ES3014621T3 - Use of prg4 as an anti-inflammatory agent - Google Patents

Abstract

En este documento se describen métodos de uso de la glicoproteína PRG4, también conocida como lubricina, para reducir, inhibir o regular negativamente las vías proinflamatorias en pacientes con riesgo de o que padecen una respuesta inflamatoria o un síntoma de alergia a través de la antagonización de CD44, regulando la producción de citocinas proinflamatorias, inhibiendo la translocación de NF-κB y/o facilitando la eliminación de restos celulares o de la matriz o alérgenos que inducen inflamación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de PRG4 como un agente antinflamatorio

Campo de la invención

Esta invención se refiere a nuevos usos de la glicoproteína humana PRG4 o lubricina. El PRG4 se describe como un agente antiinflamatorio que reduce o inhibe las respuestas inflamatorias y trata afecciones inflamatorias.

Antecedentes

El gen del proteoglicano 4 (PRG4) codifica el factor de estimulación de megacariocitos (MSF), así como también la variante de corte y empalme altamente glicosilada y glucoformas de la “ proteína de la zona superficial” , también conocida como lubricina. La proteína de la zona superficial se localizó primero en la superficie de cartílago de explante de la zona superficial y se identificó en medio acondicionado. La lubricina se aisló por primera vez del líquido sinovial y demostró una capacidad lubricantein vitrosimilar a la del líquido sinovial en una interfaz cartílago-vidrio y en una interfaz látex-vidrio. Más tarde se identificó como un producto de los fibroblastos sinoviales, y se descubrió que su capacidad lubricante dependía de los oligosacáridos Gal p (1-3)-GalNAc ligados a O dentro de un gran dominio similar a mucina de 940 aminoácidos codificados por el exón 6. Las moléculas de lubricina están glicosiladas de manera diferencial y se han descrito diversas variantes de corte y empalme de origen natural. Se denominan colectivamente en la presente memoria como PRG4. Se ha demostrado que PRG4 está presente dentro del cuerpo en la superficie de la membrana sinovial, tendón, cartílago articular como el menisco y en la película protectora del ojo, entre otros sitios, y juega un papel importante en la lubricación articular y en la homeostasis sinovial.

Antes de las invenciones de los solicitantes, PRG4 se había apreciado como una proteína con propiedades únicamente mecánicas, que proporciona funcionalidades mecánicas tales como la lubricación de articulaciones, tendones, cartílagos y actuaba como una barrera mecánica para inhibir las interacciones intercelulares. Sin embargo, como se muestra en la presente memoria, los solicitantes han descubierto que la lubricina tiene propiedades que se extienden más allá de su capacidad para proporcionar lubricación límite y anti-adhesión. En particular, los solicitantes han determinado que PRG4 tiene propiedades antiinflamatorias debido a su capacidad de actuar como ligando o molécula de señalización, que participa en las interacciones de receptor y ligando para modular, por ejemplo, la activación de CD44, la translocación de NF-<k>B y la inflamación mediada por citocinas.

Resumen de la invención

La presente invención aprovecha las propiedades antiinflamatorias hasta ahora desconocidas de PRG4, también conocida como lubricina. En consecuencia, la invención proporciona PRG4 para su uso en un método de tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal como se define en las reivindicaciones adjuntas a la presente. El descubrimiento de las propiedades antiinflamatorias de PRG4 se basa en la comprensión de diversos supuestos mecanismos por los que PRG4 consigue su efecto antiinflamatorio. Los solicitantes descubrieron estos mecanismos y determinaron que PRG4 se une a los receptores de CD44, lo que le permite actuar como un antagonista de los receptores de CD44. Como resultado, PRG4 es capaz de regular negativamente las respuestas proinflamatorias mediadas por la señalización del receptor CD44. La capacidad de PRG4 de afectar a la señalización de CD44 también tiene el efecto de regular negativamente la translocación de NF-kB. Además, se ha demostrado que la administración de PRG4 inhibe la producción de diversas citocinas proinflamatorias, y que también modula las respuestas celulares y la proliferación debidas a la inducción de citocinas proinflamatorias (p. ej., TNF-a); una característica exclusiva del PRG4 y no de otros lubricantes como el ácido hialurónico de elevado peso molecular. Por lo tanto, PRG4 puede usarse de varias maneras nuevas en contextos terapéuticos y profilácticos para efectuar una acción antiinflamatoria a través de su efecto sobre las vías de señalización involucradas en la producción de una respuesta inflamatoria.

PRG4 puede administrarse al paciente por vía sistémica. Por ejemplo, la administración puede ser intravenosa, por inhalación, intramuscular, subcutánea, oral, rectal, bucal o sublingual. PRG4 también puede administrarse al paciente por vía local, por ejemplo, administrarse al cerebro por vía tópica durante la cirugía o por inyección.

Las composiciones que contienen PRG4 pueden administrarse convenientemente a los pacientes formulando el PRG4 en una forma farmacéutica de matriz/armazón para su inyección o colocación dentro de una ubicación de un paciente. Dicha composición que contiene PRG4 puede estar en forma de una formulación de liberación controlada que es capaz de liberar lentamente PRG4 en una ubicación del paciente. Las formas farmacéuticas de matriz/armazón adecuadas incluyen, aunque no de forma limitativa, polímeros biocompatibles, matrices poliméricas, cápsulas, microcápsulas, micropartículas, dispositivos de difusión y liposomas. Otras formulaciones de este tipo incluyen líquidos que, tras la asociación con la matriz o tras la administración al paciente, forman un sólido o un gel. Además de que dichas composiciones se formulan para contener PRG4, dichas composiciones también se pueden formular para contener células genomodificadas de manera recombinante diseñadas para expresar PRG4. Las composiciones que contienen PRG4 se pueden administrar de cualquier manera adecuada para dirigir el PRG4 a la ubicación dentro de un paciente, incluida la inyección directa o la colocación de una composición de PRG4 preformada durante una intervención quirúrgica cirugía abierta o durante un procedimiento laparoscópico o artroscópico.

El PRG4 puede administrar al paciente por vía local, por ejemplo, por vía tópica o mediante inyección. La descripción contempla que la administración del PRG4 se realice en orificios, entre los que se incluye, el recto, la nariz, el oído, la faringe, la laringe y la tráquea. La descripción también contempla que la administración se realice en las vísceras, incluyendo el intestino delgado, el intestino grueso, el colon o el esófago

En otra realización, PRG4 se administra por vía sistémica o local a un paciente que padece la enfermedad de Crohn; síndrome del intestino irritable; En una reivindicación adicional, el PRG4 administrado es PRG4 humano recombinante. En otra reivindicación, el PRG4 tiene la secuencia de la Id. de sec. n.°:1 menos la secuencia de señal. En una reivindicación, PRG4 se administra en una cantidad insuficiente para proporcionar lubricación límite en el paciente. En otra realización, PRG4 se administra en una cantidad que varía de 0,1 pg/kg - 4000 pg/kg o como recubrimiento sobre una superficie tisular aplicada a partir de una solución de PRG4 que comprende, por ejemplo, una concentración de PRG4 entre 10 pg/ml y aproximadamente 2 mg/ml.

En una reivindicación, la reducción o inhibición de la respuesta inflamatoria puede medirse por el nivel de producción de una citocina proinflamatoria en el paciente. Por ejemplo, en una realización, la citocina proinflamatoria se selecciona del grupo que consiste en IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-17a, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36, TNF-a, TNF-p (linfotoxina-a), linfotoxina-p, CXC31L (Fractalquina), CXCL-8, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11, CXCL10, IFN-a, IFN-p, IFN-e, IFN-k, IFN-w , IFN-y, VEGF, MCP-1, MCP-3, EGF, GMCSF, CD40L, CD27L, CD30L, FASL, 4-1BBL, OX40L, TRAIL, FGF-2, GRO, MDC, Rantes, G-CSF, M-CSF, FGF-2, EPO, MCSF, MIP3a, MG-CSF y GCSF.

La administración de PRG4 une un receptor de CD44 en una célula del paciente, reduce o inhibe la producción de una citocina proinflamatoria en el paciente, y/o reduce o inhibe la translocación de NF-<k>B en una célula del paciente y, por lo tanto, reduce o inhibe la respuesta inflamatoria en el paciente.

En otra realización, el PRG4 se administra por vía local a dicho paciente a células donde la célula es una célula gástrica, una célula intestinal, una célula del colon o una célula rectal. En otra realización más, tanto si el PRG4 se administra por vía local como sistémica, éste se administra en una cantidad insuficiente para proporcionar una lubricación límite en el paciente. Por ejemplo, en una realización, el PRG4 se administra en una cantidad que varía de 0,1 pg/kg -4.000 pg/kg.

La administración de PRG4 puede reducir o inhibir una citocina proinflamatoria seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, IFN-<y>, TNF-a, IL-1a, IL-1p, MCP-1, EGF, FGF-2, Fractalquina, IFN-a2, GRO, MCP-3, MDC, EPO, IL-13, IL-18, MCSF, MIP-3a, MG-CSF, IL-7, IL-5, G-CSF, Rantes, IL-17a o IL-12p70.

La administración de PRG4 puede inhibir la unión de un ligando activador a CD44 presente en una superficie cuando la superficie se expone al PRG4 a una concentración suficiente para unirse a CD44 e inhibir la unión del ligando, por ejemplo, cuando el PRG4 está presente en la superficie en una cantidad suficiente para unirse a CD44 pero insuficiente para proporcionar una lubricación límite. La superficie puede ser una membrana celular de mamífero o la superficie puede estar en un detector de resonancia de plasmón superficial. La superficie puede ser de un sujeto humano. El PRG4 puede ser rhPRG4 (PRG4 humano recombinante) o nhPRG4 (Pr G4 humano natural).

El PRG4, por ejemplo rhPRG4, puede administrarse a un sujeto humano en una cantidad que varía de 0,1 pg/kg -4000 pg/kg. El PRG4, por ejemplo, rhPRG4, puede administrarse en una cantidad de 0,1 pg/ml a 30 mg/ml en pequeños volúmenes de 1-100 pl por dosis. El PRG4 puede administrarse en una cantidad de 10 pg/ml a 4 mg/ml en volúmenes de 100 p - 4 l por dosis, por ejemplo, como un enema.

Según una realización, la célula es una célula epitelial intestinal inferior de una persona con colitis o enfermedad de Crohn; Como se describe en la presente memoria, exponer una superficie a PRG4, por ejemplo, rhPRG4, antagoniza un ligando proinflamatorio de CD44. En una reivindicación, el ligando es hialuronano (HA), un complejo proteico asociado a hialuronano derivado de suero de hialuronano (HA-SHAP), o una metaloproteinasa de matriz (por ejemplo, MMP-9). En otra reivindicación, el ligando es hemopexina, EMMPRIN, somatomedina-B, osteopontina, OKT3 o una proteína relacionada con el complemento tal como C3a, CD3, CD46.

Como se describe en la presente memoria, PRG4 puede reducir o inhibir los niveles de citocinas proinflamatorias en la sangre, por ejemplo, en un sujeto humano. PRG4 puede administrarse por vía sistémica en una cantidad suficiente para reducir o inhibir los niveles de citocinas proinflamatorias. Las citocinas proinflamatorias ilustrativas incluyen IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, IFN-<y>, TNF-a, IL1-a, IL-1-p, MCP-1, EGF, FGF-2, fractalquina, IFN-a2, GRO, MCP-3, MDC, EPO, IL-13, IL-18, MCSF, MIP-3a, MG-CSF, IL-7, IL-5, G-CSF, Rantes, IL-17a o IL-12p70.

PRG4 puede inhibir la translocación de NF-kB en una célula. La puesta en contacto de una célula que contiene NF-kB con PRG4, en donde PRG4 se une a un receptor de la superficie celular, puede inhibir la activación de la vía de señalización de NF-kB. PRG4 puede inhibir un receptor de TNF-a o un receptor de IL-1 en la superficie celular.

En otra realización más, la célula es una célula epitelial.

Breve descripción de los dibujos

LasFiguras 1A-Cson gráficos de barras que presentan datos que demuestran la unión del proteoglicano 4 humano recombinante (rhPRG4), ácido hialurónico de alto peso molecular (HMW HA,high-molecular weight hyaluronic acid)y ácido hialurónico de peso molecular medio (MMW HA,médium molecular weight hyaluronic acid)al receptor de CD44 humano recombinante detectado mediante TMB-ELISA a 450 nm. Los datos representan el promedio de 4 experimentos independientes con pocillos por triplicado por grupo. LaFigura 1Arepresenta la unión de rhPRG4, HMW hA, MMW HA y vitronectina a CD44-IgG1Fc y el uso de IgG1 Fc. El asterisco (*) indica que la absorbancia a 450 nm en los pocillos CD44-IgG1 Fc fue estadísticamente significativamente mayor (p<0,001) que en los pocillos IgG1 Fc para rhPRG4, HMW HA y MMW HA. LaFigura 1Bmuestra la unión a Cd 44 dependiente de la concentración de rhPRG4, HMW HA y MMW HA. La unión de CD44 a rhPRG4 fue significativamente mayor que a HMW HA o MMW HA (p<0,001). Los asteriscos dobles (**) indican que la unión de CD44 a rhPRG4 fue significativamente mayor que a MMW HA (p<0,001). LaFigura 1Crepresenta la competencia entre rhPRG4 (5 jg/m l) y HMW HA o MMW<h>A (de 0,01 |jg/ml a 50 jg/m l) con respecto a la unión a CD44 recubierto en placas ELISA de 96 pocillos. El asterisco (*) indica que el porcentaje de unión de CD44 en los pocillos HMW HA+rhPRG4 fue significativamente inferior al de los pocillos rhPRG4 (p<0,05); (**) indica que el porcentaje de unión de CD44 en los pocillos MMW HA+rhPRG4 fue significativamente inferior al de los pocillos rhPRG4 (p<0,05).

