ES2991459T3 - Ligantes de albúmina sérica mejorados - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a secuencias de aminoácidos que pueden unirse a la albúmina sérica. En particular, la presente invención se refiere a dominios variables únicos de inmunoglobulina, y en particular a dominios variables únicos de inmunoglobulina de cadena pesada, que pueden unirse a la albúmina sérica. La invención también se refiere a proteínas, polipéptidos y otros constructos, compuestos, moléculas o entidades químicas que comprenden al menos uno de los dominios variables únicos de inmunoglobulina que se unen a la albúmina sérica que se describen en el presente documento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ligantes de albúmina sérica mejorados

La presente invención se refiere a secuencias de aminoácidos que son dominios variables únicos de inmunoglobulina que se pueden unir a albúmina sérica humana como se define en las reivindicaciones.

Los dominios variables únicos de inmunoglobulina proporcionados por la invención son VHH, VHH humanizados o VH camelizados y son tales que pueden (al menos) unirse (y en particular, unirse específicamente) a albúmina sérica humana. Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, estos dominios variables únicos de inmunoglobulina son además tales que presentan reactividad cruzada (como se describe en el presente documento) entre albúmina sérica humana y albúmina sérica de al menos una especie diferente de mamífero.

La invención también se refiere a proteínas, polipéptidos y otras construcciones o compuestos que comprenden al menos uno de los dominios variables únicos de inmunoglobulina que se unen a albúmina sérica tal como se define mediante las reivindicaciones.

Los dominios variables únicos de inmunoglobulina también se denominarán generalmente en el presente documento por medio de las abreviaturas"ISVo"ISVD'(que se utilizarán indistintamente en el presente documento).

Los dominios variables únicos de inmunoglobulina que se unen a albúmina sérica humana que son como se definen en las reivindicaciones también se denominarán en el presente documento"secuencias de aminoácidos de la invención"o"ligantes de albúmina sérica de la invención".Como se describe adicionalmente en el presente documento, los ligantes de albúmina de la invención pueden ser, en particular, nanocuerpos (como se describe adicionalmente en el presente documento).

Las proteínas, polipéptidos y otras construcciones o compuestos que comprenden al menos uno del ligante de albúmina sérica de la invención también se denominarán en el presente documento"compuestos de la invención"o"polipéptidos de la invención".Preferentemente, los compuestos de la invención son proteínas o polipéptidos y pueden ser en particular proteínas de fusión.

En la presente solicitud, los residuos/posiciones de aminoácidos en un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina se indicarán con la numeración según Kabat. Para mayor comodidad, la Figura 1 ofrece una tabla que enumera algunas de las posiciones de aminoácidos que se mencionarán específicamente en el presente documento y su numeración según algunos sistemas de numeración alternativos (como Aho e IMGT. Nota: a menos que se indique explícitamente lo contrario, para la presente descripción y las reivindicaciones, la numeración de Kabat es decisiva; otros sistemas de numeración se proporcionan solo a modo de referencia).

Con respecto a las CDR, como es bien sabido en la técnica, existen múltiples convenciones para definir y describir las CDR de un fragmento VH o VHH, como la definición de Kabat (que se basa en la variabilidad de la secuencia y es la utilizada con más frecuencia) y la definición de Chothia (que se basa en la ubicación de las regiones de bucle estructurales). Se hace referencia, por ejemplo, al sitio web http://www.bioinf.org.uk/abs/. A los efectos de la presente memoria descriptiva y reivindicaciones, aunque se mencionen también las CDR según Kabat, las CDR se definen más preferentemente basándose en la definición de Abm (que se basa en el software de modelización de anticuerpos de Oxford Molecular’s AbM), ya que se considera que esto es un término medio óptimo entre las definiciones de Kabat y Chothia. De nuevo se hace referencia, por ejemplo, al sitio web http://www.bioinf.org.uk/abs/.

Por consiguiente, en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, todas las CDR se definen según la convención Abm, a menos que se indique explícitamente lo contrario en el presente documento.

Los ISVD (y en particular nanocuerpos) que se pueden unir a albúmina sérica y sus usos se conocen bien en la técnica, por ejemplo por los documentos WO 2004/041865, WO 2006/122787, WO 2012/175400, WO 2015/173325 y PCT/EP2016/077973, que describen ISVD de unión a albúmina sérica y su uso para prolongar la semivida sérica (tal como se define en estas solicitudes) de compuestos, fracciones y entidades terapéuticos. Por ejemplo, el documento WO 2006/122787 divulga como SEQ ID NO: 62 un nanocuerpo de unión a albúmina sérica humanizado denominado Alb-8 (véase SEQ ID NO:1 en el presente documento). El documento WO 2012/175400 divulga como la SEQ ID NO: 6 un nanocuerpo de unión a albúmina sérica humanizado denominado Alb-23D (véase SEQ ID NO:2 en el presente documento). Las secuencias de aminoácidos de Alb-8 y Alb-23D y sus CDR (que son las mismas para Alb-8 y Alb-23D) se proporcionan en la Tabla A a continuación como SEQ ID NO: 1,2 y 3 a 8, respectivamente.

Algunas otras referencias que divulgan ISVD contra albúmina sérica incluyen los documentos WO 2003/035694, WO 2004/003019, EP 2139918, WO 2011 /006915 y WO 2014/111550.

El documento WO 2008/096158 describe dAb que se unen a albúmina sérica.

El documento WO 2008/028977 describe ISVD contra albúmina sérica humana denominada Alb1 a Alb10.

El documento WO2010/035012 describe anticuerpos y fragmentos Fab que se unen a albúmina sérica humana. Kang et al., 2015 (Immunology letters 169, p. 33-40) describen el aislamiento de anticuerpos Fab anti-albúmina sérica humanos.

Las Figuras 3A y 3B muestran alineamientos de Alb-8 (referencia), Alb-23D (referencia), SEQ ID NO: 18 (invención) y SEQ ID NO: 19 (invención).

La presente invención tiene como objetivo proporcionar ligantes de albúmina sérica mejorados y, en particular, ligantes de albúmina sérica que tengan propiedades mejoradas en comparación con los ligantes de albúmina sérica conocidos en la técnica En particular, la invención tiene como objetivo proporcionar ligantes de albúmina sérica que se puedan unir a albúmina sérica de perro y/o que tengan una reactividad cruzada mejorada entre la albúmina sérica humana y la albúmina sérica de perro (es decir, en comparación con ligantes de albúmina sérica del estado de la técnica como Alb-8 y/o Alb-23D).

Tabla A: Alb-8, Alb-23D y sus CDR

Tabla B: SEQ ID NOs: 18 y 19 y sus CDR

Generalmente, los ISVD de unión a albúmina sérica proporcionados por la presente invención son variantes de las secuencias de SEQ ID NO:18 y 19, en que:

• tienen las mismas CDR que la secuencia de SEQ ID NO: 18 y/o 19 según Abm; y

• tienen un cierto grado de identidad secuencial con la secuencia de la SEQ ID NO: 18 y/o 19 (cuyo grado de identidad secuencial es como se describe adicionalmente en el presente documento).

En particular, los ISVD de unión a albúmina sérica proporcionados por la presente invención tendrán generalmente un número (limitado) de "diferencias de aminoácido" (como se describe en el presente documento) en comparación con la secuencia de SEQ ID NO: 18 y/o 19. Estas diferencias de aminoácidos pueden estar presentes en las regiones marco (tal como se definen según Kabat y/o según Abm). Por ejemplo, y sin limitación, estas diferencias de aminoácidos pueden ser, por ejemplo, sustituciones humanizantes, sustituciones que mejoran la expresión en una célula hospedadora u organismo hospedador deseado, sustituciones que mejoran la estabilidad y/o resistencia a la degradación y/o proteasas, mutaciones que reducen la unión por anticuerpos preexistentes y/u otras mutaciones que están destinadas a optimizar la secuencia de las secuencias de aminoácidos de la invención; o cualquier combinación adecuada de tales diferencias de aminoácidos. Se hace referencia a la divulgación adicional en el presente documento.

La invención se refiere a un ISVD que puede unirse (y en particular, unirse específicamente) a albúmina sérica humana y que tiene:

• una CDR1 según Abm que es la secuencia de aminoácidos GGTFSTYVMG (SEQ ID NO: 12); y • una CDR2 según Abm que es la secuencia de aminoácidos AISQNSIHTY (SEQ ID NO: 13); y • una CDR3 según Abm que es la secuencia de aminoácidos SRFTSWYTADYEYDY (SEQ ID NO: 14),

en donde el dominio variable individual de inmunoglobulina es un VHH, un VHH humanizado o un VH camelizado.

Generalmente, los ligantes de albúmina sérica según la invención son preferentemente tales que tienen:

• un grado de identidad secuencial con la secuencia de SEQ ID NO: 18 y/o 19, en la que las CDR y cualquier extensión C-terminal que pueda estar presente no se tienen en cuenta para determinar el grado de identidad secuencial, de al menos 85%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%; y/o tales que tienen:

o y/o no tienen más de 7, preferentemente no más de 5, como solo 3, 2 o 1 "diferencias de aminoácidos", como se define en el presente documento, y sin tener en cuenta las CDR ni cualquier extensión C-terminal que pueda estar presente, con la secuencia de SEQ ID NO: 18 y/o 19.

En general, los ligantes de albúmina sérica según la invención son preferiblemente tales que se unen a albúmina sérica humana con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente de 10-7 a 10-12 moles/litro o menos y más preferiblemente de 10-8 a 10-12 moles/litro, y/o con una afinidad de unión de al menos 107 M-1, preferentemente al menos 108 M-1, más preferentemente al menos 109 M-1, como al menos 1012 M-1 según se determina mediante ProteOn (se hace referencia al Ejemplo 1). Preferentemente, un ligante de albúmina sérica de la invención se unirá al antígeno deseado con una afinidad inferior a 500 nM, preferentemente inferior a 200 nM, más preferentemente inferior a 10 nM, como inferior a 500 pM, de nuevo tal como se determina mediante ProteOn (se hace referencia de nuevo al Ejemplo 1).

