ES2860698T3 - Nuevo promotor y uso del mismo - Google Patents

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ES2860698T3 ES16773317T ES16773317T ES2860698T3 ES 2860698 T3 ES2860698 T3 ES 2860698T3 ES 16773317 T ES16773317 T ES 16773317T ES 16773317 T ES16773317 T ES 16773317T ES 2860698 T3 ES2860698 T3 ES 2860698T3
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Seung Bin Lee
Seong Bo Kim
Ji Hyun Lee
Jin Sook Chang
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una actividad promotora que comprende una secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevo promotor y uso del mismo
Campo de invención
La presente descripción se refiere a un nuevo promotor, un vector que lo contiene, un microorganismo que contiene el vector y un método para producir una proteína diana con el uso del promotor.
Antecedentes de la invención
En un microorganismo del género Corynebacterium usado como una cepa para producir aminoácidos o materiales útiles que pueden usarse para diversos fines como piensos, medicinas, alimentos, etcétera, se han continuado los esfuerzos para incrementar la producción mediante la manipulación de los genes en una vía biosintética y/o la introducción de un gen extraño, etcétera. (Patente coreana No. 10-0924065). Inducir la sobreexpresión de un gen diana en un microorganismo del género Corynebacterium requiere un sistema de expresión génica altamente eficaz. Entre estos esfuerzos, la selección de un promotor, que es un factor implicado de manera más significativa en la expresión génica, es por lo tanto extremadamente importante en un sistema de expresión génica. Hasta ahora, varios promotores derivados de E. coli (Plac, Ptrc, Ptac) y varios promotores derivados de microorganismos del género Corynebacterium (Psod, Peftu, PgapA) se han usado como los promotores que pueden usarse en los microorganismos del género Corynebacterium.
El documento EP 2246415 describe el promotor del gen de aspartato quinasa lysC y su uso para la expresión de aspartato quinasa en la producción de lisina por C. Glutamicum.
El documento WO2006065095 describe promotores de C. Glutamicum y su uso para la expresión génica en esta bacteria, entre los que se describe el promotor CJ4.
El documento EP 2749645 describe la expresión del gen de psicosa epimerasa bajo el control del promotor CJ1 en C. Glutamicum y la producción de psicosa por la cepa.
Sin embargo, los sistemas de expresión génica en los microorganismos del género Corynebacterium mostraron una menor eficiencia de expresión en comparación con la mayoría de los sistemas de expresión génica en E. coli.
A este respecto, existe la necesidad de desarrollar un promotor que pueda exhibir una alta eficiencia de expresión en el sistema de expresión génica de un microorganismo del género Corynebacterium.
Descripción detallada
Problema técnico
Los inventores de la presente descripción han realizado muchos esfuerzos para descubrir un promotor que pueda inducir una fuerte expresión génica en una cepa del género Corynebacterium y, como resultado, han desarrollado un nuevo promotor y han confirmado su alta actividad, completando así la presente descripción.
Solución técnica
Un objeto de la presente descripción es proporcionar una nueva molécula de ácido nucleico que tenga una actividad promotora.
Otro objeto de la presente descripción es proporcionar un casete de expresión de proteína diana que incluye la molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora y un gen que codifica una proteína diana.
Otro objeto más de la presente descripción es proporcionar un vector recombinante que incluye la molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora.
Otro objeto más de la presente descripción es proporcionar un microorganismo recombinante introducido con el vector.
Otro objeto más de la presente descripción es proporcionar un método para producir una proteína diana con el uso del microorganismo recombinante introducido con el vector.
Otro objeto más de la presente descripción es proporcionar un método para producir psicosa, que incluye: (a) cultivar el microorganismo introducido con el vector; y (b) hacer reaccionar el microorganismo cultivado con fructosa para producir psicosa.
Efecto ventajoso de la invención
El promotor obtenido a través de la presente descripción exhibe una tasa de expresión génica significativamente mayor en comparación con los promotores usados en la producción a gran escala de proteínas en los microorganismos recombinantes existentes y, por lo tanto, el promotor puede usarse eficazmente en las industrias alimentaria, farmacéutica y agrícola, etcétera, donde van a producirse materiales funcionales con alto rendimiento con el uso del microorganismo del género Corynebacterium o del género Escherichia como un huésped de expresión.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el mapa del vectorpFIS-2-ATPE-2.
