ES3014660A1 - Saccharomyces cerevisiae recombinante para la producción de serotonina - Google Patents

Saccharomyces cerevisiae recombinante para la producción de serotonina Download PDF

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Calvo Sara Muniz
Garcia Elena Valera
Carcel Andres Planells
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Abstract

Saccharomyces cerevisiae recombinante para la producción de serotonina. La presente invención se refiere a una célula de Saccharomyces cerevisiae recombinante que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican para una enzima L-triptófano descarboxilasa, una enzima triptamina 5-hidroxilasa y una enzima modificada ARO4 K229L, donde dicha célula tiene la capacidad de producir serotonina a partir de una fuente de carbono simple como la glucosa y de amonio como fuente de nitrógeno.

Description

DESCRIPCIÓN
Saccharomyces cerevisiae recombinante para la producción de serotonina
La presente invención se refiere a una célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican para una enzima L-triptófano descarboxilasa, una enzima triptamina 5-hidroxilasa y una enzima modificada ARO4 K229L, donde dicha célula tiene la capacidad de producir serotonina. Por lo tanto, la presente invención se engloba dentro del campo de la biotecnología, en particular, en el uso de microorganismos recombinantes en procesos industriales.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La serotonina o 5-hidroxitriptamina (5-HT) es un neurotransmisor importante para el correcto funcionamiento del sistema nervioso, estando también presente con diferentes funciones en el sistema inmunitario y en el eje microbiota-intestino-cerebro. También es la molécula predecesora a la melatonina, otra hormona que regula varios procesos relacionados con los ciclos circadianos y también actúa como molécula antioxidante. Otras moléculas derivadas de la serotonina, como feruloil serotonina y la 4-cumariloil serotonina, también se ha demostrado que tienen una actividad antioxidante que pueden ser útiles en la industria de cosméticos.
La producción la serotonina hoy en día se realiza principalmente mediante una compleja síntesis química que usa solventes y catálisis tóxicas. Por lo que en los últimos años se han desarrollado nuevas estrategias basadas en microorganismos modificados genéticamente para la producción de serotonina.
El documento WO2017167866A1 describe células huésped microbianas recombinantes que comprenden vías biosintéticas, y su uso, para la producción de melatonina y productos relacionados como la serotonina.
El documento WO2013127915A1 describe células microbianas recombinantes y métodos para producir melatonina y compuestos relacionados usando tales células. Más específicamente, la célula microbiana recombinante puede comprender genes exógenos que codifican uno o más de una L-triptófano hidroxilasa, una 5-hidroxi-Ltriptófano descarboxilasa, una serotonina acetiltransferasa, una acetilserotonina O-metiltransferasa; una L-triptófano descarboxilasa y una triptamina-5-hidroxilasa, y medios para proporcionar tetrahidrobiopterina (THB).
El documento WO2019173797A1 describe células microbianas modificadas genéticamente para biosintetizar triptamina y derivados de triptamina. Los microbios de la divulgación pueden diseñarse para que contengan plásmidos e integraciones de genes estables que contengan suficiente información genética para la conversión de un antranilato o un indol en una triptamina.
El documento WO2022248635A2 describe un método para la producción de derivados de triptamina, mediante una célula microbiana modificada genéticamente.
Sin embargo, existe la necesidad de proporcionar nuevos microrganismos modificados para la producción eficiente de serotonina como alternativa a la producción de la misma mediante síntesis química.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una célula deSaccharomyces cerevisiaemodificada genéticamente mediante la integración múltiple en el genoma de las secuencias de nucleótidos que codifican para una L-triptófano descarboxilasa (TDC), una enzima triptamina 5-hidroxilasa(T5H)y una enzima 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa deSaccharomyces cerevisiaecon una mutación puntual, particularmente la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición de 229 en la secuencia de aminoácidos de ARO4 (ARO K229L), en donde la célulaSaccharomyces cerevisiaemodificada es capaz de producir serotonina (5-HT) a partir de glucosa.
El desarrollo de la presente invención permite la producción de serotonina mediante la levadura S.cerevisiaecomo factoría celular, permitiendo generar este tipo de moléculas de un modo más sostenible con el medio ambiente, tal como se demanda para una transición de la industria química hacia una “green industry” .Saccharomyces cerevisiaees considerado un organismo GRAS (del inglés“Generally Recognized As Safe”),lo que implica que es seguro y hace que sea ventajoso emplearlo como factoría celular.
Inicialmente, los inventores desarrollaron cepas deSaccharomyces cerevisiaerecombinantes mediante integración múltiple en el genoma de 2 genes exógenos dentro del mismo casete para permitir la conversión de L-Triptofano a serotonina. Los genes son la enzima L-triptófano descarboxilasa deClostridium sporogenes (CsTDC),que genera la descarboxilación del L-triptofano a triptamina, y el gen de la hidroxilasa T5H deOryza sativa (OsT5H),que produce la hidroxilación de la triptamina a serotonina. La cepa de S.cerevisiaecon las modificaciones TDC T5H fue capaz de producir 22mg/L de serotonina en un medio donde sólo había glucosa y amonio, en comparación con la cepa control (sin modificaciones en su genoma) que produjo 0,042 mg/ml de serotonina en un medio con solo glucosa y amonio (tabla 4).
Posteriormente se introdujo una modificación en una enzima involucrada en la ruta de la síntesis de aminoácidos aromáticos (triptófano, fenilalanina y tirosina) aumentando así la producción de serotonina directamente desde una fuente de glucosa. Dicha modificación fue la sobreexpresión múltiple del gen deSaccharomyces cerevisiae ARO4con una mutación puntual para la desregulación de la represión catabólica en el metabolismo de los aminoácidos aromáticos, la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 de ARO4 [TDC T5H ARO4K229L]. La cepa deSaccharomyces cerevisiaeTDC T5H ARO4K229L mostró un incremento significativo en la producción de serotonina, llegando hasta una concentración de serotonina de aproximadamente 120 mg/L desde glucosa, como fuente de carbono, y amonio, como fuente de nitrógeno. Esto supone un aumento de aumento de más de 5 veces en la producción de serotonina respecto a la cepa con solo las modificaciones TDC T5H (Tabla 4). Por lo tanto, el desarrollo de la presente invención permite la producción de serotonina a partir de una fuente de carbono simple mediante microorganismos modificados adecuados para su uso en la industria alimentaria.
