ES2989584T3 - Anticuerpo bifuncional anti-PD-1 y anti-VEGFA, composición farmacéutica del mismo y uso del mismo - Google Patents

Anticuerpo bifuncional anti-PD-1 y anti-VEGFA, composición farmacéutica del mismo y uso del mismo Download PDF

Info

Publication number
ES2989584T3
ES2989584T3 ES19853809T ES19853809T ES2989584T3 ES 2989584 T3 ES2989584 T3 ES 2989584T3 ES 19853809 T ES19853809 T ES 19853809T ES 19853809 T ES19853809 T ES 19853809T ES 2989584 T3 ES2989584 T3 ES 2989584T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
variable region
chain variable
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19853809T
Other languages
English (en)
Inventor
Baiyong Li
Yu Xia
Zhongmin Maxwell Wang
Peng Zhang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Akeso Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Akeso Biopharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=64758699&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2989584(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Akeso Biopharma Inc filed Critical Akeso Biopharma Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2989584T3 publication Critical patent/ES2989584T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70521—CD28, CD152
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Un anticuerpo bifuncional anti-VEGFA y anti-PD-1, una composición farmacéutica del mismo y su uso pertenecen al campo de la terapia tumoral y la inmunología molecular. Específicamente, el anticuerpo bifuncional anti-VEGFA y anti-PD-1 comprende: una primera región funcional proteica dirigida a VEGFA, y una segunda región funcional proteica dirigida a PD-1. El anticuerpo bifuncional puede unirse específicamente a VEGFA y PD-1, aliviar específicamente la inmunosupresión de VEGFA y PD-1 en un organismo e inhibir la angiogénesis inducida por tumores, y por lo tanto tiene buenas perspectivas de aplicación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo bifuncional anti-PD-1 y anti-VEGFA, composición farmacéutica del mismo y uso del mismoCampo técnico
La presente invención se refiere a los campos del tratamiento de tumores y la inmunobiología, particularmente a un anticuerpo bifuncional anti-PD-1/VEGFA, a una composición farmacéutica del mismo y al uso del mismo. Específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo bifuncional anti-PD-1 humano/VEGFA humano, a una composición farmacéutica del mismo y al uso del mismo.
Antecedentes
Un tumor, especialmente un tumor maligno, es una enfermedad grave que amenaza la salud en el mundo actual, y es la segunda causa principal de muerte entre diversas enfermedades. En los últimos años, la incidencia de la enfermedad ha aumentado notablemente. El tumor maligno se caracteriza por una escasa respuesta al tratamiento, una elevada tasa de metástasis tardía y un mal pronóstico. Aunque los métodos de tratamiento convencionales (tales como la radioterapia, la quimioterapia y el tratamiento quirúrgico) adoptados clínicamente en la actualidad alivian en gran medida el dolor y prolongan el tiempo de supervivencia, los métodos tienen grandes limitaciones, y es difícil mejorar adicionalmente su eficacia.
Existen dos etapas distintas de crecimiento tumoral, concretamente, desde una etapa de crecimiento lento sin vasos sanguíneos hasta una etapa de proliferación rápida con vasos sanguíneos. La angiogénesis permite que el tumor adquiera la nutrición suficiente para completar la etapa de cambio de vasos sanguíneos, y si no hay angiogénesis, el tumor primario no tendrá más de 1-2 mm, por lo que no podrá realizarse la metástasis.
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un factor de crecimiento que puede promover la división y proliferación de las células endoteliales, promover la formación de nuevos vasos sanguíneos y mejorar la permeabilidad de los vasos sanguíneos, y se une a los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular en la superficie celular y desempeña un papel mediante la activación de las rutas de transducción de señales de tirosina cinasa. En los tejidos tumorales, las células tumorales y los macrófagos y mastocitos que invaden los tumores pueden secretar un alto nivel de VEGF, estimular las células endoteliales vasculares tumorales de forma paracrina, promover la proliferación y migración de las células endoteliales, inducir la angiogénesis, promover el crecimiento continuo del tumor, mejorar la permeabilidad vascular, provocar la deposición de fibrina en los tejidos circundantes y promover la infiltración de células mononucleares, fibroblastos y células endoteliales, lo que facilita la formación del estroma tumoral y la entrada de células tumorales en nuevos vasos sanguíneos, y promover la metástasis tumoral. Por tanto, la inhibición de la angiogénesis tumoral se considera uno de los métodos de tratamiento tumoral más prometedores en la actualidad. La familia de VEGF incluye: VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD y PIGF. Los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFr ) incluyen VEGFR1 (también conocido como Flt1), VEGFR2 (también conocido como KDR o Flk1), VEGFR3 (también conocido como Flt4) y neuropilina-1 (NRP-1). Los tres primeros receptores tienen una estructura similar, pertenecen a una superfamilia de tirosina cinasa y se componen de una región extramembrana, un segmento transmembrana y una región intramembrana, donde la región extramembrana se compone de un dominio similar a la inmunoglobulina y la región intramembrana es una región tirosina cinasa. VEGFR1 y VEGFR2 están ubicados principalmente en la superficie de las células endoteliales vasculares, y VEGFR3 está ubicado principalmente en la superficie de las células endoteliales linfáticas.
Las moléculas de la familia de VEGF tienen diferentes afinidades por estos receptores. VEGFA actúa principalmente en combinación con VEGFR1, VEGFR2 y NRP-1. VEGFR1 es el primer receptor encontrado y tiene una mayor afinidad por VEGFA que VEGFR2 en condiciones fisiológicas normales, pero tiene una menor actividad tirosinasa en el segmento intracelular que VEGFR2 (Ma Li, J. ChineseJournal of Birth Health and Heredity,24 (5): 146-148 (2016)).
VEGFR2 es el principal regulador de la angiogénesis y la ingeniería vascular, y tiene una actividad tirosina cinasa mucho mayor que el VEGFR1. VEGFR2, después de unirse al ligando VEGFA, media en la proliferación, diferenciación y similares de las células endoteliales vasculares, así como el proceso de formación de vasos sanguíneos y la permeabilidad de los vasos sanguíneos (Roskoski R Jr.et al., Crit Rev Oncol Hematol,62(3): 179-213 (2007)). VEGFA, después de unirse a VEGFR2, media en la expresión transcripcional de genes de proteínas intracelulares relacionadas a través de la ruta de señalización PLC-y-PKC-Raf-MEK MAPK aguas abajo, y promueve por tanto la proliferación de células endoteliales vasculares (Takahashi Tet al., Oncogene,18(13): 2221-2230 (1999)).
VEGFR3 es uno de los miembros de la familia de tirosina cinasa, y se expresa principalmente en células endoteliales vasculares embrionarias y células endoteliales linfáticas adultas, y VEGFC y VEGFD se unen a VEGFR3 para estimular la proliferación y migración de células endoteliales linfáticas y promover la neogénesis de vasos linfáticos; NRP-1 es una proteína transmembrana no tirosina cinasa y no puede transducir independientemente señales biológicas, y puede mediar en la señalización sólo después de formar un complejo con un receptor tirosina cinasa de VEGF. (Ma Li,Chínese Journal of Birth Health and Heredity,24(5): 146-148 (2016)).
VEGFA y VEGFR2 están implicados principalmente en la regulación de la angiogénesis, donde antes y después de la unión de VEGFA a VEGFR2, se forma una reacción en cascada de numerosas señales intermedias en rutas aguas arriba y aguas abajo, y finalmente se modifican las funciones fisiológicas por proliferación, supervivencia, migración, aumento de la permeabilidad e infiltración a tejidos periféricos,etc.de las células endoteliales (Dong Hongchaoet al.,Sep. 2014,Journal of Modern Oncology,22(9): 2231-3).
En la actualidad, existen varios anticuerpos monoclonales humanizados que seleccionan como diana VEGF humano, particularmente VEGFA, tal como bevacizumab, que se ha aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. para el tratamiento de diversos tumores tales como el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el carcinoma de células renales, el cáncer de cuello uterino y el cáncer colorrectal metastásico sucesivamente durante 2004.
El receptor 1 de muerte celular programada (PD-1), también conocido como CD279, es un receptor de superficie de membrana glicoproteico transmembrana de tipo 1, pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas CD28 y se expresa habitualmente en células T, células B y células mieloides. PD-1 tiene dos ligandos naturales, PD-L 1 y PD-L2. Tanto PD-L1 como PD-L2 pertenecen a la superfamilia B7 y se expresan de manera constitutiva o inducible en la superficie de la membrana de diversas células, incluyendo células no hematopoyéticas y diversas células tumorales. PD-L1 se expresa principalmente en células T, células B, DC y células endoteliales microvasculares y en diversas células tumorales, mientras que PD-L2 se expresa sólo en células presentadoras de antígenos tales como células dendríticas y macrófagos. La interacción entre PD-1 y sus ligandos puede inhibir la activación de la linfa, la proliferación de células T y la secreción de citocinas tales como IL-2 e IFN-y.
Un gran número de investigaciones muestran que el microambiente tumoral puede proteger a las células tumorales de ser dañadas por las células inmunitarias, la expresión de PD-1 en los linfocitos infiltrados en el microambiente tumoral está regulada por incremento, y diversos tejidos tumorales primarios son positivos para PD-L1 en el análisis inmunohistoquímico, tal como cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de piel, cáncer de colon y glioma. Mientras tanto, la expresión de PD-L1 en el tumor se correlaciona significativamente con el mal pronóstico de los pacientes con cáncer. El bloqueo de la interacción entre PD-1 y sus ligandos puede promover la inmunidad de las células T específicas del tumor y mejorar la eficacia de la eliminación inmunitaria de las células tumorales. Un gran número de ensayos clínicos demuestran que los anticuerpos que seleccionan como diana PD-1 o PD-L1 pueden promover la infiltración de células T CD8+ en los tejidos tumorales y regular por incremento los factores efectores inmunitarios antitumorales tales como IL-2, IFN-y, granzima B y perforina, inhibiendo así eficazmente el crecimiento de los tumores.
Además, los anticuerpos anti-PD-1 también pueden usarse en el tratamiento de infecciones crónicas víricas. Las infecciones crónicas víricas a menudo van acompañadas de una pérdida de función de las células T efectoras específicas del virus y de una reducción de su número. La interacción entre PD-1 y PD-L1 puede bloquearse mediante la inyección de un anticuerpo anti-PD-1, inhibiendo así eficazmente el agotamiento de las células T efectoras en la infección crónica vírica.
Debido a las amplias perspectivas antitumorales y a la sorprendente eficacia de los anticuerpos PD-1, está ampliamente aceptado en la industria que los anticuerpos que seleccionan como diana la ruta PD-1 supondrán un gran avance en el tratamiento de diversos tumores: para el tratamiento de cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células renales, cáncer de ovario y melanoma (Homet M. B., Parisi G.,et al.,Anti-PD-1 therapy in melanoma.Semin Oncol.Junio de 2015; 42(3): 466-473), y linfoma y anemia (Held SA, Reine A,et al.,Advances in immunotherapy of chronic myeloid leukemia CML.Curr Cancer Drug Targets.Septiembre de 2013; 13(7): 768-74).
El anticuerpo bifuncional, también conocido como anticuerpo biespecífico, es un medicamento específico que selecciona como diana simultáneamente dos antígenos diferentes, y puede producirse mediante purificación por inmunoselección. Además, el anticuerpo biespecífico también puede producirse por ingeniería genética, lo que tiene determinadas ventajas debido a la flexibilidad correspondiente en aspectos tales como la optimización de los sitios de unión, la consideración de la forma sintética y el rendimiento. En la actualidad, se ha demostrado que el anticuerpo biespecífico existe en más de 45 formas (Müller D, Kontermann RE. Bispecific antibodies for cancer immunotherapy: Current perspectives.BioDrugs2020; 24: 89-98). Se han desarrollado varios anticuerpos biespecíficos en forma de IgG-ScFv, concretamente, la forma Morrison (Coloma M. J., Morrison S. L. Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies.Nat Biotechnol.,1997; 15: 159-163), que ha demostrado ser una de las formas ideales de los anticuerpos biespecíficos debido a su similitud con la forma IgG que se produce de manera natural y a sus ventajas en la ingeniería, expresión y purificación de anticuerpos (Miller B. R., Demarest S. J.,et al.,Stability engineering of scFvs for the development of bispecific and multivalent antibodies.Protein Eng Des Sel2010; 23: 549-57; Fitzgerald J, Lugovskoy A Rational engineering of antibody therapeutics targeting multiple oncogene pathways.MAbs2011; 3: 299-309).
Actualmente, existe la necesidad de desarrollar un medicamento de anticuerpo bifuncional que selecciona como diana tanto PD-1 como VEGF (por ejemplo, VEGFA).
El documento US 2017/275353 A1 describe inhibidores triespecíficos para el tratamiento del cáncer. El documento WO2013/181452 A1 describe métodos de tratamiento del cáncer mediante antagonistas de la unión al eje de PD-L1 y antagonistas de VEGF. El documento US 2017/275375 A1 describe una terapia combinada con anticuerpos biespecíficos redireccionadores de células T e inhibidores de puntos de control. El documento WO2018/036472 A1 describe un anticuerpo monoclonal anti-PD1, una composición farmacéutica del mismo y el uso del mismo.
Sumario
La invención está definida por las reivindicaciones y cualquier otro aspecto, configuración o realización establecido en el presente documento que no entre dentro del alcance de las reivindicaciones es meramente informativo.
Mediante una investigación en profundidad y esfuerzos creativos, y basándose en el anticuerpo monoclonal contra VEGFA Avastin (bevacizumab) disponible comercialmente y en el 14C12H1L1 adquirido anteriormente (véase la publicación de patente china n.° CN106977602A), los inventores han adquirido un anticuerpo bifuncional humanizado denominado VP101, que puede unirse simultáneamente a VEGFA y PD-1, y de bloquear la unión de VEGFA a VEGFR2 y la de PD-1 a PD-L1.
Los inventores han descubierto sorprendentemente que VP101 puede:
unirse eficazmente a PD-1 en la superficie de las células inmunitarias humanas, aliviar la inmunosupresión mediada por PD-L1 y PD-1, y promover la secreción de IFN-y e IL-2 por las células inmunitarias humanas; inhibir eficazmente la proliferación inducida por VEGFA de células endoteliales vasculares, e inhibir así la angiogénesis inducida por tumor; y/o
tener el potencial de usarse para preparar medicamentos para la prevención y el tratamiento de tumores malignos tales como cáncer de hígado, cáncer de pulmón, melanoma, tumor renal, cáncer de ovario y linfoma. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, a las composiciones farmacéuticas y a los medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
La presente invención se detalla a continuación.
Un aspecto se refiere a un anticuerpo biespecífico, que comprende
una primera región funcional proteica que selecciona como diana VEGFA, y
una segunda región funcional proteica que selecciona como diana PD-1;
preferiblemente,
la primera región funcional proteica es un anticuerpo anti-VEGFA o un fragmento de unión a antígeno del mismo, una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-VEGFA que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 15-17 respectivamente, y una región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-VEGFA que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 18-20 respectivamente; y
la segunda región funcional proteica es un anticuerpo anti-PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-PD-1 que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 21-23 respectivamente, y una región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-PD-1 que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 24-26 respectivamente.
En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona el anticuerpo biespecífico, en el que, el anticuerpo anti-VEGFA o el fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona de Fab, Fab', F(ab')<2>, Fv, un scFv, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico y un diacuerpo;
y/o
el anticuerpo anti-PD-1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona de Fab, Fab', F(ab')<2>, Fv, un scFv, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico y un diacuerpo.
En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico está en forma de IgG-scFv.
En algunas realizaciones de la presente invención, la primera región funcional proteica es una inmunoglobulina, una región variable de cadena pesada de la inmunoglobulina que comprende HCDR1- HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 15-17 respectivamente, y una región variable de cadena ligera de la inmunoglobulina que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 18-20 respectivamente; y la segunda región funcional proteica es un scFv, una región variable de cadena pesada del scFv que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 21-23 respectivamente, y una región variable de cadena ligera del scFv que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 24-26 respectivamente;
o,
la primera región funcional proteica es un scFv, una región variable de cadena pesada del scFv que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 15-17 respectivamente, y una región variable de cadena ligera del scFv que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 18-20 respectivamente; y la segunda región funcional proteica es una inmunoglobulina, una región variable de cadena pesada de la inmunoglobulina que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 21-23 respectivamente, y una región variable de cadena ligera de la inmunoglobulina que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 24-26 respectivamente.
En una realización específica de la presente invención, se proporciona un anticuerpo biespecífico, que comprende:
una primera región funcional proteica que selecciona como diana VEGFA, y
una segunda región funcional proteica que selecciona como diana PD-1;
en el que,
la primera región funcional proteica es una inmunoglobulina, una región variable de cadena pesada de la inmunoglobulina que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 15-17 respectivamente, y una región variable de cadena ligera de la inmunoglobulina que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 18-20 respectivamente; y la segunda región funcional proteica es un scFv, una región variable de cadena pesada del scFv que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 21-23 respectivamente, y una región variable de cadena ligera del scFv que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 24-26 respectivamente;
o,
la primera región funcional proteica es un scFv, una región variable de cadena pesada del scFv que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 15-17 respectivamente, y una región variable de cadena ligera del scFv que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 18-20 respectivamente; y la segunda región funcional proteica es una inmunoglobulina, una región variable de cadena pesada de la inmunoglobulina que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 21-23 respectivamente, y una región variable de cadena ligera de la inmunoglobulina que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 24-26 respectivamente.
