ES3015105T3 - Anti-cd3 epsilon antibodies - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos que son específicos para el CD3 humano, en particular para el dominio CD3ε. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti CD3 épsilon

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos novedosos que son específicos para CD3 humano, en particular para el dominio CD3<e>.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a anticuerpos anti CD3 novedosos, en particular anticuerpos dirigidos contra el dominio CD3e, que combinan alta afinidad con alta potencia, y en particular anticuerpos novedosos con un perfil mejorado de especificidad y reactividad cruzada.

El receptor de linfocitos T o TCR es una molécula que se encuentra en la superficie de los linfocitos T (o células T) que es responsable de reconocer antígenos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC, por sus siglas en inglés). La unión entre el TCR y el antígeno es de una afinidad relativamente baja. Cuando el TCR se acopla con antígeno y MHC, el linfocito T se activa a través de una serie de eventos bioquímicos mediados por enzimas asociadas, correceptores, moléculas accesorias especializadas y factores de transcripción activados o liberados.

El TCR se asocia con otras moléculas como CD3, que posee tres cadenas distintas (<y>, 8 y £) en los mamíferos, y una cadena Z2 (CD247) o una cadena Z/r|. Estas moléculas accesorias tienen regiones transmembrana y son vitales para propagar la señal desde el TCR hacia la célula; la cola citoplasmática del TCR es extremadamente corta, lo que hace improbable que participe en la señalización. Las cadenas CD3 y Z, junto con el TCR, forman lo que se conoce como el complejo receptor de linfocitos T.

CD3<e>es una proteína transmembrana de tipo I expresada en la superficie de determinados linfocitos T. Participa en el complejo receptor de linfocitos T (TCR) e interactúa con otros dominios de este complejo. Uno de estos compañeros<de interacción es CD3y, que se une a CD3e en una estequiometría de 1:1 (De la Hera>et al.,<J. Exp.Med.1991; 173: 7>17). Se cree que la unión del TCR al complejo MHC-péptido en la superficie de una célula presentadora de antígeno (APC) y el movimiento posterior del linfocito T a lo largo de la APC conduce a una determinada rotación del complejo TCR que da como resultado una dislocación de CD3e y CD3y entre sí, lo que es necesario para la señalización eficiente del TCR y, por lo tanto, la activación de los linfocitos T. Se ha demostrado que determinados anticuerpos contra CD3<e>inducen la señalización del TCR, mientras que otros no lo hacen. Los anticuerpos activadores del TCR típicamente se unen a un epítopo expuesto en CD3<e>, mientras que se ha demostrado que algunos anticuerpos no estimuladores se unen a la interfaz entre CD3<e>y CD3<y>, o se unen concomitantemente a CD3<e>y CD3<y>, lo que posiblemente interfiera con el desplazamiento relativo de CD3e y CD3y (Kim et al., JBC.2009; 284: 31028-31037).

Está bien establecido que los complejos péptido-MHC se unen al TCR con baja afinidad y rápida tasa de disociación<(Matsui>et al.,<Science. 1991; 254: 1788-1791; Weber>et al.,<Nature. 1992; 356: 793-796). Se ha sugerido que esta>baja afinidad es instrumental para permitir que unos pocos complejos péptido-MHC activen en serie muchos TCR<(Valitutti>et al.,<Nature. 1995; 375:148-151) mediante unión y disociación repetidas. Esta activación en serie es crítica>para mantener la señalización a lo largo del tiempo, permitiendo que los linfocitos T finalmente alcancen el umbral de<activación (Valitutti>et al.,<Immunol. Today. 1997; 18: 299-304; Lanzavecchia>et al.<Cell. 1999; 96: 1-4). Esta noción>está respaldada por el hallazgo de que, cuando se comparan con los complejos péptido-MHC, los anticuerpos anti CD3 de alta afinidad no estimulan eficazmente los linfocitos T, ya que activan el TCR con una estequiometría de 1:1<(Viola>et al.,<Science 1996; 273: 104-106), lo que sugiere que los anticuerpos de baja afinidad pueden ser más eficaces>en la estimulación de los linfocitos T a través de la señalización del TCR debido a su capacidad de disociarse y volver a unirse repetidamente a CD3<e>. De hecho, en una comparación directa de tres derivados del anticuerpo anti CD3<e>TR66, que se unen con diferentes afinidades, TR66 de tipo natural que tiene una afinidad intermedia mostró la mejor eficacia en la activación de los linfocitos T en comparación con sus derivados que tienen afinidades más altas o más<bajas (Bortoletto>et al.,<J. Immuno.2002;32:3102-3107). Por lo tanto, una Kd cercana a la de TR66 es ideal para la>estimulación de los linfocitos T. La afinidad de TR66 se ha determinado mediante el uso de tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR), así como por citometría de flujo, produciendo constantes de disociación en equilibrio de<2,6 x 10-7 M (Moore>et al.,<Blood.2011; 117: 4542-4551) y 1,0 x 10'7 M (Amann>et al.,<Cancer Res. 2008; 68: 143-151),>respectivamente. En línea con esto, se ha recomendado usar anticuerpos anti CD3 con una afinidad inferior a 10'8 M (documento US 7.112.324), y los anticuerpos estimuladores de linfocitos T que se han publicado para uso terapéutico humano, se unen con afinidades a CD3<e>humano en el mismo intervalo. Por lo tanto, de acuerdo con la teoría de activación en serie del TCR y de conformidad con los resultados publicados para los anticuerpos anti CD3<e>, no se espera que los anticuerpos monoclonales con afinidades significativamente mejores que los publicados sean estimuladores más potentes de los linfocitos T, sino que, por el contrario, se espera que sean activadores más débiles.

Algunos de los anticuerpos publicados contra CD3<e>se han generado mediante la inmunización de animales con preparaciones de linfocitos T y el posterior aislamiento de anticuerpos monoclonales mediante el denominado procedimiento de hibridoma. La debilidad de este enfoque es que la respuesta inmunitaria no selectiva contra diversos antígenos de linfocitos T (humanos) exógenos en el animal, por un lado, y la escasa eficiencia del procedimiento de hibridoma por otro lado, disminuyen la probabilidad de identificar anticuerpos monoclonales con actividad estimuladora de linfocitos T, también porque estos anticuerpos agonistas pueden representar una minoría en la totalidad de los anticuerpos anti CD3e. La inmunización con un péptido lineal que abarca el epítopo diana aumenta la selectividad de la respuesta inmunitaria, sin embargo, puede dar lugar a anticuerpos que no reconocen el CD3<e>de longitud completa natural o que pueden ejercer una estimulación no óptima del TCR.

Para la inmunización de animales con otras proteínas transmembrana de tipo 1 ha sido particularmente útil usar el dominio extracelular purificado (ECD). Sin embargo, el ECD purificado de c D3e tiende a agregarse, y los agregados pueden tener una estructura alterada en comparación con la proteína natural. Además, este enfoque puede conducir preferentemente a la unión de anticuerpos a la interfaz entre CD3e y CD3y. En cambio, el complejo de CD3e y CD3y producido como una proteína monocatenaria, conectada por un enlazador peptídico flexible, puede purificarse en una<fracción monomérica y en su conformación natural (Kim>et al.,<JMB.2000; 302: 899-916). Sin embargo, la inmunización>de animales con una proteína monocatenaria CD3e/y de este tipo puede conducir a la unión concomitante de anticuerpos a CD3e y CD3y, lo que daría lugar a efectos antagónicos.

En el pasado se han desarrollado varios anticuerpos dirigidos contra CD3e humano.

El anticuerpo monoclonal SP34 es un anticuerpo murino que reacciona de forma cruzada con el CD3 de primate no humano y que también es capaz de inducir la proliferación celular en PBMC de primates no humanos y humanos<(Pessano>et al.,<The T3/T cell receptor complex: antigenic distinction between the two 20 kD T3 (T38 and T3e) subunits.>EMBO J 4 (1985) 337-344).

Los documentos WO 2007/042261 y WO 2008/119567, ambos asignados a Micromet (ahora Amgen Research (Munich)), divulgan aglutinantes reactivos de forma cruzada dirigidos contra los epítopos FSEXE y QDGNE, respectivamente, en CD3e. En los procedimientos de oposición presentados por varios oponentes contra la patente europea concedida EP 2 155 783 (basada en la fase regional de WO 2008/119567), se sostiene que SP34 también se une al epítopo QDGNE.

El documento WO 2014/191113 divulga aglutinantes de reactividad cruzada dirigidos contra un epítopo novedoso en el extremo N de CD3<e>, en donde dicho epítopo comprende el residuo de aminoácido N4 como residuo que es crítico para la unión, y en donde dicho epítopo comprende además el residuo de aminoácido E6 como residuo que está implicado en la unión. Se pudo demostrar que estos anticuerpos exhiben tanto alta afinidad como alta potencia. Sin embargo, aunque se pudo demostrar adicionalmente en el documento WO 2014/191113 que los anticuerpos<divulgados en la solicitud son reactivos de forma cruzada con CD3 de primates no humanos>in vitro,<no se pudo>demostrar reactividad cruzada con CD3 de macaco cangrejero en un contexto celular. Por lo tanto, estos anticuerpos tienen un uso bastante limitado con respecto al desarrollo preclínico de productos farmacéuticos que comprenden un anticuerpo anti CD3.

El documento WO 2016/014974 divulga un fragmento scFv que se une a la cadena épsilon de CD3, que también se ha demostrado que se une a CD3e de macaco cangrejero.

El documento WO 2016/020444 divulga fragmentos scFv de unión a CD3e humanizados que se unen a CD3e humano y de macaco cangrejero. Además, se muestra una construcción scFv heterodímera dirigida a CD3<e>y HER2.

El documento WO 2015/063339 divulga construcciones biespecíficas que comprenden un dominio de unión a PSMA y un dominio de unión a CD3, en donde el dominio de unión a CD3 se une tanto a CD3 humano como de macaco cangrejero.

El documento WO 2017/023761 divulga construcciones biespecíficas que comprenden un dominio de unión a CD38 y un dominio de unión a CD3, que pueden estar ambos en el formato scFv.

El documento WO 2016/071355 divulga construcciones de anticuerpos multifuncionales que comprenden un dominio de unión a IL-23R y un dominio de unión a CD3e, que se une tanto a CD3 humano como de macaco cangrejero, que puede estar, por ejemplo, en el formato scFv.

El documento WO 2016/184570 divulga anticuerpos que se unen a CD3e humano y de macaco cangrejero.

El documento WO 2015/181098 divulga un fragmento scFv biespecífico que comprende un primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de CD3<e>humano y de primate no chimpancé.

Por lo tanto, todavía sigue existiendo una gran necesidad no satisfecha de desarrollar moléculas de unión a CD3 novedosas, en particular anticuerpos anti CD3 novedosos, que exhiban el perfil de afinidad y potencia deseados, pero que además fueran reactivos de forma cruzada con otras especies, en particular con primates no humanos tales como<los macacos cangrejero, tanto>in vitro<como en un contexto celular.>

Sumario de la invención

La presente invención aborda las necesidades anteriores y proporciona anticuerpos novedosos que son específicos para CD3 humano, en particular anticuerpos específicos para el dominio CD3£. La solución proporcionada por la presente invención, es decir, moléculas de unión a CD3, en particular anticuerpos anti CD3 obtenidos mediante inmunización peptídica de conejos y cribado de linfocitos B de memoria madurados por afinidad, y en particular moléculas de unión a CD3, en particular anticuerpos anti CD3, en particular anticuerpos específicos para el dominio CD3<e>, con el perfil de reactividad cruzada requerido, hasta ahora no se ha logrado ni sugerido por la técnica anterior. Los anticuerpos CD3 novedosos de la presente invención presentan el perfil de afinidad y potencia deseados, son reactivos de forma cruzada con otras especies, en particular con primates no humanos tales como los macacos<cangrejero, tanto>in vitro<como en un contexto celular. Además, los anticuerpos de la presente invención tienen>propiedades biofísicas favorables, tales como calidad, estabilidad o solubilidad, por ejemplo, como se define por el porcentaje de anticuerpo en forma de monómero y despliegue térmico determinado por fluorimetría diferencial de barrido (DSF, por sus siglas en inglés).

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que es específico para c D3 humano, que comprende una cadena ligera variable con una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 4, y una cadena pesada variable con una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 8.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido multiespecífico que comprende el anticuerpo de la presente invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, o el polipéptido multiespecífico de la presente invención, y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, o al polipéptido multiespecífico de la presente invención para su uso como medicamento.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico o a una colección de secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un vector o a una colección de vectores que comprenden la secuencia de ácido nucleico o la colección de secuencias de ácido nucleico de la presente invención.

En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que comprende la etapa de expresar la secuencia de ácido nucleico o la colección de secuencias de ácido nucleico de la presente invención, o el vector o la colección de vectores de la presente invención.

En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a un método para generar una construcción multiespecífica, que comprende la etapa de clonar, en una o más etapas, una o más secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención, en una construcción multiespecífica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un segundo dominio de unión o un fragmento del mismo, y, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más dominios de unión adicionales o fragmentos del mismo.

Breve descripción de los dibujos

Lafigura 1muestra el contenido de monómero de cada muestra determinado por SE-HPLC inicialmente (dO) y durante un período de 28 días de almacenamiento a 4 °C y a una concentración de 10 mg/ml.

Lafigura 2muestra el agotamiento de células diana mediado por linfocitos T inducido por PRO460 (IL23RxCD3<i2 c Amgen>) y PRO389 (IL23RxCD3i<* gen. Numab>) usando PBMC humanas. El panel izquierdo muestra la lisis celular de las células que expresan la diana, mientras que el panel derecho muestra la lisis celular de las células negativas para diana. El valor numérico de la concentración eficaz semáxima (CE<50>) para las moléculas en presencia de células que expresan la diana se representa debajo de los gráficos.

Lafigura 3muestra la activación de linfocitos T de las moléculas PRO460 (IL23RxCD3<i2 c Amgen>) y PRO389 (IL23RxCD3<i * gen. Numab>) determinada por el ensayo FC. El panel izquierdo muestra la activación en presencia de células que expresan la diana, mientras que el panel derecho muestra la activación en presencia de células negativas para la diana.