LasFiguras 2A-Brepresentan la unión del proteoglicano 4 humano recombinante (rhPRG4) a CD44 recombinante y la competencia entre rhPRG4 y ácido hialurónico de elevado peso molecular (HMW HA) en la unión a CD44 usando resonancia de plasmón superficial. LaFigura 2Aes un sensograma que representa la asociación y la disociación dependientes de la concentración de rhPRG4 (de 300 jg/m l a 50 jg/m l) a CD44-IgGiFc inmovilizado. Las curvas con línea discontinua representan las curvas de unión de rhPRG4 a la proteína quimérica CD44 y las líneas negras representan el modelo de unión ajustado a 1: 1. LaFigura 2Bes un gráfico que muestra la respuesta relativa de la unión de HMW HA frente a la respuesta relativa de la unión de rhPRG4. Competencia entre rhPRG4 y HMW HA en la unión a CD44-IgGiFc inmovilizado. Se inyectó rhPRG4 a 300 (1), 250 (2), 200 (3), 150 (4), 100 (5), 50 (6) y 0 (7) jg/ml. Después de la disociación de rhPRG4, se inyectó HMW HA a 50 jg/ml. A medida que aumentaba la concentración de rhpRG4, disminuía la unión posterior de HMW HA a CD44.

LasFiguras 3A-Bmuestran el impacto de la digestión con sialidasa-A y O-glucosidasa del proteoglicano 4 humano recombinante (rhPRG4) sobre la unión de rhPRG4 a CD44. Los datos representan el promedio de 4 experimentos independientes con pocillos por triplicado por grupo. LaFigura 3Aes un gráfico de barras que representa la unión de rhPRG4, de rhPRG4 digerido con sialidasa-A, de rhPRG4 digerido con O-glucosidasa y de rhPRG4 digerido con sialidasa-A O-glucosidasa a CD44. Los valores de absorbancia a 450 nm en diferentes grupos se normalizaron a los valores de absorbancia en el grupo rhPRG4 no digerido. El (*) indica que la unión a CD44 del rhPRG4 digerido con sialidasa A y digerido con O-glucosidasa fue significativamente mayor en comparación con el rhPRG4 no digerido(p<0,01).(**) indica que la unión a CD44 del rhPRG4 digerido con sialidasa-A O-glucosidasa fue significativamente mayor en comparación con el rhPRG4 digerido con sialidasa-A, con O-glucosidasa y sin digerir(p<0,01).LaFigura 3Bes una fotografía de una SDS-PAGE de rhPRG4, de rhPRG4 digerido con sialidasa-A, de rhPRG4 digerido con O-glucosidasa y de rhPRG4 digerido con una combinación de sialidasa-A y O-glucosidasa. El gel se tiñó durante toda la noche con azul Commassie. La digestión con sialidasa-A y O-glucosidasa dio como resultado la reducción del peso molecular evidente de rhPRG4.

LasFiguras 4A-Bmuestran el impacto del tratamiento con proteoglicano 4 humano recombinante (rhPRG4) y ácido hialurónico de elevado peso molecular (HMW HA) sobre la proliferación de sinoviocitos similares a fibroblastos de la artritis reumatoide (RA-FLS,rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes)inducida por citocinas. Los datos representan el promedio de 3 experimentos independientes con pocillos por triplicado por tratamiento. LaFigura 4Aes un gráfico de barras que representa la inhibición de la proliferación de RA-FLS inducida por citocinas mediante rhPRG4 y HMW HA. (#) indica que los RA-FLS estimulados por citocinas tenían una absorbancia significativamente mayor (p<0,001) que las células no tratadas. (*) indica que el tratamiento con rhPRG4 (40 y 80 jg/m l) o HMW HA (40 y 80 jg/ml) de RA-FLS estimulados con Il-1p, redujo significativamente (p<0,05) la proliferación celular en comparación con las células estimuladas con Il-1p o no tratadas. (**) indica que el tratamiento con rhPRG4 (20, 40 y 80 jg/m l) redujo significativamente (p<0,05) la proliferación celular en comparación con células no tratadas estimuladas con TNF-a. LaFigura 4Bes un gráfico de barras que representa la inhibición de la proliferación de RA-FLS inducida por citocinas mediante rhPRG4 y HMW HA en presencia y ausencia de IM7, un anticuerpo específico de CD44. (#) indica que los RA-FLS estimulados por citocinas tenían una absorbancia significativamente mayor (p<0,001) que las células no tratadas. (*) indica que el tratamiento con rhPRG4 o HMW HA tuvo una proliferación celular significativamente menor en comparación con la IL-1p no tratada o tratada con (rhPRG4 o HMW HA) IM7 (p<0,05). (**) indica que el tratamiento con rhPRG4 tuvo una proliferación celular significativamente menor (p<0,05) en comparación con el TNF-a no tratado o tratado con rhPRG4 IM7 (p<0,05), un resultado que HMW HA no replicó. LaFigura 4Ces un gráfico de barras que representa la inhibición de rhPRG4 de la translocación nuclear de NF-<k>B inducida por TNF-a en RA-FLS. La translocación nuclear de NF-kB en el grupo TNF-a+rhPRG4 fue significativamente más baja que en los grupos de TNF-a solo o de TNF-a+rhPRG4+IM7 (p<0,001). El tratamiento con rhPRG4 o con el inhibidor MG132 de la translocación de NFkB, redujo significativamente la translocación nuclear de NFkB en comparación con los RA-FLS tratados con TNF-a (p<0,001).

LasFiguras 5A-Crepresentan el impacto de las citocinas proinflamatorias sobre la proliferación de sinoviocitos Prg4-/- y Prg4+/+ y el efecto de rhPRG4. LaFigura 5Amuestra micrografías de fluorescencia de sinoviocitos Prg4-/- y Prg4+/+ inmunocitoteñidos utilizando anticuerpos anti-CD44 (IM7) (Green) y DAPI (azul). La fluorescencia verde potenciada en los sinoviocitos Prg4-/- indica una localización de CD44 aumentada en comparación con los sinoviocitos Prg4+/+. LaFigura 5Bmuestra un gráfico de barras que representa la proliferación inducida por citocinas de sinoviocitos Prg4-/- y Prg4+/+. La proliferación inducida por IL-1p de sinoviocitos Prg4-/- fue significativamente mayor que la proliferación inducida por IL-1p de sinoviocitos Prg4+/+ (p<0,001) y la proliferación inducida por TNF-a de sinoviocitos Prg4-/- (p=0,002). La proliferación inducida por TNF-a de sinoviocitos Prg4-/- fue significativamente mayor que la proliferación inducida por TNF-a de sinoviocitos Prg4+/+ (p<0,001). LaFigura 5Cmuestra un gráfico de barras del impacto del tratamiento con rhPRG4 sobre la proliferación de sinoviocitos Prg4-/- inducida por citocinas en presencia y ausencia de IM7. (#) indica que los sinoviocitos Prg4-/- estimulados por citocinas tuvieron una absorbancia significativamente mayor en comparación con las células no tratadas (p<0,001). (*) indica que el tratamiento con rhPRG4 de sinoviocitos Prg4-/- estimulados con IL-1p redujo significativamente la proliferación celular en comparación con IL-1p sin tratamiento o tratamiento con rhPRG4 IM7 (p<0,001). (**) indica que el tratamiento con rhPRG4 de sinoviocitos Prg4-/- estimulados con TNF-a redujo significativamente la proliferación celular en comparación con TNF-a sin tratamiento o tratamiento con rhPRG4+IM7 (p<0,001).

LaFigura 6es la secuencia de aminoácidos de longitud completa (no truncada) de PRG4 humano (Id. de sec. n.°:1: 1404 residuos). Los residuos 1-24 (mostrados en negrita) representan la secuencia señal y los residuos 25-1404 representan la secuencia madura de PRG4 humano. La glicoproteína no requiere la secuencia líder en su forma activa.

LaFigura 7es la secuencia de ácido nucleico del gen de PRG4 (Id. de sec. n.°:2) que codifica la proteína PRG4 humana 1404 AA de longitud completa.

LasFiguras 8A-Bmuestran cómo la administración de lipopolisacárido regula positivamente la producción de citocinas inflamatorias. LaFigura 8Aes una tabla que muestra el nivel medido de cada citocina presente en muestras de sangre total después de exponerlas a solución salina (control) y después de exponerlas a lipopolisacárido. Las concentraciones de las diversas citocinas representan una media de determinaciones por duplicado y se expresan en pg/ml (ng/l). El cambio porcentual se muestra en el gráfico de barras de laFigura 8By se basa en la comparación de los resultados con estimulación por LPS con los del control con solución salina.

LasFiguras 9A-Bmuestran cómo la administración de lubricina regula negativamente la producción de citocinas inflamatorias. LaFigura 9Aes una tabla que muestra el nivel medido de cada citocina presente en muestras de sangre total después de exponerlas a solución salina (control) y después de exponerlas a lubricina. Las concentraciones de las diversas citocinas representan una media de determinaciones por duplicado y se expresan en pg/ml (ng/l). El cambio porcentual de cada citocina individual se basa en la comparación de la muestra suplementada con lubricina con la del control de solución salina y se muestra en el gráfico de barras de laFigura 9B.

LasFiguras 10A-Bmuestran cómo la administración de lubricina inhibe la generación de citocinas inflamatorias mediada por LPS. LaFigura 10Aes una tabla que muestra el nivel medido de cada citocina presente en muestras de sangre total después de su exposición a LPS y a LPS con lubricina. Las concentraciones de las diversas citocinas representan una media de determinaciones por duplicado y se expresan en pg/ml (ng/l). El cambio porcentual de cada una de las citocinas individuales se basa en la comparación de LPS solo y LPS suplementado con lubricina y se muestra en el gráfico de barras de laFigura 10B.

LasFiguras 11A-Bmuestran cómo la administración de lubricina inhibe la generación de citocinas inflamatorias mediada por TNF-a. LaFigura 11Aes una tabla que muestra el nivel medido de cada citocina presente en muestras de sangre total después de exponerlas a TNF-a y a lubricina y TNF-a. Las concentraciones de las diversas citocinas representan una media de determinaciones por duplicado y se expresan en pg/ml (ng/l). El cambio porcentual de cada una de las citocinas individuales se basa en la comparación de TNF-a solo y TNF-a suplementado con lubricina y se muestra en el gráfico de barras en laFigura 11B.

LasFiguras 12A-Bmuestran cómo la administración de lubricina inhibe la generación de citocinas inflamatorias mediada por el factor tisular (TF,tissue factor).LaFigura 12Aes una tabla que muestra el nivel medido de cada citocina presente en muestras de sangre total después de exponerlas al TF y a lubricina y TF. Las concentraciones de las diversas citocinas representan una media de determinaciones por duplicado y se expresan en pg/ml (ng/l). El cambio porcentual de cada una de las citocinas individuales se basa en la comparación de T<f>solo y TF suplementado con lubricina y se muestra en el gráfico de barras de laFigura 12B.

LaFigura 13es un gráfico que muestra los niveles de EPO, IL-13, IL-10, IL-18, IL-1a, IL-2, MCSF, IL-1p, IL-4, IFN-gamma, MIP-3a, GMCSF, IL-7, TNF-a, VEGF, MCP-1, IL-5, G-CSF, RANTES, IL-6, GRO, IL-17a e IL-12p70 en muestras de suero tomadas de ratones de ensayo que reciben una administración intraarticular de lubricina humana recombinante después de la cirugía (desestabilización del menisco medial; barras grises) en comparación con los ratones de control que se sometieron a cirugía pero a los que se administró solución salina en lugar de lubricina después de la cirugía (barras blancas).

LasFiguras 14A-Bson gráficos de barras que muestran los niveles de citocinas expresadas por sinoviocitos humanos normales y osteoartríticos cuando se exponen a lubricina humana recombinante. LaFigura 14Amuestra las concentraciones de FGF-2 mientras que laFigura 14Bmuestra las concentraciones de IL-1Ra.

Descripción detallada

La invención descrita en la presente memoria se basa en el descubrimiento de las propiedades antiinflamatorias previamente desconocidas y no apreciadas de PRG4, conocido, además, como lubricina. La invención explota las propiedades antiinflamatorias de PRG4 para proporcionar una serie de nuevos usos terapéuticos y profilácticos para PRG4. Por ejemplo, la invención encuentra aplicación en métodos para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal.

Si bien es necesaria una respuesta inflamatoria para combatir infecciones y enfermedades, muchas afecciones inflamatorias son el resultado de respuestas inflamatorias excesivas o injustificadas. Tal es el caso, por ejemplo, con las afecciones autoinmunes, reacciones alérgicas, afecciones inflamatorias crónicas y sepsis. Mientras que en algunas situaciones, la inflamación puede crear dolor crónico o malestar y conducir a una baja calidad de vida, en otras situaciones, la inflamación puede ser mortal, como es el caso de la sepsis. En consecuencia, el descubrimiento de que PRG4 puede usarse como un agente antiinflamatorio, por ejemplo, para mitigar la inflamación cuando es excesiva o injustificada, ofrece la promesa de tratar afecciones inflamatorias crónicas o agudas y regular, reducir o inhibir los niveles de inflamación asociada.

