ES2995488T3 - Multifunctional, hydrogel hybrid material, the method of its preparation and the use in the treatment of bone losses - Google Patents

Abstract

Se describe un material híbrido de hidrogel multifuncional y un método para su preparación y uso en el tratamiento o profilaxis de la pérdida de tejido óseo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Material híbrido de hidrogel multifuncional, el método de su preparación y el uso en el tratamiento de pérdidas óseas

La invención se refiere a un material híbrido multifuncional con potencial terapéutico, un método para la preparación de tales materiales de hidrogel, y su uso en medicina regenerativa, en particular en el tratamiento de pérdidas óseas producidas por osteoporosis.

La presente invención se refiere a un material híbrido de hidrogel inyectable multifuncional útil para la reconstrucción de tejido óseo, en particular pérdidas óseas secundarias causadas por osteoporosis. El material se puede introducir de manera precisa y mínimamente invasiva en el sitio de pérdida, donde formará un andamiaje para la reconstrucción del tejido óseo. La composición de este material permite su biointegración, crea una biomatriz conveniente para la colonización por células osteoblásticas (composición biomimética), tiene las propiedades mecánicas deseadas (matriz de polímero enriquecida con la fase mineral), y también tiene un alto potencial terapéutico (la presencia de partículas de sílice-apatita con un fármaco unido - alendronato). Los andamiajes de biopolímeros construidos de esta manera, químicamente entrecruzados con una sustancia de origen natural, además sirven como un sistema para la administración localizada, controlada de una sustancia activa (alendronato), que desempeña un papel clave en el tratamiento de la osteoporosis en el sitio de daño al tejido óseo. La solución presentada asegura una colocación no invasiva del andamiaje en el sitio de implantación, mientras se mantiene la estructura y propiedades biológicas, así como se limitan los potenciales efectos secundarios de la terapia.

Estado de la técnica

Se describen varios tipos de portadores de alendronato en la bibliografía, incluyendo nanopartículas [Posadowska, U., et al., (2015), Int. J. Pharm, 485 (1-2), 31-40], microcápsulas [Mondal, T et al., (2012), Mater. Sci. Eng. C, 32 (4), 697 706], cemento óseo [van Houdt, CI, et al., (2018), Sci Rep, 8 (1), 1-13], materiales mesoporosos [Cicco, SR, et al., (2019), Mater. Sci. Eng. C, 104, 109897; Manzano, M., et al., (2009), Expert Opin. Drug Deliv, 6 (12), 1383-1400], hidrogeles de quitosano termosensibles [Nafee, N., et al., (2018), J. Drug Target, 26 (7), 563-575], o materiales híbridos de hidrogel tal como colágeno-hidroxiapatita [Ma X., et al., Colloids Surf B Biointerfaces 143 (2016) 81-87].

En un artículo de Larsen, C., et al., (2009), Expert Opin. Drug Deliv, 6 (12), 1283-1295, se hizo una revisión de la bibliografía, que divulgó la posibilidad de usar sílice mesoporosa como un portador para alendronato. La investigación realizada incluía la aplicación de varios tipos de matrices mesoporosas, así como su modificación con grupos aminopropilo. Se ha mostrado que la carga del fármaco en la matriz mesoporosa aumenta al aumentar el área de superficie del material. También se reveló que la presencia de grupos amino en la sílice mesoporosa modificada mejora significativamente la eficacia de carga de fármaco, que se explica como el efecto de fuertes interacciones entre los grupos amino de la matriz y los grupos fosfato del alendronato.

En el artículo de Cicco, SR, et al., (2019), Mater. Sci. Eng. C, 104, 109897 se ha mostrado que la presencia de biosílice mesoporosa inhibe el efecto citotóxico del alendronato mismo. Sin embargo, el sistema modelo propuesto (material sobre el sustrato), no asegura la implantación local de una manera no invasiva.

Un artículo de Ma X., et al., Colloids Surf B Biointerfaces 143 (2016) 81-87 divulgó un proceso de dos etapas para la preparación de hidrogeles híbridos biomiméticos como potenciales andamiajes de ingeniería de tejidos, que contienen colágeno, hidroxiapatita y alendronato. La hidroxiapatita recubierta de alendronato (4,0% en peso) estaba suspendida en colágeno entrecruzado con genipina en condiciones fisiológicas. Los autores prepararon el sistema HAp-ALN aprovechándose de la afinidad descrita en la bibliografía del fármaco hacia hidroxiapatita, [Neamtu, J., et al., (2017), J. Therm. Anal. Calorim, 127 (2), 1567-1582], por lo cual usaron HAp comercialmente disponible. Se observó mejora en las propiedades mecánicas, así como una ausencia de efecto citotóxico contra la línea celular osteoclástica MG-63. El trabajo no divulga ningún estudio que muestre un efecto terapéutico, así como una biointegración mejorada. GILARSKA ET AL (International Journal of Biological Macromolecules; vol. 155 Julio 2020, p.938-950) muestra un material de hidrogel que comprende colágeno, quitosano y ácido hialurónico funcionalizado con lisina en una proporción 5:2:3, entrecruzado con genipina, para el tratamiento de defectos óseos. El material no contenía partículas y alendronato como parte de la composición.

La solicitud de patente polaca No. P.428993 describe un método para la preparación de un material híbrido de hidrogel que contiene partículas de sílice con superficie modificada con grupos amino, dispersadas en una mezcla de biopolímeros (colágeno, quitosano, ácido hialurónico en la proporción en peso 50:40:10), y entrecruzado con genipina. Para obtener este material, se usó ácido hialurónico comercialmente disponible (no se sometió a ninguna modificación) y representaba el 10% en peso de la mezcla de biopolímeros. El material no contenía alendronato como parte de la composición, y no tenía propiedades terapéuticas.

El proceso de reconstrucción de tejido óseo determina el funcionamiento apropiado del sistema esquelético, y por tanto del organismo entero. El proceso se inicia cuando la continuidad de los canalículos formados por las prolongaciones citoplásmicas de osteocitos, y que conectan los osteocitos entre sí y con osteoblastos en reposo (las llamadas células de revestimiento) se rompe (formación de microfractura). Por consiguiente, se produce apoptosis de osteocitos, que también es una señal a las células de revestimiento sobre la localización y extensión del daño tisular. En la siguiente etapa, las células de revestimiento liberan factores locales, presentando una señal a las células precursoras de osteoclastos para empezar el proceso de migración al sitio dañado, y diferenciación a osteoclastos (osteoclastogénesis). Los osteoclastos maduros resorben la matriz ósea junto con la microfractura, formando la llamada una cavidad de resorción. Esta fase, llamada la fase de resorción, dura aproximadamente 2-4 semanas y termina con la apoptosis de los osteoclastos. Esta etapa va seguida por una fase de recuperación corta, durante la cual la cavidad de resorción se vuelve a revestir con células formadoras de hueso (osteoblastos). Después, tiene lugar la fase de formación de hueso, que dura aproximadamente 4-6 meses, durante la cual los osteoblastos producen un osteoide, que gradualmente se mineraliza, produciendo el relleno de la pérdida con hueso completamente mineralizado.