Lafigura 4muestra el agotamiento de células diana mediado por linfocitos T inducido por PRO624 (IL23RxCD3<2* gen. Numab>) y PRO389 (IL23RxCD3<i * gen. Numab>) usando PBMC humanas. El panel izquierdo muestra la lisis celular de las células que expresan la diana, mientras que el panel derecho muestra la lisis celular de las células negativas para diana. El valor numérico de la concentración eficaz semáxima (CE<50>) para las moléculas en presencia de células que expresan la diana se representa debajo de los gráficos.

Lafigura 5muestra la activación de linfocitos T de las moléculas PRO624 (IL23RxCD3<2 * gen. Numab>) y PRO389 (IL23RxCD3i<* gen. Numab>) determinada por el ensayo FC. El panel izquierdo muestra la activación en presencia de células que expresan la diana, mientras que el panel derecho muestra la activación en presencia de células negativas para la diana.

Lafigura 6muestra la activación de linfocitos T de las moléculas PRO624 (IL23RxCD3<2 * gen. Numab>) y PRO389 (IL23RxCD3i<* gen. Numab>) determinada mediante el ensayo del gen indicador NFAT. El panel izquierdo muestra la activación en presencia de células que expresan la diana, mientras que el panel derecho muestra la activación en presencia de células negativas para la diana. El valor numérico de la concentración eficaz semáxima (CE<50>) para las moléculas en presencia de células que expresan la diana se representa debajo de los gráficos.

Lafigura 7muestra el agotamiento de células diana mediado por linfocitos T inducido por PRO624 (IL23RxCD3<2* gen Numab>) y PRO389 (IL23RxCD3i<* gen. Numab>) usando PBMC de macaco cangrejero. El panel izquierdo muestra la lisis celular de las células que expresan la diana, mientras que el panel derecho muestra la lisis celular de las células negativas para diana. El valor numérico de la concentración eficaz semáxima (CE<50>) para las moléculas en presencia de células que expresan la diana se representa debajo de los gráficos.

Lafigura 8muestra el agotamiento de células diana mediado por linfocitos T inducido por PRO957 (HER2xCD3<2* gen. Numab>) y PRO956 (HER2xCD3<i2c Amgen>) usando PBMC humanas después de 16 horas (A) y después de 40 horas (B). El panel izquierdo muestra la lisis celular de las células que expresan la diana, mientras que el panel derecho muestra la lisis celular de las células negativas para diana. El valor numérico de la concentración eficaz semáxima (CE<50>) para las moléculas en presencia de células que expresan la diana se representa debajo de los gráficos. Lafigura 9muestra la activación de linfocitos T de las moléculas PRO957 (HER2xCD3<2 * gen. Numab>) y PRO956 (HER2xCD3<i2 c Amgen>) determinada por el ensayo FC después de 16 horas (A) y después de 40 horas (B). El panel izquierdo muestra la activación en presencia de células que expresan la diana, mientras que el panel derecho muestra la activación en presencia de células negativas para la diana

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación se refiere a anticuerpos novedosos que son específicos para CD3 humano, en particular anticuerpos específicos para el dominio CD3£.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la materia a la que pertenece esta invención.

Los términos "que comprende" y "que incluye" se usan en el presente documento en sus sentidos más amplios y no limitantes, a menos que se indique lo contrario. Con respecto a estas últimas realizaciones, el término "que comprende" incluye, por lo tanto, el término más estricto "que consiste en".

Se ha de interpretar que los términos "un", "uno/una", "el/la" y referencias similares usados en el contexto de la presente invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones siguientes) abarcan tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. Por ejemplo, la expresión "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de los mismos. Cuando se usa la forma plural para compuestos, sales y similares, se acepta que esta también indica un único compuesto, sal o similar.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que es específico para c D3 humano, que comprende una cadena ligera variable con una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 4, y una cadena pesada variable con una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 8.

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que es específico para CD3 humano, que es una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención que comprende:

una cadena ligera variable, en donde la cadena ligera variable comprende, del extremo N al extremo C, las regiones LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4, en donde cada LFW designa una región marco de cadena ligera, y cada LCDR designa una región determinante de complementariedad de cadena ligera, y en donde dichas LCDR juntas presentan al menos un 90 % de identidad de secuencia con las LCDR correspondientes tomadas de la secuencia VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 4;

y una cadena pesada variable, en donde la cadena ligera variable comprende, del extremo N al extremo C, las regiones HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4, en donde cada HFW designa una región marco de cadena pesada, y cada HCDR designa una región determinante de complementariedad de cadena pesada, y en donde dichas HCDR juntas presentan al menos un 90 % de identidad de secuencia con las HCDR correspondientes tomadas de la secuencia VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 8.

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que es específico para CD3 humano, que es una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención que comprende:

(a) una cadena ligera variable, en donde la cadena ligera variable comprende, del extremo N al extremo C, las regiones LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4, en donde cada LFW designa una región marco de cadena ligera, y cada LCDR designa una región determinante de complementariedad de cadena ligera, y en donde dichas LCDR juntas presentan al menos un 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o un 99 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia, con las LCDR correspondientes tomadas de la secuencia VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 4; y

(b) una cadena pesada variable, en donde la cadena ligera variable comprende, del extremo N al extremo C, las regiones HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4, en donde cada HFW designa una región marco de cadena pesada, y cada HCDR designa una región determinante de complementariedad de cadena pesada, y en donde dichas HCDR juntas presentan al menos un 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o un 99 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia, con las HCDR correspondientes tomadas de la secuencia VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 8.

En el contexto de la presente invención, el término "anticuerpo" se usa como sinónimo de "inmunoglobulina" (Ig), que se define como una proteína perteneciente a la clase IgG, IgM, IgE, IgA, IgY o IgD (o cualquier subclase de las mismas), e incluye todos los anticuerpos conocidos convencionalmente. Un "anticuerpo" de origen natural es una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FW). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FW dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-FW4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno.

La expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere al menos a una porción de un anticuerpo intacto, o variantes recombinantes del mismo, y la expresión "fragmento funcional" o "fragmento de anticuerpo funcional" o "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende al menos un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, esa parte de la región variable de un anticuerpo intacto, que es suficiente para conferir reconocimiento y unión específica del fragmento de anticuerpo funcional a una diana, tal como el determinante antigénico de un antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos funcionales incluyen, pero sin limitación, Fab, Fab', F(ab')2 y fragmentos Fv, fragmentos de anticuerpos scFv, anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio único tales como sdAb (VL o VH), dominios VHH de camélidos y moléculas multiespecíficas formadas a partir de fragmentos de anticuerpos tal como un fragmento bivalente que comprende dos o más, por ejemplo, dos, fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra, o dos o más, por ejemplo, dos fragmentos de unión a CDR aislado u otros epítopos de un anticuerpo unidos. En una realización, el fragmento de unión a antígeno de la invención es un scFv. Un fragmento de anticuerpo también se puede incorporar en anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, nanocuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Los fragmentos de anticuerpos también pueden injertarse en armazones basados en polipéptidos, tales como fibronectina tipo III (Fn3) (véase la Patente de EE. UU. N .°: 6.703.199, que describe minicuerpos de polipéptidos de fibronectina). Una "región de unión a antígeno" o "dominio de unión a antígeno" de un anticuerpo se encuentra típicamente en una o más región o regiones hipervariables de un anticuerpo, es decir, las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3; sin embargo, las regiones "marco" variables también pueden desempeñar un papel importante en la unión a antígeno, tal como proporcionando un armazón para las CDR. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina con los tejidos o factores del hospedador, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos. La anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2) o subclase.

Las "regiones determinantes de complementariedad" ("CDR") son secuencias de aminoácidos con límites<determinados usando cualquiera de una serie de esquemas bien conocidos, incluyendo los descritos por Kabat>et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health,<Bethesda,>M<d (esquema de numeración "Kabat"), Al-Lazikani>et al.,<(1997) JMB 273, 927- 948 (esquema de>numeración "Chothia") y numeración ImMunoGenTics (IMGT) (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999);<Lefranc, M.-P.>et al.,<Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) (esquema de numeración "IMGT"). Por ejemplo, para>formatos clásicos, según Kabat, los residuos de aminoácidos de la CDR en el dominio variable de cadena pesada (VH) están numerados 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) y 95-102 (HCDR3); y los residuos de aminoácidos de la CDR<en el dominio variable de cadena ligera (VL) están numerados 24-34>(L<c>D<r>1),<50-56 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3).>Según Chothia, los aminoácidos de las CDR en la VH están numerados 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) y 95-102 (HCDR3); y los residuos de aminoácidos en la (VL) están numerados 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3). Al combinar las definiciones de las CDR de Kabat y Chothia, las CDR consisten en los residuos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), y 95-102. (HCDR3) en la VH humana y los residuos de aminoácidos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), y 89-97 (Lc Dr 3) en la v L humana. Según IMGT, los aminoácidos de las CDR en la VH están numerados aproximadamente 26-35 (HCDR1), 51-57 (HCDR2) y 93-102 (HCDR3), y los residuos de aminoácidos de las C<d>R en la VL se numeran aproximadamente 27-32 (<l>CD<r>1), 50-52 (LC<d>R2) y 89-97 (LCDR3) (numeración según "Kabat"). Según la IMGT, las CDR de un anticuerpo se pueden determinar usando el programa IMGT/DomainGap Align.

En el contexto de la presente invención, se usa el sistema de numeración sugerido por Honegger y Pluckthun ("numeración AHo") (Honegger y Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670), a menos que se indique específicamente lo contrario. Además, los siguientes residuos se definen como CDR: LCDR1 (también denominada CDR-L1): L24-L42; LCDR2 (también denominada CDR-L2): L58-L72; LCDR3 (también denominada CDR-L3): L107-L138; HCDR1 (también denominada CDR-H1): H27-H42; HCDR2 (también denominada CDR-H2): H57-H76; HCDR3 (también denominada CDR-H3): H108-H138. Para mayor claridad, el sistema de numeración según Honegger y Pluckthun tiene en cuenta la diversidad de longitud que se encuentra en los anticuerpos de origen natural, tanto en las diferentes subfamilias VH y VL como, en particular, en las CDR, y proporciona huecos en las secuencias. Por lo tanto, en un dominio variable de anticuerpo dado, normalmente no todas las posiciones 1 a 149 estarán ocupadas por un residuo de aminoácido.

Preferentemente, la "región de unión a antígeno" comprende al menos los residuos de aminoácidos 4 a 138 de la cadena ligera variable (VL) y 5 a 138 de la cadena pesada variable (VH) (en cada caso numeración según Honegger y Pluckthun), más preferentemente los residuos de aminoácidos 3 a 144 de VL y 4 a 144 de VH, y se prefieren particularmente las cadenas VL y VH completas (posiciones de aminoácidos 1 a 149 de VL y 1 a 149 de VH). Las regiones marco y las CDR se indican en las secuencias que se muestran en la Tabla 1. Una clase preferida de inmunoglobulinas para su uso en la presente invención es la IgG. "Fragmentos funcionales" de la invención incluyen el dominio de un fragmento F(ab')<2>, un fragmento Fab, Fv y scFv. El F(ab')<2>o Fab puede genomanipularse para minimizar o eliminar por completo las interacciones disulfuro intermoleculares que se producen entre los dominios CH1 y CL. Los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos de la presente invención pueden formar parte de polipéptidos bifuncionales o multifuncionales, como se describe con más detalle en las Secciones [0086] a [00121].

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de polinucleótidos o aminoácidos: "identidad de secuencia" o "porcentaje de identidad de secuencia". Como se usa en el presente documento, la expresión "identidad de secuencia" se determina calculando el número máximo de residuos de aminoácidos que son idénticos entre dos secuencias polipeptídicas, en donde los huecos y/o inserciones pueden tenerse en cuenta para permitir el mayor grado de superposición de secuencia. Por ejemplo, dos polipéptidos de 100 mer que son completamente idénticos tienen una identidad de secuencia de un 100 %. Cuando difieren en una sola mutación, o cuando un polipéptido contiene una deleción de un aminoácido, la identidad de secuencia es del 99 % (99 de 100 posiciones son idénticas). En otras palabras, la expresión "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) o el residuo de aminoácido aparece en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. La "similitud de secuencia" es el grado de semejanza entre dos secuencias cuando se comparan. Cuando sea necesario o se desee, se puede realizar una alineación óptima de secuencias para comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-53 (1970)), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988)), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete del programa informático Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual. (Véase en<general Ausubel>et al.<(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 4.a ed., John Wiley and Sons, Nueva York (1999)).>A menos que se indique lo contrario en el presente documento, el grado de similitud de secuencias al que se hace referencia en el presente documento se determina mediante la utilización de la matriz PAM de Dayhoff (M.O. Dayhoff, R. Schwartz, B.C. Orcutt: A model of Evolutionary Change in Proteins, páginas 345-352; en: Atlas of protein sequence and structure, National Biomedical Research Foundation, 1979).

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural o sintético, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen naturales son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen sintético. A menos que se indique lo contrario, una secuencia polipeptídica particular también abarca implícitamente variantes modificadas de manera conservadora de la misma.

