ES2979344T3 - Ratones transgénicos que expresan dominios variables de cadena ligera de inmunoglobulina lambda humana - Google Patents

Ratones transgénicos que expresan dominios variables de cadena ligera de inmunoglobulina lambda humana Download PDF

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Abstract

La invención describe métodos para la generación de anticuerpos quiméricos humanos-no humanos y cadenas de anticuerpos quiméricos, anticuerpos y cadenas de anticuerpos así producidos, y derivados de los mismos incluyendo anticuerpos totalmente humanizados; composiciones que comprenden dichos anticuerpos, cadenas de anticuerpos y derivados, así como células, mamíferos no humanos y vectores, adecuados para su uso en dichos métodos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Ratones transgénicos que expresan dominios variables de cadena ligera de inmunoglobulina lambda humana
Antecedentes
La presente invención se refiere al uso de un ratón que se modifica genéticamente para que contenga ADN génico de inmunoglobulina humana exógeno para expresar cadenas ligeras de inmunoglobulina (Ig) que contienen regiones variables lambda humanas.
Con el fin de superar los problemas de humanización de anticuerpos, varias compañías han establecido la generación de ratones con sistemas inmunitarios humanos. La estrategia utilizada fue inactivar los loci de las cadenas pesada y ligera en células ES y complementar estas lesiones genéticas con transgenes diseñados para expresar los genes de las cadenas pesada y ligera humanas. Aunque podrían generarse anticuerpos completamente humanos, estos modelos tienen varias limitaciones importantes:
(i) El tamaño de los loci de las cadenas pesada y ligera (cada uno de varios Mb) hizo imposible introducir los loci completos en estos modelos. Como resultado, las líneas transgénicas recuperadas tenían un repertorio muy limitado de regiones V, faltaban la mayoría de las regiones constantes y no se incluyeron regiones potenciadoras distantes importantes en los transgenes.
(ii) La muy baja eficacia de generación de las líneas transgénicas de insertos grandes y la complejidad y el tiempo requerido para cruzar cada una de estas en las cepas con inactivación de cadena pesada y ligera y hacerlas homocigóticas de nuevo, restringieron el número de líneas transgénicas que podrían analizarse para la expresión óptima.
(iii) Las afinidades de anticuerpos individuales raramente alcanzaron aquellas que podrían obtenerse de animales intactos (no transgénicos).
El documento WO2007117410 divulga construcciones quiméricas para expresar anticuerpos quiméricos.
El documento WO2010039900 divulga células con inserción génica dirigida y mamíferos que tienen un genoma que codifica anticuerpos quiméricos.
El documento WO 2011163311 divulga ratones modificados genéticamente que expresan secuencias variables de A humana (hVA).
Popov AV et al, A human immunoglobulin lambda locus is similarly well expressed in mice and humans, J. Exp. Med., 1999 divulgan ratones transgénicos que portan una región de 380 kb del locus de la cadena ligera (L) A de inmunoglobulina (Ig) humana en configuración de la línea germinal. M-P Lefranc et al, IMGT repertoire (IG y TR) locus representation: mouse (Mus musculus), Molecular Biology of B Cells, 2012, divulgan el locus IGL de ratón.
La presente divulgación proporciona, entre otras cosas, un procedimiento para la generación en mamíferos no humanos de anticuerpos que comprenden una región variable de Ig humana, y proporciona adicionalmente modelos animales no humanos para la generación de tales anticuerpos.
Compendio
Todas las coordenadas de nucleótidos para el ratón son las correspondientes a NCBI m37 para la cepa C57BL/6J de ratón, p. ej., ENSEMBL Release 55.37h de abril de 2007, p. ej., NCBI37 de julio de 2007 (NCBI Build 37) (p. ej., versión de UCSC mm9 véase la Red Mundial(www)genome.ucsc.edu y la Red Mundial(www)genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html) a menos que se especifique lo contrario. Las coordenadas de nucleótidos humanos son las correspondientes a GRCh37 (p. ej., UCSC versión hg 19, Red Mundial (www) genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html), Feb 2009 ENSEMBL Release 55.37, o son las correspondientes a NCBI36, ENSEMBL Release 54, a menos que se especifique lo contrario. Los nucleótidos de rata son los correspondientes a RGSC 3.4 de diciembre de 2004 ENSEMBL Release, versión 55.34w, o Baylor College of Medicine HGSC v3.4 de noviembre de 2004 (por ejemplo, UCSC rn4, véase la Red Mundial (www) genome.ucsc.edu y la Red Mundial (www) genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html) a menos que se especifique lo contrario.
La invención se expone en las reivindicaciones. La invención reivindicada se refiere al uso de un ratón para expresar cadenas ligeras de inmunoglobulina (Ig) que contienen regiones variables humanas; sin embargo, otras divulgaciones, tales como métodos o mamíferos no humanos, se consideran útiles para entender la invención.
En la presente divulgación, se divulgan métodos para construir loci quiméricos humanos de cadenas pesada y ligera en un mamífero no humano, por ejemplo, un ratón. La referencia al trabajo en ratones en el presente documento se indica solo a modo de ejemplo, y se considera que la referencia a ratones incluye la referencia a todos los mamíferos no humanos a menos que sea evidente de otro modo a partir de la divulgación, prefiriéndose los ratones como mamífero no humano.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un mamífero no humano cuyo genoma comprende:
(a) una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión; y
(b) opcionalmente una o más regiones V de cadena ligera kappa de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa de mamífero no humano anfitrión y/o una o más regiones V de cadena ligera lambda de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de mamífero no humano anfitrión;
en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos, o cadenas ligeras o pesadas quiméricas, que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un mamífero no humano cuyo genoma comprende
(a) una pluralidad de regiones V de cadena ligera kappa de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa de mamífero no humano anfitrión y/o una pluralidad de regiones V de cadena ligera lambda de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de mamífero no humano anfitrión; y
(b) opcionalmente una o más regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión;
en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos, o cadenas ligeras o pesadas quiméricas, que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
En un aspecto, la divulgación se refiere a una célula de mamífero no humano cuyo genoma comprende
(a) una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión y
(b) opcionalmente una o más regiones V de cadena ligera kappa de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa de mamífero no humano anfitrión y/o una o más regiones V de cadena ligera lambda de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de mamífero no humano anfitrión.
En un aspecto, la divulgación se refiere a una célula de mamífero no humano cuyo genoma comprende
(a) una pluralidad de regiones V de cadena ligera kappa de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa de mamífero no humano anfitrión y/o una pluralidad de regiones V de cadena ligera lambda de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de mamífero no humano anfitrión; y
(b) opcionalmente una o más regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión;
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método para producir una célula o mamífero no humanos que comprende insertar en un genoma de célula de mamífero no humano, tal como un genoma de célula ES;
(a) una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión; y
(b) opcionalmente una o más regiones V de cadena ligera kappa de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa de mamífero no humano anfitrión y/o una o más regiones V de cadena ligera lambda de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de mamífero no humano anfitrión; respectivamente, siendo la inserción tal que la célula o mamífero no humanos sean capaces de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos que tengan una región constante de mamífero no humano y una región variable humana, en donde las etapas (a) y (b) pueden llevarse a cabo en cualquier orden y cada una de las etapas (a) y (b) se puede llevar a cabo de manera escalonada o como una única etapa. La inserción puede ser por recombinación homóloga.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método para producir un anticuerpo o cadena de anticuerpo específicos para un antígeno deseado, comprendiendo el método inmunizar un mamífero transgénico no humano como se divulga en el presente documento con el antígeno deseado y recuperar el anticuerpo o cadena de anticuerpo.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método para producir un anticuerpo completamente humanizado que comprende inmunizar un mamífero no humano transgénico como se divulga en el presente documento con el antígeno deseado, recuperar el anticuerpo o células que producen el anticuerpo y después reemplazar la región constante de mamífero no humano por una región constante humana, por ejemplo, mediante ingeniería de proteínas o ADN.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a anticuerpos y cadenas de anticuerpos humanizados producidos de acuerdo con la presente divulgación, tanto en forma quimérica (por ejemplo, ratón-humano) como totalmente humanizada, así como fragmentos y derivados de dichos anticuerpos y cadenas, y el uso de dichos anticuerpos, cadenas y fragmentos en medicina, incluyendo diagnóstico.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al uso de mamífero no humano como se describe en el presente documento como modelo para probar fármacos y vacunas.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un mamífero no humano cuyo genoma comprende:
(a) una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión; y
(b) opcionalmente una o más regiones V de cadena ligera kappa de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa de mamífero no humano anfitrión y/o una o más regiones V de cadena ligera lambda de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de mamífero no humano anfitrión;
en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos o cadenas de anticuerpos quiméricos que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un mamífero no humano cuyo genoma comprende:
(a) una pluralidad de regiones V de cadena ligera kappa de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa de mamífero no humano anfitrión y/o una pluralidad de regiones V de cadena ligera lambda de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de mamífero no humano anfitrión; y
(b) opcionalmente una o más regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la constante de mamífero no humano anfitrión;
en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
Opcionalmente, el genoma de mamífero no humano se modifica para prevenir la expresión de anticuerpos completamente específicos de la especie anfitriona.
En un aspecto, el ADN humano insertado comprende al menos 50% de los genes variables (V) de cadena pesada humanos, tales como al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y en un aspecto todos los genes V humanos.
En un aspecto, el ADN humano insertado comprende al menos 50% de los genes de diversidad (D) de cadena pesada humanos, tal como al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y en un aspecto todos los genes D humanos.
En un aspecto, el ADN humano insertado comprende al menos 50% de los genes de unión (J) de cadena pesada humanos, tal como al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y en un aspecto todos los genes J humanos.
En un aspecto, el ADN humano insertado comprende al menos 50% de los genes Variables (V) de la cadena ligera humana, tal como al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y en un aspecto todos los genes V de cadena ligera humana.
En un aspecto, el ADN humano insertado comprende al menos 50% de los genes de unión (J) de cadena ligera humana, tal como al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y en un aspecto todos los genes J de cadena ligera humana.
Los genes humanos insertados pueden obtenerse del mismo individuo o de diferentes individuos, o ser sintéticos o representar secuencias consenso humanas.
Aunque el número de regiones VD y J es variable entre individuos humanos, en un aspecto se considera que son 51 genes V humanos, 27 genes D y 6 genes J en la cadena pesada, 40 genes V humanos y 5 genes J en la cadena ligera kappa y 29 genes V humanos y 4 genes J en la cadena ligera lambda (Janeway y Travers, Immunobiology, tercera edición)
En un aspecto, el locus de la cadena pesada humana insertado en el mamífero no humano contiene el repertorio completo de regiones V, D y J humanas, que en el genoma está en ordenamiento funcional con las regiones constantes de mamífero no humano de manera que pueden producirse anticuerpos quiméricos funcionales entre las regiones variables humanas y constantes de mamífero no humano. Este material genético total de la cadena pesada humana insertado se denomina en el presente documento región VDJ de IgH humana, y comprende ADN de un genoma humano que codifica todos los exones que codifican las porciones V, D y J humanas y adecuadamente también los intrones asociados. De manera similar, la referencia a las regiones V y J de la cadena ligera kappa de Ig humana en el presente documento se refiere a ADN humano que comprende todos los exones que codifican las regiones V y J y adecuadamente también los intrones asociados del genoma humano. La referencia a las regiones V y J de la cadena ligera A de Ig humana en el presente documento se refiere a ADN humano que comprende todos los exones que codifican las regiones V y J y adecuadamente también los intrones asociados del genoma humano.
Las regiones variables humanas se insertan adecuadamente aguas arriba de una región constante de mamífero no humano, comprendiendo esta última todo el ADN requerido para codificar la región constante completa o una porción suficiente de la región constante para permitir la formación de un anticuerpo quimérico eficaz capaz de reconocer específicamente un antígeno.
En un aspecto, los anticuerpos o cadenas de anticuerpos quiméricos tienen una parte de una región constante del anfitrión suficiente para proporcionar una o más funciones efectoras observadas en anticuerpos que se producen de manera natural en un mamífero anfitrión, por ejemplo, que son capaces de interactuar con receptores de Fc, y/o unirse al complemento.
La referencia a un anticuerpo o cadena de anticuerpo quiméricos que tienen una región constante que no es de mamífero anfitrión en el presente documento por lo tanto no se limita a la región constante completa, sino que también incluye anticuerpos o cadenas quiméricos que tienen toda la región constante del anfitrión, o una parte de la misma suficiente para proporcionar una o más funciones efectoras. Esto también se aplica a mamíferos y células no humanos y métodos de la divulgación en los que el ADN de la región variable humana puede insertarse en el genoma del anfitrión de manera que forme una cadena de anticuerpo quimérico con toda o parte de una región constante del anfitrión. En un aspecto, la totalidad de una región constante del anfitrión está conectada operablemente al ADN de la región variable humana.
La región constante de mamífero no humano anfitrión en el presente documento es preferiblemente la región constante de tipo salvaje del anfitrión endógeno localizada en el locus de tipo salvaje, según sea apropiado para la cadena pesada o ligera. Por ejemplo, el ADN de la cadena pesada humana se inserta adecuadamente en el cromosoma 12 de ratón, adyacente adecuadamente a la región constante de la cadena pesada de ratón.
En un aspecto, la inserción del ADN humano, tal como la región VDJ humana, se dirige a la región entre el exón J4 y el locus Cp en el locus IgH del genoma de ratón, y en un aspecto se inserta entre las coordenadas 114.667.090 y 114.665.190, o en la coordenada 114.667.091, después de 114.667.090. En un aspecto, la inserción del ADN humano, tal como VJ de la cadena ligera kappa humana, se dirige al cromosoma 6 de ratón entre las coordenadas 70.673.899 y 70.675.515, adecuadamente en la posición 70.674.734, o una posición equivalente en el locus de ratón lambda en el cromosoma 16.
En un aspecto, la región constante de mamífero no humano anfitrión para formar el anticuerpo quimérico puede estar en un locus cromosómico diferente (no endógeno). En este caso, el ADN humano insertado, tal como la región o regiones VDJ o VJ variables humanas se puede insertar a continuación en el genoma no humano en un sitio que es distinto del de la región constante pesada o ligera que se produce de manera natural. La región constante nativa puede insertarse en el genoma, o duplicarse dentro del genoma, en un locus cromosómico diferente a la posición nativa, de manera que esté en un ordenamiento funcional con la región variable humana de manera que todavía puedan producirse anticuerpos quiméricos de la divulgación.
En un aspecto, el ADN humano se inserta en la región constante endógena de tipo salvaje del anfitrión localizada en el locus de tipo salvaje entre la región constante del anfitrión y la región VDJ del anfitrión.
La referencia a la localización de la región variable aguas arriba de la región constante de mamífero no humano significa que hay una localización relativa adecuada de las dos porciones de anticuerpo, variable y constante, para permitir que las regiones variable y constante formen un anticuerpo o cadena de anticuerpo quiméricosin vivoen el mamífero. Por tanto, el ADN humano insertado y la región constante del anfitrión están en ordenamiento funcional entre sí para la producción de anticuerpos o cadenas de anticuerpos.
En un aspecto, el ADN humano insertado es capaz de expresarse con diferentes regiones constantes del anfitrión a través del cambio de isotipo. En un aspecto, el cambio de isotipo no requiere o implica cambio en trans. La inserción del ADN de la región variable humana en el mismo cromosoma que la región constante del anfitrión relevante significa que no hay necesidad de cambio en trans para producir cambio de isotipo.
Como se ha explicado anteriormente, los loci transgénicos utilizados para los modelos de la técnica anterior eran de origen humano, por tanto, incluso en aquellos casos en los que los transgenes eran capaces de complementar el locus de ratón de modo que los ratones produjeran células B que producían anticuerpos completamente humanos, las afinidades de anticuerpos individuales raramente alcanzaron las que podían obtenerse de animales intactos (no transgénicos). La razón principal para esto (además del repertorio y los niveles de expresión descritos anteriormente) es el hecho de que los elementos de control del locus son humanos. Por lo tanto, los componentes de señalización, por ejemplo, para activar la hipermutación y la selección de anticuerpos de alta afinidad están comprometidos.
Por el contrario, en la presente invención, se mantienen las regiones constantes murinas y los potenciadores murinos y se mantiene otra secuencia de control, tal como una región de cambio, en ordenamiento funcional con la región constante murina, de manera que el efecto del potenciador u otra secuencia de control, tal como se observa en el ratón, se ejerce en su totalidad o en parte en el ratón transgénico. Este enfoque anterior se diseña para permitir muestrear la diversidad completa del locus humano, para permitir los mismos niveles de expresión altos que se lograrían mediante secuencias de control de mamífero no humano tales como potenciadores, y es tal que la señalización en la célula B, por ejemplo, cambio de isotipo utilizando sitios de recombinación de cambio, todavía utilizaría secuencias de mamífero no humano.
Un mamífero que tenga tal genoma produciría anticuerpos quiméricos con regiones variables humanas y constantes de mamífero no humano, pero estos podrían humanizarse fácilmente, por ejemplo, en una etapa de clonación. Por otra parte, la eficaciain vivode estos anticuerpos quiméricos pudo evaluarse en estos mismos animales.
En un aspecto, la región VDJ de IgH humana insertada comprende, en configuración de la línea germinal, todas las regiones V, D y J y secuencias intermedias de un ser humano.
En un aspecto, se insertan 800-1000 kb de la región VDJ de IgH humana en el locus IgH de mamífero no humano, y en un aspecto se inserta un fragmento de 940, 950 o 960 kb. Adecuadamente, esto incluye las bases 105.400.051 a 106.368.585 del cromosoma 14 humano.
En un aspecto, el fragmento humano de IgH insertado consiste en las bases 105.400.051 a 106.368.585 del cromosoma 14. En un aspecto, el ADN de la cadena pesada humana insertado, tal como el ADN que consiste en las bases 105.400.051 a 106.368.585 del cromosoma 14, se inserta en el cromosoma 12 de ratón entre el extremo de la región J4 de ratón y la región Eg, adecuadamente entre las coordenadas 114.667.090 y 114.665.190, o en la coordenada 114.667.091, después de 114.667.090. En un aspecto, la inserción se realiza entre las coordenadas 114.667.089 y 114.667.090 (las coordenadas se refieren a NCBI m37, para la cepa C57BL/6J de ratón), o en una posición equivalente en otro genoma de mamífero no humano.
En un aspecto, la región VJ kappa humana insertada comprende, en configuración de la línea germinal, todas las regiones V y J y secuencias intermedias de un ser humano. Adecuadamente, esto incluye las bases 88.940.356 a 89.857.000 del cromosoma 2 humano, adecuadamente aproximadamente 917 kb. En un aspecto adicional, el inserto VJ de cadena ligera puede comprender solo las agrupaciones proximales de segmentos V y segmentos J. Tal inserto sería de aproximadamente 473 kb. En un aspecto, el ADN de la cadena ligera kappa humana, tal como el fragmento IgK humano de las bases 88.940.356 a 89.857.000 del cromosoma 2 humano, se inserta adecuadamente en el cromosoma 6 de ratón entre las coordenadas 70.673.899 y 70.675.515, adecuadamente en la posición 70.674.734. Estas coordenadas se refieren a NCBI36 para el genoma humano, ENSEMBL Release 54 y NCBIM37 para el genoma de ratón, con relación a la cepa de ratón C57BL/6J.
En un aspecto, la región VJ lambda humana comprende, en configuración de la línea germinal, todas las regiones V y J y secuencias intermedias de un ser humano.
Adecuadamente, esto incluye bases análogas a las seleccionadas para el fragmento kappa, del cromosoma 2 humano.
Una célula o mamífero no humano de la divulgación, en un aspecto, comprende una inserción de ADN de la región variable de cadena pesada humana entre las coordenadas 114.666.183 y 114.666.725, tal como entre 114.666.283 y 114.666.625, opcionalmente entre las coordenadas 114.666.335 y 114.666.536, opcionalmente entre 114.666.385 y 114.666.486, o entre 114.666.425 y 114.666.446, o entre 114.666.435 y 114.666.436 del cromosoma 12 de ratón con referencia a NCBIM37 para el genoma de ratón, con relación a la cepa C57BL/6J de ratón o una posición equivalente del cromosoma 12 de ratón de una cepa de ratón diferente o una posición equivalente en el genoma de otro vertebrado no humano, p. ej., una rata. La inserción entre las coordenadas 114.666.435 y 114.666.436 relativas a la cepa de ratón C57BL/6J es equivalente a una inserción entre las coordenadas 1207826 y 1207827 en el cromosoma 12 con referencia a la secuencia genómica 129/SvJ del número de acceso GenBank® NT114985.2. Se puede realizar una inserción en una posición equivalente en otro genoma, tal como otro genoma de ratón. En un ejemplo de este aspecto, la célula o mamífero de la divulgación comprenden una región VDJ de IgH humana que comprende o consiste en los nucleótidos 106.328.851-107.268.544, tales como los nucleótidos 106.328.901-107.268.494, tales como los nucleótidos 106.328.941-107.268.454, tales como los nucleótidos 106.328.951-107.268.444 del cromosoma 14 humano, con referencia a la base de datos de secuencias GRCH37/hg19, o la inserción de nucleótidos equivalentes relacionados con el cromosoma 14 de una secuencia o base de datos humanas diferentes. La inserción humana se puede realizar entre las regiones indicadas anteriormente.
Una célula o mamífero de la divulgación, en un aspecto, comprende una inserción de la región VJ kappa humana, que comprende o consiste adecuadamente, en configuración de la línea germinal, en todas las regiones V y J y secuencias intermedias de un ser humano, realizándose la inserción del ADN humano entre las coordenadas 70.673.918 70.675.517, tal como entre las coordenadas 70.674.418 y 70.675.017, tal como entre las coordenadas 70.674.655-70, 674.856, tal como entre las coordenadas 70.674.705-70.674.906, tal como entre las coordenadas 70.674.745 70.674.766, tal como entre las coordenadas 70.674.755 y 70.674.756 del cromosoma 6 de ratón, numerándose con referencia a NCBIM37 para el genoma de ratón, con relación a la cepa C57BL/6J de ratón, o una inserción en una posición equivalente en otro genoma, tal como otro genoma de ratón. En un ejemplo de este aspecto, una célula o mamífero de la divulgación comprenden una inserción de los nucleótidos 89.159.079-89.630.437 y/o 89.941.714 90.266.976 del cromosoma 2 humano con referencia a la base de datos de secuencias GRCH37/hg19 (o nucleótidos equivalentes relacionados con el cromosoma 2 de una secuencia o base de datos humanas diferentes), tal como una inserción de estos 2 fragmentos discretos sin la secuencia intermedia, o una inserción de la región 89.159.079 90.266.976 completa.
La inserción puede comprender, o consistir en:
(i) nucleótidos 89.158.979-89.630.537, tales como 89.159.029-89.630.487, tales como 89.159.069-89.630.447, tales como 89.159.079-89.630.437, opcionalmente además del fragmento (ii) de más abajo
(ii) nucleótidos 89.941.614-90.267.076, tales como 89.941.664-90.267.026, tales como 89.941.704-90.266.986, tales como 89.941.714-90.266.976; opcionalmente además del fragmento (i)
(iii) nucleótidos 89.158.979-90.267.076, tales como los nucleótidos 89.59.079-90.266.976.
La inserción humana se puede realizar entre las regiones indicadas anteriormente.
En un aspecto, una célula o mamífero de la divulgación comprenden una inserción de una región lambda humana que comprende al menos una región JA humana (p. ej., una región de la línea germinal) y al menos una región CA humana (p. ej., una región de la línea germinal), opcionalmente C<a>6 y/o C<a>7. Por ejemplo, la célula o mamífero comprenden una pluralidad de regiones JA humanas, opcionalmente dos o más de J<a>1 , J<a>2, J<a>6 y J<a>7, opcionalmente todas J<a>1 , J<a>2, J<a>6 y J<a>7. En un ejemplo, la célula o mamífero comprenden al menos una agrupación J<a>-C<a>humana, opcionalmente al menos J<a>7-C<a>7.
En un aspecto, la agrupación de JC humanas se inserta 3' con respecto a la última lambda J endógena o se inserta 3' con respecto a la última región J kappa endógena, adecuadamente inmediatamente 3' con respecto a estas secuencias, o sustancialmente inmediatamente 3' con respecto a estas secuencias.
En un aspecto, la inserción en el locus lambda de ratón se realiza aguas abajo del segmento génico C1 endógeno, por ejemplo, cuando hay una agrupación J1C1 en 3', adecuadamente inmediatamente 3' con respecto al segmento C1, o sustancialmente inmediatamente 3' con respecto al segmento.
En un aspecto (p. ej., célula o mamífero no humano) una agrupación de JC humanas se inserta en un locus kappa y cualquier célula o animal resultante es heterocigoto en ese locus, de manera que la célula tiene un cromosoma con ADN lambda humano insertado en el locus kappa, y otro cromosoma con<a>D<n>kappa humano en el locus kappa endógeno.
En un aspecto, una célula o mamífero de la divulgación comprenden un potenciador EA humano.
Una célula o mamífero de la divulgación pueden comprender una región VJ lambda humana insertada, que comprende o consiste adecuadamente, en configuración de la línea germinal, en todas las regiones V y J y secuencias intermedias de un ser humano, comprendiendo la región insertada o consistiendo en los nucleótidos 22.375.509-23.327.984, tales como los nucleótidos 22.375.559-23.327.934, tales como los nucleótidos 22.375.599-23.327.894, tales como los nucleótidos 22.375.609-23.327.884 del Cromosoma 22 humano, con referencia a la base de datos de secuencias GRCH37/hg19, o ADN equivalente de otra secuencia o base de datos humanas. La inserción en el genoma de ratón se puede realizar entre las coordenadas 19.027.763 y 19.061.845, tal como entre las coordenadas 19.037.763 y 19.051.845, tal como entre las coordenadas 19.047.451 y 19.047.652, tal como entre las coordenadas 19.047.491 y 19.047.602, tal como entre las coordenadas 19.047.541 y 19.047.562, tal como entre las coordenadas 19.047.551 y 19.047.552 del Cromosoma 16 de ratón (con referencia a NCBIM37 para el genoma de ratón, con relación a la cepa C57BL/6J de ratón, equivalente a las coordenadas 1.293.646 - 1.293.647 de la secuencia genómica de 129 SvJ en el archivo de secuencias de NT_039630.4), o puede ser una inserción en una posición equivalente en otro genoma, tal como otro genoma de ratón. La inserción del ácido nucleico lambda humano en el genoma de ratón se puede realizar alternativamente entre las coordenadas 70.673.918 y 70.675.517, tal como entre las coordenadas 70.674.418 y 70.675.017, tal como entre las coordenadas 70.674.655 y 70.674.856, tal como entre las coordenadas 70.674.705 y 70.674.806, tal como entre las coordenadas 70.674.745 y 70.674.766, tal como entre las coordenadas 70.674.755 y 70.674.756 del Cromosoma 6 de ratón (con referencia a NCBIM37 para el genoma de ratón, con relación a la cepa C57BL/6J de ratón) o equivalente en otro genoma. La inserción humana se puede realizar entre las regiones indicadas anteriormente.
Todos los fragmentos humanos específicos descritos anteriormente pueden variar de longitud, y pueden ser, por ejemplo, más largos o más cortos que los definidos anteriormente, tal como 500 bases, 1 KB, 2K, 3K, 4K, 5KB, 10 KB, 20KB, 30KB, 40KB o 50KB o más, que adecuadamente comprenden toda o parte de la región V(D)J humana, mientras que preferiblemente conservan el requisito de que el inserto final comprenda material genético humano que codifique la región de cadena pesada y la región de cadena ligera completas, según sea apropiado, como se describió anteriormente.
En un aspecto, el extremo 5' del inserto humano descrito anteriormente aumenta de longitud. Cuando el inserto se genera de una manera escalonada, el aumento de longitud es generalmente con respecto al clon aguas arriba (5').
En un aspecto, el extremo 3' del último gen humano insertado, generalmente el último gen J humano que se debe insertar es menor de 2 kb, preferiblemente menor de 1 KB de la región de unión humano-ratón.
En un aspecto, el mamífero no humano comprende parte o toda la región VJ de cadena ligera kappa humana como se divulga en el presente documento, pero no la región VJ de cadena ligera lambda humana.
En un aspecto, la célula o mamífero no humano comprenden un locus lambda completamente humano (regiones lambda VJC de un ser humano), un locus kappa quimérico (regiones VJ kappa humanas conectadas operativamente a una región constante kappa del anfitrión) y un locus de cadena pesada quimérica, que tiene una región VDJ humana conectada operativamente a una región constante de cadena pesada del anfitrión.
En un aspecto adicional, el genoma comprende una inserción de los genes V, D (solo cadena pesada) y J como se describe en el presente documento en el locus de cadena pesada y un locus de cadena ligera, o en el locus de cadena pesada y ambos loci de cadena ligera. Preferiblemente, el genoma es homocigoto en uno, o ambos, o los tres loci.
En otro aspecto, el genoma puede ser heterocigoto en uno o más de los loci, tal como heterocigoto para el ADN que codifica una cadena de anticuerpo quimérica y una cadena de anticuerpo nativa (célula anfitriona). En un aspecto, el genoma puede ser heterocigoto para el ADN capaz de codificar 2 cadenas de anticuerpos diferentes de la divulgación, por ejemplo, que comprende 2 cadenas pesadas quiméricas diferentes o 2 cadenas ligeras quiméricas diferentes.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un mamífero no humano o célula, y a métodos para producir dicho mamífero o célula, como se describe en el presente documento, en donde el ADN humano insertado, tal como la región VDJ de IgH humana y/o las regiones V, J de cadena ligera se encuentran en solo un alelo y no en ambos alelos en el mamífero o célula. En este aspecto, un mamífero o célula tienen el potencial de expresar tanto una cadena pesada o ligera de anticuerpo endógeno del anfitrión como una cadena pesada o ligera quimérica.
En un aspecto adicional de la divulgación, la región VDJ humana, o la región VJ de cadena ligera, no se utilizan en su totalidad, pero se pueden utilizar partes de la región VDJ o VJ humana equivalente, tales como los exones, de otras especies, tales como uno o más exones V, D o J de otras especies, o secuencias reguladoras de otras especies. En un aspecto, las secuencias utilizadas en lugar de las secuencias humanas no son humanas o de ratón. En un aspecto, las secuencias utilizadas pueden ser de roedor, o primate tal como chimpancé. Por ejemplo, se pueden utilizar 1, 2, 3, 4 o más, o todas las regiones J de un primate distinto de un ser humano para reemplazar uno, 2, 3, 4 o más o todos los exones J humanos en la región VDJ/VJ de las células y animales de la divulgación.
En un aspecto adicional, el ADN humano insertado, tal como la región VDJ de IgH humana, y/o las regiones VJ de cadena ligera, se pueden insertar de manera que estén conectadas operablemente en el genoma con una región constante mu de una especie no humana, no de ratón, tal como una secuencia de roedor o primate, tal como una secuencia de rata.
Otras especies no humanas, no de ratón de las que se pueden utilizar elementos de ADN en la presente divulgación incluyen conejos, llamas, dromedarios, alpacas, camellos y tiburones.
En un aspecto, el ADN humano insertado, tal como la región VDJ o VJ humana, no está conectado operablemente a la secuencia de mu endógena del anfitrión sino más bien a una secuencia mu que no sea del anfitrión.
La conexión operable permite adecuadamente la producción de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que comprende la región variable humana.
En un aspecto, el ADN humano insertado, tal como la región VDJ de IgH humana (y/o las regiones VJ de cadena ligera) se puede insertar en el cromosoma del anfitrión junto con el ácido nucleico de la región constante mu que no es el ácido nucleico de la región constante mu del anfitrión, y preferiblemente es una región constante mu de una especie no humana, no de ratón. Adecuadamente, el ADN humano insertado, tal como la región VDJ humana (y/o las regiones VJ de la cadena ligera) está conectado operablemente a una mu no humana, no de ratón, y es capaz de formar una cadena pesada o ligera de anticuerpo quimérico. En otro aspecto, una mu no humana, no de ratón puede insertarse en el cromosoma del anfitrión en un elemento genético separado al de la región variable humana, o en una ubicación diferente en el genoma, adecuadamente conectada operablemente a la región variable de manera que pueda formarse una cadena pesada o ligera de anticuerpo quimérico.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un mamífero no humano o una célula cuyo genoma comprende una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de una región constante de cadena ligera de mamífero no humano anfitrión, ordenada de manera que la célula o mamífero sean capaces de expresar una cadena quimérica de anticuerpo. La divulgación también se refiere a un mamífero no humano o una célula cuyo genoma comprende adicional o alternativamente una pluralidad de regiones V de cadena ligera de Ig humana, y una o más regiones J humanas aguas arriba de una región constante de cadena pesada de mamífero no humano anfitrión, de manera que la célula o mamífero sean capaces de expresar una cadena quimérica de anticuerpo. La célula o mamífero pueden ser capaces de expresar un anticuerpo que tenga cadenas tanto pesadas como ligeras, incluyendo al menos una cadena quimérica de anticuerpo, como se ha divulgado anteriormente.
Las regiones variables de cadena pesada humana insertadas pueden ser cualquiera de las descritas en el presente documento, y se pueden insertar en las posiciones descritas anteriormente para la inserción 5' de las regiones constantes lambda y kappa. Asimismo, las regiones variables de cadena ligera humana insertadas pueden ser las descritas anteriormente, y se pueden insertar en las posiciones descritas anteriormente para la inserción 5' de la región constante de cadena pesada.
Por ejemplo, el genoma o célula o mamífero no humano de la divulgación pueden codificar un anticuerpo que comprende una cadena de anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada humana aguas arriba de una región constante de cadena ligera de ratón, o una cadena de anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera humana aguas arriba de una región constante de cadena pesada de ratón, combinadas con una de:
una cadena ligera de anticuerpo completamente humana;
una cadena pesada de anticuerpo completamente humana;
una cadena ligera de anticuerpo de vertebrado no humano (p. ej., ratón o rata);
una cadena pesada de anticuerpo de vertebrado no humano (p. ej., ratón o rata);
una cadena de anticuerpo quimérica de vertebrado no humano (p. ej., ratón o rata) - humano;
una cadena de anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada humana aguas arriba de una región constante de cadena ligera de vertebrado no humano (p. ej., ratón o rata);
una cadena de anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera humana aguas arriba de una región constante de cadena pesada de vertebrado no humano (p. ej., ratón o rata).
La divulgación también se refiere a un transgén que codifica una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de una región constante de cadena ligera de mamífero no humano anfitrión, opcionalmente comprendido dentro de un vector.
La divulgación también se refiere a un transgén que codifica una pluralidad de regiones V de cadena ligera de Ig humana, y una o más regiones J de cadena ligera humana aguas arriba de una región constante de cadena pesada de mamífero no humano anfitrión, opcionalmente comprendido dentro de un vector.
En un aspecto, la divulgación se refiere a una célula, o mamífero no humano, cuyo genoma comprende: una o más regiones V de cadena ligera kappa de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de toda o parte de la región constante kappa humana.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una célula, o mamífero no humano, cuyo genoma comprende: una o más regiones V de cadena ligera lambda de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de toda o parte de la región constante lambda humana.
Adecuadamente, las regiones VJ y C de cadena ligera son capaces de formar cadenas de anticuerpos in vivo capaces de reaccionar específicamente con un antígeno.
En un aspecto de la divulgación no hay secuencia codificante no humana en la región de cadena ligera insertada. En tales aspectos, una región kappa y/o lambda humana se inserta en el genoma, combinada con la inserción de la región VDJ de cadena pesada o parte de la misma, aguas arriba de la región constante de cadena pesada del anfitrión como se divulga en el presente documento.
La célula o mamífero no humano de la descripción pueden comprender:
(a) una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión; y
(b) una o más regiones V de cadena ligera kappa de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de toda o parte de la región constante kappa no humana, en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos que tienen una cadena de anticuerpo que comprende una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
La célula o mamífero no humano de la descripción pueden comprender
(a) una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión; y
una o más regiones V de cadena ligera lambda de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de mamífero no humano anfitrión; en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos que tienen una cadena de anticuerpo que comprende una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
Adecuadamente, la inserción del ADN de la cadena ligera de VJC humana, o parte del mismo como se ha divulgado anteriormente, se realiza en el locus de ratón equivalente. En un aspecto, el ADN de VJC de la cadena ligera kappa humana, o parte del mismo, se insertan inmediatamente aguas arriba o aguas abajo de la región VJC kappa de ratón. En un aspecto, la región VJC de cadena ligera lambda humana o parte de la misma se insertan inmediatamente aguas arriba o aguas abajo de la región VJC lambda de ratón. En un aspecto, solo se inserta el locus VJC kappa humano y no el locus VJC lambda humano. En un aspecto, solo se inserta el locus VJC lambda humano y no el locus VJC kappa humano. Las inserciones se pueden realizar utilizando las técnicas divulgadas en el presente documento, y adecuadamente no eliminan las secuencias del anfitrión del genoma. En un aspecto, las secuencias VJC del anfitrión mamífero no humano pueden inactivarse de alguna manera, por mutación o inversión, o por inserción del ADN de la región variable humana, o por cualquier otro medio. En un aspecto, la célula o mamífero no humano de la divulgación pueden comprender una inserción de la región humana VJC completa.
El ADN de la región variable kappa humana podría insertarse en el genoma en ordenamiento funcional con una región constante lambda, por ejemplo, insertada aguas arriba de una región constante lambda. Alternativamente, el ADN variable de la región lambda humana podría insertarse en ordenamiento funcional con una región constante kappa, por ejemplo, insertada aguas arriba de una región constante kappa.
En un aspecto, se mantienen una o más secuencias de control de mamífero no humano tales como una o varias secuencias potenciadoras aguas arriba de la región constante Mu de mamífero no humano, adecuadamente en su posición nativa con respecto a la distancia desde la región constante.
En un aspecto, una o más secuencias de control de mamífero no humano tales como una o varias secuencias potenciadoras se mantienen aguas abajo de la región constante Mu de mamífero no humano, adecuadamente en su posición nativa con respecto a la distancia desde la región constante.
En un aspecto, una secuencia de cambio de mamífero no humano, adecuadamente la secuencia de cambio endógena, se mantiene aguas arriba de la región constante Mu de mamífero no humano, adecuadamente en su posición nativa con respecto a la distancia desde la región constante.
En tal localización, las secuencias potenciadoras o de cambio del anfitrión son operativas in vivo con la secuencia o secuencias de la región constante del anfitrión.
En un aspecto, una secuencia de cambio no es humana, ni nativa en el mamífero no humano, por ejemplo, en un aspecto, una secuencia de cambio de mamífero no humano no es una secuencia de cambio de ratón o humana. La secuencia de cambio puede ser, por ejemplo, una secuencia de roedor o primate, o una secuencia sintética. En particular, la secuencia de cambio puede ser una secuencia de rata donde el mamífero no humano es un ratón. A modo de ejemplo, una secuencia constante mu de ratón o humana puede colocarse bajo el control de una secuencia de cambio de una rata, o chimpancé, u otra secuencia de cambio, adecuadamente capaz de permitir que el cambio de isotipo ocurra in vivo.
En un aspecto, la secuencia de cambio de la divulgación es una secuencia de cambio que comprende 3, 4, 5, 6 o más (hasta 82) repeticiones contiguas de la secuencia de repetición GGGCT (SEQ ID NO 46-50), tal como una secuencia de cambio de rata. Por "cambio de rata" en el presente documento se entiende que el cambio es un cambio de tipo salvaje correspondiente a un cambio de un genoma de rata o derivado de tal cambio.
En un aspecto, la secuencia de cambio de la divulgación es una secuencia de cambio de rata que comprende las siguientes repeticiones: GAGCT (296 repeticiones; SEQ ID NO 18), GGGGT (50 repeticiones; SEQ ID NO 19) y GGGCT (83 repeticiones; SEQ ID NO 20).
En un ejemplo, la secuencia de cambio de rata comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO 1.
En estos aspectos, y cuando el mamífero no humano es un ratón o la célula es una célula de ratón, el cambio es opcionalmente un cambio de rata como se describe en el presente documento.
Alternativamente, la secuencia de cambio presente en las células o mamíferos de la divulgación es un cambio de ratón, p. ej., de un ratón tal como una cepa 129 de ratón o una cepa C57 de ratón, o de una cepa derivada de las mismas, que comprende o consiste opcionalmente en la secuencia de SEQ ID NO 4 o 5. Por "cambio de ratón" en el presente documento se entiende que el cambio es un cambio de tipo salvaje correspondiente a un cambio de un genoma de ratón o derivado de tal cambio. En este aspecto, y cuando el mamífero no humano es un ratón o la célula es una célula de ratón, la secuencia de cambio de ratón es opcionalmente el cambio endógeno o es un cambio de ratón de otra cepa de ratón.
La célula o mamífero de la divulgación puede comprender por lo tanto una secuencia de cambio de mamífero humano o no humano y una región o regiones potenciadoras de mamífero humano o no humano. Pueden estar aguas arriba de una región constante de mamífero humano o no humano. Preferiblemente, las secuencias de control son capaces de dirigir la expresión o de controlar de otro modo la producción de anticuerpos que comprenden una región constante con la que están asociadas. Una combinación prevista es un cambio de rata con secuencias potenciadoras de ratón y regiones constantes de ratón en una célula de ratón.
En un aspecto, la divulgación se refiere a una célula, preferiblemente una célula no humana, o de mamífero no humano que comprende un locus de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina que tiene ADN de 3 o más especies. Por ejemplo, la célula o animal pueden comprender ADN de la región constante de célula anfitriona, una o más secuencias codificantes de V, D o J humanas y una o más regiones de ADN que no son del anfitrión, no humanas que son capaces de controlar una región del locus de inmunoglobulina, tal como una secuencia de cambio, promotor o potenciador que son capaces de controlar la expresión o cambio de isotipo in vivo del ADN de Ig. En un aspecto, la célula es de ratón o animal es un ratón y comprenden adicionalmente ADN humano del locus de Ig humano y adicionalmente una secuencia de ADN no de ratón, tal como una secuencia de ADN de rata, capaz de regular el ADN de ratón o humano.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una célula, preferiblemente una célula no humana, o un mamífero no humano que comprenden un locus de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina que tiene ADN de 2 o más genomas humanos diferentes. Por ejemplo, podría comprender secuencias V(D)J de cadena pesada de más de un genoma humano dentro de un ADN de VDJ de cadena pesada o ligera, o de cadena pesada de un genoma y secuencias VJ de cadena ligera de un genoma diferente.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un fragmento de ADN o célula o mamífero no humano que comprenden un locus de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, o parte del mismo, que tiene ADN de 2 o más especies, donde una especie contribuye a una región no codificante tal como una región reguladora, y la otra especie a regiones codificantes de tales como V, D, J o regiones constantes.
En un aspecto, el promotor humano y/u otros elementos de control que están asociados con las diferentes regiones V, D o J humanas se mantienen después de la inserción de la VDJ humana en el genoma de ratón.
En un aspecto adicional, uno o más de los elementos promotores, u otros elementos de control, de las regiones humanas, tales como las regiones V humanas, están optimizados para interactuar con la maquinaria transcripcional de un mamífero no humano.
Adecuadamente, una secuencia codificante humana puede colocarse bajo el control de un promotor de mamífero no humano apropiado, que permite que el ADN humano se transcriba eficazmente en la célula animal no humana apropiada. En un aspecto, la región humana es una secuencia codificante de la región V humana, y una región V humana se coloca bajo el control de un promotor de mamífero no humano.
El remplazo funcional del promotor humano u otras regiones de control por regiones promotoras o de control de mamífero no humano se puede llevar a cabo mediante el uso de modificación genética in vivo mediada por recombinación homóloga (“recombineering”) u otras tecnologías de ADN recombinante, para insertar una parte de la región de Ig humana (tal como una región V humana) en un vector (tal como un BAC) que contiene una región de Ig no humana. La modificación genética in vivo mediada por recombinación homóloga/técnica recombinante reemplaza adecuadamente una porción del ADN no humano (p. ej., de ratón) por la región de Ig humana, y por lo tanto coloca la región de Ig humana bajo el control del promotor de mamífero no humano u otra región de control. Adecuadamente, la región codificante humana para una región V humana reemplaza una secuencia codificante de la región V de ratón. Adecuadamente, la región codificante humana para una región D humana reemplaza una secuencia codificante de la región D de ratón. Adecuadamente, la región codificante humana para una región J humana reemplaza una secuencia codificante de la región J de ratón. De esta manera, las regiones V, D o J humanas pueden colocarse bajo el control de un promotor de mamífero no humano, tal como un promotor de ratón.
En un aspecto, el único ADN humano insertado en la célula o animal mamífero no humano son regiones codificantes de V, D o J, y estas están situados bajo el control de las secuencias reguladoras del anfitrión u otras secuencias (no humanas, que no son del anfitrión), En un aspecto, la referencia a regiones codificantes humanas incluye tanto intrones como exones humanos, o en otro aspecto simplemente exones y ningún intrón, que pueden estar en forma de ADNc.
También es posible utilizar modificación genética in vivo mediada por recombinación homóloga, u otras tecnologías de ADN recombinante, para insertar un promotor de mamífero no humano (p. ej., de ratón) u otra región de control, tal como un promotor para una región V, en un BAC que contiene una región de Ig humana. Una etapa de modificación genética in vivo mediada por recombinación homóloga coloca en ese caso una porción de ADN humano bajo el control del promotor de ratón u otra región de control.
Los enfoques descritos en el presente documento también se pueden utilizar para insertar algunas o todas las regiones V, D y J de la cadena pesada humana aguas arriba de una región constante de cadena ligera, en lugar de aguas arriba de la región constante de cadena pesada. Asimismo, algunas o todas las regiones V y J de la cadena ligera humana pueden insertarse aguas arriba de la región constante de la cadena pesada. La inserción puede ser en el locus de la región constante endógena, por ejemplo, entre la región constante endógena y la región J, y puede ser de algunos, o todos, los genes V, D o J solos, excluyendo secuencias promotoras o potenciadoras, o puede ser de algunos, o todos, los genes V, D o J con una o más o todas las secuencias promotoras o potenciadoras respectivas. En un aspecto, el repertorio completo de fragmentos V, D o J en orientación de la línea germinal puede insertarse aguas arriba y en ordenamiento funcional con una región constante del anfitrión.
Por lo tanto, la presente divulgación permite que las regiones V y/o D y/o J de un ser humano, o cualquier especie, se inserten en un cromosoma de una célula de una especie diferente que comprende una región constante, permitiendo que se exprese una cadena quimérica de anticuerpo.
En un aspecto, la divulgación requiere solo que se inserte algún ADN de la región variable humana en el genoma de mamífero no humano en ordenamiento operable con parte, o toda, la región constante de cadena pesada humana en la región del locus endógeno de la región constante de cadena pesada de manera que pueda producirse una cadena de anticuerpo. En este aspecto de la divulgación y cuando se inserta adicionalmente ADN de cadena ligera humana, la inserción de ADN de cadena ligera puede estar en forma de una construcción completamente humana, que tiene tanto ADN variable humano como ADN de la región constante humana, o tiene ADN de la región variable humana y ADN de la región constante de una especie no humana, no anfitriona. También son posibles otras variaciones, tales como la inserción tanto de la región variable humana de cadena ligera como de la región constante del genoma del anfitrión. Además, la inserción de dichos transgenes de cadena ligera no necesita estar en el locus endógeno equivalente, sino que puede estar en cualquier lugar del genoma. En tal escenario, la célula o mamífero pueden producir cadenas pesadas quiméricas (que comprenden ADN de la región variable humana y ADN de la región constante de ratón) y cadenas ligeras que comprenden ADN de la región variable humana y constante humana. Por tanto, en un aspecto de la divulgación, el ADN de la región variable humana lambda y/o kappa puede insertarse aguas arriba del locus endógeno, o aguas abajo, o de hecho en un cromosoma diferente al locus endógeno, e insertarse con o sin ADN de la región constante.
Además de la inserción de ADN de cadena ligera humana aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión, un aspecto adicional de la divulgación se refiere a la inserción de una o ambas regiones variables humanas de cadena ligera aguas abajo de la región constante de locus endógeno equivalente, o en cualquier otro lugar en el genoma.
Generalmente, se prefiere la inserción de ADN de la región variable humana en o cerca del locus endógeno equivalente en el genoma receptor, por ejemplo, a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 kb del límite (aguas arriba o aguas abajo) de un locus de inmunoglobulina del anfitrión.
Por tanto, en un aspecto, la divulgación puede referirse a una célula o mamífero no humano cuyo genoma comprende:
(a) una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión; y
(b) una o más regiones V de cadena ligera kappa de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera kappa de Ig humana, y/o una o más regiones V de cadena ligera lambda de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera lambda de Ig humana;
en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos, o cadenas ligeras o pesadas quiméricas, que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
En un aspecto particular, el genoma de la célula o mamífero no humano comprende:
una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión;
una o más regiones V de cadena ligera kappa de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa de mamífero no humano anfitrión, y
una o más regiones V de cadena ligera lambda de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera lambda de Ig humana aguas abajo de la región constante lambda de mamífero no humano anfitrión,
en donde opcionalmente la región variable lambda humana puede insertarse aguas arriba o aguas abajo del locus lambda endógeno del anfitrión en conexión operable con una región constante lambda humana, de manera que el mamífero no humano o célula sean capaces de producir cadenas ligeras de anticuerpos completamente humanos y cadenas pesadas quiméricas.
En un aspecto adicional, diferente, de la divulgación, el uso de los métodos de la divulgación permite construir un locus de manera escalonada mediante inserciones secuenciales, y por lo tanto permite la inserción de ADN variable humano junto con ADN de la región constante humana o no humana en cualquier ubicación adecuada en el genoma de una célula anfitriona no humana. Por ejemplo, los métodos de la divulgación se pueden utilizar para insertar ADN de la región variable de inmunoglobulina humana junto con ADN de la región constante del genoma del anfitrión en cualquier lugar del genoma de una célula anfitriona no humana, permitiendo que se produzca una cadena quimérica de anticuerpo a partir de un sitio distinto de la región pesada endógena. Se puede insertar cualquier construcción de ADN de cadena pesada o cadena ligera humana contemplada anteriormente en cualquier posición deseada en el genoma de una célula anfitriona no humana utilizando las técnicas descritas en el presente documento. La presente divulgación también se refiere por tanto a células y mamíferos que tienen genomas que comprenden tales inserciones.
La divulgación también se refiere a un vector, tal como un BAC, que comprende una región V, D o J humana en un ordenamiento funcional con un promotor de mamífero no humano, u otra secuencia de control, de manera que la expresión de la región V, D o J humana esté bajo el control del promotor de mamífero no humano en una célula del mamífero no humano, tal como una célula ES, en particular una vez insertada en el genoma de esa célula.
La divulgación también se refiere a células y mamíferos no humanos que contienen dichas células, cuyas células o mamíferos tienen una región V, D o J humana en un ordenamiento funcional con un promotor de mamífero no humano, u otra secuencia de control, de manera que la expresión de la región V, D o J humana esté bajo el control del promotor de mamífero no humano en las células o mamífero.
En general, un aspecto de la divulgación se refiere por tanto a una célula anfitriona de mamífero no humano capaz de expresar una secuencia codificante de V, D o J humana bajo el control de un promotor o región de control del anfitrión, siendo capaz de producir la expresión un anticuerpo humanizado que tiene un dominio variable humano y una región constante de mamífero no humano.
En un aspecto, la divulgación se refiere a una célula, tal como una célula no de mamífero, tal como una célula ES, cuyo genoma comprende
(a) una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión; y
(b) opcionalmente una o más regiones V de cadena ligera kappa de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa de mamífero no humano anfitrión y/o una o más regiones V de cadena ligera lambda de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de mamífero no humano anfitrión;
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una célula, tal como células de mamífero no humano, tales como células ES cuyo genoma comprende
(a) una pluralidad de regiones V de cadena ligera kappa de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa de mamífero no humano anfitrión y/o una pluralidad de regiones V de cadena ligera lambda de Ig humana y una o más regiones J de cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de mamífero no humano anfitrión; y
(b) opcionalmente una o más regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión
En un aspecto, la célula es una célula ES capaz de desarrollarse en un mamífero no humano capaz de producir un repertorio de anticuerpos que son quiméricos, teniendo dichos anticuerpos quiméricos una región constante de mamífero no humano y una región variable humana. Opcionalmente, el genoma de la célula se modifica para prevenir la expresión de anticuerpos completamente específicos de la especie anfitriona.
En un aspecto, la célula es una célula madre pluripotente inducida (célula iPS).
En un aspecto, las células son células de mamífero no humano aisladas.
En un aspecto, una célula como se divulga en la presente memoria es preferiblemente una célula de mamífero no humano.
En un aspecto, la célula es una célula de una cepa de ratón seleccionada entre C57BL/6, M129 tal como 129/SV, BALB/c, y cualquier híbrido de C57BL/6, M129 tal como 129/SV, o BALB/c.
La divulgación también se refiere a una línea celular que se cultiva a partir de, o se obtiene de otro modo de células como se describe en el presente documento, incluyendo una línea celular inmortalizada. La línea celular puede comprender genes V, D o J humanos insertados como se describe en el presente documento, ya sea en configuración de la línea germinal o después del reordenamiento siguiente a la maduración in vivo. La célula se puede inmortalizar mediante fusión (p. ej., electrofusión o utilizando PEG según procedimientos convencionales) a una célula tumoral (p. ej., P3X63-Ag8.653 (obtenible de LGC Standards; CRL-1580), SP2/0-Ag14 (obtenible de ECACC), NSI o NS0), para proporcionar una célula y línea celular productoras de anticuerpos, o se puede preparar mediante inmortalización celular directa.
La presente divulgación también se refiere a vectores para su uso en la divulgación. En un aspecto, tales vectores son BAC (cromosomas artificiales bacterianos). Se apreciará que se pueden utilizar otros vectores de clonación en la divulgación y, por lo tanto, se puede considerar que la referencia a los BAC en el presente documento se refiere generalmente a cualquier vector adecuado.
En un aspecto, los BAC utilizados para la generación de ADN humano que se va a insertar, tales como las regiones VDJ o VJ, se recortan de modo que en la región VDJ o VJ humana final o parte de la misma en el mamífero no humano, no se duplique o pierda secuencia en comparación con la secuencia genómica humana original.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un vector que comprende un inserto, que comprende preferiblemente una región de ADN humano de algunos de los locus VDJ o VJ humanos, flanqueada por ADN que no es de ese locus. El ADN flanqueante puede comprender uno o más marcadores seleccionables o uno o más sitios de recombinación específica de sitio. En un aspecto, el vector comprende 2 o más, tal como 3, sitios de recombinación específica de sitio heteroespecíficos e incompatibles. En un aspecto, los sitios de recombinación específica de sitio pueden ser sitios IoxP, o variantes de los mismos, o sitios FRT o variantes de los mismos. En un aspecto, el vector comprende una o más secuencias ITR (repetición terminal invertida) de transposón.
En un aspecto, los animales no humanos de la divulgación no producen adecuadamente ningún anticuerpo completamente humanizado. En un aspecto esto se debe a que no hay ADN insertado de la región constante humana. Alternativamente, no hay ADN de la región constante humana en el genoma capaz de formar un anticuerpo junto con el componente de ADN de la región variable humana insertado, por ejemplo, debido a la mutación dentro de cualquier ADN de la región constante humana o a la distancia de cualquier ADN humano de la región constante y ADN de la región variable humana.
En un aspecto, el ADN de la región constante de la cadena ligera humana puede incluirse en el genoma celular, de manera que podría generarse una cadena de anticuerpo humano lambda o kappa completamente humana, pero esto solo sería capaz de formar un anticuerpo con una cadena pesada quimérica, y no producir un anticuerpo completamente humano que tenga regiones variables y constantes humanas.
En un aspecto, el genoma de mamífero no humano se modifica para prevenir la expresión de anticuerpos completamente específicos de la especie anfitriona. Los anticuerpos totalmente específicos de la especie anfitriona son anticuerpos que tienen regiones tanto variables como constantes del organismo anfitrión. En este contexto, no se pretende que el término "específico" se refiera a la unión de los anticuerpos producidos por las células o animales de la divulgación, sino más bien al origen del ADN que codifica esos anticuerpos.
En un aspecto, el genoma de mamífero no humano se modifica para prevenir la expresión de los anticuerpos nativos (completamente específicos de la especie anfitriona) en el mamífero mediante la inactivación de todos o una parte de los loci de Ig de mamífero no humano anfitrión. En este contexto, la inactivación o prevención del uso de anticuerpos endógenos o segmentos génicos (utilizando cualquier técnica de inactivación descrita en el presente documento) es, por ejemplo, la inactivación o prevención sustancialmente completa (sustancialmente 100%, es decir, no se expresa esencialmente nada (p. ej., menos de 10, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5%) de la cadena de anticuerpo endógena (p. ej., sin cadenas pesadas endógenas)). Esto se puede determinar, por ejemplo, a nivel de la cadena de anticuerpo (proteína) evaluando el repertorio de anticuerpos producido por el vertebrado mamífero no humano o a nivel de nucleótidos evaluando transcritos de ARNm de loci de cadenas de anticuerpos, p. ej., utilizando RACE. En un aspecto, la inactivación es de más de 50% (es decir, 50% o menos de los anticuerpos o transcritos son de una cadena de anticuerpo endógena), 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Por ejemplo, en un aspecto, la expresión de la cadena pesada endógena está sustancialmente inactivada de manera que no más de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% del repertorio de la cadena pesada del vertebrado (mamífero) es proporcionado por las cadenas pesadas endógenas. Por ejemplo, la expresión de la cadena pesada endógena está sustancialmente inactivada de manera que sustancialmente ningún repertorio de la cadena pesada del vertebrado (mamífero) es proporcionado por las cadenas pesadas endógenas. Por ejemplo, en un aspecto, la expresión de la cadena kappa endógena está sustancialmente inactivada de manera que no más de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% del repertorio de la cadena kappa del vertebrado (mamífero) es proporcionado por las cadenas kappa endógenas. Por ejemplo, la expresión de la cadena kappa endógena está sustancialmente inactivada de manera que sustancialmente ningún repertorio de la cadena kappa del vertebrado (mamífero) es proporcionado por las cadenas kappa endógenas. Por ejemplo, en un aspecto, la expresión de la cadena lambda endógena está sustancialmente inactivada de manera que no más de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% del repertorio de la cadena lambda del vertebrado (mamífero) es proporcionado por las cadenas lambda endógenas. Por ejemplo, la expresión de la cadena lambda endógena está sustancialmente inactivada de manera que sustancialmente ningún repertorio de la cadena lambda del vertebrado (mamífero) es proporcionado por las cadenas lambda endógenas.
En un aspecto, esto se logra mediante la inversión de toda o parte de la región VDJ o región VJ de mamífero no humano, opcionalmente mediante la inserción de uno o más sitios de recombinasa específica de sitio en el genoma y después el uso de estos sitios en la escisión o inversión mediada por recombinasa de todo o parte del locus de Ig de mamífero no humano. En un aspecto, se puede emplear una doble inversión, la primera para alejar las V(D)J del locus endógeno y después una inversión más local que las pone en la orientación correcta. En un aspecto, se utiliza un único sitioloxPpara invertir la región VDJ de mamífero no humano con respecto a un locus centromérico o locus telomérico.
En un ejemplo, un ratón o célula de ratón de la divulgación comprenden segmentos génicos endógenos invertidos de cadena pesada (p. ej., VH, D y JH, tales como la región VDJ de cadena pesada endógena completa) que están inmediatamente 3' con respecto a la posición 119753123, 119659458 o 120918606 en un cromosoma 12 endógeno de ratón. Opcionalmente, el genoma del ratón o célula es homocigoto para dicho cromosoma 12.
La divulgación también proporciona:
Un casete para la inversión e inactivación de segmentos génicos de cadena de anticuerpo endógeno de vertebrado no humano (p. ej., ratón o rata), siendo los segmentos parte de una secuencia del locus de cadena de anticuerpo en un cromosoma de una célula de vertebrado no humano (p. ej., ratón o rata) (p. ej., célula ES) en donde la secuencia está flanqueada en su extremo 3' por un sitio de recombinación específica de sitio (p. ej., lox, rox o frt), comprendiendo el casete una secuencia de nucleótidos que codifica una marca expresable o marcador seleccionable y un sitio de recombinación específica de sitio compatible (p. ej., lox, rox o frt) flanqueado por un brazo de homología 5' y 3', en donde los brazos de homología corresponden a, o son homólogos a, tramos adyacentes de secuencia en el genoma celular en un cromosoma diferente o en dicho cromosoma a al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mb de distancia de los segmentos génicos endógenos.
La divulgación también proporciona:
Un casete para la inversión e inactivación de segmentos génicos de cadena pesada de anticuerpo endógeno de ratón, siendo los segmentos parte de una secuencia del locus de cadena pesada en el cromosoma 12 de una célula de ratón (p. ej., célula ES) en donde la secuencia está flanqueada en su extremo 3' por un sitio de recombinación específica de sitio (p. ej., lox, rox o frt), comprendiendo el casete una secuencia de nucleótidos que codifica una marca expresable o marcador seleccionable y un sitio de recombinación específica de sitio compatible (p. ej., lox, rox o frt) flanqueado por un brazo de homología 5' y 3', en donde los brazos de homología corresponden a, o son homólogos a, tramos adyacentes de secuencia en el genoma de la célula de ratón en un cromosoma diferente o en el cromosoma 12 a al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mb de distancia de los segmentos génicos endógenos.
La divulgación proporciona:
Un casete para la inversión e inactivación de segmentos génicos de cadena pesada de anticuerpos endógenos de ratón, siendo los segmentos parte de una secuencia de locus de cadena pesada en el cromosoma 12 de una célula de ratón (p. ej., célula ES) en donde la secuencia está flanqueada en su extremo 3' por un sitio de recombinación específica de sitio (p. ej., lox, rox o frt), comprendiendo el casete una secuencia de nucleótidos que codifica una marca expresable o marcador seleccionable y un sitio de recombinación específica de sitio compatible (p. ej., lox, rox o frt) flanqueado por un brazo de homología 5' y 3', en donde (i) el brazo de homología 5' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119753124 a la coordenada 119757104 y el brazo de homología 3' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119749288 a 119753123; o (ii) el brazo de homología 5' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119659459 a la coordenada 119663126 y el brazo de homología 3' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119656536 a 119659458; o (iii) el brazo de homología 5' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 120918607 a la coordenada 120921930 y el brazo de homología 3' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 120915475 a 120918606.
La opción (i) da como resultado una inversión del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119753123 a la coordenada 114666436.
La opción (ii) da como resultado una inversión del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119659458 a la coordenada 114666436
La opción (iii) da como resultado una inversión del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 12091806 a la coordenada 114666436.
Por lo tanto, la divulgación proporciona un ratón o célula de ratón cuyo genoma comprende una inversión de un cromosoma 12, en donde la inversión comprende segmentos génicos endógenos invertidos de cadena pesada (p. ej., VH, D y JH, tal como la región VDJ de cadena pesada endógena completa); en donde el ratón comprende un locus de cadena pesada transgénica que comprende una pluralidad de segmentos génicos VH humanos, una pluralidad de segmentos D humanos y una pluralidad de segmentos JH humanos conectados operablemente aguas arriba de una región constante endógena (p. ej., C mu) de modo que el ratón o célula (opcionalmente después de la diferenciación a una célula B) sean capaces de expresar un anticuerpo que comprende una región variable que comprenda secuencias derivadas de los segmentos génicos humanos; y en donde la inversión es (i) una inversión del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119753123 a la coordenada 114666436; (ii) una inversión del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119659458 a la coordenada 114666436; o (iii) una inversión del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 12091806 a la coordenada 114666436.
