ES2989666T3

ES2989666T3 - Procedimiento para proporcionar una actividad antimicrobiana a un producto alimenticio para mascotas

Info

Publication number: ES2989666T3
Application number: ES21708662T
Authority: ES
Inventors: Françoise Michel-Salaun; Gilles Kergourlay
Original assignee: Specialites Pet Food SAS
Current assignee: Specialites Pet Food SAS
Priority date: 2020-03-05
Filing date: 2021-03-03
Publication date: 2024-11-27
Anticipated expiration: 2041-03-03
Also published as: BR112022017309A2; PL4114194T3; EP4114194B1; CN115515430A; CA3174043C; CA3174043A1; CN115515430B; US20230105082A1; WO2021175927A1; AU2021231225A1; EP4114194A1

Abstract

La invención se refiere al método y al uso de una composición antimicrobiana que consiste en: (i) al menos 30% de ácido láctico, y (ii) al menos dos ácidos carboxílicos seleccionados del grupo que consiste en ácido acético, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico y ácido isovalérico para proporcionar una actividad antimicrobiana contra uno o más microorganismos no deseados a un producto alimenticio para mascotas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para proporcionar una actividad antimicrobiana a un producto alimenticio para mascotas

La presente invención se refiere a un procedimiento para proporcionar una actividad antimicrobiana contra Salmonella, levaduras y/o mohos a un producto alimenticio para mascotas.

Antecedentes de la invención

Los productos alimentarios para mascotas están sujetos a contaminación microbiana, en particular bacteriana, por microorganismos como Salmonella, Listeria, Escherichia coli y Clostridium. Aunque la industria de alimentos para mascotas adopta un enfoque agresivo respecto a la calidad y la seguridad mediante el uso de tiempos de cocción prolongados y temperaturas elevadas, aún puede producirse contaminación cruzada con microorganismos no deseados, especialmente patógenos o alterantes, por ejemplo durante el postprocesado.

Las grasas y los aceites son uno de los principales constituyentes de los alimentos para mascotas, ya que contribuyen a su textura, olor y/o sabor, valor nutricional y palatabilidad. En la mayoría de los casos, se aplica una elevada proporción de grasa a las croquetas tras la fase de cocción-extrusión. Como resultado, la aplicación de grasa contaminada con Salmonella puede provocar enfermedades en mascotas o humanos, incluso si los fabricantes de alimentos para mascotas siguen buenas prácticas de fabricación.

Encontrar agentes antimicrobianos eficaces para este fin ha demostrado ser un reto en la industria de los alimentos para mascotas, ya que es necesario que los agentes sean apetecibles, seguros, rentables y estables, así como eficaces incluso en cantidades bajas, como inferiores al 1%.

Hasta ahora, el ácido fosfórico es uno de los agentes antimicrobianos más utilizados en la industria de alimentos para mascotas, en particular porque, siendo eficaz y barato, no afecta negativamente a la palatabilidad de los alimentos para mascotas. Sin embargo, el ácido fosfórico debe añadirse a un nivel relativamente alto para proporcionar control microbiano. La adición de agua debida a la adición de ácido fosfórico puede perjudicar la estabilidad oxidativa de la grasa y disminuir la calidad de los productos alimenticios para mascotas. Además, el ácido fosfórico no puede considerarse una solución natural. Por último, aunque no por ello menos importante, la ingesta de fósforo debe restringirse a veces, por ejemplo cuando la función renal está en declive, como en el caso de las enfermedades renales.

Se han investigado compuestos alternativos naturales, como el ácido láctico. La solicitud de patente n° WO2012/018913 divulga el uso de ácido láctico, y en particular en una cantidad del 0,1% al 3%, para impartir actividad antimicrobiana contra la Salmonella a un alimento seco para mascotas. Sin embargo, se observó además que el uso de ácido láctico por sí solo podía a veces degradar la palatabilidad, y más concretamente la palatabilidad canina.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para proporcionar una actividad antimicrobiana contra Salmonella, levaduras y/o mohos a un producto alimenticio para mascotas de forma eficaz, y al menos tan eficaz como el ácido láctico solo, al tiempo que se garantiza que la palatabilidad se mantiene al menos tanto para gatos como para perros.

El procedimiento utiliza una composición antimicrobiana que es eficaz a menos del 1%, cuando se incorpora a un producto alimenticio para mascotas.

La composición antimicrobiana podría tener la capacidad específica de proteger las grasas de las contaminaciones microbianas.

La composición puede estar hecha de agentes antimicrobianos naturales.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y cualquier otro aspecto o realización que se exponga en el presente documento tiene únicamente fines ilustrativos.

La presente invención se refiere a un procedimiento para proporcionar una actividad antimicrobiana contra Salmonella, levaduras y/o mohos a un producto alimenticio para mascotas, que comprende:

a) proporcionar un producto alimenticio para mascotas,

b) incorporar a dicho producto alimenticio para mascotas menos del 1% de una composición antimicrobiana consistente en:

(i) al menos un 30% de ácido láctico, y

(ii) al menos dos ácidos carboxílicos seleccionados del grupo formado por el ácido acético, el ácido butírico, el ácido isobutírico, el ácido valérico y el ácido isovalérico.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Actividad antimicrobiana de la Composición 15 ("medida") frente a la actividad antimicrobiana acumulada de las Composiciones 2, 3, 4 ("calculada"), tras 20 horas de incubación en grasa de una mezcla a partes iguales de Salmonella enteric subsp. entérica ser. Infantis, Salmonella ser. Mbandaka, y Salmonella ser. Senftenberg.

Figura 2: Actividad antimicrobiana a lo largo del tiempo de la Composición 16 (500 o 1000 ppm) frente a las Composiciones 1 (1000 ppm), 5 (500 ppm), 6 (500 ppm), 7 (500 ppm), 8 (500 ppm) sobre una mezcla a partes iguales de Salmonella enteric subsp. enterica ser. Newport, Salmonella ser. Senftenberg, y Salmonella ser. Typhimurium. T+ representa el Control que no contiene ningún agente antimicrobiano.

Figura 3: Actividad antimicrobiana a lo largo del tiempo de la Composición 18 (1000 ppm) frente a las Composiciones 1 (1000 ppm) y 14 (1000 ppm) sobre una mezcla a partes iguales de Salmonella ser. Infantis, Salmonella ser. Mbandaka, y Salmonella ser. Senftenberg. T+ representa el Control que no contiene ningún agente antimicrobiano.

Figura 4: Actividad antimicrobiana a lo largo del tiempo de la Composición 17 (1000 ppm) sobre una mezcla a partes iguales de Salmonella ser. Newport, Salmonella ser. Senftenberg, y Salmonella ser. Typhimurium. T+ representa el Control que no contiene ningún agente antimicrobiano.

Figura 5: Actividad antimicrobiana a lo largo del tiempo de la Composición 19 (1000 ppm) frente a las Composiciones 9, 10, 11, 12 (1000 ppm) sobre una mezcla a partes iguales de Salmonella ser. Newport, Salmonella ser. Senftenberg, y Salmonella ser. Typhimurium.

Definiciones

A menos que se indique específicamente lo contrario, las cantidades o porcentajes se expresan aquí en peso de un producto de referencia.

