR de acuerdo con cualquiera de los abTCR descritos en la presente. La composición de células efectoras de abTCR es una composición farmacéutica.

La composición farmacéutica puede comprender una población celular homogénea que comprende células efectoras de abTCR del mismo tipo celular y que expresan el mismo abTCR, o una población celular heterogénea que comprende una pluralidad de poblaciones de células efectoras de abTCR que comprenden células efectoras de abTCR de diferentes tipos celulares y/o que expresan diferentes abTCR. La composición farmacéutica puede comprender además células que no sean células efectoras de abTCR.

Por tanto, en algunas realizaciones, se proporciona una composición de células efectoras de abTCR que comprende una población celular homogénea de células efectoras de abTCR (como células T de abTCR) del mismo tipo celular y que expresan el mismo abTCR. En algunas realizaciones, la célula efectora de abTCR es una célula T. En algunas realizaciones, la célula efectora de abTCR se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora. La composición de células efectoras de abTCR es una composición farmacéutica.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición de células efectoras de abTCR que comprende una población celular heterogénea que comprende una pluralidad de poblaciones de células efectoras de abTCR que comprenden células efectoras de abTCR de diferentes tipos celulares y/o que expresan diferentes abTCR. En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR son células T. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR es de un tipo celular seleccionado del grupo que consiste en células T citotóxicas, células T auxiliares, células T asesinas naturales y células T supresoras. En algunas realizaciones, todas las células efectoras de abTCR de la composición son del mismo tipo celular (por ejemplo, todas las células efectoras de abTCR son células T citotóxicas). En algunas realizaciones, por lo menos una población de células efectoras de abTCR es de un tipo celular diferente a las demás (por ejemplo, una población de células efectoras de abTCR consiste en células T citotóxicas y las otras poblaciones de células efectoras de abTCR consiste en células T asesinas naturales). En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR expresa el mismo abTCR. En algunas realizaciones, por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR diferente de las demás. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR diferente a las demás. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR que se une específicamente al mismo antígeno diana. En algunas realizaciones, por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana distinto de los demás (por ejemplo, una población de células efectoras de abTCR se une específicamente a un complejo de pMHC y las otras poblaciones de células efectoras de abTCR se unen específicamente a un receptor de superficie celular). En algunas realizaciones, en las que por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana diferente, cada población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana asociado a la misma enfermedad o trastorno (por ejemplo, cada uno de los antígenos diana está asociado a un cáncer, como el cáncer de mama). La composición de células efectoras de abTCR es una composición farmacéutica.

Por tanto, en algunas realizaciones, se proporciona una composición de células efectoras de abTCR que comprende una pluralidad de poblaciones de células efectoras de abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, en donde todas las células efectoras de abTCR de la composición son del mismo tipo celular (por ejemplo, todas las células efectoras de abTCR son células T citotóxicas), y en donde cada población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR diferente de las demás. En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR son células T. En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR se seleccionan del grupo que consiste en células T citotóxicas, células T auxiliares, células T asesinas naturales y células T supresoras. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente al mismo antígeno diana. En algunas realizaciones, por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana diferente de los demás (por ejemplo, una población de células efectoras de abTCR se une específicamente a un complejo de pMHC y las otras poblaciones de células efectoras de abTCR se unen específicamente a un receptor de superficie celular). En algunas realizaciones, cuando por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR que se une específicamente a un antígeno diana diferente, cada población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR que se une específicamente a un antígeno diana asociado con la misma enfermedad o trastorno (por ejemplo, cada uno de los antígenos diana están asociados con un cáncer, como el cáncer de mama). La composición de células efectoras de abTCR es una composición farmacéutica.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición que comprende una pluralidad de poblaciones de células efectoras de abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, en donde por lo menos una población de células efectoras de abTCR es de un tipo celular diferente a las demás. En algunas realizaciones, todas las poblaciones de células efectoras de abTCR son de tipos celulares diferentes. En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR son células T. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR es de un tipo celular seleccionado del grupo que consiste en células T citotóxicas, células T auxiliares, células T asesinas naturales y células T supresoras. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR expresa el mismo abTCR. En algunas realizaciones, por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR diferente de las demás. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR diferente que las demás. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente al mismo antígeno diana. En algunas realizaciones, por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana distinto de los demás (por ejemplo, una población de células efectoras de abTCR se une específicamente a un complejo pMHC y las otras poblaciones de células efectoras de abTCR se unen específicamente a un receptor de superficie celular). En algunas realizaciones, cuando por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana diferente, cada población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana asociado con la misma enfermedad o trastorno (por ejemplo, cada uno de los antígenos diana están asociados con un cáncer, como el cáncer de mama). La composición de células efectoras de abTCR es una composición farmacéutica.

En varios puntos durante la preparación de una composición, puede ser necesario o beneficioso crioconservar una célula. Los términos "congelado/congelación" y "crioconservado/crioconservación" pueden usarse indistintamente. La congelación incluye la liofilización.

Como entenderán los expertos en la técnica, la congelación de células puede ser destructiva (ver Mazur, P., 1977, Cryobiology 14:251 -272) pero hay numerosos procedimientos disponibles para prevenir tal daño. Por ejemplo, el daño puede evitarse mediante (a) el uso de un agente crioprotector, (b) el control de la velocidad de congelación, y/o (c) el almacenamiento a una temperatura suficientemente baja para minimizar las reacciones degradativas. Los agentes crioprotectores ejemplares incluyen el dimetilsulfóxido (DMSO) (Lovelocky Bishop, 1959, Nature 183:1394-1395; Ashwood Smith, 1961, Nature 190:1204-1205), el glicerol, la polivinilpirrolidina (Rinfret, 1960, Ann. N.Y. Acad. Sci. 85:576), el polietilenglicol (Sloviter y Ravdin, 1962, Nature 196:548), la albúmina, el dextrano, la sacarosa, el etilenglicol, el i-eritritol, el D-ribitol, el D-manitol (Rowe et al., 1962, Fed. Proc. 21:157), el D-sorbitol, el i-inositol, la D-lactosa, el cloruro de colina (Bender et al., 1960, J. Appl. Physiol. 15:520), aminoácidos (Phan The Tran y Bender, 1960, Exp. Cell Res. 20:651), metanol, acetamida, monoacetato de glicerol (Lovelock, 1954, Biochem. J. 56:265) y sales inorgánicas (Phan The Tran y Bender, 1960, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104:388; Phan The Tran y Bender, 1961, en Radiobiology, Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology, llbery ed., Butterworth, Londres, p.

59). Puede usarse DMSO. La adición de plasma (por ejemplo, a una concentración del 20-25%) puede aumentar los efectos protectores del DMSO. Después de la adición de DMSO, las células pueden mantenerse a 0° C hasta la congelación, ya que las concentraciones de DMSO del 1% pueden ser tóxicas a temperaturas por encima de 4° C.

En la crioconservación de células, las velocidades de enfriamiento lentas y controladas pueden ser críticas y diferentes agentes crioprotectores (Rapatz et al., 1968, Cryobiology 5(1): 18-25) y diferentes tipos de células tienen diferentes velocidades óptimas de enfriamiento (consultar, por ejemplo, Rowe y Rinfret, 1962, Blood 20:636; Rowe, 1966, Cryobiology 3(1 ):12-18; Lewis, et al., 1967, Transfusion 7(1):17-32; y Mazur, 1970, Science 168:939- 949 para los efectos de la velocidad de enfriamiento en la supervivencia de las células madre y en su potencial de trasplante). El calor de la fase de fusión en la que el agua se convierte en hielo debe ser mínimo. El procedimiento de enfriamiento puede llevarse a cabo usando, por ejemplo, un dispositivo de congelación programable o un procedimiento de baño de metanol. Los aparatos de congelación programables permiten determinar las velocidades de enfriamiento óptimas y facilitan un enfriamiento estándar reproducible.

Las células tratadas con DMSO pueden preenfriarse en hielo y transferirse a una bandeja que contenga metanol enfriado que se coloca, a su vez, en un refrigerador mecánico (por ejemplo, Harris o Revco) a - 80° C. Las mediciones con termopar del baño de metanol y de las muestras indican que puede preferirse una velocidad de enfriamiento de 1° a 3°C/minuto. Después de por lo menos dos horas, los especímenes pueden haber alcanzado una temperatura de - 80° C y pueden colocarse directamente en nitrógeno líquido (-196° C).

Después de una congelación exhaustiva, las células pueden transferirse rápidamente a un recipiente de almacenamiento criogénico a largo plazo. Las muestras pueden almacenarse criogénicamente en nitrógeno líquido ( 196° C) o vapor (-1° C). Tal almacenamiento es facilitado por la disponibilidad de refrigeradores de nitrógeno líquido altamente eficientes.

Consideraciones y procedimientos adicionales para la manipulación, crioconservación y almacenamiento a largo plazo de células, pueden encontrarse en las siguientes referencias ejemplares: Patentes de Estados Unidos N° 4,199,022; 3,753,357; y 4,559,298; Gorin, 1986, Clinics In Haematology 15(1): 19-48; Bone Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscú, 22-26 de julio de 1968, Organismo Internacional de Energía Atómica, Viena, pp. 107-186; Livesey y Linner, 1987, Nature 327:255; Linner et al., 1986, J. Histochem. Cytochem. 34(9): 1123-1 135; Simione, 1992, J. Parenter. Sci. Technol. 46(6):226-32).

Después de la crioconservación, las células congeladas pueden descongelarse para su uso de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia. Las células congeladas se descongelan preferiblemente rápidamente y se enfrían inmediatamente después de la descongelación. El vial que contiene las células congeladas puede sumergirse hasta el cuello en un baño de agua caliente; una rotación suave asegurará el mezclado de la suspensión celular a medida que se descongela y aumentará la transferencia de calor del agua caliente a la masa de hielo interna. En cuanto el hielo se haya derretido completamente, el vial puede colocarse inmediatamente en hielo.

Pueden usarse métodos para evitar la aglutinación celular durante la descongelación. Los métodos ejemplares incluyen: la adición antes y/o después de la congelación de DNasa (Spitzer et al., 1980, Cancer 45:3075-3085), dextrano y citrato de bajo peso molecular, hidroxietilalmidón (Stiff et al., 1983, Cryobiology 20:17-24), etc. [0162] Como comprenderá un experto en la técnica, si se usa un agente crioprotector tóxico para los seres humanos, deberá eliminarse antes del uso terapéutico. El DMSO no tiene toxicidad grave.

En las páginas 14-15 de la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2010/0183564 se describen portadores y modos de administración de células ejemplares. En Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005) se describen soportes farmacéuticos adicionales.

En realizaciones particulares, las células pueden cosecharse de un medio de cultivo, y lavarlas y concentrarlas en un portador en una cantidad terapéuticamente eficaz. Los portadores ejemplares incluyen solución salina, solución salina tamponada, solución salina fisiológica, agua, solución de Hanks, solución de Ringer, Nonnosol R (Abbott Labs), Plasma-Lyte A(R) (Baxter Laboratories, Inc., Morton Grove, IL), glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.

En realizaciones particulares, los portadores pueden suplementarse con albúmina de suero humano (HSA) u otros componentes de suero humano o suero bovino fetal. En realizaciones particulares, un portador para infusión incluye solución salina tamponada con 5% de HAS o dextrosa. Entre los agentes isotónicos adicionales se incluyen los alcoholes de azúcar polihídricos, incluidos los alcoholes de azúcar trihídricos o superiores, como la glicerina, el eritritol, el arabitol, el xilitol, el sorbitol o el manitol.

Los portadores pueden incluir agentes tamponadores, como tampones de citrato, tampones de succinato, tampones de tartrato, tampones de fumarato, tampones de gluconato, tampones de oxalato, tampones de lactato, tampones de acetato, tampones de fosfato, tampones de histidina, y/o sales de trimetilamina.

Los estabilizantes se refieren a una amplia categoría de excipientes cuya función puede variar desde un agente espesante hasta un aditivo que ayuda a evitar la adherencia celular a las paredes del recipiente. Los estabilizantes típicos pueden incluir alcoholes polihídricos de azúcar; aminoácidos como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico y treonina; azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y ciclitoles, como el inositol; PEG; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, como la urea, el glutatión, el ácido tióctico, el tioglicolato sódico, el tioglicerol, el alfa-monotioglicerol y el tiosulfato sódico; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir, <10 residuos); proteínas como HSA, albúmina sérica bovina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; monosacáridos como xilosa, manosa, fructosa y glucosa; disacáridos como lactosa, maltosa y sacarosa; trisacáridos como rafinosa, y polisacáridos como dextrano.

Cuando sea necesario o beneficioso, las composiciones pueden incluir un anestésico local como la lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de inyección.

Los conservantes ejemplares incluyen fenol, alcohol bencílico, metacresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, haluros de benzalconio, cloruro de hexametonio, alquilparabenos como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol.

Las cantidades terapéuticamente eficaces de células dentro de las composiciones pueden ser superiores a 102 células, superiores a 103 células, superiores a 104 células, superiores a 105 células, superiores a l 06 células, superiores a 107 células, superiores a 108 células, superiores a 109 células, superiores a 1010 células o superiores a 1011 células.

En las composiciones y formulaciones divulgadas en la presente, las células se encuentran generalmente en un volumen de un litro o menos, 500 ml o menos, 250 ml o menos o 100 ml o menos. Por lo tanto, la densidad de las células administradas típicamente es mayor de 104 células/ml, 107 células/ml o 108 células/ml.

También se proporcionan en la presente composiciones farmacéuticas de ácido nucleico de abTCR (también denominadas en la presente formulaciones) que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican un abTCR descrito en la presente, como se define en las reivindicaciones. La composición de ácido nucleico de abTCR es una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, la composición de ácido nucleico de abTCR comprende además cualquiera de un agente isotonizante, un excipiente, un diluyente, un espesante, un estabilizador, un tampón, y/o un conservante; y/o un vehículo acuoso, como agua purificada, una solución acuosa de azúcar, una solución tampón, solución salina fisiológica, una solución de polímero acuosa, o agua libre de RNasa. Las cantidades de dichos aditivos y vehículos acuosos a añadir pueden seleccionarse adecuadamente de acuerdo con la forma de uso de la composición de ácido nucleico de abTCR.

Las composiciones y formulaciones divulgadas en la presente pueden prepararse para su administración mediante, por ejemplo, inyección, infusión, perfusión o lavado. Las composiciones y formulaciones pueden formularse además para inyección en médula ósea, intravenosa, intradérmica, intraarterial, intranodal, intralinfática, intraperitoneal, intralesional, intraprostática, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratecal, intratumoral, intramuscular, intravesicular y/o subcutánea.

Las formulaciones para el uso en la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Métodos de tratamiento usando abTCR

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser para su uso en un método de tratamiento de cáncer e infección vírica, que comprende administrar la composición farmacéutica a individuos (por ejemplo, mamíferos como humanos). Por tanto, en algunas realizaciones, la presente solicitud proporciona una composición farmacéutica que comprende un abTCR que comprende una fracción de anticuerpo, como cualquiera de los abTCR descritos en la presente, para su uso en un método para tratar el cáncer o la infección vírica en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además una célula (como una célula efectora) asociada con el abTCR. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona, por ejemplo, del grupo que consiste en carcinoma adrenocortical, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, colangiocarcinoma, cánceres colorrectales, cáncer esofágico, glioblastoma, glioma, carcinoma hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de páncreas, feocromocitoma, plasmocitoma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, sarcoma, cáncer de estómago, cáncer de útero y cáncer de tiroides. En algunas realizaciones, la infección vírica está provocada por un virus seleccionado, por ejemplo, del grupo que consiste en Citomegalovirus (CMV), Virus de Epstein-Barr (EBV), Virus de la Hepatitis B (HBV), herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV), virus del papiloma humano (HPV), virus del molusco contagioso (MCV), virus de la leucemia de células T humanas 1 (HTLV-1), HIV (virus de la inmunodeficiencia humana) y virus de la hepatitis C (HCV).

Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR (como un abTCR aislado) que comprende a) un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, y b) un TCRM capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, para su uso en un método de tratamiento de cáncer o infección vírica en un individuo con necesidad de ello que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. El módulo de unión a antígeno de tipo Fab comprende un dominio de anticuerpo V<h>, un dominio de anticuerpo C<h>1 , un dominio de anticuerpo Vl y un dominio de anticuerpo Cl. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. El TCRM comprende los dominios transmembrana de un TCR, como un apTCR o un<y>§TCR. En algunas realizaciones, el TCRM comprende además los péptidos de conexiones o fragmentos de los mismos del TCR. En algunas En algunas realizaciones, el TCRM comprende además por lo menos una porción de un dominio extracelular del TCR. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular. En algunas realizaciones, el por lo menos un dominio intracelular comprende cualquiera de una secuencia de un dominio intracelular del TCR, una secuencia de señalización intracelular coestimuladora, una etiqueta de epítopo, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno de tipo Fab comprende un enlace disulfuro y/o el TCRM comprende un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab comprende un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio C<h>1 y un residuo en el dominio C<l>y/o el TCRM comprende un enlace disulfuro entre un residuo en el primer péptido de conexión y un residuo en el segundo péptido de conexión. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38e, CD3ye y ZC En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un conector peptídico entre el módulo de unión a antígeno tipo Fab y el TCRM. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celulares CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica para su uso en el método produce un agotamiento mínimo o prácticamente nulo de las células efectoras de abTCR. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica para su uso en el método produce una diferenciación terminal mínima o prácticamente nula de las células efectoras de abTCR. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica para su uso en el método da como resultado una internalización mínima o sustancialmente nula de abTCR en las células efectoras de abTCR. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica para su uso en el método da como resultado un aumento de la proliferación de las células efectoras del abTCR.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que reconoce específicamente el antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo Vh y Ch1 y un primer TCRD que comprende el dominio transmembrana de una primera subunidad de TCR; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende los dominios de anticuerpo V<l>y C<l>y un segundo TCR<d>que comprende el dominio transmembrana de una segunda subunidad de TCR, en donde los dominios V<h>y C<h>1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios Vl y Cl del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, para su uso en un método de tratamiento de cáncer o infección vírica en un individuo con necesidad de ello, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, la primera subunidad de TCR es una cadena a de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena p de TCR. En algunas realizaciones, la primera subunidad de TCR es una cadena p de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena a de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCR es una cadena<y>de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena 8 de TCR. En algunas realizaciones, la primera subunidad de TCR es una cadena 8 de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena y de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la primera subunidad de TCR y/o el segundo TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la segunda subunidad de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la primera subunidad de TCR y/o el segundo TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la segunda subunidad de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular del TCR y/o el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular del<t>C<r>. En algunas realizaciones, el primer dominio intracelular del TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la primera subunidad del t Cr y/o el segundo dominio intracelular del TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la segunda subunidad del TCR. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el TCRm es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38<e>, CD3<ye>y ZZ. En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un primer conector peptídico entre el primer dominio de unión a antígeno y el primer TCRD y/o un segundo conector peptídico entre el segundo dominio de unión a antígeno y el segundo TCRD. En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, por ejemplo, mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCRd y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio de anticuerpo C<h>1 en el primer dominio de unión a antígeno y un residuo en el dominio de anticuerpo C<l>en el segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que reconoce específicamente el antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo V<h>y C<h>1 y un primer TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena a de TCR; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende los dominios de anticuerpos Vl y Cl y un segundo TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena p del TCR, en donde los dominios Vh y Ch1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios V<l>y C<l>del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno de la superficie celular, en donde el primer TCRD y el segundo TCR<d>forman un TCRM capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR, para su uso en un método de tratamiento del cáncer o infección vírica en un individuo con necesidad de ello, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena a de TCR y/o el segundo TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena p del TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena a de TCR y/o el segundo TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena p del TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular del TCR y/o el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular del TCR. En algunas realizaciones, el primer dominio intracelular de TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena a de TCR y/o el segundo dominio intracelular TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena p del TCR. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización costimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38e, CD3ye y ZC En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un primer conector peptídico entre el primer dominio de unión a antígeno y el primer TCRD y/o un segundo conector peptídico entre el segundo dominio de unión a antígeno y el segundo TCRd . En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, como por ejemplo mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCR<d>y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio de anticuerpo Ch1 en el primer dominio de unión a antígeno y un residuo en el dominio de anticuerpo C<l>en el segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a tumor o codificado por virus) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y§. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y/o p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que reconoce específicamente el antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo Vh y Ch1 y un primer TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena p de TCR; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpos V<l>y C<l>y un segundo TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena a de TCR, en donde los dominios V<h>y C<h>1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios V<l>y C<l>del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno de tipo Fab que se une específicamente al antígeno de la superficie celular, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR, para su uso en un método de tratamiento del cáncer o infección vírica en un individuo con necesidad de ello, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena p del TCR y/o el segundo TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena a de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena p del TCR y/o el segundo TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena a de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular del TCR y/o el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular del TCR. En algunas realizaciones, el primer dominio intracelular TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena p de TCR y/o el segundo dominio intracelular del TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena a del TCR. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38e, CD3ye y ZC En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un primer conector peptídico entre el primer dominio de unión a antígeno y el primer TCRD y/o un segundo conector peptídico entre el segundo dominio de unión a antígeno y el segundo TCR<d>. En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, por ejemplo, mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCRD y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio de anticuerpo C<h>1 en el primer dominio de unión a antígeno y un residuo en el dominio de anticuerpo C<l>en el segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>8. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y/o p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que reconoce específicamente el antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo Vh y Ch1 y un primer TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena y de TCR; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo Vl y Cl y un segundo TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena 8 de TCR, en donde los dominios Vh y Ch1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios Vl y Cl del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno de tipo Fab que se une específicamente al antígeno de la superficie celular, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR, para su uso en un método de tratamiento del cáncer o infección vírica en un individuo con necesidad de ello, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena<y>de TCR y/o el segundo TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena 8 de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena<y>de TCR y/o el segundo TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena 8 de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular del TCR y/o el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular del TCR. En algunas realizaciones, el primer dominio intracelular del TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena y de TCR y/o el segundo dominio intracelular del TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena 8 de TCR.