Proteína PRG4

PRG4, denominado también lubricina, es un polipéptido lubricante que en los seres humanos se expresa a partir del gen del factor estimulante de megacariocitos (MSF), también conocido como PRG4 (véase el número de acceso al NCBI AK131434 - U70136). La lubricina es una glucoproteína endógena ubicua que recubre las superficies articulares del cuerpo. La lubricina es una molécula de superficie altamente activa (por ejemplo, retiene el agua), que actúa principalmente como un potente citoprotector, antiadhesivo y lubricante de límites. La molécula tiene un dominio central largo similar a la mucina que está ubicado entre dominios proteicos terminales que permiten que la molécula se adhiera y proteja las superficies de los tejidos. Su forma natural, en todos los mamíferos investigados, contiene múltiples repeticiones de una secuencia de aminoácidos que es al menos 50% idéntica a KEPAPTT (Id. de sec. n.°:3). La lubricina natural típicamente comprende múltiples formas redundantes de esta repetición, que típicamente incluye residuos de prolina y treonina, con al menos una treonina glicosilada en la mayoría de las repeticiones. Las cadenas laterales de azúcar ligadas a O ancladas a treonina son críticas para la función de lubricación límite de la lubricina. El resto de cadena lateral es típicamente un resto p(1-3)Gal-GalNAc, con el p(1-3)Gal-GalNAc típicamente terminalmente protegido con ácido siálico o ácido N-acetilneuramínico. El polipéptido contiene, además, oligosacáridos unidos a N. El gen que codifica la lubricina de longitud completa de origen natural contiene 12 exones, y el producto del gen MSF de origen natural contiene 1404 aminoácidos (incluida la secuencia de secreción) con múltiples homologías de secuencia de polipéptidos con vitronectina, incluidas regiones similares a la hemopexina y somatomedina. El exón 6 ubicado en el centro contiene 940 residuos. El exón 6 codifica el dominio repetido rico O-glicosilado similar a mucina.

La secuencia de aminoácidos del esqueleto proteico de la lubricina puede diferir dependiendo del empalme alternativo de los exones del gen MSF humano. Esta solidez frente a la heterogeneidad se ilustró cuando los investigadores crearon una forma recombinante de lubricina a la que le faltaban 474 aminoácidos del dominio central de la mucina, pero aun así logró una lubricación razonable, aunque silenciada (Flannery et al., Arthritis Rheum 2009; 60(3):840-7). Se ha demostrado que PRG4 existe no solo como un monómero sino además, como un dímero y un multímero unidos por disulfuro a través de los dominios ricos en cisteína conservados en los extremos N y C. Lubris, LLC ha desarrollado una forma recombinante de lubricina humana de longitud completa. La molécula se expresa utilizando la línea celular de ovario de hámster chino Selexis (CHO-M), con un peso molecular aparente final de 450-600 kDa, con multímeros polidispersos que miden frecuentemente a 1000 kDa o más, todo según lo estimado en comparación con los estándares de peso molecular en geles de poliacrilamida de tris-acetato con SDS al 3-8 %. Del total de glicosilaciones, aproximadamente la mitad comprende dos unidades de azúcar (GalNAc-Gal) y la mitad tres unidades de azúcar (ácido GalNAc-Gal-Siálico). Este método de producción de PRG4 humana recombinante se describe en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/US014/061827.

Puede usarse una cualquiera o más de diversas proteínas e isoformas de PRG4 nativas y recombinantes en las diversas reivindicaciones descritas en la presente memoria. Por ejemplo, las patentes estadounidenses números 6.433.142; 6.743.774; 6.960.562; 7.030.223 y 7.361.738 describen cómo fabricar diversas formas de producto de expresión del PRG4 humano. Se prefiere usar en la práctica de la invención el PRG4 recombinante o lubricina de longitud completa, glicosilado, expresado a partir de células CHO. Esta proteína comprende 1.404 aminoácidos (véase la figura 6; Id. de sec. n.°:1) que incluye un exón central que comprende repeticiones de la secuencia KEPAPTT (Id. de sec. n.°:3) diversamente glicosilada con oligosacáridos p (1-3) Gal-GalNAc ligados a O, e incluye secuencias N y C-terminales con homología a la vitronectina. La molécula es polidispersa con el patrón de glicosilación de las moléculas individuales variable, y puede comprender especies monoméricas, diméricas y multiméricas.

Como se usa en la presente memoria, el término “ PRG4” se usa indistintamente con el término “ lubricina” . En líneas generales, estos términos se refieren a cualquier proteína PRG4 nativa o recombinante funcional aislada o purificada, homólogos, fragmentos funcionales, isoformas y/o mutantes de los mismos. Todas las moléculas útiles comprenden la secuencia codificada por el exón 6, u homólogos o versiones truncadas de la misma, por ejemplo, versiones con menos repeticiones dentro de este dominio central de repetición KEPAPTT similar a mucina, preferiblemente junto con glicosilación unida a O. Todas las moléculas útiles también comprenden al menos las partes biológicamente activas de las secuencias codificadas por los exones 1-5 y 7-12, es decir, secuencias responsables de impartir a la molécula su afinidad por la ECM y las superficies endoteliales. En ciertas reivindicaciones, una proteína p RG4 preferida tiene una masa molar promedio de entre 50 kDa y 500 kDa, preferiblemente entre 224 a 467 kDa, que comprende una o más porciones biológicamente activas de la proteína PRG4, o fragmentos funcionales, tales como un fragmento lubricante, o un homólogo del mismo. En una reivindicación más preferida, una proteína PRG4 comprende monómeros de masa molar promedio de entre 220 kDa a aproximadamente 280 kDa.

Los métodos para el aislamiento, la purificación y la expresión recombinante de proteínas tales como la proteína PRG4 son bien conocidos en la técnica. En ciertos casos, el método comienza con la clonación y el aislamiento de ARNm y ADNc que codifican proteínas o isoformas de PRG4 mediante el uso de técnicas estándar de biología molecular, tales como PCR o RT-PCR. El ADNc aislado que codifica la proteína o isoforma PRG4 se clona luego en un vector de expresión, y se expresa en una célula huésped para producir proteína PRG4 recombinante, y se aísla del sobrenadante del cultivo celular. En la Solicitud de Patente Internacional n.° PCT/US014/061827 se proporciona un método de producción de PRG4 humano recombinante.

Hasta ahora, la función de PRG4 se ha asociado casi por completo con la reducción de la fricción y la prevención del desgaste entre las articulaciones articuladas y la lubricación de los tejidos de interfaz, tales como entre la superficie del ojo y el párpado. La importancia funcional de PRG4 en el mantenimiento de las articulaciones ha sido demostrada por mutaciones que causan el de la enfermedad síndrome de camptodactilia artropatía coxa-vara pericarditis (CACP) en humanos. La CACP se manifiesta por camptodactilia, artropatía no inflamatoria y sinovitis hipertrófica, con deformidad de la coxa vara, pericarditis y derrame pleural. Además, en ratones desactivados de PRG4, se observó deterioro del cartílago y posterior falla articular. Por lo tanto, la expresión de PRG4 es un componente necesario de las articulaciones sinoviales sanas. Sin embargo, hasta donde saben los Solicitantes, el uso de un lubricante límite sistémico como la proteína PRG4, como agente antiinflamatorio, como se describe en la presente invención, no se ha sugerido anteriormente.

PRG4 como agente antiinflamatorio

El descubrimiento de las propiedades antiinflamatorias de PRG4 se basa en la observación de diversos supuestos mecanismos por los cuales PRG4 logra su efecto antiinflamatorio. Un mecanismo por el cual PRG4 produce un efecto antiinflamatorio implica CD44. Los solicitantes descubrieron que PRG4 se une a los receptores CD44, lo que le permite actuar como un antagonista del receptor CD44. Como resultado, PRG4 es capaz de regular negativamente las respuestas proinflamatorias mediadas por la señalización del receptor CD44.

CD44 es una glicoproteína y un receptor principal de la superficie celular con diversas isoformas generadas por el empalme alternativo y la glicosilación que desempeña un papel importante en la inflamación. (Cutly et al., J Cell Biol 1992; 116(4):1055-62) y participa en una variedad de interacciones célula-célula, metástasis tumoral y activación de linfocitos. CD44 se expresa en una gran cantidad de tipos de células de mamíferos y sus niveles de expresión varían entre los tipos de células y su estado de activación. Las células cancerosas o neoplásicas pueden expresar, además, CD44 y la presencia de CD44 en dichas células es indicativa de su participación en la regulación y metástasis del cáncer. En seres humanos, CD44 está codificado por el genCD44en el cromosoma 1. La señalización a través de CD44 induce la proliferación de células T y la producción de IL-2, la mejora dependiente de la dosis-respuesta de la actividad citotóxica NK y la producción de citocinas y quimiocinas de macrófagos, así como otras funciones.

Unligandobien establecido para CD44 es el hialuronano de elevado peso molecular (HMW HA), donde el HMW HA se une a un motivo extracelular en CD44 con homología con otras proteínas de unión a HA lo que da como resultado la posterior absorción intracelular de HMW HA. (Knudson et al., Matrix Biol 2002; 21(1):15-23; Harada et al., J Biol Chem 2007; 282(8):5597-607; Tibesku et al., Ann Rheum Dis 2006; 65(1):105-8). En modelos experimentales de osteoartritis, la expresión de CD44 de condrocitos aumenta con la progresión de la enfermedad y la expresión de CD44 en el cartílago articular puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad en humanos. (Fuchs et al., J Orthop Res 2004;22(4):774-80; Zhang et al., Mod Rheumatol 2013; 23(6):1186-91). Las interacciones HA/CD44 son frecuentes en una variedad de estados de enfermedad. Los carcinomas que surgen de los epitelios del colon tienden a desarrollarse en un microambiente rico en HA, en donde los receptores CD44 en las células epiteliales tumorales activan una vía de supervivencia celular mediada por tirosina cinasa, lo que conduce a una división y proliferación celular sin control (Misra S et al. Connect Tissue Res. 2008;49(3):219-24). El CD44 de las células endoteliales actúa para presentar HA al CD44 en los linfocitos T activados por antígeno, mediando así una interacción rodante que dirige el reclutamiento de leucocitos a focos inflamatorios (Johnson P y et al. Inflamm Allergy Drug Targets. Julio de 2009;8(3):208-20), p. ej., en un modelo de isquemia y reperfusión renal, la regulación positiva rápida de CD44 en las células endoteliales de los capilares renales está mediada por el reclutamiento de neutrófilos y la función y la morfología degradadas del riñón, mientras que la deficiencia de CD44 redujo la entrada de neutrófilos independientemente del nivel de factores quimiotácticos expresados (Rouschop KMA et al. J Am Soc Nephrol 2005; 16:2034-43).

El papel de CD44 puede variar según el tipo de célula, el estado inflamatorio y por ser específico del sitio. Por ejemplo, se descubrió que la deficiencia de CD44 aumentaba la inflamación en la neumonía inducida porE. colipero no en la inducida por S.pneumonia,lo que sugiere que las interacciones dependientes de CD44-HA pueden limitar la respuesta inflamatoria aE. colien lugar de aumentarla (Wang Q et al. Am J Pathol. Diciembre de 2002;161(6):2219-28).

Otros ligandos de CD44 incluyen componentes de la matriz extracelular, p. ej., colágenos, fibronectina y laminina (Naor et al., Adv Cancer Res 1997; 71:241-319; Knudson et al., Cell Mol. Life Sci. 2002; 59:36-44), la metaloproteinasa 9 de la matriz, el complejo de proteínas asociadas a hialuronano derivado del HA en suero (HA-SHAP, siglas del inglés), hemopexina, EMMPRIN, somatomedina-B, osteopontina, OKT3 o proteínas relacionadas con el complemento (tales como C3a, CD3, CD46).

Como muestran los datos presentados en el Ejemplo 1 a continuación, la interacción lubricina-CD44 muestra que esta glicoproteína tiene funciones más allá de sus propiedades mecánicas y lubricantes de límites. De hecho, los ejemplos 1A-D muestran que la lubricina actúa como un ligando, que se une a CD44. En consecuencia, debido a que la lubricina se une a CD44, la lubricina puede usarse como un antagonista de CD44 para evitar la unión de ligandos a CD44, tales como el ácido hialurónico, que dan como resultado una señalización proinflamatoria por parte de CD44. Además, debido a estas propiedades antiinflamatorias demostradas, la lubricina está indicada como un agente para tratar afecciones inflamatorias, reducir o inhibir la inflamación y reducir o inhibir una respuesta inflamatoria.

Otro mecanismo descubierto por los Solicitantes a través del cual PRG4 proporciona un efecto antiinflamatorio, es a través de la regulación negativa de la translocación de NF-kB. NF-kB es un complejo proteico que controla la transcripción del ADN, es fundamental para la supervivencia celular y desempeña un papel clave en la regulación de la respuesta inmunitaria a la infección y, a su vez, en la regulación de la producción de citocinas. NF-kB generalmente se encuentra en el citoplasma de casi todos los tipos de células animales, y cuando se induce por un estímulo, tal como estrés, citocinas, radicales libres, radiación ultravioleta, LDL oxidado y antígenos bacterianos o víricos, migra al núcleo. La regulación incorrecta de NF-<k>B se ha relacionado con cáncer, con enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias, con choque séptico, con infección vírica y con desarrollo inmunitario inadecuado. La vía de señalización de NF-kB se ha considerado durante mucho tiempo un prototipo de vía proinflamatoria. La activación de la señalización de NF-kB se desencadena en una serie de etapas a través de una de las tres vías reconocibles: la canónica, la no canónica y las vías independientes atípicas I<k>K. En su estado desactivado, NF-<k>B está unido a I<k>B. La señal de activación (p. ej., unión de TNF-a, IL-1a, LPS, CD40, Linfotoxina, UV, HER2/Neu, H202 u otro ligando) provoca la fosforilación de IkB y desencadena su degradación. El NF-kB libre no unido puede translocarse después en el núcleo y activar la transcripción, p. ej., de citocinas, quimiocinas y moléculas de adhesión proinflamatorias.

Como se muestra en el Ejemplo 1F a continuación, la administración de lubricina puede reducir la translocación de NF-kB en un modelo de sinoviocito similar a fibroblasto de la artritis reumatoide. Parece que el efecto de PRG4 sobre la translocación de NF-kB está mediado por el efecto de PRG4 en al menos CD44, como muestran los datos del Ejemplo 1F. Basándose en estos datos, PRG4 está indicado como un agente antiinflamatorio y también como un agente para tratar afecciones inflamatorias, reducir o inhibir la inflamación y reducir o inhibir una respuesta inflamatoria. PRG4 también está indicado como tratamiento de cualquier afección que pueda mejorarse reduciendo la translocación de NF-kB. Esto incluye afecciones inflamatorias ya que NF-kB es un factor de transcripción que participa en la regulación de la expresión de muchas citocinas proinflamatorias producidas por el sistema inmunitario tanto innato como adaptativo.