La Figura 2 muestra la cromatografía de HPLC después de hacer reaccionar Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-Pcj4-ATPE (FIS-4-ATPE) de con un sustrato de fructosa.
La Figura 3 muestra la cromatografía de HPLC después de hacer reaccionar Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-Pcj4-ATPE (FIS-4-ATPE) con un sustrato de fructosa.
La Figura 4 muestra la cromatografía de HPLC después de hacer reaccionar ATCC13032/pECCG117-Pspl1-ATPE-2 (FIS-2-ATPE-2) con un sustrato de fructosa.
Mejor modo
Para lograr el objeto anterior, un aspecto de la presente descripción proporciona una molécula de ácido nucleico que tiene actividad promotora. Específicamente, la molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora puede ser una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1. En la presente descripción, la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1 con una actividad promotora puede usarse indistintamente con "promotor spl1" o "Pspl1".
Además, la molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora puede denominarse promotor y todos los términos descritos anteriormente pueden usarse en la presente descripción.
El promotor de la presente descripción puede permitir la expresión de un gen diana, que está unido operativamente a la molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora, en un microorganismo diana y puede tener la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1, pero se limita a la misma.
Además, la secuencia promotora de la presente descripción puede ser fácilmente modificada por un experto en la técnica mediante una mutagénesis conocida convencionalmente, tal como evolución direccional, mutagénesis específica de sitio, etcétera. En consecuencia, el promotor puede incluir sin limitación, cualquier secuencia nucleotídica que muestra una homología del 70 % o más, específicamente 80 % o más, más específicamente 90 % o más, incluso más específicamente 95 % o más, aún incluso más específicamente 98 % o más, y aún incluso todavía más específicamente 99 % o más, a la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1. Además, debe entenderse que cualquier secuencia nucleotídica con una actividad promotora que tenga dicha homología también debe pertenecer al alcance de la presente descripción, incluso si la secuencia nucleotídica puede tener deleción, modificación, sustitución o adición, en parte de la secuencia.
El promotor de la presente invención tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1.
Como se usa en la presente descripción, el término "homología" se refiere a un porcentaje de identidad entre dos restos polinucleotídicos o polipeptídicos. La correspondencia de secuencia de un resto con respecto a otro puede determinarse mediante una técnica conocida en la técnica. Por ejemplo, la homología puede determinarse mediante el alineamiento de la información de secuencia de dos moléculas polinucleotídicas o dos moléculas polipeptídicas directamente mediante el uso de un programa informático que esté fácilmente disponible y que puede alinear la información de secuencia (por ejemplo, parámetros tales como puntuación, identidad, similitud, etcétera), (por ejemplo, BLAST 2.0). Además, la homología entre polinucleótidos puede determinarse mediante la hibridación de los polinucleótidos en una condición para formar una doble cadena estable en las regiones homólogas seguido de la digestión de la cadena hibridada por una nucleasa específica de cadena única para determinar el tamaño de los fragmentos digeridos.
Como se usa en la presente descripción, el término "promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico no traducida ubicada corriente arriba de una región codificante, que incluye un sitio de unión a polimerasa y tiene la actividad de iniciar la transcripción de un gen ubicado corriente abajo de un promotor en ARNm, es decir, un dominio de ADN al que se une la polimerasa e inicia la transcripción de un gen. El promotor puede estar ubicado en el dominio 5' de la región de inicio de la transcripción del ARNm.
La molécula de ácido nucleico de un promotor de la presente descripción puede aislarse o prepararse con el uso de la tecnología de biología molecular estándar. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico de un promotor puede prepararse con el uso de una tecnología de sintetizador estándar que usa un sintetizador de ADN automatizado, pero no se limita a ello.
Aunque el tipo de célula en la que la molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora de la presente descripción puede funcionar como un promotor no está particularmente limitado, específicamente, pueden ejemplificarse microorganismos que pertenecen al género Corynebacterium o al género Escherichia, más específicamente, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Escherichia coli K12, etcétera, e incluso más específicamente, Corynebacterium glutamicum o Escherichia coli, pero no se limita a ellos y puede incluirse sin limitación cualquier microorganismo que pertenezca al género Corynebacterium o al género Escherichia. Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un casete de expresión para una proteína diana que incluye la molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora y un gen que codifica la proteína diana. La molécula de ácido nucleico es la misma que se explicó anteriormente.