Como se usa en el presente documento, la expresión "especificidad de unión" se refiere a la capacidad de un sitio de combinación de anticuerpos individuales para reaccionar con un determinante antigénico y no con un determinante antigénico diferente. Como se usa en el presente documento, una molécula de unión es "específica de/para", "reconoce específicamente" o "se une específicamente a" una diana, tal como, por ejemplo, CD3 humano, cuando dicha molécula de unión es capaz de discriminar entre dicha biomolécula diana y una o más moléculas de referencia, ya que la especificidad de unión no es una propiedad absoluta, sino relativa. En su forma más general (y cuando no se menciona ninguna referencia definida), "unión específica" se refiere a la capacidad de la molécula de unión para discriminar entre la biomolécula diana de interés y una biomolécula no relacionada, como se determina, por ejemplo, de acuerdo con métodos de ensayo de especificidad conocidos en la materia. Dichos métodos comprenden, pero sin limitación, transferencia de Western, ELISA, RIA, ECL, IRMA, pruebas de SPR (resonancia de plasmón superficial) y exploraciones de péptidos. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo ELISA estándar. La puntuación se puede realizar mediante el desarrollo de color estándar (por ejemplo, anticuerpo secundario con peróxido de rábano picante y tetrametilbencidina con peróxido de hidrógeno). La reacción en determinados pocillos se puntúa por la densidad óptica, por ejemplo, a 450 nm. El fondo típico (= reacción negativa) puede ser de aproximadamente 0,1 DO; la reacción positiva típica puede ser de aproximadamente 1 DO. Esto significa que la relación entre una puntuación positiva y una negativa puede ser de 10 veces o mayor. En un ejemplo adicional, se puede realizar un ensayo SPR, en donde una diferencia de al menos 10 veces, preferentemente al menos 100 veces entre un fondo y una señal indica una unión específica. Típicamente, la determinación de la especificidad de unión se realiza usando no solo una biomolécula de referencia, sino un conjunto de aproximadamente tres a cinco biomoléculas no relacionadas, tales como leche en polvo, transferrina o similares. El anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una especificidad de unión para CD3 humano, preferentemente a CD3e humano.

En una realización, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno de la misma tiene una especificidad de unión a CD3 humano y a CD3 de primate no chimpancé. Como resulta evidente para un experto en la materia, no se excluye del alcance de la invención que el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo que exhibe especificidad entre especies como se define en el presente documento también puede unirse, por ejemplo, a CD3 de chimpancé. Por otro lado, resulta evidente que el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo que solo se une a CD3 humano, pero no a CD3 de primate no chimpancé, se excluye del alcance de la invención. Esto se aplicamutatis mutandisa los dominios de unión que solo se unen a CD3 de primate no chimpancé, pero no a CD3 humano, tales como, por ejemplo, los del anticuerpo monoclonal FN-18.

Como se usa en el presente documento, un "primate no chimpancé" o sus variantes gramaticales se refiere a cualquier primate distinto de un chimpancé, es decir, distinto de un animal perteneciente al género Pan, e incluyendo las<especies Pan paniscus y Pan troglodytes>,<también conocidas como Anthropopithecus troglodytes o Simia satyrus. Un>"primate", "especie de primate", "primates" o variantes gramaticales del mismo representan un orden de mamíferos euterios dividido en los dos subórdenes de prosimios y antropoides y que comprende al hombre, simios, monos y lémures. Específicamente, "primates", como se usa en el presente documento, comprende el subordenStrepsirrhini(prosimios no tarseros), incluido el infraordenLemuriformes(que incluye las superfamiliasCheirogaleoideayLemuroidea),<el infraorden Chiromyiformes (que incluye la familia Daubentoniidae>)<y el infraorden Lorisiformes (que incluye las familias Lorisidae y Galagidae>).<Como se usa en el presente documento, "primates" también comprende el suborden Haplorrhini>,<incluido el infraorden Tarsiiformes (que incluye a su vez la familia Tarsiidae>),<el infraorden Simiiformes (que incluye a los Platyrrhini>,<o monos del Nuevo Mundo, y los Catarrhini>,<que incluyen los Cercopithecidea>,<o Monos del Viejo Mundo). El más preferido es Macaca fascicularis (también conocido como macaco>cangrejero y, por lo tanto, en los Ejemplos denominado "macaco cangrejero"). De manera adecuada, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una especificidad de unión por CD3 humano y por CD3 de macaco cangrejero.

Además, dependiendo del contexto, la expresión "unión específica" también puede referirse a la capacidad de una molécula de unión para discriminar entre la biomolécula diana y una o más biomoléculas estrechamente relacionadas, que se usan como puntos de referencia, tales como, por ejemplo, moléculas CD3 de una especie diferente, por ejemplo, CD3 murino. Además, "unión específica" puede estar relacionada con la capacidad de una molécula de unión para discriminar entre diferentes partes de su antígeno diana, por ejemplo, diferentes dominios, regiones o epítopos de la biomolécula diana, en particular el dominio CD3<e>, o entre uno o más residuos de aminoácidos clave o tramos de residuos de aminoácidos de la biomolécula diana.

En una realización, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una especificidad de unión para CD3<e>humano.

El término "CD3" se refiere a una molécula expresada como parte del receptor de linfocitos T y tiene el significado que se le atribuye típicamente en la técnica anterior. En seres humanos, abarca las subunidades CD3 individuales o combinadas independientemente CD3 épsilon, CD3 delta y CD3 gamma. Los antígenos CD3 de primate no chimpancé a los que se hace referencia en el presente documento son, por ejemplo, CD3 deMacaca fascicularisy CD3 deMacaca mulatto. EnMacaca fascicularis,abarca CD3 épsilon FN-18 negativo y CD3 épsilon FN-18 positivo, CD3 gamma y CD3 delta. EnMacaca mulatto,abarca CD3 épsilon, CD3 gamma y CD3 delta.

Preferentemente, dicho CD3, como se usa en el presente documento, se refiere específicamente a CD3<e>. La expresión "CD3e humano" se refiere en particular a CD3e humano con el número de acceso de GenBank n.° NM_000733, número de identificación UniProt P07766 reproducido en el presente documento como SEQ ID NO: 19, o una variante del mismo. El CD3e "FN-18 negativo" deMacaca fascicularis(es decir, el CD3e no reconocido por el anticuerpo monoclonal FN-18 debido a un polimorfismo como se ha expuesto anteriormente) está indicado en el número de acceso de GenBank AB073994. El CD3<e>"FN-18 positivo" deMacaca fascicularis(es decir, el CD3 épsilon reconocido por el anticuerpo monoclonal FN-18) está indicado en el número de acceso de GenBank AB073993.

El CD3 gamma humano se indica en el número de acceso de GenBank NM 000073. El CD3 delta humano se indica en el número de acceso de GenBank NM 000732. El CD3 gamma deMacaca fascicularisestá indicado en el número de acceso de GenBank AB073992. El CD3 beta deMacaca fascicularisestá indicado en el número de acceso de GenBank AB073991.

De manera adecuada, los anticuerpos de la invención o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se dirigen a<CD3e humano y de macaco cangrejero>(Macaca fascicularis).

De manera adecuada, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal. Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" se refiere a anticuerpos que son sustancialmente idénticos a la secuencia de aminoácidos o que se obtienen de la misma fuente genética. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad y afinidad de unión por un epítopo particular, o especificidades y afinidades de unión por epítopos específicos.

En el contexto de la presente invención, el término "epítopo" se refiere a esa parte de una biomolécula diana dada que se requiere para la unión específica entre la biomolécula diana y una molécula de unión. Un epítopo puede ser continuo, es decir, formado por elementos estructurales adyacentes presentes en la biomolécula diana, o discontinuo, es decir, formado por elementos estructurales que se encuentran en diferentes posiciones en la secuencia primaria de la biomolécula diana, tal como en la secuencia de aminoácidos de una proteína como diana, pero en estrecha proximidad en la estructura tridimensional, que adopta la biomolécula diana, tal como en el fluido corporal.

Los anticuerpos de la invención incluyen, pero sin limitación, los anticuerpos quiméricos, humanos y humanizados.

La expresión "anticuerpo quimérico" (o fragmento de unión a antígeno del mismo) es una molécula de anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, se reemplaza o se intercambia de modo que el sitio de unión a antígeno (región variable) se una a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, se altera, se reemplaza o se intercambia por una región variable que tiene una especificidad de antígeno diferente o alterada. Por ejemplo, un anticuerpo de ratón se puede modificar reemplazando su región constante con la región constante de una inmunoglobulina humana. Debido al reemplazo por una región constante humana, el anticuerpo quimérico puede conservar su especificidad para reconocer el antígeno, al tiempo que tiene una antigenicidad reducida en seres humanos en comparación con el anticuerpo de ratón original.

Un anticuerpo "humanizado" (o fragmento de unión a antígeno del mismo), como se usa en el presente documento, es un anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que conserva la reactividad de un anticuerpo no humano mientras que es menos inmunogénico en seres humanos. Esto se puede lograr, por ejemplo, conservando las regiones CDR no humanas y reemplazando las partes restantes del anticuerpo por sus equivalentes humanos (es decir, la región constante, así como las porciones de la región variable). Se pueden realizar modificaciones adicionales de la región marco dentro de las secuencias marco humanas, así como dentro de las secuencias de CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero. Los anticuerpos humanizados de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante<mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo>,<o una sustitución conservadora para promover la estabilidad o la fabricación). Véanse, por ejemplo, Morrison et al.>,<Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al.>,<Science, 239: 1534>1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; y Padlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994. Otros ejemplos de tecnología de ingeniería de anticuerpos incluyen, pero sin limitación, la tecnología Xoma divulgada en la . Pat. de EE. UU. N.° 5.766.886.

La expresión "anticuerpo humanizado recombinante", como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanizados de la invención que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tal como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón); anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, anticuerpos aislados de una genoteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes, o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes (si están presentes) procedentes de la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, dichos anticuerpos pueden someterse a mutagénesisin vitro(o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig<humanas, mutagénesis somática>in vivo)<y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de la VH (región variable de>cadena pesada del anticuerpo) y VL (región variable de cadena ligera del anticuerpo) de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, si bien se derivan de y están relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro de la línea germinal del anticuerpo humano.

De manera adecuada, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención es un anticuerpo artificial o aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo. La expresión "anticuerpo artificial", como se usa en el presente documento, significa un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que, en virtud de su origen o manipulación: (i) está presente en una célula hospedadora como el producto de expresión de una porción de un vector de expresión, o (ii) está unido a una proteína u otro resto químico distinto del que está unido en la naturaleza, o (iii) no se produce en la naturaleza. La expresión "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo expresado en una célula hospedadora y purificado a partir de proteínas asociadas, como por cromatografía en gel. La expresión "anticuerpo aislado" también se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen distintas especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a c D3 humano está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de CD3 humano). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a CD3 humano puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas CD3 de otras especies (por ejemplo, CD3 de primate no humano y/o de roedor). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención que comprende (a) una LCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 1; (b) una LCDR2 como se expone en la SEQ ID NO: 2; (c) una lCd R3 como se expone en la SEQ ID NO: 3; (d) una HCDR1 como se expone en la SEQ ID NO: 5; (e) una h CDr 2 como se expone en la SEQ ID NO: 6; y (f) una h Cd R3 como se expone en la SEQ ID NO: 7.

El anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio de cadena pesada variable (VH) y un dominio de cadena ligera variable (VL). En el contexto de la presente invención, los términos "VH" (cadena pesada variable), "Vk" y "VA" se refieren a familias de secuencias de cadena pesada y ligera de anticuerpos que se agrupan según la identidad y homología de secuencia. Los métodos para la determinación de homologías de secuencia, por ejemplo, mediante el uso de una matriz de búsqueda de homología tal como BLOSUM (Henikoff, S. & Henikoff, J. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 10915-10919), y los métodos para la agrupación de secuencias de acuerdo con las homologías se conocen bien por un experto en la materia. Para VH, se pueden identificar diferentes<subfamilias de V k y VA, como se muestra, por ejemplo, en Knappik>et al.,<J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86, que agrupa VH en VH1 A, VH1B y VH2 a VH6, Vk en Vk1 a V k4 y VA en VA1 a VA3.>In vivo,<las cadenas Vk, las cadenas VA y las>cadenas VH de anticuerpos son el resultado de la reorganización aleatoria de los segmentos V y J de la cadena k de la línea germinal, los segmentos V y J de la cadena A de la línea germinal y los segmentos V, D y J de cadena pesada humanos, respectivamente. La subfamilia a la que pertenece una cadena variable de anticuerpo dada está determinada por el segmento V correspondiente y, en particular, por las regiones marco FW1 a FW3. Por lo tanto, cualquier secuencia VH que se caracteriza en la presente solicitud por un conjunto particular de regiones marco HFW1 a HFW3 solamente, puede combinarse con cualquier secuencia h FW4, por ejemplo, una secuencia HFW4 tomada de uno de los segmentos J de la línea germinal de cadena pesada, o una secuencia HFW4 tomada de una secuencia VH reorganizada. En realizaciones particulares, la secuencia HFW4 es WGQGTLVTVSS.

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención que se une específicamente a CD3 (por ejemplo, proteína CD3 humana, en particular CD3e humana), en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio VH4 o VH3, preferentemente un dominio VH3.

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención que se une específicamente a CD3 (por ejemplo, proteína CD3 humana, en particular CD3e humana), en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende (i) marcos Vk FW1, FW2 y FW3, particularmente marcos Vk1 o Vk3, preferentemente marcos Vk1 FW1 a FW3, y (ii) un marco FW4, que se selecciona de Vk FW4, particularmente Vk1 FW4, Vk3 FW4 y VA FW4. Los Vk1 FW1 a FW3 adecuados presentan al menos un 60, 70, 80, 90 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia, con las regiones marco correspondientes tomadas de la secuencia de Vk1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 4. El Vk1 FW4 adecuado presenta al menos un 60, 70, 80, 90 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 90 % de identidad de secuencia, con el FW4 correspondiente tomado de la secuencia de V<k>1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 4. De manera adecuada, el V<k>1 FW4 es el FW4 tomado de la secuencia de V<k>1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 4. El VA FW4 adecuado es como se expone en la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18. Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención que se une específicamente a CD3 (por ejemplo, proteína CD3 humana, en particular CD3e humana), en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende VA FW4 que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60, 70, 80, 90 por ciento de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 17 a SEQ ID NO: 18, preferentemente a SEQ ID NO: 17.