En un aspecto, los segmentos génicos endógenos son de una célula de ratón derivada de 129 (p. ej., segmentos de una célula AB2.1) y los brazos de homología son ADN isogénico (es decir, idéntico a secuencias endógenas derivadas de 129 delimitadas por las coordenadas respectivas indicadas en (i) a (iii) anteriormente). Por tanto, no se crea ninguna nueva secuencia mediante recombinación homóloga utilizando estos brazos de homología. En otro aspecto, los brazos son de una cepa de ratón que es diferente de la cepa endógena. Los sitios de recombinación específica de sitio son mutuamente compatibles y se invierten mutuamente de manera que, en la expresión de una enzima recombinasa asociada (p. ej., Cre, Dre o Flp), se lleva a cabo la recombinación entre el sitio en el casete de inversión insertado y el sitio que flanquea los segmentos génicos endógenos, invirtiendo y moviendo de ese modo los segmentos génicos endógenos bastante aguas arriba (5') de su ubicación original en el locus de cadena pesada. Esto inactiva la expresión de la cadena pesada endógena. De manera similar, la inactivación de la cadena ligera se puede realizar eligiendo los brazos de homología del casete de inversión con referencia a una región cromosómica separada a al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mb del locus endógeno de la cadena ligera, comprendiendo este último un sitio de recombinación específica de sitio que es compatible con el sitio en el casete de inversión.
En un aspecto, la marca expresable es una marca fluorescente, p. ej., GFP o una variante de la misma (p. ej., YFP, CFP o RFP). Por tanto, se utiliza una marca en lugar de un marcador de selección, tal como uno que confiera resistencia para permitir la selección de transformantes.
La divulgación proporciona un método para inactivar segmentos génicos de un locus endógeno de anticuerpo, comprendiendo el método
(i) Proporcionar una célula de vertebrado no humano (p. ej., una célula ES, p. ej., una célula ES de ratón) cuyo genoma comprende un locus de cadena de anticuerpo que comprende segmentos génicos endógenos de región variable;
(ii) Dirigir un sitio de recombinación específica de sitio para flanquear la posición 3' de las posiciones más 3' de dichos segmentos génicos endógenos;
(iii) Dirigir a un segundo sitio de recombinación específica de sitio al menos a 10 mb de distancia de dichos segmentos génicos endógenos, siendo el segundo sitio compatible con el primer sitio invertido con respecto al primer sitio;
(iv) Expresar una recombinasa compatible con dichos sitios para efectuar recombinación específica de sitio entre dichos sitios, invirtiendo y moviendo de ese modo dichos segmentos génicos lejos de dicho locus, en donde los segmentos génicos endógenos están inactivados; y
(v) Opcionalmente, desarrollar la célula hasta una célula de progenie o vertebrado (p. ej., ratón o rata) cuyo genoma es homocigoto para la inversión.
El genoma de la célula de progenie o vertebrado puede comprender loci transgénicos de cadenas pesadas y/o ligeras, cada uno capaz de expresar cadenas de anticuerpos que comprenden regiones variables humanas. Opcionalmente, la expresión de la cadena pesada y ligera kappa endógena se inactiva invirtiendo los segmentos génicos endógenos de la región variable pesada y kappa de acuerdo con el método de la divulgación. Opcionalmente, la expresión de la cadena lambda endógena también se inactiva de esta manera.
En una alternativa al método y a los casetes de inversión de la divulgación, en lugar de invertir y mover segmentos génicos de la región variable únicamente, se pueden invertir y mover alternativa o adicionalmente otras partes del locus endógeno para efectuar la inactivación. Por ejemplo, se pueden invertir y mover uno o más elementos reguladores endógenos (p. ej., Smu y/o Emu) y/o una o más regiones constantes endógenas (p. ej., C mu y/o C gamma).
Los sitios que "flanquean" en los contextos anteriores de la divulgación pueden proporcionarse de manera que un sitio de recombinación específica de sitio flanquea inmediatamente la secuencia endógena o está separado de la misma, p. ej., en no más de 250, 200, 250, 100, 50 o 20 kb en la dirección 3'.
En un aspecto, el genoma de mamífero no humano en el que se inserta ADN humano comprende regiones V, (D) y J endógenas, y las secuencias endógenas no se han eliminado.
La divulgación comprende un método para la inserción de múltiples fragmentos de ADN en una diana de ADN, adecuadamente para formar una inserción contigua en la que los fragmentos insertados se unen directamente entre sí sin secuencias intermedias. El método es especialmente aplicable a la inserción de un fragmento grande de ADN en un cromosoma del anfitrión que se puede llevar a cabo de una manera escalonada.
En un aspecto, el método comprende la inserción de una primera secuencia de ADN en una diana, teniendo la secuencia una porción del vector de ADN y una primera secuencia de interés (X1); la inserción de una segunda secuencia de ADN en la porción del vector de la primera secuencia, teniendo la segunda secuencia de ADN una segunda secuencia de interés (X2) y una segunda porción del vector; y después la escisión de cualquier ADN de la secuencia del vector que separe X1 y X2 para proporcionar una secuencia X1X2 o X2X1 contigua dentro de la diana. Opcionalmente, hay inserción de una o más secuencias de ADN adicionales, teniendo cada secuencia de ADN una secuencia de interés adicional (X3, ....) y una porción del vector adicional, en la porción del vector de la secuencia de ADN anterior, para construir un fragmento de ADN contiguo en la diana.
La diana de ADN para la inserción de la primera secuencia de ADN puede ser un sitio específico o cualquier punto en el genoma de una célula particular.
El método general se describe en el presente documento con relación a la inserción de elementos de la región VDJ humana, pero es aplicable a la inserción de cualquier región de ADN, de cualquier organismo, y en particular la inserción de fragmentos de ADN grandes de >100 kB, tal como 100-250 kb, o incluso más grandes, tal como el del TCR o HLA. Las características y enfoques descritos en el presente documento con respecto a la inserción de VDJ pueden aplicarse igualmente a cualquiera de los métodos divulgados.
En un aspecto, el ADN insertado es ADN humano, tal como la región VDJ o VJ humana, se construye en el genoma de una célula, tal como una célula ES, de manera escalonada utilizando 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 o más inserciones separadas para cada región de cadena pesada o cadena ligera. Los fragmentos se insertan adecuadamente en el mismo o sustancialmente el mismo locus celular, p. ej., locus de célula ES, uno después del otro, para formar la región VDJ o VJ completa, o parte de la misma. La presente divulgación también se refiere a células y animales no humanos que comprenden intermedios en el procedimiento cuyos genomas pueden comprender solo una región VDJ parcial, tal como solo ADN de la región variable humana.
En un aspecto adicional, el método para producir un mamífero no humano transgénico comprende la inserción de regiones VDJ o VJ humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión mediante inserción escalonada de múltiples fragmentos mediante recombinación homóloga, preferiblemente utilizando un procedimiento repetitivo. Adecuadamente, se insertan fragmentos de aproximadamente 100 KB de los locus VDJ y VJ humanos, adecuadamente para formar parte de, o una región VDJ o VJ completa después de la repetición final del procedimiento de inserción, como se divulga en el presente documento.
En un aspecto, el procedimiento de inserción comienza en un sitio en el que se ha insertado un casete de inicio en el genoma de una célula, tal como una célula ES, proporcionando una región de direccionamiento única. En un aspecto, el casete de inicio se inserta en el locus de la cadena pesada de mamífero no humano, para su uso en la inserción de ADN de la cadena pesada humana. De manera similar, se puede insertar un casete de inicio en el locus de la cadena ligera de mamífero no humano, para su uso en la inserción de ADN de VJ de cadena ligera humana. El casete de inicio comprende adecuadamente una secuencia de cadena principal de vector con la que un vector que tiene un fragmento de ADN humano en la misma secuencia de cadena principal puede recombinarse para insertar el ADN humano en el genoma celular de la célula (p. ej., ES), y adecuadamente un marcador de selección, tal como un marcador de selección negativa. Adecuadamente, la secuencia de la cadena principal del vector es la de una biblioteca de BAC, para permitir que los BAC se utilicen en la construcción de las células ES y mamíferos. La secuencia de la cadena principal del vector puede ser, sin embargo, cualquier secuencia que sirva como sitio diana en el que se pueda insertar una secuencia homóloga, por ejemplo, mediante recombinación homóloga, por ejemplo, RMCE, y preferiblemente no es ADN que codifique ninguna de la región VDJ o constante.
En un aspecto, la inserción del primer fragmento de ADN en un casete de inicio va seguida de la inserción de un segundo fragmento de ADN en una porción del primer fragmento de ADN, adecuadamente una parte de la cadena principal del vector del segundo fragmento de ADN. En un aspecto, un fragmento de ADN insertado comprende una parte de la región VDJ humana flanqueada por secuencias 5' y/o 3' que no proceden de la región VDJ humana. En un aspecto, las secuencias flanqueantes 5' y/o 3' pueden contener cada una uno o más marcadores seleccionables, o ser capaces de crear un sistema seleccionable una vez insertado en el genoma. En un aspecto, una o ambas secuencias flanqueantes pueden eliminarse del genoma in vitro, o in vivo, después de la inserción. En un aspecto, el método comprende la inserción de un fragmento de ADN seguido de la selección de ambos extremos 5' y 3' del fragmento insertado que flanquea el ADN de VDJ humano. En un aspecto, la inserción iterativa se realiza mediante la inserción de fragmentos de ADN en el extremo 5' del fragmento insertado anterior, y en este aspecto puede haber una deleción in vivo del ADN vector que separa las secuencias de ADN humano insertadas, para proporcionar una secuencia de ADN humano contigua.
En un aspecto, la inserción de ADN de VDJ humano en un genoma puede lograrse sin dejar ningún ADN flanqueante en el genoma, por ejemplo, mediante escisión de ADN mediada por transposasa. Una transposasa adecuada es la transposasa Piggybac.
En un aspecto, el primer fragmento de región variable humana se inserta mediante recombinación homóloga en la secuencia de la cadena principal del casete de inicio y después el ADN de cualquier marcador de selección negativa y casete de inicio se eliminan posteriormente mediante recombinación entre secuencias diana de recombinasa, tales como FRT utilizando en este ejemplo, expresión de FLPasa. Generalmente, las inserciones dirigidas repetidas en la secuencia de inicio de la cadena principal (p. ej., BAC) y la posterior eliminación por reordenamiento entre secuencias diana de recombinasa se repiten para construir la región VDJ humana completa aguas arriba de la región constante del anfitrión no mamífero.
En un aspecto, se puede utilizar un marcador o sistema seleccionable en el método. El marcador se puede generar tras la inserción de un fragmento de ADN en un genoma, por ejemplo, formando un marcador seleccionable junto con un elemento de ADN ya presente en el genoma.
En un aspecto, el genoma celular (p. ej., ES) no contiene 2 marcadores seleccionables idénticos al mismo tiempo durante el procedimiento. Se puede observar que el procedimiento repetitivo de inserción y selección se puede llevar a cabo utilizando solo 2 marcadores de selección diferentes, como se divulga en los ejemplos en el presente documento, y por ejemplo el tercer marcador seleccionable puede ser idéntico al primer marcador, ya que en el momento de la inserción del tercer fragmento de vector se han eliminado el primer fragmento de vector y el primer marcador.
En un aspecto, se confirma un evento de inserción correcto antes de pasar a la siguiente etapa de cualquier procedimiento de clonación de múltiples etapas, por ejemplo, mediante la confirmación de la estructura del BAC utilizando matrices genómicas de alta densidad para escrutar las células ES para identificar aquellas con inserciones intactas del BAC, secuenciación y verificación por PCR.
Casete de inicio (también denominado "lugar de emplazamiento genómico")
La divulgación también se refiere a una secuencia de "lugar de emplazamiento genómico" de polinucleótido, comprendiendo el polinucleótido regiones de ácido nucleico homólogas a regiones de un cromosoma diana para permitir la inserción por recombinación homóloga en el cromosoma diana, y que comprende un sitio de ácido nucleico que permite la inserción conducida por recombinasa de ácido nucleico en el lugar de emplazamiento genómico. La divulgación también se refiere a vectores, células y mamíferos de la divulgación que comprenden un lugar de emplazamiento genómico como se divulga en el presente documento insertado en el genoma de la célula.
El lugar de emplazamiento genómico comprende opcionalmente un S-mu no endógeno, p. ej., un cambio S-mu de rata. El lugar de emplazamiento genómico comprende opcionalmente (en orientación 5' a 3') una secuencia Ep de ratón, un p de cambio no humano, no de ratón (p. ej., de rata) y al menos una porción de un Cp de ratón o el Cp de ratón completo. La secuencia de cambio de rata comprende o consiste opcionalmente en SEQ ID NO 1.
El lugar de emplazamiento genómico comprende opcionalmente el brazo de homología 5' de SEQ ID NO 6.
El lugar de emplazamiento genómico tiene opcionalmente la secuencia de SEQ ID 2 o SEQ ID NO 3.
En un aspecto, el lugar de emplazamiento genómico comprende una marca expresable. Por ejemplo, la marca es una marca fluorescente, p. ej., GFP o una variante de la misma (p. ej., YFP, CFP o RFP). Por tanto, se utiliza una marca en lugar de un marcador de selección (tal como uno que confiere resistencia para permitir la selección de transformantes).
En un aspecto, el lugar de emplazamiento genómico comprende brazos de homología 5' y 3' para inserción en el genoma celular utilizando recombinación homóloga. Los brazos de homología pueden ser ADN isogénico (p. ej., idéntico a secuencias endógenas derivadas de 129 de cuando se utiliza una célula ES derivada de 129). Por tanto, no se crea ninguna nueva secuencia mediante recombinación homóloga utilizando estos brazos de homología. En otro aspecto, los brazos son de una cepa de ratón que es diferente de la cepa endógena (cepa de células ES).
Los métodos de la divulgación incluyen métodos en donde la secuencia del lugar de emplazamiento genómico comprende cualquiera de las configuraciones o secuencias divulgadas en el presente documento.
Otro método de la divulgación comprende la etapa de inserción del lugar de emplazamiento genómico en un cromosoma de ratón mediante recombinación homóloga entre las secuencias J1-4 de ratón y C mu de ratón.
Otro método de la divulgación comprende la etapa de inserción del lugar de emplazamiento genómico en el cromosoma 12 de ratón mediante recombinación homóloga entre J1-4 y Emu de ratón.
En un aspecto, el método utiliza recombinación específica de sitio para la inserción de uno o más vectores en el genoma de una célula, tal como una célula ES. Los sistemas de recombinasa específica de sitio son bien conocidos en la técnica y pueden incluir Cre-lox y FLP/FRT o combinaciones de los mismos, en los que la recombinación se produce entre 2 sitios que tienen homología de secuencia.
Adicionalmente o alternativamente a cualquier sistema particular de Cre/Lox o FLP/FRT descrito en el presente documento, otras recombinasas y sitios que se pueden utilizar en la presente divulgación incluyen recombinasa Dre, sitios rox y recombinasa PhiC31.
Los BAC adecuados están disponibles en el centro Sanger, véase "A genome-wide, end-sequenced 129Sv BAC library resource for targeting vector construction". Adams DJ, Quail MA, Cox T, van der Weyden L, Gorick BD, Su Q, Chan WI, Davies R, Bonfield JK, Law F, Humphray S, Plumb B, Liu P, Rogers J, Bradley A. Genomics. dic 2005;86(6):753-8. Epub 27 de octubre de 2005. The Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridgeshire CB10 1SA, ÜK. Los BAC que contienen ADN humano también están disponibles en, por ejemplo, en Invitrogen™. Üna biblioteca adecuada es descrita por Osoegawa K et al, Genome Research 2001. 11: 483-496.
En un aspecto, un método de la divulgación comprende específicamente:
(1) inserción de un primer fragmento de ADN en una célula ES no humana, conteniendo el fragmento una primera porción de ADN de la región VDJ o VJ humana y una primera porción del vector que contiene un primer marcador seleccionable;
(2) opcionalmente deleción de parte de la primera porción del vector;
(3) inserción de un segundo fragmento de ADN en una célula ES no humana que contiene el primer fragmento de ADN, produciéndose la inserción dentro de la primera porción del vector, conteniendo el segundo fragmento de ADN una segunda porción de la región VDJ o VJ humana y conteniendo una segunda porción del vector un segundo marcador seleccionable,
(4) deleción del primer marcador seleccionable y de la primera parte del vector, preferiblemente mediante una acción de enzima recombinasa;
(5) inserción de un tercer fragmento de ADN en una célula ES no humana que contiene el segundo fragmento de ADN, produciéndose la inserción dentro de la segunda porción del vector, conteniendo el tercer fragmento de ADN una tercera porción de la región VDJ o VJ humana y conteniendo una tercera porción del vector un tercer marcador seleccionable,
(6) deleción del segundo marcador seleccionable y de la segunda parte del vector; y
(7) repetición de las etapas de inserción y deleción, según sea necesario, para el cuarto y otros fragmentos de las regiones humanas VDJ o VJ humanas, según sea necesario, para producir una célula ES con una parte o la totalidad de la región VDJ o VJ humana insertada según se divulga en la presente memoria, y adecuadamente para eliminar todas las porciones del vector dentro del genoma de la célula ES.
En otro aspecto, la divulgación comprende
(1) inserción de ADN que forma un casete de inicio en el genoma de una célula;
(2) inserción de un primer fragmento de ADN en el casete de inicio, comprendiendo el primer fragmento de ADN una primera porción de un ADN humano y una primera porción del vector que contiene un primer marcador seleccionable o que genera un marcador seleccionable tras la inserción;
(3) opcionalmente eliminación de parte del ADN del vector
(4) inserción de un segundo fragmento de ADN en la porción del vector del primer fragmento de ADN, conteniendo el segundo fragmento de ADN una segunda porción de ADN humano y una segunda porción del vector, conteniendo la segunda porción del vector un segundo marcador seleccionable, o generando un segundo marcador seleccionable tras la inserción;
(5) opcionalmente, eliminación de cualquier ADN vector para permitir que el primer y segundo fragmentos de ADN humano formen una secuencia contigua; y
(6) repetición de las etapas de inserción de ADN de VDJ humano y eliminación de ADN del vector, según sea necesario, para producir una célula con la totalidad o parte de la región VDJ o VJ humana suficiente para poder generar un anticuerpo quimérico junto con una región constante del anfitrión,
en donde la inserción de uno, o más, o todos los fragmentos de ADN utiliza recombinación específica de sitio.
En un aspecto, el mamífero no humano es capaz de generar una diversidad de al menos 1 x 106 diferentes combinaciones funcionales quiméricas de secuencias de inmunoglobulina.
En un aspecto, el direccionamiento se lleva a cabo en células ES derivadas de la cepa C57BL/6N, C57BL/6J, 129S5 o 129Sv de ratón.
En un aspecto, se generan animales no humanos, tales como ratones, en un fondo con deficiencia de RAG-1 o deficiencia de RAG-2, u otro fondo genético adecuado que evite la producción de linfocitos B y T anfitriones maduros. En un aspecto, el mamífero no humano es un roedor, adecuadamente un ratón, y las células de la divulgación, son células de roedor o células ES, adecuadamente células ES de ratón.
Las células ES de la presente divulgación se pueden utilizar para generar animales utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica, que comprenden la inyección de la célula ES en un blastocisto seguido de la implantación de blastocistos quiméricos en hembras para producir progenies que pueden criarse y seleccionarse para producir recombinantes homocigotos que tienen la inserción requerida. En un aspecto, la divulgación se refiere a un animal quimérico compuesto por tejido derivado de células ES y tejido derivado de embrión del anfitrión. En un aspecto, la divulgación se refiere a animales de generación posterior alterados genéticamente, que incluyen animales que tienen recombinantes homocigotos para las regiones VDJ y/o VJ.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método para producir un anticuerpo específico para un antígeno deseado, comprendiendo el método inmunizar un mamífero transgénico no humano como anteriormente con el antígeno deseado y recuperar el anticuerpo (véase, p. ej. Harlow, E. & Lane, D. 1998, 5a edición, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY; y Pasqualini y Arap, Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101:257-259). Adecuadamente, se suministra una cantidad inmunogénica del antígeno. La divulgación también se refiere a un método para detectar un antígeno diana que comprende detectar un anticuerpo producido como anteriormente con un agente de detección secundario que reconoce una porción de ese anticuerpo.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método para producir un anticuerpo completamente humanizado que comprende inmunizar un mamífero no humano transgénico como anteriormente con el antígeno deseado, recuperar el anticuerpo o células que expresan el anticuerpo, y después reemplazar la región constante de mamífero no humano por una región constante humana. Esto se puede realizar mediante técnicas de clonación convencionales a nivel de ADN para reemplazar la región constante de mamífero no humano por una secuencia de ADN de la región constante humana apropiada - véase, p. ej. Sambrook, J y Russell, D. (2001, 3a edición) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY).
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a anticuerpos humanizados y cadenas de anticuerpos producidos de acuerdo con la presente divulgación, tanto en forma quimérica como totalmente humanizada, y al uso de dichos anticuerpos en medicina. La divulgación también se refiere a una composición farmacéutica que comprende tales anticuerpos y un portador u otro excipiente farmacéuticamente aceptables.
Las cadenas de anticuerpos que contienen secuencias humanas, tales como cadenas quiméricas de anticuerpos humanos-no humanos, se consideran humanizadas en el presente documento en virtud de la presencia de la región de regiones codificantes de proteínas humanas. Los anticuerpos totalmente humanizados se pueden producir partiendo de ADN que codifica una cadena quimérica de anticuerpo de la divulgación utilizando técnicas convencionales.
Los métodos para la generación de anticuerpos tanto monoclonales como policlonales son bien conocidos en la técnica, y la presente divulgación se refiere tanto a anticuerpos policlonales como monoclonales de anticuerpos quiméricos o totalmente humanizados producidos en respuesta a la exposición a antígeno en mamíferos no humanos de la presente divulgación.
En otro aspecto más, los anticuerpos o cadenas de anticuerpos quiméricos generados en la presente divulgación pueden manipularse, adecuadamente a nivel de ADN, para generar moléculas con propiedades o estructura similares a anticuerpos, tales como una región variable humana de una cadena pesada o ligera sin una región constante, por ejemplo un anticuerpo de dominio; o una región variable humana con cualquier región constante de la cadena pesada o ligera de la misma especie o diferente; o una región variable humana con una región constante de origen no natural; o región variable humana junto con cualquier otro compañero de fusión. La divulgación se refiere a todos estos derivados de anticuerpos quiméricos derivados de anticuerpos quiméricos identificados de acuerdo con la presente divulgación.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al uso de animales de la presente divulgación en el análisis de los efectos probables de fármacos y vacunas en el contexto de un repertorio de anticuerpos cuasihumanos.
La divulgación también se refiere a un método para la identificación o validación de un fármaco o vacuna, comprendiendo el método suministrar la vacuna o fármaco a un mamífero de la divulgación y verificar uno o más de: la respuesta inmunitaria, el perfil de seguridad; el efecto sobre la enfermedad.
La divulgación también se refiere a un kit que comprende un anticuerpo o derivado de anticuerpo como se divulga en el presente documento e instrucciones para el uso de dicho anticuerpo o un reactivo de laboratorio adecuado, tal como un tampón, reactivo de detección de anticuerpos.
La divulgación también se refiere a un método para preparar un anticuerpo, o parte del mismo, comprendiendo el método proporcionar:
(i) un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, o una parte del mismo, obtenido de acuerdo con la presente divulgación; o
(ii) información de secuencia a partir de la cual puede expresarse un ácido nucleico que codifica un anticuerpo obtenido de acuerdo con la presente divulgación, o parte del mismo, para permitir que se produzca un anticuerpo.
La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende una región variable humana y una región constante (opcionalmente C gamma o C mu) de vertebrado o mamífero no humano (opcionalmente una rata o ratón), en donde el anticuerpo está codificado por una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de nucleótidos de un locus quimérico de cadena pesada de una célula (opcionalmente una célula B, célula ES o hibridoma), comprendiendo el locus una secuencia de nucleótidos de región constante de vertebrado no humano y una secuencia de nucleótidos de VDJ reordenada producida por el reordenamientoin vivode una región V humana, una región D humana y una región J humana, seleccionándose la región V entre una de una región V1-3, región V2-5, región V4-4, región V1-2 o región V6-1, y opcionalmente un segmento V1-3 o V6-1. Opcionalmente, la región J es cualquiera de JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 o JH6, y en un aspecto es JH4 o JH6. La región D es, en un aspecto, cualquiera de D3-9, D3-10, D6-13 o D6-19. En un ejemplo, la secuencia de nucleótidos de VDJ reordenada es producida por el reordenamientoin vivode V1-3 y JH4 humanas (opcionalmente con D3-9, D3-10, D6-13 o D-19); o V1-3 y JH6 (opcionalmente con D3-9, D3-10, D6-13 o D-19); o V6-1 y JH4 (opcionalmente con D3-9, D3-10, D6-13 o D-19); o V6-1 y JH6 (opcionalmente con D3-9, D3-10, D6-13 o D-19). En un ejemplo, la secuencia de nucleótidos de VDJ reordenada es producida por el reordenamientoin vivode V6-1 DH3-10, V1-3 DH3-10, V1-3 DH6-19, V1-3 Dh3-9 o V6-1 DH6- 19. En un aspecto, el anticuerpo comprende cualquier combinación ilustrada en los Ejemplos y Figuras del presente documento. Opcionalmente, el reordenamientoin vivoes en una célula (p. ej., célula B o célula ES) derivada de la misma especie de vertebrado no humano que la secuencia de la región constante (p. ej., una célula B o célula ES de ratón). La divulgación también se refiere a una célula de vertebrado o mamífero no humano (p. ej., una célula B o célula ES o hibridoma) cuyo genoma comprende un locus de cadena quimérica pesada como se ha descrito anteriormente en este párrafo. La divulgación también se refiere a un vertebrado o mamífero no humano (p. ej., un ratón o rata) cuyo genoma comprende un locus de cadena quimérica pesada como se ha descrito anteriormente en este párrafo.
La presente divulgación también se refiere a un vertebrado o mamífero no humano que tiene un genoma que codifica un anticuerpo quimérico, comprendiendo el anticuerpo quimérico una región variable humana y una región constante (opcionalmente C gamma o C mu) de vertebrado o mamífero no humano (opcionalmente una rata o ratón), expresando el mamífero:
más anticuerpos V1-3 que anticuerpos V2-5, V4-4, V1-2 o V6-1; y/o
más anticuerpos V1 -3 JH4 o V1 -3 JH6 que cualquiera de, individualmente, anticuerpos V1-3 JH1, V1-3 JH2, V1 -3 JH3 o V1-3 JH5, y/o
más anticuerpos V6-1 JH4 o V6-1 JH6 que cualquiera de, individualmente, anticuerpos V6-1 JH1, V6-1 JH2, V6-1 JH3 o V6-1 JH5 y/o
un mayor número de anticuerpos V1-3 DH3-10 que anticuerpos V1-3 con cualquier otra región D. La expresión de anticuerpos se puede evaluar mediante métodos fácilmente disponibles para el experto en la técnica y convencionales en la técnica. Por ejemplo, la expresión puede evaluarse a nivel de ARNm como se muestra en los ejemplos más abajo.
La divulgación también se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende una región variable humana y una región constante (opcionalmente una región constante de cadena ligera) de vertebrado o mamífero no humano (opcionalmente una rata o ratón), en donde el anticuerpo se puede obtener de un mamífero (opcionalmente una rata o ratón) cuyo genoma comprende un locus de cadena de anticuerpo que comprende una secuencia V1-8 kappa humana de la línea germinal y J1 kappa humana de la línea germinal, y en donde el anticuerpo se puede obtener mediante recombinaciónin vivoen dicho mamífero de las secuencias V1-8 y J1 y en donde el anticuerpo tiene una secuencia de la región variable que es diferente de la que está codificada por las secuencias V1-8 kappa humana de la línea germinal y J1 kappa humana de la línea germinal. Por tanto, en este aspecto de la divulgación, las secuencias de la línea germinal humana pueden experimentar un reordenamiento productivo para formar una secuencia codificante que, junto con la secuencia de la región constante no humana, se puede expresar como una cadena quimérica de anticuerpo que tiene al menos una región variable humana completa y una región constante no humana. Esto está en contraste (como los ejemplos que se muestran a continuación) con la combinación de las secuencias V1-8 kappa humana de la línea germinal y J1 kappa humana de la línea germinalper se,que no proporcionan una secuencia codificante de anticuerpo (debido a la inclusión de codones de parada). En un aspecto, la secuencia reordenada del anticuerpo quimérico es un resultado de hipermutación somática. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo kappa; en otro aspecto, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada no humana (p. ej., C gamma o C mu de rata o ratón). La secuencia de anticuerpo comprende opcionalmente un X<1>X<2>TFGQ, donde X<1>X<2>= PR, RT o PW (SEQ ID NO 21); opcionalmente un motivo X<1>X<2>TFGQGTKVEIKRADA (SEQ ID NO 22). Tales motivos no se encuentran en la posición equivalente en la secuencia de la línea germinal que se muestra en los ejemplos. La divulgación también se refiere a una célula de vertebrado o mamífero no humano (p. ej., una célula B o célula ES o hibridoma) cuyo genoma comprende un locus de cadena quimérica de anticuerpo como se ha descrito anteriormente en este párrafo. La divulgación también se refiere a un vertebrado o mamífero no humano (p. ej., un ratón o rata) cuyo genoma comprende un locus de cadena quimérica de anticuerpo como se ha descrito anteriormente en este párrafo.
La divulgación también se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende una región variable humana y una región constante (opcionalmente una región constante de cadena ligera) de vertebrado o mamífero no humano (opcionalmente una rata o ratón), en donde el anticuerpo se puede obtener de un mamífero (opcionalmente una rata o ratón) cuyo genoma comprende un locus de cadena de anticuerpo que comprende una secuencia V1-6 kappa humana de la línea germinal y J1 kappa humana de la línea germinal, y en donde el anticuerpo se puede obtener mediante recombinaciónin vivoen dicho mamífero de las secuencias V1-6 y J1 y en donde el anticuerpo tiene una secuencia de región variable que es diferente de la que está codificada por las secuencias V1-6 kappa humana de la línea germinal y J1 kappa humana de la línea germinal. Por tanto, en este aspecto de la divulgación, las secuencias de la línea germinal humana pueden experimentar un reordenamiento productivo para formar una secuencia codificante que, junto con la secuencia de la región constante no humana, se puede expresar como una cadena quimérica de anticuerpo que tiene al menos una región variable humana completa y una región constante no humana. Esto está en contraste (como en los ejemplos mostrados a continuación) con la combinación de secuencias V1-6 kappa humana de la línea germinal y J1 kappa humana de la línea germinalper se,que no proporcionan una secuencia codificante de anticuerpo (debido a la inclusión de codones de parada). En un aspecto, la secuencia reordenada del anticuerpo quimérico es un resultado de hipermutación somática. En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo kappa; en otro aspecto, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada no humana (p. ej., C gamma o C mu de rata o ratón). La secuencia de anticuerpo comprende opcionalmente un X<3>X<4>TFGQ, donde X3X4= PR o PW (SEQ ID NO 23); opcionalmente un motivo X<3>X<4>TFG<q>G<t>KVEIKRADA (SEQ ID<n>O 24). Tales motivos no se encuentran en la posición equivalente en la secuencia de la línea germinal como se muestra en los ejemplos. La divulgación también se refiere a una célula de vertebrado o mamífero no humano (p. ej., una célula B o célula ES o hibridoma) cuyo genoma comprende un locus de cadena quimérica de anticuerpo como se ha descrito anteriormente en este párrafo. La divulgación también se refiere a un vertebrado o mamífero no humano (p. ej., un ratón o rata) cuyo genoma comprende un locus de cadena quimérica de anticuerpo como se ha descrito anteriormente en este párrafo.
La divulgación también se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende una región variable humana y una región constante (opcionalmente C gamma o C mu o C kappa) no humana (opcionalmente de rata o ratón), en donde el anticuerpo se puede obtener de un mamífero (opcionalmente una rata o ratón) cuyo genoma comprende un locus de cadena de anticuerpo que comprende una secuencia V1-5 kappa humana de la línea germinal y J1 kappa humana de la línea germinal, y en donde el anticuerpo se puede obtener mediante recombinaciónin vivoen dicho mamífero de las secuencias V1-5 y J1. La divulgación también se refiere a una célula de vertebrado o mamífero no humano (p. ej., una célula B o célula ES o hibridoma) cuyo genoma comprende un locus de cadena quimérica de anticuerpo como se ha descrito anteriormente en este párrafo. La divulgación también se refiere a un vertebrado o mamífero no humano (p. ej., un ratón o rata) cuyo genoma comprende un locus de cadena quimérica de anticuerpo como se ha descrito anteriormente en este párrafo.
La divulgación también se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende una región variable humana y una región constante (opcionalmente un C gamma o C mu o C kappa) no humana (opcionalmente de rata o ratón), en donde el anticuerpo se puede obtener de un mamífero (opcionalmente una rata o ratón) cuyo genoma comprende un locus de cadena de anticuerpo que comprende una secuencia V1-5 kappa humana de la línea germinal y J4 kappa humana de la línea germinal, y en donde el anticuerpo se puede obtener mediante recombinaciónin vivoen dicho mamífero de las secuencias V1-5 y J4. La divulgación también se refiere a una célula de vertebrado o mamífero no humano (p. ej., una célula B o célula ES o hibridoma) cuyo genoma comprende un locus de cadena quimérica de anticuerpo como se ha descrito anteriormente en este párrafo. La divulgación también se refiere a un vertebrado o mamífero no humano (p. ej., un ratón o rata) cuyo genoma comprende un locus de cadena quimérica de anticuerpo como se ha descrito anteriormente en este párrafo.
Los anticuerpos de la divulgación se pueden aislar, aislándose en un aspecto de la célula u organismo en los que se expresan.
Un mamífero no humano cuyo genoma comprende:
(a) la región VDJ de IgH humana aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión; y
(b) las regiones V y J de cadena ligera kappa de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa de mamífero no humano anfitrión y/o las regiones V y J de la cadena ligera lambda de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de mamífero no humano anfitrión;
en donde el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable humana,
y en donde opcionalmente el genoma de mamífero no humano se modifica para prevenir la expresión de anticuerpos totalmente específicos de la especie anfitriona.
Una célula ES de mamífero no humano cuyo genoma comprende:
(a) las regiones V, D y J de IgH humana aguas arriba de una región constante de mamífero no humano; y
(b) las regiones V y J de la cadena ligera kappa del locus de Ig humana aguas arriba de la región constante kappa de mamífero no humano anfitrión, y/o las regiones V y J de la cadena ligera lambda del locus de Ig humana aguas arriba de la región constante lambda de mamífero no humano anfitrión
en donde la célula ES es capaz de desarrollarse en un mamífero no humano, siendo capaz de producir un repertorio de anticuerpos que son quiméricos, que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
Un método para producir un mamífero no humano transgénico capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos, teniendo los anticuerpos una región constante de mamífero no humano y una región variable humana, comprendiendo el método insertar por recombinación homóloga en un genoma de célula ES de mamífero no humano
(a) la región VDJ de IgH humana aguas arriba de la región constante de la cadena pesada de mamífero no humano anfitrión, y
(b) la región VJ de IgL humana para las cadenas lambda o kappa aguas arriba de la región constante de la cadena lambda o kappa de mamífero no humano anfitrión, respectivamente
de manera que el mamífero no humano es capaz de producir un repertorio de anticuerpos quiméricos que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable humana, en donde las etapas (a) y (b) se pueden llevar a cabo en cualquier orden y cada una de las etapas (a) y (b) se puede llevar a cabo de una manera escalonada o como una única etapa.
En un aspecto, la inserción de regiones VDJ o VJ humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión se logra mediante la inserción escalonada de múltiples fragmentos por recombinación homóloga. En un aspecto, las inserciones escalonadas comienzan en un sitio en el que se ha insertado un casete de inicio en el genoma de una célula ES proporcionando una región de direccionamiento única que consiste en una secuencia de cadena principal de BAC y un marcador de selección negativa.
En un aspecto, el primer fragmento de región variable humana se inserta mediante recombinación homóloga en la secuencia de la cadena principal del BAC del casete de inicio y dichos marcador de selección negativa y casete de inicio se eliminan posteriormente mediante recombinación entre secuencias diana de recombinasa.
En un aspecto, se repiten inserciones dirigidas repetidas en la secuencia de inicio de la cadena principal del BAC y la posterior eliminación de la cadena principal por reordenamiento entre secuencias diana de recombinasa para construir la región VDJ humana completa aguas arriba de la región constante no de mamífero anfitrión.
Inserción de segmentos génicos de región variable humana precisamente dentro del intrón endógeno JH4-C mu de ratón Se proporcionan adicionalmente una célula o mamífero no humano según la divulgación, en donde el mamífero es un ratón o la célula es una célula de ratón y en donde la inserción del ADN de la cadena pesada humana se realiza en un genoma de ratón entre las coordenadas 114.665.091 y 114.665.190 del cromosoma 12 de ratón.
Se proporcionan adicionalmente una célula o mamífero no humano según la divulgación en donde la inserción del ADN de la cadena pesada humana se realiza en la coordenada 114.667.091.
Se proporcionan adicionalmente una célula o mamífero no humano según la divulgación en donde la región VDJ de IgH humana comprende los nucleótidos 105.400.051 a 106.368.585 del cromosoma 14 humano (las coordenadas se refieren a NCBI36 para el genoma humano).
Se proporcionan adicionalmente un método, célula o mamífero no humano según la divulgación en donde una secuencia de ADN de la región codificante humana está en un ordenamiento funcional con una secuencia de control de mamífero no humano, de manera que la transcripción del ADN humano está controlada por la secuencia de control de mamífero no humano. En un ejemplo, el casete de inicio se inserta entre los exones J4 y C alfa de ratón. Se proporciona adicionalmente un casete de inicio adecuado para su uso en el método que comprende una secuencia de cadena principal de vector y un marcador de selección.
La divulgación proporciona los siguientes aspectos (comenzando en el aspecto número 103):
103. Una célula o mamífero no humano según uno cualquiera de los ejemplos o aspectos anteriores, en donde el mamífero es un ratón o la célula es una célula de ratón y en donde la inserción del ADN de la cadena pesada humana se realiza en un genoma de ratón entre las coordenadas 114.667.091 y 114.665.190 del cromosoma 12 de ratón.
104. Una célula o mamífero no humano según uno cualquiera de los ejemplos o aspectos anteriores, en donde la inserción del ADN de la cadena pesada humana se realiza en la coordenada 114.667.091.
105. Una célula o mamífero según uno cualquiera de los ejemplos o aspectos anteriores, en donde la región VDJ de IgH humana comprende los nucleótidos 105.400.051 a 106.368.585 del cromosoma 14 humano (las coordenadas se refieren a NCBI36 para el genoma humano).
106. Un método, célula o mamífero según uno cualquiera de los ejemplos o aspectos anteriores, en donde una secuencia de ADN de la región codificante humana está en un ordenamiento funcional con una secuencia de control de mamífero no humano, de manera que la transcripción del ADN humano se controla por la secuencia de control de mamífero no humano.
107. Un método según el aspecto 106 en donde el casete de inicio se inserta entre los exones J4 y C alfa de ratón.
108. Un casete de inicio adecuado para su uso en el método del aspecto 107 que comprende una secuencia de cadena principal de vector y un marcador de selección.
Inactivación de la expresión de la cadena de anticuerpo endógena por inserción de segmentos génicos de la región variable del anticuerpo humano
109. Un vertebrado no humano (opcionalmente un ratón o rata) o una célula de vertebrado no humano (opcionalmente una célula de ratón o rata) que tiene un genoma que
(i) comprende un locus de cadena de anticuerpo transgénico capaz de expresar una cadena de anticuerpo que comprende una región variable humana (opcionalmente después del reordenamiento génico del anticuerpo); y
(ii) tiene inactivada la expresión de la cadena de anticuerpo de vertebrado no humano endógeno; en donde el locus transgénico comprende
(iii) una secuencia de ADN que comprende una pluralidad de segmentos génicos de región variable de anticuerpo humano insertados entre segmentos génicos de la región variable de anticuerpo endógeno y una región constante de anticuerpo endógeno, por lo que la expresión de la cadena de anticuerpo endógeno se inactiva.
El locus transgénico es un locus de cadena pesada o cadena ligera.
La inactivación de la expresión de la cadena pesada endógena en vertebrados no humanos tales como ratones y ratas ha implicado la deleción de toda o parte de la región VDJ de la cadena pesada endógena (incluyendo secuencias entre segmentos génicos). Los genes ADAM6 están presentes en la región VDJ de ratón endógena. En el ratón, hay dos copias de ADAM6 (ADAM6a, ADAM6b) localizadas entre los segmentos génicos VH y D en el locus IgH del cromosoma 12 (en la región intermedia entre los segmentos génicos VH5-1 y D1 -1 de ratón). Estos dos genes ADAM6 sin intrones adyacentes tienen una identidad de secuencia de nucleótidos de 95% y una identidad de aminoácidos de 90%. En seres humanos y ratas, sólo hay un gen ADAM6. El análisis del patrón de expresión de ADAM6 de ratón muestra que se expresa exclusivamente en testículos [1]. Aunque los transcritos de ADAM6 pueden detectarse en linfocitos, se restringe al núcleo, sugiriendo que la transcripción del gen ADAM6 en particular se debía a la lectura transcripcional a través de la región D en lugar de la producción de ARN mensajero activo [2]. En rata, ADAM6 está en el cromosoma 6.
La proteína ADAM6 madura se localiza en el acrosoma y las regiones posteriores de la cabeza del espermatozoide. Notablemente, ADAM6 forma un complejo con ADAM2 y ADAM3, que se requiere para la fertilización en ratones [3]. La referencia [4] implica que ADAM6 en un modelo en el que esta proteína interactúa con ADAMS después de que ADAM6 sea sulfatada por TPST2, siendo crítica la sulfatación de ADAM6 para la estabilidad y/o la formación de complejos que implican ADAM6 y ADAM3, y por tanto ADAM6 y ADAMS se pierden del espermatozoide nulo para Tpst2. El estudio observa que los ratones con deficiencia de Tpst2 tienen infertilidad masculina, defectos de movilidad del espermatozoide y posibles anomalías en las interacciones espermatozoide-membrana de huevo.
Por tanto, el mantenimiento de la expresión de ADAM6 en el espermatozoide es crucial para la fertilidad. Por tanto, se cree que los ratones y ratas macho transgénicos en los que se han eliminado los genes ADAM6 no son fértiles de manera viable. Esto dificulta la reproducción de colonias y dificulta la utilidad de tales ratones como plataformas generadoras de anticuerpos transgénicos. Sería deseable proporcionar vertebrados generadores de anticuerpos transgénicos no humanos mejorados que sean fértiles.
[1] . Choi I, et al., Characterization and comparative genomic analysis of intronless Adams with testicular gene expression. Genomics. abril de 2004;83(4):636-46.
[2] . Featherstone K, Wood AL, Bowen AJ, Corcoran AE. The mouse immunoglobulin heavy chain V-D intergenic sequence contains insulators that may regulate ordered V(D)J recombination. J Biol Chem. 26 de marzo de 2010; 285(13):9327-38. Epub 25 de enero de 2010.
[3] . Han C, et al., Comprehensive analysis of reproductive ADAMs: relationship of ADAM4 and ADAM6 with an ADAM complex required for fertilization in mice. Biol Reprod. mayo de 2009; 80(5):1001-8. Epub 7 de enero de 2009.
[4] . Marcello et al, Lack of tirosilprotein sulfotransferase-2 activity results in altered sperm-egg interactions and loss of ADAMS and ADAM6 in epidididymal sperm, J Biol Chem. 15 de abril de 2011; 286(15):13060-70. Epub 21 de febrero de 2011.
Según el aspecto 109 de la divulgación, la inactivación no implica la deleción de la región VDJ o parte de la misma, incluyendo ADAM6 endógeno, sino que, en cambio, la inactivación por inserción permite la conservación de ADAM6 endógeno y, por lo tanto, no corre el riesgo de problemas de infertilidad.
El ratón final resultante del método (o un ratón derivado de una célula producida por el método) es en un aspecto un macho, de modo que la divulgación mejora con los ratones transgénicos macho de la técnica anterior que son infértiles como resultado de la manipulación genómica. Los ratones fértiles producen espermatozoides que pueden fertilizar huevos de un ratón hembra. La fertilidad se determina fácilmente, por ejemplo, mediante cría satisfactoria para producir un embrión o una cría de ratón. En otro aspecto, el método de la divulgación produce un ratón hembra final. Tales hembras son, por supuesto, útiles para la cría para crear progenie masculina que porta ADAM6 y que son fértiles.
En un ejemplo del aspecto 109, el genoma es homocigoto para el locus transgénico. Por ejemplo, el genoma es homocigoto para genes ADAM6 endógenos.
En un ejemplo del vertebrado del aspecto 109, el genoma tiene inactivada la expresión de cadenas pesadas y kappa endógenas (y opcionalmente también lambda).
En un ejemplo, en la parte (iii) del aspecto 109, dicho ADN comprende segmentos génicos VH, D y JH humanos o segmentos génicos VL y JL humanos (p. ej., segmentos génicos V<k>y J<k>). En un ejemplo, el ADN comprende un lugar de emplazamiento genómico que tiene un marcador seleccionable, p. ej., un gen HPRT, un gen de resistencia a neomicina o un gen de resistencia a puromicina; y/o un promotor.
En un ejemplo, en la parte (iii) del aspecto 109, los segmentos génicos endógenos son la región VDJ endógena completa de un locus de cadena pesada y/o la región constante endógena es un Cmu o Cgamma.
En un ejemplo, en la parte (iii) del aspecto 109, los segmentos génicos endógenos son la región VJ endógena completa de un locus de cadena kappa y/o la región constante endógena es un Ckappa
En un ejemplo, en la parte (iii) del aspecto 109, los segmentos génicos endógenos son la región VJ endógena completa de un locus de cadena lambda y/o la región constante endógena es un Clambda.
La célula de vertebrado no humano puede ser un hibridoma, célula B, célula ES o una célula IPS. Cuando la célula es una célula ES o una célula IPS, la expresión de la cadena de anticuerpo endógeno se inactiva después de la diferenciación de la célula en una célula B de progenie (p. ej., en una célula B en un vertebrado no humano).
La divulgación proporciona adicionalmente:
110. El vertebrado o célula según el aspecto 109, en donde dicha pluralidad de segmentos génicos de anticuerpos humanos comprende al menos 11 segmentos V humanos y/o al menos 6 segmentos J humanos, p. ej., al menos 11 segmentos génicos VH humanos y al menos 6 segmentos JH humanos y opcionalmente también al menos 27 segmentos D humanos; opcionalmente con las secuencias intermedias de segmentos intergénicos humanos. En un ejemplo, los segmentos génicos de anticuerpos humanos se proporcionan mediante un tramo de secuencia de ADN del cromosoma 14 humano, que comprende los segmentos génicos y secuencias intermedias en configuración de la línea germinal.
111. El vertebrado o célula según el aspecto 109 o 110, en donde dicha secuencia de ADN insertada comprende una secuencia de nucleótidos humana que comprende dichos segmentos génicos de anticuerpo, en donde la secuencia de nucleótidos es de al menos 110, 130, 150, 170, 190, 210, 230, 250, 270 o 290 kb. En un ejemplo, la secuencia de nucleótidos corresponde a un tramo de secuencia de ADN del cromosoma 14 humano, que comprende los segmentos génicos y secuencias intermedias en configuración de la línea germinal, p. ej., al menos una secuencia correspondiente a la secuencia de nucleótidos de la coordenada 106328951 a la coordenada 106601551 de un cromosoma 14 humano, p. ej., una secuencia en la base de datos de secuencias GRCH37/hg19.
112. El vertebrado o célula según el aspecto 109, en donde el locus transgénico es un locus de cadena ligera kappa y los segmentos génicos de anticuerpo humano están entre el segmento génico Jk endógeno más 3' y Ck endógeno; en donde opcionalmente los segmentos génicos de anticuerpo humano comprenden cinco agrupaciones JA-CA humanas funcionales y al menos un segmento génico VA humano, p. ej., al menos una secuencia correspondiente a la secuencia de nucleótidos de las coordenadas 23217291 a 23327884 de un locus lambda encontrado en un cromosoma 22 humano.
113. El vertebrado o célula según uno cualquiera de los aspectos 109 a 112, en donde el locus transgénico es un locus de cadena pesada y los segmentos génicos de anticuerpo humano están entre el segmento génico JH endógeno más 3' (p. ej., JH4 en un genoma de ratón) y Cmu endógeno.
114. El vertebrado o célula según uno cualquiera de los aspectos 109 a 113, en donde el genoma es homocigoto para dicho locus transgénico.
115. Una ratón o célula de ratón o una rata o célula de rata según uno cualquiera de los aspectos 109 a 114.
116. Un método para preparar una célula de vertebrado no humano (opcionalmente una célula de ratón o rata), comprendiendo el método
(a) proporcionar una célula ES no humana cuyo genoma comprende un locus de cadena de anticuerpo endógeno que comprende segmentos génicos de región variable de anticuerpo endógeno y una región constante de anticuerpo endógeno; y
(b) preparar un locus de cadena de anticuerpo transgénico insertando en dicho locus endógeno una secuencia de ADN que comprende una pluralidad de segmentos génicos de región variable de anticuerpo humano entre dichos segmentos génicos de región variable de anticuerpo endógeno y dicha región constante endógena, de modo que los segmentos génicos de región variable de anticuerpo humano están conectados operablemente aguas arriba de la región constante endógena, por medio de lo cual se produce una célula ES de vertebrado no humano que es capaz de dar lugar a una célula de progenie en la que la expresión de anticuerpos endógenos está inactivada y en donde la progenie es capaz de expresar anticuerpos que comprenden regiones variables humanas; y
(c) diferenciar opcionalmente dicha célula ES en dicha célula de progenie o un vertebrado no humano (p. ej., ratón o rata) que comprende dicha célula de progenie.
117. El método según el aspecto 116, en donde dicha pluralidad de segmentos génicos de anticuerpos humanos comprende al menos 11 segmentos V humanos.
118. El método según el aspecto 116 o 117, en donde dicha pluralidad de segmentos génicos de anticuerpos humanos comprende al menos 6 segmentos J humanos.
119. El método según el aspecto 116, 117 o 118, en donde se inserta una secuencia de nucleótidos humana en la etapa (b), comprendiendo la secuencia de nucleótidos dichos segmentos génicos de anticuerpo, en donde la secuencia de nucleótidos es de al menos 110 kb.
120. El método según uno cualquiera de los aspectos 110 a 113, en donde el locus endógeno es un locus de cadena pesada y los segmentos génicos de anticuerpo humano están entre el segmento génico JH endógeno más 3' y Cmu endógeno.
121. El método según uno cualquiera de los aspectos 116 a 120, en donde la célula de progenie es homocigota para dicho locus transgénico.
En un ejemplo del método del aspecto 116, el método comprende inactivar la expresión en el genoma de las cadenas pesadas y kappa (y opcionalmente también lambda) endógenas.
En un ejemplo del método del aspecto 116, en la parte (b) dicha secuencia de ADN comprende segmentos génicos VH, D y JH humanos o segmentos génicos VL y JL humanos (p. ej., segmentos génicos V<k>y J<k>). En un ejemplo, el ADN comprende un lugar de emplazamiento genómico que tiene un marcador seleccionable, p. ej., un gen HPRT, un gen de resistencia a neomicina o un gen de resistencia a puromicina; y/o un promotor.
En un ejemplo, en la parte (b) del aspecto 116, los segmentos génicos endógenos son la región VDJ endógena completa de un locus de cadena pesada y/o la región constante endógena es un Cmu o Cgamma.
En un ejemplo, en la parte (b) del aspecto 116, los segmentos génicos endógenos son la región VJ endógena completa de un locus de la cadena kappa y/o la región constante endógena es un Ckappa
En un ejemplo, en la parte (b) del aspecto 116, los segmentos génicos endógenos son la región VJ endógena completa de un locus de cadena lambda y/o la región constante endógena es un Clambda.
La célula de vertebrado no humano puede ser un hibridoma, célula B, célula ES o una célula IPS. Cuando la célula es una célula ES o una célula IPS, la expresión de la cadena de anticuerpo endógeno se inactiva después de la diferenciación de la célula en una célula B de progenie (p. ej., en una célula B en un vertebrado no humano).
La divulgación proporciona adicionalmente:
El método según el aspecto 116, en donde dicha secuencia de ADN insertada comprende una secuencia de nucleótidos humana que comprende dichos segmentos génicos de anticuerpos humanos, en donde la secuencia de nucleótidos es de al menos 110, 130, 150, 170, 190, 210, 230, 250, 270 o 290 kb. En un ejemplo, la secuencia de nucleótidos corresponde a un tramo de secuencia de ADN del cromosoma 14 humano, que comprende los segmentos génicos y secuencias intermedias en configuración de la línea germinal, p. ej., al menos una secuencia correspondiente a la secuencia de nucleótidos de la coordenada 106328951 a la coordenada 106601551 de un cromosoma 14 humano, p. ej., una secuencia en la base de datos de secuencias GRCH37/hg19.
El método según el aspecto 116, en donde el locus transgénico es un locus de cadena ligera kappa y los segmentos génicos de anticuerpo humano están entre el segmento génico Jk endógeno más 3' y Ck endógeno; en donde opcionalmente los segmentos génicos de anticuerpo humano comprenden cinco agrupaciones JA-CA humanas funcionales y al menos un segmento génico VA humano, p. ej., al menos una secuencia correspondiente a la secuencia de nucleótidos de la coordenada 23217291 a 23327884 de un locus lambda encontrado en un cromosoma 22 humano. El método según el aspecto 116, en donde el locus transgénico es un locus de cadena pesada y los segmentos génicos de anticuerpo humano se insertan entre el segmento génico JH endógeno más 3' (p. ej., JH4 en un genoma de ratón) y Cmu endógeno.
122. El método según uno cualquiera de los aspectos 116 a 121, que comprende convertir en homocigoto el genoma de la progenie para dicho locus transgénico.
Aislamiento de anticuerpos de vertebrados no humanos transgénicos de la divulgación y anticuerpos específicos de antígeno útiles de afinidades terapéuticamente relevantes
123. Un método para aislar un anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el método (a) proporcionar un vertebrado (opcionalmente un mamífero; opcionalmente un ratón o rata según uno cualquiera de los ejemplos o aspectos anteriores;
(b) inmunizar dicho vertebrado con dicho antígeno (en donde opcionalmente el antígeno es un antígeno de un patógeno de enfermedad infecciosa);
(c) eliminar linfocitos B del vertebrado y seleccionar uno o más linfocitos B que expresan anticuerpos que se unen al antígeno;
(d) inmortalizar opcionalmente dichos linfocitos B seleccionados o progenie de los mismos, opcionalmente produciendo hibridomas a partir de los mismos; y
(e) aislar un anticuerpo (p. ej., y anticuerpo de tipo IgG) expresado por los linfocitos B.
124. El método del aspecto 123, que comprende la etapa de aislar de dichos linfocitos B el ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo que se une a dicho antígeno; opcionalmente intercambiar la secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo por una secuencia de nucleótidos que codifica una región constante de la cadena pesada humana o humanizada y opcionalmente madurar por afinidad la región variable de dicho anticuerpo; y opcionalmente insertar dicho ácido nucleico en un vector de expresión y opcionalmente un anfitrión.
125. El método del aspecto 123 o 124, que comprende adicionalmente preparar un mutante o derivado del anticuerpo producido por el método del aspecto 122 o 123.
Como se demuestra mediante los siguientes ejemplos, los vertebrados no humanos de la divulgación son capaces de producir anticuerpos específicos de antígeno de afinidad por debajo de 50 nM con secuencias humanas en sus regiones CDR3. Por tanto, la divulgación proporciona adicionalmente:
126. Un anticuerpo o fragmento (p. ej., un Fab o Fab<2>) del mismo que comprenden regiones variables que se unen específicamente a un antígeno predeterminado con una afinidad por debajo de 50 nM (opcionalmente por debajo de 40, 30, 20, 10, 1,0,1 o 0,01 nM) como se determina por resonancia de plasmón superficial, en donde el anticuerpo se aísla de un vertebrado no humano (opcionalmente un mamífero; opcionalmente un ratón o rata) según uno cualquiera de los ejemplos o aspectos anteriores y comprende CDR3 de cadena pesada (como se define por Kabat) codificadas por una VDJ reordenada de dicho vertebrado, en donde la VDJ es el producto de reordenamientoin vivode un segmento génico JH humano de un locus de cadena pesada de dicho vertebrado con segmentos génicos D (opcionalmente un segmento génico D humano de dicho locus) y VH.
En un aspecto, la resonancia de plasmón superficial (SPR) se lleva a cabo a 25°C. En otro aspecto, la SPR se lleva a cabo a 37°C.
En un aspecto, la SPR se lleva a cabo a pH fisiológico, tal como aproximadamente pH 7 o a pH 7,6 (p. ej., utilizando solución salina tamponada con Hepes a pH 7,6 (también denominada HBS-EP)).
En un aspecto, la SPR se lleva a cabo a un nivel salino fisiológico, p. ej., NaCl 150 mM.
En un aspecto, la SPR se lleva a cabo a un nivel de detergente no superior a 0,05% en volumen, p. ej., en presencia de P20 (polisorbato 20; p. ej., Tween-20™) al 0,05% y EDTA 3 mM.
En un ejemplo, la SPR se lleva a cabo a 25°C o 37°C en un tampón a pH 7,6, NaCl 150 mM, detergente al 0,05% (por ejemplo, P20) y EDTA 3 mM. El tampón puede contener Hepes 10 mM. En un ejemplo, la SPR se lleva a cabo a 25°C o 37°C en HBS-EP. El HBS-EP está disponible en Teknova Inc (California; número de catálogo H8022).
En un ejemplo, la afinidad del anticuerpo se determina utilizando SPR mediante
1. Acoplamiento de anti-IgG de ratón (u otro vertebrado no humano relevante) (p. ej., Biacore BR-1008-38) a un chip biosensor (p. ej., chip GLM) tal como mediante acoplamiento de amina primaria;
2. Exposición del anti-IgG de ratón (anticuerpo de vertebrado no humano) a un anticuerpo IgG de prueba para capturar el anticuerpo de prueba sobre el chip;
3. Pase del antígeno de prueba sobre la superficie de captura del chip a 1024 nM, 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM, 0 nM (es decir, tampón solo); y
4. Determinación de la afinidad de unión del anticuerpo de prueba al antígeno de prueba utilizando resonancia de plasmón superficial, p. ej., en las condiciones de SPR comentadas anteriormente (p. ej., a 25°C en tampón fisiológico). La SPR se puede llevar a cabo utilizando cualquier aparato de SPR convencional, tal como mediante Biacore™ o utilizando ProteOn XPR36™ (Bio-Rad®).
La regeneración de la superficie de captura se puede llevar a cabo con glicina 10 mM a pH 1,7. Esto elimina el anticuerpo capturado y permite que la superficie se use para otra interacción. Los datos de unión pueden ajustarse al modelo 1:1 inherente utilizando técnicas convencionales, p. ej., utilizando un modelo inherente al soporte lógico de análisis ProteOn XPR36™.
La divulgación también se refiere a un scFv, dianticuerpo u otro fragmento de anticuerpo que comprende un dominio VH y VL de un anticuerpo o fragmento del aspecto 126 (opcionalmente después de la maduración de afinidad, p. ej., mediante presentación en fagos).
En un aspecto, el antígeno es una serpina, p. ej., ovoalbúmina, antitrombina o antitripsina. Las serpinas son un grupo de proteínas con estructuras similares que se identificaron primero como un conjunto de proteínas capaces de inhibir proteasas. El acrónimo serpina se acuñó originalmente porque muchas serpinas inhiben serina proteasas similares a quimotripsina (inhibidores de serina proteasa). Los primeros miembros de la superfamilia de las serpinas que se estudiaron extensamente fueron las proteínas plasmáticas humanas antitrombina y antitripsina, que desempeñan papeles clave en el control de la coagulación sanguínea y la inflamación, respectivamente. Inicialmente, la investigación se centró en su papel en la enfermedad humana: la deficiencia de antitrombina da como resultado trombosis y la deficiencia de antitripsina causa enfisema. En 1980 Hunt y Dayhoff realizaron el sorprendente descubrimiento de que ambas moléculas comparten una similitud de secuencia de aminoácidos significativa con la proteína principal en clara de huevo de pollo, ovoalbúmina, y propusieron una nueva superfamilia de proteínas.
127. Un anticuerpo o fragmento que es idéntico a un anticuerpo del aspecto 126 o un derivado del mismo (opcionalmente un derivado cuyas regiones constantes son humanas y/o un derivado madurado por afinidad) que se une específicamente a dicho antígeno con una afinidad por debajo de 50 nM según se determina por resonancia de plasmón superficial.
128. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento del aspecto 126 o 127 y un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
129. Una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada de un anticuerpo o fragmento del aspecto 126 o 127, opcionalmente como parte de un vector (p. ej., un vector de expresión).
130. La secuencia de nucleótidos del aspecto 129, en donde la secuencia es un ADNc derivado de una célula B del vertebrado del que se aísla el anticuerpo del aspecto 126, o es idéntica a tal ADNc.
131. Una célula anfitriona aislada (p. ej., un hibridoma o una célula CHO o una célula HEK293) que comprende una secuencia de nucleótidos según el aspecto 129 o 130.
132. Un método para aislar un anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el método
(a) proporcionar un vertebrado (opcionalmente un mamífero; opcionalmente un ratón o rata según uno cualquiera de los ejemplos o aspectos anteriores;
(b) inmunizar dicho vertebrado con dicho antígeno;
(c) eliminar linfocitos B del vertebrado y seleccionar un linfocito B que expresa un anticuerpo que se une al antígeno con afinidad sub-nM, en donde el anticuerpo es según el aspecto 126;
(d) inmortalizar opcionalmente dicho linfocito B seleccionado o su progenie, opcionalmente produciendo hibridomas a partir del mismo; y
(e) aislar un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo de tipo IgG) expresado por el linfocito B.
133. El método del aspecto 132, que comprende la etapa de aislar de dicho linfocito B el ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo que se une a dicho antígeno; opcionalmente intercambiar la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada del anticuerpo por una secuencia de nucleótidos que codifica una región constante de cadena pesada humana o humanizada y opcionalmente madurar por afinidad la región variable de dicho anticuerpo; y opcionalmente insertar dicho ácido nucleico en un vector de expresión y opcionalmente un anfitrión.
134. El método del aspecto 132 o 133, que comprende adicionalmente preparar un mutante o derivado del anticuerpo producido por el método del aspecto 132 o 133.
Inactivación por inversión de VDJ endógena a regiones desiertas del genoma
135. Un ratón o célula de ratón que comprenden segmentos génicos endógenos invertidos de cadena pesada (p. ej., VH, D y JH, tal como la región VDJ de cadena pesada endógena completa) que están inmediatamente 3' con respecto a la posición 119753123, 119659458 o 120918606 en un cromosoma 12 endógeno de ratón, en donde el ratón comprende un locus de cadena pesada transgénico que comprende una pluralidad de segmentos génicos VH humanos, una pluralidad de segmentos D humanos y una pluralidad de segmentos JH humanos conectados operablemente aguas arriba de una región constante endógena (p. ej., C mu) de modo que el ratón o célula (opcionalmente después de la diferenciación en una célula B) sean capaces de expresar un anticuerpo que comprende una región variable que comprende secuencias derivadas de los segmentos génicos humanos.
