RS66117B1 - Poboljšana veziva serumskog albumina - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na aminokiselinske sekvence koje su pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji se mogu vezati za humani serumski albumin kako je definisano u patentnim zahtevima.

[0002] Pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina predviđeni pronalaskom su VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH i takvi su da se mogu (najmanje) vezati (a posebno, specifično vezati) za humani serumski albumin. Kao što je ovde dalje opisano, ovi pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina su dalje takvi da su unakrsno reaktivni (kao što je ovde opisano) između humanog serumskog albumina i serumskog albumina najmanje jedne druge vrste sisara.

[0003] Pronalazak se takođe odnosi na proteine, polipeptide i druge konstrukte ili jedinjenja koji obuhvataju najmanje jedan od pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina koji se vezuju za serumski albumin kako je definisano u patentnim zahtevima.

[0004] Pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina će se ovde generalno nazivati skraćenicama „ISV“ili „ISVD“ (koje će se ovde koristiti naizmenično).

[0005] Pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji se vezuju za humani serumski albumin koji su definisani u patentnim zahtevima takođe će se u ovom dokumentu nazivati „aminokiselinske sekvence pronalaska“ ili „veziva serumskog albumina pronalaska“. Kao što je ovde dalje opisano, albuminska veziva pronalaska mogu posebno biti nanotela (kao što je ovde dalje opisano).

[0006] Proteini, polipeptidi i drugi konstrukti ili jedinjenja koji sadrže najmanje jedno vezivo serumskog albumina pronalaska takođe će se ovde nazivati „jedinjenja pronalaska“ ili „polipeptidi pronalaska“. Poželjno je da su jedinjenja pronalaska proteini ili polipeptidi, a posebno mogu biti fuzioni proteini.

[0007] U predmetnoj primeni, aminokiselinski ostaci/pozicije u varijabilnom domenu teškog lanca imunoglobulina biće naznačeni numeracijom prema Kabatu. Radi jednostavnosti, slika 1 daje tabelu u kojoj se navode neke pozicije aminokiselina koje će ovde biti posebno pomenute, i njihova numeracija prema nekim alternativnim sistemima numeracije (kao što su Aho i IMGT. Napomena: osim ako nije izričito naznačeno drugačije, za ovaj opis i patentne zahteve, Kabatova numeracija je odlučujuća; drugi sistemi numerisanja su dati samo kao referenca).

[0008] Što se tiče CDR, kao što je dobro poznato u struci, postoji više konvencija za definisanje i opisivanje CDR VH ili VHH fragmenta, kao što je Kabatova definicija (koja se zasniva na varijabilnosti sekvence i najčešće se koristi) i Čotijina definicija (koja se zasniva na lokaciji regiona strukturne petlje). Upućuje se, na primer, na veb-sajt http://www.bioinf.org.uk/abs/. Za potrebe ove specifikacije i patentnih zahteva, iako se mogu pomenuti i CDR prema Kabatu, CDR su najpoželjnije definisani na osnovu Abm definicije (koja se zasniva na softveru za modeliranje AbM antitela kompanije Oxford Molecular), jer se to smatra optimalnim kompromisom između Kabatove i Čotijine definicije. Ponovo se upućuje na veb-sajt http://www.bioinf.org.uk/abs/).

[0009] Shodno tome, u ovoj specifikaciji i potraživanjima, svi CDR su definisani u skladu sa Abm konvencijom, osim ako nije izričito drugačije navedeno u ovom dokumentu.

[0010] ISVD (a posebno nanotela) koji se mogu vezati za serumski albumin i njihove upotrebe su dobro poznati u struci, na primer iz WO 2004/041865, WO 2006/122787, WO 2012/175400, WO 2015/173325 i PCT/EP2016/077973, koji opisuju ISVD koji vezuju serumski albumin i njihovu upotrebu za produženje poluvremena eliminacije seruma (kako je definisano u ovim primenama) terapeutskih jedinjenja, delova i entiteta. Na primer, 2006/122787 ĆE SE obelodanjuje kao SEQ ID NO: 62 humanizovano nanotelo koje se vezuje za serumski albumin, nazvano Alb-8 (videti SEQ ID NO: 1 u ovom dokumentu). WO 2012/175400 obelodanjuje kao SEQ ID NO: 6 humanizovano nanotelo koje vezuje serumski albumin, nazvano Alb-23D (videti SEQ ID NO: 2 u ovom dokumentu). Aminokiselinske sekvence Alb-8 i Alb-23D i njihovih CDR (koji su isti za Alb-8 i Alb-23D) date su u tabeli A u nastavku kao SEQID NO: 1, 2 i 3 do 8, respektivno.

[0011] Neke druge reference koje obelodanjuju ISVD protiv serumskog albumina uključuju WO 2003/035694, WO 2004/003019, EP 2139 918, WO 2011/006915 i WO 2014/111550.

[0012] WO 2008/096158 opisuje dAbs koji se vezuju za serumski albumin.

[0013] WO 2008/028977 opisuje ISVD protiv humanog serumskog albumina pod nazivom Alb1 do Alb10.

[0014] WO2010/035012 opisuje antitela i Fab fragmente koji se vezuju za humani serumski albumin.

[0015] Kang et al., 2015 (Immunology letters 169, p. 33-40) opisuju izolaciju humanih Fab antitela protiv serumskog albumina.

[0016] Na slikama 3A i 3B prikazana su poravnanja Alb-8 (referenca), Alb-23D (referenca), SEQ ID NO: 18 (pronalazak) i SEQ ID NO: 19 (pronalazak).

[0017] Ovaj pronalazak ima za cilj da obezbedi poboljšane veziva serumskog albumina, a posebno veziva serumskog albumina koja imaju poboljšana svojstva u poređenju sa vezivima serumskog albumina poznatim u struci. Konkretno, pronalazak ima za cilj da obezbedi veziva serumskog albumin koja se mogu vezati za serumski albumin psa i/ili koja imaju poboljšanu unakrsnu reaktivnost između humanog serumskog albumina i serumskog albumina psa (tj. u poređenju sa vezivima serumskog albumina iz prethodnog stanja tehnike, kao što su Alb-8 i/ili Alb-23D).

Tabela A: Alb-8, Alb-23D i njihovi CDR

Tabela B: SEQ ID NO: 18 i 19 i njihovi CDR

[0018] Generalno, ISVD koji se vezuju za serumske albumine predviđene ovim pronalaskom su varijante sekvenci SEQ ID NO: 18 i 19, u sledećem smislu:

● imaju iste CDR kao sekvenca SEQ ID NO: 18 i/ili 19 u skladu sa Abm; i.

● imaju određeni stepen identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 18 i/ili 19 (koji stepen identičnosti sekvence je ovde dalje opisan).

[0019] Konkretno, ISVD koji se vezuju za serumske albumine predviđene ovim pronalaskom će generalno imati (ograničen) broj „razlika aminokiselina“ (kao što je ovde opisano) u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 18 i/ili 19. Ove razlike aminokiselina mogu biti prisutne u okvirnim regionima (kako je definisano prema Kabatu i/ili prema Abm). Na primer i bez ograničenja, ove razlike aminokiselina mogu biti, na primer, humanizujuće supstitucije, supstitucije koje poboljšavaju ekspresiju u željenoj ćeliji domaćina ili domaćinskom organizmu, supstitucije koje poboljšavaju stabilnost i/ili otpornost na degradaciju i/ili proteaze, mutacije koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela i/ili druge mutacije koje su namenjene optimizaciji sekvence aminokiselinskih sekvenci pronalaska; ili bilo koja pogodna kombinacija takvih razlika aminokiselina. Upućuje se na dalje obelodanjivanje ovde.

[0020] Pronalazak se odnosi na ISVD koji se može vezati (a posebno, specifično vezati) za humani serumski albumin i koji ima:

● CDR1 prema Abm, koji je aminokiselinska sekvenca GGTFSTYVMG (SEQ ID NO:

12); i

● CDR2 prema Abm, koji je aminokiselinska sekvenca AISQNSIHTY (SEQ ID NO: 13);

i.

● CDR3 prema Abm, koji je aminokiselinska sekvenca SFTSWTSWYTADYEYDY (SEQ ID NO: 14),

gde je pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH.

[0021] Generalno, veziva serumskog albumina prema pronalasku su poželjno takva da imaju:

● stepen identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 18 i/ili 19, u kojoj se CDR i sve C-terminalne ekstenzije koje mogu biti prisutne ne uzimaju u obzir za određivanje stepena identičnosti sekvence, od najmanje 85%, po mogućnosti najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%;

i/ili takve da imaju:

o i/ili nemaju više od 7, poželjno ne više od 5, kao što su samo 3, 2 ili 1 „razlike aminokiselina“, kako je ovde definisano, i ne uzimajući u obzir CDR i bilo koju C-terminalnu ekstenziju koja može biti prisutna, sa sekvencom SEQ ID NO: 18 i/ili 19.

[0022] Veziva serumskog albumina prema pronalasku su generalno poželjno takva da se vezuju za humani serumski albumin sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-5>do10<-12>mola/litar ili manje, a poželjno 10<-7>do 10<-12>mola/litar ili manje i poželjnije 10<-8>do 10<-12>mola/litar, i/ili sa afinitetom vezivanja od najmanje 10<7>M<-1>, poželjno najmanje 10<8>M<-1>, poželjnije najmanje 10<9>M<-1>, kao što je najmanje 10<12>M<-1>, kako je utvrđeno korišćenjem ProteOn (referenca se odnosi na primer 1). Po mogućnosti, vezivo serumskog albumina pronalaska će se vezati za željeni antigen sa afinitetom manjim od 500 nM, po mogućnosti manjim od 200 nM, po mogućnosti manjim od 10 nM, kao što je manje od 500 pM, ponovo kako je određeno korišćenjem ProteOn (preferenca se ponovo odnosi na primer 1).

[0023] Veziva serumskog albumina u skladu sa različitim aspektima pronalaska su generalno takva da su unakrsno reaktivna između humanog serumskog albumina i serumskog albumina od najmanje jedne, poželjno od najmanje dve, poželjnije od najmanje tri i do suštinski svih sledećih vrsta sisara: psa, pacova, miša, zeca, zamorca, svinje, ovce, krave i cinomolgus majmuna. Konkretno, veziva serumskog albumina prema različitim aspektima pronalaska su takva da su (najmanje) unakrsno reaktivna između humanog serumskog albumina i serumskog albumina psa, a poželjno i između bilo humanog serumskog albumina i/ili serumskog albumina psa, s jedne strane, i najmanje jednog, poželjno najmanje dva, poželjnije sva tri serumska albumina pacova, serumska albumina miša i serumska albumina cinomolgus majmuna, s druge strane. U tom smislu, veziva serumskog albumina pronalaska mogu imati poboljšanu unakrsnu reaktivnost (posebno između humanog serumskog albumina s jedne strane i serumskog albumina psa s druge strane) u poređenju sa vezivima serumskog albumina koji imaju (u suštini) iste CDR kao Alb-11 i/ili Alb-23D. Upućuje se na podatke u eksperimentalnom delu u nastavku.

