ES2985061T3

ES2985061T3 - Microorganismos mutantes resistentes a la destrucción por lactosa

Info

Publication number: ES2985061T3
Application number: ES15797912T
Authority: ES
Inventors: Joeri Beauprez; Maeseneire Sofie De; Eric Timmermans
Original assignee: Inbiose NV
Current assignee: Inbiose NV
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2015-11-12
Publication date: 2024-11-04
Anticipated expiration: 2035-11-12
Also published as: CN114015714A; CN107075506A; AU2015345073B9; RU2021109889A; RU2017120211A; WO2016075243A1; AU2015345073B2; RU2746410C2; KR20170076650A; US10858684B2; JP2021000116A; CN107075506B; CA2958786A1; EP3218509A1; AU2015345073A1; JP2017534292A; US20210095321A1; US20180066294A1; DK3218509T3; EP3218509B1

Abstract

La presente invención se refiere a un método para producir microorganismos mutados que resisten el fenómeno de la muerte por lactosa y a los microorganismos que se pueden obtener mediante dicho método. Dichos microorganismos modificados pueden aplicarse para la producción de productos especiales, tales como, entre otros, carbohidratos especiales, glicolípidos y compuestos galactosilados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismos mutantes resistentes a la destrucción por lactosa

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir microorganismos mutados que resisten el fenómeno de destrucción por lactosa y a los microorganismos que pueden obtenerse por medio de dicho procedimiento. Dichos microorganismos modificados genéticamente pueden aplicarse para la producción de productos de especialidad, tales como, pero sin limitación, carbohidratos, glicolípidos y compuestos galactosilados de especialidad.

Antecedentes de la técnica

La destrucción por lactosa es un principio bien conocido y bien estudiado que dificulta el crecimiento de muchos organismos en presencia de lactosa con otra fuente de carbono. Sin embargo, no se conoce el mecanismo exacto que subyace detrás de este fenómeno, aunque las características necesarias para inducir el fenómeno son bastante claras. La destrucción por lactosa se produce cuando se añade lactosa a un cultivo microbiano que crece en otra fuente de carbono, tal como, pero sin limitación, glicerol o sacarosa. Además, se produce cuando el gen de transporte de lactosa o bien es inducible o bien se expresa constitutivamente (33, 39, 75). La destrucción por lactosa se observó por primera vezen E. co lien la que la expresión de lactosa permeasa se moduló con IPTG y lactosa en condiciones quimiostáticas (28). Posteriormente, también se observó destrucción por lactosa enRhizobium meliloti, Kluyveromyces lactisyZymomonas mobilis(55, 70, 77). Una de las posibles razones para este fenómeno se atribuyó al denominado "coste" de la actividad transportadora de lactosa para la célula; este "coste" da como resultado una reducción o inhibición del crecimiento y también está relacionado con la concentración de lactosa extracelular (34), que se mantiene en general elevada en procesos industriales para adquirir títulos y rendimientos de producto suficientemente altos. Sin embargo, la técnica establece que siempre que haya transporte de lactosa en estas condiciones, deberá producirse destrucción por lactosa. Para resolver el problema de la destrucción por lactosa, se ha propuesto la supresión de lactosa permeasa o el deterioro grave de la absorción de lactosa (34). Por ejemplo, Lodiet al(55) suprimieron (inactivaron) lactosa permeasa enK. lactisy descubrieron que ya no se produjo destrucción por lactosa. Las mutaciones espontáneas durante sus experimentos mostraron además que las cepas negativas a la destrucción por lactosa seleccionadas están gravemente deterioradas en su absorción de lactosa. Sin embargo, la absorción de lactosa es esencial para sintetizar productos o bioproductos de especialidad de forma eficaz. Por lo tanto, una supresión de lactosa permeasa o un deterioro grave en la actividad de lactosa permeasa claramente no es una solución, ya que la producción de dichos bioproductos requiere 1) una absorción de lactosa eficaz y 2) un casete de expresión que no dé lugar al "fenotipo de destrucción por lactosa". La lactosa permeasa para la producción de bioproductos basados en lactosa se ha usado anteriormente, pero sin resolver el "fenotipo de destrucción por lactosa". En el pasado, este problema se resolvió reduciendo significativamente la absorción de lactosa (y por tanto se produce poco o ningún producto de especialidad basado en lactosa) o desacoplando la fase de crecimiento y la fase de producción a fin de obtener en primer lugar suficiente biomasa. Después de esta fase de crecimiento, la lactosa se añade en una segunda fase para producir un producto de especialidad. En esta segunda fase no se produce crecimiento o se produce un crecimiento significativamente reducido (59).

Por lo tanto, el consenso actual es que, para evitar la destrucción por lactosa, la absorción de lactosa debe eliminarse o deteriorarse gravemente, ya que la absorción normal de lactosa siempre dará lugar a la destrucción por lactosa. Por el contrario, la presente invención divulga una metodología de cribado para encontrar casetes de expresión de lactosa permeasa que permitan la absorción eficaz de lactosa sin experimentar destrucción por lactosa. La lactosa es un bloque de construcción para muchos bioproductos, más particularmente carbohidratos (14), glicolípidos y compuestos galactosilados de especialidad tales como galactosil-lípidos, galactosilceramidas y aglicones galactosilados. En muchos casos, el resto galactosa se usa para el direccionamiento a órganos de productos farmacéuticos (28). Sin embargo, el uso de lactosa como sustrato en combinación con otros sustratos no es tan evidente como podría parecer debido al fenómeno descrito anteriormente de "destrucción por lactosa". En general, son necesarios sistemas de producción multifásicos, sistemas de células acopladas de no crecimiento, para evitar la destrucción por lactosa (32, 48).

La cadena principal estructural básica de muchos carbohidratos especiales consiste en unidades de lactosa o galactosa. Más específicamente, los oligosacáridos de la leche humana y por extensión los oligosacáridos de la leche materna, un amplio grupo de sacáridos y oligosacáridos, se forman a partir de unidades de galactosa y lactosa (15). Estos carbohidratos se modifican adicionalmente con restos de azúcar tales como, por ejemplo, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, ácidos siálicos (tales como N-acetilneuraminato, N-glicoilneuraminato, ácido 2-ceto-3-desoxi-D-glicero-galacto-nonulosónico,...) (21), L-fucosa,.... La síntesis de estos compuestos requiere entonces carbohidratos activados tales como UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, CMP-ácido siálico, GDP-fucosa,... , que son moléculas muy caras y difíciles de sintetizar y se producen óptimamente por células vivas en crecimiento debido a la energía que requiere su biosíntesis. Los componentes de oligosacáridos de la leche humana/materna tienen efectos antinflamatorios y prebióticos y/o tienen aplicaciones en productos terapéuticos como nutracéuticos, agentes antinflamatorios, prebióticos o productos farmacéuticos (15, 24, 68). Sin embargo, aún es necesario un procedimiento eficaz para producir estos últimos compuestos de alto valor.

La presente invención describe sistemas de expresión sintéticos para transportadores de lactosa que no dan como resultado la destrucción por lactosa, incluso a altas concentraciones de lactosa. Los organismos mutados que se pueden obtener por medio de dichos sistemas de expresión son, por lo tanto, útiles para producir los bioproductos descritos anteriormente.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Efecto de la lactosa sobre una cepa deE. colide tipo silvestre. En la flecha se añadió lactosa a uno de los cultivos y el crecimiento de este cultivo se detuvo inmediatamente, mientras que la otra cepa continuó creciendo en el otro cultivo.

Figura 2: Efecto de la lactosa sobre una cepa mutante de transportador de lactosa deE. colien la que la expresión del transportador de lactosa se altera por medio de un promotor constitutivo sintético. La flecha indica el momento en el que se añadió lactosa al medio en uno de los cultivos. En este caso no se observó ningún efecto sobre el crecimiento. Por lo tanto, estas cepas mutantes pueden seleccionarse de esta forma.

Figura 3: Ejemplo de una combinación de promotor, RBS y secuencia de transportador de lactosa (SEQ ID N° 1) que no da como resultado la destrucción por lactosa cuando se introduce en una cepa mutante deE. coli.

Figura 4: Ejemplo de una secuencia del gen de lactosa permeasa acoplado traduccionalmente al gen lacZ (SEQ ID N° 2).

Figura 5: Ejemplo de una secuencia del gen de lactosa permeasalacYacoplado traduccionalmente al gen cat (SEQ ID N° 3).

Figura 6: Ejemplo de una secuencia del gen de lactosa permeasa deK. maxianusacoplado traduccionalmente al gen aph 1 (SEQ ID N° 4).

Figura 7: Ejemplo de una secuencia del gen de lactosa permeasalacyacoplado con un aptámero que se une a (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hidroxibenciliden)-1,2-dimetil-1H-imidazol-5(4H)-ona (SEQ ID N° 5) y permite la detección de la expresión de lactosa permeasa.

Figura 8: Resistencia a cloranfenicol de una cepa de referencia que contiene un plásmido de referencia pSC101 sin una lactosa permeasa acoplada traduccionalmente a un gen de resistencia a cloranfenicol y una cepa mutante con una lactosa permeasa acoplada traduccionalmente a un gen de resistencia a cloranfenicol. El eje X muestra las diferentes concentraciones de cloranfenicol sometidas a ensayo, el eje Y muestra la densidad óptica del cultivo después de 48 horas de incubación. La cepa de referencia muestra un retraso en el crecimiento en un cribado de cloranfenicol más bajo que la cepa mutante, lo que prueba que la expresión de lactosa permeasa puede cribarse mediante acoplamiento traduccional con un gen de resistencia a antibióticos. Los organismos que expresan lactosa permeasa, por lo tanto, pueden seleccionarse de una mezcla de organismos no expresantes y expresantes de esta forma.

Figura 9: Resistencia a cloranfenicol de una cepa de referencia que contiene un plásmido de referencia pSC101 sin una lactosa permeasa acoplada traduccionalmente a un gen de resistencia a cloranfenicol y una cepa mutante con una lactosa permeasa acoplada traduccionalmente a un gen de resistencia a cloranfenicol. El eje X muestra las diferentes concentraciones de cloranfenicol sometidas a ensayo, el eje Y muestra la densidad óptica del cultivo después de 92 horas de incubación. La cepa de referencia muestra un retraso en el crecimiento en un cribado de cloranfenicol más bajo que la cepa mutante, lo que prueba que la expresión de lactosa permeasa puede cribarse mediante acoplamiento traduccional con un gen de resistencia a antibióticos. Los organismos que expresan lactosa permeasa, por lo tanto, pueden seleccionarse de una mezcla de organismos no expresantes y expresantes de esta forma.

Figura 10: pCXP14-FT_H. pylori (SEQ ID N° 6).

Figura 11: Efecto de la lactosa sobre una cepa de levadura de tipo silvestre(Kluyveromyces marxianus lactis).En la flecha se añadió lactosa a uno de los cultivos y el crecimiento de este cultivo se detuvo inmediatamente, mientras que la otra cepa continuó creciendo en el otro cultivo.

Figura 12: Efecto de la lactosa sobre cepas mutantes en transportador de lactosa de levadura(Saccharomyces cerevisiae)en las que la expresión del transportador de lactosa está alterada por medio de un promotor constitutivo sintético. La flecha indica el momento en el que se añadió lactosa al medio en uno de los cultivos. En este caso no se observó ningún efecto sobre el crecimiento. Por lo tanto, estas cepas mutantes pueden seleccionarse de esta forma.

Figura 13: Ejemplo de una combinación de promotor (p1), Kozak, secuencia codificante de lactosa permeasa deK. marxianusy terminador (SEQ ID N° 7) que no da como resultado la destrucción por lactosa cuando se introduce en una cepa mutante de levadura.

Figura 14: Ejemplo de una combinación de promotor (p2), Kozak, secuencia codificante de lactosa permeasa deK. marxianusy terminador (SEQ ID N° 8) que no da como resultado la destrucción por lactosa cuando se introduce en una cepa mutante de levadura.