La osteoporosis es una enfermedad en la que el equilibrio de los procesos de resorción y formación de hueso está alterado, que a su vez produce resorción aumentada y aceleración del recambio óseo. Además, según envejece el cuerpo, los procesos de formación de hueso se hacen menos eficaces, lo que produce menor cantidad de hueso que se forma y una cantidad aumentada de hueso que se resorbe. Esto significa que, con cada ciclo de reconstrucción ósea interna, se elimina algo de tejido óseo, produciendo pérdida de masa ósea y daño a su estructura. Como resultado, el recambio óseo se intensifica - se crean más cavidades de resorción en una superficie determinada en un momento determinado, y el tiempo de mineralización del hueso se acorta. El grupo más comúnmente usado de fármacos en el tratamiento de la osteoporosis (en mujeres posmenopáusicas, osteoporosis inducida por corticosteroides) son bisfosfonatos, en particular bisfosfonatos de nitrógeno, por ejemplo, alendronato de sodio,<a>L<n>, que, debido a su afinidad por el mineral óseo (hidroxiapatita), se caracterizan por alta selectividad hacia el tejido óseo. El principal fin de estos fármacos es normalizar la actividad de resorción excesiva de los osteoclastos, y el recambio óseo aumentado. Los bisfosfonatos de nitrógeno producen la muerte de la célula osteoclasto como resultado de la inhibición de la farnesil difosfato sintasa (FPP - una enzima de la ruta de mevalonato), cuyo papel principal es la producción de sustratos para la síntesis de compuestos clave para el metabolismo celular normal. Como resultado, el citoesqueleto de los osteoclastos, el plegamiento de membrana y el movimiento de las vesículas portadoras están alterados, produciendo pérdida de la actividad de resorción de los osteoclastos, y en consecuencia apoptosis celular. Estudios preclínicos han mostrado que el fármaco no tiene efecto directo sobre el proceso de formación de hueso, y el tejido óseo producido durante el tratamiento con alendronato muestra estructura normal. El fármaco se administra con la mayor frecuencia por vía oral, que desafortunadamente está asociado con numerosos efectos secundarios (osteonecrosis de la mandíbula, irritación del sistema gastrointestinal, nausea). La administración intravenosa de ALN, aparte de los efectos secundarios en forma de fiebre, síntomas similares a la gripe y desequilibrio de electrolitos, también tiene el riesgo de nefrotoxicidad debido a la formación de complejos con calcio y la acumulación en tejidos no calcificados. Por tanto, un sistema que permita la administración local y por tanto la acción localizada de este fármaco parece presentar una solución extremadamente atractiva, asegurando la supresión de la resorción ósea y al mismo tiempo limitando los efectos secundarios sistémicos durante la terapia entera.

Satisfacer la demanda creciente para biomateriales multifuncionales para ingeniería de tejidos, que posean propiedades físicas, químicas y biológicas específicas, se enfrenta a limitaciones relacionadas con procedimientos de producción complicados y altos costes de producción. Esto crea problemas técnicos entre ensayos de laboratorio y aplicaciones terapéuticas.

Compendio de la invención

Proporcionar un material híbrido de hidrogel multifuncional adecuado para uso en ingeniería de tejidos, que tenga un efecto terapéutico, es decir, inhibe la actividad de osteoclastos y al mismo tiempo no inhibe la actividad de osteoblastos, mientras el material de hidrogel deseado debe experimentar una biomineralización rápida, preferiblemente después de unos pocos días después de la administración, que permitiría su biointegración más rápida con el tejido óseo y apoya el proceso de formación de hueso, así como un método para la preparación de dicho material, constituye el problema técnico.

La presente invención se dirigió al desarrollo y producción de un material híbrido de hidrogel multifuncional que estaría caracterizado por: •

• potencial terapéutico que permite la inhibición de células osteoclásticas,

• bioactividad dependiente de la rápida biointegración del material con el hueso y que apoya el proceso de mineralización del hueso, especialmente el proceso de mineralización del hueso alterado por osteoporosis, • una composición biomimética que proporciona un entorno favorable para el funcionamiento de osteoblastos. • inyectabilidad que permite la administración no invasiva y localizada del material en forma de sol, en la pérdida ósea, y capacidad para entrecruzarse en condiciones fisiológicas.

Inesperadamente, el fin definido anteriormente se alcanzó por la presente invención.

La invención se refiere a un material híbrido multifuncional con potencial terapéutico, caracterizado en que contiene: a) una matriz de biopolímero que contiene: colágeno, quitosano, ácido hialurónico modificado con lisina en una proporción en peso de 5:2:3, respectivamente,

b) partículas de sílice-apatita funcionalizadas con grupos amino,

c) la sustancia activa en forma de alendronato unido a las partículas de sílice-apatita,

d) una sustancia entrecruzadora.

La sustancia entrecruzadora es genipina.

Un método de producir el material híbrido de hidrogel multifuncional constituye otro objeto de la invención, y se caracteriza en que comprende las siguientes etapas:

a) las partículas de sílice se funcionalizan con grupos amino,

b) las partículas obtenidas en a) se suspenden en solución de SBF acuosa, preferiblemente a una concentración de 1,5 M, para obtener, después de 10 días de incubación, las partículas de sílice recubiertas con la fase mineral, c) usando su afinidad por apatita, el alendronato de sodio se une a las partículas obtenidas en la etapa b), d) una solución de colágeno, quitosano y ácido hialurónico modificado con lisina, en una proporción de 5:2:3, respectivamente, se añade a la suspensión acuosa de las partículas de la etapa c),

e) la mezcla obtenida en la etapa d) se somete a una reacción de entrecruzamiento con genipina.

Preferiblemente, el proceso según la invención se lleva a cabo por el método de sol-gel.

Otra forma de realización de la invención se refiere al material híbrido de hidrogel multifuncional como se ha definido anteriormente u obtenido por el método como se ha definido anteriormente, para uso en el tratamiento o profilaxis de pérdidas óseas. Preferiblemente, las pérdidas óseas son debidas a osteoporosis.

Breve descripción de los dibujos

Para un mejor entendimiento de la esencia de la invención, la presente descripción se ilustra con las figuras acompañantes.

La figura 1 muestra las microfotografías de MEB de partículas submicrómicas de SiO<2>-Ap y SiO<2>-Ap-ALN.

La figura 2 resume los difractogramas de partículas de SiO<2>-Ap y SiO<2>-Ap-ALN.