[0024] Radi reference, slika 5 daje poravnanje serumskog albumina različitih vrsta sisara (izvor: http://macromoleculeinsights.com/albumin.php, numerisanje aminokiselina na slici 5 je numerisanje koje se koristi na navedenoj veb stranici).

[0025] Generalno, vezivo serumskog albumina pronalaska može se smatrati unakrsno reaktivnim između humanog serumskog albumina i serumskog albumina jedne od ovih vrsta kada se može vezati za humani serumski albumin sa afinitetom manjim od 500 nM, po mogućnosti manjim od 200 nM, po mogućnosti manjim od 10 nM; kao i za serumski albumin navedenih vrsta sa afinitetom manjim od 500 nM, po mogućnosti manjim od 200 nM, po mogućnosti manjim od 10 nM, ponovo kako je utvrđeno korišćenjem ProteOn (referenca se ponovo odnosi na primer 1).

[0026] Veziva serumskog albumina prema pronalasku su poželjno takva da:

● imaju poluvreme eliminacije seruma kod čoveka (izraženo kao t1/2 beta) koje je duže od 6 sati, poželjno duže od 12 sati, poželjnije duže od 24 sata, još poželjnije duže od 72 sata; na primer oko jedne nedelje, dve nedelje i do poluvremena eliminacije serumskog albumina kod čoveka (procenjuje se da je oko 19 dana);

i/ili takav da:

o kada je povezan sa terapeutskiim delom ili entitetom, rezultirajućem polipeptidu pronalaska daje poluvreme eliminacije seruma kod čoveka (izraženo kao t1/2 beta) koje je više od 6 sati, po mogućnosti više od 12 sati, po mogućnosti više od 24 sata, još poželjnije više od 72 sata; na primer oko jedne nedelje, dve nedelje i do poluvremena eliminacije serumskog albumina kod čoveka (procenjuje se da je oko 19 dana).

[0027] Poluvreme eliminacije kod vrsta sisara osim čoveka će, između ostalih faktora, uglavnom zavisiti od svojstava vezivanja (kao što je afinitet) albuminskog veziva pronalaska za serumski albumin navedenih vrsta sisara, kao i od poluvremena eliminacije naivnog serumskog albumina kod navedenih vrsta. Prema poželjnom otelotvorenju pronalaska, kada je vezivo serumskog albumina pronalaska unakrsno reaktivno (kako je ovde definisano) između humanog serumskog albumina i serumskog albumina druge vrste sisara, onda je poluvreme eliminacije veziva serumskog albumina pronalaska (i/ili jedinjenja pronalaska koje se sastoji od navedenog veziva serumskog albumina) kako je utvrđeno kod navedene vrste poželjno najmanje 5%, kao što je najmanje 10%, poželjnije najmanje 25%, na primer oko 50% i eventualno do 100% poluvremena eliminacije naivnog serumskog albumina kod navedene vrste.

[0028] U poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 18, veziva serumskog albumina pronalaska poželjno takođe sadrže (najmanje):

● jednu ili više humanizujućih supstitucija;

i/ili

● i/ili jednu ili više mutacija (tj. supstitucija aminokiselina, delecije ili adicije, a posebno supstitucije) koje smanjuju vezivanje postojećih antitela;

i mogu opcionalno sadržati jednu ili više dodatnih mutacija kako je ovde opisano.

[0029] Za odgovarajuće humanizujuće supstitucije (i odgovarajuće kombinacije istih), upućuje se na primer na WO 09/138519 (ili u prethodnom stanju tehnike navedeno u WO 09/138519) i WO 08/020079 (ili u prethodnom stanju tehnike navedeno u WO 08/020079), kao i na tabele A-3 do A-8 iz WO 08/020079 (koje su liste koje prikazuju moguće humanizujuće supstitucije). Neki poželjni, ali neograničavajući primeri takvih humanizujućih supstitucija su Q108L i A14P ili njihova odgovarajuća kombinacija. Takve humanizujuće supstitucije se takođe mogu na odgovarajući način kombinovati sa jednom ili više drugih mutacija opisanih u ovom dokumentu (kao što je jedna ili više mutacija koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela).

[0030] Za pogodne mutacije koje mogu smanjiti vezivanje već postojećih antitela (i pogodne kombinacije takvih mutacija), upućuje se na primer na WO 2012/175741 i WO 2015/173325, kao i na primer WO 2013/024059 i WO 2016/118733. Kao što je tamo opisano, takve mutacije mogu obuhvatati (odgovarajuću kombinaciju) jednu ili više supstitucija aminokiselina, delecija ili adicija (a posebno supstitucija), pri čemu će se te mutacije često nalaziti u takozvanom Cterminalnom regionu ISV. Na primer, takve mutacije mogu da obuhvataju mutacije (a posebno supstitucije) na jednoj ili više pozicija 11, 13, 14, 15, 40, 41, 42, 82, 82a, 82b, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 103, 108 i/ili mutacije na jednoj ili više pozicija u C-terminalnoj VTVSS sekvenci (tj. pozicije 109, 110, 111, 112 i 113), pri čemu je jedna ili više mutacija na pozicijama 11, 89, 110 i/ili 112 posebno poželjna. Neki poželjni, ali neograničavajući primeri takvih mutacija su odgovarajuće supstitucije (gde je to potrebno) tako da je nakon mutacije, na naznačenoj poziciji, prisutan jedan od sledećih aminokiselinskih ostataka: 11L, 11K, 11V, 14A, 14P, 41A, 41L, 41P, 41S, 41T, 42E, 42G, 87A, 87T, 89A, 89L, 89T, 108L, 110K, 110Q, 112K i/ili 112Q (pri čemu su posebno poželjni 11L, 89A, 89L, 89T, 110K, 110Q, 112K i 112Q); ili bilo koja pogodna kombinacija takvih supstitucija, kao što su na primer i bez ograničenja: 11V u kombinaciji sa 89L ili 89T; 11V u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili 11V u kombinaciji sa 89L i 110K ili 110Q. Takve mutacije koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela takođe se mogu odgovarajuće kombinovati sa jednom ili više drugih mutacija kao što je ovde opisano (kao što je jedna ili više humanizujućih supstitucija).

[0031] Po potrebi (kao što je ovde dalje opisano, a posebno kada je vezivo serumskog albumina pronalaska prisutno na i/ili formira C-terminalni kraj jedinjenja pronalaska u kojem je prisutno), za smanjenje vezivanja već postojećih antitela, veziva serumskog albumina pronalaska (i, kao što je ovde dalje opisano, takođe jedinjenja pronalaska) takođe mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju (kao što je C-terminalni alaninski ostatak). Kao što je opisano u WO 2012/175741, takva C-terminalna ekstenzija smanjuje vezivanje već postojećih antitela. Odgovarajuća C-terminalna ekstenzija se generalno može dalje opisati ovde i može posebno imati formulu -(X)n, u kojoj X može biti bilo koja prirodna aminokiselina (ali poželjno ne cistein) i n može biti 1, 2, 3, 4 ili 5. Ponovo se upućuje na WO 2012/175741, na primer na WO 2015/173325, WO 2013/024059 i WO 2016/118733. Prisustvo takve C-terminalne ekstenzije takođe se može na odgovarajući način kombinovati sa jednom ili više drugih ovde opisanih mutacija (kao što je jedna ili više humanizujućih supstitucija i/ili jedna ili više mutacija koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela).

[0032] Druge mutacije koje mogu biti prisutne u vezivima serumskog albumina pronalaska, na primer i bez ograničenja, uključuju jednu ili više mutacija (posebno supstitucije) koje poboljšavaju ekspresiju u željenoj ćeliji domaćina ili organizmu domaćinu, jednu ili više mutacija (a posebno supstitucije) koje poboljšavaju stabilnost i/ili otpornost na degradaciju i/ili proteaze, i/ili jednu ili više drugih mutacija koje su namenjene optimizaciji aminokiselinskih sekvenci pronalaska (na primer i bez ograničenja, jedna ili više mutacija koje (dalje) smanjuju bilo kakvu tendenciju albuminskih veziva da formiraju dimere); ili bilo koju odgovarajuću kombinaciju takvih mutacija.

[0033] Neki neograničavajući primeri takvih mutacija su pogodne supstitucije (po potrebi) tako da je nakon mutacije, na naznačenoj poziciji, prisutan jedan od sledećih aminokiselinskih ostataka: 16G, 49A, 61D, 74S, 75K, 76N, 82M i 83R; ili bilo koja pogodna kombinacija takvih supstitucija (na primer tako da se formira SKN motiv na pozicijama 74-76). Takođe, po potrebi (kao što je ovde dalje opisano), veziva serumskog albumina pronalaska mogu imati D na poziciji 1 (tj. mutaciju E1D u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 18 i/ili 19), posebno kada je vezivo serumskog albumina pronalaska prisutno na i/ili formira N-terminalni kraj jedinjenja pronalaska u kojem je prisutno. Takve mutacije se ponovo mogu na odgovarajući način kombinovati sa jednom ili više drugih mutacija kako je opisano u ovom dokumentu (kao što je jedna ili više humanizujućih supstitucija i/ili jedna ili više mutacija koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela).

[0034] Ostale mutacije koje mogu biti prisutne u aminokiselinskim sekvencama pronalaska biće jasne kvalifikovanoj osobi na osnovu obelodanjivanja u ovom dokumentu.

[0035] Takođe je moguće da jedna mutacija (ili odgovarajuća kombinacija mutacija) pruža višestruke funkcionalnosti ili prednosti. Na primer i bez ograničenja, humanizujuća Q108L supstitucija takođe može smanjiti vezivanje već postojećih antitela.

[0036] Neki poželjni, ali neograničavajući primeri aminokiselinskih ostataka (tj. mutacija u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 18) koji mogu biti prisutni u aminokiselinskim sekvencama pronalaska (tj. sami po sebi ili u odgovarajućoj kombinaciji) uključuju: 11V (tj. L11V), 14P (tj. A14P), 16G (tj. D16G), 49A (tj. S49A), 61D (tj. N61D), 74S (tj. D74S), 82M (tj. L82M), 83R (tj. K83R), 89L (tj. V89L), 89T (tj. V89T), 110K (npr. T110K) ili 110Q (npr. T110Q); kao i, po potrebi (kao što je ovde dalje opisano), 1D (npr. E1D) i/ili C-terminalnu ekstenziju (X)n kao što je ovde definisano (kao što je 114A). Takođe se upućuje na sekvence i mutacije prikazane na slikama 4A i 4B. Na primer, neki poželjni, ali neograničavajući primeri pogodnih kombinacija takvih aminokiselinskih ostataka (tj. mutacija u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 18) uključuju:

● L11V,T14P,D16G,N61D,D74S,K83R,V89L

● L11V,T14P,D16G,D74S,L82M,K83R,V89L

● L11V,T14P,D16G,N61D,D74S,L82M,K83R,V89L

● L11V,T14P,D16G,S49A,D74S,K83R,V89L

● L11V,T14P,D16G,S49A,N61D,D74S,K83R,V89L

● L11V,T14P,D16G,S49A,D74S,L82M,K83R,V89L

● L11V,T14P,D16G,S49A,N61D,D74S,L82M,K83R,V89L

● L11V,T14P,D74S,K83R,V89L

i druge odgovarajuće kombinacije će biti jasne kvalifikovanoj osobi na osnovu obelodanjivanja ovde.

