RS66073B1 - Anti-pd-1 i anti-vegfa bifunkcionalno antitelo, njegova farmaceutska kompozicija i njena upotreba - Google Patents

Anti-pd-1 i anti-vegfa bifunkcionalno antitelo, njegova farmaceutska kompozicija i njena upotreba

Info

Publication number
RS66073B1
RS66073B1 RS20241104A RSP20241104A RS66073B1 RS 66073 B1 RS66073 B1 RS 66073B1 RS 20241104 A RS20241104 A RS 20241104A RS P20241104 A RSP20241104 A RS P20241104A RS 66073 B1 RS66073 B1 RS 66073B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
variable region
chain variable
Prior art date
Application number
RS20241104A
Other languages
English (en)
Inventor
Baiyong Li
Yu Xia
Zhongmin Maxwell Wang
Peng Zhang
Original Assignee
Akeso Biopharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=64758699&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS66073(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Akeso Biopharma Inc filed Critical Akeso Biopharma Inc
Publication of RS66073B1 publication Critical patent/RS66073B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70521—CD28, CD152
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
TEHNIČKA OBLAST
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na oblasti lečenja tumora i imunobiologije, posebno na bifunkcionalno antitelo anti-PD-1/VEGFA, farmaceutsku kompoziciju i njenu upotrebu. Konkretno, ovaj pronalazak se odnosi na anti-humani PD-1/humani VEGFA bifunkcionalno antitelo, njegovu farmaceutsku kompoziciju i njenu upotrebu.
POZADINA
[0002] Tumor, posebno maligni tumor, predstavlja ozbiljnu pretnju po zdravlje u svetu danas, i drugi je vodeći uzrok smrti među raznim bolestima. Poslednjih godina, incidenca ove bolesti se značajno povećava. Maligni tumor karakteriše loš odgovor na lečenje, visoka stopa kasne metastaze i loša prognoza. Iako konvencionalne metode lečenja (kao što su radioterapija, hemoterapija i hirurško lečenje) koje se trenutno primenjuju klinički ublažavaju bol u velikoj meri i produžavaju vreme preživljavanja, ove metode imaju velike ograničenja i teško je dalje poboljšati njihovu efikasnost.
[0003] Postoje dvije jasne faze rasta tumora, naime, faza sporog rasta bez krvnih sudova i faza brze proliferacije sa krvnim sudovima. Angiogeneza omogućava da tumor dobije dovoljno nutritijenata za završavanje faze prebacivanja krvnih sudova, a ako ne dođe do angiogeneze, primarni tumor neće biti veći od 1-2 mm, samim tim ne može doći do metastaze.
[0004] Vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) je faktor rasta koji može podsticati deljenje i proliferaciju endotelnih ćelija, podsticati formiranje novih krvnih sudova i poboljšati propustljivost krvnih sudova. VEGF se vezuje za receptore vaskularnog endotelnog faktora rasta na površini ćelija i deluje aktiviranjem puteva signalne transdukcije kroz tirozinske kinaze. U tumorskim tkivima, tumorske ćelije, kao i makrofagi i mastociti koji prodiru u tumore, mogu da izlučuju visoke nivoe VEGF-a, čime se stimulišu vaskularne endotelne ćelije tumora u parakrinom obliku, čime se pospešuje proliferacija i migracija endotelnih ćelija, čime se izaziva angiogeneza, podstiče kontinuirani rast tumora, poboljšava popustljivost krvnih sudova, uzrokuje taloženje fibrina u okolnim tkivima i podstiče infiltracija mononuklearnih ćelija, fibroblasta i endotelnih ćelija, što olakšava formiranje tumorske strome i ulazak tumorskih ćelija u nove krvne sudove, čime se podstiče metastaza tumora. Stoga, inhibicija tumorske angiogeneze se smatra jednom od najperspektivnijih postupaka lečenja tumora u ovom trenutku. VEGF familija uključuje: VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD i PIGF. Receptori vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGFR) uključuju VEGFR1 (takođe poznat kao Flt1), VEGFR2 (takođe poznat kao KDR ili Flk1), VEGFR3 (takođe poznat kao Flt4) i neuropilin-1 (NRP-1). Prva tri receptora su slična po strukturi, pripadaju superfamiliji tirozinskih kinaza i sastoje se od ekstramembranske regije, transmembranskog segmenta i intramembranske regije, pri čemu se ekstramembranska regija sastoji od domena sličnog imunoglobulinu, a intramembranska regija je regija tirozinske kinaze. VEGFR1 i VEGFR2 se primarno nalaze na površini vaskularnih endotelnih ćelija, dok se VEGFR3 primarno nalazi na površini limfatičnih endotelnih ćelija.
[0005] Molekuli VEGF familije imaju različite afinitete prema receptorima. VEGFA uglavnom deluje u kombinaciji sa VEGFR1, VEGFR2 i NRP-1. VEGFR1 je prvi otkriveni receptor i ima veći afinitet prema VEGFA nego VEGFR2 u normalnim fiziološkim uslovima, ali ima nižu aktivnost tirozinske kinaze u intracekularnom segmentu u poređenju sa VEGFR2. (Ma Li, J. Chinese Journal of Birth Health and Heredity, 24 (5): 146-148 (2016)).
[0006] VEGFR2 je primarni regulator angiogeneze i vaskularnog inženjeringa, i ima znatno veću aktivnost tirozinske kinaze od VEGFR1. Nakon vezivanja za ligand VEGFA, VEGFR2 posreduje u proliferaciji, diferencijaciji i sličnim procesima vaskularnih endotelnih ćelija, kao i u procesu formiranja krvnih sudova i propustljivosti krvnih sudova (Roskoski R Jr. et al., Crit Rev Oncol Hematol, 62(3): 179-213 (2007)). VEGFA, nakon vezivanja za VEGFR2, posreduje u transkripcionoj ekspresiji gena proteina povezanih sa unutrašnjim signalnim putevima putem nishodne PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPK signalne transdukcije, čime se podstiče proliferacija vaskularnih endotelnih ćelija. (Takahashi T et al., Oncogene, 18(13): 2221-2230 (1999)).
[0007] VEGFR3 je jedan od članova familije tirozinskih kinaza i uglavnom se eksprimira u embriogenim vaskularnim endotelnim ćelijama i odraslim limfatičnim endotelnim ćelijama. VEGFC i VEGFD se vezuju za VEGFR3 kako bi stimulisali proliferaciju i migraciju limfatičnih endotelnih ćelija i podsticali neogenezu limfatičnih sudova; NRP-1 je transmembranski protein netirozinske kinaze i nije u stanju da samostalno transdukuje biološke signale; može posredovati u signalizaciji samo nakon formiranja kompleksa sa VEGF tirozinskim kinaznim receptorom. (Ma Li, Chinese Journal of Birth Health and Heredity, 24(5): 146-148 (2016)).
[0008] VEGFA i VEGFR2 su glavne komponente u regulaciji angiogeneze, gde se pre i posle vezivanja VEGFA za VEGFR2 formira kaskadna reakcija brojnih međusignalnih puteva u uzvodnim i nizvodnim signalnim putanjama. Na kraju, fiziološke funkcije se menjaju kroz proliferaciju, preživljavanje, migraciju, povećanje propustljivosti i infiltraciju u periferna tkiva endotelnih ćelija, itd. (Dong Hongchao et al., Sep.
2014, Journal of Modern Oncology, 22(9): 2231-3).
[0009] Trenutno, postoji nekoliko humanizovanih monoklonalnih antitela koja ciljaju humani VEGF, naročito VEGFA, kao što je bevacizumab, koji je odobrila Američka agencija za hranu i lekove za lečenje raznih tumora kao pto je kancer pluća ne-malih ćelija, karcinom renalnih ćelija, kancer grlića materice, i metastatski kolorektalni kancer sukcesivno tokom 2004.
[0010] Receptor za programiranu smrt ćelija-1 (PD-1), takođe poznat kao CD279, je tip I transmembranski glikoprotein koji pripada superfamiliji imunoglobulina CD28. Uobičajeno se eksprimira na T ćelijama, B ćelijama i mijeloidnim ćelijama. PD-1 ima dva prirodna liganda, PD-L1 i PD-L2. Obojica pripadaju B7 superfamiliji i eksprimiraju se konstitutivno ili inducibilno na površini različitih ćelija, uključujući nehematopoecke ćelije i razne tumorske ćelije. PD-L1 se prvenstveno eksprimira na T ćelijama, B ćelijama, dendritskim ćelijama i mikrovaskularnim endotelijskim ćelijama, kao i na raznim tumorskim ćelijama, dok se PD-L2 eksprimira samo na antigen-prezentujućim ćelijama, kao što su dendritske ćelije i makrofagi. Interakcija između PD-1 i njegovih liganda može inhibirati aktivaciju limfocita, proliferaciju T ćelija i sekreciju citokina, kao što su IL-2 i IFN-γ.
[0011] Veliki broj istraživanja pokazuje da tumorsko mikrookruženje može zaštititi tumorski ćelije od oštećenja od strane imunih ćelija. Ekspresija PD-1 u limfocitima infiltriranim u tumorsko mikrookruženje je povišena, a razna primarna tumorska tkiva su PD-L1 pozitivna u imunohistohemijskoj analizi, kao što su karcinom pluća, karcinom jetre, karcinom jajnika, karcinom kože, karcinom debelog creva i gliom. U međuvremenu, ekspresija PD-L1 u tumoru je značajno povezana sa lošijom prognozom kod pacijenata sa kancerom. Blokiranje interakcije između PD-1 i njegovih liganda može podstaći tumorski specifičnu T ćelijsku imunost i povećati efikasnost imunološke eliminacije tumorskih ćelija. Veliki broj kliničkih ispitivanja pokazuje da antitela koja ciljaju PD-1 ili PD-L1 mogu podsticati infiltraciju CD8+ T ćelija u tumorska tkiva i ushodno regulisati anti-tumorske imunološke efektorske faktore kao što su IL-2, IFN-γ, granzim B i perforin, čime se efikasno inhibira rast tumora.
[0012] Pored toga, anti-PD-1 antitela se mogu koristiti i u lečenju hroničnih virusnih infekcija. Hronične virusne infekcije često su praćene gubitkom funkcije T ćelija efektora specifičnih za virus i smanjenjem njihovog broja. Interakcija između PD-1 i PD-L1 može se blokirati injekcijom PD-1 antitela, čime se efikasno inhibira iscrpljenost T ćelija efektora u hroničnim virusnim infekcijama.
[0013] Zbog širokih antitumorskih perspektiva i iznenađujuće efikasnosti PD-1 antitela, u industriji je široko prihvaćeno da će antitela koja ciljaju PD-1 put doneti proboje u lečenju raznih tumora. To uključuje lečenje karcinoma pluća bez malih ćelija, karcinoma bubrega, karcinoma jajnika i melanoma (Hornet M. B., Parisi G., et al., Anti-PD-1 therapy in melanoma. Semin Oncol.2015 Jun; 42(3): 466-473), kao i limfoma i anemije (Held SA, Heine A, et al., Advances in immunotherapy of chronic myeloid leukemia CML. Curr Cancer Drug Targets 2013 Sep; 13(7): 768-74).
[0014] Bifunkcionalno antitelo, takođe poznato kao bispecifično antitelo, je specifičan lek koji istovremeno cilja dva različita antigena i može se proizvoditi imunoselekcijom i prečišćavanjem. Pored toga, bispecifična antitela se mogu proizvoditi i genetskim inženjeringom, što donosi određene prednosti zbog fleksibilnosti u aspektima kao što su optimizacija vezujućih mesta, razmatranje sintetičkog oblika i prinos. Trenutno je pokazano da bispecifična antitela postoje u više od 45 oblika (Müller D, Kontermann RE. Bispecific antitela for cancer immunotherapy: current perspectives. BioDrugs 2010; 24: 89-98). Razvijeno je nekoliko bispecifičnih antitela u formi IgG-ScFv, uključujući Morisonovu formu (Coloma M. J., Morrison S. L. Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. NatBiotechnol., 1997; 15: 159-163), koja se pokazala kao jedan od idealnih oblika bispecifičnih antitela zbog svoje sličnosti sa prirodno postojećim IgG oblikom i prednostima u inženjeringu, ekspresiji i prečišćavanju antitela (Miller B. R., Demarest S. J., et al., Stability engineering of scFvs for development of bispecific and multivalent antibodies. Protein Eng Des Sel 2010; 23: 549-57; Fitzgerald J, Lugovskoy A. Rational engineering of antibody therapeutics targeting multiple oncogene pathways. MAbs 2011; 3: 299-309).
[0015] Trenutno, postoji potreba za razvojem leka bifunkcionalnog antitela koje cilja i PD-1 i VEGF (npr., VEGFA).
[0016] US 2017/275353 A1 opisuje trispecifične inhibitore za lečenje kancera. WO2013/181452 A1 opisuje postupke lečenja kancera pomoću antagonista vezivanja PD-L1 osovine i VEGF antagonista. US 2017/275375 A1 opisuje kombinovanu terapiju sa bispecifičnim antitelima koja preusmeravaju T ćelije i inhibitorima kontrolnih tačaka. WO2018/036472 A1 opisuje anti-PD1 monoklonalno antitelo, njegovu farmaceutsku kompoziciju i njenu upotrebu.
KRATAK SADRŽAJ
[0017] Ovaj pronalazak definišu patentni zahtevi i svi drugi ovde definisani aspekti, konfiguracije ili načini ostvarivanja koji ne potpadaju pod obim ovih patentnih zahteva su dati samo informativno.
[0018] Kroz detaljno istraživanje i kreativne napore, zasnovane na komercijalno dostupnom VEGFA monoklonalnom antitelu Avastin (bevacizumab) i 14C12H1L1 dobijenom ranije (videti kinesku patentnu objavu br. CN106977602A), autori su razvili humanizovano bifunkcionalno antitelo nazvano VP101, koje može simultano da se veže za VEGFA i PD-1, pri čemu se blokira vezivanje VEGFA za VEGFR2 i vezivanje PD-1 za PD-L1.
[0019] Pronalazači su iznenađujuće otkrili da VP101 može da:
se efektivno vezuje za PD-1 na površini humanih imunih ćelija, čime se ublažava imunosupresija posredovana PD-L1 i PD-1, i pospešuje sekrecija IFN-γ i IL-2 humanim imunim ćelijama;
se efektivno inhibira proliferaciju vaskularnih endotelnih ćelija izazvanu VEGFA, i time inhibira angiogenezu izazvanu tumorom; i/ili
ima potencijal korišćenja za pripremu lekova za sprečavanja i lečenje malignih tumora kao što je kancer jetre, kancer pluća, melanom, tumor bubrega, kancer jajnika i limfom.
[0020] Sva pozivanja u ovom opisu na postupke lečenja se odnose na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje humanog (ili životinjskog) tela terapijom (ili zbog dijagnoze).
[0021] Ovaj pronalazak je detaljno predstavljen u nastavku.
[0022] Jedan aspekt se odnosi na bispecifično antitelo, koje obuhvata:
prvi proteinski funkcionalni region koji cilja VEGFA, i
drugi proteinski funkcionalni region koji cilja PD-1;
poželjno,
prvi proteinski funkcionalni region predstavlja anti-VEGFA antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, varijabilni region teškog lanca anti-VEGFA antitela koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 15-17 redom, i varijabilni region lakog lanca anti-VEGFA antitela koji obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 18-20 redom; i
drugi proteinski funkcionalni region predstavlja anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, varijabilni region teškog lanca anti-PD-1 antitela koja obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 21-23 redom, i varijabilni region lakog lanca anti-PD-1 antitela koja obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 24-26 redom.
[0023] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, obezbeđeno je bispecifično antitelo, pri čemu je, anti-VEGFA antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen izabran iz grupe koju čine Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, humanizovano antitelo, himerno antitelo, i dijatelo;
i/ili,
anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen je izabran iz grupe koju čine Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, humanizovano antitelo, himerno antitelo, i dijatelo.
[0024] U nekim načinima ostvarivanja bispecifično antitelo je u IgG-scFv obliku.
[0025] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, prvi proteinski funkcionalni region je imunoglobulin, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 15-17 redom, i varijabilni region lakog lanca imunoglobulina koja obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 18-20 redom; i drugi proteinski funkcionalni region je scFv, varijabilni region teškog lanca iz scFv koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 21-23 redom, i varijabilni region lakog lanca iz scFv koja obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 24-26 redom;
ili,
prvi proteinski funkcionalni region je scFv, varijabilni region teškog lanca iz scFv koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 15-17 redom, i varijabilni region lakog lanca iz scFv koja obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 18-20 redom; i drugi proteinski funkcionalni region je imunoglobulin, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 21-23 redom, i varijabilni region lakog lanca imunoglobulina koja obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 24-26 redom.
[0026] U konkretnom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, obezbeđeno je bispecifično antitelo, koje obuhvata:
prvi proteinski funkcionalni region koji cilja VEGFA, i
drugi proteinski funkcionalni region koji cilja PD-1;
pri čemu,
prvi proteinski funkcionalni region je imunoglobulin, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 15-17 redom, i varijabilni region lakog lanca imunoglobulina koja obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 18-20 redom; i drugi proteinski funkcionalni region je scFv, varijabilni region teškog lanca iz scFv koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 21-23 redom, i varijabilni region lakog lanca iz scFv koja obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 24-26 redom;
ili,
prvi proteinski funkcionalni region je scFv, varijabilni region teškog lanca iz scFv koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 15-17 redom, i varijabilni region lakog lanca iz scFv koja obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 18-20 redom; i drugi proteinski funkcionalni region je imunoglobulin, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 21-23 redom, i varijabilni region lakog lanca imunoglobulina koja obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 24-26 redom.