Así, en un aspecto, la presente invención se refiere a una célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante, de ahora en adelante "célula de la invención” , que comprende:
(i) una secuencia de nucleótidos que codifica para una enzima L-triptófano descarboxilasa o un fragmento de la misma, de ahora en adelante "secuencia de nucleótidos (i) de la invención”, en donde la enzima L-triptófano descarboxilasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica para una enzima triptamina 5-hidroxilasa o un fragmento de la misma, de ahora en adelante "secuencia de nucleótidos (ii) de la invención” , en donde la enzima triptamina 5-hidroxilasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2; y
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica para una enzima ARO4 o un fragmento de la misma, de ahora en adelante "secuencia de nucleótidos (iii) de la invención”, en donde la enzima ARO4 comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, y donde dicha secuencia de aminoácidos comprende la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 (ARO4 K229L).
En la presente invención el término "célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante" se refiere a aquella célula de una levadura vínica, particularmente de la especieSaccharomyces cerevisiae,que ha sido modificada genéticamente, distinguiéndose así de la cepa "madre", "parental" o"wild type”.La célula de la invención presenta insertado en su genoma las secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) de la invención, cuya expresión dota a la célula de las enzimas que le permiten una sobreproducción de serotonina a partir de una fuente de carbono simple (ej. glucosa) y amonio. Así, la célula de la invención expresa las enzimas codificadas por las secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) de la invención. En el contexto de la presente invención, los términos"Saccharomyces cerevisiaerecombinante" y "Saccharomyces cerevisiaetransgénica" son términos equivalentes y significan lo mismo.
En una realización preferida, la célula de la invención corresponde a la cepaSaccharomyces cerevisiaeBY4743 recombinante que comprende las secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (ii). La cepaSaccharomyces cerevisiaeBY4743 se encuentra disponible al público en colecciones públicas de instituciones depositarias reconocidas y accesibles sin restricciones. En la presente invención, los términos "célula” y "cepa”, son equivalentes y se usan de manera intercambiable.
Las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 corresponden a las secuencias aminoácidos de las enzimas L-triptófano descarboxilasa deClostridium sporogenes(CsTDC), triptamina 5-hidroxilasa deOryza sativa(OsT5H) y 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato deSaccharomyces cerevisiae,respectivamente (ARO4).
En la presente invención, los términos “L-triptófano descarboxilasa” y “TDC”, usados de manera intercambiable, se refieren a una enzima que cataliza la descarboxilación de L-triptófano dando como producto triptamina.
Secuencia de aminoácidos de la L-triptófano descarboxilasa deClostridium sporogenes (CsTDC)SEQ ID NO: 1:
En la presente invención, los términos “triptamina 5-hydroxilasa” y “T5H” , usados de manera intercambiable, se refirieren a una enzima que cataliza la hidroxilación de triptamina dando como producto serotonina (5-hidroxitriptamina).
Secuencia de aminoácidos de la triptamina 5-hidroxilasa deOryza sativa(OsT5H) SEQ ID NO: 2:
SEV
En la presente invención los términos “3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa” o “DAHP sintasa” , usados de manera intercambiable, se refieren a una enzima que cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato y eritrosa 4-fosfato en 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato. La enzima DAHP sintasa cataliza el primer paso de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos tales como L-triptófano. En la presente invención, la enzima “ARO4” se refiere a la 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa deSaccharmyces cerevisiae.
Secuencia de aminoácidos de la enzima ARO4 deSaccharomyces cerevisiaeSEQ ID NO: 3:
La célula de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima ARO4 con una sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 (referente a la secuencia SEQ ID NO: 3). La sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 en la secuencia de la enzima ARO4 deS.cerevisiae,le confiere a dicha enzima resistencia a la inhibición mediada por L-triptófano. Esto se traduce en un aumento de la producción de L-triptófano que es metabolizado posteriormente por las enzimas TDC y T5H produciendo así serotonina. En la presente invención el término “ARO4 K229L” se refiere a la enzima ARO4 de S.cerevisiaeque comprende la sustitución de la K (lisina) por L (leucina) en la posición 229.
La célula de la presente invención también puede denominarse como“Saccharomyces cerevisiaeTDC T5H ARO4K229L”,“Saccharomyces cerevisiaeCsTDC OsT5H ARO4K229L” o “cepaSaccharomyces cerevisiaeSER+ARO4K229L”, de manera intercambiable.
En una realización preferida, la célula de la invención comprende:
- la secuencia de nucleótidos (i) de la invención que codifica para una enzima L-triptófano descarboxilasa o un fragmento de la misma, en donde la enzima L-triptófano descarboxilasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1;
- la secuencia de nucleótidos (ii) de la invención que codifica para una enzima triptamina 5-hidroxilasa o un fragmento de la misma, en donde la enzima triptamina 5-hidroxilasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2; y
- la secuencia de nucleótidos (iii) de la invención que codifica para una enzima ARO4 o un fragmento de la misma, en donde la enzima ARO4 comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, y donde dicha secuencia de aminoácidos comprende la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 (ARO4K229L);
preferiblemente donde el valor del % de identidad de las secuencias de aminoácidos de las enzimas codificadas por las secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) (con sus respectivas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3), es el mismo valor de %.
En la presente invención, se entiende por "identidad" o "identidad de secuencia" al grado de similitud entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos obtenido mediante el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Dependiendo del número de residuos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendrá un grado de identidad expresado en tanto por ciento. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo BLAST. Los programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN, son de dominio público en la página web deThe National Center for Bíotechonology Information(NCBI).
En otra realización preferida, la célula de la invención comprende:
- la secuencia de nucleótidos (i) de la invención que codifica para una enzima L-triptófano descarboxilasa o un fragmento de la misma, donde la enzima L-triptófano descarboxilasa comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1;
- la secuencia de nucleótidos (ii) de la invención que codifica para una enzima triptamina 5-hidroxilasa o un fragmento de la misma, en donde la enzima triptamina 5-hidroxilasa comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2; y
- la secuencia de nucleótidos (iii) de la invención que codifica para una enzima ARO4 o un fragmento de la misma, en donde la enzima ARO4 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, y donde dicha secuencia de aminoácidos comprende la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 (ARO4 K229L).