Como se usa en la presente descripción, el término "casete de expresión" se refiere a un casete unitario que incluye un promotor y un gen que codifica una proteína diana, que se une operativamente cadena abajo del promotor, para que pueda expresar la proteína diana para su producción. Pueden incluirse varios factores que pueden ayudar a la producción eficiente de la proteína diana dentro o fuera del casete de expresión.
El casete de expresión puede incluir convencionalmente un promotor unido operativamente al polinucleótido, una señal de terminación de la transcripción, un dominio de unión al ribosoma, y una señal de terminación de la traducción.
Específicamente, el casete de expresión puede estar en una forma en la que el gen que codifica la proteína diana se una operativamente corriente abajo del promotor.
Como se usa en la presente descripción, el término "casete de expresión" se refiere a una proteína que se desea expresar a partir de un microorganismo. Específicamente, puede incluirse sin limitación cualquier proteína que va a expresarse a partir del microorganismo (por ejemplo, una proteína codificada por un gen ATPE), pero no se limita a ello.
La proteína codificada por el gen ATPE, es decir, una psicosa epimerasa, se refiere a una psicosa-3-epimerasa que tiene la actividad de convertir fructosa en psicosa. La secuencia del gen ATPE puede ser obtenida fácilmente por un experto en la técnica a partir de una base de datos conocida como GenBank de NIH (U.S.). Además, la enzima puede incluir, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 de la publicación de solicitud de patente coreana número 10-2011-0035805 o un fragmento funcional de la misma, pero no se limita a ello. Como se usa en la presente descripción, el término "fragmento funcional" incluye una modificación en una secuencia de aminoácidos por sustitución, inserción o deleción, etcétera, en parte de la secuencia de aminoácidos y no está particularmente limitado siempre que el fragmento tenga la actividad de convertir fructosa en psicosa.
El gen ATPE es uno de los genes diana que pueden unirse operativamente a una molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora de la presente descripción y es solo una modalidad ilustrativa. Cualquier proteína que pueda expresarse en un microorganismo recombinante puede usarse como proteína diana sin limitación.
Como se usa en la presente descripción, el término "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia génica y una secuencia promotora de modo que la secuencia de ácido nucleico que tiene una actividad promotora de la presente descripción puede iniciar y mediar la transcripción del gen que codifica la proteína diana. La unión operativa puede prepararse con el uso de una tecnología de recombinación genética conocida en la técnica, y la escisión y unión de ADN específicas de sitio pueden prepararse con el uso de enzimas, etcétera, para escisión y unión en la técnica, pero no se limita a ello.
Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un vector recombinante que incluye una molécula de ácido nucleico que tiene la actividad promotora.
La molécula de ácido nucleico es la misma que se explicó anteriormente.
El vector recombinante puede incluir además un gen que codifica una proteína diana. Es decir, el vector recombinante puede incluir un casete de expresión para la proteína diana. El gen puede estar unido operativamente a la molécula de ácido nucleico que tiene la actividad promotora dentro del vector.
Como se usa en la presente descripción, el término "vector" se refiere a una molécula de ADN artificial que posee un material genético que puede expresar un gen diana en un huésped apropiado, y se refiere específicamente a un constructo de ADN que incluye la secuencia nucleotídica de un gen unido operativamente a una secuencia de control apropiada. La secuencia de control puede incluir un promotor que puede iniciar la transcripción, cualquier secuencia operadora que puede controlar tal transcripción, una secuencia que codifica un dominio de unión al ribosoma de ARNm apropiado y una secuencia para controlar la terminación de la transcripción y traducción, pero no se limita a ello. Para el propósito de la presente descripción, el promotor puede ser el promotor spll de la presente descripción.
