ES2981441T3 - Proteínas de repetición diseñadas que se unen a la seroalbúmina - Google Patents

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Abstract

Se describen nuevas proteínas repetidas diseñadas con especificidad de unión para la albúmina sérica, así como ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas de unión a la albúmina sérica, composiciones farmacéuticas que comprenden dichas proteínas, el uso de dichas proteínas para modificar la farmacocinética de polipéptidos terapéuticamente relevantes y el uso de dichas proteínas en el tratamiento de enfermedades. Las proteínas repetidas de la invención tienen una semivida en plasma sustancialmente mayor en comparación con las proteínas que no se unen a la albúmina sérica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de repetición diseñadas que se unen a la seroalbúmina
Campo de la invención
La presente invención se refiere a proteínas de repetición diseñadas con especificidad de unión para seroalbúmina, así como a ácidos nucleicos que codifican tales proteínas de unión a la seroalbúmina, composiciones farmacéuticas que comprenden tales proteínas, el uso de tales proteínas para modificar la farmacocinética de compuestos bioactivos y al uso de tales proteínas en el tratamiento de enfermedades.
Antecedentes de la invención
Existe un gran interés por parte de la industria farmacéutica para aumentar la efectividad de los compuestos bioactivos, tales como los agentes terapéuticos proteicos, al modular o aumentar sus propiedades farmacocinéticas (PK)in vivo.Esto es especialmente cierto para los compuestos bioactivos que se eliminan rápidamente de la circulación por aclaramiento renal. El riñón filtra por lo general fuera de la circulación las moléculas que tienen un peso molecular aparente inferior a 60 kDa. Una estrategia para mejorar las propiedades farmacocinéticas de tales compuestos bioactivos pequeños es sencillamente aumentar su tamaño molecular aparente (es decir, aumentar su radio hidrodinámico), por ejemplo, por medio de la adición de restos de polímeros no proteináceos tales como polímeros de polietilenglicol o residuos de azúcar o la adición de restos de polímeros proteináceos tales como proteínas globulares o polipéptidos no estructurados, tales como los descritos en WO 2007/103515 y WO 2008/155134.
Otras estrategias aprovechan la prolongada semivida de circulación de las proteínas del suero, tales como las inmunoglobulinas y la seroalbúmina. La seroalbúmina que tiene un peso molecular de 67 kDa es la proteína más abundante en el plasma, presente a aproximadamente 50 mg/ml (0,6 mM), y tiene una semivida en el suero de 19 días en los seres humanos. La seroalbúmina ayuda a mantener el pH del plasma, contribuye a la presión sanguínea coloidal, funciona como vehículo de muchos metabolitos y ácidos grasos, y sirve como una proteína principal de transporte de fármacos en el plasma. Hay varios sitios principales de unión de moléculas pequeñas en la albúmina que se han descrito.
Se ha mostrado que la asociación no covalente con la seroalbúmina puede extender la semivida de las moléculas o polipéptidos pequeños con una vida corta ( WO 1991/001743). Los polipéptidos que se unen específicamente a la seroalbúmina y que, por lo tanto, pueden extender la semividain vivode otras moléculas acopladas a ellos, incluyen variantes de dominios bacterianos de unión a la albúmina (por ejemplo, WO 2005/097202 y WO 2009/016043), péptidos pequeños (por ejemplo, Dennis, MS, et al., J. Biol. Chem. 277(3), 35035-43, 2002 y WO 2001/045746) y fragmentos de inmunoglobulinas (por ejemplo, WO 2008/043822, WO 2004/003019; WO 2008/043821; WO 2006/040153; WO 2006/122787 y WO 2004/041865). WO 2008/043822 se refiere a otras proteínas de unión que no sean fragmentos de inmunoglobulinas, tales como moléculas basadas en dominios de proteína A, tendamistat, fibronectina, lipocalina, CTLA-4, receptores de células T, repeticiones de anquirina diseñadas y dominios PDZ, que podrían generarse para unirse específicamente a la seroalbúmina. Sin embargo, WO 2008/043822 no divulga la selección de dominios de repetición de la anquirina diseñados con especificidad de unión para la seroalbúmina (SA) ni restos de secuencia de repetición concretos de dominios de repetición que se unen específicamente a SA. Además, se describió que la semividain vivode los polipéptidos puede prolongarse por su fusión genética a la seroalbúmina (por ejemplo, WO 1991/001743). Este tipo de alteración de la semividain vivode los fármacos puede alterar positivamente sus propiedades farmacocinéticas (PK) y/o farmacodinámicas (PD). Este es un tema clave en el desarrollo de agentes terapéuticos nuevos y eficientes y de métodos de tratamiento de enfermedades. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de nuevas formas de alterar la PK y/o PD de los compuestos bioactivos.
Además de los anticuerpos, hay nuevas proteínas de unión o dominios de unión que pueden usarse para unirse específicamente a una molécula diana (por ejemplo, Binz, H.K., Amstutz, P. y Plückthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005). Una de estas nuevas clases de proteínas de unión o dominios de unión se basa en proteínas de repetición diseñadas o dominios de repetición diseñados (WO 2002/020565; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C., Forrer, P., Grütter, M.G. y Plückthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004; Stumpp, M.T.,<Binz, H.K y Amstutz, P., Drug Discov. Today 13, 695-701,2008).>W<o 2002/020565 describe cómo pueden construirse>grandes bibliotecas de proteínas de repetición y su aplicación en general. Sin embargo, WO 2002/020565 no divulga la selección de los dominios de repetición con especificidad de unión para SA ni restos concretos de secuencias de repetición de dominios repetición que se unen específicamente a SA. Además, WO 2002/020565 no sugiere que los dominios de repetición con especificidad de unión para SA puedan usarse para modular la PK o PD de otras moléculas. Estos dominios de repetición diseñados aprovechan la naturaleza modular de las proteínas de repetición y poseen módulos de limitación N-terminal y C-terminal para evitar que los dominios de repetición diseñados se agreguen al proteger el núcleo hidrófobo del dominio (Forrer, P., Stumpp, MT, Binz, HK y Plückthun, A., FEBS letters 539, 2-6, 2003). Estos módulos de protección se basaron en las repeticiones de limitación de la proteína natural de unión a guanina-adenina (proteína de unión a GA). Se mostró que la estabilidad térmica y termodinámica de estos dominios de repetición de anquirina diseñados podría aumentar aún más al mejorar la repetición de la protección C-terminal derivada de la proteína de unión a GA (Interlandi, G., Wetzel, SK, Settanni, G., Plückthun, A. y Caflisch, A., J. Mol. Biol. 375, 837-854, 2008; Kramer, M.A, Wetzel, S.K., Plückthun, A., Mittl, P.R.E, y Grütter, M.G., J. Mol. Biol.
404, 381-391, 2010). Los autores introdujeron un total de ocho mutaciones en este módulo de protección y extendieron su hélice C-terminal a través de la adición de tres aminoácidos distintos. Sin embargo, la introducción de estas modificaciones en el módulo de protección C-terminal dio como resultado una tendencia a la dimerización no deseada de un dominio de repetición diseñado que porta este módulo de protección C-terminal mutado. Por lo tanto, existe la necesidad de generar más módulos de protección C-terminales optimizados o repeticiones de protección C-terminales de dominios de repetición de anquirina.
El tomar como diana la SA para modular la PK y/o PD con los enfoques disponibles en la actualidad no siempre es efectivo. Incluso se ha vuelto cada vez más evidente que la modulación de la PK y/o PD de las moléculas a través del secuestro de SA es compleja y aún no se comprende por completo.
En general, existe una necesidad de proteínas de unión mejoradas con especificidad por SA capaces de mejorar la PK y/PD de las moléculas o los polipéptidos terapéuticamente relevantes para tratar el cáncer y otras afecciones patológicas.
El problema técnico que subyace en la presente invención es identificar nuevas proteínas de unión, tales como dominios de repetición con especificidad de unión a SA, capaces de modificar la PK y/o PD de moléculas terapéuticamente relevantes para un tratamiento mejorado del cáncer y otras afecciones patológicas. La solución a este problema técnico se logra al proporcionar las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Sumario de la invención
La invención se muestra a continuación en el conjunto adjunto de reivindicaciones. En particular, la presente invención se refiere a una proteína que comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina tiene especificidad de unión para seroalbúmina humana y en donde dicho dominio de repetición de la anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17 a 31 y 43 a 48.
En una realización preferida, dicho dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición de la anquirina que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 49, 50, 51 y 52 y secuencias, en donde hasta 9 aminoácidos en SEQ ID NO: 49, 50, 51 y 52 son intercambiados por cualquier aminoácido.
En una realización adicional, la invención se refiere a una proteína que comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina, en donde dicho dominio de repetición tiene especificidad de unión para una seroalbúmina humana y en donde dicho dominio de repetición de la anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17 a 31 y 43 a 48, en donde G en la posición 1 y/o S en la posición 2 de dicho dominio de repetición de la anquirina faltan opcionalmente.
En particular, la invención se refiere a una proteína como se define en la presente memoria anteriormente, en donde el dominio de repetición de la anquirina compite por unirse a una seroalbúmina de mamífero con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17 a 31 y 43 a 48.
Además, la invención se refiere a una proteína de este tipo que comprende un compuesto bioactivo, en particular, una proteína que comprende un compuesto bioactivo que tiene una semivida plasmática terminal al menos 2 veces mayor en un mamífero en comparación con la semivida plasmática terminal de dicho compuesto bioactivo no modificado.
La invención se refiere además a moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de la presente invención, y a una composición farmacéutica que comprende una o más de las proteínas o moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente.
Se divulga además un método de tratamiento de una afección patológica usando las proteínas de la invención.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Análisis de estabilidad de DARPin seleccionados por SEC.
Perfiles de elución de operaciones de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de DARPin con especificidad para xSA antes (Fig. 1 a), después de la incubación a 30 mg/ml (~2 mM) en PBS durante 28 días a 40 °C (Fig. 1 b) o después de su almacenamiento durante 1 mes a -80 °C (Fig. 1c) analizado con una columna Superdex 200 5/150 (Fig. 1a o Fig. 1b) o con una superdex200 10/300GL (Fig. 1c). Todas las muestras se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 1. Para el análisis SEC, las muestras se diluyeron a una concentración de 500 pM. Los estándares de masa molecular de la Aprotinina (AP) 6,5 kDa, la Anhidrasa carbónica (CA) 29 kDa y la Conalbúmina (CO) 75 kDa se indican a través de flechas.
xSA, seroalbúmina de mamíferos, A, absorbancia a 280 nm; t, tiempo de retención en minutos;
DARPin #19 (SEQ ID NO: 19 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N);
DARPin #20 (SEQ ID NO: 20 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N);
DARPin #21 (SEQ ID NO: 21 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N);
DARPin #22 (SEQ ID NO: 22 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N);
DARPin #27 (SEQ ID NO: 27 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N);
DARPin #28 (SEQ ID NO: 28 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N);
DARPin #29 (SEQ ID NO: 29 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N);
DARPin #30 (SEQ ID NO: 30 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N).
DARPin #43 (SEQ ID NO: 43 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N).
DARPin #44 (SEQ ID NO:44 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N).
DARPin #45 (SEQ ID NO:45 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N).
DARPin #46 (SEQ ID NO:46 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N).
DARPin #47 (SEQ ID NO:47 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N).
DARPin #48 (SEQ ID NO:48 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N).
Figura 2. Estabilidad térmica de DARPin seleccionados.
T razas de desnaturalización térmica de DARPin con especificidad para xSA (seguido por un aumento de la intensidad de fluorescencia del colorante SYPRO naranja presente en el tampón) en PBS a pH 7,4 (Fig. 2a) y en el tampón MES a pH 5,8 (Fig. 2b) (ácido (2-N-morfolino)-etanosulfónico 250 mM pH 5,5), NaCl 150 mM, mezclado con PBS pH 7,4 1 a 4 (v/v) y ajustando el pH a 5,8).
F, unidades de fluorescencia relativa (RFU), excitación a 515-535 nm, detección a 560-580 nm; T, temperatura en °C; Definición de DARPin ver arriba.
Figura 3. Aclaramiento plasmático de DARPin seleccionados en ratones.
El aclaramiento del plasma sanguíneo de DARPin con especificidad para MSA (seroalbúmina de ratones) y DARPin de control se evaluaron en ratones.
(Fig. 3a) DARPin que comprenden solo un dominio de repetición con especificidad de unión para MSA en comparación con DARPin #32 (ver más abajo) que no tiene especificidad de unión para MSA.
(Fig. 3b) DARPin que comprenden dos dominios de proteínas (uno de los cuales es un dominio de repetición con especificidad de unión para MSA) en comparación con DARPin #32 que no tiene especificidad de unión para MSA. Las DARPin se etiquetaron por medio de Etiqueta de His con un compuesto de 99mTc-carbonilo y se inyectaron por vía intravenosa en ratones. La radioactividad de la sangre de los ratones inyectados se midió en diferentes puntos de tiempo después de la inyección y se mostró como una relación de la dosis inyectada corregida para la desintegración radiactiva de 99mTc (%ID). Los ajustes de curvas muestran el resultado de regresiones no lineales de la radiactividad medida en diferentes puntos de tiempo - desintegración de dos fases (Graphpad Prism). Cada punto de datos indica el promedio de dos ratones por grupo.
%ID, porcentaje de dosis inyectada corregida por la desintegración radiactiva de 99mTc; t, tiempo en horas;
DARPin #18 (SEQ ID NO: 18 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N); DARPin #23 (SEQ ID NO: 23 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N ); DARPin #25 (SEQ ID NO: 25 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N); DARPin #32 (un DARPin de control negativo sin especificidad de unión a xSA, SEQ ID NO: 32 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N);
DARPin #33 (un DARPin que comprende dos dominios de repetición, uno con especificidad de unión para xSA, SEQ ID NO: 33 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N).
DARPin #35 (un DARPin que comprende dos dominios de repetición, uno con especificidad de unión para xSA, SEQ ID NO: 35 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N);
DARPin #36 (un DARPin que comprende dos dominios de repetición, uno con especificidad de unión para xSA, SEQ ID NO: 36 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N).
Figura 4.VAL.PE-128764Aclaramiento plasmático de DARPin seleccionados en monos cynomolgus.
El aclaramiento del plasma sanguíneo de DARPin con especificidad para CSA (seroalbúmina de mono cynomolgus) y DARPin de control se evaluaron en monos cynomolgus.
(Fig. 4a) DARPin #26 se comparó con DARPin #32 que no tiene especificidad de unión a CSA.
(Fig. 4b) DARPin #24, 34 y 17 se compararon con DARPin #32 que no tienen especificidad de unión a CSA. Los siguientes DARPin se inyectaron por vía intravenosa en monos cynomolgus a t = 0 horas a una concentración de 0,5 mg/ml (DARPin #26, DARPin #24, DARPin #17 y DARPin #32) o 1 mg/ml (DARPin #34): La concentración de los DARPin en el plasma de los monos se midió por ELISA en diferentes puntos de tiempo después de la inyección. Las curvas muestran el resultado de regresiones no lineales de las concentraciones medidas en diferentes puntos de tiempo - descomposición de dos fases (Graphpad Prism). A partir de la segunda fase, se puede determinar la semivida plasmática terminal de un DARPin. Cada único punto de datos indica el promedio de dos mediciones ELISA independientes de la misma muestra de suero.
