ES2981448T3 - Gen de la timidina cinasa mejorado - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan secuencias de ácidos nucleicos que codifican timidina quinasas mejoradas del virus del herpes simple, incluido su uso en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Las timidina quinasas pueden mutarse utilizando mutaciones conservadoras, mutaciones no conservadoras o ambas. También se proporcionan sistemas terapéuticos genéticos, incluidas partículas virales y retrovirales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Gen de la timidina cinasa mejorado
Antecedentes de la invención
Las enfermedades proliferativas, tal como el cáncer, representan un serio problema para la sociedad. Los crecimientos cancerosos, incluidos los crecimientos cancerosos malignos, poseen características únicas, tales como la proliferación celular incontrolable que da lugar a, por ejemplo, crecimiento descontrolado de tejido maligno, una capacidad de invadir tejidos locales e incluso remotos, falta de diferenciación, falta de síntomas detectables y, lo más importante, la falta de terapia y prevención eficaces.
El cáncer puede desarrollarse en cualquier tejido de cualquier órgano a cualquier edad. La causa del cáncer no está claramente definida, pero mecanismos como la susceptibilidad genética, trastornos de rotura cromosómica, virus, factores ambientales y trastornos inmunitarios se han relacionado con el crecimiento y la transformación de células malignas. El cáncer abarca una amplia categoría de afecciones médicas, que afecta a millones de personas en todo el mundo. Las células cancerosas pueden surgir en casi cualquier órgano y/o tejido del cuerpo. A nivel mundial, cada año se diagnostica cáncer a más de 10 millones de personas y se estima que esta cifra aumentará a 15 millones de casos nuevos anuales en 2020. El cáncer provoca seis millones de muertes cada año o el 12 % de las muertes en todo el mundo.
Ponomarev, V.et al(2003) divulgan mutantes del gen indicadorHSVI-tk/GFPredirigidos citoplasmáticamente para la optimización de imágenes genético-moleculares no invasivas (Ponomarev, V.,et al.Neoplasia, 5(3), págs. 245-254, 2003).
Degreve, B.et al(2000) divulgan la supresión selectiva de la actividad de la pirimidina nucleósido cinasa de la timidina cinasa del virus del herpes simple 1 mediante la mutación de alanina-167 en tirosina (Degreve, B.,et al.Molecular Pharmacology, 58(6), págs. 1326-1332, 2000).
Willmon, C. L.et al(2008) divulgan el papel de la alanina 168 de la timidina cinasa del HSV1 en la especificidad del sustrato (Willmon, C. L.et al.Open Biochem J., 2, págs. 60-66, 2008)
El documento EP1914304 divulga mutantes de timidina cinasa y proteínas de fusión que tienen actividades de timidina cinasa y guanilato cinasa.
Sumario de la invención
En el presente documento se proporcionan secuencias polinucleotídicas que codifican formas mutadas de timidina cinasa de un virus del herpes simple humano (HSV-TK), en donde la HSV-TK codificada está mutada en el resto de aminoácido 25, 26, 32, 33, 167, 168 o una combinación de los mismos, en donde la secuencia polinucleotídica está mutada en comparación con una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 1 o 3.
Una secuencia polinucleotídica que comprende una señal de exportación nuclear y que codifica una forma mutada de la timidina cinasa del virus del herpes simple humano 1 (HSV-TK), en donde la HSV1-TK codificada está mutada en los restos de aminoácidos 32 y 33, en donde la secuencia polinucleotídica está mutada en comparación con una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 2. Los restos de aminoácidos 32 y 33 se mutan independientemente a un aminoácido elegido del grupo que consiste en: glicina, serina y ácido glutámico. La forma mutada de la timidina cinasa aumenta la actividad de destrucción celular mediada por análogos de nucleósidos en relación con la timidina cinasa del HSV1 de tipo silvestre establecida en la SEQ ID NO: 2. En una realización, la HSV-TK codificada está mutada en los restos de aminoácidos 167, 168, o una combinación de los mismos, a un aminoácido polar, no polar, básico o ácido. En otra realización, la HSV-TK codificada está mutada en el resto de aminoácido 167 a un aminoácido polar, no polar, básico o ácido. En otra realización más, la HSV-TK codificada está mutada en el resto de aminoácido 168 a un aminoácido polar, no polar, básico o ácido. Aún en otra realización, la HSV-TK codificada está mutada tanto en el resto de aminoácido 167 como en el 168 a un aminoácido polar, no polar, básico o ácido.
En una realización, el resto de aminoácido 167 de la HSV-TK codificada está mutado a serina o fenilalanina. En otra realización, el resto de aminoácido 168 de la HSV-TK codificada está mutado a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: histidina, lisina, cisteína, serina y fenilalanina. Aún en otra realización, la HSV-TK codificada está mutada en los aminoácidos 25 y 26. En otra realización más, los restos de aminoácidos 25 y 26 se mutan a un aminoácido elegido del grupo que consiste en: glicina, serina y ácido glutámico. En una realización, la HSV-TK codificada está mutada en los restos de aminoácidos 25, 26, 32 y 33. En otra realización, los restos de aminoácidos 25, 26, 32 y 33 se mutan a un aminoácido elegido del grupo que consiste en: glicina, serina y ácido glutámico. Aún en otra realización, la HSV-TK codificada comprende al menos una mutación elegida del grupo que consiste en los restos de aminoácidos 25, 26, 32 y 33, y al menos una mutación elegida del grupo que consiste en los restos de aminoácidos 167 y 168.
La secuencia HSV-TK codificada comprende además una señal de exportación nuclear (NES, del inglésnuclear export signal).En otra realización, la secuencia de la señal de exportación nuclear se inserta en el extremo 5' de la secuencia HSV-TK o cerca de ella. En otra realización, la secuencia de la señal de exportación nuclear es LQKKLEELELDG (SEQ ID NO: 24). En una realización, la HSV-TK mutante codificada no se localiza exclusivamente en la región nuclear.
En una realización, la HSV-TK modificada codificada presenta una cantidad reducida de actividad de timidina cinasa en comparación con la HSV-TK de tipo silvestre. En otra realización, la actividad de la HSV-TK modificada codificada se reduce aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 30 veces o aproximadamente 50 veces. Aún en otra realización, la actividad de la HSV-TK modificada codificada se reduce aproximadamente un 1,5%, aproximadamente un 2%, aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente el 100 %.
En una realización, la HSV-TK codificada comprende mutaciones en los restos de aminoácidos 25, 26, 32, 33 y 168. En otra realización, la HSV-TK codificada comprende las mutaciones R25G, R26S, R32G, R33S y A168H.
En una realización, la secuencia polinucleotídica modificada comprende una secuencia de ácido nucleico establecida como una cualquiera de las SEQ ID NO: 12 a 22. Aún en otra realización, la secuencia polinucleotídica modificada comprende una secuencia de ácido nucleico establecida como una cualquiera de las SEQ ID NO: 16 a 22. En una realización, la secuencia comprende TK168dmNES (SEQ ID NO: 18). Aún en otra realización, el polinucleótido codifica un polipéptido HSV-TK modificado.
En otras realizaciones más, el polinucleótido comprende además una secuencia polinucleotídica que codifica un segundo polipéptido, en donde dicho segundo polipéptido es un polipéptido terapéutico. En otras realizaciones más, el segundo polipéptido terapéutico es un segundo gen suicida o un factor de crecimiento. En algunas realizaciones, el factor de crecimiento se elige del grupo que consiste en el factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), eritropoyetina, G-CSF, GM-CSF, TGF-a, TGF-p y factor de crecimiento de fibroblastos. En algunas realizaciones, el segundo gen suicida se elige del grupo que consiste en: una citosina desaminasa, una VSV-tk, IL-2, nitrorreductasa (NR), carboxilesterasa, p-glucuronidasa, citocromo p450, pgalactosidasa, cadena A de la toxina diftérica (DT-A), carboxipéptido G2 (CPG2), purina nucleósido fosforilasa (PNP) y desoxicitidina cinasa (dCK).
En algunas realizaciones, los polinucleótidos comprenden además un polinucleótido que codifica un polipéptido PiT-2. En otras realizaciones más, los polinucleótidos divulgados en el presente documento comprenden además un polinucleótido que codifica un polipéptido de direccionamiento. En una realización, el polipéptido de direccionamiento se une a una proteína extracelular. En otra realización, la proteína extracelular es colágeno.
En el presente documento también se proporcionan vectores retrovíricos que codifican un péptido modificado HSV1-TK de la invención para su uso en métodos para destruir células neoplásicas en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula retrovírica.
En algunas realizaciones, la partícula retrovírica se administra por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraarterial, arterial intrahepática, intratecal, intraperitoneal y/o intratumoral. En otras realizaciones, la partícula retrovírica se administra por vía intratumoral o intravenosa. En aún otras realizaciones, la partícula del vector retrovírico se administra por vía intraarterial. En otras realizaciones, al menos 1 x 1012 PVT del vector retrovírico se administran de forma acumulativa al sujeto que lo necesita. En otras realizaciones más, al menos 1 x 109 PVT del vector retrovírico se administran de una sola vez al sujeto que lo necesita.
En otras realizaciones más, el profármaco se administra entre aproximadamente 1 y 2 días después de la administración de la partícula del vector retrovírico. En algunas realizaciones, el profármaco se elige del grupo que consiste en ganciclovir, valganciclovir, aciclovir, valaciclovir y penciclovir. En algunas realizaciones, el profármaco es ganciclovir.
En el presente documento también se proporcionan vectores retrovíricos que codifican un péptido modificado HSV1-TK de la invención para su uso en métodos para tratar un cáncer en un paciente que lo necesita, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula de vector retrovírico seguido de la administración de un profármaco de nucleósido al paciente que lo necesita.
En el presente documento también se proporcionan vectores retrovíricos que codifican un péptido modificado HSV1-TK de la invención para su uso en métodos para aumentar la destrucción de células neoplásicas mediada por HSV-TK con ganciclovir, valganciclovir, aciclovir, valaciclovir o penciclovir en un sujeto, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula de vector retrovírico que comprende una HSV-TK al sujeto junto con un tratamiento que aumenta la comunicación intracelular de unión comunicante (GJIC, del inglésgap junction intracellular communication).En algunas realizaciones, el tratamiento de aumento de GJIC comprende administrar una secuencia polinucleotídica que codifica al menos una subunidad de unión comunicante. En otras realizaciones, la subunidad de unión comunicante es la conexina 43, conexina 30 o conexina 26. En aún otras realizaciones, la subunidad de unión comunicante es una subunidad de unión comunicante modificada para evitar modificaciones postraduccionales. En otras realizaciones más, el tratamiento de aumento de GJIC comprende administrar una secuencia polinucleotídica que codifica E-cadherina. En otras realizaciones más, el tratamiento de aumento de GJIC comprende administrar al sujeto un compuesto del grupo que consiste en gemcitabina; cAMP; un ácido retinoico; un carotenoide; un glucocorticoide, un flavonoide, apigenina o lovastatina. En aún otras realizaciones, el tratamiento de aumento de GJIC comprende la inhibición del proteasoma. En una realización, la inhibición del proteasoma comprende la administración de N-acetil-Leu-Leu-Nle-CHO (ALLN) y/o cloroquina. En otras realizaciones, el tratamiento de aumento de GJIC comprende un tratamiento con radiación o eléctrico.
En el presente documento también se proporcionan métodos para destruir una célula, comprendiendo el método: a) introducir en la célula una secuencia polinucleotídica de acuerdo con las reivindicaciones; b) permitir o iniciar que la célula exprese la timidina cinasa expresada o una variante de la misma; y c) poner en contacto la célula con un agente que la timidina cinasa convierte en un agente citotóxico.
En otra realización, una secuencia polinucleotídica que codifica una forma mutada de la timidina cinasa de un virus del herpes simple humano (HSV-TK) comprende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más modificaciones. En otra realización, una secuencia polinucleotídica que codifica una forma mutada de la timidina cinasa de un virus del herpes simple humano (HSV-TK) comprende 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más modificaciones. En otra realización, una secuencia polinucleotídica que codifica una forma mutada de la timidina cinasa de un virus del herpes simple humano (HSV-TK) comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más modificaciones.
En una realización, la HSV-TK codificada puede estar mutada en los restos de aminoácidos 167, 168, o una combinación de los mismos, a un aminoácido polar, no polar, básico o ácido. Por ejemplo, la HSV-TK codificada puede estar mutada en el resto de aminoácido 167 a un aminoácido polar, no polar, básico o ácido. En otro ejemplo, la HSV-TK codificada puede estar mutada en el resto de aminoácido 168 a un aminoácido polar, no polar, básico o ácido. En otro ejemplo, la HSV-TK codificada puede estar mutada tanto en el resto de aminoácido 167 como en el 168 a un aminoácido polar, no polar, básico o ácido.
En otra realización, el resto de aminoácido 167 de la HSV-TK codificada puede estar mutado a serina o fenilalanina.
En otra realización, el resto de aminoácido 168 de la HSV-TK codificada puede estar mutado a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: histidina, lisina, cisteína, serina y fenilalanina.
En otra realización, la HSV-TK codificada puede estar mutada en los aminoácidos 25 y 26. Por ejemplo, los restos de aminoácidos 25 y 26 pueden estar mutados a un aminoácido elegido del grupo que consiste en glicina, serina y ácido glutámico.
En otra realización, la HSV-TK codificada puede estar mutada en los restos de aminoácidos 25, 26, 32 y 33. Por ejemplo, los restos de aminoácidos 25, 26, 32 y 33 pueden estar mutados a un aminoácido elegido del grupo que consiste en glicina, serina y ácido glutámico.
En otra realización, la HSV-TK mutante codificada no se localiza exclusivamente en la región nuclear.
En otra realización, la HSV-TK modificada codificada presenta una cantidad reducida de actividad de timidina cinasa en comparación con la HSV-TK de tipo silvestre.
En otra realización, la actividad timidina cinasa de la HSV-TK modificada codificada puede reducirse aproximadamente 1.5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 30 veces o aproximadamente 50 veces.
En otra realización, la actividad timidina cinasa de la HSV-TK modificada codificada puede reducirse en aproximadamente un 1,5%, aproximadamente un 2% , aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente el 100 %.
En otra realización, la actividad timidina cinasa de la HSV-TK modificada codificada puede aumentar aproximadamente 1.5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 30 veces o aproximadamente 50 veces.
En otra realización, la actividad timidina cinasa de la HSV-TK modificada codificada puede aumentar en aproximadamente un 1,5%, aproximadamente un 2% , aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o aproximadamente el 100 %.
En el presente documento se proporciona una secuencia polinucleotídica como se describe anteriormente, donde la HSV-TK codificada comprende la mutación A167F, A168H o ambas.
Una secuencia polinucleotídica descrita en el presente documento puede comprender además una secuencia polinucleotídica que codifica un segundo polipéptido, donde dicho segundo polipéptido es un polipéptido terapéutico. El polipéptido terapéutico puede, en algunos casos, ser un gen suicida. Los genes suicidas incluyen, pero sin limitación, una citosina desaminasa, una VSV-tk, IL-2, nitrorreductasa (NR), carboxilesterasa, p-glucuronidasa, citocromo p450, p-galactosidasa, cadena A de la toxina diftérica (DT-A), carboxipéptido G2 (CPG2), purina nucleósido fosforilasa (PNP), guanilato cinasa y desoxicitidina cinasa (dCK).
En una realización, una secuencia polinucleotídica modificada descrita en el presente documento puede comprender una secuencia de ácido nucleico establecida como una cualquiera de las SEQ ID NO: 12 a 24.
En otra realización, una secuencia polinucleotídica modificada descrita en el presente documento puede comprender una secuencia de ácido nucleico establecida como una cualquiera de las SEQ ID NO: 22 a 24.
La secuencia polinucleotídica descrita en el presente documento comprende una señal de exportación nuclear. Por ejemplo, una secuencia polinucleotídica puede comprender HSV-TKA168HdmNES (SEQ ID NO: 18).
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende una o más modificaciones del sitio de corte y empalme.
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende HSV-TK A167Fsm, en donde "sm" se refiere al par de mutaciones único R25G-R26S (SEQ ID NO: 13).
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende HSV-TK A168Hsm (SEQ ID NO: 12).
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende HSV-TK A167Fdm, donde 'dm' se refiere al par de mutaciones doble R25G-R26S, R32G-R33S (SEQ ID NO: 17).
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende HSV-TK A168Hdm (SEQ ID NO: 16).
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende HSV-TK A167Fdm y una secuencia de exportación nuclear procedente de la proteína cinasa cinasa activada por mitógenos, un ejemplo de la cual es la SEQ ID NO: 19.
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende HSV-TK A168Hdm y una NES (SEQ ID N<o>: 18). En dicha realización, la secuencia comprende HSV-TK A168H.
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende una HSV-TK, en donde dicho vector comprende un dominio de unión a sustrato mejorado y un conjunto de mNLS/NES. Ejemplos de esta realización ilustrativa incluyen las SEQ ID NO: 18 y 19.
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende una HSV-TK, en donde el vector comprende un marcador seleccionable, un gen brillante y/o uno o más genes de destrucción.
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende dos modificaciones.
En otra realización, una partícula retrovírica comprende una secuencia polinucleotídica PiT-2 y la partícula retrovírica se une específicamente a un receptor PiT-2 en la superficie de las células diana, permitiendo así la absorción de la partícula retrovírica en la célula.
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende una HSV-TK, en donde la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia polinucleotídica comprende TK168dmNES.
En el presente documento se proporciona un método para aumentar FHBG (9-[4-fluoro-3-(hidroximetil)butil]guanina), FBPG (9-([3-fluoro-1-hidroxi-2-propoxi]metil)guanina), FGCV (fluoroganciclovir), FPCV (fluoropenciclovir), FIAU (1-(2'-desoxi-2'-fíuoro-1-p-D-arabinofuranosií)-5-yodouracilo), FEAU (fluoro-5-etil-1-p-D-arabinofuranosiluracilo), FMAU (fluoro-5-metil-1-p-D-arabinofuranosiluracilo), FHOMP (6-((1-fluoro-3-hidroxipropan-2-iloxi)metil)-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona), ganciclovir, valganciclovir, aciclovir, valaciclovir, penciclovir, pirimidina radiomarcada con cadena lateral 4-hidroxi-3-(hidroximetil)butilo en N-1 (HHG-5-FEP) o derivados de pirimidina sustituidos con 5-(2-)hidroxietil) y 5-(3-hidroxipropil) que llevan cadenas laterales similares a 2,3-dihidroxipropilo, aciclovir, ganciclovir y penciclovir que median la destrucción de células neoplásicas en un sujeto, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de partículas de vector que codifican HSV-TK al sujeto junto con un tratamiento que aumenta la comunicación intracelular de unión comunicante (GJIC).
El tratamiento de aumento de GJIC puede comprender, por ejemplo, administrar una secuencia polinucleotídica que codifica al menos una subunidad de unión comunicante. Una subunidad de unión comunicante puede ser, por ejemplo, connexina 43, conexina 30 o conexina 26. La subunidad de unión comunicante puede ser una subunidad de unión comunicante modificada para evitar modificaciones postraduccionales.
En una realización, el tratamiento de aumento de GJIC comprende administrar una secuencia polinucleotídica que codifica E-cadherina.
En otra realización, el tratamiento de aumento de GJIC comprende administrar al sujeto un compuesto del grupo que consiste en: gemcitabina; cAMP; un ácido retinoico; un carotenoide; un glucocorticoide, un flavonoide, apigenina o lovastatina.
En otra realización, el tratamiento de aumento de GJIC comprende la inhibición del proteasoma. La inhibición del proteasoma puede comprender la administración de N-Acetil-Leu-Leu-Nle-CHO (ALLN) y/o cloroquina.
En otra realización, el tratamiento de aumento de GJIC comprende radiación o tratamiento fotodinámico, incluida la administración junto con agentes oxidantes y agentes que activan las MAP cinasas.
En otra realización, el tratamiento de aumento de GJIC comprende tratamiento eléctrico.
En el presente documento se proporciona un método destruir una célula, comprendiendo el método: (a) introducir en la célula una secuencia polinucleotídica de acuerdo con las reivindicaciones; (b) permitir o iniciar que la célula exprese la timidina cinasa expresada o una variante de la misma; y (c) poner en contacto la célula con un agente que la timidina cinasa convierte en un agente citotóxico.
En el presente documento se divulga un método para aumentar el efecto por vecindad de la timidina cinasa, comprendiendo el método administrar una secuencia que codifica una subunidad de unión comunicante junto con una partícula de vector retrovírico que codifica HSV-TK. Las partículas retrovíricas pueden dirigirse a una célula o sistema de interés. El método de direccionamiento retrovírico puede comprender la incorporación de un factor que reconoce o se une a la célula o sistema de interés. El método de direccionamiento retrovírico puede comprender la incorporación de proteínas de direccionamiento, incluida la unión a proteínas o receptores en la superficie de la célula del sistema de interés, incluidos anticuerpos, proteínas de unión a receptores o proteínas que se unen a componentes celulares, incluido, pero sin limitación, el colágeno. La proteína de direccionamiento puede comprender proteínas que se unen al colágeno, incluidos, pero sin limitación, péptidos, proteínas y/o dominios proteicos que incluyen un dominio de unión a colágeno.
Breve descripción de los dibujos
Las nuevas características de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención con referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos en los que:
La Figura 1 ejemplifica cómo la eliminación del sitio de corte y empalme de HSV-TK evita una forma inactivada de HSV-TK. El análisis PCR de estirpes de linfocitos T y linfocitos T primarios transducidos con vectores HSV-TK con (HuT SF/Tk/mut) o sin (HuT G1Tk1SvNa) eliminación del sitio de corte y empalme.
En la figura 2 se proporciona un esquema ilustrativo para un ensayo clínico de fase IA con una composición descrita en el presente documento.
En la figura 3 se proporciona un esquema ilustrativo para un ensayo clínico de fase IB con una composición descrita en el presente documento.
En la figura 4 se proporciona un esquema ilustrativo de acontecimientos para el ensayo clínico de fase IA para las cohortes 1 a 3.
En la figura 5 se proporciona un esquema ilustrativo de acontecimientos para el ensayo clínico de fase IA para la cohorte 4 y siguientes.
En la figura 6 se proporciona un esquema ilustrativo para un ensayo clínico de fase IB con una composición descrita en el presente documento.
En la figura 7 se proporciona un esquema ilustrativo para un esquema A de ensayo clínico para el tratamiento con una composición descrita en el presente documento.
En la figura 8 se proporciona un esquema ilustrativo para un esquema B de ensayo clínico para el tratamiento con una composición descrita en el presente documento.
En la figura 9 se proporciona una ilustración de una molécula transmembrana PiT-2. El cuadro representa la ubicación aproximada de un sitio de unión al anticuerpo anti-PiT-2 Western.
En la figura 10 se proporciona una ilustración de una molécula transmembrana PiT-2. El cuadro representa la ubicación aproximada de un sitio de unión al anticuerpo anti-PiT-2 IHC.
En la figura 11 se proporcionan construcciones de Reximmune ilustrativas con varias modificaciones de HSV-TK.
Figura 11A: GM-CSF negativo, HSV-TK 167sm. Figura 11B: GM-CSF negativo, HSV-TK 168sm. Figura 11C: GM-CSF negativo, HSV-TK 167dm. Figura 11D: GM-CSF negativo, HSV-TK 168dm. Figura 11E: GM-CSF negativo, HSV-TK 167dm NES. Figura 11F: GM-CSF negativo, HSV-TK 168dm NES.
Figura 12: Detección de la proteína mHSV-TK mediante análisis Western para los vectores retrovíricos mostrados en la figura 11. El ADN vírico se transfectó en células productoras de vectores 293T, las células se lisaron, las proteínas HSV-TK se detectaron con un anticuerpo anti-HSV-TK. Se encontró que todos los vectores víricos HSV-TK expresaban niveles elevados de proteína HSV-TK.
En la figura 13 se proporcionan vectores retrovíricos ilustrativos. Figura 13A: RexRed-TK A168H. Figura 13B: RexRed-TK 167-dm. Figura 13C: RexRed-TK 168 dm.
En la figura 14 se proporcionan vectores retrovíricos ilustrativos adicionales en donde se empleó una forma particular de optimización de codones.
Figura 14A: RexRed-TK 167-dm NES. Figura 14B: RexRed-TK 168-dm NES. Figura 14C: RexRed-TK 167-dm NES JCO. Figura 14D: RexRed-TK 168-dm NES JCO. JCO = optimización de codones justificada.
En la figura 15 se proporcionan vectores retrovíricos ilustrativos adicionales. Figura 15A: RexRed-TK A168F. Figura 15B: RexRed-TK A168F (específico de GCV). Figura 15C: Rex-Higro-R-TK A168F que contiene el gen de resistencia a la higromicina.
En la figura 16 se proporcionan vectores retrovíricos ilustrativos adicionales. Figura 16A: Rex-Higro-R-TK A167F. Figura 16B: Q-PiT-2 es un vector que contiene un gen del receptor vírico que se une a un receptor PiT-2 en la superficie de las células diana.
En la figura 17 se proporcionan vectores retrovíricos ilustrativos adicionales. Figura 17A: Reximmune-C original. Figura 17B. Reximmune-C que contiene una mejora con un gen de destrucciónmTK39(HSV-TKSR39) con un gen de resistencia a la neomicina (NeoR) y un marcador seleccionable insertado.
En la figura 18 se proporciona un ejemplo de Reximmune-C un gen de destrucción de citidina desaminasa bacteriana mutada (mBCD).
En la figura 19 se proporciona un ejemplo de Reximmune-C un gen de destrucción de citidina desaminasa de levadura mutada (mYCD).
En la figura 20 se ilustra un ejemplo de RexRed Super TK que incluye un gen brillante (RFP) y un gen de destrucción que contiene las secuencias identificadas en las posiciones indicadas.
En la figura 21 se proporciona una ilustración de vectores retrovíricos que tienen un dominio de unión a sustrato mejorado y un conjunto /-mNLS y/o /-NES, que destaca las diferencias de secuencia entre Reximmune-C1 o 2, SR-39 y el genHSV-TKde tipo silvestre, y que tiene instalado un segundo gen terapéutico en lugar del genRFPentre los promotores LTR y SV40
En la figura 22 se ilustra RexRed Super TK A167F que incluye un gen brillante (RFP) y un gen de destrucción que contiene las secuencias indicadas en las posiciones 159 a 161 y 167 a 169.
En la figura 23 se proporcionan vectores retrovíricos ilustrativos que son clones multicolores de Reximmune-C de células transducidas con LNCE A375. Figura 23A: LNC-EGFP que contiene una proteína fluorescente verde mejorada como gen brillante. Figura 23B: RexRed que contiene una proteína fluorescente roja como gen brillante. En la figura 24 se proporcionan vectores ilustrativos que contienen únicamente un gen brillante o un marcador seleccionable de gen de resistencia a higromicina.
Figura 25: la destrucción de Tk-GCV da como resultado las estirpes progenitora y PiT-2-CHO-K1. Los gráficos ilustran los datos de un único protocolo de transducción RxC2. Se utilizó el mismo lote de RxC2 para todos los experimentos (valor de aproximadamente 5 * 1010 partículas de virus totales (PVT) por mililitro según lo determinado mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-qPCR)). Figura 25A: Destrucción por GCV de la estirpe progenitora CHO-K1 transducida con RxC2 después de 4 días en GCV (4 dosis). Figura 25B: Destrucción por GCV de PiT-2-CHO-K1 transducida con RxC2 después de 4 días en GCV (4 dosis).
Figura 26: Destrucción por Tk-GCV en progenitora y PiT-2-CHO-K1 siguiendo un protocolo de transducción Triple RxC2. Figura 26A: Destrucción por GCV de progenitora CHO-K1 transducida con RxC2-triple el día 9 (placa al 10 %, 5 dosis de GCV). Figura 26B: Destrucción por GCV de PiT-2-CHO-K1 transducida con RxC2-triple el día 9 (placa al 10 %, 5 dosis de GCV).
Figura 27: ilustra la destrucción de TK-GCV después de una triple transducción con Reximmune-C2 (HSV-TKA168HdmNES) (SEQ ID NO: 18) en una estirpe celular de carconima pancreático humano MIA-PaCa-2. Destrucción por GCV de MIA-PaCa2 transducida con RxC2.triple, 25 % de las células iniciales resembradas, día 8, con varias concentraciones de GCV.
En la figura 28 se ilustra la destrucción por TK-GCV después de la triple transducción de células PiT-2-MIA-PaCa-2 con Reximmune-C2. Destrucción por GCV de PiT-2-MIA-PaCa2 transducida con RxC2.triple, 25 % de las células iniciales, día 8, con varias concentraciones de GCV.
Figura 29: Resultados gráficos de un ensayoin vitrode vecindad donde se trataron clones de melanoma humano A375 Higro TK con GCV 20 mM.
Figura 30: Resultados gráficos de un ensayoin vitrode vecindad donde se trataron clones C6-Higro-TK con GCV 20 mM.
La figura 31 es un gráfico que representa el porcentaje de destrucción por GCV después de la triple transducción con Reximmune-C2 de varias estirpes celulares cancerosas.
En la figura 32 se ilustra un gráfico de estirpes celulares CHO-K1 transducidas con RxC2 después de cuatro días en GCV.
En la figura 33 se ilustra un gráfico de estirpes celulares PiT-2-HA-CHO-K1 transducidas con RxC2 después de cuatro días en GCV.
En la figura 34 se ilustra la inmunohistoquímica (IHC) de la localización de subcélulas HSV-TK en células 293T. Transfección transitoria, 24 horas AB primario (Santa Cruz) con RexC1 HSV-TK (cuadro izquierdo) y RexC2 HSV-TK (cuadro derecho)
Descripción detallada de la invención
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
Se encuentran disponibles productos terapéuticos del genHSV-TK,pero no son óptimos con respecto a la expresión genética máxima y la actividad de destrucción tumoralin vitroein vivoincluida la terapia genética contra el cáncer. En el presente documento se divulga por primera vez una optimización de codones dentro de los genesHSV-TKpara producir genes suicidas mejorados con un rendimiento mejorado de activación de profármacos en el contexto de un sistema de administración de genes víricos o pseudovíricos. El sistema de administración de genes optimizado garantiza una actividad enzimática óptima del profármaco HSV-TK y la producción de valores elevados de partículas víricas.
Por lo tanto, en el presente documento se divulga la optimización de genesHSV-TKcandidatos optimizados preparados mediante un programa bioinformático y análisis personalizados por parte de los presentes inventores utilizando el conocimiento de las funciones y limitaciones de los genes y del sistema de vectores víricos.
Las siguientes etapas de optimización representan métodos ilustrativos que utilizaron los presentes inventores para llegar a los ejemplos descritos en el presente documento. Se puede utilizar la optimización de codones asistida por un programa informático para eliminar codones raros y de bajo uso para mejorar la expresión de la proteína HSV-TK. El contenido de GC en el nuevo gen con codones optimizados se puede ajustar para evitar la síntesis del gen y otros problemas.
Se pueden eliminar las secuencias aceptoras de corte y empalme y donantes de corte y empalme conocidas dentro de HSV-TK.
Pueden eliminarse tramos de polipirimidinas, en particular aquellos introducidos por optimización de codones que pueden estar implicados en el corte y empalme.
Se puede incluir una única secuencia fuerte de inicio de traducción de Kozak delante del codón de inicio (ATG), mientras que se pueden eliminar posibles secuencias de Kozak dentro del marco de lectura abierto de HSV-TK. Algunas de estas secuencias pueden haberse introducido mediante optimización de codones y se entendería que es posible que sea necesario realizar modificaciones en múltiples repeticiones para optimizar un gen para una actividad tumoricida mejorada.
Las secuencias de localización nuclear (NLS, del inglésNuclear Localization Sequences)dentro de HSV-TK pueden eliminarse para exportar HSV-TK expresada en donde la proteína HSV-TK expresada no está localizada exclusivamente en el núcleo, sino que se acumula en el citoplasma.
Se pueden añadir sitios de restricción que flanquean el genHSV-TKque hacen posible clonar el gen en muchas ubicaciones en los vectores retrovíricos divulgados, mientras se excluyen estos mismos sitios de restricción dentro del propio genHSV-TK.
Puede incluirse un codón de parada doble al final del genHSV-TKpara asegurar la terminación completa de la traducción de HSV-TK.
Se pueden evaluar mutaciones cerca del dominio de unión al sustrato en las ubicaciones de los aminoácidos 159 a 161 dentro del genHSV-TK.
Se pueden evaluar mutantes en el dominio de unión al sustrato en la ubicación del aminoácido 167 dentro del genHSV-TKpara determinar una mayor actividad enzimática hacia el análogo de nucleósido del profármaco, tal como gangciclovir y profármacos similares, así como la selectividad por su capacidad para destruir células cancerosas. Se pueden evaluar mutantes en el dominio de unión al sustrato en la ubicación del aminoácido 168 dentro del genHSV-TKpara determinar una mayor actividad enzimática del profármaco GCV y selectividad por su capacidad para destruir células cancerosas.
Los mutantes en el dominio de unión al sustrato en la ubicación del aminoácido 167 168 dentro del genHSV-TKpueden evaluarse para determinar una mayor actividad enzimática del profármaco GCV y selectividad por su capacidad para destruir células cancerosas.
Se puede evaluar el uso de marcadores, proteínas de fusión y enlazadores de HSV-TK con otros genes y proteínas.
También se pueden considerar métodos adicionales de optimización para su uso en los métodos descritos en el presente documento. Una vez que un gen se optimiza de esta manera, su secuencia genética se puede enviar a una empresa de síntesis de genes para una síntesis de genes personalizada.
