ES3015389T3 - Antigen-binding polypeptide constructs comprising kappa and lambda light chains and uses thereof - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan aquí construcciones polipeptídicas multiespecíficas de unión a antígeno que comprenden al menos dos heterodímeros diferentes, cada uno con una cadena pesada y una cadena ligera. Al menos un heterodímero comprende una región Fab con una cadena ligera lambda y al menos un heterodímero comprende una región Fab con una cadena ligera kappa. Una o más de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina que forman la construcción polipeptídica de unión a antígeno comprenden modificaciones de aminoácidos que promueven el correcto apareamiento entre las cadenas pesada y ligera para formar la construcción polipeptídica multiespecífica de unión a antígeno deseada. Las modificaciones de aminoácidos pueden estar en los dominios CH1 y/o CL, en los dominios VH y/o VL, o en una combinación de estos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Construcciones polipeptídicas de unión al antígeno que comprenden cadenas ligeras kappa y lambda y usos de las mismas
Antecedentes
Los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos distintos, y a menudo se preparan en función de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de dos anticuerpos originales monoespecíficos distintos. La capacidad de unirse a dos epítopos o antígenos distintos hacen de los anticuerpos biespecíficos una herramienta atractiva para aplicaciones terapéuticas en las que dirigirse a más de un antígeno o epítopo suponga un beneficio en el tratamiento de una enfermedad. Sin embargo, la producción eficaz de anticuerpos biespecíficos en un formato que sea similar al de los anticuerpos de origen natural puede ser difícil, dado que las cadenas pesadas del anticuerpo evolucionaron para unirse a las cadenas ligeras del anticuerpo de manera relativamente indiscriminada. Como resultado de este emparejamiento indiscriminado, la expresión simultánea de dos cadenas pesadas distintas y dos cadenas ligeras distintas de un anticuerpo biespecífico conlleva naturalmente un desalineamiento de los emparejamientos de cadena pesada - cadena ligera. Este desalineamiento sigue siendo un gran desafío para la generación de agentes terapéuticos biespecíficos, donde el emparejamiento homogéneo es un requisito esencial para una buena capacidad de fabricación y eficacia biológica.
Se han descrito algunos enfoques para preparar anticuerpos biespecíficos en un formato similar a los anticuerpos de origen natural. Sin embargo, estos enfoques se han desarrollado y ejemplificado para los casos en los cuales ambos anticuerpos originales utilizados para preparar el anticuerpo biespecífico tienen cadenas ligeras de la familia génica kappa.
Si bien la mayoría de los anticuerpos terapéuticos conocidos (y, por lo tanto, posibles anticuerpos originales) tienen cadenas ligeras kappa, hay algunos que tienen cadenas ligeras lambda. Las cadenas ligeras kappa y lambda difieren entre sí tanto en estructura como en secuencia.
Es posible encontrar una revisión de varios enfoques para producir anticuerpos biespecíficos en un formato similar a los anticuerpos de origen natural a partir de dos anticuerpos originales en Klein et ál., (2012) mAbs 4:6, 1-11. La solicitud de patente internacional n.° PCT/EP2011/056388 (WO 2011/131746) describe un método in vitro para generar una proteína heterodimérica en la cual se introducen mutaciones asimétricas en las regiones CH3 de dos proteínas monoespecíficas de partida para activar el intercambio direccional del “grupo Fab” o “media molécula” entre dos anticuerpos monoespecíficos IgG4 o similares a IgG4 luego de la incubación en condiciones de reducción.
La publicación de patente estadounidense n.° 2009/0182127 (Novo Nordisk, Inc.) describe la generación de anticuerpos biespecíficos mediante la modificación de residuos de aminoácidos en la interfaz Fc y en la interfaz CH1:CL de los pares de cadenas pesada-ligera que reducen la capacidad de la cadena ligera de un par para interactuar con la cadena pesada del otro par. Las publicaciones de patentes internacionales n.° WO2014/081955 (Amgen) y WO2014/150973 (Eli Lilly) describen residuos de aminoácidos en la cadena ligera lambda que posiblemente pueden modificarse para impulsar la especificidad de emparejamiento deseada. La publicación de patente internacional WO 2014/082179 describe pares de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina modificadas y sus usos, incluyendo modificaciones en la interfaz CH1/CL kappa. Ninguna de estas publicaciones describe modificaciones de aminoácidos complementarias que pueden utilizarse para preparar un anticuerpo biespecífico a partir de un anticuerpo original con una cadena ligera kappa y otro anticuerpo original con una cadena ligera lambda. La publicación de patente internacional n.° WO2012/131555 (Glenmark) describe el reemplazo de la interfaz entre la cadena pesada y cadena ligera lambda de un anticuerpo con la de una interfaz de dominio de TCR (receptor de linfocitos T).
Compendio
La presente descripción proporciona polipéptidos de unión al antígeno multiespecíficos que comprenden una cadena ligera lambda de inmunoglobulina y una cadena ligera kappa de inmunoglobulina. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier aspecto desvelado o descrito en el presente documento que está fuera del alcance de las reivindicaciones está solo con fines de referencia.
En un aspecto, el polipéptido de unión al antígeno es una construcción que comprende un primer heterodímero y un segundo heterodímero. En una realización, el primer heterodímero (H1L1) comprende una primera secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina (H1) y una secuencia polipeptídica de cadena ligera lambda de inmunoglobulina (L1) que forman una primera región Fab que se une específicamente a un primer antígeno; y el segundo heterodímero (H2L2) comprende una segunda secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina (H2) y una secuencia polipeptídica de cadena ligera kappa de inmunoglobulina (L2) que forman una segunda región Fab que se une específicamente a un segundo antígeno.
En algunas realizaciones, H1 es distinto de H2. En algunas realizaciones, H1 y H2 comprenden un dominio variable de cadena pesada (dominio VH) y un dominio constante de cadena pesada 1 (dominio CH1). En una realización, L1 comprende un dominio variable de cadena ligera lambda (VL-lambda) y un dominio constante de cadena ligera lambda (CL-lambda). En una realización, L2 comprende un dominio variable de cadena ligera kappa (VL-kappa) y un dominio constante de cadena ligera kappa (CL-kappa). En algunas realizaciones, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos en comparación con las secuencias polipeptídicas H1, H2, L1 y L2 de tipo silvestre correspondientes, donde las modificaciones de aminoácidos fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2, y/o fomentan el emparejamiento preferencial de H2 con L2 en comparación con L1. En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos no introducen un nuevo residuo de cisteína. En una realización, las modificaciones de aminoácidos no retiran un residuo de cisteína de origen natural.
En algunas realizaciones, la construcción comprende modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2, y/o que fomentan el emparejamiento preferencial de H2 con L2 en comparación con L1, cuando H1, H2, L1 y L2 se expresan conjuntamente en una célula o una célula de mamífero, o cuando H1, H2, L1 y L2 se expresan conjuntamente en un sistema de expresión sin células, o cuando H1 y L1 se producen en una (primera) célula y H2 y L2 se producen en una segunda célula (por ejemplo, diferente) y los productos de las dos células se mezclan mediante un método de producción redox, o cuando H1 y L1 se producen en un primer sistema de expresión sin células y H2 y L2 se producen en un segundo (por ejemplo, diferente) sistema de expresión sin células y los productos de los dos sistemas de expresión sin células se mezclan.
En algunas realizaciones de la construcción, cada heterodímero comprende un único Fab.
En algunas realizaciones de las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente:
a. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124; y
i. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186 o 179; y L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 180;
ii. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186; y L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 133;
iii. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; y L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 133; o
iv. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 188; y L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 178;
En algunos aspectos de las construcciones polipeptídicas de unión al antígenos descritas en la presente
b. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131; y
i. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 186, o 124 y 186, y L2 comprende<una sustitución de aminoácidos en las posiciones 133, o 133 y>160<, o 124 y 133, o 176 y 180; o>
ii. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 188; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131;
iii. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124 y 133, o 124 y 133 y 180;
c. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131; y
i. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 124 y 186, o 124 y 179 o 188, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 176 y 178, o 176 y 180, o 131; o
ii. H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143 y 188, o 143, o 124 y 143; y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124 y 176 y 178, o 124 y 178, o 124 y 180, o 124 y 176 y 180, o 124, o 124 y 176;
d. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 179, 186, 143 y/o 188; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 180, 133 y/o 176 y 178; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131 y/o 124; e. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 39 o no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 38 o no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 39, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 38;
f. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131; y
i. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 188 o 124 y 186, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 176 y 178, o 176 y 180, o 131; o
ii. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143 o 186, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124 y 133, o 124 y 133 y 180;
g. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 188; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 176 y 178, o 178; y
i. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 177 y 188, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 176 y 178; o
ii. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186 o 124 o 124 y 179, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 176, o 131 y 176;
h. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 133; y
i. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 188; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131; o
ii. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 177 y 188, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 176 y 178; o
H1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 124 y 190; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 135; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124 o 188, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 176, o 176 y 178;
i. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 177 y 188; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 176 y 178; y
a. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 188; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 176 y 178 o 131;
b. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 133, o 124 y 160 y 180;
c. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124, o 124 y 179, o 124 y 186, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 176, o 176 y 178, o 176 y 180; o
d. H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 133, o 124 y 133;
j. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 188; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 178; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124 o 188, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 176 y 178, o 176 y 180, o 176;
k. o H1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 145 y 188; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 178; y H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124 y/o 188, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 124, 133 y 178; l. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 174, 179 o 186; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 176 o 180; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143 o 190, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131, 135 o 124; o m. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 174; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 176; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 190; y L2 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial o comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 135;
n. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 143 y 190; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 133; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 131 y 135;
o. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 143 y/o 186; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 133; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131;
p. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 143 y 179; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 124 y 178; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 178 y 180, o 160 y 180;
q. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 179 o 186, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124 y 160 y 180;
r. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 180 o 178 y 180; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143 y/o 179, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 124 y 178, o 131;
s. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 179; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 180; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124;
t. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143 o 186; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 180 o no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 143 y 145, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124;
u. H1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 135; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 139; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 116;
v. H1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial o comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 45; L1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 45, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 44;
w. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 139; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 116; H2 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 135; o
x. H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 176; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 176.
En algunas realizaciones, la afinidad de la primera región Fab con el primer antígeno se encuentra dentro de<alrededor de 1, 2, 3, 4, 5,>6<, 7,>8<, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 100 veces de la afinidad de una región Fab>formada por las secuencias polipeptídicas H1 y L1 de tipo silvestre correspondientes con el primer antígeno, y/o la afinidad de la segunda región Fab con el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 1, 2, 3,<4, 5,>6<, 7,>8<, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 100 veces de la afinidad de una región Fab formada por las>secuencias polipeptídicas H2 y L2 de tipo silvestre correspondientes con el segundo antígeno.
En algunas realizaciones, la temperatura de fusión (Tm) de la primera región Fab se encuentra dentro de<alrededor de 0, 1, 2, 3, 4, 5,>6<, 7,>8<, 9, 10 o 20 °C de la Tm de una región Fab formada por las secuencias>polipeptídicas H1 y L1 de tipo silvestre correspondientes para el primer antígeno, y/o la temperatura de fusión<(Tm) de la segunda región Fab se encuentra dentro de alrededor de 0, 1, 2, 3, 4, 5,>6<, 7,>8<, 9, 10 o 20 °C de la>Tm de una región Fab formada por las secuencias polipeptídicas H2 y L2 de tipo silvestre correspondientes para el segundo antígeno.
En algunas realizaciones de la construcción polipeptídica de unión al antígeno:
a. H1 y L1 son secuencias polipeptídicas de tipo silvestre y H2 y L2 comprenden al menos una modificación de aminoácidos;
b. uno o más de H1, L1 y H2 comprenden al menos una modificación de aminoácidos; y L2 es una secuencia polipeptídica de tipo silvestre;
c. uno o más de H1, L1 y L2 comprenden al menos una modificación de aminoácidos; y H2 es una secuencia polipeptídica de tipo silvestre;
d. uno o más de H1, H2 y L2 comprenden al menos una modificación de aminoácidos; y L1 es una secuencia polipeptídica de tipo silvestre;
e. uno o más de L1, H2 y L2 comprenden al menos una modificación de aminoácidos; y H1 es una secuencia polipeptídica de tipo silvestre; o
f. H1, L1, H2 y L2 comprenden al menos una modificación de aminoácidos.
En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos se encuentran en:
a. los dominios CH1 de H1 y H2, el dominio CL-lambda de L1 y el dominio CL-kappa de L2; o
b. los dominios CH1 y VH de H1 y H2, el dominio CL-lambda y el dominio VL-lambda de L1, y el dominio CL-kappa y el dominio VL-kappa de L2.
En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos se encuentran en:
a. al menos dos del dominio CH1 de H1, el dominio CH1 de H2, el dominio CL-lambda de L1 y el dominio CL-kappa de L2;
b. al menos dos de los dominios CH1 y VH de H1 y H2, el dominio CL-lambda y el dominio VL-lambda de L1, y el dominio CL-kappa y el dominio VL-kappa de L2, o
c. al menos dos del dominio VH de H1, el dominio VH de H2, el dominio VL-lambda de L1 y el dominio VL-kappa de L2.
En algunas realizaciones, H1, L1, H2 y/o L2 comprenden al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 mutaciones de aminoácidos en la región Fab. En algunas realizaciones, al menos uno de H1, H2, L1 y L2 comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 modificaciones de aminoácidos de al menos un dominio constante y/o al menos un dominio variable.
En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, de manera que el emparejamiento relativo de al menos uno de H1L1 o H2L2 sea al menos alrededor de 10 % superior con respecto al tipo silvestre, y el emparejamiento relativo del otro esté dentro de alrededor de 10 % del tipo silvestre o al menos alrededor de 10 % superior con respecto al tipo silvestre.
En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H1L1:H1L2 es de al menos 40:60 y la relación de H2L2:H2L1 es de al menos 60:40; o las modificaciones de aminoácidos fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H2L2:H2L1 es de al menos 40:60 y la relación de H1L1:H1L2 es de al menos 60:40.
En algunas realizaciones, la estabilidad térmica de la primera región Fab se encuentra dentro de alrededor de 0, 1, 2 o 3°C de la Tm de una región Fab formada por las secuencias polipeptídicas H1 y L1 de tipo silvestre correspondientes. En algunas realizaciones, la estabilidad térmica de la segunda región Fab se encuentra dentro de alrededor de 0, 1, 2 o 3°C de la Tm de una región Fab formada por las secuencias polipeptídicas H2 y L2 de tipo silvestre correspondientes.
En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en los conjuntos de diseños de Mab de identificador exclusivo que se muestran en la Tabla 4A o 4B. En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en los conjuntos de diseños de Mab de identificador exclusivo que se muestran en una o más de las Tablas 10-A1 a 10-A12. En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en los conjuntos de diseños de Mab de identificador exclusivo que se muestran en cualquiera de las Tablas 10-B1 a 10-B10.
En algunas realizaciones, la construcción comprende además una Fc dimérica con dos polipéptidos Fc, cada uno de los cuales comprende una secuencia de dominio CH3 y está acoplado con o sin enlazadores a la primera región Fab o la segunda región Fab. En algunas realizaciones, la Fc es una Fc humana, una Fc de IgG1 humana, una Fc de IgA humana, una Fc de IgG humana, una Fc de IgD humana, una Fc de IgE humana, una Fc de IgM humana, una Fc de IgG2 humana, una Fc de IgG3 humana, o una Fc de IgG4 humana. En una realización, la Fc comprende una o más modificaciones en comparación con el tipo silvestre, en al menos una de las secuencias de dominio CH3 que fomentan la formación de una Fc heterodimérica.
En algunas realizaciones, la Fc comprende:
i) una Fc de IgG1 heterodimérica que tiene las modificaciones L351Y_F405A_Y407V en el primer polipéptido Fc y las modificaciones T366L_k 392M_T394W en el segundo polipéptido Fc;
ii) una Fc de IgG1 heterodimérica que tiene las modificaciones L351Y_F405A_Y407V en el primer polipéptido Fc y las modificaciones T366L_K392L_T394W en el segundo polipéptido Fc;
iii) una Fc de IgG1 heterodimérica que tiene las modificaciones T350V_L351Y_F405A_Y407V en el primer polipéptido Fc y las modificaciones T350V_T366L_K392L_T394W en el segundo polipéptido Fc;
iv) una Fc de IgG1 heterodimérica que tiene las modificaciones T350V_L351Y_F405A_Y407V en el primer polipéptido Fc y las modificaciones T350V_T366L_K392M_T394W en el segundo polipéptido Fc; o
v) una Fc de IgG1 heterodimérica que tiene las modificaciones T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V en el primer polipéptido Fc y las modificaciones T350V_T366L_N390R_K392M_T394W en el segundo polipéptido Fc.
En algunas realizaciones, la Fc comprende además al menos una secuencia de dominio CH2. En una realización, la Fc comprende una o más modificaciones para fomentar la unión selectiva de los receptores Fcgamma, reducir o eliminar la unión a los receptores Fc-gamma, o fomentar la unión a FcRn.
En algunas realizaciones, cuando H1, L1, H2 y L2 se expresan conjuntamente, el cambio en la cantidad de emparejamiento correcto total, según se mide mediante la suma de emparejamiento de H1L1 y H2L2, es superior a alrededor de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 % o 45 %, en comparación con el emparejamiento de las cadenas polipeptídicas H1, L1, H2 y L2 correspondientes sin sustituciones de aminoácidos en la región Fab que fomenten el emparejamiento preferencial; o el cambio en la cantidad de emparejamiento correcto total, según se mide mediante la cantidad de anticuerpo biespecífico producido como porcentaje de las especies distintas de los medios anticuerpos producidos, sea superior a alrededor del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 %, en comparación con el emparejamiento de las cadenas polipeptídicas H1, L1, H2 y L2 correspondientes sin sustituciones de aminoácidos en la región Fab que fomenten el emparejamiento preferencial, o el cambio en la cantidad de emparejamiento correcto total, según se mide mediante la cantidad de anticuerpo biespecífico producido como porcentaje de todas las especies producidas, sea superior a alrededor del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % o 80 %, en comparación con el emparejamiento de las cadenas polipeptídicas H1, L1, H2 y L2 correspondientes sin sustituciones de aminoácidos en la región Fab que fomenten el emparejamiento preferencial.
En algunas realizaciones, los enlazadores comprenden uno o más enlazadores polipeptídicos, una o más regiones bisagra de anticuerpo, o una o más regiones bisagra de IgG1. En una realización, uno o más enlazadores polipeptídicos comprenden una o más modificaciones en comparación con un enlazador polipeptídico de tipo silvestre.
En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos comprenden sustituciones de aminoácidos.
En algunas realizaciones, las secuencias de uno o más de H1, H2, L1 y L2 derivan de secuencias humanas o secuencias humanizadas.
En algunas realizaciones, las construcciones descritas en la presente se conjugan con un agente o fármaco terapéutico.
En otro aspecto, la descripción proporciona un polinucleótido recombinante aislado o un conjunto de polinucleótidos recombinantes aislados que codifican las construcciones descritas en la presente. En algunas realizaciones, se proporciona un vector o un conjunto de vectores que comprenden uno o más de los polinucleótidos o conjuntos de polinucleótidos que se describen en la presente. En algunas realizaciones, el vector o al menos un vector del conjunto de vectores es multi-cistrónico.
En otro aspecto, la descripción proporciona una célula aislada que comprende el polinucleótido o conjunto de polinucleótidos, o el vector o conjunto de vectores que se describen en la presente. En algunas realizaciones, la célula es una célula de levadura, una célula bacteriana, una célula de insecto o una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula aislada se transfecta de manera estable o transfecta de manera transitoria con el vector o conjunto de vectores que se describen en la presente.
En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno que se describen en la presente. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además una o más sustancias que se seleccionan del grupo que consiste en un amortiguador, un antioxidante, una molécula de bajo peso molecular, un fármaco, una proteína, un aminoácido, un carbohidrato, un lípido, un agente quelante, un estabilizador y un excipiente.
En otro aspecto, se describe un método para preparar las construcciones que se describen en la presente. En algunas realizaciones, el método comprende las etapas de:
(a) obtener una célula hospedadora que comprende un polinucleótido o conjunto de polinucleótidos que codifica la construcción polipeptídica de unión al antígeno;
(b) cultivar la célula hospedadora en un cultivo de células hospedadoras en condiciones que permitan la expresión de la construcción polipeptídica de unión al antígeno, y
(c) recoger la construcción polipeptídica de unión al antígeno a partir del cultivo de células hospedadoras.
En algunas realizaciones, la célula hospedadora se transfecta de manera transitoria o se transfecta de manera estable con el polinucleótido o conjunto de polinucleótidos que se describen en la presente.
En otro aspecto, se proporciona un medio de almacenamiento legible por computadora. En algunas realizaciones, el medio de almacenamiento legible por computadora almacena un conjunto de datos que comprende datos que representan modificaciones de aminoácidos complementarios en un primer heterodímero que comprende una primera secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina (H1) y una primera secuencia polipeptídica de cadena ligera lambda de inmunoglobulina (L1); y/o un segundo heterodímero que comprende una segunda secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina (H2) y una segunda secuencia polipeptídica de cadena ligera kappa de inmunoglobulina (L2). En algunas realizaciones, las secuencias polipeptídicas H1 y H2 almacenadas en el conjunto de datos comprenden al menos un dominio variable de cadena pesada (dominio VH) y un dominio constante de cadena pesada (dominio CH1) y son distintos entre sí. En algunas realizaciones, las secuencias polipeptídicas L1 y L2 almacenadas en el conjunto de datos comprenden al menos un dominio variable de cadena ligera (dominio VL) y un dominio constante de cadena ligera (dominio CL). En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos complementarias almacenadas en el conjunto de datos fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2, y de H2 con L2 en comparación con L1. En algunas realizaciones, el conjunto de datos comprende datos que representan las modificaciones enumeradas en la Tabla 4A o Tabla 4B o un subconjunto de estas modificaciones. En algunas realizaciones, el conjunto de datos comprende los datos que representan las modificaciones enumeradas en una o más de las Tablas 10-A1 a 10-A12 o Tablas 10-B1 a 10-B10, o un subconjunto de estas modificaciones.En otro aspecto, se describe un método para producir una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica. En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica producida por el método comprende:
a. un primer heterodímero que comprende una primera secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina (H1) y una primera secuencia polipeptídica de cadena ligera lambda de inmunoglobulina (L1); y
b. un segundo heterodímero que comprende una segunda secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina (H2) y una segunda secuencia polipeptídica de cadena ligera kappa de inmunoglobulina (L2).
En algunas realizaciones, las secuencias polipeptídicas H1 y H2 producidas por el método comprenden al menos un dominio variable de cadena pesada (dominio VH) y un dominio constante de cadena pesada (dominio CH1) y son distintos entre sí. En algunas realizaciones, las secuencias polipeptídicas L1 y<l>2 producidas por el método comprenden un dominio variable de cadena ligera (dominio VL) y un dominio constante de cadena ligera (dominio CL). En algunas realizaciones, una o más de las secuencias polipeptídicas H1, L1, H2 y L2 producidas por el método comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 y de H2 con L2 en comparación con L1.
En algunas realizaciones, el método para producir la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica comprende:
a. introducir una o más modificaciones de aminoácidos complementarias del conjunto de datos descrito en la presente en H1, L1, H2 y/o L2; y
b. expresar conjuntamente H1, L1, H2 y L2 en una célula hospedadora para producir un producto de expresión que comprende la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica.
En algunas realizaciones, el método comprende además determinar la cantidad de la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica en el producto de expresión con respecto a otros productos polipeptídicos para seleccionar un subconjunto preferido de modificaciones de aminoácidos complementarias para proporcionar una cantidad mayor de la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica en comparación con la cantidad de construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica en un producto de expresión generada a partir de la expresión conjunta de H1, L1, H2 y L2 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica se produce con una pureza superior al 70 % en comparación con los otros productos polipeptídicos. En algunas realizaciones, la construcción producida mediante el método comprende una Fc que comprende al menos dos secuencias de dominio CH3, y la Fc se acopla, con o sin uno o más enlazadores, al primer heterodímero y el segundo heterodímero. En algunas realizaciones, la Fc es una Fc heterodimérica que comprende una o más modificaciones de aminoácidos que fomentan la formación de una Fc heterodimérica en una Fc homodimérica.
En algunas realizaciones del método para producir la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica, cuando H1, L1, H2 y L2 se expresan conjuntamente, el cambio en la cantidad de emparejamiento correcto total, según se mide mediante la suma de % de H1L1 y % de H2L2 producido, es superior a alrededor de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 % o 45 %, en comparación con el emparejamiento de las cadenas polipeptídicas H1, L1, H2 y L2 correspondientes sin sustituciones de aminoácidos en la región Fab que fomenten el emparejamiento preferencial; o el cambio en la cantidad de emparejamiento correcto total, según se mide mediante la cantidad de anticuerpo biespecífico producido como porcentaje de las especies distintas de los medios anticuerpos producidos, sea superior a alrededor del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 %, en comparación con el emparejamiento de las cadenas polipeptídicas H1, L1, H2 y L2 correspondientes sin sustituciones de aminoácidos en la región Fab que fomenten el emparejamiento preferencial, o el cambio en la cantidad de emparejamiento correcto total, según se mide mediante la cantidad de anticuerpo biespecífico producido como porcentaje de todas las especies producidas, sea superior a alrededor del 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 %, en comparación con el emparejamiento de las cadenas polipeptídicas H1, L1, H2 y L2 correspondientes sin sustituciones de aminoácidos en la región Fab que fomenten el emparejamiento preferencial.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 ilustra secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera de D3H44, Pertuzumab y CAT-2200 alineadas con respecto a secuencias de líneas germinales humanas para dominios variables y constantes. Las secuencias de proteínas traducidas para cada dominio, línea germinal y alelo se obtuvieron investigando directamente en IMGT/GENE-DB (http://www.imgt.org/genedb/query). Se usó IMGT/DomainGapAlign (http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi) para determinar el gen/alelo más cercano. Se realizó la identificación de secuencias consenso mediante BoxShade (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html) con un corte de 0.8. Los residuos de aminoácidos sombreados en negro representan la identidad de secuencia de aminoácidos, mientras que aquellos sombreados en gris representan la similitud de secuencia de aminoácidos. La asignación de aminoácidos a cada dominio en la Figura 1 se realizó de acuerdo con las definiciones de IMGT, como se describe en Lefranc M.-P. et ál. "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains" Dev. Comp. Immunol., 2005, 29, 185-203, y Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, G. “ IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains” Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003). La Figura 1A ilustra dominios de cadena pesada (VH) de Pertuzumab y D3H44 alineadas con respecto a los subgrupos de línea germinal IGHV e IGHJ humana (se muestra una secuencia representativa para cada gen y alelo). Las secuencias génicas y de alelo más cercanas a IGHV e IGHJ de Pertuzumab son X92218|IGHV3-66*01 y J00256|IGHJ4*01, respectivamente. Las secuencias génicas y de alelo más cercanas a IGHV e IGHJ de D3H44 son X92218|IGHV3-66*01 y J00256|IGHJ4*01, respectivamente. La Figura 1B ilustra dominios de cadena ligera variable (VL) de Pertuzumab y D3H44 alineadas con respecto a los subgrupos de línea germinal IGKV e IGKJ kappa humana (se muestra una secuencia representativa de cada gen y alelo). Las secuencias génicas y de alelo más cercanas a IGKV e IGKJ de Pertuzumab son Y14865|IGKV1-<n>L1*01 y J00242|IGKJ2*01, respectivamente. Las secuencias génicas y de alelo más cercanas a IGKV e IGKJ de D3H44 son X59315|IGKV1-39*01 y J00242|IGKJ1*01, respectivamente. La Figura 1C ilustra los dominios pesado constante 1 (CH1) de Pertuzumab y D3H44 alineados con respecto a los subgrupos de línea germinal IGHG CH1 humana. La secuencia génica y de alelo más cercana a IGHG de Pertuzumab y D3H44 es J00228|IGHG1*01. La Figura 1D ilustra los dominios ligero constante (CL) de Pertuzumab y D3H44 alineados con respecto a los subgrupos de línea germinal IGKC kappa humana. La secuencia génica y de alelo más cercana a IGKC de Pertuzumab y D3H44 es J00241|IGKC*01. La Figura 1E ilustra el dominio VH de CAT-2200 alineado con respecto a los subgrupos de línea germinal IGHV e IGHJ humana (se muestra una secuencia representativa para cada gen y alelo). Las secuencias génicas y de alelo más cercanas a IGHV e IGHJ de c At -2200 son M99660|IGHV3-23*01 y J00256|IGHJ4*01, respectivamente. La Figura 1F ilustra el dominio VL de CAT-2200 alineado con respecto a los subgrupos de línea germinal IGLV e IGLJ lambda humana (se muestra una secuencia representativa de cada gen y alelo). Las secuencias génicas y de alelo más cercanas a IGLV e IGLJ de CAT-2200 son Z73673|IGLV6-57*01 y M15641|IGLJ2*01, respectivamente. La Figura 1G ilustra el dominio CH1 de CAT-2200 alineado con respecto a los subgrupos de línea germinal IGHG CH1 humana. La secuencia génica y de alelo más cercana a IGHG de CAT-2200 es J00228|IGHG1*01. La Figura 1H ilustra el dominio CL de CAT-2200 alineado con respecto a los subgrupos de línea germinal IGLC lambda humana. La secuencia génica y de alelo más cercana a IGLC de CAT-2200 es J00253|IGLC2*01.
La Figura 2 ilustra un diagrama de flujo para identificar residuos de interfaz y para realizar un modelo informático de los diseños con emparejamiento de cadena pesada-ligera preferencial.
La Figura 3 ilustra una alineación estructural 3D entre los dominios constantes de D3H44 (PDB ID 1JPT) y CAT-2200 (PDB-ID 2VXS). La Figura 3A ejemplifica las diferencias conformacionales típicas observadas entre una cadena ligera kappa y lambda cuando se alinean en sus cadenas pesadas respectivas. La Figura 3B presenta una vista de la interfaz de cadena ligera (sin la cadena pesada) del modelo presentado en la Figura 3A, para ejemplificar aun más las diferencias conformacionales. Las flechas punteadas apuntan a la redisposición conformacional de los elementos estructurales secundarios en la interfaz entre las cadenas pesadas y ligeras.
La Figura 4 ilustra un panorama esquemático de alto nivel de los requisitos de modificación genética para formar un anticuerpo biespecífico, y los requisitos de ensayo necesarios para cuantificar los pares de cadena pesada y cadena ligera (H-L). El objetivo de diseño de la modificación genética de un anticuerpo biespecífico de pureza elevada (es decir, asociaciones H-L, cuyo emparejamiento incorrecto sea poco o nulo) puede lograrse mediante la modificación racional (mediante la introducción de mutaciones de aminoácidos específicas) del emparejamiento preferencial de dos cadenas pesadas únicas para sus cadenas ligeras únicas cognadas. Este proceso se muestra de forma esquemática; en la presente H1 se modificó genéticamente para emparejarse preferentemente con L1 (indicado con una marca de verificación) y no con L2 (indicado con una “X”). De manera similar, H2 se modificó genéticamente para emparejarse preferentemente con L2 y no con L1. Las flechas en los heterodímeros H1L1 y H2L2 representan el emparejamiento facilitado entre estos pares H-L, mientras que las flechas en los heterodímeros H1L2 y H2L1 representan la interrupción del emparejamiento entre los últimos pares H-L. El análisis experimental de los diseños para fomentar el emparejamiento preferencial requiere un ensayo capaz de cuantificar simultáneamente H1L1:H1L2 y H2L2:H2L1. Estos requisitos de ensayo se pueden simplificar asumiendo que cada brazo Fab biespecífico se puede modificar genéticamente de forma independiente. En este caso, el ensayo únicamente necesitaría cuantificar H1L1:H1L2 o H2L2:H2L1, y no ambos simultáneamente.
La Figura 5 proporciona un esquema que ilustra cómo pueden etiquetarse las cadenas pesadas y las cadenas ligeras y cómo se determina el emparejamiento preferencial. En este esquema, el límite circular representa una célula en la cual 3 construcciones (una cadena pesada y dos cadenas ligeras únicas) se transfectan. Los productos de expresión se segregan de la célula y el sobrenadante (SPNT) pasa a través de un dispositivo de detección, en este caso, un chip de SPR. En función de la detección de las dos etiquetas diferentes fusionadas a las dos cadenas ligeras que compiten por el emparejamiento de las cadenas pesadas, puede obtenerse una estimación cuantitativa del emparejamiento preferencial de la cadena pesada con respecto a las dos cadenas ligeras.
La Figura 6 ilustra los criterios de restricción del rendimiento en función de los dos resultados de LCCA para cada diseño. Estos criterios de restricción del rendimiento se utilizaron para identificar la recopilación de diseños de K-L y la recopilación de diseños de K-L derivados de K-K. A los efectos de incluirlo, un diseño debería contener un resultado de LCCA positivo por encima de la zona neutra (zona neutra definida como la región entre relaciones emparejado:emparejado incorrectamente de 40:60 y 60:40), mientras que el otro LCCA debe ser superior al límite inferior de la zona neutra (la relación emparejado:emparejado incorrectamente 40:60). Los casos A y B representan los diseños que pasan los criterios de restricción. Cabe destacar que el caso B se incluye dado que LCCA H2L2:H2L1 está por encima de la zona neutra y LCCA H1L1:H1L2 está dentro de la zona neutra (no debajo de esta). El caso C representa un diseño que se ignora, donde ambos resultados de LCCA son positivos, pero ninguno de ellos se encuentra por encima de la zona neutra. Los casos D y E representan diseños que se ignoran dado que al menos uno de los resultados de LCCA se encuentra por debajo de la zona neutra, incluso si el otro LCCA se encuentra por encima de la zona neutra (ver el caso D). También se incluyen los diseños en los cuales la designación de H1L1 y H2L2 se invierte. Esta descripción de la Figura supone que la relación de emparejamiento de tipo silvestre es 50:50.
La Figura 7 ilustra el rendimiento de los diseños de K-L seleccionados, así como los diseños de K-L derivados de K-K (en función de los datos de LCCA para el diseño de Mab establecido en las Tablas 4A y 4B), como se define según la potencia del diseño =AH1:L1:L2_escalar AH2:L2:L1_escalar. Esta métrica es un indicador del éxito de emparejamiento global al nivel del diseño.
La Figura 8 ilustra los posibles productos asociados a la cadena pesada que pueden esperarse cuando dos cadenas ligeras diferentes se expresan conjuntamente con dos cadenas pesadas diferentes en una célula.
La Figura 9 ilustra un método general para preparar una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífico usando la recopilación de conjuntos de diseño de Mab proporcionada en la presente.
La Figura 10 ilustra diagramas de recuadro min-máx que resumen el rendimiento de todos los diseños de K-L analizados en el SMCA en tres sistemas biespecíficos, según agrupamiento de diseño. La Figura 10A muestra el rendimiento medido según el cálculo biespecífico total (A% biespecífico). La Figura 10B muestra el rendimiento medido según el cálculo de emparejamiento total (A% emparejamiento).
La Figura 11 ilustra una gráfica de diagramas de recuadro min-máx que resume el rendimiento de los diseños de K-L y los diseños de K-L derivados de K-K según el sistema biespecífico, por grupo de capacidad de transferencia; “kl 3/3” indica los diseños de K-L transferibles en los sistemas biespecíficos 3/3, “kl 3/3 2/3” indica los diseños de K-L transferibles en al menos 2 sistemas biespecíficos, y “kl todos” indica todos los diseños de K-L analizados. Asimismo, “kk 3/3” indica los diseños de K-L derivados de K-K transferibles en los sistemas biespecíficos 3/3, “kk 3/3 2/3” indica los diseños de K-L derivados de K-K transferibles en al menos 2 sistemas biespecíficos, y “kk todos” indica todos los diseños de K-L derivados de K-K analizados; los resultados se presentan en función del cálculo biespecífico total (%ABiespecífico).
La Figura 12 ilustra sensogramas DSC de los anticuerpos biespecíficos producidos utilizando el conjunto de diseños de Mab 3972 (ID del diseño SMCA) (en cada uno de los tres sistemas biespecíficos), y los anticuerpos originales de tipo silvestre para cada sistema. La Figura 12A ilustra un mAb CAT-2200 de tipo silvestre (gris oscuro), mAb Pertuzumab de tipo silvestre (gris medio) y SMCA CAT-2200/Pertuzumab Diseño 3972 (gris claro); La Figura 12B ilustra mAb CAT-2200 de tipo silvestre (gris oscuro), mAb SGN-CD19a de tipo silvestre (gris medio) y SMCA CAT-2200/SGN-CD19a Diseño 3972 (gris claro); La Figura 12C ilustra mAb SGN-CD19a de tipo silvestre (gris oscuro), mAb CR8071 de tipo silvestre (gris medio) y SMCA CR8071/SGN-CD19a Diseño 3972 (gris claro).
La Figura 13 ilustra un diagrama de recuadro min-máx que resume el efecto de las sustituciones de aminoácidos de los diseños de Mab en la Tm de los Fabs analizados. Los resultados se indican como el cambio en la Tm Fab en comparación con WT y se muestran para todos los diseños para los cuales se midió la Tm (“Todos”) y se separan según parátopo.
La Figura 14 ilustra un diagrama de recuadro min-máx que resume el efecto de las sustituciones de aminoácidos de los diseños de Mab en la afinidad de los Fabs analizados para su antígeno. Los resultados se registran como la diferencia en log(KD) del Fab apropiado del biespecífico de WT (-(log(KD_variante)-log(KD_wt)). Los resultados se muestran para todos los diseños para los cuales se midió la afinidad (“Todos”) y se separan según parátopo.
La Figura 15 ilustra los perfiles de UPLC-SEC de los anticuerpos biespecíficos y anticuerpos originales purificados con proteína A y SEC prep. La Figura 15A muestra un mAb CAT-2200 original de tipo silvestre; la Figura 15B muestra un mAb CR8071 original de tipo silvestre; la Figura 15C muestra un mAb SGN-CD19a original de tipo silvestre; la Figura 15D muestra un mAb de Pertuzumab original de tipo silvestre; la Figura 15E muestra el anticuerpo biespecífico generado utilizando SMCA CAT-2200/Pertuzumab Diseño 3972; la Figura 15F muestra el anticuerpo biespecífico generado utilizando SMCA CAT-2200/SGN-CD19a Diseño 3972; y la Figura 15G muestra el anticuerpo biespecífico generado utilizando SMCA CR8071/SGN-CD19a Diseño 3972.
La Figura 16 ilustra el proceso para seleccionar los valores de referencia de tipo silvestre para el cálculo del “cambio en el emparejamiento total con respecto al WT” y del “cambio en biespecífico total con respecto al WT”, para los diseños analizados en SMCA, en los casos en los cuales la construcción biespecífica WT correspondiente no se analizó según SMCA. La Figura 16A muestra el proceso para seleccionar los valores de referencia de tipo silvestre para el “emparejamiento total” (“% emparejamiento H1L1 y % H2L2”) para cada uno de los tres sistemas biespecíficos; la Figura 16B muestra el proceso para seleccionar los valores de referencia de tipo silvestre para “biespecífico total” (“H1L1_H2L2 y H1L2_H2L1**”) para cada uno de los tres sistemas biespecíficos.
Descripción detallada
En la presente se proporcionan anticuerpos modificados genéticamente (también denominados en la presente construcciones polipeptídicas de unión al antígeno multiespecíficas) que pueden comprender el primer heterodímero (H1L1) con una primera cadena pesada de inmunoglobulina (H1) y una cadena ligera lambda de inmunoglobulina (L1) que se emparejan para formar una primera región Fab, y un segundo heterodímero (H2L2) con una cadena pesada de inmunoglobulina (H2) y una cadena ligera kappa de inmunoglobulina (L2) que se emparejan para formar una segunda región Fab. Comúnmente, la primera región Fab se une a un primer antígeno y, comúnmente, la segunda región Fab se une a un segundo antígeno. En algunas realizaciones, el primer y segundo antígeno son diferentes entre sí. H1 es distinto de H2. Una o más de las cadenas pesadas y cadenas ligeras de inmunoglobulina se modifican genéticamente para que comprendan modificaciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial de las cadenas pesadas y ligeras emparejadas correctamente (H1L1 y H2L2) cuando se expresan conjuntamente o se producen conjuntamente. Más específicamente, las modificaciones de aminoácidos fomentan el emparejamiento preferencial entre cada cadena pesada y la cadena ligera correcta, de manera que la cadena pesada del primer heterodímero (H1) pueda emparejarse preferentemente con L1 en lugar de L2, y la cadena pesada del segundo heterodímero (H2) pueda emparejarse preferentemente con L2 en lugar de L1. Como resultado, la expresión conjunta de los polipéptidos H1, L1, H2 y L2 puede permitir la producción del anticuerpo biespecífico emparejado correctamente con menor emparejamiento incorrecto o emparejamiento incorrecto limitado, mediante lo cual se disminuye la cantidad de especies emparejadas incorrectamente producidas y posiblemente se mejora la capacidad de producción. En una realización, las modificaciones de aminoácidos en las regiones Fab se emparejan con las modificaciones de aminoácidos en la región Fc que fomenta la formación de una región Fc heterodimérica para reducir aun más la cantidad de cadenas pesadas emparejadas incorrectamente. Las modificaciones de aminoácidos no afectan considerablemente la estabilidad térmica de los heterodímeros emparejados correctamente, o la afinidad de unión de cada heterodímero emparejado correctamente para el antígeno en comparación con los heterodímeros que se forman a partir de los polipéptidos H1 y L1, o H2 y L2 de tipo silvestre.
También se proporcionan en la presente métodos para producir las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno multiespecíficas descritas anteriormente.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la materia reivindicada. En el caso de que existan varias definiciones para los términos de la presente, prevalecerán las de esta sección. Cuando se hace referencia a una URL u otro identificador o dirección de ese tipo, se entiende que dichos identificadores pueden cambiar y que la información específica puede existir o verse modificada en internet, pero mediante búsquedas de internet se puede encontrar información equivalente. La referencia a estos confirma la disponibilidad y difusión pública de dicha información.
Se debe entender que tanto la descripción general anterior y la descripción detallada siguiente son únicamente ejemplos y explicaciones y no restringen ninguna materia reivindicada. En la presente solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se establezca específicamente lo contrario.
En la presente descripción, se entenderá que cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relación o intervalo de enteros incluye el valor de cualquier entero dentro del intervalo mencionado y, cuando corresponda, fracciones de estos (tales como un décimo o un centésimo de un entero), a menos que se indique de otro modo. Como se usa en la presente, “alrededor de” se refiere a ± 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 % del intervalo, valor, secuencia o estructura indicados, a menos que se indique de otro modo. Debe entenderse que los términos “un” y “una”, tal como se usan en la presente, se refieren a “uno o más” de los componentes enumerados, a menos que se indique de otro modo o el contexto lo determine de otro modo. Debe entenderse que el uso del alternativo (por ejemplo, “o”) significa una, ambas o cualquier combinación de estas alternativas. Tal como se usa en la presente, los términos “incluir” y “comprender” se usan como sinónimos. Además, debería entenderse que los polipéptidos de cadena simple individuales o las construcciones de inmunoglobulina que derivan de varias combinaciones de las estructuras y sustituyentes que se describen en la presente se describen en la presente solicitud en la misma medida en que si cada heterodímero o polipéptido de cadena simple fuera establecido de manera individual. Por lo tanto, la selección de componentes particulares para formar heterodímeros o polipéptidos de cadena simple individuales se encuentra comprendida por el alcance de la presente descripción.
Debe entenderse que los métodos y las composiciones descritas en la presente no se limitan a la metodología, los protocolos, las líneas celulares, las construcciones y los reactivos particulares descritos en la presente y como tales pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de los métodos y composiciones que se describen en la presente, que estarán limitados únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Las publicaciones planteadas en la presente se proporcionan solamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Ningún contenido de la presente debe interpretarse como una admisión de que las invenciones que se describen en la presente no tienen el derecho a considerarse anteriores a dicha publicación en virtud de la invención previa o por cualquier otra razón.
En la presente solicitud, los nombres de los aminoácidos y los nombres de los átomos (por ejemplo, N, O, C, etc.) se usan tal como se definen en el Banco de Datos de Proteínas (PDB, por sus siglas en inglés) (www.pdb.org), que se basa en la nomenclatura de IUPAC (nomenclatura y simbolismo para los aminoácidos y péptidos de IUPAC) (nombres de residuos, nombres de átomos, etc.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984) conjuntamente con sus correcciones en Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985). La expresión “residuo de aminoácidos” pretende principalmente indicar un residuo de aminoácidos contenido en el grupo que consiste en los 20 aminoácidos de origen natural, es decir, residuos de alanina (Ala o A), cisteína (Cys o C), ácido aspártico (Asp o D), ácido glutámico (Glu o E), fenilalanina (Phe o F), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (Ile o I), lisina (Lys o K), leucina (Leu o L), metionina (Met o M), asparagina (Asn o N), prolina (Pro o P), glutamina (Gln o Q), arginina (Arg o R), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), valina (Val o V), triptófano (Trp o W) y tirosina (Tyr o Y).
Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se utilizan de manera intercambiable en la presente para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácidos. Es decir, una descripción dirigida a un polipéptido se aplica de la misma forma a una descripción de un péptido y a una descripción de una proteína y viceversa. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos de origen natural, así como también a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un aminoácido de origen no natural codificado. Tal como se usa en la presente, los términos comprenden cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, lo que incluye proteínas de longitud completa, donde los residuos de aminoácidos están unidos mediante enlaces peptídicos covalentes.