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, en donde dicha cadena ligera variable es una cadena ligera Vk1, y/o dicha cadena pesada variable es una cadena VH3. Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, en donde dicha cadena ligera variable es una cadena ligera quimérica, que comprende regiones marco V<k>I a III y una región marco VA IV. Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, en donde dicha cadena ligera es una cadena ligera quimérica, que comprende:

(i) las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 1,2 y 3, respectivamente;

(ii) regiones marco Vk humanas FW1 a FW3, particularmente las regiones marco Vk1 humanas FW1 a FW3; (iii) FW4, que se selecciona de (a) una secuencia de línea germinal VA humana para FW4, en particular una secuencia de línea germinal VA seleccionada de las SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, preferentemente la SEQ ID NO: 17; y (b) una secuencia basada en VA, que tiene una o dos mutaciones, particularmente una mutación, en comparación con la secuencia de línea germinal VA humana más cercana para FW4 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, preferentemente la SEQ ID NO: 17.

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, en donde dicha cadena ligera variable presenta al menos un 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4, y/o en donde dicha cadena pesada variable presenta al menos un 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 8. Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, en donde dicha cadena ligera variable presenta al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4, y/o en donde dicha cadena pesada variable presenta al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 8.

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que es específico para CD3 humano, en particular CD3e humano, que comprende una cadena ligera variable, en donde dicha cadena ligera variable presenta al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 4, y en donde dicha cadena ligera variable comprende una Arginina (R) o una Lisina (K) en la posición de aminoácido de cadena ligera 54 (numeración AHo), preferentemente una Arginina (R). En una realización adicional, dicha cadena ligera variable comprende además una Glutamina (Q) en la posición de aminoácido de cadena ligera 50 (numeración AHo) y/o una Serina (S) en la posición de aminoácido de cadena ligera 51 (numeración AHo), y opcionalmente una Fenilalanina (F) en la posición de aminoácido de cadena ligera 44 (numeración AHo) o una Glutamina (Q) en la posición de aminoácido de cadena ligera 88 (numeración AHo) o una Histidina (H) en la posición de aminoácido de cadena ligera 88 (numeración AHo). Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que es específico para CD3 humano, en particular CD3e humano, que comprende una cadena ligera variable, en donde dicha cadena ligera variable presenta al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 4, y en donde dicha cadena ligera variable comprende una Arginina (R) en la posición de aminoácido de cadena ligera 54 (numeración AHo), una Glutamina (Q) en la posición de aminoácido de cadena ligera 50 (numeración AHo), una Serina (S) en la posición de aminoácido de cadena ligera 51 (numeración AHo) y una Fenilalanina (F) en la posición de aminoácido de cadena ligera 44 (numeración AHo).

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que es específico para CD3 humano, en particular CD3e humano, que comprende una cadena ligera variable, en donde dicha cadena ligera variable presenta al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 y en donde dicha cadena ligera variable comprende una Arginina (R) en la posición de aminoácido de cadena ligera 54 (numeración AHo), y una Fenilalanina (F) en la posición de aminoácido de cadena ligera 44 (numeración AHo).

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que es específico para CD3 humano, en particular CD3<e>humano, que comprende una cadena pesada variable, en donde dicha cadena pesada variable presenta al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo SEQ ID NO: 8 y en donde dicha cadena pesada variable comprende al menos uno, por ejemplo, al menos dos, preferentemente al menos tres, de los siguientes aminoácidos seleccionados de la lista que consiste en una Alanina (A) en la posición de aminoácido de cadena pesada 53 (numeración AHo), una Treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 103 (numeración AHo), y una Fenilalanina (F) en la posición de aminoácido de cadena pesada 105 (numeración AHo). En una realización, dicha cadena pesada variable presenta al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 8 y comprende una Alanina (A) en la posición de aminoácido de cadena pesada 53 (numeración AHo), una Treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 103 (numeración AHo), y una Fenilalanina (F) en la posición de aminoácido de cadena pesada 105 (numeración AHo).

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una variante modificada de forma conservadora de la cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y una variante modificada de forma conservadora de la cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

La expresión "variante modificada de forma conservadora" o "variantes conservadoras" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos concretas, las variantes modificadas de forma conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o si el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias prácticamente idénticas. A causa de la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican, todos ellos, el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde una alanina se especifica mediante un codón, el codón se puede alterar en cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico se denominan "variaciones silenciosas", que son un tipo de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en el presente documento que codifica un polipéptido también describe todas y cada una de las posibles variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina, y TGG, que es normalmente el único codón del triptófano) se puede modificar con el fin de conseguir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Para las secuencias polipeptídicas, las "variantes modificadas de forma conservativa" o "variantes conservadoras" incluyen sustituciones, deleciones o adiciones individuales en una secuencia polipeptídica que dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la materia. Dichas variantes modificadas de forma conservativa se suman a, y no excluyen, las variantes polimórficas, homólogos interespecíficos y alelos de la invención. Los siguientes ocho grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). En una realización, la expresión "modificaciones conservadoras de secuencia" se usa para referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos.

En una realización de la presente invención, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona de: un anticuerpo IgG, un Fab y un fragmento scFv. De manera adecuada, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo es un fragmento de anticuerpo scFv. Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL, que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a la diana (véase, por ejemplo, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, 1994, págs. 269-315).

De manera adecuada, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo es un scFv. En realizaciones particulares, dicho fragmento de unión a antígeno es un formato scFv que comprende el enlazador de acuerdo con la SEQ ID NO: 15. Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que es un scFv que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista que consiste en las SEQ ID NO: 4, 8, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42. Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una variante del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que es un scFv que comprende la una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista que consiste en las SEQ ID NO: 29, 30, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42.

Como se usa en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de la suma de interacciones no covalentes totales entre un único sitio de unión o una molécula, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y su compañero de unión, por ejemplo, un antígeno. A menos que se indique lo contrario, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión, por ejemplo, la interacción de un único dominio de unión a anticuerpos y su antígeno. La afinidad se puede representar generalmente por la constante de disociación (K<d>). La afinidad puede medirse mediante métodos habituales conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento.

En una realización adecuada, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo puede tener una Kd para CD3 humano y/o para CD3 de macaco cangrejero de entre 0,1 y 100 nM, 0,1 y 90 nM, 0,1 y 80 nM, 0,1 y 70 nM, 0,1 y 60 nM, 0,5 y 50 nM, 0,5 y 40 nM, 0,5 y 30 nM, 0,5 y 20 nM, 0,5 y 10 nM, 0,5 y 9 nM, 0,5 y 8 nM, 0,5 y 7 nM, 0,5 y 6 nM, 0,5 y 5 nM, particularmente según lo medido por resonancia de plasmón superficial. En una realización adecuada, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo puede tener una Kd para CD3 humano y/o para CD3 de macaco cangrejero inferior a aproximadamente 100 nM, inferior a aproximadamente 90 nM, inferior a aproximadamente 80 nM, inferior a aproximadamente 70 nM, inferior a aproximadamente 60 nM, inferior a aproximadamente 55 nM, inferior a aproximadamente 40 nM, inferior a aproximadamente 45 nM, inferior a aproximadamente 40 nM, inferior a aproximadamente 35 nM, inferior a aproximadamente 30 nM, inferior a aproximadamente 25 nM, inferior a 20 nM, inferior a aproximadamente 15 nM, inferior a aproximadamente 10 nM, inferior a aproximadamente 9 nM, inferior a aproximadamente 8 nM, inferior a aproximadamente 7 nM, inferior a aproximadamente 6 nM, inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 4 nM, inferior a aproximadamente 3 nM, inferior a 2 nM, inferior a 1 nM, particularmente según lo medido por resonancia de plasmón superficial. De manera adecuada, el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una K<d>para CD3 humano y/o para CD3 de macaco cangrejero inferior a 10 nM, preferentemente inferior a 6 nM, particularmente según lo medido por resonancia de plasmón superficial.

En una realización particular, el anticuerpo de la invención, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, se caracteriza por uno o más de los siguientes parámetros:

(i) un valor de K<d>para la unión a CD3 humano inferior a 40 nM, particularmente inferior a 10 nM, más particularmente inferior a 6 nM, particularmente según lo medido por resonancia de plasmón superficial, más particularmente según se determina por el método mostrado en el Ejemplo 2.1;

(ii) un valor de K<d>para la unión a CD3 de macaco cangrejero inferior a 20 nM, particularmente inferior a 10 nM, más particularmente inferior a 5 nM, particularmente según lo medido por resonancia de plasmón superficial, más particularmente según se determina por el método mostrado en el Ejemplo 2.1; y

(iii) un punto medio promedio de temperatura de despliegue térmico (Tm) que excede al menos 60 °C, particularmente al menos 65 °C, más particularmente al menos 68 °C, cuando se expresa en el formato de anticuerpo scFv (formato de fragmento variable monocatenario), como se determina mediante fluorimetría<diferencial de barrido (DSF) como se ha descrito anteriormente (Egan,>et al.,<MAbs, 9(1) (2017), 68-84; Niesen,>et al.,<Nature Protocols, 2(9) (2007) 2212-2221) en particular cuando las muestras se diluyen en cinco tampones de>fosfato-citrato a valores de pH que varían de 3,5 a 7,5 y que contienen NaCl 0,15-0,25 M, en particular NaCl 0,15 M. El punto medio de transición para el despliegue térmico de las construcciones de scFv se determina mediante fluorimetría diferencial de barrido usando el colorante de fluorescencia SYPRO® Orange (véase Wong y Raleigh, Protein Science 25 (2016) 1834-1840). Las muestras en condiciones de excipiente relevantes se preparan a una concentración de proteína final de 50 |jg ml-1 mediante la adición de excipientes de reserva que se preparan en el tampón relevante. Para un experimento de exploración de tampones, las muestras se diluyen en tampones scFv finales con diferentes valores de pH (pH 3,4, 4,4, 5,4, 6,4 y 7,2) que contienen una concentración final de 5x SYPRO® Orange en un volumen total de 100 jl. Junto con las muestras desconocidas, se mide la referencia de DSF de scFv como control interno. Se añaden veinticinco microlitros de muestras preparadas por triplicado a placas de PCR del gen AB de paredes blancas. El ensayo se realiza en una máquina de qPCR usada como termociclador y la emisión de fluorescencia se detecta usando la rutina de calibración de colorante personalizada del software. La placa de PCR que contiene las muestras de prueba se somete a una rampa de temperatura de 25 °C a 96 °C en aumentos de 1 °C con pausas de 30 s después de cada aumento de temperatura. El tiempo total del ensayo es de aproximadamente dos horas. La Tm se calcula mediante el software GraphPad Prism usando un método matemático de segunda derivada para calcular el punto de inflexión de la curva. La Tm informada es un promedio de tres mediciones. En una realización particular, la determinación de la Tm se realiza como se describe en el Ejemplo 2.2, en donde una muestra se diluye en un tampón de fosfato-citrato a un valor de pH de 6,4, que contiene NaCl 0,25 M

En un aspecto, la presente invención se refiere a una molécula multiespecífica, por ejemplo, molécula biespecífica, molécula triespecífica, molécula tetraespecífica, pentaespecífica, hexaespecífica, o una molécula multivalente, por ejemplo, molécula bivalente, trivalente, tetravalente, pentavalente, hexavalente, que comprende el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización particular, la molécula multiespecífica es un polipéptido multiespecífico. En una realización particular, la molécula multivalente es un polipéptido multivalente.

La expresión "anticuerpo biespecífico" o "polipéptido biespecífico", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que se une a dos epítopos diferentes, en particular dos epítopos diferentes en dos dianas diferentes. La expresión "anticuerpo triespecífico" o "polipéptido triespecífico", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que se une a tres epítopos diferentes, en particular tres epítopos diferentes en tres dianas diferentes.

Un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se puede derivatizar o unirse a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula multiespecífica (por ejemplo, polipéptido multiespecífico) que se une a al menos dos sitios de unión y/o moléculas diana diferentes. El anticuerpo de la invención puede, de hecho, derivatizarse o unirse a más de otra molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas (por ejemplo, polipéptidos multiespecíficos) que se unan a más de dos sitios de unión y/o moléculas diana diferentes. Para crear una molécula multiespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención puede estar funcionalmente unido (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de modo que se obtenga una molécula multiespecífica.

En una realización, el polipéptido multiespecífico de la presente invención comprende: (a) el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo, y (b) al menos un dominio de unión que se une a una diana diferente de CD3.

Las expresiones "dominio de unión", "fragmento de unión a antígeno del mismo", "porción de unión a antígeno" o "fragmento funcional" de un anticuerpo, y similares, como se usan en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo intacto que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno determinado (por ejemplo, CD3, IL23R, HER2, h Sa ). Las funciones de unión a antígeno de un anticuerpo se pueden realizar por fragmentos de un anticuerpo intacto. En algunas realizaciones, un dominio de unión de un anticuerpo multiespecífico de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CHI; un fragmento F(ab')<2>, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CHI; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento de<anticuerpo de dominio único (dAb) (Ward>et al.,<1989 Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; una región>determinante de complementariedad (CDR) aislada, dsFv, un scAb, STAB, un anticuerpo de dominio único (sdAb o dAb), un anticuerpo de cadena pesada de dominio único y un anticuerpo de cadena ligera de dominio único, un VHH, un VNAR, anticuerpos de dominio único basados en la estructura VNAr de tiburón, y dominios de unión basados en armazones alternativos que incluyen, pero sin limitación, dominios basados en anquirina, finómeros, avímeros, anticalinas, fibronectinas y sitios de unión que se construyen en regiones constantes de anticuerpos (por ejemplo, tecnología f-star). De manera adecuada, un dominio de unión de la presente invención es un fragmento Fv monocatenario (scFv) o dominios variables de anticuerpo único. En una realización preferida, un dominio de unión de la presente invención es un fragmento Fv monocatenario (scFv).

De manera adecuada, el polipéptido multiespecífico de la presente invención comprende: (a) el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo, y (b) al menos un dominio de unión a antígeno asociado a tumores (TAA), preferentemente uno.

En una realización, el polipéptido multiespecífico de la presente invención comprende: (a) el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo, y (b) al menos un dominio de unión a IL23R, preferentemente uno.