Definiciones
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece la invención. En el caso en el que exista una pluralidad de definiciones para los términos y expresiones en la presente memoria, prevalecen los de esta sección. Cuando se hace referencia a una URL u otro identificador o dirección de este tipo, se entiende que dichos identificadores pueden cambiar y la información concreta en internet puede aparecer y desaparecer, pero puede encontrarse información equivalente buscando en internet. La referencia a los mismos pone de manifiesto la disponibilidad y diseminación pública de dicha información.
Como se utiliza en el presente documento, "ácido nucleico" se refiere a un polinucleótido que contiene al menos dos subunidades de nucleótidos o análogos de nucleótidos unidos covalentemente. Un ácido nucleico es generalmente un ácido desoxirribonucleico (ADN), un ácido ribonucleico (ARN), o un análogo de ADN o ARN. Los análogos de nucleótidos están disponibles comercialmente y se conocen métodos para preparar polinucleótidos que contienen dichos análogos de nucleótidos (Linet al.(1994) Nucl. Acids Res. 22:5220-5234; Jellineket al.(1995) Biochemistry 34:11363-11372; Pagratiset al.(1997) Nature Biotechnol. 15:68-73). El ácido nucleico es generalmente monocatenario, bicatenario o una mezcla de los mismos. A efectos del presente documento, a menos que se especifique de otra manera, el ácido nucleico es bicatenario, o resulta evidente por el contexto.
Como se utiliza en el presente documento, "ADN" pretende incluir todos los tipos y tamaños de moléculas de ADN, incluido ADNc, plásmidos y ADN que incluye nucleótidos modificados y análogos de nucleótidos.
Como se utiliza en el presente documento, "nucleótidos" incluye nucleósidos mono-, di- y trifosfatos. Nucleótidos también incluye nucleótidos modificados, tal como, pero sin limitación, nucleótidos de fosforotioato y nucleótidos de deazapurina y otros análogos de nucleótidos.
El término "polinucleótido", tal como se utiliza en el presente documento, significa una forma polimérica de nucleótido de cualquier longitud e incluye ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Dicho término también incluye ADN monocatenario y bicatenario, así como ARN monocatenario y bicatenario. El término también incluye polinucleótidos modificados, tales como polinucleótidos metilados o protegidos.
Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a animales, plantas, insectos y aves en los que se introducen las moléculas grandes de ADN. Se incluyen organismos superiores, tales como mamíferos y aves, incluidos seres humanos, primates, roedores, ganado bovino, cerdos, conejos, cabras, ovejas, ratones, ratas, cobayas, gatos, perros, caballos, pollos y otros.
Como se utiliza en el presente documento, "administrar a un sujeto" es un procedimiento mediante el cual uno o más agentes de administración y/o moléculas grandes de ácido nucleico, en conjunto o por separado, se introducen o se aplican en un sujeto de manera que las células diana que están presentes en el sujeto finalmente entran en contacto con el agente y/o las moléculas grandes de ácido nucleico.
Como se utiliza en el presente documento, "vector de administración" o "vehículo de administración" o "vector terapéutico" o "sistema terapéutico" se refiere a partículas víricas y no víricas que albergan y transportan moléculas de ácido nucleico exógenas a una célula o tejido diana. Los vehículos víricos incluyen, pero sin limitación, retrovirus, adenovirus, virus lentivíricos, virus del herpes y virus adenoasociados. Los vehículos no víricos incluyen, pero sin limitación, micropartículas, nanopartículas, virosomas y liposomas. "De direccionamiento", como se utiliza en el presente documento, se refiere al uso de ligandos que están asociados con el vehículo de administración y que dirigen el vehículo a una célula o tejido. Los ligandos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos, receptores y dominios de unión a colágeno.
Como se utiliza en el presente documento, "administración", que se utiliza indistintamente con "transducción", se refiere al proceso mediante el cual las moléculas de ácido nucleico exógenas se transfieren a una célula de manera que se ubiquen dentro de la célula. La administración de ácidos nucleicos es un proceso distinto de la expresión de ácidos nucleicos.
Como se utiliza en el presente documento, un "sitio de clonación múltiple (MCS, del inglésmúltiple cloning site)"es una región de ácido nucleico en un plásmido que contiene múltiples sitios de enzimas de restricción, de los que cualquiera puede usarse junto con la tecnología recombinante convencional para digerir el vector. La "digestión con enzimas de restricción" se refiere a la escisión catalítica de una molécula de ácido nucleico con una enzima que funciona solo en ubicaciones específicas en una molécula de ácido nucleico. Muchas de estas enzimas de restricción están disponibles en el mercado. El uso de dichas enzimas está ampliamente comprendido por los expertos en la materia. Con frecuencia, un vector se linealiza o fragmenta usando una enzima de restricción que corta dentro del MCS para posibilitar que las secuencias exógenas se liguen en el vector.
Como se utiliza en el presente documento, "origen de replicación" (a menudo denominado "ori"), es una secuencia específica de ácido nucleico en la que se inicia la replicación. Como alternativa, se puede emplear una secuencia de replicación autónoma (ARS, del inglésAutonomously Replicating Sequence)si la célula hospedadora es levadura.
Como se utiliza en el presente documento, los "marcadores seleccionables o rastreables" confieren un cambio identificable a una célula que permite una fácil identificación de las células que contienen un vector de expresión. En general, un marcador seleccionable es aquel que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador seleccionable positivo es aquel en el que la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador seleccionable negativo es aquel en el que su presencia impide su selección. Un ejemplo de un marcador seleccionable positivo es un marcador de resistencia a fármacos.
Por lo general, la inclusión de un marcador de selección de fármacos ayuda en la clonación e identificación de transformantes, por ejemplo, los genes que confieren resistencia a la neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores seleccionables útiles. Además de los marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de transformantes en función de la implantación de condiciones, otros tipos de marcadores, incluidos los marcadores que se pueden examinar, tales como GFP, cuya base es el análisis colorimétrico, también se contemplan. En algunas realizaciones, se pueden utilizar enzimas detectables tales como la timidina cinasa (tk) del virus del herpes simple o la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Un experto en la materia también sabría cómo emplear marcadores inmunológicos, posiblemente, en combinación con el análisis FACS. No se cree que el marcador usado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Los expertos en la materia conocen bien ejemplos adicionales de marcadores seleccionables y detectables.
El término "transfección" se utiliza para referirse a la absorción de ADN extraño por una célula. Una célula ha sido "transfectada" cuando se ha introducido ADN exógeno en el interior de la membrana celular. En general, se conocen en la materia numerosas técnicas de transfección. Véanse, por ejemplo, Grahamet al.,Virology 52:456 (1973); Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989); Daviset al.,Basic Methods in Molecular Biology (1986); Chuet al.,Gene 13:197 (1981). Se pueden utilizar dichas técnicas para introducir una o más fracciones de ADN exógenas, tales como un vector de integración de nucleótidos y otras moléculas de ácidos nucleicos, en células hospedadoras adecuadas. El término abarca procedimientos de transfección químicos, eléctricos y mediados por virus.
Como se utiliza en el presente documento, "expresión" se refiere al proceso mediante el cual el ácido nucleico se traduce en péptidos o se transcribe en ARN, lo que, por ejemplo, se puede traducir en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido nucleico procede de ADN genómico, la expresión incluye, si se selecciona una célula u organismo hospedador eucariota adecuado, corte y empalme del ARNm. Para que el ácido nucleico heterólogo se exprese en una célula hospedadora, inicialmente debe administrarse en la célula y después, una vez en la célula, residir finalmente en el núcleo.
Como se utiliza en el presente documento, un "tratamiento terapéutico" se refiere a la administración periódica o programada de los vectores divulgados en el presente documento en un período de tiempo definido. Dicho período de tiempo es de al menos un día, al menos dos días, al menos tres días, al menos cinco días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos un mes, al menos dos meses o al menos seis meses. La administración también podría realizarse de forma crónica, es decir, durante un período de tiempo indefinido. La administración periódica o programada incluye una vez al día, dos veces al día, tres veces al día u otra administración programada.
Como se utiliza en el presente documento, los términos "coadministración" "administrado junto con" y sus equivalentes gramaticales o similares pretenden abarcar la administración de los agentes terapéuticos seleccionados a un solo paciente y se pretende que incluyan pautas de tratamiento en las que los agentes se administran por la misma vía de administración o una diferente o en el mismo momento o uno diferente. En algunas realizaciones, un agente terapéutico como se divulga en la presente solicitud se coadministrará con otros agentes. Estos términos abarcan la administración de dos o más agentes a un animal de manera que ambos agentes y/o sus metabolitos estén presentes en el animal al mismo tiempo. Incluyen la administración simultánea en composiciones separadas, la administración en diferentes momentos en composiciones separadas y/o la administración en una composición en la que están presentes ambos agentes. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un agente terapéutico y el(los) otro(s) agente(s) se administran en una única composición. En algunas realizaciones, un agente terapéutico y el(los) otro(s) agente(s) se mezclan en la composición. En realizaciones adicionales, un agente terapéutico y el(los) otro(s) agente(s) se administran en momentos separados en dosis separadas.
La expresión "célula hospedadora" indica, por ejemplo, microorganismos, células de levadura, células de insecto y células de mamífero, que pueden ser, o haber sido, utilizados como receptores para múltiples construcciones para producir un vector de administración. La expresión incluye la progenie de la célula original que se ha transfectado. Por lo tanto, una "célula hospedadora", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una célula que se ha transfectado con una secuencia de ADN exógeno. Se entiende que la progenie de una única célula precursora puede no ser necesariamente idéntica por completo en la morfología o en el complemento genómico del ADN total que la célula precursora original, debido a una mutación natural, accidental o deliberada.
Como se utiliza en el presente documento, la "terapia genética" implica la transferencia de ADN heterólogo a determinadas células, células diana, de un mamífero, en particular de un ser humano, con un trastorno o condiciones para las cuales se busca terapia o diagnóstico. El ADN se introduce en las células diana seleccionadas de manera que se exprese el ADN heterólogo y se produzca un producto terapéutico codificado por el mismo. En algunas realizaciones, el ADN heterólogo, directa o indirectamente, media la expresión del ADN que codifica el producto terapéutico. En algunas realizaciones, el ADN heterólogo codifica un producto, tal como un péptido o ARN que media, directa o indirectamente, la expresión de un producto terapéutico. En algunas realizaciones, la terapia genética se utiliza para administrar un ácido nucleico que codifica un producto génico para reemplazar un gen defectuoso o complementar un producto génico producido por el mamífero o la célula en la que se introduce. En algunas realizaciones, el ácido nucleico introducido codifica un compuesto terapéutico, tal como un factor de crecimiento o un inhibidor del mismo, o un factor de necrosis tumoral o un inhibidor del mismo, tal como un receptor del mismo, que generalmente no se produce en el hospedador mamífero o que no se produce en cantidades terapéuticamente eficaces o en un momento terapéuticamente útil. En algunas realizaciones, el ADN heterólogo que codifica el producto terapéutico se modifica antes de la introducción en las células del hospedador afectado para mejorar o alterar de otro modo el producto o su expresión.
Como se utiliza en el presente documento, "secuencia de ácido nucleico heteróloga" es generalmente ADN que codifica ARN y proteínas que normalmente no se producenin vivopor la célula en la que se expresa o que media o codifica mediadores que alteran la expresión del ADN endógeno al afectar la transcripción, traducción u otros procesos bioquímicos regulables. Cualquier ADN que un experto en la materia reconozca o considere heterólogo o extraño a la célula en la que se expresa está abarcado en el presente documento como ADN heterólogo. Ejemplos de ADN heterólogos incluyen, pero sin limitación, ADN que codifica proteínas marcadoras localizable, tal como una proteína que confiere resistencia a fármacos, ADN que codifica sustancias terapéuticamente eficaces, tales como agentes antineoplásicos, enzimas y hormonas, y ADN que codifica otros tipos de proteínas, tales como anticuerpos. En algunas realizaciones, los anticuerpos que están codificados por ADN heterólogo se secretan o expresan en la superficie de la célula en la que se ha introducido el ADN heterólogo.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "mutante de timidina cinasa" se refiere no sólo a la proteína específica descrita en el presente documento (así como a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican estas proteínas), sino a derivados de la misma que pueden incluir diversas formas estructurales de la proteína primaria que conservan la actividad biológica.
Como se utiliza en el presente documento, "timidina cinasa no mutada" se refiere a una secuencia polipeptídica de timidina cinasa nativa o de tipo silvestre.
Como se utiliza en el presente documento, "gen suicida" se refiere a un ácido nucleico que codifica un producto, en donde el producto provoca la muerte celular por sí mismo o en presencia de otros compuestos.
Como se utiliza en el presente documento, el término "mutado" o la expresión "sustituido por otro nucleótido" significa que un nucleótido en una determinada posición es sustituido en esa posición por un nucleótido distinto del que aparece en la secuencia no mutada o previamente mutada. Es decir, en algunos casos, se pueden realizar modificaciones específicas en diferentes nucleótidos. En algunas realizaciones, las sustituciones se realizan de manera que los sitios donantes y/o aceptores de corte y empalme oportunos ya no estén presentes en un gen. Véase, por ejemplo, la figura 1.
Como se utiliza en el presente documento, un "aminoácido polar" se refiere a los restos de aminoácidos Asp(N), Cys (C), Gln (Q), Gly (G), Ser (S), Thr (T) o Tyr (Y).
Como se utiliza en el presente documento, un "aminoácido no polar" se refiere a los restos de aminoácidos Ala (A), Ile (I), Leu (L), Met (M), Phe (F), Pro (P), Trp (W) o Val (V).
Como se utiliza en el presente documento, un "aminoácido básico" se refiere a los restos de aminoácidos Arg (R), His (H) o Lys (K).
Como se utiliza en el presente documento, un "aminoácido ácido" se refiere a los restos de aminoácidos Asp (D) o Glu (E).
HSV-TK MEJORADA
La timidina cinasa es una enzima de la vía de rescate que fosforila sustratos de nucleósidos naturales así como análogos de nucleósidos. En general, la timidina cinasa vírica se explota terapéuticamente mediante la administración de un análogo de nucleósido, tal como ganciclovir o aciclovir, a una célula que expresa la timidina cinasa vírica, en donde la timidina cinasa vírica fosforila el análogo de nucleósido, creando un producto tóxico capaz de destruir la célula.
Las secuencias polinucleotídicas que codifican la timidina cinasa vírica de la presente invención se pueden preparar a partir de una amplia variedad de timidina cinasas víricas. En algunas realizaciones, el mutante de timidina cinasa vírica procede de la timidina cinasa deHerpesviridaeque incluye, por ejemplo, tanto el virus del herpes de primate como el virus del herpes de no primate, tal como el virus del herpes aviar. Ejemplos representativos de virus del herpes adecuados incluyen, por ejemplo, virus del herpes simple (VHS) de tipo 1, virus del herpes simple de tipo 2, virus varicela zóster, virus del herpes del tití, virus del herpes felino de tipo 1, virus de la pseudorrabia, virus del herpes equino de tipo 1, virus del herpes bovino de tipo 1, virus del herpes del pavo, virus de la enfermedad de Marek, virus del herpes saimir y virus de Epstein-Barr.
Los virus del herpes se pueden obtener fácilmente de fuentes comerciales tales como la American Type Culture Collection ("ATCC", Rockville, Md.). Los herpesvirus también pueden aislarse de fuentes naturales(por ejemplo,un animal infectado).
MEJORAS EN EL GENTK
La secuencia polinucleotídica codifica una secuencia de aminoácidos de HSV1-TK mutada como se define en las reivindicaciones.
Los procedimientos ilustrativos que pueden utilizarse en la preparación de una secuencia polinucleotídica optimizada proporcionada en el presente documento incluyen, pero sin limitación: optimización de codones; corrección de sitios de corte y empalme, eliminación de tramos de polipirimidina y exceso de contenido de GC; adición de una única secuencia Kozak, eliminación de secuencias Kozak no deseadas; inclusión de sitios de restricción para subclonación en vectores retrovíricos u otros; eliminación de secuencias de localización nuclear o adición de secuencias de exportación nuclear; adición de secuencias de mutación; adición de secuencias de codones de parada dobles; adición de marcadores, enlazadores y secuencias de fusión; preparación de un archivo de secuencias para enviarlo a una empresa de síntesis de genes; subclonación de genes sintetizados en vectores retrovíricos; inclusión de genes de proteínas fluorescentes en vectores retrovíricos; inclusión de genes marcadores seleccionables en vectores retrovíricos; preparación de ADN plasmídico Maxiprep; transfección de células productoras de retrovirus u otras células; producción de retrovirus a escala de laboratorio, experimental o GMP; transducción de células diana con retrovirus; ensayo de destrucción celular mediado por GCV o profármaco análogo; ensayo de selección de hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT); procedimiento de selección de fármaco marcador seleccionable para producir estirpes celulares transducidas retrovíricas; microscopía fluorescente y fotografía para detectar y documentar células diana transducidas con retrovirus; detección fluorescente cuantitativa de células diana transducidas retrovíricas; ensayo Western de expresión de proteínas; otros procedimientos y ensayos necesarios para el análisis de HSV-TK; o una combinación de los mismos. Los protocolos para dichos métodos se describen en el presente documento, están disponibles comercialmente o se describen en la bibliografía y bases de datos públicas.
En el presente documento se describe un método para obtener una secuencia HSV-TK mejorada. El método puede comprender: a) corrección y/o eliminación de sitios de corte y empalme; y/o b) ajuste a una única secuencia Kozak. Opcionalmente, el método comprende además la inclusión de sitios de restricción para la subclonación de la secuencia HSV-TK. Opcionalmente, o además, el método comprende además la eliminación de secuencias de localización nuclear.
En el presente documento se proporciona una secuencia polinucleotídica que codifica una forma mutada de timidina cinasa del virus simple humano 1 (HSV1-TK), en donde la HSV1-TK codificada está mutada en los restos de aminoácidos 32 y 33 y, opcionalmente, en los restos de aminoácidos 25, 26, 167, 168 o una combinación de los mismos, en donde la secuencia polinucleotídica está mutada en comparación con una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 1 o 3. En dichas secuencias, se pueden realizar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 mutaciones.
En el presente documento se proporciona una secuencia polinucleotídica que codifica una forma mutada de timidina cinasa del virus simple humano 1 (HSV1-TK), en donde la HSV1-TK codificada está mutada en los restos de aminoácidos 32 y 33 y, opcionalmente, en el resto de aminoácido 25, 26, 167, 168 o una combinación de los mismos, en donde la secuencia polinucleotídica está mutada en comparación con una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 1. En dichas secuencias, se pueden realizar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 mutaciones.
En el presente documento se proporciona una secuencia polinucleotídica que codifica una forma mutada de timidina cinasa del virus simple humano 1 (HSV1-TK), en donde la HSV1-TK codificada está mutada en los restos de aminoácidos 32 y 33 y, opcionalmente, en el resto de aminoácido 25, 26, 167, 168 o una combinación de los mismos, en donde la secuencia polinucleotídica está mutada en comparación con una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 3. En dichas secuencias, se pueden realizar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 mutaciones.
Las modificaciones pueden ser mutaciones conservadoras o no conservadoras. Se puede realizar una mutación de manera que el aminoácido codificado se modifique a un aminoácido polar, no polar, básico o ácido.
En el presente documento se proporciona una secuencia polinucleotídica que codifica una forma mutada de timidina cinasa vírica del virus simple humano (HSV-TK), en donde la HSV-TK codificada incluye una secuencia de exportación nuclear. En el presente documento se proporciona una secuencia polinucleotídica que codifica una forma mutada de timidina cinasa del virus simple humano (HSV-TK), donde la HSV-TK codificada tiene una función mejorada en comparación con la HSV-TK de tipo silvestre y comprende A168H dmNES (potenciador del sistemaCL-CMV fusionado correctamente a regiones promotoras deLTR), donde NES se refiere a una secuencia de exportación nuclear. En una realización, un HSV - TKA168HdmNES mutante es un genHSV-TKmutante para su inclusión en Reximmune-C2. En una realización, la NES procede de MAP cinasa cinasa (MAPKK). En otra realización más, la secuencia polinucleotídica para NES es CTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGC (SEQ ID NO: 23). En otras realizaciones, la secuencia polipeptídica NES es LQKKLEELELDG (SEQ ID NO: 24).
En el presente documento se divulgan mutaciones en una secuencia polinucleotídica que codifica la timidina cinasa del virus simple humano (HSV-TK), en donde no se realizan mutaciones en la secuencia polipeptídica de HSV-TK de tipo silvestre.
Las posiciones de nucleótidos se denominan con referencia a una posición en la SEQ ID NO: 1 (secuencia de nucleótidos HSV1-TK de tipo silvestre (ts)) o en la SEQ ID NO: 3 (HSV-TK en Reximmune-C HSV-TK; Mutante SR39 y mutación R25G-R26S de la señal de localización nuclear (NLS) de HSV-TK).
En una realización, se proporcionan sitios de restricción Sac I-Kpn I que unen los oligonucleótidos bicatenarios clonables de la región mutante HSV-TK SR39. Véanse, por ejemplo, las SEQ ID NO: 6 y 7, donde los sitios Sac I y Kpn I se muestran a la izquierda y a la derecha, respectivamente. El subrayado en negrita ilustra los sitios donde se pueden realizar mutaciones. Las SEQ ID NO: 8 y 9 ilustran una secuencia ilustrativa después de cortar con Sac I y Kpn I. Los cebadores directos e inversos ilustrativos que pueden utilizarse para realizar las mutaciones se muestran como las SEQ ID NO: 10 y 11.
Se proporcionan secuencias polinucleotídicas de HSV-TK optimizadas ilustrativas, por ejemplo, como las SEQ ID NO: 12 a 24.
Sin embargo, cuando se hacen dichas referencias, la invención no pretende limitarse a la secuencia exacta establecida en la SEQ ID NO: 1 o 3, sino que incluye variantes y derivados de las mismas. Por lo tanto, se contempla la identificación de ubicaciones de nucleótidos en otras secuencias de timidina cinasa (es decir, identificación de nucleótidos en posiciones que el experto consideraría que corresponden a las posiciones citadas en la SEQ ID NO: 1 o 3).
En algunas realizaciones, los nucleótidos se reemplazan tomando nota del código genético, de modo que un codón se cambia por un codón diferente que codifica el mismo resto de aminoácido. En algunas realizaciones, los nucleótidos se reemplazan dentro de las regiones codificantes de una secuencia de ácido nucleico que codifica HSV-TK, sin embargo, la secuencia de ácido nucleico mantiene la expresión de la proteína HSV-TK de tipo silvestre.
En algunas realizaciones, los codones se mutan de tal manera que la HSV-TK codificada presenta mayor actividad. En algunas realizaciones, el codón GCT se utiliza para representar alanina. En algunas realizaciones, el codón AGA se utiliza para representar la arginina. En algunas realizaciones, el codón AAT se utiliza para representar asparagina. En algunas realizaciones, el codón GAT se utiliza para representar ácido aspártico. En algunas realizaciones, el codón TGT se utiliza para representar cisteína. En algunas realizaciones, el codón CAG se utiliza para representar la glutamina. En algunas realizaciones, el codón GAA se utiliza para representar ácido glutámico. En algunas realizaciones, el codón GGA se utiliza para representar glicina. En algunas realizaciones, el codón CAT se utiliza para representar histidina. En algunas realizaciones, el codón ATT se utiliza para representar isoleucina. En algunas realizaciones, el codón CTG se utiliza para representar la leucina. En algunas realizaciones, el codón AAA se utiliza para representar lisina. En algunas realizaciones, el codón ATG se utiliza para representar metionina. En algunas realizaciones, el codón TTT se utiliza para representar fenilalanina. En algunas realizaciones, el codón CCT se utiliza para representar prolina. En algunas realizaciones, el codón TCT se utiliza para representar la serina. En algunas realizaciones, el codón ACA se utiliza para representar treonina. En algunas realizaciones, el codón TGG se utiliza para representar triptófano. En algunas realizaciones, el codón TAT se utiliza para representar tirosina. En algunas realizaciones, el codón GTG se utiliza para representar valina. En algunas realizaciones, el codón TGA se utiliza como codón de parada. En la siguiente tabla se proporcionan ejemplos de posiciones de codones para mutación.
Uso mejorado de codones para diseñar genes humanos, optimización de codones de primera elección que reduce el contenido de G/C
En dichas realizaciones, 5/21 codones contienen "C o G" en la tercera posición (24 %); 0/21 codones contienen "C" en la tercera posición (0 %); 5/21 codones contienen "G" en la tercera posición (24 %); y 16/21 codones contienen "A o T" en la tercera posición (76%).
En aún otras realizaciones, aproximadamente de 3 a 7 codones de 21 codones contienen "C o G" en la tercera posición; por encima de 0 a 3 codones de 21 codones contienen "C" en la tercera posición; aproximadamente de 3 a 7 codones de 21 codones contienen "G" en la tercera posición; y aproximadamente de 14 a 18 codones de 21 codones contienen "A o T" en la tercera posición.
En algunas realizaciones, el codón GCA se utiliza para representar alanina. En algunas realizaciones, el codón AGG se utiliza para representar la arginina. En algunas realizaciones, el codón AAC se utiliza para representar asparagina. En algunas realizaciones, el codón GAC se utiliza para representar ácido aspártico. En algunas realizaciones, el codón TGC se utiliza para representar cisteína. En algunas realizaciones, el codón CAA se utiliza para representar la glutamina. En algunas realizaciones, el codón GAG se utiliza para representar ácido glutámico. En algunas realizaciones, el codón GGC se utiliza para representar glicina. En algunas realizaciones, el codón CAC se utiliza para representar histidina. En algunas realizaciones, el codón ATC se utiliza para representar isoleucina. En algunas realizaciones, el codón CTC se utiliza para representar la leucina. En algunas realizaciones, el codón AAG se utiliza para representar lisina. En algunas realizaciones, el codón ATG se utiliza para representar metionina. En algunas realizaciones, el codón TTC se utiliza para representar fenilalanina. En algunas realizaciones, el codón CCA se utiliza para representar prolina. En algunas realizaciones, el codón AGC se utiliza para representar la serina. En algunas realizaciones, el codón ACT se utiliza para representar treonina. En algunas realizaciones, el codón TGG se utiliza para representar triptófano. En algunas realizaciones, el codón TAC se utiliza para representar tirosina. En algunas realizaciones, el codón GTC se utiliza para representar valina. En algunas realizaciones, TAA se utiliza como codón de parada.
Uso mejorado de codones para diseñar genes humanos, optimización de codones de segunda elección que reduce el contenido de G/C
En dichas realizaciones, 16/21 codones contienen "C o G" en la tercera posición (76 %); 11/21 codones contienen "C" en la tercera posición (52 %); 5/21 codones contienen "G" en la tercera posición (24 %); y 5/21 codones contienen "A o T" en la tercera posición (24 %).
En aún otras realizaciones, aproximadamente de 14 a 18 codones de 21 codones contienen "C o G" en la tercera posición; aproximadamente de 9 a 13 codones de 21 codones contienen "C" en la tercera posición; aproximadamente de 3 a 7 codones de 21 codones contienen "G" en la tercera posición; y aproximadamente de 3 a 7 codones de 21 codones contienen "A o T" en la tercera posición.
En algunas realizaciones, si es posible, se evitan los siguientes codones poco frecuentes, a menos que el cambio de la secuencia de codones poco frecuentes cree un nuevo aceptor de corte y empalme y/o sitios Kozak alternativos o añada un sitio de restricción no deseado u otra secuencia problemática, dentro de la región codificante de un polinucleótido que codifica HSV-TK mutante, o una variante de la misma: GCG para alanina; CGA o CGT para arginina; TTA o CTA para leucina; CCG para prolina; TCG para serina; ACG para treonina; y GTA para valina. Los codones poco frecuentes que se deben evitar si es posible son aquellos que tienen un codón/a.a./fracción por codón por a.a. menor o igual a 0,12.
Codón poco frecuente
En algunas realizaciones, la alteración de codones como se describe en el presente documento da como resultado aproximadamente un 2% , aproximadamente un 5%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 15%, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 % o más de aumento porcentual de la actividad.
Se descubrió que un porcentaje elevado de optimización de codones mejora la expresión de proteínas pero aumenta el contenido génico de GC. Se evaluó la optimización de codones y se determinó que tenía las siguientes características.
continuación
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Debido a los resultados insatisfactorios obtenidos con programas informáticos de optimización de codones totalmente automatizados, se realizó una optimización de codones personalizada para aumentar tanto la expresión de proteínas como los valores obtenidos. La etapa inicial incluye el uso de un programa optimizador de codones como primera selección para configurar cada codón para el marco de lectura correcto en el más preferido en la especie en cuestión, incluidos seres humanos, dando una optimización de codones "bruta". En general, cualquier sitio de restricción de clonación deseado se excluye del uso durante esta etapa del proceso.
Los resultados se refinan aún más mediante la edición de secuencias de ADN en un programa editor de ADN y la búsqueda de codones degenerados, tales como pirimidinas (por ejemplo, mediante la búsqueda de codones "Y"). A continuación, se realizan las siguientes operaciones, en este orden:
Búsqueda manual de la secuencia para ejecuciones de "Y", generalmente al menos cinco o más ejecuciones secuenciales "Y". Estas secuencias se resaltan en una secuencia determinada y el programa editor de ADN se utiliza para determinar una traducción que incluye la secuencia de ADN enumerada en el registro de la secuencia peptídica para garantizar que los cambios en los codones no afecten a la proteína traducida.
Se evalúa cada codón en una serie de 5 o más Y. Cuando está disponible, la base oscilante de cada codón se convierte en la base A-G más favorable para el aminoácido (generalmente una adenina) y se examina el resultado. Si el resultado del cambio crea una serie rica en purinas que termina en o cerca de a G en 3', los cambios se invierten manualmente. Si no hay una base A-T más favorable disponible para la base oscilante o esto provoca otro conflicto de secuencia, la base C-G más favorable se utiliza para la base oscilante.
Si el resultado es un codón poco frecuente (uso < 10%), ese codón se mueve al siguiente codón disponible en el marco.
Si otro cambio de codón puede eliminar el sitio aceptor putativo, se realizan cambios para volver a la secuencia original. Si no hay ningún cambio alternativo disponible, entonces se implementa la modificación original.
Una vez completado este proceso, la secuencia se examina de 5' a 3' para determinar marcos de lectura alternativos. En cada marco de lectura, se examinan las 5 bases en 3' del codón ATG para determinar su idoneidad como secuencias Kozak. Si el ATG da una metionina en el marco de lectura del gen deseado, las opciones se limitan a la escisión de la secuencia Kozak, primero mediante la conversión de la base oscilante de la base oscilante "-1" del ATG a una "T" (si está posible), después, la base oscilante "-4".
En casos raros, puede ser deseable convertir el segundo codón en el marco de lectura, si originalmente era una base "AGN" (Ser/Arg) en un codón que comienza en T (para serina) o C (para arginina). Sin embargo, esta situación generalmente no se encuentra cuando se aplica estrictamente el algoritmo anterior, ya que los codones "AGN" se evitan debido al par de secuencias "AG".
En los casos en que el marco de lectura alternativo difiera del mensaje, Y la secuencia Kozak que la rodea se ajusta al consenso "CCACCatgG", la base oscilante del codón en marco se altera para eliminar el codón de inicio. Esto generalmente sucede (pero no siempre) como resultado de la optimización de codones y/o del proceso de escisión del aceptor de corte y empalme.
En general, se realizan comprobaciones durante el proceso para garantizar que la secuencia peptídica no se modifique. En la etapa de control final, si hay demasiados codones "poco frecuentes" en uso (generalmente 2 o más), puede ser conveniente priorizar cuáles se utilizan, con preferencia a los cambios dados a las series de pirimidina más largas a partir de la secuencia optimizada de codones "brutas". Finalmente, se añaden los sitios de restricción necesarios y se realiza una última verificación para asegurar que el polipéptido no haya cambiado con respecto a la secuencia original antes de comenzar el proceso de optimización y que los sitios de restricción deseados sigan siendo únicos para aquellos que se añaden con fines de clonación.
Modificación del sitio de corte y empalme
En general, los intrones se separan del ARN para unirse a los exones. Un sitio donante de corte y empalme es un sitio en el ARN en el lado 5' del ARN que se elimina durante el proceso de corte y empalme y que contiene el sitio que se corta y se vuelve a unir a un restos de nucleótido dentro de un sitio aceptor de corte y empalme. Por lo tanto, un sitio donante de corte y empalme es la unión entre el final de un exón y el inicio del intrón. En general, un sitio donante de corte y empalme en el ARN es el dinucleótido GU (o un dinucleótido GT en la secuencia de ADN correspondiente).
Un sitio aceptor de corte y empalme es un sitio en el ARN en el lado 3' del ARN que se elimina durante el proceso de corte y empalme y que contiene el sitio que se corta y se vuelve a unir a un restos de nucleótido dentro de un sitio donante de corte y empalme. Por lo tanto, un sitio aceptor de corte y empalme es la unión entre el final de un intrón (que normalmente termina con el dinucleótido AG) y el inicio del exón cadena abajo.
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga una secuencia de ácido nucleico que codifica una timidina cinasa en donde al menos un nucleótido correspondiente a un sitio donante de corte y empalme se reemplaza por otro nucleótido. Véase, por ejemplo, la figura 1 (Chalmerset al.,Mol. Ther. 4:146-8 (2001)). En realizaciones adicionales, los nucleótidos de los sitios aceptores de corte y empalme no se alteran. En algunas realizaciones, al menos un nucleótido correspondiente a un sitio aceptor de corte y empalme se reemplaza por otro nucleótido.