[0037] Neke poželjne, ali neograničavajuće aminokiselinske sekvence pronalaska su one u kojima (i) pozicija 11 je V, a pozicija 89 je L; (ii) pozicija 89 je T; (iii) pozicije 74-76 formiraju SKN motiv; (iv) pozicija 11 je V, pozicija 89 je L, a pozicije 74-76 formiraju SKN motiv; i (iv) pozicija 89 je T, a pozicije 74-76 formiraju SKN motiv; koje aminokiselinske sekvence pronalaska su kao što je ovde dalje opisano (i shodno tome mogu na odgovarajući način da sadrže jednu ili više daljih aminokiselinskih mutacija kao što je ovde opisano).

[0038] Neki poželjni, ali neograničavajući primeri aminokiselinskih sekvenci pronalaska dati su na slici 2 kao:

● SEQ ID NO: 18 do 26, koji su primeri aminokiselinskih sekvenci pronalaska bez C-terminalne alaninske ekstenzije;

● SEQ ID NO: 27 do 35, koji su primeri aminokiselinskih sekvenci pronalaska sa C-terminalnom ekstenzijom (u svakom slučaju, prikazano pomoću C-terminalne alaninske ekstenzije, koja je generalno poželjna C-terminalna ekstenzija); i

● SEQ ID NO: 36 do 44, koji su primeri aminokiselinskih sekvenci pronalaska sa N-terminalnom E1D mutacijom).

[0039] Na osnovu daljeg obelodanjivanja ovde, kvalifikovanoj osobi će biti jasno da u praksi:

● albuminska veziva pronalaska sa C-terminalnom ekstenzijom (kao što su oni sa SEQ ID NO: 27 do 35) će se često koristiti kao/prisutni na C-terminalnom kraju polipeptida pronalaska (kako je ovde definisano) u kojima su prisutni;

● albuminska veziva pronalaska sa mutacijom E1D (kao što su oni sa SEQ ID NO: 36 do 44) će se često koristiti kao/prisutni na N-terminalnom kraju polipeptida pronalaska u kojima su prisutni;

● albuminska veziva pronalaska bez C-terminalne ekstenzije i bez E1D mutacije (kao što su oni sa SEQ ID NO: 18 do 26) često će biti prisutni negde u „sredini“ polipeptida pronalaska.

[0040] Svaka od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 18 do 44, kao i proteini, polipeptidi i druga jedinjenja i konstrukti koji se sastoje od istih (kao što je ovde dalje opisano), formiraju dalje aspekte ovog pronalaska.

[0041] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na aminokiselinsku sekvencu koja je jedna od aminokiselinskih SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, i/ili SEQ ID NO:44sekvenci; i svaka od ovih aminokiselinskih sekvenci pronalaska (kao i polipeptidi pronalaska - kako je definisano patentnim zahtevima - koji čine takvu aminokiselinsku sekvencu pronalaska) formira dalji aspekt ovog pronalaska.

[0042] Kao što je ovde dalje opisano, aminokiselinske sekvence koje pruža pronalazak su proteini koji se mogu vezati za, i koji se posebno mogu specifično (kao što je ovde opisano) vezati za, humani serumski albumin. Stoga se mogu koristiti kao jedinice vezivanja ili domeni vezivanja za vezivanje za (humani) serumski albumin, na primer za povećanje poluvremena eliminacije (kako je ovde definisano) terapeutskih jedinjenja, delova ili entiteta. Za upotrebu domena koji vezuju serumske albumine za povećanje poluvremena eliminacije terapeutskih jedinjenja, delova ili entiteta, upućuje se na primer na WO 2004/041865, WO 2006/122787, EP 2139 918, WO 2011/006915, WO 2012/175400 i/ili WO 2014/111550. Veziva serumskog albumina pronalaska se generalno mogu koristiti na isti način i u iste svrhe kao i veziva serumskog albumina opisana u ovim referencama.

[0043] U nekim daljim neograničavajućim aspektima, pronalazak se takođe odnosi na:

● proteine, polipeptide i druge konstrukte ili jedinjenja koji se sastoje ili se u suštini sastoje od najmanje jednog veziva serumskog albumina pronalaska kako je definisano u patentnim zahtevima (opet, u daljem tekstu se nazivaju i „jedinjenja pronalaska“ ili „polipeptidi pronalaska“);

● metode za izražavanje/proizvodnju veziva serumskog albumina pronalaska i/ili jedinjenja pronalaska kako je definisano u patentnim zahtevima;

● ćeliju domaćina koja može da izrazi ili proizvede vezivo serumskog albumina pronalaska i/ili jedinjenje pronalaska kako je definisano u patentnim zahtevima;

● kompozicije i proizvode (kao što su farmaceutske kompozicije i proizvodi) koji sadrže vezivo serumskog albumina pronalaska i/ili jedinjenje pronalaska kako je definisano u patentnim zahtevima;

● nukleotidne sekvence i nukleinske kiseline, kao što su (ekspresijski) vektori, koji kodiraju vezivo serumskog albumina pronalaska i/ili polipeptid pronalaska kako je definisano u patentnim zahtevima;

● upotrebe jedinjenja pronalaska i/ili jedinjenja pronalaska, kao što je upotreba jedinjenja pronalaska za povećanje (serumskog) poluvremena eliminacije terapeutskih jedinjenja, dela ili entiteta.

[0044] Ovi i dodatni aspekti, otelotvorenja, prednosti, primene i upotrebe pronalaska biće jasni iz daljeg opisa u ovom dokumentu.

[0045] U predmetnoj specifikaciji:

● termin „pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina“ (koji se takođe naziva „ISV“ ili „ISVD“) se generalno koristi za označavanje varijabilnih domena imunoglobulina (koji mogu biti domeni teškog lanca ili lakog lanca, uključujući domene VH, VHH ili VL) koji mogu formirati funkcionalno mesto vezivanja antigena bez interakcije sa drugim varijabilnim domenom (npr. bez interakcije VH/VL koja je potrebna između domena VH i VL konvencionalnog monoklonskog antitela sa 4 lanca). Primeri ISVD će biti jasni kvalifikovanoj osobi i na primer uključuju nanotela (uključujući VHH, humanizovani VHH i/ili kamelizovane VH kao što su kamelizovani humani VH), IgNAR, domene, (jedan domen) antitela (kao što je dAbs<™>) koja su VH domeni ili koja su izvedena iz VH domena i (jedan domen) antitela (kao što je dAbs<™>) koja su VL domeni ili koja su izvedena iz VL domena. Osim ako ovde nije izričito drugačije navedeno, generalno se preferiraju ISVD koji se zasnivaju na varijabilnim domenima teškog lanca (kao što su VH ili VHH domeni) i/ili su izvedeni iz njih. Najpoželjnije, osim ako ovde nije izričito naznačeno drugačije, ISVD će biti nanotelo. ISVD prema patentnom zahtevu je VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH.

● termin „nanotelo“ je generalno definisan u WO 2008/020079 ili WO 2009/138519, i stoga u određenom aspektu generalno označava VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH (kao što je kamelizovani humani VH) ili generalno sekvencijalno optimizovani VHH (kao što je npr. optimizovan za hemijsku stabilnost i/ili rastvorljivost, maksimalno preklapanje sa poznatim regionima humanog okvira i maksimalnu ekspresiju). Napominje se da su termini nanotelo ili nanotela registrovani zaštitni znakovi kompanije Ablynx N.V. i stoga se mogu nazivati i Nanobody<®>i/ili Nanobodies<®>);

Generalno, osim ako nije drugačije naznačeno u ovom dokumentu, ISVD, nanotela, polipeptidi, proteini i druga jedinjenja i konstrukti navedeni u ovom dokumentu biće namenjeni za upotrebu u profilaksi ili lečenju bolesti ili poremećaja kod čoveka (i/ili opciono i kod toplokrvnih životinja, a posebno sisara). Dakle, generalno, ISVD, nanotela, polipeptidi, proteini i druga jedinjenja i konstrukti opisani u ovom dokumentu su poželjno takvi da se mogu koristiti kao i/ili prikladno biti deo (biološkog) leka ili drugog farmaceutski ili terapeutski aktivnog jedinjenja i/ili farmaceutskog proizvoda ili kompozicije. Takav lek, jedinjenje ili proizvod je poželjno takav da je pogodan za primenu na ljudskom biću, npr. za profilaksu ili lečenje subjekta kome je potrebna takva profilaksa ili lečenje ili, na primer, kao deo kliničkog ispitivanja. Kao što je ovde dalje opisano, u tu svrhu, takav lek ili jedinjenje može sadržati druge delove, entitete ili jedinice vezivanja pored ISVD predviđenih pronalaskom (koji, kao što je ovde takođe opisano, mogu biti jedan ili više drugih daljih terapeutskih delova i/ili jedan ili više drugih delova koji utiču na farmakokinetička ili farmakodinamička svojstva biološkog agensa zasnovanog na ISVD ili nanotelima, kao što je njegovo poluvreme eliminacije). Pogodni primeri za takve ostale terapeutske ili druge funkcionalne ostatke biće jasni stručnjaku, i, na primer, generalno mogu da uključuju svaki terapeutski aktivan protein, polipeptid ili drugi vezujući domen ili vezujuću jedinicu, kao i, na primer, modifikacije kao što su one opisane na stranama 149 do 152 u WO 2009/138159. Biološki agens na bazi ISVD i biološki agens na bazi nanotela je poželjno terapeutsko sredstvo ili je namenjen za upotrebu kao terapeutsko sredstvo (što uključuje profilaksu i dijagnozu) i u tu svrhu poželjno sadrži najmanje jedan ISVD za terapeutski relevantnu metu (kao što je, na primer, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 ili drugi interleukini, itd.). Za neke specifične ali neograničavajuće primere za takve biološke agense na bazi ISVD ili biološke agense na bazi nanotela, upućuje se na primere 8 do 18, i takođe, na primer, na različite primene od strane kompanije Ablynx N.V. (kao što je, na primer i bez ograničenja, WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 i WO 2009/068627), kao na primer (i bez ograničenja) na primene kao što je WO 2006/038027, WO 2006/059108, WO 2007/063308, WO 2007/063311, WO 2007/066016 i WO 2007/085814. Takođe, kao što je ovde dalje opisano, dalji deo može biti ISVD ili nanotelo kao što je ovde opisano, usmereno protiv (humanog) serumskog proteina kao što je (humani) serumski albumin, a takav ISVD ili nanotelo takođe može naći terapeutsku primenu, posebno u i/ili za produženje poluvremena eliminacije TNF veziva opisanih ovde. Na primer, upućuje se na WO 2004/041865, WO 2006/122787 i WO 2012/175400, koji generalno opisuju upotrebu nanotela koja vezuju serumski albumin radi produžetka poluvremena eliminacije. Takođe, u predmetnoj specifikaciji, osim ako ovde izričito nije rečeno drugačije, svi ovde pomenuti termini imaju značenje dato u WO 2009/138519 (ili u prethodnom stanju tehnike navedeno u WO 2009/138519) ili WO 2008/020079 (ili u prethodnom stanju tehnike navedeno u WO 2008/020079). Takođe, kada postupak ili tehnika nisu ovde posebno opisani, mogu se izvesti kao što je opisano u WO 2009/138519 (ili u prethodnom stanju tehnike navedeno u WO 2009/138519) ili WO 2008/020079 (ili u prethodnom stanju tehnike navedeno u WO 2008/020079). Takođe, kao što je ovde opisano, bilo koji farmaceutski proizvod ili kompozicija koja sadrži bilo koji ISVD ili jedinjenje pronalaska takođe može da sadrži jednu ili više dodatnih komponenti koje su same po sebi poznate za upotrebu u farmaceutskim proizvodima ili kompozicijama (tj. u zavisnosti od predviđenog farmaceutskog oblika) i/ili na primer jedno ili više drugih jedinjenja ili aktivnih principa namenjenih za terapeutsku upotrebu (tj. za obezbeđivanje kombinovanog proizvoda).