En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización costimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD36<e>, CD3<ye>y ZC En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un primer conector peptídico entre el primer dominio de unión a antígeno y el primer TCRD y/o un segundo conector peptídico entre el segundo dominio de unión a antígeno y el segundo TCR<d>. En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, por ejemplo, mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCRD y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio de anticuerpo C<h>1 en el primer dominio de unión a antígeno y un residuo en el dominio de anticuerpo C<l>en el segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y6 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 6 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que reconoce específicamente el antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende dominios de anticuerpo Vh y Ch1 y un primer TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena 6 del TCR; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende los dominios de anticuerpo Vl y Cl y un segundo TCRD que comprende el dominio transmembrana de una cadena y de TCR, en donde los dominios Vh y Ch1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios V<l>y C<l>del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno de la superficie celular, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, para su uso en un método de tratamiento del cáncer o infección vírica en un individuo con necesidad de ello, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena 6 del TCR y/o el segundo TCRD comprende además el péptido de conexión o un fragmento del mismo de la cadena y del TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena 6 del TCR o y/o el segundo TCRD comprende además una porción del dominio extracelular de la cadena y de TCR. En algunas realizaciones, el primer TCRD comprende además un primer dominio intracelular del TCR y/o el segundo TCRD comprende además un segundo dominio intracelular del TCR. En algunas realizaciones, el primer dominio intracelular del TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena 6 del TCR y/o el segundo dominio intracelular del TCR comprende una secuencia del dominio intracelular de la cadena<y>de TCR. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización costimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30 o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG o myc). En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD36<e>, CD3<ye>y ZZ. En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, hay un primer conector peptídico entre el primer dominio de unión a antígeno y el primer TCRD y/o un segundo conector peptídico entre el segundo dominio de unión a antígeno y el segundo TCRd . En algunas realizaciones, la primera y la segunda cadenas polipeptídicas están enlazadas, por ejemplo, mediante un enlace covalente (por ejemplo, péptido u otro enlace químico) o un enlace no covalente. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión del primer TCRD y un residuo en el péptido de conexión del segundo TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio de anticuerpo Ch1 en el primer dominio de unión a antígeno y un residuo en el dominio de anticuerpo Cl en el segundo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y6 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 6 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que reconoce específicamente el antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un primer dominio de unión a antígeno y un primer TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un segundo dominio de unión a antígeno y un segundo TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; en donde el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCR<m>que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a<t>C<r>, para su uso en un método de tratamiento de cáncer o infección vírica en un individuo con necesidad de ello, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende a) por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD36<e>, CD3<ye>y ZC En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión de la primera TCRD y un residuo en el péptido de conexión de la segunda TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre residuos en los dominios de anticuerpo Ch1 y Cl en el módulo de unión a antígeno tipo Fab. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRA<m>E, EBV-LMP2A, HIV-1, y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>6. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que reconoce específicamente el antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un primer dominio de unión a antígeno y un primer TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un segundo dominio de unión a antígeno y un segundo TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18; en donde el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRm que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a t Cr , para su uso en un método de tratamiento de cáncer o infección vírica en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende a) por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38<e>, CD3<ye>y ZC En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión de la primera TCRD y un residuo en el péptido de conexión de la segunda TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre residuos en los dominios de anticuerpo Ch1 y Cl en el módulo de unión a antígeno tipo Fab. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAm E, EBV-LMP2A, HIV-1, y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>§. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que reconoce específicamente el antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un primer dominio de unión a antígeno y un primer TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un segundo dominio de unión a antígeno y un segundo TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20; en donde el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCR<m>que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a t Cr , para su uso en un método de tratamiento de cáncer o infección vírica en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende a) por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38<e>, CD3<ye>y ZZ. En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión de la primera TCRD y un residuo en el péptido de conexión de la segunda TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre residuos en los dominios de anticuerpo C<h>1 y C<l>en el módulo de unión a antígeno tipo Fab. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en la superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAm E, EBV-LMP2A, HIV-1, y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas<y>y/o 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, hay una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que reconoce específicamente el antígeno diana que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un primer dominio de unión a antígeno y un primer TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende, en orden desde el extremo terminal amino al extremo terminal carboxi, un segundo dominio de unión a antígeno y un segundo TCRD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22; en donde el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un TCRM que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR, para su uso en un método de tratamiento de cáncer o infección vírica en un individuo que lo necesite que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el módulo de unión a antígeno tipo Fab es humano, humanizado, quimérico, semisintético o totalmente sintético. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende a) por lo menos una secuencia de señalización coestimuladora de células T que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 o 71; y/o b) una etiqueta de epítopo que comprende (como que consiste en) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de unión a antígeno y/o un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, el TCRM es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado a TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38e, CD3ye y ZC En algunas realizaciones, el TCRM promueve la formación del complejo abTCR-CD3. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante a) un enlace disulfuro entre un residuo en el péptido de conexión de la primera TCRD y un residuo en el péptido de conexión de la segunda TCRD; y/o b) un enlace disulfuro entre residuos en los dominios de anticuerpo C<h>1 y C<l>en el módulo de unión a antígeno tipo Fab. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato y un lípido. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es un antígeno asociado a una enfermedad, como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente. En algunas realizaciones, el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5. En algunas realizaciones, el antígeno diana es un complejo péptido/MHC presentado en superficie. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido derivado de un antígeno asociado a una enfermedad (como un antígeno asociado a un tumor o codificado viralmente) y una proteína del MHC. En algunas realizaciones, el complejo péptido/MHC comprende un péptido y una proteína del MHC, en donde el péptido se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1, y PSA. En algunas realizaciones, la proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I. En algunas realizaciones, la proteína del MHC de clase I es HLA-A. En algunas realizaciones, la HLA-A es HLA-A02. En algunas realizaciones, la HLA-A02 es HLA-A*02:01. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24, en donde la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada a AFP en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones,. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y6. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y/o p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, en donde la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada a AFP en un individuo con necesidad de ello, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>6. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y/o p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, en donde la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada a AFP en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137),<o>X40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y6. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas a y/o p del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30, en donde la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada a AFP en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137),<o>X40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y6 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 6 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32, en donde la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas a través de uno o más enlaces disulfuro, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada a AFP en un individuo con necesidad de ello que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas Y y 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34, en donde la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada a AFP en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), o X40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36, en donde la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada a AFP en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137),<o>X40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas<y>y 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43, en donde la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada a CD19 en un individuo con necesidad de ello, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas Y y 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54, en donde la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada a CD19 en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54, en donde la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada a CD19 en un individuo con necesidad de ello, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T<y>8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas Y y 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende células efectoras (como células T o células asesinas naturales) que presentan en su superficie un abTCR que comprende a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56; y b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de abTCR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54, en donde la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están enlazadas mediante uno o más enlaces disulfuro, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada a CD19 en un individuo que lo necesite, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el abTCR comprende además por lo menos un dominio intracelular accesorio que comprende una secuencia de señalización coestimuladora de células T (como de CD27, CD28, 4-1BB (CD137),<o>X40, CD30, o CD40) y/o una etiqueta de epítopo (como HA, FLAG, o myc). En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-52. En algunas realizaciones, la primera cadena polipeptídica comprende además un primer péptido señal aminoterminal al primer dominio de abTCR y/o la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo péptido señal aminoterminal al segundo dominio de abTCR. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo péptidos señal comprenden (como por ejemplo, consisten en) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T ap. En algunas realizaciones, la célula efectora es una célula T y8 modificada para bloquear o disminuir la expresión de las cadenas y y 8 del TCR. En algunas realizaciones, la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

También se contempla una composición que comprende una pluralidad de células efectoras que expresan diferentes abTCR para su uso en métodos de tratamiento de una enfermedad asociada a antígeno diana en un individuo con necesidad de ello. Por tanto, de acuerdo con cualquiera de las composiciones para su uso en los métodos para tratar una enfermedad asociada a un antígeno diana en un individuo descritos en la presente, la composición es una composición de células efectoras de abTCR heterogénea como se describe en la presente.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporciona una composición de células efectoras de abTCR heterogénea que comprende una pluralidad de poblaciones de células efectoras de abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, en donde todas las células efectoras de abTCR de la composición son del mismo tipo celular (por ejemplo, todas las células efectoras de abTCR son células T citotóxicas), en donde cada población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR diferente de las demás, y en donde por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR que se une específicamente al antígeno diana, para su uso en un método de tratamiento de cáncer o infección viral en un individuo con necesidad de ello, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición de células efectoras de abTCR heterogénea, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR son células T. En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR se seleccionan del grupo que consiste en células T citotóxicas, células T auxiliares, células T asesinas naturales y células T supresoras. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente al antígeno diana. En algunas realizaciones, por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana diferente. En algunas realizaciones, cuando por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana diferente, cada uno de los diferentes antígenos diana está asociado con el cáncer o la infección vírica.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición de células efectoras de abTCR heterogénea que comprende una pluralidad de poblaciones de células efectoras de abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, en donde por lo menos una población de células efectoras de abTCR es de un tipo celular diferente a las demás, y en donde por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente al antígeno diana, para su uso en un método de tratamiento de cáncer o infección viral en un individuo con necesidad de ello, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición de células efectoras de abTCR heterogéneas, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, todas las poblaciones de células efectoras de abTCR son de diferentes tipos celulares. En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR son células T. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR es de un tipo celular seleccionado del grupo que consiste en células T citotóxicas, células T auxiliares, células T asesinas naturales y células T supresoras. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR expresa el mismo abTCR. En algunas realizaciones, por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR diferente de las demás. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR diferente de las demás. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR que se une específicamente al antígeno diana. En algunas realizaciones, por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana diferente. En algunas realizaciones, cuando por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa un abTCR que se une específicamente a un antígeno diana diferente, cada uno de los diferentes antígenos diana está asociado con el cáncer o la infección vírica.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición de células efectoras de abTCR heterogénea que comprende una pluralidad de poblaciones de células efectoras de abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, en donde todas las células efectoras de abTCR en la composición son del mismo tipo celular (por ejemplo, todas las células efectoras de abTCR son células T citotóxicas), en donde cada población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR diferente de las demás, y en donde para cada antígeno diana de la pluralidad de antígenos diana, por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR que se une específicamente al antígeno diana, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada con una pluralidad de antígenos diana en un individuo con necesidad de ello, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición de células efectoras de abTCR heterogéneas, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR son células T. En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR se seleccionan del grupo que consiste en células T citotóxicas, células T auxiliares, células T asesinas naturales y células T supresoras.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición de células efectoras de abTCR heterogénea que comprende una pluralidad de poblaciones de células efectoras de abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, en donde por lo menos una población de células efectoras de abTCR es de un tipo celular diferente a las demás, y en donde para cada antígeno diana de la pluralidad de antígenos diana, por lo menos una población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR que se une específicamente al antígeno diana, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad asociada con una pluralidad de antígenos diana en un individuo con necesidad de ello que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición de células efectoras de abTCR heterogénea como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, todas las poblaciones de células efectoras de abTCR son de tipos celulares diferentes. En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR son células T. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR es de un tipo celular seleccionado del grupo que consiste en células T citotóxicas, células T auxiliares, células T asesinas naturales y células T supresoras. En algunas realizaciones, cada población de células efectoras de abTCR expresa una abTCR diferente de las demás.

En algunas realizaciones, el individuo es un mamífero (por ejemplo, humano, primate no humano, rata, ratón, vaca, caballo, cerdo, oveja, cabra, perro, gato, etc.). En algunas realizaciones, el individuo es un humano. En algunas realizaciones, el individuo es un paciente clínico, un voluntario de un ensayo clínico, un animal de experimentación, etc. En algunas realizaciones, el individuo tiene menos de 60 años (por ejemplo, menos de 50, 40, 30, 25, 20, 15 o 10 años). En algunas realizaciones, el individuo tiene más de 60 años (por ejemplo, más de 70, 80, 90 o 100 años). En algunas realizaciones, el individuo está diagnosticado o es propenso ambiental o genéticamente a padecer una o más de las enfermedades o trastornos descritos en la presente (como cáncer o infección viral). En algunas realizaciones, el individuo tiene uno o más factores de riesgo asociados con una o más enfermedades o trastornos descritos en la presente.

En algunas realizaciones, las composiciones de células efectoras de abTCR de la invención se administran en combinación con un segundo, tercero o cuarto agente (incluyendo, por ejemplo, un agente antineoplásico, un agente inhibidor del crecimiento, un agente citotóxico o un agente quimioterapéutico) para tratar enfermedades o trastornos que implican la expresión del antígeno diana, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la composición de células efectoras de abTCR se administra en combinación con una citoquina (como IL-2). En algunas realizaciones, el abTCR se administra en combinación con un agente que aumenta la expresión de proteínas del MHC y/o mejora la presentación en superficie de péptidos por proteínas del MHC. En algunas realizaciones, el agente incluye, por ejemplo, agonistas del receptor de IFN, inhibidores de Hsp90, potenciadores de la expresión de p53 y agentes quimioterapéuticos. En algunas realizaciones, el agente es un agonista del receptor de IFN que incluye, por ejemplo, IFNy, IFNp e IFNa. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de Hsp90 que incluye, por ejemplo, tanespimicina (17-AAG), alvespimicina (17-DMAG), retaspimicina (IPI-504), IPI-493, CNF2024/BIIB021, MPC-3100, Debio 0932 (CUDC-305), PU-H71, Ganetespib (STA-9090), NVP-AUY922 (VER-52269), HSP990, KW-2478, AT13387, SNX-5422, DS-2248 y XL888. En algunas realizaciones, el agente es un potenciador de la expresión de p53 que incluye, por ejemplo, 5-fluorouracilo y nutlin-3. En algunas realizaciones, el agente es un agente quimioterapéutico que incluye, por ejemplo, topotecán, etopósido, cisplatino, paclitaxel y vinblastina.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición de células efectoras de abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente en combinación con una citoquina (como IL-2), para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad positiva al antígeno diana en un individuo que lo necesite que comprende administrar al individuo la composición de células efectoras de abTCR en combinación con la citoquina (como IL-2), como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la composición de células efectoras de abTCR y la citoquina se administran simultáneamente. En algunas realizaciones, la composición de células efectoras de abTCR y la citoquina se administran secuencialmente.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición de células efectoras de abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente en combinación con un agente que aumenta la expresión de proteínas del MHC de clase I y/o mejora la presentación en superficie de antígenos diana por proteínas del MHC de clase I, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad positiva al antígeno diana en un individuo que lo necesite, en donde las células que expresan el antígeno diana no presentan normalmente, o presentan a niveles relativamente bajos, un complejo que comprende el antígeno diana y una proteína del MHC de clase I en su superficie, el método comprendiendo administrar al individuo la composición de células efectoras de abTCR en combinación con el agente, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el agente incluye, por ejemplo, agonistas del receptor de IFN, inhibidores de Hsp90, potenciadores de la expresión de p53 y agentes quimioterapéuticos. En algunas realizaciones, el agente es un agonista del receptor de IFN que incluye, por ejemplo, IFNy, IFNp e IFNa. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de Hsp90 que incluye, por ejemplo, tanespimicina (17-AAG), alvespimicina (17-DMAG), retaspimicina (IPI-504), IPI-493, CNF2024/BIIB021, MPC-3100, Debio 0932 (CUDC-305), PU-H71, Ganetespib (STA-9090), NVP-AUY922 (VER-52269), HSP990, KW-2478, AT13387, SNX-5422, DS-2248 y XL888. En algunas realizaciones, el agente es un potenciador de la expresión de p53 que incluye, por ejemplo, 5-fluorouracilo y nutlin-3. En algunas realizaciones, el agente es un agente quimioterapéutico que incluye, por ejemplo, topotecán, etopósido, cisplatino, paclitaxel y vinblastina. En algunas realizaciones, la composición de células efectoras de abTCR y el agente se administran simultáneamente. En algunas realizaciones, la composición de células efectoras de abTCR y el agente se administran secuencialmente.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende ácido nucleico que codifica un abTCR de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, para su uso en un método de tratamiento de cáncer o infección viral en un individuo que lo necesite que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En la técnica se conocen los métodos para la administración de genes. Consultar, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466.

Los tratamientos contra el cáncer pueden evaluarse, por ejemplo, por regresión tumoral, reducción del peso o tamaño del tumor, tiempo hasta la progresión, duración de la supervivencia, supervivencia libre de progresión, tasa de respuesta global, duración de la respuesta, calidad de vida, expresión y/o actividad de proteínas. Pueden emplearse enfoques para determinar la eficacia de la terapia, incluyendo, por ejemplo, la medición de la respuesta mediante imagenología radiológica.

En algunas realizaciones, la eficacia del tratamiento se mide como el porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (% TGI), calculado usando la ecuación 100-(T/C x 100), donde T es el volumen tumoral relativo medio del tumor tratado, y C es el volumen tumoral relativo medio de un tumor no tratado. En algunas realizaciones, el % de TGI es de aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95% o más del 95%.