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga una secuencia de ácido nucleico que codifica una timidina cinasa en donde al menos uno de los nucleótidos correspondiente a los nucleótidos del sitio donante de corte y empalme en las posiciones 329 y 330 de una secuencia polinucleotídica(por ejemplo,SEQ ID NO: 1 o 3) se reemplaza por otro nucleótido. En algunas realizaciones, ambos nucleótidos en las posiciones 327 y 555 se reemplazan por otros nucleótidos. Por ejemplo, la posición 327 puede mutarse a un resto de aminoácido seleccionado de: G a A. Como alternativa, o además, la posición 555 puede mutarse a un resto de aminoácido seleccionado de: G a A. En una realización, la HSV-TK modificada tiene una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 18 en la que HSV-TK se mejoró de las siguientes maneras:
HSV-TK NESdmNLS A168H, CO y SC
NES = secuencia de exportación nuclear de MAP cinasa cinasa (MAPKK)
dmNLS = secuencia de localización nuclear HSV-TK con doble mutación
CO = codón optimizado
SC = sitio donante/aceptor de corte y empalme corregido en 327 y 555,
Secuencia subrayada
SEQ ID NO: 18
gtcaGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGG
CAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGC
AGCACCGCaCTGCGgCCaGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCC TGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCT
GGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAG
ACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCG TGGTGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaCA CATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTTCGACCGgCACCCa ATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCtccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGG CCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCG
CCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATC
CGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACT
GGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCC aCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTAC AACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACT ACGACCAGtcaCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGT GACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCC AACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTgtca
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga una secuencia de ácido nucleico que codifica una timidina cinasa en donde al menos uno de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos del sitio aceptor de corte y empalme en las posiciones 554 y 555, o al menos uno de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos del sitio aceptor de corte y empalme en las posiciones 662 y 663, o al menos uno de los nucleótidos correspondientes a los sitios aceptores de corte y empalme en las posiciones 541 y 542 de la secuencia de tipo silvestre se reemplaza por otro nucleótido. Por ejemplo, la posición 541 puede mutarse a un resto de aminoácido seleccionado de: G a A. La posición 542 puede mutarse a un resto de aminoácido seleccionado de: G a A. La posición 554 puede mutarse a un resto de aminoácido seleccionado de: G a A. La posición 555 puede mutarse a un resto de aminoácido seleccionado de: G a A. La posición 662 puede mutarse a un resto de aminoácido seleccionado de: G a A. La posición 663 puede mutarse a un resto de aminoácido seleccionado de: G a A.
En algunas realizaciones, al menos uno de los nucleótidos de la secuencia codificante de HSV-TK de tipo silvestre se reemplaza como se describe en la tabla 1 a continuación.
TABLA 1
continuación
Una secuencia Kozak flanquea el codón de inicio AUG dentro del ARNm e influye en el reconocimiento del codón de inicio por los ribosomas eucariotas. En algunas realizaciones, una secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende no más de una secuencia Kozak. En algunas realizaciones, la secuencia Kozak está cadena arriba de la parte codificante de la secuencia de ADN. En algunas realizaciones, la secuencia Kozak de un polinucleótido que codifica HSV-TK se modifica para producir una secuencia Kozak con una mayor eficacia de inicio de traducción en una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la modificación de la secuencia Kozak no produce una sustitución de aminoácidos en el producto polipeptídico HSV-TK codificado. En algunas realizaciones, la modificación de la secuencia Kozak da como resultado al menos una sustitución de aminoácido en el producto polipeptídico HSV-TK codificado. En una realización, la HSV-TK modificada tiene una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, una secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende una modificación que inserta uno o más sitios de restricción. El sitio óptimo para la inserción de uno o más sitios de restricción se puede determinar empíricamente y/o mediante un programa informático para analizar la secuencia. En una realización no limitante, se inserta un primer sitio de restricción cadena arriba del sitio de inicio ATG y de Kozak y se inserta un segundo sitio de restricción en el extremo 3' de la secuencia. Véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 18, sección subrayada a continuación.
HSVTK NESdmNLS A168H, CO y SC
NES = secuencia de exportación nuclear de MAPKK
dmNLS = secuencia de localización nuclear con doble mutación
CO = codón optimizado
SC = corte y empalme corregido en 327 y 555, como se ha descrito anteriormente
Secuencia Kozak, como se ha descrito anteriormente
Sitios de restricción, subrayados y especificados como:
(GCGGCCGCACCGGTACGCGT = Not-I, Age-I y MLU-I)
(GGATCCCTCGAGAAGCTT = BamH-I, Xho-I y Hind-III)
SEQ ID NO: 18
g t c a GCGGCCGCACCGGrACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGG
CAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGC
AGCACCGCaCTGCGgCCaGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCC TGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCT
GGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAG
ACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCG TGGTGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaCA CATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTTCGACCGgCACCCa ATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCtccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGG CCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCG
CCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATC
CGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACT
GGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCC aCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTAC AACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtCCATGCACGTGTTCATCCTGGACT ACGACCAGtcaCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGT GACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCC AACTAATAGGGATCCCrCGAGAAGCTTg t c a
Otras modificaciones del sitio de corte y empalme se divulgan en los ejemplos siguientes y se consideran para su inclusión como una secuencia TK modificada que se puede utilizar en los métodos reivindicados.
En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más sustituciones de codones. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más sustituciones de codones, en donde las sustituciones de codones comprenden la sustitución de un codón que tiene una mayor frecuencia de uso en una célula de mamífero que el codón de tipo silvestre en esa posición. Sin embargo, en algunas realizaciones, se pueden elegir codones menos favorecidos para aminoácidos individuales dependiendo de la situación particular.
En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK que comprende al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más sustituciones de codones tiene menos de aproximadamente un 65 %, un 66 %, un 67 %, un 68 %, un 69 %, un 70 %, un 71 %, un 72 %, un 73 %, un 74 %, un 75 %, un 76 %, un 77 %, un 78 %, un 79 %, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o 3, en donde la identidad de secuencia se determina en toda la longitud de la secuencia codificante mediante un método de alineación global. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica codificada correspondiente tiene al menos un 75 %, un 76 %, un 77 %, un 78 %, un 79 %, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de HSV-TK, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 o 4.
En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más sustituciones de codones, en donde las sustituciones de codones comprenden la sustitución de un codón que tiene la mayor frecuencia de uso en una célula de mamífero por el codón de tipo silvestre en esa posición. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica codificada correspondiente tiene al menos un 75 %, un 76 %, un 77 %, un 78 %, un 79 %, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de HSV-TK, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 o 4.
En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende al menos 5, 10, 15, 20, 25,
30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más sustituciones de codones, en donde los codones sustituidos tienen una frecuencia de uso mayor o igual o igual a aproximadamente 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15,
0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,21,0,22, 0,23, 0,24, 0,25, 0,26, 0,27, 0,28, 0,29, 0,3, 0,31,0,32, 0,33, 0,34, 0,35 o superior.
En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica codificada correspondiente tiene al menos un 75 %, un 76 %, un
77 %, un 78 %, un 79 %, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un
89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de HSV-TK, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 o 4.
En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende menos de aproximadamente
45, 40, 35, 30, 25, 20 o menos codones, en donde los codones tienen una frecuencia de uso menor que aproximadamente 0,1, 0,11,0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24 o 0,25. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica codificada correspondiente tiene al menos un 75 %, un 76 %, un 77 %, un
78 %, un 79 %, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un
90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de HSV-TK, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 o 4.
En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende al menos un 78 %, un 79 %, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un
92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 % o más de codones que tienen una frecuencia de uso mayor o igual a aproximadamente 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24, 0,25, 0,26, 0,27,
0,28, 0,29, 0,3, 0,31, 0,32, 0,33, 0,34, 0,35 o superior. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica codificada correspondiente tiene al menos un 75 %, un 76 %, un 77 %, un 78 %, un 79 %, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de HSV-TK, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 o 4.
En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende al menos un 35 %, un 36 %, un 37 %, un 38 %, un 39 %, un 40 %, un 41 %, un 42 %, un 43 %, un 44 %, un 45 %, un 46 %, un 47 %, un 48 %, un
49 %, un 50 %, un 51 %, un 52 %, un 53 %, un 54 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un
85 % o más de codones que tienen la mayor frecuencia de uso en una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica codificada correspondiente tiene al menos un 75 %, un 76 %, un 77 %, un 78 %, un 79 %, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de HSV-TK, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 o 4.
En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende menos de aproximadamente un 21 %, un 20 %, un 19 %, un 18 %, un 17 %, un 16 %, un 15 %, un 14 %, un 13 %, un 12 %, un 11 %, un 10 % o menos de codones que tienen una frecuencia de uso inferior a aproximadamente 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15,
0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24 o 0,25. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica comprende menos de aproximadamente un 21 %, un 20 %, un 19 %, un 18 %, un 17 %, un 16 %, un 15 %, un 14 %, un 13%, un 12%, un 11%, un 10% o menos de codones que tienen una frecuencia de uso inferior a aproximadamente 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,2, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24 o 0,25 en una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica codificada correspondiente tiene al menos un 75 %, un 76 %, un 77 %, un 78 %, un 79 %, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de HSV-TK, por ejemplo, la SEQ ID
NO: 2 o 4.
En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende sustituciones de codones, en donde al menos un 35 %, un 36 %, un 37 %, un 38 %, un 39 %, un 40 %, un 41 %, un 42 %, un 43 %, un 44 %, un
45 %, un 46 %, un 47 %, un 48 %, un 49 %, un 50 %, un 51 %, un 52 %, un 53 %, un 54 %, un 55 %, un 60 %, un
65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o más de los codones se han cambiado en comparación con la secuencia de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende sustituciones de codones, en donde al menos un 30 %, un 31 %, un 32 %, un 33 %, un 34 %, un 35 %, un
36 %, un 37 %, un 38 %, un 39 %, un 40 %, un 41 %, un 42 %, un 43 %, un 44 %, un 45 %, un 46 %, un 47 %, un
48 %, un 49 %, un 50 %, un 51 %, un 52 %, un 53 %, un 54 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un
80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o más de los codones se han cambiado a un codón que tiene una mayor frecuencia de uso en una célula de mamífero en comparación con la secuencia de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica codificada correspondiente tiene al menos un 75 %, un 76 %, un 77 %, un 78 %, un 79 %, un
80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 % 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de HSV-TK, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 o 4.
En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende sustituciones de codones, en
donde al menos un 19 %, un 20 %, un 21 %, un 22 %, un 23 %, un 24 %, un 25 %, un 26 %, un 27 %, un 28 %, un 29 %, un 30 %, un 31 %, un 32 %, un 33 %, un 34 %, un 35 %, un 36 %, un 37 %, un 38 %, un 39 %, un 40 %, un 41 %, un 42 %, un 43 %, un 44 %, un 45 %, un 46 %, un 47 %, un 48 %, un 49 %, un 50 %, un 51 %, un 52 %, un 53 %, un 54 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o más de los codones se han cambiado a un codón que tiene la mayor frecuencia de uso en una célula de mamífero en comparación con la secuencia de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica codificada correspondiente tiene al menos un 75 %, un 76 %, un 77 %, un 78 %, un 79 %, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de HSV-TK, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 o 4.
Mutaciones no conservadas
El gen de la timidina cinasa vírica del herpesvirus seleccionado puede aislarse y mutarse fácilmente como se describe a continuación para construir moléculas de ácido nucleico que codifican una enzima timidina cinasa que comprende una o más mutaciones que aumentan la actividad biológica de la timidina cinasa, en comparación con la timidina cinasa de tipo silvestre no mutada. La actividad biológica de una timidina cinasa se puede determinar fácilmente utilizando cualquiera de los ensayos conocidos en la materia, incluida, por ejemplo, la determinación de la tasa de absorción de análogos de nucleósidos o la determinación de la tasa de fosforilación de nucleósidos o análogos de nucleósidos. De manera adicional, pueden seleccionarse fácilmente mutantes de timidina cinasa que se caractericen por otras propiedades biológicas, tales como la termoestabilidad y la estabilidad de las proteínas.
En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK se modifica para eliminar o modificar una secuencia señal prevista. En algunas realizaciones, el polinucleótido se modifica para eliminar o modificar una secuencia de localización nuclear (NLS). En algunas realizaciones, el polinucleótido se modifica para eliminar la secuencia de localización nuclear. En algunas realizaciones, el polinucleótido se modifica para modificar el NLS de modo que ya no funcione para localizar HSV-TK exclusivamente en el núcleo.
En algunas realizaciones, una secuencia polipeptídica HSV-TK está mutada en los restos de aminoácidos 167, 168 o ambos. En un ejemplo, la secuencia está mutada en el resto de aminoácido 167. En otro ejemplo, la secuencia está mutada en el resto de aminoácido 168. En otro ejemplo, la secuencia está mutada en los restos de aminoácidos 167 y 168. El resto de aminoácido 167 puede mutarse a serina o fenilalanina. El resto de aminoácido 168 puede mutarse a histidina, lisina, cisteína, serina o fenilalanina. En algunas realizaciones, se muta una secuencia polipeptídica HSV-TK en los restos de aminoácidos 25 y/o 26. Los restos de aminoácidos 25 y/o 26 pueden mutarse a un aminoácido elegido del grupo que consiste en: glicina, serina y ácido glutámico. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica HSV-TK está mutada en los restos de aminoácidos 32 y/o 33. Los restos de aminoácidos 32 y/o 33 se mutan a un aminoácido elegido del grupo que consiste en glicina, serina y ácido glutámico. En algunas realizaciones, el polipéptido HSV-TK está mutado en los restos de aminoácidos 32 y 33, y, opcionalmente, en los aminoácidos 25 y/o 26. Los restos de aminoácidos 25, 26, 32 y/o 33, puede mutarse a un aminoácido elegido del grupo que consiste en glicina, serina y ácido glutámico. Se pueden realizar modificaciones de restos de aminoácidos en comparación con una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 2 o 4.
De acuerdo con la presente invención, se proporcionan enzimas timidina cinasa mutantes que están codificadas por las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, así como vectores que son capaces de expresar dichas moléculas. En algunas realizaciones, se proporcionan vectores de expresión que comprenden un promotor unido operativamente a una molécula de ácido nucleico de la presente invención. En algunas realizaciones, el vector es un vector vírico capaz de dirigir la expresión de una molécula de ácido nucleico. Ejemplos representativos de dichos vectores víricos incluyen vectores víricos del herpes simple, vectores adenovíricos, vectores víricos asociados a adenovirus, vectores de viruela, vectores parvovíricos, vectores de baculovirus y vectores retrovíricos. En algunas realizaciones, se proporcionan vectores víricos que son capaces de dirigir la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima timidina cinasa que comprende una o más mutaciones, al menos una de las mutaciones que codifica una sustitución de aminoácidos que aumenta la actividad biológica de la timidina cinasa, en comparación con la timidina cinasa no mutada (es decir, de tipo silvestre).
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico proporcionada en el presente documento codifica una enzima timidina cinasa capaz de fosforilar un análogo de nucleósido a un nivel al menos un 10 % mayor que el nivel de fosforilación del análogo de nucleósido mediante una enzima timidina cinasa de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la enzima timidina cinasa es capaz de fosforilar un análogo de nucleósido a un nivel de al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 50 %, al menos un 75 %, al menos un 100 %, al menos un 150 %, al menos un 200 %, al menos un 300 % o al menos un 500 % mayor que el nivel de fosforilación del análogo de nucleósido por una enzima timidina cinasa de tipo silvestre. Ejemplos representativos de análogos de nucleósidos adecuados incluyen ganciclovir, aciclovir, famciclovir, buciclovir, penciclovir, valciclovir, trifluorotimidina, 1-[2-desoxi, 2-fluoro, p-D-arabinofuranosil]-5-yodouracilo, ara-A, araT 1-p-D-arabinofuranoxil timina, 5-etil-2'-desoxiuridina, 5-yodo-5'-amino-2,5'-didesoxiuridina, idoxuridina, AZT, AIU, didesoxicitidina y AraC. En algunas realizaciones, el mutante TK mejorado carece de actividad timidina cinasa.
En algunas realizaciones, el valor de Km de la actividad timidina cinasa de un mutante HSV-TK divulgado es al menos 2,5 |jm. En algunas realizaciones, el valor de Km de la actividad timidina cinasa de un mutante HSV-TK divulgado es al menos 5 jm , al menos 10 jm , al menos 15 jm , al menos 20 jm , al menos 25 jm , al menos 30 jm , al menos 40 jm , al menos 50 jm , al menos 60 jm , al menos 70 jm , al menos 80 jm , al menos 90 jm , al menos 100 jm , al menos 150 jm , al menos 200 jm , al menos 250 jm , al menos 300 jm , al menos 400 jm , al menos 500 jm , al menos 600 jm , al menos 700 jm , al menos 800 jm , al menos 900 jm o al menos 1000 jm . En algunas realizaciones, el porcentaje de Km de un mutante HSV-TK divulgado en comparación con HSV-TK de tipo silvestre es al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 50 %, al menos un 75 %, al menos un 100 %, al menos un 150 %, al menos un 200 %, al menos un 300 % o al menos un 500 %.
En una realización de la presente invención, se proporcionan derivados truncados de mutantes HSV-TK. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio puede realizarse fácilmente para eliminar los 45 aminoácidos aminoterminales de un mutante de timidina cinasa, construyendo así una forma truncada del mutante que conserva su actividad biológica.
Las mutaciones en secuencias de nucleótidos construidas para la expresión de derivados de mutantes de timidina cinasa deben conservar la fase del marco de lectura de las secuencias codificantes. Asimismo, es preferible que las mutaciones no creen regiones complementarias que puedan hibridarse para producir estructuras secundarias de ARNm, tales como bucles u horquillas, lo que afectaría negativamente a la traducción del ARNm del receptor. Dichos derivados pueden construirse fácilmente utilizando una amplia variedad de técnicas, incluidas las comentadas anteriormente.
MUTANTES DE TIMIDINA CINASA MODIFICADOS
Mediante los métodos descritos en el presente documento, los inventores determinaron que la mayoría de los candidatos para genesHSV-TKoptimizados parecían ser compatibles con un sistema de expresión retrovírica y producir valores retrovíricos biológicamente útiles.
Asimismo, los genesHSV-TKoptimizados que incorporaron la mayoría de estas optimizaciones (SEQ ID NO: 18) presentaron actividad enzimática GCV profármaco y selectividad por su capacidad para destruir células cancerosas después de la administración de transducción retrovírica. El genHSV-TKmutante A168H, que fue optimizado con codones y corregido por corte y empalme parecía tener la mayor actividad de destrucción del cáncer mediada por GCV (SEQ ID NO: 12, 16, 18 o 22). La misma versión de este genA168Hde HSV-TK y mutado en los aminoácidos 159-161 de LIF a IFL presentó actividad de destrucción de células cancerosas mediada por GCV.
El genHSV-TKmutante A167F (SEQ ID NO: 13, 17 o 19), que fue optimizado con codones y corregido por corte y empalme, tenía una actividad de destrucción del cáncer mediada por GCV muy elevada después de la administración de transducción retrovírica, pero lo más sorprendente es que NO tenía actividad timidina cinasa según se determina mediante la expresión de este gen después de la administración por transducción retrovírica en células 3T3 TK(-) seleccionadas con medio HAT. Según el conocimiento de los presentes inventores, este es el producto genético sintético HSV-TK más selectivo para GCV para la activación de GCV que no tiene actividad de timidina (ensayo HAT) jamás evaluado biológicamente.
El genHSV-TKdoble mutante A167F A168H (SEQ ID NO: 14) elimina inesperadamente la actividad enzimática de timidina y de GCV mediante la presentación de muy poca actividad de destrucción del cáncer mediada por GCV y muy poca actividad de timidina (ensayo HAT).
Los presentes inventores identificaron que es posible producir fusiones funcionales HSV-TK de genes tales como citosina desaminasa bacteriana, citosina desaminasa de levadura, neomicina fosfotransferasa, e incluyen secuencias enlazadoras y conservan la actividad de destrucción de células cancerosas mediada por HSV-TK GCV.
En una realización, se puede crear un genHSV-TKcon codón optimizado con actividad de destrucción del cáncer mediada por GCV que conserve una o más secuencias de localización nuclear que no estén fusionadas con uno o más genes terapéuticos diferentes.
Modificaciones adicionales y/o evaluaciones de un genHSV-TKoptimizado descrito en el presente documento pueden incluir uno o más de las siguientes: eliminación de secuencias de localización nuclear conocidas dentro de HSV-TK; aumento de la actividad y selectividad de la enzima GCV del profármaco por su capacidad para destruir células cancerosas, evaluar el uso de más marcadores, proteínas de fusión y enlazadores de HSV-TK a otros genes y proteínas, coexpresión de genes optimizados para HSV-TK con otros genes suicidas y de destrucción del cáncer optimizados en células cancerosas, incluir genesHSV-TKoptimizados en un sistema de vector retrovírico de tipo Reximmune-C; producción y prueba de un producto GMP de tipo Reximmune-C, o cualquier combinación de los mismos.
SECUENCIAS POLINUCLEOTÍDICAS ILUSTRATIVAS
La secuencia polinucleotídica descrita en el presente documento comprende una señal de exportación nuclear. Por ejemplo, una secuencia polinucleotídica puede comprender TK168dmNES.
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende una o más modificaciones del sitio de corte y empalme.
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende HSV-TK A167Fsm (SEQ ID NO: 13).
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende HSV-TK A168Hsm (SEQ ID NO: 12).
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende HSV-TK A167Fdm (SEQ ID NO: 17).
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende HSV-TK A168dm (SEQ ID NO: 16).
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende HSV-TK A167Fdm y una NES (SEQ ID NO: 19).
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende HSV-TK A168Hdm y una NES (SEQ ID No : 18). En dicha realización, la secuencia comprende HSV-TK A168H
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende una HSV-TK, en donde dicho vector comprende un dominio de unión a sustrato mejorado y un conjunto de mNLS/NES.
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende una forma mutada de HSV1-TK como se define en las reivindicaciones, en donde el vector comprende un marcador seleccionable, un gen brillante, fluorescente o bioluminiscente y/o uno o más genes de destrucción.
En otra realización, un vector retrovírico para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende al menos dos modificaciones.
CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES DE TIMIDINA CINASA
Los mutantes de timidina cinasa de la presente invención se pueden construir mediante una amplia variedad de técnicas. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones en loci particulares mediante la síntesis de oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la unión a fragmentos de la secuencia nativa. Tras la unión, la secuencia reconstruida resultante codifica un derivado que tiene la inserción, sustitución o eliminación de aminoácidos deseada.
Como alternativa, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis específica de sitio (o específica de segmento) dirigida por oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado que tiene codones particulares alterados de acuerdo con la sustitución, eliminación o inserción requerida. También se pueden construir derivados de eliminación o truncamiento de mutantes de timidina cinasa mediante el uso de sitios de endonucleasa de restricción convenientes adyacentes a la eliminación deseada. Después de la restricción, se pueden rellenar los salientes y volver a ligar el ADN. Se divulgan métodos ilustrativos para realizar las modificaciones expuestas anteriormente en Sambrooket al.(Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2.a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Otros derivados de los mutantes de timidina cinasa divulgados en el presente documento incluyen conjugados de mutantes de timidina cinasa junto con otras proteínas o polipéptidos. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la síntesis de proteínas de fusión aminoterminales o carboxiterminales que pueden añadirse para facilitar la purificación o identificación de mutantes de timidina cinasa (véase la patente de EE. UU. n.° 4.851.341, véase también, Hoppet al.,Bio/Technology 6:1204, 1988.).
MEJORA DE LA DESTRUCCIÓN MEDIADA POR HSV
En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica que codifica HSV-TK comprende además una secuencia que codifica un agente o polipéptido terapéutico secundario. En algunas realizaciones, el agente o polipéptido terapéutico secundario es un agente o polipéptido de diagnóstico o terapéutico.
En algunas realizaciones, el agente o polipéptido terapéutico secundario es una "proteína suicida" adicional que provoca la muerte celular por sí sola o en presencia de otros compuestos. En algunas realizaciones, el segundo gen suicida se elige del grupo que incluye: penicilina-V-amidasa, penicilina-G-amidasa, p-lactamasa, carboxipeptidasa A, linamarasa (también conocida como p-glucosidasa), el gengptdeE. coliy el genDeodeE. coli,una citosina desaminasa, una VSV-tk, IL-2, nitrorreductasa (NR), carboxilesterasa, p-glucuronidasa, citocromo p450, pgalactosidasa, cadena A de la toxina diftérica (DT-A), carboxipéptido G2 (CPG2), purina nucleósido fosforilasa (PNP) y desoxicitidina cinasa (dCK).
En algunas realizaciones, la segunda proteína suicida convierte un profármaco en un compuesto tóxico. Como se utiliza en el presente documento, "profármaco" significa cualquier compuesto útil en los métodos divulgados en el presente documento que pueda convertirse en un producto tóxico, es decir, tóxico para las células tumorales. La proteína suicida convierte el profármaco en un producto tóxico. Ejemplos representativos de dichos profármacos incluyen: FHBG (9-[4-fluoro-3-(hidroximetil)butil]guanina), FHPG (9-([3-fluoro-1-hidroxi-2-propoxi]metil)guanina), FGCV (fluoroganciclovir), FPCV (fluoropenciclovir), FIAU (1-(2'-desoxi-2'-fluoro-1-p-D-arabinofuranosil)-5-yodouracilo), FEAU (fluoro-5-etil-1-p-D-arabinofuranosiluracilo), FMAU (fluoro-5-metiM-p-D-arabinofuranosiluracilo), FHOMP (6-((-fluoro-3-hidroxipropan-2-iloxi)metil)-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona), ganciclovir, valganciclovir, aciclovir, valaciclovir, penciclovir, pirimidina radiomarcada con cadena lateral 4-hidroxi-3-(hidroximetil)butilo en N-1 (HHG-5-FEP) o derivados de pirimidina sustituidos con 5-(2-)hidroxietil) y 5-(3-hidroxipropil) que llevan 2,3-dihidroxipropilo, cadenas laterales similares a aciclovir, ganciclovir y penciclovir para timidina cinasa; ifosfamida para oxidorreductasa; arabinósido de 6-metoxipurina para VZV-TK; 5-fluorocitosina para citosina desaminasa; doxorrubicina para p-glucuronidasa; CB1954 y nitrofurazona para nitroreductasa; y N-(cianoacetil)-L-fenilalanina o N-(3-cloropropionil)-L-fenilalanina para carboxipeptidasa A.
En algunas realizaciones, el agente o polipéptido terapéutico secundario se elige del grupo que incluye, pero sin limitación, agentes de control del ciclo celular, agentes que inhiben las proteínas ciclina, tales como polinucleótidos antisentido para los genes de ciclina A y/o D, factores de crecimiento, tales como, por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), eritropoyetina, G-CSF, GM-CSF, TGF-a, TGF-p y factor de crecimiento de fibroblastos, citocinas, que incluyen, pero sin limitación, interleucinas 1 a 13 y factores de necrosis tumoral, anticoagulantes, agentes antiplaquetarios, agentes antiinflamatorios, factores antiangiogénicos, proteínas supresoras de tumores, factores de coagulación, incluidos el factor VII, factor VIII o factor IX, proteína S, proteína C, antitrombina III, factor de von Willebrand, regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) y marcadores selectivos negativos.
En algunas realizaciones, un agente o polipéptido terapéutico secundario es un supresor del cáncer, por ejemplo, p53 o Rb, o un ácido nucleico que codifica dicha proteína o polipéptido.
Otros ejemplos de agentes o polipéptidos terapéuticos secundarios incluyen proteínas y polipéptidos terapéuticos proapoptóticos, por ejemplo, p15, p16 o p21/WAF-1.
En algunas realizaciones, un agente o polipéptido terapéutico secundario es una citocina. Ejemplos de citocinas incluyen: GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos); TNF-a (factor de necrosis tumorala); interferones que incluyen, pero sin limitación, IFN-a e IFN-<y>; e interleucinas, incluidas, pero sin limitación, interleucina-1 (IL1), interleucina-p (IL-p), interleucina-2 (IL2), interleucina-4 (IL4), interleucina-5 (IL5), interleucina-6 (IL6), interleucina-8 (IL8), interleucina-10 (IL10), interleucina-12 (IL12), interleucina-13 (IL13), interleucina-14 (IL14), interleucina-15 (ILl5), interleucina-16 (IL16), interleucina-18 (ILl8), interleucina-23 (IL23), interleucina-24 (IL24), aunque se conocen otras realizaciones en la materia.
En algunas realizaciones, el agente o polipéptido terapéutico secundario es proapoptótico. Ejemplos de proteínas o polipéptidos proapoptóticos incluyen, pero sin limitación: Bax, Bad, Bik, Bak, Bim, citocromo C, factor inductor de apoptosis (AIF), Puma, cinasa regulada por CT 10 (CRK), Bok, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, proteína 4 de respuesta a la apoptosis de la próstata (Par-4), Smac, cinasa C5, Fas, proteína inhibidora del dominio PAS (IPAS) y Hrk.
En algunas realizaciones, el agente o polipéptido terapéutico secundario está implicado en la comunicación de célula a célula. En algunas realizaciones, el agente o polipéptido terapéutico secundario está implicado en las uniones comunicantes de las células. En algunas realizaciones, el agente o polipéptido terapéutico secundario es una conexina. En algunas realizaciones, la proteína o polipéptido terapéutico es una conexina elegida del grupo de conexina 43, conexina 32 y conexina 26.
En algunas realizaciones, el agente o polipéptido terapéutico secundario está codificado por el gen del receptor humano PiT-2 (SLC20A2). El producto del gen de la envoltura anfotrópica incluido en el vector retrovírico Reximmune-C1 y 2 se une al receptor PiT-2 antes de la infección de la célula diana. En algunas realizaciones, el agente o polipéptido terapéutico secundario está codificado por el gen del receptor humano PiT-1 (SLC20A1). El producto del gen de la envoltura del virus de la leucemia del mono gibón (GALV) se une al receptor PiT-1 antes de la infección de la célula diana.
En algunas realizaciones, el agente o polipéptido terapéutico secundario es un truncamiento aminoterminal de una proteína retrovírica, en donde el truncamiento aminoterminal comprende un dominio de unión al receptor funcional de la proteína de la envoltura.
AUMENTO DE LA COMUNICACIÓN INTRACELULAR PARA MEJORAR EL TRATAMIENTO
Aumento del efecto de vecindad
En el presente documento se divulga, en algunas realizaciones, un método para aumentar el efecto de vecindad del sustrato del profármaco HSV-TK. Como se utiliza en el presente documento, el "efecto de vecindad" se refiere al fenómeno mediante el cual una HSV-TK positiva ejerce un efecto de destrucción sobre las células vecinas HSV-TK negativas después de la inducción de la expresión de HSV-TK en las células HSV-TK positivas.
En algunas realizaciones, es un método para aumentar el efecto de vecindad mediado por el profármaco HSV-TK, por ejemplo después del tratamiento con GCV, junto con el aumento de la comunicación intracelular de unión comunicante. En algunas realizaciones, el efecto de vecindad mediado por el profármaco HSV-TK aumenta la tasa de destrucción en un 10 %, en un 20 %, en un 30 %, en un 40 %, en un 50 %, en un 60 %, en un 70 %, en un 80 %, en un 90 % o en un 100 % o más.
Las uniones comunicantes son regiones de la membrana celular con grupos de canales de unión comunicante que conectan directamente el citoplasma de una célula con el citoplasma de otra célula. Un canal de unión comunicante se compone de dos hemicanales (conexones) proporcionados por cada una de las dos células vecinas. Un conexón se compone con mayor frecuencia de seis proteínas conexinas, que son una gran familia de proteínas que tienen una estructura básica que comprende cuatro dominios transmembrana, dos bucles extracelulares y un bucle citoplasmático.
Las uniones comunicantes desempeñan diversas funciones fisiológicas, tales como el control del crecimiento y la homeostasis (es decir, el equilibrio rápido de iones, nutrientes y fluidos entre las células). De manera adicional, las uniones comunicantes sirven como sinapsis eléctricas en células que son capaces de propagar señales eléctricas, tales como los miocitos cardíacos, células del músculo liso y neuronas.
Una vez fosforilados, GCV puede viajar a través de GJ hacia células contiguas que comparten las uniones. GCV-P se fosforilará aún más en esas células y desencadenará la muerte celular como en la célula que expresa HSK-TK. La extensión del efecto de vecindad depende de la existencia de uniones comunicantes y, por lo tanto, diferirá entre los tipos de células.Perovéase, Dahleet al."Gap junctional intercellular communication is not a major mediator in the bystander effect in photodynamic treatment of MDCKII cells". Radiation Res. 154: 331-341 (Septiembre de 2000).
La enzima TK vírica es sensible al profármaco ganciclovir (GCV), que se asemeja a la base del ADN guanina.
Cuando se añade GCV al medio celular, la TK vírica (pero no la TK no vírica del hospedador) fosforila el GCV, convirtiéndolo en un fármaco que, ahora fosforilado, competirá con dGTP por su incorporación al ADN debido a su similitud con la guanina.