[0046] Takođe, kada se koriste u predmetnoj specifikaciji ili patentnim zahtevima, sledeći termini imaju isto značenje kao što je dato na stranama 62-75 u WO 2009/138519, i/ili gde je primenljivo mogu da se odrede na način koji je tu opisan: „agonist“, „antagonist“, „inverzni agonist“, „nepolarni, nenaelektrisani aminokiselinski ostatak“, „polarni, nenaelektrisani aminokiselinski ostatak“, „polarni, naelektrisani aminokiselinski ostatak“, „identičnost sekvence“, „potpuno isti“ i „razlika aminokiselina“ (kada se govori o poređenju sekvenci dve aminokiselinske sekvence), „(u) suštinski izolovanom (obliku)“, „domen“, „vezujući domen“, „antigenska determinanta“, „epitop“, „protiv“ ili „usmereno protiv“ (antigena), „specifičnost“ i „poluvreme eliminacije“. Pored toga, termini „modulišući“ i „modulisati“, „mesto interakcije“, „specifično za“, „unakrsna blokada“, „unakrsno blokiran“ i „unakrsno blokiranje“ i „suštinski nezavisno od pH“ su kao što je definisano (i/ili može da se odredi kao što je opisano) na stranama 74-79 WO 2010/130832 kompanije Ablynx N.V Takođe, kada se odnosi na konstrukt, jedinjenje, protein ili polipeptid iz pronalaska, termini kao „jednovalentni“, „dvovalentni“ (ili „multvalentni“), „bispecifični“ (ili „multispecifični“) i „biparatopni“ (ili „multiparatopni“) mogu imati značenje dato u WO 2009/138519, WO 2010/130832 ili WO 2008/020079.

[0047] Termin „poluvreme eliminacije“ kao što se ovde koristi u odnosu na ISVD, nanotelo, biološki agens na bazi ISVD i biološki agens na bazi nanotela ili bilo koja druga aminokiselinska sekvenca, jedinjenje ili polipeptid na koje se ovde upućuje može generalno biti definisano kao što je opisano u paragrafu o) na strani 57 WO 2008/020079 i kao što je ovde opisano odnosi se na vreme potrebno da koncentracija u serumu aminokiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida bude smanjena za 50% in vivo, na primer, usled degradacije sekvence ili jedinjenja i/ili klirensa ili sekvestracije sekvence ili jedinjenja prirodnim mehanizmima. Poluvreme eliminacije aminokiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida iz pronalaska in vivo može biti određen na bilo koji suštinski poznat način, kao što je farmakokinetička analiza. Pogodne tehnike će biti jasne stručnoj osobi, i mogu, na primer, generalno biti kao što je opisano u odeljku o) na strani 57 WO 2008/020079. Kao što je takođe opisano u odeljku o) na strani 57 WO 2008/020079, poluvreme eliminacije može biti izraženo koristeći parametre kao što je t1/2-alfa, t1/2-beta i površina ispod krive (AUC). U ovom pogledu treba napomenuti da se termin „poluvreme eliminacije“ kao što se ovde koristi posebno odnosi na t1/2-beta ili terminalno poluvreme eliminacije (u kome se t1/2-alfa i/ili AUC ili oba mogu izostaviti iz razmatranja). Na primer, upućuje se na Eksperimentalni deo u nastavku, kao i na standardne priručnike, kao što je Kenneth, A i sar: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Takođe, upućuje se na "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, izdato od strane Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982). Slično, termini „produženje poluvremena eliminacije“ i „produženo poluvreme eliminacije“ su takođe kao što je definisano u odeljku o) na strani 57 WO 2008/020079, i posebno se odnose na povećanje t1/2-beta, sa povećanjem ili bez povećanja t1/2-alfa i/ili AUC ili oba.

[0048] Kada termin ovde nije specifični definisan, on ima svoje uobičajeno značenje u struci, koje će biti jasno kvalifikovanoj osobi. Na primer, upućuje se na standardne priručnike, kao što je Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt i sar., Roitt's Essential Immunology, 10. izd. Blackwell Publishing, UK (2001); i Janeway i sar., „Immunobiology“ (6. izd.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), kao i opšte osnove koje su u njima navedene.

[0049] Takođe, kao što je ovde već napomenuto, aminokiselinski ostaci nanotela su nabrojani prema opštoj numeraciji za VH domene koju su dali Kabat i sar. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No.91), kao što je primenjeno na VHH domene kamelida u članku Riechmann i Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195; ili je ovde navedeno. Prema ovoj numeraciji, FR1 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 1-30, CDR1 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 31-35, FR2 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 36-49, CDR2 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 50-65, FR3 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 66-94, CDR3 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 95-102, i FR4 nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 103-113. [U ovom pogledu, treba napomenuti da, kao što je dobro poznato u struci za VH domene i VHH domene, ukupan broj aminokiselinskih ostataka u svakom CDR može da varira i može da se ne poklapa sa ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka naznačenih Kabatovom numeracijom (to jest, može da se desi da jedna ili više pozicija prema Kabatovoj numeraciji nije popunjena u stvarnoj sekvenci, ili stvarna sekvenca može da sadrži više aminokiselinskih ostataka od broja dozvoljenog prema Kabatovoj numeraciji). To znači da, generalno, numeracija prema Kabatu može, ali ne mora da odgovara stvarnoj numeraciji aminokiselinskih ostataka u stvarnoj sekvenci. Međutim, generalno se može reći da, prema Kabatovoj numeraciji i nezavisno od broja aminokiselinskih ostataka u CDR, pozicija 1 prema Kabatovoj numeraciji odgovara početku FR1 i obrnuto, pozicija 36 prema Kabatovoj numeraciji odgovara početku FR2 i obrnuto, pozicija 66 prema Kabatovoj numeraciji odgovara početku FR3 i obrnuto, i pozicija 103 prema Kabatovoj numeraciji odgovara početku FR4 i obrnuto.].

[0050] Alternativni postupci za numeraciju aminokiselinskih ostataka VH domena, koji se takođe mogu primeniti na analogan način na VHH domene kamelida i na nanotela, su postupak koji su opisali Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), takozvana „AbM definicija“, i takozvana „kontaktna definicija“. Međutim, u predmetnom opisu, aspektima i slikama, biće korišćena numeracija prema Kabatu kao što su je na VHH domene primenili Riechmann i Muyldermans, ako nije drugačije naznačeno.

[0051] Takođe treba napomenuti da su slike, sve liste sekvenci i eksperimentalni deo/primeri dati samo kao dodatna ilustracija pronalaska, i ne treba ih interpretirati ili tumačiti kao da ograničavaju obim pronalaska i/ili priključenih zahteva ni na koji način, osim ako ovde izričito nije drugačije naznačeno.

[0052] Kao što je ovde dalje opisano, veziva serumskog albumina pronalaska mogu se koristiti sa prednošću kao deo, jedinica za vezivanje ili fuzioni partner kako bi se povećalo poluvreme eliminacije terapeutskih jedinjenja, delova ili entiteta kao što su polipeptidi, proteini, jedinjenja (uključujući, bez ograničenja, male molekule) ili drugi terapeutski entiteti.

[0053] Dakle, u drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje polipeptide, proteine, konstrukte, jedinjenja ili druge hemijske entitete koji se sastoje ili se u suštini sastoje od veziva serumskog albumina pronalaska i jedne ili više drugih aminokiselinskih sekvenci, (obavezujućih) domena, jedinica vezivanja ili drugih delova ili hemijskih entiteta.

[0054] Konkretno, pronalaskom se obezbeđuju polipeptidi, proteini, konstrukti ili jedinjenja koja se sastoje od veziva serumskog albumina pronalaska i jednog ili više (kao što su jedan ili dva) terapeutskih delova (koji mogu biti isti ili različiti i mogu, na primer, biti usmereni protiv iste mete ili na različite mete, a kada su usmereni na istu metu, mogu biti usmereni prema istim ili različitim epitopima, delovima, domenima ili podjedinicama navedene mete), prikladno međusobno povezani bilo direktno ili preko jednog ili više odgovarajućih linkera ili spejsera. Takvi polipeptidi, proteini ili konstrukti mogu na primer i bez ograničenja biti fuzioni protein, kao što je ovde dalje opisano.

[0055] U jednom aspektu, najmanje jedan terapeutski deo se sastoji ili se u suštini sastoji od terapeutskog proteina, polipeptida, jedinjenja, faktora ili drugog entiteta. U poželjnom otelotvorenju, terapeutski deo je usmeren protiv željenog antigena ili mete, sposoban je da se veže za željeni antigen (i posebno sposoban da se specifično veže za željeni antigen) i/ili sposoban je da stupi u interakciju sa željenom metom. U drugom otelotvorenju, najmanje jedan terapeutski deo se sastoji ili se u suštini sastoji od terapeutskog proteina ili polipeptida. U daljem otelotvorenju, najmanje jedan terapeutski deo se sastoji ili se u suštini sastoji od domena vezivanja ili jedinice vezivanja, kao što je imunoglobulin ili sekvenca imunoglobulina (uključujući, ali ne ograničavajući se na fragment imunoglobulina), kao što je antitelo ili fragment antitela (uključujući, ali ne ograničavajući se na fragment ScFv), ili druge pogodne proteinske skele, kao što su domeni proteina A (kao što su Affibodies<™>), tendamistat, fibronektin, lipokalin, CTLA-4, T-ćelijski receptori, dizajnirana ankirinska ponavljanja, avimeri i PDZ domeni (Binz et al., Nat. Biotech 2005, Vol 23:1257), i vezivni delovi na osnovu DNK ili RNK, uključujući, ali ne ograničavajući se na DNK ili RNK aptamere (Ulrich et al., Comb Chem High Throughput Screen 20069(8):619-32).

[0056] U još jednom aspektu, najmanje jedan terapeutski deo se sastoji ili se u suštini sastoji od varijabilnog domena antitela, kao što je varijabilni domen teškog lanca ili varijabilni domen lakog lanca.