Figura 15: Ejemplo de combinación de promotor, Kozak, secuencia codificante de p-galactosidasa deK. marxianusy terminador (SEQ ID N° 9).

Figura 16: ADNr de HR1 (SEQ ID N° 10).

Figura 17: ADNr de HR2 (SEQ ID N° 11).

Figura 18: Ejemplos de secuencias seleccionadas que se originan a partir de la metodología de cribado de destrucción por lactosa tal como se describe en los ejemplos (SEQ ID N° 12 a 57).

Figura 19: Tasa de crecimiento relativa de los casetes de expresión de lactosa permeasa, con respecto al tipo silvestre. Las barras de error son desviaciones estándar de al menos 3 mediciones repetidas. Las secuencias que se correlacionan con los números de secuencia en el eje X se muestran en la figura 18.

Figura 20: La secuencia del casete de expresión lacIQ_lacY que se sometió a ensayo en la destrucción por lactosa en el ejemplo 16 (SEQ ID N° 58).

Figura 21: Efecto de la lactosa sobre una cepa deE. colide tipo silvestre y una cepa mutante placIQJacY. Ambas cepas se cultivaron con y sin la adición de la fase exponencial media de lactosa. La flecha indica el momento de la adición de lactosa. El crecimiento de ambas cepas se vio gravemente perjudicado por la adición de lactosa.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir microorganismos que resisten el fenómeno de destrucción por lactosa cuando se cultivan en un entorno en el que la lactosa se combina con otra fuente de carbono, comprendiendo dicho procedimiento:

a. mutar la expresión de un transportador de lactosa dentro de microorganismos introduciendo un promotor heterólogo delante de un gen de transportador de lactosa endógeno o exógeno a) suprimiendo los transportadores de lactosa endógenos del genoma y reintroduciéndolos en otra ubicación dentro del genoma de dicho microorganismo, b) introduciendo un promotor heterólogo delante de los transportadores de lactosa endógenos, o c) inactivando el promotor de lactosa endógeno e introduciendo un promotor heterólogo en la misma ubicación en el genoma de dicho microorganismo, y/o, mutando la región no traducida delante de la secuencia codificante que contiene las secuencias de unión a ribosoma o de Kozak y/o modificando el uso de codones del gen de transportador de lactosa endógeno, en el que dicha mutación da como resultado la expresión de dicho transportador de lactosa, b. cultivar dichos microorganismos mutados en un medio que comprende una fuente de carbono que no es lactosa, c. añadir lactosa a dicho medio durante el crecimiento de dichos microorganismos mutados, y d. seleccionar los microorganismos que resisten el fenómeno de destrucción por lactosa al crecer en dicho medio que comprende lactosa y que retienen al menos el 50% del influjo de lactosa obtenido con el casete de expresión de tipo silvestre de dicho transportador de lactosa.

La presente invención se refiere también al procedimiento descrito anteriormente en el que la expresión de lactosa permeasa en la etapa b) se detecta por medio de acoplamiento traduccional con un gen indicador y/o mediante acoplamiento de aptámero.

La presente invención se refiere al procedimiento descrito anteriormente en el que el transportador de lactosa expresado se detecta mediante constructos genéticos tal como se proporcionan por las SEQ ID N° 2, 3, 4 y/o 5.

La presente invención se refiere también a un procedimiento tal como se ha descrito anteriormente en el que dicho transportador de lactosa es una lactosa permeasa.

La presente invención se refiere también a un procedimiento tal como se ha descrito anteriormente en el que dicho microorganismo es una bacteria, una levadura o un hongo.

La presente invención también se refiere a secuencias promotoras, regiones no traducidas delante de la secuencia codificante que contienen secuencias de unión a ribosomas o secuencias de Kozak y/o secuencias de lactosa permeasa que dar lugar a la expresión de un transportador de lactosa, que no da como resultado un fenotipo de destrucción de lactosa cuando se cultiva un microorganismo que contiene dicha secuencia en un entorno en el que se combina lactosa con una o varias otras fuentes de carbono, y que puede obtenerse mediante un procedimiento tal como se ha descrito anteriormente

La presente invención se refiere también a un microorganismo que resiste el fenómeno de destrucción por lactosa cuando se cultivan en un entorno en el que la lactosa se combina con otra fuente de carbono, y que puede obtenerse mediante un procedimiento tal como se ha descrito anteriormente, y que tiene una secuencia heteróloga delante de un gen transportador de lactosa tal como se proporciona por las SEQ ID N° 1,7, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 o 57.

La presente invención se refiere también a un microorganismo que resiste el fenómeno de destrucción por lactosa en el que los genes que codifican las enzimas de las rutas de degradación de lactosa y/o galactosa se vuelven menos funcionales o no funcionales.

La presente invención se refiere también al uso de un microorganismo tal como se ha descrito anteriormente para la producción de productos de especialidad basados en lactosa tales como carbohidratos, glicolípidos y compuestos galactosilados de especialidad.

La presente invención se refiere también al uso de un microorganismo tal como se ha descrito anteriormente en el que dichos carbohidratos de especialidad son 2-fucosil-lactosa o 2'-fucosil-lactosa o 3-fucosil-lactosa o 2',3-d ifucosillactosa o lactoMriosa o lacto-N-tetraosa, o lacto-nN-tetraosa o 3'sialil-lactosa o 6'sialil-lactosa.

Descripción de la invención

La presente invención describe una forma novedosa de evitar la destrucción por lactosa cambiando la expresión de un transportador de lactosa mediante ingeniería genética en un organismo, dando como resultado un organismo que expresa un transportador de lactosa mutante. Para este fin, se expresa un gen de transportador de lactosa exógeno y/o endógeno por un promotor heterólogo que no da lugar a un fenotipo de destrucción por lactosa y/o se modifica el uso de codones del transportador de lactosa para crear una expresión alterada del transportador de lactosa que no da lugar a un fenotipo de destrucción de lactosa. Para este fin, el control de expresión natural de los transportadores de lactosa debe eliminarse y/o reemplazarse de tal manera que no se produzca la destrucción por lactosa. Por ejemplo, el casete de expresión del transportador de lactosa de origen natural se suprime del genoma y se reintroduce en otra ubicación, y/o, se introduce un promotor heterólogo delante del transportador de lactosa en su ubicación original, y/o, se inactiva en primer lugar el transportador de lactosa y se reintroduce con un promotor heterólogo en la misma y/u otra ubicación en el genoma, y/o, el transportador de lactosa se introduce en un operón que se expresa a través de un promotor heterólogo.

La presente invención se refiere, por lo tanto, a un procedimiento para producir microorganismos que resisten el fenómeno de destrucción por lactosa cuando se cultivan en un entorno en el que la lactosa se combina con otra fuente de carbono, en el que dicho procedimiento comprende: 1) mutar la expresión de transportadores de lactosa dentro de microorganismos, en el que dicha mutación da como resultado la expresión de dicho transportador de lactosa, 2) cultivar dichos microorganismos mutados en un medio que comprende una fuente de carbono que no es lactosa, 3) añadir lactosa a dicho medio durante el crecimiento de dichos microorganismos mutados, y 4) seleccionar los microorganismos que resisten el fenómeno de destrucción por lactosa al crecer en dicho medio que comprende lactosa y que retienen al menos el 50% del influjo de lactosa obtenido con el casete de expresión de tipo silvestre de dicho transportador de lactosa.

El término "destrucción por lactosa" se refiere al fenómeno de retraso del crecimiento o detención del crecimiento de un organismo que crece en un entorno en el que se combina lactosa o galactósido con una o varias otras fuentes de carbono. Estas fuentes de carbono son, sin limitación, glicerol, maltosa, glucosa, fructosa, sacarosa, fucosa, manosa, ácido siálico, almidón, celulosa, polioles (tales como manitol, xilitol, sorbitol), ácidos orgánicos (lactato, succinato, acetato,...) y/o pentosas (xilosa, arabinosa,...).

La presente invención describe un procedimiento para identificar sistemas de expresión de lactosa permeasa que no dan como resultado destrucción por lactosa. Este procedimiento abarca un análisis de crecimiento de la cepa mutante a la que se añade lactosa en la fase exponencial media. Este procedimiento puede realizarse en una forma de alto rendimiento en placas de microtitulación o con clasificadores celulares, permitiendo el cribado de múltiples promotores, sitios de unión a ribosomas, uso de codones y otros factores que pueden influir en la expresión de lactosa permeasa en el microorganismo mutante. La presente invención describe un procedimiento para detectar la expresión de lactosa permeasa por medio de acoplamiento traduccional y/o acoplamiento de aptámeros y la selección de secuencias que dan lugar a la expresión por medio de un gen indicador, tal como, pero sin limitación, un gen de resistencia a antibióticos (por ejemplo, pero sin limitación, cloranfenicol, geneticina G418), una proteína fluorescente, una hidrolasa (por ejemplo, pero sin limitación, galactosidasa, xilanasa) y, o una secuencia de aptámero. Las secuencias que dan lugar a la expresión de lactosa permeasa se seleccionan también basándose en el gen indicador, mediante cultivo en un medio con un antibiótico, un ensayo colorimétrico (tal como X-gal) y/o por medio de un clasificador de células activado por fluorescencia que clasifica células fluorescentes y/o un ensayo de aptámero, por ejemplo, pero sin limitación, basado en (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hidroxibenciliden)-1,2-dimetil-1H-imidazol-5(4H)-ona (37, 64). La presente invención describe también un procedimiento para cribar organismos mutantes que expresan el transportador de lactosa que no experimentan destrucción por lactosa. Además, la presente invención describe cómo se pueden crear bibliotecas de casetes de expresión de lactosa permeasa por medio de bibliotecas de promotores, bibliotecas de secuencias de RBS o de Kozak, bibliotecas de terminadores de la transcripción y/o variantes de usos de codones del gen de lactosa permeasa. Estas bibliotecas se crean también mediante procedimientos tales como, pero sin limitación, ensamblaje de Gibson, ensamblaje de Golden Gate, ensamblaje de Cliva, LCR o ligamiento por restricción (25, 36, 50, 79).

El término "que retiene al menos el 50% del influjo de lactosa obtenido con el casete de expresión de tipo silvestre de dicho transportador de lactosa" se refiere al hecho de que los microorganismos mutados de la presente invención, aunque resisten la destrucción por lactosa, aún deberán ser capaces de retener al menos el 50% (es decir, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99%) del influjo de lactosa que se obtiene cuando se usa el casete de expresión de tipo silvestre de dicho transportador de lactosa.

El término "casete de expresión" se refiere a cualquier secuencia en la que está presente una secuencia promotora, una secuencia de región no traducida (que contiene o bien una secuencia de unión a ribozima o bien una secuencia de Kozak), una secuencia codificante (por ejemplo una secuencia del gen de lactosa permeasa) y opcionalmente un terminador de transcripción (18).

El término "transportador de lactosa" se refiere a cualquier proteína expresada en un microorganismo que es capaz de translocar (transportar) lactosa a través de la membrana citoplasmática. Tales proteínas son, por ejemplo, lactosa permeasas (transportadores de la superfamilia MFS o la superfamilia de facilitadores principales).