La incorporación provocará la terminación de la síntesis de la cadena de ADN. La transferencia de GCV-monoP a células no cancerosas no será tóxica para ellas a menos que se estén dividiendo activamente. Las células normales en riesgo son sólo aquellas que están en estrecho contacto con las células que expresan TK vírica cuando se tratan con niveles elevados de fármaco GCV.
En el presente documento se divulga, en algunas realizaciones, una partícula vectorial que codifica HSV-TK de a cuerdo con las reivindicaciones junto con la comunicación intracelular por unión comunicante (GJIC): tratamiento de aumento para su uso en un método para aumentar la destrucción de células diana mediada por timidina-cinasa vírica en un sujeto, comprendiendo el método la administración. En algunas realizaciones, las células diana son células neoplásicas. En algunas realizaciones, el tratamiento de aumento de GJIC comprende administrar a las células una secuencia polinucleotídica que codifica al menos una subunidad de unión comunicante. En algunas realizaciones, la al menos una subunidad de unión comunicante es una conexina de tipo silvestre o mutante. En algunas realizaciones, la subunidad de unión comunicante se elige del grupo que consiste en conexina 43, conexina 30 y conexina 26 de tipo silvestre o mutante. En otras realizaciones, la subunidad de unión comunicante es la conexina 30,3, connexina 31, connexina 31,1, connexina 32, connexina 33, connexina 37, connexina 40, connexina 45, conexina 46 y conexina 50. En algunas realizaciones, la subunidad de unión comunicante se modifica para evitar modificaciones postraduccionales. En algunas realizaciones, el tratamiento de aumento de GJIC comprende administrar a las células una secuencia polinucleotídica que codifica E-cadherina.
En algunas realizaciones, un tratamiento de aumento de GJIC comprende la administración de un compuesto a un sujeto. En algunas realizaciones, el tratamiento de aumento de GJIC comprende administrar al sujeto un compuesto del grupo que comprende: gemcitabina; cAMP; un ácido retinoico; un carotenoide; un glucocorticoide, un flavonoide, apigenina y/o lovastatina.
En algunas realizaciones, el tratamiento de aumento de GJIC comprende la inhibición del proteasoma. En algunas realizaciones, el tratamiento de aumento de GJIC comprende la inhibición del proteasoma mediante la administración de N-acetil-Leu-Leu-Nle-CHO (ALLN) y/o cloroquina.
En algunas realizaciones, el tratamiento de aumento de GJIC comprende tratamiento de radiación.
En algunas realizaciones, el tratamiento de aumento de GJIC comprende tratamiento eléctrico.
Métodos de detección
En el presente documento se divulga, en algunas realizaciones, un método para medir el efecto de vecindad mediado por HSV-TK, comprendiendo el método: a) transfectar células con una secuencia polinucleotídica que codifica HSV1-TK de acuerdo con las reivindicaciones y una primera proteína fluorescente; b) transfectar células con una segunda secuencia polinucleotídica que codifica una segunda proteína fluorescente que es ópticamente discernible de la primera proteína fluorescente; c) tratar las células con dosis ajustadas de ganciclovir; y d) medir la cantidad relativa de expresión de la primera proteína fluorescente y la segunda proteína fluorescente.
En una realización, las proteínas fluorescentes rojas (RFP, del inglésred fluorescent proteins)se utilizan para cuantificar el número de células tumorales diana transducidas tanto con la primera proteína fluorescente como con la segunda, e Higro® se puede utilizar para seleccionar una población de células tumorales en las que todas expresan tanto Higro® como HSV-TK. Las RFP están disponibles comercialmente y se contempla su uso en el presente documento (véase, por ejemplo, las RFP descritas en las referencias bibliográficas 1 a 14 a continuación).
En otra realización, las proteínas fluorescentes verdes (GFP, del inglésgreen fluorescent proteins)se utilizan para cuantificar el número de células tumorales diana transducidas. Las GFP están disponibles comercialmente y se contemplan para su uso en el presente documento, incluida, pero sin limitación, la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP, del inglésenhanced green fluorescent protein).
PLASMIDOS Y PRODUCCIÓN DE HSV-TK
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulgan, moléculas de ácido nucleico que codifican HSV1-TK de acuerdo con las reivindicaciones, que están unidas operativamente a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales adecuados. En algunas realizaciones, los elementos reguladores adecuados proceden de genes bacterianos, fúngicos, víricos, de mamífero, de insectos o plantas. La selección de elementos reguladores adecuados depende de la célula hospedadora elegida y, en algunas realizaciones, incluye: un promotor y potenciador transcripcional o secuencia de unión a ARN polimerasa, y una secuencia de unión ribosómica, que incluye una señal de inicio de la traducción.
En el presente documento se describen plásmidos, que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica HSV1-TK de acuerdo con las reivindicaciones, o un mutante y/o variante de la misma, como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, en el presente documento se divulgan plásmidos que codifican la HSV1-TK de acuerdo con las reivindicaciones fusionados a un segundo componente peptídico. En algunas realizaciones, el segundo componente peptídico es un agente o polipéptido terapéutico. En algunas realizaciones, el segundo componente peptídico es un polipéptido de diagnóstico.
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga una variedad de vectores tanto víricos como no víricos adecuados para dirigir la expresión de las moléculas de ácido nucleico que codifican la HSV1-TK de acuerdo con las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulgan plásmidos para transfectar y producir vectores de administración o vectores terapéuticos para su uso en procedimientos terapéuticos y de diagnóstico. De manera general, dichos plásmidos proporcionan secuencias de ácidos nucleicos que codifican componentes, víricos o no víricos, de vectores de direccionamiento divulgados en el presente documento. Dichos plásmidos incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican, por ejemplo, la proteína de la envoltura de MoMLV. En algunas realizaciones, la proteína de la envoltura de MoMLV se modifica para contener un dominio de unión a colágeno. Los plásmidos adicionales pueden incluir una secuencia de ácido nucleico unida operativamente a un promotor. En general, la secuencia codifica un polipéptido vírico gag-pol. El plásmido incluye además una secuencia de ácido nucleico unida operativamente a un promotor, y la secuencia codifica un polipéptido que confiere resistencia a fármacos a la célula productora. También se incluye un origen de replicación. En algunas realizaciones, los plásmidos adicionales comprenden una secuencia codificante de HSV-TK mejorada, como se divulga en el presente documento, secuencias de repetición terminal largas en 5' y 3'; una secuencia de empaquetamiento retrovírica V, un potenciador de CMV cadena arriba del promotor 5'LTR, una secuencia de ácido nucleico unida operativamente a un promotor y un origen de replicación de SV40.
En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica HSV1-TK de acuerdo con las reivindicaciones está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados incluyen, pero sin limitación, el LTR retrovírico; el promotor SV40; el promotor de citomegalovirus (CMV); el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV); el promotor de histonas; el promotor pollII, el promotor de p-actin; promotores inducibles, tales como el promotor MMTV, el promotor de metalotioneína; promotores de choque térmico; promotores de adenovirus; el promotor de albúmina; el promotor ApoAl; promotores de parvovirus B19; promotores de globina humana; promotores víricos de timidina cinasa, tales como el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple; LTR retrovíricas; promotores de la hormona del crecimiento humano y el promotor inducible MxIFN. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor específico de tejido. En algunas realizaciones, se elige un promotor específico de tejido del grupo que incluye los promotores relacionados con la tirosinasa (TRP-1 y TRP-2), potenciador DF3 (para células mamarias), promotor SLPI (inhibidor secretor de la leucoproteasa, expresado en muchos tipos de carcinomas), TRS (secuencias reguladoras específicas de tejido), promotores de a-fetoproteína (específicos para hepatocitos normales y hepatocitos transformados, respectivamente), el promotor del antígeno carcinoembrionario (para su uso en células transformadas del tubo gastrointestinal, pulmón, mama y otros tejidos), el promotor de la tirosina hidroxilasa (para los melanocitos), colina acetil transferasa o promotores de enolasa específicos de neuronas para su uso en neuroblastomas, la secuencia reguladora de los fibroblastomas gliales, el promotor de la tirosina hidroxilasa, promotor c-erb B-2, promotor PGK, promotor PEPCK, promotor ácido del suero (tejido mamario) y promotor de caseína (tejido mamario) y el promotor P2 del adipocito. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor específico de virus(por ejemplo,promotores retrovíricos, así como otros, tales como promotores del VIH), de la hepatitis, del herpes(porejemplo,EBV). En algunas realizaciones, el promotor es el promotor HSV-TK nativo. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor específico de bacterias, hongos o parásitos(por ejemplo,de malaria) que se utiliza para atacar una célula o tejido específico que está infectado con un virus, bacteria, hongo o parásito.
En algunas realizaciones, los vectores de administración o vectores terapéuticos pueden incluir una fracción de direccionamiento que dirige los vectores de administración o vectores terapéuticos a una célula o sistema deseado. En algunas realizaciones, la fracción de direccionamiento se refiere a un ligando expresado por el vector de administración o vector terapéutico que está asociado con el vehículo de administración y dirige el vehículo a una célula o tejido. En algunas realizaciones, el ligando puede incluir, pero sin limitación, anticuerpos, receptores y proteínas que se unen a componentes celulares expuestos dentro o sobre la célula o sistema diana. En algunas realizaciones, los componentes celulares expuestos pueden incluir colágeno. En algunas realizaciones, el ligando que se une a componentes celulares expuestos comprende proteínas que incluyen un dominio de unión a colágeno.
Los plásmidos divulgados en el presente documento pueden producirse mediante técnicas de ingeniería genética conocidas por los expertos en la materia. De manera adicional, los plásmidos pueden expresarse fácilmente por una amplia variedad de células hospedadoras procariotas y eucariotas, incluidas células bacterianas, de mamífero, de levaduras u otros hongos, víricas, de insecto o vegetales. Los métodos para transformar o transfectar dichas células para expresar ADN extraño son bien conocidos en la materia (véanse, por ejemplo, Itakuraet al.,patente de EE. UU. n.° 4.704.362; Hinnenet al.,PNAS USA 75:1929-1933, 1978; Murrayet al.,patente de EE. UU. n.° 4.801.542; Upshallet al.,patente de EE. UU. n.° 4.935.349; Hagenet al.,patente de EE. UU. n.° 4.784.950; Axelet al.,patente de<e>E. UU. n.° 4.399.216; Goeddelet al.,patente de EE. UU. n.° 4.766.075; y Sambrooket al.Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; para células vegetales, véase Czako y Marton, Plant Physiol. 104:1067-1071, 1994; y Paszkowskiet al.,Biotech. 24:387-392, 1992).
Los expertos en la materia conocen bien los protocolos para la transfección de células de mamíferos. Los métodos representativos incluyen transfección mediada por fosfato de calcio y/o magnesio, electroporación, lipofección, retrovírica, lintivírica adenovírica y mediada por protoplastos.
En algunas realizaciones, la HSV1-TK de acuerdo con las reivindicaciones se prepara mediante el cultivo de los sistemas hospedador/vector descritos anteriormente, para expresar los mutantes de timidina cinasa recombinantes. Los mutantes de timidina cinasa producidos de manera recombinante pueden purificarse de forma adicional de acuerdo con métodos bien conocidos en la materia.
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento se introducen en una amplia variedad de células hospedadoras. Ejemplos representativos de dichas células hospedadoras incluyen células vegetales, células eucariotas y células procariotas. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico se introducen en células de un vertebrado o de un animal de sangre caliente, tal como una célula de un ser humano, macaco, perro, vaca, caballo, cerdo, oveja, rata, hámster, ratón o pez, o cualquier híbrido de las mismas.
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento se introducen en una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula de mamífero se elige del grupo que incluye células COS, BHK, CHO, HeLa, 293 y NS-1. En algunas realizaciones, los vectores de expresión adecuados para dirigir la expresión en células de mamíferos incluyen un promotor, así como otras secuencias de control transcripcional y traduccional. Los promotores comunes incluyen SV40, MMTV, metalotioneína-1, adenovirus E1a, promotor temprano inmediato del citomegalovirus y promotor tardío inmediato del citomegalovirus.
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento se introducen en una célula de levadura u hongo. Las células hospedadoras de levaduras y hongos adecuadas para llevar a cabo la presente invención incluyen, entre otrosSaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae,los génerosPichiaoKluyveromycesy varias especies del géneroAspergillus.Los vectores de expresión adecuados para levaduras y hongos incluyen, entre otros, YCp 50 para levadura y el vector de clonación amdS pV3. En algunas realizaciones, la transformación de la levadura se logra mediante la preparación de esferoplastos de levadura con ADN o mediante el tratamiento con sales alcalinas como LiCl. En algunas realizaciones, la transformación de los hongos se lleva a cabo utilizando polietilenglicol.
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento se introducen en una célula bacteriana. Las células hospedadoras bacterianas adecuadas para llevar a cabo la presente invención incluyen E.coli, B. subtilis, Salmonella typhimuriumy varias especies del géneroPseudomonas, StreptomycesyStaphylococcus,así como muchas otras especies bacterianas bien conocidas por un experto en la materia. Ejemplos representativos de células hospedadoras bacterianas incluyen DH5a (Stratagene, La Jolla, Calif.).
En algunas realizaciones, los vectores de expresión bacterianos comprenden un promotor que funciona en la célula hospedadora, uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación bacteriano. Los promotores representativos incluyen el sistema promotor de p-lactamasa (penicilinasa) y lactosa, el promotor de la ARN polimerasa T7, el promotor lambda, el promotortrpy el promotortac.Los marcadores seleccionables representativos incluyen diversos marcadores de resistencia a antibióticos tales como los genes de resistencia a kanamicina o ampicilina. En algunas realizaciones, los plásmidos adecuados para transformar células bacterianas hospedadoras incluyen, entre otros, pBR322, los plásmidos pUC pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pNH8A, pNH16a, pNH18a y Bluescript M13 (Stratagene, La Jolla, Calif.).
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento se expresan en animales transgénicos no humanos, tales como ratones, ratas, conejos, ovejas, perros y cerdos. En algunas realizaciones, una unidad de expresión, que incluye una molécula de ácido nucleico para expresar junto con secuencias de control de expresión colocadas de forma adecuada, se introduce en los pronúcleos de los óvulos fertilizados, por ejemplo, mediante microinyección. En algunas realizaciones, la integración del ADN inyectado se detecta mediante análisis de transferencia de ADN de muestras de tejido. En algunas realizaciones, el ADN introducido se incorpora a la línea germinal del animal para que pase a la descendencia del animal. En algunas realizaciones, la expresión específica de tejido se logra mediante el uso de un promotor específico de tejido, o mediante el uso de un promotor inducible, tal como el promotor del gen de metalotioneína, lo que permite la expresión regulada del transgén.
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento se introducen en células hospedadoras mediante una amplia variedad de mecanismos, incluidas, por ejemplo, transfección mediada por fosfato cálcico; lipofección; pistola de genes; electroporación; transfección mediada por fusión retrovírica, adenovírica, de protoplastos o transfección mediada por DEAE-dextrano.
VECTORES Y MÉTODOS DE OBTENCIÓN DE LOS MISMOS
En el presente documento se divulga una partícula vectorial, que comprende una secuencia codificante de HSV-TK mejorada de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, que se va a expresar en una célula deseada. En algunas realizaciones, la partícula vectorial es una partícula de vector vírico. En algunas realizaciones, la partícula de vector vírico es una partícula de vector retrovírico.
En algunas realizaciones, una partícula vectorial que comprende la secuencia codificante de HSV1-TK mejorada de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas contiene o expresa una amplia variedad de moléculas de ácido nucleico adicionales además de la secuencia codificante de HSV-TK mejorada. En algunas realizaciones, el vector expresa además una linfocina, una secuencia antisentido, una toxina o una proteína de "reemplazo" (por ejemplo, adenosina desaminasa). Ejemplos representativos de linfocinas incluyen, por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma y factores de necrosis tumoral (TNF). Ejemplos representativos de secuencias antisentido incluyen, pero sin limitación:mycantisentido, p53 antisentido,rasantisentido, así como secuencias antisentido que bloquean la expresión o producción de virus, tales como el VIH, VHB y VHC. Ejemplos representativos de toxinas incluyen, pero sin limitación: ricina, abrina, toxina diftérica, toxina colérica, gelonina, botulínico, proteína antivírica de la hierba carmín, tritina, toxina deShigellay exotoxina A dePseudomonas.Ejemplos representativos de genes suicidas incluyen, pero sin limitación: una citosina desaminasa, una VSV-tk, IL-2, nitrorreductasa (NR), carboxilesterasa, p-glucuronidasa, citocromo p450, p-galactosidasa, cadena A de la toxina diftérica (DT-A), carboxipéptido G2 (CPG2), purina nucleósido fosforilasa (PNP) y desoxicitidina cinasa (dCK). En algunos casos, el vector expresa además una citosina desaminasa de levadura y/o bacteriana.
Secuencias terapéuticas adicionales incluyen, pero sin limitación, citosina desaminasa bacteriana o de levadura, otros genes suicidas, p53 y otros genes apoptóticos, guanilato cinasa, IL-12 y otros genes inmunoestimulantes o de citocinas, GFP, RFP, iRFP, LUC2, GLUC y otros genes fluorescentes y bioluminiscentes, ciclina A, D y otros genes reguladores del ciclo celular, genes víricos, genes bacterianos, genes humanos, genes sintéticos, ARNip, ARNi, microARN, antisentido de genes, secuencias inhibidoras o estimulantes, genes capturados de estrategias de biblioteca, secuencia de repetición, secuencia de replicación, secuencia promotora o potenciadora, secuencias de unión al ADN, cualquier secuencia terapéutica,etc.
En algunas realizaciones, se incluye una secuencia polinucleotídica que codifica un receptor para un retrovirus gamma. En la presente solicitud se divulgan experimentos que demuestran que el dominio de unión al receptor (RBD) del producto del gen de la envoltura del vector vírico anfotrópico se une a un receptor PiT-2 en la membrana celular de las células diana y permite mejorar la transducción del vector vírico. Mediante un modelo topológico para PiT-2 y un ensayo de unión al receptor del virus de la leucemia murina (A-MuLV) en células CHO-K1 y BHK, Feldmanet al.(Eiden MV. J Virol. (2004) 78: 595-602) identificaron el dominio extracelular uno (ECD1) del receptor PiT-2 humano como importante para la unión e infección de virus anfotróficos. Los estudios de Bottger y Petersen (2004) mostraron que la parte necesaria para unir el virus podría reducirse a la región N-Term de 182 aa y la región C-Term de 170 aa.
En consecuencia, en el presente documento también se proporcionan, en realizaciones seleccionadas, secuencias polinucleotídicas que codifican una forma mutada de timidina cinasa del virus simple humano 1 (HSV1-TK) de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, en donde la HSV1-TK codificada incluye una secuencia polinucleotídica para codificar PiT-2, PiT-1, MCAT y otros receptores utilizados por el retrovirus gamma.
COMUNICACIÓN INTRACELULAR DE UNIÓN COMUNICANTE
En algunas realizaciones, una partícula vectorial comprende además un tratamiento que aumenta la comunicación intracelular de unión comunicante (GJIC), como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, una partícula vectorial expresa adicionalmente uno o más genes que codifican proteínas que facilitan o aumentan la actividad biológica de la timidina cinasa. En algunas realizaciones, un vector comprende además una secuencia que codifica una ADN polimerasa(por ejemplo,una ADN polimerasa del herpes) y/o guanilato cinasa.
Uno de los sistemas de administración más utilizados para lograr la terapia génica implica vectores víricos, más comúnmente vectores adenovíricos y retrovíricos. Los vehículos basados en virus ilustrativos incluyen, pero sin limitación, retrovirus recombinantes (véanse, por ejemplo, los documentos WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; patente de EE. UU. n.° 5.219.740; WO 93/11230; WO 93/10218; patente de EE. UU. n.° 4.777.127; patente de Gb n.° 2.200.651; EP 0 345 242; y WO 91/02805), vectores basados en alfavirus(por ejemplo,vectores del virus Sindbis, virus del bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus de Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), y vectores víricos adenoasociados (AAV) (véanse, por ejemplo, los documentos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655). La administración de ADN ligado a adenovirus muertos como lo describe Curiel (Hum. Gene Ther. (1992) 3:147) también se pueden emplear.
En general, los retrovirus tienen tres marcos de lectura abiertos comunes, gag, pol y env, que codifican las proteínas estructurales de la matriz, gag y nucleocápside, codifican enzimas que incluyen la transcriptasa inversa, la integrasa y la proteasa, y codifican proteínas de la envoltura y proteínas fusogénicas transmembrana, respectivamente. En general, las partículas de vectores retrovíricos se producen mediante el empaquetado de estirpes celulares que proporcionan los productos de los genesgag, polyenvnecesarios entrans.Este enfoque da como resultado la producción de partículas de vectores retrovíricos que transducen células de mamíferos, pero son incapaces de replicarse más una vez que se han integrado en el genoma de la célula.
Para fines de administración de genes, se puede desarrollar una partícula vírica a partir de un virus que es nativo de una célula diana o de un virus que no es nativo de una célula diana. En general, es deseable utilizar un vector vírico no nativo en lugar de un vector vírico nativo. Si bien los vectores víricos nativos pueden poseer una afinidad natural por las células diana, estos virus plantean un mayor peligro ya que poseen un mayor potencial de propagación en las células diana. A este respecto, los vectores víricos animales, en donde no están diseñados naturalmente para la propagación en células humanas, pueden ser útiles para la administración de genes a células humanas. Para obtener rendimientos suficientes de dichos vectores víricos animales para su uso en la administración de genes, sin embargo, es necesario realizar la producción en una célula de empaquetado de animales autóctonos. Los vectores víricos producidos de esta manera, sin embargo, normalmente carecen de componentes, ya sea como parte de la envoltura o como parte de la cápside, que puedan proporcionar tropismo a las células humanas. Por ejemplo, prácticas actuales para la producción de vectores víricos no humanos, tales como retrovirus ecotrópicos de ratón (murino) como MMLV, se producen en una estirpe celular de empaquetado de ratón. Debe proporcionarse otro componente necesario para el tropismo de las células humanas.
De manera general, la propagación de un vector vírico (sin un virus auxiliar) se produce en una célula empaquetadora en la que las secuencias de ácido nucleico para los componentes empaquetadores están integradas de manera estable en el genoma celular y el ácido nucleico que codifica el ácido nucleico vírico se introduce en dicha estirpe celular.
En algunas realizaciones, el vector plasmídico retrovírico incluye un polinucleótido que comprende la secuencia codificante de HSV-TK mejorada de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, y el vehículo de expresión que incluye el polinucleótido que comprende la secuencia codificante de HSV-TK mejorada se transduce en una estirpe celular empaquetadora que incluye secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas retrovíricas gag, pol y env de tipo silvestre (es decir, sin modificar). Ejemplos de dichas estirpes celulares empaquetadoras incluyen, pero sin limitación, las estirpes celulares PE501, PA317 (ATCC n.° CRL 9078),'-2,-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, T.C.E.R. TCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 y DAN como se describe en Miller, Human Gene Therap, vol. 1, págs. 5-14 (1990), o la estirpe celular 293T (Patente de EE. UU. n.° 5.952.225). Los vectores pueden transfectarse en las células empaquetadoras mediante cualquier medio conocido en la materia. Dichos medios incluyen, pero sin limitación, electroporación y uso de liposomas, tal como se describe anteriormente en el presente documento, y precipitación con CaPO4. Dichas células productoras generalmente generan partículas de vectores retrovíricos infecciosas que incluyen la primera proteína de la envoltura retrovírica de tipo silvestre o no modificada, una proteína de envoltura retrovírica quimérica y un polinucleótido que codifica el agente terapéutico o de diagnóstico.
En algunas realizaciones, se proporciona una célula empaquetadora que incluye polinucleótidos que codifican las proteínas gag y pol, un polinucleótido que codifica una primera proteína de la envoltura retrovírica libre de péptidos no retrovíricos (que, en algunas realizaciones, es una proteína de la envoltura retrovírica de tipo silvestre) y un polinucleótido que codifica una proteína de la envoltura retrovírica quimérica. En algunas realizaciones, se produce una célula productora para generar partículas de vector retrovírico que incluyen las proteínas de envoltura primera y quimérica mediante la introducción en dicha célula empaquetadora de una partícula de vector retrovírico o un vector plasmídico retrovírico, incluyendo en cada caso un polinucleótido que codifica el agente terapéutico o de diagnóstico. En algunas realizaciones, la estirpe celular productora genera así partículas de vector retrovírico infecciosas que incluyen el polinucleótido que comprende la secuencia codificante de HSV-TK mejorada.
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga un kit para la producción de vectores víricos, comprendiendo el kit: a) un recipiente que contiene un primer plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la envoltura retrovírica, en donde la secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor; b) un recipiente que contiene un segundo plásmido que comprende: una secuencia de ácido nucleico unida operativamente a un promotor, en donde la secuencia codifica un polipéptido vírico gag-pol, una secuencia de ácido nucleico unida operativamente a un promotor, en donde la secuencia codifica un polipéptido que confiere resistencia a fármacos a la célula productora, y un origen de replicación SV40; c) un recipiente que contiene un tercer plásmido que comprende: una secuencia codificante de HSV1-TK mejorada de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas unida operativamente a un promotor, secuencias de repetición terminales largas (LTR) en 5 'y 3', una secuencia de empaquetamiento retrovírica V, un promotor CMV cadena arriba de la LTR en 5'; una secuencia de ácido nucleico unida operativamente a un promotor, en donde la secuencia codifica un polipéptido que confiere resistencia a fármacos a la célula productora, un origen de replicación SV40, d) un recipiente que contiene una célula productora que expresa el antígeno T grande de SV40; y e) instrucciones para transfectar de manera transitoria la célula productora de d) con los plásmidos de a), b) y c) y cultivar la célula productora transfectada en condiciones que permitan que se produzcan partículas víricas.
Se reconoce que los vectores de administración o vectores terapéuticos divulgados en el presente documento incluyen partículas víricas y no víricas. Los sistemas de administración no víricos, tales como micropartículas o nanopartículas que incluyen, por ejemplo, liposomas y policationes catiónicos, proporcionan métodos alternativos para sistemas de administración y están abarcados por la presente divulgación. Las partículas no víricas incluyen nucleoproteínas encapsuladas, incluidas partículas víricas total o parcialmente ensambladas, en bicapas lipídicas. En la materia se conocen métodos para encapsular virus en bicapas lipídicas. Incluyen el atrapamiento pasivo en vesículas encerradas en bicapa lipídica (liposomas) y la incubación de viriones con liposomas (patente de EE. UU. n.° 5.962.429; Fasbender,et al.,J. Biol. Chem. 272:6479-6489; Hodgson y Solaiman, Nature Biotechnology 14:339-342 (1996)). Sin quedar limitados a teoría alguna, se supone que las proteínas ácidas expuestas en la superficie de un virión proporcionan una interfaz para la formación de complejos con el componente de lípido catiónico/polímero catiónico del vector de administración o vector terapéutico y sirven como "andamio" para la formación de bicapa por el componente lipídico neutro.
Ejemplos de sistemas de administración no víricos incluyen, por ejemplo, Wheeleret al.,patente de EE. UU. n.° 5.976.567 y 5.981.501. Estas patentes divulgan la preparación de partículas de lípidos y plásmidos estables en suero mediante la puesta en contacto de una solución acuosa de un plásmido con una solución orgánica que contiene lípidos catiónicos y no catiónicos. Thierryet al.,patente de EE. UU. n.° 6.096.335, divulgan la preparación de un complejo que comprende una sustancia biológicamente activa globalmente aniónica, un constituyente catiónico y un constituyente aniónico. Allen y Stuart, PCT/US98/12937 (WO 98/58630), divulgan la formación de partículas de lípidos catiónicos y polinucleótidos en un disolvente lipídico adecuado para la solubilización del lípido catiónico, la adición de un lípido neutro formador de vesículas al disolvente que contiene las partículas y la evaporación del disolvente lipídico para formar liposomas que tienen el polinucleótido atrapado en su interior. Allen y Stuart, patente de EE. UU. n.° 6.120.798, divulgan la formación de micropartículas de polinucleótidos y lípidos mediante la disolución de un polinucleótido en un primer disolvente, por ejemplo, acuoso, mediante la disolución de un lípido en un segundo disolvente, por ejemplo, orgánico, inmiscible con dicho primer disolvente, la adición de un tercer disolvente para efectuar la formación de una única fase, y la adición además de una cantidad del primer y segundo disolventes para efectuar la formación de dos fases líquidas. Ballyet al.,patente de EE. UU. n.° 5.705.385, y Zhanget al.,patente de EE. UU. n.° 6.110.745, divulgan un método para preparar una partícula de lípido y ácido nucleico mediante la puesta en contacto de un ácido nucleico con una solución que contiene un lípido no catiónico y un lípido catiónico para formar una mezcla de lípido y ácido nucleico. Maureret al.,PCT/CA00/00843 (WO 01/06574), divulgan un método para preparar partículas de agente terapéutico completamente encapsuladas y lípidos de un agente terapéutico cargado que incluye combinar vesículas lipídicas preformadas, un agente terapéutico cargado y un agente desestabilizante para formar una mezcla de los mismos en un disolvente desestabilizador que desestabiliza, pero no interrumpe, las vesículas, y posteriormente eliminar el agente desestabilizador.
Un componente formador de partículas ("PFC", del inglésParticle-Forming Component)normalmente comprende un lípido, tal como un lípido catiónico, opcionalmente junto con un PFC distinto de un lípido catiónico. Un lípido catiónico es un lípido cuya molécula es capaz de disociarse electrolíticamente produciendo una carga iónica positiva neta en el intervalo de pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 10, preferentemente en el intervalo de pH fisiológico de aproximadamente 4 a aproximadamente 9. Dichos lípidos catiónicos abarcan, por ejemplo, detergentes catiónicos, tales como anfífilos catiónicos que tienen una única cadena de hidrocarburos. La bibliografía científica y de patentes describe numerosos lípidos catiónicos que tienen propiedades potenciadoras de la transfección de ácidos nucleicos. Estos lípidos catiónicos que mejoran la transfección incluyen, por ejemplo: cloruro de 1,2-dioleiloxi-3-(N,N,N-trimetilamonio)propano-DOTMA (patente de EE. UU. n.° 4.897.355); DOSPA (véase Hawley-Nelson,et al.,Focus 15(3):73 (1993)); bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio o DdA b (patente de EE. UU. n.° 5.279.833); cloruro de 1,2-dioleoiloxi-3-(N,N,N-trimetilamonio)propano-DOTAP (Stamatatoset al.,Biochemistry 27: 3917-3925 (1988)); lípidos a base de glicerol (véase Leventiset al.,Biochem. Biophys. Acta 1023:124 (1990); arginil-PE (patente de EE. UU. n.° 5.980.935); lisinil-PE (Puyalet al.J. Biochem. 228:697 (1995)), lipopoliaminas (patente de EE. UU. n.° 5.171.678) y lípidos a base de colesterol (Documento WO 93/05162, patente de EE. UU. n.° 5.283.185); CHIM (1-(3-colesteril)-oxicarbonil-aminometilimidazol); y similares. Se revisan los lípidos catiónicos para la transfección, por ejemplo, en: Behr, Bioconjugate Chemistry, 5:382-389 (1994). Los lípidos catiónicos preferibles son DDAB, CHIM o combinaciones de los mismos. Ejemplos de lípidos catiónicos que son detergentes catiónicos incluyen sales de alquil (C12-C18) y alquenil (C12-C18)-trimetilamonio, sales de N-alquilo (C12-C18) y de N-alquenil-(C12-C18)-piridinio, y similares.
En algunas realizaciones, el tamaño de un vector de administración o vector terapéutico formado está dentro del intervalo de aproximadamente 40 a aproximadamente 1500 nm. En algunas realizaciones, el vector de administración o vector terapéutico tiene un tamaño en el intervalo de aproximadamente 50 a 500 nm. En algunas realizaciones, el vector de administración o vector terapéutico tiene un tamaño en el intervalo de aproximadamente 20 a 150 nm. Esta selección de tamaño ayuda ventajosamente al vector de administración, cuando se administra al cuerpo, para penetrar desde los vasos sanguíneos hasta los tejidos enfermos, tales como tumores malignos, y transferir un ácido nucleico terapéutico a los mismos. También es una propiedad característica y ventajosa del vector de administración que su tamaño, medido, por ejemplo, mediante el método de dispersión de luz dinámica, no aumente sustancialmente en presencia de líquidos biológicos extracelulares, tales como medios de cultivo celularin vitroo plasma sanguíneo.
Como alternativa, en algunas realizaciones, se inyectan células que producen retrovirus en un tumor. En algunas realizaciones, las células productoras de retrovirus así introducidas están genomanipuladas para producir activamente un vector de administración, tal como una partícula de vector vírico, de modo que se produzcan producciones continuas del vector dentro de la masa tumoralin situ.En algunas realizaciones, se transducen células tumorales proliferantesin vivopor proximidad a células productoras de vectores retrovíricos.
MÉTODOS DE USO
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga un método para proporcionar a las células diana un polinucleótido que codifica HSV1-TK de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, comprendiendo el método y después exponiendo las células a un sustrato adecuado que se convierte en una sustancia tóxica para destruir aquellas células que expresan el gen de la timidina cinasa del HSV-1 mutante así como aquellas en las proximidades de las células que expresan el gen de la timidina cinasa del HSV-1 mutante, es decir, células de vecindad. El gen de la timidina cinasa del HSV-1 mutante se puede administrar directamente a las células diana o deseadas o sistémicamente junto con un medio de direccionamiento, tal como mediante la selección de un vector vírico particular o una formulación de administración. Las células se pueden tratarin vivo,dentro del paciente a tratar, o tratarin vitro,y después se inyectan al paciente. Tras la introducción del gen mutante de la timidina cinasa del HSV-1 en las células del paciente, se administra el profármaco, de manera sistémica o local, en una cantidad eficaz para convertirse por la timidina cinasa del HSV-1 mutante en una cantidad suficiente de sustancia tóxica para destruir las células diana. Un análogo de nucleósido que es un sustrato para que la HSV-1 TK produzca una sustancia tóxica que destruye las células diana se denomina en el presente documento "profármaco".