En la presente divulgación, los rangos se indican de forma abreviada, para evitar tener que exponer extensamente y describir todos y cada uno de los valores dentro del rango. Cualquier valor apropiado dentro del intervalo puede seleccionarse, en su caso, como valor superior, valor inferior o final del intervalo. Por ejemplo, un rango de 0,1 -1,0 (de 0,1 a 1) representa los valores terminales de 0,1 y 1,0, así como los valores intermedios de 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, y todos los rangos intermedios comprendidos dentro de 0,1-1,0, como 0,2-0,5, 0,2-0,8, 0,7-1,0, etc. Además, los términos "al menos" y "menos que" abarcan el valor citado a continuación. Por ejemplo, "al menos el 5%" debe entenderse como que abarca también el "5%" y "menos del 5%" debe entenderse como que abarca también el "5%".

El término "aproximadamente", tal como se utiliza en el presente documento al referirse a un valor medible como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones estándar que pueden ser determinadas fácilmente por el experto en el dominio técnico de referencia. Preferiblemente, a menos que se indique específicamente lo contrario, estos valores abarcan variaciones de ±5%.

Tal como se utiliza en este documento, la forma singular de una palabra incluye el plural, y viceversa, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, las referencias "un", "una" “el” y "la" incluyen generalmente los plurales de los términos respectivos. Por ejemplo, la referencia a "un procedimiento" o "un alimento" incluye una pluralidad de tales "procedimientos" o "alimentos". Del mismo modo, las palabras "comprender", "comprende" y "que comprende" deben interpretarse de forma inclusiva. Del mismo modo, los términos "incluye", "incluyendo" y "o" deben interpretarse como inclusivos. No obstante, debe considerarse que todos estos términos engloban casos exclusivos a los que también puede hacerse referencia utilizando palabras como "consisten en".

Los procedimientos y composiciones y otros casos ejemplificados aquí no se limitan a las metodologías, protocolos y reactivos particulares que se describen aquí porque, como apreciará el experto en la materia, pueden variar.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos, términos técnicos y acrónimos utilizados aquí tienen los significados comúnmente entendidos por el experto en el(los) campo(s) de la divulgación, o en el(los) campo(s) donde se utiliza el término. Aunque pueden utilizarse productos, procedimientos u otros medios o materiales similares o equivalentes a los aquí descritos, en el presente documento se describen las combinaciones, composiciones, procedimientos u otros medios o materiales preferidos.

Los términos "mascota" y "animal" son sinónimos y se refieren a cualquier animal, incluidos, entre otros, gatos, perros, gambas, peces, conejos, aves de corral, cobayas, hurones, hámsteres, ratones, jerbos, aves, caballos, vacas, cabras, ovejas, burros, cerdos y similares. En el contexto de la presente divulgación, se prefieren animales domésticos como perros, gatos y peces. En particular, se prefieren perros y gatos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "antimicrobiano" se refiere a cualquier molécula, ingrediente, producto, composición que es capaz de reducir y/o prevenir el crecimiento de una serie de microorganismos no deseados durante un periodo de tiempo. Puede referirse, por ejemplo, a cualquier molécula, ingrediente, producto, composición que sea capaz de conservar un producto prolongando su vida útil sin que deje de ser apto para su uso o consumo debido al crecimiento microbiano, y es coherente con la definición promulgada por la AAFCo .

El término "microorganismo indeseado" se refiere a bacterias patógenas y/o microorganismos de deterioro, incluyendo levaduras y mohos. Las bacterias patógenas pueden ser bacterias Gram negativas o Gram positivas, como Salmonella, Listeria, Escherichia coli o Clostridium, o mezclas de ellas.

El término "reducción logarítmica de la población" o "reducción logarítmica numérica" o "reducción logarítmica" (donde "logaritmo" debe entenderse como "log1ü") es un término matemático para mostrar el número de células vivas del microorganismo no deseado eliminado por una composición antimicrobiana. Una "reducción de 4 logaritmos" significa que el número de células vivas en un punto de muestreo definido es 10000 veces menor que el número de células vivas en el punto de muestreo original. Una "reducción de 5 log" significa que el número de células vivas es 105 veces menor que el número de células vivas en el punto de muestreo original. Una "reducción de 6 log" significa que el número de células vivas es 106 veces menor que el número de células vivas en el punto de muestreo original.

Todas las referencias en el presente documento a "ácido láctico" o a un "ácido graso de cadena corta" de cualquier tipo o a un "ácido carboxílico" de cualquier tipo pretenden referirse a estos compuestos o a una sal de los mismos. Además, estos compuestos pueden utilizarse en cualquier forma adecuada. En particular, pueden utilizarse materiales, como materiales vegetales, o extractos o partes o extractos de partes de materiales, incluidos concentrados o zumos, y que contengan una cantidad no despreciable de ácido láctico o ácido graso de cadena corta o ácido carboxílico conforme a la divulgación. También pueden utilizarse compuestos puros, lo que engloba compuestos con una pureza de al menos el 50%, preferiblemente de al menos el 60%, más preferiblemente de al menos el 70%, más preferiblemente de al menos el 80%, más preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95%.

El término "producto alimentario para mascotas" puede referirse a un "alimento para mascotas", a un "ingrediente alimentario para mascotas" o a ambos. El significado exacto de "producto alimenticio para mascotas" será claro e inequívoco para el experto en la materia tras la lectura de la presente divulgación. Es importante destacar que todas las referencias que se hacen en el presente documento a un producto alimenticio para animales domésticos de cualquier tipo se refieren únicamente a un producto alimenticio para animales domésticos fabricado y comercializado para animales domésticos y que puede beneficiarse de una composición antimicrobiana tal como se describe en el presente documento, en particular en lo que respecta a sus propiedades de eficacia y palatabilidad.

El término "alimento para mascotas" se refiere a un alimento destinado al consumo por una mascota. Por ejemplo, un "alimento para perros" o un "producto alimenticio para perros" es una composición destinada al consumo por parte de un perro. Como otro ejemplo, un "alimento para gatos" o un "producto alimenticio para gatos" significa una composición destinada al consumo por parte de un gato. "Alimentos para mascotas" engloba los piensos para mascotas, como los piensos para peces, en adelante también denominados "alimentos para peces". Por "alimento para peces" se entiende una composición destinada al consumo de peces. El término "alimentos para mascotas" incluye alimentos para mascotas nutricionalmente equilibrados, complementos alimenticios para mascotas, golosinas, aperitivos, juguetes (masticables y/o consumibles), bebidas y refrescos.

Un alimento "nutricionalmente completo", "nutricionalmente equilibrado" o "completo y nutricionalmente equilibrado" es aquel que contiene todos los nutrientes necesarios conocidos para el destinatario o consumidor del alimento, en cantidades y proporciones adecuadas basadas, por ejemplo, en recomendaciones de autoridades reconocidas o competentes en el campo de la nutrición de mascotas. Por lo tanto, estos alimentos son capaces de servir como única fuente de ingesta dietética para mantener la vida, sin necesidad de añadir fuentes nutricionales suplementarias. Por lo tanto, dichos alimentos para mascotas no incluyen complementos alimenticios, golosinas, tentempiés, juguetes, bebidas ni refrescos. Un alimento para mascotas nutricionalmente completo suele ser un alimento seco (con menos de un 14% de humedad y/o una actividad de agua inferior a 0,65), enlatado o húmedo o con alto contenido de humedad (con más de un 50% de humedad y/o una actividad de agua superior a 0,85) o semihúmedo (con entre un 14% y un 50% de humedad y/o una actividad de agua de entre 0,65 y 0,85). Ejemplos de alimentos nutricionalmente completos para mascotas son los alimentos extrusionados, como las croquetas; los productos troceados en "X", como los productos troceados en gelatina, los productos troceados en salsa; y los panes, como las terrinas, los patés, las mousses.