El término "promotor heterólogo" se refiere a cualquier promotor que no se produzca de forma natural delante de una secuencia codificante. Un "promotor" es la totalidad de la secuencia de unión a ARN polimerasa que está ubicada antes del sitio de inicio de la transcripción y la región no traducida delante de la secuencia codificante. Una secuencia "promotora heteróloga" es, por lo tanto: 1) una variante de la secuencia promotora que no se produce de forma natural que contiene al menos 1 (es decir, 1, 2, 3, 4,...) mutación, y/o 2) un promotor nativo del microorganismo que expresa el transportador de lactosa mutante que no se produce de forma natural delante de la secuencia codificante de dicho transportador, y/o 3) una secuencia que no se produce de forma natural en el microorganismo que expresa el transportador de lactosa, y/o 4) un promotor artificial que es un promotor diseñadoin silico.Estos promotores pueden derivarse de bibliotecas tales como, pero sin limitación, las descritas por Alperet al.(2005), y/o HXT7p, Hammeret al.(2006), De Meyet al.(2007), Coussementet al(2014) o, Mutaliket al(2013) (3, 25, 29, 41, 60) (66), o Blountet al(2012), promotores tales como, pero sin limitación, ADH1p, TEF1p, TEF2p, GPDp, PDC1p, FBA1p, PGK1p, PGI1p, TDH2p, PYK1p,ENO2p, GPM1p, TPIlp (13), o diseñados tal como se describe, por ejemplo, por Rhodiuset al.(2012). El término "promotor artificial" también se refiere a promotores con secuencias de ADN que son combinaciones de la secuencia promotora nativa (autóloga) con partes de diferentes secuencias promotoras (autólogas o heterólogas). Las secuencias de dichos "promotores artificiales" se pueden encontrar en bases de datos tales como, por ejemplo, partsregistry.org (19). Los promotores heterólogos dan lugar a la expresión constitutiva o a la expresión regulada por medio de un factor de transcripción.

El término "expresión constitutiva" se define como la expresión que no está regulada por factores de transcripción distintos de las subunidades de la ARN polimerasa (por ejemplo, los factores sigma bacterianos) en determinadas condiciones de crecimiento. Ejemplos no limitantes de tales factores de transcripción son CRP, Lacl, ArcA, Cra, IclR,.. enE. coli,o, Aft2p, Crzip, Skn7,..enSaccharomyces cerevisiae,o, DeoR, GntR, Fur,... enB. subtilis.Estos factores de transcripción se unen a una secuencia específica y pueden bloquear o potenciar la expresión en determinadas condiciones de crecimiento. La ARN polimerasa se une a una secuencia específica para iniciar la transcripción, por ejemplo a través de un factor sigma en huéspedes procarióticos.

El término "expresión regulada" se define como la expresión que está regulada por factores de transcripción distintos de las subunidades de la ARN polimerasa (por ejemplo, factores sigma bacterianos) en determinadas condiciones de crecimiento. Ejemplos de tales factores de transcripción se han descrito anteriormente.

El término "región no traducida" delante de la secuencia codificante que contiene los sitios de unión al ribosoma o secuencias de Kozak se refiere a la secuencia entre la secuencia de unión a la ARN polimerasa y la secuencia codificante. Esta región no traducida es también la secuencia que se produce de forma natural delante de la secuencia codificante, y/o una secuencia que se produce de forma natural en el microorganismo que expresa el transportador de lactosa, y/o una secuencia que se deriva de otros organismos (procariotas o eucariotas), y/o una secuencia que se diseña artificialmente, que se refiere a sitios de unión a ribosoma diseñados de forma no natural oin silicocon tasas de traducción conocidas o medibles; estas secuencias pueden derivarse de bibliotecas tal como se describen por Mutaliket al(2013) (60) o diseñarse mediante algoritmos, por ejemplo, tal como se describen por Saliset al(2009) (67) o se puede encontrar en bases de datos tales como partsregistry.org (19).

La expresión "uso de codones modificados" se refiere a la alteración de los codones usados dentro de una secuencia codificante de ADN, ya sea a codones usados más frecuentemente por el organismo o usados rara vez por el organismo. El uso de codones se define en bases de datos tales como la base de datos de uso de codones (61) y el uso de codones se optimiza mediante algoritmos de diseño de uso de codones (73).

El término "acoplamiento traduccional" se refiere a la expresión acoplada de un gen de interés y un gen indicador tal como proteínas fluorescentes verdes, genes de resistencia a antibióticos, genes tóxicos, (49, 53, 58, 63). El término "sensor de traducción" se refiere a cualquier mecanismo que sea un indicador para la expresión y traducción de un gen, por ejemplo, etiquetas fluorescentes y etiquetas de división tal como se describen en las siguientes referencias (17, 72).

El término "acoplamiento de aptámero" se refiere a la introducción de una secuencia de aptámero en el ARN mensajero del transportador de lactosa que puede detectarse por un fluoróforo tal como, pero sin limitación, (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hidroxibenciliden)-1,2-dimetil-1H-imidazol-5(4H)-ona (37, 64).

El término "análisis de crecimiento" se refiere al análisis de la curva de crecimiento de un organismo. Este organismo se cultiva en un medio de crecimiento en un entorno de crecimiento. El término entorno de crecimiento se refiere a todos los parámetros ambientales tales como pH, temperatura, oxígeno disuelto. El pH se ajusta por medio de un tampón de pH o por control de pH y es por ejemplo, pero sin limitación, un pH de 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 u 8. La temperatura se establece, por ejemplo, pero sin limitación, a 25, 28, 30, 32, 34, 37, 40, 42, 45 °C. El oxígeno disuelto es anaeróbico, micro-aeróbico (con oxígeno disuelto por debajo de 1,5 mg/l) o condiciones aeróbicas.

El término "medio" o "medio de crecimiento" se refiere a cualquier solución que contiene los sustratos necesarios para que crezca un organismo. Estos sustratos son, pero sin limitación, fuentes de nitrógeno tales como sales de amonio, sales de nitrato, extracto de levadura, peptona, casamino y/o aminoácidos, fuentes de fósforo tales como, pero sin limitación, sales de fosfato, fuentes de azufre tales como, pero sin limitación, sales de sulfato, elementos tales como, pero sin limitación, cobre, cobalto, hierro, selenio, yodo, molibdato, magnesio, calcio, potasio, sodio, zinc, níquel, manganeso y/o ácido bórico y/o vitaminas tales como, pero sin limitación, tiamina, ácido pantoténico y/o niacina y/o una fuente de carbono tal como, pero sin limitación, glicerol, maltosa, glucosa, fructosa, sacarosa, fucosa, manosa, ácido siálico, almidón, celulosa, polioles (tales como manitol, xilitol, sorbitol), ácidos orgánicos (lactato, succinato, acetato,...), y/o pentosas (xilosa, arabinosa,...).

El término "organismo" o "célula" tal como se ha indicado anteriormente se refiere a un microorganismo elegido de la lista que consiste en una bacteria, una levadura o un hongo, o, se refiere a una célula vegetal o animal. Esta última bacteria pertenece preferentemente al filo Proteobacteria o al filo Firmicutes o al filo Cyanobactria o al filo Deinococcus-Thermus. Esta última bacteria que pertenece al filo Proteobacteria pertenece preferentemente a la familiaEnterobacteriaceae,preferentemente a la especieEscherichia coli.Esta última bacteria se refiere preferentemente a cualquier cepa perteneciente a la especieEscherichia colital como, pero sin limitación,Escherichia coliB,Escherichia coliC,Escherichia coliW,Escherichia coliK12,Escherichia coliNissle. Más específicamente, este último término se refiere a cepas deEscherichia colicultivadas, designadas como cepas deE. coliK12, que están bien adaptadas al entorno del laboratorio y, a diferencia de las cepas de tipo silvestre, han perdido su capacidad de crecer en el intestino. Ejemplos bien conocidos de las cepas deE. coliK12 son K12 de tipo silvestre, W3110, MG1655, M182, MC1000, MC1060, MC1061, MC4100, JM101, NZN111 y AA200. Por lo tanto, la presente invención se refiere específicamente a una cepa deEscherichia colimutada y/o transformada tal como se ha indicado anteriormente en la que la cepa deE. colies una cepa K12. Más específicamente, la presente invención se refiere a una cepa deEscherichia colimutada y/o transformada tal como se ha indicado anteriormente, en la que dicha cepa K12 esE. coliMG1655. Esta última bacteria que pertenece al filo Firmicutes pertenece preferentemente a los Bacilli, preferentemente de la especie Bacillus. Esta última levadura pertenece preferentemente al filo Ascomycota o al filo Basidiomycota o al filo Deuteromycota o al filo Zygomycetes. Esta última levadura pertenece preferentemente al géneroSaccharomyces, Pichia, Hansunella, Kluyveromyces, YarrowiaoStarmerella.Este último hongo pertenece preferentemente al géneroRhizopus, DictyosteliumoAspergillus.

La presente invención describe organismos que son capaces de absorber lactosa sin sufrir destrucción por lactosa y son capaces de convertir la lactosa o su resto galactosa en un producto de especialidad.

Más particularmente, dichos productos o bioproductos de especialidad son carbohidratos, glicolípidos de especialidad, tales como, pero sin limitación, galactolípidos y/o lactolípidos, y/o compuestos galactosilados tales como galactosillípidos, galactosilceramidas y/o aglicones galactosilados. La presente invención describe organismos que son capaces de absorber lactosa sin sufrir destrucción de lactosa y convertir dicha lactosa en un oligosacárido de leche humana, tal como, pero sin limitación 3-fucosil-lactosa, 2'-fucosil-lactosa, 6-fucosil-lactosa, 2',3-difucosil-lactosa, 2',2-d ifucosillactosa, 3,4-difucosil-lactosa, 6'-sialil-lactosa, 3-sialil-lactosa, 3,6-disiail-lactosa, 6,6'-disialilactosa, 3,6-disialil-lacto-N-tetraosa, lactodifucotetraosa, lacto-N-tetraosa, lacto-N-neotetraosa, lacto-N-fucopentaosa II, lacto-N-fucopentaosa I, lacto-N-fucopentaosa III, sialil-lacto-N-tetraosa c, sialil-lacto-N-tetraosa b, sialil-lacto-N-tetraosa a, lacto-N-difucohexaosa I, lacto-N-difucohexaosa II, lacto-N-hexaosa, lacto-N-neohexaosa, para-lacto-N-hexaosa, monofucosilmonosiail-lacto-N-tetraosa c, monofucosil para-lacto-N-hexaosa, monofucosil-lacto-N-hexaosa III, lacto-N-hexaosa III fucosilada isomérica, lacto-N-hexaosa I fucosilada isomérica, sialil-lacto-N-hexaosa, sialil-lacto-Nneohexaosa II, difucosil-para-lacto-N-hexaosa, difucosil-lacto-N-hexaosa, difucosil-lacto-N-hexaosa a, difucosil-lacto-N-hexaosa c, quitosano galactosilado, oligosacaridos fucosilados y/o oligosacáridos sialilados...