En algunas realizaciones se proporciona el anticuerpo biespecífico, en el que,
la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de la inmunoglobulina se establece en SEQ ID NO: 5, y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de la inmunoglobulina se establece en SEQ ID NO: 7; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del scFv se establece en SEQ ID NO: 9, y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del scFv se establece en SEQ ID NO: 11;
o,
la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del scFv se establece en SEQ ID NO: 5, y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del scFv se establece en SEQ ID NO: 7; y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de la inmunoglobulina se establece en SEQ ID NO: 9, y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de la inmunoglobulina se establece en SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones se proporciona el anticuerpo biespecífico, en el que
la inmunoglobulina comprende una región no CDR derivada de un anticuerpo humano.
En algunas realizaciones se proporciona el anticuerpo biespecífico, en el que,
la inmunoglobulina comprende regiones constantes derivadas de un anticuerpo humano;
preferiblemente, las regiones constantes de la inmunoglobulina se seleccionan de las regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas.
En algunas realizaciones se proporciona el anticuerpo biespecífico, en el que,
la región constante de cadena pesada de la inmunoglobulina es la región C de cadena gamma-1 de Ig humana o la región C de cadena gamma-4 de Ig humana, y su región constante de cadena ligera es la región C de cadena kappa de Ig humana.
En algunas realizaciones, las regiones constantes de la inmunoglobulina están humanizadas. Por ejemplo, cada región constante de cadena pesada es la región C de cadena gamma-1 de Ig, registro: P01857, y cada región constante de cadena ligera es la región C de cadena kappa de Ig, registro: P01834.
En algunas realizaciones se proporciona el anticuerpo biespecífico, en el que
la primera región funcional proteica y la segunda región funcional proteica están ligadas directamente o a través de un fragmento de ligador; preferiblemente, el fragmento de ligador es (GGGGS)m, en el que m es un número entero positivo tal como 1,2, 3, 4, 5 ó 6, y GGGGS (SEQ ID NO: 14) es una unidad constituyente del ligador. En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona el anticuerpo biespecífico, en el que los números de la primera región funcional proteica y la segunda región funcional proteica son cada uno independientemente 1, 2 o más.
En algunas realizaciones se proporciona el anticuerpo biespecífico, en el que
están presentes 1 inmunoglobulina y 2 scFv, preferiblemente dos scFv idénticos.
En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona el anticuerpo biespecífico, en el que la inmunoglobulina es una IgG, IgA, IgD, IgE o IgM, preferiblemente una IgG, tal como una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
En algunas realizaciones se proporciona el anticuerpo biespecífico, en el que
el scFv está ligado al extremo C-terminal de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Dado que una inmunoglobulina tiene dos cadenas pesadas, se ligan dos moléculas de scFv a una molécula de inmunoglobulina. Preferiblemente, las dos moléculas de scFv son idénticas.
En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona el anticuerpo biespecífico, en el que están presentes dos scFv, y un extremo de cada scFv está ligado al extremo C-terminal o al extremo N-terminal de una de las dos cadenas pesadas de la inmunoglobulina.
En algunas realizaciones, está presente un enlace disulfuro entre la V<h>y la V<l>del anticuerpo de cadena sencilla. Los métodos para introducir un enlace disulfuro entre la V<h>y la V<l>de un anticuerpo se conocen bien en la técnica, véase, por ejemplo, el documento US 5.747.654; Rajagopalet al., Prot. Engin.10(1997)1453-1459; Reiteret al., Nat. Biotechnol.14(1996)1239-1245; Reiteret al., Protein Engineering 8(1995)1323-1331;Webberet al., Molecular Immunology32(1995)249-258; Reiteret al., Immunity2(1995)281-287; Reiteret al., JBC269(1994)18327-18331; Reiteret al., Inter. J of Cancer58(1994)142-149; o Reiteret al., Cancer Res.
54(1994)2714-2718.
En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona el anticuerpo biespecífico, en el que el anticuerpo biespecífico se une a una proteína VEGFA y/o a una proteína PD-1 con una K<d>inferior a 10'5 M, tal como inferior a 10'6 M, 10'7 M, 10'8 M, 10'9 M o 10'10 M o menos; preferiblemente, la K<d>se mide mediante un instrumento de interacción molecular Fortebio.
En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona el anticuerpo biespecífico, en el que, el anticuerpo biespecífico se une a la proteína VEGFA con una CE<50>inferior a 1 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,2 nM, inferior a 0,15 nM o inferior a 0,14 nM; en el que la CE<50>se detecta mediante ELISA indirecto;
y/o,
el anticuerpo biespecífico se une a la proteína PD-1 con una CE<50>inferior a 1 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,2 nM, inferior a 0,17 nM, inferior a 0,16 nM o inferior a 0,15 nM; en el que la CE<50>se detecta mediante ELISA indirecto.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para el anticuerpo biespecífico tal como se reivindica.
La presente invención también se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención.
La presente invención también se refiere a una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención o que comprende el vector de la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para preparar el anticuerpo biespecífico tal como se reivindica, que comprende cultivar la célula huésped de la presente invención en condiciones adecuadas y aislar el anticuerpo biespecífico de los cultivos celulares.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un conjugado, que comprende un anticuerpo biespecífico y un resto conjugado, en el que el anticuerpo biespecífico es el anticuerpo biespecífico tal como se reivindica y el resto conjugado es un marcador detectable; preferiblemente, el resto conjugado es un radioisótopo, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente, una sustancia coloreada o una enzima.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit que comprende el anticuerpo biespecífico tal como se reivindica o que comprende el conjugado de la presente invención;
en donde el kit comprende además un segundo anticuerpo que puede unirse específicamente al anticuerpo biespecífico; opcionalmente, el segundo anticuerpo comprende además un marcador detectable, tal como un radioisótopo, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente, una sustancia coloreada o una enzima. Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del anticuerpo biespecífico tal como se reivindica en la preparación de un kit para detectar la presencia o el nivel de VEGFA y/o PD-1 en una muestra.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico tal como se reivindica o que comprende el conjugado de la presente invención; y, comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
El anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica puede formularse en cualquier forma de dosificación conocida en el campo farmacéutico, tal como, por ejemplo, comprimido, pastilla, suspensión, emulsión, disolución, gel, cápsula, polvo, gránulo, elixir, trocisco, supositorio, inyección (incluyendo la disolución inyectable, polvo estéril para inyección y disolución concentrada para inyección), medicamento inhalatorio y aerosol. La forma de dosificación preferida depende del modo de administración previsto y del uso terapéutico. La composición farmacéutica de la presente invención debe ser estéril y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Una forma de dosificación preferida es una inyección. Tales inyecciones pueden ser disoluciones inyectables estériles. Por ejemplo, las disoluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante el siguiente método: se añade una cantidad necesaria del anticuerpo biespecífico de la presente invención en un disolvente apropiado y, opcionalmente, se añaden al mismo tiempo otros componentes deseados (incluyendo, pero sin limitarse a, reguladores del pH, tensioactivos, adyuvantes, potenciadores de la fuerza iónica, agentes isotónicos, conservantes, diluyentes o cualquier combinación de los mismos), seguido de filtración y esterilización. Además, las disoluciones inyectables estériles pueden prepararse como polvos liofilizados estériles (por ejemplo, mediante secado a vacío o liofilización) para su cómodo almacenamiento y uso. Tales polvos liofilizados estériles pueden dispersarse en un portador adecuado (por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos) antes de su uso.
Además, el anticuerpo biespecífico puede estar presente en una composición farmacéutica en forma de dosis unitaria para facilitar la administración. En algunas realizaciones, la dosis unitaria es de al menos 1 mg, al menos 5 mg, al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 20 mg, al menos 25 mg, al menos 30 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 75 mg o al menos 100 mg. Cuando la composición farmacéutica está en una forma de dosificación líquida (por ejemplo, inyección), puede comprender el anticuerpo biespecífico de la presente invención a una concentración de al menos 0,1 mg/ml, tal como al menos 0,25 mg/ml, al menos 0,5 mg/ml, al menos 1 mg/ml, al menos 2,5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml o al menos 100 mg/ml.
El anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica puede administrarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, vía oral, bucal, sublingual, ocular, tópica, parenteral, rectal, intratecal, intracistemal, inguinal, intravesical, tópica (por ejemplo, polvo, pomada o gota) o nasal. Sin embargo, para muchos usos terapéuticos, la vía/modo de administración preferido es parenteral (tal como inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intraperitoneal e inyección intramuscular). Los expertos en la técnica apreciarán que la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de la finalidad prevista. El anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse mediante infusión o inyección intravenosa.
El anticuerpo biespecífico o la composición farmacéutica proporcionado en el presente documento puede usarse solo o en combinación, o usarse en combinación con agentes farmacéuticamente activos adicionales (por ejemplo, un fármaco quimioterápico contra tumores). Un agente farmacéuticamente activo adicional de este tipo puede administrarse antes, simultáneamente o después de la administración del anticuerpo biespecífico de la presente invención o de la composición farmacéutica de la presente invención.
El régimen de administración puede ajustarse para lograr la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, puede ser una única administración, puede ser múltiples administraciones a lo largo de un periodo de tiempo, o puede caracterizarse por reducir o aumentar la dosis proporcionalmente con el grado de emergencia del tratamiento.
Un métodoin vivooin vitropuede comprender administrar a una célula una cantidad eficaz del anticuerpo biespecífico según cualquier realización de la presente invención o del conjugado de la presente invención, y el método se selecciona de:
(1)
un método para detectar el nivel de VEGFA en una muestra,
un método para bloquear la unión de VEGFA a VEGFR2,
un método para regular por disminución la actividad o el nivel de VEGFA,
un método para aliviar la estimulación de VEGFA sobre la proliferación de células endoteliales vasculares, un método para inhibir la proliferación de células endoteliales vasculares, o
un método para bloquear la angiogénesis tumoral;
y/o
(2)
un método para bloquear la unión de PD-1 a PD-L1,
un método para regular por disminución la actividad o el nivel de PD-1,
un método para aliviar la inmunosupresión de PD-1 en un organismo,
un método para promover la secreción de IFN-y en linfocitos T, o
un método para promover la secreción de IL-2 en los linfocitos T.
Un métodoin vitropuede ser no terapéutico y/o no diagnóstico.
En el experimentoin vitro,tanto el anticuerpo anti-VEGFA como el anticuerpo bifuncional anti-VEGFA/PD-1 pueden inhibir la proliferación de células HUVEC, y tanto el anticuerpo anti-PD-1 como el anticuerpo bifuncional anti-VEGFA/PD-1 pueden promover la secreción de IFN-y y/o IL-2 y activar la reacción inmunitaria.
Un método para prevenir y/o tratar un tumor maligno puede comprender administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz del anticuerpo biespecífico según cualquier realización de la presente invención o del conjugado de la presente invención, en el que preferiblemente, el tumor maligno se selecciona de cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de pulmón tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de piel, glioma, melanoma, tumor renal, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer gastrointestinal, cáncer de mama, cáncer cerebral y leucemia.
Un intervalo típico no limitativo de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del anticuerpo biespecífico de la presente invención es de 0,02-50 mg/kg, tal como de 0,1-50 mg/kg, 0,1-25 mg/kg o 1-10 mg/kg. Debe tenerse en cuenta que la dosis puede variar con el tipo y la intensidad del síntoma que va a tratarse. Además, los expertos en la técnica apreciarán que, para cualquier paciente particular, el régimen de administración particular se ajustará con el tiempo según las necesidades del paciente y el juicio profesional del médico; los intervalos de dosis dados en el presente documento son sólo con fines ilustrativos y no limitan el uso o el alcance de la composición farmacéutica de la presente invención.
Un sujeto puede ser un mamífero, tal como un ser humano.
Se proporciona el anticuerpo biespecífico o el conjugado tal como se reivindica para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un tumor maligno, en el que preferiblemente, el tumor maligno se selecciona de cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de pulmón tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de piel, glioma, melanoma, tumor renal, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer gastrointestinal, cáncer de mama, cáncer cerebral y leucemia.
Un anticuerpo biespecífico o conjugado puede ser para su uso en:
(1)
detectar el nivel de VEGFA en una muestra,
bloquear la unión de VEGFA a VEGFR2,
regular por disminución la actividad o el nivel de VEGFA,
aliviar la estimulación de VEGFA sobre la proliferación de células endoteliales vasculares,
inhibir la proliferación de células endoteliales vasculares, o
bloquear la angiogénesis tumoral;
y/o
(2)
bloquear la unión de PD-1 a PD-L1,
regular por disminución la actividad o el nivel de PD-1,
aliviar la inmunosupresión de PD-1 en un organismo,
promover la secreción de IFN-y en linfocitos T, o
promover la secreción de IL-2 en linfocitos T.
Los anticuerpos terapéuticos, especialmente los anticuerpos monoclonales, han logrado una buena eficacia en el tratamiento de diversas enfermedades. Los métodos experimentales tradicionales para adquirir estos anticuerpos terapéuticos consisten en inmunizar animales con el antígeno y adquirir anticuerpos que seleccionan como diana el antígeno en los animales inmunizados, o mejorar aquellos anticuerpos con menor afinidad por el antígeno mediante maduración por afinidad.
Las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada determinan la unión del antígeno; la región variable de cada cadena contiene tres regiones hipervariables denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR) (las CDR de cadena pesada (cadena H) comprenden HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y las CDR de cadena ligera (cadena L) comprenden LCDR1, LCDR2 y LCDR3, denominadas así por Kabatet al.,véase Bethesda M.d., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, NIH Publication (1-3) 1991: 91-3242).
Preferiblemente, las CDR también pueden definirse mediante el sistema de numeración IMGT, véase Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas y Marie-Paule Lefranc. “IMGT/3Dstructure-DB e IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF y MhcSF”.Nucleic acids research38.supl_1 (2009): D301-D307.
Las secuencias de aminoácidos de las regiones CDR de las secuencias de anticuerpos monoclonales de (1) a (13) a continuación se analizaron mediante medios técnicos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante la base de datos VBASE2 y según la definición IMGT, y los resultados son los siguientes: (1) Bevacizumab
La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada se establece en SEQ ID NO: 5, y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera se establece en SEQ ID NO: 7.
Las secuencias de aminoácidos de las 3 regiones CDR de su región variable de cadena pesada son las siguientes:
HCDR1: GYTFTNYG (SEQ ID NO: 15)
HCDR2: INTYTGEP (SEQ ID NO: 16)
HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV (SEQ ID NO: 17)
Las secuencias de aminoácidos de las 3 regiones CDR de su región variable de cadena ligera son las siguientes: LCDR1: QDISNY (SEQ ID NO: 18)
LCDR2: FTS (SEQ ID NO: 19)
LCDR3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 20)
(2) 14C12H1L1
La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada se establece en SEQ ID NO: 9, y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera se establece en SEQ ID NO: 11.
Las secuencias de aminoácidos de las 3 regiones CDR de su región variable de cadena pesada son las siguientes:
HCDR1: GFAFSSYD (SEQ ID NO: 21)
HCDR2: ISGGGRYT (SEQ ID NO: 22)
HCDR3: ANRYGEAWFAY (SEQ ID NO: 23)
Las secuencias de aminoácidos de las 3 regiones CDR de su región variable de cadena ligera son las siguientes: LCDR1: QDINTY (SEQ ID NO: 24)
LCDR2: RAN (SEQ ID NO: 25)
LCDR3: LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 26)
(3) VP101
Las secuencias de aminoácidos de las 9 regiones CDR de sus cadenas pesadas son las siguientes:
HCDR1: GYTFTNYG (SEQ ID NO: 15)
HCDR2: INTYTGEP (SEQ ID NO: 16)
HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV (SEQ ID NO: 17)
HCDR4: GFAFSSYD (SEQ ID NO: 21)
HCDR5: ISGGGRYT (SEQ ID NO: 22)
HCDR6: ANRYGEAWFAY (SEQ ID NO: 23)
HCDR7: QDINTY (SEQ ID NO: 24)
HCDR8: RAN (SEQ ID NO: 25)
HCDR9: LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 26)
Las secuencias de aminoácidos de las 3 regiones CDR de su región variable de cadena ligera son las siguientes: LCDR1: QDISNY (SEQ ID NO: 18)
LCDR2: FTS (SEQ ID NO: 19)
LCDR3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 20)
En la presente invención, a menos que se defina lo contrario, los términos científicos y técnicos usados en el presente documento tienen el significado generalmente entendido por los expertos en la técnica. Además, las operaciones de laboratorio de cultivo celular, genética molecular, química de ácidos nucleicos e inmunología usadas en el presente documento son los procedimientos rutinarios ampliamente usados en los campos correspondientes. Mientras tanto, para comprender mejor la presente invención, a continuación, se proporcionan las definiciones y explicaciones de los términos pertinentes.