C, concentración de DARPin en nM; t, tiempo en horas;
DARPin #17 (SEQ ID NO:17 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N);
DARPin #24 (SEQ ID NO:24 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N);
DARPin #26 (SEQ ID NO: 26 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N);
DARPin #32 (un DARPin de control negativo sin especificidad de unión a xSA, SEQ ID NO: 32 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N);
DARPin #34 (un DARPin que comprende dos dominios de repetición, uno con especificidad de unión para xSA, SEQ ID NO: 34 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N).
Descripción detallada de la invención
El dominio de unión de acuerdo con la presente invención es específico para una seroalbúmina de origen humano (HSA).
El término "proteína" se refiere a un polipéptido, en donde al menos parte del polipéptido tiene o es capaz de adquirir una disposición tridimensional definida a través de la formación de estructuras secundarias, terciarias o cuaternarias dentro de y/o entre su(s) cadena(s) de polipéptidos. Si una proteína comprende dos o más polipéptidos, las cadenas de polipéptidos individuales pueden unirse de forma no covalente o covalente, por ejemplo, por un enlace disulfuro entre dos polipéptidos. Una parte de una proteína, que tiene individualmente o es capaz de adquirir una disposición tridimensional definida a través de la formación de estructuras secundarias o terciarias, se denomina "dominio de proteína". Tales dominios de proteínas son bien conocidos por el profesional experto en la técnica.
El término "recombinante" como se usa en la proteína recombinante, en el dominio de proteína recombinante, en la proteína de unión recombinante y similares, significa que dichos polipéptidos se producen a través del uso de tecnologías de ADN recombinante bien conocidas por el profesional experto en la técnica relevante. Por ejemplo, una molécula de ADN recombinante (por ejemplo, producida por síntesis génica) que codifica un polipéptido puede ser clonada dentro de un plásmido de expresión bacteriano (por ejemplo, pQE30, Qiagen), plásmido de expresión de levadura o plásmido de expresión de mamífero. Cuando, por ejemplo, tal plásmido de expresión bacteriano recombinante construido se inserta en una bacteria apropiada (por ejemplo,Escherichia coli),esta bacteria puede producir el polipéptido codificado por este ADN recombinante. El polipéptido producido correspondientemente se denomina un polipéptido recombinante.
En el contexto de la presente invención, el término "polipéptido" se refiere a una molécula que consiste en una o más cadenas de aminoácidos múltiples, es decir, dos o más, unidos a través de enlaces peptídicos. Preferiblemente, un polipéptido consiste en más de ocho aminoácidos unidos a través de enlaces peptídicos.
El término "etiqueta de polipéptido" se refiere a una secuencia de aminoácidos unida a un polipéptido/proteína, en donde tal secuencia de aminoácidos es útil para la purificación, detección o direccionamiento de dicho polipéptido/proteína, o en donde dicha secuencia de aminoácidos mejora el comportamiento fisicoquímico del polipéptido/proteína, o en donde dicha secuencia de aminoácidos posee una función efectora. Las etiquetas de polipéptidos individuales, restos y/o dominios de una proteína de unión pueden conectarse entre sí directamente o a través de conectores de polipéptidos. Estas etiquetas de polipéptidos son bien conocidas en la técnica y están completamente disponibles para el experto en la técnica. Los ejemplos de etiquetas de polipéptidos son pequeñas secuencias de polipéptidos, por ejemplo, His (por ejemplo, la etiqueta His de la SEQ ID NO: 15), myc, FLAG o etiquetas Strep o restos tales como enzimas (por ejemplo, enzimas como la fosfatasa alcalina), que permiten la detección de dicho polipéptido/proteína, o restos que pueden usarse para dirigir (tales como inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas) y/o como moléculas efectoras.
El término "conector polipeptídico" se refiere a una secuencia de aminoácidos, que es capaz de unir, por ejemplo, dos dominios de proteínas, una etiqueta de polipéptido y un dominio de proteínas, un dominio de proteínas y un resto no polipeptídico tales como polietilenglicol o dos secuencias de etiquetas. Tales dominios, etiquetas, restos no polipeptídicos y conectores adicionales son conocidos por la persona experta en la técnica relevante. Se proporciona una lista de ejemplos en la descripción de la solicitud de patente WO 2002/020565. Los ejemplos particulares de tales conectores son los conectores de glicina-serina y los conectores de prolina-treonina de longitudes variables; preferiblemente, dichos conectores tienen una longitud de entre 2 y 24 aminoácidos; más preferiblemente, dichos conectores tienen una longitud de entre 2 y 16 aminoácidos. Un ejemplo de un conector de glicina-serina se proporciona en la SEQ ID NO: 16.
El término "resto polimérico" se refiere ya sea a un resto polimérico proteico o a un resto polimérico no proteico. Un "resto polimérico proteico" es preferiblemente un polipéptido que no forma una estructura terciaria estable mientras que no forma más del 10 %, preferiblemente, no más del 5 %; también preferiblemente, no más del 2 %; incluso más preferiblemente, no más del 1 %; y lo más preferiblemente, no hay cantidades detectables, según lo determinado por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de oligómeros o agregados cuando se almacenan a una concentración de aproximadamente 0,1 mM en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente (RT) durante un mes. Tales restos poliméricos proteicos operan a un peso molecular aparente en SEC que es mayor que su peso molecular efectivo cuando se usan proteínas globulares como estándares de peso molecular para la SEC. Preferiblemente, el peso molecular aparente de dichos restos poliméricos proteicos determinado por SEC es 1,5x, 2x o 2,5x mayor que su peso molecular efectivo calculado a partir de su secuencia de aminoácidos. También preferiblemente, los pesos moleculares aparentes de dichos restos poliméricos no proteicos determinados por SEC son 2x, 4x u 8x mayores que su peso molecular efectivo calculado a partir de su composición molecular. Preferiblemente, más del 50 %, 70 % o incluso el 90 % de los aminoácidos de dicho resto polimérico proteico no forma estructuras secundarias estables a una concentración de aproximadamente 0,1 mM en PBS a TA según lo determinado por mediciones de dicroísmo circular (CD). Más preferiblemente, dicho polímero proteico muestra un espectro de CD típico de UV cercano de una conformación aleatoria en espiral. Dichos análisis de CD son bien conocidos por persona experta en la técnica. También son preferibles los restos poliméricos proteicos que consisten en más de 50, preferiblemente más de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, o lo más preferiblemente, más de 800 aminoácidos. Los ejemplos de los restos poliméricos proteicos son los polipéptidos XTEN® (una marca registrada de Amunix; WO 2007/103515), o los polipéptidos que comprenden residuos de prolina, alanina y serina como se describe en WO 2008/155134. Tales restos poliméricos proteicos pueden unirse covalentemente a, por ejemplo, un dominio de unión de la invención a través de la generación de polipéptidos de fusión genética al usarse tecnologías de clonación de ADN estándar, seguido de su expresión y purificación estándar.
Un resto polimérico de la invención puede variar ampliamente en peso molecular (es decir, de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 150 kDa). Preferiblemente, el resto polimérico tiene un peso molecular de al menos 2, más preferiblemente, de al menos 5, 10, 20, 30, 50, 70, o lo más preferiblemente, de al menos 100 kDa. Preferiblemente, dicho resto polimérico está conectado por un conector polipeptídico a un dominio de unión.
Los ejemplos de restos poliméricos no proteicos son hidroxietilalmidón (HES), polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquileno. El término "PEGilado" significa que un resto de PEG está unido de forma covalente a, por ejemplo, un polipéptido de la invención.
En una realización específica, un resto de PEG o cualquier otro polímero no proteináceo puede, por ejemplo, acoplarse a un tiol de cisteína a través de un conector maleimida con la cisteína acoplada a través de un conector peptídico al extremo N o C de un dominio de unión como se describe en la presente memoria.
El término "proteína de unión" se refiere a una proteína que comprende uno o más dominios de unión, uno o más compuestos bioactivos y uno o más restos poliméricos como se explica más detalladamente a continuación. Preferiblemente, dicha proteína de unión comprende hasta cuatro dominios de unión. Más preferiblemente, dicha proteína de unión comprende hasta dos dominios de unión. Lo más preferiblemente, dicha proteína de unión comprende solo un dominio de unión. Además, cualquiera de tales proteínas de unión puede comprender dominios de proteínas adicionales que no son dominios de unión, restos de multimerización, etiquetas de polipéptidos, conectores de polipéptidos y/o un solo residuo de Cys. Los ejemplos de restos de multimerización son regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina que se emparejan para proporcionar dominios Fc de inmunoglobulina funcionales, y cremalleras de leucina o polipéptidos que comprenden un tiol libre que forma un enlace disulfuro intermolecular entre dos de dichos polipéptidos. El único residuo de Cys puede usarse para conjugar otros restos con el polipéptido, por ejemplo, al usar la química de maleimida bien conocida por el experto en la técnica. Preferiblemente, dicha proteína de unión es una proteína de unión recombinante. También preferiblemente, los dominios de unión de la proteína de unión poseen diferentes especificidades de diana.
El término "dominio de unión" significa un dominio de proteína que exhibe el mismo "plegamiento" (disposición tridimensional) que un soporte de proteína y que tiene una propiedad predeterminada, como se define a continuación. Tal dominio de unión puede obtenerse a través de técnicas de ingeniería de proteínas racionales, o más comúnmente combinatorias, habilidades que se conocen en la técnica (Binz et al., 2005, loc. cit.).Por ejemplo, un dominio de unión que tiene una propiedad predeterminada puede obtenerse a través de un método que comprende los pasos de (a) proporcionar una colección diversa de dominios de proteínas que exhiben el mismo plegamiento que un soporte de proteína como se define más adelante; y (b) cribar dicha colección diversa y/o seleccionar de dicha colección diversa para obtener al menos un dominio de proteína que tenga dicha propiedad predeterminada. La colección diversa de dominios de proteínas puede ser proporcionada a través de varios métodos de acuerdo con el sistema de cribado y/o selección que se use, y puede comprender el uso de métodos bien conocidos por la persona experta en la técnica, tales como exposición en fagos o exposición en ribosomas. Preferiblemente, dicho dominio de unión es un dominio de unión recombinante.
El término "soporte de proteína" se refiere a una proteína con áreas de superficie expuestas en las cuales las inserciones, sustituciones o deleciones de aminoácidos son altamente tolerables. Los ejemplos de soportes de proteínas que pueden usarse para generar dominios de unión de la presente invención son anticuerpos o fragmentos de los mismos, tales como fragmentos Fv o Fab de cadena sencilla, proteína A deStaphylococcus aureus,la proteína de unión a bilina dePieris brassicaeu otras lipocalinas, proteínas de repetición de la anquirina u otras proteínas de repetición, y la fibronectina humana. Los soportes de proteínas son conocidos por la persona experta en la técnica (Binz et al., 2005, loc. cit.; Binz et al., 2004, loc. cit.).
El término "propiedad predeterminada" se refiere a una propiedad tal como la unión a una diana, el bloqueo de una diana, la activación de una reacción mediada por la diana, actividad enzimática y otras propiedades relacionadas. En función del tipo de propiedad deseada, un experto en la técnica podrá identificar el formato y los pasos necesarios para realizar el cribado y/o la selección de un dominio de unión con la propiedad deseada. Preferiblemente, dicha propiedad predeterminada es la unión a una diana.
En lo sucesivo, las definiciones para las proteínas de repetición se basan en las de la solicitud de patente WO 2002/020565. La solicitud de patente WO 2002/020565 contiene además una descripción general de características, técnicas y aplicaciones de proteínas de repetición.
El término "proteínas de repetición" se refiere a una proteína que comprende uno o más dominios de repetición. Preferiblemente, cada una de dichas proteínas de repetición comprende hasta cuatro dominios de repetición. Más preferiblemente, cada una de dichas proteínas de repetición comprende hasta dos dominios de repetición. Lo más preferible, cada una de dichas proteínas de repetición solo comprende un dominio de repetición. Además, dicha proteína de repetición puede comprender dominios de proteína adicionales no repetidos, etiquetas de polipéptidos y/o conectores de polipéptidos.
El término "dominio de repetición" se refiere a un dominio de proteína que comprende dos o más unidades de repetición consecutivas (módulos) como unidades estructurales, en donde dichas unidades estructurales tienen el mismo plegamiento y se apilan firmemente para crear, por ejemplo, una estructura superhelicoidal que tiene un núcleo hidrófobo articular. Preferiblemente, un dominio de repetición comprende además una unidad (o módulo) de protección N-terminal y/o C-terminal. Incluso más preferiblemente, dichas unidades (o módulos) de protección N-terminales y/o C-terminales son repeticiones de protección.
El término "proteína de repetición diseñada" y "dominio de repetición diseñado" se refieren a una proteína de repetición o dominio de repetición, respectivamente, obtenido como resultado del procedimiento de la invención explicado en la solicitud de patente WO 2002/020565. Las proteínas de repetición diseñadas y los dominios de repetición diseñados son sintéticos y no naturales. Son proteínas o dominios artificiales, respectivamente, obtenidos a través de expresión de ácidos nucleicos diseñados correspondientemente. Preferiblemente, la expresión se lleva a cabo en células eucariotas o procariotas, tales como células bacterianas, o usando un sistema de expresiónin vitrolibre de células. Por consiguiente, una proteína de repetición de la anquirina diseñada (es decir, un DARPin) corresponde a una proteína de la invención que comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina.
El término "unidad estructural" se refiere a una parte localmente ordenada de un polipéptido, formada por interacciones tridimensionales entre dos o más segmentos de estructura secundaria que están cerca uno del otro a lo largo de la cadena polipeptídica. Tal unidad estructural exhibe un resto estructural. El término "resto estructural" se refiere a una disposición tridimensional de elementos de estructura secundaria presentes en al menos una unidad estructural. Los restos estructurales son bien conocidos por el experto en la técnica. Las unidades estructurales por sí solas no son capaces de adquirir una disposición tridimensional definida; sin embargo, su disposición consecutiva, por ejemplo, como módulos de repetición en un dominio de repetición, conduce a una estabilización mutua de las unidades vecinas, lo que resulta en una estructura superhelicoidal.
El término "unidad de repetición" se refiere a secuencias de aminoácidos que comprenden restos de secuencia de repetición de una o más proteínas de repetición de origen natural, en donde dichas "unidades de repetición" se encuentran en múltiples copias, y que exhiben una topología de plegamiento definida común a todos los restos que determinan el plegamiento de la proteína. Tales unidades de repetición corresponden a las "unidades estructurales de repetición (repeticiones)" de proteínas de repetición como se describe por Forrer et al., 2003, loc. cit. o las "unidades estructurales homologas consecutivas (repeticiones)" de proteínas de repetición como se describe por Binz et al, 2004, loc. cit. Tales unidades de repetición comprenden residuos marco y residuos de interacción. Los ejemplos de tales unidades de repetición son las unidades de repetición de armadillo, unidades de repetición ricas en leucina, unidades de repetición de la anquirina, unidades de repetición de tetratricopéptido, unidades de repetición de HEAT y unidades de repetición de variantes ricas en leucina. Las proteínas de origen natural que contienen dos o más de tales unidades de repetición se denominan "proteínas de repetición de origen natural". Las secuencias de aminoácidos de las unidades de repetición individuales de una proteína de repetición pueden tener un número significativo de mutaciones, sustituciones, adiciones y/o deleciones cuando se comparan entre sí, mientras que aún conservan sustancialmente el patrón o motivo general de las unidades de repetición.