[0057] U poželjnom aspektu, najmanje jedan terapeutski deo se sastoji ili se u suštini sastoji od najmanje jednog pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina, kao što je domensko antitelo, jednodomensko antitelo, „dAb“ ili nanotelo (kao što je VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH) ili IgNAR domen.

[0058] U specifičnom otelotvorenju, najmanje jedan terapeutski deo se sastoji ili se u suštini sastoji od najmanje jednog monovalentnog nanotela ili dvovalentnog, multivalentnog, bispecifičnog ili multispecifičnog konstrukta nanotela.

[0059] Polipeptidi, (fuzioni) proteini, konstrukti ili jedinjenja koja čine vezivo serumskog albumina pronalaska i jedan ili više terapeutskih delova generalno mogu biti (pripremljeni i korišćeni) kao što je gore opisano u prethodnom stanju tehnike (kao što su WO 04/041865, WO 06/122787, WO 2012/175400 i WO 2015/173325; upućuje se i na primer, WO 2004/003019, EP 2139 918, WO 2011/006915 i WO 2014/111550) sa vezivom serumskog albumina pronalaska umesto delova koji povećavaju poluvreme eliminacije opisanih u navedenom

[0060] Polipeptidi, (fuzioni) proteini, konstrukti ili jedinjenja koja se sastoje od veziva serumskog albumina pronalaska i jednog ili više terapeutskih delova će generalno i poželjno imati produženo poluvreme eliminacije (kao što je ovde opisano i poželjno izraženo kao t1/2-beta), u poređenju sa terapeutskim delom ili delovima samim po sebi.

[0061] Generalno, ovde opisana jedinjenja, polipeptidi, konstrukti ili fuzioni proteini poželjno imaju poluvreme eliminacije (opet, kako je ovde opisano, i poželjno izraženo kao t1/2-beta) koje je najmanje 1,5 puta, poželjno najmanje 2 puta, kao što je najmanje 5 puta, na primer najmanje 10 puta ili više od 20 puta, veće od poluvremena eliminacije odgovarajućeg terapeutskog dela samog po sebi (mereno bilo kod čoveka ili odgovarajuće životinje, kao što je miš ili cinomolgus majmun).

[0062] Takođe, poželjno je da svako takvo jedinjenje, polipeptid, fuzioni protein ili konstrukt ima poluvreme eliminacije (opet, kako je ovde opisano, i poželjno izraženo kao t1/2-beta) kod čoveka koje se povećava sa više od 1 sata, poželjno više od 2 sata, poželjnije više od 6 sati, kao što je više od 12 sati, u poređenju sa poluvremenom eliminacije odgovarajućeg terapeutskog dela samog po sebi.

[0063] Takođe, poželjno je da jedinjenje ili polipeptid pronalaska ima poluvreme eliminacije (opet, kao što je ovde opisano, i poželjno izraženo kao t1/2-beta) kod čoveka koje je više od 1 sata, poželjno više od 2 sata, poželjnije više od 6 sati, kao što je više od 12 sati, i na primer oko jednog dana, dva dana, jedne nedelje, dve nedelje i do poluvremena eliminacije serumskog albumina kod čoveka (procenjuje se da je oko 19 dana).

[0064] Kao što je navedeno, u jednom aspektu, vezivo serumskog albumina pronalaska se koristi za povećanje poluvremena eliminacije (jednog ili više) pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina, kao što su antitela domena, antitela sa jednim domenom, „dAb“, VHH ili nanotela (kao što su VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH kao što su kamelizovani humani VH).

[0065] Dakle, jedno otelotvorenje pronalaska odnosi se na polipeptidni, konstruktni ili fuzioni protein koji se sastoji od veziva serumskog albumina pronalaska i jedne ili više (kao što su jedna ili dve) sekvence pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina, koje su odgovarajuće međusobno povezane, bilo direktno ili opciono preko jednog ili više odgovarajućih linkera ili spejsera. Kao što je ovde navedeno, i pored veziva serumskog albumina pronalaska koji je VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH, svaki takav pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prisutan u takvom polipeptidu, konstruktu ili fuzionom proteinu može nezavisno biti antitelo domena, antitelo sa jednim domenom, „dAb“ ili nanotelo (kao što je VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH, kao što je kamelizovani humani VH); i prema jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, najmanje jedan (a moguće i svi) od ovih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina sastoji se od dva ili tri disulfidna mosta. Po mogućnosti, svi ISVD prisutni u takvom jedinjenju pronalaska su nanotela.

[0066] Kada jedinjenje pronalaska ima ISVD na svom C-terminalnom kraju (kao što je vezivo serumskog albumina pronalaska ili ISVD koji je usmeren protiv terapeutske mete), onda navedeni C-terminalni ISVD (a time i celo jedinjenje pronalaska) poželjno ima C-terminalnu ekstenziju na svom C-terminalnom kraju. Ova C-terminalna ekstenzija će biti direktno povezana sa poslednjim C-terminalnim aminokiselinskim ostatkom ISVD, koji će obično biti aminokiselinski ostatak na poziciji 113 prema Kabatu (osim ako ISVD sadrži jednu ili više delecija aminokiselina tako da se sekvenca ISVD završava pre pozicije 113). Dakle, generalno, C-terminalna ekstenzija će biti direktno povezano sa C-terminalnom VTVSS sekvencom (SEQ ID NO: 15) C-terminalnog ISV (a samim tim i sa C-terminalnom TVTSS sekvencom jedinjenja pronalaska) ili C-terminalnom sekvencom C-terminalnog ISVD koja odgovara C-terminalnoj ISVD sekvenci (na primer, gde navedena C-terminalna sekvenca C-terminalnog ISVD sadrži jednu ili više supstitucija ili delecija u poređenju sa uobičajenom VTVSS sekvencom, kao što su T110K, T110Q, S112K ili S112K).

[0067] Takođe će biti jasno kvalifikovanoj osobi u slučaju kada jedinjenje pronalaska ima vezivo serumskog albumina pronalaska na svom C-terminalnom kraju, da će tada navedeno vezivo serumskog albumina pronalaska nositi navedenu C-terminalnu ekstenziju.

[0068] Generalno, bilo koja C-terminalna ekstenzija koja se ovde koristi (tj. na C-terminalnom kraju jedinjenja pronalaska i/ili na C-terminalnom kraju veziva serumskog albumina pronalaska) može generalno biti opisana u WO 2012/174741 ili WO 2015/173325 (takođe se upućuje na primer WO 2103/024059 i WO2016/118733). Konkretno, C-terminalna ekstenzija može imati formulu (X)n, u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što su 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodno prisutan) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran od prirodnih aminokiselinskih ostataka (iako prema poželjnom jednom aspektu, ne sadrži nikakve cisteinske ostatke), i poželjno je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I).

[0069] Prema nekim poželjnim, ali neograničavajućim aspektima takvih C-terminalnih ekstenzija X(n), X i n mogu biti sledeći:

(a) n = 1 i X = Ala;

(b) n = 2 i svaki X = Ala;

(c) n = 3 i svaki X = Ala;

(d) n = 2 i najmanje jedan X = Ala (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);

(e) n = 3 i najmanje jedan X = Ala (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);

(f) n = 3 i najmanje dva X = Ala (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);

(g) n = 1 i X = Gly;

(h) n = 2 i svaki X = Gly;

(i) n = 3 i svaki X = Gly;

(j) n = 2 i najmanje jedan X = Gly (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);

(k) n = 3 i najmanje jedan X = Gly (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);

(l) n = 3 i najmanje dva X = Gly (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);

(m) n = 2 i svaki X = Ala ili Gly;

(n) n = 3 i svaki X = Ala ili Gly;

(o) n = 3 i najmanje jedan X = Ala ili Gly (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile); ili

(p) n = 3 i najmanje dva X = Ala ili Gly (gde je preostali aminokiselinski ostatak (ili ostaci) X nezavisno izabran od bilo koje prirodne aminokiseline, ali je poželjno nezavisno izabran od Val, Leu i/ili Ile);

gde su aspekti (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) i (n) posebno poželjni, aspekti u kojima je n =1 ili 2 su poželjni i aspekti u kojima je n =1 su posebno poželjni.

[0070] Treba takođe napomenuti da, poželjno, nijedna C-terminalna ekstenzija prisutna u vezivu serumskog albumina pronalaska ne sadrži (slobodan) ostatak cisteina (osim ako pomenuti ostatak cisteina nije upotrebljen ili nameravan za dalju funkcionalizaciju, na primer, za pegilovanje).

[0071] Neki specifični, ali neograničavajući primeri korisnih C-terminalnih ekstenzija su sledeće aminokiselinske sekvence: A, AA, AAA, G, GG, GGG, AG, GA, AAG, AGG, AGA, GGA, GAA ili GAG.

[0072] Poželjno je takođe, kada jedinjenje pronalaska ima ISVD na svom C-terminalnom kraju (kao što je vezivo serumskog albumina pronalaska ili ISVD koji je usmeren protiv terapeutske mete), onda (barem) navedeni C-terminalni ISVD poželjno sadrži, još poželjnije pored C-terminalne ekstenzije kao što je ovde opisano, jednu ili više mutacija koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela (tj. kao što je ovde opisano veziva serumskog albumina pronalaska i kao što je opštije opisano u WO 2012/175741 i WO 2015/173325, kao i na primer u WO 2013/024059 i WO 2016/118733). U tom smislu, kvalifikovanoj osobi će biti jasno u slučaju kada jedinjenje pronalaska ima vezivo serumskog albumina pronalaska na svom C-terminalnom kraju, da će tada (barem) navedeno vezivo serumskog albumina pronalaska po mogućnosti sadržati takve mutacije (tj. po mogućnosti pored C-terminalne ekstenzije).

[0073] Opštije gledano, prema specifičnom aspektu pronalaska, kada jedinjenje pronalaska sadrži dva ili više ISVD (npr. vezivo serumskog albumina pronalaska i jedan ili više ISVD protiv terapeutske mete), onda po mogućnosti svi ovi ISVD sadrže mutacije koje smanjuju vezivanje za već postojeća antitela (opet, po mogućnosti pored C-terminalne ekstenzije koja je povezana sa C-terminalnim ISVD ako jedinjenje pronalaska ima ISVD na svom C-terminalnom kraju).

[0074] Kada jedinjenje pronalaska ima ISVD na svom N-terminalnom kraju (kao što je vezivo serumskog albumina pronalaska ili ISVD koji je usmeren protiv terapeutske mete), onda navedeni N-terminalni ISVD (a time i celokupno jedinjenje pronalaska) po mogućnosti sadrži D na poziciji 1. U tom smislu, kvalifikovanoj osobi će ponovo biti jasno u slučaju kada jedinjenje pronalaska ima vezivo serumskog albumina pronalaska na svom N-terminalnom kraju, da će tada navedeno vezivo serumskog albumina pronalaska po mogućnosti imati D na poziciji 1 (npr. mutacija E1D u poređenju sa na primer sekvencom SEQ ID NO: 18 i/ili 19, kao što je u aminokiselinskim sekvencama pronalaska SEQ ID NO: 36 do 44).

