ES3013486T3 - Til expansion from fine needle aspirates and small biopsies - Google Patents

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Michelle Simpson-Abelson
Cecile Chartier-Courtaud
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Abstract

La presente divulgación proporciona métodos para expandir poblaciones de TIL a partir de aspirados con aguja fina (AF) o biopsias pequeñas que contienen un bajo número de TIL, utilizando los métodos divulgados en este documento, incluidos en un sistema cerrado que conduce a un fenotipo mejorado y una mayor salud metabólica de los TIL en un período de tiempo más corto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Expansión de los TIL a partir de aspirados con aguja fina y pequeñas biopsias
Antecedentes de la invención
El tratamiento de cánceres voluminosos y refractarios mediante transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) representa un enfoque terapéutico poderoso para pacientes con mal pronóstico. Gattinoni et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393. Se requiere una gran cantidad de los TIL para una inmunoterapia exitosa y se necesita un proceso sólido y confiable para su comercialización. Esto ha sido un desafío debido a problemas técnicos, logísticos y regulatorios con la expansión celular. La expansión de los TIL basada en IL-2 seguida de un "proceso de expansión rápida" (REP) se ha convertido en un método preferido para la expansión de los TIL debido a su velocidad y eficiencia. Dudley et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. El REP puede resultar en una expansión de 1.000 veces de los TIL durante un período de 14 días, aunque requiere un gran exceso (por ejemplo, 200 veces) de células mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas (PBMC, también conocidas como células mononucleares (MNC)), a menudo de múltiples donantes, como células alimentadoras, así como anticuerpo anti-CD3 (OKT3) y altas dosis de IL-2. Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. Los TIL que se han sometido a un procedimiento REP han producido una terapia celular adoptiva exitosa después de la inmunosupresión del huésped en pacientes con melanoma. Los parámetros actuales de aceptación de infusión se basan en lecturas de la composición de los TIL (por ejemplo, positividad de CD28,<c>D8 o CD4) y de la expansión y viabilidad del producto de REP.
Los procesos actuales de fabricación de los TIL están limitados por la forma en que se obtienen los TIL del paciente. En algunos casos, cuando el tumor es suficientemente pequeño o está en una ubicación en donde la resección del tumor no es factible, sigue existiendo la necesidad de métodos adicionales para obtener TIL para su expansión y tratamiento. La presente invención satisface esta necesidad proporcionando métodos para expandir los TIL a partir de un aspirado con aguja fina (FNA) o una biopsia con aguja gruesa, que contienen un bajo número de los TIL, y utilizando estos TIL expandidos en métodos de tratamiento.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona métodos mejorados y/o abreviados para expandir los TIL aislados a partir de un aspirado con aguja fina o una biopsia con aguja gruesa y producir poblaciones terapéuticas de los TIL como se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención proporciona un método para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de los TIL que comprende:
(i) realizar una primera expansión cultivando una primera población de los TIL a partir de al menos un aspirado con aguja fina (FNA) o al menos una biopsia pequeña de un tumor en un paciente en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de los TIL, en donde el medio de cultivo celular se complementa con<o>KT-3 en cualquiera de los días 1-3, en donde la primera expansión se realiza durante 3 días a 12 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL comprende al menos 5 * 107 TIL entre 3 y 12 días cuando la primera población de los TIL proviene de una biopsia pequeña; y
(ii) realizar una segunda expansión complementando el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es al menos 25 veces mayor en número que la segunda población de los TIL, y en donde la segunda expansión se realiza durante 3 días a 12 días para obtener la tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es una población terapéutica de los TIL.
En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular que comprende IL-2 en la etapa (i) comprende además OKT-3 y no se complementa opcionalmente con OKT-3 en ninguno de los días 1-3, en donde la etapa (i) es una primera etapa de expansión y la etapa (ii) es una segunda expansión rápida.
El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde después de la etapa (ii), las células se retiran del cultivo celular y se criopreservan en un medio de almacenamiento.
En algunas realizaciones, las etapas (i) a (ii) se realizan dentro de un período de 17 días a 24 días.
En algunas realizaciones, las etapas (i) a (ii) se realizan dentro de un período de 18 días a 22 días.
En algunas realizaciones, las etapas (i) a (ii) se realizan dentro de un período de 20 días a 22 días.
En algunas realizaciones, las etapas (i) a (ii) se realizan dentro de los 22 días.
En algunas realizaciones, las células de la población terapéutica de los TIL de la etapa (ii) expresan CD4, CD8 y TCR a p en niveles similares a las células recién recolectadas.
En algunas realizaciones, las APC son células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En algunas realizaciones, las PBMC se agregan al cultivo celular en la etapa (i) en cualquiera de los días 3 a 12 después del inicio del cultivo en la etapa (i) y/o en la etapa (ii) en cualquiera de los días 11 a 14 después del inicio del cultivo en la etapa (i).
En algunas realizaciones, la tercera población de los TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de los TIL, en donde las células T efectoras y/o células T de memoria central en la población terapéutica de los TIL en la etapa (ii) exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresión de CD27, expresión de CD28, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56, en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la segunda población de células.
En algunas realizaciones, las células T efectoras y/o las células T de memoria central exhiben una mayor expresión de CD57 y una menor expresión de CD56.
En algunas realizaciones, las APC son APC artificiales (aAPC) o APC autólogas.
En algunas realizaciones, la población terapéutica de los TIL se destina a infusión en un paciente.
En algunas realizaciones, la primera expansión en la etapa (i) se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista OKT-3, IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
En algunas realizaciones, la segunda expansión en la etapa (ii) se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
En algunas realizaciones, el FNAen la etapa (i) comprende al menos 400,000 TIL.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en pancreático, melanoma, de mama y ovario.
En algunas realizaciones, el FNA se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, melanoma, de cabeza y cuello, de cuello uterino, de ovario, de páncreas, glioblastoma, colorrectal y sarcoma.
En algunas realizaciones, el tumor pulmonar es un carcinoma pulmonar de células no pequeñas (NSCLC) y, opcionalmente, el paciente se ha sometido previamente a un tratamiento quirúrgico.
En algunas realizaciones, los TIL en la etapa (i) se obtienen de un FNA.
En algunas realizaciones, el FNA se obtiene utilizando una aguja de calibre 25-18.
En algunas realizaciones, los TIL en la etapa (i) se obtienen a partir de una biopsia pequeña.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene utilizando una aguja de calibre 16-11.
En algunas realizaciones, la etapa (ii) se repite de una a cuatro veces para obtener suficientes TIL en la población terapéutica de los TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL.
En algunas realizaciones, la cantidad de los TIL suficiente para una dosis terapéuticamente eficaz es de 2.3 * 1010 hasta 13.7 * 1010.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de los TIL que comprende:
(i) realizar una primera expansión cultivando una primera población de los TIL a partir de un aspirado con aguja fina (FNA) o una biopsia pequeña de un tumor en un paciente en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para obtener una segunda población de los TIL, en donde el medio de cultivo celular se complementa con OKT-3 en cualquiera de los días 1-3, en donde la primera expansión se realiza durante 3 días a 12 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL comprende al menos 5 * 107 TIL entre 3 y 12 días cuando la primera población de los TIL proviene de una biopsia pequeña; y (ii) realizar una segunda expansión complementando el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales para obtener una tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es al menos 25 veces mayor en número que la segunda población de los TIL, y en donde la segunda expansión se realiza durante 3 días a 12 días para obtener la tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es una población terapéutica de los TIL.
En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular que comprende IL-2 en la etapa (i) comprende además OKT-3 y no se complementa opcionalmente con OKT-3 en ninguno de los días 1-3, en donde la etapa (i) es una primera etapa de expansión y la etapa (ii) es una segunda etapa de expansión rápida.
En algunas realizaciones, las APC son APC artificiales (aAPC) o APC autólogas.
En algunas realizaciones, la población terapéutica de los TIL se destina a infusión en un paciente.
En algunas realizaciones, la primera expansión en la etapa (i) se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista o KT-3, IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
En algunas realizaciones, la segunda expansión en la etapa (ii) se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
En algunas realizaciones, que comprenden una segunda expansión adicional en la etapa (ii) que se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la tercera población de los TIL con anticuerpo agonista IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
En algunas realizaciones, el FNAen la etapa (i) comprende al menos 400,000 TIL.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en pancreático, melanoma, de mama y ovario.
En algunas realizaciones, el FNA se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, melanoma, de cabeza y cuello, de cuello uterino, de ovario, de páncreas, glioblastoma, colorrectal y sarcoma.
En algunas realizaciones, el tumor pulmonar es un carcinoma pulmonar de células no pequeñas (NSCLC) y, opcionalmente, el paciente se ha sometido previamente a un tratamiento quirúrgico.
En algunas realizaciones, la primera población de los TIL en la etapa (i) se obtiene de un FNA.
En algunas realizaciones, el FNA se obtiene utilizando una aguja de calibre 25-18.
En algunas realizaciones, los TIL en la etapa (i) se obtienen a partir de una biopsia pequeña.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene utilizando una aguja de calibre 16-11.
En algunas realizaciones, la etapa (ii) se repite de una a cuatro veces para obtener suficientes TIL en la población terapéutica de los TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL.
En algunas realizaciones, la cantidad de los TIL suficiente para una dosis terapéuticamente eficaz es de 2.3 * 1010 hasta 13.7 * 1010.
En algunas realizaciones, la tercera población de los TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de los TIL, en donde las células T efectoras y/o células T de memoria central exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresión de CD27, expresión de CD28, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56, en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria central en la segunda población de células.
En algunas realizaciones, las células T efectoras y/o las células T de memoria central exhiben una mayor expresión de CD57 y una menor expresión de CD56.
Otros temas
Como se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, las células se descongelan antes de realizar la etapa (iv).
Como se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la etapa (iv) se repite de una a cuatro veces para obtener suficientes TIL en la población terapéutica de los TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL.
Como se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, las células del medio de cultivo celular en la etapa (ii) se extraen y se criopreservan en un medio de almacenamiento antes de la etapa (iii).
Como se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, las células se descongelan antes de la etapa (iii).
En el presente documento se divulga, pero no se reivindica, un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) expandidos que comprenden:
(i) obtener una primera población de los TIL a partir de un aspirado con aguja fina (FNA) o una biopsia pequeña obtenida de un tumor en un paciente;
(ii) realizar una primera expansión cultivando la primera población de los TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de los TIL, en donde el medio de cultivo celular se complementa con OKT-3 en cualquiera de los días 1-3, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL comprende al menos 5 * 107 TIL en aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días cuando la primera población de los TIL proviene de una biopsia pequeña;
(iii) realizar una segunda expansión complementando el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es al menos 25 veces mayor en número que la segunda población de los TIL, y en donde la segunda expansión se realiza durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días para obtener la tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es una población terapéutica de los TIL; y
(iv) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de los TIL al paciente.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el medio de cultivo celular que comprende IL-2 en la etapa (ii) comprende además OKT-3 y no se complementa opcionalmente con OKT-3 en ninguno de los días 1-3, y en los que la etapa (i) es una primera etapa de expansión y la etapa (ii) es una segunda etapa de expansión rápida.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, después de la etapa (ii) las células se retiran del medio de cultivo celular y se criopreservan en un medio de almacenamiento antes de la etapa (iv).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células se descongelan antes de la etapa (iv). En algunos métodos divulgados en el presente documento, la etapa (iii) se repite de una a cuatro veces para obtener suficientes TIL en la población terapéutica de los TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las APC son APC artificiales (aAPC) o APC autólogas.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión en la etapa (ii) se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista OKT-3, IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la segunda expansión en la etapa (iii) se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el FNA en la etapa (i) comprende al menos 400,000 TIL.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el FNA se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, melanoma, de cabeza y cuello, de cuello uterino, de ovario, de páncreas, glioblastoma, colorrectal y sarcoma.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el tumor pulmonar es un carcinoma pulmonar de células no pequeñas (NSCLC) y, opcionalmente, en los que el sujeto se ha sometido previamente a un tratamiento quirúrgico.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, los TIL en la etapa (i) se obtienen a partir de un FNA.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el FNA se obtiene utilizando una aguja de calibre 25-18.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, los TIL en la etapa (i) se obtienen a partir de una biopsia pequeña.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la biopsia pequeña se obtiene utilizando una aguja de calibre 16-11.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la etapa (iii) se repite de una a cuatro veces para obtener suficientes TIL en la población terapéutica de los TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la cantidad de los TIL suficiente para una dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 2.3 * 1010 hasta aproximadamente 13.7 * 1010
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la tercera población de los TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de los TIL, en donde las células T efectoras y/o células T de memoria central exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresión de CD27, expresión de CD28, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56, en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la tercera población de células.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central exhiben una expresión aumentada de CD57 y una expresión disminuida de CD56.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, cáncer de ovario, sarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo y carcinoma de pulmón de células no pequeñas.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) expandidos que comprenden:
(i) realizar una primera expansión cultivando una primera población de los TIL a partir de un aspirado con aguja fina (FNA) o una biopsia pequeña de un tumor en un paciente en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para obtener una segunda población de los TIL, en donde el medio de cultivo celular se complementa con OKT-3 en cualquiera de los días 1-3, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL comprende al menos 5 * 107 TIL en aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días cuando la primera población de los TIL proviene de una biopsia pequeña;
(ii) realizar una segunda expansión complementando el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales para obtener una tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es al menos 25 veces mayor en número que la segunda población de los TIL, y en donde la segunda expansión se realiza durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días para obtener la tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es una población terapéutica de los TIL; y
(iii) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de los TIL al paciente.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el medio de cultivo celular que comprende IL-2 en la etapa (ii) comprende además OKT-3 y no se complementa opcionalmente con OKT-3 en ninguno de los días 1-3, y en donde la etapa (i) es una primera etapa de expansión y la etapa (ii) es una segunda etapa de expansión rápida.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células del medio de cultivo celular en la etapa (ii) se eliminan y se criopreservan en un medio de almacenamiento antes de la etapa (iii).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células se descongelan antes de la etapa (iii).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las APC son APC artificiales (aAPC) o APC autólogas.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las APC son células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la población terapéutica de los TIL se infunde en un paciente.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión en la etapa (i) se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista OKT-3, IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la segunda expansión en la etapa (iii) se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el FNA en la etapa (i) comprende al menos 400,000 TIL.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la biopsia pequeña se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en pancreático, melanoma, de mama y ovario.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el FNA se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, melanoma, de cabeza y cuello, de cuello uterino, de ovario, de páncreas, glioblastoma, colorrectal y sarcoma.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el tumor pulmonar es un carcinoma pulmonar de células no pequeñas (NSCLC) y, opcionalmente, en los que el sujeto se ha sometido previamente a un tratamiento quirúrgico.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, los TIL en la etapa (i) se obtienen a partir de un FNA.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el FNA se obtiene utilizando una aguja de calibre 25-18.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, los TIL en la etapa (i) se obtienen a partir de una biopsia pequeña.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la biopsia pequeña se obtiene utilizando una aguja de calibre 16-11.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la etapa (ii) se repite de una a cuatro veces para obtener suficientes TIL en la población terapéutica de los TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la cantidad de los TIL suficiente para una dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 2.3 * 1010 hasta aproximadamente 13.7 * 1010.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la tercera población de los TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de los TIL, en donde las células T efectoras y/o células T de memoria central exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresión de CD27, expresión de CD28, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56, en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la tercera población de células.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central exhiben una expresión aumentada de CD57 y una expresión disminuida de CD56.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de los TIL que comprende:
(a) obtener una primera población de los TIL a partir de un aspirado con aguja fina (FNA) o una biopsia pequeña obtenida de un tumor en un paciente;
(b) añadir la primera población a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de los TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de los TIL, en donde el medio de cultivo celular se complementa con OKT-3 en cualquiera de los días 1-3, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL comprende al menos 5 * 107 TIL en aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días cuando la primera población de los TIL proviene de una biopsia pequeña, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL es al menos 25 veces mayor en número que la primera población de los TIL, y en donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión complementando el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de los TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días para obtener la tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es una población terapéutica de los TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una segunda área de superficie permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de los TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de los TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el medio de cultivo celular que comprende IL-2 en la etapa (ii) comprende además OKT-3 y no se complementa opcionalmente con OKT-3 en ninguno de los días 1-3, y en donde la etapa (i) es una primera etapa de expansión y la etapa (ii) es una segunda etapa de expansión rápida.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el método comprende además la etapa de criopreservar la bolsa de infusión que comprende la población de los TIL recolectada en la etapa (f) utilizando un proceso de criopreservación.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el proceso de criopreservación se realiza utilizando una proporción de 1:1 de población de los TIL recolectada con respecto al medio CS10.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las APC son células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las PBMC se irradian y son alogénicas.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las PBMC se agregan al cultivo celular en cualquiera de los días 3 a 12 en la etapa (c) y/o cualquiera de los días 3 a 12 en la etapa (d).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígeno son células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) o APC autólogas.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la población terapéutica de los TIL se infunde en un paciente.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión en la etapa (c) se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista OKT-3, IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la segunda expansión en la etapa (d) se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el FNA en la etapa (a) comprende al menos 400,000 TIL.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la biopsia pequeña se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en pancreático, melanoma, de mama y ovario.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el FNA se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, melanoma, de cabeza y cuello, de cuello uterino, de ovario, de páncreas, glioblastoma, colorrectal y sarcoma.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el tumor pulmonar es un carcinoma pulmonar de células no pequeñas (NSCLC) y, opcionalmente, en los que el sujeto se ha sometido previamente a un tratamiento quirúrgico.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, los TIL en la etapa (a) se obtienen a partir de un FNA.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el FNA se obtiene utilizando una aguja de calibre 25-18.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, los TIL en la etapa (a) se obtienen a partir de una biopsia pequeña.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la biopsia pequeña se obtiene utilizando una aguja de calibre 16-11.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la recolección en la etapa (e) se realiza utilizando un sistema de procesamiento de células LOVO.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el medio de cultivo celular se proporciona en un recipiente seleccionado del grupo que consiste en un recipiente G y una bolsa de células Xuri.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la bolsa de infusión en la etapa (f) es una bolsa de infusión HypoThermosol.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (f) se realizan en un período de aproximadamente 17 días a aproximadamente 24 días.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (f) se realizan en un período de aproximadamente 18 días a aproximadamente 22 días.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (f) se realizan en un período de aproximadamente 20 días a aproximadamente 22 días.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (f) se realizan en 22 días o menos. En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (f) y la criopreservación se realizan en 22 días o menos.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la población terapéutica de los TIL recolectada en la etapa (e) comprende suficientes TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la cantidad de los TIL suficiente para una dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 2.3 * 1010 hasta aproximadamente 13.7 * 1010.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (b) a (e) se realizan en un solo recipiente, en donde la realización de las etapas (b) a (e) en un solo recipiente da como resultado un aumento en el rendimiento de los TIL por tumor resecado en comparación con la realización de las etapas (b) a (e) en más de un recipiente.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígeno se agregan a los TIL durante el segundo período en la etapa (d) sin abrir el sistema.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la tercera población de los TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de los TIL, en donde las células T efectoras y/o células T de memoria central en la población terapéutica de los TIL exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresar CD27+, expresar CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56 en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la tercera población de los TIL exhiben una expresión aumentada de CD57 y una expresión disminuida de CD56 en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el riesgo de contaminación microbiana se reduce en comparación con un sistema abierto.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, los TIL de la etapa (g) se infunden en un paciente. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar a un sujeto con cáncer, comprendiendo el método la administración de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) expandidos que comprenden:
(a) obtener una primera población de los TIL a partir de un aspirado con aguja fina (FNA) o una biopsia pequeña de un tumor resecado de un sujeto;
(b) añadir la primera población a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de los TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de los TIL, en donde el medio de cultivo celular se complementa con OKT-3 en cualquiera de los días 1-3, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL comprende al menos 5 * 107 TIL en aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días cuando la primera población de los TIL proviene de una biopsia pequeña, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3-14 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL es al menos 25 veces mayor en número que la primera población de los TIL, y en donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión complementando el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de los TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 12 días para obtener la tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es una población terapéutica de los TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una segunda área de superficie permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de los TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de los TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) opcionalmente criopreservar la bolsa de infusión que comprende la población de los TIL recolectada de la etapa (f) utilizando un proceso de criopreservación; y
(h) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de los TIL desde la bolsa de infusión en la etapa (g) al paciente.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la población terapéutica de los TIL recolectada en la etapa (e) comprende suficientes TIL para administrar una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL en la etapa (h).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el medio de cultivo celular que comprende IL-2 en la etapa (ii) comprende además OKT-3 y no se complementa opcionalmente con OKT-3 en ninguno de los días 1-3, y en donde la etapa (i) es una primera etapa de expansión y la etapa (ii) es una segunda etapa de expansión rápida.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las APC son APC artificiales (aAPC) o APC autólogas.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la población terapéutica de los TIL se infunde en un paciente.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión en la etapa (c) se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista OKT-3, IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la segunda expansión en la etapa (d) se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista OKT-3, IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el FNA en la etapa (a) comprende al menos 400,000 TIL.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la biopsia pequeña se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en pancreático, melanoma, de mama y ovario.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el FNA se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, melanoma, de cabeza y cuello, de cuello uterino, de ovario, de páncreas, glioblastoma, colorrectal y sarcoma.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el tumor pulmonar es un carcinoma pulmonar de células no pequeñas (NSCLC) y, opcionalmente, en los que el sujeto se ha sometido previamente a un tratamiento quirúrgico.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, los TIL en la etapa (i) se obtienen a partir de un FNA.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el FNA se obtiene utilizando una aguja de calibre 25-18.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, los TIL en la etapa (i) se obtienen a partir de una biopsia pequeña.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la biopsia pequeña se obtiene utilizando una aguja de calibre 16-11.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la cantidad de los TIL suficiente para administrar una dosis terapéuticamente eficaz en la etapa (h) es de aproximadamente 2.3 * 1010 hasta aproximadamente 13.7 * 1010
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígeno (APC) son PBMC.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las PBMC se agregan al cultivo celular en cualquiera de los días 3 a 12 en la etapa (c) y/o cualquiera de los días 3 a 12 en la etapa (d).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, antes de administrar una dosis terapéuticamente eficaz de células de TIL en la etapa (h), se ha administrado al paciente un régimen de linfodepleción no mieloablativa.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el régimen de linfodepleción no mieloablativa comprende las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el método comprende además la etapa de tratar al paciente con un régimen de IL-2 de dosis alta que comienza el día después de la administración de las células de TIL al paciente en la etapa (h).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el régimen de IL-2 en dosis alta comprende 600,000 o 720,000 Ul/kg administradas como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la tercera población de los TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de los TIL, en donde las células T efectoras y/o células T de memoria central en la población terapéutica de los TIL exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresar CD27+, expresar CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56 en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población terapéutica de los TIL exhiben una expresión aumentada de CD57 y una expresión disminuida de CD56 en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de los TIL que comprende:
(a) obtener una primera población de los TIL a partir de un aspirado con aguja fina (FNA), una biopsia pequeña, una biopsia con aguja gruesa o una biopsia pequeña de un tumor en un paciente;
(b) realizar una preparación de la primera expansión cultivando la primera población de los TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) para producir una segunda población de los TIL, en donde la preparación de la primera expansión se realiza durante un primer período de aproximadamente 1 a 14 días en un recipiente que comprende una primera área de superficie permeable a los gases para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL es mayor en número que la primera población de los TIL;
(c) realizar una segunda expansión rápida complementando el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con IL-2, OKT-3 y APC adicionales, para producir una tercera población de los TIL, en donde la segunda expansión rápida se realiza durante un segundo período de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 días para obtener la tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es una población terapéutica de los TIL; y
(d) recolectar la población terapéutica de los TIL de la etapa (c).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el primer período es de aproximadamente 6 a 12 días.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el segundo período es de aproximadamente 6 a 12 días.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el primer período se selecciona del grupo que consiste en 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días o 12 días.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el segundo período se selecciona del grupo que consiste en 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días o 12 días.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las APC son células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la relación de APC utilizadas en la Etapa (b) con respecto a las APC utilizadas en la Etapa (c) es de aproximadamente 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1, 3:1, 3.1:1, 3.2:1, 3.3:1, 3.4:1, 3.5:1, 3.6:1, 3.7:1, 3.8:1, 3.9:1, 4:1, 4.1:1, 4.2:1, 4.3:1, 4.4:1, 4.5:1, 4.6:1, 4.7:1, 4.8:1, 4.9:1 o 5:1, o preferiblemente aproximadamente de 1 a 2.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera población de los TIL se obtiene a partir de una biopsia con aguja gruesa.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la biopsia con aguja gruesa se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en un tumor de melanoma, un tumor de cáncer de ovario, un tumor de cáncer de cuello uterino, un tumor de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), un tumor de cáncer de pulmón, un tumor de cáncer de vejiga, un tumor de cáncer de mama, un tumor de un cáncer causado por el virus del papiloma humano, un tumor de cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), un tumor de glioblastoma, un tumor de cáncer gastrointestinal y un tumor de cáncer renal.
La divulgación de la presente invención también proporciona composiciones que comprenden TIL expandidos utilizando los métodos descritos en el presente documento.
En algunas composiciones divulgadas en el presente documento, la composición comprende además un crioconservante.
En algunas composiciones divulgadas en el presente documento, el crioconservante comprende dimetilsulfóxido.
En algunas composiciones divulgadas en el presente documento, la composición comprende además un crioconservante y un agente isotónico.
En algunas composiciones divulgadas en el presente documento, la composición comprende además un crioconservante que comprende dimetilsulfóxido y un agente isotónico que comprende cloruro de sodio, gluconato de sodio y acetato de sodio.
En algunas composiciones divulgadas en el presente documento, la composición comprende además un crioconservante que comprende dimetilsulfóxido y dextrano 40 y un agente isotónico que comprende cloruro de sodio, gluconato de sodio y acetato de sodio.
En algunas composiciones divulgadas en el presente documento, la composición que comprende los TIL se proporciona en una bolsa de infusión estéril.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Diagrama de proceso ejemplar 2A que proporciona una descripción general de las Etapas A a F. Figura 2: Diagrama de flujo de proceso del proceso 2A.
Figura 3: Se muestra un diagrama de una realización de un proceso de fabricación ejemplar de los TIL criopreservado (~22 días).
Figura 4: Muestra un diagrama de una realización del proceso 2A, un proceso de 22 días para la fabricación de los TIL.
Figura 5: Tabla comparativa de las Etapas A a F de las realizaciones ejemplares del proceso 1C y del proceso 2A.
Figura 6: Comparación detallada de una realización del proceso 1C y una realización del proceso 2A.
Figura 7: Diagrama ejemplar de biopsia pequeña que proporciona una descripción general de las Etapas A a F del proceso de expansión de biopsia pequeña.
Figura 8: Imagen de células viables expandidas a partir de biopsias con aguja gruesa tomadas de un paciente con cáncer de páncreas (P7015). A) Biopsias con aguja gruesa tratadas con IL-2, y B) Biopsia con aguja gruesa tratadas con una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21.
Figura 9: Análisis FACS de los TIL ampliados a partir de biopsias con aguja gruesa de páncreas. A) Las células T expandidas a partir de biopsias con aguja gruesa tratadas con IL-2 son CD4+ y CD8+. B) Las células T CD8+ expandidas a partir de biopsias con aguja gruesa tratadas con IL-2 son CD107a+. C) Las células T expandidas a partir de biopsias con aguja gruesa tratadas con una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 son CD4+ y CD8+. D) Las células T CD8+ expandidas a partir de biopsias con aguja gruesa tratadas con una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 son CD107a+.
Figura 10: Análisis FACS de los TIL ampliados a partir de aspirados con aguja fina de un paciente con carcinoma de cuello uterino (C2005). A) Aspirados con aguja fina tratados con IL-2, y B) aspirados con aguja fina tratados con una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21.
Figura 11: Análisis FACS de los TIL ampliados a partir de aspirados con aguja fina de un paciente con carcinoma de pulmón (L4032). A) Aspirados con aguja fina tratados con IL-2, y B) aspirados con aguja fina tratados con una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21. C) Como control, se cultivaron fragmentos de tumores de pulmón con IL-2 y se expandieron para producir células T CD4+ y CD8+.
Figura 12: Los TIL de la muestra de FNA de un paciente con carcinoma de pulmón (L4032) se expandieron aún más utilizando un protocolo de expansión rápida. A) Recuentos totales de células después de la expansión rápida de los TIL expandidos a partir de aspirados que fueron tratados inicialmente con IL-2 sola, una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21, o inicialmente una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 y luego IL-2 sola. B) Las células T CD4+ y CD8+ estaban presentes en la población de los TIL expandida tratada con Il-2.
Figura 13: Análisis FACS de los TIL expandidos a partir de aspirados con aguja fina de un paciente con carcinoma de pulmón (L4033). A) Células T de aspirados con aguja fina tratadas con IL-2, y B) como control, células T de fragmentos de tumor pulmonar cultivados con IL-2.
Figura 14: Los TIL expandidos a partir de aspirados con aguja fina de un paciente con carcinoma de pulmón (L4033) se expandieron aún más utilizando un protocolo de expansión rápida. A) Recuento total de células después de la expansión rápida de los TIL obtenidos a partir de aspirados con aguja fina tratados con IL-2.
Figura 15: TIL de aspirados con aguja fina de tumores de ovario tomados de pacientes con carcinoma de ovario (OV8011, OV8012 y OV8013). Recuentos totales de células después de cultivar los aspirados con aguja fina con IL-2 o una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21.
Figura 16: Análisis FACS de los TIL expandidos a partir de aspirados con aguja fina de un paciente con melanoma (M1101). A) Células T de aspirados con aguja fina tratadas con IL-2, y B) como control, células T de fragmentos de tumor pulmonar cultivados con IL-2.
Figura 17: Estado fenotípico y funcional de los TIL derivados de muestras de tumores de páncreas obtenidos mediante biopsias con aguja gruesa. A) Resultados de tumores de páncreas cultivados en medio de cultivo con IL-2 o medio de cultivo con IL-2 y aditivos de cultivo celular. B y C) Resultados de la expresión de CD107a en células CD4+ y células CD8+ en diferentes medios de cultivo (medio de cultivo complementado con IL-2 frente a medio de cultivo complementado con aditivos) después de la estimulación con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA).
Figura 18: Tabla resumen de resultados de biopsias con aguja gruesa y aspirados con aguja fina. A) Resultados de muestras de cáncer de páncreas y cáncer de pulmón. B) Resultados de muestras de cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino y melanoma.
Figura 19: Estado fenotípico y funcional de los TIL derivados de muestras de melanoma obtenidas mediante biopsias por aspirado con aguja fina. A) Recuento total de células en cultivos celulares después de 0 días, 11 días, 18 días y 21 días. B) Análisis fenotípico de células derivadas de fragmentos y aspirados. B) Análisis funcional (expresión de CD107a) de células derivadas de fragmentos y aspirados después de la estimulación con PMA.
Figura 20: Resumen de datos que muestran que TIL se puede expandir a partir de las biopsias con aguja gruesa de cáncer de páncreas obtenidas de UPMC (Centro Médico de la Universidad de Pittsburgh).
Figura 21: Datos que muestran el fenotipado general de los TIL derivados de tumores de páncreas.
Figura 22: Los TIL aislados del pre-REP y REP de biopsias con aguja gruesa de páncreas son funcionales de acuerdo con lo determinado por IFNy y CD107a.
Figura 23: Se observó un aumento en la población de células CD3+/NK en los TIL de pulmón pre-REP de baja expansión.
Figura 24: La relación CD4/8 es superior a 1 en la mayoría de los TIL de pulmón pre-REP.
Figura 25: Se observó una expansión de varias veces comparable durante el REP tanto en el rendimiento alto como en el bajo.
Figura 26: Datos sobre Sarcoma (UPMC 58).
Figura 27: Datos sobre cáncer de cuello uterino (UPMC45). Los TIL pre-REP se expandieron a partir de 4 fragmentos en G-REX 10 durante 21 días.
Figura 28: Datos relativos a ES 19001 (UPMC46). Los TIL pre-REP se expandieron a partir de 4 fragmentos en G-REX 10 durante 21 días.
Figura 29: Datos sobre paladar duro (UPMC 67) y cáncer oral (UPMC 68). Los TIL pre-REP se expandieron a partir de 4 fragmentos en G-REX 10 durante 21 días.
Figura 30: El resumen de datos que muestra que TIL se puede expandir a partir de las biopsias con aguja gruesa de cáncer de páncreas proporcionadas por UPMC.
Figura 31: Biopsia con aguja gruesa de páncreas: Los TIL se pueden expandir a partir de biopsias con aguja gruesa de cáncer de páncreas. Resumen y resultados experimentales de P7015: Se colocó una biopsias con aguja gruesa en un pocillo de una placa de 24 pocillos para un total de 5 pocillos. Se colocaron dos biopsias con aguja gruesa en dos pocillos, sin embargo, hubo poco o ningún crecimiento en estos pocillos. Se trataron tres pocillos con 1) IL-2 y dos pocillos con 2) IL-2/IL-15/IL-21.
Figura 32: Los datos muestran que la mayoría de las células expandidas desde biopsias con aguja gruesa de páncreas eran células T CD4 y CD8+, y eran funcionales de acuerdo con lo determinado por la expresión de CD107a (P7015). Resultados experimentales de P7015: La mayoría de las células extraídas de las biopsias con aguja gruesa del páncreas son células T (aproximadamente el 80 % eran CD4+ y CD8+). La estimulación con PMA/I demostró la capacidad del CD8+ para desgranularse como lo indica la expresión de CD107a+, lo que sugiere que estas células son funcionales. El % de CD8+ que expresa CD107a+ fue mayor en la condición de cóctel triple IL-2/IL-15/IL-21, en comparación con IL-2 sola.
Figura 33: Biopsia con aguja gruesa del páncreas: Los TIL se pueden expandir a partir de biopsias con aguja gruesa de cáncer de páncreas. Resumen y resultados experimentales pre-REP P7028 y P7031: Se colocaron 11 biopsias con aguja gruesa en un G-Rex 10 con el cóctel triple (IL-2/IL-15/IL-21). Los TIL P7028 se evaluaron el día 12 y se mantuvieron en cultivo hasta el día 19. Recuento de células: día 12 = 1.61e6 células viables; día 21 3.49e7 células viables. Los TIL P7028 se evaluaron el día 12 y se mantuvieron en cultivo hasta el día 27. Recuento de células: día 12 = 1.52e5 células viables; día 27: 1.14e7 células viables.
Figura 34: Biopsia con aguja gruesa del páncreas: Los TIL se pueden expandir a partir de biopsias con aguja gruesa y fragmentos tratados con IL-2/IL-15/IL-21 del cáncer de páncreas. El día de la recolección de los TIL derivados de fragmentos osciló entre el día 11-21. El día de la recolección de los TIL derivados de biopsias con aguja gruesa osciló entre el día 21-28.
Figura 35: Caracterización fenotípica de los TIL derivados de biopsias con aguja gruesas y de tumores. El día de la recolección de los TIL derivados de fragmentos osciló entre el día 11-21. El día de la recolección de los TIL derivados de biopsias con aguja gruesa osciló entre el día 21-28.
Figura 36: Caracterización fenotípica de los TIL derivados de biopsias con aguja gruesas y de tumores. Figura 37: Los TIL de biopsias con aguja gruesa pueden expresar CD107a y secretar IFNy de manera similar a los TIL aislados de fragmentos.
Figura 38: A) Proceso ejemplar para el procedimiento de expansión de biopsia con aguja gruesa. Se sometieron 1-2 biopsias con aguja gruesa (3 de páncreas, 4 de melanoma, 1 de mama y 1 de ovario) a un proceso ejemplar que incluía la adición de OKT3 alimentadores en el día 3. Se expandieron las biopsias con aguja gruesa de páncreas /- IL-15 e IL-21 (REP1 y REP2; es decir, primera expansión y segunda expansión). Las biopsias con aguja gruesa de ovario fueron tratadas con /- OX40 (BMS) (n = 1). Todos los TIL fueron sometidos a una segunda REP (segunda expansión). B) Proceso ejemplar para el procedimiento de expansión de biopsia con aguja gruesa. Se someten 1-2 biopsias con aguja gruesa a un proceso que incluye la adición de OKT3 alimentadores en el día 3.
Figura 39: Tabla resumen del procedimiento de expansión de biopsia con aguja gruesa del páncreas.
Figura 40: Datos sobre el número de células para expansiones de biopsia con aguja gruesa de páncreas. Figura 41: Tabla resumen del procedimiento de expansión de biopsia con aguja gruesa de melanoma.
Figura 42: Datos sobre el número de células para expansiones de biopsia con aguja gruesa de melanoma. Figura 43: La expresión fenotípica de los marcadores de agotamiento y activación son similares entre REP1 y REP2 (es decir, primera expansión y segunda expansión).
Figura 44: La adición de OKT3 alimentadores a las biopsias con aguja gruesa en el día 3 no altera significativamente el fenotipo de los TIL en comparación con Gen2 (es decir, proceso 2A) TIL derivado de fragmentos.
Figura 45: Tabla resumen del procedimiento de expansión de biopsia con aguja gruesa de mama y ovario. Figura 46: Datos sobre el número de células para expansiones de biopsias con aguja gruesa de mama (izquierda) y ovario (panel derecho).
Figura 47: Experimento que demuestra que los TIL pueden expandirse a partir de biopsias con aguja gruesa de cáncer de páncreas. Resumen y resultados experimentales pre-REP P7028 y P7031. Las biopsias con aguja gruesa se colocaron en un G-Rex 10 con el cóctel triple (IL-2/IL-15/IL-21). Los TIL P7028 se evaluaron el día 12 y se mantuvieron en cultivo hasta el día 19. Recuento de células: día 12 = 1.61 * 106 células viables; día 21 3.49 * 107 células viables. Los TIL P7030 se evaluaron el día 12 y se mantuvieron en cultivo hasta el día 27. Recuento de células: día 12 = 1.52 * 105 células viables; día 27: 1.14 * 107 células viables.
Figura 48: Los TIL se pueden expandir a partir de biopsias con aguja gruesa y fragmentos tratados con IL-2/IL-15/IL-21 del cáncer de páncreas. Gráficos que muestran los números de expansión celular para fragmentos y biopsias con aguja gruesa. El día de la recolección de los TIL derivados de fragmentos osciló entre el día 11 21. El día de la recolección de los TIL derivados de biopsias con aguja gruesa osciló entre el día 21-28. Figura 49: Los TIL derivados de biopsias con aguja gruesa y fragmentos son fenotípicamente similares. El día de la recolección de los TIL derivados de fragmentos osciló entre el día 11-21. El día de la recolección de los TIL derivados de biopsias con aguja gruesa osciló entre el día 21-28.
Figura 50: Los "marcadores de agotamiento" se expresan de forma diferencial al comparar TIL de biopsias con aguja gruesa y fragmentos.
Figura 51: Los TIL de biopsias con aguja gruesa pueden expresar CD107a y secretar IFN<y>de manera similar a los TIL aislados de fragmentos.
Figura 52: El TC (cóctel triple; IL-2/IL-15/IL-21) no altera significativamente el recuento total de células biopsia con aguja gruesa de páncreas en REP2 (segunda expansión), independientemente de las condiciones de cultivo iniciales (REP1; primera expansión).
Figura 53: El TC (cóctel triple; IL-2/IL-15/IL-21) no altera significativamente la relación CD4/CD8 ni los subconjuntos de memoria en REP2 (segunda expansión) biopsia con aguja gruesa de páncreas.
Figura 54: CD107a es similar en las poblaciones CD4 y CD8 de REP2 (segunda expansión) en todas las condiciones de tratamiento biopsia con aguja gruesa de páncreas.
Figura 55: La secreción de IFN<y>es similar independientemente de la condición del tratamiento con REP2 (segunda expansión) biopsia con aguja gruesa de páncreas.
Figura 56: La adición de OKT3 y alimentadores en el día 3 (REP1; primera expansión) no altera significativamente la expresión fenotípica, en comparación con las condiciones pre-REP biopsia con aguja gruesa de páncreas.
Figura 57: La adición de OKT3 y alimentadores en el día 3 (REP1; primera expansión) no altera significativamente la expresión fenotípica de los "marcadores de agotamiento" biopsia con aguja gruesa de páncreas.
Figura 58: La adición de OKT3 y alimentadores en el día 3 (REP1; primera expansión) no altera significativamente la expresión fenotípica de los marcadores de activación biopsia con aguja gruesa de páncreas.
Figura 59: CD107a es similar en las poblaciones CD4 y CD8 biopsia con aguja gruesa de páncreas pre-REP, REP1 (primera expansión) y REP2 (segunda expansión).
Figura 60: La secreción de IFNy se reduce en REP2 (segunda expansión), en comparación con REP1 (primera expansión) biopsia con aguja gruesa de páncreas.
Figura 61: La población de TCM (células T de memoria central) aumenta y la de TEM (células T de memoria efectora) disminuye en REP2 (segunda expansión), pero CD27 y CD28 no se alteran en el melanoma. TEMRA: células de memoria efectoras diferenciadas terminalmente que expresan nuevamente CD45RA. TSCM: células T madre de memoria.
Figura 62: IFN<y>y CD107a son similares en biopsias con aguja gruesa del melanoma REP1 (primera expansión) y REP2 (segunda expansión).
Figura 63: Datos que muestran marcadores fenotípicos CD4 y CD8 en fragmentos de melanoma frente a biopsias con aguja gruesa de melanoma.
Figura 64: Datos que muestran marcadores fenotípicos CD4 y CD8 en fragmentos de melanoma frente a biopsias con aguja gruesa de melanoma.
Figura 65: Datos que muestran el nivel de CD107a en CD4 y CD8 en fragmentos de melanoma frente a biopsias con aguja gruesa de melanoma.
Figura 66: El tratamiento con OX40 mejoró el porcentaje de células CD8+ en las biopsias con aguja gruesa de ovario.
Figura 67: Expresión de CD107a y secreción de IFN<y>similares en biopsias con aguja gruesa de ovario tratadas con OX40.
Figura 68: TCM mejorado y expresión diferencial de marcadores de agotamiento y activación biopsias con aguja gruesa mamarias REP1 (primera expansión) y REP2 (segunda expansión).
Figura 69: CD107a e IFNy son similares en REP1 (primera expansión) y REP2 (segunda expansión) de las biopsias con aguja gruesa mamarias.
Figura 70: Esquema de un procedimiento ejemplar de expansión de los TIL en biopsias con aguja gruesa del tumor.
Figura 71: Los TIL derivados de biopsias con aguja gruesa del páncreas tratados con OKT3 alimentadores secretan IFN<y>con reestimulación.
Figura 72: Los TIL derivados de biopsias con aguja gruesa de melanoma expresan CD107a y secretan IFN<y>tras la reestimulación.
Figura 73: Expansión de los TIL a partir de biopsias con aguja gruesa de mama y ovario.
Figura 74: El fenotipo del producto final de los TIL derivado de las biopsias con aguja gruesa de mama tratadas con OKT3 alimentadores durante REP1 fue similar al de biopsias con aguja gruesa tratadas solo con IL-2 durante REP1.
Figura 75: El fenotipo del producto final de los TIL derivado de las biopsias con aguja gruesa de mama tratadas con OKT3 alimentadores durante REP1 fue similar al de biopsias con aguja gruesa tratadas solo con IL-2 durante REP1.
Figura 76: Expresión de secreción de IFN<y>mejorada en biopsias con aguja gruesa mamarias tratados con OKT3 alimentadores durante REP1 en comparación con biopsias con aguja gruesa tratadas con IL-2 solo durante REP1.
Figura 77: El tratamiento con OX40 mejoró el porcentaje de células CD8+ en las biopsias con aguja gruesa de ovario en REP2.
Figura 78: El tratamiento con OX40 durante ambos REP alteró la expresión de PD-1, KLRG1 y CD25 en REP2.
Figura 79: La secreción de IFNy en las biopsias con aguja gruesa de ovario tratadas con OX40 es ligeramente mayor en el producto final (REP2).
Figura 80: Expresión de CD107a en biopsias con aguja gruesa de ovario tratadas con OX40.
Figura 81: El tratamiento con OX40 a través de 2 REP alteró la expresión de marcadores asociados con la “juventud” de las células T
Figura 82: El tratamiento con OX40 durante ambos REP alteró ligeramente la expresión de PD-1, KLRG1 y CD25 en REP2.
Figura 83: Expresión diferencial de marcadores de agotamiento y activación en biopsias con aguja gruesa mamarias REP1 y REP 2.
Figura 84: CD107a e IFN<y>son similares en REP1 y REP2 de biopsias con aguja gruesa mamarias.
Figura 85A-85B: A) Muestra una comparación entre el proceso 2A (proceso de aproximadamente 22 días) y una realización del proceso de Gen 3 de biopsia pequeña para la fabricación de los TIL (proceso de aproximadamente 17 a 24 días). B) Diagrama ejemplar del proceso de Gen3 que proporciona una descripción general de las etapas A a F (proceso de aproximadamente 17 a 24 días).
Figura 86: Proporciona un diagrama de flujo experimental para la comparabilidad entre GEN 2 (proceso 2A) frente a GEN 3.
Figura 84A-87C: A) L4054 - Caracterización fenotípica del producto TIL en el proceso de Gen 2 y Gen 3. B) L4055-Caracterización fenotípica del producto TIL en el proceso de Gen 2 y Gen 3. C) M1085T-Caracterización fenotípica del producto TIL en el proceso de Gen 2 y Gen 3.
Figura 88A-88C: A) L4054 - Análisis de marcadores de memoria en el producto TIL de los procesos Gen 2 y Gen 3. B) L4055 - Análisis de marcadores de memoria en el producto TIL de los procesos Gen 2 y Gen 3. C) M1085T-Análisis de marcadores de memoria en el producto TIL de los procesos Gen 2 y Gen 3.
Figura 89: L4054 Marcadores de activación y agotamiento (A) Activados en CD4+, (B) Activados en CD8+. Figura 90: L4055 Marcadores de activación y agotamiento (A) Activados en CD4+, (B) Activados en CD8+. Figura 91: Producción de IFN<y>(pg/mL): (A) L4054, (B) L4055 y (C) M1085T para los procesos Gen 2 y Gen 3: Cada barra representada en este documento la media ± SEM de los niveles de IFN<y>de los niveles estimulados, no estimulados y de control del medio. Densidad óptica medida a 450 nm.
Figura 92: Análisis ELISA de la concentración de IL-2 en el sobrenadante del cultivo celular: (A) L4054 y (B) L4055. Cada barra representada en este documento es la media SEM de los niveles de IL-2 en medios gastados. Densidad óptica medida a 450 nm.
Figura 93: Cuantificación de glucosa y lactato (g/L) en medios gastados: (A) Glucosa y (B) Lactato: En las dos líneas tumorales y en ambos procesos se observó una disminución de la glucosa a lo largo de la expansión de REP. Por el contrario, como se esperaba, se observó un aumento del lactato. Tanto la disminución de glucosa como el aumento de lactato fueron comparables entre los procesos Gen 2 y Gen 3.
Figura 94: A) Cuantificación de L-glutamina en medios gastados para L4054 y L4055. B) Cuantificación de Glutamax en medios gastados para L4054 y L4055. C) Cuantificación de amoniaco en medios gastados para L4054 y L4055.
Figura 95: Análisis de la longitud de los telómeros: El valor de la longitud relativa del telómero (RTL) indica la fluorescencia promedio del telómero por cromosoma/genoma en el proceso de Gen 2 y Gen 3 de la fluorescencia del telómero por cromosoma/genoma en la línea de células de control (línea celular de leucemia 1301) utilizando el kit DAKO.
Figura 96: Análisis de secuencia CDR3 única para el producto final TIL en L4054 y L4055 bajo procesos Gen 2 y Gen 3. Las columnas muestran el número de clonotipos únicos de TCR B identificados de 1 * 106 células recolectadas el día de la recolección del proceso de Gen 2 (por ejemplo, día 22) y Gen 3 (por ejemplo, día 14 16). Gen 3 muestra una mayor diversidad clonal en comparación con Gen 2 en función de la cantidad de CDR de péptidos únicos dentro de la muestra.
Figura 97: Frecuencia de secuencias de CDR3 únicas en el producto celular final cosechado con IL L4054 (Gen 2 (por ejemplo, día 22) y proceso de Gen 3 (por ejemplo, día 14-16)).
Figura 98: Frecuencia de secuencias de CDR3 únicas en el producto celular final cosechado con los TIL L4055 (proceso de Gen 2 (por ejemplo, día 22) y Gen 3 (por ejemplo, día 14-16)).
Figura 99: Índice de diversidad del producto final TIL en L4054 y L4055 bajo el proceso de Gen 2 y Gen 3. El índice de diversidad de entropía de Shanon es una métrica más confiable y común para la comparación. L4054 y L4055 de Gen 3 mostraron una diversidad ligeramente mayor que la de Gen 2.
Figura 100: Los datos sin procesar de los recuentos de células del día 7 al inicio de REP de Gen 3 se presentan en la Tabla 37 (véase el Ejemplo 14 a continuación).
Figura 101: Los datos sin procesar de los recuentos de células del día 11 al inicio de REP de Gen 2 y el aumento proporcional de Gen 3 se presentan en la Tabla 37 (véase el Ejemplo 14 a continuación).
Figura 102: Los datos sin procesar de los recuentos de células del día 16 de aumento proporcional de Gen 2 y recolección de Gen 3 (por ejemplo, día 16) presentado en la Tabla 38 (véase Ejemplo 14 a continuación). Figura 103: Datos sin procesar de recuentos de células del día 22 de la recolección de Gen 2 (por ejemplo, día 22) presentados en la Tabla 38 (véase el Ejemplo 14 a continuación). Para L4054 Gen 2, el recuento posterior a LOVO se extrapoló a 4 matraces, porque era el número total del estudio. Se contaminó 1 matraz y se realizó la extrapolación para un total de 6.67 * 1010.
Figura 104: Los datos sin procesar de los resultados de la citometría de flujo se muestran en las Figs. 87A, 87A y 87B.
Figura 105: Los datos sin procesar de los resultados de la citometría de flujo se muestran en las Figs. 87C y 87C.
Figura 106: Los datos sin procesar de los resultados de la citometría de flujo se muestran en las Figs. 89 y 90. Figura 107: Los datos sin procesar de los resultados del ensayo de producción de IFN<y>para las muestras L4054 se muestran en la Fig. 91.
Figura 108: Los datos sin procesar de los resultados del ensayo de producción de IFNy para las muestras L4055 se muestran en la Fig. 91.
Figura 109: Los datos sin procesar de los resultados del ensayo de producción de IFNy para las muestras M1085T se muestran en la Fig. 91.
Figura 110: Los datos sin procesar de los resultados del ensayo ELISA de IL-2 se muestran en la Fig. 92. Figura 111: Los datos sin procesar del sustrato metabólico y los resultados del análisis metabólico se presentan en las Figs. 93 y 94.
Figura 112: Los datos sin procesar para los resultados del análisis de la longitud relativa de los telómeros se presentan en la Fig. 95.
Figura 113: Los datos sin procesar de la secuencia única CD3 y los resultados de los análisis de diversidad clonal se presentan en las Figs. 96 y 99.
Figura 114: Muestra una comparación entre varias realizaciones del proceso de Gen 2 (proceso 2A) y el Gen 3.1.
Figura 115: Tabla que describe diversas características de las realizaciones del proceso de Gen 2, Gen 2.1 y Gen 3.0.
Figura 116: Descripción general de las condiciones del medio para una realización del proceso de Gen 3, denominado Gen 3.1
Figura 117: Tabla que describe diversas características de las realizaciones del proceso de Gen 2, Gen 2.1 y Gen 3.0.
Figura 118: Tabla que compara diversas características de realizaciones de los procesos Gen 2 y Gen 3.0. Figura 119: Tabla que proporciona usos de los medios en las diversas realizaciones de los procesos de expansión descritos.
Figura 120: Comparación de fenotipos: Las realizaciones Gen 3.0 y Gen 3.1 del proceso mostraron una expresión comparable de CD28, CD27 y CD57.
Figura 121: Mayor producción de IFN<y>en el producto final de Gen 3. Se evaluó el análisis de IFN<y>(mediante ELISA) en el sobrenadante congelado del cultivo para comparar ambos procesos. Para cada tumor, estimulación nocturna con placa anti-CD3 recubierta, utilizando producto TIL fresco en cada proceso de Gen 2 (por ejemplo, día 22) y Gen 3 (por ejemplo, día 16). Cada barra representa en este documento los niveles de IFN-y del control estimulado, no estimulado y del medio.
Figura 122: Arriba: Análisis de secuencia CDR3 única para el producto final TIL: Las columnas muestran el número de clonotipos únicos de TCR B identificados de 1 * 106 células recolectadas en el proceso de Gen2 (porejemplo, día 22) y Gen 3 (por ejemplo, día 14-16). Gen 3 muestra una mayor diversidad clonal en comparación con Gen 2 en función de la cantidad de CDR de péptidos únicos dentro de la muestra. Abajo: Índice de diversidad del producto final de los TIL: El índice de diversidad de entropía de Shanon es una métrica común más confiable para la comparación. Gen 3 mostró una diversidad ligeramente mayor que Gen 2. Figura 123: Se comparten 199 secuencias entre el producto final de Gen 3 y Gen 2, lo que corresponde al 97.07 % del 80 % superior de secuencias de CDR3 únicas de Gen 2 compartidas con el producto final de Gen 3.
Figura 124: Se comparten 1833 secuencias entre el producto final de Gen 3 y Gen 2, lo que corresponde al 99.45 % del 80 % superior de secuencias de CDR3 únicas de Gen 2 compartidas con el producto final de Gen 3.
Figura 125: Esquema de una realización ejemplar del proceso de Gen 3 (un proceso de 16 días).
Figura 126: Esquema de una realización ejemplar de un método para expandir los TIL a partir de neoplasias hematopoyéticas utilizando la plataforma de expansión Gen 3.
Figura 127: Proporciona datos que muestran que la adición de OKT3 alimentadores a las biopsias con aguja gruesa en el día 3 no alteró significativamente el fenotipo de los TIL en comparación con Gen2, lo que indica que los TIL eran TIL sanos.
Figura 128: Proporciona datos que muestran que la expresión de marcadores de agotamiento y activación por parte de los TIL derivados con biopsias con aguja gruesa del melanoma siguió tendencias similares a las de los TIL derivados de biopsias con aguja gruesa de páncreas. No se observaron diferencias en la expresión fenotípica entre IL-2 y el cóctel triple, en REP1 y REp2.
Figura 129: Proporciona datos sobre la expansión de los TIL a partir de biopsias con aguja gruesa de pulmón. Figura 130: Proporciona datos que muestran que se observan perfiles fenotípicos similares en las biopsias con aguja gruesa de pulmón tratadas el día 0 frente al día 3 (OKT3 alimentadores).
Figura 131: Proporciona datos que muestran una expresión fenotípica mejorada de marcadores de activación y células T residentes en biopsias con aguja gruesa tratadas con OKT3 y alimentadores en el día 3.
Figura 132: Los TIL de las biopsias con aguja gruesa de pulmón son funcionales de acuerdo con lo determinado por la secreción de IFNy y la movilización de CD107a en respuesta a una estimulación no específica.
Figura 133: Los TIL CD8+ de las biopsias con aguja gruesa de pulmón tratadas el día 3 son oligoclonales en comparación con los TIL tratados el día 0.
Breve descripción del listado de secuencias
SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de muromonab.
SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de muromonab.
SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-2 humana recombinante. SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de la aldesleucina.
SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-4 humana recombinante. SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-7 humana recombinante. SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-15 humana recombinante. SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-21 humana recombinante. SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos del 4-1BB humano.
SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos del 4-1BB murino.
SEQ ID NO: 11 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO: 12 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566). SEQ ID NO: 13 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO: 14 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO: 15 es la CDR1 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO: 16 es la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO: 17 es la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO: 18 es la CDR1 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO: 19 es la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO: 20 es la CDR3 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO: 21 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513). SEQ ID NO: 22 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513). SEQ ID NO: 23 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO: 24 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO: 25 es la CDR1 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO: 26 es la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO: 27 es la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO: 28 es la CDR1 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO: 29 es la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO: 30 es la CDR3 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO: 31 es un dominio de Fc para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 32 es un enlazador para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 33 es un enlazador para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 34 es un enlazador para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 35 es un enlazador para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 36 es un enlazador para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 37 es un enlazador para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 38 es un enlazador para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 39 es un enlazador para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 40 es un enlazador para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 41 es un enlazador para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 42 es un dominio de Fc para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 43 es un enlazador para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 44 es un enlazador para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 45 es un enlazador para una proteína de fusión agonista TNFRSF.
SEQ ID NO: 46 es una secuencia de aminoácidos del ligando 4-1BB (4-1BBL).
SEQ ID NO: 47 es una porción soluble del polipéptido 4-1BBL.
SEQ ID NO: 48 es una región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo agonista de 4-1BB 4B4-1-1 versión 1.
SEQ ID NO: 49 es una región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo agonista de 4-1BB 4B4-1-1 versión 1.
SEQ ID NO: 50 es una región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo agonista de 4-1BB 4B4-1-1 versión 2.
SEQ ID NO: 51 es una región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo agonista de 4-1BB 4B4-1-1 versión 2.
SEQ ID NO: 52 es una región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo agonista de 4-1BB H39E3-2. SEQ ID NO: 53 es una región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo agonista de 4-1BB H39E3-2. SEQ ID NO: 54 es la secuencia de aminoácidos del OX40 humano.
SEQ ID NO: 55 es la secuencia de aminoácidos del OX40 murino.
SEQ ID NO: 56 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562). SEQ ID NO: 57 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562). SEQ ID NO: 58 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID NO: 59 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID NO: 60 es la CDR1 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID NO: 61 es la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID NO: 62 es la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID NO: 63 es la CDR1 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID NO: 64 es la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID NO: 65 es la CDR3 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).
SEQ ID NO: 66 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.
SEQ ID NO: 67 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.
SEQ ID NO: 68 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.
SEQ ID NO: 69 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.
SEQ ID NO: 70 es la CDR1 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.
SEQ ID NO: 71 es la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.
SEQ ID NO: 72 es la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.
SEQ ID NO: 73 es la CDR1 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.
SEQ ID NO: 74 es la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.
SEQ ID NO: 75 es la CDR3 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.
SEQ ID NO: 76 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.
SEQ ID NO: 77 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.
SEQ ID NO: 78 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.
SEQ ID NO: 79 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.
SEQ ID NO: 80 es la CDR1 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.
SEQ ID NO: 81 es la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.
SEQ ID NO: 82 es la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.
SEQ ID NO: 83 es la CDR1 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.
SEQ ID NO: 84 es la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.
SEQ ID NO: 85 es la CDR3 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.
SEQ ID NO: 86 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu119-122.
SEQ ID NO: 87 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu119-122.
SEQ ID NO: 88 es la CDR1 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu119-122. SEQ ID NO: 89 es la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu119-122. SEQ ID NO: 90 es la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu119-122. SEQ ID NO: 91 es la CDR1 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu119-122. SEQ ID NO: 92 es la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu119-122. SEQ ID NO: 93 es la CDR3 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu119-122. SEQ ID NO: 94 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu106-222.
SEQ ID NO: 95 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu106-222.
SEQ ID NO: 96 es la CDR1 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu106-222. SEQ ID NO: 97 es la CDR2 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu 106-222. SEQ ID NO: 98 es la CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu106-222. SEQ ID NO: 99 es la CDR1 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu106-222. SEQ ID NO: 100 es la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu 106-222. SEQ ID NO: 101 es la CDR3 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu106-222.
SEQ ID NO: 102 es una secuencia de aminoácidos del ligando OX40 (OX40L).
SEQ ID NO: 103 es una porción soluble del polipéptido OX40L.
SEQ ID NO: 104 es una porción soluble alternativa del polipéptido OX40L.
SEQ ID NO: 105 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 008.
SEQ ID NO: 106 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 008.
SEQ ID NO: 107 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 011.
SEQ ID NO: 108 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 011.
SEQ ID NO: 109 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 021.
SEQ ID NO: 110 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 021.
SEQ ID NO: 111 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 023.
SEQ ID NO: 112 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 023.
SEQ ID NO: 113 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40.
SEQ ID NO: 114 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40. SEQ ID NO: 115 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40.
SEQ ID NO: 116 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40. SEQ ID NO: 117 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
SEQ ID NO: 118 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
SEQ ID NO: 119 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
SEQ ID NO: 120 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
SEQ ID NO: 121 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
SEQ ID NO: 122 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
SEQ ID NO: 123 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
SEQ ID NO: 124 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.
SEQ ID NO: 125 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40.
SEQ ID NO: 126 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40. Descripción detallada de la invención
I. Introducción
Terapia celular adoptiva utilizando TIL cultivadosex vivomediante el protocolo de expansión rápida (REP) ha producido una terapia celular adoptiva exitosa después de la inmunosupresión del huésped en pacientes con melanoma. Los parámetros actuales de aceptación de infusión dependen de lecturas de la composición de los TIL(porejemplo, positividad de CD28, CD8 o CD4) y de las veces que se produce la expansión y viabilidad del producto de REP.
Los protocolos de REP actuales brindan poca información sobre la salud de los TIL que se infundirán en el paciente. Las células T experimentan un cambio metabólico profundo durante el curso de su maduración desde células T no modificadas a células T efectoras (véase Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17, 364, y en particular para la discusión y los marcadores del metabolismo anaeróbico y aeróbico). Por ejemplo, las células T no modificadas dependen de la respiración mitocondrial para producir ATP, mientras que las células T efectoras maduras y sanas, como los TIL, son altamente glucolíticos y dependen de la glucólisis aeróbica para proporcionar los sustratos bioenergéticos que requieren para la proliferación, la migración, la activación y la eficacia antitumoral.
Artículos anteriores informan que es deseable limitar la glucólisis y promover el metabolismo mitocondrial en los TIL antes de la transferencia, ya que las células que dependen en gran medida de la glucólisis sufrirán una privación de nutrientes tras la transferencia adoptiva, lo que da como resultado la muerte de la mayoría de las células transferidas. Así, la técnica enseña que promover el metabolismo mitocondrial podría promoverin vivolongevidad y de hecho sugiere utilizar inhibidores de la glucólisis antes de la inducción de la respuesta inmune. Véase Chang et al. (Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17(364).
También se divulgan en el presente documento, pero no se reivindican, métodos para evaluar y cuantificar este aumento en la salud metabólica. Por lo tanto, la divulgación proporciona métodos para evaluar la salud relativa de una población de los TIL utilizando una o más evaluaciones generales del metabolismo, que incluyen, entre otras, tasas y cantidades de glucólisis, fosforilación oxidativa, capacidad respiratoria de reserva (SRC) y reserva glucolítica.
Además, también se divulgan en el presente documento, pero no se reivindican, métodos para evaluar y cuantificar este aumento en la salud metabólica. Por lo tanto, la divulgación proporciona métodos para evaluar la salud relativa de una población de los TIL utilizando una o más evaluaciones generales del metabolismo, que incluyen, entre otras, tasas y cantidades de glucólisis, fosforilación oxidativa, capacidad respiratoria de reserva (SRC) y reserva glucolítica.
Además, las evaluaciones adicionales opcionales incluyen, entre otras, la producción de ATP, la masa mitocondrial y la captación de glucosa.
II. Definiciones
El término"in vivo"se refiere a un evento que tiene lugar en el cuerpo de un sujeto.
El término"in vitro"se refiere a un evento que tiene lugar fuera del cuerpo de un sujeto. Los ensayosin vitroabarcan ensayos basados en células en los que se emplean células vivas o muertas y también pueden abarcar un ensayo sin células en donde no se emplean células intactas.
El término "expansión rápida" significa un aumento en el número de los TIL específicos de antígeno de igual o aproximadamente 3 veces (o 4, 5, 6, 7, 8 o 9 veces) durante un período de una semana, más preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces (o 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 veces) durante un período de una semana, o lo más preferiblemente al menos aproximadamente 100 veces durante un período de una semana. A continuación, se describen varios protocolos de expansión rápida.
Por "linfocitos infiltrantes de tumores" o "TIL" en el presente documento se entiende una población de células obtenidas originalmente como glóbulos blancos que han abandonado el torrente sanguíneo de un sujeto y han migrado a un tumor. Los TIL incluyen, entre otros, células T citotóxicas CD8+ (linfocitos), células T CD4+ Th1 y Th17, células asesinas naturales, células dendríticas y macrófagos M1. Los TIL incluyen tanto TIL primarios como secundarios. Los "TIL primarios" son aquellos que se obtienen de muestras de tejido del paciente como se divulga en el presente documento (a veces denominados "recién recogidos"), y los "TIL secundarios" son cualquier población de células de TIL que se haya expandido o proliferado como se analiza en el presente documento, incluidos, entre otros, los TIL a granel y los TIL expandidos ("TIL REP" o "TIL post-REP").
Por "población de células" (incluidos los TIL) se entiende en el presente documento un número de células que comparten rasgos comunes. En general, las poblaciones suelen oscilar entre 1 * 106 hasta 1 * 1010 en número, con diferentes poblaciones de los TIL que comprenden diferentes números. Por ejemplo, el crecimiento inicial de los TIL primarios en presencia de IL-2 da como resultado una población de los TIL a granel de aproximadamente 1 * 108 células. La expansión de REP generalmente se realiza para proporcionar poblaciones de 1.5 * 109 hasta 1.5 * 1010 células para infusión.
Por "biopsia pequeña" en el presente documento se entiende una biopsia que efectúa la extracción de un volumen de tejido de un tumor que normalmente es menor, y en algunas realizaciones sustancialmente menor, que el volumen del tumor. Las biopsias pequeñas incluyen biopsias con aguja gruesa, biopsias con sacabocados y similares. Se incluye cualquier biopsia pequeña, por ejemplo, cualquier biopsia con un volumen inferior a aproximadamente 1 mm3, 2 mm3, aproximadamente 5 mm3, aproximadamente 10 mm3, aproximadamente 25 mm3, aproximadamente 50 mm3, o aproximadamente 100 mm3 o con un área de sección transversal de menos de aproximadamente 1 mm2, 2 mm2, aproximadamente 5 mm2, aproximadamente 10 mm2, aproximadamente 25 mm2, aproximadamente 50 mm2, o aproximadamente 100 mm2. Una biopsia pequeña también puede incluir múltiples biopsias tomadas del mismo lugar o de varios lugares del cuerpo, incluso de diferentes lesiones cancerosas en la enfermedad metastásica.
En el presente documento, por "TIL criopreservados" se entiende que los TIL, ya sean primarios, a granel o expandidos (TIL REP), se tratan y almacenan en un intervalo de igual o aproximadamente -150 °C a -60 °C. Los métodos generales para la criopreservación también se describen en otras partes del presente documento, incluidos los Ejemplos. Para mayor claridad, los "TIL criopreservados" se pueden distinguir de las muestras de tejido congelado que pueden usarse como fuente de los TIL primarios.
En este documento, por "TIL criopreservados descongelados" se entiende una población de los TIL que se criopreservaron previamente y luego se trataron para llevarlos a temperatura ambiente o superior, incluidas, entre otras, las temperaturas de cultivo celular o las temperaturas en las que se pueden administrar TIL a un paciente.
Los TIL generalmente se pueden definir bioquímicamente, utilizando marcadores de superficie celular, o funcionalmente, por su capacidad de infiltrarse en tumores y efectuar el tratamiento. Los TIL se pueden clasificar generalmente de acuerdo con la expresión de uno o más de los siguientes biomarcadores: CD4, CD8, TCR ap, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 y CD25. Además, y como alternativa, los TIL pueden definirse funcionalmente por su capacidad de infiltrarse en tumores sólidos tras su reintroducción en un paciente.
El término "medios de criopreservación" o "medio de criopreservación" se refiere a cualquier medio que pueda utilizarse para la criopreservación de células. Dichos medios pueden incluir medios que comprendan entre un 7 % y un 10 % de DMSO. Los medios ejemplares incluyen CryoStor CS10, Hyperthermasol, así como combinaciones de los mismos. El término "CS10" se refiere a un medio de criopreservación que se obtiene de Stemcell Technologies o de Biolife Solutions. El medio CS10 puede conocerse por el nombre comercial "CryoStor® CS10". El medio CS10 es un medio libre de suero y de componentes animales que contiene DMSO.
Por "población de células" (incluidos los TIL) se entiende en el presente documento un número de células que comparten rasgos comunes. En general, las poblaciones suelen oscilar entre 1 * 106 hasta 1 * 1010 en número, con diferentes poblaciones de los TIL que comprenden diferentes números. Por ejemplo, el crecimiento inicial de los TIL primarios en presencia de IL-2 da como resultado una población de los TIL a granel de aproximadamente 1 * 108 células. La expansión de REP generalmente se realiza para proporcionar poblaciones de 1.5 * 109 hasta 1.5 * 1010 células para infusión.
El término "célula T de memoria central" se refiere a un subconjunto de células T que en el ser humano son CD45R0+ y expresan constitutivamente CCR7 (CCR7alto) y CD62L (CD62alto). El fenotipo de superficie de las células T de memoria central también incluye TCR, CD3, CD127 (IL-7R) e IL-15R. Los factores de transcripción de las células T de memoria central incluyen BCL-6, BCL-6B, MBD2 y BMI1. Las células T de memoria central secretan principalmente IL-2 y CD40L como moléculas efectoras después de la activación del TCR. Las células T de memoria central predominan en el compartimento CD4 en la sangre y, en los seres humanos, están proporcionalmente enriquecidas en los ganglios linfáticos y las amígdalas.
El término "célula T de memoria efectora" se refiere a un subconjunto de células T humanas o de mamíferos que, al igual que las células T de memoria central, son CD45R0+, pero han perdido la expresión constitutiva de Cc R7 (CCR7bajo) y son heterogéneas o bajas para la expresión de CD62L (CD62Lbajo). El fenotipo de superficie de las células T de memoria central también incluye TCR, CD3, CD127 (IL-7R) e IL-15R. Los factores de transcripción de las células T de memoria central incluyen BLIMP1. Las células T de memoria efectoras secretan rápidamente altos niveles de citocinas inflamatorias después de la estimulación antigénica, incluidos interferón-Y, IL-4 e IL-5. Las células T de memoria efectoras predominan en el compartimento CD8 en la sangre y, en los seres humanos, se enriquecen proporcionalmente en el pulmón, el hígado y el intestino. Las células T de memoria efectoras CD8+ transportan grandes cantidades de perforina. El término "sistema cerrado" se refiere a un sistema que está cerrado al entorno exterior. Cualquier sistema cerrado apropiado para métodos de cultivo celular se puede emplear con los métodos de la presente invención. Los sistemas cerrados incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, recipientes G cerrados. Una vez que se agrega un segmento de tumor al sistema cerrado, el sistema no se abre al ambiente exterior hasta que los TIL estén listos para ser administrados al paciente.
Los términos "fragmentar", "fragmento" y "fragmentado", tal como se utilizan en el presente documento para describir procesos para cortar un tumor, incluyen métodos de fragmentación mecánica tales como triturar, cortar, dividir y morcelar el tejido tumoral, así como cualquier otro método para cortar la estructura física del tejido tumoral.
Los términos "células mononucleares de sangre periférica" y "PBMC" se refieren a una célula de sangre periférica que tiene una biopsias con aguja gruesa redondo, que incluye linfocitos (células T, células B, células NK) y monocitos. Cuando se utilizan como células presentadoras de antígeno (las PBMC son un tipo de células presentadoras de antígeno), las células mononucleares de sangre periférica son células mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas.
Los términos "linfocitos de sangre periférica" y "PBL" se refieren a células T expandidas desde la sangre periférica. En algunas realizaciones, los PBL se separan de la sangre completa o del producto de aféresis de un donante. En algunas realizaciones, los PBL se separan de la sangre completa o del producto de aféresis de un donante mediante la selección positiva o negativa de un fenotipo de células T, como el fenotipo de células T de CD3+ CD45+.
El término "anticuerpo anti-CD3" se refiere a un anticuerpo o variante del mismo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que incluye anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o murinos que se dirigen contra el receptor CD3 en el receptor de antígeno de células T de células T maduras. Los anticuerpos anti-CD3 incluyen OKT-3, también conocido como muromonab. Otros anticuerpos anti-CD3 incluyen, por ejemplo, otelixizumab, teplizumab y visilizumab.
El término "OKT-3" (también denominado en el presente documento "OKT3") se refiere a un anticuerpo monoclonal o biosimilar o variante del mismo, incluidos anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o murinos, dirigidos contra el receptor CD3 en el receptor de antígeno de células T de células T maduras, e incluye formas disponibles comercialmente como OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 puro, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, EE. UU.) y muromonab o variantes, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas o biosimilares de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de muromonab se presentan en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2). Un hibridoma capaz de producir OKT-3 está depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo y se le asignó el número de acceso ATCC CRL 8001. Un hibridoma capaz de producir OKT-3 también está depositado en la Colección Europea de Cultivos Celulares Autenticados (ECACC) y se le asignó el número de catálogo 86022706.
Tabla 1. Secuencias de aminoácidos de muromonab.
El término "IL-2" (también denominado en el presente documento "IL2") se refiere al factor de crecimiento de células T conocido como interleucina-2, e incluye todas las formas de IL-2, incluidas las formas humanas y de mamíferos, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas, biosimilares y variantes de las mismas. Se describe IL-2, por ejemplo, en Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 y Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79. La secuencia de aminoácidos de IL-2 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 3). Por ejemplo, el término IL-2 abarca formas humanas recombinantes de IL-2, como la aldesleucina (PROLEUKIN, disponible comercialmente de múltiples proveedores en viales de 22 millones de UI por un solo uso), así como la forma de IL-2 recombinante suministrada comercialmente por CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, EE. UU. (CELLGRO GMP) o ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EE. UU. (Cat. No. CYT-209-b) y otros equivalentes comerciales de otros proveedores. La aldesleucina (desalanil-1, serina-125 IL-2 humana) es una forma recombinante humana no glicosilada de IL-2 con un peso molecular de aproximadamente 15 kDa. La secuencia de aminoácidos de la aldesleucina adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 4). El término IL-2 también abarca las formas pegiladas de IL-2, como se divulga en el presente documento, incluido el profármaco IL2 pegilado NKTR-214, disponible en Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, EE. UU. NKTR-214 y la<i>L-2 pegilada adecuados para su uso en la invención se describen en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. US 2014/0328791 A1 y la publicación de solicitud de patente internacional No. WO 2012/065086 A1. Se describen formas alternativas de IL-2 conjugada adecuadas para su uso en la invención en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4.766.106, 5.206.344, 5,089.261 y 4.902.502. Las formulaciones de IL-2 adecuadas para su uso en la invención se describen en la patente de los Estados Unidos No. 6.706.289
Tabla 2. Secuencias de aminoácidos de las interleucinas.
El término "IL-4" (también denominado en el presente documento como "IL4") se refiere a la citocina conocida como interleucina 4, que es producida por las células T Th2 y por los eosinófilos, basófilos y mastocitos. IL-4 regula la diferenciación de células T colaboradoras no modificadas (células Th0) a células T Th2. Steinke y Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70. Tras la activación por IL-4, las células T Th2 posteriormente producen IL-4 adicional en un ciclo de retroalimentación positiva. IL-4 también estimula la proliferación de células B y la expresión de MHC de clase II, e induce el cambio de clase a la expresión de IgE e IgGi de las células B. La IL-4 humana recombinante adecuada para su uso en la invención está disponible comercialmente de múltiples proveedores, incluidos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EE. UU. (Cat. No. CYT-211) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU. (proteína recombinante IL-15 humana, Cat. No. Gibco CTP0043). La secuencia de aminoácidos de IL-4 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 5).
El término "IL-7" (también denominado en el presente documento "IL7") se refiere a una citocina derivada de tejido glicosilada conocida como interleucina 7, que puede obtenerse de células estromales y epiteliales, así como de células dendríticas. Fry y Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904. IL-7 puede estimular el desarrollo de células T IL-7 se une al receptor de IL-7, un heterodímero que consiste en el receptor alfa de IL-7 y el receptor de cadena gamma común, que envía una serie de señales importantes para el desarrollo de las células T dentro del timo y la supervivencia dentro de la periferia. La IL-4 humana recombinante adecuada para su uso en la invención está disponible comercialmente de múltiples proveedores, incluidos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EE. UU. (Cat. No. CYT-254) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU. (proteína recombinante IL-15 humana, Cat. No. Gibco PHC0071). La secuencia de aminoácidos de IL-7 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 6).
El término "IL-15" (también denominado en el presente documento como "IL15") se refiere al factor de crecimiento de células T conocido como interleucina-15, e incluye todas las formas de IL-2, incluidas las formas humanas y de mamíferos, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas, biosimilares y variantes de las mismas. Se ha descrito IL-15, por ejemplo, en Fehniger y Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32. IL-15 comparte subunidades del receptor de señalización p y<y>con IL-2. La IL-15 humana recombinante es una cadena polipeptídica única, no glicosilada, que contiene 114 aminoácidos (y una metionina N-terminal) con una masa molecular de 12.8 kDa. La IL-15 humana recombinante está disponible comercialmente a través de múltiples proveedores, incluidos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EE. UU. (Cat. No. CYT-230-b) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU. (proteína recombinante IL-15 humana, Cat. No. 34-8159 82). La secuencia de aminoácidos de la IL-15 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 7).
El término "IL-21" (también denominado en el presente documento como "IL21") se refiere a la proteína citocina pleiotrópica conocida como interleucina-21, e incluye todas las formas de IL-21, incluidas las formas humanas y de mamíferos, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas, biosimilares y variantes de las mismas. Se describe IL-21, por ejemplo, en Spolski y Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95. IL-21 es producida principalmente por células T asesinas naturales y células T CD4+ humanas activadas. IL-21 humana recombinante es una cadena polipeptídica única, no glicosilada, que contiene 132 aminoácidos con una masa molecular de 15.4 kDa. La IL-21 humana recombinante está disponible comercialmente a través de múltiples proveedores, incluidos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EE. UU. (Cat. No. CYT-408-b) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU. (proteína recombinante IL-21 humana, Cat. No.
14-8219-80). La secuencia de aminoácidos de IL-21 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 8).
Cuando se indica "una cantidad eficaz antitumoral", "una cantidad eficaz inhibidora de tumores" o "cantidad terapéutica", la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención a administrar puede ser determinada por un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y condición del paciente (sujeto). En general, se puede afirmar que una composición farmacéutica que comprende los linfocitos citotóxicos modificados genéticamente descritos en el presente documento se puede administrar en una dosis de 104 a 1011 células/kg de peso corporal (por ejemplo, 105 a 106, 105 a 1010, 105 a 1011, 106a 1010, 106 a 1011 , 107 a 1011, 107 a 1010, 108a 1011, 108 a 1010, 109a 1011, o 109 a 1010 células/kg de peso corporal), incluidos todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones de linfocitos citotóxicos modificados genéticamente también pueden administrarse varias veces en estas dosis. Los linfocitos citotóxicos modificados genéticamente se pueden administrar mediante técnicas de infusión que se conocen comúnmente en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). La dosis óptima y el régimen de tratamiento para un paciente en particular pueden ser fácilmente determinados por un experto en el arte de la medicina monitoreando al paciente para detectar signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.