En otra realización preferida, la célula de la invención comprende:
- la secuencia de nucleótidos (i) de la invención que codifica para una enzima L-triptófano descarboxilasa o un fragmento de la misma, donde la enzima L-triptófano descarboxilasa consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1;
- la secuencia de nucleótidos (ii) de la invención que codifica para una enzima triptamina 5-hidroxilasa o un fragmento de la misma, en donde la enzima triptamina 5-hidroxilasa consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2; y
- la secuencia de nucleótidos (iii) de la invención que codifica para una enzima ARO4 o un fragmento de la misma, en donde la enzima ARO4 consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, y donde dicha secuencia de aminoácidos comprende la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 (ARO4 K229L).
La secuencia de aminoácidos de la enzima ARO4 que comprende la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 (ARO4 K229L) consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7.
Secuencia de aminoácidos de la enzima ARO4 deSaccharomyces cerevisiaeque comprende la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229, SEQ ID NO: 7:
En otra realización preferida de la célula de la invención:
- la secuencia de nucleótidos (i) de la invención que codifica para la enzima L-triptófano descarboxilasa comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4;
- la secuencia de nucleótidos (ii) de la invención que codifica para la enzima triptamina 5-hidroxilasa comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5; y
- la secuencia de nucleótidos (iii) de la invención que codifica para la enzima ARO4 K229L comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6.
Secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima L-triptófano descarboxilasa deClostridium sporogenesSEQ ID NO: 4:
En la presente invención, todas las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que presente una identidad de secuencia de, al menos un 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% con la secuencia SEQ ID NO: 1 o con la secuencia SEQ ID NO: 4, respectivamente, se consideran variantes funcionalmente equivalentes de la enzima y gen L-triptófano descarboxilasa deClostrídium sporogenes(CsTDC), es decir, aunque comprendan distintas secuencias de aminoácidos o de nucleótidos, tienen actividad L-triptófano descarboxilasa para catalizar la descarboxilación de L-triptófano dando como producto triptamina.
Secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima triptamina 5-hidroxilasa deOryza sativaSEQ ID NO: 5:
En la presente invención, todas las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que presente una identidad de secuencia de, al menos un 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% con la secuencia SEQ ID NO:2 o con la secuencia SEQ ID NO: 5, respectivamente, se consideran variantes funcionalmente equivalentes de la enzima y gen triptamina 5-hidroxilasa deOryza sativa,es decir, aunque comprendan distintas secuencias de aminoácidos o de nucleótidos, tienen actividad triptamina 5-hidroxilasa para catalizar la hidroxilación de triptamina dando como producto serotonina.
Secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima ARO4 K229L deSaccharomyces cerevisiaeSEQ ID NO: 6:
En la presente invención, todas las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que presente una identidad de secuencia de, al menos un 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% con la secuencia SEQ ID NO: 3 donde dicha secuencia comprende la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 (alternativamente la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7), o con la secuencia SEQ ID NO: 6, respectivamente, se consideran variantes funcionalmente equivalentes del gen y enzima ARO4 K229L deSaccharomyces cerevisiae,es decir, aunque comprendan distintas secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, tienen actividad sintasa 3-desoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato (DAHP) para catalizar el primer paso en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos.
La secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6 preserva el triplete TTG (codificante para el aminoácido leucina, L en la posición 229 en la secuencia de aminoácidos) en la posición de nucleótido 685.
Es práctica de rutina para un experto en la materia los ensayos para determinar si diferentes secuencias se consideran funcionalmente equivalentes.
En la presente invención, el término "variante" se refiere a un polipéptido o proteína (o en su caso un polinucleótido) que tiene la misma actividad que un polipéptido o proteína (o polinucleótido) de referencia, pero que comprende una alteración en su secuencia, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción, en una o más (p.ej., varias) posiciones. A modo de ejemplo, una sustitución significa el reemplazo del aminoácido (o de un nucleótido) que ocupa una posición con un aminoácido (o de un nucleótido) diferente; una deleción significa la deleción del aminoácido (o de un nucleótido) que ocupa una posición; y una inserción significa agregar un aminoácido (o de un nucleótido) adyacente e inmediatamente después del aminoácido (o de un nucleótido) que ocupa una posición. Los cambios en los polinucleótidos incluyen, sin limitar a, sustituciones, inserciones y/o deleción entre uno o más nucleótidos, representados por sus bases nitrogenadas tales como adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) y uracilo (U). Los cambios en los aminoácidos pueden ser de una naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad del polipéptido/de la proteína; pequeñas deleciones, típicamente de 1-30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o carboxilo-terminales, tales como un residuo de metionina amino-terminal; un péptido enlazador pequeño de hasta 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, como una cola de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión. Los ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica. Las sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/lle, Asp/Giu, Thr/Ser, Ala/Giy, Ala/Thr, Ser/Asn, AlaNal, Ser/Giy, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, LeuNal, Ala/Giu y Asp/Giy.
En el contexto de la presente invención también se contemplan fragmentos de las secuencias de nucleótidos o fragmentos de las proteínas codificadas por dichas secuencias de nucleótidos, siempre y cuando dichos fragmentos puedan desempeñar la función de la proteína completa. Así, el término "fragmento" se refiere a una proteína o polipéptido (o polinucleótido) con uno o más aminoácidos (o nucleótidos) ausentes de los extremos de su secuencia, como por ejemplo el terminal amino y/o carboxilo de la proteína o el polipéptido o en los extremos 3' o 5' de la secuencia de nucleótidos; donde el fragmento tiene la actividad de la proteína completa (fragmento funcionalmente equivalente). Ensayos para averiguar si un fragmento de una proteína/polinucleótido tiene la misma actividad/función que la proteína/polinucleótido completa son conocidos para la persona experta en la materia.
Como entiende un experto en la materia los codones de las secuencias de nucleótidos de la invención (secuencias de nucleótidos de la invención (i),(ii) y (iii)) pueden estar optimizados para su expresión enSaccharomyces cerevisiae,es decir, la secuencia de nucleótidos ha sido alterada con respecto a la secuencia de nucleótidos original de forma que uno o más codones de la secuencia de nucleótidos han sido cambiados a un codón diferente que codifica el mismo aminoácido, pero que es utilizado con más frecuencia por la célula huésped (en la presente invención, unaSaccharomyces cerevisiae)que el codón original. La degeneración del código genético hace que todos los aminoácidos excepto metionina y triptófano estén codificados por más de un condón. Por ejemplo, arginina, leucina y serina están codificados por 6 codones diferentes, pero muchos organismos usan ciertos codones con más frecuencia que otros. Particularmente como las secuencias (i) y (ii) de la invención son heterólogas a la célula huésped cabe la posibilidad de optimizar la secuencia de nucleótidos para su expresión enSaccharomyces cerevisiae.