La interleucina (IL)-23 es una citocina heterodímera compuesta por dos subunidades proteínicas, designadas p40 y p19 por sus pesos moleculares aproximados. La proteína p40 es compartida entre IL-12 e IL-23, mientras que la subunidad proteínica p19 es exclusiva de IL-23. La IL-23 envía señales a través de un complejo receptor bicatenario que consiste en la cadena beta-1 del receptor de IL-12 (IL-12Rp1), que se une a p40, y una cadena única del receptor de IL-23 (IL23R), que confiere señalización intracelular específica de IL-23. El término "IL23R" se refiere en particular al IL23R humano con número de identificación UniProt Q5VWK5.

En algunas realizaciones, el dominio de unión a IL23R se obtiene de un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo.

Un dominio de unión a IL23R adecuado es específico para IL23R humano y comprende: una cadena ligera variable, en donde la cadena ligera variable comprende, del extremo N al extremo C, las regiones LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4, en donde cada LFW designa una región marco de cadena ligera, y cada LCDR designa una región determinante de complementariedad de cadena ligera, y en donde dichas LCDR juntas presentan al menos un 90 % de identidad de secuencia con las LCDR correspondientes tomadas de la secuencia VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 11; y una cadena pesada variable, en donde la cadena ligera variable comprende, del extremo N al extremo C, las regiones HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4, en donde cada HFW designa una región marco de cadena pesada, y cada HCDR designa una región determinante de complementariedad de cadena pesada, y en donde dichas HCDR juntas presentan al menos un 90 % de identidad de secuencia con las HCDR correspondientes tomadas de la secuencia VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 12. De manera adecuada, el dominio de unión a IL23R de la presente invención comprende (i) una LCDR1, LCDR2, LCDR3 como se expone en las regiones CDR correspondientes tomadas de la secuencia VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, y (ii) una HCDR1, HCDR2, HCDR3 como se expone en las regiones CDR correspondientes tomadas de la secuencia VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 12.

En una realización, dicha cadena ligera variable del dominio de unión a IL23R presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con a secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, y/o dicha cadena pesada variable del dominio de unión a IL23R presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12. En una realización específica, el dominio de unión a IL23R de la presente invención comprende: (i) una cadena ligera variable que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, en donde dicha cadena ligera variable comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3 como se expone en las regiones CDR correspondientes tomadas de la secuencia VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, y/o (ii) una cadena pesada variable que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, en donde dicha cadena pesada variable comprende una HCDR1, HCDR2, HCDR3 como se expone en las regiones CDR correspondientes tomadas de la secuencia VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 12. En una realización específica, dicha cadena ligera variable del dominio de unión a IL23R comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11 o una variante modificada de forma conservadora de la misma, y/o dicha cadena pesada variable del dominio de unión a IL23R comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 o una variante modificada de forma conservadora de la misma. En una realización más específica, dicha cadena ligera variable del dominio de unión a IL23R comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, y/o dicha cadena pesada variable del dominio de unión a IL23R comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12.

En realizaciones particulares, dicho dominio de unión a IL23R está en un formato scFv que comprende el enlazador de acuerdo con la SEQ ID NO: 15.

En una realización, el polipéptido multiespecífico de la presente invención comprende: (a) el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo, y (b) un dominio de unión a IL23R, en donde dicho polipéptido multiespecífico comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 26. En otra realización, el polipéptido multiespecífico de la presente invención comprende: (a) el anticuerpo de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y (b) al menos un dominio de unión a IL23R, y en donde dicho polipéptido multiespecífico comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60, 70, 80, 90 por ciento de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26.

En una realización, el polipéptido multiespecífico de la presente invención comprende: (a) el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo, y (b) al menos un dominio de unión a HER2, preferentemente uno.

El término "HER2" se refiere en particular al HER2 humano con número de identificación UniProt Q5VWK5.

En algunas realizaciones, el dominio de unión a HER2 se obtiene de un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo.

Un dominio de unión a HER2 adecuado es específico para HER2 humano y comprende: una cadena ligera variable, en donde la cadena ligera variable comprende, del extremo N al extremo C, las regiones LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4, en donde cada LFW designa una región marco de cadena ligera, y cada LCDR designa una región determinante de complementariedad de cadena ligera, y en donde dichas LCDR juntas presentan al menos un 90 % de identidad de secuencia con las LCDR correspondientes tomadas de la secuencia VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 20; y una cadena pesada variable, en donde la cadena ligera variable comprende, del extremo N al extremo C, las regiones HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4, en donde cada HFW designa una región marco de cadena pesada, y cada HCDR designa una región determinante de complementariedad de cadena pesada, y en donde dichas HCDR juntas presentan al menos un 90 % de identidad de secuencia con las HCDR correspondientes tomadas de la secuencia VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 21. De manera adecuada, el dominio de unión a HER2 de la presente invención comprende (i) una LCDR1, LCDR2, LCDR3 como se expone en las regiones CDR correspondientes tomadas de la secuencia VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 20, y (ii) una HCDR1, HCDR2, HCDR3 como se expone en las regiones CDR correspondientes tomadas de la secuencia VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 21.

En una realización, dicha cadena ligera variable del dominio de unión a HER2 presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con a secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 20, y/o dicha cadena pesada variable del dominio de unión a HER2 presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 21. En una realización específica, el dominio de unión a HER2 de la presente invención comprende: (i) una cadena ligera variable que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 20, en donde dicha cadena ligera variable comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3 como se expone en las regiones CDR correspondientes tomadas de la secuencia VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 20, y/o (ii) una cadena pesada variable que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con<la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID n>O:<21, en donde dicha cadena pesada variable comprende>una HCDR1, HCDR2, HCDR3 como se expone en las regiones CDR correspondientes tomadas de la secuencia VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 21. En una realización específica, dicha cadena ligera variable del dominio de unión a HER2 comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 20 o una variante modificada de forma conservadora de la misma, y/o dicha cadena pesada variable del dominio de unión a HER2 comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 21 o una variante modificada de forma conservadora de la misma. En una realización más específica, dicha cadena ligera variable del dominio de unión a HER2 comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 20, y/o dicha cadena pesada variable del dominio de unión a HER2 comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 21.

En realizaciones particulares, dicho dominio de unión a HER2 está en un formato scFv que comprende el enlazador de acuerdo con la SEQ ID NO: 15.

En una realización específica, el dominio de unión a HER2 de la presente invención es trastuzumab o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización, el polipéptido multiespecífico de la presente invención comprende: (a) el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo, y (b) un dominio de unión a h ER2, en donde dicho polipéptido multiespecífico comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 27. En otra realización, el polipéptido multiespecífico de la presente invención comprende: (a) el anticuerpo de la invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y (b) al menos un dominio de unión a HER2, y en donde dicho polipéptido multiespecífico comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60, 70, 80, 90 por ciento de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27.

En una realización adicional, el polipéptido multiespecífico de la presente invención puede comprender un dominio de unión adicional que tiene una especificidad para la seroalbúmina humana. En una realización, el polipéptido multiespecífico de la presente invención comprende: (a) el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo, (b) al menos un dominio de unión a IL23R, preferentemente uno, y (c) al menos un dominio de unión a HSA, preferentemente uno. En una realización, el polipéptido multiespecífico de la presente invención comprende: (a) el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo, (b) al menos un dominio de unión a HER2, preferentemente uno, y (c) al menos un dominio de unión a HSA, preferentemente uno.

El término "HSA" se refiere en particular a la seroalbúmina humana con número de identificación UniProt P02768, o una variante de la misma. La seroalbúmina humana (HSA) es una proteína abundante de 66,4 kDa en el suero humano (50 % de la proteína total) compuesta por 585 aminoácidos (Sugio, Protein Eng, Vol. 12, 1999, 439-446). La proteína HSA multifuncional está asociada con su estructura que le permite unirse y transportar una serie de metabolitos tales como ácidos grasos, iones metálicos, bilirrubina y algunos fármacos (Fanali, Molecular Aspects of Medicine, Vol. 33, 2012, 209-290). La concentración de HSA en suero es de aproximadamente 3,5-5 g/dl. Los anticuerpos de unión a<albúmina y fragmentos de los mismos se pueden usar, por ejemplo, para prolongar la semivida sérica>in vivo<de>fármacos o proteínas conjugadas con los mismos.

En algunas realizaciones, el dominio de unión a HSA se obtiene de un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo.

Los dominios de unión a HSA adecuados para su uso en el polipéptido multiespecífico de la invención son los dominios de unión proporcionados en la presente divulgación. Los dominios de unión a HSA de la invención incluyen, pero sin limitación, los anticuerpos monoclonales humanizados cuyas secuencias se enumeran en la Tabla 1.

Un dominio de unión a HSA adecuado es específico para HSA humana y comprende: una cadena ligera variable que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 22, y/o una cadena pesada variable que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 23. En una realización específica, el dominio de unión a HSA de la presente invención comprende: (i) una cadena ligera variable que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 22, en donde dicha cadena ligera variable comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3 como se expone en las regiones CDR correspondientes tomadas de la secuencia VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 22, y/o (ii) una cadena pesada variable que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 23, en donde dicha cadena pesada variable comprende una HCDR1, HCDR2, HCDR3 como se expone en las regiones CDR correspondientes tomadas de la secuencia VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 23. En una realización más específica, dicha cadena ligera variable del dominio de unión a HSA comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 22, y/o dicha cadena pesada variable del dominio de unión a HSA comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 23. Otro dominio de unión a HSA adecuado específico para HSA humana comprende: una cadena ligera variable que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 24, y/o una cadena pesada variable que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID<n>O: 25. En una realización específica, el dominio de unión a HSA de la presente invención comprende: (i) una cadena ligera variable que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 24, en donde dicha cadena ligera variable comprende una LCDR1, LCDR2, LCDR3 como se expone en las regiones CDR correspondientes tomadas de la secuencia VL de acuerdo con la SEQ ID NO: 24, y/o (ii) una cadena pesada variable que presenta al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID<n>O: 25, en donde dicha cadena pesada variable comprende una HCDR1, HCDR2, HCDR3 como se expone en las regiones CDR correspondientes tomadas de la secuencia VH de acuerdo con la SEQ ID NO: 25. En una realización específica, dicha cadena ligera variable del dominio de unión a HSA comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 24 o una variante modificada de forma conservadora de la misma, y/o dicha cadena pesada variable del dominio de unión a HSA comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 25 o una variante modificada de forma conservadora de la misma. En una realización más específica, dicha cadena ligera variable del dominio de unión a HSA comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 24, y/o dicha cadena pesada variable del dominio de unión a HSA comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 25.

En realizaciones particulares, dicho dominio de unión a HSA está en un formato scFv que comprende el enlazador de acuerdo con la SEQ ID NO: 15.

De manera adecuada, el polipéptido multiespecífico de la presente invención está en un formato de anticuerpo seleccionado de cualquier multiespecífico adecuado, por ejemplo, biespecífico, formato conocido en la técnica, incluyendo, a modo de ejemplo no limitativo, formatos basados en un diacuerpo monocatenario (scDb), un scDb en tándem (Tandab), un scDb dimérico lineal (LD-scDb), un scDb dimérico circular (CD-scDb), un activador de linfocitos T biespecífico (BiTE; di-scFv en tándem), un tri-scFv en tándem, un tricuerpo (Fab-(scFv)2) o bicuerpo (Fab-(scFv)l), Fab, Fab-Fv2, Morrison (fusión de IgG CH3-scFv (Morrison L) o fusión de IgG CL-scFv (Morrison H)), triacuerpo, scDbscFv, Fab2 biespecífico, di-minianticuerpo, tetracuerpo, fusión scFv-Fc-scFv, fusión scFv-HSA-scFv, di-diacuerpo, DVD-lg, COVD, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, fusiones IgG-scFv, tales como bsAb (scFv unido al extremo C de la cadena ligera), Bs1Ab (scFv unido al extremo N de la cadena ligera), Bs2Ab (scFv unido al extremo N de la cadena pesada), Bs3Ab (scFv unido al extremo C de la cadena pesada), Ts1Ab (scFv unido al extremo N tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera), Ts2Ab (dsscFv unido al extremo C de la cadena pesada) y anticuerpos botón en ojal (KiHs) (IgG biespecíficas preparadas mediante la tecnología KiH), un MATCH (descrito en el documento<WO2016/0202457; Egan T.,>et al.,<mAbs 9 (2017) 68-84) y DuoBodies ((IgG biespecíficas preparadas mediante la>tecnología Duobody) (MAbs. febrero/marzo de 2017;9(2): 182-212. doi: 10.1080/19420862.2016.1268307). Particularmente adecuado para su uso en el presente documento es un diacuerpo monocatenario (scDb), en particular un scDb monomérico biespecífico, o un scDb-scFv, en particular un scDb-scFv monomérico triespecífico.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un v H conectado a un VL en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena para crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Se describen diacuerpos con más detalle en, por ejemplo, el<documento EP 404097, el documento WO 1993/01161, Hudson>et al.,<Nat. Med. 9:129-134 (2003) y Hollinger>et al.,<Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson>et al.,<Nat. Med. 9:129-134 (2003).>

El scDb biespecífico, en particular el scDb monomérico biespecífico, comprende particularmente dos dominios de cadena pesada variable (VH) o fragmentos de los mismos y dos dominios de cadena ligera variable (VL) o fragmentos de los mismos conectados por los enlazadores L1, L2 y l3 en el orden VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-v La , VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA, VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA, VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA, VHB-L1-VLA-L2- VHA-L3-VLB, VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB, VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB o VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB, en donde los dominios VLA y VHA forman conjuntamente el sitio de unión a antígeno para el primer antígeno, y VLB y VHB forman conjuntamente el sitio de unión a antígeno para el segundo antígeno.

El enlazador L1 es particularmente un péptido de 2-10 aminoácidos, más particularmente de 3-7 aminoácidos, y mucho más particularmente de 5 aminoácidos, y el enlazador L3 es particularmente un péptido de 1-10 aminoácidos, más particularmente de 2-7 aminoácidos, y mucho más particularmente de 5 aminoácidos. En realizaciones particulares, L1 y L3 son ambos GGGGS (SEQ iD NO: 16). El enlazador intermedio L2 es particularmente un péptido de 10-40 aminoácidos, más particularmente de 15-30 aminoácidos, y mucho más particularmente de 20-25 aminoácidos. En realizaciones particulares, L2 es (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 15).