La expresión "unidad de repetición de la anquirina" significa una unidad de repetición, que es una repetición de la anquirina como se describe, por ejemplo, por Forrer et al., 2003, loc. cit. Las repeticiones de la anquirina son bien conocidos por el experto en la técnica.
El término "residuos marco" se refiere a residuos de aminoácidos de las unidades de repetición, o los residuos de aminoácidos correspondientes de los módulos de repetición, que contribuyen a la topología del plegamiento, es decir, que contribuyen al plegamiento de dicha unidad (o módulo) de repetición o que contribuyen a la interacción con una unidad (o módulo) vecina. Tal contribución podría ser la interacción con otros residuos en la unidad (o módulo) de repetición, o la influencia en la conformación del esqueleto del polipéptido como se encuentra en las hélices a o las láminas p, o en las cadenas de aminoácidos que forman polipéptidos lineales o bucles.
El término "residuos de interacción con la diana" se refiere a residuos de aminoácidos de las unidades de repetición, o los residuos de aminoácidos correspondientes de los módulos de repetición, que contribuyen a la interacción con las sustancias diana. Tal contribución podría ser la interacción directa con las sustancias diana, o la influencia en otros residuos que interactúan directamente, por ejemplo, al estabilizar la conformación del polipéptido de una unidad (o módulo) de repetición para permitir o mejorar la interacción de residuos que interactúan directamente con dicha diana. Tales residuos marco y de interacción con la diana pueden ser identificados a través del análisis de los datos estructurales obtenidos por medio de métodos fisicoquímicos, tales como cristalografía de rayos X, espectroscopía de RMN y/o de CD, o a través de la comparación con información estructural conocida y relacionada bien conocida por los profesionales en biología estructural. y/o bioinform ática.
Preferiblemente, las unidades de repetición utilizadas para la deducción de un resto de secuencia de repetición son unidades de repetición homólogas, en donde las unidades de repetición comprenden el mismo resto estructural y en donde más del 70 % de los residuos marco de dichas unidades de repetición son homólogos entre sí. Preferiblemente, más del 80 % de los residuos marco de dichas unidades de repetición son homólogos. Mas preferiblemente, más del 90 % de los residuos marco de dichas unidades de repetición son homólogos. Los expertos en la técnica conocen los programas informáticos para determinar el porcentaje de homología entre polipéptidos, tales como Fasta, Blast o Gap. Más preferiblemente, las unidades de repetición utilizadas para la deducción de un resto de secuencia de repetición son unidades de repetición homólogas obtenidas de dominios de repetición seleccionados en una diana, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 1 y que tienen la misma especificidad de diana.
La expresión "resto de secuencia de repetición" se refiere a una secuencia de aminoácidos, que se deduce a partir de una o más unidades de repetición o módulos de repetición. Preferiblemente, dichas unidades de repetición o módulos de repetición son de dominios de repetición que tienen una especificidad de unión para la misma diana. Tales restos de secuencia de repetición comprenden posiciones de residuos marco y posiciones de residuos de interacción con la diana. Tales posiciones de residuos marco corresponden a las posiciones de residuos marco de las unidades (o módulos) de repetición. Asimismo, dichas posiciones de residuos de interacción con la diana corresponden a las posiciones de los residuos de interacción con la diana de las unidades (o módulos) de repetición. Los restos de secuencia de repetición comprenden posiciones fijas y posiciones aleatorias. El término "posición fija" se refiere a una posición de aminoácido en un resto de secuencia de repetición, en donde dicha posición se establece en un aminoácido particular. Lo más frecuentemente, dichas posiciones fijas corresponden a las posiciones de los residuos marco y/o a las posiciones de los residuos de interacción con la diana que son específicos para una determinada diana. El término "posición aleatoria" se refiere a una posición de aminoácidos en un resto de secuencia de repetición, en donde se permiten dos o más aminoácidos en dicha posición de aminoácidos, por ejemplo, en donde se permite cualquiera de los veinte aminoácidos habituales de origen natural, o en donde la mayoría de los veinte aminoácidos de origen natural están permitidos, tales como los aminoácidos distintos de la cisteína o los aminoácidos distintos de la glicina, la cisteína y la prolina. Lo más frecuentemente, dichas posiciones aleatorias corresponden a las posiciones de los residuos de interacción con la diana. Sin embargo, algunas posiciones de residuos marco también pueden ser aleatorias.
El término "topología de plegamiento" se refiere a la estructura terciaria de dichas unidades de repetición o módulos de repetición. La topología de plegamiento se determinará a través de las cadenas de aminoácidos que formen al menos partes de hélices a o láminas p, o las cadenas de aminoácidos que formen polipéptidos lineales o bucles, o cualquier combinación de hélices a, láminas p y/o polipéptidos/bucles lineales.
El término "consecutivo" se refiere a una disposición, en donde las unidades de repetición o los módulos de repetición están dispuestos en tándem. En las proteínas de repetición diseñadas, hay al menos 2, habitualmente aproximadamente de 2 a 6, en particular, al menos aproximadamente 6, frecuentemente 20 o más unidades (o módulos) de repetición. En la mayoría de los casos, las unidades (o módulos) de repetición de un dominio de repetición exhibirán un alto grado de identidad de secuencia (los mismos residuos de aminoácidos en las posiciones correspondientes) o similitud de secuencia (los residuos de aminoácidos son diferentes, pero tienen propiedades fisicoquímicas similares), y algunos de los residuos de aminoácidos podrían ser residuos clave que están fuertemente conservados. Sin embargo, un alto grado de variabilidad de secuencia por inserciones y/o deleciones de aminoácidos, y/o sustituciones entre las diferentes unidades (o módulos) de repetición de un dominio de repetición puede ser posible siempre y cuando la topología de plegamiento común de las unidades (o módulos) de repetición se mantenga.
Los profesionales expertos en la técnica conocen bien los métodos para determinar directamente la topología de plegamiento de proteínas de repetición por medios fisicoquímicos tales como cristalografía de rayos X, espectroscopía de RMN o CD. Los métodos para identificar y determinar unidades de repetición o restos de secuencia de repetición o para identificar familias de proteínas relacionadas que comprenden tales unidades o restos de repetición, tales como búsquedas de homología (BLAST, etc.), están bien establecidos en el campo de la bioinformática, y son bien conocidos por los profesionales en la técnica. El paso de refinar un resto de secuencia de repetición inicial puede comprender un proceso iterativo.
El término "módulos de repetición" se refiere a las secuencias de aminoácidos repetidas de los dominios de repetición diseñados, que se derivan originalmente de las unidades de repetición de proteínas de repetición de origen natural. Cada módulo de repetición comprendido en un dominio de repetición se deriva de una o más unidades de repetición de la familia o subfamilia de proteínas de repetición de origen natural, por ejemplo, la familia de las proteínas de repetición de armadillo o de las proteínas de repetición de la anquirina.
Los "módulos de repetición" pueden comprender posiciones con residuos de aminoácidos presentes en todas las copias de los módulos de repetición correspondientes ("posiciones fijas") y posiciones con residuos de aminoácidos diferentes o "aleatorizados" ("posiciones aleatorizadas").
Una proteína de acuerdo con la invención comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina, en donde dicho dominio de repetición tiene especificidad de unión para la seroalbúmina humana (HSA).
La expresión "tiene especificidad de unión para una diana", "se une específicamente a una diana" o "especificidad de diana" y similares significa que una proteína de unión o dominio de unión se une en PBS a una diana con una constante de disociación menor que a una proteína no relacionada tal como la proteína de unión a la maltosa (MBP) deE. coli.Preferiblemente, la constante de disociación en PBS para la diana es al menos 10, más preferiblemente, 102, aún más preferiblemente 103, o lo más preferiblemente 104 veces menor que la constante de disociación correspondiente para MBP.
La proteína de la invención no es un anticuerpo o un fragmento del mismo, tal como fragmentos Fab o scFv. Los anticuerpos y fragmentos de los mismos son bien conocidos por el experto en la técnica.
Además, el dominio de unión de la invención no comprende un pliegue de inmunoglobulina como el presente en los anticuerpos y/o en el dominio de fibronectina tipo III. Un pliegue de inmunoglobulina es un pliegue de proteína común todo p que consiste en un sándwich de dos capas de alrededor aproximadamente 7 hebras p antiparalelas dispuestas en dos láminas p. Los pliegues de inmunoglobulina son bien conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, dichos dominios de unión que comprenden un pliegue de inmunoglobulina se describen en WO 2007/080392 o WO 2008/097497.
En particular, la invención se refiere a una proteína que comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina tiene especificidad de unión para seroalbúmina humana y en donde dicho dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición de la anquirina que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 49, 50, 51 y 52 y secuencias, en donde hasta 9 aminoácidos en SEQ ID NO: 49, 50, 51 y 52 son intercambiados por cualquier aminoácido.
Preferiblemente, se intercambian en las SEQ ID NO: 49, 50, 51 y 52 hasta 8 aminoácidos por otro aminoácido, más preferiblemente se intercambian en las SEQ ID NO: 49, 50, 51 y 52 hasta 7 aminoácidos, más preferiblemente hasta 6 aminoácidos, más preferiblemente hasta 5 aminoácidos, incluso más preferiblemente hasta 4 aminoácidos, más preferiblemente hasta 3 aminoácidos, más preferiblemente hasta 2 aminoácidos, más preferiblemente hasta 1 aminoácido, y lo más preferiblemente ningún aminoácido en las SEQ ID NO: 49, 50, 51 y 52.
Preferiblemente, cuando los aminoácidos se intercambian en SEQ ID NO: 49, 50, 51 y 52, estos aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; más preferiblemente, del grupo que consiste en A, D, E, H, I, K, L, Q, R, S, T, V e Y. También preferiblemente, el reemplazo de aminoácidos es por un aminoácido homólogo; es decir, un aminoácido se intercambia por un aminoácido que tiene una cadena lateral con propiedades biofísicas similares. Por ejemplo, el aminoácido con carga negativa D puede ser reemplazado por el aminoácido con carga negativa E, o un aminoácido hidrófobo como L puede ser reemplazado por A, I o V. El reemplazo de un aminoácido por un aminoácido homólogo es bien conocido por el experto en la técnica.
Una proteína preferida comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina, en donde dicho dominio de repetición se une a HSA con una constante de disociación (Kd) en PBS por debajo de 10-4 M. Preferiblemente, dicho dominio de repetición se une a HSA con un Kd en PBS por debajo de 10-4 M, más preferiblemente, por debajo de 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, o lo más preferiblemente 10-8 M.
Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para determinar las constantes de disociación de las interacciones proteína-proteína, como las tecnologías basadas en la resonancia de plasmón superficial (SPR) (por ejemplo, análisis de SPR en equilibrio) o calorimetría de titulación isotérmica (ITC). Los valores de Kd medidos de una interacción proteína-proteína particular pueden variar si se miden en diferentes condiciones (por ejemplo, concentración de sal, pH). Por lo tanto, las mediciones de los valores de Kd se llevan a cabo preferiblemente con soluciones estandarizadas de proteína y un tampón estandarizado, tal como PBS.
Las proteínas que comprenden un dominio de repetición de la anquirina que se unen a HSA con una Kd en PBS por debajo de 10-4 M se muestran en los Ejemplos.
Un dominio de repetición de la anquirina de una proteína de la invención se une a seroalbúmina humana (HSA).
Más preferible es un dominio de unión que comprenda entre 70 y 300 aminoácidos, en particular, entre 100 y 200 aminoácidos.
Más preferible es una proteína o dominio de unión desprovisto de un residuo de Cys libre. Un "residuo de Cys libre" no está involucrado en la formación de un enlace disulfuro. Aún más preferible es una proteína o dominio de unión libre de cualquier residuo de Cys.
Un dominio de unión de la invención es un dominio de repetición de la anquirina o un dominio de repetición de la anquirina diseñado (Binz et al., 2004, loc. cit.), preferiblemente como se describe en WO 2002/020565. Los ejemplos de dominios de repetición de la anquirina diseñados se muestran en los Ejemplos.
En una realización adicional, la invención se refiere a una proteína que comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina, en donde dicho dominio de repetición tiene especificidad de unión para seroalbúmina humana y en donde dicho dominio de repetición de la anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17 a 31 y 43 a 48, en donde G en la posición 1 y/o S en la posición 2 de dicho dominio de repetición de la anquirina faltan opcionalmente.
Preferiblemente, dicho dominio de repetición de la anquirina en una proteína de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21, 27 y 46; preferiblemente 27 y 46. Como se definió anteriormente, dicho dominio de repetición de la anquirina se une a HSA con una constante de disociación (Kd) en PBS por debajo de 10-4 M. Preferiblemente, dicho dominio de repetición se une a HSA con una Kd en PBS por debajo de 10-4 M, más preferiblemente, por debajo de 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, o lo más preferiblemente 10-8 M.
Preferiblemente, dicho dominio de repetición de la anquirina en una proteína de la invención comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con "unidades de repetición aleatorizadas" o "posiciones aleatorizadas" en un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17 a 31 y 43 a 48.
Preferiblemente, en lugar del 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, dicho dominio de repetición de la anquirina en una proteína de la invención comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos.
En una realización particular, la proteína con especificidad de unión para la seroalbúmina humana definida por el reemplazo de hasta 9 aminoácidos en módulos de repetición de la anquirina de SEQ ID NO: 49, 50, 51 y 52, o definida por al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17 a 31 y 43 a 48, tiene una semivida plasmática terminal al menos 5 veces mayor en un mamífero en comparación con una proteína correspondiente que no se une a la seroalbúmina de mamífero, por ejemplo, el dominio de repetición de la anquirina de SEQ ID NO: 32. En dicha proteína preferida, la semivida plasmática terminal mínima en humanos es de al menos 1 día, más preferiblemente, de al menos 3 días, aún más preferiblemente, de al menos 5 días.
En una realización adicional, la invención se refiere a una proteína, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el resto de secuencia de repetición de la anquirina
X<1>DX<2>X<3>X<4>X<5>TPLHLAAX<6>X<7>GHLX<8>IVEVLLKX<9>GADVNA (SEQ ID NO:53)
en donde X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>, X6, X<7>, X8 y X<9>, representan, independientemente el uno del otro, un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; preferiblemente en donde
Xi representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, M, F, S, I, T, N, Y y K; más preferiblemente K y A;
X<2>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K, D, F, M, N, I e Y; más preferiblemente I, E e Y;
X<3>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en W, R, N, T, H, K, A y F; más preferiblemente W, R y F;
X<4>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y S;
X<5>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, T y H;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, V y R;
X<7>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, Y, N, D, H, S, A, Q, T y G; más preferiblemente E, Y y N;
X8 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E y K;
X<9>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, Y, H y N; más preferiblemente Y y H; y
en donde, opcionalmente, hasta 5 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEQ ID NO: 53 se intercambian por cualquier aminoácido.