136. El ratón o célula del aspecto 135, en donde el genoma del ratón o célula es homocigoto para dicho cromosoma 12.
137. Un casete para la inversión e inactivación de segmentos génicos de cadena de anticuerpo endógeno de vertebrado no humano (p. ej., ratón o rata), siendo los segmentos parte de una secuencia de locus de cadena de anticuerpo en un cromosoma de una célula (p. ej., célula ES) de vertebrado no humano (p. ej., ratón o rata) en donde la secuencia está flanqueada en su extremo 3' por un sitio de recombinación específica de sitio (p. ej., lox, rox o frt), comprendiendo el casete una secuencia de nucleótidos que codifica una marca expresable o marcador seleccionable y un sitio de recombinación específica de sitio compatible (p. ej., lox, rox o frt) flanqueada por un brazo de homología 5' y 3', en donde los brazos de homología corresponden o son homólogos a tramos adyacentes de secuencia en el genoma celular en un cromosoma diferente o en dicho cromosoma al menos a 10 mb de los segmentos génicos endógenos.
138. Un casete para la inversión e inactivación de segmentos génicos de cadena pesada de anticuerpos endógenos de ratón, siendo los segmentos parte de una secuencia de locus de cadena pesada en el cromosoma 12 de una célula de ratón (p. ej., célula ES) en donde la secuencia está flanqueada en su extremo 3' por un sitio de recombinación específica de sitio (p. ej., lox, rox o frt), comprendiendo el casete una secuencia de nucleótidos que codifica una marca expresable o marcador seleccionable y un sitio de recombinación específica de sitio compatible (p. ej., lox, rox o frt) flanqueada por un brazo de homología 5' y 3', en donde (i) el brazo de homología 5' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119753124 a la coordenada 119757104 y el brazo de homología 3' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119749288 a 119753123; (ii) el brazo de homología 5' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119659459 a la coordenada 119663126 y el brazo de homología 3' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119656536 a 119659458; o (iii) el brazo de homología 5' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 120918607 a la coordenada 120921930 y el brazo de homología 3' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 120915475 a 120918606.
139. Un método para inactivar segmentos génicos de un locus de anticuerpo endógeno, comprendiendo el método
(i) Proporcionar una célula de vertebrado no humano (p. ej., una célula ES, p. ej., una célula ES de ratón) cuyo genoma comprende un locus de cadena de anticuerpo que comprende segmentos génicos endógenos de región variable;
(ii) Dirigir un sitio de recombinación específica de sitio para flanquear el 3' del más 3' de dichos segmentos génicos endógenos;
(iii) Dirigir un segundo sitio de recombinación específica de sitio al menos a 10 mb de distancia de dichos segmentos génicos endógenos, siendo el segundo sitio compatible con el primer sitio invertido con respecto al primer sitio;
(iv) Expresar una recombinasa compatible con dichos sitios para efectuar recombinación específica de sitio entre dichos sitios, invirtiendo y moviendo de ese modo dichos segmentos génicos lejos de dicho locus, en donde los segmentos génicos endógenos están inactivados; y
(v) Opcionalmente, desarrollar la célula en una célula de progenie o vertebrado (p. ej., ratón o rata) cuyo genoma es homocigoto para la inversión.
140. Un ratón o célula de ratón cuyo genoma comprende una inversión de un cromosoma 12, en donde la inversión comprende segmentos génicos endógenos invertidos de cadena pesada (p. ej., VH, D y JH, tal como la región VDJ de cadena pesada endógena completa); en donde el ratón comprende un locus de cadena pesada transgénica que comprende una pluralidad de segmentos génicos VH humanos, una pluralidad de segmentos D humanos y una pluralidad de segmentos JH humanos conectados operablemente aguas arriba de una región constante endógena (p. ej., C mu) de modo que el ratón o célula (opcionalmente después de la diferenciación en una célula B) sean capaces de expresar un anticuerpo que comprende una región variable que comprende secuencias derivadas de los segmentos génicos humanos; y en donde la inversión es (i) una inversión del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119753123 a la coordenada 114666436; (ii) una inversión del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119659458 a la coordenada 114666436; o (iii) una inversión del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 12091806 a la coordenada 114666436.
Otros aspectos incluyen:
Un método para producir un anticuerpo específico para un antígeno deseado, comprendiendo el método inmunizar un mamífero no humano como se divulga en el presente documento con el antígeno deseado y recuperar el anticuerpo o una célula que produce el anticuerpo.
Un método para producir un anticuerpo totalmente humanizado que comprende inmunizar un mamífero no humano como se divulga en el presente documento y después reemplazar la región constante de mamífero no humano de un anticuerpo específicamente reactivo con el antígeno por una región constante humana, adecuadamente mediante modificación mediante ingeniería genética del ácido nucleico que codifica el anticuerpo.
Un método, célula o mamífero como se divulgan en el presente documento, en donde una secuencia de ADN de la región codificante humana está en un ordenamiento funcional con una secuencia de control de mamífero no humano, de manera que la transcripción del ADN está controlada por la secuencia de control de mamífero no humano. En un aspecto, la región V, D o J de la región codificante humana está en un ordenamiento funcional con una secuencia promotora de ratón.
La divulgación también se refiere a un anticuerpo humanizado producido según cualquiera de los métodos divulgados en el presente documento y al uso de un anticuerpo humanizado producido de este modo en medicina.
Inactivación de la cadena ligera endógena y alta expresión de regiones variables lambda humanas en vertebrados no humanos transgénicos y células
Como se explica adicionalmente en los ejemplos más abajo, los autores de la presente invención han observado sorprendentemente niveles de expresión muy altos de cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda humanas (al menos 70 u 80% lambda V humana) a partir de loci de cadenas ligeras transgénicas producidos por inserción dirigida de segmentos génicos lambda humanos en loci de cadenas ligeras endógenas de vertebrados no humanos. Esto es posible incluso en presencia de segmentos génicos V y J endógenos no humanos de vertebrados en el genoma de vertebrados. Además, los niveles sorprendentemente altos de expresión se consiguen cuando la inserción de segmentos génicos lambda humanos está en el locus endógeno kappa o lambda. Tales niveles elevados por inserción dirigida no han sido publicados hasta ahora en la técnica.
Los autores de la presente invención también observaron sorprendentemente que la expresión de la cadena kappa endógena se puede inactivar completamente mediante la inserción dirigida de la secuencia del gen lambda humano en el locus kappa endógeno, como se explica adicionalmente en los ejemplos.
La inserción dirigida de segmentos génicos humanos en loci de Ig endógenos es ventajosa porque permite la localización operable de secuencias de Ig humanas insertadas con respecto a regiones constantes endógenas de Ig y regiones de control endógenas, tales como potenciadores y otras regiones de control de locus, por ejemplo. Por tanto, la inserción dirigida permite aprovechar el control endógeno importante en uno o más de recombinación de segmentos génicos de Ig, exclusión alélica, maduración de afinidad, cambio de clase, niveles de expresión de Ig y desarrollo deseable del compartimento de células B. Como tal, la inserción dirigida es superior a los intentos tempranos en la técnica para producir loci y expresión de Ig transgénicos, intentos que se basaron en la introducción en células de vertebrados no humanos de vectores tales como YAC que portaban segmentos génicos de Ig humanos. Los YAC se integran aleatoriamente en el genoma de la célula de vertebrado, de modo que es difícil conseguir el control proporcionado por la inserción dirigida y los beneficios concomitantes que se producen en términos de aprovechamiento de los mecanismos de control endógenos. Además, la inserción aleatoria a menudo da como resultado que los segmentos génicos de Ig humanos insertados estén bajo el control de elementos de control heterólogos y/o modificaciones cromosómicas epigenéticas tales como metilación y confirmaciones de cromatina, cualquiera de los cuales puede ser perjudicial para la recombinación de segmentos génicos de Ig, exclusión alélica, maduración de afinidad, cambio de clase, niveles de expresión de Ig y desarrollo deseable del compartimento de células B apropiados. La inserción aleatoria típicamente da como resultado 2 o más copias del transgén introducido que pueden provocar inestabilidad cromosómica y por lo tanto da como resultado un rendimiento de reproducción deficiente de los animales además de efectos perjudiciales sobre la recombinación de segmentos génicos de Ig, exclusión alélica, maduración de afinidad, cambio de clase, niveles de expresión de Ig y desarrollo deseable del compartimento de células B apropiados. Por lo tanto, los intentos de la técnica anterior que utilizan inserción aleatoria han tendido a conducir a un desarrollo deficiente de células B, compartimentos de células B relativamente pequeños y expresión inferior de Ig y una dificultad concomitante en el aislamiento de un anticuerpo con una característica deseada.
La divulgación proporciona por lo tanto los siguientes aspectos:
Expresión de regiones variables lambda humanas
1. Un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido por inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci de Ig endógenos, comprendiendo el genoma segmentos génicos VA y JA humanos aguas arriba de una región constante, en donde los segmentos génicos VA y JA humanos se han proporcionado por inserción en un locus endógeno de cadena ligera del vertebrado, en donde el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda (cadenas ligeras lambda), en donde las cadenas ligeras lambda comprenden cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos.
Un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido mediante la inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más locus de Ig endógenos, comprendiendo el genoma segmentos génicos VA y JA humanos aguas arriba de una región constante, en donde los segmentos génicos VA y JA humanos se han proporcionado mediante inserción en un locus endógeno de cadena ligera del vertebrado, en donde el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda (cadenas ligeras lambda), y en donde al menos 70 u 80% de las regiones variables de las cadenas ligeras lambda expresadas por el vertebrado derivan de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos. Esto se demuestra en los ejemplos más abajo.
Por ejemplo, al menos 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99%, o 100% de las regiones variables de las cadenas ligeras lambda expresadas por el vertebrado derivan de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos. Esto se demuestra en los ejemplos más abajo.
En aspectos, se proporciona
Una célula ES de vertebrado no humano (p. ej., una célula ES de ratón o una célula ES de rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido por la inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci de Ig endógenos, comprendiendo el genoma segmentos génicos VA y JA humanos aguas arriba de una región constante, en donde los segmentos génicos VA y JA humanos se han proporcionado por inserción en un locus endógeno de cadena ligera de la célula de vertebrado, en donde la célula se puede desarrollar hasta un vertebrado que expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda (cadenas ligeras lambda), en donde las cadenas ligeras lambda comprenden cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos.
Una célula ES de vertebrado no humano (p. ej., una célula ES de ratón o una célula ES de rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido por inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci endógenos de Ig, comprendiendo el genoma segmentos génicos VA y JA humanos aguas arriba de una región constante, en donde los segmentos génicos VA y JA humanos se han proporcionado por inserción en un locus endógeno de cadena ligera de la célula de vertebrado, en donde la célula se puede desarrollar hasta un vertebrado que expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda (cadenas ligeras lambda), y en donde al menos 70 u 80% (por ejemplo, al menos 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% o 100%) de las regiones variables de las cadenas ligeras lambda expresadas por el vertebrado derivan de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos.
En un ejemplo, sorprendentemente, la expresión de cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos se logra incluso cuando el genoma comprende segmentos génicos endógenos de región variable lambda de vertebrado no humano (p. ej., segmentos génicos endógenos VA y/o JA, opcionalmente un repertorio endógeno completo de segmentos génicos VA y JA). Por tanto, en un ejemplo, el genoma comprende segmentos génicos endógenos de región variable lambda de vertebrado no humano (p. ej., segmentos génicos endógenos VA y/o JA, opcionalmente un repertorio endógeno completo de segmentos génicos Va y/o JA). En otro ejemplo, tales segmentos génicos endógenos están ausentes del genoma.
2. El vertebrado o célula del aspecto 1, en donde opcionalmente la inserción de VA y JA humanos comprende al menos los segmentos génicos V y J humanos funcionales (opcionalmente también CA humano) comprendidos por un locus de cadena lambda de Ig humana de VA2-18 a CA7. En un ejemplo, la inserción también comprende secuencias de segmentos intergénicos lambda. Estas son secuencias humanas o pueden ser secuencias de especies de vertebrados no humanos (p. ej., cuando el vertebrado es un ratón, se pueden utilizar secuencias entre los segmentos génicos lambda de ratón correspondientes).
3. El vertebrado o célula del aspecto 1 o 2, en donde opcionalmente el genoma es homocigoto para la inserción del segmento génico VA y JA humano y la expresión de la cadena kappa endógena en dicho vertebrado es sustancial o completamente inactiva. En un ejemplo, menos de 10, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% de las cadenas ligeras son proporcionadas por cadenas kappa endógenas (es decir, cadenas kappa cuyas regiones variables derivan de la recombinación de segmentos génicos V y J de vertebrados no humanos).
4. El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente el locus endógeno es un locus kappa endógeno.
5. El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente el locus endógeno es un locus lambda endógeno.
> 60% de todas las cadenas ligeras tienen regiones V lambda humanas
6. Un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido mediante la inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci de Ig endógenos, comprendiendo el genoma (i) segmentos génicos VA y JA humanos aguas arriba de una región constante, en donde los segmentos génicos VA y JA humanos se han proporcionado mediante inserción en un locus endógeno de cadena ligera del vertebrado y (ii) segmentos génicos V kappa aguas arriba de una región constante, en donde el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda humanas (cadenas ligeras lambda humanas), y en donde al menos 60% de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado son proporcionadas por dichas cadenas ligeras lambda humanas. Esto se demuestra en los ejemplos más abajo.
Por ejemplo, al menos 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99%, o 100% de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado son proporcionadas por dichas cadenas ligeras lambda humanas. Por ejemplo, al menos 84% de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado son proporcionadas por dichas cadenas ligeras lambda humanas. Por ejemplo, al menos 95% de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado son proporcionadas por dichas cadenas ligeras lambda humanas. Esto se demuestra en los ejemplos más abajo.
En un aspecto, se proporciona una célula ES de vertebrado no humano (p. ej., una célula ES de ratón o una célula ES de rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido mediante inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci endógenos de Ig, comprendiendo el genoma (i) segmentos génicos VA y JA humanos aguas arriba de una región constante, en donde los segmentos génicos VA y JA humanos se han proporcionado mediante inserción en un locus endógeno de cadena ligera del vertebrado y (ii) segmentos génicos V kappa aguas arriba de una región constante, en donde la célula se puede desarrollar hasta un vertebrado que expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda humanas (cadenas ligeras lambda humanas), y en donde al menos 60% de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado son proporcionadas por dichas cadenas ligeras lambda humanas.
7. Una vertebrado no humano o una célula de vertebrado no humano (p. ej., un ratón, una rata, una célula de ratón o una célula de rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido por inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci endógenos de Ig, comprendiendo el genoma una inserción dirigida de segmentos génicos humanos VA y JA de inmunoglobulina en un locus endógeno de cadena ligera kappa o lambda de vertebrado no humano aguas abajo de segmentos génicos endógenos VL y JL para la expresión de cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda humanas; en donde la inserción de VA y JA humanos comprende al menos los segmentos génicos V y J humanos funcionales (y opcionalmente también CA humano funcional) comprendidos por un locus de Ig humano de cadena lambda desde VA2-18 a CA7.
Como se demuestra en los ejemplos, la expresión de la cadena ligera endógena de dicho locus está inactivada y también la expresión de la región variable lambda humana domina sobre la expresión de la región variable lambda endógena.
Por "aguas abajo" se entiende 3' con respecto a los segmentos génicos en el mismo cromosoma. En un ejemplo, los segmentos génicos V y J endógenos se invierten con respecto a los segmentos génicos humanos y opcionalmente se mueven fuera del locus endógeno de la cadena ligera. En un ejemplo, los segmentos génicos humanos están aguas abajo de todos los segmentos V y J endógenos de dicho locus kappa o lambda. La posibilidad de conservar las secuencias V-J endógenas y las secuencias intergénicas es ventajosa ya que se conservan regiones y/o genes de control incorporados que pueden ser deseables en el vertebrado.
Opcionalmente, la inserción también comprende secuencias de segmentos intergénicos lambda. Estas son secuencias humanas o pueden ser secuencias de especies de vertebrados no humanos (p. ej., cuando el vertebrado es un ratón, se pueden utilizar secuencias entre los segmentos génicos lambda de ratón correspondientes).
Expresión de cadenas lambda VJCA
8. Un vertebrado no humano o una célula de vertebrado no humano (p. ej., un ratón, una rata, una célula de ratón o una célula de rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido mediante la inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci endógenos de Ig, comprendiendo el genoma una inserción dirigida de genes humanos de inmunoglobulina VA, JA y CA en un locus endógeno de cadena ligera kappa o lambda de vertebrado no humano aguas arriba de una región constante endógena kappa o lambda de vertebrado no humano para la expresión de una cadena ligera de VJC humana; en donde opcionalmente la inserción de VJC humana comprende al menos los segmentos génicos V, J y C humanos funcionales comprendidos por un locus de cadena lambda de Ig humana de VA3-1 a CA7 (p. ej., comprendido por un locus de cadena lambda de Ig humana de 2-18 a CA7).
Como se demuestra en los ejemplos, la expresión de la región variable lambda humana domina sobre la expresión de la región variable kappa endógena. La expresión de la cadena kappa endógena del locus endógeno se puede inactivar.
Opcionalmente, la inserción también comprende secuencias de segmentos intergénicos lambda. Estas son secuencias humanas o pueden ser secuencias de especies de vertebrados no humanos (p. ej., cuando el vertebrado es un ratón, se pueden utilizar secuencias entre los segmentos génicos lambda de ratón correspondientes).
9. Un vertebrado no humano o una célula de vertebrado no humano (p. ej., un ratón, una rata, una célula de ratón o una célula de rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido por inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci endógenos de Ig, comprendiendo el genoma una inserción dirigida de al menos los segmentos génicos VA y JA humanos funcionales (y opcionalmente CA funcional humano) comprendidos por un locus de cadena lambda de Ig humana de VA3-1 a CA7 (opcionalmente de VA2-18 a CA7) en un locus endógeno de cadena ligera kappa de vertebrado no humano aguas abajo de los segmentos génicos Vky Jkde ratón para la expresión de una cadena ligera que comprende una región variable lambda humana, por medio de lo cual en presencia de dicha inserción, la expresión de cadenas ligeras kappa endógenas derivadas de dichos segmentos génicos Vky Jkde ratón está sustancialmente o completamente inactivada.
En un ejemplo, menos de 10, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% de las cadenas ligeras son proporcionadas por cadenas kappa endógenas (es decir, cadenas kappa cuyas regiones variables derivan de la recombinación de segmentos génicos Vky Jkde vertebrados no humanos).
Opcionalmente, la inserción también comprende secuencias de segmentos intergénicos lambda. Estas son secuencias humanas o pueden ser secuencias de especies de vertebrados no humanos (p. ej., cuando el vertebrado es un ratón, se pueden utilizar secuencias entre los segmentos génicos lambda de ratón correspondientes).
10. Un vertebrado no humano o una célula de vertebrado no humano (p. ej., un ratón, una rata, una célula de ratón o una célula de rata), en donde en el genoma la VJ de IgK de ratón se ha alejado del potenciador Ekde ratón, inactivando de este modo las regiones VJ de IgK endógenas. Esto se demuestra en los ejemplos.
11. El vertebrado de la célula del aspecto 10, en donde opcionalmente la VJ de IgK se ha alejado del potenciador Ekde ratón mediante la inserción de segmentos génicos VL y JL humanos entre la VJ de IgK de ratón y el potenciador Ek; en donde opcionalmente la inserción es una inserción como se menciona en cualquier aspecto 1-9 anterior o una inserción de segmentos génicos Vk y Jk humanos.
12. El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente los segmentos génicos VA y JA humanos se han insertado en el intervalo de 100, 75, 50, 40, 30, 20, 15, 10 o 5 kb de un potenciador endógeno de la cadena ligera de vertebrado no humano. En un ejemplo, el potenciador es un potenciador lambda (p. ej., EA2-4, EA4-10 o EA3-1 de ratón) cuando la inserción es en un locus lambda endógeno. En un ejemplo, el potenciador es un potenciador kappa (p. ej., ÍEko 3'Ek) cuando la inserción es en un locus kappa endógeno.
13. El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente los segmentos génicos VA y JA humanos se proporcionan en el genoma mediante la inserción dirigida de al menos 10 segmentos génicos VA humanos con segmentos génicos JA humanos aguas arriba de una región constante endógena de cadena ligera de vertebrado no humano de dicho locus de cadena ligera. Por ejemplo, los segmentos génicos humanos se proporcionan mediante la inserción de al menos una porción de un locus de la cadena lambda de Ig humana de VA2-18 a VA3-1; o al menos una porción de un locus de la cadena lambda de Ig humana de VA2-18 a VA3-1 insertado con JA1, JA2, JA3, JA6 y JA7; o al menos una porción de un locus de la cadena lambda de Ig humana de VA2-18 a CA7 (excluyendo opcionalmente JA4CA4 y/o JA5CA5).
Opcionalmente, se insertan al menos 2, 3, 4 o 5 JA humanos. En un ejemplo, los JA insertados son diferentes entre sí. Por ejemplo, se insertan JA1, JA2, JA3, JA6 y JA7 humanos, opcionalmente como parte de las respectivas agrupaciones de JACA humanos.
Opcionalmente, se inserta un potenciador de la cadena ligera humana, p. ej. EA. Por ejemplo, la inserción de EA humano entre los segmentos JA humanos y la región constante endógena; o entre segmentos génicos CA humanos (cuando estos se insertan) y la región constante endógena.
14. El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente las cadenas ligeras lambda proporcionan un repertorio de regiones variables lambda humanas derivadas de segmentos génicos VA3-1 humanos y opcionalmente uno o más de VA2-18, VA3-16, V2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8 y VA4-3 que se han proporcionado en el genoma mediante inserción dirigida en dicho locus de cadena ligera.
Esto es útil porque VA3-1 es un segmento génico lambda muy utilizado en seres humanos (Fig. 59; Ignatovichet al1997) y, por lo tanto, es deseable que las células y vertebrados de la divulgación proporcionen la inclusión de regiones variables lambda basadas en este segmento génico para la selección frente a antígenos, particularmente para el desarrollo de agentes terapéuticos de anticuerpos para uso humano.
15. El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente las cadenas ligeras lambda proporcionan un repertorio de regiones variables lambda humanas derivadas de segmentos génicos VA humanos VA2-14 y uno o más de VA2-18, VA3-16, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1 que se han proporcionado en el genoma mediante inserción dirigida en dicho locus de cadena ligera.
Esto es útil porque VA2-14 es un segmento génico lambda muy utilizado en seres humanos y por tanto es deseable que las células y vertebrados de la divulgación proporcionen la inclusión de regiones variables lambda basadas en este segmento génico para la selección frente a antígenos, particularmente para el desarrollo de agentes terapéuticos de anticuerpos para uso humano.
El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente las cadenas ligeras lambda proporcionan un repertorio de regiones variables lambda humanas derivadas de segmentos génicos VA humanos VA2-8 y uno o más de VA2-18, VA3-16, V2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1 que se han proporcionado en el genoma mediante inserción dirigida en dicho locus de cadena ligera.
Esto es útil porque VA2-8 es un segmento génico lambda muy utilizado en seres humanos y por tanto es deseable que las células y vertebrados de la divulgación proporcionen la inclusión de regiones variables lambda basadas en este segmento génico para la selección frente a antígenos, particularmente para el desarrollo de agentes terapéuticos de anticuerpos para uso humano.
El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente las cadenas ligeras lambda proporcionan un repertorio de regiones variables lambda humanas derivadas de segmentos génicos VA humanos VA3-10 y uno o más de VA2-18, VA3-16, V2-14, VA3-12, VA2-11, VA2-14, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1 que se han proporcionado en el genoma mediante inserción dirigida en dicho locus de cadena ligera.
Esto es útil porque VA3-10 es un segmento génico lambda muy utilizado en seres humanos y por tanto es deseable que las células y vertebrados de la divulgación proporcionen la inclusión de regiones variables lambda basándose en este segmento génico para la selección frente a antígenos, particularmente para el desarrollo de agentes terapéuticos de anticuerpos para uso humano.
16. El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente los segmentos génicos VA humanos comprenden el VA funcional comprendido por un locus de cadena lambda de Ig humana de VA2-18 a VA3-1.
Por ejemplo, los segmentos génicos VA humanos comprenden al menos el segmento génico V humano VA3-1 o al menos los segmentos VA2-18, VA3-16, V2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1.
17. El vertebrado de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente el vertebrado expresa más cadenas lambda que cadenas kappa. Las cadenas lambda comprenden regiones variables derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA y JA - por ejemplo, expresados con una región constante lambda. Las cadenas kappa comprenden regiones variables derivadas de la recombinación de segmentos génicos Vky Jk- por ejemplo, expresados con una región constante kappa.
18. El vertebrado de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente el vertebrado no expresa cadenas kappa endógenas. Por ejemplo, la expresión de la cadena kappa endógena se puede inactivar mediante cualquiera de los medios descritos en el presente documento, tal como mediante inversión de toda o parte de la región VJ kappa endógena o mediante inserción de un marcador (p. ej., neo) u otra secuencia interferente en un locus kappa endógeno (un locus que no comprende segmentos génicos lambda humanos según la divulgación).
19. El vertebrado de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente la expresión de la cadena kappa es sustancial o completamente inactiva en dicho vertebrado. En un ejemplo, menos de 10, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% de las cadenas ligeras son proporcionadas por cadenas kappa.
20. El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente se inserta un potenciador EA humano en dicho locus endógeno de vertebrado no humano. Por ejemplo, se inserta un MAR 5' de ser humano y EA humano (y opcionalmente MAR 3' de ser humano) en configuración de la línea germinal. Por ejemplo, se inserta una secuencia correspondiente a la región intrónica lambda humana inmediatamente 3' de JA7-CA7 humano a, e incluyendo, al menos EA humano (y opcionalmente también MAR 3' de ser humano) - incluyendo opcionalmente al menos 30 kb de la región intrónica 3' del EA humano.
21. El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente se insertan al menos segmentos génicos JC humanos JA1-CA1, JA2-CA2, JA3-CA3, JA6-CA6 y JA7-CA7 además de los otros segmentos génicos humanos.
22. El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente los segmentos génicos humanos insertados están en configuración de la línea germinal; opcionalmente con las secuencias de segmentos intergénicos humanos o las secuencias de segmentos intergénicos endógenos de vertebrados no humanos correspondientes.
23. El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente un potenciador endógeno de la cadena ligera de vertebrado no humano se mantiene en el locus endógeno; opcionalmente en configuración de la línea germinal. Por ejemplo, cuando el locus endógeno es un locus kappa, se mantiene un potenciador kappa endógeno. Este puede ser iEk y/o 3'Ek, opcionalmente en configuración de la línea germinal con respecto a una región constante endógena de cadena ligera. Esto puede ser útil para ayudar al control de la expresión de la cadena ligera en el vertebrado no humano o célula.
24. El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente el genoma es heterocigoto para la inserción de lambda humano en el locus endógeno. Por ejemplo, heterocigótico para la inserción de VJ o VJC humanos en un locus kappa endógeno (p. ej., kappa de ratón o rata). Esto ayuda y simplifica la reproducción de los vertebrados, ya que el otro locus endógeno (p. ej., el otro locus kappa) se puede utilizar para proporcionar un locus de Ig transgénico diferente, tal como un locus kappa transgénico que comprende segmentos génicos V y J kappa humanos, ya sea aguas arriba de la región constante kappa endógena de ratón o aguas arriba de una región constante kappa humana. En este caso, los potenciadores kappa (iEk y/o 3'Ek) pueden mantenerse en ese locus kappa para ayudar a la expresión en el vertebrado utilizando mecanismos de control endógenos.
En otro ejemplo, se proporciona un vertebrado no humano o célula según cualquier aspecto anterior, en donde
(a) el locus endógeno es un locus lambda endógeno (p. ej., en un ratón), siendo el genoma heterocigoto para la inserción en el locus lambda, por lo tanto, comprendiendo por lo tanto un alelo del locus lambda la inserción del segmento génico VA y JA humano (opcionalmente con la inserción del segmento génico CA humano; opcionalmente con la inserción EA humano) como se describió anteriormente;
(b) el otro alelo lambda endógeno comprende una pluralidad de segmentos génicos Vkhumanos y uno o más segmentos génicos Jkhumanos aguas arriba de una región constante (p. ej., una región constante kappa de dicha especie de vertebrado no humano; una región constante kappa humana; la región constante lambda endógena; o una región constante lambda humana); opcionalmente con uno o más potenciadores kappa (p. ej., iEk y/o 3'Ek, p. ej., de dicha especie de vertebrado no humano); y
(c) se ha inactivado la expresión de las cadenas lambda y kappa endógenas.
Por tanto, no hay expresión de cadenas ligeras que comprendan regiones variables derivadas de la recombinación de regiones V y J endógenas, pero hay expresión de cadenas ligeras lambda humanas y kappa humanas a partir de los alelos en el locus lambda endógeno. Esto es beneficioso, ya que el diseño ayuda en gran medida a la construcción y reproducción de vertebrados evitando la necesidad de proporcionar loci transgénicos tanto en los loci lambda como kappa endógenos. El locus kappa endógeno (y por tanto la expresión de la cadena kappa endógena) se puede inactivar mediante inversión, deleción de segmentos génicos kappa (p. ej., V kappa y/o J y/o C endógenos) y/o mediante inserción de una secuencia de interrupción tal como un marcador (p. ej., neo) en el locus kappa endógeno.
La inserción del segmento kappa humano en el lambda endógeno se puede llevar a cabo, por ejemplo, insertando una secuencia correspondiente a una porción de un locus kappa humano que comprende en configuración de la línea germinal todos Vky Jkhumanos funcionales (es decir, excluyendo opcionalmente pseudogenes y ORF; véase la base de datos de IMGT); y opcionalmente también un iEk humano.
25. El vertebrado o célula del aspecto 24, en donde opcionalmente el genoma comprende dicha inserción de segmento génico lambda humano en un alelo de locus kappa endógeno de vertebrado no humano, y en donde el otro alelo de locus kappa endógeno comprende una inserción de genes V y J de inmunoglobulina kappa humana aguas arriba de una región constante kappa endógena de vertebrado no humano; en donde opcionalmente un potenciador de cadena ligera kappa endógeno se mantiene en uno o ambos locus kappa; opcionalmente en configuración de la línea germinal.
El vertebrado o célula del aspecto 24, en donde opcionalmente el genoma comprende dicha inserción de segmento génico lambda humano en un alelo de locus lambda endógeno de vertebrado no humano, y en donde el otro alelo de locus lambda endógeno comprende una inserción de genes V y J de inmunoglobulina kappa humana aguas arriba de una región constante kappa endógena de vertebrado no humano; en donde opcionalmente un potenciador endógeno de la cadena ligera lambda se mantiene en uno o ambos locus lambda; opcionalmente en configuración de la línea germinal.
26. El vertebrado o célula de la reivindicación 24, en donde opcionalmente el genoma comprende dicha inserción de segmento génico lambda humano en un alelo de locus lambda endógeno de vertebrado no humano, y en donde el otro alelo de locus lambda endógeno comprende una inserción de genes V y J de inmunoglobulina kappa humana aguas arriba de una región constante kappa endógena de vertebrado no humano; en donde opcionalmente un potenciador de cadena ligera lambda endógeno se mantiene en uno o ambos locus kappa; opcionalmente en configuración de la línea germinal.
27. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 1 a 23, en donde opcionalmente el genoma es homocigoto para la inserción de lambda humano en el locus endógeno de vertebrado no humano.
28. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 1 a 23, en donde opcionalmente el genoma es homocigoto para una inserción de segmento génico lambda humano en los loci kappa y lambda endógenos de vertebrado no humano.
29. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 1 a 23 y 28, en donde opcionalmente el genoma es homocigoto para una inserción de segmento génico lambda humano en los loci lambda endógenos de vertebrados no humanos, comprendiendo un alelo de locus kappa endógeno una inserción de segmento génico lambda humano y comprendiendo el otro alelo de locus kappa endógeno una inserción de una pluralidad de segmentos génicos Vk y Jk humanos aguas arriba de una región Ckpara la expresión de cadenas ligeras kappa que comprenden regiones variables kappa humanas. Las regiones variables kappa humanas son las derivadas de la recombinación de Vky Jkhumanas.
30. El vertebrado o célula del aspecto 27 o 28, en donde opcionalmente las inserciones de segmentos génicos lambda humanos en los loci kappa y lambda son inserciones del mismo repertorio de segmentos génicos lambda humanos.
31. El vertebrado o célula del aspecto 27 o 28, en donde opcionalmente las inserciones del segmento génico lambda humano en los loci kappa son diferentes de las inserciones del segmento génico lambda humano en los loci lambda. Esto es útil para expandir el repertorio potencial de regiones variables para la posterior selección frente a antígeno.
32. Un vertebrado no humano o una célula de vertebrado no humano (p. ej., un ratón, una rata, una célula de ratón o una célula de rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido mediante inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci de Ig endógenos, comprendiendo el genoma el siguiente ordenamiento de loci de cadena ligera
(a) L en un alelo de la cadena kappa endógena y K en el otro alelo de la cadena kappa endógena; o
(b) L en un alelo de la cadena lambda endógena y K en el otro alelo de la cadena lambda endógena; o (c) L en ambos alelos de la cadena kappa endógena;
(d) L en ambos alelos de la cadena lambda endógena;
(e) L en un alelo de la cadena kappa endógena y el otro alelo de la cadena kappa endógena ha sido inactivado; o (f) L en un alelo de la cadena lambda endógena y el otro alelo de la cadena lambda endógena ha sido inactivado; En donde
L representa una inserción de segmento génico lambda humano de al menos VA y JA humanos funcionales (opcionalmente también segmentos génicos CA) comprendido por un locus de cadena lambda de Ig humana de VA3-1 a CA7 (p. ej., comprendido por un locus de cadena lambda de Ig humana de 2-18 a CA7); y
K representa una inserción de Vky Jkhumanos;
En donde en el genoma los segmentos génicos humanos se insertan aguas arriba de una región constante para la expresión de cadenas ligeras que comprenden regiones variables derivadas de la recombinación de segmentos génicos V y J humanos.
33. El vertebrado o célula según el aspecto 32, en donde opcionalmente el genoma comprende el ordenamiento (a) y L en uno o ambos alelos de la cadena lambda endógena; o
(a) y K en uno o ambos alelos de la cadena lambda endógena; o
(a) y L en un alelo de la cadena lambda endógena y K en el otro alelo de la cadena lambda endógena; o (b) y L en uno o ambos alelos de la cadena kappa endógena; o
(b) y K en uno o ambos alelos de la cadena kappa endógena; o
(b) y L en un alelo de la cadena kappa endógena y K en el otro alelo de la cadena kappa endógena; o (c) y K en uno o ambos alelos de la cadena lambda endógena; o
(c) y L en uno o ambos alelos de la cadena lambda endógena; o
(c) y L en un alelo de la cadena lambda endógena y K en el otro alelo de la cadena lambda endógena; o (c) y ambos alelos de la cadena lambda endógena han sido inactivados; o
(d) y L en uno o ambos alelos de la cadena kappa endógena; o
(d) y K en uno o ambos alelos de la cadena kappa endógena; o
(d) y L en un alelo de la cadena kappa endógena y K en el otro alelo de la cadena kappa endógena; o (d) y ambos alelos de la cadena kappa endógena han sido inactivados.
34. El vertebrado o célula del aspecto 32 o 33, en donde opcionalmente la expresión de la cadena kappa endógena está sustancialmente o completamente inactivada. Las cadenas kappa endógenas son cadenas ligeras kappa que comprenden regiones variables derivadas de la recombinación de segmentos génicos endógenos Vky Jk(vertebrado no humano).
35. El vertebrado o célula del aspecto 32, 33 o 34, en donde opcionalmente la expresión de la cadena lambda endógena es sustancial o completamente inactiva. Las cadenas lambda endógenas son cadenas ligeras lambda que comprenden regiones variables derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA y JA endógenos (vertebrado no humano).
36. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 35, en donde opcionalmente cada inserción de L es aguas arriba de una región constante lambda o kappa endógena.
37. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 36, en donde opcionalmente cada inserción de L en un locus lambda es aguas arriba de una región constante lambda endógena.
38. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 36, en donde opcionalmente cada inserción de L en un locus kappa es aguas arriba de una región constante kappa endógena.
39. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 35, en donde opcionalmente cada inserción de L en un locus lambda es aguas arriba de una región constante lambda humana.
40. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 35, en donde opcionalmente cada inserción de L en un locus kappa es aguas arriba de una región constante kappa humana.
41. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 40, en donde opcionalmente cada inserción de K es aguas arriba de una región constante lambda o kappa endógena.
42. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 41, en donde opcionalmente cada inserción de K en un locus lambda es aguas arriba de una región constante lambda endógena.
43. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 42, en donde opcionalmente cada inserción de K en un locus kappa es aguas arriba de una región constante kappa endógena.
44. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 40, en donde opcionalmente cada inserción de K en un locus lambda es aguas arriba de una región constante lambda humana.
45. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 40 y 44, en donde opcionalmente cada inserción de K en un locus kappa es aguas arriba de una región constante kappa humana.
46. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 45, en donde opcionalmente las inserciones son según uno cualquiera de los aspectos 1 a 9, 11 a 16 y 20 a 31.
47. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 46, en donde opcionalmente cada inserción de lambda humano es según uno cualquiera de los aspectos 1 a 9, 11 a 16 y 20 a 31.
48. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 47, en donde opcionalmente cada inserción de kappa humano es según uno cualquiera de los aspectos 1 a 9, 11 a 16 y 20 a 31.
49. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 48, en donde opcionalmente cada inserción de lambda humano comprende el repertorio de segmentos génicos VA y JA (y opcionalmente CA) humanos.
50. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 48, en donde opcionalmente se realizan una primera y segunda (y opcionalmente tercera) inserciones de lambda humano y las inserciones comprenden repertorios diferentes de segmentos génicos VA y JA (y opcionalmente CA) humanos.
51. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 50, en donde opcionalmente cada inserción de kappa humano comprende el repertorio de segmentos génicos Vky Jk(y opcionalmente Ck) humanos.
52. El vertebrado o célula de uno cualquiera de los aspectos 32 a 50, en donde opcionalmente se realizan una primera y segunda (y opcionalmente tercera) inserciones de kappa humano y las inserciones comprenden repertorios diferentes de segmentos génicos Vk y Jk (y opcionalmente Ck) humanos.
53. El vertebrado o célula de cualquier aspecto anterior, en donde opcionalmente el genoma comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VH humanos, p. ej., un locus de cadena pesada como se describe en el presente documento que comprende segmentos génicos V, D y J humanos.
54. Un método para producir un anticuerpo o cadena ligera que comprenden una región variable lambda específica para un antígeno deseado, comprendiendo el método inmunizar un vertebrado según cualquier aspecto anterior con el antígeno deseado y recuperar el anticuerpo o cadena ligera o recuperar una célula que produce el anticuerpo o cadena ligera.
55. Un método para producir un anticuerpo o cadena ligera de anticuerpo totalmente humanizados que comprende llevar a cabo el método del aspecto 54 para obtener un anticuerpo o cadena ligera que comprenden una región constante de vertebrado no humano de cadena lambda, y reemplazar la región constante de vertebrado no humano por una región constante humana, opcionalmente mediante modificación mediante ingeniería genética del ácido nucleico que codifica el anticuerpo o cadena ligera.
56. Un anticuerpo o cadena ligera de anticuerpo humanizados producidos según el aspecto 54 o un derivado del mismo; opcionalmente para su uso en medicina.
57. El uso de un anticuerpo o cadena humanizados producidos según el aspecto 54 o un derivado del mismo en medicina.
58. Un método para inactivar regiones VJ de Ig endógenas en el genoma de un vertebrado no humano o una célula de vertebrado no humano (p. ej., un ratón, una rata, una célula de ratón o una célula de rata), en donde el método comprende insertar segmentos génicos de inmunoglobulina humana (p. ej., segmentos génicos V y J) en el genoma entre VJ de Ig endógenos y un potenciador endógeno o región constante endógena para mover VJ de Ig endógenos lejos del potenciador o región constante, inactivando de este modo regiones VJ de Ig endógenas.
En un ejemplo, los VJ de Ig endógenos son segmentos génicos de cadena pesada, el potenciador es un potenciador de cadena pesada endógeno, la región constante es una región constante de cadena pesada endógena y los segmentos génicos de Ig humanos comprenden segmentos génicos VH, DH y JH humanos.
En un ejemplo, los VJ de Ig endógenos son segmentos génicos de cadena ligera lambda, el potenciador es un potenciador de cadena lambda endógeno, la región constante es una región constante de cadena lambda endógena y los segmentos génicos de Ig humanos comprenden segmentos génicos VA y JA humanos.
En un ejemplo, los VJ de Ig endógenos son segmentos génicos de cadena ligera kappa, el potenciador es un potenciador de cadena kappa endógeno, la región constante es una región constante de cadena kappa endógena y los segmentos génicos de Ig humanos comprenden segmentos génicos Vky Jkhumanos.
Un método para inactivar regiones VJ de IgK endógenas en el genoma de un vertebrado no humano o una célula de vertebrado no humano (p. ej., un ratón, una rata, una célula de ratón o una célula de rata), en donde el método comprende insertar segmentos génicos de inmunoglobulina humana en el genoma entre VJ de IgK endógeno y el potenciador Ekpara mover VJ de IgK lejos del potenciador Ek, inactivando de ese modo regiones VJ de IgK endógenas.
59. El método del aspecto 58, en donde opcionalmente los segmentos génicos humanos comprenden segmentos génicos VL y JL humanos; en donde opcionalmente la inserción es una inserción como se describe en uno cualquiera de los aspectos 1 a 9, 11 a 16 y 20 a 31 o una inserción de segmentos génicos Vky Jkhumanos.
60. Un método para expresar cadenas ligeras de inmunoglobulina en un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata), comprendiendo las cadenas ligeras regiones variables lambda (cadenas ligeras lambda), en donde al menos 70 u 80% (por ejemplo, al menos 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99%) de las regiones variables de las cadenas ligeras lambda expresadas por el vertebrado derivan de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos, comprendiendo el método proporcionar en el genoma del vertebrado un repertorio de segmentos génicos de Ig producido mediante inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci de Ig endógenos, comprendiendo el genoma segmentos génicos VA y JA humanos aguas arriba de una región constante, en donde el método comprende insertar al menos los segmentos génicos VA y JA humanos funcionales (opcionalmente también CA humano) (y opcionalmente secuencias de segmentos intergénicos) comprendidos por un locus de cadena lambda de Ig humana de VA2-18 a CA7 en un locus endógeno de cadena ligera del vertebrado, en donde al menos 70 u 80% (por ejemplo, al menos 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99%) de las regiones variables de las cadenas ligeras lambda expresadas por el vertebrado derivan de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos; comprendiendo el método expresar dichas cadenas ligeras en el vertebrado y aislar opcionalmente una o más de dichas cadenas ligeras (p. ej., como parte de un anticuerpo de 4 cadenas).
En un aspecto, el método comprende adicionalmente aislar del vertebrado una cadena ligera lambda que comprende una región variable derivada de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos. En un ejemplo, el método comprende inmunizar el ratón con un antígeno (p. ej., un antígeno humano) antes de aislar la cadena ligera lambda. En un ejemplo, la cadena ligera es parte de un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo que se une específicamente al antígeno.
En una realización, el uso comprende adicionalmente aislar tejido esplénico (p. ej., el bazo) del ratón; seguido opcionalmente del aislamiento de al menos una célula B específica de antígeno del tejido, en donde la célula o células B expresan dicha cadena ligera lambda. Por ejemplo, dicha cadena ligera lambda es proporcionada por un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno predeterminado (p. ej., un antígeno humano). En un ejemplo, el uso comprende inmunizar el ratón con el antígeno (p. ej., un antígeno humano) antes de aislar el tejido esplénico o la cadena ligera lambda. En un ejemplo, el uso comprende aislar la cadena ligera lambda producida por la célula B (o por un hibridoma producido por fusión de la célula B con una célula de mieloma). En un ejemplo, el uso comprende preparar un hibridoma a partir de una célula B aislada del tejido esplénico, en donde el hibridoma expresa dicha cadena ligera lambda o un derivado de la misma. Opcionalmente, el uso comprende preparar un derivado del anticuerpo o cadena ligera lambda aislados. Los ejemplos de anticuerpos derivados (según cualquier aspecto del presente documento) son anticuerpos que tienen una o más mutaciones en comparación con el anticuerpo aislado (p. ej., para mejorar la afinidad de unión al antígeno y/o para potenciar o inactivar la función de Fc). Tales mutantes se unen específicamente al antígeno. La mutación o adaptación para producir un derivado incluyen, p. ej., mutación para producir potenciación o inactivación de Fc. Un derivado puede ser un anticuerpo después de la conjugación con una carga útil tóxica o informador o una marca u otro radical activo. En otro ejemplo, una cadena quimérica de anticuerpo o anticuerpo aislado de una célula de vertebrado de la invención se modifican reemplazando una o todas las regiones constantes humanas de los mismos por una región constante humana correspondiente. Por ejemplo, todas las regiones constantes de un anticuerpo aislado de tal célula o vertebrado se reemplazan por regiones constantes humanas para producir un anticuerpo completamente humano (es decir, que comprende regiones variables y constantes humanas). Tal anticuerpo es útil para la administración a pacientes humanos para reducir la reacción anti anticuerpo por parte del paciente.
61. Un método para expresar cadenas ligeras de inmunoglobulina en un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata), en donde al menos 60% (por ejemplo, al menos 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99%) de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado son proporcionadas por cadenas ligeras lambda humanas, comprendiendo el método proporcionar en el genoma del vertebrado un repertorio de segmentos génicos de Ig producido por inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci de Ig endógenos, comprendiendo el genoma (i) segmentos génicos VA y JA humanos aguas arriba de una región constante, en donde los segmentos génicos VA y JA humanos se proporcionan insertando al menos los segmentos génicos VA y JA humanos funcionales (opcionalmente también CA humano) (y opcionalmente secuencias de segmentos intergénicos) comprendidos por un locus de cadena lambda de Ig humana de VA2-18 a CA7 en un locus endógeno de cadena ligera del vertebrado y (ii) segmentos génicos de V kappa aguas arriba de una región constante, en donde el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda humanas (cadenas ligeras lambda humanas) y al menos 60% (por ejemplo, más del 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99%) de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado son proporcionadas por dichas cadenas ligeras lambda humanas; comprendiendo el método expresar dichas cadenas ligeras en el vertebrado y aislar opcionalmente una o más de dichas cadenas ligeras (p. ej., como parte de un anticuerpo de 4 cadenas).
En un aspecto, el método comprende adicionalmente aislar del vertebrado una cadena ligera lambda que comprende una región variable derivada de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos. En un ejemplo, el método comprende inmunizar el ratón con un antígeno (p. ej., un antígeno humano) antes de aislar la cadena ligera lambda. En un ejemplo, la cadena ligera es parte de un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo que se une específicamente al antígeno.
En una realización, el uso comprende adicionalmente aislar tejido esplénico (p. ej., el bazo) del ratón; seguido opcionalmente del aislamiento de al menos una célula B específica de antígeno del tejido, en donde la célula o células B expresan dicha cadena ligera lambda. Por ejemplo, dicha cadena ligera lambda es proporcionada por un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno predeterminado (p. ej., un antígeno humano). En un ejemplo, el uso comprende inmunizar el ratón con el antígeno (p. ej., un antígeno humano) antes de aislar el tejido esplénico o la cadena ligera lambda. En un ejemplo, el uso comprende aislar la cadena ligera lambda producida por la célula B (o por un hibridoma producido por fusión de la célula B con una célula de mieloma). En un ejemplo, el uso comprende preparar un hibridoma a partir de una célula B aislada del tejido esplénico, en donde el hibridoma expresa dicha cadena ligera lambda o un derivado de la misma. Opcionalmente, el uso comprende preparar un derivado del anticuerpo o cadena ligera lambda aislados. Los ejemplos de anticuerpos derivados (según cualquier aspecto del presente documento) son anticuerpos que tienen una o más mutaciones en comparación con el anticuerpo aislado (p. ej., para mejorar la afinidad de unión al antígeno y/o para potenciar o inactivar la función de Fc). Tales mutantes se unen específicamente al antígeno.
62. Un método para expresar cadenas ligeras VJC de inmunoglobulina humana en un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata), comprendiendo el método proporcionar en el genoma del vertebrado un repertorio de segmentos génicos de Ig producido mediante la inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci endógenos de Ig, en donde el método comprende insertar al menos los segmentos génicos VA, JA y CA humanos funcionales (y opcionalmente secuencias de segmentos intergénicos) comprendidos por un locus de cadena lambda de Ig humana de VA3-1 a CA7 (p. ej., comprendido por un locus de cadena lambda de Ig humana de 2-18 a CA7) en un locus de cadena ligera kappa de vertebrado no humano endógeno aguas arriba de una región constante kappa endógena de vertebrado no humano para la expresión de una cadena ligera VJC humana; comprendiendo el método expresar dichas cadenas ligeras en el vertebrado y aislar opcionalmente una o más de dichas cadenas ligeras (p. ej., como parte de un anticuerpo de 4 cadenas).
En un aspecto, el método comprende adicionalmente aislar del vertebrado una cadena ligera lambda que comprende una región variable derivada de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos. En un ejemplo, el método comprende inmunizar el ratón con un antígeno (p. ej., un antígeno humano) antes de aislar la cadena ligera lambda. En un ejemplo, la cadena ligera es parte de un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo que se une específicamente al antígeno.
En una realización, el uso comprende adicionalmente aislar tejido esplénico (p. ej., el bazo) del ratón; seguido opcionalmente del aislamiento de al menos una célula B específica de antígeno del tejido, en donde la célula o células B expresan dicha cadena ligera lambda. Por ejemplo, dicha cadena ligera lambda es proporcionada por un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno predeterminado (p. ej., un antígeno humano). En un ejemplo, el uso comprende inmunizar el ratón con el antígeno (p. ej., un antígeno humano) antes de aislar el tejido esplénico o la cadena ligera lambda. En un ejemplo, el uso comprende aislar la cadena ligera lambda producida por la célula B (o por un hibridoma producido por fusión de la célula B con una célula de mieloma). En un ejemplo, el uso comprende preparar un hibridoma a partir de una célula B aislada del tejido esplénico, en donde el hibridoma expresa dicha cadena ligera lambda o un derivado de la misma. Opcionalmente, el uso comprende preparar un derivado del anticuerpo o cadena ligera lambda aislados. Los ejemplos de anticuerpos derivados (según cualquier aspecto del presente documento) son anticuerpos que tienen una o más mutaciones en comparación con el anticuerpo aislado (p. ej., para mejorar la afinidad de unión al antígeno y/o para potenciar o inactivar la función de Fc). Tales mutantes se unen específicamente al antígeno.
63. El método de uno cualquiera de los aspectos 38 a 40, en donde opcionalmente el vertebrado es conforme a uno cualquiera de los otros aspectos.
64. Una cadena ligera de anticuerpo aislada según el método de uno cualquiera de los aspectos 58 a 63 o un derivado de la misma, o un anticuerpo que comprende tal cadena ligera o derivado; opcionalmente para su uso en medicina.
65. El uso de una cadena ligera de anticuerpo aislada según el método de uno cualquiera de los aspectos 58 a 63 o un derivado de la misma (o un anticuerpo que comprende tal cadena ligera o derivado) en medicina.
<6 6>. Un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata) según uno cualquiera de los aspectos 1 a 53 para expresar cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda (cadenas ligeras lambda), en donde al menos 70 u 80% (por ejemplo, al menos 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% o 100%) de las regiones variables de las cadenas ligeras lambda expresadas por el vertebrado derivan de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos.
Un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata) según uno cualquiera de los aspectos 1 a 53 que expresa cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda (cadenas ligeras lambda), en donde al menos 70 u 80% (por ejemplo, al menos 70, 75, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% o 100%) de las regiones variables de las cadenas ligeras lambda expresadas por el vertebrado derivan de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos.
67. Un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata) según uno cualquiera de los aspectos 1 a 53 para expresar cadenas ligeras, en donde al menos 60% (por ejemplo, más del 65, 70,<8 0>, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% o 100%) de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado son proporcionadas por cadenas ligeras lambda humanas.
Un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata) según uno cualquiera de los aspectos 1 a 53 que expresa cadenas ligeras, en donde al menos 60% (por ejemplo, más del 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% o 100%) de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado son proporcionadas por cadenas ligeras lambda humanas.
<6 8>. Un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata) según el aspecto 7 para expresar cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda (cadenas ligeras lambda), en donde la expresión de cadenas ligeras lambda que comprenden regiones variables lambda humanas domina sobre la expresión de cadenas ligeras lambda que comprenden regiones variables lambda endógenas de vertebrados no humanos: y opcionalmente para inactivar la expresión de regiones variables lambda endógenas de vertebrados no humanos del locus endógeno de la cadena ligera.
Un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata) según el aspecto 7 que expresa cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda (cadenas ligeras lambda), en donde la expresión de cadenas ligeras lambda que comprenden regiones variables lambda humanas domina sobre la expresión de cadenas ligeras lambda que comprenden regiones variables lambda endógenas de vertebrados no humanos: y opcionalmente para inactivar la expresión de regiones variables lambda endógenas de vertebrados no humanos del locus endógeno de la cadena ligera.
69. Un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata) según el aspecto 7,<8>, 9 o 10 para inactivar la expresión de regiones variables lambda endógenas de vertebrados no humanos del locus endógeno de la cadena ligera.
El porcentaje de expresión o nivel de expresión de las cadenas de anticuerpos se puede determinar a nivel de transcritos de ARNm de cadena ligera en células B (p. ej., linfocitos de sangre periférica). Alternativa o adicionalmente, el porcentaje de expresión se determina a nivel de cadenas ligeras de anticuerpo en suero o sangre de los vertebrados. Adicional o alternativamente, la expresión se puede determinar mediante análisis FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia) de células B. Por ejemplo, evaluando la expresión de C kappa de ratón o C lambda humana en la superficie celular cuando las regiones variables de lambda humano se expresan con regiones C kappa de ratón o C lambda humanas respectivamente.
El término "cadena ligera lambda" en estos aspectos se refiere a una cadena ligera que comprende una secuencia de región variable (a nivel de ARN o aminoácido) derivada de la recombinación de segmentos génicos VA y JA. Así, una "región variable lambda humana", por ejemplo, es una región variable derivada de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos. La región constante puede ser una región constante kappa o lambda, p. ej., una región constante humana o de ratón.
El vertebrado en estos aspectos, por ejemplo, no ha sido sometido a exposición previa (es decir, no inmunizado con un antígeno predeterminado, tal como se entiende el término en la técnica; por ejemplo, un vertebrado tal que se ha mantenido en un entorno relativamente estéril como el proporcionado por un animalario utilizado para I D). En otro ejemplo, el vertebrado se ha inmunizado con un antígeno predeterminado, p. ej., un antígeno que porta un epítopo humano.
La referencia a segmentos génicos humanos "funcionales" reconoce que en un locus lambda de Ig humana algunos segmentos génicos V son pseudogenes no funcionales (p. ej., VA3-17, VA3-15, VA3-13, VA3-7, VA3-6, VA2-5, VA3-4, VA3-2; véase la base de datos IMGT: en la Red Mundial(www)imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=locus&species=human&grupo=IGL. Asimismo, JA4-CA4 y JA5-CA5 no son funcionales en seres humanos. El término "funcional" cuando se refiere a segmentos génicos excluye pseudogenes. Un ejemplo de segmentos génicos VA humanos funcionales es el grupo VA2-18, VA3-16, V2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1. Un ejemplo de segmentos génicos JA humanos funcionales es el grupo JA1, JA2 y JA3; o JA1, JA2 y JA7; o JA2, JA3 y JA7; o JA1, JA2, JA3 y JA7. Un ejemplo de segmentos génicos CA humanos funcionales es el grupo CA1, CA2 y CA3; o CA1, CA2 y CA7; o CA2, CA3 y CA7; o CA1, CA2, CA3 y CA7.
En un aspecto, las cadenas ligeras lambda, junto con las cadenas pesadas expresadas en las células o vertebrados de la divulgación, forman anticuerpos. Las cadenas pesadas pueden expresarse a partir de un locus de cadena pesada transgénico como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el genoma de la célula o vertebrado comprende un locus de cadena pesada en el que un locus quimérico de cadena pesada de inmunoglobulina comprende uno o más segmentos génicos V humanos, uno o más segmentos génicos D humanos y uno o más segmentos génicos J humanos aguas arriba de una región constante mu de dicha especie no humana; la expresión de la cadena pesada endógena se ha inactivado sustancialmente; y el locus de la cadena pesada comprende un potenciador Eg de dicha especie de vertebrado no humano.
En un aspecto del vertebrado o célula, todos los potenciadores endógenos se eliminan del locus endógeno en el que se insertan los segmentos génicos humanos. Por tanto, cuando se inserta un potenciador humano (p. ej., EA), esto controla el locus transgénico en ausencia del efecto de otros potenciadores endógenos (por ejemplo, potenciadores kappa si el locus es un potenciador kappa endógeno). Esto puede ser útil para evitar razones de expresión kappa:lambda de tipo vertebrado no humano (p. ej., para dirigir la expresión a una razón más alta de lambda:kappa en ratones).
Cuando la expresión de la cadena ligera endógena (p. ej., kappa o lambda) es sustancialmente inactiva o está inactivada como se divulga en el presente documento, menos de 10, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% de tales cadenas ligeras endógenas se expresa o se puede expresar. En un ejemplo, hay una inactivación completa, de manera que tales cadenas ligeras no se expresan o no se pueden expresar.
Opcionalmente, el vertebrado de la divulgación no ha sido sometido a exposición previa. Por tanto, el vertebrado no se ha inmunizado con un antígeno predeterminado.
Cuando, por ejemplo, una célula de la divulgación es una célula ES u otra célula madre IPS u otra célula madre pluripotente, la célula se puede desarrollar hasta un vertebrado de la divulgación. Por ejemplo, la célula puede implantarse en un blastocisto de una madre de cría y desarrollarse hasta un embrión y un animal según técnicas convencionales.
En un aspecto, cuando se insertan segmentos génicos kappa humanos, cada inserción comprende segmentos génicos kappa humanos
(i) Vk1-5, Vk1-6, Vk1-8 y Vk1-9 (y opcionalmente Vk5-2 y Vk4-1); o
(ii) Vk1 -5, Vk1 -6, Vk1 -8, Vk1 -9, Vk3-11, Vk1-12, Vk3-15, Vk1 -16, Vk1 -17, Vk3-20 (y opcionalmente Vk2 24 y/o Vk1-13); o
(iii) Vk1 -5, Vk1 -6, Vk1 -8, Vk1 -9, Vk3-11, Vk1-12, Vk3-15, Vk1-16, Vk1-17, Vk3-20, Vk2-24, Vk1 -27, Vk2 28, Vk2-30 y Vk1-33 (y opcionalmente Vk2-29 y/o Vk2-40 y/o Vk1-39); y opcionalmente
(iv) Jk1 , Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5.
En un aspecto, la inserción kappa humana también comprende un ÍEkhumano y/o 3'Ekhumano aguas abajo de los segmentos génicos J humanos en el locus.
Los ratones transgénicos de la divulgación que expresan esencialmente de manera exclusiva regiones variables de cadena pesada humanas desarrollan compartimentos esplénicos y BM normales y expresión de Ig normal en los que la Ig comprende regiones variables de cadena pesada humanas
Los autores de la presente invención observaron sorprendentemente la expresión del subtipo normal de Ig y el desarrollo de células B en ratones transgénicos de la divulgación que expresan anticuerpos con regiones variables de la cadena pesada humana sustancialmente en ausencia de expresión endógena de la cadena pesada y kappa. Véase el Ejemplo 16 más adelante.
Los autores de la presente invención observaron que sorprendentemente la inactivación de la expresión de la región variable de la cadena pesada endógena en presencia de la expresión de la región variable humana no cambia la razón de células B en el compartimento esplénico (Fig. 66) o el compartimento progenitor B de la médula ósea (Fig. 67) y los niveles de inmunoglobulina en suero son normales y se expresan los subtipos correctos de Ig (Fig. 68). Estos datos demuestran que se insertaron segmentos génicos de cadena pesada humana según la divulgación (p. ej., una inserción de al menos segmentos génicos V<h>humanos V<h>2-5, 7-4-1,4-4, 1 -3, 1 -2, 6-1, y todos los segmentos génicos D y J<h>humanos D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1 -7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1 -20, 2-21, 3-22, 6-25, 1-26 y 7-27; y J1, J2, J3, J4, J5 y J6) son completamente funcionales para el reordenamiento del segmento génico VDJ del locus de la cadena pesada transgénica, la señalización del receptor de células B (BCR) y la maduración de células B apropiada.
La divulgación proporciona por lo tanto los siguientes aspectos (numeración comenzando en el aspecto 70): 70. Un ratón que expresa o para expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden regiones variables humanas, en donde las cadenas pesadas expresadas por el ratón son esencialmente de manera exclusiva dichas cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas; y dichas cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas se expresan como parte de anticuerpos IgG1, IgG2b e IgM (y opcionalmente IgG2a) en suero en el ratón;
comprendiendo el ratón un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VH, DH y JH humanos aguas arriba de una región constante de ratón (p. ej., C-mu y/o C-delta y/o C-gamma; tal como (en una orientación de 5' a 3') C-mu de ratón y C-delta de ratón y C-gamma de ratón), en donde
(a) el ratón es capaz de expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden regiones variables humanas y las cadenas pesadas expresadas por el ratón son esencialmente de manera exclusiva dichas cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas; y
(b) el ratón expresa anticuerpos IgG1, IgG2b e IgM (y opcionalmente IgG2a) en suero que comprenden dichas cadenas pesadas.
Los isotipos de Ig se pueden determinar, por ejemplo, utilizando anticuerpos de isotipo coincidente como será fácilmente familiar para el experto (y como se ilustra en el Ejemplo 16).
En un aspecto, el ratón no ha sido sometido a exposición previa.
71. El ratón del aspecto 70 para expresar una proporción relativa normal de anticuerpos IgG1, IgG2a, IgG2b e IgM en suero.
Por "normal" se entiende comparable a la expresión en un ratón (p. ej., un ratón no sometido a exposición previa) que expresa solo cadenas de anticuerpos de ratón, p. ej., un ratón cuyo genoma comprende solo loci de cadena pesada y ligera de Ig funcionales de tipo salvaje, p. ej., un ratón de tipo salvaje.
72. El ratón del aspecto 70 o 71, en donde el ratón expresa una proporción relativa normal de anticuerpos IgG1, IgG2a, IgG2b e IgM en suero.
Por "normal" se entiende comparable a la expresión en un ratón (p. ej., un ratón no sometido a exposición previa) que expresa solo cadenas de anticuerpos de ratón, p. ej., un ratón cuyo genoma comprende solo loci de cadena pesada y ligera de Ig funcionales de tipo salvaje, p. ej., un ratón de tipo salvaje.
73. El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 72, para expresar en el ratón
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 25-350 pg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-200 pg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 30-800 pg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-300 pg/ml;
o
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 10-600 pg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-500 pg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 20-700 pg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-700 pg/ml;
como se determina por captura de Ig en una placa seguida de incubación (p. ej., durante una hora a RT, p. ej., durante una hora a 20°C) con anti-anticuerpos marcados específicos de isotipo de ratón y cuantificación de Ig utilizando la marca (p. ej., utilizando anticuerpos específicos de isotipo anti-Ig de ratón conjugados cada uno con peroxidasa de rábano picante conjugada a una razón de 1/10000 en PBS con Tween™ al 0,1%, seguido de revelado de la marca con sustrato de tetrametilbencidina (TMB) durante 4-5 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (p. ej., 20°C), añadiendo ácido sulfúrico para detener el revelado de la marca y leyendo la marca a 450 nm).