En otra realización más preferida de la célula de la invención:
- la secuencia de nucleótidos (i) de la invención que codifica para la enzima L-triptófano descarboxilasa comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4;
- la secuencia de nucleótidos (ii) de la invención que codifica para la enzima triptamina 5-hidroxilasa comprende la secuencia de nucleótidos con al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5.; y
- la secuencia de nucleótidos (iii) de la invención que codifica para la enzima ARO4 comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6;
preferiblemente donde el valor del % de identidad de las secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) (con sus respectivas SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6), es el mismo valor de %.
En otra realización más preferida de la célula de la invención:
- la secuencia de nucleótidos (i) de la invención que codifica para la enzima L-triptófano descarboxilasa comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4;
- la secuencia de nucleótidos (ii) de la invención que codifica para la enzima triptamina 5-hidroxilasa comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5; y
- la secuencia de nucleótidos (iii) de la invención que codifica para la enzima ARO4 comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6;
En una realización más preferida, las secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) de la invención consisten en las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 respectivamente.
Las secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) de la célula de la invención pueden formar de parte de una o más construcciones genéticas que son introducidas enSaccharomyces cerevisiaepara obtener la célula de la invención. Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con una construcción génica que comprende, al menos, una secuencia de entre las secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) de la célula de la invención. La construcción génica puede comprender, además, los elementos necesarios para la expresión de las secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) de la célula de la invención. Dichos elementos incluyen, sin limitación, promotores, terminadores de la transcripción, marcadores de selección, orígenes de replicación, potenciadores de la expresión (enhancers) y sitios de unión a ribosomas (RBS).
Además, como entiende un experto en la materia, las secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) de la célula de la invención pueden estar unidas operativamente con un promotor que puede actuar en laSaccharomyces cerevisiaehospedadora.
Los términos "promotor" o "región promotora" se refieren cada uno a una secuencia de nucleótidos dentro de un gen que se sitúa 5' de una secuencia codificante y funciona para dirigir la transcripción de la secuencia codificante.
La selección del promotor puede permitir la expresión de un producto génico deseado en una diversidad de condiciones. Los promotores pueden seleccionarse para una función óptima, de manera que se inserte la construcción del vector. Los promotores pueden seleccionarse también basándose en sus características reguladoras. Los ejemplos de dichas características incluyen mejora de la actividad de transcripción e inducibilidad. Así, el promotor puede ser un promotor constitutivo o un promotor inducible. En la presente invención, el término “promotor inducible” se refiere a un promotor que activa la transcripción en presencia de un estímulo externo como por ejemplo, pero sin limitación, temperatura, el pH, una hormona, un metabolito (por ejemplo, lactosa, manitol, un aminoácido), la luz (por ejemplo, longitud de onda específica), un metal pesado o un antibiótico. En la presente invención el término “promotor constitutivo” se refiere a un promotor que activa la transcripción de manera permanente, independientemente de las condiciones ambientales, ejemplos de promotores constitutivos para la expresión enSaccharomyces cerevisisaeincluyen, sin limitación, promotores como PGK1p, TEF1p o GPDp.
En la presente invención el término "unido operativamente” se refiere a la relación entre dos regiones de ácido nucleico de tal modo que les permite funcionar de la manera prevista. Por ejemplo, una secuencia de control "unida operativamente a una secuencia codificante” puede ligarse de tal manera que la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias de control. Así, en algunas realizaciones, la frase "operativamente unido" se refiere a un promotor conectado a una secuencia codificante de tal manera que la transcripción de esa secuencia codificante esté controlada y regulada por dicho promotor. Las técnicas para unir operativamente un promotor a una secuencia codificante son conocidas en la técnica; la orientación y la secuencia codificante de interés depende, entre otras cosas, de la naturaleza específica de la secuencia codificante, entre otras cosas, de la naturaleza específica del promotor.
Así, en otra realización preferida de la célula de la invención, secuencias de nucleótidos de la invención (i), (ii) y/o (iii) se encuentran unidas operativamente a un promotor, preferiblemente un promotor constitutivo. Más preferiblemente la secuencia de nucleótidos (i) de la invención se encuentra unida operativamente al promotor constitutivo TEF1p, la secuencia de nucleótidos (ii) de la invención se encuentra unida operativamente al promotor PGK1p y la secuencia de nucleótidos (iii) se encuentra unida operativamente al promotor constitutivo GPDp. Los promotores TEF1p , PGK1p y GPDp permiten la sobreexpresión de las secuencias de nucleótidos cuya expresión controlan.
En otra realización preferida de la célula de la invención, la enzima codificada por la secuencia de nucleótidos (i) se encuentra sobreexpresada. Más concretamente, la enzima codificada por la secuencia de nucleótidos (i) se encuentra sobreexpresada con respecto a una célula deSaccharomyces cerevisiaeno recombinante o“wild type”.
En otra realización preferida de la célula de la invención, la enzima codificada por la secuencia de nucleótidos (ii) se encuentra sobreexpresada. Más concretamente, la enzima codificada por la secuencia de nucleótidos (ii) se encuentra sobreexpresada con respecto a una célula deSaccharomyces cerevisiaeno recombinante o“wild type”.
En otra realización preferida de la célula de la invención, la enzima codificada por la secuencia de nucleótidos (iii) se encuentra sobreexpresada. Más concretamente, la enzima codificada por la secuencia de nucleótidos (iii) se encuentra sobreexpresada con respecto a una célula deSaccharomyces cerevisiaeno recombinante o“wild type”.
En otra realización más preferida de la célula de la invención, la enzima la enzima codificada por la secuencia de nucleótidos (i), la enzima codificada por la secuencia de nucleótidos (ii) y la enzima codificada por la secuencia de nucleótidos (iii) se encuentran sobreexpresadas.
Los marcadores de selección son ampliamente conocidos en el estado de la técnica. Estos marcadores de selección, o genes de selección, pueden ser marcadores de auxotrofía, genes de resistencia a antibióticos, genes reporteros, como el gen que codifica la beta-galactosidasa del operón lactosa, etc. Entre los genes que confieren resistencia a antibióticos se incluyen, sin limitar a , ampicilina, tetraciclina, kanamicina, higromicina, gentamicina, etc. Los marcadores permiten la selección de las células transformadas satisfactoriamente que crecen en un medio que contiene el antibiótico correspondiente porque llevan el gen de resistencia apropiado.