El vector recombinante usado en la presente descripción puede no estar particularmente limitado siempre que el vector sea replicable en la célula huésped, y puede usarse cualquier vector conocido en la técnica. Los ejemplos de los vectores pueden incluir plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos naturales o recombinantes. Los vectores a usar en la presente descripción no están particularmente limitados, pero puede usarse cualquier vector de expresión conocido en la técnica. Por ejemplo, como un vector de fago o vector de cósmido, pueden usarse pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etcétera; y como un vector de plásmido, pueden usarse los basados en pBR, pUC, pBluescriptlI, pGEM, pTZ, pCL, pET, etcétera. Los vectores que pueden usarse en la presente descripción no están particularmente limitados, sino que puede usarse cualquier vector de expresión conocido. Por ejemplo, pueden usarse vectores pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL,pUC19, pBR322,pMW118, pCCIBAC, pCES208, pXMJ19, etcétera, pero los vectores no están limitados a estos.
Además, el promotor endógeno en un cromosoma puede reemplazarse con la molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora de la presente descripción a través de un vector para insertar en una célula huésped. La inserción de la molécula de ácido nucleico en el cromosoma puede realizarse con el uso de cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante recombinación homóloga. Dado que el vector de la presente descripción puede insertarse en el cromosoma mediante recombinación homóloga, puede incluirse adicionalmente un marcador de selección para confirmar la inserción del vector en el cromosoma. El marcador de selección se usa para la selección de una célula transformada, es decir, para confirmar si se insertó la molécula de ácido nucleico diana, y pueden usarse marcadores que pueden proporcionar fenotipos seleccionables tales como resistencia a fármacos, requerimiento de nutrientes, resistencia a agentes citotóxicos y expresión de proteínas de superficie. En las circunstancias en las que se tratan agentes selectivos, solo las células que pueden expresar los marcadores de selección pueden sobrevivir o expresar otros rasgos fenotípicos y por lo tanto pueden seleccionarse fácilmente las células transformadas.
En consecuencia, incluso en el caso de un vector en el que el gen diana no está unido operativamente a la molécula de ácido nucleico con una actividad promotora que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1 de la presente descripción, el promotor endógeno en una célula huésped (por ejemplo, un microorganismo del género Corynebacterium) puede reemplazarse con la molécula de ácido nucleico mediante recombinación homóloga. Al hacerlo, puede sobreexpresarse un gen endógeno de una célula huésped (por ejemplo, un microorganismo del género Corynebacterium).
En el vector recombinante, el gen que codifica la proteína diana puede ser un gen ATPE, pero no se limita a este. En este caso, el vector recombinante puede ser un gen ATPE que está unido operativamente a la molécula de ácido nucleico con una actividad promotora que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, "pFIS-2-ATPE' o "pFIS-2-ATPE-2" usado en una modalidad ilustrativa de la presente descripción, pero no se limita a esta. Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un microorganismo recombinante introducido con el vector anterior.
El vector es el mismo que se explicó anteriormente.
El vector puede ser un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora o un vector que contiene la molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora y un gen que codifica una proteína diana.
El vector puede introducirse en un microorganismo mediante transformación.
Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" se refiere a un proceso de introducción de un vector que incluye el promotor de acuerdo con la presente descripción, o incluye adicionalmente un gen que codifica una proteína diana, en una célula huésped. Para el gen transformado que codifica una proteína diana, no importa si el gen se inserta en el cromosoma de una célula huésped y se ubica en el mismo o se ubica fuera del cromosoma, siempre que el gen pueda expresarse en la célula huésped.
El método para transformar un vector de la presente descripción puede incluir cualquier método que pueda introducir ácidos nucleicos en una célula, y la transformación puede realizarse al seleccionar una técnica apropiada conocida en la técnica de acuerdo con la célula huésped. Por ejemplo, el método puede incluir electroporación, precipitación con fosfato cálcico (CaPO4), precipitación con cloruro cálcico (CaCh), microinyección, un método con polietilenglicol (PEG), un método con DEAE-dextrano, un método con liposomas catiónicos y un método con acetato de litio/DMSO, etcétera, pero no se limita a estos.
El microorganismo a usar en la presente descripción puede ser cualquier microorganismo sin limitación siempre que la molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora de la presente descripción se introduzca en el microorganismo y pueda operar como un promotor. Específicamente, el microorganismo puede ser uno que pertenezca al género Corynebacterium, por ejemplo, Corynebacterium glutamicum o Corynebacterium ammoniagenes, pero no se limita a estos. Además, el microorganismo puede ser uno que pertenezca al género Escherichia, por ejemplo, Escherichia coli, pero no se limita a este.
Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un método para producir una proteína diana, que incluye (a) cultivar el microorganismo recombinante en un medio para producir una proteína diana; y (b) recuperar la proteína diana producida del microorganismo cultivado o del medio.
Como se usa en la presente descripción, el término "cultivo" se refiere al crecimiento del microorganismo en un ambiente ajustado adecuadamente. En la presente descripción, el método para producir una proteína diana con el uso de un microorganismo recombinante puede realizarse mediante un método bien conocido en la técnica. Específicamente, el cultivo puede realizarse de forma continua en un proceso por lotes, un proceso por lotes alimentados o por lotes alimentados repetido, pero no se limita a este.
Los medios usados para el cultivo deben cumplir con los requisitos de una cepa particular en un método apropiado. Ya se conocen los medios de cultivo para la cepa que pertenece al género Corynebacterium o la cepa que pertenece al género Escherichia (por ejemplo, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington DC, EE. UU., 1981). Los ejemplos de las fuentes de carbono pueden incluir azúcares y carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón, celulosa, etcétera; aceites y grasas tales como aceite de soya, aceite de girasol, aceite de ricino, aceite de coco, etcétera; ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, etcétera; alcoholes tales como glicerol y etanol; y ácidos orgánicos tales como ácido glucónico, ácido acético y ácido pirúvico, pero no se limitan a estos. Estas fuentes de carbono pueden usarse solas o en combinación. Los ejemplos de las fuentes de nitrógeno pueden incluir peptona, extracto de levadura, salsa de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz (CLS), harina de soya y urea; o fuentes de nitrógeno inorgánico tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, pero no se limitan a estos. Estas fuentes de nitrógeno pueden usarse además solas o en combinación. Los ejemplos de la fuente de fósforo a usar pueden incluir dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio y las correspondientes sales que contienen sodio, pero no se limitan a estos. Adicionalmente, el medio puede contener sales metálicas tales como sulfato de magnesio o sulfato de hierro. Por último, pueden usarse materiales esenciales para el crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas. Además, el medio también puede contener precursores apropiados. Los materiales fuente anteriores pueden añadirse a un medio en un tipo por lotes o en un tipo continuo mediante un método apropiado. Estos diversos métodos de cultivo se describen en las referencias, por ejemplo, "Biochemical Engineering" de James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, págs. 138 a 176.
El pH del cultivo puede ajustarse con el uso apropiado de un compuesto básico tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, y amoniaco, o un compuesto ácido tales como ácido fosfórico y ácido sulfúrico. Adicionalmente, puede añadirse un agente antiespumante tal como éster de poliglicol de ácido graso para evitar la generación de espuma. Para mantener el estado aeróbico del cultivo, puede inyectarse oxígeno o un gas que contenga oxígeno (por ejemplo, aire) en el cultivo. La temperatura de cultivo puede ser generalmente de 20 °C a 45 °C, y preferentemente de 25 °C a 40 °C, y la temperatura puede variar de acuerdo con las condiciones, pero no se limita a estas.
El método para preparar una proteína diana de la presente descripción puede incluir recuperar una proteína diana de un microorganismo o cultivo del mismo. Como un método para recuperar una proteína diana de un microorganismo, pueden usarse aquellos métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, filtración, cromatografía de intercambio aniónico, cristalización, HPLC, etcétera, pero los métodos no se limitan a estos.
La recuperación puede incluir una etapa de purificación y un experto en la técnica puede seleccionar una etapa de purificación de varios procesos de purificación y usarlos según sea necesario.
Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un método para producir psicosa, que incluye (a) cultivar un microorganismo en el que se introduce un vector que incluye un promotor que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1 y un gen ATPE; y (b) hacer reaccionar el microorganismo cultivado con fructosa para producir psicosa.
El promotor, el gen ATPE, el vector y el microorganismo son los mismos que se explicaron anteriormente.
El método de producción anterior puede mejorar significativamente la productividad de psicosa en comparación con cualquier caso convencional en el que el gen ATPE se unió operativamente a un promotor conocido y se expresó en un microorganismo.