Tal como se usa en el presente documento, cuando se hace referencia a la secuencia de aminoácidos de la proteína VEGFA (ID de GenBank: NP_001165097.1), incluye la longitud completa de la proteína VEGFA, así como una proteína de fusión de VEGFA, tal como un fragmento fusionado a un fragmento de proteína Fc de IgG de ratón o humana (mFc o hFc). Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que en la secuencia de aminoácidos de la proteína VEGFA, pueden generarse de manera natural o introducirse artificialmente mutaciones o variaciones (incluyendo, pero sin limitarse a, sustituciones, deleciones y/o adiciones) sin afectar a las funciones biológicas de la misma. Por tanto, en la presente invención, el término “proteína VEGFA” debe incluir todas esas secuencias, incluyendo sus variantes naturales o artificiales. Además, al describir el fragmento de secuencia de la proteína VEGF<a>, también incluye los fragmentos de secuencia correspondientes en sus variantes naturales o artificiales. En una realización de la presente invención, la secuencia de aminoácidos de la proteína VEGFA se muestra como la parte subrayada de SEQ ID NO: 1 (sin las últimas 6 His, un total de 302 aminoácidos).
Tal como se usa en el presente documento, cuando se hace referencia a la secuencia de aminoácidos de la proteína VEGFR2 (también conocida como KDR, ID de GenBank: NP_002244), incluye la longitud completa de la proteína VEGFR2, o el fragmento extracelular VEGFR2-ECD de VEGFR2, o un fragmento que comprende VEGFR2-ECD, y también incluye una proteína de fusión de VEGFR2-ECD, tal como un fragmento fusionado a un fragmento de proteína Fc de IgG de ratón o humana (mFc o hFc). Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que en la secuencia de aminoácidos de la proteína VEGFR2, pueden generarse de manera natural o introducirse artificialmente mutaciones o variaciones (incluyendo, pero sin limitarse a, sustituciones, deleciones y/o adiciones) sin afectar a las funciones biológicas de la misma. Por tanto, en la presente invención, el término “proteína VEGFR2” debe incluir todas esas secuencias, incluyendo sus variantes naturales o artificiales. Además, al describir el fragmento de secuencia de la proteína VEGFR2, también incluye los fragmentos de secuencia correspondientes en sus variantes naturales o artificiales. En una realización de la presente invención, la secuencia de aminoácidos del fragmento extracelular VEGFR2-ECD de VEGFR2 se muestra como la parte subrayada con línea ondulada de SEQ ID NO: 4 (766 aminoácidos).
Tal como se usa en el presente documento, a menos que se especifique lo contrario, el VEGFR es VEGFR1 y/o VEGFR2; la secuencia proteica específica del mismo es una secuencia conocida en la técnica anterior, y puede hacerse referencia a la secuencia dada a conocer en la bibliografía existente o en GenBank. Por ejemplo, VEGFR1 (VEGFR1, ID de gen de NCBI: 2321); VEGFR2 (VEGFR2, ID de gen de NCBI: 3791).
Tal como se usa en el presente documento, cuando se hace referencia a la secuencia de aminoácidos de la proteína PD-1 (proteína de muerte celular programada 1, NCBI GenBank: NM_005018), incluye la longitud completa de la proteína PD-1, o el fragmento extracelular PD-1ECD de PD-1 o un fragmento que comprende PD-1ECD, y también incluye una proteína de fusión de PD-1ECD, tal como un fragmento fusionado a un fragmento de proteína Fc de una IgG de ratón o humana (mFc o hFc). Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que en la secuencia de aminoácidos de la proteína PD-1, pueden generarse de manera natural o introducirse artificialmente mutaciones o variaciones (incluyendo, pero sin limitarse a, sustituciones, deleciones y/o adiciones) sin afectar a las funciones biológicas de la misma. Por tanto, en la presente invención, el término “proteína PD-1” debe incluir todas esas secuencias, incluyendo sus variantes naturales o artificiales. Además, al describir el fragmento de secuencia de la proteína PD-1, también incluye los fragmentos de secuencia correspondientes en sus variantes naturales o artificiales.
Tal como se usa en el presente documento, el término CE<50>se refiere a la concentración para el 50% del efecto máximo, es decir, la concentración que puede provocar el 50% del efecto máximo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a una molécula de inmunoglobulina que generalmente consiste en dos pares de cadenas polipeptídicas (cada par con una cadena “ligera” (L) y una cadena “pesada” (H)). En sentido general, la cadena pesada puede interpretarse como una cadena polipeptídica de mayor peso molecular en un anticuerpo, y la cadena ligera se refiere a una cadena polipeptídica de menor peso molecular en un anticuerpo. Las cadenas ligeras se clasifican como cadenas ligeras k y X. Las cadenas pesadas se clasifican generalmente como |i, 8, y, a o g, y los isotipos de anticuerpos se definen como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. En las cadenas ligeras y pesadas, la región variable y la región constante están ligadas por una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, y la cadena pesada también comprende una región “D” de aproximadamente 3 o más aminoácidos. Cada cadena pesada consiste en una región variable de cadena pesada (V<h>) y una región constante de cadena pesada (C<h>). La región constante de cadena pesada consiste en 3 dominios (C<h>1 , C<h>2 y C<h3>). Cada cadena ligera consiste en una región variable de cadena ligera (V<l>) y una región constante de cadena ligera (C<l>). La región constante de cadena ligera consiste en un dominio C<l>. La región constante del anticuerpo puede mediar en la unión de inmunoglobulinas a tejidos o factores del huésped, incluyendo la unión de diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) al primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. Las regiones V<h>y V<l>pueden subdividirse adicionalmente en regiones altamente variables (denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR)), entre las que se distribuyen regiones conservadoras denominadas regiones de entramado (FR). Cada V<h>y V<l>consiste en 3 CDR y 4 FR dispuestas desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables (V<h>y V<l>) de cada par de cadena pesada/cadena ligera forman sitios de unión a anticuerpos, respectivamente. La asignación de aminoácidos a las regiones o dominios puede basarse en Sequences of Proteins of Immunological Interest de Kabat (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & LeskJ Mol. Biol.196(1987): 901 917; Chothiaet al. Nature342(1989): 878-883 o la definición del sistema de numeración iMgT, véase Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas y Marie-Paule Lefranc. “IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF”.Nucleic acids research38.supl_1 (2009): D301-D307. Particularmente, la cadena pesada también puede comprender más de 3 CDR, tal como 6, 9 ó 12. Por ejemplo, en el anticuerpo biespecífico de la presente divulgación la cadena pesada puede ser un ScFv con el extremo C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo IgG unido a otro anticuerpo, y en este caso, la cadena pesada comprende 9 CDR. El término “anticuerpo” no está limitado por ningún método específico de producción de anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo incluye, particularmente, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal. Los anticuerpos pueden ser de diferentes isotipos, talels como anticuerpo IgG (por ejemplo, subtipo IgGI, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA, IgA2, IgD, IgE o IgM.
Tal como se usa en el presente documento, el término “fragmento de unión a antígeno”, también conocido como “porción de unión a antígeno”, se refiere a un polipéptido que comprende el fragmento de un anticuerpo de longitud completa, que mantiene la capacidad de unirse específicamente al mismo antígeno al que se une el anticuerpo de longitud completa, y/o compite con el anticuerpo de longitud completa por la unión específica a un antígeno. Véase en general, Fundamental Immunology, cap. 7 (Paul, W., ed., 2a edición, Raven Press, N.Y. (1989). Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede producirse mediante una técnica de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de un anticuerpo intacto. En muchos casos, el fragmento de unión a antígeno incluye Fab, Fab', F(ab')2, scFv, anticuerpo quimérico, diacuerpo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “fragmento Fd” se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en los dominios V<h>y C<h i>; el término “fragmento Fv” se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en los dominios V<l>y V<h>de un solo brazo de un anticuerpo; el término “fragmento dAb” se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en un dominio V<h>(Wardet al., Nature341 (1989):544-546); el término “fragmento Fab” se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en los dominios V<l>, V<h>, C<l>y C<h i>; y el término “fragmento F(ab')2” se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en dos fragmentos Fab ligados por el puente disulfuro en una región bisagra.
En algunos aspectos, el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo es un scFv en el que los dominios V<l>y V<h>se emparejan para formar una molécula monovalente a través de un ligador que les permite producir una única cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, Birdet al., Science242 (1988):423-426 y Hustonet al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 85 (1988):5879-5883). Tales moléculas scFv pueden tener una estructura general: NH2-V<l>-ligador-VH-COOH o NH2-VH-ligador-VL-COOH. Un ligador apropiado en la técnica anterior consiste en una secuencia repetida de aminoácidos GGGGS o una variante de la misma. Por ejemplo, puede usarse un ligador que tenga la secuencia de aminoácidos (GGGGS)<4>, y también pueden usarse variantes de la misma (Holligeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 (1993): 6444-6448). Otros ligadores útiles en la presente invención se describen en Alfthanet al., Protein Eng.8 (1995): 725-731,Choi et al., Eur. J Immunol.31 (2001): 94-106, Huet al., Cancer Res. 56 (1996):3055-3061, Kipriyanovet al., J. Mol. Biol.293 (1999): 41-56, y Rooverset al., Cancer Immunol. (2001).
En algunos aspectos, el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo es un diacuerpo, es decir, un anticuerpo bivalente en el que los dominios V<h>y V<l>se expresan en una única cadena polipeptídica. Sin embargo, el ligador usado es demasiado corto para permitir el emparejamiento de los dos dominios en la misma cadena, por lo que los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de la otra cadena y se generan dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger P.et al., Proc. Acad Sci. USA90 (1993):6444-6448, y Poljak RJet al., Structure2 (1994): 1121-1123).
Los fragmentos de unión a antígeno (por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo mencionados anteriormente) de anticuerpos pueden obtenerse a partir de anticuerpos dados usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, técnica de ADN recombinante o escisión enzimática o química), y los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos se examinan para determinar la especificidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.
Tal como se usa en el presente documento, a menos que se defina claramente lo contrario en el contexto, cuando se hace referencia al término “anticuerpo”, incluye no sólo anticuerpos intactos, sino también fragmentos de unión a anticuerpos de los anticuerpos. Tal como se usa en el presente documento, los términos “AcM” y “anticuerpo monoclonal” se refieren a un anticuerpo o fragmento del mismo derivado de un grupo de anticuerpos altamente homólogos, es decir, de un grupo de moléculas de anticuerpo idénticas, excepto por las mutaciones naturales que pueden producirse espontáneamente. El anticuerpo monoclonal tiene una alta especificidad para un único epítopo de un antígeno. El anticuerpo policlonal, en relación con el anticuerpo monoclonal, generalmente comprende al menos dos o más anticuerpos diferentes que generalmente reconocen diferentes epítopos en un antígeno. Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse generalmente mediante la técnica del hibridoma descrita por primera vez por Kohleret al. (Nature,256:495, 1975), y también pueden obtenerse mediante la técnica del ADN recombinante (por ejemplo, véase la patente estadounidense 4.816.567).
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo en el que una parte de las cadenas ligeras y/o pesadas se deriva de un anticuerpo (que puede derivarse de una especie específica o pertenecer a una clase o subclase específica de anticuerpos), y la otra parte de las cadenas ligeras y/o pesadas se deriva de otro anticuerpo (que puede derivarse de la misma especie o de especies diferente o pertenecer a la misma clase o subclase de los mismos anticuerpos o de anticuerpos diferentes). Pero, en cualquier caso, conserva la actividad de unión para el antígeno diana (patente estadounidense 4.816.567 de Cabillyet al.;Morrisonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81 (1984):6851-6855).
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo obtenido cuando todas o parte de las regiones CDR de una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) se sustituyen por las regiones CDR de un anticuerpo no humano (anticuerpo donante), en el que el anticuerpo donante puede ser un anticuerpo no humano (por ejemplo, de ratón, rata o conejo) que tiene la especificidad, afinidad o reactividad esperadas. Además, algunos residuos de aminoácidos en las regiones de entramado (FR) del anticuerpo receptor también pueden sustituirse por los residuos de aminoácidos de los anticuerpos no humanos correspondientes o por los residuos de aminoácidos de otros anticuerpos para mejorar u optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. Para más detalles sobre los anticuerpos humanizados, véanse, por ejemplo, Joneset al., Nature,321 (1986): 522-525; Reichmannet al., Nature,332:323 329 (1988); Presta,Curr. Op. Struct. Biol,2 (1992): 593-596, y Clark,Immunol. Today21 (2000): 397-402.
Tal como se usa en el presente documento, el término “epítopo” se refiere a un sitio en el antígeno al que se une específicamente una inmunoglobulina o anticuerpo. “Epítopo” también se denomina en la técnica “determinante antigénico”. El epítopo o determinante antigénico consiste generalmente en grupos superficiales químicamente activos de una molécula, tales como aminoácidos o hidratos de carbono o cadenas laterales de azúcar, y habitualmente tiene características estructurales tridimensionales específicas y características de carga específicas. Por ejemplo, el epítopo generalmente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 aminoácidos consecutivos o no consecutivos en una conformación espacial única, que puede ser “lineal” o “conformacional”. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). En un epítopo lineal, todos los sitios de interacción entre una proteína y una molécula de interacción (por ejemplo, un anticuerpo) existen linealmente a lo largo de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína. En un epítopo conformacional, los sitios de interacción existen a lo largo de los residuos de aminoácidos de la proteína que están separados entre sí.
Tal como se usa en el presente documento, el término “aislado” se refiere a obtenido por medios artificiales a partir del estado natural. Si una determinada sustancia o componente “aislado” aparece en la naturaleza, puede ser que se produzca un cambio en su entorno natural, o que esté aislado del entorno natural, o ambas cosas. Por ejemplo, un determinado polinucleótido o polipéptido no aislado existe de manera natural en un determinado animal vivo, y el mismo polinucleótido o polipéptido con una alta pureza aislado de un estado natural de este tipo se denomina polinucleótido o polipéptido aislado. El término “aislado” no excluye la existencia de sustancias artificiales o sintéticas u otras impurezas que no afecten a la actividad de la sustancia.
Tal como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a un vehículo de ácido nucleico en el que puede insertarse un polinucleótido. Cuando un vector permite la expresión de la proteína codificada por el polinucleótido insertado, el vector se denomina vector de expresión. Un vector puede introducirse en una célula huésped mediante transformación, transducción o transfección, de modo que los elementos de la sustancia genética transportados por el vector puedan expresarse en la célula huésped. Los vectores se conocen bien por los expertos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a: plásmidos; fagémidos; cósmidos; cromosomas artificiales, tales como cromosoma artificial de levadura (YAC), cromosoma artificial de bacterias (BAC) o cromosoma artificial derivado de P1 (PAC); fagos tales como fagos lambda o fagos M13, y virus animales. Los virus animales que pueden usarse como vectores incluyen, pero no se limitan a, retrovirus (incluyendo lentivirus), adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes (tales como virus del herpes simple), poxvirus, baculovirus, papilomavirus y papovavirus (tales como SV40). Un vector puede contener una variedad de elementos que controlan la expresión, incluyendo, pero sin limitarse a, secuencias promotoras, secuencias de iniciación de la transcripción, secuencias potenciadoras, elementos de selección y genes indicadores. Además, el vector puede contener además un sitio de iniciación de la replicación.
Tal como se usa en el presente documento, el término “célula huésped” se refiere a las células en las que puede introducirse el vector, incluyendo, pero sin limitarse a, células procariotas tales comoE. colioBacillus subtilis,células fúngicas tales como células de levadura oAspergillus,células de insecto tales como células deDrosophilaS2 o Sf9, o células animales tales como fibroblastos, células CHO, células COS, células NSO, células HeLa, células BHK, células HEK 293 o células humanas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “unirse específicamente” se refiere a una reacción de unión no aleatoria entre dos moléculas, tal como una reacción entre un anticuerpo y un antígeno que selecciona como diana. En algunas realizaciones, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno (o un anticuerpo que es específico para un antígeno) significa que el anticuerpo se une al antígeno con una afinidad (K<d>) inferior a aproximadamente 10-5 M, tal como inferior a aproximadamente 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o menos. En algunas realizaciones de la presente invención, el término “diana” se refiere a la unión específica.
Tal como se usa en el presente documento, el término “K<d>” se refiere a una constante de disociación de equilibrio para una interacción específica entre anticuerpo y antígeno, que se usa para describir la afinidad de unión entre el anticuerpo y el antígeno. Cuanto menor sea la constante de disociación de equilibrio, más estrecha será la unión anticuerpo-antígeno y mayor será la afinidad entre el anticuerpo y el antígeno. En general, los anticuerpos se unen a antígenos con una constante de disociación de equilibrio (K<d>) inferior a aproximadamente 10-5 M, tal como inferior a aproximadamente 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o menos, por ejemplo, tal como se determina en un instrumento BIACORE usando resonancia de plasmón superficial (SPR).
Tal como se usa en el presente documento, los términos “anticuerpo monoclonal” y “AcM” tienen el mismo significado y pueden usarse de manera intercambiable; los términos “anticuerpo policlonal” y “AcPc” tienen el mismo significado y pueden usarse de manera intercambiable; los términos “polipéptido” y “proteína” tienen el mismo significado y pueden usarse de manera intercambiable. Además, en la presente invención, los aminoácidos se representan generalmente mediante abreviaturas de una y tres letras conocidas en la técnica. Por ejemplo, la alanina puede representarse por A o Ala.
Tal como se usa en el presente documento, el término “excipiente farmacéuticamente aceptable” se refiere a un portador y/o vehículo que es farmacológica y/o fisiológicamente compatible con el sujeto y el principio activo, lo cual se conoce bien en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. Editado por Gennaro AR, 19a ed., Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) e incluye, pero no se limita a, reguladores del pH, tensioactivos, adyuvantes y potenciadores de la fuerza iónica. Por ejemplo, los reguladores del pH incluyen, pero no se limitan a, tampón fosfato; los tensioactivos incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos catiónicos, aniónicos o no iónicos, tales como Tween-80; los potenciadores de la fuerza iónica incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio.