Los ligantes de albúmina sérica según los diferentes aspectos de la invención son generalmente también tales que presentan reactividad cruzada entre albúmina sérica humana y albúmina sérica de al menos una, preferentemente de al menos dos, más preferentemente de al menos tres y hasta esencialmente todas las siguientes especies de mamífero: perro, rata, ratón, conejo, cobaya, cerdo, oveja, vaca y mono cinomolgo. En particular, los ligantes de albúmina sérica según los diferentes aspectos de la invención son tales que presentan (al menos) reactividad cruzada entre albúmina sérica humana y albúmina sérica de perro, y preferiblemente también entre albúmina sérica humana y/o albúmina sérica de perro por un lado, y al menos una, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente las tres albúmina sérica de rata, albúmina sérica de ratón y albúmina sérica de mono cinomolgo por otro lado. A este respecto, los ligantes de albúmina sérica de la invención pueden tener una reactividad cruzada mejorada (en particular entre albúmina sérica humana por un lado y albúmina sérica de perro por otro lado) en comparación con los ligantes de albúmina sérica que tienen (esencialmente) las mismas CDR que Alb-11 y/o Alb-23D. Se hace referencia a los datos en la parte experimental a continuación.

En aras de la referencia, la Figura 5 indica un alineamiento de albúmina sérica de diferentes especies de mamífero (fuente: http://macromoleculeinsights.com/albumin.php. la numeración de aminoácidos en la Figura 5 es la numeración usada en dicha página web).

En general, se considera que un ligante de albúmina sérica de la invención tiene reactividad cruzada entre albúmina sérica humana y albúmina sérica de una de estas especies cuando puede unirse a albúmina sérica humana con una afinidad inferior a 500 nM, preferiblemente inferior a 200 nM, más preferiblemente inferior a 10 nM; y también a la albúmina sérica de dicha especie con una afinidad inferior a 500 nM, preferentemente inferior a 200 nM, más preferentemente inferior a 10 nM, de nuevo ambos como se determinan mediante ProteOn (se hace referencia de nuevo al Ejemplo 1).

Los ligantes de albúmina sérica según la invención son preferiblemente también tales que o bien:

• tienen una semivida sérica en el hombre (expresada como t1/2 beta) que es de más de 6 horas, preferiblemente más de 12 horas, más preferiblemente de más de 24 horas, incluso más preferiblemente más de 72 horas; por ejemplo de aproximadamente una semana, dos semanas y hasta la semivida de albúmina sérica en el hombre (se estima que es de aproximadamente 19 días);

y/o tales que:

o cuando está unido a una fracción o entidad terapéutica, confiere al polipéptido resultante de la invención una semivida sérica en el hombre (expresada como t1/2 beta) que es de más de 6 horas, preferiblemente más de 12 horas, más preferiblemente de más de 24 horas, incluso más preferiblemente más de 72 horas; por ejemplo de aproximadamente una semana, dos semanas y hasta la semivida de albúmina sérica en el hombre (estimada como de aproximadamente 19 días)

La semivida en especies de mamíferos que no sean el hombre dependerá, entre otros factores, principalmente de las propiedades de unión (tales como afinidad) del ligante de albúmina de la invención para la albúmina de suero de dichas especies de mamíferos, así como de la semivida de la albúmina de suero naive en dichas especies. Según una realización preferida de la invención, cuando un ligante de albúmina sérica de la invención presenta reactividad cruzada (tal como se define en el presente documento) entre albúmina sérica humana y albúmina sérica de otra especie de mamífero, a continuación, la semivida del ligante de albúmina sérica de la invención (y/o de un compuesto de la invención que comprende dicho ligante de albúmina sérica) como se determina en dicha especie es preferentemente de al menos 5%, como al menos 10%, más preferentemente al menos 25%, por ejemplo aproximadamente 50% y posiblemente hasta 100% de la semivida de la albúmina sérica naive en dichas especies.

En comparación con la secuencia de SEQ ID NO:18, los ligantes de albúmina sérica de la invención contienen preferiblemente también (al menos):

• una o más sustituciones humanizantes;

y/o

• una o más mutaciones (es decir, sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos y en particular sustituciones) que reducen la unión por de anticuerpos preexistentes;

y puede contener opcionalmente una o más mutaciones adicionales como se describe en el presente documento.

Para sustituciones humanizantes adecuadas (y combinaciones adecuadas de las mismas), se hace referencia, por ejemplo, al documento WO 09/138519 (o en el estado de la técnica citado en el documento WO 09/138519) y el documento WO 08/020079 (o en el estado de la técnica citado en el documento WO 08/020079), así como a las Tablas A-3 a A-8 de WO 08/020079 (que son listas que muestran posibles sustituciones humanizantes). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de tales sustituciones humanizantes son Q108L y A14P o una combinación adecuada de los mismos. Tales sustituciones humanizantes también pueden combinarse adecuadamente con una o más mutaciones diferentes como se describe en el presente documento (como con una o más mutaciones que reducen la unión por anticuerpos preexistentes).

Para mutaciones adecuadas que pueden reducir la unión por anticuerpos preexistentes (y combinaciones adecuadas de tales mutaciones), se hace referencia, por ejemplo, a los documentos WO 2012/175741 y WO 2015/173325 y también, por ejemplo, a los documentos WO 2013/024059 y WO 2016/118733. Tal como se describe en el presente documento, tales mutaciones pueden comprender (una combinación adecuada de) una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos (y en particular sustituciones), donde las mutaciones estarán a menudo en la denominada región C-terminal del ISV. Por ejemplo, tales mutaciones pueden comprender mutaciones (y en particular sustituciones) en una o más de las posiciones 11, 13, 14, 15, 40, 41,42, 82, 82a, 82b, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 103, 108 y/o mutaciones en una o más posiciones en la secuencia de VTVSS C-terminal (es decir, las posiciones 109, 110, 111, 112 y 113), siendo preferentes particularmente una o más mutaciones en las posiciones 11, 89, 110 y/o 112. Algunos ejemplos preferidos pero no limitantes de tales mutaciones son sustituciones adecuadas (cuando sea necesario) de modo que después de la mutación, en la posición indicada, esté presente uno de los siguientes residuos de aminoácido: 11L, 11K, 11V, 14A, 14P, 41A, 41L, 41P, 41S, 41T, 42E, 42G, 87A, 87T, 89A, 89L, 89T, 108L, 110K, 110Q, 112K y/o 112Q (siendo particularmente preferentes 11L, 89A, 89L, 89T, 110K, 110Q, 1l2K y 1l2Q); o cualquier combinación adecuada de dichas sustituciones, como por ejemplo y sin limitación: 11V en combinación con 89L o 89T; 11V en combinación con 110K o 110Q; u 11V en combinación con 89L y 110K o 110Q. Dichas mutaciones que reducen la unión por anticuerpos preexistentes también pueden combinarse adecuadamente con una o más mutaciones diferentes como se describe en el presente documento (como con una o más sustituciones humanizantes).

Cuando proceda (como se describe adicionalmente en el presente documento y en particular cuando el ligante de albúmina sérica de la invención está presente en y/o forma el extremo C-terminal del compuesto de la invención en el que está presente), para reducir la unión de anticuerpos preexistentes, los ligantes de albúmina sérica de la invención (y, como se describe adicionalmente en el presente documento, también los compuestos de la invención) pueden comprender una extensión C-terminal (como un residuo de alanina C-terminal). Tal como se describe en el documento WO 2012/175741, tal extensión C-terminal reduce la unión por anticuerpos preexistentes. En general, una extensión C-terminal adecuada se puede describir adicionalmente en el presente documento y en particular puede tener la fórmula -(X)<n>, en donde X puede ser cualquier aminoácido que se produce de forma natural (pero preferiblemente no cisteína) y n puede ser 1, 2, 3, 4 o 5. Se hace referencia de nuevo al documento WO 2012/175741, también, por ejemplo, a los documentos Wo 2015/173325, WO 2013/024059 y WO 2016/118733. La presencia de dicha extensión C-terminal también puede combinarse adecuadamente con una o más de las otras mutaciones descritas en el presente documento (como con una o más sustituciones humanizantes y/o una o más mutaciones que reducen la unión por anticuerpos preexistentes).

Otras mutaciones que pueden estar presentes en los ligantes de albúmina sérica de la invención, por ejemplo y sin limitación, incluyen una o más mutaciones (y en particular sustituciones) que mejoran la expresión en una célula hospedadora u organismo hospedador deseado, una o más mutaciones (y en particular sustituciones) que mejoran la estabilidad y/o resistencia a la degradación y/o proteasas, y/o una o más mutaciones diferentes que están destinadas a optimizar la secuencia de las secuencias de aminoácidos de la invención (por ejemplo y sin limitación una o más mutaciones que reducen (además) cualquier tendencia de los ligantes de albúmina a formar dímeros); o cualquier combinación adecuada de dichas mutaciones.

Algunos ejemplos no limitantes de dichas mutaciones son sustituciones adecuadas (cuando sea necesario) de modo que después de la mutación, en la posición indicada, esté presente uno de los siguientes residuos de aminoácido: 16G, 49A, 61D, 74S, 75K, 76N, 82M y 83R; o cualquier combinación adecuada de tales sustituciones (por ejemplo para formar un motivo SKN en las posiciones 74-76). Además, cuando proceda (como se describe adicionalmente en el presente documento), los ligantes de albúmina sérica de la invención pueden tener un D en posición 1 (es decir, una mutación de E1D en comparación con la secuencia de SEQ ID NO:18 y/o 19), en particular cuando el ligante de albúmina sérica de la invención está presente en y/o forma el extremo N-terminal del compuesto de la invención en el que está presente. Tales mutaciones se pueden combinar de nuevo de forma adecuada con una o más mutaciones diferentes como se describe en el presente documento (tal como con una o más sustituciones humanizantes y/o una o más mutaciones que reducen la unión por anticuerpos preexistentes).

Otras mutaciones que pueden estar presentes en las secuencias de aminoácidos de la invención serán evidentes para el experto basándose en la divulgación en el presente documento.

También es posible que una sola mutación (o una combinación adecuada de mutaciones) proporcione múltiples funcionalidades o ventajas. Por ejemplo, y sin limitación, una sustitución Q108L humanizante también puede reducir la unión por anticuerpos preexistentes.