[0027] U nekim načinima ostvarivanja obezbeđeno je bispecifično antitelo, pri čemu, aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina je definisana u SEQ ID NO: 5, i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina je definisana u SEQ ID NO: 7; i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca iz scFv je definisana u SEQ ID NO: 9, i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca iz scFv je definisana u SEQ ID NO: 11;
ili,
aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca iz scFv je definisana u SEQ ID NO: 5, i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca iz scFv je definisana u SEQ ID NO: 7; i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina je definisana u SEQ ID NO: 9, i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina je definisana u SEQ ID NO: 11.
[0028] U nekim načinima ostvarivanja obezbeđeno je bispecifično antitelo, pri čemu
taj imunoglobulin obuhvata ne-CDR region izveden iz humanog antitela.
[0029] U nekim načinima ostvarivanja obezbeđeno je bispecifično antitelo, pri čemu,
taj imunoglobulin obuhvata konstantne regione izveden iz humanog antitela;
poželjno, konstantne regione imunoglobulina izabrani od konstantnih regiona humanog IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4.
[0030] U nekim načinima ostvarivanja obezbeđeno je bispecifično antitelo, pri čemu,
konstantni region teškog lanca imunoglobulina predstavlja C region gamma-1 lanca humanog Ig ili C region gamma-4 lanca humanog Ig, a njegov konstantni region lakog lanca predstavlja C region kappa lanca humanog Ig.
[0031] U nekim načinima ostvarivanja konstantni regioni imunoglobulina su humanizovani. Na primer, svaki konstantni region teškog lanca je C region gamma-1 lanca Ig, PRISTUP: P01857, i svaki konstantni region lakog lanca je C region kappa lanca Ig, PRISTUP: P01834.
[0032] U nekim načinima ostvarivanja obezbeđeno je bispecifično antitelo, pri čemu prvi proteinski funkcionalni region i drugi proteinski funkcionalni region su povezani direktno ili putem fragmenta linkera;
poželjno, taj fragment linkera je (GGGGS)m, pri čemu m predstavlja pozitivan ceo broj kao što je 1, 2, 3, 4, 5, ili 6, i GGGGS (SEQ ID NO: 14) predstavlja sastavnu jedinicu linkera.
[0033] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, obezbeđeno je bispecifično antitelo, pri čemu su brojevi prvog proteinskog funkcionalnog regiona i drugog proteinskog funkcionalnog regiona su svaki nezavisno 1, 2 ili više.
[0034] U nekim načinima ostvarivanja obezbeđeno je bispecifično antitelo, pri čemu su prisutni 1 imunoglobulin i 2 scFv, poželjno dva identična scFv.
[0035] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, obezbeđeno je bispecifično antitelo, pri čemu imunoglobulin predstavlja IgG, IgA, IgD, IgE, ili IgM, poželjno IgG, kao što je IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.
[0036] U nekim načinima ostvarivanja obezbeđeno je bispecifično antitelo, pri čemu je scFv povezan sa C-krajem teškog lanca imunoglobulina. Budući da imunoglobulin ima dva teška lanca, dva scFv su povezana sa jednim imunoglobulinskim molekulom. Poželjno, ta dva scFv su identična.
[0037] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, obezbeđeno je bispecifično antitelo, pri čemu su prisutna dva scFv, i jedan kraj svakog scFv je povezan sa C-krajem ili N-krajem jednog od ta dva teška lanca imunoglobulina.
[0038] U nekim načinima ostvarivanja disulfidna veza je prisutna između VHi VLantitela pojedinačnog lanca. Postupci uvođenja disulfidne veze između VH i VL antitela su dobro poznati u nauci, videti, na primer, US 5,747,654; Rajagopal et al., Prot. Engin.10(1997)1453-1459; Reiter et al., Nat. Biotechnol.
14(1996)1239-1245; Reiter et al., Protein Engineering 8(1995)1323-1331; Webber et al., Molecular Immunology 32(1995)249-258; Reiter et al., Immunity 2(1995)281-287; Reiter et al., JBC 269(1994)18327-18331; Reiter et al., Inter. J. of Cancer 58(1994)142-149; ili Reiter et al., Cancer Res.
54(1994)2714-2718.
[0039] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, obezbeđeno je bispecifično antitelo, pri čemu se bispecifično antitelo vezuje za VEGFA protein i/ili PD-1 protein sa KDmanjom od 10<-5>M, kao što je manjom od 10<-6>M, 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M ili 10<-10>M ili manje poželjno, KDse meri instrumentom za molekulsku interakciju Fortebio.
[0040] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, obezbeđeno je bispecifično antitelo, pri čemu, bispecifično antitelo se vezuje za VEGFA protein sa EC50manjom od 1 nM, manjom od 0.5 nM, manjom od 0.2 nM, manjom od 0.15 nM, ili manjom od 0.14 nM; pri čemu EC50se detektuje indirektnom ELISA-om;
i/ili,
bispecifično antitelo se vezuje za PD-1 protein sa EC50manjom od 1 nM, manjom od 0.5 nM, manjom od 0.2 nM, manjom od 0.17 nM, manjom od 0.16 nM, ili manjom od 0.15 nM; pri čemu EC50se detektuje indirektnom ELISA-om.
[0041] Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira bispecifično antitelo koje se štiti.
[0042] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na vektor koji obuhvata izolovani molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska.
[0043] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja obuhvata izolovani molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska ili koja obuhvata vektor ovog pronalaska.
[0044] Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na postupak za pripremu bispecifičnog antitela koje se štiti, koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina ovog pronalaska u pogodnom stanju i izolovanje bispecifičnog antitela iz ćelijskih kultura.
[0045] Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na konjugat, koji obuhvata bispecifično antitelo i konjugovanu grupu, pri čemu bispecifično antitelo predstavlja bispecifično antitelo koje se štiti, a konjugovana grupa predstavlja obeležje koje može da se detektuje; poželjno, konjugovana grupa predstavlja radioizotop, fluorescentnu supstancu, luminiscentnu supstancu, obojenu supstancu, ili enzim.
[0046] Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na komplet koji obuhvata bispecifično antitelo koje se štiti ili koji obuhvata konjugat ovog pronalaska;
pri čemu taj komplet dodatno obuhvata drugo antitelo koje specifično može da se vezuje za bispecifično antitelo; opciono, to drugo antitelo dodatno obuhvata obeležje koje može da se detektuje, kao što je radioizotop, fluorescentna supstanca, luminiscentna supstanca, obojena supstanca, ili enzim.
[0047] Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na upotrebu bispecifičnog antitela koje se štiti u pripremi kompleta za detektovanje prisustva ili nivoa VEGFA i/ili PD-1 u nekom uzorku.
[0048] Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata bispecifično antitelo koje se štiti ili koja obuhvata konjugat ovog pronalaska; i, dodatno obuhvata farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
[0049] Bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija može da se formuliše u bilo koji oblik doziranja poznat u farmaceutskoj oblasti, kao što su tablete, pilule, suspenzije, emulzije, rastvori, gelovi, kapsule, prahovi, granule, eliksiri, troheje, supozitorije, injekcije (uključujući rastvore za injekciju, sterilne praškove za injekciju i koncentrisane rastvore za injekciju), inhalatore i sprejeve. Poželjan oblik doziranja zavisi od predviđenog načina primene i terapijske upotrebe. Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska treba da bude sterilna i stabilna u uslovima proizvodnje i skladištenja. Jedan od poželjnih oblika doziranja je injekcija. Takve injekcije mogu biti sterilni injekcioni rastvori. Na primer, sterilni injekcioni rastvori se mogu pripremiti na sledeći način: neophodna količina bispecifičnog antitela ovog pronalaska dodaje se u odgovarajući rastvarač, a opciono se dodaju i drugi poželjni sastojci (uključujući, ali bez ograničenja na, regulatore pH, surfaktante, adjuvanse, pojačivače jonske snage, izotonične agense, konzervanse, razblaživače ili bilo koju kombinaciju istih), nakon čega sledi filtracija i sterilizacija. Pored toga, sterilni injekcioni rastvori mogu se pripremiti kao sterilni liofilizovani praškovi (npr. putem vakuum sušenja ili lioforzacije) za praktično skladištenje i upotrebu. Takvi sterilni liofilizovani praškovi mogu se raspršiti u pogodnom nosaču (npr. sterilnoj vodi bez pirogena) pre upotrebe.
[0050] Pored toga, bispecifično antitelo može biti prisutno u farmaceutskoj kompoziciji u jediničnom doznom obliku radi lakše primene. U nekim načinima ostvarivanja, jedinična doza je najmanje 1 mg, najmanje 5 mg, najmanje 10 mg, najmanje 15 mg, najmanje 20 mg, najmanje 25 mg, najmanje 30 mg, najmanje 45 mg, najmanje 50 mg, najmanje 75 mg, ili najmanje 100 mg. Gde je farmaceutska kompozicija u tečnom (npr., injekcija) doznom obliku, može da obuhvata bispecifično antitelo ovog pronalaska u koncentraciji od najmanje 0.1 mg/mL, kao što je najmanje 0.25 mg/mL, najmanje 0.5 mg/mL, najmanje 1 mg/mL, najmanje 2.5 mg/mL, najmanje 5 mg/mL, najmanje 8 mg/mL, najmanje 10 mg/mL, najmanje 15 mg/mL, najmanje 25 mg/mL, najmanje 50 mg/mL, najmanje 75 mg/mL, ili najmanje 100 mg/mL.
[0051] Bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija može se primenjivati bilo kojim postupkom poznatom u struci, uključujući, ali bez ograničenja na, oralnu, bukalnu, sublingvalnu, očnu, topikalnu, parenteralnu, rektalnu, intratekalnu, intracisternalnu, ingvinalnu, intravezikalnu, topikalnu (npr. prašak, mast ili kap) ili nazalnu primenu. Međutim, za mnoge terapijske upotrebe, poželjan način primene je parenteralno (kao što su intravenska injekcija, subkutana injekcija, intraperitonealna injekcija i intramuskularna injekcija). Stručnjaci iz ove oblasti će razumeti da će se način i/ili put primene razlikovati u zavisnosti od namene. Bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može se primenjivati putem intravenske infuzije ili injekcije.
[0052] Ovde obezbeđeno bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija mogu da se koriste samostalno ili u kombinaciji, ili se koriste u kombinaciji sa dodatnim farmaceutski aktivnim agensima (npr., hemoterapijski lek za tumor). Takav dodatni farmaceutski aktivni agens može da se daje pre, istovremeno sa, ili nakon primene bispecifičnog antitela ovog pronalaska ili farmaceutske kompozicije ovog pronalaska.
[0053] Režim primene može se prilagoditi kako bi se postigao optimalni željeni odgovor (npr. terapijski ili profilaktički odgovor). Na primer, to može biti jedna primena, više primena tokom određenog perioda, ili može biti okarakterisana smanjenjem ili povećanjem doze proporcionalno stepenu hitnosti lečenja.
[0054] In vivo ili in vitro postupak može da obuhvata davanje ćeliji efektivne količine bispecifičnog
1
antitela prema bilo kom načinu ostvarivanja ovog pronalaska ili konjugata ovog pronalaska, a postupak je izabran iz grupe koju čine:
(1)
postupak za detektovanje nivoa VEGFA u nekom uzorku,
postupak za blokiranje vezivanja VEGFA za VEGFR2,
postupak za nishodno regulisanje aktivnosti ili nivoa VEGFA,
postupak za ublažvanje stimulacije VEGFA na proliferaciju vaskularnih endotelnih ćelija,
postupak za inhibiranje proliferacije vaskularnih endotelnih ćelija, ili
postupak za blokiranje angiogeneze tumora;
i/ili
(2)
postupak za blokiranje vezivanja PD-1 za PD-L1,
postupak za nishodno regulisanje aktivnosti ili nivoa PD-1,
postupak za ublažavanje imunosupresije PD-1 u organizmu,
postupak za podsticanje IFN-γ sekrecije u T limfocitima, ili
postupak za podsticanje IL-2 sekrecije u T limfocitima.
[0055] In vitro postupak može biti neterapijski i/ili nedijagnostički.
[0056] U in vitro eksperimentu, anti-VEGFA antitelo i anti-VEGFA/PD-1 bifunkcionalno antitelo oba mogu da inhibiraju HUVEC ćelijsku proliferaciju, i anti-PD-1 antitelo i anti-VEGFA/PD-1 bifunkcionalno antitelo oba mogu da pospeše sekreciju IFN-γ i/ili IL-2 i da aktiviraju imunu reakciju.
[0057] Postupak za sprečavanje i/ili tretiranje malignog tumora može da obuhvata davanje subjektu kojem je to potrebno efektivne količine bispecifičnog antitela prema bilo kom načinu ostvarivanja ovog pronalaska ili konjugata ovog pronalaska, pri čemu poželjno, maligni tumor je izabran iz grupe koju čine kancer debelog creva, rektalni kancer, kancer pluća kao što je kancer pluća ne-malih ćelija, kancer jetre, kancer jajnika, kancer kože, gliom, melanom, renalni tumor, kancer prostate, kancer bešike, gastrointestinalni kancer, kancer dojke, kancer mozga i leukemija.
[0058] Uobičajen, neograničavajući opseg terapijski ili profilaktički efektivnih količina bispecifičnog antitela ovog pronalaska je 0.02-50 mg/kg, kao što su 0.1-50 mg/kg, 0.1-25 mg/kg ili 1-10 mg/kg. Treba napomenuti da doza može varirati u zavisnosti od vrste i težine simptoma koji se leče. Pored toga, stručnjaci iz oblasti će znati će se za svakog pacijenta određeni režim primene prilagođavati tokom vremena prema potrebama pacijenta i profesionalnoj proceni lekara; opsezi doza navedeni ovde su samo ilustrativni i ne ograničavaju upotrebu ili opseg farmaceutske kompozicije ovog pronalaska.
[0059] Subjekat može biti sisar, kao što je čovek.
[0060] Ovde je obezbeđeno bispecifično antitelo ili konjugat koji se štiti za upotrebu u sprečavanju i/ili lečenju malignog tumora, pri čemu poželjno, maligni tumor izabran iz grupe koju čine kancer debelog creva, rektalni kancer, kancer pluća kao što je kancer pluća ne-malih ćelija, kancer jetre, kancer jajnika, kancer kože, gliom, melanom, renalni tumor, kancer prostate, kancer bešike, gastrointestinalni kancer, kancer dojke, kancer mozga i leukemija.
[0061] Bispecifično antitelo ili konjugat može biti za upotrebu u:
(1)
detektovanju nivoa VEGFA u nekom uzorku,
blokiranju vezivanja VEGFA za VEGFR2,
nishodnom regulisanju aktivnosti ili nivoa VEGFA,
ublažavanju stimulacije VEGFA na vaskularnu endotelnu ćelijsku proliferaciju,
inhibiranju vaskularne endotelne ćelijske proliferacije, ili
blokiranju angiogeneze tumora;
i/ili
(2)
blokiranju vezivanja PD-1 za PD-L1,
nishodnom regulisanju aktivnosti ili nivoa PD-1,
ublažavanju imunosupresije PD-1 u organizmu,
podsticanju IFN-γ sekrecije u T limfocitima, ili
podsticanju IL-2 sekrecije u T limfocitima.
[0062] Lekovi antitela, naročito monoklonalnih antitela, postigli su dobru efikasnost u lečenju raznih bolesti. Tradicionalni eksperimentalni postupci za dobijanje ovih terapijskih antitela uključuju imunizaciju životinja antigenom i dobijanje antitela koja ciljaju antigen kod imunizovanih životinja, ili poboljšanje tih antitela sa nižom afinitetom za antigen putem afinitetne zrelosti.
[0063] Varijabilni regioni lakog i teškog lanca određuju vezivanje za antigen; varijabilni region svakog lanca sadrži tri hipervarijabilna regiona koja se nazivaju regioni za određivanje komplementarnosti (CDR). CDR teškog lanca (H lanac) obuhvataju HCDR1, HCDR2 i HCDR3, dok CDR lakog lanca (L lanac) obuhvataju LCDR1, LCDR2 i LCDR3, koji su imenovani po Kabatu et al., videti Bethesda M.d., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication (1-3) 1991: 91-3242).
[0064] Poželjno, CDR takođe mogu biti identifikovani IMGT sistemom numerisanja, videti Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas, i Marie-Paule Lefranc. "IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for imunoglobulins or antibodies, T cell receptori, MHC, IgSF and MhcSF." Nucleic acids research 38.suppl_1 (2009): D301-D307.
[0065] Aminokiselinske sekvence CDR regiona sekvenci monoklonalnog antitela u (1) do (13) u nastavku su analizirani tehničkim sredstvima dobro poznatim u nauci, na primer pomoću VBASE2 baze podataka i prema IMGT definiciji, i rezultati su kao što sledi:
(1) Bevacizumab
[0066] Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca je definisana u SEQ ID NO: 5, i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca je definisana u SEQ ID NO: 7.
[0067] Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona teškog lanca su sledeće:
HCDR1: GYTFTNYG (SEQ ID NO: 15)
HCDR2: INTYTGEP (SEQ ID NO: 16)
HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV (SEQ ID NO: 17)
[0068] Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona lakog lanca su sledeće:
LCDR1: QDISNY (SEQ ID NO: 18)
LCDR2: FTS (SEQ ID NO: 19)
LCDR3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 20)
(2) 14C12H1L1
[0069] Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca je definisana u SEQ ID NO: 9, i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca je definisana u SEQ ID NO: 11.