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga un método para destruir una célula, comprendiendo el método: i) introducir en la célula un polinucleótido o vector de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas; ii) permitir o dirigir a la célula para que exprese timidina cinasa; y iii) poner en contacto la célula con un agente que la timidina cinasa convierte en un agente citotóxico.
En algunas realizaciones de la presente invención, se proporcionan en el presente documento linfocitos T genéticamente modificados para incluir un polinucleótido o vector de la presente invención para su uso en un método para prevenir la enfermedad de injerto contra hospedador (GvHD, del inglésgraft-versus-host disease)en un paciente, comprendiendo el método: (i) administrar a un hospedador linfocitos T genéticamente modificados para incluir un polinucleótido o vector de la presente invención; y (ii) administrar a dicho hospedador, antes de la aparición de la enfermedad de injerto contra hospedador, un agente capaz de convertirse por la timidina cinasa en un agente citotóxico en una cantidad eficaz para destruir linfocitos T genéticamente modificados capaces de provocar GvHD. Durante un alotrasplante de médula ósea, los linfocitos T alorreactivos se pueden eliminar del injerto para prevenir la enfermedad de injerto contra hospedador. La GvHD ocurre cuando los linfocitos T en el injerto de células madre trasplantadas atacan el cuerpo del receptor del trasplante. Sin embargo, la eliminación de los linfocitos T puede aumentar la incidencia de recaída de la enfermedad, rechazo del injerto y reactivación de infección vírica. Para contrarrestar la posibilidad de GvHD, los pacientes con alotrasplante de médula ósea pueden tratarse mediante la introducción de linfocitos T del donante después de un retraso después del alotrasplante de médula ósea. Sin embargo, el retraso en la introducción de linfocitos T del donante después del alotrasplante de médula ósea está limitado por la GvHD, una complicación frecuente y potencialmente letal del tratamiento. Mediante la administración de linfocitos T genéticamente modificados a un receptor de trasplante para incluir un polinucleótido que codifica un "gen suicida", los linfocitos T pueden morir si comienzan a atacar el cuerpo del receptor del trasplante.
En algunas realizaciones, las partículas del vector retrovírico, que incluyen una proteína de envoltura retrovírica quimérica y un polinucleótido que codifica un agente terapéutico, se administran a un hospedador para expresar el agente terapéutico en el hospedador. El polinucleótido que codifica un agente terapéutico es un polinucleótido que codifica la HSV1-TK de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
En algunas realizaciones, las células se obtienen de un paciente, y se utilizan partículas de vector retrovírico para introducir un agente terapéutico o polipéptido en las células, y dichas células modificadas se administran al paciente. En algunas realizaciones, se administran partículas de vector retrovírico al pacientein vivo,de modo que las partículas del vector retrovírico transducen células del pacientein vivo.
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga una partícula retrovírica de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas para su uso en un método para administrar un agente o polipéptido terapéutico a un sitio de lesión tisular en un sujeto, que comprende administrar directamente o por vía intravenosa al sitio de lesión tisular una partícula retrovírica que comprende: i) una proteína quimérica de la envoltura retrovírica y ii) al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido terapéutico, en donde la partícula vírica se une al colágeno expuesto en el sitio de la lesión tisular y expresa el polipéptido terapéutico en el sitio de la lesión tisular. En algunas realizaciones, la lesión tisular se selecciona del grupo que consiste en lesión tisular debida a invasión tumoral, lesión vascular, lesiones ulcerosas, lesión del tejido inflamatorio, lesión por láser en los ojos, cirugía, articulaciones artríticas, cicatrices y queloides. En algunas realizaciones, la lesión tisular es una lesión del tejido debido al crecimiento de un tumor en el hospedador.
En algunas realizaciones, los vectores terapéuticos, como se divulga en el presente documento, son para su uso en el tratamiento del cáncer, incluidos tumores malignos y no malignos. En algunas realizaciones, los vectores terapéuticos comprenden además un péptido o dominio peptídico de unión a la matriz extracelular. En algunas realizaciones, el péptido o dominio peptídico de unión a la matriz extracelular es un dominio o péptido de unión a colágeno. En algunas realizaciones, los tumores incluyen, pero sin limitación, todos los tumores sólidos.
En algunas realizaciones, los vectores terapéuticos, como se divulga en el presente documento, son para su uso en el tratamiento del cáncer seleccionándose del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de hueso, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer de laringe, vesícula biliar, páncreas, recto, glándula paratiroidea, tiroides, suprarrenal, tejido neuronal, cabeza y cuello, colon, estómago, bronquios, riñones, carcinoma basocelular, carcinoma epidermoide tanto de tipo ulceroso como papilar, carcinoma de piel metastásico, melanoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, sarcoma de células reticulares, mieloma, tumor gigantocelular, tumor de pulmón microcítico, cálculos biliares, tumor de células de los islotes, tumor cerebral primario, tumores linfocíticos y granulocíticos agudos y crónicos, tumor de tricoleucocitos, adenoma, hiperplasia, carcinoma medular, feocromocitoma, neuronas de la mucosa, ganglioneuromas intestinales, tumor hiperplásico del nervio corneal, tumor de hábito marfanoide, tumor de Wilm, seminoma, tumor de ovario, tumor de leiomiomater, displasia cervical y carcinomain situ,neuroblastoma, retinoblastoma, sarcoma de tejidos blandos, tumor carcinoide maligno, lesión tópica de la piel, micosis fungoide, rabdomiosarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma osteogénico y de otro tipo, hipercalciemia maligna, tumor de células renales, policitemia vera, adenocarcinoma, glioblastoma multiforme, leucemias, linfomas, melanomas malignos y carcinomas epidermoides. En otras realizaciones, el cáncer que se está tratando es un cáncer pancreático, cáncer de hígado, cáncer de mama, osteosarcoma, cáncer de pulmón, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de laringe, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cerebro, sarcoma de Ewing o cáncer de colon.
En otras realizaciones, el cáncer a tratar se elige del grupo que consiste en carcinoma hepatocelular primario, carcinoma de mama metastásico al hígado, cáncer de páncreas metastásico al hígado, cáncer gástrico metastásico al hígado, cáncer de esófago metastásico al hígado, cáncer de pulmón metastásico al hígado, melanoma metastásico al hígado, carcinoma de ovario metastásico al hígado y cáncer de riñón metastásico al hígado.
Los vectores terapéuticos pueden administrarse solos o junto con otros tratamientos terapéuticos o agentes activos. Ejemplos de otros agentes activos que pueden utilizarse incluyen, pero sin limitación, agentes antineoplásicos, agentes antiinflamatorios, inhibidores de proteasa, tales como inhibidores de la proteasa del VIH, análogos nucleosídicos, tal como AZT. En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento comprenden además administrar al sujeto un agente antineoplásico, un agente biológico o radioterapia antes, simultáneamente o después de la administración de las partículas víricas terapéuticas. Un experto en la materia apreciará que las partículas retrovíricas descritas en el presente documento pueden administrarse por la misma ruta que uno o más agentes(por ejemplo,el vector retrovírico y el agente se administran ambos por vía intravenosa) o por vías diferentes(por ejemplo,el vector retrovírico se administra por vía intravenosa y el uno o más agentes se administran por vía oral).
La dosis de las partículas víricas terapéuticas se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada. Una dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante en plasma que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra una infección o una inhibición semimáxima) según se determina en cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar de forma más precisa las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante métodos RT-qPCR o ddPCR.
Una cantidad eficaz o terapéuticamente eficaz de las partículas retrovíricas divulgadas en el presente documento para ser administradas a un sujeto que necesita tratamiento se puede determinar de diversas maneras. A modo de ejemplo, la cantidad puede basarse en el valor vírico o la eficacia en un modelo animal. Como alternativa, los regímenes de dosificación utilizados en los ensayos clínicos pueden utilizarse como pautas generales.
En algunas realizaciones, la dosis diaria puede administrarse en una sola dosis o en partes a distintas horas del día. En algunas realizaciones, es posible que se requiera una dosis más elevada y que se pueda reducir con el tiempo cuando se obtenga la respuesta inicial óptima. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser continuo durante días, semanas o años, o puede ser a intervalos con períodos de descanso intermedios. En algunas realizaciones, la dosis se modifica de acuerdo con otros tratamientos que el individuo pueda estar recibiendo. Sin embargo, el método de tratamiento no se limita de ninguna manera a una concentración o intervalo particular de la partícula retrovírica y puede variarse para cada individuo que se está tratando y para cada derivado utilizado.
Es posible que sea necesaria la individualización de la dosis para lograr el máximo efecto para un individuo determinado. En algunas realizaciones, la dosis administrada a un individuo que está siendo tratado varía dependiendo de la edad del individuo, la gravedad o estadio de la enfermedad y respuesta al tratamiento. En algunas realizaciones, los parámetros clínicos para determinar la dosis incluyen, pero sin limitación, el tamaño del tumor y la alteración en el nivel de marcadores tumorales utilizados en pruebas clínicas para enfermedades malignas particulares. En algunas realizaciones, el médico tratante determina la cantidad terapéuticamente eficaz que se utilizará para un individuo determinado. En algunas realizaciones, las terapias divulgadas en el presente documento se administran con la frecuencia necesaria y durante el período de tiempo que el médico tratante considere necesario.
Los vectores terapéuticos, incluidos, pero sin limitación, las partículas retrovíricas terapéuticas que son específicas para la célula o sistema de interés, pueden administrarse de forma sistémica o regional (local) a un sujeto que necesita tratamiento. Por ejemplo, los vectores terapéuticos pueden administrarse de formas sistémica por vía intravenosa. Como alternativa, los vectores terapéuticos también pueden administrarse por vía intraarterial. Los vectores terapéuticos también pueden administrarse por vía tópica, intravenosa, intraarterial, intratumoral, intracolónica, intratraqueal, intraperitoneal, intranasal, intravascular, intratecal, intracraneal, intramédular, intrapleural, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraocular, intraósea y/o intrasinovial o estereotáctica. También se puede utilizar una combinación de modos de administración, por ejemplo, un paciente puede recibir los vectores terapéuticos tanto de forma sistémica como regional (local) para mejorar las respuestas tumorales con el tratamiento de los vectores terapéuticos.
En algunas realizaciones, múltiples tratamientos(por ejemplo,primer y segundo tratamiento) se administran a un sujeto que necesita tratamiento. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo tratamiento se administra por vía intravenosa. En otras realizaciones, el primer y/o segundo tratamiento se administra mediante infusión intraarterial, incluida, pero sin limitación, la infusión a través de la arteria hepática, arteria cerebral, arteria coronaria, arteria pulmonar, arteria ilíaca, tronco celíaco, arteria gástrica, arteria esplénica, arteria renal, arteria gonadal, arteria subclavia, arteria vertebral, arteria axilar, arteria braquial, arteria radial, arteria cubital, arteria carótida, arteria femoral, arteria mesentérica inferior y/o arteria mesentérica superior. La infusión intraarterial se puede lograr mediante procedimientos endovasculares, procedimientos percutáneos o abordajes quirúrgicos abiertos. En algunas realizaciones, el primer y segundo tratamiento pueden administrarse de forma secuencial. En aún otras realizaciones, el primer y segundo tratamiento pueden administrarse de forma simultánea. En otras realizaciones más, el tercer tratamiento opcional podrá administrarse de forma secuencial o simultánea con el primer y segundo tratamiento.
En algunas realizaciones, los vectores terapéuticos divulgados en el presente documento pueden administrarse junto con un tratamiento administrado de forma secuencial o simultánea en dosis elevadas de forma acumulativa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, a un paciente que lo necesite se le puede administrar de forma sistémica, por ejemplo, por vía intravenosa, con un primer tratamiento de al menos 1 * 109 PVT, al menos 1 x 1010 PVT, al menos 1 * 1011 PVT, al menos 1 * 1012 PVT, al menos 1 * 1013 PVT, al menos 1 * 1014 PVT, al menos 1 * 1015 PVT, al menos 1 * 1016 PVT, al menos 1 * 1017 PVT, al menos 1 * 1018 PVT, al menos 1 * 1019 PVT, al menos 1 * 1020 PVT, al menos 1 * 1021 PVT o al menos 1 * 1022 PVT del vector de administración de forma acumulativa. El primer tratamiento puede administrarse de forma sistémica. Como alternativa, el primer tratamiento puede administrarse de forma localizada, por ejemplo, intraarterial, por ejemplo a un paciente que lo necesite se le puede administrar mediante infusión intraarterial al menos 1 * 109 PVT, al menos 1 * 1010 PVT, al menos 1 * 1011 PVT, al menos 1 * 1012 PVT, al menos 1 x 1013 PVT, al menos 1 x 1014 PVT, al menos 1 x 1015 PVT, al menos 1 x 1016 PVT, al menos 1 x 1017 PVT, al menos 1 x 1018PVT, al menos 1 x 1019PVT, al menos 1 x 1020 PVT, al menos 1 x 1021 PVT o al menos 1 x 1022 PVT del vector de administración de forma acumulativa.
En aún otras realizaciones, un sujeto que lo necesite puede recibir una combinación, ya sea de forma secuencial o simultánea, de administración de infusiones sistémica e intraarterial de dosis elevadas del vector de administración. Por ejemplo, a un paciente que lo necesite se le puede administrar primero por vía sistémica al menos 1 x 109 PVT, al menos 1 x 1010PVT, al menos 1 x 1011 pVt , al menos 1 x 1012 PVT, al menos 1 x 1013PVT, al menos 1 x 1014 PVT, al menos 1 x 1015, al menos 1 x 1016 PVT, al menos 1 x 1017 PVT, al menos 1 x 1018 PVT, al menos 1 x 1019 PVT, al menos 1 x 1020 PVT, al menos 1 x 1021 PVT o al menos 1 x 1022 PVT del vector de administración de forma acumulativa, seguido de un tratamiento adicional de infusión intraarterial, por ejemplo, infusión arterial hepática, del vector de administración administrado de al menos 1 x 109 PVT, al menos 1 x 1010 PVT, al menos 1 x 1011 PVT, al menos 1 x 1012 PVT, al menos 1 x 1013 PVT, al menos 1 x 1014 PVT, al menos 1 x 1015 PVT, al menos 1 x 1016 PVT, al menos 1 x 1017 PVT, al menos 1 x 1018 PVT, al menos 1 x 1019 PVT, al menos 1 x 1020 PVT, al menos 1 x 1021 PVT 0 al menos 1 x 1022 PVT de forma acumulativa. Aún en otra realización, un paciente que lo necesite puede recibir una combinación de infusión intraarterial y administración sistémica del vector de administración en dosis elevadas. Por ejemplo, a un paciente que lo necesite se le puede administrar primero mediante infusión intraarterial al menos 1 x 109 PVT, al menos 1 x 1010 PVT, al menos 1 x 1011 PVT, al menos 1 x 1012 PVT, al menos 1 x 1013 PVT, al menos 1 x 1014 PVT, al menos 1 x 1015 PVT, al menos 1 x 1016 PVT, al menos 1 x 1017 PVT, al menos 1 x 1018 PVT, al menos 1 x 1019PVT, al menos 1 x 1020 PVT, al menos 1 x 1021 PVT o al menos 1 x 1022 PVT del vector de administración de forma acumulativa, seguido de un tratamiento adicional del vector de administración administrado de forma sistémica de al menos 1 x 109 PVT, al menos 1 x 1010 PVT, al menos 1 x 1011 PVT, al menos 1 x 1012 PVT, al menos 1 x 1013PVT, al menos 1 x 1014 PVT, al menos 1 x 1015 PVT, al menos 1 x 1016PVT, al menos 1 x 1017 PVT, al menos 1 x 1018 PVT, al menos 1 x 1019 PVT, al menos 1 x 1020 PVT, al menos 1 x 1021 PVT o al menos 1 x 1022 PVT de forma acumulativa. Los tratamientos también podrán administrarse de forma simultánea, es decir, un tratamiento de dosis elevadas del vector de administración, por ejemplo, de al menos 1 x 109 PVT, al menos 1 x 1010 PVT, al menos 1 x 1011 PVT, al menos 1 x 1012 PVT, al menos 1 x 1013 PVT, al menos 1 x 1014 PVT, al menos 1 x 1015 PVT, al menos 1 x 1016 PVT, al menos 1 x 1017 PVT, al menos 1 x 1018 PVT, al menos 1 x 1019 PVT, al menos 1 x 1020 PVT, al menos 1 x 1021 PVT o al menos 1 x 1022 PVT del vector de administración de forma acumulativa, junto con un tratamiento de infusión intraarterial, por ejemplo, infusión arterial hepática, del vector de administración administrado de al menos 1 x 109 PVT, al menos 1 x 1010 PVT, al menos 1 x 1011 PVT, al menos 1 x 1012 PVT, al menos 1 x 1013 PVT, al menos 1 x 1014 PVT, al menos 1 x 1015 PVT, al menos 1 x 1016 PVT, al menos 1 x 1017 PVT, al menos 1 x 1018 PVT, al menos 1 x 1019 PVT, al menos 1 x 1020 PVT, al menos 1 x 1021 PVT o al menos 1 x 1022 PVT de forma acumulativa.
En otras realizaciones más, un sujeto que lo necesite puede recibir adicionalmente, ya sea de forma secuencial o simultánea, el primer y segundo tratamiento, tratamientos adicionales(por ejemplo,tercer tratamiento, cuarto tratamiento, quinto tratamiento) de dosis acumulativa del vector de administración, por ejemplo, de al menos 1 x 109 PVT, al menos 1 x 1010 PVT, al menos 1 x 1011 PVT, al menos 1 x 1012 PVT, al menos 1 x 1013 PVT, al menos 1 x 1014 PVT, al menos 1 x 1015 PVT, al menos 1 x 1016 PVT, al menos 1 x 1017 PVT, al menos 1 x 1018 PVT, al menos 1 x 1019PVT, al menos 1 x 1020 PVT, al menos 1 x 1021 PVT o al menos 1 x 1022 PVT del vector de administración de forma acumulativa.
En algunas realizaciones, al sujeto que necesita tratamiento se le administra de forma sistémica(por ejemplo,por vía intravenosa) una dosis de al menos 1 x 1011 PVT, seguido de la administración mediante infusión intraarterial(por ejemplo,infusión hepático-arterial) de una dosis de al menos 1 x 1011 PVT. En otras realizaciones, al paciente que necesita tratamiento se le puede administrar de forma sistémica(por ejemplo,por vía intravenosa) una dosis acumulativa de al menos 1 x 1012PVT, seguido de la administración mediante infusión intraarterial(por ejemplo,infusión hepático-arterial) de una dosis de al menos 1 x 1012 PVT. En una realización, al paciente que necesita tratamiento se le puede administrar de forma sistémica(por ejemplo,por vía intravenosa) una dosis de al menos 1 x 1013 PVT, seguido de la administración mediante infusión intraarterial(por ejemplo,infusión hepático-arterial) de una dosis de al menos 1 x 1013 PVT. En aún otras realizaciones, al paciente que necesita tratamiento se le puede administrar de forma sistémica(por ejemplo,por vía intravenosa) una dosis de al menos 1 x1014PVT, simultáneamente con la administración mediante infusión intraarterial(por ejemplo,infusión hepático-arterial) de una dosis de al menos 1 x 1014PVT. En otras realizaciones más, al paciente que necesita tratamiento se le puede administrar de forma sistémica(por ejemplo,por vía intravenosa) una dosis de al menos 1 x 1015 PVT, junto con la administración mediante infusión intraarterial(por ejemplo,infusión hepático-arterial) de una dosis de al menos 1 x 1015 PVT. En aún otras realizaciones, al paciente que necesita tratamiento se le puede administrar de forma sistémica(por ejemplo,por vía intravenosa) una dosis de al menos 1 x1016PVT, simultáneamente con la administración mediante infusión intraarterial(por ejemplo,infusión hepático-arterial) de una dosis de al menos 1 x 1016 PVT. En otras realizaciones más, al paciente que necesita tratamiento se le puede administrar de forma sistémica(por ejemplo,por vía intravenosa) una dosis de al menos 1 x 1013 PVT, junto con la administración mediante infusión intraarterial(por ejemplo,infusión hepático-arterial) de una dosis de al menos 1 x 1017 PVT.
También se puede administrar a un sujeto que necesita tratamiento, ya sea de forma sistémica o localizada (por ejemplo, infusión intraarterial, tal como infusión arterial hepática) un tratamiento del vector de administración durante un período de tiempo definido. En algunas realizaciones, el periodo de tiempo puede ser al menos un día, al menos dos días, al menos tres días, al menos cuatro días, al menos cinco días, al menos seis días, al menos siete días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas, al menos seis semanas, al menos siete semanas, al menos ocho semanas, al menos 2 meses, al menos tres meses, al menos cuatro meses, al menos cinco meses, al menos seis meses, al menos siete meses, al menos ocho meses, al menos nueve meses, al menos diez meses, al menos once meses, al menos un año, al menos dos años, al menos tres años, al menos cuatro años o al menos cinco años. La administración también podría realizarse de forma crónica, es decir, durante un período de tiempo indefinido o no definido.
La administración del vector terapéutico también puede ocurrir de manera periódica, por ejemplo, al menos una vez al día, al menos dos veces al día, al menos tres veces al día, al menos cuatro veces al día, al menos cinco veces al día. La administración periódica del vector de administración puede depender del momento de administración del vector así como del modo de administración. Por ejemplo, la administración parenteral puede realizarse sólo una vez al día durante un período de tiempo prolongado, mientras que la administración oral del vector de administración puede tener lugar más de una vez al día, en donde la administración del vector de administración se realiza durante un período de tiempo más corto.
En una realización, se permite al sujeto descansar de 1 a 2 días entre el primer tratamiento y el segundo tratamiento. En algunas realizaciones, se permite al sujeto descansar de 2 a 4 días entre el primer tratamiento y el segundo tratamiento. En otras realizaciones, se permite al sujeto descansar al menos 2 días entre el primer y segundo tratamiento. En aún otras realizaciones, se permite al sujeto descansar al menos 4 días entre el primer y segundo tratamiento. En otras realizaciones más, se permite al sujeto descansar al menos 6 días entre el primer y segundo tratamiento. En algunas realizaciones, se permite al sujeto descansar al menos 1 semana entre el primer y segundo tratamiento. En aún otras realizaciones, se permite al sujeto descansar al menos 2 semanas entre el primer y segundo tratamiento. En una realización, se permite al sujeto descansar al menos un mes entre el primer y segundo tratamiento. En algunas realizaciones, se permite al sujeto descansar al menos de 1 a 7 días entre el segundo tratamiento y el tercer tratamiento opcional. En aún otras realizaciones, se permite al sujeto descansar al menos de 1 a 2 semanas entre el segundo tratamiento y el tercer tratamiento opcional.
En algunas realizaciones, el vector terapéutico se administra para aumentar la concentración local del péptido o vector. En algunas realizaciones, el vector terapéutico se administra mediante infusión intraarterial, lo que aumenta la concentración local del vector terapéutico en un sistema de órganos específico. En aún otras realizaciones, el vector terapéutico se administra por vía intratumoral. Dependiendo de la ubicación de las lesiones diana, en algunas realizaciones, el cateterismo de la arteria hepática va seguido de una infusión en el las arterias pancreaticoduodenal, hepática derecha y hepática media, respectivamente, para atacar localmente las lesiones hepáticas. En algunas realizaciones, la distribución localizada a otros sistemas de órganos, incluidos el sistema pulmonar, gastrointestinal, cerebral, reproductor, esplénico u otro órgano definido, del péptido o vector de administración se logra mediante cateterismo u otro sistema de administración localizado. En algunas realizaciones, las infusiones intraarteriales se realizan a través de cualquier otra fuente arterial disponible, incluida, pero sin limitación, la infusión a través de la arteria hepática, arteria cerebral, arteria coronaria, arteria pulmonar, arteria ilíaca, tronco celíaco, arteria gástrica, arteria esplénica, arteria renal, arteria gonadal, arteria subclavia, arteria vertebral, arteria axilar, arteria braquial, arteria radial, arteria cubital, arteria carótida, arteria femoral, arteria mesentérica inferior y/o arteria mesentérica superior. En algunas realizaciones, la infusión intraarterial se logra mediante procedimientos endovasculares, procedimientos percutáneos o abordajes quirúrgicos abiertos.
Formulaciones
Las composiciones farmacéuticas que comprenden un vector terapéutico se pueden formular de cualquier manera convencional mediante la mezcla de una cantidad seleccionada del vector terapéutico con uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Por ejemplo, el vector terapéutico puede suspenderse en un vehículo, tal como PBS (solución salina tamponada con fosfato). Estos compuestos activos se pueden administrar por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, intravenosa, intradérmica, subcutánea o tópica, en forma líquida, semilíquida o sólida y se formulan de manera adecuada para cada vía de administración.
En algunas realizaciones, el vector terapéutico y las sales y solvatos fisiológicamente aceptables se formulan para administración por inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o la nariz) o para administración oral, yugal, parenteral o rectal. En algunas realizaciones, para administración por inhalación, el vector terapéutico se administra en forma de una presentación en aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En algunas realizaciones, una unidad de dosificación de aerosol presurizado o una válvula para administrar una cantidad medida. En algunas realizaciones, se formulan cápsulas y cartuchos (por ejemplo, de gelatina) para su uso en un inhalador o insuflador que contienen una mezcla en polvo de un compuesto terapéutico y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se formulan para administración oral en forma de comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes(por ejemplo,almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); rellenos(por ejemplo,lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes(por ejemplo,estearato magnésico, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o carboximetilalmidón sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato sódico). En algunas realizaciones, los comprimidos se cubren mediante métodos bien conocidos en la materia. En algunas realizaciones, las preparaciones líquidas para administración por vía oral están en forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden se presentan como un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. En algunas realizaciones, dichas preparaciones líquidas se preparan mediante medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión(por ejemplo,jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas hidrogenadas comestibles); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes(por ejemplo,p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). En algunas realizaciones, las preparaciones también contienen sales tamponantes, saborizantes, colorantes y agentes edulcorantes, según corresponda. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se formulan para administración oral para dar una liberación controlada del compuesto activo. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se formulan para vía yugal en forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.
En algunas realizaciones, el vector terapéutico está formulado para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua. En algunas realizaciones, las formulaciones para inyección están en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o recipientes multidosis, con un conservante añadido. En algunas realizaciones, las composiciones se formulan como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos. En algunas realizaciones, las formulaciones comprenden agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, en algunas realizaciones, el principio activo está en forma de polvo liofilizado para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril sin pirógenos, antes de su uso.
En algunas realizaciones, el vector terapéutico se formula como una preparación de depósito. En algunas realizaciones, dichas formulaciones de acción prolongada se administran mediante implante (por ejemplo, subcutáneo o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, en algunas realizaciones, los compuestos terapéuticos se formulan con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como una sal moderadamente soluble.
En algunas realizaciones, los agentes activos están formulados para aplicación local o tópica, tal como para aplicación tópica a la piel y membranas mucosas, tal como en el ojo, en forma de geles, cremas y lociones y para aplicación al ojo o para aplicación intracisternal o intramedular. En algunas realizaciones, dichas soluciones, en particular aquellas pensadas para uso oftálmico, están formulados como soluciones isotónicas al 0,01 %-10 %, pH de aproximadamente 5 a 9, con sales adecuadas. En algunas realizaciones, los compuestos se formulan como aerosoles para aplicación tópica, tal como mediante inhalación.
La concentración de compuesto activo en la composición del fármaco dependerá de las velocidades de absorción, inactivación y excreción del compuesto activo, del programa de dosificación y de la cantidad administrada, así como de otros factores conocidos por los expertos en la materia.
En algunas realizaciones, las composiciones se presentan en un paquete o dispositivo dispensador que comprende una o más formas farmacéuticas unitarias que contienen el ingrediente activo. En algunas realizaciones, el envase puede comprender papel de aluminio de metal o de plástico, tal como un envase de tipo blíster. En algunas realizaciones, el paquete o dispositivo dispensador va acompañado de instrucciones para la administración.
En algunas realizaciones, los agentes activos se envasan como artículos manufacturados que contienen material de embalaje, un agente proporcionado en el presente documento y una etiqueta que indica el trastorno para el cual se proporciona el agente.
Modelos animales
Las partículas del vector retrovírico, descrito anteriormente en el presente documento pueden administrarse a un animalin vivocomo parte de un modelo animal para el estudio de la eficacia de un tratamiento de terapia génica. Las partículas del vector retrovírico se administran en dosis variables a diferentes animales de la misma especie. Después los animales son evaluados para la expresiónin vivodel agente terapéutico o de diagnóstico deseado. A partir de los datos obtenidos de dichas evaluaciones, un experto en la materia determina la cantidad de partículas de vector retrovírico que se van a administrar a un paciente humano.
KITS
También se proporcionan kits o sistemas de administración de fármacos que comprenden las composiciones para su uso en los métodos descritos en el presente documento. Todos los materiales y reactivos esenciales necesarios para la administración de las partículas retrovíricas divulgados en el presente documento pueden ensamblarse en un kit(por ejemplo,construcción celular o estirpe celular de empaquetamiento, vector de expresión de citocinas). Los componentes del kit pueden proporcionarse en una variedad de formulaciones como se describe anteriormente. La una o más partículas retrovíricas terapéuticas pueden formularse con uno o más agentes(por ejemplo,un agente quimioterapéutico) en una única composición farmacéuticamente aceptable o en composiciones farmacéuticamente aceptables separadas.
Los componentes de estos kits o sistemas de administración de fármacos también pueden proporcionarse en formas secas o liofilizadas. Cuando los reactivos o los componentes se proporcionan como una forma en seco, la reconstitución es normalmente mediante la adición de un disolvente adecuado, que también puede proporcionarse en otro medio contenedor.
El medio contenedor de los kits generalmente puede incluir al menos un frasco, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa y/u otro medio contenedor, en donde se puede colocar la al menos una sustancia.
Los kits divulgados en el presente documento también pueden comprender instrucciones con respecto a la información de dosificación y/o administración de la partícula retrovírica. Las instrucciones pueden incluir instrucciones para practicar cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, incluidos los métodos de tratamiento. Las instrucciones pueden incluir además indicaciones de un criterio de valoración clínico satisfactorio o cualquier síntoma adverso que pueda ocurrir, o información adicional requerida por agencias reguladoras, tal como la Administración de Alimentos y Medicamentos para su uso en un sujeto humano.
Las instrucciones pueden estar en "material impreso", por ejemplo, en papel o cartón dentro del kit o adherido a él, o en una etiqueta adherida al kit o al material de embalaje, o adherida a un frasco o tubo que contenga un componente del kit. Las instrucciones también pueden incluirse en un medio legible por ordenador, tal como un disco (disquete o disco duro), CD óptico, tal como CD o DVD-ROM/RAM, cinta magnética, medios de almacenamiento eléctrico, tal como RAM y ROM, punta IC e híbridos de estos, tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos.
En algunas realizaciones, los kits o sistemas de administración de fármacos incluyen un medio para contener los frascos en confinamiento estrecho para la venta comercial, tal como, por ejemplo, recipientes de plástico para inyección o moldeados por soplado en los que se conservan los frascos deseados. Independientemente del número o tipo de recipientes, los kits también pueden comprender, o estar empaquetados con, un instrumento para ayudar con la inyección/administración o colocación de la composición compleja definitiva dentro del cuerpo de un sujeto. Dicho instrumento puede ser un aplicador, inhalador, jeringa, pipeta, pinzas, cucharilla de medición, cuentagotas o cualquier vehículo de administración aprobado médicamente de este tipo.
Los paquetes y kits pueden incluir además una etiqueta que especifique, por ejemplo, una descripción del producto, el modo de administración y/o la indicación del tratamiento. Los paquetes proporcionados en el presente documento pueden incluir cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento. El paquete puede incluir además una etiqueta para tratar una o más enfermedades y/o afecciones.
La expresión "material de envasado" se refiere a una estructura física que alberga los componentes del kit. El material de envasado puede mantener los componentes de forma estéril y puede estar hecho de material comúnmente utilizado para estos fines(por ejemplo,papel, fibra corrugada, vidrio, plástico, papel de aluminio, ampollas,etc.).La etiqueta o el prospecto del paquete pueden incluir instrucciones escritas adecuadas. Los kits, por tanto, pueden incluir adicionalmente etiquetas o instrucciones para usar los componentes del kit en cualquier método descrito en el presente documento. Un kit puede incluir un compuesto en un paquete o dispensador junto con instrucciones para administrar el compuesto en un método descrito en el presente documento.
Ejemplos
Para que los expertos en la materia puedan practicar mejor las composiciones y métodos descritos en el presente documento, se proporcionan los siguientes ejemplos con fines ilustrativos.
Ejemplo 1: Generación de estirpes celulares
En primer lugar, el sobrenadante retrovírico se genera mediante la transfección de un sistema de 3 o 4 plásmidos con reactivo de fosfato cálcico en linfocitos T 293. El sobrenadante se filtra a través de un filtro de 0,45 pm. El sobrenadante filtrado se puede utilizar fresco, almacenarlo hasta 48 horas a 4 °C, o almacenarlo a -80 °C.