Algunos ejemplos preferidos pero no limitantes de residuos de aminoácidos (es decir, mutaciones en comparación con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18) que pueden estar presentes en las secuencias de aminoácidos de la invención (es decir, por sí mismos o en combinación adecuada) incluyen: 11V (es decir, L11V), 14P (es decir, A14P), 16G (es decir, D16G), 49A (es decir, S49A), 61D (es decir, N61D), 74S (es decir, D74S), 82M (es decir, L82M), 83R (es decir, K83R), 89L (i.e.V89L), 89T (i.e.V89T), 110K (e.g.T11oK) o 110Q (por ejemplo T11oQ); así como, cuando proceda (como se describe adicionalmente en el presente documento), 1D (por ejemplo E1D) y/o una extensión C-terminal (X)<n>como se define en el presente documento (como 114A). También se hace referencia a las secuencias y mutaciones que se muestran en las Figuras 4A y 4B. Por ejemplo, algunos ejemplos preferidos pero no limitantes de combinaciones adecuadas de tales residuos de aminoácidos (es decir, mutaciones en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18) incluyen:

• L11V,T14P,D16G,N61D,D74S,K83R,V89L

• L11V,T14P,D16G,D74S,L82M,K83R,V89L

• L11V,T14P,D16G,N61D,D74S,L82M,K83R,V89L

• L11V,T14P,D16G,S49A,D74S,K83R,V89L

• L11V,T14P,D16G,S49A,N61D,D74S,K83R,V89L

• L11V,T14P,D16G,S49A,D74S,L82M,K83R,V89L

• L11V,T14P,D16G,S49A,N61D,D74S,L82M,K83R,V89L

• L11V,T14P,D74S,K83R,V89L

y otras combinaciones adecuadas serán evidentes para el experto basándose en la divulgación en el presente documento.

Algunas secuencias de aminoácidos preferidas pero no limitantes de la invención son aquellas en las que (i) la posición 11 es V y la posición 89 es L; (ii) la posición 89 es T; (iii) las posiciones 74-76 forman un motivo SKN; (iv) la posición 11 es V, la posición 89 es L y las posiciones 74-76 forman un motivo SKN; y (iv) la posición 89 es T y las posiciones 74-76 forman un motivo SKN; secuencias de aminoácidos de la invención que son como se describen adicionalmente en el presente documento (y por consiguiente también pueden contener adecuadamente una o más mutaciones de aminoácidos adicionales como se describe en el presente documento).

Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes, de las secuencias de aminoácidos de la invención se proporcionan en la Figura 2 como:

• SEQ ID NO: 18 a 26, que son ejemplos de secuencias de aminoácidos de la invención sin una extensión de alanina C-terminal;

• SEQ ID NO: 27 a 35, que son ejemplos de secuencias de aminoácidos de la invención con una extensión C-terminal (en cada caso, ejemplificadas por medio de una extensión C-terminal de alanina, que es generalmente la extensión C-terminal preferida); y.

• SEQ ID NO: 36 a 44, que son ejemplos de secuencias de aminoácidos de la invención con una mutación de E1D N-terminal).

Basándose en la divulgación adicional en el presente documento, resultará evidente para el experto que en la práctica:

• Los ligantes de albúmina de la invención con una extensión C-terminal (como las de las SEQ ID NO: 27 a 35) a menudo se usarán como/estarán presentes en el extremo C-terminal de los polipéptidos de la invención (tal como se definen en el presente documento) en los que están presentes;

• Los ligantes de albúmina de la invención con una mutación de E1D (tal como las de SEQ ID NO: 36 a 44) a menudo se usarán como/estarán presentes en el extremo N-terminal de los polipéptidos de la invención en los que están presentes;

• Los ligantes a albúmina de la invención sin una extensión C-terminal y sin una mutación de E1D (tal como las de SEQ ID NO: 18-26) estarán presentes a menudo en algún punto en el "centro" de un polipéptido de la invención.

Cada una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 18 a 44, así como proteínas, polipéptidos y otros compuestos y construcciones que los comprenden (como se describe adicionalmente en el presente documento), forman aspectos adicionales de la presente invención.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos que es una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, y/o SEQ ID NO:44; y cada una de estas secuencias de aminoácidos de la invención (así como polipéptidos de la invención, como se definen mediante las reivindicaciones, que comprenden una secuencia de aminoácidos de la invención de este tipo) forma un aspecto adicional de la presente invención.

Como se describe adicionalmente en el presente documento, las secuencias de aminoácidos proporcionadas por la invención son proteínas que pueden unirse a, y que en particular pueden unirse específicamente (como se describe en el presente documento) a albúmina sérica humana. Por tanto, pueden usarse como unidades de unión o dominios de unión para la unión a albúmina sérica (humana), por ejemplo para conferir un aumento en la semivida (como se define en el presente documento) a compuestos, fracciones o entidades terapéuticos. Para el uso de dominios de unión a albúmina sérica para aumentar la semivida de compuestos, fracciones o entidades terapéuticos, se hace referencia, por ejemplo, a los documentos WO 2004/041865, WO 2006/122787, EP 2139918, WO 2011/006915, WO 2012/175400 y/o WO 2014/111550. Los ligantes de albúmina sérica de la invención se pueden utilizar generalmente del mismo modo y con los mismos fines que los ligantes de albúmina sérica descritos en estas referencias.

En algunos aspectos no limitantes adicionales, la invención también se refiere a:

• proteínas, polipéptidos y otras construcciones o compuestos que comprenden o consisten esencialmente en al menos un ligante de albúmina sérica de la invención como se define mediante las reivindicaciones (nuevamente, también denominados en el presente documento"compuestos de la invención”o"polipéptidos de la invención'');

•métodos para expresar/producir un ligante de albúmina sérica de la invención y/o un compuesto de la invención como se define mediante las reivindicaciones;

• una célula hospedadora que puede expresar o producir un ligante de albúmina sérica de la invención y/o un compuesto de la invención como se define en las reivindicaciones;

• composiciones y productos (tales como composiciones y productos farmacéuticos) que comprenden un aglutinante de albúmina sérica de la invención y/o un compuesto de la invención como se define en las reivindicaciones;

• secuencias de nucleótidos y ácidos nucleicos, como vectores (de expresión), que codifican un ligante de albúmina sérica de la invención y/o un polipéptido de la invención como se define mediante las reivindicaciones;

• usos de los compuestos de la invención y/o los compuestos de la invención, como el uso de un compuesto de la invención para aumentar la semivida (sérica) de un compuesto, fracción o entidad terapéuticos.

Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invención se aclararán a partir de la descripción adicional del presente documento.

En la presente memoria descriptiva:

• el término"dominio variable único de inmunoglobulina"(también denominado"ISV"o"ISVD")se usa generalmente para referirse a dominios variables de inmunoglobulina (que pueden ser dominios de cadena pesada o cadena ligera, incluyendo dominios VH, VHH o VL) que pueden formar un sitio de unión a antígeno funcional sin interacción con otro dominio variable (por ejemplo, sin una interacción VH/VL según sea necesario entre los dominios VH y VL del anticuerpo monoclonal de cadena 4 convencional). Los ejemplos de ISVD serán evidentes para el experto y, por ejemplo, incluyen nanocuerpos (que incluyen un VHH, un VHH humanizado y/o VH camelizados como VH humanos camelizados), IgNAR, dominios, anticuerpos (de dominio único) (como dAb™) que son dominios VH o que se derivan de un dominio VH y anticuerpos (de dominio único) (tales como dAb™) que son dominios VL o que se derivan de un dominio VL. A menos que se mencione explícitamente lo contrario en el presente documento, se prefieren generalmente los ISVD que se basan en y/o se derivan de dominios variables de cadena pesada (como los dominios VH o VHH). Más preferiblemente, a menos que se indique explícitamente lo contrario en el presente documento, un ISVD será un nanocuerpo. El ISVD tal como se reivindica es un VHH, un VHH humanizado o un VH camelizado. • El término "nanocuerpo" es generalmente como se define en el documento WO 2008/020079 o el documento WO 2009/138519, y, por lo tanto, en un aspecto específico, indica generalmente un VHH, un VHH humanizado o un VH camelizado (como un VH humano camelizado) o generalmente un VHH con secuencia optimizada (como, por ejemplo, optimizada para estabilidad química y/o solubilidad, solapamiento máximo con regiones marco humanas conocidas y expresión). Cabe destacar que los términos nanocuerpo o nanocuerpos son marcas registradas de Ablynx N.V. y, por lo tanto, también se pueden denominar Nanobody® y/o Nanobodies®);

• En general, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, los ISVD, nanocuerpos, polipéptidos, proteínas y otros compuestos y construcciones a los que se hace referencia en el presente documento estarán destinados para uso en la profilaxis o tratamiento de enfermedades o trastornos en el ser humano (y/u opcionalmente también en animales de sangre caliente y en particular mamíferos). Por tanto, generalmente, los ISVD, nanocuerpos, polipéptidos, las proteínas y otros compuestos y construcciones descritos en el presente documento son preferentemente tales que pueden usarse como, y/o pueden formar parte adecuadamente de un fármaco (biológico) u otro compuesto farmacéutica o terapéuticamente activo y/o de un producto o composición farmacéutica. Dicho fármaco, compuesto o producto es preferentemente tal que es adecuado para la administración a un ser humano, por ejemplo, para la profilaxis o el tratamiento de un sujeto que necesite dicha profilaxis o tratamiento o, por ejemplo, como parte de un ensayo clínico. Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, para este fin, dicho fármaco o compuesto puede contener otras fracciones, entidades o unidades de unión además de los ISVD proporcionados por la invención (que, como también se describe en el presente documento, pueden ser, por ejemplo, una o más fracciones terapéuticas adicionales diferentes y/o una o más fracciones diferentes que influyen en las propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas del producto biológico basado en ISVD o basado en nanocuerpos, como su semivida). Los ejemplos adecuados de dichas fracciones terapéuticas adicionales serán evidentes para el experto y, por ejemplo, generalmente pueden incluir cualquier proteína, polipéptido u otro dominio de unión o unidad de unión terapéuticamente activo, así como, por ejemplo, modificaciones como las descritas en las páginas 149 a 152 del documento WO 2009/138159. Un producto biológico basado en ISVD o un producto biológico basado en nanocuerpos es preferentemente un agente terapéutico o destinado para uso como un agente terapéutico (que incluye profilaxis y diagnóstico) y para este fin contiene preferentemente al menos un ISVD contra una diana terapéuticamente relevante (como, por ejemplo, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, Il-23 u otras interleucinas, etc.). Para algunos ejemplos específicos pero no limitantes de dichos productos biológicos basados en ISVD o basados en nanocuerpos, se hace referencia a los Ejemplos 8 a 18 y también, por ejemplo, a las diversas aplicaciones de Ablynx N.V. (como, por ejemplo y sin limitación, los documentos W2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 y WO 2009/068627), así como, por ejemplo (y sin limitación) a solicitudes tales como los documentos WO 2006/038027, WO 2006/059108, WO 2007/063308, WO 2007/063311, WO 2007/066016 y WO 2007/085814. Además, como se describe adicionalmente en el presente documento, la fracción adicional puede ser un ISVD o nanocuerpo como se describe en el presente documento dirigido contra una proteína sérica (humana) como albúmina sérica (humana), y tal ISVD o nanocuerpo también puede encontrar usos terapéuticos, en particular en y/o para prolongar la semivida de los ligantes de TNF descritos en el presente documento. Se hace referencia, por ejemplo, a los documentos WO 2004/041865, WO 2006/122787 y WO 2012/175400, que describen en general el uso de nanocuerpos de unión a albúmina sérica para la extensión de la semivida. Además, en la presente memoria descriptiva, a menos que se mencione explícitamente lo contrario en el presente documento, todos los términos mencionados en el presente documento tienen el significado dado en el documento WO 2009/138519 (o en el estado de la técnica citado en el documento WO 2009/138519) o el documento WO 2008/020079 (o en el estado de la técnica citado en el documento WO 2008/020079). Además, cuando un método o técnica no se describe específicamente en el presente documento, puede realizarse como se describe en el documento WO 2009/138519 (o en el estado de la técnica citado en el documento WO 2009/138519) o el documento WO 2008/020079 (o en el estado de la técnica citado en el documento WO 2008/020079). Además, como se describe en el presente documento, cualquier producto o composición farmacéutica que comprenda cualquier ISVD o compuesto de la invención también puede comprender uno o más componentes adicionales conocidos de por sí para uso en productos o composiciones farmacéuticas (es decir, dependiendo de la forma farmacéutica pretendida) y/o, por ejemplo, uno o más compuestos o principios activos diferentes destinados a uso terapéutico (es decir, para proporcionar un producto combinado).