[0075] U nekim daljim aspektima, pronalazak se odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt koji se sastoji ili se u suštini sastoji od najmanje jednog (i po mogućnosti samo jednog) veziva serumskog albumina pronalaska i najmanje jednog (kao što su jedan, dva ili tri) terapeutskog dela ili entiteta (u kojem su navedeno vezivo serumskog albumina i jedan ili više terapeutskih delova ili entiteta odgovarajuće povezani, opciono preko jednog ili više odgovarajućih linkera), koji protein, polipeptid, jedinjenje, konstrukt je takav da:

● kada ima ISVD na svom C-terminalnom kraju, onda (C-terminalni ISVD) navedeni protein, polipeptid, jedinjenje, konstrukt ima C-terminalnu ekstenziju (X)n(kao što je ovde dalje opisano) na svom C-terminalnom kraju; i/ili

● kada ima ISVD na svom C-terminalnom kraju, onda barem pomenuti C-terminalni ISVD sadrži jednu ili više mutacija koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela (kao što je ovde dalje opisano);

● kada ima ISVD na svom N-terminalnom kraju, onda (N-terminalni ISVD) navedeni protein, polipeptid, jedinjenje, konstrukt po mogućnosti sadrži D na poziciji 1; i/ili

● pri čemu navedeni ISVD, koje protein, polipeptid ili drugo jedinjenje takođe mogu imati na svom N-terminalnom kraju, pri čemu taj N-terminalni ISVD poželjno ima D ili E1D na poziciji 1;

● po mogućnosti, u suštini svi ISVD prisutni u navedenom proteinu, polipeptidu, jedinjenju, konstruktu sadrže jednu ili više mutacija koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela (kao što je ovde dalje opisano).

[0076] Prema jednom specifičnom aspektu pronalaska, svi terapeutski delovi prisutni u jedinjenju pronalaska su ISVD (tj. ISVD protiv terapeutske mete), a posebno ISVD teških lanaca, a posebno nanotela (tj. nanotela protiv terapeutske mete).

[0077] Na primer i bez ograničenja, takva jedinjenja pronalaska mogu obuhvatati:

● jednu kopiju veziva serumskog albumina pronalaska i jedan ISVD (i poželjno nanotelo) protiv terapeutske mete; ili

● jednu kopiju veziva serumskog albumina pronalaska i dva ISVD (i po mogućnosti dva nanotela) protiv terapeutske mete (pri čemu ISVD mogu biti isti ili različiti, a kada su različiti mogu biti usmereni protiv iste mete, protiv različitih epitopa na istoj meti ili protiv različitih terapeutskih meta); ili

● jednu kopiju veziva serumskog albumina pronalaska i tri ISVD (i po mogućnosti tri nanotela) protiv terapeutske mete (pri čemu ISVD mogu biti isti ili različiti, a kada su različiti mogu biti usmereni protiv iste mete, protiv različitih epitopa na istoj meti ili protiv različitih terapeutskih meta).

[0078] Neki neograničavajući primeri konstrukata, fuzionih proteina ili polipeptida pronalaska mogu se šematski predstaviti na sledeći način, u kojima „[Alb]“ predstavlja vezivo serumskog albumina pronalaska, „[terapeutski deo 1]“ i „[terapeutski deo 2]“ predstavljaju terapeutske delove (koji, kao što je pomenuto, svaki može nezavisno biti pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina), „ - “ predstavlja odgovarajući linker (koji je opcionalan; pogodni primeri su 9GS i 35GS linkovi) i N-terminus je na levoj strani, a C-terminus je na desnoj strani:

[Alb] [terapeutski deo 1]

[terapeutski deo 1] - [Alb]-X(n)

[Alb] [terapeutski deo 1] - [terapeutski deo 1]

[terapeutski deo 1] - [terapeutski deo 1] - [Alb]-X(n)

[terapeutski deo 1] - [Alb] - [terapeutski deo 1]

[Alb] [terapeutski deo 1] - [terapeutski deo 2]

[terapeutski deo 1] - [terapeutski deo 2] - [Alb]-X(n)

[terapeutski deo 1] - [Alb] - [terapeutski deo 2]

[0079] Kada su terapeutski delovi ISVD (i poželjno nanotela) protiv terapeutske mete, poželjni, ali neograničavajući konstrukti, fuzioni proteini ili polipeptidi pronalaska mogu biti šematski predstavljeni na sledeći način, u kojima „[Alb]“ predstavlja vezivo serumskog albumina pronalaska, „[terapeutski ISVD 1]“ i „[terapeutski ISVD 2]“ predstavljaju ISVD protiv terapeutske mete (pri čemu ISVD mogu biti isti ili različiti, a kada su različiti mogu biti usmereni protiv iste mete, protiv različitih epitopa na istoj meti ili protiv različitih terapeutskih meta), „ - “ predstavlja odgovarajući linker (koji je opcionalan), X(n) predstavlja C-terminalnu ekstenziju kao što je ovde opisano, a N-terminus je na levoj strani, a C-terminus je na desnoj strani:

[Alb] - [terapeutski ISVD 1] -X(n)

[terapeutski ISVD 1] - [Alb]-X(n)

[Alb] - [terapeutski ISVD 1] - [terapeutski ISVD 1] -X(n)

[terapeutski ISVD 1] - [terapeutski ISVD 1] - [Alb]-X(n)

[terapeutski ISVD 1] - [Alb] - [terapeutski ISVD 1] -X(n)

[Alb] - [terapeutski ISVD 1] - [terapeutski ISVD 2] -X(n)

[terapeutski ISVD 1] - [terapeutski ISVD 2] - [Alb]-X(n)

[terapeutski ISVD 1] - [Alb] - [terapeutski ISVD 2] -X(n)

[0080] Dakle, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na multispecifični (a posebno bispecifičnu) konstrukt nanotela koji se sastoji od veziva serumskog albumina pronalaska i najmanje jednog drugog nanotela (kao što su jedno ili dva druga nanotela, koja mogu biti ista ili različita), u kom je navedeno najmanje jedno drugo nanotelo poželjno usmereno protiv željene mete (koja je poželjno terapeutska meta) i/ili drugo nanotelo koje je korisno ili pogodno za terapeutske, profilaktičke i/ili dijagnostičke svrhe. Ponovo, vezivo serumskog albumina pronalaska i druga nanotela mogu biti odgovarajuće međusobno povezani bilo direktno ili opciono preko jednog ili više odgovarajućih linkera ili spejsera.

[0081] Za opšti opis multivalentnih i multispecifičnih polipeptida koji sadrže jedno ili više nanotela i njihovu pripremu, takođe se upućuje na Konrat et al., J. Biol. Hem., Vol. 276, 10.

7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302; kao i na primer WO 96/34103, WO 99/23221, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0082] Kao ilustracija, neki primeri jedinjenja pronalaska dati su u SEQ ID NO: 46 do 52, koristeći anti-HER2-nanotelo sa SEQ ID NO: 45 kao reprezentativan primer anticiljnog nanotela, pri čemu se konstituentna nanotela nalaze na različitim pozicijama u jedinjenju pronalaska. Jedinjenja SEQ ID NO: 46 do 49 su primeri koji ilustruju dvovalentna bispecifična jedinjenja pronalaska, a jedinjenja SEQ ID NO: 50 do 52 su primeri koji ilustruju trovalentna bispecifična jedinjenja pronalaska. U svakom slučaju, jedinjenja sadrže mutaciju E1D i C-terminalni alaninski ostatak i sadrže reprezentativne, ali neograničavajuće primere upotrebe odgovarajućih linkera (tj.15GS linkera u SEQ ID NO:47 i 48 i ili 35GS linkera u SEQ ID NO: 46 i 49 do 52).

[0083] Neki drugi primeri nekih specifičnih multispecifičnih i/ili multivalentnih polipeptida pronalaska mogu se naći u primenama od strane Ablynx N.V. pomenutim ovde. Konkretno, za opšti opis multivalentnih i multispecifičnih konstrukata koji sadrže najmanje jedno nanotelo protiv serumskog proteina za povećanje poluvremena eliminacije, nukleinskih kiselina koje ih kodiraju, kompozicija koje sadrže iste, pripreme prethodno pomenutog i upotrebe gore pomenutog, upućuje se na međunarodne prijave WO 04/041865 i WO 06/122787 koje su gore pomenute (ovde opisana veziva serumskog albumina mogu se generalno koristiti analogno nanotelima koja produžavaju poluvreme eliminacije, kao što je Alb -8), kao i na opšti opis i specifične primere takvih konstrukata datih na primer u WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0084] Pronalazak se takođe odnosi na nukleotidne sekvence ili nukleinske kiseline koje kodiraju albuminska veziva ili polipeptide pronalaska. Pronalazak dalje uključuje genetske konstrukte koji uključuju gorenavedene nukleotidne sekvence ili nukleinske kiseline i jedan ili više elemenata za genetske konstrukte poznate same po sebi. Genetski konstrukt može biti u obliku plazmida ili vektora. Opet, takvi konstrukti mogu generalno biti opisani u objavljenim patentnim prijavama kompanije Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0085] Pronalazak se takođe odnosi na ćelije domaćine koje sadrže takve nukleotidne sekvence ili nukleinske kiseline, i/ili koje izražavaju (ili su sposobne da izražavaju), albuminska veziva, jedinjenja ili polipeptide pronalaska. Opet, takve ćelije domaćini mogu generalno biti opisane u objavljenim patentnim prijavama kompanije Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0086] Pronalazak se takođe odnosi na metodu pripreme albuminskog veziva, jedinjenja ili polipeptida pronalaska, koja metoda obuhvata kultivaciju ili održavanje ćelije domaćina kako je ovde opisano pod uslovima tako da navedena ćelija domaćin proizvodi ili izražava albuminsko vezivo, jedinjenje ili polipeptid pronalaska, i opciono dalje obuhvata izolaciju albuminskog veziva, jedinjenja ili polipeptida pronalaska koji je tako proizveden. Opet, takve metode se mogu izvršiti kako je generalno opisano u objavljenim patentnim prijavama kompanije Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0087] Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedno jedinjenje ili polipeptid pronalaska, i opciono najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens. Takvi preparati, nosači, ekscipijensi i razblaživači generalno mogu biti opisani u objavljenim patentnim prijavama kompanije Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0088] Međutim, pošto jedinjenja ili polipeptidi pronalaska imaju povećano poluvreme eliminacije, poželjno je da se primenjuju na cirkulaciju. Kao takvi, mogu se primenjivati na bilo koji pogodan način koji omogućava jedinjenju ili polipeptidu pronalaska da uđe u cirkulaciju, kao što je intravenski, putem injekcije ili infuzije, ili na bilo koji drugi pogodan način (uključujući oralnu primenu, supkutanu primenu, intramuskularnu primenu, primenu kroz kožu, intranazalnu primenu, primenu preko pluća, itd.). Kvalifikovanoj osobi biće jasne odgovarajuće metode i putevi primene, takođe, na primer iz učenja objavljenih patentnih prijava kompanije Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0089] Bolesti i poremećaji koji se mogu sprečiti ili lečiti upotrebom jedinjenja ili polipeptida pronalaska kako je ovde opisano generalno će biti isti kao i bolesti i poremećaji koji se mogu sprečiti ili lečiti upotrebom terapeutskog dela ili delova koji su prisutni u jedinjenju ili polipeptidu pronalaska.

