ES2996461T3 - Plants producing 2n gametes or apomeiotic gametes - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a plantas en las que la proteína OSD1, implicada en la transición de la meiosis I a la meiosis II, está inactiva. Estas plantas producen gametos de restitución de segunda división (SDR) 2n. La invención se refiere además a plantas en las que la inactivación de OSD1 se combina con la inactivación de un gen implicado en la recombinación meiótica en plantas, y de un gen implicado en la orientación monopolar de los cinetocoros durante la meiosis. Estas plantas producen gametos apomeióticos. Estas plantas son útiles en el fitomejoramiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Plantas productoras de gametos 2n o gametos apomeióticos

La presente invención se refiere a plantas que producen gametos de Restitución de Segunda División (SDR,Second División Restitution)2n, y a plantas que producen gametos apomeióticos, y a su utilización en el fitomejoramiento.

Los gametos 2n (también conocidos como diplogametos) son gametos que tienen el número de cromosomas somáticos en lugar del número de cromosomas gametofíticos. Se ha demostrado que son útiles para la mejora genética de varios cultivos (para una revisión, véase, por ejemplo, RAMANNA y JACOBSEN, Euphytica 133, 3-18, 2003). En particular, la producción de diplogametos permite realizar cruces entre plantas de diferente nivel de ploidía, por ejemplo, cruces entre plantas de cultivo tetraploides y sus parientes silvestres diploides, con el fin de utilizar su diversidad genética en programas de fitomejoramiento.

La formación de gametos 2n es resultado de anomalías durante la meiosis (para una revisión, véase, VEILLEUX, Plant Breeding Reviews 3, 252-288, 1985, o BRETAGNOlLe y THOMPSON, New Phytologist 129, 1-22, 1995).

En la meiosis normal, los cromosomas primero se duplican, dando como resultado pares de cromátidas hermanas. Esta ronda de replicación es seguida por dos rondas de división, conocidas como meiosis I y meiosis II. Durante la meiosis I, los cromosomas homólogos se recombinan y se separan en dos células, comprendiendo cada una de las cuales un contenido haploide completo de cromosomas. En la meiosis II, las dos células resultantes de la meiosis I se dividen adicionalmente, y las cromátidas hermanas se segregan. Las esporas resultantes de esta división son, por lo tanto, haploides y contienen información genética recombinada.

Entre las anomalías que conducen a la formación de gametos 2n se incluyen, en particular, la citocinesis anormal, la omisión de la primera o segunda división meiótica o la geometría anormal del huso (para una revisión, véase, VEILLEUX, Plant Breeding Reviews 3, 252-288, 1985, o BRETAGNOLLE y THOMPSON, New Phytologist 129, 1-22, 1995). Estas anomalías dan lugar a diferentes clases de gametos no reducidos. Por ejemplo, el fracaso de la primera división meiótica da lugar a gametos de Restitución de Primera División (FDR,First División Restitution),mientras que el fracaso de la segunda división meiótica da lugar a gametos de restitución de segunda división (SDR).

Aunque se han descrito numerosos mutantes capaces de producir gametos 2n en diversas especies de plantas, hasta ahora se ha identificado y caracterizado a nivel molecular sólo un gen implicado en la formación de polen 2n. La inactivación de este gen, denominadoAtPSI(porArabidopsis thaliana parallel spindles),genera esporas masculinas diploides, dando lugar a granos de polen diploides viables y a plantas triploides espontáneas en la progenie. Este gen y su utilización para producir polen 2n se dan a conocer en la Patente EP08490672, presentada el 8 de julio de 2008, y en la publicación de D'ERFURTH et al (PLoS Genet. Noviembre de 2008; 4(11 ):e1000274. Publicación electrónica de 28 de noviembre de 2008).

Los inventores han identificado ahora en la planta modeloArabidopsis thaliana,otro gen implicado en la formación de gametos 2n en plantas. Los inventores han descubierto que la inactivación de este gen da como resultado la omisión de la segunda división meiótica. Esto genera esporas masculinas y femeninas diploides, dando lugar a gametos masculinos y femeninos diploides viables, que son gametos SDR. Este gen se designará en lo sucesivoOSD1,por omisión de la segunda división. La secuencia del genOSD1deArabidopsis thalianaestá disponible en la base de datos TAIR con el número de acceso At3g57860 o en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_115648. Este gen codifica una proteína de 243 aminoácidos (GenBank NP_191345), cuya secuencia también está representada en el listado de secuencias adjunto como SEQ ID NO: 1.

El genOSD1deArabidopsis thalianaha sido descrito previamente como gen“UVI4-Uke" (UVI4-L),en una publicación de HASE et al. (Plant J, 46, 317-26, 2006)), que describe su parálogo, denominadoUVI4.Según HASE et al.,UVI4actúa como un supresor de la endorreduplicación y es necesario para mantener el estado mitótico, mientras queOSD1 (UVI4-L)no parece ser necesario para este proceso. Por el contrario, tal como se muestra en el presente documento,OSD1parece necesario para permitir la transición de la meiosis I a la meiosis II.

Los inventores también han identificado en arroz(Oryza sativa)un ortólogo del genOSD1 de Arabidopsis thaliana.La secuencia del genOSD1 de Oryza sativaestá disponible en las bases de datos OryGenes o TAIR con el número de acceso Os02g37850. Codifica una proteína de 234 aminoácidos, cuya secuencia está representada en el listado de secuencias adjunto como SEQ ID NO: 35. Las proteínas OSD1 deArabidopsis thalianayOryza sativatienen el 23,6 % de identidad y el 35 % de similitud sobre la longitud total de sus secuencias.

La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones 1 a 10.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener una planta productora de gametos de Restitución de Segunda División 2n, en el que dicho procedimiento comprende la inhibición en dicha planta de una proteína designada en lo sucesivo proteína OSD1, en el que dicha proteína OSD1 a. tiene, como mínimo, el 35 % de identidad de secuencia utilizando el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch o, como mínimo, el 50 % de similitud de secuencia utilizando la matriz de puntuación BLOSUM62 con la proteína AtOSD1 de la SEQ ID NO: 1 o con la proteína OsOSD1 de la SEQ ID NO: 35, y

b. permite la transición de la meiosis I a la meiosis II,

en el que la inhibición de la proteína OSD1 se obtiene mediante mutagénesis del genOSD1o de su promotor, y se seleccionan los mutantes que han perdido parcial o totalmente la actividad de la proteína OSD1, y en el que la mutagénesis se realiza mediante deleción dirigida de la secuencia codificante o del promotor del gen que codifica dicha proteína o de una parte del mismo, o mediante inserción dirigida de una secuencia exógena dentro de dicha secuencia codificante o de dicho promotor, o mediante inducción de mutaciones aleatorias o mutagénesis insercional aleatoria, seguida de un cribado de los mutantes dentro del gen deseado. A menos que se especifique lo contrario, los valores de identidad y similitud de secuencia de proteína dados a conocer en el presente documento se calculan sobre la longitud total de las secuencias, utilizando el programa BLASTP con parámetros predeterminados, o el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch (herramienta Needle de alineamiento por pares EMBOSS con parámetros predeterminados). Los cálculos de similitud se realizan utilizando la matriz de puntuación BLOSUM62.