El término "neoplasia maligna hematológica" o términos de significado correlativo se refieren a cánceres y tumores de mamíferos de los tejidos hematopoyéticos y linfoides, incluidos, entre otros, los tejidos de la sangre, la médula ósea, los ganglios linfáticos y el sistema linfático. Las neoplasias hematológicas también se denominan "tumores líquidos". Las neoplasias malignas hematológicas incluyen, entre otras, leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma linfocítico crónico (CLL), linfoma linfocítico pequeño (SLL), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia monocítica aguda (AMoL), linfoma de Hodgkin y linfomas no Hodgkin. El término "neoplasia maligna hematológica de células B" se refiere a las neoplasias malignas hematológicas que afectan a las células B.
El término "tumor sólido" se refiere a una masa anormal de tejido que generalmente no contiene quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. El término "cáncer de tumor sólido" se refiere a tumores sólidos malignos, neoplásicos o cancerosos. Los cánceres de tumores sólidos incluyen, entre otros, sarcomas, carcinomas y linfomas, tal como cánceres de pulmón, mama, próstata, colon, recto y vejiga. La estructura tisular de los tumores sólidos incluye compartimentos tisulares interdependientes que incluyen el parénquima (células cancerosas) y las células del estroma de soporte en las que se dispersan las células cancerosas y que pueden proporcionar un microambiente de soporte.
El término "aspirado con aguja fina" o FNA se refiere a un tipo de procedimiento de biopsia que puede emplearse para procedimientos de muestreo o diagnóstico, incluido el muestreo de tumores, en donde se toma una muestra, pero no se extirpa ni se reseca el tumor. En el aspirado con aguja fina, se inserta una aguja hueca, por ejemplo, de calibre 25-18, en el tumor o en un área que contiene el tumor y se obtienen líquido y células (incluido tejido) para su posterior análisis o expansión, como se divulga en el presente documento. Con un FNA se eliminan las células sin preservar la arquitectura histológica de las células del tejido. Un FNA puede incluir TIL. En algunos casos, se realiza una biopsia por aspirado con aguja fina utilizando una aguja de biopsia por aspirado con aguja fina guiada por ultrasonido. Las agujas de FNA están disponibles comercialmente en Becton Dickinson, Covidien y similares.
El término "biopsia gruesa" o "biopsia con aguja gruesa" se refiere a un tipo de procedimiento de biopsia que puede emplearse para procedimientos de muestreo o diagnóstico, incluido el muestreo de tumores, en donde se toma una muestra, pero no se extirpa ni se reseca el tumor. En una biopsia con aguja gruesa, se inserta una aguja hueca, por ejemplo, de calibre 16-11, en el tumor o en un área que contiene el tumor y se obtienen líquido y células (incluido tejido) para su posterior análisis o expansión, como se divulga en el presente documento.
Con una biopsia con aguja gruesa, se pueden extraer las células con cierta preservación de la arquitectura histológica de las células del tejido, dado el mayor tamaño de la aguja en comparación con un FNA. La aguja de biopsia gruesa generalmente tiene un calibre que permite preservar al menos una parte de la arquitectura histológica del tumor. Una biopsia con aguja gruesa puede contener TIL. En algunos casos, se realiza una biopsia con aguja gruesa utilizando un instrumento de biopsia, un instrumento de biopsia con aguja gruesa asistido por vacío, un instrumento de biopsia con aguja gruesa guiado estereotácticamente, un instrumento de biopsia con aguja gruesa guiado por ultrasonido, un instrumento de biopsia con aguja gruesa guiado por IRM disponible comercialmente en Bard Medical, Becton Dickinson y similares.
El término "tumor líquido" se refiere a una masa anormal de células que es de naturaleza fluida. Los cánceres de tumores líquidos incluyen, entre otros, leucemias, mielomas y linfomas, así como otras neoplasias hematológicas. Los TIL obtenidos a partir de tumores líquidos también pueden denominarse en el presente documento linfocitos infiltrantes de médula ósea (MIL). Los TIL obtenidos a partir de tumores líquidos, incluidos los tumores líquidos que circulan en la sangre periférica, también pueden denominarse en el presente documento PBL. Los términos MIL, TIL y PBL se utilizan indistintamente en el presente documento y difieren únicamente en función del tipo de tejido del que se derivan las células.
El término "microambiente", como se utiliza en el presente documento, puede referirse al microambiente del tumor sólido o hematológico en su totalidad o a un subconjunto individual de células dentro del microambiente. El microambiente tumoral, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una mezcla compleja de "células, factores solubles, moléculas de señalización, matrices extracelulares y señales mecánicas que promueven la transformación neoplásica, apoyan el crecimiento y la invasión tumoral, protegen al tumor de la inmunidad del huésped, fomentan la resistencia terapéutica y proporcionan nichos para que prosperen las metástasis dominantes", como se describe en Swartz et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473. Aunque los tumores expresan antígenos que deberían ser reconocidos por las células T, la eliminación del tumor por parte del sistema inmunológico es rara debido a la supresión inmunitaria por parte del microambiente.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar un cáncer con una población de los TIL remanentes (rTIL), en donde un paciente es tratado previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de rTIL de acuerdo con la invención. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la población de rTIL puede estar provista de una población de los TIL emigrantes normales (eTIL), en donde un paciente es tratado previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de rTIL y eTIL de acuerdo con la invención. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la quimioterapia no mieloablativa es ciclofosfamida a razón de 60 mg/kg/día durante 2 días (días 27 y 26 antes de la infusión de rTIL) y fludarabina a razón de 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de rTIL). En algunos métodos divulgados en el presente documento, después de la quimioterapia no mieloablativa y la infusión de rTIL (en el día 0) de acuerdo con la invención, el paciente recibe una infusión intravenosa de IL-2 por vía intravenosa a razón de 720.000 UI/kg cada 8 horas hasta la tolerancia fisiológica.
Los hallazgos experimentales indican que la linfodepleción previa a la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos del tumor desempeña un papel clave en la mejora de la eficacia del tratamiento al eliminar las células T reguladoras y los elementos competitivos del sistema inmunológico ("sumideros de citocinas"). Por consiguiente, se puede utilizar una etapa de linfodepleción (a veces también denominada "acondicionamiento inmunosupresor") en el paciente antes de la introducción de los rTIL de la invención.
Los términos "coadministración", "coadministrar", "administrado en combinación con", "administrar en combinación con", "simultáneo" y "concurrente", como se utilizan en el presente documento, abarcan la administración de dos o más ingredientes farmacéuticos activos (en una realización preferida de la presente invención, por ejemplo, al menos un agonista del canal de potasio en combinación con una pluralidad de los TIL) a un sujeto de modo que ambos ingredientes farmacéuticos activos y/o sus metabolitos estén presentes en el sujeto al mismo tiempo. La coadministración incluye la administración simultánea en composiciones separadas, la administración en diferentes momentos en composiciones separadas o la administración en una composición en donde están presentes dos o más ingredientes farmacéuticos activos. Se prefiere la administración simultánea en composiciones separadas y la administración en una composición en donde están presentes ambos agentes.
El término "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a aquella cantidad de un compuesto o combinación de compuestos como se divulga en el presente documento que es suficiente para efectuar la aplicación prevista, incluyendo, pero no limitado a, el tratamiento de enfermedades. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo de la aplicación prevista(in vitrooin vivo),o el sujeto y la condición de la enfermedad que se está tratando (por ejemplo, el peso, la edad y el sexo del sujeto), la gravedad de la enfermedad o la forma de administración. El término también se aplica a una dosis que inducirá una respuesta particular en las células objetivo (por ejemplo, la reducción de la adhesión plaquetaria y/o la migración celular). La dosis específica variará dependiendo de los compuestos particulares elegidos, el régimen de dosificación a seguir, si el compuesto se administra en combinación con otros compuestos, el momento de la administración, el tejido al que se administra y el sistema de administración física en donde se transporta el compuesto.
Los términos "tratamiento", "tratando", "tratar" y similares se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir total o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se utiliza en el presente documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir la aparición de la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a padecerla pero que aún no ha sido diagnosticado de padecerla; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo o progresión; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocando regresión de la enfermedad y/o aliviando uno o más síntomas de la enfermedad. El término "tratamiento" también incluye la administración de un agente con el fin de producir un efecto farmacológico, incluso en ausencia de una enfermedad o afección. Por ejemplo, "tratamiento" abarca la administración de una composición que puede provocar una respuesta inmune o conferir inmunidad en ausencia de una enfermedad. por ejemplo, en el caso de una vacuna.
El término "heterólogo" cuando se utiliza con referencia a porciones de un ácido nucleico o proteína indica que el ácido nucleico o proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, con dos o más secuencias de genes no relacionados organizadas para formar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región codificante de otra fuente, o regiones codificantes de diferentes fuentes. De manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).
Los términos "identidad de secuencia", "identidad porcentual" e "identidad porcentual de secuencia" (o sinónimos de los mismos, por ejemplo, "99 % idéntico") en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo espacios, si es necesario) para lograr la máxima correspondencia, sin considerar ninguna sustitución conservadora de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad se puede medir utilizando software o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Se conocen en la técnica varios algoritmos y software que pueden utilizarse para obtener alineaciones de secuencias de aminoácidos o de nucleótidos. Los programas adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia incluyen, por ejemplo, el conjunto de programas BLAST disponible en el sitio web BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica del Gobierno de los Estados Unidos. Las comparaciones entre dos secuencias se pueden realizar utilizando el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se utiliza para comparar secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP se utiliza para comparar secuencias de aminoácidos. ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o MegAlign, disponibles en DNASTAR, son programas de software adicionales disponibles públicamente que se pueden utilizar para alinear secuencias. Un experto en la materia puede determinar los parámetros apropiados para la alineación máxima mediante un software de alineación particular. En ciertas realizaciones, se utilizan los parámetros predeterminados del software de alineación.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "variante" abarca, pero no se limita a, anticuerpos o proteínas de fusión que comprenden una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de referencia mediante una o más sustituciones, eliminaciones y/o adiciones en ciertas posiciones dentro o adyacentes a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de referencia. La variante puede comprender una o más sustituciones conservadoras en su secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de referencia. Las sustituciones conservadoras pueden implicar, por ejemplo, la sustitución de aminoácidos con carga o sin carga similar. La variante conserva la capacidad de unirse específicamente al antígeno del anticuerpo de referencia. El término variante también incluye anticuerpos o proteínas pegilados.
El término"in vivo"se refiere a un evento que tiene lugar en el cuerpo de un sujeto.
El término"in vitro"se refiere a un evento que tiene lugar fuera del cuerpo de un sujeto. Los ensayosin vitroabarcan ensayos basados en células en los que se emplean células vivas o muertas y también pueden abarcar un ensayo sin células en donde no se emplean células intactas.
El término "expansión rápida" significa un aumento en el número de los TIL específicos de antígeno de igual o aproximadamente 3 veces (o 4, 5, 6, 7, 8 o 9 veces) durante un período de una semana, más preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces (o 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 veces) durante un período de una semana, o lo más preferiblemente al menos aproximadamente 100 veces durante un período de una semana. A continuación, se describen varios protocolos de expansión rápida.
Por "linfocitos infiltrantes de tumores" o "TIL" en el presente documento se entiende una población de células obtenidas originalmente como glóbulos blancos que han abandonado el torrente sanguíneo de un sujeto y han migrado a un tumor. Los TIL incluyen, entre otros, células T citotóxicas CD8+ (linfocitos), células T CD4+ Th1 y Th17, células asesinas naturales, células dendríticas y macrófagos M1. Los TIL incluyen tanto TIL primarios como secundarios. Los "TIL primarios" son aquellos que se obtienen de muestras de tejido del paciente como se divulga en el presente documento (a veces denominados "recién recolectados"), y los "TIL secundarios" son cualquier población de células de TIL que se haya expandido o proliferado como se divulga en el presente documento, incluidos, entre otros, los t Il a granel, los TIL expandidos ("TIL REP") así como los "TIL reREP" como se divulga en el presente documento. Los TIL reREP pueden incluir, por ejemplo, TIL de segunda expansión o TIL de segunda expansión adicional (tal como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP).
Los TIL generalmente se pueden definir bioquímicamente, utilizando marcadores de superficie celular, o funcionalmente, por su capacidad de infiltrarse en tumores y efectuar el tratamiento. Los TIL se pueden clasificar generalmente de acuerdo con la expresión de uno o más de los siguientes biomarcadores: CD4, CD8, TCR ap, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 y CD25. Además, y de forma alternativa, los TIL pueden definirse funcionalmente por su capacidad de infiltrarse en tumores sólidos tras su reintroducción en un paciente. Los TIL pueden caracterizarse además por su potencia - por ejemplo, los TIL pueden considerarse potentes si, por ejemplo, la liberación de interferón (IFN) es mayor que aproximadamente 50 pg/mL, mayor que aproximadamente l0o pg/mL, mayor que aproximadamente 150 pg/mL o mayor que aproximadamente 200 pg/mL.
Por "población de células" (incluidos los TIL) se entiende en el presente documento un número de células que comparten rasgos comunes. En general, las poblaciones suelen oscilar entre 1 * 106 hasta 1 * 1010 en número, con diferentes poblaciones de los TIL que comprenden diferentes números. Por ejemplo, el crecimiento inicial de los TIL primarios en presencia de IL-2 da como resultado una población de los TIL a granel de aproximadamente 1 * 108 células. La expansión de REP generalmente se realiza para proporcionar poblaciones de 1.5 * 109 hasta 1.5 * 1010 células para infusión.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales derivadas de una variedad de contraiones orgánicos e inorgánicos conocidos en la técnica. Se pueden formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables con ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos. Los ácidos inorgánicos preferidos de los cuales se pueden derivar sales incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico y ácido fosfórico. Los ácidos orgánicos preferidos de los cuales se pueden derivar sales incluyen, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico y ácido salicílico. Se pueden formar sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables con bases inorgánicas y orgánicas. Las bases inorgánicas de las que se pueden derivar sales incluyen, por ejemplo, sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso y aluminio. Las bases orgánicas de las que se pueden derivar sales incluyen, por ejemplo, aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluidas las aminas sustituidas naturales, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas. Los ejemplos específicos incluyen isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina y etanolamina. También se divulga en el presente documento que la sal de adición de base farmacéuticamente aceptable puede elegirse entre sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio. El término "cocristal" se refiere a un complejo molecular derivado de varios formadores de cocristales conocidos en la técnica. A diferencia de una sal, un cocristal normalmente no implica transferencia de hidrógeno entre el cocristal y el fármaco, y en cambio implica interacciones intermoleculares, como enlaces de hidrógeno, apilamiento de anillos aromáticos o fuerzas dispersivas, entre el formador del cocristal y el fármaco en la estructura cristalina.
Los términos "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" pretenden incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción e ingredientes inertes. El uso de dichos vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables para ingredientes farmacéuticos activos es bien conocido en la técnica. Salvo en la medida en que cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable convencional sea incompatible con el ingrediente farmacéutico activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas de la invención. También se pueden incorporar a las composiciones y métodos divulgados ingredientes farmacéuticos activos adicionales, tales como otros medicamentos.
Los términos "alrededor de" y "aproximadamente" significan dentro de un intervalo estadísticamente significativo de un valor. Tal intervalo puede estar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro del 50 %, más preferiblemente dentro del 20 %, más preferiblemente aún dentro del 10 %, e incluso más preferiblemente dentro del 5 % de un valor o intervalo dado. La variación permisible comprendida entre los términos "alrededor de" o "aproximadamente" depende del sistema particular en estudio y puede ser fácilmente apreciada por una persona con conocimientos ordinarios en la materia. Además, tal como se utilizan en el presente documento, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" significan que las dimensiones, tamaños, formulaciones, parámetros, formas y otras cantidades y características no son ni necesitan ser exactos, sino que pueden ser aproximados y/o más grandes o más pequeños, según se desee, reflejando tolerancias, factores de conversión, redondeo, error de medición y similares, y otros factores conocidos por los expertos en la materia. En general, una dimensión, tamaño, formulación, parámetro, forma u otra cantidad o característica es "alrededor de" o "aproximada", independientemente de que se indique expresamente que lo es o no. Se observa que realizaciones de tamaños, formas y dimensiones muy diferentes pueden emplear las disposiciones descritas.
Los términos transitorios "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en", cuando se utilizan en las reivindicaciones adjuntas, en forma original y enmendada, definen el alcance de la reivindicación con respecto a qué elementos o etapas de reivindicación adicionales no citados, si los hubiera, están excluidos del alcance de la(s) reivindicación(es). El término "que comprende" pretende ser inclusivo o abierto y no excluye ningún elemento, método, etapa o material adicional no mencionado. El término "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o material distinto de los especificados en la reivindicación y, en este último caso, las impurezas ordinarias asociadas con el material o materiales especificados. El término "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los elementos, etapas o material(es) especificados y aquellos que no afectan materialmente la(s) característica(s) básicas y novedosas de la invención reivindicada. Todas las composiciones, métodos y kits descritos en el presente documento que incorporan la presente invención pueden, en realizaciones alternativas, definirse más específicamente mediante cualquiera de los términos transicionales "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en".
III. Procesos de fabricación de los TIL - Proceso 2A (procesos Gen 2)
En algunas realizaciones, la invención proporciona el método de cualquiera de los procesos GEN 2 (p. ej., procesos del proceso 2A) modificados para utilizar una biopsia pequeña, una biopsia con aguja gruesa o un aspirado con aguja fina como fuente de células T para la expansión en la primera expansión de cualquier proceso GEN 2 de este tipo, en donde (1) la duración de la primera expansión se alarga para lograr el recuento de células de TIL deseado en la población de los TIL recolectada después de la segunda expansión de dicho proceso GEN 2 o (2) la duración de la segunda expansión de dicho proceso GEN 2 se alarga para lograr el recuento de células de TIL deseado en la población de los TIL recolectada después de la segunda expansión o (3) la duración de la primera expansión se alarga y la duración de la segunda expansión de dicho proceso GEN 2 se alarga para lograr el recuento de células de TIL deseado en la población de los TIL recolectada después de la segunda expansión.
También se divulga en el presente documento una población de los TIL creada mediante el método de cualquiera de los procesos GEN 2 (p. ej., procesos del proceso 2A) modificados para utilizar una biopsia pequeña, una biopsia con aguja gruesa o un aspirado con aguja fina como fuente de células T para la expansión en la primera expansión de cualquier proceso GEN 2 de este tipo, en donde (1) la duración de la primera expansión se alarga para lograr el recuento de células de TIL deseado en la población de los TIL recolectada después de la segunda expansión de dicho proceso GEN 2 o (2) la duración de la segunda expansión de dicho proceso GEN 2 se alarga para lograr el recuento de células de TIL deseado en la población de los TIL recolectada después de la segunda expansión o (3) la duración de la primera expansión se alarga y la duración de la segunda expansión de dicho proceso GEN 2 se alarga para lograr el recuento de células de TIL deseado en la población de los TIL recolectada después de la segunda expansión.
Los procesos de los TIL ejemplares conocidos como proceso 2A y el proceso de biopsia pequeña que contiene algunas de estas características se muestran en la Figura 7, y algunas de las ventajas de esta realización de la presente invención sobre el proceso 1C se describen en las Figuras 5 y 6. Una realización del proceso 2A se muestra en la Figura 1. Además, en la Figura 7 se proporciona una descripción general y una comparación del proceso 2A con respecto al proceso de biopsia con aguja gruesa ejemplar. El proceso 2A (Gen 2), los métodos de tratamiento que utilizan TIL del proceso 2A y las composiciones de los TIL preparadas mediante el proceso 2A se pueden utilizar junto con una biopsia pequeña/biopsia con aguja gruesa con duraciones de períodos de expansión ajustadas según sea necesario para lograr los recuentos de células necesarios, como se proporciona a continuación y en toda la presente solicitud.
Como se analiza en el presente documento, la presente divulgación incluye una etapa relacionada con la reestimulación de los TIL criopreservados para aumentar su actividad metabólica y, por lo tanto, su salud relativa antes del trasplante a un paciente, y métodos para probar dicha salud metabólica. Como se describe en términos generales en el presente documento, los TIL generalmente se toman de una muestra de un paciente y se manipulan para expandir su número antes del trasplante a un paciente. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que los TIL pueden manipularse genéticamente de manera opcional, como se analiza a continuación.
En algunas realizaciones, los TIL pueden criopreservarse. Una vez descongelados, también pueden volver a estimularse para aumentar su metabolismo antes de su infusión en un paciente.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la primera expansión (incluidos los procesos denominados pre-REP, así como los procesos que se muestran en la Figura 7 como Etapa A) es de 1-19 días y la segunda expansión (incluidos los procesos denominados REP, así como los procesos que se muestran en la Figura 7 como Etapa B) se acorta a 11 a 14 días, como se analiza en detalle a continuación, así como en los ejemplos y las figuras. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 7) se divide en dos períodos de 12 días y 3-19, o en algunos casos 1-2 días y 3-10 días y la segunda expansión (por ejemplo, una expansión como se describe en la etapa D en la Figura 7) es de 11-14 días, como se analiza en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4, 5 y 7. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la combinación de la primera expansión y la segunda expansión (por ejemplo, las expansiones descritas como Etapa B y Etapa D en la Figura 7) se acorta a 22 días, como se analiza en detalle a continuación y en los ejemplos y figuras.
Las designaciones de "Etapa" A, B, C,etc.,a continuación, se hace referencia a la Figura 7. El orden de las etapas a continuación y en la Figura 7 es ejemplar y la presente solicitud y los métodos divulgados en el presente documento contemplan cualquier combinación u orden de etapas, así como etapas adicionales, repetición de etapas y/u omisión de etapas.
A. Etapa A: Obtener muestra del tumor del paciente
En general, los TIL se obtienen inicialmente de una muestra de tumor del paciente ("TIL primarios") obtenidos mediante una biopsia con aguja gruesa o un procedimiento similar y luego se expanden a una población más grande para una mayor manipulación como se divulga en el presente documento, opcionalmente se criopreservan y opcionalmente se evalúan para determinar el fenotipo y los parámetros metabólicos.
Se puede obtener una muestra de tumor del paciente utilizando métodos conocidos en la técnica, generalmente mediante una biopsia pequeña, una biopsia con aguja gruesa, una biopsia con aguja u otros medios para obtener una muestra que contenga una mezcla de células tumorales y TIL. En general, la muestra de tumor puede provenir de cualquier tumor sólido, incluidos tumores primarios, tumores invasivos o tumores metastásicos. La muestra de tumor también puede ser un tumor líquido, tal como un tumor obtenido de una neoplasia maligna hematológica. En algunas realizaciones, la muestra puede provenir de múltiples muestras de tumores pequeños o biopsias. En algunas realizaciones, la muestra puede comprender múltiples muestras de tumor de un solo tumor del mismo paciente. En algunas realizaciones, la muestra puede comprender múltiples muestras de tumores de uno, dos, tres o cuatro tumores del mismo paciente. En algunas realizaciones, la muestra puede comprender múltiples muestras de tumores de múltiples tumores del mismo paciente. El tumor sólido puede ser de cualquier tipo de cáncer, incluidos, entre otros, cáncer de mama, de páncreas, de próstata, colorrectal, de pulmón, de cerebro, de riñón, de estómago y de piel (incluidos, entre otros, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales y melanoma). En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello (incluido, por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), glioblastoma (GBM), cáncer gastrointestinal, cáncer de ovario, sarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo y carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En algunas realizaciones, los TIL útiles se obtienen a partir de tumores de melanoma maligno, ya que se ha informado que estos tienen niveles particularmente altos de los TIL.
En general, la suspensión celular obtenida de la biopsia con aguja gruesa o fragmento del tumor se denomina "población celular primaria" o población celular "recién obtenida" o "recién aislada". En ciertas realizaciones, la población de células recién obtenida de los TIL se expone a un medio de cultivo celular que comprende células presentadoras de antígeno, IL-2 y OKT-3.
Si el tumor es metastásico y la lesión primaria ha sido tratada/eliminada eficazmente en el pasado, puede ser necesaria la extirpación de una de las lesiones metastásicas. El enfoque menos invasivo puede ser la extirpación de una lesión cutánea o de un ganglio linfático del cuello o de la zona axilar, cuando esté disponible. Se puede extirpar una lesión de la piel o tomar una biopsia pequeña de la misma. Se puede extirpar un ganglio linfático o una biopsia pequeña del mismo. Se puede emplear una lesión metastásica de pulmón o hígado, o un ganglio linfático intraabdominal o torácico o una biopsia pequeña del mismo.
En algunas realizaciones, el tumor es un melanoma. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña de un melanoma comprende un lunar o porción del mismo.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por punción. En algunas realizaciones, la biopsia por punción se obtiene previamente con una cuchilla circular presionada en la piel. En algunas realizaciones, la biopsia por punción se obtiene previamente con una hoja circular presionada en la piel alrededor de un lunar sospechoso. En algunas realizaciones, la biopsia por punción se obtiene previamente con una hoja circular presionada en la piel y se extrae un trozo redondo de piel. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por punción y previamente se ha extirpado una porción redonda del tumor.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por escisión. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por escisión y se extirpa todo el lunar o crecimiento. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por escisión y se ha extirpado previamente todo el lunar o crecimiento junto con un pequeño borde de piel de apariencia normal.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por incisión. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por incisión y solo se toma la parte más irregular de un lunar o crecimiento. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por incisión y la biopsia por incisión se utiliza cuando no se pueden realizar otras técnicas, como si un lunar sospechoso es muy grande.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de pulmón. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente mediante broncoscopia. Generalmente, en la broncoscopia, se pone al paciente bajo anestesia y se pasa un pequeño instrumento por la nariz o la boca, hasta la garganta, y dentro de los pasajes bronquiales, donde se utilizan pequeñas herramientas para extraer algo de tejido. En algunas realizaciones, cuando no se puede llegar al tumor o crecimiento mediante broncoscopia, se puede emplear una biopsia con aguja transtorácica. Generalmente, para una biopsia con aguja transtorácica, el paciente también está bajo anestesia y se inserta una aguja a través de la piel directamente en el lugar sospechoso para extraer una pequeña muestra de tejido. En algunas realizaciones, una biopsia con aguja transtorácica puede requerir radiología intervencionista (por ejemplo, el uso de rayos X o una tomografía computarizada para guiar la aguja). En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente mediante biopsia con aguja. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente mediante ecografía endoscópica (por ejemplo, un endoscopio con una luz y se coloca a través de la boca hasta el esófago). En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente quirúrgicamente.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de cabeza y cuello. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por incisión. La biopsia pequeña puede ser una biopsia por incisión, en donde se corta un pequeño trozo de tejido de un área de aspecto anormal. Si se accede fácilmente a la región anormal, se puede tomar la muestra sin necesidad de hospitalización. Si el tumor está más profundo en la boca o la garganta, es posible que sea necesario realizar la biopsia en un quirófano, con anestesia general. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por escisión. La biopsia pequeña puede ser una biopsia por escisión, en donde se extirpa toda el área. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es un aspirado con aguja fina (FNA). En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es un aspirado con aguja fina (FNA), en donde se puede utilizar una aguja muy fina unida a una jeringa para extraer (aspirar) células de un tumor o bulto. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por punción. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por punción, en donde se pueden utilizar fórceps de punción para extraer una parte del área sospechosa.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de cuello uterino. La biopsia pequeña se puede obtener mediante colposcopia. Generalmente, los métodos de colposcopia emplean el uso de un instrumento de aumento iluminado conectado a unos binoculares de aumento (un colposcopio) que luego se utiliza para realizar una biopsia de una pequeña sección de la superficie del cuello uterino. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una conización/biopsia de cono. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una conización/biopsia de cono, en donde previamente puede ser necesaria una cirugía ambulatoria para extraer un trozo más grande de tejido del cuello uterino. La biopsia de cono, además de ayudar a confirmar un diagnóstico, puede servir como tratamiento inicial.
El término "tumor sólido" se refiere a una masa anormal de tejido que generalmente no contiene quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. El término "cáncer de tumor sólido" se refiere a tumores sólidos malignos, neoplásicos o cancerosos. Los cánceres de tumores sólidos incluyen, entre otros, sarcomas, carcinomas y linfomas, tal como cánceres de pulmón, mama, cáncer de mama triple negativo, próstata, colon, recto y vejiga. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, cáncer de ovario, sarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo y carcinoma de pulmón de células no pequeñas. La estructura tisular de los tumores sólidos incluye compartimentos tisulares interdependientes que incluyen el parénquima (células cancerosas) y las células del estroma de soporte en las que se dispersan las células cancerosas y que pueden proporcionar un microambiente de soporte.
En algunas realizaciones, la muestra del tumor se obtiene como un aspirado con aguja fina (FNA), una biopsia con aguja gruesa, una biopsia pequeña (incluyendo, por ejemplo, una biopsia por punción). En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 10. En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 10 cuando hay 1 o 2 muestras de biopsia con aguja gruesa y/o biopsias pequeñas. En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 100 cuando hay 3, 4, 5, 6 , 8 , 9 o 10 o más muestras de biopsia con aguja gruesa y/o biopsia pequeña. En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 500 cuando hay 3, 4, 5, 6 , 8 , 9 o 10 o más muestras de biopsia con aguja gruesa y/o biopsia pequeña.
El FNA se puede obtener de un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, melanoma, de cabeza y cuello, de cuello uterino, de ovario, de páncreas, glioblastoma, colorrectal y sarcoma. En algunas realizaciones, el FNA se obtiene de un tumor pulmonar, tal como un tumor pulmonar de un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En algunos casos, el paciente con NSCLC ha sido sometido previamente a un tratamiento quirúrgico.
Los TIL descritos en el presente documento se pueden obtener a partir de una muestra de FNA. En algunos casos, la muestra de f Na se obtiene o se aísla del paciente utilizando una aguja de calibre fino que va desde una aguja de calibre 18 hasta una aguja de calibre 25. La aguja de calibre fino puede ser calibre 18, calibre 19, calibre 20, calibre 21, calibre 22, calibre 23, calibre 24 o calibre 25. En algunas realizaciones, la muestra de FNA del paciente puede contener al menos 400,000 TIL, por ejemplo, 400,000 TIL, 450,000 TIL, 500,000 TIL, 550.000 TIL, 600,000 TIL, 650,000 TIL, 700,000 TIL, 750,000 TIL, 800,000 TIL, 850,000 TIL, 900,000 TIL, 950.000 TIL o más.
En algunos casos, los TIL descritos en el presente documento se obtienen a partir de una muestra de biopsia con aguja gruesa. En algunos casos, la muestra de biopsia con aguja gruesa se obtiene o se aísla del paciente utilizando una aguja quirúrgica o médica que puede ser de calibre 11 a calibre 16. La aguja puede ser de calibre 11, calibre 12, calibre 13, calibre 14, calibre 15 o calibre 16. En algunas realizaciones, la muestra de biopsia con aguja gruesa del paciente puede contener al menos 400,000 TIL, por ejemplo, 400,000 TIL, 450,000 TIL, 500.000 TIL, 550,000 TIL, 600,000 TIL, 650,000 TIL, 700,000 TIL, 750,000 TIL, 800,000 TIL, 850,000 TIL, 900.000 TIL, 950,000 TIL o más.
En general, la suspensión de células recolectadas se denomina "población celular primaria" o población celular "recién recolectada".
En algunas realizaciones, los TIL no se obtienen a partir de digestos tumorales. En algunas realizaciones, las biopsias con aguja gruesa de tumores sólidos no están fragmentados.
En algunas realizaciones, los TIL se obtienen a partir de digestos tumorales. En algunas realizaciones, los digestos tumorales se generaron mediante incubación en medios enzimáticos, por ejemplo, pero sin limitarse a, RPMI 1640, GlutaMAX 2 mM, 10 mg/mL de gentamicina, 30 U/mL de DNasa, y 1.0 mg/mL de colagenasa, seguido de disociación mecánica (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Después de colocar el tumor en un medio enzimático, éste puede disociarse mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. La solución puede luego incubarse durante 30 minutos a 37 °C en 5 % de CO2 y luego se volvió a romper mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. Después de incubarlo nuevamente durante 30 minutos a 37 °C en 5 % de CO2, el tumor puede romperse mecánicamente una tercera vez durante aproximadamente 1 minuto. En algunas realizaciones, después del tercer rompimiento mecánico, si había grandes trozos de tejido, se aplicaron 1 o 2 disociaciones mecánicas adicionales a la muestra, con o sin 30 minutos adicionales de incubación a 37 °C en 5 % de CO2. En algunas realizaciones, al término de la incubación final, si la suspensión celular contenía una gran cantidad de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación por gradiente de densidad utilizando Ficoll para eliminar estas células.
En algunas realizaciones, la suspensión de células recolectadas antes de la primera etapa de expansión se denomina "población celular primaria" o población celular "recién recolectada".
En algunas realizaciones, las células pueden congelarse opcionalmente después de la recolección de la muestra y almacenarse congeladas antes de ingresar a la expansión descrita en la Etapa B, que se describe con más detalle a continuación, así como también se ejemplifica en la Figura 7.
B. Etapa B: Primera expansión
En algunas realizaciones, los métodos actuales permiten obtener TIL jóvenes, que son capaces de aumentar los ciclos de replicación tras la administración a un sujeto/paciente y, como tal, pueden proporcionar beneficios terapéuticos adicionales sobre los TIL más viejos (es decir, TIL que han pasado por más rondas de replicación antes de su administración a un sujeto/paciente). Las características de los TIL jóvenes se han descrito en la literatura, por ejemplo: Donia, et al., Scandinavian Journal of Immunology, 75: 157-167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16 : 6122-6131 (2010)); Huang et al., J Immunother, 28(3): 258-267 (2005); Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17): OF1-OF9 (2013 ); Besser et al., J Immunother 32: 415-423 (2009); Robbins et al., J Immunol 2004; 173: 7125-7130; Shen et al., J Immunother, 30: 123-129 (2007); Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005); y Tran, et al., J Immunother, 31: 742-751 (2008).
Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos de genes. Estos segmentos de genes: V (variable), D (diversidad), J (unión) y C (constante) determinan la especificidad de unión y las aplicaciones posteriores de las inmunoglobulinas y los receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un método para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos mediante el presente método exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos mediante el presente método exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los provistos en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 1. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos mediante el presente método exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando métodos denominados proceso 1C, como se ejemplifica en la Figura 3 y/o la Figura 4. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos en la primera expansión exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, el aumento en la diversidad es un aumento en la diversidad de inmunoglobulina y/o la diversidad del receptor de células T En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina y en la cadena pesada de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina y en la cadena ligera de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionados del grupo que consiste en receptores alfa, beta, gamma y delta. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de TCRab (es decir, TCRa/p).
Después de obtener la biopsia pequeña, la biopsia con aguja gruesa o el fragmento o fragmentos de tumor aspirado con aguja fina (que pueden denominarse "biopsias con aguja gruesa" o "fragmentos"), por ejemplo, como se describe en la etapa A de la Figura 7, las células resultantes se cultivan en suero que contiene IL-2 en condiciones que favorecen el crecimiento de los TIL sobre el tumor y otras células. En algunas realizaciones, los digestos tumorales se incuban en pocillos de 2 mL en medios que comprenden suero AB humano inactivado con 6000 UI/mL de IL-2. Esta población de células primarias se cultiva durante un período de días, generalmente de 3 a 14 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel, generalmente de aproximadamente 1 * 108 células de TIL a granel. En algunas realizaciones, IL-2 se incluye durante los días 1 2 de la primera expansión y OKT3 y los alimentadores se agregan el día 3 de la primera expansión. En algunas realizaciones, el OKT3 y los alimentadores se incluyen durante los días 3-12. En algunas realizaciones, el OKT3 y los alimentadores se incluyen durante los días 3-11. En algunas realizaciones, el OKT3 y los alimentadores se incluyen durante los días 3-10. En algunas realizaciones, el OKT3 y los alimentadores se incluyen durante los días 3-9. En una realización preferida, la expansión de los TIL se puede realizar utilizando una etapa inicial de expansión de los TIL a granel (por ejemplo, como los descritos en la etapa B de la Figura 7, que pueden incluir procesos denominados pre-REP) como se describe a continuación y en el presente documento, seguido de una segunda expansión (Etapa D, que incluye procesos denominados etapas de protocolo de expansión rápida (REP)) como se describe a continuación en la etapa D y en el presente documento, seguido de criopreservación opcional, y seguido de una segunda Etapa D (que incluye procesos denominados etapas de reestimulación REP) como se describe a continuación y en el presente documento. Los TIL obtenidos a partir de este proceso pueden caracterizarse opcionalmente por características fenotípicas y parámetros metabólicos como se divulga en el presente documento.
En realizaciones en las que los cultivos de los TIL se inician en placas de 24 pocillos, por ejemplo, utilizando un grupo de cultivo celular Costar de 24 pocillos, de fondo plano (Corning Incorporated, Corning, NY, cada pocillo se puede sembrar con 1 * 106 de biopsia pequeña, biopsia con aguja gruesa o células tumorales obtenidas mediante aspirado con aguja fina o un fragmento de tumor obtenido mediante biopsia pequeña, biopsia con aguja gruesa o aspirado con aguja fina en 2 mL de medio completo (CM) con IL-2 (6000 UI/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA).
En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión se denomina "CM", una abreviatura de medio de cultivo. En algunas realizaciones, el CM para la etapa B consiste en RPMI 1640 con GlutaMAX, complementado con 10 % de suero AB humano, 25 mM de Hepes y 10 mg/mL de gentamicina. En realizaciones en las que los cultivos se inician en matraces permeables a los gases con una capacidad de 40 mL y un fondo de silicio permeable al gas con un diámetro de 10 cm2 (por ejemplo, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Fig. 1), cada matraz se cargó con 10-40 * 106 células tumorales viables obtenidas mediante biopsia pequeña, biopsia con aguja gruesa o aspirado con aguja fina, o de 5 a 30 fragmentos de tumor obtenidos mediante biopsia pequeña, biopsia con aguja gruesa o aspirado con aguja fina en 10-40 mL de CM con IL-2. Tanto la placa G-Rex10 como la de 24 pocillos se incubaron en una incubadora humidificada a 37 °C en 5 % de CO2 y 5 días después de iniciar el cultivo, se extrajo la mitad del medio y se reemplazó con CM fresco e IL-2 y después del día 5, la mitad del medio se cambió cada 2-3 días.
Después de la recolección de los fragmentos de tumor de la biopsia pequeña, la biopsia con aguja gruesa o el aspirado con aguja fina, las células resultantes (es decir, los fragmentos) se cultivan en suero que contiene IL-2 en condiciones que favorecen el crecimiento de los TIL sobre células tumorales y de otro tipo. En algunas realizaciones, los fragmentos de tumor se incuban en pocillos de 2 mL en medios que comprenden suero AB humano inactivado (o, en algunos casos, como se divulga en el presente documento, en presencia de una población de células aAPC) con 6000 UI/mL de IL-2. Esta población de células primarias se cultiva durante un período de días, generalmente de 10 a 14 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel, generalmente de aproximadamente 1 * 108 células de TIL a granel. En algunas realizaciones, el medio de crecimiento durante la primera expansión comprende IL-2 o una variante de la misma. En algunas realizaciones, la IL es IL-2 humana recombinante (rhIL-2). En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 20-30 * 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 20-30 * 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 25 * 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 30 * 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 4-8 * 106 UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 5-7 * 106 UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 6 * 106 Ul/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 se prepara como se describe en el Ejemplo 4. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 10.000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 9,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 8,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 7,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2 o aproximadamente 5,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 9,000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 5,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 8,000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 7,000 UI/mL de IL-2, a aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1000 UI/mL, aproximadamente 1500 UI/mL, aproximadamente 2000 UI/mL, aproximadamente 2500 UI/mL, aproximadamente 3000 UI/mL, aproximadamente 3500 UI/mL, aproximadamente 4000 UI/mL, aproximadamente 4500 UI/mL, aproximadamente 5000 UI/mL, aproximadamente 5500 UI/mL, aproximadamente 6000 UI/mL, aproximadamente 6500 UI/mL, aproximadamente 7000 UI/mL, aproximadamente 7500 UI/mL o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 1000 y 2000 UI/mL, entre 2000 y 3000 UI/mL, entre 3000 y 4000 UI/mL, entre 4000 y 5000 UI/mL, entre 5000 y 6000 UI/mL, entre 6000 y 7000 UI/mL, entre 7000 y 8000 UI/mL, o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2.
En algunas realizaciones, la primera expansión se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista OKT-3, IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB. Por ejemplo, el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL se complementa con OKT3, IL-15, un anticuerpo agonista de OX40, un anticuerpo agonista de 4-1BB, una combinación de OKT3 e IL-15, una combinación de OKT3 y un anticuerpo agonista de OX40, una combinación de OKT3 y un anticuerpo agonista de 4-1BB, una combinación de iL-15 y un anticuerpo agonista de OX40, una combinación de IL-15 y un anticuerpo agonista de 4-1BB, una combinación de un anticuerpo agonista de OX40 y un anticuerpo agonista de 4-1BB, una combinación de OKT3, IL-15 y un anticuerpo agonista de OX40, una combinación de OKT3, IL-15 y un anticuerpo agonista de 4-1BB, una combinación de OKT3, un anticuerpo agonista de OX40 y un anticuerpo agonista de 4-1BB, una combinación de IL-15, un anticuerpo agonista de OX40 y un anticuerpo agonista de 4-1BB, una combinación de OKT3, IL-15, un anticuerpo agonista de OX40 y un anticuerpo agonista de 4-1BB, y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, IL-15 no está incluida.
Después de obtener los fragmentos de tumor de biopsia pequeña, biopsia con aguja gruesa o aspirado con aguja fina, por ejemplo, como se describe en la etapa A de la Figura 7A, las células resultantes se cultivan en suero que contiene lL-2 en condiciones que favorecen el crecimiento de los TIL sobre el tumor y otras células. En algunas realizaciones, los fragmentos de tumor se incuban en pocillos de 2 mL en medios que comprenden suero AB humano inactivado con 6000 UI/mL de IL-2. Esta población de células primarias se cultiva durante un período de días, generalmente de 1 a 19 días, lo que da como resultado una población de los TIL de igual o aproximadamente 5 * 107 (es decir, 50 millones) de células de TIL al menos entre el día 11 y el día 19. Esta población de células primarias se puede cultivar durante un período de 1 a 18 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel de igual o aproximadamente 5 * 107 (es decir, 50 millones) de células de TIL al menos el día 18. Esta población de células primarias se puede cultivar durante un período de 1 a 17 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel de igual o aproximadamente 5 * 107 (es decir, 50 millones) de células de TIL al menos el día 17. Esta población de células primarias se puede cultivar durante un período de 1 a 16 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel de igual o aproximadamente 5 * 107 (es decir, 50 millones) de células de TIL al menos el día 16. Esta población de células primarias se puede cultivar durante un período de 1 a 15 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel de igual o aproximadamente 5 * 107 (es decir, 50 millones) de células de TIL al menos el día 15. Esta población de células primarias se puede cultivar durante un período de 1 a 14 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel de igual o aproximadamente 5 * 107 (es decir, 50 millones) de células de TIL al menos el día 14. Esta población de células primarias se puede cultivar durante un período de 1 a 13 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel de igual o aproximadamente 5 * 107 (es decir, 50 millones) de células de TIL al menos el día 13. Esta población de células primarias se puede cultivar durante un período de 1 a 12 días, lo que da como resultado una población de los TlL a granel de igual o aproximadamente 5 * 107 (es decir, 50 millones) de células de TlL al menos el día 12. Esta población de células primarias se puede cultivar durante un período de 1 a 11 días, lo que da como resultado una población de los TlL a granel de igual o aproximadamente 5 * 107 (es decir, 50 millones) de células de TlL al menos el día 11. La población de los TlL puede ser de igual o aproximadamente 5 * 107 (es decir, 50 millones) de células de TlL al final de la primera etapa de expansión (por ejemplo, como los descritos en la etapa B de la Figura 7, que pueden incluir procesos denominados pre-REP).
En una realización preferida, la expansión de los TIL se puede realizar utilizando una etapa inicial de expansión de los TIL a granel (por ejemplo, como los descritos en la etapa B de la Figura 7, que pueden incluir procesos denominados pre-REP) como se describe a continuación y en el presente documento, seguido de una segunda expansión (Etapa D, que incluye procesos denominados etapas de protocolo de expansión rápida (REP)) como se describe a continuación en la etapa D y en el presente documento, seguido de criopreservación opcional, y seguido de una segunda Etapa D (que incluye procesos denominados etapas de reestimulación REP) como se describe a continuación y en el presente documento. Los TIL obtenidos a partir de este proceso pueden caracterizarse opcionalmente por características fenotípicas y parámetros metabólicos como se divulga en el presente documento.
En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión se denomina "CM", una abreviatura de medio de cultivo. En algunas realizaciones, el CM para la etapa B consiste en RPMI 1640 con GlutaMAX, complementado con 10 % de suero AB humano, 25 mM de Hepes y 10 mg/mL de gentamicina. En realizaciones en las que los cultivos se inician en matraces permeables a los gases con una capacidad de 40 mL y un fondo de silicio permeable a los gases con un diámetro de 10 cm2(por ejemplo, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN), cada matraz se cargó con 1-2 biopsias con aguja gruesa en 10-40 mL de CM con IL-2. Tanto la placa G-Rex10 como la de 24 pocillos se incubaron en una incubadora humidificada a 37 °C en 5 % de CO2 y 5 días después de iniciar el cultivo, se extrajo la mitad del medio y se reemplazó con CM fresco e IL-2 y después del día 2, la mitad del medio se cambió cada 2-3 días. En algunas realizaciones, cuando la biopsia con aguja gruesa proviene de un tumor de ovario(porejemplo, de origen de ovario), las biopsias con aguja gruesa se incuban en CM e IL-2 durante 1-2 días. En algunas realizaciones, cuando la biopsia con aguja gruesa proviene de células tumorales de páncreas (por ejemplo, de origen pancreático), las biopsias con aguja gruesa se incuban en CM e IL-2/IL-15/IL-21 durante 1-2 días. En algunas realizaciones, en el día 3, se agregan OKT3 y células alimentadoras a las biopsias con aguja gruesa. En algunas realizaciones, el día 3, 30 ng de OKT3 y 106 células alimentadoras se agregan a las biopsias con aguja gruesa.
Los pequeños fragmentos o biopsias con aguja gruesa se cultivan en suero que contiene IL-2 en condiciones que favorecen el crecimiento de los TIL sobre el tumor y otras células. En algunas realizaciones, los fragmentos de biopsia pequeña o las biopsias con aguja gruesa se incuban en pocillos de 2 mL en medios que comprenden suero AB humano inactivado (o, en algunos casos, como se divulga en el presente documento, en presencia de una población de células aAPC) con 6000 UI/mL de IL-2. Esta población de células primarias se cultiva durante un período de días, generalmente de 1 a 19 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel, de igual o aproximadamente 5 * 107 células de TIL en el día 11. En algunas realizaciones, el medio de crecimiento durante la primera expansión comprende IL-2 o una variante de la misma. En algunas realizaciones, la IL es IL-2 humana recombinante (rhIL-2). En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 20-30 * 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 20 * 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 25 * 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 30 * 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 4-8 * 106 UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 5-7 * 106 UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 6 * 106 UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 se prepara como se describe en el Ejemplo E. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 10.000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 9,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 8,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 7,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2 o aproximadamente 5,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 9,000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 5,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 8,000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 7,000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1000 UI/mL, aproximadamente 1500 UI/mL, aproximadamente 2000 UI/mL, aproximadamente 2500 UI/mL, aproximadamente 3000 UI/mL, aproximadamente 3500 UI/mL, aproximadamente 4000 UI/mL, aproximadamente 4500 UI/mL, aproximadamente 5000 UI/mL, aproximadamente 5500 UI/mL, aproximadamente 6000 UI/mL, aproximadamente 6500 UI/mL, aproximadamente 7000 UI/mL, aproximadamente 7500 UI/mL o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 1000 y 2000 UI/mL, entre 2000 y 3000 UI/mL, entre 3000 y 4000 UI/mL, entre 4000 y 5000 UI/mL, entre 5000 y 6000 UI/mL, entre 6000 y 7000 UI/mL, entre 7000 y 8000 UI/mL, o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2.
En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 500 UI/mL de IL-15, aproximadamente 400 UI/mL de IL-15, aproximadamente 300 UI/mL de IL-15, aproximadamente 200 UI/mL de IL-15, aproximadamente 180 UI/mL de IL-15, aproximadamente 160 UI/mL de IL-15, aproximadamente 140 UI/mL de IL-15, aproximadamente 120 UI/mL de IL-15 o aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 500 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 400 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 300 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 200 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-15. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, se incluye IL-15 cuando las biopsias con aguja gruesa provienen de un tumor pancreático(porejemplo, de origen pancreático).
En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 20 UI/mL de IL-21, aproximadamente 15 UI/mL de IL-21, aproximadamente 12 UI/mL de IL-21, aproximadamente 10 UI/mL de IL-21, aproximadamente 5 UI/mL de IL-21, aproximadamente 4 UI/mL de IL-21, aproximadamente 3 UI/mL de IL-21, aproximadamente 2 UI/mL de IL-21, aproximadamente 1 UI/mL de IL-21 o aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 20 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 15 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 12 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 10 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 5 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 2 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-21. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, se incluye IL-21 cuando las biopsias con aguja gruesa provienen de un tumor pancreático (por ejemplo, de origen pancreático).
En una realización, el medio de cultivo celular comprende el anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 30 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0.1 ng/mL, aproximadamente 0.5 ng/mL, aproximadamente 1 ng/mL, aproximadamente 2.5 ng/mL, aproximadamente 5 ng/mL, aproximadamente 7.5 ng/mL, aproximadamente 10 ng/mL, aproximadamente 15 ng/mL, aproximadamente 20 ng/mL, aproximadamente 25 ng/mL, aproximadamente 30 ng/mL, aproximadamente 35 ng/mL, aproximadamente 40 ng/mL, aproximadamente 50 ng/mL, aproximadamente 60 ng/mL, aproximadamente 70 ng/mL, aproximadamente 80 ng/mL, aproximadamente 90 ng/mL, aproximadamente 100 ng/mL, aproximadamente 200 ng/mL, aproximadamente 500 ng/mL y aproximadamente 1 pg/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 0.1 ng/mL y 1 ng/mL, entre 1 ng/mL y 5 ng/mL, entre 5 ng/mL y 10 ng/mL, entre 10 ng/mL y 20 ng /mL, entre 20 ng/mL y 30 ng/mL, entre 30 ng/mL y 40 ng/mL, entre 40 ng/mL y 50 ng/mL, y entre 50 ng/mL y 100 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular no comprende el anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el anticuerpo OKT-3 es muromonab.
Tabla 3: Secuencias de aminoácidos de muromonab (anticuerpo OKT-3 ejemplar)
En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende uno o más agonistas de TNFRSF en un medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF es un agonista de 4-1BB, y el agonista de 4-1BB se selecciona del grupo que consiste en urelumab, utomilumab, EU-101, una proteína de fusión y fragmentos, derivados, variantes, biosimilares y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF se agrega a una concentración suficiente para lograr una concentración en el medio de cultivo celular de entre 0.1 |jg/mL y 100 |jg/mL En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF se agrega a una concentración suficiente para lograr una concentración en el medio de cultivo celular de entre 20 jg/m L y 40 jg/mL.
En algunas realizaciones, además de uno o más agonistas de TNFRSF, el medio de cultivo celular comprende además IL-2 a una concentración inicial de aproximadamente 3000 UI/mL y anticuerpo OKT-3 a una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL, y en donde el uno o más agonistas de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB.
En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión se denomina "CM", una abreviatura de medio de cultivo. En algunas realizaciones, se denomina CM1 (medio de cultivo 1). En algunas realizaciones, CM consiste en RPMI 1640 con GlutaMAX, complementado con 10 % de suero AB humano, 25 mM de Hepes y 10 mg/mL de gentamicina. En realizaciones en las que los cultivos se inician en matraces permeables a los gases con una capacidad de 40 mL y un fondo de silicio permeable a los gases con un diámetro de 10 cm2 (por ejemplo, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN). En algunas realizaciones, el CM es el CM1 descrito en los Ejemplos, véase, Ejemplo 1. En algunas realizaciones, la primera expansión ocurre en un medio de cultivo celular inicial o un primer medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular inicial o el primer medio de cultivo celular comprende IL-2.
El primer proceso de expansión (incluyendo procesos como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 7, que pueden incluir aquellos a los que a veces se hace referencia como el pre-REP) puede durar aproximadamente 1-19 días, un período de tiempo suficiente para obtener 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL, como se analiza en los ejemplos y las figuras. La primera expansión (incluyendo procesos como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 7, que pueden incluir los que a veces se denominan pre-REP) puede dividirse en dos fases, de 1-2 días y de 3 a 19 días, como se indica en las Figuras 7 y 38. La primera expansión de la etapa B se puede dividir en dos fases, de 1-2 días (cultivado con IL-2 o IL2/IL-15/IL-21) y de 3 a 19 días (cultivado con OKT3 y alimentadores), como se muestra en las Figuras 7 y 38.
En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, para obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 1 día a 19 días, para obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 2 días a 19 días, para obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 3 días a 19 días, para obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 6 días a 19 días, para obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 7 días a 19 días, para obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 8 días a 19 días, para obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 9 días a 19 días, para obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 10 días a 19 días, para obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 11 días a 19 días, con el fin de obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 12 días a 19 días, para obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 13 días a 19 días, con el fin de obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 16 días, con el fin de obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 17 días, con el fin de obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 18 días, con el fin de obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 19 días, con el fin de obtener al menos 5 * 107 (es decir, 50 millones) de los TIL. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña (por ejemplo, la muestra de biopsia con aguja gruesa se extrae del cultivo aproximadamente el día 1, 2 o 3. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña (por ejemplo, la biopsia con aguja gruesa) se extrae del cultivo el día 3.
En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 como combinación durante la primera expansión. En algunas realizaciones, IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 así como cualquier combinación de las mismas se pueden incluir durante la primera expansión, incluyendo, por ejemplo, durante un proceso de la etapa B de acuerdo con la Figura 7, así como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 como combinación durante la primera expansión. En algunas realizaciones, IL-2, IL-15 e IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, se pueden incluir durante los procesos de la etapa B de acuerdo con la Figura 7 y como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, se agrega IL-15 y/o IL-21 el día 1. En algunas realizaciones, se agrega IL-15 y/o IL-21 el día 1 si la biopsia con aguja gruesa es de un tumor pancreático (por ejemplo, de origen pancreático). En algunas realizaciones, IL-15 no está incluida. En algunas realizaciones, IL-21 no está incluida. En algunas realizaciones, no se incluyen ni IL-15 ni IL-21.
En algunas realizaciones, la primera expansión, por ejemplo, la etapa B de acuerdo con la Figura 7, se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de los TIL, como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un solo biorreactor. En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un GREX-10 o un GREX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor de sistema cerrado es un biorreactor único.
En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL genera al menos 50 * 106 TIL, por ejemplo, 50 * 106 (es decir, 5 * 107), 55 * 106, 60 * 106, 65 * 106, 70 * 106, 75 * 106, 80 * 106, 85 * 106, 90 * 106, 95 * 106, 100 * 106, 105 * 106, 110 * 106, 115 * 106, 120 * 106, 125 * 106, 150 * 106, 200 * 106, 300 * 106, 400 * 106, o más.
C. Etapa C: Transición de la primera expansión a la segunda expansión
En algunos casos, la población de los TIL a granel obtenida de la primera expansión, incluida, por ejemplo, la población de los TIL obtenida, por ejemplo, de la etapa B como se indica en la Figura 7, se puede criopreservar inmediatamente, utilizando los protocolos que se analizan a continuación. Como alternativa, la población de los TIL obtenida de la primera expansión, denominada segunda población de los TIL, puede someterse a una segunda expansión (que puede incluir expansiones a veces denominadas REP) y luego criopreservarse como se analiza a continuación. De manera similar, en el caso en que se utilizarán TIL modificados genéticamente en terapia, la primera población de los TIL (a veces denominada población de los TIL a granel) o la segunda población de los TIL (que en algunas realizaciones puede incluir poblaciones denominadas poblaciones de los TIL REP) pueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados antes de la expansión o después de la primera expansión y antes de la segunda expansión.
En algunas realizaciones, los TIL obtenidos de la primera expansión (por ejemplo, de la etapa B como se indica en la Figura 7) se almacenan hasta que se fenotipifican para su selección. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos de la primera expansión (por ejemplo, de la etapa B como se indica en la Figura 7) no se almacenan y proceden directamente a la segunda expansión. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos de la primera expansión no se criopreservan después de la primera expansión y antes de la segunda expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente a los 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días o 19 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 3 y 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 4 y 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 4 y 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 7 y 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 10 y 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 11 y 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 12 y 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 13 y 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 14 y 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 15 y 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 16 y 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 17 y 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 18 y 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente 10 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente 11 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente 12 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente 13 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente 14 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente 15 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente 16 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente 17 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente 18 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente 19 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa al medio de cultivo para la primera expansión.
En algunas realizaciones, los TIL no se almacenan después de la primera expansión y antes de la segunda expansión, y los TIL proceden directamente a la segunda expansión (por ejemplo, en algunas realizaciones, no hay almacenamiento durante la transición de la etapa B a la Etapa D como se muestra en la Figura 7). En algunas realizaciones, la transición ocurre en un sistema cerrado, como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, los TIL de la primera expansión, la segunda población de los TIL, proceden directamente a la segunda expansión sin período de transición.
En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión, por ejemplo, la etapa C de acuerdo con la Figura 7, se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de los TIL, como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un solo biorreactor. En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un GREX-10 o un GREX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor de sistema cerrado es un biorreactor único.
D. Etapa D: Segunda expansión
En algunas realizaciones, la población de células de TIL se expande en número después de la recolección y el procesamiento masivo inicial, por ejemplo, después de la etapa A y la etapa B, y la transición denominada Etapa C, como se indica en la Figura 7). Esta expansión adicional se denomina en el presente documento segunda expansión, que puede incluir procesos de expansión generalmente denominados en la técnica como proceso de expansión rápida (REP; así como procesos como los indicados en la etapa D de la Figura 7). La segunda expansión generalmente se logra utilizando un medio de cultivo que comprende varios componentes, incluidas células alimentadoras, una fuente de citocinas y un anticuerpo anti-CD3, en un recipiente permeable al gas.
En algunas realizaciones, la segunda expansión o segunda expansión de los TIL (que puede incluir expansiones a veces denominadas REP; así como procesos como los indicados en la etapa D de la Figura 7) de los TIL se puede realizar utilizando cualquier matraz o recipiente de los TIL conocido por aquellos expertos en la materia. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante 10 días, 11 días o 12 días.
En una realización, la segunda expansión se puede realizar en un recipiente permeable al gas utilizando los métodos de la presente divulgación (incluyendo, por ejemplo, expansiones denominadas REP; así como procesos como los indicados en la etapa D de la Figura 7). Por ejemplo, los TIL pueden expandirse rápidamente mediante la estimulación no específica del receptor de células T en presencia de interleucina-2 (IL-2) o interleucina-15 (IL-15). El estímulo del receptor de células T no específico puede incluir, por ejemplo, aproximadamente 30 ng/mL de OKT3, un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD3 (disponible comercialmente en Ortho-McNeil, Raritan, NJ o Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Los TIL se pueden expandir para inducir una mayor estimulación de los TILin vitromediante la inclusión de uno o más antígenos durante la segunda expansión, incluidas porciones antigénicas de los mismos, tales como epítopos, del cáncer, que pueden expresarse opcionalmente a partir de un vector, tal como un péptido de unión al antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), por ejemplo, 0.3 pM de MART-1:26-35 (27 L) o gpl 00:209-217 (210 M), opcionalmente en presencia de un factor de crecimiento de células T, como 300 UI/mLde IL-2 o IL-15. Otros antígenos adecuados pueden incluir, por ejemplo, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, antígeno de cáncer de tirosinasa, MAGE-A3, SSX-2 y VEGFR2, o porciones antigénicas de los mismos. Los TIL también puede expandirse rápidamente mediante la reestimulación con el(los) mismo(s) antígeno(s) del cáncer aplicados a las células presentadoras de antígeno que expresan HLA-A2. Como alternativa, los TIL pueden volver a estimularse, por ejemplo, con linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2. En algunos métodos divulgados en el presente documento, la reestimulación se produce como parte de la segunda expansión. En algunas realizaciones, la segunda expansión ocurre en presencia de linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2. En algunas realizaciones, se agregan 13 * 106 células alimentadoras durante la segunda expansión. En algunas realizaciones, se agregan 13 * 106 células alimentadoras al comienzo de la segunda expansión.
En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1000 UI/mL, aproximadamente 1500 UI/mL, aproximadamente 2000 UI/mL, aproximadamente 2500 UI/mL, aproximadamente 3000 UI/mL, aproximadamente 3500 UI/mL, aproximadamente 4000 UI/mL, aproximadamente 4500 UI/mL, aproximadamente 5000 UI/mL, aproximadamente 5500 UI/mL, aproximadamente 6000 UI/mL, aproximadamente 6500 UI/mL, aproximadamente 7000 UI/mL, aproximadamente 7500 UI/mL o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 1000 y 2000 UI/mL, entre 2000 y 3000 UI/mL, entre 3000 y 4000 UI/mL, entre 4000 y 5000 UI/mL, entre 5000 y 6000 UI/mL, entre 6000 y 7000 UI/mL, entre 7000 y 8000 UI/mL, o entre 8000 UI/mL de IL-2.
En una realización, el medio de cultivo celular comprende el anticuerpo OKT3. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 30 ng/mL de anticuerpo OKT3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0.1 ng/mL, aproximadamente 0.5 ng/mL, aproximadamente 1 ng/mL, aproximadamente 2.5 ng/mL, aproximadamente 5 ng/mL, aproximadamente 7.5 ng/mL, aproximadamente 10 ng/mL, aproximadamente 15 ng/mL, aproximadamente 20 ng/mL, aproximadamente 25 ng/mL, aproximadamente 30 ng/mL, aproximadamente 35 ng/mL, aproximadamente 40 ng/mL, aproximadamente 50 ng/mL, aproximadamente 60 ng/mL, aproximadamente 70 ng/mL, aproximadamente 80 ng/mL, aproximadamente 90 ng/mL, aproximadamente 100 ng/mL, aproximadamente 200 ng/mL, aproximadamente 500 ng/mL y aproximadamente 1 pg/mL de anticuerpo OKT3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 0.1 ng/mL y 1 ng/mL, entre 1 ng/mL y 5 ng/mL, entre 5 ng/mL y 10 ng/mL, entre 10 ng/mL y 20 ng /mL, entre 20 ng/mL y 30 ng/mL, entre 30 ng/mL y 40 ng/mL, entre 40 ng/mL y 50 ng/mL, y entre 50 ng/mL y 100 ng/mL de anticuerpo OKT3.
En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 como combinación durante la segunda expansión. En algunas realizaciones, IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 así como cualquier combinación de las mismas se pueden incluir durante la segunda expansión, incluyendo, por ejemplo, durante un proceso de la etapa D de acuerdo con la Figura 7, así como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 como combinación durante la segunda expansión. En algunas realizaciones, IL-2, IL-15 e IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, se pueden incluir durante los procesos de la etapa D de acuerdo con la Figura 7 y como se divulga en el presente documento.
En algunas realizaciones, la segunda expansión se puede realizar en un medio de cultivo celular complementado que comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, la segunda expansión ocurre en un medio de cultivo celular complementado. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular complementado comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC; también denominadas en el presente documento células alimentadoras presentadoras de antígeno, células alimentadoras o alimentadores). En algunas realizaciones, la segunda expansión ocurre en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno (es decir, células presentadoras de antígeno).
En algunas realizaciones, la segunda expansión se realiza complementando aún más el medio de cultivo celular de la población de los TIL en la segunda expansión con anticuerpo agonista IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB (a veces denominado segunda población de los TIL). Por ejemplo, el medio de cultivo celular de la población de los TIL en la segunda expansión se complementa con IL-15, un anticuerpo agonista de OX40, un anticuerpo agonista de 4-1BB, una combinación de IL-15 y un anticuerpo agonista de OX40, una combinación de IL-15 y un anticuerpo agonista de 4-1BB, una combinación de un anticuerpo agonista de OX40 y un anticuerpo agonista de 4-1BB, una combinación de IL-15, un anticuerpo agonista de OX40 y un anticuerpo agonista de 4-1BB, y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, se incluye OX40 cuando las biopsias con aguja gruesa provienen de un tumor de ovario (por ejemplo, de origen de ovario). En algunas realizaciones, OKT-3 se agrega durante la primera y/o segunda expansión. En algunas realizaciones, se agrega OKT-3 el día 3, junto con las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC). En algunas realizaciones, cuando la muestra proviene de un FNA, se agrega OKT-3 el día 1, junto con las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC).
En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC) son PBMC. En una realización, la relación de los TIL a PBMC y/o células presentadoras de antígeno en la expansión rápida y/o la segunda expansión es de aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 125, aproximadamente 1 a 150, aproximadamente 1 a 175, aproximadamente 1 a 200, aproximadamente 1 a 225, aproximadamente 1 a 250, aproximadamente 1 a 275, aproximadamente 1 a 300, aproximadamente 1 a 325, aproximadamente 1 a 350, aproximadamente 1 a 375, aproximadamente 1 a 400 o aproximadamente 1 a 500. En una realización, la relación de los TIL a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión es entre 1 a 50 y 1 a 300. En una realización, la relación de los TIL a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión es entre 1 a 100 y 1 a 200.
En una realización, el REP y/o la segunda expansión se realizan en matraces con los TIL a granel mezclados con un exceso de 100 o 200 veces de células alimentadoras inactivadas, 30 mg/mL de anticuerpo anti-CD3
OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2 en 150 mL de medio. Se realiza el reemplazo del medio (generalmente 2/3 del medio mediante respiración con medio fresco) hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa. Las cámaras de crecimiento alternativas incluyen matraces GREX y recipientes permeables a los gases, como se analiza con más detalle a continuación.
La segunda expansión (que puede incluir procesos denominados proceso REP) puede durar entre 11 y 14 días, como se analiza en los ejemplos y las figuras. En algunas realizaciones, la segunda expansión es de 11 días.
En algunas realizaciones, la segunda expansión es de 12 días.
En una realización, el REP y/o la segunda expansión se pueden realizar utilizando matraces T-175 y bolsas permeables a los gases como se describió anteriormente (Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) o recipientes de cultivo permeables a los gases (matraces G-Rex). En algunas realizaciones, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas expansiones rápidas) se realiza en matraces T-175 y se pueden añadir aproximadamente 1 * 106 TIL suspendidos en 150 mL de medio a cada matraz T-175. Los TIL pueden cultivarse en una mezcla 1 a 1 de medio CM y AIM-V, complementada con 3000 UI por mL de IL-2 y 30 ng por mL de anti-CD3. Los matraces T-175 pueden incubarse a 37° C en 5
% de CO2. La mitad del medio se puede intercambiar el día 5 utilizando medio 50/50 con 3000 UI por mL de IL-2. En algunas realizaciones, el día 7, las células de dos matraces T-175 se pueden combinar en una bolsa de
3 L y se agregaron 300 mL de AIM V con 5 % de suero AB humano y 3000 UI por mL de IL-2 a los 300 mL de suspensión de los TIL. El número de células en cada bolsa se contó cada día o cada dos días y se agregó medio fresco para mantener el recuento de células entre 0.5 y 2.0 * 106 células/mL.
En una realización, la segunda expansión (que puede incluir expansiones denominadas REP, así como aquellas a las que se hace referencia en la etapa D de la Figura 7) se puede realizar en matraces permeables a los gases con una capacidad de 500 mL con fondos de silicio permeables a los gases de 100 cm (G-Rex 100, disponible comercialmente en Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, EE. UU.), 5 * 106 o
10 * 106 TIL se pueden cultivar con PBMC en 400 mL de medio 50/50, complementado con 5 % de suero AB humano, 3000 Ui por mL de IL-2 y 30 ng por mL de anti-CD3 (OKT3). Los matraces G-Rex 100 se pueden incubar a 37 °C en 5 % de CO2. El día 5, se pueden retirar 250 mL de sobrenadante y colocarlos en matraces para centrífuga y centrifugarlos a 1500 rpm (491 * g) durante 10 minutos. Los sedimentos de los TIL pueden resuspenderse con 150 mLde medio fresco con 5 % de suero AB humano, 3000 UI por mLde IL-2 y agregarse nuevamente a los matraces G-Rex 100 originales. Cuando los TIL se expanden en serie en matraces G-Rex
100, el día 7 los TIL de cada G-Rex 100 se pueden suspender en los 300 mL de medio presente en cada matraz y la suspensión celular se puede dividir en 3 alícuotas de 100 mL que se pueden usar para sembrar 3 matraces
G-Rex 100. Luego se pueden agregar 150 mL de AIM-V con 5 % de suero AB humano y 3000 UI por mL de IL-2 a cada matraz. Los matraces G-Rex 100 pueden incubarse a 37 °C en 5 % de CO2 y después de 4 días se pueden agregar 150 mL de AIM-V con 3000 UI por mL de IL-2 a cada matraz G-Rex 100. Las células pueden recolectarse el día 11 de cultivo. Las células pueden recolectarse el día 12 de cultivo. En algunas realizaciones, los cultivos se expanden en un G-Rex 500.
En una realización, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) se realiza en matraces con los TIL a granel mezclados con un exceso de 100 o 200 veces de células alimentadoras inactivadas, 30 mg/mL de anticuerpo anti-CD3 OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2 en 150 mL de medio. En algunas realizaciones, el reemplazo del medio se realiza hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa.
En algunas realizaciones, 2/3 del medio se reemplazan mediante aspirado del medio gastado y reemplazo con un volumen equivalente de medio nuevo. En algunas realizaciones, las cámaras de crecimiento alternativas incluyen matraces GRex y recipientes permeables a los gases, como se analiza con más detalle a continuación.
En una realización, se realiza la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) y comprende además una etapa en donde se seleccionan TIL para una reactividad tumoral superior. Se puede utilizar cualquier método de selección conocido en la técnica. Por ejemplo, los métodos descritos en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2016/0010058 A1, puede utilizarse para la selección de los TIL para una reactividad tumoral superior.
Opcionalmente, se puede realizar un ensayo de viabilidad celular después de la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas expansión REP), utilizando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de exclusión de azul tripán en una muestra de los TIL a granel, que marca selectivamente las células muertas y permite una evaluación de la viabilidad. En algunas realizaciones, las muestras de los TIL se pueden contar y determinar la viabilidad utilizando un contador de células automatizado Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). En algunas realizaciones, la viabilidad se determina de acuerdo con el protocolo del contador celular automático del citómetro de imágenes Cellometer K2.
En algunas realizaciones, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) de los TIL se puede realizar utilizando matraces T-175 y bolsas permeables a los gases como se describió anteriormente (Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31: 742-751, y Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J. Inmunother., 26: 332-342) o matraces G-Rex permeables a los gases. En algunas realizaciones, la segunda expansión se realiza utilizando matraces. En algunas realizaciones, la segunda expansión se realiza utilizando matraces G-Rex permeables a los gases. En algunas realizaciones, la segunda expansión se realiza en matraces T-175 y se suspenden aproximadamente 1 * 106 TIL en aproximadamente 150 mL de medio y esto se agrega a cada matraz T-175. Los TIL se cultivan con PBMC alogénicas irradiadas (50 Gy) como células "alimentadoras" en una proporción de 1 a 100 y las células se cultivaron en una mezcla 1 a 1 de CM y medio AIM-V (medio 50/50), complementado con 3000 UI/mL de IL-2 y 30 ng/mL de anti-CD3. Los matraces T-175 se incuban a 37 °C en 5 % de CO2. En algunas realizaciones, la mitad del medio se cambia el día 5 utilizando medio 50/50 con 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el día 7, las células de 2 matraces T-175 se combinan en una bolsa de 3 L y se agregan 300 mL de AIM-V con 5 % de suero AB humano y 3000 UI/mL de IL-2 a los 300 mL de suspensión de los TIL. La cantidad de células en cada bolsa se puede contar cada día o cada dos días y se puede agregar medio fresco para mantener el recuento de células entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 2.0 * 106 células/mL. En algunas realizaciones, los cultivos se expanden en un G-Rex 500.
En algunas realizaciones, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) se realizan en matraces de 500 mL con fondos de silicio permeables a los gases con diámetro de 100 cm2 (G-Rex100, Wilson Wolf) (Fig. 1), aproximadamente 5 * 106 o 10 * 106 TIL se cultivan con PBMC alogénicas irradiadas en una proporción de 1 a 100 en 400 mL de medio 50/50, complementado con 3000 UI/mL de IL-2 y 30 ng/mL de anti-CD3. Los matraces G-Rex100 se incuban a 37 °C en 5 % de CO2. En algunas realizaciones, el día 5, se extraen 250 mL de sobrenadante y se colocan en botellas de centrífuga y se centrifugan a 1500 rpm (491 * g) durante 10 minutos. Luego, los sedimentos de los TIL se pueden resuspender con 150 mL de medio fresco 50/50 con 3000 UI/mL de IL-2 y agregar nuevamente a los matraces G-Rex100 originales. En las realizaciones en las que los TIL se expanden en serie en matraces G-Rex100, el día 7 los TIL en cada G-Rex100 se suspenden en los 300 mL de medio presente en cada matraz y la suspensión celular se dividió en tres alícuotas de 100 mL que se utilizan para sembrar 3 matraces G-Rex100. Luego se agregan a cada matraz 150 mL de AIM-V con 5 % de suero AB humano y 3000 UI/mL de IL-2. Los matraces G-Rex100 se incuban a 37 °C en 5 % de CO2 y después de 4 días se agregan 150 mL de AIM-V con 3000 UI/mL de IL-2 a cada matraz G-Rex100. Las células se recolectan el día 14 de cultivo. En algunas realizaciones, los cultivos se expanden en un G-Rex 500.
En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión (por ejemplo, a veces denominado CM2 o segundo medio de cultivo celular), comprende IL-2, OKT-3, así como las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC), como se analiza con más detalle a continuación.
En algunas realizaciones, la segunda expansión, por ejemplo, la etapa D de acuerdo con la Figura 7, se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de los TIL, como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un solo biorreactor. En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un GREX-10 o un GREX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor de sistema cerrado es un biorreactor único.
1. Células alimentadoras y células presentadoras de antígeno
En una realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento (por ejemplo, incluyendo expansiones tales como las descritas en la etapa D de la Figura 7, así como aquellas denominadas REP) requieren un exceso de células alimentadoras durante la expansión de REP TIL y/o durante la segunda expansión. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas a partir de unidades de sangre completa estándar de donantes de sangre sanos. Las PBMC se obtienen utilizando métodos estándar como la separación por gradiente de Ficoll-Paque.
En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos REP, como se describe en los ejemplos, en particular el Ejemplo 4, que proporciona un protocolo ejemplar para evaluar la incompetencia de replicación de las PBMC alogénicas irradiadas.
En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de los TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables en el día 14 es menor que el número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión (es decir, día de inicio de la segunda expansión). Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 3 y/o 4.
En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de los TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado con respecto al número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión). En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2. Véanse, por ejemplo, los Ejemplos 3 y/o 4.
En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de los TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado con respecto al número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión). En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 5-60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 1000-6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBM<c>se cultivan en presencia de 10-50 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2000-5000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 20-40 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2000-4000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 25-35 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2500-3500 UI/mL de IL-2.
En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son PBMC. En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son células alimentadoras presentadoras de antígeno artificiales. En una realización, la relación de los TIL con respecto a células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 125, aproximadamente 1 a 150, aproximadamente 1 a 175, aproximadamente 1 a 200, aproximadamente 1 a 225, aproximadamente 1 a 250, aproximadamente 1 a 275, aproximadamente 1 a 300, aproximadamente 1 a 325, aproximadamente 1 a 350, aproximadamente 1 a 375, aproximadamente 1 a 400 o aproximadamente 1 a 500. En una realización, la relación de los TIL con respecto a células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es entre 1 a 50 y 1 a 300. En una realización, la relación de los TIL con respecto a células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es entre 1 a 100 y 1 a 200.
En una realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren un exceso de células alimentadoras durante la segunda expansión. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas a partir de unidades de sangre completa estándar de donantes de sangre sanos. Las PBMC se obtienen utilizando métodos estándar como la separación por gradiente de Ficoll-Paque. En una realización, se utilizan células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) en lugar de PBMC.
En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos de expansión de los TIL descritos en el presente documento, incluidos los procedimientos ejemplares descritos, por ejemplo, en la Figura 7.
En una realización, se utilizan células presentadoras de antígeno artificiales en la segunda expansión como reemplazo de, o en combinación con, PBMC.
Los métodos de expansión descritos en el presente documento generalmente utilizan medios de cultivo con altas dosis de una citocina, en particular IL-2, como se conoce en la técnica.
Como alternativa, también es posible utilizar combinaciones de citocinas para la expansión rápida y/o segunda expansión de los TIL, con combinaciones de dos o más de IL-2, IL-15 e<i>L-21, como se describe generalmente en la publicación internacional No. WO 2015/189356 y la publicación internacional No. WO 2015/189357. Por lo tanto, las combinaciones posibles incluyen IL-2 e IL-15, IL-2 e IL-21, IL-15 e IL-21 e IL-2, IL-15 e IL-21, siendo esta última particularmente útil en muchas realizaciones. El uso de combinaciones de citocinas favorece específicamente la generación de linfocitos, y en particular de células T como se describe en dicho documento.
E. Etapa E: Recolección de los TIL
Después de la segunda etapa de expansión, se pueden recolectar las células. En algunas realizaciones, los TIL se recolectan después de una, dos, tres, cuatro o más etapas de expansión, por ejemplo, como se proporciona en la Figura 7. En algunas realizaciones, los TIL se recolectan después de dos etapas de expansión, por ejemplo, como se proporciona en la Figura 7.
Los TIL se pueden recolectar de cualquier manera apropiada y estéril, incluso, por ejemplo, mediante centrifugación. Los métodos para la recolección de los TIL son bien conocidos en la técnica y cualquiera de dichos métodos conocidos se puede emplear con el presente proceso. En algunas realizaciones, los TIL se recolectan utilizando un sistema automatizado.
En algunas realizaciones, la recolección, por ejemplo, la etapa E de acuerdo con la Figura 7, se realiza desde un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de los TIL, como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un solo biorreactor. En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un GREX-10 o un GREX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor de sistema cerrado es un biorreactor único.
F. Etapa F: Formulación final/transferencia a bolsa de infusión
Una vez completadas las Etapas A a E, tal como se proporciona en un orden ejemplar en la Figura 7 y como se describe en detalle anteriormente y en el presente documento, las células se transfieren a un recipiente para su uso en la administración a un paciente. En algunas realizaciones, una vez que se obtiene una cantidad terapéuticamente suficiente de los TIL utilizando los métodos de expansión descritos anteriormente, se transfieren a un recipiente para su uso en la administración a un paciente.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que los TIL expandidos utilizando procesos de la presente divulgación se administran a un paciente como una composición farmacéutica. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la composición farmacéutica es una suspensión de los TIL en un tampón estéril. Los TIL expandidos utilizando procesos de la presente divulgación pueden administrarse mediante cualquier vía adecuada como se conoce en la técnica. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que las células T se administran como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura aproximadamente entre 30 y 60 minutos. Otras vías de administración adecuadas incluyen la intraperitoneal, intratecal e intralinfática.