Los tratamientos de infecciones víricas pueden evaluarse, por ejemplo, mediante la carga vírica, la duración de la supervivencia, la calidad de vida, la expresión de proteínas y/o la actividad.

Enfermedades

En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR pueden ser útiles para métodos de tratamiento de cánceres asociados con un antígeno diana. Los cánceres que pueden tratarse usando cualquiera de las composiciones para el uso descrito en la presente incluyen tumores que no están vascularizados, o aún no sustancialmente vascularizados, así como tumores vascularizados. Los cánceres pueden comprender tumores no sólidos (como tumores hematológicos, por ejemplo, leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores sólidos. Los tipos de cánceres a tratar con las células efectoras de abTCR de la invención incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, blastoma y sarcoma, y ciertas leucemias o neoplasias linfoides, tumores benignos y malignos, y enfermedades malignas, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. También se incluyen los tumores/cancerosos adultos y los tumores/cancerosos pediátricos.

Los cánceres hematológicos son cánceres de la sangre o de la médula ósea. Los ejemplos de cánceres hematológicos (o hematógenos) incluyen las leucemias, incluyendo las leucemias agudas (como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (como la leucemia mielocítica crónica (granulocítica), la leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (formas indolentes y de grado alto), mieloma múltiple, plasmocitoma, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas y mielodisplasia.

Los tumores sólidos son masas anormales de tejido que habitualmente no contienen quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Los diferentes tipos de tumores sólidos reciben su nombre por el tipo de células que los forman (como sarcomas, carcinomas y linfomas). Algunos ejemplos de tumores sólidos, como sarcomas y carcinomas, incluyen el carcinoma adrenocortical, el colangiocarcinoma, el fibrosarcoma, el mixosarcoma, el liposarcoma, el condrosarcoma, el osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de estómago, neoplasia linfoide, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, cáncer de tiroides (por ejemplo, carcinoma medular de tiroides y carcinoma papilar de tiroides), feocromocitomas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino (por ejemplo, carcinoma cervicouterino y displasia cervicouterina preinvasiva), cáncer colorrectal, cáncer de ano, canal anal o anorrecto, cáncer vaginal, cáncer de vulva (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma y fibrosarcoma), cáncer de pene, cáncer de orofaringe, cáncer de esófago, cánceres de cabeza (por ejemplo, carcinoma de células escamosas), cánceres de cuello (por ejemplo, carcinoma de células escamosas), cáncer de testículo (por ejemplo, seminoma, teratoma, carcinoma embrionario, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, tumor de células de Leydig, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatoides y lipoma), carcinoma de vejiga, cáncer de riñón, melanoma, cáncer de útero (por ejemplo, carcinoma de endometrio), cánceres uroteliales (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células transicionales, adenocarcinoma, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria), y tumores del SNC (como un glioma (como glioma del tronco encefálico y gliomas mixtos), glioblastoma (también conocido como glioblastoma multiforme) astrocitoma, linfoma del SNC, germinoma, meduloblastoma, Schwannoma craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebrales).

Los tratamientos contra el cáncer pueden evaluarse, por ejemplo, por regresión tumoral, reducción del peso o tamaño del tumor, tiempo hasta la progresión, duración de la supervivencia, supervivencia libre de progresión, tasa de respuesta global, duración de la respuesta, calidad de vida, expresión y/o actividad de proteínas. Pueden emplearse enfoques para determinar la eficacia de la terapia incluyendo, por ejemplo, la medición de la respuesta mediante imagenología radiológica.

En otras realizaciones las células efectoras de abTCR pueden ser útiles para tratar enfermedades infecciosas dirigiéndose a antígenos codificados viralmente. La infección a prevenir o tratar puede estar provocada por un virus. El antígeno diana puede ser una proteína, polipéptido o péptido patógeno responsable de una enfermedad provocada por el patógeno, o capaz de inducir una respuesta inmunológica en un huésped infectado por el patógeno. Los antígenos patógenos a los que pueden dirigirse las células efectoras de abTCR incluyen, entre otros, antígenos derivados de Acinetobacter baumannii, género Anaplasma, Anaplasma phagocytophilum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma duodenale, Arcanobacterium haemolyticum, Ascaris lumbricoides, género Aspergillus, Astroviridae, género Babesia, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, virus BK, Blastocystis hominis, Blastomyces dermatitidis, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, género Borrelia, Borrelia spp, género Brucella, Brugia malayi, familia Bunyaviridae, Burkholderia cepacia y otras especies de Burkholderia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, familia Caliciviridae, género Campylobacter, Candida albicans, Candida spp, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, prión de ECJ, Clonorchis sinensis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium perfringens, Clostridium spp, Clostridium tetani, Coccidioides spp, coronavirus, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella bumetii, virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, Cryptococcus neoformans, Cryptosporidium genus, Citomegalovirus (CMV), Virus del dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4), Dientamoeba fragilis, Ebolavirus (EBOV), género Echinococcus, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, género Ehrlichia, Entamoeba histolytica, género Enterococcu, género Enterovirus, Enterovirus, principalmente Coxsackie A virus y Enterovirus 71 (EV71), Epidermophyton spp, Epstein-Barr Virus (EBV), Escherichia coli O157: H7, O111 y O104: H4, Fasciola hepatica y Fasciola gigantica, prión FFI, superfamilia Filarioidea, Flavivirus, Francisella tularensis, género Fusobacterium, Geotrichum candidum, Giardia intestinalis, Gnathostoma spp, GSS prion, Guanarito virus, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Henipavirus (Hendra virus Nipah virus), virus de la Hepatitis A, Virus de la hepatitis B (VHB), virus de la Hepatitis C (VHC), virus de la Hepatitis D, virus de la Hepatitis E, virus del herpes simple 1 y 2 (VHS-1 y VHS-2), Histoplasma capsulatum, VIH (Virus de la inmunodeficiencia humana), Hortaea werneckii, Bocavirus humano (HBoV), Herpesvirus humano 6 (HHV-6) y Herpesvirus humano 7 (HHV-7), Metapneumovirus humano (hMPV), Virus del papiloma humano (VPH), Virus de la parainfluenza humana (HPIV), Virus de la leucemia de células T humanas 1 (HTLV-1), Virus de la encefalitis japonesa, Virus JC, Virus Junin, Herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV), Kingella kingae, Klebsiella granulomatis, Kuru prion, virus de Lassa, Legionella pneumophila, género Leishmania, género Leptospira, Listeria monocytogenes, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), Machupo virus, Malassezia spp, Marburg virus, Metagonimus yokagawai, Microsporidia phylum, Molluscum contagiosum virus (MCV), Mumps virus, Mycobacterium leprae y Mycobacterium lepromatosis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Naegleria fowleri, Necator americanus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Nocardia spp, Onchocerca volvulus, Orientia tsutsugamushi, Orthomyxoviridae family (Influenza), Paracoccidioides brasiliensis, Paragonimus spp, Paragonimus westermani, Parvovirus B19, Género Pasteurella, Género Plasmodium, Pneumocystis jirovecii, Poliovirus, Virus de la rabia, Virus sincitial respiratorio (VSR), Rinovirus, rinoviruses, Rickettsia akari, género Rickettsia, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia typhi, virus de la fiebre del Valle del Rift, rotavirus, virus de la rubéola, virus Sabia, género Salmonella, Sarcoptes scabiei, SARS coronavirus, género Schistosoma, género Shigella, Sin Nombre virus, Hantavirus, Sporothrix schenckii, género Staphylococcus, género Staphylococcus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Strongyloides stercoralis, género Taenia, Taenia solium, Virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), Toxocara canis o Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, Trichinella spiralis, Trichomonas vaginalis, Trichophyton spp, Trichuris trichiura, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Ureaplasma urealyticum, virus de la varicela zóster (VVZ), virus de la varicela zóster (VVZ), Variola major o Variola minor, prión vECJ, virus de la encefalitis equina venezolana, Vibrio cholerae, virus del Nilo Occidental, virus de la encefalitis equina occidental, Wuchereria bancrofti, virus de la fiebre amarilla, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis y Yersinia pseudotuberculosis, como se define en las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, las células efectoras de abTCR se usan para métodos de tratamiento de enfermedades infecciosas oncogénicas, como infección por virus oncogénicos. Los virus oncogénicos incluyen, pero no se limitan a, CMV, EBV, HBV, KSHV, HPV, MCV, HTLV-1, HIV-1, y HCV. El antígeno diana del abTCR puede ser una oncoproteína vírica que incluye, entre otras, Tax, E7, E6/E7, E6, HBx, proteínas EBNA (por ejemplo, EBNA3 A, EBNA3 C y EBNA 2), v-ciclina, LANA1, LANA2, LMP-1, k-bZIP, RTA, KSHV K8 y fragmentos de las mismas. Consultar Ahuja, Richa, et al, Curr. Sci., 2014.

Artículos de fabricación y kits

En la presente se describe un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de una enfermedad positiva para el antígeno diana, como cáncer (por ejemplo, carcinoma adrenocortical, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, colangiocarcinoma, cánceres colorrectales, cáncer de esófago, glioblastoma, glioma, carcinoma hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de páncreas, feocromocitoma, plasmocitoma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, sarcoma, cáncer de estómago, cáncer de útero o cáncer de tiroides) o infección vírica (por ejemplo, infección por CMV, EBV, HBV, KSHV, HPV, MCV, HTLV-1, HIV-1 o HCV). El artículo de fabricación puede comprender un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado al envase. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar hechos de una variedad de materiales, como vidrio o plástico. En general, el recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar una enfermedad o trastorno descrito en la presente, y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo de la composición es una célula efectora que presenta en su superficie un abTCR de la invención. La etiqueta o el prospecto indican que la composición se usa para tratar la afección particular. La etiqueta o el prospecto comprenderá además instrucciones para administrar la composición de células efectoras de abTCR al paciente. También se contemplan artículos de fabricación y kits que comprenden las terapias combinatorias descritas en la presente.

El prospecto se refiere a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias relativas al uso de tales productos terapéuticos. El prospecto puede indicar que la composición es para uso en un método de tratamiento de un cáncer positivo al antígeno diana (como carcinoma adrenocortical, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, colangiocarcinoma, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, glioblastoma, glioma, carcinoma hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de páncreas, feocromocitoma, plasmacitoma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, sarcoma, cáncer de estómago, cáncer de útero o cáncer de tiroides). El prospecto puede indicar que la composición es para su uso en un método de tratamiento de una infección vírica positiva para el antígeno diana (por ejemplo, infección por CMV, EBV, HBV, KSHV, HPV, MCV, HTLV-1, HIV-1 o HCV).

Además, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además, puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

También se proporcionan kits que son útiles para varios propósitos, por ejemplo, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno positivo para el antígeno diana descrito en la presente, opcionalmente en combinación con los artículos de fabricación. Los kits descritos en la presente incluyen uno o más recipientes que comprenden una composición de células efectoras de abTCR (o forma de dosificación unitaria y/o artículo de fabricación), y pueden comprender además otro agente (como los agentes descritos en la presente) y/o instrucciones de uso de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente. El kit puede comprender además una descripción de la selección de individuos adecuados para el tratamiento. Las instrucciones suministradas en los kits son típicamente instrucciones escritas en una etiqueta o prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero también se aceptan instrucciones legibles por máquina (por ejemplo, instrucciones transportadas en un disco de almacenamiento magnético u óptico).

Por ejemplo, el kit comprende una composición que comprende una célula efectora que presenta en su superficie un abTCR. El kit puede comprender a) una composición que comprende una célula efectora que presenta en su superficie un abTCR, y b) una cantidad eficaz de por lo menos otro agente, en donde el otro agente aumenta la expresión de proteínas del MHC y/o aumenta la presentación en superficie de péptidos por proteínas del MHC (por ejemplo, IFN<y>, IFNp, IFNa, o inhibidor de Hsp90). el kit puede comprender a) una composición que comprende una célula efectora que presenta en su superficie un abTCR, y b) instrucciones para administrar la composición de células efectoras de abTCR a un individuo para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad positiva para el antígeno diana (como cáncer o infección vírica). El kit puede comprender a) una composición que comprende una célula efectora que presenta en su superficie un abTCR, b) una cantidad eficaz de por lo menos otro agente, en donde el otro agente aumenta la expresión de proteínas del MHC y/o mejora la presentación en superficie de péptidos por proteínas del MHC (por ejemplo, IFN<y>, IFNp, IFNa, o inhibidor de Hsp90), y c) instrucciones para administrar la composición de células efectoras de abTCR y el otro agente o agentes a un individuo para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad positiva al antígeno diana (como cáncer o infección vírica). La composición de células efectoras de abTCR y el otro agente o agentes pueden estar presentes en recipientes separados o en un único recipiente. Por ejemplo, el kit puede comprender una composición distinta o dos o más composiciones en donde una composición comprende la célula efectora de abTCR y otra composición comprende el otro agente.

El kit puede comprender a) una composición que comprende un abTCR, y b) instrucciones para combinar el abTCR con células efectoras (como células efectoras, por ejemplo, células T o células asesinas naturales, derivadas de un individuo) para formar una composición que comprende las células efectoras que presentan en su superficie el abTCR y administrar la composición de células efectoras de abTCR al individuo para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad positiva para el antígeno diana (como cáncer o infección viral). El kit puede comprender a) una composición que comprende un abTCR, y b) una célula efectora (como una célula citotóxica). El kit puede comprender a) una composición que comprende un abTCR, b) una célula efectora (como una célula citotóxica), y c) instrucciones para combinar el abTCR con la célula efectora para formar una composición que comprende la célula efectora que presenta en su superficie el abTCR y administrar la composición de células efectoras de abTCR a un individuo para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad positiva para el antígeno diana (como cáncer o infección vírica).

El kit puede comprender un ácido nucleico (o conjunto de ácidos nucleicos) que codifica un abTCR. El kit puede comprender a) un ácido nucleico (o conjunto de ácidos nucleicos) que codifica un abTCR, y b) una célula huésped (como una célula efectora) para expresar el ácido nucleico (o conjunto de ácidos nucleicos). el kit puede comprender a) un ácido nucleico (o conjunto de ácidos nucleicos) que codifica un abTCR, y b) instrucciones para i) expresar el abTCR en una célula huésped (como una célula efectora, por ejemplo, una célula T), ii) preparar una composición que comprenda la célula huésped que expresa el abTCR, y iii) administrar la composición que comprende la célula huésped que expresa el abTCR a un individuo para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad positiva para el antígeno diana (como cáncer o infección vírica). La célula huésped puede derivarse del individuo. El kit puede comprender a) un ácido nucleico (o conjunto de ácidos nucleicos) que codifica un abTCR, b) una célula huésped (como una célula efectora) para expresar el ácido nucleico (o conjunto de ácidos nucleicos) y c) instrucciones para i) expresar el abTCR en la célula huésped, ii) preparar una composición que comprenda la célula huésped que expresa el abTCR, y iii) administrar la composición que comprende la célula huésped que expresa el abTCR a un individuo para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad positiva para el antígeno diana (como cáncer o infección vírica).

Los kits se encuentran en envases adecuados. Los envases adecuados incluyen, pero no se limitan a, viales, botellas, frascos, envases flexibles (por ejemplo, bolsas de Mylar o de plástico), y similares. Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales como tampones e información interpretativa. Por lo tanto, la presente solicitud también describe artículos de fabricación, que incluyen viales (como viales sellados), botellas, frascos, envases flexibles y similares.

Las instrucciones relativas al uso de las composiciones de células efectoras de abTCR generalmente incluyen información sobre la dosificación, el programa de dosificación y la vía de administración para el tratamiento pretendido. Los recipientes pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (por ejemplo, paquetes multidosis) o dosis subunitarias. Por ejemplo, pueden proporcionarse kits que contengan dosificaciones suficientes de una composición de células efectoras de abTCR como se divulga en la presente para proporcionar un tratamiento eficaz de un individuo durante un período prolongado, como una semana, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, o más. Los kits también pueden incluir dosis unitarias múltiples del abTCR y composiciones farmacéuticas e instrucciones de uso y envasadas en cantidades suficientes para su almacenamiento y uso en farmacias, por ejemplo, farmacias hospitalarias y farmacias de compuestos.

La invención se describirá ahora con mayor detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos. Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención, pero, por supuesto, no deben interpretarse de ninguna manera como una limitación de su alcance.

Ejemplos

Materiales y métodos

Muestras celulares, líneas celulares y anticuerpos

Se obtuvieron las líneas celulares HepG2 (ATCC HB-8065; HLA-A2+, AFP+), SK-HEP-1 (ATCC HTB-52; HLA-A2+, AFP), Raji (ATCC CCL-86; CD19+), CA46 (ATCC CRL-1648; CD19+), Jurkat (ATCC CRL-2899, CD19- ), J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153), Jeko-1 (ATCC CRL-3006; CD19+), THP-1 (ATCC TIB-202, CD19- ), Daudi (ATCC CCL-213; CD19+), HeLa (ATCC CCL-2), MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) y MCF-7 (ATCC HTB-22) de la American Type Culture Collection. Jurkat es una línea celular de linfocitos T humanos derivada de la leucemia de células T. J.RT3-T3.5 es una línea mutante derivada de células Jurkat que carece de la cadena p del receptor de células T. Raji es una línea celular de linfoma de Burkitt que expresa CD19. La línea Raji-CD19 inactivada (Raji CD19KO) se generó mediante la tecnología CRISPR. Se diseñaron tres secuencias guía diferentes para dirigirse a CD19 en células Raji. El vector CRISPR-Cas9 se adquirió a Origene y cada guía se clonó por separado en el vector pCas-Guide. Tres días después de la electroporación, se evaluó la eficiencia de la inactivación de cada guía mediante citometría de flujo y se eligió el mejor grupo de inactivación de CD19 para la selección clonal mediante dilución limitante. El clon seleccionado se confirmó como una inactivación completa de CD19 mediante secuenciación. Se generó otra línea celular de control, SK-HEP-1-AFP-MG, transduciendo la línea celular SK-HEP-1 con un casete minigénico que expresaba un péptido de AFP AFP158 (SEQ ID NO: 53), que da como resultado un alto nivel de expresión en la superficie celular del complejo AFP158/HLA-A*02:01. Todas las líneas celulares se cultivaron en RPMI1640 o DMEM suplementado con FBS al 10% y 2 mM de glutamina a 371C/5% de CO2.

Se adquirieron Ab monoclonal contra HLA-A02 humana (clon BB7.2) conjugado con FITC o APC, y su control de isotipo IgG 2b de ratón conjugado con FITC o APC, anticuerpos contra CD3 humano o de ratón, subunidad de varios receptores de células T humanos, etiqueta 3xFlag, etiqueta HA, IgG antihumana F(ab)2 de cabra conjugada con PE o FITC, e Ig antiratón F(ab')2 de cabra conjugada con fluorescencia (Invitrogen). El anticuerpo antiidiotípico contra un anticuerpo específico AFP158/HLA-A*02:01 fue desarrollado y producido internamente en Eureka Therapeutics. Los datos de citometría de flujo se recogieron usando BD FACSCanto II y se analizaron usando el paquete de software FlowJo.