Los gametos SDR 2n producidos, según la presente invención, son útiles en todas las aplicaciones habituales de los gametos 2n, por ejemplo, para producir plantas poliploides, o para permitir cruces entre plantas de diferente nivel de ploidía. También pueden ser útiles en procedimientos de mapeo genético, por ejemplo el procedimiento de “Mapeo de progenie inverso” dado a conocer en la Patente US20080057583.

Los inventores han descubierto, además, que combinando la inactivación deOSD1,con la inactivación de otros dos genes, uno(SPO11-1)que codifica una proteína necesaria para una recombinación meiótica eficiente en plantas, y cuya inhibición elimina la recombinación y el apareamiento (GRELON et al., Embo J, 20, 589-600, 2001), y otro(REC8,At2g47980) que codifica una proteína necesaria para la orientación monopolar de los cinetocoros durante la meiosis (CHELYSHEVA et al., J Cell Sci, 118, 4621-32, 2005), y cuya inhibición modifica la segregación de cromátidas, dio como resultado un genotipo en el que la meiosis es totalmente sustituida por mitosis sin afectar a los procesos sexuales posteriores. Este genotipo se denominará en lo sucesivoMiMepor “mitosis en lugar de meiosis”. Esta sustitución de la meiosis por la mitosis da como resultado gametos apomeióticos, que conservan toda la información genética del progenitor (BICKNELL y KOLTUNOW, Plant Cell, 16 Supl., S228-45, 2004).

La figura 1 da a conocer una comparación esquemática entre los mecanismos de la mitosis, la meiosis normal, la meiosis en el mutanteosd1,la meiosis en un mutante que carece de actividad SPO11-1(Atspo11-1),la meiosis en un mutante doble que carece de actividad SPO11-1 y REC8(Atspo11-1/Atrec8)y la meiosis en el mutanteMiMe.

Durante la mitosis en células diploides, los cromosomas se replican y las cromátidas hermanas se segregan para generar células hijas que son diploides y genéticamente idénticas a la célula inicial. Durante la meiosis normal, dos rondas de segregación cromosómica siguen a una única ronda de replicación. En la primera división, los cromosomas homólogos se recombinan y se separan. La meiosis II es más similar a la mitosis, lo que da como resultado una distribución igualitaria de las cromátidas hermanas. Las esporas obtenidas son, por lo tanto, haploides y contienen información genética recombinada. En el mutanteosd1(este estudio), se omite la meiosis II, lo que da lugar a esporas diploides y gametos SDR con información genética recombinada.

El mutanteAtspo11-1experimenta una primera división desequilibrada seguida de una segunda división que conduce a esporas desequilibradas y esterilidad.

El mutante dobleAtspo11-1/Atrec8experimenta una división similar a la mitótica en lugar de una primera división meiótica normal, seguida de una segunda división desequilibrada que conduce a esporas desequilibradas y esterilidad.

En el mutante tripleosd1/Atspo11-1/Atrec8 (MiMe),la presencia de las mutacionesAtspo11-1yAtrec8conduce a una primera división meiótica similar a la mitótica y la presencia de la mutaciónosd1impide que se produzca la segunda división meiótica. De este modo, la meiosis se sustituye por una división similar a la mitótica. Las esporas y gametos obtenidos son genéticamente idénticos a la célula inicial.

Los gametos apomeióticos producidos por el mutanteMiMepueden utilizarse, de la misma forma que los gametos SDR 2n, para producir plantas poliploides o para cruzar plantas de diferente nivel de ploidía. También son de interés para la producción de plantas apomícticas, es decir, plantas que son capaces de formar semillas a partir de los tejidos maternos del óvulo, lo que da como resultado una progenie que son clones genéticos del progenitor materno. Aunque existe en más de 400 especies de angiospermas, muy pocas especies de cultivo son apomícticas y los intentos de introducir este rasgo mediante cruzamiento han fracasado (SAVIDAN, The Flowering of Apomixis: From Mechanisms to Genetic Engineering 2001; SPILLANE et al., Sexual Plant Reproduction, 14, 2001).

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener una planta productora de gametos apomeióticos, en el que dicho procedimiento comprende la inhibición en dicha planta de las siguientes proteínas:

a) la proteína OSD1, tal como se ha definido anteriormente;

b) una proteína implicada en la iniciación de la recombinación meiótica en plantas, siendo dicha proteína seleccionada entre:

i) una proteína designada en lo sucesivo proteína SPO11-1, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 55 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 70 % de similitud de secuencia con la proteína SPO11-1 de la SEQ ID NO: 2;

ii) una proteína designada en lo sucesivo proteína SPO11-2, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 60 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 75 % de similitud de secuencia con la proteína SPO11-2 de la SEQ ID NO: 3;

iii) una proteína designada en lo sucesivo proteína PRD1, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 25 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 40 % de similitud de secuencia con la proteína PRD1 de la SEQ ID NO: 4;

iv) una proteína designada en lo sucesivo proteína PAIR1, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 30 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 40 % de similitud de secuencia con la proteína PAIR1 de la SEQ ID NO: 5;

c) una proteína designada en lo sucesivo proteína Rec8, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 40 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 50 % de similitud de secuencia con la proteína Rec8 de la SEQ ID NO: 6,

en el que en este procedimiento, el porcentaje de identidad se calcula utilizando el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch y el porcentaje de similitud se calcula utilizando la matriz de puntuación BLOSUM62, y en el que,

- la inhibición de dichas proteínas se obtiene mediante mutagénesis del gen que codifica dicha proteína o de su promotor, y se seleccionan los mutantes que han perdido parcial o totalmente la actividad de dicha proteína, y en el que la mutagénesis se realiza mediante deleción dirigida de la secuencia codificante o del promotor del gen que codifica dicha proteína o de una parte del mismo, o mediante inserción dirigida de una secuencia exógena dentro de dicha secuencia codificante o de dicho promotor, o mediante inducción de mutaciones aleatorias o mutagénesis insercional aleatoria, seguida de un cribado de los mutantes dentro del gen deseado, o

- la inhibición de dichas proteínas se obtiene mediante la expresión en dicha planta de un ARN silenciador dirigido al gen que codifica dicha proteína.

La SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de la proteína SPO11-1 deArabidopsis thaliana.Esta secuencia también está disponible en la base de datos Swissprot con el número de acceso Q9M4A2.

La SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de la proteína SPO11-2 deArabidopsis thaliana.Esta secuencia también está disponible en la base de datos SwissProt con el número de acceso Q9M4A1.