Por "complemento alimenticio para mascotas" se entiende un producto destinado a ser ingerido como complemento de la dieta normal. Los suplementos pueden tener cualquier forma, por ejemplo, sólida, líquida, gel, comprimidos, cápsulas, polvo y similares. Preferiblemente, se suministran en cómodas formas de dosificación. En algunos casos, se suministran en envases de consumo a granel, como polvos, líquidos, geles o aceites a granel. En otros casos, los suplementos se suministran en grandes cantidades para incluirlos en otros alimentos como aperitivos, golosinas, barritas de suplementos, bebidas y similares.

El término "golosina" se refiere a cualquier alimento diseñado para ser suministrado a una mascota, preferiblemente en un momento distinto a la comida, por el propietario para ayudar, promover o mantener un proceso de vinculación entre la mascota y su propietario. Ejemplos de golosinas son huesos, pieles crudas, palos, almohadas, galletas y similares. Las golosinas pueden ser nutricionales o no, total o parcialmente consumibles (por ejemplo, juguetes consumibles). Las golosinas suelen contener potenciadores de la palatabilidad comparables a los alimentos nutricionalmente equilibrados. Las golosinas suelen contener grasas animales, vegetales o marinas, incluidas o recubiertas en las golosinas.

Un alimento para mascotas "extruido" se refiere a cualquier producto que haya sido transformado mediante un proceso de extrusión o peletización. Preferiblemente, un producto extruido es un producto extruido seco. En un caso particular, un producto extruido es una croqueta. En otro caso particular, un producto extruido es un pellet de pescado.

El término "pellet de pescado" se refiere a un alimento para peces, en particular un producto extruido seco (que contiene menos de aproximadamente un 14% de humedad, preferentemente menos de aproximadamente un 9% de humedad) que puede obtenerse mediante un proceso de extrusión o peletización, preferentemente un proceso de peletización. Los pellets de pescado se componen normalmente de una o más fuentes proteínicas como, por ejemplo, proteínas marinas que incluyen, entre otras, harina de pescado y harina de krill, proteínas vegetales y subproductos de matadero.

El término "croqueta" utilizado aquí se refiere a trozos de alimento seco para mascotas formados por un proceso de peletización o extrusión, preferiblemente un proceso de extrusión. Las piezas pueden variar en tamaño y forma, según el proceso o el equipo. Por ejemplo, las croquetas pueden tener forma esférica, cilíndrica, ovalada o similar. Pueden tener una dimensión mayor de menos de unos 2 cm, por ejemplo.

Un "ingrediente alimentario para mascotas" es cualquier compuesto, composición o material apto para el consumo de mascotas y que puede añadirse a un alimento para mascotas. Ejemplos no limitativos de ingredientes de alimentos para mascotas son las harinas animales, las carnes frescas, los digeridos animales, las grasas, las harinas vegetales, las levaduras, los cereales, los potenciadores de palatabilidad, los nutrientes, los aditivos, etc.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "producto alimenticio para mascotas que contiene grasa" se refiere a un "producto alimenticio para mascotas" que contiene al menos una grasa que puede estropearse por microorganismos no deseados. El contenido de grasa de un "producto alimenticio para mascotas que contiene grasa" no es "trazas de grasa". El término "trazas de grasa", tal como se utiliza aquí, significa una cantidad insignificante de grasa o una cantidad indetectable de grasa (por debajo del nivel umbral determinado por procedimientos estándar, como el descrito en el Reglamento europeo EC n° 152/2009 Determinación de aceites crudos y grasas - Procedimiento B - disponible en línea). Normalmente, un alimento para mascotas equilibrado nutricionalmente, una grasa, un potenciador de la palatabilidad, una harina animal o una harina vegetal es un producto alimenticio para mascotas que contiene grasa.

Ejemplos de grasas incluyen grasas o aceites de cualquier origen, como grasas animales, aceites vegetales o aceites marinos. Los aceites vegetales disponibles en grandes cantidades suelen ser aceite de canola, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de linaza, aceite de palma, aceite de colza, aceite de sésamo, aceite de coco, aceite de cártamo y similares, así como subproductos de los mismos. Las grasas animales típicas son la grasa de cerdo, la grasa de pollo, la grasa de ave, el sebo de cordero o el sebo de vacuno y similares, así como sus subproductos. Los aceites marinos suelen ser aceite de atún, de sardina, de salmón, de arenque, de caballa, de lanzón, de trucha, de tilapia, de siluro, de anchoa, de pescado, de menhaden y similares, así como sus subproductos. También se incluyen las grasas derivadas de fuentes animales, vegetales o marinas.

Las grasas son, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos o ácidos grasos libres saturados o insaturados, y pueden ser endógenas (como las grasas contenidas en los digeridos animales, las harinas animales o vegetales, etc.) o exógenas.

Tal como se utiliza aquí, el término "palatabilidad" se refiere a la disposición general de un sujeto a comer una determinada composición alimentaria. Siempre que un sujeto muestre preferencia, por ejemplo, por uno de dos o más alimentos, el alimento preferido es más "agradable al paladar", y tiene una "palatabilidad mejorada". Existen diferentes procedimientos para evaluar la palatabilidad, como la palatabilidad de los animales domésticos. Ejemplos de tales procedimientos implican la exposición de los animales domésticos a alimentos para animales domésticos, ya sea simultáneamente (por ejemplo, en comparaciones lado a lado, de libre elección, por ejemplo, mediante la medición del consumo relativo de al menos dos alimentos diferentes para animales domésticos), o secuencialmente (por ejemplo, utilizando metodologías de ensayo en un solo recipiente). Ventajosamente, pueden utilizarse al menos dos procedimientos diferentes para consolidar los resultados así obtenidos sobre la palatabilidad de un determinado alimento para mascotas.

Los términos "potenciador de la palatabilidad" y cualquier otro término similar (por ejemplo, "ingrediente potenciador de la palatabilidad") se refieren a cualquier material que mejore la palatabilidad de un alimento para mascotas para un animal. Normalmente, un potenciador de la palatabilidad es una composición comestible líquida o seca que proporciona un aroma, sabor, regusto, olor, sensación en la boca, textura y/o sensación organoléptica que resulta atractiva o agradable para el sujeto. Ejemplos no limitativos de ingredientes que mejoran la palatabilidad son los digeridos animales, compuestos inorgánicos de fosfato (como polifosfatos, pirofosfatos y monofosfatos), ingredientes de Maillard, productos de levadura (como extractos de levadura, hidrolizados de levadura, autolisados de levadura, cremas de levadura, levaduras secas), etc.

El término "digestión animal" se refiere al material resultante de la hidrólisis química y/o enzimática de tejido animal limpio y sin descomponer, como el de aves de corral, cerdo, ternera, oveja, cordero, pescado, etc. En algunos casos, un digerido animal, tal como se utiliza en el presente documento, coincide plenamente con la definición promulgada por la Association Of American Feed Control Officials, Inc. (AAFCO).