Además, cuando se usan en la presente memoria descriptiva o en las reivindicaciones, los siguientes términos tienen el mismo significado que se da en, y/o cuando sea aplicable pueden determinarse de la manera descrita en las páginas 62-75 del documento WO 2009/138519:"agonista", "antagonista", "agonista inverso", "residuo de aminoácido no cargado no polar", "residuo de aminoácido no cargado polar", "residuo de aminoácido cargado polar", "identidad secuencia!", "exactamente igual"y"diferencia de aminoácido"(cuando se refiere a una comparación de secuencias de dos secuencias de aminoácidos),"(en) esencialmente aislado (forma)"dominio", "dominio de unión", "determinante antigénico", "epítopo", "contra"o"dirigido contra"(unantígeno), "especificidad"y"semivida".Además, los términos"modulación"y"modular", "sitio de interacción", "específico para", "bloqueo cruzado", "bloqueado de manera cruzada"y"bloqueo cruzado"y "esencialmente independiente de!pH "son como se definen en (y/o pueden determinarse como se describe en) las páginas 74-79 del documento WO 2010/130832 de Ablynx N.V.. Además, cuando se hace referencia a una construcción, un compuesto, una proteína o un polipéptido de la invención, términos como"monovalente", "bivalente"(o"multivalente"), "biespecííico"(o"multiespecííico")y"biparatópico"(o"multiparatópico")pueden tener el significado dado en los documentos WO 2009/138519, WO 2010/130832 o WO 2008/020079.

El término"semivida", como se utiliza en el presente documento en relación con un ISVD, nanocuerpo, agente biológico basado en ISVD, agente biológico basado en nanocuerpo o cualquier otra secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido mencionado en el presente documento, se puede definir generalmente como se describe en el párrafo o) en la página 57 del documento WO 2008/020079, y como se menciona en la misma se refiere al tiempo necesario para reducir la concentración sérica de la secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido en 50%, in vivo. por ejemplo, debido a la degradación de la secuencia o el compuesto y/o al aclaramiento o secuestro de la secuencia o el compuesto por mecanismos naturales. La semivida in vivo de una secuencia, compuesto o polipéptido de aminoácidos de la invención se puede determinar de cualquier manera conocida de por sí, como mediante análisis farmacocinético. Las técnicas adecuadas resultarán evidentes para el experto en la técnica y, por ejemplo, pueden ser generalmente como se describe en el párrafo o) en la página 57 del documento WO 2008/020079. Como se menciona también en el párrafo o) en la página 57 del documento WO 2008/020079, la semivida puede expresarse mediante parámetros como t1/2-alfa, t1/2-beta y el área bajo la curva (AUC). A este respecto, cabe señalar que el término "semivida", como se utiliza en el presente documento, se refiere en particular a la semivida t1/2-beta o terminal (en la que la t1/2-alfa y/o el AUC o ambos se pueden mantener sin consideraciones). Se hace referencia, por ejemplo, a la parte experimental a continuación, así como a los manuales estándar, como Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a edición rev. (1982). De manera similar, los términos "aumento en la semivida" o "semivida aumentada" también son como se definen en el párrafo o) en la página 57 del documento WO 2008/020079 y se refieren en particular a un aumento en la t1/2-beta, con o sin un aumento en la t1 /2-alfa y/o el AUC o ambos.

Cuando un término no se define específicamente en el presente documento, tiene su significado habitual en la técnica, que será evidente para el experto. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales convencionales, como Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y, (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2a edición, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6a Ed.), Mosby/Elsevier, Edimburgo (2001); Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10.a Ed. Blackwell Publishing, R.U. (2001); y Janeway et al., "Immunobiology" (6a Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, Nueva York (2005), así como a los antecedentes técnicos generales citados en este documento.

Además, como ya se ha indicado en el presente documento, los residuos de aminoácido de un nanocuerpo se pueden numerar según la numeración general de VH proporcionada por Kabat et al ("Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, publicación n° 91), aplicada a dominios VHH de camélidos en el artículo de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods 23 de junio de 2000; 240 (1-2): 185-195; o a la que se hace referencia en el presente documento. Según esta numeración, FR1 de un nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 1-30, CDR1 de un nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 31-35, FR2 de un nanocuerpo comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, CDR2 de un nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 50-65, FR3 de un nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 66-94, CDR3 de un nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 95-102, y FR4 de un nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 103 113. [A este respecto, cabe señalar que, como es bien sabido en la técnica para los dominios VH y para los dominios VHH, el número total de residuos de aminoácido en cada una de las CDR puede variar y puede no corresponder al número total de residuos de aminoácido indicados por la numeración de Kabat (es decir, una o más posiciones según la numeración de Kabat pueden no estar ocupadas en la secuencia real, o la secuencia real puede contener más residuos de aminoácido que el número permitido por la numeración de Kabat). Esto significa que, generalmente, la numeración según Kabat puede o no corresponder a la numeración real de los residuos de aminoácido en la secuencia real. Generalmente, sin embargo, puede decirse que, según la numeración de Kabat e independientemente del número de residuos de aminoácido en las CDR, la posición 1 según la numeración de Kabat corresponde al inicio de FR1 y viceversa, la posición 36 según la numeración de Kabat corresponde al inicio de FR2 y viceversa, la posición 66 según la numeración de Kabat corresponde al inicio de FR3 y viceversa. y la posición 103 según la numeración de Kabat corresponde al inicio de FR4 y viceversa].

Métodos alternativos para numerar los residuos de aminoácidos de dominios VH, métodos que también pueden aplicarse de manera análoga a dominios VHH de camélidos y a nanocuerpos, son el método descrito por Chothia et al (Nature 342, 877-883 (1989)), la denominada "definición de Abm" y la denominada "definición de contacto". Sin embargo, en la presente descripción, aspectos y figuras, se seguirá la numeración según Kabat aplicada a los dominios VHH descritos anteriormente, a menos que se indique lo contrario.

También debe observarse que las figuras, cualquier listado de secuencias y la parte experimental/ejemplos se proporcionan solo para ilustrar adicionalmente la invención y no deben interpretarse o entenderse como limitantes del alcance de la invención y/o de las reivindicaciones adjuntas de ninguna manera, a menos que se indique explícitamente lo contrario en el presente documento.

Como se describe adicionalmente en el presente documento, los ligantes de albúmina sérica de la invención pueden usarse con ventaja como fracción, unidad de unión o asociado de fusión para aumentar la semivida de compuestos, fracciones o entidades terapéuticos como polipéptidos, proteínas, compuestos (incluyendo, sin limitación, moléculas pequeñas) u otras entidades terapéuticas.

Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos, proteínas, construcciones, compuestos u otras entidades químicas que comprenden o consisten esencialmente en un ligante de albúmina sérica de la invención y una o más secuencias de aminoácidos, dominios (de unión), unidades de unión u otras fracciones o entidades químicas.

En particular, la invención proporciona polipéptidos, proteínas, construcciones o compuestos que comprenden un ligante de albúmina sérica de la invención y una o más (como uno o dos) fracciones terapéuticas (que pueden ser iguales o diferentes y pueden estar dirigidas, por ejemplo, contra la misma diana o a dianas diferentes, y cuando se dirigen a la misma diana, pueden dirigirse hacia epítopos, partes, dominios o subunidades iguales o diferentes de dicha diana), adecuadamente unidos entre sí o bien directamente o bien mediante uno o más engarces o espaciadores adecuados. Dichos polipéptidos, proteínas o construcciones pueden ser, por ejemplo y sin limitación, una proteína de fusión, como se describe adicionalmente en el presente documento.

En un aspecto, el al menos una fracción terapéutica comprende o consiste esencialmente en una proteína terapéutica, polipéptido, compuesto, factor u otra entidad. En una realización preferida, la fracción terapéutica se dirige contra un antígeno o diana deseado, es capaz de unirse a un antígeno deseado (y en particular capaz de unirse específicamente a un antígeno deseado) y/o es capaz de interaccionar con una diana deseada. En otra realización, la al menos una fracción terapéutica comprende o consiste esencialmente en una proteína o polipéptido terapéutico. En una realización adicional, la al menos una fracción terapéutica comprende o consiste esencialmente en un dominio de unión o unidad de unión, como una secuencia de inmunoglobulina o inmunoglobulina (incluyendo pero sin limitarse a un fragmento de una inmunoglobulina), como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (incluyendo pero sin limitarse a un fragmento ScFv), o de otra matriz de proteína adecuada, como dominios de proteína A (como Affibodies™), tendamistat, fibronectina, lipocalina, CTLA-4, receptores de células T, repeticiones de anquirina diseñadas, avímeros y dominios PDZ (Binz et al., Nat. Biotech 2005, Vol 23:1257), y fracciones de unión basadas en ADN o ARN, incluyendo, pero sin limitación, aptámeros de ADN o ARN (Ulrich et al., Comb Chem High Throughput Screen 2006 9(8):619-32).

En otro aspecto más, la al menos una fracción terapéutica comprende o consiste esencialmente en un dominio variable de anticuerpo, como un dominio variable de cadena pesada o un dominio variable de cadena ligera.

En un aspecto preferido, la al menos una fracción terapéutica comprende o consiste esencialmente en al menos un dominio variable único de inmunoglobulina, como un anticuerpo de dominio, un anticuerpo de dominio único, ''dAb'' o nanocuerpo (como un VHH, un VHH humanizado o un VH camelizado) o un dominio IgNAR.