La presente invención describe también, pero no como parte de la invención, organismos que no experimentan destrucción por lactosa y que sintetizan nucleótido-azúcares tales como, pero sin limitación, GDP-L-fucosa, GDP-manosa, GDP-glucosa, CMP-ácido siálico, UDP-glucosa, UDP-galactosa, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilmanosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, UDP-ácido glucurónico, UDP-ácido galacturónico, UDP-xilosa, UDP-arabinosa y/o, dTDP-ramnosa. El término "ácido siálico" es el nombre de grupo para compuestos tales como, pero sin limitación, ácido neurámico, ácido N-acetilneurámico, o ácido N-glicoilneurámico tal como se definen por Varki (1992) (71). La concentración o combinación intracelular de GDP-fucosa se potencia por regulación al alza mediante la ruta de novo y/o la ruta de rescate. La ruta de novo consiste en una GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3,5-epimerasa-4-reductasa o GDP-fucosa sintasa, una GDP-manosa 4,6-deshidratasa, una GDP-D-manosa pirofosforilasa, una fosfomanosa isomerasa y/o una fosfomanomutasa, cuya expresión se potencia individualmente por medio de elementos genéticos tales como, pero sin limitación, promotores y/o sitios de unión a ribosomas y/o uso de codones alterado en un monocistrón o policistrón (estructura del operón); y/o por medio de los reguladoresarcA icIRenEnterobacteriaceaey/o por medio del regulador transcripcional RcsA enEnterobacteriaceaeo genes homólogos en bacterias, o,Xbp1, Spt2o, Sfp1, Rpd3, Rap1, Gcr1, Gcn5, Cst6, Abf1, Hsf1, Reb1, Cad1, Sin4, Ash1, Ixr1, Met32, Pho2, Rgrl, Spt7, Swi4enSaccharomyces cerevisiaeo genes homólogos en levaduras u hongos. La ruta de rescate consiste en una L-fucosa quinasa y/o una GDP-L-fucosa pirofosforilasa. La combinación de GDP-manosa se potencia regulando al alza los genes que codifican una GDP-D-manosa pirofosforilasa, una fosfomanosa isomerasa y/o una fosfomanomutasa; y/o, los genes que codifican una manoquinasa y una GDP-D-manosa pirofosforilasa. La combinación UDP-galactosa se potencia regulando al alza los genes que codifican una galactoquinasa y/o galactosa 1-fosfato uridil transferasa, y/o, una UDP-galactosa-4-epimerasa, y/o, una UDP-galactosa/glucosa pirofosforilasa, y/o una lactosa sintasa, y/o una lactosa fosforilasa y/o una sacarosa fosforilasa. La combinación UDP-glucosa se potencia regulando al alza los genes que codifican una glucoquinasa, y/o una UDP-glucosa pirofosforilasa, y/o una sacarosa fosforilasa y/o una fosfoglucomutasa, y/o una sacarosa sintasa. La combinación CMP-ácido siálico se potencia regulando al alza los genes que codifican L-glutamina:D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa y/o fosfoglucosamina mutasa y/o glucosamina-1-fosfato acetiltransferasa y/o N-acetilglucosamina-1-fosfato uridiltransferasa y/o UDP-W-acetilglucosamina 2-epimerasa y/o W-acetilneuraminato sintasa y/o citidina 5'-monofosfato N-acetilneuraminato sintetasa. La combinación UDP-N-acetilglucosamina se potencia regulando al alza los genes que codifican L-glutamina:D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa, y/o fosfoglucosamina mutasa, y/o glucosamina-1-fosfato acetiltransferasa y/o N-acetilglucosamina-1-fosfato uridiltransferasa y/o glucosamina-6-fosfato W-acetiltransferasa y/o fosfoacetilglucosamina mutasa y/o UDP-W-acetilglucosamina pirofosforilasa. La combinación UDP-W-acetilmanosamina se potencia regulando al alza los genes que codifican la potenciación de la combinación UDP-W-acetilglucosamina y/o una UDP-W-acetilglucosamina 2-epimerasa. La combinación UDP-W-acetilgalactosamina se potencia regulando al alza los genes que codifican la potenciación de la combinación UDP-W-acetilglucosamina y/o una UDP-W-acetilglucosamina C4-epimerasa. La combinación UDP-ácido glucurónico se potencia regulando al alza los genes que codifican la potenciación de la combinación UDP-glucosa y/o UDP-glucosa deshidrogenasa. La combinación UDP-xilosa se potencia regulando al alza los genes que codifican la potenciación de la combinación UDP-glucurónico y/o UDP-D-xilosa sintasa. La combinación UDP-ácido galacturónico se potencia regulando al alza los genes que codifican la potenciación de la combinación UDP-ácido glucurónico y/o UDP-D-ácido glucurónico 4-epimerasa. La combinación UDP-arabinosa se potencia regulando al alza los genes que codifican la potenciación de la combinación UDP-glucurónico y/o UDP-D-xilosa 4-epimerasa y/o arabinosa quinasa y/o UDP-L-arabinosa pirofosforilasa. La combinación dTDP-ramnosa se potencia regulando al alza los genes que codifican una dTDP-glucosa pirofosforilasa y/o dTDP-glucosa 4,6-deshidratasa y/o dTDP-4-deshidroramnosa 3,5-epimerasa y/o dTDP-4-deshidroramnosa reductasa y o una glucosa-1-fosfato timidililtransferasa y/o una nucleótido ramnosa sintasa.

El término "combinación" se refiere también a concentraciones de metabolitos que se producen de forma natural en el organismo de tipo silvestre, por ejemplo, la concentración de una combinación nucleótido-azúcar. El término "combinación mejorada" se refiere a una concentración significativamente aumentada de dicha combinación de metabolitos, superior a la de la combinación de metabolitos en el organismo de tipo silvestre.

El término "regular al alza un gen" se refiere a cada modificación genética que da lugar a la mejora en la expresión del gen y/o la actividad del producto de dicho gen. Dicha modificación genética es una modificación en el promotor, región no traducida, sitio de unión a ribosomas, la secuencia codificante, la ubicación génica, la estructura intrón/exón y/o el terminador transcripcional, que da lugar a dicho aumento en la expresión y/o la actividad.

Además, la presente invención describe, pero no como parte de la invención, organismos modificados genéticamente que pueden transferir estos nucleótido-azúcares a un mono-, di- u oligosacárido, tales como, pero sin limitación, galactosa, lactosa, lactoNbiosa, lactoNtriosa, lactoNtetraosa, lacto-N-neotetraosa, globotriosa, 2'fucosil-lactosa, 3-fucosilactosa, 3-sialil-lactosa, 6-sialil-lactosa, oligosacáridos de leche humana, heparosanos, quitosanos, factores de nod, glicolípidos y/o aglicones,.. por medio de una enzima glicosiltransferasa.

La presente invención describe también, pero no como parte de la invención, organismos que no experimentan destrucción por lactosa y que pueden modificar adicionalmente dicha lactosa con enzimas tales como, pero sin limitación, carbohidrato hidrolasas, carbohidrato transferasas, carbohidrato sintasas, acetilasas, aciltransferasas, carbohidrato fosfatasas, polisacárido liasas, quinasas, piruvilasas y/o sulfotransferasa.

La presente invención describe también, pero no como parte de la invención, organismos que no experimentan destrucción por lactosa y ya no degradan la lactosa haciendo que el gen de la lactosa hidrolasa sea menos funcional o no funcional.

Los términos "genes que se vuelven menos funcionales o no funcionales" se refieren a las tecnologías bien conocidas para un experto, tales como el uso de ARNpi, ARNi, miARN, ARNas, mutación de genes, inactivación de genes, mutagénesis por transposón, CrispR/CAS, etc., que se utilizan para cambiar los genes de tal forma que sean menos capaces (es decir, estadísticamente significativamente "menos capaces" en comparación con un gen de tipo silvestre funcional) o completamente incapaces (tales como genes inactivados) de producir productos finales funcionales. El término "inactivación (génica)" se refiere, por lo tanto, a un gen que se vuelve no funcional. El término "gen suprimido" o "supresión génica" también se refiere a un gen que se convierte en no funcional (2, 4-9, 22, 27, 30, 43, 45, 46, 51, 65, 74).

La presente invención, pero no como parte de la invención, describe organismos en los que se introducen/activan/regulan al alza genes para producir bioproductos tal como se ha descrito anteriormente. Estos genes se encuentran en bases de datos de genes tales como, pero sin limitación, bases de datos de genes o proteínas tales como, pero sin limitación, uniprot, o bases de datos de enzimas tales como, pero sin limitación, base de datos de enzimas Brenda (16, 23, 38) y se encuentran rutas hacia productos biológicos en bases de datos tales como, pero sin limitación, KEGG, Biocyc, Metacyc (20, 44, 47). La ruta hacia un determinado bioproducto descrito anteriormente puede determinarse mediante varias herramientas matemáticas descritas en la técnica (35, 54, 57, 76).

Ejemplos

1. Material y procedimientos Escherichia coli

Cepas y plásmidos

LasEscherichia coliMG1655 [A-, F,rph-1]y JM109 se obtuvieron de la Netherlands Culture Collection of Bacteria (NCCB). Todas las cepas mutantes se crearon usando el procedimiento de Datsenko y Wanner (27).

Medios

El medio de caldo Luria (LB) consistía en triptona peptona al 1% (Difco, Erembodegem, Bélgica), extracto de levadura al 0,5% (Difco) y cloruro de sodio al 0,5% (VWR, Lovaina, Bélgica). El medio del matraz en agitación contenía 2 g/l de NH4Cl, 5 g/l de (NH4)2SO4, 2,993 g/l de KH2PO4, 7,315 g/l de K2HPO4, 8,372 g/l de MOPS, 0,5 g/l de NaCl, 0,5 g/l de MgSO4-7H2O, 15 g/l de glicerol (a menos que se indique lo contrario), 1 ml/l de solución de vitamina, 100 |jl/l de solución de molibdato y 1 ml/l de solución de selenio. El medio se ajustó a un pH de 7 con KOH 1 M.

La solución vitamínica consistía en 3,6 g/l de FeCl2 ■ 4H2O, 5 g/l de CaCl2 ■ 2 H2O, 1,3 g/l de MnCl2 ■ 2 H2O, 0,38 g/l de CuCl2 ■ 2H2O, 0,5 g/l de CoCl2 ■ 6H2O, 0,94 g/l de ZnCl2, 0,0311 g/l de H3BO4, 0,4 g/l de Na2EDTA2H2O y 1,01 g/l de tiamina. HCl. La solución de molibdato contenía 0,967 g/l de Na2MoO4 ■ 2H2O. La solución de selenio contenía 42 g/l de SeO2.

El medio mínimo para las fermentaciones contenía 6,75 g/l de NH4Cl, 1,25 g/l de (NH4)2SO4, 1,15 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCl, 0,5 g/l de MgSO4-7H2O, 30 g/l de lactosa y 20 g/l de sacarosa (o diferentes concentraciones si se indica lo contrario), 1 ml/l de solución de vitamina, 100 jl/ l de solución de molibdato, y 1 ml/l de solución de selenio con la misma composición que se ha descrito anteriormente.

Condiciones de cultivo

Se incubó un precultivo de una única colonia en una placa LB en 5 ml de medio LB durante 8 horas a 37 °C en un agitador orbital a 200 rpm. A partir de este cultivo se transfirieron 2 ml a 100 ml de cultivo mínimo en un matraz de agitación de 500 ml y se incubaron durante 16 horas a 37 °C en un agitador orbital a 200 rpm. Se usó el 4% de inóculo en un recipiente de cultivo Biostat B Plus de 2 o 5 l con un volumen de trabajo de 1,5 l o 4 l (Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Alemania). Las condiciones de cultivo eran: 37 °C, agitación a 800 rpm y caudal de gas de 1,5 l/min. Se mantuvieron condiciones aeróbicas mediante inyección de aire. El pH se mantuvo a 7 con H2SO40,5 M y solución de amoniaco al 35% M. El gas de escape se enfrió a 4 °C mediante un refrigerador de escape (Frigomix 1000, Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Alemania). Se añadió una disolución al 10% de agente antiespumante de silicona (BDH 331512K, VWR Int Ltd., Poole, Inglaterra) al subir la espuma durante la fermentación (aproximadamente 10 ^l). El gas de descarga se midió con un analizador de gas de descarga EL3020 (ABB Automation GmbH, 60488 Frankfurt am Main, Alemania).

Todos los datos se registraron con el sistema Sartorius MFCS/win v3.0 (Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Alemania).

Metodología de muestreo

El biorreactor contiene en su interior un tubo de recolección (aguja espinal BD, 1,2x152 mm (BDMedical Systems, Franklin Lakes, NJ - Estados Unidos) conectado a un puerto del reactor, unido en el exterior a una tubería Masterflex-14 (Cole-Parmer, Amberes, Bélgica), seguida de un puerto de recolección con un septo para el muestreo. El otro lado de este puerto de recolección está conectado de vuelta al recipiente del reactor con un tubo Masterflex-16. Este sistema se denomina bucle de muestreo rápido. Durante el muestreo, el caldo del reactor se bombea en el bucle de muestreo. Se ha estimado que, a un caudal de 150 ml/min, el caldo del reactor necesita 0,04 s para alcanzar el puerto de recogida y 3,2 s para volver a entrar en el reactor. A un nivel de pO2 del 50%, hay aproximadamente 3 mg/l de oxígeno en el líquido a 37°C. El nivel de pO2 nunca debería reducirse por debajo del 20% para evitar condiciones micro-aeróbicas. Por lo tanto, durante el tránsito a través del bucle de muestreo pueden consumirse 1,8 mg/l de oxígeno. Suponiendo una tasa de absorción de oxígeno de 0,4 g de oxígeno/g de biomasa/h (la tasa de absorción de oxígeno máxima encontrada en |Jmáx), esto proporciona 5 g/l de biomasa, una tasa de absorción de oxígeno de 2 g/l/h o 0,56 mg/l/s, que multiplicada por 3,2 s (tiempo de residencia en el bucle) da 1,8 mg/l de consumo de oxígeno.