En una realización de la presente invención, el polipéptido multiespecífico que comprende el anticuerpo de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo multiespecífico y/o multivalente en un formato MATCH<descrito en el documento WO 2016/0202457; Egan T.,>et al.,<mAbs 9 (2017) 68-84.>

Las construcciones biespecíficas, bivalentes, multiespecíficas y/o multivalentes de la presente invención se pueden producir usando cualquier método de fabricación de anticuerpos conveniente conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Fischer, N. y Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14 con respecto a la producción de construcciones biespecíficas; Hornig, N. y Farber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907 (2012)713-727, y el documento WO 99/57150 con respecto a diacuerpos biespecíficos y scFv en tándem). Los ejemplos específicos de métodos adecuados para la preparación de la construcción biespecífica de la presente invención incluyen además, entre otros, las tecnologías<Genmab (véase Labrijn>et al.,<Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150) y Merus (véase de Kruif>et al., Biotechnol. Bioeng. 106 (2010) 741-750). También se conocen en la técnica métodos para la producción de<anticuerpos biespecíficos que comprenden una parte Fc de anticuerpo funcional (véanse, por ejemplo, Zhu>et al.,<Cancer Lett. 86 (1994) 127-134); y Suresh>et al.,<Methods Enzymol. 121 (1986) 210-228).>

Estos métodos implican típicamente la generación de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, mediante la fusión de células de mieloma con los esplenocitos de un ratón que ha sido inmunizado con el antígeno deseado usando la<tecnología de hibridoma (véase, por ejemplo, Yokoyama>et al.,<Curr. Protoc. Immunol. Capítulo 2, Unit 2.5, 2006) o>mediante ingeniería de anticuerpos recombinantes (clonación de repertorio o presentación en fagos/presentación en levadura) (véase, por ejemplo, Chames y Baty, FEMS Microbiol. Letters 189 (2000) 1-8), y la combinación de los dominios de unión a antígeno o fragmentos o partes de los mismos de dos anticuerpos monoclonales diferentes para dar una construcción biespecífica usando técnicas de clonación molecular conocidas.

En realizaciones particulares, el polipéptido multiespecífico comprende además uno o más enlazadores polipeptídicos.

En realizaciones particulares, dicho polipéptido multiespecífico es un polipéptido monomérico, particularmente un polipéptido monomérico en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención es un fragmento de anticuerpo scFv unido a través de un enlazador a un segundo dominio de unión, particularmente en donde dicho segundo dominio de unión es un segundo fragmento de anticuerpo scFv.

En realizaciones particulares, dicho polipéptido multiespecífico es un polipéptido dimérico, particularmente un polipéptido dimérico, en donde la asociación de los dos polipéptidos está causada por la asociación de dominios VL y VH complementarios de fragmentos de anticuerpo comprendidos en dicho polipéptido multiespecífico. En tales realizaciones particulares, el polipéptido multiespecífico es una construcción de anticuerpo multiespecífico de acuerdo con las enseñanzas del documento WO 2016/202457. En otras realizaciones particulares, el polipéptido multiespecífico es una construcción de diacuerpo monocatenario (scDb). En otras realizaciones particulares, el polipéptido multiespecífico es una construcción Fab-(scFv)<n>(siendo n un número entero seleccionado entre 1, 2, 3 o 4) que emplea un ensamblaje heterodimérico de un fragmento Fab que consiste en VL-CL y VH-CH1 con un dominio constante que forma un armazón, al que se unen uno o más fragmentos scFv mediante enlazadores flexibles.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, o el polipéptido multiespecífico de la presente invención, y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del alcance de un buen criterio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos o animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente divulgación pueden contener además de forma rutinaria concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes tamponantes, conservantes, agentes potenciadores inmunitarios complementarios tales como adyuvantes y citocinas y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos. La composición también puede incluir antioxidantes y/o conservantes. Como antioxidantes pueden mencionarse los derivados de tiol (por ejemplo, tioglicerol, cisteína, acetilcisteína, cistina, ditioeritreitol, ditiotreitol, glutatión), tocoferoles, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, sales de ácido sulfuroso (por ejemplo, sulfato de sodio, bisulfito de sodio, bisulfito de sodio y acetona, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio, formaldehído sulfoxilato de sodio, tiosulfato de sodio) y ácido nordihidroguaiarético. Los conservantes adecuados pueden ser, por ejemplo, fenol, clorobutanol, alcohol bencílico, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de benzalconio y cloruro de cetilpiridinio.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, o al polipéptido multiespecífico de la presente invención para su uso como medicamento.

En realizaciones particulares proporcionadas en el presente documento, dichos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se pueden aislar, preparar, expresar o crear por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, anticuerpos aislados de una genoteca de anticuerpos combinatorios recombinantes, o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique la creación, por ejemplo, a través de síntesis, ingeniería genética de secuencias de ADN que codifican secuencias de inmunoglobulina humana, o corte y empalme de secuencias que codifican inmunoglobulinas humanas, por ejemplo, secuencias de genes de inmunoglobulina humana, a otras secuencias de este tipo.

Por lo tanto, en un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico o a una colección de secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención.

La expresión "ácido nucleico" se usa en el presente documento de forma intercambiable con el término "polinucleótido" y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria. La expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces modificados de la cadena principal, que son sintéticos, de origen natural y de origen sintético, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de forma similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforoamidatos, metil fosfonatos, metil fosforatos quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (ANP). A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácido nucleico también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, como se detalla a continuación, las sustituciones de codones degenerados se pueden conseguir mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o de<desoxiinosina (Batzer>et al.,<Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka>et al.,<J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; y Rossolini>et al.,<Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).>

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un vector o a una colección de vectores que comprenden la secuencia de ácido nucleico o una colección de secuencias de ácido nucleico de la presente invención. El término "vector" o "vector de expresión" significa un polinucleótido, más comúnmente un plásmido de ADN, que comprende secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención o un fragmento de los mismos para la expresión recombinante en células hospedadoras, preferentemente en células de mamífero. Un vector puede o no ser capaz de replicarse en una célula. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica la cadena pesada variable y/o la cadena ligera variable de un anticuerpo, o un fragmento del mismo descrito en el presente documento, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo se puede producir mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la materia. Por lo tanto, en el presente documento se describen métodos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo. Se pueden usar métodos que son bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes de anticuerpos y señales de control transcripcional y traduccional<apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante>in vitro,<técnicas sintéticas y recombinación genética>in vivo.

Se puede transferir un vector de expresión a una célula hospedadora mediante técnicas convencionales y, a continuación, las células resultantes se pueden cultivar mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo descrito en el presente documento o un fragmento del mismo. Por lo tanto, la presente invención se refiere a una célula hospedadora, particularmente una célula hospedadora de expresión, que comprende la secuencia de ácido nucleico o la colección de secuencias de ácido nucleico de la presente invención, o el vector o la colección de vectores de la presente invención. En determinadas realizaciones, una célula hospedadora contiene un vector que comprende un polinucleótido que codifica tanto la cadena pesada variable como la cadena ligera variable del anticuerpo de la invención, o un fragmento del mismo. En realizaciones específicas, una célula hospedadora contiene dos vectores diferentes, un primer vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada variable de dicho anticuerpo, o un fragmento del mismo, y un segundo vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera variable de dicho anticuerpo, o un fragmento del mismo. En otras realizaciones, una primera célula hospedadora comprende un primer vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena pesada variable de dicho anticuerpo, o un fragmento del mismo, y una segunda célula hospedadora comprende un segundo vector que comprende un polinucleótido que codifica una cadena ligera variable de dicho anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo.

Los métodos para la humanización de anticuerpos de conejo o anticuerpos de roedores se conocen bien por cualquier<experto en la materia (véanse, por ejemplo, Borras, J Biol Chem. 19 de marzo de 2010;285(12):9054-66; Rader>et al.,<The FASEB Journal, artículo expreso 10.1096/fj.02-0281fje, publicado en línea el 18 de octubre de 2002; Yu>et al. (2010) A Humanized Anti-VEGF Rabbit Monoclonal Antibody Inhibits Angiogenesis and Blocks Tumor Growth in Xenograft Models. PLoS ONE 5(2): e9072.doi:10.1371/journal.pone.0009072). La inmunización de los conejos o roedores puede realizarse con el antígeno de interés tal cual, tal como una proteína, o, en el caso de antígenos peptídicos o proteicos, mediante inmunización con ADN de un conejo con un ácido nucleico, por ejemplo, un plásmido, que codifica los péptidos o proteínas de interés.

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, una célula hospedadora, particularmente una célula hospedadora de expresión, que comprende la secuencia de ácido nucleico o la colección de secuencias de ácido nucleico de la presente invención, o el vector o la colección de vectores de la presente invención.

La expresión "célula hospedadora" se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión. Debe entenderse que dichos términos pretenden referirse no sólo a la célula en cuestión en particular, sino a la descendencia de dicha célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha descendencia puede, de hecho, no ser idéntica a la célula precursora, pero aun así se incluye dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora", como se usa en el presente documento.

En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que comprende la etapa de expresar la secuencia de ácido nucleico o la colección de secuencias de ácido nucleico de la presente invención, o el vector o la colección de vectores de la presente invención, o la célula hospedadora, particularmente la célula hospedadora de expresión, de la presente invención.

En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a un método para generar una construcción multiespecífica, que comprende la etapa de clonar, en una o más etapas, una o más secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención, en una construcción multiespecífica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un segundo dominio de unión o un fragmento del mismo, y, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más dominios de unión adicionales o fragmentos del mismo.

En realizaciones particulares del octavo aspecto, el segundo dominio de unión es un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En realizaciones particulares, al menos uno de dichos dominios de unión adicionales opcionales está presente, particularmente en donde dicho dominio de unión adicional es un tercer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al anticuerpo de la presente invención o fragmento de unión a antígeno del mismo, o al polipéptido multiespecífico que comprende dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o a la composición de la invención para su uso en la fabricación de un medicamento.

En un aspecto, la presente invención se refiere al anticuerpo de la presente invención o fragmento de unión a antígeno del mismo, o al polipéptido multiespecífico que comprende dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o a la composición de la invención para su uso en el tratamiento de un cáncer, una enfermedad inflamatoria y/o autoinmunitaria en un sujeto que lo necesite.

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, el uso del anticuerpo de la presente invención o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el polipéptido multiespecífico que comprende dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o la composición de la invención para tratar un cáncer, una enfermedad inflamatoria y/o autoinmunitaria en un sujeto que lo necesite.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso del anticuerpo de la presente invención o fragmento de unión a antígeno del mismo, o al polipéptido multiespecífico que comprende dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o a la composición de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer, un enfermedad inflamatoria y/o autoinmunitaria, en un sujeto que lo necesite.

Se describe adicionalmente en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar un cáncer, una enfermedad inflamatoria y/o autoinmunitaria en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la presente invención o fragmento de unión a antígeno del mismo, o el polipéptido multiespecífico que comprende dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o la composición de la invención.

El término "sujeto" incluye animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, oveja, perro, vaca, pollos, anfibios y reptiles. Excepto cuando se indique lo contrario, los términos "paciente" o "sujeto" se usan en el presente documento de manera intercambiable.

Los términos "tratamiento", "que trata", "tratar', "tratado" y similares, como se usan en el presente documento, se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad o retraso de la progresión de la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en el presente documento, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, por ejemplo, en un ser humano e incluye: (a) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de un agente que, cuando se administra a un mamífero u otro sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para realizar dicho tratamiento para la enfermedad. La "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo del agente, la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, etc., del sujeto que se va a tratar.

La enfermedad inflamatoria y/o autoinmunitaria puede ser artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, psoriasis, artritis psoriásica, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, diabetes juvenil, uveítis autoinmunitaria y esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y lesión por isquemiareperfusión.

El término "cáncer" se refiere a una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido y descontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas se pueden diseminar localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Los términos "tumor" y "cáncer" se usan indistintamente en el presente documento, por ejemplo, ambos términos abarcan tumores sólidos y líquidos, por ejemplo, difusos o circulantes. Como se usa en el presente documento, el término "cáncer" o "tumor" incluye cánceres y tumores preneoplásicos malignos, así como neoplásicos malignos.

El cáncer que se va a tratar incluye, pero sin limitación, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer nasofaríngeo, cáncer oral, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, linfomas de linfocitos B y linfomas de linfocitos T, incluyendo leucemia/linfoma de linfocitos T del adulto (ATLL), linfoma mieloide agudo (AML), linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma linfoblástico agudo pediátrico (B-ALL), linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T (AITL), linfoma de células grandes anaplásicas (ALCL), linfomas de linfocitos T/citolíticos naturales y linfoma periférico de linfocitos T (PTCL). En realizaciones particulares, el cáncer se selecciona de cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer nasofaríngeo, cáncer oral, cáncer de esófago, linfomas de linfocitos B y linternas de linfocitos T, tales como leucemia/linfoma de linfocitos T del adulto (ATLL), linterna angioinmunoblástico de linfocitos T (AITL), linterna de células grandes anaplásicas (ALCL), linfomas de linfocitos T/citolíticos naturales y linterna periférico de linfocitos T (PTCL).

Ejemplos

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención sin limitar su alcance.

Ejemplo 1: Selección y humanización

Para la generación del candidato principal del dominio de unión CD3e se seleccionaron seis clones de anticuerpos monoclonales de conejo.

La humanización del clon seleccionado comprendió la transferencia de las CDR de conejo a un marco aceptor scFv del tipo Vk1A/H3 como se describe en el documento WO 2014/206561. En este proceso, las secuencias de aminoácidos de las seis regiones CDR se identificaron en la secuencia donante (mAb de conejo) y se injertaron en la secuencia de armazón aceptora. Para la selección, los scFv se construyeron en una disposición VL-Enlazador-VH. Un ejemplo sería la combinación de SEQ ID NO: 4, 15 y 8 desde el extremo N al extremo C de la cadena proteica.