[0090] U kontekstu ovog pronalaska, termin „prevencija i/ili lečenje“ ne sastoji se samo od sprečavanja i/ili lečenja bolesti, već se generalno sastoji i od sprečavanja nastanka bolesti, usporavanja ili preokretanja napretka bolesti, sprečavanja ili usporavanja nastanka jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, smanjenja i/ili ublažavanja jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, smanjenja težine i/ili trajanja bolesti i/ili bilo kojih simptoma povezanih sa njom i/ili sprečavanja daljeg povećanja težine bolesti i/ili bilo kojih simptoma povezanih sa njom, sprečavanja, smanjenja ili preokretanja bilo kakvog fiziološkog oštećenja izazvanog bolešću, i generalno bilo kog farmakološkog delovanja koje je korisno za pacijenta koji se leči.

[0091] Subjekat koji treba tretirati može biti bilo koja toplokrvna životinja, ali je posebno sisar, a posebno čovek. Kao što će biti jasno kvalifikovanom licu, subjekt koji će biti tretiran će posebno biti osoba koja boluje od, ili je u riziku od, bolesti i poremećaja navedenih u ovom dokumentu.

[0092] U drugom otelotvorenju, pronalazak se odnosi na jedinjenje ili polipeptid pronalaska za upotrebu u metodi za imunoterapiju, a posebno za pasivnu imunoterapiju, koja metoda obuhvata primenu, kod subjekta koji boluje od ili je u riziku od bolesti i poremećaja navedenih u ovom dokumentu, farmaceutski aktivne količine jedinjenja ili polipeptida pronalaska, i/ili farmaceutske kompozicije koja se sastoji od istih.

[0093] Jedinjenje ili polipeptid pronalaska i/ili kompozicije koje se sastoje od istih primenjuju se u skladu sa režimom lečenja koji je pogodan za sprečavanje i/ili lečenje bolesti ili poremećaja koje treba sprečiti ili lečiti. Kliničar će generalno moći da odredi odgovarajući režim lečenja, u zavisnosti od faktora kao što su bolest ili poremećaj koji se sprečava ili leči, ozbiljnost bolesti koja se leči i/ili ozbiljnost njenih simptoma, specifični polipeptid pronalaska koji će se koristiti, specifičan put primene i farmaceutska formulacija ili kompozicija koja će se koristiti, starost, pol, težina, ishrana, opšte stanje pacijenta i slični faktori dobro poznati kliničaru.

[0094] Generalno, režim lečenja će se sastojati od primene jednog ili više jedinjenja ili polipeptida pronalaska, ili jedne ili više kompozicija koje se sastoje od istih, u jednoj ili više farmaceutski efikasnih količina ili doza. Specifične količine ili doze koje treba primeniti može odrediti kliničar, ponovo na osnovu gorenavedenih faktora.

[0095] Generalno, za prevenciju i/ili lečenje bolesti i poremećaja navedenih u ovom dokumentu i u zavisnosti od specifične bolesti ili poremećaja koji se leče, potencija i/ili poluvreme eliminacije jedinjenja ili polipeptida pronalaska koji će se koristiti, specifičan put primene i specifična farmaceutska formulacija ili kompozicija koja se koristi, jedinjenja ili polipeptidi pronalaska će se generalno primenjivati u količini između 1 grama i 0,01 mikrograma po kg telesne težine dnevno, po mogućnosti između 0,1 grama i 0,1 mikrograma po kg telesne težine dnevno, kao što je oko 1, 10, 100 ili 1000 mikrograma po kg telesne težine dnevno, bilo kontinuirano (npr. infuzijom), kao jedna dnevna doza ili kao više podeljenih doza tokom dana. Kliničar će generalno moći da odredi odgovarajuću dnevnu dozu, u zavisnosti od faktora navedenih u ovom dokumentu. Takođe će biti jasno da u specifičnim slučajevima kliničar može da odluči da odstupi od ovih iznosa, na primer na osnovu gorenavedenih faktora i svoje stručne procene. Generalno, neke smernice o količinama koje treba primeniti mogu se dobiti iz količina koje se obično primenjuju za uporediva konvencionalna antitela ili fragmente antitela protiv iste mete koji se primenjuju suštinski istim putem, uzimajući u obzir razlike u afinitetu/aviditetu, efikasnosti, biodistribuciji, poluvremenu eliminacije i sličnim faktorima koji su dobro poznati kvalifikovanoj osobi.

[0096] Takođe, pošto jedinjenja pronalaska sadrže vezivo serumskog albumina koje produžava poluvreme eliminacije, ne moraju se primenjivati u suštini kontinuirano (npr. infuzijom), ali se mogu primenjivati u odgovarajućim intervalima (koje određuje kvalifikovana osoba). Na primer, mogu se primenjivati (u odgovarajućoj dozi) jednom u dva dana, jednom u četiri dana, jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, a u nekim slučajevima jednom u četiri nedelje ili još ređe, na primer injekcijom ili infuzijom.

[0097] Jedan aspekt pronalaska odnosi se na farmaceutsku kompoziciju koja se sastoji od najmanje jednog jedinjenja ili polipeptida pronalaska pri čemu je navedena kompozicija namenjena za primenu u intervalu između jednom nedeljno i jednom u 4 nedelje, a posebno između jednom u 7 dana i jednom u 21 dan, kao što je jednom u 7 dana ili 14 dana.

[0098] Obično, u gorenavedenoj medicinskoj upotrebi, koristiće se jedan polipeptid pronalaska. Međutim, u okviru pronalaska je upotreba dva ili više polipeptida pronalaska u kombinaciji.

[0099] Polipeptidi pronalaska se takođe mogu koristiti u kombinaciji sa jednim ili više daljih farmaceutski aktivnih jedinjenja ili principa, tj. kao kombinovani režim lečenja, koji mogu ili ne moraju dovesti do sinergijskog efekta. Opet, kliničar će moći da izabere takva dodatna jedinjenja ili principe, kao i odgovarajući kombinovani režim lečenja, na osnovu gorenavedenih faktora i njegove stručne procene.

[0100] Konkretno, polipeptidi pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim jedinjenjima ili principima koji se koriste ili se mogu koristiti za prevenciju i/ili lečenje bolesti i poremećaja koji se mogu sprečiti ili lečiti fuzionim proteinima ili konstruktima pronalaska, i kao rezultat toga može se dobiti sinergijski efekat.

[0101] Efikasnost režima lečenja koji se koristi u skladu sa pronalaskom može se odrediti i/ili pratiti na bilo koji način koji je sam po sebi poznat za uključenu bolest ili poremećaj, što će biti jasno kliničaru. Kliničar će takođe biti u mogućnosti da, po potrebi i/ili od slučaja do slučaja, promeni ili modifikuje određeni režim lečenja, kako bi postigao željeni terapeutski efekat, izbegao, ograničio ili smanjio neželjene efekte i/ili postigao odgovarajuću ravnotežu između postizanja željenog terapeutskog efekta s jedne strane i izbegavanja, ograničavanja ili smanjenja neželjenih efekata s druge strane.

[0102] Generalno, režim lečenja će se pratiti dok se ne postigne željeni terapeutski efekat i/ili sve dok se održava željeni terapeutski efekat. Opet, ovo može odrediti kliničar. Svako pozivanje na metod tretmana koji se primenjuje na ljudskom ili životinjskom telu treba shvatiti kao supstance i kompozicije za upotrebu u takvim tretmanima.

● Slika 1 je tabela u kojoj se navode neke pozicije aminokiselina koje će ovde biti posebno pomenute, i njihova numeracija prema nekim alternativnim sistemima numeracije (kao što su Aho i IMGT);

● Na slici 2 navedene su aminokiselinske sekvence na koje se upućuje u ovom dokumentu;

● Na slikama 3A i 3B prikazano je poravnanje sekvenci SEQ ID NO: 18 i 19 (pronalazak) sa sekvencama prethodnog stanja tehnike SEQ ID NO: 1 i 2;

● Na slici 4 prikazano je poravnanje SEQ ID NO: 18 do 44;

● Slika 5 daje poravnanje serumskog albumina različitih vrsta sisara.

● Slika 6 je grafikon koji prikazuje vezivanje SEQ ID NO: 1 (referenca)-cMycHis6 za obloženi HSA u prisustvu veziva serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak).

1,5 nM SQE ID NO: 1-cMycHis6 i serija koncentracija His6Flag3-SEQ ID NO: 1 (referenca), Flag3His6-SEQ ID NO: 19 (pronalazak) ili cAblys3-Flag3His6 (referenca) inkubirani su na obloženom HSA. Vezani SEQ ID NO: 1-cMycHis6 je detektovan sa kozjim anti-cMyc i HRP-obeleženim zečjim anti-kozjim antitelima.

● Slika 7 je grafikon koji prikazuje vezivanje HSA za FcRn u prisustvu veziva serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak). Heterodimer ljudskog FcRn-humanog β2 mikroglobulina je imobilizovan na CM5 čipu. Vezivanje 1 µM HSA u odsustvu ili prisustvu 2 µM nanotela u 50 mM NaPO4 150 mM NaCl 0,05% Tween-20 pH 6,0 praćeno je na Biacore T100 instrumentu.

Eksperimentalni deo

Primer 1 Afinitet za serumski albumin

[0103] Afinitet veziva serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak) za serumski albumin (SA) čoveka (Sigma-Aldrich A3782), cinomolgus majmuna (generisan interno), miša (Albumin Bioscience 2601), pacova (Sigma-Aldrich A4538), zeca (Sigma-Aldrich A0764), zamorca (Gentaur GPSA62), svinje (Sigma-Aldrich A4414), ovce (Sigma-Aldrich A3264), psa (Abcam 119814) i goveda (Sigma-Aldrich A3059) izmeren je putem površinske plazmonske rezonance (SPR) na ProteOn XPR36 (BioRad) instrumentu. Serumski albumin je imobilizovan preko kuplovanja amina na GLC ProteOn čipu korišćenjem ProteOn kompleta za kuplovanje amina (BioRad). Različite koncentracije (300 nM, 100 nM, 33,3 nM, 11,1 nM, 3,7 nM i 1,23 nM) veziva serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak) su ubrizgane u HBS-P pH 7,4 pufer (GE Healthcare) pri 45 µL/min tokom 120 sekundi, nakon čega je usledila disocijacija tokom 900 sekundi. Nije primećeno vezivanje ili je ono bilo veoma nisko za vezivo serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak) na SA zeca, ovce i goveda. Afiniteti veziva serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak) za SA čoveka, cinomolgus majmuna, pacova, miša i zamorca bili su veći u poređenju sa odgovarajućim afinitetima albuminskog veziva SEQ ID NO: 1. Rezultati su dati u tabeli 1 u nastavku i pokazuju da je vezivo serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak) unakrsno reaktivno sa SA psa i svinje.