Para inactivar el metabolismo de las células durante el muestreo, el caldo del reactor se succionó a través del puerto de recolección en una jeringa rellena con 62 g de perlas de acero inoxidable pre-enfriadas a -20 °C, para enfriar 5 ml de caldo inmediatamente a 4 °C. El muestreo vino seguido inmediatamente por centrifugación en frío (15000 g, 5 min, 4 °C). Durante los experimentos discontinuos, se tomó una muestra para la medición mediante DO600nm usando el bucle de muestreo rápido y el procedimiento de muestreo de perlas inoxidables frías.

Procedimientos analíticos

La densidad celular del cultivo se supervisó frecuentemente mediante medición de la densidad óptica a 600 nm (espectrofotómetro Uvikom 922, BRS, Bruselas, Bélgica). El peso celular en seco se obtuvo por centrifugación (15 min, 5000 g, rotor GSA, Sorvall RC-5B, Goffin Meyvis, Kapellen, Bélgica) de 20 g de caldo de reactor en tubos falcon presecados y pesados. A continuación, los sedimentos se lavaron una vez con 20 ml de disolución fisiológica (9 g/l NaCl) y se secaron a 70 °C hasta un peso constante. Para poder convertir las mediciones de DO600nm en concentraciones de biomasa, se realizó una curva de correlación de la DO600nm con la concentración de biomasa. Las concentraciones de glucosa y ácidos orgánicos se determinaron en un sistema Varian Prostar HPLC (Varian, Sint-Katelijne-Waver, Bélgica) utilizando una columna Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Eke, Bélgica) calentada a 65 °C, equipada con una columna de 1 cm, utilizando H2SO45 mM (0,6 ml/min) como fase móvil. Para la detección de picos se utilizó un detector UV-VIS de doble onda (210 nm y 265 nm) (Varian Prostar 325) y un detector de índice de refracción diferencial (Merck LaChrom L-7490, Merck, Lovaina, Bélgica). Los picos se pudieron identificar mediante división de las absorciones de los picos en 265 y 210 nm. La división da como resultado un valor constante, típico para un determinado compuesto (fórmula de Beer-Lambert).

Se midieron glucosa, fructosa, sacarosa, oligosacaridos y glucosa-1-fosfato mediante HPLC con una columna Hypercarb y se detectaron con un detector MSMS (Antonio et al., 2007; Nielsen et al., 2006).

Procedimientos genéticos

Los procedimientos usados para la construcción de mutantes se describen a continuación.

Los plásmidos se mantuvieron en el huéspedE. coliDH5a, (F-, $80d/acZAM15,A(LacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk-,mk+),phoA, supE44,A-,thi-1, gyrA96, relA1).

Plásmidos.Se usaron los plásmidos pKD46 (plásmido Red helper, resistencia a ampicilina), pKD3 (contiene un gen de resistencia a cloranfenicol flanqueado por FRT(cat)pKD4 (contiene un gen de resistencia a kanamicina flanqueado por FRT(kan)y pCP20 (expresa la actividad de recombinasa FLP) para la construcción de mutantes. El plásmido pBluescript (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania) se utilizó para construir los derivados de pKD3 y pKD4 con una biblioteca de promotores, o con alelos portadores de una mutación puntual.

MutacionesLas mutaciones consistían en una alteración génica (inactivación, KO). Se introdujeron utilizando el concepto de Datsenko y Wanner (27).

Los transformantes portadores de un plásmido Red helper se cultivaron en 10 ml de medio LB con ampicilina (100 mg/l) y L-arabinosa (10 mM) a 30 °C hasta una DO600nm de 0,6. Las células se volvieron electrocompetentes lavándolas con 50 ml de agua enfriada con hielo, una primera vez, y con 1 ml de agua enfriada con hielo, una segunda vez. Después se resuspendieron las células en 50 gl de agua helada. La electroporación se realizó con 50 j l de células y 10-100 ng de producto de ADN bicatenario lineal usando un Gene Pulser™ (BioRad) (600 Q, 25 pFD, y 250 voltios).

Tras la electroporación, las células se añadieron a 1 ml de medio LB incubado 1 h a 37 °C, y finalmente se extendieron sobre LB-agar que contenía 25 mg/l de cloranfenicol o 50 mg/l de kanamicina para seleccionar transformantes resistentes a antibiótico. Los mutantes seleccionados se verificaron mediante PCR con cebadores cadena arriba y cadena abajo de la región modificada y se cultivaron en LB-agar a 42 °C para la pérdida del plásmido auxiliar. Los mutantes se analizaron para determinar la sensibilidad a ampicilina.

ADN bicatenario lineal.Los amplicones lineales de ADN-bc se obtuvieron mediante PCR utilizando pKD3, pKD4 y sus derivados como plantilla. Los cebadores usados tenían una parte de la secuencia complementaria al molde y otra parte complementaria al lado del ADN cromosómico en el que tiene que tener lugar la recombinación. Para la inactivación, la región de homología se diseñó 50 nt cadena arriba y 50 nt cadena abajo del codón de inicio y detención del gen de interés. Para la activación, el punto de partida transcripcional (+1) tuvo que respetarse. Los productos de PCR se purificaron por PCR, se digirieron conDpnl, se volvieron a purificar a partir de un gel de agarosa y se suspendieron en tampón de elución (Tris 5 mM, pH 8,0).

Eliminación del gen de resistencia a antibióticos.Los mutantes seleccionados (resistentes a cloranfenicol o kanamicina) se transformaron con el plásmido pCP20, que es un plásmido resistente a ampicilina y cloranfenicol que muestra replicación sensible a la temperatura e inducción térmica de la síntesis de FLP. Los transformantes resistentes a ampicilina se seleccionaron a 30°C, después de lo cual unos pocos se purificaron en colonias en LB a 42°C y después se sometieron a ensayo para determinar la pérdida de toda la resistencia a antibióticos y del plásmido auxiliar FLP. Las inactivaciones e inserciones génicas se comprueban con cebadores de control (Fw/Rv-gene-out).

Transformación.Los plásmidos se transformaron en células competentes a CaCl2 usando el procedimiento simplificado de Hanahan (42) o mediante electroporación tal como se ha descrito anteriormente.

2. Material y procedimientos levadura

2.1. Cepas

Se obtuvoSaccharomyces cerevisiaeBY4742 de la colección de cultivos Euroscarf. Todas las cepas mutantes se crearon mediante recombinación homóloga o transformación de plásmidos usando el procedimiento de Gietz (40). Se obtuvoKluyveromyces marxianus lactisde la colección de cultivos Laboratory of Industrial Biotechnology and Biocatalysis.

2.2. Medios

Las cepas se cultivan en medio de levadura definido sintético (SD) con mezcla de suplemento completo (CSM) (SD CSM) o CSMdrop-out(SD CSM-Ura) que contiene 6,7 g.l-1 de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (YNB w/o AA, Difco), 20 g.l-1 de agar (Difco) (cultivos sólidos), 22 g.l-1 de glucosa monohidratada o 20 g.l-1 de lactosa y 0,79 g.l-1 de CSM o 0,77 g.l-1 de CSM-Ura (MP Biomedicals).

2.3. Condiciones de cultivo

Los cultivos de levadura se inoculan en primer lugar en 5 ml del medio apropiado y se incuban durante la noche a 30°C y 200 rpm. Para obtener cultivos de mayor volumen, se inocula el 2% (o más) del precultivo en 50-200 ml de medio. Estos cultivos se incuban de nuevo a 30°C y 200 rpm.

Los experimentos de crecimiento se realizan en una placa de 96 pocillos o en una escala de Erlenmeyer. Para obtener colonias individuales como material de partida para los experimentos de crecimiento y producción, las cepas se siembran en placas SD CSM selectivas y se incuban durante 2-3 días a 30°C. A continuación, se elige una colonia y se transfiere a 5 ml de medio para los estudios en Erlenmeyer o a 1 ml de medio para los experimentos en placas de microtitulación.

Para los experimentos en Erlenmeyer, los precultivos se incuban durante la noche a 30°C y 200 rpm y se añade el 2% de estos precultivos a 100 ml de medio con el fin de iniciar los experimentos de crecimiento.

Para los experimentos de crecimiento en MTP (placas de microtitulación), se añaden colonias a 150 pl de medio y se incuban durante 24 horas a 30 °C. Después de la incubación, se añaden 2 pl de los precultivos de MTP a una MTP que contiene 150 pl de medio nuevo. La DO se mide cada quince minutos durante 48 horas con el Infinite® 200 ProTecan.

2.4. Metodología de muestreo

Se toman muestras tanto de la DO (0,2 ml) como de la fracción celular y sobrenadante (1 ml) del cultivo cada dos horas hasta la fase estacionaria y cada par de horas durante la fase estacionaria. La muestra de 1 ml es la primera centrífuga (11) después de lo cual el sedimento celular y el sobrenadante se separan y se almacenan por separado a -20 °C. El sobrenadante se almacena para el análisis del producto extracelular mientras que los sedimentos se usan para el análisis de metabolitos intracelulares.

2.5. Procedimientos analíticos

La densidad celular del cultivo se supervisó frecuentemente midiendo la densidad óptica a 600 nm (espectrofotómetro Uvikom 922, BRS, Brussel, Bélgica) o con el lector de placa de microtitulación Biochrom Anthos Zenyth 340. El peso celular en seco se obtuvo por centrifugación (15 min, 5000 g, rotor GSA, Sorvall RC-5B, Goffin Meyvis, Kapellen, Bélgica) de 20 g de caldo de reactor en tubos falcon presecados y pesados. A continuación, los sedimentos se lavaron una vez con 20 ml de disolución fisiológica (9 g/l NaCl) y se secaron a 70 °C hasta un peso constante. Para poder convertir las mediciones de DO600nm en concentraciones de biomasa, se realizó una curva de correlación de la DO600nm con la concentración de biomasa. Las concentraciones de glucosa y ácidos orgánicos se determinaron en un sistema Varian Prostar HPLC (Varian, Sint-Katelijne-Waver, Bélgica) utilizando una columna Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Eke, Bélgica) calentada a 65 °C, equipada con una columna de 1 cm, utilizando H2SO45 mM (0,6 ml/min) como fase móvil. Para la detección de picos se utilizó un detector UV-VIS de doble onda (210 nm y 265 nm) (Varian Prostar 325) y un detector de índice de refracción diferencial (Merck LaChrom L-7490, Merck, Lovaina, Bélgica). Los picos se pudieron identificar mediante división de las absorciones de los picos en 265 y 210 nm. La división da como resultado un valor constante, típico para un determinado compuesto (fórmula de Beer-Lambert). Se midieron glucosa, fructosa, sacarosa, oligosacaridos y glucosa-1-fosfato mediante HPLC con una columna Hypercarb y se detectaron con un detector de MSMS (Antonio et al., 2007; Nielsen et al., 2006).

2.6. Procedimientos genéticos

Los plásmidos se mantuvieron en el huéspedE. coliDH5a, (F-, $80d/acZAM15,A(LacZYA-argF)U169, deoR, recAI, endAI, hsdR17(rk~,mk+),phoA, supE44,A-,thi-1, gyrA96, relA1).

Plásmidos.El plásmido de expresión de levadura p2a_2p_Lac4 disponible en elLaboratory of Industrial Biotechnology and Biocatalysisse usó para permitir el crecimiento deSaccharomycesen lactosa como única fuente de C. Este plásmido contiene un gen de resistencia a ampicilina y un origen de replicación bacteriano para permitir la selección y mantenimiento enE. coli.El plásmido contiene además el ori de levadura 2p y el marcador de selecciónUra3para la selección y mantenimiento en levaduras. Finalmente, el plásmido contiene un casete de expresión de p-galactosidasa (SEQ ID 9, figura 15).