En particular, la invención se refiere a una proteína, en donde el dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el resto de secuencia de repetición de la anquirina X<1>DX<2>X<3>GX<4>TPLHLAAX<5>X<6>GHLEIVEVLLKX<7>GADVNA (SEQ ID NO:10)
en donde
X<1>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, M, F, S, I, T, N, Y y K; preferiblemente K y A;
X<2>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K, D, F, M, N, I e Y; preferiblemente I, E e Y;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en W, R, N, T, H, K, A y F; preferiblemente W, R y F;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, T y H;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, V y R;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, Y, N, D, H, S, A, Q, T y G; preferiblemente E, Y y N;
X<7>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S, A, Y, H y N; preferiblemente Y y H; y
en donde, opcionalmente, hasta 5 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEQ ID NO: 10 se intercambian por cualquier aminoácido;
En una realización adicional, la invención se refiere a una proteína, en donde el dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el resto de secuencia de repetición de la anquirina X<1>DYFX<2>HTPLHLAARX<3>X<4>HLX<5>IVEVLLKX<6>GADVNA (SEQ ID NO:11)
en donde
X<1>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, K y A; preferiblemente K y A; X<2>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en D, G y S; preferiblemente G y S; X<3>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, N, D, H, S, A, Q, T y G; preferiblemente Q, D y N; más preferiblemente Q y N;
X<4>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y D;
X<5>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K y G; preferiblemente E y K; X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, A y N; preferiblemente H, A Y, más preferiblemente A e Y; y
en donde, opcionalmente, hasta 5 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEQ ID NO:
11 se intercambian por cualquier aminoácido.
En otra realización más, la invención se refiere a una proteína, en donde el dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el resto de secuencia de repetición de la anquirina.
X<1>DFX<2>GX<3>TPLHLAAX<4>X<5>GHLEIVEVLLKX<6>GADVNA (SEQ ID NO:54)
en donde
X<1>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K; preferiblemente S y K;
X<2>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N;
X<5>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N, D, Q, S, A, T y E; preferiblemente
D y Q;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; preferiblemente A y
H; y
en donde, opcionalmente, hasta 5 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEQ ID NO:
54 se intercambian por cualquier aminoácido;
En particular, la invención se refiere a una proteína, en donde el dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el resto de secuencia de repetición de la anquirina.
X<1>DFX<2>GX<3>TPLHLAAX<4>DGHLEIVEVLLKX<5>GADVNA (SEQ ID NO:12)
en donde
X<1>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, S, L y K; preferiblemente S y K;
X<2>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y K;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en S y N;
X<5>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, H, Y, S y N; preferiblemente A y H; y
en donde, opcionalmente, hasta 5 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEQ ID NO:
12 se intercambian por cualquier aminoácido;
Se prefiere una proteína, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición
con el resto de secuencia de repetición de la anquirina de SEQ ID NO: 12, precedido por un módulo de repetición
con el resto de secuencia de repetición de la anquirina de SEQ ID NO: 11.
En otra realización más, la invención se refiere a una proteína, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el resto de secuencia de repetición de la anquirina X<1>DX<2>X<3>GTTPLHLAAVYGHLEX<4>VEVLLKX<5>GADVNA (SEQ ID NO:13)
en donde
X<1>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K, A, D, M, F, S, I, T, N, e Y; preferiblemente K y A;
X<2>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E, K, D, F, M, N e Y, preferiblemente
E, D e Y;
X<3>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, N, T, H, K, A y F; preferiblemente R y F;
X<4>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I y M;
X<5>representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, Y, K, A y N; preferiblemente de<K y A; y>
en donde, opcionalmente, hasta 5 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEQ ID NO: 13 se intercambian por cualquier aminoácido;
En otra realización más, la invención se refiere a una proteína, en donde el dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el resto de secuencia de repetición de la anquirina
X1NETGYTPLHLADSSGHX2EIVEVLLKX3X4X5DX6NA (SEQ ID NO:14)
en donde
X1 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y K;
X2 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L y P;
X3 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H, N, Y y A; preferiblemente H y A;
X4 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y S;
X5 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, V, T y S; preferiblemente S y A;
X6 representa un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V e F; y
en donde, opcionalmente hasta 5 aminoácidos en otras posiciones que no sean las indicadas con X en SEQ ID NO: 14 se intercambian por cualquier aminoácido;
Se prefiere una proteína, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de repetición con el resto de secuencia de repetición de la anquirina de SEQ ID NO: 14, precedido por un módulo de repetición con el resto de secuencia de repetición de la anquirina de SEQ ID NO: 13.
El término "módulo de protección" se refiere a un polipéptido fusionado con el módulo de repetición N o C-terminal de un dominio de repetición, en donde dicho módulo de protección forma interacciones terciarias estrechas (es decir, interacciones de estructura terciaria) con dicho módulo de repetición proporcionando así una protección que protege el núcleo hidrófobo de dicho módulo de repetición en el lado que no está en contacto con el módulo de repetición consecutivo del disolvente. Dicho módulo de protección N y/o C-terminal puede ser, o puede derivarse de, una unidad de protección u otra unidad estructural que se encuentra en una proteína de repetición de origen natural adyacente a una unidad de repetición. El término "unidad de protección" se refiere a un polipéptido plegado de origen natural, en donde dicho polipéptido define una unidad estructural particular que está fusionada de forma N o C-terminal a una unidad de repetición, en donde dicho polipéptido forma interacciones de estructura terciaria estrechas con dicha unidad de repetición proporcionando de esta forma una protección que protege el núcleo hidrófobo de dicha unidad de repetición a un lado del disolvente. Preferiblemente, los módulos de protección o unidades de protección son repeticiones de protección. El término "repetición de protección" se refiere al módulo de protección o unidad de protección que tiene un plegamiento similar o el mismo al de dicha unidad (o módulo) de repetición adyacente y/o similitudes de secuencia con dicha unidad (o módulo) de repetición adyacente. Los módulos de protección y las repeticiones de protección se describen en WO 2002/020565 y en Interlandi et al., 2008 (loc. cit.). Por ejemplo, WO 2002/020565 describe el módulo de protección N-terminal (es decir, una repetición de protección) que tiene la secuencia de aminoácidos GSDLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNA (SEQ ID NO: 1) y el módulo de protección C-terminal (es decir, una repetición de protección) que tiene la secuencia de aminoácidos QDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQKLN (SEQ ID NO: 2).
Interlandi et al., 2008 (loc. cit.) describen los módulos de protección C-terminales que tienen las secuencias de aminoácidos QDKFGKTPFDLAIREGHEDIAEVLQKAA (SEQ ID NO: 3) y QDKFGKTPFDLAIDNGNEDIAEVLQKAA (SEQ ID NO: 4).
Por ejemplo, el módulo de protección N-terminal de la SEQ ID NO: 17 está codificado por los aminoácidos de la posición 1 a 32 y el módulo de protección C-terminal de la SEQ ID NO: 17 está codificado por los aminoácidos de la posición 99 a 126.
Un módulo de protección N-terminal preferido comprende el resto de secuencia
X1LX2KKLLEAARAGQDDEVRILX3AX4GADVNA (SEQ ID NO:5)
en donde X1 representa un residuo de aminoácido G, A o D;
en donde X<2>representa un residuo de aminoácido G o D;
en donde X<3>representa un residuo de aminoácido L, V, I, A o M; preferiblemente, L o M; y
en donde X<4>representa un residuo de aminoácido A, H, Y, K, R o N; preferiblemente, A o N.
Más preferido es cualquier módulo de protección N-terminal que comprende una repetición de protección N-terminal, en donde uno o más de los residuos de aminoácidos en dicha repetición de protección se reemplazan por un residuo de aminoácido encontrado en la posición correspondiente en la alineación de una unidad de protección correspondiente o unidad de repetición.
Un módulo de protección C-terminal preferido comprende el resto de secuencia X<1>DKX<2>GKTX<3>X<4>DX<5>X<6>X<7>DX<8>GX<9>EDX<10>AEX<11>LQKAA (SEQ ID NO:6)
en donde X<1>representa un residuo de aminoácido Q o K;
en donde X<2>representa un residuo de aminoácido A, S. o F; preferiblemente, S o F;
en donde X<3>representa un residuo de aminoácido A o P;
en donde X4 representa un residuo de aminoácido A o F;
en donde X5 representa un residuo de aminoácido I o L;
en donde X6 representa un residuo de aminoácido S o A;
en donde X7 representa un residuo de aminoácido I o A;
en donde X8 representa un residuo de aminoácido A, E o N; preferiblemente A o N;
en donde X9 representa un residuo de aminoácido N o H;
en donde X<10>representa un residuo de aminoácido L o I;
en donde X<11>representa un residuo de aminoácido I o V; y
en donde X<2>no representa F si X4 representa F y X7 representa I y X8 representa N o E.
Otro módulo de protección C-terminal preferido comprende el resto de secuencia X<1>DKX<2>GKTX<3>ADX<4>X<5>X<6>DX<7>GX<8>EDX<9>AEX<10>LQKAA (SEQ ID NO:7)
en donde X<1>representa un residuo de aminoácido Q o K;
en donde X<2>representa un residuo de aminoácido A, S. o F; preferiblemente, S o F;
en donde X<3>representa un residuo de aminoácido A o P;
en donde X<4>representa un residuo de aminoácido I o L;
en donde X5 representa un residuo de aminoácido S o A;
en donde X6 representa un residuo de aminoácido I o A;
en donde X<7>representa un residuo de aminoácido A, E o N; preferiblemente, A o N;
en donde X8 representa un residuo de aminoácido N o H;
en donde X9 representa un residuo de aminoácido L o I; y
en donde X<10>representa un residuo de aminoácido I o V;
Otro módulo de protección C-terminal preferido comprende el resto de secuencia X<1>DKX<2>GKTX<3>ADX<4>X<5>ADX<6>GX<7>EDX<8>AEX<9>LQKAA (SEQ ID NO:8)
en donde X<1>representa un residuo de aminoácido Q o K;
en donde X<2>representa un residuo de aminoácido A, S o F; preferiblemente, S o F;
en donde X3 representa un residuo de aminoácido A o P;
en donde X<4>representa un residuo de aminoácido I o L;
en donde X<5>representa un residuo de aminoácido S o A;
en donde X6 representa un residuo de aminoácido A, E o N; preferiblemente A o N;
en donde X<7>representa un residuo de aminoácido N o H;
en donde X8 representa un residuo de aminoácido L o I; y
en donde X<9>representa un residuo de aminoácido I o V;
Preferiblemente, dicho módulo de protección C-terminal que comprende el resto de secuencia de la SEQ ID NO: 6, 7 u 8 tiene un residuo de aminoácido A, I o K; preferiblemente, I o K; en la posición correspondiente a la posición 3 de dicho resto de secuencia.
También preferiblemente, dicho módulo de protección C-terminal que comprende el resto de secuencia de la SEQ ID NO: 6, 7 u 8 tiene un residuo de aminoácido R o D en la posición correspondiente a la posición 14 de dicho resto de secuencia.
Un módulo de protección C-terminal preferido es un módulo de protección C-terminal que tiene la secuencia de aminoácidos QDKSGKTPADLAADAGHEDIAEVLQKAA (SEQ ID NO: 9).
Más preferido es un módulo de protección C-terminal que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, en donde
el residuo de aminoácido en la posición 1 es Q o K;
el residuo de aminoácido en la posición 4 es S o F;
el residuo de aminoácido en la posición 9 es A o F;
el residuo de aminoácido en la posición 13 es A o I;
el residuo de aminoácido en la posición 15 es A, E o N; y
en donde dicho módulo de protección C-terminal no tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 3 o 4. Más preferido es un módulo de protección C-terminal que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o lo más preferible, al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos en la alineación con la SEQ ID NO: 9 o 2. Preferiblemente, el residuo de aminoácido de dicho módulo de protección C-terminal en la posición correspondiente a la posición 4 de la SEQ ID: 9 en la alineación es S, el residuo de aminoácido de dicho módulo de protección C-terminal en la posición correspondiente a la posición 9 de la SEQ ID: 9 en la alineación es A, el residuo de aminoácido de dicho módulo de protección C-terminal en la posición correspondiente a la posición 13 de la SEQ ID: 9 en la alineación es A, y/o el residuo de aminoácido de dicho módulo de protección C-terminal en la posición correspondiente a la posición 15 de SEQ ID: 9 en la alineación es A. Más preferiblemente, el residuo de aminoácido de dicho módulo de protección C-terminal en la posición correspondiente a la posición 9 de la SEQ ID: 9 en la alineación es A y/o el residuo de aminoácido de dicho módulo de protección C-terminal en la posición correspondiente a la posición 13 de la SEQ ID: 9 en la alineación es A. También preferiblemente, dicho módulo de protección C-terminal comprende 28 aminoácidos. Más preferido es un módulo de protección C-terminal que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o 9, en donde uno o más de los residuos de aminoácidos de dicho módulo de protección C-terminal se intercambian por un aminoácido encontrado en la posición correspondiente en la alineación de una unidad de protección o repetición de protección C-terminal correspondiente y en donde
el residuo de aminoácido en la posición 4 es S;
el residuo de aminoácido en la posición 9 es A;
el residuo de aminoácido en la posición 13 es A; y/o
el residuo de aminoácido en la posición 15 es A.
Preferiblemente, se intercambian hasta el 30 % de los residuos de aminoácidos de dicho módulo de protección C-terminal, más preferiblemente, se intercambian hasta el 20 % e incluso más preferiblemente, hasta el 10 % de los residuos de aminoácidos. También preferiblemente, dicho módulo de protección C-terminal es una repetición de protección C-terminal de origen natural.
También se prefiere un módulo de protección C-terminal que comprende los aminoácidos de la posición 1 a 25 o de la posición 1 a 26 de cualquiera de los módulos de protección C-terminales anteriores basados en la SEQ ID NO: 9.
Más preferido es un módulo de protección C-terminal de este tipo que tiene una secuencia de aminoácidos que no comprende el aminoácido N seguido de G.
También se prefiere un módulo de protección C-terminal que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o lo más preferible, al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de los módulos de protección C-terminales anteriores basados en la SEQ ID NO: 9 o con la propia SEQ ID NO: 9.
Más preferido es un módulo de protección C-terminal que tiene al menos un 70 %, preferiblemente, al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o lo más preferido, al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2 o 9 y en donde dicho módulo de protección C-terminal tiene el aminoácido A en la posición 9; preferiblemente, dicho módulo de protección C-terminal tiene el aminoácido A en las posiciones 9 y 13; más preferiblemente, dicho módulo de protección C-terminal tiene el aminoácido A en las posiciones 9, 13 y 15; y lo más preferiblemente, dicho módulo de protección C-terminal tiene el aminoácido A en las posiciones 9, 13 y 15 y S en la posición 4.
Más preferido es que dicho módulo de protección C-terminal no tenga el aminoácido R en la posición 14 y/o no tenga el aminoácido E en la posición 15.
También se prefiere que dicho módulo de protección C-terminal no tenga una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 2, 3 o 4.