Tal como se usa en el presente documento, el término “adyuvante” se refiere a un potenciador inmunitario no específico, que puede potenciar la respuesta inmunitaria de un organismo a los antígenos o cambiar el tipo de respuesta inmunitaria cuando se administra en el organismo junto con los antígenos o se administra en el organismo por adelantado. Existen diversos adyuvantes, incluyendo, pero sin limitarse a, adyuvante de aluminio (tal como hidróxido de aluminio), adyuvante de Freund (tal como adyuvante de Freund completo y adyuvante de Freund incompleto),Corynebacterium parvum,lipopolisacárido, citocina, etc. El adyuvante de Freund es el adyuvante más usado en experimentación animal. El adyuvante de hidróxido de aluminio se usa más en los ensayos clínicos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad suficiente para obtener o al menos parcialmente obtener el efecto deseado. Por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz (por ejemplo, para una enfermedad asociada con la unión de PD-1 a PD-L1 o la sobreexpresión de VEGF, tal como un tumor) es una cantidad suficiente para prevenir, detener o retrasar la aparición de la enfermedad (por ejemplo, una enfermedad asociada con la unión de PD-L1 a PD-L1 o la sobreexpresión de VEGF, tal como un tumor); una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para curar o detener al menos parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que padece la enfermedad. Sin duda, está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica determinar una cantidad eficaz de este tipo. Por ejemplo, la cantidad eficaz para uso terapéutico dependerá de la gravedad de la enfermedad que va a tratarse, el estado general del sistema inmunitario del paciente, el estado general del paciente tal como la edad, el peso y el sexo, el modo de administración del fármaco y otros tratamientos administrados simultáneamente, etc.
Ventajas de la presente invención:
El anticuerpo biespecífico VP101 puede unirse específicamente a VEGFA, bloquear eficazmente la unión de VEGFA a VEGFR2, y aliviar específicamente la inmunosupresión de VEGFA en un organismo y el efecto promotor de VEGFA sobre la angiogénesis; VP101 puede unirse específicamente a PD-1, bloquear eficazmente la unión de PD-1 a PD-L1, y aliviar específicamente la inmunosupresión de PD-1 en un organismo, y activar la respuesta inmunitaria.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra los resultados de detección en SDS-PAGE del anticuerpo bifuncional VP101. Las muestras de los cuatro carriles de izquierda a derecha y sus respectivas cantidades de carga son: anticuerpo en tampón de carga de electroforesis de proteínas no reducida, 1 |ig; anticuerpo en tampón de carga de electroforesis de proteínas reducida, 1 |ig; marcador, 5 |il; BSA, 1 |ig.
La figura 2 muestra los resultados de detección de los parámetros cinéticos característicos de la unión del anticuerpo VP101 a PD-1.
La figura 3 muestra los resultados de detección de los parámetros cinéticos característicos de la unión del anticuerpo BsAbB7 a PD-1.
La figura 4 muestra los resultados de detección de los parámetros cinéticos característicos de la unión del anticuerpo BsAbB8 a PD-1.
La figura 5 muestra los resultados de detección de los parámetros cinéticos característicos de la unión del anticuerpo 14C12H1L1 a PD-1.
La figura 6 muestra los resultados de detección de los parámetros cinéticos característicos de la unión del anticuerpo nivolumab a PD-1.
La figura 7 muestra los resultados de detección de los parámetros cinéticos característicos de la unión del anticuerpo VP101 a VEGF.
La figura 8 muestra los resultados de detección de los parámetros cinéticos característicos de la unión del anticuerpo BsAbB7 a VEGF.
La figura 9 muestra los resultados de detección de los parámetros cinéticos característicos de la unión del anticuerpo BsAbB8 a VEGF.
La figura 10 muestra los resultados de detección de los parámetros cinéticos característicos de la unión del anticuerpo bevacizumab a VEGF.
La figura 11 muestra la actividad de unión del anticuerpo VP101 a VEGFA detectada mediante ELISA indirecto. La figura 12 muestra las respectivas actividades de unión de los anticuerpos VP101, BsAbB7, BsAbB8 y bevacizumab a VEGFA-his detectadas mediante ELISA indirecto.
La figura 13 muestra la actividad de unión del anticuerpo VP101 a PD-1 detectada mediante ELISA indirecto. La figura 14 muestra las respectivas actividades de unión de los anticuerpos VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 y nivolumab a PD-1 detectadas mediante ELISA indirecto.
La figura 15 muestra la actividad del anticuerpo VP101 al competir con VEGFR2 por la unión a VEGFA detectada mediante ELISA competitivo.
La figura 16 muestra la actividad del anticuerpo VP101 al competir con PD-L1 por la unión a PD-1 detectada mediante ELISA competitivo.
La figura 17 muestra la CE<50>de unión de los anticuerpos 14C12H1L1 y VP101 a la proteína PD-1 de la superficie de células 293T-PD-1 detectada mediante FACS.
La figura 18 muestra la CE<50>de unión de los anticuerpos VP101, BsAbB7 y BsAbB8 a la proteína PD-1 de la superficie de células 293T-PD-1 detectada mediante FACS.
La figura 19 muestra la actividad de los anticuerpos VP101 y 14C12H1L1 al competir con PD-L1 por la unión a la proteína PD-1 de la superficie de células 293T-PD-1 detectada mediante FACS.
La figura 20 muestra la actividad de los anticuerpos 14C12H1L1, VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L y nivolumab al competir con PD-L1 por la unión a la proteína PD-1 de la superficie de células 293T-PD-1 detectada mediante FACS.
La figura 21 muestra la bioactividad de neutralización de los anticuerpos VP101, BsAbB7 y BsAbB8 al bloquear el VEGF para activar la ruta de señalización NFAT.
La figura 22 muestra el efecto de bevacizumab y VP101 sobre la proliferación de células HUVEC.
La figura 23 muestra el efecto de VP101 sobre la secreción de IFN-y en un sistema de cultivo mixto de células DC y PBMC.
La figura 24 muestra el efecto de VP101, BsAbB7 y BsAbB8 sobre la secreción de IFN-y en un sistema de cultivo mixto de células DC y PBMC.
La figura 25 muestra el efecto de VP101, BsAbB7 y BsAbB8 sobre la secreción de IL-2 en un sistema de cultivo mixto de células DC y PBMC.
La figura 26 muestra el efecto de los anticuerpos 14C12H1L1 y VP101 sobre la secreción de la citocina IL-2 inducida por cultivo mixto de células PBMC y Raji-PD-L1 detectado mediante ELISA.
La figura 27 muestra el efecto de los anticuerpos 14C12H1L1 y VP101 sobre la secreción de la citocina IFN-y inducida por cultivo mixto de células PBMC y Raji-PD-L1 detectado mediante ELISA.
La figura 28 muestra el efecto de los anticuerpos 14C12H1L1, VP101, BsAbB7 y BsAbB8 sobre la secreción de la citocina IFN-y inducida por cultivo mixto de células PBMC y Raji-PD-L1 detectado mediante ELISA.
La figura 29 muestra el efecto de los anticuerpos 14C12H1L1, VP101, BsAbB7 y BsAbB8 sobre la secreción de la citocina IL-2 inducida por cultivo mixto de células PBMC y Raji-PD-L1 detectado mediante ELISA.
La figura 30 muestra la inhibición del crecimiento tumoral por VP101 a diferentes concentraciones.
La figura 31 muestra el efecto de VP101 a diferentes concentraciones sobre el peso corporal del ratón.
Descripción detallada
Las realizaciones de la presente invención se describirán con detalle a continuación con referencia a los ejemplos. Los expertos en la técnica comprenderán que los siguientes ejemplos sólo se usan para ilustrar la presente invención, y no deben considerarse limitativos del alcance de la misma. Los casos sin las descripciones específicas de técnicas o condiciones se llevaron a cabo según las tecnologías o condiciones descritas en la bibliografía de la técnica (por ejemplo, véase, Guide to Molecular Cloning Experiments, autoría de J. Sambrooket al.,y traducido por Huang Peitanget al.,tercera edición, Science Press) o según el manual del producto. Los reactivos o instrumentos usados son todos productos convencionales disponibles comercialmente, si no se especifica el fabricante de los mismos.
En los siguientes ejemplos de la presente invención, el anticuerpo comercializado bevacizumab (nombre comercial Avastin®) para la misma diana se adquirió de Roche como anticuerpo de control, o se preparó según el ejemplo de preparación 4.
En los siguientes ejemplos de la presente invención, el anticuerpo comercializado nivolumab para la misma diana (nombre comercial Opdivo®) se adquirió de BMS como anticuerpo de control.
En los siguientes ejemplos de la presente invención, las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos de control BsAbB7 y BsAbB8 eran idénticas a las secuencias de aminoácidos de BsAbB7 y BsAbB8 respectivamente en la publicación de patente china CN105175545A.
Ejemplo de preparación 1: preparación de proteínas de fusión PD-1-mFc, PD-1-hFc y PD-L1-hFc
La preparación de las proteínas de fusión PD-1-mFc, PD-1-hFc y PD-L1-hFc y la detección por electroforesis en SDS-PAGE se llevan a cabo haciendo referencia completa al ejemplo de preparación 1 de la publicación de patente china CN106632674A.
Las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos codificantes de las proteínas de fusión PD-1mFc, PD-1-hFc y PD-L1-hFc en este ejemplo de preparación son las mismas que las de PD-1-mFc, PD-1-hFc y PDL-1-hFc respectivamente en el ejemplo de preparación 1 de la publicación de patente china CN106632674A. Se obtuvieron así las proteínas de fusión PD-1-mFc, PD-1-hFc y PD-L1-hFc.
Ejemplo de preparación 2: expresión y purificación de la proteína de fusión VEGFA-His
1. Construcción del plásmido VEGFA-His
La amplificación por PCR se realizó usando ADNc humano de VEGFA (adquirido de Origene) como molde y el fragmento de hVEGFA-His se purificó y aisló usando un kit de purificación de productos de ADN normal. El fragmento de hVEGFA-His aislado y un vector de expresión pcDNA3.1 se digirieron enzimáticamente con XbaI y HindIII-HF, y se aisló un fragmento del gen diana mediante extracción en gel y se ligó con un vector de expresión lineal mediante ligasa T4. Luego, todos los productos de ligamiento se transformaron en células DH5a químicamente competentes y se recubrieron sobre una placa de agar con Amp. Se seleccionaron colonias individuales bien separadas para la identificación de colonias por PCR, los clones positivos por PCR se inocularon en un medio de cultivo LB para su cultivo y se tomó una disolución de bacterias y se envió a Guangzhou Invitrogen Biotechnology para la verificación de la secuencia. La alineación de los resultados de la secuenciación mostró que la secuencia de inserción del reconocimiento positivo era completamente correcta. 2. Expresión y purificación de la proteína de fusión VEGFA-His
Después de transfectar el plásmido recombinante VEGFA-his en células 293F (adquiridas de Invitrogen) durante 7 días según el manual del kit de transfección de Lipofectamine (adquirido de Invitrogen), el medio de cultivo se sometió a centrifugación a alta velocidad, concentración de sobrenadante e intercambio de tampón en el tampón de unión A, y luego se cargó en una columna HisTrap, y las proteínas se eluyeron linealmente con el tampón de elución A. La muestra pura primaria se sometió a un intercambio de tampón en el tampón de unión B con una columna de desalinización HiTrap y se cargó en una columna HiTrap Q, las proteínas se eluyeron linealmente con tampón de elución B, se aisló la muestra diana y se intercambió el tampón por PBS. La muestra purificada se añadió a un tampón de carga de electroforesis de proteínas reducida para la detección por electroforesis en SDS-PAGE.
Se obtuvo así la proteína de fusión VEGFA-His.
La secuencia de aminoácidos de VEGFA-His es la siguiente (171 aa):
APMAEGGGQNHHE VVKFMD V Y QRS YCHPIETL VDIF QEYPDEIE YIFKP S C VPLMRC GG CCNDEGLECVPTEESNITMOIMRIKPHOGOHIGEMSFLOHNKCECRPKKDRAROENPCGP C SERRKHLF VQDPQTCKC SCKNTD SRCKARQLELNERTCRCDKPRRHHHHHH ( SEQ ID
NO: 1)
en la que la parte subrayada es la secuencia de aminoácidos de VEGFA.
Secuencia de nucleótidos que codifica para VEGFA-His (513 pb)
GCACCCATGGCCGAGGGCGGCGGCCAGAACCACCACGAGGTGGTGAAGTTCATGGA CGTGTACCAGAGAAGCTACTGCCACCCCATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGA GTACCCCGACGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCCAGCTGCGTGCCCCTGATGAGATG CGGCGGCTGCTGCAACGACGAGGGCCTGGAGTGCGTGCCCACCGAGGAGAGCAACA TCACCATGCAGATCATGAGAATCAAGCCCCACCAGGGCCAGCACATCGGCGAGATG AGCTTCCTGCAGCACAACAAGTGCGAGTGCAGACCCAAGAAGGACAGAGCCAGACA GGAGAACCCCTGCGGCCCCTGCAGCGAGAGAAGAAAGCACCTGTTCGTGCAGGACC CCCAGACCTGCAAGTGCAGCTGCAAGAACACCGACAGCAGATGCAAGGCCAGACAG CTGGAGCTGAACGAGAGAACCTGCAGATGCGACAAGCCCAGAAGACATCATCACCA TCACCAC ( SEQ ID NO: 2)
Ejemplo de preparación 3: expresión y purificación de la proteína de fusión VEGFR2-hFc
1. Síntesis del gen VEGFR2-hFc:
Los aminoácidos correspondientes al fragmento extracelular VEGFR2 ECD del gen VEGFR2 (receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular, GenBank de NCBI: NP_002244) se fusionaron con TEV y el fragmento proteico Fc de IgG humana (hFc) respectivamente (SEQ ID NO: 3). A Genscript se le encomendó la síntesis de la secuencia de nucleótidos codificante correspondiente (SEQ ID NO: 4).
VEGFR2, receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular, GenBank de NCBI NP_002244; hFc: región C de cadena gamma-1 de Ig, registro: P01857, 106-330; secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión VEGFR2-hFc: (998 aa)
en la que la parte subrayada con línea ondulada es la parte ECD de VEGFR2, la parte enmarcada es el sitio de digestión de enzima TEV y la parte subrayada con línea continua es la parte hFc.
Secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión VEGFR2-hFc: (2997 pb) ATGCAGAGCAAGGTGCTGCTGGCCGTCGCCCTGTGGCTCTGCGTGGAGACCCGGGCC GCCTCTGTGGGTTTGCCTAGTGTTTCTCTTGATCTGCCCAGGCTCAGCATACAAAAAG ACATACTTACAATTAAGGCTAATACAACTCTTCAAATTACTTGCAGGGGACAGAGGG ACTTGGACTGGCTTTGGCCCAATAATCAGAGTGGCAGTGAGCAAAGGGTGGAGGTG ACTGAGIGCAGCGATGGCCTCTTCTGTAAGACACTCACAATTCCAAAAGIGATCGGA AATGACACTGGAGCCTACAAGTGCTTCTACCGGGAAACTGACTTGGCCTCGGTCATT TATGTCTATGTTCAAGATTACAGATCTCCATTTATTGCTTCTGTTAGTGACCAACATG GAGTCGTGTACATTACTGAGAACAAAAACAAAACTGTGGTGATTCCATGTCTCGGGT CCATTTCAAATCTCAACGTGTCACTTTGTGCAAGATACCCAGAAAAGAGATTTGTTC CTGATGGTAACAGAATTTCCTGGGACAGCAAGAAGGGCTTTACTATTCCCAGCTACA TGATCAGCTATGCTGGCATGGTCTTCTGTGAAGCAAAAATTAATGATGAAAGTTACC AGTCTATTATGTACATAGTTGTCGTTGTAGGGTATAGGATTTATGATGTGGTTCTGAG TCCGTCTCATGGAATTGAACTATCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGC AAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCA TCAGCAT A AGA AACTTGT A A ACCGAGACCT A AA A ACCCAGTCTGGGAGTGAGATGA AGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGT ACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGG GTCCATGAAAAACCTTTTGTTGCTTTTGGAAGTGGCATGGAATCTCTGGTGGAAGCC ACGGTGGGGGAGCGTGTCAGAATCCCTGCGAAGTACCTTGGTTACCCACCCCCAGAA AT AAAAT GGT AT A AAAAT GGAAT AC CCCTT GAGT C C AAT C AC AC AATT AAAGCGGG GCATGTACTGACGATTATGGAAGTGAGTGAAAGAGACACAGGAAATTACACTGTCA TCCTTACCAATCCCATTTCAAAGGAGAAGCAGAGCCATGTGGTCTCTCTGGTTGTGT ATGTCCCACCCCAGATTGGTGAGAAATCTCTAATCTCTCCTGTGGATTCCTACCAGTA CGGCACCACTCAAACGCTGACATGTACGGTCTATGCCATTCCTCCCCCGCATCACAT CCACTGGTATTGGCAGTTGGAGGAAGAGTGCGCCAACGAGCCCAGCCAAGCTGTCTC AGTGACAAACCCATACCCTTGTGAAGAATGGAGAAGTGTGGAGGACTTCCAGGGAG GAAATAAAATTGAAGTTAATAAAAATCAATTTGCTCTAATTGAAGGAAAAAACAAA ACTGTAAGTACCCTTGTTATCCAAGCGGCAAATGTGTCAGCTTTGTACAAATGTGAA GCGGTCAACAAAGTCGGGAGAGGAGAGAGGGTGATCTCCTTCCACGTGACCAGGGG TCCTGAAATTACTTTGCAACCTGACATGCAGCCCACTGAGCAGGAGAGCGTGTCTTT GTGGTGCACTGCAGACAGATCTACGTTTGAGAACCTCACATGGTACAAGCTTGGCCC ACAGCCTCTGCCAATCCATGTGGGAGAGTTGCCCACACCTGTTTGCAAGAACTTGGA T ACTCTTT GGAAATT GAAT GCC ACCAT GTT CTCT AATAGC AC AAATGAC ATTTTGAT C ATGGAGCTTAAGAATGCATCCTTGCAGGACCAAGGAGACTATGTCTGCCTTGCTCAA GACAGGAAGACCAAGAAAAGACATTGCGTGGTCAGGCAGCTCACAGTCCTAGAGCG TGTGGCACCCACGATCACAGGAAACCTGGAGAATCAGACGACAAGTATTGGGGAAA GCATCGAAGTCTCATGCACGGCATCTGGGAATCCCCCTCCACAGATCATGTGGTTTA AAGATAATGAGACCCTTGTAGAAGACTCAGGCATTGTATTGAAGGATGGGAACCGG AACCTCACTATCCGCAGAGTGAGGAAGGAGGACGAAGGCCTCTACACCTGCCAGGC ATGCAGTGTTCTTGGCTGTGCAAAAGTGGAGGCATTTTTCATAATAGAAGGTGCCCA GGAAAAGACGAACTT GGAATCT AGAjGAAAACCTGTATTTTC AGGGClACTC AC AC AT GCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGG AGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCT GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGA GCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGA (S E Q ID N O :4 )
en la que la parte subrayada con línea ondulada es la parte ECD de VEGFR2, la parte enmarcada es el sitio de digestión de enzima TEV y la parte subrayada con línea continua es la parte hFc.