La figura 3 resume los espectros XPS de partículas de SiO<2>-Ap y SiO<2>-Ap-ALN.

La figura 4 resume los perfiles termogravimétricos de partículas de SiO<2>-Ap y SiO<2>-Ap-ALN.

La figura 5 muestra las microfotografías de MEB que demuestran la morfología de los materiales híbridos obtenidos, así como el material control ColChHAmod.

La figura 6 resume los resultados de los estudios reológicos, los valores G' medidos después de 10, 35 y 70 minutos del experimento, donde los resultados se presentan en una escala logarítmica. Se demostró la significancia estadística (p < 0,05) usando la prueba de la t de Student. * indica significancia estadística relativa a los resultados de KolChHAmod a 70 min, # indica significancia estadística relativa a los resultados de KolChHAmod C1 después de 70 min.

La figura 7 resume los resultados de las pruebas de grado de hinchamiento.

La figura 8 resume los resultados de los estudios de degradación enzimática.

La figura 9 muestra microfotografías de MEB de los materiales híbridos junto con los valores de la proporción de calcio a fósforo (Ca/P), determinados por EDS para la fase mineral formada en la superficie de los materiales después de 3 días de incubación en SBF.

La figura 10 muestra (A) los resultados de la prueba de Alamar Blue los días 1, 3, y 7 de crecimiento de las células MG-63 en los materiales ensayados. (B) Actividad de fosfatasa alcalina después de 3 y 7 días de crecimiento de las células MG-63 en los materiales ensayados. Se demostró la significancia estadística (p < 0,05) usando la prueba de la t de Student. (A) % indica la significancia estadística relativa al resultado para ColChHAmod el día 3, $ indica la significancia estadística relativa al resultado para ColChHAmod el día 7 (B) * indica la significancia estadística relativa al resultado para el control el día 3, ** indica la significancia estadística relativa al resultado para el control el día 7, # indica la significancia estadística relativa al resultado para ColChHAmod C1 el día 3. Se usaron las células crecidas en la placa de cultivo como controles.

La figura 11 muestra (A) un resumen de las microfotografías de MEB que muestran la morfología de las células MG-63 fijadas después de 3 días de crecimiento en la superficie de los materiales ensayados (B) un gráfico que muestra la distribución en superficie de las células MG-63 después de 3 días de crecimiento (estimado basado en las microfotografías de MEB obtenidas).

La figura 12 muestra los resultados de la prueba de Alamar Blue los días 1, 3, y 7 de crecimiento de las células J774A.1 en los materiales ensayados. Se demostró la significancia estadística (p < 0,05) usando la prueba de la t de Student. El % indica la significancia estadística relativa al resultado para ColChHAmod el día 1.

La figura 13 muestra un esquema de la formación de las partículas de SiO<2>-Ap-ALN (SO<2>-NH<2>- partículas de sílice funcionalizadas con amino; Ap- capa de apatita formada en la superficie de las partículas de sílice después de incubación en SBF 1,5 M; ALN - alendronato de sodio).

La figura 14 muestra un patrón de las partículas de SiO<2>-Ap-ALN obtenidas (SO<2>-NH<2>- partículas de sílice amino funcionales; Ap- capa de apatita; ALN alendronato de sodio). El producto obtenido (SiO<2>-Ap-ALN) se suspendió en un sol de biopolímero (colágeno-quitosano-hialurónico) y se entrecruzó con genipina para obtener el material híbrido útil para rellenar defectos osteoporóticos.

La figura 15 muestra una vista esquemática de la formación del material híbrido.

La figura 16 muestra: (A) fragmentos de piel aislada con materiales basados en hidrogel, (B) una disminución en el volumen de hidrogel observado después de varios periodos después de la inyección de material, (C) imágenes de MEB representativas de ColChHAmodC1 aislada de piel de ratones después de 60 días tras la inyección. Los círculos blancos indican agregados de hidroxiapatita determinado por análisis de EDS. La flecha blanca señala vasos sanguíneos en el hidrogel.

La figura 17 muestra análisis de hematología de sangre realizados para ratones expuestos a hidrogeles.

La figura 18 muestra análisis bioquímicos de suero realizados para ratones expuestos a hidrogeles.

La figura 19 muestra la detección de citoquinas en suero después de la administración de los materiales.

La figura 20 muestra hidrogel ColChHAmod teñido con tricromo de Masson. La flecha blanca indica neutrófilos y la flecha gris oscura indica macrófagos.

La figura 21 muestra hidrogel ColChHAmod C1 teñido con tricromo de Masson. El cuadrado está marcado con un área que se muestra a mayores aumentos. La flecha blanca indica neutrófilos y la, flecha gris oscura indica macrófagos.

Descripción de formas de realización preferidas

Además, la esencia de la invención se explica en los siguientes ejemplos.

Los ejemplos 1, 2 y 4 divulgan etapas consecutivas de una implementación ejemplar del método según la invención, mientras los ejemplos 3 y 5 divulgan propiedades de los materiales obtenidos según la invención.

Ejemplo 1. Preparación de partículas minerales subm icrónicas de SiO2-Ap

El depósito controlado de apatita (Ap) en la superficie de las partículas de sílice se realizó en contacto con plasma artificial (SBF 1,5).

Preparación de plasma artificial

Para este fin, se prepararon 1000 ml de SBF 1,5. Se añadieron 700 ml de agua desionizada a un vaso de precipitado de plástico de 1000 ml. El vaso de precipitado se colocó en un agitador magnético en un baño de agua a 36,5 ± 1,5°C. Los reactivos 1 a 8 se disolvieron según el orden mostrado en la tabla 1 (el siguiente reactivo se añadió después de que el anterior se hubiera disuelto por completo). Se añadió agua desionizada hasta un volumen de 900 ml y la temperatura de la solución se ajustó de nuevo a 36,5 ± 1,5°C. Después se inició el control de pH, para este fin el electrodo del pH metro se colocó en la solución. En la siguiente etapa, se disolvió Tris en la solución, con control constante de pH, añadiendo pequeñas porciones del reactivo. Cuando el pH llegó a 7,30 ± 0,05, la temperatura se comprobó para mantenerla a 36,5 ± 1,5°C. Después de comprobar la temperatura, se añadió Tris otra vez, para subir el pH a 7,45. Cuando el pH subió a 7,45 ± 0,01, la disolución del Tris se paró y se añadió HCl 1 M para bajar el pH a 7,42 ± 0,01, teniendo cuidado de no dejar bajar el pH por debajo de 7,40. Después de disminuir el pH a 7,42 ± 0,01, el Tris restante se disolvió sin superar un pH de 7,45. Después de haber disuelto todo el Tris, la temperatura de la solución se ajustó a 36,5 ± 0,2°C. El pH de la solución se ajustó por adición gota a gota de HCl 1 M a 7,42 ± 0,01 a una temperatura de 36,5 ± 0,2°C. El pH se ajustó por último a 7,40 a 36,5°C. La solución se echó después en un matraz de fondo plano de plástico, se llevó hasta 1000 ml y se almacenó en una nevera.