Más preferido es que dicho módulo de protección C-terminal tenga una secuencia de aminoácidos basada en la SEQ ID NO: 9, en donde dicho módulo de protección C-terminal tiene aminoácidos en las posiciones 26, 27 y 28 seleccionados del grupo que consiste en A, L, R, M, K y N; más preferiblemente, A, L, R y K; y lo más preferiblemente, K, A y L.
Un módulo de protección de un dominio de repetición puede intercambiarse por un módulo de protección como se describe en la presente memoria combinando técnicas, tales como la alineación de secuencias de aminoácidos, mutagénesis y síntesis de genes, conocidas por el experto en la técnica. Por ejemplo, la repetición de protección C-terminal de la SEQ ID NO: 17 puede ser reemplazada por la repetición de protección C-terminal de la SEQ ID NO: 9 por (i) la determinación de la repetición de protección C-terminal de la SEQ ID NO: 17 (es decir, la posición de secuencia 99 a 126) a través de la alineación de secuencia con la SEQ ID NO: 9, (ii) el reemplazo de la secuencia de la repetición de protección C-terminal determinada de la SEQ ID NO: 17 con la secuencia de la SEQ ID NO: 9, (iii) la generación de un gen que codifica el dominio de repetición que codifica el módulo de protección C-terminal intercambiado, (iv) la expresión del dominio de repetición modificado en el citoplasma deE. coliy (v) la purificación del dominio de repetición modificado por medios estándar.
Además, un dominio de repetición de la invención puede construirse genéticamente ensamblando un módulo de protección N-terminal (es decir, la repetición de protección N-terminal de la SEQ ID NO: 1) seguido de uno o más módulos de repetición (es decir, los módulos de repetición que comprenden los residuos de aminoácidos de la posición 33 a 98 de la SEQ ID NO: 17) y un módulo de protección C-terminal (es decir, la repetición de protección C-terminal de la SEQ ID NO: 9) a través de síntesis génica. El gen del dominio de repetición ensamblado genéticamente puede expresarse enE. colicomo se describió anteriormente.
También se prefiere una proteína, en donde el dominio de repetición de la anquirina o el dominio de repetición de la anquirina diseñado comprende un módulo de protección C-terminal con el resto de secuencia de la SEQ ID NO: 6, 7 u 8, en donde dicho módulo de protección tiene el aminoácido I en la posición 3 y en donde dicho módulo de repetición esté precedido por un módulo de repetición con el resto de secuencia de repetición de la anquirina de la SEQ ID NO: 12.
Más preferida es una proteína, un dominio de repetición, un módulo de protección N-terminal o un módulo de protección C-terminal que tenga una secuencia de aminoácidos desprovista de los aminoácidos C, M o N.
Más preferida es una proteína, un dominio de repetición, un módulo de protección N-terminal o un módulo de protección C-terminal que tenga una secuencia de aminoácidos desprovista del aminoácido N seguido de G.
Más preferido es cualquier módulo de protección C-terminal que comprenda una repetición de protección C-terminal, en donde uno o más de los residuos de aminoácidos en dicha repetición de protección se reemplacen por un residuo de aminoácido encontrado en la posición correspondiente en la alineación de una unidad de protección correspondiente o unidad de repetición.
Más preferida es una proteína que comprenda cualquiera de dichos módulos de protección N-terminal o C-terminal.
Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de dichos módulos de protección C-terminales son las secuencias de aminoácidos de la posición 99 a 126 en las SEQ ID NO: 19, 21, 27, 28, 38, 40 y 42. El Ejemplo 6 demuestra que la estabilidad térmica de un dominio de repetición puede aumentarse reemplazando sus módulos de protección C-terminales por un módulo de protección como se describe en la presente memoria.
El término "diana" se refiere a una molécula individual tal como una molécula de ácido nucleico, un polipéptido o proteína, un carbohidrato o cualquier otra molécula de origen natural, incluyendo cualquier parte de dicha molécula individual, o complejos de dos o más de dichas moléculas. La diana puede ser una célula completa o una muestra de tejido, o puede ser cualquier molécula o resto que no sea de natural. Preferiblemente, la diana es un polipéptido de origen natural o no natural o un polipéptido que contenga modificaciones químicas, por ejemplo, modificado por fosforilación, acetilación o metilación natural o no natural. En la aplicación particular de la presente invención, la diana es HSA.
El término "xSA" se refiere a una seroalbúmina de mamífero, tal como una seroalbúmina de ratón, rata, conejo, perro, cerdo, mono o ser humano. El término "MSA" se refiere a una seroalbúmina de ratón (número de acceso primario de UniProtKB/Swiss-Prot P07724), el término "CSA" se refiere a una seroalbúmina de mono cynomolgus (es decir,macaca fascicularis)(número de acceso primario de UniProtKB/Swiss-Prot A2V9Z4) y el término "HSA" se refiere a una seroalbúmina humana (número de acceso primario de UniProtKB/Swiss-Prot P02768).
El término "secuencia de consenso" se refiere a una secuencia de aminoácidos, en donde dicha secuencia de consenso se obtiene a través de la alineación estructural y/o secuencial de múltiples unidades de repetición. Usando dos o más unidades de repetición alineadas estructurales y/o secuenciales, y permitiendo espacios en la alineación, es posible determinar el residuo de aminoácido más frecuente en cada posición. La secuencia de consenso es esa secuencia que comprende los aminoácidos que se representan con mayor frecuencia en cada posición. En el caso de que dos o más aminoácidos estén representados por encima del promedio en una sola posición, la secuencia de consenso puede incluir un subconjunto de esos aminoácidos. Dichas dos o más unidades de repetición pueden tomarse de las unidades de repetición comprendidas en una única proteína de repetición, o de dos o más proteínas de repetición diferentes.
Las secuencias de consenso y los métodos para determinarlas son bien conocidos por el experto en la técnica.
Un "residuo de aminoácido de consenso" es el aminoácido encontrado en una posición determinada en una secuencia de consenso. Si dos o más, por ejemplo, tres, cuatro o cinco, residuos de aminoácidos se encuentran con una probabilidad similar en dichas dos o más unidades de repetición, el aminoácido de consenso puede ser uno de los aminoácidos más frecuentemente encontrados o una combinación de dichos dos o más residuos de aminoácidos.
Más preferidos son los módulos de protección , módulos de repetición, proteínas de unión o dominios de unión de origen no natural.
La expresión "de origen no natural" significa sintético o no de la naturaleza, más específicamente, la expresión significa fabricado por la mano del hombre. La expresión "proteína de unión de origen no natural" o "dominio de unión de origen no natural" significa que dicha proteína de unión o dicho dominio de unión es sintético (es decir, producida por síntesis química a partir de aminoácidos) o recombinante y no de origen natural. "Proteína de unión de origen no natural" o "dominio de unión de origen no natural" es una proteína o dominio artificial, respectivamente, obtenido por expresión de ácidos nucleicos diseñados correspondientemente. Preferiblemente, la expresión se realiza en células eucariotas o bacterianas, o usando un sistema de expresiónin vitrolibre de células. Además, el término significa que la secuencia de dicha proteína de unión o de dicho dominio de unión no está presente como una entrada de secuencia no artificial en una base de datos de secuencias, por ejemplo, en GenBank, EMBL-Bank o Swiss-Prot. Estas bases de datos y otras bases de datos de secuencias similares son bien conocidas por el experto en la técnica
La invención se refiere a una proteína que comprende un dominio de unión, en donde dicho dominio de unión es un dominio de repetición de la anquirina y se une específicamente a HSA y en donde dicha proteína y/o dominio de unión tiene una temperatura de desnaturalización (Tm) de punto medio por encima de 40 °C tras el despliegue térmico en PBS y forma menos del 5 % (p/p) de agregados insolubles a concentraciones de hasta 10 g/l cuando se incuba a 37 °C durante 1 día en PBS.
El término "PBS" significa una solución de agua tamponada con fosfato que contiene NaCl 137 mM, fosfato 10 mM y KCl 2,7 mM y tiene un pH de 7,4.
Preferiblemente, la proteína y/o el dominio de unión tiene una temperatura de desnaturalización (Tm) en el punto medio por encima de 45 °C, más preferiblemente por encima de 50 °C, más preferiblemente, por encima de 55 °C, y lo más preferiblemente, por encima de 60 °C tras el despliegue térmico en PBS a pH 7,4 o en tampón MES a pH 5,8. Una proteína o un dominio de unión de la invención posee una estructura secundaria y terciaria definida en condiciones fisiológicas. El despliegue térmico de dicho polipéptido da como resultado una pérdida de su estructura terciaria y secundaria, que puede ser seguida, por ejemplo, por mediciones de dicroísmo circular (CD). La temperatura de desnaturalización en el punto medio de una proteína o dominio de unión tras el despliegue térmico corresponde a la temperatura en el punto medio de la transición cooperativa en tampón fisiológico tras la desnaturalización térmica de dicha proteína o dominio aumentando lentamente la temperatura de 10 °C a aproximadamente 100 °C. La determinación de la temperatura de desnaturalización en el punto medio tras el despliegue térmico es bien conocida por el experto en la técnica. Esta temperatura de desnaturalización en el punto medio de una proteína o dominio de unión tras el despliegue térmico es indicativa de la estabilidad térmica de dicho polipéptido.
También se prefiere una proteína y/o dominio de unión que forme menos del 5 % (p/p) de agregados insolubles a concentraciones de hasta 20 g/l, preferiblemente hasta 40 g/l, más preferiblemente, hasta 60 g/l, incluso más preferiblemente, hasta 80 g/l, y lo más preferiblemente, hasta 100 g/l cuando se incuba durante más de 5 días, preferiblemente, durante 10 días, más preferiblemente, durante 20 días, más preferiblemente, durante 40 días, y lo más preferiblemente durante 100 días a 37 °C en PBS. La formación de agregados insolubles puede detectarse por la aparición de precipitaciones visuales, filtración en gel o dispersión dinámica de la luz, que aumenta fuertemente con la formación de agregados insolubles. Los agregados insolubles pueden ser eliminados de una muestra de proteína por centrifugación a 10’000 x g durante 10 minutos. Preferiblemente, una proteína y/o dominio de unión forma menos del 2 %, más preferiblemente, menos del 1 %, 0,5 %, 0,2 %, 0,1 %, o lo más preferiblemente menos del 0,05 % (p/p) de agregados insolubles bajo las condiciones de incubación mencionadas a 37 °C en PBS. Los porcentajes de los agregados insolubles pueden determinarse al separar los agregados insolubles de la proteína soluble, seguido por la determinación de las cantidades de proteína en la fracción soluble e insoluble por métodos de cuantificación estándar.
También se prefiere una proteína y/o dominio de unión que no pierda su estructura tridimensional nativa tras la incubación en PBS que contiene ditiotreitol (DTT) 100 mM durante 1 o 10 horas a 37 °C.
En una realización particular, la invención se refiere a una proteína que comprende un dominio de unión que es un dominio de repetición de la anquirina, que se une específicamente a HSA y que tiene la temperatura de desnaturalización en el punto medio indicado o preferido y propiedades no agregantes como se definió anteriormente, en donde dicha proteína tiene una semivida plasmática terminal al menos 5 veces mayor en un mamífero en comparación con un dominio de unión que no se une a una proteína del suero como xSA.
Preferiblemente, dicho dominio de unión tiene una semivida plasmática terminal al menos 10 veces, más preferiblemente, al menos 20 veces, 40 veces, 100 veces, 300 veces, o lo más preferiblemente al menos 103 veces mayor en un mamífero en comparación con un dominio de unión que no se une a una proteína del suero como xSA.
También preferiblemente, dicho dominio de unión no se une a xSA indicado por una Kd superior a 10-4 M, más preferiblemente, superior a 10-3 M o lo más preferiblemente superior a 10-2 M para la unión de xSA. Un ejemplo de un dominio de unión que no se une a xSA es el dominio de repetición de la SEQ ID NO: 32.
Más preferiblemente, dicho dominio de unión es un dominio de repetición y tiene una semivida plasmática terminal al menos 5 veces, más preferiblemente, al menos 10 veces, 20 veces, 40 veces, 100 veces, 300 veces, o lo más preferiblemente al menos 103 mayor (es decir, más larga) en un mamífero en comparación con el dominio de repetición de la SEQ ID NO: 32 o en comparación con DARPin #32, DARPin #41 o DARPin #42.
Una proteína preferida comprende un dominio de unión con especificidad de unión para HSA que tiene una semivida plasmática terminal superior a 1, más preferiblemente superior a 3, 5, 7, 10, 15, o lo más preferiblemente superior a 20 días en los seres humanos.
La semivida plasmática terminal de un dominio de unión puede determinarse a través de ensayos bien conocidos por el experto en la técnica (Toutain, P.L. y Bousquet-Mélou, A., J. Vet. Pharmacol. Ther. 27(5), 427-439, 2004). Los ejemplos sobre la determinación de la semivida plasmática terminal se dan en los Ejemplos.
La expresión "semivida plasmática terminal" de un fármaco tal como una proteína o dominio de unión de la invención se refiere al tiempo requerido para alcanzar la mitad de la concentración plasmática del fármaco aplicado a un mamífero después de alcanzar el pseudoequilibrio. Esta semivida no se define como el tiempo requerido para eliminar la mitad de la dosis del fármaco administrado al mamífero.
En una realización particular, la invención se refiere a una proteína que comprende un dominio de unión que es un dominio de repetición de la anquirina, que se une específicamente a HSA y que comprende un compuesto bioactivo.
El término "compuesto bioactivo" se refiere a un compuesto que modifica la enfermedad cuando se aplica a un mamífero que tiene dicha enfermedad. Un compuesto bioactivo puede tener propiedades antagonistas o agonistas y puede ser un compuesto bioactivo proteináceo o un compuesto bioactivo no proteináceo.
Dichos compuestos bioactivos proteináceos pueden unirse covalentemente, por ejemplo, a un dominio de unión de la invención a través de la generación de polipéptidos de fusión genética usando tecnologías de clonación de ADN estándar, seguido de su expresión y purificación estándar. Por ejemplo, DARPin #36 comprende un dominio de repetición con especificidad de unión para un factor de crecimiento humano (es decir, un compuesto bioactivo) seguido de un dominio de repetición con especificidad de unión para HSA.
Dichos compuestos bioactivos no proteináceos pueden unirse covalentemente, por ejemplo, a un dominio de unión de la invención por medios químicos, por ejemplo, a través del acoplamiento a un tiol de cisteína a través de un conector maleimida con una cisteína acoplada a través de un conector peptídico al extremo N o C de un dominio de unión como se describe en la presente memoria.
Los ejemplos de compuestos bioactivos proteináceos son dominios de unión que tienen una especificidad de diana distinta (por ejemplo, neutralizar un factor de crecimiento uniéndose a él), citocinas (por ejemplo, interleucinas), factores de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento humana), anticuerpos y fragmentos de los mismos, hormonas (por ejemplo, GLP-1) y cualquier posible fármaco proteináceo.
Los ejemplos de compuestos bioactivos no proteináceos son toxinas (por ejemplo, DM1 de ImmunoGen), moléculas pequeñas que se dirigen a GPCR, antibióticos y cualquier posible fármaco no proteináceo.