Los solicitantes han observado, además, que la lubricina logra su efecto antiinflamatorio al inhibir o regular negativamente la producción de una serie de citocinas proinflamatorias por mecanismos desconocidos. Como se muestra en los datos presentados en los Ejemplos 2 y 3 a continuación, la lubricina regula negativamente la producción de citocinas proinflamatorias y, por lo tanto, tiene un efecto antiinflamatorio. Este efecto se demostró con la generación de citocinas inflamatorias mediada por lipopolisacárido (LPS), generación de citocinas inflamatorias mediada por TNF-a y generación de citocinas inflamatorias mediada por el factor tisular (TF). En consecuencia, el efecto de la lubricina sobre la producción de citocinas proinflamatorias se ha verificado en diversas vías diferentes.

La lubricina puede, además, lograr su efecto antiinflamatorio a través de su función como antiadhesivo/lubricante. Los solicitantes han observado que las mitocondrias en las células sometidas a estrés mecánico pueden deformarse, perturbar su función y conducir a la producción de especies reactivas oxidativas, muerte celular y producción de restos celulares localizados, y la consiguiente inflamación local. La acción lubricante de la lubricina presente en dichas células estresadas mecánicamente o cerca de ellas inhibe, además, el desarrollo de inflamación localizada en la medida en que mitiga el estrés mecánico en las células y sus mitocondrias.

En virtud de sus propiedades antiinflamatorias, la lubricina, en consecuencia, será útil como modulador paninmunitario y como agente antiinflamatorio para reducir o inhibir la respuesta inflamatoria, por ejemplo, al reducir o inhibir la generación de citocinas proinflamatorias. En consecuencia, la lubricina se indica como un agente para tratar afecciones inflamatorias, reducir o inhibir la inflamación y reducir o inhibir una respuesta inflamatoria.

En consecuencia, a través de estos modos de acción, PRG4 tiene la capacidad de regular negativamente varias vías de señalización involucradas en la respuesta inflamatoria y, por lo tanto, es útil como agente antiinflamatorio. Como se describe en la presente memoria, la administración de<p>RG4 se indica para tratar una amplia variedad de afecciones y enfermedades inflamatorias y la inflamación asociada con esas afecciones.

Usos de PRG4 como agente antiinflamatorio

Debido a las propiedades antiinflamatorias de PRG4 descritas en la presente memoria, PRG4 está indicado para nuevos usos no apreciados previamente. PRG4 está indicado para su uso en un método de tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal.

Como se describe en la presente memoria, “ tratar” al paciente puede implicar prevenir el empeoramiento de la afección, mientras que en otros puede implicar aliviar o reducir o inhibir la inflamación asociada a la afección, o “ tratar” puede referirse a reducir el nivel de una o más citocinas proinflamatorias en el paciente.

Se describe un método para reducir o inhibir una respuesta inflamatoria en un paciente, donde el método implica administrar al paciente PRG4, que se une a un receptor de CD44 en una célula del paciente, reduce o inhibe la producción de una citocina proinflamatoria en el paciente o reduce o inhibe la translocación de NF-kB en una célula del paciente. Como resultado, el paciente experimenta una reducción o inhibición de la respuesta inflamatoria.

Mientras que el paciente es preferiblemente un humano, el paciente puede ser cualquier mamífero, por ejemplo, un caballo, una vaca, un cerdo, una rata, un ratón, un perro o un gato.

Mientras que la lubricina se produce naturalmente dentro del cuerpo, los efectos de la invención se observan cuando se administra lubricina exógena al paciente. Por consiguiente, en una reivindicación, el PRG4 administrado al paciente es lubricina humana exógena, mientras que en otra reivindicación, el PRG4 administrado al paciente es lubricina humana recombinante (rhPRG4). En otra reivindicación, rhPRG4 tiene la secuencia de la Id. de sec. n.°:1.

En una realización, el PRG4 se administra en una cantidad que es insuficiente para proporcionar una lubricación límite. En consecuencia, una cantidad terapéuticamente eficaz de lubricina para la administración según la invención está en el intervalo de 0,1 pg/kg a 4000 pg/kg, o de 0,1 pg/kg a 1000 pg/kg, o de 0,1 pg/kg a 100 pg/kg, o de 0,1 a 50 pg/kg. La lubricina se puede administrar, p. ej., mediante aplicación a la superficie de un tejido, en una cantidad de 0,1 pg/ml a 30 mg/ml, o de 1 pg/ml a 10 mg/ml, o de 10 pg/ml a 1 mg/ml. En algunos casos, la lubricina se administra en pequeños volúmenes de 1 a 100 pl por dosis. En algunos casos, la lubricina se administra en grandes volúmenes de 100 pl a 4 l, por ejemplo, como un enema. En otros casos, la lubricina se administra en concentraciones no superiores a 60 pg/ml.

La cantidad de lubricina administrada dependerá de variables tales como el nivel o el lugar de la inflamación, la extensión de la afección a tratar, la salud general del paciente, la formulación farmacéutica y la vía de administración. La dosificación inicial puede aumentar más allá del nivel superior para alcanzar rápidamente el nivel deseado en sangre o en tejido. Alternativamente, la dosis inicial puede ser menor que la óptima, y la dosis puede aumentarse progresivamente durante el curso del tratamiento. La dosis óptima puede determinarse mediante experimentación de rutina.

Para la administración, la lubricina se combina preferentemente con un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente memoria, “ portador farmacéuticamente aceptable” significa tampones, portadores y excipientes adecuados para usar en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, proporcional a una relación riesgo/beneficio razonable. Los portadores deben ser “ aceptables” en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de las formulaciones y no perjudiciales para el receptor. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen tampones, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. Los portadores pueden incluir, además, biomateriales tales como matrices, hidrogeles, polímeros, armazones de tejidos y materiales portadores reabsorbibles, incluidas esponjas de colágeno. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Pueden prepararse formulaciones útiles por métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (Mack Publishing Company, 1990). Los componentes de la formulación adecuados para la administración parenteral incluyen un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos como el alcohol bencílico o el metilparabeno; antioxidantes como el ácido ascórbico o el bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como EDTA; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad como el cloruro de sodio o la dextrosa. La lubricina para administración puede presentarse en una forma de unidad de dosificación y puede prepararse mediante cualquier método adecuado y debe formularse para que sea compatible con la ruta de administración prevista.

La invención contempla que PRG4 pueda administrarse al paciente por vía sistémica o local. La administración local puede estar justificada en casos donde la respuesta inflamatoria se localiza en un tejido u órgano específico y es posible acceder al tejido u órgano mediante, por ejemplo, inyección o administración local. Sin embargo, la administración sistémica está contemplada, además, por algunas reivindicaciones de la invención. La administración sistémica puede estar justificada cuando la respuesta inflamatoria está localizada, pero la administración local no es factible o no está indicada. La administración sistémica, además, puede estar justificada cuando la respuesta inflamatoria no se localiza en un área del paciente, sino que se encuentra en todo el paciente o en más de una ubicación del paciente. Además, debido a que las células proinflamatorias viajan a través del sistema circulatorio del paciente, la administración sistémica puede ser el modo óptimo de administración para garantizar que PRG4 tenga la mayor oportunidad de interactuar y contrarrestar las actividades de las células proinflamatorias, por ejemplo, en el tratamiento de la sepsis.

La lubricina se describe para su administración por vía sistémica para lograr una reducción o inhibición de la respuesta inflamatoria o para tratar una afección inflamatoria. Por ejemplo, la lubricina puede administrarse por vía sistémica de manera enteral, tal como mediante suministro oral, rectal, sublingual, sublabial o bucal. La lubricina también se describe para administración sistémica de manera parenteral, tal como mediante suministro nasal, por inhalación, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intradérmico, intraperitoneal o transmucoso.

La descripción contempla que la administración del PRG4 se realice en orificios, entre los que se incluye, el recto, la nariz, el oído, la faringe, la laringe y la tráquea. La descripción también contempla que la administración se realice en las vísceras, incluyendo el intestino delgado, el intestino grueso, el colon o el esófago. En algunas realizaciones, el sitio de administración puede ser un lugar de inflamación, mientras que en otras realizaciones, el sitio de administración puede elegirse para facilitar la administración.

Para su uso en la práctica de la invención, PRG4 puede formularse en un portador, por ejemplo, suspendido en solución salina tamponada con fosfato, a concentraciones que varían de 1 pg/ml a 1000 pg/ml, y más preferiblemente, 100-500 pg/ml. Los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS), opcionalmente en mezcla con tensioactivos tales como polisorbatos. El portador debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe preservarse contra microorganismos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), y mezclas adecuadas de los mismos.

El momento de la administración dependerá de una variedad de factores y de la afección a tratar. Por ejemplo, en una reivindicación, la administración de lubricina para tratar la inflamación que incide en una afección crónica puede dar como resultado la administración diaria, semanal, quincenal, dos veces al día o mensual. En otra reivindicación, el tratamiento de la inflamación que incide en una afección aguda puede requerir la administración continua de lubricina, por ejemplo, por goteo intravenoso, durante un período fijo de tiempo.

Las afecciones inflamatorias que pueden tratarse con los métodos de la invención incluyen, enfermedad inflamatoria intestinal, que incluye;síndrome del intestino irritable o enfermedad de Crohn. En algunos casos donde PRG4 se une a un receptor de CD44 en una célula, la célula puede ser un glóbulo blanco (es decir, un leucocito) tal como un linfocito (por ejemplo, célula T, célula B, célula NK), neutrófilo, eosinófilo, basófilo y monocito, macrófago o célula dendrítica; célula suprarrenal; célula cerebral; célula cancerosa; célula cardíaca; condrocito; célula de colon; célula conjuntival; célula corneal; célula dendrítica; célula endotelial; célula epitelial; fibroblasto; célula de la vesícula biliar; célula gástrica; célula hepática; célula inmunitaria tal como un mastocito, una célula dendrítica, un linfocito, un leucocito o un macrófago; célula intestinal; leucocitos; célula del limbo; célula pulmonar; linfocito; macrófago; mastocito; célula muscular; célula nerviosa; célula ocular u oftálmica; osteoblasto; osteoclasto; célula pancreática; célula rectal; célula renal; célula retiniana; célula del bazo; célula madre; sinoviocito; célula del timo; célula tiroidea; célula de la malla trabecular; célula uretral; o célula vascular. Sin embargo, esta lista no es limitante.

En algunos casos donde la administración de PRG4 reduce o inhibe la translocación de NF-<k>B en una célula, la célula puede ser un glóbulo blanco (es decir, un leucocito) tal como un linfocito (por ejemplo, célula T, célula B, célula NK), neutrófilo, eosinófilo, basófilo y monocito, macrófago o célula dendrítica; célula suprarrenal; célula cerebral; célula cancerosa; célula cardíaca; condrocito; célula de colon; célula conjuntival; célula corneal; célula dendrítica; célula endotelial; célula epitelial; fibroblasto; célula de la vesícula biliar; célula gástrica; célula hepática; célula inmunitaria tal como un mastocito, una célula dendrítica, un linfocito, un leucocito o un macrófago; célula intestinal; leucocitos; célula del limbo; célula pulmonar; linfocito; macrófago; mastocito; célula muscular; célula nerviosa; célula ocular u oftálmica; osteoblasto; osteoclasto; célula pancreática; célula rectal; célula renal; célula retiniana; célula del bazo; célula madre; sinoviocito; célula del timo; célula tiroidea; célula de la malla trabecular; célula uretral; o célula vascular. Sin embargo, esta lista no es limitante.

En algunos casos donde PRG4 se une a un receptor CD44 en una célula o donde la administración de PRG4 reduce o inhibe la translocación de NF-<k>B en una célula, cuando la célula es un sinoviocito, un condrocito, un osteocito, un osteoblasto, una célula de la retina, una célula del limbo, una célula de malla trabecular, una célula corneal, una célula conjuntival, una célula ocular o una célula oftálmica, PRG4 se administra al paciente por vía sistémica.

En otro caso, la citocina proinflamatoria, cuya producción se inhibe o reduce mediante la administración de lubricina es IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-17a, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36, TNF-a, TNF-p (linfotoxina-a), linfotoxina- p, CXC31L (Fractalquina), CXCL-8, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11, CXCL10, IFN-a, IFN-p, IFN-e, IFN-k, IFN-w , IFN-y, VEGF, MCP-1, MCP-3, EGF, GMCSF, CD40L, CD27L, CD30L, FASL, 4-1BBL, OX40L, TRAIL, FGF-2, GRO, MDC, Rantes, G-CSF, M-CSF, FGF-2, EPO, MCSF, MIP3a, MG-CSF o GCSF. En otro caso, la administración de lubricina reduce o inhibe el nivel de una o más, dos o más, o tres o más, o cuatro o más de las citocinas proinflamatorias mencionadas anteriormente.

La reducción o inhibición de la producción de una citocina proinflamatoria puede confirmarse por el nivel inferior de la citocina en una muestra de fluido corporal tomada del paciente después de la administración de lubricina en comparación con el nivel anterior. La muestra de fluido corporal puede ser sangre o plasma, por ejemplo. Dado que el efecto de la lubricina sobre un determinado nivel de citocinas puede no ser medible inmediatamente después de la administración de lubricina, puede observarse una reducción o inhibición en el transcurso de horas, días o semanas después de la administración inicial de lubricina.

En la presente memoria se describe un método de inhibición de la unión de un ligando a CD44 presente en una superficie. Según este método, la superficie está expuesta a la lubricina y la lubricina se une a CD44 e inhibe la unión del ligando.