El término "harina animal" o "harina de carne" se refiere a la carne que ha sido secada y molida para formar partículas de tamaño sustancialmente uniforme. Por ejemplo, la Association of American Feed Control Officials (AAFCO) define la "harina de carne" como el producto extraído de los tejidos de los mamíferos, sin adición de sangre, pelo, pezuñas, cuernos, recortes de piel, estiércol, contenidos estomacales y ruminales, excepto en las cantidades que puedan producirse inevitablemente en las buenas prácticas de procesamiento, y no contendrá materiales extraños no previstos en esta definición. Ejemplos no limitativos de harinas cárnicas adecuadas para las composiciones aquí divulgadas incluyen harina de vacuno, harina de ave, harina de cerdo, harina de pavo, harina de pescado y combinaciones de las mismas. La harina de carne de vacuno es el producto extraído de los tejidos de la carne de vacuno, sin adición de sangre, pelo, pezuñas, cuernos, recortes de piel, estiércol ni contenido estomacal o ruminal, salvo en las cantidades que puedan producirse inevitablemente en las buenas prácticas de transformación. La harina de aves de corral es el producto seco extraído de una combinación de carne y piel limpias, con o sin hueso acompañante, procedente de partes de canales enteras de aves de corral o de una combinación de las mismas, excluidas plumas, cabezas, patas y vísceras. La harina de cerdo es el producto seco extraído de una combinación de carne y piel limpias (con o sin hueso), procedente de partes de canales enteras de cerdo o de una combinación de las mismas, excluidas la cabeza, las patas y las vísceras. La harina de pavo es el producto seco extraído de una combinación de carne y piel limpias, con o sin hueso acompañante, derivado de las partes de canales enteras de pavos, excluidas plumas, cabezas, patas o vísceras. La harina de pescado es el tejido limpio, seco y molido de pescado entero no descompuesto o de trozos de pescado, ya sea uno u otro, con o sin la extracción de parte del aceite.

El término "harina vegetal" (o harina vegetal) engloba las harinas de cereales como el trigo, el gluten de trigo, la cebada, el arroz, la avena, el maíz y la harina de gluten de maíz; las harinas de leguminosas como la harina de soja y de guisantes; y las harinas vegetales como la harina de patata y de mandioca. Los expertos en la materia conocen otras harinas de este tipo.

El término "origen natural" o "natural" se refiere a un compuesto que existe o se produce en la naturaleza. Dichos compuestos pueden extraerse o aislarse de su entorno natural por cualquier medio adecuado. Por supuesto, estos compuestos también pueden producirse sintéticamente por la mano del hombre y entonces se denominan "sintéticos".

"Recubrimiento" o "recubierto", como se utiliza aquí, se refiere a la deposición tópica de un ingrediente o una composición sobre la superficie del alimento para mascotas, como por pulverización, espolvoreado y similares.

"Inclusión" o "incluido", como se utiliza aquí, se refiere a la adición de un ingrediente o una composición en el núcleo de un alimento para mascotas. Si es necesario, se pueden realizar otras etapas de procesamiento para obtener el producto final de comida para mascotas (incluyendo tratamiento térmico y/o extrusión y/o esterilización, etc.).

Los "envases" incluyen, entre otros, bolsas, cajas, cartones, botellas, paquetes de cualquier tipo o diseño o material, envoltorios, envoltorios retráctiles, elementos grapados o fijados de otro modo, o combinaciones de los mismos.

El término "envase único" significa que los componentes de un kit están físicamente asociados en o con uno o más contenedores y se consideran una unidad para la fabricación, distribución, venta o uso. Los envases incluyen, entre otros, bolsas, cajas, cartones, botellas, paquetes de cualquier tipo o diseño o material, envoltorios, envoltorios retráctiles, componentes grapados o fijados de otro modo, o combinaciones de los mismos. Un mismo envase puede estar formado por contenedores de componentes individuales asociados físicamente de forma que se consideren una unidad para su fabricación, distribución, venta o uso.

Tal como se utiliza en el presente documento, "medio para comunicar información o instrucciones" es un componente del kit bajo cualquier forma adecuada para proporcionar información, instrucciones, recomendaciones y/o garantías, etc. Dicho medio puede comprender un documento, un medio de almacenamiento digital, un medio de almacenamiento óptico, una presentación sonora, una presentación visual que contenga información. El medio de comunicación puede ser una página web, un folleto, una etiqueta de producto, un prospecto, un anuncio, una presentación visual, etc.

Descripción de algunas realizaciones de la invención

Los inventores muestran aquí por primera vez que una combinación que incluye ácido láctico y al menos dos ácidos carboxílicos específicos es sorprendentemente ventajosa en comparación con otras combinaciones y en comparación con el ácido láctico u otros ácidos solamente. En particular, cuando se incorpora a un producto alimentario para mascotas, dicha combinación es capaz de inhibir la actividad microbiana a lo largo del tiempo en dicho producto alimentario para mascotas sin perjudicar su palatabilidad (en comparación con el mismo producto alimentario para mascotas sin ninguna composición antimicrobiana incorporada).

Producto alimenticio para mascotas

La composición antimicrobiana y el producto alimenticio para mascotas descritos en esta sección son los utilizados en el procedimiento para proporcionar una actividad antimicrobiana según la invención que se describe más adelante en la descripción.

El alimento para mascotas comprende menos de aproximadamente 1% de una composición antimicrobiana consistente en:

(i) al menos un 30% de ácido láctico, y

Esta combinación antimicrobiana contiene así, además de al menos un 30% de ácido láctico, al menos dos ácidos carboxílicos específicos. En la actualidad, la industria de alimentos para mascotas está preocupada por el uso de agentes antimicrobianos naturales, como el ácido láctico, debido a su posible influencia negativa en la palatabilidad de los alimentos para mascotas. Sin embargo, los inventores demuestran que la palatabilidad para perros y gatos de un alimento para mascotas que contenga menos de un 1% de una composición antimicrobiana no se ve afectada negativamente. Los inventores demuestran incluso que puede presentar una palatabilidad mejorada, en particular para los perros, en comparación con la palatabilidad cuando se utiliza únicamente ácido láctico.

Los inventores demostraron que el ácido láctico combinado con al menos dos ácidos carboxílicos específicos, tal como se reivindica, proporciona una actividad antimicrobiana significativa, e incluso puede proporcionar una actividad antimicrobiana sinérgica.

La composición antimicrobiana tiene actividad antimicrobiana contra bacterias patógenas y/o microorganismos de deterioro, incluidas levaduras y mohos. La composición antimicrobiana tiene actividad antimicrobiana contra Salmonella, en particular Salmonella entérica subsp. entérica.

La composición antimicrobiana descrita anteriormente consiste en:

(i) al menos un 30% de ácido láctico, y

La composición proporciona preferiblemente una reducción de la población de microorganismos no deseados de al menos aproximadamente 2, preferiblemente de al menos aproximadamente 3, más preferiblemente de al menos aproximadamente 4, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 5. Dicha reducción puede lograrse de acuerdo con la presente divulgación tras un tiempo de exposición relativamente corto. Por ejemplo, a temperaturas de entre 30 y 40°C (temperatura adecuada para el desarrollo de microorganismos como la Salmonella), la reducción logarítmica deseada puede conseguirse tras una exposición de sólo 48 horas, preferiblemente 24 horas, más preferiblemente 10 horas, más preferiblemente 5 horas, más preferiblemente 2 horas, más preferiblemente 1 hora.

En particular, la composición antimicrobiana comprende menos del 95%, preferiblemente menos del 90%, más preferiblemente menos del 85%, más preferiblemente menos del 80% de ácido láctico.

Dicho ácido láctico puede ser una sal de ácido láctico, como lactato de sodio, lactato de calcio o lactato de potasio.

Es importante destacar que esta combinación de agentes antimicrobianos es eficaz incluso en cantidades bajas. En particular, el producto alimenticio para mascotas descrito comprende menos del 1%, preferiblemente menos del 0,9%, más preferiblemente menos del 0,8%, más preferiblemente menos del 0,7%, más preferiblemente menos del 0,6%, más preferiblemente menos del 0,5%, más preferiblemente menos del 0,4%, más preferiblemente menos del 0,3%, más preferiblemente menos del 0,25%, más preferiblemente menos del 0,2%, más preferiblemente menos del 0,15%, más preferiblemente menos del 0,1% de la composición antimicrobiana. En particular, el producto alimenticio para mascotas descrito comprende más del 0,01%, preferiblemente más del 0,02%, más preferiblemente más del 0,03% de la composición antimicrobiana.