En una realización, los TIL expandidos utilizando procesos de la divulgación anterior pueden ser para administración como composiciones que comprenden además un criopreservante. En una realización, los TIL expandidos utilizando procesos de la divulgación anterior pueden ser para administración como composiciones que comprenden además un criopreservante y un agente isotónico. En una realización, los TIL expandidos utilizando procesos de la divulgación anterior pueden ser para administración como composiciones que comprenden además un criopreservante que comprende dimetilsulfóxido y un agente isotónico que comprende cloruro de sodio, gluconato de sodio y acetato de sodio. En una realización, los TIL expandidos utilizando procesos de la divulgación anterior pueden ser para administración como composiciones que comprenden además un criopreservante que comprende dimetilsulfóxido y dextrano 40 y un agente isotónico que comprende cloruro de sodio, gluconato de sodio y acetato de sodio. En una realización, los TIL expandidos utilizando procesos de la divulgación anterior pueden ser para administración como composiciones suministradas en una bolsa de infusión estéril, comprendiendo dichas composiciones además un criopreservante que comprende dimetilsulfóxido y dextrano 40 y un agente isotónico que comprende cloruro de sodio, gluconato de sodio y acetato de sodio.
1. Composiciones farmacéuticas, dosis y regímenes de dosificación
En una realización, los TIL expandidos utilizando los métodos de la presente divulgación son para administración a un paciente como una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede ser una suspensión de los TIL en un tampón estéril. Los TIL expandidos utilizando procesos de la presente divulgación pueden administrarse mediante cualquier vía adecuada como se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, las células T pueden administrarse como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura aproximadamente entre 30 y 60 minutos. Otras vías de administración adecuadas incluyen la administración intraperitoneal, intratecal e intralinfática.
Se puede administrar cualquier dosis adecuada de los TIL. En algunas realizaciones, se necesita una cantidad terapéuticamente suficiente de los TIL para una dosis adecuada. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que se administran de aproximadamente 2.3 * 1010 hasta aproximadamente 13.7 * 1010 TIL, con un promedio de aproximadamente 7.8 * 1010 TIL, particularmente si el cáncer es melanoma. En una realización, se administran aproximadamente 1.2 * 1010 hasta aproximadamente 4.3 * 1010 TIL. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, aproximadamente que se administran 3 * 1010 hasta aproximadamente 12 * 1010 TIL. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que se administran aproximadamente 4 * 1010 hasta aproximadamente 10 * 1010 TIL. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que se administran aproximadamente 5 * 1010 hasta aproximadamente 8 * 1010 TIL. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que se administran aproximadamente 6 * 1010 hasta aproximadamente 8 * 1010 TIL. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que se administran aproximadamente 7 * 1010 hasta aproximadamente 8 * 1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 2.3 * 1010 hasta aproximadamente 13.7 * 1010. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 7.8 * 1010 TIL, en particular cuando el cáncer es melanoma. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1.2 * 1010 hasta aproximadamente 4.3 * 1010 de los TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 3 * 1010 hasta aproximadamente 12 * 1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 4 * 1010 hasta aproximadamente 10 * 1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 5 * 1010 hasta aproximadamente 8 * 1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 6 * 1010 hasta aproximadamente 8 *
1010 TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 7 * 1010 hasta aproximadamente 8 * 1010 TIL.
En algunas realizaciones, el número de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la
invención es de aproximadamente 1 * 106, 2 * 106, 3 * 106, 4 * 106, 5 * 106, 6 * 106, 7 * 106, 8 * 106, 9 * 106,
1 * 107, 2 * 107, 3 * 107, 4 * 107, 5 * 107, 6 * 107, 7 * 107, 8 * 107, 9 * 107, 1 * 108, 2 * 108, 3 * 108, 4 * 5 * 108, 6 * 108, 7 * 108, 8 * 108, 9 * 108, 1 * 109, 2 * 109, 3 * 109, 4 * 109, 5 * 109, 6 * 109, 7 * 109, 8 * 9 * 109, 1 * 1010, 2 * 1010, 3 * 1010, 4 * 1010, 5 * 1010, 6 * 1010, 7 * 1010, 8 3 * 1011, 4 * 1Q11, 5 * 1011, 6 * 1011, 7 * 1011, 8 * 1011, 9 * 1011, 1 * 1012, 2 * 1012, 3 * 1012, 4 * 1012, 5 * 1012, 6 * 1012, 7 * 1012, 8 * 1012, 9 * 1012, 1 * 1013, 2 * 1013, 3 * 1013, 4 * 1013, 5 * 1013, 6 * 1013, 7 * y 9 * 1013. En una realización, el número de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la
invención está en el intervalo de 1 * 106 hasta 5 * 106, 5 * 106 hasta 1 * 107, 1 * 107 hasta 5 * 107, 5 * 107
hasta 1 * 108, 1 * 108 hasta 5 * 108, 5 * 108 hasta 1 * 109, 1 * 109 hasta 5 * 109, 5 * 109 hasta 1 * 1010, 1 *
1010 hasta 5 * 1010, 5 * 1010 hasta 1 * 1011, 5 * 1011 hasta 1 * 1012, 1 * 1012 hasta 5 * 1012, y 5 * 1012 hasta 1
* 1013 En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1 * 106, 2 * 106, 3
* 106, 4 * 106, 5 * 106, 6 * 106, 7 * 106, 8 * 106, 9 * 106, 1 * 107, 2 * 107, 3 * 107, 4 * 107, 5 * 107, 6 * 1 * 107, 8 * 107, 9 * 107, 1 * 108, 2 * 108, 3 * 108, 4 * 108, 5 * 108, 6 * 108, 7 * 108, 8 * 108, 9 * 108, 1 * 1 * 109, 3 * 109, 4 * 109, 5 * 109, 6 * 109, 7 * 109, 8 * 109, 9 * 109, 1 * 1010, 2 * 1010, 3 6 * 1010, 7 * 1010, 8 * 1010, 9 * 1010, 1 * 1011, 2 * 1011, 3 * 1011, 4 * 1011, 5 * 1011, 6 * 1011, 7 * 9 * 1011, 1 * 1012, 2 * 1012, 3 * 1012, 4 * 1012, 5 * 1012, 6 * 1012, 7 * 1012, 8 * 1012, 9 * 1012, 1 * 1013, 2 * 1013, 3 * 1013, 4 * 1013, 5 * 1013, 6 * 1013, 7 * 1013, 8 * 1013, y 9 * 1013.
En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de
la invención es menor que, por ejemplo, 100 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 19 %, 18
%, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.5 %, 0.4
%, 0.3 %, 0.2 %, 0.1 %, 0.09 %, 0.08 %, 0.07 %, 0.06 %, 0.05 %, 0.04 %, 0.03 %, 0.02 %, 0.01 %, 0.009 %,
0.008 %, 0.007 %, 0.006 %, 0.005 %, 0.004 %, 0.003 %, 0.002 %, 0.001 %, 0.0009 %, 0.0008 %, 0.0007 %,
0.0006 %, 0.0005 %, 0.0004 %, 0.0003 %, 0.0002 % o 0.0001 % p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de
la invención es mayor que 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 19.75 %, 19.50 %, 19.25 % 19
%, 18.75 %, 18.50 %, 18.25 % 18 %, 17.75 %, 17.50 %, 17.25 % 17 %, 16.75 %, 16.50 %, 16.25 % 16 %, 15.75
%, 15.50 %, 15.25 % 15 %, 14.75 %, 14.50 %, 14.25 % 14 %, 13.75 %, 13.50 %, 13.25 % 13 %, 12.75 %, 12.50
%, 12.25 % 12 %, 11.75 %, 11.50 %, 11.25 % 11 %, 10.75 %, 10.50 %, 10.25 % 10 %, 9.75 %, 9.50 %, 9.25 %
9 %, 8.75 %, 8.50 %, 8.25 % 8 %, 7.75 %, 7.50 %, 7.25 % 7 %, 6.75 %, 6.50 %, 6.25 % 6 %, 5.75 %, 5.50 %,
5.25 % 5 %, 4.75 %, 4.50 %, 4.25 %, 4 %, 3.75 %, 3.50 %, 3.25 %, 3 %, 2.75 %, 2.50 %, 2.25 %, 2 %, 1.75 %,
1.50 %, 1.25 %, 1 %, 0.5 %, 0.4 %, 0.3 %, 0.2 %, 0.1 %, 0.09 %, 0.08 %, 0.07 %, 0.06 %, 0.05 %, 0.04 %, 0.03
%, 0.02 %, 0.01 %, 0.009 %, 0.008 %, 0.007 %, 0.006 %, 0.005 %, 0.004 %, 0.003 %, 0.002 %, 0.001 %, 0.0009
%, 0.0008 %, 0.0007 %, 0.0006 %, 0.0005 %, 0.0004 %, 0.0003 %, 0.0002 % o 0.0001 % p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de
la invención está en el intervalo de aproximadamente 0.0001 % hasta aproximadamente 50 %, aproximadamente 0.001 % hasta aproximadamente 40 %, aproximadamente 0.01 % hasta aproximadamente
30 %, aproximadamente 0.02 % hasta aproximadamente 29 %, aproximadamente 0.03 % hasta aproximadamente 28 %, aproximadamente 0.04 % hasta aproximadamente 27 %, aproximadamente 0.05 %
hasta aproximadamente 26 %, aproximadamente 0.06 % hasta aproximadamente 25 %, aproximadamente 0.07
% hasta aproximadamente 24 %, aproximadamente 0.08 % hasta aproximadamente 23 %, aproximadamente
0.09 % hasta aproximadamente 22 %, aproximadamente 0.1 % hasta aproximadamente 21 %, aproximadamente 0.2 % hasta aproximadamente 20 %, aproximadamente 0.3 % hasta aproximadamente 19
%, aproximadamente 0.4 % hasta aproximadamente 18 %, aproximadamente 0.5 % hasta aproximadamente
17 %, aproximadamente 0.6 % hasta aproximadamente 16 %, aproximadamente 0.7 % hasta aproximadamente
15 %, aproximadamente 0.8 % hasta aproximadamente 14 %, aproximadamente 0.9 % hasta aproximadamente 12 % o aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 10 % p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de
la invención está en el intervalo de aproximadamente 0.001 % hasta aproximadamente 10 %, aproximadamente
0.01 % hasta aproximadamente 5 %, aproximadamente 0.02 % hasta aproximadamente 4.5 %, aproximadamente 0.03 % hasta aproximadamente 4 %, aproximadamente 0.04 % hasta aproximadamente 3.5
%, aproximadamente 0.05 % hasta aproximadamente 3 %, aproximadamente 0.06 % hasta aproximadamente
2.5 %, aproximadamente 0.07 % hasta aproximadamente 2 %, aproximadamente 0.08 % hasta aproximadamente 1.5 %, aproximadamente 0.09 % hasta aproximadamente 1 %, aproximadamente 0.1 %
hasta aproximadamente 0.9 % p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, la cantidad de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la
invención es igual o menor que 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0g,
3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g,
0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.20.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02
g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g,
0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g o 0.0001 g.
En algunas realizaciones, la cantidad de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la
invención es más de 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g,
0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065
g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g,
0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15
g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95
g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g o 10 g.
Los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención son eficaces en un amplio intervalo
de dosis. La dosis exacta dependerá de la vía de administración, la forma en que se administra el compuesto,
el género y la edad del sujeto a tratar, el peso corporal del sujeto a tratar y la preferencia y experiencia del
médico tratante. También se pueden utilizar las dosis clínicamente establecidas de los TIL, si es apropiado. Las cantidades de las composiciones farmacéuticas administradas utilizando los métodos divulgados en el presente documento, tales como las dosis de los TIL, dependerán del ser humano o mamífero que se esté tratando, la
gravedad del trastorno o afección, la velocidad de administración, la disposición de los ingredientes farmacéuticos activos y la discreción del médico prescriptor.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que los TIL pueden administrarse en una
dosis única. Dicha administración puede realizarse mediante inyección, por ejemplo, inyección intravenosa. Los
TIL pueden administrarse en dosis múltiples. La dosis puede ser una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de
seis veces al año. La dosificación puede ser una vez al mes, una vez cada dos semanas, una vez a la semana
0 una vez cada dos días. La administración de los TIL podrá continuar durante el tiempo que sea necesario.
En algunas realizaciones, una dosis efectiva de los TIL es de aproximadamente 1 * 106, 2 * 106, 3 * 106, 4 *
106, 5 * 1066 * 106, 7 * 106, 8 * 106, 9 * 106, 1 * 107, 2 * 107, 3 * 107, 4 * 107, 5 * 107, 6 * 107, 7 * 107, 8 *
107, 9 * 107, 1 * 108, 2 * 108, 3 * 108, 4 * 108, 5 * 108, 6 * 108, 7 * 108, 8 * 108, 9 * 108, 1 * 109, 2 * 109, 3 *
109, 4 * 109, 5 * 109, 6 * 109, 7 * 109, 8 * 109, 9 * 109, 1 * 1010, 2 * 1010, 7 * 1010, 8 * 1010, 9 * 1010, 1 * 1011, 2 * 1011, 3 * 1011, 4 * 1011, 5 * 1011, 6 * 1011, 7 * 1011, 8 * 1011, 9 * 1011,
1 * 1012, 2 * 1012, 3 * 1012, 4 * 1012, 5 * 1012, 6 * 1012, 7 * 1012, 8 * 1012, 9 * 1012, 1 * 1013, 2 * 1013, 3 * 1013,
4 * 1013, 5 * 1013, 6 * 1013, 7 * 1013, 8 * 1013, y 9 * 1013. En algunas realizaciones, una dosis efectiva de los
TIL está en el intervalo de 1 * 106 hasta 5 * 1065 * 106 hasta 1 * 107, 1 * 107 hasta 5 * 107, 5 * 107 hasta 1 *
108, 1 * 108 hasta 5 * 108, 5 * 108 hasta 1 * 109, 1 * 109 hasta 5 * 109, 5 * 109 hasta 1 * 1010, 1 * 1010 hasta
5 * 1010, 5 * 1010 hasta 1 * 1011, 5 * 1011 hasta 1 * 1012, 1 * 1012 hasta 5 * 1012, y 5 * 1012 hasta 1 * 1013.
En algunas realizaciones, una dosis eficaz de los TIL está en el intervalo de aproximadamente 0.01 mg/kg hasta aproximadamente 4.3 mg/kg, aproximadamente 0.15 mg/kg hasta aproximadamente 3.6 mg/kg, aproximadamente 0.3 mg/kg hasta aproximadamente 3.2 mg/kg, aproximadamente 0.35 mg/kg hasta aproximadamente 2.85 mg/kg, aproximadamente 0.15 mg/kg hasta aproximadamente 2.85 mg/kg, aproximadamente 0.3 mg hasta aproximadamente 2.15 mg/kg, aproximadamente 0.45 mg/kg hasta aproximadamente 1.7 mg/kg, aproximadamente 0.15 mg/kg hasta aproximadamente 1.3 mg/kg, aproximadamente 0.3 mg/kg hasta aproximadamente 1.15 mg/kg, aproximadamente 0.45 mg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 0.55 mg/kg hasta aproximadamente 0.85 mg/kg, aproximadamente 0.65 mg/kg hasta aproximadamente 0.8 mg/kg, aproximadamente 0.7 mg/kg hasta aproximadamente 0.75 mg/kg, aproximadamente 0.7 mg/kg hasta aproximadamente 2.15 mg/kg, aproximadamente 0.85 mg/kg hasta aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 1.85 mg/kg, aproximadamente 1.15 mg/kg hasta aproximadamente 1.7 mg/kg, aproximadamente 1.3 mg/kg hasta aproximadamente 1.6 mg/kg, aproximadamente 1.35 mg/kg hasta aproximadamente 1.5 mg/kg, aproximadamente 2.15 mg/kg hasta aproximadamente 3.6 mg/kg, aproximadamente 2.3 mg/kg hasta aproximadamente 3.4 mg/kg, aproximadamente 2.4 mg/kg hasta aproximadamente 3.3 mg/kg, aproximadamente 2.6 mg/kg hasta aproximadamente 3.15 mg/kg, aproximadamente 2.7 mg/kg hasta aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 2.8 mg/kg hasta aproximadamente 3 mg/kg, o aproximadamente 2.85 mg/kg hasta aproximadamente 2.95 mg/kg.
En algunas realizaciones, una dosis eficaz de los TIL está en el intervalo de aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 500 mg, aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 300 mg, aproximadamente 20
mg hasta aproximadamente 250 mg, aproximadamente 25 mg hasta aproximadamente 200 mg, aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 50 mg, aproximadamente 5 mg hasta aproximadamente 45
mg, aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 40 mg, aproximadamente 15 mg hasta aproximadamente 35 mg, aproximadamente 20 mg hasta aproximadamente 30 mg, aproximadamente 23 mg
hasta aproximadamente 28 mg, aproximadamente 50 mg hasta aproximadamente 150 mg, aproximadamente
60 mg hasta aproximadamente 140 mg, aproximadamente 70 mg hasta aproximadamente 130 mg, aproximadamente 80 mg hasta aproximadamente 120 mg, aproximadamente 90 mg hasta aproximadamente 110 mg, o aproximadamente 95 mg hasta aproximadamente 105 mg, aproximadamente 98 mg hasta aproximadamente 102 mg, aproximadamente 150 mg hasta aproximadamente 250 mg. mg, aproximadamente 160 mg hasta aproximadamente 240 mg, aproximadamente 170 mg hasta aproximadamente 230 mg, aproximadamente 180 mg hasta aproximadamente 220 mg, aproximadamente 190 mg hasta aproximadamente 210 mg, aproximadamente 195 mg hasta aproximadamente 205 mg, o aproximadamente 198 a aproximadamente 207 mg.
Se puede administrar una cantidad efectiva de los TIL en dosis únicas o múltiples mediante cualquiera de los modos de administración aceptados de agentes que tienen utilidades similares, incluidas las vías intranasal y transdérmica, por inyección intraarterial, por vía intravenosa, intraperitoneal, parenteral, intramuscular, subcutánea, tópica, por trasplante o por inhalación.
IV. Procesos de fabricación de los TIL - procesos Gen 3
También se divulga en el presente documento una población de los TIL creada mediante el método de cualquiera de los procesos GEN 3 modificados para utilizar una biopsia pequeña, una biopsia con aguja gruesa o un aspirado con aguja fina. En algunas realizaciones, la invención proporciona el método de cualquiera de los procesos GEN 3 modificados para utilizar una biopsia pequeña, una biopsia con aguja gruesa o un aspirado con aguja fina como fuente de células T para la expansión en la preparación de la primera expansión de cualquiera de dichos procesos GEN 3, en donde (1) la duración de la preparación de la primera expansión se alarga para lograr el recuento de células de TIL deseado en la población de los TIL recolectada después de la segunda expansión rápida de dicho proceso GEN 3 o (2) la duración de la segunda expansión rápida de dicho proceso GEN 3 se alarga para lograr el recuento de células de TIL deseado en la población de los TIL recolectada después de la segunda expansión rápida o (3) la duración de la preparación de la primera expansión se alarga y la duración de la segunda expansión rápida de dicho proceso GEN 3 se alarga para lograr el recuento de células de TIL deseado en la población de los TIL recolectada después de la segunda expansión rápida.
También se divulga en el presente documento una población de los TIL creada mediante el método de cualquiera de los procesos GEN 3 modificados para utilizar una biopsia pequeña, una biopsia con aguja gruesa o un aspirado con aguja fina como fuente de células T para la expansión en la preparación de la primera expansión de cualquiera de dichos procesos GEN 3, en donde (1) la duración de la preparación de la primera expansión se alarga para lograr el recuento de células de TIL deseado en la población de los TIL recolectada después de la segunda expansión rápida de dicho proceso GEN 3 o (2) la duración de la segunda expansión rápida de dicho proceso<g>E<n>3 se alarga para lograr el recuento de células de TIL deseado en la población de los TIL recolectada después de la segunda expansión rápida o (3) la duración de la preparación de la primera expansión se alarga y la duración de la segunda expansión rápida de dicho proceso GEN 3 se alarga para lograr el recuento de células de TIL deseado en la población de los TIL recolectada después de la segunda expansión rápida.
Sin limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que la preparación de la primera expansión que ceba una activación de células T obtenidas de una biopsias con aguja gruesa o fragmento tumoral obtenido de un donante seguida de la segunda expansión rápida que estimula la activación de células T como se describe en algunos métodos de la invención permite la preparación de células T expandidas que conservan un fenotipo "más joven", y como tal, se espera que las células T expandidas de la invención exhiban una mayor citotoxicidad contra las células cancerosas que las células T expandidas por otros métodos. En particular, se cree que una activación de las células T que se ceba mediante la exposición a un anticuerpo anti-CD3 (p. ej., OKT-3), IL-2 y, opcionalmente, células presentadoras de antígeno (APC) y luego se refuerza mediante la exposición posterior a anticuerpos anti-CD-3 adicionales (p. ej., OKT-3), IL-2 y APC como se enseña mediante los métodos de la invención limita o evita la maduración de células T en cultivo, produciendo una población de células T con un fenotipo menos maduro, células T que se agotan menos por la expansión en cultivo y exhiben mayor citotoxicidad contra las células cancerosas. Por lo tanto, se divulga en el presente documento un método para expandir los TIL que comprende: (a) realizar una preparación de la primera expansión de una primera población de células T obtenidas de una biopsias con aguja gruesa o fragmento tumoral obtenido de un donante cultivando la primera población de células T para efectuar el crecimiento y preparar una activación de la primera población de células T; (b) después de que la activación de la primera población de células T preparada en la etapa (a) comienza a decaer, realizar una segunda expansión rápida de la primera población de células T cultivando la primera población de células T para efectuar el crecimiento y para impulsar la activación de la primera población de células T para obtener una segunda población de células T; y (c) recolectar la segunda población de células T. El proceso de Gen 3, los métodos de tratamiento que utilizan TIL del proceso de Gen 3 y las composiciones de los TIL preparadas por el Gen 3 se pueden utilizar junto con una biopsia pequeña/biopsia con aguja gruesa con duraciones de períodos de expansión ajustadas según sea necesario para lograr los recuentos de células necesarios, como se proporciona a continuación y en toda la presente solicitud.
La etapa de segunda expansión rápida se puede dividir en una pluralidad de etapas para lograr una ampliación del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando células T en un cultivo a pequeña
escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (b) efectuar la transferencia de las células T en el cultivo a pequeña escala
a un segundo recipiente más grande que el primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-R<e>X 500MCS y
cultivar las células T del cultivo a pequeña escala en un cultivo a mayor escala en el segundo recipiente durante
un período de aproximadamente 4 a 7 días. La etapa de expansión rápida se puede dividir en una pluralidad
de etapas para lograr un escalamiento del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando
células T en un primer cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX
100MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (b) efectuar la transferencia y distribución
de las células T del primer cultivo a pequeña escala hacia y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 segundos recipientes que son iguales en tamaño al primer recipiente, en donde en
cada segundo recipiente la porción de las células T del primer cultivo a pequeña escala transferida a dicho
segundo recipiente se cultiva en un segundo cultivo a pequeña escala durante un período de aproximadamente
4 a 7 días. La etapa de expansión rápida se puede dividir en una pluralidad de etapas para lograr un escalamiento horizontal y vertical del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando
células T en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX 100MCS,
durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (b) efectuar la transferencia y distribución de las
células T del cultivo a pequeña escala hacia y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18, 19 o 20 segundos recipientes que son de mayor tamaño que el primer recipiente, por ejemplo, recipientes
G-REX 500MCS, en donde en cada segundo recipiente la porción de las células T del cultivo a pequeña escala
transferida a dicho segundo recipiente se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un período de aproximadamente 4 a 7 días. La etapa de expansión rápida se puede dividir en una pluralidad de etapas para
lograr un escalamiento horizontal y vertical del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida
cultivando células T en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX
100MCS, durante un período de aproximadamente 4 días, y luego (b) efectuar la transferencia y distribución
de las células T del cultivo a pequeña escala hacia y entre 2, 3 o 4 segundos recipientes que son de mayor
tamaño que el primer recipiente, por ejemplo, recipientes G-REX 500MCS, en donde en cada segundo
recipiente la porción de las células T del cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo recipiente se
cultiva en un cultivo a mayor escala durante un período de aproximadamente 5 días.
La segunda expansión rápida se puede realizar después de que la activación de las células T efectuada por la preparación de la primera expansión comience a disminuir, menguar, decaer o bajar.
La segunda expansión rápida se puede realizar después de que la activación de las células T efectuada por la preparación de la primera expansión haya disminuido igual o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 41 , 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 , 67, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 99 o 100 %.
La segunda expansión rápida se puede realizar después de que la activación de las células T efectuada por la preparación de la primera expansión haya disminuido en un porcentaje en el intervalo de igual o aproximadamente 1 % a 100 %.
La segunda expansión rápida se puede realizar después de que la activación de las células T efectuada por la preparación de la primera expansión haya disminuido en un porcentaje en el intervalo de igual o aproximadamente 1 % a 10 %, 10 % a 20 %, 20 % a 30 %, 30 % a 40 %, 40 % a 50 %, 50 % a 60 %, 60 % a
70 %, 70 % a 80 %, 80 % a 90 %, o 90 % a 100 %.
La segunda expansión rápida se puede realizar después de que la activación de las células T efectuada por la preparación de la primera expansión haya disminuido al menos igual o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 ,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,
39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 , 67, 68 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
97, 98 o 99 %.
La segunda expansión rápida se puede realizar después de que la activación de las células T efectuada por la preparación de la primera expansión haya disminuido en al menos igual o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,
38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 ,
67, 68 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95,
96, 97, 98, 99 o 100%.
La disminución en la activación de las células T efectuada por la preparación de la primera expansión puede
estar determinada por una reducción en la cantidad de interferón gamma liberado por las células T en respuesta
a la estimulación con antígeno.
La preparación de la primera expansión de las células T puede realizarse durante un período de hasta o aproximadamente 7 días.
La preparación de la primera expansión de las células T se puede realizar durante un período de hasta o aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días.
La preparación de la primera expansión de células T se puede realizar durante un período de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días.
La segunda expansión rápida de células T puede realizarse durante un período de hasta o aproximadamente 11 días.
La segunda expansión rápida de células T puede realizarse durante un período de hasta o aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días u 11 días.
La segunda expansión rápida de células T puede realizarse durante un período de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días u 11 días.
La preparación de la primera expansión de células T se puede realizar durante un período de o hasta aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 7 días y la segunda expansión rápida de células T se realiza durante un período de desde al menos 1 día hasta aproximadamente 11 días.
La preparación de la primera expansión de células T se puede realizar durante un período de hasta o aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días y la segunda expansión rápida de células T se realiza durante un período de hasta o aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días u 11 días.
La preparación de la primera expansión de células T se puede realizar durante un período de hasta o aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 7 días y la segunda expansión rápida de células T se realiza durante un período de hasta o aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 9 días.
La primera expansión de células T puede realizarse durante un período de 7 días y la segunda expansión rápida de células T se realiza durante un período de 9 días.
Las células T pueden ser linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).
Las células T pueden ser linfocitos infiltrantes de la médula ósea (MIL).
Las células T pueden obtenerse de un donante que padece cáncer.
Las células T pueden ser TIL obtenidos a partir de una biopsia con aguja gruesa o de un aspirado con aguja fina obtenido de un tumor en un paciente que padece cáncer.
Las células T pueden ser MIL obtenidas de la médula ósea de un paciente que padece una neoplasia maligna hematológica.
En algunas realizaciones, el donante padece cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), glioblastoma (incluido GBM), cáncer gastrointestinal, cáncer renal y carcinoma de células renales. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), glioblastoma (incluido GBM), cáncer gastrointestinal, cáncer renal y carcinoma de células renales. En algunas realizaciones, el donante padece un tumor. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor líquido. En algunas realizaciones, el tumor es un tumor sólido. En algunas realizaciones, el donante padece una neoplasia maligna hematológica.
Un proceso de los TIL ejemplar conocido como proceso 3 (también denominado en el presente documento GEN3) que contiene algunas de estas características se muestra en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), y algunas de las ventajas de esta realización de la presente invención sobre el proceso 2A se describen en las Figuras 1, 2, 30 y 31 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En las Figuras 1 y 30 se muestran dos realizaciones del proceso 3 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). El proceso 2A o Gen 2 también se describe en la publicación de patente de los Estados Unidos No. 2018/0280436
Como se analiza y describe en términos generales en el presente documento, los TIL se toman de una muestra de un paciente y se manipulan para expandir su número antes del trasplante a un paciente utilizando el proceso de expansión de los TIL descrito en el presente documento y denominado Gen 3. En algunas realizaciones, los TIL pueden manipularse genéticamente de manera opcional como se analiza a continuación. En algunas realizaciones, los TIL pueden criopreservarse antes o después de la expansión. Una vez descongelados, también pueden volver a estimularse para aumentar su metabolismo antes de su infusión en un paciente.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión (incluidos los procesos denominados en el presente documento como la expansión rápida previa (pre-REP), así como los procesos que se muestran en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B) como Etapa B) se acorta a 1 a 7 días y la segunda expansión rápida (incluidos los procesos denominados en el presente documento como Protocolo de expansión rápida (RE<p>), así como los procesos que se muestran en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B) como Etapa D) se acorta a 1 a 9 días, como se analiza en detalle a continuación, así como en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)) se acorta a 7 días y se realiza la segunda expansión rápida (por ejemplo, una expansión como la descrita en la etapa D en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, La Figura 85B)) es de 7 a 9 días. En algunas realizaciones, la combinación de la preparación de la primera expansión y la segunda expansión rápida (por ejemplo, las expansiones descritas como Etapa B y Etapa D en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, La Figura 85B)) es de 14-16 días, como se analiza en detalle a continuación y en los ejemplos y figuras. En particular, se considera que ciertas realizaciones de la presente invención comprenden una etapa de preparación de la primera expansión en donde los TIL se activan mediante la exposición a un anticuerpo anti-CD3, por ejemplo, OKT-3 en presencia de IL-2 o exposición a un antígeno en presencia de igual o aproximadamente IL-2 y un anticuerpo anti-CD3, p. ej.,<o>KT-3. En ciertas realizaciones, los TIL que se activan en la etapa de preparación de la primera expansión como se describió anteriormente son una primera población de los TIL, es decir, que son una población celular primaria.
Las designaciones de "Etapa" A, B, C, etc., a continuación, se hacen en referencia al ejemplo no limitativo de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B) y en referencia a ciertas realizaciones no limitantes descritas en el presente documento. El orden de las etapas a continuación y en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B) es ejemplar y la presente solicitud y los métodos aquí descritos contemplan cualquier combinación u orden de etapas, así como etapas adicionales, repetición de etapas y/u omisión de etapas.
En algunas realizaciones, si el tumor es metastásico y la lesión primaria ha sido tratada/eliminada eficazmente en el pasado, puede ser necesaria la eliminación de una de las lesiones metastásicas. En algunas realizaciones, el enfoque menos invasivo es extirpar una lesión cutánea o un ganglio linfático del cuello o la zona axilar cuando esté disponible. Se extirpa una lesión de la piel o se puede extraer una biopsia pequeña de la misma. Se puede extirpar un ganglio linfático o una biopsia pequeña del mismo. En algunas realizaciones, se puede emplear una lesión metastásica de pulmón o hígado, o un ganglio linfático intraabdominal o torácico o una biopsia pequeña del mismo.
En algunas realizaciones, el tumor es un melanoma. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña de un melanoma comprende un lunar o porción del mismo.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por punción. En algunas realizaciones, la biopsia por punción se obtiene previamente con una cuchilla circular presionada en la piel. En algunas realizaciones, la biopsia por punción se obtiene previamente con una hoja circular presionada en la piel alrededor de un lunar sospechoso. En algunas realizaciones, la biopsia por punción se obtiene previamente con una cuchilla circular presionada en la piel y se extrae un trozo redondo de piel. La biopsia pequeña puede ser una biopsia por punción y se puede extirpar una porción redonda del tumor.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por escisión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una biopsia por escisión y se elimina todo el lunar o crecimiento. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una biopsia por escisión y se extirpa todo el lunar o crecimiento junto con un pequeño borde de piel de apariencia normal.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por incisión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una biopsia por incisión y solo se toma la parte más irregular de un lunar o crecimiento. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una biopsia por incisión y la biopsia por incisión se utiliza cuando no se pueden realizar otras técnicas, como si un lunar sospechoso es muy grande.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de pulmón. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente mediante broncoscopia. Generalmente, en la broncoscopia, se pone al paciente bajo anestesia y se le pasa una pequeña sonda por la nariz o la boca, hasta la garganta, hasta los bronquios, donde se utilizan pequeñas herramientas para extraer algo de tejido. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que cuando no se puede llegar al tumor o crecimiento mediante broncoscopia, se puede emplear una biopsia con aguja transtorácica. Generalmente, para una biopsia con aguja transtorácica, el paciente también está bajo anestesia y se inserta una aguja a través de la piel directamente en el lugar sospechoso para extraer una pequeña muestra de tejido. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que una biopsia con aguja transtorácica puede requerir radiología intervencionista (por ejemplo, el uso de rayos X o una tomografía computarizada para guiar la aguja). En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente mediante biopsia con aguja. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente mediante ecografía endoscópica (por ejemplo, un endoscopio con una luz y se coloca a través de la boca hasta el esófago). En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente mediante cirugía.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de cabeza y cuello. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por incisión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una biopsia por incisión, en donde se corta un pequeño trozo de tejido de un área de aspecto anormal. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que, si se accede fácilmente a la región anormal, la muestra se puede tomar sin hospitalización. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que, si el tumor está más profundamente dentro de la boca o la garganta, puede ser necesario realizar la biopsia en un quirófano, con anestesia general. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por escisión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una biopsia por escisión, en donde se extirpa toda el área. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es un aspirado con aguja fina (FNA). También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es un aspirado con aguja fina (FNA), en donde se utiliza una aguja muy fina unida a una jeringa para extraer (aspirar) células de un tumor o bulto. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por punción. La biopsia pequeña puede ser una biopsia por punción, en donde se utilizan pinzas para extraer una parte del área sospechosa.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de cuello uterino. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente mediante colposcopia. Generalmente, los métodos de colposcopia emplean el uso de un instrumento de aumento iluminado conectado a unos binoculares de aumento (un colposcopio) que luego se utiliza para realizar una biopsia de una pequeña sección de la superficie del cuello uterino. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de conización/cono. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una conización/biopsia de cono, en donde puede ser necesaria una cirugía ambulatoria para extraer un trozo más grande de tejido del cuello uterino. En algunas realizaciones, la biopsia de cono, además de ayudar a confirmar un diagnóstico, puede servir como tratamiento inicial.
El término "tumor sólido" se refiere a una masa anormal de tejido que generalmente no contiene quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. El término "cáncer de tumor sólido" se refiere a tumores sólidos malignos, neoplásicos o cancerosos. Los cánceres de tumores sólidos incluyen, entre otros, sarcomas, carcinomas y linfomas, como cánceres de pulmón, mama, cáncer de mama triple negativo, próstata, colon, recto y vejiga. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, cáncer de ovario, sarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo y carcinoma de pulmón de células no pequeñas. La estructura tisular de los tumores sólidos incluye compartimentos tisulares interdependientes que incluyen el parénquima (células cancerosas) y las células del estroma de soporte en las que se dispersan las células cancerosas y que pueden proporcionar un microambiente de soporte.
En algunas realizaciones, la muestra del tumor se obtiene como un aspirado con aguja fina (FNA), una biopsia con aguja gruesa o una biopsia pequeña (incluida, por ejemplo, una biopsia por punción). En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 10. En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 10 cuando hay 1 o 2 muestras de biopsia con aguja gruesa y/o biopsias pequeñas. En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 100 cuando hay 3, 4, 5, 6 , 8 , 9 o 10 o más muestras de biopsia con aguja gruesa y/o biopsia pequeña. En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 500 cuando hay 3, 4, 5, 6 , 8 , 9 o 10 o más muestras de biopsia con aguja gruesa y/o biopsia pequeña.
El FNA se puede obtener de un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, melanoma, de cabeza y cuello, de cuello uterino, de ovario, de páncreas, glioblastoma, colorrectal y sarcoma. En algunas realizaciones, el FNA se obtiene previamente de un tumor pulmonar, tal como un tumor pulmonar de un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En algunos casos, el paciente con NSCLC ha sido sometido previamente a un tratamiento quirúrgico.
Los TIL descritos en el presente documento se pueden obtener a partir de una muestra de FNA. En algunos casos, la muestra de FNAse obtiene o aísla previamente del paciente utilizando una aguja de calibre fino que va desde una aguja de calibre 18 hasta una aguja de calibre 25. La aguja de calibre fino puede ser calibre 18, calibre 19, calibre 20, calibre 21, calibre 22, calibre 23, calibre 24 o calibre 25. En algunas realizaciones, la muestra de FNA del paciente puede contener al menos 400,000 TIL, por ejemplo, 400,000 TIL, 450,000 TIL, 500.000 TIL, 550,000 TIL, 600,000 TIL, 650,000 TIL, 700,000 TIL, 750,000 TIL, 800,000 TIL, 850,000 TIL, 900.000 TIL, 950,000 TIL o más.
En algunos casos, los TIL descritos en el presente documento se obtienen a partir de una muestra de biopsia con aguja gruesa. En algunos casos, la pequeña muestra de biopsia o biopsia con aguja gruesa se obtiene o aísla previamente del paciente utilizando una aguja quirúrgica o médica que puede ser desde una aguja de calibre 11 hasta una aguja de calibre 16. La aguja puede ser de calibre 11, calibre 12, calibre 13, calibre 14, calibre 15 o calibre 16. En algunas realizaciones, la muestra de biopsia con aguja gruesa del paciente puede contener al menos 400,000 TIL, por ejemplo, 400,000 TIL, 450,000 TIL, 500,000 TIL, 550,000 TIL, 600,000 TIL, 650,000 TIL, 700,000 TIL, 750,000 TIL, 800,000 TIL, 850,000 TIL, 900,000 TIL, 950,000 TIL o más.
En algunas realizaciones, los TIL se obtienen a partir de digestos tumorales. En algunas realizaciones, los digestos tumorales se generaron mediante incubación en medios enzimáticos, por ejemplo, pero sin limitarse a, RPMI 1640, 2 mM de GlutaMAX, 10 pg/mL de gentamicina, 30 U/mL de DNasa y 1.0 mg/mL de colagenasa, seguido de disociación mecánica (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Después de colocar el tumor en un medio enzimático, éste puede disociarse mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. La solución puede luego incubarse durante 30 minutos a 37 °C en 5 % de CO2 y luego se volvió a romper mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. Después de incubarlo nuevamente durante 30 minutos a 37 °C en 5 % de CO2, el tumor puede romperse mecánicamente una tercera vez durante aproximadamente 1 minuto. En algunas realizaciones, después del tercer rompimiento mecánico, si había grandes trozos de tejido, se aplicaron 1 o 2 disociaciones mecánicas adicionales a la muestra, con o sin 30 minutos adicionales de incubación a 37 °C en 5 % de CO2. En algunas realizaciones, al término de la incubación final, si la suspensión celular contenía una gran cantidad de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación por gradiente de densidad utilizando Ficoll para eliminar estas células.
En algunas realizaciones, la suspensión de células recolectadas antes de la primera etapa de expansión se denomina "población celular primaria" o población celular "recién recolectada".
En algunas realizaciones, las células pueden congelarse opcionalmente después de la recolección de la muestra y almacenarse congeladas antes de ingresar a la expansión descrita en la etapa B, que se describe con más detalle a continuación, así como también se ejemplifica en la Figura 85.
A. Etapa A: Obtener muestra del tumor del paciente
En general, los TIL se obtienen inicialmente de una muestra de tumor del paciente ("TIL primarios") obtenidos mediante una biopsia con aguja gruesa o un procedimiento similar y luego se expanden a una población más grande para una mayor manipulación como se divulga en el presente documento, opcionalmente se criopreservan y opcionalmente se evalúan para determinar el fenotipo y los parámetros metabólicos.
Se puede obtener una muestra de tumor del paciente utilizando métodos conocidos en la técnica, generalmente mediante resección quirúrgica, biopsia con aguja gruesa, biopsia con aguja u otros medios para obtener una muestra que contenga una mezcla de células tumorales y TIL. En general, la muestra de tumor puede provenir de cualquier tumor sólido, incluidos tumores primarios, tumores invasivos o tumores metastásicos. En algunas realizaciones, la muestra puede provenir de múltiples muestras de tumores pequeños o biopsias. En algunas realizaciones, la muestra puede comprender múltiples muestras de tumor (tal como múltiples biopsias con aguja gruesa) de un solo tumor del mismo paciente. En algunas realizaciones, la muestra puede comprender múltiples muestras de tumores de uno, dos, tres o cuatro tumores del mismo paciente (tal como biopsias con aguja gruesa obtenidas de múltiples lesiones en enfermedad metastásica). En algunas realizaciones, la muestra puede comprender múltiples muestras de tumores de múltiples tumores del mismo paciente. La muestra de tumor también puede ser un tumor líquido, tal como un tumor obtenido de una neoplasia maligna hematológica. El tumor sólido puede ser de cualquier tipo de cáncer, incluidos, entre otros, cáncer de mama, de páncreas, de próstata, colorrectal, de pulmón, de cerebro, de riñón, de estómago y de piel (incluidos, entre otros, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales y melanoma). En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello (incluido, por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), glioblastoma (GBM), cáncer gastrointestinal, cáncer de ovario, sarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo y carcinoma de pulmón de células no pequeñas. En algunas realizaciones, los TIL útiles se obtienen a partir de tumores de melanoma maligno, ya que se ha informado que estos tienen niveles particularmente altos de los TIL.
Como se indicó anteriormente, en algunas realizaciones, los TIL se derivan de biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores sólidos. En algunas realizaciones, las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores sólidos se someten a digestión enzimática. En algunas realizaciones, las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumor se digieren en una mezcla de enzimas que comprende colagenasa, DNasa y hialuronidasa. En algunas realizaciones, las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumor se digieren en una mezcla de enzimas que comprende colagenasa, DNasa y hialuronidasa durante 1-2 horas. En algunas realizaciones, los tumores se digieren en una mezcla de enzimas que comprende colagenasa, DNasa y hialuronidasa durante 1-2 horas a 37 °C, 5 % de CO2. En algunas realizaciones, las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumor se digieren en una mezcla de enzimas que comprende colagenasa, DNasa y hialuronidasa durante 1-2 horas a 37 °C, 5 % de CO2 con rotación. En algunas realizaciones, las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumor se digieren durante la noche con rotación constante. En algunas realizaciones, las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumor se digieren durante la noche a 37 °C, 5 % de CO2 con rotación constante. En algunas realizaciones, las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumor se combinan con las enzimas para formar una mezcla de reacción de digestión tumoral.
En algunas realizaciones, los TIL no se obtienen a partir de digestos tumorales. En algunas realizaciones, las biopsias con aguja gruesa de tumores sólidos no están fragmentados.
En algunas realizaciones, las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumor se reconstituyen con las enzimas liofilizadas en un tampón estéril. En algunas realizaciones, el tampón es HBSS estéril.
En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende colagenasa. En algunas realizaciones, la colagenasa es colagenasa IV. En algunas realizaciones, la solución de trabajo para la colagenasa es una solución de trabajo 10X de 100 mg/mL.
En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende ADNasa. En algunas realizaciones, la solución de trabajo para la ADNasa es una solución de trabajo 10X de 10,000 UI/mL.
En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende hialuronidasa. En algunas realizaciones, la solución de trabajo para la hialuronidasa es una solución de trabajo 10X de 10 mg/mL.
En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende 10 mg/mL de colagenasa, 1000 UI/mL de ADNasa y 1 mg/mL de hialuronidasa.
En algunas realizaciones, la mezcla de enzimas comprende 10 mg/mL de colagenasa, 500 UI/mL de ADNasa y 1 mg/mL de hialuronidasa.
En general, la suspensión celular obtenida de la biopsia con aguja gruesa o fragmento del tumor se denomina "población celular primaria" o población celular "recién obtenida" o "recién aislada". En ciertas realizaciones, la población de células recién obtenida de los TIL se expone a un medio de cultivo celular que comprende células presentadoras de antígeno, IL-12 y OKT-3.
En algunas realizaciones, los TIL se pueden cultivar inicialmente a partir de digeridos enzimáticos de biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores y biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores obtenidos previamente de pacientes. En una realización, los TIL se pueden cultivar inicialmente a partir de digeridos enzimáticos de biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores y biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores obtenidos previamente de pacientes.
En algunas realizaciones, los TIL se obtienen a partir de fragmentos de tumor o de digestos de la biopsia con aguja gruesa. En algunas realizaciones, los fragmentos de tumor o los digestos de biopsias con aguja gruesa se generan mediante incubación en medios enzimáticos, por ejemplo, pero sin limitarse a, RPMI 1640, 2 mM de GlutaMAX, 10 mg/mL de gentamicina, 30 U/mL de DNasa y 1.0 mg/mL de colagenasa, seguido de disociación mecánica (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Después de colocar el fragmento o biopsia con aguja gruesa del tumor en un medio enzimático, el fragmento o biopsia con aguja gruesa del tumor se puede disociar mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. La solución puede luego incubarse durante 30 minutos a 37 °C en 5 % de CO2 y luego se volvió a romper mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. Después de incubarlo nuevamente durante 30 minutos a 37 °C en 5 % de CO2, el fragmento o biopsia con aguja gruesa del tumor puede romperse mecánicamente una tercera vez durante aproximadamente 1 minuto. En algunas realizaciones, después de la tercera ruptura mecánica, si había grandes trozos de tejido, se aplicaron 1 o 2 disociaciones mecánicas adicionales a la muestra, con o sin 30 minutos adicionales de incubación a 37 °C en 5 % de CO2. En algunas realizaciones, al término de la incubación final, si la suspensión celular contenía una gran cantidad de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación por gradiente de densidad utilizando Ficoll para eliminar estas células.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que, si el tumor es metastásico y la lesión primaria ha sido tratada/eliminada de manera eficiente en el pasado, puede ser necesaria la eliminación de una de las lesiones metastásicas. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que el enfoque menos invasivo es eliminar una lesión de la piel o un ganglio linfático en el cuello o el área axilar cuando esté disponible. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que se elimina una lesión de la piel o se extrae una biopsia pequeña de la misma. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que se extirpa un ganglio linfático o una biopsia pequeña del mismo. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que se puede emplear una lesión metastásica de pulmón o hígado, o un ganglio linfático intraabdominal o torácico o una biopsia pequeña del mismo.
En algunas realizaciones, el tumor es un melanoma. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña de un melanoma comprende un lunar o porción del mismo.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por punción. En algunas realizaciones, la biopsia por punción se obtiene previamente con una cuchilla circular presionada en la piel. En algunas realizaciones, la biopsia por punción se obtiene previamente con una hoja circular presionada en la piel alrededor de un lunar sospechoso. En algunas realizaciones, la biopsia por punción se obtiene previamente con una hoja circular presionada en la piel y se extrae un trozo redondo de piel. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una biopsia por punción y se extrae una porción redonda del tumor.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por escisión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una biopsia por escisión y se elimina todo el lunar o crecimiento. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una biopsia por escisión y se extirpa todo el lunar o crecimiento junto con un pequeño borde de piel de apariencia normal.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por incisión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una biopsia por incisión y solo se toma la parte más irregular de un lunar o crecimiento. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por incisión y la biopsia por incisión se utiliza cuando no se pueden realizar otras técnicas, como si un lunar sospechoso es muy grande.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de pulmón. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente mediante broncoscopia. Generalmente, en la broncoscopia, se pone al paciente bajo anestesia y se le pasa una pequeña sonda por la nariz o la boca, hasta la garganta, hasta los bronquios, donde se utilizan pequeñas herramientas para extraer algo de tejido. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que cuando no se puede llegar al tumor o crecimiento mediante broncoscopia, se puede emplear una biopsia con aguja transtorácica. Generalmente, para una biopsia con aguja transtorácica, el paciente también está bajo anestesia y se inserta una aguja a través de la piel directamente en el lugar sospechoso para extraer una pequeña muestra de tejido. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que una biopsia con aguja transtorácica puede requerir radiología intervencionista (por ejemplo, el uso de rayos X o una tomografía computarizada para guiar la aguja). En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente mediante biopsia con aguja. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente mediante ecografía endoscópica (por ejemplo, un endoscopio con una luz y se coloca a través de la boca hasta el esófago). En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente mediante cirugía.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de cabeza y cuello. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por incisión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una biopsia por incisión, en donde se corta un pequeño trozo de tejido de un área de aspecto anormal. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que, si se accede fácilmente a la región anormal, la muestra se puede tomar sin hospitalización. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que, si el tumor está más profundamente dentro de la boca o la garganta, puede ser necesario realizar la biopsia en un quirófano, con anestesia general. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por escisión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una biopsia por escisión, en donde se extirpa toda el área. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es un aspirado con aguja fina (FNA). En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es un aspirado con aguja fina (FNA), en donde se puede conectar una aguja muy fina a una jeringa y se utiliza para extraer (aspirar) células de un tumor o bulto. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por punción. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia por punción, en donde se pueden utilizar fórceps de punción para extraer una parte del área sospechosa.
En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de cuello uterino. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña se obtiene previamente mediante colposcopia. Generalmente, los métodos de colposcopia emplean el uso de un instrumento de aumento iluminado conectado a unos binoculares de aumento (un colposcopio) que luego se utiliza para realizar una biopsia de una pequeña sección de la superficie del cuello uterino. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña es una biopsia de conización/cono. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia pequeña es una conización/biopsia de cono, en donde puede ser necesaria una cirugía ambulatoria para extraer un trozo más grande de tejido del cuello uterino. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la biopsia de cono, además de ayudar a confirmar un diagnóstico, puede servir como tratamiento inicial.
El término "tumor sólido" se refiere a una masa anormal de tejido que generalmente no contiene quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. El término "cáncer de tumor sólido" se refiere a tumores sólidos malignos, neoplásicos o cancerosos. Los cánceres de tumores sólidos incluyen, entre otros, sarcomas, carcinomas y linfomas, tal como cánceres de pulmón, mama, cáncer de mama triple negativo, próstata, colon, recto y vejiga. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, cáncer de ovario, sarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo y carcinoma de pulmón de células no pequeñas. La estructura tisular de los tumores sólidos incluye compartimentos tisulares interdependientes que incluyen el parénquima (células cancerosas) y las células del estroma de soporte en las que se dispersan las células cancerosas y que pueden proporcionar un microambiente de soporte.
En algunas realizaciones, la muestra del tumor se obtiene previamente como un aspirado con aguja fina (FNA), una biopsia con aguja gruesa, una biopsia pequeña (incluyendo, por ejemplo, una biopsia por punción). En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 10. En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 10 cuando hay 1 o 2 muestras de biopsia con aguja gruesa y/o biopsias pequeñas. En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 100 cuando hay 3, 4, 5, 6 , 8 , 9 o 10 o más muestras de biopsia con aguja gruesa y/o biopsia pequeña. En algunas realizaciones, la muestra se coloca primero en un G-Rex 500 cuando hay 3, 4, 5, 6 , 8 , 9 o 10 o más muestras de biopsia con aguja gruesa y/o biopsia pequeña.
El FNA se puede obtener de un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, melanoma, de cabeza y cuello, de cuello uterino, de ovario, de páncreas, glioblastoma, colorrectal y sarcoma. En algunas realizaciones, el FNA se obtiene previamente de un tumor pulmonar, como un tumor pulmonar de un paciente con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En algunos casos, el paciente con NSCLC ha sido sometido previamente a un tratamiento quirúrgico.
Los TIL descritos en el presente documento se pueden obtener a partir de una muestra de FNA. En algunos casos, la muestra de FNAse obtiene o aísla previamente del paciente utilizando una aguja de calibre fino que va desde una aguja de calibre 18 hasta una aguja de calibre 25. La aguja de calibre fino puede ser calibre 18, calibre 19, calibre 20, calibre 21, calibre 22, calibre 23, calibre 24 o calibre 25. En algunas realizaciones, la muestra de FNA del paciente puede contener al menos 400,000 TIL, por ejemplo, 400,000 TIL, 450,000 TIL, 500.000 TIL, 550,000 TIL, 600,000 TIL, 650,000 TIL, 700,000 TIL, 750,000 TIL, 800,000 TIL, 850,000 TIL, 900.000 TIL, 950,000 TIL o más.
En algunos casos, los TIL descritos en el presente documento se obtienen a partir de una muestra de biopsia con aguja gruesa. En algunos casos, la muestra de biopsia con aguja gruesa o biopsia pequeña se obtiene o aísla previamente del paciente utilizando una aguja quirúrgica o médica que puede ser desde una aguja de calibre 11 hasta una aguja de calibre 16. La aguja puede ser de calibre 11, calibre 12, calibre 13, calibre 14, calibre 15 o calibre 16. En algunas realizaciones, la muestra de biopsia con aguja gruesa del paciente puede contener al menos 400,000 TIL, por ejemplo, 400,000 TIL, 450,000 TIL, 500,000 TIL, 550,000 TIL, 600,000 TIL, 650.000 TIL, 700,000 TIL, 750,000 TIL, 800,000 TIL, 850,000 TIL, 900,000 TIL, 950,000 TIL o más.
En algunas realizaciones, los TIL se obtienen a partir de digestos de biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores. En algunas realizaciones, los digestos de biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores se generaron mediante incubación en medios enzimáticos, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, RPMI 1640, 2 mM de GlutaMAX, 10 pg/mL de gentamicina, 30 U/mL de DNasa y 1.0 mg/mL de colagenasa, seguido de disociación mecánica (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Después de colocar la biopsia con aguja gruesa o fragmento del tumor en un medio enzimático, el tumor puede disociarse mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. La solución puede luego incubarse durante 30 minutos a 37 °C en 5 % de CO2 y luego se volvió a romper mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. Después de incubarlo nuevamente durante 30 minutos a 37 °C en 5 % de CO2 la biopsia con aguja gruesa o fragmento del tumor puede romperse mecánicamente una tercera vez durante aproximadamente 1 minuto. En algunas realizaciones, después de la tercera ruptura mecánica, si había grandes trozos de tejido, se aplicaron 1 o 2 disociaciones mecánicas adicionales a la muestra, con o sin 30 minutos adicionales de incubación a 37 °C en 5 % de CO2. En algunas realizaciones, al término de la incubación final, si la suspensión celular contenía una gran cantidad de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación por gradiente de densidad utilizando Ficoll para eliminar estas células.
En algunas realizaciones, la suspensión celular antes de la etapa de preparación de la primera expansión se denomina "población celular primaria" o una población celular "recién obtenida" o "recién aislada".
En algunas realizaciones, las células se pueden congelar opcionalmente después del aislamiento de la muestra (por ejemplo, después de obtener la muestra de tumor y/o después de obtener la suspensión celular de la muestra de tumor) y almacenarlas congeladas antes de ingresar a la expansión descrita en la etapa B, que se describe con más detalle a continuación, así como se ejemplifica en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B).
B. Etapa B: Preparación de la primera expansión
En algunas realizaciones, los métodos actuales prevén TIL más jóvenes, que pueden proporcionar beneficios terapéuticos adicionales sobre los TIL más viejos (es decir, TIL que han pasado por más rondas de replicación antes de su administración a un sujeto/paciente). Las características de los TIL jóvenes se han descrito en la literatura, por ejemplo: Donia, et al., Scandinavian Journal of Immunology, 75: 157-167 (2012)); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16 : 6122-6131 (2010)); Huang et al., J Immunother, 28(3): 258-267 (2005)); Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17): OF1-OF9 (2013); Besser et al., J Immunother 32: 415-423 (2009); Robbins et al., J Immunol 2004; 173: 7125-7130; Shen et al., J Immunother, 30: 123-129 (2007)); Zhou, et al., J Immunother, 28: 53-62 (2005); y Tran, et al., J Immunother, 31: 742-751 (2008).
Después de la biopsia o digestión de fragmentos de tumor y/o biopsias con aguja gruesa de tumor, por ejemplo, como se describe en la Etapa A de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), las células resultantes se cultivan en suero que contiene IL-2, OKT-3 y células alimentadoras (por ejemplo, células alimentadoras presentadoras de antígeno), en condiciones que favorecen el crecimiento de los TIL sobre células tumorales y de otro tipo. En algunas realizaciones, las células IL-2, OKT-3 y alimentadoras se agregan al inicio del cultivo junto con el fragmento tumoral o la biopsia con aguja gruesa digeridos y/o los fragmentos de tumor o biopsias con aguja gruesa (por ejemplo, en el día 0). En algunas realizaciones, los fragmentos de tumor o los digestos de la biopsia con aguja gruesa y/o los fragmentos de tumor o biopsias con aguja gruesa se incuban en un recipiente con hasta 60 fragmentos o biopsias con aguja gruesa por recipiente y con 6000 UI/mL de IL-2. Esta población de células primarias se cultiva durante un período de días, generalmente de 1 a 7 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel, generalmente de aproximadamente 1 * 108 células de TIL a granel. En algunas realizaciones, esta preparación de la primera expansión ocurre durante un período de 5 a 7 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel, generalmente de aproximadamente 1 * 108 células de TIL a granel. En algunas realizaciones, esta preparación de la primera expansión ocurre durante un período de aproximadamente 6 a 7 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel, generalmente de aproximadamente 1 * 108 células de TIL a granel. En algunas realizaciones, esta preparación de la primera expansión ocurre durante un período de aproximadamente 7 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel, generalmente de aproximadamente 1 * 108 células de TIL a granel.
En una realización preferida, la expansión de los TIL se puede realizar utilizando una etapa de preparación de la primera expansión (por ejemplo, como los descritos en la etapa B de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), que puede incluir procesos denominados como pre-REP o preparación de REP y que contiene células alimentadoras del día 0 y/o del inicio del cultivo) como se describe a continuación y en el presente documento, seguido de una segunda expansión rápida (Etapa D, incluidos los procesos denominados etapas del protocolo de expansión rápida (REP)) como se describe a continuación en la etapa D y en el presente documento, seguido de una criopreservación opcional, y seguido de una segunda Etapa D (incluidos los procesos denominados etapas de REP de reestimulación) como se describe a continuación y en el presente documento. Los TIL obtenidos a partir de este proceso pueden caracterizarse opcionalmente por características fenotípicas y parámetros metabólicos como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el fragmento de tumor mide entre aproximadamente 1 mm3 y 10 mm3.
En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión se denomina "CM", una abreviatura de medio de cultivo. En algunas realizaciones, el CM para la etapa B consiste en RPMI 1640 con GlutaMAX, complementado con 10 % de suero AB humano, 25 mM de Hepes y 10 pg/mL de gentamicina.
En algunas realizaciones, hay menos o igual a 240 fragmentos o biopsias con aguja gruesa tumorales. En algunas realizaciones, hay menos de o igual a 240 fragmentos o biopsias con aguja gruesa de tumor colocados en menos de o igual a 4 recipientes. En algunas realizaciones, los recipientes son matraces GREX100 MCS. En algunas realizaciones, se colocan menos de o igual a 60 fragmentos o biopsias con aguja gruesa de tumor en 1 recipiente. En algunas realizaciones, cada recipiente comprende menos o igual a 500 mL de medio por recipiente. En algunas realizaciones, el medio comprende IL-2. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el medio comprende células alimentadoras presentadoras de antígeno (también denominadas en el presente documento "células presentadoras de antígeno"). En algunas realizaciones, el medio comprende 2.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente. En algunas realizaciones, el medio comprende OKT-3. En algunas realizaciones, el medio comprende 30 ng/mL de OKT-3 por recipiente. En algunas realizaciones, el recipiente es un matraz GREX100 MCS. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2, 30 ng/mL de OKT-3 y 2.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2, 30 ng/mL de OKT-3 y 2.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente.
Después de la preparación de los fragmentos o biopsias con aguja gruesa tumorales, las células resultantes (es decir, que son de los fragmentos o biopsias con aguja gruesa, y que constituyen una población celular primaria) se cultivan en medios que contienen IL-2, células alimentadoras presentadoras de antígeno y OKT-3 en condiciones que favorecen el crecimiento de los TIL sobre el tumor y otras células y que permiten la preparación de los TIL y el crecimiento acelerado desde el inicio del cultivo el día 0. En algunas realizaciones, los digestos de fragmentos o biopsias con aguja gruesa tumorales y/o los fragmentos o biopsias con aguja gruesa tumorales se incuban con 6000 UI/mL de IL-2, así como con células alimentadoras presentadoras de antígeno y OKT-3. Esta población de células primarias se cultiva durante un período de días, generalmente de 1 a 7 días, lo que da como resultado una población de los TIL a granel, generalmente de aproximadamente 1 * 108 células de TIL a granel. En algunas realizaciones, el medio de crecimiento durante la preparación de la primera expansión comprende IL-2 o una variante de la misma, así como células alimentadoras presentadoras de antígeno y OKT-3. En algunas realizaciones, la IL-2 es IL-2 humana recombinante (rhIL-2). En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 20-30 * 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 20 * 106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 25 * 106 Ul/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 30 * 106 Ul/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 4-8 * 106 Ul/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 5-7 * 106 Ul/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 6 * 106 UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución madre de IL-2 se prepara como se describe en el Ejemplo 5. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 10,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 9,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 8,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 7,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2 o aproximadamente 5,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 9,000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 5,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 8,000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 7,000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 3,000 UI/mL de IL-2. En una realización, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende además IL-2. En una realización preferida, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 3,000 UI/mL de IL-2. En una realización, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 1000 UI/mL, aproximadamente 1500 UI/mL, aproximadamente 2000 UI/mL, aproximadamente 2500 UI/mL, aproximadamente 3000 UI/mL, aproximadamente 3500 UI/mL, aproximadamente 4000 UI/mL, aproximadamente 4500 UI/mL, aproximadamente 5000 UI/mL, aproximadamente 5500 UI/mL, aproximadamente 6000 UI/mL, aproximadamente 6500 UI/mL, aproximadamente 7000 UI/mL, aproximadamente 7500 UI/mL o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En una realización, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende entre 1000 y 2000 UI/mL, entre 2000 y 3000 UI/mL, entre 3000 y 4000 UI/mL, entre 4000 y 5000 UI/mL, entre 5000 y 6000 UI/mL, entre 6000 y 7000 UI/mL, entre 7000 y 8000 UI/mL, o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2.
En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 500 UI/mL de IL-15, aproximadamente 400 UI/mL de IL-15, aproximadamente 300 UI/mL de iL-15, aproximadamente 200 UI/mL de IL-15, aproximadamente 180 UI/mL de IL-15, aproximadamente 160 UI/mL de IL-15, aproximadamente 140 UI/mL de IL-15, aproximadamente 120 UI/mL de IL-15 o aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 500 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 400 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 300 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 200 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15. En una realización, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende además IL-15. En una realización preferida, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15.
En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 20 UI/mL de IL-21, aproximadamente 15 UI/mL de IL-21, aproximadamente 12 UI/mL de IL-21, aproximadamente 10 UI/mL de IL-21, aproximadamente 5 UI/mL de IL-21, aproximadamente 4 UI/mL de IL-21, aproximadamente 3 UI/mL de IL-21, aproximadamente 2 UI/mL de IL-21, aproximadamente 1 UI/mL de IL-21 o aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 20 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de lL-21. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 15 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 12 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 10 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 5 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 2 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-21. En una realización preferida, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21.
En una realización, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende el anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende aproximadamente 30 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular de preparación de la primera expansión comprende aproximadamente 0.1 ng/mL, aproximadamente 0.5 ng/mL, aproximadamente 1 ng/mL, aproximadamente 2.5 ng/mL, aproximadamente 5 ng/mL, aproximadamente 7.5 ng/mL, aproximadamente 10 ng/mL, aproximadamente 15 ng/mL, aproximadamente 20 ng/mL, aproximadamente 25 ng/mL, aproximadamente 30 ng/mL, aproximadamente 35 ng/mL, aproximadamente 40 ng/mL, aproximadamente 50 ng/mL, aproximadamente 60 ng/mL, aproximadamente 70 ng/mL, aproximadamente 80 ng/mL, aproximadamente 90 ng/mL, aproximadamente 100 ng/mL, aproximadamente 200 ng/mL, aproximadamente 500 ng/mL y aproximadamente 1 pg/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 0.1 ng/mL y 1 ng/mL, entre 1 ng/mL y 5 ng/mL, entre 5 ng/mL y 10 ng/mL, entre 10 ng/mL y 20 ng /mL, entre 20 ng/mL y 30 ng/mL, entre 30 ng/mL y 40 ng/mL, entre 40 ng/mL y 50 ng/mL, y entre 50 ng/mL y 100 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 15 ng/mL y 30 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende 30 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el anticuerpo OKT-3 es muromonab.
Tabla 18: Secuencias de aminoácidos de muromonab (anticuerpo OKT-3 ejemplar)
En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende uno o más agonistas de TNFRSF en un medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF es un agonista de 4-1BB, y el agonista de 4-1BB se selecciona del grupo que consiste en urelumab, utomilumab, EU-101, una proteína de fusión y fragmentos, derivados, variantes, biosimilares y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF se agrega a una concentración suficiente para lograr una concentración en el medio de cultivo celular de entre 0.1 pg/mL y 100 pg/mL. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF se agrega a una concentración suficiente para lograr una concentración en el medio de cultivo celular de entre 20 pg/mL y 40 pg/mL.
En algunas realizaciones, además de uno o más agonistas de TNFRSF, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende además IL-2 a una concentración inicial de aproximadamente 3000 UI/mL y anticuerpo OKT-3 a una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL, y en donde el uno o más agonistas de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB. En algunas realizaciones, además de uno o más agonistas de TNFRSF, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión comprende además IL-2 a una concentración inicial de aproximadamente 6000 UI/mL y anticuerpo OKT-3 a una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL, y en donde el uno o más agonistas de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB.
En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión se denomina "CM", una abreviatura de medio de cultivo. En algunas realizaciones, se denomina CM1 (medio de cultivo 1). En algunas realizaciones, CM consiste en RPMI 1640 con GlutaMAX, complementado con 10 % de suero AB humano, 25 mM de Hepes y 10 pg/mL de gentamicina. En algunas realizaciones, el CM es el CM1 descrito en los Ejemplos, véase, los Ejemplos 1 y 14. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión ocurre en un medio de cultivo celular inicial o un primer medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, la preparación del medio de cultivo para la primera expansión o el medio de cultivo celular inicial o el primer medio de cultivo celular comprende IL-2 , o KT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno (también denominadas en el presente documento células alimentadoras).
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la preparación de la primera expansión (incluidos procesos tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, La Figura 85B), que puede incluir aquellos a los que a veces se hace referencia como proceso preREP o preparación de REP), dura entre 1 y 7 días, como se analiza en los ejemplos y las figuras. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la preparación de la primera expansión (incluidos procesos tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), que puede incluir aquellos a los que a veces se hace referencia como proceso pre-REP o preparación de REP), dura entre 2 y 7 días. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión (incluidos procesos tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), que puede incluir aquellos a los que a veces se hace referencia como proceso pre-REP o preparación de r Ep ) dura entre 3 y 7 días. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión (incluidos procesos tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), que puede incluir aquellos a los que a veces se hace referencia como proceso pre-REP o preparación de REP), dura entre 4 y 7 días. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión (incluidos procesos tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), que puede incluir aquellos a los que a veces se hace referencia como proceso pre-REP o preparación de REP), dura entre 5 y 7 días. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión (incluidos procesos tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 85 (en particular, p .ej., la Figura 85B), que puede incluir aquellos a los que a veces se hace referencia como proceso pre-REP o preparación de REP), dura de 6 a 7 días. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión (incluidos procesos tales como, por ejemplo, los proporcionados en la etapa B de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), que puede incluir aquellos a los que a veces se hace referencia como proceso pre-REP o preparación de REP), es de 7 días.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 1 día a 7 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 2 días a 7 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 3 a 7 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 4 a 7 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 5 a 7 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 6 a 7 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 7 días desde cuando se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 1 día a 10 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 2 días a 10 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 3 a 10 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 4 a 7 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 5 a 10 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 6 a 10 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 8 días desde cuando se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 9 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 10 días desde cuando se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña (por ejemplo, la biopsia con aguja gruesa se extrae del cultivo aproximadamente el día 1 ,2 o 3. En algunas realizaciones, la biopsia pequeña (por ejemplo, la biopsia con aguja gruesa) se extrae del cultivo el día 3.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 8 a 17 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 9 a 17 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 10 días a 17 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 11 días a 17 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 12 a 17 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 13 a 17 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 14 a 17 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 15 a 17 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 16 a 17 días desde que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión.
En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días o 10 días. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la primera expansión de los TIL puede continuar durante 1 día a 7 días. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la primera expansión de los TIL puede continuar durante 2 a 7 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede durar entre 3 y 7 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 4 a 7 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede durar entre 5 y 7 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 6 a 7 días. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la primera expansión de los TIL puede continuar durante 1 día a 10 días. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la primera expansión de los TIL puede continuar durante 2 a 10 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede durar entre 3 y 10 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede durar entre 4 y 10 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede durar entre 5 y 10 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede durar entre 6 y 10 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede durar entre 7 y 10 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede durar entre 8 y 10 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede durar entre 9 y 10 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 7 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 8 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 9 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de los TIL puede continuar durante 10 días.
En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión de los TIL puede continuar durante 8 días, 9 días, 10 días, 11 días o 12 días. La primera expansión de los TIL podrá durar entre 8 y 17 días. La primera expansión de los TIL podrá durar entre 9 y 17 días. La primera expansión de los TIL podrá durar entre 10 y 17 días. La primera expansión de los TIL podrá durar entre 11 y 17 días. La primera expansión de los TIL podrá durar entre 12 y 17 días. La primera expansión de los TIL podrá durar entre 13 y 17 días. La primera expansión de los TIL podrá durar entre 14 y 17 días. La primera expansión de los TIL podrá prolongarse durante 15 a 17 días. La primera expansión de los TIL podrá prolongarse durante 16 o 17 días. La primera expansión de los TIL podrá prolongarse durante 17 días.
En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 como combinación durante la preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 así como cualquier combinación de las mismas se pueden incluir durante la preparación de la primera expansión, incluyendo, por ejemplo, durante los procesos de la etapa B de acuerdo con la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), así como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 como combinación durante la preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, IL-2, IL-15 e IL-21 así como cualquier combinación de las mismas pueden incluirse durante los procesos de la etapa B de acuerdo con la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B) y como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión, por ejemplo, la etapa B de acuerdo con la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85<b>), se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de los TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un biorreactor. En algunas realizaciones, se emplea un biorreactor como recipiente. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX-10 o un G-REX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es un G-REX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es un G-REX-10.
1. Células alimentadoras y células presentadoras de antígeno
En una realización, los procedimientos de preparación de la primera expansión descritos en el presente documento (por ejemplo, incluyendo una expansión como la descrita en la etapa B de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), así como aquellas denominadas pre-REP o preparación de REP) requieren células alimentadoras (también denominadas en el presente documento "células presentadoras de antígeno") al inicio de la expansión de los TIL y durante la preparación de la primera expansión. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas a partir de unidades de sangre completa estándar de donantes de sangre sanos alogénicos. Las PBMC se obtienen utilizando métodos estándar como la separación por gradiente de Ficoll-Paque. En algunas realizaciones, se usan 2.5 * 108 células alimentadoras durante la preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, se usan 2.5 * 108 células alimentadoras por recipiente durante la preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, se usan 2.5 * 108 células alimentadoras por GREX-10 durante la preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, se usan 2.5 * l08 células alimentadoras por GREX-100 durante la preparación de la primera expansión.
En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos REP, como se describe en los ejemplos, que proporcionan un protocolo ejemplar para evaluar la incompetencia de replicación de las PBMC alogénicas irradiadas.
En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y aceptables para su uso en los procedimientos de expansión de los TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables en el día 14 es menor que el número inicial de células viables puestas en cultivo en el día 0 de la preparación de la primera expansión.
En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y aceptables para su uso en los procedimientos de expansión de los TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 no ha aumentado con respecto al número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 de la preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 6000 UI/mL de IL-2.
En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y aceptables para su uso en los procedimientos de expansión de los TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 no ha aumentado con respecto al número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 de la preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 5-60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 1000-6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 10-50 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2000-5000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 20-40 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2000 4000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 25-35 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2500-3500 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 15 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 15 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 6000 UI/mL de IL-2.
En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son PBMC. En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son células alimentadoras presentadoras de antígeno artificiales. En una realización, la relación de los TIL con respecto a células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 125, aproximadamente 1 a 150, aproximadamente 1 a 175, aproximadamente 1 a 200, aproximadamente 1 a 225, aproximadamente 1 a 250, aproximadamente 1 a 275, aproximadamente 1 a 300, aproximadamente 1 a 325, aproximadamente 1 a 350, aproximadamente 1 a 375, aproximadamente 1 a 400 o aproximadamente 1 a 500. En una realización, la relación de los TIL con respecto a células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es entre 1 a 50 y 1 a 300. En una realización, la relación de los TIL con respecto a células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es entre 1 a 100 y 1 a 200.
En una realización, los procedimientos de preparación de la primera expansión descritos en el presente documento requieren una relación de aproximadamente 2.5 * 108 células alimentadoras a aproximadamente 100 * 106 TIL. En otra realización, los procedimientos de preparación de la primera expansión descritos en el presente documento requieren una relación de aproximadamente 2.5 * 108 células alimentadoras a aproximadamente 50 * l06 TIL. En otra realización más, la preparación de la primera expansión descrita en el presente documento requiere aproximadamente 2.5 * 108 células alimentadoras a aproximadamente 25 * 106 TIL. En otra realización más, la preparación de la primera expansión descrita en el presente documento requiere aproximadamente 2.5 * 108 células alimentadoras. En otra realización más, la preparación de la primera expansión requiere un cuarto, un tercio, cinco doceavos o la mitad del número de células alimentadoras utilizadas en la segunda expansión rápida.
En algunas realizaciones, el medio en la preparación de la primera expansión comprende IL-2. En algunas realizaciones, el medio en la preparación de la primera expansión comprende 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el medio en la preparación de la primera expansión comprende células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio en la preparación de la primera expansión comprende 2.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente. En algunas realizaciones, el medio en la preparación de la primera expansión comprende OKT-3. En algunas realizaciones, el medio comprende 30 ng de OKT-3 por recipiente. En algunas realizaciones, el recipiente es un matraz GREX100 MCS. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2, 30 ng/mL de OKT-3 y 2.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2, 30 ng/mL de OKT-3 y 2.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente. En algunas realizaciones, el medio comprende 500 mL de medio de cultivo y 15 |jg de OKT-3 por 2.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente. En algunas realizaciones, el medio comprende 500 mL de medio de cultivo y 15 jg de OKT-3 por recipiente. En algunas realizaciones, el recipiente es un matraz GREX100 MCS. En algunas realizaciones, el medio comprende 500 mL de medio de cultivo y 6000 UI/mL de IL-2, 30 ng/mL de OKT-3 y 2.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio comprende 500 mL de medio de cultivo y 6000 UI/mL de IL-2, 15 jg de OKT-3 y 2.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente. En algunas realizaciones, el medio comprende 500 mL de medio de cultivo y 15 jg de OKT-3 por 2.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente.
En una realización, los procedimientos de la preparación de la primera expansión descritos en el presente documento requieren un exceso de células alimentadoras sobre TIL durante la segunda expansión. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas a partir de unidades de sangre completa estándar de donantes de sangre sanos alogénicos. Las PBMC se obtienen utilizando métodos estándar como la separación por gradiente de Ficoll-Paque. En una realización, se utilizan células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) en lugar de PBMC.
En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos de expansión de los TIL descritos en el presente documento, incluidos los procedimientos ejemplares descritos en las figuras y los ejemplos.
En una realización, se utilizan células presentadoras de antígeno artificiales en la preparación de la primera expansión como reemplazo de, o en combinación con, PBMC.
2. Citocinas
Los métodos de expansión descritos en el presente documento generalmente utilizan medios de cultivo con altas dosis de una citocina, en particular IL-2, como se conoce en la técnica.
Como alternativa, también es posible utilizar combinaciones de citocinas para la preparación de la primera expansión TIL, con combinaciones de dos o más de IL-2, IL-15 e IL-21, como se describe generalmente en la publicación internacional No. WO 2015/189356 y WO 2015/189357. Por lo tanto, las combinaciones posibles incluyen IL-2 e IL-15, IL-2 e IL-21, IL-15 e IL-21, e IL-2, IL-15 e IL-21, siendo esta última particularmente útil en muchas realizaciones. El uso de combinaciones de citocinas favorece específicamente la generación de linfocitos, y en particular de células T como se describe en dicho documento.
Tabla 19: Secuencias de aminoácidos de las interleucinas.
C. Etapa C: Preparación de la primera expansión para la transición rápida a la segunda expansión
En algunos casos, la población de los TIL a granel obtenida de la preparación de la primera expansión (que puede incluir expansiones a veces denominadas pre-REP), incluida, por ejemplo, la población de los TIL obtenida, por ejemplo, de la etapa B como se indica en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), pueden someterse a una segunda expansión rápida (que puede incluir expansiones a veces denominadas protocolo de expansión rápida (REP)) y luego criopreservarse como se analiza a continuación. De manera similar, en el caso en que se utilizarán TIL modificados genéticamente en una terapia, la población de los TIL expandida de la preparación de la primera expansión o la población de los TIL expandida de la segunda expansión rápida se pueden someter a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados antes de la etapa de expansión o después de la preparación de la primera expansión y antes de la segunda expansión rápida.
En algunas realizaciones, los TIL obtenidos a partir de la preparación de la primera expansión (por ejemplo, de la etapa B como se indica en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)) se almacenan hasta que se fenotipifican para la selección. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos a partir de la preparación de la primera expansión (por ejemplo, de la etapa B como se indica en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)) no se almacenan y proceden directamente a la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos a partir de la preparación de la primera expansión no se criopreservan después de la preparación de la primera expansión y antes de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días, desde cuando se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos de tumores al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la primera etapa de preparación de la expansión. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión rápida ocurre aproximadamente entre 3 y 7 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 4 y 7 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 5 y 7 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente entre 6 y 7 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión ocurre aproximadamente 7 días después de que se agregan o biopsias con aguja gruesa o fragmentos al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión.
En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión rápida ocurre 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días, a 10 días desde cuando se agregan o biopsias con aguja gruesa o fragmentos al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión rápida ocurre entre 1 y 7 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 2 a 7 días desde que se agregan o biopsias con aguja gruesa o fragmentos al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 3 a 7 días desde que se agregan o biopsias con aguja gruesa o fragmentos al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión rápida ocurre entre 4 y 7 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión rápida ocurre entre 5 y 7 días después de que se agregan las biopsias con aguja gruesa o fragmentos al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión rápida ocurre de 6 a 7 días desde que se agregan o biopsias con aguja gruesa o fragmentos al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión rápida ocurre 7 días desde cuando se agregan o biopsias con aguja gruesa o fragmentos al medio de cultivo celular y/o cuando se inicia la etapa de preparación de la primera expansión.
En algunas realizaciones, los TIL no se almacenan después de la primera expansión primaria y antes de la segunda expansión rápida, y los TIL proceden directamente a la segunda expansión rápida (por ejemplo, en algunas realizaciones, no hay almacenamiento durante la transición de la etapa B a la Etapa D como se muestra en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)). En algunas realizaciones, la transición ocurre en un sistema cerrado, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los TIL de la preparación de la primera expansión, la segunda población de los TIL, proceden directamente a la segunda expansión rápida sin período de transición.