En una realización particular, la invención se refiere a una proteína que comprende un dominio de repetición de la anquirina que se une específicamente a HSA y que además comprende un compuesto bioactivo, en donde dicha proteína tiene una semivida terminal al menos 2 veces mayor en un mamífero en comparación con la semivida terminal de dicho compuesto bioactivo no modificado, en donde dicha semivida terminal mayor se confiere a dicha proteína por dicho dominio de repetición.
Preferiblemente, dicha proteína tiene una semivida plasmática terminal al menos 5 veces, más preferiblemente, al menos 10 veces, 20 veces, 40 veces, 100 veces, 300 veces, o lo más preferiblemente al menos 103 veces mayor en un mamífero en comparación con dicho compuesto bioactivo no modificado.
Otra realización preferida es una proteína recombinante que comprende un dominio de unión que se une específicamente a HSA y en donde dicho dominio de unión es un dominio de repetición de la anquirina o un dominio de repetición de la anquirina diseñado. Dicho dominio de repetición de la anquirina puede comprender uno, dos, tres o más módulos de repetición internos que participarán en la unión a HSA. Preferiblemente, dicho dominio de repetición de la anquirina comprende un módulo de protección N-terminal, dos a cuatro módulos de repetición internos y un módulo de protección C-terminal. Preferiblemente, dicho dominio de unión es un dominio de repetición de la anquirina o un dominio de repetición de la anquirina diseñado. También preferiblemente, dichos módulos de protección son repeticiones de protección.
En particular, la invención se refiere a una proteína como se define anteriormente en la presente memoria, en donde el dominio de repetición de la anquirina compite por unirse a una seroalbúmina de mamífero con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17 a 31 y 43 a 48; preferiblemente, s Eq ID NO: 17 a 31; más preferiblemente, SEQ ID NO: 19, 21,27 y 28, en particular, SEQ ID NO: 19 y 27.
La más preferida es una proteína de unión, en donde el dominio de repetición de la anquirina se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17 a 31 y 43 a 48, en donde G en la posición 1 y/o S en la posición 2 de dicho dominio de repetición de la anquirina faltan opcionalmente.
También preferiblemente, dicho dominio de repetición compite por la unión a xSA con una proteína de unión seleccionada del grupo de DARPin #17 a 31 y 43 a 48. Preferiblemente, dicho dominio de repetición compite por unirse a xSA con una proteína de unión del grupo de DARPin #19, 21, 27, 28, 45, 46, 47 y 48. Más preferiblemente, dicho dominio de repetición compite por la unión a xSA con la proteína de unión DARPin #19, 45, 46, 48 o 27; incluso más preferiblemente, dicho dominio de repetición compite por la unión a xSA con la proteína de unión DARPin #46 o 27.
El término "competir por la unión" significa la incapacidad de dos dominios de unión diferentes de la invención para unirse simultáneamente a la misma diana, mientras que ambos pueden unirse a la misma diana individualmente. Por lo tanto, dichos dos dominios de unión compiten por la unión a dicha diana. Preferiblemente, dichos dos dominios de unión competitivos se unen a un epítopo de unión superpuesto o igual en dicha diana. El experto en la técnica conoce bien los métodos, tales como el ensayo competitivo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) o las mediciones SPR de competencia (por ejemplo, al utilizar el instrumento Proteon de BioRad), para determinar si dos dominios de unión compiten por la unión a una diana.
Otra realización preferida es una proteína que comprende un dominio de repetición con especificidad de unión para HSA seleccionado del grupo que consiste en los dominios de repetición de SEQ ID NO: 17 a 31. Preferiblemente, dicho dominio de repetición es el dominio de repetición de SEQ ID NO: 19, 21, 27 o 28. Más preferiblemente, dicho dominio de repetición es el dominio de repetición de SEQ ID NO: 19. También más preferiblemente, dicho dominio de repetición es el dominio de repetición de SEQ ID NO: 21. También más preferiblemente, dicho dominio de repetición es el dominio de repetición de SEQ ID NO: 27. También más preferiblemente, dicho dominio de repetición es el dominio de repetición de SEQ ID NO: 28.
Más preferida es una proteína, en donde dicho dominio de repetición con especificidad de unión para HSA comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de dicho grupo de dominios de repetición. Preferiblemente, dicha identidad de secuencia de aminoácidos es al menos un 95 %.
Más preferida es una proteína, en donde dicho dominio de repetición con especificidad de unión para HSA comprende un módulo de repetición que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un módulo de repetición de un dominio de repetición de dicho grupo de dominios de repetición. Preferiblemente, dicha identidad de secuencia de aminoácidos es al menos un 75 %, más preferiblemente, al menos un 80 %, más preferiblemente, al menos un 85 %, más preferiblemente, al menos un 90 % y lo más preferiblemente, al menos un 95 %.
Más preferida es una proteína, en donde dicha proteína comprende dos o más de dichos dominios de repetición con especificidad de unión para xSA. Preferiblemente, dicha proteína comprende 2 o 3 de dichos dominios de repetición. Dichos dos o más dominios de repetición tienen la misma o diferente secuencia de aminoácidos.
En una realización preferida adicional de una proteína que comprende un dominio de repetición de acuerdo con la presente invención, uno o más de los residuos de aminoácidos de los módulos de repetición de dicho dominio de repetición se intercambian por un residuo de aminoácido encontrado en la posición correspondiente en la alineación de una unidad de repetición. Preferiblemente, se intercambian hasta el 30 % de los residuos de aminoácidos, más preferiblemente, se intercambian hasta el 20 %, e incluso más preferiblemente, hasta el 10 % de los residuos de aminoácidos. Más preferiblemente, dicha unidad de repetición es una unidad de repetición de origen natural.
En una realización preferida adicional de una proteína que comprende un dominio de repetición de acuerdo con la presente invención, uno o más de los residuos de aminoácidos del módulo de protección N-terminal de dicho dominio de repetición se intercambian por un residuo de aminoácido encontrado en la posición correspondiente en la alineación de una unidad de protección N-terminal. Preferiblemente, se intercambian hasta el 30 % de los residuos de aminoácidos, más preferiblemente, se intercambian hasta el 20 %, e incluso más preferiblemente, hasta el 10 % de los residuos de aminoácidos. Lo más preferiblemente, dicha unidad de protección N-terminal es una unidad de protección N-terminal de origen natural.
En una realización preferida adicional de una proteína que comprende un dominio de repetición de acuerdo con la presente invención, uno o más de los residuos de aminoácidos del módulo de protección C-terminal de dicho dominio de repetición se intercambian por un residuo de aminoácido encontrado en la posición correspondiente en la alineación de una unidad de protección C-terminal. Preferiblemente, se intercambian hasta el 30 % de los residuos de aminoácidos, más preferiblemente, se intercambian hasta el 20 %, e incluso más preferiblemente, hasta el 10 % de los residuos de aminoácidos. Lo más preferiblemente, dicha unidad de protección C-terminal es una unidad de protección C-terminal de origen natural.
En aún otra realización particular, se intercambian hasta el 30 % de los residuos de aminoácidos, más preferiblemente, hasta el 20 %, e incluso más preferiblemente, hasta el 10 % de los residuos de aminoácidos con aminoácidos que no se encuentran en las correspondientes posiciones de las unidades de repetición, unidades de protección N-terminales o unidades de protección C-terminales.
En realizaciones adicionales, cualquiera de las proteínas o dominios de unión a xSA descritos en la presente memoria puede unirse covalentemente a uno o más restos adicionales, que incluyen, por ejemplo, un resto que se une a una diana diferente para crear un agente de unión de especificidad dual, un compuesto bioactivo, una resto de etiquetado (por ejemplo, una etiqueta fluorescente tal como fluoresceína, o un trazador radiactivo), un resto que facilita la purificación de proteínas (por ejemplo, una pequeña etiqueta peptídica, tal como una etiqueta His o estrep), un resto que proporciona funciones efectoras para una eficacia terapéutica mejorada (por ejemplo, la parte Fc de un anticuerpo para proporcionar citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, un resto de proteína tóxica tal como la exotoxina A dePseudomonas aeruginosa(ETA) o un agente tóxico molecular pequeño tal como los maitansinoides o los agentes alquilantes de ADN) o un resto que proporciona una farmacocinética mejorada. La farmacocinética mejorada puede evaluarse de acuerdo con la necesidad terapéutica percibida. A menudo, es deseable incrementar la biodisponibilidad y/o incrementar el tiempo entre dosis, posiblemente incrementando el tiempo en el que una proteína permanece disponible en el suero después de la dosificación. En algunos casos, es deseable mejorar la continuidad de la concentración en suero de la proteína a través del tiempo (por ejemplo, disminuir la diferencia en la concentración en suero de la proteína entre la concentración poco después de la administración y la concentración poco antes de la siguiente administración).
En una realización adicional, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas particulares, los módulos de protección N-terminales particulares o los módulos de protección C-terminales particulares. Además, se considera un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico.
Además, se considera una composición farmacéutica que comprende una o más de las proteínas mencionadas anteriormente, en particular, proteínas que comprenden dominios de repetición o moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas particulares, y opcionalmente un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables son conocidos por el experto en la técnica y se explican con más detalle a continuación. Aún más, se considera una composición de diagnóstico que comprende una o más de las proteínas mencionadas anteriormente, en particular proteínas que comprenden dominios de repetición.
Una composición farmacéutica comprende proteínas como se describieron anteriormente y un vehículo excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como se describe en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. [1980]. Los vehículos, excipientes o estabilizadores adecuados conocidos por el experto en la técnica son solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, solución de Hank, aceites fijos, oleato de etilo, dextrosa al 5 % en solución salina, sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química, tampones y conservantes. Otros vehículos adecuados incluyen cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos y copolímeros de aminoácidos. Una composición farmacéutica también puede ser una formulación de combinación, que comprende un agente activo adicional, tal como un agente anticanceroso o un agente antiangiogénico.
Las formulaciones que se utilizarán para la administraciónin vivodeben ser asépticas o estériles. Esto se logra fácilmente a través de la filtración a través de membranas de filtración estériles.
La composición farmacéutica puede administrarse por cualquier método adecuado dentro del conocimiento del experto en la técnica. La ruta de administración preferida es parenteralmente. En la administración parenteral, el medicamento de esta invención se formulará en una forma inyectable de dosificación unitaria, tal como una solución, suspensión o emulsión, en asociación con los excipientes farmacéuticamente aceptables como se definió anteriormente. La dosificación y el modo de administración dependerán del individuo a tratar y la enfermedad particular. Por lo general, la composición farmacéutica se administra de modo que la proteína de unión de la presente invención se administre a una dosis de entre 1 pg/kg y 20 pg/kg, más preferiblemente entre 10 pg/kg y 5 mg/kg, lo más preferible mente entre 0,1 y 2 mg/kg. Preferiblemente, se administra como una dosis en bolo. La infusión continua también puede usarse e incluye el suministro subcutáneo continuo a través de una minibomba osmótica. Si es así, la composición farmacéutica puede infundirse a una dosis de entre 5 y 20 pg/kg/minuto, más preferiblemente entre 7 y 15 pg/kg/minuto.
Además, cualquiera de las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente se considera para el tratamiento de un trastorno.
Además, se considera un método para tratar una afección patológica en un mamífero que incluye al hombre, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de la composición farmacéutica mencionada anteriormente.
La proteína de acuerdo con la invención puede obtenerse y/o desarrollarse adicionalmente a través de varios métodos tales como la exposición en la superficie de bacteriófagos (WO 1990/002809, WO 2007/006665) o células bacterianas (WO 1993/010214), exposición ribosómica (WO 1998/048008), exposición en plásmidos (WO 1993/008278) o a través del uso de construcciones híbridas de proteínas de repetición de ARN covalente (WO 2000/032823), o expresión intracelular y selección/cribado tal como por ensayo de complementación de proteínas (WO 1998/341120). Dichos métodos son bien conocidos por el experto en la técnica.
Se puede obtener una biblioteca de proteínas de repetición de la anquirina utilizada para la selección/cribado de una proteína de acuerdo con la invención de acuerdo con los protocolos conocidos por el experto en la técnica (WO 2002/020565, Binz, HK, et al., J. Mol. Biol., 332, 489-503, 2003, y Binz et al., 2004, loc. cit). El uso de dicha biblioteca para la selección de DARPin específicas de xSA se da en el Ejemplo 1. En analogía, los restos de la secuencia de repetición de la anquirina como se presentaron anteriormente pueden ser usados para construir bibliotecas de proteínas de repetición de la anquirina que pueden usarse para la selección o el cribado de DARPin específicas de xSA. Además, los dominios de repetición de la presente invención pueden ensamblarse de forma modular a partir de los módulos de repetición de acuerdo con la presente invención y los módulos de protección o repeticiones de protección apropiados (Forrer, P., et al., FEBS letters 539, 2-6, 2003) usando tecnologías de ADN recombinantes estándares (por ejemplo, WO 2002/020565, Binz et al., 2003, loc. cit. y Binz et al., 2004, loc. cit).
La invención no está restringida a las realizaciones particulares descritas en los Ejemplos. Se pueden usar y procesar otras fuentes siguiendo el esquema general que se describe a continuación.
Ejemplos
Todos los materiales de partida y reactivos divulgados a continuación son conocidos por los expertos en la técnica, y están disponibles comercialmente o pueden prepararse usando técnicas bien conocidas.
Materiales
Los productos químicos se adquirieron en Fluka (Suiza). Los oligonucleótidos fueron de Microsynth (Suiza). A menos que se indique lo contrario, las polimerasas de ADN, las enzimas de restricción y los tampones fueron de New England Biolabs (EE. UU.) o Fermentas (Lituania). La cepa de clonación y producción de proteínas fueE. co liXL1-blue (Stratagene, EE. UU.) o BL21 (Novagen, EE. UU.). Se adquirieron seroalbúmina purificada y sueros de diferentes especies (por ejemplo, de Sigma-Aldrich, Suiza o Innovative Research, EE. UU.). La seroalbúmina biotinilada de diferentes especies se obtuvo químicamente a través del acoplamiento del resto de biotina a aminas primarias de las seroalbúminas purificadas usando reactivos y métodos de biotinilación estándar (Pierce, EE. UU.).
Biología molecular
A menos que se indique lo contrario, los métodos se realizan de acuerdo con los protocolos descritos (Sambrook J., Fritsch E.F. y Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, Nueva York).
Bibliotecas de proteínas de repetición de la anquirina diseñadas
Se describen las bibliotecas de proteínas de repetición de la anquirina diseñadas N2C y N3C (WO 2002/020565; Binz et al. 2003, loc. cit.; Binz et al. 2004, loc. cit.). El dígito en N2C y N3C describe el número de módulos de repetición aleatorizados presentes entre los módulos de producción N-terminal y C-terminal. La nomenclatura utilizada para definir las posiciones dentro de las unidades y módulos de repetición se basa en Binz et al. 2004, loc. cit. con la modificación de que los bordes de los módulos de repetición de la anquirina y las unidades de repetición de la anquirina se desplazan en una posición de aminoácido. Por ejemplo, la posición 1 de un módulo de repetición de la anquirina de Binz et al.2004 (loc. Cit.) corresponde a la posición 2 de un módulo de repetición de la anquirina de la presente divulgación y, en consecuencia, la posición 33 de un módulo de repetición de la anquirina de Binz et al. 2004, loc. cit. corresponde a la posición 1 de un siguiente módulo de repetición de la anquirina de la presente divulgación.