Las estirpes celulares se generan mediante el sembrado de 1 x 104 células/pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Al día siguiente, se añade al sobrenadante retrovírico 8 pg/ml de polibreno durante 16 a 24 horas y se selecciona con la dosis adecuada del fármaco de selección (higromicina G418 o puromicina). La dosis del fármaco de selección es la cantidad mínima para provocar la destrucción del 100 % de las células que no presentan HSV-TK al menos 4 días después de la adición del fármaco, para evitar una toxicidad excesiva para las células.
Ejemplo 2: Ensayo de sensibilidad con GCV
Las células que expresan HSV-TK, o un mutante y/o variante de la misma, están sembrados en 1 x 105 en placas de 6 pocillos. Al día siguiente, se añaden 5 diluciones seriadas de 10 veces de GCV con una concentración final que varía de 1 mM a 0,1 |jm. Tres (3) días después del tratamiento con GCV, se añade azul de metileno para teñir las células vivas.
Ejemplo 3: Ensayo de vecindad
Las células se siembran a 1 a 4 x 104 células/pocillo en una placa de 96 pocillos, por triplicado, con mezclas de células TK que van del 0 al 100 %. Al día siguiente, se añade GCV en dosis que varían de 10 jm a 1 mM. Las placas de células en confluencia se dividen 1:30 en 3 placas, 20 a 24 horas después de la adición de GCV. 5 días después, se analizan las células mediante Presto Blue para determinar el metabolismo de las células vivas y se leen en un lector de microplacas. Las placas de células en subconfluencia se analizan 3 días después del tratamiento con GCV mediante Presto Blue.
En un ensayo, los inventores utilizaron estirpes celulares clonales HSV-TK; se compararon estirpes celulares de neomicina-HSV-TK, higromicina-HSV-TK, proteína fluorescente roja (RFP)-HSV-TK y varios mutantes del genHSV-TK.
RexC2 lleva una versión mejorada del gen de la timidina cinasa (TK) del virus delHerpes Simple(HSV). Un hospedador celular que se haya infectado (transducido) de manera eficiente con RxC2 integrará la TK vírica en su genoma y expresará esta enzima. HSV-TK fosforila la base del ADN timidina para su incorporación al ADN recién sintetizado en células en división.
En la siguiente tabla se muestra un plan típico de placas de 96 pocillos para la siembra de células y el tratamiento con GCV (HK=HSV-TK):
Los resultados gráficos de un experimento de ensayo de vecindad se muestran en las figuras 19 y 20.
Se realizaron más de 40 ensayos de vecindad utilizando diferentes mutantes de HSV-TK y poblaciones clonales. Los datos se recopilaron con mediciones de sensibilidad al GCV y de la cinética enzimática y el valor vírico de producción para los mutantes con potencial.
El examen cuidadoso de todos estos parámetros permitió la selección del mutanteHSV-TK168dmNEScomo el genTKen Reximmune C-2.
Ejemplo 4: Cuantificación de la forma de corte y empalme de ARN de TK mediante PCR en tiempo realLa forma no empalmada y truncada de HSV-TK se subclona en un vector pCR2.1 TOPO (Invitrogen). Se configuran dos PCR cuantitativas en tiempo real con dos conjuntos diferentes de cebadores y sondas capaces de amplificar y detectar de manera selectiva la forma empalmada y sin empalmar de HSV-TK, usando el sistema de detección de secuencias TaqMan®/ABI PRISM 7700. Para la forma HSV-TK sin empalmar, los cebadores y la sonda se diseñan en la región empalmada del genHSV-tk.
La PCR en tiempo real para la forma no empalmada se realiza en una mezcla de reacción de 25 |jl que contiene de 100 a 500 ng de ADN genómico o 10 j l de ADNc, una mezcla maestra de PCR 1X TaqMan® Universal, 300 nM de cada uno de los dos cebadores TKwtfor (5'-CGG CGG TGG TAA TGA CAA G-3') y Tkwtrev (5'-GCG TCG GTC ACG GCA TA-3') y 200 nM de la sonda TKwt MGB (5'-FAM CCA GAT AAC AAT GGG C-3').
Una sonda Taqman® que abarca la unión de corte y empalme se diseña para detectar de manera selectiva la forma empalmada de HSV-TK. La PCR cuantitativa en tiempo real específica para la forma empalmada (truncada) de TK se realizó en una mezcla de reacción de 25 j l que contenía de 100 a 500 ng de ADN genómico o 10 j l de ADNc, una mezcla maestra 1X (PE Applied Biosystems) 300 nM de cada uno de los dos cebadores. Las condiciones del ciclo térmico son las siguientes: activación inicial de UNG a 50 °C durante 2 min, seguido de la activación de Taq Gold y la inactivación de UNG a 95 °C durante 15 min. Después, se realizan 40 ciclos de amplificación a 95 °C durante 15 s y a 60 °C durante 1 min. Ambas PCR se realizan en paralelo en placas de reacción ópticas de 96 pocillos MicroAmp® (Applied Biosystems) utilizando los sistemas de detección de secuencias ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). La fluorescencia inicial media se calculó a partir de los ciclos de PCR 3 a 15, y Ct se definió como el ciclo de PCR en el que la intensidad de fluorescencia normalizada del colorante indicador era igual a 0,05. En cada ensayo TaqMan® se generan dos curvas patrón con números de copias conocidos (de 10<6> a 4 copias/reacción) mediante el trazado de los valores de Ct frente al logaritmo de la entrada inicial de la cantidad de ADN. Las diluciones convencionales y las muestras de ADNc se analizan por duplicado y triplicado, respectivamente.
Ejemplo 5: Ensayo clínico
Se llevó a cabo un ensayo de aumento escalonado de la dosis para evaluar la seguridad, farmacocinética y farmacodinamia de Reximmune-C2 (genes de la timidina cinasa y GM-CSF) en sujetos resistente al tratamiento con carcinoma hepatocelular primario o tumores metastásicos en el hígado.
Antecedentes y fundamento
Reximmune-C2 se compone de una plataforma de administración genética que contiene una carga útil interna que codifica proteínas terapéuticas de interés. La plataforma de administración genética se ha dosificado en más de 280 sujetos en todo el mundo; aproximadamente 270 sujetos fueron tratados con el vector que contenía dnG1 como carga útil (Rexin-G) y 16 sujetos con timidina cinasa (vTK) y el estimulador inmunitario factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) como carga útil (Reximmune-C). La plataforma de administración genética es un vector vírico Moloney de ratón (MoMLV) no recombinante muy genomanipulado. Anteriormente, se realizó un ensayo de fase 1 de aumento escalonado de la dosis para investigar la combinación de Rexin-G y Reximmune-C en sujetos con tumores sólidos primarios o metastásicos resistentes al tratamiento (ensayo Genevieve). Este ensayo clínico de fase I propuesto (titulado Ensayo Genevieve 2) es una extensión de un ensayo realizado que investiga Reximmune-C2 solo, sin Rexin-G, utilizando una forma mejorada de timidina cinasa en una combinación de timidina cinasa más GM-CSF.
En el ensayo original de Genevieve, se reclutaron dieciséis sujetos en 3 niveles de dosis, siendo la exposición media en el grupo de dosis más alta 8,0 * 1010 ufc (n.° de pts = 7) y la duración más larga 6 ciclos (intervalo de ciclos de 3 a 6). Para la parte A del estudio, el tratamiento consistió en una dosis segura y eficaz (óptima) previamente determinada de Rexin-G y dosis crecientes de Reximmune-C. Específicamente, Rexin-G, 2 * 1011 ufc, los días 1, 3, 5, 8, 10 y 12, Reximmune-C, 1,0, 2,0 o 3,0 * 1010 ufc el día 3 (niveles de dosis I, II, III respectivamente) y valaciclovir a 1 mg por vía oral tres veces al día los días 6 al 19, como un ciclo. Para la parte B del estudio, los sujetos que no tuvieron toxicidad 0 en quienes la toxicidad se había resuelto al grado 1 o menos podrían recibir ciclos adicionales de tratamiento hasta un total de 6 ciclos de tratamiento.
No hubo toxicidades limitantes de la dosis en ningún nivel de dosis. Se informaron acontecimientos adversos no relacionados para los 16 sujetos del estudio, pero el número de acontecimientos fue bajo (en la mayoría de los casos, 1 o 2 sucesos por término preferido) y la mayoría fueron de grado 1 o 2. Se produjeron acontecimientos adversos no graves relacionados en 2 sujetos y ambos fueron de grado 2. Cuatro sujetos experimentaron acontecimientos adversos graves, todos los cuales se consideraron no relacionados con el fármaco del estudio.
El motivo para continuar con este ensayo de fase 1 es que: (1) la propia timidina cinasa podría resultar un agente antineoplásico eficaz, en particular en sujetos cuyos tumores demuestran un efecto de vecindad; (2) la administración de la plataforma de administración genética hasta la fecha a un grupo internacional de sujetos ha demostrado un grado muy elevado de seguridad; y (3) la biodistribución en animales sugiere una biodistribución elevada al hígado. Por otra parte, la adición de GM-CSF podría contribuir a un efecto inmunológico y a una mayor destrucción de células tumorales a través de antígenos asociados al tumor mediante el reclutamiento de las células inmunitarias adecuadas.
La biodistribución de las partículas víricas es mayor en el hígado, seguido por el bazo, y luego el pulmón; esta es la razón para centrarse inicialmente en los tumores hepatocelulares, donde la intensidad de la dosis debería ser la más elevada. También existe una gran necesidad clínica insatisfecha de agentes antineoplásicos eficaces para estos cánceres.
Cabe señalar que, como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/uno", "una", y "el/la" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a una "proteína" es una referencia a una o más proteínas e incluye equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, y así sucesivamente.
A menos que se definan de otra manera, todas las expresiones/términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento, tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Se describen métodos específicos, dispositivos y materiales, aunque puede usarse cualquier método y material similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o el ensayo de la presente invención.
De manera adicional, se proporcionan el significado de determinados términos y expresiones empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 6: Ensayo clínico para aplicaciones de tratamiento génico.
Este ensayo clínico se divide en dos fases: La fase IA en la que Reximmune-C2 se administró como una dosis intravenosa única en tres de cinco días. La dosificación de valganciclovir (la forma oral de ganciclovir) se inicia el día 8 durante 5 días, independientemente de los resultados de la exploración por TEP. Le sigue un descanso farmacológico de aproximadamente una semana. Cada ciclo tendrá una duración de tres semanas.
Habrá tres pacientes en la primera cohorte y en las siguientes hasta que un paciente experimente toxicidad limitante de la dosis (TLD) o dos casos de toxicidad de grado 2 del NCI-CTC atribuidas al fármaco del estudio (excepto náuseas/vómitos, cansancio, anorexia, alopecia o anemia). Si no hay TLD, los pacientes pasarán al siguiente nivel de dosis. Si hay una TLD, la cohorte se ampliará a 6 pacientes y no se excederá el nivel de dosis si 2 o más pacientes presentan TLD.
Una vez alcanzada la dosis máxima administrada (DMA), se seguirá un programa de Fibonacci modificado comenzando con la dosis de cohorte que no tenía TLD y continuando hasta que se observen toxicidades limitantes de la dosis en dos pacientes a un nivel de dosis. Una vez definida la dosis recomendada de la fase 2 (DRF2), se reclutarán de 6 a 12 pacientes.
La fase IB está diseñada para explorar la actividad de Reximmune-C2 en pacientes con un tipo de tumor y estadio definido según los datos de la fase IA y que son positivos en la exploración con [18F]FHBG entre el tercer y el sexto día después de una dosis (DRF2) de Reximmune-C2. Si la exploración es positiva, el paciente es aceptado en la fase de tratamiento de la fase IB del protocolo y la DRF2 se administra en tres dosis en 5 días, seguido de 5 días de valganciclovir comenzando el día 8 de esa fase, seguido de una semana de descanso farmacológico. Cada ciclo tiene una duración de tres semanas. Los pacientes que tienen un resultado negativo en la exploración de TEP con [18F]FHBG después de una dosis única de Reximmune-C2 recibirán 5 días de valganciclovir y no continuarán en el estudio.
La TLD del paciente se definirá como la aparición de cualquiera de los siguientes acontecimientos atribuidos a Reximmune-C2 y que ocurren durante el primer ciclo (3 semanas) de administración del fármaco:
Neutrocitopenia de grado 4 (es decir, recuento absoluto de neutrófilos (RAN) <500 células/mm3) durante 7 o más días consecutivos o neutrocitopenia febril (es decir, fiebre >38,5 °C con un RAN <1000 células/mm3); Trombocitopenia de grado 4 (<25.000 células/mm3 o episodio hemorrágico que requiera transfusión de plaquetas); Náuseas y/o vómitos de grado 3 o superior a pesar del uso de intervención médica y/o profilaxis adecuada/máxima; Cualquier toxicidad no hematológica de grado 3 o superior (excepto reacción en el lugar de la inyección de grado 3, alopecia, cansancio); Retraso del retratamiento de más de 3 semanas debido a un retraso en la recuperación de una toxicidad relacionada con el tratamiento con Reximmune-C2; y reacción de hipersensibilidad de grado 3 o superior a pesar del uso adecuado de premedicación (según los Criterios Comunes de Toxicidad definidos como "broncoespasmo sintomático, que requieran medicamentos parenterales, con o sin urticaria; edema-angioedema relacionado con la alergia").
Reximmune-C2 se infunde por vía intravenosa durante 15 a 60 minutos (dependiendo de la dosis) mediante una bomba de infusión. Reximmune-C2 se proporciona en frascos de 30 ml almacenados a -80 °C ± 10 °C.
En este ensayo de fase I, se investigarán la seguridad, la farmacocinética y la farmacodinamia de dosis crecientes de Reximmune-C2. Se identificará la dosis máxima tolerada y se definirá una dosis recomendada de fase 2 para Reximmune C2. Se describirá cualquier actividad antitumoral y respuestas clínicas al tratamiento con Reximmune-C2.
La dosis inicial en este ensayo se basa en: experiencia de seguridad clínica humana con los productos farmacéuticos de plataforma vectorial relacionados Rexin-G y Reximmune-C y los resultados del estudio de toxicología GLP en ratas de 21 días para Reximmune-C2.
Objetivos
El objetivo principal del estudio es determinar la dosis máxima tolerada (DMT), la toxicidad limitante de la dosis (TLD), la seguridad y una dosis recomendada de fase 2 (DRF2) de Reximmune-C2 administrado durante un ciclo de tres semanas que consiste en una serie de tres dosis administradas por vía intravenosa dentro de los cinco días de la semana 1, seguido de 5 dosis diarias de valganciclovir en la semana 2 en pacientes inscritos en este estudio a quienes se les ha diagnosticado tumores primarios avanzados o metastásicos en el hígado.
Los objetivos secundarios incluyen: (i) evaluación de la farmacocinética plasmática de Reximmune-C2; (ii) evaluación del sustituto de la expresión de la proteína HSV-TK-m2 a partir de Reximmune-C2 mediante imágenes seriadas de TEP con [18F]FHBG y/o SPECT; (iii) descripción y evaluación de cualquier evidencia preliminar de actividad antitumoral de Reximmune-C2; y (iv) proporcionar pruebas de investigación clínica para detectar anticuerpos contra el retrovector gp70 env, retrovirus con capacidad de replicación en linfocitos de sangre periférica (LSP); integración del vector en el ADN genómico de LSP y proteína hGM-CSF circulante.
Métodos
Diseño del estudio: Ensayo clínico sin enmascaramiento, en tres centros, con grupos en paralelo y con aumento escalonado de la dosis.
Estratificación: Ninguna.
Tratamiento: Reximmune-C2 se administrará mediante infusión intravenosa para separar a los pacientes. En la fase IA, que investiga Reximmune-C2, la dosis se aumentará de forma escalonada entre cohortes de pacientes hasta que se observe TLD. En la DRF2, se reclutarán pacientes adicionales. En la fase IB, los pacientes serán evaluados previamente mediante TEP con [18F]FHBG para la expresión de HSV-TK-m2. Aquellos que expresen HSV-TK-m2 recibirán dosis adicionales de Reximmune-C2. Los pacientes no serán premedicados a menos que se produzcan reacciones de hipersensibilidad.
Métodos estadísticos: Se utilizarán estadísticas descriptivas para el análisis estadístico.
Determinación del tamaño de la muestra: No se puede definir un tamaño de muestra preciso, ya que depende de la toxicidad observada. Para cada programa, se tratarán cohortes de tres a seis sujetos en cada nivel de dosis hasta que se defina la DMT. Una vez identificada la DMT, este nivel de dosis se ampliará a un máximo de 12 pacientes que se tratarán para definir mejor la tolerabilidad y farmacocinética de la dosis y el programa. Se espera que se inscriban entre 45 y 70 sujetos, con 33 a 46 en la parte IA.
Criterios de inscripción
Los sujetos deben cumplir todos los siguientes criterios de inclusión para ser elegibles para la aleatorización en el estudio:
1. Diagnóstico de tumores sólidos primarios o metastásicos en adultos en estadio avanzado histológicamente documentados en el hígado que son resistentes al tratamiento convencional o para los cuales no existe un tratamiento convencional curativo.
2. Evidencia de enfermedad medible o evaluable de manera radiográfica.
3. Todos los efectos tóxicos agudos de cualquier radioterapia, quimioterapia o procedimientos quirúrgicos previos deben haberse resuelto a frado <1 según los Criterios de toxicidad comunes (CTC) del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) (Versión 4.0).
4. La edad debe ser >18 años.
5. La última dosis del tratamiento antineoplásico, excepto tratamiento hormonal, debe ser hace >21 días. La radioterapia de haz externo debe haber consistido en <25 % de esqueleto que contenga médula ósea.
6. Los pacientes pueden ser positivos para la hepatitis B y C. (Los pacientes pueden continuar con sus medicamentos antivíricos).
7. Los pacientes pueden tener metástasis intracraneales de cualquier número si han recibido irradicaión cerebral y están estables durante 6 semanas. Los pacientes pueden estar tomando medicamentos anticonvulsivos, pero no deben tomar esteroides.
8. El estado funcional de Karnofsky debe ser >70.
9. Esperanza de vida de al menos 3 meses.
10. Los pacientes deben poder viajar al St. Luke's Medical Center para realizarse las exploraciones de TEP.
11. Los datos de laboratorio de referencia necesarios incluyen:
12. Firmar el consentimiento informado indicando que conoce el carácter neoplásico de su enfermedad y ha sido informado de los procedimientos a seguir, la naturaleza experimental del tratamiento, alternativas, posibles beneficios, efectos secundarios, riesgos y malestares.
13. Dispuesto y capaz de cumplir con las visitas programadas, el plan de tratamiento y las pruebas de laboratorio.
La presencia de cualquiera de los siguientes criterios excluirá a un sujeto de la inscripción en el estudio
1. Tratamiento simultáneo con cualquier tratamiento contra el cáncer, incluido cualquier otro agente en investigación.
2. Edema intracraneal conocido o ACV dentro de las 6 semanas anteriores a la detección.
3. Mujeres embarazadas o lactantes. Las mujeres deben aceptar utilizar métodos anticonceptivos eficaces, ser quirúrgicamente estériles o ser posmenopáusicas. Los sujetos masculinos deben aceptar utilizar un método anticonceptivo eficaz o ser quirúrgicamente estériles. La definición de anticoncepción eficaz se basará en el criterio del investigador o de un asociado designado. Todas las mujeres en riesgo deben tener una prueba de embarazo negativa dentro de los 7 días anteriores al inicio del tratamiento del estudio.
4. Enfermedad cardíaca clínicamente significativa (New York Heart Association, clase III o IV).
5. Demencia o alteración del estado mental que prohibiría el consentimiento informado.
6. Otra afección médica o psiquiátrica grave, aguda o crónica o anomalía de laboratorio que pueda aumentar el riesgo asociado con la participación en el estudio o la administración del fármaco del estudio o pueda interferir con la interpretación de los resultados del estudio y, a juicio del investigador principal, haría que el sujeto fuera inadecuado para este estudio.
7. Efectos secundarios conocidos de los antivíricos de la clase ganciclovir.
8. Pacientes que se sabe que son VIH positivos.
9. El paciente no debe estar tomando esteroides en el momento de la evaluación.
Justificación de la dosis inicial y el programa
Reximmune-C se ha dosificado en 16 pacientes en un intervalo de 1,0, 2,0 o 3,0 * 1010 ufc (niveles de dosis I, II y III respectivamente el día 3 del ciclo). No hubo toxicidades limitantes de la dosis en ningún nivel de dosis. Se informaron acontecimientos adversos no relacionados en los 16 pacientes del estudio, pero el número de acontecimientos fue bajo (en la mayoría de los casos, 1 o 2 sucesos por término preferido) y la mayoría fueron de grado 1 o 2. Se produjeron acontecimientos adversos no graves relacionados en 2 pacientes y ambos fueron de grado 2. Cuatro pacientes experimentaron acontecimientos adversos graves, todos los cuales se consideraron no relacionados con el fármaco del estudio. El ensayo se cerró antes de determinar la dosis óptima y el programa de Reximmune-C. En este ensayo, el nuevo ensayo Genevieve-2, la dosificación inicial se basará en la toxicología de 21 días y en el estudio HSV-TK-m1. La dosificación futura se realizará utilizando partículas virales totales (PVT)/ml, que es una medida más precisa del valor que las ufc por ml.
El programa se basa en el fundamento de que la exposición a Reximmune-C2 no transducirá todas las células tumorales. Por tanto, los pacientes recibirán dosis tres veces en un ciclo durante un período de 5 días.
Se estima que el tiempo entre la exposición a GDS y la expresión de HSV-TK-m2 (y hGM-CSF) es de 48 a 72 horas. Por tanto, 72 horas después de la tercera dosis de Reximmune-C2, se iniciará valganciclovir. La dosis (que se ajustará según la función renal) se administrará a los niveles de dosis antivíricos convencionales. Debido a la posible toxicidad de valganciclovir y a las observaciones publicadas de que 5 días de ganciclovir deberían ser suficientes para destruir la mayoría de las células que contienen HSV-TK-m2, se eligieron 5 días de tratamiento. Debido a la posible toxicidad tanto de Reximmune-C2 como de valganciclovir, a esto le seguirán aproximadamente 9 días de descanso farmacológico. El hGM-CSF puede estar en concentraciones suficientes en el momento de la adición de valganciclovir para influir en la presentación de cualquier antígeno asociado a tumores (AAT) que pueda aparecer durante la apoptosis de las células tumorales.
Se tomarán muestras de plasma después de la primera y tercera dosis del ciclo uno y después de la primera dosis del ciclo dos para farmacocinética.
Como la distribución es principalmente al hígado, las toxicidades se controlarán cuidadosamente allí y, debido a sus implicaciones, en la médula ósea.
Este protocolo clínico exige la administración de Reximmune-C2 mediante infusión intravenosa a pacientes con neoplasias malignas avanzadas, ya sean hepatocelulares primarias o tumores metastásicos en el hígado. Habrá dos partes: fase IA (aumento escalonado de la dosis 3 dosis/semana cada tres semanas) y fase IB (selección previa después de una dosis de Reximmune-C2 y una exploración con [18F]FHBG). Si la exploración de PET es positiva, el paciente continuará en el estudio. Si la exploración de PET es negativa, el paciente recibirá 5 días de valganciclovir y no continuará en el ensayo. Para la fase IA, el aumento escalonado de la dosis seguirá un diseño de valoración acelerada, mediante la incorporación de tres pacientes por nivel de dosis hasta que se observa un caso de TLD o dos casos de toxicidades de grado 2 del NCI-CTC atribuidas al fármaco del estudio (excepto náuseas/vómitos, cansancio, anorexia, alopecia o anemia). En lo sucesivo, la dosificación en el protocolo clínico seguirá un programa de Fibonacci modificado hasta que se logren toxicidades limitantes de la dosis.
Diseño del ensayo
Este es un ensayo de fase 1, sin enmascaramiento, en cuatro centros, con aumento escalonado de la dosis. La dosis se aumentará hasta que se observe TLD y se defina la DMT.
Reximmune-C2 se administrará mediante infusión i.v. durante 15 a 60 minutos. Se prevé que se tratarán entre 33 y 70 pacientes durante el transcurso del estudio.
Para la fase IA, la dosis de Reximmune-C2 aumentará de forma escalonada desde 6,0 * 1011 PVT. En la fase de aumento escalonado de la dosis acelerada, se inscribirán cohortes de tres pacientes en cada nivel de dosis. El incremento de aumento escalonado de la dosis será del 100 % hasta que se observe TLD o dos toxicidades de grado 2 o mayores de CTC. Cuando finalice el aumento escalonado de la dosis acelerado, el aumento escalonado de la dosis para un nuevo paciente en el aumento escalonado de la dosis convencional seguirá un esquema de Fibonacci modificado (es decir, incrementos de la dosis del 67 %, el 50 %, el 40 %, el 33 % y el 25 %). Se inscribirá un mínimo de tres pacientes por nivel de dosis. Para la fase IB, la dosis de Reximmune-C2 será la DRF2. Se evaluará la TLD. Si se observa una TLD en >2 de seis pacientes a un nivel de dosis, no habrá más aumentos de dosis; este nivel de dosis definirá la dosis máxima administrada (DMS).
La dosis justo por debajo de la DMA se considerará DMT. Una vez definida la DMT, este nivel de dosis se puede ampliar a un máximo de doce pacientes para caracterizar mejor los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos y la idoneidad como dosis recomendada para los estudios clínicos de fase 2.
Tratamiento de los pacientes
Sólo personal calificado que esté familiarizado con los procedimientos que minimicen la exposición indebida de sí mismo y del medio ambiente debe realizar la preparación, manipulación y eliminación segura de agentes bioterapéuticos en un entorno adecuado.
Reximmune C2 es una partícula retrovectorial incompetente para la replicación murina de Moloney que contiene los genes que codifican HSV-TK-m2 y hGM-CSF. El medicamento contiene DMEM (glucosa baja), partículas retrovectoriales RD, L-glutamina, piruvato de sodio, seroalbúmina humana, ácido n-butírico, Pulmozyme®, magnesio y otros excipientes.
El medicamento está disponible en un tamaño de frasco: frascos de vidrio transparente de tipo 1 de 30 ml con acabado de 20 mm (que contienen 25 ml de >1,0 * 1010 PVT). Los frascos se cierran con tapones de suero recubiertos de teflón de 20 mm y tapas abatibles lacadas de 20 mm.
Reximmune-C2 se administrará por vía intravenosa mediante una bomba de infusión durante 15 minutos hasta un volumen de 100 ml, de >100 ml a 200 ml en 30 minutos, de >200 ml a 300 ml en 45 minutos, y de >300 ml a 400 ml en 60 minutos. Se administrarán volúmenes superiores a 400 ml a un ritmo determinado por el investigador y el monitor médico de Gleneagles. Una vez que se ha identificado la DMT para el programa, el momento de la administración puede cambiarse, si está indicado (y según lo acordado entre el investigador y el monitor médico de Gleneagles).
Valganciclovir se administra por vía oral y debe tomarse con las comidas. Se deben controlar cuidadosamente los niveles de creatinina en suero o de aclaramiento de creatinina. Es necesario ajustar la dosis según el aclaramiento de creatinina, como se muestra en la siguiente tabla. La dosificación de valganciclovir puede comenzar del día 7 al 9 del ciclo, pero debe administrarse durante 5 días consecutivos.
El aclaramiento de creatinina se puede calcular a partir de la creatinina en suero mediante la siguiente fórmula:
Para hombres = {(140 - edad [años]) * (peso corporal [kg])}/{(72) * (0,011 * creatinina en suero [micromol/l])}
Para mujeres = 0,85 * valor masculino.
T l I. D ifi i n v l n i l vir r i n n in fi i n i r n l
El propósito del estudio de fase 1 es establecer la DMT, la TLD, la seguridad y una DRF2 del agente en investigación. Por tanto, los efectos tóxicos son el criterio de valoración principal del estudio y se evaluarán continuamente. Se obtendrá información de respuesta si los pacientes tienen una enfermedad que pueda medirse y reevaluarse fácilmente. Estas evaluaciones se realizarán con cada ciclo. Asimismo, se debe observar una respuesta entre dos exámenes con al menos 6 semanas de diferencia para que se documente como una respuesta confirmada al tratamiento.
• Evaluable por toxicidad. - Todos los pacientes serán evaluables por toxicidad si reciben algún fármaco del estudio.
• Evaluable para respuesta - Todos los pacientes que hayan recibido al menos un único ciclo de tratamiento y se les haya realizado una reevaluación del tumor se considerarán evaluables para respuesta. De manera adicional, aquellos pacientes que desarrollen una enfermedad progresiva temprana también se considerarán evaluables para respuesta. Se evaluará la respuesta de los pacientes que estén en tratamiento durante al menos dos ciclos de tratamiento.
La determinación de la eficacia antitumoral se basará en evaluaciones objetivas del tumor realizadas de acuerdo con el sistema de evaluación de Criterios de respuesta inmunitaria (irRC, del inglésImmune-Related Response Criteria)y las decisiones de tratamiento por parte del investigador se basarán en estas evaluaciones.
Dada la presencia del transgén del GM-CSF en Reximmune-C2 y la posibilidad de que una respuesta inmunitaria contribuya al efecto tumoral, los criterios de respuesta inmunitaria se utilizarán para la respuesta clínica. Las razones para utilizar los criterios de respuesta inmunitaria frente a RECIST 1.1 son las siguientes: (1) la aparición de una actividad antitumoral medible puede tardar más en las inmunoterapias que en los tratamientos citotóxicos; (2) las respuestas a la inmunoterapia ocurren después de la EP convencional; (3) la interrupción de la inmunoterapia puede no ser adecuada en algunos casos, a menos que se confirme la EP (como se hace habitualmente para la respuesta); (4) se recomienda tener en cuenta la EP "clínicamente insuficiente" (por ejemplo, pequeñas lesiones nuevas en presencia de otras lesiones que responden); y (5) la ES duradera puede representar actividad antitumoral.
Las comparaciones entre RECIST 1.1 y los criterios de respuesta relacionada con el sistema inmunitario se enumeran a continuación:
Tabla II. Comparación de los criterios RECIST de la OMS y de respuesta inmunitaria
OMS irRC
Nuevas lesiones Representa siempre a EP Incorporadas a la carga tumoral medibles (es decir,
> 5 * 5 mm)
Lesiones nuevas no Representa siempre a EP No definen la progresión (pero excluyen medibles (es decir la RCir)
< 5 * 5 mm)
Lesiones no indexadas Los cambios contribuyen a definir la MRG Contribuye a la definición de RCir (se de RC, RP, ES y EP requiere desaparición completa)
RC Desaparición de todas las lesiones en dos Desaparición de todas las lesiones en observaciones consecutivas con no menos dos observaciones consecutivas con no de 4 semanas de diferencia menos de 4 semanas de diferencia (continuación)
OMS irRC
RP >50%de disminución en la SPD de todas >50 % de disminución en la carga
las lesiones índice en comparación con el tumoral en comparación con el valor valor inicial en dos observaciones con al inicial en dos observaciones con al menos 4 semanas de diferencia, en menos 4 semanas de diferencia ausencia de nuevas lesiones o progresión
inequívoca de lesiones no indexadas
ES No se puede establecer una disminución No se puede establecer una disminución del 50 % en la SPD en comparación con el del 50 % en la carga tumoral en valor inicial ni un aumento del 25 % comparación con el valor inicial ni un aumento del 25 %
en comparación con la mínima, en en comparación con la mínima ausencia de nuevas lesiones o progresión
inequívoca de lesiones no indexadas
EP Aumento de al menos un 25 % en la SPD Aumento de al menos un 25 % en la en comparación con la mínima y/o carga tumoral en comparación con la progresión inequívoca de lesiones no mínima (en cualquier momento único) en indexadas y/o aparición de nuevas lesiones dos observaciones consecutivas con al (cualquier punto temporal) menos 4 semanas de diferencia
Momento y tipo de evaluaciones
Todas las evaluaciones tumorales basadas en imágenes de referencia deben realizarse dentro de los 14 días anteriores al inicio del tratamiento. Para los fines del estudio, las evaluaciones de tumores de todos los pacientes deben reevaluarse a partir de 9 semanas después del inicio del tratamiento y cada 6 semanas a partir de entonces (por ejemplo, semana 9, semana 15, semana 21, etc.) tanto para la fase IA como para la fase IB. Se debe confirmar la respuesta de todos los pacientes con tumores que responden (RCri o RPri) al menos 6 semanas después de la primera documentación de respuesta. En todos los pacientes con progresión tumoral se debe confirmar la progresión al menos 6 semanas después de la primera documentación de progresión.
Se debe utilizar el mismo método de evaluación y la misma técnica para caracterizar cada lesión identificada y notificada al inicio del estudio y durante el seguimiento. Se prefiere la evaluación basada en imágenes a la evaluación mediante examen clínico cuando se han utilizado ambos métodos para evaluar el efecto antitumoral del tratamiento. Todas las medidas deben registrarse en notación métrica.
La TC y la TC/TEP son los métodos para la evaluación de tumores. La TC convencional debe realizarse con cortes de 10 mm o menos de espesor de corte contiguos. La TC en espiral debe realizarse utilizando un algoritmo de reconstrucción contigua de 5 mm. Esto se aplica al pecho, abdomen y pelvis.
La TC de tórax se utilizará para evaluar las lesiones pulmonares.
Las lesiones clínicas sólo se considerarán medibles cuando sean superficiales (por ejemplo, nódulos cutáneos, ganglios linfáticos palpables). En el caso de lesiones cutáneas, se recomienda la documentación por fotografía en color, que incluye una regla para estimar el tamaño de la lesión.