El término “secuencia de nucleótidos” o “secuencia de ácidos nucleicos” pretende indicar un tramo consecutivo de dos o más moléculas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede tener origen sintético, semisintético, genómico, en ADNc o en ARN, o cualquier combinación de estos.
“Célula”, “célula hospedadora”, “línea celular” y “cultivo celular” se usan de manera intercambiable en la presente y debería entenderse que todos estos términos incluyen la progenie que resulta del crecimiento o cultivo de una célula. “Transformación” y “transfección” se usan de manera intercambiable para hacer referencia al procedimiento de introducir una secuencia de ácido nucleico en una célula.
El término “aminoácido” hace referencia a aminoácidos de origen natural o de origen no natural, así como también a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos codificados de forma natural son los 20 aminoácidos comunes (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina) y pirrolisina y selenocisteína. Análogos de aminoácidos hace referencia a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, tal como homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, sulfonio metílico de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (tal como norleucina) o estructuras peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que el aminoácido de origen natural. La referencia a un aminoácido incluye, por ejemplo, aminoácidos L proteogénicos de origen natural; aminoácidos D, aminoácidos modificados químicamente, tales como variantes o derivados de aminoácidos; aminoácidos no proteogénicos de origen natural, tales como alanina, ornitina, etc.; y compuestos sintetizados químicamente con propiedades conocidas en la técnica por ser características de los aminoácidos. Los ejemplos de aminoácidos de origen no natural incluyen, de modo no taxativo, aminoácidos de N-metilo (por ejemplo, metilalanina), aminoácidos D, aminoácidos similares a la histidina (por ejemplo, 2-amino-histidina, hidroxi-histidina, homohistidina), aminoácidos con un metileno extra en la cadena lateral (aminoácidos “homo”) y aminoácidos en los cuales el grupo funcional de ácido carboxílico en la cadena lateral se sustituye con un grupo de ácido sulfónico (por ejemplo, ácido de cisteína). La incorporación de aminoácidos de origen no natural, que incluyen aminoácidos sintéticos no naturales, aminoácidos sustituidos o uno o más aminoácidos D en las proteínas de las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente, puede ser ventajosa en una cantidad de maneras diferentes. Los péptidos que contienen aminoácidos D, etc., exhiben estabilidad aumentada in vitro o in vivo en comparación con las contrapartes que contienen aminoácidos L. Por lo tanto, las construcciones de péptidos, etc., que incorporan aminoácidos D, pueden ser particularmente útiles cuando se desea o se necesita mayor estabilidad intracelular. Más específicamente, los péptidos D, etc. son resistentes a las peptidasas y proteasas endógenas, lo que proporciona de este modo una biodisponibilidad mejorada de la molécula y semividas prolongadas in vivo cuando se deseen tales propiedades. Adicionalmente, los péptidos D, etc., no se pueden procesar de forma eficaz para la presentación restringida a los linfocitos T auxiliares por el complejo de histocompatibilidad principal clase II, y es, por lo tanto, menos probable que induzcan respuestas inmunitarias humorales en la totalidad del organismo.
Se hace referencia a los aminoácidos en la presente ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por sus símbolos de una letra recomendado por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica(B io c h e m ic a l N o m e n c la tu re C o m m iss io n )IUPAC-IUB. De manera similar, se puede hacer referencia a los nucleótidos mediante sus códigos de letras individuales comúnmente aceptados.
“Variantes modificadas de manera conservadora” se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como a las de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, “variantes modificadas de manera conservadora” se refiere a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, para secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degradación del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, todos los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde una alanina se especifica por un codón, el codón se puede alterar para obtener cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácidos nucleicos son “variaciones silenciosas”, que son una especie de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente que codifica un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que comúnmente es el único codón para la metionina, y TGG que comúnmente es el único codón para el triptófano) puede ser modificado para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.
En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto en la técnica reconocerá que las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia de ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos o proteínas que modifique, agregue o elimine un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una “variante modificada de manera conservadora”, donde la modificación da como resultado la eliminación de un aminoácido, la adición de un aminoácido o la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son conocidas para los expertos en la técnica. Dichas variantes modificadas de manera conservadora son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos de la invención.
Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son conocidas para los expertos en la técnica. Cada uno de los siguientes ocho grupos contiene aminoácidos que pueden considerarse sustituciones conservadoras entre sí:
Alanina (A), Glicina (G);
Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);
Asparagina (N), Glutamina (Q);
Arginina (R), Lisina (K);
Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);
Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); y
Serina (S), Treonina (T);
(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2.a edición (diciembre 1993).
Los términos “idéntico” o porcentaje de “ identidad” en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o de polipéptidos, se refiera a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Las secuencias son “sustancialmente idénticas” o “sustancialmente similares” si tienen un porcentaje de nucleótidos o residuos de aminoácidos que es el mismo (es decir, al menos alrededor de 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad en una región específica), cuando se comparan y alinean para obtener la correspondencia máxima con respecto a una ventana de comparación, o región designada tal como se midió usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias (u otros algoritmos disponibles para los expertos en la técnica) o mediante alineamiento manual e inspección visual. Esta definición también hace referencia al complemento de una secuencia de prueba. La identidad puede existir con respecto a una región con una longitud de al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos o con respecto a una región con una longitud de 75-100 aminoácidos o nucleótidos, o, cuando no se especifique, a través de toda la secuencia de un polinucleótido o polipéptido. Puede obtenerse un polinucleótido que codifica un polipéptido de las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente, que incluye homólogos de especies diferentes a la humana, mediante un proceso que comprende las etapas de analizar una recopilación en condiciones rigurosas de hibridación con una sonda etiquetada que tiene una secuencia de polinucleótidos de las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente o un fragmento de esta, y aislar el ADNc de longitud completa y los clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótidos. Dichas técnicas de hibridación son conocidas por el experto en la técnica.
Ejemplos de un algoritmo que sea adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST™ y BLAST™ 2.0, que se describen en Altschule t ál. (Nuc. A c id s Res.25:3389-402, 1977), y Altschule t ál. (J. Mol. B io l.215:403-10, 1990), respectivamente. El software para la realización de los análisis con BLAST™ se encuentra públicamente disponible a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (ver en www.ncbi.nlm.nih.gov en Internet). En el caso de secuencias de nucleótidos, los puntajes acumulados se calculan con los parámetros M (puntaje de compensación por un par de residuos emparejados, siempre > 0) y N (puntaje de penalización por residuos emparejados incorrectamente, siempre < 0). En el caso de secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntaje para calcular el puntaje acumulado. La extensión de los resultados de la palabra en cada dirección se detiene cuando: el valor de alineamiento acumulativo desciende por la cantidad X del valor máximo logrado; el valor acumulativo disminuye a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de valor negativo; o se alcanza el final de alguna secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. Ejemplos de parámetros de algoritmos para el programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) son longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. En el caso de secuencias de aminoácidos, ejemplos de parámetros de algoritmos para el programa BLASTP son longitud de palabra de 3, expectativa (E) de 10 y la matriz de puntajes BLOSUM62 (remitirse a Henikoff & Henikoff,P roc. Natl. A cad . Sci. E U A89:10915, 1989).
Se dice que un derivado o una variante de un polipéptido comparte “homología” o es “homólogo” respecto al péptido si las secuencias de aminoácidos del derivado o variante tienen al menos 50 % de identidad con una secuencia de 100 aminoácidos de longitud con respecto al péptido original. En determinadas realizaciones, el derivado o variante es al menos 75 % idéntico al péptido o un fragmento del péptido que tiene la misma cantidad de residuos de aminoácidos que el derivado. En determinadas realizaciones, el derivado o variante es al menos 85% idéntico al péptido o un fragmento del péptido que tiene la misma cantidad de residuos de aminoácidos que el derivado. En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del derivado es al menos 90 % idéntica al péptido o un fragmento del péptido que tiene la misma cantidad de residuos de aminoácidos que el derivado. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del derivado es al menos 95 % idéntica al péptido o un fragmento del péptido que tiene la misma cantidad de residuos de aminoácidos que el derivado. En determinadas realizaciones, el derivado o variante es al menos 99% idéntico al péptido o un fragmento del péptido que tiene la misma cantidad de residuos de aminoácidos que el derivado.
Tal como se usa en la presente, una construcción o polipéptido “aislado” significa una construcción o polipéptido que se identificó y se separó y/o recuperó a partir de un componente de su ambiente de cultivo celular natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que comúnmente interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos del heteromultímero y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos.
En determinadas realizaciones, como se utiliza en la presente, construcciones polipeptídicas de unión al antígeno “aisladas” describen construcciones polipeptídicas de unión al antígeno que se identificaron y separaron y/o recuperaron de un componente de su entorno de cultivo celular natural. Por ejemplo, una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica aislada descrita en la presente comprende pares de heterodímeros o pares de heterodímeros “aislados” que comprenden un heterodímero o par de heterodímeros que se identificó y se separó y/o recuperó a partir de un componente de su entorno de cultivo celular natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir en los usos terapéuticos o de diagnóstico para el heterodímero o construcciones polipeptídicas de unión al antígeno, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos.
Los heterodímeros y construcciones polipeptídicas de unión al antígeno se pueden purificar para obtener homogeneidad sustancial. Las expresiones “sustancialmente homogéneo”, “forma sustancialmente homogénea” y “homogeneidad sustancial” se usan para indicar que el producto emparejado correctamente carece sustancialmente de subproductos originados a partir de combinaciones de polipéptidos no deseadas (por ejemplo, homodímeros o heterodímeros emparejados incorrectamente). En el contexto de un conjunto de diseños de LCCA (H1L1L2), el producto correctamente emparejado es el heterodímero que comprende H1 y L1 (H1L1). En el contexto de un conjunto de diseños de LCCA (H2L1L2), el producto correctamente emparejado es el heterodímero que comprende H2 y L2 (H2L2). En una realización, en el contexto de una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica, donde se expresan H1, L1, H2 y L2, el producto correctamente emparejado es un par de heterodímeros que comprende H1L1 y H2L2 correctamente emparejados (H1L1H2L2). En algunas realizaciones, en el contexto de una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica, donde se expresan H1, L1, H2 y L2, el producto correctamente emparejado puede comprender productos adicionales que presentan emparejamiento correcto en al menos una región Fab, tal como, por ejemplo, H1L1H2L1 o H1L2H2L2, o donde se producen “medios anticuerpos”, H1L1 o H2L2. Expresada en términos de pureza, en una realización, homogeneidad sustancial significa que la cantidad de subproductos completamente mal emparejados no supera el 20 %, por ejemplo, se encuentra por debajo del 10 %, por debajo del 5 %, por debajo del 1 % o por debajo del 0.5 % de la intensidad de LC-Ms total de todas las especies presentes en la mezcla, donde los porcentajes reflejan los resultados del análisis de espectrometría de masas.
A cada uno de los términos entendidos por los expertos en la técnica de la tecnología de anticuerpos se le da el significado adquirido en la técnica, a menos que se defina diferente de manera expresa en la presente. Se sabe que los anticuerpos tienen regiones variables, una región bisagra y dominios constantes. Se revisan la estructura y función de la inmunoglobulina, por ejemplo, en Harlow et ál, Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988).
Tal como se usan en la presente, los términos “anticuerpo”, “inmunoglobulina” o “construcción polipeptídica de unión al antígeno” se utilizan de manera indistinta. Una “construcción polipeptídica de unión al antígeno” se refiere a un polipéptido sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina o uno o más fragmentos de estos, que se unen específicamente a un analito (antígeno). Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como también los innumerables genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gama, mu, alfa, delta o epsilon, que a su vez definen los isotipos de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Adicionalmente, el anticuerpo puede pertenecer a uno de una cantidad de subtipos, por ejemplo, el IgG puede pertenecer a las subclases IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4.
Un ejemplo de una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) se compone de dos pares de cadenas de polipéptidos, donde cada par tiene una cadena “ ligera” de inmunoglobulina (alrededor de 25 kD) y una cadena “pesada” de inmunoglobulina (alrededor de 50-70 kD). Este tipo de inmunoglobulina o unidad estructural de anticuerpo se considera de “origen natural”. La expresión “cadena ligera” incluye una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de esta con una secuencia de dominio variable suficiente para otorgar especificidad de unión. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio variable, VL, y un dominio constante, CL. El dominio variable de la cadena ligera está en el extremo amino del polipéptido. Las cadenas ligeras incluyen cadenas kappa y cadenas lambda. La expresión “cadena pesada” incluye una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de esta con una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de unión. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio variable, VH y tres dominios constantes, CH1, CH2 y CH3. El dominio VH se encuentra en el extremo amino del polipéptido y los dominios CH se encuentran en el extremo carboxilo, donde CH3 es el más cercano al extremo carboxilo del polipéptido. Las cadenas pesadas pueden ser de cualquier isotipo inclusive IgG (lo que incluye a las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (lo que incluye las subclases IgA1 e IgA2), IgM, IgD e IgE. La expresión “región variable” o “dominio variable” se refiere a una parte de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo responsable en general del reconocimiento del antígeno, que incluye típicamente aproximadamente los 120 a 130 aminoácidos del extremo amino en la cadena pesada (VH) y alrededor de 100 a 110 aminoácidos del extremo amino en la cadena ligera (VL).
Una “región determinante de complementariedad” o “CDR” es una secuencia de aminoácidos que contribuye a la especificidad y afinidad de unión al antígeno. Las regiones “marco” (FR, por sus siglas en inglés) pueden ayudar a mantener la conformación adecuada de las CDR para fomentar la unión entre la región de unión al antígeno y un antígeno. Desde el punto de vista estructural, las regiones de marco pueden ubicarse en los anticuerpos entre las CDR. Típicamente, las regiones variables exhiben la misma estructura general que las regiones de marco (FR) relativamente conservadas, unidas mediante tres regiones hipervariables, CDR. Típicamente, las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean mediante las regiones de marco, que pueden permitir la unión a un epítopo específico. Típicamente, desde el extremo N al extremo C, tanto las regiones variables de las cadenas pesadas como de las ligeras comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Típicamente, la asignación de aminoácidos para cada dominio se hace de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), a menos que se establezca de otro modo.
Una “construcción polipeptídica de unión al antígeno multiespecífica” o “anticuerpo multispecífico” es una que se dirige o une a más de un antígeno o epítopo diferente. Un anticuerpo o construcción polipeptídica de unión al antígeno “biespecífica”, “específica dual” o “bifuncional” es una especie de construcción polipeptídica de unión al antígeno multiespecífica que se dirige o une a dos antígenos o epítopos diferentes. En general, una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica puede tener dos dominios de unión al antígeno diferentes. Los dos dominios de unión al antígeno de un anticuerpo o construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica se unirán a dos epítopos diferentes, que pueden residir en la misma diana molecular o en diferentes dianas moleculares. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica se encuentra en formato de origen natural. Dicho de otro modo, la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica tiene el mismo formato que un anticuerpo IgG, IgA, IgM, IgD o IgE de origen natural.
Las cadenas pesadas de anticuerpos se emparejan con cadenas ligeras de anticuerpos y se encuentran o entran en contacto entre sí en una o más “interfaces”. Una “interfaz” incluye uno o más residuos de aminoácidos “de contacto” en un primer polipéptido que interactúa con uno o más residuos de aminoácidos “de contacto” de un segundo polipéptido. Por ejemplo, existe una interfaz entre los dos dominios CH3 de una región Fc dimerizada, entre el dominio CH1 de la cadena pesada y el dominio CL de la cadena ligera, y entre el dominio VH de la cadena pesada y el dominio VL de la cadena ligera. La “ interfaz” puede derivar de un anticuerpo de IgG y, por ejemplo, de un anticuerpo de IgG1 humano.
La expresión “modificaciones de aminoácidos”, tal como se usa en la presente, incluye, de modo no taxativo, inserciones, eliminaciones, sustituciones, modificaciones químicas, modificaciones físicas y reajustes de aminoácidos.
Los residuos de aminoácidos para las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina pueden enumerarse de acuerdo con varias convenciones que incluyen Kabat (como se describe en Kabat y Wu, 1991; Kabate t ál,Sequences of proteins of immunological interest. 5a edición - Departamento de Salud y Servicios Sociales de Estados Unidos, Publicación NIH n.° 91-3242, p 647 (1991)), IMGT (como se establece en Lefranc, M.-P.,e t ál.,IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® Nucl. Acids Res, 37, D1006-D1012 (2009), y Lefranc, M.-P., IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System, Cold Spring Harb Protoc. 1 jun 2011; 2011(6)), 1JPT (como se describe en Katja Faelber, Daniel Kirchhofer, Leonard Presta, Robert F Kelley, Yves A Muller, The 1.85 A resolution crystal structures of tissue factor in complex with humanized fab d3h44 and of free humanized fab d3h44: revisiting the solvation of antigen combining sites1, Journal of Molecular Biology, Tomo 313, edición 1, páginas 83-97,) y EU (de acuerdo con el índice EU en Kabat con referencia a la numeración del anticuerpo EU (Edelman et ál., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85)). La numeración de Kabat se utiliza en la presente para los dominios VH, CH1, CL y VL, a menos que se indique de otro modo. La numeración EU se utiliza en la presente para los dominios<c>H3 y CH2 y la región bisagra, a menos que se indique de otro modo. La Tabla 22A proporciona una tabla de correspondencia que muestra la numeración de aminoácidos para las posiciones seleccionadas en el polipéptido de cadena pesada de IgG1 utilizando los sistemas de numeración de IMGT, Kabat, 1JPT y EU. La Tabla 22B proporciona una tabla de correspondencia que muestra la numeración de aminoácidos para las posiciones seleccionadas en el polipéptido de cadena ligera lambda utilizando los sistemas de numeración de IMGT y Kabat. La Tabla 22C proporciona una tabla de correspondencia que muestra la numeración de aminoácidos para las posiciones seleccionadas en el polipéptido de cadena ligera kappa utilizando los sistemas de numeración de IMGT, 1JPT y Kabat.
Construcciones polipeptídicas de unión al antígeno
Las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno (es decir, anticuerpos) descritas en la presente pueden ser multiespecíficas o biespecíficas. Una construcción polipeptídica de unión al antígeno multiespecífica puede comprender al menos un primer heterodímero (H1L1) con una primera secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina (H1) y una secuencia polipeptídica de cadena ligera lambda de inmunoglobulina (L1) que forman una primera región Fab y al menos un segundo heterodímero (H2L2) con una secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina (H2) y una secuencia polipeptídica de cadena ligera kappa de inmunoglobulina (L2) que forman una segunda región Fab, donde H1 y H2 son distintos entre sí. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica comprende un primer heterodímero (H1L1) con una primera secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina (H1) y una secuencia polipeptídica de cadena ligera lambda de inmunoglobulina (L1) que forman una primera región Fab y un segundo heterodímero (H2L2) con una secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina (H2) y una secuencia polipeptídica de cadena ligera kappa de inmunoglobulina (L2) que forman una segunda región Fab, donde H1 y H2 son distintos entre sí. En una realización, cada heterodímero comprende una única región Fab. La expresión “región Fab”, como se usa en la presente, se refiere a la región que se genera a partir del emparejamiento de una secuencia polipeptídica de cadena ligera de inmunoglobulina con una secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina, y está compuesta por los dominios VH y CH1 de la secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina, y los dominios VL y CL de la secuencia polipeptídica de cadena ligera de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la primera región Fab se une a un primer antígeno y la segunda región Fab se une a un segundo antígeno. El primer y segundo antígeno pueden ser iguales o diferentes. Una o más de las cadenas pesadas y cadenas ligeras de inmunoglobulina pueden comprender modificaciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial de las cadenas pesadas y ligeras emparejadas correctamente cuando se expresan conjuntamente o se producen conjuntamente.
Cuando la construcción polipeptídica de unión al antígeno es una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica (es decir, anticuerpo biespecífico), también puede denominarse “par de heterodímeros”.
Con fines ilustrativos, el primer heterodímero de la construcción polipeptídica de unión al antígeno se denomina H1L1, y comprende una primera secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina (H1) emparejada con una secuencia polipeptídica de cadena ligera lambda de inmunoglobulina (L1), y el segundo heterodímero se denomina H2L2 y comprende una segunda secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina (H2) emparejada con una secuencia polipeptídica de cadena ligera kappa de inmunoglobulina (L2). Sin embargo, debería entenderse que esta designación es arbitraria y pretende especificar solamente que un heterodímero comprende una cadena ligera kappa de inmunoglobulina y el otro comprende una cadena<ligera lambda de inmunoglobulina. La región Fab del primer heterodímero, H>1<L>1<, también puede denominarse>en la presente “Fab lambda”; mientras que la región Fab del segundo heterodímero, H2L2, también puede denominarse en la presente “Fab kappa”.
Anticuerpos originales
Las secuencias polipeptídicas de cadena pesada de inmunoglobulina, también denominadas “cadenas pesadas” y las secuencias polipeptídicas de cadena ligera de inmunoglobulina, también denominadas “cadenas ligeras”, de cada heterodímero pueden obtenerse de uno o más anticuerpos originales, donde al menos un anticuerpo original comprende una cadena ligera kappa, y al menos otro anticuerpo original comprende una cadena ligera lambda, y las modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial se modifican genéticamente en estas cadenas pesadas y ligeras. Las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina y cadena ligera de inmunoglobulina originales que carecen de las modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial se denominan secuencias polipeptídicas de cadena pesada de inmunoglobulina de tipo silvestre, secuencias polipeptídicas de cadena ligera kappa de inmunoglobulina de tipo silvestre y secuencias polipeptídicas de cadena ligera lambda de inmunoglobulina de tipo silvestre. En una realización, las cadenas pesadas y ligeras de los heterodímeros de la construcción polipeptídica de unión al antígeno se obtienen de dos anticuerpos originales. En general, los dos anticuerpos originales son distintos entre sí; sin embargo, este no es necesariamente el caso siempre. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno es una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica donde cada heterodímero se obtiene de un anticuerpo original distinto. En otra realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno es una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica donde ambos anticuerpos originales se unen al mismo antígeno, pero se dirigen a distintos epítopos en el mismo antígeno. En una realización, al menos un anticuerpo original es monoespecífico, es decir, puede unirse solamente a un epítopo. En otra realización, al menos un anticuerpo original puede unirse a más de un epítopo.
La cadena pesada y la cadena ligera de cada heterodímero de la construcción polipeptídica de unión al antígeno se emparejan para formar una región Fab que se une específicamente al mismo antígeno que el anticuerpo original del cual se obtuvieron. Por ejemplo, si se preparó una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica en función de los anticuerpos originales CAT-2200 (que contienen una cadena ligera lambda, y unión a IL-17A) y D3H44 (que contienen una cadena ligera kappa, y unión al factor tisular), la cadena pesada y la cadena ligera de un heterodímero se emparejarían para formar una región Fab que se une a IL-17A, y la cadena pesada y ligera del segundo heterodímero se emparejarían para formar una región Fab que se une al factor tisular.
Los anticuerpos originales pueden obtenerse de especies que incluyen, de modo no taxativo, humanos, ratones, ratas, conejos, ovejas, vacas, cabras o camellos. En una realización, los anticuerpos originales pueden obtenerse de humanos o ratones.
Los anticuerpos originales también pueden incluir aquellos preparados de hibridomas utilizando los protocolos de producción de anticuerpos monoclonales estándar, tales como los que describen Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).
Los anticuerpos que se unen a una diana particular también pueden identificarse según la cantidad de distintas estrategias, que incluyen la visualización en fagos, visualizaciónin v itroy otros métodos. Estas estrategias generan anticuerpos en formato scFv, formato Fab o formato IgG de longitud completa. Es posible encontrar una reseña de estas estrategias en el Capítulo 4 deT h e ra p e u tic A n tib o d y E ng in ee ring ,de William R. Strohl y Lila M. Strohl, Woodhead Publishing series en Biomedicine N.° 11, ISBN 1907568 37 9, Oct 2012. En una realización, los anticuerpos originales incluyen los anticuerpos identificados por visualización en fagos o visualizaciónin v itro. Los anticuerpos identificados en formatos distintos a los formatos Fab o IgG de longitud completa pueden convertirse en los mismos, como se sabe en la técnica. Los métodos para convertir scFv en Fab son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Steinwande t ál.Mabs 6: 204-218, o Zuberbuhlere t ál.Protein Engineering, Design & Selection 22:169-174). En una realización, los anticuerpos identificados originalmente como scFv, pero donde el scFv se ha convertido en formato Fab y modificado genéticamente en la forma de un anticuerpo convencional o de origen natural, también se pueden utilizar como anticuerpos originales.
En una realización, las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de cada heterodímero de la construcción polipeptídica de unión al antígeno se pueden obtener de un anticuerpo original que es un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos humanizados pueden obtenerse sustituyendo la región determinante de complementariedad (CDR) de un anticuerpo humano por la CDR de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano, por ejemplo, un ratón. Los métodos para identificar las CDR son conocidos en la técnica (Kabat et ál., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342:877). Las técnicas de recombinación genética generales adecuadas para este fin también son conocidas (ver la publicación de solicitud de patente europea n.° EP 125023; y WO 96/02576). Por ejemplo, la CDR de un anticuerpo de ratón puede determinarse mediante métodos conocidos, y un ADN puede prepararse de manera que codifique un anticuerpo en el cual la CDR se ligue con la región marco (FR) de un anticuerpo humano. Luego, un anticuerpo humanizado puede producirse usando un sistema que utiliza vectores de expresión convencionales. Dicho ADN puede sintetizarse mediante PCR usando como cebadores varios oligonucleótidos diseñados para que incluyan partes que superponen los extremos de las regiones CDR y FR (ver el método descrito en WO 98/13388). Las FR de anticuerpo humano unidas mediante CDR se seleccionan de manera que las CDR formen un sitio de unión al antígeno adecuado. Si fuera necesario, los aminoácidos en las FR de una región variable de anticuerpo pueden modificarse de manera que las CDR del anticuerpo humano remodelado pueda formar un dominio de unión al antígeno adecuado (Sato, K. et ál., Cancer Res. (1993) 53:851-856). Los residuos de aminoácidos modificables en las FR incluyen partes que se unen directamente a un antígeno mediante enlaces no covalentes (Amit et ál., Science (1986) 233: 747-53), partes que tienen algún impacto o efecto en la estructura de la CDR (Chothia et ál., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17), y partes implicadas en la interacción entre VH y VL (EP 239400).
En una realización, las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de cada heterodímero de la construcción polipeptídica de unión al antígeno se pueden obtener de un anticuerpo original que es un anticuerpo quimérico. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos preparados al combinar secuencias derivadas de distintos animales. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede prepararse al combinar los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo de ratón con los dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo humano. Los anticuerpos quiméricos pueden prepararse mediante métodos conocidos. Para obtener dichos anticuerpos quiméricos, por ejemplo, un ADN que codifica un dominio variable de anticuerpo puede unirse al ácido nucleico que codifica un dominio constante de anticuerpo humano; el producto de unión resultante puede insertarse en un vector de expresión; y la construcción puede introducirse en una célula hospedadora para producir el anticuerpo quimérico.
Las cadenas pesadas y ligeras de los heterodímeros pueden obtenerse de varios anticuerpos originales conocidos en la técnica. La mayoría de los anticuerpos puede servir como un anticuerpo original, siempre que comprendan una secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina que se empareja con una secuencia polipeptídica de cadena ligera de inmunoglobulina para formar una región Fab que se une a un antígeno. En una realización, al menos un anticuerpo original es un anticuerpo terapéutico, es decir, un anticuerpo que se usa para tratar una enfermedad. Los ejemplos no taxativos de anticuerpos terapéuticos adecuados que comprenden una cadena ligera kappa y los antígenos a los que se unen se identifican en la Tabla A a continuación:
T l A: E m l ni r r i m r n n n n li r k
Los ejemplos no taxativos de anticuerpos terapéuticos adecuados que comprenden una cadena ligera lambda y los antígenos a los que se unen se identifican en la Tabla B a continuación:
T l B: E m l ni r r i m r n n n n li r l m
Subclases de inmunoglobulina
Las cadenas pesadas de inmunoglobulina de los anticuerpos originales están comprendidas en las siguientes clases: IgA1, IgA2, IgM, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En una realización, el primer y segundo heterodímero de la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una cadena pesada IgG. En una realización, el primer y segundo heterodímero de la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una cadena pesada IgG1. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina de los anticuerpos originales son cadenas ligeras kappa o cadenas ligeras lambda.
Las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente comprenden al menos un heterodímero con una secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina y una secuencia polipeptídica de cadena ligera kappa de inmunoglobulina, y al menos otro heterodímero con una secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina y una secuencia polipeptídica de cadena ligera lambda de inmunoglobulina. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una secuencia polipeptídica de cadena pesada de IgG y una secuencia polipeptídica de cadena ligera kappa de inmunoglobulina, y otro heterodímero con una secuencia polipeptídica de cadena pesada de IgG y una secuencia polipeptídica de cadena ligera lambda de inmunoglobulina.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena pesada con un dominio VH que se selecciona de los grupos de línea germinal de dominio VH IGHV1, IGHV2, IGHV3, IGHV4, IGHV5, IGHV6 o IGHV7. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena pesada con un dominio VH del subgrupo de línea germinal IGHV3. En otra realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena pesada con un segmento J que se selecciona de los genes de línea germinal de segmento J IGHJ1, IGHJ2, IGHJ3, IGHJ4, IGHJ5 o IGHJ6. En otra realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena pesada con un segmento J del subgrupo de línea germinal IGHJ4. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena pesada con un dominio<c>H1 que se selecciona de los subgrupos de línea germinal de dominio CH1 IGHG1, IGHG2, IGHG3 o IGHG4. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena pesada con un dominio CH1 del subgrupo de línea germinal IGHG1.
Para los heterodímeros que comprenden una secuencia polipeptídica de cadena ligera lambda, las cadenas ligeras lambda pueden comprender un dominio CL-lambda que se selecciona de los genes de línea germinal IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 o IGLC7. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena ligera lambda que comprende un dominio CL-lambda del subgrupo de línea germinal IGLC2. Las cadenas ligeras lambda pueden comprender un dominio VL-lambda que se selecciona de los subgrupos de línea germinal IGLV1, IGLV2, IGLV3, IGLV4, IGLV5, IGLV6, IGLV7, IGLV8, IGLV9, IGLV10 o IGLV11. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena ligera lambda que tiene un dominio VL-lambda del subgrupo de línea germinal IGLV6. En otra realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena ligera lambda con un segmento J que se selecciona de los genes de línea germinal de segmento J lambda que se selecciona de los genes de línea germinal del segmento J IGLJ1, IGLJ2, IGLJ3, IGLJ6 o IGLJ7. En otra realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena pesada con un segmento J lambda del subgrupo de línea germinal IGLJ2.
Para los heterodímeros que comprenden una secuencia polipeptídica de cadena ligera kappa, las cadenas ligeras kappa pueden comprender un dominio CL-kappa que se selecciona de los alelos de línea germinal CL IGKC*01, IGKC*02, IGKC*03, IGKC*04 o IGKC*05. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena ligera kappa que comprende un dominio CL-kappa del subgrupo de línea germinal IGKC*01. Las cadenas ligeras kappa pueden comprender un dominio VL-kappa que se selecciona de los subgrupos de línea germinal IGKV1, IGKV1D, IGKV2, IGKV3, IGKV4, IGKV5 o IGKV6. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena ligera kappa que tiene un dominio VL-kappa del subgrupo de línea germinal IGKV1. En otra realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena ligera kappa con un segmento J que se selecciona de los genes de línea germinal de segmento J IGKJ1, IGKJ2, IGKJ3, IGKJ4 o IGKJ5. En otra realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un heterodímero con una cadena ligera kappa con un segmento J del subgrupo de línea germinal IGKJ1 o IGKJ2.
Las cadenas pesadas de inmunoglobulina comprenden comúnmente al menos un dominio variable (VH) y tres dominios constantes CH1, CH2 y CH3. En una realización, cada cadena pesada del primer heterodímero y segundo heterodímero de la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un dominio VH, un dominio CH1, un dominio CH2 y un dominio CH3. En otra realización, cada cadena pesada del primer heterodímero y segundo heterodímero comprende un dominio VH, un dominio CH1 y un dominio CH3. En aun otra realización, cada cadena pesada del primer heterodímero y segundo heterodímero comprende un dominio VH y un dominio CH1. Las cadenas ligeras de inmunoglobulina comprenden comúnmente un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). En una realización, la cadena ligera de cada heterodímero comprende un dominio VL y un dominio CL.
Como se indicó anteriormente, en algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina y la secuencia polipeptídica de cadena ligera de inmunoglobulina de cada heterodímero pueden obtenerse de un anticuerpo terapéutico conocido o de un anticuerpo que se une a varias moléculas o antígenos de cáncer diana. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de varias de esas moléculas están disponibles (véase, por ejemplo, N.° de registro GenBank: AJ308087.1 (dominio CL y región variable de cadena ligera de anticuerpo D3H44 de factor tisular antihumano humanizado); N.° de registro GenBank: AJ308086.1 (dominio CH1 y región variable de cadena pesada de anticuerpo D3H44 de factor tisular antihumano humanizado); N.° de registro GenBank: HC359025.1 (módulo génico de cadena ligera de Fab Pertuzumab); N.° de registro GenBank: HC359024.1 (módulo génico de cadena pesada de Fab Pertuzumab); N.° de registro GenBank: GM685465.1 (anticuerpo Trastuzumab (= Herceptin) - de tipo silvestre; cadena ligera); N.° de registro GenBank: GM685463.1 (anticuerpo Trastuzumab (= Herceptin) - de tipo silvestre; cadena pesada); N.° de registro GenBank: GM685466.1 (anticuerpo Trastuzumab (= Herceptin) - cadena ligera optimizada por GC); y N.° de registro GenBank: GM685464.1 (anticuerpo Trastuzumab (= Herceptin) - cadena pesada optimizada por GC. Las secuencias de cada uno de los polipéptidos descritos anteriormente están disponibles en el sitio web de NCBI desde el 28 de noviembre de 2012 y se incorporan en su totalidad a la presente mediante referencia a todos los efectos. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para cetuximab también se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, el sitio web de Drug Bank apoyado por Canadian Institutes of Health Research, Alberta Innovates - Health Solutions y por The Metabolomics Innovation Centre (TMIC), n.° de acceso DB00002.
Modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial
Una o más de las cadenas pesadas y ligeras H1, L1, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial entre las cadenas pesadas y ligeras, que se modifican genéticamente en las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos originales. En una realización, dos de las cadenas pesadas y ligeras H1, L1, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial entre las cadenas pesadas y ligeras. En una realización, tres de las cadenas pesadas y ligeras H1, L1, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial entre las cadenas pesadas y ligeras.
En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos pueden ser asimétricas, dado que las posiciones de aminoácidos que se modifican son distintas entre H1 y H2, y entre L1 y L2.
En una realización, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial entre las cadenas pesadas y ligeras, mientras que H1 y L1 no. En una realización, H1, L1 y H2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial entre las cadenas pesadas y ligeras, mientras que L2 no. En una realización, H1, h 2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial entre las cadenas pesadas y ligeras, mientras que L1 no. En una realización, L1, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial entre las cadenas pesadas y ligeras, mientras que H1 no.
En una realización, una o más modificaciones de aminoácidos comprenden una o más sustituciones de aminoácidos. Las modificaciones de aminoácidos fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 y H2 con L2 cuando H1 o H2 se expresan conjuntamente con L1 y L2, o cuando H1, L1, H2 y L2 se expresan conjuntamente. Como se indicó anteriormente, a los efectos de la ilustración, los heterodímeros de la construcción polipeptídica de unión al antígeno se identificarán de la siguiente manera: el heterodímero H1L1 comprende una cadena ligera lambda L1, y el heterodímero H2L2 comprende una cadena ligera kappa L2.
Un “diseño de Mab” o “conjunto de diseños de Mab”, como se usan en la presente, se refieren a un conjunto específico de modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial que se encuentran presentes en un conjunto de H1, L1, H2 y L2, y también se identifica como H1L1H2L2. Las modificaciones de aminoácidos en uno o más de H1, L1, h 2 y L2 que fomentan el emparejamiento preferencial se denominan y presentan como diseños de Mab o conjuntos de diseños de Mab (es decir, H1L1H2L2). Los conjuntos de diseños de Mab se analizan inicialmente como conjuntos de diseño de LCCA (es decir, H1L1L2 o H2L1L2) para determinar la potencia de especificidad de emparejamiento, donde H1 y H2 se expresan conjuntamente de manera individual con L1 y L2.
En una realización, las modificaciones de aminoácidos pueden realizarse a uno o más aminoácidos que forman parte de la interfaz entre la cadena ligera y la cadena pesada. En una realización, las modificaciones de aminoácidos introducidas en las secuencias polipeptídicas de cadena pesada de inmunoglobulina y las secuencias polipeptídicas de cadena ligera de inmunoglobulina son complementarias entre sí. La complementariedad en la interfaz de la cadena pesada y ligera se puede lograr en función de contactos estéricos e hidrofóbicos, interacciones electrostáticas/de carga o una combinación de estos y una variedad de otras interacciones. La complementariedad entre superficies de proteínas es descrita ampliamente en la bibliografía en términos de encaje de llave y cerradura, botón en ojal, protrusión y cavidad, donante y aceptor, etc., los cuales implican la naturaleza de coincidencia química y estructural entre dos superficies que interactúan. En una realización, al menos uno de los heterodímeros comprende una modificación de aminoácidos introducida en las cadenas pesadas de inmunoglobulina y ligeras de inmunoglobulina que introducen un nuevo enlace de hidrógeno a través de la cadena ligera y pesada en la interfaz. En una realización, al menos uno de los heterodímeros comprende una modificación de aminoácidos introducida en las cadenas pesadas de inmunoglobulina y ligeras de inmunoglobulina que introducen un nuevo puente de sal a través de la cadena ligera y pesada en la interfaz.
En una realización, las modificaciones de aminoácidos del conjunto de diseños de Mab fomentan el emparejamiento preferencial predominantemente a través de atracción electrostática y repulsión. En una realización, las modificaciones de aminoácidos del conjunto de diseños de Mab fomentan el emparejamiento preferencial predominantemente a través de mecanismos estéricos. Dichos diseños de Mab se incluyen en las Tablas 4A, 4b , 7A y 7B, con ejemplos seleccionados que incluyen los que tienen identificadores exclusivos 10771-11335, 10771-11360, 10780-11417. En una realización, las modificaciones de aminoácidos del conjunto de diseños de Mab fomentan el emparejamiento preferencial a través de mecanismos estéricos y electrostáticos.
En una realización, uno o más de H1, L1, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos en las cuales H1 y L1 no incluyen modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial y H2 y L2 comprenden al menos una modificación de aminoácidos que fomenta el emparejamiento preferencial. En una realización, uno o más de H1, L1, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos, en las cuales uno o más de H1, L1 y H2 comprenden al menos una modificación de aminoácidos que fomenta el emparejamiento preferencial, y L2 no incluye modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial. En una realización, uno o más de H1, L1, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos, en las cuales uno o más de H1, L1 y L2 comprenden al menos una modificación de aminoácidos que fomenta el emparejamiento preferencial, y H2 no incluye modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial. En una realización, uno o más de H1, L1, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos, en las cuales uno o más de H1, H2 y L2 comprenden al menos una modificación de aminoácidos que fomenta el emparejamiento preferencial, y L1 no incluye modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial. En una realización, uno o más de H1, L1, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos, en las cuales uno o más de L1, H2 y L2 comprenden al menos una modificación de aminoácidos que fomenta el emparejamiento preferencial, y H1 no incluye modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial. En una realización, uno o más de H1, L1, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos en las cuales L1, H2 y L2 comprenden al menos una modificación de aminoácidos que fomenta el emparejamiento preferencial.
Las modificaciones de aminoácidos pueden estar en los dominios constantes y/o los dominios variables de uno o más de H1, L1, H2 y L2. En una realización, las modificaciones de aminoácidos pueden estar en los dominios CH1 de H1 y H2, el dominio CL-lambda de L1 y el dominio CL-kappa de L2. En otra realización, las modificaciones de aminoácidos pueden estar en los dominios CH1 y VH de H1 y H2, los dominios CL-lambda y VL-lambda de L1 y los dominios CL-kappa y VL-kappa de L2. En otra realización, las modificaciones de aminoácidos pueden estar en los dominios Vh de H1 y H2, el dominio VL-lambda de L1 y el dominio VL-kappa de L2.
En una realización, las modificaciones de aminoácidos pueden estar en las regiones marco de uno o más de H1, L1, H2 y L2. En una realización, las modificaciones de aminoácidos se limitan a residuos marco conservados de los dominios variables (VH, VL) y constantes (CH1, CL) tal como se indica en la numeración Kabat de residuos. Por ejemplo, Almagro [Frontiers In Bioscience (2008) 13: 1619-1633] proporciona una definición de residuos de marco en función de los esquemas de numeración Kabat, Chotia e IMGT.
La cantidad de modificaciones de aminoácidos en cada diseño de Mab o conjunto de diseños de Mab puede variar. En una realización, H1 comprende 0 a 8 modificaciones de aminoácidos, 0 a 7 modificaciones de aminoácidos, 0 a 6 modificaciones de aminoácidos, 0 a 5 modificaciones de aminoácidos, 0 a 4 modificaciones de aminoácidos, 0 a 3 modificaciones de aminoácidos, 0 a 2 modificaciones de aminoácidos, una modificación de aminoácidos, o ninguna modificación de aminoácidos. En una realización, L1 comprende 0 a 8 modificaciones de aminoácidos, 0 a 7 modificaciones de aminoácidos, 0 a 6 modificaciones de aminoácidos, 0 a 5 modificaciones de aminoácidos, 0 a 4 modificaciones de aminoácidos, 0 a 3 modificaciones de aminoácidos, 0 a 2 modificaciones de aminoácidos, una modificación de aminoácidos, o ninguna modificación de aminoácidos. En una realización, H2 comprende 0 a 8 modificaciones de aminoácidos, 0 a 7 modificaciones de aminoácidos, 0 a 6 modificaciones de aminoácidos, 0 a 5 modificaciones de aminoácidos, 0 a 4 modificaciones de aminoácidos, 0 a 3 modificaciones de aminoácidos, 0 a 2 modificaciones de aminoácidos, una modificación de aminoácidos, o ninguna modificación de aminoácidos. En una realización, L2 comprende 0 a 8 modificaciones de aminoácidos, 0 a 7 modificaciones de aminoácidos, 0 a 6 modificaciones de aminoácidos, 0 a 5 modificaciones de aminoácidos, 0 a 4 modificaciones de aminoácidos, 0 a 3 modificaciones de aminoácidos, 0 a 2 modificaciones de aminoácidos, una modificación de aminoácidos, o ninguna modificación de aminoácidos.
En una realización, la cantidad total de modificaciones de aminoácidos en H1, L1, H2 y L2 es inferior a 20, inferior a 15, inferior a 12, inferior a 11, inferior a 10, inferior a 9. En una realización, la cantidad total de modificaciones de aminoácidos en H1, L1, H2 y L2 es 2.
En una realización, las modificaciones de aminoácidos se pueden diseñar de manera específica para un sistema kappa-lambda, donde un anticuerpo original comprende una secuencia polipeptídica de cadena ligera kappa y un anticuerpo original comprende una secuencia polipeptídica de cadena ligera lambda. Las modificaciones o diseños de aminoácidos mencionados se denominan en la presente diseños de K-L. Los ejemplos de dichas modificaciones de aminoácidos o diseños de K-L se muestran en la Tabla 4A, Tabla 7A y Tablas 10-A1 a 10-A12.
En otra realización, las modificaciones de aminoácidos se pueden identificar inicialmente con respecto a un sistema kappa-kappa (diseños K-K), donde ambos anticuerpos originales comprenden una secuencia polipeptídica de cadena ligera kappa, y que posteriormente se lleva a un sistema kappa-lambda. Un experto en la técnica comprenderá cómo pueden llevarse a un sistema kappa-lambda estos diseños. Por ejemplo, las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos originales kappa y lambda pueden alinearse para determinar las posiciones de cadena ligera lambda equivalentes que corresponden a los diseños K-K. Las posiciones de cadena ligera lambda equivalentes luego pueden modificarse para atenerse al diseño K-K. Las modificaciones o diseños de aminoácidos mencionados se denominan en la presente diseños de K-L derivados de K-K, y pueden estar comprendidos en los siguientes grupos: a) aquellos en los cuales no se requieren cambios a los diseños, y los residuos de aminoácidos modificados en el sistema kappa-kappa son idénticos a los modificados en el sistema kappa-lambda; b) aquellos que contienen modificaciones silenciosas, en las cuales al menos una modificación realizada en el sistema kappa-kappa es innecesaria en el sistema kappa-lambda, dado que la modificación existe naturalmente en la secuencia polipeptídica de cadena ligera lambda; c) aquellas que contienen modificaciones de aminoácidos a al menos un residuo de aminoácido en la misma posición relativa en la secuencia polipeptídica de cadena ligera kappa y la secuencia polipeptídica de cadena ligera lambda, pero donde el residuo de aminoácidos inicial en las posiciones difiere entre las secuencias polipeptídicas de cadena ligera kappa y lambda, lo que genera la misma modificación de aminoácidos en la posición, y d) aquellos que contienen al menos una modificación de aminoácidos adicional en el sistema kappa-lambda en comparación con el sistema kappa-kappa. Los ejemplos de dichos diseños de K-L derivados de K-K se proporcionan en la Tabla 4B, Tabla 7B y Tablas 10-B1 a 10-B10. Los ejemplos específicos del grupo a) se marcan con un asterisco en la Tabla 4B. Se demuestra un ejemplo específico del grupo b) con el conjunto de diseños de Mab con el identificador exclusivo 10689-10707. La modificación silenciosa se encuentra en L1 (Q160E está ausente en WT en lambda ya que el residuo en la posición 160 es E y no Q). Se demuestra un ejemplo específico del grupo c) con el conjunto de diseños de Mab con el identificador exclusivo 10652-10734, donde en L1, el residuo de aminoácido 124 es un E en lambda WT y un Q en kappa WT. Se demuestra un ejemplo específico del grupo d) con el conjunto de diseños de Mab con el identificador exclusivo 10684-10706, que incluye la modificación de aminoácidos K129T.