Mutaciones.Las mutaciones consistieron en la introducción de plásmidos usando p2a_2p_Lac4 (descrito anteriormente) e inserción génica (KI) (KI en el locus de ADNr) usando ADN lineal bicatenario (descrito anteriormente). Los transformantes se plaquearon en SD CSM-Ura después de la transformación con ADN plasmídico o en SD CSM-Ura con lactosa como única fuente de C después de la transformación con ADN lineal bicatenario. Los mutantes que portaban plásmidos seleccionados se verificaron por PCR con cebadores correspondientes a p2a_2p_Lac4. Los mutantes de inserción genómica seleccionados se verificaron por PCR con cebadores cadena arriba y cadena abajo de la región modificada y se confirmaron por secuenciación (realizada en LGC Genomics (grupo LGC, Alemania)).

ADN bicatenario lineal.Los amplicones de ADNbc lineales se obtuvieron mediante PCR usando el plásmido pJet_KI_p1_Lac12_t@rDNA o pJet_KI_p2_Lac12_t@rDNA. Estos plásmidos contienen 2 regiones de homología de 500 pb (HR1 (SEQ ID 10, figura 16) y HR2 (SEQ ID 11, figura 17)) que flanquean la SEQ ID 7 y la SEQ ID 8, respectivamente, en el sitio de clonación múltiple del vector de clonación pJET (Thermoscientific). Los cebadores usados son homólogos al extremo 5' de HR1 (cebador directo) y al extremo 3' de HR2 (cebador inverso). Los productos de PCR se purificaron por PCR antes de la transformación.

Transformaciones.Los plásmidos y el ADN bicatenario lineal se transformaron usando el procedimiento Gietz (40).

3. Resultados

Ejemplo 1: Construcción de una inserción de lacYde lactosa permeasa de E. coli en el locus agp

En primer lugar, se construyó la cepa MG1655AlacY según el procedimiento de Datsenko y Wanner tal como se ha descrito anteriormente. Para este fin, se transformó MG1655 con pKD46 y se construyó ADN lineal a partir de los plásmidos base pKD3 y pKD4 con homologías flanqueantes al gen lacY. Las recombinaciones exitosas se cribaron después con los antibióticos apropiados. Para asegurar que no se podía absorber lactosa en esta cepa, la cepa se cultivó en un medio mínimo que contenía solo lactosa como fuente de carbono. No se observó crecimiento durante este experimento, por lo tanto esta célula ya no pudo transportar lactosa sobre su membrana.

Para construir adicionalmente un sistema de expresión sintético, se sintetizaron un promotor sintético y RBS en combinación con el genlacY(encargado a IDT y Geneart). Esta secuencia se muestra en la figura 3. Esta secuencia también se introdujo en el genoma en el locus génicoagppor medio de una adaptación de la metodología de Datsenko y Wanner. Brevemente, el constructo de lactosa permeasa se ensambló en primer lugar con un casete de cribado del plásmido pKD3, dando como resultado un plásmido novedoso, pCX_lacY-kan. A partir de este plásmido pudo amplificarse ADN lineal por PCR con homologías con la región genómicaagp.Este ADN lineal obtenido puede transformarse entonces en unE. coliMG1655AlacY en el que está presente el plásmido pKD46. Esto da lugar a la recombinación del casete de expresión del transportador de lactosa en el genoma, dando como resultado un organismo de expresión de lactosa permeasa MG1655AlacYAagp::lacYsintético. Para asegurar que se restauraba el crecimiento en lactosa, esta cepa se cultivó en un medio mínimo de lactosa tal como se ha descrito anteriormente. Esto dio como resultado la restauración completa del crecimiento en lactosa, con una tasa de crecimiento similar al tipo silvestre.

Ejemplo 2: Efecto de la lactosa sobre la cepa de E. coli de tipo silvestre y una cepa de E. coli mutante que no experimenta destrucción por lactosa

Se preparó un experimento en matraz de agitación tal como se describe en materiales y procedimientos con la MG1655 de tipo silvestre y MG1655AlacYAagp::lacYsintético. Estas cepas se cultivaron en un medio de matraz en agitación de glicerol (15 g/l de glicerol, tal como se describe en materiales y procedimientos) y se añadió lactosa (solución madre de 200 g/l, dando como resultado una concentración final de 10 g/l) a la fase exponencial media (aproximadamente a DO 0,8). Como puede observarse en la figura 1 y la figura 2, la cepa mutante no sufre destrucción por lactosa.

Ejemplo 3: Uso de acoplamiento traduccional o sensores traduccionales para asegurar la expresión del transportador de lactosa

Debido a que una cepa completa inactivada en lactosa permeasa tampoco sufriría destrucción por lactosa y el objetivo es obtener una lactosa permeasa expresada, activa, funcional, se necesita un cribado para garantizar la expresión de la lactosa permeasa. Para este fin, se pueden crear variantes de secuencia de promotores, sitios de unión a ribozima, secuencias de Kozak, uso de codones y terminadores de transcripción. Sin embargo, estas variantes de secuencia pueden dar lugar a constructos de expresión nula, dando lugar, por lo tanto, a cepas mutantes negativas en transportador de lactosa. Por lo tanto, es necesario diseñar un sistema para detectar la expresión del transportador de lactosa, preferentemente mediante un gen indicador fácil de cribar tal comoLacZ,proteínas fluorescentes o genes de resistencia a antibióticos.

Construcción de un sistema de acoplamiento traduccional que reinicia la traducción del gen indicador para detectar la expresión del transportador de lactosa

Dos genes pueden acoplarse traduccionalmente introduciendo una región de reiniciación de la traducción 3' del gen de interés y 5' del gen indicador. La traducción puede reiniciarse mediante diversos codones, tales como AUG, UUG, GUG o AUA (63). La secuencia de dicho constructo, que acopla el gen del gen de lactosa permeasa yel gen lacZtraduccionalmente se muestra en la figura 4. Para crear esta secuencia, las secuencias delacYy yLacZse amplifican a partir del genoma deE. colicon cebadores con sitios de restricción de Golden Gate (BsaI, obtenidos de NEB). La región intergénica que permite el acoplamiento traduccional puede encargarse a cualquier empresa de síntesis génica, tal como IDT o Geneart. Todas las piezas se ensamblan a continuación mediante el procedimiento Golden Gate tal como se describe por Engleret al.(2013) (36) en un plásmido pUC54 junto con un promotor y una secuencia RBS tal como se muestra en la figura 3 (paraE. coli)o en pGK12 que se replica enBacillussp. con un promotor deBacillusy un sitio de unión a ribosoma.

Construcción de un sistema de acoplamiento traduccional que inicia la traducción del gen indicador para detectar la expresión del transportador de lactosa mediante la apertura de un bucle en el sitio de unión a ribosoma

Un segundo procedimiento para cribar la expresión a través del acoplamiento traduccional se describe por Mendez-Perezet al(2012) (58). Este procedimiento se adaptó para el cribado de la expresión de lactosa permeasa con un gen indicador de cloranfenicol. En este caso, el transportador de lactosalacYse acopla a través de una etiqueta HIS y un sitio de unión al ribosoma al gen de resistencia al cloranfenicol. Las partes de secuencia para este constructo también se encargan a IDT o Geneart y se ensamblan mediante ensamblaje de Golden Gate. La secuencia resultante se proporciona en la figura 5.

Construcción de un sistema de acoplamiento traduccional que acopla el transportador de lactosa de levadura con un gen indicador

Aunque las levaduras no usan cistrones, todavía es posible cribar la expresión mediante acoplamiento traduccional mediante sitios de entrada ribosómica internos víricos (denominados secuencias IRES) (56). Un ejemplo de tal secuencia es la secuencia T2A (10), que permite la traducción totalmente independiente (lo que significa no como una fusión de proteínas), pero acoplada, de dos proteínas en un cistrón. Esto significa que si se expresa la última proteína del cistrón, también se expresa la primera proteína.

En levaduras, el gen de la lactosa permeasa de, por ejemplo, Kluyveromyces marxianus se puede usar para transportar lactosa en la célula. Este gen puede acoplarse con la secuencia T2A al gen aph1, que codifica resistencia a geneticina. Esta secuencia se construye de forma análoga a la descrita anteriormente. La secuencia final se proporciona en la figura 6.

Construcción de un sistema de acoplamiento de aptámeros que introduce un aptámero en el ARN mensajero de la lactosa permeasa

La expresión de la lactosa permeasa también se puede detectar a nivel de ARN mensajero. Para este fin, se clona un aptámero de unión a (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hidroxibenciliden)-1,2-dimetil-1H-imidazol-5(4H)-ona después de la secuencia codificante de lactosa permeasa tal como se muestra en la figura 7. La expresión de este constructo se modula adicionalmente tal como se describe en el ejemplo 6. Después del crecimiento de las células, se añade (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hidroxibenciliden)-1,2-dimetil-1H-imidazol-5(4H)-ona al medio tal como se describe por Pothoulakiset al(2013) (64) y las cepas mutantes que expresan lactosa permeasa se seleccionan mediante un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS).

Ejemplo 4: Detección de la expresión de un transportador de lactosa acoplado traduccionalmente con un gen de resistencia a cloranfenicol

Se construyeron dos cepas en las que la lactosa permeasa se suprimió del genoma. En ambas cepas se transformó un plásmido pSC101 que contenía un gen de resistencia a kanamicina, con la diferencia de que uno de los plásmidos contenía una lactosa permeasa expresada constitutivamente tal como se describe en los ejemplos 1 y 2, dando como resultado una cepa de referencia MG1655AlacY pSC101_kan y la cepa acoplada traduccionalmente a lacY_cat MG1655AlacY pSC101_kan_ lacYsintético_cat tal como se describe en el ejemplo 4 y la figura 5. Ambas cepas se cultivaron en un medio mínimo tal como se ha descrito anteriormente a diferentes concentraciones de cloranfenicol (entre 0 y 30 mg/l). Las figuras 8 y 9 muestran después de 48 y 92 horas de crecimiento que el crecimiento de la cepa de referencia se inhibe a una concentración de cloranfenicol más baja que la cepa acoplada traduccionalmente a lacY_cat mutante, lo que hace de dicho sistema un excelente cribado para constructos genéticos que expresan lactosa permeasa.

Ejemplo 5: Procedimiento de cribado para mutantes que expresan lactosa permeasa que no sufren destrucción por lactosa

De forma similar al ejemplo 2, se cultivó una mezcla de dos cepas resistentes al cloranfenicol, una cepa que no experimenta destrucción por lactosa y está acoplada traduccionalmente al cloranfenicol y una cepa con el casete del cloranfenicol pero con el sistema de expresión natural de la lactosa permeasa. Ambas cepas se cultivaron en el medio tal como se describe en el ejemplo 2 y se añadió lactosa en fase exponencial media tal como se muestra en el ejemplo 2. La cepa mutante que no experimenta destrucción por lactosa se mantuvo en crecimiento mientras que la otra cepa, que es sensible a la destrucción por lactosa, dejó de crecer. Al final de la fase exponencial, se inocularon 0,1 ml de este cultivo en un segundo matraz de agitación con un medio similar al descrito anteriormente. De nuevo, a DO 0,8 se añadió lactosa, deteniendo el crecimiento de la cepa sensible a la destrucción por lactosa y enriqueciendo adicionalmente la cepa mutante que no sufre destrucción por lactosa. Después de 5 repeticiones de este procedimiento se obtuvo un enriquecimiento del 99% de la cepa mutante que no sufría destrucción por lactosa, que después se aisló fácilmente del cultivo.