2. Construcción del plásmido pUC57simple-VEGFR2-hFc:
El gen que codifica para VEGFR2-hFc sintetizado por Genscript se clonó en un vector de expresión pUC57simple (proporcionado por Genscript), y se obtuvo un plásmido pUC57simple-VEGFR2-hFc.
3. Construcción del plásmido recombinante pcDNA3.1-VEGFR2-hFc:
El plásmido pUC57simple-VEGFR2-hFc se digirió con enzimas (Xba I y BamH I), y el fragmento del gen de fusión VEGFR2-hFc aislado mediante electroforesis se ligó con el vector de expresión pcDNA3.1 (adquirido de Invitrogen) para dar pcDNA3.1-VEGFR2-hFc, que se transfectó en célula DH5a deE. colicompetente (adquirida de TIANGEN); la transfección y el cultivo se realizaron según el manual. Se examinaron para seleccionar las colonias positivas de pcDNA3.1-VEGFR2-hFc,E. colise amplificó según un método convencional, y luego se usó un kit (adquirido de Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd., DP103-03) y se extrajo un plásmido recombinante pcDNA3.1-VEGFR2-hFc según el manual del kit.
4. Transfección del plásmido recombinante pcDNA3.1-VEGFR2-hFc en células 293F
El plásmido recombinante pcDNA3.1-VEGFR2-hFc se transfectó en células 293F (adquiridas de Invitrogen) según el kit de transfección de Lipofectamine (adquirido de Invitrogen).
5. Detección por electroforesis en SDS-PAGE de la proteína VEGFR2-hFc
Después de transfectar el plásmido recombinante pcDNA3.1-VEGFR2-hFc en células 293F durante 7 días, el medio de cultivo se sometió a centrifugación a alta velocidad, filtración a vacío con membrana microporosa y purificación en una columna Mabselect SuRe para obtener una muestra de proteína de fusión VEGFR2-hFc, y una parte de la muestra se añadió a un tampón de carga de electroforesis de proteínas reducida para la detección por electroforesis en SDS-PAGE.
Se obtuvo así la proteína de fusión VEGFR2-hFc.
Ejemplo de preparación 4: preparación del anticuerpo anti-VEGFA bevacizumab
Para las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal contra VEGFA Avastin (bevacizumab) comercializado, se hace referencia a la publicación de patente china CN1259962A. A Genscript se le encomendó la síntesis de secuencias de nucleótidos que codifican para la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera.
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de bevacizumab: (123 aa) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGE PT Y A ADFKRRF TF SLDT SK S T A YLQM N SLRAEDT A V Y Y C A K YPH Y Y GS SHW YFD VWG QGTLVTVSS ( SEQ ID NO: 5)
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de cadena pesada de bevacizumab: (369 pb) GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCCGGGGGGGGGCTGGTGCAGCCAGGCGGGTCTCTGAG GCTGAGTTGCGCCGCTTCAGGGTACACCTTCACAAACTATGGAATGAATTGGGTGCG CCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGGCTGGATCAACACTTACACCGGGG AACCTACCTATGCAGCCGACTTTAAGCGGCGGTTCACCTTCAGCCTGGATACAAGCA AATCCACTGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGAGCTGAGGACACCGCAGTCTACT ATTGTGCTAAATATCCCCACTACTATGGGAGCAGCCATTGGTATTTTGACGTGTGGG GGCAGGGGACTCTGGTGACAGTGAGCAGC ( SEQ ID NO: 6)
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de bevacizumab: (107 aa)
DIQMT QSPSSLSASY GDRVTIT C S AS QDISNYLNW Y QQKPGK APK VLIYF T S SLHS GVP SR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKYEIK (SEQ ID NO: 7)
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de cadena ligera de bevacizumab: (321 pb) GATATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTC ACCATCACATGCAGTGCTTCACAGGATATTTCCAACTACCTGAATTGGTATCAGCAG AAGCCAGGAAAAGCACCCAAGGTGCTGATCTACTTCACTAGCTCCCTGCACTCAGGA GTGCCAAGCCGGTTCAGCGGATCCGGATCTGGAACCGACTTTACTCTGACCATTTCT AGTCTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATACTATTGCCAGCAGTATTCTACCGTGCCAT GGACATTTGGCCAGGGGACTAAAGTCGAGATCAAG (SEQ ID NO: 8)
Las regiones constantes de cadena pesada eran todas la región C de cadena gamma-1 de Ig, registro: P01857; las regiones constantes de cadena ligera eran todas la región C de cadena kappa de Ig, registro: P01834.
El ADNc de cadena pesada y el ADNc de cadena ligera de bevacizumab se clonaron en el vector pcDNA3.1 y se obtuvo el plásmido de expresión recombinante del anticuerpo bevacizumab. El plásmido recombinante se transfectó en células 293F. Se purificó y luego se detectó el medio de cultivo de células 293F.
Se obtuvo así el anticuerpo monoclonal anti-VEGFA Avastin (bevacizumab).
Ejemplo de preparación 5: preparación y detección del anticuerpo humanizado anti-PD-1 14C12H1L1La preparación se llevó a cabo según los ejemplos 3-4 descritos en la publicación de patente china CN106977602A.
Las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado 14C12H1L1, y la secuencia de nucleótidos que codifica para las mismas también son las mismas que las descritas en los ejemplos 3-4 de la publicación de patente china CN106977602A, y también se proporcionan en el presente documento tal como sigue:
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado 14C12H1L1: (118 aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYT YYPD S VKGRFTISRDN SKNNLYLQMN SLRAEDTAL Y Y C ANRY GEAWF AYW GQGTL VT VSS (SEQ ID NO: 9)
Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado 14C12H1L1: (354 pb)
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCG ACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCG ACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGAT ACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTA AGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACT ATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGT GACAGTCTCTAGT (SEQ ID NO: 10)
Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado 14C12H1L1: (107 aa)
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPS RF S GS GS GQD YTLTIS SLQPEDM AT Y Y CLQ YDEFPLTF GAGTKLELK (SEQ ID NO: 11) Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado 14C12H1L1: (321 pb) GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTC ACCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAG AAGCCAGGGAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGG AGTCCCAAGTCGGTTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAG CTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCC ACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAGCTGAAG (SEQ ID NO: 12)
Se obtuvo así el anticuerpo humanizado anti-PD-1 14C12H1L1.
Ejemplo de preparación 6: preparación e identificación de hIgG
La secuencia de IgG contra lisozima de huevo de gallina humana (anti-HEL, es decir, la IgG humana, abreviada como hIgG) se deriva de una secuencia de región variable de la secuencia Fab F10.6.6 en la investigación publicada por Aciernoet al.,que se titula “Affinity maturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodiies” (Aciernoet al.,J Mol Biol. 2007; 374(1): 130-46). El método de preparación es tal como sigue:
Se encomendó a Nanjing Genscript Biology llevar a cabo la optimización de codones de aminoácidos y la síntesis de genes en genes de cadenas pesada y ligera (secuencia completa o región variable) del anticuerpo IgG humana, y haciendo referencia a las tecnologías convencionales introducidas en “Guide to Molecular Cloning Experiments (tercera edición)” y usando tecnologías de clonación molecular convencionales tales como PCR, digestión enzimática, extracción en gel de ADN, transformación por ligamiento, PCR de colonias o identificación por digestión enzimática, se subclonaron los genes de cadenas pesada y ligera respectivamente en el vector de expresión de cadena pesada del anticuerpo y el vector de expresión de cadena ligera del anticuerpo del sistema de expresión de mamíferos y se secuenciaron y se analizaron adicionalmente los genes de cadenas pesada y ligera del vector de expresión recombinante. Después de verificar que la secuencia era correcta, se prepararon plásmidos de expresión libres de endotoxinas a gran escala, y los plásmidos de cadenas pesada y ligera se cotransfectaron transitoriamente en células HEK293 para la expresión de anticuerpos recombinantes. Después de 7 días de cultivo, se recogió el medio de cultivo celular y se purificó por afinidad usando una columna rProtein A (GE), y se determinó la calidad de la muestra de anticuerpo resultante usando técnicas de análisis convencionales de SDS-PAGE y SEC-HPLC.
Se obtuvo así la hIgG y se usó en los ejemplos 8-9 siguientes.
Ejemplo 1: diseño de secuencia, preparación y detección de cadenas pesada y ligera del anticuerpo bifuncional VP101
1. Diseño de secuencia
La estructura del anticuerpo bifuncional VP101 de la presente invención está en la forma Morrison (IgG-scFv), es decir, los extremos C-terminales de dos cadenas pesadas de un anticuerpo IgG están ligados cada uno a un fragmento scFv de otro anticuerpo, y el diseño de composición principal de las cadenas pesada y ligera es tal como se muestra en la tabla 1 a continuación.
Tabla 1: diseño de composición de las cadenas pesada y ligera de VP101
En la tabla 1 anterior:
(1) Aquellos con una “V” marcada en la esquina inferior derecha se refieren a la región variable de cadena pesada correspondiente o a la región variable de cadena ligera correspondiente. Para aquellos sin marca “V”, la cadena pesada o ligera correspondiente es la longitud completa que comprende la región constante. Para las secuencias de aminoácidos de estas regiones variables o la longitud completa y las secuencias de nucleótidos que las codifican, se hace referencia a las secuencias correspondientes descritas en los ejemplos de preparación anteriores se refieren.
(2) La secuencia de aminoácidos del ligador 1 es GGGGSGGGGSGG GGSGGGGS (SEQ ID NO: 13).
2. Expresión y purificación del anticuerpo VP101
La secuencia de ADNc de la cadena pesada y la secuencia de ADNc de la cadena ligera de VP101 se clonaron cada una en el vector pUC57simple (proporcionado por Genscript) para obtener los plásmidos pUC57simple-VP101H y pUC57simple-VP101L, respectivamente.
Los plásmidos pUC57simple-VP101H y pUC57simple-VP101L se digirieron con enzimas (HindIII y EcoRI), y las cadenas pesada y ligera aisladas mediante electroforesis se subclonaron en el vector pcDNA3.1 y los plásmidos recombinantes se extrajeron para cotransfectar células 293F. Después de 7 días de cultivo celular, el medio de cultivo se centrifugó a alta velocidad y el sobrenadante se concentró y se cargó en una columna HiTrap MabSelect SuRe. La proteína se eluyó adicionalmente en una etapa con tampón de elución, y se aisló el anticuerpo de muestra diana VP101 y se intercambió el tampón por PBS.
2. Detección del anticuerpo VP101
La muestra purificada se añadió tanto a un tampón de carga de electroforesis de proteínas reducida como a un tampón de carga de electroforesis de proteínas no reducida, y luego se hirvió para la detección por electroforesis en SDS-PAGE. El electroferograma de VP101 se muestra en la figura 1. La proteína diana de la muestra de proteína reducida está en 75 kD y 25 kD, y la proteína diana de la muestra de proteína no reducida (anticuerpo único) está en 200 kD.
A menos que se especifique lo contrario, el anticuerpo humanizado VP101 usado en los siguientes experimentos se preparó mediante el método de este ejemplo.
Ejemplo 2: detección de parámetros cinéticos del anticuerpo humanizado VP101
1. Detección de parámetros cinéticos de la unión del anticuerpo humanizado VP101 a PD-1-mFc
El tampón de dilución de la muestra fue PBS (Tween-20 al 0,02 %, BSA al 0,1 %, pH 7,4). Se inmovilizaron 5 |ig/ml de anticuerpo en un sensor AHC siendo la altura de inmovilización de aproximadamente 0,4 nM. Se equilibró el sensor en un tampón durante 60 s, y se unió el anticuerpo inmovilizado en el sensor a PD-1-mFc a una concentración de 0,62-50 nM (dilución en gradiente tres veces) durante 120 s, y luego se disociaron el antígeno y el anticuerpo en el tampón durante 300 s. Los datos se analizaron mediante ajuste de modelo 1:1 para obtener constantes de afinidad. El software de adquisición de datos fue Fortebio Data Acquisition 7.0 y el software de análisis de datos fue Fortebio Data Analysis 7.0. Los parámetros cinéticos de la unión de los anticuerpos VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 y el anticuerpo de control nivolumab a PD-1-mFc se muestran en la tabla 2, y los resultados de la detección de los parámetros cinéticos característicos se muestran en la figura 2, figura 3, figura 4, figura 5 y figura 6, respectivamente.
Tabla 2: parámetros cinéticos de la unión del anticuerpo humanizado VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 y el anticuerpo de control nivolumab a PD-1-mFc
K<d>es la constante de afinidad; kon es la tasa de unión de antígeno y anticuerpo; kdis es la tasa de disociación de antígeno y anticuerpo; K<d>= kdis/kon.
Los resultados muestran que los anticuerpos VP101 y BsAbB7 son equivalentes en cuanto a afinidad por PD-1-mFc; la constante de afinidad de VP101 por PD-1-mFc es significativamente menor que la de BsAbB8, lo que sugiere que VP101 tiene una mejor actividad de unión; la constante de tasa de disociación para VP101 y PD-1-mFc fue significativamente menor que la de BsAbB8 y 14C12H1L1, lo que sugiere que VP101 se une al antígeno de manera más estable con una tasa de disociación más lenta que la de 14C12H1L1 y BsAbB8.
2. Detección de parámetros cinéticos de la unión del anticuerpo humanizado VP101 a VEGF-His
El tampón de dilución de la muestra fue PBS (Tween-20 al 0,02 %, BSA al 0,1 %, pH 7,4). Se inmovilizó 1 |ig/ml de VEGF-His en el sensor HIS1K durante 20 s, luego se equilibró el sensor en un tampón durante 60 s y se unió el VEGF inmovilizado en el sensor al anticuerpo a una concentración de 12,34-1000 nM (dilución en gradiente tres veces) durante 120 s, y luego se disociaron el antígeno y el anticuerpo en el tampón durante 300 s. Los datos se analizaron mediante ajuste de modelo 1:1 para obtener constantes de afinidad. El software de adquisición de datos fue Fortebio Data Acquisition 7.0 y el software de análisis de datos fue Fortebio Data Analysis 7.0.
Los parámetros cinéticos de la unión de los anticuerpos VP101, BsAbB7, BsAbB8 y el anticuerpo de control bevacizumab a VEGF-His se muestran en la tabla 3, y los resultados de la detección de los parámetros cinéticos característicos se muestran en la figura 7, figura 8, figura 9 y figura 10, respectivamente.
Tabla 3: parámetros cinéticos de la unión de los anticuerpos VP101, BsAbB7, BsAbB8 y el anticuerpo de control bevacizumab a VEGF-His
Los resultados muestran que los anticuerpos VP101 y BsAbB7 son equivalentes en cuanto a afinidad por el antígeno, y la constante de afinidad de VP101 es significativamente menor que la de BsAbB8 y el anticuerpo de control bevacizumab, lo que sugiere que VP101 tiene una mejor actividad de unión; la constante de tasa de disociación de VP101 para VEGF-His es significativamente menor que la de BsAbB8, lo que sugiere que VP101 se une al antígeno de manera más estable con una tasa de disociación más lenta que la de BsAbB8.