En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión rápida, por ejemplo, la etapa C de acuerdo con la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de los TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un solo biorreactor. En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un GREX-10 o un GREX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor de sistema cerrado es un biorreactor único. En algunas realizaciones, la transición de la preparación de la primera expansión a la segunda expansión rápida implica un aumento de escala en el tamaño del recipiente. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión se realiza en un recipiente más pequeño que la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la preparación de la primera expansión se realiza en un GREX-100 y la segunda expansión rápida se realiza en un GREX-500.
D. Etapa D: Segunda expansión rápida
En algunas realizaciones, la población de células de TIL se expande aún más en número después de la recolección y la preparación de la primera expansión, después de la etapa A y la etapa B, y la transición denominada Etapa C, como se indica en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)). Esta expansión adicional se denomina en el presente documento segunda expansión rápida, que puede incluir procesos de expansión generalmente denominados en la técnica como proceso de expansión rápida (protocolo de expansión rápida o REP; así como procesos como los indicados en la etapa D de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)). La segunda expansión rápida generalmente se logra utilizando un medio de cultivo que comprende varios componentes, incluidas células alimentadoras, una fuente de citocinas y un anticuerpo anti-CD3, en un recipiente permeable al gas. En algunas realizaciones, 1 día, 2 días, 3 días o 4 días después del inicio de la segunda expansión rápida (es decir, en los días 8, 9, 10 u 11 del proceso general Gen 3), los TIL se transfieren a un recipiente de mayor volumen.
En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida (que puede incluir expansiones a veces denominadas REP; así como procesos como los indicados en la etapa D de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)) de los TIL se puede realizar utilizando cualquier matraz o recipiente de los TIL conocido por aquellos expertos en la materia. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días o 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 1 día a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 2 días a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 4 días a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 5 días a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 6 días a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 7 días a aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 7 días a aproximadamente 10 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 1 día después del inicio de la segunda expansión rápida. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 2 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 3 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 4 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 5 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 6 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 7 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 8 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 9 días después del inicio de la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones, la segunda expansión de los TIL puede continuar durante aproximadamente 10 días después del inicio de la segunda expansión rápida.
En una realización, la segunda expansión rápida se puede realizar en un recipiente permeable al gas utilizando los métodos de la presente divulgación (incluyendo, por ejemplo, expansiones denominadas REP; así como procesos como los indicados en la etapa D de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)). En algunas realizaciones, los TIL se expanden en la segunda expansión rápida en presencia de IL-2, OKT-3 y células alimentadoras (también denominadas en el presente documento "células presentadoras de antígeno"). En algunas realizaciones, los TIL se expanden en la segunda expansión rápida en presencia de IL-2, OKT-3 y células alimentadoras, en donde las células alimentadoras se agregan a una concentración final que es el doble, 2.4 veces, 2.5 veces, 3 veces, 3.5 veces o 4 veces la concentración de células alimentadoras presentes en la preparación de la primera expansión. Por ejemplo, los TIL pueden expandirse rápidamente mediante la estimulación no específica del receptor de células T en presencia de interleucina-2 (IL-2) o interleucina-15 (IL-15). El estímulo del receptor de células T no específico puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, tal como aproximadamente 30 ng/mL de OKT3, un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD3 (disponible comercialmente en Ortho-McNeil, Raritan, NJ o Miltenyi Biotech, Auburn, CA) o UHCT-1 (disponible comercialmente en BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.). Los TIL se pueden expandir para inducir una mayor estimulación de los TILin vitromediante la inclusión de uno o más antígenos durante la segunda expansión, incluidas porciones antigénicas de los mismos, tales como epítopo(s), del cáncer, que pueden expresarse opcionalmente a partir de un vector, tal como un péptido de unión al antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), por ejemplo, 0.3 pM de MART-1:26-35 (27 l ) o gpl 00:209-217 (210 M), opcionalmente en presencia de un factor de crecimiento de células T, tal como 300 UI/mL de IL-2 o IL-15. Otros antígenos adecuados pueden incluir, por ejemplo, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, antígeno de cáncer de tirosinasa, MAGE-A3, SSX-2 y<v>E<g>FR2, o porciones antigénicas de los mismos. Los TIL también puede expandirse rápidamente mediante la reestimulación con el mismo(s) antígeno(s) del cáncer aplicados a las células presentadoras de antígeno que expresan HLA-A2. Como alternativa, los TIL pueden volver a estimularse, por ejemplo, con linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2. En algunas realizaciones, la reestimulación ocurre como parte de la segunda expansión. En algunas realizaciones, la segunda expansión ocurre en presencia de linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2.
En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1000 UI/mL, aproximadamente 1500 UI/mL, aproximadamente 2000 UI/mL, aproximadamente 2500 UI/mL, aproximadamente 3000 UI/mL, aproximadamente 3500 UI/mL, aproximadamente 4000 UI/mL, aproximadamente 4500 UI/mL, aproximadamente 5000 UI/mL, aproximadamente 5500 UI/mL, aproximadamente 6000 UI/mL, aproximadamente 6500 UI/mL, aproximadamente 7000 UI/mL, aproximadamente 7500 UI/mL o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 1000 y 2000 UI/mL, entre 2000 y 3000 UI/mL, entre 3000 y 4000 UI/mL, entre 4000 y 5000 UI/mL, entre 5000 y 6000 UI/mL, entre 6000 y 7000 UI/mL, entre 7000 y 8000 UI/mL, o entre 8000 UI/mL de IL-2.
En una realización, el medio de cultivo celular comprende el anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 30 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0.1 ng/mL, aproximadamente 0.5 ng/mL, aproximadamente 1 ng/mL, aproximadamente 2.5 ng/mL, aproximadamente 5 ng/mL, aproximadamente 7.5 ng/mL, aproximadamente 10 ng/mL. , aproximadamente 15 ng/mL, aproximadamente 20 ng/mL, aproximadamente 25 ng/mL, aproximadamente 30 ng/mL, aproximadamente 35 ng/mL, aproximadamente 40 ng/mL, aproximadamente 50 ng/mL, aproximadamente 60 ng/mL, aproximadamente 70 ng/mL, aproximadamente 80 ng/mL, aproximadamente 90 ng/mL, aproximadamente 100 ng/mL, aproximadamente 200 ng/mL, aproximadamente 500 ng/mL y aproximadamente 1 pg/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 0.1 ng/mL y 1 ng/mL, entre 1 ng/mL y 5 ng/mL, entre 5 ng/mL y 10 ng/mL, entre 10 ng/mL y 20 ng /mL, entre 20 ng/mL y 30 ng/mL, entre 30 ng/mL y 40 ng/mL, entre 40 ng/mL y 50 ng/mL, y entre 50 ng/mL y 100 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 30 ng/mL y 60 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 30 ng/mL de OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 60 ng/mL de OKT-3. En algunas realizaciones, el anticuerpo OKT-3 es muromonab.
En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende IL-2. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende 7.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende OKT-3. En algunas realizaciones, el medio de segunda expansión rápida comprende 500 mL de medio de cultivo y 30 pg de OKT-3 por recipiente. En algunas realizaciones, el recipiente es un matraz GREX100 MCS. En algunas realizaciones, el medio de segunda expansión rápida comprende 6000 UI/mL de IL-2, 60 ng/mL de OKT-3 y 7.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio comprende 500 mL de medio de cultivo y 6000 Ul/mL de IL-2, 30 pg de OKT-3 y 7.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente.
En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende IL-2. En algunas realizaciones, el medio comprende 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio comprende entre 5 * 108 y 7.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende OKT-3. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende 500 mL de medio de cultivo y 30 pg de OKT-3 por recipiente. En algunas realizaciones, el recipiente es un matraz GREX100 MCS. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende 6000 UI/mL de IL-2, 60 ng/mL de OKT-3 y entre 5 * 108 y 7.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el medio en la segunda expansión rápida comprende 500 mL de medio de cultivo y 6000 UI/mL de IL-2, 30 pg de OKT-3 y entre 5 * 108 y 7.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno por recipiente.
En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende uno o más agonistas de TNFRSF en un medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF es un agonista de 4-1BB, y el agonista de 4-1BB se selecciona del grupo que consiste en urelumab, utomilumab, EU-101, una proteína de fusión y fragmentos, derivados, variantes, biosimilares y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF se agrega a una concentración suficiente para lograr una concentración en el medio de cultivo celular de entre 0.1 pg/mL y 100 pg/mL. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF se agrega a una concentración suficiente para lograr una concentración en el medio de cultivo celular de entre 20 pg/mL y 40 pg/mL.
En algunas realizaciones, además de uno o más agonistas de TNFRSF, el medio de cultivo celular comprende además IL-2 a una concentración inicial de aproximadamente 3000 UI/mL y anticuerpo OKT-3 a una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL, y en donde el uno o más agonistas de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB.
En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 como combinación durante la segunda expansión. En algunas realizaciones, IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 así como cualquier combinación de las mismas se pueden incluir durante la segunda expansión, incluyendo, por ejemplo, durante un proceso de la etapa D de acuerdo con la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), así como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 como combinación durante la segunda expansión. En algunas realizaciones, IL-2, IL-15 e IL-21 así como cualquier combinación de las mismas pueden incluirse durante los procesos de la etapa D de acuerdo con la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B) y como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la segunda expansión se puede realizar en un medio de cultivo celular complementado que comprende IL-2, o KT-3, células alimentadoras presentadoras de antígeno y, opcionalmente, un agonista de TNFRSF. En algunas realizaciones, la segunda expansión ocurre en un medio de cultivo celular complementado. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular complementado comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC; también denominadas células alimentadoras presentadoras de antígeno). En algunas realizaciones, la segunda expansión ocurre en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno (es decir, células presentadoras de antígeno).
En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 500 UI/mL de IL-15, aproximadamente 400 UI/mL de IL-15, aproximadamente 300 UI/mL de<i>L-15, aproximadamente 200 UI/mL de IL-15, aproximadamente 180 UI/mL de IL-15, aproximadamente 160 UI/mL de IL-15, aproximadamente 140 UI/mL de IL-15, aproximadamente 120 UI/mL de IL-15 o aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 500 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 400 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 300 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 200 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-15. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15.
En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 20 UI/mL de IL-21, aproximadamente 15 UI/mL de IL-21, aproximadamente 12 UI/mL de IL-21, aproximadamente 10 UI/mL de IL-21, aproximadamente 5 UI/mL de IL-21, aproximadamente 4 UI/mL de IL-21, aproximadamente 3 UI/mL de IL-21, aproximadamente 2 UI/mL de IL-21, aproximadamente 1 UI/mL de IL-21 o aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 20 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 15 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 12 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 10 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 5 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 2 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-21. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21.
En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC) son PBMC. En una realización, la relación de los TIL a PBMC y/o células presentadoras de antígeno en la expansión rápida y/o la segunda expansión es de aproximadamente 1 a 10, aproximadamente 1 a 15, aproximadamente 1 a 20, aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 30, aproximadamente 1 a 35, aproximadamente 1 a 40, aproximadamente 1 a 45, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 75, aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 125, aproximadamente 1 a 150, aproximadamente 1 a 175, aproximadamente 1 a 200, aproximadamente 1 a 225, aproximadamente 1 a 250, aproximadamente 1 a 275, aproximadamente 1 a 300, aproximadamente 1 a 325, aproximadamente 1 a 350, aproximadamente 1 a 375, aproximadamente 1 a 400 o aproximadamente 1 a 500. En una realización, la relación de los TIL a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión es entre 1 a 50 y 1 a 300. En una realización, la relación de los TIL a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión es entre 1 a 100 y 1 a 200.
En una realización, el REP y/o la segunda expansión rápida se realizan en matraces con los TIL a granel mezclados con un exceso de 100 o 200 veces de células alimentadoras inactivadas, en donde la concentración de células alimentadoras es al menos 1.1 veces (1.1X), 1.2X, 1.3X, 1.4X, 1.5X, 1.6X, 1.7X, 1.8X, 1.8X, 2X, 2.1X, 2.2X, 2.3X, 2.4X, 2.5X, 2.6X, 2.7X, 2.8X, 2.9X, 3.0X, 3.1X, 3.2X, 3.3X, 3.4X, 3.5X, 3.6X, 3.7X, 3.8X, 3.9X o 4.0X la concentración de células alimentadoras en la preparación de la primera expansión, 30 ng/mL de anticuerpo anti-CD3 OKT3 y 6000 UI/mL de IL-2 en 150 mL de medio. Se realiza el reemplazo del medio (generalmente 2/3 del medio mediante aspirado de 2/3 del medio gastado y reemplazo con un volumen igual de medio nuevo) hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa. Las cámaras de crecimiento alternativas incluyen matraces G-REX y recipientes permeables a los gases, como se analiza con más detalle a continuación.
En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida (que puede incluir procesos denominados proceso REP) es de 7 a 10 días, como se analiza en los ejemplos y las figuras. En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida (que puede incluir procesos denominados proceso REP) es de 7 a 9 días, como se analiza en los ejemplos y las figuras. En algunas realizaciones, la segunda expansión es de 7 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión es de 8 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión es de 9 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión es de 10 días.
En una realización, la segunda expansión (que puede incluir expansiones denominadas REP, así como aquellas a las que se hace referencia en la etapa D de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)) se puede realizar en matraces permeables a los gases con una capacidad de 500 mL con fondos de silicio permeables a los gases de 100 cm (G-Rex 100, disponible comercialmente en Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, EE. UU.), 5 * 106 o 10 * 106 TIL se pueden cultivar con PBMC en 400 mL de medio 50/50, complementado con 5 % de suero AB humano, 3000 UI por mL de IL-2 y 30 ng por mL de anti-CD3 (OKT3). Los matraces G-Rex 100 se pueden incubar a 37 °C en 5 % de CO2. El día 5, se pueden retirar 250 mL de sobrenadante y colocarlos en matraces para centrífuga y centrifugarlos a 1500 rpm (491 * g) durante 10 minutos. Los sedimentos de los TIL pueden resuspenderse con 150 mL de medio fresco con 5 % de suero AB humano, 6000 UI por mL de IL-2 y agregarse nuevamente a los matraces GREX-100 originales. Cuando los TIL se expanden en serie en matraces GREX-100, el día 10 u 11 los TIL se pueden trasladar a un matraz más grande, como un GREX-500. Las células pueden recolectarse el día 14 de cultivo. Las células pueden recolectarse el día 15 de cultivo. Las células pueden recolectarse el día 16 de cultivo. En algunas realizaciones, el reemplazo del medio se realiza hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa. En algunas realizaciones, 2/3 del medio se reemplazan mediante aspirado del medio gastado y reemplazo con un volumen igual de medio nuevo. En algunas realizaciones, las cámaras de crecimiento alternativas incluyen matraces GREX y recipientes permeables a los gases, como se analiza con más detalle a continuación.
En una realización, se realiza la segunda expansión rápida (incluidas las expansiones denominadas REP) y comprende además una etapa en donde se seleccionan TIL para una reactividad tumoral superior. Se puede utilizar cualquier método de selección conocido en la técnica. Por ejemplo, los métodos descritos en publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2016/0010058 A1, puede usarse para la selección de los TIL para una reactividad tumoral superior.
Opcionalmente, se puede realizar un ensayo de viabilidad celular después de la segunda expansión rápida (incluidas las expansiones denominadas expansión REP), utilizando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de exclusión de azul tripán en una muestra de los TIL a granel, que marca selectivamente las células muertas y permite una evaluación de la viabilidad. En algunas realizaciones, las muestras de los TIL se pueden contar y determinar la viabilidad utilizando un contador de células automatizado Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). En algunas realizaciones, la viabilidad se determina de acuerdo con el protocolo estándar del contador de células automático del citómetro de imágenes Cellometer K2.
Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos de genes. Estos segmentos de genes: V (variable), D (diversidad), J (unión) y C (constante) determinan la especificidad de unión y las aplicaciones posteriores de las inmunoglobulinas y los receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un método para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos mediante el presente método exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos en la segunda expansión exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, el aumento en la diversidad es un aumento en la diversidad de inmunoglobulina y/o la diversidad del receptor de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina y en la cadena pesada de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina y en la cadena ligera de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionados del grupo que consiste en receptores alfa, beta, gamma y delta. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de TCRab (es decir, (TCRa/p).
En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión rápida (por ejemplo, a veces denominado CM2 o el segundo medio de cultivo celular), comprende IL-2, OKT-3, así como las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC), como se analiza con más detalle a continuación. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión rápida (por ejemplo, a veces denominado CM2 o segundo medio de cultivo celular), comprende 6000 UI/mL de IL-2, 30 pg/matraz de OKT-3, así como 7.5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC), como se analiza con más detalle a continuación. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión rápida (por ejemplo, a veces denominado CM2 o el segundo medio de cultivo celular), comprende IL-2, OKT-3, así como las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC), como se analiza con más detalle a continuación. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión rápida (por ejemplo, a veces denominado CM2 o segundo medio de cultivo celular), comprende 6000 UI/mL de IL-2, 30 pg/matraz de OKT-3, así como 5 * 108 células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC), como se analiza con más detalle a continuación.
En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida, por ejemplo, la etapa D de acuerdo con la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de los TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un biorreactor. En algunas realizaciones, se emplea un biorreactor como recipiente. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX-100 o un G-REX-500. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es un G-REX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es un G-REX-500.
1. Células alimentadoras y células presentadoras de antígeno
En una realización, los procedimientos de segunda expansión rápida descritos en el presente documento (por ejemplo, incluyendo una expansión como la descrita en la etapa D de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), así como aquellas denominadas REP) requieren un exceso de células alimentadoras durante la expansión de REP TIL y/o durante la segunda expansión rápida. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas a partir de unidades de sangre completa estándar de donantes de sangre sanos. Las PBMC se obtienen utilizando métodos estándar como la separación por gradiente de Ficoll-Paque.
En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos REP, como se describe en los ejemplos, que proporcionan un protocolo ejemplar para evaluar la incompetencia de replicación de las PBMC alogénicas irradiadas.
En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y aceptables para su uso en los procedimientos de expansión de los TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables en el día 7 o 14 es menor que el número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión).
En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y aceptables para su uso en los procedimientos de expansión de los TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado con respecto al número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión). En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 15 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 15 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 6000 UI/mL de IL-2.
En algunas realizaciones, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y aceptables para su uso en los procedimientos de expansión de los TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado con respecto al número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión). En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30-60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 1000-6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30-60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2000-5000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30-60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2000-4000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30-60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2500-3500 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30-60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 6000 UI/mL de IL-2.
En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son PBMC. En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son células alimentadoras presentadoras de antígeno artificiales. En una realización, la relación de los TIL con respecto a células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de aproximadamente 1 a 10, aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 125, aproximadamente 1 a 150, aproximadamente 1 a 175, aproximadamente 1 a 200, aproximadamente 1 a 225, aproximadamente 1 a 250, aproximadamente 1 a 275, aproximadamente 1 a 300, aproximadamente 1 a 325, aproximadamente 1 a 350, aproximadamente 1 a 375, aproximadamente 1 a 400 o aproximadamente 1 a 500. En una realización, la relación de los TIL con respecto a células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es entre 1 a 50 y 1 a 300. En una realización, la relación de los TIL con respecto a células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es entre 1 a 100 y 1 a 200.
En una realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una relación de aproximadamente 5 * 108 células alimentadoras a aproximadamente 100 * 106 TIL. En una realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una relación de aproximadamente 7.5 * 108 células alimentadoras a aproximadamente 100 * 106 TIL. En otra realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una relación de aproximadamente 5 * 108 células alimentadoras a aproximadamente 50 * 106 TIL. En otra realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una relación de aproximadamente 7.5 * 108 células alimentadoras a aproximadamente 50 * 106 TIL. En otra realización más, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren aproximadamente 5 * 108 células alimentadoras a aproximadamente 25 * 106 TIL. En otra realización más, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren aproximadamente 7.5 * 108 células alimentadoras a aproximadamente 25 * 106 TIL. En otra realización más, la segunda expansión rápida requiere el doble de número de células alimentadoras que la segunda expansión rápida. En otra realización más, cuando la preparación de la primera expansión descrita en el presente documento requiere aproximadamente 2.5 * 108 células alimentadoras, la segunda expansión rápida requiere aproximadamente 5 * 108 células alimentadoras. En otra realización más, cuando la preparación de la primera expansión descrita en el presente documento requiere aproximadamente 2.5 * 108 células alimentadoras, la segunda expansión rápida requiere aproximadamente 7.5 * 108 células alimentadoras. En otra realización más, la segunda expansión rápida requiere dos veces (2.0X), 2.5X, 3.0X, 3.5X o 4.0X el número de células alimentadoras que la preparación de la primera expansión.
En una realización, los procedimientos de segunda expansión rápida descritos en el presente documento requieren un exceso de células alimentadoras durante la segunda expansión rápida. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas a partir de unidades de sangre completa estándar de donantes de sangre sanos alogénicos. Las PBMC se obtienen utilizando métodos estándar como la separación por gradiente de Ficoll-Paque. En una realización, se utilizan células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) en lugar de PBMC. En algunas realizaciones, las PBMC se agregan a la segunda expansión rápida al doble de la concentración de PBMC que se agregaron a la preparación de la primera expansión.
En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos de expansión de los TIL descritos en el presente documento, incluidos los procedimientos ejemplares descritos en las figuras y los ejemplos.
En una realización, se utilizan células presentadoras de antígeno artificiales en la segunda expansión rápida como reemplazo de, o en combinación con, PBMC.
2. Citocinas
Los métodos de segunda expansión rápida descritos en el presente documento generalmente utilizan medios de cultivo con altas dosis de una citocina, en particular IL-2, como se conoce en la técnica.
Alternativamente, también es posible utilizar combinaciones de citocinas para la segunda expansión rápida de los TIL, con combinaciones de dos o más de IL-2, IL-15 e IL-21 como se describe generalmente en los documentos WO 2015/189356 y WO 2015/189357. Por lo tanto, las combinaciones posibles incluyen IL-2 e IL-15, IL-2 e IL-21, IL-15 e IL-21, e IL-2, IL-15 e IL-21, siendo esta última particularmente útil en muchas realizaciones. El uso de combinaciones de citocinas favorece específicamente la generación de linfocitos, y en particular de células T como se describe en dicho documento.
E. Etapa E: Recolección de los TIL
Después de la segunda etapa de expansión rápida, se pueden recolectar las células. En algunas realizaciones, los TIL se recolectan después de una, dos, tres, cuatro o más etapas de expansión, por ejemplo, como se proporciona en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, los TIL se recolectan después de dos etapas de expansión, por ejemplo, como se proporciona en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, los TIL se recolectan después de dos etapas de expansión, una preparación de la primera expansión y una segunda expansión rápida, por ejemplo, como se proporciona en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B).
Los TIL se pueden recolectar de cualquier manera apropiada y estéril, incluso, por ejemplo, mediante centrifugación. Los métodos para la recolección de los TIL son bien conocidos en la técnica y cualquiera de dichos métodos conocidos se puede emplear con el presente proceso. En algunas realizaciones, los TIL se recolectan utilizando un sistema automatizado.
Los recolectores de células y/o sistemas de procesamiento de células están disponibles comercialmente de una variedad de fuentes, incluyendo, por ejemplo, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer e Inotech Biosystems International, Inc. Cualquier recolector basado en células puede emplearse con los métodos actuales. En algunas realizaciones, el recolector de células y/o el sistema de procesamiento de células es un recolector de células basado en membrana. En algunas realizaciones, la recolección de células se realiza a través de un sistema de procesamiento de células, como el sistema LOVO (fabricado por Fresenius Kabi). El término "sistema de procesamiento de células LOVO" también se refiere a cualquier instrumento o dispositivo fabricado por cualquier proveedor que pueda bombear una solución que comprende células a través de una membrana o filtro, tal como una membrana giratoria o un filtro giratorio, en un entorno de sistema cerrado y/o estéril, lo que permite un flujo continuo y el procesamiento de células para eliminar el sobrenadante o el medio de cultivo celular sin sedimentación. En algunas realizaciones, el recolector de células y/o el sistema de procesamiento de células pueden realizar separación de células, lavado, intercambio de fluidos, concentración y/u otras etapas de procesamiento de células en un sistema cerrado y estéril.
En algunas realizaciones, la segunda expansión rápida, por ejemplo, la etapa D de acuerdo con la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de los TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un biorreactor. En algunas realizaciones, se emplea un biorreactor como recipiente. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX-100 o un G-REX-500. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es un G-REX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor empleado es un G-REX-500.
En algunas realizaciones, la etapa E de acuerdo con la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), se realiza de acuerdo con los procesos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, se accede al sistema cerrado a través de jeringas en condiciones estériles para mantener la esterilidad y la naturaleza cerrada del sistema. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, los TIL se recolectan de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los TIL entre los días 14 y 16 se recolectan utilizando los métodos como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los TIL se recolectan a los 14 días utilizando los métodos como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los TIL se recolectan a los 15 días utilizando los métodos como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los TIL se recolectan a los 16 días utilizando los métodos como se describe en el presente documento.
F. Etapa F: ¡Formulación final! Transferencia a bolsa de infusión
Una vez completadas las etapas A a E, tal como se proporciona en un orden ejemplar en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B) y como se describió en detalle anteriormente y en el presente documento, las células se transfieren a un recipiente para su uso en la administración a un paciente. En algunas realizaciones, una vez que se obtiene una cantidad terapéuticamente suficiente de los TIL utilizando los métodos de expansión descritos anteriormente, se transfieren a un recipiente para su uso en la administración a un paciente.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que los TIL expandidos utilizando los métodos de la presente divulgación se administran a un paciente como una composición farmacéutica. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la composición farmacéutica es una suspensión de los TIL en un tampón estéril. Los TIL expandidos como se divulga en el presente documento se pueden administrar mediante cualquier vía adecuada conocida en la técnica. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que los TIL se administran como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura aproximadamente entre 30 y 60 minutos. Otras vías de administración adecuadas incluyen la intraperitoneal, la intratecal y la intralinfática.
En una realización, los TIL expandidos utilizando procesos de la divulgación anterior pueden ser para administración como composiciones que comprenden además un criopreservante. En una realización, los TIL expandidos utilizando procesos de la divulgación anterior pueden ser para administración como composiciones que comprenden además un criopreservante y un agente isotónico. En una realización, los TIL expandidos utilizando procesos de la divulgación anterior pueden ser para administración como composiciones que comprenden además un criopreservante que comprende dimetilsulfóxido y un agente isotónico que comprende cloruro de sodio, gluconato de sodio y acetato de sodio. En una realización, los TIL expandidos utilizando procesos de la divulgación anterior pueden ser para administración como composiciones que comprenden además un criopreservante que comprende dimetilsulfóxido y dextrano 40 y un agente isotónico que comprende cloruro de sodio, gluconato de sodio y acetato de sodio. En una realización, los TIL expandidos utilizando procesos de la divulgación anterior pueden ser para administración como composiciones suministradas en una bolsa de infusión estéril, comprendiendo dichas composiciones además un criopreservante que comprende dimetilsulfóxido y dextrano 40 y un agente isotónico que comprende cloruro de sodio, gluconato de sodio y acetato de sodio.
G. Proporciones de células alimentadoras de PBMC
En algunas realizaciones, los medios de cultivo utilizados en los métodos de expansión descritos en el presente documento (véase, por ejemplo, la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)) incluyen un anticuerpo anti-CD3, p. ej., OKT-3. Un anticuerpo anti-CD3 en combinación con IL-2 induce la activación de células T y la división celular en la población TIL. Este efecto se puede observar con anticuerpos de longitud completa, así como con fragmentos Fab y F(ab')2, siendo generalmente preferidos los primeros; véase por ejemplo, Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719.
En una realización, el número de capas de alimentación de PBMC se calcula de la siguiente manera:
A. Volumen de una célula T (10 pm de diámetro): V= (4/3) nr3 = 523.6 pm3
B. Columna de G-Rex 100 (M) con una altura de 40 pm (4 células):V= (4/3) nr3 = 4 * 1012 pm3
C. Número de células necesario para llenar la columna B: 4 * 1012 |jm3 / 523.6 |jm3 = 7.6 * 108 |jm3 * 0.64 = 4.86 * 108
D. Número de células que se pueden activar de forma óptima en el espacio 4D: 4.86 * 108 / 24 = 20.25 * 106
E. Número de alimentadores y TIL extrapolados a G-Rex 500: TIL: 100 * 106 y Alimentador: 2.5 * 109
En este cálculo se usa una aproximación del número de células mononucleares necesarias para proporcionar una geometría icosaédrica para la activación de los TIL en un cilindro con un diámetro de l00 cm2. El cálculo deriva en un resultado experimental de ~5 * 108 para la activación umbral de las células T, lo que refleja fielmente los datos experimentales del NCI(1). (C) El multiplicador (0.64) es la densidad de empaquetamiento aleatorio para esferas equivalentes calculado por Jaeger y Nagel en 1992(2). (D) El divisor 24 es el número de esferas equivalentes que podrían entrar en contacto con un objeto similar en un espacio de 4 dimensiones "el número de Newton"(3).
(1) Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3): 283-292.
(2) Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20; 255(5051): 1523-31.
(3) O. R. Musin (2003). "The problem of the twenty-five spheres". Russ. Math. Surv. 58 (4): 794-795.
En una realización, la cantidad de células alimentadoras presentadoras de antígeno suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión es aproximadamente la mitad de la cantidad de células alimentadoras presentadoras de antígeno suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida. En ciertas realizaciones, el método comprende realizar la preparación de la primera expansión en un medio de cultivo celular que comprende aproximadamente un 50 % menos de células presentadoras de antígeno en comparación con el medio de cultivo celular de la segunda expansión rápida.
En otra realización, la cantidad de células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC) suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida es mayor que el número de APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 20:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 10:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 9:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 8:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 7:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 6:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 5:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 4:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 3:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.9:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.8:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.7:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.6:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.5:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.4:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.3:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.2:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.1:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2 y 3:1 hasta igual o aproximadamente 10:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2 y 3:1 hasta igual o aproximadamente 5:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 4:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2 y 3:1 hasta igual o aproximadamente 3:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.9:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.8:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.7:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.6:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.5:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.4:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.3:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.2:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.1:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión sea igual o aproximadamente 2:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida y el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión sea igual o aproximadamente 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1, 3:1, 3.1:1, 3.2:1, 3.3:1, 3.4:1, 3.5:1, 3.6:1, 3.7:1, 3.8:1, 3.9:1, 4:1, 4.1:1, 4.2:1,4.3:1,4.4:1, 4.5:1, 4.6:1, 4.7:1, 4.8:1,4.9:1 o 5:1.
En otra realización, el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión sea igual o aproximadamente 1 * 108, 1.1 * 108, 1.2 * 108, 1.3 * 108, 1.4 * 108, 1.5 * 108, 1.6 * 108, 1.7 * 108, 1.8 * 108, 1.9 * 108, 2 * 108, 2.1 * 108, 2.2 * 108, 2.3 * 108, 2.4 * 108, 2.5 * 108, 2.6 * 108, 2.7 * 108, 2.8 * 108, 2.9 * 108, 3 * 108, 3.1 * 108, 3.2 * 108, 3.3 * 108, 3.4 * 108 o 3.5 * 108APC, y el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida sea igual o aproximadamente 3.5 * 108, 3.6 * 108, 3.7 * 108, 3.8 * 108, 3.9 * 108, 4 * 108, 4.1 * 108, 4.2 * 108, 4.3 * 108, 4.4 * 108, 4.5 * 108, 4.6 * 108, 4.7 * 108, 4.8 * 108, 4.9 * 108, 5 * 108, 5.1 * 108, 5.2 * 108, 5.3 * 108, 5.4 * 108, 5.5 * 108, 5.6 * 108, 5.7 * 108, 5.8 * 108, 5.9 * 108, 6 * 108, 6.1 * 108, 6.2 * 108, 6.3 * 108, 6.4 * 108, 6.5 * 108, 6.6 * 108, 6.7 * 108, 6.8 * 108, 6.9 * 108, 7 * 108, 7.1 * 108, 7.2 * 108, 7.3 * 108, 7.4 * 108, 7.5 * 108, 7.6 * 108, 7.7 * 108, 7.8 * 108, 7.9 * 108, 8 * 108, 8.1 * 108, 8.2 * 108, 8.3 * 108, 8.4 * 108, 8.5 * 108, 8.6 * 108, 8.7 * 108, 8.8 * 108, 8.9 * 108, 9 * 108, 9.1 * 108, 9.2 * 108, 9.3 * 108, 9.4 * 108, 9.5 * 108, 9.6 * 108, 9.7 * 108, 9.8 * 108, 9.9 * 108 o 1 * 109 APC.
En otra realización, el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1.5 * 108 APC hasta igual o aproximadamente 3 * 108 APC y el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida se seleccionan del intervalo de igual o aproximadamente 4 * 108 APC hasta igual o aproximadamente 7.5 * 108 APC.
En otra realización, el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 2 * 108 APC hasta igual o aproximadamente 2.5 * 108APC y el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 4.5 * 108 APC hasta igual o aproximadamente 5.5 * 108 APC.
En otra realización, el número de las APC suministradas exógenamente durante la preparación de la primera expansión sea igual o aproximadamente 2.5 * 108 APC, y el número de las APC suministradas exógenamente durante la segunda expansión rápida sea igual o aproximadamente 5 * 108 APC.
En una realización, el número de APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) agregadas el día 0 de la preparación de la primera expansión es aproximadamente la mitad de la cantidad de PBMC agregadas el día 7 de la preparación de la primera expansión (por ejemplo, el día 7 del método). En ciertas realizaciones, el método comprende agregar células presentadoras de antígeno el día 0 de la preparación de la primera expansión a la primera población de los TIL y agregar células presentadoras de antígeno el día 7 a la segunda población de los TIL, en donde el número de células presentadoras de antígeno agregadas el día 0 es aproximadamente el 50 % del número de células presentadoras de antígeno agregadas el día 7 de la preparación de la primera expansión (por ejemplo, el día 7 del método).
En otra realización, el número de APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida es mayor que la cantidad de PBMC suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la preparación de la primera expansión se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.0 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 4.5 * 106APC/cm2.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la preparación de la primera expansión se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.5 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 3.5 * 106 APC/cm2.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la preparación de la primera expansión se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada de un intervalo desde igual o aproximadamente 2 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 3 * 106 APC/cm2.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la preparación de la primera expansión se siembran en el matraz de cultivo a una densidad de igual o aproximadamente 2 * 106 APC/cm2.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la preparación de la primera expansión se siembran en el matraz de cultivo a una densidad de igual o aproximadamente 1.0 * 106, 1.1 * 106, 1.2 * 106, 1.3 * 106, 1.4 * 106, 1.5 * 106, 1.6 * 106, 1.7 * 106, 1.8 * 106, 1.9 * 106, 2 * 106, 2.1 * 106, 2.2 * 106, 2.3 * 106, 2.4 * 106, 2.5 * 106, 2.6 * 106, 2.7 * 106, 2.8 * 106, 2.9 * 106, 3 * 106, 3.1 * 106, 3.2 * 106, 3.3 * 106, 3.4 * 106, 3.5 * 106, 3.6 * 106, 3.7 * 106, 3.8 * 106, 3.9 * 106, 4 * 106, 4.1 * 106, 4.2 * 106, 4.3 * 106, 4.4 * 106 o 4.5 * 106 APC/cm2.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada de un intervalo desde igual o aproximadamente 2.5 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 7.5 * 106 APC/cm2.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada de un intervalo desde igual o aproximadamente 3.5 * 106 APC/cm2 hasta aproximadamente 6.0 * 106 APC/cm2
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada de un intervalo desde igual o aproximadamente 4.0 * 106 APC/cm2 hasta aproximadamente 5.5 * 106 APC/cm2.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada de un intervalo desde igual o aproximadamente 4.0 * 106 APC/cm2.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad de igual o aproximadamente 2.5 * 106 APC/cm2, 2.6 * 106 APC/cm2, 2.7 * 106 APC/cm2, 2.8 * 106, 2.9 * 106, 3 * 106, 3.1 * 106, 3.2 * 106, 3.3 * 106, 3.4 * 106, 3.5 * 106, 3.6 * 106, 3.7 * 106, 3.8 * 106, 3.9 * 106, 4 * 106, 4.1 * 106, 4.2 * 106, 4.3 * 106, 4.4 * 106, 4.5 * 106, 4.6 * 106, 4.7 * 106, 4.8 * 106, 4.9 * 106, 5 * 106, 5.1 * 106, 5.2 * 106, 5.3 * 106, 5.4 * 106, 5.5 * 106, 5.6 * 106, 5.7 * 106, 5.8 * 106, 5.9 * 106, 6 * 106, 6.1 * 106, 6.2 * 106, 6.3 * 106, 6.4 * 106, 6.5 * 106, 6.6 * 106, 6.7 * 106, 6.8 * 106, 6.9 * 106, 7 * 106, 7.1 * 106, 7.2 * 106, 7.3 * 106, 7.4 * 106, o 7.5 * 106 APC/cm2.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la preparación de la primera expansión se siembran en el matraz de cultivo a una densidad de igual o aproximadamente 1.0 * 106, 1.1 * 106, 1.2 * 106, 1.3 * 106, 1.4 * 106, 1.5 * 106, 1.6 * 106, 1.7 * 106, 1.8 * 106, 1.9 * 106, 2 * 106, 2.1 * 106, 2.2 * 106, 2.3 * 106, 2.4 * 106, 2.5 * 106, 2.6 * 106, 2.7 * 106, 2.8 * 106, 2.9 * 106, 3 * 106, 3.1 * 106, 3.2 * 106, 3.3 * 106, 3.4 * 106, 3.5 * 106, 3.6 * 106, 3.7 * 106, 3.8 * 106, 3.9 * 106, 4 * 106, 4.1 * 106, 4.2 * 106, 4.3 * 106, 4.4 * 106, o 4.5 * 106 APC/cm2 y las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad de igual o aproximadamente 2.5 * 106 APC/cm2, 2.6 * 106 APC/cm2, 2.7 * 106 APC/cm2, 2.8 * 106, 2.9 * 106, 3 * 106, 3.1 * 106, 3.2 * 106, 3.3 * 106, 3.4 * 106, 3.5 * 106, 3.6 * 106, 3.7 * 106, 3.8 * 106, 3.9 * 106, 4 * 106, 4.1 * 106, 4.2 * 106, 4.3 * 106, 4.4 * 106, 4.5 * 106, 4.6 * 106, 4.7 * 106, 4.8 * 106, 4.9 * 106, 5 * 106, 5.1 * 106, 5.2 * 106, 5.3 * 106, 5.4 * 106, 5.5 * 106, 5.6 * 106, 5.7 * 106, 5.8 * 106, 5.9 * 106, 6 * 106, 6.1 * 106, 6.2 * 106, 6.3 * 106, 6.4 * 106, 6.5 * 106, 6.6 * 106, 6.7 * 106, 6.8 * 106, 6.9 * 106, 7 * 106, 7.1 * 106, 7.2 * 106, 7.3 * 106, 7.4 * 106, o 7.5 * 106 APC/cm2.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la preparación de la primera expansión se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.0 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 4.5 * 106 APC/cm2, y las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada de un intervalo desde igual o aproximadamente 2.5 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 7.5 * 106 APC/cm2.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la preparación de la primera expansión se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.5 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 3.5 * 106 APC/cm2, y las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada de un intervalo desde igual o aproximadamente 3.5 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 6 * 106 APC/cm2.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la preparación de la primera expansión se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada de un intervalo desde igual o aproximadamente 2 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 3 * 106 APC/cm2, y las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad seleccionada de un intervalo desde igual o aproximadamente 4 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 5.5 * 106 APC/cm2.
En otra realización, las APC suministradas exógenamente en la preparación de la primera expansión se siembran en el matraz de cultivo a una densidad de igual o aproximadamente 2 * 106 APC/cm2 y las APC suministradas exógenamente en la segunda expansión rápida se siembran en el matraz de cultivo a una densidad de igual o aproximadamente 4 * 106 APC/cm2.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de PBMC suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 20:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de PBMC suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 10:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de PBMC suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 9:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 8:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 7:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 6:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 5:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 4:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 3:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.9:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.8:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.7:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.6:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.5:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.4:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.3:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.2:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.1:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 10:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 5:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 4:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 3:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.9:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.8:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.7:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.6:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.5:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.4:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.3:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.2:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.1:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 sea igual o aproximadamente 2:1.
En otra realización, la relación entre el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente el día 7 de la segunda expansión rápida y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente el día 0 de la preparación de la primera expansión sea igual o aproximadamente 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1,2:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1, 3:1, 3.1:1, 3.2:1, 3.3:1, 3.4:1, 3.5:1, 3.6:1, 3.7:1, 3.8:1, 3.9:1, 4:1, 4.1:1, 4.2:1, 4.3:1, 4.4:1, 4.5:1, 4.6:1, 4.7:1, 4.8:1, 4.9:1 o 5:1.
En otra realización, el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión sea igual o aproximadamente 1 * 108, 1.1 * 108, 1.2 * 108, 1.3 * 108, 1.4 * 108, 1.5 * 108, 1.6 * 108, 1.7 * 108, 1.8 * 108, 1.9 * 108, 2 * 108, 2.1 * 108, 2.2 * 108, 2.3 * 108, 2.4 * 108, 2.5 * 108, 2.6 * 108, 2.7 * 108, 2.8 * 108, 2.9 * 108, 3 * 108, 3.1 * 108, 3.2 * 108, 3.3 * 108, 3.4 * 108 o 3.5 * 108 APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida sea igual o aproximadamente 3.5 * 108, 3.6 * 108, 3.7 * 108, 3.8 * 108, 3.9 * 108, 4 * 108, 4.1 * 108, 4.2 * 108, 4.3 * 108, 4.4 * 108, 4.5 * 108, 4.6 * 108, 4.7 * 108, 4.8 * 108, 4.9 * 108, 5 * 108, 5.1 * 108, 5.2 * 108, 5.3 * 108, 5.4 * 108, 5.5 * 108, 5.6 * 108, 5.7 * 108, 5.8 * 108, 5.9 * 108, 6 * 108, 6.1 * 108, 6.2 * 108, 6.3 * 108, 6.4 * 108, 6.5 * 108, 6.6 * 108, 6.7 * 108, 6.8 * 108, 6.9 * 108, 7 * 108, 7.1 * 108, 7.2 * 108, 7.3 * 108, 7.4 * 108, 7.5 * 108, 7.6 * 108, 7.7 * 108, 7.8 * 108, 7.9 * 108, 8 * 108, 8.1 * 108, 8.2 * 108, 8.3 * 108, 8.4 * 108, 8.5 * 108, 8.6 * 108, 8.7 * 108, 8.8 * 108, 8.9 * 108, 9 * 108, 9.1 * 108, 9.2 * 108, 9.3 * 108, 9.4 * 108, 9.5 * 108, 9.6 * 108, 9.7 * 108, 9.8 * 108, 9.9 * 108 o 1 * 109APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC).
En otra realización, el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1 * 108 APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) hasta igual o aproximadamente 3.5 * 108 APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida se seleccionan del intervalo de igual o aproximadamente 3.5 * 108 APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) en una proporción de 1 * 109 APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC).
En otra realización, el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1.5 * 108 APC hasta igual o aproximadamente 3 * 108 APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida se seleccionan del intervalo de igual o aproximadamente 4 * 108 APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) hasta igual o aproximadamente 7.5 * 108APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC).
En otra realización, el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 2 * 108 APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) hasta igual o aproximadamente 2.5 * 108 APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida se seleccionan del intervalo de igual o aproximadamente 4.5 * 108 APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) hasta igual o aproximadamente 5.5 * 108APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC).
En otra realización, el número de APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión sea igual o aproximadamente 2.5 * 108 APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el número de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida sea igual o aproximadamente 5 * 108 APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC).
En una realización, el número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) agregadas el día 0 de la preparación de la primera expansión es aproximadamente la mitad del número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) agregadas el día 7 de la segunda expansión rápida. En ciertas realizaciones, el método comprende agregar capas de células presentadoras de antígeno en el día 0 de la preparación de la primera expansión a la primera población de los TIL y agregar capas de células presentadoras de antígeno en el día 7 a la segunda población de los TIL, en donde el número de capas de células presentadoras de antígeno agregadas en el día 0 es aproximadamente el 50 % del número de capas de células presentadoras de antígeno agregadas en el día 7.
En otra realización, el número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 7 de la segunda expansión rápida es mayor que el número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) suministradas exógenamente en el día 0 de la preparación de la primera expansión.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 2 capas de células y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 4 capas de células.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente una capa de células y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 3 capas de células.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las<p>B<m>C) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 1.5 capas de células hasta igual o aproximadamente 2.5 capas de células y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las ApC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 3 capas de células.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente una capa de células y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 2 capas de células.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 o 3 capas de células y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1,4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 u 8 capas de células.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 1 capa de células hasta igual o aproximadamente 2 capas de células y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 3 capas de células hasta igual o aproximadamente 10 capas de células.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 2 capas de células hasta igual o aproximadamente 3 capas de células y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 4 capas de células hasta igual o aproximadamente 8 capas de células.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 2 capas de células y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 4 capas de células hasta igual o aproximadamente 8 capas de células.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 1, 2 o 3 capas de células y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un espesor promedio de igual o aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 capas de células.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:10.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:8.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:7.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:6.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:5.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:4.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:3.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:2.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.2 hasta igual o aproximadamente 1:8.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.3 hasta igual o aproximadamente 1:7.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.4 hasta igual o aproximadamente 1:6.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.5 hasta igual o aproximadamente 1:5.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.6 hasta igual o aproximadamente 1:4.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.7 hasta igual o aproximadamente 1:3.5.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.8 hasta igual o aproximadamente 1:3.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.9 hasta igual o aproximadamente 1:2.5.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) sea igual o aproximadamente 1:2.
En otra realización, el día 0 de la preparación de la primera expansión ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un primer espesor promedio igual a un primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) y el día 7 de la segunda expansión rápida ocurre en presencia de las APC en capas (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) con un segundo espesor promedio igual a un segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC), en donde la relación del primer número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) al segundo número de capas de las APC (incluyendo, por ejemplo, las PBMC) se selecciona de igual o aproximadamente 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9, 1:5, 1:5.1, 1:5.2, 1:5.3, 1:5.4, 1:5.5, 1:5.6, 1:5.7, 1:5.8, 1:5.9, 1:6, 1:6.1, 1:6.2, 1:6.3, 1:6.4, 1:6.5, 1:6.6, 1:6.7, 1:6.8, 1:6.9, 1:7, 1:7.1, 1:7.2, 1:7.3, 1:7.4, 1:7.5, 1:7.6, 1:7.7, 1:7.8, 1:7.9, 1:8, 1:8.1, 1:8.2, 1:8.3, 1:8.4, 1:8.5, 1:8.6, 1:8.7, 1:8.8, 1:8.9, 1:9, 1:9.1, 1:9.2, 1:9.3, 1:9.4, 1:9.5, 1:9.6, 1:9.7, 1:9.8, 1:9.9 o 1:10.
V. Componentes opcionales del medio celular
1. Anticuerpos anti-CD3
En algunas realizaciones del Proceso 2A, los medios de cultivo utilizados en los métodos de expansión descritos en el presente documento (incluidos los denominados REP, véase, por ejemplo, la Figura 1) también incluyen un anticuerpo anti-CD3. Un anticuerpo anti-CD3 en combinación con IL-2 induce la activación de células T y la división celular en la población de los TIL. Este efecto se puede observar con anticuerpos de longitud completa, así como con fragmentos Fab y F(ab')2, siendo generalmente preferidos los primeros; véase, por ejemplo, Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719.
Como apreciarán los expertos en la materia, hay una serie de anticuerpos anti-CD3 humanos adecuados que encuentran uso en la invención, incluidos anticuerpos policlonales y monoclonales anti-CD3 humanos de varios mamíferos, incluidos, entre otros, anticuerpos murinos, humanos, de primates, de rata y caninos. En realizaciones particulares, se utiliza el anticuerpo anti-CD3 OKT3 (disponible comercialmente en Ortho-McNeil, Raritan, NJ o Miltenyi Biotech, Auburn, CA).
Tabla 4: Secuencias de aminoácidos de muromonab (anticuerpo OKT-3 ejemplar)
2. Agonistas de 4-1BB (CD137)
En una realización, el agonista de TNFRSF es un agonista de 4-1BB (CD137). El agonista de 4-1BB puede ser cualquier molécula de unión a 4-1BB conocida en la técnica. La molécula de unión a 4-1BB puede ser un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión capaz de unirse a 4-1BB humano o de mamífero. Los agonistas de 4-1BB o las moléculas de unión a 4-1BB pueden comprender una cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. El agonista de 4-1BB o la molécula de unión a 4-1BB puede tener una cadena pesada y una ligera. Tal como se utiliza en el presente documento, el término molécula de unión también incluye anticuerpos (incluidos anticuerpos de longitud completa), anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos y fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores y formas diseñadas de anticuerpos, por ejemplo, moléculas de scFv, que se unen a 4-1BB. En una realización, el agonista de 4-1BB es una proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo completamente humano. En una realización, el agonista de 4-1BB es una proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, los agonistas de 4-1BB para su uso en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento incluyen anticuerpos anti-4-1BB, anticuerpos anti-4-1BB humanos, anticuerpos anti-4-1BB de ratón, anticuerpos anti-4-1BB de mamífero, anticuerpos anti-4-1BB monoclonales, anticuerpos anti-4-1BB policlonales, anticuerpos anti-4-1BB quiméricos, adnectinas anti-4-1BB, anticuerpos de dominio anti-4-1BB, fragmentos anti-4-1BB monocatenarios, fragmentos anti-4-1BB de cadena pesada, fragmentos anti-4-1BB de cadena ligera, proteínas de fusión anti-4-1BB y fragmentos, derivados, conjugados, variantes o biosimilares de los mismos. Se sabe que los anticuerpos anti-4-1BB agonistas inducen respuestas inmunes fuertes. Lee et al., PLOS One 2013, 8, e69677. En una realización preferida, el agonista de 4-1BB es un anticuerpo monoclonal agonista, anti-4-1BB humanizado o completamente humano (es decir, un anticuerpo derivado de una sola línea celular). En una realización, el agonista de 4-1BB es EU-101 (Eutilex Co. Ltd.), utomilumab o urelumab, o un fragmento, derivado, conjugado, variante o biosimilar del mismo. En una realización preferida, el agonista de 4-1BB es utomilumab o urelumab, o un fragmento, derivado, conjugado, variante o biosimilar del mismo.
En una realización preferida, el agonista de 4-1BB o la molécula de unión a 4-1BB también puede ser una proteína de fusión. En una realización preferida, un agonista multimérico de 4-1BB, tal como un agonista trimérico o hexamérico de 4-1BB (con tres o seis dominios de unión a ligando), puede inducir una agrupación del receptor (4-1BBL) superior y la formación de complejos de señalización celular interna en comparación con un anticuerpo monoclonal agonista, que típicamente posee dos dominios de unión a ligando. Se describen proteínas de fusión triméricas (trivalentes) o hexaméricas (o hexavalentes) o mayores que comprenden tres dominios de unión de TNFRSF e IgG 1-Fc y que opcionalmente unen además dos o más de estas proteínas de fusión. por ejemplo, en Gieffers, et al., Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47.
Se sabe que los anticuerpos agonistas 4-1BB y las proteínas de fusión inducen fuertes respuestas inmunes. En una realización preferida, el agonista de 4-1BB es un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión que se une específicamente al antígeno 4-1BB de una manera suficiente para reducir la toxicidad. En algunas realizaciones, el agonista de 4-1BB es un anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB o una proteína de fusión que anula la toxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), por ejemplo, la citotoxicidad de las células Nk . En algunas realizaciones, el agonista de 4-1BB es un anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB o una proteína de fusión que anula la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). En algunas realizaciones, el agonista de 4-1BB es un anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB o una proteína de fusión que anula la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En algunas realizaciones, el agonista de 4-1BB es un anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB o una proteína de fusión que anula la funcionalidad de la región Fc.
En algunas realizaciones, los agonistas de 4-1BB se caracterizan por unirse a 4-1BB humano (SEQ ID NO: 9) con alta afinidad y actividad agonista. En una realización, el agonista de 4-1BB es una molécula de unión que se une al 4-1BB humano (SEQ ID NO: 9). En una realización, el agonista de 4-1BB es una molécula de unión que se une al 4-1BB murino (SEQ ID NO: 10). Las secuencias de aminoácidos del antígeno 4-1BB al que se une un agonista de 4-1BB o molécula de unión se resumen en la Tabla DD.
Tabla 5. Secuencias de aminoácidos de los antígenos 4-1BB.
En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de 4-1BB que se une al 4-1BB humano o murino con una Kd de aproximadamente 100 pM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una Kd de aproximadamente 90 pM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una Kd de aproximadamente 80 pM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una K<d>de aproximadamente 70 pM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una Kd de aproximadamente 60 pM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una Kd de aproximadamente 50 pM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una Kd de aproximadamente 40 pM o menos, o se une al 4-1BB humano o murino con una Kd de aproximadamente 30 pM o menos.
En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de 4-1BB que se une a 4-1BB humano o murino con una kasociación de aproximadamente 7.5 * 1051/Ms o más rápido, se une a 4-1BB humano o murino con una kasociación de aproximadamente 7.5 * 1051/Ms o más rápido, se une a 4-1BB humano o murino con una kasociación de aproximadamente 8 * 1051/Ms o más rápido, se une a 4-1BB humano o murino con una kasociación de aproximadamente 8.5 * 1051/Ms o más rápido, se une a 4-1BB humano o murino con una kasociación de aproximadamente 9 * 1051/Ms o más rápido, se une a 4-1BB humano o murino con una kasociación de aproximadamente 9.5 * 1051/Ms o más rápido, o se une a 4-1BB humano o murino con una kasociación de aproximadamente 1 * 1061/Ms o más rápido.
En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de 4-1BB que se une a 4-1BB humano o murino con una kasociación de aproximadamente 2 * 10-51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.1 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.2 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.3 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.4 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.5 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.6 * 10'51/s o más lento o se une a 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.7 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.8 * 10'51/s o más lento, se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.9 * 10'51/s o más lento, o se une a 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 3 * 10'51/s o más lento.
En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de 4-1BB que se une a 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 10 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 9 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 8 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 7 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 6 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 5 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 4 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 3 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 2 nM o menos, o se une a 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 1 nM o menos.
En una realización preferida, el agonista de 4-1BB es utomilumab, también conocido como PF-05082566 o MOR-7480, o un fragmento, derivado, variante o biosimilar del mismo. Utomilumab está disponible en Pfizer, Inc. Utomilumab es una inmunoglobulina G2-lambda, anti-[TNFRSF9 deHomo sapiens(miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) 9, 4-1BB, antígeno de células T ILA, CD137)], anticuerpo monoclonal deHomo sapiens(completamente humano). Las secuencias de aminoácidos de utomilumab se establecen en la Tabla EE. El utomilumab comprende sitios de glicosilación en Asn59 y Asn292; puentes disulfuro intracadena de cadena pesada en las posiciones 22-96 (Vh-Vl), 143-199 (Ch1-Cl), 256-316 (C<h>2) y 362-420 (C<h>3); puentes disulfuro intracadena de cadena ligera en las posiciones 22'-87' (V<h>-V<l>) y 136'-195' (Ch1-Cl); puentes disulfuro entre cadena pesada-cadena pesada en las posiciones 218-218, 219-219, 222-222 y 225-225 de las isoformas IgG2A, en las posiciones 218-130, 219-219, 222-222 y 225-225 de las isoformas IgG2A/B, y en las posiciones 219-130 (2), 222-222 y 225-225 de las isoformas IgG2B; y puentes disulfuro entre cadena pesada-cadena ligera en las posiciones 130-213' (2) de las isoformas IgG2A, las posiciones 218-213' y 130-213' de las isoformas IgG2A/B, y en las posiciones 218-213' (2) de las isoformas IgG2B. La preparación y las propiedades de utomilumab y sus variantes y fragmentos se describen en las patentes de los Estados Unidos No. 8,821,867; 8,337,850; y 9,468,678, y la publicación de solicitud de patente internacional No. WO 2012/032433 A1. Las características preclínicas de utomilumab se describen en Fisher et al., Cancer Immunolog. & Inmunother. 2012, 61, 1721-33. Los ensayos clínicos actuales de utomilumab en una variedad de indicaciones hematológicas y de tumores sólidos incluyen los identificadores NCT02444793, NCT01307267, NCT02315066 y NCT02554812 de clinicaltrials.gov de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos.
En una realización, un agonista de 4-1BB comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 12. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables monocatenarios (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 98 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 97 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 96 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente.
En una realización, el agonista de 4-1BB comprende las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables (VR) de utomilumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de 4-1BB (Vh) comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 13, y la región variable de la cadena ligera del agonista de 4-1BB (Vl) comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 14 y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la<s>E<q>ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende un anticuerpo de scFv que comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14.
En una realización, un agonista de 4-1BB comprende dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y la SEQ ID N<o>: 17, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos, y dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos.
En una realización, el agonista de 4-1BB es un anticuerpo monoclonal biosimilar al agonista de 4-1BB aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia a utomilumab. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo 4-1BB que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab. En algunas realizaciones, las una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de 4-1BB autorizado o presentado para autorización, en donde el anticuerpo agonista de 4-1BB se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab. El anticuerpo agonista de 4-1BB puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos, como la FDA de los Estados Unidos. y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab.
Tabla 6. Secuencias de aminoácidos para anticuerpos agonistas 4-1BB relacionados con utomilumab.
En una realización preferida, el agonista de 4-1BB es el anticuerpo monoclonal urelumab, también conocido como BMS-663513 y 20H4.9.h4a, o un fragmento, derivado, variante o biosimilar del mismo. Urelumab está disponible en Bristol-Myers Squibb, Inc. y Creative Biolabs, Inc. Urelumab es una inmunoglobulina G4-kappa, anti-[TNFRSF9 deHomo sapiens(miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral 9, 4-1BB, antígeno de células T ILA, CD137)], anticuerpo monoclonal deHomo sapiens(completamente humano). Las secuencias de aminoácidos de urelumab se establecen en la Tabla EE. Urelumab comprende sitios de N-glicosilación en las posiciones 298 (y 298"); puentes disulfuro intracadena de cadena pesada en las posiciones 22-95 (Vh-Vl), 148-204 (Ch1-Cl), 262-322 (Ch2) y 368-426 (Ch3) (y en las posiciones 22"-95", 148"-204", 262"-322" y 368"-426"); puentes disulfuro intracadena de cadena ligera en las posiciones 23'-88' (Vh-Vl) y 136'-196' (C<h>1-C<l>) (y en las posiciones 23m-88m y 136"'-196"'); puentes disulfuro entre cadena pesada-cadena pesada en las posiciones 227-227" y 230-230"; y puentes disulfuro entre cadena pesada-cadena ligera en las posiciones 135-216' y 135"-216m. La preparación y las propiedades de urelumab y sus variantes y fragmentos se describen en las patentes de los Estados Unidos No. 7,288,638 y 8,962,804. Las características preclínicas y clínicas de urelumab se describen en Segal, et al., Clin. Cancer Res. 2016, disponible en http://dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-16-1272. Los ensayos clínicos actuales de urelumab en una variedad de indicaciones hematológicas y de tumores sólidos incluyen los identificadores NCT01775631, NCT02110082, NCT02253992 y NCT01471210 de clinicaltrials.gov de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos.
En una realización, un agonista de 4-1BB comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 21 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 22. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables monocatenarios (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 98 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 97 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 96 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente.
En una realización, el agonista de 4-1BB comprende las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables (VR) de urelumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de 4-1BB (Vh) comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 23 y la región variable de la cadena ligera del agonista de 4-1BB (Vl) comprende la secuencia mostrada en la s Eq ID NO: 24 y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la<s>E<q>ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende un anticuerpo de scFv que comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24.
En una realización, un agonista de 4-1BB comprende dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 26 y la SEQ ID N<o>: 27, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos, y dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 30, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos.
En una realización, el agonista de 4-1BB es un anticuerpo monoclonal biosimilar al agonista de 4-1BB aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia a urelumab. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo 4-1BB que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es urelumab. En algunas realizaciones, las una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de 4-1BB autorizado o presentado para autorización, en donde el anticuerpo agonista de 4-1BB se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es urelumab. El anticuerpo agonista de 4-1BB puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos, como la FDA de los Estados Unidos. y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es urelumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es urelumab.
Tabla 7: Secuencias de aminoácidos para anticuerpos agonistas de 4-1BB relacionados con urelumab.
En una realización, el agonista de 4-1BB se selecciona del grupo que consiste en 1D8, 3Elor, 4B4 (BioLegend 309809), H4-1BB-M127 (BD Pharmingen 552532), BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX), 145501 (Leinco Technologies B591), el anticuerpo producido por la línea celular depositada como ATCC No. HB-11248 y divulgada en la patente de los Estados Unidos No. 6,974,863, 5<f>4 (BioLegend 31 1503), C65-485 (<b>D Pharmingen 559446), anticuerpos descritos en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. US 2005/0095244, anticuerpos divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 7,288,638 (como 20H4.9-IgGl (BMS-663031)), anticuerpos divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 6,887,673 (como 4E9 o BMS-554271), anticuerpos divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 7,214,493, anticuerpos divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 6,303,121, anticuerpos divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 6,569,997, anticuerpos divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 6,905,685 (como 4E9 o BMS-554271), anticuerpos divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 6,362,325 (como 1d 8 o BMS-469492; 3H3 o BMS-469497; o 3El), anticuerpos descritos en la patente de los Estados Unidos No.
6,974,863 (como 53A2); anticuerpos divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 6,210,669 (como 1D8, 3B8 o 3El), anticuerpos descritos en la patente de los Estados Unidos No. 5,928,893, anticuerpos divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 6,303,121, anticuerpos divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 6,569,997, anticuerpos divulgados en las publicaciones de solicitudes de patente internacional No. WO 2012/177788, WO 2015/119923, y WO 2010/042433, y fragmentos, derivados, conjugados, variantes o biosimilares de los mismos.
En una realización, el agonista de 4-1BB es una proteína de fusión agonista de 4-1BB descrita en las publicaciones de solicitudes de patente internacional No. WO 2008/025516 A1, WO 2009/007120 A1, WO 2010/003766 A1, WO 2010/010051 A1, y WO 2010/078966 A1; publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos No. US 2011/0027218 A1, US 2015/0126709 A1, US 2011/0111494 A1, US 2015/0110734 A1, y US 2015/0126710 A1; y patentes de los Estados Unidos No. 9,359,420, 9,340,599, 8,921,519 y 8,450,460.
En una realización, el agonista de 4-1BB es una proteína de fusión agonista de 4-1BB como se representa en la Estructura I-A (proteína de fusión de fragmento de anticuerpo-Fc C-terminal) o la Estructura I-B (proteína de fusión de fragmento de anticuerpo-Fc N-terminal), o un fragmento, derivado, conjugado, variante o biosimilar de la misma:
En las estructuras I-A y I-B, los cilindros se refieren a dominios de unión de polipéptidos individuales. Las estructuras I-A e I-B comprenden tres dominios de unión de TNFRSF unidos linealmente derivados de por ejemplo, 4-1BBL o un anticuerpo que se une a 4-1BB, que se pliegan para formar una proteína trivalente, que luego se une a una segunda proteína trivalente a través de IgG1-Fc (incluidos los dominios de C<h>3 y C<h>2) luego se utilizan para unir dos de las proteínas trivalentes a través de enlaces disulfuro (pequeños óvalos alargados), estabilizando la estructura y proporcionando un agonista capaz de unir los dominios de señalización intracelular de los seis receptores y proteínas de señalización para formar un complejo de señalización. Los dominios de unión de TNFRSF denominados cilindros pueden ser dominios de scFv que comprenden, por ejemplo, una cadena V<h>y una V<l>conectadas por un enlazador que puede comprender residuos hidrófilos y secuencias de Gly y Ser para flexibilidad, así como Glu y Lys para solubilidad. Se puede utilizar cualquier diseño de dominio de scFv, como los descritos en de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44; Ahmad, et al., Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250; o Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208. Las estructuras de proteínas de fusión de esta forma se describen en las patentes de los Estados Unidos No. 9,359,420, 9,340.599, 8.921,519, y 8,450,460.
Las secuencias de aminoácidos para los otros dominios polipeptídicos de estructura I-A se proporcionan en la Tabla GG. El dominio de Fc comprende preferiblemente un dominio constante completo (aminoácidos 17-230 de la SEQ ID NO: 31), el dominio de bisagra completo (aminoácidos 1-16 de la SEQ ID NO: 31) o una porción del dominio de bisagra (por ejemplo, aminoácidos 4-16 de la SEQ ID NO: 31). Los enlazadores preferidos para conectar un anticuerpo Fc C-terminal se pueden seleccionar de las realizaciones proporcionadas en la SEQ ID NO: 32 a la SEQ ID NO: 41, incluidos enlazadores adecuados para la fusión de polipéptidos adicionales.
Tabla 8: Secuencias de aminoácidos para proteínas de fusión TNFRSF, incluidas las proteínas de fusión 4-1BB, con diseño de proteína de fusión de fragmento de anticuerpo-Fc del C-terminal (estructura I-A).
Las secuencias de aminoácidos para los otros dominios polipeptídicos de estructura I-B se proporcionan en la Tabla 9. Si un fragmento de anticuerpo Fc se fusiona al N-terminal de una proteína de fusión TNRFSF como en la estructura I-B, la secuencia del módulo Fc es preferiblemente la que se muestra en la SEQ ID NO: 42, y las secuencias de enlace se seleccionan preferiblemente de aquellas realizaciones establecidas en la SEQ ID NO: 43 a la SEQ ID NO: 45.
Tabla 9: Secuencias de aminoácidos para proteínas de fusión TNFRSF, incluidas las proteínas de fusión 4-1BB, con diseño de proteína de fusión de fragmento de anticuerpo-Fc N-terminal (estructura I-B).
En una realización, una proteína de fusión agonista de 4-1BB de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de 4-1BB seleccionados del grupo que consiste en una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de utomilumab, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de urelumab, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de utomilumab, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable seleccionadas de las cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables descritas en la Tabla GG, cualquier combinación de una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de las anteriores, y fragmentos, derivados, conjugados, variantes y biosimilares de las mismas.
En una realización, una proteína de fusión agonista de 4-1BB de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de 4-1BB que comprenden una secuencia de 4-1BBL. En una realización, una proteína de fusión agonista de 4-1BB de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de 4-1BB que comprenden una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 46. En una realización, una proteína de fusión agonista de 4-1BB de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de 4-1BB que comprenden una secuencia de 4-1BBL soluble. En una realización, una proteína de fusión agonista de 4-1BB de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de 4-1BB que comprenden una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 47.
En una realización, una proteína de fusión agonista de 4-1BB de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de 4-1BB que es un dominio de scFv que comprende regiones de V<h>y Vl que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente, en donde los dominios de Vh y Vl están conectados mediante un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista de 4-1BB de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de 4-1BB que es un dominio de scFv que comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente, en donde los dominios de Vh y Vl están conectados mediante un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista de 4-1B<b>de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de 4-1BB que es un dominio de scFv que comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias de Vh y Vl dadas en la Tabla II, donde los dominios de Vh y Vl están conectados mediante un enlazador.
Tabla 10: Dominios polipeptídicos adicionales útiles como dominios de unión de 4-1BB en proteínas de fusión o como anticuerpos agonistas de scFv 4-1BB.
En una realización, el agonista de 4-1BB es un polipéptido de fusión de cadena monocatenario de 4-1BB que comprende (i) un primer dominio de unión de 4-1BB soluble, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) un segundo dominio de unión de 4-1BB soluble, (iv) un segundo enlazador peptídico y (v) un tercer dominio de unión de 4-1BB soluble, que comprende además un dominio adicional en el extremo N-terminal y/o C-terminal, y en donde el dominio adicional es un dominio de fragmento Fab o Fc. En una realización, el agonista de 4-1BB es un polipéptido de fusión monocatenario agonista de 4-1BB que comprende (i) un primer dominio de unión de 4-1BB soluble, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) un segundo dominio de unión de 4-1BB soluble, (iv) un segundo enlazador peptídico y (v) un tercer dominio de unión de 4-1BB soluble, que comprende además un dominio adicional en el extremo N-terminal y/o C-terminal, en donde el dominio adicional es un dominio de fragmento Fab o Fc, en donde cada uno de los dominios solubles de 4-1BB carece de una región de tallo (que contribuye a la trimerización y proporciona una cierta distancia a la membrana celular, pero no es parte del dominio de unión de 4-1BB) y el primer y el segundo enlazadores peptídicos tienen independientemente una longitud de 3-8 aminoácidos.
En una realización, el agonista de 4-1BB es un polipéptido de fusión monocatenario agonista de 4-1BB que comprende (i) un primer dominio de citocina de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) soluble, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) un segundo dominio de citocina de la superfamilia del TNF soluble, (iv) un segundo enlazador peptídico y (v) un tercer dominio de citocina de la superfamilia del TNF soluble, en donde cada uno de los dominios de citocina de la superfamilia del TNF soluble carece de una región de tallo y el primer y el segundo enlazadores peptídicos tienen independientemente una longitud de 3-8 aminoácidos, y en donde cada dominio de citocina de la superfamilia del TNF es un dominio de unión de 4-1BB.
En una realización, el agonista de 4-1BB es un anticuerpo de scFv agonista de 4-1BB que comprende cualquiera de los dominios anteriores de Vh vinculados a cualquiera de los dominios anteriores de Vl.
En una realización, el agonista de 4-1BB es el anticuerpo agonista de 4-1BB de BPS Bioscience, número de catálogo 79097-2, disponible comercialmente en BPS Bioscience, San Diego, CA, EE. UU. En una realización, el agonista de 4-1BB es el anticuerpo agonista de 4-1BB de Creative Biolabs, número de catálogo MOM-18179, disponible comercialmente en Creative Biolabs, Shirley, NY, EE. UU.
3. Agonistas de OX40 (CD134)
En una realización, el agonista de TNFRSF es un agonista de OX40 (CD134). El agonista de OX40 puede ser cualquier molécula de unión de OX40 conocida en la técnica. La molécula de unión de OX40 puede ser un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión capaz de unirse a OX40 humano o de mamífero. Los agonistas de OX40 o las moléculas de unión de OX40 pueden comprender una cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. El agonista de OX40 o la molécula de unión de OX40 puede tener una cadena pesada y una ligera. Tal como se utiliza en el presente documento, el término molécula de unión también incluye anticuerpos (incluidos anticuerpos de longitud completa), anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos y fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores y formas diseñadas de anticuerpos, por ejemplo, moléculas de scFv, que se unen a OX40. En una realización, el agonista de OX40 es una proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo completamente humano. En una realización, el agonista de OX40 es una proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, los agonistas de OX40 para su uso en los métodos y composiciones divulgados en la presente invención incluyen anticuerpos anti-OX40, anticuerpos anti-OX40 humanos, anticuerpos anti-OX40 de ratón, anticuerpos anti-OX40 de mamífero, anticuerpos anti-OX40 monoclonales, anticuerpos anti-OX40 policlonales, anticuerpos anti-OX40 quiméricos, adnectinas anti-OX40, anticuerpos de dominio anti-OX40, fragmentos anti-OX40 monocatenarios, fragmentos anti-OX40 de cadena pesada, fragmentos anti-OX40 de cadena ligera, proteínas de fusión anti-OX40 y fragmentos, derivados, conjugados, variantes o biosimilares de los mismos. En una realización preferida, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal agonista, anti-OX40 humanizado o completamente humano (es decir, un anticuerpo derivado de una sola línea celular).
En una realización preferida, el agonista de OX40 o la molécula de unión de OX40 también puede ser una proteína de fusión. Las proteínas de fusión OX40 que comprenden un dominio de Fc fusionado a OX40L se describen, por ejemplo, en Sadun, et al., J. Immunother. 2009, 182, 1481-89. En una realización preferida, un agonista de OX40 multimérico, tal como un agonista de OX40 trimérico o hexamérico (con tres o seis dominios de unión a ligando), puede inducir una agrupación superior del receptor (OX40L) y la formación de un complejo de señalización celular interna en comparación con un anticuerpo monoclonal agonista, que típicamente posee dos dominios de unión a ligando. Se describen proteínas de fusión triméricas (trivalentes) o hexaméricas (o hexavalentes) o mayores que comprenden tres dominios de unión de TNFRSF e IgG 1-Fc y que opcionalmente unen además dos o más de estas proteínas de fusión, por ejemplo, en Gieffers, et al., Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47.
Se sabe que los anticuerpos OX40 agonistas y las proteínas de fusión inducen fuertes respuestas inmunes. Curtis et al., Cancer Res. 2013, 73, 7189-98. En una realización preferida, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión que se une específicamente al antígeno OX40 de una manera suficiente para reducir la toxicidad. En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal OX40 agonista o una proteína de fusión que anula la toxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), por ejemplo, la citotoxicidad de las células NK. En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal OX40 agonista o una proteína de fusión que anula la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal OX40 agonista o una proteína de fusión que anula la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal OX40 agonista o una proteína de fusión que anula la funcionalidad de la región Fc.
En algunas realizaciones, los agonistas de OX40 se caracterizan por unirse a OX40 humano (SEQ ID NO: 54) con alta afinidad y actividad agonista. En una realización, el agonista de OX40 es una molécula de unión que se une a OX40 humano (SEQ ID NO: 54). En una realización, el agonista de OX40 es una molécula de unión que se une a OX40 murino (SEQ ID NO: 55). Las secuencias de aminoácidos del antígeno OX40 al que se une un agonista o molécula de unión de OX40 se resumen en la Tabla 11.
Tabla 11: Secuencias de aminoácidos de los antígenos OX40.
En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de OX40 que se une a OX40 humano o murino con una K<d>de aproximadamente 100 pM o menos, se une al OX40 humano o murino con una Kd de aproximadamente 90 pM o menos, se une al OX40 humano o murino con una Kd de aproximadamente 80 pM o menos, se une al OX40 humano o murino con una Kd de aproximadamente 70 pM o menos, se une al OX40 humano o murino con una K<d>de aproximadamente 60 pM o menos, se une al OX40 humano o murino con una K<d>de aproximadamente 50 pM o menos, se une al OX40 humano o murino con una K<d>de aproximadamente 40 pM o menos, o se une a OX40 humano o murino con una K<d>de aproximadamente 30 pM o menos.
En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de OX40 que se une a OX40 humano o murino con una kasociación de aproximadamente 7.5 * 1051/Ms o más rápido, se une a OX40 humano o murino con una kasociación de aproximadamente 7.5 * 1051/Ms o más rápido, se une a OX40 humano o murino con una kasociación de aproximadamente 8 * 1051/Ms o más rápido, se une a OX40 humano o murino con una kasociación de aproximadamente 8.5 * 1051/Ms o más rápido, se une a OX40 humano o murino con una kasociación de aproximadamente 9 * 1051/Ms o más rápido, se une a OX40 humano o murino con una kasociación de aproximadamente 9.5 * 1051/Ms o más rápido, o se une a OX40 humano o murino con una kasociación de aproximadamente 1 * 1061/Ms o más rápido.
En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de OX40 que se une a OX40 humano o murino con una kasociación de aproximadamente 2 * 10-51/s o más lento, se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.1 * 10-51/s o más lento, se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.2 * 10-51/s o más lento, se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.3 * 10-51/s o más lento, se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.4 * 10-51/s o más lento, se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.5 * 10-51/s o más lento, se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.6 * 10-5 1/s o más lento o se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.7 * 10-5 1/s o más lento, se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.8 * 10-5 1/s o más lento, se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.9 * 10-5 1/s o más lento, o se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 3 * 10-51/s o más lento.
En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de OX40 que se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 10 nM o menos, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 9 nM o menos, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 8 nM o menos, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 7 nM o menos, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 6 nM o menos, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 5 nM o menos, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 4 nM o menos, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 3 nM o menos, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 2 nM o menos, o se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 1 nM o menos.
En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es tavolixizumab, también conocido como MEDI0562 o MEDI-0562. Tavolixizumab está disponible a través de la subsidiaria MedImmune de AstraZeneca, Inc. Tavolixizumab es inmunoglobulina G1-kappa, anti-[ TNFRSF4 deHomo sapiens(miembro 4 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), OX40, CD134), anticuerpo monoclonal humanizado y quimérico. Las secuencias de aminoácidos de tavolixizumab se establecen en la Tabla KK. Tavolixizumab comprende sitios de N-glicosilación en las posiciones 301 y 301", con glicanos tipo CHO biantenarios complejos fucosilados; puentes disulfuro intracadena de cadena pesada en las posiciones 22-95 (Vh-Vl), 148-204 (Ch1-Cl), 265-325 (Ch2) y 371-429 (Ch3) (y en las posiciones 22"-95", 148"-204", 265"-325" y 371"-429"); puentes disulfuro intracadena de cadena ligera en las posiciones 23'-88' (Vh-Vl) y 134'-194' (Ch1-Cl) (y en las posiciones 23™-88™ y 134™-194m); puentes disulfuro entre cadena pesada-cadena pesada en las posiciones 230-230" y 233 233"; y puentes disulfuro entre cadena pesada-cadena ligera en las posiciones 224-214' y 224"-214"'. Los ensayos clínicos actuales de tavolixizumab en una variedad de indicaciones de tumores sólidos incluyen los identificadores NCT02318394 y NCT02705482 de clinicaltrials.gov de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos.
En una realización, un agonista de OX40 comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 56 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 57. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 57, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables monocatenarios (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 57, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 98 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 57, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 97 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 57, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 96 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 57, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 57, respectivamente.
En una realización, el agonista de OX40 comprende las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables (VR) de tavolixizumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de OX40 (Vh) comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 58 y la región variable de la cadena ligera del agonista de OX40 (V<l>) comprende la secuencia mostrada en la<s>E<q>ID NO: 59 y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende un anticuerpo de scFv que comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59.
En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61 y la SEQ ID NO: 62, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos, y dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 65, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos.
En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar al agonista de OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia a tavolixizumab. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es tavolixizumab. En algunas realizaciones, las una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de OX40 autorizado o presentado para autorización, en donde el anticuerpo agonista de OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es tavolixizumab. El anticuerpo agonista de OX40 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos, como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es tavolixizumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es tavolixizumab.
Tabla 12: Secuencias de aminoácidos para anticuerpos agonistas de OX40 relacionados con tavolixizumab.
En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es 11D4, que es un anticuerpo completamente humano disponible de Pfizer, Inc. La preparación y las propiedades de llD 4 se describen en las patentes de los Estados Unidos No. 7,960,515; 8,236,930; y 9,028,824. Las secuencias de aminoácidos de 11D4 se establecen en la Tabla 13.
En una realización, un agonista de OX40 comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 66 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 67. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 67, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables monocatenarios (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 67, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 98 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 67, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 97 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 67, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 96 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 67, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 67, respectivamente.
En una realización, el agonista de OX40 comprende las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables (VR) de 11D4. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de OX40 (Vh) comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 68 y la región variable de la cadena ligera del agonista de OX40 (Vl) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 69 y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 69, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 69, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 69, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 69, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 69, respectivamente.
En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71 y la SEQ ID NO: 72, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos, y dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 73, la SEQ ID NO: 74 y la SEQ ID NO: 75, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos.
En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar al agonista de OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia a 11D4. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es 11D4. En algunas realizaciones, las una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de OX40 autorizado o presentado para autorización, en donde el anticuerpo agonista de OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es 11D4. El anticuerpo agonista de OX40 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos, como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es 11D4. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es 11D4.