La SEQ ID NO: 4 representa la secuencia de la proteína PRD1 deArabidopsis thaliana.Esta secuencia también está disponible en la base de datos GenBank con el número de acceso ABQ12642.

La SEQ ID NO: 5 representa la secuencia de la proteína PAIR1 deArabidopsis thaliana.Esta secuencia también está disponible en la base de datos GenBank con el número de acceso NP_171675.

La SEQ ID NO: 6 representa la secuencia de la proteína Rec8 deArabidopsis thaliana.Esta secuencia también está disponible en la base de datos GenBank con el número de acceso NP_196168.

Las proteínas SPO11-1, SPO11-2, PRD1, PAIR1 y Rec8 se conservan en plantas superiores, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. A modo de ejemplos no limitativos de ortólogos de las proteínas SPO11-1, SPO11-2, PRD1, PAIR1 y Rec8 deArabidopsis thalianaen plantas monocotiledóneas, se pueden citar las proteínas SPO11-1, SPO11-2, PRD1, PAIR1 y Rec8de Oryza sativa.La secuencia de la proteína SPO11-1 deOryza sativaestá disponible en GenBank con el número de acceso AAP68363; la secuencia de la proteína SPO11-2 deOryza sativaestá disponible en GenBank con el número de acceso NP_001061027; la secuencia de la proteína PRD1 deOryza sativaestá disponible en GenBank con el número de acceso EAZ30311; la secuencia de la proteína PAIR1 deOryza sativaestá disponible en SwissProt con el número de acceso Q75RY2; la secuencia de la proteína Rec8 deOryza sativaestá disponible en GenBank con el número de acceso AAQ75095.

La inhibición de las proteínas OSD1, SPO11-1, SPO11-2, PRD1, PAIR1 o Rec8 mencionadas anteriormente se puede obtener ya sea eliminando, bloqueando o disminuyendo su función o, de manera ventajosa, previniendo o regulando negativamente la expresión de los genes correspondientes.

A modo de ejemplo, la inhibición de dicha proteína se puede obtener mediante la mutagénesis del gen correspondiente o de su promotor, y la selección de los mutantes que han perdido parcial o totalmente la actividad de dicha proteína. Por ejemplo, una mutación dentro de la secuencia codificante puede inducir, dependiendo de la naturaleza de la mutación, la expresión de una proteína inactiva, o de una proteína con una actividad alterada; de la misma manera, una mutación dentro de la secuencia promotora puede inducir una falta de expresión de dicha proteína o una disminución de la misma.

La mutagénesis se puede realizar, por ejemplo, mediante la deleción dirigida de la secuencia codificante o del promotor del gen que codifica dicha proteína o de una parte del mismo, o mediante la inserción dirigida de una secuencia exógena dentro de dicha secuencia codificante o dicho promotor. También se puede realizar mediante la inducción de mutaciones aleatorias, por ejemplo, mediante mutagénesis EMS o mutagénesis insercional aleatoria, seguida del cribado de los mutantes dentro del gen deseado. En la técnica se encuentran disponibles procedimientos para la mutagénesis y el cribado de alto rendimiento. A modo de ejemplo, se puede mencionar TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes, descrito por McCallum et al., 2000).

Entre las mutaciones dentro del genOSD1,las que dan lugar a la capacidad de producir gametos SDR 2n pueden identificarse sobre la base de las características fenotípicas de las plantas que son homocigóticas para esta mutación: estas plantas pueden formar, como mínimo, el 5 %, de manera preferente, como mínimo, el 10 %, de manera más preferente, como mínimo, el 20 %, de manera aún más preferente, como mínimo, el 50 %, y hasta el 100 % de díadas como producto de la meiosis.

Entre las mutaciones dentro de un gen que codifica una proteína implicada en la iniciación de la recombinación meiótica en plantas, tales como el genSPO11-1o el genSPO11-2, PRD1oPAIR1,aquellas útiles para obtener una planta productora de gametos apomeióticos pueden identificarse sobre la base de las características fenotípicas de las plantas que son homocigóticas para esta mutación, en particular la presencia de univalentes en lugar de bivalentes en la meiosis I, y la esterilidad de la planta.

Entre los mutantes que tienen una mutación dentro del genREC8,aquellos útiles para obtener una planta productora de gametos apomeióticos se pueden identificar sobre la base de las características fenotípicas de las plantas que son homocigóticas para esta mutación, en particular la fragmentación cromosómica en la meiosis y la esterilidad de la planta.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener una planta productora de gametos de Restitución de Segunda División 2n, en el que dicho procedimiento comprende la inhibición de la proteína OSD1, en el que dicha proteína OSD1 es tal como se ha definido anteriormente y en el que la inhibición de dicha proteína OSD1 se obtiene mediante la expresión en dicha planta de un ARN silenciador dirigido al gen que codifica dicha proteína.

Los procedimientos para silenciar genes en plantas son conocidos en sí mismos en la técnica. Por ejemplo, se puede mencionar la inhibición antisentido o la cosupresión, tal como se describen, a modo de ejemplo, en las Patentes US5,190,065 y US5,283,323. También es posible utilizar ribozimas dirigidas al ARNm de dicha proteína.

Los procedimientos preferentes son aquellos en los que el silenciamiento génico se induce por medio de ARN de interferencia (ARNi), utilizando un ARN silenciador que se dirige al gen que se va a silenciar. En la técnica se encuentran disponibles diversos procedimientos y construcciones de ADN para el suministro de ARN silenciadores.

Un “ARN silenciador” se define en el presente documento como un ARN pequeño que puede silenciar un gen diana de una manera específica de secuencia mediante el apareamiento de bases con moléculas de ARNm complementarias. Los ARN silenciadores incluyen, en particular, ARN de interferencia pequeños (ARNip) y microARN (miARN).

Inicialmente, las construcciones de ADN para suministrar un ARN silenciador en una planta incluían un fragmento de 300 pb o más (en general, 300-800 pb, aunque secuencias más cortas pueden inducir a veces un silenciamiento eficaz) del ADNc del gen diana, bajo el control transcripcional de un promotor activo en dicha planta. Actualmente, las construcciones de ARN silenciador más ampliamente utilizadas son aquellas que pueden producir transcripciones de ARN de horquilla (ARNh). En estas construcciones, el fragmento del gen diana se repite de forma inversa, con, generalmente, una región espaciadora entre las repeticiones (para una revisión, véase WATSONet al.,2005). También se pueden utilizar microARN artificiales (miARNa) dirigidos contra el gen que se va a silenciar (para una revisión sobre el diseño y las aplicaciones de los ARN silenciadores, que incluyen, en particular, los miARNa, en plantas, véase, por ejemplo, OSSOWSKI et al., (Plant J., 53, 674-90, 2008).