Ejemplo 3: detección de la actividad de unión del anticuerpo VP101 al antígeno mediante ELISA
1. Detección de la actividad de unión del anticuerpo VP101 al antígeno VEGFA-his mediante ELISA indirecto El método se especifica tal como sigue:
Se recubrió la microplaca con VEGFA-His y se incubó a 37 °C durante 2 horas. Después de lavarla, la microplaca se bloqueó con BSA al 1 % durante 2 horas. Después de lavarla, a la microplaca se le añadió el anticuerpo diluido en gradiente y se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Después de lavarla, a la microplaca se le añadió la disolución de trabajo de anticuerpo secundario de cabra anti-IgG humana marcado con enzima y se incubó durante 30 minutos a 37 °C. Después de lavarla, a la microplaca se le añadió disolución cromogénica TMB para desarrollar el color durante 5 minutos en ausencia de luz, y luego se añadió disolución de parada para terminar la reacción cromogénica. Luego, la microplaca se colocó inmediatamente en un lector de microplacas y se leyó el valor de DO de cada pocillo en la microplaca a 450 nm. Se usó SoftMax Pro 6.2.1 para analizar y procesar los datos.
El resultado de la detección de la unión del anticuerpo VP101 al antígeno VEGFA-His se muestra en la figura 11. Las intensidades de absorbancia en cada dosis se muestran en la tabla 4. La CE<50>de unión de anticuerpo se calculó ajustando la curva usando la concentración de anticuerpo como abscisa y el valor de absorbancia como ordenada, y los resultados se muestran en la tabla 4 a continuación.
Tabla 4: unión del anticuerpo bifuncional a VEGFA-his (ELISA indirecto)
Los resultados muestran que el anticuerpo VP101 puede unirse a la proteína VEGFA de manera eficiente y su eficiencia de unión depende de la dosis, y los dos anticuerpos son equivalentes en cuanto a actividad de unión al VEGFA humano.
2. Detección de las respectivas actividades de unión de los anticuerpos VP101, BsAbB7 y BsAbB8 al antígeno VEGFA-His mediante ELISA indirecto
El método se especifica tal como sigue:
Se recubrió la microplaca con VEGFA-His y se incubó durante la noche a 4 °C. Después de lavarla, la microplaca se bloqueó con BSA al 1 % (disuelta en PBS) durante 2 horas. Después de lavarla, a la microplaca se le añadió el anticuerpo diluido en gradiente y se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Después de lavarla, a la microplaca se le añadió la disolución de trabajo de Fc de cabra anti-IgG humana marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson, 109-035-098) y se incubó durante 30 minutos a 37 °C. Después de lavarla, a la microplaca se le añadió TMB (Neogen, 308177) para desarrollar el color durante 5 minutos en ausencia de luz, y luego se añadió una disolución de parada para terminar la reacción cromogénica. Luego, la microplaca se colocó inmediatamente en un lector de microplacas y se leyó el valor de DO de cada pocillo en la microplaca a 450 nm. Se usó SoftMax Pro 6.2.1 para analizar y procesar los datos.
El resultado de la unión del anticuerpo VP101 al antígeno VEGFA-His se muestra en la figura 12. Las intensidades de absorbancia en cada dosis se muestran en la tabla 5. La CE50 de unión de anticuerpo se calculó ajustando la curva usando la concentración de anticuerpo como abscisa y el valor de absorbancia como ordenada, y los resultados se muestran en la tabla 5 a continuación.
Tabla 5: actividades de unión respectivas de VP101, BsAbB7, BsAbB8 y bevacizumab a VEGFA-His (ELISA indirecto)
Los resultados muestran que todos los anticuerpos VP101, BsAbB7, BsAbB8 y bevacizumab pueden unirse a la proteína VEGF de manera eficiente y su eficiencia de unión depende de la dosis, y el anticuerpo VP101 tiene una mayor actividad de unión al VEGF humano que BsAbB7 y BsAbB8.
3. Detección de la actividad de unión del anticuerpo VP101 al antígeno PD-1 mediante ELISA indirecto
El método se especifica tal como sigue:
Se recubrió la microplaca con PD-1-mFc humano y se incubó durante la noche a 4 °C. Después de bloquearse con BSA al 1 % a 37 °C durante 2 horas, a la microplaca se le añadió anticuerpo y luego se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Después de lavar y secar la microplaca, se añadió el anticuerpo secundario de cabra anti-IgG humana (H+L) marcado con HRP (Jackson, 109-035-088) y la microplaca se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Después de lavar y secar la microplaca, se añadió TMB (Neogen, 308177) para desarrollar el color durante 5 minutos y luego se añadió una disolución de parada para detener el desarrollo del color. Luego, la microplaca se colocó inmediatamente en un lector de microplacas y se leyó el valor de DO de cada pocillo en la microplaca a 450 nm. Se usó SoftMax Pro 6.2.1 para analizar y procesar los datos.
El resultado de la detección de la unión del anticuerpo VP101 al antígeno PD-1 se muestra en la figura 13. Las intensidades de absorbancia en cada dosis se muestran en la tabla 6. Mediante análisis cuantitativo del anticuerpo VP101 unido, se realizó la simulación de la curva para obtener la eficiencia de unión CE<50>del anticuerpo, que se muestra en la tabla 6 a continuación.
Tabla 6: unión del anticuerpo bifuncional a PD-1 (ELISA indirecto)
Los resultados muestran que el anticuerpo VP101 es capaz de unirse a la proteína PD-1 de manera eficiente y su eficiencia de unión depende de la dosis.
4. Detección de las respectivas actividades de unión de los anticuerpos VP101, BsAbB7 y BsAbB8 al antígeno PD-1 mediante ELISA indirecto
El método se especifica tal como sigue:
Se recubrió la microplaca con PD-1-mFc humano y se incubó durante la noche a 4 °C. Después de bloquearse con BSA al 1 % a 37 °C durante 2 horas, a la microplaca se le añadió anticuerpo y luego se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Después de lavar y secar la microplaca, se añadió Fc de cabra anti-IgG humana marcado con peroxidasa de rábano picante (Jackson, 109-035-098) y la microplaca se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Después de lavar y secar la microplaca, se añadió TMB (Neogen, 308177) para desarrollar el color durante 5 minutos y luego se añadió una disolución de parada para detener el desarrollo del color. Luego, la microplaca se colocó inmediatamente en un lector de microplacas y se leyó el valor de DO de cada pocillo en la microplaca a 450 nm. Se usó SoftMax Pro 6.2.1 para analizar y procesar los datos.
El resultado de la detección de la unión del anticuerpo VP101 al antígeno PD-1 se muestra en la figura 14. Las intensidades de absorbancia en cada dosis se muestran en la tabla 7. Mediante análisis cuantitativo del anticuerpo VP101 unido, se realizó la simulación de la curva para dar la eficiencia de unión CE<50>del anticuerpo, que se muestra en la tabla 7 a continuación.
Tabla 7: actividades de unión respectivas de los anticuerpos VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 y nivolumab a PD-1 (ELISA indirecto)
Los resultados muestran que el anticuerpo VP101 puede unirse a la proteína PD-1 de manera eficiente y su eficiencia de unión depende de la dosis, y el anticuerpo VP101 tiene una mayor actividad de unión al PD-1 humano que BsAbB7 y BsAbB8.
5. Detección de la actividad del anticuerpo VP101 al competir con VEGFR2 por la unión al antígeno VEGFA mediante ELISA competitivo
El método es específicamente tal como sigue:
Se recubrió la microplaca con VEGF-His y se incubó a 37 °C durante 2 horas. Después de lavarla, la microplaca se bloqueó con BSA al 1 % durante 1 hora a 37 °C. Después de lavarla, a la microplaca se le añadieron los anticuerpos diluidos en gradiente y VEGFR2 ECD-mFc-bio humano (concentración final: 0,02 |ig/ml) y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavarla, a la microplaca se le añadió una disolución de trabajo de estreptavidina SA-HRP (1:4000) marcada con HRP y se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Después de lavarla, a la microplaca se le añadió disolución cromogénica TMB para desarrollar el color durante 5 minutos en ausencia de luz, y luego se añadió disolución de parada para terminar la reacción cromogénica. Luego, la microplaca se colocó inmediatamente en un lector de microplacas y se leyó el valor de DO de cada pocillo en la microplaca a 450 nm. Se usó SoftMax Pro 6.2.1 para analizar y procesar los datos.
Los resultados de la detección se muestran en la figura FIG 15. Las intensidades de absorbancia en cada dosis se muestran en la tabla 8. Mediante análisis cuantitativo de las intensidades de absorbancia de los anticuerpos unidos, se realizó la simulación de la curva para dar la eficiencia de unión CE<50>de los anticuerpos (tabla 8). Tabla 8: detección de anticuerpo al competir con VEGFR2-mFc por la unión al antígeno VEGFA-His mediante ELISA competitivo
Recubrimiento: VEGF-His (2 |ig/ml)
Los resultados muestran que el anticuerpo VP101 puede unirse eficazmente al antígeno VEGFA e inhibir la unión de VEGFR2 a VEGFA, y su eficacia para inhibir la unión de VEGFR2 a VEGFA depende de la dosis.
6. Detección del anticuerpo VP101 al competir con PD-L1 por la unión al antígeno PD-1 mediante ELISA competitivo
El método es específicamente tal como sigue:
Se recubrió la microplaca con PD-1-hFc y se incubó durante la noche a 4 °C. Después de bloquear la microplaca con BSA al 1 % durante 2 horas, se mezcló cada uno de los anticuerpos a diferentes concentraciones con PD-L1-hFc durante 10 minutos (véase la tabla 10 para conocer las concentraciones de dilución). Después de la incubación a 37 °C durante 30 minutos, la microplaca se lavó y se secó. Luego se añadió el anticuerpo secundario marcado con enzima y la microplaca se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Después de lavar y secar la microplaca, se añadió TMB para desarrollar el color durante 5 minutos y luego se añadió una disolución de parada para detener el desarrollo del color. Luego, la microplaca se colocó inmediatamente en un lector de microplacas y se leyó el valor de DO de cada pocillo en la microplaca a 450 nm (véase la tabla 10). Se usó SoftMax Pro 6.2.1 para analizar y procesar los datos.
Los resultados de la detección se muestran en la figura 16. Las intensidades de absorbancia en cada dosis se muestran en la tabla 9. Mediante análisis cuantitativo del anticuerpo VP101 unido, se realizó la simulación de la curva para dar la eficiencia de unión CE<50>del anticuerpo (tabla 9).
Tabla 9: detección de anticuerpo bifuncional que compite con PD-L1 por la unión a PD-1 mediante ELISA competitivo
Los resultados muestran que el anticuerpo VP101 puede unirse eficazmente al antígeno PD-1 e inhibir la unión del ligando PD-L1 a PD-1, y su eficacia para inhibir la unión de PD-L1 a PD-1 depende de la dosis.
Ejemplo 4: unión de anticuerpo VP101 al antígeno de superficie de la membrana celular
En primer lugar, se construyeron células 293T que expresaban el antígeno PD-1 y luego se analizó y verificó mediante citometría de flujo la capacidad de unión específica del anticuerpo al antígeno de superficie de la membrana celular.
1. Construcción de células 293T que expresan el antígeno PD-1
El vector pLenti6.3-PD-1 de PD-1 (el vector pLenti6.3 se adquirió de Invitrogen) se transfectó en células 293T, y se obtuvieron mediante examen células del grupo clon 293T-PD-1 que expresan establemente PD-1.
2. Detección de unión del anticuerpo al antígeno de superficie celular
El antígeno que expresa 293T-PD-1 obtenido en la etapa anterior se digirió con pancreatina mediante un método de digestión con pancreatina convencional, y se hizo que el número de células en cada tubo de recolección fuera de 2 x 105. Cada una de las disoluciones de dilución de anticuerpo con concentración diluida en gradiente con PBSA (BSA al 1 %) se incubó con células 293T-PD-1 en hielo durante 2 horas, y luego a cada tubo se le añadieron 100 |il de anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con FITC (1:500) y se incubó en hielo durante 1 hora. Luego se usó PBS para lavar y se usaron 300 |il de PBSA para resuspender las células y se detectaron señales de fluorescencia (MFI) con un canal de FITC en un citómetro de flujo.
Los resultados se muestran en la figura 17, y los valores de MFI a cada concentración se muestran en la tabla 10. Mediante análisis de cuantificación de fluorescencia y ajuste de la curva del anticuerpo 14C12H1L1 unido, se calculó que la EC<50>de unión del anticuerpo VP101 era de 3,5 nM.
Tabla 10: análisis de la intensidad de fluorescencia de la unión de VP101 al antígeno de superficie 293T-PD-1 detectada mediante FACS
Los resultados muestran que el anticuerpo VP101 puede unirse eficazmente al antígeno PD-1 en la superficie de la célula huésped 293T-PD-1, y su eficacia de unión depende de la dosis, y bevacizumab no tiene actividad de unión a 293T-PD-1, lo que indica que la unión de VP101 a 293T-PD-1 es específica.
3. La unión de los anticuerpos VP101, BsAbB7 y BsAbB8 al antígeno de superficie celular se detectó haciendo referencia al procedimiento experimental descrito en la etapa 2 de este ejemplo.
Los resultados se muestran en la figura 18, y los valores de MFI a cada concentración se muestran en la tabla 11. Mediante análisis de cuantificación de fluorescencia y ajuste de la curva del anticuerpo unido, se calculó que los valores de CE<50>de unión de nivolumab, 14C12H1L1, VP101, BsAbB7 y BsAbB8 eran de 7,853 nM, 3,607 nM, 7,896 nM, 9,943 nM y 10,610 nM, respectivamente.
Tabla 11: análisis de intensidades de fluorescencia de la unión de VP101, BsAbB7 y BsAbB8 al antígeno de superficie 293T-PD-1 detectadas mediante FACS
BsAbB8 4,41 16,77 36,86 89,89 210,40 457,91 804,43 863,35 10,610 Los resultados muestran que el anticuerpo VP101 puede unirse a PD-1 de superficie de la membrana de 293T-PD1 de manera dependiente de la dosis. Bevacizumab no tiene actividad de unión a 293T-PD-1, lo que indica que la unión de VP101 a 293T-PD-1 es específica.
Ejemplo 5: unión competitiva del anticuerpo VP101 al antígeno de superficie de la membrana celular1. Se adoptó un método competitivo de citometría de flujo para detectar la CE<50>del VP101 al competir con PD-L1 por la unión al antígeno PD-1 de superficie de la membrana celular, y el método se especifica tal como sigue: Las células 293T-PD-1 se digirieron de manera convencional y se dividieron en varias muestras con 300.000 células para cada una, que luego se sometieron a centrifugación y lavado. Luego, a cada tubo se le añadieron 100 |il del correspondiente anticuerpo diluido en gradiente y se incubó en hielo durante 30 minutos; luego se añadieron 100 |il de PD-L1-mFc a cada tubo y la mezcla se mezcló bien para alcanzar una concentración final de 20 nM y luego se incubó en hielo durante 1 hora. Luego se añadieron 500 |il de PBSA al 1 % y la mezcla se centrifugó a 5600 rpm durante 5 minutos para retirar el sobrenadante. Luego se añadieron a cada tubo 100 |il de anticuerpo de cabra anti-IgG ratón marcado con FITC diluido a una razón de 1:500 y la mezcla se incubó en hielo durante 40 minutos en ausencia de luz después de mezclarla bien. Luego la mezcla se centrifugó, se lavó y se resuspendió, y luego se transfirió a un tubo de carga para las pruebas.
Los resultados se muestran en la figura 19, y los valores de MFI a cada concentración se muestran en la tabla 12. Mediante análisis de cuantificación de fluorescencia y ajuste de la curva, se calculó que lo valores de CE<50>de unión de los anticuerpos VP101 y 14C12H1L1 eran de 8,33 nM y 4,37 nM, respectivamente.
Tabla 12: análisis de las intensidades de fluorescencia de 14C12H1L1 y VP101 al competir por la unión al antígeno de superficie 293T-PD-1 detectadas mediante FACS
Los resultados muestran que el anticuerpo VP101 puede bloquear eficazmente la unión de PDL-1 a PD-1 en la superficie de las células huésped 293T-PD-1 de manera dependiente de la dosis.
2. Los valores de CE<50>de VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 y nivolumab al competir con PD-L1 por la unión al antígeno PD-1 de superficie de la membrana celular se detectaron usando citometría de flujo competitiva y haciendo referencia al procedimiento experimental descrito en la etapa 1 de este ejemplo.
Los resultados se muestran en la figura 20, y los valores de MFI a cada concentración se muestran en la tabla 13. Mediante análisis de cuantificación de fluorescencia y ajuste de la curva, se calculó que los valores de CE<50>de unión competitiva de los anticuerpos VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 y nivolumab eran de 15,04 nM, 22,25 nM, 19,25. nM, 9,21 nM y 9,72 nM, respectivamente.
Tabla 13: análisis de las intensidades de fluorescencia de VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 y nivolumab al competir por la unión al antígeno de superficie 293T-PD-1 detectadas mediante FACS
Los resultados muestran que la actividad del anticuerpo 14C12H1L1 es equivalente a la del anticuerpo comercializado nivolumab que selecciona como diana PD-1, y es superior a la del anticuerpo bifuncional VP101. La actividad del anticuerpo VP101 es superior a la de BsAbB7 y BsAbB8.
Ejemplo 6: detección de la bioactividad de neutralización de los anticuerpos VP101, BsAbB7 y BsAbB8 albloquear VEGF para activar la ruta de señalización de NFAT
1. Construcción de células 293T-NFAT-(opv)KDR(C7)
El vector KDR (VEGFR2) pCDH-KDRFL(OPV)-GFP-Puro (el vector pCDH-GFP-Puro se adquiere de Youbio) y el vector NFAT pNFAT-luc-hygro (el vector pGL4-luc2P-hygro se adquiere de Promega) se transfectaron en células 293T y se obtuvieron mediante examen células del grupo clon 293T-NFAT-(opv) KDR(C7) que expresaban de manera estable los genes indicadores de luciferasa KDR y NFAT.