Por ejemplo, el ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 72, para expresar en el ratón
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 25-150 pg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-200 pg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 30-300 pg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-200 gg/ml;
o
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 10-200 gg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-500 gg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 20-400 gg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-700 gg/ml;
como se determina por captura de Ig en una placa seguida de incubación (p. ej., durante una hora a RT, p. ej., durante una hora a 20°C) con anti-anticuerpos marcados específicos de isotipo de ratón y cuantificación de Ig utilizando la marca (p. ej., utilizando anticuerpos específicos de isotipo anti-Ig de ratón conjugados cada uno con peroxidasa de rábano picante conjugada a una razón de 1/10000 en PBS con Tween al 0,1%™, seguido de revelado de la marca con sustrato de tetrametilbencidina (TMB) durante 4-5 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (p. ej., 20°C), añadiendo ácido sulfúrico para detener el revelado de la marca y leyendo la marca a 450 nm).
El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 72, para expresar la Ig de ratón en las proporciones relativas de (i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 25-350 gg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-200 gg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 30-800 gg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-300 gg/ml;
o
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 10-600 gg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-500 gg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 20-700 gg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-700 gg/ml;
como se determina por captura de Ig en una placa seguida de incubación (p. ej., durante una hora a RT, p. ej., durante una hora a 20°C) con anti-anticuerpos marcados específicos de isotipo de ratón y cuantificación de Ig utilizando la marca (p. ej., utilizando anticuerpos específicos de isotipo anti-Ig de ratón conjugados cada uno con peroxidasa de rábano picante conjugada a una razón de 1/10000 en PBS con Tween™ al 0,1%, seguido de revelado de la marca con sustrato de tetrametilbencidina (TMB) durante 4-5 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (p. ej., 20°C), añadiendo ácido sulfúrico para detener el revelado de la marca y leyendo la marca a 450 nm).
Por ejemplo, el ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 72, para expresar la Ig de ratón en las proporciones relativas de
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 25-150 gg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-200 gg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 30-300 gg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-200 gg/ml;
o
(i) lgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 10-200 gg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-500 gg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 20-400 gg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-700 gg/ml;
como se determina por captura de Ig en una placa seguida de incubación (p. ej., durante una hora a RT, p. ej., durante una hora a 20°C) con anti-anticuerpos marcados específicos de isotipo de ratón y cuantificación de Ig utilizando la marca (p. ej., utilizando anticuerpos específicos de isotipo anti-Ig de ratón conjugados cada uno con peroxidasa de rábano picante conjugada a una razón de 1/10000 en PBS con Tween™ al 0,1%, seguido de revelado de la marca con sustrato de tetrametilbencidina (TMB) durante 4-5 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (p. ej., 20°C), añadiendo ácido sulfúrico para detener el revelado de la marca y leyendo la marca a 450 nm).
74. El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 73, en donde el ratón expresa
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 25-350 pg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-200 pg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 30-800 pg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-300 pg/ml;
o
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 10-600 pg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-500 pg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 20-700 pg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-700 pg/ml;
como se determina por captura de Ig en una placa seguida de incubación (p. ej., durante una hora a RT, p. ej., durante una hora a 20°C) con anti-anticuerpos marcados específicos de isotipo de ratón y cuantificación de Ig utilizando la marca (p. ej., utilizando anticuerpos específicos de isotipo anti-Ig de ratón conjugados cada uno con peroxidasa de rábano picante conjugada a una razón de 1/10000 en PBS con Tween™ al 0,1%, seguido de revelado de la marca con sustrato de tetrametilbencidina (TMB) durante 4-5 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (p. ej., 20°C), añadiendo ácido sulfúrico para detener el revelado de la marca y leyendo la marca a 450 nm).
Por ejemplo, el ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 72, en donde el ratón expresa
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 25-150 pg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-200 pg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 30-300 pg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-200 pg/ml;
o
(i) lgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 10-200 pg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-500 pg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 20-400 pg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-700 pg/ml;
como se determina por captura de Ig en una placa seguida de incubación (p. ej., durante una hora a RT, p. ej., durante una hora a 20°C) con anti-anticuerpos marcados específicos de isotipo de ratón y cuantificación de Ig utilizando la marca (p. ej., utilizando anticuerpos específicos de isotipo anti-Ig de ratón conjugados cada uno con peroxidasa de rábano picante conjugada a una razón de 1/10000 en PBS con Tween™ al 0,1%, seguido de revelado de la marca con sustrato de tetrametilbencidina (TMB) durante 4-5 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (p. ej., 20°C), añadiendo ácido sulfúrico para detener el revelado de la marca y leyendo la marca a 450 nm).
El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 73, en donde el ratón expresa Ig en las proporciones relativas de (i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 25-350 pg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-200 pg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 30-800 pg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-300 pg/ml;
o
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 10-600 pg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-500 gg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 20-700 gg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-700 gg/ml;
como se determina por captura de Ig en una placa seguida de incubación (p. ej., durante una hora a RT, p. ej., durante una hora a 20°C) con anti-anticuerpos marcados específicos de isotipo de ratón y cuantificación de Ig utilizando la marca (p. ej., utilizando anticuerpos específicos de isotipo anti-Ig de ratón conjugados cada uno con peroxidasa de rábano picante conjugada a una razón de 1/10000 en PBS con Tween™ al 0,1%, seguido de revelado de la marca con sustrato de tetrametilbencidina (TMB) durante 4-5 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (p. ej., 20°C), añadiendo ácido sulfúrico para detener el revelado de la marca y leyendo la marca a 450 nm).
Por ejemplo, el ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 72, en donde el ratón expresa Ig en las proporciones relativas de
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 25-150 gg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-200 gg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 30-300 gg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-200 gg/ml;
o
(i) lgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 10-200 gg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-500 gg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 20-400 gg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-700 gg/ml;
como se determina por captura de Ig en una placa seguida de incubación (p. ej., durante una hora a RT, p. ej., durante una hora a 20°C) con anti-anticuerpos marcados específicos de isotipo de ratón y cuantificación de Ig utilizando la marca (p. ej., utilizando anticuerpos específicos de isotipo anti-Ig de ratón conjugados cada uno con peroxidasa de rábano picante conjugada a una razón de 1/10000 en PBS con Tween™ al 0,1%, seguido de revelado de la marca con sustrato de tetrametilbencidina (TMB) durante 4-5 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (p. ej., 20°C), añadiendo ácido sulfúrico para detener el revelado de la marca y leyendo la marca a 450 nm).
75. El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 74 para expresar dichas cadenas pesadas de células B esplénicas en un ratón que produce una proporción o porcentaje normal de células B esplénicas maduras, p. ej., como se determina mediante FACS.
Por "normal" se entiende comparable a la producción de células B esplénicas maduras en un ratón (p. ej., un ratón no sometido a exposición previa) que expresa sólo cadenas de anticuerpos de ratón, p. ej., un ratón cuyo genoma comprende sólo loci de cadenas pesada y ligera de Ig funcionales de tipo salvaje, p. ej., un ratón de tipo salvaje. Por ejemplo, al menos 40, 50, 60 o 70% de las células B esplénicas totales producidas por el ratón de la divulgación son células B maduras. Las células B esplénicas son B220+ y expresa B220 a niveles relativamente altos como conocerá el experto. Las células B esplénicas maduras expresan B220 e IgD, ambas a niveles relativamente altos como será conocido por el experto. La expresión de IgM es relativamente baja en células B esplénicas maduras, de nuevo como se conoce en la técnica. Por ejemplo, véase J Exp Med. 5 de julio de 1999; 190(1):75-89; "B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals"; Loder Fet al.
Opcionalmente, el ratón produce una razón normal de células T1, T2 y B esplénicas maduras, p. ej., como se determina mediante FACS. Por ejemplo, el ratón de la divulgación produce aproximadamente 40-70% de células B esplénicas maduras, 15-35% de células T1 esplénicas; y 5-10% de células T2 esplénicas (porcentaje con referencia a la población (alta) B220 positiva esplénica total). Por ejemplo, aproximadamente 40-60% de células B esplénicas maduras, 15-30% de células T1 esplénicas; y 5-10% de células T2 esplénicas. Por "normal" se entiende comparable a una proporción de células T1/T2/ B esplénicas maduras en un ratón (p. ej., un ratón no sometido a exposición previa) que expresa sólo cadenas de anticuerpos de ratón, p. ej., un ratón cuyo genoma comprende sólo loci de cadenas pesadas y ligeras de Ig funcionales de tipo salvaje, p. ej., un ratón de tipo salvaje.
76. El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 75, en donde el ratón produce una proporción o porcentaje normal de células B esplénicas maduras, p. ej., como se determina mediante FACS.
77. Un ratón que expresa o para expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden regiones variables humanas, en donde las cadenas pesadas expresadas por el ratón son esencialmente de manera exclusiva dichas cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas y se expresan en un ratón que produce una proporción 0 porcentaje normal de células B esplénicas maduras (p. ej., como se determina mediante FACS); comprendiendo el ratón un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VH, DH y JH humanos aguas arriba de una región constante de ratón (p. ej., C-mu y/o C-delta y/o C-gamma; tal como (en una orientación 5' a 3') y en donde el ratón produce una proporción o porcentaje normal de células B esplénicas maduras. Por "normal" se entiende comparable a la producción de células B esplénicas maduras en un ratón (p. ej., un ratón no sometido a exposición previa) que expresa sólo cadenas de anticuerpos de ratón, p. ej., un ratón cuyo genoma comprende sólo loci de cadenas pesada y ligera de Ig funcionales de tipo salvaje, p. ej., un ratón de tipo salvaje.
Por ejemplo, al menos 40, 50, 60 o 70% de las células B esplénicas totales producidas por el ratón de la divulgación son células B maduras. Las células B esplénicas son B220+ y expresan B220 a niveles relativamente altos como conocerá el experto. Las células B esplénicas maduras expresan B220 e IgD, ambas a niveles relativamente altos como será conocido por el experto. La expresión de IgM es relativamente baja en células B esplénicas maduras, de nuevo como se conoce en la técnica. Por ejemplo, véase J Exp Med. 5 de julio de 1999; 190(1):75-89; "B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals"; Loder Fet al.
Opcionalmente, el ratón produce una razón normal de células T1, T2 y B esplénicas maduras, p. ej., como se determina mediante FACS. Por ejemplo, el ratón de la divulgación produce aproximadamente 40-70% de células B esplénicas maduras, 15-35% de células T1 esplénicas; y 5-10% de células T2 esplénicas (porcentaje con referencia a la población (alta) B220 positiva esplénica total). Por ejemplo, aproximadamente 40-60% de células B esplénicas maduras, 15-30% de células T1 esplénicas; y 5-10% de células T2 esplénicas. Por "normal" se entiende comparable a una proporción de células T1/T2/B esplénicas maduras en un ratón (p. ej., un ratón no sometido a exposición previa) que expresa sólo cadenas de anticuerpos de ratón, p. ej., un ratón cuyo genoma comprende sólo loci de cadenas pesadas y ligeras de Ig funcionales de tipo salvaje, p. ej., un ratón de tipo salvaje.
78. El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 77 para expresar dichas cadenas pesadas en un ratón que produce una proporción o porcentaje normal de células progenitoras de células B de médula ósea (p. ej., como se determina mediante FACS).
En un aspecto, el ratón es para expresar dichas cadenas pesadas en un ratón que produce una proporción o porcentaje normal de células pre-, pro- y prepro-B de médula ósea (p. ej., como se determina mediante FACS). Véase J Exp Med.
1 de mayo de 1991; 173(5):1213-25; Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow; Hardy RRet alpara más discusión sobre células progenitoras.
Por "normal" se entiende comparable a la producción de células B de médula ósea en un ratón (p. ej., un ratón no sometido a exposición previa) que expresa solo cadenas de anticuerpos de ratón, p. ej., un ratón cuyo genoma comprende solo loci de cadena pesada y ligera de Ig funcionales de tipo salvaje, p. ej., un ratón de tipo salvaje.
79. El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 78, en donde el ratón produce una proporción o porcentaje normal de células progenitoras de células B de médula ósea (p. ej., como se determina mediante FACS).
En un aspecto, el ratón produce una proporción o porcentaje normal de células pre-, pro- y prepro-B de médula ósea (p. ej., como se determina mediante FACS).
Por "normal" se entiende comparable a la producción de células B de médula ósea en un ratón (p. ej., un ratón no sometido a exposición previa) que expresa sólo cadenas de anticuerpos de ratón, p. ej., un ratón cuyo genoma comprende sólo loci de cadenas pesada y ligera de Ig funcionales de tipo salvaje, p. ej., un ratón de tipo salvaje.
80. Un ratón que expresa o para expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden regiones variables humanas, en donde las cadenas pesadas expresadas por el ratón son esencialmente de manera exclusiva dichas cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas y se expresan en un ratón que produce una proporción o porcentaje normal de células progenitoras de células B de médula ósea (p. ej., como se determina mediante FACS), comprendiendo el ratón un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VH, DH y JH humanos aguas arriba de una región constante de ratón (p. ej., C-mu y/o C-delta y/o C-gamma; tal como (en una orientación 5' a 3') y en donde el ratón produce una proporción o porcentaje normal de células progenitoras de células B de médula ósea.
En un aspecto, el ratón es para expresar dichas cadenas pesadas en un ratón que produce una proporción o porcentaje normal de células pre-, pro- y prepro-B de médula ósea (p. ej., como se determina mediante FACS).
Por "normal" se entiende comparable a la producción de células B de médula ósea en un ratón (p. ej., un ratón no sometido a exposición previa) que expresa sólo cadenas de anticuerpos de ratón, p. ej., un ratón cuyo genoma comprende sólo loci de cadenas pesada y ligera de Ig funcionales de tipo salvaje, p. ej., un ratón de tipo salvaje.
81. El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 80, en donde al menos 90% de las cadenas pesadas son cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas.
Por ejemplo, al menos 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 99,5% o 100% de las cadenas pesadas comprenden regiones variables humanas, es decir, regiones variables derivadas de la recombinación de los segmentos génicos VH humano con D y JH humanos.
82. El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 81, en donde la región constante de ratón comprende una región C-mu, una región C-delta y una región C-gamma de ratón.
En un ejemplo, cada una de las regiones C es una región C de ratón endógena. En un ejemplo, al menos las regiones C-mu y C-delta son regiones C de ratón. Esto es útil para aprovechar los mecanismos de control endógenos implicados en el desarrollo de los diversos tipos de células B y progenitores en el bazo y la médula ósea.
En un ejemplo, la región C-gamma es una región C-gamma humana. Esto es beneficioso para producir cadenas pesadas de tipo gamma de cambio de clase en el ratón en el que esencialmente todas las cadenas pesadas expresadas tienen regiones variables humanas y regiones constantes humanas.
83. El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 82, en donde hay un potenciador de cadena pesada de ratón entre los segmentos génicos humanos y la región constante de ratón. Esto es útil para aprovechar los mecanismos de control del desarrollo de anticuerpos y células B endógenos de ratón.
84. El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 83, en donde hay un cambio S-mu de ratón entre los segmentos génicos humanos y la región constante de ratón.
85. El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 84, en donde el genoma del ratón comprende segmentos génicos V, D y J de locus endógenos de cadena pesada de ratón aguas arriba de los segmentos génicos humanos.
86. El ratón del aspecto 85, en donde los segmentos génicos V, D y J de ratón están presentes junto con las secuencias de segmentos intergénicos endógenos.
87. El ratón del aspecto 85 u 86, en donde los segmentos génicos de ratón están en orientación invertida. Por lo tanto, se invierten con respecto a la orientación de tipo salvaje en un genoma de ratón. Por tanto, se invierten con respecto a la orientación de la región constante de ratón.
88. El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 87, en donde el ratón expresa cadenas ligeras que comprenden regiones variables humanas (p. ej., cadenas ligeras kappa que comprenden regiones variables kappa humanas). Por tanto, las regiones variables humanas derivan de la recombinación de segmentos génicos VL y JL humanos, p. ej., Vkhumano y Jkhumano.
89. El ratón del aspecto 88, que comprende segmentos génicos Vky Jkhumanos aguas arriba de un CL de ratón (p. ej., CK endógeno); en donde opcionalmente los segmentos génicos Vky Jkhumanos comprenden Vk2-24, Vk3-20, Vk1 -17, Vk1 -16, Vk3-15, Vk1 -13, Vk1 -12, Vk3-11, Vk1 -9, Vk1 -8, Vk1 -6, Vk1 -5, Vk5-2, Vk4-1 , Jk1 , Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5.
90. El ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 89, en donde los segmentos génicos VH, DH y JH humanos comprenden los segmentos génicos V<h>humanos V<h>2-5, 7-4-1,4-4, 1 -3, 1 -2, 6-1, y todos los segmentos génicos D y Jh humanos D1-1,2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1-20, 2-21,3-22, 6-25, 1-26 y 7-27; y J1, J2, J3, J4, J5 y J6. Por ejemplo, los segmentos génicos VH, DH y JH humanos comprenden segmentos génicos V<h>humanosVH2-5, 7-4-1,4-4, 1 -3, 1 -2, 6-1, y todos los segmentos génicos D y J<h>humanos D1 -1,2-2, 3-3, 4 4, 5-5, 6-6, 1 -7, 2-8, 3-9, 3-10, 4-11,5-12, 6-13, 1-14, 2-15, 3-16, 4-17, 5-18, 6-19, 1 -20, 2-21,3-22, 4-23, 5-24, 6-25, 1 -26 y 7-27; y J1, J2, J3, J4, J5 y J6.
91. El uso del ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 90 para expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden regiones variables humanas, en donde las cadenas pesadas expresadas por el ratón son esencialmente de manera exclusiva dichas cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas; y dichas cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas se expresan como parte de anticuerpos IgG 1, IgG2b e IgM (y opcionalmente IgG2a) de suero en el ratón. El uso es un uso no terapéutico, no diagnóstico y no quirúrgico.
En un ejemplo, el uso comprende inmunizar el ratón con un antígeno (p. ej., un antígeno humano) y aislar un anticuerpo IgG1 que se une específicamente al antígeno.
En un ejemplo, el uso comprende inmunizar el ratón con un antígeno (p. ej., un antígeno humano) y aislar un anticuerpo IgG2a que se une específicamente al antígeno.
En un ejemplo, el uso comprende inmunizar el ratón con un antígeno (p. ej., un antígeno humano) y aislar un anticuerpo IgG2b que se une específicamente al antígeno.
Opcionalmente, el uso comprende preparar un derivado del anticuerpo aislado. Los ejemplos de anticuerpos derivados (según cualquier aspecto del presente documento) son anticuerpos que tienen una o más mutaciones en comparación con el anticuerpo aislado (p. ej., para mejorar la afinidad de unión al antígeno y/o para potenciar o inactivar la función de Fc). Tales mutantes se unen específicamente al antígeno.
92. Uso del ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 90 para expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden regiones variables humanas, en donde las cadenas pesadas expresadas por el ratón son esencialmente de manera exclusiva dichas cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas y se expresan en un ratón que produce una proporción o porcentaje normal de células B esplénicas maduras. El uso es un uso no terapéutico, no diagnóstico y no quirúrgico.
En un ejemplo, el uso comprende adicionalmente aislar tejido esplénico (p. ej., el bazo) del ratón; seguido opcionalmente del aislamiento de al menos una célula B específica de antígeno del tejido, en donde la célula o células B expresan un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno predeterminado. En un ejemplo, el uso comprende inmunizar el ratón con el antígeno antes de aislar el tejido esplénico. En un ejemplo, el uso comprende aislar un anticuerpo producido por la célula B (o por un hibridoma producido por fusión de la célula B con una célula de mieloma). Opcionalmente, el uso comprende preparar un derivado del anticuerpo aislado. Los ejemplos de anticuerpos derivados (según cualquier aspecto del presente documento) son anticuerpos que tienen una o más mutaciones en comparación con el anticuerpo aislado (p. ej., para mejorar la afinidad de unión al antígeno y/o para potenciar o inactivar la función de Fc). Tales mutantes se unen específicamente al antígeno.
93. Uso del ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 90 para expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden regiones variables humanas, en donde las cadenas pesadas expresadas por el ratón son esencialmente de manera exclusiva dichas cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas y se expresan en un ratón que produce una proporción o porcentaje normal de células progenitoras de células B de médula ósea. El uso es un uso no terapéutico, no diagnóstico y no quirúrgico.
94. Uso del ratón de uno cualquiera de los aspectos 70 a 90 para el propósito indicado en uno o más de los aspectos 70, 71,73, 75 y 78.
La expresión (p. ej., porcentaje de expresión o proporción o nivel de expresión) de Ig se puede determinar a nivel de transcritos de ARNm de la cadena de anticuerpo en células B (p. ej., linfocitos de sangre periférica). Alternativa o adicionalmente, el porcentaje de expresión se determina a nivel de anticuerpo en suero o sangre de los vertebrados. Adicional o alternativamente, la expresión se puede determinar mediante análisis FACS de células B.
En estos aspectos, "cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas" significa regiones variables derivadas de la recombinación de segmentos génicos VH, D y JH humanos.
"Esencialmente de manera exclusiva" las cadenas pesadas expresadas comprenden regiones variables humanas, es decir, solo hay una expresión de la región variable endógena de cadena pesada de ratón relativamente muy baja o incluso nula. Por ejemplo, al menos 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 99,5% o 100% de las cadenas pesadas son cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas. En un ejemplo, al menos 90% de las cadenas pesadas son cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas. El porcentaje de expresión se puede determinar a nivel de transcritos de ARNm de cadena pesada en células B (p. ej., linfocitos de sangre periférica). Alternativa o adicionalmente, el porcentaje de expresión se determina a nivel de cadenas pesadas o anticuerpos en suero o sangre de los ratones. Adicional o alternativamente, la expresión se puede determinar mediante análisis FACS de células B.
El ratón puede comprender cualquier locus endógeno de cadena pesada en el que están presentes segmentos génicos V, D y J humanos, como se describe en el presente documento. En un ejemplo, el genoma de ratón comprende un locus de cadena pesada de ratón en el que al menos los segmentos génicos V<h>humanos V<h>2-5, 7-4-1,4-4, 1-3, 1-2,<6>-<1>, y todos los segmentos génicos D y J<h>humanos D<1>-<1>,<2>-<2>, 3-3, 4-4, 5-5,<6>-<6>,<1>-7,<2>-<8>, 3-9, 5-1<2>, 6-13, 2-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1-20, 2-21, 3-22, 6-25, 1-26 y 7-27; y J1, J2, J3, J4, J5 y J<6>se encuentran aguas arriba de la región constante de ratón.
El vertebrado en estos aspectos, p. ej., no ha sido sometido a exposición previa (es decir, no se ha inmunizado con un antígeno predeterminado, tal como se entiende el término en la técnica; por ejemplo, un vertebrado tal que se ha mantenido en un entorno relativamente estéril tal como es proporcionado por un animalario utilizado para I D). En otro ejemplo, el vertebrado se ha inmunizado con un antígeno predeterminado, p. ej., un antígeno que porta un epítopo humano.
En un ejemplo, las cadenas pesadas, junto con las cadenas ligeras expresadas en los ratones de la divulgación, forman anticuerpos (Ig). Las cadenas ligeras pueden expresarse a partir de cualquier locus de cadena ligera transgénico como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el genoma del ratón comprende un locus de cadena pesada que es un locus quimérico de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende uno o más segmentos génicos V humanos, uno o más segmentos génicos D humanos y uno o más segmentos génicos J humanos aguas arriba de una región constante mu de dicha especie no humana; la expresión de la cadena pesada endógena se ha inactivado sustancialmente; y el locus de la cadena pesada comprende un potenciador Eg de dicha especie de vertebrado no humano.
En un ejemplo de cualquier aspecto, la expresión de la cadena ligera endógena (p. ej., kappa y/o lambda) es sustancialmente inactiva o está inactivada, p. ej., utilizando el método descrito en el presente documento. En este caso, menos de 10, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% de tales cadenas ligeras lambda endógenas se expresa o se puede expresar. Adicional o alternativamente, menos de 10, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% de tales cadenas ligeras kappa endógenas se expresa o se puede expresar. En un ejemplo, hay una inactivación completa de la expresión endógena de kappa y/o lambda, de modo que no se expresan o se pueden expresar tales cadenas ligeras.
En un ejemplo, el genoma del ratón comprende segmentos génicos kappa humanos
(i) Vk1-5, Vk1-6, Vk1-8 y Vk1-9 (y opcionalmente Vk5-2 y Vk4-1); o
(ii) Vk1 -5, Vk1 -6, Vk1 -8, Vk1 -9, Vk3-11, Vk1-12, Vk3-15, Vk1 -16, Vk1 -17, Vk3-20 (y opcionalmente Vk2
24 y/o Vk1-13);
o
(iii) Vk1 -5, Vk1 -6, Vk1 -8, Vk1 -9, Vk3-11, Vk1-12, Vk3-15, Vk1-16, Vk1-17, Vk3-20, Vk2-24, Vk1 -27, Vk2
28, Vk2-30 y Vk1-33 (y opcionalmente Vk2-29 y/o Vk2-40 y/o Vk1-39); y opcionalmente
(iv) Jk1 , Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5.
En un ejemplo, el genoma también comprende (i) al menos segmentos génicos V<h>humanos V<h>2-5, 7-4-1,4-4, 1-3, 1
2, 6-1, y todos los segmentos génicos D y J<h>humanos D1 -1,2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1 -7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3
16, 4-17, 6-19, 1-20, 2-21,3-22, 6-25, 1-26 y 7-27; y J1, J2, J3, J4, J5 y J6 y (ii) al menos segmentos génicos humanos
Vk2-24, Vk3-20, Vk1-17, Vk1-16, Vk3-15, Vk1-13, Vk1-12, Vk3-11, Vk1-9, Vk1-8, Vk1-6, Vk1-5, Vk5-2, Vk4-1, Jk1, Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5. Como se demuestra en el Ejemplo 16, tales ratones son completamente funcionales en el aspecto de reordenamiento, señalización de BCR y maduración de células B. Más de 90% de los anticuerpos expresados por los ratones comprendía regiones variables de cadena pesada humana y regiones variables de cadena ligera kappa humana. Estos ratones son, por lo tanto, muy útiles para la selección de anticuerpos que tienen regiones variables humanas que se unen específicamente a antígenos humanos después de la inmunización de los ratones con tales antígenos. Después del aislamiento de tal anticuerpo, el experto puede reemplazar las regiones constantes de ratón por regiones constantes humanas utilizando técnicas convencionales para llegar a anticuerpos totalmente humanos que son útiles como candidatos a fármacos para la administración a seres humanos (opcionalmente después de la mutación o adaptación para producir un derivado adicional, p. ej., con potenciación o inactivación de Fc o después de la conjugación con una carga útil tóxica o indicador o marca u otro radical activo).
En un ejemplo, el genoma también comprende un ÍEkhumano y/o 3'Ekhumano aguas abajo de los segmentos génicos
J humanos en el locus.
La divulgación también incluye las siguientes cláusulas:
Cláusula 1. Un ratón que expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen regiones variables humanas,
en donde el ratón comprende un genoma que incluye un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VH, DH y J<h>humanos situados aguas arriba de una región constante de ratón;
en donde el ratón expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina, caracterizadas porque al menos 90% de las cadenas pesadas de inmunoglobulina expresadas por el ratón comprende una región variable humana;
y
en donde el ratón expresa anticuerpos IgG1, IgG2b e IgM en suero que comprenden dichas cadenas pesadas que contienen una región variable humana.
Cláusula 2. Un ratón que expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen regiones variables humanas,
en donde el ratón comprende un genoma que incluye un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VH, DH y JH humanos que están situados aguas arriba de una región constante de ratón;
en donde el ratón expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina, caracterizadas porque al menos 90% de las cadenas pesadas de inmunoglobulina expresadas por el ratón comprende una región variable humana;
y
en donde el ratón produce una proporción normal de células B esplénicas maduras;
en donde dicha proporción normal es una proporción de células B esplénicas maduras producidas por un ratón que expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen regiones variables de ratón y no expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen regiones variables humanas.
Cláusula 3. Un ratón que expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen regiones variables humanas,
en donde el ratón comprende un genoma que incluye un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VH, DH y JH humanos que están situados aguas arriba de una región constante de ratón;
en donde el ratón expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina, caracterizada porque al menos 90% de las cadenas pesadas de inmunoglobulina expresadas por el ratón comprende una región variable humana; y
en donde el ratón produce una proporción normal de células progenitoras de células B de médula ósea; en donde la proporción normal es una proporción de células progenitoras de células B de médula ósea producidas por un ratón que expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen regiones variables de ratón y no expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen regiones variables humanas.
Cláusula 4. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde el ratón expresa una proporción normal de IgG1, IgG2b e IgM en una muestra de suero obtenida del ratón; en donde la proporción normal es la producida por un ratón que expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen regiones variables de ratón y no expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen regiones variables humanas.
Clausula 5. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde la región constante de ratón es C-mu, C-delta y/o C-gamma.
Cláusula<6>. El ratón de la cláusula 5, en donde la región constante de ratón es al menos C-mu, C-delta y C-gamma.
Clausula 7. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde la región constante de ratón es una región C de ratón endógena.
Clausula<8>. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde el ratón expresa una región C-gamma humana.
Cláusula 9. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde el ratón es un ratón no sometido a exposición previa.
Cláusula 10. El ratón de la cláusula 1, en donde el ratón expresa IgG2a en suero que comprende dichas cadenas pesadas que contienen una región variable humana.
Cláusula 11. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde el ratón expresa subtipos de Ig en una proporción relativa de
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 25-350 pg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-200 pg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 30-800 pg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-300 pg/ml;
o
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 10-600 pg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-500 pg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 20-700 pg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-700 pg/ml;
según se determina por captura de inmunoglobulina en una placa seguida de incubación con anti-anticuerpos específicos de isotipo de ratón, comprendiendo cada uno una marca y cuantificación de cada inmunoglobulina basándose en el nivel de cada marca.
Cláusula 12. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde el ratón expresa subtipos de Ig en una proporción relativa de
(i) IgG e IgM en suero totales a una concentración de aproximadamente 200-2500 pg/ml; y
(ii) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 100-800 gg/ml;
según se determina por captura de inmunoglobulina en una placa seguida de incubación con anti-anticuerpos específicos de isotipo de ratón, comprendiendo cada uno una marca y cuantificación de cada inmunoglobulina basándose en el nivel de cada marca.
Cláusula 13. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde el ratón expresa dichas cadenas pesadas de inmunoglobulina de células B esplénicas y en donde el ratón produce una proporción normal de células B esplénicas maduras en células de bazo totales que comprenden células B maduras y células T1 y T2 esplénicas.
Cláusula 14. El ratón de una cualquiera de las cláusulas 1 -3, en donde, al menos 95, 96, 97, 98, 99 o 99,5% de las cadenas pesadas de inmunoglobulina expresadas por el ratón son cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden regiones variables humanas.
Clausula 15. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde un potenciador de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón se coloca en dicho locus de inmunoglobulina de la cadena pesada de ratón entre los segmentos génicos VH, DH y JH humanos y la región constante de ratón.
Cláusula 16. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde un cambio S-mu de ratón se coloca en dicho locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón entre los segmentos génicos VH, DH y JH humanos y la región constante de ratón.
Clausula 17. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde los segmentos génicos V, D y J endógenos de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón están situados en dicho locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón aguas arriba de los segmentos génicos VH, DH y JH humanos.
Clausula 18. El ratón de la cláusula 17, en donde los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón están presentes en dicho locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón con secuencias de segmentos intergénicos endógenos.
Clausula 19. El ratón de la cláusula 17 o 18, en donde los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón están situados en dicho locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón en una orientación que se invierte con respecto a su orientación endógena natural.
Cláusula 20. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde el ratón expresa cadenas ligeras que contienen regiones variables kappa humanas.
Cláusula 21. El ratón de la cláusula 20, en donde el ratón expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina derivadas de la recombinación de Vkcon Jkhumano.
Clausula 22. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde el ratón expresa cadenas ligeras que contienen regiones variables lambda humanas.
Clausula 23. El ratón de la cláusula 22, en donde el ratón expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina derivadas de la recombinación de VA con JA humano.
Cláusula 24. El ratón de la cláusula 21, que comprende un genoma que incluye segmentos génicos Vky Jkhumanos situados en dicho locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón aguas arriba de un CL de ratón.
Clausula 25. El ratón de la cláusula 24, en donde el CL de ratón es un Ck endógeno.
Cláusula 26. El ratón de las cláusulas 24 o 25, en donde los segmentos génicos Vk y Jk humanos comprenden Vk2-24, Vk3-20, Vk1-17, Vk1-16, Vk3-15, Vk1-13, Vk1-12, Vk3-11, Vk1-9, Vk1-8, Vk1-6, Vk1-5, Vk5-2, Vk4-1, Jk1 , Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5.
Clausula 27. El ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores, en donde los segmentos génicos VH, DH y JH humanos contienen
Segmentos génicos VH humanos: VH2-5, 7-4-1,4-4, 1 -3, 1 -2, 6-1;
Segmentos génicos DH humanos: D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1 -20, 2-21,3-22, 6-25, 1 -26 y 7-27; y
Segmentos génicos JH humanos: J1, J2, J3, J4, J5 y J6.
Cláusula 28. Un método para obtener una o más cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen regiones variables humanas, que comprende proporcionar el ratón de cualquiera de las cláusulas anteriores y aislar una o más cadenas pesadas de inmunoglobulina.
Cláusula 29. El método de la cláusula 28, en donde cada cadena pesada de inmunoglobulina se incluye en un anticuerpo.
Cláusula 30. El método de la cláusula 29, en donde dicha cadena pesada y/o dicho anticuerpo que contiene dicha cadena pesada se modifican después de dicho aislamiento.
Clausula 31. El método de la cláusula 28, en donde se realiza una etapa de inmunización del ratón con un antígeno antes de la etapa de aislamiento de las cadenas pesadas de inmunoglobulina.
Clausula 31 a. El método de la cláusula 30, en donde el antígeno es un antígeno humano.
Cláusula 32. El método de la cláusula 30, 31 o 31a, en donde las cadenas pesadas de inmunoglobulina se incluyen en un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo de IgG<1>que se unen específicamente al antígeno.
Clausula 33. El método de la cláusula 30, 31 o 31a, en donde las cadenas pesadas de inmunoglobulina se incluyen en un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo de IgG<2>a que se unen específicamente al antígeno.
Clausula 34. El método de la cláusula 30, 31 o 31a, en donde las cadenas pesadas de inmunoglobulina se incluyen en un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo de IgG<2>b que se unen específicamente al antígeno.
Cláusula 35. El método de la cláusula 30, 31 o 31a, en donde las cadenas pesadas de inmunoglobulina se incluyen en un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo de IgM que se unen específicamente al antígeno.
Cláusula 36. Un anticuerpo o cadena pesada de inmunoglobulina aislado en el método de una cualquiera de las cláusulas 28 a 35, o un fragmento de unión a antígeno o derivado del anticuerpo o cadena pesada.
Cláusula 37. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo de la cláusula 36 y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptables.
Cláusula 38. Un método para aislar tejido esplénico que comprende proporcionar al ratón de 1 a 27, recoger un bazo o una porción del mismo del ratón, y
obtener tejido del bazo o porción.
Clausula 39. El método de la cláusula 38, que comprende adicionalmente aislar al menos una célula B específica de antígeno del tejido esplénico, en donde la célula B expresa una cadena pesada que contiene una región variable humana.
Clausula 40. El método de la cláusula 38 o 39, en donde se realiza una etapa de inmunización del ratón con un antígeno antes de la etapa de recogida del bazo del ratón.
Clausula 41. El método de la cláusula 40, en donde el antígeno es un antígeno humano.
Clausula 42. El método de la cláusula 40 o 41 en donde la al menos una célula B específica de antígeno produce un anticuerpo IgG1, IgG2a, IgG2b o IgM que comprende dicha cadena pesada, en donde el anticuerpo se une específicamente al antígeno.
Cláusula 43. El método de las cláusulas 38 a 42, en donde la al menos una célula B específica de antígeno que produce dicha cadena pesada se fusiona con una célula de mieloma inmortal para producir una célula de hibridoma.
Cláusula 44. El método de las cláusulas 38 a 43, que comprende adicionalmente una etapa de aislamiento de una cadena pesada de inmunoglobulina de la célula B o la célula de hibridoma.
Clausula 45. Un anticuerpo o cadena pesada de inmunoglobulina aislados en el método de la cláusula 44, o un fragmento de unión a antígeno o derivado del anticuerpo o cadena pesada.
Clausula 46. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo de la cláusula 45 y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptables.
Clausula 47. Un método para obtener un anticuerpo humanizado, que comprende
seleccionar un ratón que expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen regiones variables humanas,
en donde el ratón comprende un genoma que incluye un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VH, DH y J<h>humanos situados aguas arriba de una región constante de ratón,
en donde el ratón expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina, caracterizadas porque al menos 90% de las cadenas pesadas de inmunoglobulina expresadas por el ratón consiste en cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen una región variable humana,
en donde el ratón expresa anticuerpos IgG1, IgG2b e IgM en suero que comprenden dichas cadenas pesadas que contienen una región variable humana,
en donde el ratón produce una proporción normal de células B esplénicas maduras,
en donde el ratón produce una proporción normal de células progenitoras de células B de médula ósea, y en donde el ratón expresa una proporción normal de IgG1, IgG2a, IgG2b e IgM en una muestra de suero obtenida del ratón, y
en donde cada una de dichas proporciones normales es una proporción producida por un ratón que expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen regiones variables de ratón y no expresa cadenas pesadas de inmunoglobulina que contienen regiones variables humanas;
recoger suero de dicho ratón; y
obtener un conjunto de anticuerpos humanizados que comprenden anticuerpos IgG1, IgG2b e IgM del suero.
Clausula 48. El método de la cláusula 47, que comprende una etapa de inmunización del ratón con un antígeno antes de la etapa de recogida de suero de dicho ratón.
Cláusula 49. El método de la cláusula 48, que comprende adicionalmente las etapas de
poner en contacto dicho conjunto de anticuerpos humanizados con dicho antígeno;
unir dicho antígeno con un anticuerpo humanizado en dicho conjunto de anticuerpos humanizados; y aislar el anticuerpo humanizado que se une a dicho antígeno.
Clausula 50. El método de la cláusula 49, que comprende adicionalmente las etapas de
poner en contacto el anticuerpo humanizado que se une a dicho antígeno con un anticuerpo específico de isotipo, en donde el anticuerpo específico de isotipo reconoce IgG1, IgG2a, IgG2b o IgM; y
aislar el anticuerpo humanizado que se une a dicho anticuerpo específico de isotipo.
Clausula 51. El método de la cláusula 48, que comprende adicionalmente las etapas de
recoger el bazo o tejido del mismo de dicho ratón,
aislar células B de tejido esplénico,
Fusionar dichas células B con células de mieloma inmortales para producir células de hibridoma que expresan un conjunto de anticuerpos humanizados que comprenden anticuerpos IgG del suero, en donde el conjunto de anticuerpos se utiliza en el método de la cláusula 48.
Clausula 52. El método de cualquiera de las cláusulas 47-51, en donde dicho ratón seleccionado comprende segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón que están situados en dicho locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón en una orientación que se invierte con respecto a su orientación endógena natural.
Clausula 53. El método de cualquiera de las cláusulas 47-52, en donde el ratón expresa subtipos de Ig en una proporción relativa de
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 25-350 pg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-200 pg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 30-800 pg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-300 pg/ml;
o
(i) IgG1 en suero a una concentración de aproximadamente 10-600 gg/ml;
(ii) IgG2a en suero a una concentración de aproximadamente 0-500 gg/ml;
(iii) IgG2b en suero a una concentración de aproximadamente 20-700 gg/ml; y
(iv) IgM en suero a una concentración de aproximadamente 50-700 gg/ml;
según se determina por captura de inmunoglobulina en una placa seguida de incubación con anti-anticuerpos específicos de isotipo de ratón, comprendiendo cada uno una marca y cuantificación de cada inmunoglobulina basándose en el nivel de cada marca.
Cláusula 54. El método de una cualquiera de las cláusulas 47 a 53, en donde, al menos 95, 96, 97, 98, 99 o 99,5% de las cadenas pesadas de inmunoglobulina expresadas por el ratón consiste en cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden regiones variables humanas.
Clausula 55. El método de cualquiera de las cláusulas 47-54, en donde un potenciador de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón se coloca en dicho locus de inmunoglobulina de la cadena pesada de ratón entre los segmentos génicos VH, DH y JH humanos y la región constante de ratón.
Clausula 56. El método de cualquiera de las cláusulas 47-55, en donde un conmutador S-mu de ratón se coloca en dicho locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón entre los segmentos génicos VH, DH y JH humanos y la región constante de ratón.
Clausula 57. El método de cualquiera de las cláusulas 47-56, en donde los segmentos génicos endógenos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón están situados en dicho locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón aguas arriba de los segmentos génicos VH, DH y JH humanos.
Clausula 58. El método de la cláusula 57, en donde los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón están presentes en dicho locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón con secuencias de segmentos intergénicos endógenos.
Clausula 59. El método de la cláusula 57 o 58, en donde los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón están situados en dicho locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón en una orientación que se invierte con respecto a su orientación endógena natural.
Clausula 60. El método de cualquiera de las cláusulas 47-59, en donde el ratón expresa cadenas ligeras que contienen regiones variables kappa humanas.
Clausula 61. El método de la cláusula 60, en donde el ratón expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que contienen Jkhumano.
Cláusula 62. El método de cualquiera de las cláusulas 47-51, en donde el ratón expresa cadenas ligeras que contienen regiones variables lambda humanas.
Clausula 63. El método de la cláusula 62, en donde el ratón expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que contienen JA humano.
Clausula 64. El método de la cláusula 61, que comprende un genoma que incluye segmentos génicos Vky Jkhumanos situados en dicho locus de inmunoglobulina de cadena pesada de ratón aguas arriba de un CL de ratón.
Clausula 65. El ratón de la cláusula 64, en donde el CL de ratón es un Ck endógeno.
Cláusula 66. El ratón de las cláusulas 64 o 65, en donde los segmentos génicos Vk y Jk humanos comprenden Vk2-24, Vk3-20, Vk1-17, Vk1-16, Vk3-15, Vk1-13, Vk1-12, Vk3-11, Vk1-9, Vk1-8, Vk1-6, Vk1-5, Vk5-2, Vk4-1, Jk1 , Jk2, Jk3, Jk4 y Jk5.
Clausula 67. El método de cualquiera de las cláusulas 47-51, en donde los segmentos génicos VH, DH y JH humanos contienen
Segmentos génicos VH humanos: VH2-5, 7-4-1,4-4, 1 -3, 1 -2, 6-1;
Segmentos génicos DH humanos: D1-1, 2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6-6, 1-7, 2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16, 4-17, 6-19, 1 -20, 2-21,3-22, 6-25, 1 -26 y 7-27; y
Segmentos génicos JH humanos: J1, J2, J3, J4, J5 y J6.
La divulgación también incluye los siguientes atributos:
Atributo 1. Una célula de vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, aislada cuyo genoma comprende un locus de la cadena H de Ig, comprendiendo el locus, en orientación transcripcional 5' a 3', una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata y una región C, en donde la región C no es una región C de rata.
Atributo 1 a. Una célula de vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, aislada cuyo genoma comprende un locus de la cadena H de Ig, comprendiendo el locus, en orientación transcripcional 5' a 3', una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata,
en donde el locus comprende una unión de secuencia de ser humano-rata y/o ratón-rata, y
en donde la secuencia de rata es proporcionada por la secuencia de cambio de rata.
Atributo 2. Una célula de vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, aislada cuyo genoma comprende un locus de la cadena H de Ig, comprendiendo el locus, en orientación transcripcional 5' a 3', una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata, y una región C, en donde la secuencia de cambio de rata es una secuencia S-mu de rata que comprende al menos 3 repeticiones contiguas de la secuencia de repetición GGGCT (SEQ ID NO. 46-50).
Atributo 3. Una célula de vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, aislada cuyo genoma comprende un locus de la cadena H de Ig, comprendiendo el locus, en orientación transcripcional 5' a 3', una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata y una región C, en donde el cambio de rata es una secuencia S-mu de rata que comprende GAGCT (296 repeticiones), GGGGT (50 repeticiones) y/o GGGCT (83 repeticiones).
Atributo 4. Un organismo vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, cuyo genoma comprende un locus de la cadena H de Ig, comprendiendo el locus, en orientación transcripcional 5' a 3', una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata, y una región C, en donde la región C no es una región C de rata.
Atributo 4a. Un organismo vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, cuyo genoma comprende un locus de la cadena H de Ig, comprendiendo el locus, en orientación transcripcional 5' a 3', una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata,
en donde el locus comprende una unión de secuencia de ser humano-rata y/o ratón-rata, y
en donde la secuencia de rata es proporcionada por la secuencia de cambio de rata.
Atributo 5. Un organismo vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, cuyo genoma comprende un locus de la cadena H de Ig, comprendiendo el locus, en orientación transcripcional 5' a 3', una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata y una región C, en donde la secuencia de cambio de rata es una secuencia S-mu de rata que comprende al menos 3 repeticiones contiguas de la secuencia de repetición GGGCT (SEQ ID NO. 46 - 50).
Atributo<6>. Un organismo vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, cuyo genoma comprende un locus de la cadena H de Ig, comprendiendo el locus, en orientación transcripcional 5' a 3', una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata y una región C, en donde la secuencia de cambio de rata es una secuencia S-mu de rata que comprende GAGCT (296 repeticiones), GGGGT (50 repeticiones) y/o GGGCT (83 repeticiones).
Atributo 7. Una célula de vertebrado no humano aislada u organismo, opcionalmente un mamífero, cuyo genoma comprende un locus de la cadena H de Ig que comprende secuencias de ADN de tres o más especies de vertebrados, comprendiendo el locus de la cadena H de Ig en orientación transcripcional 5' a 3' al menos una región V, una región D, una región J, un potenciador, una secuencia de cambio de rata y una región C.
Atributo<8>. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1 a 7, en donde el genoma de la célula u organismo comprende adicionalmente un locus de la cadena L de Ig que comprende secuencias de ADN de tres o más especies de vertebrados y en donde el locus de la cadena L de Ig comprende en orientación transcripcional 5' a 3' al menos una región V humana, una región J humana y una región C.
Atributo 9. La célula de vertebrado no humano u organismo del atributo 7 u<8>, en donde dichas tres o más especies de vertebrados son ratón, humano y rata.
Atributo 10. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1 a 9, en donde dicha región C es endógena de la célula u organismo, y dichas regiones V, D y/o J son humanas.
Atributo 11. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1-10, en donde el locus de la cadena H de Ig comprende una pluralidad de regiones V, una o más regiones D, y una o más regiones J y/o en donde el locus de la cadena L de Ig comprende una pluralidad de regiones V y una o más regiones J. Atributo 12. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1-11, en donde dicha región V o dicha pluralidad de regiones V son humanas.
Atributo 13. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1-11, en donde dicha región D o dichas una o más regiones D son humanas.
Atributo 14. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1-11, en donde dicha región J o dichas una o más regiones J son humanas.
Atributo 15. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 11-14, en donde dicha región V o dicha pluralidad de regiones V son humanas, dicha región D o dichas una o más regiones D son humanas, y dicha región J o dichas una o más regiones J son humanas.
Atributo 16. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1, 1a, 4a, 4, 7-11 y 15, en donde dicha secuencia de cambio de rata es S-mu de rata.
Atributo 17. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1,4, 7-11 y 15 que comprenden adicionalmente una secuencia potenciadora de ratón colocada aguas arriba de dicha secuencia de cambio de rata y asociada operativamente a la misma.
Atributo 18. La célula de vertebrado no humano u organismo del atributo 16, que comprenden adicionalmente una secuencia potenciadora de ratón colocada aguas arriba de dicha secuencia S-mu de rata y asociada operativamente con la misma.
Atributo 19. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1-4, 7-15, en donde la región C es una de una región C de ratón o una región C humana.
Atributo 20. La célula de vertebrado no humano u organismo del atributo 19, en donde la región C es CH1. Atributo 21. La célula de vertebrado no humano u organismo del atributo 19, en donde la región C de ratón es una o más de C-mu o C-gamma.
Atributo 22. La célula de vertebrado no humano u organismo del atributo 21, en donde la región C de ratón es C-mu y C-gamma.
Atributo 23. La célula de vertebrado no humano u organismo del atributo 7, en donde la célula es una célula de ratón o el vertebrado es un ratón y en donde la región C de ratón es la región C de ratón endógena.
Atributo 24. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1, 1a, 4, 4a y 7, en donde la secuencia S-mu de rata comprende al menos 3 y hasta 83 repeticiones contiguas de la secuencia de repetición GGGCT (SEQ ID NO. 46 - 50).
Atributo 25. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1, 1a, 2, 4, 4a, 5 y 7, que comprende una secuencia S-mu de rata que comprende 296 repeticiones del motivo GAGCT.
Atributo 26. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1, 1a, 2, 4, 4a, 5 y 7, que comprende una secuencia S-mu de rata que comprende 50 repeticiones del motivo GGGGT.
Atributo 27. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1, 1a, 2, 4, 4a, 5 y 7, que comprende una secuencia S-mu de rata que comprende 83 repeticiones del motivo GGGCT.
Atributo 28. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquier atributo anterior, en donde la secuencia S-mu de rata comprende SEQ ID NO 1.
Atributo 29. La célula de vertebrado no humano de cualquier atributo anterior, en donde la célula es una célula ES, célula madre hematopoyética o hibridoma.
Atributo 30. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquier atributo anterior, en donde la célula u organismo es una célula ES de ratón o un ratón, respectivamente.
Atributo 31. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1 -10, en donde dicho locus de la cadena H de Ig comprende un JH humano, un DH humano y VH2-5 humano asociados operativamente con una secuencia S-mu de rata.
Atributo 32. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1 -10, en donde dicho locus de la cadena H de Ig comprende JH1-5 humano, un DH humano y un humano asociado operativamente con una secuencia S-mu de rata.
Atributo 33. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1 -10, en donde dicha célula es una célula de ratón o dicho organismo es un ratón;
en donde dicho locus de la cadena H de Ig comprende un potenciador de ratón situado aguas arriba de y asociado operativamente con una secuencia de cambio de rata que es S-mu de rata y
en donde dicha región C es una región constante de ratón.
Atributo 34. La célula de vertebrado no humano u organismo del atributo 33, en donde dichas regiones V, D y J de la cadena H de Ig son humanas y/o dichas regiones V y J de la cadena L de Ig son humanas.
Atributo 35. La célula de vertebrado no humano u organismo de los atributos 1-10, en donde dicho locus de la cadena H de Ig comprende una región VDJ reordenada.
Atributo 36. La célula de vertebrado no humano u organismo del atributo 35, en donde dicha región VDJ reordenada es humana.
Atributo 37. La célula de vertebrado no humano u organismo de cualquiera de los atributos 1-10, en donde la célula u organismo comprenden un genoma que comprende ADN humano que comprende una pluralidad de regiones V de IgH humana, una o más regiones D humanas y una o más regiones J humanas aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión y en donde la región VDJ de IgH humana comprende los nucleótidos 105.400.051 a 106.68.585 del cromosoma 14 humano (las coordenadas se refieren a NCBI36 para el genoma humano, ENSEMBL Release 54) o una región humana equivalente de otro ser humano.
Atributo 38. La célula de vertebrado no humano u organismo del atributo 37, en donde el ADN humano está situado entre una región constante de mamífero no humano y una región J de mamífero no humano situada en posición 3' distal con respecto a cualquier otra región J no humana.
Atributo 39. La célula de vertebrado no humano u organismo según el atributo 37, en donde la célula es una célula de ratón o el organismo es un ratón, dichas regiones V, D y J son humanas y están situados entre las coordenadas 114, 667.091 y 114.665.190 del cromosoma 12 de ratón (las coordenadas se refieren a NCBI m37, para la cepa C57BL/6J de ratón), o en una posición equivalente en otro genoma de mamífero no humano.
Atributo 40. La célula de vertebrado no humano u organismo del atributo 39, en donde la célula es una célula de ratón o el organismo es un ratón, dichas regiones V, D y J son humanas y están situados entre las coordenadas 114.667.089 y 114.667.090 (las coordenadas se refieren a NCBI m37, para la cepa C57BL/6J de ratón), o en una posición equivalente en otro genoma de mamífero no humano.
Atributo 41. La célula de vertebrado no humano u organismo del atributo 37, en donde la célula es una célula de ratón o el organismo es un ratón, y en donde dichas regiones V, D y J son humanas y están situadas entre las coordenadas 114.666,183 y 114.666, 725, tal como entre las coordenadas 114.666, 283 y 114.666.625, opcionalmente entre las coordenadas 114.666.335 y 114.666.536, opcionalmente entre las coordenadas 114.666.385 y 114.666.486, opcionalmente entre las coordenadas 114.666.425 y 114.666.446, tal como entre las coordenadas 114.666.435 y 114.666.436 del cromosoma 12 de ratón, con referencia al NCBI m37 para el genoma de ratón relacionado con la cepa C57BL/6J de ratón o una posición equivalente del cromosoma 12 de ratón de una cepa de ratón diferente o una posición equivalente en el genoma de otro vertebrado no humano.
Atributo 42. La célula de vertebrado no humano u organismo según cualquiera de los atributos 1 -10, en donde la célula es una célula de ratón o el organismo es un ratón y en donde dichas regiones V, D y J de la cadena H de Ig o dichas regiones V y J de la cadena L de Ig son humanas.
Atributo 43. La célula de vertebrado no humano u organismo según cualquiera de los atributos 1-10, en donde dichas regiones V, D y J son humanas y comprenden o consisten en los nucleótidos 106.328.851 -107.268.544, tales como los nucleótidos 106.328.901 -107.268.494, tales como los nucleótidos 106.328.941 -107.268.454, tales como los nucleótidos 106.328.951-107.268.444 del Cromosoma 14 humano, con referencia a la base de datos de secuencias GRCH37/hg19, o nucleótidos equivalentes relacionados con el cromosoma 14 de una secuencia o base de datos humanas diferentes.
Atributo 44. La célula de vertebrado no humano u organismo según cualquiera de los atributos 1-10, que comprende un ADN de la región VJ kappa humana que comprende, en configuración de la línea germinal, todas las regiones V y J y secuencias intermedias de un ser humano.
Atributo 45. La célula de vertebrado no humano u organismo según el atributo 44, en donde el ADN de la región VJ kappa humana se sitúa entre las coordenadas 70.673.918 - 70.675.517, tal como entre las coordenadas 70.674.418 - 70675.017, tal como entre las coordenadas 70.674.655 - 70.674.856, tal como entre las coordenadas 70.674.705 - 70.674.906, tal como entre las coordenadas 70.674.745 - 70.674.766, tal como entre las coordenadas 70.674.755 y 70.674.756 del cromosoma<6>de ratón (con referencia al NCBI m37 para el genoma de ratón, con relación a la cepa C57BL/6J de ratón), o en una posición equivalente en otro genoma.
Atributo 46. La célula de vertebrado no humano u organismo según el atributo 45, en donde el ADN de la región VJ kappa humana comprende o consiste en un fragmento del cromosoma 2 humano, numerado con referencia a la base de datos de secuencias GRCH37/hg19, o nucleótidos equivalentes relacionados con el cromosoma 2 de una secuencia o base de datos humanas diferentes, seleccionándose el fragmento entre<1>o más de: (i) nucleótidos 89.158.979-89.630.537, tales como 89.159.029-89.630.487, tales como 89.159.069-89.630.447, tales como 89.159.079-89.630.437, opcionalmente además del fragmento (ii); (ii) nucleótidos 89.941.614 90.267.076, tales como 89.941.664-90.267.026, tales como 89.941.704-90.266.986, tales como 89.941.714 90.266.976; opcionalmente además del fragmento (i); y (iii) los nucleótidos 89.158.979-90.267.076, tales como los nucleótidos 89.159.079-90.266.976.
Atributo 47. La célula de vertebrado no humano u organismo según cualquiera de los atributos 1-10, que comprenden ADN de la región lambda humana que comprende al menos una región JA humana y al menos una región CA humana, opcionalmente CA<6>y/o CA7.
Atributo 48. La célula de vertebrado no humano u organismo según el atributo 47, que comprende una pluralidad de regiones JA humanas, opcionalmente dos o más de JA1, JA2, JA<6>y JA7, opcionalmente la totalidad de JA1, JA2, JA<6>y JA7.
Atributo 49. La célula de vertebrado no humano u organismo según el atributo 47, que comprende al menos una agrupación JA-CA humana, opcionalmente al menos JA7-CA7.
Atributo 50. La célula de vertebrado no humano u organismo según cualquiera de los atributos 1-10, que comprende un potenciador EA humano.
Atributo 51. La célula de vertebrado no humano u organismo según cualquiera de los atributos 1-10, que comprende ADN de la región VJ lambda humana que comprende, en configuración de la línea germinal, todas las regiones V y J y secuencias intermedias de un ser humano.
Atributo 52. La célula de vertebrado no humano u organismo según el atributo 51, en donde el ADN de la región VJ lambda humana comprende o consiste en los nucleótidos 22.375.509-23.327.984, tales como los nucleótidos 22.375.559-23.327.934, tales como los nucleótidos 22.375.599-23.327.894, tales como los nucleótidos 22.375.609-23.327.884 del cromosoma 22 humano, con referencia a la base de datos de secuencias GRCH37/hg19, o nucleótidos equivalentes relacionados con el cromosoma 22 humano de una secuencia o base de datos humanas diferentes.
Atributo 53. La célula de vertebrado no humano u organismo según cualquiera de los atributos 1 -10, en donde el ADN no de ratón se sitúa en el genoma del ratón entre las coordenadas 19.027.763 y 19.061.845, tal como entre las coordenadas 19.037.763 y 19.051.845, tal como entre las coordenadas 19.047.451 y 19.047.652, tal como entre las coordenadas 19.047.491 y 19.047.602, tal como entre las coordenadas 19.047.541 y 19.047.562, tal como entre las coordenadas 19.047.551 y 19.047.552 del cromosoma 16 de ratón, con referencia al NCBI m37 para el genoma del ratón, o en una posición equivalente en otro genoma.
Atributo 54. La célula de vertebrado no humano u organismo según cualquiera de los atributos 1 -10, en donde el ADN no humano se sitúa en el genoma del ratón entre las coordenadas 70.673.918 y 70.675.517 tal como entre las coordenadas 70.674.418 y 70.675.017, tal como entre las coordenadas 70.674.655 y 70.674.856, tal como entre las coordenadas 70.674.705 y 70.674.806, tal como entre las coordenadas 70.674.745 y 70.674.766, tal como entre las coordenadas 70.674.755 y 70.674.756 del cromosoma<6>del ratón, con referencia al NCBI m37 para el genoma del ratón, con relación a la cepa C57BL/6J) de ratón o en una posición equivalente en otro genoma.
Atributo 55. La célula de vertebrado no humano u organismo según cualquiera de los atributos 1-10, en donde dichas regiones V, D y J son humanas y el ADN de VJC de cadena ligera kappa humana, o parte del mismo, se insertan inmediatamente aguas arriba de la región VJC kappa de ratón.
Atributo 56. La célula de vertebrado no humano u organismo según cualquiera de los atributos 1 -10, en donde el genoma de la célula u organismo está modificado para prevenir o reducir la expresión de anticuerpos completamente específicos de la especie anfitriona.
Atributo 57. La célula de vertebrado no humano u organismo según el atributo 56, en donde el genoma de la célula u organismo se modifica mediante inversión de toda o parte de la región VDJ o región VJ de mamífero no humano.
Atributo 58. La célula de vertebrado no humano u organismo según el atributo 56, en donde el genoma de la célula u organismo comprende ADN humano y ADN no humano, y dicho ADN no humano comprende regiones V y J endógenas o regiones V, D y J que no han sido suprimidas.
Atributo 59. El organismo vertebrado no humano según cualquiera de los atributos 1-10 generado en un fondo genético que previene la producción de linfocitos B y T del anfitrión maduro.
Atributo 60. El organismo vertebrado no humano según el atributo 59 generado un fondo con deficiencia de Rag-1 o Rag-2.
Atributo 61. La célula de vertebrado no humano según el atributo 29, que es una célula ES o una célula madre hematopoyética capaz de desarrollarse en un mamífero no humano capaz de producir un repertorio de anticuerpos o cadenas de anticuerpos que son quiméricos, teniendo dichos anticuerpos o cadenas quiméricos una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
Atributo 62. La célula de vertebrado no humano según el atributo 29, que es una célula ES o una célula madre hematopoyética capaz de contribuir a tejidos y órganos de mamífero no humano que es capaz de producir un repertorio de anticuerpos o cadenas de anticuerpos que son quiméricos, teniendo dichos anticuerpos o cadenas quiméricos una región constante de mamífero no humano y una región variable humana.
Atributo 63. La célula de vertebrado no humano u organismo según cualquiera de los atributos 1-10, que comprenden ADN de la región variable humana de al menos una cadena pesada humana y ligera humana. Atributo 64. La célula de vertebrado no humano u organismo según cualquiera de los atributos 1 -10, en donde la célula u organismo son homocigotos en uno, dos o los tres loci de inmunoglobulina para ADN que codifica una cadena quimérica de anticuerpo.
Atributo 65. La célula de vertebrado no humano u organismo según cualquiera de los atributos 1 -10, en donde la célula u organismo son heterocigotos en uno, dos o los tres loci de inmunoglobulina para ADN que codifica una cadena pesada o ligera quimérica.
Atributo<66>. La célula de vertebrado no humano u organismo según los atributos 1-10, en donde el genoma de la célula u organismo no comprende ADN de la región constante de otra célula u organismo.
Atributo 67. La célula de vertebrado no humano según el atributo 29 que se inmortaliza.
Atributo<6 8>. La célula de vertebrado no humano según el atributo 67 que es una línea celular ES AB2.1, o una célula de una cepa de ratón seleccionada entre C57BL/6, M129, 129/SV, BALB/c, y cualquier híbrido de C57BL/6, M129, 129/SV o BALB/c.
Atributo 69. Un método para obtener una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una región variable de inmunoglobulina humana,
que comprende proporcionar al ratón cualquiera de los atributos 1a, 4, 4a, 5-28, 30-60 y 63-66, y aislar el polipéptido que comprende la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende dicha región variable humana.
Atributo 69a. El método del atributo 69, en donde dicha cadena pesada de inmunoglobulina es una cadena pesada de un anticuerpo de dos cadenas o de cuatro cadenas.
Atributo 69b. Un anticuerpo aislado según el método del atributo 69.
Atributo 69c. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo del atributo 69b y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptables.
Atributo 69d. El método del atributo 69 o 69a, en donde se realiza una etapa de inmunización del ratón con un antígeno antes de la etapa de aislamiento de las cadenas pesadas de inmunoglobulina.
Atributo 69e. El método del atributo 69d, en donde el antígeno es un antígeno humano.
Atributo 69f. El método del atributo 69 o 69a, en donde dicha cadena pesada de inmunoglobulina es una de isotipo IgG1, IgG2, IgG3 e IgM, dicha región variable humana se une específicamente a dicho antígeno.