La presente invención da a conocer herramientas para silenciar uno o más genes diana seleccionados entreOSD1, SPO11-1, SPO11-2, PRD1, PAIR1yREC8,incluyendo, en particular, casetes de expresión para ARNhp o miARNa dirigidos a dicho o dichos genes.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un casete de expresión que comprende:

- un promotor funcional en una célula vegetal;

- como mínimo, una construcción de ADN seleccionada entre:

a) una o más construcciones de ADN de 200 a 1.000 pb, comprendiendo cada una de las cuales un fragmento de un ADNc del genOSD1y puede comprender, además, un fragmento de un ADNc de un gen diana seleccionado entreSPO11-1, SPO11-2, PRD1, PAIR1yREC8,o de sus complementarios, o que tiene, como mínimo, el 95 % de identidad con dicho fragmento, estando dicha secuencia o secuencias de ADN colocadas bajo el control transcripcional de dicho promotor;

b) una o más construcciones de ADN en horquilla capaces, cuando se transcriben, de formar un ARN en horquilla dirigido, como mínimo, al genOSD1y de poder formar, además, un ARN en horquilla dirigido a un gen seleccionado entreSPO11-1, SPO11-2, PRD1, PAIR1yREC8;

c) una o más construcciones de ADN capaces, cuando se transcriben, de formar un miARNa dirigido al genOSD1y de poder formar, además, un miARNa dirigido a un gen seleccionado entreSPO11-1, SPO11-2, PRD1, PAIR1yREC8;

estando dicha construcción o construcciones de ADN colocadas bajo el control transcripcional de dicho promotor.

En general, dicha construcción de ADN en horquilla comprende: i) una primera secuencia de ADN de 200 a 1.000 pb, de manera preferente, de 300 a 900 pb, que consiste en un fragmento de un ADNc del gen diana, o que tiene, como mínimo, el 95 % de identidad, y por orden de preferencia creciente, como mínimo, el 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con dicho fragmento; ii) una segunda secuencia de ADN que es la complementaria de dicho primer ADN, estando dichas primera y segunda secuencias en orientaciones opuestas y ii) una secuencia espaciadora que separa dichas primera y segunda secuencias, de modo que estas primera y segunda secuencias de ADN son capaces, cuando se transcriben, de formar una única molécula de ARN bicatenario. El espaciador puede ser un fragmento aleatorio de ADN. Sin embargo, de manera preferente, se utilizará un intrón que sea empalmable por la célula vegetal diana. Su tamaño es, en general, de 400 a 2.000 nucleótidos de longitud.

En una realización, la presente invención se refiere a un casete de expresión, tal como se ha definido anteriormente, que comprende una construcción de ADN dirigida al genOSD1.

En una realización, la presente invención se refiere a un casete de expresión, tal como se ha definido anteriormente, que comprende: una construcción de ADN dirigida al genOSD1,una construcción de ADN dirigida a un gen seleccionado entreSPO11-1, SPO11-2, PRD1yPAIR1,y una construcción de ADN dirigida aREC8.

En la técnica se encuentra disponible una amplia variedad de promotores adecuados para la expresión de genes heterólogos en plantas.

Pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de plantas, virus vegetales o bacterias, tales comoAgrobacterium.Incluyen promotores constitutivos, es decir, promotores que son activos en la mayoría de los tejidos y células y en la mayoría de las condiciones ambientales, así como promotores específicos de tejido o específicos de célula que son activos solo o principalmente en determinados tejidos o determinados tipos de células, y promotores inducibles que se activan por estímulos físicos o químicos, tales como los que resultan de la infección por nematodos.

Ejemplos no limitativos de promotores constitutivos que se utilizan habitualmente en células vegetales son el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor Nos, el promotor de rubisco y el promotor del virus del mosaico de la vena de la yuca (CsVMV).

Entre los promotores específicos de órganos o tejidos que se pueden utilizar en la presente invención se incluyen, en particular, promotores capaces de conferir expresión asociada a la meiosis, tales como el promotorDMC1(KLI<m>YU<k>y JONES, Plant J, 11, 1-14, 1997); también se puede utilizar cualquiera de los promotores endógenos de los genesOSD1, SPO11-1, SPO11-2, PRD1, PAIR1oREC8.

Las construcciones de ADN de la presente invención, en general, también incluyen un terminador transcripcional (por ejemplo, el terminador transcripcional 35S o el terminador transcripcional de la nopalina sintasa (Nos)).

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector recombinante que comprende un casete de expresión, tal como se ha definido anteriormente. Clásicamente, dichos vectores recombinantes también incluyen uno o más genes marcadores, que permiten la selección de hospedadores transformados.

La selección de vectores adecuados y los procedimientos para insertar construcciones de ADN en los mismos son bien conocidos por el experto en la materia. La elección del vector depende del hospedador previsto y del procedimiento de transformación previsto de dicho hospedador. En la técnica se encuentran disponibles diversos procedimientos para la transformación genética de células vegetales o plantas para muchas especies vegetales, dicotiledóneas o monocotiledóneas. A modo de ejemplos no limitativos, se pueden mencionar la transformación mediada por virus, la transformación por microinyección, por electroporación, la transformación mediada por microproyectiles, la transformación mediada porAgrobacteriumy similares.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una planta productora de gametos de Restitución de Segunda División 2n,

en la que está inhibida una proteína, en lo sucesivo denominada proteína OSD1, teniendo dicha proteína OSD1, como mínimo, el 35 % de identidad de secuencia o, como mínimo, el 50 % de similitud de secuencia con la proteína AtOSD1 de la SEQ ID NO: 1 o con la proteína OsOSD1 de la SEQ ID NO: 35, en la que el porcentaje de identidad se calcula utilizando el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch y el porcentaje de similitud se calcula utilizando la matriz de puntuación BLOSUM62, en la que:

el gen que codifica la proteína o su promotor está mutado y el mutante obtenido ha perdido parcial o totalmente la actividad de la proteína, o

un ARN silenciador dirigido al gen que codifica la proteína está expresado en dicha planta.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una planta productora de gametos apomeióticos, en la que están inhibidas las siguientes proteínas:

a) una proteína designada en lo sucesivo proteína OSD1, teniendo dicha proteína OSD1, como mínimo, el 35 % de identidad de secuencia o, como mínimo, el 50 % de similitud de secuencia con la proteína AtOSD1 de la SEQ ID NO: 1 o con la proteína OsOSD1 de la SEQ ID NO: 35,

b) una proteína implicada en la iniciación de la recombinación meiótica en plantas, siendo dicha proteína seleccionada entre:

i) una proteína designada en lo sucesivo proteína SPO11-1, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 55 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 70 % de similitud de secuencia con la proteína SPO11-1 de la SEQ ID NO: 2;

ii) una proteína designada en lo sucesivo proteína SPO11-2, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 60 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 75 % de similitud de secuencia con la proteína SPO11-2 de la SEQ ID NO: 3;

iii) una proteína designada en lo sucesivo proteína PRD1, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 25 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 40 % de similitud de secuencia con la proteína PRD1 de la SEQ ID NO: 4;

iv) una proteína designada en lo sucesivo proteína PAIR1, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 30 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 40 % de similitud de secuencia con la proteína PAIR1 de la SEQ ID NO: 5;

c) una proteína designada en lo sucesivo proteína Rec8, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 40 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 50 % de similitud de secuencia con la proteína Rec8 de la SEQ ID NO: 6,

en la que el porcentaje de identidad se calcula utilizando el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch y el porcentaje de similitud se calcula utilizando la matriz de puntuación BLOSUM62, en la que:

el gen que codifica la proteína o su promotor está mutado, y el mutante obtenido ha perdido parcial o totalmente la actividad de la proteína, o

un ARN silenciador dirigido al gen que codifica la proteína está expresado en dicha planta.