Además del ácido láctico, la composición antimicrobiana de la divulgación contiene al menos dos ácidos carboxílicos específicos. Dichos ácidos carboxílicos se seleccionan del grupo que consiste en ácido acético, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico y ácido isovalérico, preferentemente del grupo que consiste en ácido acético, ácido butírico, ácido valérico y ácido isovalérico.

La presencia esencial de al menos dos ácidos carboxílicos, además del ácido láctico, se ha demostrado en los siguientes ejemplos. En particular, la composición antimicrobiana contiene dos o tres ácidos carboxílicos. En particular, la composición antimicrobiana contiene dos ácidos carboxílicos. En particular, la composición antimicrobiana contiene tres ácidos carboxílicos.

En particular, la composición antimicrobiana comprende más del 5%, preferiblemente más del 10%, más preferiblemente más del 15%, más preferiblemente más del 20%, más preferiblemente más del 25% de ácidos carboxílicos. En particular, la composición antimicrobiana comprende menos del 70% de ácidos carboxílicos.

Ventajosamente, el ácido láctico y los ácidos carboxílicos de la composición antimicrobiana son de origen natural. Alternativamente, el ácido láctico y los ácidos carboxílicos de la composición antimicrobiana son sintéticos.

Ventajosamente, la composición antimicrobiana utilizada en el procedimiento de la invención está en forma de polvo o en forma líquida.

Así, en el procedimiento de la presente invención se proporciona un producto alimenticio para mascotas, que comprende además un portador apropiado en combinación con la composición antimicrobiana. El experto puede determinar los soportes adecuados en función del uso del producto alimenticio para mascotas y, en particular, también en función de la forma de la composición, es decir, líquido o polvo, y/o de la forma hidrófila o hidrófoba de la composición.

Como se ha explicado anteriormente, el término "producto alimenticio para mascotas" se refiere al producto alimenticio para mascotas que se beneficia de la composición antimicrobiana tal como se divulga en el presente documento. Un producto alimentario para mascotas según la divulgación puede ser un alimento para mascotas o un ingrediente alimentario para mascotas (que a su vez puede incorporarse a un alimento para mascotas). Preferiblemente, dicho producto alimenticio para mascotas es un producto alimenticio para mascotas que contiene grasa.

En particular, el producto alimentario para mascotas es un ingrediente alimentario para mascotas, preferentemente seleccionado de la lista que consiste en una grasa, una harina animal, una harina vegetal y un potenciador de la palatabilidad. Este ejemplo concreto se refiere a un ingrediente alimentario para mascotas protegido que comprende una composición antimicrobiana de la divulgación, que puede añadirse a un alimento para mascotas. En otros términos, en este ejemplo concreto, la composición antimicrobiana tiene por objeto proteger el ingrediente alimentario para mascotas (pero no el alimento para mascotas al que puede añadirse el ingrediente alimentario para mascotas).

En una primera alternativa, el ingrediente alimentario para mascotas es una grasa, preferiblemente seleccionada entre grasa animal, aceite vegetal o aceite marino, más preferiblemente grasa animal o aceite marino.

Aún más particularmente, dicha grasa animal se selecciona entre grasa de cerdo, grasa de pollo, grasa de ave, sebo de cordero o sebo de vacuno, y similares, así como subproductos de los mismos. Por ejemplo, dicha grasa animal es grasa de ave.

Más concretamente, dicho aceite vegetal se selecciona entre aceite de canola, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de linaza, aceite de palma, aceite de colza, aceite de sésamo, aceite de coco, aceite de cártamo y similares, así como subproductos de los mismos. Más preferentemente, dicho aceite vegetal es aceite de girasol o de canola.

Más concretamente, dicho aceite marino se selecciona entre aceite de atún, sardina, salmón, arenque, caballa, lanzón, trucha, tilapia, siluro, anchoa, pescado, menhaden y similares, así como subproductos de los mismos. Más preferentemente, dicho aceite marino es aceite de pescado, de salmón o de atún.

En una segunda alternativa, el ingrediente del alimento para mascotas es una harina animal o una harina vegetal, preferentemente con contenido graso.

En una tercera alternativa, el ingrediente del alimento para mascotas es un potenciador de la palatabilidad, que preferentemente contiene grasa.

En particular, el producto alimenticio para mascotas es un alimento para mascotas, preferentemente un alimento para perros o un alimento para gatos. Este ejemplo particular se refiere a un alimento protegido para mascotas que comprende una composición antimicrobiana de la divulgación. En otros términos, en este ejemplo concreto, la composición antimicrobiana tiene por objeto proteger el alimento para mascotas. En relación con este ejemplo, la actividad antimicrobiana puede proporcionarse añadiendo directamente la composición antimicrobiana al alimento para mascotas, o añadiendo la composición antimicrobiana a un ingrediente del alimento para mascotas que se añade posteriormente al alimento para mascotas. En esta última alternativa, tanto el ingrediente como el alimento pueden beneficiarse de la actividad antimicrobiana de la composición.

Preferiblemente, el alimento para mascotas es un alimento nutricionalmente equilibrado, más preferiblemente seleccionado de la lista que consiste en alimentos extruidos para mascotas, como croquetas, pellets de pescado; productos troceados en "X", como productos troceados en gelatina, productos troceados en salsa; y panes, como terrinas, patés, mousses. En particular, el producto alimenticio para mascotas es una croqueta.

Procedimiento para preparar un producto alimenticio para mascotas (no forma parte de la invenc¡ón)/Proced¡miento para proporcionar una actividad antimicrobiana contra uno o más microorganismos no deseados a un producto alimenticio para mascotas

Puede prepararse un producto alimenticio para mascotas

a) proporcionar un producto alimenticio para mascotas,

b) incorporar menos del 1% de una composición antimicrobiana como la descrita anteriormente en dicho producto alimenticio para mascotas.

La invención se refiere a un procedimiento para proporcionar una actividad antimicrobiana contra uno o más microorganismos no deseados, preferentemente contra Salmonella, a un producto alimenticio para mascotas, que comprende:

a) proporcionar un producto alimenticio para mascotas,

La composición antimicrobiana proporciona una actividad antimicrobiana contra uno o más microorganismos indeseados reduciendo y/o previniendo el número de microorganismos indeseados durante un periodo de tiempo. La composición antimicrobiana tiene actividad antimicrobiana contra Salmonella, levaduras y/o mohos.

Muy ventajosamente, esta eficacia antimicrobiana no es perjudicial para la palatabilidad del producto alimenticio para mascotas. De hecho, la palatabilidad para perros y gatos de un producto alimenticio para mascotas que contenga menos del 1% de una composición antimicrobiana según la divulgación no se ve afectada negativamente.

La composición puede incorporarse a cualquier producto alimenticio para mascotas, preferentemente a un producto alimenticio para mascotas que contenga grasa. En el campo técnico particular de los alimentos para animales domésticos y como se ha explicado anteriormente, el producto alimenticio para animales domésticos de la etapa a) de los procedimientos anteriores puede ser un alimento para animales domésticos o un ingrediente para alimentos para animales domésticos.

El producto alimenticio para mascotas de la etapa a) puede ser un alimento para mascotas, en particular un alimento extruido para mascotas, como una croqueta.