2. Se recogieron células 293T-NFAT-(opv)KDR(C7) y se centrifugaron durante 5 minutos para retirar el sobrenadante; se usó medio DMEM FBS al 10 % para resuspender las células, se contó el número de células y se detectó la viabilidad celular; luego se ajustó la concentración celular para que estuviera en un intervalo adecuado y se añadieron 50.000 células/50 |il de suspensión celular a cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos;
los anticuerpos correspondientes (siendo las concentraciones finales de 300, 100, 10, 2, 0,2, 0,02, 0,002 nM) y VEGF (siendo la concentración final de 30 ng/ml) se diluyeron según el diseño experimental, y los anticuerpos que seleccionaban como diana VEGF se preincubaron con VEGF durante 1 hora a temperatura ambiente antes de añadirlos a las células. Se diseñaron controles en blanco y de isotipo (siendo el volumen final de cada pocillo de 100 |il) y se incubaron en una incubadora de dióxido de carbono a 37 °C, el 5% de CO<2>durante 4 horas; se añadieron 50 |il de sistema de ensayo de luciferasa a cada pocillo y se detectaron unidades relativas de fluorescencia (URL) mediante un probador de microplacas de múltiples marcadores en el plazo de 5 minutos. Los resultados experimentales se muestran en la figura 21, y los valores de CE<50>para cada anticuerpo se muestran en la tabla 14.
Tabla 14: detección de la bioactividad de neutralización de los anticuerpos VP101, BsAbB7 y BsAbB8 al bloquear VEGF para activar la ruta de señalización de NFAT mediante ensayo indicador
Los resultados muestran que la CE<50>de VP101 es de 1,240 nM, la CE<50>de BsAbB7 es de 1,217 nM, la CE<50>de BsAbB8 es de 1,728 nM, y la CE<50>de bevacizumab es de 0,773 nM, y los resultados experimentales muestran que la actividad de VP101 y BsAbB7 al bloquear VEGF para activar la ruta de señalización de NFAT es mejor que la de BsAbB8.
Ejemplo 7: experimento del anticuerpo VP101 que inhibe la proliferación de células HUVEC inducida por VEGFA
Se inocularon células HUVEC (adquiridas de Allcell) en buen estado de crecimiento, después de que la concentración celular se ajustara a 1,5 * 104/ml, en una placa de 96 pocillos a 200 |il/pocillo y luego se incubaron en una incubadora a 37 °C, el 5% de CO<2>durante 24 horas. Luego se observó que las células se adherían bien, y luego se descartó el medio de cultivo. Luego se añadió VEGFA 20 nM preparado usando medio 1640 que contenía FBS al 2 % en la placa de 96 pocillos a 200 |il/pocillo, y se añadieron anticuerpos a diferentes concentraciones, seguido de una incubación durante 72 horas. Después 72 horas se descartó el medio de cultivo y se añadió MTT. Después 4 horas, se descartó el MTT y se añadió DMSO, y luego se usó un lector de microplacas para medir el valor de DO a 490 nm.
Los resultados se muestran en la figura 22. Los resultados muestran que los anticuerpos humanizados VP101 y bevacizumab pueden inhibir eficazmente la proliferación de células HUVEC inducida por VEGFA de manera dependiente de la dosis, y la actividad farmacológica de VP101 para inhibir la proliferación de células HUVEC inducida por VEGFA es mayor que la de bevacizumab a la misma dosis.
Ejemplo 8: promoción de la secreción de citocinas IFN-y e IL-2 en una reacción de linfocitos mixtos1. Promoción de la secreción de IFN-y por VP101, 14C12H1L1 y nivolumab en un sistema de cultivo mixto de células DC y PBMC
Se aislaron PBMC mediante Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) y se añadieron a IL-4 (Peprotech 200-04, 1000 U/ml) y GM-CSF (Peprotech 300-03, 1000 U/ml) durante 6 días de inducción. y luego se añadió adicionalmente TNF-a (Peprotech 300-01A, 200 U/ml) durante 3 días de inducción para obtener células DC maduras.
El día del cocultivo, se aislaron PBMC nuevas de la sangre periférica de otro donante y las células DC maduras obtenidas se mezclaron con las PBMC recién aisladas de otro donante a una razón de 1:10 y, mientras tanto, se añadieron anticuerpos a diferentes concentraciones (hIgG como control). Después del cocultivo durante 5-6 días, se recogió el sobrenadante celular y se sometió a ensayo para determinar el contenido de IFN-y usando un kit de ELISA (adquirido de Dakewe).
En la figura 23 se muestra el efecto de VP101 sobre la secreción de IFN-y en un sistema de cultivo mixto de células DC y PBMC. Tal como puede observarse en la figura 23, VP101 puede promover eficazmente la secreción de IFN-y de manera dependiente de la dosis. Además, a dosis de 30 nM y 300 nM, VP101 tiene una mayor actividad para promover la secreción de IFN-y que el 14C12H1L1 equivalente, y a un nivel de dosis de 30 nM, tiene una mayor actividad para promover la secreción de IFN-y que el nivolumab equivalente.
2. Promoción de la secreción de IL-2 e IFN-y por VP101, BsAbB7 y BsAbB8b en un sistema de cultivo mixto de células DC y PBMC.
Se hizo referencia a la etapa 1 en este ejemplo para el método experimental, es decir, se aislaron PBMC mediante Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) y se añadieron a IL-4 (Peprotech 200-04, 1000 U/ml) y GM-CSF (Peprotech 300-03, 1000 U/ml) durante 6 días de inducción, y luego se añadió adicionalmente TNF-a (Peprotech 300-01A, 200 U/ml) durante 3 días de inducción para obtener células DC maduras.
El día del cocultivo, se aislaron PBMC nuevas de la sangre periférica de otro donante y las células DC maduras obtenidas se mezclaron con las PBMC recién aisladas de otro donante a una razón de 1:10 y, mientras tanto, se añadieron anticuerpos a diferentes concentraciones (hIgG como control); después del cocultivo durante 5-6 días, se recogió el sobrenadante celular y se sometieron a ensayo para determinar el contenido de IL-2 e IFN-y usando un kit de ELISA (adquirido de Dakewe).
En la figura 24 se muestra el efecto de VP101 sobre la secreción de IFN-y en un sistema de cultivo mixto de células DC y PBMC. Tal como puede observarse en la figura 24, VP101 puede promover eficazmente la secreción de IFN-y de manera dependiente de la dosis. La actividad farmacológica de VP101 para promover la secreción de IFN-y es significativamente mejor que la de BsAbB7 y BsAbB8.
En la figura 25 se muestra el efecto de VP101 sobre la secreción de IL-2 en un sistema de cultivo mixto de células DC y PBMC. 25. Tal como puede observarse en la figura 25, VP101 puede promover eficazmente la secreción de IL-2 de manera dependiente de la dosis, y la actividad farmacológica de VP101 para promover la secreción de IL-2 es mejor que la de BsAbB7 y BsAbB8.
3. Promoción de la secreción de IL-2 e IFN-y por VP101, 14C12H1L1 y nivolumab en un sistema de cultivo mixto de células PBMC y Raji-PD-L1
Se transfectó PD-L1 de manera estable en células Raji mediante infección por lentivirus, y se obtuvieron células Raji-PD-L1 que expresaban de manera estable PD-L1 después de la dosificación y el examen; las PBMC, después de dos días de estimulación con SEB, se cultivaron junto con Raji-PD-L1 tratadas con mitomicina C.
Los resultados se muestran en las figuras 26 y 27. Los resultados muestran que VP101 puede promover eficazmente la secreción de IL-2 e IFN-y, y a un nivel de dosis de 300 nM, la actividad de VP101 para promover la secreción de IL-2 es significativamente mejor que la de 14C12H1L1 y nivolumab.
El anticuerpo de control de isotipo que iba a estudiarse fue el anticuerpo humano contra lisozima de gallina (anti-HEL, es decir, IgG humana, abreviada como hIgG), y se preparó tal como se describe en el ejemplo de preparación 6 anterior.
4. La promoción de la secreción de IL-2 e IFN-y por VP101, BsAbB7 y BsAbB8 en un sistema de cultivo mixto de células PBMC y Raji-PD-L1 se estudió haciendo referencia al método experimental descrito en la etapa 3 de este ejemplo.
Los resultados de la secreción de IFN-y se muestran en la figura 28. Los resultados muestran que VP101 puede promover eficazmente la secreción de IFN-y de manera dependiente de la dosis. Al mismo tiempo, VP101 es significativamente mejor que BsAbB7 a la misma dosis, mientras que la actividad farmacológica de VP101 es significativamente mejor que la de BsAbB8 a niveles de dosis de 3 nM y 30 nM.
Los resultados de la secreción de IL-2 se muestran en la figura 29. Los resultados muestran que VP101 puede promover eficazmente la secreción de IL-2 de manera dependiente de la dosis. Al mismo tiempo, la actividad farmacológica de VP101 es significativamente mejor que la de BsAbB7 a dosis de 3 nM y 300 nM, mientras que VP101 es equivalente a BsAbB8 a la misma dosis.
Ejemplo 9: experimento de inhibición del crecimiento tumoral in v iv o por VP101
Para detectar la actividad de inhibición tumoralin vivode VP101, se inocularon en primer lugar células U87MG (células de glioma humano, adquiridas de ATCC) por vía subcutánea en ratones hembra Scid Beige de 5-7 semanas de edad (adquiridos de Vital River), y el modelado y el modo específico de administración se mostraron en tabla 15. Después de la administración, se midieron la longitud y el ancho de cada grupo de tumores y se calculó el volumen tumoral.
Tabla 15: régimen de dosificación para el tratamiento del xenoinjerto tumoral U87MG en modelo de ratón Scid Beige con VP101
Los resultados se muestran en la figura 30. Los resultados muestran que, en comparación con un anticuerpo de control de isotipo hIgG (el método de preparación es el mismo que el del ejemplo de preparación 6), bevacizumab y VP101 a dosis diferentes pueden inhibir eficazmente el crecimiento de tumores de ratón, y el VP101 a dosis altas es mejor que el VP101 a dosis bajas en la inhibición de tumores.
Además, tal como se muestra en la figura 31, VP101 no afecta el peso corporal del ratón que porta un tumor. La invención está definida por las reivindicaciones, y cualquier otro aspecto, configuración o realización establecido en el presente documento que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones es sólo con fines informativos.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo biespecífico, que comprende:
una primera región funcional proteica que selecciona como diana VEGFA, y
una segunda región funcional proteica que selecciona como diana PD-1;
en el que:
la primera región funcional proteica es un anticuerpo anti-VEGFA o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo anti-VEGFA o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 15-17 respectivamente, y comprende una región variable de cadena ligera que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 18- 20 respectivamente; y
la segunda región funcional proteica es un anticuerpo anti-PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo anti-PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 21-23 respectivamente, y comprende una región variable de cadena ligera que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 24-26 respectivamente.
2. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1, en el que,
el anticuerpo anti-VEGFA o el fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona de Fab, Fab', F(ab')<2>, Fv, un scFv, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico y un diacuerpo;
y/o,
el anticuerpo anti-PD-1 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona de Fab, Fab', F(ab')<2>, Fv, un scFv, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico y un diacuerpo.
3. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1, en el que:
(i) la primera región funcional proteica es una inmunoglobulina, en el que la inmunoglobulina comprende una región variable de cadena pesada que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 15-17 respectivamente, y comprende una región variable de cadena ligera que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 18-20 respectivamente; y la segunda región funcional proteica es un scFv, en el que el scFv comprende una región variable de cadena pesada que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 21-23 respectivamente, y comprende una región variable de cadena ligera que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 24-26 respectivamente,
opcionalmente, en el que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de la inmunoglobulina se establece en SEQ ID NO: 5, y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de la inmunoglobulina se establece en SEQ ID NO: 7; y
la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del scFv se establece en SEQ ID NO: 9, y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del scFv se establece en SEQ ID NO: 11; o,
(ii) la primera región funcional proteica es un scFv, en el que el scFv comprende una región variable de cadena pesada que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 15-17 respectivamente, y comprende una región variable de cadena ligera que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 18-20 respectivamente; y
la segunda región funcional proteica es una inmunoglobulina, en el que la inmunoglobulina comprende una región variable de cadena pesada que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 21-23 respectivamente, y comprende una región variable de cadena ligera que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 24-26 respectivamente, opcionalmente, en el que la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del scFv se establece en SEQ ID NO: 5, y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del scFv se establece en SEQ ID NO: 7; y
la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de la inmunoglobulina se establece en SEQ ID NO: 9, y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de la inmunoglobulina se establece en SEQ ID NO: 11.
4. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 3, en el que:
(i) la inmunoglobulina es una IgG, IgA, IgD, IgE o IgM;
(ii) el anticuerpo biespecífico comprende dos scFv, y un extremo de cada scFv está unido al extremo C-terminal o al extremo N-terminal de cada uno de los dos polipéptidos de cadena pesada de la inmunoglobulina; y/o (iii) en el que la inmunoglobulina comprende dos pares de cadenas polipeptídicas, en el que cada par comprende un polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera.
5. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 3 ó 4, en el que la inmunoglobulina comprende una región no CDR derivada de un anticuerpo humano.
6. Anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que,
la inmunoglobulina comprende regiones constantes derivadas de un anticuerpo humano, opcionalmente, en el que las regiones constantes de la inmunoglobulina se seleccionan de regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas.
7. Anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en el que,
la inmunoglobulina comprende una región constante de cadena pesada y una región constante de cadena ligera, en el que la región constante de cadena pesada es la región C de cadena gamma-1 de Ig humana o la región C de cadena gamma-4 de Ig humana, y la región constante de cadena ligera es la región C de cadena kappa de Ig humana.
8. Anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que las regiones funcionales proteicas primera y segunda están ligadas directamente o a través de un fragmento de ligador; opcionalmente, en el que el fragmento de ligador es (GGGGS)m, en el que m es un número entero positivo tal como 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
9. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 3, en el que,
la primera región funcional proteica que selecciona como diana VEGFA es una inmunoglobulina IgG1 anti-VEGFA y comprende dos pares de cadenas polipeptídicas, en el que cada par comprende un polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera, en el que:
(i) el polipéptido de cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 15-17, respectivamente, y una región C de cadena gamma-1 de Ig humana; y
(ii) el polipéptido de cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 18-20, respectivamente, y una región C de cadena kappa de Ig humana; y
la segunda región funcional proteica que selecciona como diana PD1 son dos scFv anti-PD-1, en el que cada scFv comprende:
(i) una región variable de cadena pesada que comprende HCDR1-HCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 21-23, respectivamente; y
(ii) una región variable de cadena ligera que comprende LCDR1-LCDR3 con secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 24-26, respectivamente;
en el que la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de cada uno de los scFv anti-PD-1 están ligadas por un primer fragmento de ligador que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 13; y
en el que un extremo de cada scFv anti-PD-1 está ligado al extremo C-terminal de cada polipéptido de cadena pesada de la inmunoglobulina IgG1 anti-VEGFA mediante un segundo fragmento de ligador que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 13.
10. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1 ó 2, en el que los números de las regiones funcionales proteicas primera y segunda son cada uno independientemente 1, 2 o más.
11. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1 ó 2, en el que,
el anticuerpo biespecífico se une a la proteína VEGFA con una CE<50>inferior a 1 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,2 nM, inferior a 0,15 nM o inferior a 0,14 nM; en el que la CE<50>se detecta mediante ELISA indirecto;
y/o,
el anticuerpo biespecífico se une a la proteína PD-1 con una CE<50>inferior a 1 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,2 nM, inferior a 0,17 nM, inferior a 0,16 nM o inferior a 0,15 nM; en el que la CE<50>se detecta mediante ELISA indirecto.
12. Molécula de ácido nucleico aislada, que codifica para el anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
13. Vector, que comprende la molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 12.
14. Célula huésped, que comprende la molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 12 o el vector según la reivindicación 13.
15. Método para preparar el anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende: cultivar la célula huésped según la reivindicación 14 en condiciones adecuadas, y aislar el anticuerpo biespecífico de los cultivos celulares.
16. Conjugado, que comprende un anticuerpo biespecífico y un resto conjugado, en el que el anticuerpo biespecífico es el anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, y el resto conjugado es un marcador detectable; opcionalmente, el resto conjugado es un radioisótopo, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente, una sustancia coloreada o una enzima.
17. Kit, que comprende el anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o el conjugado según la reivindicación 16;
en el que el kit comprende además un segundo anticuerpo que puede unirse específicamente al anticuerpo biespecífico; opcionalmente,
en el que el segundo anticuerpo comprende además un marcador detectable, tal como un radioisótopo, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente, una sustancia coloreada o una enzima.
18. Uso del anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 en la preparación de un kit para detectar la presencia o el nivel de VEGFA y/o PD-1 en una muestra.
19. Composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o el conjugado según la reivindicación 16, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
20. Anticuerpo biespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o conjugado según la reivindicación 16, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un tumor maligno, en el que opcionalmente, el tumor maligno se selecciona de cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de pulmón tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de piel, glioma, melanoma, tumor renal, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer gastrointestinal, cáncer de mama, cáncer cerebral y leucemia.