En una realización, la presente invención se refiere a una planta, tal como se ha definido anteriormente, que es una planta transgénica que contiene un transgén que comprende un casete de expresión, tal como se ha definido anteriormente, que comprende: una construcción de ADN dirigida al genOSD1,una construcción de ADN dirigida a un gen seleccionado entreSPO11-1, SPO11-2, PRD1yPAIR1,y una construcción de ADN dirigidaa REC8.

Esto también incluye plantas transformadas genéticamente por una o más construcciones de ADN de la presente invención. De manera preferente, dichas plantas son plantas transgénicas, en las que dicha construcción está contenida en un transgén integrado en el genoma de la planta, de modo que se transmite a generaciones sucesivas de plantas.

La expresión de una construcción de ADN quimérica dirigida al genOSD1,que da como resultado una regulación negativa de la proteína OSD1, proporciona a dicha planta transgénica la capacidad de producir gametos SDR 2n. La coexpresión de una construcción de ADN quimérica dirigida al genOSD1,una construcción de ADN quimérica dirigida a un gen seleccionado entreSPO11-1, SPO11-2, PRD1yPAIR1,y una construcción de<a>D<n>quimérica dirigida al genREC8,da como resultado una regulación negativa de las proteínas codificadas por estos tres genes y proporciona a dicha planta transgénica la capacidad de producir gametos apomeióticos.

La presente invención también abarca un procedimiento para producir gametos SDR 2n, en el que dicho procedimiento comprende cultivar una planta de la presente invención y recuperar los gametos producidos por dicha planta. De manera preferente, dichos gametos comprenden, como mínimo, el 10 %, de manera más preferente, como mínimo, el 20 %, y por orden de preferencia creciente, como mínimo, el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de gametos 2n viables.

La presente invención también abarca un procedimiento para producir gametos apomeióticos, en el que dicho procedimiento comprende cultivar una planta de la presente invención y recuperar los gametos producidos por dicha planta. De manera preferente, dichos gametos comprenden, como mínimo, el 10 %, de manera más preferente, como mínimo, el 20 %, y por orden de preferencia creciente, como mínimo, el 30 %, 40 %, 50 % o 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de gametos apomeióticos viables.

La presente invención se aplica a una amplia gama de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas de interés agronómico. A modo de ejemplos no limitativos, se pueden mencionar la patata, el arroz, el trigo, el maíz, el tomate, el pepino, la alfalfa, la caña de azúcar, la batata, la mandioca, el trébol, la soja, el raigrás, el plátano, el melón, la sandía, el algodón o plantas ornamentales, tales como las rosas, los lirios, los tulipanes y los narcisos.

Los objetivos y ventajas anteriores y otros de la presente invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos. Sin embargo, debe entenderse que esta descripción detallada anterior es solo a modo de ejemplo y no limita la presente invención.

EJEMPLOS:

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Material vegetal y condiciones de crecimiento.

Las plantas deArabidopsisse cultivaron, tal como se ha descrito en VIGNARD et al., (PLoS Genet, 3, 1894-906, 2007). Para los ensayos de germinación y los experimentos de citometría, se cultivaronArabidopsis in vitroen medioArabidopsis(ESTELLE y SOMErV iLLE, Mol. Gen. Genet., 206, 200-06, 1987) a 21 °C con un fotoperiodo de 16 horas de día/8 horas de noche y una higrometría del 70 %.

Análisis genético.

Las plantas se genotiparon mediante PCR (30 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 56 °C y 1 minuto a 72 °C) utilizando dos pares de cebadores. Para cada genotipo, el par de cebadores se muestra en la tabla I y el par de cebadores específico para la inserción se muestra en la tabla II.

Tabla

Tabla

Los marcadores genéticos utilizados para genotipar la población F1osd1-1(No-0)/osd1-2(Ler) x Col-0 y la población F1 del triple mutante osd1-1(No-O)/spo11-1(Col-0)/rec8 (Col-0) x Ler se enumeran en la tabla III. Las condiciones de PCR fueron 40 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a Tf y 30 segundos a 72 °C.

Estos marcadores se amplificaron (40 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 58 °C y 30 segundos a 72 °C) con los cebadores indicados y se observaron después de la migración en gel de agarosa al 3 %.

Se observó CAPS K4 10355 después de la doble digestión con Eco47III/HpaII. Los dos pares de cebadores específicos para los bordes de inserción deosd1-1yosd1-2se utilizaron como marcador en el cromosoma 3.

Citología y Citometría de Flujo:

Los productos meióticos finales se observaron, tal como se ha descrito en AZUMI et al., (Embo J, 21, 3081-95, 2002) y se observaron con un microscopio óptico convencional con un objetivo seco de 40X. Las propagaciones y observaciones de cromosomas se llevaron a cabo utilizando la técnica descrita en MERCIER et al., (Biochimie, 83, 1023-28, 2001). La fluorescencia del ADN de los núcleos de polen espermático se cuantificó utilizando el software Open LAB 4.0.4. Para cada núcleo se calculó el ruido circundante y se restó de la fluorescencia global del núcleo. Los husos meióticos se observaron según el protocolo descrito en MERCIER et al., (Genes Dev, 15, 1859-71, 2001), excepto que el ADN se contratiñó con DAPI. Las observaciones se realizaron utilizando un microscopio confocal Leica SP2. Las imágenes se adquirieron con un objetivo de agua de 63X en xyz y se realizaron reconstrucciones 3D utilizando el software de Leica. Se muestran las proyecciones. Se obtuvieron imágenes de las células a una excitación de 488 nm y 405 nm con AlexaFluor488 y DAPI, respectivamente. Los tamaños del genoma deArabidopsisse midieron, tal como se ha descrito en MARIE y BROWN, (Biol Cell, 78, 41-51, 1993) utilizando como patrón el tomate Lycopersicon esculentum cv “Montfavet”. (2C = 1,99 pg, %GC = 40,0 %)

EJEMPLO 1: PRODUCCIÓN DE GAMETOS DIPLOIDES POR MUTANTES osdl.