[0070] Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona teškog lanca su sledeće:
HCDR1: GFAFSSYD (SEQ ID NO: 21)
HCDR2: ISGGGRYT (SEQ ID NO: 22)
HCDR3: ANRYGEAWFAY (SEQ ID NO: 23)
[0071] Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona lakog lanca su sledeće:
LCDR1: QDINTY (SEQ ID NO: 24)
LCDR2: RAN (SEQ ID NO: 25)
LCDR3: LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 26)
(3) VP101
[0072] Aminokiselinske sekvence 9 CDR regiona teškog lanca su sledeće:
HCDR1: GYTFTNYG (SEQ ID NO: 15)
HCDR2: INTYTGEP (SEQ ID NO: 16)
HCDR3: AKYPHYYGSSHWYFDV (SEQ ID NO: 17)
HCDR4: GFAFSSYD (SEQ ID NO: 21)
HCDR5: ISGGGRYT (SEQ ID NO: 22)
HCDR6: ANRYGEAWFAY (SEQ ID NO: 23)
HCDR7: QDINTY (SEQ ID NO: 24)
HCDR8: RAN (SEQ ID NO: 25)
HCDR9: LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 26)
[0073] Aminokiselinske sekvence 3 CDR regiona varijabilnog regiona lakog lanca su sledeće:
LCDR1: QDISNY (SEQ ID NO: 18)
LCDR2: FTS (SEQ ID NO: 19)
LCDR3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 20)
[0074] U ovom pronalasku, osim ukoliko nije drugačije definisano, naučni i tehnički pojmovi korišćeni
1
ovde imaju značenja koja su opšte poznata stručnjacima iz oblasti. Pored toga, laboratorijske radnje kao što su kultivisanje ćelija, molekularna genetika, hemija nukleinskih kiselina i imunologija, korišćene ovde, predstavljaju rutinske postupke koji se široko primenjuju u odgovarajućim oblastima. U međuvremenu, kako bi se bolje razumeo ovaj pronalazak, definicije i objašnjenja relevantnih pojmova su navedeni u nastavku.
[0075] Kako se ovde koristi, kada se misli na aminokiselinsku sekvencu VEGFA proteina (GenBank ID: NP_001165097.1), ona podrazumeva punu dužinu VEGFA proteina, kao i fuzioni protein VEGFA, kao što je fragment spojen sa Fc proteinskim fragmentom miša iil humanog IgG (mFc ili hFc). Međutim, stručnjaci iz oblasti će znati da u aminokiselinskoj sekvenci VEGFA proteina, mutacije ili varijacije (uključujući ali bez ograničenja na, supstitucije, delecije i/ili dodavanja) mogu prirodno da nastanu ili da se veštački uvedu bez uticaja na njihove biološke funkcije. Shodno tome, u ovom pronalasku, pojam "VEGFA protein" bi trebalo da uključuje sve takve sekvence, uključujući njihove prirodne ili veštačke varijante. Pored toga, kada se opisuje fragment sekvence VEGFA proteina, takođe uključuje odgovarajuće fragmente sekvenci u njihovim prirodnim ili veštačkim varijantama. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, aminokiselinska sekvenca VEGFA proteina je prikazana kao podvučeni deo iz SEQ ID NO: 1 (bez poslednjih 6 His, ukupno 165 aminokiselina).
[0076] Kako se ovde koristi, kada se misli na aminokiselinsku sekvencu VEGFR2 proteina (takođe poznatu kao KDR, GenBank ID: NP_002244), ona uključuje punu dužinu VEGFR2 proteina, ili ekstracelularni fragment VEGFR2-ECD iz VEGFR2, ili fragment koji obuhvata VEGFR2-ECD, i on takođe uključuje fuzioni protein iz VEGFR2-ECD, kao što je fragment spojen sa Fc proteinskim fragmentom miša ili humani IgG (mFc ili hFc). Međutim, stručnjaci iz oblasti će znati da u aminokiselinskoj sekvenci VEGFR2 proteina, mutacije ili varijacije (uključujući ali bez ograničenja na, supstitucije, delecije i/ili dodavanja) mogu prirodno da nastanu ili da se veštački uvedu bez uticaja na njihove biološke funkcije. Shodno tome, u ovom pronalasku, pojam "VEGFR2 protein" bi trebalo da uključuje sve takve sekvence, uključujući njihove prirodne ili veštačke varijante. Pored toga, kada se opisuje fragment sekvence VEGFR2 proteina, on takođe uključuje odgovarajuće fragmente sekvenci u njihovim prirodnim ili veštačkim varijantama. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog fragmenta VEGFR2-ECD iz VEGFR2 je prikazana kao krivudavi podvučeni deo iz SEQ ID NO: 3 (766 aminokiselina).
[0077] Kako se ovde koristi, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, VEGFR predstavlja VEGFR1 i/ili VEGFR2; specifična proteinska sekvenca je sekvenca poznata u stanju tehnike, i referenca se može napraviti vezano za sekvencu objavljenu u postojećoj literaturi ili GenBank-u. Na primer, VEGFR1 (VEGFR1, NCBI Gene ID: 2321); VEGFR2 (VEGFR2, NCBI Gene ID: 3791).
[0078] Kako se ovde koristi, kada se misli na aminokiselinsku sekvencu PD-1 protein (protein programirane ćelijske smrti 1, NCBI GenBank: NM_005018), uključuje punu dužinu PD-1 proteina, ili ekstracelularni fragment PD-1ECD iz PD-1 ili fragment koji obuhvata PD-1ECD, i takođe uključuje fuzioni protein iz PD-1ECD, kao što je fragment spojen sa Fc proteinskim fragmentom mišjeg ili humanog IgG (mFc ili hFc). Međutim, stručnjaci iz oblasti će znati da u aminokiselinskoj sekvenci PD-1 proteina, mutacije ili varijacije (uključujući, ali bez ograničenja na, supstitucije, delecije i/ili dodavanja) mogu prirodno da nastanu ili da se veštački uvedu bez uticaja na njihove biološke funkcije. Shodno tome, u ovom pronalasku, pojam "PD-1 protein" treba da obuhvata sve takve sekvence, uključujući njihove prirodne ili veštačke varijante. Pored toga, kada se opisuje fragment sekvence PD-1 proteina, to takođe uključuje odgovarajuće fragmente sekvenci u njihovim prirodnim ili veštačkim varijantama.
[0079] Kako se ovde koristi, pojam EC50se odnosi na koncentraciju za 50% maksimalnog
efekta, tj. koncentraciju koja može da uzrokuje 50% maksimalnog efekta.
[0080] Kako se ovde koristi, pojam "antitelo" se odnosi na imunoglobulinski molekul koji se obično sastoji od dva para polipeptidnih lanaca (svaki par čini jedan "laki" (L) lanac i jedan "teški" (H) lanac). U opštem smislu, teški lanac može se tumačiti kao polipeptidni lanac sa većom molekularnom težinom u antitelu, dok se lakši lanac odnosi na polipeptidni lanac sa manjom molekularnom težinom. Laki lanci se klasifikuju kao κ i λ laki lanci. Teški lanci se obično klasifikuju kao µ, δ, γ, α ili ε, a izotipi antitela definišu se kao IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, redom. U lakim i teškim lancima, varijabilni region i konstantni region su povezani "J" regionom od otprilike 12 ili više aminokiselina, a teški lanac takođe obuhvata "D" region od otprilike 3 ili više aminokiselina. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona teškog lanca (CH). Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena (CH1, CH2i CH3). Svaki lakši lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona lakog lanca (CL), pri čemu se konstantni region lakog lanca sastoji od jednog domena CL. Konstantni region antitela može posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva domaćina ili faktore, uključujući vezivanje različitih ćelija imunološkog sistema (npr. efektorskih ćelija) za prvu komponentu (C1q) klasičnog komplementarnog sistema. VHi VLregioni mogu se dalje deliti na veoma varijabilne regione (nazvane regioni komplementarnog određivanja, CDR), između kojih su raspoređeni konzervativni regioni poznati kao okviri (FR). Svaki VHi VLse sastoji od 3 CDR i 4 FR, raspoređenih od amino kraja do karboksilnog kraja po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni (VHi VL) svakog para teškog i lakog lanca formiraju mesta vezivanja antitela. Dodela aminokiselina regionima ili domenima može se zasnivati na Kabatovim sekvencama proteina od imunološkog značaja (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), ili na Chothia & Lesk J. Mol. Biol.196(1987): 901-917; Chothia et al. Nature 342(1989): 878-883 ili na definiciji IMGT numeričkog sistema (videti Ehrenmann, Francois, Quentin Kaas, i Marie-Paule Lefranc. "IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF." Nucleic acids research 38.suppl_1 (2009): D301-D307). Osim toga, teški lanac može da obuhvata više od 3 CDR, kao što je 6, 9 ili 12. Na primer, u bispecifičnom antitelu ovog pronalaska, teški lanac može biti ScFv sa C-krajem teškog lanca IgG antitela povezanog sa drugim antitelom, pri čemu teški lanac obuhvata 9 CDR. Pojam "antitelo" nije ograničen na bilo koji specifičan postupak za proizvodnju antitela. Na primer, antitelo
1
uključuje, posebno, rekombinantno antitelo, monoklonalno antitelo i poliklonalno antitelo. Antitela mogu biti različitih izotipova, kao što su antitela IgG (npr. podtipovi IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE ili IgM.
[0081] Kako se ovde koristi, pojam "fragment koji se vezuje za antigen," takođe poznat kao "proton koji se vezuje za antigen," se odnosi na polipeptid koji obuhvata fragment antitela pune dužine, koji održava sposobnost da se specifično vezuje za isti antigen za koji se vezuje i antitelo pune dužine, i/ili ulazi u kompeticiju sa antitelom pune dužine za specifično vezivanje za antigen. Fragment koji se vezuje za antigen može se proizvesti pomoću tehnika rekombinantne DNK ili enzimskim ili hemijskim razlaganjem netaknutog antitela. U nekim slučajevima, fragment koji se vezuje za antigen uključuje Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, himerno antitelo i dijatelo.
[0082] Pojam 'Fd fragment' se odnosi na fragment antitela koji se sastoji od VHi CH1domena; pojam 'Fv fragment' se odnosi na fragment antitela koji se sastoji od VLi VHdomena jednog kraka antitela; pojam 'dAb fragment' se odnosi na fragment antitela koji se sastoji od VHdomena (Ward et al., Nature 341 (1989):544-546); pojam 'Fab fragment' se odnosi na fragment antitela koji se sastoji od VL, VH, CLi CH1domena; i pojam 'F(ab')2 fragment' se odnosi na fragment antitela koji obuhvata dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom na zglobnom regionu.
[0083] U nekim aspektima, fragment koji se vezuje za antigen antitela je scFv, u kojem su VLi VHdomeni povezani kako bi formirali monovalentni molekuli putem linkera koji omogućava da se proizvede jedan polipeptidni lanac (videti, npr., Bird et al., Science 242 (1988):423-426 i Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988):5879-5883). Takvi scFv molekuli mogu imati opštu strukturu: NH2-VL-linker-VH-COOH ili NH2-VH-linker-VL-COOH. Odgovarajući linker u stanju tehnike se sastoji od ponavljajuće GGGGS aminokiselinske sekvence ili njene varijante. Na primer, linker koji ima aminokiselinsku sekvencu (GGGGS)4 može se koristiti, a takođe se mogu koristiti i njene varijante (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993): 6444-6448). Druge linkere korisne u ovom pronalasku su opisali Alfthan et al., Protein Eng.8 (1995): 725-731, Choi et al., Eur. J. Immunol.31 (2001): 94-106, Hu et al., Cancer Res.56 (1996): 3055-3061, Kipriyanov et al., J. Mol. Biol.293 (1999): 41-56, i Roovers et al., Cancer Immunol. (2001).
[0084] U nekim aspektima, fragment koji se vezuje za antigen antitela je dijatelo, odnosno, bivalentno antitelo, u kojem su VHi VLdomeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu. Međutim, linker koji se koristi je prekratak da bi omogućio uparivanje dva domena na istom lancu, čime su domeni primorani da se povežu sa komplementarnim domenima na drugom lancu, čime se generišu dva mesta za vezivanje antigena (videti, npr., Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993):6444-6448, i Poljak RJ et al., Structure 2 (1994):1121-1123).
[0085] Fragmenti koji se vezuju za antigen (npr., prethodno pomenuti fragmenti antitela) mogu se dobiti iz datih antitela korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima iz oblasti (npr., rekombinantna DNK tehnika ili enzimsko ili hemijsko cepanje), a fragmenti koji se vezuju za antigene
1
antitela se ispituju na specifičnost na isti način kao i netaknuta antitela.
[0086] Kako se ovde koristi, osim ukoliko to kontekst jasno ne definiše drugačije, kada se misli na pojam "antitelo", on uključuje ne samo netaknuta antitela već takođe i fragment koji se vezuje za antigene antitela.
[0087] Kako se ovde koriste, pojmovi "mAb" i "monoklonalno antitelo" se odnosi na antitelo ili njegov fragment koji je izveden iz grupe izuzetno homolognih antitela, tj. iz grupe molekula identičnih antitela, osim prirodnih mutacija koje mogu spontano da se jave. Monoklonalno antitelo ima izuzetnu specifičnost za pojedinačni epitop na antigenu. Poliklonalno antitelo, u odnosu na monoklonalno antitelo, generalno obuhvata najmanje dva ili više različitih antitela koja generalno prepoznaju različite epitope na antigenu. Monoklonalna antitela generalno mogu da se dobiju tehnikom hibridoma koju su prvi prijavili Kohler et al. (Nature, 256:495, 1975), i takođe može da se dobije rekombinantnom DNK tehnikom (na primer, videti U.S. Patent 4,816,567).
[0088] Kako se ovde koristi, pojam "himerno antitelo" se odnosi na antitelo čiji deo lakog i/ili teškog lanca potiče iz jednog antitela (koje može biti izvedeno iz specifične vrste ili pripadati određenoj klasi ili podklasi antitela), dok je drugi deo lakog i/ili teškog lanca izveden iz drugog antitela (koje može poticati iz iste ili različite vrste ili pripadati istoj ili različitoj klasi ili podklasi antitela). U svakom slučaju, zadržava aktivnost vezivanja za ciljani antigen (U.S. Patent 4,816,567 do Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984):6851-6855).
[0089] Kako se ovde koristi, pojam "humanizovano antitelo" se odnosi na antitelo ili fragment antitela dobijen kada svi ili deo CDR regiona humanog imunoglobulina (antitelo receptora) je zamenjeno CDR regionima nehumanog antitela (antitelo davaoca), pri čemu to antitelo davaoca može biti nehumano (npr., od miša, pacova ili zeca) antitelo sa očekivanom specifičnošću, afinitetom ili reaktivnošću. Pored toga, neki aminokiselinski ostaci u okviru regiona (FR) receptor antitela takođe mogu biti zamenjeni aminokiselinskim ostacima odgovarajućih nehumanih antitela ili aminokiselinskim ostacima drugih antitela kako bi se dodatno poboljšala ili optimizovala funkcionalnost antitela. Za više detalja o humanizovanim antitelima, videti, npr., Jones et al., Nature, 321 (1986): 522-525; Reichmann et al., Nature, 332:323329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2 (1992): 593-596, i Clark, Immunol. Today 21 (2000): 397-402.
[0090] Pojam 'epitop' se odnosi na mesto na antigenu na koje se specifično vezuje imunoglobulin ili antitelo. 'Epitop' se takođe u praksi naziva 'antigenska determinanta'. Epitop ili antigenska determinanta se generalno sastoji od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula, kao što su aminokiseline ili ugljeni hidrati ili šećerne bočne lance, i obično ima specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i specifične karakteristike naelektrisanja. Na primer, epitop obično uključuje najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 uzastopnih ili neuzastopnih aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji, koja može biti 'linearno' ili 'konformaciono. Videti, na primer, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, G. E. Morris, Ed. (1996). U linearnom epitopu, sva interaktivna mesta između
1
proteina i interakcionog molekula (npr., antitela) postoje linearno duž primarne aminokiselinske sekvence proteina. U konformacionom epitopu, interaktivna mesta postoje između aminokiselinskih ostataka proteina koji su odvojeni jedan od drugog.
[0091] Pojam 'izolovan' se odnosi na dobijen na veštački način iz prirodnog stanja. Ako određena 'izolovana' supstanca ili komponenta postoji u prirodi, može se desiti da dođe do promene u njenom prirodnom okruženju, ili da se izoluje iz prirodnog okruženja, ili oboje. Na primer, određeni neizolovani polinukleotid ili polipeptid prirodno postoji u određenoj živoj životinji, a isti polinukleotid ili polipeptid sa visokom čistoćom, izolovan iz takvog prirodnog stanja, naziva se izolovan polinukleotid ili polipeptid. Pojam 'izolovan' ne isključuje postojanje veštačkih ili sintetičkih supstanci ili drugih nečistoća koje ne utiču na aktivnost supstance.