Tabla 1. Reactivos y sus cantidades necesarias para preparar 1000 ml de SBF 1,5

en

Depósito de apatita (Ap) en la superficie de partículas de sílice funcionalizadas con amino

Las partículas de sílice funcionalizadas con amino se obtuvieron por el método sol-gel según el procedimiento descrito en [J. Lewandowska-tañcucka et al., Int. J. Biol. Macromol. 136 (2019) 1196-1208] como sigue: 1,0 ml de tetraetoxisilano (TEOS) y 0,1 ml de aminopropiltrietoxisilano (APTES) se añadieron secuencialmente a una mezcla de etanol (5,1 ml) y agua (5 ml). La mezcla resultante se dejó en un agitador magnético y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. El material obtenido de esta manera se sometió al proceso de centrifugación y después se limpió lavando con etanol y centrifugación. El ciclo de lavado en etanol/centrifugación se repitió cuatro veces. El material se secó en un horno de vacío a 60°C. Después de la purificación, se obtuvo un polvo blanco (SO<2>-NH<2>).

En la siguiente etapa, 20 mg de partículas de SO<2>-NH<2>se colocaron en viales de 50 ml y se añadieron 20 ml de solución de SBF 1,5 M. Las muestras se sonicaron continuamente durante 10-15 minutos. Los viales se protegieron después con Parafilm y se colocaron en un incubador ajustado a 37°C y agitaron (50 rpm). Los materiales preparados de esta manera se incubaron durante un periodo de 10 días, sustituyendo la solución de SBF con la reciente cada 2 3 días. Para este fin, la suspensión de partículas en SBF se centrifugó a 10.000 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se eliminó, una alícuota reciente de tampón se introdujo, agitó con vortex e incubó de nuevo. Después de una incubación de<10>días en plasma artificial, el material se centrifugó, después limpió lavando con agua y centrifugación (el procedimiento se repitió tres veces), y después se secó a temperatura ambiente. El material (SO<2>-Ap) se obtuvo en forma de un polvo blanco.

Ejemplo 2. Preparación de las partículas minerales bioactivas submicrónicas que portan alendronato (SÍO2-Ap-ALN)

El alendronato de sodio se unió al sistema SiO<2>-Ap obtenido como resultado de depósito controlado en condiciones SBF. Para esto, 20 mg del material SiO<2>-Ap se suspendieron en 3 ml de hidróxido de sodio (5 mM) y se sonicó durante 5 min. Después 4 mg de alendronato de sodio (ALN) se disolvieron en 2 ml de solución de NaOH (5 mM). El electrodo del pH-metro se colocó en la solución y el pH se ajustó a 10 añadiendo solución de NaOH (20 mM). Después la solución de alendronato de sodio preparada de esta manera se añadió a la suspensión de SiO<2>-Ap. La muestra se colocó en un agitador magnético con función calefactora (500 rpm, 37°C) durante 3 días. El material con alendronato unido resultante (SiO<2>-Ap-ALN) se purificó por diálisis en agua (24 horas, temperatura ambiente) y se liofilizó para dar un polvo blanco.

Ejemplo 3. Propiedades fisicoquím icas de las partículas minerales submicrónicas (SiO2-Ap) y las partículas minerales bioactivas subm icrónicas que portan alendronato (SiO2-Ap-ALN)

Las partículas obtenidas en los ejemplos 1 y 2 se caracterizaron en detalle usando un número de técnicas fisicoquímicas - se determinaron la morfología (MEB), así como la composición química (EDS, XRD, XPS, TG). Los estudios de MEB y EDS (Figura 1) mostraron la presencia de una fase mineral con la morfología y composición (proporción Ca/P = 1,2) características de estructuras de apatita.

Los resultados de los análisis de difracción de rayos X (XRD) (Figura 2) confirmaron inequívocamente la presencia de la fase cristalina en el material obtenido. Además, las señales que aparecen en los difractogramas a 20 iguales a: 25,9; 32,0; 39,4; 42,2; 46,8; 53,2 están de acuerdo con los valores de la bibliografía de las señales atribuidas a hidroxiapatita.

Los resultados de los estudios confirmaron la eficacia de la metodología propuesta para obtener material híbrido bioactivo (SiO<2>-Ap) en condiciones suaves simulando el proceso de biomineralización. Además, la estabilidad del material obtenido se basa en interacciones resultantes de la fuerte afinidad de ALN por apatita. Los átomos de oxígeno desprotonados de los grupos fosfato en ALN interaccionan electrostáticamente con los iones calcio presentes en la superficie de la apatita. El conjugado Ap-ALN resultante no afecta la estructura cristalina de apatita.

Las partículas de SiO<2>-Ap-ALN submicrónicas obtenidas, como se describe en el ejemplo 2, se caracterizaron por un número de método fisicoquímicos complementarios (MEB, XPS, XRD, TG) (figuras 1-4). Los análisis de XPS (Figura 3) y TG (Figura 4) confirmaron la eficacia de unión de alendronato al soporte bioactivo SiO<2>-Ap. Se demostraron cambios en la composición elemental de la superficie del material SiO<2>-Ap-ALN obtenido (análisis de XPS, tabla 2), así como diferencias en el perfil termogravimétrico (para el material con el fármaco unido, se encontró una pérdida de peso mayor en el 3,3% en relación al soporte SiO<2>-Ap solo). El difractograma obtenido para el material con el fármaco unido (figura 2) no mostró diferencias significativas comparado con el patrón de difracción obtenido para el soporte mismo, lo que confirma que el proceso de conjugación de ALN a SiO<2>-Ap no afectó su estructura cristalina.