Todos los péptidos fueron adquiridos y sintetizados por Elim Biopharma. Los péptidos tenían una pureza de >90%. Los péptidos se disolvieron en DMSO o se diluyeron en solución salina a 10 mg/ml y se congelaron a -80°C. Se generaron monómeros de AFP158/HLA-A*02:01 de cadena sencilla biotinilados y complejos de péptidos de control/HLA-A*02:01 replegando los péptidos con HLA-A*02:01 recombinante y beta-2 microglobulina (p2M). Los monómeros se biotinilaron mediante el péptido BSP enlazado al extremo C-terminal del dominio extracelular (ECD) de HLA-A*02:01 por la enzima BirA. Se mezcló estreptavidina marcada con fluorescencia con el monómero de complejo péptido/HLA-A*02:01 biotinilado para formar un tetrámero de péptido/HLA-A*02:01 marcado con fluorescencia.

Se produjeron lentivirus que contenían abTCR o CAR humanos específicos de CD19 o específicos de AFP158/HLA-A*02:01, por ejemplo, por transfección de células 293T con vectores que codifican los constructos quiméricos. Se usaron células T humanas primarias para la transducción tras un día de estimulación con perlas CD3/CD28 (Dynabeads®, Invitrogen) en presencia de interleucina-2 (IL-2) a 100 U/ml. Los lentivirus concentrados se aplicaron a las células T en placas de 6 pocillos recubiertas de Retronectina (Takara) durante 96 horas. Las eficiencias de transducción de los constructos quiméricos anti-AFP y anti-CD19 se evaluaron mediante citometría de flujo, usando tetrámero AFP158/HLA-A*02:01 biotinilado ("tetrámero AFP158") con estreptavidina conjugada con PE o anticuerpo anti-myc respectivamente. Se repitieron los análisis de citometría de flujo el día 5 y posteriormente cada 3-4 días.

Se transdujeron líneas celulares con uno o dos vectores que codifican las dos subunidades del constructo abTCR. Cinco días después de la transducción, se generaron lisados celulares para transferencia western usando anticuerpos anti-HA (Anticuerpo anti-etiqueta HA - Grado ChIP, Abcam) o anticuerpos anti-Flag (Anticuepro anti-Flag producido en conejos, Sigma).

Las citotoxicidades tumorales se ensayaron mediante El ensayo de citotoxicidad de LDH no radiactivo Cytox 96 (Promega). Las células T CD3+ se prepararon a partir de sangre total enriquecida con PBMC usando el kit de aislamiento de células T humanas EasySep (StemCell Technologies) que agota negativamente las células que expresan CD14, CD16, CD19, CD20, Cd 36, Cd 56, CD66b, CD123, glicoforina A. Las células T humanas se activaron y expandieron con, por ejemplo, CD3/CD28 Dynabeads (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células T activadas (ATC) se cultivaron y mantuvieron en medio RPMI1640 con un 10% de FBS más 100 U/ml de IL-2, y se usaron en el día 7-14. Las células T activadas (células efectoras) y las células diana se cocultivaron en varias proporciones de efector a diana (por ejemplo, 2,5: 1 o 5: 1) durante 16 horas y se ensayaron para citotoxicidades.

Ejemplo 1. Diseños de quimeras de anticuerpo-receptor de células T (abTCR)

En las FIGS. 1A y 1B se muestran cuatro diseños diferentes de constructos quiméricos de receptores de células T de anticuerpos (abTCRs) (abTCR-3, abTCR-4, abTCR-5, y abTCR-6), incluyendo variaciones contempladas. En estos diseños, los dominios de cadena pesada (IgVH-IgCH1) y ligera (IgVL-IgCL) de un fragmento Fab de anticuerpo se fusionan con el extremo terminal amino de fragmentos de cadena a/p o de cadena y/S de receptores de células T que carecen de dominios variables y constantes e incluyen todo o parte de su péptido de conexión (región posterior al dominio constante) para formar heterodímeros quiméricos anticuerpo-TCR que pueden expresarse en la superficie de las células T. Los dominios IgVH e IgVL de cada uno de los diseños de abTCR determinan la especificidad de unión al antígeno y, junto con el IgCH1 y el IgCL, forman una estructura que se asemeja a un fragmento Fab. En un TCR nativo, los dominios Va/Vp o VS/Vy forman el dominio de unión al antígeno del TCR. Estos diseños sustituyen las regiones Va-Ca/Vp-Cp o VS-CS/V<y>-C<y>por IgVH-IgCH1 o IgVL-IgCL, confiriendo así la especificidad de unión de un anticuerpo al constructo, a la vez que mantienen la capacidad del constructo para asociarse con las moléculas accesorias en un complejo TCR nativo, como CD3Se, CD3ye y CD3ZC Estos diseños son distintos de los diseños de cTCR descritos por Gross y Eshhar (Endowing T cells with antibody specificity using chimeric T cell receptors, FASEB J. 1992 (15):3370), donde los dominios variables de los anticuerpos están enlazados a las regiones constantes del TCR, sustituyendo únicamente las regiones Va/Vp con IgVH/IgVL.

En otros diseños de abTCR, los dominios de cadena pesada (IgVH) y ligera (IgVL) de un fragmento Fv de anticuerpo que es específico para un complejo que comprende un péptido y una proteína del MHC (una fracción de anticuerpo restringida a MHC) se fusionan con el extremo terminal amino de fragmentos de cadena a/p o la cadena Y/S de receptor de células T que carecen de dominios variables e incluyen la totalidad o parte de sus péptidos de conexión (región después del dominio constante). En algunos de estos diseños de abTCR, los fragmentos de la cadena a/p o la cadena y/S de receptor de células T incluyen todos o parte de los dominios constantes del TCR. En uno de tales diseños, abTCR-7, la IgVH se fusiona a un fragmento TCRS que incluye el dominio constante y la IgVL se fusiona a un fragmento TCRy que incluye el dominio constante. Estos diseños son distintos de los diseños de cTCR descritos por Gross y Eshhar (supra), en los que los dominios variables del anticuerpo son para la unión no restringida al MHC.

En el diseño abTCR-3 (IgVH-IgCH1-TCRa/IgVL-IgCL-TCRp), el dominio variable y el primer dominio constante (IgVH-IgCHl) de una cadena pesada de anticuerpo reemplaza la porción amino terminal de la cadena TCRa hasta una posición limítrofe o dentro del péptido de conexión en el dominio extracelular después de la región Va-Ca. El dominio variable y el dominio constante (IgVL-IgCL) de la cadena ligera del anticuerpo correspondiente sustituye a la porción aminoterminal de la cadena TCRp hasta una posición limítrofe o dentro del péptido de conexión en el dominio extracelular después de la región Vp-Cp. En el diseño abTCR-4 (IgVH-IgCH1-TCRp/IgVL-IgCL-TCRa), el dominio variable y el primer dominio constante (IgVH-IgCHl) de una cadena pesada de anticuerpo sustituye a la porción aminoterminal de la cadena TCRp hasta una posición limítrofe o dentro del péptido de conexión en el dominio extracelular después de la región Vp-Cp. El dominio variable y el dominio constante (IgVL-IgCL) de la cadena ligera del anticuerpo correspondiente sustituye a la porción aminoterminal de la cadena TCRa hasta una posición limítrofe o dentro del péptido de conexión en el dominio extracelular después de la región Va-Ca. Las cadenas a y p quiméricas se dimerizan a través de dos enlaces disulfuro, uno entre los dominios IgCL e IgCHl, y otro entre los péptidos de conexión en las cadenas TCRa y p. Opcionalmente, se fusiona una etiqueta 3x-Flag al extremo C-terminal de la región citoplasmática de la cadena TCRa, y opcionalmente se fusiona una etiqueta HA al extremo C-terminal de la región citoplasmática de la cadena TCRp.

En una realización de abTCR-3, una cadena incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 23 (anti-AFP158/HLA-A*02:01-abTCR-3), donde el dominio IgVH de un anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 38) está fusionado a un dominio IgCHl (SEQ ID NO: 39) fusionado a la SEQ ID NO: 15, una porción de la cadena TCRa que incluye parte del péptido de conexión en el dominio extracelular de la cadena TCRa después de la región Va-Ca, y la otra cadena incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 24, donde el dominio IgVL del anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 40) está fusionado a un dominio IgCL (SEQ ID NO: 41) fusionado a la SeQ ID NO: 16, una porción carboxi de la cadena TCRp incluyendo parte del péptido de conexión en el dominio extracelular de la cadena TCRp después de la región Vp-Cp. En una realización de abTCR-4, una cadena incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 25 (anti-AFP158/HLA-A*02:01-abTCR-4), donde el dominio IgVL de un anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 40) está fusionado a un dominio IgCL (SEQ ID NO: 41) fusionado a la SEQ ID NO: 15, una porción de la cadena TCRa que incluye parte del péptido de conexión en el dominio extracelular de la cadena TCRa después de la región Va-Ca, y la otra cadena incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 26, donde el dominio IgVH del anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 38) está fusionado a un dominio IgCH1 (SEQ ID NO: 39) fusionado a la SEQ ID NO: 16, una porción carboxi de la cadena TCRp incluyendo parte del péptido de conexión en el dominio extracelular de la cadena TCRp después de la región Vp-Cp.

En el diseño de abTCR-5 (IgVH-IgCH1-TCRY/IgVL-IgCL-TCRS), el dominio variable y el primer dominio constante (IgVH-IgCH1 ) de una cadena pesada de anticuerpo reemplaza la porción amino terminal de la cadena TCR<y>hasta una posición limítrofe o dentro del péptido de conexión en el dominio extracelular de la cadena TCRy después de la región V<y>-C<y>. El dominio variable y el dominio constante (IgVL-IgCL) de la cadena ligera del anticuerpo correspondiente sustituye la porción terminal amino de la cadena TCRS hasta una posición limítrofe o dentro del péptido de conexión en el dominio extracelular de la cadena TCRS después de la región VS-CS. En el abTCR-6 (IgVH -IgCH1-TCR5/IgVL-IgCL-TCRY), el dominio variable y el primer dominio constante (IgVH-IgCH1 ) de una cadena pesada de anticuerpos sustituye a la porción aminoterminal de la cadena TCRS hasta una posición limítrofe o dentro del péptido de conexión en el dominio extracelular de la cadena TCRS después de la región VS-CS. El dominio variable y el dominio constante (IgVL-IgCL) de la cadena ligera del anticuerpo correspondiente sustituyen a la porción aminoterminal de la cadena TCRy hasta una posición limítrofe o dentro del péptido de conexión en el dominio extracelular de la cadena TCRy después de la región Vy-Cy. Las cadenas quiméricas y y S se dimerizan a través de dos enlaces disulfuro, uno entre los dominios IgCL e IgCH1 , y otro entre los péptidos de conexión en las cadenas TCRy y S. Opcionalmente, se fusiona una etiqueta 3xflag al extremo C-terminal de la región citoplasmática de la cadena TCR<y>, y una etiqueta HA al extremo C-terminal de la región citoplasmática de la cadena TCR<s>.

En una realización abTCR-5, una cadena incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 30 (anti-AFP158/HLA-A*02:01-abTCR-5), donde el dominio IgVH de un anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 38) está fusionado a un dominio IgCH1 (SEQ ID NO: 39) fusionado a la SEQ ID NO: 20, una porción de la cadena TCRy que incluye parte del péptido de conexión en el dominio extracelular de la cadena TCR<y>después de la región V<y>-C<y>, y la otra cadena incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 29, en la que el dominio IgVL del anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 40) se fusiona a un dominio IgCL (SEQ iD NO: 41) y luego a la SEQ ID NO: 19, una porción carboxi de la cadena TCRS que incluye parte del péptido de conexión en el dominio extracelular de la cadena TCRS después de la región VS-CS. En una realización de abTCR-6, una cadena incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 34 (anti-AFP158/HLA-A*02:01-abTCR-6) donde el dominio IgVL de un anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 40) está fusionado a un dominio IgCL (SEQ ID NO: 41) fusionado a la SEQ ID NO: 20, una porción de la cadena TCR<y>que incluye parte del péptido de conexión en el dominio extracelular de la cadena TCRy después de la región Vy-Cy, y la otra cadena incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 33, en donde el dominio IgVH del anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 38) está fusionado a un dominio IgCH1 (SEQ ID NO: 39) fusionado a la SEQ ID NO: 19, una porción carboxi terminal de la cadena TCRS incluyendo parte del péptido de conexión en el dominio extracelular de la cadena TCRS después de la región VS-CS.

Como se ilustra en la FIG. 1B, también se contemplan variaciones de cada uno de los cuatro diseños de abTCR. Tales variaciones pueden incluir variar la longitud del dominio extracelular, como (i) alargar añadiendo residuos en la unión formada por la fusión de IgC y TCR o (ii) acortar suprimiendo residuos en el extremo N-terminal de los péptidos de conexión del TCR. Una realización de dicha variante de abTCR-6 es abTCR-6MD, donde una cadena incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 36 (anti-AFP158/HLA-A*02:01-abTCR-6MD), donde el dominio IgVL de un anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 40) se fusiona con un dominio IgCL (SEQ ID NO: 41) fusionado a la SEQ ID NO: 22, una porción carboxi terminal de la cadena TCR<y>que incluye una porción más larga (en comparación con abTCR-6) del péptido de conexión después de la región V<y>-C<y>en la cadena TCR<y>, y la otra cadena incluye la secuencia de la Se Q ID NO: 35, donde el dominio IgVH del anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 38) está fusionado a un dominio IgCHl (SEQ ID NO: 39) fusionado a la SEQ ID NO: 21, una porción carboxi terminal de la cadena TCRS incluyendo una porción más larga (en comparación con abTCR-6) del péptido de conexión después de la región VS-CS de la cadena TCRS. Una realización de dicha variante de abTCR-5 es abTCR-5MD, donde una cadena incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 31 (anti-AFP158/HLA-A*02:01-abTCR-5MD) donde el dominio IgVL del anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID No : 40) está fusionado a un dominio IgCL (SEQ ID NO: 41) fusionado a la SEQ ID NO: 21, una porción carboxi terminal de la cadena TCRS que incluye una porción más larga (en comparación con abTCR-5) del péptido de conexión después de la región VS-CS de la cadena TCRS, y la otra cadena incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 32, donde el dominio IgVH de un anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 38) está fusionado a un dominio IgCH1 (SEQ ID NO: 39) fusionado con la SEQ ID NO: 22, una porción carboxi terminal de la cadena TCR<y>que incluye una porción más larga (en comparación con abTCR-5) del péptido de conexión después de la región V<y>-C<y>de la cadena TCR<y>. Una realización de tal variación de abTCR-4 es abTCR-4MD, donde una cadena incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 27 (anti-AFP158/HLA-A*02:01-abTCR-4MD) donde el dominio IgVL de un anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 40) se fusiona a un dominio IgCL (SEQ ID NO: 41) fusionada a la SEQ ID NO: 17, una porción carboxi terminal de la cadena TCRa que incluye una porción más larga (en comparación con abTCR-4) del péptido de conexión después de la región Va-Ca, y la otra cadena incluye la secuencia de la SEQ ID NO: 28, donde el dominio IgVH del anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 38) está fusionado a un dominio IgCH1 (SEQ ID NO: 39) fusionado a la SEQ ID NO: 18, una porción carboxi terminal de la cadena TCRp que incluye una porción más larga (en comparación con abTCR-4) del péptido de conexión después de la región Vp-Cp.

Variaciones adicionales pueden incluir fusionar dominios efectores adicionales (por ejemplo, dominio intracelular de CD28) al extremo C-terminal de cualquiera de las cadenas TCRa/p/Sfy Otra variación puede incluir variar la región conectora entre los dominios IgV e IgC.

Ejemplo 2: Expresión de abTCRs en líneas de células T

En las células T maduras, el complejo TCR-CD3 se compone de cuatro módulos diméricos: TCRap(o TCRy§), CD38<e>, CD3<ye>y CD3ZZ que se cree que se asocian a través de contactos intramembrana y extramembrana para formar el complejo intacto, como se muestra en la FIG. 2 (de Wucherpfennig KW, et al., Structural biology of the T-cell receptor: insights into receptor assembly, ligand recognition, and initiation ofsignaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. Abril 2010; 2(4):a005140). El ensamblaje del complejo se produce en el retículo endoplásmico (RE). Sólo los complejos TCR-CD3 completos se transfieren al aparato de Golgi, donde pasan por el proceso de glicosilación y son transportados a la membrana plasmática de las células T. Los TCR incompletos se dirigen desde el Golgi a los lisosomas, donde se degradan.

Para probar la expresión de abTCR en células T y examinar si los abTCR pueden funcionar como los TCR endógenos en el reclutamiento de moléculas CD3 y permitir la expresión del complejo abTCR-CD3 en la superficie de células T, se introdujeron constructos de abTCR en una línea de células T Jurkat mutante, J.RT3-T3.5. A diferencia de Jurkat, una línea de células T de leucemia positivas para TCR ap, J.RT3-T3.5 es una línea mutante Jurkat que carece de expresión de la subunidad p de TCR. Como el ensamblaje del complejo TCR-CD3 es deficiente sin la subunidad p del TCR, ni el TCR ni el CD3 pueden ser transportados a la membrana plasmática en las células J.RT3-T3.5.

D e t e c c i ó n d e l a e x p r e s i ó n d e a b T C R m e d i a n t e t r a n s f e r e n c i a w e s t e r n

Se generaron cinco conjuntos de constructos de abTCR (abTCR-3, -4, -5, -6, -6MD) con las regiones IgVH e IgVL de un anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01. Se transdujeron células J.RT3-T3.5 y Jurkat con constructos de abTCR-3 (SEQ ID NO: 23 y 24), abTCR-4 (SEQ ID NO: 25 y 26), abTCR-5 (SEQ ID NO: 29 y 30), abTCR-6 (SEQ ID NO: 33 y 34) o abTCR-6MD (SEQ ID NO: 35 y 36) y se detectó la expresión de subunidades individuales de los abTCR en transferencias western usando anticuerpos anti-Flag o anti-HA (FIG. 3). Para cada constructo, las dos subunidades se subclonaron en dos vectores lentivirales separados. Para expresar el heterodímero de abTCR completo, se transdujeron células T con ambos vectores. Las quimeras de TCRp y TCRS se marcaron con HA, mientras que las quimeras de TCRa y TCRy se marcaron con 3xFlag unido a los extremos C-terminales de las subunidades abTCR. En la FIG. 3, las cadenas de TCR con HA o 3xFlag se indican entre paréntesis bajo la etiqueta de cada diseño de abTCR.

Entre las quimeras marcadas con HA tanto en J.RT3-T3.5 como en Jurkat (FIG. 3, paneles anti-HA), la subunidad IgVL-IgCL-TCRp en abTCR-3 mostró la expresión más alta, seguido de la subunidad IgVH-IgCHl-TCR8 en abTCR-6 y abTCR-6MD y la subunidad IgVH-IgCHl-TCRp en abTCR-4. Entre las quimeras marcadas con 3xFlag (FIG.

3, paneles anti-flag), la expresión más alta se observó para IgVL-IgCL-TCRY en abTCR-6 y abTCR-6MD, seguido de IgVL-IgCL-TCRa en ab-TCR-4. Ambas cadenas para abTCR-5 (IgVH-IgCHl-TCRY/IgVL-IgCL-TCRS) mostraron la expresión más baja entre los 5 conjuntos de constructos probados. La cadena TCRS para abTCR-6MD se expresó a un nivel similar al de abTCR6 , mientras que la cadena TCR<y>para abTCR-6MD se expresó a un nivel más bajo que el observado para abTCR6. Tanto el porcentaje de células transducidas como el nivel de expresión dentro de las células transducidas contribuyen a las señales detectadas en las transferencias western. Por lo tanto, a continuación se realizó una citometría de flujo para determinar el nivel de expresión de abTCR en la superficie celular.