[0092] Kako se ovde koristi, pojam "vektor" se odnosi na vehikulum nukleinske kiseline u koji može da se umetne polinukleotid. Kada vektor omogućava ekspresiju proteina koji je kodiran umetnutim polinukleotidom, vektor se naziva ekspresioni vektor. Vektor se može uvesti u ćelije domaćina putem transformacije, transdukcije ili transfekcije kako bi se genetski elementi koje nosi vektor mogli eksprimirati u ćeliji domaćina. Vektori su dobro poznati stručnjacima iz oblasti, uključujući, ali bez ograničenja na: plazmide; fagimide; kozmide; veštačke hromozome, kao što su veštački hromozom kvasca (YAC), bakterijski veštački hromozom (BAC) ili P1-izvedeni veštački hromozom (PAC); fage kao što su lambda fage ili M13 fage; i viruse životinja. Virusi životinja koji se mogu koristiti kao vektori uključuju, ali bez ograničenja na, retroviruse (uključujući lentiviruse), adenoviruse, viruse povezane sa adenovirusima, herpes viruse (kao što je virus herpes simplex-a), viruse boginja, bakuloviruse, papiloma viruse i papovaviruse (kao što je SV40). Vektor može sadržati razne elemente koji kontrolišu ekspresiju, uključujući, ali bez ograničenja na, sekvence promotera, sekvence inicijacije transkripcije, pojačivače, selekcione elemente i reporter gene. Pored toga, vektor može dodatno sadržati mesto za inicijaciju replikacije.
[0093] Kako se ovde koristi, pojam "ćelija domaćina" se odnosi na ćelije u koje se može uvesti vektor, uključujući, ali bez ograničenja na, prokariotske ćelije kao što su E. coli ili Bacillus subtilis, gljivične ćelije kao što su kvasne ćelije ili Aspergillus, insektne ćelije kao što su S2 Drosophila ćelije ili Sf9, ili životinjske ćelije kao što su fibroblasti, CHO ćelije, COS ćelije, NSO ćelije, HeLa ćelije, BHK ćelije, HEK 293 ćelije ili humane ćelije.
[0094] Kako se ovde koristi, pojam "specifično se vezuje" se odnosi na nenasumičnu reakciju vezivanja između dva molekula, kao što je reakcija između antitela i antigena koji cilja. U nekim načinima ostvarivanja, antitelo koje se specifično vezuje za antigen (ili antitelo koje je specifično za antigen) znači da se antitelo vezuje za antigen sa afinitetom (KD) manjim od oko 10<-5>M, kao što je manjom od oko 10<-6>M, 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M ili 10<-10>M ili manje. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, pojam 'cilj' se odnosi na specifično vezivanje.
[0095] Kako se ovde koristi, pojam "KD" se odnosi na konstantu ravnoteže disocijacije za specifičnu
1
interakciju antitela i antigena, koja se koristi za opisivanje afiniteta vezivanja između antitela i antigena. Što je manja konstanta ravnoteže disocijacije, to je jače vezivanje antitela i antigena, i veći je afinitet između antitela i antigena. Generalno, antitela se vezuju za antigene sa konstantom ravnoteže disocijacije (KD) manjom od oko 10-5 M, kao što je manjom od oko 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M ili 10-10 M ili manje, na primer, kako se određuje u BIACORE instrumentu korišćenjem površinske plazmonske rezonance (SPR).
[0096] Kako se ovde koriste, pojmovi "monoklonalno antitelo" i "mAb" imaju isto značenje i mogu se koristiti naizmenično; pojmovi 'poliklonalno antitelo' i 'PcAb' imaju isto značenje i mogu se koristiti naizmenično; pojmovi 'polipeptid' i 'protein' imaju isto značenje i mogu se koristiti naizmenično. Pored toga, u ovom pronalasku, aminokiseline se generalno predstavljaju jednoslovnim i troslovnim skraćenicama poznatim u praksi. Na primer, alanin se može predstaviti sa A ili Ala.
[0097] Kako se ovde koristi, pojam "farmaceutski prihvatljiv ekscipijens" se odnosi na nosač i/ili vehikulum koji je farmakološki i/ili fiziološki kompatibilan sa subjektom i aktivnom supstancom, koja je dobro poznata u praksi (videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) i uključuje, ali bez ograničenja na, regulatore pH, surfaktante, adjuvanse i pojačivače jonske snage. Na primer, regulatori pH uključuju, ali bez ograničenja na, fosfatni pufer; surfaktanti uključuju, ali bez ograničenja na, katjonske, anjonske ili nejonske surfaktante, kao što je Tween-80; pojačivači jonske snage uključuju, ali bez ograničenja na, natrijum hlorid.
[0098] Kako se ovde koristi, pojam "adjuvans" se odnosi na nespecifični pojačivač imunog odgovora, koji može pojačati imunološki odgovor organizma na antigene ili promeniti tip imunološkog odgovora kada se isporuči u organizmu zajedno sa antigenima ili se isporuči u organizam unapred.
[0099] Postoje razni adjuvanasi, uključujući, ali bez ograničenja na, aluminijumski adjuvans (kao što je aluminijum hidroksid), Freundov adjuvans (kao što su kompletni i nepotpuni Freundov adjuvans), corynebacterium parvum, lipopolisaharid, citokine itd. Freundov adjuvans je najčešće korišćeni adjuvans u eksperimentima na životinjama. Aluminijum hidroksid se više koristi u kliničkim ispitivanjima.
[0100] Kako se ovde koristi, pojam "efektivna količina" se odnosi na količinu dovoljnu da se postigne ili barem delimično postigne željeni efekat. Na primer, profilaktički efikasna količina (npr. za bolest povezanu sa vezivanjem PD-1 na PD-L1 ili prekomernom ekspresijom VEGF, kao što je tumor) predstavlja količinu dovoljnu da spreči, zaustavi ili odloži pojavu bolesti. Terapeutski efektivna količina je količina dovoljna da izleči ili barem delimično zaustavi bolest i njene komplikacije kod pacijenta koji boluje od te bolesti. Nesumnjivo, stručnjaci iz ove oblasti mogu odrediti takvu efektivnu količinu. Na primer, količina efektivna za terapeutsku upotrebu zavisiće od težine bolesti koja se leči, opšteg stanja imunološkog sistema pacijenta, kao i opšteg stanja pacijenta, kao što su starost, telesna masa i pol, način primene leka, i drugih tretmana koji se istovremeno primenjuju, itd.
[0101] Prednosti ovog pronalaska:
1
bispecifično antitelo VP101 može specifično da se vezuje za VEGFA, efikasno blokira vezivanje VEGFA za VEGFR2, i specifično ublažava imunosupresiju izazvanu VEGFA u organizmu, čime se podstiče efekat VEGFA na angiogenezu. Takođe, VP101 može specifično da se vezuje za PD-1, efikasno blokira vezivanje PD-1 za PD-L1, i specifično ublažava imunosupresiju PD-1 u organizmu, i aktivira imunološki odgovor.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0102]
FIG.1 prikazuje SDS-PAGE rezultate detekcije bifunkcionalnog antitela VP101. Uzorci iz četiri trake sa leva na desno i njihove odgovarajuće količine za punjenje su: antitelo u puferu za bojenje uzoraka elektroforeze nesniženog nivoa proteina, 1 µg; antitelo u puferu za bojenje uzoraka elektroforeze sniženog nivoa proteina, 1 µg; Marker, 5 µL; BSA, 1 µg.
FIG.2 prikazuje rezultate detekcije kinetičkih karakterističnih parametara vezivanja antitela VP101 za PD-1.
FIG.3 prikazuje rezultate detekcije kinetičkih karakterističnih parametara vezivanja antitela BsAbB7 za PD-1.
FIG.4 prikazuje rezultate detekcije kinetičkih karakterističnih parametara vezivanja antitela BsAbB8 za PD-1.
FIG.5 prikazuje rezultate detekcije kinetičkih karakterističnih parametara vezivanja antitela 14C12H1L1 za PD-1.
FIG.6 prikazuje rezultate detekcije kinetičkih karakterističnih parametara vezivanja antitela nivolumab za PD-1.
FIG.7 prikazuje rezultate detekcije kinetičkih karakterističnih parametara vezivanja antitela VP101 za VEGF.
FIG.8 prikazuje rezultate detekcije kinetičkih karakterističnih parametara vezivanja antitela BsAbB7 za VEGF.
FIG.9 prikazuje rezultate detekcije kinetičkih karakterističnih parametara vezivanja antitela BsAbB8 za VEGF.
FIG.10 prikazuje rezultate detekcije kinetičkih karakterističnih parametara vezivanja antitela bevacizumab za VEGF.
FIG.11 prikazuje aktivnost vezivanja antitela VP101 za VEGFA detektovanog indirektnom ELISA-om. FIG.12 prikazuje odgovarajuće aktivnosti vezivanja antitela VP101, BsAbB7, BsAbB8 i bevacizumaba za VEGFA-h se detektuje indirektnom ELISA-om.
FIG.13 prikazuje aktivnost vezivanja antitela VP101 za PD-1 detektovanog indirektnom ELISA-om. FIG.14 prikazuje odgovarajuće aktivnosti vezivanja antitela VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 i nivolumaba za PD-1 detektovanog indirektnom ELISA-om.
2
FIG.15 prikazuje aktivnost antitela VP101 u kompeticiji sa VEGFR2 za vezivanje za VEGFA detektovano kompetitivnom ELISA-om.
FIG.16 prikazuje aktivnost antitela VP101 u kompeticiji sa PD-L1 za vezivanje za PD-1 detektovano kompetitivnom ELISA-om.
FIG.17 prikazuje vezivanje EC50antitela 14C12H1L1 i VP101 za 293T-PD-1 ćelijski površinski protein PD-1 detektovan FACS-om.
FIG.18 prikazuje vezivanje EC50antitela VP101, BsAbB7 i BsAbB8 za 293T-PD-1 ćelijski površinski protein PD-1 detektovan FACS-om.
FIG.19 prikazuje aktivnost antitela VP101 i 14C12H1L1 u kompeticiji sa PD-L1 za vezivanje za 293T-PD-1 ćelijski površinski protein PD-1 detektovan FACS-om.
FIG.20 prikazuje aktivnost antitela 14C12H1L1, VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L i nivolumaba u kompeticiji sa PD-L1 za vezivanje za 293T-PD-1 ćelijski površinski protein PD-1 detektovan FACS-om. FIG.21 prikazuje neutralizacionu bioaktivnost antitela VP101, BsAbB7 i BsAbB8 u blokiranju VEGF kako bi se aktivirao NFAT signalni put.
FIG.22 prikazuje efekat bevacizumaba i VP101 na HUVEC ćelijsku proliferaciju.
FIG.23 prikazuje efekat VP101 na sekreciju IFN-γ u mešanom sistemu kultura DC i PBMC ćelija. FIG.24 prikazuje efekat VP101, BsAbB7 i BsAbB8 na sekreciju IFN-γ u mešanom sistemu kultura DC i PBMC ćelija.
FIG.25 prikazuje efekat VP101, BsAbB7 i BsAbB8 na sekreciju IL-2 u mešanom sistemu kultura DC i PBMC ćelija.
FIG.26 prikazuje efekat antitela 14C12H1L1 i VP101 na sekreciju citokina IL-2 indukovanu pomešanom kulturom PBMC i Raji-PD-L1 ćelija detektovanih ELISA-om.
FIG.27 prikazuje efekat antitela 14C12H1L1 i VP101 na sekreciju citokina IFN-γ indukovanu pomešanom kulturom PBMC i Raji-PD-L1 ćelija detektovanih ELISA-om.
FIG.28 prikazuje efekat antitela 14C12H1L1, VP101, BsAbB7 i BsAbB8 na sekreciju citokina IFN-γ indukovanu pomešanom kulturom PBMC i Raji-PD-L1 ćelija detektovanih ELISA-om.
FIG.29 prikazuje efekat antitela 14C12H1L1, VP101, BsAbB7 i BsAbB8 na sekreciju citokina IL-2 indukovanu pomešanom kulturom PBMC i Raji-PD-L1 ćelija detektovanih ELISA-om.
FIG.30 prikazuje inhibiciju tumora rasta od strane VP101 u različitim koncentracijama.
FIG.31 prikazuje efekat VP101 u različitim koncentracijama na telesnu masu miša.
DETALJAN OPIS
[0103] Načini ostvarivanja ovog pronalaska biće detaljno opisani u nastavku uz pozivanje na primere. Stručnjaci iz oblasti će znati da su sledeći primeri korišćeni samo za ilustrovanje ovog pronalaska i ne treba ih smatrati ograničavajućim u smislu obima ovog pronalaska. Slučajevi bez specifičnih opisa tehnika ili uslova su sprovedeni prema tehnologijama ili uslovima opisanim u literaturi iz oblasti (npr., videti, Guide to Molecular Cloning Eksperiments, od autora J. Sambrook et al., i prevodilaca Huang Peitang et al., treće izdanje, Science Press) ili u skladu sa uputstvom za proizvod. Reagensi ili instrumenti koji se koriste su svi komercijalno dostupni uobičajeni proizvodi osim ukoliko njihovi proizvođači nisu naznačeni.
[0104] U narednim primerima ovog pronalaska, tržišno antitelo bevacizumab (trgovinski naziv Avastin<®>) za isti cilj je nabavljeno od kompanije Roche kao kontrolno antitelo, ili je pripremljeno prema primeru pripreme 4.
[0105] U narednim primerima ovog pronalaska, tržišno antitelo nivolumab za isti cilj (trgovinski naziv Opdivo<®>) je nabavljen od BMS kao kontrolno antitelo.
[0106] U narednim primerima ovog pronalaska, aminokiselinske sekvence kontrolnih antitela BsAbB7 i BsAbB8 su bile identične aminokiselinskim sekvencama BsAbB7 i BsAbB8 redom u Kineskoj patentnoj objavi CN105175545A.
Primer pripreme 1: Priprema fuzionih proteina PD-1-mFc, PD-1-hFc i PD-L1-hFc
[0107] Priprema fuzionih proteina PD-1-mFc, PD-1-hFc i PD-L1-hFc i SDS-PAGE detekcija elektroforezom se izvode u potpunosti uz pozivanje na primer pripreme 1 Kineske patentne objave CN106632674A.
[0108] Aminokiselinske sekvence i kodirajuće nukleotidne sekvence fuzionih proteina PD-1-mFc, PD-1-hFc i PD-L1-hFc u ovom primeru pripreme su isti kao oni od PD-1-mFc, PD-1-hFc i PDL-1-hFc redom u primeru pripreme 1 Kineske patentne objave CN106632674A.
Fuzioni proteini PD-1-mFc, PD-1-hFc i PD-L1-hFc su dobijeni na taj način.
Primer pripreme 2: Ekspresija i prečišćavanje fuzionog proteina VEGFA-His
1. Konstrukcija plazmida VEGFA-His
[0109] PCR amplifikacija je izvedena pomoću humane cDNK VEGFA (nabavljene od Origene-a) kao obrazac, a hVEGFA-His fragment je prečišćen i izolovan pomoću uobičajenog DNK proizvoda za pročišćavanje. Izolovani hVEGFA-His fragment i ekspresioni vektor pcDNA3.1 su enzimski digestovani sa XbaI i HindIII-HF, a fragment ciljanog gena je izolovan ekstrakcijom iz gela i ligiran sa linearno ekspresionim vektorom pomoću T4 ligaze. Zatim su svi proizvodi ligacije transformisani u DH5α hemijski kompetentne ćelije i naneseni naa ploču sa Amp. Dobro odvojene pojedinačne kolonije su odabrane za PCR identifikaciju kolonija, PCR pozitivne klonovi su inokulisani u LB podlogu za kultivisanje, a bakterijski rastvor je poslat u Guangzhou Invitrogen Biotechnology radi verifikacije sekvenciranja. Poravnanje rezultata sekvenciranja pokazalo je da je sekvenca umetanja pozitivnog rekombinanta potpuno ispravna.
2. Ekspresija i prečišćavanje fuzionog proteina VEGFA-His
[0110] Nakon što je rekombinantni plazmid VEGFA-his transfektovan u 293F ćelije (nabavljene od Invitrogena) na 7 dana u skladu sa uputstvom iz kompleta za transfekciju lipofektamina (nabavljene od Invitrogena), podloga za kulture je podvrgnuta centrifugiranju velike brzine, koncentracija supernatanta i zamena pufera u vezujućem puferu A, a zatim je učitan na HisTrap koloni. Proteini su linearno eluirali sa puferom za eluciju A. Primarni čisti uzorak je podvrgnut zameni pufera u vezujućem puferu B pomoću HiTrap Desalting kolone i učitan na HiTrap Q koloni, proteini su linearno eluirali sa puferom za eluciju B, a ciljani uzorak je izolovan i zamenjen u PBS. Prečišćeni uzorak je dodat u pufer za bojenje uzoraka elektroforeze sniženog nivoa proteina za SDS-PAGE detekciju elektroforezom.
[0111] Fuzioni protein VEGFA-His je dobijen na taj način.
[0112] Aminokiselinska sekvenca iz VEGFA-His je kao što sledi (171 aa):
pri čemu, podvučeni deo bez 6-His predstavlja aminokiselinsku sekvencu iz VEGFA.
Nukleotidna sekvenca koja kodira VEGFA-His (513 bp)
[0113]
Primer pripreme 3: Ekspresija i prečišćavanje fuzionog proteina VEGFR2-hFc
1. Sinteza genskog VEGFR2-hFc:
[0114] Aminokiseline koje odgovaraju ekstracelularnom fragmentu VEGFR2 ECD gena VEGFR2 (receptor vaskularnog endotelnog faktora rasta 2, NCBI GenBank: NP_002244) su spojene sa TEV i Fc proteinskim fragmentom humanog IgG (hFc) redom (SEQ ID NO: 3). Genscript je poveren sintetisanju odgovarajuće kodirajuće nukleotidne sekvence (SEQ ID NO: 4).