La introducción de las secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (ii) de la célula de la invención o de la construcción/es génica/s que comprenden dichas secuencias de nucleótidos puede realizarse mediante el empleo de un vector, por ejemplo, un vector de expresión.
En la presente descripción, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede usarse para transportar o trasferir una secuencia de nucleótidos al interior de una célula. Un vector puede contener diferentes elementos funcionales que incluyen, pero no se limitan a, elementos de control de la transcripción, como promotores u operadores, regiones o potenciadores de la unión a factores de transcripción, y elementos de control para iniciar y terminar la transcripción. Los vectores incluyen, pero no se limitan a: plásmidos, cósmidos, virus, fagos, casetes de expresión recombinantes y transposones. Algunos vectores son capaces de replicarse o dividirse autónomamente tras ser introducidos en la célula huésped, como los vectores bacterianos con un origen de replicación bacteriano. Otros vectores pueden integrarse en el genoma de la célula huésped y replicarse así junto con el genoma celular. Ejemplos de vectores que pueden usarse para la modificación genética de células deSaccharomyces cerevisiae,incluyen, sin limitación, plásmidos como p426GPD, pCfB2803, pCfB2988 o pCfB2628.
En una realización preferida de la célula de la invención, las secuencias de nucleótidos (i) y (ii) se integran en el genoma de dicha célula mediante el plásmido de integración múltiple pCfB2803, y la secuencia de nucleótidos (iii) se integra mediante el plásmido de integración pCfB2988.
La obtención de dichos vectores puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia, al igual que para la transformación deSaccharomyces, cerevisiaese pueden utilizar diferentes métodos ampliamente conocidos - transformación química, liposomas, transfección, electroporación, bombardeo de partículas, balas génicas ("gene gun"), microinyección, etc, descritos en diversos manuales ampliamente conocidos por el experto en la materia.
En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una composición, de aquí en adelante "composición de la invención", que comprende la célula de la invención.
Tal como se demuestra en los ejemplos de la presente invención, mediante el cultivo de la célula de la invención es posible producir serotonina a partir de glucosa.
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de la célula de la invención o la composición de la invención, para la producción de serotonina, de ahora en adelante “uso de la invención” .
En una realización preferida del uso de la invención, la producción de serotonina es a partir de una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno, donde preferiblemente la fuente de carbono es glucosa y la fuente de nitrógeno es amonio.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de serotonina, de ahora en adelante “método de la invención” , que comprende:
(a) cultivar la célula de la invención, o la composición de la invención, en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno.
La célula de la invención ha sido definida en párrafos anteriores del presente documento, y se aplica de igual forma al uso de la invención y al método de la invención, así como todas sus realizaciones particulares.
Como entiende el experto en la materia, el crecimiento o cultivo de la célula o de una población que comprende la célula deSaccharomyces cerevisiaede la invención se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende los componentes necesarios para que dicho microorganismo prolifere. Así, en el presente documento, el término "medio de cultivo" se refiere a una sustancia, un compuesto, una mezcla, una disolución que comprende la fuente de carbono y nitrógeno necesarias para la supervivencia, crecimiento y/o metabolismo del microorganismo, en donde dicho medio de cultivo puede ser sólido, semisólido, semilíquido o líquido.
En el presente documento, el término "fuente de nitrógeno" se refiere a moléculas, compuestos químicos, materia orgánica, que comprenden átomos de nitrógeno (N) y que son metabolizadas por los microorganismos para llevar a cabo su crecimiento y desarrollo, en donde dicha fuente de nitrógeno puede tener origen inorgánico u orgánico.
En una realización preferida del método de la invención la fuente de nitrógeno se selecciona de la lista que consiste en: amonio, urea, los diferentes veintidós aminoácidos proteinogénicos y cualquier combinación entre ellos. En otra realización particular del método de la invención, la fuente de nitrógeno es amonio. Preferiblemente, el amonio está en forma de sal. En la presente invención, el término “sal de amonio” se refiere a un compuesto que comprende un catión de amonio y un anión que puede ser inorgánico, como por ejemplo el anión cloruro.
En una realización más preferida del método de la invención, la fuente de nitrógeno es amonio en forma de cloruro de amonio.
En el presente documento, el término "fuente de carbono" se refiere a moléculas, compuestos químicos, materia orgánica, que comprenden átomos de carbono (C) y que son metabolizadas por los microorganismos para llevar a cabo su crecimiento y desarrollo, en donde dicha fuente de carbono puede tener origen inorgánico u orgánico.
En una realización preferida del método de la invención la fuente de carbono se selecciona de la lista que consiste en: glucosa, fructosa, manosa, galactosa, sacarosa, maltosa y rafinosa. En otra realización más preferida del método de la invención, la fuente de carbono es glucosa.
En otra realización preferida del método de la invención, el medio de cultivo comprende glucosa en una concentración de entre 10 y 300 gramos de glucosa por litro de medio de cultivo (g/L), más preferiblemente entre 20 y 250 gramos de glucosa por litro de medio de cultivo, entre 30 y 150 gramos de glucosa por litro de medio de cultivo, y aún más preferiblemente entre 50 y 100 gramos de glucosa por litro de medio de cultivo.
En otra realización preferida del método de la invención, el medio de cultivo comprende la sal de amonio, preferiblemente cloruro de amonio, en una concentración de entre 0,1 y 10 gramos de sal de amonio por litro de medio de cultivo, más preferiblemente entre 0,2 y 5 gramos de sal de amonio por litro de medio de cultivo, entre 0,2 y 2 gramos de sal de amonio por litro de medio de cultivo, y aún más preferiblemente entre 0,4 y 1,5 gramos de amonio por litro de medio de cultivo.
Los presentes inventores han demostrado que la célula de la invención además puede sintetizar serotonina a partir de otras fuentes de nitrógeno como el aminoácido L-triptófano.
Así en otra realización preferida del método de la invención, el medio de cultivo comprende triptófano, más preferiblemente el medio de cultivo comprende L-triptófano y amonio como fuentes de cultivo.
En otra realización preferida del método de la invención, el medio de cultivo comprende entre 0,5 y 5 gramos de L-triptófano por litro de medio de cultivo, más preferiblemente entre 1 y 3 gramos de L-triptófano por litro de medio de cultivo.
Como entiende un experto en la materia, el cultivo de la célula o de una población que comprende la célula de la invención tiene que llevarse a cabo en unas condiciones adecuadas para que la levadura pueda crecer y sintetizar serotonina. Las condiciones adecuadas de pH, temperatura, humedad, etc., necesarias para cultivar una cepa deSaccharomyces cerevisiaeson ampliamente conocidas en el estado de la técnica.