Las exploraciones de TEP-TC con [18F]FHBG se obtendrán después de que el paciente reciba las primeras tres dosis de Reximmune-C2 (ciclo 1) en la fase IA y después de la dosis de detección de Reximmune-C2 en la fase IB. En la fase IA se pueden obtener exploraciones de TEP-TC adicionales con [18F]FHBG en ciclos posteriores a criterio del investigador y con la aprobación del monitor médico.
El ultrasonido no debe utilizarse para medir lesiones tumorales que clínicamente no sean fácilmente accesibles para una evaluación de respuesta objetiva, por ejemplo, lesiones viscerales. Es una posible alternativa a las mediciones clínicas de los ganglios palpables superficiales, lesiones s.c. y nódulos tiroideos. La ecografía también podría ser útil para confirmar la desaparición completa de las lesiones superficiales que habitualmente se valoran mediante el examen clínico.
La endoscopia, la laparoscopia y la gammagrafía con radionúclidos no deben utilizarse para evaluar la respuesta.
Todos los archivos de los pacientes y las imágenes radiológicas deben estar disponibles para la verificación de la fuente y pueden enviarse para una revisión externa para la evaluación final de la actividad antitumoral.
Medición de las lesiones tumorales
En el inicio, el investigador clasificará las lesiones tumorales como medibles o no medibles según los criterios que se describen a continuación:
• Medible: Lesiones que se pueden medir con precisión en al menos una dimensión (el diámetro más largo que se registrará) como >20 mm con técnicas convencionales o como >10 mm con tomografía computarizada en espiral. Las lesiones clínicas sólo se considerarán medibles cuando sean superficiales (por ejemplo, nódulos cutáneos, ganglios linfáticos palpables).
• No medibles: Todas las demás lesiones, incluidas lesiones pequeñas (diámetro mayor <20 mm con técnicas convencionales o <10 mm con tomografía computarizada en espiral) y lesiones óseas, enfermedad leptomeníngea, ascitis, derrames pleural o pericárdico, linfangitis de la piel o del pulmón, masas abdominales no confirmadas y seguidas por técnicas de imagen, lesiones quísticas, lesiones previamente irradiadas y enfermedad documentada únicamente mediante evidencia indirecta (por ejemplo, mediante pruebas de laboratorio tal como la fosfatasa alcalina).
NOTA:Citología e histología: Si la enfermedad medible se restringe a una lesión solitaria, su naturaleza neoplásica debe confirmarse mediante citología/histología.
La respuesta al tratamiento también puede evaluarse mediante una revisión independiente, central, radiológica y con enmascaramiento.
Registro de mediciones tumorales
Todas las lesiones medibles hasta un máximo de 10 lesiones, representativas de todos los órganos implicados, deben identificarse como lesiones diana y medirse y registrarse al inicio y en los intervalos estipulados durante el tratamiento. Las lesiones diana deben seleccionarse en función de su tamaño (lesión con el diámetro más largo) y de su idoneidad con respecto a mediciones repetidas exactas (ya sea mediante técnicas de obtención de imágenes o clínicamente). Se registrará el diámetro más largo para cada lesión diana. Se calculará la suma del diámetro más largo de todas las lesiones diana y se registrará como el valor inicial. La suma de los diámetros más largos se utilizará como referencia para caracterizar mejor la respuesta tumoral objetiva de la dimensión medible de la enfermedad durante el tratamiento. Todas las medidas deben registrarse en notación métrica en centímetros.
Las restantes lesiones (o sitios de enfermedad) deben identificarse como lesiones no diana y también deben registrarse al inicio del estudio. No requieren mediciones y estas lesiones deben seguirse como "presentes" o "ausentes".
Definiciones de respuesta tumoral
Se seguirán los criterios de los criterios de respuesta relacionados con el sistema inmunitario para evaluar la respuesta tumoral.
Determinación de la respuesta general mediante criterios de respuesta relacionados con el sistema inmunitario Lesiones diana para tumores sólidos
• La respuesta completa (RCri) se define como la desaparición de todas las lesiones (sean medibles o no, y la ausencia de lesiones nuevas); confirmación mediante evaluación repetida y consecutiva no menos de 6 semanas a partir de la fecha documentada por primera vez.
• La respuesta parcial (RPri) se define como una disminución >50 % en la carga tumoral en relación con el valor inicial confirmado mediante una evaluación consecutiva al menos 6 semanas después de la primera documentación.
• La enfermedad progresiva (EPri) se define como un aumento >25 % en la carga tumoral en relación con la mínima (carga tumoral mínima registrada) confirmada mediante una evaluación repetida y consecutiva no menos de 6 semanas desde la fecha de las primeras lesiones documentadas registradas desde el inicio del tratamiento, o la aparición de una o más lesiones nuevas.
• Enfermedad estable (ESri) se define como no cumplir con los criterios de RCri o RPri, en ausencia de EPri. Lesiones no diana para tumores sólidos
La confirmación citológica del origen neoplásico de cualquier derrame que aparece o empeora durante el tratamiento cuando el tumor medible ha cumplido criterios de respuesta o ESri es obligatoria para diferenciar entre respuesta o ESri y EPri.
Confirmación de la respuesta tumoral
Para que se le asigne un estado de RPri o RCri, los cambios en las mediciones tumorales en pacientes con tumores que responden deben confirmarse mediante estudios repetidos que deben realizarse >6 semanas después de que se cumplan por primera vez los criterios de respuesta. En el caso de ESri, las mediciones de seguimiento deben haber cumplido los criterios ESri al menos una vez después del ingreso al estudio en un intervalo mínimo de 6 semanas. Cuando están presentes lesiones tanto diana como no diana, las evaluaciones individuales se registrarán por separado. La evaluación general de la respuesta incluirá todos los parámetros como se muestra en la tabla III.
La mejor respuesta general es la mejor respuesta registrada desde el inicio del tratamiento hasta la progresión/recidiva de la enfermedad (tomando como referencia para la progresión del tumor las mediciones más pequeñas registradas desde el inicio del tratamiento). La asignación de mejor respuesta del paciente dependerá del logro de los criterios de medición y confirmación.
Los pacientes se definirán como no evaluables (NE) para la respuesta si no hay una evaluación oncológica posterior a la aleatorización. Estos pacientes se contarán como fracasos en el análisis de los datos de respuesta tumoral.
Evaluación de la eficacia clínica: Estado de rendimiento.
Los pacientes serán calificados de acuerdo con la escala de estado de rendimiento de Karnofsky.
Respuesta del marcador tumoral
Método de evaluación
Si bien no es una medida de eficacia completamente validada en muchas neoplasias malignas, las determinaciones en serie de marcadores tumorales pueden permitir la evaluación de una herramienta clínica cuantitativa, barata y fácil de realizar como posible medio adicional para seguir el curso de la enfermedad durante el tratamiento.
Una disminución o un aumento de un marcador tumoral no se evaluará como una medida objetiva del resultado. En particular, un valor creciente del marcador tumoral no se considerará en la definición de progresión tumoral, pero debe provocar una repetición de la evaluación radiológica para documentar si se ha producido o no progresión radiográfica del tumor.
Definiciones de criterios de valoración calculados
La supervivencia se define como el tiempo desde la fecha del primer tratamiento con el fármaco del estudio hasta la fecha de la muerte. A falta de confirmación del fallecimiento, el tiempo de supervivencia será objeto de censura estadística en la última fecha de seguimiento.
La tasa de respuesta tumoral se define como la proporción de pacientes que tienen alguna evidencia de RCri o RPri objetiva.
El TTP se define como el tiempo transcurrido desde el tratamiento hasta la primera documentación confirmada de progresión del tumor o hasta la muerte por cualquier causa. Para los pacientes que no tienen evidencia objetiva de progresión del tumor y que son retirados del tratamiento del estudio o reciben un tratamiento antitumoral distinto al tratamiento del estudio, el TTP será objeto de censura estadística. Un aumento de marcadores tumorales que cumpla con los criterios de progresión de marcadores tumorales no constituye evidencia objetiva adecuada de progresión tumoral. Sin embargo, dicho aumento del marcador tumoral debería provocar una repetición de la evaluación radiográfica para documentar si se ha producido o no progresión objetiva del tumor.
TTF se define como el tiempo desde el tratamiento hasta la primera documentación confirmada de la progresión del tumor, o hasta la fecha de finalización del tratamiento, o hasta la muerte por cualquier causa, lo que suceda primero. Pacientes que todavía están en tratamiento en el momento del análisis y pacientes que son retirados del tratamiento por sus médicos durante una respuesta objetiva y que, en la fecha de finalización del tratamiento, no tienen evidencia de progresión objetiva del tumor no se les considerará que hayan experimentado un fracaso del tratamiento, a menos que el retiro se deba a la manifestación de un acontecimiento médico. Para estos pacientes, TTF será objeto de censura estadística en la fecha de finalización del estudio. También se realizará censura estadística para TTF en aquellos pacientes que reciban tratamiento antitumoral, aparte del tratamiento del estudio, antes de la primera progresión del tumor objetiva, fecha de finalización del estudio o muerte. Un aumento de marcadores tumorales que cumpla con los criterios de progresión de marcadores tumorales no constituye evidencia objetiva adecuada de fracaso del tratamiento. Sin embargo, dicho aumento del marcador tumoral debería provocar una repetición de la evaluación radiográfica para documentar si se ha producido o no progresión del tumor objetiva (y, por tanto, fracaso del tratamiento).
El tiempo hasta el primer empeoramiento definitivo del estado de rendimiento es el tiempo transcurrido desde el tratamiento hasta la última vez que el estado de rendimiento no fue peor que al inicio o hasta la muerte, debida a cualquier causa, en ausencia de documentación previa de un empeoramiento definitivo y confirmado del estado de rendimiento. Para los pacientes que no tienen un empeoramiento definitivo del estado de rendimiento y que son retirados del estudio o reciben un tratamiento antitumoral distinto al tratamiento del estudio, se les realizará censura estadística del empeoramiento definitivo del estado de rendimiento.
El tiempo hasta la primera pérdida de peso definitiva se define como el tiempo desde el tratamiento hasta la última vez que el porcentaje de disminución de peso desde el inicio fue <5 % o hasta la muerte por cualquier causa en ausencia de documentación previa de pérdida de peso definitiva. Para los pacientes que no tienen una pérdida de peso definitiva y que son retirados del estudio o reciben un tratamiento antitumoral distinto del tratamiento del estudio, la pérdida de peso definitiva será objeto de censura estadística.
Las evaluaciones adicionales de los datos pueden incluir la mejor respuesta objetiva, tasa de respuesta objetiva confirmada y no confirmada, duración del tratamiento del estudio, tiempo hasta la primera aparición de nuevas lesiones, tiempo hasta la respuesta del tumor, enfermedad estable a las 24 semanas y tasa de supervivencia libre de progresión a las 24 semanas. Los datos pueden evaluarse según los criterios RECIST 1.1, si es necesario.
Evaluación de la administración del tratamiento
Tanto para la fase IA como para la IB: la intensidad de la dosis se define como la dosis total/ciclo multiplicada por el número de semanas entre el inicio del tratamiento y el último tratamiento más 13 días.
El porcentaje de intensidad de dosis relativa se define como la proporción de la intensidad de dosis real dividida por la intensidad de dosis planificada para ese mismo período de tiempo.
Ejemplo 7: Ensayo de destrucción por RxC2-GCV
Los ensayos de eliminación se realizaron como sigue. El porcentaje de destrucción celular por GCV después del tratamiento con RxC2 depende de la infectabilidad (transducibilidad) de las células cancerosas analizadas. Las células para cada estirpe celular se sembraron en placas de 6 pocillos. Al día siguiente, las células se transdujeron con un retrovector que contenía EGFP (gen de proteína fluorescente verde mejorada) diluido 1:5. Después de 48 horas se recogieron las células. Las células fluorescentes y no fluorescentes se contaron utilizando un contador de células fluorescentes automatizado para determinar el porcentaje transducido. La eficacia de la transducción se examinó utilizando un virus que porta el gen de la proteína verde fluorescente, donde la eficacia de la transducción se muestra en orden decreciente.
Se utilizó la misma preparación vírica para todas las estirpes celulares que se muestran aquí (valor 2,72 * 1010 PVT)Ejemplo 8: Análisis de destrucción por GCV mediada por Reximmune-C2 de estirpes celulares que expresan PiT-2
Las estirpes celulares que expresan PiT-2 se establecieron mediante transducción de células diana con un vector retrovírico de expresión E-Rex que contiene los genes de PiT-2 y de resistencia a la neomicina. A continuación, se seleccionaron estirpes celulares estables con fármacos (G418) para establecer una población pura de células que expresan PiT-2. Las estirpes celulares se verificaron mediante transducción con vector retrovírico anfotrópico del genLUC-2en células que expresan PiT2 seguido de análisis bioluminiscente. Para el análisis de destrucción de células Reximmune-C2, a continuación, se sembraron estirpes celulares que expresaban PiT2 en placas de 48 pocillos. Al día siguiente, las células se transdujeron con el retrovector Reximmune-C2. Después de la transducción, las células se expusieron a una dosis diaria de 20-40 |<j>M de GCV. Después de cuatro días de tratamiento con GCV, se analizó la viabilidad celular de las células utilizando el reactivo PrestoBlue. Este reactivo es una solución a base de resazurina que, en presencia del entorno reductor de células viables, convierte el reactivo en fluorescencia que se cuantifica mediante mediciones de absorbancia.
Las líneas de cáncer de colon humano HCT-15 demostraron una destrucción deficiente de HSV-TK-GCV y la estirpe celular RKO no demostró ninguna destrucción celular después de la transducción con Reximmune-C2 y la exposición a GCV. Se generaron estirpes HCT-15 y RKO que expresan PiT-2 y se examinó su eficacia de la transducción; los resultados se proporcionan en la siguiente tabla.
Se observó un aumento considerable de la eficacia de la transducción de LNCE-RVE en todas las estirpes celulares que expresan PiT-2, lo que demuestra que la actividad de destrucción aumenta cuando las células diana expresan PiT2.
Con estirpes celulares que expresan PiT-2, los datos muestran que el requisito de la presencia del receptor PiT-2 para la transducción LNCE-RVE se refleja en el nivel de expresión de EGFP en células analizadas mediante microscopía fluorescente (datos no mostrados). El requisito de la presencia de PiT-2 para la infectividad de Reximmune-C2 también se ha demostrado mediante un ensayo de destrucción de células con GCV. Por tanto, PiT-2 representa un buen biomarcador de Reximmune-C2.
Se determinó que la expresión de Pit2 se correlacionaba con la destrucción de células con GCV mediada por Reximmune-C2. Destrucción por HSV-TK-GCV de la estirpe parental CHO-K1 frente a estirpes CHO-K1 que expresan PIT2.
En las figuras 25 y 26 se proporcionan resultados gráficos de la destrucción por HSV-TK-GCV después de una transducción simple o triple en varias estirpes celulares después de una transducción simple o triple en ausencia de PiT-2 (gráfico A de cada figura) o presencia de PiT-2 (gráfico B de cada figura).
En la figura 27 se proporcionan los resultados de la destrucción por TK-GCV después de una triple transducción con Reximmune-C2 en una estirpe celular de carconima pancreática humana MIA-PaCa-2. La destrucción con GCV fue eficaz en concentraciones más elevadas de PVT.
En la figura 28 se proporcionan los resultados de la destrucción por HSV-TK-GCV después de la triple transducción de células PiT-2-MIA-PaCa-2 con Reximmune-C2. Destrucción por GCV de la estirpe celular de carconima pancreática humana PiT-2-MIA-PaCa2 transducida triplemente con RxC2. La presencia de PiT-2 aumentó drásticamente la cantidad de destrucción celular en concentraciones más bajas de PVT.
En la figura 32 se ilustra un gráfico de estirpes celulares CHO-K1 transducidas con RxC2 después de cuatro días en GCV.
En la figura 33 se ilustra un gráfico de estirpes celulares PiT-2-HA-CHO-K1 transducidas con RxC2 después de cuatro días en GCV.
Es muy evidente que, incluso en la concentración más baja de GCV, la presencia de PiT-2 permite una transducción y destrucción celular significativamente mayores.
Ejemplo 9: Eficacia de la transducción frente a la destrucción por GCV después de la triple transducción con Reximmune C2
Para demostrar la eficacia de la transducción y la destrucción por GCV, se sembraron las células en placas de 48 pocilios. Al día siguiente, las células se transducen con Reximmune-C2 diluido en el intervalo de 1:40 a 1:5120. Después de la última de tres transducciones, las células se expusieron a dosis diarias de GCV (20-40 |jM) durante cuatro días. Un día después de la última dosis de GCV, las células se analizaron utilizando el reactivo Prestoblue para determinar la viabilidad celular. Este reactivo es una solución a base de resazurina que, en presencia del entorno reductor de células viables, convierte el reactivo en fluorescencia que se cuantifica mediante mediciones de absorbancia. Los resultados se informan como porcentaje de destrucción basado en la viabilidad celular no transducida.
La figura 31 es un gráfico que representa el porcentaje de destrucción por GCV después de la triple transducción con Reximmune-C2 de diversas estirpes celulares cancerosas. El gráfico demuestra la variación en la destrucción por GCV entre las diferentes estirpes celulares. Las estirpes celulares son comparables en cada dilución convertida a partículas de virus totales/ml frente al porcentaje de destrucción celular. La tabla proporciona las eficacias de transducción de las estirpes celulares representadas en el gráfico. El porcentaje de eficacia no parece tener una correlación directa con la destrucción celular, pero es evidente una tendencia en la que una mayor eficacia conduce a una mayor destrucción celular.
Ejemplo 10: Inmunohistoquímica (IHC) de la expresión de proteínas celulares mutantes HSV-TK
Los plásmidos Reximmune C1 o C2 se transfectaron transitoriamente en células 293T y se incubaron en condiciones convencionales en un aparato de portaobjetos de cultivo de tejidos, un par de días después, las células se fijaron con aproximadamente un 2% de formalina, se lavaron con PBS y se permeabilizaron con Triton al 0,1 % * 100 o un detergente equivalente. El anticuerpo primario anti-HSV-TK (Santa Cruz Biotechnology) en una dilución eficaz se incuba con estas células a 4 grados C durante la noche. Las células se lavan y se incuban durante 1 a 2 horas con anticuerpo secundario antiprimario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRPO) a temperatura ambiente. Las células se lavan de nuevo y se aplica reactivo de tinción de detección HRPO durante 5 a 30 minutos a temperatura ambiente. Las imágenes de IHC se adquieren con un microscopio óptico equipado con una cámara digital CCD, y las imágenes se capturan con un programa informático de análisis de imágenes. Nota: La IHC en este ejemplo también se puede describir como Inmunocitoquímica (ICC, del inglésImmunoCyto Chemistry).
Se descubrió que el vector de tipo silvestre se localiza en el núcleo (según lo determinado con genes fluorescentes fusionados con HSV-TK de tipo silvestre). Datos no mostrados.
RexC1 se distribuye entre el núcleo y el citoplasma en fusión fluorescente (datos no mostrados), pero sobre todo en el núcleo en inmunohistoquímica (IHC; véase la figura 37, gráfico izquierdo).
RexC2 es casi completamente citoplasmático en fusión fluorescente (datos no mostrados), con cierto desplazamiento hacia el citoplasma observado en IHC (véase la figura 37, gráfico de la derecha).
Ejemplo 11: Mutantes mejorados
El efecto de diversas mutaciones se comparó con construcciones previamente divulgadas, tales como las descritas por Margaret Black. En la siguiente tabla se muestra el rescate de células BL21 DE3 tk(-) mediante construcciones pET variantes de HSV-TK:
La siguiente tabla muestra la destrucción por GCV después del rescate de células BL21 DE3 tk(-) mediante construcciones de pET variante de HSV-TK.
Leyenda:n.° pTK = vector de expresión de proteína bacteriana basado en pET30a que codifica un gen o variante de HSV-TK; pTK1 = HSV-TK de tipo silvestre; pTK2 = HSV-TK NESdmNLS A167Y(SR39); pTK3 = HSV-TK(SR39) (como en Reximmune-C1); pTK4 = HSV-TK-NESdmNLS A167F; pTK5 = HSV-TK-NESdmNLS A168H (como en Reximmune-C2); pET24a = vector de expresión vacío como control negativo; GCV = ganciclovir (en las concentraciones indicadas), IPTG = isopropil b-D-1-tiogalactopiranósido (como inductor de operónlacpara la expresión de la proteína HSV-TK); 2xYT = 2* medio bacteriano de levadura/triptona en placas de agar, donde los ensayos en la columna así marcada carecen tanto de IPTG como de GCV. Todas estas HSV-TK tienen codones optimizados para su expresión en procariotas y se expresan en el plásmido pET30a inducible por IPTG. Nota; Los mutantes HSV-TK que no tienen actividad enzimática timidina no favorecerán el crecimiento de estas células bacterianas sin TK.
Ejemplo 12:Ensayos de vecindad in vitro
Se realizaron experimentos en el laboratorio para demostrar el efecto de vecindadin vitroen mezclas de células cancerosas que expresan varios mutantes de TK con células que no expresan. Se establecieron estirpes celulares de población pura estable de melanoma humano A375 y glioma de rata C6 que contenían el gen de HSV-TK-m2 mutado A168H. Los ensayos de vecindad se realizaron mediante la colocación en placas de las células cancerosas con mezclas de células parentales no HSV-TK-m2 con la estirpe celular HSV-TK-m2 correspondiente que variaba entre el 0 y el 100 % de HSV-TK-m2. Posteriormente, las mezclas de células cancerosas se expusieron a GCV 5 a 20 pM y en las figuras siguientes se representa la destrucción celular. Los resultados muestran claramente aumentos significativos en las poblaciones mixtas sobre lo que se consideraría teórico, sin un efecto de vecindad.
Se realizaron más de 40 ensayos de vecindad utilizando diferentes TK mutantes y poblaciones clonales. Los datos se recopilaron con mediciones de sensibilidad al GCV y de la cinética enzimática así como el valor vírico de producción para los mutantes con potencial.
En la figura 29 se proporcionan resultados gráficos de un ensayo de vecindadin vitropara varios mutantes. Los datos respaldan que el genHSV-TK A168Hmutado tiene una mayor destrucción celular y efecto de vecindad que los mutantes HSV-TK 167 o Margaret Black.
En la figura 30 se proporciona un gráfico de un ensayo de vecindadin vitrodonde los clones C6-Higro-TK se trataron con GCV 20 mM. Los datos respaldan además que los mutantes Margaret Black de HSV-TK tuvieron la destrucción celular más baja de los otros mutantes probados.
El análisis de todos los mutantes identificó al mutante TK168dmNES como un candidato principal para el genTKen Reximmune C-2.
Ejemplo 13: Secuencias de moléculas de TK modificadas
Eliminación de sitios de corte y empalme de HSV-TK;TK1 optimizada con codones (s itios de corte y em palm e corregidos)
ATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAG
CCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCCCTGCGCCCCCGCCGCCAGCAGGAGGCCA
CCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGC
CCCCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCG
CGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCA
GCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATC
AGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATCACCATGGGCATGCC
CTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCCCCCCACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCA
GCCACGCCCCCCCCCCCGCCCTGACCATCTTCCTGGACCGCCACCCCATCGCCTTCA
TGCTGTGCTACCCCGCCGCCCGCTACCTGATGGGCAGCATGACaCCaCAaGCCGTGCT
GGCCTTCGTGGCCCTGATCCCCCCCACCCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGC
CCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGC
GCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAAC
ACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAG
CGGCACCGCCGTGCCCCCCCAGGGCGCCGAGCCCCAGAGCAACGCCGGCCCCCGCC
CCCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGCGCCCCCGAGCTGCTGGCCCCCA
ACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTG
CGCAGCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGAGCCCCGCCGGCTGCCGCGA
CGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACCACCCCCGGCA
GCATCCCCACCATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCC
AACTAATK1 con codones optimizados, todos los supuestos sitios aceptores de empalme extirpados, con RE, Kozak, 2xTK A168H (LIF...AHL)
gtcaGCGGCCGG4CCGG?ACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGC CAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaC TGCGgCCaCGgCGCCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCC ACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACC CAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCAT GACCT ACTGGCGCGTGCTGGGCGCC AGCGAGACC AT CGCC AAC ATCT AC ACC ACCC AGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACC AGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCa CACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATC TTCGACCGgCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGG GCtccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCG GCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCC AAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCG CGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGC GCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCa CAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgG CaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGG ACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtca CCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCA CGTGACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGC GAGAT GGGCGAGGCC AACT AATAGGGAT CCCTCGAGAAGCTT gtca
La eliminación de los sitios de corte y empalme de HSV-TK mejora la optimización de los codonesgtcaGCGGCCGC4CCGG7ACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGC CAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaC TGCGgCCaCGgCGCCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCC ACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACC CAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCAT GACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCC AGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACC AGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaC ACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTT CGACCGgCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCt ccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCA CCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAG CGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGT GTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCG AGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAG AGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCC aGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGT GCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtcaCCgG CCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTG ACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGA T GGGCGAGGCC AACT AATAGGGATCCCTCGAGAAGCTT gtca
HSV-TK NLS con eliminación y sustitución en NESgtcaGCGGCCGCL4CCGG7ACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCA CCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCA GCACCGCaCTGCGgCCaCGgCGCCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGA AGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCA CCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCC GAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTA CACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGG TGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGC TGGCaCCaCACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGAC CCTGATCTTCGACCGeCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACC TGATGGGCtccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaC TGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGC CTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCAT CCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCA GCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCC GAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGT TCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGC CCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGAC CAGtcaCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAG ACCCACGTGACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCG CCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCrCGv4GAAGCTIgtca
HSV-TK con eliminación de NLS
gtcaGCGGCCGG4 CCGGrACGCGTCC ACC ATGGCC AGCT ACCCCGGCC ACC AGC ACGC CAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaC TGCGgCCaGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCC ACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACC
CAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCAT
GACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCC
AGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACC AGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaC ACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTT CGACCGgCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCt ccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCA
CCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAG
CGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGT
GTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCG
AGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAG AGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCC aGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGT GCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtcaCCgG
CCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTG
ACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGA TGGGCGAGGCCAACTAAT AGGGATCCCTCGAGAAGCTT gtca
HSV-TK con optimización de codones personalizadosgtcaGCGGCCGC4CCGG7ACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGC TGGAACTGGATGGCTCTTATCCT
GGACATCAGCATGCTTCTGCTTTTGATCAGGCTGCCAGATCTAGAGGACATTCTAAT
GGCAGCACAGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAAGCTACAGAAGTGAGACCTG
AACAGAAAATGCCTACACTGCTGAGAGTGTATATTGATGGACCACATGGAATGGGA
AAAACAACCACAACCCAGCTGCTGGTGGCTCTCGGATCTAGAGATGATATTGTGTA
TGTGCCTGAACCTATGACATATTGGAGAGTGCTGGGAGCTTCTGAAACAATTGCTA
ATATCTATACAACACAGCATAGACTGGATCAAGGAGAAATTTCTGCCGGAGATGCT
GCCGTGGTGATGACATCTGCTCAGATTACAATGGGAATGCCTTATGCTGTGACAGAT
GCTGTGCTGGCACCACATATTGGAGGCGAAGCTGGAAGCTCTCATGCACCACCACC
AGCACTGACACTGATTTTTGATCGGCATCCAATTGCACATCTGCTGTGTTATCCGGC
AGCAAGATATCTGATGGGAAGCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCTTTTGTGGCTC
TGATTCCACCAACACTGCCTGGAACAAACATCGTGCTGGGAGCTCTGCCTGAAGAT
AGACATATCGATCGGCTGGCCAAACGGCAGAGACCTGGAGAACGGCTGGATCTGGC
CATGCTGGCTGCCATTCGGAGAGTGTATGGCCTGCTGGCTAACACAGTGAGATATCT
GCAGTGTGGAGGCTCTTGGAGAGAGGATTGGGGACAGCTGTCTGGCACAGCTGTGC
CACCACAGGGAGCCGAACCACAGAGCAATGCTGGACCACGACCACATATCGGAGA
CACACTGTTTACACTGTTTCGGGCACCAGAACTGCTGGCACCAAATGGAGACCTGT
ACAACGTGTTTGCCTGGGCTCTGGATGTGCTGGCTAAACGGCTGAGATCTATGCATG
TGTTTATCCTGGACTATGATCAGTCACCGGCCGGATGTCGCGATGCCCTGCTGCAGC
TGACATCTGGGATGGTGCAGACACATGTGACAACACCTGGATCTATCCCAACAATC
TGTGATCTGGCTAGAACATTCGCTAGGGAGATGGGAGAGGCCAACTAATAGGGATC
CCTCGAGAAGCTT gtca
HSV-TK NLS con eliminación de NES y adicióngtcaGCGGCCGC4CCGG7ACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGC
TGGAACTGGATGGCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCC
GCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaCTGCGgCCaGGATCTCAGCAG
GAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACAT
CGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGG
GCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTG
GGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGG CGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGG CATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaCACATCGGCGGCGAGGCCGG CAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTTCGACCGgCACCCaATCGCaC ACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCtccATGACaCCaCAaGCCGTGC TGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGC
CCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGC
GCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAAC
ACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAG
CGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCCa CACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACG GCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCt ccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtcaCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTG CTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACaACaCCCGGCAGCATCCCa ACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATA GGGAT CCCTCGAGAAGCTTgtca
HSV-TK con optimización de codones personalizadosgtcaGCGGCCGC4CCGG7ACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGC TGGAACTGGATGGCTCTTATCCT
GGACATCAGCATGCTTCTGCTTTTGATCAGGCTGCCAGATCTAGAGGACATTCTAAT
GGCAGCACAGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAAGCTACAGAAGTGAGACCTG
AACAGAAAATGCCTACACTGCTGAGAGTGTATATTGATGGACCACATGGAATGGGA
AAAACAACCACAACCCAGCTGCTGGTGGCTCTCGGATCTAGAGATGATATTGTGTA
TGTGCCTGAACCTATGACATATTGGAGAGTGCTGGGAGCTTCTGAAACAATTGCTA
ATATCTATACAACACAGCATAGACTGGATCAAGGAGAAATTTCTGCCGGAGATGCT
GCCGTGGTGATGACATCTGCTCAGATTACAATGGGAATGCCTTATGCTGTGACAGAT
GCTGTGCTGGCACCACATATTGGAGGCGAAGCTGGAAGCTCTCATGCACCACCACC
AGCACTGACACTGATTTTTGATCGGCATCCAATTGCACATCTGCTGTGTTATCCGGC
AGCAAGATATCTGATGGGAAGCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCTTTTGTGGCTC
TGATTCCACCAACACTGCCTGGAACAAACATCGTGCTGGGAGCTCTGCCTGAAGAT
AGACATATCGATCGGCTGGCCAAACGGCAGAGACCTGGAGAACGGCTGGATCTGGC
CATGCTGGCTGCCATTCGGAGAGTGTATGGCCTGCTGGCTAACACAGTGAGATATCT
GCAGTGTGGAGGCTCTTGGAGAGAGGATTGGGGACAGCTGTCTGGCACAGCTGTGC
CACCACAGGGAGCCGAACCACAGAGCAATGCTGGACCACGACCACATATCGGAGA
CACACTGTTTACACTGTTTCGGGCACCAGAACTGCTGGCACCAAATGGAGACCTGT
ACAACGTGTTTGCCTGGGCTCTGGATGTGCTGGCTAAACGGCTGAGATCTATGCATG
TGTTTATCCTGGACTATGATCAGTCACCGGCCGGATGTCGCGATGCCCTGCTGCAGC
TGACATCTGGGATGGTGCAGACACATGTGACAACACCTGGATCTATCCCAACAATC
TGTGATCTGGCTAGAACATTCGCTAGGGAGATGGGAGAGGCCAACTAATAGGGATC
CCTCGAGAAGCTTgtca
Ejemplo 14: Ensayo HAT
Se produjeron vectores retrovíricos de RexRed Super TK A168H y RexRed TK 167F en células 293T y se utilizaron para transducir células 3T3(TK-). Estas células transducidas se seleccionaron con HAT durante 7 a 14 días. Las células 3T3(TK-) no transducidas morirán después de la selección HAT. Estas mismas células transducidas con RexRed Super TK A168H sobrevivieron a la selección HAT, sin embargo, las células 3T3(TK-) transducidas con RexRed TK 167F no sobrevivieron a la selección HAT. Se trata de un ensayo de supervivencia celular más/menos, las células supervivientes se fijan y se tiñen con azul de metileno al 1 % en metanol.
Los ensayos de destrucción celular HAT basados en transducción anteriores revelan una especificidad de GCV sobre la timidina para los mutantes A167F HSV-TK en vectores retrovíricos que contienen el marcador RFP. Esa especificidad se encuentra en las células NIH 3T3 en un ensayo de 72 horas y 7 días con una dosis de 1* HAT.
Los ensayos de destrucción celular HAT basados en transducción actuales revelan una especificidad de GCV sobre la timidina para los mutantes A167F HSV-TK en vectores retrovíricos que contienen el marcador RFP. Esa especificidad se encuentra en las células NIH 3T3 en un ensayo de 7 días con una dosis de 2* HAT.
Los ensayos de destrucción celular HAT basados en transducción revelan una especificidad de GCV sobre la timidina para los mutantes A167F HSV-TK en vectores retrovíricos que contienen el marcador RFP. Esa especificidad se encuentra en las células NIH 3T3 en un ensayo de 72 horas y un ensayo de 7 días con una dosis de 1* HAT.