En una realización, uno o más de H1, L1, H2 y L2 comprende las modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1, en comparación con L2 y de H2 con L2, en comparación con L1, donde las modificaciones de aminoácidos comprenden sustituciones de aminoácidos conservadoras de los conjuntos de diseños de Mab proporcionados en la Tabla 4A, Tabla 4B, Tabla 7A, Tabla 7B, Tablas 10-A1 a 10-A12 y Tablas 10-B1 a 10-B10.
En una realización, las modificaciones de aminoácidos no introducen un nuevo residuo cisteína y no retiran un residuo cisteína de origen natural en las cadenas pesadas de inmunoglobulina o las cadenas ligeras de inmunoglobulina dentro del mismo diseño.
La combinación de modificaciones de aminoácidos en H1, L1, H2 y L2 que fomentan el emparejamiento preferencial se denominan, en general, diseños. Los diseños pueden denominarse más específicamente “diseños de LCCA” (en el contexto de H1, L1, L2 o H2, L1, L2) o “diseños de Mab” (en el contexto de H1, L1, H2, L2). Comúnmente, los diseños de LCCA se modifican genéticamente con uno o más diseños de LCCA complementarios específicos en función de cada cadena pesada del anticuerpo biespecífico deseado y, por consiguiente, se presentan comúnmente en un formato en el que se identifican las modificaciones de aminoácidos en las cuatro cadenas polipeptídicas del anticuerpo biespecífico (véanse, por ejemplo, las Tablas 4A y 4B). Si bien las sustituciones de aminoácidos específicas pueden identificarse en la presente, se debería entender que la sustitución conservadora en cada posición de aminoácido también puede contemplarse. Además, con fines ilustrativos, el heterodímero H1L1 representa un heterodímero que comprende una cadena ligera lambda, y el heterodímero H2L2 representa un heterodímero que comprende una cadena ligera kappa, a menos que se indique de otro modo. Finalmente, todos los residuos o posiciones de aminoácidos se enumeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, a menos que se indique de otro modo.
Los diseños comprenden conjuntos controladores de sustituciones de aminoácidos complementarias que fomentan el emparejamiento preferencial, y también pueden comprender sustituciones secundarias. Las sustituciones secundarias pueden actuar para optimizar el rendimiento de los conjuntos controladores.
Uno o más conjuntos controladores pueden emplearse para fomentar el emparejamiento preferencial. Estos conjuntos controladores se pueden usar individualmente, o de forma combinada, para fomentar el emparejamiento preferencial. En una realización, el conjunto controlador es un conjunto controlador electrostático en el que se espera que la atracción electrostática y repulsión sean factores predominantes que fomenten el emparejamiento preferencial. Por ejemplo, un diseño en el que H1 comprende la sustitución de aminoácidos 186K, L1 comprende la sustitución de aminoácidos 133D, H2 comprende la sustitución de aminoácidos 188D, y L2 comprende la sustitución de aminoácidos 131K, pueden fomentar el emparejamiento preferencial mediante un mecanismo electrostático. Varios ejemplos alternativos de controladores electrostáticos se encuentran en los ejemplos. En una realización, uno o más conjuntos controladores electrostáticos se pueden seleccionar de los identificados en la Tabla C:
Tabla C: Ejemplos de conjuntos controladores electrostáticos
En una realización, el conjunto controlador es un conjunto controlador de direccionamiento de disulfuro, que puede actuar para desfavorecer la formación del enlace disulfuro en los heterodímeros emparejados incorrectamente. Un ejemplo de este tipo de conjunto controlador incluye 125R en H1, 122D en L1, 228D en H2 y 121K en L2.
En una realización, el conjunto controlador puede ser un conjunto controlador estérico, que puede actuar para fomentar las interacciones estéricamente complementarias entre los heterodímeros emparejados correctamente y la incompatibilidad estérica entre los heterodímeros emparejados incorrectamente. Los ejemplos no taxativos de conjuntos controladores estéricos se muestran en la Tabla D, donde “-” indica que no hay sustituciones de aminoácidos presentes que fomenten el emparejamiento preferencial.
Tabla D: Ejemplos de conjuntos controladores estéricos
En una realización, el conjunto controlador es un conjunto controlador de diseño variable. Dichos conjuntos controladores de diseño variable comprenden una o más modificaciones de aminoácidos en los dominios variables de los Fab kappa y/o lambda que fomentan el emparejamiento preferencial. En una realización, el conjunto controlador de diseño variable fomenta el emparejamiento preferencial en función de los mecanismos estéricos. En una realización, el conjunto controlador de diseño variable fomenta el emparejamiento preferencial en función de los mecanismos electrostáticos. Los ejemplos no taxativos de conjuntos controladores de diseño variable se muestran en la Tabla E, donde “-” indica que no hay modificaciones de aminoácidos presentes en ese polipéptido que fomenten el emparejamiento preferencial.
Tabla E: Eem los de conuntos controladores de dominio variable
En una realización, uno o más enlaces disulfuro de origen no natural pueden modificarse genéticamente en uno o ambos heterodímeros de la construcción polipeptídica de unión al antígeno. Un ejemplo de este tipo de modificación de aminoácidos es una en la cual la cadena pesada comprende una sustitución 122C, emparejada con una sustitución 124C en la cadena ligera kappa.
Las sustituciones secundarias pueden incluirse en un diseño para optimizar el rendimiento de emparejamiento del diseño. Por ejemplo, las sustituciones secundarias pueden actuar para A) optimizar la cantidad de contactos entre la cadena pesada y ligera emparejada correctamente, B) proporcionar un entorno propicio para los controladores, C) optimizar la red de unión de hidrógeno para los conjuntos controladores o D) proporcionar ajuste estérico para los controladores. Los ejemplos no taxativos de estos tipos de sustituciones secundarias se muestran en la Tabla F, donde “LK” designa una sustitución específica de cadena ligera kappa, “Ll” designa una sustitución específica de cadena ligera lambda. “L” designa una sustitución específica de cadena ligera en la cadena ligera kappa o lambda, y “H” designa una sustitución específica de cadena pesada.
T l F: E m l i i n n ri
Las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno pueden modificarse genéticamente con distintas combinaciones de modificaciones de aminoácidos que corresponden a los conjuntos controladores y sustituciones secundarias descritas anteriormente. Los ejemplos específicos no taxativos de dichas combinaciones agrupadas en grupos en función de las características comunes se describen más adelante. Como se describe en la presente, las combinaciones de modificaciones de aminoácidos en múltiples posiciones dentro de una única cadena se identifican mediante el uso de “_ ” entre cada posición modificada. Por ejemplo, “124_186” indica que ambas posiciones 124 y 186 se modifican en la cadena polipeptídica mencionada. Asimismo, “124_133_180” indica que todas las posiciones 124, 133 y 180 se modifican en la cadena polipeptídica mencionada.
Grupo 1 de K-L:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-L donde:
H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131; y
a) H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 188 o 124_186, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 176_178, o 176_180 o 131; o
b) H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143 o 186, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_133 o 124_133_180.
En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 125, 145 y 179, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 122, 124 y 133, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 228, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 121.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-L donde: H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 125_143_145; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 122_124_131; y H2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 228, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 121_133. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 179, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 133, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 124, 143, 186 y 188, y L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 124, 131, 176, 178 y 180.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-L donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 125_143_145, o 125_143_145_179; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 122_124_131 o 122_124_131_133; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_186_228, 143_228, 143_186_228, 186_228 o 188_228, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 121_124_133, 121_124_133_180, 121_131_133_178, 121_133_176_178, o 121_133_176_180.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-L donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 125R, 145T, 143D, 143E, 179E, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 124Q, 122d , 131K, 13IR, 133S, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 228D, 124R, 143I, 143R, 186K, 186R, 188K, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 124E, 121K, 131D, 176D, 178E, 178F, 180D, 180E, 133D, 1330, 133I, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-L, donde el heterodímero H1L1 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En una realización, H1 comprende 125R_143E_145T_179E y L1 comprende 122D_124Q_131R. En otra realización, H1 comprende 125R_143E_145T y L1 comprende 122D_124Q_131R. En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-L, donde el heterodímero H2L2 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, H1 comprende 125R_143E_145T_179E, L1 comprende 122D_124Q_131R, H2 comprende 188K 228D, y L2 comprende 121K_133I_176D_178E. En otra realización, H1 comprende 125R_143D_145T, L1 comprende 122D_124Q_131R, H2 comprende 143R_228D, y L2 comprende 121K_124E_133D.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-L, que comprende un conjunto controlador de direccionamiento de disulfuro:
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 1 de K-L comprende una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-L como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-A1.
Grupo 2 de K-L:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-L donde:
H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131; y
c) H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 186 o 124_186, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 133 o 133_160 o 124_133 o 176_180; o
d) H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 188; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131;
e) H2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 143; y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_133 o 124_133_180;
En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 139, 145, 174 y 179, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 116, 124, 133 y 176, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 190, 39 y 45, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 135, 178, 38 y 44.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-L donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143_145; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 131; y H2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 143 o 186 o 188, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 133. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 139, 174 y 179, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 116, 124, 133 y 176, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 124, 190, 39 y 45, y L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 124, 131, 135, 160, 176, 178, 180, 38, 44.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-L donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 139_143_145, 143_145, 143_145_174, o 143_145_179; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 116_124_131_176, 124_131, 124_131_133, 124_131_133_176, 131, o 131_133; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_186_190, 143, 143_186 , 143_186_190, 143_190, 186, 186_190, 188, 39_143, o 45_143, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_133, 124_133_135, 124_133_135_180, 124_133_180, 131_133_135_178, 131_133_178, 133, 133_135_176_180, 133_160, 38_124_133, o 44_124_133.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-L donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 139W, 143D, 145T, 174G, 179E, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 124Q, 176F, 116F, 131K, 131R, 133S, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 124R, 143I, 143K, 143R, 186K, 188K, 190F, 39E, 45P, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 124E, 131D, 131E, 133D, 133G, 135A, 135W, 160E, 176D, 178F, 180D, 180E, 38R, 44F, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-L, donde el heterodímero H1L1 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-L, donde el heterodímero H2L2 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 el heterodímero H2L2 es una de las si uientes:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-L, con uno o más de conjuntos controladores estérico 1, estérico 2, estérico de dominio variable o electrostático de dominio variable.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 2 de K-L comprende una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-L como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-A2.
Grupo 3 de K-L:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-L donde:
H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131; y
a) H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 124_186 o 124_179 o 188, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 176_178 o 176_180 o 131; o
b) H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 143_188 o 143 o 124_143, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 124_176_178 o 124_178 o 124_180 o 124_176_180, o 124, o 124_176.
En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 139, 145, 174 y 179, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 116, 124 y 176, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 177, 190, 39 y 45, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 133, 135, 178, 38 y 44.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-L donde: H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143_145; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_131; y H2 comprende sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 143, 124 y 188, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 133, o 176_178. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 139, 174 y 179, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 116 o 176, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 177, 179, 186, 190, 39 y 45, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 124, 131, 135, 180, 38 y 44.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-L donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 139_143_145, 139_143_145_179, 143_145, 143_145_174_179, o 143_145_179; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 116_124_131_176, o en 124_131; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_143, 124_179, 124_186, 143, 143_188, 177_188, 188, 188_190, 39_124_179, o 45_124_179, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_133, 124_133_176, 124_133_176_178, 124_133_176_180, 124_133_178, 124_133_180, 131_133_178, 133_135_176_178, 133_135_176_180, 133_176_178, 133_176_180, 176_178, 38_133_176_180, o 44_133_176_180.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-L donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 139W, 174G, 145T, 143D, 143E, 179E, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 116F, 124Q, 131K, 131R, 176F, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 124R, 143k , 143R, 177I, 179K, 186K, 186R, 188K, 190F, 39E, 45P, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 135A, 135W, 44F, 124E, 38R, 131D, 131E, 176D, 176E, 178D, 178E, 178F, 180D, 180E, 133D, 1330, 133I, 133L, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-L, donde el heterodímero H1L1 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
H1 L1
En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-L, donde el heterodímero H2L2 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 y el heterodímero H2L2 es una de las siguientes:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-L, con uno o más de conjuntos controladores estérico 1, estérico 2, estérico de dominio variable o electrostático de dominio variable.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 3 de K-L comprenden una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-L como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-A3.
Grupo 4 de K-L:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-L donde: H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 188; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 176_178 o 178; y
a) H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 177_188; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 176_178; o
b) H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186 o 124 o 124_179, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 176, o 131_176.
En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 125, 139 y 177, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 122, 129 y 133, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 145, 228, 45 y 39, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 135, 44, 38, 121 y 133.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-L donde: H1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial o comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 188; L1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial o comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 176_178; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 188 o 186_188, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 176_178.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-L donde: H1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial o comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 188; L1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial o comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 178; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 124, 186 y 188, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 176. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 125, 139 y 177, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 122, 129, 133 y 176, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 145, 228, 45, 177, 179 y 39, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 135, 44, 38, 121, 131, 178 y 133.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-L donde H1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial o comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 125_188, 139_188, 188 o 177_188; L1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial o comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 129_176_178, 129_178, 122_129_176_178, 176_178 o 133_176_178; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 145_186, 145_186_228, 145_177_188, 124, 124_145_179, 124_145_179_186_188, 124_145_179_188, 124_186_188, 124_188, 45_124_145_179, 39_124_145_179 o186_188, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 44_131_133_176, 38_131_133_176, 121_131_176, 131_135_176, 131_176, 131_133_176, 131_133_176_178, 176, 176_178, 133_176, o 133_176_178.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-L donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 125R, 139W, 188A, 188K y 177I, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 129T, 122<d>, 176A, 176D, 176E, 133I, 133L, 178D, 178E, 178T y 178W, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 124E, 145T, 177D, 179E, 186E, 186I, 186L, 188D, 188W, 228D, 39E y 45P, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 121K, 131K, 131R, 133A, 133G, 135W, 176A, 176K, 176R, 176V, 178A, 178K, 178L, 178R, 38R y 44F, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-L, donde el heterodímero H1L1 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-L, donde el heterodímero H2L2 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 y el heterodímero H2L2 es una de las siguientes:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-L, con uno o más de conjuntos controladores electrostático, de direccionamiento de disulfuro, estérico 3, estérico de dominio variable y electrostático de dominio variable.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 4 de K-L comprenden una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-L como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-A4.
Grupo 5 de K-L:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 5 de K-L donde:
H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 133; y
a) H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 188; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131; o
b) H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 177_188; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 176_178; o
donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_190; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 135; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124 o 188, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 176 o 176_178.
En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 143 y/o 188, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 131 y/o 178, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143 y/o 145, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 133 y/o 178.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 5 de K-L donde: H1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 186 o 124; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 133 y/o 135; y H2 comprende sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 188, 177 y 124, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 176 y/o 131.
En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 143, 188 y 190, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 131 y/o 178, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143 y/o 145, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 133 y/o 178.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 5 de K-L donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_190, 143_186_188, o 186_188; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 131_133_178, 133_135, 133_135_178, 133_178, o 135_178; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124, 143_188, 145_177_188, o 177_188, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 131_176_178, 131_178, 133_176, 133_176_178, o 176_178.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 5 de K-L donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 124E, 143S, 186K, 188T, 190<d>, 190E, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 131S, 133D, 133I, 135K, 135R, 178F, 178T, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 124R, 143T, 145T, 177D, 177I, 188D, 188K, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 131K, 133G, 133L, 176A, 176D, 176K, 178E, 178K, 178R, 178S, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 5 de K-L, donde el heterodímero H1L1 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 5 de K-L, donde el heterodímero H2L2 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 y el heterodímero H2L2 es una donde H1 comprende 186K_188T, L1 comprende 133D_178T, H2 comprende 145T_177D_188D, y L2 comprende 176K_178K.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 5 de K-L comprenden una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 5 de K-L como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-A5.
Grupo 6 de K-L:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 6 de K-L donde:
H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 177_188; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 176_ 178; y
a) H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 188; y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 176_178 o 131;
b) H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186; y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 133 o 124_160_180;
c) H2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 124 o 124_179 o 124_186, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 176 o 176_178 o 176_180; o
d) H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 133 o 124_133.
En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en 145 y/o 146, y/o H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 143 y/o 177.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 6 de K-L donde:
H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 177_188; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 176_178; y H2 comprende sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 124, 143, 179, 186 y 188, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 133, 176 y 178.
En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en 145 y/o 146, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 177 y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 124, 131, 160 y 180.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 6 de K-L donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 145_177_188, o 146_177_188; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 176_ 178; H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124, 124_179, 124_186, 143, 143_186_188, 177_188, 179, 186, 186_188, o 188, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_133, 124_160_176_178 180, 124_160_180, 131_133_178, 133, 133_176, 133_176_178, 133_176_180, o 176_178.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 6 de K-L donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 145T, 146T, 177D, 188D, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 176K, 178K, 178L, 178R, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 124R, 143K, 143R, 143S, 177I, 179K, 186K, 186R, 188K, 188T, 188W, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 124E, 131D, 131E, 133D, 1330, 133I, 133L, 160E, 176A, 176D, 176E, 178A, 178D, 178E, 178F, 180E, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 6 de K-L, donde el heterodímero H1L1 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 6 de K-L, donde el heterodímero H2L2 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 y el heterodímero H2L2 es una de las siguientes:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 6 de K-L, que tiene un conjunto controlador estérico.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 6 de K-L comprenden una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 6 de K-L como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-A6.
Grupo 7 de K-L:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 7 de K-L donde:
H1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 188; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 178; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 124 o 188, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 176_ 178 o 176_180 o 176. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 125, 139, 145 y 177, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 122, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 143, 177, 179, 186, 228, 39 y 45, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 121, 124, 133, 135, 160, 38 y 44.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 7 de K-L donde: H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 145_188; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 178; y H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124 y/o 188, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 124, 133 y 178.
En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 125, 139 y 177, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 122, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 143, 177, 179, 186, 228, 39, y 45, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 121, 135, 160, 176, 180, 38 y 44.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 7 de K-L donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 125_145_188, 139_145_188, 145_177_188, o 145_188; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 122_178, o 178; H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124, 124_143, 124_179, 124_186, 124_186_228, 124_188, 124_228, 143_188, 177_188, 179_188, 186_188, 188, 188_228, 39_124_179, o 45_124_179, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 121_133_176, 121_133_176_180, 121_176_178, 124_133_176, 124_133_176_178, 124_133_176_178_180, 124_133_176_180, 124_133_178, 124_160_176_178, 124_160_176_178_180, 124_176_178_180, 124_176_180, 133_135_176, 133_135_176_180, 133_176, 133_176_178, 133_176_180, 135_176_178, 176_178, 38_133_176_180, o 44_133_176_180.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 7 de K-L donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 125R, 139W, 145T, 177T, 188E, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 122D, 178K, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 124K, 124R, 143K, 143R, 177I, 179K, 186R, 188K, 228D, 39E, 45P, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 121K, 124E, 133D, 133G, 133L, 135W, 160E, 176D, 176E, 178D, 178E, 180E, 38R, 44F, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 7 de K-L, donde el heterodímero H1L1 com rende uno de los si uientes conuntos de sustituciones de aminoácidos:
En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 7 de K-L, donde el heterodímero H2L2 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 el heterodímero H2L2 es una de las si uientes:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno del grupo 7 de K-L comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos con uno o más conjuntos controladores que se seleccionan de un conjunto controlador de direccionamiento de disulfuro, un conjunto controlador estérico 2 y un conjunto controlador de dominio variable.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 7 de K-L comprenden una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 7 de K-L como se indica en uno o más de los diseños establecidos en la Tabla 10-A7.
Grupo 8 de K-L:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-L donde:
H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124; y
a) H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186 o 179; y L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 180;
b) H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186; y L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 133;
c) H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; y L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 133; o
d) H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 188; y L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 178.
En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 124, 139, 177 y 190, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 129, 131, 135 y 176, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 122, 124, 145, 179, 186, 188, 39 y 45, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 129, 133, 135, 160, 176, 178, 38 y 44.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-L donde: H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143, 186, 179 y/o 188; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 129 y/o 178; y H2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 143, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 124. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 124, 139, 177 y 190, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 131, 133, 135, 176 y 180, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 122, 124, 145, 179, 186, 188, 39 y 45, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 129, 133, 135, 160, 176, 178, 38 y 44.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-L donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_143, 139_143, 139_143_186, 139_186, 139_188, 143, 143_179, 143_186, 143_186_188, 143_190, 177_188, 179, 179_190, 186, o 186_188, 188; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 129_131_133, 129_133, 129_133_135, 129_133_135_180, 129_133_178, 129_133_180, 129_176_178, 129_176_178_180, 129_178, 129_178_180, 129_180, 133_176_178, 133_178, o 176_178; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 122_143_145, 122_143_145 179, 124_143_145, 124_143_145_179, 143_145, 143_145_179, 143_145_179_186_188, 143_145_179_188, 143_145_188, 39_143_145_179, o 45_143_145_179, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_129_160_178, 124_129_178, 124_133_178, 124_135_160_178, 124_135_178, 124_160_176_178, 124_160_178, 124_176_178, 124_178, 38_124_178, o 44_124_178.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-L donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 124K, 139W, 143A, 143I, 143K, 143S, 177I, 179K, 186K, 186R, 188K, 188T, 190K, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 129T, 131D, 131E, 133D, 133L, 133W, 135S, 176A, 176D, 176E, 178D, 178E, 178T, 178W, 180E, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 122C, 124W, 143E, 145T, 179E, 186I, 188L, 188W, 39E, 45P, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 124C, 124K, 124R, 129K, 133A, 135W, 160K, 160R, 176A, 178R, 38R, 44F, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-L, donde el heterodímero H1L1 com rende uno de los si uientes conuntos de sustituciones de aminoácidos:
En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-L, donde el heterodímero H2L2 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 y el heterodímero H2L2 es una de las siguientes:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-L, con uno o más de conjuntos controladores estérico 2, estérico 3, estérico 4 y de dominio variable. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-L que introducen un enlace disulfuro de origen no natural.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 8 de K-L comprenden una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-L como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-A8.
Grupo 9 de K-L:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 9 de K-L donde:
H1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 179, 186, 143 y/o 188; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 180, 133 y/o 176_178; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 143, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 131 y/o 124. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 125, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 122 o 129, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 145, 179 y 228, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 121, 129, 135, 160 y 178.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 9 de K-L donde: H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 125; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 122_129; y H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 145; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 121 y/o 124. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 143, 179, 186 y 188, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 133, 176, 178 y 180, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 143, 179 y 228, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 129, 131, 135, 160 y 178.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 9 de K-L donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 125_143, 125_179, 125_186, o 125_188; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 122_129_133, 122_129_176_178, o 122_129_180; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143_145, 143_145_179, 143_145_179_228, 143_145_228, o 145_179_228, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 121_124_160_178, 121_124_178, 121_129_131, 121_131, 124_135_160_178, o 124_135_178.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 9 de K-L donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 125R, 143K, 179K, 186R, 188K, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 122D, 129T, 133D, 176D, 176E, 178E, 178T, 180E, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 143E, 145T, 179E, 228D, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 135W, 124R, 160K, 121K, 131K, 129K, 178R, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 9 de K-L, donde el heterodímero H1L1 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 9 de K-L, donde el heterodímero H2L2 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 y el heterodímero H2L2 es una de las siguientes:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 9 de K-L, que tiene un conjunto controlador de direccionamiento de disulfuro.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 9 de K-L comprenden una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 9 de K-L como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-A9.
Grupo 10 de K-L:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión a antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-L donde: H1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 174, 179 o 186; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 176 o 180; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143 o 190, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131, 135 o 124; o H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 174; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 176; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 190; y L2 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial o comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 135. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 143, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 116, 129 y 133, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 145, 179 y 188, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 133, 160 y 178.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-L donde: H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 174 y/o 186; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 176 y/o 180; y H2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 145, 190 y/o 188, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 135, 131, 178 o 133 o no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 143 y/o 179, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 116, 129 y 133, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143 y/o 179, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124 y/o 160.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-L donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143_174, 174, 174_179, 174_186, o 186; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 116_129_133_176, 116_129_176_180, 116_176, 129_180, o 176; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143_145_179_188_190, 143_145_179_190, 143_145_190, 143_190, 145_179, 145_179_188_190, 188, o 190, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_135_160_178, 124_135_178, 131, 131_135, 133, 135, 135_178, 178, o no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-L, donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 143K, 174G, 179K, 186R, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 116F, 129T, 133D, 176F, 180E, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 143E, 143I, 145T, 179E, 188F, 190F, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 124K, 124R, 131K, 133A, 135A, 160K, 178F, 178R, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-L, donde el heterodímero H1L1 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-L, donde el heterodímero H2L2 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 y el heterodímero H2L2 es una de las siguientes:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-L, que tiene un conjunto controlador estérico 1.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 10 de K-L comprenden una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-L como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-A10.
Grupo 11 de K-L:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 11 de K-L donde: H1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 143_190; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 133; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 131_135. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 125, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 122, 129 y 135, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 139, 145, 190 y 228, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 121.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 11 de K-L donde:
H1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 143_190; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 129_133_135; y H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124_145; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 131_135. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 125, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 122, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 139, 190 y 228, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 121.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 11 de K-L donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 125_143_190, o 143_190; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 122_129_133_135, o 129_133_135; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_139_145_190, 124_139_145_190_228, o 124_145, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 121_131_135, o 131_135.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 11 de K-L donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 125R, 143K, 190K, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 122D, 129T, 133D, 135S, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 124E, 139I, 145T, 190I, 228D, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 121K, 131K, 135K, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 11 de K-L, donde el heterodímero H1L1 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 11 de K-L, donde l h r ím r H2L2 m r n n l i i n n n i i n min i :
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 y el heterodímero H2L2 es una donde H1 comprende 143K_190K, L1 comprende 129T_133D_135S, H2 comprende 124E_145T, y L2 comprende 131K_135K.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 11 de K-L, que tiene un conjunto controlador de direccionamiento de disulfuro.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 11 de K-L comprenden una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 11 de K-L como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-A11.
Grupo 12 de K-L:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 12 de K-L donde: H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143 y/o 186; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 133; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 131. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 124, 125, 139 y 188, L1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 122, 129, 131 y 178, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 143, 145, 179, 186, 188, 228, 39 y 45, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 121, 133, 135, 176, 178, 38 y 44.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 12 de K-L donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_143, 125_143, 125_143_186, 125_186, 125_186_188, 139_143, 139_143_186, 139_186, 139_186_188, 143, o 186_188; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 122_129_133, 122_129_133_178, 122_133_178, 129 131_133, 129_133, 129_133_178, o 133_178; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_143_145, 124_145_179, 124_145_179_186_188, 124_145_179_188, 124_145_179_228, 124_145_186, 39_124_145_179, o 45_124_145_179, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 121_131_133_176, 131_133_135, 131_133_135_176, 131_133_135_178, 131_133_176, 131_133_176_178, 38_131_133_176, o 44_131_133_176.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 12 de K-L donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 124K, 125R, 139W, 143I, 143k , 186K, 188T, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 122D, 129T, 131D, 131E, 133D, 178T, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 124E, 143E, 145T, 179E, 186E, 186I, 188W, 228D, 39E, 45P, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 121K, 131K, 131R, 133G, 133S, 133T, 135K, 135W, 176R, 178A, 178S, 38R, 44F, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 12 de K-L, donde el heterodímero H1L1 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 12 de K-L, donde el heterodímero H2L2 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 y el heterodímero H2L2 es una de las siguientes:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 12 de K-L, con uno o más de conjuntos controladores de direccionamiento de disulfuro, estérico 2, estérico 3, electrostático de dominio variable y estérico de dominio variable.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 12 de K-L comprenden una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 12 de K-L como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-A12.
Grupo 1 de K-K:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-K donde: H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143_179; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_ 178; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186; y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 178_180 o 160_180. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, una sustitución de aminoácidos en la posición 145.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-K donde: H1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 143_145_179; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en las posicione 124_178; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 186; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 180. En algunas realizaciones, L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 160 y/o 178.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-K donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 143_145_179; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_178; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 186, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 178_180 o 160_180.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-K donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 143E, 145T, 179E, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 124K, 178R, y sustituciones conservadoras de estos; la sustitución de aminoácidos en H2 es 186R, o sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 160E, 178E, 180E, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-K, donde el heterodímero H1L1 comprende el siguiente conjunto de sustituciones de aminoácidos: H1 comprende 143E_145T_179E y L1 comprende 124K_178R. En una realización adicional, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-K, donde el heterodímero H2L2 comprende los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos: H2 comprende 124K_178R y L2 comprende 178E_180E o 160E180E. En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de estos heterodímeros H1L1 y H2L2.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 1 de K-K como se indica en la Tabla 10-B1.
Grupo 2 de K-K:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-K donde: H1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 143; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 124; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 179 o 186, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 124_160_180. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 145, y/o H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 146.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-K donde: H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143_145; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 124; y H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 179 o 186, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_160_180. En algunas realizaciones, H2 comprende, además, una sustitución de aminoácidos en la posición 146.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-K donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143_145; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 124; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 186, 179 o 146_179, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_160_180.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-K donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 143E, 145T, y sustituciones conservadoras de estos; la sustitución de aminoácidos en L1 es 124R, o sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 186R, 179K, 1460, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 124E, 160E, 180E, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-K, donde el heterodímero H1L1 comprende el siguiente conjunto de sustituciones de aminoácidos: H1 comprende 143E_145T y L1 comprende 124R. En una realización adicional, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-K, donde el heterodímero H2L2 comprende los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos: H2 comprende 186R, 179K o 146G_179K y L2 comprende 124E_160E_180E. En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 y el heterodímero H2L2 es una donde H1 comprende 143E_145T, L1 comprende 124R, H2 comprende 179K, y L2 comprende 124E_160E_180E.
En una realización, la combinación de aminoácidos del grupo 2 de K-K comprende una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 2 de K-K como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-B2.
Grupo 3 de K-K:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-K donde:
H1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 186; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 180 o 178_180; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 143 y/o 179, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124_178 o 131. En algunas realizaciones, h 2 comprende, además, una sustitución de aminoácidos en la posición 145.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-K donde: H1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 186; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 180; y H2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 145, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 124 o 131. En algunas realizaciones, L1 comprende, además, una sustitución de aminoácidos en la posición 178, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143 y/o 179, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 178.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-K donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 186; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 180 o 178_180; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143_145, 143_145_179, o 145_179, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 131 o 124_178.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-K donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 186R, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 178E, 180E, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 143E, 145T, 179E, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 124K, 131K, 178R, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-K, donde el heterodímero H1L1 comprende el siguiente conjunto de sustituciones de aminoácidos: H1 comprende 186R y L1 comprende 178E_180E o 180E. En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-K, donde el heterodímero H2L2 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 y el heterodímero H2L2 es una donde H1 comprende 186R, L1 comprende 180E, H2 comprende 143E_145T_179E, y L2 comprende 124K_178R.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 3 de K-K comprenden una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 3 de K-K como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-B3.
Grupo 4 de K-K:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-K donde: H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 179; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 180; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 146, H2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 145, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 160 y/o 178.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-K donde: H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 179; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 180; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 143_145; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124. En algunas realizaciones, H1 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 146, y/o L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en la posición 160 y/o 178.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-K donde H1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 146_179 o 179; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 180; H2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 143_145, y L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124 o 124_160_178.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-K donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 146G, 179K, y sustituciones conservadoras de estos; la sustitución de aminoácidos en L1 es 180E, o sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 143E, 145T, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 124R, 160K, 178R, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-K, donde el heterodímero H1L1 comprende el siguiente conjunto de sustituciones de aminoácidos: H1 comprende 179K o 146G_179K, y L1 comprende 180E. En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-K, donde el heterodímero H2L2 comprende los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos: H2 comprende 143E_145T y L2 comprende Q124R_Q160K_T178R o Q124R. En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 y el heterodímero H2L2 es una donde H1 comprende 179K, L1 comprende 180E, H2 comprende 143E_145T, y L2 comprende 124R_160K_178R.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 4 de K-K comprende una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 4 de K-K como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-B4.
Grupo 5 de K-K:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 5 de K-K donde: H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 143 o 186; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 180 o no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial;<h>2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 143_145, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124. En algunas realizaciones, L2 comprende, además, sustituciones de aminoácidos en una o más de las posiciones 160 y/o 178. En una realización adicional, L2 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 124, 124_178 o 124_160_178.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 5 de K-K donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 186R, 143R, 143K, y sustituciones conservadoras de estos; la sustitución de aminoácidos en L1 es 180E, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 143E, 145T, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 124R, 160K, 178R, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 5 de K-K, donde el heterodímero H1L1 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 5 de K-K, donde el heterodímero H2L2 com rende uno de los si uientes conuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 5 de K-K comprende una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 5 de K-K como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-B5.
Grupo 6 de K-K:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 6 de K-K donde: H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 39 o no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 38 o no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 39; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 38.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 6 de K-K donde las sustituciones de aminoácidos en H1 se seleccionan de 39D, 39E, 39K, 39R, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 38D, 38E, 38K, 38R, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en H2 se seleccionan de 39D, 39E, 39K, 39R, y sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 38D, 38E, 38K, 38R, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 6 de K-K, donde el heterodímero H1L1 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 6 de K-K, donde el heterodímero H2L2 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos:
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H2L2. En una realización, la combinación del heterodímero H1L1 y el heterodímero H2L2 es una donde H1 comprende 39R, L1 comprende 38E, H2 comprende 39D, y L2 comprende 38R.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 6 de K-K como se establece en uno o más de los diseños en la Tabla 10-B6. En una realización, el diseño del grupo 6 de K-K no es el diseño que corresponde al identificador exclusivo de LCCA 10674-10749 o 10679-10744.
Grupo 7 de K-K:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 7 de K-K donde: H1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 135; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 139; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 116. En algunas realizaciones, L2 comprende, además, una sustitución de aminoácidos en la posición 135.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 7 de K-K donde la sustitución de aminoácidos en L1 es 135W, o sustituciones conservadoras de estos; la sustitución de aminoácidos en H2 es 139W, o sustituciones conservadoras de estos; y las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 116A, 135V, y sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 7 de K-K, donde el heterodímero H1L1 comprende el siguiente conjunto de sustituciones de aminoácidos: H1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial, y L1 comprende 135W. En una realización adicional, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 7 de K-K, donde el heterodímero H2L2 comprende el siguiente conjunto de sustituciones de aminoácidos: H2 comprende 139W y L2 comprende 116A o 116A_1335V. En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al<antígeno comprende una combinación de un heterodímero H1L1 con un heterodímero H>2<L>2<.>
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 7 de K-K como se indica en uno o el otro de los diseños en la Tabla 10-B7.
Grupo 8 de K-K:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-K donde: H1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial o comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 45; L1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 45, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 44.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-K donde la sustitución de aminoácidos en H1 es 45F, o sustituciones conservadoras de estos; la sustitución de aminoácidos en H2 es 45P, 45A, o sustituciones conservadoras de estos; la sustitución de aminoácidos en L2 es 44F, o sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-K, donde el heterodímero H1L1 comprende uno de los siguientes conjuntos de sustituciones de aminoácidos: H1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial o comprende 45F, y L1 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial. En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-K, donde el heterodímero H2L2 comprende el siguiente conjunto de sustituciones de aminoácidos: H2 comprende 45A o 45P, y L2 comprende 44F. En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de heterodímeros H1L1 y H2L2, donde H1 y L1 no comprenden sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial, H2 comprende 45 A y L2 comprende 44F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 8 de K-K como se indica en uno o más de los diseños en la Tabla 10-B8.
Grupo 9 de K-K:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígenono comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 9 de K-K donde: H1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 139; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 116; H2 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial, y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 135.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 9 de K-K donde la sustitución de aminoácidos en H1 es 139W, o sustituciones conservadoras de estos; la sustitución de aminoácidos en L1 es 116A, o sustituciones conservadoras de estos; y la sustitución de aminoácidos en L2 es 135W, o sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 9 de K-K, donde el heterodímero H1L1 comprende el siguiente conjunto de sustituciones de aminoácidos: H1 comprende 139W y L1 comprende 116A. En una realización adicional, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 9 de K-K, donde el heterodímero H2L2 comprende el siguiente conjunto de sustituciones de aminoácidos: H2 no comprende sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial, y L2 comprende 135W.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 9 de K-K como se indica en la Tabla 10-B9.
Grupo 10 de K-K:
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-K donde: H1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124; L1 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 176; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 176. En algunas realizaciones, L1 y/o L2 comprenden, además, una sustitución de aminoácidos en la posición 133.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-K donde: H1 comprende sustituciones de aminoácidos en la posición 124; L1 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 133_176; H2 comprende una sustitución de aminoácidos en la posición 124; y L2 comprende una sustitución de aminoácidos en las posiciones 133_176.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-K donde la sustitución de aminoácidos en H1 es 124E, o sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L1 se seleccionan de 133G, 176R, o sustituciones conservadoras de estos; la sustitución de aminoácidos en H2 es 124R, o sustituciones conservadoras de estos; las sustituciones de aminoácidos en L2 se seleccionan de 133G, 176D, o sustituciones conservadoras de estos.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H1L1 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-K, donde el heterodímero H1L1 comprende el siguiente conjunto de sustituciones de aminoácidos: H1 comprende 124E y L1 comprende 133G_176R. En realizaciones adicionales, la construcción polipeptídica de unión al antígeno tiene un heterodímero H2L2 que comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-K, donde el heterodímero H2L2 comprende el siguiente conjunto de sustituciones de aminoácidos: H2 comprende 124R, y L2 comprende 133G_176D. En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de estos heterodímeros H1L1 y H2L2.
En una realización, las combinaciones de aminoácidos del grupo 9 de K-L comprenden una o más sustituciones secundarias que se seleccionan de la Tabla F.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una combinación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo con el grupo 10 de K-K como se indica en la Tabla 10-B10.
Emparejamiento preferencial en conjuntos de diseños de LCCA
Uno o más de H1, L1, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 y de H2 con L2 en comparación con L1. En general, en ausencia de las modificaciones de aminoácidos y cualquier preferencia de origen natural, una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina de tipo silvestre (H1), cuando se expresa conjuntamente con dos secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de tipo silvestre (L1 y L2) distintas, estadísticamente se emparejará de igual manera con ambas cadenas ligeras, lo que genera una mezcla 50:50 aproximada de H1 emparejado con L1 (H1L1, emparejado correctamente) y H1 emparejado con L2 (H1L2, emparejado incorrectamente). Asimismo, si el H2 de tipo silvestre es expresado de forma conjunta con el L1 y L2 de tipo silvestre, la cadena pesada, estadísticamente, se emparejará de igual manera con ambas cadenas ligeras, lo que genera una mezcla 50:50 aproximada de H2 emparejado con L1 (H2L1, emparejado incorrectamente) y H2 emparejado con L2 (H2L2, emparejado correctamente). La expresión “emparejamiento preferencial” se usa en la presente para describir la especificidad de emparejamiento o la preferencia de emparejamiento de una secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina con una secuencia polipeptídica de cadena ligera de inmunoglobulina en comparación con otra secuencia polipeptídica de cadena ligera de inmunoglobulina. En este contexto, el emparejamiento preferencial podría producirse, por ejemplo, entre H1 y L1, si la cantidad del heterodímero H1L1 fuera mayor que la cantidad del heterodímero H1L2 cuando se expresa conjuntamente H1 con L1 y L2. De manera similar, el emparejamiento preferencial podría producirse, por ejemplo, entre H2 y L2, si la cantidad del heterodímero H2L2 fuera mayor que la cantidad del heterodímero H2L1 cuando se expresa conjuntamente H2 con L1 y L2.
Sin embargo, en algunos casos, se observa una tendencia de emparejamiento inherente en las secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera de tipo silvestre obtenidas de los anticuerpos originales. La tendencia de emparejamiento inherente puede observarse en el contexto de un conjunto de diseño de LCCA en el cual se expresan conjuntamente H1 o H2 originales de tipo silvestre con L1 y L2 originales de tipo silvestre, donde una de las cadenas ligeras se empareja preferentemente con las cadenas pesadas de ambos anticuerpos originales. En una realización, el emparejamiento preferencial se produce cuando las modificaciones de aminoácidos en uno o más de H1, L1, H2 y L2 fomentan el emparejamiento preferencial que es mayor que el emparejamiento preferencial que se produce en el sistema de tipo silvestre correspondiente.
El grado de emparejamiento preferencial, o la potencia del diseño, es una medida de la capacidad de las modificaciones de aminoácidos de fomentar el emparejamiento preferencial. El grado de emparejamiento preferencial se puede evaluar como se describe en otra parte de la presente, y en los ejemplos, y se basa en la medición de los heterodímeros emparejados correctamente (es decir, H1L1 y H2L2) en comparación con los heterodímeros emparejados incorrectamente (es decir, H1L2 y H2L1). El grado de emparejamiento preferencial se puede evaluar en el contexto de los conjuntos de diseño de LCCA (H1L1L2 o H2L1L2), donde se expresa conjuntamente una cadena pesada con dos cadenas ligeras únicas, o un conjunto de diseños de Mab (H1L1H2L2), donde se expresan conjuntamente las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo original.
Las siguientes realizaciones se refieren al contexto de conjuntos de diseño de LCCA. En todas las realizaciones en la presente sección, la expresión “alrededor de” se refiere al 5 % de la relación indicada, y el emparejamiento preferencial se compara con respecto al tipo silvestre, a menos que se indique de otro modo. En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y<l>2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 60:40. En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 60:40.
En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 65:35. En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 65:35.
En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 70:30. En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 70:30.
En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 75:25. En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 75:25.
En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 80:20. En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 80:20.
En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 85:15. En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 85:15.
En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 90:10. En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 90:10.
En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 95:5. En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 95:5.
En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 99:1. En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y l2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, donde la relación de H2L2:H2L1 es de al menos alrededor de 40:60 y la relación de H1L1:H1L2 es de al menos alrededor de 99:1.
En otras realizaciones, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1, en comparación con L2 para formar H1L1, o de H2 con L2, en comparación con L1 para formar H2L2, de manera que la cantidad de H1L1 o H2L2 sea mayor que alrededor de 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %.
En una realización, el emparejamiento preferencial se mide mediante LCCA como se describe en los ejemplos. En general, los resultados de LCCA predicen los resultados en el contexto de emparejamiento preferencial en los conjuntos de diseños de Mab (que se describen más adelante) en los cuales se expresan conjuntamente H1, L1, H2 y L2.
En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, de manera que el emparejamiento relativo de al menos uno de H1L1 o H2L2 sea al menos alrededor de 10 % superior con respecto al tipo silvestre, y el emparejamiento relativo del otro esté dentro de alrededor de 10 % del tipo silvestre o al menos alrededor de 10 % superior con respecto al tipo silvestre.
En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, de manera que el emparejamiento relativo de al menos uno de H1L1 o H2L2 sea al menos alrededor de 20% superior con respecto al tipo silvestre, y el emparejamiento relativo del otro esté dentro de alrededor de 10 % del tipo silvestre o al menos alrededor de 10 % superior con respecto al tipo silvestre.
En una realización, uno o más de H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2 para formar H1L1, o H2 con L2 en comparación con L1 para formar H2L2, de manera que el emparejamiento relativo de al menos uno de H1L1 o H2L2 sea al menos alrededor de 30% superior con respecto al tipo silvestre, y el emparejamiento relativo del otro esté dentro de alrededor de 10 % del tipo silvestre o al menos alrededor de 10 % superior con respecto al tipo silvestre.
Emparejamiento preferencial en conjuntos de diseños de Mab
El emparejamiento preferencial también puede evaluarse en el contexto de conjuntos de diseño de Mab en los cuales se expresan conjuntamente H1, L1, H2 y L2 y uno o más de H1, L1, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 y de H2 con L2 para formar una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica que comprenda un primer heterodímero emparejado correctamente (H1L1) y un segundo heterodímero emparejado correctamente (H2L2). En este tipo de realización, como se muestra en la Figura 8, cuando las dos secuencias polipeptídicas de cadena pesada de inmunoglobulina diferentes se expresan conjuntamente con dos secuencias polipeptídicas de cadena ligera de inmunoglobulina diferentes, es posible producir una cantidad de posibles productos, catorce de los cuales se muestran en la Figura 8, solamente uno de los cuales es el anticuerpo biespecífico deseado, o emparejado correctamente, H1L1H2L2 (especie de anticuerpo A en la Figura 8). Sin embargo, en el contexto de evaluar el emparejamiento correcto entre las cadenas pesadas y las cadenas ligeras en función de los conjuntos de diseño de Mab, también se puede considerar que algunos de los productos adicionales presentan emparejamiento correcto en el contexto de las regiones Fab dado que comprenden heterodímeros emparejados correctamente en el nivel Fab (ver, por ejemplo, especies de anticuerpo E, H, K y M en la Figura 8). En algunas realizaciones, la parte Fc de la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas que fomentan la formación de un Fc heterodimérico. En estas realizaciones, se espera que disminuyan el número y la cantidad de especies E a J.