En un caso, la superficie puede ser la superficie de una célula que expresa CD44, tal como una célula de mamífero. En otro caso, la superficie está en un detector de resonancia de plasmón superficial. En otro caso más, la superficie de la célula está en un humano.

Una célula que expresa CD44 puede incluir glóbulos blancos (es decir, leucocitos) tales como linfocitos (por ejemplo, células T, células B, células NK), neutrófilos, eosinófilos, basófilos y monocitos, macrófagos y células dendríticas; células epiteliales, células endoteliales, fibroblastos, sinoviocitos, condrocitos, osteoclastos, osteoblastos, células cardíacas, mastocitos, células musculares, células pulmonares, células renales, células hepáticas, células cerebrales, células del bazo, células uretrales, células vasculares, células nerviosas, células pancreáticas, células gástricas, células intestinales, células del colon, células rectales, células oculares u oftálmicas, células de la vesícula biliar y células madre.

En otro caso, una célula que expresa CD44 es una célula neoplásica o cancerosa. En un caso, una célula cancerosa incluye células de cáncer de mama, células de cáncer de colon, células de cáncer de endometrio, células de cáncer de ovario, células de cáncer de piel, células de cáncer de vejiga, células de cáncer de hígado, células de cáncer renal, células de cáncer de cuello uterino, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de lengua, células de cáncer de páncreas, células de carcinoma de pulmón de células no pequeñas, células de cáncer de cabeza y cuello, células de cáncer de próstata, células de cáncer uterino, células de carcinoma hepatocelular, células de cáncer gástrico, células de carcinoma nasofaríngeo, células de cáncer de vesícula biliar, células de cáncer anal, células de osteosarcoma, células de liposarcoma, células de leiomiosarcoma, células de rabdomiosarcoma, células de neurofibrosarcoma, células de tumor del estroma gastrointestinal, células de tumor de vasos sanguíneos, células de fibrosarcoma, células de linfoma y células de cáncer de cerebro.

El ligando inhibido por la unión de PRG4 a CD44 presente en una superficie puede ser hialuronano (HA), un complejo de proteína asociada a hialuronano derivado de suero de hialuronano (HA-SHAP), metaloproteinasa-9 matriz, una citocina, una quimiocina, un interferón, una interleucina, una linfocina, un factor de necrosis tumoral, un factor de crecimiento o una hormona.

La lubricina puede proporcionarse en una cantidad que es insuficiente para proporcionar lubricación límite. Los solicitantes han determinado que los efectos de la lubricina sobre la unión a CD44 pueden lograrse a concentraciones mucho más bajas que las necesarias para lograr la lubricación límite. En consecuencia, en una realización, la lubricina se administra en una cantidad que varía de 0,1 pg/kg a 4000 pg/kg. La lubricina, en una realización, se administra por vía sistémica, es decir, mediante inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular, aunque puede administrarse por vía local.

La célula que expresa CD44 puede ser una célula de mamífero, por ejemplo, una célula humana.

las pruebas sugieren que la señalización del CD44 está implicada en la progresión del cáncer y que también puede interferir con la eficacia de ciertos medicamentos quimioterápicos. Por ejemplo, se ha demostrado que la resistencia del mieloma múltiple al tratamiento con dexametasona, un agente quimioterápico, puede deberse a la interacción de CD44 con HA. (Ohwada et al., Eur J Heamatol 2008; 80:245). En consecuencia, en una realización, la lubricina puede utilizarse para unirse a CD44 en la superficie de una célula cancerosa para inhibir la señalización de CD44 implicada en el crecimiento, la supervivencia, la progresión o la actividad metastásica de las células cancerosas. En otra realización, la lubricina se administra a un paciente que tiene cáncer o a un paciente con riesgo de desarrollar cáncer para tratar el cáncer o retrasar el crecimiento o la progresión de un tumor. Según otra realización, la lubricina puede administrarse simultáneamente con un tratamiento quimioterápico o radiológico para el cáncer. En consecuencia, en una realización, la lubricina se administra a un paciente que tiene cáncer, en donde la lubricina se administra para tratar el cáncer, o en donde la lubricina se administra junto con otro fármaco o tratamiento contra el cáncer para tratar el cáncer. En un ejemplo, el cáncer está en un sujeto humano.

Como se describe en la presente memoria, PRG4 puede usarse para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal, tal como la enfermedad de Crohn o la colitis. En tales casos, se introducirá una solución concentrada de PRG4 en el tubo digestivo mediante una simple ingestión, un enema, una sonda de alimentación, una sonda de gastrostomía, una sonda yeyunal o una colostomía. En el caso de la ingestión, el PRG4 puede encapsularse dentro de un comprimido, un espacio cerrado o una cápsula, preferentemente biodegradable, en donde el comprimido, el espacio cerrado o la cápsula, están hechos de una sustancia que se degrada o se disocia de otro modo cuando se expone a las condiciones presentes en el tubo digestivo de un paciente. Dichas formulaciones orales pueden estar presentes en un polímero como un sistema de suministro de liberación lenta. Las formulaciones orales se conocen bien en la tecnología de suministro de fármacos y un experto podría seleccionar dicho comprimido, espacio cerrado o cápsula, según sea apropiado, para el suministro ingerible del PRG-4.

Como se describió en la presente memoria, PRG4 puede reducir el nivel de citocinas proinflamatorias en el cuerpo. Las citocinas cuya producción puede inhibirse o reducirse mediante la administración de lubricina incluyen IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-17a, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36, TNF-a, TNF-p (linfotoxina-a), linfotoxina-p, CXC31L (Fractalquina), CXCL-8, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11, CXCL10, IFN-a, IFN-p, IFN-e, IFN-<k>, IFN-<w>, IFN-<y>, VEGF, MCP-1, MCP-3, EGF, GMCSF, CD40L, CD27L, CD30L, FASL, 4-1BBL, OX40L, TRAIL, FGF-2, GRO, MDC, Rantes, G-CSF, M-CSF, FGF-2, EPO, MCSF, MIP3a, MG-CSF o GCSF.

En una realización adicional, la célula humana es una; célula gástrica; célula intestinal; célula de colon; célula rectal. En una realización, la lubricina se administra en una cantidad insuficiente para proporcionar una lubricación límite, es decir, se administra en el intervalo de 0,1 pg/kg a 4.000 pg/kg. En otra realización, la lubricina se administra en una cantidad de 0,1 pg/ml a 30 mg/ml y se administra en pequeños volúmenes de 1 a 100 pl por dosis. En otra realización, la lubricina se administra en volúmenes de 100 pl a 4 l por dosis. En un ejemplo, la lubricina se proporciona a un paciente humano mediante administración sistémica.

Como se describe en la presente memoria, PRG4 puede inhibir la translocación de NF-kB en una célula al inhibir la activación de la vía de señalización de NF-<k>B. PRG4 puede inhibir indirectamente la translocación de NF-<k>B al unirse a CD44 o al reducir o inhibir la señalización de CD44 o interactuar con otros receptores unidos a la superficie celular.

La reducción o inhibición de la translocación de NF-<k>B, mediada por PRG4, puede dar lugar a la reducción de los niveles de citocinas proinflamatorias en sangre y, por lo tanto, puede usarse para tratar una afección inflamatoria.

Ejemplo 1: Prueba experimental de que PRG4 antagoniza a CD44 e inhibe las vías inflamatorias mediadas por CD44

Para evaluar la interacción entre el receptor del proteoglicano 4 humano y el de CD44 y la consecuencia de esta interacción sobre la proliferación de sinoviocitos inducida por citocinas pro-inflamatorias, se realizaron los siguientes experimentos.

La unión de rhPRG4 a CD44 y la competencia con ácido hialurónico de elevado peso molecular (HMW HA) se evaluó usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) directo y por resonancia de plasmón superficial. Se realizó digestión de rhPRG4 con sialidasa-A y O-glucosidasa y se evaluó la unión a CD44 mediante el uso de ELISA. Se estimularon sinoviocitos similares a fibroblastos de la artritis reumatoide (RA-FLS) con interleucina-1 beta (IL-1p) o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) durante 48 horas en presencia o ausencia de rhPRG4 o HMW HA a 20, 40 y 80 pg/ml y se midió la proliferación celular. La contribución de CD44 se evaluó mediante la incubación conjunta con un anticuerpo anti-CD44 (IM7). El efecto antiproliferativo de rhPRG4 se investigó después del tratamiento de sinoviocitos Prg4-/- con IL-1p o TNF a en presencia o ausencia de IM7.

Las variables se probaron inicialmente para determinar la normalidad y la igualdad de varianzas. Las variables que cumplieron ambos supuestos se probaron para determinar la significación estadística usando la prueba de la t de Student o el análisis de varianza (ANOVA) con la pruebaa posterioride Tukey para comparaciones de dos grupos y más de dos grupos, respectivamente. Las variables que no cumplieron el supuesto de normalidad se probaron mediante la prueba U de Mann-Whitney o ANOVA por rangos. El nivel de significación estadística se estableció en a=0,05. Los datos se representan gráficamente como el promedio ± desviación estándar.

1A Unión a CD44 de rhPRG4, HA de elevado peso molecular, HA de peso molecular medio y de vitronectina, utilizando un ELISA directo

Placas de microtitulación de alta unión (Corning, Sigma Aldrich, EE. UU.) se recubrieron con rhPRG4(Mr=240 KDa), con HA de elevado peso molecular (HMW HA; Mr=1.500 KDa) (R & D System, EE. UU.), con HA de peso molecular medio (MMW HA; Mr=300KDa) (R & D System) y con vitronectina (Mr=75 KDa)(Sigma Aldrich) a 400 pg/ml en tampón PBS (100 pl por pocillo) durante la noche a 4 °C. El rhPrg4 es un producto de longitud completa producido por células CHO-M (Lubris, Framingham, MA, EE. UU.). Después de lavar con PBS Tween 20 al 0,1 %, los pocillos se bloquearon con seroalbúmina bovina al 2 % (BSA; 300 pl por pocillo) durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. Se añadieron CD44-IgGiFc (R & D systems) o IgGiFc (R & D systems), cada uno a 1 pg/ml (100 pl por pocillo), a la placa y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS+Tween 20 al 0,1 %, se añadió anti-IgGiFc-HRP (Sigma Aldrich) a una dilución 1:10 000 (100 pl por pocillo) y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS+Tween 20 al 0,1 %, el ensayo se desarrolló mediante el uso del reactivo ELISA Turbo TMB de la etapa 1 (ThermoScientific, EE. UU.) y se midió la absorbancia a 450 nm. Los datos representan un promedio de 4 ensayos independientes, cada uno con pocillos por triplicado por grupo.

La unión de rhPRG4, HMW HA, MMW HA y vitronectina a la proteína de fusión CD44-IgG-iFc e IgGiFc se presenta en laFigura 1A.La absorbancia a 450 nm en el grupo CD44-IgG-iFc fue significativamente mayor (p<0,001) que la absorbancia en el grupo IgGiFc para los pocillos recubiertos con rhPRG4, HMW HA y MMW h A. Por el contrario, no hubo diferencias significativas entre CD44-IgG-iFc e IgGiFc en los pocillos recubiertos con vitronectina.

Estos datos muestran que rhPRG4 se une a CD44 e interfiere con la unión de HMW HA CD44. rhPRG4, HMW HA y MMW HA se unen específicamente al CD44 quimérico con una unión no específica extremadamente baja. Por el contrario, la vitronectina que comparte una homología de secuencia significativa con la lubricina no muestra ninguna especificidad hacia la unión a CD44. Debido a que rhPRG4 se une a CD44, puede funcionar como un antagonista de CD44, lo que interfiere con la señalización proinflamatoria de CD44.

IB. Unión dependiente de la concentración de rhPRG4, HMW HA, MMW HA a CD44 y competencia entre rhPrG4 y HA al unirse a CD44 usando un ELISA directo

La unión dependiente de la concentración de rhPRG4, HMW HA y MMW HA a CD44, se realizó mediante el recubrimiento de placas de microtitulación con 400, 200, 100, 20, 4, 2 y 0,1 pg/ml de las macromoléculas. El ensayo se realizó como se describió anteriormente. Los valores de absorbancia en los pocillos con IgG-iFc se restaron de los valores de absorbancia en los pocillos con CD44 IgG-iFc y los valores de absorbancia corregidos para CD44 IgG-iFc se normalizaron a los del grupo de rhPRG4 a 400 pg/ml y los datos se expresaron como porcentaje de unión a CD44. La unión dependiente de la concentración de rhPRG4, HMW HA y MMW HA a CD44 recombinante se representa en laFigura 1B.El porcentaje de unión a CD44 recombinante fue significativamente mayor (p<0,001) en los pocillos recubiertos con rhPRG4 en comparación con los pocillos recubiertos con HMW HA o m Mw HA a las concentraciones de 400, 100, 20, 4 y 2 pg/ml. Además, el porcentaje de unión a CD44 recombinante fue significativamente mayor (p<0,001) en los pocillos recubiertos con rhPRG4 en comparación con los pocillos recubiertos con MMW HA a las concentraciones de 200 pg/ml. No hubo diferencias significativas en el porcentaje de unión a CD44 entre los pocillos recubiertos con rhPRG4, HMW HA y MMW HA a la concentración de 0,1 pg/ml. Los datos representan un promedio de 4 ensayos independientes, cada uno con pocillos por triplicado por grupo.