La etapa b) de los procedimientos descritos anteriormente puede comprender las siguientes etapas:

i) preacondicionamiento mezclando ingredientes húmedos y secos a temperatura elevada para formar una masa de croquetas;

ii) extrusión de la masa de croquetas a alta temperatura y presión;

iii) secado de las croquetas extruidas; y

iv) recubrimiento de las croquetas deshidratadas con una o varias grasas y/o uno o varios potenciadores de la palatabilidad;

en la que la composición antimicrobiana se incorpora a las croquetas en las etapas i) y/o iv).

Por ejemplo, la composición antimicrobiana se incorpora a las croquetas en la etapa iv), recubriendo las croquetas secas con al menos una grasa que comprenda la composición antimicrobiana. Preferiblemente, las croquetas deshidratadas están recubiertas de 1% a 10% de dicha grasa, más preferiblemente de 2% a 6% de dicha grasa. El producto alimentario para mascotas de la etapa a) puede ser un ingrediente alimentario para mascotas, preferiblemente seleccionado de la lista que consiste en una grasa, una harina animal, una harina vegetal y un potenciador de la palatabilidad.

Con respecto a este ejemplo particular, la etapa b) de los procedimientos descritos anteriormente puede realizarse mezclando la composición antimicrobiana con el ingrediente alimentario para mascotas.

Las características técnicas mencionadas anteriormente para el producto alimenticio para mascotas y la composición antimicrobiana también se aplican en el presente documento.

Usos (no forman parte de la invención)

Un objeto de la divulgación se refiere al uso de una composición antimicrobiana que consiste en:

(i) al menos un 30% de ácido láctico, y

(ii) al menos dos ácidos carboxílicos seleccionados del grupo formado por el ácido acético, el ácido butírico, el ácido isobutírico, el ácido valérico y el ácido isovalérico,

para proporcionar una actividad antimicrobiana contra uno o más microorganismos no deseados, preferentemente contra Salmonella y/o mohos, más preferentemente contra Salmonella, a un producto alimenticio para mascotas. Más particularmente, una composición antimicrobiana de la divulgación puede utilizarse para proporcionar una actividad antimicrobiana contra uno o más microorganismos no deseados a un producto alimenticio para mascotas sin afectar negativamente a la palatabilidad para los mascotas, preferiblemente gatos y/o perros, más preferiblemente gatos y perros, de un alimento para mascotas que comprenda o consista en dicho producto alimenticio para mascotas. En particular, la composición es una cantidad inferior al 1% (en peso del producto alimenticio para mascotas).

Kit (no forma parte de la invención)

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un kit que comprende, en uno o más recipientes en un único envase:

• uno o varios productos alimenticios para mascotas según la definición anterior; y

• una composición antimicrobiana como la descrita anteriormente.

Los kits particulares según la presente divulgación comprenden además un medio para comunicar información o instrucciones, para ayudar a utilizar los elementos de los kits.

Ejemplos

1. Materiales y procedimientos

1.1. Preparación de composiciones antimicrobianas

Las composiciones antimicrobianas líquidas enumeradas en la Tabla 1 se prepararon mezclando uno o más de los siguientes compuestos naturales (excepto ácido fosfórico) ácido fosfórico (Brenntag - 80% de pureza), ácido butírico (Penta - >95% de pureza / Naturamole - >95% de pureza), ácido valérico (Penta - >95% de pureza), ácido iso-valérico (Naturamole - >95% de pureza), ácido láctico (Jungbunzlauer - 80% de pureza / Naturamole - >95% de pureza), ácido caprílico (Penta - >95% de pureza), aceite de orégano (Kalsec), ácido caproico (Sigma Aldrich - >95%), ácido láurico (Sigma Aldrich - >95%), ácido acético (Naturamole - >95%).

Tabla 1

Las composiciones 1-14 están fuera de la invención y las composiciones 15-20 están de acuerdo con la presente invención.

1.2. Pruebas de palatabilidad

1.2.1. Preparación de alimentos para mascotas con composiciones antimicrobianas

Las croquetas secas nutricionalmente equilibradas (Dieta "X") adecuadas para el consumo de mascotas y obtenidas tras un proceso de extrusión y secado se recubrieron con un 6% de grasa que comprendía composiciones antimicrobianas como las preparadas en el Ejemplo 1.1 (composición "X") y potenciador(es) de la palatabilidad. Estas croquetas secas nutricionalmente equilibradas estaban libres de cualquier microorganismo no deseado.

A continuación, se recubrieron croquetas secas para perros y gatos con una composición potenciadora de la palatabilidad.

1.2.2. Determinación de la palatabilidad con una prueba de dos boles

Principio de la prueba de las dos cubetas:

La prueba se basa en el postulado según el cual cuanto más alimento se consume, más apetecible es.

Se realizaron pruebas de palatabilidad individuales frente a (dos cuencos), basadas en la comparación entre dos alimentos. Las pruebas se realizan en un panel de 36 perros o en un panel de 40 gatos, en función de los objetivos de la prueba.

Procedimiento operativo de la prueba:

• Se pesaron cantidades idénticas de alimento A y alimento B y se colocaron en cuencos idénticos. La cantidad presente en cada ración permite cubrir las necesidades diarias.

• Distribución de los cuencos:

Prueba con perros: los cuencos se colocaron en un comedero individual accesible a los perros.

Prueba con gatos: Los cuencos se presentaron al mismo tiempo a cada gato en una caja suelta individual y sus posiciones se intercambiaron en cada comida para evitar una elección guiada por la mano.

• Duración de la prueba:

* Prueba con gatos: de unos 15 minutos a unas 20 horas (si uno de los dos cuencos se comía por completo antes del final de la prueba, se retiraban los dos cuencos y se detenía la prueba);

* Prueba con perros: de unos 15 minutos a unos 30 minutos (si uno de los dos cuencos se comía por completo antes del final de la prueba, se retiraban los dos cuencos y se detenía la prueba).

Parámetros estudiados

• Parámetro medido: cantidad de cada alimento consumida al final de la prueba;

• Parámetros calculados: ratio de consumo individual en % (CR)

CRA = consumo de A (g)xIOO/(consumo de A-B) (g)

CRB = consumo de B(g}x ioa/{iconsumo de A+B)(s);

^ Ratio media de consumo (ACR) = media de todas las ratios individuales (se da la misma importancia a cada animal, independientemente de su tamaño y de su consumo correspondiente).

Si los animales tienen un consumo mayor o menor en comparación con los valores predeterminados (que son función de, por ejemplo, el peso del animal y/o su metabolismo), no se tienen en cuenta en el tratamiento estadístico.

Análisis estadístico:

Se utilizó un análisis estadístico para determinar si había una diferencia significativa entre las 2 proporciones. Se realizó una prueba t de Student con 3 umbrales de error, a saber, 5%, 1% y 0,1%.

Se utilizó una prueba de Chi-cuadrado para determinar si había una diferencia significativa entre el número de mascotas con el alimento A como primer alimento ingerido y el número de mascotas con el alimento B como primer alimento ingerido.