Como en el caso de los conjuntos de diseño de LCCA, en el contexto de un conjunto de diseño de Mab en el cual se expresan conjuntamente las cuatro secuencias polipeptídicas de inmunoglobulina H1, L1, H2 y L2, en algunos casos puede haber una tendencia inherente en el emparejamiento, lo que genera que una de las cadenas ligeras (L1 o L2) se empareje preferentemente con H1 y H2. Por lo tanto, al determinar la potencia de un diseño de Mab en el contexto de una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica, puede ser necesario evaluar el grado de emparejamiento con las modificaciones de aminoácidos del diseño de Mab en comparación con la cantidad de emparejamiento correcto observado en el sistema original de tipo silvestre correspondiente (secuencias polipeptídicas H1, L1, H2, L2 sin las modificaciones de aminoácidos del diseño de Mab). Por lo tanto, en una realización, se considera que un diseño de Mab muestra emparejamiento preferencial si la cantidad de construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica emparejada correctamente es mayor que la cantidad de anticuerpo biespecífico deseado emparejado correctamente obtenida en el sistema original de tipo silvestre correspondiente. De manera alternativa, se considera que un diseño de Mab muestra emparejamiento preferencial si el porcentaje de construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica emparejada correctamente en el producto de expresión total es mayor que el porcentaje de anticuerpo biespecífico emparejado correctamente obtenido en el producto de expresión total en el sistema original de tipo silvestre correspondiente. En una realización, el producto de expresión total puede comprender especies de anticuerpo A a N en la Figura 8. En una realización, el producto de expresión total puede consistir únicamente en las especies de anticuerpo que presentan dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras (especies de anticuerpo A a J en la Figura 8). En la última realización, el emparejamiento preferencial se mide como porcentaje del anticuerpo biespecífico total, excluyendo los medio anticuerpos (tales como las especies K a N en la Figura 8).
En otra realización, se considera que un diseño de Mab muestra emparejamiento preferencial si aumenta la cantidad de emparejamiento preferencial en el heterodímero de la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica que presenta un grado alto de emparejamiento incorrecto en el sistema original de tipo silvestre correspondiente. En otra realización, se considera que un diseño de Mab muestra emparejamiento preferencial si la cantidad total de emparejamiento correcto entre H1 y L1 y entre H2 y L2 es mayor que el observado en el sistema original de tipo silvestre correspondiente. Por ejemplo, con referencia a la Figura 8, las especies A, B, H, I y M se considerarían emparejadas correctamente con respecto a H1L1, y las especies A, C, E, F y K se considerarían emparejadas correctamente con respecto a H2L2. En esta realización, el emparejamiento preferencial se mide como porcentaje del emparejamiento total.
En una realización, el emparejamiento preferencial se mide mediante SMCA como se describe en la presente.
En algunas realizaciones, se considera que un diseño de Mab fomenta el emparejamiento preferencial cuando el cambio en la cantidad de emparejamiento correcto total, según se mide mediante la suma de emparejamiento de H1L1 y H2L2, es superior a alrededor de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 % o 45 %, en comparación con el emparejamiento de las cadenas polipeptídicas de H1, L1, H2 y L2 correspondientes sin sustituciones de aminoácidos en la región Fab que fomenten el emparejamiento preferencial.
En algunas realizaciones, se considera que un diseño de Mab fomenta el emparejamiento preferencial cuando el cambio en la cantidad de emparejamiento correcto total, según se mide mediante la cantidad de anticuerpo biespecífico producido, como porcentaje de las especies distintas de los medio anticuerpos producido es superior a alrededor de 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 %, en comparación con el emparejamiento de las cadenas polipeptídicas de H1, L1, H2 y L2 correspondientes sin sustituciones de aminoácidos en la región Fab que fomenten el emparejamiento preferencial.
En una realización, se considera que un diseño de Mab fomenta el emparejamiento preferencial cuando el cambio en la cantidad de emparejamiento correcto total, según se mide mediante la cantidad de anticuerpo biespecífico producido, como porcentaje de todas las especies producidas, es superior a alrededor de 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 %, en comparación con el emparejamiento de las cadenas polipeptídicas de H1, L1, H2 y L2 correspondientes sin sustituciones de aminoácidos en la región Fab que fomenten el emparejamiento preferencial.
Estabilidad térmica de las regiones Fab
Las modificaciones de aminoácidos en una o más de las secuencias polipeptídicas de H1, L1, H2 y L2 fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1, en comparación con L2 y de H2 con L2, en comparación con L1, y afectan mínimamente la estabilidad térmica de cada heterodímero de la construcción polipeptídica de unión al antígeno. Se determina el efecto de las modificaciones de aminoácidos en cada heterodímero midiendo la estabilidad térmica de las regiones Fab formadas mediante H1 y L1, o mediante H2 y L2, y comparándola con la estabilidad térmica de una región Fab formada mediante las secuencias polipeptídicas H1 y L1 de tipo silvestre correspondientes (primera región Fab de tipo silvestre) o mediante las secuencias polipeptídicas H2 y L2 de tipo silvestre correspondientes (segunda región Fab de tipo silvestre). Las expresiones “secuencias polipeptídicas H1 y L1 de tipo silvestre correspondientes” y “secuencias polipeptídicas H2 y L2 de tipo silvestre correspondientes” pretenden describir las secuencias polipeptídicas H1, L1, H2 y L2 correspondientes que no tienen las modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial como se describe en la presente.
La estabilidad térmica se puede medir mediante diversos métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente, que incluyen calorimetría de barrido diferencial (DSC, por sus siglas en inglés) o fluorimetría de barrido diferencial (DSF, por sus siglas en inglés). Los últimos métodos proporcionan una medida de la estabilidad térmica en términos de “temperatura de fusión” o Tm.
En el contexto de las siguientes realizaciones, la expresión “alrededor de” se refiere a 10 % de la temperatura indicada. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una primera región Fab que tiene una Tm en alrededor de 20°C de la Tm de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una primera región Fab que tiene una Tm en alrededor de 15°C de la Tm de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una primera región Fab que tiene una Tm en alrededor de 10°C de la Tm de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una primera región Fab que tiene una Tm en alrededor de 9°C de la Tm de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una primera región Fab que tiene una Tm en alrededor de 8°C de la Tm de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una primera región Fab que tiene una Tm en alrededor de 7°C de la Tm de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una primera región Fab que tiene una Tm en alrededor de 6°C de la Tm de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una primera región Fab que tiene una Tm en alrededor de 5°C de la Tm de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una primera región Fab que tiene una Tm en alrededor de 4°C de la Tm de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una primera región Fab que tiene una Tm en alrededor de 3°C de la Tm de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una primera región Fab que tiene una Tm en alrededor de 2°C de la Tm de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una primera región Fab que tiene una Tm en alrededor de 1 °C de la Tm de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una primera región Fab que tiene una Tm que es aproximadamente igual que la de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una segunda región Fab que tiene una Tm en alrededor de 20°C de la Tm de la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una segunda región Fab que tiene una Tm en alrededor de 15°C de la Tm de la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una segunda región Fab que tiene una Tm en alrededor de 10°C de la Tm de la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una segunda región Fab que tiene una Tm en alrededor de 9°C de la Tm de la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una segunda región Fab que tiene una Tm en alrededor de 8°C de la Tm de la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una segunda región Fab que tiene una Tm en alrededor de 7°C de la Tm de la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una segunda región Fab que tiene una Tm en alrededor de 6°C de la Tm de la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una segunda región Fab que tiene una Tm en alrededor de 5°C de la Tm de la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una segunda región Fab que tiene una Tm en alrededor de 4°C de la Tm de la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una segunda región Fab que tiene una Tm en alrededor de 3°C de la Tm de la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una segunda región Fab que tiene una Tm en alrededor de 2°C de la Tm de la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una segunda región Fab que tiene una Tm en alrededor de 1 °C de la Tm de la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende una segunda región Fab que tiene una Tm que es aproximadamente igual que la de la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un primer heterodímero y un segundo heterodímero, donde la temperatura de fusión (Tm) de la primera región Fab se encuentra dentro de alrededor de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 20 °C de la Tm de una región Fab formada por las secuencias polipeptídicas H1 y L1 de tipo silvestre correspondientes para el primer antígeno (primera región Fab de tipo silvestre), y/o la temperatura de fusión (Tm) de la segunda región Fab se encuentra dentro de alrededor de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 20 °C de la Tm de una región Fab formada por las secuencias polipeptídicas H2 y L2 de tipo silvestre correspondientes para el segundo antígeno (segunda región Fab de tipo silvestre).
Además, en algunas realizaciones, la Tm de la primera o segunda región Fab es superior a la del primer Fab de tipo silvestre correspondiente o segundo Fab de tipo silvestre correspondiente. Por lo tanto, en una realización, la Tm de la primera o segunda región Fab aumenta en alrededor de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8. 0.9, 1.0, 1.1, 1.2,.1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.5, 5.0 °C o más en comparación con la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente o segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente.
En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende sustituciones de aminoácidos que corresponden a los números de diseño K-L 2979, 3018, 3041, 3102, 3898 y/o 3947. En una realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende sustituciones de aminoácidos que corresponden a los números de diseño K-L 3025, 3109, 3113, 3878, 3890, 3910, 3931, 3954, 3967, 4010 y/o 4040.
Capacidad de regiones Fab de unirse al antígeno
Las modificaciones de aminoácidos en una o más de las secuencias polipeptídicas de H1, L1, H2 y L2 fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1, en comparación con L2 y de H2 con L2, en comparación con L1, y afectan mínimamente la capacidad de cada heterodímero de la construcción polipeptídica de unión al antígeno de unirse a su antígeno. El efecto de las modificaciones de aminoácidos en cada heterodímero se determina midiendo la capacidad de las regiones Fab formadas mediante H1 y L1, o mdiante H2 y L2 de unirse a sus antígenos respectivos, y comparándola con la capacidad de la primera región Fab de tipo silvestre correspondiente, o la segunda región Fab de tipo silvestre correspondiente de unirse a sus antígenos respectivos.
La capacidad de las regiones Fab de unirse a sus antígenos respectivos se puede medir mediante diversos métodos conocidos en la técnica, algunos de los cuales se describen en otra parte de la presente. Por ejemplo, se pueden usar ensayos de resonancia de plasmones superficiales (SPR, por sus siglas en inglés) o de unión de células enteras para evaluar la capacidad de la primera región Fab de unirse a un primer antígeno o de la segunda región Fab de unirse a un segundo antígeno. Los últimos dos métodos miden la capacidad de las regiones Fab de unirse a sus respectivos antígenos al determinar la afinidad de la región Fab por su antígeno.
En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de alrededor de 100 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de alrededor de 50 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de alrededor de 40 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de alrededor de 30 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de alrededor de 20 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de alrededor de 10 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de alrededor de 9 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de alrededor de 8 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de alrededor de 7 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de alrededor de 6 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de alrededor de 5 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de 4 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de alrededor de 3 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno se encuentra dentro de alrededor de 2 veces de la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno. En una realización, la afinidad de la primera región Fab por el primer antígeno es aproximadamente igual a la afinidad de la primera región Fab de tipo silvestre por el primer antígeno.
En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 100 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 50 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 40 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 30 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 20 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 10 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 9 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 8 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 7 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 6 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 5 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de 4 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 3 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno se encuentra dentro de alrededor de 2 veces de la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno. En una realización, la afinidad de la segunda región Fab por el segundo antígeno es aproximadamente igual que la afinidad de la segunda región Fab de tipo silvestre por el segundo antígeno.
Capacidad de transferencia de modificaciones de aminoácidos o conjuntos de diseño
Las modificaciones de aminoácidos o conjuntos de diseño que se describen en la presente se pueden utilizar para preparar una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica en la cual las secuencias polipeptídicas de cadena pesada de inmunoglobulina y los polipéptidos de cadena ligera de inmunoglobulina de cada heterodímero pueden obtenerse de uno o más anticuerpos originales, donde al menos un anticuerpo original comprende una cadena ligera kappa, y al menos otro anticuerpo original comprende una cadena ligera lambda. En función de la siguiente descripción, los conjuntos de diseño de Mab pueden aplicarse a la mayoría de dichas construcciones polipeptídicas de unión al antígeno biespecíficas.
Los residuos de la interfaz VH:VL y CH1:CL en la interfaz entre las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina están relativamente bien conservados (Padlan et ál., 1986, Mol. Immunol. 23(9): 951-960). Esta conservación de secuencia, un resultado de restricciones evolutivas, aumenta la probabilidad de formación de dominios de unión a anticuerpos funcionalmente activos durante el emparejamiento combinatorio de cadenas pesada y ligera. Como resultado de esta conservación de la secuencia, los conjuntos de diseño de Mab descritos en la presente y basados en el modelado de las estructuras de Fab kappa D3H44 y Fab lambda CAT-2200, que impulsan el emparejamiento preferencial, pueden transferirse a los Fab kappa y los Fab lambda de otros anticuerpos originales para impulsar el emparejamiento preferencial, dado que esta región muestra conservación de secuencia elevada entre los anticuerpos. Además, cuando se producen diferencias en la secuencia, por lo general se encuentran alejadas de la interfaz CH1:CL. Particularmente este es el caso para los dominios CH1 y CL. En una realización, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente comprenden heterodímeros en los cuales el Fab kappa comprende una o más modificaciones de aminoácidos en los dominios CL y/o CH1 que fomentan el emparejamiento preferencial. En una realización, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente comprenden heterodímeros en los cuales el Fab lambda comprende una o más modificaciones de aminoácidos en los dominios CL y/o CH1 que fomentan el emparejamiento preferencial.
Existe, sin embargo, algo de variabilidad de secuencia en el sitio de unión a antígeno con respecto a los residuos de bucle (y longitud) de la CDR (regiones determinantes de complementariedad), particularmente para CDR-H3. Por lo tanto, en una realización, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente comprenden heterodímeros en los cuales el Fab kappa comprende una o más modificaciones de aminoácidos en los dominios VH y/o VL que están alejados de los bucles de CDR cuando la secuencia de aminoácidos del sitio de unión al antígeno es significativamente diferente de la del anticuerpo D3H44. En otra realización, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente comprenden heterodímeros en los cuales el Fab lambda comprende una o más modificaciones de aminoácidos en los dominios VH y/o VL que fomentan el emparejamiento preferencial y que están alejados de los bucles de CDR cuando la secuencia de aminoácidos del sitio de unión al antígeno es significativamente diferente de la del anticuerpo CAT-2200. En otra realización, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente comprenden heterodímeros en los cuales el Fab kappa comprende una o más modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial en los dominios VH y/o VL que están cerca o lejos de los bucles de CDR cuando la secuencia de aminoácidos del sitio de unión al antígeno es básicamente similar a la del anticuerpo D3H44. En otra realización, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente comprenden heterodímeros en los cuales el Fab lambda comprende una o más modificaciones de aminoácidos en los dominios VH y/o VL que fomentan el emparejamiento preferencial y que están cerca o lejos de los bucles de CDR cuando la secuencia de aminoácidos del sitio de unión al antígeno es básicamente similar a la del anticuerpo CAT-2200. En una realización, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente comprenden heterodímeros en los cuales el Fab kappa comprende una o más modificaciones de aminoácidos en los dominios CL y/o CH1, así como modificaciones en los dominios VH y/o VL que fomentan el emparejamiento preferencial. En una realización, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente comprenden heterodímeros en los cuales el Fab lambda comprende una o más modificaciones de aminoácidos en los dominios CL y/o CH1, así como modificaciones en los dominios VH y/o VL que fomentan el emparejamiento preferencial.
En una realización, las modificaciones de aminoácidos en una o más de H1, L1, H2 y L2 de la construcción polipeptídica de unión al antígeno pueden fomentar el emparejamiento preferencial en una construcción polipeptídica de unión al antígeno en la cual el Fab kappa de un anticuerpo original es una IgG1/Khumana o humanizada. Los ejemplos no taxativos de dichos anticuerpos originales incluyen Ofatumumab (humano) o Trastuzumab o Bevacizumab (humanizado). En una realización, las modificaciones de aminoácidos en una o más de H1, L1, H2 y L2 de la construcción polipeptídica de unión al antígeno pueden fomentar el emparejamiento preferencial en una construcción polipeptídica de unión al antígeno en la cual el Fab lambda de un anticuerpo original es una IgG1/lambda humana o humanizada. Los ejemplos no taxativos de dichos anticuerpos humanos incluyen Briakinumab o Sifalimumab, mientras que un ejemplo de un anticuerpo humanizado es Brontictuzumab.
En otra realización, las modificaciones de aminoácidos descritas en la presente son transferibles a las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de anticuerpos que utilizan los subgrupos VH y VL comúnmente usados.
En una realización, las modificaciones de aminoácidos descritas en la presente son transferibles a las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de anticuerpos que tienen un marco cerca de la línea germinal. Los ejemplos de dichos anticuerpos incluyen Obinutuzumab.
En una realización, las modificaciones de aminoácidos descritas en la presente son transferibles a las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de anticuerpos que tienen un ángulo interdominio VH:VL cerca al promedio observado para los pares de cadenas pesada y ligera. Un ejemplo de este tipo de anticuerpo incluye, de modo no taxativo, Pertuzumab. En otra realización, las modificaciones de aminoácidos descritas en la presente son transferibles a las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de anticuerpos que tienen dominios CL y CH1 canónicos. Los ejemplos adecuados de dichos anticuerpos incluyen, de modo no taxativo, Trastuzumab.
Los Ejemplos, Figuras y Tablas demuestran que las modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, dentro de uno o más fragmentos Fab que comprenden una región variable y una región constante) que fomentan el emparejamiento preferencial son transferibles a otras cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, lo que da como resultado patrones similares de emparejamiento preferencial de una cadena pesada de inmunoglobulina con una de las dos cadenas ligeras de inmunoglobulina.
Andamiajes
Los heterodímeros de la construcción polipeptídica de unión al antígeno se pueden enlazar a un andamiaje. Un andamiaje puede ser un péptido, polipéptido, polímero, nanopartícula u otra entidad química. Los heterodímeros de la construcción polipeptídica de unión al antígeno pueden estar enlazados al extremo N o C del andamiaje, donde el andamiaje es un polipéptido. En una realización, el andamiaje es un polipéptido de albúmina.
En otra realización, el andamiaje es un Fc de inmunoglobulina (Fc), o una parte de este. En algunas realizaciones, el Fc comprende al menos una o dos secuencias de dominio CH3. En algunas realizaciones, el Fc comprende, además, al menos una o dos secuencias de dominio CH2. En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno comprende un Fc acoplado, con o sin uno o más enlazadores, al primer heterodímero y/o el segundo heterodímero. En algunas realizaciones, el Fc es un Fc humano. En algunas realizaciones, el Fc es un Fc de IgG o IgG1 humana. En algunas realizaciones, el Fc es un Fc heterodimérico. En algunas realizaciones, un Fc es un solo polipéptido. En algunas realizaciones, un Fc son múltiples péptidos, por ejemplo, dos polipéptidos.
En algunas realizaciones, el Fc comprende una o más modificaciones de aminoácidos en al menos una de las secuencias de dominio CH3. Las modificaciones de aminoácidos pueden realizarse al Fc de inmunoglobulina para impulsar el emparejamiento preferencial entre las secuencias de dominio CH3 heterodiméricas con respecto a las secuencias de dominio CH3 homodiméricas. Dichas modificaciones de aminoácidos son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, las descritas en la publicación de patente estadounidense n.° 2012/0149876. Estrategias alternativas para impulsar el emparejamiento preferencial entre secuencias de dominio CH3 heterodiméricas con respecto a las secuencias CH3 homodiméricas incluyen, por ejemplo, “botones en ojales”, residuos cargados con interacciones iónicas, y también se pueden emplear tecnologías de dominio modificado por intercambio de cadenas (SEED, por sus siglas en inglés). Estas últimas estrategias se han descrito en la técnica y se reseñan en Kleine t ál,supra. A continuación sigue una descripción adicional de los dominios Fc.
En algunos aspectos, Fc es un Fc descrito en las solicitudes de patente PCT/CA2011/001238 (WO 2012/058768), presentada el 4 de noviembre de 2011 o PCT/CA2012/050780 (WO 2013/063702), presentada el 2 de noviembre de 2012.
En algunos aspectos, la construcción polipeptídica de unión al antígeno descrita en la presente comprende un Fc heterodimérico que comprende un dominio CH3 modificado que se modificó de forma asimétrica. El Fc heterodimérico puede comprender dos polipéptidos de dominio constante de cadena pesada: un primer polipéptido de cadena pesada y un segundo polipéptido de cadena pesada, que se pueden utilizar de manera intercambiable siempre y cuando el Fc comprenda un primer polipéptido de cadena pesada y un segundo polipéptido de cadena pesada. Generalmente, el primer polipéptido de cadena pesada comprende una primera secuencia de CH3 y el segundo polipéptido de cadena pesada comprende una segunda secuencia de CH3.
Dos secuencias de CH3 que comprenden una o más modificaciones de aminoácidos introducidas de forma asimétrica generalmente dan como resultado un Fc heterodimérico, en vez de un homodímero, cuando se dimerizan las dos secuencias de CH3. Tal como se usa en la presente, “modificaciones de aminoácidos asimétricas” hace referencia a cualquier modificación donde un aminoácido en una posición específica en una primera secuencia de CH3 es diferente del aminoácido en una segunda secuencia de CH3 en la misma posición, y la primera y la segunda secuencia de CH3 preferentemente se emparejan para formar un heterodímero, en vez de un homodímero. Esta heterodimerización puede ser un resultado de la modificación de solo uno de los dos aminoácidos en la misma posición de aminoácidos respectiva en cada secuencia; o la modificación de ambos aminoácidos en cada secuencia en la misma posición respectiva en cada una de las primera y segunda secuencias de CH3. La primera y segunda secuencia de CH3 de un Fc heterodimérico puede comprender una o más de una modificación de aminoácidos asimétrica.
La Tabla X proporciona la secuencia de aminoácidos de la secuencia de Fc de IgG1 humana, correspondiente a los aminoácidos 231 a 447 de la cadena pesada de IgG1 humana de longitud completa. La secuencia de CH3 comprende los aminoácidos 341-447 de la cadena pesada IgG1 humana de longitud completa.
Normalmente, un Fc puede incluir dos secuencias de cadena pesada contiguas (A y B) que son capaces de dimerizarse. En algunos aspectos, una o ambas secuencias de un Fc incluyen una o más mutaciones o modificaciones en las siguientes ubicaciones: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400 y/o N390, de acuerdo con la numeración de la UE. En algunos aspectos, un Fc incluye una secuencia mutante que se muestra en la Tabla X. En algunos aspectos, un Fc incluye las mutaciones de la Variante 1 A-B. En algunos aspectos, un Fc incluye las mutaciones de la Variante 2 A-B. En algunos aspectos, un Fc incluye las mutaciones de la Variante 3 A-B. En algunos aspectos, un Fc incluye las mutaciones de la Variante 4 A-B. En algunos aspectos, un Fc incluye las mutaciones de la Variante 5 A-B.
En algunas realizaciones, el Fc puede comprender una o más modificaciones de aminoácidos en al menos una de las secuencias de dominio CH2. En la técnica se conocen una cantidad de mutaciones en la secuencia de cadena pesada del Fc para alterar de forma selectiva la afinidad del Fc de anticuerpo para los diferentes receptores Fc gamma. En algunas realizaciones, el Fc comprende una o más modificaciones para modificar la unión de los receptores Fc-gamma a la construcción polipeptídica de unión al antígeno.
El dominio CH2 corresponde a los aminoácidos 231-340 de la secuencia que se muestra en la Tabla X. A continuación, se enumeran ejemplos de modificaciones de aminoácidos no taxativas que modifican la capacidad del Fc de la construcción polipeptídica de unión al antígeno de unirse a receptores Fc-gamma:
S298A/E333A/K334A, S298A/E333A/K334A/K326A (Lu Y, Vernes JM, Chiang N, et ál. J Immunol Methods. 28 de febrero de 2011;365( 1-2):132-41);
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen JB, Gorlatov S, Tuaillon N, et ál. Cancer Res. 15 de setiembre de 2007; 67(18):8882-90; Nordstrom JL, Gorlatov S, Zhang W, et ál. Breast Cancer Res. 30 de noviembre de 2011;13(6):R123); F243L (Stewart R, Thom G, Levens M, et ál. Protein Eng Des Sel. setiembre de 2011;24(9):671-8.), S298A/E333A/K334A (Shields RL, Namenuk AK, Hong K, et ál. J Biol Chem. 2 de marzo de 2001;276(9):6591-604);
S239D/I332E/A330L, S239D/I332E (Lazar GA, Dang W, Karki S, et ál. Proc Natl Acad Sci U S A. 14 de marzo de 2006;103(11):4005-10); S239D/S267E, S267E/L328F (Chu SY, Vostiar I, Karki S, et ál. Mol Immunol. setiembre de 2008;45(15):3926-33);
S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/S298A/K326A/A327H, G237F/S298A/A330L/
I332E, S239D/I332E/S298A, S239D/K326E/A330L/I332E/S298A, G236A/S239D/D270L/I332E, S239E/S267E /H268D, L234F/S267E/N325L, G237F/V266L/S267D y otras mutaciones enumeradas en WO2011/120134 y WO2011/120135, que se incorporan a la presente mediante esta referencia.T he ra p e u tic A n tib o d y E n g in e e rin g(by William R. Strohl y Lila M. Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9, octubre de 2012) describe modificaciones adicionales al Fc que afectan la unión del Fc a los receptores Fc-gamma en la página 283.
Modificaciones adicionales para mejorar la función efectora
En algunas realizaciones, el Fc de la construcción polipeptídica de unión al antígeno descrita en la presente se puede modificar para mejorar su función efectora. Dichas modificaciones son conocidas en la técnica e incluyen afucosilación, o modificación genética de la afinidad de la parte Fc de anticuerpos hacia un receptor de activación, principalmente FCGR3a para ADCC, y hacia C1q para CDC. La siguiente Tabla Y resume varios
Por lo tanto, en una realización, una construcción polipeptídica de unión al antígeno descrita en la presente puede incluir un Fc dimérico que comprende una o más modificaciones de aminoácidos tal como se indicó en la tabla anterior que confiere función efectora mejorada. En otra realización, la construcción polipeptídica de unión al antígeno se puede afucosilar para mejorar la función efectora.
Unión a FcRn y parámetros PK
Tal como se conoce en la técnica, la unión a FcRn recicla en anticuerpo endocitosado desde el endosoma nuevamente hacia el flujo sanguíneo (Raghavan et ál., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et ál., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766). Este proceso, acoplado con la exclusión de filtración de riñón debido al gran tamaño de la molécula de longitud completa, da como resultado semividas en suero del anticuerpo favorables que oscilan de una a tres semanas. La unión de Fc a FcRn también cumple un rol clave en el transporte de anticuerpos. Por lo tanto, en una realización, el Fc comprende una o más modificaciones de aminoácidos que modifican o fomentan la capacidad del Fc de unirse a FcRn.
Enlazadores
Las construcciones descritas en la presente pueden incluir uno o más heterodímeros descritos en la presente acoplados de forma operativa a un Fc descrito en la presente. En algunos aspectos, el Fc está acoplado al uno o más heterodímeros con o sin uno o más enlazadores. En algunos aspectos, el Fc está acoplado directamente al uno o más heterodímeros. En algunos aspectos, el Fc está acoplado al uno o más heterodímeros mediante uno o más enlazadores. En algunos aspectos, el Fc está acoplado a la cadena pesada de cada heterodímero mediante un enlazador.
En algunos aspectos, el uno o más enlazadores son uno o más enlazadores de polipéptidos. En algunos aspectos, el uno o más enlazadores comprenden una o más regiones bisagra del anticuerpo. En algunos aspectos, el uno o más enlazadores comprenden una o más regiones bisagra de IgG1.
Modificaciones opcionales adicionales
En una realización, las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de la construcción polipeptídica de unión al antígeno descrita en la presente se pueden modificar adicionalmente (es decir, mediante la unión covalente de varios tipos de moléculas) de modo que la unión covalente no interfiera con el emparejamiento preferencial entre la cadena pesada y las cadenas ligeras o afecte la capacidad del heterodímero de unirse a su antígeno, o afecte su estabilidad. Dicha modificación incluye, por ejemplo, de modo no taxativo, glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Se puede realizar cualquiera de las numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas que incluyen, de modo no taxativo, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc.
En otra realización, las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de la construcción polipeptídica de unión al antígeno descrita en la presente se pueden conjugar (directa o indirectamente) con un agente terapéutico o resto de fármaco que modifica una respuesta biológica determinada. En determinadas realizaciones, una construcción polipeptídica de unión al antígeno se conjuga con un fármaco, por ejemplo, una toxina, un agente quimioterapéutico, un inmunomodulador o un radioisótopo. Se conocen en la técnica varios métodos para preparar ADC (conjugados de anticuerpo-fármaco o conjugados de construcción polipeptídica de unión al antígeno-fármaco) y se describen en las patentes estadounidenses 8,624,003 (método de una etapa), 8,163,888 (una etapa) y 5,208,020 (método de dos etapas), por ejemplo. En algunas realizaciones, el fármaco se selecciona de una maitansina, auristatina, caliqueamicina o derivado de estas. En otras realizaciones, el fármaco es una maitansina seleccionada de DM1 y DM4.
En algunas realizaciones, la construcción polipeptídica de unión al antígeno se conjuga con un agente citotóxico. La expresión “agente citotóxico”, como se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o provoca destrucción celular. Se pretende que la expresión incluya isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 y Lu177), agentes quimioterapéuticos y toxinas, tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas activas de forma enzimática de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, inclusive fragmentos y/o variantes de estos.
No debe interpretarse que los agentes terapéuticos o restos de fármaco se limitan a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, Onconasa (u otra RNasa citotóxica), exotoxina de pseudomonas, toxina del cólera o toxina de la difteria; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, interferón alfa, interferón beta, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador tisular del plasminógeno, un agente apoptótico, por ejemplo, TNF-alfa, TNF-beta, AIM I (véase, publicación internacional n.° WO 97/33899), AIM II (véase, publicación internacional n.° WO 97/349l1), Ligando Fas (Takahashi et ál., 1994, J. Immunol., 6:1567) y VEGI (véase, publicación internacional n.° WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o, un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina 1 (“ IL-1”), interleucina 2 (“ IL-2”), interleucina 6 (“ IL-6”), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (“GM-CSF”), y factor estimulante de colonias de granulocitos (“G-CSF”)), o un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento (“GH”)). Además, en una realización alternativa, la construcción polipeptídica de unión al antígeno se puede conjugar con restos terapéuticos tales como materiales radioactivos o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos (véanse anteriormente los ejemplos de materiales radioactivos). En determinadas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"-tetraacético (DOTA) que se puede unir al anticuerpo mediante una molécula enlazadora. Dichas moléculas enlazadoras son conocidas comúnmente en la técnica y se describen en Denardo et ál., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483; Peterson et ál., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; y Zimmerman et ál., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943.
En algunas realizaciones, las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de la construcción polipeptídica de unión al antígeno se expresan como proteínas de fusión que comprenden una etiqueta para facilitar la purificación y/o análisis etc. Tal como se usa en la presente, una “etiqueta” es cualquier serie de aminoácidos agregada que se proporciona en una proteína ya sea en el extremo C, el extremo N o internamente que contribuye a la identificación o purificación de la proteína. Las etiquetas adecuadas incluyen, de modo no taxativo, etiquetas que los expertos en la técnica saben que son útiles en la purificación y/o análisis tal como dominio de unión a albúmina (ABD), etiqueta His, etiqueta FLAG, glutationa-s-transferasa, hemaglutinina (HA) y proteína de unión a maltosa. Dichas proteínas etiquetadas también se pueden modificar genéticamente para que comprendan un sitio de escisión, tal como una trombina, enterocinasa o sitio de escisión de factor X, para la fácil eliminación de la etiqueta antes, durante o después de la purificación.
Métodos para preparar construcciones polipeptídicas de unión al antígeno
Como se describió anteriormente, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente pueden comprender un primer heterodímero y un segundo heterodímero, el primer heterodímero comprende una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de esta con al menos un dominio VH y CH1, y una cadena ligera lambda de inmunoglobulina con un dominio VL y un dominio CL, y el segundo heterodímero comprende una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de esta con al menos un dominio VH y CH1, y una cadena ligera kappa de inmunoglobulina con un dominio VL y un dominio CL. Las secuencias polipeptídicas de inmunoglobulina se modifican genéticamente para incorporar modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial como se describe en la presente. Por consiguiente, en el caso de una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica, comúnmente hay cuatro secuencias polipeptídicas diferentes, dos secuencias polipeptídicas de cadena pesada de inmunoglobulina o fragmentos de estas y dos secuencias polipeptídicas de cadena ligera de inmunoglobulina, que conforman la construcción polipeptídica de unión al antígeno. Las secuencias polipeptídicas de cadena pesada de inmunoglobulina y las secuencias polipeptídicas de cadena ligera de inmunoglobulina de la construcción polipeptídica de unión al antígeno se pueden preparar fácilmente usando tecnología de ADN recombinante conocida en la técnica. Las técnicas estándar tal como, por ejemplo, aquellas descritas en Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3.a ed., 2001); Sambrook et ál., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2.a ed., 1989); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et ál., John Wiley and Sons, Nueva York, 4.a ed., 1999); y Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principies and Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 2.a ed., 1998) se pueden usar para métodos de ácidos nucleicos recombinantes, síntesis de ácidos nucleicos, cultivo celular, incorporación de transgenes y expresión de proteínas recombinantes.
Las secuencias de polinucleótidos y de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de los anticuerpos originales que conforman la construcción polipeptídica de unión al antígeno son conocidas en la técnica o se pueden determinar fácilmente usando métodos de secuenciación de ácidos nucleicos y/o proteínas.
Por consiguiente, también se proporcionan polinucleótidos o un conjunto de polinucleótidos que codifican las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de la construcción polipeptídica de unión al antígeno. Dichos polinucleótidos incluyen ADN y ARN en forma tanto de cadena simple como de cadena doble, así como las secuencias complementarias correspondientes. El ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado químicamente, ADN amplificado por PCR y combinaciones de estos. Los polinucleótidos incluyen genes de longitud completa o moléculas de ADNc, así como una combinación o fragmentos de estos.
Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina modificados genéticamente descritos en la presente se pueden preparar mediante mutagénesis dirigida al sitio de nucleótidos en el ADN que codifica el polipéptido, usando mutagénesis de casete o por PCR u otras técnicas conocidas en la técnica, para producir ADN que codifica los polipéptidos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina modificados genéticamente y, a continuación, expresando el ADN recombinante en un cultivo celular como se detalla en la presente. Sin embargo, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina modificados genéticamente también se pueden preparar mediante síntesis génicain v itrousando las técnicas establecidas.
Como reconocerán los expertos en la técnica, debido a la degeneración del código genético, puede producirse una cantidad extremadamente grande de polinucleótidos, los cuales codifican los polipéptidos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina modificados genéticamente descritos en la presente. Por lo tanto, habiendo identificado una secuencia de aminoácidos particular, los expertos en la técnica podrán producir cualquier cantidad de polinucleótidos diferentes, simplemente mediante la modificación de la secuencia de uno o más codones de una forma que no cambie la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada.
También se proporcionan sistemas de expresión y construcciones en forma de plásmidos, vectores de expresión, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido como se indicó anteriormente. También se proporcionan células hospedadoras que comprenden dichos sistemas de expresión o construcciones.
Comúnmente, los vectores de expresión usados en las células hospedadoras contendrán secuencias para el mantenimiento de plásmidos y para la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenas. Dichas secuencias, referidas en forma colectiva como “secuencias flanqueantes”, en determinadas realizaciones incluirán normalmente una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia de intrones completa que contiene un sitio de corte donante y aceptor, una secuencia que codifica una secuencia líder para la secreción de polipéptidos, un sitio de unión a ribosomas, una secuencia de poliadenilación, una región poliligadora para insertar el polinucleótido que codifica el polipéptido a expresarse y un elemento marcador seleccionable. El vector puede ser multicistrónico, es decir, que expresa dos o más de los polinucleótidos que codifican las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de la construcción polipeptídica de unión al antígeno, o la construcción polipeptídica de unión al antígeno puede expresarse mediante un conjunto de vectores, donde cada vector expresa uno o más de los polinucleótidos. La construcción polipeptídica de unión al antígeno también puede expresarse usando un conjunto de vectores que comprenden una combinación de vectores multicistrónicos y vectores que comprenden un único polinucleótido que codifica una de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina.
En algunas realizaciones, el vector puede contener una secuencia que codifica “etiquetas”, es decir, una molécula de oligonucleótido ubicada en el extremo 5' o 3' de la secuencia de codificación de polipéptidos; la secuencia de oligonucleótidos codifica poliHis (tal como hexaHis), u otra “etiqueta” tal como FLAG, HA (hemaglutinina del virus de la influenza), o myc, para las que existen anticuerpos comercialmente disponibles. Esta etiqueta normalmente se fusiona al polipéptido tras la expresión del polipéptido y puede servir como medio para la purificación por afinidad o detección del polipéptido de la célula hospedadora. La purificación por afinidad puede lograrse, por ejemplo, mediante cromatografía en columna usando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz de afinidad. De manera opcional, posteriormente la etiqueta puede retirarse del polipéptido purificado mediante diversos medios tales como escisión de peptidasa.
Los vectores usualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y está enlazado de forma operativa al polinucleótido que codifica el polipéptido. Los promotores son secuencias no transcritas ubicadas antes (es decir, 5') que el codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 bp) que controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores tradicionalmente se agrupan en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician los niveles aumentados de transcripción de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Los promotores constitutivos, por el contrario, transcriben uniformemente el gen al que están enlazados de forma operativa, es decir, con poco o ningún control sobre la expresión génica. Se conoce una gran cantidad de promotores, reconocidos por diversas células hospedadoras potenciales.
Los promotores adecuados para uso con hospedadores de levadura, hospedadores bacterianos y hospedadores de insectos son conocidos en la técnica. Los potenciadores de levadura se usan ventajosamente con los promotores de levadura. Los promotores adecuados para usar con células hospedadoras de mamíferos son conocidos e incluyen, de modo no taxativo, los obtenidos de los genomas de virus tal como poliomavirus, viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y con mayor preferencia Virus del Simio 40 (SV40). Otros promotores mamíferos adecuados incluyen promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de actina.
El vector puede contener uno o más elementos que faciliten la expresión cuando el vector se integra al genoma de la célula hospedadora. Los ejemplos incluyen un elemento EASE (Aldrich et ál. 2003 Biotechnol Prog.
19:1433-38) y una región de unión a la matriz (MAR). Las MAR median la organización estructural de la cromatina y pueden aislar el vector integrado de efectos de “posición”. Por lo tanto, las MAR son particularmente útiles cuando el vector se usa para crear transfectantes estables. En la técnica se conoce una cantidad de ácidos nucleicos que contienen MAR naturales y sintéticos, por ejemplo, las patentes estadounidenses N.° 6,239,328; 7,326,567; 6,177,612; 6,388,066; 6,245,974; 7,259,010; 6,037,525; 7,422,874; 7,129,062.
Luego de construir el vector y de insertar el polinucleótido en el sitio adecuado del vector, el vector completo puede insertarse en una célula hospedadora adecuada para la amplificación y/o la expresión del polipéptido. La transformación de un vector de expresión en una célula hospedadora seleccionada puede lograrse mediante métodos conocidos, los cuales incluyen transfección, infección, coprecipitación con fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, transfección mediada por DEAE-dextrano u otras técnicas conocidas. El método seleccionado dependerá, en parte, del tipo de célula hospedadora a utilizarse. Las células hospedadoras pueden transfectarse de manera transitoria o las células hospedadoras pueden transfectarse de manera estable. Estos métodos y otros métodos adecuados son conocidos por el experto en la técnica y se establecen, por ejemplo, en Sambrook et ál., 2001, supra.
Para la producción a largo plazo de alto rendimiento de proteínas recombinantes, a menudo se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden preparar las líneas celulares que expresan de forma estable las cadenas pesadas y ligeras modificadas genéticamente de la construcción polipeptídica de unión al antígeno. En vez de usar los vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células hospedadoras se pueden transformar con ADN controlado por elementos de control de expresión adecuada (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Luego de la introducción del ADN o polinucleótido foráneo, las células modificadas genéticamente se pueden dejar crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante otorga resistencia a la selección y permite que las células integren establemente al plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez se pueden clonar y expandir en líneas celulares.
Se pueden usar varios sistemas de selección, incluyendo, de modo no taxativo, la timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigler et ál., 1977, Cell 11 :223), fosforribosiltransferasa de hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), y los genes de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et ál., 1980, Cell 22:817) se pueden emplear en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Además, la resistencia antimetabolito se puede usar como la base de selección para dhfr que otorga resistencia al metotrexato (Wigler et ál., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare et ál., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que otorga resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que otorga resistencia al aminoglucósido G-418 (Colberre-Garapin et ál., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); y hygro, que otorga resistencia a los genes de higromicina (Santerre et ál., 1984, Gene 30:147).
Una célula hospedadora, cuando se cultiva en condiciones adecuadas, produce la construcción polipeptídica de unión al antígeno que puede recolectarse posteriormente del medio de cultivo (si la célula hospedadora la secreta en el medio) o directamente de la célula hospedadora que la produce (si no es secretada). La selección de una célula hospedadora adecuada dependerá de diversos factores, tales como los niveles de expresión deseados, las modificaciones del polipéptido que son deseables o necesarias para la actividad (tales como glicosilación o fosforilación) y la facilidad para plegarse en una molécula biológicamente activa. Una célula hospedadora puede ser eucariota o procariota. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano producirá un producto no glicosilado y la expresión en levadura producirá un producto glicosilado. Se pueden usar las células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado de la transcripción primaria (por ejemplo, glicosilación y fosforilación) del producto genético.
Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadoras para la expresión son conocidas en la técnica e incluyen, de modo no taxativo, líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y cualquier línea celular usada en un sistema de expresión que se conozca en la técnica puede usarse para producir los polipéptidos recombinantes descritos en la presente. En general, las células hospedadoras se transforman con un vector de expresión recombinante que comprende ADN que codifica la construcción polipeptídica de unión al antígeno. Entre las células hospedadoras que se pueden emplear están las células procariotas, de levadura o eucariotas mayores. Las procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o bacilli. Las células eucariotas mayores incluyen células de insectos y líneas celulares establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células renales de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et ál., 1981, Cell 23:175), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), o sus derivados como Veggie CHO y líneas celulares relacionadas que crecen en medios libres de suero (Rasmussen et ál., 1998, Cytotechnology 28: 31), células HeLa, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) como describe en McMahan et ál., 1991, EMBO J. 10: 2821, células renales de embriones humanos como las 293, 293 EBNA o MSR 293, células epidérmicas humanas A431, células humanas Colo205, otras líneas celulares transformadas de primates, células normales diploides, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, HL-60, U937, HaK o células Jurkat. De manera alternativa, es posible producir el polipéptido en eucariontes menores tales como levaduras o en procariontes tales como bacterias. Las levaduras adecuadas incluyenS a cch a ro m yce s ce rev is iae , S ch izo sa cch a ro m yce s pom be , K lu yve ro m yce sstrains,C and ida ,o cualquier cepa de levadura que pueda expresar polipéptidos heterólogos. Las cepas bacterianas adecuadas incluyenE sch e rich ia coli, B a c illu s sub tilis , S a lm o n e lla typh im u riu m ,o cualquier cepa bacteriana que pueda expresar polipéptidos heterólogos.
Si la construcción polipeptídica de unión al antígeno se produce en levaduras o bacterias, puede ser deseable modificar el producto allí producido, por ejemplo, mediante la fosforilación o glicosilación de los sitios adecuados, con el fin de obtener un producto funcional. Dichos enlaces covalentes pueden lograrse usando métodos químicos o enzimáticos conocidos. También se puede producir la construcción polipeptídica de unión al antígeno mediante el enlace de forma operativa de los polinucleótidos a secuencias de control adecuadas en uno o más vectores de expresión de insectos y empleando un sistema de expresión de insectos. Los materiales y métodos para los sistemas de expresión de baculovirus/células de insectos están comercialmente disponibles en forma de kit, por ejemplo, de Invitrogen, San Diego, Calif., EUA (el kit MaxBac™) y dichos métodos se conocen en la técnica, como se describe en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), y Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Los vectores de clonación y de expresión adecuados para el uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero fueron descritos por Pouwels et ál. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985).