Como parte de un cribado de los perfiles de expresión para genes meióticos, utilizando la herramienta Expression Angler (TOUFIGHI et al., Plant J, 43, 153-63, 2005) con el conjunto de tejidos AtGenExpress (SCHMID et al., Nat Genet, 37, 501-6, 2005), se seleccionó At3g57860 como un buen candidato debido a su corregulación con varios genes meióticos conocidos. At3g57860 corresponde al genUVI4-Like (UVI4-L)que fue descrito brevemente en un estudio de su parálogo, el genUVI4(HASE et al., Plant J, 46, 317-26, 2006). Debido a su papel en la meiosis (ver más abajo), se renombró el gen At3g57860 comoOSD1,poromisión de la segunda división.Las proteínas OSD1 y UVI4 se conservan en todo el reino vegetal, pero no contienen ningún dominio funcional conocido conservado obvio. No se identificaron homólogos fuera del reino vegetal. Se investigó el papel del genOSD1aislando y caracterizando dos mutantes. Los mutantes insercionales Dsosd1-1(pst15307) yosd1-2(GT21481) se encuentran en los antecedentes de Nooseen (No-0) y Landsberg (Ler), respectivamente, y en ambos casos la inserción se encuentra en el segundo exón del genOSD1.

La estructura intrón/exón del genOSD1y la ubicación de las dos inserciones Ds diferentes se muestran en la figura 2. El genOSD1contiene 3 exones y 2 intrones y codifica una proteína de 243 aminoácidos. Las posiciones de las dos inserciones Ds están indicadas por triángulos.

La figura 3 representa la meiosis en plantas de tipo silvestre y la figura 4 representa la meiosis en mutantesosd1.

Leyenda de la figura 3: (A) Paquiteno. Los cromosomas homólogos están completamente sinapsados. (B) Diacinesis. Se observan cinco pares de cromosomas homólogos (bivalentes), unidos por quiasmas. (C) Metafase I. Los cinco bivalentes están alineados en la placa de metafase. (D) Anafase I. Los cromosomas homólogos están separados. (E) Telofase I. (F) Metafase II. Los pares de cromátidas hermanas se alinean en las placas de metafase. (G) Anafase II. Las cromátidas hermanas están separadas. (H e I) Telofase II. Se forman cuatro esporas haploides (tétrada). Barra de escala = 10 pmi.

Leyenda de la figura 4: (A y B) Productos meióticos masculinos teñidos con azul de toluidina. (A) Una tétrada de tipo silvestre. (B) Una díada en el mutanteosd1-1.(C a D) La meiosis masculina enosd1es indistinguible del tipo silvestre hasta la telofase I (comparar con la figura 3), pero no se observaron figuras características de una segunda división. (C) paquiteno. (D) diacinesis. (E) metafase I. (F) Anafase I. (G) Telofase I. (H) Metafase I de la meiosis femenina enosd1.

En ambos mutantesosd1independientes los productos de la meiosis masculina fueron díadas(osd1-1:714/714osd1-2:334/334) en lugar de tétradas (figuras 4A y B). Las pruebas de complementación entreosd1-1yosd1-2confirmaron que estas mutaciones son alélicas(osd1-1/osd1-2: 369 díadas/369) y, por lo tanto, demostraron que las díadas observadas se deben a la alteración del genOSD1.Los mutantesosd1no mostraron ningún defecto de desarrollo somático, letalidad de gametofitos masculinos y femeninos o fertilidad reducida (tipo silvestre 38 ± 11 semillas/fruto,osd135 ± 6).

A continuación, se midieron los niveles de ploidía entre la descendencia de mutantesosd1diploides. Entre la progenie autofecundada, se encontraron tetraploides (84 %) y triploides (16 %), pero no plantas diploides(osd1-1:n = 56;osd1-2:n = 24). Cuando se utilizó polen mutante para fertilizar una planta de tipo silvestre, toda la progenie resultante fue triploide(osd1-1:n = 75). Cuando se fertilizaron óvulos mutantes con granos de polen de tipo silvestre, se aisló el 12 % de plantas diploides y el 88 % de plantas triploides (n = 25). Esto demostró que los mutantesosdlproducen altos niveles de esporas diploides masculinas (100 %) y femeninas (~85 %), que dan como resultado gametos funcionales.

Para desentrañar los mecanismos que conducen a la producción de díadas enosdl,se investigó el comportamiento cromosómico durante la meiosis. La meiosis I tanto masculina como femenina fueron indistinguibles del tipo silvestre (comparar la figura 4 con la figura 3). De manera destacada, se observaron quiasmas, la manifestación citológica de cruzamientos, y bivalentes. Sin embargo, no se pudo encontrar ninguna figura de meiosis II (entre > 500 meiocitos masculinos desde la profase hasta la formación de esporas), lo que sugiere firmemente que la producción de díadas se debe a una ausencia de la segunda división meiótica. Si esta segunda división no tiene lugar, entonces cualquier heterocigosis en los centrómeros se perderá en los gametos diploides debido a la cosegregación de las cromátidas hermanas y a la separación de los homólogos durante la primera división. Debido a la recombinación, cualquier loci que no esté unido a los centrómeros se segregará. Se probó la suposición aprovechando los dos antecedentes genéticos diferentes de los mutantesosd1-1(No-0) yosd1-2(Ler). Las plantas F1 que portaban las dos mutaciones (mutante paraosdly heterocigótica para cualquier polimorfismo No-0/Ler) se cruzaron como masculinas o femeninas con un tercer antecedente genético, Columbia (Col-0). El cariotipo y el genotipo de las plantas obtenidas para marcadores moleculares trimórficos proporcionaron información directa sobre la composición genética de los granos de polen y los gametofitos femeninos producidos por el mutante. Todos los gametos diploides analizados tenían las características genéticas predichas. Eran sistemáticamente homocigóticos en los centrómeros y se segregaban, debido a la recombinación, en otros loci (n = 48 para gametos diploides masculinos y n = 41 para gametos diploides femeninos). Estos resultados confirmaron que la ausencia de una segunda división meiótica es de hecho la causa de la producción de gametos 2n enosdl.Este mecanismo también implica que la segregación cromosómica desequilibrada en la meiosis I daría lugar a díadas desequilibradas enosdl;esto se confirmó analizando un mutante dobleAtspo11-1/osd1-1(datos no mostrados).

Debido a la ausencia de la segunda división meiótica, los mutantesosd1producen frecuencias elevadas de gametofitos masculinos y femeninos diploides viables, que generan, después de la fecundación, plantas tetraploides viables. Sin embargo, este fenómeno difiere de la apomeiosis en que los gametos producidos son genéticamente diferentes de la planta madre.

EJEMPLO 2: PRODUCCIÓN DE GAMETOS APOMEIÓTICOS POR MUTANTES TRIPLES osd1/Atrec8/Atspo11-1

En mutantes doblesAtspo11-1/Atrec8la primera división meiótica es reemplazada por una división similar a la mitótica, seguida por una segunda división desequilibrada que conduce a esporas desequilibradas y esterilidad. (CHELYSHEVA et al., J Cell Sci, 118, 4621-32, 2005).