Los niveles de significación se indican a continuación:

NS no significativo (p > 0,05)

* significativo (p < 0,05)

** altamente significativo (p < 0,01)

*** muy altamente significativo (p < 0,001)

1.3. Inhibición de lasalmonela

Cepas bacterianas y medio de cultivo

En estos estudios se utilizaron seis serovares de Salmonella entérica subsp. entérica : Salmonella ser. Infantis (CIP103549), Salmonella ser. Mbandaka (CIP105859), y Salmonella ser. Senftenberg (aislado de cerdo/aves de corral de la colección ANSES) para los Ejemplos 1, 3 y 6 o Salmonella ser. Newport, Salmonella ser. Senftenberg, y Salmonella ser. Typhimurium (todos aislados de alimentos para mascotas) para el Ejemplo 2, el Ejemplo 4 y el Ejemplo 5. Todas las cepas se conservaron en colección a -80 °C en caldo de glicerol. Las cepas bacterianas se cultivaron en agar infusión cerebro corazón y se subcultivaron en caldo infusión cerebro corazón a 37 °C durante 20±2h (BHI, VWR, EE.UU.). El recuento de Salmonella en grasa aviar se llevó a cabo utilizando agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD, VWR, EE.UU.) para el Ejemplo 1, Ejemplo 3 y Ejemplo 6 o agar Rojo Violeta Bilis Glucosa (VRBG, BioRad, EE.UU.) para el Ejemplo 2, Ejemplo 4 y Ejemplo 5. La detección de Salmonella se realizó siguiendo la norma EN ISO 6579-1 modificada en 125 g de grasa de ave.

Preparación del inoculo

Se utilizaron dos tipos de inóculo matriz. (i) Preparación de inóculo húmedo: Tras los subcultivos, las cepas de Salmonella se cosecharon por centrifugación en la fase estacionaria temprana (3750 x g durante 10 min) a partir de caldo BHI, luego se lavaron y se resuspendieron en peptona al 0,1% (VWR, EE.UU.). Cada cepa individual se mezcló finalmente a partes iguales para obtener un inóculo estándar. (ii) Preparación de inóculo seco: Tras los subcultivos, el caldo BHI en la fase estacionaria temprana se extendió en placas de agar BHI. Tras la incubación, el césped bacteriano resultante se recogió en peptona al 0,1% aflojándolo con un esparcidor estéril. A continuación, se lavaron las cepas, se resuspendieron en peptona al 0,1%, se mezclaron a partes iguales y, por último, se mezclaron con harina de carne como soporte. Esta mezcla se secó a temperatura ambiente hasta alcanzar un nivel de humedad bajo y estable.

Inoculación de grasa aviar

Para alcanzar una concentración de alrededor de 5 - 6 UFC/g lógicas, se añadió inóculo húmedo (Ejemplos 1 a 5) o seco (Ejemplo 6) al 0,1% (p/p) en grasa de ave, después se mezcló bien y se siguió una adaptación fisiológica de 24 horas a la matriz. Durante todos los experimentos, la grasa de ave se almacenó a 35°C (inóculo húmedo) o 40°C (inóculo seco). A continuación, se añadieron soluciones antimicrobianas a la matriz (T0) y se compararon con el Control (T+) libre de cualquier agente antimicrobiano. Los puntos de muestreo para el recuento y la detección de Salmonella se repartieron en el tiempo según los ejemplos.

1.4.Inhibición de hongos

Cepa fúngica y medio de cultivo

En el estudio se utilizaron tres cepas fúngicas aisladas de productos alimenticios para mascotas: Eurotium amstelodami, Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum. P. chrysogenum se cultivó y subcultivó en agar de dextrosa de patata (PDA) a 25°C durante 72 h. E. amstelodami y A. niger se cultivaron y subcultivaron en agar de dextrosa de patata 40% de sacarosa a 28°C durante 72h.

Preparación del inóculo

Tras los subcultivos, cada cepa se recogió en peptona al 0,1% aflojando el cultivo con un esparcidor estéril. A continuación, se lavaron las cepas, se resuspendieron en peptona al 0,1%, se estandarizaron utilizando el recuento de células de Malassez y se añadieron en torno a 3 log UFC/g dentro de placas Deepwell de 2 ml y 96 pocillos (Axygen, AM-2ML-RD) previamente rellenadas con 1 ml de un potenciador de palatabilidad líquido no acidificado suplementado con la composición antimicrobiana deseada. Se incluyeron controles (sin antimicrobianos) para el análisis qPCR. Tras 72 horas de incubación a 25°C, los cultivos se cosecharon pipeteando 150 pl en nuevas placas de 96 pocillos (Axygen, AM-2ML-RD) aptas para la extracción de ADN.

Extracción de ADN

Se extrajo ADN genómico total de cada muestra según el procedimiento descrito por Ladirat et al., (2013) con algunos ajustes menores: Las muestras se mezclaron inicialmente con 300 pl de tampón de lisis (Agowa, Berlín, Alemania), 500 pl de perlas de circonio (0,5 mm) y 500 pl de fenol, antes de introducirlas en un BeadBeater (BioSpec Products, Bartlesville, OK, EE.UU.) durante 3 minutos.

PCR cuantitativa (qPCR)

Para cuantificar el efecto de la composición antimicrobiana, se analizó la cantidad de ADN genómico total en cada muestra mediante PCR cuantitativa (qPCR). El ADN genómico extraído se diluyó 10-50 veces y se utilizó como molde para el análisis cuantitativo por PCR como lectura del crecimiento o de la inhibición del crecimiento. La mezcla de reacción contenía 12,5 pl de 2x Mastermix (Diagenode), 10 pM de cebador directo, 10 pM de cebador inverso, 5 pM de sonda (marcada con FAM y con quencher MGB), más molde (ADN cromosómico) y mQ hasta un volumen total de 25 pl. La qPCR se realizó en un sistema ABI 7500 Fast (Taqman-MGB). Las condiciones del ciclo fueron 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 95°C, seguidos de 40 ciclos de 15 segundos a 95°C, 1 minuto a 60°C.

Uso de datos qPCR como medida de inhibición

Los resultados del análisis qPCR se analizaron como sigue. El valor umbral del ciclo (Ct) se utilizó como base para evaluar la eficacia antimicrobiana. El valor Ct se define como el número de ciclo en el que la fluorescencia de un producto PCR puede detectarse por encima de la señal de fondo. Se compararon los valores Ct del punto inicial (inóculo) y del momento de la recolección de los controles sin composición antimicrobiana. El valor Ct en el momento de la cosecha para el control de crecimiento que no contenía ninguna composición antimicrobiana debía ser inferior al valor Ct del punto de partida (causado por el crecimiento y, por lo tanto, más ADN y, por lo tanto, valores Ct inferiores) y la diferencia (Ctt=0 menos Ctt=cosecha) dio lugar a un valor ACt que representaba el crecimiento máximo durante la incubación. Al mismo tiempo, este valor también puede considerarse como la inhibición máxima: si el valor de Ct en el momento de la recolección es igual al valor de Ct al inicio, no se ha producido ningún crecimiento y, por tanto, la inhibición es máxima. Por lo tanto, este valor ACt también se utilizó como la inhibición máxima.

Para puntuar el efecto de la composición antimicrobiana, se comparó el valor Ct de las muestras con el valor Ct del control sin composición antimicrobiana (control de crecimiento) en el momento de la cosecha. Si el compuesto de ensayo inhibe totalmente el crecimiento, el valor Ct de la muestra de ensayo se asemeja al del punto de partida, lo que da lugar a un valor ACt que es igual a la inhibición máxima. Si, por el contrario, el valor Ct de la muestra de ensayo es igual al del control sin inhibidores, entonces el valor ACt es igual a cero, lo que indica que no hay inhibición alguna.

2. Resultados

2.1. Ejemplo 1

Se evaluaron las composiciones de la Tabla 2.