En una realización específica, la al menos una fracción terapéutica comprende o consiste esencialmente en al menos un nanocuerpo monovalente o una construcción de nanocuerpo bivalente, multivalente, biespecífico o multiespecífico.

Los polipéptidos, proteínas (de fusión), construcciones o compuestos que comprenden un ligante de albúmina sérica de la invención y uno o más fracciones terapéuticas generalmente pueden ser (prepararse y usarse) como se describe en el estado de la técnica citado anteriormente (como los documentos W o 04/041865, w O 06/122787, WO 2012/175400 y WO 2015/173325; también se hace referencia, por ejemplo, a los documentos WO 2004/003019, EP 2 139918, WO 2011/006915 y WO 2014/111550) con un ligante de albúmina sérica de la invención en lugar de las fracciones de aumento de la semivida descritas en dicho documento.

Los polipéptidos, proteínas (de fusión), construcciones o compuestos que comprenden un ligante de albúmina sérica de la invención y una o más fracciones terapéuticas tendrán generalmente y preferiblemente una mayor semivida (como se describe en el presente documento, y preferiblemente expresados como t1/2-beta), en comparación con la fracción o las fracciones terapéuticas de por sí.

Generalmente, los compuestos, polipéptidos, construcciones o proteínas de fusión descritos en el presente documento tienen preferentemente una semivida (nuevamente, como se describe en el presente documento, y preferentemente expresada como t1/2-beta) que es al menos 1,5 veces, preferentemente al menos 2 veces, como al menos 5 veces, por ejemplo, al menos 10 veces o más de 20 veces, mayor que la semivida de la fracción terapéutica correspondiente per se (como se mide en el hombre o en un animal adecuado, como ratón o mono cinomolgo).

Además, preferentemente, cualquier compuesto, polipéptido, proteína de fusión o construcción de este tipo tiene una semivida (nuevamente, como se describe en el presente documento, y preferiblemente expresada como t1/2-beta) en el hombre que se aumenta en más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente más de 6 horas, como de más de 12 horas, en comparación con la semivida de la fracción terapéutica correspondiente de por sí.

Además, preferentemente, un compuesto o polipéptido de la invención tiene una semivida (nuevamente, como se describe en el presente documento, y preferiblemente expresada como t1/2-beta) en el hombre que es de más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente de más de 6 horas, como de más de 12 horas y por ejemplo de aproximadamente un día, dos días, una semana, dos semanas y hasta la semivida de albúmina sérica en el hombre (que se estima que es de aproximadamente 19 días).

Como se ha mencionado, en un aspecto, un ligante de albúmina sérica de la invención se usa para aumentar la semivida de (uno o más) dominios variables individuales de inmunoglobulina, tales como anticuerpos de dominio, anticuerpos de dominio único, "dAb", VHH o nanocuerpos (tales como VHH, VHH humanizados o VH camelizados como VH humanos camelizados).

Por tanto, una realización de la invención se refiere a un polipéptido, construcción o proteína de fusión que comprende un ligante de albúmina sérica de la invención y una o más (tal como una o dos) secuencias de dominio variable único de inmunoglobulina, que están adecuadamente unidas entre sí, o bien directamente u opcionalmente mediante uno o más engarces o espaciadores adecuados. Como se menciona en el presente documento, y además del ligante de albúmina sérica de la invención que es un VHH, un VHH humanizado o un VH camelizado, cada dominio variable único de inmunoglobulina de este tipo presente en un polipéptido, construcción o proteína de fusión de este tipo puede ser independientemente un anticuerpo de dominio, anticuerpo de dominio único, "dAb"' o nanocuerpo (tal como un VHH, VHH humanizado o VH camelizado, como un VH humano camelizado); y según un aspecto específico pero no limitante, al menos uno (y hasta todos) de estos dominios variables únicos de inmunoglobulina comprende dos o tres puentes disulfuro. Preferentemente, todos los ISVD presentes en tal compuesto de la invención son nanocuerpos.

Cuando un compuesto de la invención tiene un ISVD en su extremo C-terminal (como un ligante de albúmina sérica de la invención o un ISVD que está dirigido contra una diana terapéutica), entonces dicho ISVD C-terminal (y por tanto, por extensión, todo el compuesto de la invención) tiene preferiblemente una extensión C-terminal en su extremo C-terminal Esta extensión C-terminal estará directamente unida al último residuo de aminoácido C-terminal del ISVD, que normalmente será el residuo de aminoácido en posición 113 según Kabat (a menos que el ISVD contenga una o más deleciones de aminoácido de manera que la secuencia del ISVD termine antes de la posición 113). Por lo tanto, generalmente, la extensión C-terminal estará directamente unida a la secuencia de VTVSS C-terminal (SEQ ID NO: 15) del ISV C-terminal (y por lo tanto, por extensión, a la secuencia de TVTSS C-terminal del compuesto de la invención) o la secuencia C-terminal del ISVD C-terminal que corresponde a la secuencia de ISVD C-terminal (por ejemplo, donde dicha secuencia C-terminal del ISVD C-terminal contiene una o más sustituciones o deleciones terminales en comparación con la secuencia de VTVSS usual, como T110K, T110Q, S112K o S112K).

También resultará evidente para el experto. en el caso en el que un compuesto de la invención tiene un ligante de albúmina sérica de la invención en su extremo C-terminal, que entonces dicho ligante de albúmina sérica de la invención llevará dicha extensión C-terminal.

En general, cualquier extensión C-terminal que se utilice en el presente documento (es decir, en el extremo C-terminal de un compuesto de la invención y/o en el extremo C-terminal de un ligante de albúmina sérica de la invención) generalmente puede ser como se describe en el documento WO 2012/174741 o el documento WO 2015/173325 (también se hace referencia, por ejemplo, a los documentos WO 2103/024059 y WO2016/118733). En particular, una extensión C-terminal puede tener la fórmula (X)<n>, en la que n es 1 a 10, preferiblemente 1 a 5, como 1, 2, 3, 4 o 5 (y preferiblemente 1 o 2, como 1); y cada X es un residuo de aminoácido (preferentemente de origen natural) que se elige independientemente entre residuos de aminoácido de origen natural (aunque, según un aspecto preferido, no comprende ningún residuo de cisteína) y de modo preferente se elige independientemente a partir del grupo constituido por alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I).

Según algunos aspectos preferidos, pero no limitantes, de dichas extensiones C-terminales X<(n)>, X y n pueden ser como se indica a continuación:

(a) n = 1 y X = Ala;

(b) n = 2 y cada X = Ala;

(c) n = 3 y cada X = Ala;

(d) n = 2 y al menos un X = Ala (donde el (los) residuo(s) de aminoácido X restantes se seleccionan independientemente a partir de cualquier aminoácido de origen natural pero se seleccionan preferentemente de forma independiente a partir de Val, Leu y/o Ile);

(e) n = 3 y al menos un X = Ala (donde el (los) residuo(s) de aminoácido X restantes se seleccionan independientemente a partir de cualquier aminoácido de origen natural pero se seleccionan preferentemente de forma independiente a partir de Val, Leu y/o Ile);

(f) n = 3 y al menos dos X = Ala (donde el (los) residuo(s) de aminoácido X restantes se seleccionan independientemente a partir de cualquier aminoácido de origen natural pero se seleccionan preferentemente independientemente a partir de Val, Leu y/o Ile);

(g) n = 1 y X = Gly;

(h) n = 2 y cada X = Gly;

(i) n = 3 y cada X = Gly;

(j) n = 2 y al menos un X = Gly (donde el (los) residuo(s) de aminoácido X restantes se eligen independientemente a partir de cualquier aminoácido de origen natural pero se eligen preferentemente de forma independiente a partir de Val, Leu y/o Ile);

(k) n = 3 y al menos un X = Gly (donde el (los) residuo(s) de aminoácido X restantes se eligen independientemente a partir de cualquier aminoácido de origen natural pero se eligen preferentemente de forma independiente a partir de Val, Leu y/o Ile);

(l) n = 3 y al menos dos X = Gly (donde el (los) residuo(s) de aminoácido X restantes se eligen independientemente a partir de cualquier aminoácido de origen natural pero se eligen preferentemente de forma independiente a partir de Val, Leu y/o Ile);

(m) n = 2 y cada X = Ala o Gly;

(n) n = 3 y cada X = Ala o Gly;

(o) n = 3 y al menos un X = Ala o Gly (donde el (los) residuo(s) de aminoácido X restantes se eligen independientemente a partir de cualquier aminoácido de origen natural pero se eligen preferentemente de forma independiente a partir de Val, Leu y/o Ile); o.

(p) n = 3 y al menos dos X = Ala o Gly (donde el (los) residuo(s) de aminoácido X restantes se eligen independientemente a partir de cualquier aminoácido de origen natural pero se eligen preferentemente de forma independiente a partir de Val, Leu y/o Ile);

siendo particularmente preferentes los aspectos (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) y (n), siendo preferentes aspectos en los que n =1 o 2 y siendo particularmente preferentes aspectos en los que n = 1.

También cabe señalar que, preferiblemente, cualquier extensión C-terminal presente en un ligante de albúmina sérica de la invención no contiene un residuo de cisteína (libre) (a menos que se use o se destine dicho residuo de cisteína para una funcionalización adicional, por ejemplo para la pegilación).

Algunos ejemplos específicos pero no limitantes de extensiones C-terminales útiles son las siguientes secuencias de aminoácidos: A, AA, AAA, G, GG, GGG, AG, GA, AAG, AGG, AGA, GGA, GAA o GAG.

También preferiblemente, cuando un compuesto de la invención tiene un ISVD en su extremo C-terminal (como un ligante de albúmina sérica de la invención o un ISVD que está dirigido contra una diana terapéutica), entonces (al menos) dicho ISVD C-terminal contiene preferentemente, incluso más preferentemente además de una extensión C-terminal como se describe en el presente documento, una o más mutaciones que reducen la unión por anticuerpos preexistentes (es decir, como se describe en el presente documento para los ligantes a albúmina sérica de la invención y como se describe más generalmente en los documentos WO 2012/175741 y WO 2015/173325 y también, por ejemplo, en los documentos WO 2013/024059 y WO 2016/118733). A este respecto, para el experto resultará evidente, en el caso en el que un compuesto de la invención tenga un ligante de albúmina sérica de la invención en su extremo C-terminal, que entonces (al menos) dicho ligante de albúmina sérica de la invención contendrá preferiblemente tales mutaciones (es decir, preferiblemente además de una extensión C-terminal).