Todas las secuencias de ADN se confirmaron a través de la secuenciación, y el peso molecular calculado de todas las proteínas descritas se confirmó por espectrometría de masas.
Ejemplo 1: Selección de proteínas de unión que comprenden un dominio de repetición con especificidad de unión para xSA
Usando la exposición en ribosomas (Hanes, J. y Plückthun, A., PNAS 94, 4937-42, 1997), muchas proteínas de repetición de la anquirina diseñadas (DARPin) con especificidad de unión para xSA se seleccionaron de las bibliotecas DARPin N2C o N3C descritas por Binz et al. 2004 (loc. cit.). La unión de los clones seleccionados a dianas específicas (xSA; es decir, MSA, HSA o CSA) e inespecíficos (MBP, proteína de unión a maltosa deE. coli)se evaluó a través de ELISA de extracto bruto que indica que las proteínas de unión a xSA fueron seleccionadas con éxito. Los dominios de repetición de SEQ ID NO: 17 a 31 constituyen secuencias de aminoácidos de proteínas de unión seleccionadas que comprenden un dominio de repetición con especificidad de unión para xSA. El análisis de secuencia de los ligantes seleccionados reveló restos específicos de secuencia de repetición de la anquirina inherentes a ciertas familias de ligantes seleccionados. Dichos restos de secuencia de repetición de la anquirina presentes en los dominios de repetición con especificidad de unión para xSA se proporcionan en SEQ ID NO: 11 a 14.
Selección de proteínas de repetición de la anquirina específicas de la seroalbúmina por exposición en ribosomas
La selección de proteínas de repetición de la anquirina específicas de la seroalbúmina se realizó a través de la exposición en ribosomas (Hanes y Plückthun, loc. cit.) usando HSA, CSA o MSA como proteínas de diana, la biblioteca de proteínas de repetición de la anquirina diseñadas como se describe (WO 2002/020565, Binz et al., 2003, loc. cit. y Binz et al., 2004, loc. cit) y protocolos establecidos (Zahnd, C., Amstutz, P. y Plückthun, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007). Las rondas de selección de exposición en ribosomas se realizaron en HSA, CSA o MSA (incluidas las variantes biotiniladas de HSA o MSA inmovilizadas sobre neutravidina o estreptavidina) con ambas bibliotecas N2C y N3C de DARPin utilizando protocolos establecidos (Binz et al. 2004, loc. cit.). El número de ciclos de PCR con transcripción inversa (RT) después de cada ronda de selección se redujo constantemente de 40 a 30, ajustándose al rendimiento debido al enriquecimiento de ligantes. Cuatro rondas de selección en HSA, CSA o MSA produjeron grupos de DARPin de afinidad micromolar a nanomolar, como se reveló por las mediciones de ELISA y SPR de clones individuales. La afinidad de ciertas DARPin se mejoró aún más a través del uso de la maduración por afinidad por métodos bien conocidos por el experto en la técnica (por ejemplo, a través de la diversificación de los clones de DARPin por PCR propensa a errores y la selección y cribado de ligantes mejorados como se describe anteriormente).
Los clones seleccionados se unen específicamente a la seroalbúmina como se muestra por ELISA del extracto en bruto
Las DARPin individuales seleccionadas que se unieron específicamente a xSA se identificaron por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) usando extractos crudos deEscherichia colide células de expresión de DARPin usando protocolos estándar. A través de la exposición en ribosomas, los clones seleccionados se clonaron en el vector de expresión pQE30 (Qiagen), se transformaron enE. coliXL1-Blue (Stratagene) y a continuación se cultivaron durante la noche a 37 °C en una placa de 96 pocillos profundos (cada clon en un solo pocillo) que contenía 1 ml de medio de cultivo (2YT que contenía glucosa al 1 % y 100 pg/ml de ampicilina). Se inoculó 1 ml de 2YT fresco que contenía 50 pg/ml de ampicilina con 100 pl del cultivo de toda la noche en una placa nueva de 96 pocillos profundos. Después de la incubación durante 2 h a 37 °C, se indujo la expresión con IPTG (concentración final 1 mM) y continuó durante 3 h. Las células se recogieron, se resuspendieron en 100 pl de B-PERII (Pierce) y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente con agitación. Posteriormente, se añadieron 900 pl de PBS-TC (PBS suplementado con hidrolizado de caseína al 0,25 %, Tween 20® al 0,1 %, pH 7,4) y los restos celulares se eliminaron por centrifugación. Se aplicaron 100 pl de cada clon lisado a un pocillo de una placa MaxiSorp recubierta con NeutrAvidina que contenía xSA o la MBP no relacionada inmovilizada a través de su resto de biotina y se incubaron durante 1 h a RT. Después de un lavado exhaustivo con PBS-T (PBS suplementado con Tween 20® al 0,1 %, pH 7,4), la placa se reveló usando procedimientos ELISA estándar usando el anticuerpo monoclonal anti-RGS(His)4 (34650, Qiagen) como anticuerpo primario y anticuerpo policlonal de cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (A3562, Sigma) como reactivo secundario. A continuación, se detectó la unión utilizando fosfato disódico de 4-nitrofenilo (4NPP, Fluka) como un sustrato para la fosfatasa alcalina. El desarrollo del color se midió a 405 nm. El cribado de varios cientos de clones a través de dicho ELISA de extracto celular bruto reveló más de cien DARPin diferentes con especificidad para xSA. Estas proteínas de unión fueron elegidas para su posterior análisis. Se proporcionan ejemplos de secuencias de aminoácidos de dominios de repetición seleccionados que se unen específicamente a xSA en SEQ ID NO: 17 a 31,37 a 40 y 43 a 48.
Deducción de restos de secuencia de repetición de dominios de repetición seleccionados con especificidad de unión para xSA
Las secuencias de aminoácidos de dominios de repetición seleccionados con especificidad de unión para xSA se analizaron adicionalmente a través de herramientas de análisis de secuencia conocidas por el experto en la técnica (WO 2002/020565; Forrer et al., 2003, loc. cit.; Forrer, P., Binz, H.K, Stumpp, M.T y Plückthun, A., ChemBioChem, 5(2), 183-189, 2004). Sin embargo, en contraste con WO 2002/020565 en el que se usaron restos de repetición de origen natural para deducir restos de secuencia de repetición, aquí, los restos de secuencia de repetición se dedujeron de las unidades de repetición de dominios de repetición seleccionados con especificidad de unión para xSA. De este modo, se determinaron las familias de dominios de repetición seleccionados que comprenden un resto de secuencia de repetición común. Dichos restos de secuencia de repetición presentes en los dominios de repetición con especificidad de unión para xSA se proporcionan en SEQ ID NO: 11 a 14.
Expresión a alto nivel y soluble de DARPin
Para un análisis adicional, los clones seleccionados que muestran unión específica a xSA en el ELISA de extracto de células en bruto como se describió anteriormente se expresaron en célulasE. co liBL21 o XL1-Blue y se purificaron usando su etiqueta de His usando protocolos estándar. Se usaron 25 ml de cultivos estacionarios de toda la noche (LB, glucosa al 1 %, 100 mg/l de ampicilina; 37 °C) para inocular cultivos de 1 l (mismo medio). A una absorbancia de 0,7 a 600 nm, los cultivos se indujeron con IPTG 0,5 mM y se incubaron a 37 °C durante 4 h. Los cultivos se centrifugaron y los sedimentos resultantes se resuspendieron en 40 ml de TBS500 (Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM, pH 8) y se sonicaron. El lisado se volvió a centrifugar, y se añadieron al sobrenadante resultante glicerol (concentración final al 10 % (v/v)) e imidazol (concentración final 20 mM). Las proteínas se purificaron sobre una columna de ácido Ni-nitrilotriacético (volumen de columna de 2,5 ml) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (QIAgen, Alemania). Alternativamente, las DARPin o dominios de repetición seleccionados desprovistos de una etiqueta 6xHis se purificaron por cromatografía de intercambio aniónico seguido de cromatografía de exclusión por tamaño de acuerdo con resinas estándar y protocolos conocidos por el experto en la técnica. Se pueden purificar hasta 200 mg de DARPin altamente solubles con especificidad de unión a la seroalbúmina a partir de un litro de cultivo deE. colicon una pureza > 95 % como se estima por SDS-15 % PAGE. Dichas DARPin purificadas se usan para caracterizaciones adicionales.
Ejemplo 2: Análisis de estabilidad y cromatografía de exclusión por tamaño de DARPin con especificidad de unión para xSA
Las DARPin #19 a 22 y las DARPin #27 a 30 con especificidad de unión para xSA se purificaron hasta casi la homogeneidad usando su etiqueta His como se describe anteriormente y se almacenaron en PBS durante 28 días a 30 mg/ml (~2 mM) a 40 °C (estudio de estabilidad). En el día 0 (Figura 1a) y en el día 28 (Figura 1b) se tomaron muestras, se diluyeron a 500 pM y se analizaron por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para evaluar su peso molecular aparente y su estabilidad (es decir, su tendencia a la agregación, multimerización o degradación) a través del tiempo.
En un experimento adicional (Fig. 1c), las DARPin #19 y 43 a 48 con especificidad de unión para xSA se purificaron hasta casi la homogeneidad usando su etiqueta His como se describe anteriormente y se almacenaron en PBS durante 28 días a aproximadamente 100 mg/ml a -80 °C, se diluyeron a 500 pM y se analizaron por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para su caracterización (es decir, su tendencia a la agregación, multimerización o degradación). En particular, se utilizó una columna mayor en comparación con la primera serie de análisis (ver más abajo).
Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
La SEC analítica se llevó a cabo utilizando un sistema de HPLC (serie Agilent 1200) utilizando una columna Superdex 200 5/150 (Fig. 1a y Fig. 1b) o una columna Superdex 200 10/300GL (Fig. 1c) (<g>E Healthcare) a 20 °C. La columna Superdex 200 5/150 tiene un volumen de lecho de 3,0 ml y un volumen vacío de 1,08 ml (determinado experimentalmente usando azul de dextrano). La columna Superdex 200 10/300GL tiene un volumen de lecho de 24 ml y un volumen vacío de aproximadamente 8 ml. Las mediciones se realizaron de acuerdo con procedimientos estándar conocidos por el experto en la técnica. Las operaciones se realizaron a un caudal de 0,2 ml/min y una presión máxima de 15 bar (Superdex 200 5/150) o 0,6 ml/min y una presión máxima de 18 bar (Superdex 200 10/300GL) en PBS. Las muestras de proteínas fueron diluidas en PBS a aproximadamente 20-500 pM, se filtraron (0,22 pm) y se inyectaron 20-100 pl de las muestras diluidas en la columna para su separación. Los perfiles de elución de las muestras de proteínas se registraron al leer la absorbancia a 280 nm. Se utilizaron como proteínas estándar aprotinina (AP) con un peso molecular de 6,5 kDa, anhidrasa carbónica (CA) con un peso molecular de 29 kDa y conalbúmina (CO) con un peso molecular de 75 kDa, para obtener una curva de calibración a partir de la cual se pueden determinar los pesos moleculares aparentes de las proteínas de la muestra.
Los resultados se muestran en la Figura 1. Las DARPin #19-22 y 27-30 muestran cromatogramas de SEC indistinguibles (es decir, perfiles de elución indistinguibles) en el día 0 y en el día 28 del estudio de estabilidad. En conclusión, todas las DARPin eluyen como monómero en las condiciones de ensayo y las DARPin #19-23 y 27-30 son estables durante al menos 1 mes a 40 °C en PBS (es decir, sus perfiles de elución no revelaron ninguna tendencia a la agregación, multimerización o degradación).
Ejemplo 3: Estabilidad térmica de DARPin con especificidad de unión de xSA
La estabilidad térmica de DARPin con especificidad para xSA se analizó con un ensayo de estabilidad térmica basado en fluorescencia (Niesen, F.H., Nature Protocols 2(9): 2212-2221,2007). De este modo, la temperatura a la que se despliega una proteína (es decir, tal como una DARPin) se mide por un incremento en la fluorescencia de un tinte (por ejemplo, SYPRO naranja; Invitrogen, No. de cat. S6650) con afinidad por las partes hidrófobas de la proteína, que se exponen a medida que la proteína se despliega. La temperatura en el punto medio de transición de fluorescencia obtenido de este modo (desde una intensidad de fluorescencia más baja a una intensidad de fluorescencia más alta) corresponde entonces a la temperatura de desnaturalización (Tm) del punto medio de la proteína analizada.
Ensayo de estabilidad térmica basada en fluorescencia.
La desnaturalización térmica de DARPin usando SYPRO naranja como un tinte de fluorescencia se midió usando un instrumento de PCR en tiempo real (es decir, el termociclador C1000 (BioRad) en combinación con un sistema óptico CFX96 (BioRad)). Se prepararon DARPin a una concentración de 80 pM en PBS a pH 7,4 o tampón MES a pH 5,8 que contenía 1x SYPRO Naranja (diluido a partir de una solución madre de SYPRO Naranja 5'000x, Invitrogen) y se añadieron 50 pl de dichas soluciones de proteína o tampón solo en una placa de PCR blanca de 96 pocillos (Bio-Rad). Las placas se sellaron con sellos adhesivos Microseal 'B' (Bio-Rad) y se calentaron en el instrumento de PCR en tiempo real de 20 °C a 95 °C en incrementos de 0,5 °C, incluido un paso de retención de 25 seg después de cada incremento de temperatura, y la desnaturalización térmica de las DARPin fue seguida por la medición de las unidades de fluorescencia relativa de las muestras en cada incremento de temperatura. Las unidades de fluorescencia relativas en los pocillos de la placa se midieron usando el canal 2 de los instrumentos de PCR en tiempo real (es decir, la excitación fue a 515-535 nm y la detección fue a 560-580 nm), y se restaron los valores correspondientes obtenidos para el tampón solamente. A partir de los puntos medios de transición de desnaturalización térmica obtenidos de este modo, se pueden determinar los valores de Tm para las DARPin analizadas.
Los resultados de la desnaturalización térmica de las DARPin en PBS a pH 7,4 o tampón MES a pH 5,8 seguido de un incremento en la intensidad de fluorescencia de SYPRO Naranja se muestran en la Figura 2 y la Figura 3. Las transiciones de desnaturalización térmica medidas demuestran que todas las DARPin con especificidad de unión para xSA analizadas tienen valores de Tm muy superiores a 40 °C (tanto a pH 7,4 como a pH 5,8).
Ejemplo 4: Caracterización de las DARPin con especificidad de unión para xSA por análisis de resonancia de plasmón superficial
Las DARPin con especificidad de unión para xSA se inmovilizaron en una celda de flujo a través de su etiqueta His al anticuerpo a-RGS-His recubierto (Qiagen, no. de cat. 34650), y se analizó la interacción de seroalbúmina humana, de mono cynomolgus (cyno), ratón, rata, conejo y perro con las DARPin inmovilizadas.
Análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR)
La SPR se midió utilizando un instrumento ProteOn (BioRad) y la medición se llevó a cabo de acuerdo con procedimientos estándar conocidos por el experto en la técnica. El tampón de operación fue PBS, pH 7,4, que contenía Tween 20® al 0,01 %. El anticuerpo anti-RGS-His se inmovilizó covalentemente en un chip GLC (BioRad) a un nivel de aproximadamente 2.000 unidades de resonancia (RU). La inmovilización de las DARPin en el chip recubierto con anticuerpo se realizó entonces inyectando 150 pl de solución de DARPin 1 pM en 300 s (velocidad de flujo = 30 pl/min). La interacción con la seroalbúmina de las diferentes especies se midió entonces inyectando en 60 seg un volumen de 100 pl de tampón de operación (PBS que contenía Tween® al 0,01 %) que contenía una seroalbúmina distinta a una concentración de 400, 200, 100, 50 nM (medición de tasa de asociación), seguido de un flujo de tampón de operación durante 10 a 30 minutos (velocidad de flujo = 100 pl/min) (medición de tasa de disociación). Las señales (es decir, los valores de la unidad de resonancia (RU)) de una celda de referencia no recubierta y de una inyección de referencia (es decir, la inyección de tampón de operación solamente) se sustrajeron de las trazas de RU obtenidas después de la inyección de las seroalbúminas (doble referencia). A partir de las trazas de SRP obtenidas a partir de las mediciones de la tasa de asociación y de disociación, puede determinarse la tasa de asociación y de disociación de la interacción de seroalbúmina y DARPin correspondiente.
Los resultados se resumen en la Tabla 1 y en la Tabla 2. Las constantes de disociación (Kd) se calcularon a partir de las tasas estimadas de asociación y de disociación utilizando procedimientos estándar conocidos por la persona experta en la técnica y que se encontró que estaban en el rango de aproximadamente 3 a aproximadamente 300 nM. Mientras que todas las DARPin analizadas se unían a la seroalbúmina humana y de mono cynomolgus, solo un subconjunto de estas DARPin se unía a la seroalbúmina de conejo, ratón, rata y perro.
Tabla 1: Constantes de disociación de las interacciones de DARPin y seroalbúmina
Kd [nM] Kd [nM] (cyno) Kd [nM] (ratón) Kd [nM] Kd [nM] Kd [nM] (humana) (rata) (conejo) (perro) DARPin 15 7 n.b. n.b. 17 n.b. #29
DARPin 27 110 124 242 n.b. 185 #20
DARPin 11 6 n.b. n.b. 19 n.b. #27
DARPin 13 74 68 109 n.b. 81 #22
DARPin 6 3 n.b. n.b. 9 n.b. #28
DARPin 14 63 56 91 n.b. 77 #19
DARPin 26 110 142 266 n.b. 180 #21
DARPin 7 4 n.b. n.b. 8 n.b. #30
Las constantes de disociación para diversas interacciones de DARPin y seroalbúmina (de diferentes especies como se indica en el título de cada columna) se midieron usando SPR. (n.b. = sin unión observable).
Tabla 2:Constantes de disociación de las interacciones de DARPin y seroalbúmina
Kd [nM] (humana)
DARPin #43 30
DARPin #44 39
DARPin #45 35
DARPin #46 43
DARPin #47 96
DARPin #48 68
Las constantes de disociación para diversas interacciones de DARPin y seroalbúmina humana se midieron usando SPR.
Ejemplo 5: Semivida plasmática terminal de DARPin con especificidad de unión para xSA
La semivida plasmática terminal de DARPin en ratones y monos cynomolgus(Macaca fascicularis, también abreviado como "cyno") se determinó de acuerdo con procedimientos estándar conocidos por el experto en la técnica (Toutain, et al., loc. cit.). Una cierta cantidad de DARPin se inyectó por vía intravenosa en un mamífero y el aclaramiento de DARPin del plasma sanguíneo fue seguido a través del tiempo siguiendo su concentración plasmática. La concentración de DARPin inicialmente disminuye hasta que se alcanza un pseudoequilibrio (fase alfa) seguido de una disminución exponencial adicional de la concentración de DARPin en el plasma (fase beta). A partir de esta fase beta, puede calcularse la semivida plasmática terminal de la DARPin.
Determinación del aclaramiento plasmático de DARPin en ratones
Con el fin de evaluar el aclaramiento plasmático de las DARPin con especificidad de unión para xSA, las proteínas de prueba se radiomarcaron y se inyectaron en la vena de la cola de ratones Balb/c sin tratamiento previo. Se inyectaron los siguientes DARPin: DARPin #19, DARPin #21, DARPin #23, DARPin #25, DARPin #18, DARPin #32, DARPin #35, DARPin #36, DARPin #33, DARPin #34, DARPin #37, DARPin #38, DARPin #43, DARPin #44, DARPin #45, DARPin #46, DARPin #47 y DARPin #48. Las DARPin se radiomarcaron con un complejo de 99mTc-carbonilo como se describió previamente (Waibel, R., et al., Nature Biotechnol. 17 (9), 897-901, 1999).
Las DARPin (40 pg) se incubaron con 99mTc-carbonilo (0,8-1,6 mCi) durante 1 h antes de diluirlas a 400 pl en PBS (pH 7,4). Se inyectaron a ratón por vía intravenosa 100 pl de la solución de DARPin marcada obtenida de este modo (equivalente a 10 pg de proteína y 0,2 - 0,4 mCi). Se recogieron muestras de sangre de los ratones a 1 h, 4 h, 24 h y 48 h después de la inyección inicial y se midió la radioactividad de las muestras. El nivel de radioactividad medido en un determinado punto de tiempo es una medida directa de la cantidad de DARPin que todavía está presente en el plasma sanguíneo en ese punto de tiempo. El % de dosis inyectada es el porcentaje de la radiactividad total de la sangre completa del ratón (1,6 ml para un ratón de 18 g) medido en un cierto punto de tiempo en relación con la radiactividad total de la muestra inyectada corregida por la desintegración radiactiva de 99mTc.
<Las DARPin con especificidad de unión para MSA tienen una semivida plasmática terminal fuertemente aumentada>en ratones en comparación con DARPin #32 que no tiene especificidad de unión para xSA (Figura 4). DARPin #19, DARPin #21, DARPin #23, DARPin #33, DARPin #37, DARPin #43, DARPin #44, DARPin #45, DARPin #46, DARPin #47 y DARPin #48 tuvieron una semivida plasmática terminal en ratones de aproximadamente 2 - 2,5 días.
Determinación del aclaramiento plasmático de las DARPin en monos cynomolgus
<Se inyectaron DARPin diluidas en PBS como una inyección en bolo en la vena cefálica de monos cynomolgus. Se>inyectaron las siguientes DARPin: DARPin #26 (0,5 mg/kg), DARPin #24 (0,5 mg/kg), DARPin #17 (0,5 mg/g), DARPin #34 (1 mg/kg), y DARPin #32 (0,5 mg/kg). En diferentes puntos de tiempo después de la inyección, se generó plasma a partir de la sangre recogida de la vena femoral de los animales. La concentración de las DARPin en las muestras de plasma se determinó luego a través de un ELISA en sándwich utilizando protocolos estándar conocidos<por el experto en la técnica y una curva estándar de DARPin apropiada con concentraciones de DARPin conocidas.>
Las muestras de plasma de monos cynomolgus se diluyeron en serie en PBS-C (PBS que contenía caseína al 0,25 %, pH 7,4) en placas ELISA MaxiSorp que se recubrieron con un anticuerpo monoclonal de conejo específico anti-DARPin. Después de un lavado exhaustivo con PBS-T (PBS suplementado con Tween 20® al 0,1 %, pH 7,4), las placas se revelaron con el anticuerpo monoclonal anti-RGS (His)4 marcado con peroxidasa de rábano picante HRP<(Qiagen). La unión se detectó entonces utilizando 100 pl de sustrato BM-Blue POD (Roche Diagnostics). La reacción>se detuvo añadiendo 50 pl de H<2>SO<4>1 M y se midió la absorbancia a 450 nm (y restando la absorbancia a 620 nm). La concentración de la DARPin en la muestra de plasma se calculó realizando una regresión monoexponencial en una curva estándar de la DARPin diluida en suero de mono (GraphPad Prism). La semivida plasmática terminal de las DARPin se calculó realizando regresiones no lineales (desintegración de dos fases) en los valores de<concentración determinados hasta 240 h después de la inyección. La semivida de la segunda fase (beta) corresponde>a la semivida plasmática terminal.
Las DARPin con especificidad de unión para xSA tienen una semivida plasmática terminal aumentada en el mono cynomolgus en comparación con la DARPin #32 que no tiene especificidad de unión para xSA (Figura 5, Tabla 3). DARPin #19, DARPin #21, DARPin #43, DARPin #44, DARPin #45, DARPin #46, DARPin #47 y DARPin #48 tuvieron<una semivida plasmática terminal en el mono cynomolgus de aproximadamente 10 a 15 días.>
Tabla 3: Estimaciones de la semivida plasmática terminal de DARPin en el mono cynomolgus (cyno)
t1/2 [h]
DARPin #32 0,2
DARPin #26 129
DARPin #34 111
DARPin #17 40
DARPin #24 126
DARPin #19 288
DARPin #21 384
DARPin #28 144
Estimaciones de parámetros farmacocinéticos t<1>/<2>: semivida plasmática terminal
Ejemplo 6: Mayor estabilidad térmica de las DARPin con módulos de protección C-terminales mejorados
<La estabilidad térmica de las DARPin se analizó con un ensayo de estabilidad térmica basado en fluorescencia como>se describe en el Ejemplo 3. Alternativamente, la estabilidad térmica de una DARPin se analizó por espectrometría de CD; es decir, al medir su desnaturalización por calor siguiendo su señal de dicroísmo circular (CD) a 222 nm por técnicas bien conocidas por la persona experta en la técnica. La señal de CD de la muestra se registró a 222 nm en un instrumento Jasco J-715 (Jasco, Japón) mientras se calentaba lentamente la proteína a una concentración de<0,02 mM en PBS pH 7,4 de 20 °C a 95 °C usando una rampa de temperatura de 1 °C por min. Este es un medio>eficaz para seguir la desnaturalización de las DARPin, ya que consisten principalmente en hélices alfa que muestran un fuerte cambio en su señal de CD a 222 nm al desplegarse. El punto medio de la transición observada de dicha señal de CD medida para un DARPin corresponde a su valor de Tm.
La estabilidad térmica de DARPin #37 (SEQ ID NO: 37 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo<N) se comparó con la estabilidad térmica de DARPin #38 (SEQ ID NO: 38 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15)>fusionada a su extremo N) usando el ensayo de estabilidad térmica basado en fluorescencia. Estas dos DARPin poseen una secuencia de aminoácidos idéntica a excepción del módulo de protección C-terminal de sus dominios de repetición. El dominio de repetición de DARPin #38, pero no de DARPin #37, comprende un módulo de protección C mejorado tal como se describe en la presente memoria. Los valores de Tm en PBS pH 7,4 determinados para<DARPin #37 y DARPin #38 fueron de aproximadamente 63 °C y de aproximadamente 73 °C, respectivamente. Los>valores de Tm en el tampón MES pH 5,8 determinados para DARPin #37 y DARPin #38 fueron de aproximadamente 54,5 °C y de aproximadamente 66°C, respectivamente.
La estabilidad térmica de DARPin #39 (SEQ ID NO: 39 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15) fusionada a su extremo N) se comparó con la estabilidad térmica de DARPin #40 (SEQ ID NO: 40 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 15)<fusionada a su extremo N) usando el ensayo de estabilidad térmica basado en fluorescencia. Estas dos DARPin>poseen una secuencia de aminoácidos idéntica a excepción del módulo de protección C-terminal de sus dominios de repetición. El dominio de repetición de DARPin #40, pero no de DARPin #39, comprende un módulo de protección C mejorado tal como se describe en la presente memoria. Los valores de Tm en el tampón MES pH 5,8 determinados para DARPin #39 y DARPin #40 fueron de aproximadamente 51 °C y de aproximadamente 55 °C, respectivamente.
<La estabilidad térmica de DARPin #41 (SEQ ID NO: 41) se comparó con la estabilidad térmica de DARPin #42 (SEQ>ID NO: 42) usando espectroscopía de CD. Estas dos DARPin poseen una secuencia de aminoácidos idéntica a excepción del módulo de protección C-terminal de sus dominios de repetición. El dominio de repetición de DARPin #42, pero no de DARPin #41, comprende un módulo de protección C mejorado tal como se describe en la presente memoria. Los valores de Tm en PBS pH 7,4 determinados para DARPin #41 y DARPin #42 fueron de<aproximadamente 59,5 °C y de aproximadamente 73 °C, respectivamente.>

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína que comprende al menos un dominio de repetición de la anquirina, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina tiene especificidad de unión para seroalbúmina humana y en donde dicho dominio de repetición de la anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17 a 31 y 43 a 48.
2. La proteína de la reivindicación 1, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17 a 31 y 43 a 48.
3. La proteína de la reivindicación 1, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 21,27 y 46.
4. La proteína de la reivindicación 1, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 21,27 y 46.
5. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina se une a seroalbúmina humana con una constante de disociación (Kd) en PBS por debajo de 10-7 M.
6. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina tiene una semivida plasmática terminal al menos 5 veces mayor en un mamífero en comparación con el dominio de repetición de la anquirina de la SEQ ID NO: 32.
7. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina tiene una semivida plasmática terminal en seres humanos de al menos 1 día.
8. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende además un compuesto bioactivo, en donde dicha proteína tiene una semivida plasmática terminal al menos 2 veces mayor en un mamífero en comparación con la semivida plasmática terminal de dicho compuesto bioactivo no modificado y en donde dicha semivida plasmática terminal mayor se confiere a dicha proteína por dicho dominio de repetición de la anquirina.
9. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina compite por unirse a una seroalbúmina de mamífero con un dominio de repetición de la anquirina seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17 a 31 y 43 a 48.
10. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho dominio de repetición compite por unirse a una seroalbúmina de mamífero con DARPin #46 o DARPin #27, y en donde DARPin #46 se define por la SEQ ID NO: 46, con una etiqueta His definida por la SEQ ID NO: 15 fusionada a su extremo N y DARPin #27 se define por la SEQ ID NO: 27, con una etiqueta His definida por la SEQ ID NO: 15 fusionada a su extremo N.
11. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho dominio de repetición de la anquirina se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17 a 31 y 43 a 48.
12. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde G en la posición 1 y/o S en la posición 2 de dicho dominio de repetición de la anquirina están ausentes.
13. Un ácido nucleico que codifica la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o el ácido nucleico de la reivindicación 13, y opcionalmente, un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.
15. Una proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 9 a 12 para su uso en un método para aumentar la semivida plasmática terminal de un compuesto bioactivo en un mamífero, en donde dicho método comprende unir covalentemente dicha proteína a dicho compuesto bioactivo.
16. La proteína para su uso de la reivindicación 15, en donde dicha proteína aumenta la semivida plasmática terminal de dicho compuesto bioactivo en un mamífero al menos 2 veces.
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