Atributo 69g. El método del atributo 69f, en donde dicha cadena pesada de inmunoglobulina es una cadena pesada de un anticuerpo de dos o cuatro cadenas y dicho anticuerpo se une específicamente a dicho antígeno. Atributo 70. Una secuencia de lugar de emplazamiento genómico de polinucleótido, comprendiendo el polinucleótido regiones de ácido nucleico homólogas a regiones de un cromosoma diana para permitir la inserción por recombinación homóloga en el cromosoma diana, y que comprende un sitio de ácido nucleico que permite la inserción conducida por recombinasa de un ácido nucleico en el lugar de emplazamiento genómico, en donde la secuencia de polinucleótido comprende uno o más de: (i) una secuencia de cambio de rata, opcionalmente un cambio S-mu de rata, que es opcionalmente la secuencia de SEQ ID NO 1; (ii) en una dirección 5' a 3', una secuencia Eg de ratón, una secuencia de cambio de rata, y Cg de ratón; y/o (iii) un brazo de homología 3' que tiene la secuencia de SEQ ID NO<6>.
Atributo 71. El organismo vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, que comprende una secuencia de lugar de emplazamiento genómico según el atributo 70 que se ha insertado en el genoma de la célula. Atributo 72. La célula de vertebrado no humano u organismo, opcionalmente un mamífero, o lugar de emplazamiento genómico según el atributo 70 o 71, en donde la secuencia de cambio de rata comprende 3, 4, 5,<6>o más repeticiones contiguas de la secuencia GGGCT, que opcionalmente es SEQ ID NO 1.
Atributo 73. La célula de vertebrado no humano u organismo, opcionalmente un mamífero, o lugar de emplazamiento genómico según cualquiera de los atributos 70 a 72, en donde la secuencia de lugar de emplazamiento genómico comprende la secuencia de SEQ ID NO 2.
Atributo 74. La célula de vertebrado no humano u organismo, opcionalmente un mamífero, o lugar de emplazamiento genómico según cualquiera de los atributos 70 a 73, en donde la secuencia de lugar de emplazamiento genómico comprende la secuencia de SEQ ID NO 3.
Atributo 75. Un método para producir una célula de vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, aislada que comprende:
insertar una o más construcciones de ADN no nativo en un genoma de célula de mamífero no humano, produciendo de este modo una célula cuyo genoma incluye un locus de la cadena H de Ig que tiene una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata y una región C en una orientación transcripcional de 5' a 3', en donde la región C no es una región C de rata.
Atributo 76. Un método para producir una célula de vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, aislada que comprende:
insertar una o más construcciones de ADN no nativo en un genoma de célula de mamífero no humano, produciendo de este modo una célula cuyo genoma incluye un locus de la cadena H de Ig que tiene una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata y una región C en una orientación transcripcional de 5' a 3', en donde la secuencia de cambio de rata es una secuencia S-mu de rata que comprende al menos 3 repeticiones contiguas de la secuencia de repetición GGGCT (SEQ ID NO. 46 - 50). Atributo 77. Un método para producir una célula de vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, que comprende:
insertar una o más construcciones de ADN no nativo en un genoma de célula de mamífero no humano, produciendo de este modo una célula cuyo genoma incluye un locus de la cadena H de Ig que tiene una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata y una región C en una orientación transcripcional de 5' a 3', en donde el cambio de rata es una secuencia S-mu de rata que comprende GAGCT (296 repeticiones), GGGGT (50 repeticiones) y/o GGGCT (83 repeticiones).
Atributo 78. Un método para producir un organismo vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, que comprende:
insertar una o más construcciones de ADN no nativo en un genoma de célula de mamífero no humano, produciendo de este modo un genoma que incluye un locus de la cadena H de Ig que tiene una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata y una región C en una orientación transcripcional de 5' a 3', en donde la región C no es una región C de rata.
Atributo 79. Un método para producir un organismo vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, que comprende:
insertar una o más construcciones de ADN no nativo en un genoma de célula de mamífero no humano, produciendo de este modo un genoma que incluye un locus de la cadena H de Ig que tiene una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata y una región C en una orientación transcripcional de 5' a 3', en donde el cambio de rata es una secuencia S-mu de rata que comprende al menos 3 repeticiones contiguas de la secuencia de repetición GGGCT (SEQ ID NO. 46 - 50).
Atributo 80. Un método para producir un organismo vertebrado no humano, opcionalmente un mamífero, que comprende:
insertar una o más construcciones de ADN no nativo en un genoma de célula de mamífero no humano, produciendo de este modo un genoma que incluye un locus de la cadena H de Ig que tiene una región V, una región J, una región D, una secuencia de cambio de rata y una región C en una orientación transcripcional de 5' a 3', en donde el cambio de rata es una secuencia S-mu de rata que comprende GAGCT (296 repeticiones), GGGGT (50 repeticiones) y/o GGGCT (83 repeticiones).
Atributo 81. Un método para producir una célula de vertebrado no humano u organismo aislados, opcionalmente un mamífero, que comprende:
insertar una o más construcciones de ADN no nativo en un genoma de célula de mamífero no humano, produciendo de este modo un genoma que incluye un locus de la cadena H de Ig que tiene ADN de tres o más especies de mamífero, en donde el locus de la cadena H de Ig incluye, en una orientación transcripcional de 5' a 3', al menos una región V, una región D, una región J, un potenciador, una secuencia de cambio de rata y una región C.
Atributo 82. El método de cualquiera de los atributos 75 a 81, que comprende adicionalmente:
insertar una o más construcciones de ADN no nativo en el genoma de la célula de mamífero no humano, produciendo de este modo un genoma que incluye un locus de la cadena L de Ig que comprende en orientación transcripcional de 5' a 3' al menos una región VL humana, una región JL humana y una región CL.
Atributo 83. El método del atributo 81 u 82, en donde dicha región constante (CL) es una región constante de ratón o humana.
Atributo 84. El método del atributo 81 u 82, en donde el potenciador es una secuencia potenciadora de ratón. Atributo 85. El método de cualquiera de los atributos 75, 78 u 81-84, en donde dicha secuencia de cambio de rata es S-mu de rata.
Atributo<8 6>. El método de cualquiera de los atributos 75 a 85, en donde dicha región V, D y/o J es humana o la región V y/o J es humana.
Atributo 87. El método de cualquiera de los atributos 75 a<8 6>, en donde la región C del locus IgH es una de una región C de ratón o una región C humana.
Atributo<8 8>. El método según cualquiera de los atributos 75 a 87, en donde el genoma de la célula de mamífero no humano se modifica después para prevenir la expresión de anticuerpos nativos (completamente específicos de la especie del anfitrión) en la célula u organismo vertebrado, opcionalmente por inversión de todo o parte del locus de Ig de mamífero no humano anfitrión, opcionalmente por inserción de uno o más sitios de recombinasa específica de sitio en el genoma y después uso de estos sitios en escisión o inversión mediadas por recombinasa de todo o una parte del locus de Ig de mamífero no humano anfitrión.
Atributo 89. El método según cualquiera de los atributos 75 a<8 8>, en donde la célula es una célula ES.
Atributo 90. El método según cualquiera de los atributos 75 a 89, en donde la etapa de inserción de ADN se logra mediante la inserción escalonada de múltiples construcciones mediante recombinación homóloga y en donde dicho ADN se inserta aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión.
Atributo 91. El método según cualquiera de los atributos 75 a 90, en donde la etapa de inserción de ADN se produce en un sitio donde se ha insertado un casete de inicio en el genoma de una célula ES, proporcionando de este modo una región de direccionamiento única.
Atributo 92. El método según cualquiera de los atributos 75 a 91, en donde uno o más eventos de inserción utilizan recombinación específica de sitio.
Atributo 93. El método según el atributo 92, en donde dichos uno o más eventos de inserción están mediados por, o implican, uno o más de los sitios Frt, recombinasa Flp, recombinasa Dre, sitios Rox o recombinasa PhiC31. Atributo 94. El método según cualquiera de los atributos 75 a 93, en donde la inserción de una o más construcciones de ADN no nativo en un genoma de célula de mamífero no humano comprende las etapas de:
1 inserción de ADN que forma un casete de inicio (también denominado lugar de emplazamiento genómico en el presente documento) en el genoma de una célula;
2 inserción de un primer fragmento de ADN en el sitio de inserción, comprendiendo el primer fragmento de ADN una primera porción de un ADN humano y una primera porción del vector que contiene un primer marcador seleccionable o que genera un marcador seleccionable tras la inserción;
3 opcionalmente eliminación de una parte del ADN vector;
4 inserción de un segundo fragmento de ADN en la porción del vector del primer fragmento de ADN, conteniendo el segundo fragmento de ADN una segunda porción de ADN humano y una segunda porción del vector, conteniendo la segunda porción del vector un segundo marcador seleccionable, o generando un segundo marcador seleccionable tras la inserción;
5 eliminación de cualquier ADN vector para permitir que el primer y segundo fragmentos de ADN humano formen una secuencia contigua; y
<6>repetición de las etapas de inserción de una parte del ADN de V(D)J humano y eliminación del ADN vector, según sea necesario, para producir una célula con la totalidad o parte de la región VDJ o VJ humana suficiente para ser capaz de generar un anticuerpo quimérico junto con una región constante del anfitrión,
en donde la inserción de al menos un fragmento de ADN utiliza recombinación específica de sitio.
Atributo 95. El método según cualquiera de los atributos 75 a 94, en donde la secuencia del lugar de emplazamiento genómico comprende SEQ ID NO<6>, SEQ ID NO. 2, o SEQ ID NO. 3.
Atributo 96. El método según cualquiera de los atributos 75 a 95, en donde el lugar de emplazamiento genómico se inserta en el genoma de la célula de ratón mediante recombinación homóloga entre las secuencias J1-4 de ratón y C mu de ratón.
Atributo 97. El método según cualquiera de los atributos 75 a 96, en donde el lugar de emplazamiento genómico se recombina en el genoma de la célula de ratón mediante recombinación homóloga entre las secuencias J1-4 y E mu de ratón.
Atributo 98. El método según cualquiera de los atributos 75 a 97, en donde el lugar de emplazamiento genómico comprende un S-mu que no es del anfitrión, tal como un cambio S-mu de rata.
Atributo 99. El método, célula o mamífero atribuidos en cualquiera de los atributos 1 a 98, en donde una secuencia de ADN de la región codificante humana está en un ordenamiento funcional con una secuencia de control de mamífero no humano, de manera que la transcripción del ADN humano está controlada por la secuencia de control de mamífero no humano.
Atributo 100. Un método para producir un anticuerpo o cadena pesada o ligera de anticuerpo específicos para un antígeno deseado, comprendiendo el método inmunizar el vertebrado no humano como se atribuye en los atributos 4-28, 30-60, 63-66 o 71-74 con el antígeno deseado y recuperar el anticuerpo o cadena de anticuerpo o recuperar una célula que produce el anticuerpo o cadena pesada o ligera.
Atributo 101. El método para producir un anticuerpo o cadena de anticuerpo completamente humanizados que comprende llevar a cabo el método según el atributo<100>y después reemplazar la región constante de mamífero no humano del anticuerpo o cadena de anticuerpo recuperados por una región constante humana, adecuadamente mediante ingeniería genética del ácido nucleico que codifica el anticuerpo o cadena de anticuerpo.
Atributo 102. Un anticuerpo o cadena de anticuerpo humanizados producidos según el atributo 100 o 101 o un derivado del mismo que se une al antígeno deseado.
Atributo 103. Uso del anticuerpo o cadena humanizados producidos según el atributo 100 o 101 o un derivado del mismo que se une al antígeno deseado en medicina.
Atributo 104. El anticuerpo o cadena de anticuerpo humanizados producidos según el atributo 100 o 101 o un derivado del mismo que se une al antígeno deseado para su uso en medicina.
Atributo 105. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o cadena de anticuerpo según el atributo<100>o<101>o un derivado de los mismos que se unen al antígeno deseado y un portador u otro excipiente farmacéuticamente aceptables.
Atributo 106. Un derivado de anticuerpo quimérico de un anticuerpo quimérico producido según el atributo 100, en donde el derivado se une al antígeno deseado.
Atributo 107. Un ratón cuyo genoma comprende una inserción de ADN de VDJ de IgH humano entre las coordenadas 114.665, 090 y 114.665.190 del cromosoma 12 de ratón, tal como entre las coordenadas 114.665.089 y 114.665.090, comprendiendo el inserto los nucleótidos 105.400.051 a 106.368.585 del cromosoma 14 humano (las coordenadas se refieren a NCBI36 para el genoma humano y NCBI m37, para la cepa C57BL/6J de ratón, o coordenadas equivalentes en otra secuencia del cromosoma 14 humano o en otro genoma de ratón respectivamente), estando la inserción aguas arriba de la región constante de mamífero no humano anfitrión de manera que el ratón es capaz de producir un repertorio de cadenas pesadas quiméricas que tienen una región constante de mamífero no humano y una región variable humana, en donde el mamífero comprende también una inserción de la región de la cadena ligera humana VJC completa de manera que se pueda generar una cadena de anticuerpo humano lambda o kappa completamente humana que sea capaz de formar un anticuerpo con una cadena pesada quimérica.
Atributo 108. Un ratón cuyo genoma comprende una inserción de ADN de VDJ de IgH humano entre las coordenadas 114.667.090 y 114.667.091 del cromosoma 12 de ratón, comprendiendo o consistiendo el inserto en los nucleótidos 105.400.051 a 106.368.585 del cromosoma 14 humano (las coordenadas se refieren a NCBI36 para el genoma humano y NCBI m37 para la cepa C57BL/6J de ratón, o coordenadas equivalentes en otra secuencia del cromosoma 14 humano o en otro genoma de ratón respectivamente), estando la inserción aguas arriba de la región constante de ratón de manera que el ratón es capaz de producir un repertorio de cadenas pesadas quiméricas que tienen una región constante de ratón y una región variable humana, en donde el ratón también comprende una inserción de la región de cadena ligera humana VJC completa de manera que se puede generar una cadena de anticuerpo humano lambda o kappa completamente humana que es capaz de formar un anticuerpo con una cadena pesada quimérica.
Atributo 109. Un ratón cuyo genoma comprende una inserción de ADN de VDJ de IgH humano entre las coordenadas 114.665.090 y 114.665.190 del cromosoma 12 de ratón, donde las coordenadas se refieren a NCBI m37, para la cepa C57BL/6J de ratón, o una inserción en una posición equivalente en otra cepa de ratón, comprendiendo o consistiendo el inserto en los nucleótidos 106.328.951-107.268.444 del cromosoma 14 humano, donde las coordenadas se refieren a la base de datos de secuencias GRCH37/hg19 para seres humanos, o los mismos nucleótidos de una posición equivalente en otra secuencia del cromosoma 14 humano, estando la inserción aguas arriba de la región constante del ratón anfitrión de manera que el ratón es capaz de producir un repertorio de cadenas pesadas quiméricas que tienen una región constante de ratón y una región variable humana, en donde el ratón comprende también una inserción de la región de la cadena ligera humana VJC completa que es funcional para generar una cadena de anticuerpo humano lambda o kappa completamente humana que forma un anticuerpo con una cadena pesada quimérica.
Atributo 110. Un ratón según el atributo 109, en donde la inserción está entre las coordenadas 114.666.435 y 114.666.436 del cromosoma 12 del ratón.
Atributo 116. Un método para preparar una célula de vertebrado no humano, opcionalmente un ratón o rata, comprendiendo el método:
(a) proporcionar la célula ES no humana del atributo 29, 61,62 o<68>y por medio de lo cual la célula ES no humana es capaz de dar lugar a una célula de progenie en la que la expresión de anticuerpos endógenos está inactivada y en donde la célula de progenie es capaz de expresar anticuerpos que comprenden regiones variables humanas; y
(b) opcionalmente diferenciar dicha célula ES no humana en dicha célula de progenie o un organismo vertebrado no humano que comprende dicha célula de progenie.
Atributo 117. El método según el atributo 116, en donde dicha pluralidad de segmentos génicos de anticuerpos humanos comprende al menos once segmentos V humanos.
Atributo 118. El método según el atributo 116 o 117, en donde dicha pluralidad de segmentos génicos de anticuerpos humanos comprende al menos seis segmentos J humanos.
Atributo 119. El método según uno cualquiera de los atributos 116 a 118, en donde se inserta una secuencia de nucleótidos humana en la etapa (b), comprendiendo la secuencia de nucleótidos dichos segmentos génicos de anticuerpo, en donde la secuencia de nucleótidos es de al menos<110>kb.
Atributo 120. El método según uno cualquiera de los atributos 116 a 119, en donde el locus endógeno es un locus de cadena pesada y los segmentos génicos de anticuerpo humano están entre el segmento génico JH endógeno más 3' y C-mu endógeno.
Atributo 121. El método según uno cualquiera de los atributos 116 a 120, en donde la célula de progenie es homocigota para dicho locus transgénico.
Atributo 122. Un método para aislar un anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el método
(a) proporcionar un organismo vertebrado, ratón o mamífero, opcionalmente una rata, según uno cualquiera de los atributos 1 a, 4, 4a, 5-28, 30-60, 63-66 o 71 -74 y 107-110;
(b) inmunizar dicho organismo vertebrado, ratón o mamífero con dicho antígeno (en donde opcionalmente el antígeno es un antígeno de un patógeno de enfermedad infecciosa);
(c) eliminar linfocitos B del organismo vertebrado, ratón o mamífero y seleccionar uno o más linfocitos B que expresan anticuerpos que se unen al antígeno;
(d) inmortalizar opcionalmente dichos linfocitos B seleccionados o progenie de los mismos, opcionalmente produciendo hibridomas a partir de los mismos; y
(e) aislar un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo de tipo IgG) expresado por los linfocitos B.
Atributo 123. El método del atributo 122, que comprende la etapa de aislar de dichos linfocitos B el ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo que se une a dicho antígeno; opcionalmente intercambiar la secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo por una secuencia de nucleótidos que codifica una región constante de la cadena pesada humana o humanizada y opcionalmente madurar por afinidad la región variable de dicho anticuerpo; y opcionalmente insertar dicho ácido nucleico en un vector de expresión y opcionalmente un anfitrión.
Atributo 124. El método del atributo 122 o 123, que comprende adicionalmente preparar un mutante o derivado del anticuerpo producido por el método del atributo 122 o 123.
Atributo 125. Un anticuerpo o fragmento del mismo que comprenden regiones variables que se unen específicamente a un antígeno predeterminado con una afinidad por debajo de 50 nM como se determina por resonancia de plasmón superficial, en donde el anticuerpo se aísla de un organismo vertebrado no humano, ratón o mamífero, opcionalmente una rata, según uno cualquiera de los atributos 1 a, 4, 4a, 5-28, 30-60, 63-66 o 71-74 y 107-110 y comprende CDR3 de cadena pesada (como define Kabat) codificadas por un VDJ reordenado de dicho organismo vertebrado, ratón o mamífero, en donde el VDJ es el producto de reordenamiento in vivo de un segmento génico JH humano de un locus de cadena pesada de dicho vertebrado con segmentos génicos D (opcionalmente un segmento génico D humano de dicho locus) y VH.
Atributo 126. Un anticuerpo o fragmento que son idénticos a un anticuerpo del atributo 125 o un derivado del mismo, opcionalmente un derivado cuyas regiones constantes son humanas y/o un derivado madurado por afinidad, que se une específicamente a dicho antígeno con una afinidad por debajo de 50 nM según se determina por resonancia de plasmón superficial.
Atributo 127. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento del atributo 125 o 126 y un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptables.
Atributo 128. Una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada de un anticuerpo o fragmento del atributo 125 o 126, opcionalmente como parte de un vector (p. ej., un vector de expresión).
Atributo 129. La secuencia de nucleótidos del atributo 128, en donde la secuencia es un ADNc derivado de una célula B del vertebrado del que se aísla el anticuerpo del atributo 125, o es idéntica a tal ADNc.
Atributo 130. Una célula anfitriona aislada (p. ej., un hibridoma o una célula CHO o una célula HEK293) que comprende una secuencia de nucleótidos según el atributo 128 o 129.
Atributo 131. Un método para aislar un anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el método
(a) proporcionar un organismo vertebrado, ratón o mamífero, opcionalmente una rata, según uno cualquiera de los atributos 1 a, 4, 4a, 5-28, 30-60, 63-66 o 71 -74 y 107-110;
(b) inmunizar dicho organismo vertebrado, ratón o mamífero con dicho antígeno;
(c) eliminar linfocitos B del organismo vertebrado, ratón o mamífero y seleccionar un linfocito B que expresa un anticuerpo que se une al antígeno con afinidad sub-nM, en donde el anticuerpo es conforme al atributo 125;
(d) inmortalizar opcionalmente dicho linfocito B seleccionad o su progenie, opcionalmente produciendo hibridomas a partir del mismo; y
(e) aislar un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo de tipo IgG) expresado por el linfocito B.
Atributo 132. El método del atributo 131, que comprende la etapa de aislar de dicho linfocito B ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo que se une a dicho antígeno; opcionalmente intercambiar la secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada del anticuerpo por una secuencia de nucleótidos que codifica una región constante de cadena pesada humana o humanizada y opcionalmente madurar por afinidad la región variable de dicho anticuerpo; y opcionalmente insertar dicho ácido nucleico en un vector de expresión y opcionalmente un anfitrión.
Atributo 133. El método del atributo 131 o 132, que comprende adicionalmente preparar un mutante o derivado del anticuerpo producido por el método del atributo 131 o 132.
Atributo 137. Un casete para la inversión e inactivación de segmentos génicos de cadena pesada de anticuerpos endógenos de ratón, siendo los segmentos parte de una secuencia de locus de cadena pesada en el cromosoma 12 de una célula de ratón (p. ej., célula ES) en donde la secuencia está flanqueada en su extremo 3' por un sitio de recombinación específica de sitio (p. ej., lox, rox o frt), comprendiendo el casete una secuencia de nucleótidos que codifica una marca expresable o marcador seleccionable y un sitio de recombinación específica de sitio compatible (p. ej., lox, rox o frt) flanqueado por un brazo de homología 5' y 3', en donde (i) el brazo de homología 5' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119.753.124 a la coordenada 119.757.104 y el brazo de homología 3' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119.749.288 a 119.753.123; (ii) el brazo de homología 5' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119.659, 459 a la coordenada 119.663,126 y el brazo de homología 3' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119.656.536 a 119.659.458; o (iii) el brazo de homología 5' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 120.918.607 a la coordenada 120.921.930 y el brazo de homología 3' es ADN del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 120.915.475 a 120.918.606.
Atributo 138. Un ratón o célula de ratón cuyo genoma comprende una inversión de un cromosoma 12, en donde la inversión comprende segmentos génicos endógenos invertidos de cadena pesada (p. ej., VH, D y JH, tal como la región VDJ de cadena pesada endógena completa); en donde el genoma del ratón o célula de ratón comprende un locus de cadena pesada transgénica que comprende una pluralidad de segmentos génicos VH humanos, una pluralidad de segmentos D humanos y una pluralidad de segmentos JH humanos aguas arriba de, y asociados operablemente con, una región constante endógena (p. ej., Cu) de modo que el ratón o la célula de ratón (opcionalmente después de la diferenciación hasta una célula B) es capaz de expresar un anticuerpo que comprende una región variable que comprende secuencias derivadas de los segmentos génicos humanos; y en donde la inversión es (i) una inversión del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119.753.123 a la coordenada 114.666.436; (ii) una inversión del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 119.659.458 a la coordenada 114.666.436; o (iii) una inversión del cromosoma 12 de ratón de la coordenada 120.918.606 a la coordenada 114.666.436.
La divulgación también incluye las siguientes disposiciones:
>70 u 80% de todas las cadenas ligeras son VA humanas
Disposición 1. Un vertebrado no humano que tiene un genoma que comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina recombinante, comprendiendo dicho locus un inserto diana situado en un locus endógeno de cadena ligera,
en donde el inserto diana comprende ADN del locus de la cadena ligera lambda humano y está situado aguas arriba de una región constante de la cadena ligera lambda,
en donde dicho inserto diana incluye un repertorio de segmentos génicos VA y JA humanos,
en donde el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda humanas, y
en donde al menos 70 u 80% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina expresadas en dicho vertebrado comprende regiones variables lambda humanas.
Disposición 2. El vertebrado de la disposición 1, en donde el repertorio de inserción de VA y JA humanos comprende al menos los segmentos génicos V y J humanos funcionales comprendidos por un locus de inmunoglobulina de cadena lambda humana de VA2-18 a CA7.
Disposición 3. El vertebrado de la disposición 1, en donde el locus endógeno de la cadena ligera es el locus kappa endógeno.
Disposición 4. El vertebrado según la disposición 3, en donde el genoma es homocigoto para el repertorio de segmentos génicos VA y JA humanos y en donde la expresión de la cadena kappa endógena es sustancialmente inactiva.
Disposición 5. El vertebrado de la disposición 4, en donde la expresión de la cadena kappa endógena es completamente inactiva.
Disposición 6. El vertebrado de la disposición 1, en donde el locus endógeno de la cadena ligera es el locus lambda endógeno.
Disposición 7. El vertebrado de la disposición 6, en donde el genoma es homocigoto para el repertorio de segmentos génicos VA y JA humanos y en donde la expresión de la cadena lambda endógena es sustancialmente inactiva.
Disposición 8. El vertebrado de la disposición 7, en donde la expresión de la cadena lambda endógena es completamente inactiva.
Disposición 9. El vertebrado de la disposición 1, en donde el inserto diana está situado aguas abajo de los segmentos génicos endógenos de las cadenas ligeras V y J.
Disposición 10. El vertebrado de la disposición 1, en donde el inserto diana incluye una región constante de un locus de cadena ligera lambda humana.
Disposición 11. El vertebrado de la disposición 10, en donde dichas cadenas ligeras expresadas por dicho vertebrado comprenden regiones V-C derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA, JA y CA humanos.
Disposición 12. El vertebrado de la disposición 1, en donde el vertebrado deriva de una célula ES de ratón o una célula ES de rata.
Disposición 13. El vertebrado de la disposición 1, en donde el vertebrado es un ratón o una rata.
Disposición 14. El vertebrado de la disposición 1, en donde el inserto diana comprende secuencias intermedias de segmentos intergénicos que son ADN del locus de la cadena ligera lambda humano que está entre segmentos génicos de la cadena ligera V y J humanos funcionales en un locus humano o comprende secuencias intermedias de segmentos intergénicos que son ADN del locus de la cadena ligera lambda que está entre segmentos génicos de la cadena ligera lambda correspondientes en un genoma endógeno de vertebrado no humano.
Disposición 15. El vertebrado de la disposición 14, en donde el inserto diana incluye un pseudogén de segmento génico de inmunoglobulina lambda humana.
Disposición 16. El vertebrado de la disposición 14, en donde el inserto diana carece de un pseudogén del segmento génico de inmunoglobulina lambda humana.
Disposición 17. El vertebrado de la disposición 1, en donde al menos 70, 75 u 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98, o 99%, o 100% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina expresadas por dicho vertebrado comprenden regiones V humanas derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos.
Disposición 18. El vertebrado de la disposición 17, en donde al menos 90% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina expresadas por dicho vertebrado comprenden regiones V humanas derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos.
> 60% de todas las cadenas ligeras tienen regiones VA humanas
Disposición 19. Un vertebrado no humano que tiene un genoma que comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina recombinante, comprendiendo dicho locus un inserto diana situado en un locus endógeno de cadena ligera,
en donde el inserto diana comprende ADN del locus de la cadena ligera lambda humano que está situado aguas arriba de una región constante de la cadena ligera lambda e incluye un repertorio de segmentos génicos VA y JA humanos,
en donde dicho genoma comprende segmentos génicos V kappa situados aguas arriba de una región constante de cadena ligera,
en donde el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda, y
en donde al menos 60% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina expresadas por dicho vertebrado comprende regiones variables lambda humanas.
Disposición 20. El vertebrado de la disposición 19, en donde al menos 65, 70, 80, 84, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% o 100% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina expresadas por dicho vertebrado comprenden regiones variables humanas derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos.
Disposición 21. El vertebrado de la disposición 20, en donde al menos 84% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina expresadas por dicho vertebrado comprende regiones variables humanas derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos.
Disposición 22. El vertebrado de la disposición 21, en donde al menos 95% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina expresadas por dicho vertebrado comprende regiones variables humanas derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos.
Disposición 23. El vertebrado de la disposición 19, en donde el vertebrado deriva de una célula ES de ratón o una célula ES de rata.
Disposición 24. El vertebrado de la disposición 19, en donde el vertebrado es un ratón o una rata.
Disposición 25. El vertebrado o célula de la disposición 19, en donde el inserto diana está situado aguas abajo de los segmentos génicos endógenos de las cadenas ligeras V y J.
Disposición 25a. El vertebrado de las disposiciones 19, en donde los segmentos génicos V kappa situados aguas arriba de una región constante de la cadena ligera son segmentos endógenos del gen V kappa.
VA JA en locus kappa o lambda
Disposición 26. Un vertebrado o célula no humanos que tienen un genoma que comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina recombinante, comprendiendo dicho locus un inserto diana situado aguas abajo de los segmentos génicos endógenos de cadena ligera V y J,
en donde el inserto diana comprende segmentos génicos VA y JA de inmunoglobulina humana, en donde dichos segmentos génicos VA y JA humanos están situados aguas arriba de una región constante de cadena ligera,
en donde dichos segmentos génicos VA y JA humanos comprenden al menos los segmentos génicos V y J funcionales de VA2-18 a CA7 de un locus de cadena ligera lambda humana, y
en donde dicho vertebrado o célula expresan cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda humanas.
Disposición 27. El vertebrado o célula de la disposición 26, en donde el inserto diana incluye una región constante de un locus de cadena ligera lambda humana.
Disposición 28. El vertebrado o célula de la disposición 27, en donde dichas cadenas ligeras expresadas por dicho vertebrado o célula comprenden regiones V-C humanas derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA, JA y CA humanos.
Disposición 29. El vertebrado o célula de la disposición 26, en donde los segmentos génicos endógenos de las cadenas ligeras V y J son segmentos génicos V kappa y J kappa.
Disposición 30. El vertebrado o célula de la disposición 26, en donde la expresión de la cadena kappa endógena es sustancialmente inactiva.
Disposición 31. El vertebrado o célula de la disposición 30, en donde la expresión de la cadena kappa endógena es completamente inactiva.
Disposición 32. El vertebrado o célula de la disposición 26, en donde los segmentos génicos endógenos de las cadenas ligeras V y J son segmentos génicos V lambda y J lambda.
Disposición 33. El vertebrado o célula de la disposición 26, en donde la expresión de la cadena lambda endógena es sustancialmente inactiva.
Disposición 34. El vertebrado o célula de la disposición 30, en donde la expresión de la cadena lambda endógena es completamente inactiva.
Disposición 35. El vertebrado o célula de la disposición 25, en donde el inserto diana comprende secuencias intermedias de segmentos intergénicos que son ADN del locus de la cadena ligera lambda humano que está entre segmentos génicos de la cadena ligera V y J humanos funcionales en un locus humano o comprende secuencias intermedias de segmentos intergénicos que son ADN del locus de la cadena ligera lambda que está entre segmentos génicos de la cadena ligera lambda correspondientes en un genoma endógeno.
Disposición 36. El vertebrado o célula de la disposición 35, en donde el inserto diana incluye un pseudogén. Disposición 37. El vertebrado de la disposición 25, en donde el vertebrado deriva de una célula ES de ratón o una célula ES de rata.
Disposición 38. El vertebrado de la disposición 25, en donde el vertebrado es un ratón o una rata.
Disposición 38a. El vertebrado de las disposiciones 25, en donde dichos segmentos génicos VA y JA humanos están situados aguas arriba de una región constante endógena de cadena ligera.
VJCA en el locus kappa
Disposición 39. Un vertebrado o célula no humanos que tienen un genoma que comprende un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina recombinante, comprendiendo dicho locus un inserto diana de segmentos génicos VA, JA y CA humanos situados aguas arriba de una región constante kappa endógena,
en donde dicho vertebrado o célula expresan cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones V-C humanas derivadas de la recombinación de segmentos génicos VA, JA y CA humanos, y en donde dicho inserto diana comprende al menos los segmentos génicos V, J y C funcionales de VA3-1 a CA7 de un locus de inmunoglobulina de cadena lambda humana.
Disposición 40. El vertebrado o célula de la disposición 39, en donde dicho inserto diana comprende al menos los segmentos génicos V, J y C funcionales de VA2-18 a CA7 de un locus de inmunoglobulina de cadena ligera lambda humana.
Disposición 41. El vertebrado o célula de la disposición 39, en donde el inserto diana comprende secuencias intermedias de segmentos intergénicos que son ADN del locus de la cadena ligera lambda humano que está entre segmentos génicos de la cadena ligera V y J o J y C humanas funcionales en un locus humano o comprende secuencias intermedias de segmentos intergénicos que son ADN del locus de la cadena ligera lambda que está entre segmentos génicos de la cadena ligera lambda correspondientes en un genoma endógeno de vertebrado no humano.
Disposición 42. El vertebrado o célula de la disposición 41, en donde el inserto diana incluye un pseudogén.
Disposición 43. El vertebrado de la disposición 39, en donde el vertebrado deriva de una célula ES de ratón o una célula ES de rata.
Disposición 44. El vertebrado de la disposición 39, en donde el vertebrado es un ratón o una rata.
Disposición 45. El vertebrado o célula de la disposición 39, en donde la expresión de la cadena kappa endógena es sustancialmente inactiva.
Disposición 46. El vertebrado o célula de la disposición 45, en donde la expresión de la cadena kappa endógena es completamente inactiva.
Disposición 47. El vertebrado o célula de la disposición 39, en donde el inserto diana está situado aguas abajo de los segmentos génicos endógenos de las cadenas ligeras V y J.
VJA en el locus kappa
Disposición 48. El vertebrado o célula no humanos que tiene un genoma que comprende un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina recombinante, comprendiendo dicho locus segmentos génicos endógenos V<k>y J<k>aguas arriba de un inserto diana,
en donde el inserto diana comprende al menos los segmentos génicos VA y JA funcionales de VA3-1 a CA7 de un locus de inmunoglobulina de cadena ligera lambda humana,
en donde dicho vertebrado o célula expresan una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una región variable lambda humana, y
en donde la expresión de cadenas ligeras que comprenden regiones variables kappa endógenas derivadas de la recombinación de segmentos génicos endógenos V<k>y J<k>es sustancialmente inactiva.
Disposición 49. El vertebrado de la disposición 48, en donde el vertebrado deriva de una célula ES de ratón o una célula ES de rata.
Disposición 50. El vertebrado de la disposición 48, en donde el vertebrado es un ratón o una rata.
Disposición 51. El vertebrado o célula de la disposición 48, en donde dicho inserto diana comprende al menos los segmentos génicos VA y JA funcionales de VA2-18 a CA7 de un locus de inmunoglobulina de cadena ligera lambda humana.
Disposición 52. El vertebrado o célula de la disposición 48, en donde la expresión de la cadena ligera endógena de V<k>y J<k>es completamente inactiva.
Disposición 53. El vertebrado o célula de la disposición 48, en donde menos de 10, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina expresadas por dicho vertebrado o célula comprenden regiones variables kappa endógenas.
Disposición 54. El vertebrado o célula de la disposición 48, en donde el inserto diana comprende secuencias intermedias de segmentos intergénicos que son ADN del locus de la cadena ligera lambda humano que está entre los segmentos génicos V y J humanos funcionales en un locus humano o comprende secuencias intermedias de segmentos intergénicos que son ADN del locus de la cadena ligera lambda que está entre los segmentos génicos de la cadena ligera lambda correspondientes en un genoma endógeno.
Disposición 55. Un vertebrado o célula no humanos, que tienen un genoma recombinante que comprende secuencias de locus endógeno de cadena ligera kappa de inmunoglobulina que comprenden al menos una secuencia potenciadora endógena kappa (E<k>), al menos un segmento génico endógeno V kappa, al menos un segmento génico endógeno J kappa y al menos una región constante endógena C kappa, en donde los segmentos génicos endógenos V kappa y J kappa están separados de una secuencia endógena E<k>respectiva en el mismo cromosoma por una distancia que evita sustancialmente la producción de un polipéptido de cadena ligera kappa de inmunoglobulina endógena.
Disposición 56. El vertebrado o célula de la disposición 55, en donde los segmentos génicos endógenos V kappa y J kappa están separados de la respectiva secuencia endógena E<k>por una distancia que es mayor que la distancia entre los segmentos génicos endógenos V kappa y J kappa y una respectiva secuencia endógena E<k>en un locus endógeno de la cadena ligera kappa no recombinante.
Disposición 57. La célula de la disposición 55, en donde la célula es una célula de ratón o una célula de rata. Disposición 57a. El vertebrado de la disposición 55, en donde el vertebrado deriva de una célula ES de ratón o una célula ES de rata.
Disposición 58. El vertebrado de la disposición 55, en donde el vertebrado es un ratón o una rata.
Disposición 59. El vertebrado o célula de la disposición 55, en donde dicho genoma recombinante comprende un inserto diana que comprende uno o más segmentos génicos de la cadena ligera V humana y uno o más segmentos génicos de la cadena ligera J humana, en donde el inserto diana está situado entre dichos segmentos génicos endógenos V kappa y J kappa y dicha secuencia endógena E<k>respectiva.
Disposición 59a. El vertebrado o célula de la disposición 59, en donde dicho genoma recombinante es homocigoto para el inserto diana.
Disposición 60. El vertebrado o célula de la disposición 59, en donde el inserto diana comprende segmentos génicos de cadena ligera que comprenden uno o más segmentos génicos V<k>y uno o más J<k>humanos.
Disposición 60a. El vertebrado o célula de la disposición 60, en donde dicho genoma recombinante es homocigoto para el inserto diana.
Disposición 61. El vertebrado o célula de cualquier disposición anterior, en donde el inserto diana comprende un repertorio de segmentos génicos VA y JA humanos y en donde el inserto diana se ha insertado a 100 kb de una secuencia potenciadora del locus endógeno de la cadena ligera.
Disposición 62. El vertebrado o célula de cualquier disposición anterior, en donde el inserto diana comprende un repertorio de al menos 10 segmentos génicos VA humanos o segmentos génicos JA humanos y en donde el inserto diana está situado aguas arriba de una región constante endógena de cadena ligera.
Disposición 63. El vertebrado o célula de la disposición 62, en donde el inserto diana comprende al menos una porción de un locus de la cadena lambda de inmunoglobulina humana de VA2-18 a VA3-1.
Disposición 64. El vertebrado o célula de la disposición 62, en donde el inserto diana comprende al menos 2, 3, 4 o 5 segmentos génicos JA humanos.
Disposición 65. El vertebrado o célula de la disposición 64, en donde los segmentos génicos JA humanos son diferentes entre sí.
Disposición 66. El vertebrado o célula de la disposición 65, en donde los segmentos génicos JA humanos son JA1, JA2, JA3, JA6 y JA7.
Disposición 67. El vertebrado o célula de la disposición 62, en donde el inserto diana incluye al menos una parte de un locus de la cadena lambda de inmunoglobulina humana de VA2-18 a CA7.
Disposición 68. El vertebrado o célula de la disposición 62, en donde el inserto diana excluye JA4CA4 humano y/o JA5CA5 humano.
Disposición 69. El vertebrado o célula de la disposición 62, en donde el inserto diana incluye un potenciador de la cadena ligera humana.
Disposición 70. El vertebrado o célula de la disposición 69, en donde el potenciador de la cadena ligera humana es una secuencia EA y en donde la secuencia EA está colocada entre los segmentos génicos JA humanos y una región constante endógena de la cadena ligera.
Disposición 71. El vertebrado o célula de la disposición 70, en donde los segmentos génicos JA humanos son parte de una agrupación de JACA humanos.
Disposición 72. El vertebrado o célula de cualquier disposición anterior, en donde el vertebrado o célula expresan cadenas ligeras de inmunoglobulina lambda que comprenden un repertorio de regiones variables lambda humanas codificadas por segmentos génicos VA y JA humanos, en donde el VA humano incluye VA3-1 y, o p c io n a lm e n te , u n o o m á s d e V A 2 -18, V A 3 -16, V 2 -14 , V A 3 -12, V A 2 -11, V A 3 -10, V A 3 -9 , V A 2 -8 y V A 4 -3 , e n d o n d e lo s s e g m e n to s g é n ic o s VA y JA h u m a n o s e s tá n in c lu id o s e n e l in s e r to d ia n a .
D is p o s ic ió n 73. El v e r te b ra d o o c é lu la d e c u a lq u ie r d is p o s ic ió n a n te r io r , e n d o n d e e l v e r te b ra d o o c é lu la e x p re s a n c a d e n a s lig e ra s d e in m u n o g lo b u lin a la m b d a q u e c o m p re n d e n u n re p e r to r io d e re g io n e s v a r ia b le s la m b d a<h u m a n a s c o d if ic a d a s p o r s e g m e n to s g é n ic o s>V<a y JA h u m a n o s , e n d o n d e e l VA h u m a n o in c lu y e V A 2 -14 y,>o p c io n a lm e n te , u n o o m á s d e V A 2 -18, V A 3 -16, V 2 -14 , V A 3 -12, V A 2 -11, V Á 3 -10, V A 3 -9 , V A 2 -8 , V A 4 -3 y V A 3 -1 , e n d o n d e lo s s e g m e n to s g é n ic o s VA y JA h u m a n o s e s tá n in c lu id o s e n e l in s e r to d ia n a .
D is p o s ic ió n 74. El v e r te b ra d o o c é lu la d e c u a lq u ie r d is p o s ic ió n a n te r io r , e n d o n d e e l v e r te b ra d o o c é lu la e x p re s a n c a d e n a s lig e ra s d e in m u n o g lo b u lin a la m b d a q u e c o m p re n d e n u n re p e r to r io d e re g io n e s v a r ia b le s la m b d a h u m a n a s c o d if ic a d a s p o r s e g m e n to s g é n ic o s VA y JA h u m a n o s , e n d o n d e e l VA h u m a n o in c lu y e V A 2 -8 y, o p c io n a lm e n te , u n o o m á s d e V A 2 -18, V A 3 -16, V 2 -14 , V A 3 -12, V A 2 -11, V Á 3 -10, V A 3 -9 , V A 4 -3 y V A 3 -1 , e n d o n d e lo s s e g m e n to s g é n ic o s VA y JA h u m a n o s e s tá n in c lu id o s e n e l in s e r to d ia n a .
D is p o s ic ió n 75. El v e r te b ra d o o c é lu la d e c u a lq u ie r d is p o s ic ió n a n te r io r , e n d o n d e e l v e r te b ra d o o c é lu la e x p re s a n c a d e n a s lig e ra s d e in m u n o g lo b u lin a la m b d a q u e c o m p re n d e n u n re p e r to r io d e re g io n e s v a r ia b le s la m b d a<h u m a n a s c o d if ic a d a s p o r s e g m e n to s g é n ic o s>V<a y JA h u m a n o s , e n d o n d e e l VA h u m a n o in c lu y e V A 3 -10 y,>o p c io n a lm e n te , u n o o m á s d e V A 2 -18, V A 3 -16, V 2 -14 , V A 3 -12, V A 2 -11, V Á 3 -10, V A 3 -9 , V A 2 -8 , V A 4 -3 y V A 3 -1 , e n d o n d e lo s s e g m e n to s g é n ic o s VA y JA h u m a n o s e s tá n in c lu id o s e n e l in s e r to d ia n a .
D is p o s ic ió n 76. El v e r te b ra d o o c é lu la d e c u a lq u ie r d is p o s ic ió n a n te r io r , e n d o n d e e l in s e r to d ia n a c o m p re n d e c a d a s e g m e n to g é n ic o VA fu n c io n a l d e V A 2 -18 a VA3-1 d e un lo c u s d e c a d e n a lig e ra la m b d a h u m a n a .
D is p o s ic ió n 77. E l v e r te b ra d o o c é lu la d e c u a lq u ie r d is p o s ic ió n a n te r io r , e n d o n d e a l m e n o s un VA3-1 h u m a n o e s tá in c lu id o e n e l in s e r to d ia n a .
D is p o s ic ió n 78. El v e r te b ra d o o c é lu la d e la d is p o s ic ió n 77 , e n d o n d e a l m e n o s V A 2 -18 , V A 3 -16 , V 2 -14 , V A 3 -12 , V A 2 -11 , V A 3 -10 , V A 3 -9 , V A 2 -8 , V A 4 -3 y VA3-1 e s tá n in c lu id o s e n e l in s e r to d ia n a .
D is p o s ic ió n 79. El v e r te b ra d o d e c u a lq u ie r d is p o s ic ió n a n te r io r , e n d o n d e e l v e r te b ra d o e x p re s a m á s c a d e n a s la m b d a q u e c a d e n a s k a p p a .
D is p o s ic ió n 80. E l v e r te b ra d o d e c u a lq u ie r d is p o s ic ió n a n te r io r , e n d o n d e e l v e r te b ra d o n o e x p re s a c a d e n a s k a p p a e n d ó g e n a s .
D is p o s ic ió n 81. El v e r te b ra d o d e c u a lq u ie r d is p o s ic ió n a n te r io r , e n d o n d e la e x p re s ió n d e la c a d e n a k a p p a e n d ó g e n a e s s u s ta n c ia lm e n te in a c tiv a .
D is p o s ic ió n 82. E l v e r te b ra d o d e la d is p o s ic ió n 81 , e n d o n d e la e x p re s ió n d e la c a d e n a k a p p a e n d ó g e n a e s c o m p le ta m e n te in a c tiv a .
D is p o s ic ió n 83. El v e r te b ra d o d e c u a lq u ie r d is p o s ic ió n a n te r io r , e n d o n d e e l v e r te b ra d o e x p re s a c a d e n a s p e s a d a s d e in m u n o g lo b u lin a .
D is p o s ic ió n 84. E l v e r te b ra d o o c é lu la d e c u a lq u ie r d is p o s ic ió n a n te r io r , e n d o n d e e l in s e r to d ia n a in c lu y e u n a s e c u e n c ia p o te n c ia d o ra la m b d a h u m a n a (EA) y e n d o n d e la s e c u e n c ia EA e s tá c o lo c a d a e n d ic h o lo c u s e n d ó g e n o d e la c a d e n a lig e ra .
D is p o s ic ió n 85. El v e r te b ra d o o c é lu la d e la d is p o s ic ió n 84 , e n d o n d e la s e c u e n c ia E A e s tá s itu a d a a g u a s a b a jo d e u n a re g ió n CA a g u a s a b a jo m á s 3 ' q u e e s tá in c lu id a e n e l in s e r to d ia n a .
D is p o s ic ió n 86. El v e r te b ra d o o c é lu la d e c u a lq u ie r d is p o s ic ió n a n te r io r , e n d o n d e al m e n o s lo s s e g m e n to s g é n ic o s J C h u m a n o s J A 1 -C A 1 , J A 2 -C A 2 , J A 3 -C A 3 , J A 6 -C A 6 y JA 7 -C A 7 e s tá n in c lu id o s e n e l in s e r to d ia n a . D is p o s ic ió n 87. El v e r te b ra d o o c é lu la d e c u a lq u ie r d is p o s ic ió n a n te r io r , e n d o n d e lo s s e g m e n to s g é n ic o s h u m a n o s in c lu id o s e n e l in s e r to d ia n a e s tá n e n c o n f ig u ra c ió n d e la lín e a g e rm in a l.
D is p o s ic ió n 88. El v e r te b ra d o o c é lu la d e la d is p o s ic ió n 87 , e n d o n d e la in s e rc ió n d ir ig id a c o m p re n d e s e c u e n c ia s d e s e g m e n to s in te rg é n ic o s d e u n lo c u s d e c a d e n a lig e ra h u m a n a o s e c u e n c ia s d e s e g m e n to s in te rg é n ic o s d e un lo c u s e n d ó g e n o d e c a d e n a lig e ra .
D is p o s ic ió n 89. El v e r te b ra d o o c é lu la d e c u a lq u ie r d is p o s ic ió n a n te r io r , e n d o n d e u n p o te n c ia d o r e n d ó g e n o d e la c a d e n a lig e ra p e rm a n e c e e n e l lo c u s e n d ó g e n o .
D is p o s ic ió n 90. E l v e r te b ra d o o c é lu la d e la d is p o s ic ió n 89 , e n d o n d e e l p o te n c ia d o r e n d ó g e n o e s tá e n c o n f ig u ra c ió n d e la lín e a g e rm in a l.
D ispos ic ió n 91. El ve rte b ra d o o cé lu la de la d isp o s ic ió n 90, en d o n d e el locus e n d ó g e n o es un locus kappa .
Disposición 92. El vertebrado o célula de la disposición 90, en donde está presente el potenciador kappa endógeno.
Disposición 93. El vertebrado o célula de la disposición 92, en donde el potenciador endógeno es una secuencia IE<k>y/o 3' E<k>.
Disposición 94. El vertebrado o célula de la disposición 90, en donde la configuración de la línea germinal es con respecto a una región constante endógena de la cadena ligera.
Disposición 95. El vertebrado o célula de cualquier disposición anterior, en donde el genoma es heterocigoto para el inserto diana.
Disposición 96. El vertebrado o célula de la disposición 95, en donde el inserto diana comprende segmentos génicos de cadena ligera V y J humanos o V, J y C humanos.
Disposición 97. El vertebrado o célula de la disposición 96, en donde el inserto diana está situado en un locus endógeno de cadena ligera lambda.
Disposición 98. El vertebrado o célula de la disposición 96, en donde el inserto diana se sitúa en un locus endógeno de la cadena ligera kappa.
Disposición 99. El vertebrado o célula de la disposición 98, en donde el potenciador kappa endógeno está presente y es una secuencia ÍE<k>y/o 3' E<k>.
Disposición 100. El vertebrado de la disposición 95, en donde el vertebrado deriva de una célula ES de ratón o una célula ES de rata.
Disposición 101. El vertebrado de la disposición 95, en donde el vertebrado es un ratón o una rata.
Disposición 102. El vertebrado o célula de la disposición 95, en donde el genoma comprende un primer inserto diana que comprende un segmento génico lambda humano y un segundo inserto diana que comprende segmentos génicos V y J kappa de inmunoglobulina humana,
en donde el primer inserto diana está situado en un primer locus kappa endógeno y en donde el segundo inserto diana está situado en un segundo locus kappa endógeno y aguas arriba de una región constante kappa endógena.
Disposición 103. El vertebrado o célula de la disposición 102, en donde un potenciador endógeno de la cadena ligera kappa está presente en el primer y/o segundo locus endógeno kappa.
Disposición 104. El vertebrado o célula de la disposición 103, en donde los loci kappa endógenos están opcionalmente en configuración de la línea germinal.
Disposición 105. El vertebrado o célula de la disposición 95, en donde el genoma comprende un primer inserto diana que comprende un segmento génico lambda humano y un segundo inserto diana que comprende segmentos génicos V y J kappa de inmunoglobulina humana,
en donde el primer inserto diana está situado en un primer locus lambda endógeno y en donde el segundo inserto diana está situado en un segundo locus lambda endógeno y aguas arriba de una región constante lambda endógena.
Disposición 106. El vertebrado o célula de la disposición 105, en donde un potenciador endógeno de la cadena ligera lambda está presente en el primer y/o segundo locus lambda endógeno.
Disposición 106. El vertebrado o célula de la disposición 105, en donde los loci kappa endógenos están opcionalmente en configuración de la línea germinal.
Disposición 107. El vertebrado o célula de cualquier disposición anterior, en donde el genoma es homocigoto para un inserto diana que comprende un segmento génico lambda humano y está situado en el locus endógeno de la cadena ligera de inmunoglobulina.
Disposición 108. El vertebrado o célula de cualquier disposición anterior, en donde el genoma comprende dos o más insertos diana que comprenden segmentos génicos lambda humanos y situados en el locus endógeno kappa y/o lambda.
Disposición 109. El vertebrado o célula de la disposición 108, en donde el genoma es homocigoto para un primer inserto diana que comprende un segmento génico lambda humano y está situado en cada locus lambda endógeno, en donde el vertebrado o célula expresan cadenas ligeras lambda que comprenden regiones variables lambda humanas;
en donde un segundo inserto diana que comprende un segmento génico lambda humano está situado en un primer locus kappa endógeno,
en donde un tercer inserto diana que comprende una pluralidad de segmentos génicos V<k>y J<k>humanos está situado aguas arriba de un segmento génico C<k>endógeno en un segundo locus kappa endógeno, y en donde el vertebrado o la célula expresan cadenas ligeras kappa que comprenden regiones variables kappa humanas.
Disposición 110. El vertebrado o célula de la disposición 108, en donde los insertos diana que comprenden un segmento génico lambda están situados en los loci endógenos kappa y lambda comprenden el mismo repertorio de segmentos génicos lambda humanos.
Disposición 111. El vertebrado o célula de la disposición 109, en donde el primer y segundo insertos diana comprenden el mismo repertorio de segmentos génicos lambda humanos.
Disposición 112. El vertebrado o célula de la disposición 108, en donde los insertos diana que comprenden un segmento génico lambda están situados en los loci kappa y los insertos diana situados en los loci lambda comprenden un repertorio diferente de segmentos génicos lambda humanos.
Disposición 113. El vertebrado o célula de la disposición 109, en donde el primer y segundo insertos diana comprenden un repertorio diferente de segmentos génicos lambda humanos.
Disposición 114. El vertebrado o célula no humanos que tienen un genoma que comprende uno o más primer y/o segundo insertos diana situados en al menos un locus de inmunoglobulina endógeno, en donde los uno o más primero y/o segundo insertos diana comprenden cada uno un repertorio de segmentos génicos de inmunoglobulina humana,
comprendiendo el genoma uno de los siguientes ordenamientos de loci de cadena ligera:
(a) un L situado en un primer locus endógeno de la cadena kappa y un K situado en un segundo locus endógeno de la cadena kappa;
(b) un L situado en un primer locus endógeno de la cadena lambda y un K situado en un segundo alelo endógeno de la cadena lambda;
(c) un L situado en cada locus endógeno de la cadena kappa;
(d) un L situado en cada locus endógeno de la cadena lambda;
(e) un L situado en un primer locus endógeno de la cadena kappa y con un segundo locus endógeno de la cadena kappa que es inactivo; o
(f) un L situado en un primer locus endógeno de la cadena lambda y con un segundo locus endógeno de la cadena lambda que es inactivo;
en donde
un L representa un primer inserto diana que comprende al menos segmentos génicos VA y JA humanos funcionales de VA3-1 a CA7 comprendidos por un locus de inmunoglobulina de cadena lambda humana; en donde
un K representa un segundo inserto diana que comprende segmentos génicos V<k>y J<k>humanos; y en donde cada L o K está situado aguas arriba de una región constante, permitiendo de este modo la expresión de cadenas ligeras que comprenden regiones V humanas derivadas de la recombinación de segmentos génicos V y J humanos.
Disposición 115. El vertebrado de la disposición 114, en donde el vertebrado deriva de una célula ES de ratón o una célula ES de rata.
Disposición 116. El vertebrado de la disposición 114, en donde el vertebrado es un ratón o una rata.
Disposición 117. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde L comprende adicionalmente una región CA humana
Disposición 118. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde el L comprende segmentos génicos de cadena lambda de inmunoglobulina humana funcionales de VA2-18 a CA7.
D ispos ic ió n 119. El ve rte b ra d o o cé lu la de la d isp o s ic ió n 114, en d o n d e e l g e n o m a co m p re n d e uno de los siguientes ordenamientos de loci de cadena ligera:
(a) y un L situado en el primer o en el primer y segundo loci endógenos de la cadena lambda;
(a) y un K situado en el primer o en el primer y segundo loci endógenos de la cadena lambda;
(a) y un L situado en el primer locus endógeno de la cadena lambda y un K situado en el segundo locus endógeno de la cadena lambda;
(b) y un L situado en el primer o en el primer y segundo loci endógenos de la cadena kappa;
(b) y un K situado en el primer o en el primer y segundo loci endógenos de la cadena kappa;
(b) y un L situado en el primer locus endógeno de la cadena kappa y un K situado en el segundo locus endógeno de la cadena kappa;
(c) y un K situado en el primer o en el primer y segundo loci endógenos de la cadena lambda;
(c) y un L situado en el primer o en el primer y segundo loci endógenos de la cadena lambda;
(c) y un L situado en el primer locus endógeno de la cadena lambda y un K situado en el segundo locus endógeno de la cadena lambda;
(c) y con el primer y segundo loci endógenos de la cadena lambda inactivos;
(d) y un L situado en el primer o en el primer y segundo loci endógenos de la cadena kappa;
(d) y un K situado en el primer o en el primer y segundo loci endógenos de la cadena kappa;
(d) y un L situado en el primer locus endógeno de la cadena kappa y un K situado en el segundo locus endógeno de la cadena kappa; o
(d) y con el primer y segundo loci endógenos de la cadena kappa inactivos.
Disposición 120. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde la expresión de la cadena kappa endógena es sustancialmente inactiva.
Disposición 121. El vertebrado o célula de la disposición 120, en donde la expresión de la cadena kappa endógena es completamente inactiva.
Disposición 122. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde la expresión de la cadena lambda endógena es sustancialmente inactiva.
Disposición 123. El vertebrado o célula de la disposición 122, en donde la expresión de la cadena lambda endógena es completamente inactiva.
Disposición 124. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde uno o más L están situados aguas arriba de una región constante endógena lambda o kappa.
Disposición 125. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde uno o más L situados en un locus lambda están situados aguas arriba de una región constante endógena lambda.
Disposición 126. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde uno o más L situados en un locus kappa están situados aguas arriba de una región constante endógena kappa.
Disposición 127. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde cada L situado en un locus lambda está situado aguas arriba de una región constante lambda humana.
Disposición 128. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde cada L situado en un locus kappa está situado aguas arriba de una región constante kappa humana.
Disposición 129. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde uno o más K están situados aguas arriba de una región constante lambda o kappa endógena.
Disposición 130. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde uno o más K situados en un locus lambda están situados aguas arriba de una región constante lambda endógena.
Disposición 131. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde cada K situado en un locus kappa está situado aguas arriba de una región constante kappa endógena.
D ispos ic ió n 132. El ve rte b ra d o o cé lu la de la d isp o s ic ió n 114, en do nd e ca d a K s itua do en un locus la m bd a es tá situado aguas arriba de una región constante lambda humana.
Disposición 133. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde cada K situado en un locus kappa está situado aguas arriba de una región constante kappa humana.
Disposición 134. El vertebrado o célula de disposición 114, en donde el genoma comprende más de un L y cada L comprende un repertorio diferente de segmentos génicos VA y JA humanos.
Disposición 135. El vertebrado o célula de la disposición 134, en donde el genoma comprende dos L. Disposición 136. El vertebrado o célula de la disposición 134, en donde el genoma comprende tres L. Disposición 137. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde el genoma comprende más de un L y cada L comprende un repertorio diferente de segmentos génicos VA, JA y CA humanos.
Disposición 138. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde el genoma comprende más de un K y cada K comprende un repertorio diferente de segmentos génicos V<k>y J<k>humanos.
Disposición 139. El vertebrado o célula de la disposición 138, en donde el genoma comprende dos L. Disposición 140. El vertebrado o célula de la disposición 138, en donde el genoma comprende tres K. Disposición 141. El vertebrado o célula de la disposición 114, en donde el genoma comprende más de un L y cada L comprende un repertorio diferente de segmentos génicos Vk, Jk y Ck humanos.
Disposición 141a. El vertebrado de la disposición 114, en donde el vertebrado deriva de una célula ES de ratón o una célula ES de rata.
Disposición 142. El vertebrado o célula de cualquier disposición anterior, en donde el genoma comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende segmentos génicos VH humanos.
Disposición 143. Un método para producir un anticuerpo o cadena ligera que comprende una región variable lambda específica para un antígeno deseado, comprendiendo el método inmunizar un vertebrado según cualquier disposición anterior con el antígeno deseado y recuperar el anticuerpo o cadena ligera o recuperar una célula que produce el anticuerpo o cadena ligera.
Disposición 144. El método de disposición 143, que comprende adicionalmente una etapa de reemplazo de la región constante de vertebrado no humano por una región constante humana produciendo de ese modo un anticuerpo o cadena ligera de anticuerpo humanizados.
Disposición 145. El método de la disposición 144, en donde el anticuerpo o la cadena ligera de anticuerpo humanizados se producen mediante modificación por ingeniería genética de un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o cadena ligera totalmente humanizados.
Disposición 146. Un anticuerpo o cadena ligera de anticuerpo humanizados producidos mediante el método de disposición 143.
Disposición 147. Un derivado del anticuerpo o cadena ligera del anticuerpo humanizados de la disposición 146. Disposición 148. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o la cadena ligera de anticuerpo humanizados producidos mediante el método de la disposición 143, un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptables.
Disposición 149. Un método para inactivar segmentos génicos endógenos VJ de IgK en un genoma de un vertebrado o célula no humanos, comprendiendo el método colocar en el genoma un inserto diana que comprende segmentos génicos de inmunoglobulina humana, en donde el inserto diana se coloca entre un segmento génico endógeno VJ de IgK y la secuencia potenciadora E<k>que aumenta la distancia física entre el VJ de IgK endógeno y el potenciador E<k>, inactivando de ese modo los segmentos génicos endógenos VJ de IgK. Disposición 150. El método de la disposición 149, en donde el vertebrado no humano es un ratón o rata.
Disposición 150a. El método de la disposición 148, en donde el vertebrado se desarrolló a partir de una célula ES de ratón o una célula ES de rata.
Disposición 151. El método de disposición 149, en donde la célula es una célula de ratón o una célula de rata. Disposición 152. El método de disposición 149, en donde los segmentos génicos de inmunoglobulina humana comprenden segmentos génicos VL y JL humanos.
D ispos ic ió n 153. El m é tod o de la d isp o s ic ió n 152, en do nd e los s e g m e n to s g é n ico s V L y JL hu m an os com p re n d e n segmentos génicos VA y JA humanos y/o segmentos génicos V<k>y J<k>humanos.
Disposición 154. Un método para obtener un conjunto de cadenas ligeras de inmunoglobulina, en donde al menos 70 u 80% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina comprenden regiones VA y JA humanas, comprendiendo el método
proporcionar el vertebrado o célula de la disposición 1 y
aislar una muestra que comprende las cadenas ligeras de inmunoglobulina.
Disposición 154a. El método de disposición 154, que comprende adicionalmente una etapa de aislamiento de las cadenas ligeras de inmunoglobulina de la muestra.
Disposición 154b. El método de disposición 154a, en donde la muestra es suero, bazo, timo, ganglio linfático o apéndice.
Disposición 154c. El método de disposición 154b en donde el bazo comprende tejido esplénico que contiene células B.
Disposición 154d. El método de disposición 154c, que comprende adicionalmente una etapa de aislamiento de células B del tejido esplénico.
Disposición 155. El método de disposición 154, en donde las cadenas ligeras de inmunoglobulina se incluyen en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
Disposición 156. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislados en el método de la disposición 155.
Disposición 156a. Un derivado del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la disposición 156.
Disposición 157. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la disposición 156 y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptables.
Disposición 158. El método de disposición 154, que comprende una etapa de inmunización del vertebrado con un antígeno antes de la etapa de aislamiento de una muestra que comprende las cadenas ligeras de inmunoglobulina.
Disposición 159. Un método para obtener un conjunto de cadenas ligeras de inmunoglobulina, en donde al menos 60% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina comprenden cadenas ligeras lambda humanas, comprendiendo el método
proporcionar el vertebrado o célula de la disposición 19 y
aislar una muestra que comprende las cadenas ligeras de inmunoglobulina.