Tabla 13: Secuencias de aminoácidos para anticuerpos agonistas de OX40 relacionados con 11D4.
60 120 180
En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es 18D8, que es un anticuerpo completamente humano disponible de Pfizer, Inc. La preparación y las propiedades de 18D8 se describen en las patentes de los Estados Unidos No. 7,960,515; 8,236,930; y 9,028,824. Las secuencias de aminoácidos de 18D8 se establecen en la Tabla 14.
En una realización, un agonista de OX40 comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 76 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 77. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 77, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables monocatenarios (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 77, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 98 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 77, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 97 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 77, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos 96 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 77, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 77, respectivamente.
En una realización, el agonista de OX40 comprende las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables (VR) de 18D8. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de OX40 (Vh) comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 78 y la región variable de la cadena ligera del agonista de OX40 (V<l>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 79 y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 78 y la SEQ ID NO: 79, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 78 y la SEQ ID NO: 79, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 78 y la SEQ ID NO: 79, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 78 y la SEQ ID NO: 79, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 78 y la SEQ ID NO: 79, respectivamente.
En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 80, la SEQ ID NO: 81 y la SEQ ID NO: 82, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos, y dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 84 y la SEQ ID NO: 85, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos.
En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar al agonista de OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia a 18D8. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es 18D8. En algunas realizaciones, las una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de OX40 autorizado o presentado para autorización, en donde el anticuerpo agonista de OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es 18D8. El anticuerpo agonista de OX40 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos, como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es 18D8. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es 18D8.
Tabla 14: Secuencias de aminoácidos para anticuerpos agonistas de OX40 relacionados con 18D8.
Identificador Secuencia (símbolos de aminoácidos de una letra)
En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es Hu119-122, que es un anticuerpo humanizado disponible en GlaxoSmithKline plc. La preparación y las propiedades de Hu119-122 se describen en las patentes de los Estados Unidos No. 9,006,399 y 9,163,085, y en la publicación internacional de patente No. WO 2012/027328. Las secuencias de aminoácidos de Hu119-122 se establecen en la Tabla 15.
En una realización, el agonista de OX40 comprende las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables (VR) de Hu119-122. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de OX40 (Vh) comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 86 y la región variable de la cadena ligera del agonista de OX40 (V<l>) comprende la secuencia mostrada en la<s>E<q>ID NO: 87 y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID N<o>: 87, respectivamente.
En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 88, la SEQ ID NO: 89 y la SEQ ID NO: 90, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos, y dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 91, la SEQ ID NO: 92 y la SEQ ID NO: 93, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos.
En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar al agonista de OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia a Hu119-122. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu119-122. En algunas realizaciones, las una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de OX40 autorizado o presentado para autorización, en donde el anticuerpo agonista de OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu119-122. El anticuerpo agonista de OX40 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos, como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu119-122. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu119-122.
TABLA 15: Secuencias de aminoácidos para anticuerpos agonistas de OX40 relacionados con Hu119-122.
En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es Hu106-222, que es un anticuerpo humanizado disponible en GlaxoSmithKIine plc. La preparación y las propiedades de Hu106-222 se describen en las patentes de los Estados Unidos No. 9,006,399 y 9,163,085, y en la publicación internacional de patentes No. WO 2012/027328. Las secuencias de aminoácidos de Hu106-222 se establecen en la Tabla 16.
En una realización, el agonista de OX40 comprende las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables (VR) de Hu106-222. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de OX40 (Vh) comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 94 y la región variable de la cadena ligera del agonista de OX40 (V<l>) comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 95 y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 95, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 95, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 95, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 95, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 95, respectivamente.
En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 96, la SEQ ID NO: 97 y la SEQ ID NO: 98, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos, y dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 99, la SEQ ID NO: 100 y la SEQ ID NO: 101, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos.
En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar al agonista de OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia a Hu106-222. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu106-222. En algunas realizaciones, las una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de OX40 autorizado o presentado para autorización, en donde el anticuerpo agonista de OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu106-222. El anticuerpo agonista de OX40 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos, como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu106-222. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde los uno o más excipientes son los mismos o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu106-222.
Tabla 16: Secuencias de aminoácidos para anticuerpos agonistas de OX40 relacionados con Hu106-222.
En algunas realizaciones, el anticuerpo agonista de OX40 es MEDI6469 (también denominado 9B12). MEDI6469 es un anticuerpo monoclonal murino. Weinberg, et al., J. Immunother. 2006, 29, 575-585. En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es un anticuerpo producido por el hibridoma 9B12, depositado en Biovest Inc. (Malvern, MA, EE. UU.), como se describe en Weinberg, et al., J. Immunother. 2006, 29, 575-585. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende las secuencias de CDR de MEDI6469. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada y/o una secuencia de región variable de cadena ligera de MEDI6469.
En una realización, el agonista de OX40 es L106 (producto de BD Pharmingen # 340420). En algunas realizaciones, el agonista de OX40 comprende las CDR del anticuerpo L106 (producto de BD Pharmingen # 340420). En algunas realizaciones, el agonista de OX40 comprende una secuencia de región variable de cadena pesada y/o una secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo L106 (producto de BD Pharmingen # 340420). En una realización, el agonista de OX40 es ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, catálogo # 20073). En algunas realizaciones, el agonista de OX40 comprende las CDR del anticuerpo ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, catálogo # 20073). En algunas realizaciones, el agonista de OX40 comprende una secuencia de región variable de cadena pesada y/o una secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catálogo # 20073). En una realización, el agonista de OX40 es el anticuerpo monoclonal murino anti-mCD134/mOX40 (clon OX86), disponible comercialmente en InVivoMAb, BioXcell Inc., West Lebanon, NH.
En una realización, el agonista de OX40 se selecciona entre los agonistas OX40 descritos en las publicaciones de solicitudes de patente internacionales No. WO 95/12673, WO 95/21925, WO 2006/121810, WO 2012/027328, WO 2013/028231, WO 2013/038191, y WO 2014/148895; solicitud de patente europea EP 0672141; publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos No. US 2010/136030, US 2014/377284, US 2015/190506, y US 2015/132288 (incluidos los clones 20E5 y 12H3); y patentes de los Estados Unidos No. 7,504,101, 7,550,140, 7,622,444, 7,696,175, 7,960,515, 7,961,515, 8,133,983, 9,006,399, y 9,163,085.
En una realización, el agonista de OX40 es una proteína de fusión agonista de OX40 como se representa en la Estructura I-A (proteína de fusión de fragmento de anticuerpo-Fc C-terminal) o la Estructura I-B (proteína de fusión de fragmento de anticuerpo-Fc N-terminal), o un fragmento, derivado, conjugado, variante o biosimilar de la misma. Las propiedades de las estructuras I-Ae I-B se describen arriba y en las patentes de los Estados Unidos No. 9,359,420, 9,340,599, 8,921,519, y 8,450,460. Las secuencias de aminoácidos para los dominios polipeptídicos de estructura I-A se proporcionan en la Tabla GG. El dominio de Fc comprende preferiblemente un dominio constante completo (aminoácidos 17-230 de la SEQ ID NO: 31), el dominio de bisagra completo (aminoácidos 1-16 de la s Eq ID NO: 31) o una porción del dominio de bisagra (por ejemplo, aminoácidos 4-16 de la SEQ ID NO: 31). Los enlazadores preferidos para conectar un anticuerpo Fc C-terminal se pueden seleccionar de las realizaciones proporcionadas en la SEQ ID NO: 32 a la SEQ ID NO: 41, incluidos enlazadores adecuados para la fusión de polipéptidos adicionales. Asimismo, las secuencias de aminoácidos para los dominios polipeptídicos de estructura I-B se proporcionan en la Tabla 9. Si un fragmento de anticuerpo Fc se fusiona al N-terminal de una proteína de fusión TNRFSF como en la estructura I-B, la secuencia del módulo Fc es preferiblemente la que se muestra en la SEQ ID NO: 42, y las secuencias de enlace se seleccionan preferiblemente de aquellas realizaciones establecidas en la SED ID NO: 43 a la SEQ ID NO: 45.
En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de OX40 seleccionados del grupo que consiste en una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de tavolixizumab, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de 11D4, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de 18D8, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de Hu119-122, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de Hu106-222, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable seleccionadas de las cadenas pesadas variables y las cadenas ligeras variables descritas en la Tabla OO, cualquier combinación de una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de las anteriores, y fragmentos, derivados, conjugados, variantes y biosimilares de las mismas.
En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de OX40 que comprenden una secuencia OX40L. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de OX40 que comprenden una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 102. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de OX40 que comprenden una secuencia de OX40L soluble. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de OX40 que comprenden una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 103. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de OX40 que comprenden una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 104.
En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de OX40 que es un dominio de scFv que comprende regiones de V<h>y Vl que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59, respectivamente, en donde los dominios de Vh y Vl están conectados mediante un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de OX40 que es un dominio de scFv que comprende regiones de V<h>y V<l>que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 69, respectivamente, en donde los dominio de V<h>y V<l>están conectados mediante un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de OX40 que es un dominio de scFv que comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 78 y la SEQ ID NO: 79, respectivamente, en donde los dominio de Vh y Vl están conectados mediante un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de OX40 que es un dominio de scFv que comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, respectivamente, en donde los dominio de V<h>y V<l>están conectados mediante un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de OX40 que es un dominio de scFv que comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 95, respectivamente, en donde los dominio de Vh y Vl están conectados mediante un enlazador. En una realización, una proteína de fusión agonista de OX40 de acuerdo con las estructuras I-A o I-B comprende uno o más dominios de unión de OX40 que es un dominio de scFv que comprende regiones de Vh y Vl que son cada una al menos 95 % idénticas a las secuencias de Vh y Vl dadas en la Tabla 17, donde los dominio de Vh y Vl están conectados mediante un enlazador.
Tabla 17: Dominios polipeptídicos adicionales útiles como dominios de unión de OX40 en proteínas de fusión (por ejemplo, estructuras I-A y I-B) o como anticuerpos agonistas de scFv OX40.
En una realización, el agonista de OX40 es un polipéptido de fusión monocatenario agonista de OX40 que comprende (i) un primer dominio de unión de OX40 soluble, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) un segundo dominio de unión de OX40 soluble, (iv) un segundo enlazador peptídico y (v) un tercer dominio de unión de OX40 soluble, que comprende además un dominio adicional en el extremo N-terminal y/o C-terminal, y en donde el dominio adicional es un dominio de fragmento Fab o Fc. En una realización, el agonista de OX40 es un polipéptido de fusión monocatenario agonista de OX40 que comprende (i) un primer dominio de unión de OX40 soluble, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) un segundo dominio de unión de OX40 soluble, (iv) un segundo enlazador peptídico y (v) un tercer dominio de unión de OX40 soluble, que comprende además un dominio adicional en el extremo N-terminal y/o C-terminal, en donde el dominio adicional es un dominio de fragmento Fab o Fc en donde cada uno de los dominios de unión de OX40 solubles carece de una región de tallo (que contribuye a la trimerización y proporciona una cierta distancia a la membrana celular, pero no es parte del dominio de unión de OX40) y el primer y el segundo enlazadores peptídicos tienen independientemente una longitud de 3-8 aminoácidos.
En una realización, el agonista de OX40 es un polipéptido de fusión monocatenario agonista de OX40 que comprende (i) un primer dominio de citocina de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) soluble, (ii) un primer enlazador peptídico, (iii) un segundo dominio de citocina de la superfamilia del TNF soluble, (iv) un segundo enlazador peptídico y (v) un tercer dominio de citocina de la superfamilia del TNF soluble, en donde cada uno de los dominios de citocina de la superfamilia del TNF soluble carece de una región de tallo y el primer y el segundo enlazadores peptídicos tienen independientemente una longitud de 3-8 aminoácidos, y en donde el dominio de citocina de la superfamilia del TNF es un dominio de unión de OX40.
En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es MEDI6383. MEDI6383 es una proteína de fusión agonista de OX40 y se puede preparar como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 6,312,700.
En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo de scFv agonista de OX40 que comprende cualquiera de los dominios de V<h>anteriores enlazados a cualquiera de los dominios de V<l>anteriores.
En una realización, el agonista de OX40 es el anticuerpo monoclonal agonista de OX40 MOM-18455 de Creative Biolabs, disponible comercialmente en Creative Biolabs, Inc., Shirley, NY, EE. UU.
En una realización, el agonista de OX40 es el clon de anticuerpo agonista de OX40 Ber-ACT35 disponible comercialmente en BioLegend, Inc., San Diego, CA, EE. UU.
VI. Análisis opcional de viabilidad celular
Opcionalmente, se puede realizar un ensayo de viabilidad celular después de la primera expansión de la etapa B de los procesos 2a (Gen 2) o Gen 3, utilizando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de exclusión de azul tripán en una muestra de los TIL a granel, que marca selectivamente las células muertas y permite una evaluación de la viabilidad. Otros ensayos que se pueden utilizar para probar la viabilidad incluyen, entre otros, el ensayo azul Alamar y el ensayo m Tt .
1. Recuento celular, viabilidad, citometría de flujo
En algunas realizaciones del Proceso 2A (Gen 2) o Gen 3, se miden los recuentos de células y/o la viabilidad. La expresión de marcadores tales como, entre otros, CD3, CD4, CD8 y CD56, así como cualquier otro divulgado o descrito en el presente documento, se puede medir mediante citometría de flujo con anticuerpos, por ejemplo, entre otros, los disponibles comercialmente de BD Biosciences (BD Biosciences, San José, CA) utilizando un citómetro de flujo FACSCanto™ (BD Biosciences). Las células se pueden contar manualmente utilizando un hemocitómetro c-chip desechable (VWR, Batavia, IL) y la viabilidad se puede evaluar utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluida, entre otras, la tinción con azul tripán. En algunas realizaciones del Proceso 2A (Gen 2) y/o Gen 3, los TIL exhiben un aumento en las células CD8+ después de la primera expansión, la segunda expansión, la preparación de la primera expansión o la segunda expansión rápida. En algunas realizaciones del Proceso 2A (Gen 2), los TIL exhiben un aumento en las células CD8+ después de la primera expansión y/o la segunda expansión. En algunas realizaciones de Gen 3, los TIL exhiben un aumento en las células CD8+ después de la preparación de la primera expansión o la segunda expansión rápida.
En algunos casos, la mayor parte de la población de los TIL se puede criopreservar inmediatamente, utilizando los protocolos que se analizan a continuación. Como alternativa, la población de los TIL a granel puede someterse a REP y luego criopreservarse como se analiza a continuación. De manera similar, en el caso en que se utilicen TIL modificados genéticamente en terapia, las poblaciones de los TIL a granel o REP pueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados.
2. Cultivos celulares
En una realización, un método para expandir los TIL puede incluir el uso de aproximadamente 5,000 mL a aproximadamente 25,000 mL de medio celular, de aproximadamente 5,000 mL a aproximadamente 10,000 mL de medio celular, o de aproximadamente 5,800 mL a aproximadamente 8,700 mL de medio celular. En una realización, la expansión del número de los TIL no utiliza más de un tipo de medio de cultivo celular. Se puede utilizar cualquier medio de cultivo celular adecuado, por ejemplo, medio de cultivo celular AIM-V (L-glutamina, 50 |<j>M de sulfato de estreptomicina y 10<j>M de sulfato de gentamicina) (Invitrogen, Carlsbad CA). En este sentido, los métodos inventivos reducen ventajosamente la cantidad de medio y el número de tipos de medio necesarios para expandir el número de los TIL. En una realización, expandir el número de los TIL puede comprender agregar medio de cultivo celular fresco a las células (también denominado alimentación de las células) con una frecuencia no mayor que cada tercer o cuarto día. Ampliar el número de células en un recipiente permeable al gas simplifica los procedimientos necesarios para expandir el número de células al reducir la frecuencia de alimentación necesaria para expandir las células.
En una realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable al gas no está filtrado. El uso de medio celular sin filtrar puede simplificar los procedimientos necesarios para expandir el número de células. En una realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable al gas carece de beta-mercaptoetanol (BME).
En una realización, los TIL se expanden en recipientes permeables a los gases. Se han utilizado recipientes permeables a los gases para expandir los TIL utilizando PBMC utilizando métodos, composiciones y dispositivos conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2005/0106717 A1. En una realización, los TIL se expanden en bolsas permeables a los gases. En una realización, los TIL se expanden utilizando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el sistema de expansión celular Xuri W25 (GE Healthcare). En una realización, los TIL se expanden utilizando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables a los gases, como el sistema de biorreactor WAVE, también conocido como sistema de expansión celular Xuri W5 (GE Healthcare). En una realización, el sistema de expansión celular incluye una bolsa celular permeable al gas con un volumen seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 100 mL, aproximadamente 200 mL, aproximadamente 300 mL, aproximadamente 400 mL, aproximadamente 500 mL, aproximadamente 600 mL, aproximadamente 700 mL, aproximadamente 800 mL, aproximadamente 900 mL, aproximadamente 1 L, aproximadamente 2 L, aproximadamente 3 L, aproximadamente 4 L, aproximadamente 5 L, aproximadamente 6 L, aproximadamente 7 L, aproximadamente 8 L, aproximadamente 9 L y aproximadamente 10 L. En una realización, los TIL se pueden expandir en matraces G-Rex (disponibles comercialmente en Wilson Wolf Manufacturing). Estas realizaciones permiten que las poblaciones de células se expandan desde aproximadamente 5 * 105 células/cm2 hasta entre 10 * 106 y 30 * 106 células/cm2 En una realización, esta expansión se lleva a cabo sin agregar medio de cultivo celular fresco a las células (también denominado alimentación de las células). En una realización, esto se realiza sin alimentación siempre que el medio se encuentre a una altura de aproximadamente 10 cm en el matraz GRex. En una realización, esto es sin alimentación, pero con la adición de una o más citocinas. En una realización, la citocina se puede agregar como un bolo sin necesidad de mezclar la citocina con el medio. Dichos recipientes, dispositivos y métodos son conocidos en la técnica y se han utilizado para expandir los TIL, e incluyen aquellos descritos en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos. No. US 2014/0377739A1, publicación internacional No. WO 2014/210036 A1, publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. US 2013/0115617 A1, publicación internacional No. WO 2013/188427 A1, publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. US 2011/0136228 A1, patente de los Estados Unidos No. 8,809,050 B2, publicación internacional No. WO 2011/072088 A2, publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. US 2016/0208216 A1, publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. US 2012/0244133 A1, publicación internacional No. WO 2012/129201 A1, publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. US 2013/0102075 A1, patente de los Estados Unidos No. US 8,956,860 B2, publicación internacional No. WO 2013/173835 A1, publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. US 2015/0175966 A1. Estos procesos también se describen en Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35: 283-292.
VII. Salud metabólica de los TIL expandidos
La capacidad respiratoria de reserva (SRC) y la reserva glucolítica se pueden evaluar para los TIL expandidos con los métodos divulgados en el presente documento. La prueba de estrés celular mitocondrial Seahorse XF mide la función mitocondrial midiendo directamente la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de las células, utilizando moduladores de la respiración que se dirigen a los componentes de la cadena de transporte de electrones en las mitocondrias. Los compuestos de prueba (oligomicina, FCCP y una mezcla de rotenona y antimicina A, descritos a continuación) se inyectan en serie para medir la producción de ATP, la respiración máxima y la respiración no mitocondrial, respectivamente. La fuga de protones y la capacidad respiratoria de reserva se calculan luego utilizando estos parámetros y la respiración basal. Cada modulador se dirige a un componente específico de la cadena de transporte de electrones. La oligomicina inhibe la ATP sintasa (complejo V) y la disminución de OCR después de la inyección de oligomicina se correlaciona con la respiración mitocondrial asociada con la producción de ATP celular. El cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) es un agente desacoplador que colapsa el gradiente de protones y altera el potencial de la membrana mitocondrial. Como resultado, el flujo de electrones a través de la cadena de transporte de electrones no se inhibe y el oxígeno es consumido al máximo por el complejo IV. La OCR estimulada por FCCP se puede utilizar luego para calcular la capacidad respiratoria de reserva, definida como la diferencia entre la respiración máxima y la respiración basal. La capacidad respiratoria de reserva (SRC) es una medida de la capacidad de la célula para responder a una mayor demanda de energía. La tercera inyección es una mezcla de rotenona, un inhibidor del complejo I, y antimicina A, un inhibidor del complejo III. Esta combinación detiene la respiración mitocondrial y permite el cálculo de la respiración no mitocondrial impulsada por procesos fuera de las mitocondrias.
El ensayo metabólico puede ser la respiración basal.
En general, los TIL tienen una tasa de respiración basal que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la tasa de respiración basal es de aproximadamente el 50 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la tasa de respiración basal es de aproximadamente el 60 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la tasa de respiración basal es de aproximadamente el 70 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la tasa de respiración basal es de aproximadamente el 80 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la tasa de respiración basal es de aproximadamente el 90 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la tasa de respiración basal es de aproximadamente el 95 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, los TIL tienen una tasa de respiración basal que no es estadísticamente significativamente diferente de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados.
El ensayo metabólico puede ser capacidad respiratoria de reserva.
El ensayo metabólico puede ser de reserva glucolítica. El ensayo metabólico puede ser capacidad respiratoria de reserva. Para medir el metabolismo celular (respiratorio), las células se trataron con inhibidores de la respiración mitocondrial y la glucólisis para determinar un perfil metabólico para el TIL que consta de las siguientes medidas: fosforilación oxidativa basal (medida por OCR), capacidad respiratoria de reserva, actividad glucolítica basal (medida por ECAR) y reserva glucolítica. Los perfiles metabólicos se realizaron utilizando el ensayo de prueba de estrés mitocondrial/glucólisis combinado Seahorse (incluido el kit disponible comercialmente de Agilent®), que permite determinar la capacidad de una célula para realizar la glucólisis ante el bloqueo de la producción de<a>T<p>mitocondrial. Se puede privar a las células de glucosa, luego se inyecta glucosa, seguida de un agente estresante. El agente de estrés puede seleccionarse del grupo que consiste en oligomicina, FCCP, rotenona, antimicina A y/o 2-desoxiglucosa (2-DG), así como combinaciones de los mismos. Se puede añadir oligomicina a 10 mM. Se puede añadir FCCP a 10 mM. Se puede añadir rotenona a 2.5 mM. Se puede añadir antimicina A a 2.5 mM. Se puede añadir 2-desoxiglucosa (2-DG) a 500 mM. Se puede medir la capacidad glucolítica, la reserva glucolítica y/o la acidificación no glucolítica. En general, los TIL tienen una reserva glucolítica que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 50 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 60 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 70 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 80 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 90 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 95 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados.
El ensayo metabólico puede ser la glucólisis basal. En algunos casos, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tal como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen un aumento de la glucólisis basal de igual o aproximadamente dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces o al menos diez veces. En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen un aumento en la glucólisis basal de aproximadamente dos veces a aproximadamente diez veces. En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen un aumento en la glucólisis basal de aproximadamente dos veces a aproximadamente ocho veces. En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen un aumento en la glucólisis basal de aproximadamente tres veces a aproximadamente siete veces. En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen un aumento en la glucólisis basal de aproximadamente dos veces a aproximadamente cuatro veces. En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen un aumento en la glucólisis basal de aproximadamente dos veces a aproximadamente tres veces.
En general, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tal como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominadas TIL reREP) tienen una capacidad respiratoria de reserva que es al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de latasa de respiración basalde los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 50 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 50 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 60 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 70 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 80 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 90 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 95 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tal como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen una capacidad respiratoria de reserva que no es estadísticamente significativamente diferente de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados.
VIII. Caracterización funcional de los TIL
Producción de granzima B: La granzima B es otra medida de la capacidad de los TIL para matar células objetivo. Los sobrenadantes de medios reestimulados como se describió anteriormente usando anticuerpos contra CD3, CD28 y CD137/4-1BB también se evaluaron para determinar sus niveles de Granzima B utilizando el kit ELISA Human Granzyme B DuoSet (R & D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) han aumentado la producción de Granzima B. En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen una actividad citotóxica aumentada.
En algunas realizaciones, la longitud de los telómeros se puede utilizar como medida de la viabilidad celular y/o la función celular. Medición de la longitud de los telómeros: se han utilizado diversos métodos para medir la longitud de los telómeros en el ADN genómico y en preparaciones citológicas. El análisis del fragmento de restricción del telómero (TRF) es el estándar de oro para medir la longitud del telómero (de Lange et al., 1990). Sin embargo, la principal limitación del TRF es el requerimiento de una gran cantidad de ADN (1.5 |jg). Con la presente invención se pueden emplear dos técnicas ampliamente utilizadas para la medición de longitudes de telómeros, a saber, hibridaciónin situcon fluorescencia (FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y PCR cuantitativa. En algunas realizaciones, no hay cambio en la longitud de los telómeros entre los TIL recolectados inicialmente en la etapa A y los TIL expandidos, por ejemplo, de la etapa D, como se proporciona en la Figura 7.
En algunas realizaciones, la salud de los TIL se mide mediante la secreción de IFN-gamma. En algunas realizaciones, se emplea un ensayo de potencia para la producción de IFN-<y>. La producción de IFN-<y>es otra medida del potencial citotóxico. La producción de IFN-<y>se puede medir determinando los niveles de la citocina IFN-y en los medios de los TIL estimulados con anticuerpos contra CD3, CD28 y CD137/4-1BB. Los niveles de IFN-<y>en los medios de estos TIL estimulados se pueden determinar midiendo la liberación de IFN-<y>. En algunas realizaciones, un aumento en la producción de IFN-<y>en, por ejemplo, los TIL de la etapa D como se proporciona en la Figura 7 en comparación con los TIL recolectados inicialmente en, por ejemplo, la etapa A como se proporciona en la Figura 7 es indicativo de un aumento en el potencial citotóxico de los TIL de la etapa D.
El ensayo de lisis redirigida bioluminiscente: El potencial citotóxico de los TIL para lisar las células objetivo se evaluó utilizando un ensayo de cocultivo de los TIL con la línea celular bioluminiscente, P815 (clon G6), de acuerdo con un ensayo de lisis redirigida bioluminiscente (ensayo de potencia) para TIL, que mide la citotoxicidad de los TIL de una manera altamente sensible y dependiente de la dosis.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un ensayo para evaluar la viabilidad de los TIL, utilizando los métodos descritos anteriormente y en el presente documento, incluidos, por ejemplo, los descritos en los Ejemplos y Figuras. En algunas realizaciones, los TIL se expanden como se discutió anteriormente, incluso, por ejemplo, como se proporciona en la Figura 7. Los TIL pueden criopreservarse antes de evaluar su viabilidad. La evaluación de viabilidad puede incluir la descongelación de los TIL antes de realizar una primera expansión, una segunda expansión y una segunda expansión adicional. Ciertos métodos divulgados en el presente documento pueden proporcionar un ensayo para evaluar la proliferación celular, la toxicidad celular, la muerte celular y/u otros términos relacionados con la viabilidad de la población de los TIL.
La viabilidad se puede medir mediante cualquiera de los ensayos metabólicos de los TIL descritos anteriormente, así como mediante cualquier método conocido para evaluar la viabilidad celular que se conoce en la técnica. Ciertos métodos divulgados en el presente documento proporcionan un ensayo para evaluar la proliferación celular, la toxicidad celular, la muerte celular y/u otros términos relacionados con la viabilidad de los TIL expandidos utilizando los métodos descritos en el presente documento, incluidos aquellos ejemplificados en la Figura 7.
En algunas realizaciones, el ensayo metabólico es la respiración basal. En general, los TIL de segunda expansión tienen una tasa de respiración basal que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL de proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la tasa de respiración basal es de aproximadamente el 50 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la tasa de respiración basal es de aproximadamente el 60 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la tasa de respiración basal es de aproximadamente el 70 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la tasa de respiración basal es de aproximadamente el 80 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la tasa de respiración basal es de aproximadamente el 90 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la tasa de respiración basal es de aproximadamente el 95 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen una tasa de respiración basal que no es estadísticamente significativamente diferente de la tasa de respiración basal de los TIL de proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7).
En general, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tal como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen una capacidad respiratoria de reserva que es al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL de proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 50 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 50 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 60 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 70 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 80 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 90 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la capacidad respiratoria de reserva es de aproximadamente el 95 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tal como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen una capacidad respiratoria de reserva que no es estadísticamente significativamente diferente de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7).
En general, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tal como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen una capacidad respiratoria de reserva que es al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL de proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). El ensayo metabólico medido puede ser la reserva glucolítica. El ensayo metabólico puede ser capacidad respiratoria de reserva. Para medir el metabolismo celular (respiratorio), las células se trataron con inhibidores de la respiración mitocondrial y la glucólisis para determinar un perfil metabólico para el TIL que consta de las siguientes medidas: fosforilación oxidativa basal (medida por OCR), capacidad respiratoria de reserva, actividad glucolítica basal (medida por ECAR) y reserva glucolítica. Los perfiles metabólicos se realizaron utilizando el ensayo de prueba de estrés mitocondrial/glucólisis combinado Seahorse (incluido el kit disponible comercialmente de Agilent®), que permite determinar la capacidad de las células para realizar la glucólisis tras el bloqueo de la producción de ATP mitocondrial. Se puede privar a las células de glucosa, luego se inyecta glucosa, seguida de un agente estresante. El agente estresante puede seleccionarse del grupo que consiste en oligomicina, FCCP, rotenona, antimicina A y/o 2-desoxiglucosa (2-DG), así como combinaciones de los mismos. Se puede añadir oligomicina a 10 mM. Se puede añadir FCCP a 10 mM. Se puede añadir rotenona a 2.5 mM. Se puede añadir antimicina A a 2.5 mM. Se puede añadir 2-desoxiglucosa (2-DG) a 500 mM. Se miden la capacidad glucolítica, la reserva glucolítica y/o la acidificación no glucolítica. En general, los TIL tienen una reserva glucolítica que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 50 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 60 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 70 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 80 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 90 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 95 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7).
El ensayo metabólico puede ser la glucólisis basal. En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen un aumento en la glucólisis basal de igual o aproximadamente dos veces, al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces o al menos diez veces. En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen un aumento en la glucólisis basal de aproximadamente dos veces a aproximadamente diez veces. En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen un aumento en la glucólisis basal de aproximadamente dos veces a aproximadamente ocho veces. En algunas realizaciones, los segundos<t>I<l>de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen un aumento en la glucólisis basal de aproximadamente tres veces a aproximadamente siete veces. En algunas realizaciones, los segundos t Il de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen un aumento en la glucólisis basal de aproximadamente dos veces a aproximadamente cuatro veces. En algunas realizaciones, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen un aumento en la glucólisis basal de aproximadamente dos veces a aproximadamente tres veces.
En general, los segundos TIL de expansión o los segundos TIL de expansión adicionales (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 7, incluidos los TIL denominados TIL reREP) tienen una reserva glucolítica que es al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL de proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 50 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 60 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 70 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 80 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 90 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7). En algunas realizaciones, la reserva glucolítica es de aproximadamente el 95 % hasta aproximadamente el 99 % de la tasa de respiración basal de los TIL del proceso 2A (véase, por ejemplo, la Figura 7).
Producción de granzima B: La granzima B es otra medida de la capacidad de los TIL para matar células objetivo. Los sobrenadantes de medios reestimulados como se describió anteriormente usando anticuerpos contra CD3, CD28 y CD137/4-1BB también se evaluaron para determinar sus niveles de Granzima B utilizando el kit ELISA Human Granzyme B DuoSet (R & D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un ensayo para evaluar la viabilidad de los TIL, utilizando los métodos descritos anteriormente. Los TIL se pueden expandir como se explicó anteriormente, incluso, por ejemplo, como se muestra en la Figura 7. Los TIL pueden criopreservarse antes de evaluar su viabilidad. La evaluación de viabilidad incluye la descongelación de los TIL antes de realizar una primera expansión, una segunda expansión y una segunda expansión adicional. Los métodos divulgados en el presente documento pueden proporcionar un ensayo para evaluar la proliferación celular, la toxicidad celular, la muerte celular y/u otros términos relacionados con la viabilidad de la población de los TIL. La viabilidad se puede medir mediante cualquiera de los ensayos metabólicos de los TIL descritos anteriormente, así como mediante cualquier método conocido para evaluar la viabilidad celular en la técnica. Ciertos métodos divulgados en el presente documento pueden proporcionar un ensayo para la evaluación de la proliferación celular, toxicidad celular, muerte celular y/u otros términos relacionados con la viabilidad de los TIL expandidos utilizando los métodos descritos en el presente documento, incluidos aquellos ejemplificados en la Figura 7.
También se divulgan en el presente documento, pero no se reivindican, métodos de ensayo para determinar la viabilidad de los TIL. La presente divulgación proporciona métodos para analizar la viabilidad de los TIL mediante la expansión de los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población más grande de los TIL que comprende:
(i) obtener una primera población de los TIL que haya sido previamente expandida;
(ii) realizar una primera expansión cultivando la primera población de los TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de los TIL, en donde el medio de cultivo celular se complementa con OKT-3 el día 3, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 19 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL comprende al menos 5 * 107 TIL entre 10 días y 19 días aproximadamente cuando la primera población de los TIL proviene de una biopsia con aguja gruesa; y
(iii) realizar una segunda expansión complementando el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es al menos 100 veces mayor en número que la segunda población de los TIL, y en donde la segunda expansión se realiza durante aproximadamente 11 días a aproximadamente 14 días para obtener la tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de los TIL, y en donde la tercera población se analiza adicionalmente para determinar su viabilidad. En algunas realizaciones, el método comprende, además:
(iv) realizar una segunda expansión adicional complementando el medio de cultivo celular de la tercera población de los TIL con IL-2 adicional, OKT-3 adicional y APC adicionales, en donde la segunda expansión adicional se realiza durante al menos 14 días para obtener una población más grande de los TIL que la obtenida en la etapa (iii), en donde la población más grande de los TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la tercera población de los TIL, y en donde la tercera población se analiza adicionalmente para determinar su viabilidad.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, antes de la etapa (i), las células se criopreservan.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células se descongelan antes de realizar la etapa (i).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la etapa (iv) se repite de una a cuatro veces para obtener suficientes TIL para el análisis.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (i) a (iii) o (iv) se realizan dentro de un período de aproximadamente 21 días a aproximadamente 33 días.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (i) a (iii) o (iv) se realizan dentro de un período de aproximadamente 21 días a aproximadamente 30 días.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (i) a (iii) o (iv) se realizan dentro de un período de aproximadamente 21 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (i) a (iii) o (iv) se realizan dentro de un período de aproximadamente 24 días.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células de las etapas (iii) o (iv) expresan CD4, CD8 y TCR a p en niveles similares a las células recién recolectadas.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígeno son células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las PBMC se agregan al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 17 en la etapa (iii).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población más grande de los TIL en la etapa (iv) exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresión de CD27, expresión de CD28, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56, en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la tercera población de células.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central exhiben una expresión aumentada de CD57 y una expresión disminuida de CD56.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las APC son APC artificiales (aAPC).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el método comprende además la etapa de transducir la primera población de los TIL con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de células T de alta afinidad.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la etapa de transducción ocurre antes de la etapa (i).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el método comprende además la etapa de transducir la primera población de los TIL con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un anticuerpo de fragmento variable de cadena única fusionado con al menos un endodominio de una molécula de señalización de células T.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la etapa de transducción ocurre antes de la etapa (i).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, se analiza la viabilidad de los TIL.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, se analiza la viabilidad de los TIL después de la criopreservación.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, los TIL se analizan para determinar su viabilidad después de la criopreservación y después de la etapa (iv).
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) expandidos que comprenden: (i) obtener una primera población de los TIL a partir de un aspirado con aguja fina (FNA) o una biopsia con aguja gruesa obtenida de un tumor en un paciente; (ii) realizar una primera expansión cultivando la primera población de los TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de los TIL, en donde el medio de cultivo celular se complementa con OKT-3 el día 3, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 19 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL comprende al menos 5 * 107 TIL en aproximadamente 10 días a aproximadamente 19 días cuando la primera población de los TIL es de una biopsia con aguja gruesa; (iii) realizar una segunda expansión complementando el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es al menos 25 veces mayor en número que la segunda población de los TIL, y en donde la segunda expansión se realiza durante aproximadamente 11 días a aproximadamente 14 días para obtener la tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es una población terapéutica de los TIL; y (iv) administrar una dosis terapéuticamente efectiva de la tercera población de los TIL al paciente.
De acuerdo con la presente divulgación, se proporciona un método para analizar los TIL para determinar su viabilidad y/o su uso posterior en la administración a un sujeto. El método para analizar los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) puede comprender:
(i) obtener una primera población de los TIL;
(ii) realizar una primera expansión cultivando la primera población de los TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de los TIL, en donde el medio de cultivo celular se complementa con OKT-3 el día 3, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 19 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL comprende al menos 5 * 107 TIL entre 10 días y 19 días aproximadamente cuando la primera población de los TIL proviene de una biopsia con aguja gruesa; y
(iii) realizar una segunda expansión complementando el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con IL-2 adicional, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC), para producir una tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es al menos 50 veces mayor en número que la segunda población de los TIL, y en donde la segunda expansión se realiza durante aproximadamente 11 días a aproximadamente 14 días para obtener la tercera población de los TIL;
(iv) recolectar, lavar y criopreservar la tercera población de los TIL;
(v) almacenar los TIL criopreservados a una temperatura criogénica;
(vi) descongelar la tercera población de los TIL para proporcionar una tercera población de los TIL descongelada; y
(vii) realizar una segunda expansión adicional de una porción de la tercera población descongelada de los TIL complementando el medio de cultivo celular de la tercera población con IL-2, OKT-3 y APC durante un período de reREP de igual o aproximadamente 3 días, en donde la tercera expansión se realiza para obtener una cuarta población de los TIL, en donde el número de los TIL en la cuarta población de los TIL se compara con el número de los TIL en la tercera población de los TIL para obtener una relación;
(viii) determinar, en función de la relación en la etapa (vii), si la población descongelada de los TIL es adecuada para su administración a un paciente;
(ix) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la población descongelada de los TIL al paciente cuando se determina que la relación entre el número de los TIL en la cuarta población de los TIL y el número de los TIL en la tercera población de los TIL es mayor que 5:1 en la etapa (viii).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el período reREP se realiza hasta que la relación entre el número de los TIL en la cuarta población de los TIL y el número de los TIL en la tercera población de los TIL sea mayor que 50:1.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el número de los TIL suficiente para una dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 2.3 * 1010 hasta aproximadamente 13.7 * 1010.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (i) a (vii) se realizan en un período de aproximadamente 21 días a aproximadamente 33 días. En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (i) a (vii) se realizan en un período de aproximadamente 21 días a aproximadamente 30 días. En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (i) a (vii) se realizan en un período de aproximadamente 21 días hasta igual o aproximadamente 28 días. En algunos métodos divulgados en el presente documento, las etapas (i) a (vii) se realizan en aproximadamente 24 días. En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células de las etapas (iii) o (vii) expresan CD4, CD8 y TCR a p en niveles similares a las células recién recolectadas. En algunas realizaciones, las células son TIL.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígeno son células mononucleares de sangre periférica (PBMC). En algunas realizaciones, las PBMC se agregan al cultivo celular en cualquiera de los días 3 a 12 en la etapa (ii) y/o cualquiera de los días 11 a 14 en la etapa (iii).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población más grande de los TIL en las etapas (iii) o (vii) exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresión de CD27, expresión de CD28, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56, en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la tercera población de células.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central exhiben una expresión aumentada de CD57 y una expresión disminuida de CD56.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, las APC son APC artificiales (aAPC).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la etapa de transducir la primera población de los TIL con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de células T de alta afinidad.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la etapa de transducción ocurre antes de la etapa (i).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la etapa de transducir la primera población de los TIL con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un anticuerpo de fragmento variable de cadena única fusionado con al menos un endodominio de una molécula de señalización de células T.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la etapa de transducción ocurre antes de la etapa (i).
En Algunos métodos divulgados en el presente documento, los TIL se analizan para determinar su viabilidad después de la etapa (vii).
La divulgación de la presente invención también proporciona métodos adicionales para analizar los TIL. La divulgación proporciona un método para ensayar los TIL que comprende:
(i) obtener una porción de una primera población de los TIL criopreservados obtenidos a partir de una muestra de biopsia con aguja gruesa;
(ii) descongelar la porción de la primera población de los TIL criopreservados;
(iii) realizar una primera expansión cultivando la porción de la primera población de los TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) durante un período de reREP de igual o aproximadamente 3 días, para producir una segunda población de los TIL, en donde la porción de la primera población de los TIL se compara con la segunda población de los TIL para obtener una relación del número de los TIL, en donde la relación del número de los TIL en la segunda población de los TIL con el número de los TIL en la porción de la primera población de los TIL es mayor que 5:1, en donde la segunda población de los TIL comprende al menos 5 * 1o7 TIL en aproximadamente 10 y hasta aproximadamente 19 días;
(iv) determinar, en función de la relación en la etapa (iii) y el número de los TIL en la etapa (iii), si la primera población de los TIL es adecuada para su uso en la administración terapéutica a un paciente;
(v) determinar que la primera población de los TIL es adecuada para su uso en administración terapéutica cuando la relación entre el número de los TIL en la segunda población de los TIL y el número de los TIL en la primera población de los TIL se determina que es mayor que 5:1 en la etapa (iv).
En algunos métodos divulgados en el presente documento, la relación entre el número de los TIL en la segunda población de los TIL y el número de los TIL en la porción de la primera población de los TIL es mayor que 50:1.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el método comprende además realizar la expansión de toda la primera población de los TIL criopreservados de la etapa (i) de acuerdo con los métodos descritos en cualquiera de las realizaciones proporcionadas en el presente documento.
En algunos métodos divulgados en el presente documento, el método comprende además administrar toda la primera población de los TIL criopreservados de la etapa (i) al paciente.
IX. Sistemas cerrados para la fabricación de los TIL
La presente invención prevé el uso de sistemas cerrados durante el proceso de cultivo de los TIL utilizando procesos Gen 2 o procesos Gen 3. Estos sistemas cerrados permiten prevenir y/o reducir la contaminación microbiana, permiten utilizar menos matraces y permiten reducir costes. En algunas realizaciones, el sistema cerrado utiliza dos recipientes.
Estos sistemas cerrados son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm y https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceCompliance RegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm.
Los dispositivos de conexión estériles (STCD) producen soldaduras estériles entre dos piezas de tubos compatibles. Este procedimiento permite la conexión estéril de una variedad de recipientes y diámetros de tubos. En algunas realizaciones, los sistemas cerrados incluyen sistemas de cierre luer y sellados térmicamente. En algunas realizaciones, se accede al sistema cerrado a través de jeringas en condiciones estériles para mantener la esterilidad y la naturaleza cerrada del sistema. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado. En algunas realizaciones, los TIL se formulan en un recipiente de formulación de producto final.
En algunas realizaciones, el sistema cerrado utiliza un recipiente desde el momento en que se obtienen los fragmentos del tumor hasta que los TIL están listos para su administración al paciente o su criopreservación. En algunas realizaciones, cuando se utilizan dos recipientes, el primer recipiente es un recipiente G cerrado y la población de los TIL se centrifuga y se transfiere a una bolsa de infusión sin abrir el primer recipiente G cerrado. En algunas realizaciones, cuando se utilizan dos recipientes, la bolsa de infusión es una bolsa de infusión que contiene HypoThermosol. Un sistema cerrado o sistema cerrado de cultivo de células de TIL se caracteriza porque una vez agregada la muestra tumoral y/o los fragmentos de tumor, el sistema se sella herméticamente desde el exterior para formar un ambiente cerrado libre de la invasión de bacterias, hongos y/o cualquier otra contaminación microbiana.
En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana está entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 100 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana está entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana está entre aproximadamente el 5%y aproximadamente el 90 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana está entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 90 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana está entre aproximadamente el 15 % y aproximadamente el 85 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana es de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 %.
El sistema cerrado permite el crecimiento de los TIL en ausencia y/o con una reducción significativa de la contaminación microbiana.
Además, el pH, la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de oxígeno del entorno de cultivo de células de TIL varían a medida que se cultivan las células. Por consiguiente, aunque circule un medio apropiado para el cultivo celular, el entorno cerrado debe mantenerse constantemente como un entorno óptimo para la proliferación de los TIL. Para este fin, es deseable que los factores físicos de pH, presión parcial de dióxido de carbono y presión parcial de oxígeno dentro del líquido de cultivo del ambiente cerrado sean monitoreados por medio de un sensor, cuya señal se utiliza para controlar un intercambiador de gases instalado a la entrada del ambiente de cultivo, y que la presión parcial de gas del ambiente cerrado sea ajustada en tiempo real de acuerdo con los cambios en el líquido de cultivo para optimizar el ambiente de cultivo celular. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un sistema de cultivo celular cerrado que incorpora en la entrada del entorno cerrado un intercambiador de gases equipado con un dispositivo de monitoreo que mide el pH, la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de oxígeno del entorno cerrado, y optimiza el entorno de cultivo celular ajustando automáticamente las concentraciones de gas en función de las señales del dispositivo de monitoreo.
En algunas realizaciones, la presión dentro del entorno cerrado se controla de forma continua o intermitente. Es decir, la presión en el entorno cerrado se puede variar mediante un dispositivo de mantenimiento de presión, por ejemplo, garantizando así que el espacio sea adecuado para el crecimiento de los TIL en un estado de presión positiva, o promoviendo la exudación de fluido en un estado de presión negativa y promoviendo así la proliferación celular. Además, aplicando presión negativa de forma intermitente, es posible reemplazar de manera uniforme y eficiente el líquido circulante en el entorno cerrado mediante una contracción temporal del volumen del entorno cerrado.
En algunas realizaciones, se pueden sustituir o agregar componentes de cultivo óptimos para la proliferación de los TIL, e incluso se pueden agregar factores como IL-2 y/o OKT3, así como también combinaciones.
X. Ingeniería genética opcional de los TIL
En algunas realizaciones de los procesos Gen 2 o Gen 3, los TIL expandidos de la presente invención se manipulan adicionalmente antes, durante o después de una etapa de expansión, incluso durante procesos de fabricación cerrados y estériles, cada uno como se proporciona en el presente documento, para alterar la expresión de proteínas de manera transitoria. En algunas realizaciones, la expresión de proteína alterada transitoriamente se debe a una edición genética transitoria. En algunas realizaciones, los TIL expandidos de la presente invención se tratan con factores de transcripción (TF) y/u otras moléculas capaces de alterar transitoriamente la expresión de proteínas en los TIL. En algunas realizaciones, los TF y/u otras moléculas que son capaces de alterar transitoriamente la expresión de proteínas proporcionan una expresión alterada de antígenos tumorales y/o una alteración en el número de células T específicas del antígeno tumoral en una población de los TIL.
En ciertas realizaciones, el método comprende la edición genética de una población de los TIL. En ciertas realizaciones, el método comprende editar genéticamente la primera población de los TIL, la segunda población de los TIL y/o la tercera población de los TIL.
En algunas realizaciones, la presente invención incluye la edición genética a través de la inserción de nucleótidos, tal como a través de la inserción de ácido ribonucleico (ARN), incluida la inserción de ARN mensajero (ARNm) o ARN interferente pequeño (o corto) (ARNip), en una población de los TIL para la promoción de la expresión de una o más proteínas o la inhibición de la expresión de una o más proteínas, así como combinaciones simultáneas de la promoción de un conjunto de proteínas con la inhibición de otro conjunto de proteínas.
En algunas realizaciones, los TIL expandidos de la presente invención experimentan una alteración transitoria de la expresión de proteínas. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas ocurre en la población de los TIL a granel antes de la primera expansión, incluyendo, por ejemplo, en la población de los TIL obtenida, por ejemplo, de la etapa A como se indica en la Figura 85 (particularmente la Figura 85B). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas ocurre durante la primera expansión, incluyendo, por ejemplo, en la población de TIL expandida en, por ejemplo, la etapa B como se indica en la Figura 85 (por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas ocurre después de la primera expansión, incluyendo, por ejemplo, en la población de TIL en transición entre la primera y la segunda expansión (p. ej., la segunda población de los TIL como se describe en el presente documento), la población de los TIL obtenida, por ejemplo, de la etapa B e incluida en la etapa C como se indica en la Figura 85. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas ocurre en la población de los TIL a granel antes de la segunda expansión, incluyendo, por ejemplo, en la población de los TIL obtenida, por ejemplo, de la etapa C y antes de su expansión en la etapa D como se indica en la Figura 85. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas ocurre durante la segunda expansión, incluyendo, por ejemplo, en la población de TIL expandida en, por ejemplo, la etapa D como se indica en la Figura 85 (p. ej., la tercera población de los TIL). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas ocurre después de la segunda expansión, incluyendo, por ejemplo, en la población de TIL obtenida de la expansión en, por ejemplo, la etapa D como se indica en la Figura 85.
En una realización, un método para alterar transitoriamente la expresión de proteínas en una población de los TIL incluye la etapa de electroporación. Los métodos de electroporación son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Tseng, Biophys. J. 1991, 60, 297-306, y en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2014/0227237 A1. En una realización, un método para alterar transitoriamente la expresión de proteínas en una población de los TIL incluye la etapa de transfección con fosfato de calcio. Los métodos de transfección con fosfato de calcio (precipitación de<a>D<n>con fosfato de calcio, recubrimiento de la superficie celular y endocitosis) son conocidos en la técnica y se describen en Graham y van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467; Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376; y Chen y Okayarea, Mol. Cel. Biol.
1987, 7, 2745-2752; y en la patente de los Estados Unidos No. 5,593,875. En una realización, un método para alterar transitoriamente la expresión de proteínas en una población de los TIL incluye la etapa de transfección liposomal. Métodos de transfección liposomal, como los métodos que emplean una formulación de liposomas 1:1 (p/p) del lípido catiónico cloruro de A/-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-n,n,n-trimetilamonio (DOTMA) y dioleoil fosfotidiletanolamina (DOPE) en agua filtrada, son conocidos en la técnica y se describen en Rose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525 y Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 1987, 84, 7413-7417 y en las patentes de los Estados Unidos No. 5,279,833; 5,908,635; 6,056,938; 6,110,490; 6,534,484; y 7,687,070. En una realización, un método para alterar transitoriamente la expresión de proteínas en una población de los TIL incluye la etapa de transfección utilizando métodos descritos en las patentes de los Estados Unidos No.
5,766,902; 6,025,337; 6,410,517; 6,475,994; y 7,189,705.
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado un aumento en las células T madre de memoria (TSCM). Las TSCM son progenitores tempranos de células T de memoria central con experiencia en antígenos. Las TSCM generalmente muestran las capacidades de supervivencia a largo plazo, autorrenovación y multipotencia que definen a las células madre y generalmente son deseables para la generación de productos de TIL efectivos. Las TSCM han demostrado una actividad antitumoral mejorada en comparación con otros subconjuntos de células T en modelos de ratón de transferencia celular adoptiva (Gattinoni et al., Natl Med. 2009, 2011; Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012; Cieri et al., Blood 2013). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una población de los TIL con una composición que comprende una alta proporción de TSCM. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado un aumento de igual o aproximadamente el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % en el porcentaje de TSCM. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado un aumento de igual o aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces en las TSCM en la población de TIL. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una población de TIL con al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de las TSCM. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una población de los TIL terapéutica con al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de las TSCM.
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado el rejuvenecimiento de las células T experimentadas con antígenos. En algunas realizaciones, el rejuvenecimiento incluye, por ejemplo, mayor proliferación, mayor activación de células T y/o mayor reconocimiento de antígenos.
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas altera la expresión en una gran fracción de las células T para preservar el repertorio de TCR derivado del tumor. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas no altera el repertorio de TCR derivado del tumor. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas mantiene el repertorio de TCR derivado del tumor.
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la proteína da como resultado la expresión alterada de un gen particular. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a un gen que incluye, entre otros, PD-1 (también denominado PDCD1 o CC279), TGFBR2, CCR4/5, CBLB (CBL-B), CISH, CCR (receptores coestimuladores quiméricos), IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, NOTCH 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFp, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP1-P), CCL5 (RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1 y/o proteína quinasa A de AMPc (PKA). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a un gen seleccionado del grupo que consiste en PD-1, TGFBR2, CCR4/5, CBLB (CBL-B), CISH, CCR (receptores coestimuladores quiméricos), IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, NOTCH 1/2 ICD, TIM3, LAG3, TIGIT, TGFp, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CSCR3, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP1-P), CCL5 (RANTES), CXCL1/CXCL8, CCL22, CCL17, CXCL1/CXCL8, VHL, CD44, PIK3CD, SOCS1 y/o proteína quinasa A de AMPc (PKA). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a PD-1. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a TGFBR2. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a CCR4/5. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a CBLB. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a CISH. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a los CCR (receptores coestimuladores quiméricos). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a IL-2. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a IL-12.
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a IL-15. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a IL-21. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige al NOTCH 1/2 ICD. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a TIM3. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a LAG3. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a TIGIT. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a TGFp. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a CCR1. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a CCR2. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a CCR4. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a CCR5. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige n algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige n algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige n algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a C CP-1). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a C IP-1a). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a C IP1-p). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a CCL5 (RANTES). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a CXCL1. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a CXCL8. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a CCL22. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a CCL17. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a VHL. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a CD44. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a PIK3CD. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a SOCS1. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se dirige a la proteína quinasa A de AMPc (PKA).
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado un aumento y/o sobreexpresión de un receptor de quimiocina. En algunas realizaciones, el receptor de quimiocina que se sobreexpresa mediante la expresión transitoria de proteínas incluye un receptor con un ligando que incluye, entre otros, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP1-p), CCL5 (RANTES), CXCL1, CXCL8, CCL22 y/o CCL17.
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una disminución y/o una expresión reducida de PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, TIGIT, TGFpR2 y/o TGFp (incluido el bloqueo de la vía de TGFp, por ejemplo). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una disminución y/o reducción de la expresión de CBLB (CBL-B). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una disminución y/o expresión reducida de CISH.
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado un aumento y/o sobreexpresión de los receptores de quimiocinas para, por ejemplo, mejorar el tráfico o el movimiento de los TIL al sitio del tumor. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado un aumento y/o sobreexpresión de un CCR (receptor coestimulador quimérico). En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una mayor y/o sobreexpresión de un receptor de quimiocina seleccionado del grupo que consiste en CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2 y/o CSCR3.
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado un aumento y/o sobreexpresión de una interleucina. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado un aumento y/o sobreexpresión de una interleucina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-12, IL-15 y/o IL-21.
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado un aumento y/o sobreexpresión de NOTCH 1/2 ICD. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado un aumento y/o sobreexpresión de VHL. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado un aumento y/o sobreexpresión de CD44. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado un aumento y/o sobreexpresión de PIK3CD. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado un aumento y/o sobreexpresión de SOCS1.
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de la proteína quinasa A de AMPc (PKA).
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de una molécula seleccionada del grupo que consiste en PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3) y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de dos moléculas seleccionadas del grupo que consiste en PD-1, LAG3, TI<m>3, CTLA-4, TIGIT, ClSH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3) y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de PD-1 y una molécula seleccionada del grupo que consiste en LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3) y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de PD-1, LAG-3, CISH, CBLB, TIM3 y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de PD-1 y una de LAG3, CISH, CBLB, TIM3 y combinaciones de las mismos. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de PD-1 y LAG3. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de PD-1 y CISH. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de PD-1 y CBLB. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de LAG3 y CISH. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de LAG3 y CBLB. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de CISH y CBLB. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de TIM3 y PD-1. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de TIM3 y LAG3. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de TIM3 y CISH. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de TIM3 y CBLB.
En algunas realizaciones, una molécula de adhesión seleccionada del grupo que consiste en CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1 y combinaciones de las mismas, se inserta mediante un método gammaretroviral o lentiviral en la primera población de los TIL, la segunda población de los TIL o la población recolectada de los TIL (por ejemplo, la expresión de la molécula de adhesión aumenta).
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de una molécula seleccionada del grupo que consiste en PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3) y combinaciones de las mismas, y una expresión aumentada y/o mejorada de CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1 y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas da como resultado una expresión disminuida y/o reducida de una molécula seleccionada del grupo que consiste en PD-1, LAG3, TIM3, CISH, CBLB y combinaciones de las mismas, y una expresión aumentada y/o mejorada de CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1 y combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 80 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 85 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 90 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 99 %.
En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 % o aproximadamente 95 %. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 80 %. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 85 %. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 90 %. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de al menos aproximadamente el 99 %.
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas se induce mediante el tratamiento de los TIL con factores de transcripción (TF) y/u otras moléculas capaces de alterar transitoriamente la expresión de proteínas en los TIL. En algunas realizaciones, la plataforma microfluídica sin vector SQZ se emplea para la administración intracelular de factores de transcripción (TF) y/u otras moléculas capaces de alterar transitoriamente la expresión de proteínas. Estos métodos demuestran la capacidad de suministrar proteínas, incluidos factores de transcripción, a una variedad de células humanas primarias, incluidas las células T (Sharei et al., PNAS 2013, así como Sharei et al., PLOS ONE 2015 y Greisbeck et al., J. Immunology, vol. 195, 2015) se han descrito; véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales de Patentes WO 2013/059343A1, WO 2017/008063A1, y WO 2017/123663A1. Métodos como los descritos en las Publicaciones de Patentes Internacionales WO 2013/059343A1, WO 2017/008063A1, y WO 2017/123663A1 se pueden emplear con la presente invención para exponer una población de los TIL a factores de transcripción (TF) y/o otras moléculas capaces de inducir la expresión transitoria de proteínas, en donde dichos TF y/u otras moléculas capaces de inducir la expresión transitoria de proteínas proporcionan una mayor expresión de antígenos tumorales y/o un aumento en el número de células T específicas de antígenos tumorales en la población de los TIL, dando como resultado así la reprogramación de la población de los TIL y un aumento en la eficacia terapéutica de la población de los TIL reprogramada en comparación con una población de los TIL no reprogramada. En algunas realizaciones, la reprogramación da como resultado una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la población inicial o anterior (es decir, antes de la reprogramación) de los TIL, como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) incluye, entre otros, TCF-1, NOTCH 1/2 ICD y/o MYB. En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) es TCF-1. En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) es NOTCH 1/2 ICD. En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) es MYB. En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) se administra con un cultivo de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), tal como el reemplazo de suero KNOCKOUT disponible comercialmente (Gibco/ThermoFisher), para inducir una reprogramación adicional de los TIL. En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) se administra con un cóctel de iPSC para inducir una reprogramación adicional de los TIL. En algunas realizaciones, el factor de transcripción (TF) se administra sin un cóctel de iPSC. En algunas realizaciones, la reprogramación da como resultado un aumento en el porcentaje de TSCM. En algunas realizaciones, la reprogramación da como resultado un aumento en el porcentaje de TSCM en aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 45 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 55 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 % o aproximadamente un 95 % de TSCM.
En algunas realizaciones, un método de alteración transitoria de la expresión de proteínas, como se describió anteriormente, puede combinarse con un método de modificación genética de una población de los TIL que incluye la etapa de incorporación estable de genes para la producción de una o más proteínas. En ciertas realizaciones, el método comprende una etapa de modificación genética de una población de los TIL. En ciertas realizaciones, el método comprende modificar genéticamente la primera población de los TIL, la segunda población de los TIL y/o la tercera población de los TIL. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de los TIL incluye la etapa de transducción retroviral. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de los TIL incluye la etapa de transducción lentiviral. Los sistemas de transducción lentiviral son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Levine, et al., Proc. Nat'l. Sci. 2006.103, 17372-77; Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75; Dull et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71, y la patente de los Estados Unidos No. 6,627,442. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de los TIL incluye la etapa de transducción gamma-retroviral. Los sistemas de transducción gamma-retroviral son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Cepko y Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de los TIL incluye la etapa de transferencia de genes mediada por transposones. Los sistemas de transferencia de genes mediados por transposones son conocidos en la técnica e incluyen sistemas en los que la transposasa se proporciona como un vector de expresión de ADN o como un ARN expresable o una proteína de modo que la expresión a largo plazo de la transposasa no ocurre en las células transgénicas, por ejemplo, una transposasa proporcionada como un ARNm (por ejemplo, un ARNm que comprende una tapa y una cola de poli-A). En la presente memoria se describen sistemas de transferencia de genes mediados por transposones adecuados, incluida la transposasa tipo Tel de tipo salmónido (SB o transposasa Sleeping Beauty), tal como SB10, SB11 y SB100x, y enzimas diseñadas con mayor actividad enzimática. por ejemplo, Hackett, et al., Mol. Therapy 2010, 18, 674-83 y la patente de los Estados Unidos No. 6,489,458.
En algunas realizaciones, la alteración transitoria de la expresión de proteínas es una reducción en la expresión inducida por la interferencia de ARN autoadministrada (ARNaa), que es un dúplex de ARNip asimétrico sintetizado químicamente con un alto porcentaje de sustituciones de 2'-OH (normalmente flúor o -OCH3) que comprende una cadena antisentido (guía) de 20 nucleótidos y una cadena sentido (pasajera) de 13 a 15 bases conjugada con colesterol en su extremo 3' utilizando un conector de tetraetilenglicol (TEG). En algunas realizaciones, el método comprende la alteración transitoria de la expresión de proteínas en una población de los TIL, que comprende el uso de interferencia de ARN autoadministrada (ARNaa), que es un dúplex de ARNip asimétrico sintetizado químicamente con un alto porcentaje de sustituciones de 2'-OH (normalmente flúor o -OCH3) que comprende una cadena antisentido (guía) de 20 nucleótidos y una cadena sentido (pasajera) de 13 a 15 bases conjugada con colesterol en su extremo 3' utilizando un conector de tetraetilenglicol (TEG). Se han descrito métodos de uso de ARNaa en Khvorova y Watts, Nat. Biotechnol. 2017, 35, 238-248; Byrne et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2013, 29, 855-864; y Ligtenberg et al., Mol. Therapy, 2018, en prensa. En una realización, la administración de ARNaa a una población de los TIL se logra sin el uso de electroporación, SQZ u otros métodos, en su lugar se utiliza un período de 1 a 3 días en donde una población de los TIL se expone a ARNaa a una concentración de 1 pM/10,000 TIL en un medio. En ciertas realizaciones, el método comprende la administración de ARNaa a una población de los TIL, lo que comprende exponer la población de los TIL a ARNaa a una concentración de 1 pM/10,000 TIL en un medio durante un período de entre 1 y 3 días. En una realización, la administración de ARNaa a una población de los TIL se logra utilizando un período de 1 a 3 días en donde una población de los TIL se expone a ARNaa a una concentración de 10 pM/10,000 TIL en un medio. En una realización, la administración de ARNaa a una población de los TIL se logra utilizando un período de 1 a 3 días en donde una población de los TIL se expone a ARNaa a una concentración de 50|jM/10,000 TIL en un medio. En una realización, la administración de ARNaa a una población de los TIL se logra utilizando un período de 1 a 3 días en donde una población de los TIL está expuesta a ARNaa a una concentración de entre 0.1 pM/10,000 TIL y 50 pM/10,000 TIL en un medio. En una realización, la administración de ARNaa a una población de los TIL se logra utilizando un período de 1 a 3 días en donde una población de los TIL se expone a ARNaa a una concentración de entre 0.1 pM/10,000 TIL y 50 pM/10,000 T il en un medio, en donde la exposición a ARNaa se realiza dos, tres, cuatro o cinco veces mediante la adición de ARNaa fresco al medio. Otros procesos adecuados se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. US 2011/0039914 A1, US 2013/0131141 A1, y US 2013/0131142 A1, y la patente de los Estados Unidos No. 9,080,171.
En algunas realizaciones, el ARNaa se inserta en una población de los TIL durante la fabricación. En algunas realizaciones, el ARNaa codifica ARN que interfiere con NOTCH 1/2 ICD, PD-1, CTLA-4 TIM-3, LAG-3, TIGIT, TGFp, TGFBR2, proteína quinasa A de AMPc(PKA), BAFF BR3, CISH y/o CBLB. En algunas realizaciones, la reducción en la expresión se determina en función de un porcentaje de silenciamiento de genes, por ejemplo, según se evalúa mediante citometría de flujo y/o qPCR. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 80 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 85 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 90 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, hay una reducción en la expresión de al menos aproximadamente el 99 %.
La tecnología de ARNi autoadministrable basada en la modificación química de ARNip se puede emplear con los métodos de la presente invención para administrar con éxito los ARNaa a los TIL como se describe en el presente documento. La combinación de modificaciones de la cadena principal con estructura asimétrica de ARNip y un ligando hidrofóbico (véase, por ejemplo, Ligtenberg, et al., Mol. Therapy, 2018 y el documento US20160304873) permiten que los ARNaa penetren en las células de mamíferos cultivadas sin formulaciones ni métodos adicionales mediante la simple adición al medio de cultivo, aprovechando la estabilidad de la nucleasa de los ARNaa. Esta estabilidad permite mantener niveles constantes de reducción de la actividad del gen objetivo mediada por ARNi simplemente manteniendo la concentración activa de ARNaa en el medio. Si bien no estamos limitados por la teoría, la estabilización de la estructura principal del ARNaa proporciona efectos de reducción prolongada en la expresión genética que pueden durar meses en células que no se dividen.
En algunas realizaciones, se produce una eficiencia de transfección de los TIL superior al 95 % y una reducción en la expresión del objetivo por varios ARNaa específicos. En algunas realizaciones, los ARNaa que contienen varios residuos de ribosa no modificados se reemplazaron con secuencias completamente modificadas para aumentar la potencia y/o la longevidad del efecto del ARNi. En algunas realizaciones, se mantiene una reducción en el efecto de expresión durante 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 5 días, 6 días, 7 días u 8 días o más. En algunas realizaciones, la reducción en el efecto de expresión disminuye 10 días o más después del tratamiento con ARNaa de los TIL. En algunas realizaciones, se mantiene una reducción de más del 70 % en la expresión de la expresión objetivo. En algunas realizaciones, se mantiene una reducción de más del 70 % en la expresión de la expresión objetivo de los TIL. En algunas realizaciones, una reducción en la expresión en la vía PD-1/PD-L1 permite que los TIL muestren un efecto más potentein vivo,que, en algunas realizaciones, se debe a la evitación de los efectos supresores de la vía PD-1/PD-L1. En algunas realizaciones, una reducción en la expresión de PD-1 por ARNaa da como resultado un aumento en la proliferación de los TIL.
El ARN interferente pequeño (ARNip), a veces conocido como ARN interferente corto o ARN silenciador, es una molécula de ARN bicatenario, generalmente de 19-25 pares de bases de longitud. El ARNip se utiliza en la interferencia de ARN (ARNi), donde interfiere con la expresión de genes específicos con secuencias de nucleótidos complementarias.
El ADN bicatenario (ARNbc) se puede utilizar generalmente para definir cualquier molécula que comprenda un par de cadenas complementarias de ARN, generalmente una cadena sentido (pasajera) y una cadena antisentido (guía), y puede incluir regiones salientes monocatenarias. El término ARNbc, en contraste con ARNip, generalmente se refiere a una molécula precursora que incluye la secuencia de una molécula de ARNip que se libera de la molécula de ARNbc más grande por la acción de sistemas de enzimas de escisión, incluido Dicer.
Los ARNaa (ARN autoadministrable) son una nueva clase de compuestos de ARNi modificados covalentemente que no requieren un vehículo de administración para ingresar a las células y tienen una farmacología mejorada en comparación con los ARNip tradicionales. El "ARN autoadministrable" o "ARNaa" es un híbrido antisentido interferente de ARN modificado hidrofóbicamente, que ha demostrado ser altamente eficazin vitroen células primarias ein vivotras la administración local. Se ha demostrado una captación robusta y/o silenciamiento sin toxicidad. Los ARNaa son generalmente moléculas de ácido nucleico modificadas químicamente asimétricas con regiones bicatenarias mínimas. Las moléculas de ARNaa normalmente contienen regiones monocatenarias y regiones bicatenarias, y pueden contener una variedad de modificaciones químicas dentro de las regiones monocatenarias y bicatenarias de la molécula. Además, las moléculas de ARNaa se pueden unir a un conjugado hidrófobo, como una molécula de tipo esterol convencional y avanzada, como se describe en el presente documento. Los ARNaa y los métodos asociados para fabricar dichos ARNaa también se han descrito ampliamente en, por ejemplo, los documentos US20160304873, WO2010033246, WO2017070151, WO2009102427, WO2011119887, WO2010033247A2, WO2009045457, WO2011119852. Para optimizar la estructura, la química, la posición de destino, las preferencias de secuencia y similares del ARNaa, se ha desarrollado y utilizado un algoritmo patentado para la predicción de la potencia del ARNaa (véase, por ejemplo, US 20160304873). Con base en estos análisis, las secuencias de ARNaa funcionales se han definido generalmente como aquellas que tienen una reducción de expresión de más del 70 % a una concentración de 1 j M, con una probabilidad de más del 40 %.
En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción del 70 % en la expresión del gen objetivo. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción del 75 % en la expresión del gen objetivo.
En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción del 80 % en la expresión del gen objetivo. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción del 85 % en la expresión del gen objetivo. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción del 90 % en la expresión del gen objetivo. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción del 95 % en la expresión del gen objetivo. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción del 99 % en la expresión del gen objetivo. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 0.25 j M a aproximadamente 4 j M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 0.25<j>M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 0.5<j>M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 0.75 j M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 1.0<j>M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 1.25 j M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 1.5<j>M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 1.75<j>M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 2.0 j M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 2.25<j>M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 2.5<j>M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 2.75<j>M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 3.0 j M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 3.25 j M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 3.5<j>M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 3.75<j>M. En algunas realizaciones, las secuencias de ARNaa utilizadas en la invención exhiben una reducción en la expresión del gen objetivo cuando se administran a una concentración de aproximadamente 4.0 j M.
En algunas realizaciones, los agentes oligonucleotídicos comprenden una o más modificaciones para aumentar la estabilidad y/o eficacia del agente terapéutico y para efectuar una administración eficiente del oligonucleótido a las células o tejido a tratar. Dichas modificaciones pueden incluir una modificación de 2'-O-metilo, una modificación de 2'-O-Fluro, una modificación de difosforotioato, un nucleótido modificado con 2' F, un nucleótido modificado con 2'-O-metilo y/o un nucleótido 2'desoxi. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se modifica para incluir una o más modificaciones hidrófobas que incluyen, por ejemplo, esterol, colesterol, vitamina D, naftilo, isobutilo, bencilo, indol, triptófano y/o fenilo. En una realización particular adicional, los nucleótidos modificados químicamente son una combinación de fosforotioatos, 2'-O-metilo, 2'desoxi, modificaciones hidrófobas y fosforotioatos. En algunas realizaciones, los azúcares se pueden modificar y los azúcares modificados pueden incluir, entre otros, D-ribosa, 2'-O-alquilo (incluidos 2'-O-metilo y 2'-O-etilo), es decir, 2'-alcoxi, 2'-amino, 2'-S-alquilo, 2'-halo (incluido 2'-fluoro), T-metoxietoxi, 2'-aliloxi (-OCH2CH=CH2), 2'-propargilo, 2'-propilo, etinilo, etenilo, propenilo y ciano y similares. En una realización, la fracción de azúcar puede ser una hexosa e incorporarse en un oligonucleótido como se describe (Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res. 18:4711 (1992)).
En algunas realizaciones, el oligonucleótido bicatenario de la invención es bicatenario en toda su longitud, es
decir, sin ninguna secuencia monocatenaria sobresaliente en ninguno de los extremos de la molécula, es decir,
tiene extremos romos. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico individuales pueden tener diferentes longitudes. En otras palabras, un oligonucleótido bicatenario de la invención no es bicatenario en
toda su longitud. Por ejemplo, cuando se utilizan dos moléculas de ácido nucleico separadas, una de las moléculas, por ejemplo, la primera molécula que comprende una secuencia antisentido, puede ser más larga
que la segunda molécula que se hibrida con ella (dejando una porción de la molécula monocatenaria). En algunas realizaciones, cuando se utiliza una única molécula de ácido nucleico, una porción de la molécula en
cada extremo puede permanecer monocatenaria.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido bicatenario de la invención contiene desajustes y/o bucles o protuberancias, pero es bicatenario en al menos aproximadamente el 70 % de la longitud del oligonucleótido.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido bicatenario de la invención es bicatenario en al menos aproximadamente el 80 % de la longitud del oligonucleótido. En otra realización, un oligonucleótido bicatenario
de la invención es bicatenario en al menos aproximadamente el 90 %-95 % de la longitud del oligonucleótido.
En algunas realizaciones, un oligonucleótido bicatenario de la invención es bicatenario en al menos aproximadamente el 96 %-98 % de la longitud del oligonucleótido. En algunas realizaciones, el oligonucleótido bicatenario de la invención contiene al menos o hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 desajustes.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido puede protegerse sustancialmente de las nucleasas. por ejemplo,modificando los enlaces 3' o 5' (por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N° 5,849,902 y el documento
WO 98/13526). Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden hacerse resistentes mediante la inclusión de un
"grupo bloqueador". El término "grupo bloqueador" como se utiliza en el presente documento se refiere a sustituyentes (por ejemplo, distintos de los grupos OH) que pueden unirse a oligonucleótidos o nucleomonómeros, ya sea como grupos protectores o grupos de acoplamiento para la síntesis (por ejemplo,
FITC, propilo (CH2-CH2-CH3), glicol (-O-CH2-CH2-O-), fosfato (PO32+), fosfonato de hidrógeno o fosforamidita).
Los "grupos bloqueadores" también pueden incluir "grupos bloqueadores de extremos" o "grupos bloqueadores
de exonucleasas" que protegen los extremos 5' y 3' del oligonucleótido, incluidos nucleótidos modificados y estructuras no nucleotídicas resistentes a exonucleasas.
En algunas realizaciones, al menos una parte de los polinucleótidos contiguos dentro del ARNaa están unidos
por un enlace sustituto, por ejemplo, un enlace fosforotioato.
En algunas realizaciones, la modificación química puede conducir hasta al menos un 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 mejoras en la captación celular. En algunas realizaciones, al menos uno de los residuos C o U
incluye una modificación hidrófoba. En algunas realizaciones, una pluralidad de C y U contienen una modificación hidrófoba. En algunas realizaciones, al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60
%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o al menos el 95 % del C y U pueden contener una modificación hidrófoba. En algunas realizaciones, todos los C y U contienen una modificación hidrófoba.
En algunas realizaciones, los ARNaa o sd-rxRNA exhiben una liberación endosómica mejorada de moléculas
de sd-rxRNA a través de la incorporación de aminas protonables. En algunas realizaciones, las aminas protonables se incorporan en la cadena sentido (en la parte de la molécula que se descarta después de la
carga de RISC). En algunas realizaciones, los compuestos de ARNaa de la invención comprenden un compuesto asimétrico que comprende una región dúplex (requerida para una entrada de RISC eficiente de 10
15 bases de largo) y una región monocatenaria de 4-12 nucleótidos de largo; con un dúplex de 13 nucleótidos.
En algunas realizaciones, se emplea una región monocatenaria de 6 nucleótidos. En algunas realizaciones, la
región monocatenaria del ARNaa comprende 2-12 enlaces internucleotídicos de fosforotioato (denominados modificaciones de fosforotioato). En algunas realizaciones, se emplean 6-8 enlaces internucleotídicos de fosforotioato. En algunas realizaciones, los compuestos ARNaa de la invención también incluyen un patrón de modificación química único, que proporciona estabilidad y es compatible con la entrada de RISC.
La cadena guía, por ejemplo, también puede modificarse mediante cualquier modificación química que confirme
la estabilidad sin interferir con la entrada de RISC. En algunas realizaciones, el patrón de modificación química
en la cadena guía incluye la mayoría de los nucleótidos C y U modificados en 2' F y el extremo 5' fosforilado.
En algunas realizaciones, al menos el 30 % de los nucleótidos en el ARNaa o sd-rxRNA están modificados. En
algunas realizaciones, al menos 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %,
42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56
, 72 %, 73 , 89 %, 90 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de los nucleótidos en el ARNaa o sd-rxRNA están modificados.
En algunas realizaciones, el 100 % de los nucleótidos en el ARNaa o sd-rxRNA están modificados.
En algunas realizaciones, las moléculas de ARNaa tienen regiones bicatenarias mínimas. En algunas realizaciones, la región de la molécula que es bicatenaria tiene una longitud de entre 8-15 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región de la molécula que es bicatenaria tiene una longitud de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región bicatenaria tiene una longitud de 13 nucleótidos. Puede haber una complementariedad del 100 % entre las cadenas guía y pasajera, o puede haber uno o más desajustes entre las cadenas guía y pasajera. En algunas realizaciones, en un extremo de la molécula bicatenaria, la molécula tiene extremos romos o tiene un saliente de un nucleótido. La región monocatenaria de la molécula tiene en algunas realizaciones entre 4-12 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la región monocatenaria puede tener una longitud de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región monocatenaria también puede tener menos de 4 o más de 12 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, la región monocatenaria tiene una longitud de 6 o 7 nucleótidos.
En algunas realizaciones, las moléculas de ARNaa tienen mayor estabilidad. En algunos casos, una molécula de ARNaa o sd-rxRNA modificada químicamente tiene una vida media en un medio mayor a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o más de 24 horas, incluidos cualquier valor intermedio. En algunas realizaciones, el sd-rxRNA tiene una vida media en el medio que es más larga que 12 horas.
En algunas realizaciones, el ARNaa está optimizado para una mayor potencia y/o una toxicidad reducida. En algunas realizaciones, la longitud de nucleótidos de la cadena guía y/o pasajera, y/o el número de modificaciones de fosforotioato en la cadena guía y/o pasajera, pueden en algunos aspectos influir en la potencia de la molécula de ARN, mientras que reemplazar modificaciones de 2'-fluoro (2'F) con modificaciones de 2'-O-metilo (2'OMe) puede en algunos aspectos influir en la toxicidad de la molécula. En algunas realizaciones, se predice que la reducción del contenido de 2'F de una molécula reducirá la toxicidad de la molécula. En algunas realizaciones, la cantidad de modificaciones de fosforotioato en una molécula de ARN puede influir en la captación de la molécula en una célula, por ejemplo, la eficiencia de la captación pasiva de la molécula en una célula. En algunas realizaciones, el ARNaa no tiene modificación de 2'F y aun así se caracteriza por una eficacia igual en la captación celular y la penetración tisular.