Para evaluar la competencia entre rhPRG4 y HMW HA o MMW HA en la unión a CD44, las placas de microtitulación se recubrieron con CD44 IgG-iFc o IgGiFc a 1 pg/ml (100 pl por pocillo) durante toda la noche a 4 °C. Posteriormente, los pocillos se lavaron con PBS+Tween 20 al 0,1 % y los pocillos se bloquearon utilizando BSA al 2 % (300 pl por pocillo) durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. Ya sea rhPRG4 a 5 pg/ml o una combinación de rhPRG4 (5 pg/ml) y HMW HA o MMW HA a 0,01, 0,05, 0,25, 1, 5 o 50 pg/ml se añadieron a los pocillos (100 pl por pocillo) y se incubó a temperatura ambiente durante 60 min. Después de lavar con PBS+Tween 20 al 0,1 %, se añadió anticuerpo monoclonal específico de lubricina (Mab 9G3) a 1:1000 (100 pl por pocillo) y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS+Tween 20 al 0,1 %, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con HRP (Thermo Scientific) a una dilución 1:1000 (100 pl por pocillo) y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. El ensayo se desarrolló como se describió anteriormente. Los valores de absorbancia en los pocillos de IgGiFc se restaron de los valores de absorbancia en los pocillos de CD44-IgG-iFc y los valores de absorbancia corregidos en los grupos rhPRG4+HA se normalizaron a los valores de absorbancia del grupo rhPRG4 y los datos se expresaron como porcentaje de unión a CD44. Los datos representan un promedio de 4 ensayos independientes, cada uno con pocillos por triplicado por grupo.

La competencia entre rhPRG4 y HMW HA o MMW HA por la unión a CD44 recombinante se presenta en laFigura IC .HMW HA o MMW HA a 0,05, 0,25, 1, 5 y 25 pg/ml redujo significativamente la unión de rhPRG4 a CD44 (p<0,05).

Estos datos demuestran que rhPRG4 se une a CD44 de una manera dependiente de la concentración con una afinidad comparable a HMW HA. Además, rhPRG4 compite con HMW HA por la unión a CD44. La presencia de un exceso de HMW o MMW HA redujo la unión de rhPRG4 a CD44 solo en aproximadamente 50 %. Estos datos sugieren que rhPRG4 es un antagonista de CD44; en consecuencia, tiene el potencial de interferir con la señalización proinflamatoria de CD44.

IC. Unión dependiente de la concentración de rhPRG4 a CD44 y competencia entre rhPRG4 y HMW HA usando resonancia de plasmón superficial

Se investigó la unión de rhPRG4 a CD44-IgG1Fc usando resonancia de plasmón superficial (Biacore T100, GE Healthcare Lifesciences, NJ, EE. UU.). Ver Figura 1C. Los chips de la Serie S se funcionalizaron utilizando el kit de captura de anticuerpos humanos (GE Life Sciences) y se permitió que CD44-IgGiFc o IgG-iFC se unieran a la superficie de los chips funcionalizados en la celda de flujo 1 (Fc-i) y la celda de flujo 2 (Fc2), respectivamente. Se inyectó rhPRG4 a 30 pl/min durante 8 min a concentraciones de 300, 25o, 200, 150, l0o y 50 pg/ml seguido de una disociación de 10 min utilizando HEPES 0,1 M, NaCl 1,5 M, EDTA 30 mM y P20 al 0,5 % (GE Life Sciences). La superficie del chip se regeneró al final de cada ciclo con un pulso de 1 min de MgCh 3 M. Cada concentración de analito se inyectó por duplicado. Las curvas resultantes tenían doble referencia (es decir, Fc2-Fc-i, seguido de la resta de la curva de 0 pg/ml). La cinética de unión y la afinidad de unión se determinaron mediante el software BiaEvaluation, mediante el uso del modelo de cambio de conformación/unión 1:1 o el equilibrio de estado estacionario, respectivamente. Para estudiar la competencia entre rhPRG4 y HMW HA por la unión a CD44, se inyectó rhPRG4 a concentraciones que variaban entre 0 y 300 pg/ml como se ha descrito anteriormente. Después del final de la fase de disociación, se inyectó HMW HA a 50 pg/ml (30 pl por minuto) durante 1 minuto. Las señales de unión de doble referencia de rhPRG4 (a diversas concentraciones) a CD44 se representaron después gráficamente luego frente a las señales de unión generadas por la unión de HMW HA a CD44 tras las inyecciones de rhPRG4.

La unión de rhPRG4 a CD44 recombinante se confirmó utilizando resonancia de plasmón superficial. El rhPRG4 mostró una asociación dependiente de la concentración con, y una disociación de cD44-IgGiFc inmovilizado (Figura 2A), con una Kd aparente de = 38 nM basándose en un peso molecular de rhPRG4 de 240 KDa. El rhPRG4 interfirió con la unión de h Mw HA a CD44 recombinante, como muestra una relación inversa entre la intensidad de la señal de unión de HMW HA(eje x)y la intensidad de la señal de unión de rhPRG4(eje y)(Figura 2B).

Estos datos demuestran que rhPRG4 se une a CD44 de una manera dependiente de la concentración con una afinidad comparable a HMW HA. Además, como se demostró en el Ejemplo 1B y 1C, la presencia de rhPRG4 unido a CD44 evitó que HMW HA se uniera a CD44 de una manera dependiente de la concentración y puede indicar que rhPRG4 y HMW HA comparten un sitio de unión común en el receptor. En el entorno de la articulación donde la concentración de HA SF es aproximadamente 10 veces mayor que la de lubricina, y en base a los datos de unión competitivos mostrados en la presente memoria, se espera que la lubricina pueda unirse al CD44 en la superficie de sinoviocitos y condrocitos y ejercer una función biológica mediada por CD44 en presencia de HA, lo que proporciona un papel homeostático conjunto al interferir con mediadores que de otro modo promueven la inflamación.

ID. Impacto de la eliminación de las glucosilaciones del dominio de mucina en la unión de rhPRG4 a CD44

La capacidad de lubricación límite de la lubricina está mediada por los oligosacáridos (p1-3) Gal-GalNAc ligados a O (Jay et al., Glucoconj J 2001; 18(10):807-15). Una combinación de digestiones con neuraminidasa y beta 1,3,6 galactosidasa redujo la capacidad de lubricación límite de la lubricina en un 50% (Jay et al., Glucoconj J2001; 18(10):807-15). La lubricina aislada de muestras RA SF contiene estructuras de glicosilación de núcleo 1 aumentadas y muestra el epítopo sulfatado que se propone que forma parte del ligando de L-selectina (Estrella et al., Biochem J2010; 429(2):359-67). Además, la lubricina de RA SF se une a la L-selectina de manera dependiente de la glicosilación y recubre los granulocitos polimorfonucleares reclutados para la sinovia inflamada y SF de pacientes con RA (Jin et al. J Biol Chem 2012; 287(43):35922-33).

rhPRG4 se digirió utilizando sialidasa A (Prozyme, EE. UU.), O-glucosidasa (New England Biolabs, EE. UU.) o una combinación de sialidasa A y O-glucosidasa durante 16 horas a 37 °C. En la digestión con sialidasa A, se añadieron 12 pl de la enzima (1U/200 pl) a rhPRG4 en un volumen total de reacción de 180 pl y a una concentración final de rhPRG4 de 300 pg/ml. En la digestión con O-glucosidasa, se añadieron 4,8 pl de la enzima (40 millones de unidades/ml) a rhpRG4 en un volumen total de reacción de 180 pl y a una concentración final de rhPRG4 de 300 pg/ml en condiciones no desnaturalizantes. En la digestión con sialidasa-A y O-glucosidasa, las enzimas se usaron en volúmenes idénticos a los indicados anteriormente y se incubó con rhPRG4 en un volumen total de reacción y a concentración final de rhPRG4 como se indicó anteriormente. El efecto de las digestiones con sialidasa-A y O-glucosidasa sobre el peso molecular aparente de rhPRG4 se determinó mediante SDS-PAGE utilizando gel Bis-Tris al 4-12 % (NuPage, life technologies, E<e>. UU.). Un total de 20 pl de rhPRG4 o de rhPRG4 digerido con enzima se procesó en condiciones reductoras (200 mV durante 60 min) seguido de tinción utilizando tinción azul Gelcode (Thermo Scientific, EE. UU.). La unión de rhPRG4 digerido enzimáticamente a CD44, se comparó con la de rhPRG4 no digerido, utilizando el enfoque ELISA directo descrito anteriormente y una concentración de recubrimiento de rhPRG4 de 30 pg/ml. Los datos representan el promedio de 4 experimentos independientes, cada uno con pocillos por triplicado por grupo.

La digestión con sialidasa-A dio como resultado un aumento significativo (p<0,001) en el porcentaje de unión de rhPRG4 a CD44 en comparación con el control no tratado como se muestra en laFigura 3A.De manera similar, la digestión con O-glucosidasa dio como resultado un aumento significativo (p=0,008) en el porcentaje de unión de rhPRG4 a CD44 en comparación con el control no tratado. No hubo diferencias significativas en cuanto al porcentaje de unión a CD44 entre el rhPRG4 digerido conjuntamente con sialidasa-A y con O-glucosidasa (p=0,105). El porcentaje de unión a CD44 en rhPRG4 digerido con sialidasa-A y O-glucosidasa fue significativamente mayor que rhPRG4 digerido con sialidasa-A (p = 0,007), rhPRG4 digerido con O-glucosidasa (p<0,001) y el control no tratado (p<0,001). La digestión de rhPRG4 con sialidasa-A y O-glucosidasa dio como resultado la reducción del peso molecular aparente de rhPRG4 hasta aproximadamente 200 KDa(Figura 3B).

La eliminación de ácido siálico y las O-glicosilaciones aumentaron significativamente la unión a CD44 de rhPRG4 (p<0,001). Los tratamientos con sialidasa-A y O-glucosidasa individualmente produjeron una mejora de la unión de rhPRG4 al receptor de CD44. Las digestiones acumulativas de sialidasa-A y O-glucosidasa dieron como resultado una unión aún más significativa de rhPRG4 a CD44 en comparación con las digestiones de enzimas individuales. La sialidasa-A escinde los residuos terminales ramificados y no ramificados del ácido siálico de las glicoproteínas, mientras que la O-glucosidasa cataliza la eliminación de los núcleos 1 y 2 de las glicoproteínas. La mejora en la unión a CD44 indica que ni la glicosilación del núcleo 1 ni los residuos terminales de ácido siálico se requieren en la unión de rhPRG4 a c D44. En consecuencia, el nivel de sialilación y las glicosilaciones del núcleo 1 en el núcleo proteico de rhPRG4 no son esenciales para la capacidad de PRG4 de unirse a CD44. En cambio, la eliminación de estos residuos puede conducir a cambios conformacionales en la estructura semirrígida en forma de bastón de rhPRG4, que resulta en la mejora de la interacción con CD44.

1E. (Ejemplo ilustrativo) Proliferación de sinoviocitos similares a fibroblastos de la artritis reumatoide inducida por citocinas proinflamatorias e impacto del tratamiento con rhPRG4 o HMW HA.

La sinovia de los pacientes con RA (artrosis reumatoide) contiene cantidades considerable de varias isoformas de CD44 y están presentes generalmente a un grado más alto en comparación con la sinovia OA o normal (Naor et al., Arthritis Res Ther 2003;5(3):105-15;. Grisar et al., Clin Exp Rheumatol 2012; 30(1):64-72). Los sinoviocitos similares a fibroblastos de la artritis reumatoide (RA-FLS), juegan un papel importante en la invasividad de la sinovia de los pacientes con RA. La expresión de una variante única de CD44 (CD44v7/8) contribuye a la proliferación de RA-FLSin vitro(Wibulswas et al., Am J Pathol 2000;157(6):2037-2044) y los agentes farmacológicos que se unen a CD44 de la superficie celular con el consiguiente desprendimiento del receptor, han demostrado su eficacia en modelos experimentales de artritis (Runnels et al. Adv Ther 2010; 27(3):168-80).

Se utilizaron sinoviocitos similares a fibroblastos de la artritis reumatoide (RA-FLS); Cell Applications, EE. UU.) entre los pases 3ro y 6to para llevar a cabo estos experimentos. En placas esterilizadas de 96 pocillos, se cultivaron RA-FLS (5.000 células por pocillo en 80 j l ) en DMEM suplementado con FBS al 1 % y piruvato 1 mM y se estimularon con interleucina-1 beta humana recombinante (IL-1p; R & D systems) a 20 ng/ml o con factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a; R & D systems) a 5 ng/ml durante 48 horas a 37 °C en ausencia o presencia de rhPRG4 o HMW HA a una concentración final de 20, 40 u 80 pg/ml. El volumen total en cada pocillo fue de 200 jl. La proliferación celular, una indicación de inflamación, se determinó usando el ensayo de proliferación celular CellTiter 96 AQueous one solution (MTS; Promega, EE. UU.) y se determinó la absorbancia a 490 nm. Los datos se presentan como el número de veces de cambio en la absorbancia a 490 nm en comparación con los RA-FLS de control no tratados. Los datos representan el promedio de 3 experimentos independientes con al menos tres pocillos por tratamiento. Para evaluar la contribución de CD44 al efecto de rhPRG4 o HMW HA, se estimularon RA-FLS con IL-1p o TNF-a como se describió anteriormente. El tratamiento con rhPRG4 o HMW HA se realizó a una concentración final de 80 jg/m l en ausencia o presencia de IM7 (Abcam, EE. UU.), un anticuerpo neutralizante de CD44 que reconoce un epítopo conservado en todas las isoformas CD44 (Samson et al., Exp Eye Res, 2014; 127C:14-19), a una dilución final de 1:200. El volumen total en cada pocillo fue de 200 jl. La proliferación celular en todos los grupos experimentales se determinó como se describió anteriormente y los datos se presentan como el número de veces de cambio en la absorbancia a 490 nm en comparación con los RA-FLS de control no tratados. Los datos representan el promedio de 3 experimentos independientes con al menos tres pocillos por tratamiento.