En general, el crecimiento de levadurasSaccharomyces cerevisiaerequiere de una temperatura por encima de aproximadamente 10°C y por debajo de aproximadamente 40°C. Así, en una realización preferida del método de la invención, la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 15°C y 40°C, preferiblemente de entre 20°C y 35°C, más preferiblemente de entre 24°C y 32°C. En otra realización todavía más preferida, la etapa (a) del método de la invención se lleva a cabo a una temperatura de 28°C.
En otra realización preferida del método de la invención, la etapa a) se lleva a cabo durante un período de tiempo de entre 24 y 120 horas, más preferiblemente durante un período de entre 48 y 96 horas, y aún más preferiblemente durante 72 horas.
Preferiblemente la etapa a) del método de la invención se lleva a cabo en condiciones de agitación.
Una vez que ha finalizado la etapa a) del método de la invención, se puede aislar la serotonina producida mediante métodos conocidos para la persona experta en la materia, que incluyen ejemplos como, sin limitación, centrifugación, cromatografía, decantación, filtración, liofilización o mediante solventes orgánicos.
Así, en otra realización preferida, el método de la invención además comprende la siguiente etapa: b) purificar la serotonina tras el paso a).
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.Comparación de la concentración de serotonina en mg/L entre las cepas control BY4743, la cepa SER y la cepa SER+ARO4K229L en un medio enriquecido en triptófano.
Figura 2.Comparación de la concentración de serotonina en mg/L entre las cepas control BY4743, la cepa SER y la cepa SER+ARO4K229L en un medio con glucosa y amonio como fuente de nitrógeno.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Ejemplo 1. Producción de serotonina
Los inventores han optimizado la producción de serotonina a partir de glucosa con la cepa deSaccharomyces cerevisiaerecombinante, la cepa S.cerevisiaeTDC T5H ARO4K229L, mediante la combinación de la integración múltiple en el genoma de los genes L-triptófano descarboxilasa deClostridium sporogenes(CsTDC), que genera la descarboxilación del L-triptofano a triptamina, y la hidroxilasa T5H deOryza sativa(OsT5H), que produce la hidroxilación de la triptamina a serotonina y la sobreexpresión deARO4de S.cerevisiaecon la mutación puntual K229L (ARO4 K229L), igualmente mediante la integración en el genoma.
Materiales y Métodos
2.1. Construcción de plásmidos y cepas productoras serotonina
Las secuencias de los genes TDC deClostridium sporogenesy T5H deOryza sativafueron sintetizadas químicamente por la empresa Twist Bioscience. Estas secuencias fueron optimizadas para el uso de codones de S.cerevisiae.Para clonarlas en los plásmidos fueron amplificadas con los cebadores TDC SamHI F, TDCXhoIR, T5H SamHI F y T5H XhoI R (Tabla 1) a partir de los fragmentos de ADN sintetizados químicamente. Estos cebadores incluyen colas que contienen la secuencia de reconocimiento de las enzimas de restricción SamHI y XhoI, las cuales se utilizaron para el clonaje de ambos genes en el plásmido p426GPD (Mumberg et al., 1995), originando el plásmido p426GPD-TDC y p426GPD-T5H (Tabla 2).
Tabla 1. Cebadores utilizados para la obtención de cepas de levadura modificadas genéticamente para la producción de serotonina.
Tabla 2. Plásmidos utilizados para la obtención de cepas de levadura modificadas 5 genéticamente para la producción de serotonina.
Para la modificación de un cambio de aminoácido en el genARO4,se procedió a la amplificación del genARO4mediante PCR a partir del DNA genómico de la cepa de S.cerevisiaeSc288C, utilizando los cebadores ARO4 F BamHI y ARO4 R XhoI. Estos cebadores incluyen colas que contienen la secuencia de reconocimiento de las enzimas de restricción BamHI yXhoI,las cuales se utilizaron para el clonaje deARO4en el plásmido p426GPD (Mumberg et al., 1995), originando el plásmido p426GPD-aro4. A partir del plásmido p426GPD-aro4 se realizó mutagénesis dirigida por PCR, para generar una mutación puntual en la secuencia deARO4utilizando los cebadores ARO4 F BamHI / ARO4 R XhoI / ARO4 K229L F / ARO4 K229L R. En concreto, se produjo la sustitución de la secuencia AAG (codificante para el aminoácido lisina, K) por TTG (codificante para el aminoácido leucina, L) en la posición de nucleótido 685 de la secuencia de nucleótidos que codifica ARO4 (SEQ ID NO: 8) obteniendo la secuencia nucleótidos que codifica ARO4 K229L (SEQ ID NO: 6).
Secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima de ARO4 deSaccharomyces cerevisisae,SEQ ID NO: 8:
Para la construcción de los plásmidos de integración pCfB2803 TDC+T5H y pCfB2988 ARO4* se procedió al ensamblaje de los mismos mediante la técnica de clonaje conocida como USER (reacción de escisión específica de uracilo). Para ello, se amplificaron mediante PCR los siguientes “biobricks”: TDC, T5H, promotor dual TEF1-PGK1, y GPDp-ARO4*. Para la amplificación de dichos “biobricks”, se utilizaron cebadores que contenían uracilos y la ADN polimerasa Phusion U Hot Start (Thermo Scientific). Los cebadores empleados para la amplificación de los “biobricks” fueron: OsT5H-GV2R, CsTDC-GV1R, CsTDC-GP1F, OsT5H-GV2R, PG1R (TEF1p), PG2R (PGK1p), PV2F (GPDp), y GV2R (ARO4).
Para ensamblar los genes productores de serotonina en el plásmido pCfB2803 se amplificaron tres secuencias o “biobricks” , una conteniendo TDC, otra conteniendo T5H y una tercera conteniendo dos promotores constitutivos fuertes PGK1p y TEF1p, amplificados a partir de los plásmidos construidos previamente p426GPD-TDC, p426GPD-T5H y pCfB2628 (Germann et al., 2016), respectivamente. Para ello se usaron los cebadores OsT5H-GV2, CsTDC-GV1R, CsTDC-GP1F, OsT5H-GV2R, PG1R (TEF1p), PG2R (PGK1p).