Ejemplo 6: Creación de mutantes de casetes de expresión de lactosa permeasa

Las variantes de promotores, sitios de unión a ribosomas, secuencias de Kozak, terminadores de la transcripción y variantes de genes de lactosa permeasa (con diferentes usos de codones) se encargan a proveedores de síntesis génica tales como IDT, Geneart, Genscript, Gen9,... El diseño de una biblioteca de promotores para bacterias se basa en la secuencia consenso de promotores bacterianos, con dos regiones conservadas a -10 y -35 pb del inicio de la transcripción. Las bases intermedias, anteriores y posteriores a estas regiones conservadas se varían entonces aleatoriamente con A, T, G o C, dando lugar a promotores con diferentes fuerzas de expresión. Alternativamente, las regiones conservadas se varían y la secuencia circundante se mantiene fija, lo que también da lugar a promotores con diferentes fuerzas. Estas mezclas de secuencias se clonan a continuación (a través de ensamblaje de Gibson, ensamblaje de Golden Gate, ensamblaje de Cliva, LCR o ligación de restricción) (25, 36, 50, 79) delante de una lactosa permeasa acoplada traduccionalmente, dando lugar a una biblioteca de casetes de expresión de lactosa permeasa que se puede cribar por medio del protocolo de cribado descrito en el ejemplo 5.

Se crea una biblioteca de promotores eucariotas basándose en un promotor central (13). ParaSaccharomyces cerevisiaeeste promotor puede ser un promotor de TEF heterólogo pTEF1 que se potencia con secuencias UAS y se muta para variar la fuerza del promotor (12). Dicho promotor se encarga y se clona tal como se ha descrito anteriormente delante de una lactosa permeasa acoplada traduccionalmente y el constructo final se transforma en una levadura tal comoSaccharomyces cerevisiaeen un plásmido o para integración en un cromosoma.

La región no traducida consiste en procariotas de un sitio de unión a ribosomas y en eucariotas de una secuencia de Kozak. Ambas secuencias se distribuyen aleatoriamente y se clonan delante de la secuencia codificante tal como se ha descrito anteriormente, lo que da lugar a una biblioteca de casetes de expresión con diferentes eficacias traduccionales. La aleatorización puede racionalizarse con herramientas tales como el calculador de RBS que calcula la correlación de la eficacia de traducción de secuencia, y reduciendo el número de variantes que tienen que incluirse en la biblioteca (67).

El uso de codones se cambia por medio del cambio de la secuencia codificante del gen sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína. Esto se denomina adaptación de codones. Los usos de codones a través de la secuencia de codones se cambian de tal manera que se introducen codones más o menos raros en determinadas regiones, lo que da lugar a eficacias de expresión y eficacias de plegamiento alteradas. Una permeasa con solo codones raros en su secuencia (determinada sobre una base de organismos por medio de la base de datos de uso de codones (61)) muestra tasas de traducción más bajas que permeasas con una secuencia completamente optimizada por codones (con solo codones con alta aparición en el organismo diana). Además, los primeros codones de la secuencia codificante también influyen en la eficacia de Kozak o del sitio de unión a ribosoma (62, 69, 78).

La región terminadora de la transcripción se varía por medio de secuencias terminadoras de la transcripción endógenas o exógenas que se encuentran en la base de datos (18, 26). Estos terminadores de la transcripción también se clonan de forma similar al procedimiento descrito anteriormente.

Ejemplo 7: Enriquecimiento de casetes de expresión que expresan lactosa permeasa y no dan lugar a la destrucción por lactosa

Los casetes de expresión se crean según los ejemplos 3 y 7. Esto da lugar a una biblioteca de casetes de expresión de lactosa permeasa. Los casetes de expresión que dan como resultado la expresión de lactosa permeasa se seleccionan según los procedimientos de los ejemplos 3 y 4. Los casetes de expresión, la expresión de la lactosa permeasa, que no dan lugar a la destrucción por lactosa, se seleccionan según los procedimientos descritos en los ejemplos 2 y 5. Los casetes de expresión seleccionados se analizan adicionalmente mediante secuenciación y mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 2.

Ejemplo 8: Producción fermentativa de 2-fucosil-lactosa con una fucosiltransferasa que se origina a partir de Helicobacter pylori con E. coli

La cepa mutante en la que los genesacZ, glgC, agp, pfkA, pfkB, pgi, arcA, icIR, wcaJse inactivan ylacYse expresó mediante expresión constitutiva tal como se describe en el ejemplo 1 y el ejemplo 2 para asegurar la expresión en todas las condiciones de cultivo, se transformó adicionalmente con una fucosiltransferasa que se origina a partir deHelicobacter pyloriy una sacarosa fosforilasa que se origina a partir deBifidobacterium adolescentis,que también se expresaron constitutivamente. Los promotores constitutivos proceden de la biblioteca de promotores descrita por De Meyet al.2007. Esta cepa se cultivó en un medio tal como se describe en materiales y procedimientos, pero con 30 g/l de sacarosa y 50 g/l de lactosa. Esto dio como resultado la formación de hasta 1,5 g/l de 2'-fucosil-lactosa.

Ejemplo 9: Producción por lotes alimentados de 2-fucosil-lactosa con E. coli

Se construyó una cepa mutante mediante las metodologías de ingeniería genética descritas anteriormente con el siguiente genotipo:

ñlacZYAñglgCñagpñpgiñpfkA-P22-baSPñpfkBñarcAñiclR::slñwcaJñlonñadhE-P14-frkpCXP14-FT_H.pylori(un vector con la secuencia SEQ ID N° 6, véase la figura 10) con la expresión de lactosa permeasa alterada tal como se describe en el ejemplo 1 y el ejemplo 2. El promotor P22 y P14 se origina a partir de la biblioteca de promotores construida por De Meyet al(29) y se clonó de forma similar a la metodología descrita por Aertset al(1). "::sl" marca una supresión génica sin cicatriz, por lo tanto sin un sitio FRT que permanece en el cromosoma.

Esta cepa se cultivó en un biorreactor tal como se ha descrito anteriormente en materiales y procedimientos, en el medio mineral con 30 g/l de sacarosa y 50 g/l de lactosa. Después de la fase de lote, el biorreactor se alimentó con 500 g/l de sacarosa, 50 g/l de lactosa y 1 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado. Esto dio lugar a la acumulación de 27,5 g/l de fucosil-lactosa en el sobrenadante.

Ejemplo 10: Producción de lactoMriosa con E. coli

Se construyó una cepa mutante mediante ingeniería genética con las metodologías descritas anteriormente de expresión de una UDP-N-acetilglucosamina transferasa, una sacarosa fosforilasa y una L-glutamina:D-fructosa-6-fosfato aminotransferasa y una glucosamina uridiltransferasa en un plásmido pBR322 con, en cada caso, un promotor constitutivo de la biblioteca de promotores de De Meyet al(29) y con un marcador de selección de beta-lactamasa. Este vector se transformó en un cepa deE. colimutante con genotipoALacZYAúglgCúagp::P14-frk-P22-BaSPñpgiñpfkAñpfkB AnagABCDEúmanAúnanATEKúmanXYZque expresa lactosa permeasa constitutivamente tal como se ha descrito anteriormente. Esta cepa se cultivó en un matraz en agitación tal como se ha descrito anteriormente con lactosa y sacarosa como fuentes de carbono, con o sin glicerol adicional. Este huésped de producción no sufrió destrucción de lactosa y produjo 62,5 y 55,3 mg/l de lactoMriosa, respectivamente, a partir de la lactosa añadida.

Ejemplo 11: Construcción de una inserción de lactosa permeasa de levadura K. marxianus (p1) en el locus de ADNr.

En primer lugar, se usó el plásmido p2a_2p_Lac4 para transformar la cepa deSaccharomyces cerevisiaede tipo silvestre BY4742. La transformación se realizó usando un total de 4 gg de plásmido usando el protocolo de Gietz (40). Las células de levadura transformadas se sembraron en placas con SD-CSMdrop-out(sin uracilo). Después de dos días, se observó crecimiento en las placas y se analizó la presencia del plásmido deseado en las colonias de levadura. La PCR de colonias se llevó a cabo en las 33 colonias. Todas las colonias dieron positivo en cuanto a la presencia del plásmido p2a_2g_Lac4. La colonia 5 se seleccionó para su uso posterior. Esta colonia se transformó con 2 gg de ADN lineal bicatenario obtenido de pJet_KI_p1_Lac12_t@rDNA. Las células transformadas se sembraron en placas SD-CSM-Ura con lactosa como única fuente de C. Tres días después de la transformación, se hicieron crecer varias colonias suficientemente para analizar la presencia del casete de expresiónLac12en el ADNr deSaccharomyces.La PCR de colonias se llevó a cabo en todas las colonias. Todas las colonias dieron positivo en cuanto a la presencia del casete de expresiónLac12.La colonia 6 se seleccionó para su uso posterior(SaccharomycesKI_p1_Lac12_t@rDNA).

Ejemplo 12: Construcción de una inserción de lactosa permeasa de levadura K. marxianus(p2) en el locus de ADNr.

En primer lugar, se usó el plásmido p2a_2p_Lac4 para transformar la cepa deSaccharomyces cerevisiaede tipo silvestre BY4742. La transformación se realizó usando un total de 4 gg de plásmido usando el protocolo de Gietz (40). Las células de levadura transformadas se sembraron en placas con SD-CSMdrop-out(sin uracilo). Después de dos días, se observó crecimiento en las placas y se analizó la presencia del plásmido deseado en las colonias de levadura. La PCR de colonias se llevó a cabo en las 33 colonias. Todas las colonias dieron positivo en cuanto a la presencia del plásmido p2a_2g_Lac4. La colonia 5 se seleccionó para su uso posterior. Esta colonia se transformó con 2 gg de ADN lineal bicatenario obtenido de pJet_KLp2_Lac12_t@rDNA. Las células transformadas se sembraron en placas SD-CSM-Ura con lactosa como única fuente de C. Tres días después de la transformación, se hicieron crecer varias colonias suficientemente para analizar la presencia del casete de expresiónLac12en el ADNr deSaccharomyces.La PCR de colonias se llevó a cabo en todas las colonias. Todas las colonias dieron positivo en cuanto a la presencia del casete de expresiónLac12.La colonia 7 se seleccionó para su uso posterior(SaccharomycesKI_p2_Lac12_t@rDNA).

Ejemplo 13: Crecimiento en lactosa de una cepa de levadura de tipo silvestre y 2 cepas de levadura mutantes

Se preparó un experimento en matraz en agitación tal como se describe en los materiales y procedimientos conKluyveromycesde tipo silvestre,SaccharomycesKI_p1_Lac12_t@rDNA ySaccharomycesKI_p2_Lac12_t@rDNA. Estas cepas se cultivaron en un medio de matraz en agitación que contenía lactosa como única fuente de C (20 g/l). Como se puede observarse en la tabla 1, las cepas deSaccharomycesmutantes crecen tan rápido como laKluyveromyces marcianus lactisde tipo silvestre, que es conocida por el rápido crecimiento sobre lactosa (31). La lactosa permeasa expresada constitutivamente asegura así un influjo rápido y eficaz de lactosa en la célula de levadura.

Tabla 1

Ejemplo 14: El efecto de la lactosa sobre la cepa de levadura de tipo silvestre y las cepas de levadura mutantes que no sufren destrucción por lactosa

Se preparó un experimento en matraz en agitación tal como se describe en los materiales y procedimientos con Kluyveromyces de tipo silvestre,SaccharomycesKI_p1_Lac12_t@rDNA ySaccharomycesKI_p2_Lac12_t@rDNA. Estas cepas se cultivaron en un medio de matraz en agitación de glucosa (20 g/l de glucosa, tal como se describe en materiales y procedimientos) y se añadió lactosa (solución madre de 200 g/l, dando como resultado una concentración final de 10 g/l) a la fase exponencial media. Como puede observarse en la figura 11 y la figura 12, las cepas mutantes no sufren destrucción por lactosa. Sin embargo, en el ejemplo 13 se demostró un influjo rápido y eficaz de lactosa en estas células de levadura.