La proliferación de RA-FLS inducida por IL-1p y TNF-a durante un período de 48 horas se muestra en laFigura 4A.El tratamiento con 40 y 80 jg/m l de rhPRG4 o HMW HA suprimió significativamente la proliferación de RA-FLS con la estimulación por IL-1p (p<0,05). El tratamiento con 20, 40 y 80 jg/m l de rhPRG4 suprimió significativamente la proliferación de RA-FLS con estimulación por TNF-a (p<0,05). El tratamiento con HMW HA no produjo la supresión de la proliferación de RA-FLS con TNF-a. El tratamiento conjunto con el anticuerpo IM7 anti-CD44 invirtió el efecto de rhPRG4 y HMW HA sobre los RA-FLS estimulados por IL-1p, como lo muestra la ausencia de diferencia significativa en el cambio de absorbancia entre los RA-FLS estimulados por IL-1p tratados con rhPRG4+IM7 o HMW HA+IM7 y los RA-FLS estimulados por IL-1p, como se muestra en laFigura 4B.De manera similar, el tratamiento conjunto con el anticuerpo IM7 invirtió el efecto de rhPRG4 sobre la proliferación de RA-FLS inducida por TNF-a.

rhPRG4 y HMW HA a 40 y 80 jg/m l suprimieron significativamente la proliferación de RA-FLS inducida por IL-1p (p<0,05). rhPRG4 a 20, 40 y 80 jg/m l suprimió significativamente la proliferación de RA-FLS inducida por TNF-a (p<0,05). La neutralización de CD44 invirtió el efecto de rhPRG4 sobre los RA-FLS estimulados por IL-1p y TNF-a y el efecto de HMW HA sobre los RA-FLS estimulados por IL-1p.

La IL-1p y el TNF-a indujeron la proliferación de RA-FLS y se observó una mayor proliferación celular con la estimulación del TNF-a, lo que concuerda con otros informes publicados (p. ej., Lacey et al. Arthritis Rheum 2003;48(1):103-109). rhPRG4 inhibió la proliferación de RA-FLS inducida por IL-1p y TNF-a en un mecanismo que implica la unión al CD44. El efecto posterior de la interacción de rhPRG4 y CD44 es la inhibición de la translocación nuclear de NF-<k>B. En este ensayo de proliferación celular, HMW HA inhibió la proliferación de RA-FLS inducida por IL-1p pero no inhibió la proliferación inducida por TNF-a. Al igual que con el tratamiento con rhPRG4, el efecto de HMW HA se invirtió con un anticuerpo CD44, lo que indica el papel de CD44 en la mediación de este efecto.

Estos datos muestran que rhPRG4 ejerce un efecto antiproliferativo y antiinflamatorio sobre RA-FLS posterior a la estimulación por IL-1p o TNF-a. Curiosamente, las concentraciones de rhPRG4 que demuestran este efecto antiproliferativo son generalmente más bajas que las concentraciones óptimas de rhPRG4 requeridas para proporcionar lubricación límite. Este efecto antiproliferativo de rhPRG4 está mediado por la interacción de CD44 con una inhibición posterior de la translocación nuclear de NF-kB, lo que sugiere que la lubricina aplicada terapéuticamente puede mitigar los efectos de las citocinas proinflamatorias sobre la proliferación de tipos de células nocivas a través de un mecanismo dependiente de CD44.

IF.(Ejemplo ilustrativo) Efecto del tratamiento con rhPRG4 sobre la translocación nuclear de NFkB después de la estimulación con TNF-a de RA-FLS

Se cultivaron RA-FLS (400,000 células/pocillo) y se estimularon con TNF-a (5 ng/ml) y se trataron con rhPRG4 (200 |jg/ml) o con un inhibidor de translocación de NFkB disponible en el comercio MG 132 (3 jM ; Tocris Bioscience) durante 24 horas en medios sin suero. Las células se recogieron y la extracción nuclear se realizó utilizando un kit disponible en el comercio (Thermo scientific). La proteína total se midió utilizando un kit de ácido micro bicinconínico (BCA) (Thermo scientific) y se utilizaron 3 jg de extracto nuclear de cada grupo experimental. La subunidad p50 de NF<k>B se detectó en el extracto nuclear utilizando un kit de ensayo de unión a ADN de NF<k>B disponible en el comercio (Abcam). Los datos se presentan como el número de veces de cambio en los niveles nucleares de NF<k>B en comparación con el control no tratado. Para evaluar si la inhibición de la translocación de NF<k>B por rhPRG4 depende de CD44, el experimento anterior se repitió en presencia o ausencia de anticuerpo CD44 IM7 (dilución 1:1000). Los datos representan el promedio de 3 experimentos independientes con al menos tres pocillos por tratamiento.

El tratamiento con TNF-a produjo una translocación nuclear significativa de NFkB en comparación con los controles no tratados (p<0,001)(Figura 4C).El tratamiento con rhPRG4 o con el inhibidor MG132 de la translocación de NF<k>B, redujo significativamente la translocación nuclear de NF<k>B en comparación con los RA-FLS tratados con TNF-a (p<0,001). La translocación nuclear de NFkB en el grupo TNF-a+rhpRG4+IM7 fue significativamente mayor que la translocación de NF<k>B en el grupo TNF-a+rhPRG4 (p<0,001) y no fue significativamente diferente a la del grupo TNF-a. En consecuencia, el efecto antiproliferativo y antiinflamatorio de rhPRG4 está mediado por la interacción de CD44, con una inhibición posterior de la translocación nuclear de NFkB, lo que sugiere que rhPRG4 tiene la capacidad de reducir directamente los efectos proinflamatorios de la translocación nuclear de NF-<k>B a través de un mecanismo dependiente de CD44.

IG. (Ejemplo ilustrativo) Aislamiento de sinoviocitosPrg4-/-y Prg4+/+ e inmunocitoquímicade CD44

Se recogió tejido sinovial de ratones macho Prg4-/- y Prg4+/+ (de 8-10 semanas; 5-8 animales por genotipo) y se digirió con enzima pronasa (2 mg/ml; Sigma Aldrich) en tampón HBSS esterilizado durante 30 minutos a 37 °C con agitación. A esto le siguió una digestión con colagenasa de tipo I (1 mg/ml; Sigma Aldrich) durante 4 horas a 37 °C con agitación. La reacción enzimática se detuvo utilizando DMEM+FBS al 10%. Las células se cultivaron en DMEM+FBS al 10% y se usaron sinoviocitos Prg4-/- entre el 2do y 4to pases, mientras que se usaron sinoviocitos Prg4+/+ en su segundo pase.

Los sinoviocitos Prg4-/- y Prg4+/+ se cultivaron en portaobjetos de cámara (Thermo Scientific). Las células se fijaron en formaldehído al 4 % durante 15 minutos y se lavaron dos veces con tampón PBS. Las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % durante 10 minutos y se lavaron 3 veces con tampón PBS. Las células se bloquearon con BSA al 2 % durante 30 minutos. Los sinoviocitos se incubaron con anticuerpo IM7 anti-CD44 (1:200) a 4 °C durante toda la noche. Después de lavar tres veces con PBS, los sinoviocitos se incubaron con IgG de cabra anti-rata Alexa Fluor 488 (Life Technologies) a una dilución 1:400 durante 1 hora en la oscuridad. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente a menos que se especifique de otro modo. Después del lavado con PBS durante 5 minutos, se añadió medio de montaje Vectashield que contiene DAPI (Vector Labs, Burlingame, CA, EE. UU.). Se tomaron imágenes de las células con el microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse 90i utilizando el software de imágenes NIS Elements.

La inmunocitoquímica de CD44 de los sinoviocitos Prg4-/- y Prg4+/+ se muestra en la Figura 5A. Se observó fluorescencia verde intensa, indicativa de la localización de CD44 y epítopos de CD44 no ocupados, para los sinoviocitos Prg4-/-. Alternativamente, no se observó fluorescencia o se observó verde tenue débil para los sinoviocitos de Prg4+/+, lo que indica que la mayoría de los receptores CD44 (epítopos) estaban ocupados o antagonizados por la expresión de Prg4 nativa. El tratamiento con IL-1p y TNF-a dio como resultado un aumento significativo de la proliferación de sinoviocitos Prg4-/- en comparación con la de los sinoviocitos Prg4-/- no tratados (p<0,001)(Figura 5B).En cambio, únicamente la estimulación con IL-1p dio como resultado un aumento significativo de la proliferación de sinoviocitos Prg4+/+ en comparación con la de los sinoviocitos Prg4+/+ no tratados (p<0,001). Además, el aumento en veces de la proliferación de los sinoviocitos Prg4-/- inducida por IL-1p y TNF-a fue significativamente mayor que el aumento en veces en la proliferación inducida por citocinas de los sinoviocitos Prg4+/+ (p<0,001).

El tratamiento con rhPRG4 inhibió significativamente la proliferación de sinoviocitos Prg4-/- inducida por IL-1p y TNF-a (p<0,001)(Figura 5C).El tratamiento conjunto con IM7 invirtió el efecto de rhPRG4. Esto se ilustra por el aumento significativo (p<0,001) en la proliferación de sinoviocitos Prg4-/- en los grupos de IL-1p+rhPRG4+IM7 y TNF-a+rhPRG4+lM7 en comparación con los grupos de IL-1p+rhPRG4 y TNF-a+rhPRG4, respectivamente. No hubo diferencias significativas en la proliferación de sinoviocitos Prg4-/- entre los grupos de TNF-a+rhPRG4+IM7 y TNF-a. En cambio, la proliferación de sinoviocitos Prg4-/- fue significativamente mayor en el grupo de IL-1p que en el grupo de IL-ip+rhPRG4+IM7 (p<0,001).

Los ratones Prg4-/- presentan signos tempranos de degeneración del cartílago, lo que se demuestra por fibrilaciones superficiales y un aumento del coeficiente de fricción articular en comparación con los ratones Prg4+/- y Prg4+/+ (Jay et al., Arthritis Rheum, 2007; 56(11):3662-9). Además, los ratones Prg4-/- muestran una mayor tinción de condrocitos con caspasa-3 activados en el cartílago articular en comparación con el cartílago Prg4+/+ de la misma edad (Waller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 2013; 110(15): 5852-7) y la hiperplasia sinovial y el crecimiento excesivo son evidentes en los ratones Prg4 -/-, sin hiperplasia sinovial evidente en los ratones Prg4 /- o Prg4 /+ (Rhee et al., J. Clin. Invest, 2005; 115(3):622-31). Los sinoviocitos Prg4-/- muestran una tinción mejorada de CD44 en comparación con los sinoviocitos Prg4+/+. Además, las citocinas proinflamatorias indujeron una proliferación significativa de sinoviocitos Prg4-/-sin un efecto apreciable sobre sinoviocitos Prg4+/+. Combinadas, estas observaciones indican una inflamación en proceso en las articulaciones Prg4-/- con un fenotipo proliferativo de sinoviocitos similar al de RA-FLS. rhPRG4 inhibió la proliferación de sinoviocitos de Prg4-/- inducida por citocinas y este efecto estuvo mediado por la interacción de rhPRG4-CD44. La neutralización de CD44 invirtió completamente el efecto antiproliferativo de rhpRG4 después de la estimulación con TNF-a e invirtió parcialmente el efecto antiproliferativo de rhPRG4 después del estímulo con IL-1p. Esta diferencia relacionada con la interacción rhPRG4-CD44 en el contexto de la estimulación de los sinoviocitos de Prg4-/- con TNF-a y IL-1p puede deberse posiblemente a la capacidad de rhPRG4 de modular otras vías de señalización independientemente de su capacidad de interactuar con CD44. En consecuencia, rhPRG4 inhibe la proliferación de sinoviocitos Prg4-/- inducida por IL-1p y TNF-a en un mecanismo que implica CD44, y por lo tanto es un antagonista de CD44 capaz de regular negativamente la actividad proinflamatoria de la señalización de CD44.

Ejemplo ilustrativo 2. La lubricina modula la producción de citocinas inflamatorias en los sistemas de sangre total humana.

Los lipopolisacáridos (LPS) se encuentran en la membrana externa de las bacterias Gram negativas y provocan fuertes respuestas inmunitarias inflamatorias en los animales. El efecto de la exposición con LPS sobre la producción de citocinas inflamatorias se estudió en sangre total humana citratada utilizando tecnología de matriz Biochip para obtener el perfil de la generación de varias citocinas y la modulación de su producción. Se estudió la generación de IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, VEGF, IFNg, TNFa, IL1a, IL1b, MCP1 y EGF en muestras de sangre total citratada suplementada con solución salina (relación 1-10) y LPS a 10|jg/ml en muestras incubadas durante 60 minutos a 37 °C. Estas mezclas se centrifugaron y se analizó el plasma sobrenadante para los 14 biomarcadores inflamatorios mediante el uso de una matriz de citocinas de alta sensibilidad en un lector de Biochip Randox Invesitigator. Estos estudios se realizaron por duplicado y se tabularon en forma de una tabla y una figura. Como se muestra en lasFiguras 8A-B,la suplementación de lipopolisacárido en una dilución 1:10 en sangre total da como resultado un aumento en la producción de citocinas inflamatorias IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, TNF-a, IL1-p y MCP-1 en las condiciones especificadas. No se observaron cambios en IL2, en IFNg ni en IL1b. La Figura 8B muestra los cambios porcentuales en los diversos parámetros que demuestran claramente un aumento pronunciado en IL6, IL8, VEGF y TNFa.

Mediante el uso del mismo enfoque, se estudió, además, el efecto de la lubricina sobre la generación de citocinas inflamatorias en sangre total mediante el uso de entornos experimentales similares. En estos estudios, se estudió el efecto de la lubricina (,57 mg/ml) mediante la suplementación a la sangre total citratada extraída de voluntarios sanos normales. Las muestras se procesaron para determinar los niveles de citocinas inflamatorias junto con un control de solución salina en muestras incubadas durante 60 minutos. La sangre total se centrifugó para obtener plasma que se procesó para diversas citocinas inflamatorias mediante el uso de un ensayo de citocinas de alta sensibilidad. Como se muestra en lasFiguras 9A-B, la suplementación con lubricina a 0,57 mg/ml en sangre total produjo una disminución en la producción de IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, TNF-a, IL-1p, MCP-1 y EGF. La disminución más prominente se observó en VEGF, IL8, IL6 e IL10.