Disposición 159a. El método de disposición 159, que comprende adicionalmente una etapa de aislamiento de las cadenas ligeras de inmunoglobulina de la muestra.
Disposición 159b. El método de disposición 159a, en donde la muestra es suero, bazo, timo, ganglio linfático o apéndice.
Disposición 159c. El método de disposición 159b, en donde el bazo comprende tejido esplénico que contiene células B.
Disposición 159d. El método de disposición 159c, que comprende adicionalmente una etapa de aislamiento de células B del tejido esplénico.
Disposición 160. El método de disposición 159, en donde las cadenas ligeras de inmunoglobulina se incluyen en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
Disposición 161. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislados en el método de la disposición 160.
Disposición 161a. Un derivado del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la disposición 161.
Disposición 162. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la disposición 161 y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptables.
Disposición 163. El método de disposición 159, que comprende una etapa de inmunización del vertebrado con un antígeno antes de la etapa de aislamiento de una muestra que comprende las cadenas ligeras de inmunoglobulina.
Disposición 164. Un método para expresar cadenas ligeras VJC de inmunoglobulina humana en un vertebrado no humano, comprendiendo el método
proporcionar el vertebrado o célula de la disposición 40 y
aislar una muestra que comprende las cadenas ligeras VJC de inmunoglobulina.
Disposición 164a. El método de disposición 164, en donde el vertebrado no humano se desarrolla a partir de una célula ES.
Disposición 164a. El método de disposición 164, que comprende adicionalmente una etapa de aislamiento de las cadenas ligeras de inmunoglobulina de la muestra.
Disposición 164b. El método de disposición 164a, en donde la muestra es suero, bazo, timo, ganglio linfático o apéndice.
Disposición 164c. El método de disposición 164b en donde el bazo comprende tejido esplénico que contiene células B.
Disposición 164d. El método de disposición 164c, que comprende adicionalmente una etapa de aislamiento de células B del tejido esplénico.
Disposición 165. El método de disposición 164, en donde las cadenas ligeras VJC de inmunoglobulina se incluyen en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
Disposición 166. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado en el método de la disposición 165.
Disposición 166a. Un derivado del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la disposición 166.
Disposición 167. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la disposición 166 y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptables.
Disposición 168. El método de disposición 164, que comprende una etapa de inmunización del vertebrado con un antígeno antes de la etapa de aislamiento de una muestra que comprende las cadenas ligeras VJC de inmunoglobulina.
Disposición 169. El método de disposición 164, en donde el vertebrado se desarrolló a partir de una célula ES de ratón o una célula ES de rata.
Disposición 39N. Un vertebrado no humano que tiene un genoma que comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina recombinante, comprendiendo dicho locus un inserto diana situado en un locus endógeno de cadena ligera,
en donde el inserto diana comprende ADN del locus de la cadena ligera lambda humano y está situado aguas arriba de una región constante de la cadena ligera lambda,
en donde dicho inserto diana incluye un repertorio de segmentos génicos VA y JA humanos,
en donde el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda humanas, y
en donde al menos 70 u 80% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda expresadas en dicho vertebrado comprenden regiones variables lambda humanas. Disposición 40N. Un vertebrado no humano que tiene un genoma que comprende un locus de cadena ligera de inmunoglobulina recombinante, comprendiendo dicho locus un inserto diana situado en un locus endógeno de cadena ligera,
en donde el inserto diana comprende ADN del locus de la cadena ligera lambda humano que está situado aguas arriba de una región constante de la cadena ligera lambda e incluye un repertorio de segmentos génicos VA y JA humanos,
en donde dicho genoma comprende segmentos génicos V kappa situados aguas arriba de una región constante de cadena ligera,
en donde el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda, y
en donde al menos 60% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina expresadas por dicho vertebrado comprende regiones variables lambda humanas.
Disposición 47N. Un método para obtener un conjunto de cadenas ligeras de inmunoglobulina, en donde al menos 70 u 80% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina comprenden regiones VA y JA humanas, comprendiendo el método
proporcionar el vertebrado o célula de la disposición 39N y
aislar una muestra que comprende las cadenas ligeras de inmunoglobulina.
Disposición 48N. Un método para obtener un conjunto de cadenas ligeras de inmunoglobulina, en donde al menos 60% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina comprenden cadenas ligeras lambda humanas, comprendiendo el método
proporcionar el vertebrado o célula de la disposición 40N y
aislar una muestra que comprende las cadenas ligeras de inmunoglobulina.
Disposición 49N. Un método para obtener una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una región variable lambda humana de un conjunto de cadenas ligeras de inmunoglobulina, comprendiendo el método proporcionar el vertebrado o célula de la disposición 40N, proporcionando de este modo un conjunto de cadenas ligeras de inmunoglobulina en donde al menos 60% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina comprenden regiones variables lambda humanas y
aislar una o más cadenas ligeras de inmunoglobulina del conjunto, en donde cada cadena ligera de inmunoglobulina aislada comprende una región variable lambda humana.
Disposición 50N. Un método para obtener una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una región variable lambda humana de un conjunto de cadenas ligeras de inmunoglobulina, comprendiendo el método seleccionar un ratón que expresa cadenas ligeras lambda de inmunoglobulina que contienen regiones variables humanas,
en donde el ratón comprende un inserto diana situado aguas arriba de una región constante de cadena ligera,
en donde el inserto diana comprende segmentos génicos de inmunoglobulina VA y JA humanos, en donde al menos 70 u 80% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda expresadas en dicho vertebrado comprenden regiones variables lambda humanas, en donde la expresión de las cadenas kappa y lambda endógenas es sustancialmente inactiva, recoger suero de dicho ratón; y
aislar una o más cadenas ligeras de inmunoglobulina del suero recogido, en donde cada cadena ligera de inmunoglobulina aislada comprende una región variable lambda humana.
Disposición 51N. Un método para obtener una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una región variable lambda humana de un conjunto de cadenas ligeras de inmunoglobulina, comprendiendo el método seleccionar un ratón que expresa cadenas ligeras lambda de inmunoglobulina que contienen regiones variables humanas,
en donde el ratón comprende un inserto diana situado aguas arriba de una región constante de cadena ligera,
en donde el inserto diana comprende segmentos génicos VA y JA de inmunoglobulina humana, en donde al menos 60% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina expresadas por dicho vertebrado comprende regiones variables lambda humanas,
en donde la expresión de las cadenas kappa y lambda endógenas es sustancialmente inactiva, recoger suero de dicho ratón; y
aislar una o más cadenas ligeras de inmunoglobulina del suero recogido, en donde cada cadena ligera de inmunoglobulina aislada comprende una región variable lambda humana.
Disposición 52N. Un método para obtener una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una región variable lambda humana de un conjunto de cadenas ligeras de inmunoglobulina, comprendiendo el método seleccionar un ratón que expresa cadenas ligeras lambda de inmunoglobulina que contienen regiones variables humanas,
en donde el ratón comprende un inserto diana situado aguas arriba de una región constante de cadena ligera,
en donde el inserto diana comprende segmentos génicos de inmunoglobulina VA y JA humanas,
en donde al menos 70 u 80% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables lambda expresadas en dicho vertebrado comprenden regiones variables lambda humanas,
en donde al menos 60% de las cadenas ligeras de inmunoglobulina expresadas por dicho vertebrado comprende regiones variables lambda humanas,
en donde la expresión de las cadenas kappa y lambda endógenas es sustancialmente inactiva,
recoger suero de dicho ratón; y
aislar una o más cadenas ligeras de inmunoglobulina del suero recogido, en donde cada cadena ligera de inmunoglobulina aislada comprende una región variable lambda humana.
Vertebrados no humanos que expresan regiones variables kappa y lambda
(i) Cadenas K y L producidas a razones similares a las humanas
La invención es útil para producir cadenas ligeras que no están desviadas con respecto a razones que no son similares a las humanas. Por ejemplo, en ratones, las cadenas ligeras de tipo kappa predominan con mucho sobre las cadenas ligeras de tipo lambda (típicamente del orden de 95% de cadenas ligeras kappa: 5% de las cadenas ligeras lambda en un ratón de tipo salvaje). Los seres humanos, por otro lado, muestran típicamente alrededor de 60% kappa: alrededor de 40% lambda. Por tanto, la expresión de lambda es mucho mayor que la encontrada en un ratón. Sería deseable proporcionar un vertebrado no humano, tal como un ratón o una rata, en el que se pueda expresar una proporción mayor de cadenas ligeras de tipo lambda. Esto es útil cuando el vertebrado expresa cadenas ligeras que portan regiones variables lambda humanas y otras cadenas ligeras que portan regiones variables kappa humanas. Con este fin, los autores de la presente invención han demostrado por primera vez que tal vertebrado expresa cadenas ligeras lambda elevadas y, por tanto, la invención proporciona el uso expuesto en las reivindicaciones. La divulgación proporciona adicionalmente:
Un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido por inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci de Ig endógenos, comprendiendo el genoma segmentos génicos VA y JA humanos proporcionados por inserción en un locus endógeno de cadena ligera del vertebrado aguas arriba de una región constante, comprendiendo el genoma segmentos génicos V<k>y J<k>humanos proporcionados por inserción en un locus endógeno de cadena ligera del vertebrado aguas arriba de una región constante, en donde el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables de cadena ligera kappa y cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables de cadena ligera lambda, en donde más de 20% de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado comprende regiones variables lambda (p. ej., tal como se determina mediante FACS de células B esplénicas).
Las cadenas ligeras restantes expresan regiones variables kappa.
El documento WO03047336 ilustra la conveniencia de producir razones kappa:lambda similares a las humanas, pero esto no proporciona una divulgación permitida o plausible de cómo lograr esto.
(ii) Cadenas K y L producidas con compartimentos de células B normales
Los autores de la presente invención han generado con éxito vertebrados no humanos que contienen la inserción dirigida de segmentos génicos V y J lambda humanos para permitir la expresión de cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda humanas mediante compartimentos de células B normales (es decir, comparables a vertebrados de tipo salvaje). Por lo tanto, los autores de la presente invención han proporcionado tales vertebrados que pueden producir de manera útil tales cadenas ligeras con buenos repertorios y más fiablemente que los vertebrados no humanos transgénicos de la técnica anterior que presentan compartimentos de células B de tamaño y madurez reducidos, y de hecho que ni siquiera pueden producir cadenas ligeras que tienen regiones variables lambda humanas. Por tanto, la divulgación proporciona:
Un vertebrado no humano (p. ej., un ratón o rata) cuyo genoma comprende un repertorio de segmentos génicos de Ig producido mediante la inserción dirigida de segmentos génicos de Ig humanos en uno o más loci de Ig endógenos, comprendiendo el genoma segmentos génicos VA y JA humanos proporcionados mediante la inserción en un locus endógeno de cadena ligera del vertebrado aguas arriba de una región constante, comprendiendo el genoma segmentos génicos Vk y Jk humanos proporcionados mediante la inserción en un locus endógeno de cadena ligera del vertebrado aguas arriba de una región constante, en donde el vertebrado expresa cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables de cadena ligera kappa y cadenas ligeras de inmunoglobulina que comprenden regiones variables de cadena ligera lambda, y en donde el vertebrado produce una proporción o porcentaje normal de células B esplénicas maduras (p. ej., como se determina mediante FACS de células B esplénicas).
Con respecto a los vertebrados no humanos (i) y (ii), se contemplan los siguientes ejemplos (a menos que se especifique, cada ejemplo se aplica a (i) o (ii)): En un ejemplo, la inserción de VA y JA humanos comprende al menos los segmentos génicos V y J humanos funcionales comprendidos por un locus de cadena lambda de Ig humana de VA3-27 a CA7.
En un ejemplo, la inserción de VA y JA humanos comprende al menos segmentos génicos V humanos VA3-27, VA3-25, VA2-23, VA3-22, VA3-21, VA3-19, VA2-18, VA3-16, VA2-14, VA3-12, VA2-11, VÁ3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3 y VA3-1.
En un ejemplo, la inserción de VA y JA humanos comprende uno, más o todos los segmentos génicos J humanos JA1, JA2, JA3, JA6 y JA7.
En un ejemplo, la inserción de VA y JA humanos comprende una inserción de una agrupación JA-CA humana, en donde la agrupación comprende los segmentos génicos J y C de JA1 a CA7.
En un ejemplo, la inserción de VA y JA humanos comprende una inserción de un potenciador EA humano. Por ejemplo, el potenciador EA se proporciona en configuración de la línea germinal con respecto a un JA7 humano que también está comprendido por la inserción. Por ejemplo, el potenciador EA se proporciona en configuración de la línea germinal con respecto a una agrupación JA-CA humana que también está comprendida por la inserción, en donde la agrupación comprende de JA1 a CA7 en configuración de la línea germinal humana. En una configuración de la línea germinal humana, el potenciador EA está en posición 3' con respecto a la agrupación JA-CA.
En un ejemplo de vertebrado (i) o (ii), la inserción de VA y JA humanos se proporciona mediante una inserción de una secuencia correspondiente a las coordenadas 22886217 a 23327884 del cromosoma 22 humano.
En un ejemplo de vertebrado (ii), la inserción de VA y JA humanos se proporciona mediante una inserción de una secuencia correspondiente a las coordenadas 23064876 a 23327884 del cromosoma 22 humano.
En un ejemplo, la inserción de V<k>y J<k>humanos comprende al menos los segmentos génicos V y J humanos funcionales comprendidos por un locus de Ig de cadena kappa humana de V<k>1 -33 a J<k>5.
En un ejemplo, la inserción de V<k>y J<k>humano comprende al menos segmentos génicos V humanos V<k>1 -33, V<k>2-30, V<k>2-29, V<k>2-28, V<k>1 -27, V<k>2-24, V<k>3-20, V<k>1 -17, V<k>1 -16, V<k>3-15, V<k>1 -13, V<k>1 -12, V<k>3-11, V<k>1 -9, V<k>1 -8, V<k>1 -6, V<k>1 -5, V<k>5-2 y V<k>4-1.
En un ejemplo, la inserción de V<k>y J<k>humanos comprende uno, más o todos los segmentos génicos J<k>1, J<k>2, J<k>3, J<k>4 y J<k>5 humanos.
En un ejemplo, más del 30, 35, 40, 45 o 50% de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado comprenden regiones variables lambda.
En un ejemplo, de 20 a 40, 45 o 50% de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado comprenden regiones variables lambda. En un ejemplo, de 30 a 40, 45 o 50% de las cadenas ligeras expresadas por el vertebrado comprenden regiones variables lambda.
En un ejemplo, dichas regiones variables de la cadena ligera kappa son regiones variables de la cadena ligera kappa humana.
En un ejemplo, los segmentos génicos V<k>y J<k>están en un locus endógeno de la cadena ligera kappa del vertebrado aguas arriba de una región constante kappa.
En un ejemplo, los segmentos génicos VA y JA humanos están en un locus de cadena ligera kappa endógena del vertebrado.
En un ejemplo, los segmentos génicos VA y JA humanos están en un locus endógeno de la cadena ligera lambda del vertebrado.
En un ejemplo, el vertebrado expresa cadenas ligeras que comprenden regiones variables kappa humanas y expresa cadenas ligeras que comprenden regiones variables lambda humanas. En un ejemplo, la expresión de la cadena kappa endógena (vertebrado no humano) es sustancialmente inactiva o es inactiva y/o la expresión de la cadena lambda endógena (vertebrado no humano) es sustancialmente inactiva o es inactiva. Cuando el vertebrado es un ratón, la expresión de la cadena lambda de ratón es típicamente muy baja (alrededor de 5% o menos) y en este caso puede no ser necesario modificar por ingeniería genética el genoma del ratón para inactivar adicionalmente la expresión de la cadena lambda endógena. Por tanto, cuando el vertebrado es un ratón, la expresión de la cadena kappa endógena es sustancialmente inactiva o es inactiva y la expresión de la cadena lambda de ratón es de 5% o menos de toda la expresión de la cadena ligera.
En un ejemplo, el vertebrado produce una proporción o porcentaje normal de células B esplénicas maduras. Por ejemplo, esto se puede determinar mediante FACS de células B esplénicas aisladas del vertebrado.
En un ejemplo, el vertebrado produce una razón normal de células T1, T2 y B esplénicas maduras. Por ejemplo, esto se puede determinar mediante FACS de células B esplénicas aisladas del vertebrado.
En un ejemplo, al menos 40, 50, 60 o 70% de las células B esplénicas totales producidas por el vertebrado son células B maduras. Por ejemplo, esto se puede determinar mediante FACS de células B esplénicas aisladas del vertebrado.
Las siguientes definiciones se aplican a cualquier configuración, aspecto, disposición, cláusula, atributo o ejemplo de la invención o divulgación.
"Derivado de" se utiliza en el sentido ordinario del término. Los sinónimos ilustrativos incluyen "producido como", "resultante de", "recibido de", "obtenido de", "un producto de", "consecuencia de" y "modificado a partir de". Por ejemplo, una región variable humana de una cadena pesada puede derivar de la recombinación de segmentos génicos VH, D y JH humanos y esto refleja la recombinaciónin vivode estos segmentos génicos, por ejemplo, en un locus de cadena pesada transgénica según la divulgación con cualquier mutación acompañante (p. ej., mutación de unión).
Las muestras de las que se pueden obtener células B incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, bazo, tejido esplénico, médula ósea, linfa, ganglio linfático, timo y apéndice. Los anticuerpos y cadenas de inmunoglobulina pueden obtenerse de cada una de las muestras mencionadas anteriormente y también de la siguiente lista no limitante de células B, líquido ascítico, hibridomas y cultivos celulares.
"Pluralidad" se utiliza en el sentido ordinario del término y significa "al menos uno" o "más de uno".
El término "configuración de la línea germinal" se refiere a una configuración genómica de la línea germinal. Por ejemplo, los segmentos génicos de inmunoglobulina humana de un locus de inmunoglobulina transgénica están en una configuración de la línea germinal cuando el orden relativo de los segmentos génicos es el mismo que el orden de los segmentos génicos correspondientes en un genoma de la línea germinal humana. Por ejemplo, cuando el locus transgénico es un locus de cadena pesada de la divulgación que comprende segmentos génicos de inmunoglobulina humana hipotéticos A, B y C, estos se proporcionarían en este orden (de 5' a 3' en el locus) cuando los segmentos génicos correspondientes de un genoma de la línea germinal humana comprenden el ordenamiento 5'-A-B-C-3'. En un ejemplo, cuando se proporcionan elementos de un locus de inmunoglobulina humana (p. ej., segmentos génicos, potenciadores u otros elementos reguladores) en un locus de inmunoglobulina transgénica según la divulgación, los elementos del locus de Ig humana están en configuración de la línea germinal cuando el orden relativo de los segmentos génicos es el mismo que el orden de los segmentos génicos correspondientes en un genoma de la línea germinal humana y se incluyen secuencias humanas entre los elementos, correspondiendo estas a tales secuencias entre elementos correspondientes en el genoma de la línea germinal humana. Por lo tanto, en un ejemplo hipotético, el locus transgénico comprende elementos humanos en el ordenamiento 5'-A-S1-B-S2-C-S3-3', en donde A, B y C son segmentos génicos de inmunoglobulina humana y S1-S3 son secuencias de segmentos intergénicos humanos, en donde el ordenamiento correspondiente 5'-A-S1-B-S2-C-S3-3' está presente en un genoma de la línea germinal humana. Por ejemplo, esto puede lograrse proporcionando en un locus de inmunoglobulina transgénica de la divulgación un inserto de ADN correspondiente a la secuencia de ADN de A a C en un genoma de la línea germinal humana (o el inserto que comprende la secuencia de ADN de A a C). Los ordenamientos en genomas de la línea germinal humana y loci de inmunoglobulina se conocen en la técnica (p. ej., véase IMGT en la Red Mundial (véase anteriormente), Kabat y otras fuentes de anticuerpos a los que se hace referencia en el presente documento).
El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos de longitud completa que tienen una región Fc de inmunoglobulina), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos, dianticuerpos y moléculas de cadena sencilla, así como fragmentos de anticuerpos (p. ej., dAb, Fab, F(ab')2 y Fv). El término "anticuerpo" también incluye anticuerpos H2 que comprenden un dímero de una cadena pesada (5'-VH-(bisagra opcional)-CH2-CH3-3') y están desprovistos de una cadena ligera (similar a los anticuerpos H2 naturales; véase, p. ej., Nature. 3 de junio de 1993; 363 (6428): 446-8; Naturally occurring antibodies devoid of light chains; Hamers-Caterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R). Por tanto, en un ejemplo de la presente divulgación, el ARN producido a partir del locus de cadena pesada transgénica codifica cadenas pesadas que están desprovistas de un segmento génico CH1 y no comprenden la cadena ligera de anticuerpo funcional. En un ejemplo, el ARN producido a partir del locus de la cadena pesada transgénica codifica dominios variables individuales de VH (dAb; anticuerpos de dominio). Estos pueden comprender opcionalmente una región constante.
El término "inmunoglobulina" (Ig) se utiliza indistintamente con "anticuerpo" en el presente documento.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado, separado y/o recuperado de un componente de su entorno de producción (p. ej., de manera natural o recombinante). Preferiblemente, el polipéptido aislado está libre de asociación con todos los demás componentes de su entorno de producción, p. ej., de modo que el anticuerpo se ha aislado con un patrón aprobado o que puede aprobarse por la FDA. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, tales como el resultante de células transfectadas recombinantes, son materiales que interferirían típicamente en los usos de investigación, diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En ejemplos preferidos, el polipéptido se purificará: (1) hasta más del 95% en peso de anticuerpo como se determina, por ejemplo, mediante el método de Lowry, y en algunos ejemplos, a más del 99% en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, se preparará un polipéptido o anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificación.
Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la unión al antígeno y/o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos dAb, Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; dianticuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Un anticuerpo que "se une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido, antígeno o epítopo particular es aquel que se une a ese polipéptido, antígeno o epítopo particular sin unirse sustancialmente a otros polipéptidos, antígenos o epítopos. Por ejemplo, la unión al antígeno o epítopo es específica cuando el anticuerpo se une con una Kd de 100 pM o menos, 10 pM o menos, 1 pM o menos, 100 nM o menos, p. ej., 10 nM o menos, 1 nM o menos, 500 pM o menos, 100 pM o menos, o 10 pM o menos. La afinidad de unión (Kd) se puede determinar utilizando procedimientos convencionales como conocerá el experto en la materia, p. ej., unión en ELISA y/o determinación de afinidad utilizando resonancia de plasmón superficial (medición de afinidad de fase en solución p. ej., Biacore™ o KinExA™ que puede detectar afinidades por debajo de fM (Sapidyne Instruments, Idaho)). "Farmacéuticamente aceptable" se refiere a aprobado o aprobable por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal de EE.UU. o enumerado en la farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, incluyendo seres humanos. Un "portador, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptables" se refiere a un portador, excipiente o adyuvante que se puede administrar a un sujeto, junto con un agente, p. ej., cualquier anticuerpo o cadena de anticuerpo descritos en el presente documento, y que no destruye la actividad farmacológica del mismo y no es tóxico cuando se administra a dosis suficientes para suministrar una cantidad terapéutica del agente.
Breve descripción de las figuras
Las Fig. 1-8 muestran un procedimiento repetitivo para la inserción de una serie de BAC humanos en un locus de Ig de ratón
Las Fig. 9-18 muestran con más detalle el procedimiento de las Figuras 1-8 para el locus IgH y kappa
Las Fig. 19 y 20 muestran los principios detrás de la generación de anticuerpos en ratones quiméricos
La Fig. 21 muestra un posible sitio de inserción para el ADN humano en un cromosoma de ratón
Las Fig. 22-26 divulgan un procedimiento repetitivo alternativo para la inserción de una serie de BAC humanos en un locus de Ig de ratón
Las Fig. 27-29 ilustran un mecanismo para la inversión de la región VDJ del anfitrión
La Fig. 30 ilustra la prueba de principio para la inserción de un plásmido utilizando un enfoque de RMCE
La Fig. 31 ilustra RMCE secuencial - Integración en el Lugar de Emplazamiento Genómico
La Fig. 32 ilustra la confirmación de la inserción satisfactoria en el lugar de emplazamiento genómico
La Fig. 33 ilustra la confirmación por PCR del curado del extremo 3'
La Fig. 34 ilustra la inserción de BAC#1 y diagnostico por PCR
La Fig. 35 ilustra el uso de JH y JK
La Fig. 36 ilustra el uso de DH
La Fig. 37 ilustra la distribución de la longitud de CDR-H3 en transcritos de VDJCp humanos de ratones quimera
La Fig. 38 ilustra la distribución de los números de nucleótidos de deleción e inserción en las uniones IGH-VDI o IGK-VJ
La Fig. 39 ilustra la distribución del uso de JH dentro de cada VH
La Fig. 40 ilustra la distribución del uso de DH dentro de cada VH
La Fig. 41 ilustra que la ganancia o pérdida de nucleótidos en las uniones VJ genera variantes de IGK
La Fig. 42 ilustra que la hipermutación en regiones J genera variantes de IGK
La Fig. 43 ilustra que la diversidad de unión produce CDS funcionales
La Fig. 44 ilustra un gráfico de identidad del segmento génico Jh utilizando una biblioteca específica de Cg 5'-RACE generada a partir de linfocitos B esplénicos de ratones transgénicos según la divulgación donde el uso de segmentos génicos endógenos se ha inactivado por inversión
La Fig. 45 ilustra la razón de uso de V<h>de ratón con respecto a V<h>humano según se determina a partir de secuencias de anticuerpos de linfocitos B esplénicos de ratones transgénicos según la descripción donde el uso de segmentos génicos endógenos se ha inactivado por inversión
La Fig. 46 ilustra el esquema de la estrategia de inversión
La Fig. 47 ilustra la construcción de direccionamiento R57 para la inversión
La Fig. 48 ilustra el análisis de secuencia de una biblioteca 5'-RACE específica de Cg de linfocitos B esplénicos de ratón S1inv1 (un BAC humano en IGH (es decir, VH humano múltiple, todos D y JH humanos funcionales) con un locus IGH endógeno invertido) muestra que prácticamente todos los transcritos proceden de segmentos génicos Vh-D-Jh humanos reordenados
La Fig. 49 ilustra que el ratón S1inv1 muestra un uso similar de ambos segmentos génicos D y J<h>al humano La Fig. 50 ilustra que el uso de Vh de ratón está reducido significativamente de manera adicional después de la inserción del 2°<b>A<c>humano en el locus endógeno de la cadena pesada
La Fig. 51 ilustra un gel que muestra que se observó cambio de clase normal (a tipo IgG) en transcritos de ratones de la divulgación. Los transcritos reordenados se detectaron utilizando RT-PCR con cebadores específicos de VH humano y específicos de C<y>de ratón para la amplificación a partir de células de sangre periférica de ratones transgénicos inmunizados
La Fig. 52 ilustra fragmentos amplificados de análisis de secuencia que demuestran que la hipermutación se produjo dentro de las regiones variables humanas de estas cadenas de IG<y>de ratones de la divulgación La Fig. 53 ilustra el análisis citométrico de flujo que muestra compartimentos de células B normales en ratones transgénicos de la divulgación
Las Figuras 54 y 55 ilustran isotipos de IgH normales y los niveles séricos obtenidos en animales transgénicos de la divulgación después de la inmunización con antígenos
La Fig. 56, parte 1 ilustra el primer y segundo BAC utilizados para la inserción en loci de cadena ligera endógena de ratón. Se muestra el ADN humano en cada BAC. La parte 2 de la figura 56 muestra el punto de inserción del ADN del locus Ig lambda humano en el locus endógeno de la cadena kappa de ratón. La parte 3 de la figura 56 muestra el punto de inserción del ADN del locus Ig lambda humano en el locus endógeno de la cadena lambda de ratón.
La Fig. 57 muestra los resultados del análisis FACS para determinar la expresión de CA de ratón y humano (y por tanto la correspondiente expresión de la región variable de ratón y humana) en células B esplénicas B220+ de ratones homocigotos P1 (P1/P1) en comparación con ratones de tipo salvaje (WT).
La Fig. 58A muestra los resultados del análisis FACS para determinar la expresión de C<k>y CA de ratón en células B esplénicas B220+ de ratones homocigotos para P2 (P2/P2) en comparación con ratones de tipo salvaje (WT). No se observó expresión detectable de C<k>de ratón.
La Fig. 58B muestra los resultados del análisis FACS para determinar la expresión de CA humano (y por tanto la correspondiente expresión de la región variable humana) en células B esplénicas B220+ de ratones homocigotos para P2 (P2/P2) en comparación con ratones de tipo salvaje (WT).
La Fig. 59 muestra el uso de VA humano en ratones homocigotos para P2 (P2/P2) y el uso de VA típico en seres humanos (recuadro)
La Fig. 60 muestra el uso de JA humano en ratones homocigotos para P2 (P2/P2) y el uso de JA típico en seres humanos (recuadro)
La Fig. 61 muestra que el uso de VA es muy alto en ratones homocigotos para P2 (P2/P2).
La Fig. 62 muestra la distribución del uso de segmentos génicos V<k>de ratón y VA humano a partir del locus kappa quimérico en ratones homocigotos para P2 (P2/P2).
La Fig. 63 ilustra el ordenamiento de RSS en los loci lambda y kappa.
La Fig. 64A muestra los resultados del análisis FACS para determinar la expresión de CA de ratón y humano (y por tanto la correspondiente expresión de la región variable de ratón y humana) en células B esplénicas B220+ de ratones homocigotos para L2 en los que la expresión de la cadena kappa endógena se ha inactivado (L2/L2; KA/KA) en comparación con ratones que no tienen ADN lambda humano insertado y en los que la expresión de la cadena kappa endógena se ha inactivado (KA/KA). Se observó un uso muy alto de VA humano en los ratones L2/L2; KA/KA, casi con la exclusión del uso de VA de ratón.
Fig. 64B: Análisis de Compartimentos de Células B Esplénicas. Esta figura muestra los resultados del análisis FACS en células B esplénicas de ratones L2/L2;KA/KA transgénicos (homocigotos para L2; homocigotos para la inserción del segmento génico lambda humano en loci lambda endógenos; habiéndose inactivado la expresión de la cadena kappa endógena) en comparación con células B esplénicas de ratones que expresan solo anticuerpos de ratón (ratones KA/KA). Los resultados muestran que los compartimentos de células B esplénicas en los ratones de la divulgación son normales (es decir, equivalentes a los compartimentos de ratones que expresan sólo cadenas de anticuerpos de ratón).
Fig. 65: Desarrollo de células B y marcadores en la médula ósea y compartimentos esplénicos.
Fig. 66A: Análisis de Compartimentos de Células B Esplénicas. Esta figura muestra los resultados del análisis FACS en células B esplénicas de ratones transgénicos S1F/HA, KA/+ de la divulgación que expresan regiones variables de cadena pesada que son todas humanas (donde la expresión de la cadena pesada endógena se ha inactivada por inversión), en comparación con células B esplénicas de ratones que expresan solo anticuerpos de ratón. Los resultados muestran que los compartimentos de células B esplénicas en los ratones de la divulgación son normales (es decir, equivalentes a los compartimentos de ratones que expresan sólo cadenas de anticuerpos de ratón).
S1 F/HA, /KA = (i) S1F - el primer alelo endógeno de la cadena pesada tiene una inserción de ADN del locus de la cadena pesada humana, la región VDJ endógena de ratón se ha inactivado por inversión y movimiento aguas arriba en el cromosoma; (ii) HA - el segundo alelo endógeno de la cadena pesada se ha inactivado (por inserción de una secuencia de interrupción endógena); (iii) - el primer alelo kappa endógeno es un alelo kappa de tipo salvaje; y (iv) KA - el segundo alelo kappa endógeno se ha inactivado (por inserción de una secuencia de interrupción endógena). Esta disposición codifica exclusivamente cadenas pesadas del primer alelo endógeno de la cadena pesada.
Fig. 66B: Análisis de Compartimentos de Células B Esplénicas. Esta figura muestra los resultados del análisis FACS en células B esplénicas de ratones S1 F/HA, K2/KA transgénicos de la divulgación que expresan regiones variables de cadena pesada que son todas regiones variables humanas (donde la expresión de la cadena pesada endógena se ha inactivado por inversión) y humanas de cadena kappa, en comparación con células B esplénicas de ratones /HA, K2/KA. Los resultados muestran que los compartimentos de células B esplénicas en los ratones de la divulgación son normales.
S1 F/HA, K2/KA = (i) K2 - el primer alelo kappa endógeno tiene dos inserciones de ADN del locus de la cadena kappa entre el J<k>endógeno más 3' y el C<k>de ratón, proporcionando una inserción de 14 V<k>y J<k>1-J<k>5 humanos; y (ii) KA -el segundo alelo kappa endógeno se ha inactivado (por inserción de una secuencia de interrupción endógena). Este ordenamiento codifica exclusivamente cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas y cadenas ligeras sustancialmente kappa del primer alelo kappa endógeno.
+/HA, K2/KA - este ordenamiento codifica cadenas pesadas de ratón y cadenas kappa humanas.
Fig. 67A: Análisis del compartimento progenitor de médula ósea B. Esta figura muestra los resultados del análisis FACS en células B de médula ósea (BM) de ratones S1F/HA, KA/+ transgénicos de la divulgación que expresan regiones variables de cadena pesada que son todas humanas (donde la expresión de la cadena pesada endógena se ha inactivado por inversión), en comparación con células B de BM de ratones que expresan solo anticuerpos de ratón. Los resultados muestran que los compartimentos de células B de BM en los ratones de la divulgación son normales (es decir, equivalentes a los compartimentos de ratones que expresan solo cadenas de anticuerpos de ratón).
Fig. 67B: Análisis del compartimento progenitor de médula ósea B. Esta figura muestra los resultados del análisis FACS en células B de médula ósea (BM) de ratones S1F/HA, K2/KA transgénicos de la divulgación que expresan regiones variables de cadena pesada que son todas humanas (donde la expresión de la cadena pesada endógena se ha inactivado por inversión) y regiones variables de cadena kappa humana, en comparación con células B de BM de ratones /HA, K2/KA. Los resultados muestran que los compartimentos de células B de BM en los ratones de la divulgación son normales.
Fig. 68: muestra la cuantificación de Ig para el subtipo e Ig total en diversos ratones:
S1 F/HA, KA/+ = (i) S1F - el primer alelo endógeno de la cadena pesada tiene una inserción de ADN del locus de la cadena pesada humana, la región VDJ endógena de ratón se ha inactivado por inversión y movimiento aguas arriba en el cromosoma; (ii) HA - el segundo alelo endógeno de la cadena pesada se ha inactivado (por inserción de una secuencia de interrupción endógena); (iii) KA - el primer alelo kappa endógeno se ha inactivado (por inserción de una secuencia de interrupción endógena); y (iv) - el segundo alelo kappa endógeno es un alelo de la kappa de tipo salvaje. Este ordenamiento codifica exclusivamente cadenas pesadas del primer alelo endógeno de la cadena pesada.
S1F/HA, K2/KA = (i) K2 - el primer alelo kappa endógeno tiene dos inserciones de ADN del locus de la cadena kappa entre el J<k>endógeno más 3' y el C<k>de ratón, proporcionando una inserción de 14 V<k>y J<k>1-J<k>5 humanos; y (ii) KA -el segundo alelo kappa endógeno se ha inactivado (por inserción de una secuencia de interrupción endógena). Este ordenamiento codifica exclusivamente cadenas pesadas que comprenden regiones variables humanas y cadenas ligeras sustancialmente kappa del primer alelo kappa endógeno.
+/HA, K2/+ - este ordenamiento codifica cadenas pesadas de ratón y cadenas kappa tanto de ratón como humanas. /HA, /KA - este ordenamiento codifica las cadenas pesada y kappa de ratón.
En esta figura, "suma de Ig" es la suma de los isotipos IgG e IgM.
Fig. 69: muestra la cuantificación de Ig para el subtipo e Ig total en diversos ratones: S1F/HA, K2/KA (n=15) y 12 ratones que expresan sólo cadenas de anticuerpos de ratón (+/HA, /KA (n=6) y ratones de tipo salvaje (WT; n=6)).
Secuencias
SEQ ID NO 1 es una secuencia de cambio de rata
SEQ ID NO 2 es un vector de direccionamiento del lugar de emplazamiento genómico (versión larga) SEQ ID NO 3 es un vector de direccionamiento del lugar de emplazamiento genómico (versión más corta) SEQ ID NO 4 es el cambio de la cepa 129 de ratón
SEQ ID NO 5 es el cambio de la cepa C57 de ratón
SEQ ID NO 6 es el brazo de homología 5' de un lugar de emplazamiento genómico
SEQ ID NO 7 es oligo HV2-5
SEQ ID NO 8 es oligo HV4-4
SEQ ID NO 9 es oligo HV1-3
SEQ ID NO 10 es oligo HV1-2
SEQ ID NO 11 es oligo HV6-1
SEQ ID NO 12 es oligo Cg
SEQ ID NO 13 es oligo KV1-9
SEQ ID NO 14 es oligo KV1-8
SEQ ID NO 15 es oligo KV1-6
SEQ ID NO 16 es oligo KV1-5
SEQ ID NO 17 es oligo Ck
SEQ ID NO 18-20 son secuencias de cambio de rata
SEQ ID NO 21 es X<1>X<2>TFGQ, donde X<1>X<2>= PR, RT o PW
SEQ ID NO 22 es X<1>X<2>TFGQGTCVEIKRADA, donde X<1>X<2>= PR, RT o PW;
SEQ ID NO 23 es X<3>X<4>TFGQ, donde XaX4= PR o PW
SEQ ID NO 24 es X<3>X<4>TFGQGTKVEIKIRADA, donde X3X4= PR o PW
SEQ ID NO 25 es el Cebador E1554
SEQ ID NO 26 es el Cebador E1555
SEQ ID NO 27 es el Cebador ELP1352_C<y>1
SEQ ID NO 28 es el Cebador ELP1353_CY2b
SEQ ID NO 29 es el Cebador ELP1354_CY2a
SEQ ID NO 30 es el Cebador ELP1356 VH4-4
SEQ ID NO 31 es el Cebador ELP1357_VH1-2,3
SEQ ID NO 32 es el Cebador ELP1358_VH6-1
SEQ ID NO 33 es el Cebador mlgG1_2 rev
SEQ ID NO 34 es el Cebador mlgG2b rev
SEQ ID NO 35 es el Cebador mlgG2a_2 rev
SEQ ID NO 36 es el cebador mCH1 unirev
SEQ ID NO 37 es el cebador mCH1 unirev_2
SEQ ID NO 38-45 son secuencias de CDRH3
SEQ ID NO 46-50 son 3, 4, 5, 6 o más (hasta 82) repeticiones de GGGCT
SEQ ID NO 51-55 son secuencias de CDR1 de cadena pesada contra CTB (clonadas y de referencia)
SEQ ID NO 56-60 son secuencias de CDR2 de cadena pesada contra CTB (clonadas y de referencia)
SEQ ID NO 61-63 son secuencias de CDR3 de cadena pesada contra CTB (clonadas y de referencia)
SEQ ID NO 64-68 son secuencias de la región J contra CTB (clonadas y de referencia)
Descripción detallada de la invención
Se entenderá que las realizaciones particulares descritas en el presente documento se muestran a modo de ilustración y no como limitaciones de la invención.
El uso de las palabras "un", "uno" o "una" cuando se emplean junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar "uno", pero también es coherente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno". El uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza para significar "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiere a alternativas solamente o las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la divulgación soporta una definición que se refiere a alternativas solamente y "y/o". A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, el método que se emplea para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos del estudio.
Como se emplea en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, las palabras "que comprende" (y cualquier forma de comprender, tal como "comprenden" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de tener, tal como "tienen" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de incluir, tal como "incluye" e "incluyen") o "que contiene" (y cualquier forma de contener, tal como "contiene" y "contienen") son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos o etapas de método adicionales, no citados. El término "o combinaciones de los mismos" como se emplea en el presente documento se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los elementos enumerados que preceden al término. Por ejemplo, "se pretende que A, B, C, o combinaciones de los mismos incluya al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también<b>A, CA, CB, CBA, BCA, ACB,<b>A<c>o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más elementos o términos, tales como BB, AAA, Mb , BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, y así sucesivamente. El experto en la técnica entenderá que típicamente no hay límite en el número de elementos o términos en cualquier combinación, a menos que sea evidente de otro modo a partir del contexto.
Como fuente de secuencias de segmentos génicos de anticuerpos, el experto en la técnica también estará al tanto de las siguientes bases de datos y recursos disponibles (incluyendo actualizaciones de los mismos):
The Kabat Database (G. Johnson y T.T. Wu, 2002; Red Mundial (www) kabatdatabase.com). Creada por E. A. Kabat y T. T. Wu en 1966, la base de datos de Kabat publica secuencias alineadas de anticuerpos, receptores de células T, moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II, y otras proteínas de interés inmunológico. Se proporciona una interfaz buscable por la herramienta Seqhuntll, y una gama de utilidades está disponible para el alineamiento de secuencias, la clasificación de subgrupos de secuencias, y la generación de gráficos de variabilidad. Véase también Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H., Gottesman, K., y Foeller, C. (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5a ed., Publicación NÍH Núm. 91-3242, Bethesda, MD, en particular, con referencia a segmentos génicos humanos para su uso en la presente invención.
KabatMan (A. C. R. Martin, 2002; Red Mundial (www) bioinf.org.uk/abs/simkab.html).). Esta es una interfaz web para realizar consultas simples a la base de datos de secuencias de Kabat.
IMGT(Sistema Internacional de Información ImMunoGeneTics®; M. P. Lefranc, 2002; Red Mundial (J. Biolwww) imgt.cines.fr). IMGT es un sistema de información integrado que se especializa en anticuerpos, receptores de células T y moléculas del MHC de todas las especies de vertebrados. Proporciona un portal común para los datos normalizados que incluyen secuencias de nucleótidos y proteínas, cebadores oligonucleotídicos, mapas génicos, polimorfismos genéticos, especificidades y estructuras bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D). El IMGT incluye tres bases de datos de secuencias(IMGT/LIGM-DB, IMGT/MHC-DB, IMGT/PRIMERDB),una base de datos de genoma(IMGT/GENE-DB),una base de datos de estructuras 3D(IMGT/3Dstructure-DB),y una gama de recursos web("IMGTMarie-Paule page") y herramientas interactivas.
V-BASE (I. M. Tomlinson, 2002; Red Mundial (www) mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase). V-BASE es un directorio exhaustivo de todas las secuencias de región variable de la línea germinal de anticuerpos humanos compiladas a partir de más de mil secuencias publicadas. Incluye una versión del programa informático de alineamiento DNAPLOT (desarrollado por Hans-Helmar Althaus y Werner Müller) que permite la asignación de genes V de anticuerpos reordenados a sus segmentos génicos de la línea germinal más cercanos.
Antibodies-Structure and Sequence (A. C. R. Martin, 2002; Red Mundial (www) bioinf.org.uk/abs).). Esta página resume la información útil sobre la estructura y secuencia del anticuerpo. Proporciona una interfaz de consulta para los datos de secuencia de anticuerpo de Kabat, información general sobre anticuerpos, estructuras cristalinas y enlaces a otra información relacionada con anticuerpos. También distribuye un resumen automatizado de todas las estructuras de anticuerpos depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (PDB). Es de particular interés una descripción y comparación exhaustivas de los diversos esquemas de numeración para regiones variables de anticuerpo.
AAAA(A Ho's Amazing Atlas of Antibody Anatomy; A. Honegger, 2001; Red Mundial (www) unizh.ch/-antibody). Este recurso incluye herramientas para análisis estructural, modelado y modificación mediante ingeniería genética. Adopta un esquema unificante para el alineamiento estructural exhaustivo de anticuerpos y secuencias de receptores de células T, e incluye macros Excel para el análisis de anticuerpos y la representación gráfica.
WAM(Web Antibody Modeling; N. Whitelegg y A. R. Rees, 2001; Red Mundial (www) antibody.bath.ac.uk). Alojado por el Centro para el Análisis y Diseño de Proteínas en la Universidad de Bath, Reino Unido. Basándose en el paquete AbM (anteriormente comercializado por Oxford Molecular) para construir modelos 3D de secuencias Fv de anticuerpos utilizando una combinación de métodos teóricos establecidos, este sitio también incluye la última información estructural del anticuerpo.
Mike's Immunoglobulin Structure/Function Page (M.R. Clark, 2001; Red Mundial (www) path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html). Estas páginas proporcionan materiales educativos sobre la estructura y función de inmunoglobulinas, y se ilustran mediante muchas imágenes, modelos y animaciones en color. Se dispone de información adicional sobre la humanización de anticuerpos y el Proyecto de Homología Humana de Anticuerpos Terapéuticos de Mike Clark, que tiene como objetivo correlacionar la eficacia clínica y las respuestas antiinmunoglobulina con secuencias de región variable de anticuerpos terapéuticos.
The Antibody Resource Page(The Antibody Resource Page, 2000; Red Mundial (www) antibodyresource.com).). Este sitio se describe como la "guía completa para la investigación y los proveedores de anticuerpos". Se proporcionan enlaces a herramientas de secuenciación de aminoácidos, herramientas de secuenciación de nucleótidos de anticuerpos y bases de datos de hibridoma/cultivo celular.
Humanization bY Design (J. Saldanha, 2000; Red Mundial (www) people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s).). Este recurso proporciona una visión general de la tecnología de humanización de anticuerpos. La característica más útil es una base de datos buscable (por secuencia y texto) de más de 40 anticuerpos humanizados publicados que incluyen información sobre cuestiones de diseño, elección del marco, retromutaciones del marco y afinidad de unión de las construcciones humanizadas.
Véase también Antibody Engineering Methods and Protocols, Ed. Benny K C Lo, Methods in Molecular Biology™ Human Press. También en la Red Mundial(www)blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-and-protocols antibody-engineering-methods-and-protocols.pdf
Cualquier parte de esta divulgación puede leerse combinada con cualquier otra parte de la divulgación, a menos que sea evidente de otro modo a partir del contexto.
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo realizar y utilizar la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 (Ejemplo de referencia)
Modificación genética in vivo mediada por recombinación homologa de BAC
Estrategia global:Se puede conseguir un modelo de ratón de la divulgación insertando ~960 kb del locus de la cadena pesada humana que contiene todas las regiones V, D y J aguas arriba de la región constante de ratón y 473 kb de la región kappa humana aguas arriba de la región constante de ratón. Alternativamente, o en tándem, la región lambda humana se inserta aguas arriba de la región constante de ratón. Esta inserción se logra mediante el direccionamiento génico en células ES utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica.
La inserción de alta fidelidad de las regiones V-D-J intactas en cada locus en su configuración nativa (tipo salvaje) se logra adecuadamente mediante la inserción de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) humanos en el locus. Adecuadamente, los BAC se recortan de modo que en el locus final no se duplique o se pierda secuencia en comparación con el original. Tal recorte se puede llevar a cabo por modificación genética in vivo mediada por recombinación homóloga.
Los BAC humanos relevantes, adecuadamente recortados que cubren estos loci tienen un tamaño medio de 90 kb.
En un enfoque, el complemento completo de los elementos D y J humanos, así como siete u ocho regiones V humanas, están cubiertos por los primeros BAC que se insertarán en el esquema de inserción experimental descrito a continuación. Los primeros BAC que se insertarán en los loci de IgH e IgK pueden contener las siguientes regiones V. IgH:V6-1, VII-1-1, V1-2, VIII-2-1, V1-3, V4-4, V2-5 e IgK: V4-1, V5-2, V7-3, V2-4, V1-5, V1-6, V3-7, V1-8.
De manera adecuada, el rendimiento de cada locus se evalúa después de la primera inserción de BAC utilizando ratones quiméricos y también después de cada adición posterior de BAC. Véase a continuación para una descripción detallada de esta prueba de rendimiento.
Se requerirán nueve inserciones adicionales de BAC para el locusIgHy cinco paraIgKpara proporcionar el complemento completo de las regiones V humanas que cubren los 0,96 Mb y 0,473 Mb de los lociIgHeIgK,respectivamente.
No todos los BAC conservan su configuración de tipo salvaje cuando se insertan en el genoma de las células ES. Por tanto, se desplegaron matrices genómicas de alta densidad para escrutar células ES para identificar aquellas con inserciones intactas de BAC (Barrett, M.T., Scheffer, A., Ben-Dor, A., Sampas, N., Lipson, D., Kincaid, R., Tsang, P., Curry, B., Baird, K., Meltzer, P.S., et al. (2004). Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 17765 17770.). Este escrutinio también permite identificar y seleccionar frente a clones de ES en los que el genoma de las células ES está comprometido y por lo tanto no es capaz de poblar la línea germinal de animales quiméricos. Otras herramientas genómicas adecuadas para facilitar esta evaluación incluyen secuenciación y verificación por PCR.
Por lo tanto, en un aspecto, la estructura de BAC correcta se confirma antes de pasar a la siguiente etapa.
Queda implícito en la descripción anterior que para la modificación genética completa de los loci con BAC de 90 kb, es necesario realizar un mínimo de 10 etapas de direccionamiento para ellosIgHy 5 etapas paraIgK.Los ratones con un locus IgL se pueden generar de manera similar al locus IgK. Se requieren etapas adicionales para eliminar los marcadores de selección requeridos para soportar el direccionamiento génico. Puesto que estas manipulaciones se están llevando a cabo en células ES de una manera escalonada, en un aspecto la capacidad de transmisión de la línea germinal se mantiene a lo largo de este procedimiento.
Puede ser importante en la presente divulgación mantener el rendimiento de los clones de células ES a través de múltiples rondas de manipulación sin la necesidad de probar el potencial de la línea germinal de la línea celular ES en cada etapa. Las líneas celulares actualmente en uso para los proyectos de inactivación génica global KOMP y EUCOMM se han modificado dos veces antes de su uso para este proyecto y sus velocidades de transmisión de la línea germinal no cambian con respecto a las células parentales (estas líneas están disponibles públicamente, véanse la Red Mundial(www)komp.org y Red Mundial (www) eucomm.org). Esta línea celular, denominada JM8, puede generar ratones derivados de células ES al 100% en condiciones de cultivo publicadas (Pettit, S.J., Liang, Q., Rairdan, X.Y., Moran, J.L., Prosser, H.M., Beier, D.R., Lloyd, K.C., Bradley, A., y Skarnes, W.C. (2009). Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods.). Estas células han demostrado la capacidad de contribuir de forma reproducible al tejido somático y de la línea germinal de animales quiméricos utilizando condiciones de cultivo de células ES de ratón convencionales. Esta capacidad se puede encontrar con células cultivadas en una línea celular alimentadora convencional (SNL) e incluso sin alimentador, cultivadas solo en placas de cultivo tisular recubiertas de gelatina. Una sub-línea particular, JM8A3, mantuvo la capacidad de poblar la línea germinal de quimeras después de varias rondas en serie de subclonación. La manipulación genética extensa mediante, por ejemplo, recombinación homóloga - como sería el caso en la presente divulgación - no puede comprometer la pluripotencia de las células. La capacidad de generar quimeras con tal alto porcentaje de tejido derivado de células ES tiene otras ventajas. En primer lugar, los niveles elevados de quimerismo se correlacionan con el potencial de transmisión de la línea germinal y proporcionan un ensayo sustituto para la transmisión de la línea germinal mientras que sólo tarda de 5 a 6 semanas. En segundo lugar, puesto que estos ratones derivan 100% de células ES, los loci modificados genéticamente pueden probarse directamente, eliminando el retraso provocado por la reproducción. La prueba de la integridad de los nuevos loci de Ig es posible en la quimera, ya que el embrión anfitrión derivará de animales que son mutantes para el gen RAG-1, como se describe en la siguiente sección.
Otra línea celular que se puede utilizar es una línea celular HPRT-ve, tal como AB2.1, como divulgan Ramirez-Solis R, Liu P y Bradley A, en "Chromosome engineering in mice", Nature, 1995; 378; 6558; 720-4.
Complementación de RAG-1:Aunque muchos clones generarán 100% de ratones derivados de ES, algunos no lo harán. Por tanto, en cada etapa se generan ratones con un fondo con deficiencia de RAG-1. Esto proporciona ratones con células B y T 100% derivadas de ES que se pueden utilizar directamente para inmunización y producción de anticuerpos. Se pueden utilizar células que tienen un fondo con deficiencia de RAG-2, o un fondo con deficiencia combinada de RAG-1/RAG-2, o mutaciones equivalentes en las que los ratones producen solo células B y/o células T derivadas de células ES.
Con el fin de que solo los lociIgHoIgKde humano-ratón sean activos en estos ratones, se pueden modificar por ingeniería genética los lociIgHeIgKde humano-ratón en una línea celular en la que un alelo del locusIgHoIgKya se ha inactivado. Alternativamente, la inactivación del locus de Ig anfitrión, tal como el locus IgH o IgK, se puede llevar a cabo después de la inserción.
Las cepas de ratón que tienen el gen RAG-1 mutado son inmunodeficientes ya que no tienen linfocitos B o T maduros (documento US 5.859.307). Los linfocitos T y B sólo se diferencian si se produce una recombinación V(D)J apropiada. Puesto que RAG-1 es una enzima que es crucial para esta recombinación, los ratones que carecen de RAG-1 son inmunodeficientes. Si los embriones anfitriones son mutantes homocigotos genéticamente para RAG-1, una quimera producida inyectando tal embrión no será capaz de producir anticuerpos si los tejidos linfoides del animal proceden del embrión anfitrión. Sin embargo, las células JM8 y las células AB2.1, por ejemplo, contribuyen generalmente en más de 80% de los tejidos somáticos del animal quimérico y, por lo tanto, normalmente poblarían el tejido linfoide. Las células JM8 tienen actividad RAG-1 de tipo salvaje y, por lo tanto, los anticuerpos producidos en el animal quimérico estarían codificados solo por el genoma de las células ES JM8 modificadas genéticamente. Por lo tanto, el animal quimérico puede exponerse a un antígeno mediante inmunización y posteriormente producir anticuerpos contra ese antígeno. Esto permite a un experto en la técnica probar el rendimiento de los loci IgH e IgK humanos/de ratón modificados genéticamente como se describe en la presente divulgación. Véanse las figuras 19 y 20.
Un experto en la técnica utilizaría el animal quimérico como se describe para determinar el grado de diversidad de anticuerpos (véase, por ejemplo. Harlow, E. & Lane, D. 1998, 5a edición, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Por ejemplo, la existencia en el suero de un animal quimérico de ciertos epítopos de anticuerpos se podría determinar mediante la unión a antisuero anti-idiotipo específico, por ejemplo, en un ensayo ELISA. Un experto en la técnica también podría secuenciar los genomas de clones de células B derivados del animal quimérico y comparar dicha secuencia con la secuencia de tipo salvaje para determinar el nivel de hipermutación, siendo dicha hipermutación indicativa de maduración normal de anticuerpos.
Un experto en la técnica también utilizaría dicho animal quimérico para examinar la función de anticuerpos en donde dichos anticuerpos se codifican a partir de los loci de Ig modificados por ingeniería genética (véase, p. ej. Harlow, E. & Lane, D. 1998, 5a edición, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Por ejemplo, se podría probar la unión de antisueros a un antígeno, utilizándose dicho antígeno para inmunizar al animal quimérico. Tal medición se podría realizar mediante un ensayo ELISA. Alternativamente, un experto en la técnica podría probar la neutralización del antígeno mediante la adición de los antisueros recogidos del animal quimérico inmunizado apropiadamente.
Es bien conocido por los expertos en la técnica que los resultados positivos para cualquiera de estas pruebas demuestran la capacidad de los loci de Ig modificados genéticamente, el objeto de la presente divulgación, para codificar anticuerpos con regiones variables humanas y regiones constantes de ratón, siendo dichos anticuerpos capaces de funcionar a modo de anticuerpos de tipo salvaje.
Técnicas experimentales:La modificación genética in vivo mediada por recombinación homóloga para la producción de vectores para su uso en recombinación homóloga en células ES se divulga, por ejemplo, en los documentos WO9929837 y WO0104288, y los mecanismos son bien conocidos en la técnica. En un aspecto, la modificación genética in vivo mediada por recombinación homóloga del ADN humano tiene lugar utilizando BAC como fuente de dicho ADN humano. El a Dn del BAC humano se aislará utilizando Kit de purificación de BAC QIAGEN®. La cadena principal de cada BAC humano se modificará utilizando modificación genética in vivo mediada por recombinación homóloga a la misma configuración exacta o similar que el BAC ya insertado en la región IgH de ratón. El inserto genómico de cada BAC humano se recortará utilizando modificación genética in vivo mediada por recombinación homóloga de modo que una vez que se inserten los BAC, se formará una parte contigua sin interrupciones de la región genómica de V(D)J humana en el locus IgH o IgK de ratón. La transfección de ADN de BAC por electroporación y genotipificación se realizará según protocolos convencionales (Prosser, H.M., Rzadzinska, A.K., Steel, K.P., y Bradley, A. (2008). "Mosaic complementation demonstrates a regulatory role for miosina VIIa in actin dynamics of stereocilia". Molecular and Cellular Biology 28, 1702-1712; Ramirez-Solis, R., Davis, A.C., y Bradley, A. (1993). "Gene targeting in embryonic stem cells". Methods in Enzymology 225, 855-878.). La modificación genética in vivo mediada por recombinación homóloga se realizará utilizando los procedimientos y reactivos desarrollados por los laboratorios Pentao Liu y Don Court (Chan, W., Costantino, N., Li, R., Lee, S.C., Su, Q., Melvin, D., Court, D.L., y Liu, P. (2007). "A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction". Nucleic Acids Research 35, e64).
Estas y otros mecanismos para el direccionamiento génico y la recombinación de fragmentos cromosómicos derivados de BAC en un genoma de mamífero no humano, tal como un ratón, son bien conocidas en la técnica y se divulgan, por ejemplo, en la Red Mundial (www) eucomm.org/information/targeting y Red Mundial (www) eucomm.org/information/publications.
El cultivo celular de líneas celulares derivadas de C57BL/6N, tales como las células ES JM8 macho seguirá técnicas convencionales. Se ha demostrado que las células ES JM8 son competentes para contribuir extensamente a los tejidos somáticos y a la línea germinal, y están siendo utilizadas para grandes programas de mutagénesis en ratón en el Instituto Sanger tales como EUCOMM y KOMP (Pettit, S.J., Liang, Q., Rairdan, X.Y., Moran, J.L., Prosser, H.M., Beier, D.R., Lloyd, K.C., Bradley, A., y Skarnes, W.C. (2009). "Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources". Nature Methods.). Las células JM8 ES (1,0*107) se someterán a electroporación (500 pF, 230V; Bio-Rad®) con 10 pg de ADN de BAC humano linealizado con I-Scel. Los transfectantes se seleccionarán con puromicina (3 pg/ml) o G418 (150 pg/ml). La selección comenzará 24 horas (con G418) o 48 horas (con puromicina) después de la electroporación y continuará durante 5 días. Diez pg de ADN de BAC humano linealizado pueden producir hasta 500 colonias de células ES resistentes a puromicina o G418. Las colonias de células ES resistentes a antibióticos se recogerán en placas de cultivo celular de 96 pocillos para la genotipificación para identificar los clones diana.
Una vez identificados los clones de células ES de ratón diana, se analizarán mediante hibridación genómica comparativa (CGH) de matrices para determinar la integridad total del genoma (Chung, Y.J., Jonkers, J., Kitson, H., Fiegler, H., Humphray, S., Scott, C., Hunt, S., Yu, Y., Nishijima, I., Velds, A., et al. (2004). "A whole-genome mouse BAC microarray with 1-Mb resolution for analysis of DNA copy number changes by array comparative genomic hybridization". Genome research 14, 188-196y Liang, Q., Conte, N., Skarnes, W.C., y Bradley, A. (2008). "Extensive genomic copy number variation in embryonic stem cells". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 17453-17456.). Las células ES que tienen genomas anormales no contribuyen a la línea germinal de los ratones quiméricos de manera eficaz. La integridad del BAC se examinará mediante amplificación por PCR de cada gen V funcional conocido en el BAC. Por ejemplo, en un enfoque, el primer BAC humano elegido para el locus IgH tiene 6 genes V funcionales. Para confirmar la integridad de este BAC para determinar la presencia de estos 6 genes V de IGH, se diseñarán al menos 14 pares de cebadores de PCR y se utilizarán para amplificar por PCR el ADN genómico de las células ES diana. El tamaño y secuencia de tipo salvaje humana de estos fragmentos garantizarán que el BAC insertado no se haya reordenado.
La CGH más detallada también confirmará la integridad de los BAC insertados. Por ejemplo, un experto en la técnica podría utilizar una plataforma oligo aCGH, que es desarrollada por Agilent Technologies, Inc. Esta plataforma no solo permite estudiar la variación del número de copias de ADN para todo el genoma a alta resolución (Barrett, M.T., Scheffer, A., Ben-Dor, A., Sampas, N., Lipson, D., Kincaid, R., Tsang, P., Curry, B., Baird, K., Meltzer, P.S.,et al.(2004). "Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 17765-17770.), pero permiten el examen de una región genómica específica utilizando matrices diseñadas a medida. Comparando las técnicas tradicionales de aCGH que dependen de sondas de ADNc o sondas de BAC completas, las sondas de oligonucleótidos de 60 unidades pueden garantizar la hibridación específica y la alta sensibilidad y precisión que se necesitan para detectar las alteraciones cromosómicas modificadas genéticamente que se hicieron. Por ejemplo, los oligos diseñados para hibridarse a intervalos regulares a lo largo de toda la longitud del BAC insertado detectarían incluso deleciones, inserciones u otros reordenamientos bastante cortos. Además, esta plataforma proporciona la mayor flexibilidad para diseños de micromatrices personalizados. El ADN genómico de células ES diana y el ADN genómico de individuo humano normal se marcarán por separado con colorantes e hibridarán con la matriz. Los portaobjetos de matrices se explorarán utilizando un escáner de micromatrices de ADN de Aglient Technologies. Las intensidades de fluorescencia recíprocas del colorante Cy5 y el colorante Cy3 en cada imagen de matriz y los valores de la razón log2 se extraerán utilizando el soporte lógico Bluefuse (Bluegnome). Se excluirán manchas con patrones de fluorescencia irregulares ("confianza" < 0,29 o "calidad" = 0) antes de normalizar todos los valores de la razón log2. En un experimento, la razón Log2 entre -0,29 y 0,29 para la señal de cualquier oligosonda se considera que no hay cambio en el número de copias. El umbral de razón log2 para "Duplicación" es normalmente >0,29999, y para la deleción es <0,29999.
Una vez que el primer BAC humano se inserta en el locus IgH de ratón y se confirma que está en su configuración nativa intacta, la cadena principal del BAC flanqueada por FRT se escindirá utilizando recombinasa específica de sitio Flp. Si la recombinación de FRT catalizada por Flp regular no es suficientemente alta, se puede utilizar Flo, una versión mejorada de recombinasa Flpo que en ciertas pruebas es 3-4 veces más eficiente que la Flp original en células ES. Después de que se escinda la cadena principal del BAC, las células ES se volverán sensibles a puromicina (o G418) y resistentes a FIAU (para pérdida del casete de TK). Los eventos de escisión se caracterizarán adicionalmente por amplificación mediante PCR del fragmento de unión utilizando cebadores de ADN genómico humano. Estas células ES libres de cadena principal de BAC flanqueada por FRT se utilizarán para la siguiente ronda de inserción de BAC humano y para inyección de blastocistos.
El direccionamiento del genoma de una célula ES para producir un ratón transgénico se puede llevar a cabo utilizando un protocolo como se explica mediante la referencia a las figuras 1-18 adjuntas.