D e t e c c i ó n d e l a e x p r e s i ó n e n l a s u p e r f i c i e c e l u l a r d e a b T C R y f o r m a c i ó n d e c o m p l e j o T C R - C D 3 p o r c i t o m e t r í a d e f lu jo

Los 5 pares de cadenas abTCR quiméricas descritas anteriormente (abTCR-3, -4, -5, -6, -6MD) se transdujeron individualmente en células J.RT3-T3.5 (FIGS. 4A-4C) y Jurkat (FIGS. 5A-5C). Las células transducidas con constructos de abTCR se evaluaron mediante lo siguiente: (i) anticuerpo anti-CD3£ para evaluar el rescate de la expresión de CD3e en células J.RT3-T3.5 (FIG. 4A), (ii) anticuerpo anti TCRap para evaluar el impacto de los constructos de abTCR sobre la expresión endógena de TCRap en células Jurkat (FIG. 5A), (iii) tetrámero AFP158/HLA-A*02:01 marcado con PE para evaluar la unión a antígeno por los constructos de abTCR transducidos (FIGS. 4B y 5B) y (iv) anticuerpo anti-idiotipo contra el anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 usado en las quimeras de abTCR (FIGS. 4C y 5C) para evaluar la expresión de superficie de los constructos quiméricos.

Para las células J.RT3-T3.5, la transducción simulada no confirió unión a tetrámeros de AFP158/HLA-A*02:01 y anticuerpo antiidiotipo y no dio como resultado la expresión de CD3<e>en la superficie celular (FIGS. 4A-4C). El anticuerpo antiidiotipo detectó un resalte que se extendía desde el pico negativo de abTCR en las células J.RT3-T3.5 transducidas con abTCR-3 y abTCR-4. Por el contrario, las células transducidas con abTCR-5, -6 y -6MD mostraron picos distintos a altas intensidades de fluorescencia cuando se tiñeron con el anticuerpo antiidiotipo (FIG. 4C). Los constructos de abTCR son funcionales al poder unirse al tetrámero AFP158 de antígeno diana (FIG. 4B). Una mayor población de células expresaron los constructos de abTCR-6MD en comparación con abTCR-6, como se evidencia por un pico más alto positivo para el tetrámero AFP158 en abTCR-6MD. Sin embargo, las células transducidas con abTCR-6MD parecen expresar un número de copias por célula similar al de las células transducidas con abTCR-6, ya que los picos positivos para el tetrámero AFP158 tienen una intensidad media de fluorescencia (IMF) similar. Además, la expresión de los constructos de abTCR rescató la expresión de CD3<e>en la superficie celular de las células J.RT3-T3.S (FIG. 4A). Esto es inesperado ya que los dominios constantes del TCR se han atribuido a la interacción con las cadenas CD3 (revisado por Kuhns y Davis, la señalización de TCR surge de la suma de muchas partes, Front Immunol.

2012; 3: 1S9, Wang y Reinherz, The structural basis of a T-lineage immune recognition: TCR docking topologies, mechanotransduction, and co-receptor function, Immunol Rev. 2012, 250:102). Como las quimeras sustituyeron los dominios constantes del TCR por IgC, demostramos que el dominio constante del TCR no es necesario para el ensamblaje de CD3 con el complejo TCR. Cuando las células transducidas con abTCR-6 y abTCR-6MD se cotiñeron con tetrámeros anti-CD3£ y AFPl58/HLA-A*02:01 y se analizaron por citometría de flujo, confirmamos que las células CD3e+ J.RT3-T3.S también son positivas para los tetrámeros AFP158 (FIG. 6). Esto indica que las quimeras de abTCR exógenas forman receptores funcionales que pueden unirse a sus antígenos afines y rescatar la expresión del complejo CD3 en la superficie celular de las células J.RT3-T3.S.

También realizamos el mismo conjunto de experimentos en células Jurkat (una línea de células T positiva para TCR ap), usando los constructos de abTCR-3, -4, -S, -6 y -6MD con el anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 (FIG. 5A-5C). Los resultados concuerdan con los observados en las células J.RT3-T3.S en cuanto a la tinción del tetrámero AFP158 (FIG. 5B) y la unión del anticuerpo antiidiotípico (FIG. 5C). Las células transducidas también se tiñeron con un anticuerpo anti-TCRa/p para determinar el impacto de los constructos de abTCR sobre la expresión de las cadenas TCRa/p endógenas. Mientras que las células Jurkat transducidas de manera simulada expresaban un alto nivel de TCRa/p, se detectó una población negativa de TCRa/p en cada una de las células transducidas con abTCR como un resalte a la izquierda del pico de TCRa/p (FIG. 5A). Estos datos sugieren que la expresión de las quimeras abTCR compite por las cadenas CD3, dando como resultado una reducción de la expresión en superficie del TCRa/p endógeno.

Combinando las observaciones de las transferencias western y los experimentos de citometría de flujo, postulamos que en las células transducidas con abTCR-3 y -4, parte de la subunidad de TCRa endógena puede emparejarse con las cadenas p exógenas de la quimera abTCR. exógenas de la quimera abTCR, para formar complejos TCR-CD3 que puedan ser transportados a la superficie celular. Alternativamente, los abTCR-3 y -4 pueden tener una conformación diferente que limite la exposición del epítopo para el anticuerpo antiidiotipo. En células Jurkat y J.RT3-T3.S transducidas con abTCR-3, el alto nivel de expresión de la cadena TCRp IgVL-IgCL (por transferencia western, FIG. 3) dio como resultado un gran porcentaje de células J.RT3-T3.5 que expresan CD3<e>en la superficie celular (FIG. 4A) y a una reducción de la expresión endógena de TCRa/p en un subconjunto de las células Jurkat transducidas con abTCR-3. En las células transducidas con abTCR-4, la cadena IgVH-IgCHl-TCR también dio como resultado la expresión de CD3<e>en células J.RT3-T3.5 y a la reducción de la expresión del TCRa/p endógeno en células Jurkat, pero en mucha menor medida, ya que la expresión de la cadena abTCR p quimérica es mucho menor en abTCR-4 que en abTCR-3 (por transferencia western, FIG. 3).

Para las células transducidas con abTCR-3 y -4, se espera que el emparejamiento de la quimera TCRp exógena con las cadenas TCRa endógenas en células TCRap+ reduzca el conjunto de cadenas de quimera TCRp disponibles para el emparejamiento correcto con cadenas de quimera TCRa exógenas. Esto no será un problema en células TCRa+ cuando se expresen constructos de abTCR-5, -6 o -6MD, donde las quimeras se generan con las cadenas TCR8 y TCRy. La elevada MFI en los picos positivos para abTCR es coherente con un elevado número de quimeras emparejadas correctamente tanto en células J.RT3-T3.5 como Jurkat que expresan los constructos de abTCR-5, -6 o -6M<d>. Por el contrario, sería preferible el uso de los constructos de abTCR-3 y -4, donde las quimeras se generan con las cadenas TCRa y TCRp, para la expresión en células T TCR8<y>+ para evitar el emparejamiento de las cadenas quiméricas exógenas con las cadenas TCR8 y TCRy endógenas.

Ejemplo 3. Expresión de abTCR en células T primarias

Habiendo demostrado que los constructos de abTCR pueden transducirse con éxito en líneas de células T y expresarse en la superficie celular junto con el complejo CD3 como receptores funcionales de unión a antígeno, a continuación probamos la expresión de abTCR en células T primarias.

a b T C R e x p r e s a d o e n c é l u l a s T p r i m a r i a s C D 4 y C D 8

Se aislaron linfocitos de sangre periférica de donantes sanos y se transdujeron con un constructo abTCR-6MD que codifica una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01 (Se Q ID NO: 35 y 36). Las subunidades abTCRY y 8 se subclonaron en el mismo vector lentiviral para transducir células T humanas primarias. Después de 5 días de transducción, las células abTCR-T y las células transducidas de manera simulada se tiñeron conjuntamente con el tetrámero AFP158, y los anticuerpos CD4 y CD8, y se analizaron por citometría de flujo. La FIG. 7A muestra un gráfico de dispersión de la unión de CD8 frente al antígeno (tetrámero AFP158), mientras que la FIG. 7B muestra gráficos de dispersión de CD8 frente a CD4. En las células T transducidas de manera simulada, la relación CD4:CD8 es de aproximadamente 2:1 (panel superior de la FIG. 7B). Se observó la misma proporción de CD4:CD8 en las células transducidas con el constructo abTCR-6MD (FIG. 7B, panel central). Descubrimos que la proporción de CD4:CD8 es también de aproximadamente 2:1 entre la población de tetrámero+ AFP158 en las células transducidas con abTCR-6MD (ver FIG. 7B panel inferior y separación en la FIG. 7A). Esto indica que la quimera abTCR puede expresarse tanto en células T primarias CD4+ como CD8+.

L a s c a d e n a s d e a b T C R e x ó g e n a s s e a s o c i a n f í s i c a m e n t e c o n e l c o m p l e j o C D 3

Como la expresión de abTCR en líneas de células T fue capaz de rescatar la expresión superficial de CD3<e>en células J.RT3-T3.5, probamos si los constructos de abTCR expresados en células T primarias se asocian físicamente con cadenas individuales en el complejo CD3 mediante co-inmunoprecipitación (co-ip). Las células T primarias se estimularon usando anti-CD3 y anti-CD28 y, a continuación, se transdujeron de manera simulada o se transdujeron con constructos de abTRC-6MD que codifican una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 35 y 36). Doce días después de la transducción, las células abTCR-T se cocultivaron con SK-HEP-1-AFP-MG durante otros 12 días para enriquecer las células tetrámero+AFP158. A continuación, las células se lisaron con tampón de lisis digitonina (0,1%) y se usó un anticuerpo anti-Flag para i.p. la cadena TCR<y>a través de la etiqueta 3xFlag. Como se muestra en la FIG. 8, las cadenas CD38, CD3e, CD3y y CD3Z se coinmunoprecipitaron con la quimera abTCRY, demostrando que las quimeras abTCR transducidas estaban físicamente asociadas con el complejo CD3 endógeno. La banda con un MW superior al de CD3<e>, observado en la muestra transducida de manera simulada con inmunoprecipitación anti-Flag, es una banda inespecífica.

Se realizan experimentos de coinmunoprecipitación similares en líneas celulares JRT3-T3.5 y Jurkat. Las líneas celulares JRT3-T3.5 y Jurkat se transducen con constructos de abTCR-6MD que codifican una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NOs 35 y 36). 5 días después de la transducción, se usa el kit de unión a biotina CELLection para purificar las poblaciones de tetrámero+ AFP158 de las líneas celulares JRT3-T3.5 y Jurkat. Las células Jurkat y JRT3-T3.5 transducidas con abTCR-6MD y purificadas con el tetrámero AFP158 se denominan JurkatabTCR-puras y JRT3-T3. 5-abTCR-puras, respectivamente. Las células JRT3-T3.5, JRT3-T3.5-abTCR-puras, Jurkat y Jurkat-abTCR-puras se expanden y lisan en tampón de lisis con digitonina al 0,1%. La coinmunoprecipitación se realiza usando anticuerpos anti-Flag (Sigma) y Proteína G Dynabeads para inmunoprecipitación (Life Technologies) siguiendo el protocolo estándar.

Ejemplo 4. Caracterización de las actividades biológicas de células T transducidas con abTCR-6MD y constructos CAR que contienen los mismos dominios variables anti-AFP158/HLA-A*02:01

L a s c é l u l a s T t r a n s d u c i d a s c o n a b T C R p u e d e n d e s t r u i r e s p e c í f i c a m e n t e c é l u l a s c a n c e r o s a s p o s i t i v a s p a r a e l a n t í g e n o

Se transdujeron de manera simulada células T primarias o se transdujeron con vectores lentivirales que codificaban un CAR que contenía un scFv anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 37) o un abTCR-6MD que contenía los mismos dominios variables anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 35 y 36). La eficacia de la transducción se determinó mediante tinción con tetrámeros AFP158/HLA-A*02:01 marcados con PE (FIG. 9A). Se usaron poblaciones de células T con tasas de transducción similares (32% para CART y 34% para abTCR) para comprobar su capacidad de destruir líneas celulares cancerosas. Se usaron tres líneas celulares: HepG2 (AFP+/HLA-A2+), SK-HEP-1 (AFP-/HLA-A2+) y SK-HEP-1-AFP-MG (SK-HEP-1 transducidas con un minigén AFP) en una proporción efector a objetivo de 2,5:1. La lisis específica se midió después de 6 horas de incubación usando el ensayo de citotoxicidad no radiactiva Cytox 96 (Promega). Como se muestra en la FIG. 9B, las células T transducidas tanto con CAR como con abTCR-6Md que tienen una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01 dirigieron la destrucción de las líneas celulares positivas para el antígeno HepG2 y SK-HEP-1-AFP-MG, pero no llevaron a la destrucción de la línea celular negativa para el antígeno SK-HEP-1. El nivel de lisis específica observado en las células transducidas por abTCR es equivalente al de las células CAR-T.

L a s c é l u l a s T t r a n s d u c i d a s p o r a b T C R d e s g r a n u l a n d e s p u é s d e l a e s t i m u l a c i ó n c o n a n t í g e n o s

Para caracterizar adicionalmente las actividades biológicas en células T transducidas con abTCR frente a CAR, usamos un ensayo de citometría de flujo para detectar la expresión de superficie de CD107a como una medición de la actividad de desgranulación. Las células T transducidas con abTCR y CAR con una fracción de unión anti-AFP158/HLA*02:01 se generaron como se ha indicado anteriormente y se coincubaron con células HepG2, SK-HEP-1 y SK-HEP-1-AFP-MG durante 4 horas en presencia de una dilución 1:200 de anticuerpo anti-CD107a y un cóctel de inhibidores del transporte de proteínas (eBioscience). Después de la coincubación con las células diana, las células T transducidas se tiñeron con tetrámeros AFP158/HLA y anti-CD8. La desgranulación en células T positivas para tetrámeros y positivas para CD8 se muestra en la FIG 10, panel derecho. El nivel más alto de desgranulación, medido por la expresión de CD107a, se observó tras la coincubación con SK HEP-1-AFP-MG (línea continua, relleno gris), seguido de HepG2 (línea de puntos, relleno gris), mientras que no se observó desgranulación con el antígeno parental negativo para SK-HEP-1 (línea continua, relleno blanco) tanto con células T transducidas con abTCR como con CAR. Cuando se usaron las mismas células diana el nivel de desgranulación fue similar entre las células transducidas con abTCR y CAR. Esto concuerda con los datos anteriores de lisis celular mediada por células T. En conjunto, hemos demostrado que las células T transducidas con abTCR son igual de sensibles que las células transducidas con CAR a las células cancerosas positivas para el antígeno en la desgranulación (FIG. 10) y en la mediación de la muerte celular (FIG. 9).

P r o d u c c i ó n y s e c r e c i ó n d e c i t o q u i n a s p o r c é l u l a s T d e a b T C R y C A R e n l a d e s t r u c c i ó n d e c é l u l a s t u m o r a l e s

Se generaron células T transducidas con abTCR o CAR y con tasas de transducción similares y se coincubaron con células diana como se ha indicado anteriormente. La liberación de IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-<y>y TNF-a en los medios después del ensayo de destrucción in vitro mostrado en la FIG. 9B se midió usando el sistema multiplex Magpix (Luminex) con el ensayo Bio-plex Pro Human Cytokine 8-plex (BioRad). Para alcanzar los límites de detección de los sobrenadantes del ensayo de las reacciones diana de SK-HEP-1-AFP-MG se diluyeron 25 veces, mientras que las demás muestras no se diluyeron. Las concentraciones de citoquinas se determinaron con una curva estándar conocida, después de restar la liberación de citoquinas de los medios, la diana sola y el efector solo.

Estimamos que el número de complejos AFP158/HLA-A*02:01 en la superficie de HepG2 era de ~100 por célula, usando microscopía de alta resolución (datos no mostrados). Con un número tan bajo de copias del complejo péptido/HLA, la citometría de flujo usando el anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 no pudo detectar un cambio significativo de MFI. Por el contrario, la expresión de un minigén AFP en las células SK-HEP-1-AFP-MG dio como resultado un cambio logarítmico en MFI por citometría de flujo, lo que indica que el nivel del complejo AFP158/HLA-A*02:01 en las células SK-HEP-1-AFP-MG era significativamente mayor que en HepG2. Cuando se usó HepG2 como células diana y se midió un panel de ocho citoquinas humanas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-y, TNF-a) después de 16 horas de coincubación con células T transducidas con abTCR o CAR, se detectaron IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-y, TNF-a en el medio (FIG. 11A). La liberación de citoquinas fue consistentemente más baja en las muestras transducidas con abTCR en comparación con las muestras transducidas con CAR. Cuando se realizó el mismo ensayo con SK-HEP-1-AFP-MG, se detectó la secreción de 7 de las 8 citoquinas que probamos tras la coincubación con células T primarias transducidas con abTCR o CAR (FIG. 11B). En el caso de cada citoquina probada, el nivel de citoquina detectado en el medio fue similar o inferior en las muestras que contenían células T transducidas por abTCR en comparación con las muestras CAR-T, en algunos casos en más del doble (por ejemplo, IL-2, IFN-<y>, TNF-a). Las células SK-HEP-1 solas también mostraron un nivel detectable (~3000 pg/ml por encima del fondo) de IL-6 e IL-8 en ausencia de células T.

Para determinar la contribución de las células T transducidas como fuente de las citoquinas detectadas en los medios, se cocultivaron células T transducidas con abTCR y CAR con eficiencias de transducción similares (34%) con células diana en una proporción de 2,5:1 con un cóctel inhibidor del transporte de proteínas (eBioscience Cat N° 00498003) para prevenir la secreción de citoquinas. Después de 4 horas de tratamiento, las células T se tiñeron con el tetrámero AFP158/HLA-A*02:01 y el anticuerpo anti-CD4 junto con los anticuerpos anti-TNF-a, anti-IFN-Y, anti-IL-2 o anti-IL-6. Usando citometría de flujo, con separación en células AFP158 tetrámero+(FIGS. 12A-12H), demostramos que el TNF-a, el IFN-y y la IL-2 intracelular pero no la IL-6, se expresaron tanto en las células T transducidas con abTCR como en las transducidas con CAR cuando se cocultivaron con células diana positivas para el antígeno. Para cada citoquina examinada, el nivel de citoquina intracelular fue sistemáticamente mayor en<s>K-HEP-1-AFP-MG que en HepG2, correlacionándose con el nivel de expresión de antígeno en las células diana. Para cada población de células diana, no hubo diferencias significativas en las citoquinas intracelulares entre las células transducidas con abTCR frente a las células transducidas con CAR, para cada citoquina probada. Esto sugiere que la diferencia observada en el ensayo de liberación de citoquinas puede deberse a la retroalimentación de citoquinas. La ausencia de IL-6 intracelular en las células T transducidas sugiere que la fuente de la IL-6 detectada en los medios de la FIG.

11B procede de las células SK-HEP-1 y no de las células T.