En algunas realizaciones, una cadena guía tiene aproximadamente 18-19 nucleótidos de longitud y tiene aproximadamente 2-14 modificaciones de fosfato. Por ejemplo, una cadena guía puede contener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más de 14 nucleótidos modificados con fosfato. La cadena guía puede contener una o más modificaciones que confieren mayor estabilidad sin interferir con la entrada de RISC. Los nucleótidos modificados con fosfato, como los nucleótidos modificados con fosforotioato, pueden estar en el extremo 3', en el extremo 5' o distribuidos por toda la cadena guía. En algunas realizaciones, los 10 nucleótidos del terminal 3' de la cadena guía contienen 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos modificados con fosforotioato. La cadena guía también puede contener modificaciones de 2'F y/o 2'OMe, que pueden estar ubicadas en toda la molécula. En algunas realizaciones, el nucleótido en la posición uno de la cadena guía (el nucleótido en la posición más 5' de la cadena guía) está modificado con 2'OMe y/o fosforilado. Los nucleótidos C y U dentro de la cadena guía pueden modificarse con 2'F. Por ejemplo, los nucleótidos C y U en las posiciones 2-10 de una cadena guía de 19 nt (o posiciones correspondientes en una cadena guía de una longitud diferente) pueden modificarse con 2'F. Los nucleótidos C y U dentro de la cadena guía también pueden modificarse con 2'OMe. Por ejemplo, los nucleótidos C y U en las posiciones 11-18 de una cadena guía de 19 nt (o posiciones correspondientes en una cadena guía de una longitud diferente) pueden modificarse con 2'OMe. En algunas realizaciones, el nucleótido en el extremo 3' de la cadena guía no está modificado. En ciertas realizaciones, la mayoría de C y U dentro de la cadena guía están modificados con 2'F y el extremo 5' de la cadena guía está fosforilado. En otras realizaciones, la posición 1 y los C o U en las posiciones 11-18 están modificados con 2'OMe y el extremo 5' de la cadena guía está fosforilado. En otras realizaciones, la posición 1 y los C o U en las posiciones 11-18 están modificados con 2'OMe, el extremo 5' de la cadena guía está fosforilado y los C o U en la posición 2-10 están modificados con 2'F.
La tecnología de ARNip autoadministrable proporciona un método para transfectar directamente las células con el agente de ARNi, sin necesidad de formulaciones o técnicas adicionales. La capacidad de transfectar líneas celulares difíciles de transfectar, alta actividadin vivoy la simplicidad de uso son características de las composiciones y métodos que presentan ventajas funcionales significativas sobre las técnicas tradicionales basadas en ARNip y, como tal, los métodos con ARNaa se emplean en varias realizaciones relacionadas con los métodos de reducción en la expresión del gen objetivo en los TIL de la presente invención. Los métodos con ARNiaa permiten la administración directa de compuestos sintetizados químicamente a una amplia gama de células y tejidos primarios, tantoex vivocomoin vivo.Los ARNaa descritos en algunas realizaciones de la invención están disponibles comercialmente en Advirna LLC, Worcester, MA, EE. UU.
Los ARNaa se forman como estructuras híbridas de oligonucleótidos antisentido-ARNip modificados hidrofóbicamente y se divulgan, por ejemplo, en Byrne et al., diciembre de 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10): 855-864.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos de ARNaa se pueden administrar a los TIL descritos en el presente documento mediante electroporación estéril. En ciertas realizaciones, el método comprende la electroporación estéril de una población de los TIL para administrar oligonucleótidos de ARNaa.
En algunas realizaciones, los oligonucleótidos se pueden administrar a las células en combinación con un sistema de administración transmembrana. En algunas realizaciones, este sistema de administración transmembrana comprende lípidos, vectores virales y similares. En algunas realizaciones, el agente oligonucleotídico es un agente de ARNi de autoadministración, que no requiere ningún agente de administración. En ciertas realizaciones, el método comprende el uso de un sistema de administración transmembrana para administrar oligonucleótidos de ARNaa a una población de los TIL.
Los oligonucleótidos y las composiciones de oligonucleótidos se ponen en contacto con (por ejemplo, se ponen en contacto con, también denominado en el presente documento administrado o suministrado a) y absorbido por los TIL descritos en el presente documento, incluso a través de la absorción pasiva por los TIL. El ARNaa se puede añadir a los TIL como se describe en el presente documento durante la primera expansión, por ejemplo, Figura 7 y/o Figura 85, Etapa B, después de la primera expansión, por ejemplo, durante la etapa C, antes o durante la segunda expansión, por ejemplo, antes o durante la etapa D, después de la etapa D y antes de la recolección en la etapa E, durante o después de la recolección en la etapa F, antes o durante la formulación final y/o transferencia a la bolsa de infusión en la etapa F, así como antes de cualquier etapa de criopreservación opcional en la etapa F. Además, el ARNaa se puede añadir después de la descongelación de cualquier etapa de criopreservación en la etapa F. En una realización, uno o más ARNaa que se dirigen a genes como se describe en el presente documento, incluyendo PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH y CBLB, se pueden añadir a medios de cultivo celular que comprenden TIL y otros agentes en concentraciones seleccionadas del grupo que consiste en 100 nM a 20 mM, 2 O0 nM a 10 mM, 500 nm a 1 mM, 1 pM a 100 pM y 1 pM a 100 pM. En una realización, uno o más ARNaa dirigidos a genes como se describe en el presente documento, incluidos PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH y CBLB, se pueden agregar a medios de cultivo celular que comprenden TIL y otros agentes en cantidades seleccionadas del grupo que consiste en 0.1 pM de ARNaa/10,000TIL/100 pL de medio, 0.5 pM de ARNaa/10,000 TIL/100 pL de medio, 0.75 pM de ARNaa/10,000 TIL/100 pL de medio, 1 pM de ARNaa/10,000 TIL/100 pL de medio, 1.25 pM de ARNaa/10,000 TIL/100 pL de medio, 1.5 pM de ARNaa/10,000 TIL/100 pL de medio, 2 pM de ARNaa/10,000 TIL/100 pL de medio, 5 pM de ARNaa/10,000 TIL/100 pL de medio o 10 pM de ARNaa/10,000 TIL/100 pL de medio. En una realización, uno o más ARNaa dirigidos a genes como los descritos en el presente documento, incluidos PD-1, LAG-3, TIM-3, CISH y CBLB, se pueden agregar a cultivos de los TIL durante las etapas pre-REP o REP dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días o cada siete días.
Las composiciones de oligonucleótidos de la invención, incluido el ARNaa, se pueden poner en contacto con los TIL como se describe en el presente documento durante el proceso de expansión, por ejemplo, disolviendo el ARNaa en altas concentraciones en medios de cultivo celular y dejando tiempo suficiente para que se produzca la captación pasiva. En ciertas realizaciones, el método de la presente invención comprende poner en contacto una población de los TIL con una composición de oligonucleótidos como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el método comprende disolver un oligonucleótido, p. ej., ARNaa en un medio de cultivo celular y poniendo en contacto el medio de cultivo celular con una población de los TIL. Los TIL pueden ser una primera población, una segunda población y/o una tercera población como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la administración de oligonucleótidos a las células se puede mejorar mediante métodos reconocidos en la téc
nica adecuados que incluyen fosfato de calcio, DMSO, glicerol o dextrano, electroporación o mediante transfección, por ejemplo, utilizando composiciones lipídicas catiónicas, aniónicas o neutras o liposomas utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, los documentos WO 90/14074; WO 91/16024; WO 91/17424; la patente de los Estados Unidos No. 4,897,355; Bergan et al., 1993. Nucleic Acids Research.
21: 3567).
En algunas realizaciones, se utiliza más de un ARNaa para reducir la expresión de un gen objetivo. En algunas realizaciones, se utilizan juntos uno o más de los ARNaa dirigidos a PD-1, TIM-3, CBLB,<l>AG3 y/o CISH. En algunas realizaciones, se utiliza un ARNaa de PD-1 con uno o más de TIM-3, CBLB, LAG3 y/o CISH para reducir la expresión de más de un gen objetivo. En algunas realizaciones, se utiliza un ARNaa de LAG3 en combinación con un ARNaa dirigido a CISH para reducir la expresión génica de ambos objetivos. En algunas realizaciones, los ARNaa dirigidos a uno o más de PD-1, TIM-3, CBLB, LAG3 y/o CISH descritos en el presente documento están disponibles comercialmente en Advirna LLC, Worcester, mA, EE. UU.
En algunas realizaciones, el ARNaa se dirige a un gen seleccionado del grupo que consiste en PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3) y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el ARNaa se dirige a un gen seleccionado del grupo que consiste en PD-1, LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3) y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un ARNaa se dirige a PD-1 y otro ARNaa se dirige a un gen seleccionado del grupo que consiste en LAG3, TIM3, CTLA-4, TIGIT, CISH, TGFpR2, PKA, CBLB, BAFF (BR3) y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el ARNaa se dirige a un gen seleccionado entre PD-1, LAG-3, CISH, CBLB, TIM3 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el ARNaa se dirige a un gen seleccionado entre PD-1 y uno de LAG3, CISH, CBLB, TIM3 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un ARNaa se dirige a PD-1 y un ARNaa se dirige a LAG3. En algunas realizaciones, un ARNaa se dirige a PD-1 y un ARNaa se dirige a CISH. En algunas realizaciones, un ARNaa se dirige a PD-1 y un ARNaa se dirige a CBLB. En algunas realizaciones, un ARNaa se dirige a LAG3 y otro ARNaa se dirige a CISH. En algunas realizaciones, un ARNaa se dirige a LAG3 y un ARNaa se dirige a CBLB. En algunas realizaciones, un ARNaa se dirige a CISH y otro ARNaa se dirige a CBLB. En algunas realizaciones, un ARNaa se dirige a TIM3 y un ARNaa se dirige a PD-1. En algunas realizaciones, un ARNaa se dirige a TIM3 y otro ARNaa se dirige a LAG3. En algunas realizaciones, un ARNaa se dirige a TIM3 y un ARNaa se dirige a CISH. En algunas realizaciones, un ARNaa se dirige a TIM3 y otro ARNaa se dirige a CBLB.
Como se discutió anteriormente, la presente divulgación proporciona linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que han sido modificados genéticamente a través de la edición genética para mejorar su efecto terapéutico. Las realizaciones de la presente invención abarcan la edición genética a través de la inserción de nucleótidos (ARN o ADN) en una población de los TIL tanto para la promoción de la expresión de una o más proteínas como para la inhibición de la expresión de una o más proteínas, así como combinaciones de las mismas. Las realizaciones de la presente invención también proporcionan métodos para expandir los TIL en una población terapéutica, en donde los métodos comprenden la edición de genes de los TIL. Existen varias tecnologías de edición de genes que pueden utilizarse para modificar genéticamente una población de los TIL, que son adecuadas para su uso de acuerdo con la presente invención.
En algunas realizaciones, el método comprende un método de modificación genética de una población de los TIL que incluye la etapa de incorporación estable de genes para la producción de una o más proteínas. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de los TIL incluye la etapa de transducción retroviral. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de los TIL incluye la etapa de transducción lentiviral. Los sistemas de transducción lentiviral son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Levine, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 2006, 103, 17372-77; Zufferey, et al., Nat. Biotechnol. 1997, 15, 871-75; Dull et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71, y la patente de los Estados Unidos No. 6,627,442. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de los TIL incluye la etapa de transducción gamma-retroviral. Los sistemas de transducción gamma-retroviral son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Cepko y Pear, Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de los TIL incluye la etapa de transferencia genética mediada por transposones. Los sistemas de transferencia de genes mediados por transposones son conocidos en la técnica e incluyen sistemas en los que la transposasa se proporciona como un vector de expresión de ADN o como un ARN expresable o una proteína de modo que la expresión a largo plazo de la transposasa no ocurre en las células transgénicas, por ejemplo, una transposasa proporcionada como un ARNm (por ejemplo, un ARNm que comprende una tapa y una cola de poli-A). En la presente memoria se describen sistemas de transferencia de genes mediados por transposones adecuados, incluida la transposasa tipo Tel de tipo salmónido (SB o transposasa Sleeping Beauty), tal como SB10, SB11 y SB100x, y enzimas diseñadas con mayor actividad enzimática, como se describe, por ejemplo, en Hackett, et al., Mol. Therapy 2010, 18, 674-83 y la patente de los Estados Unidos No. 6,489,458.
En una realización, el método comprende un método de modificación genética de una población de los TIL, p. ej., una primera población, una segunda población y/o una tercera población como se describe en el presente documento. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de los TIL incluye la etapa de incorporación estable de genes para la producción o inhibición (por ejemplo, silenciamiento) de una o más proteínas. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de los TIL incluye la etapa de electroporación. Los métodos de electroporación son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Tseng, Biophys. J. 1991, 60, 297-306, y la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2014/0227237 A1. Otros métodos de electroporación conocidos en la técnica, como los descritos en las patentes de los Estados Unidos No. 5,019,034; 5,128,257; 5,137,817; 5,173,158; 5,232,856; 5,273,525; 5,304,120; 5,318,514; 6,010,613 y 6,078,490. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación estéril. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación pulsada. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación pulsada que comprende las etapas de tratar los TIL con campos eléctricos pulsados para alterar, manipular o provocar cambios definidos y controlados, permanentes o temporales en los TIL, que comprende la etapa de aplicar una secuencia de igual o aproximadamente tres pulsos eléctricos de CC individuales, controlados por el operador y programados independientemente, que tienen intensidades de campo iguales o mayores que 100 V/cm, a los TIL, en donde la secuencia de igual o aproximadamente tres pulsos eléctricos de c C tiene una, dos o tres de las siguientes características: (1) al menos dos de los al menos tres pulsos difieren entre sí en la amplitud del pulso; (2) al menos dos de los al menos tres pulsos difieren entre sí en el ancho del pulso; y (3) un primer intervalo de pulso para un primer conjunto de dos de los al menos tres pulsos es diferente de un segundo intervalo de pulso para un segundo conjunto de dos de los al menos tres pulsos. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación pulsada que comprende las etapas de tratar los TIL con campos eléctricos pulsados para alterar, manipular o provocar cambios definidos y controlados, permanentes o temporales en los TIL, que comprende la etapa de aplicar una secuencia de igual o aproximadamente tres pulsos eléctricos de CC individuales, controlados por el operador y programados independientemente, que tienen intensidades de campo iguales o mayores que 100 V/cm, a los TIL, en donde al menos dos de los al menos tres pulsos difieren entre sí en la amplitud del pulso. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación pulsada que comprende las etapas de tratar los TIL con campos eléctricos pulsados para alterar, manipular o provocar cambios definidos y controlados, permanentes o temporales en los TIL, que comprende la etapa de aplicar una secuencia de igual o aproximadamente tres pulsos eléctricos de CC individuales, controlados por el operador y programados independientemente, que tienen intensidades de campo iguales o mayores que 100 V/cm, a los TIL, en donde al menos dos de los al menos tres pulsos difieren entre sí en el ancho de pulso. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación pulsada que comprende las etapas de tratar los TIL con campos eléctricos pulsados para alterar, manipular o provocar cambios definidos y controlados, permanentes o temporales en los TIL, que comprende la etapa de aplicar una secuencia de igual o aproximadamente tres pulsos eléctricos de CC individuales, controlados por el operador y programados independientemente, que tienen intensidades de campo iguales o mayores que 100 V/cm, a los t Il , en donde un primer intervalo de pulso para un primer conjunto de dos de los al menos tres pulsos es diferente de un segundo intervalo de pulso para un segundo conjunto de dos de los al menos tres pulsos. En una realización, el método de electroporación es un método de electroporación pulsada que comprende las etapas de tratar los TIL con campos eléctricos pulsados para inducir la formación de poros en los TIL, que comprende la etapa de aplicar una secuencia de igual o aproximadamente tres pulsos eléctricos de CC, que tienen intensidades de campo iguales o mayores que 100 V/cm, a los TIL, en donde la secuencia de igual o aproximadamente tres pulsos eléctricos de CC tiene una, dos o tres de las siguientes características: (1) al menos dos de los al menos tres pulsos difieren entre sí en la amplitud del pulso; (2) al menos dos de los al menos tres pulsos difieren entre sí en el ancho del pulso; y (3) un primer intervalo de pulso para un primer conjunto de dos de los al menos tres pulsos es diferente de un segundo intervalo de pulso para un segundo conjunto de dos de los al menos tres pulsos, de modo que los poros inducidos se mantienen durante un período de tiempo relativamente largo, y de modo que se mantiene la viabilidad de los TIL. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de los TIL incluye la etapa de transfección con fosfato de calcio. Los métodos de transfección con fosfato de calcio (precipitación de ADN con fosfato de calcio, recubrimiento de la superficie celular y endocitosis) son conocidos en la técnica y se describen en Graham y van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467; Wigler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 1373-1376; y Chen y Okayarea, Mol. Cell. Biol. 1987, 7, 2745-2752; y en la patente de los Estados Unidos No. 5,593,875. En una realización, un método para modificar genéticamente una población de los TIL incluye la etapa de transfección liposomal. Métodos de transfección liposomal, como los métodos que emplean una formulación de liposomas 1:1 (p/p) del lípido catiónico cloruro de A/-[1-(2.3-dioleiloxi)propil]-n,n,n-trimetilamonio (DOTMA) y dioleoil fosfotidiletanolamina (DOPE) en agua filtrada, son conocidos en la técnica y se describen en Rose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525 y Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 1987, 84, 7413-7417 y en las patentes de los Estados Unidos No. 5,279,833; 5,908,635; 6,056,938; 6,110,490; 6,534,484; y 7,687,070, En una realización, un método para modificar genéticamente una población de los TIL incluye la etapa de transfección utilizando métodos divulgados en las patentes de los Estados Unidos No. 5,766,902; 6,025,337; 6,410,517; 6,475,994; y 7,189,705. Los TIL pueden ser una primera población, una segunda población y/o una tercera población de los TIL como se divulga en el presente documento.
De acuerdo con una realización, el proceso de edición genética puede comprender el uso de una nucleasa programable que media la generación de una rotura de cadena doble o de cadena simple en uno o más genes de punto de control inmunológico. Estas nucleasas programables permiten una edición precisa del genoma al introducir rupturas en loci genómicos específicos, es decir, se basan en el reconocimiento de una secuencia de ADN específica dentro del genoma para dirigirse a un dominio de nucleasa en esta ubicación y mediar la generación de una ruptura de doble cadena en la secuencia objetivo. Una rotura de doble cadena en el ADN posteriormente recluta maquinaria de reparación endógena al sitio de la rotura para mediar en la edición del genoma mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o reparación dirigida por homología (HDR). Por lo tanto, la reparación de la rotura puede dar lugar a la introducción de mutaciones de inserción/eliminación que alteran (por ejemplo, silencian, reprimen o mejoran) el producto del gen objetivo.
Las principales clases de nucleasas que se han desarrollado para permitir la edición genómica en sitios específicos incluyen las nucleasas de dedo de zinc (ZFN), las nucleasas similares a activadores de la transcripción (TALEN) y las nucleasas asociadas a CRISPR (por ejemplo, CRISPR/Cas9). Estos sistemas de nucleasas se pueden clasificar en dos categorías de acuerdo con su modo de reconocimiento del ADN: las ZFN y las TALEN logran una unión específica al ADN a través de interacciones proteína-ADN, mientras que los sistemas CRISPR, tal como Cas9, se dirigen a secuencias de ADN específicas mediante una molécula guía de ARN corta que se aparea directamente con el ADN objetivo y mediante interacciones proteína-ADN. Véase, por ejemplo, Cox et al., Nature Medicine, 2015, vol. 21, No. 2.
Los ejemplos no limitantes de métodos de edición genética que pueden usarse de acuerdo con los métodos de expansión de los TIL de la presente invención incluyen métodos CRISPR, métodos TALE y métodos ZFN, que se describen con más detalle a continuación. De acuerdo con una realización, un método para expandir los TIL en una población terapéutica se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier realización de los métodos descritos en el presente documento (por ejemplo, proceso GEN 3) o como se describe en los documentos PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605, o PCT/US2018/012633, en donde el método comprende además la edición genética de igual o aproximadamente una parte de los TIL mediante uno o más de un método CRISPR, un método TALE o un método ZFN, para generar TIL que puedan proporcionar un efecto terapéutico mejorado. De acuerdo con una realización, los TIL editados genéticamente se pueden evaluar para determinar un efecto terapéutico mejorado comparándolos con los TIL no modificadosin vitro,por ejemplo, mediante la evaluaciónin vitrode la función efectora, perfiles de citocinas, etc. en comparación con los TIL no modificados. En ciertas realizaciones, el método comprende la edición genética de una población de los TIL utilizando los métodos CRISPR, TALE y/o ZFN.
En algunas realizaciones de la presente invención, se utiliza la electroporación para la administración de un sistema de edición genética, como los sistemas CRISPR, TALEN y ZFN. En algunas realizaciones de la presente invención, el sistema de electroporación es un sistema de electroporación de flujo. Un ejemplo de un sistema de electroporación de flujo adecuado para su uso con algunas realizaciones de la presente invención es el sistema MaxCyte STX disponible comercialmente. Hay varios instrumentos de electroporación alternativos disponibles comercialmente que pueden ser adecuados para su uso con la presente invención, tales como el sistema AgilePulse o ECM 830 disponible en BTX-Harvard Apparatus, Cellaxess Elektra (Cellectricon), Nucleofector (Lonza/Amaxa), GenePulser MXcell (BIORAD), iPorator-96 (Primax) o siPORTer96 (Ambion). En algunas realizaciones de la presente invención, el sistema de electroporación forma un sistema cerrado y estéril con el resto del método de expansión de los TIL. En algunas realizaciones de la presente invención, el sistema de electroporación es un sistema de electroporación pulsada como se describe en el presente documento, y forma un sistema cerrado y estéril con el resto del método de expansión de los TIL.
Un método para expandir los TIL en una población terapéutica se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier realización de los métodos descritos en el presente documento (por ejemplo, proceso GEN 3) o como se describe en los documentos PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605, o PCT/US2018/012633, en donde el método comprende además la edición genética de igual o aproximadamente una parte de los TIL mediante un método CRISPR (por ejemplo, CRISPR/Cas9 o CRISPR/Cpf1). De acuerdo con realizaciones particulares, el uso de un método CRISPR durante el proceso de expansión de los TIL hace que la expresión de uno o más genes de puntos de control inmunológico se silencie o reduzca en al menos una parte de la población terapéutica de los TIL. Como alternativa, el uso de un método CRISPR durante el proceso de expansión de los TIL hace que la expresión de uno o más genes de puntos de control inmunitario se mejore en al menos una parte de la población terapéutica de los TIL.
CRISPR significa "repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas". Un método que utiliza un sistema CRISPR para la edición genética también se denomina en el presente documento método CRISPR. Existen tres tipos de sistemas CRISPR que incorporan ARN y proteínas Cas, y que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención: Tipos I, II y III. El CRISPR tipo II (ejemplificado por Cas9) es uno de los sistemas mejor caracterizados.
La tecnología CRISPR fue adaptada de los mecanismos de defensa naturales de bacterias y arqueas (el dominio de los microorganismos unicelulares). Estos organismos utilizan ARN derivado de CRISPR y varias proteínas Cas, incluida Cas9, para frustrar los ataques de virus y otros cuerpos extraños cortando y destruyendo el ADN de un invasor extraño. Un CRISPR es una región especializada de ADN con dos características distintivas: la presencia de repeticiones de nucleótidos y espaciadores. Las secuencias repetidas de nucleótidos se distribuyen a lo largo de una región CRISPR con segmentos cortos de ADN extraño (espaciadores) intercalados entre las secuencias repetidas. En el sistema CRISPR/Cas tipo II, los espaciadores se integran dentro de los loci genómicos CRISPR y se transcriben y procesan en ARN CRISPR corto (ARNcr). Estos ARNcr se unen a los ARNcr transactivadores (ARNtracr) y dirigen la escisión y el silenciamiento específicos de la secuencia del ADN patógeno por las proteínas Cas. El reconocimiento del objetivo por parte de la proteína Cas9 requiere una secuencia "semilla" dentro del ARNcr y una secuencia conservada de motivo protoespaciador adyacente (PAM) que contiene un dinucleótido secuencia arriba de la región de unión del ARNcr. De este modo, el sistema CRISPR/Cas puede reorientarse para escindir prácticamente cualquier secuencia de ADN rediseñando el ARNcr. El ARNcr y el ARNtracr del sistema nativo se pueden simplificar en un único ARN guía (ARNg) de aproximadamente 100 nucleótidos para su uso en ingeniería genética. El sistema CRISPR/Cas es directamente transportable a las células humanas mediante la administración conjunta de plásmidos que expresan la endonucleasa Cas9 y los componentes ARNcr necesarios. Se pueden utilizar diferentes variantes de proteínas Cas para reducir las limitaciones de direccionamiento (por ejemplo, ortólogos de Cas9, tales como Cpf1).
Los ejemplos no limitantes de genes que pueden silenciarse o inhibirse mediante la edición genética permanente de los TIL a través de un método CRISPR incluyen PD-1, CTLA-4, LAG-3, HAVCR2 (TIM-3), Cish, TGFp, PKA, CBL-B, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 y GUCY1B3.
Los ejemplos no limitantes de genes que pueden mejorarse mediante la edición genética permanente de los TIL a través de un método CRISPR incluyen CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, IL-2, IL12, IL-15 e IL-21.
Se describen en la presente memoria ejemplos de sistemas, métodos y composiciones para alterar la expresión de una secuencia de un gen objetivo mediante un método CRISPR, y que pueden utilizarse de acuerdo con realizaciones de la presente invención en las patentes de los Estados Unidos No. 8,697,359; 8,993,233; 8,795,965; 8,771,945; 8,889,356; 8,865,406; 8,999,641; 8,945,839; 8,932,814; 8,871,445; 8,906,616; y 8,895,308. Los recursos para llevar a cabo los métodos CRISPR, como los plásmidos para expresar CRISPR/Cas9 y CRISPR/Cpf1, están disponibles comercialmente en empresas como GenScript.
En una realización, las modificaciones genéticas de poblaciones de los TIL, como se describe en el presente documento, se pueden realizar utilizando el sistema CRISPR/Cpf1 como se describe en la patente de los Estados Unidos No. US 9790490.
Un método para expandir los TIL en una población terapéutica se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier realización de los métodos descritos en el presente documento (por ejemplo, proceso 2A) o como se describe en los documentos PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605, o PCT/US2018/012633, en donde el método comprende además la edición genética de igual o aproximadamente una parte de los TIL mediante un método TALE. De acuerdo con realizaciones particulares, el uso de un método TALE durante el proceso de expansión de los TIL hace que la expresión de uno o más genes de puntos de control inmunológico se silencie o reduzca en al menos una parte de la población terapéutica de los TIL. Como alternativa, el uso de un método TALE durante el proceso de expansión de los TIL hace que la expresión de uno o más genes de puntos de control inmunitario se mejore en al menos una parte de la población terapéutica de los TIL.
TALE significa proteínas "efectoras similares a activadores de la transcripción", que incluyen las TALEN ("nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción"). Un método de utilización de un sistema TALE para la edición genética también puede denominarse en el presente documento método TALE. Los TALE son proteínas naturales del géneroXanthomonasde bacterias patógenas de plantas, y contienen dominios de unión al ADN compuestos por una serie de dominios repetidos de 33 a 35 aminoácidos, cada uno de los cuales reconoce un solo par de bases. La especificidad de TALE está determinada por dos aminoácidos hipervariables que se conocen como di-residuos variables repetidos (RVD). Las repeticiones TALE modulares están vinculadas entre sí para reconocer secuencias de ADN contiguas. Un RVD específico en el dominio de unión al ADN reconoce una base en el locus objetivo, proporcionando una característica estructural para ensamblar dominios de unión al ADN predecibles. Los dominios de unión al ADN de un TALE se fusionan al dominio catalítico de una endonucleasa FokI tipo IIS para formar una nucleasa TALE dirigible. Para inducir una mutación específica del sitio, dos brazos de TALEN individuales, separados por una región espaciadora de 14-20 pares de bases, acercan los monómeros FokI para dimerizarlos y producir una ruptura dirigida de doble cadena.
Varios estudios sistemáticos a gran escala que utilizan diversos métodos de ensamblaje han indicado que las repeticiones TALE pueden combinarse para reconocer prácticamente cualquier secuencia definida por el usuario. Las matrices TALE diseñadas a medida también están disponibles comercialmente a través de Cellectis Bioresearch (París, Francia), Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, EE. UU.) y Life Technologies (Grand Island, NY, EE. UU.). Los métodos TALE y TALEN adecuados para su uso en la presente invención se describen en las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos No. US 2011/0201118 A1; US 2013/0117869 A1; US 2013/0315884 A1; US 2015/0203871 A1 y US 2016/0120906 A1.
Los ejemplos no limitantes de genes que pueden silenciarse o inhibirse mediante la edición genética permanente de los TIL a través de un método TALE incluyen PD-1, CTLA-4, LAG-3, HAVCR2 (TIM-3), Cish, TGFp, PKA, CBL-B, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 y GUCY1B3.
Los ejemplos no limitantes de genes que pueden mejorarse mediante la edición genética permanente de los TIL a través de un método TALE incluyen CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, IL-2, IL12, IL-15 e IL-21.
Se describen ejemplos de sistemas, métodos y composiciones para alterar la expresión de una secuencia de un gen objetivo mediante un método TALE, y que pueden usarse de acuerdo con realizaciones de la presente invención en la patente de los Estados Unidos No. 8,586,526.
Un método para expandir los TIL en una población terapéutica se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier realización de los métodos descritos en el presente documento (por ejemplo,proceso GEN 3) o como se describe en los documentos PCT/US2017/058610, PCT/US2018/012605, o PCT/US2018/012633, en donde el método comprende además la edición genética de igual o aproximadamente una porción de los TIL mediante un método de dedo de zinc o nucleasa de dedo de zinc. De acuerdo con realizaciones particulares, el uso de un método de dedo de zinc durante el proceso de expansión de los TIL hace que la expresión de uno o más genes de puntos de control inmunológico se silencie o reduzca en al menos una parte de la población terapéutica de los TIL. Como alternativa, el uso de un método de dedo de zinc durante el proceso de expansión de los TIL hace que la expresión de uno o más genes de puntos de control inmunológico se mejore en al menos una parte de la población terapéutica de los TIL.
Un dedo de zinc individual contiene aproximadamente 30 aminoácidos en una configuración ppa conservada. Varios aminoácidos en la superficie de la hélice a generalmente entran en contacto con 3 pb en el surco mayor del ADN, con distintos niveles de selectividad. Los dedos de zinc tienen dos dominios proteicos. El primer dominio es el dominio de unión al ADN, que incluye factores de transcripción eucariotas y contiene el dedo de zinc. El segundo dominio es el dominio nucleasa, que incluye la enzima de restricción FokI y es responsable de la escisión catalítica del ADN.
Los dominios de unión al ADN de las ZFN individuales suelen contener entre tres y seis repeticiones de dedos de zinc individuales y cada uno puede reconocer entre 9 y 18 pares de bases. Si los dominios de dedos de zinc son específicos para su sitio objetivo previsto, entonces incluso un par de ZFN de 3 dedos que reconocen un total de 18 pares de bases pueden, en teoría, apuntar a un solo locus en el genoma de un mamífero. Un método para generar nuevas matrices de dedos de zinc es combinar "módulos" de dedos de zinc más pequeños de especificidad conocida. El proceso de ensamblaje modular más común implica la combinación de tres dedos de zinc separados que pueden reconocer cada uno una secuencia de ADN de 3 pares de bases para generar una matriz de 3 dedos que puede reconocer un sitio objetivo de 9 pares de bases. Como alternativa, se pueden utilizar enfoques basados en la selección, como la ingeniería de agrupaciones oligomerizadas (OPEN), para seleccionar nuevas matrices de dedos de zinc a partir de bibliotecas aleatorias que tienen en cuenta las interacciones dependientes del contexto entre dedos vecinos. Los dedos de zinc diseñados están disponibles comercialmente; Sangamo Biosciences (Richmond, CA, EE. UU.) ha desarrollado una plataforma patentada (CompoZr®) para la construcción de dedos de zinc en colaboración con Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).
Los ejemplos no limitantes de genes que pueden silenciarse o inhibirse mediante la edición genética permanente de los TIL a través de un método de dedo de zinc incluyen PD-1, CTLA-4, LAG-3, HAVCR2 (TIM-3), Cish, TGFp, PKA, CBL-B, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 y GUCY1B3.
Los ejemplos no limitantes de genes que pueden mejorarse mediante la edición genética permanente de los TIL a través de un método de dedo de zinc incluyen CCR2, CCR4, CCR5, CXCR2, CXCR3, CX3CR1, IL-2, IL12, IL-15 e IL-21.
Se describen ejemplos de sistemas, métodos y composiciones para alterar la expresión de una secuencia de un gen objetivo mediante un método de dedo de zinc, que se pueden utilizar de acuerdo con realizaciones de la presente invención, en las patentes de los Estados Unidos No. 6,534,261, 6,607,882, 6,746,838, 6,794,136, 6,824,978, 6,866,997, 6,933,113, 6,979,539, 7,013,219, 7,030,215, 7,220,719, 7,241,573, 7,241,574, 7,585,849, 7,595,376, 6,903,185, y 6,479,626,
Otros ejemplos de sistemas, métodos y composiciones para alterar la expresión de una secuencia de un gen objetivo mediante un método de dedo de zinc, que pueden usarse de acuerdo con realizaciones de la presente invención, se describen en Beane, et al., Mol. Therapy, 2015, 23 1380-1390.
En algunas realizaciones, los TIL se modifican genéticamente de manera opcional para incluir funcionalidades adicionales, que incluyen, entre otras, un receptor de células T de alta afinidad (TCR), por ejemplo, un TCR dirigido a un antígeno asociado a un tumor, tal como MAGE-1, HER2 o NY-ESO-1, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a una molécula de superficie celular asociada a un tumor (por ejemplo,mesotelina) o molécula de superficie celular restringida por linaje (por ejemplo, CD19). En ciertas realizaciones, el método comprende la modificar genéticamente una población de los TIL para incluir un receptor de células T de alta afinidad (TCR), por ejemplo, un TCR dirigido a un antígeno asociado a un tumor, tal como MAGE-1, HER2 o NY-ESO-1, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a una molécula de superficie celular asociada a un tumor (por ejemplo, mesotelina) o molécula de superficie celular restringida por linaje (por ejemplo, CD19). Apropiadamente, la población de los TIL puede ser una primera población, una segunda población y/o una tercera población como se describe en el presente documento.
XI. Sistemas cerrados para la fabricación de los TIL
La presente invención prevé el uso de sistemas cerrados durante el proceso de cultivo de los TIL, por ejemplo, junto con los procesos Gen 2 o Gen 3. Estos sistemas cerrados permiten prevenir y/o reducir la contaminación microbiana, permiten utilizar menos matraces y permiten reducir costes. En algunas realizaciones, el sistema cerrado utiliza dos recipientes.
Estos sistemas cerrados son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm y https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceCompliance RegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm.
Los dispositivos de conexión estériles (STCD) producen soldaduras estériles entre dos piezas de tubos compatibles. Este procedimiento permite la conexión estéril de una variedad de recipientes y diámetros de tubos. En algunas realizaciones, los sistemas cerrados incluyen sistemas de cierre luer y sellados térmicamente como se describe. En algunas realizaciones, se accede al sistema cerrado a través de jeringas en condiciones estériles para mantener la esterilidad y la naturaleza cerrada del sistema. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado como el descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, los TIL se formulan en un recipiente de formulación de producto final de acuerdo con el método descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, el sistema cerrado utiliza un recipiente desde el momento en que se obtienen los fragmentos del tumor hasta que los TIL están listos para su administración al paciente o su criopreservación. En algunas realizaciones, cuando se utilizan dos recipientes, el primer recipiente es un recipiente G cerrado y la población de los TIL se centrifuga y se transfiere a una bolsa de infusión sin abrir el primer recipiente G cerrado. En algunas realizaciones, cuando se utilizan dos recipientes, la bolsa de infusión es una bolsa de infusión que contiene HypoThermosol. Un sistema cerrado o sistema cerrado de cultivo de células de TIL se caracteriza porque una vez agregada la muestra tumoral y/o los fragmentos de tumor, el sistema se sella herméticamente desde el exterior para formar un ambiente cerrado libre de la invasión de bacterias, hongos y/o cualquier otra contaminación microbiana.
En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana está entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 100 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana está entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana está entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 90 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana está entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 90 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana está entre aproximadamente el 15 % y aproximadamente el 85 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana es de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o aproximadamente 100 %.
El sistema cerrado permite el crecimiento de los TIL en ausencia y/o con una reducción significativa de la contaminación microbiana.
Además, el pH, la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de oxígeno del entorno de cultivo de células de TIL varían a medida que se cultivan las células. Por consiguiente, aunque circule un medio apropiado para el cultivo celular, el entorno cerrado debe mantenerse constantemente como un entorno óptimo para la proliferación de los TIL. Para este fin, es deseable que los factores físicos de pH, presión parcial de dióxido de carbono y presión parcial de oxígeno dentro del líquido de cultivo del ambiente cerrado sean monitoreados por medio de un sensor, cuya señal se utiliza para controlar un intercambiador de gases instalado a la entrada del ambiente de cultivo, y que la presión parcial de gas del ambiente cerrado sea ajustada en tiempo real de acuerdo con los cambios en el líquido de cultivo para optimizar el ambiente de cultivo celular. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un sistema de cultivo celular cerrado que incorpora en la entrada del entorno cerrado un intercambiador de gases equipado con un dispositivo de monitoreo que mide el pH, la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de oxígeno del entorno cerrado, y optimiza el entorno de cultivo celular ajustando automáticamente las concentraciones de gas en función de las señales del dispositivo de monitoreo.
En algunas realizaciones, la presión dentro del entorno cerrado se controla de forma continua o intermitente. Es decir, la presión en el entorno cerrado se puede variar mediante un dispositivo de mantenimiento de presión, por ejemplo, garantizando así que el espacio sea adecuado para el crecimiento de los TIL en un estado de presión positiva, o promoviendo la exudación de fluido en un estado de presión negativa y promoviendo así la proliferación celular. Además, aplicando presión negativa de forma intermitente, es posible reemplazar de manera uniforme y eficiente el líquido circulante en el entorno cerrado mediante una contracción temporal del volumen del entorno cerrado.
En algunas realizaciones, se pueden sustituir o agregar componentes de cultivo óptimos para la proliferación de los TIL, e incluso se pueden agregar factores como IL-2 y/u OKT3, así como también combinaciones.
XII. Criopreservación opcional de los TIL
La población de los TIL a granel (por ejemplo, la segunda población de los TIL) o la población expandida de los TIL (por ejemplo, la tercera población de los TIL) preparada mediante procesos Gen 2 o Gen 3 se pueden criopreservar de manera opcional. En algunas realizaciones, la criopreservación se produce en la población terapéutica de los TIL. En algunas realizaciones, la criopreservación se produce en los TIL recolectados después de la segunda expansión. En algunas realizaciones, la criopreservación se produce en los TIL en la etapa F ejemplar de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, los TIL se criopreservan en la bolsa de infusión. En algunas realizaciones, los TIL se criopreservan antes de colocarlos en una bolsa de infusión. En algunas realizaciones, los TIL se criopreservan y no se colocan en una bolsa de infusión. En algunas realizaciones, la criopreservación se realiza utilizando un medio de criopreservación. En algunas realizaciones, el medio de criopreservación contiene dimetilsulfóxido (DMSO). Esto generalmente se logra colocando la población de los TIL en una solución de congelación, p. ej., 85 % de suero AB inactivado con complemento y 15 % de dimetilsulfóxido (DMSO). Las células en solución se colocan en viales criogénicos y se almacenan durante 24 horas a -80 °C, con transferencia opcional a congeladores de nitrógeno gaseoso para su criopreservación. Véase, Sadeghi, et al., Acta Oncológica 2013, 52, 978-986.
Cuando sea apropiado, las células se retiran del congelador y se descongelan en un baño de agua a 37 °C hasta que aproximadamente 4/5 de la solución se haya descongelado. Las células generalmente se resuspenden en medios completos y opcionalmente se lavan una o más veces. En algunas realizaciones, los TIL descongelados se pueden contar y evaluar para determinar su viabilidad como se conoce en la técnica.
En una realización preferida, una población de los TIL se criopreserva utilizando medio de criopreservación CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions). En una realización preferida, una población de los TIL se criopreserva utilizando un medio de criopreservación que contiene dimetilsulfóxido (DMSO). En una realización preferida, una población de los TIL se criopreserva utilizando una proporción 1:1 (vol:vol) de CS10 y medio de cultivo celular. En una realización preferida, una población de los TIL se criopreserva utilizando una proporción de aproximadamente 1:1 (vol:vol) de CS10 y medio de cultivo celular, que comprende además IL-2 adicional.
Como discutido anteriormente y ejemplificó en las Etapas A a E como se proporciona en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), la criopreservación puede ocurrir en numerosos puntos a lo largo del proceso de expansión de los TIL. En algunas realizaciones, la población expandida de los TIL después de la segunda expansión (como se proporciona, por ejemplo, de acuerdo con la etapa D de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, La Figura 85B)) se puede criopreservar. La criopreservación generalmente se puede lograr colocando la población de los TIL en una solución de congelación, por ejemplo, 85 % de suero A<b>inactivado con complemento y 15 % de dimetilsulfóxido (DMSO). Las células en solución se colocan en viales criogénicos y se almacenan durante 24 horas a -80 °C, con transferencia opcional a congeladores de nitrógeno gaseoso para su criopreservación. Véase Sadeghi, et al., Acta Oncológica 2013, 52, 978-986. En algunas realizaciones, los TIL se criopreservan en DMSO al 5 %. En algunas realizaciones, los TIL se criopreservan en medios de cultivo celular más DMSO al 5 %. En algunas realizaciones, los TIL se criopreservan de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento.
Cuando sea apropiado, las células se retiran del congelador y se descongelan en un baño de agua a 37 °C hasta que aproximadamente 4/5 de la solución se haya descongelado. Las células generalmente se resuspenden en medios completos y opcionalmente se lavan una o más veces. En algunas realizaciones, los TIL descongelados se pueden contar y evaluar para determinar su viabilidad como se conoce en la técnica.
En algunos casos, la población de TIL de la etapa B se puede criopreservar inmediatamente, utilizando los protocolos que se analizan a continuación. Como alternativa, la población de los TIL a granel puede someterse a la Etapa C y a la Etapa D y luego criopreservarse después de la etapa D. De manera similar, en el caso en que se utilizaran TIL modificados genéticamente en terapia, las poblaciones de los TIL de la etapa B o de la etapa D pueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados.
XIII. Características fenotípicas de los TIL expandidos
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que los TIL se analizan para determinar la expresión de numerosos marcadores fenotípicos después de la expansión, incluidos los descritos en el presente documento y en los Ejemplos. Se puede examinar la expresión de uno o más marcadores fenotípicos. Las características fenotípicas de los TIL se pueden analizar después de la primera expansión en la etapa B. Las características fenotípicas de los TIL se pueden analizar durante la transición en la etapa C. Las características fenotípicas de los TIL se pueden analizar durante la transición de acuerdo con la etapa C y después de la criopreservación. Las características fenotípicas de los TIL pueden analizarse después de la segunda expansión de acuerdo con la etapa D. Las características fenotípicas de los TIL pueden analizarse después de dos o más expansiones de acuerdo con la etapa D.
El marcador puede seleccionarse del grupo que consiste en CD8 y CD28. Se puede examinar la expresión de CD8. Se puede examinar la expresión de<c>D28. La expresión de CD8 y/o<c>D28 puede ser mayor en los TIL producidos de acuerdo con el proceso de la presente invención, en comparación con otros procesos (por ejemplo, el proceso de Gen 3 como se proporciona, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), en comparación con el proceso 2A como se proporciona, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)). La expresión de CD8 puede ser mayor en los TIL producidos de acuerdo con el proceso de la presente invención, en comparación con otros procesos (por ejemplo, el proceso de Gen 3 como se proporciona, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), en comparación con el proceso 2A como se proporciona, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)). La expresión de CD28 puede ser mayor en los TIL producidos de acuerdo con el proceso de la presente invención, en comparación con otros procesos (por ejemplo, el proceso de Gen 3 como se proporciona, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), en comparación con el proceso 2A como se proporciona, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85A)). Se puede medir la expresión de uno o más marcadores reguladores.
No se puede realizar ninguna selección de la primera población de los TIL, la segunda población de los TIL, la tercera población de los TIL o la población de los TIL recolectada en función de la expresión de CD8 y/o CD28 durante ninguna de las etapas del método para expandir los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) descrito en el presente documento.
El porcentaje de células de memoria central puede ser mayor en los TIL producidos de acuerdo con el proceso de invención actual, en comparación con otros procesos (por ejemplo, el proceso de Gen 3 como se proporciona, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), en comparación con el proceso 2A como se proporciona, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85A)). El marcador de memoria para las células de memoria central puede seleccionarse del grupo que consiste en CCR7 y CD62L.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que los TIL reestimulados también pueden evaluarse para la liberación de citocinas, utilizando ensayos de liberación de citocinas. Los TIL pueden evaluarse para la secreción de interferón-Y (IFN-y). La secreción de IFN-y puede medirse mediante un ensayo ELISA. La secreción de IFN-y se puede medir mediante un ensayo ELISA después de la segunda etapa de expansión rápida, después de la etapa D como se proporciona, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). La salud de los TIL se puede medir mediante la secreción de IFN-gamma (IFN-y). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>es indicativa de los TIL activos. Se puede emplear un ensayo de potencia para la producción de IFN-y. La producción de IFN-y es otra medida del potencial citotóxico. La producción de IFN-y se puede medir determinando los niveles de la citocina IFN-y en los medios de los TIL estimulados con anticuerpos contra CD3, CD28 y CD137/4-1BB. Los niveles de IFN-<y>en los medios de estos TIL estimulados se pueden determinar midiendo la liberación de IFN-<y>. En algunas realizaciones, un aumento en la producción de IFN-y en, por ejemplo, la etapa D en el proceso de Gen 3 como se proporciona en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B) los TIL en comparación con, por ejemplo, la etapa D en el proceso 2A como se proporciona en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85A) es indicativo de un aumento en el potencial citotóxico de los TIL de la etapa D. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y aumenta una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces o más. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>aumenta una vez. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>aumenta dos veces. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y aumenta tres veces. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y aumenta cuatro veces. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>aumenta cinco veces. El IFN-<y>se puede medir utilizando un kit ELISA Quantikine. El IFN-y se puede medir en los TILex vivo.El IFN-y puede medirse en los TILex vivo,incluyendo TIL producidos por los métodos de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, los métodos de la Figura 85B.
Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos de genes. Estos segmentos de genes: V (variable), D (diversidad), J (unión) y C (constante) determinan la especificidad de unión y las aplicaciones posteriores de las inmunoglobulinas y los receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un método para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos mediante el presente método exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos mediante el presente método exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, los TIL obtenidos mediante el presente método exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando métodos denominados proceso 2A, como se ejemplifica en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85A). En algunas realizaciones, los TIL obtenidos en la primera expansión exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, el aumento en la diversidad es un aumento en la diversidad de inmunoglobulina y/o la diversidad del receptor de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina y en la cadena pesada de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina y en la cadena ligera de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionados del grupo que consiste en receptores alfa, beta, gamma y delta. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de TCRab (es decir, TCRa/p). En algunas realizaciones, el proceso como se describe en el presente documento (por ejemplo, el proceso de Gen 3) muestra una mayor diversidad clonal en comparación con otros procesos, por ejemplo, el proceso conocido como Gen 2 basado en la cantidad de CDR de péptidos únicos dentro de la muestra (véase, por ejemplo, las Figuras 12-14).
La caracterización fenotípica puede examinarse después de la criopreservación.
XIV. Realización de procesos adicionales
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de los TIL que comprende: (a) obtener una primera población de los TIL a partir de uno o más fragmentos o biopsias con aguja gruesa tumorales de un sujeto; (b) realizar una preparación de la primera expansión cultivando la primera población de los TIL en un medio de cultivo celular que comprende iL-2 y OKT-3, en donde la preparación de la primera expansión se realiza durante aproximadamente 1 a 17 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL es mayor en número que la primera población de los TIL; (c) realizar una segunda expansión rápida poniendo en contacto la segunda población de los TIL con un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígenos (APC) exógenas para producir una tercera población de los TIL, en donde la segunda expansión rápida se realiza durante aproximadamente 1 a 11 días para obtener la tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es una población terapéutica de los TIL; y (d) recolectar la población terapéutica de los TIL obtenida de la etapa (c). En algunas realizaciones, la etapa de segunda expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr una ampliación del cultivo mediante: (1) realizar la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de los TIL en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (2) efectuar la transferencia de la segunda población de los TIL del cultivo a pequeña escala a un segundo recipiente más grande que el primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX 500MCS, en donde en el segundo recipiente la segunda población de los TIL del cultivo a pequeña escala se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un período de aproximadamente 4 a 7 días. En algunas realizaciones, la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalamiento del cultivo mediante: (1) realizar la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de los TIL en un primer cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (2) efectuar la transferencia y distribución de la segunda población de los TIL del primer cultivo a pequeña escala hacia y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 segundos recipientes que son iguales en tamaño al primer recipiente, en donde en cada segundo recipiente la porción de la segunda población de los TIL del primer cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo recipiente se cultiva en un segundo cultivo a pequeña escala durante un período de aproximadamente 4 a 7 días. En algunas realizaciones, la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalamiento horizontal y vertical del cultivo mediante: (1) realizar la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de los TIL en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (2) efectuar la transferencia y distribución de la segunda población de los TIL del primer cultivo a pequeña escala hacia y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 segundos recipientes que son de mayor tamaño que el primer recipiente, por ejemplo, recipientes G-REX 500MCS, en donde en cada segundo recipiente la porción de la segunda población de los TIL transferida desde el cultivo a pequeña escala a dicho segundo recipiente se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un período de aproximadamente 4 a 7 días. En algunas realizaciones, la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalamiento horizontal y vertical del cultivo mediante: (1) realizar la segunda expansión rápida cultivando la segunda población de los TIL en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-RE<x>100MCS, durante un período de aproximadamente 4 días, y luego (2) efectuar la transferencia y distribución de la segunda población de los TIL del primer cultivo a pequeña escala hacia y entre 2, 3 o 4 segundos recipientes que son de mayor tamaño que el primer recipiente, por ejemplo, recipientes G-REX 500MCS, en donde en cada segundo recipiente la porción de la segunda población de los TIL transferida desde el cultivo a pequeña escala a dicho segundo recipiente se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un período de aproximadamente 5 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza poniendo en contacto la primera población de los TIL con un medio de cultivo que comprende además células presentadoras de antígeno (APC) exógenas, en donde el número de las APC en el medio de cultivo en la etapa (c) es mayor que el número de las APC en el medio de cultivo en la etapa (b).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (c) el medio de cultivo se complementa con APC exógenas adicionales.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 20:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 10:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1.1:1 hasta igual o aproximadamente 9:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1.1:1 hasta igual o aproximadamente 8:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1.1:1 hasta igual o aproximadamente 7:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1.1:1 hasta igual o aproximadamente 6:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1.1:1 hasta igual o aproximadamente 5:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1.1:1 hasta igual o aproximadamente 4:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1.1:1 hasta igual o aproximadamente 3:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.9:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.8:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.7:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.6:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.5:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.4:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.3:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.2:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2.1:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 1.1.1:1 hasta igual o aproximadamente 2:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 10:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 5:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 4:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 3:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.9:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.8:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.7:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.6:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la
segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde
igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.5:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la
segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde
igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.4:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la
segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde
igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.3:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la
segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde
igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.2:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número de las APC añadidas en la
segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) se selecciona de un intervalo desde
igual o aproximadamente 2:1 hasta igual o aproximadamente 2.1:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la
segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) sea igual o aproximadamente 2:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que la relación entre el número de las APC añadidas en la
segunda expansión rápida y el número de las APC añadidas en la etapa (b) sea igual o aproximadamente 1.1:1,
1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1,
3:1, 3.1:1, 3.2:1, 3.3:1, 3.4:1, 3.5:1, 3.6:1, 3.7:1, 3.8:1, 3.9:1, 4:1, 4.1:1, 4.2:1, 4.3:1, 4.4:1, 4.5:1, 4.6:1, 4.7:1, 4.8:1,4.9:1 o 5:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el número de las APC añadidas en la primera expansión
primaria sea igual o aproximadamente 1 * 108, 1.1 * 108, 1.2 * 108, 1.3 * 108, 1.4 * 108, 1.5 * 108, 1.6 * 108,
1.7 * 108, 1.8 * 108, 1.9 * 108, 2 * 108, 2.1 * 108, 2.2 * 108, 2.3 * 108, 2.4 * 108, 2.5 * 108, 2.6 * 108, 2.7 * 108,
2.8 * 108, 2.9 * 108, 3 * 108, 3.1 * 108, 3.2 * 108, 3.3 * 108, 3.4 * 108 o 3.5 * 108APC, y de modo que el número
de las APC añadidas en la segunda expansión rápida sea igual o aproximadamente 3.5 * 108, 3.6 * 108, 3.7 *
108, 3.8 * 108, 3.9 * 108, 4 * 108, 4.1 * 108, 4.2 * 108, 4.3 * 108, 4.4 * 108, 4.5 * 108, 4.6 * 108, 4.7 * 108, 4.8
* 108, 4.9 * 108, 5 * 108, 5.1 * 108, 5.2 * 108, 5.3 * 108, 5.4 * 108, 5.5 * 108, 5.6 * 108, 5.7 * 108, 5.8 * 108, 5.9
* 108, 6 * 108, 6.1 * 108, 6.2 * 108, 6.3 * 108, 6.4 * 108, 6.5 * 108, 6.6 * 108, 6.7 * 108, 6.8 * 108, 6.9 * 108, 7
* 108, 7.1 * 108, 7.2 * 108, 7.3 * 108, 7.4 * 108, 7.5 * 108, 7.6 * 108, 7.7 * 108, 7.8 * 108, 7.9 * 10 * 108, 8.2 * 108, 8.3 * 108, 8.4 * 108, 8.5 * 108, 8.6 * 108, 8.7 * 108, 8.8 * 108, 8.9 * 108, 9 * 108, * 108, 9.3 * 108, 9.4 * 108, 9.5 * 108, 9.6 * 108, 9.7 * 108, 9.8 * 108, 9.9 * 108 o 1 * 109 APC.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el número de las APC añadidas en la primera expansión
primaria se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1 * 108 APC hasta igual o aproximadamente
3.5 * 108 APC, y en donde el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida se selecciona del
intervalo de igual o aproximadamente 3.5 * 108 APC hasta igual o aproximadamente 1 * 109 APC.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el número de las APC añadidas en la primera expansión
primaria se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1.5 * 108APC hasta igual o aproximadamente
3 * 108 APC, y en donde el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida se selecciona del
intervalo de igual o aproximadamente 4 * 108 APC hasta igual o aproximadamente 7.5 * 108 APC.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el número de las APC añadidas en la primera expansión
primaria se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 2 * 108 APC hasta igual o aproximadamente
2.5 * 108 APC y en donde el número de las APC añadidas en la segunda expansión rápida se selecciona del
intervalo de igual o aproximadamente 4.5 * 108 APC hasta igual o aproximadamente 5.5 * 108 APC.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que igual o aproximadamente 2.5 * 108 APC se agregan a la primera expansión primaria y se agregan igual o aproximadamente 5 * 108 APC a la segunda expansión rápida.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las células presentadoras de antígeno sean células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que los múltiples fragmentos de tumor se distribuyen en una pluralidad de recipientes separados, en cada uno de los cuales recipientes separados se obtiene la primera población de los TIL en la etapa (a), la segunda población de los TIL se obtiene en la etapa (b), y la tercera población de los TIL se obtiene en la etapa (c), y las poblaciones terapéuticas de los TIL de la pluralidad de recipientes en la etapa (c) se combinan para producir la población de los TIL recolectada de la etapa (d).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la primera población de los TIL se obtiene a partir de múltiples fragmentos o biopsias con aguja gruesa de tumor del sujeto en la etapa (a).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que los múltiples tumores se distribuyan uniformemente en la pluralidad de recipientes separados.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que la pluralidad de recipientes separados comprende al menos dos recipientes separados.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que la pluralidad de recipientes separados comprende de dos a veinte recipientes separados.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que la pluralidad de recipientes separados comprende de dos a quince recipientes separados.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que la pluralidad de recipientes separados comprende de dos a diez recipientes separados.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que la pluralidad de recipientes separados comprende de dos a cinco recipientes separados.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que la pluralidad de recipientes separados comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 recipientes separados.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que para cada recipiente en donde se realiza la preparación de la primera expansión sobre una primera población de los TIL en la etapa (b), la segunda expansión rápida en la etapa (c) se realiza en el mismo recipiente sobre la segunda población de los TIL producida a partir de dicha primera población de los TIL.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que cada uno de los recipientes separados comprende una primera área de superficie permeable a los gases.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que los múltiples fragmentos de tumor se distribuyan en un solo recipiente.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que el recipiente único comprende una primera área de superficie permeable a los gases.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde en la etapa (b) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente una capa de células hasta igual o aproximadamente tres capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 1.5 capas de células hasta igual o aproximadamente 2.5 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 2 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 1, 1.1 , 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 o 3 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (c) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 3 capas de células hasta igual o aproximadamente 10 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (c) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 4 capas de células hasta igual o aproximadamente 8 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (c) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (c) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 4, 4.1, 4.2, 4.3 , 4.4 , 4.5 , 4.6 , 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6 , 6.1,6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6 , 6.7, 6.8 , 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 u 8 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) la preparación de la primera expansión se realiza en un primer recipiente que comprende una primera área de superficie permeable a los gases y en la etapa (c) la segunda expansión rápida se realiza en un segundo recipiente que comprende una segunda área de superficie permeable a los gases.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que el segundo recipiente sea más grande que el primer recipiente.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la preparación de la primera expansión se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde en la etapa (b) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente una capa de células hasta igual o aproximadamente tres capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 1.5 capas de células hasta igual o aproximadamente 2.5 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 2 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 o 3 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (c) las APC se colocan en capas sobre la segunda área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 3 capas de células hasta igual o aproximadamente 10 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (c) las APC se colocan en capas sobre la segunda área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 4 capas de células hasta igual o aproximadamente 8 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (c) las APC se colocan en capas sobre la segunda área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (c) las APC se colocan en capas sobre la segunda área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 u 8 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la preparación de la primera expansión se realiza en un primer recipiente que comprende una primera área de superficie permeable a los gases y en la etapa (c) la segunda expansión rápida se realiza en el primer recipiente.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde en la etapa (b) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente una capa de células hasta igual o aproximadamente tres capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 1.5 capas de células hasta igual o aproximadamente 2.5 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 2 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 o 3 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (c) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 3 capas de células hasta igual o aproximadamente 10 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (c) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 4 capas de células hasta igual o aproximadamente 8 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (c) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (c) las APC se colocan en capas sobre la primera área de superficie permeable a los gases con un espesor promedio de igual o aproximadamente 4, 4.1, 4.2, 4.3 , 4.4 , 4.5 , 4.6 , 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6 , 6.1,6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6 , 6.7, 6.8 , 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 u 8 capas de células.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1 :1.1 hasta igual o aproximadamente 1 :10.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:9.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1 :1.1 hasta igual o aproximadamente 1 :8.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:7.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1 :1.1 hasta igual o aproximadamente 1 :6.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:5.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:4.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:3.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.1 hasta igual o aproximadamente 1:2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.2 hasta igual o aproximadamente 1:8.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.3 hasta igual o aproximadamente 1:7.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.4 hasta igual o aproximadamente 1:6.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.5 hasta igual o aproximadamente 1:5.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.6 hasta igual o aproximadamente 1:4.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.7 hasta igual o aproximadamente 1:3.5.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.8 hasta igual o aproximadamente 1:3.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:1.9 hasta igual o aproximadamente 1:2.5.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona del intervalo de igual o aproximadamente 1:2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que en la etapa (b) la primera expansión primaria se realiza complementando el medio de cultivo celular de la primera población de los TIL con células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, en donde el número de las APC agregadas en la etapa (c) es mayor que el número de las APC agregadas en la etapa (b), y en donde la relación del número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (b) con respecto al número promedio de capas de las APC en capas en la etapa (c) se selecciona desde igual o aproximadamente 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9, 1:5, 1:5.1, 1:5.2, 1:5.3, 1:5.4, 1:5.5, 1:5.6, 1:5.7, 1:5.8, 1:5.9, 1:6, 1:6.1, 1:6.2, 1:6.3, 1:6.4, 1:6.5, 1:6.6, 1:6.7, 1:6.8, 1:6.9, 1:7, 1:7.1, 1:7.2, 1:7.3, 1:7.4, 1:7.5, 1:7.6, 1:7.7, 1:7.8, 1:7.9, 1:8, 1:8.1, 1:8.2, 1:8.3, 1:8.4, 1:8.5, 1:8.6, 1:8.7, 1:8.8, 1:8.9, 1:9, 1:9.1, 1:9.2, 1:9.3, 1:9.4, 1:9.5, 1:9.6, 1:9.7, 1:9.8, 1:9.9 o 1:10.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de los TIL en la segunda población de los TIL con respecto al número de los TIL en la primera población de los TIL sea igual o aproximadamente 1.5:1 hasta igual o aproximadamente 100:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de los TIL en la segunda población de los TIL con respecto al número de los TIL en la primera población de los TIL sea igual o aproximadamente 50:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de los TIL en la segunda población de los TIL con respecto al número de los TIL en la primera población de los TIL sea igual o aproximadamente 25:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de los TIL en la segunda población de los TIL con respecto al número de los TIL en la primera población de los TIL sea igual o aproximadamente 20:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de los TIL en la segunda población de los TIL con respecto al número de los TIL en la primera población de los TIL sea igual o aproximadamente 10:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la segunda población de los TIL está en al menos igual o aproximadamente 50 veces mayor en número que la primera población de los TIL.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la segunda población de los TIL está en al menos igual o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 veces mayor en número que la primera población de los TIL.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que sea igual o aproximadamente 2 días o igual o aproximadamente 3 días después del comienzo del segundo período en la etapa (c), el medio de cultivo celular se complementa con IL-2 adicional.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado para comprender además la etapa de criopreservar la población de los TIL recolectada en la etapa (d) utilizando un proceso de criopreservación.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado para comprender realizar después de la etapa (d) la etapa adicional de (e) transferir la población de los TIL recolectada de la etapa (d) a una bolsa de infusión que opcionalmente contiene HypoThermosol.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado para comprender la etapa de criopreservar la bolsa de infusión que comprende la población de los TIL recolectada en la etapa (e) utilizando un proceso de criopreservación.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el proceso de criopreservación se realiza utilizando una relación de 1:1 de población de los TIL recolectada con respecto al medio de criopreservación.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las células presentadoras de antígeno sean células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las PBMC se irradien y sean alogénicas.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el número total de las APC agregadas al cultivo celular en la etapa (b) sea 2.5 * 108.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el número total de las APC agregadas al cultivo celular en la etapa (c) sea 5 * 108.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las APC sean PBMC.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las PBMC se irradien y sean alogénicas.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las células presentadoras de antígeno sean células presentadoras de antígeno artificiales.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la recolección en la etapa (d) se realiza utilizando un sistema de procesamiento de células basado en membrana.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la recolección en la etapa (d) se realiza utilizando un sistema de procesamiento de células LOVO.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que los fragmentos múltiples comprendan igual o aproximadamente 5 hasta igual o aproximadamente 60 o biopsias con aguja gruesa o fragmentos por recipiente en la etapa (b).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que los fragmentos múltiples comprendan igual o aproximadamente 10 hasta igual o aproximadamente 60 o biopsias con aguja gruesa o fragmentos por recipiente en la etapa (b).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que los fragmentos múltiples comprendan igual o aproximadamente 15 hasta igual o aproximadamente 60 o biopsias con aguja gruesa o fragmentos por recipiente en la etapa (b).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que los fragmentos múltiples comprendan igual o aproximadamente 20 hasta igual o aproximadamente 60 o biopsias con aguja gruesa o fragmentos por recipiente en la etapa (b).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que los fragmentos múltiples comprendan igual o aproximadamente 25 hasta igual o aproximadamente 60 o biopsias con aguja gruesa o fragmentos por recipiente en la etapa (b).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que los fragmentos múltiples comprendan igual o aproximadamente 30 hasta igual o aproximadamente 60 o biopsias con aguja gruesa o fragmentos por recipiente en la etapa (b).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que los fragmentos múltiples comprendan igual o aproximadamente 35 hasta igual o aproximadamente 60 o biopsias con aguja gruesa o fragmentos por recipiente en la etapa (b).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que los fragmentos múltiples comprendan igual o aproximadamente 40 hasta igual o aproximadamente 60 o biopsias con aguja gruesa o fragmentos por recipiente en la etapa (b).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que los fragmentos múltiples comprendan igual o aproximadamente 45 hasta igual o aproximadamente 60 o biopsias con aguja gruesa o fragmentos por recipiente en la etapa (b).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que los fragmentos múltiples comprendan igual o aproximadamente 50 hasta igual o aproximadamente 60 o biopsias con aguja gruesa o fragmentos por recipiente en la etapa (b).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que las biopsias con aguja gruesa o fragmentos múltiples comprendan igual o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 biopsias con aguja gruesa o fragmento(s) por recipiente en la etapa (b).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada biopsia con aguja gruesa o fragmento tenga un volumen de igual o aproximadamente 1 mm3.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada biopsia con aguja gruesa o fragmento tenga un volumen de igual o aproximadamente 1 mm3 hasta igual o aproximadamente 10 mm3.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada fragmento de biopsia con aguja gruesa tenga un volumen de igual o aproximadamente 1 mm3 hasta igual o aproximadamente 9 mm3.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada fragmento tenga un volumen de igual o aproximadamente 1 mm3 hasta igual o aproximadamente 8 mm3.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada fragmento tenga un volumen de igual o aproximadamente 1 mm3 hasta igual o aproximadamente 7 mm3.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada fragmento tenga un volumen de igual o aproximadamente 1 mm3 hasta igual o aproximadamente 6 mm3.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada fragmento tenga un volumen de igual o aproximadamente 1 mm3 hasta igual o aproximadamente 5 mm3.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada fragmento tenga un volumen de igual o aproximadamente 1 mm3 hasta igual o aproximadamente 4 mm3.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada fragmento tenga un volumen de igual o aproximadamente 1 mm3 hasta igual o aproximadamente 3 mm3.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada fragmento tenga un volumen de igual o aproximadamente 1 mm3 hasta igual o aproximadamente 2 mm3.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada fragmento tenga un volumen de igual o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mm3.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el medio de cultivo celular se proporciona en un recipiente que es un recipiente G o una bolsa de células Xuri.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la concentración de IL-2 en el medio de cultivo celular sea de aproximadamente 10,000 UI/mL hasta aproximadamente 5,000 UI/mL.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la concentración de IL-2 en el medio de cultivo celular sea de aproximadamente 6,000 UI/mL.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el medio de criopreservación comprenda dimetilsulfóxido (DMSO).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el medio de criopreservación comprende 7 % a 10 % de DMSO.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el primer período en la etapa (b) se realiza dentro de un período de igual o aproximadamente 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el segundo período en la etapa (c) se realiza dentro de un período de igual o aproximadamente 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días u 11 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el primer período en la etapa (b) y el segundo período en la etapa (c) se realizan cada uno individualmente dentro de un período de igual o aproximadamente 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días o 12 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el primer período en la etapa (b) y el segundo período en la etapa (c) se realizan cada uno individualmente dentro de un período de igual o aproximadamente 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días o 12 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el primer período en la etapa (b) y el segundo período en la etapa (c) se realizan cada uno individualmente dentro de un período de igual o aproximadamente 7 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 14 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de aproximadamente 15 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de aproximadamente 16 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de aproximadamente 17 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de aproximadamente 18 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de aproximadamente 19 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de aproximadamente 20 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de aproximadamente 21 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de aproximadamente 22 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de aproximadamente 23 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de aproximadamente 24 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de aproximadamente 25 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 26 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 27 días hasta igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 14 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 15 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 16 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 17 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 18 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 19 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 20 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 21 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 22 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 23 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 24 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 25 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 26 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 27 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 28 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 16 días o menos.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 20 días o menos.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 24 días o menos.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las etapas (a) a (d) se realizan en un total de igual o aproximadamente 28 días o menos.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la población terapéutica de los TIL recolectada en la etapa (d) comprende suficientes TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el número de los TIL suficiente para una dosis terapéuticamente eficaz sea de igual o aproximadamente 2.3 * 1010 hasta igual o aproximadamente 13.7 * 10io.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la tercera población de los TIL en la etapa (c) proporcione una mayor eficacia, una mayor producción de interferón gamma y/o una mayor policlonalidad.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la tercera población de los TIL en la etapa (c) proporcione durante al menos una producción de interferón gamma de una a cinco veces o más en comparación con los TIL preparados mediante un proceso de más de 16 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la tercera población de los TIL en la etapa (c) exhiban una expresión aumentada de CD8 y CD28 en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células en la etapa (b).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada recipiente mencionado en el método sea un recipiente cerrado.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada recipiente mencionado en el método sea un recipiente G.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada recipiente mencionado en el método sea un GREX-10.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada recipiente mencionado en el método sea un GREX-100.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que cada recipiente mencionado en el método sea un GREX-500.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) elaborada mediante el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba.
La divulgación de la presente invención también proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) preparados a partir de tejido tumoral de un paciente, en donde la población terapéutica de los TIL proporciona una mayor eficacia, una mayor producción de interferón gamma y/o una mayor policlonalidad en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de los TIL se realiza sin ninguna célula presentadora de antígeno (APC) o OKT3 añadida.
La divulgación de la presente invención también proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) preparados a partir de tejido tumoral de un paciente, en donde la población terapéutica de los TIL proporciona una mayor eficacia, una mayor producción de interferón gamma y/o una mayor policlonalidad en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de los TIL se realiza sin ninguna célula presentadora de antígeno (APC) añadida.
La divulgación de la presente invención también proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) preparados a partir de tejido tumoral de un paciente, en donde la población terapéutica de los TIL proporciona una mayor eficacia, una mayor producción de interferón gamma y/o una mayor policlonalidad en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de los TIL se realiza sin ningún OKT3 añadido.
La divulgación de la presente invención también proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) preparados a partir de tejido tumoral de un paciente, en donde la población terapéutica de los TIL proporciona una mayor eficacia, una mayor producción de interferón gamma y/o una mayor policlonalidad en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de los TIL se realiza sin células presentadoras de antígeno (APC) añadidas y sin OKT3 añadido.
La divulgación de la presente invención también proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) preparados a partir de tejido tumoral de un paciente, en donde la población terapéutica de los TIL proporciona una mayor eficacia, una mayor producción de interferón gamma y/o una mayor policlonalidad en comparación con los TIL preparados mediante un proceso que dura más de 16 días.
La divulgación de la presente invención también proporciona la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba que proporciona una mayor producción de interferón gamma.
La divulgación de la presente invención también proporciona la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba que proporciona una mayor policlonalidad.
La divulgación de la presente invención también proporciona la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba que proporciona una mayor eficacia.
La divulgación de la presente invención también proporciona la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que la población terapéutica de los TIL sea capaz de producir al menos una vez más interferón gamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso de más de 16 días.
La divulgación de la presente invención también proporciona la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que la población terapéutica de los TIL sea capaz de producir al menos dos veces más interferón gamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso de más de 16 días.
La divulgación de la presente invención también proporciona la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que la población terapéutica de los TIL sea capaz de producir al menos tres veces más interferón gamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso de más de 16 días.
La divulgación de la presente invención también proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que es capaz de producir al menos una vez más interferón gamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de los TIL se realiza sin ninguna célula presentadora de antígeno (APC) añadida.
La divulgación de la presente invención también proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que es capaz de producir al menos una vez más interferón gamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de los TIL se realiza sin ningún OKT3 añadido.
La divulgación de la presente invención también proporciona una población terapéutica de los TIL que es capaz de producir al menos dos veces más interferón gamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de los TIL se realiza sin ninguna APC añadida.
La divulgación de la presente invención también proporciona una población terapéutica de los TIL que es capaz de producir al menos dos veces más interferón gamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de los TIL se realiza sin ningún OKT3 añadido.
La divulgación de la presente invención también proporciona una población terapéutica de los TIL que es capaz de producir al menos tres veces más interferón gamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de los TIL se realiza sin ninguna APC añadida.
La divulgación de la presente invención también proporciona una población terapéutica de los TIL que es capaz de producir al menos tres veces más interferón gamma en comparación con los TIL preparados mediante un proceso en el que la primera expansión de los TIL se realiza sin ningún OKT3 añadido.
En otra realización, la invención proporciona un método para expandir células T que comprende: (a) realizar una preparación de la primera expansión de una primera población de células T obtenidas de un fragmento o biopsia con aguja gruesa de tumor obtenido de un donante cultivando la primera población de células T para efectuar el crecimiento y preparar una activación de la primera población de células T; (b) después de que la activación de la primera población de células T preparadas en la etapa (a) comienza a decaer, realizar una segunda expansión rápida de la primera población de células T cultivando la primera población de células T para efectuar el crecimiento y para reforzar la activación de la primera población de células T para obtener una segunda población de células T; y (c) recolectar la segunda población de células T. En otra realización, la etapa de segunda expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un aumento de escala del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (b) efectuar la transferencia de la primera población de células T del cultivo a pequeña escala a un segundo recipiente más grande que el primer recipiente, por ejemplo,un recipiente G-RE<x>500MCS y cultivar la primera población de células T del cultivo a pequeña escala en un cultivo a mayor escala en el segundo recipiente durante un período de aproximadamente 4 a 7 días. En otra realización, la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalamiento del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un primer cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (b) efectuar la transferencia y distribución de la primera población de células T del primer cultivo a pequeña escala hacia y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 segundos recipientes que son iguales en tamaño al primer recipiente, en donde en cada segundo recipiente la porción de la primera población de células T del primer cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo recipiente se cultiva en un segundo cultivo a pequeña escala durante un período de aproximadamente 4 a 7 días. En otra realización, la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalamiento horizontal y vertical del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 3 a 4 días, y luego (b) efectuar la transferencia y distribución de la primera población de células T del cultivo a pequeña escala hacia y entre al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 segundos recipientes que son de mayor tamaño que el primer recipiente, por ejemplo, recipientes G-REX 500MCS, en donde en cada segundo recipiente la porción de la primera población de células T del cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo recipiente se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un período de aproximadamente 4 a 7 días. En otra realización, la etapa de expansión rápida se divide en una pluralidad de etapas para lograr un escalamiento horizontal y vertical del cultivo mediante: (a) realizar la segunda expansión rápida cultivando la primera población de células T en un cultivo a pequeña escala en un primer recipiente, por ejemplo, un recipiente G-REX 100MCS, durante un período de aproximadamente 4 días, y luego (b) efectuar la transferencia y distribución de la primera población de células T del cultivo a pequeña escala hacia y entre 2, 3 o 4 segundos recipientes que son de mayor tamaño que el primer recipiente, por ejemplo, recipientes G-REX 500MCS, en donde en cada segundo recipiente la porción de la primera población de células T del cultivo a pequeña escala transferida a dicho segundo recipiente se cultiva en un cultivo a mayor escala durante un período de aproximadamente 5 días.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la preparación de la primera expansión de la etapa (a) se realiza durante un período de hasta 17 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de manera que la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un período de hasta 11 días.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la preparación de la primera expansión en la etapa (a) se realiza durante un período de 17 días y la segunda expansión rápida de la etapa (b) se realiza durante un período de hasta 9 días.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (a) la primera población de células T se cultiva en un primer medio de cultivo que comprende<o>KT-3 e IL-2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el primer medio de cultivo comprende OKT-3, IL-2 y células presentadoras de antígeno (APC).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) la primera población de células T se cultiva en un segundo medio de cultivo que comprende OKT-3, IL-2 y células presentadoras de antígeno (APC).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificado de tal manera que en la etapa (a) la primera población de células T se cultiva en un primer medio de cultivo en un recipiente que comprende una primera superficie permeable al gas, en donde el primer medio de cultivo comprende OKT-3, IL-2 y una primera población de células presentadoras de antígeno (APC), en donde la primera población de APC es exógena al donante de la primera población de células T y la primera población de APC se coloca en capas sobre la primera superficie permeable al gas, en donde en la etapa (b) la primera población de células T se cultiva en un segundo medio de cultivo en el recipiente, en donde el segundo medio de cultivo comprende OKT-3, IL-2 y una segunda población de APC, en donde la segunda población de APC es exógena al donante de la primera población de células T y la segunda población de APC se coloca en capas sobre la primera superficie permeable al gas, y en donde la segunda población de APC es mayor que la primera población de APC.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que la relación entre el número de las APC en la segunda población de APC y el número de las APC en la primera población de APC sea aproximadamente 2:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el número de las APC en la primera población de APC sea aproximadamente 2.5 * 108 y el número de las APC en la segunda población de APC es de aproximadamente 5 * 108.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (a) la primera población de APC se coloca en capas sobre la primera superficie permeable al gas con un espesor promedio de 2 capas de APC.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) la segunda población de APC se coloca en capas sobre la primera superficie permeable al gas con un espesor promedio seleccionado del intervalo de 4 a 8 capas de Ap C.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que la relación entre el número promedio de capas de las APC colocadas en capas sobre la primera superficie permeable al gas en la etapa (b) y el número promedio de capas de las APC colocadas en capas sobre la primera superficie permeable al gas en la etapa (a) es 2:1.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad seleccionada del intervalo de igual o aproximadamente 1.0 x 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 4.5 * 106APC/cm2
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad seleccionada del intervalo de igual o aproximadamente 1.5 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 3.5 * 106 APC/cm2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad seleccionada del intervalo de igual o aproximadamente 2.0 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 3.0 * 106 APC/cm2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad de igual o aproximadamente 2.0 * 106 APC/cm2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad seleccionada del intervalo de igual o aproximadamente 2.5 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 7.5 * 106 APC/cm2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad seleccionada del intervalo de igual o aproximadamente 3.5 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 6.0 * 106 APC/cm2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad seleccionada del intervalo de igual o aproximadamente 4.0 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 5.5 * 106 APC/cm2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad de igual o aproximadamente 4.0 * 106 APC/cm2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad seleccionada del intervalo de igual o aproximadamente 1.0 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 4.5 * 106 APC/cm2 y en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad seleccionada del intervalo de igual o aproximadamente 2.5 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 7.5 * 106 APC/cm2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad seleccionada del intervalo de igual o aproximadamente 1.5 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 3.5 * 106 APC/cm2 y en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad seleccionada del intervalo de igual o aproximadamente 3.5 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 6.0 * 106 APC/cm2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad seleccionada del intervalo de igual o aproximadamente 2.0 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 3.0 * 106 APC/cm2 y en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad seleccionada del intervalo de igual o aproximadamente 4.0 * 106 APC/cm2 hasta igual o aproximadamente 5.5 * 106 APC/cm2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que en la etapa (a) la primera población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad de igual o aproximadamente 2.0 * 106 APC/cm2 y en la etapa (b) la segunda población de APC se siembra en la primera superficie permeable al gas a una densidad de igual o aproximadamente 4.0 * 106 APC/cm2.
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las APC sean células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que las PBMC se irradien y sean exógenas al donante de la primera población de células T
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que las células T sean linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), la primera población de células T sea una primera población de los TIL en la etapa (a), la segunda población de células T sea una segunda población de los TIL en la etapa (b), la segunda población de los TIL sea una población terapéutica de los TIL, y la población terapéutica de los TIL se recolecte en la etapa (c).
También se divulga en el presente documento el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que las células T sean linfocitos infiltrantes de médula ósea (MIL).
En otra realización, la invención proporciona el método descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el fenotipo de células T sea CD3+ y CD45+.
XV. Composiciones farmacéuticas, dosis y regímenes de dosificación
En una realización, los TIL expandidos utilizando los métodos de la presente divulgación son para administración a un paciente como una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede ser una suspensión de los TIL en un tampón estéril. Los TIL expandidos utilizando las PBMC de la presente divulgación se pueden administrar mediante cualquier vía adecuada como se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, las células T se administran como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura aproximadamente entre 30 y 60 minutos. Otras vías de administración adecuadas incluyen la administración intraperitoneal, intratecal e intralinfática.