En las construcciones finales se incluyeron aminoácidos adicionales del donante de conejo en determinadas posiciones del armazón, que se ha descrito que influyen potencialmente en el posicionamiento de CDR y, por lo tanto,<en la unión al antígeno (Borras>et al.,<2010; J. Biol. Chem., 285:9054-9066). La Tabla 2 muestra los cambios realizados>para el clon 28-21-D09 (numeración según AHo). Una comparación de los datos de caracterización para estas construcciones reveló una ventaja significativa sobre el injerto de CDR solo.

<Una vez completado el diseño>in silico<de las construcciones descritas en la sección anterior, se sintetizaron los genes>correspondientes y se construyeron los vectores de expresión bacterianos. La secuencia de las construcciones de expresión se confirmó a nivel de ADN y las construcciones se fabricaron de acuerdo con protocolos genéricos de expresión y purificación.

<La expresión heteróloga de las proteínas se realizó en>E. coli<como cuerpos de inclusión insolubles. El cultivo de>expresión se inoculó con un cultivo de partida de crecimiento exponencial. El cultivo se realizó en matraces de agitación en un agitador orbital usando medios ricos disponibles comercialmente. Las células se cultivaron hasta una DO<600>definida de 2 y se indujeron mediante expresión durante una noche con isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM. Al final de la fermentación, las células se recogieron por centrifugación y se homogeneizaron por sonicación. En este punto, el nivel de expresión de las diferentes construcciones se determinó mediante análisis SDS-PAGE del lisado celular. Los cuerpos de inclusión se aislaron del sedimento celular homogeneizado mediante un protocolo de centrifugación que incluyó varias etapas de lavado para eliminar los restos celulares y otras impurezas de la célula hospedadora. Los cuerpos de inclusión purificados se solubilizaron en un tampón desnaturalizante (Tris 100 mM/HCl a pH 8,0, Gdn-HCl 6 M, EDTA 2 mM) y los scFv se replegaron mediante un protocolo de replegamiento escalable que generó cantidades de miligramos de scFv monoméricos plegados de forma natural. Se empleó un protocolo estandarizado para purificar los scFv, que incluyó las siguientes etapas. El producto después del replegamiento se capturó mediante una cromatografía de afinidad empleando agarosa Capto L (GE Healthcare) para producir los scFv purificados. Los candidatos principales que cumplieron con los criterios de afinidad y potencia en las pruebas iniciales se purificaron aún más mediante una cromatografía de exclusión por tamaño de pulido usando una columna HiLoad Superdex75 (GE Healthcare). Después del protocolo de purificación, las proteínas se formularon en una solución salina tamponada y se caracterizaron.

Ejemplo 2: Caracterización de los scFv humanizados

2.1 Afinidad por CD3c humano y de macaco cangrejero

La afinidad de los scFv humanizados por el CD3<e>humano y de macaco cangrejero se determinó mediante mediciones de SPR usando un dispositivo T200 (Biacore, General Electric). CD3e se acopló directamente a un chip sensor CM5 (Biacore, General Electric) usando química de acoplamiento de amina. Después de realizar una exploración de regeneración y una prueba de rendimiento de superficie para encontrar las mejores condiciones de ensayo, se midió una respuesta a la dosis de scFv y las curvas de unión obtenidas se referenciaron dos veces (canal de referencia vacío e inyección de analito cero) y se ajustaron usando el modelo Langmuir 1:1 para recuperar los parámetros cinéticos. El ensayo se realizó en un tampón PBS-Tween 1 X a pH 7,4.

El experimento de SPR muestra el efecto de añadir residuos estructurales de la IgG del donante de conejo a la secuencia humanizada (véase la Tabla 3). La construcción 28-21-D09-sc03, que contiene solo los CDR de conejo, no presenta unión detectable a la diana. Todos los clones que contienen una arginina o lisina en la posición 54 del VL presentan cierta unión a la diana. Basándose en los datos de SPR, se eligieron los dominios de la construcción 28-<21-D09-sc04 para una caracterización>in vitro<adicional en el formato scDb.>

2.2 Despliegue térmico

El punto medio de transición para el despliegue térmico de las construcciones scFv ensayadas se determinó mediante<fluorimetría diferencial de barrido (DSF), esencialmente como se describe por Niesen (Niesen>et al.,<Nat Protoc. 2>(2007) 2212-21). El ensayo DSF se realiza en una máquina de qPCR (por ejemplo, MX3005p, Agilent Technologies). Las muestras se diluyeron en un tampón (citrato-fosfato a pH 6,4, NaCl 0,25 M) que contenía una concentración final de 5x SYPRO Orange en un volumen total de 25 pl. En un experimento de exploración del tampón se determinó la dependencia del pH de la temperatura de despliegue y se observaron características de pH comparables para todas las construcciones. Las muestras se midieron por triplicado y se programó una rampa de temperatura de 25-96 °C. Se adquirió la señal de fluorescencia y los datos sin procesar se analizaron con GraphPad Prism (GraphPad Software Inc.).

El despliegue térmico de todas las construcciones scFv humanizadas funcionales se analizó mediante DSF como se ha descrito anteriormente. Si bien todas las construcciones mostraron un punto medio de despliegue por encima de 60 °C (véase la Tabla 4), no parece haber correlación entre una alta estabilidad conformacional y una alta afinidad (compárese con la Tabla 3).

2.3. Estabilidad durante el almacenamiento

El contenido inicial de monómero de cada muestra se determinó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento con exclusión por tamaño (SE-HPLC) (dO). Las muestras se pasaron a través de una columna Shodex™ (Showa Denko) KW402.5-4F con tampón de análisis (NaCI 250 mM, NaOAc 50 mM, pH 6,0; a un caudal de 0,35 ml/min. La proteína eluida se detectó por absorbancia a 280 nm. Para calcular el porcentaje de proteína monomérica, el área bajo la curva que alcanzó el pico en el tiempo de retención del monómero se dividió por el área total bajo las curvas no atribuible a la matriz de la muestra. Las muestras se almacenaron a 4 °C y se analizaron repetidamente durante un período de 28 días (figura 1) a una concentración de 10 mg/ml.

Ejemplo 3: Generación de un formato de diacuerpo monocatenario (scDb)

Para la caracterización funcional del dominio CD3, los dominios seleccionados se incorporaron al formato de diacuerpo monocatenario con el fin de ensayar el potencial de los dominios para inducir la activación de linfocitos T y el agotamiento de células diana.

El dominio CD3 seleccionado se incorporó en el formato de diacuerpo monocatenario, ya sea junto con un dominio de unión a IL23R (clon anti IL23R 14-11-D07, véanse las SEQ ID NO: 11 y 12; PRO624, véase la SEQ ID NO: 26) o con<un dominio de unión a HER2 (trastuzumab, véanse las SEQ ID NO: 20 y 21; PRO957, véase la SEQ ID n>O:<27).>Además de los dominios VL y VH del clon 28-21-D09, también se ensayaron los dominios VL y VH de otros dos aglutinantes de CD3 publicados (clon anti CD309-24-H09-sc10: véanse el documento WO 2014/191113 y las SEQ ID NO: 9 y 10; clon anti CD3 I2C: véase el documento US 2010/0150918 y las SEQ ID NO: 13 y 14).

El diseño de la construcción en el formato de diacuerpo monocatenario (scDb) se realizó como se ha descrito<previamente (Holliger>et al.,<"Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.>

90, 6444-6448). En resumen, los dominios variables que se enumeran en la Tabla 1 se organizaron de la siguiente manera VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA (véase la Tabla 5), donde L1 y L3 son enlazadores G4S cortos (SEQ ID NO:<16) y L2 es un enlazador (G4S)4 largo>(S<e>Q<ID NO: 15).>

<Las secuencias de nucleótidos se sintetizaron>de novo<y se clonaron en un vector adaptado para la expresión de>E. coli<que se basa en una cadena principal pET26b(+) (Novagen). La construcción de expresión se transformó en la cepa de>E. coli<BL12 (DE3) (Novagen) y las células se cultivaron en medio 2YT (Sambrook, J.,>et al.,<Molecular Cloning:>A Laboratory Manual) como cultivo de partida. Los cultivos de expresión se inocularon y se incubaron en matraces de agitación a 37 °C y 200 rpm. Una vez que se alcanzó una DO<600>de 1, se indujo la expresión de la proteína mediante la adición de IPTG a una concentración final de 0,5 mM. Después de la expresión durante una noche, las células se recogieron mediante centrifugación a 4.000 g. Para la preparación de los cuerpos de inclusión, el sedimento celular se suspendió de nuevo en tampón de resuspensión de IB (Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 al 0,5 %). La suspensión celular se complementó con DTT 1 mM, 0,1 mg/ml de lisozima, leupeptina 10 mM, PMSF 100 pM y pepstatina 1 pM. Las células se lisaron mediante 3 ciclos de homogeneización ultrasónica mientras se enfriaban en hielo. Posteriormente, se añadieron 0,01 mg/ml de DNasa y el homogeneizado se incubó a temperatura ambiente durante 20 min. Los cuerpos de inclusión (IB) se sedimentaron mediante centrifugación a 15.000 g y 4 °C. Los IB se suspendieron de nuevo en tampón de resuspensión de IB y se homogeneizaron mediante sonicación antes de otra centrifugación. En total, se realizaron un mínimo de tres etapas de lavado con tampón de resuspensión de IB y, posteriormente, dos lavados con tampón de lavado de IB (Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM) para obtener los IB finales.

Para el replegamiento de proteínas, los IB aislados se suspendieron de nuevo en tampón de solubilización (Tris/HCl 100 mM a pH 8,0, Gdn-HCl 6 M, EDTA 2 mM) en una relación de 5 ml por g de IB húmedos. La solubilización se incubó durante 30 min a temperatura ambiente hasta que se añadió DTT a una concentración final de 20 mM y la incubación continuó durante 30 min más. Una vez completada la solubilización, la solución se clarificó mediante centrifugación durante 10 minutos a 21.500 g y 4 °C. El replegamiento se realizó mediante dilución rápida a una concentración final de proteína de 0,3 g/l de la proteína solubilizada en tampón de replegamiento (típicamente: Tris-HCl 100 mM a pH 8,0, urea 5,0 M, cisteína 5 mM, cistina 1 mM). La reacción de replegamiento se incubó de forma rutinaria durante un mínimo de 14 h. La solución proteica resultante se clarificó mediante centrifugación durante 10 min a 8.500 g y 4 °C. La proteína replegada se purificó mediante cromatografía de afinidad en resina Capto L (GE Healthcare). La fracción de monómero aislada se analizó mediante HPLC de exclusión por tamaño, SDS-PAGE para determinar la pureza y espectroscopia UV/Vis para determinar el contenido de proteína. El tampón se cambió por tampón nativo (citratofosfato 50 mM, pH 6,4, NaCl 200 mM) mediante diálisis. Las concentraciones de proteína se ajustaron al valor deseado para el análisis de estabilidad.

Ejemplo 4: Caracterización funcional de las construcciones de diacuerpos monocatenarios (scDb)

4.1 Activación de linfocitos T mediante el ensayo del gen indicador NFAT

La activación de linfocitos T se ensayó en un ensayo NFAT. La estirpe de linfocitos T indicadores Jurkat NFAT expresa el gen indicador de la luciferasa bajo el control de los elementos de respuesta NFAT (factor nuclear de linfocitos T activados) del promotor IL-2 (células Jurkat GloResponse™ NFAT-luc2). El factor de transcripción NFAT se activa tras la reticulación de CD3e e induce una serie de genes implicados en la activación de linfocitos T. En este sistema, la reticulación de CD3e induce la expresión del gen indicador de la luciferasa. Se usaron células de ovario de hámster chino transgénicas (CHO-K1) que expresaban IL-23R (figuras 2 a 7) o HER2 (figuras 8 a 9) como células diana y se usó la estirpe celular CHO-K1 precursora como estirpe celular de control negativo. Se sembraron 25.000 células diana viables diluidas en 50 pl de medio de ensayo (RPMI 1640, FCS al 10 %) en placas de 96 pocillos de color blanco de fondo plano. A continuación, se añadieron 25 pl de proteínas de prueba concentradas 4 veces diluidas en medio de ensayo a los pocillos apropiados. Finalmente, se añadieron 25 pl de medio de ensayo que contenía 50.000 células Jurkat a cada pocillo y las placas se incubaron primero a TA durante 10 min con agitación suave y a continuación se transfirieron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 5 h. Para detectar la actividad de la luciferasa, se usó un kit de ensayo de luciferasa de una sola etapa (Amsbio) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, al final de los tiempos de incubación, el sustrato reactivo de luciferasa se mezcló con el tampón reactivo de luciferasa y se añadieron 50 pl a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 15 min en la oscuridad a TA. Las placas se leyeron con el lector de microplacas multimodo Flexstation III (Molecular Devices).

4.2 Ensayo de citotoxicidad (agotamiento de células diana impulsada por linfocitos T)

Fraccionamiento de células sanguíneas:

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre recién extraída de voluntarios sanos o macacos cangrejeros sanos usando el medio de separación de linfocitos Lymphoprep (Stemcell Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, la sangre se diluyó 1:2 con tampón de aislamiento de PBMC humanas (PBS, FCS al 2 %, EDTA 2 mM) o tampón de aislamiento de PBMC de macaco cangrejero (PBS, FCS al 5%, EDTA 2 mM) y se aplicó a tubos Leucosep que contenían la cantidad recomendada de medio Lymphoprep. Los tubos LeucoSep se centrifugaron durante 30 min a 800 g (sangre humana) o 2.000 g (sangre de macaco cangrejero) sin detenciones a TA. A continuación, la capa celular que contenía PBMC se recogió y se lavó dos veces con tampón de aislamiento de PBMC humanas o de macaco cangrejero y los glóbulos rojos se lisaron usando tampón de lisis de glóbulos rojos durante 5 min a TA. A continuación, las células humanas y de macaco cangrejero aisladas se lavaron una vez con su respectivo tampón de aislamiento y una vez con medio de ensayo (RPMI-1640, FCS al 10%). Después de la eliminación de plaquetas, las PBMC aisladas se suspendieron de nuevo en medio de ensayo a una densidad de 3 x 106 células viables por ml.