VEGFR2, receptor vaskularnog endotelnog faktora rasta 2, NCBI GenBank NP_002244;
hFc: C region gamma-1 lanca Ig, PRISTUP: P01857, 106-330;
Aminokiselinska sekvenca fuzionog proteina VEGFR2-hFc: (998 aa)
[0115]
2
pri čemu, deo podvučen krivudavom linijom predstavlja ECD deo VEGFR2, uokvireni deo predstavlja TEV mesto digestije enzima, a masno podvučeni deo predstavlja hFc part.
Nukleotidna sekvenca koja kodira fuzioni protein VEGFR2-hFc: (2997 bp)
[0116]
�
pri čemu, deo podvučen krivudavom linijom predstavlja ECD deo VEGFR2, uokvireni deo predstavlja TEV mesto digestije enzima, a masno podvučeni deo predstavlja hFc deo.
2. Konstrukcija plazmida pUC57jednostavan-VEGFR2-hFc:
[0117] VEGFR2-hFc koji kodira gen sintetisan od strane Genscript je kloniran u ekspresioni vektor pUC57jednostavan (koji obezbeđuje Genscript), i dobijen je pUC57jednostavan-VEGFR2-hFc plazmid.
3. Konstrukcija rekombinantnog plazmida pcDNK3.1-VEGFR2-hFc:
[0118] Plazmid pUC57jednostavan-VEGFR2-hFc je enzimski digestovan (Xba I i BamH I), a fuzioni genski fragment VEGFR2-hFc je izolovan elektroforezom i ligiran sa ekspresionim vektorom pcDNA3.1 (nabavljen od Invitrogen) kako bi se dobio pcDNA3.1-VEGFR2-hFc, koji je transfektovan u kompetentne E. coli ćelije DH5α (nabavljene od TIANGEN-a); transfekcija i kultivacija su sprovedene prema uputstvu. Pozitivne kolonije pcDNA3.1-VEGFR2-hFc su ekranizovane, E. coli je amplifikovana prema konvencionalnom postupku, i zatim je korišćen komplet (nabavljen od Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd., DP103-03), a rekombinantni plazmid pcDNA3.1-VEGFR2-hFc je ekstrahovan prema uputstvu kompleta.
4. Transfekcija rekombinantnog plazmida pcDNA3.1-VEGFR2-hFc u 293F ćelije
2
[0119] Rekombinantni plazmid pcDNA3.1-VEGFR2-hFc je transfektovan u 293F ćelije (nabavljene od Invitrogena) u skladu sa kompletom za transfekciju lipofektamina (nabavljene od Invitrogena).
5. SDS-PAGE detekcija VEGFR2-hFc proteina elektroforezom
[0120] Nakon transfekcije rekombinantnog plazmida pcDNA3.1-VEGFR2-hFc u 293F ćelije na 7 dana, podloga za kulture je podvrgnuta centrifugiranju velike brzine, filtraciji kroz mikroporousnu membranu pod vakuumom i prečišćavanju u Mabselect SuRe koloni kako bi se dobio uzorak fuzionog proteina VEGFR2-hFc, a deo uzorka je dodat u pufer za bojenje uzoraka elektroforeze sniženog nivoa proteina radi SDS-PAGE detekcije elektroforezom.
[0121] Fuzioni protein VEGFR2-hFc je dobijen na taj način.
Primer pripreme 4: Priprema Anti-VEGFA antitela Bevacizumab
[0122] Kineska patentna objava CN1259962A se odnosi na aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca tržišnog VEGFA monoklonalnog antitela Avastin (bevacizumab). Genscript je poveren sintetisanju nukleotidnih sekvenci koje kodiraju varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca.
Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca bevacizumaba: (123 aa)
[0123]
Nukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region teškog lanca bevacizumaba: (369 bp)
[0124]
Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca bevacizumaba: (107 aa)
[0125]
2
Nukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region lakog lanca bevacizumaba: (321 bp)
[0126]
[0127] Konstantni regioni teškog lanca svi su bili C region gamma-1 lanca Ig, PRISTUP: P01857; konstantni regioni lakog lanca su svi bili C region kappa lanca Ig, PRISTUP: P01834.
[0128] cDNK teškog lanca i cDNk lakog lanca bevacizumaba su klonirane u vektor pcDNA3.1, i dobijen je rekombinantni ekspresioni plazmid antitela bevacizumab. Rekombinantni plazmid je transfektovan u 293F ćelije.293F podloga za ćelijske kulture je prečišćena a zatim detektovana.
[0129] Anti-VEGFA monoklonalno antitelo Avastin (bevacizumab) je samim tim dobijeno.
Primer pripreme 5: Priprema i detekcija anti-PD-1 humanizovanog antitela 14C12H1L1
[0130] Priprema je izvedena u skladu sa primerima 3-4 opisanim u Kineskoj patentnoj
objavi CN106977602A.
[0131] Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilni region lakog lanca humanizovanog antitela 14C12H1L1, i nukleotidna sekvenca koja kodira iste su takođe iste kao i one opisane u primerima 3-4 Kineske patentne objave CN106977602A, i takođe su obezbeđene ovde kao što sledi:
Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca humanizovanog antitela 14C12H1L1: (118 aa)
Nukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region teškog lanca humanizovanog antitela 14C12H1L1: (354 bp)
2
Aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca humanizovanog antitela 14C12H1L1: (107 aa)
Nukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region lakog lanca humanizovanog antitela 14C12H1L1: (321 bp)
[0132] Anti-PD-1 humanizovano antitelo 14C12H1L1 je samim tim dobijeno.
Primer pripreme 6: Priprema i identifikacija hIgG
[0133] Sekvenca humanog IgG anti-lizozima iz kokošijeg jajeta (anti-HEL, tj., humani IgG, skraćeno kao hIgG) je izvedena iz sekvence varijabilnog regiona Fab F10.6.6 u istraživanju koje je objavio Acierno i saradnici, pod naslovom "Affinity maturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodies" (Acierno et al., J Mol Biol.2007; 374(1): 130-46). Pripremni postupak je sledeći: Nanjing Genscript Biology je povereno izvođenje optimizacije kodona aminokiselina i sinteze gena za teški i laki lanac (kompletna sekvenca ili varijabilni region) humanog IgG antitela, i koristeći standardne tehnologije opisane u “Vodiču za molekularne kloniranje eksperimente (Treće izdanje)” i standardne tehnologije molekulskog kloniranja kao što su PCR, enzimska digestija, ekstrakcija DNK iz gela, ligacija, transfekcija, PCR kolonija ili identifikacija enzimske digestije, geni za teški i laki lanac su redom subklonirani u vektor za eksprimiranje teškog lanca antitela i vektor za ekspresiju lakog lanca antitela u sistemu za eksprimiranje sisara, a geni za teški i laki lanac rekombinantnog ekspresionog vektora su dalje sekvencionirani i analizirani. Nakon što je sekvenca potvrđena kao ispravna, pripremljeni su plazmidi za ekspresiju bez endotoksina u velikim količinama, a plazmidi za teški i laki lanac su privremeno kotransfektovani u HEK293 ćelije za ekspresiju rekombinantnog antitela. Nakon 7 dana kultivacije, podloga za kulture je prikupljena i afinitetno prečišćena korišćenjem rProtein A kolone (GE), a kvalitet dobijenog uzorka antitela je određen koristeći standardne analitičke tehnike SDS-PAGE i SEC-HPLC.
[0134] hIgG je samim tim dobijeno, i korišćeno u primerima 8-9 u nastavku.
Primer 1: Dizajn sekvence. Priprema i detekcija teških i lakih lanaca bifunkcionalnog antitela VP101 1. Dizajn sekvence
[0135] Struktura bifunkcionalnog antitela VP101 ovog pronalaska je u Morisonovom obliku formi (IgG-
2
scFv), tj. C-krajevi dva teška lanca IgG antitela su svaki povezani sa scFv fragmentom drugog antitela, a glavni dizajn kompozicije teških i lakih lanaca je prikazan u tabeli 1 ispod.
Tabela 1: Dizajn kompozicije teških i lakih lanaca VP101
[0136] U prethodnoj tabeli 1:
(1) One sa oznakom “V” u donjem desnom uglu se odnose na varijabilni region odgovarajućeg teškog lanca ili varijabilni region odgovarajućeg lakog lanca. Za one bez “V” oznake, odgovarajući teški ili laki lanac je pune dužine koja obuhvata konstantni region. Odgovarajuće sekvence opisane u gornjim primerima priprema se odnose na aminokiselinske sekvence ovih varijabilnih regiona ili pune dužine i nukleotidne sekvence koje ih kodiraju.
(2) Aminokiselinska sekvenca linkera 1 je GGGGSGGGGSGG GGSGGGGS (SEQ ID NO: 13) 2. Ekspresija i prečišćavanje antitela VP101
[0137] Svaka od cDNK sekvence teškog lanca i cDNK sekvence lakog lanca VP101 je klonirana u vektor pUC57jednostavan (koji obezbeđuje Genscript) da bi se dobili plazmidi pUC57jednostavan-VP101H i pUC57jednostavan- VP101L, redom.
[0138] Plazmidi pUC57jednostavan-VP101H i pUC57jednostavan-VP101L su enzimski digestovani (HindIII&EcoRI), a teški i laki lanci izolovani elektroforezom su subklonirani u vektor pcDNA3.1, a rekombinantni plazmidi su ekstrahovani za ko-transfekciju 293F ćelija. Nakon 7 dana kultivacije ćelija, podloga za kulture je centrifugirana na visokoj brzini, a supernatant je koncentrisan i učitan na HiTrap MabSelect SuRe koloni. Protein je dalje eluiran u jednoj fazi sa puferom za eluaciju, a ciljani uzorak antitela VP101 je izolovan i izmenjen puferom u PBS.
2. Detekcija antitela VP101
[0139] Prečišćeni uzorak je dodat i u pufer za bojenje uzoraka elektroforeze sniženog nivoa proteina i u pufer za bojenje uzoraka elektroforeze nesniženog nivoa proteina, a zatim je kuvan za SDS-PAGE detekciju elektroforezom. Elektroferogram VP101 je prikazan na FIG.1. Ciljani protein uzorka sniženog proteina je na 75 kD i 25 kD, a ciljani protein uzorka nesniženog proteina (jedno antitelo) je na 200 kD.
[0140] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, humanizovano antitelo VP101 korišćeno u eksperimentima koji slede je pripremljeno postupkom iz ovog primera.
Primer 2: Detekcija kinetičkih parametara humanizovanog antitela VP101
1. Detekcija kinetičkih parametara vezivanja humanizovanog antitela VP101 za PD-1-mFc
[0141] Pufer za razblaživanje uzorka je bio PBS (0.02% Tween-20, 0.1% BSA, pH 7.4).5 µg/mL antitela je imobilisano na AHC senzoru sa visinom imobilizacije od oko 0.4 nM. Senzor je bio izjednačen u puferu 60 sekundi, a antitelo imobilisano na senzoru vezanom za PD-1-mFc u koncentraciji od 0.62-50 nM (trostruko razblaživanje) tokom 120 sekundi, a zatim su antigen i antitelo disocirali u puferu 300 sekundi. Podaci su analizirani pomoću 1:1 prilagođavanja modela da bi se dobili afinitetne konstantne. Softver za dobijanje podataka bio je Fortebio Data Acquisition 7.0, a softver za analizu podataka bio je Fortebio Data Analiza 7.0. Kinetički parametri vezivanja antitela VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 i kontrolnog antitela nivolumab za PD-1-mFc su prikazani u tabeli 2, a rezultati detekcije kinetičkih karakterističnih parametara su prikazani na FIG.2, FIG.3, FIG.4, FIG.5 i FIG.6, redom.
Tabela 2: Kinetički parametri vezivanja humanizovanog antitela VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 i kontrolnog antitela nivolumab za PD-1-mFc
[0142] KDje konstanta afiniteta; kon je brzina vezivanja antigena i antitela; kdis je brzina disocijacije antigena i antitela; KD= kdis/kon.
[0143] Rezultati pokazuju da su antitela VP101 i BsAbB7 ekvivalentna u pogledu afiniteta za PD-1-mFc; konstanta afiniteta VP101 za PD-1-mFc je značajno manja od one za BsAbB8, što sugeriše da VP101 ima bolju aktivnost vezivanja; konstanta brzine disocijacije za VP101 i PD-1-mFc je značajno manja od onih za BsAbB8 i 14C12H1L1, što sugeriše da VP101 vezuje antigen stabilnije sa brzinom disocijacije koja je sporija od one za 14C12H1L1 i BsAbB8.
2. Detekcija kinetičkih parametara vezivanja humanizovanog antitela VP101 za VEGF-His
[0144] Pufer za razblaživanje uzorka bio je PBS (0.02% Tween-20, 0.1% BSA, pH 7.4).1 µg/mL VEGF-His je imobilisan na HIS1K senzoru tokom 20 sekundi, zatim je senzor ekvilibrisan u puferu 60 sekundi, a VEGF imobilisan na senzoru se vezivao za antitelo u koncentraciji od 12.34-1000 nM (trostruko gradijentno razblaživanje) tokom 120 s, a nakon čega su antigen i antitelo disocirali u puferu 300 s.
Podaci su analizirani pomoću 1:1 prilagođavanja modela da bi se dobila konstanta afiniteta. Softver za
1
dobijanje podataka bio je Fortebio Data Acquisition 7.0, a softver za analizu podataka bio je Fortebio Data Analiza 7.0.
[0145] Kinetički parametri vezivanja antitela VP101, BsAbB7, BsAbB8 i kontrolnog antitela bevacizumab za VEGF-His prikazani su u tabeli 3, a rezultati detekcije kinetičkih karakterističnih parametara su prikazani na FIG.7, FIG.8, FIG.9 i FIG.10 redom.
Tabela 3: Kinetički parametri vezivanja antitela VP101, BsAbB7, BsAbB8 i kontrolnog antitela bevacizumab za VEGF-His
[0146] Rezultati pokazuju da su antitela VP101 i BsAbB7 ekvivalentna u smislu afiniteta za antigen, a konstanta afiniteta VP101 je značajno manja od one kod BsAbB8 i kontrolnog antitela bevacizumab, što ukazuje na to da VP101 ima bolju aktivnost vezivanja; konstanta brzine disocijacije VP101 za VEGF-His je značajno manja od one kod BsAbB8, što ukazuje na to da se VP101 vezuje za antigen stabilnije sa sporijom brzinom disocijacije nego BsAbB8.
Primer 3: Detekcija aktivnosti vezivanja antitela VP101 za antigen ELISA-om
1. Detekcija aktivnosti vezivanja antitela VP101 za antigen VEGFA-his indirektnom ELISA-om [0147] Postupak je definisan na sledeći način:
Mikroploča je prekrivena VEGFA-His i inkubirana na 37 °C tokom 2 sata. Nakon pranja, mikroploča je blokirana sa 1% BSA tokom 2 sata. Nakon pranja, na mikroploču je dodato antitelo razblaženo po gradijentu i inkubirano na 37 °C tokom 30 minuta. Nakon pranja, na mikroploču je dodat radni rastvor enzimski označenog kozijeg anti-humanog IgG sekundarnog antitela i inkubirano je 30 minuta na 37 °C. Nakon pranja, na mikroploču je dodat TMB hromogeni rastvor za razvoj boje tokom 5 minuta u odsustvu svetlosti, a zatim je dodat rastvor za zaustavljanje hromogene reakcije. Nakon toga, mikroploča je odmah stavljena u čitač mikroploča, i OD vrednost svakog bunara u mikroploči je očitana na 450 nm. SoftMax Pro 6.2.1 je korišćen za analizu i obradu podataka.
[0148] Rezultat detekcije vezivanja antitela VP101 za antigen VEGFA-His je prikazan na FIG.11.
Intenziteti apsorbance pri svakoj dozi su prikazani u tabeli 4. Vezivanje EC50antitela je izračunat pomoću prilagođavanja krive, koristeći koncentraciju antitela kao abscisu i vrednost apsorbance kao ordinatu, a rezultati su prikazani u tabeli 4 u nastavku.
2
Tabela 4: Vezivanje bifunkcionalnog antitela za VEGFA-his (indirektna ELISA)
[0149] Rezultati pokazuju da antitelo VP101 može efikasno da se vezuje za VEGFA protein i da je njegova efikasnost vezivanja zavisna od doze. Takođe, dva antitela su ekvivalentna u pogledu aktivnosti vezivanja za humani VEGFA.
2. Detekcija odgovarajućih aktivnosti vezivanja antitela VP101, BsAbB7 i BsAbB8 za antigen VEGFA-His indirektnom ELISA-om
[0150] Postupak je definisan na sledeći način:
Mikroploča je prekrivena VEGFA-His i inkubirana tokom noći na 4 °C. Nakon pranja, mikroploča je blokirana sa 1% BSA (razblaženog u PBS) tokom 2 sata. Nakon pranja, mikroploča je dodata sa antitelom razblaženim u gradijentima i inkubirana na 37 °C tokom 30 minuta. Nakon pranja, mikroploči je dodat kozji anti-humani IgG Fc obeležen peroksidazom (Jackson, 109-035-098) i inkubirana je 30 minuta na 37 °C. Nakon pranja, mikroploči je dodatTMB (Neogen, 308177) za razvijanje boje tokom 5 minuta u odsustvu svetlosti, a zatim je dodat rastvor za zaustavljanje kako bi se prekinula hromogena reakcija. Potom je mikroploča odmah stavljena u čitač mikroploča, a OD vrednost svakog bunarčića u mikroploči je očitana na 450 nm. SoftMax Pro 6.2.1 je korišćen za analizu i obradu podataka.