La Figura 1 ilustra tres vectores de cadena principal básicos; un casete de inicio y 2 vectores inserto grandes 1 y 2 respectivamente. El casete de inicio comprende secuencias homólogas al sitio de inserción deseado en el genoma de ratón, flanqueando esos sitios un marcador seleccionable y una secuencia de cebador de relleno para genotipificación basada en PCR para confirmar la inserción correcta de BAC. La secuencia de cebador de relleno proporciona la base para genotipificar cada etapa de adición de BAC. Se considera que esta secuencia proporciona un molde de secuencia bien validado, robusto para el cebador de PCR y puede localizarse en el sitio IScel, idealmente ~1 kb desde el inserto de BAC.
Los vectores inserto grandes comprenden ADN humano en plásmidos con marcadores seleccionables y un sitio de restricción único para la linealización del plásmido para ayudar a la recombinación homóloga en el genoma de la célula ES.
La Figura 2 ilustra la inserción de un casete de inicio en el genoma de ratón mediante recombinación homóloga entre los exones alfa J4 y C de ratón. La selección con puromicina permite la identificación de células ES con inserción del casete. pu(Delta)tk es una proteína de fusión bifuncional entre puromicina N-acetiltransferasa (Puro) y una versión truncada de timidina quinasa del virus del herpes simplex tipo 1 (DeltaTk). Las células madre embrionarias murinas (ES) transfectadas con pu(Delta)tk se vuelven resistentes a puromicina y sensibles a 1-(-2-desoxi-2-fluoro-1-beta-D-arabinofuranosil)-5-yodouracilo (FIAU). A diferencia de otros transgenes tk de HSV1, puDeltatk se transmite fácilmente a través de la línea germinal masculina. Por tanto, pu(Delta)tk es un marcador seleccionable positivo/negativo conveniente que se puede utilizar ampliamente en muchas aplicaciones de células ES.
La Figura 3 ilustra el direccionamiento del vector inserto grande 1 al genoma de la célula ES de ratón. La linealización del vector se realiza en la misma posición que la secuencia del cebador de relleno que permite una estrategia de genotipificación de reparación de huecos, bien conocida en la técnica - véase Zheng et al., NAR 1999, Vol 27, 11, 2354-2360. En esencia, la inserción aleatoria del vector de direccionamiento en el genoma no "reparará" el hueco, mientras que un evento de recombinación homóloga reparará el hueco. La yuxtaposición de secuencias apropiadas de cebadores de PCR permite escrutar individualmente colonias para localizar un fragmento positivo de PCR que indica la inserción apropiada. La selección positiva utilizando G418 permite la identificación de células ES de ratón que contienen el marcador de selección neo. Se puede realizar la verificación por PCR de todas las regiones críticas V, D y J. La hibridación genómica comparativa de matrices se puede utilizarse para validar la estructura de BAC.
La Figura 4 ilustra que el casetepuro-delta-tky la cadena principal del plásmido BAC se suprimen utilizando Flpe y se seleccionan en FIAU. Puesto que Flpe funciona ineficientemente en células ES de ratón (5% de deleción con expresión transitoria de Flpe), se espera que, en la mayoría de los casos, la recombinación ocurra entre los dos sitios FRT que flanquean la cadena principal del BAC. Flpo también se puede probar para averiguar la eficacia de recombinación entre dos sitios FRT que están a 10 kb de distancia.
Dado que la etapa de deleción de FRT es seleccionable, es posible agrupar clones resistentes a FIAU y proceder inmediatamente a la siguiente etapa en paralelo con el análisis clonal. Alternativamente, puede ser deseable mostrar mediante PCR de corto alcance que las secuencias humanas están ahora adyacentes a las del ratón como se muestra (cebador Hu 1 y cebador Mo)
En esta fase se habrá insertado un locus humano de 200 kb.
La Figura 5 ilustra un segundo vector inserto grande que se dirige al cromosoma de las células ES. El BAC humano se dirige al locus IgH de ratón utilizando la misma inserción de casete de inicio seguido de linealización de BAC porIScel,direccionamiento de BAC al casete de inicio y estrategia de genotipificación de reparación de huecos. La verificación de la inserción de BAC se lleva a cabo como antes.
La Figura 6 ilustra que la cadena principal de BAC flanqueada por FRTY del vector inserto grande 2 y el marcador neo se suprimen medianteFlpo.Obsérvese que esto no es seleccionable, por lo tanto, será necesario para el análisis clonal en este punto. Esto permitirá la confirmación de la yuxtaposición del inserto 2 humano con 1 humano y otros esfuerzos de validación.
En esta fase se habrá insertado un locus humano de ~ 200 kb.
La Figura 7 ilustra el siguiente vector inserto grande dirigido al locus IgH de ratón. El casete pu-delta TK se retira a continuación, como para la figura 4. El procedimiento puede repetirse para incorporar otros BAC.
La Figura 8 ilustra la construcción final de células ES predicha.
Las Figuras 9-18 proporcionan un nivel adicional de detalle de este procedimiento.
Ejemplo 2
Recombinación específica de sitio
En un método adicional de la divulgación, también se puede emplear recombinación específica de sitio. La recombinación específica de sitio (SSR) se ha utilizado ampliamente en los últimos 20 años para la integración de transgenes en loci cromosómicos definidos. SSR implica la recombinación entre secuencias de ADN homólogas.
La primera generación de direccionamiento cromosómico basado en SSR implicaba la recombinación entre (i) un único sitio diana de recombinación (RT) tal como loxP o FRT en un plásmido transfectado con (ii) un sitio RT cromosómico proporcionado por una integración previa. Un problema importante con este enfoque es que los eventos de inserción son raros ya que la escisión siempre es más eficiente que la inserción. Una segunda generación de SSR denominada RMCE (intercambio de casete mediado por recombinasa) fue introducida por Schlake y Bode en 1994 (Schlake, T.; J. Bode (1994). Use of mutated FLP-recognition-target-(FRT-) sites for the interchange of expression cassettes at defined chromosomal locus. Biochemistry 33: 12746-12751). Su método se basa en el uso de dos RT heteroespecíficos e incompatibles en el plásmido transfectado que pueden recombinarse con sitios RT compatibles en el cromosoma, dando como resultado el intercambio de un fragmento de ADN por otro, o un intercambio de casete. Este enfoque se ha explotado con éxito en una variedad de direccionamiento cromosómico eficaz, incluyendo integración de insertos de BAC de más de 50 kb (Wallace, H.A.C. et al. (2007). "Manipulating the mouse genome to engineering accurate functional syntenic replacements with human sequence". Cell 128: 197-209; Prosser, H.M. et al. (2008). "Mosaic complementation demonstrates a regulatory role for miosina VIIa in actin dynamics of Stereocilia". Mol. Célula. Biol.
28: 1702-12).
El tamaño de inserto más grande de un BAC es de aproximadamente 300 kb y, por lo tanto, esto pone un límite superior en el tamaño de casete para RMCE.
En la presente divulgación se utilizó una nueva técnica basada en SSR denominada RMCE secuencial (SRMCE), que permite la inserción continua de insertos de BAC en el mismo locus.
El método comprende las etapas de
1 Inserción de ADN que forma un casete de inicio (también denominado lugar de emplazamiento genómico en el presente documento) en el genoma de una célula;
2 inserción de un primer fragmento de ADN en el sitio de inserción, comprendiendo el primer fragmento de ADN una primera porción de un ADN humano y una primera porción del vector que contiene un primer marcador seleccionable o que genera un marcador seleccionable tras la inserción;
3 - eliminación de parte del ADN vector;
4 inserción de un segundo fragmento de ADN en la porción del vector del primer fragmento de ADN, conteniendo el segundo fragmento de ADN una segunda porción de ADN humano y una segunda porción del vector, conteniendo la segunda porción del vector un segundo marcador seleccionable, o generando un segundo marcador seleccionable tras la inserción;
5 la eliminación de cualquier ADN vector para permitir que el primer y segundo fragmentos de ADN humano formen una secuencia contigua; y
6 repetición de las etapas de inserción de una parte del ADN de V(D)J humano y de eliminación del ADN vector, según sea necesario, para producir una célula con la totalidad o parte de la región VDJ o VJ humana suficiente para ser capaz de generar un anticuerpo quimérico junto con una región constante del anfitrión,
en donde la inserción de al menos un fragmento de ADN utiliza recombinación específica de sitio.
En un aspecto específico, el enfoque utiliza tres sitios loxP heteroespecíficos e incompatibles. El método está compuesto por las siguientes etapas, e ilustrado en las Figuras 22-26:
1.Direccionamiento de un lugar de emplazamiento genómico al locus definido.Un vector de entrada que contiene un minigen de HPRT flanqueado por ITR de piggyBac (PB) invertido se dirige a una región definida (por ejemplo: una región entre IGHJ y Eg o IGKJ eK o IGLC1 y E<á>3-1) para que sirva como un lugar de emplazamiento genómico para el direccionamiento de BAC. El minigen HPRT está compuesto por dos exones sintéticos e intrón asociado. El exón 5' de HPRT está flanqueado por dos sitios loxP heteroespecíficos e incompatibles (uno de tipo salvaje y el otro un sitio mutado, lox5171) en orientación invertida entre sí (Fig. 22). Estos dos sitios loxP proporcionan sitios de recombinación para la inserción de BAC a través de RMCE.
2.Inserción del 1er BAC modificado en el lugar de emplazamiento genómico diana.El 1er BAC tiene una longitud de ADN que se insertará en el genoma flanqueado por modificaciones diseñadas genéticamente. La modificación 5' (loxP - gen neo - lox2272 - promotor PGK - PB 5'LTR) y la modificación 3' (PB3'LTR - gen puroATK - LOX5171) se representan en la Fig. 23 junto con las orientaciones relativas de los sitios lox y las LTR de PB. Con la expresión transitoria de CRE a partir de un vector sometido a electroporación conjuntamente, la secuencia de ADN se insertaría en el locus definido a través de RMCE. Las células en las que se ha producido una inserción correcta se pueden seleccionar de la siguiente manera: (i) resistencia a puromicina (el gen puroATK ha adquirido un promotor -"PGK" - del lugar de emplazamiento genómico), (ii) resistencia a 6T<g>(el minigen HPRT se ha alterado), y (iii) resistencia a G418 (selecciona cualquier inserción a través del ordenamiento PGK-neo de la región 5'). Se puede utilizar cualquier combinación de estos regímenes de selección. La resistencia a G418 y 6TG selecciona los eventos correctos en el extremo 5', mientras que la resistencia a Puro selecciona los eventos correctos en el extremo 3'.
3.Curado (eliminación) de la modificación 3' de la 1a inserción.Un 1er BAC insertado adecuadamente da como resultado el extremo 3' que tiene un gen puroATK flanqueado por LTR de PB invertidas (Fig. 24) -esencialmente una estructura de transposón apropiada. Este transposón puede ser eliminado después por la expresión transitoria de la transposasa piggyBac (de un vector sometido a electroporación). Las células con el evento de escisión correcto pueden seleccionarse por resistencia a FIAU, es decir, sin actividad timidina quinasa del gen puroATK. Esto elimina completamente la modificación 3' sin dejar nucleótidos traza.
4.Inserción de un 2° BAC modificado en el extremo 5' de 1a inserción.El 2° BAC tiene una longitud de ADN que se va a insertar en el genoma (normalmente destinado a ser contiguo al ADN insertado con el 1er BAC) flanqueado por modificaciones diseñadas mediante ingeniería genética. La modificación 5' (loxP - porción 5' del minigen HPRT - lox5171 - promotor PGK - PB5'LTR) y la modificación 3' (PB3'LTR - puroATK - lox2272) se representan en la Fig. 25 junto con las orientaciones relativas de los sitios lox y las LTR de PB. Con la expresión transitoria de CRE a partir de un vector sometido a electroporación conjuntamente, la secuencia de ADN se insertaría en el locus definido a través de RMCE. Las células en las que se había producido una inserción correcta se pueden seleccionar de la siguiente manera: (i) resistencia a HAT (el minigen HPRT se reconstituye mediante un evento de inserción correcto, es decir: las estructuras de exón 5' y 3' se juntan), y (ii) resistencia a puromicina (el gen puroATK ha adquirido un promotor -"PGK" - del lugar de emplazamiento genómico).
5.Curado (eliminación) de la modificación 3' de la 2a inserción.Un 2° BAC insertado adecuadamente da como resultado el extremo 3' que tiene un gen puroATK flanqueado por LTR de PB invertidas (Fig. 26) -esencialmente una estructura de transposón apropiada, exactamente análoga a la consecuencia de una 1a inserción de BAC satisfactoria. Y por lo tanto este transposón se puede eliminar igualmente por la expresión transitoria de la transposasa piggyBac (de un vector sometido a electroporación). Las células con el evento de escisión correcto se pueden seleccionar por resistencia a FIAU, es decir, sin actividad timidina quinasa del gen puroATK. Esto elimina completamente la modificación 3' sin dejar nucleótidos traza.
6. Después del curado de la modificación 3' de la 2a inserción de BAC, el lugar de emplazamiento genómico se vuelve idéntico al original. Este procedimiento completo, etapas 2 a 5, se puede repetir múltiples veces para construir una gran inserción en el genoma. Cuando se completa, no quedan nucleótidos residuales distintos de la inserción deseada.
Con la inserción de un número impar de BAC en los loci de Ig, las secuencias endógenas de VDJ o VJ se pueden inactivar a través de una inversión mediante ingeniería cromosómica como sigue (véanse las figuras 27-29):
1.Direccionamiento de un casete "de volteo" a una región 5' de 10 a 40 megabases lejos de VDJ o VJ endógenos.El vector de volteo (PB3'LTR - promotor de PGK - porción 5' del minigen HPRT - loxP - puroATK -promotor de CAGGS - PB3'LTR) se representa en la Fig. 27 junto con las orientaciones relativas de los sitios lox y las LTR de PB.
2. La expresión transitoria de CRE dará como resultado la recombinación entre el sitio loxP en el casete "de volteo" y el sitio loxP en la modificación 5'. Esta modificación 5' es como se describe en las Etapas 2 y 3 anteriores - esencialmente la modificación resultante de la inserción de un número impar de BAC, después de que la modificación 3' se haya curado. Los sitios loxP se invierten uno con respecto al otro y por lo tanto el evento de recombinación descrito da como resultado una inversión como se representa en la Fig. 28. Las células con la inversión correcta serán resistentes a HAT ya que el minigen HPRT se reconstituye mediante una inversión correcta.
3. Una inversión correcta también deja dos estructuras de transposón flanqueando el casete "de volteo" y la modificación 5'. Ambas pueden escindirse con expresión transitoria de transposasa piggyBAC, sin dejar remanente de cualquier modificación (Fig. 29). Las células con las escisiones correctas se pueden seleccionar de la siguiente manera: (i) resistencia a 6TG (se suprime el minigen HPRT) y (ii) resistencia a FIAU (se suprime el gen puroATK). Una inversión como se describe en los loci de Ig movería la región IGH-VDJ o IGK-VJ endógenas lejos de la región potenciadora E|u o Ek, respectivamente, y conduciría a la inactivación de las regiones IGH-VDJ o IGK-VJ endógenas.
Los métodos de inserción de la divulgación proporcionan adecuadamente uno o más de:
Selección en ambos extremos 5' y 3' del fragmento de ADN insertado;
Curado eficiente de la modificación 3', preferiblemente por escisión de ADN mediada por transposasa;
Inactivación de la actividad de IGH o IGK endógenas a través de una inversión; y
Escisión de modificaciones, sin dejar que queden trazas de nucleótidos en el cromosoma.
Ejemplo 3 (Ejemplo de referencia)
Inserción de un vector de prueba en el genoma en una ubicación definida
La prueba de concepto del enfoque se divulga en la Figura 30. En la Figura 30 se insertó un lugar de emplazamiento genómico como se muestra en la Figura 22 en el genoma de un ratón por recombinación homóloga, seguido por inserción del plásmido R21 en ese lugar de emplazamiento genómico por medio de recombinación específica de sitio mediada por cre. El evento de inserción generó una serie de eventos de inserción generales, 360 colonias resistentes a G418, de las cuales ~220 se insertaron en el locus deseado, como se demuestra por la interrupción del minilocus HRPT.
El vector R21 imita el 1er vector de inserción de BAC en los extremos 5' y 3', incluyendo todos los elementos de selección y sitios diana de recombinasa. En lugar de secuencias de BAC, hay una pequeña secuencia "de relleno". Este vector someterá a prueba todos los principios diseñados en la divulgación y permitirá una prueba fácil de los resultados en que la PCR a través del relleno es factible, y por lo tanto permite que ambos extremos de la inserción se sometan a prueba fácilmente. R21 se sometió a electroporación conjunta con un vector que expresa cre en las células ES que albergan el lugar de emplazamiento genómico en el locus IGH. Se transfectaron cuatro conjuntos de células transformadas en paralelo y después se colocaron bajo diferentes regímenes de selección como se indica en la Figura 30. La selección con G418 (expresión del gen neo) dio como resultado el mayor número de colonias debido a que no hubo requisitos para la integración específica del lugar de emplazamiento genómico. Cualquier integración de R21 en el genoma proporcionará la expresión de neo que conduce a resistencia a G418. La selección con Puro dio como resultado un número de colonias similar a Puro 6TG o G418 6TG, lo que sugiere que la rigurosidad de la selección con Puro se debe a que la PuroATK carece de un promotor en el vector. La expresión de Puro sólo se adquiere cuando se produce una integración cerca de un elemento promotor - en este diseño lo más probablemente específicamente en el lugar de emplazamiento genómico. Estas conclusiones están apoyadas por los resultados de la PCR de unión que se muestra en la Figura 31. La siguiente etapa en la divulgación es el "curado" del extremo 3' del vector BAC integrado, dejando una transición sin interrupciones entre la inserción y el genoma flanqueante. Este curado se demostró expandiendo un clon individual desde arriba (R21 insertado en el lugar de emplazamiento genómico) y expresando la recombinasa piggyBac en este clon mediante la transfección de un plásmido de expresión. Se utilizó FIAU para seleccionar colonias en las que se escindió la modificación 3' - es decir, a través de la pérdida del elemento 'PGK-puroATK' entre las repeticiones terminales piggyBac. Cincuenta de tales clones resultaron de una transfección de 106 células; de estos, seis se sometieron a prueba para determinar la estructura genómica esperada. El curado satisfactorio dio como resultado una PCR positiva entre el conjunto de cebadores marcado como "3" en la Figura 32. De los 6 clones, 4 tuvieron escisiones correctas, 1 clon permaneció en la configuración original y 1 otro tuvo una deleción.
Estos datos demuestran la inserción iterativa de ADN en un lugar de emplazamiento genómico en un locus genómico definido utilizando los enfoques esbozados anteriormente.
Ejemplo 4 (Ejemplo de referencia)
Inserción de partes grandes de los loci de Ig humana en posiciones definidas en el genoma de ratón
El Ejemplo 3 demostró que el diseño de la divulgación reivindicada era capaz de proporcionar la inserción de un vector de prueba en el genoma en una ubicación definida, en este caso el vector R21 en el locus IGH de ratón. El uso de los medios de selección apropiados y la expresión de recombinasa cre dieron como resultado una alteración genómica con la estructura predicha.
Los mismos elementos de diseño descritos en esta divulgación se construyeron en los extremos 5' y 3' de un inserto de BAC. Dicho inserto comprendía secuencias humanas del locus IGH y era de aproximadamente 166 kb. Este BAC modificado por ingeniería genética se sometió a electroporación junto con un ADN plasmídico que expresa cre en células ES de ratón que albergaban el lugar de emplazamiento genómico en el locus IGH de ratón. La población celular transfectada se cultivó en medio que contenía Puro para seleccionar los eventos de inserción apropiados.
Se aislaron siete clones resultantes y se analizaron adicionalmente. El evento de recombinación esperado y la estructura resultante se representan en la Figura 33. Basándose en los datos del experimento R21 esbozado en el Ejemplo 3, se esperaba una selección rigurosa para los clones correctos cuando la población transfectada se seleccionó en medios que contenían Puro. Esto se debe a que la región codificante de Puro requiere un elemento promotor y éste es suministrado preferiblemente por el lugar de emplazamiento genómico después de la recombinación. Por consiguiente, la mayoría de los 7 clones aislados se habían insertado correctamente en el genoma en el lugar de emplazamiento genómico según se determina por la PCR diagnóstica. Los cebadores para diagnosticar una inserción correcta se representan en la Figura 33. Las uniones correctas están presentes en el genoma si un fragmento de 610 pb se amplifica entre los cebadores 'A' y 'X' y un fragmento de 478 pb se amplifica entre los cebadores 'Y' y 'B' (Figuras 33 y 34). Obsérvese que existen fragmentos amplificados entre cebadores 'A' y '1' y cebadores '2' y 'B' que indican la presencia de genoma parental (es decir, el lugar de emplazamiento genómico solo). Estos resultan de células parentales presentes internamente en las colonias celulares bajo selección con Puro que escapan de la selección debido a la geometría de una colonia. Después de pasar la colonia a través de medios que contienen Puro, estos fragmentos de unión parentales desaparecen, lo que indica que las células parentales se eliminan de la población. Además, se demostró que todos los clones eran resistentes a 6-TG como se esperaba si el gen HPRT se inactivaba por el evento de inserción correcto.
Estos datos indican que la estrategia divulgada para insertar partes grandes de los loci de IG humana en posiciones definidas en el genoma de ratón permitirá la construcción de un ratón con una pluralidad de las regiones variables de regiones de IG humana aguas arriba de las regiones constantes de ratón como se describe.
Ejemplo 5 (Ejemplo de referencia)
Los loci insertados son funcionales en términos de reordenamiento génico, diversidad de unión, así como expresión
Se crearon cromosomas artificiales bacterianos (BAC), en donde que los BAC tenían insertos de segmentos génicos de Ig humanos (segmentos génicos V, D y/o J humanos). Empleando los métodos descritos en el presente documento, se utilizaron lugares de emplazamiento genómico en un método para construir loci quiméricos de Ig en células madre embrionarias de ratón (células ES), de manera que se proporcionaron loci quiméricos IgH e IgK en los que se insertan funcionalmente segmentos génicos humanos aguas arriba de regiones constantes endógenas. Para probar si los segmentos génicos IgH-VDJ o IgK-VJ humanos en los ratones quimera derivados de clones de células ES con inserción de BAC humano se reorganizan y expresan de manera apropiada, se realizó una RT-PCR para las muestras de ARN de glóbulos blancos de esos ratones con los pares de cebadores de la región variable (V) humana y la región constante (C) de ratón. Las secuencias de oligos se muestran como sigue (Tabla 1). Cada oligo V se empareja con oligo C (HV con Cg; KV con Ck) para la reacción de PCR.
Tabla 1:
Usando la formulación de una etapa de Superscript™ III One-Step RT-PCR System Platinum® Taq High Fidelity (Invitrogen™; Red mundial(www)invitrogen.com/site/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-amplification-andexpression-profiling/pcr-protocol/superscript-3-one-step-rt-pcr-system-with-platinum-taq-high-fidelity.html#prot3), tanto la síntesis de ADNc como la amplificación por PCR se lograron en un único tubo utilizando cebadores específicos de gen y ARN diana.
Los resultados de la RT-PCR mostraron que la mayoría de los segmentos génicos IGH-VDJ o IGK-VJ humanos se reordenaron y expresaron apropiadamente en los ratones quimera. Para investigar los detalles sobre la diversidad generada a partir del reordenamiento de VDJ/VJ, se clonaron esos fragmentos de RT-PCR específicos en un vector común para la secuenciación.
Los resultados de la secuenciación indican que los usos de JH, DH y JK (Fig. 35 y Fig.36) son similares a los resultados humanos. Además, los resultados de los transcritos de IGH-VDJCg muestran que el rango y la media de la longitud de CDR-H3 (Fig. 37) son similares a los observados en seres humanos. También se observó la diversidad de unión generada a partir de las actividades de adición de exonucleasa y nucleótidos (Fig. 38). El reordenamiento de IGH poseía una frecuencia más alta de estas actividades en comparación con la de IGK. Estos datos sugieren que los loci insertados son funcionales en términos de reordenamiento génico, diversidad de unión, así como expresión.
Ejemplo 6 (Ejemplo de referencia)
Se pueden obtener reordenamiento productivo de VJ e hipermutación somática
La Figura 41 muestra un análisis de ARNm kappa de células B de ratón que portan VJ reordenado, habiendo sido reordenado VJ a partir de V1-8 y J1 kappa de la línea germinal humana, y demuestra que se pueden obtener tanto un reordenamiento productivo de VJ como una hipermutación somática, esto último como se observa en los cambios en anticuerpos codificados por ARNm con respecto a las secuencias de la línea germinal. Lo mismo se muestra para V1-6 y J1 en la Figura 42. Es importante destacar que la recombinación elimina codones de parada que están codificados por la combinación de segmentos génicos de la línea germinal humana (no mutados), permitiendo de este modo secuencias de ARNm que codifican anticuerpos. La Figura 43 demuestra que V1-5 J1 y V1-5 J4 kappa humanos insertadas pueden producir secuencias codificantes funcionales in vivo y diversidad de uniones.
Ejemplo 7 (Ejemplo de referencia)
Inactivación del uso de segmentos génicos HV de IG endógenos para la cadena pesada reordenada expresada mediante inversión
Introducción
Se generó una biblioteca específica de Cg 5'-RACE a partir de linfocitos B esplénicos de ratones transgénicos, denominados ratones S1. Estos ratones comprenden loci de cadena pesada transgénica, conteniendo cada locus los seis segmentos génicos Vh humanos funcionales más 3' (Vh2-5, 7-4-1, 4-4, 1-3, 1-2, 6-1), y todos los segmentos génicos D y Jh humanos (que comprenden los segmentos génicos D humanos funcionales D1 -1,2-2, 3-3, 4-4, 5-5, 6 6,1-7.2-8, 3-9, 5-12, 6-13, 2-15, 3-16.4-17, 6-19, 1 -20, 2-21,3-22, 6-25, 1 -26 y 7-27; y segmentos génicos J humanos funcionales J1, J2, J3, J4, J5 y J6) insertados en el locus endógeno de la cadena pesada entre IGHJ4 y Eg endógenos (cromosoma 12 de ratón: entre las coordenadas 114666435 y 114666436). El ADN humano se obtuvo de un cromosoma artificial bacteriano (BAC) que contenía la secuencia del cromosoma 14 humano de la coordenada 106328951 a la coordenada 106494908. Los detalles adicionales sobre la construcción de loci de anticuerpos transgénicos utilizando sRMCE se proporcionan en otra parte en el presente documento y en el documento WO2011004192. Se seleccionaron aleatoriamente placas de 4x96 pocillos de clones para la secuenciación para determinar el uso de los segmentos génicos. Todas las cadenas pesadas de inmunoglobulina detectadas se reordenaron a partir de Vh de ratón o Vh humano con D-Jh humano. No se detectaron segmentos D y Jh de ratón en productos reordenados (Fig. 44).
Este resultado indica que la inserción de segmentos génicos Vh-D-Jh humanos en un locus endógeno entre la última región J endógena (en este caso, J<h>4) y el potenciador Eg inactiva eficazmente el uso de segmentos génicos D y J<h>endógenos para cadenas pesadas de inmunoglobulina reordenadas expresadas.
La razón de uso de Vh de ratón respecto a Vh humano fue de alrededor de 3 a 1 (Fig. 45). Para eliminar completamente el uso de V<h>de ratón para la generación de anticuerpos, se invirtió V<h>-D-J<h>endógeno de ratón y se movió a una región distante del mismo cromosoma. El reordenamiento de los segmentos V<h>de ratón respecto a D-V<h>humano se bloqueó totalmente por los efectos de la inversión y la distancia desde el locus de la cadena pesada.
La estrategia de inversión incluía tres etapas: (a) direccionamiento de un casete de inversión, (b) inversión de VDJ endógeno y (c) escisión de marcadores (Fig. 46).
(a) Direccionamiento del casete de inversión:
El casete de inversión consiste en cuatro componentes: un gen de delta-timidina quinasa resistente a puromicina (puroAtk) guiado por el promotor CAGGS, un segmento génico 5' HPRT bajo el control del promotor PGK, un sitio loxP entre ellos e inversamente orientado a otro sitio loxP ya en el locus de la cadena pesada, y dos LTR piggyback flanqueantes (PB3'LTR). El casete de direccionamiento de inversión se insertó en una región que está 5' y distante del locus endógeno de IGH en el cromosoma 12 como se muestra en la figura 46. Los clones de ES diana se identificaron y confirmaron por PCR.
(b) Inversión:
Después de la inserción, la expresión transitoria de cre a partir de un plásmido transfectado dio como resultado la inversión de una sección del fragmento del cromosoma 12 que incluía el locus endógeno Vh-D-Jh y secuencias intermedias a través de recombinación de dos sitios loxP invertidos, es decir, aquellos en el casete de inversión y el lugar de emplazamiento genómico para la inserción de BAC respectivamente. Los productos de la inversión se seleccionaron mediante HAT y se confirmaron mediante cruce por PCR de unión de los dos sitios loxP recombinados.
(c) Escisión de marcadores:
La inversión reordenó la orientación relativa de las PB3'LTR del casete de inversión y las PB5'LTR del lugar de emplazamiento genómico para generar dos estructuras de transposón piggyBac que flanqueaban la región invertida. Con la expresión transitoria de la transposasa piggyBac (PBasa), estos dos transposones se escindieron del cromosoma (y por lo tanto del genoma celular de ratón). Los clones de ES curados se seleccionaron mediante 1-(2-desoxi-2-fluoro-1-b-D-arabinofuranosil)-5-yodouracilo (FIAU) y 6TG, y se confirmaron mediante cruce por PCR de unión de las regiones escindidas.
Métodos
Cultivo tisular:Los procedimientos para el cultivo de células ES, electroporación y selección de fármacos se han descrito previamente (Ramirez-Solis, R., A. C. Davis, y A. Bradley. 1993. Gene targeting in mouse embryonic stem cells. Methods Enzymol. 225:855-878).
Direccionamiento del locus para inversión:En resumen, la línea celular S1 (S1.11.1) se cultivó en medio M15 (DMEM Knockout™complementado con suero bovino fetal al 15%, glutamina 2 mM, antibióticos y 2-mercaptoetanol 0,1 mM). La construcción de direccionamiento R57 (Fig. 47) se linealizó fuera de la región de homología por medio de Notl. Un total de 20 pg de la construcción linealizada se sometió a electroporación en líneas celulares S1 (derivadas de AB2.1) con un Bio-Rad® Genepulser™, se colocaron en placas 107 células en tres placas alimentadoras SNL76/7 de 90 mm de diámetro que contenían medio M15. A las 24 h de la electroporación, se añadió M15 que contenía puromicina (3 pg del ingrediente activo por ml) a cada placa de 90 mm de diámetro, y las células se mantuvieron bajo selección durante 9 días. A continuación, se seleccionaron 96 clones resistentes a puromicina y se expandieron en placas de 96 pocillos. Los eventos de direccionamiento se identificaron mediante PCR de largo alcance.
Inversión mediada por Cre-loxP:Los 12 clones positivos se reunieron y se cultivaron en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos con medio M15. Las células se transfectaron con 10 pg de plásmido pCAGGS-Cre para la inversión del locus endógeno de ratón y después se sembraron en tres placas alimentadoras SNL76/7 de 90 mm de diámetro que contenían medio M15. A las 24 h de la electroporación, se añadió M15 que contenía 1XHAT (hipoxantina-aminopterinatimidina) a cada placa de 90 mm de diámetro, y las células se mantuvieron bajo selección durante 7 días y después se trataron con 1XHT (hipoxantina-timidina) durante 2 días. Se seleccionaron 48 colonias resistentes a HAT y se genotipificaron mediante amplificación por PCR de las uniones después de la inversión mediada por Cre-loxP.
Escisión de marcadores mediada por HyPBase:Los 12 clones positivos se reunieron y se cultivaron en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos utilizando medio M15. Las células se transfectaron con 5 pg de plásmido HyPBase para activar las LTR del transposón PB que flanquean dos marcadores de selección (minigen Hprt y gen PGK-puroAtk) y se sembraron en una placa alimentadora SNL76/7 de 90 mm de diámetro que contenía medio M15. A las 72 h de la electroporación, se sembró una dilución en serie de las células en tres placas alimentadoras SNL76/7 de 90 mm de diámetro que contenían M15 complementado con 1-(-2-desoxi-2-fluoro-1-b-D-arabinofuranosil)-5-yodouracilo (FIAU). Las células se mantuvieron bajo selección durante 10 días, y las colonias resistentes a FIAU se contaron, se recogieron y se expandieron en placas de 96 pocillos. Los clones positivos se identificaron mediante amplificación por PCR de las uniones después de la escisión de los marcadores de selección. Los clones positivos se expandieron después para microinyección de blastocisto.
Generación de quimeras y reproducción:Se generaron quimeras de ratón mediante microinyección de células ES en blastocistos C57/BL6 y se transfirieron a receptores pseudopreñados. Se sometieron a cruces de prueba de quimeras macho con ratones C57/BL6. La progenie F1 Agouti se genotipificó mediante PCR de unión de 3' de S1. Los heterocigotos positivos para el cruce de prueba se cruzaron adicionalmente entre sí para generar homocigotos.
Determinación del uso de VH-D-JH mediante PCR para amplificación rápida de extremos de ADNc 5' (5'RACE)Se extrajo el ARN total del bazo de ratón S1 inv1 (KMSF30.1d) con Reactivo TRIzol® (Invitrogen™, Life Technologies Ltd™) y se trató con ADNasa I. La PCR para amplificación rápida de extremos de ADNc 5' (5' RACE) se realizó utilizando el kit 5'/3' RACE (2nd Generation, Roche) siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante. El ADNc de primera hebra se sintetizó utilizando el cebador E1554 (5'- ATGACTTCAGTGTTGTTCTGGTAG -3'; SEQ ID NO 25) que está localizado en la región Cp endógena de ratón. La primera hebra de ADNc sintetizada se purificó utilizando el Kit de Purificación de Productos de PCR de Alta Pureza (Roche). Se añadió una cola de poli(A) siguiendo el protocolo suministrado con el kit 5'/3' RACE (2nd Generation, Roche). El extremo 5' del transcrito Vh-D-Jh reordenado se amplificó mediante PCR anidada con cebadores directos Oligo dT, que se incluyen en el kit, y cebadores inversos específicos de Cp anidados E1555 (5'- CACCAGATTCTTATCAGAC -3'; SEQ ID NO 26). Después de la reacción, el producto de PCR para 5'RACE se comprobó en un gel de agarosa al 1 % y se purificó utilizando el kit de extracción en gel QIAquick® (QIAGEN) siguiendo el protocolo suministrado con el kit, después se clonó en el vector pDrive utilizando el Kit de Clonación QIAGEN PCR (QIAGEN) para el análisis de secuenciación.
Resultados
El análisis de secuencia de una biblioteca 5'-RACE específica de Cp de linfocitos B esplénicos de ratón S1inv1 (un BAC de IGH humano (es decir, VH humano múltiple, todos los D y JH humanos funcionales) con una versión 1 del locus endógeno de IgH invertido) muestra que prácticamente todos los transcritos proceden de segmentos génicos Vh-D-Jh humanos reordenados (Fig. 48). El uso de V<h>de ratón rara vez se detectó (0,4%) y tampoco se detectó el uso de D y J<h>de ratón. El uso de V<h>humano fue de 99,6% y sólo se utilizaron D y J<h>humanos; se planteó la hipótesis de que el raro uso de Vh de ratón se debiera al cambio en trans con otro cromosoma y no se debiera al uso de Vh de ratón a partir de las secuencias invertidas. La inversión dio como resultado la inactivación completa del uso de V<h>endógeno.
Este resultado indica que la inversión es una forma eficaz de inactivar el reordenamiento de segmentos génicos endógena de Vh.El ratón S1inv1 también muestra un uso similar al de ser humano de ambos segmentos génicos D y J<h>(Fig. 49) (Link, JM et al. Mol. Immunol. 2005. 42, 943-955). Por tanto, se produjo un ratón que c o m p re n d ía u n lo c u s d e c a d e n a p e s a d a tra n s g é n ic o q u e e x p re s a b a c a d e n a s p e s a d a s q u e c o m p re n d ía n re g io n e s v a r ia b le s h u m a n a s , p e ro n o re g io n e s v a r ia b le s d e ra tó n , y a d e m á s la s re g io n e s v a r ia b le s h u m a n a s d e m o s tra ro n u n a d is tr ib u c ió n d e s e c u e n c ia h u m a n a n o rm a l c o r re s p o n d ie n te a l u s o d e D y J h u m a n a s o b s e rv a d o e n s e re s h u m a n o s .
Ejemplo 8 (Ejemplo de referencia)
Inactivación del uso de segmentos génicos IGHV endógenos para la cadena pesada reordenada expresada mediante inserción de ADN genómico de IgH humana
Introducción
L a in s e rc ió n d e B A C h u m a n o s c o n s e g m e n to s g é n ic o s V h- D -J h e n u n lo c u s e n d ó g e n o d e la c a d e n a p e s a d a d e ra tó n e n tre J h4 y E p e n e l c ro m o s o m a 12 p e rm ite q u e lo s s e g m e n to s g é n ic o s V h-D -J h h u m a n o s u t il ic e n e f ic a z m e n te p o te n c ia d o re s d e E p y 3 ' d e ra tó n y s e re o rd e n e n p a ra g e n e ra r a n t ic u e rp o s q u im é r ic o s c o n re g io n e s v a r ia b le s h u m a n a s y re g io n e s c o n s ta n te s d e ra tó n . M ie n tra s ta n to , lo s s e g m e n to s g é n ic o s e n d ó g e n o s V h- D -J h s e s e p a ra n d e p o te n c ia d o re s e n d ó g e n o s y re g io n e s c o n s ta n te s . E s te e fe c to d e d is ta n c ia d a c o m o re s u lta d o la in a c t iv a c ió n d e l u so<d e D y J>H<d e ra tó n p a ra p ro d u c to s d e a n t ic u e rp o s re o rd e n a d o s e x p re s a d o s . A m e d id a q u e la d is ta n c ia a u m e n ta p o r>in s e rc ió n d e B A C e s c a lo n a d a , s e e s p e ra q u e e l u s o d e V H d e ra tó n s e re d u z c a s ig n if ic a t iv a m e n te .
Resultados
<L a in s e rc ió n d e A D N h u m a n o a p a r t ir d e u n 1>er<B A C h u m a n o (B A C q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e l C ro m o s o m a 14>d e ra tó n d e la c o o rd e n a d a 106328951 a la c o o rd e n a d a 106494908 ; q u e c o n t ie n e lo s s e is s e g m e n to s g é n ic o s V h fu n c io n a le s m á s e n 3 ' (V h2 -5 , 7 -4 -1 , 4 -4 , 1 -3 , 1 -2 , 6 -1 ) , y to d o s lo s s e g m e n to s g é n ic o s D y J h h u m a n o s ) e n e l lo c u s e n d ó g e n o d e c a d e n a p e s a d a d e u n g e n o m a d e c é lu la E S A B 2.1 e n tre IG H J 4 y E p e n d ó g e n o s (en e l c ro m o s o m a 12 d e ra tó n : e n tre la s c o o rd e n a d a s 114666435 y 114666436 ) in a c t iv a e f ic a z m e n te e l u s o d e s e g m e n to s g é n ic o s e n d ó g e n o s D y J h p a ra la c a d e n a p e s a d a d e in m u n o g lo b u lin a re o rd e n a d a e x p re s a d a (F ig . 44 ). L o s t ra n s c r ito s<re o rd e n a d o s c o n lo s s e g m e n to s g é n ic o s V>H<d e ra tó n s e re d u c e n e n e l ra tó n S1 re s u lta n te . L a p ro p o rc ió n d e t ra n s c r ito s>q u e u t il iz a n V h d e ra tó n e s d e a lre d e d o r d e 75 % d e to d a s la s s e c u e n c ia s o b s e rv a d a s (F ig . 45 ).
D e s p u é s d e la in s e rc ió n d e l A D N d e 1a B A C , s e in s e r tó A D N h u m a n o d e u n 2 ° B A C h u m a n o (C h r14 : 106494909 106601551 ) (B A C q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e l C ro m o s o m a 14 d e ra tó n d e la c o o rd e n a d a 106494909 a la c o o rd e n a d a 106601551 ; q u e c o n t ie n e 5 s e g m e n to s g é n ic o s V H fu n c io n a le s m á s (V h3 -13 , 3 -11 , 3 -9 , 1 -8 , 3 -7 ) ) e n e l<lu g a r d e e m p la z a m ie n to g e n ó m ic o q u e q u e d a d e trá s d e s p u é s d e l c u ra d o p o s te r io r a la in s e rc ió n d e l 1>er<B A C (v é a s e ,>p . e j., la F ig . 24 ). El u s o d e V h d e ra tó n s e re d u c e a d ic io n a lm e n te d e m a n e ra s ig n if ic a t iv a d e s p u é s d e e s ta in s e rc ió n d e l 2 ° B A C e n e l lo c u s . L a p ro p o rc ió n d e t ra n s c r ito s u t i l iz a n d o V H d e ra tó n s e re d u jo a d ic io n a lm e n te h a s ta 35 % d e to d a s la s s e c u e n c ia s o b s e rv a d a s (F ig . 50 ).
E s te re s u lta d o in d ic a q u e lo s s e g m e n to s g é n ic o s e n d ó g e n o s V h- D -J h p o d ría n in a c t iv a rs e (e s d e c ir , no u t il iz a rs e p a ra c a d e n a s p e s a d a s re o rd e n a d a s e x p re s a d a s ) a t ra v é s d e la in s e rc ió n d e s e c u e n c ia s d e V D J h u m a n a s d e u n o o m á s B A C . A m e d id a q u e la d is ta n c ia a u m e n ta p o r in s e rc ió n d e B A C e s c a lo n a d a , s e e s p e ra q u e e l u s o d e V H d e ra tó n se re d u z c a s ig n if ic a t iv a m e n te .
Ejemplo 9 (Ejemplo de referencia)
Cambio de clase normal e hipermutación en ratones transgénicos de la divulgación
Introducción
El b ra z o d e c é lu la s B d e l s is te m a in m u n ita r io h a e v o lu c io n a d o p a ra p ro d u c ir a n t ic u e rp o s e s p e c íf ic o s d e a n tíg e n o d e a lta a f in id a d e n re s p u e s ta a la e x p o s ic ió n a n t ig é n ic a . L o s a n t ic u e rp o s s e g e n e ra n e n lin fo c ito s B m e d ia n te un p ro c e d im ie n to d e re o rd e n a m ie n to g é n ic o e n e l q u e s e g m e n to s g é n ic o s v a r ia b le s (V ), d e d iv e rs id a d (D ; p a ra e l lo c u s Ig H ) y d e u n ió n (J ) se re c o m b in a n , t r a n s c r ib e n y e m p a lm a n a u n s e g m e n to g é n ic o d e re g ió n c o n s ta n te C p (p a ra IG H ) o C k o CA (p a ra IG L ) p a ra fo rm a r un a n t ic u e rp o Ig M . D e p e n d ie n d o d e la fa s e d e d e s a rro llo d e la s c é lu la s B, la IgM se lo c a liz a e n la s u p e r f ic ie c e lu la r o s e s e c re ta . El p ro c e d im ie n to d e re c o m b in a c ió n g e n e ra u n re p e r to r io d e a n t ic u e rp o s p r im a r io s c o n s u f ic ie n te d iv e rs id a d d e lín e a s g e rm in a le s p a ra u n irs e a u n a a m p lia g a m a d e a n tíg e n o s . S in e m b a rg o , n o rm a lm e n te n o e s lo s u f ic ie n te m e n te g ra n d e c o m o p a ra p ro p o rc io n a r lo s a n t ic u e rp o s d e a lta a f in id a d q u e s e re q u ie re n p a ra u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia e f ic a z a u n a n tíg e n o ta l c o m o u n a g e n te in fe c c io s o . P o r lo ta n to , e l s is te m a in m u n ita r io a d o p ta u n p ro c e d im ie n to d e d iv e rs i f ic a c ió n d e d o s fa s e s p a ra a u m e n ta r a d ic io n a lm e n te la d iv e rs id a d . C u a n d o se e x p o n e n a a n tíg e n o s , la s c é lu la s B e x p e r im e n ta n s e le c c ió n y m a d u ra c ió n m e d ia n te u n p ro c e d im ie n to d e n o m in a d o m u ta c ió n s o m á tic a . L a s c é lu la s B q u e e x p re s a n a n t ic u e rp o s q u e s e u n e n a l a n tíg e n o e x p e r im e n ta n m ú lt ip le s ro n d a s d e d iv e rs i f ic a c ió n , e x p a n s ió n c lo n a l y s e le c c ió n d e a n tíg e n o e n lo s c e n tro s g e rm in a le s (G C ) d e lo s ó rg a n o s lin fo id e s s e c u n d a r io s . D u ra n te e s te p ro c e d im ie n to , la s re g io n e s v a r ia b le s re o rd e n a d a s d e lo s g e n e s d e in m u n o g lo b u lin a a d q u ie re n h ip e rm u ta c ió n s o m á t ic a a t ra v é s d e s u s t itu c ió n , a d ic ió n o d e le c ió n d e n u c le ó tid o s . E s te p ro c e d im ie n to e s c a lo n a d o c re a u n re p e r to r io s e c u n d a r io a p a r t ir d e lo s lig a n te s d é b ile s s e le c c io n a d o s o r ig in a lm e n te a p a r t ir d e l re p e r to r io p r im a r io y c o m b in a la p ro li fe ra c ió n rá p id a d e c é lu la s B re a c t iv a s c o n a n tíg e n o c o n u n a in te n s a s e le c c ió n d e la c a lid a d d e la u n ió n , d a n d o lu g a r f in a lm e n te a a n t ic u e rp o s d e a lta a f in id a d c o n u n a a m p lia c o b e r tu ra d e e p íto p o s . D u ra n te e s te p ro c e d im ie n to , lo s a n t ic u e rp o s e x p e r im e n ta n c a m b io d e c la s e e n e l q u e la re g ió n c o n s ta n te C p se reemplaza por Cy, CA o Ce para producir respectivamente clases de anticuerpo IgG, A o E con diferentes funciones efectoras.
La inserción del 1er BAC humano (Cr14: 106328951-1064949908) que contiene los seis segmentos génicos V<h>funcionales más 3' (V<h>2-5, 7-4-1,4-4, 1 -3, 1 -2, 6-1), y todos los segmentos génicos endógenos D y J<h>en el locus entre IGHJ4 y Ep (Cr12: 114666435 y 114666436) produce ratones transgénicos que generan cadenas pesadas de inmunoglobulina quimérica que contienen regiones variables humanas y constantes de ratón. Este resultado demuestra que los segmentos génicos de inmunoglobulina humana pueden reordenarse y expresarse en ratones. Aquí, se realizaron experimentos de RT-PCR y análisis de secuencias para demostrar adicionalmente que los ratones transgénicos inmunizados tienen un cambio de clase e hipermutación apropiados para los anticuerpos generados.
Métodos
RT-PCR y análisis de secuencia:Se cebaron ratones de tipo salvaje o quimera S1 a las 6-8 semanas de edad mediante inyección intraperitoneal de 106 glóbulos rojos de oveja suspendidos en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los ratones inmunizados recibieron refuerzo dos veces con la misma cantidad de glóbulos rojos de oveja dos y cuatro semanas después del cebado. Cuatro días después del último refuerzo, se recogieron células de sangre periférica de los ratones inmunizados. Se aisló el ARN total de células de sangre periférica con reactivo TRIzol® (Invitrogen™) y se trató con ADNasa I. La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) se realizó utilizando el Sistema de Síntesis de Primera Hebra SuperScript® III (Invitrogen™) siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. La 18 hebra de ADNc se sintetizó con los cebadores Cy específicos (Cy1 , CY2a, CY2b), seguido de PCR con cebadores V humanos específicos (cebadores VH1-2,3, VH4-4, VH6-1) y cebadores C<y>(Tabla 2). Después de la reacción, el producto de RT-PCR se comprobó en un gel de agarosa al 1% y se purificó utilizando el Kit de Extracción en Gel QIAquick® (QIAGEN) siguiendo el protocolo suministrado con el kit, después se clonó en el vector pDrive utilizando el kit de clonación QIAGEN PCR (QIAGEN) para el análisis de secuenciación.
Tabla 2:
Resultados
Los transcritos reordenados se detectaron utilizando RT-PCR con cebadores específicos de VH humano y específicos de Cy de ratón para la amplificación a partir de células de sangre periférica de ratones transgénicos inmunizados (Fig. 51). El análisis de secuencia adicional de estos fragmentos amplificados demostró que la hipermutación ocurrió dentro de las regiones variables humanas de estas cadenas de IGy (Fig. 52). Estos resultados indican que los loci de la divulgación que comprenden la inserción de BAC en IGH humana que contiene los segmentos génicos V<h>, D y J<h>en el locus entre las regiones IGHJ4 y Ep endógenas tienen una funcionalidad de cambio de clase e hipermutación normal (IgM a IgG) después de la exposición al antígeno.
Ejemplo 10 (Ejemplo de referencia)
Compartimentos de células B normales en ratones transgénicos de la divulgación
Introducción
En ratones, se producen diariamente aproximadamente 2 x 107 células B inmaduras de médula ósea. Entre ellas, sólo 10-20% de estas células sobreviven para salir de la médula ósea y entrar en el bazo. La población de células B esplénicas inmaduras se divide en dos subgrupos distintos: células B transicionales 1 (T1) y transicionales 2 (T2). Los experimentosin vivoindican que las células T1 dan lugar a células T2, mientras que las células T2 pueden diferenciarse adicionalmente hasta células B maduras (M). En contraste con las células B inmaduras (de 3-4 días de edad), las células B maduras tienen una vida larga (de 15-20 semanas de edad) y están listas para responder a los antígenos (Pillai S et al; Immunol. Reviews. 2004. 197: 206-218). Por tanto, el componente de la población de células B maduras está directamente relacionado con la eficacia de la respuesta inmunitaria humoral.
Las poblaciones de células T1, T2 y M pueden clasificarse por sus niveles de IgM e IgD en la superficie celular. Se requiere un fenotipo normal de compartimento de células B esplénicas para montar una respuesta inmunitaria robusta.
Métodos
Análisis de citometría de flujo de linfocitos B madurosPara obtener una suspensión de células individuales del bazo, los bazos de los ratones enumerados a continuación se pasaron suavemente a través de un filtro celular de 30 pm. Las células individuales se resuspendieron en PBS complementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 3% (FCS; Gibco®). Se utilizaron los siguientes anticuerpos para la tinción: Anticuerpo contra B220/CD45R conjugado con aloficocianina (APC) (eBioscience, clon RA3-6B2), anticuerpo contra receptor de IgD conjugado con ficoeritrina (PE) (eBioscience, clon 11-26) y receptor de IgM conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (eBioscience, clon 11/41).
Se utilizaron 5x106 células para cada tinción. A cada vial que contenía esplenocitos se le añadió un cóctel de anticuerpos que consistía en: IgD (PE) (eBioscience, clon 11-26), IgM (FITC) y B220/CD45R (APC). Las células se incubaron a 6°C durante 15 minutos, se lavaron para eliminar el exceso de anticuerpos no unidos y se analizaron utilizando un analizador de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de Miltenyi Biotech. Las células B se seleccionaron como B220+IgM+IgD- para la población T1, B220+IgM+IgD+ para la población T2 y B220+IgM-IgD+ para la población M. El porcentaje de células se calculó utilizando un sistema de selección.
Resultados
Se generaron cuatro genotipos diferentes de ratones:
• Tipo salvaje (WT);
• Un ratón transgénico homocigoto para un transgén de cadena pesada que comprende la inserción del ADN humano del 1er BAC indicado anteriormente en el que hay 6 segmentos génicos VH humanos, todos D y JH humanos funcionales (S1/S1);
• Un ratón transgénico homocigoto para un transgén de cadena pesada que comprende la inserción de un VH humano, todos los segmentos génicos D y JH humanos funcionales (H1/H1); y
• Un ratón transgénico homocigoto para un transgén de cadena kappa que comprende la inserción de 6 segmentos génicos V<k>funcionales humanos y 5 segmentos génicos J<k>funcionales (K1/K1).
Se recogieron los bazos de estos ratones no sometidos a exposición previa y se analizaron para determinar sus compartimentos de células B. El número y porcentajes de células T1, T2 y M entre esos ratones son similares (Fig. 53), lo que indica que la manipulación genética de los loci de Ig endógenos en ratones transgénicos según la divulgación no compromete su desarrollo de células B. Estos datos ayudan a establecer que los animales según la divulgación proporcionan una plataforma robusta para el descubrimiento de anticuerpos.
Como se explica en el Ejemplo 16 más adelante, se realizó un análisis adicional en ratones S1 en los que la expresión de la cadena pesada endógena se ha inactivado (ratones S1F en los que hay inactivación por inversión como se describe en el presente documento). Como se ha explicado, se observan compartimentos esplénicos y de médula ósea normales en tales ratones de la descripción (es decir, equivalentes a los compartimentos de ratones que expresan sólo cadenas de anticuerpos de ratón).
Ejemplo 11 (Ejemplo de referencia)
Isotipos de IgH y niveles en suero normales en animales transgénicos de la divulgación
Se inmunizaron ratones transgénicos (H1) que portaban todo JH humano, todo DH humano y Vh2-5 humano bajo el control de una región de cambio de rata o ratones (S1) que portaban todo JH humano, todo DH humano y Vh2-5, Vh7-41, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2 y Vh6-1 humanos bajo el control de una región de cambio de ratón con 100 pg de subunidad B de la toxina del cólera (CTB; Sigma-Aldrich® C9903) emulsionada en adyuvante completo de Freund CFA; Sigma-Aldrich® F 5881). Al menos tres animales recibieron inyecciones sc o ip y después fueron reforzados con 25 gg de antígeno en adyuvante incompleto de Freund (IFA; Sigma-Aldrich® F 5506) a los (i) 14 días y 21 días o (ii) 28 días después del cebado. Se extrajo sangre antes del cebado el día "-1" (muestras de sangre tomadas previamente) y en el día se extrajeron los bazos (normalmente 4 días después del último refuerzo). El suero se analizó mediante ELISA utilizando una evaluación independiente de antígeno de isotipos de Ig. Este ensayo detecta anticuerpos séricos totales de todas las especies. Se utilizó la detección específica para IgG1, IgG2a, IgG2b e IgM de ratón ((Anti-IgG1 de ratón HRP AbD Serotec STAR132P, Anti-IgG2a de ratón HRP AbD Serotec STAR133P, Anti-IgG2b de ratón HRP AbD Serotec STAR134P, Anti-IgM de ratón HRP Abcam® ab97230) y las concentraciones se leyeron en una curva normalizada producida para cada isotipo utilizando controles de isotipo policlonales (lgG1, mieloma murino Kappa Sigma-Aldrich® M9269, IgG2a, mieloma murino Kappa Sigma-Aldrich® M9144, IgG2b, Kappa de mieloma murino Sigma-Aldrich® M8894, IgM, Kappa de mieloma murino Sigma-Aldrich® M3795). Los resultados (Figuras 54 y 55 para ratones homocigotos H1y homocigotos y heterocigóticos para S1) mostraron que incluso con estos regímenes de inmunización relativamente cortos, los ratones mostraron un aumento en los niveles globales de IgG después de la inmunización sobre los de las muestras de sangre tomadas previamente. En los casos en los que se incluyeron e inmunizaron ratones de control (+/+) que no portaban ningún gen de inmunoglobulina humana, estos ratones mostraron cambios comparables en los niveles de Ig observados totales (Figura 54). Los niveles de isotipos individuales fueron más variables entre animales que posiblemente mostraban diversas fases de cambio de clase. Los niveles de IgM nunca superaron los 800 pg/ml, mientras que los niveles de IgG alcanzaron más de 6 mg/ml en algunos animales. Los controles no inmunizados no mostraron tales aumentos en los niveles de Ig de isotipo cambiado.
Estos resultados demuestran que los ratones que comprenden múltiples segmentos génicos VDJ humanos bajo el control de un cambio de rata o ratón Sp de rata son capaces de experimentar recombinación productiva y cambio de clase en respuesta a la exposición al antígeno y que los ratones producen niveles de anticuerpos que son ampliamente comparables a los ratones sin modificar. Los ratones transgénicos son capaces de producir anticuerpos de cada uno de los isotipos IgG1, IgG2a, IgG2b e IgM después de la inmunización. Se determinaron los títulos para Ig específica de CTB en las muestras de sangre tomadas previamente y las muestras de sangre terminales y todos los animales inmunizados mostraron títulos específicos de CTB de al menos 1/100.000.
Ejemplo 12 (Ejemplo de referencia)
Generación de anticuerpos antiovoalbúmina con afinidades por debajo de 50 nm a partir de animales de la divulgación
Se inmunizaron ratones transgénicos que portaban todo JH humano, todo DH humano y Vh2-5 humano bajo el control de una región de cambio Sp de rata con 25 pg de ovoalbúmina (OVA; Sigma-Aldrich® A7641) en adyuvante Sigma-Aldrich® (Sigma Adjuvant System® S6322) ip y después se reforzaron con la misma cantidad de OVA en adyuvante el día 14 y el día 21. Se tomaron esplenocitos 4 días después y se fusionaron utilizando 1 ml de polietilenglicol (PEG de PM promedio de 1450; Sigma-Aldrich® P7306) con una línea de mieloma. Las células de hibridoma fusionadas se sembraron en 5 placas de 96 pocillos y después de la selección con hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) los pocillos se sometieron a prueba para determinar la expresión de anticuerpos específicos de OVA mediante ELISA. Los clones positivos por ELISA se volvieron a someter a prueba por resonancia de plasmón superficial (SPR) y se determinó la cinética de unión utilizando ProteOn™ XPR36 (Bio-Rad®). Brevemente, se acopló anti-IgG de ratón (GE Biacore™ BR-1008-38) a un chip biosensor GLM mediante acoplamiento de amina primaria, y se utilizó para capturar los anticuerpos que se iban a probar directamente a partir de sobrenadantes de cultivo tisular. Se utilizó ovoalbúmina como analito y se pasó sobre la superficie del anticuerpo capturado a 1024 nM, 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM con un tampón 0 nM (es decir, solo) utilizado para referenciar doblemente los datos de unión. La regeneración de la superficie de captura de anti-IgG ratón fue mediante glicina 10 mM de pH 1,7, esto eliminó el anticuerpo capturado y permitió que la superficie se utilizara para otra interacción. Los datos de unión se ajustaron a un modelo 1:1 inherente al programa informático de análisis ProteOn™ XPR36. La prueba se llevó a cabo en 1 xHBS-EP (Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, polisorbato al 0,05%, pH 7,6 (Teknova H8022)) utilizado como tampón de migración y se llevó a cabo a 25°C.
Para 8 clones positivos, las regiones V de la cadena pesada se recuperaron mediante RT-PCR (Access RT-PCR System, A1250, Promega) utilizando cebadores directos específicos para secuencias señal de Ig (Wademann et al Science 301, 1374 (2003) y los siguientes cebadores inversos para las regiones constantes de IgG de ratón (Tabla 3):
Tabla 3:
Los productos de RT-PCR se secuenciaron directamente utilizando los mismos pares de cebadores o se clonaron en plásmidos TA (TOPO® TA Cloning® Kit para secuenciación, K4595-40, Invitrogen™) y se sometieron a secuenciación de plásmidos. Los resultados (Tabla 4, a continuación) muestran que las secuencias de CDRH3 tenían CDR variables excepto para dos clones idénticos (16C9 y 20B5) que también tenían valores cinéticos de KD casi idénticos. La constante de unión en equilibrio determinada Kd oscilaba de 0,38 nM a 40,60 nM, según se determina por SPR a 25°C.
Estos resultados demuestran que los ratones que comprenden múltiples segmentos génicos VDJ humanos bajo el control de un cambio Cp de rata son capaces de experimentar recombinación productiva y producir anticuerpos específicos de antígeno de alta afinidad cuyas regiones CDR3 tienen secuencias codificadas por segmentos génicos humanos (JH humano se identificó por separado mediante V-Quest, IMGT).
Tabla 4:
Ejemplo 13 (Ejemplo de referencia)
Generación de anticuerpos anti-toxina B del cólera con regiones Vh humanas de animales de la divulgación
Se inmunizaron ratones transgénicos que portaban todo JH humano, todo DH humano y Vh2-5, Vh7-41, Vh4-4, Vh1-3, Vh1-2 y Vh6-1 humanos bajo el control de una región de cambio Sg de ratón y se fusionaron como se describe en el Ejemplo 11. Las células de hibridoma fusionadas se sembraron en 5 placas de 96 pocillos y después de la selección con hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) o G418 (Gibco® Núm. de Cat. 10131-027, Lote 503317) los pocillos se sometieron a prueba para determinar la expresión de anticuerpos específicos de CTB por ELISA. Los clones positivos por ELISA se volvieron a someter a prueba por resonancia de plasmón superficial SPR y se determinó la cinética de unión utilizando ProteOn XPR36™ (Bio-Rad®).
Brevemente, se acopló anti-IgG de ratón (GE Biacore™ BR-1008-38) a un chip biosensor GLM mediante acoplamiento de amina primaria, y se utilizó para capturar los anticuerpos que se iban a probar directamente a partir de sobrenadantes de cultivo tisular. Se utilizó toxina B del cólera como analito y se pasó sobre la superficie del anticuerpo capturado a 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM y 1 nM, utilizando un tampón 0 nM (es decir, solo) para referenciar doblemente los datos de unión. La regeneración de la superficie de captura de anti-IgG ratón fue mediante glicina 10 mM de pH 1,7, esto eliminó el anticuerpo capturado y permitió que la superficie se utilizara para otra interacción. Los datos de unión se ajustaron al modelo 1:1 inherente al programa informático de análisis ProteOn XPR36™. La prueba se llevó a cabo en 1xHBS-EP (Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, polisorbato al 0,05%, pH 7,6 (Teknova H8022)) utilizado como tampón de prueba y se llevó a cabo a 37°C.
A partir de los clones identificados inicialmente mediante ELISA, se confirmó la unión a CTB por SPR. Sin embargo, debido a la naturaleza pentamérica de la toxina B del cólera, la mayoría de los ajustes en el modelo 1:1 fueron pobres y las constantes de unión en equilibrio KD no pudieron ser determinadas con precisión. Cuando los ajustes fueron aceptables, las constantes de unión en equilibrio KD determinadas variaron de 0,21 nM a 309 nM, pero debido a la naturaleza pentamérica de la toxina B del cólera, es probable que estas fueran el resultado de interacciones multiméricas y, por lo tanto, afinidades aparentes con posibles componentes de avidez.
Los clones identificados por SPR para la unión a CTB se sometieron a RT-PCR como se describe en el Ejemplo 12 para recuperar las regiones Vh. Los productos de RT-PCR se secuenciaron directamente utilizando los mismos pares de cebadores. Los resultados se obtuvieron para sólo 14 clones presumiblemente debido a que los cebadores humanos descritos por Wardemannet alno se diseñaron para amplificar regiones Vh de ratón y, por lo tanto, pueden haber fracasado al amplificar ciertas clases Vh de ratón. Los resultados mostraron que 3 de las 14 secuencias de la región V de la cadena pesada recuperadas específicas de CTB eran regiones V, D y J humanas identificadas por V-Quest, IMGT (Tabla 5).