Se generaron los mutantesosd1/Atrec8/Atspo11-1.Se obtuvieron plantas heterocigóticas para las mutacionesAtspo11-1yAtrec8cruzando plantas heterocigóticas para cada mutación y se cruzaron con una planta heterocigótica paraosd1.Las plantas triplemente heterocigóticas identificadas se autofecundaron y se analizaron las plantas homocigóticas para las tres mutaciones.

La observación del comportamiento cromosómico durante la meiosis masculina y femenina de estos mutantes se muestra en la figura 5.

Leyenda de la figura 5: (A) Metafase I masculina (B) Anafase I masculina. La viñeta muestra una díada en MiMe. (C) Metafase I femenina. (D) Anafase I femenina. Barra de escala = 10 pm.

Estas observaciones revelaron una división similar a la mitótica: 10 univalentes alineados en la placa de metafase y cromátidas hermanas separadas en la anafase (figura 5).

Las mutacionesAtspo11-1yAtrec8conducen a una primera división meiótica similar a la mitótica y la mutaciónosd1impide que se produzca la segunda división meiótica. Esto da como resultado la sustitución de la meiosis por una división similar a la mitótica y la apomeiosis.

Se denomina a este genotipoMiMepor “mitosis en lugar de meiosis”. Las plantasMiMegeneran díadas (408/408) y son fértiles (25 ± 6 semillas por fruto). Por lo tanto, la mutaciónosd1suprimió el fenotipo de esterilidad del mutante dobleAtspo11-1/Atrec8.

La progenie autofecundada de plantasMiMefue sistemáticamente tetraploide (n = 24) y los retrocruzamientos entre plantasMiMediploides y plantas de tipo silvestre generaron plantas triploides independientemente de si se utilizaron gametosMiMemasculinos (n = 24) o femeninos (n = 67), lo que demuestra que esta división similar a la mitótica da lugar a gametos diploides funcionales. Todos los gametos (masculinos y femeninos), probados de manera similar a la descrita anteriormente, conservaron sistemáticamente la heterocigosidad de la planta madre para cada marcador genético probado y, por lo tanto, fueron idénticos genéticamente a la planta madre. Estos resultados confirman que las plantasMiMeexperimentan una división similar a la mitótica en lugar de una división meiótica normal, sin afectar los procesos sexuales posteriores.

Cuando la meiosis es reemplazada por mitosis, se espera que la ploidía se duplique con cada generación. Esto se observó en plantasMiMe,tal como se muestra en la figura 6.

Leyenda de la figura 6: Columna de la izquierda: metafase mitótica, barra de escala = 10 pm. Columna de la derecha: las plantas de cuatro semanas de vida correspondientes (barra de escala = 2 cm) y flores (barra de escala = 1 mm).

En generaciones posteriores, se obtuvieron tetraploides (4N, 20 cromosomas, n = 26) y octoploides (8N, 40 cromosomas, n = 33).

EJEMPLO 3: IDENTIFICACIÓN DE UN ORTÓLOGO DE ARROZ DEL GEN OSD1 DE ARABIDOPSIS.El genoma deOriza sativacontiene dos candidatos homólogos de OSD1/UVI4 (Os02g37850 y Os04g39670). Se aislaron dos mutantes de inserción de T-ADN en uno de estos supuestos homólogos (Os02g37850). Las dos líneas, AMBA12 y AMQF10, se genotiparon mediante PCR para seleccionar homocigotos. En ambas líneas se observaron plantas tetraploides espontáneas entre la descendencia de plantas mutantes diploides, lo que sugiere la producción de gametos 2n masculinos y femeninos funcionales (AMBA 12: 100 % de tetraploides, n = 30; AMQF10 37 % de tetraploides, n = 27). A continuación, se estudiaron los productos meióticos en mutantes AMB12 (n > 400) y se observó la producción del 100 % de díadas en lugar de tétradas, tal como se ilustra mediante la figura 7.

Leyenda de la figura 7: A: Tétrada de esporas en tipo silvestre; B: Díada de esporas en AMB12.

Este fenotipo es idéntico al mutanteosdldeArabidopsis.Para desentrañar los mecanismos que conducen a la producción de díadas en mutantes homocigotos AMBA12, se investigó el comportamiento cromosómico durante la meiosis. La meiosis I fue indistinguible del tipo silvestre. De manera destacada, se observaron quiasmas, la manifestación citológica de cruzamientos, y bivalentes. Sin embargo, no se pudo encontrar ninguna figura de meiosis II, lo que sugiere firmemente que la producción de esporas 2N se debe a una ausencia de la segunda división meiótica, como enosdldeArabidopsis.En conjunto, estos resultados muestran que Os02g37850 es el homólogo funcional deOSD1deArabidopsisy, por lo tanto, se le denominóOsOSDI.Las proteínas OSD1 y OsOSD1 tienen el 23,6 % de identidad y el 35 % de similitud en una alineación que cubre toda la longitud de las secuencias (herramienta Needle de alineación por pares EMBOSS).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para obtener una planta productora de gametos de Restitución de Segunda División 2n, en el que dicho procedimiento comprende la inhibición en dicha planta de una proteína designada en lo sucesivo proteína OSD1, en el que dicha proteína OSD1

a. tiene, como mínimo, el 35 % de identidad de secuencia utilizando el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch o, como mínimo, el 50 % de similitud de secuencia utilizando la matriz de puntuación BLOSUM62 con la proteína AtOSD1 de la SEQ ID NO: 1 o con la proteína OsOSD1 de la SEQ ID NO: 35, y

b. permite la transición de la meiosis I a la meiosis II,

en el que la inhibición de la proteína OSD1 se obtiene mediante mutagénesis del genOSD1o de su promotor, y se seleccionan los mutantes que han perdido parcial o totalmente la actividad de la proteína OSD1, y en el que la mutagénesis se realiza mediante deleción dirigida de la secuencia codificante o del promotor del gen que codifica dicha proteína o de una parte del mismo, o mediante inserción dirigida de una secuencia exógena dentro de dicha secuencia codificante o de dicho promotor, o mediante inducción de mutaciones aleatorias o mutagénesis insercional aleatoria, seguida de un cribado de los mutantes dentro del gen deseado.

2. Procedimiento para obtener una planta productora de gametos de Restitución de Segunda División 2n, en el que dicho procedimiento comprende la inhibición de la proteína OSD1, en el que dicha proteína OSD1 se define en la reivindicación 1 y en el que la inhibición de dicha proteína OSD1 se obtiene mediante la expresión en dicha planta de un ARN silenciador dirigido al gen que codifica dicha proteína.