Se puede administrar cualquier dosis adecuada de los TIL. En algunas realizaciones, desde aproximadamente 2.3 * 1010 hasta aproximadamente 13.7 * 1010 de los TIL son para administración, con un promedio de aproximadamente 7.8 * 1010 de los TIL, particularmente si el cáncer es melanoma. En una realización, aproximadamente 1.2 * 1010 hasta aproximadamente 4.3 * 1010 de los TIL son para administración. En algunas realizaciones, aproximadamente 3 * 1010 hasta aproximadamente 12 * 1010 de los TIL son para administración. En algunas realizaciones, aproximadamente 4 * 1010 hasta aproximadamente 10 * 1010 de los TIL son para administración. En algunas realizaciones, aproximadamente 5 * 1010 hasta aproximadamente 8 * 1010 de los TIL son para administración. En algunas realizaciones, aproximadamente 6 * 1010 hasta aproximadamente 8 * 1010 de los TIL son para administración. En algunas realizaciones, aproximadamente 7 * 1010 hasta aproximadamente 8 * 1010 de los TIL son para administración. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 2.3 * 1010 hasta aproximadamente 13.7 * 1010. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 7.8 * 1010 de los TIL, en particular los del cáncer, son melanomas. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1.2 * 1010 hasta aproximadamente 4.3 * 1010de los TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 3 * 1010 hasta aproximadamente 12 * 1010 de los TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 4 * 1010 hasta aproximadamente 10 * 1010 de los TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 5 * 1010 hasta aproximadamente 8 * 1010 de los TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 6 * 1010 hasta aproximadamente 8 * 1010 de los TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 7 * 1010 hasta aproximadamente 8 * 1010 de los TIL.
En algunas realizaciones, el número de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención es de aproximadamente 1 * 106, 2 * 106, 3 * 106, 4 * 106, 5 * 106, 6 * 106, 7 * 106, 8 * 106, 9 * 106, 1 * 107, 2 * 107, 3 * 107, 4 * 107, 5 * 107, 6 * 107, 7 * 107, 8 * 107, 9 * 107, 1 * 108, 2 * 108, 3 * 108, 4 * 108, 5 * 108, 6 * 108, 7 * 108, 8 * 108, 9 * 108, 1 * 109, 2 * 109, 3 * 109, 4 * 109, 5 * 109, 6 * 109, 7 * 109, 8 * 109, 9 * 109, 1 * 1010, 2 * 1010, 3 * 1010, 4 * 1010, 5 * 1010, 6 * 1010, 7 * 1010, 8 * 1010, 9 * 1010, 1 * 1011, 2 * 1011, 3 * 1011, 4 * 1011, 5 * 1011, 6 * 1011, 7 * 1011, 8 * 1011, 9 * 1011, 1 * 1012, 2 * 1012, 3 * 1012, 4 * 1012, 5 * 1012, 6 * 1012, 7 * 1012, 8 * 1012, 9 * 1012, 1 * 1013, 2 * 1013, 3 * 1013, 4 * 1013, 5 * 1013, 6 * 1013, 7 * 1013, 8 * 1013, y 9 * 1013. En una realización, el número de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención está en el intervalo de 1 * 106 hasta 5 * 106, 5 * 106 hasta 1 * 107, 1 * 107 hasta 5 * 107, 5 * 107 hasta 1 * 108, 1 * 108 hasta 5 * 108, 5 * 108 hasta 1 * 109, 1 * 109 hasta 5 * 109, 5 * 109 hasta 1 * 1010, 1 * 1010 hasta 5 * 1010, 5 * 1010 hasta 1011, 5 * 1011 hasta 1 * 1012, 1 * 1012 hasta 5 * 1012, y 5 * 1 x 1013.
En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de
la invención es menor que, por ejemplo, 100 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 19 %, 18
%, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.5 %, 0.4
%, 0.3 %, 0.2 %, 0.1 %, 0.09 %, 0.08 %, 0.07 %, 0.06 %, 0.05 %, 0.04 %, 0.03 %, 0.02 %, 0.01 %, 0.009 %,
0.008 %, 0.007 %, 0.006 %, 0.005 %, 0.004 %, 0.003 %, 0.002 %, 0.001 %, 0.0009 %, 0.0008 %, 0.0007 %,
0.0006 %, 0.0005 %, 0.0004 %, 0.0003 %, 0.0002 % o 0.0001 % p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de
la invención es mayor que 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 19.75 %, 19.50 %, 19.25 % 19
%, 18.75 %, 18.50 %, 18.25 % 18 %, 17.75 %, 17.50 %, 17.25 % 17 %, 16.75 %, 16.50 %, 16.25 % 16 %, 15.75
%, 15.50 %, 15.25 % 15 %, 14.75 %, 14.50 %, 14.25 % 14 %, 13.75 %, 13.50 %, 13.25 % 13 %, 12.75 %, 12.50
%, 12.25 % 12 %, 11.75 %, 11.50 %, 11.25 % 11 %, 10.75 %, 10.50 %, 10.25 % 10 %, 9.75 %, 9.50 %, 9.25 %
9 %, 8.75 %, 8.50 %, 8.25 % 8 %, 7.75 %, 7.50 %, 7.25 % 7 %, 6.75 %, 6.50 %, 6.25 % 6 %, 5.75 %, 5.50 %,
5.25 % 5 %, 4.75 %, 4.50 %, 4.25 %, 4 %, 3.75 %, 3.50 %, 3.25 %, 3 %, 2.75 %, 2.50 %, 2.25 %, 2 %, 1.75 %,
1.50 %, 125 %, 1 %, 0.5 %, 0.4 %, 0.3 %, 0.2 %, 0.1 %, 0.09 %, 0.08 %, 0.07 %, 0.06 %, 0.05 %, 0.04 %, 0.03
%, 0.02 %, 0.01 %, 0.009 %, 0.008 %, 0.007 %, 0.006 %, 0.005 %, 0.004 %, 0.003 %, 0.002 %, 0.001 %, 0.0009
%, 0.0008 %, 0.0007 %, 0.0006 %, 0.0005 %, 0.0004 %, 0.0003 %, 0.0002 % o 0.0001 % p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de
la invención está en el intervalo de aproximadamente 0.0001 % hasta aproximadamente 50 %, aproximadamente 0.001 % hasta aproximadamente 40 %, aproximadamente 0.01 % hasta aproximadamente
30 %, aproximadamente 0.02 % hasta aproximadamente 29 %, aproximadamente 0.03 % hasta aproximadamente 28 %, aproximadamente 0.04 % hasta aproximadamente 27 %, aproximadamente 0.05 %
hasta aproximadamente 26 %, aproximadamente 0.06 % hasta aproximadamente 25 %, aproximadamente 0.07
% hasta aproximadamente 24 %, aproximadamente 0.08 % hasta aproximadamente 23 %, aproximadamente
0.09 % hasta aproximadamente 22 %, aproximadamente 0.1 % hasta aproximadamente 21 %, aproximadamente 0.2 % hasta aproximadamente 20 %, aproximadamente 0.3 % hasta aproximadamente 19
%, aproximadamente 0.4 % hasta aproximadamente los 18 %, aproximadamente 0.5 % hasta aproximadamente 17 %, aproximadamente 0.6 % hasta aproximadamente 16 %, aproximadamente 0.7 % hasta aproximadamente 15 %, aproximadamente 0.8 % hasta aproximadamente 14 %, aproximadamente 0.9 % hasta aproximadamente 12 % o aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 10 % p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de
la invención está en el intervalo de aproximadamente 0.001 % hasta aproximadamente 10 %, aproximadamente
0.01 % hasta aproximadamente 5 %, aproximadamente 0.02 % hasta aproximadamente 4.5 %, aproximadamente 0.03 % hasta aproximadamente las 4 %, aproximadamente 0.04 % hasta aproximadamente
3.5 %, aproximadamente 0.05 % hasta aproximadamente 3 %, aproximadamente 0.06 % hasta aproximadamente 2.5 %, aproximadamente 0.07 % hasta aproximadamente 2 %, aproximadamente 0.08 %
hasta aproximadamente 1.5 %, aproximadamente 0.09 % hasta aproximadamente 1 %, aproximadamente 0.1
% hasta aproximadamente 0.9 % p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, la cantidad de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la
invención es igual o menor que 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0
g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g,
0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.20.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02
g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g,
0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g o 0.0001 g.
[1119] En algunas realizaciones, la cantidad de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de
la invención es más de 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009
g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065
g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g,
0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15
g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95
g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g o 10 g.
Los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención son eficaces en un amplio intervalo
de dosis. La dosis exacta dependerá de la vía de administración, la forma en que se administra el compuesto,
el género y la edad del sujeto a tratar, el peso corporal del sujeto a tratar y la preferencia y experiencia del
médico tratante. También se pueden utilizar las dosis clínicamente establecidas de los TIL, si es apropiado. Las cantidades de las composiciones farmacéuticas administradas utilizando los métodos divulgados en el presente documento, tales como las dosis de los TIL, dependerán del ser humano o mamífero que se esté tratando, la
gravedad del trastorno o condición, la velocidad de administración, la disposición de los ingredientes farmacéuticos activos y la discreción del médico prescriptor.
En algunas realizaciones, los TIL pueden administrarse en una dosis única. Dicha administración puede
realizarse mediante inyección, por ejemplo, inyección intravenosa. En algunas realizaciones, los TIL pueden administrarse en múltiples dosis. La dosis puede ser una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de seis veces al
año. La dosificación puede ser una vez al mes, una vez cada dos semanas, una vez a la semana o una vez
cada dos días. La administración de los TIL podrá continuar durante el tiempo que sea necesario.
En algunas realizaciones, una dosis efectiva de los TIL es de aproximadamente 1 * 106, 2 * 106, 3 * 106, 4 *
106, 5 * 106, 6 * 106, 7 * 106, 8 * 106, 9 * 106, 1 * 107, 2 * 107, 3 * 107, 4 * 107, 5 * 107, 6 * 107, 7 * 107, 8 *
107, 9 * 107, 1 * 108, 2 * 108, 3 * 108, 4 * 108, 5 * 108, 6 * 108, 7 * 108, 8 * 108, 9 * 108, 1 * 109, 2 * 109, 3 *
109, 4 * 109, 5 * 109, 6 * 109, 7 * 109, 8 * 109, 9 * 109, 1 * 1010, 2 * 1010, 3 * 7 * 1010, 8 * 1010, 9 * 1010, 1 * 1011, 2 * 1011, 3 * 1011, 4 * 1011, 5 * 1011, 6 * 1011, 7 * 1011, 8 * 1011, 9 * 1011,
1 * 1012, 2 * 1012, 3 * 1012, 4 * 1012, 5 * 1012, 6 * 1012, 7 * 1012, 8 * 1012, 9 * 1012, 1 * 1013, 2 * 1013, 3 * 1013,
4 * 1013, 5 * 1013, 6 * 1013, 7 * 1013, 8 * 1013, y 9 * 1013 En algunas realizaciones, una dosis efectiva de los
TIL está en el intervalo de 1 * 106 hasta 5 * 106, 5 * 106 hasta 1 * 107, 1 * 107 hasta 5 * 107, 5 * 107 hasta 1 *
108, 1 * 108 hasta 5 * 108, 5 * 108 hasta 1 * 109, 1 * 109 hasta 5 * 109, 5 * 109 hasta 1 * 1010, 1 * 1010 hasta
5 * 1010, 5 * 1010 hasta 1 * 1011, 5 * 1011 hasta 1 * 1012, 1 * 1012 hasta 5 * 1012, y 5 * 1012 hasta 1 * 1013.
En algunas realizaciones, una dosis eficaz de los TIL está en el intervalo de aproximadamente 0.01 mg/kg hasta aproximadamente 4.3 mg/kg, aproximadamente 0.15 mg/kg hasta aproximadamente 3.6 mg/kg, aproximadamente 0.3 mg/kg hasta aproximadamente 3.2 mg/kg, aproximadamente 0.35 mg/kg hasta aproximadamente 2.85 mg/kg, aproximadamente 0.15 mg/kg hasta aproximadamente 2.85 mg/kg, aproximadamente 0.3 mg hasta aproximadamente 2.15 mg/kg, aproximadamente 0.45 mg/kg hasta aproximadamente 1.7 mg/kg, aproximadamente 0.15 mg/kg hasta aproximadamente 1.3 mg/kg, aproximadamente 0.3 mg/kg hasta aproximadamente 1.15 mg/kg, aproximadamente 0.45 mg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 0.55 mg/kg hasta aproximadamente 0.85 mg/kg, aproximadamente 0.65 mg/kg hasta aproximadamente 0.8 mg/kg, aproximadamente 0.7 mg/kg hasta aproximadamente 0.75 mg/kg, aproximadamente 0.7 mg/kg hasta aproximadamente 2.15 mg/kg, aproximadamente 0.85 mg/kg hasta aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 1.85 mg/kg, aproximadamente 1.15 mg/kg hasta aproximadamente 1.7 mg/kg, aproximadamente 1.3 mg/kg hasta aproximadamente 1.6 mg/kg, aproximadamente 1.35 mg/kg hasta aproximadamente 1.5 mg/kg, aproximadamente 2.15 mg/kg hasta aproximadamente 3.6 mg/kg, aproximadamente 2.3 mg/kg hasta aproximadamente 3.4 mg/kg, aproximadamente 2.4 mg/kg hasta aproximadamente 3.3 mg/kg, aproximadamente 2.6 mg/kg hasta aproximadamente 3.15 mg/kg, aproximadamente 2.7 mg/kg hasta aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 2.8 mg/kg hasta aproximadamente 3 mg/kg, o aproximadamente 2.85 mg/kg hasta aproximadamente 2.95 mg/kg.
En algunas realizaciones, una dosis eficaz de los TIL está en el intervalo de aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 500 mg, aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 300 mg, aproximadamente 20
mg hasta aproximadamente 250 mg, aproximadamente 25 mg hasta aproximadamente 200 mg, aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 50 mg, aproximadamente 5 mg hasta aproximadamente 45
mg, aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 40 mg, aproximadamente 15 mg hasta aproximadamente 35 mg, aproximadamente 20 mg hasta aproximadamente 30 mg, aproximadamente 23 mg
hasta aproximadamente 28 mg, aproximadamente 50 mg hasta aproximadamente 150 mg, aproximadamente
60 mg hasta aproximadamente 140 mg, aproximadamente 70 mg hasta aproximadamente 130 mg, aproximadamente 80 mg hasta aproximadamente 120 mg, aproximadamente 90 mg hasta aproximadamente
110 mg, o aproximadamente 95 mg hasta aproximadamente 105 mg, aproximadamente 98 mg hasta aproximadamente 102 mg, aproximadamente 150 mg hasta aproximadamente 250 mg. mg, aproximadamente
160 mg hasta aproximadamente 240 mg, aproximadamente 170 mg hasta aproximadamente 230 mg, aproximadamente 180 mg hasta aproximadamente 220 mg, aproximadamente 190 mg hasta aproximadamente
210 mg, aproximadamente 195 mg hasta aproximadamente 205 mg, o aproximadamente 198 a aproximadamente 207 mg.
Una cantidad efectiva de los TIL puede administrarse en dosis únicas o múltiples mediante cualquiera de los
modos de administración aceptados de agentes que tienen utilidades similares, incluidas las vías intranasal y transdérmica, por inyección intraarterial, por vía intravenosa, intraperitoneal, parenteral, intramuscular, subcutánea, tópica, por trasplante o por inhalación.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una bolsa de infusión que comprende la
población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más
arriba.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una composición de linfocitos infiltrantes
de tumores (TIL) que comprende la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos
anteriores según corresponda más arriba y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una bolsa de infusión que comprende la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una preparación criopreservada de la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una composición de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba y un medio de criopreservación.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el medio de criopreservación contenga DMSO.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el medio de criopreservación contenga entre 7-10 % de DMSO.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una preparación criopreservada de la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba.
XVI. Métodos de tratamiento de pacientes
Los métodos de tratamiento comienzan con la recolección inicial de los TIL y el cultivo de los mismos. Dichos métodos han sido descritos en la técnica, por ejemplo, Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3): 283-292. Los métodos de tratamiento que no se reivindican se describen en las secciones siguientes, incluidos los Ejemplos.
Los TIL expandidos producidos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, como se describe en las Etapas A a F anteriores o de acuerdo con las Etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)) encuentran un uso particular en el tratamiento de pacientes con cáncer (por ejemplo, como se describe en Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20): 2389-239, así como el contenido complementario. En algunas realizaciones, los TIL se cultivaron a partir de depósitos resecados de melanoma metastásico como se describió anteriormente (véase, Dudley et al., J Immunother., 2003, 26: 332-342). El tumor fresco se puede disecar en condiciones estériles. Se puede recolectar una muestra representativa para un análisis patológico formal. Se pueden utilizar fragmentos únicos de 2 mm3 hasta 3 mm3. En algunas realizaciones, se obtienen 5, 10, 15, 20, 25 o 30 muestras por paciente. En algunas realizaciones, se obtienen 20, 25 o 30 muestras por paciente. En algunas realizaciones, se obtienen 20, 22, 24, 26 o 28 muestras por paciente. En algunas realizaciones, se obtienen 24 muestras por paciente. Las muestras pueden colocarse en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos, mantenerse en un medio de crecimiento con IL-2 en dosis altas (6,000 UI/mL) y monitorearse para detectar la destrucción del tumor y/o la proliferación de los TIL. Cualquier tumor con células viables restantes después del procesamiento puede digerirse enzimáticamente en una suspensión de células únicas y criopreservarse, como se describe en el presente documento.
Los TIL cultivados con éxito se pueden muestrear para análisis de fenotipo (CD3, CD4, CD8 y CD56) y probarlos contra un tumor autólogo cuando esté disponible. Los TIL pueden considerarse reactivos si el cocultivo nocturno arrojó niveles de interferón gamma (IFN-y) superiores a 200 pg/mL y el doble del fondo (Goff et al., J Immunother., 2010, 33: 840-847). Los cultivos con evidencia de reactividad autóloga o patrones de crecimiento suficientes se pueden seleccionar para una segunda expansión (por ejemplo, una segunda expansión como se proporciona de acuerdo con la etapa D de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)), incluidas segundas expansiones que a veces se denominan expansión rápida (REP). Los TIL expandidos con alta reactividad autóloga (por ejemplo, alta proliferación durante una segunda expansión) pueden seleccionarse para una segunda expansión adicional. Los TIL con alta reactividad autóloga (por ejemplo, alta proliferación durante la segunda expansión como se proporciona en la etapa D de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B)), puede seleccionarse para una segunda expansión adicional de acuerdo con la etapa D de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B).
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que el paciente no es trasladado directamente para ACT (transferencia celular adoptiva), por ejemplo, después de la recolección del tumor y/o una primera expansión, las células no se utilizan inmediatamente. Los TIL se pueden criopreservar y descongelar 2 días antes de su administración a un paciente. Los TIL se pueden criopreservar y descongelar 1 día antes de su administración a un paciente. Los TIL se pueden criopreservar y descongelar inmediatamente antes de su administración a un paciente.
Los fenotipos celulares de muestras criopreservadas de TIL en bolsa de infusión se pueden analizar mediante citometría de flujo (por ejemplo, FlowJo™) para los marcadores de superficie CD3, CD4, CD8, CCR7 y CD45RA (BD BioSciences), así como mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Las citocinas séricas se midieron utilizando técnicas estándar de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Un aumento del IFN-g sérico se definió como más de 100 pg/mL y mayor que 43 niveles basales.
En algunas realizaciones, los TIL producidos por los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo, los ejemplificados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B) muestra una mejora sorprendente en la eficacia clínica de los TIL. En algunas realizaciones, los TIL producidos por los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo, los ejemplificados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), exhiben una eficacia clínica aumentada en comparación con los TIL producidos por métodos distintos a los descritos en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos a los ejemplificados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, los métodos distintos de los descritos en el presente documento incluyen métodos denominados proceso 1C y/o Generación 1 (Gen 1). En algunas realizaciones, la mayor eficacia se mide mediante DCR, ORR y/u otras respuestas clínicas. En algunas realizaciones, los TILS producidos por los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo, los ejemplificados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), exhiben un tiempo de respuesta y un perfil de seguridad similares en comparación con los TIL producidos por métodos distintos a los descritos en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos a los ejemplificados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), por ejemplo, el proceso de Gen 1.
En algunas realizaciones, el IFN-gamma (IFN-y) es indicativo de la eficacia del tratamiento y/o una mayor eficacia clínica. En algunas realizaciones, el IFN-y en la sangre de sujetos tratados con los TIL es indicativo de los TIL activos. Se puede emplear un ensayo de potencia para la producción de IFN-<y>. La producción de IFN-<y>es otra medida del potencial citotóxico. La producción de IFN-y se puede medir determinando los niveles de la citocina IFN-y en la sangre, el suero o los TILex vivode un sujeto tratado con los TIL preparados mediante los métodos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, un aumento de IFN-<y>es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, el IFN-y aumenta una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>aumenta una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la secreción de iFN-y aumenta dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>aumenta tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la secreción de<i>FN-<y>aumenta cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y aumenta cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, el IFN-<y>se mide utilizando un kit ELISA Quantikine. En algunas realizaciones, el IFN-<y>se mide en los TILex vivode un sujeto tratado con los TIL preparados mediante los métodos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85<b>). El IFN-<y>se puede medir en la sangre de un sujeto tratado con los TIL preparados mediante los métodos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). El IFN-<y>se puede medir en el suero de los TIL de un sujeto tratado con los TIL preparados mediante los métodos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85b ).
En algunas realizaciones, los TIL preparados mediante los métodos de la presente invención, incluidos aquellos descritos, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), exhiben una policlonalidad aumentada en comparación con los TIL producidos por otros métodos, incluidos aquellos no ejemplificados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), como, por ejemplo, los métodos denominados métodos del proceso 1C. En algunas realizaciones, una policlonalidad significativamente mejorada y/o una policlonalidad aumentada es indicativa de eficacia del tratamiento y/o una mayor eficacia clínica. En algunas realizaciones, la policlonalidad se refiere a la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, un aumento en la policlonalidad puede ser indicativo de la eficacia del tratamiento con respecto a la administración de los TIL producidos por los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta una vez, dos veces, diez veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces en comparación con los TIL preparados utilizando métodos distintos a los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos a los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta diez veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta 100 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta 500 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta 1000 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B).
Las medidas de eficacia pueden incluir la tasa de control de la enfermedad (DCR), así como la tasa de respuesta general (ORR), como se conoce en la técnica y como se describe en el presente documento.
1. Métodos de tratamiento del cáncer y otras enfermedades
Las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse en un método para tratar enfermedades. Pueden utilizarse en el tratamiento de trastornos hiperproliferativos. También pueden utilizarse en el tratamiento de otros trastornos como se describe en este documento y en los párrafos siguientes.
El trastorno hiperproliferativo puede ser cáncer. El trastorno hiperproliferativo puede ser un cáncer de tumor sólido. El cáncer de tumor sólido puede seleccionarse del grupo que consiste en glioblastoma (GBM), cáncer gastrointestinal, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales. El trastorno hiperproliferativo puede ser una neoplasia maligna hematológica. El cáncer de tumor sólido puede seleccionarse del grupo que consiste en leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de células B grandes, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma folicular y linfoma de células del manto.
El cáncer puede ser un fenotipo de cáncer hipermutado. Los cánceres hipermutados se describen ampliamente en Campbell et al. (Cell, 171: 1042-1056 (2017)). Un tumor hipermutado puede comprender entre 9 y 10 mutaciones por megabase (Mb). Los tumores pediátricos hipermutados pueden comprender 9.91 mutaciones por megabase (Mb). Los tumores hipermutados de adultos pueden comprender 9 mutaciones por megabase (Mb). Los tumores hipermutados mejorados pueden comprender entre 10 y 100 mutaciones por megabase (Mb). Los tumores pediátricos hipermutados mejorados pueden comprender entre 10 y 100 mutaciones por megabase (Mb). Los tumores hipermutados de adultos mejorados pueden comprender entre 10 y 100 mutaciones por megabase (Mb). Un tumor ultrahipermutado puede comprender más de 100 mutaciones por megabase (Mb). Los tumores ultrahipermutados pediátricos pueden comprender más de 100 mutaciones por megabase (Mb). Los tumores de adultos ultrahipermutados pueden comprender más de 100 mutaciones por megabase (Mb).
Los tumores hipermutados pueden tener mutaciones en las vías de reparación de la replicación. Los tumores hipermutados pueden tener mutaciones en las ADN polimerasas asociadas a la reparación de la replicación. Los tumores hipermutados pueden presentar inestabilidad de microsatélites. Los tumores ultrahipermutados pueden tener mutaciones en las polimerasas de ADN asociadas a la reparación de la replicación y presentar inestabilidad de microsatélites. La hipermutación en el tumor puede estar correlacionada con la respuesta a los inhibidores del punto de control inmunitario. Los tumores hipermutados pueden ser resistentes al tratamiento con inhibidores de puntos de control inmunitario. Los tumores hipermutados se pueden tratar utilizando los TIL de la presente invención. La hipermutación en el tumor es causada por factores ambientales (exposiciones extrínsecas). Por ejemplo, la luz ultravioleta puede ser la causa principal del alto número de mutaciones en el melanoma maligno (véase, por ejemplo, Pfeifer, GP, You, YH, y Besaratinia, A. (2005). Mutat. Res. 571, 19-31; Sage, E. (1993) Photochem. Photobiol. 57, 163-174). La hipermutación en el tumor puede ser causada por los más de 60 carcinógenos presentes en el humo del tabaco para los tumores de pulmón y laringe, así como otros tumores, debido a la exposición directa a mutágenos (véase, por ejemplo, Pleasance, ED, Stephens, PJ, O'Meara, S., McBride,<d>J, Meynert, A., Jones, D., Lin, M<l>, Beare, D., Lau, KW, Greenman, C., et al. (2010). Nature 463, 184-190). La hipermutación en el tumor puede ser causada por la desregulación de la enzima editora de ARNm de la apolipoproteína B, miembros de la familia similares de polipéptidos catalíticos (APOBEC), que se ha demostrado que da como resultado mayores niveles de transiciones de C a T en una amplia gama de cánceres (véase, por ejemplo, Roberts, SA, Lawrence, MS, Klimczak, LJ, Grimm, SA, Fargo, D., Stojanov, P., Kiezun, A., Kryukov, GV, Carter, SL, Saksena, G., et al. (2013). Nat. Genet. 45, 970-976). La hipermutación en el tumor puede ser causada por una reparación defectuosa de la replicación del ADN mediante mutaciones que comprometen la corrección de errores, que es realizada por las principales enzimas replicativas Pol3 y Pold1. La hipermutación en el tumor puede ser causada por defectos en la reparación de desajustes del<a>D<n>, que están asociados con la hipermutación en el cáncer colorrectal, endometrial y otros cánceres (véase, por ejemplo, Kandoth, C., Schultz, N., Cherniack, AD, Akbani, R., Liu, Y., Shen, H., Robertson, AG, Pashtan, I., Shen, R., Benz, CC, et al.; (2013). Nature 497, 67-73; Muzny, DM, Bainbridge, MN, Chang, K., Dinh, HH, Drummond, JA, Fowler, G., Kovar, CL, Lewis, LR, Morgan, MB, Newsham, IF, et al.; (2012). Nature 487, 330-337). También se pueden encontrar mutaciones de reparación de la replicación del ADN en síndromes de predisposición al cáncer, como la deficiencia de reparación de desajustes constitucionales o bialélicos (CMMRD), el síndrome de Lynch y la poliposis asociada a la corrección de la polimerasa (PPAP).
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar un cáncer con una población de los TIL, en donde el cáncer es un cáncer hipermutado. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar un cáncer con una población de los TIL, en donde el cáncer es un cáncer hipermutado mejorado. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar un cáncer con una población de los TIL, en donde el cáncer es un cáncer ultrahipermutado.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar un cáncer con una población de los TIL, en donde un paciente es tratado previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de los TIL de acuerdo con la presente divulgación. La quimioterapia no mieloablativa puede ser ciclofosfamida 60 mg/kg/día durante 2 días (días 27 y 26 antes de la infusión de los TIL) y fludarabina 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de los TIL). También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que después de la quimioterapia no mieloablativa y la infusión de los TIL (en el día 0) de acuerdo con la presente divulgación, el paciente recibe una infusión intravenosa de IL-2 por vía intravenosa a razón de 720,000 UI/kg cada 8 horas hasta la tolerancia fisiológica.
La eficacia de los compuestos y combinaciones de compuestos descritos en el presente documento para tratar, prevenir y/o controlar las enfermedades o trastornos indicados se puede probar utilizando varios modelos conocidos en la técnica, que proporcionan orientación para el tratamiento de enfermedades humanas. Por ejemplo, se describen modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de ovario, por ejemplo, en Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92; y Fong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de páncreas se describen en Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294. Se describen modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de mama, por ejemplo, en Fantozzi, Brest Cancer Res. 2006, 8, 212. Se describen modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el melanoma. por ejemplo, en Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859. Se describen modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de pulmón. por ejemplo, en Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664. Se describen modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de pulmón. por ejemplo, en Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60; y Sano, Head Neck Oncol.
2009, 1, 32.
En algunas realizaciones, el IFN-gamma (IFN-y) es indicativo de la eficacia del tratamiento para el trastorno hiperproliferativo. En algunas realizaciones, el IFN-y en la sangre de sujetos tratados con los TIL es indicativo de los TIL activos. Se puede emplear un ensayo de potencia para la producción de IFN-y. La producción de IFN-y es otra medida del potencial citotóxico. La producción de IFN-y se puede medir determinando los niveles de la citocina IFN-<y>en la sangre de un sujeto tratado con los TIL preparados mediante los métodos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, los TIL obtenidos mediante el presente método proporcionan un aumento de IFN-y en la sangre de sujetos tratados con los TIL del presente método en comparación con sujetos tratados con los TIL preparados utilizando métodos denominados proceso de Gen 3, como se ejemplifica en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B) y en toda esta solicitud. En algunas realizaciones, un aumento de IFN-<y>es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, el IFN-<y>aumenta una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y aumenta una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y aumenta dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y aumenta tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>aumenta cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y aumenta cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). El IFN-y se puede medir utilizando un kit ELISA Quantikine. El IFN-y se puede medir utilizando un kit ELISA Quantikine. El IFN-<y>se puede medir en los TILex vivode un paciente tratado con los TIL producidos mediante los métodos de la presente invención. El IFN-<y>se puede medir en la sangre de un paciente tratado con los TIL producidos mediante los métodos de la presente invención. El IFN-y se puede medir en suero en un paciente tratado con los TIL producidos mediante los métodos de la presente invención.
En algunas realizaciones, los TIL preparados mediante los métodos de la presente invención, incluidos aquellos descritos, por ejemplo, en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), exhiben una policlonalidad aumentada en comparación con los TIL producidos por otros métodos, incluidos aquellos no ejemplificados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), como, por ejemplo, los métodos denominados métodos del proceso 1C. En algunas realizaciones, una policlonalidad significativamente mejorada y/o una policlonalidad aumentada es indicativa de una eficacia del tratamiento y/o una eficacia clínica aumentada para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, la policlonalidad se refiere a la diversidad del repertorio de células T En algunas realizaciones, un aumento en la policlonalidad puede ser indicativo de la eficacia del tratamiento con respecto a la administración de los TIL producidos por los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta una vez, dos veces, diez veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces en comparación con los TIL preparados utilizando métodos distintos a los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos a los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta diez veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta 100 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta 500 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta 1000 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con los TIL preparados utilizando otros métodos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los incorporados en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B).
2. Métodos de coadministración
En algunas realizaciones, los TIL producidos como se describe en el presente documento, incluidos, por ejemplo, los TIL derivados de un método descrito en las Etapas A a F de la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B), pueden ser para administración en combinación con uno o más reguladores de puntos de control inmunitarios, tales como los anticuerpos descritos a continuación. Por ejemplo, los anticuerpos que se dirigen a PD-1 y que pueden coadministrarse con los TIL de la presente invención incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a nivolumab (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®), pembrolizumab (lambrolizumab, MK03475 o MK-3475, Merck; Keytruda®), anticuerpo anti-pD-1 humanizado JS001 (ShangHai JunShi), anticuerpo monoclonal anti-PD-1 TSR-042 (Tesaro, Inc.), Pidilizumab (mAb anti-PD-1 Ct-011, Medivation), anticuerpo monoclonal anti-PD-1 BGB-A317 (BeiGene) y/o anticuerpo anti-PD-1 SHR-1210 (ShangHai HengRui), anticuerpo monoclonal humano REGN2810 (Regeneron), anticuerpo monoclonal humano MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb) y/o anticuerpo IgG4 anti-PD-1 humanizado PDR001 (Novartis). En algunas realizaciones, el anticuerpo PD-1 es del clon: RMP1-14 (IgG de rata) - BioXcell cat. # BP0146. Otros anticuerpos adecuados para su uso en métodos de coadministración con los TIL producidos de acuerdo con las Etapas A a F como se describe en el presente documento son los anticuerpos anti-PD-1 divulgados en la patente de los Estados Unidos No. 8,008,449. El anticuerpo o la porción de unión al antígeno del mismo se une específicamente a PD-L1 e inhibe su interacción con PD-1, aumentando así la actividad inmunológica. Cualquier anticuerpo conocido en la técnica que se una a PD-L1 e interrumpa la interacción entre PD-1 y PD-L1, y estimule una respuesta inmune antitumoral, es adecuado para su uso en métodos de coadministración con los TIL producidos de acuerdo con las Etapas A a F como se describe en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos que se dirigen a PD-L1 y que se encuentran en ensayos clínicos incluyen BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) y MPDL3280A (Genentech). Otros anticuerpos adecuados que se dirigen a PD-L1 se divulgan en la patente de los Estados Unidos No. 7,943,743. Cualquier persona con conocimientos medios entenderá que cualquier anticuerpo que se una a PD-1 o PD-L1, interrumpa la interacción PD-1/PD-L1 y estimule una respuesta inmunitaria antitumoral es adecuado para su uso en métodos de coadministración con los TIL producidos de acuerdo con las Etapas A a F como se describe en el presente documento. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que al sujeto al que se le administra la combinación de los TIL producida de acuerdo con las etapas A a F se le administra conjuntamente un anticuerpo anti-PD-1 cuando el paciente tiene un tipo de cáncer que es refractario a la administración del anticuerpo anti-PD-1 solo. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que se administran al paciente TIL en combinación con un anti-PD-1 cuando el paciente tiene melanoma refractario. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que se administran al paciente TIL en combinación con un anti-PD-1 cuando el paciente tiene carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
3. Preacondicionamiento de pacientes con linfodepleción opcional
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar un cáncer con una población de los TIL, en donde un paciente es tratado previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de los TIL de acuerdo con la presente divulgación. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una población de los TIL para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente que ha sido tratado previamente con quimioterapia no mieloablativa. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la población de los TIL es para administración por infusión. La quimioterapia no mieloablativa puede ser ciclofosfamida 60 mg/kg/día durante 2 días (días 27 y 26 antes de la infusión de los TIL) y fludarabina 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de los TIL). También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que después de la quimioterapia no mieloablativa y la infusión de los TIL (en el día 0) de acuerdo con la presente divulgación, el paciente recibe una infusión intravenosa de IL-2 (aldesleucina, disponible comercialmente como PROLEUKIN) por vía intravenosa a razón de 720,000 UI/kg cada 8 horas hasta la tolerancia fisiológica. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la población de los TIL se utiliza en el tratamiento del cáncer en combinación con iL-2, en donde la IL-2 se administra después de la población de los TIL.
Los hallazgos experimentales indican que la linfodepleción previa a la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos del tumor desempeña un papel clave en la mejora de la eficacia del tratamiento al eliminar las células T reguladoras y los elementos competitivos del sistema inmunológico ('sumideros de citocinas'). Por consiguiente, se puede utilizar una etapa de linfodepleción (a veces también denominado "acondicionamiento inmunosupresor") en el paciente antes de la introducción de los TIL de la invención.
En general, la linfodepleción se logra mediante la administración de fludarabina o ciclofosfamida (la forma activa se denomina mafosfamida) y combinaciones de las mismas. Estos métodos se describen en Gassner et al., Cancer Immunol. Inmunother. 2011, 60, 75-85, Muranski et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239, y Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la fludarabina se administra a una concentración de 0.5 pg/mL-10 pg/mL de fludarabina. La fludarabina puede administrarse en una concentración de 1 pg/mL de fludarabina. El tratamiento con fludarabina puede administrarse durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días o más. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la fludarabina se administra en una dosis de 10 mg/kg/día, 15 mg/kg/día, 20 mg/kg/día, 25 mg/kg/día, 30 mg/kg/día, 35 mg/kg/día, 40 mg/kg/día o 45 mg/kg/día. El tratamiento con fludarabina puede administrarse durante 2-7 días a razón de 35 mg/kg/día. El tratamiento con fludarabina puede administrarse durante 4-5 días a razón de 35 mg/kg/día. El tratamiento con fludarabina puede administrarse durante 4-5 días a razón de 25 mg/kg/día.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la mafosfamida, la forma activa de ciclofosfamida, se obtiene a una concentración de 0.5 pg/mL-10 pg/mL mediante la administración de ciclofosfamida. La mafosfamida, la forma activa de la ciclofosfamida, puede obtenerse en una concentración de 1 pg/mL mediante la administración de ciclofosfamida. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que el tratamiento con ciclofosfamida se administra durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días o más. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la ciclofosfamida se administra en una dosis de 100 mg/m2/día, 150 mg/m2/día, 175 mg/m2/día, 200 mg/m2/día, 225 mg/m2/día, 250 mg/m2/día, 275 mg/m2/día, o 300 mg/m2/día. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la ciclofosfamida se administra por vía intravenosa (es decir, iv). También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que el tratamiento con ciclofosfamida se administra durante 2-7 días a razón de 35 mg/kg/día. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que el tratamiento con ciclofosfamida se administra durante 4 a 5 días a razón de 250 mg/m2/día iv. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que el tratamiento con ciclofosfamida se administra durante 4 días a razón de 250 mg/m2/día iv.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la linfodepleción se realiza administrando fludarabina y ciclofosfamida juntas a un paciente. La fludarabina puede administrarse a razón de 25 mg/m2/día iv y se puede administrar ciclofosfamida a razón de 250 mg/m2/día iv durante 4 días.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que la linfodepleción puede realizarse mediante la administración de ciclofosfamida en una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
4. Regímenes de IL-2
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que el régimen de IL-2 comprende un régimen de IL-2 en dosis alta, en donde el régimen de IL-2 en dosis alta comprende aldesleucina, o un biosimilar o variante de la misma, administrado por vía intravenosa comenzando el día después de administrar una porción terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de los TIL, en donde la aldesleucina o un biosimilar o variante de la misma se administra en una dosis de 0.037 mg/kg o 0.044 mg/kg de UI/kg (masa corporal del paciente) utilizando infusiones intravenosas en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia, durante un máximo de 14 dosis. Tras 9 días de descanso, se podrá repetir este esquema con otras 14 dosis, hasta un máximo de 28 dosis en total.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que el régimen de IL-2 comprende un régimen de IL-2 decreciente. Se han descrito regímenes decrecientes de IL-2 en O'Day, et al., J. Clin. Oncol.
1999, 17, 2752-61 y Eton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un régimen de IL-2 decreciente que comprende 18 * 106 UI/m2 administrado por vía intravenosa durante 6 horas, seguida de 18 * 106 UI/m2 administrado por vía intravenosa durante 12 horas, seguido de 18 * 106 UI/m2 administrado por vía intravenosa durante 24 horas, seguido de 4.5 * 106 UI/m2 administrado por vía intravenosa durante 72 horas. Este ciclo de tratamiento puede repetirse cada 28 días hasta un máximo de cuatro ciclos. En una realización, un régimen decreciente de IL-2 comprende 18,000,000 UI/m2 el día 1, 9,000,000 UI/m2 el día 2 y 4,500,000 UI/m2 los días 3 y 4.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que el régimen de IL-2 comprende la administración de IL-2 pegilada cada 1, 2, 4, 6, 7, 14 o 21 días en una dosis de 0.10 mg/día a 50 mg/día.
5. Transferencia de células adoptivas
La transferencia celular adoptiva (ACT) es una forma eficaz de inmunoterapia e implica la transferencia de células inmunes con actividad antitumoral a pacientes con cáncer. La ACT es un enfoque de tratamiento que implica la identificación,in vitro,de linfocitos con actividad antitumoral, la expansiónin vitrode estas células en grandes cantidades y su infusión en el huésped portador del cáncer. Los linfocitos utilizados para la transferencia adoptiva pueden derivarse del estroma de tumores resecados (linfocitos infiltrantes de tumores o TIL). Los TIL para a Ct se pueden preparar como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los TIL se preparan, por ejemplo, de acuerdo con un método como se describe en la Figura 85 (en particular, por ejemplo, la Figura 85B). También pueden derivarse de la sangre si se modifican genéticamente para expresar receptores de células T antitumorales (TCR) o receptores de antígenos quiméricos (CAR), se enriquecen con cultivos de células tumorales de linfocitos mixtos (MLTC) o se clonan utilizando células presentadoras de antígenos autólogas y péptidos derivados de tumores. La ACT en donde los linfocitos se originan en el huésped portador del cáncer que se va a infundir se denomina ACT autólogo. La publicación de los Estados Unidos No. 2011/0052530 se refiere a un método para realizar una terapia celular adoptiva para promover la regresión del cáncer, principalmente para el tratamiento de pacientes que padecen melanoma metastásico. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que los TIL se pueden administrar como se describe en el presente documento. Los TIL pueden administrarse en una sola dosis. Dicha administración podrá realizarse mediante inyección, por ejemplo, inyección intravenosa. Los TIL y/o linfocitos citotóxicos pueden administrarse en dosis múltiples. La dosis puede ser una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de seis veces al año. La dosificación puede ser una vez al mes, una vez cada dos semanas, una vez a la semana o una vez cada dos días. La administración de los TIL y/o linfocitos citotóxicos puede continuar tanto tiempo como sea necesario.
6. Métodos adicionales de tratamiento
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que antes de administrar la dosis terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de los TIL y la composición de los TIL descritas en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, respectivamente, se ha administrado al sujeto un régimen de linfodepleción no mieloablativa.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de manera que el régimen de linfodepleción no mieloablativa comprende las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado para comprender además la etapa de tratar al sujeto con un régimen de IL-2 de dosis alta que comienza el día después de la administración de las células de TIL al sujeto.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que el régimen de IL-2 en dosis alta comprende 600,000 o 720,000 UI/kg administrados como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que el cáncer sea un tumor sólido.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que el cáncer sea melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), glioblastoma (incluido GBM), cáncer gastrointestinal, cáncer renal o carcinoma de células renales.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que el cáncer es melanoma, HMSCC, cánceres de cuello uterino, NSCLC, glioblastoma (incluido GBM) y cáncer gastrointestinal.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que el cáncer sea melanoma.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que el cáncer sea HNSCC.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que el cáncer sea un cáncer de cuello uterino.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que el cáncer sea NSCLC.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que el cáncer sea glioblastoma (incluido GBM).
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que el cáncer sea cáncer gastrointestinal.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que el cáncer sea un cáncer hipermutado.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el método para tratar a un sujeto con cáncer descrito en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificado de modo que el cáncer sea un cáncer hipermutado pediátrico.
También se divulga en el presente documento que la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba para su uso en un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de los TIL.
También se divulga en el presente documento la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba para su uso en un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la composición de los TIL.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificada de modo que antes de administrar al sujeto la dosis terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, se le ha administrado al sujeto un régimen de linfodepleción no mieloablativa.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificada de modo que el régimen de linfodepleción no mieloablativa comprende las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada para comprender además la etapa de tratar al paciente con un régimen de IL-2 de dosis alta que comienza el día después de la administración de las células de TIL al paciente.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el régimen de IL-2 en dosis alta comprende 600,000 o 720,000 UI/kg administradas como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea un tumor sólido.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), glioblastoma (incluido GBM), cáncer gastrointestinal, cáncer renal o carcinoma de células renales.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea melanoma, HNSCC, cánceres de cuello uterino, NSCLC, glioblastoma (incluido GBM) y cáncer gastrointestinal.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea melanoma.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea HNSCC.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea un cáncer de cuello uterino.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea NSCLC.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea glioblastoma (incluido GBM).
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea cáncer gastrointestinal.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea un cáncer hipermutado.
También se divulga en el presente documento la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea un cáncer hipermutado pediátrico.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba en un método para tratar el cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de los TIL.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba en un método para tratar el cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la composición de los TIL.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba en un método para tratar el cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto un régimen de linfodepleción no mieloablativa y luego administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba o la dosis terapéuticamente eficaz de la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el régimen de linfodepleción no mieloablativa comprende las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba o el uso de la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba modificada para comprender además la etapa de tratar al paciente con un régimen de IL-2 de dosis alta que comienza el día después de la administración de las células de TIL al paciente.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el régimen de IL-2 de dosis alta comprende 600,000 o 720,000 UI/kg administradas como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea un tumor sólido.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), glioblastoma (incluido GBM), cáncer gastrointestinal, cáncer renal o carcinoma de células renales.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea melanoma, HNSCC, cánceres de cuello uterino, NSCLC, glioblastoma (incluido GBM) y cáncer gastrointestinal.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea melanoma.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea HNSCC.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea un cáncer de cuello uterino.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea NSCLC.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea glioblastoma (incluido GBM).
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea cáncer gastrointestinal.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea un cáncer hipermutado.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, el uso de la población terapéutica de los TIL o la composición de los TIL descrita en cualquiera de los párrafos anteriores según corresponda más arriba, modificada de modo que el cáncer sea un cáncer hipermutado pediátrico.
7. Ejemplos de realización de tratamientos
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar un cáncer con una población de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) que comprende las etapas de (a) obtener una primera población de los TIL a partir de un fragmento o biopsia con aguja gruesa de tumor obtenido de un paciente; (b) realizar una expansión inicial de la primera población de los TIL en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL es al menos 5 veces mayor en número que la primera población de los TIL, y en donde el primer medio de cultivo celular comprende IL-2; (c) realizar una expansión rápida de la segunda población de los TIL utilizando una población de células presentadoras de antígeno artificial mieloides (aAPC mieloides) en un segundo medio de cultivo celular para obtener una tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es al menos 50 veces mayor en número que la segunda población de los TIL después de 7 días desde el inicio de la expansión rápida; y en donde el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2 y OKT-3; (d) administrar una porción terapéuticamente eficaz de la tercera población de los TIL a un paciente con cáncer. La IL-2 puede estar presente en una concentración inicial de aproximadamente 3000 UI/mLy el anticuerpo OKT-3 está presente en una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL en el segundo medio de cultivo celular. La primera expansión podrá realizarse en un período no mayor a 14 días. La primera expansión puede realizarse utilizando un recipiente permeable al gas. La segunda expansión puede realizarse utilizando un recipiente permeable al gas. La relación entre la segunda población de los TIL y la población de aAPC en la expansión rápida puede estar entre 1 a 80 y 1 a 400. La relación entre la segunda población de los TIL y la población de aAPC en la expansión rápida puede ser de aproximadamente 1 a 300. El cáncer por tratar puede seleccionarse del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal y carcinoma de células renales. El cáncer por tratar puede seleccionarse del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario y cáncer de cuello uterino. El cáncer por tratar puede ser el melanoma. El cáncer por tratar puede ser el cáncer de ovario. El cáncer por tratar puede ser el cáncer de cuello uterino. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que el método para tratar el cáncer comprende además la etapa de tratar al paciente con un régimen de linfodepleción no mieloablativo antes de administrar la tercera población de los TIL al paciente. El régimen de linfodepleción no mieloablativa puede comprender las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días. El régimen de dosis alta de IL-2 puede comprender 600,000 o 720,000 UI/kg de aldesleucina, o un biosimilar o variante del mismo, administrado como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar a un sujeto con cáncer que comprende administrar linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) expandidos que comprenden: (i) obtener una primera población de los TIL a partir de un aspirado con aguja fina (FNA) o una biopsia pequeña obtenida de un tumor en un paciente; (ii) realizar una primera expansión cultivando la primera población de los TIL en un medio de cultivo celular que comprende<i>L-2 para producir una segunda población de los TIL, en donde el medio de cultivo celular se complementa con OKT-3 el día 3, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3 días a aproximadamente 19 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL comprende al menos 5 * 107 TIL durante aproximadamente 10 días hasta aproximadamente 19 días cuando la primera población de los TIL es de una biopsia pequeña; (iii) realizar una segunda expansión complementando el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es al menos 25 veces mayor en número que la segunda población de los TIL, y en donde la segunda expansión se realiza durante aproximadamente 11 días a aproximadamente 14 días para obtener la tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es una población terapéutica de los TIL; y (iv) administrar una dosis terapéuticamente efectiva de la tercera población de los TIL al paciente. La IL-2 puede estar presente en una concentración inicial de aproximadamente 3000 UI/mL y el anticuerpo OKT-3 está presente en una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL en el segundo medio de cultivo celular. La primera expansión puede realizarse utilizando un recipiente permeable al gas. La segunda expansión puede realizarse utilizando un recipiente permeable al gas. La relación entre la segunda población de los TIL y la población de APC en la expansión rápida puede estar entre 1 a 80 y 1 a 400. La relación entre la segunda población de los TIL y la población de APC en la expansión rápida puede ser de aproximadamente 1 a 300. Las APC pueden ser PMBC. La biopsia pequeña se puede obtener de un tumor seleccionado del grupo que consiste en pancreático, melanoma, de mama y ovario. El cáncer por tratar puede seleccionarse del grupo que consiste en pancreático, melanoma, de mama y ovario. El FNA se puede obtener de un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, melanoma, de cabeza y cuello, de cuello uterino, de ovario, de páncreas, glioblastoma, colorrectal y sarcoma. El cáncer por tratar puede seleccionarse del grupo que consiste en cáncer de pulmón, melanoma, de cabeza y cuello, de cuello uterino, de ovario, de páncreas, glioblastoma, colorrectal y sarcoma. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que el método para tratar el cáncer comprende además la etapa de tratar al paciente con un régimen de linfodepleción no mieloablativo antes de administrar la tercera población de los TIL al paciente. El régimen de linfodepleción no mieloablativa puede comprender las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días. El régimen de dosis alta de IL-2 puede comprender 600,000 o 720,000 UI/kg de aldesleucina, o un biosimilar o variante del mismo, administrado como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
Ejemplos
Las realizaciones comprendidas en el presente documento se describen ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y la divulgación comprendida en el presente documento no debe interpretarse de ninguna manera como limitada a estos ejemplos, sino que debe interpretarse como que abarca todas y cada una de las variaciones que se hagan evidentes como resultado de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento.
Ejemplo 1:Preparación de medios para procesos PRE-REP Y REP
Este ejemplo describe el procedimiento para la preparación de medios de cultivo de tejidos para su uso en protocolos que implican el cultivo de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) derivados de varios tipos de tumores, incluidos, entre otros, melanoma metastásico, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), carcinoma de ovario, carcinoma de mama triple negativo y adenocarcinoma de pulmón. Este medio se puede utilizar para la preparación de cualquiera de los TIL descritos en la presente solicitud y Ejemplos.
Preparación del CM1
Se retiraron los siguientes reactivos del almacenamiento en frío y se calentaron en un baño de agua a 37 °C: (RPMI1640, suero AB humano, 200 mM de L-glutamina). Se preparó el medio CM1 de acuerdo con la Tabla 32 a continuación agregando cada uno de los ingredientes en la sección superior de una unidad filtrante de 0.2 |jm apropiada para el volumen a filtrar. Almacenar a 4°C.
Tabla 32: Preparación del CM1
El día de uso, se precalentó la cantidad necesaria de CM1 en un baño de agua a 37 °C y se agregaron 6000 UI/mLde IL-2.
Complementación adicional - según fue necesario de acuerdo con la Tabla 33.
Tabla 33: Complementación adicional de CM1, según fue necesario.
Preparación de CM2
Se extrajo el CM1 preparado del refrigerador o se preparó CM1 fresco de acuerdo con la Sección 7.3 anterior. Se extrajo AIM-V® del refrigerador y se preparó la cantidad de CM2 necesaria mezclando CM1 preparado con un volumen igual de AIM-V® en un matraz de medio estéril. Se agregaron 3000 UI/mL de IL-2 al medio CM2 el día de uso. Se preparó una cantidad suficiente de CM2 con 3000 UI/mL de IL-2 el día del uso. Se etiquetó el matraz de medio CM2 con su nombre, las iniciales del preparador, la fecha en que se filtró/preparó, la fecha de vencimiento de dos semanas y se almacenó a 4 °C hasta que se necesitó para el cultivo de tejidos.
Preparación de CM3
Se preparó CM3 el día que se requirió para su uso. CM3 era el mismo que el medio AIM-V®, complementado con 3000 UI/mL de IL-2 el día de uso. Se preparó una cantidad de CM3 suficiente para las necesidades experimentales agregando la solución madre de IL-2 directamente al matraz o bolsa de AIM-V. Se mezcló bien agitando suavemente. Se etiquetó el matraz con “3000 UI/mL de IL-2” inmediatamente después de agregarlo al AIM-V. Si hubo un exceso de CM3, almacénelo en matraces a 4 °C etiquetados con el nombre del medio, las iniciales del preparador, la fecha en que se preparó el medio y su fecha de vencimiento (7 días después de la preparación). Medio descartado complementado con IL-2 después de 7 días de almacenamiento a 4°C.
Preparación de CM4
El CM4 era igual que CM3, con el complemento adicional de 2mM de GlutaMAX™ (concentración final). Por cada 1 L de CM3, se agregan 10 mL de 200 mM de GlutaMAX™. Se preparó una cantidad de CM4 suficiente para las necesidades experimentales agregando solución madre de IL-2 y solución madre de GlutaMAX™ directamente en el matraz o bolsa de AIM-V. Se mezcló bien agitando suavemente. Se etiquetó el matraz con la leyenda “3000 IL/mLde IL-2 y GlutaMAX” inmediatamente después de añadirlo al AIM-V. Si había un exceso de CM4, se almacenó en matraces a 4°C etiquetados con el nombre del medio, “GlutaMAX”, y su fecha de vencimiento (7 días después de la preparación). Medio descartado complementado con IL-2 después de 7 días de almacenamiento a 4°C.
Ejemplo 2:Uso del cóctel de citoquinas de IL-2, IL-15 e IL-21
Este ejemplo describe el uso de las citocinas IL-2, IL-15 e IL-21, que sirven como factores de crecimiento de células T adicionales, en combinación con el proceso de TIL de los Ejemplos.
Utilizando los procesos descritos en el presente documento, se cultivaron los TIL a partir de tumores colorrectales, de melanoma, de cuello uterino, de mama triple negativos, de pulmón y renales en presencia de IL-2 en una parte del experimento y, en lugar de IL-2, una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 en otra parte al inicio del cultivo. Al finalizar el pre-REP, se evaluaron los cultivos para determinar la expansión, el fenotipo, la función (CD107a+ e IFN<y>) y el repertorio de TCR Vp. La IL-15 y la IL-21 se describen en otras partes de este documento y en Gruijl et al., IL-21 promueve la expansión de linfocitos infiltrantes de tumores CD27+CD28+ con alto potencial citotóxico y baja expansión colateral de células T reguladoras, Santegoets, SJ, J Transl Med., 2013, 11:37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/).
Los resultados mostraron una mayor expansión de los TIL (superior a 20 %), tanto en células CD4+ y CD8+ y se observaron las condiciones tratadas con IL-2, IL-15 e IL-21 en múltiples histologías en relación con las condiciones tratadas solo con IL-2. Hubo una tendencia hacia un predominio de la población de CD8+ con un repertorio de TCR Vp sesgado en los TIL obtenidos de los cultivos tratados con IL-2, IL-15 e IL-21 en relación con los cultivos tratados solo con IL-2. IFN<y>y CD107a estaban elevados en los TIL tratados con IL-2, IL-15 e IL-21, en comparación con los TIL tratados solo con IL-2.
Ejemplo 3:Calificación de lotes individuales de células mononucleares periféricas irradiadas con gamma
Este ejemplo describe un nuevo procedimiento abreviado para calificar lotes individuales de células mononucleares periféricas irradiadas con rayos gamma (PBMC, también conocidas como MNC) para su uso como células alimentadoras alogénicas en los métodos ejemplares descritos en el presente documento.
Cada lote de alimentador MNC irradiado se preparó a partir de un donante individual. Cada lote o donante fue examinado individualmente para determinar su capacidad de expandir los TIL en el REP en presencia de anticuerpo anti-CD3 purificado (clon OKT3) e interleucina-2 (IL-2). Además, cada lote de células alimentadoras se probó sin la adición de los TIL para verificar que la dosis recibida de radiación gamma fuera suficiente para volverlas incompetentes para la replicación.
Antecedentes
Se requirieron células alimentadoras MNC de crecimiento detenido e irradiadas con rayos gamma para el REP de los TIL. Los receptores de membrana de las células MNC alimentadoras se unen al anticuerpo anti-CD3 (clon OKT3) y se entrecruzan con los TIL en el matraz REP, estimulando la expansión de los TIL. Los lotes alimentadores se prepararon a partir de la leucocitaféresis de sangre completa extraída de donantes individuales. El producto de leucocitaféresis fue sometido a centrifugación sobre Ficoll-Hypaque, lavado, irradiado y criopreservado en condiciones GMP
Es importante que a los pacientes que recibieron terapia con TIL no se les infundan células alimentadoras viables ya que esto puede resultar en enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Por lo tanto, las células alimentadoras detienen su crecimiento al administrarles radiación gamma, lo que produce roturas de ADN bicatenario y la pérdida de viabilidad celular de las células MNC tras el nuevo cultivo.
Criterios de evaluación y configuración experimental
Los lotes alimentadores se evaluaron de acuerdo con dos criterios: 1) su capacidad para expandir los TIL en cocultivo más de 100 veces y 2) su incompetencia de replicación.
Los lotes alimentadores se probaron en formato mini-REP utilizando dos líneas de TIL primarias pre-REP cultivadas en matraces de cultivo de tejidos T25 en posición vertical. Los lotes alimentadores se probaron contra dos líneas de TIL distintas, ya que cada línea de TIL es única en su capacidad de proliferar en respuesta a la activación en un REP Como control, se utilizaron muchas células alimentadoras MNC irradiadas que históricamente han demostrado cumplir con los criterios anteriores, junto con los lotes de prueba.
Para garantizar que todos los lotes evaluados en un solo experimento reciban pruebas equivalentes, se dispuso de suficientes existencias de las mismas líneas de TIL pre-REP para evaluar todas las condiciones y todos los lotes alimentadores.
Para cada lote de células alimentadoras analizadas, había un total de seis matraces T25: línea de TIL pre-REP #1 (2 matraces); línea de TIL pre-REP #2 (2 matraces); y control de alimentación (2 matraces). Los matraces que contienen líneas de TIL #1 y #2 evaluaron la capacidad del lote alimentador para expandir los TIL. Los matraces de control alimentadores evaluaron la incompetencia de replicación del lote alimentador.
Protocolo experimental
Día -2/3, Descongelamiento de las líneas de TIL
Se preparó medio CM2. Se calentó CM2 en baño de agua a 37 °C. Se prepararon 40 mL de CM2 complementado con 3000 UI/mL de IL-2. Se mantuvo caliente hasta su uso. Se colocaron 20 mL de CM2 precalentado sin IL-2 en cada uno de dos tubos cónicos de 50 mL etiquetados con los nombres de las líneas de TIL utilizadas. Se retiraron las dos líneas de TIL pre-REP designadas del almacenamiento en LN2 y se transfirieron los viales a la sala de cultivo de tejidos. Se descongelaron los viales colocándolos dentro de una bolsa de almacenamiento sellada con cierre en un baño de agua a 37 °C hasta que quedo una pequeña cantidad de hielo.
Utilizando una pipeta de transferencia estéril, se transfirieron inmediatamente el contenido del vial a los 20 mL de CM2 en el tubo cónico de 50 mL preparado y etiquetado. Se llevó a volumen hasta 40 mL usando CM2 sin IL-2 para lavar las células. Se centrifugó a 400 x CF durante 5 minutos. Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió en 5 mL de CM2 caliente complementado con 3000 UI/mL de IL-2.
Se extrajo una pequeña alícuota (20<j>L) por duplicado para el recuento de células utilizando un contador de células automático. Se registraron los recuentos. Durante el recuento, se colocó el tubo cónico de 50 mL con células de TIL en una incubadora humidificada a 37 °C, CO2 al 5 %, con la tapa aflojada para permitir el intercambio de gases. Se determinó la concentración celular y se diluyeron los TIL hasta 1 * 106 células/mL en CM2 complementado con IL-2 a razón de 3000 UI/mL.
Se cultivaron en 2 mL/pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos en tantos pocillos como fuera necesario en una incubadora humidificada a 37 °C hasta el día 0 del mini-REP Se cultivaron las diferentes líneas de los TIL en placas de cultivo de tejidos separadas de 24 pocillos para evitar confusiones y posible contaminación cruzada.
Día 0, inicio del mini-REP
Se preparó suficiente medio CM2 para la cantidad de lotes alimentadores que se analizarían (por ejemplo, para probar 4 lotes alimentadores a la vez, se prepararon 800 mL de medio CM2). Se tomaron alícuotas de una porción del CM2 preparado anteriormente y se complementó con 3000 UI/mL de IL-2 para el cultivo de las células (por ejemplo, para analizar 4 lotes alimentadores a la vez, se prepararon 500 mL de medio CM2 con 3000 UI/mL de IL-2).
Trabajando con cada línea de TIL por separado para evitar la contaminación cruzada, se retiró la placa de 24 pocillos con cultivo de TIL de la incubadora y se transfirió al BSC.
Utilizando una pipeta de transferencia estéril o una pipeta y punta de 100-1000 j L, se extrajo aproximadamente 1 mL de medio de cada pocillo de los TIL a utilizar y se colocó en un pocillo no utilizado de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.
Utilizando una pipeta de transferencia estéril nueva o una pipeta y punta de 100-1000<j>L, se mezcló el medio restante con los TIL en los pocillos para resuspender las células y luego se transfirió la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mL etiquetado con el nombre de los TIL y se registró el volumen.
Se lavaron los pocillos con el medio reservado y se transfirió ese volumen al mismo tubo cónico de 50 mL. Se centrifugaron las células a 400 x CF para recoger el sedimento celular. Se aspiró el sobrenadante del medio y se resuspendió el precipitado celular en 2-5 mL de medio CM2 que contenía 3000 UI/mL de IL-2; el volumen que se utilizará dependerá de la cantidad de pocillos recolectados y del tamaño del precipitado; el volumen debe ser suficiente para garantizar una concentración de más de 1.3 * 106 células/mL.
Utilizando una pipeta serológica, se mezcló bien la suspensión celular y se registró el volumen. Se extrajeron 200<j>L para realizar un recuento de células utilizando un contador de células automatizado. Durante el recuento, se colocó el tubo cónico de 50 mL con células de TIL en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % a 37 °C, con la tapa aflojada para permitir el intercambio de gases. Se registraron los recuentos.
Se retiró el tubo cónico de 50 mL que contiene las células de TIL de la incubadora y se resuspendieron las células a una concentración de 1.3 * 106 células/mL en CM2 caliente complementado con 3000 UI/mL de IL-2. Se retornó el tubo cónico de 50 mL a la incubadora con la tapa aflojada.
Se repitieron las etapas anteriores para la segunda línea de TIL.
Justo antes de sembrar los TIL en los matraces T25 para el experimento, los TIL se diluyeron 1:10 para una concentración final de 1.3 * 105 células/mL de acuerdo con lo indicado a continuación.
Preparar la solución de trabajo MACS GMP CD3 pura (OKT3)
Se sacó la solución madre de OKT3 (1 mg/mL) del refrigerador a 4 °C y se colocó en BSC. Se utilizó una concentración final de 30 ng/mL de OKT3 en el medio del mini-REP.
Se necesitaron 600 ng de OKT3 para 20 mL en cada matraz T25 del experimento; esto fue el equivalente a 60 j L de una solución de 10 jg/mL por cada 20 mL, o 360 j L para los 6 matraces analizados para cada lote alimentador.
Para cada lote alimentador analizado, se prepararon 400 pL de una dilución 1:100 de 1 mg/mL de OKT3 para una concentración de trabajo de 10 pg/mL (por ejemplo, para analizar 4 lotes alimentadores a la vez, prepare 1600 pL de una dilución 1:100 de 1 mg/mL de OKT3: 16 pL de 1 mg/mL de OKT3 1.584 mL de medio CM2 con 3000 UI/mL de IL-2).
Preparación de matraces T25
Se etiquetó cada matraz y se llenó con el medio CM2 antes de preparar las células alimentadoras. Se colocaron los matraces en una incubadora humidificada a 37 °C, CO2 al 5 %, para mantener el medio caliente mientras se espera agregar los componentes restantes. Una vez preparadas las células alimentadoras, se agregarán los componentes al CM2 en cada matraz.
Tabla 34: Soluciones
Preparación de células alimentadoras
Se necesitaron un mínimo de 78 * 106 células alimentadoras por lote analizado para este protocolo. Cada vial de 1 mL congelado por SDBB tenía 100 * 106 células viables al congelarse. Suponiendo una recuperación del 50 % tras la descongelación del almacenamiento en LN2, se recomendó descongelar al menos dos viales de 1 mL de células alimentadoras por lote, lo que da un estimado de 100 * 106 células viables para cada REP Alternativamente, si se suministra en viales de 1.8 mL, solo un vial proporciona suficientes células alimentadoras.
Antes de descongelar las células alimentadoras, se precalentaron aproximadamente 50 mL de CM2 sin IL-2 para cada lote alimentador que se va a analizar. Se retiraron los viales del lote alimentador designado del almacenamiento en LN2, colocado en una bolsa de almacenamiento con cierre y se coloca en hielo. Se cierran los viales descongelados dentro de una bolsa de almacenamiento con cierre sumergiéndolos en un baño de agua a 37 °C. Se retiraron los viales de la bolsa con cierre, se rociaron o limpiaron con EtOH al 70 % y se transfirieron a viales con BSC.
Utilizando una pipeta de transferencia, se transfirió inmediatamente el contenido de los viales alimentadores a 30 mL de CM2 caliente en un tubo cónico de 50 mL. Se lavó el vial con un pequeño volumen de CM2 para eliminar cualquier célula residual en el vial. Se centrifugó a 400 x CF durante 5 minutos. Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió en 4 mL de CM2 caliente más 3000 UI/mL de IL-2. Se extrajeron 200 pL para el recuento de células utilizando el contador de células automatizado. Se registraron los recuentos.
Se resuspendieron las células a razón de 1.3 * 107 células/mL en CM2 caliente más 3000 UI/mL de IL-2. Se diluyeron las células de TIL desde 1.3 * 106 células/mL hasta 1.3 * 105 células/mL.
Establecimiento del cocultivo
Se diluyeron las células de TIL desde 1.3 * 106 células/mL hasta 1.3 * 105 células/mL. Se agregaron 4.5 mL de medio CM2 a un tubo cónico de 15 mL. Se retiraron las células de TIL de la incubadora y se resuspendieron bien utilizando una pipeta serológica de 10 mL. Se extrajeron 0.5 mL de células de la suspensión de TIL de 1.3 * 106 células/mL y se agregan a los 4.5 mL de medio en el tubo cónico de 15 mL. Se retornó el vial de reserva de los TIL a la incubadora. Se mezcló bien. Se repitió para la segunda línea de TIL.
Se transfirieron matraces con medios precalentados para un solo lote alimentador desde la incubadora al BSC. Se mezclaron las células alimentadoras pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces con una punta de pipeta de 1 mL y se transfirió 1 mL (1.3 * 107 células) a cada matraz para ese lote alimentador. Se agregaron 60 pL de solución de trabajo OKT3 (10 pg/mL) a cada matraz. Se retornaron los dos matraces de control a la incubadora.
Se transfirió 1 mL (1.3 * 105) de cada lote de los TIL al matraz T25 etiquetado correspondientemente. Se retornaron los matraces a la incubadora y se incubaron en posición vertical. No se perturbó hasta el día 5. Se repite para todos los lotes alimentadores analizados.
Día 5, cambio de medio
Se preparó CM2 con 3000 UI/mL de IL-2. Se necesitan 10 mL para cada matraz. Con una pipeta de 10 mL, se transfirieron 10 mL de CM2 caliente con 3000 UI/mL de IL-2 a cada matraz. Los matraces se devolvieron a la incubadora y se incubaron en posición vertical hasta el día 7. Se repite para todos los lotes alimentadores analizados.
Día 7, recolección
Se retiraron los matraces de la incubadora y se transfirieron al BSC, teniendo cuidado de no alterar la capa de células en el fondo del matraz. Sin alterar las células que crecen en el fondo de los matraces, se extrajeron 10 mL de medio de cada matraz de prueba y 15 mL de medio de cada uno de los matraces de control.
Utilizando una pipeta serológica de 10 mL, se resuspendieron las células en el medio restante y se mezclaron bien para romper cualquier conglomerado de células. Después de mezclar bien la suspensión celular mediante pipeteo, se extrajeron 200 pL para el recuento celular. Se recontaron los TIL utilizando el procedimiento operativo estándar apropiado junto con el equipo contador de células automático. Se registraron los recuentos en el día 7.
Se repitió para todos los lotes alimentadores analizados.
Los matraces de control alimentadores se evaluaron para detectar incompetencia de replicación y los matraces que contenían TIL se evaluaron para detectar las veces que hubo expansión a partir del día 0 de acuerdo con la Tabla TT a continuación.
Día 7, continuación de los matraces de control alimentadores hasta el día 14
Después de completar los recuentos del día 7 de los matraces de control alimentadores, se agregaron 15 mL de medio CM2 fresco que contenía 3000 UI/mL de IL-2 a cada uno de los matraces de control. Se devolvieron los matraces de control a la incubadora y se incubaron en posición vertical hasta el día 14.
Día 14, sin proliferación extendida de matraces de control alimentadores
Se retiraron los matraces de la incubadora y se transfirieron al BSC; se tuvo cuidado de no alterar la capa de células en el fondo del matraz. Sin alterar las células que crecen en el fondo de los matraces, se extrajeron aproximadamente 17 mL de medio de cada matraz de control. Utilizando una pipeta serológica de 5 mL, se resuspendieron las células en el medio restante y se mezcló bien para romper cualquier conglomerado de células. Se registraron los volúmenes de cada matraz.
Después de mezclar bien la suspensión celular mediante pipeteo, se extrajeron 200 pL para el recuento celular. Se contaron los TIL utilizando el procedimiento operativo estándar apropiado junto con el equipo contador de células automático. Se registraron los recuentos.
Se repitió para todos los lotes alimentadores analizados.
Resultados y criterios de aceptación
Resultados
La dosis de irradiación gamma fue suficiente para hacer que la replicación de las células alimentadoras fuera incompetente. Se esperaba que todos los lotes cumplieran con los criterios de evaluación y también demostraran una reducción en el número total viable de células alimentadoras restantes en el día 7 del cultivo REP en comparación con el día 0.
Se esperaba que todos los lotes alimentadores cumplieran con los criterios de evaluación de expansión de 100 veces el crecimiento de los TIL para el día 7 del cultivo REP.
Se esperaba que los recuentos del día 14 de los matraces de control alimentadores continuaran la tendencia no proliferativa observada el día 7.
Criterios de aceptación
Se cumplieron los siguientes criterios de aceptación para cada línea de TIL replicada analizada para cada lote de células alimentadoras.
La aceptación fue doble, como se detalla a continuación (en la Tabla 35 a continuación).
Tabla 35: Criterios de aceptación
Se evaluó si la dosis de radiación fue suficiente para incapacitar la replicación de las células alimentadoras de MNC cuando se cultivaron en presencia de 30 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2. La incompetencia de replicación se ev0aluó mediante el recuento total de células viables (TVC), determinado mediante el recuento celular automatizado el día 7 y el día 14 del REP
El criterio de aceptación fue "sin crecimiento", lo que significa que el número total de células viables no aumentó el día 7 y el día 14 con respecto al número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP
Se evaluó la capacidad de las células alimentadoras para soportar la expansión de los TIL. El crecimiento de los TIL se midió en términos de veces que se produjo expansión de células viables desde el inicio del cultivo el día 0 del REP hasta el día 7 del REP El día 7, los cultivos de los TIL alcanzaron una expansión mínima de 100 veces, (es decir, más de 100 veces el número total de células de TIL viables puestas en cultivo el día 0 de REP), de acuerdo con lo evaluado mediante recuento celular automatizado.
Pruebas de contingencia de lotes alimentadores de MNC que no cumplen con los criterios de aceptación
En el caso de que un lote alimentadorde MNC no cumpliera con ninguno de los criterios de aceptación descritos anteriormente, se seguirán las siguientes etapas para volver a analizar el lote y descartar que la causa sea un simple error del experimentador.
Si quedan dos o más viales de prueba satelital del lote, entonces se vuelve a analizar el lote. Si quedaba uno o ningún vial de prueba satelital restante del lote, entonces el lote fallaba de acuerdo con los criterios de aceptación enumerados anteriormente.
Para ser calificados, el lote en cuestión y el lote de control debían cumplir los criterios de aceptación anteriores. Una vez cumplidos estos criterios, el lote quedó liberado para su uso.
Ejemplo 4:Calificación de lotes individuales de células mononucleares de sangre periférica irradiadas con radiación gamma
Este ejemplo describe un nuevo procedimiento abreviado para calificar lotes individuales de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) irradiadas con rayos gamma para su uso como células alimentadoras alogénicas en los métodos ejemplares descritos en el presente documento. Este ejemplo proporciona un protocolo para la evaluación de lotes de células PBMC irradiadas para su uso en la producción de lotes clínicos de los TIL. Cada lote de PBMC irradiado se preparó a partir de un donante individual. A lo largo de más de 100 protocolos de calificación, se ha demostrado que, en todos los casos, los lotes de PBMC irradiados de SDBB (Banco de Sangre de San Diego) expanden los TIL más de 100 veces el día 7 de un REP Este protocolo de calificación modificado fue pensado para aplicarse a lotes de PBMC de donantes irradiados de SDBB que luego fueron sometidos a pruebas adicionales para verificar que la dosis recibida de radiación gamma fuera suficiente para volverlos incompetentes para la replicación. Una vez demostrado que mantuvieron la incompetencia de replicación durante el transcurso de 14 días, los lotes de PBMC de donantes se consideraron "calificados" para su uso para producir lotes clínicos de los TIL.
Antecedentes
Se requirieron PBMC de crecimiento detenido e irradiados con rayos gamma para el REP estándar actual de los TIL. Los receptores de membrana en las PBMC se unen al anticuerpo anti-CD3 (clon OKT3) y se entrecruzan con los TIL en el cultivo, estimulando la expansión de los TIL. Los lotes de PBMC se prepararon a partir de la leucocitaféresis de sangre completa extraída de donantes individuales. El producto de leucocitaféresis fue sometido a centrifugación sobre Ficoll-Hypaque, lavado, irradiado y criopreservado en condiciones de GMP
Es importante que a los pacientes que recibieron terapia con los TIL no se les infundan PBMC viables ya que esto podría provocar enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Por lo tanto, el crecimiento de las PBM<c>del donante se detiene al dosificar las células con irradiación gamma, lo que produce roturas de doble cadena de ADN y la pérdida de viabilidad celular de las PBMC al cultivarlas nuevamente.
Criterios de evaluación
7.2.1 El criterio de evaluación de los lotes de PBMC irradiados fue su incompetencia de replicación.
Configuración experimental
Los lotes alimentadores se probaron en formato mini-REP como si fueran a ser cocultivados con los TIL, utilizando matraces de cultivo de tejidos T25 en posición vertical. Lote de control: un lote de PBMC irradiadas, que históricamente había demostrado cumplir con el criterio de 7.2.1, se utilizó junto con los lotes experimentales como control. Para cada lote de PBMC de donante irradiado analizado, se procesaron matraces duplicados.
Protocolo experimental
Día 0
Se prepararon ~90 mL de medio CM2 para cada lote de PBMC del donante que se iba a analizar. Se mantuvo el CM2 caliente en un baño de agua a 37 °C. Se descongeló una alícuota de 6 * 106 UI/mL de IL-2. Se devolvió el medio CM2 al BSC y se limpió con EtOH al 70 % antes de colocarlo en la campana. Para cada lote de PBMC analizado, se extrajeron aproximadamente 60 mL de CM2 a una botella estéril separada. Se agregó IL-2 de la solución madre descongelada de 6 * 106 UI/mL a este medio para obtener una concentración final de 3000 UI/mL. Se etiquetó esta botella como "CM2/IL2" (o similar) para distinguirla del CM2 sin complemento.
Preparación de OKT3
Se retiró la solución madre de anti-CD3 (OKT3) del refrigerador a 4 °C y se colocó en el BSC. Se utilizó una concentración final de 30 ng/mL de OKT3 en el medio del mini-REP. Se preparó una solución de trabajo de 10 |jg/mL de anti-CD3 (OKT3) a partir de la solución madre de 1 mg/mL. Se colocó en el refrigerador hasta su uso.
Para cada lote de PBMC analizado, se prepararon 150 jL de una dilución 1:100 de la solución madre anti-CD3 (OKT3). Por ejemplo, para analizar 4 lotes de PBMC a la vez, se prepararon 600 jL de anti-CD3 (OKT3) de 10 jg/m L agregando 6 jL de la solución madre de 1 mg/mL a 594 jL de CM2 complementado con 3000 UI/mL de IL-2.
Preparación de matraces
Se agregaron 19 mL por matraz de CM2/IL-2 a los matraces T25 etiquetados y se colocaron los matraces en una incubadora humidificada a 37 °C, con 5 % de CO2 mientras se preparan las células.
Preparación de PBMC irradiadas
Se recuperaron viales de lotes de PBMC para ser analizados a partir del almacenamiento en LN2. Estos se colocaron a -80°C o se mantuvieron en hielo seco antes de descongelarlos. Se colocaron 30 mL de CM2 (sin complemento de IL-2) en tubos cónicos de 50 mL para cada lote a descongelar. Se etiquetó cada tubo con los diferentes números de lote de las PBMC que se descongelaron. Se taparon bien los tubos y se colocaron en un baño de agua a 37 °C antes de usarlos. Según fuera necesario, se devolvieron los tubos cónicos de 50 mL al BSC limpiando con EtOH al 70 % antes de colocarlos en la campana.
Se sacaron un vial de PBMC del almacenamiento en frío y se colocó en un soporte de tubos flotantes en un baño de agua a 37 °C para descongelarlo. Se dejó descongelar hasta que quedo una pequeña cantidad de hielo en el vial. Utilizando una pipeta de transferencia estéril, se transfirió inmediatamente el contenido del vial a los 30 mL de CM2 en el tubo cónico de 50 mL. Se extrajo aproximadamente 1 mL de medio del tubo para enjuagar el vial y se devolvió el enjuague al tubo cónico de 50 mL. Se tapó bien y se giro suavemente para lavar las células.
Se centrifugó a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Se aspire el sobrenadante y resuspendió el precipitado celular en 1 mL de CM2/IL-2 caliente utilizando una punta de pipeta de 1000 jL . Alternativamente, antes de agregar el medio, se resuspendió el precipitado celular arrastrando el tubo tapado a lo largo de una rejilla para tubos vacía. Después de resuspender el precipitado celular, se llevó el volumen a 4 mL utilizando medio CM2/IL-2. Se registró el volumen.