Los ensayos de destrucción celular HAT basados en transducción revelan una especificidad de GCV sobre la timidina para los mutantes A167F HSV-TK en vectores retrovíricos que contienen el marcador HigroR. Esa especificidad se encuentra en las células NIH 3T3 en un ensayo de 72 horas y 7 días con una dosis de 1* HAT.
Ejemplo 15: Ensayo de destrucción con GCV
Las células se sembraron en una placa de 24 pocillos. Las células se transdujeron al día siguiente con 6 diluciones de los vectores retrovíricos (1:4-4096). Al día siguiente se añadió a las células GCV 0-200 |<j>M. Después de siete días de tratamiento con GCV, las células se fijaron y las células vivas se tiñeron con azul de metileno al 1 % en metanol. Cuanto mayor es la potencia de los mutantes víricos, se produce una mayor destrucción celular.
Los ensayos de destrucción celular HSV-TK/GCV basados en transducción anteriores revelan un orden de potencia para los mutantes A168F, A167F y A168H HSV-TK en vectores retrovíricos que contienen el marcador RFP. Ese orden es A168H > A168F = A167F cuando se prueba en células RgA375 en un ensayo de 72 horas y 7 días con una dosis elevada de GCV (1 mM -125 mM).
Los ensayos de destrucción celular HSV-TK/GCV basados en transducción actuales revelan un orden de potencia para los mutantes HSV-TK A167F y A168H en vectores retrovíricos que contienen el marcador RFP. Ese orden es A168H > A167F cuando se analiza en células RgA375 en un ensayo de 7 días con una dosis elevada de GCV (0,2 mM - 0,05 mM). La adición de dm NLS o NES no parece cambiar este orden. El uso de JCO parece reducir el valor y añadir la actividad de destrucción celular HSV-TK.
Los ensayos de destrucción celular HSV-TK/GCV basados en transducción revelan un orden de potencia para los mutantes A168F, A167F y A168H HSV-TK en vectores retrovíricos que contienen el marcador RFP. Ese orden es A168H > A168F = A167F cuando se prueba en células A375 y RgA375 en un ensayo de 72 horas con una dosis elevada de GCV (1 mM -125 mM).
Los ensayos de destrucción celular HSV-TK/GCV basados en transducción revelan un orden de potencia para los mutantes A168F, A167F y A168H HSV-TK en vectores retrovíricos que contienen el marcador RFP. Ese orden es A168H > A168F = A167F cuando se analiza en células NIH 3T3 en un ensayo de 72 horas con una dosis elevada de GCV (1 mM - 500 mM).
Los ensayos de destrucción celular HSV-TK/GCV basados en transducción revelan un orden de potencia para los mutantes A168F, A167F y A168H HSV-TK en vectores retrovíricos que contienen el marcador RFP. Ese orden es A168H > A168F = A167F cuando se prueba en células RgA375 en un ensayo de 72 horas y 7 días con una dosis elevada de GCV (1 mM -125 mM).
Los ensayos de destrucción celular HSV-TK/GCV basados en transducción revelan un orden de potencia para los mutantes A168F, A167F y A168H HSV-TK en vectores retrovíricos que contienen el marcador RFP o HigroR. Ese orden es A168H > A168F = A167F cuando se analiza en células A375, RgA375 o NIH 3T3 en un ensayo de 72 horas con una dosis elevada de GCV (1 mM -125 mM).
Los ensayos de destrucción celular HSV-TK/GCV basados en transducción revelan un orden de potencia para los mutantes A168F, A167F y A168H HSV-TK en vectores retrovíricos que contienen el marcador HigroR. Ese orden es A168H > A168F = A167F cuando se prueba en células A375 y RgA375 en un ensayo de 72 horas con una dosis elevada de GCV (1 mM -125 mM).
Los ensayos de destrucción celular HSV-TK/GCV basados en transducción revelan un orden de potencia para los mutantes A168F, A167F y A168H HSV-TK en vectores retrovíricos que contienen el marcador HigroR. Ese orden es A168H > A168F = A167F cuando se analiza en células NIH 3T3 en un ensayo de 72 horas con una dosis elevada de GCV (1 mM - 500 mM).
Ejemplo 16: Resistencia higro
Se seleccionaron estirpes celulares transducidas con retrovectores mutantes Higro-HSV-TK en presencia de higromicina para producir una población pura de células que contenían los mutantes Higro-HSV-TK y que expresaban el gen de resistencia a la higromicina.
Estirpes celulares similares a A375 Reximmune-C2: Las estirpes celulares HSV-TK dmNESA168H seleccionadas por A375 Higro se han convertido en Luc(+). La estirpe celular anterior tiene la misma destrucción con GCV que la estirpe parental. Una estirpe celular A375 Luc(+) únicamente tiene la misma actividad Luc que la estirpe celular anterior.
Estirpes celulares similares a C6 Reximmune-C2: Las estirpes celulares HSV-TK dmNESA168H seleccionadas por C6 Higro se han convertido en Luc(+). La estirpe celular anterior tiene la misma destrucción con GCV que la estirpe parental. Una estirpe celular C6 Luc(+) únicamente tiene la misma actividad Luc que la estirpe celular anterior.
ABREVIATURAS
ALT Alanina aminotransferasa
CAN Cifra absoluta de neutrófilos
AST Aspartato aminotransferasa
ABC Área bajo la curva de concentración en plasma-tiempo
SC Superficie corporal (mg/m2)
CL Aclaramiento plasmático sistémico
Cmáx Concentración máxima en plasma
RC Respuesta completa
CRD Cuaderno de recogida de datos
TC Tomografía computarizada
CTC Criterios de toxicidad comunes
TLD Toxicidad limitante de la dosis
FdI Fin de la Infusión
FDA Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU.
G-CSF Factor estimulante de colonias de granulocitos (filgrastim, Neupogen®)
BPC Buena práctica clínica
GM-CSF Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (sargramostim, Leukine®)
VIH Virus de inmunodeficiencia humana
CR Cociente de riesgo
CEI Comité de ética independiente
i.p. Intraperitoneal
CEIC Comité Ético de Investigación Clínica
i.v. Intravenoso, por vía intravenosa
DL10 o Dosis que es letal para el 10 % o el 50 % de los animales
DL50 LDH Lactato deshidrogenasa
DMA Dosis máxima administrada
RMN Resonancia Magnética Nuclear
DMT Dosis Máxima Tolerada
NCI National Cancer Institute
NE No evaluable para respuesta tumoral
NSEAO Nivel sin efectos adversos observados
Sin CR Sin respuesta completa
Sin PD Enfermedad no progresiva
CMSP PCE Propilen glicol: Cremophor® EL: Etanol
EP Enfermedad progresiva
RP Respuesta parcial
SAER-S Informe de acontecimientos adversos graves-Estudio
s.c. Subcutáneo, por vía subcutánea
ES Enfermedad estable
STD10 Dosis que es severamente tóxica para el 10 % de los animales
THP Tiempo hasta la progresión
THF Tiempo hasta el fracaso
T y2 Semivida
Tmáx Tiempo de concentración máxima en plasma
Vee Volumen de distribución en estado estacionario
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SECUENCIAS
SEQ ID NO: 1: secuencia de nucleótidos de HSV1-TK de tipo silvestre
a t g g c t t c g t a c c c c g g c c a t c a a c a c g c g t c t g c g t t c g a c c a g g c t g c g c g t t c t c g c g g c c a t a g c a a c c g a c g t a c g g c g t tg c g c c c t c g c c g g c a g c a a g a a g c c a c g g a a g t c c g c c c g g a g c a g a a a a tg c c c a c g c t a c tg c g g g t t t a t a t a g a c g g t c c c c a c g g g a t g g g g a a a a c c a c c a c c a c g c a a c t g c t g g t g g c c c t g g g t t c g c g c g a c g a t a t c g t c t a c g t a c c c g a g c c g a t g a c t t a c t g g c g g g t g c t g g g g g c t t c c g a g a c a a t c g c g a a c a t c t a c a c c a c a c a a c a c c g c c t c g a c c a g g g t g a g a t a t c g g c c g g g g a c g c g g c g g t g g ta a t g a c a a g c g c c c a g a t a a c a a t g g g c a t g c c t t a t g c c g t g a c c g a c g c c g t t c t g g c t c c t c a t a t c g g g g g g g a g g c t g g g a g c t c a c a t g c c c c g c c c c c g g c c c t c a c c c t c a t c t t c g a c c g c c a t c c c a t c g c c g c c c t c c t g t g c t a c c c g g c c g c g c g g t a c c t t a t g g g c a g c a t g a c c c c c c a g g c c g t g c t g g c g t t c g t g g c c c t c a t c c c g c c g a c c t t g c c c g g c a c c a a c a t c g t g c t t g g g g c c c t t c c g g a g g a c a g a c a c a t c g a c c g c c tg g c c a a a c g c c a g c g c c c c g g c g a g c g g c t g g a c c tg g c t a tg c t g g c t g c g a t t c g c c g c g t t t a c g g g c t a c t t g c c a a t a c g g t g c g g t a t c t g c a g t g c g g c g g g t c g t g g c g g g a g g a c tg g g g a c a g c t t t c g g g g a c g g c c g tg c c g c c c c a g g g tg c c g a g c c c c a g a g c a a c g c g g g c c c a c g a c c c c a t a t c g g g g a c a c g t t a t t t a c c c t g t t t c g g g c c c c c g a g t t g c t g g c c c c c a a c g g c g a c c t g t a t a a c g t g t t t g c c t g g g c c t t g g a c g t c t t g g c c a a a c g c c t c c g t t c c a t g c a c g t c t t t a t c c t g g a t t a c g a c c a a t c g c c c g c c g g c tg c c g g g a c g c c c tg c t g c a a c t t a c c t c c g g g a t g g t c c a g a c c c a c g t c a c c a c c c c c g g c t c c a t a c c g a c g a t a tg c g a c c tg g c g c g c a c g t t t g c c c g g g a g a t g g g g g a g g c t a a c t g a
SEQ ID NO: 2: secuencia de aminoácidos de HSV1-TK de tipo silvestre
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDD
IVY
VPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAWMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPAL
TLI
FDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRR
VYG
LLANTVRYLQCGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAK
RLR SMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN
SEQ ID NO: 3: HSV-TK en Reximmune-C HSV-TK; Mutante SR 39 y mutación R25G-R26S de NLS
a t g g c c t c g t a c c c c g g c c a t c a a c a c g c g t c t g c g t t c g a c c a g g c t g c g c g t t c t c g c g g c c a t a g c a a c g g a t c c a c g g c g t t g c g c c c t c g c c g g c a g c a a g a a g c c a c g g a a g t c c g c c c g g a g c a g a a a a t g c c c a c g c t a c t g c g g g t t t a t a t a g a c g g t c c c c a c g g g a t g g g g a a a a c c a c c a c c a c g c a a c t g c t g g t g g c c c t g g g t t c g c g c g a c g a t a t c g t c t a c g t a c c c g a g c c g a t g a c t t a c t g g c g g g t g c t g g g g g c t t c c g a g a c a a t c g c g a a c a t c t a c a c c a c a c a a c a c c g c c t c g a c c a g g g t g a g a t a t c g g c c g g g g a c g c g g c g g t g g t a a t g a c a a g c g c c c a g a t a a c a a t g g g c a t g c c t t a t g c c g t g a c c g a c g c c g t t c t g g c t c c t c a t a t c g g g g g g g a g g c t g g g a g c t c a c a t g c c c c g c c c c c g g c c c t c a c c a t c t t c c t c g a c c g c c a t c c c a t c g c c t t c a t g c t g t g c t a c c c g g c c g c g c g g t a c c t t a t g g g c a g c a t g a c c c c c c a g g c c g t g c t g g c g t t c g t g g c c c t c a t c c c g c c g a c c t t g c c c g g c a c c a a c a t c g t g c t t g g g g c c c t t c c g g a g g a c a g a c a c a t c g a c c g c c t g g c c a a a c g c c a g c g c c c c g g c g a g c g g c t g g a c c t g g c t a t g c t g g c t g c g a t t c g c c g c g t t t a c g g g c t a c t t g c c a a t a c g g t g c g g t a t c t g c a g t g c g g c g g g t c g t g g c g g g a g g a c t g g g g a c a g c t t t c g g g g a c g g c c g t g c c g c c c c a g g g t g c c g a g c c c c a g a g c a a c g c g g g c c c a c g a c c c c a t a t c g g g g a c a c g t t a t t t a c c c t g t t t c g g g c c c c c g a g t t g c t g g c c c c c a a c g g c g a c c t g t a t a a c g t g t t t g c c t g g g c c t t g g a c g t c t t g g c c a a a c g c c t c c g t t c c a t g c a c g t c t t t a t c c t g g a t t a c g a c c a a t c g c c c g c c g g c t g c c g g g a c g c c c t g c t g c a a c t t a c c t c c g g g a t g g t c c a g a c c c a c g t c a c c a c c c c c g g c t c c a t a c c g a c g a t a t g c g a c c t g g c g c g c a c g t t t g c c c g g g a g a t g g g g g a g g c t a a c t g a
SEQ ID NO: 4 (secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 3)
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNGSTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLV
ALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVEA
PHIGGEAGSSHAPPPALTIFLDRHPIAFMLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPE
DRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQCGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGP
RPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRSMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQT
HVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN
SEQ ID NO: 5: Los sitios de HSV-TK para mutar están en negrita, subrayados (secuencia de localización nuclear de HSV-TK, RR y dominio de unión al sustrato, LIF y AAL
a t g g c c t c g t a c c c c g g c c a t c a a c a c g c g t c t g c g t t c g a c c a g g c t g c g c g t t c t c g c60
M A S Y P G H Q H A S A F D Q A A R S R
g g c c a t a g c a a c c g a c g t a c g g c g t t g c g c c c t c g c c g g c a g c a a g a a g c c a c g g a a g t c120
G H S N R R T A L R P R R Q Q E A T E V
c g c c c g g a g c a g a a a a t g c c c a c g c t a c t g c g g g t t t a t a t a g a c g g t c c c c a c g g g a t g180
R P E Q K M P T L L R V Y I D G P H G M
g g g a a a a c c a c c a c c a c g c a a c t g c t g g t g g c c c t g g g t t c g c g c g a c g a t a t c g t c t a c240
G K T T T T Q L L V A L G S R D D I V Y
g t a c c c g a g c c g a t g a c t t a c t g g c g g g t g c t g g g g g c t t c c g a g a c a a t c g c g a a c a t c300V P E P M T Y W R V L G A S E T I A N I
t a c a c c a c a c a a c a c c g c c t c g a c c a g g g t g a g a t a t c g g c c g g g g a c g c g g c g g t g g t a360
Y T T Q H R L D Q G E I S A G D A A V V
a t g a c a a g c g c c c a g a t a a c a a t g g g c a t g c c t t a t g c c g t g a c c g a c g c c g t t c t g g c t420
M T S A Q I T M G M P Y A V T D A V L A
c c t c a t a t c g g g g g g g a g g c t g g g a g c t c a c a t g c c c c g c c c c c g g c c c t c a c c c t c a t c480P H I G G E A G S S H A P P P A L T L I
t t c g a c c g c c a t c c c a t c g c c c j c c c t c c t g t g c t a c c c g g c c g c g c g g t a c c t t a t g g g c540
F D R H P I A A L L C Y P A A R Y L M G
a g c a t g a c c c c c c a g g c c g t g c t g g c g t t c g t g g c c c t c a t c c c g c c g a c c t t g c c c g g c600
S M T P Q A V L A F V A L I P P T L P G
a c c a a c a t c g t g c t t g g g g c c c t t c c g g a g g a c a g a c a c a t c g a c c g c c t g g c c a a a c g c660
T N I V L G A L P E D R H I D R L A K R
c a g c g c c c c g g c g a g c g g c t g g a c c t g g c t a t g c t g g c t g c g a t t c g c c g c g t t t a c g g g720
Q R P G E R L D L A M L A A I R R V Y G
c t a c t t g c c a a t a c g g t g c g g t a t c t g c a g t g c g g c g g g t c g t g g c g g g a g g a c t g g g g a780
L L A N T V R Y L Q C G G S W R E D W G
c a g c t t t c g g g g a c g g c c g t g c c g c c c c a g g g t g c c g a g c c c c a g a g c a a c g c g g g c c c a840
Q L S G T A V P P Q G A E P Q S N A G P
c g a c c c c a t a t c g g g g a c a c g t t a t t t a c c c t g t t t c g g g c c c c c g a g t t g c t g g c c c c c900R P H I G D T L F T L F R A P E L L A P
a a c g g c g a c c t g t a t a a c g t g t t t g c c t g g g c c t t g g a c g t c t t g g c c a a a c g c c t c c g t960
N G D L Y N V F A W A L D V L A K R L R
t c c a t g c a c g t c t t t a t c c t g g a t t a c g a c c a a t c g c c c g c c g g c t g c c g g g a c g c c c t g1020
S M H V F I L D Y D Q S P A G C R D A L
c t g c a a c t t a c c t c c g g g a t g g t c c a g a c c c a c g t c a c c a c c c c c g g c t c c a t a c c g a c g1080
L Q L T S G M V Q T H V T T P G S I P T
a t a t g c g a c c t g g c g c g c a c g t t t g c c c g g g a g a t g g g g g a g g c t a a c t g a
I C D L A R T F A R E M G E A N *
SEQ ID NO: 6 y 7: Región mutante Sac I-Kpn I (SR39)
GAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCATCTTCCTCGACCGCCATCCCATCGCC-CTCGAGTGTACGGGGCGGGGGCCGGGAGTGGIAGAAGGAGCTGGCGGTAGGGTAGCGG-Sac I -TJCATGCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTACC(SEQ ID NO: 6) -AAGTACGACACGATGGGCCGGCGCGCCATGG(SEQ ID NO: 7)
Kpn I
SEQ ID NO: 8 y 9: Región mutante Sac I-Kpn I (SR39) (cortada)
CACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCATCTTCCTCGACCGCCATCCCATCGCCTTCATG
TCGAGTGTACGGGGCGGGGGCCGGGAGTGGTAGAAGGAGCTGGCGGTAGGGTAGCGGAA
S ac I ( c u t )
CTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTAC (SEQ ID NO: 8)
GJACGACACGATGGGCCGGC (SEQ ID NO: 9)
Kpn I (cortado)
SEQ ID NO: 10 y 11: Cebadores
SR39sackpn F1
5 ' CACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCATCTTCCTCGACCGCCATCCCATCGCCTTCATGCTGTGCTAC
CCGGCCGCGCGGTAC 3 ' (SE Q ID N O : 10 )
SR39sackpn R1
5 ' CGCGCGGCCGGGTAGCACAGCATGAAGGCGATGGGATGGCGGTCGAGGAAGATGGTGAGGGCCGGGGG
CGGGGCATGTGAGCT 3 ' (SE Q ID N O : 11 )
SEQ ID NO: 12 Gen n.° 3 mHSV-TK CO A168H(LIF...AHL): Longitud: 1185
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGC
CTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCACGGCGC
CAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCG
ACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGA
CGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATC
GCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCG
TGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGC
ACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTC
GACCGGCACCCAATCGCACACCTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGA
CACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGT
GCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAG
CGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGC
GCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCC
AC CACAGGGC GC C GAGC CACAGAGCAAC GC CGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTC
ACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGG
CCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTC
ACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACA
ACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGG
C CAAC TAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCA
SEQ ID NO: 13 Gen n.° 4 mHSV-TK CO TK A167F(LIF...FAL): Longitud: 1185
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGC
CTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCACGGCGC
CAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCG
ACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGA
CGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATC
GCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCG
TGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGC
ACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTC
GACCGGCACCCAATCTTCGCACTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGA
CACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGT
GCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAG
CGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGC
GCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCC
AC CACAGGGC GC C GAGC CACAGAGCAAC GC C GGAC CAC GAC CACACAT C GGC GACAC C C T GT T C
ACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGG
CCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTC
ACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACA
ACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGG
C CAAC TAATAGGGAT C C C T C GAGAAGCT T GT CA
SEQ ID NO: 14 Gen n.° 5 mHSV-TK CO mutante doble A167F-A168H (LIF...FHL): Longitud: 1185
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGC
CTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCACGGCGC
CAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCG
ACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGA
CGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATC
GCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCG
TGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGC
ACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTC
GACCGGCACCCAATCTTCCACCTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGA
CACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGT
GCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAG
CGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGC
GCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCC
AC CACAGGGC GC C GAGC CACAGAGCAAC GC CGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTC
ACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGG
CCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTC
ACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACA
ACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGG
C CAAC TAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCA
SEQ ID NO: 15 Gen n.° 6 mHSV-TK CO MB-IFL A168H(IFL...AHL): Longitud: 1185
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGC
CTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCACGGCGC
CAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCG
ACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGA
CGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATC
GCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCG
TGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGC
ACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCATCTTCCTG
GACCGGCACCCAATCGCACACCTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGA
CACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGT
GCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAG
CGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGC
GCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCC
AC CACAGGGC GC C GAGC CACAGAGCAAC GC C GGAC CAC GAC CACACAT C GGC GACAC C C T GT T C
ACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGG
CCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTC
ACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACA
ACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGG
C CAAC TAATAGGGAT C C C T C GAGAAGCT T GT CA
SEQ ID NO: 16 Gen n.° 1 HSV-TK A168H dmNLS CO SC: Longitud: 1185
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGC
CTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCAGGATCT
CAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCG
ACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGA
CGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATC
GCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCG
TGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGC
ACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTC
GACCGGCACCCAATCGCACACCTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGA
CACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGT
GCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAG
CGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGC
GCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCC
AC CACAGGGC GC C GAGC CACAGAGCAAC GC CGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTC
ACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGG
CCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTC
ACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACA
ACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGG
C CAAC TAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCA
SEQ ID NO: 17 Gen n.° 2 HSV-TK A167F dmNLS CO SC: Longitud: 1185
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGC
CTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCAGGATCT
CAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCG
ACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGA
CGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATC
GCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCG
TGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGC
ACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTC
GACCGGCACCCAATCTTCGCACTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGA
CACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGT
GCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAG
CGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGC
GCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCC
AC CACAGGGC GC C GAGC CACAGAGCAAC GC C GGAC CAC GAC CACACAT C GGC GACAC C C T GT T C
ACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGG
CCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTC
ACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACA
ACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGG
C CAAC TAATAGGGAT C C C T C GAGAAGCT T GT CA
SEQ ID NO: 18 Gen n.° 3 HSV-TK A168H NESdmNLS CO SC: Longitud: 1221
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACT
GGATGGCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGC
CACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCG
AGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCAC
CACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATG
ACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCC
TGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAAT
GGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGC
AGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTCGACCGGCACCCAATCGCACACCTGCTGT
GCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGC
CCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCAC
ATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCA
TCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCG
CGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCACCACAGGGCGCCGAGCCACAGAGCAAC
GCCGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGG
CACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCG
CTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTCACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTG
CAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACAACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCG
ACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCT
TGTCA
SEQ ID NO: 19 Gen n.° 4 HSV-TK A167F NESdmNLS CO SC: Longitud: 1221
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACT
GGATGGCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGC
CACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCG
AGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCAC
CACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATG
ACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCC
TGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAAT
GGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGC
AGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTCGACCGGCACCCAATCTTCGCACTGCTGT
GCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGC
CCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCAC
ATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCA
TCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCG
CGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCACCACAGGGCGCCGAGCCACAGAGCAAC
GCCGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGG
CACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCG
CTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTCACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTG
CAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACAACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCG
ACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCT
TGTCA
SEQ ID NO: 20 Gen n.° 5 HSV-TK A168H NESdmNLS JCO SC: Longitud: 1221
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCTCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACT
GGATGGCTCTTATCCTGGACATCAGCATGCTTCTGCTTTTGATCAGGCTGCCAGATCTAGAGGA
CATTCTAATGGCAGCACAGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAAGCTACAGAAGTGAGACCTG
AACAGAAAAT GC CTACACTGCTGAGAGTGTATATTGATGGACCACATGGAATGGGAAAAACAAC
CACAACCCAGCTGCTGGTGGCTCTCGGATCTAGAGATGATATTGTGTATGTGCCTGAACCTATG
ACATAT T GGAGAGT GC T GGGAGC T T C T GAAACAATTGCTAATATCTATACAACACAGCATAGAC
TGGATCAAGGAGAAATTTCTGCCGGAGATGCTGCCGTGGTGATGACATCTGCTCAGATTACAAT
GGGAATGCCTTATGCTGTGACAGATGCTGTGCTGGCACCACATATTGGAGGCGAAGCTGGAAGC
TCTCATGCACCACCACCAGCACTGACACTGATTTTTGATCGGCATCCAATTGCACATCTGCTGT
GTTATCCGGCAGCAAGATATCTGATGGGAAGCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCTTTTGTGGC
T C T GAT T C CAC CAACAC T GC C T GGAACAAACATCGTGCTGGGAGCTCTGCCTGAAGATAGACAT
ATCGATCGGCTGGCCAAACGGCAGAGACCTGGAGAACGGCTGGATCTGGCCATGCTGGCTGCCA
TTCGGAGAGTGTATGGCCTGCTGGCTAACACAGTGAGATATCTGCAGTGTGGAGGCTCTTGGAG
AGAGGATTGGGGACAGCTGTCTGGCACAGCTGTGCCACCACAGGGAGCCGAACCACAGAGCAAT
GCTGGACCACGACCACATATCGGAGACACACTGTTTACACTGTTTCGGGCACCAGAACTGCTGG
CACCAAATGGAGACCTGTACAACGTGTTTGCCTGGGCTCTGGATGTGCTGGCTAAACGGCTGAG
ATCTATGCATGTGTTTATCCTGGACTATGATCAGTCACCGGCCGGATGTCGCGATGCCCTGCTG
CAGC T GACAT C T GGGAT GGT GCAGACACAT GTGACAACAC C TGGAT C TAT C C CAACAAT C T GT G
AT C T GGC TAGAACAT T C GC TAGGGAGAT GGGAGAGGC CAAC TAAT GAGGATCCCTCGAGAAGCT
TGTCA
SEQ ID NO: 21 Gen n.° 6 HSV-TK A167F NESdmNLS JCO SC: Longitud: 1221
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCTCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACT
GGATGGCT C T TAT C C TGGACAT CAGCAT GC T TC T GC T T T T GAT CAGGCTGCCAGAT C TAGAGGA
CATTCTAATGGCAGCACAGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAAGCTACAGAAGTGAGACCTG
AACAGAAAAT GC C TACAC T GC T GAGAGT GTATAT T GAT GGAC CACAT GGAAT GGGAAAAACAAC
CACAACCCAGCTGCTGGTGGCTCTCGGATCTAGAGATGATATTGTGTATGTGCCTGAACCTATG
ACATAT T GGAGAGT GC T GGGAGC T T C T GAAACAAT T GC TAATAT C TATACAACACAGCATAGAC
TGGAT CAAGGAGAAAT T T C T GC C GGAGAT GC TGC C GT GGT GAT GACAT C T GC T CAGAT TACAAT
GGGAATGCCTTATGCTGTGACAGATGCTGTGCTGGCACCACATATTGGAGGCGAAGCTGGAAGC
TCTCATGCACCACCACCAGCACTGACACTGATTTTTGATCGGCATCCAATTTTCGCACTGCTGT
GTTATCCGGCAGCAAGATATCTGATGGGAAGCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCTTTTGTGGC
T C T GAT T C CAC CAACAC T GC C T GGAACAAACAT C GT GC T GGGAGC T C T GC C T GAAGATAGACAT
ATCGATCGGCTGGCCAAACGGCAGAGACCTGGAGAACGGCTGGATCTGGCCATGCTGGCTGCCA
TTCGGAGAGTGTATGGCCTGCTGGCTAACACAGTGAGATATCTGCAGTGTGGAGGCTCTTGGAG
AGAGGATTGGGGACAGCTGTCTGGCACAGCTGTGCCACCACAGGGAGCCGAACCACAGAGCAAT
GCTGGACCACGACCACATATCGGAGACACACTGTTTACACTGTTTCGGGCACCAGAACTGCTGG
CACCAAATGGAGACCTGTACAACGTGTTTGCCTGGGCTCTGGATGTGCTGGCTAAACGGCTGAG
ATCTATGCATGTGTTTATCCTGGACTATGATCAGTCACCGGCCGGATGTCGCGATGCCCTGCTG
CAGC T GACAT C T GGGAT GGT GCAGACACAT GTGACAACAC C TGGAT C TAT C C CAACAAT C T GT G
AT C T GGC TAGAACAT T C GC TAGGGAGAT GGGAGAGGC CAAC TAAT GAGGAT C C C T C GAGAAGCT
TGTCA
SEQ ID NO: 22
HSV-TK dmNLS A168H, CO y SC
dmNLS = secuencia de localización nuclear con doble mutación
CO = codón optimizado
EC = empalme corregido en 327 y 555
Secuencia Kozak, Subrayada
gtcaGCGGCCGCACCGGrACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGC CTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaCTGCGgCCaGGATCT
CAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCG
ACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGA
CGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATC
GC CAACAT C TACAC CAC C CAGCAC C GC C TGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCG TGGTGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGC aCCaCACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTTC GACCGgCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCtccATGA CaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCACCAACATCGT
GCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAG
CGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGC
GCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCC
aCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTC ACCCTGTTCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGG CCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtc aCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACa ACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGG CCAACTAATAGGGATCCCrCGAGAAGCTTgtca
SEQ ID NO: 23 - Secuencia polinucleotídica de exportación nuclear MAP cinasa cinasaCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGCSEQ ID NO: 24 Secuencia polipeptídica de exportación nuclear MAP cinasa cinasa
LQKKLEELELDG

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una secuencia polinucleotídica que comprende una señal de exportación nuclear y que codifica una forma mutada de la timidina cinasa de un virus del herpes simple humano 1 (HSV1-TK), en donde la HSV1-TK codificada está mutada en los restos de aminoácidos 32 y 33 y, opcionalmente, junto con al menos uno de los restos de aminoácidos 25 o 26, en donde los restos de aminoácidos 32, 33, 25 y 26 corresponden a los restos 32, 33, 25 y 26, respectivamente, de la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 2, y en donde los restos de aminoácidos 32 y 33 están mutados independientemente a un aminoácido elegido del grupo que consiste en glicina, serina y ácido glutámico; y en donde los restos de aminoácidos 25 y 26 están mutados independientemente a un aminoácido elegido del grupo que consiste en: glicina, serina y ácido glutámico, y en donde la forma mutada de la timidina cinasa aumenta la actividad de destrucción celular mediada por análogos de nucleósidos en relación con la timidina cinasa del HSV1 de tipo silvestre establecida en la SEQ ID NO: 2.
2. Una secuencia polinucleotídica de la reivindicación 1, en donde la señal de exportación nuclear comprende una secuencia LQKKLEELELDG (SEQ ID NO: 24).
3. Una secuencia polinucleotídica de la reivindicación 1, en donde la HSV1-TK está mutada adicionalmente en el resto de aminoácido 167, 168 o una combinación de los mismos.
4. Una secuencia polinucleotídica de la reivindicación 3, en donde el resto de aminoácido 167 de la HSV1-TK codificada está mutado a serina o fenilalanina.
5. Una secuencia polinucleotídica de la reivindicación 3, en donde el resto de aminoácido 168 de la HSV1-TK codificada está mutado a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: histidina, lisina, cisteína, serina y fenilalanina.
6. Una secuencia polinucleotídica modificada de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia polinucleotídica modificada comprende una secuencia de ácido nucleico establecida como una cualquiera de las SEQ Id NO: 16 a 22.
7. Una secuencia polinucleotídica de la reivindicación 6, en donde la secuencia comprende HSV1-TK168dmNES establecida en la SEQ ID NO: 18.
8. Un vector retrovírico que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que codifica un polipéptido HSV1-TK modificado.
9. El vector retrovírico de la reivindicación 8, que comprende además una secuencia polinucleotídica que codifica un segundo polipéptido, en donde dicho segundo polipéptido es un polipéptido terapéutico.
10. El vector retrovírico de la reivindicación 9, en donde el segundo polipéptido terapéutico es un segundo gen suicida o un factor de crecimiento.
11. El vector retrovírico de la reivindicación 8, que comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido PiT-2 o PiT-1.
12. El vector retrovírico de la reivindicación 8, que comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido dirigido que se une a una proteína extracelular.
13. Una partícula retrovírica que comprende el vector retrovírico de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, y un profármaco de nucleósido, para su uso en un método para destruir células neoplásicas en un animal o en un ser humano o en un método para tratar el cáncer en un animal o en un ser humano, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula del vector retrovírico que comprende el vector retrovírico de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, seguido de la administración de un profármaco de nucleósido al animal o al ser humano.
14. Una secuencia polinucleotídica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un agente que la timidina cinasa convierte en un agente citotóxico, para su uso en un método para destruir células neoplásicas en un animal o en un ser humano, comprendiendo el método:
a) introducir en una célula neoplásica la secuencia polinucleotídica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;
b) permitir o iniciar que la célula exprese la timidina cinasa expresada; y
c) poner en contacto la célula con el agente que la timidina cinasa convierte en un agente citotóxico.
15. La secuencia polinucleotídica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y el agente que la timidina cinasa convierte en un agente citotóxico, para el uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la HSV1-TK está codificada por la secuencia polinucleotídica de una cualquiera de las SEQ ID NO: 16 a 22.
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