Para determinar si la activación de abTCR en células T CD4+ podría llevar a respuestas biológicas específicas, investigamos la expresión de citoquinas intracelulares en células T CD4+, que expresan abTCR anti-AFP158 tras la estimulación con líneas celulares cancerosas que expresan AFP. Las células T CD3+ se transdujeron con el abTCR anti-AFP158 como se ha descrito anteriormente y se incubaron con la línea celular cancerosa SK-HEP1-MG (AFP+), SK-HEP1 (AFP- o HEPG2 (AFP+) durante 4 horas en presencia de un inhibidor del transportador de proteínas. Como control negativo, las células T transducidas por abTCR se incubaron en ausencia de cualquier línea celular cancerosa. Después de la incubación, las células T se tiñeron con anticuerpos anti-IFNY, anti-IL2 o anti-TNFa, y se tiñeron conjuntamente con AFP-tetrámero-PE y anti-CD4. Las células separadas para la expresión de abTCR se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la granularidad y la expresión de citoquinas (FIG. 13, el eje Y es la dispersión lateral, el eje X es la tinción de citoquinas). La expresión de IFN<y>, IL2 y TNFa se indujo tras la incubación de las células T transducidas con abTCR anti-AFP158 con líneas celulares cancerosas AFP+ SK-HEP1-MG y HEPG2, pero no cuando se incubaron con la línea celular AFP' SK-HEP1 o en ausencia de cualquier línea celular cancerosa, lo que indica la activación específica del antígeno del abTCR en células T CD4+.

E x p r e s i ó n d e m a r c a d o r e s d e a g o t a m i e n t o d e c é l u l a s T e n c é l u l a s T a b T C R y C A R d e s p u é s d e l c o c u l t i v o c o n c é l u l a s d i a n a

Para examinar el nivel de marcadores de agotamiento expresados en células transducidas con abTCR y CAR tras la estimulación con antígeno, se prepararon células T CD3+ a partir de sangre completa enriquecida con PBMC usando el kit de aislamiento de células T humanas EasySep (StemCell Technologies) y se activaron con CD3/CD28 Dynabeads como antes. La población celular activada y expandida fue del >99% de CD3+ por citometría de flujo. A continuación, estas células se transdujeron con vectores lentivirales que codificaban un CAR que contenía un scFv anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 37) o un abTCR-6MD que contenía los mismos dominios variables anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 35 y 36) durante 7-9 días. Las células transducidas se cocultivaron con células diana durante 16 horas a una proporción efector-diana de 2,5:1 y se cotiñeron con el tetrámero AFP158 y el anticuerpo anti-CD8, junto con anticuerpos contra los marcadores de agotamiento PD-1, TIM-3 o LAG-3. El nivel de marcadores de agotamiento en las células T transducidas se analizó mediante citometría de flujo mediante separación en las células T tetrámero+ (es decir, transducidas). En un experimento independiente de citometría de flujo, determinamos que las células T tetrámero+ que eran CD8- eran CD4+ (datos no mostrados).

Se observó una regulación al alza de PD-1 entre las células T CD81etrámero+, mientras que se observó una regulación al alza de LAG-1 y TIM-3 entre las células T CD8+tetrámero+, tras la exposición a células diana que expresan AFP (HepG2 y SK-HEP-1-AFP-MG) (FIG. 14). En todos los casos, el nivel de regulación al alza del marcador de agotamiento observado en las células T transducidas por CAR fue igual o superior al observado en las células T transducidas por abTCR. Esto sugiere que las células T transducidas con abTCR pueden provocar un menor nivel de agotamiento de las células T, lo que da como resultado una mayor persistencia de las células T in vivo. Se determinó el porcentaje de células positivas para cada uno de los marcadores de agotamiento en las condiciones probadas y se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2

E x p r e s i ó n d e m a r c a d o r e s d e d i f e r e n c i a c i ó n d e c é l u l a s T e n c é l u l a s T d e a b T C R y C A R

Para determinar si los abTCR anti-AFP158 pueden retrasar la diferenciación de las células T durante la expansión in vitro, medimos la expresión en la superficie celular de tres marcadores de diferenciación de células T, los marcadores de células T de memoria CCR7 y CD28, y el marcador de diferenciación terminal Granzima B. Se transdujeron células T con vectores lentivirales que codificaban un CAR que contenía un scFv anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 37) o un abTCR-6MD que contenía el mismo scFv anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 35 y 36), teñidos con anticuerpos contra estos marcadores, y analizados por citometría de flujo en el día 10-12 después de la transducción viral (FIG. 15). Los resultados muestran que, tanto para las células T CD4+ como para las CD8+, las células T de abTCR expresaron más CCR7 y CD28, pero menos Granzima B, que las células T CAR, lo que sugiere que las células T de abTCR anti-AFP158 estaban menos diferenciadas que las células T CAR anti-AFP158 tras la expansión de células T in vitro.

C o m p a r a c i ó n d e l o s c o n s t r u c t o s a b T C R - 6 M D y a b T C R - 7 a n t i - A F P

Se comparó el crecimiento celular de células T primarias transducidas para que expresen un abTCR-6MD anti-AFP158/HLA-A*02:01 con el de las células T transducidas con un anticuerpo abTCR-7 anti-AFP158/HLA A*02:01 con los mismos dominios variables. Se activaron 6,7 x 105 células T mediante perlas aCD3/aCD28 (proporción 1:1) en presencia de 100 U/ml de IL-2 el día 0. Se transdujeron células T activadas con un anticuerpo abTCR-6MD anti-AFP158/HLA A*02:01. Las células T activadas se transdujeron con un vector lentiviral que codificaba el abTCR-6MD anti-AFP158/HLA-A*02:01 (subunidad de quimera de TCR8 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35 y la subunidad de quimera de TCRy que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36) o un vector lentiviral que codifica el abTCR-7 anti-AFP158/HLA-A*02:01 (subunidad de quimera de TCRS con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 81 y la subunidad de quimera de TCR<y>que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 82) a MOI 4 el día 1. A continuación, las células T transducidas se cultivaron y expandieron en presencia de IL-2 durante 9-10 días. Se contó el número de células el día 1, el día 5, el día 7 y el día 9. Como se muestra en la FIG. 16A, las células T transducidas con abTCR-6-MD crecieron más rápido que las células T transducidas con abTCR-7, con casi el doble de células viables en el día 9. La expresión de los constructos de abTCR-6-MD y abTCR-7 en las células T transducidas en el día 9 se evaluó mediante análisis de transferencia Western para los constructos marcados con FLAG. Brevemente, se lisaron 5 millones de células T transducidas en 100 pl de tampón de lisis y se separaron 13 pl de lisado en un gel de poliacrilamida al 4-12% usando el sistema NuPage. Se usó anticuerpo anti-FLAG de ratón (1 pg/ml) para detectar cadenas gamma de abTCR y anti-CD3zeta de ratón (1 pg/ml) para detectar CD3 endógeno. Como se muestra en la FIG. 16B, el constructo abTCR-7 se expresó a niveles más altos que el constructo abTCR-6MD. Las intensidades de las bandas anti-FLAG para los lisados, normalizadas a las bandas anti-CD3Z correspondientes, se cuantificaron usando el software ImageJ y mostraron un aumento relativo del 20% para la expresión del abTCR-7 en comparación con el abTCR-6MD.

La actividad de destrucción de células diana de las células T anti-AFP158/HLA-A*02:01 abTCR-6MD se comparó con la de las células T anti-AFP158/HLA-A*02:01 abTCR-7. Las células T primarias fueron transducidas de manera simulada o transducidas con vectores lentivirales que codificaban el anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 abTCR-6MD o anti-AFP158/HLA-A*02:01 abTCR-7 descritos anteriormente. Se probó la capacidad de las células T transducidas con abTCR-6MD o abTCR-7 para destruir SK-HEP-1 (AFP-/HLA-A2+) y SK-HEP-1-AFP-MG (SK-HEP-1 transducidas con un minigén AFP) en una proporción efectora a diana de 5:1. El nivel de destrucción específica se midió a las 16 horas como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la FIG. 16C, el constructo abTCR-6MD con la fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01 dirigió una lisis específica similar de células SK-HEP-1-AFP-MG positivas para AFP en comparación con el abTCR-7 con los mismos dominios variables de anticuerpo.

Ejemplo 5. Caracterización de las actividades biológicas de células T transducidas con constructos abTCR-6MD y CAR que tienen los mismos dominios variables anti-CD19 humanos.

En el ejemplo 4, la fracción de anticuerpo usada fue un mímico de TCR, que se une a un complejo péptido/MHC como antígeno. Para demostrar que los diseños de abTCR también funcionan con dianas de anticuerpos tradicionales (antígenos de la superficie celular), se llevó a cabo un conjunto similar de experimentos usando constructos basados en un anticuerpo contra CD19 humano.

L a s c é l u l a s T t r a n s d u c i d a s c o n C D 19 a b T C R p u e d e n d e s t r u i r l a s c é l u l a s c a n c e r o s a s p o s i t i v a s p a r a C D 19

Se transdujeron de manera simulada células T primarias o se transdujeron con vectores lentivirales que codificaban un CAR que contenía un dominio de unión anti-CD19 (SEQ ID NO: 44, que comprende un scFv con un dominio IgVH, SEQ ID NO: 45, y un dominio IgVL, SEQ ID NO: 46, de un anticuerpo anti CD19 ejemplar) o un abTCR-6MD que contiene los mismos dominios variables anti-CD19 (SEQ ID NO: 42 y 43). Se usaron células T transducidas con CAR o abTCR (ambas a una tasa de transducción del 25%) para comprobar su capacidad de destruir las líneas de células B JeKo-1 (CD19+), IM9 (CD19+), Jurkat (CD19‘) y THP-1 (CD19‘) en una proporción efector-objetivo de 5:1. El nivel de destrucción específica se midió a las 16 horas usando el mismo método que el descrito para la FIG 9B. Como se muestra en la FIG. 17, tanto CAR como abTCR-6MD con una fracción de unión anti-CD19 dirigieron la destrucción de células JeKo-1 e IM9 positivas para CD19 a niveles similares, pero no destruyeron Jurkat y THP-1, que son negativas para CD19.

S e c r e c i ó n d e c i t o q u i n a s p o r c é l u l a s T d e a b T C R y C A R e n l a d e s t r u c c i ó n d e c é l u l a s t u m o r a l e s

Se usaron las mismas poblaciones de células T transducidas que se usaron en el experimento de destrucción del cáncer anterior en un ensayo de liberación de citoquinas coincubándolas con células JeKo-1, IM9, THP-1 y Jurkat como células diana. Después de 16 horas se midió un panel de ocho citoquinas humanas (IL-2, IL-4, IL-6 , IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-y, TNF-a). Todas las citoquinas probadas se detectaron en el medio de las células T transducidas con CAR en coincubación con células diana CD19+, pero no con células CD19' (FIGS. 18A y 18B). En las muestras coincubadas con células T transducidas con abTCR, la liberación de todas las citoquinas probadas, con la excepción de IL-10, fue menor en las muestras de abTCR con células CD19+. Estos descubrimientos con los constructos de anticuerpos anti-CD19 son similares a los de los constructos de anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01: aunque se observó una destrucción similar de células cancerosas en las células CAR-T y las transducidas con abTCR, el nivel de liberación de citoquinas fue menor cuando se usaron células T transducidas por abTCR. Esto podría suponer una ventaja para el uso de abTCR en entornos en los que los altos niveles de liberación de citoquinas provocan efectos fisiológicos indeseables.

Para determinar si la activación de los abTCR en células T CD4+ podría dar lugar a respuestas biológicas específicas, investigamos la expresión intracelular de citoquinas en células T CD4+ que expresan abTCR, anti-CD19, tras la estimulación con líneas celulares cancerosas que expresan CD19. Se transdujeron células T CD3+ con el clon 5-13 abTCR-6MD (abTCR-6MD con una fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13 que comprende secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 56 y 54) y se incubaron con la línea celular cancerosa Raji (CD19+), Raji-CD19KO (CD19‘) o Jeko-1 (CD19+) durante 4 horas en presencia de un inhibidor del transportador de proteínas. Como control negativo, las células T transducidas con abTCR se incubaron en ausencia de cualquier línea celular cancerosa. Después de la incubación, las células T se tiñeron con anticuerpos anti-IFNY, anti-IL2 o anti-TNFa, y se tiñeron conjuntamente con Fab anti-humano (CD19) y anti-CD4. Las células separadas para la expresión de abTCR se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la granularidad y la expresión de citoquinas (FIG. 19, el eje Y es la dispersión lateral, el eje X es la tinción de citoquinas). La expresión de IFNy, IL2 y TNFa se indujo tras la incubación de las células T anti CD19 transducidas con abTCR con las líneas celulares cancerosas de CD19+ Raji y Jeko-1, pero no cuando se incubaron con la línea celular CD19- Raji-CD19KO o en ausencia de cualquier línea celular cancerosa, indicando la activación específica del antígeno de abTCR en células T CD4+.

E x p r e s i ó n d e m a r c a d o r e s d e a g o t a m i e n t o d e c é l u l a s T e n c é l u l a s T d e a b T C R y C A R d e s p u é s d e l c o c u l t i v o c o n c é l u l a s d i a n a

El nivel de marcadores de agotamiento expresados en las células transducidas con abTCR anti-CD19 y CAR tras la estimulación con antígeno se determinó como se ha descrito anteriormente para los receptores quiméricos anti-AFP158. Las células se transdujeron con el clon 5-13 abTCR-6MD o con un CAR que contenía los mismos dominios variables anti-CD19. Las líneas celulares diana fueron Raji (CD19+), Raji-CD19KO (CD19-) y Jeko-1 (CD19+). Se determinó el porcentaje de células positivas para cada uno de los marcadores de agotamiento en las condiciones probadas y se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3

E x p r e s i ó n d e m a r c a d o r e s d e d i f e r e n c i a c i ó n d e c é l u l a s T e n c é l u l a s T d e a b T C R y C A R

ara determinar si los abTCR anti-CD19 pueden retrasar la diferenciación de las células T durante la expansión in vitro, se midió la expresión de la superficie celular de tres marcadores de diferenciación de células T, los marcadores de células T de memoria CCR7 y CD28, y el marcador de diferenciación terminal Granzima B. Las células T se transdujeron con el clon 5-13 abTCR-6MD o un CAR que tenía los mismos dominios variables anti-CD19, se tiñeron con anticuerpos contra estos marcadores, y se analizaron por citometría de flujo en el día 10-12 después de la transducción viral (FIG. 20). Los resultados muestran que, tanto para las células T CD4+ como para las CD8+, las células T de abTCR expresaron más CCR7 y CD28, pero menos Granzima B, que las células T CAR, lo que sugiere que las células T de abTCR del clon 5-13 estaban menos diferenciadas que las células T CAR correspondientes tras la expansión de células T in vitro, de acuerdo con lo observado para los receptores quiméricos anti-AFP158.

P r o l i f e r a c i ó n d e c é l u l a s T d e a b T C R y C A R

Para determinar además si las células T de abTCR están menos diferenciadas y tienen mayor potencial de proliferación que las células T CAR, monitorizamos el cambio en la fluorescencia de CFSE, un indicador de la división celular, de las células T de abTCR y CAR después de su acoplamiento con células cancerosas positivas para el antígeno. Las células T se marcaron con colorante CFSE en el día 10 después de la transducción viral con el clon 5 13 abTCR-6MD o un CAR que tenía los mismos dominios variables anti-CD19, y la fluorescencia basal se registró por citometría de flujo. Las células T marcadas se incubaron con células Raji (una línea celular de cáncer CD19+) en medio libre de citoquinas. La fluorescencia CFSE se midió por citometría de flujo en el día 2 y en el día 3 para las células T CD4+ y CD8+ (FIG. 21). La disminución de la intensidad de fluorescencia CFSE entre el día 2 y el día 3, que indica la cantidad de proliferación celular, fue significativamente mayor en las células T de abTCR que en las células T CAR, lo que indica que las células T de abTCR del clon 5-13 experimentan más divisiones celulares que las células T CAR correspondientes.

I n t e m a l i z a c i ó n d e r e c e p t o r e s q u i m é r i c o s d e c é l u l a s T d e a b T C R y C A R

Para comparar la tasa de internalización de abTCR y CAR de superficie de células T, se transdujeron células T con el clon 5-13 abTCR-6MD o un CAR que contenía los mismos dominios variables anti-CD19, y se tiñeron en hielo durante 30 minutos con un anticuerpo antiidiotipo que reconocía la fracción de unión anti-CD19 marcada con CypHer5E, un colorante sensible al PH que emite fluorescencia a pH ácido de 6,5. A continuación, las células se incubaron a 37° C durante el tiempo indicado, se fijaron y se analizaron por citometría de flujo para determinar la granularidad y la expresión del receptor quimérico (FIG. 22, el eje Y es la dispersión lateral, el eje X es la tinción con CypHer5E). Los resultados muestran que casi todo el CAR fue internalizado 90 minutos después de la tinción. En cambio, el abTCR se internalizó a una velocidad mucho más lenta, y la mayor parte del abTCR permaneció en la superficie celular incluso a los 90 minutos.

Comparación de los constructos anti-CD19 abTCR y cTCR

Se comparó el crecimiento celular de células T primarias transducidas para expresar un abTCR-6MD anti-CD19 con el de células T transducidas con una constructo quimérico anti-CD19 (cTCR) que tenía los mismos dominios variables de anticuerpo y dominios transmembrana pero con regiones constantes de los polipéptidos TCR5 y TCR<y>. Se activaron 6,7 x 105 células T mediante perlas aCD3/aCD28 (proporción 1:1) en presencia de 100 U/ml de IL-2 el día 0. Las células T activadas se transdujeron o con un vector lentiviral que codificaba el abTCR-6MD anti-CD19 (subunidad de quimera de TCR5 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56 y la subunidad de quimera de TCR<y>que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54) o un vector lentiviral que codifica el cTCR anti-CD19 (subunidad de quimera de TCR5 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 75 y la subunidad de quimera de TCRy que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 76) a MOI 4 en el día 1. Las células T transducidas se cultivaron y expandieron en presencia de IL-2 durante 9-10 días. Se contó el número de células el día 1, el día 5, el día 7 y el día 9. Como se muestra en la FIG. 23A, las células T transducidas con abTCR crecieron más rápidamente que las células T transducidas con cTCR, con más de 1,7 veces más células viables contadas en el día 9.

La actividad de destrucción de células diana de las células T abTCR anti-CD19 se comparó con la de las células T cTCR anti-CD19. Las células T primarias se transdujeron de manera simulada o se transdujeron con vectores lentivirales que codificaban el abTCR-6MD anti-CD19 o el cTCR anti-CD19. Se probaron las células T transducidas con el abTCR o el cTCR para determinar su capacidad de destruir la línea celular diana positiva para CD19 Nalm-6 a una proporción efector-diana de 5:1. El nivel de destrucción específica se midió a las 16 horas como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la FIG. 23B, el constructo abTCR-6MD con la fracción de unión anti-CD19 dirigió una mayor lisis específica de células Nalm-6 positivas para CD19 que cTCR con los mismos dominios variables anti-CD19.

Ejemplo 6. Caracterización de las actividades biológicas de células T transducidas con constructos de abTCR-6MD y CAR que tienen los mismos dominios variables anti-NY-ESO-1/HLA-A*02:01

L a s c é l u l a s T t r a n s d u c i d a s c o n a b T C R a n t i - N Y - E S O - 1 / H L A - A * 02 : 01 p u e d e n d e s t r u i r c é l u l a s c a n c e r o s a s p o s i t i v a s p a r a N Y - E S O - 1

Las células T primarias se transdujeron de manera simulada o se transdujeron para que expresasen un CAR o abTCR-6MD que contenía una fracción de unión anti-NY-ESO-1/HLA-A*02:01 que comprendía un dominio IgVL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 73 y un dominio IgVH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 72. El CAR comprendía un scFv que tenía desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal un conector (SEQ ID NO: 74) y un dominio IgVH (Se Q ID NO: 72). El CAR comprendía un scFv que tenía, desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal, el dominio IgVL, un conector (SEQ ID NO: 74), y el dominio IgVH. Las células T transducidas con CAR o abTCR expresaron sus respectivos receptores quiméricos a niveles similares a los analizados por citometría de flujo y se usaron para probar su capacidad para destruir líneas celulares M9 (HLA-A2+, NY-ESO-1+), Colo205 (HLA-A2+, NY-ESO-1- ), MDA-231 (HLA-A2+, NY-ESO-1- ), MCF7 (HLA-A2+, NY-ESO-1- ), JeKo-1 (HLA-A2+, NY-ESO-1+), Raji (HLA-A2+, NY-ESO-1- ), Hep1 (HLA-A2+, NY-ESO-1- ), y Jurkat (HLA-A2+, NY-ESO-1- ) a una proporción efector-objetivo de 5: 1. El nivel de destrucción específica se midió a las 16 horas usando los mismos métodos descritos anteriormente. Como se muestra en la FIG. 24, tanto el CAR como el abTCR-6MD con la fracción de unión anti-NY-ESO-1/HLA-A*02:01 dirigieron la destrucción de células JeKo-1 e IM9 positivas para NY-ESO-1 a niveles similares, pero no destruyeron las otras células, que son negativas para NY-ESQ-1.