Ejemplos
En lo adelante, la presente descripción se describirá con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos, etcétera, para ayudar a la comprensión de la presente descripción. Sin embargo, estos Ejemplos pueden modificarse en otras formas diversas y el alcance de la presente descripción no debe interpretarse como limitado por estos Ejemplos. Los ejemplos de la presente descripción se proporcionan con el propósito de una explicación más completa para aquellos que tienen un conocimiento promedio en la técnica.
Para la síntesis de un promotor que puede inducir la expresión de un gen diana, se sintetizó un promotor que tiene la secuencia nucleotídica de la s Eq ID NO: 1 mediante el análisis de varias secuencias promotoras derivadas de microorganismos del género Corynebacterium y del género Escherichia, y el promotor se nombró promotor spll (en adelante, "Pspll"). Para medir la actividad inductora de expresión de Pspll, se construyó un vector recombinante uniendo operativamente Pspll con un gen GFP o un gen ATPE. El vector se transformó en un microorganismo del género Corynebacterium y se preparó a partir del mismo una cepa transformada.
Ejemplo 1: preparación de la biblioteca de promotores
Se preparó una biblioteca para tamizar promotores sintéticos fuertes que pueden expresar altos niveles de expresión de proteínas extrañas en una cepa del género Corynebacterium. Específicamente, se obtuvo una biblioteca de promotores que pueden exhibir una expresión más fuerte o un perfil de expresión diferente mediante la técnica de transposición de ADN con el uso del ADN genómico respectivo de Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes y Escherichia coli K12.
Más específicamente, los ADN genómicos de Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes y Escherichia coli K12 se digirieron primero con DNasa I en varios fragmentos y después se sometieron a PCR sin usar cebadores. En consecuencia, cada fragmento que tenga una secuencia nucleotídica similar puede actuar como cebador entre sí y puede prepararse una biblioteca a partir del mismo. La biblioteca se introdujo después en un vector pUC19 mediante una ligación de extremos romos. Después, se realizó la PCR con el uso de los cebadores de la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 que contenían un sitio de restricción KpnI/PstI para preparar una biblioteca de promotores sintetizados de diversas formas.
El vector vacío de la biblioteca usado fue pECCG117 (patente coreana número 10-0620092, KFCC-10673/KFCC-10674), que es un vector lanzadera que puede expresarse en las cepas de Corynebacterium y Escherichia. Primero, el fragmento del gen que codifica la proteína verde fluorescente se preparó mediante PCR con el uso de un vector pGFPuv (Clontech Laboratories Inc., U.S.A.) como plantilla junto con un cebador directo (SEQ ID NO: 4) que contenía un sitio de restricción PstI/XbaI (SEQ ID NO: 4) y un cebador inverso que contenía el sitio de restricción PstI/XbaI (SEQ ID NO: 5). La PCR se realizó mediante desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 minutos; 30 ciclos que consisten en desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 1 minuto; y finalmente amplificación a 72 °C durante 7 minutos. Como resultado, se obtuvo un producto de PCR (SEQ ID NO: 6) que contenía el marco de lectura abierto (ORF) del gen de GFP. El producto de la PCR y el pECCG117, que es un vector vacío, se trataron respectivamente con enzimas de restricción (PstI y XbaI), se ligaron operativamente con el uso de una ADN ligasa y un plásmido pECCG117-gfp, que es un vector recombinante unido a GFP, se preparó finalmente.
La biblioteca de promotores así obtenida y el vector, en el que se clonó la proteína verde fluorescente (en lo adelante, GFP), se trataron con enzimas de restricción (KpnI y PstI) y se ligaron con el uso de una ADN ligasa para preparar un plásmido de biblioteca de promotores.
El plásmido así preparado se transformó en Corynebacterium glutamicum ATCC13032 para preparar una biblioteca de promotores sintéticos.
La biblioteca de promotores sintéticos de Corynebacterium glutamicum así preparada se tamizó en células que muestran fluorescencia al expresar GFP después de someterse a las etapas de cultivo, obtención de las células del microorganismo y pretratamiento. Después de varias rondas de tamizaje, se obtuvo el promotor sintético fuerte Psl1 final y el promotor tenía la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1.