Tabla 2. Resultados de análisis de XPS

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Ejemplo 4. Preparación de los materiales híbridos de hidrogel químicamente entrecruzados con fase mineral bioactiva dispersada que porta alendronato (SiO2-Ap-ALN)

Las partículas de SiO<2>-Ap-ALN submicrónicas obtenidas en el ejemplo 2 se suspendieron en un sol de biopolímero que consistía en colágeno, quitosano y ácido hialurónico funcionalizado con lisina, y entrecruzado con genipina para obtener un material híbrido. Para este fin, se prepararon tres lotes de partículas minerales bioactivas submicrónicas que portan alendronato de sodio (SiO<2>-Ap-ALN), 5 mg, 2,5 mg y 1 mg, respectivamente, y cada una se resuspendió en 0,1 ml de agua. Después, se añadieron volúmenes apropiados de soluciones de biopolímeros: 76 pl de solución de quitosano (Ch) (solución al 1% en peso en ácido acético al 1%), 540 pl de solución de colágeno (Col) (solución en ácido clorhídrico con una concentración de 3,5 mg/ml - solución suministrada por el fabricante BD Biosciences), 114 pl del ácido hialurónico modificado con lisina (HAmod) (solución al 1% en peso en tampón fosfato (PBS) 10x; compuesto de: NaCl (c = 1,37 M), KCl (c = 27 mM), Na<2>PO<4>(c = 43 mM), KH<2>PO<4>(c = 14 mM), pH ajustado a 7,4 con solución de ácido clorhídrico HCl concentrado (c = 35%)). El sol obtenido se agitó vigorosamente y después se añadieron 170 pl de solución de genipina (solución 20 mM, preparada en PBS 10x) y se incubó a 37°C hasta que se produjo el entrecruzamiento completo. El material obtenido estaba en forma de un hidrogel. La proporción en peso de los biopolímeros en el material obtenido era: Col:Ch:HAmod - 50:20:30.

Se ensayaron tres concentraciones de partículas de SiO<2>-Ap-ALN suspendidas en el sol. Usando tres concentraciones diferentes de suspensiones/dispersiones de las partículas minerales bioactivas (C1 = 5 mg/ml, C2 = 2,5 mg/ml, C3 = 1 mg/ml), se obtuvieron tres tipos de materiales híbridos: ColChHAmod C1, ColChHAmod C2 y ColChHAmod C3. Un hidrogel con una composición de biopolímeros análoga, pero sin la adición de las partículas de SiO<2>-Ap-ALN (se añadieron 0,1 ml de agua) se obtuvo como material control (ColChHAmod).

El procedimiento para la preparación del ácido hialurónico modificado con lisina se presentó en la publicación (Gilarska, A et al., (2020), Int. J. Biol. Macromol, 155, 938-950).

En la primera etapa, se preparó el tampón MES (50 mM). Para este fin, 0,97 g de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) se disolvieron en 100 ml de agua desionizada y el pH se ajustó a 4 con solución de NaOH 0,1 M. La mezcla entera se filtró a través de un filtro de jeringa. Se disolvieron 500 mg de ácido hialurónico (HA) en 20 ml del tampón MES (50 mM, pH = 4), y después 0,73 g de lisina, 360 mg de EDC (clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida) y 200 mg de NHS (N-hidroxisuccinimida) se añadieron secuencialmente (cada uno de estos reactivos primero se disolvió en 5 ml de tampón MES debido a la consistencia de gel de la mezcla). La mezcla se agitó durante 24 horas en un agitador magnético a temperatura ambiente, y después se dializó durante la noche en una solución de Na<2>CO<3>acuosa 0,1 M (que dura aproximadamente 12 horas), seguido por una diálisis de 8 días contra agua. En la siguiente etapa, la mezcla se concentró en un evaporador (a un volumen de aproximadamente 50 ml) y se liofilizó durante tres días. El grado de sustitución de lisina del producto así obtenido (HAmod) se determinó por análisis elemental y espectroscopía de 1H RMN, fue de aproximadamente el 25%.

Ejemplo 5. Caracterización de los materiales híbridos de hidrogel químicamente entrecruzados con fase mineral bioactiva dispersada que portan alendronato (SiO2-Ap-ALN)

Los materiales híbridos de hidrogel obtenidos, ColChHAmod C1, ColChHAmod C2 y ColChHAmod C3, respectivamente, se sometieron a características fisicoquímicas. Se determinaron la morfología, liofilicidad, grado de hinchamiento, y propiedades reológicas.

Usando la técnica de MEB, se caracterizó la microestructura de los materiales híbridos obtenidos, así como el material control ColChHAmod. El análisis de las microfotografías obtenidas (Figura 5) reveló la presencia de las partículas submicrónicas de SiO<2>-Ap-ALN en cada uno de los sistemas híbridos obtenidos. Las partículas existían tanto como objetos individuales, así como en forma de agregados parcialmente cubiertos con la red de biopolímeros creada.

Con el fin de confirmar la posibilidad de usar los sistemas desarrollados como materiales inyectables, se llevaron a cabo medidas reológicas en modo oscilatorio. Los valores del módulo elástico (G') medido después de 10, 35 y 70 minutos del experimento se muestran en la figura 6 (el experimento se llevó a cabo a 37°C, después de añadir solución de genipina al sol descrito anteriormente). Siguiendo los cambios del módulo elástico (G') a lo largo del tiempo, fue posible verificar la transición del estado sol al de gel y por tanto demostrar el potencial inyectable de los materiales obtenidos. Al principio del proceso de gelificación (10 minutos después de preparar la mezcla), los valores del módulo elástico para todos los materiales estaban a un nivel bajo (en el intervalo de 10-14 Pa), confirmando su estado viscoelástico y la forma inyectable. Los valores de G' aumentaron significativamente después de 35 minutos, alcanzando un valor máximo a los 70 minutos desde el inicio del proceso de entrecruzamiento (formación de gel). Por tanto, una comparación del valor G' al principio y al final del experimento reológico demostró que los materiales desarrollados pueden funcionar como materiales inyectables.

Además, los resultados obtenidos demostraron que la introducción del soporte bioactivo en la matriz de biopolímeros mejoró significativamente las propiedades mecánicas de los híbridos obtenidos. Se demostró una diferencia estadísticamente significativa para el valor G' después de 70 min de gelificación para todos los materiales híbridos, en comparación con el módulo de elasticidad (G' después de 70 min) obtenido para el material control. También se observó un aumento en el valor del módulo de elasticidad (G') desde el valor de 900 Pa para la matriz de polímeros, a 2500 Pa para el sistema con el mayor contenido en soporte (ColChHAmod C1) después de 70 min de proceso de gelificación (Figura 6) (significancia estadística en relación a todos los materiales).

Los resultados anteriores claramente demuestran que después del final del proceso de gelificación (después de 70 min) los materiales híbridos, mientras mantienen la inyectabilidad típica para la matriz de polímero misma, se caracterizan por valores significativamente mayores (significancia estadística) del módulo elástico.

También se determinó el grado de hinchamiento (SP) para los materiales híbridos obtenidos. El experimento se llevó a cabo en condiciones fisiológicas (pH = 7,4; temp = 37°C), los resultados se muestran en la figura 7. Analizando los resultados obtenidos, se puede ver que todos los materiales ensayados muestran la capacidad de hinchamiento (SP en el intervalo del 6700-11700%), mientras la presencia de las partículas de SiO<2>-Ap-ALN tiene un impacto significativo en las propiedades de hinchamiento de los sistemas híbridos. Las pruebas de hinchamiento realizadas mostraron que al aumentar la concentración de las partículas de SiO<2>-Ap-ALN, el grado de hinchamiento disminuyó (Figura 7). Por tanto, este resultado indica que las partículas obtenidas afectan la rigidez de la estructura de hidrogel, que también se confirmó por pruebas reológicas.