En determinadas realizaciones, se pueden utilizar los sistemas de expresión de proteínas sin células para coexpresar polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos de cadena pesada y ligera) del conjunto de polinucleótidos sin el uso de células vivas. En lugar de eso, todos los componentes necesarios para transcribir ADN en ARN y traducir el ARNA en proteína (por ejemplo, ribosomas, ARNt, enzimas, cofactores, aminoácidos) se proporcionan en solución para usarin vitro.En determinadas realizaciones, la expresiónin v itrorequiere (1) la plantilla genética (ARNm o ADN) que codifica los polipéptidos de cadena pesada y ligera y (2) una solución de reacción que contiene la maquinaria molecular de transcripción y traducción necesaria. En determinadas realizaciones, los extractos celulares sustancialmente suministran componentes de la solución de reacción, por ejemplo: ARN polimerasas para la transcripción de ARNm, ribosomas para la traducción de polipéptidos, ARNt, aminoácidos, cofactores enzimáticos, una fuente de energía y componentes celulares esenciales para el plegamiento de proteínas adecuado. Los sistemas de expresión de proteínas sin células se pueden preparar usando lisados derivados de células bacterianas, células de levadura, células de insectos, células vegetales, células de mamíferos, células humanas o combinaciones de estas. Dichos lisados celulares pueden proporcionar la composición y proporción correcta de enzimas y componentes básicos necesarios para la traducción. En algunas realizaciones, se retiran las membranas celulares para dejar solamente los componentes citosólicos y orgánulos de la célula.
En la técnica se conocen varios sistemas de expresión de proteínas sin células tal como se reseña en Carlsone t ál.(2012) Biotechnol. Adv. 30:1185-1194. Por ejemplo, los sistemas de expresión de proteínas sin células están disponibles en función de células procariotas o eucariotas. Los ejemplos de sistemas de expresión de proteínas sin células procariotas incluyen los deE. coli.Los sistemas de expresión de proteínas sin células eucariotas están disponibles en función de extractos de reticulocitos de conejo, germen de trigo y células de insectos, por ejemplo. Dichos sistemas de expresión de proteínas sin células procariotas y eucariotas están comercialmente disponibles de empresas tales como Roche, Invitrogen, Qiagen y Novagen. Un experto en la técnica podrá seleccionar fácilmente los sistemas de expresión de proteínas sin células adecuados que producirán polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos de cadena pesada y cadena ligera) que son capaces de emparejarse entre sí. Además, el sistema de expresión de proteínas sin células también se puede suplementar con chaperonas (por ejemplo, BiP) e isomerasas (por ejemplo, isomerasa disulfuro) para mejorar la eficacia del plegamiento de IgG.
Coexpresión de cadenas pesadas y cadenas ligeras
Las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina modificadas genéticamente de la construcción polipeptídica de unión al antígeno descrita en la presente se pueden expresar conjuntamente en células de mamífero, tal como se indicó anteriormente. En una realización, las cadenas pesadas de inmunoglobulina y las cadenas ligeras de inmunoglobulina de la construcción polipeptídica de unión al antígeno se expresan conjuntamente en una célula hospedadora. Por lo tanto, en el caso de una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica, se expresan conjuntamente dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina en una célula hospedadora. Sin embargo, también se conocen en la técnica métodos alternativos de producción de construcciones polipeptídicas de unión al antígeno biespecíficas que no dependen del uso de una línea celular única clonal o transitoria que expresa las cuatro cadenas (Gramer, et ál. (2013) mAbs 5, 962; Strop et ál. (2012) J Mol Biol 420, 204.). Estos métodos dependen del intercambio de brazos postproducción en condiciones redox de los pares de cadena ligera y pesada que participan en la<formación del anticuerpo biespecífico (producción Redox). En este enfoque, los heterodímeros H>1<L>1<y H2L2>pueden expresarse en dos líneas celulares diferentes para producir independientemente los dos heterodímeros. Posteriormente, los dos heterodímeros se mezclan en condiciones redox selectas para lograr la reasociación de las dos cadenas pesadas únicas H1 y H2 para formar la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica que comprende H1L1H2L2.
Si bien el emparejamiento preferencial es impulsado principalmente mediante la incorporación de las modificaciones de aminoácidos del conjunto de diseño de Mab en los polipéptidos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, la cantidad de heterodímeros emparejados correctamente puede optimizarse adicionalmente variando la relación de los polinucleótidos que codifican cada polipéptido entre sí, como se muestra en los Ejemplos.
Análisis de construcciones polipeptídicas de unión al antígeno
Como se describió anteriormente, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno comprenden un primer heterodímero que comprende H1 y L1, así como un segundo heterodímero que comprende H2 y L2, donde L1 es una cadena ligera lambda, y L2 es una cadena ligera kappa, y H1 y H2 son distintos entre sí. Uno o más de H1, L1, H2 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1, en comparación con L2 y de H2 con L2, en comparación con L1. La primera región Fab del heterodímero H1L1 y la segunda región Fab del heterodímero H2L2 pueden unirse al antígeno con una afinidad similar a la primera región Fab de tipo silvestre o la segunda región Fab de tipo silvestre correspondientes. La primera región Fab del heterodímero H1L1 y la segunda región Fab del heterodímero H2L2 también muestran estabilidad térmica comparable a la de la primera región Fab de tipo silvestre o la segunda región Fab de tipo silvestre correspondientes.
La afinidad de cada heterodímero del par de heterodímeros con su antígeno respectivo se puede evaluar tal como se describe a continuación. La estabilidad térmica de cada heterodímero del par de heterodímeros también se puede evaluar tal como se describe a continuación.
En una realización, una cadena pesada se coexpresa con dos cadenas ligeras diferentes en un conjunto de diseño de LCCA tal como se describió anteriormente, donde la cadena pesada se empareja preferentemente con una de las dos cadenas ligeras. En otra realización, dos cadenas pesadas únicas se coexpresan con dos cadenas ligeras únicas, donde cada cadena pesada se empareja preferentemente con una de las cadenas ligeras.
Métodos para medir el emparejamiento preferencial
El grado de emparejamiento preferencial se puede evaluar, por ejemplo, usando los métodos descritos más adelante y en los ejemplos. El emparejamiento preferencial se puede evaluar en el contexto de los conjuntos de diseño de LCCA (H1L1L2 o H2L1L2) o los conjuntos de diseño de Mab (H1L1H2L2).
En una realización, es posible usar un ensayo de competencia de cadena ligera (LCCA) para evaluar el emparejamiento preferencial en el contexto de los conjuntos de diseño de LCCA. La solicitud de patente de titularidad compartida PCT/US2013/063306 (WO 2014/055784), presentada el 3 de octubre de 2013, describe varias realizaciones de LCCA y se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines. El método permite el análisis cuantitativo del emparejamiento de cadenas pesadas con cadenas ligeras específicas dentro de la mezcla de proteínas coexpresadas y se puede usar para determinar si una cadena pesada de inmunoglobulina particular se asocia de forma selectiva a cualquiera de las dos cadenas ligeras de inmunoglobulina cuando la cadena pesada y las cadenas ligeras están coexpresadas. El método se describe brevemente de la siguiente manera: Se expresan conjuntamente al menos una cadena pesada y dos cadenas ligeras distintas en una célula, en relaciones tales que la cadena pesada sea el reactivo de emparejamiento limitante. Las cadenas pesadas y cadenas ligeras pueden etiquetarse para facilitar la detección. Las proteínas secretadas pueden separarse de la célula, y los polipéptidos de cadena ligera de inmunoglobulina unidos a la cadena pesada se aíslan de otras proteínas secretadas para producir una fracción emparejada de cadena pesada aislada. Luego, se detecta la cantidad de cada cadena ligera distinta en la fracción de cadena pesada aislada, y la cantidad relativa de cada cadena ligera distinta en la fracción de cadena pesada aislada se analiza para determinar la capacidad de la cadena pesada de emparejarse selectivamente con una de las cadenas ligeras. En los Ejemplos se proporcionan más detalles con respecto a una realización de este método.
En otra realización, se evalúa el emparejamiento preferencial en el contexto de conjuntos de diseño de Mab, donde se expresan conjuntamente H1, l 1, H2 y l2. En esta realización, uno o más de H1, L2, H2 y L2 pueden etiquetarse para facilitar la detección y el análisis. Las especies resultantes de cadenas pesadas y cadenas ligeras emparejadas se evalúan usando LCMS (cromatografía líquida - espectrometría de masa), en función de las diferencias en el peso molecular de cada especie. También se puede usar un ensayo de actividad de antígeno para cuantificar las poblaciones de heterodímeros relativas que contienen cada cadena ligera, a través del cual se puede usar el grado de unión medido (con respecto a los controles) para calcular cada población de heterodímeros respectiva.
Estabilidad térmica
La estabilidad térmica de los heterodímeros se puede determinar de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. La temperatura de fusión de cada heterodímero indica su estabilidad térmica. El punto de fusión del heterodímero se puede medir usando técnicas tal como la calorimetría diferencial de barrido (Chen et ál (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et ál (1999) Immunol Lett 68:47-52). De manera alternativa, la estabilidad térmica del heterodímero se puede medir usando el dicroísmo circular (Murray et ál. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
Afinidad con el antígeno
La afinidad de unión de los heterodímeros con sus antígenos respectivos y la tasa de disociación de la interacción se puede determinar mediante ensayos de unión competitiva de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Un ejemplo de un ensayo de unión competitivo es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de un antígeno etiquetado (por ejemplo, 3H o 125I con una molécula de interés (por ejemplo, heterodímeros descritos en la presente) en presencia de cantidades en aumento del antígeno no etiquetado y la detección de la molécula unida al ligando etiquetado. La afinidad de los heterodímeros por el antígeno y las tasas de disociación de la unión se pueden determinar a partir de los datos de saturación mediante el análisis Scatchard.
Los parámetros cinéticos de un heterodímero descritos en la presente también se pueden determinar usando ensayos basados en la resonancia de plasmones superficiales (SPR) conocidos en la técnica (por ejemplo, análisis cinético de BIAcore). Para una reseña de la tecnología basada en SPR véase Mullet et ál., 2000, Methods 22: 77-91; Dong et ál., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et ál., 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich et ál., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61. De manera adicional, cualquiera de los instrumentos de SPR y los métodos basados en SPR para medir las interacciones de proteína-proteína descritos en las patentes estadounidenses N.° 6,373,577; 6,289,286; 5,322,798; 5,341,215; 6,268,125 se contemplan en los métodos de la invención. También se puede usar FACS para medir la afinidad, tal como se conoce en la técnica
Composiciones farmacéuticas
En la presente también se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción polipeptídica de unión al antígeno, y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, “farmacéuticamente aceptable” significa que está aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, o se menciona en la Farmacopea de EUA o en otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, que incluyen los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de maní, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Se prefiere agua como portador cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Se pueden emplear también soluciones salinas y soluciones de dextrosa y glicerol acuosas como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos aceptables incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Si así se desea, la composición también puede contener cantidades pequeñas de agentes humectantes, agentes emulsionantes o agentes amortiguadores de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como los triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. EnR e m in g to n 's P h a rm a c e u tic a l S c ie nce sde E. W. Martin se describen ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma para la administración adecuada al paciente. La formulación debería adaptarse al modo de administración.
En determinadas realizaciones, la composición que comprende la construcción polipeptídica de unión al antígeno se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en amortiguador acuoso isotónico estéril. En los casos que sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de inyección. Por lo general, los ingredientes se suministran ya sea por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado sin agua en un recipiente sellado herméticamente, tal como una ampolla o sachet que indique la cantidad del agente activo. En los casos en que la composición se deba administrar por infusión, se puede dosificar con un frasco de infusión que contiene agua de grado farmacéutico estéril o solución salina. En los casos en que la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua esterilizada para inyección o solución salina de modo que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.
En determinadas realizaciones, las composiciones descritas en la presente se formulan como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como las derivadas de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con cationes tales como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, isopropilamina de hidróxido férrico, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
La cantidad de la composición descrita en la presente que será eficaz en el tratamiento, inhibición y prevención de una enfermedad o trastorno asociado a la expresión y/o actividad anómala de una proteína terapéutica se puede determinar mediante técnicas clínicas estándar. Además, se pueden emplear ensayos in vitro opcionalmente para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis exacta que se empleará en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad o trastorno y se decidirá conforme al criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. Se extrapolan dosis eficaces a partir de curvas de respuesta a la dosis derivadas de sistemas de ensayo en modelos animales oin vitro.
Usos de construcciones polipeptídicas de unión al antígeno
Como se describió anteriormente, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente se obtienen de anticuerpos originales, donde cada heterodímero de la construcción polipeptídica de unión al antígeno corresponde a uno de los anticuerpos originales, y se ha modificado genéticamente para incorporar modificaciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina que conforman los heterodímeros. Por consiguiente, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente se pueden utilizar en el tratamiento o la prevención de la misma enfermedad, trastorno o infección para la/el cual se usa el anticuerpo original o una combinación de anticuerpos originales.
En otra realización, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente también se pueden utilizar junto con otros agentes terapéuticos conocidos en la técnica para el tratamiento o la prevención de un cáncer, enfermedad autoinmune, trastornos inflamatorios o enfermedades infecciosas. En una realización específica, las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente se pueden utilizar junto con anticuerpos monoclonales o quiméricos, linfocinas, o factores de crecimiento hematopoyético (tal como, por ejemplo, IL-2, IL-3 e IL-7), que, por ejemplo, sirven para aumentar la cantidad o actividad de células efectoras que interactúan con las moléculas y, aumentan la respuesta inmunitaria. Las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente también se pueden utilizar junto con uno o más fármacos para tratar una enfermedad, trastorno o infección tal como, por ejemplo, agentes anticancerosos, agentes antiinflamatorios o agentes antivirales.
Generación de anticuerpos biespecíficos usando una recopilación de conjuntos de diseños de Mab
En una realización, los conjuntos de diseños de Mab descritos en la presente se pueden emplear para producir construcciones polipeptídicas de unión al antígeno biespecíficas. Los conjuntos de diseño de Mab descritos en la presente se pueden utilizar en forma de una recopilación de conjuntos de diseño de Mab, donde la recopilación de conjuntos de diseño de Mab comprende conjuntos de diseño de Mab que muestran utilidad para fomentar el emparejamiento preferencial para formar las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno biespecíficas. En una realización, las recopilaciones de conjuntos de diseño de Mab están representadas por los conjuntos de diseño de Mab incluidos en la Tabla 4A y la Tabla 4B. En una realización, la recopilación de conjuntos de diseño de Mab está representada por los conjuntos de diseño de Mab en una o más de las Tablas 10-A1 a 10-A12, y 10-B1 a 10-B10. En otra realización, la recopilación de conjuntos de diseño de Mab está representada por una o más de las Tablas 10-A1 a 10-A12. En una realización, la recopilación de conjuntos de diseño de Mab está representada por una o más de las Tablas 10-B1, 10-B2, 10-B3, 10-B4, 10-B6, 10-B8 y 10-B10. La recopilación de conjuntos de diseño de Mab se puede utilizar para producir una construcción polipeptídica de unión al antígeno a partir de dos anticuerpos originales (es decir, Mab1 y Mab2) como figura más adelante. Con fines ilustrativos, Mab1 comprende un Fab lambda y comprende el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina H1 y el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina L1, mientras que Mab2 comprende un Fab kappa y comprende el polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina H2 y el polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina L2.
Las modificaciones de aminoácidos de los conjuntos de diseño de Mab (H1L1H2L2) de la recopilación de conjuntos de diseño de Mab se introducen en la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de Mab1 (H1 y L2) y la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de Mab2 (H2 y L2). Luego, se expresan conjuntamente H1, L1, H2 y L2 y se determina la cantidad de la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica correctamente emparejada. Se pueden analizar o seleccionar de manera individual uno o más de los conjuntos de diseño de Mab de la recopilación de conjuntos de diseño de Mab para determinar cuál proporciona la cantidad deseada de la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica. Cada heterodímero de la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica se puede analizar de manera adicional para evaluar la capacidad de cada heterodímero de unirse al antígeno o de evaluar su estabilidad térmica, como se describe en la presente. Las propiedades adicionales que se pueden evaluar incluyen solubilidad, agregación, índices de asociación y disociación, capacidad de soportar la exposición a ácidos, bases, oxidación, ciclos de congelamiento/descongelamiento, agitación, presión, etc. de la construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica en comparación con los anticuerpos originales o regiones Fab de los anticuerpos originales. Las últimas propiedades pueden verse influenciadas por las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de un anticuerpo de interés y, por lo tanto, pueden analizarse para cada construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica generada.
En algunas realizaciones, la cantidad de construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica emparejada correctamente es evaluada por LCMS. En algunas realizaciones, la cantidad de construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica emparejada correctamente se evalúa mediante técnicas de separación basada en carga tal como una técnica de isoelectroenfoque capilar (cIEF, por sus siglas en inglés) o una técnica cromatográfica. El procedimiento para la preparación de una construcción polipeptídica de unión al antígeno biespecífica a partir de Mab1 y Mab2 usando una recopilación de conjuntos de diseño de Mab se muestra de manera esquemática en la Figura 9.
En una realización, la recopilación de conjuntos de diseño de Mab se almacena en un medio de almacenamiento legible por computadora para facilitar el uso de la recopilación de conjuntos de diseño de Mab para diseñar las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno biespecíficas.
Implementación informática
En una realización, una computadora comprende al menos un procesador acoplado a un conjunto de chips. También se encuentran acoplados al conjunto de chips, una memoria, un dispositivo de almacenamiento, un teclado, un adaptador de gráficos, un dispositivo apuntador y un adaptador de red. Una pantalla está acoplada al adaptador de gráficos. En una realización, la funcionalidad del conjunto de chips se proporciona por un centro controlador de memoria y un centro controlador I/O. En otra realización, la memoria está acoplada directamente al procesador en vez de al conjunto de chips.
El dispositivo de almacenamiento es cualquier dispositivo capaz de contener datos, como un disco duro, disco compacto de memoria de solo lectura (CD-ROM), DVD, o un dispositivo de memoria de estado sólido. La memoria contiene instrucciones y datos usados por el procesador. El dispositivo apuntador puede ser un ratón, track ball, u otro tipo de dispositivo apuntador, y se usa en combinación con el teclado para ingresar datos en el sistema informático. El adaptador de gráficos muestra imágenes y otra información en la pantalla. El adaptador de red acopla el sistema informático a una red de área local o amplia.
Tal como se conoce en la técnica, una computadora puede tener otros componentes y/o componentes diferentes a los descritos previamente. Además, la computadora puede carecer de determinados componentes. Además, el dispositivo de almacenamiento puede ser local y/o remoto con respecto a una computadora (tal como incluido en una red de área de almacenamiento (SAN, por sus siglas en inglés)).
Tal como se conoce en la técnica, la computadora está adaptada para ejecutar módulos de programas informáticos para proporcionar la funcionalidad descrita en la presente. Tal como se usa en la presente, el término “módulo” se refiere a la lógica del programa informático utilizada para proporcionar la funcionalidad especificada. Por lo tanto, un módulo se puede implementar en hardware, firmware y/o software. En una realización, los módulos de programa se almacenan en el dispositivo de almacenamiento, se cargan en la memoria y se ejecutan con el procesador.
Ejemplos
A continuación, figuran ejemplos de realizaciones específicas para realizar y utilizar las construcciones polipeptídicas de unión al antígeno descritas en la presente. Los ejemplos se proporcionan solamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la descripción de forma alguna. Se han llevado a cabo esfuerzos para asegurar la exactitud de los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales.
Las construcciones y métodos descritos en la presente se pueden preparar y llevar a cabo empleando, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de la técnica. Dichas técnicas se explican exhaustivamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., edición actual); Sambrook, et ál., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3.a Ed. (Plenum Press) Vol. A y B(1992).
Ejemplos
Ejemplo 1: Modelado molecular y modificación genética guiada por computadora de la interfaz de Fab
Se utilizó un enfoque guiado por modelado molecular informático y por estructura para producir una recopilación de diseños de kappa-lambda (K-L) para la preparación de anticuerpos biespecíficos, donde un Fab tiene una cadena ligera kappa y el otro Fab tiene una cadena ligera lambda (es decir, un sistema kappalambda, o sistema K-L). La recopilación de diseños K-L comprende diseños con modificaciones de aminoácidos en las cadenas pesadas y ligeras de los Fab que fomentan la formación preferencial del anticuerpo biespecífico deseado cuando se expresan conjuntamente estas cadenas pesadas y ligeras. La recopilación de diseños de K-L se beneficia de las diferencias inherentes entre las cadenas ligeras kappa y lambda en anticuerpos biespecíficos y, por lo tanto, es optimizada para los sistemas kappa-lambda. Se generó la recopilación de diseños de K-L estudiando la estructura de Fab representativos, con D3H44 (anticuerpo de factor antitisular) como Fab representativo que contiene una cadena ligera kappa (Fab kappa), y CAT-2200 (anticuerpo anti-IL-17A) como Fab representativo que contiene una cadena ligera lambda (Fab lambda), pero la recopilación se puede utilizar en el contexto de otros anticuerpos del sistema K-L biespecíficos o fragmentos de estos para identificar diseños que presenten la especificidad de emparejamiento deseada en los anticuerpos de interés.
Los Fab representativos se pueden seleccionar en función de los criterios indicados en la Tabla 1. Estos criterios incluyeron que los Fab, ya sea humanos o humanizados, tienen subgrupos VH y VL comúnmente utilizados y contienen mutaciones de región de marco mínimas. Además, se realizó superposición 3D en pares con estructuras kappa y lambda no redundantes (umbral de identidad de secuencia del 90 %) disponibles (estructuras obtenidas de RSCB PDB, una base de datos mantenida por la Universidad de Rutgers (Camden, NJ) y la Universidad de California en San Diego (San Diego, CA), ver la internet en www.rcsb.org. Junto con los otros parámetros descritos en la Tabla 1, se usaron RMSD (desviaciones cuadráticas medias) de dominio cruzado H-L para VH-VL o CH1-CL para seleccionar una estructura representativa para cada uno de los sistemas kappa y lambda. Después de la selección de D3H44 (PDB ID 1JPT) y CAT-2200 (PDB ID 2VXS) como Fab representativos, se realizó un análisis estructuralin s ilicode estas interfaces de Fab para identificar y comprender los residuos importantes para las interacciones entre cadenas pesadas y ligeras, usando un enfoque doble.
Primero, se realizó un análisis global de la conservación de secuencia a través de las interfaces de Fab variable y constante mediante alineaciones de secuencia y estructura de anticuerpos conocidos. Una alineación de secuencias de dominio constante y variable de varios subgrupos de anticuerpo, en comparación con las secuencias de D3H44 y el anticuerpo anti-HER2 pertuzumab (los cuales contienen cadenas ligeras kappa) y CAT-2200 (que contiene una cadena ligera lambda) se muestra en la Figura 1. La Figura 1A y la Figura 1E representan una alineación que compara subgrupos de línea germinal VH humana representativa con la de D3H44/Pertuzumab y CAT-2200, respectivamente. La Figura 1B ilustra una alineación que compara D3H44/Pertuzumab con los subgrupos de línea germinal VL kappa humana representativos. La Figura 1C y la Figura 1G representan una alineación que compara las secuencias de alelo CH1 humano con la de D3H44/Pertuzumab y CAT-2200, respectivamente. La Figura 1D ilustra una alineación que compara D3H44/Pertuzumab con las secuencias de alelo kappa humano. La Figura 1F ilustra una alineación que compara CAT-2200 con los subgrupos de línea germinal VL lambda humana representativos. La Figura 1H ilustra una alineación que compara CAT-2200 con las secuencias de alelo lambda humano. Este análisis reveló que pertuzumab y D3H44 muestran un grado alto de conservación de secuencia con líneas germinales de dominio constante y variable kappa, mientras que CAT-2200 muestra un grado alto de conservación se secuencia con líneas germinales de dominio constante y variable lambda. Estas alineaciones también ejemplifican el mayor grado de conservación en los dominios constantes tanto de cadenas pesada como ligera, lo que hace que sea más probable que los diseños en la interfaz de dominio constante se transfieran a otros anticuerpos.
El segundo enfoque implicó el análisis de las interfaces de estructura cristalina de D3H44 y CAT-2200 usando una cantidad de herramientas de modelado molecular que se muestran en la Figura 2 (por ejemplo, ResidueContacts™ y AffinityDecomposition™). Para mejorar la capacidad de transferencia a otros anticuerpos o fragmentos, el análisis se enfocó en el dominio constante, en el cual la conservación de secuencia es más alta (ver la Figura 1). Estos análisis se usaron para identificar las diferencias en las posiciones clave (residuos de interfaz clave) entre las estructuras de Fab kappa (D3H44) y Fab lambda (CAT-2200) representativas, como se muestra en la Tabla 2. Existen diferencias conformacionales notorias en el dominio constante entre las estructuras CH1-CL (kappa) y CH1-CL (lambda). La superposición de las estructuras de Fab disponibles en el dominio CH1 mostró que las estructuras de CL (kappa) adoptan una conformación muy similar y forman un agrupamiento ceñido. Sin embargo, las conformaciones de CL (lambda) tienden a encontrarse en dos agrupamientos distintos: un agrupamiento más cerca de la orientación kappa (agrupamiento tipo kappa) y una orientación más discrepante (agrupamiento lambda). Según este análisis, D3H44 representa una estructura kappa común y CAT-2200 representa una estructura lambda común (agrupamiento lambda). La Figura 3 ilustra la diferencia conformacional kappa-lambda de dominio constante común usando D3H44 y CAT-2200 como estructuras representativas. Estas diferencias parecen surgir principalmente de un movimiento de cuerpo rígido del dominio constante ligero con respecto al dominio CH1, que cambia la naturaleza de la interfaz H-L en el dominio constante de kappa en comparación con un sistema lambda. Las discrepancias clave identificadas (Tabla 2), así como las diferencias conformacionales mencionadas anteriormente (Figura 3) sirvieron como punto de partida para la modificación genética de diseños de emparejamiento H-L para un sistema biespecífico que contiene un Fab kappa y un Fab lambda. La numeración de aminoácidos en las secuencias D3H44 y CAT-2200 originales de acuerdo con Kabat se proporciona en la Tabla 3A y la Tabla 3B.
A continuación, se simulan mutaciones potenciales en las posiciones de interés, así como también posiciones cercanas a los puntos de interés en la estructura cristalina 3D y se identificaron mediante mutagénesisin s ilicoy empaque y modelado con Zymepack™. Zymepack™ es un paquete de software que, dada una estructura de entrada y un conjunto de mutaciones, alterará los tipos de residuos en la estructura de entrada de acuerdo con las mutaciones suministradas y generará una nueva estructura que es una aproximación a la estructura física de la proteína mutante. De manera adicional, Zymepack™ evalúa las propiedades de la proteína mutante mediante el cálculo de una variedad de métricas cuantitativas. Estas métricas incluyen mediciones de complementariedad estérica y electrostática, que pueden correlacionarse con la estabilidad, afinidad de unión o especificidad heterodimérica de la proteína mutante.
Al aprovechar las discrepancias de la interfaz, se introdujeron mutaciones para fomentar el emparejamiento selectivo de las cadenas polipeptídicas o heterodímeros deseados o preferidos, a la vez que se desfavorece la formación de cadenas polipeptídicas o heterodímeros emparejados incorrectamente. Por ejemplo, para preparar un anticuerpo biespecífico con un Fab kappa y un Fab lambda, son necesarias cuatro cadenas polipeptídicas. El Fab kappa comprende la cadena pesada 1 (H1) y la cadena ligera kappa 1 (L1), mientras que el Fab lambda comprende la cadena pesada 2 (H2) y la cadena ligera lambda 2 (L2). En este caso, los pares H-L deseados serían H1L1 y H2L2, mientras que los pares incorrectos serían H1L2 y H2L1. Cabe destacar que la designación/numeración de las cadenas polipeptídicas en la presente es arbitraria. Por lo tanto, las mutaciones que favorecen la interfaz CH1-CL (kappa) emparejada (H1L1) sobre la interfaz CH1-CL (lambda) emparejada incorrectamente (H1L2) y las mutaciones que favorecen la interfaz CH1-CL (lambda) emparejada (H2L2) sobre la interfaz CH1-C L (kappa) emparejada incorrectamente (H2L1) se identificaron para generar los diseños personalizados de Fab kappa-Fab lambda en el dominio constante. Usando los métodos informáticos que incluyen Zymepack™, se modeló la complementariedad estérica y también se computó en función de factores de energía tales como empaquetamiento de van der Waals, efectos de cavitación y contacto cercano de grupos hidrofóbicos. De manera similar, las energías de interacción electrostática se modelaron y evaluaron en función de las interacciones de coulomb entre las cargas, enlaces de hidrógeno y efectos de la desolvatación. Los modelos de pares de cadena pesada y ligera preferidos H1L1 y H2L2 y los modelos de pares incorrectos H1L2 y H2L1 obtenidos mediante la introducción de las mutaciones de interés se simularon para contabilizar los valores estéricos y electrostáticos relativos. Esto permitió la determinación de si un conjunto de mutaciones particular conducía a energías favorables, es decir, mayor complementariedad estérica y/o electrostática para los pares de cadena pesada - ligera preferidos con respecto a los pares incorrectos. Las energías estéricas y electrostáticas computadas son componentes de la energía libre asociados al emparejamiento de cadena ligera y pesada. Por lo tanto, mayor complementariedad estérica o electrostática indica un cambio mayor de energía libre asociado al emparejamiento del par deseado con respecto al emparejamiento del par incorrecto. Una mayor complementariedad estérica yo electrostática da como resultado el emparejamiento preferencial (selectivo) de las cadenas pesada y ligera deseadas con respecto a la desventaja estérica y/o la repulsión electrostática del par incorrecto.
Ejemplo 2: Selección y descripción de los diseños
El enfoque descrito en el Ejemplo 1 se usó para diseñar pares de heterodímeros de cadena pesada-cadena ligera (es decir, H1L1 y H2L2) que muestran el emparejamiento selectivo o preferencial cuando uno de los pares de heterodímeros H-L contiene una cadena ligera kappa y el otro contiene una cadena ligera lambda. Los heterodímeros se diseñaron en pares, denominados “diseño de Mab” o “conjunto de diseños de Mab” e incluyen un conjunto de sustituciones de aminoácidos en las cadenas H1, L1, H2 y L2 que fomentan el emparejamiento preferencial. Los conjuntos de diseños de Mab se analizaron inicialmente como “diseños de LCCA”, donde se expresó conjuntamente una cadena pesada del conjunto de diseños de Mab con dos cadenas ligeras del conjunto de diseños de Mab, uno kappa y uno lambda, para evaluar el emparejamiento relativo. Las sustituciones de aminoácidos descritas en los Ejemplos se identifican con referencia a la Tabla 3A y la Tabla 3B (para Fab de pertuzumab y CAT-2200), usando el sistema de numeración de Kabat como se describe en Kabat y Wu, 1991; Kabate t ál,Sequences of proteins of immunological interest. 5ta. edición - US Department of Health and Human Services (Departamento de salud y servicios sociales de los Estados Unidos), publicación NIH n.° 91-3242, pág. 647 (1991), a menos que se indique de otro modo. Sin embargo, como referencia, las Tablas 22A, 22B y 22C proporcionan una identificación de las posiciones de aminoácidos seleccionadas en la cadena pesada, cadena ligera kappa y cadena ligera lambda usando los sistemas de numeración IMGT, 1JPT y EU, según corresponda.
Los diseños de Mab se empaquetaron en un modelo molecular de D3H44 y CAT-2200 y se calcularon las métricas como se describe en el Ejemplo 1. Los diseños principales luego se seleccionaron en función del riesgo (efectos de minimización en la estabilidad, así como también la inmunogenicidad) e impacto (que toma en cuenta la fuerza propuesta para impulsar la especificidad de emparejamiento). Luego, se analizaron los diseños superiores mediante un ensayo de competencia de cadena ligera (LCCA) para determinar de forma experimental su especificidad de emparejamiento (ver el Ejemplo 4). Si bien se identificaron los diseños de Mab usando D3H44 y CAT-2200 como Fab representativos, se evaluaron en un sistema K-L usando Pertuzumab como el Fab kappa y CAT-2200 como el Fab lambda (sistema K-L pertuzumab-CAT-2200). Como se muestra en la Figura 1C y en la Figura 1D, D3H44 y Pertuzumab tienen secuencias idénticas en el dominio constante, lo que permite interconversión continua entre los dos sistemas. Estos diseños de Mab se denominan diseños K-L.
También se analizó un segundo conjunto de diseños en el sistema K-L pertuzumab/CAT-2200. Se propusieron estos diseños usando diseños representativos que reflejaron la diversidad de los diseños de la recopilación de diseños kappa-kappa (K-K) descrita en la Tabla 30 de la solicitud de patente internacional número PCT/CA2013/050914 (publicación de patente internacional n.° WO2014/082179) como punto de partida. Estos diseños derivados de K-K representativos incluyeron un subconjunto de diseños que se llevaron sin modificación al sistema K-L, cuando fuera posible, o se adaptaron al sistema kappa-lambda modificando los residuos de aminoácidos según fuera necesario para tener en cuenta las diferencias de secuencia y estructurales entre las cadenas ligeras kappa y lambda. Ambos tipos de diseños derivados de K-K representativos se denominan diseños K-L derivados de K-K.
La especificidad de emparejamiento para los diseños K-L y diseños K-L derivados de K-K se evaluó experimentalmente como diseños de LCCA mediante LCCA en el sistema kappa-lambda, como se describe en el Ejemplo 4.
Ejemplo 3: Preparación de construcciones Fab que codifican cadenas pesadas de IgG Pertuzumab, cadenas ligeras de IgG Pertuzumab, cadenas pesadas de IgG CAT-2200 y cadenas ligeras de IgG CAT-2200.
Las cadenas pesada y ligera Fab de tipo silvestre del anticuerpo anti-HER2 Pertuzumab y del anticuerpo anti-IL17 CAT-2200 se prepararon de la siguiente manera. Las secuencias de proteína de la cadena ligera Fab pertuzumab (número de acceso GenBank HC359025.1, SEQ ID NO:2) y cadena pesada (número de acceso GenBank HC359024.1, SEQ ID NO:1) se tradujeron de forma inversa en ADN, optimizaron por codones para expresión en mamíferos, y se sintetizaron con genes (SEQ ID NO: 8 y 7, respectivamente). Las secuencias de proteína de la cadena ligera Fab CAT-2200 (cadena L 2VXS, SEQ ID NO:4) y cadena pesada (cadena H 2VXS, SEQ ID NO:3) se tomaron de la entrada PDB 2VXS, se tradujeron de forma inversa en ADN, optimizaron por codones para expresión en mamíferos y se sintetizaron con genes (SEQ ID NO:10 y 9, respectivamente). Las secuencias polipeptídicas y ADN de estas cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo se muestran en la Tabla 3C.
Los insertos de vector de cadena ligera, que consisten en un sitio de corte 5'-EcoRI - péptido señal HLA-A -etiqueta HA o FLAG - clon de Ig de cadena ligera - 'terminación de TGA o TAA' - sitio de corte BamH1-3', se ligaron en un vector pTT5 (Durocher Y et ál., Nucl. Acids Res. 2002; 30, No.2 e9) para producir vectores de expresión de cadena ligera. Los vectores de expresión de cadena ligera resultantes se secuenciaron para confirmar el marco de lectura y secuencia correctos del ADN codificante. Asimismo, los insertos de vector de cadena pesada, que consisten en un sitio de restricción 5'-EcoR1 - péptido señal HLA-A - clon de cadena<pesada (que termina en T238; véase la Tabla 3A) - etiqueta ABD>2<-His>6<tag - terminación TGA - sitio de corte BamH1-3', se ligaron en un vector de pTT5 (ABD>2<=dos copias de la proteína de dominio de unión a albúmina,>en tándem) para producir vectores de expresión de cadena pesada. Los vectores de expresión de cadena pesada resultantes también se secuenciaron para confirmar el marco de lectura y secuencia correctos del ADN codificante. Las variadas construcciones Fab de Pertuzumab o CAT-2200 que contienen sustituciones de aminoácidos para los conjuntos de diseños de Mab se generaron ya sea mediante síntesis de genes o mediante mutagénesis dirigida al sitio (Braman J, Papworth C & Greener A., Methods Mol. Biol. (1996) 57:31-44).
Las cadenas pesada y ligera se etiquetaron en los extremos C y N, respectivamente, para facilitar la evaluación del emparejamiento preferencial mediante un ensayo de competición-análisis de SPR (LCCA). La etiqueta de<cadena pesada ABD>2<-His>6<permitió que se capturaran los complejos H-L en una superficie de chip de SPR de>etiqueta anti-His, mientras que las etiquetas de cadena ligera FlAg y HA permitieron que se cuantificaran las poblaciones de L1 y L2 relativas.
Ejemplo 4: Evaluación de emparejamiento preferencial de heterodímeros Fab diseñados mediante ensayo de competición de cadena ligera (LCCA)
Se prepararon las construcciones que codifican las cadenas ligera y pesada de IgG de CAT-2200 y Pertuzumab en el formato Fab que comprenden modificaciones de aminoácidos como se describe en el Ejemplo 3. La capacidad de las construcciones de emparejarse preferentemente para formar el heterodímero H-L deseado en el contexto de un conjunto de diseño LCCa (H1, L1, L2 o H2, l2, L1) se determinó usando un ensayo de competición de cadena ligera (LCCA).
El LCCA cuantifica el emparejamiento relativo de una cadena pesada para al menos dos cadenas ligeras únicas, una kappa y una lambda, y puede resumirse de la siguiente manera. Para determinar la especificidad de emparejamiento para el Fab lambda, se expresó conjuntamente una construcción Fab de cadena pesada CAT-2200 con una construcción Fab de cadena ligera CAT-2200 (para el producto Fab emparejado H lL1) y una construcción Fab de cadena ligera Pertuzumab (para el producto Fab emparejado incorrectamente H1L2) y la especificidad de emparejamiento de cadena ligera relativa (H1L1:H1L2) se determinó a partir de un ensayo de competición-análisis SPR, realizado en duplicado. De lo contrario, para determinar la especificidad de emparejamiento para el Fab kappa, se expresó conjuntamente una construcción Fab de cadena pesada Pertuzumab con una construcción Fab de cadena ligera Pertuzumab (para el producto Fab emparejado H2L2) y una construcción Fab de cadena ligera CAT-2200 (para el producto Fab emparejado incorrectamente H2L1) y la especificidad de emparejamiento de cadena ligera relativa (H2L2:H2L1) se determinó a partir de un ensayo de competición-análisis SPR, realizado en duplicado.
Se realizó el ensayo LCCA mediante expresión concomitante de cadenas pesadas y ligeras en relaciones de 1:1:1 (en peso) para H1:L1:L2 o H2:L2:L1, donde la cadena pesada se encuentra en cantidades limitantes. La cantidad de cada heterodímero formado (es decir, H1L1 y H1L2 o H2L2 y H2L1) se determinó mediante la unión de cadenas pesadas al chip de SPR mediante extracción de la etiqueta his, seguido de la detección de la cantidad para cada etiqueta de cadena ligera (HA o FLAG) usando anticuerpos específicos para estas etiquetas. Posteriormente, los resultados de los heterodímeros seleccionados se verificaron mediante una verificación del ensayo de competición de cadena ligera a través del cual las relaciones de ADN L1:L2 se comprobaron nuevamente para una relación 1:1, mientras se mantuvo la cadena pesada en cantidades limitantes. Para estas combinaciones del sistema kappa-lambda particulares, las etiquetas de cadena ligera pueden tener un efecto en el emparejamiento de LCCA de tipo silvestre, lo que conlleva desviaciones de la relación 50 %:50 % neutral esperada. Por esta razón, la disposición con la menor cantidad de desviación de la neutral se seleccionó enfocando la cadena ligera Pertuzumab con la etiqueta HA y la cadena ligera CAT-2200 con la etiqueta FLAG. En la Figura 4 se muestra un esquema que representa el diseño del ensayo. La Figura 5 ilustra cómo están etiquetadas las cadenas pesadas y cadenas ligeras y cómo se evalúa el emparejamiento preferencial. Los detalles experimentales del LCCA se proporcionan a continuación.
Método de transfección
Los diseños LCCA que comprenden una construcción de cadena pesada y dos construcciones de cadenas ligeras, preparadas tal como se describió en el Ejemplo 3, se transfectaron en células CHO-3E7 de la siguiente manera. Se cultivaron células CHO-3E7, con una densidad de 1.7 - 2 x 106 células/ml, a 37 °C en medio FreeStyle™ F17 (Invitrogen cat# A-1383501) complementado con glutamina 4 mM y KoliphorP188 al 0.1 % (Sigma #K4894). Un volumen total de 2 ml se transfectó con un total de 2 |jg de ADN usando PEI-pro (transfección Polyplus # 115-375) con una relación de ADN:PEI de 1:2.5. Todas las transfecciones se realizaron usando 333 ng de cada cadena pesada y cada cadena ligera de (es decir, H1:L1:L2 o H2:L2:L1 = relación 1:1:1) 300 ng de AKTdd pTT22 (un vector que contiene un mutante B de proteína cinasa constitutivamente activa) y 700 ng de ADNes (ADN de esperma de salmón). Veinticuatro horas después de la adición de la mezcla de ADN-PEI, se agregaron ácido valproico 0.5 mM (concentración final) y triptona al 1 % p/v (concentración final) a las células que luego se transfirieron a 32°C. Los sobrenadantes se analizaron para determinar la expresión en el día 7 mediante análisis de SDS-PAGE no reductor seguido por tinción con azul de Coommassie para visualizar las bandas.
Método de SPR de ensayo de competición
El grado de emparejamiento preferencial de cadena pesada con cada una de las dos cadenas ligeras en los diseños de LCCA se evaluó usando una lectura basada en SPR de etiquetas de epítopo único ubicadas en el extremo N de cada cadena ligera. La construcción LC CAT-2200 contiene una etiqueta FLAG y la construcción LC Pertuzumab contiene una etiqueta HA.
Suministros de resonancia de plasmones superficiales (SPR). Los chips sensores GLC, el kit de acoplamiento de aminas Biorad ProteOn (clorhidrato de 7-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), N-hidroxisulfosuccinimida (sNHS) y etanolamina) y los amortiguadores de acetato de sodio 10 mM se obtuvieron de Bio-Rad Laboratories (Canadá) Ltd. (Mississauga, ON). El amortiguador de ácido 4-(2-hidroxietil)-7-piperazineetanesulfónico (HEPES), ácido etilendiaminatetracético (EDTA), y NaCl se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Oakville, ON). La solución de Tween 20 al 10 % se obtuvo de Teknova (Hollister, CA).
Ensayos de biosensores de SPR. Todos los ensayos de resonancia de plasmones superficiales se llevaron a cabo mediante el instrumento BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories (Canadá) Ltd. (Mississauga, ON) con amortiguador de ejecución PBST (PBS Teknova Inc con 0.05 % de Tween 20) a una temperatura de 25°C. Se generó una superficie de captura anti-penta His™ mediante un chip sensor GLC activado mediante una dilución de 1:5 de las soluciones sNHS/EDC de BioRad estándar inyectadas durante 140 s a 100 pL/min en la dirección del analito (horizontal). Inmediatamente después de la activación, se inyectó una solución de 25 pg/mL de anticuerpo anti-penta His™ (Qiagen Inc.) en NaOAc 10 mM pH 4.5 en la dirección del analito (vertical) con una velocidad de flujo de 25 pL/min hasta que se inmovilizaron aproximadamente 3000 unidades de resonancia (RU, por sus siglas en inglés). Los grupos activos restantes se inactivaron mediante una inyección de 140 s de etanolamina 1M a 100 pL/min en la dirección del analito, y esto también garantiza la creación de interpuntos activada por simulación para la referencia en blanco.
El análisis de los heterodímeros para su unión a los anticuerpos monoclonales anti-FLAG (Sigma Inc.) y anti HA (Roche Inc.) se llevó a cabo en dos etapas: una captura indirecta de los heterodímeros en la superficie de His™ anti-penta en la dirección del ligando seguida de una inyección de anti-FLAG y anti-HA en la dirección del analito. Primero, se usó una inyección de PBST durante 30 s a 100 pL/min en la dirección del ligando para estabilizar el punto de referencia. Para cada captura de heterodímeros, se diluyeron heterodímeros no purificados en medios de cultivo celular al 4% en PBST. Uno a cinco heterodímeros o controles (es decir, controles que contienen 100 % de HA-cadena ligera o 100 % de FLAG-cadena ligera) fueron inyectados simultáneamente en los canales del ligando individual durante 240 s con un flujo de 25 pL/min, lo que provocó una captura de heterodímero saturada de aproximadamente 300 a 400 RU en la superficie de His antipenta. El primer canal del ligando se dejó vacío para usarse como un control en blanco si era necesario Esta etapa de captura de heterodímeros fue seguida inmediatamente por dos inyecciones de amortiguador en la dirección del analito para estabilizar la línea de referencia, y luego se inyectaron por duplicado anti-FLAG 5 nM y anti HA 5 nM a 50 pL/min durante 120 s con una fase de disociación de 180 s, lo que da lugar a un conjunto de sensogramas de unión con una referencia de amortiguador para cada uno de los heterodímeros capturados. Los heterodímeros se regeneraron mediante un impulso de 18 s de ácido fosfórico al 0,85 % durante 18 s a 100 pL/min para preparar la superficie de His™ anti-penta para el siguiente ciclo de inyección. Se realizó una doble referencia y se alinearon los sensogramas mediante interpuntos e inyección en blanco de amortiguador, y se analizaron los sensogramas resultantes mediante el software ProteOn Manager v3.0.