Ejemplo 2: Confirmación de la actividad inductora de la expresión en Corynebacterium glutamicum mediante la comparación de la actividad entre el promotor finalmente obtenido mediante tamizaje y otros promotores
La actividad de los promotores de acuerdo con la expresión de GFP, que es una proteína indicadora, se analizó con el uso del plásmido pECCG117-Pspl1-gfp que tiene el promotor Pspl1 finalmente obtenido en el Ejemplo 1, el plásmido pECCG117-Pcj4-gfp que tiene el promotor Pcj4 convencionalmente conocido (patente coreana núm. 10­ 0620092) como un grupo de control positivo, y el plásmido pECCG117 como un grupo de control negativo.
Específicamente, para la confirmación de la actividad de Pspl1, las cepas transformadas de Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117, Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-Pcj4-gfp y Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-Pspl1-gfp obtenidas anteriormente se cultivaron como se describe a continuación, y se midió su actividad de GFP.
Cada una de las cepas transformadas de Corynebacterium glutamicum se inoculó en una relación de 1:20 en un matraz con deflector de esquina de 250 ml que contenía 25 ml de un medio (glucosa (20 g), sulfato de amonio (5 g), extracto de levadura (5 g), urea (1,5 g), KH2PO4 (4 g), K2HPO4 (8 g), MgSO4-7H2O (0,5 g), biotina (150 |jg), tiamina HCl (1,5 mg), ácido cálcico-pantoténico (3 mg) y nicotinamida (3 mg) (basado en 1 L de agua destilada), pH 7,2), respectivamente, y se cultivaron en una incubadora con agitación (200 rpm) a 30 °C hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzó 10,0. Las células de microorganismos se recuperaron del cultivo mediante centrifugación (5000 rpm, 15 minutos), se lavaron dos veces con un tampón de Tris-HCl al 0,1 % (pH 8,0) y se suspendieron en el mismo tampón para tener una turbidez de aproximadamente 160. La suspensión se cargó con perlas de vidrio (1,25 g de perlas de vidrio/1,5 ml de suspensión) y las células se rompieron durante 6 minutos con el uso de un batidor de perlas. Después, se recuperó el sobrenadante mediante centrifugación (15 000 rpm, 20 minutos) y se cuantificó la concentración de proteínas mediante el método de Bradford (Bradford, MM 1976. Anal. Biochem. 72: 248 a 254). Un extracto de las células del microorganismo en la misma cantidad se sometió a irradiación de luz de excitación a 488 nm con el uso del método Laure Gory, etcétera, (FEMS Microbiology Letters 194, 127 a 133, 2001) y se midió la luz emitida desde el mismo con el uso del dispositivo espectrofotómetro LS-50B (Perkin-Elmer), midiendo así el nivel de expresión del gen de GFP (Tabla 1).
Tabla 1
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Como se muestra en la Tabla 1, Pspll tenía realmente una actividad promotora en Corynebacterium glutamicum, y se confirmó que Pspll es un excelente promotor que puede expresar el gen de GFP con más fuerza que el promotor Pcj4 existente preparado por la empresa del solicitante.
Ejemplo 3: Preparación del vector para la expresión de ATPE que incluye la secuencia del promotor Pspll Para la evaluación del promotor con expresión mejorada de Corynebacterium (en lo adelante Pspll), en una modalidad ilustrativa, se preparó un vector para una cepa de Corynebacterium, en la que se incrementó la expresión de ATPE (epimerasa cíclica derivada de Agrobacterium tumefaciens ATCC 33970).
El marco de lectura abierto (ORF) del gen de ATPE se amplificó mediante PCR (30 ciclos en las siguientes condiciones: 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto) con el uso del vector pET24-ATPE (la misma secuencia nucleotídica que la de la SEQ ID NO: 1 descrita en la publicación de solicitud de patente coreana núm. 10-2011-0035805) o vector pET24-ATPE-2 (la misma que la secuencia nucleotídica descrita en la patente coreana núm. 10-1203856: variantes con termoestabilidad mejorada, I33L-S213C) junto con cebadores que tienen las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NOS: 7 y 8. El vector pECCG117-Pspl1GFP para la cepa del género Corynebacterium preparado en el Ejemplo 1 se trató con enzimas de restricción (PstI y Xbal), y después los fragmentos de ORF del gen de ATPE y ATPE-2 (variantes con estabilidad de ATPE mejorada) se ligaron operativamente con el uso del kit BD In-Fusion y, por lo tanto, se prepararon finalmente el vector pECCG117-Pspl1-ATPE (en lo adelante, "pFIS-2-ATPE") y pECCG117-Pspl1-ATPE-2 (en lo adelante, "pFIS-2-ATPE-2") para la cepa del género Corynebacterium (Figura 1).