Tabela 1 Kinetički parametri za vezivanje SEQ ID NO: 19 (pronalazak) na SA različitih vrsta.

[0104] Dugo poluvreme eliminacije albumina u krvi uglavnom je uslovljeno dvema karakteristikama: (i) velika veličina (65 kDa) albumina ograničava njegovu glomerularnu filtraciju i (ii) albumin se vezuje za FcRn pri niskom pH (pH 6), koji štiti albumin od razgradnje u lizozomima nakon pasivne endocitoze u endotelnim i epitelnim ćelijama, reciklažom iz ranog endozoma nazad u ekstracelularno okruženje. Da bi nanotela koja vezuju albumin dovela do dugog poluvremena eliminacije seruma putem vezivanja albumina i naknadnog recikliranja, ona treba da ostanu vezana za albumin u opsegu pH od 5,0 do 7,4. Stopa disocijacije veziva serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak) iz HSA pri pH 5, pH 6 i pH 7,4 izmerena je na ProteOn instrumentu kao što je gore opisano, uključujući SEQ ID NO: 1 (referenca) kao referencu, vezivo serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak) i SEQ ID NO: 1 (referenca) ubrizgano je na 500 nM i 300 nM respektivno u HBS-P pH 7,4 pufer. Puferi za disocijaciju bili su 50 mM NaOAc/HOAc 150 mM NaCl 0,05% Tween-20 pH 5,0, 50 mM NaOAc/HOAc 150 mM NaCl 0,05% Tween-20 pH 6,0 i HBS-P+ pH 7,4 respektivno. Disocijacija je analizirana tokom 2700 sekundi. Brzine disocijacije za vezivo serumskog albumina SEQ ID No: 19 (pronalazak) se ne razlikuju značajno u opsegu pH od 5,0 do 7,4. Rezultati su prikazani u tabeli 2.

Tabela 2 Brzina disocijacije veziva serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak) iz HSA pri različitom pH.

Primer 2 Epitop

[0105] Grupisanje epitopa je analizirano kompetitivnim ELISA testom. Humani serumski albumin je preko noći obložen sa 125 ng/ml u PBS na 4°C. Nakon blokiranja sa PBS 1% kazeinom, dodati su 1,5 nM SEQ ID NO: 1 (referenca)-cMycHis6 i serija koncentracija kompetitora (His6Flag3-vezivo serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak), His6Flag3-SEQ ID NO: 1 (referenca) kao pozitivna kontrolna grupa ili antitelo koje vezuje lizozim kokošjeg jajeta cAblys3-Flag3His6 kao negativna kontrolna grupa). Vezani SEQ ID NO: 1 (referenca)-cMycHis6 detektovan je sa kozijim anti-cMyc antitelom (Abeam ab19234) i HRP-obeleženim zečjim anti-kozjim antitelima (Genway 18-511-244226). Vezivo serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak) i SEQ ID NO:1 (referenca) ne vezuju identične epitope na HSA (slika 6).

Primer 3 Interferencija sa interakcijom između SA i FcRn

[0106] Da bi vezivo serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak) rezultiralo dugim poluvremenom eliminacije putem vezivanja albumina i naknadnog recikliranja, ne bi trebalo da ometa vezivanje albumina za FcRn. Ovo je analizirano u SPR na Biacore T100 (GE Healthcare) instrumentu. Heterodimer ljudskog FcRn-humanog β2 mikroglobulina (Sino Biological CT009-H08H) je imobilizovan na CM5 čipu putem standardnog kuplovanja amina (Biacore komplet za kuplovanje amina). Smeša 1 µM HSA i 2 µM nanotela (His6Flag3-vezivo serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak), His6Flag3-SEQ ID NO: 1 (referenca) ili cAblys3-Flag3His6) u 50 mM NaPO4 150 mM NaCl 0,05% Tween-20 pH 6,0 je ubrizgan pri 10 µl/min tokom 120 sekundi, nakon čega je usledila disocijacija tokom 600 sekundi. Krive vezivanja su kvalitativno upoređene sa krivom vezivanja od 1 µM HSA u odsustvu nanotela. Vezivo serumskog albumina SEQ ID NO: 19 (pronalazak) nije ometalo vezivanje HSA za FcRn (slika 7).

Primer 4 PK profil kod psa

[0107] Farmakokinetika trovalentnog konstrukta nanotela (SEQ ID NO: 53) nakon pojedinačne i.v. doze proučavana je na psima. Trovalentni konstrukt je proizveden u Pichia pastoris i sastojao se od dva nanotela protiv respiratornog sincicijalnog virusa (RSV) sa nanotelom koje se vezuje za albumin SEQ ID NO: 21 na C-terminalnom kraju (u kojem su tri nanotela međusobno povezana pomoću (Gly4Ser)7 linkera).

[0108] Farmakokinetički profil konstrukta procenjivao se u farmakokinetičkoj studiji (bez ukrštanja, pojedinačna doza) kod dvanaest zdravih mužjaka pasa rase bigl, natašte (zdravih kako je utvrđeno zdravstvenim pregledom pre ispitivanja). Konstrukt se primenjivao intravenozno.

[0109] Životinje su gladovale (sa neprekidnim pristupom vodi) preko noći pre doziranja, i pre prikupljanja uzoraka krvi pre doziranja, 24, 168 i 336 sati nakon doziranja (ukupno vreme gladovanja ne duže od 24 sata). Hrana je vraćena 4 sata nakon doze ili odmah nakon uzimanja krvi u 24, 168 i 336 sati. Telesna težina se takođe beležila i pratila tokom studije.

[0110] 1 ml pune krvi (ili 2-3 ml pre doze i 24, 168 i 336 sati) za plazmu prikupljao se iz perifernog suda pre doze i na 5, 15, 30 minuta i 1, 4, 8, 12, 24, 72, 168, 240, 336, 504 i 672 sata nakon početne doze. Prikupljeni uzorci za obradu seruma čuvani se na sobnoj temperaturi i ostavljeni su da se zgrušaju. Krv se centrifugirala na 10.000 o/min 2 minuta pomoću rashlađene centrifuge (podešene da održava 4°C). Uzorci su zamrzavani u roku od 30 minuta od sakupljanja dok se nisu dostavili na analizu (uključujući merenje koncentracije relevantnog konstrukta nanotela).

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Aminokiselinska sekvenca koja je pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina sposoban za vezivanje za humani serumski albumin koji ima:

CDR1 prema Abm, koji je aminokiselinska sekvenca GGTFSTYVMG (SEQ ID NO: 12); i

- CDR2 prema Abm, koji je aminokiselinska sekvenca AISQNSIHTY (SEQ ID NO: 13); i.

- CDR3 prema Abm, koji je aminokiselinska sekvenca SRFTSWYTADYEYDY (SEQ ID NO: 14),

gde je aminokiselina sekvenca VHH ili humanizovani VHH.

2. Aminokiselina sekvenca prema patentnom zahtevu 1, koja ima:

- stepen identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 18 i/ili 19, u kojoj se CDR i sve C-terminalne ekstenzije koje mogu biti prisutne ne uzimaju u obzir za određivanje stepena identičnosti sekvence, od najmanje 85%, po mogućnosti najmanje 90%, poželjnije najmanje 95%;

i/ili ima:

- ne više od 7, poželjno ne više od 5, kao što su samo 3, 2 ili 1 razlike aminokiselina, ne uzimajući u obzir CDR i bilo koju C-terminalnu ekstenziju koja može biti prisutna, sa sekvencom SEQ ID NO: 18 i/ili 19.

3. Aminokiselinska sekvenca prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2, koja sadrži, u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 18, jednu ili više mutacija koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela, tako da je nakon mutacije prisutan jedan od sledećih aminokiselinskih ostataka prema Kabatovoj numeraciji: 11L, 11K, 11V, 14A, 14P, 41A, 41L, 41P, 41S, 41T, 42E, 42G, 87A, 87T, 89A, 89L, 89T, 108L, 110K, 110Q, 112K i/ili 112Q; ili bilo koja odgovarajuća kombinacija takvih supstitucija, kao što su: 11V u kombinaciji sa 89L ili 89T; 11V u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili 11V u kombinaciji sa 89L i 110K ili 110Q.

4. Aminokiselinska sekvenca prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, koja je VHH i koja sadrži, u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 18, jednu ili više humanizujućih supstitucija koje su Q108L ili A14P ili njihova odgovarajuća kombinacija.

5. Aminokiselinska sekvenca prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koja je pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina koji je sposoban da se veže za humani serumski albumin i koji se bira između SEQ ID NO: 18 do 44.

6. Proteini, polipeptidi ili drugi konstrukt ili jedinjenje koje se sastoji od najmanje jedne aminokiselinske sekvence prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5.

7. Proteini, polipeptidi ili drugi konstrukt ili jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 6, koje se sastoji od najmanje jednog terapeutskog dela ili entiteta.

8. Proteini, polipeptidi ili drugi konstrukt ili jedinjenje u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 6 do 7, koje je takvo da:

- kada ima pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina na svom C-terminalnom kraju, onda C-terminalni pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina navedenog proteina, polipeptida ili drugog konstrukta ili jedinjenja ima C-terminalnu ekstenziju (X)n, u kojoj je n 1 do 10; i svaki X je aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran od prirodnih aminokiselinskih ostataka, na svom C-terminalnom kraju; i/ili

- kada ima pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina na svom C-terminalnom kraju, onda barem navedeni C-terminalni pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina sadrži jednu ili više mutacija koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela kako je definisano u patentnom zahtevu 3; i/ili

- kada ima pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina na svom N-terminalnom kraju, onda barem navedeni N-terminalni pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina navedenog proteina, polipeptida ili drugog konstrukta ili jedinjenja po mogućnosti sadrži D na poziciji 1; i/ili

po mogućnosti, svi pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina prisutni u navedenom proteinu, polipeptidu ili drugom konstruktu ili jedinjenju sadrže jednu ili više mutacija koje smanjuju vezivanje već postojećih antitela kako je definisano u patentnom zahtevu 3.

9. Farmaceutska kompozicija se sastoji od proteina, polipeptida ili drugog konstrukta ili jedinjenja prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 8.

10. Nukleinska kiselina koja kodira aminokiselinsku sekvencu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 ili polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 8, opciono uključen u genetski konstrukt.

11. Ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 10 ili jedinjenje ili polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 8.

12. Metoda za pripremu aminokiselinske sekvence prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 ili jedinjenja ili polipeptida prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 8, pri čemu se navedena metoda sastoji od kultivacije ili održavanja ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 11 pod uslovima tako da navedena ćelija domaćin proizvodi ili izražava aminokiselinsku sekvencu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 ili jedinjenje ili polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 8, i opciono se dalje sastoji od izolacije aminokiselinske sekvence prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 ili jedinjenja ili polipeptida prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 8 tako proizvedenih.

13. Jedinjenje ili polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 8 za upotrebu u terapiji.