[0151] Rezultat vezivanja antitela VP101 za antigen VEGFA-His prikazan je na FIG.12. Intenziteti apsorbance pri svakoj dozi su prikazani u tabeli 5. Vezivanje EC50antitela je izračunato prilagođavanjem krive koristeći koncentraciju antitela kao apscisu i vrednost apsorbance kao ordinatu, a rezultati su prikazani u Tabeli 5 u nastavku.
Tabela 5: Odgovarajuće aktivnosti vezivanja VP101, BsAbB7, BsAbB8 i bevacizumab za VEGFA-His (indirektna ELISA)
[0152] Rezultati pokazuju da antitela VP101, BsAbB7, BsAbB8 i bevacizumab mogu efikasno da vezuju VEGF protein, pri čemu je njihova efikasnost vezivanja zavisna od doze. Antitelo VP101 pokazuje veću aktivnost vezivanja za humani VEGF u poređenju sa BsAbB7 i BsAbB8.
3. Detekcija aktivnosti vezivanja antitela VP101 za antigen PD-1 indirektnom ELISA-om
[0153] Postupak je definisan na sledeći način:
Mikroploča je obložena humanim PD-1-mFc i inkubirana preko noći na 4 °C. Nakon blokiranja sa 1% BSA na 37 °C tokom 2 sata, dodato je antitelo i inkubirano na 37 °C tokom 30 minuta. Nakon pranja i sušenja mikroploče, dodato je sekundarno antitelo kozjeg anti-humanog IgG (H+L) obeleženog HRP (Jackson, 109-035-088) i inkubirano na 37 °C tokom 30 minuta. Nakon pranja i sušenja mikroploče, TMB (Neogen, 308177) je dodat za razvoj boje tokom 5 minuta, a zatim je dodat rastvor za zaustavljanje razvoja boje. Zatim je mikroploča je odmah stavljena u čitač mikroploča, a OD vrednost svakog bunarčića u ploči je merena na 450 nm. SoftMax Pro 6.2.1 je korišćen za analizu i obradu podataka.
[0154] Rezultat detekcije vezivanja antitela VP101 za antigen PD-1 prikazan je na FIG.13. Intenziteti apsorbance pri svakoj dozi prikazani su u tabeli 6. Kvantitativnom analizom vezanog antitela VP101, izvršena je simulacija krive kako bi se dobila efikasnost vezivanja EC50antitela, koja je prikazana u tabeli 6 u nastavku.
4
Tabela 6: Vezivanje bifunkcionalnog antitela za PD-1 (indirektna ELISA)
[0155] Rezultati pokazuju da antitelo VP101 može efikasno da se vezuje za PD-1 protein i da je njegova efikasnost vezivanja zavisna od doze.
4. Detekcija odgovarajućih aktivnosti vezivanja antitela VP101, BsAbB7 i BsAbB8 za antigen PD-1 indirektnom ELISA-om
[0156] Postupak je definisan na sledeći način:
Mikroploča je obložena humanim PD-1-mFc i inkubirana preko noći na 4 °C. Nakon blokiranja sa 1% BSA na 37 °C tokom 2 sata, mikroploči je dodato antitelo, a zatim je inkubirana na 37 °C tokom 30 minuta. Nakon pranja i sušenja mikroploči je dodat kozji anti-humani IgG Fc obeležen peroksidazom rena (Jackson, 109-035-098), i mikroploča je inkubirana na 37 °C tokom 30 minuta. Nakon pranja i sušenja mikroploči je dodat TMB (Neogen, 308177) za razvoj boje tokom 5 minuta, a zatim je dodat rastvor za zaustavljanje razvoja boje. Zatim je ploča neposredno stavljena u čitač mikroploča, i OD vrednost svakog bunarčića u mikroploči je očitana na 450 nm. SoftMax Pro 6.2.1 je korišćen za analizu i obradu podataka.
[0157] Rezultat detekcije vezivanja antitela VP101 za antigen PD-1 je prikazan na FIG.14. Intenziteti apsorbance u svakoj dozi su prikazani u tabeli 7. Kvantitativnom analizom vezanog antitela VP101, izvedena je simulacija krive da bi se dobila efikasnost vezivanja EC50antitela, koja je prikazana u tabeli 7 u nastavku.
Tabela 7: Odgovarajuće aktivnosti vezivanja antitela VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 i nivolumaba za PD-1 (indirektna ELISA)
[0158] Rezultati pokazuju da antitelo VP101 može efikasno da se vezuje za PD-1 protein i da je njegova efikasnost vezivanja zavisna od doze, i antitelo VP101 ima veću aktivnost vezivanja za humani PD-1 u odnosu na BsAbB7 i BsAbB8.
5. Detekcija antitela aktivnosti VP101 u kompeticiji sa VEGFR2 za vezivanje za antigen VEGFA kompetitivnom ELISA-om
[0159] Postupak je definisan na sledeći način:
Mikroploča je obložena sa VEGF-His i inkubirana na 37 °C tokom 2 sata. Nakon pranja, mikroploča je blokirana sa 1% BSA tokom 1 sata na 37 °C. Nakon pranja, mikroploči su dodata gradijentno razblažena antitela i humani VEGFR2 ECD-mFc-bio (konačna koncentracija: 0.02 µg/mL) i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Nakon pranja, mikroploči je dodat radni rastvor HRP-obeleženog streptavidina SA-HRP (1:4000) i inkubirana je na 37 °C tokom 30 minuta. Nakon pranja, mikroploči je dodat TMB hromogeni rastvor za razvoj boje tokom 5 minuta u odsustvu svetla, i zatim je dodat rastvora za zaustavljanje enzimske reakcije kako bi se završila hromogena reakcija. Zatim je ploča neposredno stavljena u čitač mikroploča, i OD vrednost svakog bunarčića u mikroploči je očitana na 450 nm. SoftMax Pro 6.2.1 je korišćen za analizu i obradu podataka.
[0160] Rezultati detekcije su prikazani na FIG 15. Intenziteti apsorbance u svakoj dozi su prikazani u tabeli 8. Kvantitativnom analizom intenziteta apsorbance vezanih antitela, izvedena je simulacija krive da bi se dobila efikasnost vezivanja EC50antitela (tabela 8).
Tabela 8: Detekcija antitela u kompeticiji sa VEGFR2-mFc za vezivanje za antigen VEGFA-His kompetitivnom ELISA-om
[0161] Rezultati pokazuju da antitelo VP101 može efikasno da se vezuje za antigen VEGFA i da inhibira vezivanje VEGFR2 za VEGFA, i njegova efikasnost u inhibiranju vezivanja VEGFR2 za VEGFA je dozno zavisna.
6. Detekcija antitela VP101 u kompeticiji sa PD-L1 za vezivanje za antigen PD-1 kompetitivnom ELISA-om
[0162] Postupak je definisan na sledeći način:
Mikroploča je obložena sa PD-1-hFc i inkubirana preko noći na 4 °C. Nakon što je mikroploča blokirana sa 1% BSA tokom 2 sata, antitela u različitim koncentracijama su mešana sa PD-L1-hFc tokom 10 minuta (videti tabelu 10 za koncentracije razblaženja). Nakon inkubacije na 37 °C tokom 30 minuta, mikroploča je oprana i osušena. Zatim je dodato sekundarno antitelo obeleženo enzimom, i mikroploča je inkubirana na 37 °C tokom 30 minuta. Nakon pranja i sušenja mikroploči je dodat TMB za razvoj boje tokom 5 minuta, a zatim je dodat rastvor za zaustavljanje razvoja boje. Zatim je ploča neposredno stavljena u čitač mikroploča, i OD vrednost svakog bunarčića u mikroploči je očitana na 450 nm (videti tabelu 10). SoftMax Pro 6.2.1 je korišćen za analizu i obradu podataka.
[0163] Rezultati detekcije su prikazani na FIG 16. Intenziteti apsorbance u svakoj dozi su prikazani u tabeli 9. Kvantitativnom analizom vezanog antitela VP101, izvedena je simulacija krive da bi se dobila efikasnost vezivanja EC50antitela (tabela 9).
Tabela 9: Detekcija bifunkcionalnog antitela koje ulazi u kompeticiju sa PD-L1 za vezivanje za PD-1 kompetitivnom ELISA-om
[0164] Rezultati pokazuju da antitelo VP101 može efikasno da se vezuje za antigen PD-1 i inhibira vezivanje liganda PD-L1 za PD-1, i njegova efikasnost kod inhibiranja vezivanja PD-L1 za PD-1 je dozno zavisna.
Primer 4: Vezivanja antitela VP101 za površinski antigen ćelijske membrane
[0165] Prvo, 293T ćelije koje eksprimiraju PD-1 antigen su konstruisane, i zatim je kapacitet specifičnog vezivanja antitela za površinski antigen ćelijske membrane analiziran i verifikovana portočnom citometrijom.
1. Konstrukcija 293T ćelija koje eksprimiraju PD-1 antigen
[0166] Vektor pLenti6.3-PD-1 iz PD-1 (vektor pLenti6.3 je nabavljen od Invitrogena) je transfektovan u 293T ćelijama, i skriningom je dobijena klonska grupa 293T-PD-1 ćelija koje stabilno eksprimiraju PD-1.
2. Detekcija vezivanja antitela za antigen ćelijske površine
[0167] 293T-PD-1 koji eksprimira antigen dobijen u prethodnoj fazi digestovan je pankreatinom konvencionalnim postupkom digestije pankreatina, a broj ćelija u svakoj epruveti za sakupljanje je podešen na 2×10<5>. Rastvori za razblaživanje antitela su postepeno razblaženi sa PBSA (1% BSA) i svako je inkubirano sa 293T-PD-1 ćelijama na ledu tokom 2 sata i zatim je u svaku epruvetu dodato 100 µL FITC kozjeg anti-humanog IgG (1:500) i inkubirano na ledu tokom 1 sata. Nakon toga, korišćen je PBS za pranje, a 300 µL PBSA je korišćeno za resuspendovanje ćelija, a signali fluorescencije (MFI) su detektovani u FITC kanalu na citometru protoka.
[0168] Rezultati su prikazani na FIG.17, i MFI vrednosti u svakoj koncentraciji su prikazani u tabeli 10. Analizom kvantifikacije fluorescencije i prilagođavanjem krive vezanog 14C12H1L1 antitela, vezivanje EC50VP101 antitela je izračunato da iznosi 3.5 nM.
Tabela 10: Analiza intenziteta fluorescencije vezivanja VP101 za 293T-PD-1 površinski antigen detektovan FACS-om
[0169] Rezultati pokazuju da VP101 antitelo može efikasno da se vezuje za PD-1 antigen na 293T-PD-1 površini ćelije domaćina, i efikasnost njegovog vezivanja je dozno zavisna, i bevacizumab nema aktivnost vezivanja za 293T-PD-1, što ukazuje da je vezivanje VP101 za 293T-PD-1 specifično.
3. Vezivanje antitela VP101, BsAbB7 i BsAbB8 za ćelijski površinski antigen je detektovano pozivanjem na eksperimentalni postupak opisan u fazi 2 ovog primera.
[0170] Rezultati su prikazani na FIG.18, MFI vrednosti u svakoj koncentraciji su prikazane u tabeli 11. Analizom kvantifikacije fluorescencije i prilagođavanjem krive vezanog antitela, vrednosti vezivanja EC50nivolumaba, 14C12H1L1, VP101, BsAbB7 i BsAbB8 su izračunate da iznose 7.853 nM, 3.607 nM, 7.896 nM, 9.943 nM i 10.610 nM, redom.
Tabela 11: Analiza intenziteta fluorescencije vezivanja VP101, BsAbB7 i BsAbB8 za 293T-PD-1 površinski antigen detektovan FACS-om
[0171] Rezultati pokazuju da VP101 antitelo može dase vezuje za membransku površinu PD-1 293T-PD1 na dozno zavisan način. Bevacizumab nema aktivnost vezivanja za 293T-PD-1, što ukazuje da je vezivanje VP101 za 293T-PD-1 specifično.
Primer 5: Kompetitivno vezivanja antitela VP101 za površinski antigen ćelijske membrane
[0172]
1. Usvojen je kompetitivni postupak protočne citometrije za detekciju EC50 VP101 u kompeticiji sa PD-L1 za vezivanje za površinski antigen ćelijske membrane PD-1, a postupak je definisan na sledeći način: 293T-PD-1 ćelije su digestovane na uobičajen način i podeljene u nekoliko uzoraka sa 300.000 ćelija za svaki, koji su zatim podvrgnuti centrifugiranju i pranju. Zatim je u svaku epruvetu dodato 100 µL odgovarajućeg antitela razblaženog u gradijent, i inkubirano na ledu tokom 30 minuta; zatim je u svaku epruvetu dodato 100 µL PD-L1-mFc, a smeša je dobro promešana da se postigne konačna koncentracija od 20 nM, i zatim inkubirana na ledu tokom 1 sata. Nakon toga je dodato 500 µL 1% PBSA, a smeša je centrifugirana na 5600 o/m tokom 5 minuta da se ukloni supernatant. Zatim je u svaku epruvetu dodat o100 µL FITC kozjeg anti-mišjeg antitela razblaženog u odnosu 1:500, i smeša je inkubirana na ledu tokom 40 minuta u odsustvu svetla, nakon što je dobro promešana. Nakon toga, smeša je centrifugirana, oprana i resuspendovana, a zatim prebačena u epruvetu za ispitivanje.
Rezultati su prikazani na FIG.19, MFI vrednosti u svakoj koncentraciji su prikazane u tabeli 12. Analizom kvantifikacije fluorescencije i prilagođavanjem krive, vrednosti vezivanja EC50antitela VP101 i 14C12H1L1 su izračunate da iznose 8.33 nM i 4.37 nM, redom.
Tabela 12: Analiza intenziteta fluorescencije 14C12H1L1 i VP101 u kompeticiji za vezivanje za 293T-PD-1 površinski antigen detektovan FACS-om
Rezultati pokazuju da VP101 antitelo može efikasno da blokira vezivanje PDL-1 za PD-1 na površini 293T-PD-1 ćelija domaćina na dozno zavisan način.
2. EC50vrednosti VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 i nivolumaba u kompeticiji sa PD-L1 za vezivanje za površinski antigen ćelijske membrane PD-1 detektovane pomoću kompetitivne citometrije protoka, uz oslanjanje na eksperimentalni postupak opisan u fazi 1 ovog primera.
[0173] Rezultati su prikazani na FIG.20, i MFI vrednosti u svakoj koncentraciji su prikazane u tabeli 13. Analizom kvantifikacije fluorescencije i prilagođavanjem krive, vrednosti kompetitivnog vezivanja EC50 antitela VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 i nivolumaba su izračunate da iznose 15.04 nM, 22.25 nM, 19.25 nM, 9.21 nM i 9.72 nM, redom.
4
Tabela 13: Analiza intenziteta fluorescencije VP101, BsAbB7, BsAbB8, 14C12H1L1 i nivolumaba u kompeticiji za vezivanje za 293T-PD-1 površinski antigen detektovan FACS-om
[0174] Rezultati pokazuju da je aktivnost antitela 14C12H1L1 ekvivalentna onog tržišnog antitela nivolumab koje cilja PD-1, i superiorno je u odnosu na bifunkcionalno antitelo VP101. Aktivnost antitela VP101 je superiorna u odnosu na BsAbB7 i BsAbB8.
Primer 6: Detekcija bioaktivnosti neutralizacije antitela VP101, BsAbB7 i BsAbB8 u blokiranju VEGF kako bi se aktivirao NFAT signalni put
1. Konstrukcija 293T-NFAT-(opv)KDR(C7) ćelija
[0175] KDR (VEGFR2) vektor pCDH-KDRFL(OPV)-GFP-Puro (Vektor pCDH-GFP-Puro is nabavljen od Youbio) i NFAT vektor pNFAT-luc-hygro (vektor pGL4-luc2P-hygroje nabavljen od Promega) su transfektovana u 293T ćelije, i skriningom je dobijena klonska grupa 293T-NFAT-(opv) KDR(C7) ćelija koje stabilno eksprimiraju reporterske gene luciferaze KDR i NFAT.
[0176] 2.293T-NFAT-(opv)KDR(C7) su prikupljene i centrifugirane tokom 5 minuta da bi se uklonio supernatant; korišćena je DMEM+10%FBS podloga za resuspendovanje ćelija, a zatim je prebrojan broj ćelija i detektovana je njihova vitalnost. Nakon toga, koncentracija ćelija je podešena na odgovarajući nivo, a 50.000 ćelija/50 µL ćelijske suspenzije je dodato u svaki bunarčić crne ploče sa 96 bunarčića;
[0177] Odgovarajuća antitela (konačne koncentracije 300, 100, 10, 2, 0.2, 0.02, 0.002 nM) i VEGF (konačna koncentracija 30 ng/mL) razblažena su prema eksperimentalnom dizajnu, a antitela koja cilja VEGF su prethodno inkubirana sa VEGF tokom 1 sata na sobnoj temperaturi pre nego što su dodata ćelijama. Prazne i izotipne kontrole (konačna zapremina svakog bunarčića 100 µL) su pripremljene i inkubirane u inkubatoru sa ugljen-dioksidom na 37 °C, 5% CO2tokom 4 sata. Zatim je u svaki bunarčić dodato 50 µL sistema za određivanje luciferaze, a relativne jedinice fluorescencije (RLUs) su detektovane pomoću višestruko obeleženog testera mikroploče u roku od 5 minuta.