Ejemplo 4: Confirmación de la expresión de la enzima productora de psicosa y la actividad de la misma en la cepa de Corynebacterium glutamicum
Los vectores "pFIS-2-ATPE"y "pFIS-2-ATPE-2» preparados anteriormente se introdujeron en la cepa ATCC13032 mediante electroporación para preparar las cepas FIS-2-ATPE y FIS-2-ATPE-2. De estos, la cepa FIS-2-ATPE-2 se depositó en el Centro de cultivo coreano de microorganismos (KCCM) el 27 de marzo de 2015 y se le asignó el número de acceso KCCM11678P. Las cepas se cultivaron en un matraz Erlenmeyer con el uso del medio del Ejemplo 1 (glucosa (20 g), sulfato de amonio (5 g), extracto de levadura (5 g), urea (1,5 g), KH2PO4 (4 g), K2HPO4 (8 g), MgSO4-7H2O (0,5 g), biotina (150 jg), tiamina HCl (1,5 mg), ácido cálcico-pantoténico (3 mg) y nicotinamida (3 mg) (con base en 1 L de agua destilada), pH 7,2) y se midió la actividad de ATPE.
Cada una de las cepas cultivadas durante la noche en medio sólido LB mantenido en una incubadora a 30 °C se inoculó en 25 ml de un medio y se cultivó en la incubadora (30 °C, 200 rpm) durante 24 horas. Después del cultivo, el sobrenadante resultante se eliminó por centrifugación y los cuerpos de microorganismos obtenidos del mismo se lavaron con PBS frío. Cada uno de los sedimentos así obtenidos se disolvió en una solución de EPPS (pH 8,0) a una concentración del 20 % (p/v), se trató con POESA (1 mg/ml) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora y se centrifugó. Cada uno de los sedimentos obtenidos por centrifugación se disolvió en la solución de EPPS

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una actividad promotora que comprende una secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1.
2. Un casete de expresión de proteína diana que comprende la molécula de ácido nucleico aislada que tiene una actividad promotora de la reivindicación 1 y un gen que codifica una proteína diana.
3. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 o el casete de expresión de proteína diana de la reivindicación 2.
4. El vector recombinante de la reivindicación 3, en donde el gen que codifica la proteína diana es el gen de ATPE que codifica la psicosa-3-epimerasa.
5. Un microorganismo recombinante que comprende el vector de la reivindicación 3 o la reivindicación 4.
6. El microorganismo recombinante de la reivindicación 5, en donde el microorganismo es un microorganismo del género Corynebacterium.
7. El microorganismo recombinante de la reivindicación 6, en donde el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum o Corynebacterium ammoniagenes.
8. El microorganismo recombinante de la reivindicación 5, en donde el microorganismo es un microorganismo del género Escherichia.
9. El microorganismo recombinante de la reivindicación 8, en donde el microorganismo del género Escherichia es Escherichia coli.
10. Un método de producción de una proteína diana, que comprende:
(a) cultivar el microorganismo recombinante de la reivindicación 5 en un medio para producir una proteína diana; y
(b) recuperar la proteína diana producida del microorganismo cultivado o del medio.
11. Un método para producir psicosa, que comprende:
(a) cultivar el microorganismo que comprende el vector de la reivindicación 4; y
(b) hacer reaccionar el microorganismo cultivado con fructosa para producir psicosa.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100930203B1 (ko) * 2008-01-28 2009-12-07 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
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KR101481142B1 (ko) 2013-03-04 2015-01-15 한국과학기술원 코리네박테리아 발현용 합성프로모터
KR20140140215A (ko) 2013-05-28 2014-12-09 경상대학교산학협력단 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법
JP6774875B2 (ja) * 2013-09-03 2020-10-28 ロケット フレールＲｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓ Ｄ−プシコース ３−エピメラーゼの改良された変異体およびその使用

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