La liofilicidad de las superficies de los materiales obtenidos también se examinó. Los resultados obtenidos en la base de las medidas de ángulos de contacto se resumen en la tabla 3. Analizando los datos obtenidos, se puede advertir que la introducción de partículas de SiO<2>-Ap-ALN en la matriz de biopolímeros produce que la superficie de los materiales híbridos se vuelva más hidrofílica, como se evidencia por valores menores de los ángulos de contacto, en comparación con el material control (ColChHAmod). Se observó que el material con la mayor concentración de partículas (ColChHAmod C1) tenía la superficie más hidrofílica (66°). La mejora en hidrofilicidad se puede explicar por la presencia de partículas híbridas de SiO<2>-Ap-ALN en la superficie de los materiales (microfotografías de MEB presentadas en la figura 5) que contienen grupos amino hidrofílicos expuestos en la superficie derivados del alendronato unido (confirmado por análisis de XPS).

Tabla 3. Valores de los ángulos de contacto para los materiales obtenidos

Tipo de material Valor del ángulo de contacto n

ColChHAmod 77,7 ± 1,3

ColChHAmod C1 65,8 ± 0,6

ColChHAmod C2 70,9 ± 1,3

ColChHAmod C3 67,1 ± 0,8

Degradación enzimática

Los materiales obtenidos también se sometieron al proceso de degradación enzimática en presencia de la enzima colagenasa. La degradación enzimática se estudió durante 144 horas. La figura 8 muestra cambios en la masa de los materiales durante la incubación en una solución de colagenasa. Se observó una ralentización significativa del proceso de degradación enzimática para todos los materiales con un soporte introducido. Después de 4 horas de degradación enzimática, se advirtió una ligera pérdida de peso para los materiales híbridos (aproximadamente el 3-7%) y el 12% para el material ColChHAmod. En puntos de medida posteriores, se observaron cambios significativos en el peso restante del material control (31% después de 144 h), mientras la pérdida de peso para los materiales híbridos perdió mucho más despacio. Después de 144 h de degradación de los materiales híbridos, se observó una pérdida de peso de aproximadamente el 44-52%. Cuando se analiza la pérdida de peso de todos los materiales ensayados en un punto determinado del experimento, se puede indicar una tendencia que con un aumento en el contenido de partículas de SiO<2>-Ap-ALN, la velocidad del proceso de degradación disminuye. Estos resultados están en línea con los resultados del experimento reológico, que confirmó la mejora de las propiedades mecánicas de los materiales híbridos junto con la concentración creciente de partículas de SiO<2>-Ap-ALN en el sistema.

Propiedades bioactivas

Con el fin de demostrar que los materiales híbridos obtenidos, gracias a la presencia de partículas de sílice-apatita, favorecerán la biointegración del material con el hueso y por tanto apoyarán el proceso de mineralización ósea alterado en el proceso de osteoporosis, se examinaron sus propiedades bioactivas. Se llevó a cabo un experimento de biomineralizaciónin vitroen condiciones de fluido corporal simulado (SBF). Los datos de la bibliografía muestran que los materiales que muestran la capacidad de producir una capa de apatita en su superficie en condiciones de SBF también experimentarán biomineralización en un organismo vivo, asegurando de esta manera la integración eficaz del andamiaje con el hueso natural. El experimento de biomineralización en condiciones modelo incluía una incubación de 5 días de los materiales en SBF a 37°C. Posteriormente, los materiales se ensayaron usando técnicas de MEB y EDS. La figura 9 muestra las microfotografías de MEB obtenidas y los valores de la proporción de calcio respecto a fosfato (Ca/P) determinados por la técnica EDS para la fase mineral formada en la superficie de los materiales después de 3 días de incubación en SBF.

El análisis detallado de los resultados (MEB/EDS) permitió manifestar que la formación de la fase mineral en forma de una estructura más fluida, en la que la proporción Ca/P es característica de apatita, se observó para los materiales híbridos ColChHAmod C1 y ColChHAmod C2, después de 3 días. Además, debido al hecho que la matriz de hidrogel según la presente invención consiste en el 30% en peso del ácido hialurónico modificado, se observó apoyo adicional para la biomineralización del ácido hialurónico (formación de la fase mineral en forma de capas en la superficie de ColChHAmod y ColChHAmod C3). En el caso de la invención previa, la matriz de polímeros con el 10% en peso de ácido hialurónico sin modificar no mostró esta propiedad. Merece la pena indicar que el material presentado en la solicitud previa se sometió a un experimento similar (estudio de bioactividad en SBF); en ese caso, el proceso de biomineralización tuvo lugar solo después de 7 días.

Los resultados obtenidos claramente indican que los materiales híbridos discutidos con las partículas de SiO<2>-Ap-ALN en una concentración en el intervalo de 1-5 mg/ml se caracterizan por propiedades bioactivas que aseguran una aceleración significativa del proceso de biomineralización, es decir hasta 3 días, y por tanto por biointegración más eficaz del material con el hueso natural.

Estudios de las propiedades biológicas del material híbrido

Los materiales híbridos basados en hidrogel obtenidos también se sometieron a pruebas biológicas preliminaresin vitrocon el uso de células osteoblásticas MG-63. Se determinaron la proliferación, actividad de fosfatasa alcalina, morfología y adhesiones de células hechas crecer en la superficie de los materiales ensayados. Las pruebas biológicas realizadasin vitrodemostraron que la introducción de partículas de SiO<2>-Ap-ALN a las concentraciones ensayadas de C1, C2 y C3 en la matriz de hidrogel no deterioró la biocompatibilidad de los materiales híbridos comparado con el material control ColChHAmod. Los resultados de las pruebas de viabilidad celular (se usó la prueba de Alamar Blue) llevadas a cabo el 1er, 3er y 7° día de cultivo (Figura 10A) mostraron que todos los materiales híbridos obtenidos apoyaron la capacidad de proliferación de células MG-63. Se observó un aumento similar (sin diferencias estadísticamente significativas) en el número de células en los días consecutivos (1, 3, 7) del experimento realizado con el uso de materiales híbridos que contenían las partículas de SiO<2>-Ap-ALN en concentraciones C1 y C2, en comparación con los resultados para el material control (ColChHAmod).

La actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) como un marcador que confirma el fenotipo y la mineralización de osteoblastos el 3er y 7° día de cultivo también se ensayó (Figura 10B). Para todos los materiales analizados, se observó un aumento en la actividad después de 7 días de experimento. El nivel de ALP tanto el tercer como el séptimo día de cultivo era significativamente mayor comparado con la actividad de ALP de las células en la placa de cultivo. Cuando se analiza el efecto de la concentración de las partículas de SiO<2>-Ap-ALN en la actividad ALP, se observaron diferencias estadísticamente significativas solo para el material ColChHAmod C3 el 3er día del experimento (frente a ColChHAmod C1 el 3er día). El día 7 de cultivo, no se encontraron diferencias significativas en la actividad ALP entre los sistemas híbridos obtenidos.

La morfología y la adhesión de células MG-63 después de 3 días de cultivo en las superficies de los materiales también se analizaron. Las células se fijaron y visualizaron usando la técnica de MEB. La figura 11 resume las microfotografías de MEB que muestran la morfología de las células fijadas (Figura 11A), así como un gráfico de la distribución de superficie celular de MG-63 después de 3 días de crecimiento (estimado basado en las microfotografías de MEB obtenidas) (Figura 11B). Mientras se analiza las microfotografías obtenidas (Figura 11A), se puede concluir que las células se adhieren igualmente bien a la superficie de los materiales híbridos y a la superficie del hidrogel control (ColChHAmod). La distribución de superficie celular estimada (Figura 11B) muestra que las células hechas crecer en el material control ColChHAmod y en el sistema híbrido con la menor concentración de las partículas de SiO<2>-Ap-ALN (C3) ocupan un área de superficie comparable y tienen una morfología similar. La morfología de las células hechas crecer en los materiales híbridos con concentración de partículas C1 y C2 es más diversa. Se observó una población de células aplanadas, que ocupan un área mayor con formas elongadas. Por tanto, los datos demuestran que la presencia de partículas de SiO<2>-Ap-ALN tiene un efecto positivo en la adhesión celular.

Estudio de las propiedades terapéuticas

Con el fin de demostrar la capacidad de los materiales híbridos desarrollados para inhibir la resorción ósea, se llevaron a cabo estudios biológicos preliminaresin vitrousando una línea de osteoclastos modelo (células J774A.1). Esta línea constituye la línea de referencia usada en análisisin vitrode metabolismo de compuestos que pertenecen al grupo bisfosfonato.

Los resultados de las pruebas de viabilidad celular (se usó la prueba de Alamar Blue) realizadas después de 1, 3 y 7 días de crecimiento celular se muestran en la figura 12. Los estudios biológicos preliminares mostraron que la proliferación de las células osteoclásticas hechas crecer en materiales híbridos se inhibió después de 7 días del experimento. Se observó una tendencia a aumentar este efecto con el aumento en la concentración de partículas de SiÜ<2>-Ap-ALN presente en la matriz de hidrogel, y era más visible para el sistema ColChHAmod C1. Por tanto, se mostró que los materiales híbridos ensayados con el contenido propuesto de las partículas de SiÜ<2>-Ap-ALN (C1, C2 y C3) tienen un potencial terapéutico manifestado por el deterioro de la actividad de las células osteoclásticas modelo. Por tanto, considerando la forma de la formulación desarrollada y la posibilidad de su administración local por inyección directamente en el menor, será posible asegurar la acción local del fármaco, minimizando de esta manera los efectos secundarios sistémicos de la aplicación de alendronato. El material presentado en el ámbito de la aplicación previa no tenía propiedades terapéuticas.

Ejemplo 6. Evaluación biológicain vivo

Considerando las potenciales aplicaciones de los materiales desarrollados se realizó evaluación biológicain vivo.Basado en los resultados de la caracterización fisicoquímica, así como los estudios biológicosin vitro,el híbrido con la mayor concentración de SiÜ<2>-Ap-ALN (ColChHAmod C1) y el hidrogel ColChHAmod puro como un control se seleccionaron para investigación biológica adicional. Los experimentos en el modelo de ratón se realizaron para evaluar la biocompatibilidad de los sistemas seleccionados y examinar el potencial y seguridad de los materiales obtenidos en condicionesin vivo.La inyectabilidad, así como la capacidad de gelificarin vivose verificaron mientras el panel de análisis bioquímicos e histopatológicos permitían la determinación de la hemo-, hepato- y nefrotoxicidad de los sistemas desarrollados.

Inyectabilidad y degradaciónin vivode los materiales híbridos basados en hidrogel

En estudiosin vivo,los materiales ensayados se inyectaron por vía subcutánea (flanco derecho, área del hombro) en ratones C57Bl/6 sanos. Antes de la administración, todos los componentes se mezclaron, transfirieron a una jeringa, e incubaron durante 15 minutos a 37°C (para inducir la formación de gel). Después de la incubación, el color de los materiales ensayadas era de gris claro a azul verdoso; todos los materiales siguieron siendo líquidos; por tanto, no se encontraron problemas con su administración subcutánea. Además, no se observó pérdida de hidrogel inmediatamente después de la administración (a través del agujero creado cuando la aguja se retiró) de este modo, y la mezcla entera se inyectó. Por tanto, se confirmó que todos los materiales ensayados tenían inyectabilidad muy buena. Los ratones se sacrificaron el 1er, 7°, 30°, 60° día del experimento y tanto ColChHAmod como ColChHAmod C1 se visualizaron después de retirar la piel (Fig. 16A). El color de ambos materiales ensayados era azul. ColChHAmod era más blando, más hidratado, y tenía una estructura decididamente menos compacta que ColChHAmod C1. Se observó el progreso del cambio en volumen cuantitativamente a lo largo del tiempo solo para ColChHAmod C1. Una disminución rápida, significativa en el volumen de ColChHAmod C1 se reveló después de siete días (el volumen era 2,5 veces menor que este observado después de un día tras la inyección), indicando su biodegradación (Fig. 16B). Entre 7 y 30 días del experimento, el volumen de ColChHAmod C1 no cambio significativamente y, por último, al final del experimento que dura 60 días, el volumen era casi 60 veces menor que el observado después de un día tras la inyección (Fig. 16). Asimismo, ColChHAmod C1 ya no tenía consistencia de gel, y este material era duro, de color azul-verde claro, y se observaron vasos sanguíneos cerca de él. También se reveló la degradación postmortem significativa de ColChHAmod. El 60° día del experimento, el material ya no parecía un gel; sus restos/residuos eran visibles bajo la piel como fibras negras.

Bioseguridadin vivode los materiales ColChHAmod y ColChHAmod C1

El análisis de la biocompatibilidad sistémica se dirigía a excluir reacciones adversas provocadas por la administración subcutánea de los materiales y los productos de su degradación. Aunque los materiales se han inyectado por vía subcutánea, sus productos de degradación pueden producir toxicidad sistémica al entrar en el torrente sanguíneo. Los animales se sacrificaron a diferentes tiempos después de administrar los materiales (1 día, 7 días, 30 días, 60 días), lo que permitió investigar la potencial toxicidad aguda y crónica. No se observaron pérdida de peso o cambios preocupantes en el aspecto y comportamiento de los animales durante el experimento. Como se muestra en la figura 17 y la figura 18, no se observaron cambios en la morfología de la sangre o en la actividad o concentración de marcadores de hepatotoxicidad (ALT, T-Pro), nefrotoxicidad (BUN, Cre), o daño a otro tejido (ALP).