[0178] Eksperimentalni rezultati su prikazani na FIG.21, i EC50vrednosti za svako antitelo su prikazane u tabeli 14.
Tabela 14: Detekcija bioaktivnosti neutralizacije antitela VP101, BsAbB7 i BsAbB8 u blokiranju VEGF kako bi se aktivirao NFAT signalni put određivanjem reportera
[0179] Rezultati pokazuju da EC50iz VP101 je 1.240 nM, EC50iz BsAbB7 je 1.217 nM, EC50iz BsAbB8 je 1.728 nM, i EC50bevacizumaba je 0.773 nM, i eksperimentalni rezultati pokazuju da aktivnost VP101 i BsAbB7 u blokiranju VEGF kako bi se aktivirao NFAT signalni put je bolja od BsAbB8.
Primer 7: Eksperiment o inhibiciji proliferacije HUVEC ćelija izazvane VEGFA antitelom VP101
[0180] HUVEC ćelije (nabavljene od Allcell-a) u dobrom stanju rasta, nakon što je koncentracija ćelija podešena na 1,5 × 10<4>/mL, su inokulisane u ploči sa 96 bunarčića u zapremini od 200 µL po bunarčiću i zatim inkubirane u inkubatoru na 37 °C, 5% CO2tokom 24 sata. Nakon toga, primećeno je da su se ćelije dobro prilagodile, a zatim je podloga za kulture odbačena. U ploču sa 96 bunarčića je dodat 20 nM VEGFA pripremljen korišćenjem 1640 koji sadrži 2% FBS, u zapremini od 200 µL po bunarčiću, a zatim su dodata antitela u različitim koncentracijama, nakon čega je usledila inkubacija tokom 72 sata. Nakon 72 sata, podloga za kulture je odbačena, a dodat je MTT. Nakon 4 sata, MTT je odbačen, a dodat je DMSO, i zatim je korišćen čitač mikroploča za merenje OD vrednosti na 490 nm.
[0181] Rezultati su prikazani na FIG.22. Rezultati pokazuju da humanizovana antitela VP101 i bevacizumab mogu efikasno inhibirati VEGFA-indukovanu proliferaciju HUVEC ćelija na dozno zavisan način, a farmakološka aktivnost VP101 u inhibiciji VEGFA-indukovane proliferacije HUVEC ćelija je veća od one bevacizumaba pri istoj dozi.
Primer 8: Pospešivanje sekrecije citokina IFN-γ i IL-2 u mešovitoj limfocitnoj reakciji
[0182] 1. Pospešivanje sekrecije IFN-γ putem VP101, 14C12H1L1 i nivolumaba u mešanom sistemu kultura DC i PBMC ćelija
[0183] PBMC su izolovani Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) i dodati u IL-4 (Peprotech 200-04, 1000 U/mL) i GM-CSF (Peprotech 300-03, 1000 U/mL) u trajanju od 6 dana od indukcije, i zatim je TNF-α (Peprotech 300-01A, 200 U/mL) dodatno dodavan 3 dana od indukcije kako bi se dobile zrele DC ćelije.
[0184] Na dan zajedničkog kultivisanja, sveže PBMC su izolovane iz periferne krvi drugog davaoca, a dobijene zrele DC ćelije su pomešane sa sveže izolovanim PBMC drugog davaoca u odnosu 1:10. U međuvremenu su dodata antitela u različitim koncentracijama (hIgG kao kontrola). Nakon zajedničkog kultivisanja koje je trajalo 5-6 dana, supernatant ćelija je prikupljen i analiziran na sadržaj IFN-γ pomoću ELISA kompleta (nabavljen od Dakewe).
[0185] Efekat VP101 na sekreciju IFN-y u mešanom sistemu kultura DC i PBMC ćelija je prikazan na FIG.
23. Kao što da se vidi na FIG.23, VP101 može efikasno podsticati sekreciju IFN-γ na dozno zavisan način. Pored toga, pri dozama od 30 nM i 300 nM, VP101 ima veću aktivnost u pospešivanju sekrecije IFN-γ nego ekvivalentni 14C12H1L1, a na nivou doze od 30 nM, ima veću aktivnost u pospešivanju sekrecije IFN-γ nego ekvivalentni nivolumab.
[0186] 2. Pospešivanje sekrecije IL-2 i IFN-y putem VP101, BsAbB7 i BsAbB8b u mešanom sistemu kultura DC i PBMC ćelija
[0187] Faza 1 u ovom primeru se oslanja na eksperimentalni postupak, gde su PBMC izolovani korišćenjem Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) i dodavani su IL-4 (Peprotech 200-04, 1000 U/mL) i GM-CSF (Peprotech 300-03, 1000 U/mL) tokom 6 dana indukcije. Zatim je dodatno dodavan TNF-α (Peprotech 300-01A, 200 U/mL) tokom 3 dana indukcije kako bi se dobile zrele DC ćelije.
[0188] Na dan zajedničkog kultivisanja, sveži PBMC su izolovani iz periferne krvi drugog davaoca, a dobijene zrele DC ćelije su pomešane sa sveže izolovanim PBMC drugog davaoca u odnosu 1:10. U međuvremenu su dodata antitela u različitim koncentracijama (hIgG kao kontrola). Nakon zajedničkog kultivisanja koje je trajalo 5-6 dana, supernatant ćelija je prikupljen i analiziran na sadržaj IL-2 i IFN-γ pomoću ELISA kompleta (nabavljen od Dakewe).
[0189] Efekat VP101 na sekreciju IFN-γ u mešanom sistemu kultura DC i PBMC ćelija je prikazan na FIG.
24. Kao što se može videti sa FIG.24, VP101 može efikasno da pospešuje sekreciju IFN-γ na dozno zavisan način. Farmakološka aktivnost VP101 u pospešivanju sekrecije IFN-γ je značajno bolja od aktivnosti BsAbB7 i BsAbB8.
[0190] Efekat VP101 na sekreciju IL-2 u mešanom sistemu kultura DC i PBMC ćelija je prikazan na FIG.
25. Kao što se može videti sa FIG.25, VP101 može efikasno da pospešuje sekreciju IL-2 na dozno zavisan način, a farmakološka aktivnost VP101 u pospešivanju sekrecije IL-2 je bolja od aktivnosti BsAbB7 i BsAbB8.
[0191] 3. Pospešivanje sekrecije IL-2 i IFN-y putem VP101, 14C12H1L1 i nivolumaba u mešanom sistemu kultura PBMC i Raji-PD-L1 ćelija.
[0192] PD-L1 je stabilno transfektovan u Raji ćelije putem infekcije lentivirusom, a Raji-PD-L1 ćelije koje stabilno eksprimiraju eksprimiraju PD-L1 su dobijene nakon doziranja i skeniranja. PBMC, nakon dvodnevne stimulacije SEB-om, su kultivisane zajedno sa mitomicin C-tretiranim Raji-PD-L1 ćelijama.
[0193] Rezultati su prikazani na FIG.26 i 27. Rezultati pokazuju da VP101 može efikasno da pospešuje sekreciju IL-2 i IFN-y, i u doznom nivou od 300 nM, aktivnost VP101 u pospešivanju sekrecije IL-2 je značajno bolje od ekvivalentnog 14C12H1L1 i nivolumaba.
[0194] Antitelo izotipne kontrole koje će se proučavati je human anti-hen lizozim (anti-HEL, tj. humani IgG, skraćeno kao hIgG), a pripremljeno je kao što je opisano u prethodno pomenutom primeru pripreme 6.
[0195] 4. Pospešivanje sekrecije IL-2 i IFN-y putem VP101, BsAbB7 i BsAbB8 u mešanom sistemu kultura PBMC i Raji-PD-L1 ćelija je ispitano u odnosnom eksperimentalnom postupkom opisanom u fazi 3 ovog
4
primera.
[0196] Rezultati sekrecije IFN-y su prikazani na FIG.28. Rezultati pokazuju da VP101 može efikasno da pospeši sekreciju IFN-y na dozno zavisan način. U isto vreme, VP101 je značajno bolji od BsAbB7 u istoj dozi, dok je farmakološka aktivnost VP101 značajno bolja od one od BsAbB8 u doznim nivoima od 3 nM i 30 nM.
[0197] Rezultati sekrecije IL-2 prikazani su na FIG.29. Rezultati pokazuju da VP101 može efikasno da pospeši sekreciju IL-2 na dozno-zavisan način. U isto vreme, farmakološka aktivnost VP101 je značajno bolja od aktivnosti BsAbB7 pri dozama od 3 nM i 300 nM, dok je VP101 ekvivalentan BsAbB8 pri istoj dozi.
Primer 9: Eksperiment inhibicije tumora rasta In Vivo pomoću VP101
[0198] Da bi se otkrila in vivo aktivnost inhibicije tumora VP101, U87MG ćelije (ćelije humanog glioma, nabavljene od ATCCa-) prvo su inokulisane subkutano u ženke Scid Beige miševa stare 5-7 nedelja (nabavljene od Vital River-a), i modelovanje i specifičan način primene prikazani su u tabeli 15. Nakon primene, merene su dužina i širina tumora svake grupe, i izračunata je zapremina tumora.
Tabela 15: Dozni režim tretiranja U87MG ksenografta tumora Scid Beige mišjeg modela sa VP101
[0199] Rezultati su prikazani na FIG.30. Rezultati pokazuju da u poređenju sa izotipskim kontrolnim antitelom hIgG (postupak pripreme je isti kao u primeru pripreme 6), bevacizumab i VP101 u različitim dozama mogu efikasno da inhibiraju rast tumora kod miševa, pri čemu je visokodozni VP101 bolji od niskodoznog VP101 u inhibiciji tumora.
[0200] Dalje, kao što je prikazano na FIG.31, VP 101 ne utiče na telesnu masu miša sa tumorom.
[0201] Ovaj pronalazak definišu patentni zahtevi i svi drugi ovde definisani aspekti, konfiguracije ili načini ostvarivanja koji ne potpadaju pod obim ovih patentnih zahteva su dati samo informativno.

Claims (20)

Patentni zahtevi
1. Bispecifično antitelo, koje obuhvata:
prvi proteinski funkcionalni region koji cilja VEGFA, i
drugi proteinski funkcionalni region koji cilja PD-1;
pri čemu:
prvi proteinski funkcionalni region predstavlja anti-VEGFA antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu anti-VEGFA antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 15-17 redom, i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 18-20 redom; i
drugi proteinski funkcionalni region predstavlja anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, pri čemu anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 21-23 redom, i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 24-26 redom.
2. Bispecifično antitelo prema zahtevu 1, pri čemu je,
anti-VEGFA antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen izabran iz grupe koju čine Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, humanizovano antitelo, himerno antitelo, i dijatelo;
i/ili,
anti-PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen izabran iz grupe koju čine Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, humanizovano antitelo, himerno antitelo, i dijatelo.
3. Bispecifično antitelo prema zahtevu 1, pri čemu:
(i) prvi proteinski funkcionalni region je imunoglobulin, pri čemu taj imunoglobulin obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 15-17 redom, i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 18-20 redom; i
drugi proteinski funkcionalni region je scFv, pri čemu taj scFv obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 21-23 redom, i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 24-26 redom,
opciono pri čemu je aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina definisana u SEQ ID NO: 5, a aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina je definisana u SEQ ID NO: 7; i
4
aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca iz scFv je definisana u SEQ ID NO: 9, i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca iz scFv je definisana u SEQ ID NO: 11;
ili,
(ii) prvi proteinski funkcionalni region je scFv, pri čemu taj scFv obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 15-17 redom, i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 18-20 redom; i
drugi proteinski funkcionalni region je imunoglobulin, pri čemu taj imunoglobulin obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 21-23 redom, i obuhvata varijabilni region lakog lanca koji obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 24-26 redom,
opciono pri čemu je aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca iz scFv definisana u SEQ ID NO: 5, i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca iz scFv je definisana u SEQ ID NO: 7; i
aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina je definisana u SEQ ID NO: 9, i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina je definisana u SEQ ID NO: 11.
4. Bispecifično antitelo prema zahtevu 3, pri čemu:
(i) imunoglobulin predstavlja IgG, IgA, IgD, IgE, ili IgM;
(ii) bispecifično antitelo obuhvata dva scFv, i jedan kraj svakog scFv je povezan sa C-krajem ili N-krajem svakog od ta dva polipeptida teškog lanca imunoglobulina; i/ili
(iii) pri čemu taj imunoglobulin obuhvata dva para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par obuhvata polipeptid teškog lanca i polipeptid lakog lanca.
5. Bispecifično antitelo prema zahtevu 3 ili 4, pri čemu taj imunoglobulin obuhvata ne-CDR region izveden iz humanog antitela.
6. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 3-5, pri čemu,
taj imunoglobulin obuhvata konstantne regione izvedene iz humanog antitela, opciono, pri čemu su ti konstantni regioni imunoglobulina izabrani od konstantnih regiona humanog IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4.
7. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 3-6, pri čemu,
taj imunoglobulin obuhvata konstantni region teškog lanca i konstantni region lakog lanca, pri čemu taj konstantni region teškog lanca predstavlja C region gamma-1 lanca humanog Ig ili C region gamma-4
4
lanca humanog Ig, i konstantni region lakog lanca predstavlja C region kappa lanca humanog Ig.
8. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu su prvi i drugi proteinski funkcionalni regioni povezani direktno ili putem fragmenta linkera;
opciono, pri čemu taj fragment linkera predstavlja (GGGGS)m, pri čemu m predstavlja pozitivan ceo broj kao što je 1, 2, 3, 4, 5, ili 6.
9. Bispecifično antitelo prema zahtevu 3, pri čemu,
prvi proteinski funkcionalni region koji cilja VEGFA predstavlja anti-VEGFA IgG1 imunoglobulin i obuhvata dva para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par obuhvata polipeptid teškog lanca i polipeptid lakog lanca, pri čemu:
(i) polipeptid teškog lanca obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 15-17, redom, i C region gamma-1 lanca humanog Ig ; i
(ii) polipeptid lakog lanca obuhvata varijabilni region lakog lanca koji obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 18-20, redom, i C region kappa humanog Ig; i drugi proteinski funkcionalni region koji cilja PD1 predstavlja dva anti-PD-1 scFv, pri čemu svaki scFv obuhvata:
(i) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata HCDR1-HCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 21-23, redom; i
(ii) varijabilni region lakog lanca koji obuhvata LCDR1-LCDR3 sa aminokiselinskim sekvencama definisanim u SEQ ID NO: 24-26, redom;
pri čemu varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca svakog od anti-PD-1 scFv su povezani fragmentom prvog linkera sa aminokiselinskom sekvencom definisanom u SEQ ID NO: 13; i pri čemu jedan kraj svakog anti-PD-1 scFv je povezan sa C-krajem svakog polipeptida teškog lanca anti -VEGFA IgG1 imunoglobulina fragmentom drugog linkera sa aminokiselinskom sekvencom definisanom u SEQ ID NO:13.
10. Bispecifično antitelo prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu su brojevi prvih i drugih funkcionalnih regiona proteina svaki nezavisno 1, 2 ili više.
11. Bispecifično antitelo prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu,
bispecifično antitelo se vezuje za VEGFA protein sa EC50manjom od 1 nM, manjom od 0.5 nM, manjom od 0.2 nM, manjom od 0.15 nM, ili manjom od 0.14 nM; pri čemu se EC50detektuje indirektnom ELISA-om;
i/ili,
4
bispecifično antitelo se vezuje za PD-1 protein sa EC50manjom od 1 nM, manjom od 0.5 nM, manjom od 0.2 nM, manjom od 0.17 nM, manjom od 0.16 nM, ili manjom od 0.15 nM; pri čemu, EC50se detektuje indirektnom ELISA-om.
12. Izolovani molekul nukleinske kiseline, koji kodira bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-11.
13. Vektor, koji obuhvata izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 12.
14. Ćelija domaćina, koja obuhvata izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 12 ili vektor prema zahtevu 13.
15. Postupak za pripremu bispecifičnog antitela prema bilo kom od zahteva 1-11, koji obuhvata: kultivisanje ćelije domaćina prema zahtevu 14 u pogodnom stanju, i izolovanje bispecifičnog antitela iz ćelijskih kultura.
16. Konjugat, koji obuhvata a bispecifično antitelo i konjugovanu grupu, pri čemu to bispecifično antitelo je bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-11, a konjugovana grupa je obeležje koje može da se detektuje; opciono, konjugovana grupa je radioizotop, fluorescentna supstanca, luminiscentna supstanca, obojena supstanca, ili enzim.
17. Komplet, koji obuhvata bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-11 ili konjugat prema zahtevu 16;
pri čemu taj komplet dodatno obuhvata drugo antitelo koje specifično može da se vezuje za bispecifično antitelo; opciono,
pri čemu to drugo antitelo dodatno obuhvata obeležje koje može da se detektuje, kao što je radioizotop, fluorescentna supstanca, luminiscentna supstanca, obojena supstanca, ili enzim.
18. Upotreba bispecifičnog antitela prema bilo kom od zahteva 1-11 u pripremi kompleta za detektovanje prisustva ili nivoa VEGFA i/ili PD-1 u nekom uzorku.