Ejemplo 15: Secuenciación de casetes de expresión de lactosa permeasa que no sufren destrucción de lactosaSe secuenciaron 46 colonias que se originaron del cribado descrito anteriormente, dando como resultado las SEQ ID N° 12-57 (figura 18). Estas secuencias son promotores y variantes de RBS que no dan como resultado la destrucción por lactosa cuando se expresan enE. coli.Obsérvese que esta es una selección de una enorme cantidad de colonias que se han secuenciado, por lo tanto, la metodología de cribado ha dado como resultado muchas más secuencias que las mostradas en la figura 18 y metodologías de creación de bibliotecas alternativas tal como se ha descrito anteriormente también darán lugar a otras secuencias distintas de las mostradas en la figura 18.

Ejemplo 16: Determinación de pmáx de las cepas mutantes del casete de expresión de lactosa permeasa

Todas las cepas se iniciaron a partir de una placa de agar LB o se iniciaron a partir de criovial y se inocularon en 5,0 ml de medio de caldo Luria (10 g de triptona; 5 g de extracto de levadura; 10 g de NaCI). Después de cultivar durante toda la noche a 37°C, se añadió 1 ml de este precultivo a un matraz agitador de 500 ml que contenía 100 ml de medio de lactosa mínimo (2,0 g/l de NH4Cl; 5,0 g/l; (NH4)2SO4; 3,0 g/l de KH2PO4, 7,3 g/l de K2HPO4; 8,4 g/l de MOPS; 0,5 g/l de MgSO4 x 7H2O; 0,5 g/l de NaCl; 10 g/l de lactosa; 0,4 mg/l de Na2EDTA * 2H2O; 0,03 mg/l de H3BO3; 1, 01 mg/l de tiamina HCl; 0, 94 mg/l de ZnCl2; 0,5 mg/l de CoCl2 * 6H2O; 0,38 mg/l de CuCl2 * 2H2O; 1,59 mg/l de MnCl2 * 4H2O; 3,6 mg/l de CaCl2 y 0,096 mg/l de Na2MoO4 * 2H2O); pH 7,0. Después de cultivar durante toda la noche a 37°C, ambos precultivos se diluyeron con medio de lactosa mínimo hasta una DO600 de 0,050. La suspensión se transfirió después a una placa de 96 MTP (n=32), cubierta por una cubierta de sello fácil. Las mediciones de DO se realizaron cada 10 minutos durante 24 horas usando el Infinite M200 pro (TECAN) en las siguientes condiciones: Temperatura: 37 °C+/-0,5; agitación 597 segundos; amplitud de agitación 2 mm; 280 rpm; longitud de onda DO600;Flash#10; tiempo de sedimentación 150 ms).

Ejemplo 17: Caracterización de casetes de expresión de lactosa permeasa

Un procedimiento para reducir o eliminar la destrucción por lactosa es reducir o eliminar significativamente la actividad de la lactosa permeasa (véase el ejemplo 16). Sin embargo, a la luz de la producción de bioproductos basados en lactosa o galactosa, se requiere un alto influjo de lactosa en la célula. A este respecto se prueba que el influjo de lactosa de las cepas mutantes resistentes a la destrucción por lactosa es todavía comparable, igual o incluso mayor que el influjo de lactosa del organismo de tipo silvestre que sufre destrucción por lactosa. Para este fin, los nuevos casetes de expresión de lactosa permeasa se introdujeron en una cepa MG1655AlacY, que todavía expresa betagalactosidasa. La velocidad de crecimiento de estas nuevas cepas es una medida para el influjo de lactosa, porque cualquier cepa que tenga una expresión significativamente reducida en la expresión de lactosa permeasa tendrá una velocidad de crecimiento significativamente reducida.

Los resultados de este análisis se muestran en la figura 19. Casi todas las cepas mostradas en esta figura tienen una tasa de crecimiento igual o superior al tipo silvestre, lo que indica una actividad de lactosa permeasa y una expresión que es igual o superior al tipo silvestre, sin embargo, en contraste con el sistema de expresión de tipo silvestre, estos casetes de expresión no dan como resultado la destrucción por lactosa. Sin embargo, este procedimiento está limitado por la expresión del gen de beta galactosidasa que se convierte en la etapa limitante de la velocidad para el crecimiento. Por lo tanto, la expresión del gen de la lactosa permeasa se midió a través del sistema de acoplamiento traduccional descrito anteriormente. La concentración de inhibición mínima (MIC) para cloranfenicol es indicativa de la expresión del gen de la lactosa permeasa y esto se determinó para cada uno de los casetes. La MIC más baja que todavía dio como resultado la misma tasa de crecimiento en comparación con el tipo silvestre se usó como un indicador para la expresión de la expresión de la lactosa permeasa de tipo silvestre.

Los casetes con la MIC más baja que tienen la misma tasa de crecimiento que la cepa de tipo silvestre tienen una MIC de aproximadamente 20 mg/l de cloranfenicol. Las cepas mutantes con una tasa de crecimiento ligeramente inferior tienen una MIC que varía entre 15 y 20 mg/l y las cepas mutantes con una tasa de crecimiento igual o superior tienen una MIC entre 20 y 80 mg/l. El 85% de las secuencias entran dentro de la última categoría, lo que significa que la mayor parte de las secuencias que se identificaron como casetes de expresión negativos a la destrucción por lactosa tienen una expresión de lactosa permeasa más alta, al contrario de lo que se ha descrito previamente en la literatura.

Ejemplo 18: Construcción de un casete de expresión del promotor laclq

De forma similar a la metodología descrita anteriormente, se clonó un promotor placIQ delante del gen lacY deE. coli.La secuencia final de este constructo se muestra en la figura 20.

Ejemplo 19: Otros promotores usados en la técnica que experimentan destrucción por lactosa

El promotor placIQ es un promotor que se ha usado en la técnica para la expresión de lactosa permeasa enE. coli.El uso de este promotor dio como resultado la absorción de lactosa en la célula. Sin embargo, no se analizó el efecto de dicha absorción. La velocidad de crecimiento en lactosa del tipo silvestre no fue significativamente diferente del promotor lacIq (pmáx de 0,1 y 0,11 h-1 respectivamente), lo que indica, por lo tanto, una tasa de absorción de lactosa similar. Un cribado de destrucción por lactosa de este casete de expresión de lacIQ demostró que este promotor también daba lugar a destrucción por lactosa (véase la figura 21). Esto prueba que hay secuencias de promotor específicas que dan lugar a la destrucción por lactosa y otras secuencias que no dan lugar a la destrucción de la lactosa. La racionalización de las secuencias no es posible y el ensayo y error de secuencias individuales es un trabajo laborioso que daría lugar a enormes costes, por lo tanto la metodología descrita anteriormente para identificar los casetes de expresión que no sufren destrucción con lactosa es la forma perfecta de evitar trabajos de cribado largos y costosos.

Ejemplo 20: Producción de lactoNtetraosa con S. cerevisiae

Las cepas mutantes construidas en los ejemplos 11 y 12 se transformaron adicionalmente con una p-1,4-galactosiltransferasa y una (31,3-N-acetilglucosaminiltransferasa que se originan a partir deNeisseria meningitidis, que también se expresaron constitutivamente, utilizando un vector de expresión de levadura estándar, por ejemplo tal como se describe por Leeet. al.(52). Las cepas se cultivaron en un medio tal como se describe en materiales y procedimientos, pero con 20 g/l de sacarosa y 20 g/l de lactosa. Esto dio como resultado la formación de hasta 30 mg/l de lactoNtetraosa.

Ejemplo 21: Producción de 2-fucosil-lactosa con S. cerevisiae

Las cepas mutantes construidas en los ejemplos 11 y 12 se transformaron adicionalmente con una GDP-fucosa sintasa y una GDP-manosa 4,6-deshidratasa deE. co liy una fucosiltransferasa que se origina a partir deHelicobacterpylori,que también se expresaron constitutivamente, utilizando un vector de expresión de levadura estándar, por ejemplo tal como se describe por Leeet al.(52). Las cepas se cultivaron en un medio tal como se describe en materiales y procedimientos, pero con 20 g/l de sacarosa y 20 g/l de lactosa. Esto dio como resultado la formación de hasta 10 mg/l de 2 fucosil-lactosa.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir microorganismos que resisten el fenómeno de destrucción por lactosa cuando se cultivan en un entorno en el que la lactosa se combina con otra fuente de carbono, comprendiendo dicho procedimiento:

a. mutar la expresión de un transportador de lactosa dentro de microorganismos mediante la introducción de un promotor heterólogo delante de un gen de transportador de lactosa endógeno o exógeno a) suprimiendo los transportadores de lactosa endógenos del genoma y reintroduciéndolos en otra ubicación dentro del genoma de dicho microorganismo, b) introduciendo un promotor heterólogo delante de los transportadores de lactosa endógenos, o c) inactivando el promotor de lactosa endógeno e introduciendo un promotor heterólogo en la misma ubicación en el genoma de dicho microorganismo, y/o, mutando la región no traducida delante de la secuencia codificante que contiene las secuencias de unión a ribosoma o de Kozak y/o modificando el uso de codones del gen de transportador de lactosa endógeno, en el que dicha mutación da como resultado la expresión de dicho transportador de lactosa. b. cultivar dichos microorganismos mutados en un medio que comprende una fuente de carbono que no es lactosa, c. añadir lactosa a dicho medio durante el crecimiento de dichos microorganismos mutados, y

d. seleccionar los microorganismos que resisten el fenómeno de destrucción por lactosa al crecer en dicho medio que comprende lactosa y que retienen al menos el 50% del influjo de lactosa obtenido con el casete de expresión de tipo silvestre de dicho transportador de lactosa.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la expresión del transportador de lactosa se detecta mediante acoplamiento traduccional con un gen indicador y/o mediante acoplamiento de aptámero.

3. El procedimiento según las reivindicaciones 1-2, en el que la expresión del transportador de lactosa se detecta por medio de constructos genéticos tal como se proporcionan por las SEQ ID NO: 2, 3, 4 y/o 5.

4. El procedimiento según las reivindicaciones 1 -3, en el que dicho transportador de lactosa es una lactosa permeasa.

5. El procedimiento según las reivindicaciones 1-4 en el que dicho microorganismo es una bacteria, una levadura o una célula fúngica.

6. Una secuencia heteróloga delante de un gen de transportador de lactosa tal como se proporciona por las SEQ ID NO: 1,7, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56 o 57 que da lugar a la expresión de un transportador de lactosa y que no da como resultado un fenotipo de destrucción por lactosa.

7. Un microorganismo que resiste el fenómeno de destrucción por lactosa cuando se cultiva en un entorno en el que la lactosa se combina con una o varias otras fuentes de carbono, en el que dicho microorganismo es una bacteria que tiene una secuencia heteróloga delante de un gen de transportador de lactosa tal como se proporciona por las SEQ ID NO: 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56 o 57, o en el que dicho microorganismo es una levadura que tiene una secuencia heteróloga delante de un gen transportador de lactosa tal como se proporciona por las SEQ ID NO: 7 u 8.

8. El microorganismo según la reivindicación 7, en el que dicha bacteria esE. coliy dicha levadura es S.cerevisae.

9. El microorganismo según la reivindicación 7 u 8, en el que los genes que codifican las enzimas de las rutas de degradación de lactosa y/o galactosa se vuelven menos funcionales o no funcionales.

10. Uso de un microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 o secuencia según la reivindicación 6 para la producción de productos de especialidad basados en lactosa y/o galactosa.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que dichos productos de especialidad basados en lactosa son carbohidratos, glicolípidos y compuestos galactosilados de especialidad.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que dichos carbohidratos de especialidad son 2-fucosil-lactosa o 2'-fucosillactosa o 3-fucosil-lactosa o 2',3-difucosil-lactosa o lactoMriosa o lacto-N-tetraosa, o lacto-nN-tetraosa o 3'sialil-lactosa o 6'sialil-lactosa.