Por último, las concentraciones en suero de citoquinas, incluyendo citoquinas proinflamatorias, confirmaron la ausencia de inmunotoxicidad de hidrogeles administrados por vía subcutánea o productos de su degradación (Fig. 19). Estos resultados indican una falta de toxicidad sistémica que podría resultar de la administración a los aminales de hidrogel que contiene productos de degradación potencialmente tóxicos.

Por tanto, confirman que el uso de biomateriales cargados con SiÜ<2>-Ap-ALN puede ser un método prometedor de reparación de hueso osteoporótico sin el riesgo de toxicidad sistémica causada por el fármaco u otros productos de degradación de los materiales.

Cambios biológicos que se producen en los hidrogeles y su interacción con célulasin vivo

También se investigaron los cambios en los materiales ensayados (aislados con fragmentos de piel) en varios tiempos después de su administración. En primer lugar, se analizó el reclutamiento de las células huéspedes al material. Veinticuatro horas después de la administración subcutánea de ColChHAmod y ColChHAmod C1, se observó una afluencia de células inmunitarias (principalmente neutrófilos) responsables para desarrollar inflamación local (Fig. 20 y Fig. 21). Las células inmunitarias estaban presentes en los materiales en todos los puntos de tiempo. Sin embargo, cuanto más tiempo después de la administración de los biomateriales, más poblaciones de leucocitos se reclutaron. Por tanto, el 7° día después de la administración, también eran visibles macrófagos y linfocitos además de neutrófilos. La afluencia de células inmunitarias se produce a lo largo de todo el volumen del material; sin embargo, este fenómeno era mucho más intenso en la periferia de los materiales. Con ColChHAmod C1, se observó una inflamación más intensa. El resultado era la producción por fibroblastos de piel animal de una capa clara de colágeno (formación de cápsula fibrótica) alrededor del hidrogel con SiO<2>-Ap-ALN, visible el 30° y 60° día después de administrar el material. Este fenómeno era mucho menos severo con el hidrogel ColChHAmod. Para el material ColChHAmod, se observó inhibición de la respuesta proinflamatoria en el 60° día después de la administración. Además, se observaron vasos sanguíneos recién creados en secciones aisladas de materiales 60 días después de la administración. La presencia de vasos sanguíneos en los materiales también se confirmó por análisis de MEB (Fig. 16C).

En conjunto, no se reveló la respuesta proinflamatoria sistémica manifestada por citoquinas proinflamatorias elevadas en la sangre (como se demuestra en la figura 21). Por tanto, nuestros resultados indican que solo se puede inducir inflamación local después de administrar los materiales ensayados.

Basado en la investigación realizada, se pueden indicar las siguientes ventajas inesperadas del material híbrido obtenido:

• potencial terapéutico - se realizaron pruebas biológicasin vitropreliminares usando la línea celular de osteoclastos (células J774A.1), y demostraron que los materiales híbridos con la composición y contenido de alendronato propuestos tienen potencial terapéutico manifestado por el deterioro de la actividad de las células osteoclásticas modelo,

• mejora de la bioactividad - se observó la biomineralización acelerada del material de hidrogel. El análisis detallado de los resultados (MEB/EDS) permitió manifestar que en caso de mayores contenidos de SiO<2>-Ap-ALN (C1, C2), después de 3 días de incubación del material en fluido corporal simulado (SBF), se forma una nueva fase mineral, asegurando la biointegración más rápida del material con el hueso natural,

• inyectabilidad de los materiales híbridos caracterizada por propiedades mecánicas muy buenas. Por tanto, considerando la forma de la formulación desarrollada y la posibilidad de su administración local por inyección en la pérdida, será posible asegurar la acción local de alendronato, minimizando de esta manera sus efectos secundarios sistémicos relacionados con la administración oral o intravenosa,

• biocompatibilidad - las pruebas biológicasin vitrorealizadas han mostrado que la presencia de las partículas de SiO<2>-Ap-ALN no reduce la compatibilidad de los materiales híbridos (comparado con el material control KolChHAmod), así como su capacidad para apoyar adhesión, proliferación y también para mantener el fenotipo de células osteoblásticas (MG-63),

• la seguridad de los materiales desarrollados en condicionesin vivo.Los resultados de los experimentosin vivoindicaron una falta de toxicidad sistémica de los sistemas desarrollados y por tanto demostraron que el uso del híbrido con SiO<2>-Ap-ALN puede ser un método prometedor para la reparación de hueso osteoporótico,

• falta de respuesta proinflamatoria sistémica - solo se observó inflamación local,

• los materiales indujeron la angiogénesis - se observaron nuevos vasos sanguíneos en el material híbrido después de 60 días de experimentoin vivo,

•se confirmó la inyectabilidad de los materiales y su capacidad para gelificarin vivo.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un material híbrido de hidrogel multifuncional, en donde contiene:

a) una matriz de biopolímero que contiene: colágeno, quitosano, ácido hialurónico modificado con lisina en una proporción en peso de 5:2:3, respectivamente,

b) las partículas de sílice-apatita funcionalizadas con grupos amino,

c) la sustancia activa en forma de alendronato unido a las partículas de sílice-apatita,

d) una sustancia entrecruzadora,

en donde la sustancia entrecruzadora es genipina.

2. Un método de producir el material híbrido de hidrogel multifuncional en donde comprende las siguientes etapas:

a) las partículas de sílice se funcionalizan con grupos amino,

b) las partículas obtenidas en la etapa a) se suspenden en una solución de SBF acuosa, preferiblemente a una concentración de 1,5 M, para obtener, después de 10 días de incubación, las partículas de sílice recubiertas con la fase mineral,

c) el alendronato de sodio se une a las partículas obtenidas en la etapa b),

d) una solución de colágeno, quitosano y ácido hialurónico modificado con lisina en una proporción en peso de 5:2:3, respectivamente, se añade a la suspensión acuosa de las partículas de la etapa c), e) la mezcla obtenida en la etapa d) se somete a una reacción de entrecruzamiento con genipina.

3. El método según la reivindicación 2, en donde se lleva a cabo por el método de sol-gel.

4. El material híbrido de hidrogel multifuncional como se define en la reivindicación 1 u obtenido por un método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, para uso en el tratamiento o la profilaxis de pérdidas óseas.

5. El material híbrido para uso según la reivindicación 4, en donde las pérdidas óseas son debidas a osteoporosis.