S e c r e c i ó n d e c i t o q u i n a s p o r c é l u l a s T d e a b T C R y C A R e n l a d e s t r u c c i ó n d e c é l u l a s t u m o r a l e s

Las mismas poblaciones de células T transducidas que se usaron en el experimento de destrucción del cáncer anterior se usaron en un ensayo de liberación de citoquinas coincubándolas con células IM9, Colo205, MDA-231, MCF7, JeKo-1, Hep1 y Jurkat. Después de 16 horas se midió un panel de cuatro citoquinas humanas (IL-2, GM-CSF, IFN-y, TNF-a). Todas las citoquinas analizadas se detectaron en el medio de las células T transducidas por CAR y abTCR tras la coincubación con células diana NY-ESO-1+, pero no en la mayoría de las células NY-ESO-1' (datos no mostrados). Es importante destacar que los niveles de citoquinas liberadas por la mayoría de las células diana NY-ESO-1+ probadas mediante la coincubación de células T transducidas con abTCR fueron significativamente inferiores que mediante la coincubación de células T transducidas con CAR (datos no mostrados).

Ejemplo 7. Caracterización de las actividades biológicas de células T asesinas naturales (NKT) y células T reguladoras (Treg) transducidas con constructos de abTCR-6MD.

C é l u l a s N K T t r a n s d u c i d a s c o n a b T C R a n t i - C D 19

Las células NKT se aislaron de PBMC humanas mediante marcado magnético indirecto de células no CD3+/CD56+ (células no NKT) con un cóctel de anticuerpos de biotina y microperlas antibiotina, y agotando las células no NKT para enriquecer las células NKT CD3+/CD56+. La expresión superficial de CD3 y c D56 para la población enriquecida de células NKT se evaluó mediante citometría de flujo y se muestra en la FIG. 25A. Las células NKT se activaron mediante perlas anti-CD3/anti-CD28, se transdujeron con lentivirus que codificaban el abTCR anti-CD19 y se expandieron en RPMI-1640 que contenía un 10% de FBS e IL-2 (100 U/ml). La eficiencia de la transducción fue mayor del 80%, medida por citometría de flujo con un anticuerpo antiidiotipo específico para la fracción de unión anti-CD19. Las células NKT se coincubaron con líneas celulares cancerosas Raji o Raji CD19-inactivado (CD19ko) que expresaban CD19 en una proporción efector-objetivo de 5:1 durante 16 horas, tras lo cual se midió la liberación de citoquinas (IL-2, GM-CSF, IFN<y>, TNFa) en el medio (FIG. 25B). Las células NKT transducidas con abTCR anti-CD19, pero no las células NKT transducidas de manera simulada, se activaron para liberar cada una de las citoquinas probadas cuando se incubaron con las células Raji positivas para CD19, pero no con las células Raji negativas para CD19, Raji CD19ko, lo que indica que las células NKT pueden activarse específicamente mediante la unión del abTCR transducido con el antígeno CD19 de las células cancerosas.

C é l u l a s T r e g t r a n s d u c i d a s c o n a b T C R a n t i - C D 19

Las células Treg se aislaron de PBMC humanas mediante marcado magnético directo de células Treg CD4+/CD25+. La expresión superficial de CD4 y CD25 para la población de células Treg aisladas se evaluó mediante citometría de flujo y se muestra en la FIG. 26A. Las células Treg se activaron mediante perlas anti-CD3/anti-CD28, se transdujeron con lentivirus que codificaban el abTCR anti-CD19 y se expandieron en RpMI-1640 con un 10% de FBS e IL-2 (100 U/ml). La eficiencia de la transducción fue del 80%, medida por citometría de flujo con un anticuerpo antiidiotipo específico para la fracción de unión anti-CD19. Las células Treg se coincubaron con líneas celulares de cáncer Raji o Raji CD19-inactivado (CD19ko) que expresaban CD19 en una proporción efector-objetivo de 5: 1 durante 16 horas, seguido de la medición de la liberación de citoquina IL-10 en los medios (FIG. 26B). Las células Treg transducidas con abTCR anti-CD19, pero no las células Treg transducidas de manera simulada, se activaron para liberar IL-10 cuando se incubaron con las células Raji positivas para CD19, pero no con las células Raji CD19ko negativa para CD19 s, lo que indica que las células Treg pueden activarse específicamente mediante la unión del abTCR transducido con el antígeno c D19 de las células cancerosas.

Ejemplo 8. Caracterización de las actividades biológicas de células T transducidas con abTCRs que tienen diferentes dominios constantes de cadena pesada de anticuerpos

En los ejemplos anteriores, las fracciones de anticuerpo usadas en los constructos de abTCR contenían un dominio CH1 de IgGI que tenía la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39. Para demostrar que los diseños abTCR también funcionan con dominios CH1 de otras cadenas pesadas de inmunoglobulina, se llevaron a cabo ensayos de destrucción de células diana como se ha descrito anteriormente usando constructos basados en un anticuerpo anti-AFP158/HLA-A*02:01 que tenía dominios CH1 de IgGI (SEQ ID NO: 39), IgG2 (SEQ ID NO: 60, 61, o 62), IgG3 (SEQ ID NO: 63), o IgG4 (SEQ ID NO: 64). Se probaron las células T transducidas con los abTCR para determinar la unión del tetrámero AFP158 como indicación de la expresión de superficie (Tabla 4) y se probó su capacidad para destruir células HepG2 (AFP+/HLA-A2+), SK-HEP-1 (AFP-/HLA-A2+), y SK-HEP-1-AFP-MG (SK-HEP-1 transducida con un minigen de AFP). La lisis específica se midió después de 6 horas de incubación usando el ensayo de citotoxicidad no radiactiva Cytox 96 (Promega). Como se muestra en la FIG. 27, las células T transducidas con cualquiera de los abTCR con la fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01 dirigieron la destrucción de las líneas celulares positivas para el antígeno HepG2 y SK-HEP-1-AFP-MG, pero no provocaron la destrucción de la línea celular negativa para antígeno SK-HEP-1. Es importante destacar que, aunque la expresión en superficie de los abTCR que contenían dominios CH1 no de IgG1 era inferior a la de los abTCR que contenían dominios CH1 de IgG1 (consultar la Tabla 4), dieron como resultado niveles similares de destrucción de células diana, lo que sugiere que pueden tener propiedades funcionales mejoradas.

Tabla 4. Ex resión su erficial de abTCR

Ejemplo 9. Caracterización de actividades biológicas de células T transducidas con abTCR que contienen dominios coestimuladores

Para demostrar la viabilidad de los diseños de abTCR que incluyen dominios coestimuladores C-terminales, se diseñaron varios constructos de abTCR anti-AFP158/HLA-A*02:01 usando fragmentos coestimuladores derivados de CD28 y/o 4-1BB (FIG. 28). Los abTCR consistían en una subunidad quimérica de TCRy que contenía la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36 y una subunidad quimérica de TCR8 que contenía la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35. Las subunidades de abTCR que tenían un dominio coestimulador CD28 tenían la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70 fusionada a su extremo C-terminal, y las subunidades que tenían un dominio coestimulador de 4-1BB tenían la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 71 fusionada a su extremo C-terminal. Los constructos de abTCR se transdujeron en células J.RT3-R3.5, y el rescate de la expresión de abTCR y de la expresión de superficie de CD3 se ensayaron como se ha descrito anteriormente mediante citometría de flujo. Los resultados se resumen en la Tabla 5. La expresión de los abTCR y su capacidad para rescatar la expresión de CD3 fue similar entre los distintos constructos de abTCR con y sin dominios coestimuladores. En otro experimento, se transdujeron células T primarias con los constructos de abTCR y se analizaron mediante citometría de flujo para la expresión de CD8 y la unión del tetrámero AFP158 (Tabla 6). Las células T primarias transducidas con los abTCR se separaron para la unión del tetrámero AFP158 y la expresión de CD4 o c D8 y se analizaron por citometría de flujo para la expresión de CCR7, CD45RA, CD28 y Granzima B (Tabla 7). Estos resultados muestran que la transducción viral y la diferenciación de las células T transducidas fueron similares entre los varios constructos de abTCR con y sin dominios coestimuladores. Los ensayos de destrucción de células diana se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente usando los constructos de abTCR. Se ensayaron las células T transducidas con los abTCR para determinar su capacidad de destruir células HepG2 (AFP+/HLA-A2+), SK-HEP-1 (AFP-/HLA-A2+), y SK-HEP-1-AFP-MG (SK-HEP-1 transducida con un minigén de AFP). Como se muestra en la FIG. 29, las células T transducidas con cualquiera de los abTCRs dirigieron la muerte de las líneas celulares positivas para el antígeno HepG2 y SK-HEP-1-AFP-MG, pero no llevaron a la destrucción de la línea celular negativa para el antígeno SK HEP-1.

Para caracterizar adicionalmente los constructos de abTCR que contienen dominios coestimuladores, las células T transducidas con los varios abTCR se agruparon en 4 poblaciones diferentes (CD8+/abTCR+; CD8+/abTCR-; CD4+/abTCR+; CD4+/abTCR-) y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la expresión de los marcadores de agotamiento de células T PD-1, TIM-3 y LAG-3 tras la incubación con células HepG2, SK-HEP-1 y SK-HEP-1-AFP-MG. Las células T transducidas con los distintos abTCR que contenían dominios coestimuladores C-terminales no mostraron un agotamiento de células T significativamente mayor tras la activación por las células positivas para la diana HepG2 y SK-HEP-1-AFP-MG en comparación con las células T transducidas con el abTCR que carecía de dominios coestimuladores (datos no mostrados). Se usaron células T transducidas con los distintos abTCR en un ensayo de liberación de citoquinas como el descrito anteriormente, coincubándolas con células SK-HEP-1 y SK-HEP-1-AFP-MG. Se midió un panel de cuatro citoquinas humanas (IL-2, GM-CSF, IFN-<y>, TNF-a) después de 16 horas. Todas las citoquinas analizadas se detectaron en el medio de las células T transducidas con abTCR después de la coincubación con células AFP+ SK-HEP-1-AFP-MG, pero no con células AFP' SK-HEP-1 (FIG. 30). Las células T transducidas con los varios abTCR que contenían dominios coestimuladores C-terminales no mostraron un aumento significativo de la liberación de citoquinas después de la activación por las células SK-HEP-1-AFP-MG positivas para la diana en comparación con las células T transducidas con el abTCR que carecía de dominios coestimuladores, y en algunos casos mostraron una liberación de citoquinas reducida.

Los experimentos de destrucción de células diana, agotamiento de células T y liberación de citoquinas se repitieron usando constructos de abTCR anti-CD19 diseñadas usando fragmentos coestimuladores derivados de CD28 y/o 4-1BB como se ha descrito anteriormente y se representan en la FIG. 28. Los abTCR consistían en una subunidad quimérica de TCRy que contenía la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54 y una subunidad quimérica de TCR8 que contenía la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56. Al igual que los constructos de abTCR anti-AFP158/HLA-A*02:01, las células T transducidas con los abTCR anti-CD19 que contenían dominios coestimuladores se comportaron de manera similar a las células T transducidas con el constructo abTCR anti-CD19 sin ningún dominio coestimulador (FIGS. 31 y 32).

Tabla 5. Ex resión de su erficie de abTCR CD3

Tabla 6. Ex resión de su erficie de CD8 abTCR

Tabla 7. Ex resión de su erficie de CCR7 CD45RA CD28 Granzima B en células T abTCR CD4+ CD8+

Ejemplo 10. Estudios de eficacia in vivo de células T transducidas con abTCR

A c t i v i d a d a n t i t u m o r a l i n v i v o p a r a e l a n t i c u e r p o a n t i - A F P 158 / H L A - A * 02 : 01 e n u n m o d e l o d e x e n o i n j e r t o d e c a r c i n o m a h e p a t o c e l u l a r h u m a n o

La actividad antitumoral in vivo de las células T transducidas con constructos de abTCR-6MD que contienen una fracción de unión anti-AFP158/HLA-A*02:01 (SEQ ID NO: 35 y 36) se probó usando un modelo subcutáneo (s.c.) de SK-HEP-1-AFP-MG en ratones SCID-beige. Las células SK-h Ep -1- AFP-MG se implantaron s.c. sobre el costado derecho de los ratones SCID-beige a 5 x 106 células por ratón. Cuando el volumen tumoral medio alcanzó los 100 mm3, los animales se aleatorizaron sobre la base del volumen tumoral a dos grupos (con 8 ratones por grupo) que recibieron: (i) células T transducidas de manera simulada y (ii) células T transducidas con abTCR. Los animales se trataron inmediatamente después de la aleatorización mediante la inyección de 107 transducidas de manera simulada o con abTCR por ratón, por vía intravenosa (i.v.) una vez cada dos semanas, para tres dosis. Se monitorizó estrechamente el estado de salud general de los ratones, las posibles respuestas adversas, si las hubo, y los cambios en el volumen tumoral. Tanto las células T simuladas como las transducidas con abTCR fueron bien toleradas a la dosis y el calendario actuales. No se observaron cambios en el peso corporal relacionados con la dosificación a lo largo del estudio (FIG. 33). Aunque los tumores SK-HEP-1-AFP-MG siguieron creciendo tras la administración i.v. de células T transducidas de manera simulada o con abTCR, la tasa de crecimiento de los tumores tratados con células T transducidas con abTCR fue más lenta en comparación con los tumores tratados con células T simuladas. Como se muestra en la FIG. 34A, la separación de las curvas de crecimiento tumoral comenzó a los 20 días después del inicio de la dosificación. En el día 31, se observó una inhibición del crecimiento del 23% en los tumores tratados con células T transducidas con abTCR (prueba t, p=0,018).

La actividad antitumoral de las células T transducidas con abTCR se evaluó además en tumores SK-HEP-1-AFP-MG s.c. de mayor tamaño. En un estudio con ratones portadores de tumores SK-HEP-1-AFP-MG, los animales se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos cuando el volumen tumoral medio alcanzó los 300 mm3 (n=4 ratones por grupo). Los animales no recibieron tratamiento o recibieron una única inyección intratumoral (i.t.) de 107 células T transducidas por abTCR por ratón. Como se muestra en la FIG. 34B, la administración i.t. de células T transducidas con abTCR ralentizó el crecimiento de los tumores SK-HEP-1-AFP-MG grandes, según se mide por el cambio en el volumen tumoral a lo largo del tiempo. La comparación de las áreas bajo la curva entre los tumores SK-HEP-1-AFP-MG grandes no tratados y los tratados con células T transducidas con abTCR mostró una diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos (prueba t de dos colas, p=0,04). En conjunto, tanto la administración i.v. como la i.t. de células T transducidas con abTCR inhibió significativamente el crecimiento de xenoinjertos s.c. establecidos de SK-HEP-1-AFP-MG.

A c t i v i d a d a n t i t u m o r a l in v i v o d e l a n t i c u e r p o a n t i - C D 19 e n u n m o d e l o d e x e n o i n j e r t o d e l i n f o m a

Se probó la actividad antitumoral in vivo de las células T transducidas con CAR y abTCR con una fracción de unión a anticuerpo anti-hCD19 ejemplar en el modelo de xenoinjerto de linfoma humano CD19 positivo en ratones NOD SCID gamma (NSG). Las células Raji-luc-GFP se adquirieron de Comparative Biosciences, Inc. (Sunnyville, California 94085) y se cultivaron en medio RPMI+ FBS al 10% y L-Glutamina al 1% a 37°C en atmósfera humidificada con 5% de CO2. Las células Raji-luc-GFP se derivan de la línea celular de linfoma de Burkitt positivo para CD19, Raji, después de la transfección estable con genes informadores duales que codifican tanto la luciferasa de luciérnaga (luc) como la proteína verde fluorescente, lo que da como resultado células que pueden rastrearse in vivo usando imagenología bioluminiscente. Los ratones NSG se adquieren de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME USA 04609) y se aclimatan durante por lo menos 7 días antes del experimento. Las células Raji-luc-GFP se vuelven a suspender en PBS y se implantan por vía intravenosa (i.v.) en ratones NSG a través de la vena de la cola a 1 x 106 células/100 jI/ratón. Cinco días después de la implantación del tumor, se toman imágenes de los animales usando el sistema de imagenología Xenogen IVIS para evaluar la carga tumoral. Los ratones se distribuyen aleatoriamente en función de la emisión de fotones en los cuatro grupos siguientes con una emisión media de fotones de 6,7 x 105 fotones (n= 6 ratones por grupo): (i) sin tratamiento, (ii) células T humanas transducidas de manera simulada, (iii) tratados con CAR-T anti-CD19 y (iv) tratados con células T abTCR anti-hCD19. Los animales se tratan i.v. con células CAR t simuladas o anti-CD19 inmediatamente después de la aleatorización a una dosis de 107 células por ratón, una vez cada dos semanas durante 3 dosis.

Después de la dosificación los animales se monitorizan estrechamente. Se toman imágenes bioluminiscentes mediante el sistema Xenogen IVIS una vez a la semana durante un máximo de 8 semanas.

Los estudios en animales se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente para evaluar las capacidades antitumorales in vivo de las células T transducidas con abTCR-6MD que tienen fracciones de unión anti-CD19.

En este estudio se usaron ratones NSG hembra de 6-8 semanas de edad. La línea celular Raji-luc-GFP se cultivó en medio RPMI FBS al 10% y L-Glutamina al 1% a 37°C en un ambiente humidificado con un 5% de CO2. Las células Raji-luc-GFP se volvieron a suspender en PBS y se implantaron i.v. en 40 ratones NSG a 1 x 106 células/100|jl/ratón.

A los cuatro días de la implantación del tumor, se tomaron imágenes de los ratones usando el Ivis Spectrum para confirmar el crecimiento del tumor. A continuación, los ratones se distribuyeron aleatoriamente, sobre la base de la emisión de fotones, en seis grupos para los siguientes tratamientos (n=6 ratones/grupo): 1) Vehículo (PBS); 2) Simulacro (8x106 células T transducidas de manera simulada); 3) Clon 5 abTCR (8x106 células T transducidas con un abTCR-6MD que tiene una fracción de unión de clon 5 anti-CD19 que comprende secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 42 y 54); 4) Clon 5-3 abTCR (8x106 células T transducidas con un abTCR-6MD que tiene una fracción de unión del clon 5-3 anti-CD19 que comprende secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 42 y 43); 5) Clon 5-9 abTCR (8x106 células T transducidas con un abTCR-6MD que tiene una fracción de unión del clon 5-9 anti-CD19 que comprende secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 55 y 54); y 6) Clon 5-13 abTCR (8x106 células T transducidas con un abTCR-6MD que tiene una fracción de unión de clon 5-13 anti-CD19 que comprende secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 56 y 54).