Análisis de datos y descripción de métrica de LCCA
La evaluación de emparejamiento preferencial para cada diseño, presente en el formato H1L1H2L2, se evaluó mediante dos conjuntos de diseño de LCCA complementarios, uno para la combinación H1L1L2 y el otro para la combinación H2L1L2. Cada conjunto de diseño de LCCA se señala con un “identificador único” (por ejemplo, 10629 o 10695). Cada conjunto de diseño de Mab (H1L1H2L2) se identifica por consiguiente mediante los números de conjuntos de diseños LCCA para los dos LCCA constitutivos (por ejemplo, 10629-10695).
Los conjuntos de diseños de LCCA (H1L1L2 o H2L1L2) de cada conjunto de diseño de Mab fueron analizados en el LCCA, y los conjuntos de diseños de interés se identificaron en función de los siguientes criterios de inclusión. Para ser considerado un diseño de interés, el diseño debe contener al menos un resultado LCCA positivo por encima de la zona neutra (relación emparejado correctamente:emparejado incorrectamente > 60:40), mientras que el otro LCCA complementario tendría que estar por encima del límite inferior de la zona neutra (relación emparejado correctamente:emparejado incorrectamente 40:60) como se ilustra mediante la Figura 6. La zona neutra se definió como la región entre relaciones de emparejado correctamente:emparejado incorrectamente 40 %:60 % y 60 %:40 % usando la mediana de los valores normalizados para H1-L1:H1-L2 y H2-L2:H2-L1. Por ejemplo, los casos A y B en la Figura 6 representan los diseños que pasan los criterios de inclusión. El caso B se incluye dado que LCCA H2L2:H2L1 está por encima de la zona neutra y LCCA H1L1:H1L2 está dentro de la zona neutra (no debajo de esta). El caso C representa un diseño donde ambos resultados de LCCA son positivos, pero ninguno de ellos se encuentra por encima de la zona neutra y, por lo tanto, no se incluye. Los casos D y E representan diseños que se ignoran dado que al menos uno de los resultados de LCCA se encuentra por debajo de la zona neutra, incluso si el otro LCCA se encuentra por encima de la zona neutra (ver el caso D). Las Tablas 4A (diseños K-L) y 4B (diseños K-L derivados de K-K) enumeran los conjuntos de diseños de Mab que cumplen con estos criterios, mientras que las Tablas 5A y 5B muestran los resultados del LCCA para estos diseños. En las Tablas 4A y 4B y todas las tablas posteriores que enumeran sustituciones de aminoácidos de los conjuntos de diseños de LCCa o conjuntos de diseños de Mab, la ausencia de una sustitución en la tabla, o un “-” indica que la cadena polipeptídica no incluye una sustitución de aminoácidos que fomente el emparejamiento preferencial.
El rendimiento de cada conjunto de diseño de LCCA se describe mediante dos valores escalares, ln(r1/f1) o ln(r2/f2), donde r1 y r2 corresponden a la mediana de los valores de las relaciones H1L1:H1L2 y H2L2:H2L1, respectivamente, y f1 y f2 corresponden a la mediana de los valores de relaciones respectivos H1L1:H1L2 y H2L2:H2L1. Se generan los valores escalares normalizados restando la contribución del sistema WT (tipo silvestre) del diseño; ln(r1/f1)diseño - ln(r1/f1)wr o ln(r2/f2)diseño - ln(r2/f2)wr. Para el CAT-2200 de tipo silvestre (HC) compitió contra el CAT-2200 (Lc -FLAG) más el Pertuzumab (LC-HA) el ln(r1/f1)wr = -0.48. Para el Pertuzumab de tipo silvestre (HC) compitió contra el Pertuzumab (<l>C-HA) más el CAT-2200 (LC-FLAG) el ln(r2/f2)wT = 0.66. Este procedimiento retiró eficazmente cualquier tendencia de emparejamiento WT existente y normaliza la especificidad en comparación con un sistema WT 50%:50% L1:L2 neutro. Estos valores se registran en las columnas 2 y 5 en las Tablas 5A y 5B.
Además, los valores escalares normalizados también se convirtieron en una mediana de la relación normalizada pura H1L1:H1L2 y H2L2:H2L1. Esta conversión normalizó eficazmente las relaciones de LCCA hasta 100 %, como se observó para algunos Fab diseñados que la cantidad total de H1L1 y H1L2, o H2L2 y H2L1 difirió significativamente del 100 %. Se cree que esta discrepancia en el porcentaje total de la cadena ligera se debe en parte a la aparición de uniones no específicas variables durante la captura de heterodímeros inicial en el chip de SPR. Estos valores se registran en las columnas 4 y 7 en las Tablas 5A y 5B.
Además, se muestra el intervalo escalar para cada LCCA normalizado de un diseño (experimentos H1L1:H1L2 y H2L2:H2L1), así como el intervalo para la relación normalizada de heterodímeros Fab emparejados correctamente a emparejados incorrectamente (el intervalo es el mismo que el porcentaje de L1 y el porcentaje de L2 en la relación normalizada). Para los resultados registrados de una única medición, los valores de intervalo se marcan como NC (no corresponde). Estos valores se registran en las columnas 3 y 6 en las Tablas 5A y 5B.
Como referencia, la Tabla 23 presenta la correspondencia entre el % de heterodímeros emparejados:emparejados incorrectamente y el valor escalar de LCCA correspondiente.
Resultados
Los resultados de LCCA se muestran en las Tablas 5A y 5B en el contexto de conjuntos de diseños de Mab. La Tabla 5A proporciona los datos de LCCA relativos a los diseños de K-L descritos en el Ejemplo 2, mientras que la Tabla 5B proporciona los datos de LCCA relacionados con los diseños de K-L derivados de K-K que también se describen en el Ejemplo 2. Nótese que todos los experimentos de LCCA se llevaron a cabo en construcciones que contenían el enlace disulfuro entre cadenas de Fab ubicado en el dominio constante (H/C233-L/C214, numeración Kabat).
La Tabla 4A enumera 231 diseños de K-L que cumplieron con los criterios de inclusión. Los datos de LCCA relacionados con estos diseños se muestran en la Tabla 5A. La Tabla 4B enumera 44 diseños de K-L derivados de K-K que cumplieron los criterios de inclusión y la Tabla 5B muestra los datos de LCCA relacionados con estos diseños. Los diseños que mantienen el l00 % de identidad entre la recopilación de diseños de K-K original de la Tabla 30 en la solicitud PCT mencionada anteriormente PCT/CA2013/050914 y el nuevo sistema kappa-lambda (es decir, se trasladaron sin modificación) se identifican con un asterisco (*) en la Tabla 4B. La mayoría de los diseños en la Tabla 4B tienen modificaciones de aminoácidos solamente en la región constante, algunos de los diseños también incorporan modificaciones de aminoácidos en la región variable. Los diseños se propusieron para impulsar adicionalmente la especificidad de emparejamiento y al mismo tiempo favorecer la capacidad de transferencia a otros sistemas de anticuerpos.
La potencia del diseño se puede definir como la suma de los dos valores escalares de LCCA para un diseño particular. Al comparar la potencia de diseño de los diseños K-L derivados de K-K con los diseños de K-L, fue evidente que estos diseños adaptados específicamente al sistema K-L tendieron a mostrar una mejor especificidad de emparejamiento que los diseños de K-K transferidos al sistema K-L, como se resume en la Figura 7. La mediana de la potencia del diseño para los diseños de K-L derivados de K-K fue de 1.86 con una potencia de diseño máxima de 3.53. La mediana de la potencia del diseño para los diseños de K-L fue de 2.69 con una potencia de diseño máxima de 5.23.
Ejemplo 5: Ampliación de heterodímeros Fab diseñados para caracterización biofísica
Los heterodímeros correctamente emparejados H1L1 o H2L2, tal como se indica en los conjuntos de identificadores únicos (Tablas 4A y 4B), se aumentaron (comúnmente hasta 20 ml) y se purificaron de la siguiente manera para analizar la estabilidad térmica y la unión al antígeno. Para estos experimentos, las<cadenas pesadas de los Fab se expresaron sin la etiqueta ABD>2<, mientras que las cadenas ligeras se>expresaron con la misma etiqueta hA o FLAG utilizada en el LCCA. Las cadenas pesada y ligera de cada heterodímero se expresaron en cultivos de 20 ml de células CHO-3E7. Se cultivaron células CHO-3E7, con una densidad de 1.7 - 2 x 106 células/ml, a 37 °C en medio FreeStyle™ F17 (Invitrogen cat# A-1383501) complementado con glutamina 4 mM y KoliphorP188 al 0.1 % (Sigma #K4894). Un volumen total de 20 ml se transfectó con un total de 20 |jg de ADN usando PEI-pro (Polyplus cat# 115-375) con una relación de ADN:PEI de 1:2.5. Veinticuatro horas después de la adición de la mezcla de ADN-PEI, se agregaron ácido valproico 0.5 mM (concentración final) y triptona al 1 % p/v (concentración final) a las células que luego se transfirieron a 32°C.
Las células se centrifugaron 7 días después de la transfección y los heterodímeros se purificaron a partir del sobrenadante mediante captura por afinidad usando IgG-CH1 CaptureSelect™ (Life Technologies™, n.° de catálogo: 194-320-005) a 4°C de la siguiente manera. Los sobrenadantes se diluyeron hasta 20 - 25 % de sobrenadante de cultivo celular en amortiguador de equilibrio (solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (DPBS) sin calcio, magnesio y rojo de fenol (HyClone™# SH30028.02)) y luego se incubaron con mezcla durante 16 horas con resina IgG-CH1 CaptureSelect™, también previamente equilibrada con el amortiguador de equilibrio. Luego, la resina se recogió mediante centrifugación, se transfirió a una placa fritada de 96 pocillos, se lavó con amortiguador de equilibrio tres veces. Las muestras unidas se eluyeron con 1 a 4 volúmenes en lecho de amortiguador de elución: glicina 100 mM, pH 2.6. Las muestras eluidas se recogieron mediante centrifugación en una placa receptora UV transparente de 96 pocillos, donde cada pocillo contiene amortiguador de neutralización: 1<m>Tris pH 9.0 a 10 % de volumen de elución.
Después de la purificación, se evaluó la expresión de los heterodímeros mediante un ensayo de expresión de proteínas de alto rendimiento no reductor usando Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer #760499). Los procedimientos se realizaron de acuerdo con el manual del usuario de LabChip GXII, versión 2, de la guía del usuario de HT Protein Express LabChip, con las siguientes modificaciones. Las muestras de heterodímeros, ya sea de 2 j l o 5 j l (intervalo de concentración de 5-2000 ng/jl) se agregaron en pocillos separados en placas de 96 pocillos (BioRad # HSP9601) junto con 7 j l de solución amortiguadora de muestra de HT Protein Express (Perkin Elmer # 760328). Las muestras de heterodímeros se desnaturalizaron luego a 70 °C durante 15 min. El instrumento LabChip funcionó usando el chip de HT Protein Express (Perkin Elmer #760499) y la configuración de ensayo Ab-200. °Luego de su uso, el chip se limpió con agua MilliQ y se almacenó a 4 °C.
La inclusión de las modificaciones del conjunto de diseños de Mab no tuvo un impacto significativo en la expresión de la proteína. Los niveles de expresión obtenidos para los Fab CAT-2200 que contienen las modificaciones de diseño son 0.45 mg/20 mL de expresión (SD de 0.16 mg), en comparación con 0.64 mg/20 mL de expresión (SD de 0.1 mg) para el Fab de tipo silvestre. Los Fab de Pertuzumab que contienen las modificaciones de diseño se expresan en 0.39 mg/20 mL de expresión (SD de 0.14 mg), en comparación con 0.4 mg/20 mL de expresión (SD de 0.03 mg) para el Fab de tipo silvestre. El análisis de calibre mostró niveles de pureza comparables al Fab WT.
Ejemplo 6: Mediciones de afinidad del antígeno de los heterodímeros Fab diseñados.
La capacidad de los heterodímeros Fab CAT-2200 de unirse a IL-17A y del Fab Pertuzumab de unirse a HER2-ECD se evaluó con el fin de determinar si las sustituciones de aminoácidos tenían algún efecto en la capacidad del heterodímero de unirse al antígeno. Los heterodímeros Fab se prepararon tal como se describe en el Ejemplo 5. La afinidad de cada heterodímero Fab por su antígeno se determinó mediante SPR de la siguiente manera.
Suministros de SPR. Los chips sensores GLC, el kit de acoplamiento de aminas Biorad ProteOn (EDC, sNHS y etanolamina) y los amortiguadores de acetato de sodio 10 mM se obtuvieron de Bio-Rad Laboratories (Canadá) Ltd. (Mississauga, ON). El amortiguador de ejecución PBS con Tween20 al 0,05 % (PBST) se obtuvo de Teknoca Inc. (Hollister, CA). La proteína HER2 recombinante se obtuvo de eBioscience (San Diego, CA). El anticuerpo policlonal de cabra anti-humano se obtuvo de Jackson Immuno Research Laboratories Inc. (West Grove, PA). Se adquirió IL-17A humana recombinante de R&D Systems (Mineapolis, MN).
Determinación de afinidad de CAT-2200:IL-17A. Todos los ensayos de resonancia de plasmones superficiales se llevaron a cabo usando un instrumento BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories (Canadá) Ltd. (Mississauga, ON)) con amortiguador de ejecución PBST a una temperatura de 25 °C. La superficie de IL-17A se generó usando un chip sensor GLC activado por una dilución 1:10 de las soluciones sNHS/EDC de BioRad estándar inyectadas durante 140 s a 100 pL/min en la dirección del ligando (vertical). Inmediatamente después de la activación, se inyectó una solución de 2 microg/mL de IL-17A en NaOAc 10 mM pH 4.5 en la dirección del ligando (vertical) con una velocidad de flujo de 25 microL/min hasta que se inmovilizaron aproximadamente 50 unidades de resonancia (RU).
Los grupos activos restantes se inactivaron mediante una inyección de 140 s de etanolamina 1M a 100 pL/min también en la dirección del ligando.
El análisis de los Fab diseñados para la unión a IL-17A se realizó mediante inyección de los Fab CAT-2200 purificados en la dirección del analito (horizontal). En primer lugar, se usaron dos inyecciones de amortiguador durante 30 s a 100 microL/min en la dirección del analito (horizontal) para estabilizar la línea de referencia. Se inyectaron simultáneamente cinco concentraciones de una serie de dilución triple de cada Fab CAT-2200 diseñado (60 nM, 20 nM, 6.7 nM, 2.2 nM, 0.74 nM) con un control de amortiguador vacío a 50 microL/min durante 120 s con una fase de disociación de 15 minutos, lo que genera un conjunto de sensogramas de unión con una referencia de amortiguador. Los complejos CAT-2200:IL-17A en la superficie de SPR se disocian y se regeneró la superficie de IL-17A para prepararse para el siguiente ciclo de inyección mediante dos pulsos de ácido fosfórico al 0.85 % durante 18 s a 100 microL/min. Se realizó una doble referencia y se alinearon los sensogramas mediante interpuntos e inyección en blanco de amortiguador, y se analizaron los sensogramas resultantes mediante el software ProteOn Manager v3.1. Los sensogramas de doble referencia se ajustaron al modelo de unión de Langmuir.
Determinación de afinidad de Pertuzumab:HER2. Todos los ensayos de resonancia de plasmones superficiales se llevaron a cabo usando un instrumento BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories (Canadá) Ltd. (Mississauga, ON)) con amortiguador de ejecución PBST a una temperatura de 25 °C. La superficie de captura del anticuerpo anti-penta-His™ (Qiagen) se generó usando un chip sensor GLC activado por una dilución 1:10 de las soluciones sNHS/EDC de BioRad estándar inyectadas durante 140 s a 100 pL/min en la dirección del analito (horizontal). Inmediatamente después de la activación, se inyectó una solución de 10 microg/mL de anticuerpo anti-penta-His en NaOAc 10 mM pH 4,5 en la dirección del ligando (vertical) con una velocidad de flujo de 25 pL/min hasta que se inmovilizaron aproximadamente 3000 unidades de resonancia (RU). Los grupos activos restantes se inactivaron mediante una inyección de 140 s de etanolamina 1M a 100 pL/min en la dirección del analito para garantizar la creación de interpuntos activadas por simulación para la referencia en blanco.
El análisis de los Fab diseñados para su unión a HER2 tuvo lugar en dos etapas: una captura indirecta de los Fab diseñados en la superficie del anticuerpo anti-penta-His™ en la dirección del ligando seguida de la inyección simultánea de 5 concentraciones de antígeno HER2 purificado y un amortiguador en blanco para referencia doble en la dirección del analito.
En primer lugar, se usó una inyección de amortiguador durante 30 s a 100 microL/min en la dirección del ligando para estabilizar la línea de referencia. Para cada captura de Fab diseñado, los Fab diseñados se diluyeron hasta 2 microg/mL en PBST. Se inyectaron uno a cinco Fab diseñados o controles de manera simultánea en canales de ligandos individuales durante 240 s a un flujo de 25 pL/min. Esto dio como resultado una captura de aproximadamente 400 a 600 RU en la superficie de His antihumano. El primer canal del ligando se dejó vacío para usarse como un control en blanco si era necesario Esta etapa de captura fue inmediatamente seguida de dos inyecciones de amortiguador en la dirección del analito para estabilizar la línea de referencia, y luego se inyectó Her2 100 nM, 33.3 nM, 11.1 nM, 3.7 nM y 0.41 nM junto con un amortiguador en blanco de manera simultánea a 50 pL/min durante 120 s con una fase de disociación de 1200 s. Las superficies de anticuerpo capturadas se regeneraron mediante un impulso de 18 s de ácido fosfórico al 0.85 % a 100 pL/min para prepararlas para el siguiente ciclo de inyección. Se realizó una doble referencia y se alinearon los sensogramas mediante interpuntos e inyección en blanco de amortiguador, y se analizaron los sensogramas resultantes mediante el software ProteOn Manager v3.1. Los sensogramas de doble referencia se ajustaron al modelo de unión 1:1.
Resultados. Los valores de afinidad del antígeno (KD) para las muestras de heterodímero Fab diseñado se registran en la Tabla 6A (diseños K-L) y en la Tabla 6B (diseños K-L derivados de K-K) en el contexto de pares de diseño. Los valores de KD de Fab H1L1 y H2L2 se incluyen en las columnas 2 y 4 (KD de heterodímero Fab CAT-2200 H1L1 y heterodímero Fab Pertuzumab H2L2, respectivamente), y 3 y 5 (cambio en KD de heterodímero Fab H1L1 o H2L2 en comparación con su tipo silvestre respectivo). Los valores de KD se determinaron solamente para muestras de heterodímeros Fab que exhibieron una captura del heterodímero Fab de al menos 100 RU. El valor KD de referencia para CAT-2200 de tipo silvestre unido a IL-17A usado para la comparación con los heterodímeros diseñados fue de 0.273 nM. Este valor es una mediana del valor basado en múltiples mediciones del heterodímero Fab CAT-2200 de tipo silvestre, donde la cadena ligera contiene una etiqueta FLAG. De manera similar, el valor KD de referencia para el pertuzumab de tipo silvestre unido a HER2 fue de 8.055 nM. Este valor es una mediana del valor basado en múltiples mediciones del heterodímero Fab pertuzumab de tipo silvestre, donde la cadena ligera contiene una etiqueta HA. En la Tabla 6, la diferencia en la KD con respecto a la afinidad de unión de tipo silvestre se muestra usando el cálculo -(log(KD_diseño) -log(KD_wt)), de modo que los valores positivos indican valores de KD menores mientras los valores negativos indican mayores valores de KD del heterodímero Fab en comparación con la afinidad de unión de tipo silvestre para el antígeno. NB indica que no se detectó unión. Cabe destacar que algunos heterodímeros Fab carecen de los valores KD medidos y, por lo tanto, se marcan como no determinado (ND). En algunos de estos casos, se evaluaron los heterodímeros Fab pero las dificultades técnicas (tales como baja captura de heterodímero Fab en el experimento de SPR, es decir, menos de 100 RU) impidieron determinaciones precisas de los valores de KD.
Para la mayoría de los heterodímeros Fab diseñados analizados, las sustituciones de aminoácidos presentaron un impacto bajo o nulo en los valores de KD. Tres diseños (identificadores únicos 10881-11412, 10883-11236 y 10888-11415) en la recopilación de diseños K-L mostraron una disminución > 5 veces en la KD en el Fab CAT-2200. En la recopilación de diseños K-L derivados de K-K, uno de los heterodímeros Fab Pertuzumab (diseños que contienen el código 10724 en el identificador único) mostraron una disminución >5 veces en la KD en el lado de Pertuzumab.
Ejemplo 7: Mediciones de estabilidad térmica de heterodímeros Fab diseñados mediante DSF.
Se utilizó fluorescencia diferencial de barrido (DSF, por sus siglas en inglés) para medir la estabilidad térmica de los heterodímeros correctamente emparejados en comparación con la del par de cadena pesada-cadena ligera no modificado de tipo silvestre. Si bien se sabe que DSF es un método menos preciso para medir las temperaturas de fusión, se usó en la presente ya que es un método de alto rendimiento para medir la estabilidad térmica y, por lo tanto, permitió obtener alguna medición de la estabilidad térmica para una gran cantidad de heterodímeros Fab. Los heterodímeros Fab se prepararon tal como se describe en el Ejemplo 5.
Medición de estabilidad térmica mediante DSF
La estabilidad térmica de los pares de heterodimeros Fab diseñados se midió usando DSF de la siguiente manera. Cada heterodímero se purificó tal como se describe en el Ejemplo 5 y se diluyó hasta 0.5 mg/mL en DPBS (solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco, HyClone Cat # SH30028.02). Para la mayoría de las muestras, se preparó una solución madre de trabajo de tinción de gel Sypro Orange (Life Technologies Cat # S-6650) mediante dilución de 4 pL de tinción de gel Sypro Orange hasta 2 ml de DPBS. Las muestras de DSF se prepararon mediante adición de 14 pL de proteína 0.5 mg/mL a 60 pL de la solución madre de trabajo de tinción de gel Sypro Orange diluida. Sin embargo, para proteínas que tenían menos de 0,5 mg/mL, cada muestra de DSF se preparó mediante adición de 14 pL de la proteína no diluida a 60 pL de una solución madre de trabajo de tinte Sypro Orange (que estaba diluida a 1:1500 en DPBS). Luego se realizó el análisis DSF, en duplicado, en alícuotas de 20 pl usando el instrumento Rotor-Gene 6000 qPCR (QiaGen Inc). Cada muestra se escaneó de 30 °C a 94 °C usando intervalos de 1°C con un equilibrio de 10 segundos entre cada etapa y un tiempo de espera de 30 segundos al comienzo. Se utilizó un filtro de excitación de 470 nM y un filtro de emisión de 610 nM con una ganancia de 9. Los datos se analizaron con el software de Rotor-Gene 6000 usando el valor máximo de la primera derivada de la curva de desnaturalización como la Tm. Las muestras de DSF restantes se prepararon y analizaron de manera similar, con las siguientes modificaciones de protocolo que no alteran los valores de Tm medidos: 1) la solución madre de trabajo se preparó mediante dilución de 1 pL de tinción de gel Sypro Orange hasta 2 ml de DPBS, 2) se analizaron alícuotas de 30 pl y 3) se utilizó una ganancia de 10.
Los resultados de DSF para las muestras de heterodímeros Fab diseñados se registran en la Tabla 6A (diseños K-L) y en la Tabla 6B (diseños K-L derivados de K-K) en el contexto de conjuntos de diseño de Mab. La estabilidad térmica de Fab H1L1 y H2L2 se incluyen en las columnas 6 y 8 (H1L1 se refiere al heterodímero Fab CAT-2200 y H2L2 al heterodímero Fab Pertuzumab) de las Tablas 6A y 6B. Para los heterodímeros Fab donde se realizaron repeticiones, el valor de Tm registrado es la mediana del valor. Las comparaciones de los valores de Tm del heterodímero Fab diseñado con respecto al valor de Tm del heterodímero Fab de tipo silvestre se registran en la columna 7 para H1L1 CAT-2200 y en la columna 9 para el H2L2 Pertuzumab. La mediana de la Tm para la construcción Fab CAT-2200 de tipo silvestre que contiene una etiqueta FLAG se determinó que era de 76.9 °C. La mediana de la Tm para el heterodímero Fab Pertuzumab de tipo silvestre que contiene una etiqueta HA se determinó que era de 82.4 °C. Dadas las limitaciones de rendimiento en el procedimiento de ampliación para la gran cantidad de heterodímeros Fab generados por los conjuntos de diseño de Mab, las mediciones de DSF se realizaron mediante extracción de muestras de un subconjunto de heterodímeros Fab diseñados. Por este motivo, algunos heterodímeros Fab carecen de los valores de Tm medidos por DSF y, por lo tanto, se marcan como no determinado (ND). La mayoría de los diseños analizados demostró buena estabilidad térmica, dentro del intervalo de valores de Tm esperados que se observan comúnmente para los Fab de tipo silvestre. Los heterodímeros Fab diseñados que contienen las mutaciones K145T_V177D_S188D en el HC y S176K_Y178L en el LC lambda o S176K_T178L en el LC kappa, afectaron negativamente los valores de Tm en >10 oC en el heterodímero Fab que contiene dichas mutaciones.
Ejemplo 8: Mediciones de estabilidad térmica de heterodímeros Fab diseñados mediante DSC.
Para complementar la medición de la estabilidad térmica mediante DSF, el método más preciso de calorimetría de barrido diferencial (DSC) también se usó para medir la estabilidad térmica de los heterodímeros Fab diseñados correctamente emparejados en comparación con la del par de cadena pesada-cadena ligera no modificado de tipo silvestre. Los heterodímeros Fab se prepararon tal como se describe en el Ejemplo 5.
Medición de estabilidad térmica mediante DSC
La estabilidad térmica de los pares de heterodímeros Fab diseñados se midió usando DSC de la siguiente manera. Se utilizaron muestras purificadas de 400|jL principalmente a concentraciones de 0.2 mg/ml o 0.4 mg/mL en PBS para análisis de DSC con un VP-Capillary DSC (GE Healthcare). En el comienzo de cada ejecución de DSC, se aplicaron 5 inyecciones en blanco de amortiguador para estabilizar la línea de referencia, y se colocó una inyección de amortiguador antes de cada inyección de muestra para obtener una referencia. Cada muestra se analizó de 20 a 100 °C a una velocidad de 60 °C/h, con retroalimentación baja, se filtró durante 8 seg, 5 min de preTstat y 70 psi de presión de nitrógeno. Se realizó una referencia y se analizaron los termogramas resultantes mediante el software Origin 7.
La estabilidad térmica de Fab H1L1 y H2L2 se incluyen en las columnas 10 y 12 (H1L1 se refiere al heterodímero Fab CAT-2200 y H2L2 al heterodímero Fab Pertuzumab, respectivamente) de la Tabla 6. Para cada heterodímero Fab donde se realizaron repeticiones, el valor de Tm informado es el valor de la mediana. Se registran comparaciones de los valores de Tm del heterodímero Fab diseñado con respecto al valor de Tm del heterodímero Fab tipo silvestre en la columna 11 para el H1L1 CAT-2200 (construcción Fab CAT-2200 tipo silvestre que contiene una etiqueta FLAG, con una mediana de Tm de 70.7 °C) y la columna 13 para el H2L2 Pertuzumab (construcción Fab Pertuzumab tipo silvestre que contiene una etiqueta HA, con una mediana de Tm de 78.7 °C). Dado el requisito de cantidades elevadas de muestra y la naturaleza de rendimiento bajo de DSC, se realizaron las mediciones mediante extracción de muestras de un subconjunto de diseños. Por este motivo, algunos heterodímeros Fab carecen de los valores de Tm medidos por DSC y, por lo tanto, se marcan como no determinado (ND). Todos los heterodímeros Fab diseñados analizados mediante DSC mostraron buena estabilidad térmica. En general, los valores de Tm derivados de DSC fueron inferiores a los observados mediante DSF (Ejemplo 7).
Ejemplo 9: Optimización de diseños
El rendimiento de los diseños K-L y los diseños K-L derivados de K-K en el sistema pertuzumab/CAT-2200, como se muestra en las Tablas 5A y 5B, respectivamente, se examinó para guiar la comprensión adicional de la capacidad de los diseños de impulsar el emparejamiento selectivo. Este examen permitió un ciclo posterior de optimización del diseño para mejorar la especificidad de emparejamiento cuando sea posible y/o aumentar la estabilidad de los heterodímeros. La optimización del diseño incluyó la modificación de los diseños K-L y los diseños K-L derivados de K-K en un residuo de aminoácido sustituido particular para evaluar el efecto de alternar la sustitución de aminoácidos en dicho residuo, agregar sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos adicionales y/o retirar sustitución de aminoácidos en un residuo particular (es decir, convirtiéndolo nuevamente en el residuo de tipo silvestre). El proceso de diseño y la selección de diseños se realizó como se describe en los Ejemplos 1 y 2, y los diseños resultantes se analizaron en el sistema K-L pertuzumab/CAT-2200.
Se propuso un conjunto adicional de diseños K-L usando un método alternativo para aumentar la diversidad de diseños con una mejora de la especificidad de emparejamiento, donde los diseños de dominio constante seleccionados de la Tabla 4A y 4B, así como los candidatos de diseño de optimización de dominio constante seleccionados descritos en el párrafo anterior, se combinaron con dos diseños de dominio variable K-K. Los dos diseños de dominio variable K-K se incluyen en la Tabla 4B, y presentan los identificadores exclusivos 10621-10733 y 10623-10745. Estos diseños no fomentaron una fuerte especificidad de emparejamiento por sí mismos y no afectaron la unión del antígeno, pero se ha demostrado que mejoran la especificidad de emparejamiento en combinación con determinados diseños de dominio constante Fab en un sistema de anticuerpo kappa-kappa. Este conjunto adicional de diseños K-L también incluyó combinaciones solamente de diseños de dominio constante, donde los diseños de dominio constante se seleccionan de la Tabla 4A, 4B y candidatos de diseños de optimización descritos en el párrafo anterior.
Finalmente, se propuso un conjunto adicional de diseños K-L derivados de K-K usando diseños representativos de la recopilación de diseños de K-K descrita en la Tabla 5 de la solicitud PCT n.° PCT/IB2015/054107 como punto de partida, y se analizó en el sistema K-L pertuzumab/CAT-2200. Como se describe en el Ejemplo 2, los diseños derivados de K-K representativos se adaptaron al sistema kappa-lambda modificando los residuos de aminoácidos según fuera necesario para tener en cuenta las diferencias de secuencia y estructurales entre las cadenas ligeras kappa y lambda.
La especificidad de emparejamiento de los diseños K-L adicionales y los diseños K-L derivados de K-K descritos en este Ejemplo se evaluó de forma experimental mediante LCCA en el sistema K-L pertuzumab-CAT-2200 como se describe en el Ejemplo 10.
Ejemplo 10: Preparación y evaluación de emparejamiento preferencial de heterodímeros Fab diseñados mediante LCCA
Las construcciones Fab pertuzumab y CAT-2200 que comprenden sustituciones de aminoácidos que corresponden a los conjuntos de diseño de Mab se prepararon como se describe en el Ejemplo 3. Como se describe en el Ejemplo 4, todos los experimentos de LCCA se llevaron a cabo en construcciones que contenían el enlace disulfuro entre cadenas de Fab ubicado en el dominio constante (H/C233-L/C214, numeración de Kabat). Para evaluar el emparejamiento preferencial presentado por los conjuntos de diseño de Mab, el emparejamiento preferencial presentado por los conjuntos de diseños de LCCA correspondientes se midió como se describe en el Ejemplo 4, con las siguientes excepciones.
La evaluación del emparejamiento preferencial en los conjuntos de diseños de LCCA se llevó a cabo mediante LCCA como se describe en el Ejemplo 4, salvo que la transfección se llevó a cabo con las cadenas pesadas y ligeras en una relación 1:1:3 (en peso) para H1:L1:L2 o H2:L2:L1, en lugar de 1:1:1, con la cadena pesada presente en cantidades limitantes, y la cadena ligera emparejada incorrectamente presente en exceso. Dado que los diseños descritos en el Ejemplo 9 fueron versiones optimizadas de los descritos en las Tablas 4A y 4B, o combinaciones constituidas de dos diseños, algunos de los cuales ya muestran especificidad de emparejamiento relativamente alta, fue posible que no se detectara una mejora adicional en dicha especificidad (si se logra) en el LCCA en el H1:L1:L2 o H2:L2:L1 de 1:1:1, debido a la limitación del ensayo. Por lo tanto, se usó la relación de ADN de 1:1:3, en lugar de 1:1:1, para detectar la mejora en la especificidad. Todas las transfecciones se realizaron usando 300 ng de H1, 300 ng de L1 y 900 ng de L2 (es decir, relación de H1:L1:L2 o H2:L2:L1 =1:1:3), 100 ng de AKTdd pTT22 (un vector que contiene un mutante B de proteína cinasa constitutivamente activa) y 400 ng de ADNes (ADN de esperma de salmón).
Análisis de datos y descripción de métrica de LCCA
El análisis de datos se llevó a cabo usando una versión modificada del análisis descrito en el Ejemplo 4, como se establece más adelante.
Todos los conjuntos de diseños de LCCA fueron analizados en el LCCA, y los diseños de interés se identificaron en función de los siguientes criterios de inclusión. Para ser considerado un diseño de interés, el diseño debía contener al menos un resultado de LCCA positivo por encima del límite superior de 95 % del intervalo de confianza escalar WT, mientras que el otro LCCA complementario debía ser superior al límite inferior de 95 % del intervalo de confianza escalar WT. Todos los diseños que pasaron los criterios anteriores se incluyeron en una segunda recopilación de diseños K-L, como se identifica en la Tabla 7A, o una segunda recopilación de diseños K-L derivados de K-K, como se identifica en la Tabla 7B.
La Tabla 8A y la Tabla 8B describen los datos de LCCA obtenidos para la segunda recopilación de diseños K-L y la segunda recopilación K-L derivada de K-K, respectivamente, en el contexto de diseños de Mab. El rendimiento de cada conjunto de diseños de LCCA en este Ejemplo se describió mediante dos valores escalares que correspondían al logaritmo natural de la relación de H1L1:H1L2 (mediana del valor) y la relación de H2L2:H2L1 (mediana del valor), respectivamente. Cabe destacar que estos valores escalares son levemente distintos de los valores escalares calculados en el Ejemplo 4, pero se utilizan de manera similar para evaluar el emparejamiento preferencial. Estos valores escalares se registran en las columnas 2 y 5 en la Tabla 8A para la segunda recopilación de diseños K-L, y en la Tabla 8B para la segunda recopilación de K-L derivada de K-K. Para el CAT-2200 de tipo silvestre (Hc ) compitió contra el CAT-2200 (LC-FLAG) más el Pertuzumab (LC-HA) el intervalo de confianza escalar del 95 % fue de -3.24 (límite inferior) hasta -2.94 (límite superior). Para el Pertuzumab de tipo silvestre (HC) compitió contra el Pertuzumab (LC-HA) más el CAT-2200 (LC-FLAG) el intervalo de confianza escalar del 95 % fue de -0.9 (límite inferior) hasta -0.6 (límite superior).
El intervalo escalar para cada LCCA de un diseño (experimentos H1L1L2 y H2L1L2) se muestra en las columnas 3 y 6 en las Tablas 8A y 8B como medida de la capacidad de reproducción de los resultados, y representa la diferencia entre los valores escalares superiores e inferiores medidos para el diseño. Para los resultados registrados de una única medición, los valores de intervalo se marcan como NC (no corresponde). Además, los valores escalares también se convirtieron en una mediana de la relación pura para H1L1:H1L2 y H2L2:H2L1. Esta conversión normalizó eficazmente las relaciones de LCCA hasta 100 %, como se observó en algunos casos que la cantidad total de H1L1 y H1L2, o H2L2 y H2L1 difirió significativamente del 100 %. Estos valores se registran en las columnas 4 y 7 en las Tablas 8A y 8B.
Resultados
Como se indicó anteriormente, los resultados de LCCA se muestran en las Tablas 8A y 8B en el contexto de conjuntos de diseños de Mab. La Tabla 8A proporciona los datos de LCCA relacionados con los diseños de K-L descritos en el Ejemplo 9. 151 diseños de K-L cumplieron con los criterios de inclusión, y la mayoría de los diseños tienen modificaciones de aminoácidos solamente en la región constante, algunos de los diseños también incorporan modificaciones de aminoácidos en la región variable (ver la Tabla 7A). Estos diseños se propusieron para impulsar adicionalmente la especificidad de emparejamiento y estabilidad y al mismo tiempo favorecer la capacidad de transferencia a otros sistemas de anticuerpos.
La Tabla 8B proporciona los datos de LCCA relacionados con los diseños de K-L derivados de K-K también descritos en el Ejemplo 9. 21 diseños de K-L derivados de K-K cumplieron con los criterios de inclusión. Estos diseños incluyen solamente diseños de dominio constante.
Ejemplo 11: Ampliación de heterodímeros Fab diseñados para caracterización biofísica
Para examinar las características biofísicas de los heterodímeros emparejados correctamente, la preparación<de los heterodímeros emparejados correctamente seleccionados H>1<L>1<o H2L2 (Fab diseñados) identificados>en los conjuntos de identificadores únicos que se muestran en las Tablas 7A y 7B se amplió como se describe en el Ejemplo 5, con la excepción de que se realizó una ampliación de 50 ml en lugar de 20 ml. Los Fab expresados se purificaron como se describe en el Ejemplo 5 para analizar la estabilidad térmica y la unión al antígeno. Se modificó el protocolo de purificación para incubar los sobrenadantes con la resina IgG-CH1 CaptureSelect™ sin dilución inicial en el amortiguador de equilibrio y se realizó elución de las muestras unidas con 4 volúmenes en lecho de amortiguador de elución.
Después de la purificación, se evaluó la expresión de los heterodímeros mediante un ensayo de expresión de proteínas de alto rendimiento no reductor y reductor usando Caliper LabChip GXII, como se indicó previamente en el Ejemplo 5.
Los datos demostraron que la inclusión de las modificaciones del conjunto de diseño de Mab en los Fab diseñados no presentaron un impacto significativo en la expresión de la proteína, teniendo en cuenta el rendimiento posterior a la purificación. El rendimiento posterior a la purificación obtenido para los Fab CAT-2200 diseñados fue de 1.3 mg/50 mL de expresión (SD de 0.6), en comparación con 1.9 mg/50 mL de expresión (SD de 0.5) para el Fab de tipo silvestre. Los Fab pertuzumab diseñados se prepararon con un rendimiento de 0.9 mg/50 mL de expresión (SD de 0.4), en comparación con 1.1 mg/50 mL de expresión (SD de 0.2) para el Fab de tipo silvestre. El análisis de calibre demostró un grado de pureza comparable con el Fab WT (no se muestran los datos). Una cantidad de Fab diseñados tuvieron precipitado asociado con estos (indicado con '*' en las Tablas 9A y 9B) luego de la purificación. La información de rendimiento proporcionada anteriormente se midió luego de retirar el precipitado.
Ejemplo 12: Mediciones de afinidad del antígeno de los heterodímeros Fab diseñados
La capacidad de los heterodímeros Fab diseñados CAT-2200 de unirse a IL-17A y de los heterodímeros Fab diseñados Pertuzumab de unirse a HER2-ECD se evaluó con el fin de determinar si las sustituciones de aminoácidos tenían algún efecto en la capacidad del heterodímero de unirse al antígeno. La unión al antígeno se evaluó como se describe en el Ejemplo 6, salvo que los Fab diseñados CAT-2200 se inyectaron a 50 pL/min durante 120s con una fase de disociación de 600 a 800 s, en lugar de una fase de disociación de 900 s. Además, el análisis de los Fab pertuzumab diseñados para la unión a HER2 se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 6, con las siguientes modificaciones: para cada captura de Fab, se diluyeron los Fab hasta 2.5 pg/ml en lugar de 2 pg/ml con un período de inyección de 120 s en lugar de 240 s. La concentración del antígeno HER2 inferior inyectada fue de 1.23 nM en lugar de 0.41 nM. La fase de disociación para la serie de concentración fue de 600 s en lugar de 1200 s.
Resultados. Los valores de afinidad del antígeno (KD) para las muestras de heterodímero Fab diseñado se registran en la Tabla 9A (diseños K-L) y en la Tabla 9B (diseños K-L derivados de K-K) en el contexto de pares de diseño de Mab. Los valores de KD de Fab H1L1 y H2L2 se incluyen en las columnas 2 y 4 (KD de heterodímero Fab CAT-2200 H1L1 y heterodímero Fab Pertuzumab H2L2, respectivamente), y 3 y 5 (cambio en KD de heterodímero Fab H1L1 o H2L2 en comparación con su tipo silvestre respectivo). Los valores de KD se determinaron solamente para muestras de heterodímeros Fab que exhibieron una captura del heterodímero Fab de al menos 100 RU. El valor KD de referencia para Fab CAT-2200 de tipo silvestre unido a IL-17A usado para la comparación con los heterodímeros diseñados fue de 0.209 nM. Este valor es una mediana del valor basado en múltiples mediciones del heterodímero Fab CAT-2200 de tipo silvestre, donde la cadena ligera contiene una etiqueta FLAG y no difiere significativamente del valor registrado en el Ejemplo 6. De manera similar, el valor KD de referencia para el pertuzumab de tipo silvestre unido a HER2 fue de 7.8 nM. Este valor también es una mediana del valor basado en múltiples mediciones del heterodímero Fab pertuzumab de tipo silvestre, donde la cadena ligera contiene una etiqueta HA y no difiere significativamente del valor registrado en el Ejemplo 6. En las Tablas 9A y 9B, la diferencia en la KD con respecto a la afinidad de unión de tipo silvestre se muestra usando el cálculo -(log(KD_diseño) - log(KD_wt)), de modo que los valores positivos indican valores de KD menores mientras los valores negativos indican mayores valores de KD del heterodímero Fab en comparación con la afinidad de unión de tipo silvestre para el antígeno. Como se indicó anteriormente, debido a las limitaciones en el rendimiento en el procedimiento de ampliación para la gran cantidad de heterodímeros Fab generados por los conjuntos de diseños de Mab, las mediciones de SPR se realizaron mediante extracción de muestras de un subconjunto de heterodímeros Fab diseñados. Por este motivo, algunos heterodímeros Fab carecen de los valores de KD medidos mediante SPR y, por lo tanto, se marcan como no determinado (ND). Para los heterodímeros Fab diseñados analizados, las sustituciones de aminoácidos presentaron un impacto bajo o nulo en los valores de KD (dentro de 2 veces del WT).
Ejemplo 13: Mediciones de estabilidad térmica de heterodímeros Fab diseñados mediante DSF
Se utilizó fluorescencia diferencial de barrido (DSF, por sus siglas en inglés) para medir la estabilidad térmica de los heterodímeros Fab diseñados correctamente emparejados en comparación con la de los Fab de tipo silvestre. Los heterodímeros Fab se prepararon tal como se describe en el Ejemplo 11.
Medición de estabilidad térmica mediante DSF
La estabilidad térmica del heterodimero Fab diseñado se midió usando DSF de la siguiente manera. Cada heterodímero purificado se diluyó hasta 0.67 mg/mL en DPBS (solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco, HyClone Cat # SH30028.02). Se preparó una solución madre de trabajo de tinción de gel Sypro Orange (Life Technologies Cat # S-6650) mediante dilución 1:1000 en DPBS. Las muestras de DSF se prepararon mediante adición de 15 pL de proteína 0.67 mg/mL a 15 pL de la solución madre de trabajo de tinción de gel Sypro Orange. Sin embargo, para proteínas que tenían una concentración inferior a 0.67 mg/mL, cada muestra de DSF se preparó mediante adición de 15 pL de la proteína no diluida a 15 pL de una solución madre de trabajo de tinte Sypro Orange. Luego se realizó el análisis DSF en alícuotas de 30 pl usando el instrumento Rotor-Gene 6000 qPCR (QiaGen Inc). Cada muestra se escaneó de 30 °C a 94 °C usando intervalos de 1°C con un equilibrio de 10 segundos entre cada etapa y un tiempo de espera de 30 segundos al comienzo. Se utilizó un filtro de excitación de 470 nM y un filtro de emisión de 610 nM con una ganancia de 8. Los datos se analizaron con el software de Rotor-Gene 6000 usando el valor máximo de la primera derivada de la curva de desnaturalización como la Tm.
Los resultados de DSF para las muestras de heterodímeros Fab diseñados se registran en la Tabla 9A (diseños K-L) y en la Tabla 9B (diseños K-L derivados de K-K) en el contexto de conjuntos de diseño de Mab. La estabilidad térmica de Fab H1L1 y H2L2 se incluyen en las columnas 6 y 8 (H1L1 se refiere al heterodímero Fab CAT-2200 y H2L2 al heterodímero Fab Pertuzumab) de las Tablas 9A y 9B. Para los heterodímeros Fab donde se realizaron repeticiones, el valor de Tm registrado es la mediana del valor. Las comparaciones de los valores de Tm del heterodímero Fab diseñado con respecto al valor de Tm del heterodímero Fab de tipo silvestre se registran en la columna 7 para H1L1 CAT-2200 y en la columna 9 para el H2L2 Pertuzumab. La mediana de la Tm para la construcción Fab CAT-2200 de tipo silvestre que contenía una etiqueta FLAG se determinó que era de 77.0 °C. La mediana de la Tm para el heterodímero Fab Pertuzumab de tipo silvestre que contenía una etiqueta HA se determinó que era de 81.7 °C. Como se mencionó anteriormente, se realizaron mediciones de DSF mediante extracción de muestras de un subconjunto de heterodímeros Fab diseñados, por lo tanto, algunos heterodímeros Fab carecen de los valores de Tm medidos por DSF y se marcan como no determinados (ND). La mayoría de los diseños analizados mostraron buena estabilidad térmica (que presenta una disminución de Tm en comparación con WT de hasta 4-5°C), dentro del intervalo de valores de Tm esperados que se observan comúnmente para Fab de tipo silvestre, con la siguiente excepción. La presencia de las mutaciones S131K_L135K en la cadena ligera kappa junto con las mutaciones L124E_K145T en la cadena pesada kappa en dos heterodímeros Fab que parecieron afectar negativamente sus valores de Tm en > 10 oC. También cabe destacar que, para algunos de los Fab diseñados CAT-2200, se observó una meseta con el pico Fab principal en los espectros de DSC (estos Fabs se marcan con ‘#' en las Tablas 9A y 9B). Dicho perfil también se observó para el Fab CAT-2200 de tipo silvestre.