Ejemplo 14 (Ejemplo de referencia)
Expresión elevada de la región variable lambda humana en ratones transgénicos que comprenden segmentos génicos lambda humanos insertados en el locus kappa endógeno
Se realizó la inserción de segmentos génicos lambda humanos a partir de un 1er BAC de IGL para el locus IGK de células ES AB2.1 de ratón (Baylor College of Medicine) para crear un alelo quimérico de la cadena ligera denominado alelo P1 (Fig. 56). La secuencia humana insertada corresponde a la secuencia del cromosoma 22 humano de la posición 23217291 a la posición 23327884 y comprende los segmentos génicos lambda funcionales V<A>3-1, J<A>1-CA1, J<A>2-CA2, J<A>3-CA3, J<A>6-CA6 y J<A>7-C<A>7. La inserción se realizó entre las posiciones 70674755 y 706747756 en el cromosoma 6 de ratón, que está aguas arriba de la región C<k>de ratón y 3'E<k>(es decir, dentro de 100 kb del potenciador endógeno de la cadena ligera) como se muestra en la Figura 56. Los segmentos génicos V<k>y J<k>de ratón se retuvieron en el locus quimérico, inmediatamente aguas arriba del ADN de lambda humano insertado. Los loci lambda de ratón se dejaron intactos. Se generaron ratones homocigotos para el locus quimérico P1 a partir de las células ES utilizando procedimientos convencionales.
Se produjo un segundo tipo de ratones (ratones P2) en los que se insertaron más segmentos génicos V<A>funcionales humanos aguas arriba (5') de V<A>3-1 humano mediante la inserción secuencial del ADN humano de BAC1 y después el ADN de BAC2 para crear el alelo P2. La secuencia humana insertada de BAC2 corresponde a la secuencia del cromosoma 22 humano de la posición 23064876 a la posición 23217287 y comprende los segmentos génicos lambda funcionales V<A>2-18, V<A>3-16, V2-14, V<A>3-12, V<A>2-11, V<A>3-10, V<A>3-9, V<A>2-8 y V<A>4-3. Se generaron ratones homocigotos para el locus quimérico P2 a partir de las células ES utilizando procedimientos convencionales.
Se realizó un análisis FACS de células B esplénicas de los homocigotos para P1 y P2 para evaluar la expresión de lambda frente a kappa y la expresión de lambda humano frente a lambda de ratón en los ratones transgénicos.
Se llevó a cabo 5'-RACE convencional para analizar transcritos de ARN de los loci de la cadena ligera en homocigotos para P2.
Expresión de la cadena ligera y análisis FACS
Para obtener una suspensión de células individuales de bazo, el bazo se pasó suavemente a través de un filtro de células de 30 pm. Las células individuales se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) complementada con suero de ternera fetal (FCS) inactivado por calor al 3%.
Se utilizaron los siguientes anticuerpos para la tinción: Anticuerpo anti-lambda de ratón (mC<A>) de rata-ficoeritrina (PE) (Southern Biotech), anti-kappa de ratón mC<K>de rata (BD Pharmingen (clon 187.1)-isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-lambda humano (hC<A>) (eBioscience, clon 1 -155-2)-ficoeritrina (PE), anti-B220/CD45R (eBioscience, clon RA3-6B2)-aloficocianina (APC). NB: se esperaba que las cadenas ligeras que portaban C<A>humano tuvieran regiones variables derivadas del reordenamiento de V<A>humano y J<A>humano insertados. Se esperaba que las cadenas ligeras que portaban C<A>de ratón tuvieran regiones variables derivadas del reordenamiento de V<A>y J<A>de ratón de los loci lambda endógenos.
Se añadieron 5x106 células a tubos individuales, se centrifugaron para eliminar el exceso de fluido, y se resuspendieron en 100<p>l de PBS FCS al 3% de nueva aportación. A cada tubo individual se añadieron los siguientes anticuerpos: Para la tinción de m<A>frente a m<K>, se añadió 1 pl de cada anticuerpo además de 1 pl de anticuerpo contra B220/CD45R. Para la detección de células B que expresaban la cadena ligera lambda humana, el anticuerpo contra m<A>se sustituyó con anticuerpo h<A>. Las células se incubaron en la oscuridad a 6°C durante 15 minutos seguido de varios lavados con PBS FCS al 3% de nueva aportación para eliminar el anticuerpo no unido. Las células se analizaron utilizando un analizador de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de Miltenyi Biotech.
Los esplenocitos vivos se seleccionaron utilizando dispersión lateral (SSC) y dispersión frontal (FSC). Dentro de la población seleccionada por SSC y FSC, se detectó una subpoblación de B220/CD45R (células B de ratón) utilizando el fluorocromo APC. La población positiva única de B220/CD45R se subdividió adicionalmente en una célula que portaba fluorocromo PE de m<A>o h<A>junto con fluorocromo FITC de m<K>. El porcentaje de cada población se calculó utilizando un sistema de selección.
Sorprendentemente, el análisis FACS de células B esplénicas de los homocigotos para P1 no mostró expresión de C<k>de ratón detectable (Fig. 57), lo que indica que la inserción del ADN del locus lambda humano de BAC1 interrumpe la expresión de la cadena de IGK endógena.
La fuerte expresión de C<A>endógeno y la débil expresión de C<A>humano en las células B esplénicas agrupadas por análisis FACS (C<A>de ratón:C<A>humana = 65:32) en estos ratones sugieren que la secuencia de IGL humana insertada, aunque interrumpe la actividad de IGK, no puede competir totalmente con los genes de IGL endógenos.
El análisis FACS de nuevo sorprendentemente no mostró expresión detectable de C<k>de ratón en los homocigotos para P2 (Fig. 58A y B). Sin embargo, C<A>humano predomina en gran medida en células B expresadas agrupadas como C<A>de ratón o humano después del análisis FACS (C<A>de ratón:C<A>humano = 15:80 correspondiente a una relación de 15 regiones variables lambda de ratón:80 regiones variables lambda humanas, es decir, 84% de regiones variables lambda humanas con referencia a las células B agrupadas - que corresponde a 80% de células B totales) de los homocigotos para P2. Aunque no se desea estar limitados por ninguna teoría, los autores de la presente invención sugieren que la secuencia del locus lambda humano insertado del 2° BAC proporciona algunas ventajas para competir con el reordenamiento o expresión del segmento génico endógeno lambda.
Los autores de la presente invención analizaron el uso de VA y JA humanos en los homocigotos para P2. Véase la Figura 59 que muestra el uso de VA humano en homocigotos para P2. El uso observado fue similar al observado en seres humanos (según lo indicado J Mol Biol. 25 de abril de 1997; 268(1):69-77; "The creation of diversity in the human immunoglobulin V(lambda) repertoir"; Ignatovich Oet al).Además, el uso de JA humano fue similar al observado en seres humanos (Figura 60). El análisis de uso de VA frente a V<k>de transcritos de CA humanos mediante secuenciación de clones de PCR no sesgados 5'-RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc) mostró que, entre 278 secuencias de clones, sólo una utilizó Vk para el reordenamiento a JA (JA humano), y todos los demás (277 clones) utilizaron VA humano (Fig. 61 y 62; se detectó VA2-5 a nivel de transcrito de ARN, pero este es un pseudogén que normalmente no se recoge mediante el uso a nivel de proteínas). Aunque no se desea estar limitados por ninguna teoría, los autores sugieren que los segmentos génicos Vk de ratón retenidos esencialmente no pueden reordenar eficazmente con los segmentos génicos JA humanos insertados porque tienen el mismo tipo de RSS (secuencias señal de recombinación; véase la explicación a continuación) y son incompatibles para el reordenamiento (Fig. 63). Este resultado también indica que la inactivación de la actividad de IGK endógena y la expresión predominante de la secuencia lambda humana insertada se puede lograr sin modificación adicional del locus IgK, por ejemplo, no son necesarias la deleción o inversión de segmentos génicos de locus kappa endógenos, lo que simplifica en gran medida la generación de ratones transgénicos útiles que expresan cadenas ligeras que portan regiones variables lambda humanas (es decir, regiones variables producidas por recombinación de segmentos génicos VA y JA humanos).
El ordenamiento de las secuencias señal de recombinación (RSS) que median la recombinación V(D)Jin vivose discute, p. ej., en Cell. Abril de 2002; Supl 109:S45-55; "The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination"; Bassing CH, Swat W, Alt FW. Se han identificado dos tipos de elementos RSS: una RSS de un giro (12-RSS) y una RSS de dos giros (23-RSS). En la recombinación natural de VJ en el locus de la cadena ligera lambda, la recombinación se efectúa entre una RSS de dos giros que se encuentra en 3' con respecto a un V lambda y una RSS de un giro que se encuentra en 5' con respecto a un J lambda, estando las RSS en orientación opuesta. En la recombinación natural de VJ en el locus de la cadena ligera kappa, la recombinación si se efectúa entre una RSS de un giro que se encuentra en 3' con respecto a un V kappa y una RSS de dos giros que se encuentra en 5' con respecto a una J kappa, estando las RSS en orientación opuesta. Por lo tanto, generalmente una RSS de dos giros es compatible con una RSS de un giro en la orientación opuesta.
Por tanto, los autores de la presente invención han demostrado cómo (i) inactivar la expresión de la cadena kappa endógena mediante la inserción de segmentos génicos lambda humanos en el locus kappa; y (ii) cómo lograr una expresión de la región variable lambda humana muy alta (proporcionando así repertorios de cadenas ligeras útiles para la selección frente al antígeno diana) - incluso en presencia de segmentos génicos endógenos V lambda y kappa. Por lo tanto, los autores de la presente invención han demostrado cómo eliminar significativamente (lambda) o eliminar totalmente (kappa) la competición de segmentos génicos V y, por lo tanto, la expresión de cadenas ligeras endógenas mediante la inserción de al menos los segmentos génicos lambda humanos funcionales comprendidos por los BAC 1 y 2. En este ejemplo, sorprendentemente se logró un nivel muy alto de expresión de la región variable lambda humana (84% de las cadenas lambda totales y las cadenas ligeras totales como se explicó anteriormente).
Ejemplo 15:
Expresión elevada de la región variable lambda humana en ratones transgénicos que comprenden segmentos génicos lambda humanos insertados en el locus lambda endógeno
Se realizó la inserción de segmentos génicos lambda humanos a partir del 1er y 2° BAC de IGL para el locus lambda de células ES AB2.1 de ratón (Baylor College of Medicine) para crear un alelo de cadena ligera lambda denominado alelo L2 (Fig. 56). La secuencia humana insertada corresponde a la secuencia del cromosoma 22 humano de la posición 23064876 a la posición 23327884 y comprende los segmentos génicos lambda funcionales VA2-18, VA3-16, V2-14, VA3-12, VA2-11, VA3-10, VA3-9, VA2-8, VA4-3, VA3-1, JA1-CA1, JA2-CA2, JA3-CA3, JA6-CA6 y JA7-CA7. La inserción se realizó entre las posiciones 19047551 y 19047556 en el cromosoma 16 de ratón, que está aguas arriba de la región CA de ratón y entre EA4-10 y EA3-1 (es decir, dentro de 100 kb de los potenciadores de cadena ligera endógenos) como se muestra en la Figura 56. Los segmentos génicos VA y JA de ratón fueron retenidos en el locus, inmediatamente aguas arriba del ADN lambda humano insertado. Los loci kappa de ratón se inactivaron para prevenir la expresión de la cadena kappa. Se generaron ratones homocigotos para el locus L2 a partir de las células ES utilizando procedimientos convencionales.
Utilizando un método similar al del Ejemplo 14, se realizó análisis FACS de células B esplénicas de homocigotos para L2 para evaluar la expresión lambda frente a kappa y la expresión lambda humana frente a lambda de ratón en los ratones transgénicos.
Expresión de la cadena ligera y análisis FACS
El a n á lis is F A C S d e c é lu la s B e s p lé n ic a s e n h o m o c ig o to s p a ra L 2 b a jo e l fo n d o d e in a c t iv a c ió n d e IG K (en lo s q u e se h a n c o n s e rv a d o s e g m e n to s g é n ic o s V k y J k ) m o s tró s o rp re n d e n te m e n te q u e la e x p re s ió n d e CA h u m a n o p re d o m in a e n g ra n m e d id a e n c é lu la s B a g ru p a d a s c o m o CA d e ra tó n o h u m a n o d e s p u é s d e l a n á lis is F A C S (CA d e ra tó n :C A h u m a n o = 5 :93 c o r re s p o n d ie n te a u n a ra zó n d e 5 re g io n e s v a r ia b le s la m b d a d e ra tó n :93 re g io n e s v a r ia b le s la m b d a h u m a n a s , e s d e c ir , 95 % d e re g io n e s v a r ia b le s la m b d a h u m a n a s c o n re fe re n c ia a la s c é lu la s B a g ru p a d a s - q u e c o r re s p o n d e a 93 % d e c é lu la s B to ta le s ) (F ig . 64 A ), d e m o s tra n d o q u e los s e g m e n to s g é n ic o s IGA h u m a n o s in s e rta d o s d e n tro d e l lo c u s IgA e n d ó g e n o p u e d e n c o m p e n s a r e l re o rd e n a m ie n to o e x p re s ió n d e s e g m e n to s g é n ic o s IGA e n d ó g e n o s .
P o r ta n to , lo s a u to re s d e la p re s e n te in v e n c ió n h a n d e m o s tra d o c ó m o lo g ra r u n a e x p re s ió n m u y a lta d e la re g ió n v a r ia b le la m b d a h u m a n a (p ro p o rc io n a n d o a s í re p e r to r io s d e c a d e n a s lig e ra s ú t ile s p a ra la s e le c c ió n c o n tra e l a n tíg e n o d ia n a ) - in c lu s o e n p re s e n c ia d e s e g m e n to s g é n ic o s e n d ó g e n o s V la m b d a y k a p p a . P o r lo ta n to , lo s a u to re s d e la p re s e n te in v e n c ió n h a n d e m o s tra d o c ó m o e lim in a r s ig n if ic a t iv a m e n te la c o m p e t ic ió n d e s e g m e n to s g é n ic o s V la m b d a e n d ó g e n o s y , p o r lo ta n to , la e x p re s ió n d e la c a d e n a lig e ra la m b d a e n d ó g e n a m e d ia n te la in s e rc ió n d e a l m e n o s los s e g m e n to s g é n ic o s la m b d a h u m a n o s fu n c io n a le s c o m p re n d id o s p o r lo s B A C 1 y 2. En e s te e je m p lo , s o rp re n d e n te m e n te s e lo g ró un n iv e l m u y a lto d e e x p re s ió n d e la re g ió n v a r ia b le la m b d a h u m a n a (95 % d e la s c a d e n a s la m b d a to ta le s y la s c a d e n a s lig e ra s to ta le s c o m o s e e x p lic ó a n te r io rm e n te ) .
E s to s d a to s in d ic a n q u e lo s ra to n e s q u e p o rta n a le lo s P (E je m p lo 14) o L (E je m p lo 15 ) p ro d u c id o s m e d ia n te in s e rc ió n d ir ig id a d e lo s s e g m e n to s g é n ic o s fu n c io n a le s p ro p o rc io n a d o s p o r B A C 1 y B A C 2 p u e d e n fu n c io n a r e n re o rd e n a m ie n to y e x p re s ió n e n c é lu la s B m a d u ra s . E s to s d o s t ip o s d e a le lo s so n m u y ú t ile s p a ra p ro p o rc io n a r ra to n e s t r a n s g é n ic o s q u e p ro d u c e n c a d e n a s la m b d a d e Ig h u m a n a p a ra e l d e s c u b r im ie n to d e a n t ic u e rp o s te ra p é u t ic o s y c o m o h e rra m ie n ta s d e in v e s t ig a c ió n .
Los ratones transgénicos de la divulgación que expresan regiones variables lambda humanas desarrollan compartimentos esplénicos normales
En e l b a z o , la s c é lu la s B s e c a ra c te r iz a n c o m o in m a d u ra s (T1 y T 2 ) y m a d u ra s (M ) b a s á n d o s e a lo s n iv e le s d e m a rc a d o re s d e s u p e r f ic ie c e lu la r , IgM e IgD . L a s c é lu la s T1 t ie n e n IgM a lta e Ig D b a ja . L a s c é lu la s T 2 t ie n e n n iv e le s m e d io s d e a m b a s . L a s c é lu la s M t ie n e n IgM b a ja p e ro Ig D a lta ( f ig u ra 65 ). V é a s e ta m b ié n J E x p M e d . 5 d e ju lio d e 1999 ; 190 (1 ) :75 -89 ; "B c e ll d e v e lo p m e n t in th e s p le e n ta k e s p la c e in d is c re te s te p s a n d is d e te rm in e d b y th e q u a lity o f B c e ll re c e p to r -d e r iv e d s ig n a ls " ; L o d e r Fe t al.
U til iz a n d o m é to d o s s im ila re s a lo s d e s c r ito s e n e l E je m p lo 16 m á s a d e la n te , s e p u n tu a ro n la s c é lu la s B e s p lé n ic a s d e lo s a n im a le s p a ra d e te rm in a r la e x p re s ió n d e Ig D e IgM u t il iz a n d o F A C S . L o s a u to re s d e la p re s e n te in v e n c ió n c o m p a ra ro n ra to n e s d e c o n tro l K A /K A (en lo s q u e la e x p re s ió n d e la c a d e n a k a p p a e n d ó g e n a s e h a in a c t iv a d o , p e ro n o la e x p re s ió n d e la c a d e n a la m b d a e n d ó g e n a ) c o n ra to n e s L 2 /L 2 ; K A /K A (h o m o c ig o to s p a ra L 2 ). L o s h o m o c ig o to s p a ra L 2 s o rp re n d e n te m e n te m o s tra ro n c o m p a r t im e n to s d e c é lu la s B e s p lé n ic a s c o m p a ra b le s a lo s ra to n e s c o n tro l (F ig . 64 B ).
Ejemplo 16 (Ejemplo de referencia)
Evaluación del desarrollo de células B e Ig en ratones transgénicos de la divulgación
L o s a u to re s d e la p re s e n te in v e n c ió n o b s e rv a ro n la e x p re s ió n d e l s u b t ip o d e Ig n o rm a l y e l d e s a r ro l lo d e c é lu la s B e n ra to n e s tra n s g é n ic o s d e la d iv u lg a c ió n q u e e x p re s a b a n a n t ic u e rp o s c o n re g io n e s v a r ia b le s d e la c a d e n a p e s a d a h u m a n a s s u s ta n c ia lm e n te e n a u s e n c ia d e e x p re s ió n d e la c a d e n a p e s a d a y k a p p a e n d ó g e n a s .
U t il iz a n d o c é lu la s E S y lo s m é to d o s d e m a n ip u la c ió n g e n ó m ic a d e R M C E d e s c r ito s a n te r io rm e n te , s e c o n s tru y e ro n ra to n e s c o n c o m b in a c io n e s d e lo s s ig u ie n te s a le lo s d e l lo c u s d e Ig : S 1 F /H A , /K A = (i) S 1 F - e l p r im e r a le lo e n d ó g e n o d e la c a d e n a p e s a d a t ie n e u n a in s e rc ió n d e A D N d e l lo c u s d e la c a d e n a p e s a d a h u m a n a , la re g ió n e n d ó g e n a d e V D J d e ra tó n s e h a in a c t iv a d o p o r in v e rs ió n y m o v im ie n to a g u a s a r r ib a e n e l c ro m o s o m a (v é a s e la d e s c r ip c ió n a n te r io r , d o n d e e s te a le lo s e d e n o m in a S 1 inv1); ( ii) H A - e l s e g u n d o a le lo e n d ó g e n o d e la c a d e n a p e s a d a h a s id o in a c t iv a d o (p o r in s e rc ió n d e u n a s e c u e n c ia d e in te r ru p c ió n e n d ó g e n a ) ; (iii) - e l p r im e r a le lo e n d ó g e n o k a p p a e s un a le lo k a p p a d e t ip o s a lv a je y ( iv ) K A - e l s e g u n d o a le lo e n d ó g e n o k a p p a h a s id o in a c t iv a d o (p o r in s e rc ió n d e u n a s e c u e n c ia d e in te r ru p c ió n e n d ó g e n a ) . E s te o rd e n a m ie n to c o d if ic a e x c lu s iv a m e n te c a d e n a s p e s a d a s d e l p r im e r a le lo e n d ó g e n o d e la c a d e n a p e s a d a .
S1 F /H A , K 2 /K A = (i) K 2 - e l p r im e r a le lo k a p p a e n d ó g e n o t ie n e d o s in s e rc io n e s d e A D N d e l lo c u s d e la c a d e n a k a p p a e n tre J k e n d ó g e n o m á s 3 ' y e l C k d e ra tó n , p ro p o rc io n a n d o u n a in s e rc ió n d e 14 V k y J k 1 -J k 5 h u m a n o s ; y ( ii) K A - e l s e g u n d o a le lo k a p p a e n d ó g e n o s e h a in a c t iv a d o (p o r in s e rc ió n d e u n a s e c u e n c ia d e in te r ru p c ió n e n d ó g e n a ) . E s te o rd e n a m ie n to c o d if ic a e x c lu s iv a m e n te c a d e n a s p e s a d a s q u e c o m p re n d e n re g io n e s v a r ia b le s h u m a n a s y s u s ta n c ia lm e n te c a d e n a s lig e ra s k a p p a d e l p r im e r a le lo k a p p a e n d ó g e n o .
+ /H A , K 2 /K A - e s te o rd e n a m ie n to c o d if ic a c a d e n a s p e s a d a s d e ra tó n y c a d e n a s k a p p a h u m a n a s .
+ /H A , /K A - e s te o rd e n a m ie n to co d ifica las ca d e n a s p e sa d a y ka p p a de ra tón - los ra ton es só lo p ro du cen ca d e n a s pesada y ligera de ratón.
En la médula ósea, las poblaciones progenitoras B se caracterizan basándose en sus marcadores de superficie, B220 y CD43. Las células preProB portan una configuración de IGH e IGK/L de la línea germinal y tienen bajo B220 y alto CD43 sobre su superficie celular. Las células ProB comienzan a iniciar la recombinación de VDJ en el locus IGH y portan niveles medios tanto de B220 como de CD43. Las células PreB portan el locus VDJ de IGH reorganizado y comienzan a iniciar el reordenamiento de VJ de la cadena ligera, y tienen B220 alto pero CD43 bajo. En el bazo, las células B se caracterizan como inmaduras (T1 y T2) y maduras (M) basándose en los niveles de marcadores de superficie celular, IgM e IgD. Las células T1 tienen IgM alta e IgD baja. Las células T2 tienen niveles medios de ambas. Las células M tienen IgM baja pero IgD alta (figura 65). Véanse también J Exp Med. 1 de mayo de 1991; 173(5):1213-25; "Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow"; Hardy RR et al y J Exp Med. 5 de julio de 1999; 190(1):75-89; "B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals"; Loder Fet al.
Los ratones transgénicos de la divulgación desarrollan compartimentos esplénicos y BM normales
(a) Análisis del compartimento esplénico
Para cada ratón, para obtener una suspensión de células individuales de bazo, el bazo se pasó suavemente a través de un filtro celular de 30 gm. Las células individuales se resuspendieron enSolución Salina Tamponada con Fosfato(PBS) complementada con suero de ternera fetal (FCS) inactivado por calor al 3%. Se añadieron 5x106 células a tubos individuales, se centrifugaron para eliminar el exceso de fluido y se resuspendieron en 100 gl de PBS FCS al 3% de nueva aportación. A cada tubo individual se le añadieron los siguientes anticuerpos: anti-B220/CD45R (eBioscience, clon RA3-6B2)-aloficocianina (APC), anticuerpo contra el receptor de IgD conjugado con ficoeritrina (PE) (eBioscience, clon 11-26) y anticuerpo contra el receptor de IgM conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (eBioscience, clon 11/41).
Para la tinción de IgM frente a IgD, se utilizaron 5x106 células para cada tinción. A cada vial que contenía esplenocitos se le añadió un cóctel de anticuerpos que consistía en: anti-IgD (PE), anti-IgM (FITC) y anti-B220/CD45R (APC). Las células se incubaron a 6°C durante 15 minutos, se lavaron para eliminar el exceso de anticuerpos no unidos y se analizaron utilizando un analizador de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de Miltenyi Biotech. Las células B se seleccionaron como B220ALTO IgMALTA lgDBAJA (es decir, B220+ IgM+ IgD-) para la población T1, B220ALTO lgMALTA IgDALTA (B220+ IgM+ IgD+) para la población T2 y B220ALTO lgMBAJA IgDALTA (B220+ IgM- IgD+) para la población M. El porcentaje de células se calculó utilizando un sistema de selección. Los autores de la presente invención utilizaron ventanas de análisis para identificar y definir subconjuntos de poblaciones celulares en representaciones gráficas con escala logarítmica. Antes de aplicar las ventanas de análisis, se utiliza un único anticuerpo de tinción para cada fluorocromo para discriminar entre una población positiva (fluorocromo de alta intensidad) y negativa (fluorocromo de intensidad no detectable). Se aplican ventanas de análisis basadas en intensidades de fluorocromo de la misma manera a todas las muestras. Las tinciones individuales fueron:
IgD-PE
IgM-FITC
B220-APC
Los esplenocitos vivos se seleccionaron utilizando dispersión lateral (SSC) y dispersión frontal (FSC). Dentro de la población seleccionada por SSC y FSC, se detectó una subpoblación de células positivas para B220/CD45R (células B de ratón) utilizando el fluorocromo APC. La población positiva única de B220/CD45R se subdividió adicionalmente en una célula que portaba IgM-isotiocianato de fluoresceína (FITC) o IgD-fluorocromo junto con mK-fluorocromo FITC. El porcentaje de cada población se calculó utilizando un sistema de selección. Los compartimentos de células B esplénicas en los ratones de la divulgación son normales (es decir, equivalentes a los compartimentos de ratones que expresan solo cadenas de anticuerpos de ratón).
(b) Análisis de progenitores B de médula ósea
Para obtener una suspensión de células individuales de médula ósea para cada ratón, se lavaron el fémur y la tibia conSolución Salina Tamponada con Fosfato(PBS) complementada con suero de ternera fetal (FCS) inactivado por calor al 3%. Las células se pasaron adicionalmente a través de un filtro celular de 30 gm para eliminar trozos de hueso o grumos celulares. Las células se resuspendieron en PBS fría complementada con suero al 3%. Se añadieron 2x106 células a tubos individuales, se centrifugaron para eliminar el exceso de tampón, y se resuspendieron en 100 gl de PBS FCS al 3% de nueva aportación. A cada tubo individual se le añadieron los siguientes anticuerpos: antileucosialina (CD43)-isotiocianato de fluoresceína (FITC) (eBioscience, clon eBioR2/60) y anti-B220/CD45R (eBioscience, clon RA3-6B2)-aloficocianina (APC). Las células se incubaron en la oscuridad a 6°C durante 15 minutos seguido de varios lavados con PBS FCS al 3% de nueva aportación para eliminar el anticuerpo no unido. Las células se analizaron utilizando un analizador deClasificación celular activada por fluorescencia (FACS)de Miltenyi Biotech. Las células vivas de médula ósea se seleccionaron utilizando dispersión lateral (SSC) y dispersión frontal (FSC). Los autores de la presente invención utilizaron ventanas de análisis para identificar y definir subconjuntos de poblaciones c e lu la re s e n re p re s e n ta c io n e s g rá f ic a s c o n e s c a la lo g a rí tm ic a . A n te s d e a p lic a r la s v e n ta n a s d e a n á lis is , s e u t i l iz a un ú n ic o a n t ic u e rp o d e t in c ió n p a ra c a d a f lu o ro c ro m o p a ra d is c r im in a r e n tre u n a p o b la c ió n p o s it iv a ( f lu o ro c ro m o d e a lta in te n s id a d ) y n e g a t iv a ( f lu o ro c ro m o d e in te n s id a d n o d e te c ta b le ) . S e a p lic a n v e n ta n a s d e a n á lis is b a s a d a s e n in te n s id a d e s d e f lu o ro c ro m o d e la m is m a m a n e ra a to d a s la s m u e s tra s . L a s t in c io n e s in d iv id u a le s fu e ro n :
B 220 -A P C
C D 43 -F IT C
D e n tro d e la p o b la c ió n v iv a s e id e n t if ic ó u n a p o b la c ió n d o b le d e c é lu la s p o s it iv a s p a ra B 220 /C D 45 R y C D 43 c o m o c é lu la s p re -B , p ro -B y p re -p ro B. L o s c o m p a r t im e n to s d e c é lu la s B e s p lé n ic a s e n los ra to n e s d e la d iv u lg a c ió n son n o rm a le s (e s d e c ir , e q u iv a le n te s a los c o m p a r t im e n to s d e ra to n e s q u e e x p re s a n s o lo c a d e n a s d e a n tic u e rp o s d e ra tó n ).
Los ratones transgénicos de la divulgación desarrollan expresión normal de Ig
Cuantificación de IgM e IgG séricas
L a s p la c a s N U N C d e 96 p o c il lo s s e re c u b r ie ro n in ic ia lm e n te c o n u n a n t ic u e rp o d e c a p tu ra (a n t ic u e rp o a n ti-F a b d e ra tó n d e c a b ra a 1 p g /m l) d u ra n te la n o c h e a 4 °C ) . L a s p la c a s d e IgG u t il iz a ro n a n t i-F a b , (M 4155 S ig m a ) y la s p la c a s d e Ig M u t il iz a ro n a n t i-F a b (O B T 1527 A b D S e ro te c ) . D e s p u é s d e tre s la v a d o s c o n s o lu c ió n s a lin a ta m p o n a d a c o n fo s fa to (P B S ) q u e c o n te n ía T w e e n 20 a l 0 ,1 % v /v , la s p la c a s s e b lo q u e a ro n c o n 200 p l d e P B S q u e c o n te n ía a lb ú m in a d e s u e ro b o v in o (B S A ) a l 1 % p /v d u ra n te 1 h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te (R T ). L a s p la c a s s e la v a ro n t re s v e c e s c o m o a n te s y d e s p u é s s e a ñ a d ie ro n a c a d a p o c il lo 50 p l d e p a tro n e s (a n t ic u e rp o s d e is o t ip o d e ra tó n d e c o n tro l, IgG 1 (M 9269 S ig m a ), Ig G 2 a (M 9144 S ig m a ), Ig G 2 b (M 8894 s ig m a ) , Ig M (M 3795 S ig m a ) o m u e s tra s d e s u e ro d ilu id a s e n P B S c o n B S A a l 0 ,1 % , y se in c u b a ro n d u ra n te 1 h o ra a R T . D e s p u é s d e la v a r t re s v e c e s c o m o a n te s , s e a ñ a d ie ro n a c a d a p o c il lo 100 p l d e a n t ic u e rp o d e d e te c c ió n (a n t i-a n t ic u e rp o e s p e c íf ic o d e is o t ip o d e ra tó n d e c a b ra c o n ju g a d o c o n p e ro x id a s a d e rá b a n o p ic a n te , 1 /10000 e n P B S c o n T w e e n a l 0 ,1 % ) (a n ti- Ig G 1 d e ra tó n (S T A R 132 P A b D S e ro te c ) , a n t i- Ig G 2 a d e ra tó n (S T A R 133 P A d D S e ro te c ) , a n t i- Ig G 2 b d e ra tó n (S T A R 134 P A b D S e ro te c ) y a n ti- Ig M ra tó n (a b 97230 A b c a m ) y s e in c u b a ro n d u ra n te 1 h o ra a R T . L a s p la c a s se la v a ro n tre s v e c e s c o m o a n te s y s e re v e la ro n u t il iz a n d o s u s tra to d e te t ra m e t i lb e n c id in a (T M B , S ig m a ) d u ra n te 4 -5 m in u to s e n la o s c u r id a d a R T . E l re v e la d o se d e tu v o a ñ a d ie n d o 50 p l/p o c il lo d e á c id o s u lfú r ic o 1 M . L a s p la c a s s e le y e ro n c o n u n le c to r d e p la c a s B io te k S y n e rg y H T a 450 nm .
C o n c lu s ió n :
L a in v e rs ió n d e V h- D -J h e n d ó g e n a d e s p u é s d e la in s e rc ió n d e l B A C d e IG H h u m a n a , p ro d u c e la in a c t iv a c ió n d e l re o rd e n a m ie n to d e V h e n d ó g e n o a D -J h h u m a n o in s e rta d o . L o s a u to re s d e la p re s e n te in v e n c ió n o b s e rv a ro n , s in e m b a rg o , q u e s o rp re n d e n te m e n te la in a c t iv a c ió n d e la e x p re s ió n d e la c a d e n a p e s a d a e n d ó g e n a n o c a m b ia la ra z ó n d e c é lu la s B e n e l c o m p a r t im e n to e s p lé n ic o (F ig . 66 ) o e n e l c o m p a r t im e n to p ro g e n ito r B d e la m é d u la ó s e a (F ig . 67 ) y lo s n iv e le s d e in m u n o g lo b u lin a e n s u e ro s o n n o rm a le s y s e e x p re s a n lo s s u b t ip o s c o r re c to s d e Ig (F ig . 68 ). E s to se m o s tró e n ra to n e s q u e e x p re s a b a n re g io n e s v a r ia b le s d e c a d e n a p e s a d a h u m a n a c o n c a d e n a s lig e ra s d e ra tó n (F ig .
66 A y 67 A ) a s í c o m o e n ra to n e s q u e e x p re s a b a n ta n to re g io n e s v a r ia b le s d e c a d e n a p e s a d a h u m a n a c o m o re g io n e s v a r ia b le s d e c a d e n a lig e ra h u m a n a (F ig . 66 B y 67 B ). E s to s d a to s d e m u e s tra n q u e s e in s e r ta ro n s e g m e n to s g é n ic o s d e IG H h u m a n a (u n a in s e rc ió n d e a l m e n o s lo s s e g m e n to s g é n ic o s V h h u m a n o s V h2 -5 , 7 -4 -1 , 4 -4 , 1 -3 , 1 -2 , 6 -1 , y to d o s lo s s e g m e n to s g é n ic o s D y J h h u m a n o s D 1 -1 , 2 -2 , 3 -3 , 4 -4 , 5 -5 , 6 -6 ,1 -7 ,2 -8 , 3 -9 , 5 -12 , 6 -13 , 2 -15 , 3 -16 , 4 -17 , 6 -19 , 1 -20 , 2 -21 , 3 -22 , 6 -25 , 1 -26 y 7 -27 ; y J 1 , J 2 , J3 , j 4 , J 5 y J 6 ) s o n c o m p le ta m e n te fu n c io n a le s e n e l a s p e c to d e l re o rd e n a m ie n to , s e ñ a liz a c ió n d e B C R y m a d u ra c ió n d e c é lu la s B. L a fu n c io n a lid a d se m a n t ie n e ta m b ié n c u a n d o se in s e r ta n s e g m e n to s g é n ic o s V J d e c a d e n a lig e ra h u m a n a p a ra p ro p o rc io n a r c a d e n a s lig e ra s t r a n s g é n ic a s , s e g ú n la in s e rc ió n u t il iz a d a p a ra c re a r e l a le lo K 2. E s ta in s e rc ió n e s u n a in s e rc ió n q u e c o m p re n d e lo s s e g m e n to s g é n ic o s h u m a n o s V k 2 -24 , V k 3 -20 , V k 1 -17 , V k 1 -16 , V k 3-1 5, V k 1 -13 , V k 1 -12 , V k 3-1 1, V k 1 -9 , V k 1 -8 , V k 1 -6 , V k 1 -5 , V k5 -2 , V k4 -1, J k 1, J k 2, J k3, J k4 y J k 5. M á s d e 90 % d e lo s a n t ic u e rp o s e x p re s a d o s p o r lo s ra to n e s S 1 F /H A ; K 2 /K A c o m p re n d ía n re g io n e s v a r ia b le s d e c a d e n a p e s a d a h u m a n a y re g io n e s v a r ia b le s d e c a d e n a lig e ra k a p p a h u m a n a . E s to s ra to n e s s o n , p o r lo ta n to , m u y ú t ile s p a ra la s e le c c ió n d e a n t ic u e rp o s q u e t ie n e n re g io n e s v a r ia b le s h u m a n a s q u e s e u n e n e s p e c íf ic a m e n te a u n a n tíg e n o h u m a n o d e s p u é s d e la in m u n iz a c ió n d e lo s ra to n e s c o n ta l a n tíg e n o . D e s p u é s d e l a is la m ie n to d e ta l a n t ic u e rp o , e l e x p e r to e n la té c n ic a p u e d e re e m p la z a r la s re g io n e s c o n s ta n te s d e ra tó n p o r re g io n e s c o n s ta n te s h u m a n a s u t il iz a n d o té c n ic a s c o n v e n c io n a le s p a ra l le g a r a a n t ic u e rp o s to ta lm e n te h u m a n o s q u e s o n ú t ile s c o m o c a n d id a to s a fá rm a c o s p a ra la a d m in is tra c ió n a s e re s h u m a n o s (o p c io n a lm e n te d e s p u é s d e la m u ta c ió n o a d a p ta c ió n p a ra p ro d u c ir u n d e r iv a d o a d ic io n a l, p . e j., c o n p o te n c ia c ió n o in a c t iv a c ió n d e F c o d e s p u é s d e la c o n ju g a c ió n c o n u n a c a rg a ú til tó x ic a o in d ic a d o r o m a rc a u o tro ra d ic a l a c t iv o ).
S e lle v ó a c a b o u n e x p e r im e n to a d ic io n a l p a ra e v a lu a r lo s n iv e le s d e IgG e IgM y la s p ro p o rc io n e s re la t iv a s e n ra to n e s tra n s g é n ic o s d e la d iv u lg a c ió n q u e e x p re s a n a n t ic u e rp o s q u e t ie n e n re g io n e s v a r ia b le s p e s a d a s y l ig e ra s (k a p p a ) h u m a n a s ( ra to n e s S1 F /H A , K 2 /K A ; n = 15 ). E s to s s e c o m p a ra ro n f re n te a 12 ra to n e s q u e e x p re s a b a n s ó lo c a d e n a s d e a n t ic u e rp o s d e ra tó n ( ra to n e s /H A , /K A (n = 6 ) y d e t ip o s a lv a je ( W T ; n = 6 )) . L o s re s u lta d o s s e ta b u la n a c o n t in u a c ió n (T a b la 6 ) y s e m u e s tra n e n la F ig u ra 69.
S e p u e d e o b s e rv a r q u e lo s ra to n e s d e la d iv u lg a c ió n , e n lo s q u e e s e n c ia lm e n te to d a s la s re g io n e s v a r ia b le s d e c a d e n a p e s a d a s o n re g io n e s v a r ia b le s d e c a d e n a p e s a d a h u m a n a s , e x p re s a ro n p ro p o rc io n e s n o rm a le s d e s u b t ip o s d e IgM e Ig G , y ta m b ié n fu e n o rm a l la IgG to ta l c o n re la c ió n a Ig M .
Tabla 6:
Ejemplo 17:
Evaluación de la razón kappa : lambda y compartimentos de células B esplénicas en ratones transgénicos de la divulgación y ratones L2/L2; KA/KA y L3/L3; KA/KA de la invención
S e o b tu v ie ro n ra to n e s q u e c o m p re n d ía n lo s s ig u ie n te s g e n o m a s .
W T /W T = t ip o s a lv a je ;
K A /K A = c a d a a le lo k a p p a e n d ó g e n o s e h a in a c t iv a d o ; y lo s lo c i la m b d a e n d ó g e n o s s e d e ja n in ta c to s ;
K 3 F /K 3 F = c a d a a le lo k a p p a e n d ó g e n o t ie n e t re s in s e rc io n e s d e A D N d e l lo c u s d e la c a d e n a k a p p a e n tre e l J k e n d ó g e n o m á s 3 ' y e l C k d e ra tó n , p ro p o rc io n a n d o la in s e rc ió n d e lo s s e g m e n to s g é n ic o s V h u m a n o s V k 2 -40 , V k 1 -39 , V k 1 -33 , V k 2 -30 , V k 2 -29 , V k 2 -28 , V k 1 -27 , V k 2 -24 , V k3 -20 , V k 1 -17 , V k 1 -16 , V k3-1 5 , V k 1 -13 , V k 1 -12 , V k 3 -11, V k 1 -9 , V k 1 -8 , V k 1 -6 , V k 1 -5 , V k 5 -2 y V k4-1 y s e g m e n to s g é n ic o s J h u m a n o s J k 1 , J k 2, J k 3, J k4 y J k 5 (e s ta n d o lo s s e g m e n to s g é n ic o s V h u m a n o s 5 ' c o n re s p e c to a lo s s e g m e n to s g é n ic o s J h u m a n o s ) ; c a d a V J k a p p a e n d ó g e n o s e h a in a c t iv a d o p o r in v e rs ió n y m o v im ie n to a g u a s a r r ib a e n e l c ro m o s o m a ; y lo s lo c i la m b d a e n d ó g e n o s se d e ja n in ta c to s ;
L 2 /L 2 = c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 15 (h o m o c ig o to s p a ra L 2 d o n d e e l A D N d e la re g ió n v a r ia b le la m b d a h u m a n a s e h a in s e r ta d o e n los lo c i la m b d a e n d ó g e n o s ; lo s lo c i k a p p a e n d ó g e n o s s e d e ja n in ta c to s ) ;
L 2 /L 2 ; K A /K A = c o m o L 2 /L 2 p e ro lo s a le lo s k a p p a e n d ó g e n o s s e h a n in a c t iv a d o (m e d ia n te in s e rc ió n d e u n a s e c u e n c ia d e in te r ru p c ió n e n d ó g e n a = K A );
L 3 /L 3 ; K A /K A = c o m o L 2 /L 2 ; K A /K A p e ro c o m p le m e n ta d o p o r u n a te rc e ra in s e rc ió n d e A D N d e la re g ió n v a r ia b le la m b d a h u m a n a 5 ' c o n re s p e c to a la s e g u n d a in s e rc ió n d e A D N la m b d a e n lo s lo c i la m b d a e n d ó g e n o s d e m a n e ra q u e lo s s ig u ie n te s s e g m e n to s g é n ic o s la m b d a h u m a n o s s e in s e r ta n e n tre e l JA e n d ó g e n o m á s 3 ' y e l CA d e ra tó n : s e g m e n to s g é n ic o s V h u m a n o s V A 3 -27 , V A 3 -25 , V A 2 -23 , V A 3 -22 , V A 3 -21 , V A 3 -19 , V A 2 -18 , V A 3 -16 , V A 2 -14 , V A 3-12 , V A 2 -11 , V A 3 -10 , V A 3 -9 , V A 2 -8 , V A 4 -3 y V A 3 -1 , s e g m e n to s g é n ic o s J y C h u m a n o s JA 1 -C A 1 , J A 2 -C A 2 , JA 3-C A 3 , J A 6 -C A 6 y JA 7 -C A 7 ( ta m b ié n s e in c lu y e ro n s e g m e n to s n o fu n c io n a le s JA 4 -C A 4 , JA 5 -C A 5 ), p ro p o rc io n a r a s í u n a in s e rc ió n c o r re s p o n d ie n te a la s c o o rd e n a d a s 2886217 a 23327884 d e l c ro m o s o m a 22 h u m a n o in s e rta d o in m e d ia ta m e n te d e s p u é s d e la p o s ic ió n 19047551 e n e l c ro m o s o m a 16 d e ra tó n ;
S 3 F /H A ; K A /K A ; L 3 /L 3 = e l p r im e r a le lo e n d ó g e n o d e la c a d e n a p e s a d a t ie n e t re s in s e rc io n e s d e A D N d e la re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a p e s a d a h u m a n a e n tre e l J h e n d ó g e n o m á s 3 ' y E M p ro p o rc io n a n d o la in s e rc ió n d e s e g m e n to s g é n ic o s h u m a n o s V h2 -26 , V h1 -24 , V h3 -23 , V h3-21 , V h3 -20 , V h1 -18 , V h3-1 5 , V h3-1 3, V h3-1 1, V h3 -9 , V h1 -8 , V h3 -7 , V h2 -5 , V h7 -4 -1 , V h4 -4 , V h1 -3 , V h1 -2 , V h6-1 , D 1 -1 , D 2 -2 , D 3 -9 , D 3 -10, D 4 -11, D 5 -12, D 6 -13, D1 -14 , D 2 -15, D 3 -16 , D 4 -17 , D 5 -18 , D 6 -19 , D1 -20 , D 2 -21 , D 3 -22 , D 4 -23 , D 5 -24 , D 6 -25 , D1 -26 , D 7 -27 , J h1 , J h2, J h3, J h4 , J h5 y J h6 (en e l o rd e n : s e g m e n to s g é n ic o s V h u m a n o s , s e g m e n to s g é n ic o s D h u m a n o s y s e g m e n to s g é n ic o s J h u m a n o s ) ; la s e c u e n c ia d e V D J d e la c a d e n a p e s a d a e n d ó g e n a s e h a in a c t iv a d o p o r in v e rs ió n y m o v im ie n to a g u a s a rr ib a e n e l c ro m o s o m a ; y lo s lo c i la m b d a e n d ó g e n o s s e d e ja n in ta c to s ; e l s e g u n d o a le lo d e la c a d e n a p e s a d a e n d ó g e n a s e h a in a c t iv a d o p o r in s e rc ió n d e u n a s e c u e n c ia d e in te r ru p c ió n e n d ó g e n a = H A ); lo s a le lo s k a p p a e n d ó g e n o s se h a n in a c t iv a d o (= K A /K A ) ; y lo s a le lo s la m b d a e n d ó g e n o s se h a n m o d if ic a d o p o r in s e rc ió n d e A D N d e la re g ió n v a r ia b le la m b d a h u m a n a (= L 3 /L 3 );
P 2 /W T = a le lo P2 (A D N d e la re g ió n v a r ia b le la m b d a h u m a n a c o m o se d e s c r ib e e n e l E je m p lo 14 ) e n un lo c u s k a p p a e n d ó g e n o ; e l o tro lo c u s k a p p a e n d ó g e n o s e d e jó in ta c to ; a m b o s lo c i la m b d a e n d ó g e n o s se d e ja ro n in ta c to s ;
P 2 /P 2 = v é a s e e l E je m p lo 14 ; a m b o s lo c i la m b d a e n d ó g e n o s s e d e ja ro n in ta c to s ;
P 2 /K 2 = a le lo P 2 e n u n lo c u s k a p p a e n d ó g e n o ; e l o tro lo c u s k a p p a e n d ó g e n o q u e t ie n e d o s in s e rc io n e s d e A D N e n tre e l J k e n d ó g e n o m á s 3 ' y e l C k d e ra tó n , p ro p o rc io n a n d o in s e rc ió n d e lo s s e g m e n to s g é n ic o s V h u m a n o s V k 2 -24 , V k 3 -20 , V k 1 -17 , V k 1 -16 , V k 3-1 5 , V k 1 -13 , V k 1 -12 , V k 3-1 1, V k 1 -9 , V k 1 -8 , V k 1 -6 , V k 1 -5 , V k 5 -2 y V k4-1 y lo s s e g m e n to s g é n ic o s J h u m a n o s J k 1, J k 2, J k 3, J k4 y J k 5 (e s ta n d o lo s s e g m e n to s g é n ic o s V h u m a n o s 5 ' co n re s p e c to a lo s s e g m e n to s g é n ic o s J h u m a n o s ) ; a m b o s lo c i la m b d a e n d ó g e n o s s e d e ja ro n in ta c to s ;
P 3 /K 3 F = c o m o lo c u s k a p p a e n d ó g e n o q u e t ie n e u n a in s e rc ió n e n tre lo s s ig u ie n te s s e g m e n to s g é n ic o s la m b d a h u m a n o s s e in s e r ta n e n tre e l J k e n d ó g e n o m á s 3 ' y e l C k d e ra tó n , p ro p o rc io n a n d o la in s e rc ió n d e s e g m e n to s g é n ic o s V h u m a n o s V A 3 -27 , V A 3 -25 , V A 2 -23 , V A 3 -22 , V A 3 -21 , V A 3 -19, V A 2 -18, V A 3 -16, V A 2 -14 , V A 3 -12, V A 2 -11, V A 3 -10, V A 3 -9 , V A 2 -8 , V A 4 -3 y V A 3 -1 , s e g m e n to s g é n ic o s J y C h u m a n o s J A 1 -C A 1 , J A 2 -C A 2 , J A 3 -C A 3 , J A 6 -C A 6 y JA 7 -C A 7 ( ta m b ié n s e in c lu y e ro n s e g m e n to s n o fu n c io n a le s JA 4 -C A 4 , JA 5 -C A 5 ), p ro p o rc io n a n d o a s í u n a in s e rc ió n c o r re s p o n d ie n te a la s c o o rd e n a d a s 2886217 a 233278884 d e l c ro m o s o m a 22 h u m a n o in s e r ta d o in m e d ia ta m e n te d e s p u é s d e la p o s ic ió n 70674755 e n e l c ro m o s o m a 6 d e ra tó n ; e l o tro lo c u s k a p p a e n d ó g e n o q u e t ie n e e l a le lo K 3 F d e s c r ito a n te r io rm e n te (s e g m e n to s g é n ic o s V k a p p a y J h u m a n o s in s e r ta d o s ) ; a m b o s lo c i la m b d a e n d ó g e n o s s e d e ja ro n in ta c to s ;
P 2 /P 2 ; L 2 /W T = C o m o P 2 /P 2 p e ro e n d o n d e u n lo c u s la m b d a e n d ó g e n o t ie n e e l a le lo L 2 (s e g m e n to s g é n ic o s V y J la m b d a h u m a n o s in s e rta d o s ) y e l o tro lo c u s la m b d a e n d ó g e n o e s d e t ip o s a lv a je ; y
P 2 /P 2 ; L 2 /L 2 = h o m o c ig o to p a ra lo s a le lo s P 2 y L2 e n lo s lo c u s k a p p a y la m b d a e n d ó g e n o s , re s p e c t iv a m e n te .
S e lle v ó a c a b o e l a n á lis is F A C S d e c é lu la s B e s p lé n ic a s (c o m o s e h a d e s c r ito a n te r io rm e n te ) y se d e te rm in a ro n las p ro p o rc io n e s d e e x p re s ió n d e la c a d e n a lig e ra . L o s a u to re s d e la p re s e n te in v e n c ió n ta m b ié n d e te rm in a ro n las p ro p o rc io n e s d e c é lu la s B e s p lé n ic a s T 1 , T 2 y m a d u ra s (M ) y s e c o m p a ra ro n c o n ra to n e s d e t ip o s a lv a je , c o n e l f in d e e v a lu a r si s e o b tu v ie ro n o n o c o m p a r t im e n to s d e c é lu la s B e s p lé n ic a s n o rm a le s e n lo s ra to n e s t r a n s g é n ic o s . L o s re s u lta d o s se m u e s tra n e n la s T a b la s 7 y 8. L o s a u to re s d e la p re s e n te in v e n c ió n ta m b ié n e v a lu a ro n la p ro p o rc ió n d e c é lu la s p o s it iv a s p a ra B 220 c o m o in d ic a c ió n d e la p ro p o rc ió n d e c é lu la s B e n la s m u e s tra s d e c é lu la s e s p lé n ic a s .
Tabla 7: Comparaciones con ratones con insertos de región variable lambda humana en el locus lambda endógeno
Tabla 8: Ratones con insertos de región variable lambda humana en el locus kappa endógeno
Conclusiones
C o m o s e d e m u e s tra m e d ia n te L 2 /L 2 ; K A /K A y L 3 /L 3 ; K A /K A , la s in s e rc io n e s d e A D N d e la re g ió n v a r ia b le la m b d a h u m a n a e n e l lo c u s la m b d a e n d ó g e n o (c o n u n a in a c t iv a c ió n d e k a p p a e n d ó g e n o ) m o s tra ro n u n a e x p re s ió n p re d o m in a n te d e c a d e n a s lig e ra s q u e p o rta n re g io n e s v a r ia b le s la m b d a h u m a n a s ( in d ic a d a p o r la e x p re s ió n d e c a d e n a s p o s it iv a s p a ra CA e n a lre d e d o r d e 93 % ). E s to o c u rre s o rp re n d e n te m e n te in c lu s o a u n q u e e l A D N e n d ó g e n o d e la re g ió n v a r ia b le la m b d a d e ra tó n e s tá a ú n p re s e n te , lo q u e in d ic a q u e e l A D N in s e r ta d o d e la re g ió n v a r ia b le la m b d a h u m a n a p u e d e c o m p e n s a r e l re o rd e n a m ie n to d e IGA e n d ó g e n o .
A d e m á s , lo s ra to n e s q u e t ie n e n lo s s e g m e n to s g é n ic o s V y J h u m a n o s p re s e n te s e n la in s e rc ió n L 3 h o m o c ig o ta p ro d u c e n c é lu la s B (c é lu la s p o s it iv a s p a ra B 220 ) e n u n a p ro p o rc ió n q u e e s s im ila r a l t ip o s a lv a je y p ro d u c e n a d ic io n a lm e n te u n a p ro p o rc ió n o p o rc e n ta je n o rm a le s d e c é lu la s B e s p lé n ic a s m a d u ra s (e s d e c ir , s im ila re s a l t ip o s a lv a je ) . E s to s e c o n f irm a n o s o lo p o r lo s ra to n e s L 3 /L 3 ;K A /K A , s in o q u e ta m b ié n s e o b s e rv ó p a ra S 3 F /H A ;K A /K A ;L 3 /L 3 , q u e ta m b ié n c o m p re n d e u n lo c u s q u im é r ic o (h u m a n o -ra tó n ) d e IgH .
A s im is m o , lo s a u to re s d e la p re s e n te in v e n c ió n o b s e rv a ro n q u e lo s ra to n e s q u e t ie n e n lo s s e g m e n to s g é n ic o s V y J h u m a n o s p re s e n te s e n la in s e rc ió n h o m o c ig o ta d e K 3 F p ro d u c e n c é lu la s B (c é lu la s p o s it iv a s p a ra B 220 ) e n u n a p ro p o rc ió n q u e e s s im ila r a l t ip o s a lv a je y p ro d u c e n a d ic io n a lm e n te u n a p ro p o rc ió n o p o rc e n ta je n o rm a le s d e c é lu la s B e s p lé n ic a s m a d u ra s (e s d e c ir , s im ila r a l t ip o s a lv a je ) .
L o s ra to n e s q u e t ie n e n lo s s e g m e n to s g é n ic o s V y J h u m a n o s p re s e n te s e n la in s e rc ió n P 2 h o m o c ig o ta e n e l lo c u s k a p p a e n d ó g e n o m o s tra ro n u n a a lta e x p re s ió n d e c a d e n a s lig e ra s q u e c o m p re n d e n re g io n e s v a r ia b le s la m b d a h u m a n a s (c o m o s e in d ic a p o r u n a p ro p o rc ió n o b s e rv a d a d e 76 % ). L o s a u to re s d e la p re s e n te in v e n c ió n p u d ie ro n d e s v ia r a un p o rc e n ta je a ú n m a y o r g lo b a l c o m b in a n d o la in s e rc ió n d e s e g m e n to s g é n ic o s la m b d a V y J h u m a n o s e n a m b o s lo c i k a p p a y la m b d a e n d ó g e n o s (v é a s e P 2 /P 2 ; L 2 /W T a a lre d e d o r d e 94 % y P 2 /P 2 ; L 2 /L 2 a a lre d e d o r d e 95 % ). A d e m á s , lo s ra to n e s q u e c o m p re n d e n e l o rd e n a m ie n to d e s e g m e n to s g é n ic o s V y J h u m a n o s d e P 2 /P 2 ; L 2 /L 2 p ro d u c e n u n a p ro p o rc ió n o p o rc e n ta je n o rm a le s d e c é lu la s B e s p lé n ic a s m a d u ra s (e s d e c ir , s im ila re s a l t ip o s a lv a je ) .
C u a n d o s e in s e r ta ro n s e g m e n to s g é n ic o s V y J la m b d a h u m a n o s e n u n lo c u s k a p p a e n d ó g e n o y e l o tro lo c u s k a p p a e n d ó g e n o c o m p re n d ía u n a in s e rc ió n d e s e g m e n to s g é n ic o s V y J k a p p a h u m a n o s , lo s a u to re s d e la p re s e n te in v e n c ió n o b tu v ie ro n ra to n e s q u e p o d ía n e x p re s a r c a d e n a s lig e ra s q u e c o m p re n d ía n re g io n e s v a r ia b le s la m b d a y ta m b ié n c a d e n a s lig e ra s q u e c o m p re n d ía n re g io n e s v a r ia b le s k a p p a . S o rp re n d e n te m e n te , s e o b s e rv ó q u e s e p o d ía a u m e n ta r la p ro p o rc ió n d e c a d e n a s lig e ra s q u e c o m p re n d ía n re g io n e s v a r ia b le s la m b d a p o r e n c im a d e la o b s e rv a d a e n u n ra tó n d e t ip o s a lv a je e n e l q u e s ó lo 5 % o m e n o s d e c a d e n a s lig e ra s c o m p re n d e n t íp ic a m e n te re g io n e s v a r ia b le s la m b d a . L o s a u to re s d e la p re s e n te in v e n c ió n o b s e rv a ro n u n a p ro p o rc ió n d e a lre d e d o r d e 22 % p a ra e l g e n o t ip o P 2 /K 2 y a lre d e d o r d e 31 % p a ra e l g e n o t ip o P 3 /K 3 F . L a p ro p o rc ió n o b s e rv a d a c o n e l ú lt im o g e n o t ip o s e a p ro x im a a la o b s e rv a d a e n u n s e r h u m a n o e n e l q u e t íp ic a m e n te a lre d e d o r d e 60 % d e la s c a d e n a s lig e ra s c o m p re n d e n re g io n e s v a r ia b le s k a p p a y a lre d e d o r d e 40 % d e la s c a d e n a s lig e ra s c o m p re n d e n re g io n e s v a r ia b le s la m b d a . T a m b ié n e n lo s c a s o s P 2 /K 2 y P 3 /K 3 F , lo s ra to n e s p ro d u je ro n u n a p ro p o rc ió n n o rm a l d e c é lu la s B e n c o m p a ra c ió n c o n ra to n e s d e t ip o s a lv a je . A d e m á s , lo s ra to n e s q u e c o m p re n d e n e l o rd e n a m ie n to d e s e g m e n to s g é n ic o s V y J h u m a n o s d e P 3 /K 3 F p ro d u c e n u n a p ro p o rc ió n o p o rc e n ta je n o rm a le s d e c é lu la s B e s p lé n ic a s m a d u ra s (e s d e c ir , s im ila re s a l t ip o s a lv a je ) .
Otras realizaciones
A p a r t ir d e la d e s c r ip c ió n a n te r io r , s e rá e v id e n te q u e s e p u e d e n re a liz a r v a r ia c io n e s y m o d if ic a c io n e s d e la in v e n c ió n d e s c r ita e n e l p re s e n te d o c u m e n to p a ra a d a p ta r la a d iv e rs o s u s o s y c o n d ic io n e s . T a le s re a liz a c io n e s ta m b ié n e s tá n d e n tro d e l a lc a n c e d e la s s ig u ie n te s re iv in d ic a c io n e s .
L a m e n c ió n d e u n a lis ta d e e le m e n to s e n c u a lq u ie r d e f in ic ió n d e u n a v a r ia b le e n e l p re s e n te d o c u m e n to in c lu y e d e f in ic io n e s d e e s a v a r ia b le c o m o c u a lq u ie r e le m e n to in d iv id u a l o c o m b in a c ió n (o s u b c o m b in a c ió n ) d e e le m e n to s e n u m e ra d o s . L a m e n c ió n d e u n a re a liz a c ió n e n e l p re s e n te d o c u m e n to in c lu y e e s a re a liz a c ió n c o m o c u a lq u ie r re a liz a c ió n ú n ic a o c o m b in a d a c o n c u a lq u ie r o t ra re a liz a c ió n o p a rte s d e la m is m a .
T o d a s la s p u b lic a c io n e s y s o lic itu d e s d e p a te n te m e n c io n a d a s e n la m e m o r ia d e s c r ip t iv a s o n in d ic a t iv a s d e l n iv e l d e c o n o c im ie n to p rá c t ic o d e lo s e x p e r to s e n la té c n ic a a la q u e p e r te n e c e e s ta in v e n c ió n .

Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. U s o d e u n ra tó n p a ra e x p re s a r c a d e n a s lig e ra s d e in m u n o g lo b u lin a ( Ig ) q u e c o n t ie n e n re g io n e s v a r ia b le s h u m a n a s ;
e n d o n d e e l ra tó n c o m p re n d e u n g e n o m a q u e e s h o m o c ig o to p a ra u n lo c u s d e c a d e n a lig e ra d e in m u n o g lo b u lin a q u e c o m p re n d e s o lo u n a s e c u e n c ia h u m a n a , e n d o n d e la ú n ic a s e c u e n c ia h u m a n a c o r re s p o n d e a la s e c u e n c ia d e l c ro m o s o m a 22 h u m a n o d e la p o s ic ió n 23064876 a la p o s ic ió n 23327884 , q u e c o m p re n d e s e g m e n to s g é n ic o s d e c a d e n a la m b d a h u m a n o s V A 2 -18, V A 3 -16, V A 2 -14 , V A 3 -12, V A 2 -11, V A 3 -10, V A 3 -9 , V A 2 -8 , V A 4 -3 , V A 3 -1 , JA1 -C A 1 , JA 2 -C A 2 , JA 3 -C A 3 , JA 6 -C A 6 , JA 7 -C A 7 , y 3 ' EA in s e r ta d o s a g u a s a b a jo d e s e g m e n to s g é n ic o s e n d ó g e n o s d e c a d e n a lig e ra la m b d a V y J -C , e n tre E A 4 -10 y E A 3-1 , e s ta n d o lo s s e g m e n to s g é n ic o s V h u m a n o s 5 ' c o n re s p e c to a lo s s e g m e n to s g é n ic o s J h u m a n o s ; e n d o n d e lo s lo c i k a p p a e n d ó g e n o s s e h a n in a c t iv a d o ; y
e n d o n d e e l ra tó n e x p re s a c a d e n a s lig e ra s d e in m u n o g lo b u lin a , c a ra c te r iz a d o p o rq u e a l m e n o s 60 % d e las c a d e n a s lig e ra s d e in m u n o g lo b u lin a e x p re s a d a s p o r e l ra tó n c o m p re n d e n u n a re g ió n v a r ia b le la m b d a h u m a n a .
2. U s o s e g ú n la re iv in d ic a c ió n 1, e n d o n d e la ú n ic a s e c u e n c ia h u m a n a c o r re s p o n d e a la s p o s ic io n e s 2886217 a 23327884 d e l c ro m o s o m a 22 h u m a n o , q u e c o m p re n d e lo s s e g m e n to s g é n ic o s d e la c a d e n a la m b d a h u m a n a V A 3 -27 , V A 3 -25 , V A 2 -23 , V A 3 -22 , V A 3 -21 , V A 3 -19 , V A 2 -18 , V A 3 -16 , V A 2 -14 , V A 3 -12 , V A 2 -11 , V A 3 -10 , V A 3 -9 , V A 2 -8 , V A 4 -3 , V A 3 -1, JA 1 -C A 1 , JA 2 -C A 2 , JA 3 -C A 3 , JA 6 -C A 6 y JA 7 -C A 7 , y e n d o n d e al m e n o s 50 % d e la s c é lu la s B e s p lé n ic a s to ta le s p ro d u c id a s p o r e l ra tó n s o n c é lu la s B m a d u ra s .
3. El u s o s e g ú n la re iv in d ic a c ió n 1 o la re iv in d ic a c ió n 2 , q u e c o m p re n d e a d ic io n a lm e n te in m u n iz a r e l ra tó n c o n un a n tíg e n o , y re c u p e ra r u n a n t ic u e rp o e s p e c íf ic o p a ra e l a n tíg e n o .
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