Se eliminó una pequeña alícuota (por ejemplo, 100 jL ) para el recuento de células utilizando un contador de células automatizado. Se realizaron recuentos por duplicado de acuerdo con el procedimiento operativo estándar del contador de células automatizado particular. Lo más probable es que haya sido necesario realizar una dilución de las PBMC antes de realizar los recuentos celulares. La dilución inicial recomendada fue 1:10, pero esto variaba dependiendo del tipo de contador de células utilizado. Se registraron los recuentos.
Se ajustó la concentración de PBMC a 1.3 * 107 células/mL utilizando medio CM2/IL-2. Se mezcló bien agitando suavemente o aspirando suavemente de arriba a abajo utilizando una pipeta serológica.
Preparación de matraces de cultivo
Se devolvieron dos matraces T25 etiquetados al BSC desde la incubadora de cultivo de tejidos. Se devolvió el vial de 10 pg/mL de anti-CD3/OKT3 al BSC. Se agregó 1 mL de la suspensión de células PBMC de 1.3 * 107 en cada matraz. Se agregaron 60 pL de anti-CD3/OKT3 de 10 pg/mL a cada matraz. Los matraces tapados se devolvieron a las incubadoras de cultivo de tejidos durante 14 días de crecimiento sin perturbaciones. Se colocó el vial de anti-CD3/OKT3 nuevamente en el refrigerador hasta que se necesitó para el siguiente lote. Se repitió para cada lote de PBMC a evaluar.
Día 14, medición de la no proliferación de PBMC
Se devolvieron los matraces T25 duplicados al BSC. Para cada matraz, utilizando una pipeta serológica nueva de 10 mL, se extrajeron ~17 mL de cada uno de los matraces y luego se extrajo con cuidado el medio restante para medir el volumen restante en los matraces. Se registró el volumen.
Se mezcló bien la muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo utilizando la misma pipeta serológica.
Se extrajo una muestra de 200 pL de cada matraz para realizar el recuento. Se contaron células utilizando un contador de células automatizado. Se repitieron las etapas para cada lote de PBMC que se evaluó.
Resultados y criterios de aceptación
Resultados
Se esperaba que la dosis de irradiación gamma fuera suficiente para hacer que la replicación de las células alimentadoras fuera incompetente. Se esperaba que todos los lotes cumplieran con el criterio de evaluación, demostrando una reducción en el número total viable de células alimentadoras restantes en el día 14 del cultivo REP en comparación con el día 0.
Criterio de aceptación
Se cumplieron los siguientes criterios de aceptación para cada lote de PBMC de donante irradiado analizado: "sin crecimiento" - significó que el número total de células viables en el día 14 fue menor que el número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP
Pruebas de contingencia de lotes de PBMC que no cumplen con los criterios de aceptación.
En el caso de que un lote de PBMC de donante irradiado no cumpliera con el criterio de aceptación anterior, se siguieron las siguientes etapas para volver a analizar el lote y descartar un simple error del experimentador como causa de su falla. Si quedaban dos o más viales satélite del lote, entonces se volvía a analizar el lote. Si queda uno o ningún vial satélite del lote, entonces el lote fue rechazado de acuerdo con el criterio de aceptación anterior.
Para ser calificado, un lote de PBMC que pasa por pruebas de contingencia tuvo que lograr que tanto el lote de control como ambas réplicas del lote en cuestión cumplieran el criterio de aceptación. Una vez cumplido este criterio, el lote quedó liberado para su uso.
Ejemplo 5:preparación de la solución madre de IL-2 (CellGenix)
Este Ejemplo describe el proceso de disolución de interleucina-2 humana recombinante purificada y liofilizada en muestras madre adecuadas para su uso en otros protocolos de cultivo de tejidos, incluidos todos aquellos descritos en la presente solicitud y los Ejemplos, incluidos aquellos que implican el uso de rhIL-2.
Procedimiento
Se preparó una solución de ácido acético al 0.2 % (HAc). Se transfirieron 29 mL de agua esterilizada a un tubo cónico de 50 mL. Se añadió 1 mL de ácido acético 1 N al tubo cónico de 50 mL. Se mezcló bien invirtiendo el tubo 2-3 veces. Se esterilizó la solución de HAc mediante filtración utilizando un filtro Steriflip.
Se preparó HSA al 1 % en PBS. Se agregaron 4 mL de solución madre de HSA al 25 % a 96 mL de PBS en una unidad de filtro estéril de 150 mL. Se filtró la solución. Se almacenó a 4°C. Para cada vial de rhIL-2 preparado, se completaron los formularios.
Se preparó una solución madre de rhIL-2 (concentración final de 6 * 106 UI/mL). Cada lote de rhIL-2 era diferente y se requería información que se encontraba en el Certificado de análisis (COA) del fabricante, tal como: 1) Masa de rhIL-2 por vial (mg), 2) Actividad específica de rhIL-2 (Ul/mg) y 3) Volumen de reconstitución recomendado de HAc al 0.2 % (mL).
Se calculó el volumen de HSA al 1%requerido para el lote de rhIL-2 utilizando la siguiente ecuación:
Por ejemplo, de acuerdo con el COA del lote 10200121 de rhIL-2 de CellGenix, la actividad específica para el vial de 1 mg es 25 * 106 Ul/mg. Se recomienda reconstituir la rhIL-2 en 2 mL de HAc al 0.2 %.
Se limpió el tapón de goma del vial de IL-2 con una toallita con alcohol. Utilizando una aguja 16G conectada a una jeringa de 3 mL, se inyectó el volumen recomendado de HAc al 0.2 % en el vial. Se tuvo cuidado de no aflojar el tapón al retirar la aguja. Se invirtió el vial 3 veces y se agitó hasta que todo el polvo se disolvió. Se retiró con cuidado el tapón y se dejó sobre una toallita con alcohol. Se agregó el volumen calculado de HSA al 1 % al vial.
Almacenamiento de la solución de rhIL-2. Para almacenamiento a corto plazo (<72 horas), el vial se debe almacenar a 4 °C. Para almacenamiento a largo plazo (superior a 72 horas), se deben dividir los viales en alícuotas más pequeñas y almacenar en crioviales a -20 °C hasta que estén listos para su uso. Se evitaron ciclos de congelación/descongelación. Expiró 6 meses después de la fecha de preparación. Las etiquetas de Rh-IL-2 incluían el número de proveedor y catálogo, número de lote, fecha de vencimiento, iniciales del operador, concentración y volumen de alícuota.
Ejemplo 6:Proceso de crioconservación
Este ejemplo describe el método del proceso de criopreservación para TIL preparados con el procedimiento cerrado y abreviado descrito en el Ejemplo G utilizando el congelador de velocidad controlada CryoMed, modelo 7454 (Thermo Scientific).
El equipo utilizado fue el siguiente: estante porta casetes de aluminio (compatible con bolsas de congelación CS750), casetes de crioalmacenamiento para bolsas de 750 mL, tanque de nitrógeno líquido de baja presión (22 psi), refrigerador, sensor de termopar (tipo cinta para bolsas) y bolsas de congelación CryoStore CS750 (OriGen Scientific).
El proceso de congelación permite una velocidad de 0.5 °C desde la nucleación hasta -20 °C y una velocidad de enfriamiento de 1 °C por minuto hasta una temperatura final de -80 °C. Los parámetros del programa son los siguientes: Etapa 1 - esperar a 4 °C; Etapa 2: 1.0 °C/min (temperatura de la muestra) hasta -4 °C; Etapa 3: 20.0 °C/min (temperatura de la cámara) hasta -45 °C; Etapa 4: 10.0 °C/min (temperatura de la cámara) hasta -10.0 °C; Etapa 5: 0.5 °C/min (temperatura de la cámara) hasta -20 °C; y Etapa 6: 1.0 °C/min (temperatura de la muestra) hasta -80 °C.
Ejemplo7:Uso del cóctel de citoquinas IL-2, IL-15 e IL-21
Este ejemplo describe el uso de las citocinas IL-2, IL-15 e IL-21, que sirven como factores de crecimiento de células T adicionales, en combinación con el proceso de TIL de los Ejemplos 1 a 6.
Utilizando el proceso de los Ejemplos 1 a 9, se cultivaron los TIL a partir de tumores colorrectal, de melanoma, de cuello uterino, de mama triple negativo, de pulmón y renal en presencia de IL-2 en una parte del experimento y, en lugar de IL-2, una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 en otra parte al inicio del cultivo. Al finalizar el pre-REP, se evaluaron los cultivos para determinar la expansión, el fenotipo, la función (CD107a+ e IFNy) y el repertorio de TCR Vp. La IL-15 y la IL-21 se describen en otras partes de este documento y en Gruijl et al., IL-21 promueve la expansión de linfocitos infiltrantes de tumores CD27+CD28+ con alto potencial citotóxico y baja expansión colateral de células T reguladoras, Santegoets, SJ, J Transl Med., 2013, 11:37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/).
Los resultados mostraron una mayor expansión de los TIL (superior a 20 %), tanto en células CD4+ y CD8+ y se observaron las condiciones tratadas con IL-2, IL-15 e IL-21 en múltiples histologías en relación con las condiciones tratadas solo con IL-2. Hubo una tendencia hacia un predominio de la población de CD8+ con un repertorio de TCR Vp sesgado en los TIL obtenidos de los cultivos tratados con IL-2, IL-15 e IL-21 en relación con los cultivos tratados solo con IL-2. IFN<y>y CD107a estaban elevados en los TIL tratados con IL-2, IL-15 e IL-21, en comparación con los TIL tratados solo con IL-2.
Ejemplo 8:Expansión de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de aspirados con aguja fina (FNA) y biopsias con aguja gruesa
1. Antecedentes
Este ejemplo proporciona datos relacionados con la expansión de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a partir de muestras de tumores obtenidas mediante aspirados con aguja fina o biopsias con aguja gruesa.
El objetivo del estudio fue desarrollar un método para expandir los TIL a partir de biopsias con aguja gruesa o aspirados con aguja fina. En algunos casos, se obtuvieron de 3 a 5 muestras de tumores de pacientes con cáncer, tales como cáncer de pulmón (n = 3), melanoma (n = 1), cáncer de cabeza y cuello (n = 1), cáncer de cuello uterino (n = 1), cáncer de ovario (n = 3), cáncer de páncreas (n = 2), glioblastoma (GBM) y cáncer colorrectal (n = 1).
II. TIL expandidos a partir de biopsias con aguja gruesa de un paciente con cáncer de páncreas (P7015).
Se recibieron biopsias con aguja gruesa del páncreas para el estudio. Se colocó una biopsia con aguja gruesa en un pocillo de una placa de 24 pocillos para un total de 5 pocillos. Cuando se colocaron las biopsias con aguja gruesa en dos pocillos, se observó poco o ningún crecimiento en estos pocillos. Se trataron tres pocillos con medio de cultivo complementado con IL-2 y dos pocillos se trataron con medio de cultivo complementado con un cóctel de citocinas que contenía IL-2, IL-15 e IL-21. Se observaron células viables en los pocillos tratados solo con IL-2 (Figura 8A) y en los pocillos tratados con el cóctel de citocinas (Figura 8B). Se obtuvieron aproximadamente 1.3 * 106 células viables/pocillo (1.2 * 106 células viables/pocillo en promedio) con el tratamiento con IL-2. Se obtuvieron aproximadamente 2.3 * 106 células viables/pocillo (2.0 * 106 células viables/pocillo en promedio) con el tratamiento de cóctel de citocinas.
Las Figuras 17A, 17B y 17C muestran el fenotipado y el estado funcional de los TIL derivados de una biopsia con aguja gruesa de tumores de páncreas. Los TIL se expandieron a partir de tumores de páncreas y se cultivaron en un medio que contenía IL-2 o un medio complementado con aditivos de cultivo celular. Los TIL se expandieron a partir de tumores de páncreas en un medio de cultivo complementado con IL-2 y en un medio de cultivo que contenía aditivos de cultivo celular (Figura 17D). La Figura 17A muestra el porcentaje de células que eran CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD3+/CD56+ o CD3-/CD56+. La Figura 17B muestra el porcentaje de células CD107a en la subpoblación CD4+ después de la estimulación con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) en comparación con una condición no estimulada. La Figura 17C muestra el análisis funcional de los TIL expandidos de la biopsia con aguja gruesa del páncreas. El gráfico muestra el porcentaje de células CD107a en la subpoblación de CD8+ después de la estimulación con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) en comparación con una condición no estimulada.
La mayoría de las células expandidas de las biopsias con aguja gruesa del páncreas son células T (células CD4+ y células CD8+). La estimulación con PMA demostró la capacidad de la CD8+ para desgranularse como lo indica la expresión de CD107a+, lo que sugiere que estas células son funcionales. El % de CD8+ que expresa CD107a+ fue mayor en los pocillos tratados con los pocillos de aditivo de cultivo en comparación con IL-2 sola (Figura 17C).
III. TIL expandidos a partir de aspirados con aguja fina de un paciente con carcinoma de cuello uterino (C2005).
Se recibió un tumor de cuello uterino para el estudio. Se aislaron cinco aspirados con aguja fina del tumor utilizando una aguja de calibre 22 y una jeringa. Cada muestra de FNA se colocó en al menos tres pocillos de una placa de 24 pocillos. Se trataron dos pocillos de cada muestra con IL-2 y un pocillo de cada muestra se trató con el cóctel de citocinas (IL-2, IL-15 e IL-21).
La Figura 10A muestra que las células T CD4+ y CD8+ estaban presentes en las FNA tratadas con IL-2. En promedio 3.45 * 105 células viables/pocillo estaban presentes en los pocillos tratados con IL-2. La Figura 10B muestra que las células T CD4+ y CD8+ estaban presentes en las FNA tratadas con el cóctel de citocinas. En promedio estaban presentes 8.69 * 105 células viables/pocillo en estos pocillos. Los aspirados tratados con IL-2, IL-15 e IL-21 demostraron más células/pocillo en comparación con los aspirados tratados con IL-2. El porcentaje de células CD8+ fue mayor en los pocillos tratados con cóctel (20.1 %) en comparación con los pocillos tratados con IL-2 (8.58 %).
IV. TIL expandidos a partir de aspirados con aguja fina de un paciente con carcinoma de pulmón (L4032).
Se recibieron tres tumores de pulmón para el estudio. Se aislaron aspirados con aguja fina de los tumores utilizando una aguja de calibre 22 y una jeringa. Una muestra de FNA incluía 1.6 * 106 células con 28 % de células viables. Se trataron dos pocillos (cada condición) con medio de cultivo complementado con (1) IL-2 sola o (2) el cóctel de citocinas. Además, se cultivaron fragmentos de tumores de pulmón en una placa de 24 pocillos (dos pocillos cada una) como control. Las células se recolectaron el día 13 y se evaluaron mediante análisis FACS.
La Figura 11A muestra que las células T se expandieron a partir de una muestra de FNA tratada con IL-2. Había en promedio aproximadamente 4.64 * 105 células viables/pocillo. La Figura 11B muestra que las células T se expandieron a partir de una muestra de FNA tratada con el cóctel que contenía IL-2, IL-15 e IL-21. Había en promedio aproximadamente 7.75 * 105 células viables/pocillo. La Figura 11C muestra que las células T se expandieron a partir de un fragmento de tumor pulmonar tratado con IL-2. Había en promedio aproximadamente 4.28 * 105 células viables/pocillo.
A continuación, los TIL cultivados a partir de las muestras de FNA se expandieron utilizando un protocolo de expansión rápida (por ejemplo, segundo protocolo de expansión o etapa D). Las células se recolectaron el día 14 y se evaluaron mediante análisis FACS. La Figura 12A muestra el recuento total de células de los TIL expandidos de las muestras de FNA tratadas con (i) IL-2, (ii) IL-2, IL-15 e IL-21, y (iii) IL-2, IL-15 e IL-21 en IL-2. La Figura 12A muestra que después de la segunda expansión, los TIL incluyeron células T CD4+ y CD8+ (84.1 % y 10.3 %, respectivamente).
V. TIL expandidos a partir de aspirados con aguja fina de un paciente con carcinoma de pulmón (L4033).
Se aisló un aspirado con aguja fina de un tumor pulmonar utilizando una aguja de calibre 22 y una jeringa. La muestra de f Na incluía 5.5 * 106 células con 76 % de células viables. Se trató un matraz G-Rex 10 (de cada condición) con medio de cultivo que contenía (1) IL-2 sola o (2) el cóctel de citocinas. Además, se cultivaron cuatro fragmentos de tumor pulmonar en un matraz G-Rex 10 como control. Las células se recolectaron el día 12 y se evaluaron mediante análisis FACS. La Figura 13A muestra que las células T CD4+ (4.25 %) y las células T CD8+ (55.1 %) se obtuvieron de la muestra de FNA tratada con IL-2. La Figura 13B muestra que las células T CD4+ (7.76 %) y las células T CD8+ (54.5 %) se obtuvieron de los fragmentos de tumor tratados con IL-2.
A continuación, los TIL cultivados a partir de las muestras de FNA se expandieron utilizando un protocolo de expansión rápida (por ejemplo, segundo protocolo de expansión o etapa D). Los aspirados se incubaron durante los primeros 6 días en un tubo cónico. Las células se recolectaron el día 14 y se evaluaron mediante análisis FACS. La Figura 14 muestra el recuento total de células de los TIL expandidos de las muestras de FNA y los fragmentos de tumor tratados con IL-2. El gráfico muestra que los TIL de las muestras de FNA se expandieron de manera similar a los TIL de los fragmentos de tumor.
En un experimento similar, se aislaron muestras de FNA de tres muestras de tumores de pulmón de un paciente con carcinoma pulmonar (L4034). Se cultivaron aproximadamente 1.0 * 106 células de una muestra de FNA en un matraz G-Rex 10 durante 15 días en un medio de cultivo complementado solo con IL-2. Como control, se cultivaron cuatro fragmentos de tumor en un medio de cultivo de matraz G-Rex 10 complementado solo con IL-2. Se obtuvieron pocas o ninguna célula detectable del cultivo de FNA.
VI. TIL expandidos a partir de aspirados con aguja fina de pacientes con carcinoma de ovario (OV8011, OV8012 y OV8013).
Se recibieron tres tumores de ovario (OV8011, OV8012 y OV8013) para el estudio. Se aislaron aspirados con aguja fina de los tumores utilizando una aguja de calibre 22 y una jeringa.
La muestra de FNA de OV8011 incluía 3.19 * 105 células con 28 % de células viables. Esta muestra de FNA se dividió en cuatro pocillos; dos pocillos se cultivaron en medio de cultivo que contenía IL-2 y dos pocillos se cultivaron en medio de cultivo que contenía IL-2, IL-15 e IL-21. La muestra de FNA de OV8012 incluía 8.3 * 105 células con 11 % de células viables. Esta muestra de FNA se dividió en dos pocillos; un pocillo se cultivó en un medio de cultivo que contenía IL-2 y el otro pocillo se cultivó en un medio de cultivo que contenía IL-2, IL-15 e IL-21. La muestra de FNA de OV8013 incluía 1.5 * 105 células con 7 % de células viables. Esta muestra de FNA se dividió en dos pocillos; un pocillo se cultivó en un medio de cultivo que contenía IL-2 y el otro pocillo se cultivó en un medio de cultivo que contenía IL-2, IL-15 e IL-21. No se observó expansión en las muestras de FNA.
Como control, se cultivaron cuatro fragmentos de tumor de cada tumor en un matraz G-Rex 10. Algunos matraces recibieron medio de cultivo que contenía IL-2 solamente y otros matraces recibieron medio de cultivo que contenía IL-2, IL-15 e IL-21. La Figura 15 muestra los recuentos celulares totales de las células derivadas de los fragmentos de tumor de ovario cultivados en medio de cultivo que contenía (1) IL-2 sola o (2) el cóctel de citocinas. Los resultados muestran que los tumores de ovario se expandieron pobremente en la primera expansión.
VII. TIL expandidos a partir de aspirados con aguja fina de un paciente con melanoma (M1101).
Se recibió un tumor de melanoma (M1101) para el estudio. Se obtuvo una muestra de FNA del tumor. La muestra incluía 1.96 * 106 células con 65 % de células viables. La muestra se colocó en un matraz G-Rex 10 y se trató con medio de cultivo complementado con IL-2. Como control, cuatro fragmentos de tumor de melanoma se colocaron en un matraz G-Rex 10 y se trataron con medio de cultivo complementado con IL-2. Las células se recolectaron el día 12. La Figura 16A muestra que las células T CD4+ (21.4 %) y las células T CD8+ (52.8 %) se expandieron a partir de la muestra de FNA tratada con IL-2. La Figura 16B muestra que las células T CD4+ (18.0 %) y las células T CD8+ (71.5 %) se expandieron a partir de los fragmentos de tumor tratados con IL-2.
Las Figuras 18A y 18B proporcionan un resumen de los resultados obtenidos de las biopsias con aguja gruesa y los aspirados con aguja fina.
VIII. TIL expandidos a partir de aspirados con aguja fina de un paciente con melanoma (M1101).
El día 11 del pre-REP, se realizaron recuentos celulares en los matraces que contenían el aspirado y los fragmentos (n = 2). Los cultivos pre-REP que contenían los fragmentos se recolectaron el día 11 (Gen2). Se continuó con el cultivo pre-REP que contenía el aspirado debido al bajo recuento de células en el día 11. El aspirado se volvió a contar el día 18 y luego nuevamente el día 21 (Figura 19A). El día 21, el cultivo había alcanzado casi 60 * 106 células, las células se recolectaron en este momento y se evaluaron mediante citometría de flujo. Se demostró que el fenotipo (Figura 19B) y la función (expresión de CD107a, Figura 19C) de los TIL pre-REP de los fragmentos y aspirados eran comparables.
Las Figuras 19A, 19B y 19C muestran la expansión de los TIL de una muestra de FNA de otro paciente con melanoma (M1107). La Figura 19A muestra el recuento total de células en diferentes momentos durante la expansión. La Figura 19B muestra el fenotipo de los TIL expandidos. La Figura 19C muestra el análisis funcional de los TIL expandidos a partir de fragmentos y aspirados. El gráfico muestra el porcentaje de células CD107a en las subpoblaciones CD4+ y CD8+ después de la estimulación con PMA en comparación con una condición no estimulada.
Ejemplo 9:Expansión de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a partir de aspirados con aguja fina (FNA) y biopsias con aguja gruesa
I. Biopsias con aguja gruesa de páncreas: los datos se muestran en las Figuras 20-29.
Se informaron quince tumores (de páncreas, pulmón, cuello uterino, mesotelioma, colorrectal). Hasta la fecha, se han recibido 37 muestras de tumores de diferente histología, incluidos cánceres de páncreas, cuello uterino, pulmón, boca y esófago, sarcoma.
Al llegar, los tumores se fragmentaron y se colocaron en matraces/placas con IL-2 para un protocolo de expansión rápida previo (REP). Los TIL pre-REP se propagaron aún más en un protocolo REP en presencia de PBMC irradiadas, anticuerpo anti-CD3 (30 ng/mL) e IL-2 (3000 UI/mL). Los TIL pre-REP de pulmón y sarcoma se expandieron a partir de 4 fragmentos de tumor en formato de placa de 24 pocillos durante hasta 22 días. Otros cánceres se expandieron a partir de 4 fragmentos de tumor en TIL de G-REX durante hasta 22 días. II. Los TIL se pueden expandir a partir de biopsias con aguja gruesa de cáncer de páncreas: datos que se muestran en las Figuras 30-37.
Conclusiones generales
La cinética de crecimiento demostró muy pocas células el día 11-12 tanto en P7028 como en P7031, sin embargo, se demostró una expansión significativa entre el día 21-28.
La mayoría de las células expandidas de las biopsias con aguja gruesa del páncreas son células T y fenotípicamente CD4+. Los TIL aislados de tumores de páncreas son típicamente CD4+.
La estimulación con PMA demostró la capacidad del CD4+ para desgranularse como lo indica la expresión de CD107a+, lo que sugiere que estas células son funcionales, como se demostró en los estudios anteriores con P7015. La expresión de cD107a fue similar en los TIL derivados de fragmentos.
Los TIL derivados de biopsias con aguja gruesa secretaron niveles significativos de IFN<y>en un ensayo de reestimulación con anti-CD3 unido a placa, similar a los TIL derivados de fragmentos.
Un fenotipado extenso demostró una expresión similar de la mayoría de los marcadores evaluados en los TIL derivados de fragmentos de tumor, lo que sugiere que el resultado del crecimiento de los TIL a partir de biopsias con aguja gruesa es similar al de los fragmentos.
El panel de agotamiento/activación demostró diferencias significativas en PD-1, Tim3 y KLRG1 en las células CD4+ y LAG3, Tim3 y KLRG1 en las células CD8+. Se requieren estudios adicionales de biopsias con aguja gruesa de páncreas para validar estos hallazgos.
Propuestas generales:
Estos resultados sugieren que el proceso para cultivar TIL con éxito a partir de biopsias con aguja gruesa del páncreas (y otras histologías) probablemente requerirá tiempo adicional en cultivo (más allá de los requisitos pre-REP para Gen2), a menos que se utilicen "estrategias de ajuste" adicionales para mejorar el crecimiento (véase a continuación).
Con base en los datos preliminares de crecimiento en biopsias con aguja gruesa de páncreas, se recomienda que el proceso pre-REP se realice entre el día 21 y 28, para obtener suficientes células.
Para este proceso el pre-REP debe iniciarse en G-Rex 10 o G-Rex 10M con medio CM1 e IL-2/IL-15/IL-21. El REP debe iniciarse en un G-Rex 100M o G-Rex 500M, dependiendo del recuento de células pre-REP. G-Rex 500M: si el recuento de células es 5 * 107.
G-Rex 100M: si el recuento de células está entre 1-5 * 107.
Se utilizarán experimentos futuros para determinar el número mínimo de células necesarias para un crecimiento celular suficiente en cada recipiente.
Los experimentos futuros compararán el crecimiento, el fenotipo y la función de biopsias con aguja gruesa de páncreas expandidos en IL-2/IL-15/IL-21 solo o con IL-2/IL-15/IL-21 con OKT3 y alimentadores.
Ejemplo 10:Expansión de TIL usando biopsias con aguja gruesa
Razón fundamental:
La extirpación/resección del tumor no es adecuada ni factible para todos los pacientes. En esta cohorte de pacientes, las biopsias con aguja gruesa pueden ser una fuente de los TIL para ACT (terapia celular adoptiva). Estas biopsias con aguja gruesa permiten tomar muestras de múltiples lesiones y potencialmente obtener un repertorio de los TIL más amplio.
Estrategia:
El presente ejemplo proporciona un método para expandir los TIL a partir de biopsias con aguja gruesa, de múltiples histologías y desarrollar un proceso definido que sea factible para la producción de los TlL a partir de biopsias con aguja gruesa. Véase, por ejemplo, la Figura 38, que proporciona un diagrama de dos procesos ejemplares.
Datos
Se ha demostrado la capacidad de expandir las biopsias de los TIL para biopsias con aguja gruesa pancreáticas utilizando Gen2, que también mostró que los TIL obtenidos de biopsias son fenotípica y funcionalmente comparables a los TIL obtenidos de fragmentos.
Se trataron siete conjuntos de biopsias con aguja gruesa del páncreas (entre 7-10 biopsias con aguja gruesa) con IL-2/IL-15/IL-21 y se les realizó una REP previa y se evaluó su expansión. Tres se expandieron con éxito, sin embargo, el crecimiento fue extremadamente variable. Los cultivos pre-REP requirieron al menos 21-28 días para adquirir una cantidad suficiente de células (por ejemplo, 21-28 días para las etapas A a E de la Figura 7). Un fenotipado extenso demostró una expresión similar de la mayoría de los marcadores evaluados en los TIL derivados del fragmento de tumor pancreático. La expresión de CD107a e IFNy fue similar en los TIL derivados de fragmentos.
Protocolo actual:
La adición de OKT3 y alimentadores en el día 3 del cultivo mejoró el rendimiento de los TIL. Se cultivan menos biopsias con aguja gruesa por matraz y se evalúa el crecimiento (por ejemplo, se cultivan 1 o 2 biopsias con aguja gruesa).
Se sometieron 1-2 biopsias con aguja gruesa (3 de páncreas, 4 de melanoma, 1 de mama y 1 de ovario) a un proceso de escala de investigación modificado que incluía la adición de OKT3 alimentadores en el día 3 (véase las Figuras 39-40).
• Los TIL fueron sometidos a un segundo REP (por ejemplo, una segunda expansión).
• Se expandieron las biopsias con aguja gruesa de páncreas /- IL15 y 21 (el cóctel triple; REP1 y REP2; por ejemplo, una primera expansión y una segunda expansión)
• Las biopsias con aguja gruesa de ovario fueron tratadas con /- OX40 (BMS) (n = 1, datos preliminares). • Todos los TIL fueron sometidos a un segundo REP
Pancreático
Los TIL de biopsias con aguja gruesa de páncreas se expandieron con éxito en presencia de OKT3 alimentadores. Se adquirieron más de 50e6 células entre el día 11-17 de la primera expansión.
Generalmente se necesitaban dos biopsias con aguja gruesa para adquirir la cantidad adecuada de células. La adición del cóctel triple (TC: IL-2, IL-15/IL-21) a los segundos REP (ya sea cultivado previamente en IL-2 o en TC) no alteró significativamente la expansión de los TIL en comparación con IL-2 sola.
La adición de OKT3 alimentadores en el día 3 a las biopsias con aguja gruesa no altera significativamente el fenotipo (memoria, CD27/CD28, agotamiento, activación) de los TIL en comparación con las biopsias con aguja gruesa cultivadas en condiciones similares a Gen2. El fenotipo (memoria, CD27/CD28, agotamiento, activación) de los TIL expandidos a través de 2 REP no difirió significativamente del de los TIL cultivados utilizando condiciones de Gen2.
La expresión de CD107a no varió significativamente con la adición de OKT3 y alimentadores. Los TIL expandidos a través de 2 REP mantuvieron la capacidad de responder a estímulos no específicos, de acuerdo con lo evaluado mediante la inducción de CD107a.
Los TIL expandidos a través de 2 REP mantuvieron la capacidad de responder a estímulos no específicos, de acuerdo con lo evaluado mediante la inducción de CD107a.
Se evaluó la secreción de IFN<y>. Los TIL producen IFN<y>tras la estimulación con OKT3.
Los TIL de páncreas se pueden expandir a partir de biopsias con aguja gruesa de cáncer de páncreas. Resumen y resultados experimentales pre-REP de P7028 y P7031
Las biopsias con aguja gruesa se colocaron en un G-Rex 10 con el cóctel triple (IL-2/IL-15/IL-21)
Los TIL P7028 se evaluaron el día 12 y se mantuvieron en cultivo hasta el día 19.
Recuento de células: día 12= 1.61 * 106 células viables; día 21 3.49 * 107 células viables
Los TIL P7030 se evaluaron el día 12 y se mantuvieron en cultivo hasta el día 27.
Recuento de células: día 12= 1.52 * 105 células viables; día 27: 1.14 * 107 células viables
Melanoma
Los TIL derivados de biopsias con aguja gruesa de melanoma se expandieron con éxito en presencia de OKT3 alimentadores (n = 4). Se adquirieron más de 50 * 106 células el día 12 de la primera expansión.
Generalmente se necesitaban una o dos biopsias con aguja gruesa para adquirir la cantidad adecuada de células. La adición de OKT3 alimentadores en el día 3 a las biopsias con aguja gruesa no altera significativamente el fenotipo (memoria, CD27/CD28, agotamiento, activación) de los TIL en comparación con los fragmentos que utilizan condiciones similares a Gen2.
Los TIL expandidos a través de 2 REP respondió a estímulos no específicos, de acuerdo con lo evaluado por la movilización de CD107a y la secreción de IFN<y>.
Pulmón
Los TIL de 1 biopsia con aguja gruesa del pulmón se expandieron con éxito en presencia de IL-2 OKT3 alimentadores en el día 0. Se adquirieron más de 50 * 106 el día 11.
El fenotipo (memoria, CD27/CD28, agotamiento, activación) de los TIL expandidos a través de 2-REP varió levemente respecto de los TIL expandidos a partir de biopsias con aguja gruesa tratados con OKT3 alimentadores en el día 3 del inicio del cultivo. Se observó un aumento en la proporción de CD8+/CD4+ en biopsias con aguja gruesa tratadas el día 3.
Se observaron ligeras diferencias en la expresión de CD28, CD69, CD39, CD49a, Tim3 y CD101 entre las condiciones de cultivo del día 0 y el día 3.
Los TIL produjeron IFNy tras la estimulación con anti-CD3. Las biopsias con aguja gruesa de pulmón tratadas con OKT3 alimentadores del día 0 tuvieron mayores niveles de IFN<y>en comparación con las biopsias con aguja gruesa de pulmón tratadas con OKT3 alimentadores del día 3.
Los TIL expandidos a través de 2 REP mantuvieron la capacidad de responder a estímulos no específicos, de acuerdo con lo evaluado mediante la inducción de CD107a.
Los TIL CD8+ de las biopsias con aguja gruesa de pulmón tratadas con OKT3 alimentadores del día 3 fueron oligoclonales en comparación con los TIL con biopsias con aguja gruesa pulmonares tratados con OKT3 alimentadores del día 0, lo que indica un repertorio de TCR diferente de acuerdo con el momento de la adición de los OKT3 alimentadores.
Conclusiones
La adición de OKT3 alimentadores a las biopsias con aguja gruesa en el día 3 de cultivo mejoró significativamente el rendimiento de los TIL. Se adquirieron más de 50 * 106 células (umbral de iniciación de REP2) entre 11-15 días después de la primera expansión en todas las histologías evaluadas (páncreas, melanoma, mama y ovario). Dos biopsias con aguja gruesa (en las histologías ensayadas) fueron suficientes para adquirir el número de células requeridas.
Los TIL de al menos 2 biopsias con aguja gruesa de mama se expandieron con éxito en presencia de IL-2 OKT3 alimentadores, pero no IL-2 sola. Se adquirieron más de 50 * 106 células el día 11. Una o dos biopsias con aguja gruesa son suficientes para adquirir el número de células requeridas.
Los datos sugieren que el fenotipo y la función de los TIL expandidos a partir de biopsias con aguja gruesa (con OKT3 alimentadores tempranos) son similares a las biopsias con aguja gruesa/fragmentos expandidos en condiciones de Gen2 (IL-2 sola). La adición de OX40 en las biopsias con aguja gruesa de ovario mejoró la expansión de los TIL en comparación con IL-2 sola.
1-2 biopsias con aguja gruesa de páncreas no lograron expandirse con IL-2 sola.
Se realizarán experimentos de lado a lado con fragmentos /- OKT3 alimentadores en el día 3. Los TIL produjeron IFN<y>tras la estimulación con OKT3 y se están realizando más experimentos. Se observaron diferencias en KLRG1, CD25 y PD1 en las biopsias con aguja gruesa de ovario tratadas con /- OX40 (población terapéutica de TIL).
Se evaluaron y continúan evaluándose el fenotipo, la función (potencia) y el repertorio TCR (actualmente en curso). La adición de OKT3 alimentadores en el día 3 a las biopsias con aguja gruesa no alteró significativamente el fenotipo (memoria, CD27/CD28, agotamiento, activación) de los TIL en comparación con los fragmentos que utilizaron condiciones similares a Gen2. Los TIL expandidos a través de 2 REP respondieron a estímulos no específicos, de acuerdo con lo evaluado por la movilización de CD107a y la secreción de IFNy. El fenotipo (memoria, CD27/CD28, agotamiento, activación) de los TIL expandidos a través de 2-REP no difirió significativamente del de los TIL expandidos utilizando un proceso de 1-REP (es decir, sin OKT3 alimentadores durante la primera expansión) en biopsias con aguja gruesa de mama.
Se observaron ligeras diferencias en la expresión de KLRG1 y PD1.
Los TIL expandidos a través de 2 REP mantuvieron la capacidad de responder a estímulos no específicos, de acuerdo con lo evaluado mediante la inducción de CD107a.
Se realizará una evaluación adicional que incluirá /- la extracción de biopsias con aguja gruesa el día 3, así como también una evaluación adicional del efecto del anti-OX40 en los TIL expandidos.
Ejemplo 11:Expansión de TIL a partir de biopsias con aguja gruesa de mama y ovario usando OKT3 alimentadores: resumen de los Ejemplos 9-10
Los TIL de al menos 2 biopsias con aguja gruesa de mama se expandieron con éxito en presencia de IL-2 OKT3 alimentadores, pero no IL-2 sola. Se adquirieron más de 50 * 106 células el día 11.
La adición de OX40 en las biopsias con aguja gruesa de ovario mejoró la expansión de los TIL en comparación con IL-2 sola.
El fenotipo (memoria, CD27/CD28, agotamiento, activación) de los TIL expandidos a través de 2-REP no difirió significativamente del de los TIL expandidos utilizando un proceso de 1-REP (es decir, no hay OKT3 alimentadores durante la primera expansión) en biopsias con aguja gruesa mamarias.
Se observaron ligeras diferencias en la expresión de KLRG1 y PD1.
Se observaron diferencias en KLRG1, CD25 y PD1 en las biopsias con aguja gruesa de ovario tratadas con /-OX40 (producto final).
Los TIL producen IFN<y>tras la estimulación con OKT3.
Los TIL expandidos a través de 2 REP mantuvieron la capacidad de responder a estímulos no específicos, de acuerdo con lo evaluado mediante la inducción de CD107a.
La adición de OKT3 alimentadores a las biopsias con aguja gruesa en el día 3 mejoró significativamente el rendimiento de los TIL. Se adquirieron más de 50 * 106 células (umbral de iniciación de REP en condiciones de Gen2) entre 11-15 días en todas las histologías evaluadas (páncreas, melanoma, mama y ovario). Dos biopsias con aguja gruesa (en las histologías ensayadas) son suficientes para adquirir el número de células requeridas. Los datos preliminares sugieren que el fenotipo y la función de los TIL expandidos a partir de biopsias con aguja gruesa (con OKT3 alimentadores tempranos) son similares a las biopsias con aguja gruesa/fragmentos expandidos en condiciones de control.
Ejemplo 12:Expansión de TIL desde aspirados con aguja
Estrategia:
Expansión de TIL a partir de aspirados con aguja, de múltiples histologías y desarrollo de un proceso definido que sea factible para la producción de los TIL. Estudios preliminares demostraron que los TIL podrían expandirse a partir de "algunos" aspirados realizados en condiciones óptimas (es decir, tomados directamente de biopsias de tumor).
Se aislaron 22 aspirados de biopsias tumorales de diversas histologías en Iovance utilizando condiciones de Gen2 (es decir, sin OKT3 y alimentadores en el día 3). Se observó crecimiento en 6 tumores (1 de cuello uterino, 2 de pulmón y 3 de melanoma). El número de células aisladas durante el pre-REP estuvo muy por debajo del umbral de 50 * 106 células.
Además, se han recibido 10 aspirados con aguja, incluidos tres de melanoma (n-3) y siete de mama (n-7). Los aspirados fueron tratados con OKT3 y alimentadores.
Debido al pequeño número inicial de células, la mayoría de los experimentos se iniciaron en una placa de 96 pocillos. Se obtuvieron menos de 50 * 106 células el día 11 en todos los aspirados. Se necesitarían varios subcultivos para adquirir la cantidad necesaria de células.
Ejemplo 13:Expansión de TIL a partir de biopsias con aguja gruesa del tumor
Introducción
La terapia de células T adoptivas (ACT) con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) autólogos ha demostrado eficacia clínica en pacientes con melanoma metastásico y carcinoma de cuello uterino. Actualmente los TIL se expanden a partir de tumores fragmentados que se extirpan quirúrgicamente. Desafortunadamente, los pacientes con tumores irresecables actualmente no califican para la terapia con TIL. Si la expansión de los TIL fuera posible a partir del tipo de muestras de tumores pequeños que utilizan los médicos para fines de diagnóstico y estadificación, estudios correlacionales y análisis de biomarcadores, la terapia con TIL estaría disponible para un mayor número de pacientes con cáncer.
Una biopsia con aguja gruesa es un ejemplo de este tipo de muestras de tumores tan pequeñas. Es un procedimiento económico, seguro, sencillo y menos invasivo que la resección quirúrgica. Una biopsia con aguja gruesa extrae un pequeño cilindro de tejido tumoral mediante una pequeña incisión y una aguja. Normalmente, se puede insertar una aguja en la incisión hasta 5 veces para extirpar una cantidad adecuada de tejido. Las biopsias con aguja gruesa son pequeñas muestras del microambiente tumoral intacto y, por lo tanto, contienen células tumorales, estroma y células inmunes, incluidos los TIL. Hasta la fecha, hay un estudio clínico, en melanoma, que utilizó tejido derivado de biopsias con aguja gruesa para expandir los TIL (Ullenhag, GJ, et al., Cancer Immunol Immunother, 61(5): 725-732 (2014)). Los números absolutos de células y las veces que hubo expansión fueron similares entre los TIL derivados de resección quirúrgica frente a los TIL derivados de biopsias con aguja gruesa. Curiosamente, la mayoría de las respuestas objetivo (4/5) en este estudio fueron tratadas con células derivadas de biopsias con aguja gruesa. Ningún estudio adicional ha corroborado estos hallazgos.
En algunas realizaciones, se emplea un proceso 2-REP para expandir los TIL derivados de biopsias con aguja gruesa, como se describió anteriormente y en el presente ejemplo.
Objetivo
El presente ejemplo proporciona un protocolo para expandir los TIL a cantidades clínicamente apropiadas a partir de muestras de tumores pequeños para<a>C<t>(transferencia celular adoptiva). Este protocolo se desarrolló utilizando biopsias con aguja gruesa a partir de tumores de páncreas, melanoma, mama y ovario. Se evaluaron los TIL expandidos en cuanto a crecimiento, viabilidad, fenotipo, función (secreción de IFN<y>, movilización de CD107a) y repertorio de TCR Vp (secuenciación de ARN). Materiales
Tejido de biopsia con aguja gruesa del tumor. Las biopsias con aguja gruesa tumorales de páncreas, melanoma, mama y ovario se recibieron de UPMC, Biotheme y el grupo MT.
Procedimiento
Procesamiento de biopsias con aguja gruesa e inicio del cultivo
Las biopsias con aguja gruesa de tumores recién resecados se reciben de alianzas de investigación (UPMC) y proveedores de adquisición de tejidos (Biotheme y grupo MTG). Las biopsias con aguja gruesa del tumor se envían durante la noche en HypoThermosol (Biolife Solutions, Washington, Cat # 101104) (con antibiótico) o RPMI 1640 (Fisher Scientific, Pennsylvania, Cat # 11875-085) suero AB humano masculino (Access Biologicals, California, A13012).
Utilizando un filtro de 0.22 pM en la parte superior de un tubo cónico de 50 mL, se vierte con cuidado y lentamente el contenido del recipiente de envío que incluye las biopsias con aguja gruesa del tumor a través del filtro. Las biopsias con aguja gruesa quedan retenidas en el filtro. Se lavan las biopsias con aguja gruesa agregando suavemente 10-20 mL de HBSS sobre ellas.
Se retira con cuidado cada biopsia con aguja gruesa de la membrana del filtro, mientras se intenta mantener la biopsia con aguja gruesa intacta. Utilizando pinzas de plástico estériles o pipeteando suavemente (con aproximadamente 200 pL de HBSS en una pipeta de 1 mL), se transfiere la biopsia con aguja gruesa a un G-Rex 10 con 40 mL de CM2 y 6000 UI/mL de IL-2.
Inicio de REP1 (por ejemplo, preparación de la primera expansión)
El día 3 posterior al cultivo, se agregan OKT3 (30 ng/mL) (Miltenyi Biotec, Alemania, Cat # 170-076-116) y alimentadores (1:100) al G-Rex 10 sin alterar el cultivo al momento de la adición.
Se evalúa diariamente el crecimiento del cultivo mediante microscopía. REP1 se lleva a cabo durante 8 días después de la adición de OKT3 alimentadores y finaliza el día 11. Las células permanecen intactas durante toda la duración del cultivo.
Para realizar el recuento, se retiran aproximadamente 30 mL de medio y se resuspenden las células en los 10 mL restantes de medio, pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Se colocan las células en un tubo cónico de 50 mL y se centrifuga a 1500 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos en una centrífuga Sorvell Legend XFR y cubo oscilante (Thermo Scientific, CA, Cat #75003180).
Se determina el recuento de células y su viabilidad, utilizando el Nexcelom Cellometer K2 (Nexcelom, MA).
Si después de la centrifugación no hay precipitado, o el precipitado es < 200 pL, se resuspende el precipitado en 2 mL de medio para el recuento. Si el precipitado es > 200 pL, se resuspende en 5 mL de medio CM2 para el recuento.
Los experimentos se recolectan el día 11 después del inicio del cultivo (8 días después de la adición de OKT3 alimentadores). Se evalúa el producto REP1 en cuanto a recuento de células, viabilidad, fenotipo (TIL1, TIL2 y TIL3 (panel de TIL2 y TIL3 para tinción de antígeno de superficie de los TIL), TIL3) y función (CD107a (evaluación de la función de los TIL mediante la movilización de CD107a), IFNy (WRK LAB-059)). Las células restantes se congelan y se almacenan en nitrógeno líquido.
Iniciación de REP2 (por ejemplo, segunda expansión rápida)
Para la iniciación de mini-REP2, se colocan 1 * 105 células en un G-Rex 10 con 40 mL de medio CM2 y 3000 UI/mL de IL-2. Se agregan anti-CD3 (clon: OKT3, 30 ng/mL) y alimentadores (proporción 1:100, TIL: alimentadores) al inicio del cultivo. Todos los matraces se tratan con OKT3 alimentadores en REP2, incluso si no se agregaron OKT3 alimentadores durante REP1.
Se realiza un cambio de medio en el día 5-7 del REP2 (día 16-18 del proceso). El medio en el matraz G-Rex 10 se reduce en volumen a aproximadamente 10 mLy se complementa a 40 mL con CM2 o AimV 3000 UI/mL de IL-2.
En el día 11 de REP2, el volumen se reduce como se indicó anteriormente y las células se centrifugan a 1500 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos.
El producto final se evalúa en cuanto a recuento de células, viabilidad, fenotipo (TIL1, TIL2 (panel de TIL2 para tinción de antígeno de superficie de los TIL, v1 y v2), TIL3 y función (CD107a (evaluación de la función de los TIL mediante movilización de CD107a, IFN<y>). Se precipitan células adicionales (1 * 106 - 5 * 106 células y se congelan para la secuenciación y análisis del a Rn . Las células restantes se congelan y se almacenan en nitrógeno líquido.
Resultados y criterios de aceptación
Se espera que el rendimiento de REP1 sea superior a 50 * 106 el D11 en matraces que fueron tratados con OKT3 alimentadores. Se espera que las veces que se produce expansión durante REP2 no se vea afectada por la adición de OKT3 y alimentadores durante REP1 y que sea consistente con el número de veces que se expande REP de Gen2. Se espera que el fenotipo de los TIL derivado de biopsias con aguja gruesa tumorales y expuesto tempranamente a los OKT3 alimentadores sea similar al de los TIL derivados de resecciones quirúrgicas (o biopsias pequeñas) y expandido de acuerdo con el proceso de Gen 2.
Ejemplo 14:Proceso ejemplar de Gen 3
El ejemplo proporciona una comparación entre los procesos de Gen 2 y Gen 3. Este ejemplo describe el desarrollo de una plataforma de expansión de TIL robusta. Las modificaciones al proceso de Gen 2 reducen el riesgo y agilizan el proceso de fabricación al reducir la cantidad de intervenciones del operador, reducen el tiempo total de fabricación, optimizan el uso de reactivos y facilitan un proceso de producción de células semicerrado y semiautomatizado flexible, apto para una fabricación de alto rendimiento a escala comercial.
Los TIL del proceso de Gen 2 y Gen 3 están compuestos de los TIL autólogos derivados de un paciente individual a través de la resección quirúrgica de un tumor y luego expandidoex vivo.La etapa de preparación de la primera expansión del proceso de Gen 3 fue un cultivo celular en presencia de interleucina-2 (IL-2) y el anticuerpo monoclonal OKT3, que se dirige al correceptor de células T CD3 en una estructura de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) irradiadas.
La fabricación de los productos de TIL de Gen 2 constó de dos fases: 1) pre-expansión rápida (pre-REP) y 2) protocolo de expansión rápida (REP). Durante el pre-REP, los tumores resecados se cortaron en < 50 fragmentos de 2-3 mm en cada dimensión que se cultivaron con medio de cultivo que contenía suero (medio RPMI 1640 que contenía 10 % de HuSAB complementado) y 6,000 UI/mL de interleucina-2 (IL-2) durante un período de 11 días. El día 11 se recolectaron los TIL y se introdujeron en la expansión secundaria de REP a gran escala. El REP consiste en la activación de <200 * 106 células viables de pre-REP en un cocultivo de 5 * 109 células alimentadoras de PBMC alogénicas irradiadas cargadas con 150 |jg de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (OKT3) en un volumen de 5 L de CM2 complementado con 3000 UI/mL de rhIL-2 durante 5 días. El día 16, el volumen del cultivo se reduce 90 % y la fracción celular se divide en múltiples matraces G-REX-500 a > 1 * 109 linfocitos viables/matraz y se lleva a un volumen de 5 L con CM4. Los TIL se incuban 6 días más. El REP se recolecta el día 22, se lava, se formula y se criopreserva antes de enviarlo a -150 °C al sitio clínico para su infusión.
La fabricación de los productos de TIL de Gen 3 constaba de tres fases: 1) protocolo de preparación de la primera expansión, 2) protocolo de segunda expansión rápida (también conocido como fase de expansión rápida o r Ep ) y 3) división del subcultivo. Para efectuar la propagación de los TIL de preparación de la primera expansión, el tumor resecado se cortó en < 120 fragmentos de 2-3 mm en cada dimensión. El día 0 de la preparación de la primera expansión, se estableció una capa de alimentación de aproximadamente 2.5 * 108 células alimentadoras de PBMC irradiadas alogénicas cargadas con OKT-3 en un área de superficie de aproximadamente 100 cm2 en cada uno de los 3 recipientes de 100 MCS. Los fragmentos de tumor se distribuyeron y cultivaron en 3 recipientes de 100 MCS, cada uno con 500 mL de medio de cultivo CM1 que contenía suero y 6,000 UI/mL de interleucina-2 (IL-2) y 15 jg de OKT-3 durante un período de 7 días. El día 7, se inició el REP incorporando una capa de células alimentadoras adicional de aproximadamente 5 * 108 células alimentadoras de PBMC irradiadas alogénicas cargadas con OKT-3 en la fase de cultivo fragmentada del tumor en cada uno de los 3 recipientes de 100 MCS y cultivadas con 500 mL de medio de cultivo CM2 y 6,000 UI/mL de IL-2 y 30 jg de OKT-3. La iniciación de REP se mejoró activando todo el cultivo de preparación de la primera expansión en el mismo recipiente utilizando una transferencia de fluido de sistema cerrado de células alimentadoras cargadas con OKT3 en el recipiente 100MCS. Para Gen 3, la ampliación o división de los TIL implicó etapas de proceso en las que todo el cultivo celular se escaló a un recipiente más grande a través de una transferencia de fluido de sistema cerrado y se transfirió (de un matraz de 100 M a un matraz de 500 M) y se agregaron 4 L adicionales de medio CM4. Las células REP se recolectaron el día 16, se lavaron, se formularon y se criopreservaron antes de enviarlas a -150 °C al sitio clínico para su infusión.
En general, el proceso de Gen 3 es una plataforma de expansión más corta, más escalable y fácilmente modificable que se acomodará para adaptarse a una fabricación sólida y a la comparabilidad de procesos.
Tabla 36: Comparación de los procesos de fabricación ejemplares de Gen 2 y Gen 3.
El día 0, para ambos procesos, el tumor se lavó 3 veces y los fragmentos se repartieron aleatoriamente y se dividieron en dos grupos; un grupo por proceso. Para el proceso de Gen 2, los fragmentos se transfirieron a un matraz GREX 100MCS con 1 L de medio CM1 que contenía 6,000 UI/mL de rhIL-2. Para el proceso de Gen 3, los fragmentos se transfirieron a un matraz GRE * 100MCS con 500 mL de CM1 que contenía 6,000 UI/mL de rhIL-2, 15 |jg de OKT-3 y 2.5 * 108 células alimentadoras. La siembra de los TIL para el día de inicio de Rep se produjo en días diferentes de acuerdo con cada proceso. Para el proceso de Gen 2, en donde el matraz G-REX 100MCS se redujo en un 90 % del volumen, la suspensión celular recolectada se transfirió a un nuevo G-REX 500MCS para comenzar la iniciación de REP el día 11 en medio CM2 que contenía IL-2 (3000 UI/mL), más 5 * 109 células alimentadoras y OKT-3 (30 ng/mL). Las células se expandieron y dividieron el día 16 en múltiples matraces GREX 500 MCS con medio CM4 con IL-2 (3000 UI/mL) por protocolo. Luego, el cultivo se recolectó y se criopreservaron el día 22 de acuerdo con el protocolo. Para el proceso de Gen 3, la iniciación de REP ocurrió el día 7, en donde se utilizó el mismo G-REX 100MCS para la iniciación de REP Brevemente, se añadieron 500 mL de medio CM2 que contenía IL-2 (6000 UI/mL) y 5 * 108 células alimentadoras con 30 jg de OKT-3 a cada matraz. El día 9-11 se escaló el cultivo. Todo el volumen de G-Re X 100M (1L) se transfirió a un G-REX 500MCS y se agregaron 4L de CM4 que contenía IL-2 (3000 UI/mL). Los matraces se incubaron durante 5 días. Los cultivos se recolectaron y criopreservaron el día 16.
Se incluyeron tres tumores diferentes en la comparación: dos tumores de pulmón (L4054 y L4055) y un tumor de melanoma (M1085T).
Los medios CM1 (medio de cultivo 1), CM2 (medio de cultivo 2) y CM4 (medio de cultivo 4) se prepararon con antelación y se mantuvieron a 4 °C para L4054 y L4055. Los medios CM1 y CM2 se prepararon sin filtración para comparar el crecimiento celular con y sin filtración del medio.
El medio se calentó a 37 °C hasta 24 horas antes para el inicio y la ampliación del REP del tumor L4055.
Resumen de resultados
Gen 3 se situó dentro del 30%de Gen 2 en cuanto al total de células viables logradas. El producto final de Gen 3 exhibió una mayor producción de INF-<y>después de la reestimulación. El producto final de Gen 3 exhibió una mayor diversidad clonal medida por la cantidad total de secuencias de CDR3 únicas presentes. El producto final de Gen 3 exhibió una longitud media más larga de telómeros.
Resultados obtenidos
Recuento celular y % de viabilidad:
Pre REP y la expansión de REP en los procesos Gen 2 y Gen 3 siguieron los detalles descritos anteriormente.
Tabla 37: Recuento de células pre-REP Para cada tumor, los dos grupos contenían el mismo número de fragmentos. Debido al pequeño tamaño de los tumores, no se alcanzó el número máximo de fragmentos por matraz. Las células pre-REP totales (TVC) se recolectaron y contaron el día 11 para el proceso de Gen 2 y el día 7 para el proceso de Gen 3. Para comparar las dos partes de pre-REP, el recuento de células se dividió por la cantidad de fragmentos proporcionados en el cultivo para calcular un promedio de células viables por fragmento. Como se indica en la siguiente tabla, el proceso de Gen 2 generó consistentemente más células por fragmento en comparación con el proceso de Gen 3. Un cálculo extrapolado del número de TVC esperado para el proceso de Gen 3 en el día 11, que se calculó dividiendo el TVC pre-REP por 7 y luego multiplicado por 11.
Tabla 37: recuento de células pre-REP
Tabla 38: Recuento total de células viables y veces que se produce expansión en el producto final de TIL: Para los procesos Gen 2 y Gen 3, se contó el<t>V<c>por condición del proceso y se generó el porcentaje de células viables para cada día del proceso. En la recolección, el día 22 (Gen 2) y el día 16 (Gen 3) se recolectaron células y se estableció el recuento de TVC. Luego, el TVC se dividió por la cantidad de fragmentos proporcionados el día 0, para calcular un promedio de células viables por fragmento. Las veces que se produjo expansión se calculó dividiendo el TVC de recolección por el TVC de iniciación de REP Como se muestra en la tabla, al comparar Gen 2 y Gen 3, las veces que se produce expansión fueron similares para L4054; en el caso de L4055, las veces que se produce expansión fue mayor para el proceso de Gen 2. En concreto, en este caso, el medio se calentó 24 horas antes del día de inicio del REP También se observó las veces que se produjo expansión en Gen 3 para M1085T. Un cálculo extrapolado del número de TVC esperado para el proceso de Gen 3 en el día 22, que se calculó dividiendo el TVC de REP por 16 y luego multiplicado por 22.
Tabla 38: Recuento total de células viables y expansión de pliegues en el producto final de los TIL
Tabla 39:%de viabilidad del producto final de TIL: Tras la recolección, los productos finales de los TIL de REP se compararon con los criterios de liberación para determinar el % de viabilidad. Todas las condiciones para los procesos Gen 2 y Gen 3 superaron el criterio de viabilidad del 70 % y fueron comparables entre procesos y tumores.
Tabla 39: % de Viabilidad de REP
Tabla 40: Estimar el recuento de células por matraz adicional para el proceso de Gen 3. Debido a que el número de fragmentos por matraz estaba por debajo del número máximo requerido, se calculó un recuento de células estimado en el día de la recolección para cada tumor. La estimación se basó en la expectativa de que los tumores clínicos fueran lo suficientemente grandes como para sembrar 2 o 3 matraces el día 0.
Tabla 40: Cálculo del recuento de células estimado extrapolado a escala completa de los matraces 2 y 3 en el proceso de Gen 3
Inmunofenotipación:
Comparación de marcadores fenotípicos en el producto final de TIL:
Tres tumores, L4054, L4055 y M1085T, experimentaron expansión de los TIL en los procesos de Gen 2 y de Gen 3. Tras la recolección, los productos finales de TIL de REP se sometieron a análisis de citometría de flujo para probar la pureza, la diferenciación y los marcadores de memoria. Para todas las condiciones el porcentaje de células a/b+ del TCR fue superior al 90 %.
Los TIL recolectados del proceso de Gen 3 mostraron una mayor expresión de CD8 y CD28 en comparación con los TIL recolectados del proceso de Gen 2. El proceso de Gen 2 mostró un mayor porcentaje de CD4+. Véase, la Figura 3 (A, B, C).
Comparación de marcadores de memoria en el producto final de los TIL:
Los TIL recolectados del proceso de Gen 3 mostraron una mayor expresión en los compartimentos de memoria central en comparación con los TIL del proceso de Gen 2. Véase, la Figura 4 (A, B, C).
Comparación de marcadores de activación y agotamiento en el producto final de los TIL:
Se analizaron los marcadores de activación y agotamiento en los TIL de dos tumores, L4054 y L4055, para comparar el producto de TIL final mediante los procesos de expansión de los TIL de Gen 2 y Gen 3. Los marcadores de activación y agotamiento fueron comparables entre los procesos de Gen 2 y Gen 3. Véase, la Figura 5 (A, B); Figura 6 (A, B).
Secreción de interferón gamma tras la reestimulación:
El día de la recolección, el día 22 para Gen 2 y el día 16 para Gen 3, los TIL se sometieron a una reestimulación durante la noche con placas anti-CD3 recubiertas para L4054 y L4055. La reestimulación en M1085T se realizó utilizando perlas anti-CD3, CD28 y CD137. El sobrenadante se recogió después de 24 horas de la reestimulación en todas las condiciones y se congeló. El análisis de IFN<y>mediante ELISA se evaluó en el sobrenadante de ambos procesos al mismo tiempo utilizando la misma placa ELISA. Se observó una mayor producción de IFN<y>a partir del proceso de Gen 3 en los tres tumores analizados. Véase, la Figura 7 (A, B, C).
Medición de los niveles de IL-2 en medios de cultivo:
Para comparar el consumo de IL-2 entre los procesos de Gen 2 y Gen 3, se recolectó el sobrenadante celular el día de inicio, aumento y recolección de REP en los tumores L4054 y L4055. La cantidad de IL-2 en el sobrenadante del cultivo celular se midió mediante el kit ELISA Quantitate de R&D. La tendencia general indica que la concentración de IL-2 sigue siendo mayor en el proceso de Gen 3 en comparación con el proceso de Gen 2. Es probable que esto se deba a la mayor concentración de IL-2 en la iniciación de REP (6000 UI/mL) para Gen 3, junto con el arrastre del medio durante todo el proceso. Véase, la Figura 8 (A, B).
Análisis de sustratos metabólicos y metabolitos
Se midieron los niveles de sustratos metabólicos como D-glucosa y L-glutamina como sustitutos del consumo general de medios. Se midieron sus metabolitos recíprocos, como el ácido láctico y el amoníaco. La glucosa es un azúcar simple presente en los medios que las mitocondrias utilizan para producir energía en forma de ATP. Cuando se oxida la glucosa, se produce ácido láctico (el lactato es un éster del ácido láctico). El lactato se produce fuertemente durante la fase de crecimiento exponencial de las células. Los niveles elevados de lactato tienen un impacto negativo en los procesos de cultivo celular. Véase, Figura 9 (A, B).
Los medios gastados para L4054 y L4055 se recolectaron en los días de inicio, ampliación y recolección del REP tanto para el proceso de Gen 2 como para el Gen 3. La recolección de medios gastados fue para Gen 2 el día 11, día 16 y día 22; para Gen 3 fue el día 7, día 11 y día 16. El sobrenadante se analizó en un bioanalizador CEDEX para determinar las concentraciones de glucosa, ácido láctico, glutamina, glutamax y amoníaco.
La L-glutamina es un aminoácido esencial inestable necesario en las formulaciones de medios de cultivo celular. La glutamina contiene una amina, y este grupo estructural amida puede transportar y suministrar nitrógeno a las células. Cuando la L-glutamina se oxida, la célula produce un subproducto tóxico de amoníaco. Para contrarrestar la degradación de la L-glutamina, el medio para los procesos de Gen 2 y Gen 3 se complementó con Glutamax, que es más estable en soluciones acuosas y no se degrada espontáneamente. En las dos líneas tumorales, la parte de Gen 3 mostró una disminución de L-glutamina y Glutamax durante el proceso y un aumento de amoníaco a lo largo del REP. En la parte de Gen 2 se observó una concentración constante de L-glutamina y Glutamax y un ligero aumento en la producción de amoníaco. Los procesos de Gen 2 y Gen 3 fueron comparables el día de la recolección para el amoníaco y mostraron una ligera diferencia en la degradación de L-glutamina. Véase, la Figura 10 (A, B, C).
Repeticiones de telómeros por Flow - FISH:
Se utilizó la tecnología Flow-FISH para medir la longitud promedio de la repetición de telómeros en L4054 y L4055 bajo el proceso de Gen 2 y Gen 3. La determinación de la longitud relativa del telómero (RTL) se calculó utilizando el kit Telomere PNA/FITC para análisis de citometría de flujo de DAKO. Gen 3 mostró una longitud de telómero comparable a la de Gen 2.
Análisis de CD3
Para determinar la diversidad clonal de los productos celulares generados en cada proceso, se tomaron muestras del producto final de TIL cosechado para L4054 y L4055 y se analizó la diversidad clonal mediante la secuenciación de la porción de CDR3 de los receptores de células T
Tabla 41: Comparación de Gen 2 y Gen3 del porcentaje compartido de secuencias de CDR3 únicas en L4054 en el producto celular recolectado con los TIL. Se comparten 199 secuencias entre el producto final de Gen 3 y Gen 2, lo que corresponde al 97.07 % del 80 % superior de secuencias de CDR3 únicas de Gen 2 compartidas con el producto final de Gen 3.
Tabla 41: Comparación de secuencias de uCDR3 compartidas entre procesos de Gen 2 y Gen 3 en L4054.
Tabla 42: Comparación de Gen 2 y Gen3 del porcentaje compartido de secuencias de CDR3 únicas en L4055 en el producto celular recogido con los TIL. Se comparten 1833 secuencias entre el producto final de Gen 3 y Gen 2, lo que corresponde al 99.45 % del 80 % superior de secuencias de CDR3 únicas de Gen 2 compartidas con el producto final de Gen 3.
Tabla 42: Comparación de secuencias uCDR3 compartidas entre procesos Gen 2 y Gen 3 en L4055.
Los medios CM1 y CM2 se prepararon con anticipación sin filtración y se mantuvieron a 4 °C hasta su uso para el tumor L4055 en el proceso de Gen 2 y Gen 3.
El medio se calentó a 37 °C durante 24 horas antes para el tumor L4055 el día de inicio de REP para el proceso de Gen 2 y Gen 3.
No se midió LDH en los sobrenadantes recolectados en los procesos.
El recuento de células de TIL M1085T se realizó con el contador de células Cellometer K2.
En el tumor M1085T, no se encontraron muestras disponibles como sobrenadante para análisis metabólico, producto de TIL para análisis de marcadores de activación y agotamiento, longitud de telómero y análisis de CD3 - TCR vb.
Conclusiones
Este ejemplo compara tres tejidos tumorales de donantes independientes en términos de atributos de calidad funcional, además de una caracterización fenotípica extendida y consumo de medios entre los procesos de Gen 2 y Gen 3.
Se evaluó la comparación de la expansión de REP y pre-REP de Gen 2 y Gen 3 en términos de células viables totales generadas y viabilidad de la población total de células nucleadas. Las dosis de células TVC en el día de la recolección no fueron comparables entre Gen 2 (22 días) y Gen 3 (16 días). Las dosis de células de Gen 3 fueron inferiores a las de Gen 2, aproximadamente el 40 % del total de células viables recolectadas en la recolección.
Se calculó un número de células extrapolado para el proceso de Gen 3 asumiendo que la recolección de pre-REP ocurrió el día 11 en lugar del día 7 y la recolección de REP el día 22 en lugar del día 16. En ambos casos se muestra un número más cercano en TVC en comparación con el proceso de Gen 2, lo que indica que la activación temprana podría permitir un mejor desempeño general en el crecimiento de los TlL. Tabla 4 y 5 fila inferior.
En el caso del valor extrapolado para matraces adicionales (2 o 3) en el proceso de Gen 3, asumiendo un mayor tamaño de tumor procesado y alcanzando el número máximo de fragmentos requeridos por proceso como se describe. Se observó que se puede alcanzar una dosis similar en TVC en el día 16 de recolección para el proceso de Gen 3 en comparación con el proceso de Gen 2 en el día 22. Esta observación es importante e indica que una activación temprana del cultivo puede permitir un mejor rendimiento de los TIL en menos tiempo de procesamiento.
Se evaluó la comparación de la expansión de REP y pre-REP de Gen 2 y Gen 3 en términos de células viables totales generadas y viabilidad de la población total de células nucleadas. Las dosis de células TVC en el día de la recolección no fueron comparables entre Gen 2 (22 días) y Gen 3 (16 días). Las dosis de células de Gen 3 fueron inferiores a las de Gen 2, aproximadamente el 40%del total de células viables recolectadas en la recolección.
En términos de caracterización fenotípica, se observó una mayor expresión de CD8+ y CD28+ en tres tumores en el proceso de Gen 3 en comparación con el proceso de Gen 2. Estos datos indican que el proceso de Gen 3 ha mejorado los atributos del producto de TIL final en comparación con Gen 2.
El proceso de Gen 3 mostró compartimentos de memoria central ligeramente más altos en comparación con el proceso de Gen 2.
Los procesos de Gen 2 y Gen 3 mostraron marcadores de activación y agotamiento comparables, a pesar de la duración más corta del proceso de Gen 3.
La producción de IFN gamma (IFNy) fue 3 veces mayor en el producto final de Gen 3 en comparación con Gen 2 en los tres tumores analizados. Estos datos indican que el proceso de Gen 3 generó un producto TIL altamente funcional y más potente en comparación con el proceso de Gen 2, posiblemente debido a la mayor expresión de CD8 y CD28 en Gen 3. La caracterización fenotípica sugirió tendencias positivas en Gen 3 hacia la expresión de CD8+, CD28+ en tres tumores en comparación con el proceso de Gen 2.
La longitud de los telómeros en el producto final de TIL entre Gen 2 y Gen 3 fue comparable.
Los niveles de glucosa y lactato fueron comparables entre el producto final de Gen 2 y Gen 3, lo que sugiere que los niveles de nutrientes en los medios del proceso de Gen 3 no se vieron afectados debido a la no ejecución de la eliminación de reducción de volumen en cada día del proceso y al menor volumen de medios en general en el proceso, en comparación con Gen 2.
En general, el proceso de Gen 3 mostró una reducción de casi dos veces el tiempo de procesamiento en comparación con el proceso de Gen 2, lo que produciría una reducción sustancial en el coste de los bienes (COG) para el producto de TIL expandido por el proceso de Gen 3.
El consumo de IL-2 indica una tendencia general de consumo de IL-2 en el proceso de Gen 2, y en el proceso de Gen 3, IL-2 fue mayor debido a la no eliminación de los medios antiguos.
El proceso de Gen 3 mostró una mayor diversidad clonal medida mediante el análisis de la secuencia de TCRab de CDR3.
La adición de alimentadores y OKT-3 el día 0 del pre-REP permitió una activación temprana de los TIL y, en general, un mejor rendimiento de crecimiento de los TIL utilizando el proceso de Gen 3.
La Tabla 43 describe varias realizaciones y resultados para el proceso de Gen 3 en comparación con el proceso de Gen 2 actual:
Tabla 43: Proceso Gen 3 ejemplar.
Los TIL se han expandido con éxito a partir de biopsias con aguja gruesa aisladas de tumores de páncreas. Los TIL también se expandieron a partir de FNA de ciertos tipos de tumores. En el estudio no se observó crecimiento de los TIL en tumores de ovario (n = 3) ni en un tumor colorrectal (n = 1). Se observó crecimiento de los TIL a partir de FNA obtenidos de un tumor de pulmón, un melanoma y un tumor de cuello uterino. Actualmente se están realizando la fenotipificación y los ensayos funcionales de la población de los TIL de la primera expansión y de la segunda expansión. Los datos del estudio muestran que en el aspirado pre-REP está presente una población significativa de células T CD4+ y CD8+.

Claims (26)

REIVINDICACIONES
1. Un método para expandir los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de los TIL que comprende:
(i) realizar una primera expansión cultivando una primera población de los TIL a partir de al menos un aspirado con aguja fina (FNA) o al menos una biopsia pequeña de un tumor en un paciente en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de los TIL, en donde
el medio de cultivo celular se complementa con OKT-3 en cualquiera de los días 1-3, en donde la primera expansión se realiza durante 3 días a 12 días para
obtener la segunda población de los TIL, donde la segunda población de los TIL comprende al menos 5 * 107 TIL entre 3 y 12 días cuando la primera población de los TIL proviene de una biopsia pequeña; y
(ii) realizar una segunda expansión complementando el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es al menos 25 veces mayor en número que la segunda población de los TIL, y en donde la segunda expansión se realiza durante 3 días a 12 días para obtener la tercera población de los TIL, en donde la tercera población de los TIL es una población terapéutica de los TIL.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el medio de cultivo celular que comprende IL-2 en la etapa (i) comprende además OKT-3 y no se complementa opcionalmente con OKT-3 en ninguno de los días 1-3, en donde la etapa (i) es una primera etapa de expansión y la etapa (ii) es una segunda expansión rápida, en donde opcionalmente después de la etapa (ii), las células se retiran del cultivo celular y se criopreservan en un medio de almacenamiento.
3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las etapas (i) a (ii) se realizan en un período de 17 días a 24 días, opcionalmente en un período de 18 días a 22 días, opcionalmente además en un período de 20 días a 22 días, y opcionalmente además en un período de 22 días.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células de la población terapéutica de los TIL de la etapa (ii) expresan CD4, CD8 y TCR a p en niveles similares a las células recién recolectadas.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las APC son células mononucleares de sangre periférica (PBMC), en donde opcionalmente las PBMC se agregan al cultivo celular en la etapa (i) en cualquiera de los días 3 a 12 después del inicio del cultivo en la etapa (i) y/o en la etapa (ii) en cualquiera de los días 11 a 14 después del inicio del cultivo en la etapa (i), en donde además opcionalmente las APC son APC artificiales (aAPC) o APC autólogas.
6. El método de acuerdo con las reivindicaciones 2 a 5, en donde la tercera población de los TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de los TIL, en donde las células T efectoras y/o células T de memoria central en la población terapéutica de los TIL en la etapa (ii) exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27, expresión de CD28, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56, en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria central en la segunda población de células, en donde opcionalmente las células T efectoras y/o células T de memoria central exhiben expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la población terapéutica de los TIL es para infusión en un paciente.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera expansión en la etapa (i) se realiza complementando adicionalmente el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista de OKT-3, IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB y/o la segunda expansión en la etapa (ii) se realiza complementando adicionalmente el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista de IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el FNA en la etapa (i) comprende al menos 400,000 TIL.10
10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la biopsia pequeña se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en pancreático, melanoma, de mama y ovario y opcionalmente en donde el FNA se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en pulmón, melanoma, cabeza y cuello, de cuello uterino, ovario, páncreas, glioblastoma, colorrectal y sarcoma, en donde opcionalmente el tumor de pulmón es un carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), y opcionalmente en donde el paciente se ha sometido previamente a un tratamiento quirúrgico.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera población de los TIL en la etapa (i) se obtiene a partir de un FNA, en donde opcionalmente el FNAse obtiene utilizando una aguja de calibre 25-18.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera población de los TIL en la etapa (i) se obtiene a partir de una biopsia pequeña, y se obtiene opcionalmente a partir de una biopsia con aguja gruesa, y además opcionalmente en donde la biopsia pequeña se obtiene utilizando una aguja de calibre 16-11.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa (ii) se repite de una a cuatro veces para obtener suficientes TIL en la población terapéutica de los TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL, opcionalmente donde el número de los TIL suficiente para una dosis terapéuticamente eficaz es de 2.3 * 1010 hasta 13.7 * 1010
14. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la primera expansión se realiza durante 3 días a 10 días.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende además una segunda expansión adicional en la etapa (ii) que se realiza complementando adicionalmente el medio de cultivo celular de la tercera población de los TIL con anticuerpo agonista de IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende:
(a) agregar la primera población de los TIL a un sistema cerrado;
(b) realizar la primera expansión cultivando la primera población de los TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de los TIL, en donde el medio de cultivo celular se complementa con OKT-3 en cualquiera de los días 1-3, en donde la primera expansión se realiza durante 3 días a 12 días para obtener la segunda población de los TIL, en donde la segunda población de los TIL comprende al menos 5 * 107 TIL de 3 días a 12 días cuando la primera población de los TIL proviene de una biopsia pequeña, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, en donde la segunda población de los TIL es al menos 25 veces mayor en número que la primera población de los TIL, y en donde la transición de la etapa (a) a la etapa (b) ocurre sin abrir el sistema;
(c) realizar la segunda expansión complementando el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con IL-2 adicional,<o>KT-3 y células presentadoras de antígeno (APC), para producir una tercera población de los TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante 3 días a 12 días para obtener la tercera población de los TIL,
en donde la tercera población de los TIL es una población terapéutica de los TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una segunda área de superficie permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) recolectar la población terapéutica de los TIL obtenida de la etapa (c), en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema; y
(e) transferir la población de los TIL recolectada de la etapa (d) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (d) a la (e) ocurre sin abrir el sistema.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el medio de cultivo celular que comprende IL-2 en la etapa (b) comprende además OKT-3 y no se complementa opcionalmente con OKT-3 en ninguno de los días 1-3, y en donde la etapa (b) es una primera etapa de expansión y la etapa (c) es una segunda etapa de expansión rápida, en donde opcionalmente el método comprende además la etapa de criopreservar la bolsa de infusión que comprende la población de los TIL recolectada en la etapa (e) utilizando un proceso de criopreservación.
18. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, en donde las APC son células mononucleares de sangre periférica (PBMC), en donde opcionalmente las PBMC están irradiadas y son alogénicas y, opcionalmente, en donde las PBMC se agregan al cultivo celular en cualquiera de los días 3 a 12 del primer período en la etapa (b) y/o cualquiera de los días 3 a 12 del segundo período en la etapa (c).
19. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la primera expansión en la etapa (b) se realiza complementando adicionalmente el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista de OKT-3, IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB y/o en donde la segunda expansión en la etapa (c) se realiza complementando adicionalmente el medio de cultivo celular de la segunda población de los TIL con anticuerpo agonista de IL-15, OX40 y/o anticuerpo agonista de 4-1BB.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde los TIL en la etapa (a) se obtienen a partir de un FNA, y opcionalmente en donde el FNA en la etapa (a) comprende al menos 400,000 TIL, además opcionalmente en donde el FNA se obtiene utilizando una aguja de calibre 25-18, y además opcionalmente en donde el FNA se obtiene a partir de un tumor seleccionado del grupo que consiste en pulmón, melanoma, cabeza y cuello, de cuello uterino, de ovario, pancreático, glioblastoma, colorrectal y sarcoma, en donde opcionalmente el tumor de pulmón es un carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), y opcionalmente en donde el sujeto se ha sometido previamente a un tratamiento quirúrgico.
21. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la primera población de los TIL en la etapa (a) se obtiene a partir de una biopsia pequeña y, opcionalmente, en donde la biopsia pequeña se obtiene de un tumor seleccionado del grupo que consiste en pancreático, melanoma, de mama y ovario, y, además, opcionalmente, en donde la biopsia pequeña se obtiene utilizando una aguja de calibre 16-11.
22. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la recolección en la etapa (d) se realiza utilizando un sistema de procesamiento de células LOVO®, en donde opcionalmente el medio de cultivo celular se proporciona en un recipiente seleccionado del grupo que consiste en un recipiente G™y una bolsa para células Xuri™ y además opcionalmente en donde la bolsa de infusión en la etapa (e) es una bolsa de infusión HypoThermosol.
23. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde las etapas (a) a (e) se realizan en un período de 17 días a 24 días, opcionalmente en donde las etapas (a) a (e) se realizan en un período de 18 días a 22 días, además opcionalmente en donde las etapas (a) a (e) se realizan en un período de 20 días a 22 días.
24. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde las etapas (a) a (e) y opcionalmente la criopreservación se realizan en 22 días o menos.
25. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, en donde la población terapéutica de los TIL recolectada en la etapa (d) comprende suficientes TIL para una dosificación terapéuticamente eficaz de los TIL, opcionalmente en donde el número de los TIL suficiente para una dosificación terapéuticamente eficaz es de 2.3 * 1010 hasta 13.7 * 1010.
26. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, en donde las etapas (a) a (d) se realizan en un solo recipiente, en donde la realización de las etapas (a) a (d) en un solo recipiente da como resultado un aumento en el rendimiento de los TIL por tumor resecado en comparación con la realización de las etapas (a) a (d) en más de un recipiente,
opcionalmente, en donde las células presentadoras de antígeno se agregan a los TIL durante la segunda expansión en la etapa (c) sin abrir el sistema, en donde opcionalmente la tercera población de los TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de los TIL, en donde las células T efectoras y/o células T de memoria central en la población terapéutica de los TIL exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresar CD27+, expresar CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56 en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células, y además opcionalmente, en donde las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la tercera población de los TIL exhiben expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56 en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
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