Ejemplo 14: Mediciones de estabilidad térmica de heterodímeros Fab diseñados mediante DSC
Para complementar la medición de la estabilidad térmica mediante DSF, el método más preciso de calorimetría de barrido diferencial (DSC) también se usó para medir la estabilidad térmica de los heterodímeros Fab diseñados correctamente emparejados en comparación con la del par de cadena pesada-cadena ligera no modificado de tipo silvestre. Se prepararon heterodímeros Fab como se describe en el Ejemplo 11 y la estabilidad térmica se midió mediante DSC como se describe en el Ejemplo 8. Sin embargo, para los heterodímeros Fab que presentaron concentraciones de muestra inferiores a las indicadas en el protocolo, se realizó DSC en la concentración disponible.
Las mediciones de la estabilidad térmica para los Fab H1L1 y H2L2 se muestran en las columnas 10 y 12 (H1L1 se refiere al heterodímero Fab CAT-2200 y H2L2 al heterodímero Fab Pertuzumab, respectivamente) de la Tabla 9A y 9B. Para cada heterodímero Fab donde se realizaron repeticiones, el valor de Tm informado es el valor de la mediana. Se registran comparaciones de los valores de Tm del heterodímero Fab diseñado con respecto al valor de Tm del heterodímero Fab tipo silvestre en la columna 11 para el H1L1 CAT-2200 (construcción Fab CAT-2200 tipo silvestre que contiene una etiqueta FLAG, con una mediana de Tm de 70.7 °C) y la columna 13 para el H2L2 Pertuzumab (construcción Fab Pertuzumab tipo silvestre que contiene una etiqueta HA, con una mediana de Tm de 78.1°C). Dado el requisito elevado de las cantidades de muestra y la naturaleza de rendimiento bajo de DSC, se realizaron las mediciones mediante extracción de muestras de un subconjunto de diseños caracterizados mediante DSF. Por este motivo, algunos heterodímeros Fab carecen de los valores de Tm medidos mediante DSC y, por lo tanto, se marcan como no determinados (ND). Todos los heterodímeros Fab diseñados sometidos a ensayo mediante DSC mostraron buena estabilidad térmica (disminución de Tm en comparación con WT hasta 2-3 C). En general, los valores de Tm derivados de DSC fueron inferiores a los observados mediante DSF (Ejemplo 13). Si bien se observó que la diferencia absoluta en la Tm de los Fab diseñados en comparación con WT depende del método utilizado, ya sea DSF o DSC, la clasificación relativa de los Fab diseñados con respecto al Fab de tipo silvestre fue igual, independientemente del método utilizado.
Ejemplo 15: Agrupamiento de diseños y selección de diseños representativos
Los ejemplos 2 a 14 describieron el diseño y el análisis de los diseños de K-L y los diseños de K-L derivados de K-K. La capacidad de estos diseños de fomentar el emparejamiento se analizó en el LCCA, en un formato Fab en el que se determinó la capacidad de una cadena pesada de cada conjunto de diseños de LCCA de emparejarse con la cadena ligera apropiada. También se evaluaron los efectos de las sustituciones de aminoácidos en la estabilidad y la unión al antígeno de los heterodímeros emparejados correctamente resultantes (una cadena pesada y una cadena ligera).
Para analizar si los resultados de emparejamiento preferencial para los conjuntos de diseños de Mab (H1L1H2L2) obtenidos en un formato de LCCA (expresión conjunta de H1, L1 y<l>2, o de H2, L1 y L2) para los diseños de K-L y los diseños de K-L derivados de K-K también se aplicaron cuando las cadenas polipeptídicas de un conjunto de diseños de Mab se expresaron conjuntamente (es decir, cuando se expresan conjuntamente H1, L1, H2 y L2), se seleccionó una cantidad representativa de los más de 400 diseños descritos en las Tablas 4A, 4B, 7A y 7B, dado que no era viable analizar todos los diseños de esta manera. Se analizaron los diseños representativos en un ensayo denominado “SMCA” (que se describe en detalle en el Ejemplo 16).
Para seleccionar los diseños representativos, los diseños K-L identificados en las Tablas 4A y 7A (n=404) se combinaron y agruparon de acuerdo con la identidad en las posiciones de residuos de aminoácidos sustituidas. En algunos casos en los que el diseño de K-L derivado de K-K de la Tabla 7B se modificó significativamente del diseño de K-K original, también se incluyó en este grupo de diseños de K-L para el agrupamiento. Las Tablas 10-A1 a 10-A12 muestran los agrupamientos resultantes 1 a 12 para los diseños de K-L. Asimismo, los diseños de K-L derivados de K-K indicados en las Tablas 4B y 7B (n=43), excluyendo los que se movieron al grupo de diseño de K-L, también se combinaron y agruparon. Las Tablas 10-B1 a 10-B10 muestran los agrupamientos resultantes 1 a 10 para los diseños de K-L derivados de K-K. Luego se seleccionaron los diseños representativos de cada agrupamiento como se describe más adelante. El conjunto final de diseños representativos seleccionados también se incluye en la Tabla 11A (diseños de K-L) y 11B (diseños de K-L derivados de K-K) que incluyen la designación ID de diseño de SMCA.
Diseños representativos para SMCA
Se seleccionaron diseños representativos en función de los criterios principales para demostrar la especificidad de emparejamiento y que tienen un impacto mínimo o nulo en la unión al antígeno, así como teniendo en cuenta los criterios secundarios tales como: estabilidad de diseño, minimizando la cantidad de sustituciones, expresión comparable a WT. Se evaluó la especificidad de emparejamiento máxima teniendo en cuenta ambos Fab, así como cada Fab individualmente, donde un Fab se emparejó menos correctamente que el otro Fab en el par de heterodímeros, pero aún demostró un emparejamiento mejor al del tipo silvestre (casos A y B, como se muestra en la Figura 6). Además, la diversidad dentro de un grupo y la cantidad de diseños en un grupo guiaron de manera adicional el tipo y la cantidad de representantes del grupo seleccionados.
Se seleccionaron un total de 33 diseños de K-L representativos de los grupos 1 a 12 para el análisis en el formato SMCA. Asimismo, se seleccionaron 7 diseños de K-L derivados de K-K con valores de rendimiento de LCCA promedio alto a medio de 7 grupos de los 10 grupos identificados. Tres de los grupos de diseños de K-L derivados de K-K no incluyeron los diseños que cumplieron con los criterios de un representante con respecto a los criterios principales, tales como los criterios de rendimiento de LCCA o la falta de efecto en la unión al antígeno.
Se seleccionó al menos un diseño representativo de cada grupo. Los grupos que se representaron solamente con un diseño representativo incluyeron los grupos de diseños de K-L 5 y 11, y los 7 grupos de diseños K-L derivados de K-K. Los grupos restantes tuvieron más de un diseño representativo dado que los grupos eran grandes (es decir, grupos 2, 3, 4, 6, 7, 8) y/o presentaron más subdiversidad de diseño (grupos menores) (es decir, grupos 1, 9, 10, 12). Aunque los diseños dentro de cada grupo compartían similitudes de secuencia, los grupos menores dentro de un grupo se diferenciaban en al menos un controlador (sustitución de aminoácidos). Los diseños representativos para cada grupo se resaltan en negrita en las Tablas 10-A1 a 10-A12 y 10-B1 a 10-B10. Como se indicó en otra parte de la presente, “-” en estas tablas indica que no había sustituciones de aminoácidos que fomenten el emparejamiento preferencial presentes en dicha cadena polipeptídica particular.
Controladores y sustituciones secundarias
Los grupos para los cuales se seleccionaron representantes se describen en la presente, enfocándose en la identificación de los “controladores” o “conjuntos controladores” (posiciones y/o sustituciones de aminoácidos) que fomentaron la especificidad de emparejamiento deseada en cada grupo, según se evalúa mediante LCCA. La expresión “conjunto de controladores” se refieren a un conjunto de posiciones y sustituciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial, mientras que el término “controlador” se refiere a una única posición/sustitución dentro de un conjunto de controladores. Sin embargo, a menudo otros residuos y sustituciones estuvieron asociados a un diseño o conjunto de diseños en un grupo. Estos residuos y sustituciones se denominan sustituciones “secundarias” y a menudo se incluyeron en un conjunto de diseños de Mab para mejorar el rendimiento del conjunto de controladores o conjuntos de controladores utilizados. De manera mecánica, estas sustituciones secundarias pueden actuar para i) fomentar el ajuste estérico de los controladores, ii) aumentar la cantidad de contactos o sustituir contactos que se pierden luego de las sustituciones en las posiciones de conjuntos de controladores, en la interfaz entre las cadenas pesadas y ligeras, iii) optimizar la red de unión al hidrógeno en función de los conjuntos de controladores, y/o iv) crear un caso que contribuye a la mejora del rendimiento de los conjuntos de controladores. Uno o más de estos mecanismos se pueden usar para/pretenden mejorar el rendimiento de los controladores en cada grupo.
Algunas de estas sustituciones secundarias fueron comunes en varios grupos. Por ejemplo, la sustitución K145T en la cadena pesada se utilizó en H1L1 o H2L2 para retirar la carga positiva cuando se diseñaron uno o más controladores con carga negativa en sus inmediaciones. En una cantidad de grupos, la sustitución K129T en la cadena ligera lambda a menudo se utilizó para retirar la carga positiva cuando se diseñaron uno o más controladores con carga negativa en sus inmediaciones (por ejemplo, grupo de diseño de K-L 4 y grupos 8 12). Además, la sustitución E124Q en la cadena ligera lambda se utilizó en algunos grupos para retirar la carga negativa en las inmediaciones de uno o más controladores con carga positiva (por ejemplo, grupos de diseño de K-L 1-3). La sustitución V133G se aplicó predominantemente en la cadena ligera kappa en algunos de los diseños para adaptar estéricamente los conjuntos de controladores particulares (por ejemplo, predominantemente en los grupos de diseño K-L 1, 3, 4, 6, 7, 10, 12 y en el grupo de diseño K-L 10 derivado de K-K). Y178T en la cadena ligera lambda se introdujo en diseños para ajuste estérico de conjuntos controladores específicos en el H1L1 respectivo (por ejemplo, grupos K-L 4, 5, 8 y 12). V133S en la cadena ligera se aplicó en aún otro conjunto controlador (por ejemplo, grupos K-L 1, 2 y 12) dirigido a una mejora de la red de unión a hidrógeno.
Descripción de grupos de diseño K-L
Para el grupo 1, se seleccionaron dos diseños (13175-13486 y 13180-13515) para representar al grupo ya que estos diseños utilizaron controladores electrostáticos similares que ocupan espacio similar (véase la Tabla 10-A1). Para todos los miembros de este grupo, se utilizó una combinación de dos conjuntos de controladores. Se diseñó un primer conjunto controlador electrostático para permitir que la sustitución con carga negativa (predominantemente L143D) en H1 forme puentes de sal con una sustitución con carga positiva (T131K/R) en L1, mientras que H2 se diseñó para permitir que a) las sustituciones con carga positiva, S188K o L124R_S186R, formen puentes de sal con sustituciones con carga negativa en L2 (S176D_T178E o S176D_T180E) o b) formación de puentes de sal entre L143R o S186K en H2 y Q124E_V133D en L2. Se agregó un segundo conjunto controlador electrostático, denominado “conjunto controlador de direccionamiento de disulfuro” para desfavorecer la formación del H-L o enlace disulfuro de heterodímero en heterodímeros emparejados incorrectamente en las etapas tempranas del proceso de montaje de H-L. El conjunto controlador de direccionamiento de disulfuro utilizó una sustitución con carga positiva en H1 (A125R), una sustitución con carga negativa en L1 (S122D), una sustitución con carga negativa en H2 (K228D) y una sustitución con carga positiva en L2 (S121K). Estas sustituciones de aminoácidos se ubican en las cercanías del enlace disulfuro, lejos de la interfaz H-L cubierta (principal), donde se ubica la mayoría de las sustituciones de aminoácidos en los diseños de K-L. Los dos conjuntos controladores se diseñaron para formar puentes de sal en los heterodímeros emparejados preferentemente, mientras que los pares emparejados incorrectamente se verían desfavorecidos principalmente debido a la repulsión electrostática.
Para el grupo 2, se seleccionaron cuatro diseños representativos (13282-13484, 13287-13494, 13218-13482 y 10945-11377) para reflejar el grado de diversidad en este grupo (véase la Tabla 10-A2). Todos los miembros de este grupo se basan en H1 diseñado de forma similar al primer conjunto controlador electrostático del grupo 1, para permitir que sustituciones con carga negativa (L143D o L143D_Q179E) formen puentes de sal con una sustitución con carga positiva (T131K/R) en L1, mientras que H2 se diseñó para permitir que a) una sustitución con carga positiva (S186K) forme puentes de sal con sustituciones con carga negativa en L2, principalmente V133D o V133D_Q160E; b) S188K se empareje con S131D/E de L2; o c) L143R/K se empareje con Q124E_V133D de L2. Algunos miembros del grupo 2 también contenían un conjunto controlador estérico además del conjunto controlador electrostático. Se usaron dos conjuntos controladores estéricos, denominados “estérico 1” y “estérico 2”. El conjunto controlador estérico 1 incluyó F174G en H1, diseñado para que sea estéricamente complementario a S176F o T116F_S176F de L1, y V190F de H2 estéricamente complementario a L135A de L2. El conjunto controlador estérico 2 incluyó A139W en H1 estéricamente compatible con los residuos WT de L1 y Wt de H2 estéricamente compatible con L135W de L2. Por lo tanto, en este grupo, el emparejamiento incorrecto de H1L2 y H2L1 se vería desfavorecido debido principalmente a la repulsión electrostática o repulsión electrostática junto con la incompatibilidad estérica. También hay dos miembros del grupo que, además del conjunto controlador electrostático contienen un componente de diseño variable (“conjunto controlador de dominio variable”) en la cadena H2 (Q39E o L45P) y cadena L2 (Q38R o P44F, respectivamente) para los cuales no se seleccionaron representantes, pero se esperaría que mejore el emparejamiento.
Para el grupo 3, se seleccionaron cinco diseños representativos (10931-11263, 13221-13411, 10987-11257, 10983-11306 y 10947-11392) (véase la Tabla 10-A3). Los miembros de este grupo utilizaron conjuntos controladores electrostáticos similares en H1 (L143D o L143E_Q179E) y L1 (T131R/K) como en el grupo 2, pero difirieron con respecto al diseño de H2L2. El diseño de H2L2 se basó principalmente en a) L124R_S186R/K o L124R_Q179K o S188K de H2 emparejándose con S176D_T178E o S176D_T180E de L2; o b) L143R_S188K de H2 emparejándose con Q124e_V133D_S176D_T178D/E de L2, lo que conlleva el desfavorecimiento de los pares emparejados incorrectamente principalmente debido a la repulsión electrostática. Como en el grupo 2, algunos miembros del grupo también utilizaron un conjunto controlador estérico 1 o estérico 2 además del conjunto controlador electrostático. Un representante de dicha combinación de conjuntos controladores es 13221-13411. Este grupo también incluyó dos diseños que contienen un “conjunto controlador de dominio variable” además del conjunto controlador electrostático.
Se seleccionaron tres diseños representativos (13335-13361, 13209-13364 y 11100-11205) para el grupo 4 (véase la Tabla 10-A4). La mayoría de los miembros de este grupo utilizó controladores electrostáticos similares en H1 (S188K) y L1 (S176E/D_Y178E) con diversas variaciones en el par H2L2: a) V177D_S188D de H2 emparejándose con S176K_T178R/K de L2; o b) S186E o L124E o L124E_Q179E de H2 emparejándose con S176K/R o S131K/R_S176R/K de L2, lo que permitiría la formación de puentes de sal en los heterodímeros emparejados preferentemente, mientras que los pares emparejados incorrectamente se verían desfavorecidos principalmente debido a la repulsión electrostática. Algunos miembros de este grupo utilizaron solamente un conjunto controlador estérico, es decir, un conjunto controlador estérico 3 o algunos componentes del conjunto controlador estérico 3, además de los conjuntos controladores electrostáticos. El conjunto controlador estérico 3 se basó en los residuos WT en H1L1 o S188A en H1 y S176A_Y178W en L1 y S188W o S186I/L_S188W en H2 diseñado para que sea estéricamente complementario a S176V o S176A_T178A en L2. Además, algunos miembros de este grupo también contenían el conjunto controlador de direccionamiento disulfuro además de los conjuntos controladores electrostáticos. Además, unos pocos miembros del grupo contenían los conjuntos controladores de dominio variable además del controlador electrostático.
El grupo 5 se representó con un identificador exclusivo 11066-11181 (véase la Tabla 10-A5). Todos los miembros de este grupo utilizaron conjuntos controladores electrostáticos. Un primer conjunto de controladores electrostáticos se basó en S186K en H1 emparejándose con V133D en L1 y S188D o V177D_S188D de H2 emparejándose con S131K o S176K_T178R/K respectivamente, en L2. Un segundo conjunto de controladores tenía orientación de carga inversa, principalmente L124E_V190D en H1 emparejándose con L135K en L1 y L124R o S188K de H2 emparejándose con S176D o S176D_T178E de L2.
Para el grupo 6, se seleccionaron dos diseños representativos (10808-11308 y 10814-11233) (véase la Tabla 10-A6). Todos los miembros de este grupo utilizaron conjuntos controladores electrostáticos similares en el par H1L1: V177D_S188D de H1 con S176K_Y178K/R de L1 y un conjunto más diverso de controladores en el par H2L2, a saber a) S188K de H2 emparejándose con S176E/D_T178E o S131D/E de L2; b) S186K/R de H2 emparejándose con V133D o Q124E_Q160E_T180E de L2; c) L124R o L124R_Q179K de H2 emparejándose con S176D o S176D_T178D o S176D_T180E de L2; o d) L143K/R de H2 emparejándose con V133D o Q124E_V133D de L2. Estas sustituciones permitieron la formación de puentes de sal en los heterodímeros emparejados preferentemente, mientras que los pares emparejados incorrectamente se verían desfavorecidos principalmente debido a la repulsión electrostática.
Para el grupo 7, se seleccionaron tres diseños (13167-13514, 13263-13493 y 12878-11240) para representar el grupo (véase la Tabla 10-A7). Todos los miembros del grupo utilizaron conjuntos controladores electrostáticos basados en un conjunto controlador común en H1L1: S188E en H1 y Y178K en L1, con alguna diversidad del conjunto controlador en el par H2L2: principalmente L124R o S188K (también combinados con L143K o S186R o Q179K) de H2 emparejándose principalmente con S176D/E_T178D/E o S176D/E_T180E o junto con Q124E de L2. Algunos de los miembros del grupo también contenían el conjunto controlador de direccionamiento de disulfuro, el conjunto controlador estérico 2 o un conjunto controlador de dominio variable además del conjunto controlador electrostático.
Para el grupo 8, se seleccionaron cinco diseños (13320-13370, 12938-13469, 13226-13434, 11026-11270 y 13316-13451) para representar el grupo (véase la Tabla 10-A7). Los miembros de este grupo tuvieron más variabilidad en el par electrostático H1L1, mientras que el par H2L2 se basaba en los controladores L143E o L143E_Q179E en H2 emparejándose principalmente con controladores Q124R/K_T178R o Q124R_Q160R/K_T178R en L2. La diversidad del controlador H1L1 fue la siguiente: a) S186R o Q179K utilizados como controladores en H1 se emparejaron principalmente con el controlador S180E de L1 (la variación de S186K en H1 se emparejó con el controlador V133D en L1); b) el controlador L143K de H1 se emparejó con V133D o T131E/D_V133D de L1; o c) S188K de H1 se emparejó principalmente con S176D/E_Y178E de L1. Algunos de los miembros del grupo contenían el conjunto controlador estérico 2 o estérico 3 o el conjunto controlador estérico 4 basado en L124W en H2 modificado genéticamente para que sea estéricamente complementario a V133A en L2 (algunos miembros del grupo como parte del último diseño también utilizaron una sustitución de L143A en H1 y V133W en L1) además del conjunto controlador electrostático. Además, unos pocos miembros del grupo contenían un conjunto controlador de dominio variable además del conjunto electrostático, para el cual se seleccionó un representante, o contenían un enlace disulfuro modificado genéticamente entre F122C de H2 y Q124C de L2.
Para el grupo 9, se seleccionaron dos diseños representativos (13208-13455 y 13194-13427) (véase la Tabla 10-A9). Casi todos los miembros de este grupo utilizaron una combinación de dos conjuntos controladores electrostáticos. Un primer conjunto controlador estaba compuesto predominantemente por Q179K o S186R en H1 y S180E en L1 con L143E o L143E_Q179E en H2 y S131K o Q124R_T178R o Q124R_Q160K_T178R en L2, y el segundo conjunto controlador fue el conjunto controlador de direccionamiento de disulfuro.
Para el grupo 10, se seleccionaron dos diseños representativos (13238-13463 y 13304-13466) (véase la Tabla 10-A10). Los miembros de este grupo se basaron en el controlador estérico 1 solo, o combinado con los conjuntos controladores electrostáticos utilizados en el grupo 9.
Para el grupo 11, se seleccionó un diseño representativo (13306-13375) (véase la Tabla 10-A11). Todos los miembros de este grupo utilizaron sustituciones electrostáticas para impulsar el emparejamiento preferencial de los heterodímeros, en función de los siguientes controladores: L143K_V190K en H1 y V133D en L1 y L124E en H2 y S131K_L135K en L2.
Para el grupo 12, se seleccionaron tres diseños representativos (13227-13383, 11065-11206 y 11034-11204) (véase la Tabla 10-A12). Los miembros de este grupo utilizaron principalmente sustituciones electrostáticas para impulsar el emparejamiento preferencial de los heterodímeros. Estas incluyeron L143K o S186K en H1 y V133D o T131D/E_V133D en L1 y predominantemente L124E_Q179E en H2 y S131K/R_S176R en L2. Algunos miembros del grupo incluyeron además los conjuntos controladores de direccionamiento de disulfuro, estérico 2, estérico 3 o de dominio variable.
Descripción de grupos de diseño K-L derivados de K-K
Se analizó un conjunto significativamente más pequeño de diseños de K-L derivados de K-K (n=43) en el LCCA en comparación con los diseños de K-L. Por lo tanto, cada uno de los diez grupos transportados kappa-kappa se representó con un único diseño. La mayoría de los grupos utilizó conjuntos controladores electrostáticos, salvo dos que utilizaron conjuntos controladores estéricos. Además, dos grupos estaban compuestos de diseños en el dominio variable únicamente, mientras que el resto de los grupos comprendían diseños de dominio constante.
El grupo 1 incluyó diseños electrostáticos basados en el siguiente conjunto de controladores: L143E_Q179E en H1, E124K_Y178R en L1, S186R en H2, y T178E_T180E o Q160E_T180E en L2 y está representado por el diseño 10657-10760.
El grupo 2 incluyó los conjuntos controladores electrostáticos que presentan L143E en H1, E124R en L1 y S186R o Q179K en H2, Q124E_Q160E_T180E en L2 (representante de diseño 10652-10734).
El grupo 3 contenía un controlador con carga positiva S186R en H1 complementario a un controlador con carga negativa S180E en L1, y un controlador con carga negativa L143E o Q179E o su combinación en H2 complementario predominantemente a un controlador con carga positiva Q124K_T178R en L2 (representante de diseño 10685-10726).
El grupo 4 utilizó los siguientes controladores: Q179K en H1, S180E en L1 y L143E en H2, Q124R o Q124R_Q160K_T178R en L2 (representante de diseño 10665-10724).
Los miembros del grupo 6 contenían diseños de dominio variable basados en el par electrostático de Q39K/R y Q38E/D en un brazo y Q39E/D con Q38K/R en el otro brazo (se utilizaron orientaciones con pares de ambas cargas en los brazos H1L1 y H2L2) (representante de diseño 10681-10741).
Los miembros del grupo 8 incluyeron un segundo conjunto de controladores de dominio variable, de naturaleza estérica: WT o L45F en H1 complementario a WT en L1, y L45A/P en H2 complementario a P44F de L2 (representante de diseño 10621-10733).
El grupo 10 incluyó un único diseño basado en L124E en H1, S176R en L1 y L124R en H2 y S176D en L2 (diseño 10640-10713).
Los representantes de los grupos 5, 7 y 9 no se seleccionaron ya que no cumplieron con los criterios de rendimiento, tal como impulso moderado a fuerte o falta de impacto en la unión al antígeno con respecto al Fab parental.
Ejemplo 16: Evaluación de emparejamiento preferencial de heterodímeros diseñados en conjuntos de diseños de Mab en un formato de anticuerpo biespecífico
Los ejemplos 2 a 4 y 10 demostraron la capacidad de los Fab diseñados de emparejarse preferentemente en el contexto de un diseño LCCA (es decir, H1, L1, L2 o H2, L1, L2, donde se expresó conjuntamente una cadena pesada con dos cadenas ligeras en un formato Fab). En este ejemplo, los heterodímeros diseñados en los conjuntos de diseño de Mab (H1, L1, H2, L2) se evaluaron para determinar si fomentaron el emparejamiento preferencial en un formato de anticuerpo biespecífico (es decir, donde se expresan conjuntamente H1, L1, H2 y L2). Además de las sustituciones de aminoácidos del conjunto de diseño de Mab, la región Fc de la cadena pesada de longitud completa de cada heterodímero se modificó asimétricamente de manera que una cadena pesada comprendiera sustituciones de aminoácidos T350V, L351Y, F405A y Y407V (cadena A) y la otra cadena pesada comprendiera sustituciones de aminoácidos T350V, T366L, K392L y T394W (cadena B) donde la numeración de aminoácidos del Fc concuerda con el sistema de numeración de EU. Estas modificaciones Fc asimétricas se incluyeron para fomentar la heterodimerización de las cadenas pesadas únicas.
La capacidad de los heterodímeros diseñados en los conjuntos de Mab para fomentar el emparejamiento preferencial en el contexto de un anticuerpo biespecífico se evaluó en 3 sistemas biespecíficos usando combinaciones de los anticuerpos CAT-2200 y pertuzumab descritos en los ejemplos anteriores, y un anticuerpo CR8071(proteína hemaglutinina B anti-influenza) y SGN-CD19a (anti-CD19). Los 3 sistemas biespecíficos analizados fueron: A) CAT-2200 (con una cadena ligera lambda)/pertuzumab (con una cadena ligera kappa), B) CAT-2200 (con una cadena ligera lambda)/SGN-CD19a (con una cadena ligera kappa), y C) CR8071 (con una cadena ligera lambda)/SGN-CD19a (con una cadena ligera kappa). CAT-2200 y<c>R8071 son anticuerpos humanos, mientras que pertuzumab y SGN-CD19a son anticuerpos humanizados.
Formato de ensayo (SMCA)
Se evaluó la capacidad de los heterodímeros que contienen sustituciones de aminoácidos de un conjunto de diseño de Mab de emparejarse preferentemente para formar un anticuerpo biespecífico correctamente emparejado como se describe más adelante. El ensayo se basa en la coexpresión de las cuatro cadenas (cadenas H1 y L1 de un anticuerpo con las cadenas H2 y L2 del otro anticuerpo) y la detección de la presencia de anticuerpos biespecíficos formados correctamente mediante espectrometría de masas (LC-MS). La Figura 8 proporciona un esquema que ilustra las cuatro cadenas de polipéptidos de partida y los productos potenciales que resultan de la expresión conjunta de estas cadenas de polipéptidos de partida en ausencia del emparejamiento preferencial entre cadenas pesadas y ligeras (en regiones Fab y Fc) de los pares de heterodímeros. Se expresaron conjuntamente dos construcciones de cadena pesada de longitud completa únicas con dos construcciones de cadena ligera únicas, lo que produjo diez especies de anticuerpos posibles (también denominadas especies Mab): H1L1_H1L1, H1L2_H1L2, H1L1_H1L2, H2L1_H2L1, H2L2_H2L2, H2L1_H2L2, H1L1_H2L1, H1L2_H2L2, H1L2_H2L1 y H1L1_H2L2. La especie H1L1_H2L2 es el anticuerpo biespecífico correctamente emparejado (véase la Figura 8). También son posibles cuatro tipos de medios anticuerpos (medio Ab), como se muestra en la Figura 8. Cuando se introducen modificaciones en la región Fc para fomentar la heterodimerización de las cadenas pesadas únicas, la cantidad de especies Mab posibles disminuye (es decir, se observan menos especies E a J). La especificidad de emparejamiento relativo en términos de cantidad de especies de anticuerpo biespecífico emparejado correctamente H1L1_H2L2 vs. otras especies se determinó usando LC-MS después de la desglicosilación y purificación de la proteína A (pA). Cuando fue posible, las cadenas se dejaron sin etiquetar, siempre que todas las especies Mab y medios Ab diferían entre sí en al menos 50 Da. Cuando las diferencias de masa excluyeron esta posibilidad, las etiquetas de extremo N (HA o FLAG) se agregaron a las cadenas ligeras para proporcionar suficiente diferenciación de masa entre las especies, con énfasis en el uso de la etiqueta FLAG cuando fuera posible, dado que a menudo se observaba la escisión de la etiqueta HA (en el caso de las construcciones que contenían CR8071, solamente se usó la etiqueta FLAG).
Este ensayo, que implica la expresión de H1, L1, H2 y L2 de un anticuerpo biespecífico, y el análisis posterior de los productos emparejados se denomina SMCA.
Preparación de construcciones
Las construcciones que codifican las cadenas pesadas y ligeras de IgG de CAT-2200, pertuzumab, CR8071 y SGN-CD19a que comprenden modificaciones de aminoácidos de acuerdo con los diseños, se prepararon de la siguiente manera. Las secuencias de cadena ligera de CAT-2200 y pertuzumab se prepararon como se describe en el Ejemplo 3, mientras que las secuencias de cadena pesada de longitud completa para estos anticuerpos se crearon añadiendo la secuencia de ADN de IgG1*01 que codifica los dominios bisagra-CH2-CH3 parciales [SEQ ID NO:6] y se modificaron para fomentar la heterodimerización, en el extremo C del dominio CH1 de las cadenas pesadas Fab (que contienen una parte de la bisagra y que excluyen la extensión<ABD>2<utilizada para las construcciones en LCCA), cuya preparación se describió en el Ejemplo 3. Las>construcciones que contienen sustituciones de aminoácidos para los conjuntos de diseño de Mab se generaron mediante síntesis génica o mediante mutagénesis dirigida al sitio, como se indica en el Ejemplo 3. Cabe destacar que se eliminó el residuo de lisina de la cadena pesada del extremo C canóni heterogeneidad de la señal LC-MS debido al pinzamiento de lisina en el extremo C (Lawrence W. Dick Jr. et ál., Biotechnol. Bioeng. (2008) 100:1132-43).
Las secuencias de ADN de base para la parte Fab de la cadena pesada (SEQ ID NO:18) y las secuencias de ADN de la cadena ligera (SEQ ID NO:19) de CR8071 se muestran en la Tabla 3C. Las secuencias de aminoácidos Fab CR8071 para la cadena pesada (SEQ ID NO:14) y la cadena ligera (SEQ ID NO:15) corresponden a las de la entrada de PDB 4FQJ (complejo de Fab CR8071 y hemaglutinina) donde se realizó una sustitución de R222K en la cadena pesada para convertirla en la secuencia de IGHG1*01 más común.
Las secuencias de ADN de base para la parte Fab de la cadena pesada (SEQ ID NO:16) y las secuencias de ADN de la cadena ligera (SEQ ID NO:17) de SGN-CD19a también se muestran en la Tabla 3C. Las secuencias de SGN-CD19a corresponden a las S<e>Q ID NO: 7 y 17 indicadas en la patente estadounidense n.° 8,242,252 y se incluyen en la presente como SEQ ID NO:12 (cadena pesada) y s Eq ID NO:13 (cadena ligera).
Como se mencionó anteriormente, las secuencias de cadena ligera de CAT-2200, CR8071, pertuzumab y SGN-CD19a en algunos de los heterodímeros diseñados en los conjuntos de Mab se prepararon con o sin las etiquetas FLAG o HA para proporcionar suficiente diferenciación de masa entre las especies. Las cadenas ligeras con etiquetas se prepararon como se describe en el Ejemplo 3.
Las versiones de tipo silvestre de estas construcciones también se prepararon para evaluar la tendencia natural en cada sistema, discernir el efecto potencial de las etiquetas HA o FLAG en el emparejamiento y para determinar el efecto de las construcciones diseñadas en el emparejamiento preferencial con respecto al tipo silvestre.
Transfección, expresión y purificación de construcciones
Las construcciones que codifican las dos cadenas pesadas y las dos cadenas ligeras de cada sistema de anticuerpo biespecífico, ya sea de tipo silvestre o con sustituciones de aminoácidos que corresponden a cada conjunto de diseño de Mab analizado se transfectaron en las células CHO-3E7 de la siguiente manera. °Se cultivaron células CHO-3E7, con una densidad de 1.7 - 2 x 106 células/ml, a 37 °C en medio FreeStyle™ F17 (Invitrogen cat# A-1383501) complementado con glutamina 4 mM y KoliphorP188 al 0.1 % (Sigma #K4894). Se transfectó un volumen total de 200 ml con un total de 200 |ig de ADN con relaciones diversas de H1:H2:L1:L2 (que consiste en 100 |ig de ADN de anticuerpo y 100 |ig de GFP/AKT/ADN de relleno) usando PEI-máx (Polysciences Cat #24765-2) en una relación de ADN:PEI de 1:4. Veinticuatro horas después de la adición de la mezcla de ADN-PEI, se agregaron ácido valproico 0.5 mM (concentración final) y triptona N1 al 1 % p/v (concentración final) a las células que luego se transfirieron a 32°C y se incubaron durante 7 días antes de la recolección. El medio de cultivo se recolectó mediante centrifugación y se filtró al vacío usando un filtro Stericup de 0.22 pM (Millipore Cat # SCGPU05RE). El medio de cultivo filtrado luego se purificó usando la resina de proteína A MabSelect SuRe (GE Healthcare #17- 5438-02) que se llevó a equilibrio previamente con PBS pH 7.4. Las especies de anticuerpo unidas a la resina luego se lavaron con PBS pH 7.4 y eluyeron con 100 mM de amortiguador de citrato de sodio pH 3.6. Las especies de anticuerpo eluidas se concentraron y el amortiguador se intercambió en PBS pH 7.4 mediante centrifugación usando un filtro de centrifugadora Amicon ultra 15 Ultracel 10K (Millipore # SCGP00525). Las muestras de SMCA purificadas con proteína A resultantes que contenían las especies de anticuerpo se evaluaron mediante Caliper antes de la desglicosilación y LC-MS.
Método de espectrometría de masas
El grado de emparejamiento preferencial de los heterodímeros impulsado por los conjuntos de diseño de Mab en el contexto de un anticuerpo biespecífico se evaluó usando espectrometría de masa después de la purificación de la proteína A y la desglicosilación no desnaturalizante. Dado que los heterodímeros contenían solamente glicanos Fc unidos a N, las muestras de SMCA se trataron solo con una enzima, N-glicosidasa F (PNGasa-F). Las muestras purificadas se deglicosilaron con PNGasaF de la siguiente manera: °0.2U PNGasaF/jg de anticuerpo en Tris-HCl 50 mM con pH 7.0, incubación durante la noche a 37 °C, la concentración final de la proteína fue de 0.5 mg/mL. Después de la deglicosilación, las muestras se almacenaron a 4 °C antes del análisis de LC-MS.
Las muestras de proteínas deglicosiladas se analizaron mediante LC-MS intacto usando un sistema Agilent 1100 HPLC acoplado con un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap XL (ThermoFisher Scientific) mediante una fuente de electrospray Ion Max (ThermoFisher). Las muestras (5 |jg) se inyectaron en una columna de fase inversa de 2.1 x 30 mm Poros R2 (Applied Biosystems) y se resolvieron usando las siguientes condiciones de gradiente: 0-3 min: 20 % de solvente B; 3-6 min: 20-90 % de solvente B; 6-7 min: 90-20 % de solvente B; 7 9 min: 20 % de solvente B. El solvente A era ácido fórmico ac. al 0.1 % desgasificado y el solvente B era acetonitrilo desgasificado. La velocidad de flujo fue de 3 mL/min. El flujo se separó después de la columna para dirigir 100 jL a la interfaz de electrospray. La columna se calentó hasta 82.5 °C y los solventes se calentaron antes de la columna hasta 80 °C para mejorar la forma del pico de proteína. El LTQ-Orbitrap XL se calibró usando la solución de calibración LTQ Positive Ion ESI de ThermoFisher Scientific (cafeína, MRFA y Ultramark 1621) y se ajustó usando una solución de 10 mg/mL de Csl. El voltaje de cono (configuración de fragmentación de fuente) fue de 48 V, la resolución de FT fue de 7.500 y el intervalo de escaneo fue m/z 400-4,000. El LTQ-Orbitrap XL se ajustó para la detección óptima de proteínas más grandes (>50 kDa).
Los intervalos que contenían los iones con carga múltiple de los anticuerpos de tamaño completo (m/z 2000 3800) y los medios anticuerpos (m/z 1400-2000) se sometieron a deconvolución por separado en perfiles de peso molecular usando el módulo MaxEnt 1 de MassLynx, el software de control de instrumentos y análisis de datos (Waters). En resumen, los datos en bruto de LC-MS de las proteínas se abrieron primero en QualBrower, el módulo de visualización de espectros de Xcalibur (Thermo Scientific) y se convirtieron para que sean compatibles con MassLynx mediante Databridge, un programa de conversión de archivos proporcionado por Waters. Los espectros de proteínas convertidos se visualizaron en el módulo de Espectro de MassLynx y se sometieron a deconvolución mediante MaxEnt 1. La cantidad de cada especie de anticuerpo en cada muestra se determinó directamente a partir de los perfiles de peso molecular resultantes.
Análisis de resultados de LC-MS
En general, en la mayoría de los casos, los tratamientos de desglicosilación dieron como resultado la capacidad de identificar todas las especies de anticuerpos diferentes posibles identificadas mediante LC-MS. En muchos casos, cada especie de anticuerpo estaba representada por un pico individual de LC-MS. Las excepciones incluyeron los picos laterales que probablemente también corresponden a la especie biespecífica deseada (posiblemente aductos o heterogeneidad en la escisión de péptidos líderes); sin embargo, debido a que la identidad de las especies que producen los picos laterales no era clara, estos picos laterales no se consideraron en las contribuciones a la especie biespecífica. Además, las especies biespecíficas deseadas, H1L1_H2L2, en general, no pueden distinguirse de forma experimental del tipo emparejado incorrectamente, H1L2_H2L1, en base a LC-Ms . De este modo, cuando el contenido de anticuerpo biespecífico se informa en las tablas, no se puede excluir completamente de modo que no contenga este tipo de especies emparejadas incorrectamente. Sin embargo, el muy bajo contenido observado para las especies tales como H1L2_H1L2 y H2L1_H2L1 así como los medios anticuerpos H1L2 y H2L1 indica que ocurrió únicamente contaminación de menor importancia, o ninguna, de las especies biespecíficas con especies emparejadas incorrectamente.
Evaluación de tendencia natural y efecto de las etiquetas en el emparejamiento en sistemas de tipo silvestre
Como primera etapa, para cada uno de los tres sistemas biespecíficos analizados, el tipo silvestre (una de las cadenas ligeras que contiene una etiqueta si se requiere para lograr suficiente diferenciación de masa entre las especies), las cadenas pesadas y ligeras no modificadas de los anticuerpos originales para cada sistema se expresaron conjuntamente usando diversas relaciones de ADN para H1:H2:L1:L2, y las especies de anticuerpo resultantes se identificaron y cuantificaron. Esto permitió la identificación de cualquier tendencia de emparejamiento inherente (o la tendencia introducida por la presencia de una etiqueta) en cada sistema (por ejemplo, si la cadena ligera de un anticuerpo original en el sistema biespecífico se une preferentemente a la cadena pesada del otro anticuerpo original en el sistema biespecífico), y también permitió la identificación de una relación de ADN para H1:H2:L1:L2 que proporcionó la mayor cantidad de anticuerpo biespecífico con la menor cantidad de medios Ab. Las relaciones de ADN se seleccionaron para compensar las diferencias naturales en los niveles de expresión y/o desviaciones de emparejamiento intrínsecas entre las cadenas pesadas y ligeras de los dos anticuerpos originales y/o la influencia de la etiqueta para cada sistema. En los sistemas biespecíficos de tipo silvestre analizados A y B, L2 se etiquetó con una etiqueta FLAG. En el sistema biespecífico C, ninguna de las cadenas ligeras se etiquetó.
La Tabla 12 muestra el resultado de esta evaluación. La relación de ADN para H1:H2:L1:L2 que proporcionó la mayor cantidad de anticuerpo biespecífico con la menor cantidad de medios anticuerpos fue de 10:20:24:46 para el sistema A, 15:15:35:35 para el sistema B, y 15:15:35:35 para el sistema C. Cabe destacar que, en el sistema Ab biespecífico CAT-2200/pertuzumab (Sistema A), se observó una tendencia donde la cadena pesada de pertuzumab (H2) se emparejó preferentemente con la cadena ligera de CAT-2200 (L1). Esta tendencia fue evidente cuando se consideran los datos para relaciones equivalentes de cadena pesada 1 y cadena pesada 2, pero relaciones inversas de cadena ligera 1 y cadena ligera 2 (por ejemplo, se consideran las relaciones de ADN L1:L2 en H1:H2:L1:L2 de 8:22:17:53 y 8:22:53:17 en la Tabla 12). En estas condiciones de H1:H2:L1:L2=8:22:53:17, las especies de Mab emparejadas incorrectamente predominantes de H1L1_H2L1 son mucho más abundantes (79.6 %) que en el caso de H1:H2:L1:L2=8:22:17:53, donde las especies emparejadas incorrectamente predominantes de H1L2_H2L2 conforman alrededor del 38.4 %. Esto indicó que la cadena pesada de pertuzumab parecía emparejarse preferentemente con la cadena ligera de CAT-2200 en este sistema, cuando la cadena ligera de pertuzumab tenía una etiqueta FLAG.
Las construcciones de SMCA de diseño que contenían etiquetas de extremo N (HA o FLAG) en una de las cadenas ligeras guiaron la preparación de las construcciones de SMCA WT análogas que se investigaron para determinar la posible influencia de las etiquetas en la capacidad de las cadenas ligeras de emparejarse con las cadenas pesadas. La Tabla 13 muestra los resultados de este experimento, e indica que, en algunos casos, la etiqueta tuvo un impacto en el emparejamiento de las cadenas ligeras con las cadenas pesadas. Por ejemplo, con respecto al caso del sistema A mencionado anteriormente, donde hubo un emparejamiento preferencial de la cadena pesada de pertuzumab con la cadena ligera de CAT-2200 cuando la cadena ligera de pertuzumab contenía la etiqueta FLAG, la cadena ligera de CAT-2200 contenía la etiqueta HA y las 4 cadenas polipeptídicas se expresaron en la misma relación de ADN, se observó el emparejamiento preferencial de la cadena pesada de CAT-2200 con la cadena ligera de pertuzumab (véase la Tabla 13, 'Sistema A, L1-HA' y comparar el 'Sistema A, L1-HA' con el 'Sistema A, L2-FLAG' en la misma relación de 10:20:24:46). Además, para el sistema biespecífico SGN-CD19a/CAT-2200 (Sistema B), el grado de emparejamiento incorrecto entre la cadena pesada de SGN-CD19a con la cadena ligera de CAT-2200 en el sistema que contiene la cadena ligera de SGN-CD19a etiquetada con FLAG fue mayor que en las otras dos variaciones del mismo sistema en la misma relación (Tabla 13, 'Sistema B, L1-FLAG' y contrastar el 'Sistema B, L1-FLAG con el 'Sistema B, L2-FLAG y L2-HA' en la misma relación de 15:15:35:35). Cabe destacar que la Tabla 13 refleja los datos acumulados para todas las repeticiones realizadas, por lo tanto, el porcentaje de especies, en algunos casos, puede diferir de los datos en la etapa de evaluación inicial, que se proporcionan en la Tabla 12.