Más generalmente, según un aspecto específico de la invención, cuando un compuesto de la invención contiene dos o más ISVD (por ejemplo, un ligante de albúmina sérica de la invención y uno o más ISVD contra una diana terapéutica), entonces preferiblemente todos estos ISVD contienen mutaciones que reducen la unión a anticuerpos preexistentes (de nuevo, preferiblemente además de la extensión C-terminal que está unida al ISVD C-terminal si el compuesto de la invención tiene un ISVD en su extremo C-terminal).

Cuando un compuesto de la invención tiene un ISVD en su extremo N-terminal (como un ligante de albúmina sérica de la invención o un ISVD que está dirigido contra una diana terapéutica), entonces dicho ISVD N-terminal (y por tanto, por extensión, todo el compuesto de la invención) contiene preferiblemente un D en posición 1. A este respecto, en el caso en el que un compuesto de la invención tiene un ligante de albúmina sérica de la invención en su extremo N-terminal, para el experto volverá a ser evidente que dicho ligante de albúmina sérica de la invención tendrá preferiblemente un D en posición 1 (por ejemplo, una mutación de E1D en comparación con, por ejemplo, la secuencia de SEQ ID NO: 18 y/o 19, como en las secuencias de aminoácidos de la invención de SEQ ID NOs: 36 a 44).

En algunos aspectos adicionales, la invención se refiere a una proteína, un polipéptido u otro compuesto o construcción que comprende o consiste esencialmente en al menos un (y preferiblemente solo un) ligante de albúmina sérica de la invención y al menos una (como uno, dos o tres) fracción o entidad terapéutica (en la que dicho ligante de albúmina sérica y la una o más fracciones o entidades terapéuticas están unidas adecuadamente, opcionalmente a través de uno o más engarces adecuados), proteína, polipéptido, compuesto, construcción que es tal que:

• cuando tiene un ISVD en su extremo C-terminal, entonces (el ISVD C-terminal de) dicha proteína, polipéptido, compuesto, construcción tiene una extensión C-terminal de (X)<n>(como se describe adicionalmente en el presente documento) en su extremo C-terminal; y/o.

• cuando tiene un ISVD en su extremo C-terminal, entonces al menos dicho ISVD C-terminal contiene una o más mutaciones que reducen la unión de anticuerpos preexistentes (como se describe adicionalmente en el presente documento);

• cuando tiene un ISVD en su extremo N-terminal, entonces (el ISVD N-terminal de) dicha proteína, polipéptido, compuesto, construcción contiene preferiblemente un D en posición 1; y/o.

• en el que dichos ISVD cuya proteína, polipéptido u otro compuesto también puede tener ISVD en su extremo N-terminal, en cuyo caso dicho extremo ISVD N-terminal tiene preferiblemente un D o un E1D en posición 1;

• de modo preferente, esencialmente todos los ISVD presentes en dicha proteína, polipéptido, compuesto, construcción contienen una o más mutaciones que reducen la unión de anticuerpos preexistentes (como se describe adicionalmente en el presente documento).

Según un aspecto específico de la invención, todas las fracciones terapéuticas presentes en un compuesto de la invención son ISVD (es decir, ISVD contra una diana terapéutica) y, en particular, ISVD de cadena pesada y, más en particular, nanocuerpos (es decir, nanocuerpos contra una diana terapéutica).

Por ejemplo, y sin carácter limitante, tales compuestos de la invención pueden comprender:

• una copia de un ligante de albúmina sérica de la invención y un ISVD (y preferiblemente nanocuerpo) contra una diana terapéutica; o.

• una copia de un ligante de albúmina sérica de la invención y dos ISVD (y preferiblemente dos nanocuerpos) contra una diana terapéutica (ISVD que pueden ser iguales o diferentes y cuando son diferentes pueden dirigirse contra la misma diana, contra diferentes epítopos en la misma diana o contra diferentes dianas terapéuticas); o

• una copia de un ligante de albúmina sérica de la invención y tres ISVD (y preferiblemente tres nanocuerpos) contra una diana terapéutica (ISVD que pueden ser iguales o diferentes y cuando son diferentes pueden dirigirse contra la misma diana, contra diferentes epítopos en la misma diana o contra diferentes dianas terapéuticas).

Algunos ejemplos no limitativos de construcciones, proteínas de fusión o polipéptidos de la invención pueden representarse esquemáticamente como sigue, en los que "[Alb]" representa un ligante de albúmina sérica de la invención, "[fracción terapéutica 1]" y "[fracción terapéutica 2]" representan las fracciones terapéuticas (que, como se menciona, pueden ser cada una independientemente un dominio variable único de inmunoglobulina), " - " representa un engarce adecuado (que es opcional; ejemplos adecuados son engarces 9GS y 35GS) y el extremo N-terminal está en el lado izquierdo y el extremo C-terminal está en el lado derecho:

[Alb] - [fracción terapéutica 1]

[fracción terapéutica 1] - [Alb]-X(n)

[Alb] - [fracción terapéutica 1] - [fracción terapéutica 1]

[fracción terapéutica 1] - [fracción terapéutica 1] - [Alb]-X(n)

[fracción terapéutica 1] - [Alb] - [fracción terapéutica 1]

[Alb] - [fracción terapéutica 1] - [fracción terapéutica 2]

[fracción terapéutica 1] - [fracción terapéutica 2] - [Alb]-X(n)

[fracción terapéutica 1] - [Alb] - [fracción terapéutica 2]

Cuando las fracciones terapéuticas son ISVD (y preferiblemente nanocuerpos) contra una diana terapéutica, construcciones, proteínas de fusión o polipéptidos preferidos pero no limitantes de la invención pueden representarse esquemáticamente de la siguiente manera, en la que "[Alb]" representa un ligante de albúmina sérica de la invención, "[ISVD 1 terapéutico]" y "[ISVD 2 terapéutico]" representan ISVD contra una diana terapéutica (que pueden ser iguales o diferentes y cuando pueden dirigirse contra la misma diana, contra diferentes epítopos en la misma diana o contra a diferentes dianas terapéuticas), " - " representa un engarce adecuado (que es opcional), X(n) representa una extensión C-terminal como se describe en el presente documento, y el extremo N-terminal está en el lado izquierdo y el extremo C-terminal está en el lado derecho:

[Alb] - [ISVD 1 terapéutico] -X(n)

[ISVD 1 terapéutico] - [Alb]-X(n)

[Alb] - [ISVD 1 terapéutico] - [<i>S<v>D 1 terapéutico] -X(n)

[ISVD 1 terapéutico] - [ISVD 1 terapéutico] - [Alb]-X(n)

[iSVD 1 terapéutico] - [Alb] - [ISVD 1 terapéutico] -X(n)

[Alb] - [ISVD 1 terapéutico] - [ISVD 2 terapéutico] -X(n)

[ISVD 1 terapéutico] - [ISVD 2 terapéutico] - [Alb]-X(n)

[ISVD 1 terapéutico] - [Alb] - [ISVD 2 terapéutico] -X(n)

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una construcción de nanocuerpo multiespecífica (y en particular biespecífica) que comprende un ligante de albúmina sérica de la invención y al menos otro nanocuerpo (como otro u otros dos nanocuerpos diferentes, que pueden ser iguales o diferentes), en el que dicho al menos otro nanocuerpo está dirigido preferiblemente contra una diana deseada (que es preferiblemente una diana terapéutica) y/u otro nanocuerpo que sea útil o adecuado para fines terapéuticos, profilácticos y/o de diagnóstico. De nuevo, el ligante de albúmina de suero de la invención y los otros nanocuerpos se pueden conectar adecuadamente entre sí, ya sea directa u opcionalmente, mediante uno o más engarces o espaciadores adecuados.

Para una descripción general de polipéptidos multivalentes y multiespecíficos que contienen uno o más nanocuerpos y su preparación, también se hace referencia a Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302; así como, por ejemplo, las publicaciones WO 96/34103, WO 99/23221, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

A modo de ilustración, se proporcionan algunos ejemplos de compuestos de la invención en las SEQ ID NOs:46 a 52, utilizando el nanocuerpo anti-HER2 de la SEQ ID NO: 45 como un ejemplo representativo de un nanocuerpo anti diana y estando los nanocuerpos constituyentes en diferentes posiciones en el compuesto de la invención. Los compuestos de las SEQ ID NOs: 46 a 49 son ejemplos que ilustran compuestos biespecíficos bivalentes de la invención y los compuestos de SEQ ID NOs: 50 a 52 son ejemplos que ilustran compuestos biespecíficos trivalentes de la invención. En cada caso, los compuestos contienen una mutación de E1D y un residuo de alanina C-terminal y contienen ejemplos representativos pero no limitantes del uso de engarces adecuados (es decir, un engarce 15GS en las SEQ ID NOs:47 y 48 y/o engarces 35GS en las SEQ ID NOs:46 y 49 a 52).

Algunos ejemplos diferentes de algunos polipéptidos multiespecíficos y/o multivalentes específicos de la invención se pueden encontrar en las solicitudes de Ablynx N. V. mencionadas en el presente documento. En particular, para una descripción general de construcciones multivalentes y multiespecíficas que comprenden al menos un nanocuerpo contra una proteína sérica para aumentar la semivida, de ácidos nucleicos que codifican los mismos, de composiciones que comprenden los mismos, de la preparación de lo mencionado anteriormente y de los usos de los mencionados anteriormente, se hace referencia a las solicitudes internacionales WO 04/041865 and WO 06/122787 mencionadas anteriormente (los ligantes de albúmina sérica de la invención descritos en el presente documento se pueden utilizar generalmente de manera análoga a los nanocuerpos que prolongan la semivida descritos en las mismas como Alb-8), así como también a la descripción general y ejemplos específicos de tales construcciones proporcionadas, por ejemplo, en los documentos WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

La invención también se refiere a secuencias de nucleótidos o ácidos nucleicos que codifican los ligantes de albúmina o polipéptidos de la invención. La invención incluye además construcciones genéticas que incluyen las secuencias de nucleótidos o ácidos nucleicos anteriores y uno o más elementos para construcciones genéticas conocidas de por sí. La construcción genética puede estar en forma de un plásmido o vector. Nuevamente, dichas construcciones pueden ser generalmente como se describe en las solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V., como, por ejemplo, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

La invención también se refiere a células hospedadoras que contienen tales secuencias de nucleótidos o ácidos nucleicos y/o que expresan (o son capaces de expresar) los ligantes de albúmina, compuestos o polipéptidos de la invención. De nuevo, tales células hospedadoras pueden ser generalmente como se describe en las solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V., como, por ejemplo, los documentos WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