Tabla 2

Eficacia antimicrobiana

Se evaluó la sinergia antimicrobiana del ácido láctico, el ácido valérico y el ácido butírico en la Composición 15. Cada componente se probó solo cuando se añadió a la grasa (como se describe en 1.2): 7.25 ppm de ácido butírico (composición 2), 7,25 ppm de ácido valérico (composición 3) y 43,5 ppm de ácido láctico (composición 4), respectivamente, fueron sometidos a pruebas para comprobar su eficacia antimicrobiana contra la Salmonella. Se calculó la suma de los efectos antimicrobianos de los componentes individuales (composiciones 2-4) ("calculado").

58 ppm de la Composición 15 (7,25 ppm de ácido butírico 7,25 ppm de ácido valérico 43,5 ppm de ácido láctico) también se añadieron a la grasa y se probó su eficacia antimicrobiana contra la Salmonella ("medida").

Como se ilustra en la Figura 1, el efecto antimicrobiano de la Composición 15 es mayor que la suma de los efectos antimicrobianos de los componentes individuales (Composiciones 2-4), lo que demuestra una eficacia sinérgica de los componentes de la Composición 15.

Palatabilidad

Las composiciones 2, 3, 4, 15 se añadieron en diferentes cantidades a la grasa (como se describe en 1.2) y se recubrieron con croquetas secas (como se describe en 1.3).

Los resultados de la palatabilidad de perros y gatos se presentan en la Tabla 3.

Tabla 3

Como se muestra en la Tabla 3, mientras que el ácido butírico, el ácido valérico y el ácido láctico disminuyeron significativamente la palatabilidad de los perros cuando se añadieron solos a las dietas, su combinación aumentó sorprendentemente el consumo de las dietas.

Además, ventajosamente, la Composición 15 no deteriora la palatabilidad de los gatos.

2.2. Ejemplo 2

Se evaluaron las composiciones de la Tabla 4.

Tabla 4

Eficacia antimicrobiana

Se probó la eficacia antimicrobiana de las Composiciones 5, 6, 7, 8, 16 cuando se añadieron a 500 ppm en grasa y se comparó con la eficacia antimicrobiana del ácido fosfórico (Composición 1) cuando se añadió a 1000 ppm en grasa. También se evaluó la eficacia antimicrobiana de la composición 16 a 1000 ppm en grasa.

Como se ilustra en la Figura 2, la Composición 16 había inhibido totalmente el crecimiento de las bacterias inoculadas 2 días después de la inoculación, independientemente de la cantidad de incorporación (500 ppm o 1000 ppm). Esta inhibición se mantuvo a los 71 días de la inoculación.

La composición 7 también había inhibido totalmente el crecimiento de las bacterias inoculadas 2 días después de la inoculación. Sin embargo, la Salmonella volvió a superar el umbral de recuento (1 log-10 UFC/g) 7 días después de la inoculación.

Por el contrario, se siguió detectando Salmonella 1 mes después de la inoculación cuando se añade ácido fosfórico (Composición 1) en la grasa. Las composiciones 5, 6 y 8 tampoco eran buenas candidatas para inhibir la actividad microbiana.

Palatabilidad

Los resultados de la palatabilidad de perros y gatos se presentan en la Tabla 5.

Tabla 5

Como se muestra en la Tabla 5, la combinación de ácido butírico, ácido valérico y ácido láctico de la Composición 16 aumentó significativamente el consumo de dieta de los perros. Además, ventajosamente, la composición 16 no deteriora la palatabilidad de los gatos.

Las composiciones 6 y 7 aplicadas a 1000 ppm en grasas disminuyeron la palatabilidad de los perros.

2.3. Ejemplo 3

Se evaluaron las composiciones de la Tabla 6.

Tabla 6

Eficacia antimicrobiana

Se probó la eficacia antimicrobiana de la Composición 14 y la Composición 18 cuando se añadieron a 1000 ppm en grasa.

Como se ilustra en la Figura 3, tanto la Composición 14 como la Composición 18 habían inhibido todas las cepas de Salmonella por debajo del umbral de recuento 1,5 horas después de la inoculación. Sin embargo, la Salmonella volvió a superar el umbral de recuento (1 log-10 UFC/g) 4 horas después de la inoculación para la Composición 14.

Palatabilidad

Los resultados de la palatabilidad de los perros se presentan en la Tabla 7.

Tabla 7

Como se muestra en la Tabla 7, la combinación de ácido butírico, ácido isovalérico y ácido láctico de la Composición 18 no deteriora la palatabilidad de la mascota.

2.4. Ejemplo 4

Se evaluó la composición de la Tabla 8.

Tabla 8

Eficacia antimicrobiana

Se probó la eficacia antimicrobiana de la Composición 17 cuando se añadió a 1000 ppm en grasa.

Como se ilustra en la Figura 4, la Composición 17 inactivó las bacterias inoculadas 6 horas después de la inoculación (como máximo).

Palatabilidad

Los resultados de la palatabilidad de perros y gatos se presentan en la Tabla 9.

Tabla 9

Como se muestra en la Tabla 9, la combinación de ácido butírico, ácido isovalérico y ácido láctico en la Composición 17 no deteriora ventajosamente la palatabilidad de perros y gatos.

2.5.Ejemplo 5

Se evaluaron las composiciones de la Tabla 10.

Tabla 10

Eficacia antimicrobiana

Se probó la eficacia antimicrobiana de las Composiciones 9, 10, 11, 12, 19 cuando se añadieron a 1000 ppm en grasa.

Como se ilustra en la Figura 5, la Composición 19 fue la primera composición en inactivar el inóculo de Salmonella por debajo del umbral de recuento (5 horas después de la inoculación). Esta inhibición se mantuvo a los 71 días de la inoculación.

Palatabilidad

Los resultados de la palatabilidad de perros y gatos se presentan en la Tabla 11.

Tabla 11

Como se muestra en la Tabla 11, la combinación de ácido butírico, ácido acético y ácido láctico en la Composición 19 aumentó significativamente el consumo de dieta de los perros.

Además, ventajosamente, la Composición 19 no deteriora la palatabilidad de los gatos.

2.6.Ejemplo 6

Se evaluó la composición de la Tabla 12.

Tabla 12

Palatabilidad

Los resultados de la palatabilidad de los perros se presentan en la Tabla 13.

Tabla 13

1 Significación estadística

Como se muestra en la Tabla 13, la Composición 13, que comprende menos del 30% de ácido láctico, disminuyó significativamente el consumo de dietas de los perros.

2.7.Ejemplo 7

Se evaluó la composición de la Tabla 14.

Tabla 14

Eficacia antimicrobiana

La eficacia antimicrobiana de la Composición 20 se probó en 3 cepas de Hongos, cuando se añadió a 5000 ppm en un potenciador de palatabilidad.

Los resultados de ACt se muestran en la Tabla 15. A menudo se reconoce que ACt superiores a aproximadamente 6 muestran composiciones antimicrobianas eficientes.

Tabla 15

La composición 20 proporciona un buen rendimiento de inhibición de las 3 cepas de microorganismos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para proporcionar una actividad antimicrobiana contra Salmonella, levaduras y/o mohos a un producto alimenticio para mascotas, que comprende:

a) proporcionar un producto alimenticio para mascotas,

(i) al menos un 30% de ácido láctico, y

(ii) al menos dos ácidos carboxílicos seleccionados del grupo que consiste en ácido acético, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico y ácido isovalérico.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la composición antimicrobiana comprende menos del 80% de ácido láctico.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho producto alimenticio para mascotas es un ingrediente alimenticio para mascotas, preferentemente seleccionado entre grasas, harinas animales, harinas vegetales y potenciadores de la palatabilidad.