19. Farmaceutska kompozicija, koja obuhvata bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-11 ili konjugat prema zahtevu 16, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
20. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1-11 ili konjugat prema zahtevu 16 za upotrebu u sprečavanju i/ili lečenju malignog tumora, pri čemu je opciono, maligni tumor izabran iz grupe koju čine kancer debelog creva, rektalni kancer, kancer pluća kao što je kancer pluća ne-malih ćelija, kancer jetre, kancer jajnika, kancer kože, gliom, melanom, tumor bubrega, kancer prostate, kancer bešike, gastrointestinalni kancer, kancer dojke, kancer mozga i leukemija.
4
RS20241104A 2018-08-30 2019-08-30 Anti-pd-1 i anti-vegfa bifunkcionalno antitelo, njegova farmaceutska kompozicija i njena upotreba RS66073B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811002548.4A CN109053895B (zh) 2018-08-30 2018-08-30 抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途
EP19853809.2A EP3882275B1 (en) 2018-08-30 2019-08-30 Anti-pd-1 and anti-vegfa bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof
PCT/CN2019/103618 WO2020043184A1 (zh) 2018-08-30 2019-08-30 抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66073B1 true RS66073B1 (sr) 2024-11-29

Family

ID=64758699

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241104A RS66073B1 (sr) 2018-08-30 2019-08-30 Anti-pd-1 i anti-vegfa bifunkcionalno antitelo, njegova farmaceutska kompozicija i njena upotreba

Country Status (25)

Country Link
US (3) US20210340239A1 (sr)
EP (2) EP3882275B1 (sr)
JP (3) JP7374995B2 (sr)
KR (1) KR102924276B1 (sr)
CN (1) CN109053895B (sr)
AU (2) AU2019332708B2 (sr)
BR (1) BR112021003559A2 (sr)
CA (1) CA3110749A1 (sr)
DK (1) DK3882275T5 (sr)
EA (1) EA202190535A1 (sr)
ES (1) ES2989584T3 (sr)
FI (1) FI3882275T3 (sr)
HR (1) HRP20241417T1 (sr)
HU (1) HUE068809T2 (sr)
IL (1) IL281116A (sr)
LT (1) LT3882275T (sr)
MX (1) MX2021002312A (sr)
PH (1) PH12021550407A1 (sr)
PL (1) PL3882275T3 (sr)
PT (1) PT3882275T (sr)
RS (1) RS66073B1 (sr)
SG (1) SG11202101985TA (sr)
SI (1) SI3882275T1 (sr)
WO (1) WO2020043184A1 (sr)
ZA (1) ZA202101894B (sr)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
SG11201805420SA (en) 2015-12-30 2018-07-30 Kodiak Sciences Inc Antibodies and conjugates thereof
CA3092588A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 Kodiak Sciences Inc. Il-6 antibodies and fusion constructs and conjugates thereof
CN109053895B (zh) * 2018-08-30 2020-06-09 中山康方生物医药有限公司 抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途
CN111423512B (zh) * 2019-01-10 2024-01-05 北京比洋生物技术有限公司 阻断血管内皮细胞生长且活化t细胞的多靶向融合蛋白和包含其的药物组合物
CN109942712B (zh) * 2019-04-01 2022-12-20 华博生物医药技术（上海）有限公司 抗pd-l1/vegf双功能抗体及其用途
AU2020324185A1 (en) * 2019-08-02 2022-03-03 CTTQ-Akeso (ShangHai) Biomed. Tech. Co., Ltd. Anti-PD-1 antibody and medical use thereof
CN112480253B (zh) 2019-09-12 2022-09-20 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗pd-l1纳米抗体及其衍生物和用途
AU2020364071A1 (en) 2019-10-10 2022-05-26 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
GB201914747D0 (en) * 2019-10-11 2019-11-27 Ultrahuman Eight Ltd PD1 and vegfr2 dual-binding agents
MX2022006330A (es) * 2019-11-25 2022-08-17 Akeso Biopharma Inc Anticuerpo biespecífico anti-pd-1 anti-vegfa, composición farmacéutica y uso del mismo.
BR112022014487A2 (pt) * 2020-01-21 2022-09-27 Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd Anticorpo bispecífico anti-pd-l1/vegf e usos do mesmo
BR112022021426A2 (pt) * 2020-04-22 2022-12-13 Akeso Biopharma Inc Anticorpo biespecífico anti-cd73/anti-pd-1, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, método para preparar o anticorpo biespecífico anti-cd73/anti-pd-1, conjugado, kit, usos do anticorpo biespecífico anti-cd73/anti-pd-1, composição farmacêutica, método in vitro, linhagem celular de hibridoma e anticorpo monoclonal anti-cd73
CA3181579A1 (en) * 2020-04-29 2021-11-04 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Bifunctional protein against pd-1 and tgf-.beta.
CN114057883B (zh) * 2020-07-31 2024-04-16 江苏恒瑞医药股份有限公司 双特异性抗原结合分子及其医药用途
CN114106190B (zh) 2020-08-31 2025-04-08 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗vegf/pd-l1双特异性抗体及其用途
WO2022068894A1 (zh) * 2020-09-30 2022-04-07 上海齐鲁制药研究中心有限公司 同时靶向pd-l1和vegf的双功能分子及其医药用途
CN114316025B (zh) * 2020-12-25 2025-01-03 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Vegfr2基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
EP4190819A4 (en) * 2021-03-12 2024-08-14 Akeso Biopharma, Inc. PHARMACEUTICAL COMBINATION CONTAINING BISPECIFIC ANTI-PD-1-ANTI-VEGFA ANTIBODY, AND USE THEREOF
CN117062841A (zh) * 2021-03-31 2023-11-14 上海药明生物技术有限公司 双特异性抗pd-l1/vegf抗体及其用途
BR112023018450A2 (pt) * 2021-04-14 2023-11-07 Akeso Biopharma Inc Anticorpo monoclonal anti-cd47 e seu uso
CN115197325A (zh) * 2021-04-14 2022-10-18 康方药业有限公司 抗体在抗肿瘤治疗中的用途
CN116143935A (zh) * 2021-11-22 2023-05-23 杭州翰思生物医药有限公司 重组抗体及其应用
CN114181310B (zh) * 2022-02-14 2022-07-05 中山康方生物医药有限公司 抗tigit抗体、其药物组合物及用途
KR20250048552A (ko) * 2022-07-20 2025-04-09 밍훼이 파마슈티컬 (항저우) 리미티드 다중특이적 항체 및 이의 용도
TW202413427A (zh) * 2022-08-09 2024-04-01 大陸商上海濟煜醫藥科技有限公司 一種靶向ｐｄ－１和ｖｅｇｆ的抗體及其應用
CN117679505A (zh) * 2022-09-09 2024-03-12 中山康方生物医药有限公司 药物组合及用途
CN116003619B (zh) * 2022-12-12 2023-08-04 三门峡市眼科医院 人源化抗Ang-2和VEGF双功能抗体及其医药用途
IL324586A (en) 2022-12-30 2026-01-01 Remegen Shanghai Co Ltd Bispecific antibody and its use
CN119039450A (zh) * 2023-05-22 2024-11-29 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd-1-抗vegf的双特异性抗体、其药物组合物及其用途
WO2025006794A1 (en) * 2023-06-29 2025-01-02 Promab Biotechnologies, Inc. Her-2 -cd3-epsilon bispecific antibodies
WO2025056056A1 (zh) * 2023-09-14 2025-03-20 中山康方生物医药有限公司 药物组合及用途
CN120361206A (zh) * 2024-01-25 2025-07-25 中山康方生物医药有限公司 抗pd-1-抗vegfa的双特异性抗体的医药用途
WO2025193962A1 (en) * 2024-03-15 2025-09-18 OncoC4, Inc. Anti-vegf and pd-1 bispecific antibodies and uses thereof

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
WO1998045331A2 (en) 1997-04-07 1998-10-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
EP3441402A1 (en) 2007-10-30 2019-02-13 Genentech, Inc. Antibody purification by cation exchange chromatography
PL2350129T3 (pl) * 2008-08-25 2015-12-31 Amplimmune Inc Kompozycje antagonistów PD-1 i sposoby stosowania
ES2534355T3 (es) 2009-06-17 2015-04-21 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anticuerpos anti-VEGF y sus usos
EP2542590B2 (en) 2010-03-05 2020-04-01 The Johns Hopkins University Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins
US9834615B2 (en) 2010-08-16 2017-12-05 Novimmune Sa Methods for the generation of multispecific and multivalent antibodies
US20150086584A1 (en) 2012-03-22 2015-03-26 University Of Miami Multi-specific binding agents
KR102129636B1 (ko) * 2012-05-31 2020-07-03 제넨테크, 인크. Pd-l1 축 결합 길항제 및 vegf 길항제를 사용하여 암을 치료하는 방법
US10131712B2 (en) * 2012-08-14 2018-11-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with T-cell redirecting bispecific antibodies and checkpoint inhibitors
US20140154255A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
EP3161000A4 (en) * 2014-06-28 2018-05-02 Kodiak Sciences Inc. Dual pdgf/vegf antagonists
AR103477A1 (es) * 2015-01-28 2017-05-10 Lilly Co Eli Compuestos de vegfa / ang2
WO2017185662A1 (zh) 2016-04-29 2017-11-02 深圳市中联生物科技开发有限公司 多特异性结合偶联物、相关的药物组合物及应用
CN105175544B (zh) 2015-10-20 2021-04-09 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗pd-1人源化单克隆抗体及其应用
CN105175545B (zh) * 2015-10-20 2019-01-25 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗vegf-抗pd-1双功能抗体及其应用
CN106632674B (zh) 2015-10-30 2018-11-16 泽达生物医药有限公司 一种抗pd-1单克隆抗体、其药物组合物及其用途
US11459405B2 (en) * 2015-12-28 2022-10-04 Massachusetts Institute Of Technology Bispecific antibodies having constant region mutations and uses therefor
EP3397281B1 (en) 2015-12-29 2020-09-09 Outlook Therapeutics, Inc. Buffered formulations of bevacizumab
CN107922503B (zh) 2016-03-04 2018-08-28 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种pdl-1抗体、其药物组合物及其用途
WO2017165681A1 (en) * 2016-03-24 2017-09-28 Gensun Biopharma Inc. Trispecific inhibitors for cancer treatment
KR20190003958A (ko) * 2016-04-15 2019-01-10 제넨테크, 인크. 암의 치료 및 모니터링 방법
CN106967172B (zh) * 2016-08-23 2019-01-08 康方药业有限公司 抗ctla4-抗pd-1 双功能抗体、其药物组合物及其用途
CN106977602B (zh) * 2016-08-23 2018-09-25 中山康方生物医药有限公司 一种抗pd1单克隆抗体、其药物组合物及其用途
CN106519034B (zh) 2016-12-22 2020-09-18 鲁南制药集团股份有限公司 抗pd-1抗体及其用途
KR102536145B1 (ko) 2017-01-20 2023-05-30 타유 후아시아 바이오테크 메디컬 그룹 컴퍼니 리미티드 항-pd-1 항체 및 이의 용도
MA48637A (fr) 2017-05-09 2021-03-17 Merck Sharp & Dohme Polythérapies pour le traitement du cancer
CN109963592B (zh) 2017-06-05 2022-11-22 江苏恒瑞医药股份有限公司 Pd-1抗体与vegf配体或vegf受体抑制剂联合在制备治疗肿瘤的药物中的用途
WO2019148412A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-pd-1/lag3 bispecific antibodies
AU2019218433A1 (en) 2018-02-11 2020-09-03 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-PD-1/anti-VEGF natural antibody structure-like heterodimeric form bispecific antibody and preparation thereof
KR102469248B1 (ko) 2018-02-28 2022-11-22 에이피 바이오사이언시스, 아이엔씨. 표적치료법을 위한 체크포인트 억제력을 갖는 이중작용성 단백질
CN109053895B (zh) 2018-08-30 2020-06-09 中山康方生物医药有限公司 抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途
US20210403575A1 (en) 2018-10-22 2021-12-30 Shanghai Yichen Biomed Co. Ltd Bispecific antibody
CN113272330B (zh) 2019-03-02 2024-07-26 南通壹宸生物医药科技有限公司 一种双特异抗体
US20210107969A1 (en) 2019-07-09 2021-04-15 The Johns Hopkins University Molecules, compositions and methods for treatment of cancer
KR20220044748A (ko) 2019-07-11 2022-04-11 우한 이지 바이오파마 씨오., 엘티디. 4가 대칭 이중 특이적 항체
AU2020324185A1 (en) 2019-08-02 2022-03-03 CTTQ-Akeso (ShangHai) Biomed. Tech. Co., Ltd. Anti-PD-1 antibody and medical use thereof
PH12022550243A1 (en) 2019-08-02 2023-04-24 Akeso Pharmaceuticals Inc Anti-ctla4-anti-pd-1 bispecific antibody and uses thereof
US11661454B2 (en) 2019-08-09 2023-05-30 Anhui Biox Vision Biological Technology Co., Ltd. Anti-VEGF-PD1 bispecific antibody with novel structure and use thereof
CN110498857B (zh) 2019-08-09 2022-09-09 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗vegf-抗pd1双特异性抗体
CN110563849B (zh) 2019-08-09 2022-09-09 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗vegf-抗pd1双特异性抗体
GB201914747D0 (en) 2019-10-11 2019-11-27 Ultrahuman Eight Ltd PD1 and vegfr2 dual-binding agents
MX2022006330A (es) 2019-11-25 2022-08-17 Akeso Biopharma Inc Anticuerpo biespecífico anti-pd-1 anti-vegfa, composición farmacéutica y uso del mismo.
CN110960543A (zh) 2019-12-10 2020-04-07 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种联合抗vegf-抗pd1双特异性抗体用于制备抗癌药物
CA3181579A1 (en) 2020-04-29 2021-11-04 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Bifunctional protein against pd-1 and tgf-.beta.
KR20220001106A (ko) 2020-06-29 2022-01-05 (주)메디톡스 고농도 항-ｖｅｇｆ 항체 제제 및 이에 사용하기 위한 항-ｖｅｇｆ 항체
WO2022143801A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins
BR112023018450A2 (pt) * 2021-04-14 2023-11-07 Akeso Biopharma Inc Anticorpo monoclonal anti-cd47 e seu uso

Also Published As

Publication number Publication date
PT3882275T (pt) 2024-10-15
PH12021550407A1 (en) 2021-09-20
US20210340239A1 (en) 2021-11-04
EA202190535A1 (ru) 2021-07-20
WO2020043184A1 (zh) 2020-03-05
ZA202101894B (en) 2022-08-31
FI3882275T3 (fi) 2024-10-25
HUE068809T2 (hu) 2025-01-28
EP4461746A2 (en) 2024-11-13
KR20210053912A (ko) 2021-05-12
LT3882275T (lt) 2024-10-25
US20230340097A1 (en) 2023-10-26
EP3882275A4 (en) 2022-08-10
JP7589314B2 (ja) 2024-11-25
KR102924276B1 (ko) 2026-02-09
DK3882275T3 (da) 2024-10-14
CA3110749A1 (en) 2020-03-05
CN109053895B (zh) 2020-06-09
SG11202101985TA (en) 2021-04-29
EP4461746A3 (en) 2025-01-01
SI3882275T1 (sl) 2025-04-30
US12195527B2 (en) 2025-01-14
JP2025037880A (ja) 2025-03-18
CN109053895A (zh) 2018-12-21
ES2989584T3 (es) 2024-11-27
PL3882275T3 (pl) 2025-02-10
BR112021003559A2 (pt) 2021-05-25
AU2019332708B2 (en) 2026-03-05
JP2021536242A (ja) 2021-12-27
IL281116A (en) 2021-04-29
AU2026201467A1 (en) 2026-03-19
JP7374995B2 (ja) 2023-11-07
MX2021002312A (es) 2021-07-02
EP3882275B1 (en) 2024-09-18
DK3882275T5 (da) 2024-10-28
AU2019332708A1 (en) 2021-04-15
EP3882275A1 (en) 2021-09-22
US20250197487A1 (en) 2025-06-19
JP2024023186A (ja) 2024-02-21
HRP20241417T1 (hr) 2025-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7589314B2 (ja) 抗ｐｄ－１／抗ｖｅｇｆａ二官能性抗体、その医薬組成物およびその使用
JP7662635B2 (ja) 抗ｐｄ－１－抗ｖｅｇｆａ二重特異性抗体、その医薬組成物および使用
KR102469286B1 (ko) 항-pd1 단일클론 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도
JP2022130393A (ja) 抗ｃｔｌａ４－抗ｐｄ－１二機能性抗体、その医薬組成物および使用
US20250114450A1 (en) Pharmaceutical combination containing anti-pd-1-anti-vegfa bispecific antibody, and use thereof
JP2024538669A (ja) 抗ｌａｇ３二重特異性抗体、医薬組成物、及び使用
CN116135884A (zh) 抗tigit-抗pd-l1双特异性抗体、其药物组合物及用途
WO2023246247A1 (zh) 药物组合物及其用途
KR20250060271A (ko) 약학적 조합 및 이의 용도
HK40118237A (en) Anti-pd-1/vegfa bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof
CN119613559B (zh) 药物组合及用途
EA049135B1 (ru) Бифункциональное антитело против pd-1 и против vegfa, его фармацевтическая композиция и его применение
HK40091003A (en) Pharmaceutical combination containing anti-pd-1-anti-vegfa bispecific antibody, and use thereof
HK40123044A (zh) 药物组合及用途
HK40096182A (zh) 药物组合物及其用途
HK40109390A (zh) 药物组合及用途