La invención también se refiere a un método para preparar un ligante, compuesto o polipéptido de albúmina de la invención, comprendiendo dicho método cultivar o mantener una célula huésped como se describe en el presente documento en condiciones tales que dicha célula huésped produzca o exprese un ligante, compuesto o polipéptido de albúmina de la invención, y opcionalmente comprende además aislar el ligante, compuesto o polipéptido de albúmina de la invención producido de este modo. De nuevo, tales métodos pueden realizarse como se describe generalmente en las solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V., como, por ejemplo, los documentos WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto o polipéptido de la invención y opcionalmente al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichas preparaciones, vehículos, excipientes y diluyentes pueden ser generalmente como se describe en las solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V., como, por ejemplo, los documentos WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

Sin embargo, dado que los compuestos o polipéptidos de la invención tienen una semivida aumentada, se administran preferiblemente a la circulación. Como tales, se pueden administrar de cualquier manera adecuada que permita que el compuesto o polipéptido de la invención entre en la circulación, como por vía intravenosa, mediante inyección o infusión, o de cualquier otra manera adecuada (incluyendo administración oral, administración subcutánea, administración intramuscular, administración a través de la piel, administración intranasal, administración a través de los pulmones, etc.). Los métodos y vías de administración adecuados serán evidentes para el experto, nuevamente, por ejemplo, también a partir de la enseñanza de las solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V., como, por ejemplo, los documentos WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

Las enfermedades y trastornos que pueden prevenirse o tratarse mediante el uso de un compuesto o polipéptido de la invención como se describe en el presente documento serán generalmente las mismas que las enfermedades y trastornos que pueden prevenirse o tratarse mediante el uso de la fracción o las fracciones terapéuticas que están presentes en el compuesto o polipéptido de la invención.

En el contexto de la presente invención, el término "prevención y/o tratamiento" no solo comprende prevenir y/o tratar la enfermedad, sino que comprende también generalmente prevenir la aparición de la enfermedad, ralentizar o revertir la evolución de la enfermedad, prevenir o ralentizar uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir y/o aliviar uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir la gravedad y/o la duración de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado con esta y/o prevenir un mayor aumento de la gravedad de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado con esta, prevenir, reducir o revertir cualquier daño fisiológico causado por la enfermedad y, en general, cualquier acción farmacológica que sea beneficiosa para el paciente que se está tratando.

El sujeto que se va a tratar puede ser cualquier animal de sangre caliente, pero es en particular un mamífero, y más en particular un ser humano. Como quedará claro para el experto, el sujeto que se va a tratar será, en particular, una persona que padezca, o en riesgo de padecer, las enfermedades, trastornos y afecciones mencionados en el presente documento.

En otra realización, la invención se refiere al compuesto o polipéptido de la invención para uso en un método para inmunoterapia y, en particular, para inmunoterapia pasiva, comprendiendo dicho método administrar, a un sujeto que padece o corre el riesgo de padecer las enfermedades y trastornos mencionados en el presente documento, una cantidad farmacéuticamente activa de un compuesto o polipéptido de la invención y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.

El compuesto o polipéptido de la invención y/o las composiciones que los comprenden se administran según un régimen de tratamiento que es adecuado para prevenir y/o tratar la enfermedad o trastorno que se ha de prevenir o tratar. El médico podrá determinar generalmente un régimen de tratamiento adecuado, dependiendo de factores tales como la enfermedad o trastorno que se vaya a prevenir o tratar, la gravedad de la enfermedad que se vaya a tratar y/o la gravedad de los síntomas de esta, el polipéptido específico de la invención que se va a utilizar, la vía de administración específica y formulación o composición farmacéutica que se va a utilizar, la edad, género, peso, dieta, condición general del paciente, y factores similares bien conocidos por el médico.

Generalmente, la pauta de tratamiento comprenderá la administración de uno o más compuestos o polipéptidos de la invención, o de una o más composiciones que comprendan los mismos, en una o más cantidades o dosis farmacéuticamente eficaces. La(s) cantidad(es) o dosis específica(s) que se administrará(n) pueden ser determinadas por el médico, de nuevo basándose en los factores citados anteriormente.

Generalmente, para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en el presente documento y dependiendo de la enfermedad o trastorno específico a tratar, la potencia y/o la semivida de los compuestos o polipéptidos de la invención a usar, la vía de administración específica y la formulación o composición farmacéutica específica usada, los compuestos o polipéptidos de la invención se administrarán generalmente en una cantidad entre 1 gramo y 0,01 microgramos por kg de peso corporal al día, preferentemente entre 0,1 gramos y 0,1 microgramos por kg de peso corporal al día, como aproximadamente 1, 10, 100 o 1000 microgramos por kg de peso corporal al día, ya sea de forma continua (p. ej., por infusión), como una dosis diaria única o como múltiples dosis divididas durante el día. El médico podrá determinar generalmente una dosis diaria adecuada, dependiendo de los factores mencionados en el presente documento. También quedará claro que, en casos específicos, el médico puede elegir desviarse de estas cantidades, por ejemplo, basándose en los factores citados anteriormente y su criterio experto. Generalmente, puede obtenerse alguna orientación sobre las cantidades a administrar a partir de las cantidades habitualmente administradas para anticuerpos convencionales o fragmentos de anticuerpos comparables contra la misma diana administrados a través de esencialmente la misma ruta, teniendo en cuenta sin embargo diferencias en afinidad/avidez, eficacia, biodistribución, semivida y factores similares bien conocidos por el experto en la materia.

Además, dado que los compuestos de la invención contienen un ligante de albúmina sérica que prolonga la semivida de la invención, no es necesario que se administren de manera esencialmente continua (por ejemplo, mediante infusión), pero pueden administrarse a intervalos adecuados (a determinar por el experto). Por ejemplo, pueden administrarse (a una dosis adecuada) una vez cada dos días, una vez cada cuatro días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas y en algunos casos una vez cada cuatro semanas o incluso con menor frecuencia, por ejemplo, mediante inyección o infusión.

Un aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto o polipéptido de la invención, en donde dicha composición está destinada a la administración a un intervalo entre una vez a la semana y una vez cada 4 semanas, y en particular entre una vez cada 7 días y una vez cada 21 días, como una vez cada 7 días o 14 días.

Habitualmente, en el uso médico anterior, se usará un único polipéptido de la invención. Sin embargo, está comprendido en el alcance de la invención utilizar dos o más polipéptidos de la invención en combinación.

Los polipéptidos de la invención pueden utilizarse en combinación con uno o más compuestos o principios farmacéuticamente activos, es decir, como una de tratamiento de tratamiento combinada, que puede dar lugar o no a un efecto sinérgico. Una vez más, el médico podrá seleccionar estos compuestos o principios adicionales, así como una pauta de tratamiento combinado adecuada, basándose en los factores citados anteriormente y su criterio de experto.

En particular, los polipéptidos de la invención pueden ser utilizados en combinación con otros compuestos o principios farmacéuticamente activos que son o pueden ser utilizados para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades, trastornos y afecciones que se mencionan en el presente documento, como resultado de lo cual se obtener o no un efecto sinérgico.

La eficacia del régimen de tratamiento utilizado según la invención puede determinarse y/o seguirse de cualquier manera conocida de por sí para la enfermedad o trastorno involucrados, como será evidente para el médico. El médico también podrá, cuando proceda y caso por caso, cambiar o modificar un régimen de tratamiento particular, a fin de lograr el efecto terapéutico deseado, evitar, limitar o reducir los efectos secundarios no deseados y/o conseguir un equilibrio adecuado entre obtener el efecto terapéutico deseado por una parte y evitar, limitar o reducir los efectos secundarios no deseados por otra parte.

Generalmente, el régimen de tratamiento se seguirá hasta que se consiga el efecto terapéutico deseado y/o mientras se deba mantener el efecto terapéutico deseado. Una vez más, esto lo puede determinar el médico. Cualquier referencia a un método de tratamiento practicado en el cuerpo humano o animal debe entenderse como sustancias y composiciones para uso en tales tratamientos.

• La Figura 1 es una tabla que enumera algunas de las posiciones de aminoácidos a las que se hará referencia específicamente en el presente documento y su numeración según algunos sistemas de numeración alternativos (como Aho e IMGT);

• la Figura 2 enumera las secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en el presente documento;

• las Figuras 3A y 3B muestran un alineamiento de las secuencias de SEQ ID NOs:18 y 19 (invención) con las secuencias de SEQ ID NOs del estado de la técnica: 1 y 2;

• la Figura 4 muestra un alineamiento de SEQ ID NOs: 18 a 44;

• la Figura 5 indica un alineamiento de albúmina sérica de diferentes especies de mamífero.

• La Figura 6 es un gráfico que muestra la unión de SEQ ID NO: 1 (referencia)-cMycHis6 a HSA recubierta en presencia del ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO: 19 (invención). Se incubaron 1,5 nM de SEQ ID NO:1-cMycHis6 y series de concentraciones de His6Flag3-SEQ ID NO:1 (referencia), Flag3His6-SEQ ID NO:19 (invención) o cAblys3-Flag3His6 (referencia) sobre HSA recubierta. Se detectó la SEQ ID NO: 1-cMycHis6 unida con anticuerpos anti-cMyc de cabra y anti-cabra de conejo marcados con HRP.

• La Figura 7 es un gráfico que muestra la unión de HSA a FcRn en presencia del ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO: 19 (invención). Se inmovilizó heterodímero de microglobulina FcRn humana-p2 humana en un chip CM5. La unión de HSA 1 pM en ausencia o presencia de nanocuerpo 2 pM en NaPO450 mM NaCl 150 mM Tween-20 al 0,05 % pH 6,0 se monitorizó en un instrumento Biacore T100.

Parte experimental

Ejemplo 1 Afinidad por albúmina sérica

Se midió mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento ProteOn XPR36 (BioRad) la afinidad del ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO: 19 (invención) por albúmina sérica (SA) humana (Sigma-Aldrich A3782), de mono cinomolgo (generada internamente), de ratón (Albumin Bioscience 2601), de rata (Sigma-Aldrich A4538), de conejo (Sigma-Aldrich A0764), de cobaya (Gentaur GPSA62), de cerdo (Sigma-Aldrich A4414), de oveja (Sigma-Aldrich A3264), de perro (Abcam 119814) y bovina (Sigma-Aldrich A3059). Se inmovilizó albúmina sérica mediante acoplamiento de amina en un chip GLC ProteOn utilizando el kit de acoplamiento ProteOn Amine (BioRad). Se inyectaron diferentes concentraciones (300 nM, 100 nM, 33,3 nM, 11,1 nM, 3,7 nM y 1,23 nM) del ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO:19 (invención) en tampón HBS-P+ pH 7,4 (GE Healthcare) a 45 pL/min durante 120 s, seguido de disociación durante 900 s. Se observó unión nula o muy baja para el ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO:19 (invención) en SA de conejo, oveja y bovina. Las afinidades del ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO:19 (invención) por SA de humano, mono cinomolgo, rata, ratón y cobaya fueron más altas en comparación con las afinidades respectivas del ligante de albúmina de SEQ ID NO:1. Los resultados se proporcionan en la Tabla 1 a continuación y muestran que el ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO:19 (invención) presenta reactividad cruzada con SA de perro y cerdo.