El efecto de la lubricina en la generación de citocinas inflamatorias mediadas por LPS se estudió mediante el uso de la tecnología Biochip Array. En estos estudios, se comparó LPS solo a 10 ng/ml y pre-suplementación de LPS a 10 ng/ml seguido de suplementación con lubricina a 0,57 mg/ml en la sangre total citratada para la generación de diversas citocinas inflamatorias. Todas las muestras se incubaron durante 60 minutos y se centrifugaron para obtener plasma. Este plasma se analizó posteriormente mediante el uso de la matriz de biochips para citocinas inflamatorias. Se suplementó LPS a sangre total en una dilución 1:10. Como se muestra en lasFiguras. 10A-B,la presencia de lubricina produjo una disminución de IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, TNF-a, IL-1p, MCP-1 y EGF, aunque, como se ha indicado anteriormente, la presencia de LPS solo produjo un aumento en la producción de cada una de estas citocinas. Como se muestra en la Figura 10B, la lubricina dio como resultado una disminución marcada en los niveles de EGF, IL10, VEGF, MCP1, IL1b y TNF. Estos datos sugieren que la suplementación de lubricina interfiere con la generación de citocinas inflamatorias mediadas por LPS de manera significativa, lo que indica que la lubricina tiene propiedades antiinflamatorias.

Se estudió el efecto de la lubricina sobre la generación de citocinas inflamatorias mediada por TNF-a utilizando la tecnología de matriz Biochip. Se usó TNF-a recombinante como desencadenante para generar citocinas inflamatorias en sangre total. Se estudió el efecto de la lubricina sobre la generación de varias citocinas mediada por TNF-a. Se suplementó TNF-a solo a una concentración de 100 mg/ml a sangre total y se incubó durante 60 minutos a 37 °C. Se suplementó TNF-a a sangre total en una dilución 1:10. Se estudiaron los efectos moduladores de la lubricina sobre la generación de varias citocinas mediada por TNF-a suplementando lubricina a 0,57 mg/ml en la sangre total inmediatamente antes de la adición de TNF-a. Después de 60 minutos, se obtuvo plasma de la centrifugación y se analizó la citocina inflamatoria mediante el uso de matrices Randox Biochip. Como se muestra en lasFiguras 11A-B,la presencia de lubricina produjo una disminución de IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, TNF-a, IL-1p y EGF, aunque la exposición a TNF-a solo condujo a la producción de cada una de estas citocinas. La Figura 11B muestra que la lubricina disminuyó los niveles de citocinas en un intervalo de 10-100%. Se observó que la disminución más drástica en cuanto a la expresión de citocinas estimuladas por TNF-a fue la reducción de IFN-<y>y TNF-a estimulados (ya que, al parecer, la lubricina interrumpió un bucle de retroalimentación positiva de la producción de TNF-a) en comparación con la estimulación en ausencia de lubricina. Estos datos sugieren que la administración de lubricina interfiere con la generación de citocinas inflamatorias mediadas por TNF de manera significativa, lo que indica que la lubricina tiene propiedades antiinflamatorias.

Se estudió el efecto de la lubricina sobre la generación de citocinas inflamatorias mediada por el factor tisular (TF) recombinante utilizando tecnología de matriz Biochip. En estos estudios, se usó el factor tisular de la marca recombiplastina (Laboratorios IL) para desencadenar la generación de citocinas inflamatorias en sangre total humana. Se estudió el efecto de la lubricina a 0,57 mg/ml al suplementar este agente antes de la adición de factor tisular a la sangre total. El factor tisular solo sirvió como control positivo. Las muestras de sangre se centrifugaron y se recuperó el plasma. Este plasma se procesó luego para el perfil de citocinas inflamatorias en las matrices de Randox Biochip. TF se suplementó con sangre total en una dilución 1:10. Como se muestra en lasFiguras 12A-B,la presencia de lubricina produjo una disminución de IL-6, IL-8, VEGF, TNF-a, IL-1a, IL-1p, MCP-1 y EGF, aunque la exposición a TF solo dio como resultado la producción de cada una de estas citocinas. Como se muestra en la Figura 12B, la lubricina produjo una disminución pronunciada en los niveles de TNF-a y de VEGF en muestras suplementadas con factor tisular. Estos datos sugieren que la administración de lubricina interfiere con la generación de citocinas inflamatorias mediadas por TF de manera significativa, lo que indica que la lubricina tiene propiedades antiinflamatorias.

Estos estudios muestran que la lubricina puede inhibir la generación de diversas citocinas inflamatorias en sangre total, que se suplementó con lipopolisacárido (LPS) bacteriano, TNF-a y factor tisular. Todos estos agentes son mediadores de la inflamación. Por lo tanto, la lubricina puede regular negativamente la generación de citocinas inflamatorias en una amplia variedad de mediadores.

Ejemplo ilustrativo 3. La lubricina reduce los niveles de citocinas proinflamatorias in vivo

Para determinar si la lubricina podría modular los niveles de citocinas proinflamatoriasin vivo,se utilizó un modelo de rata. Nueve ratas se sometieron a cirugía para desestabilizar el menisco medial (cirugía DMM). Siete días después de la cirugía, cada rata recibió una dosis intraarticular única de lubricina de 200 pg/kg. Las ratas de control recibieron una inyección de un mismo volumen de solución salina. Los niveles de citocinas en las muestras de suero tomadas de los ratones de prueba se compararon con los de los ratones de control sometidos a cirugía pero sin dosis de lubricina después de cirugía. Las muestras se extrajeron 3 semanas después de la administración de la dosis de lubricina y se analizaron utilizando la plataforma Luminex Multiplex. Los resultados se muestran en laFigura 13donde se muestran los niveles medidos de EPO, IL-13, IL-10, IL-18, IL-1a, IL-2, MCSF, IL-1P, IL-4, IFN-<y>, MIP-3a, GMCSF, IL-7, TNF-a, VEGF, MCP-1, IL-5, G-CSF, RANTES, IL-6, GRO, Il-17a e IL-12p70. Los niveles de IL-18, MCSF, MCP-1, RANTES y GRO se redujeron en las ratas que recibieron lubricina en comparación con las ratas a las que se les inyectó solución salina sola. Más específicamente, esto muestra los amplios efectos antiinflamatorios de la lubricina, ya que este patrón de citocinas inflamatorias era distinto del perfil de los mediadores LPS y TF dominado por TNF-a/IL-6/IL-8 (que generalmente no estaban regulados positivamente en este modelo). No obstante, la lubricina pudo reducir significativamente la producción de citocinas proinflamatoriasin vivo.

Ejemplo ilustrativo 4. El efecto de la lubricina sobre los niveles de citocinas secretadas por sinoviocitos osteoartríticos humanos

Se obtuvieron células de líquido sinovial de pacientes normales y osteoartríticos (OA) y se purificaron con CD90+ después de un agotamiento de las células inmunitarias. Las células se colocaron en placas a 10000 por pocillo y se suspendieron en medios que contenían DMEM, Hyclone FBS inactivado por calor (10 %) y Anti-Anti (1 %). Los ensayos contenían la suspensión celular (células medios) a 180 pl y los ligandos a 20 pl para un volumen total de 200 pl. La lubricina recombinante (rhPRG4) se introdujo después en las células a una concentración de 90 pg/ml y el control negativo fue PBS. Después, la placa se incubó a 37 °C con CO2 al 5 % durante 24 horas tras lo cual se recogieron los sobrenadantes para el análisis de citocinas a través de la plataforma multiplex Luminex. Como se muestra en lasFiguras 14A-B,las células normales no mostraron ningún cambio en la respuesta de las citocinas al comparar las condiciones de lubricina frente a PBS. Sin embargo, las células OA mostraron una regulación negativa en las citocinas FGF-2 e IL-1Ra cuando se expusieron a lubricina. En consecuencia, en las células que ya exhiben una respuesta inflamatoria, tales como las células osteoartríticas probadas en la presente memoria, la administración de lubricina tiene la capacidad de reducir los niveles de citocinas proinflamatorias expresadas a partir de estas células.

Ejemplo 5. Tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal

La enfermedad inflamatoria intestinal se caracteriza por un reclutamiento mediado por citocinas de células T activadas que produce daño oxidativo y un desgaste del epitelio intestinal. Se calcula que entre el 25 % y el 40 % de las personas con colitis ulcerosa (CU) o enfermedad de Crohn pueden evolucionar a una intervención quirúrgica, tal como una anastomosis anal con bolsa ileal o una proctocolectomía que extirpa partes del colon y el recto. Las terapias comunes incluyen medicamentos antiinflamatorios de amplio espectro, tales como corticosteroides, anticuerpos anti-TNF o anticuerpos anti-integrina más específicos que tienen como objetivo impedir la movilidad de las células T que migran de forma selectiva al intestino. Ninguno de estos enfoques es adecuado para la terapia a largo plazo debido a los efectos secundarios graves, tales como las infecciones y el cáncer que acompañan a estos enfoques. Por el contrario, wl hPRG4 recombinante puede aplicarse selectivamente al intestino para reponer el glicocáliz epitelial ausente y reducir localmente la expresión de citocinas. Una caracterización reciente del perfil de citocinas de la enfermedad inflamatoria intestinal predominantemente colónica, reveló un aumento de TNF-a, GRO, CCL11 (eotaxina) en UC, IL-6 en Crohn e IL-8 en U<c>y Crohn frente a los controles (Korolkova et al., Clin Med Insights Gastroenerol 6 de mayo de 2015;8:29-44). Se ha demostrado que la lubricina reduce significativamente la expresión de estas citocinas. En una reivindicación, rhPRG4 se administra mediante enema u oralmente, ya sea mediante sonda, irrigación de intestino entero, beber una solución o mediante píldoras encapsuladas (por ejemplo, encapsulación de micropartículas, encapsulación de nanopartículas, encapsulación de polímeros, etc.). Como ejemplo, una administración de enema de 100 ml a 4 l de rhPRG4 en concentraciones que varían entre 10 pg/ml y 200 pg/ml, más preferiblemente volúmenes de 200 ml a 500 ml en concentraciones de 50 pg/ml a 150 pg/ml, suspendido en una solución de sal tamponada, aceptable desde un punto de vista intestinal, repone el glicocáliz, impide la migración selectiva de las células T y regula negativamente la expresión de citocinas en el lugar donde se administra la lubricina. La administración de rhPRG4 da como resultado una mejora de la función de barrera epitelial, menos permeabilidad vascular, menos susceptibilidad a la actividad de la proteasa y una mejora de la absorción de nutrientes. En ciertas reivindicaciones, se administra un citrato de magnesio u otro laxante hasta 24 horas antes de la administración de lubricina, seguido de un ayuno apropiado.

Si bien las reivindicaciones preferidas de la presente invención se han mostrado y descrito en la presente memoria, será evidente para los expertos en la técnica que tales reivindicaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo. Ahora se les ocurrirán numerosas variaciones, cambios y sustituciones a los expertos en la técnica sin apartarse de la invención. Debe entenderse que varias alternativas a las reivindicaciones de la invención descritas en la presente memoria pueden emplearse en la práctica de la invención y muchas otras reivindicaciones de la invención serán evidentes para un experto en la técnica tras una revisión de la descripción y los ejemplos.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
2. i.Proteoglicano 4 (PRG4) para su uso en un método de tratamiento de enfermedad inflamatoria intestinal. 2. PRG4 para su uso según la reivindicación 1, que comprende administrar el PRG4 en el tubo digestivo de un sujeto.
3. 3. PRG4 para su uso según la reivindicación 2, en donde el PRG4 se administra por vía oral, rectal, en el colon, en el intestino delgado, en el estómago o a través de una combinación de los mismos.
4. 4. PRG4 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el PRG4 es PRG4 humano exógeno recombinante.
5. 5. PRG4 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el PRG4 tiene la secuencia de la Id. de sec. n.°:1 menos la secuencia señal.
6. 6. PRG4 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el PRG4 se administra en una cantidad insuficiente para proporcionar lubricación límite en el paciente.
7. 7. PRG4 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el PRG4 se administra en una cantidad que varía de 0,1 pg/kg - 4000 pg/kg, o se administra por vía local para proporcionar un recubrimiento de PRG4 a partir de una solución de PRG4.
8. 8. PRG4 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho PRG4:

   a) se une a un receptor de CD44 en una célula de dicho paciente;

   b) reduce o inhibe la producción de una citocina proinflamatoria en una célula de dicho paciente, opcionalmente en donde dicha citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-6, IL-8, TNF-a, CCL11 y<g>RO;

   y/o

   c) reduce o inhibe la translocación de NF-kB en una célula en dicho paciente, reduciendo o inhibiendo de este modo la respuesta inflamatoria en dicho paciente.
9. 9. PRG4 para su uso según la reivindicación 8, en donde la célula es una célula gástrica, una célula intestinal o una célula de colon.
10. 10. PRG4 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la enfermedad inflamatoria intestinal es enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa.
11. 11. PRG4 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el PRG4 se administra por vía oral como un comprimido, una cápsula, como una solución por ingestión o mediante sonda de alimentación.
12. 12. PRG4 para su uso según la reivindicación 11, en donde el PRG4 se administra por vía oral como un comprimido o una cápsula y en donde el comprimido o la cápsula está hecho de una sustancia que se degrada cuando se expone a afecciones presentes en el tubo digestivo.
13. 13. PRG4 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el PRG4 se administra mediante enema, colostomía, sonda yeyunal, inyección en el estómago, el colon, el intestino delgado o el recto.
14. 14. PRG4 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el PRG4 se administra en una cantidad de 100 pl a 4 l en una concentración que varía de 10 pg/ml a 200 pg/ml.
15. 15. PRG4 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se administra un laxante hasta 24 horas antes de la administración de lubricina, seguido de un ayuno apropiado.