Se monitorizó a los animales estrechamente después de la implantación del tumor y la dosificación con 8 millones de células T receptoras positivas. Se pesaron los animales y se realizó imagenología Xenogen dos veces por semana durante la duración del estudio. Los animales que mostraron las siguientes condiciones se sacrificaron y se registró como "muerte condicional": a) respuesta adversa aguda: respiración dificultosa, temblor, comportamiento pasivo (pérdida de apetito y letargo); b) pérdida de peso corporal superior al 25% del peso corporal inicial; y c) parálisis de las extremidades que afectan al movimiento del ratón.

Los resultados de este experimento se representan en la FIG. 35, que representa la emisión de flujo total del tumor frente a los días posteriores a la dosificación con células abTCR o controles. Las 4 células T CD19-abTCR se dirigieron y se lisaron los tumores Raji positivos para CD19s in vivo, demostrando la eficacia de los anticuerpos anti CD19 en la plataforma abTCR para inhibir el crecimiento tumoral.

En otro experimento, se trataron ratones NSG sin tumores implantados con 8x106 células T transducidas con un abTCR-6MD anti-CD19 o un CAR anti-CD19 con las mismas secuencias de unión, y se comparó el efecto de estas células T transducidas in vivo. Los ratones tratados con las células T anti-CD19 CAR murieron en el plazo de 24 horas, mientras que los ratones tratados con las células T anti-CD19 abTCR sobrevivieron después de 5 semanas. Este resultado indica que las células T que expresan constructos de abTCR son más seguras que las que expresan CAR.

Comparación de abTCR anti-CD19 y CAR anti-CD19

Se implantaron células de linfoma de células B Raji-luc-GFP en ratones NSG como se ha descrito anteriormente. A continuación, se inyectaron a los ratones 5 x 106 células T de abTCR+ transducidas con el clon 5-13 abTCR-6MD (abTCR-6MD con una fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13 que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 56 y 54), 5 x 106 células T CAR+ transducidas con CAR de clon 5-13 (CAR que tiene la fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13), o 5 x 106 células T simuladas en grupos de ocho ratones por muestra de inyección. 24 horas después de la implantación de células T se recogió suero y se midió la concentración de citoquinas humanas en el suero usando la máquina Luminex Magpix, como se ha descrito anteriormente. Los resultados de la medición de citoquinas se muestran en la FIG. 36. La carga tumoral se midió mediante la actividad de luciferasa como se ha descrito anteriormente y los resultados se muestran en las FIGS. 37 (cuantificación) y 27 (imagenología).

En una comparación directa entre las células CAR del clon 5-13 y las células T abTCR del clon 5-13, las células T abTCR inyectadas en ratones produjeron una regresión tumoral rápida en comparación con las células T CAR en puntos temporales tempranos, mientras que los ratones a los que se les inyectaron células T CAR no mostraron regresión tumoral hasta después de aproximadamente cinco días. A lo largo de este experimento, las células T abTCR del clon 5-13 mostraron una mayor eficacia de inhibición tumoral in vivo que las células T del clon 5 13 CAR. Los resultados de la medición de citoquinas a las 24 horas indican que los ratones tratados con células T abTCR del clon 5-13 también tuvieron niveles de secreción de citoquinas reducidos que los ratones tratados con células T CAR. Estos resultados proporcionan pruebas de que la eficacia antitumoral no necesita una sobreproducción de citoquinas, ya que las células T de abTCR tienen una mayor potencia de inhibición tumoral pero menores efectos secretores de citoquinas que las células T CAR.

A las 7 semanas después de la implantación del tumor, ninguno de los ratones tratados con células T de abTCR del clon 5-13 tenía tumores detectables. En este momento, 3 ratones del grupo tratado con células T simuladas y 3 ratones del grupo tratado con células T abTCR del clon 5-13 se volvieron a desafiar mediante implantación i.v. con 5 x 105 células de linfoma Raji. La carga tumoral se midió mediante la actividad de luciferasa como se ha descrito anteriormente y los resultados se muestran en la FIG. 39. Mientras que los tumores crecieron rápidamente en los ratones del grupo tratado con células T simuladas, el tratamiento previo con células T transducidas con abTCR del clon 5-13 impidió el crecimiento de tumores tras un nuevo desafio con la implantación de células de linfoma Raji, lo que indica que las células T transducidas con abTCR persistieron y mantuvieron su capacidad de responder al antígeno.

En otro experimento, se recogió suero de ratones NSG 24 horas después de la inyección de 5 x 106 células T abTCR-6MD del clon 5-3 (abTCR-6MD con fracción de unión anti-CD19 del clon 5-3 que comprende secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 42 y 43) o 5 x 106 células T CAR del clon 5-3 (CAR con fracción de unión anti-CD19 del clon 5-3, SEQ ID NO: 44). La concentración de citoquinas en el suero del ratón se midió como se ha descrito anteriormente. Se observaron niveles elevados de citoquinas humanas derivadas de células T y de IL-6 derivada de ratones en ratones tratados con células T CAR del Clon 5-3. Por el contrario, los ratones tratados con abTCR del clon 5- 3 mostraron unos niveles séricos de citoquinas drásticamente inferiores (datos no mostrados), lo que proporciona una prueba más del efecto reducido sobre la sobreproducción de citoquinas de las células T de abTCR.

A c t i v i d a d a n t i t u m o r a l in v i v o d e l a n t i c u e r p o a n t i - C D 19 e n u n m o d e l o d e x e n o i n j e r t o d e l e u c e m i a

Se probó la actividad antitumoral in vivo de células T transducidas con un CAR o abTCR que contiene una fracción de unión a anticuerpos anti-hCD19 ejemplar en un modelo de xenoinjerto de leucemia humana positiva para CD19 en ratones NSG. Las células NALM-6-luc-GFP fueron un regalo del laboratorio de Eric Smith en el Memorial Sloan Kettering Cancer Center y se cultivaron en medio RPMI+ FBS al 10% a 37°C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Las células NALM-6-luc-GFP se derivan de la línea celular de leucemia linfoblástica aguda positiva para CD19, NALM-6, después de la transfección estable con genes informadores duales que codifican tanto la luciferasa de luciérnaga (luc) como la proteína verde fluorescente, lo que da como resultado células que pueden rastrearse in vivo usando imagenología bioluminiscente. Los ratones<n>S<g>se adquirieron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME USA 04609) y se aclimataron por lo menos 3 días antes del experimento. Las células NALM-6-luc-GFP se volvieron a suspender en PBS y se implantaron por vía intravenosa (i.v.) en treinta ratones NSG hembra de 6- 8 semanas de edad a través de la vena de la cola a 5 x 105 células/100 pI/ratón. Cuatro días después de la implantación del tumor, se tomaron imágenes de los animales usando el sistema de imagenología Xenogen IVIS para evaluar la carga tumoral. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente sobre la base de la emisión de fotones en los cuatro grupos siguientes: (i) Vehículo, sólo PBS (n= 6 ratones); (ii) 10 x 106 células T humanas transducidas de manera simulada (n= 6 ratones); (iii) 5 x 106 células T CAR de clon 5-13 (células T transducidas con un CAR con una fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13) (n= 8 ratones); y iv) 5 x 106 células T abTCR-6MD del clon 5-13 (células T transducidas con un abTCR-6MD con una fracción de unión anti-CD19 del clon 5-13 que comprende secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 56 y 54) (n= 8 ratones).

Los animales se monitorizaron estrechamente después de la implantación del tumor y la dosificación con células T receptoras positivas. Se pesaron los animales y se realizó imagenología Xenogen dos veces por semana durante la duración del estudio. Los animales que mostraban las siguientes condiciones se sacrificaron y se registró como "muerte condicional": a) respuesta adversa aguda: respiración dificultosa, temblor, comportamiento pasivo (pérdida de apetito y letargo); b) pérdida de peso corporal superior al 25% del peso corporal inicial; y c) parálisis de las extremidades que afectan al movimiento del ratón.

Los resultados de este experimento se representan en la FIG. 40, que traza las emisiones de flujo total derivadas de tumor medias para cada brazo de tratamiento frente a días postratamiento. Tanto las células T de abTCR del clon 5-13 como las células T CAR del clon 5-13 se dirigieron y lisaron los tumores NALM-6 positivos para CD19 in vivo, demostrando la eficacia de los anticuerpos anti-CD19 en la plataforma abTCR para inhibir el crecimiento tumoral en múltiples modelos de cáncer.

A las 24 horas después del tratamiento, se extrajo sangre de 3 ratones por grupo para mediciones de citoquinas, y los resultados se muestran en la FIG. 41. Al igual que con el modelo de xenoinjerto de linfoma, el tratamiento con células T de abTCR anti-CD19 en este modelo de xenoinjerto de leucemia dio como resultado niveles más bajos de secreción de citoquinas que el tratamiento con células T c Ar anti-CD19.

A los 7 y 13 días después del tratamiento, se recogió sangre de ratones representativos de cada grupo y se analizó por citometría de flujo usando el kit "123count eBeads" de Affymetrix eBioscience, Inc. para determinar el número de células T CD3+, células T que expresan CAR/abTCR y células tumorales por pl de sangre, y el nivel de expresión de PD-1 en las células T. A los 13 días después del tratamiento, se sacrificaron 2 ratones por grupo y se analizaron los extractos de médula ósea por citometría de flujo para detectar células T CD3+/CAR/abTCR y la presencia de células tumorales y los niveles de expresión de PD-1 en las células T.

A los ratones que se les habían administrado células T de abTCR tenían niveles más altos de células T que expresaban receptores quiméricos en la sangre tanto el día 7 como el 13 después de la administración que lo observado para los ratones a los que se les habían administrado células T CAR (FIG. 42), lo que indica que las células T de abTCR tenían niveles más altos de viabilidad y/o proliferación que sus células T CAR homólogas en este modelo. Como se muestra en las FIGS. 43 y 44, mientras que los ratones tratados con células T CAR o células T de abTCR mostraron una reducción de células tumorales (indicada por la tinción FITC) tanto en sangre periférica como en médula ósea en comparación con los animales de control tratados con vehículo y simulado a los 13 días después del tratamiento, la reducción de células tumorales tanto en sangre periférica como en médula ósea fue mayor para los animales tratados con células T de abTCR. Como se muestra en las FIGS. 45 y 46, el nivel de expresión de PD-1, un marcador de agotamiento de células T, en la superficie de las células T de la sangre periférica y la médula ósea fue menor en los ratones tratados con células T de abTCR que en los tratados con células T CAR, y comparables a los niveles observados en ratones tratados de manera simulada, tanto para células T CD4+ como CD8+. Estos resultados sugieren que las células T que expresan abTCR pueden tener menos probabilidades de agotarse que las células T que expresan CAR.

Listado de secuencias

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Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula quimérica de anticuerpo-receptor de células T (TCR) (abTCR) que se une específicamente a un antígeno diana, que comprende:

a) una primera cadena polipeptídica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende los dominios de anticuerpos Vh y Ch1 y un primer dominio de receptor de células T (TCRD) que comprende un primer dominio transmembrana de una primera subunidad de TCR, en donde la primera cadena polipeptídica carece de dominios variables y constantes de la primera subunidad de TCR; y

b) una segunda cadena polipeptídica que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende los dominios de anticuerpo Vl y Cl y un segundo TCRD que comprende un segundo dominio transmembrana de una segunda subunidad de TCR, en donde la segunda cadena polipeptídica carece de los dominios variable y constante de la segunda subunidad de TCR,

en donde los dominios V<h>y C<h>1 del primer dominio de unión a antígeno y los dominios V<l>y C<l>del segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno diana, en donde el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular o un complejo que comprende un péptido y una proteína del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), en donde

(i) la primera subunidad de TCR es una cadena a de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena p de TCR;

(ii) la primera subunidad de TCR es una cadena<y>de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena a de TCR;

(iii) la primera subunidad de TCR es una cadena y de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena 8 de TCR; o

(iv) la primera subunidad de TCR es una cadena 8 de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena<y>de TCR,

y en donde el primer TCRD y el segundo TCRD forman un módulo receptor de células T (TCRM) que es capaz de reclutar por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR; en donde opcionalmente el módulo de unión a antígeno comprende un enlace disulfuro entre un residuo en el dominio Ch1 y un residuo en el dominio Cl.

2. El abTCR de la reivindicación 1, en donde:

(i) la primera cadena polipeptídica comprende además un primer conector peptídico entre el primer dominio de unión a antígeno y el primer TCRD; y/o

(ii) la segunda cadena polipeptídica comprende además un segundo conector peptídico entre el segundo dominio de unión a antígeno y el segundo TCRD,

en donde opcionalmente el primer conector peptídico y/o el segundo conector peptídico tienen, individualmente, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud.

3. El abTCR de la reivindicación 1 o 2, en donde:

(i) el antígeno diana es un antígeno de la superficie celular, en donde:

(1 ) el antígeno de la superficie celular se selecciona del grupo que consiste en proteínas, hidratos de carbono y lípidos; y/o

(2) el antígeno de la superficie celular es CD19, ROR1, ROR2, BCMA, GPRC5D o FCRL5, o

(ii) el antígeno diana es un complejo que comprende un péptido y una proteína del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), y en donde el péptido del complejo de antígeno diana se deriva de una proteína seleccionada del grupo que consiste en WT-1, AFP, HPV16-E7, NY-ESO-1, PRAME, EBV-LMP2A, HIV-1 y PSA.

4. El abTCR de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde:

(i) la primera subunidad de TCR es una cadena y de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena 8 de TCR, o la primera subunidad de TCR es una cadena 8 de TCR, y la segunda subunidad de TCR es una cadena y de TCR; y/o

(ii) el primer TCRD comprende además un primer péptido de conexión o fragmento del mismo de una subunidad de TCR N-terminal al primer dominio transmembrana, y/o el segundo TCRD comprende además un segundo péptido de conexión o fragmento del mismo de una subunidad de TCR N-terminal al segundo dominio transmembrana.

5. El abTCR de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde:

(a) el antígeno diana es un complejo que comprende un péptido AFP y una proteína del MHC I, el dominio VH de anticuerpo comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 38, y el dominio VL comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 40;

(b) el antígeno diana es un complejo que comprende un péptido NY-ESO-1 157-165 y una proteína del MHC I, el dominio VH del anticuerpo comprende la secuencia de la<s>E<q>ID NO: 72, y el dominio VL comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 73; o

c) el antígeno diana es CD19, el dominio VH de anticuerpo comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 59, y el dominio VL comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 57.

6. El abTCR de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el antígeno diana es CD19.

7. El abTCR de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno forman un módulo de unión a antígeno tipo Fab que se une específicamente al antígeno diana, y en donde:

a) el primer TCRD y el segundo TCRD comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 15 y 16; b) el primer TCRD y el segundo TCRD comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 17 y 18; c) el primer TCRD y el segundo TCRD comprenden las secuencias de aminoácidos de las

SEQ ID NO: 19 y 20; o d) el primer TCRD y el segundo TCRD comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 21 y 22.

8. El ácido nucleico o los ácido nucleicos que codifican la primera y la segunda cadenas polipeptídicas del abTCR de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un complejo que comprende el abTCR de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y por lo menos un módulo de señalización asociado al TCR seleccionado del grupo que consiste en CD38e, CD3ye y ZC en donde opcionalmente el complejo es un octámero que comprende el abTCR y CD38e, CD3ye y ZZ.

10. Una célula efectora que presenta en su superficie el abTCR de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el complejo de la reivindicación 9, o que comprende el o los ácidos nucleicos de la reivindicación 8, en donde la célula efectora está modificada para bloquear o disminuir la expresión de una primera subunidad del TCR endógena y/o una segunda subunidad del t Cr endógena, opcionalmente:

(i) en donde:

(1) la primera subunidad de TCR es TCRa y la segunda subunidad de TCR es TCRp; o

(2) la primera subunidad de TCR es TCRp y la segunda subunidad de TCR es TCRa; y

en donde la célula efectora es una célula T ap modificada para bloquear o disminuir la expresión de TCRa y/o TCRp; o

(ii) en donde:

(1) la primera subunidad de TCR es TCR<y>y la segunda subunidad de TCR es TCRS ; o

(2) la primera subunidad de TCR es TCRS y la segunda subunidad de TCR es TCR<y>; y

en donde la célula efectora es una célula T<y>§ modificada para bloquear o disminuir la expresión de TCR<y>y/o TCRS.

11. Una célula efectora que presenta en su superficie el abTCR de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el complejo de la reivindicación 9, o que comprende el o los ácidos nucleicos de la reivindicación 8, y en donde la célula efectora no expresa la primera subunidad del TCR y/o la segunda subunidad del TCR, opcionalmente:

(i) en donde:

(1) la primera subunidad de TCR es TCRa y la segunda subunidad de TCR es TCRp; o

(2) la primera subunidad de TCR es TCRp y la segunda subunidad de TCR es TCRa; y

en donde la célula efectora es una célula T<y>§; o

(ii) en donde:

(1) la primera subunidad de TCR es TCR<y>y la segunda subunidad de TCR es TCRS ; o

(2) la primera subunidad de TCR es TCRS y la segunda subunidad de TCR es TCR<y>; y

en donde la célula efectora es una célula T ap.

12. La célula efectora de la reivindicación 10 o de la reivindicación 11, en donde la célula efectora es una célula CD3+, en donde opcionalmente la célula CD3+ se selecciona del grupo que consiste en una célula T citotóxica, una célula T auxiliar, una célula T asesina natural y una célula T supresora.

13. La célula efectora de cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en donde:

(i) la célula efectora comprende:

(1 ) a) un primer vector que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR bajo el control de un primer promotor y b) un segundo vector que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR bajo el control de un segundo promotor;

(2) un vector que comprende: a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR bajo el control de un primer promotor; y b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR bajo el control de un segundo promotor; o

(3) un vector que comprende: a) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena polipeptídica del abTCR y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena polipeptídica del abTCR, en donde la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico están bajo el control de un único promotor; y/o

(ii) la expresión de la primera cadena polipeptídica del abTCR es más de dos veces diferente que la expresión de la segunda cadena polipeptídica del abTCR.

14. Un método para destruir una célula diana que presenta un antígeno diana, en donde el método comprende poner en contacto la célula diana in vitro con la célula efectora de cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en donde el abTCR se une específicamente al antígeno diana.

15. Una composición farmacéutica que comprende el abTCR de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el o los ácidos nucleicos de la reivindicación 8, o la célula efectora de cualquiera de las reivindicaciones 10-13, y un portador farmacéuticamente aceptable.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, para su uso en un método de:

(i) tratar el cáncer en un individuo que lo necesite, en donde opcionalmente el cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma adrenocortical, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, colangiocarcinoma, cáncer colorrectal, cáncer esofágico, glioblastoma, glioma, carcinoma hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, leucemia, linfoma, cáncer de pulmón, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de páncreas, feocromocitoma, plasmocitoma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, sarcoma, cáncer de estómago, cáncer de útero y cáncer de tiroides; o

(ii) tratar una infección vírica en un individuo que lo necesite, en donde opcionalmente la infección vírica está provocada por un virus seleccionado del grupo que consiste en Citomegalovirus (CMV), Virus de Epstein-Barr (EBV), Virus de la Hepatitis B (HBV), Herpesvirus asociado al Sarcoma de Kaposi (KSHV), Virus del papiloma humano (HPV), Virus de molusco contagioso (MCV), virus de la leucemia de células T humanas 1 (HTLV-1), VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) y virus de la hepatitis C (VHC).