ES19853809T 2018-08-30 2019-08-30 Anticuerpo bifuncional anti-PD-1 y anti-VEGFA, composición farmacéutica del mismo y uso del mismo Active ES2989584T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811002548.4A CN109053895B (zh) 2018-08-30 2018-08-30 抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途
PCT/CN2019/103618 WO2020043184A1 (zh) 2018-08-30 2019-08-30 抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2989584T3 true ES2989584T3 (es) 2024-11-27

Family

ID=64758699

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19853809T Active ES2989584T3 (es) 2018-08-30 2019-08-30 Anticuerpo bifuncional anti-PD-1 y anti-VEGFA, composición farmacéutica del mismo y uso del mismo

Country Status (25)

Country Link
US (3) US20210340239A1 (es)
EP (2) EP3882275B1 (es)
JP (3) JP7374995B2 (es)
KR (2) KR20260036304A (es)
CN (1) CN109053895B (es)
AU (2) AU2019332708B2 (es)
BR (1) BR112021003559A2 (es)
CA (1) CA3110749A1 (es)
DK (1) DK3882275T5 (es)
EA (1) EA202190535A1 (es)
ES (1) ES2989584T3 (es)
FI (1) FI3882275T3 (es)
HR (1) HRP20241417T1 (es)
HU (1) HUE068809T2 (es)
IL (1) IL281116A (es)
LT (1) LT3882275T (es)
MX (1) MX2021002312A (es)
PH (1) PH12021550407A1 (es)
PL (1) PL3882275T3 (es)
PT (1) PT3882275T (es)
RS (1) RS66073B1 (es)
SG (1) SG11202101985TA (es)
SI (1) SI3882275T1 (es)
WO (1) WO2020043184A1 (es)
ZA (1) ZA202101894B (es)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
KR20250057128A (ko) 2015-12-30 2025-04-28 코디악 사이언시스 인코포레이티드 항체 및 이의 접합체
US12071476B2 (en) 2018-03-02 2024-08-27 Kodiak Sciences Inc. IL-6 antibodies and fusion constructs and conjugates thereof
CN109053895B (zh) 2018-08-30 2020-06-09 中山康方生物医药有限公司 抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途
CN111423512B (zh) * 2019-01-10 2024-01-05 北京比洋生物技术有限公司 阻断血管内皮细胞生长且活化t细胞的多靶向融合蛋白和包含其的药物组合物
CN109942712B (zh) * 2019-04-01 2022-12-20 华博生物医药技术（上海）有限公司 抗pd-l1/vegf双功能抗体及其用途
KR20220062503A (ko) * 2019-08-02 2022-05-17 씨티티큐-아케소 (상하이) 바이오메드. 테크. 컴퍼니, 리미티드 항-pd-1 항체 및 이의 약제학적 용도
CN115947846A (zh) 2019-09-12 2023-04-11 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗pd-l1纳米抗体及其衍生物和用途
AU2020364071A1 (en) 2019-10-10 2022-05-26 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
GB201914747D0 (en) * 2019-10-11 2019-11-27 Ultrahuman Eight Ltd PD1 and vegfr2 dual-binding agents
BR112022010069A2 (pt) * 2019-11-25 2022-09-06 Akeso Biopharma Inc Anticorpo biespecífico, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, conjugado, kit, uso do anticorpo biespecífico e composição farmacêutica
AU2021210025A1 (en) * 2020-01-21 2022-08-25 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. A bispecific anti-PD-L1/VEGF antibody and uses thereof
KR20230004726A (ko) * 2020-04-22 2023-01-06 아케소 바이오파마, 인크. 항-cd73/항-pd-1 이중특이항체 및 이의 용도
KR20230003178A (ko) * 2020-04-29 2023-01-05 치아타이 티안큉 파마수티컬 그룹 주식회사 PD-1 및 TGF-β에 대한 이중 기능성 단백질
CN114057883B (zh) * 2020-07-31 2024-04-16 江苏恒瑞医药股份有限公司 双特异性抗原结合分子及其医药用途
CN114106190B (zh) 2020-08-31 2025-04-08 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗vegf/pd-l1双特异性抗体及其用途
WO2022068894A1 (zh) * 2020-09-30 2022-04-07 上海齐鲁制药研究中心有限公司 同时靶向pd-l1和vegf的双功能分子及其医药用途
CN114316025B (zh) * 2020-12-25 2025-01-03 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Vegfr2基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
US20250114450A1 (en) * 2021-03-12 2025-04-10 Akeso Biopharma, Inc. Pharmaceutical combination containing anti-pd-1-anti-vegfa bispecific antibody, and use thereof
WO2022206843A1 (en) * 2021-03-31 2022-10-06 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. A bispecific anti-pd-l1/vegf antibody and uses thereof
JP2024515396A (ja) * 2021-04-14 2024-04-10 中山康方生物医▲藥▼有限公司 抗ｃｄ４７モノクローナル抗体及びその使用
MX2023012182A (es) * 2021-04-14 2023-10-25 Akeso Pharmaceuticals Inc Uso de anticuerpo en el tratamiento antitumoral.
CN116143935A (zh) * 2021-11-22 2023-05-23 杭州翰思生物医药有限公司 重组抗体及其应用
CN114181310B (zh) * 2022-02-14 2022-07-05 中山康方生物医药有限公司 抗tigit抗体、其药物组合物及用途
WO2024017281A1 (zh) * 2022-07-20 2024-01-25 明慧医药（杭州）有限公司 多特异性抗体及其用途
CN119654343A (zh) * 2022-08-09 2025-03-18 上海济煜医药科技有限公司 一种靶向pd-1和vegf的抗体及其应用
WO2024051223A1 (zh) * 2022-09-09 2024-03-14 中山康方生物医药有限公司 药物组合及用途
JP2025534252A (ja) * 2022-09-14 2025-10-15 尋済生物科技（北京）有限公司 抗ｖｅｇｆａ抗体またはその抗原結合フラグメント、およびその使用
CN116003619B (zh) * 2022-12-12 2023-08-04 三门峡市眼科医院 人源化抗Ang-2和VEGF双功能抗体及其医药用途
KR20250054821A (ko) * 2022-12-30 2025-04-23 레메젠 (상하이) 씨오., 엘티디. 이중특이적 항체 및 이의 응용
CN119039450A (zh) * 2023-05-22 2024-11-29 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd-1-抗vegf的双特异性抗体、其药物组合物及其用途
WO2025006794A1 (en) * 2023-06-29 2025-01-02 Promab Biotechnologies, Inc. Her-2 -cd3-epsilon bispecific antibodies
WO2025056056A1 (zh) * 2023-09-14 2025-03-20 中山康方生物医药有限公司 药物组合及用途
WO2025157267A1 (zh) * 2024-01-25 2025-07-31 中山康方生物医药有限公司 抗pd-1-抗vegfa的双特异性抗体的医药用途
WO2025193962A1 (en) * 2024-03-15 2025-09-18 OncoC4, Inc. Anti-vegf and pd-1 bispecific antibodies and uses thereof

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
IL132240A0 (en) 1997-04-07 2001-03-19 Genentech Inc Anti-vegf antibodies
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
CN105315323A (zh) 2007-10-30 2016-02-10 健泰科生物技术公司 通过阳离子交换层析进行的抗体纯化
ES2545609T3 (es) * 2008-08-25 2015-09-14 Amplimmune, Inc. Composiciones de antagonistas de PD-1 y métodos de uso
BRPI1012321A8 (pt) 2009-06-17 2016-09-27 Abbott Biotherapeutics Corp Anticorpos anti-vegf e seus usos
PT2542590T (pt) 2010-03-05 2017-08-31 Univ Johns Hopkins Composições e métodos para anticorpos e proteínas de fusão imunomoduladores direcionados
AU2011290480B2 (en) 2010-08-16 2015-07-30 Novimmune S.A. Methods for the generation of multispecific and multivalent antibodies
US20150086584A1 (en) 2012-03-22 2015-03-26 University Of Miami Multi-specific binding agents
JP6312659B2 (ja) 2012-05-31 2018-04-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｄ−１系結合アンタゴニスト及びｖｅｇｆアンタゴニストを用いた癌の治療方法
US10131712B2 (en) * 2012-08-14 2018-11-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with T-cell redirecting bispecific antibodies and checkpoint inhibitors
US20140154255A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
MX379491B (es) 2014-06-28 2025-03-10 Kodiak Sciences Inc Antagonistas duales de factor de crecimiento derivado de plaquetas (pdgf)/factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
AR103477A1 (es) * 2015-01-28 2017-05-10 Lilly Co Eli Compuestos de vegfa / ang2
CN105175545B (zh) * 2015-10-20 2019-01-25 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗vegf-抗pd-1双功能抗体及其应用
CN105175544B (zh) 2015-10-20 2021-04-09 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗pd-1人源化单克隆抗体及其应用
CN106632674B (zh) 2015-10-30 2018-11-16 泽达生物医药有限公司 一种抗pd-1单克隆抗体、其药物组合物及其用途
CN108779182A (zh) * 2015-12-28 2018-11-09 麻省理工学院 具有恒定区突变的双特异性抗体及其用途
CN109152831A (zh) 2015-12-29 2019-01-04 安口生物公司 贝伐珠单抗的缓冲制剂
EP3309177B1 (en) 2016-03-04 2020-05-13 Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. Pdl-1 antibody, pharmaceutical composition thereof, and uses thereof
CN109069638B (zh) * 2016-03-24 2022-03-29 璟尚生物制药公司 用于癌症治疗的三特异性抑制剂
MX384141B (es) * 2016-04-15 2025-03-14 Genentech Inc Métodos para monitorear y terapias para usarse en tratar el cáncer.
CN109195992A (zh) 2016-04-29 2019-01-11 本康生物制药（深圳）有限公司 多特异性结合偶联物、相关的药物组合物及应用
CN106967172B (zh) * 2016-08-23 2019-01-08 康方药业有限公司 抗ctla4-抗pd-1 双功能抗体、其药物组合物及其用途
CN106977602B (zh) 2016-08-23 2018-09-25 中山康方生物医药有限公司 一种抗pd1单克隆抗体、其药物组合物及其用途
CN106519034B (zh) * 2016-12-22 2020-09-18 鲁南制药集团股份有限公司 抗pd-1抗体及其用途
CN110291109B (zh) 2017-01-20 2023-01-31 大有华夏生物医药集团有限公司 人程序性死亡受体pd-1的单克隆抗体及其片段
TW202444417A (zh) 2017-05-09 2024-11-16 美商提薩羅有限公司 治療癌症的組合療法
WO2018223923A1 (zh) 2017-06-05 2018-12-13 江苏恒瑞医药股份有限公司 Pd-1抗体与vegf配体或vegf受体抑制剂联合在制备治疗肿瘤的药物中的用途
WO2019148412A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-pd-1/lag3 bispecific antibodies
JP2021512624A (ja) 2018-02-11 2021-05-20 ベイジン・ハンミ・ファーマシューティカル・カンパニー・リミテッドＢｅｉｊｉｎｇ Ｈａｎｍｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 抗ｐｄ−１／抗ｖｅｇｆ天然抗体構造様ヘテロ二量体型二重特異性抗体及びその製造
EP3758735B1 (en) 2018-02-28 2023-12-13 AP Biosciences, Inc. Bifunctional proteins combining checkpoint blockade for targeted therapy
CN109053895B (zh) 2018-08-30 2020-06-09 中山康方生物医药有限公司 抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途
WO2020083277A1 (zh) 2018-10-22 2020-04-30 上海一宸医药科技有限公司 一种双特异性抗体
CN113272330B (zh) 2019-03-02 2024-07-26 南通壹宸生物医药科技有限公司 一种双特异抗体
WO2021007428A2 (en) 2019-07-09 2021-01-14 The Johns Hopkins University Molecules, compositions and methods for treatment of cancer
AU2019456113A1 (en) 2019-07-11 2022-03-03 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Tetravalent symmetric bispecific antibody
CN112300286A (zh) 2019-08-02 2021-02-02 康方药业有限公司 抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体及其用途
KR20220062503A (ko) 2019-08-02 2022-05-17 씨티티큐-아케소 (상하이) 바이오메드. 테크. 컴퍼니, 리미티드 항-pd-1 항체 및 이의 약제학적 용도
CN110563849B (zh) 2019-08-09 2022-09-09 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗vegf-抗pd1双特异性抗体
CN110498857B (zh) 2019-08-09 2022-09-09 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗vegf-抗pd1双特异性抗体
US11661454B2 (en) 2019-08-09 2023-05-30 Anhui Biox Vision Biological Technology Co., Ltd. Anti-VEGF-PD1 bispecific antibody with novel structure and use thereof
GB201914747D0 (en) 2019-10-11 2019-11-27 Ultrahuman Eight Ltd PD1 and vegfr2 dual-binding agents
BR112022010069A2 (pt) 2019-11-25 2022-09-06 Akeso Biopharma Inc Anticorpo biespecífico, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, conjugado, kit, uso do anticorpo biespecífico e composição farmacêutica
CN110960543A (zh) 2019-12-10 2020-04-07 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种联合抗vegf-抗pd1双特异性抗体用于制备抗癌药物
KR20230003178A (ko) 2020-04-29 2023-01-05 치아타이 티안큉 파마수티컬 그룹 주식회사 PD-1 및 TGF-β에 대한 이중 기능성 단백질
KR20220001106A (ko) 2020-06-29 2022-01-05 (주)메디톡스 고농도 항-ｖｅｇｆ 항체 제제 및 이에 사용하기 위한 항-ｖｅｇｆ 항체
US20240076411A1 (en) 2020-12-30 2024-03-07 WuXi Biologics Ireland Limited Multispecific antigen binding proteins
JP2024515396A (ja) * 2021-04-14 2024-04-10 中山康方生物医▲藥▼有限公司 抗ｃｄ４７モノクローナル抗体及びその使用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210053912A (ko) 2021-05-12
JP2021536242A (ja) 2021-12-27
RS66073B1 (sr) 2024-11-29
EP3882275A4 (en) 2022-08-10
JP7589314B2 (ja) 2024-11-25
EP3882275A1 (en) 2021-09-22
AU2026201467A1 (en) 2026-03-19
KR102924276B1 (ko) 2026-02-09
PT3882275T (pt) 2024-10-15
HRP20241417T1 (hr) 2025-01-03
CN109053895B (zh) 2020-06-09
US20250197487A1 (en) 2025-06-19
CN109053895A (zh) 2018-12-21
AU2019332708A1 (en) 2021-04-15
SI3882275T1 (sl) 2025-04-30
MX2021002312A (es) 2021-07-02
ZA202101894B (en) 2022-08-31
HUE068809T2 (hu) 2025-01-28
SG11202101985TA (en) 2021-04-29
PL3882275T3 (pl) 2025-02-10
DK3882275T5 (da) 2024-10-28
JP7374995B2 (ja) 2023-11-07
EA202190535A1 (ru) 2021-07-20
IL281116A (en) 2021-04-29
PH12021550407A1 (en) 2021-09-20
EP4461746A2 (en) 2024-11-13
JP2025037880A (ja) 2025-03-18
LT3882275T (lt) 2024-10-25
AU2019332708B2 (en) 2026-03-05
FI3882275T3 (fi) 2024-10-25
DK3882275T3 (da) 2024-10-14
US20210340239A1 (en) 2021-11-04
EP4461746A3 (en) 2025-01-01
CA3110749A1 (en) 2020-03-05
US20230340097A1 (en) 2023-10-26
WO2020043184A1 (zh) 2020-03-05
KR20260036304A (ko) 2026-03-16
JP2024023186A (ja) 2024-02-21
BR112021003559A2 (pt) 2021-05-25
US12195527B2 (en) 2025-01-14
EP3882275B1 (en) 2024-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7589314B2 (ja) 抗ｐｄ－１／抗ｖｅｇｆａ二官能性抗体、その医薬組成物およびその使用
ES3001154T3 (es) Anticuerpo monoclonal anti-PD1, composición farmacéutica del mismo y uso del mismo
KR102340832B1 (ko) 항 pd-1 항체 및 그의 용도
ES2900381T3 (es) Composiciones y anticuerpos anti-tim-3
US20250034253A1 (en) Pharmaceutical composition comprising anti-tigit antibody and anti-pd-1/anti-vegfa bispecific antibody, and use thereof
US20250114450A1 (en) Pharmaceutical combination containing anti-pd-1-anti-vegfa bispecific antibody, and use thereof
JP2024536881A (ja) 抗ｌａｇ３抗体、医薬組成物、及び使用
JP2025520232A (ja) 医薬組成物及びその使用
KR20250060271A (ko) 약학적 조합 및 이의 용도
HK40118237A (en) Anti-pd-1/vegfa bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof
EA049135B1 (ru) Бифункциональное антитело против pd-1 и против vegfa, его фармацевтическая композиция и его применение
KR20250160510A (ko) 항-lag3 항체, 약학적 조성물 및 용도
HK40091003A (en) Pharmaceutical combination containing anti-pd-1-anti-vegfa bispecific antibody, and use thereof
HK40096182A (zh) 药物组合物及其用途
EA053093B1 (ru) Фармацевтическая композиция и ее применение
CN118846036A (zh) 一种包含特异性结合cd3和muc16的双特异性抗体的药物组合
HK40115876A (zh) 抗lag3抗体、药物组合物及用途