Para ensamblar elARO4modificado en el pCfB2988, tras la mutagénesis dirigida se construyó el plásmido p426GPD-ARO4*, a partir del cual se amplificó tanto el promotor como la secuencia deARO4mutado con los cebadores PV2F (GPDp) / GV2R (ARO4), obteniéndose así el “biobrick” GPDp-ARO4*.
En paralelo, los vectores pCfB2988 y pCfB2803 empleados (Maury et al., 2016) se prepararon mediante tratamiento secuencial con las enzimas AsiSI(SfaAI)(Thermo Fisher Scientific) y BsmI (New England Biolabs). Después de la purificación, los vectores preparados y las secuencias amplificadas se mezclaron y trataron con la enzima USER™ (New England Biolabs) y tras la reacción, la mezcla se utilizó directamente para la transformación bacteriana obteniéndose pCfB2803 TDC+T5H y pCfB2988 ARO4*. La correcta construcción de los plásmidos pCfB2803 TDC+T5H y pCfB2988 ARO4* se confirmó mediante secuenciación Sanger utilizando los cebadores ADH1_test_fw y CYC1_test_rv.
El plásmido pCfB2803 T5H TDC es un vector que permite integraciones múltiples TDC y T5H en sitios que comparten homología con los elementos Ty4, y el plásmido pCfB2988 ARO4* en sitios que comparten homología con los elementos Ty1, los cuales ambos están distribuidos ampliamente por todo el genoma de la levadura (Maury et al., 2016). Para poder integrar el casete génico TDC+T5H, así como el casete génico con el gen ARO4 mutado, se empleó la cepa BY4743, una cepa de S.cerevisiaede laboratorio que tiene auxotrofia para los genesURA3, LEU2eHIS3.El casete que complemente la auxotrofía de URA fue pCfB2988, mientras que el caste que complementó la auxotrofía de LEU fue pCfB2803.
Para la integración de las modificaciones anteriormente comentadas en la cepa, tras la comprobación de la correcta construcción de los vectores pCfB2803 TDC+T5H y pCfB2988 ARO4* mediante secuenciación Sanger, se amplificaron ambos vectores para la extracción de los casetes génicos, mediante la digestión de ambos plásmidos con la enzima de restricciónNotIy purificación por columna, previo a la transformación de la levadura.
Para la transformación de S.cerevisiaese utilizó el protocolo de transformación de acetato de litio descrito por Gietz et al., (2004), en el que las células son incubadas en presencia de acetato de litio, polietilenglicol, DNA “carrier” y el plásmido de interés y sometidas a un choque térmico de 28°C durante 30 minutos, seguido de un choque térmico de 42°C durante 30 minutos. Posteriormente, las células se siembran en los diferentes medios de selección y se incuban a 28°C durante 2 o 3 días. La correcta integración de las secuencias fue confirmada mediante PCR de colonia utilizando los cebadores CsTDC R Xhol / OsT5H R Xhol para la integración de TDC Y T5H, y los cebadores GPD_test_Fw / ARO4 R Xhol para la integración de pGPD_ARO4 K229L.
La cepa originada tras la integración del casete génico obtenido de la digestión conNotI del pCfB2803 TDC+T5H se identifica como “cepa SER”. La cepa originada tras la integración en la cepa SER del casete génico obtenido de la digestión con Notl del pCfB2988 ARO4K229L se identifica como “cepa SER ARO4K229L “.
2.2. Condiciones de crecimiento y preparación de las muestras
Para determinar la producción de serotonina, las cepas modificadas SER y SER ARO4K229L fueron inoculadas en 5 mL de medio YNB toda la noche a 28° C en agitación. A la mañana siguiente, se inoculó el cultivo en medio fresco en una cantidad de células de 2x106 células/ml y se creció en 2 medios: Uno con toda la fuente de nitrógeno proveniente del amonio, y otra donde había una proporción 1:1 entre amonio y L-triptofano (Tabla 3). Se inocularon las cepas en matraces tipo Erlenmeyer con una proporción de volumen de medio / volumen total de 1/5. Este cultivo se incubó en agitación constante a 28° C, y tras 72 h de crecimiento se tomó muestra para analizar por HPLC-FLD. Las muestras se diluyeron al 50% con metanol absoluto de calidad de HPLC y fueron filtradas con filtros de nylon de 0,22 pm previamente a la inyección en el cromatógrafo.
Tabla 3.Composición del medio mínimo (YNB) utilizado para la producción de serotonina.
2.3. Detección y cuantificación de serotonina mediante cromatografía líquida
La serotonina producida se detectó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en un cromatógrafo Waters ACQ Arc Sys Core usando una columna Accucore™ C18 (Thermo Scientific) de fase reversa, de dimensiones 4,6 * 150 mm y 2,6 pm de tamaño de partícula. Las fases móviles empleadas fueron A (acetonitrilo) y B (0.01% ácido trifluoroacético en agua) con un flujo constante de 0,8 m Lm in-1, el volumen de inyección fue de 10 pL y el programa de gradientes se ajustó como sigue: flujo inicial de 5:95% (A:B) 0-7min, 90:10 % (A:B) 7-11 min, 5:95 % (A:B), 11-17 min. La detección de analitos tuvo lugar en un detector de fluorescencia Waters 2475 (FLR) donde se extrajo el cromatograma correspondiente a la A excitación = 295 nm y A emisión = 330nm. El tiempo de retención para la serotonina fue 5,5 min.
Resultados
La cepa de S.cerevisiaecon los genes TDC y T5H produjo aproximadamente 567 mg L-1 desde un medio enriquecido con L-triptofano. En cambio, en un medio donde solo hay glucosa y amonio, la cepa SER fue capaz de producir 22 m g L -1 de serotonina tras 72 h de crecimiento en dicho medio. Al modificar dicha cepa con la sobreexpresión del genARO4modificado con la sustitución K229L produjo un aumento de más de 5 veces la producción de serotonina respecto a la cepa con solo TDC T5H, superando los 120 mg/L (Tabla 4).
Tabla 4. Concentraciones en m g L -1 de serotonina producida por las cepas modificadas tras 72 h en medio mínimo con 80 g-L'1 de glucosa y diferentes fuentes de nitrógeno.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Una célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante que comprende:
(i) una secuencia de nucleótidos que codifica para una enzima L-triptófano descarboxilasa o un fragmento de la misma, en donde la enzima L-triptófano descarboxilasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica para una enzima triptamina 5-hidroxilasa o un fragmento de la misma, en donde la enzima triptamina 5-hidroxilasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2; y
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica para una enzima ARO4 o un fragmento de la misma, en donde la enzima ARO4 comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, y donde dicha secuencia de aminoácidos comprende la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 (ARO4 K229L).
2. Célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante según la reivindicación 1, donde dicha célula comprende:
- la secuencia de nucleótidos (i) que codifica para una enzima L-triptófano descarboxilasa o un fragmento de la misma, en donde la enzima L-triptófano descarboxilasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1;
- la secuencia de nucleótidos (ii) que codifica para una enzima triptamina 5-hidroxilasa o un fragmento de la misma, en donde la enzima triptamina 5-hidroxilasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2; y
- la secuencia de nucleótidos (iii) que codifica para una enzima ARO4 o un fragmento de la misma, en donde la enzima ARO4 comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, y donde dicha secuencia de aminoácidos comprende la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 (ARO4 K229L).
3. Célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante según la reivindicación 1 o 2, donde dicha célula comprende:
- la secuencia de nucleótidos (i) que codifica para la enzima L-triptófano descarboxilasa comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4;
- la secuencia de nucleótidos (ii) que codifica para la enzima triptamina 5-hidroxilasa comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5; y
- la secuencia de nucleótidos (iii) que codifica para la enzima ARO4 K229L comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6.
4. Célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha célula comprende:
- la secuencia de nucleótidos (i) que codifica para la enzima L-triptófano descarboxilasa comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4;
- la secuencia de nucleótidos (ii) que codifica para la enzima triptamina 5-hidroxilasa comprende la secuencia una nucleótidos con al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5; y - la secuencia de nucleótidos (iii) que codifica para la enzima ARO4 K229L comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6.
5. Célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicha célula comprende:
- la secuencia de nucleótidos (i) que codifica para una enzima L-triptófano descarboxilasa o un fragmento de la misma, donde la enzima L-triptófano descarboxilasa comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1;
- la secuencia de nucleótidos (ii) que codifica para una enzima triptamina 5-hidroxilasa o un fragmento de la misma, en donde la enzima triptamina 5-hidroxilasa comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2; y
- la secuencia de nucleótidos (iii) que codifica para una enzima ARO4 en donde la enzima ARO4 consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, y donde dicha secuencia comprende la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 (ARO4 K229L).
6. Célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicha célula comprende:
- la secuencia de nucleótidos (i) que codifica para una enzima L-triptófano descarboxilasa o un fragmento de la misma, donde la enzima L-triptófano descarboxilasa consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1;
- la secuencia de nucleótidos (ii) que codifica para una enzima triptamina 5-hidroxilasa o un fragmento de la misma, en donde la enzima triptamina 5-hidroxilasa consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2; y
- la secuencia de nucleótidos (iii) que codifica para una enzima ARO4 o un fragmento de la misma, en donde la enzima ARO4 consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, y donde dicha secuencia de aminoácidos comprende la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 (ARO4K229L).
7. Célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde las secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) comprenden las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 respectivamente.
8. Célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde las secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) consisten en las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 respectivamente.
9. Célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la enzima codificada por la secuencia (iii) se encuentra sobreexpresada.
10. Célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la enzima codificada por la secuencia (i) se encuentra sobreexpresada.
11. Célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la enzima codificada por la secuencia (ii) se encuentra sobreexpresada.
12. Una composición que comprende la célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Uso de la cepa deSaccharomyces cerevisiaerecombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o la composición según la reivindicación 12, para la producción de serotonina.
14. Un método para la producción de serotonina que comprende:
(a) cultivar la célula deSaccharomyces cerevisiaerecombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o la composición según la reivindicación 12, en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno.
15. Método para la producción de serotonina según la reivindicación 14, en donde la fuente de carbono es glucosa.
16. Método para la producción de serotonina según la reivindicación 14 o 15, en donde la fuente de carbono es glucosa y/o la fuente de nitrógeno es amonio.
17. Método para la producción de serotonina según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde el amonio está en forma de sal, preferiblemente como cloruro de amonio.
18. Método para la producción para la producción de serotonina según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde el medio de cultivo comprende glucosa en una concentración de entre 10 y 300 gramos de glucosa por litro de medio de cultivo.
19. Método para la producción de serotonina según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en donde el medio de cultivo comprende la sal de amonio, preferiblemente cloruro de amonio, en una concentración de entre 0,1 y 10 gramos de sal de amonio por litro de medio de cultivo.
20. Método para la producción de serotonina según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, donde la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 24°C y 32°C.
21. Método para la producción de serotonina según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, donde la etapa a) se lleva a cabo durante un tiempo de entre 24 horas y 120 horas.
22. Método para la producción de serotonina según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, en donde dicho método además comprende el siguiente paso: (b) purificar la serotonina tras el paso (a).
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160230200A1 (en) * 2013-09-05 2016-08-11 Danmarks Tekniske Universitet Microorganisms for efficient production of melatonin and related compounds
WO2020249784A1 (en) * 2019-06-13 2020-12-17 Danmarks Tekniske Universitet Advanced microbiome therapeutics engineered to produce serotonin in vivo

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160230200A1 (en) * 2013-09-05 2016-08-11 Danmarks Tekniske Universitet Microorganisms for efficient production of melatonin and related compounds
WO2020249784A1 (en) * 2019-06-13 2020-12-17 Danmarks Tekniske Universitet Advanced microbiome therapeutics engineered to produce serotonin in vivo

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BISQUERT, R. ET AL. Microbial Biotechnology (2022) 15(5), 1499¿1510 . Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for hydroxytyrosol overproduction directly from glucose, 24/10/2021, [en línea][recuperado el 26/04/2024]. (DOI: doi:10.1111/1751-7915.1395 ) Figura 1 y página 1502. *
CAO M., ET AL. Metabolic Engineering 58 (2020) 94¿132 . Building microbial factories for the production of aromatic amino acid pathway derivatives: From commodity chemicals to plant-sourced natural products, 10/08/2019, [en línea][recuperado el 26/04/2024]. (DOI: doi.org/10.1016/j.ymben.2019.08.008 ) Abstract; pags: 94, 103, 105; figura 3 *
WILLIAMS. Cell Host Microbe. 2014 October 8; 16(4): 495¿503. Discovery and characterization of gut microbiota decarboxylases that can produce the neurotransmitter tryptamine, 08/04/2015, [en línea][recuperado el 26/04/2024]. (DOI: doi:10.1016/j.chom.2014.09.001 ) Abstract; pag 2. *

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