Ensayo de citotoxicidad in vitro basado en citometría de flujo (ensayo FC) y activación de linfocitos T CD8+:

Para las construcciones biespecíficas anti IL23RxCD3£, se usaron células de ovario de hámster chino transgénicas (CHO-K1) que expresaban IL-23R como células diana y se usó la estirpe celular CHO-K1 precursora como estirpe celular de control negativo (figuras 2 a 7). Para las construcciones biespecíficas anti HER2xanti CD3e, se usaron células de ovario de hámster chino transgénicas (CHO-K1) que expresaban HER2 (figuras 8 a 9). Se añadieron 5.000 células diana viables previamente marcadas con PKH67 y diluidas en 75 pl de medio de ensayo (RPMI-1640, FCS al 10%) a placas de 96 pocillos. A continuación, se añadieron 25 pl de proteínas de prueba concentradas 6 veces diluidas en medio de ensayo a los pocillos apropiados. A continuación, para tener una relación E:D de 30:1, se añadieron 150.000 células efectoras viables (PBMC) diluidas en 50 pl de medio de ensayo a cada pocillo y las placas se mezclaron en un mezclador oscilante a TA antes de su incubación a 37 °C, CO<2>al 5 %. Después de 16 h, las células se tripsinizaron, se suspendieron de nuevo en tampón de tinción (PBS, BCS al 2 %, EDTA 2 mM) y se transfirieron a placas no aglutinantes.

Las células se tiñeron para diferentes marcadores como CD69, CD8, CD4, CD11c y Anexina V. Para el análisis, el enfoque está en las células diana apoptóticas y muertas y los linfocitos T CD8+ activados. De este modo, las células diana se identifican por fluorescencia verde (PKH67) y su viabilidad se analiza por Anexina V APC. Las células efectoras (células CD8+) se identificaron detectando<c>D8 en su superficie (anti CD8 PerCP-Cy5.5). La activación de los linfocitos T CD8+ se detecta finalmente por cuantificación de la expresión de CD69 (anti CD69 PE). Se usa CD4 para discriminar mejor los linfocitos T CD8+ y CD4+. Se usa CD11c para marcar monocitos y células dendríticas y excluirlos. Para cada marcador, excepto Anexina V, los anticuerpos se incuban durante 30 minutos a TA con agitación suave. Las células se lavan una vez con tampón de tinción, una vez con tampón de unión a anexina y la tinción de Anexina V se realiza durante 30 minutos a TA con agitación. Las células se lavan una vez con tampón de unión a Anexina V y se realizó un análisis de citometría de flujo en un citómetro de flujo Novocyte.

El porcentaje de lisis de células diana específicas se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación:

Viabilidad de las células diana de la muestra

<Lisis específica de células diana [en %] = 1 - ->viabilidad promedio de las muestras de control.x100

El porcentaje de linfocitos T CD8+ activados corresponde a la proporción de linfocitos T CD69+ CD8+.

Resultados

Comparación de la especificidad de la activación de linfocitos T

La comparación de la lisis específica de células diana de las células que expresan la diana mediada por PRO389 (IL23RxCD3i<* gen. Numab>) y PRO460 (IL23RxCD3<|2c Amgen>) muestra una potencia similar con una CE<50>de 5,3 y 3,3 pM, respectivamente (véase la figura 2). Además, el nivel máximo alcanzable de lisis es idéntico para estas dos proteínas. Sin embargo, junto con células negativas al antígeno, se manifiesta una diferencia en concentraciones más altas de las moléculas, donde PRO460 (IL23RxCD3<|2c Amgen>) provoca un agotamiento parcial de las células de control negativo (figura 2). La cuantificación de la activación de las células efectoras en los pocillos del ensayo de citotoxicidad por citometría de flujo (FC) concuerda con los resultados de la lisis específica. Para las condiciones que incluyen células positivas a la diana, también se observa una respuesta a la dosis para la activación de las células efectoras. Estos resultados revelan una CE<50>similar de la activación de las células efectoras, mientras que PRO389 (IL23RxCD3i<* gen. Numab>) alcanza aparentemente una meseta inferior para la respuesta máxima (véase la figura 3). En el caso de los pocillos con células negativas a la diana, una diferencia aparente de la CE<50>para la activación inespecífica distingue a las dos moléculas. La administración de concentraciones más altas de ambas moléculas conduce a un aumento de las células activadas, incluso en ausencia de la diana (figura 3). Sin embargo, este efecto se observa a concentraciones aproximadamente 25 veces inferiores de la molécula PRO460 (IL23R<x>CD3<|2c Amgen>). Por lo tanto, los datos proporcionan evidencia de que el dominio anti CD3 en PRO389 (IL23R<x>CD3<i * gen. Numab>) muestra una activación de linfocitos T más específica en una comparación directa con el dominio anti CD3 de PRO460 (IL23R<x>CD3<|2c Amgen>) usando el mismo formato y dominio de unión a la diana.

El agotamiento de células diana específico de los dominios anti CD3 en PRO389 (IL23R<x>CD3<i * gen. Numab>) y PRO624 (IL23RxCD3<2.* gen. Numab>) se comparó en el ensayo de citotoxicidad usando PBMC humanas. Los dos scDb mostraron propiedades casi idénticas en términos de agotamiento de células diana de células positivas a la diana y falta de agotamiento de células diana de células negativas a la diana (véase la figura 4). La cuantificación de la activación de las células efectoras en los pocillos del ensayo de citotoxicidad por citometría de flujo (FC) concuerda con los resultados de la lisis específica. Para las condiciones que incluyen células positivas a la diana, también se observa una respuesta a la dosis para la activación de las células efectoras, con ambas moléculas dando como resultado respuestas similares. En las condiciones que contienen células negativas a la diana, solo se observa un aumento de células efectoras activadas en la condición más alta ensayada (véase la figura 5).

En un experimento confirmatorio, se ensayó la potencia de las moléculas PRO624 (IL23RxCD3<2 * gen. Numab>) y PRO389 (IL23R<x>CD3<i * gen. Numab>) para la activación de linfocitos T usando el ensayo del gen indicador NFAT. En el experimento, se confirmó la potencia casi idéntica para inducir la activación de linfocitos T en presencia de células positivas al antígeno (véase la figura 6). Si bien la CE<50>se desplaza aproximadamente 8 veces a concentraciones más altas en comparación con la lisis celular (véase la figura 4), los datos coinciden con los datos de activación del mismo experimento (véase la figura 5), que también muestran una CE<50>aparentemente 5 veces mayor. Junto con células negativas al antígeno, ambas moléculas muestran solo en la concentración más alta ensayada de 50 nM un aumento de la señal de activación sobre el valor de referencia.

En conclusión, los resultados anteriores muestran que los dominios anti CD3 incorporados en PRO624 (IL23R<x>CD3<2* gen. Numab>) y PRO389 (IL23RxCD3i<* gen. Numab>) se comportan de manera idéntica en términos de potencia y especificidad in vitro<para inducir tanto el agotamiento de células diana como la activación de linfocitos T. En comparación, mientras>que el dominio anti CD3 de PRO460 (IL23R<x>CD3<|2c Amgen>) muestra en el mismo contexto molecular una potencia comparable para activar linfocitos T en presencia de células diana y mediar en su agotamiento específico, PRO460 (IL23R<x>CD3<|2c Amgen>) también muestra una mayor activación de linfocitos T en ausencia de células diana, lo que incluso provoca la lisis celular de células negativas a la diana.

Además, se realizó una comparación de la lisis específica de células diana de células que expresaban HER2 mediada por PRO957 (HER2xCD3<2 * gen. Numab>) y PRO956 (HER2xCD3<i2 c Amgen>). La comparación de la lisis específica de células diana de células diana que expresan HER2 mediada por PRO957 (H<e>R2<x c>D32*<gen. Numab>) y PRO956 (HER2xCD3<i2 c Amgen>) muestra una potencia aproximadamente 10 veces mayor de PRO957 (HER2xCD3<2 * gen. Numab>) después de 16 horas y aproximadamente 3 a 4 veces mayor después de 40 horas (véase la figura 8A y 8B). Después de 40 horas, ambas moléculas alcanzan niveles idénticos de lisis específica de células diana. La cuantificación de la activación de las células efectoras en los pocillos del ensayo de citotoxicidad por citometría de flujo (FC) concuerda con los resultados de la lisis específica. Para las condiciones que incluyen células positivas a la diana, también se observa una respuesta a la dosis para la activación de las células efectoras. Estos resultados revelan una CE<50>similar de la activación de las células efectoras para PRO957 (HER2xCD3<2 * gen. Numab>) y PRO956 (HER2xCD3<i2C Amgen>). Sin embargo, para los pocillos con células diana negativas, una diferencia aparente de la CE<50>para la activación inespecífica distingue a PRO957 (HER2xCD3<2 * gen. Numab>) y PRO956 (HER2xCD3<i2C Amgen>). La administración de concentraciones más altas de ambas moléculas conduce a un aumento de las células activadas, incluso en ausencia de diana. Sin embargo, este efecto se observa a concentraciones aproximadamente 25 veces inferiores de la molécula PRO956 (HER2xCD3<i2C Amgen>) (véase la figura 9A y 9B). Además, cuando se ensaya el dominio anti CD3 junto con un dominio de unión anti HER2, PRO957 (HER2xCD3<2 * gen. Numab>) muestra una potencia y especificidad superiores para inducir tanto el agotamiento de células diana como la activación de linfocitos T en comparación con PRO956 (HER2xCD3<I2C Amgen>).

4.3 Reactividad cruzada de PRO624 (IL23RxCD32.> gen. Numab) y PRO 389 (IL23RxCD3i> gen. Numab) con respecto a macaco cangrejero

Una característica importante del dominio de unión anti CD3e I2C (documento US 2010/0150918) es la reactividad entre especies con primates humanos y no chimpancés, lo que ofrece una ventaja en el desarrollo preclínico de terapias derivadas. Ambos dominios anti CD3e incorporados en PRO624 (IL23RxCD3<2 * gen. Numab>) y PRO389 (IL23RxCD3i<* gen. Numab>) se unen a CD3e recombinantes humanos y de macaco cangrejero en mediciones de SPR (Tabla 3 y documento WO 2014/191113). Sin embargo, la reactividad de los dominios del clon 09-24-H09, que se incorporan en PRO389 (IL23RxCD3i<* gen. Numab>), no se mantuvo en el contexto celular de CD3e unido a la membrana plasmática. En cambio, los dominios derivados del clon 28-21-D09, presentes en PRO624 (IL23RxCD3<2 * gen. Numab>), muestran una reactividad de especie conservada también en ensayos celulares. Estas características diferenciales se han caracterizado mediante ensayos de citotoxicidad usando PBMC de macaco cangrejero como células efectoras.

Los datos del ensayo de citotoxicidad con PBMC de macaco cangrejero (véase la figura 7) muestran una potencia similar de PRO624 (IL23RxCD3<2 * gen. Numab>) para inducir el agotamiento de células diana específicas en comparación con el uso de células efectoras humanas (véase la figura 4). Además, tampoco en el contexto de células negativas a la diana no se observa lisis inespecífica de las células. Por otro lado, el análisis de PRO389 (IL23RxCD3i<* gen. Numab>) no muestra agotamiento de células diana por parte de las células efectoras de macaco cangrejero. Una caracterización adicional de los dominios reveló la ausencia de unión celular para PRO389 (IL23RxCD3i<* gen. Numab>) a las células que expresan CD3e de macaco cangrejero.

En conclusión, el sorprendente hallazgo de que los dominios 09-24-H09 no muestran una reactividad relevante entre especies en primates humanos y no chimpancés da como resultado que solo los dominios 28-21-D09 ofrezcan tanto una ventaja en especificidad sobre el estado actual de la técnica como la característica deseada de reactividad entre especies.

Tabla 3: Datos de afinidad de los scFv anti CD3 para CD3c humano y de macaco cangrejero, determinados por SPR

Tabla 4: Datos de despliegue térmico de las diversas construcciones aCD3 scFv

Construcción Tm

28-21-D09-sc28 61,9

28-21-D09-sc04 68,1

28-21-D09-sc22 69,5

28-21-D09-sc23 64,7

28-21-D09-sc26 65,1

28-21-D09-sc21 64,9

28-21-D09-sc15 62,9

28-21-D09-sc18 63,8

28-21-D09-sc27 61,3

28-21-D09-sc16 71,8

28-21-D09-sc19 76,0

28-21-D09-sc24 60,7

28-21-D09-sc25

28-21-D09-sc14 69,5

28-21-D09-sc17 70,7

28-21-D09-sc20 69,4

28-21-D09-sc03

Tabla 5: Construcciones de diacuer o anti CD3/anti IL23R diacuer o anti CD3/anti HER2

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que es específico para CD3 humano, que comprende una cadena ligera variable con una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 4, y una cadena pesada variable con una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 8.

2. Un polipéptido multiespecífico que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1.

3. El polipéptido multiespecífico de la reivindicación 2, que comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 26 y 27.

4. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, o el polipéptido multiespecífico de la reivindicación 2 o 3, y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, o el polipéptido multiespecífico de la reivindicación 2 o 3, o la composición farmacéutica de la reivindicación 4 para su uso como medicamento.

6. Una secuencia de ácido nucleico o una colección de secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, o el polipéptido multiespecífico de la reivindicación 2 o 3.

7. Un vector o una colección de vectores que comprenden la secuencia de ácido nucleico o la colección de secuencias de ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. Un método para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende la etapa de expresar la secuencia de ácido nucleico o la colección de secuencias de ácido nucleico de la reivindicación 6, o el vector o la colección de vectores de la reivindicación 7.

9. Un método para generar una construcción multiespecífica, que comprende la etapa de

clonar, en una o más etapas, una o más secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en una construcción multiespecífica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un segundo dominio de unión o un fragmento del mismo, y, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más dominios de unión adicionales o fragmentos del mismo.

10. El método de la reivindicación 9, en donde dicho segundo dominio de unión es un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.