Tabla 1 Parámetros cinéticos para la unión de SEQ ID NO: 19 (invención) en SA de diferentes especies.

La larga semivida de la albúmina en la sangre se debe principalmente a dos características: (i) el gran tamaño (65 kDa) de la albúmina limita su filtración glomerular y (ii) la albúmina se une a FcRn a pH bajo (pH 6), lo que protege la albúmina de la degradación en los lisosomas después de la endocitosis pasiva en células endoteliales y epiteliales, mediante el reciclaje del endosoma temprano de nuevo al entorno extracelular. Para que los nanocuerpos de unión a albúmina den como resultado una semivida sérica larga a través de la unión a albúmina y el posterior reciclaje, estos deben permanecer unidos a albúmina en el intervalo de pH de 5,0 a 7,4. Se midió la tasa de disociación del ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO: 19 (invención) de HSA en pH 5, pH 6 y pH 7,4 en un instrumento ProteOn como se describió anteriormente, incluyendo SEQ ID NO: 1 (referencia) como referencia, el ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO: 19 (invención) y SEQ ID NO: 1 (referencia) se inyectaron a 500 nM y 300 nM respectivamente en tampón HBS-P+ pH 7,4. Los tampones de disociación fueron NaOAc/HOAc 50 mM NaCl 150 mM Tween-20 al 0,05 % pH 5,0, NaOAc/HOAc 50 mM NaCl 150 mM Tween-20 al 0,05 % pH 6,0 y HBS-P+ pH 7,4 respectivamente. Se analizó la disociación durante 2700 s. Las tasas de disociación para el ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO:19 (invención) no difieren significativamente en todo el intervalo de pH de 5,0 a 7,4. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Tasa de disociación del ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO: 19 (invención) de HSA a diferente pH.

Ejemplo 2 Epítopo

Se analizó la clasificación de epítopos en un ELISA competitivo. Se recubrió albúmina sérica humana a 125 ng/ml en PBS a 4 °C durante la noche. Después de bloquear con PBS caseína al 1 %, se añadieron SEQ ID NO: 1 (referencia)-cMycHis6 1,5 nM y una serie de concentraciones de competidores (His6Flag3-el ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO: 19 (invención), His6Flag3-SEQ ID NO: 1 (referencia) como control positivo o anticuerpo de dominio único de unión a lisozima de huevo de gallina cAblys3-Flag3His6 como control negativo). Se detectó la SEQ ID NO:1 (referencia)-cMycHis6 unida con anticuerpos anti-cMyc de cabra (Abeam ab19234) y anti-cabra de conejo marcados con HRP (Genway 18-511-244226). El ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO:19 (invención) y s Eq ID NO:1 (referencia) no se unen a epítopos idénticos en HSA (Figura 6).

Ejemplo 3 Interferencia con la interacción entre SA y FcRn

Para el ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO:19 (invención) para dar lugar a una semivida larga por medio de unión a albúmina y posterior reciclaje, no debe interferir con la unión de albúmina a FcRn. Este se analizó por SPR en un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare). Se inmovilizó heterodímero de microglobulina FcRn humana-p2 humana (Sino Biological CT009-H08H) en un chip CM5 mediante acoplamiento de amina estándar (kit de acoplamiento de amina Biacore). Se inyectó una mezcla de HSA 1 gM y nanocuerpo 2 gM (His6Flag3-el ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO:19 (invención), His6Flag3-SEQ ID<n>O:1 (referencia) o cAblys3-Flag3His6) en NaPO4 50 mM NaCl 150 mM Tween-20 al 0,05 % pH 6,0 a 10 gl/min durante 120 s, seguido de disociación durante 600 s. Las curvas de unión se compararon cualitativamente con la curva de unión de HSA 1 gM en ausencia de nanocuerpo. El ligante de albúmina sérica de SEQ ID NO: 19 (invención) no interfirió con la unión de HSA a FcRn (Figura 7).

Ejemplo 4 Perfil PK en perros

Se estudia la farmacocinética de una construcción de nanocuerpo trivalente (SEQ ID NO: 53) después de una dosis i.v. única en perros. La construcción trivalente se produjo enPichia pastorisy comprende dos nanocuerpos contra el virus sincitial respiratorio (RSV) con el nanocuerpo de unión a albúmina de SEQ ID NO:21 en el extremo C-terminal (en el que los tres nanocuerpos están unidos entre sí utilizando engarces (Gly4Ser)7).

Se evalúa el perfil farmacocinético de la construcción en un estudio farmacocinético (dosis única no cruzada) en doce perros Beagle macho sanos en ayunas (sanos, según se determina mediante un examen de salud previo al estudio). La construcción se administra por vía intravenosa.

Los animales se someten a ayuno (con acceso ininterrumpido al agua) durante la noche antes de la dosificación, y antes de la recogida de muestras de sangre antes de la dosis, 24, 168, y 336 horas después de la dosificación (tiempo de ayuno total no superior a 24 horas). La comida se devuelve 4 horas después de la dosis o inmediatamente después de la extracción sanguínea a las 24, 168, y 336 horas. También se registra y se realiza un seguimiento del peso corporal durante el estudio.

Se extrae 1 ml de sangre completa (o 2-3 ml predosis y a las 24, 168 y 336 horas) para plasma de un vaso periférico predosis y a los 5, 15, 30 min y 1, 4, 8, 12, 24, 72, 168, 240, 336, 504, y 672 horas después de la dosis inicial. Las muestras obtenidas para el procesamiento de suero se mantienen a temperatura ambiente y se dejan coagular. La sangre se centrifuga a 10.000 rpm durante 2 minutos usando una centrífuga refrigerada (configurada para mantener 4°C). Las muestras se congelan en los 30 minutos posteriores a la recogida hasta que se envían para análisis (incluyendo la medición de la concentración de la construcción de nanocuerpo relevante).

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Secuencia de aminoácidos que es un dominio variable único de inmunoglobulina capaz de unirse a albúmina sérica humana que tiene:

- una CDR1 según Abm que es la secuencia de aminoácidos GGTFSTYVMG (SEQ ID NO: 12); y

- una CDR2 según Abm que es la secuencia de aminoácidos AISQNSIHTY (SEQ ID NO: 13); y

- una CDR3 según Abm que es la secuencia de aminoácidos SRFTSWYTa Dy EYDY (SEQ ID NO: 14),

en donde la secuencia de aminoácidos es un VHH o un VHH humanizado.

2. Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1, que tiene:

- un grado de identidad secuencial con la secuencia de SEQ ID NO: 18 y/o 19, en la que las CDR y cualquier extensión C-terminal que pueda estar presente no se tienen en cuenta para determinar el grado de identidad secuencial, de al menos 85%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%;

y/o que tiene:

- no más de 7, preferentemente no más de 5, como solo 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos, sin tener en cuenta las CDR ni cualquier extensión C-terminal que pueda estar presente, con la secuencia de SEQ ID NO: 18 y/o 19.

3. Secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que contiene, en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 18, una o más mutaciones que reducen la unión por anticuerpos preexistentes, de modo que, después de la mutación, está presente uno de los siguientes residuos de aminoácidos según la numeración de Kabat: 11L, 11K, 11V, 14A, 14P, 41A, 41L, 41 P, 41S, 41T, 42E, 42G, 87A, 87T, 89A, 89L, 89T, 108L, 110K, 110Q, 112K y/o 112Q; o cualquier combinación adecuada de tales sustituciones, como: 11V en combinación con 89L o 89T; 11V en combinación con 110K o 110Q; u 11V en combinación con 89L y 110K o 110Q.

4. Secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un VHH y que contiene, en comparación con la secuencia de SEQ ID NO:18, una o más sustituciones humanizantes que son Q108L o A14P o una combinación adecuada de las mismas.

5. Secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un dominio variable único de inmunoglobulina capaz de unirse a albúmina sérica humana y que se elige a partir de las SEQ ID NO: 18 a 44.

6. Proteína, polipéptidos u otra construcción o compuesto que comprende al menos una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Proteína, polipéptido u otra construcción o compuesto según la reivindicación 6, que comprende al menos una fracción o entidad terapéutica.

8. Proteína, polipéptido u otra construcción o compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, que es tal que:

- cuando tiene un dominio variable único de inmunoglobulina en su extremo C-terminal, entonces el dominio variable único de inmunoglobulina C-terminal de dicha proteína, polipéptido u otra construcción o compuesto tiene una extensión C-terminal (X)<n>, en la que n es 1 a 10; y cada X es un residuo de aminoácido que se elige independientemente a partir de residuos de aminoácido que se producen de manera natural, en su extremo C-terminal; y/o.

- cuando tiene un dominio variable único de inmunoglobulina en su extremo C-terminal, entonces al menos dicho dominio variable único de inmunoglobulina C-terminal contiene una o más mutaciones que reducen la unión de anticuerpos preexistentes como se define en la reivindicación 3; y/o.

- cuando tiene un dominio variable único de inmunoglobulina en su extremo N-terminal, entonces el dominio variable único de inmunoglobulina N-terminal de dicha proteína, polipéptido u otra construcción o compuesto contiene preferentemente un D en posición 1; y/o.

- preferentemente, todos los dominios variables únicos de inmunoglobulina presentes en dicha proteína, polipéptido u otra construcción o compuesto contienen una o más mutaciones que reducen la unión de anticuerpos preexistentes como se define en la reivindicación 3.

9. Composición farmacéutica que comprende una proteína, un polipéptido u otra construcción o compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

10. Ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, incluidos opcionalmente en una construcción genética.

11. Célula hospedadora que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 10 o el compuesto o polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

12. Un método para preparar la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el compuesto o polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, comprendiendo dicho método cultivar o mantener una célula hospedadora según la reivindicación 11 en condiciones tales que dicha célula hospedadora produzca o exprese la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el compuesto o polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, y que comprende opcionalmente aislar la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el compuesto o polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 producido de este modo.

13. Compuesto o polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para uso en terapia.