3. Procedimiento para obtener una planta productora de gametos apomeióticos, en el que dicho procedimiento comprende la inhibición en dicha planta de las siguientes proteínas:

a) la proteína OSD1, tal como se ha definido en la reivindicación 1;

b) una proteína implicada en la iniciación de la recombinación meiótica en plantas, siendo dicha proteína seleccionada entre:

i) una proteína designada en lo sucesivo proteína SPO11-1, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 55 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 70 % de similitud de secuencia con la proteína SPO11-1 de la SEQ ID NO: 2;

ii) una proteína designada en lo sucesivo proteína SPO11-2, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 60 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 75 % de similitud de secuencia con la proteína SPO11-2 de la SEQ ID NO: 3;

iii) una proteína designada en lo sucesivo proteína PRD1, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 25 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 40 % de similitud de secuencia con la proteína PRD1 de la SEQ ID NO: 4;

iv) una proteína designada en lo sucesivo proteína PAIR1, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 30 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 40 % de similitud de secuencia con la proteína PAIR1 de la SEQ ID NO: 5;

c) una proteína designada en lo sucesivo proteína Rec8, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 40 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 50 % de similitud de secuencia con la proteína Rec8 de la SEQ ID NO: 6,

en el que en este procedimiento, el porcentaje de identidad se calcula utilizando el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch y el porcentaje de similitud se calcula utilizando la matriz de puntuación BLOSUM62, y en el que,

- la inhibición de dichas proteínas se obtiene mediante mutagénesis del gen que codifica dicha proteína o de su promotor, y se seleccionan los mutantes que han perdido parcial o totalmente la actividad de dicha proteína, y en el que la mutagénesis se realiza mediante deleción dirigida de la secuencia codificante o del promotor del gen que codifica dicha proteína o de una parte del mismo, o mediante inserción dirigida de una secuencia exógena dentro de dicha secuencia codificante o de dicho promotor, o mediante inducción de mutaciones aleatorias o mutagénesis insercional aleatoria, seguida de un cribado de los mutantes dentro del gen deseado, o

- la inhibición de dichas proteínas se obtiene mediante la expresión en dicha planta de un ARN silenciador dirigido al gen que codifica dicha proteína.

4. Casete de expresión que comprende:

- un promotor funcional en una célula vegetal;

- como mínimo, una construcción de ADN seleccionada entre:

a) una o más construcciones de ADN de 200 a 1.000 pb, comprendiendo cada una de las cuales un fragmento de un ADNc del genOSD1,tal como se ha definido en la reivindicación 1, y puede comprender, además, un fragmento de un ADNc de un gen diana que codifica una proteína seleccionada entre SPO11-1, SPO11-2, PRD1, PAIR1 y REC8, tal como se ha definido en la reivindicación 3, o de su complementario, o que tiene, como mínimo, el 95 % de identidad con dicho fragmento, estando dicha secuencia o secuencias de ADN colocadas bajo el control transcripcional de dicho promotor;

b) una o más construcciones de ADN en horquilla capaces, cuando se transcriben, de formar un ARN en horquilla dirigido, como mínimo, al genOSD1,tal como se ha definido en la reivindicación 1, y de poder formar, además, un ARN en horquilla dirigido a un gen que codifica una proteína seleccionada entre SPO11-1, SPO11-2, PRD1,<p>A<i>R1 y REC8, tal como se ha definido en la reivindicación 3; c) una o más construcciones de ADN capaces, cuando se transcriben, de formar un miARNa dirigido al genOSD1,tal como se ha definido en la reivindicación 1, y de poder formar, además, un miARNa dirigido a un gen que codifica una proteína seleccionada entre SPO11-1, SPO11-2, PRD1, PAIR1 y REC8, tal como se ha definido en la reivindicación 3;

estando dicha construcción o construcciones de ADN colocadas bajo el control transcripcional de dicho promotor.

5. Casete de expresión, según la reivindicación 4, que comprende una construcción de ADN dirigida al genOSD1.

6. Casete de expresión, según la reivindicación 4, que comprende: una construcción de ADN dirigida al genOSD1,una construcción de ADN dirigida a un gen seleccionado entreSPO11-1, SPO11-2, PRD1yPAIR1,y una construcción de ADN dirigida aREC8.

7. Vector recombinante que comprende un casete de expresión, según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Planta productora de gametos de Restitución de Segunda División 2n,

en la que está inhibida una proteína, designada en lo sucesivo proteína OSD1,

teniendo dicha proteína OSD1, como mínimo, el 35 % de identidad de secuencia o, como mínimo, el 50 % de similitud de secuencia con la proteína AtOSD1 de la SEQ ID NO: 1 o con la proteína OsOSD1 de la SEQ ID NO: 35,

en la que el porcentaje de identidad se calcula utilizando el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch y el porcentaje de similitud se calcula utilizando la matriz de puntuación BLOSUM62, en la que:

el gen que codifica la proteína o su promotor está mutado y el mutante obtenido ha perdido parcial o totalmente la actividad de la proteína, o

un ARN silenciador dirigido al gen que codifica la proteína está expresado en dicha planta.

9. Planta productora de gametos apomeióticos,

en la que están inhibidas las siguientes proteínas:

a) una proteína designada en lo sucesivo proteína OSD1, teniendo dicha proteína OSD1, como mínimo, el 35 % de identidad de secuencia o, como mínimo, el 50 % de similitud de secuencia con la proteína AtOSD1 de la SEQ ID NO: 1 o con la proteína OsOSD1 de la SEQ ID NO: 35,

b) una proteína implicada en la iniciación de la recombinación meiótica en plantas, siendo dicha proteína seleccionada entre:

i) una proteína designada en lo sucesivo proteína SPO11-1, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 55 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 70 % de similitud de secuencia con la proteína SPO11-1 de la SEQ ID NO: 2;

ii) una proteína designada en lo sucesivo proteína SPO11-2, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 60 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 75 % de similitud de secuencia con la proteína SPO11-2 de la SEQ ID NO: 3;

iii) una proteína designada en lo sucesivo proteína PRD1, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 25 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 40 % de similitud de secuencia con la proteína PRD1 de la SEQ ID NO: 4;

iv) una proteína designada en lo sucesivo proteína PAIR1, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 30 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 40 % de similitud de secuencia con la proteína PAIR1 de la SEQ ID NO: 5;

c) una proteína designada en lo sucesivo proteína Rec8, en la que dicha proteína tiene, como mínimo, el 40 % de identidad de secuencia, o, como mínimo, el 50 % de similitud de secuencia con la proteína Rec8 de la SEQ ID NO: 6,

en la que el porcentaje de identidad se calcula utilizando el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch y el porcentaje de similitud se calcula utilizando la matriz de puntuación BLOSUM62, en la que:

el gen que codifica la proteína o su promotor está mutado, y el mutante obtenido ha perdido parcial o totalmente la actividad de la proteína, o

un ARN silenciador dirigido al gen que codifica la proteína está expresado en dicha planta.

10. Planta, según la reivindicación 9, que es una planta transgénica que contiene un transgén que comprende un casete de expresión, según la reivindicación 6.