Para el análisis de cada uno de los 40 diseños representativos dentro de cada sistema biespecífico, las relaciones de ADN H1:H2:L1:L2 utilizadas fueron las relaciones de los sistemas biespecíficos de tipo silvestre correspondientes que proporcionaron la mayor cantidad de especies de Ab biespecíficos y la menor cantidad de medios Ab. Como se indicó anteriormente, para el sistema CAT-2200/pertuzumab, la relación utilizada fue 10:20:24:46 (H1:H2:L1:L2), donde H1 y L1 se refieren a CAT-2200 y H2 y L2 se refieren a pertuzumab. Para los sistemas SGN-CD19a/CAT-2200 y SGN-CD19a/CR8071, la relación utilizada fue de 15:15:35:35 (H1:H2:L1:L2).
Resultados de emparejamiento preferencial en formato de anticuerpo biespecífico
Los resultados del SMCA con los 40 diseños representativos analizados se muestran en las Tablas 14 a 17. Las Tablas 14 a 17 se refieren a los conjuntos de diseño de Mab como “diseños” y se han identificado con un número de 4 dígitos. Cada número de 4 dígitos corresponde a un identificador único del conjunto de diseños de Mab (identificadores únicos de conjunto LCCA) en las Tablas 10-A1 a A12 y 10-B1 a 10-B10. La Tabla 24 proporciona una tabla de correspondencia entre los diseños analizados en SMCA y los identificadores únicos del conjunto de LCCA. El análisis del emparejamiento preferencial se realizó en función de dos tipos de cálculos. El primer tipo de cálculo se denomina como “% de emparejamiento de H1L1 y % de H2L2” en las Tablas, y representa la cantidad de emparejamiento correcto entre H1 y L1 y entre H2 y L2 en todas las especies de Mab y especies de medios Ab observadas, que incluyen las especies Mab que pueden haber tenido solamente ub brazo emparejado correctamente, como porcentaje del producto total (H1L1_H2L2_y_H1L2_H2L1 H1L1_H1L1 H2L2_H2L2 H1L1 H2L2 0.5 x (H1L1_H2L1 H1L1_H1L2 H1L2_H2L2 H2L1_H2L2)). Este cálculo se denomina cálculo de “emparejamiento total”. El segundo tipo de cálculo se denomina “H1L1_H2L2 y H1L2_H2L1**” en las Tablas, y representa la cantidad de anticuerpo biespecífico emparejado correctamente como porcentaje de todas las especies de Mab (es decir, especies de Mab A-J en la Figura 8) observadas (H1L1_H2L2_y_H1L2_H2L1 / (H1L1_H2L2_y_H1L2_H2L1 H1L1_H1L1 H2L2_H2L2 H1L1_H2L1 H1L2_H2L2 H1L1_H1L2 H2L1_H2L2 H1L2_H1L2 H2L1 _H2L1)). Este cálculo se denomina cálculo de “biespecífico total”. Los medios anticuerpos no se tomaron en cuenta en este cálculo, dado que si estuvieran presentes, podrían retirarse/minimizarse mediante SEC preparativa o mediante titulaciones de ADN H1:H2:L1:L2 adicionales. La Tabla 12 demuestra que las titulaciones de ADN son eficaces para manipular el porcentaje de las especies de medios Ab expresadas. La eficacia de la purificación de prep-SEC para reducir la cantidad de medios Ab de tipo “Cadena Fc A” se demuestra en el Ejemplo 18.
Para justificar las tendencias que se observaron en algunos sistemas biespecíficos de tipo silvestre, como se describió anteriormente, los datos de emparejamiento preferencial se indicaron en comparación con las construcciones biespecíficas de tipo silvestre correspondientes a la misma relación de ADN H1:H2:L1:L2. Esta comparación se indicó en las columnas “Cambio en % de emparejamiento de H1L1 y % de emparejamiento de H2L2 con respecto al tipo silvestre” (es decir, cambio en emparejamiento total con respecto al WT) y “Cambio en H1L1_H2L2 y H1L2_H2L1** con respecto al tipo silvestre”(es decir,cambio en biespecífico total con respecto a WT). Cuando la construcción biespecífica de tipo silvestre correspondiente no se evaluó mediante SMCA, se realizó una comparación con una construcción de tipo silvestre similar. Estos casos se indican con “t ” a continuación de los valores indicados. La construcción de tipo silvestre similar elegida para la comparación se seleccionó de la siguiente manera. Para cada sistema biespecífico y construcción (con o sin etiquetas), se tomaron la mediana de los valores para “H1L1_H2L2 y H1L2_H2L1**” y los valores promedio para “% de emparejamiento de H1L1 y % de emparejamiento de H2L2” de los experimentos de SMCA de repetición según la relación de ADN. Se tomaron los valores más altos de cualquier relación dentro de cada construcción, y la mediana en todas las construcciones se usó para representar la referencia de WT para un sistema particular (ver la Figura 16A y 16B).
Las Tablas 14 y 15 proporcionan un resumen de los resultados de SMCA para los diseños de K-L representativos analizados, donde los diseños se descartaron de acuerdo con el “Cambio en el % de emparejamiento de H1L1 y % de emparejamiento de H2L2 con respecto al tipo silvestre” (Tabla 14) o el “Cambio en H1L1_H2L2 y H1L2_H2L1** con respecto al tipo silvestre” (Tabla 15). De manera similar, las Tablas 16 y 17 proporcionan un resumen de los resultados de SMCA para los diseños de K-L derivados de K-K representativos analizados, donde los diseños se descartaron de acuerdo con el cambio en los cálculos de emparejamiento total (Tabla 16) o el cambio en los cálculos biespecíficos totales (Tabla 17).
Rendimiento
El rendimiento o la capacidad para fomentar el emparejamiento preferencial de las cadenas pesadas y ligeras correctas, para cada uno de los diseños representativos se evaluó usando el cálculo de emparejamiento total y usando el cálculo biespecífico total. En primer lugar, un valor positivo en la columna “Cambio en el % de<emparejamiento de H>1<L>1<y % de emparejamiento de H2L2 con respecto al tipo silvestre” (cambio en>emparejamiento total con respecto a WT) indicó que el conjunto de diseño Mab pudo fomentar el emparejamiento preferencial. En segundo lugar, un valor positivo en la columna “Cambio en H1L1_H2L2 y H1L2_H2L1** con respecto al tipo silvestre” (cambio en biespecífico total con respecto a WT) también indicó un conjunto de diseño Mab que pudo fomentar el emparejamiento preferencial.
Todos los diseños de K-L y 18 de 21 diseños de K-L derivados de K-K mostraron menores cantidades de las especies emparejadas incorrectamente principales (H1L2_H2L2 o H1L1_H2L1) en comparación con el tipo silvestre, si bien en algunos casos la cantidad de una especie emparejada incorrectamente distinta aumentó en comparación con el tipo silvestre. En promedio, los diseños de K-L y de K-L derivados de K-K generaron el mayor aumento de biespecífico deseado con respecto al tipo silvestre (cambio en biespecífico total con respecto a WT) en el sistema A (48.8 %), seguido del sistema B (31.1 %) y el sistema C (14.5 %). En promedio, todos los diseños analizados dieron como resultado un aumento relativamente menor en la cantidad total de medio anticuerpo en comparación con el tipo silvestre, de 24.1 % a 27.9 %, pero mejoraron la relación promedio de medio anticuerpo emparejado a emparejado incorrectamente de 1.5 a 6.9.
Capacidad de transferencia
La capacidad del conjunto representativo de diseños de Mab de fomentar el emparejamiento preferencial en múltiples sistemas se analizó como medida de la “capacidad de transferencia” de los diseños. Usando el cálculo del 'cambio en emparejamiento total con respecto al WT', 29 de 33 diseños de K-L se transfirieron en 3 de 3 sistemas analizados y 3 diseños se transfirieron en 2 de los 3 sistemas analizados (Tabla 14). Dicho de otro modo, estos diseños mostraron un valor positivo de “cambio en emparejamiento con respecto al WT”. Cuando se midió el emparejamiento preferencial usando el cálculo del 'cambio en biespecífico total con respecto al WT', 24 de 33 diseños de K-L se identificaron como transferibles en 3 de 3 sistemas y 8 diseños se transfirieron en 2 de 3 sistemas (Tabla 15). Para los diseños de K-L derivados de K-K, 2 de 7 diseños se transfirieron en 3 de 3 sistemas y 4 diseños se transfirieron en 2 de 3 sistemas usando el cálculo de “cambio en emparejamiento total con respecto al WT” (Tabla 16). Usando el cálculo del 'cambio en biespecífico total con respecto al WT', 1 de 7 diseños de se transfirieron en 3 de 3 sistemas y 5 diseños se transfirieron en 2 de 3 sistemas (Tabla 17). 23 de 33 diseños de K-L y 1 de 7 diseños de K-L derivados de K-K se transfirieron en 3 de 3 sistemas analizados cuando se evaluaron usando ambos cálculos.
Con respecto al rendimiento de los grupos, todos los diseños dentro de 9 de 12 grupos K-L se transfirieron en 3/3 sistemas de acuerdo con el cálculo del “cambio en emparejamiento total con respecto al WT”, y 4 de 12 de acuerdo con el cálculo del “cambio en biespecífico total con respecto al WT”. Todos los diseños dentro de los grupos kl-4, kl-9 y kl-12 se transfirieron en 3/3 sistemas usando ambos cálculos. La Figura 10 muestra diagramas de recuadros que comparan el rendimiento de los diseños representativos de cada grupo, en función del cálculo del “cambio en biespecífico total con respecto al WT” (Figura 10A, cambio en % biespecífico) o el “cambio en emparejamiento total con respecto al WT” (Figura 10B, cambio en % emparejamiento). Para los grupos K-L derivados de K-K, solamente se analizó un diseño por grupo y, por lo tanto, la capacidad de transferencia fue equivalente a la capacidad de transferencia del diseño mencionada anteriormente.
En resumen, los diseños de K-L pudieron fomentar el emparejamiento preferencial más eficazmente que los diseños de K-L derivados de K-K. La Figura 11 muestra diagramas de recuadros que ilustran la capacidad de los diseños de K-L y los diseños de K-L derivados de K-K para fomentar el emparejamiento preferencial en cada sistema analizado, en función del cálculo en el “cambio en biespecífico total con respecto al WT”. Por ejemplo, la Figura 11 muestra que los diseños de K-L, en general, fomentaron un mayor aumento de la cantidad de anticuerpo biespecífico en comparación con el WT que los diseños de K-L derivados de K-K (comparando el valor “kl total” con el valor “kk total” para cada sistema). Esto también es así cuando se consideran solamente los diseños transferibles en 2 o más o en los 3 sistemas.
Ejemplo 17: Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) preparativa de anticuerpos biespecíficos de SMCA seleccionados y Mab originales para caracterización biofísica.
Para evaluar las características biofísicas de los anticuerpos biespecíficos generados en el SMCA descrito en el Ejemplo 16, las muestras de SMCA purificadas con proteína A de un subconjunto de los diseños representativos analizados se sometieron a SEC preparativa para retirar especies de medios Ab. Las muestras de SMCA con al menos 60 % de “H1L1_H2L2 y H1L2_H2L1**” (biespecífico total) se seleccionaron para esta etapa (36 en total). Algunas muestras de SMCA que no cumplieron con este límite también se incluyeron para completar esta etapa. Por ejemplo, en los casos en los que las muestras de SMCA para un diseño determinado cumplieron con este límite en dos de los tres sistemas biespecíficos analizados, la muestra de SMCA cumplió con este límite, pero no el tercero, se incluyeron las muestras de SMCA para los 3 sistemas. La SEC preparativa se realizó de la siguiente manera. Se separaron especies de anticuerpo en las muestras de SMCA usando una columna Superdex 200 10/300 Increase (GE Healthcare) montada en un sistema ÁKTA Avant 25 de GE Healthcare equipado con un automuestreador ALIAS Bio Cool (Spark-Holland) utilizado para inyectar las muestras en la columna. Se cargaron automáticamente muestras de SMCA (0.9 ml) en PBS pH 7.4 (Hyclone DPBS/modificado, no calcio, no magnesio, Cat. N.° SH-300028.02) en un bucle de 2 ml relleno con PBS. Luego, se inyectaron las muestras automáticamente a la columna y se resolvieron a 0.5 ml/min con un volumen de<elución de 1 CV. La elución de la proteína se monitoreó en OD>280<y se recolectó en fracciones de 0.5 ml. Para>cada muestra de SMCA, las fracciones que comprendían el pico principal (se evaluaron las fracciones mediante Caliper) se agruparon y caracterizaron biofísicamente de manera adicional, como se describe en los Ejemplos 19 y 20.
Ejemplo 18: Retiro de medios anticuerpos mediante cromatografía de exclusión por tamaño preparativa
En el Ejemplo 16, se mencionó que los medios Ab se excluyeron de los cálculos de emparejamiento de acuerdo con el cálculo “biespecífico total”, dado que el porcentaje de los medios Ab producidos pueden manipularse mediante titulación de ADN o, en el caso de medios Ab de tipo “cadena A de Fc”, estos también se pueden retirar/minimizar mediante purificación de SEC preparativa de muestras de SMCA purificadas por la proteína A. Para demostrar el retiro de “medios Ab de cadena A de Fc”, las muestras de SMCa purificadas del Ejemplo 17 para dos diseños de K-L en los tres sistemas biespecíficos se sometieron al análisis de LC-MS como se describe en el Ejemplo 16. Los dos diseños de K-L seleccionados fueron 2901 y 3972 (como se identifica en la Tabla 11A). Los resultados se muestran en la Tabla 18.
La comparación de los datos de LC-MS en la Tabla 18 con los datos de LC-MS respectivos para las muestras de SMCA purificados con la proteína A en la Tabla 14 demuestra que la SEC preparativa puede ser eficaz para retirar/minimizar las especies de medios Ab del tipo “Cadena A del Fc” (H1L1 en 2901 y 3972). En todas las muestras analizadas, hubo un enriquecimiento en el porcentaje de las especies de anticuerpos biespecíficos deseadas (H1L1_H2L2 y H1L2_H2L1), así como una disminución en el porcentaje de las especies de medios anticuerpos del tipo “Cadena A de Fc” (H1L1 en la Tabla 18).
Ejemplo 19: Estabilidad térmica de anticuerpos biespecíficos de SMCA.
Luego de la SEC preparativa, se midió la estabilidad térmica de los anticuerpos biespecíficos de SMCA purificados de SEC preparativa y se comparó con los anticuerpos monoclonales CAT-2200, pertuzumab, CR8071 y SGN-CD19a para determinar si las sustituciones de aminoácidos tenían efecto en la estabilidad térmica.
Medición de estabilidad térmica
La estabilidad térmica de anticuerpos heterodiméricos biespecíficos seleccionados y controles de tipo silvestre se midió mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) de la siguiente manera. Después del tratamiento de SEC preparativa, se utilizaron muestras de 400 pL principalmente a concentraciones de 0.4 mg/ml en PBS para análisis de DSC con un VP-Capillary DSC (GE Healthcare). En el comienzo de cada DSC, se aplicaron 5 inyecciones en blanco de amortiguador para estabilizar la línea de referencia, y se colocó una inyección de amortiguador antes de cada inyección de muestra para obtener una referencia. Cada muestra se analizó de 20 a 100 °C a una velocidad de 60 °C/h, con retroalimentación baja, se filtró durante 8 seg, 3 min de preTstat y 70 psi de presión de nitrógeno. Se realizó una referencia y se analizaron los termogramas resultantes mediante el software Origin 7.
Se muestran los resultados en la Tabla 20 y en la Tabla 21. Los valores de Tm de Fab de tipo silvestre utilizados para calcular la “diferencia promedio en la Tm de Fab de tipo silvestre (°C)” como se indica en las tablas se obtuvieron a partir de termogramas de DSC de anticuerpos originales de CAT-2200 (71.2 °C), pertuzumab (76.7 °C), CR8071 (66.9 °C, que corresponde al pico principal) y SGN-CD19a (91.0 °C). El anticuerpo original CR8071 mostró dos transiciones de Fab. Para los anticuerpos originales, se observaron transiciones térmicas adicionales para los dominios CH2 y CH3 del Fc (a aproximadamente 71 °C y 82 °C, respectivamente) donde estos no se superpusieron con la transición de Fab (Figura 12). Algunos diseños con grandes cantidades de medio anticuerpo de “cadena B de Fc” de H2L2 mostró una transición térmica adicional a aproximadamente 60 °C, probablemente debido a la presencia de homodímeros no covalentes. En algunos casos, los diseños provocaron una reducción en la Tm del Fab de pertuzumab, de modo que dio lugar a la superposición del Fab CAT-2200, Fab pertuzumab y picos de CH2 en estas muestras (Figura 12A, diseño representativo 3972). Asimismo, muchos diseños redujeron la Tm de Fab SGN-CD19a en la medida en que provoque la superposición con los picos de c H3 en estos anticuerpos (Figura 12B y 12C, diseño representativo 3972). Estas superposiciones conllevan cierta ambigüedad en la asignación de Tm de los componentes de Fab contribuyentes y, por lo tanto, los valores de Tm indicados en las Tablas 20 y 21 se consideran aproximaciones. Cabe destacar que los anticuerpos biespecíficos CRS0711SGN-CD19a que contienen diseños mostraron una única transición de Fab CR8071 en lugar de dos transiciones observadas en los anticuerpos biespecíficos de tipo silvestre (por ejemplo, Figura 12C).
De todos los diseños de K-L analizados, la diferencia promedio en la Tm de Fab del tipo silvestre en todos los sistemas fue de entre 0 °C y -1.5 °C para 6 diseños, entre -1.5 °C y -3.0 °C para 11 diseños, entre -3.0 °C y -4.5 °C para 15 diseños (Tabla 20). De todos los diseños de K-L derivados de K-K analizados, la diferencia promedio fue de entre 0 °C y -1.5 °C para 2 diseños, entre -1.5 °C y -3.0 °C para 1 diseño y entre -3.0 °C y -4.5 °C para 1 diseño (Tabla 21). Las diferencias promedio en la Tm de Fab del tipo silvestre en los diseños analizados fue de -0.9°C para CAT-2200 (STd Ev = 1.4), -4.6°C para pertuzumab (STDEV = 1.6), -5.8°C para SGN-CD19a (STDEV = 3.5), y 1.1°C para CR8071 (STDEV = 0.8). La Figura 13 ilustra un diagrama de recuadros del cambio en la Tm de Fab en comparación con el anticuerpo original para los diseños analizados, para todos los diseños analizados (“Todos” o según parátopo (CAT-2200, pertuzumab, CR8071 o SGN-CD19a).
Ejemplo 20: Mediciones de afinidad del antígeno de los anticuerpos biespecíficos
La capacidad de los anticuerpos biespecíficos de unirse a los antígenos apropiados se evaluó con el fin de determinar si las sustituciones de aminoácidos tenían algún efecto en la unión al antígeno. La afinidad de unión al antígeno se determinó mediante SPR de la siguiente manera.
Ensayos de biosensores de SPR
Para los estudios en Biacore T200: El chip sensor CM5 de serie S, kit de acoplamiento de amina Biacore (NHS, EDC y etanolamina 1 M), y amortiguadores de acetato de sodio 10 mM se obtuvieron de GE Healthcare Life Science (Mississauga, ON, Canadá). Para los estudios en Biorad ProteOn: Los chips sensores GLC, el kit de acoplamiento de aminas Biorad ProteOn (EDC, sNHS y etanolamina) y los amortiguadores de acetato de sodio 10 mM se obtuvieron de Bio-Rad Laboratories (Canadá) Ltd. (Mississauga, ON). El amortiguador de ejecución PBS con Tween20 al 0.05% (PBST) se obtuvo de Teknova Inc. (Hollister, CA). El anticuerpo policlonal de cabra anti-humano se obtuvo de Jackson Immuno Research Laboratories Inc. (West Grove, PA). Antígenos: Se adquirió CD-19 humana recombinante etiquetada con His de Abcam (Cambridge, Reino Unido) y hemaglutinina de influenza B etiquetada con His (B/Brisbane/60/2008) se adquirió de Sino Biological (Beijing, China). La proteína de dominio extracelular (ECD) de Her2 recombinante se obtuvo de eBioscience (San Diego, CA). Se adquirió IL-17A humana recombinante de R&D Systems (Mineapolis, MN).
Los ensayos de resonancia de plasmones superficiales (SPR) con antígenos hemaglutinina y CD-19 se llevaron a cabo usando un instrumento Biacore T200 (GE Healthcare) con amortiguador de ejecución PBST (con solución madre de EDTA 0.5 M agregado a una concentración final 3.4 mM) a una temperatura de 25 °C. Los ensayos de resonancia de plasmones superficiales con antígenos ECD HER2 e IL-17 se llevaron a cabo usando un instrumento BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories (Canadá) Ltd. (Mississauga, ON)) con amortiguador de ejecución PBST a una temperatura de 25 °C.
La determinación de la afinidad de SGN-CD19a:CD-19 se llevó a cabo de la siguiente manera. El análisis de los anticuerpos (muestras de SMCA de SEC preparativa y controles de OAA) para la unión al antígeno CD-19 tuvo lugar en dos etapas: una captura indirecta de CD-19 etiquetada con His sobre la superficie de IgG anti-His, seguido de la inyección de cinco concentraciones de anticuerpo purificado para el análisis cinético usando cinética de único ciclo. Se preparó la superficie de captura anti-His en un chip sensor de serie S CM5 mediante acoplamiento con amina aproximadamente 12000 r U de IgG anti-His (kit de captura His, GE Healthcare) sobre las celdas de flujo y de referencia, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se inyectó CD-19 a 10 |jg/ml en la celda de flujo activo durante 60 s en un índice de flujo de 10 pl/min. En general, esto dio como resultado una captura de aproximadamente 250 RU de CD-19 sobre la superficie de IgG anti-His. CD-19 no se capturó en la celda de flujo de referencia (vacío). A la etapa de captura le siguieron cinco concentraciones de anticuerpo purificado (200 nM y diluciones de 2 veces, 80 nM y diluciones de 2 veces o 40 nM y diluciones de 2 veces; dependiendo del anticuerpo) que se inyectaron secuencialmente sobre las celdas de flujo activo y de referencia a 40 pl/min durante 180 s con una fase de disociación de 600 s. Las superficies de anticuerpo capturadas se regeneraron mediante glicina 10 mM pH 1.5 durante 120 s a 30 pl/min para preparar las superficies para el siguiente ciclo de inyección. Se realizaron al menos dos inyecciones de amortiguador de simulación para cada inyección de analito y se utilizaron como referencia. Los sensogramas de cinética de ciclo único resultantes se analizaron usando el software Biacore T200 BiaEvaluation versión 3.0 y se ajustaron al modelo de unión 1:1.
La determinación de la afinidad de CR8071:hemaglutinina se llevó a cabo de la siguiente manera. La hemaglutinina (HA) se diluyó en amortiguador de acetato 10 mM pH 5.5 y se inmovilizó directamente mediante acoplamiento con amina en un chip sensor CM5 de serie S. Esto dio como resultado aproximadamente 120 130 RU de HA inmovilizada. La celda de flujo de referencia se dejó vacía (bloqueada con etanolamina) para usarse como control en blanco. Los anticuerpos se inyectaron sobre la superficie de HA para el análisis cinético usando cinética de único ciclo. Se inyectaron secuencialmente cinco concentraciones (40 nM y diluciones de 2 veces) de anticuerpo purificado (muestras de SMCA purificadas con SEC preparativa y controles de OAA) sobre las celdas de flujo activo y de referencia a 50 pl/min durante 300 s con una fase de disociación de 3600 s. Las superficies de Ha se regeneraron usando 2 ciclos de glicina 10 mM pH 1.5 durante 120 s a 30 pl/min para preparar las superficies para el siguiente ciclo de inyección. Se realizaron al menos dos inyecciones de amortiguador de simulación para cada inyección de analito que se utilizará como referencia. Los sensogramas de cinética de ciclo único resultantes se analizaron usando el software Biacore T200 BiaEvaluation versión 3.0 y se ajustaron al modelo de unión 1:1.
La determinación de la afinidad de CAT-2200:IL-17 se llevó a cabo como se describió anteriormente en el Ejemplo 6 con las siguientes modificaciones: los anticuerpos analizados fueron muestras de SMCA purificadas con SEC preparativa y controles de OAA en lugar de Fab CAT-2200. Uno de los anticuerpos de control 13612 se inyectó comenzando a 10 nM en lugar de 60 nM.
Pertuzumab: La determinación de la afinidad de HER2 se llevó a cabo de la siguiente manera. Todas las líneas se inmovilizaron horizontalmente con 25 pg/ml de IgG anti-humana de cabra, Fcy fragmento específico (Fc anti humano). Se inmovilizó un promedio de 4058 unidades de resonancia (RU). Se generó la superficie de captura de anticuerpo Fc anti-humano usando un chip sensor GLC activado mediante una dilución de 1:10 de las soluciones sNHS/EDC de BioRad estándar inyectadas durante 140 s a 100 pL/min en la dirección del analito (horizontal). Inmediatamente después de la activación, se inyectó una solución de 25 pg/mL de anticuerpo Fc anti-humano en NaOAc 10 mM pH 4.5 en la dirección del analito (horizontal) con una velocidad de flujo de 25 pL/min durante 240 s hasta que se inmovilizaron aproximadamente 4000 unidades de resonancia (RU). Los grupos activos restantes se inactivaron mediante una inyección de 140 s de etanolamina 1M a 30 pL/min durante 300 s también en la dirección del analito para garantizar la creación de interpuntos activados por simulación para la referencia en blanco. y El análisis de los anticuerpos para la unión a HER2 se llevó a cabo en dos etapas: una captura indirecta de los anticuerpos (muestras de SMCA purificadas con SEC preparativa y controles de OAA) sobre la superficie de IgG anti-humana (fragmento específico de Fcy) en la dirección del ligando seguida de la inyección simultánea de 5 concentraciones de ECD HER2 purificada y un amortiguador en blanco para referencia doble en la dirección del analito. En primer lugar, se usó una inyección de amortiguador durante 30 s a 100 pl/min en la dirección del ligando para estabilizar la línea de referencia. Para cada captura de anticuerpo, los anticuerpos se diluyeron hasta 2 pg/ml en PBST. Se inyectaron uno a cinco anticuerpos o controles de manera simultánea en canales de ligandos individuales durante 480 s a un flujo de 25 pL/min. Esto dio como resultado una captura de aproximadamente 800-1200 RU sobre la superficie de Fc anti-humano. El primer canal del ligando se dejó vacío para usarse como un control en blanco si era necesario A esta etapa de captura le siguió inmediatamente una inyección de amortiguador en la dirección del analito para estabilizar la línea de referencia, y luego se inyectó He R2 100 nM, 33.3 nM, 11.1 nM, 3.7 nM y 0.41 nM junto con un amortiguador en blanco de manera simultánea a 50 pl/min durante 120 s con una fase de disociación de 300 s. Las superficies de anticuerpo capturadas se regeneraron mediante un impulso de 18 s de ácido fosfórico al 0.85 % a 100 pl/min para prepararlas para el siguiente ciclo de inyección. Se realizó una doble referencia y se alinearon los sensogramas mediante interpuntos e inyección en blanco de amortiguador, y se analizaron los sensogramas resultantes mediante el software ProteOn Manager v3.1. Los sensogramas de doble referencia se ajustaron al modelo de unión de Langmuir.
Se evaluaron las afinidades de antígeno de los anticuerpos heterodiméricos con referencia a los controles de tipo silvestre de OAA (un brazo) respectivos. Las afinidades de antígeno también se obtuvieron para los anticuerpos biespecíficos de tipo silvestre; sin embargo, la captura de SPR de los biespecíficos WT puede ser heterogénea (por ejemplo, que implica la captura de heterodímeros mal emparejados), lo que interfirió con la determinación de KD. Además, se midió la afinidad del tipo silvestre en formatos de OAA que contienen etiquetas de cadena ligera pertinentes presentes en los anticuerpos. Se observó que la presencia de las etiquetas reduce la afinidad de SGN-CD-19a por CD19 tanto como 4-5 veces (Tabla 19). Por ejemplo, la afinidad de unión medida de SGN-CD-19a por CD19 disminuyó de 67.5 nM a 224.5 nM con la adición de una etiqueta FLAG a la cadena ligera (Tabla 19). Por lo tanto, todos los cálculos de cambio en la afinidad con respecto al tipo silvestre se realizaron usando la mediana de los valores de coincidencia de las construcciones de tipo silvestre etiquetadas.
Al medir la unión a CD-19, los sensogramas de algunos anticuerpos no pudieron ajustarse a un modelo de unión 1:1. En estos casos, los anticuerpos contenían grandes cantidades de medio anticuerpo de “cadena B de Fc” que tienden a la homodimerización, lo que provocó efectos de avidez y ocultó el comportamiento de unión del Fab. Para los anticuerpos afectados, se evaluaron adicionalmente las afinidades de unión en el formato de OAA.
La mayoría de los diseños analizados (36 diseños que corresponden a 96 anticuerpos biespecíficos realizados) presentó valores de KD comparables a los del tipo silvestre respectivo (Tabla 20 y 21, Figura 14). Nueve Fab diseñados presentaron menor afinidad, entre 2 y 3 veces en comparación con el WT, y en un único Fab diseñado se observó una reducción de 4 veces en la afinidad. De estos 10 Fab, solamente un diseño (#34) estaba presente dos veces, y 8 de 10 Fab afectados fueron CR8071. El promedio de diferencia en log(KD) de WT (-(log KD_anticuerpo- log KD_wt)) para todas las ojivas que poseen diseños fue de 0.003 con una desviación estándar de 0.187 (por ejemplo, -0.3 corresponde a una disminución de 2 veces en la afinidad, -0.6 corresponde a una disminución de 4 veces en la afinidad). Estos resultados se resumen en la Figura 14, que ilustra un diagrama de recuadros del cambio en la afinidad en comparación con el anticuerpo original para los diseños analizados, para todos los diseños analizados (“Todos”) o según parátopo (CAT-2200, pertuzumab, CR8071 o SGN-CD19a).
Ejemplo 21: Perfiles de cromatografía líquida de ultra rendimiento cromatografía de exclusión por tamaño (UPLC-SEC) de anticuerpos biespecíficos modificados genéticamente en comparación con anticuerpos originales
Para evaluar la calidad de los anticuerpos biespecíficos modificados genéticamente, los anticuerpos purificados mediante SEC preparativa como en el Ejemplo 17 se sometieron a UPLC-SEC. Se realizó la UPLC-SEC usando una columna de SEC Waters BEH200 (2,5 mL, 4,6 x 150 mm, acero inoxidable, partículas de 1,7 pm) fijada en 30 °C y montada en un sistema de UPLC Waters Acquity con un detector de PDA. Los tiempos de ejecución consistían en 7 min y un volumen total por inyección de 2.8 mL con un amortiguador de ejecución de PBS y Tween 20 al 0.02 % pH 7.4 a 0.4 ml/min. La elución se monitoreó mediante absorbancia UV en el intervalo de 210-400 nm, y se extrajeron cromatogramas a 280 nm. Se realizó la integración de los picos usando el software Empower 3.
La Figura 15A-D ilustra los perfiles de UPLC-SEC de los anticuerpos originales y la Figura 15E-G ilustra los que corresponden a los anticuerpos de diseño 3972 en tres sistemas biespecíficos. El ejemplo de diseño 3972 se usó en la presente para demostrar que los anticuerpos biespecíficos diseñados/modificados genéticamente de alto contenido biespecífico (>80 %) tienen perfiles de UPLC-SEC comparables a los de los anticuerpos originales. Para dichos anticuerpos biespecíficos modificados genéticamente, la mediana de porcentaje de las especies monoméricas es de 95.2 % (es decir, se detectaron pocas o ninguna especie de alto peso molecular).
Tabla 2: Posiciones de aminoácidos clave (marcadas con asterisco) en la interfaz de las cadenas pesadas y ligeras en D3H44 (1JPT, un Fab típico que contiene una cadena ligera kappa) y CAT-2200 (2VXS, un Fab típico que contiene una cadena ligera lambda)._____________________________________________________ _____________________________ Cadena pesada (numeración de Kabat)_____________________________
Tabla 3A. Numeración de Kabat de las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de Fab D3H44, Pertuzumab CAT-2200.
Tabla 3B. Numeración de Kabat de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de D3H44, Pertuzumab y CAT-2200.
Tabla 3C. Secuencias de aminoácidos ADN
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Varios heterodímeros tenían precipitados asociados, señalados con “*” en las Tablas 9A y 9B si el precipitado estaba asociado con el Fab H1L1; señalados con “t” en las Tablas 9A y 9B si el precipitado estaba asociado con el Fab H2L2; y señalados con “t ” en las Tablas 9A y 9B si el precipitado estaba asociado tanto con el Fab H1L1 como con el Fab H2L2. H2L2 Fab; y señalado con “t ” en las Tablas 9A y 9B si el precipitado estaba asociado tanto con el H1L1 como con el H2L2 Fabs. #-indica la presencia de un hombro al pico principal del Fab (transición) en el termograma DSC.
Varios heterodímeros presentaban precipitados asociados, señalados con «*» en las Tablas 9A y 9B si el precipitado estaba asociado al Fab H1L1; señalado con «t» en las Tablas 9A y 9B si el precipitado estaba asociado al Fab H2L2 Fab; y anotado con « t» en las Tablas 9A y 9B si el precipitado estaba asociado tanto<con el H1 L1 como con el H>2<L>2<Fabs. #-Indica la presencia de un hombro en el pico principal del Fab (transición)>en el termograma DSC.
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ı75Tabla 10-B1 Diseños de K-L derivados de K-Kdel grupo 1
Tabla 10-B2 Diseños de K-L derivados de K-K del grupo 2
Tabla 10-B3 Diseños de K-L derivados de K-K del grupo 3
Tabla 10-B4 Diseños de K-L derivados de K-K del grupo 4
Tabla 10-B5 Diseños de K-L derivados de K-K del grupo 5
Tabla 10-B 6 Diseños de K-L derivados de K-K del grupo 6
Tabla 10 -B 7 Diseños de K-L derivados de K-K del grupo 7
Tabla 10-B 8 Diseños de K-L derivados de K-K del grupo 8
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Tabla 11B: Mutaciones de aminoácidos en las reglones FabdeHI. L1. H2y L2 para diseños de K-L derivados de K-K analizados en formato SMCA (numeración de Kabat).
Tabla 19: Dalos de unión al antígeno para parátopos de tipo silvestre en formato OAA
'Indica un método de caplura diferente
Tabla 20: Evaluación de afinidad de unión al antígeno y estabilidad térmica para diseños de K-L seleccionados
Tabla 22A: Numeración de residuos aminoácidos de cadena pesada de IgG1 de acuerdo con sistemas de numeración de IMGT Kabat 1JPT EU
Tabla 22B: Numeración de residuos aminoácidos de cadena ligera lambda de acuerdo con sistemas de numeración de IMGT Kabat
Tabla 22C: Numeración de residuos aminoácidos de cadena ligera kappa de acuerdo con sistemas de numeración de IMGT Kabat 1JPT
Tabla 23: Tabla de correspondencia para % de especies emparejadas/% de especies no emparejadas y valores escalares de LCCA
Tabla 24: Números de diseños de SMCA e identificadores exclusivos de conuntos de LCCA corres ondientes

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una construcción polipeptídica de unión al antígeno multiespecífica que comprende un primer heterodímero y un segundo heterodímero,
el primer heterodímero (H1L1) comprende una primera secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina G (IgG) (H1) y una secuencia polipeptídica de cadena ligera lambda de inmunoglobulina (L1) que forman una primera región Fab que se une específicamente a un primer antígeno; y el segundo heterodímero (H2L2) comprende una segunda secuencia polipeptídica de cadena pesada de inmunoglobulina G (IgG) (H2) y una secuencia polipeptídica de cadena ligera kappa de inmunoglobulina (L2) que forman una segunda región Fab que se une específicamente a un segundo antígeno,
donde:
las secuencias de cada uno de H1, H2, L1 y L2 derivan de secuencias humanas o secuencias humanizadas; H1 es distinto de H2, y H1 y H2 comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada (dominio VH) y un dominio constante de cadena pesada 1 (dominio CH1);
L1 comprende un dominio variable de cadena ligera lambda (VL-lambda) y un dominio constante de cadena ligera lambda (CL-lambda), y L2 comprende un dominio variable de cadena ligera kappa (VL-kappa) y un dominio constante de cadena ligera kappa (CL-kappa); y
H1, H2, L1 y L2 comprenden modificaciones de aminoácidos que fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2, y que fomentan el emparejamiento preferencial de H2 con L2 en comparación con L1, donde el emparejamiento preferencial es mayor que el emparejamiento preferencial que se produce en un sistema de tipo silvestre correspondiente,
donde dichas modificaciones de aminoácidos comprenden las siguientes sustituciones, donde la numeración es según Kabat:
(a) H1 comprende la sustitución de aminoácido L143K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y Vl33D, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos Ll43E, K145T y Q179E y S188L, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R;
(b) H1 comprende la sustitución de aminoácido L143K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y V133D, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R;
(c) H1 comprende la sustitución de aminoácido L143K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y Vl33D, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E y S188W, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, S176A y T178R;
(d) H1 comprende la sustitución de aminoácido L143K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T<y V133D, H>2<comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E y S186I y S188W, y L2>comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, S176A y T178R;
(e) H1 comprende la sustitución de aminoácido L143K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y V133D, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160R y T178R;
(f) H1 comprende la sustitución de aminoácido L143K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T<y V133D, H>2<comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E y S188W, y L2 comprende>las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160R, S176A y T178R;
(g) H1 comprende la sustitución de aminoácido L143K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T<y V133D, H>2<comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E y S186I y S188W, y L2>comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160R, S176A y T178R;
(h) H1 comprende la sustitución de aminoácido L143K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y Vl33D, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L124W, L143E y K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124K, V133A y T178R;
(i) H1 comprende la sustitución de aminoácido L143K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T<y V133D, H>2<comprende las sustituciones de aminoácidos Ll43E, K145T y Q179E y S188L, y L2 comprende>las sustituciones de aminoácidos Q124K y T178R;
(j) H1 comprende las sustituciones de aminoácidos A139W y L143K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y V133D, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, L135W y T178R;
(k) H1 comprende las sustituciones de aminoácidos L143A y S186R, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, V133W y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L124W, L143E y K145T, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124K, V133A y T178R;
(l) H1 comprende las sustituciones de aminoácidos L143A y Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, V133W y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E y S188L, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160K y T178R;
(m) H1 comprende las sustituciones de aminoácidos A139W, L143I y S186K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, V133D y Y178T, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, L135W, Q160K y T178R;
(n) H1 comprende las sustituciones de aminoácidos L143A y Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, V133W y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E y S188L, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R;
(o) H1 comprende las sustituciones de aminoácidos L143A y Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, V133W y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y S188L, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R;
(p) H1 comprende las sustituciones de aminoácidos L143A y Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, V133W y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y S188L, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160K y T178R;
(q) H1 comprende la sustitución de aminoácido S186R, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, T129K, Q160K y T178R;
(r) H1 comprende la sustitución de aminoácido S186R, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y S188L, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R;
(s) H1 comprende la sustitución de aminoácido S186R, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T, Q179E y S188L, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R;
(t) H1 comprende la sustitución de aminoácido S186R, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y S188L, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160K y T178R;
(u) H1 comprende la sustitución de aminoácido S186R, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T, Q179E y S188L, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160K y T178R;
(v) H1 comprende la sustitución de aminoácido S186R, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E y K145T, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160K y T178R;
(w) H1 comprende la sustitución de aminoácido S186R, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q39E, L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q38R, Q124K y T178R;
(x) H1 comprende la sustitución de aminoácido S186R, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L45P, L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos P44F, Q124K y T178R;
(y) H1 comprende las sustituciones de aminoácidos A139W y S186K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, V133D y Y178T, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, L135W, Q160K y T178R;
(z) H1 comprende la sustitución de aminoácido S186R, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, T129K, Q160K y T178R;
(aa) H1 comprende la sustitución de aminoácido S186R, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos Kl29T y S180<e>, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, T129K y T178R;
(bb) H1 comprende la sustitución de aminoácido S186R, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos Kl29T y S180<e>, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160K y T178R;
(cc) H1 comprende la sustitución de aminoácido S186R, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R;
(dd) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E y K145T, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160K y T178R;
(ee) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180e , H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R;
(ff) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, Y178E y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E y K145T, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160K y T178R;
(gg) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos<K129T y S>180<E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos F122C, L143E, K145T y Q179E, y L2>comprende las sustituciones de aminoácidos Q124C, Q160K y T178R;
(hh) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos<K129T y S>180<E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T, Q179E y S188L, y L2>comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160K y T178R;
(ii) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, Y178E y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160K y T178R;
(jj) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160K y T178R;
(kk) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y S188L, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, Q160K y T178R;
(ll) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y S188L, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R;
(mm) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129t y S180e , H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T, Q179E y S188L, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R;
(nn) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, Y178E y S180E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R;
(oo) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180e , H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, T129K y T178R;
(pp) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y S180<e>, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos F122C, L143E y K145T, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124C, Q160K y T178R;
(qq) H1 comprende la sustitución de aminoácido Q179K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos Kl29T y S180e , H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, T129K, Q160K y T178R;
(rr) H1 comprende la sustitución de aminoácido S188K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y Y178E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R;
(ss) H1 comprende las sustituciones de aminoácidos A139W y S188K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, S176D y Y178T, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, L135W y T178R;
(tt) H1 comprende las sustituciones de aminoácidos A139W y S188K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, S176E y Y178E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R, L135W y T178R;
(uu) H1 comprende la sustitución de aminoácido S188K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T y Y178<d>, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R;
(vv) H1 comprende la sustitución de aminoácido S188K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, S176<d>y Y178T, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R; o
(ww) H1 comprende la sustitución de aminoácido S188K, L1 comprende las sustituciones de aminoácidos K129T, S176E y Y178E, H2 comprende las sustituciones de aminoácidos L143E, K145T y Q179E, y L2 comprende las sustituciones de aminoácidos Q124R y T178R.
2. La construcción de la reivindicación 1, donde las modificaciones de aminoácidos fomentan el emparejamiento preferencial de H1 con L1 en comparación con L2, y/o fomentan el emparejamiento preferencial de<h>2 con L2 en comparación con L1, cuando H1, H2, L1 y L2 se expresan conjuntamente en una célula o una célula de mamífero, o cuando H1, H2, L1 y L2 se expresan conjuntamente en un sistema de expresión sin células, o cuando H1 y L1 se producen en una célula y H2 y L2 se producen en una célula distinta y los productos de las dos células se mezclan mediante un método de producción redox, o cuando H1 y L1 se producen en un sistema de expresión sin células y H2 y L2 se producen en un sistema de expresión sin células diferente y los productos de los dos sistemas de expresión sin células se mezclan.
3. La construcción de una cualquera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la construcción comprende además un Fc dimérico que tiene dos polipéptidos Fc que comprende cada uno una secuencia de dominio CH3 y acoplado con o sin enlazadores a una o más de la primera región Fab y la segunda región Fab, opcionalmente donde el Fc es un Fc humano.
4. La construcción de la reivindicación 3, donde el Fc comprende una o más modificaciones en comparación con el tipo silvestre,
donde el Fc comprende:
i. un Fc de IgG1 heterodimérico que tiene las modificaciones L351Y_F405A_Y407V en el primer polipéptido Fc, y las modificaciones T366L_K392M_T394W en el segundo polipéptido Fc;
ii. un Fc de IgG1 heterodimérico que tiene las modificaciones L351Y_F405A_Y407V en el primer polipéptido Fc, y las modificaciones T366L_k 392L_T394W en el segundo polipéptido Fc;
iii. un Fc de IgG1 heterodimérico que tiene las modificaciones T350V_L351Y_F405A_Y407V en el primer polipéptido Fc, y las modificaciones T350V_T366L_K392L_T394W en el segundo polipéptido Fc;
iv. un Fc de IgG1 heterodimérico que tiene las modificaciones T350V_L351Y_F405A_Y407V en el primer polipéptido Fc, y las modificaciones T350V_T366L_K392M_T394W en el segundo polipéptido Fc; o
v. un Fc de IgG1 heterodimérico que tiene las modificaciones T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V en el primer polipéptido Fc, y las modificaciones T350V_T366L_N390R_K392M_T394W en el segundo polipéptido Fc;
donde la numeración de los residuos de aminoácidos en el Fc es según el sistema de numeración EU; y/o donde el Fc comprende además al menos una secuencia de dominio CH2.
5. La construcción de la reivindicación 3 o 4, donde los enlazadores son uno o más enlazadores polipeptídicos, opcionalmente
donde los enlazadores comprenden una o más regiones bisagra de anticuerpo, opcionalmente
donde los enlazadores comprenden una o más regiones bisagra de IgG1.
6. La construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la construcción está conjugada con un agente terapéutico o fármaco.
7. Un polinucleótido o conjunto de polinucleótidos que codifica la construcción de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. Un vector o conjunto de vectores que comprenden uno o más de los polinucleótidos o conjuntos de polinucleótidos según la reivindicación 7, opcionalmente donde el vector o al menos un vector del conjunto de vectores es multicistrónico.
9. Una célula aislada que comprende el polinucleótido o conjunto de polinucleótidos según la reivindicación 7, o el vector o conjunto de vectores de la reivindicación 8, opcionalmente donde la célula es una célula de levadura, una célula bacteriana, una célula de insecto o una célula de mamífero, opcionalmente
donde la célula se transfecta de forma estable o transfecta de forma transitoria con el vector o conjunto de vectores de la reivindicación 8.
10. Una composición farmacéutica que comprende la construcción polipeptídica de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente que comprende además una o más sustancias que se seleccionan del grupo que consiste en un amortiguador, un antioxidante, una molécula de bajo peso molecular, un fármaco, una proteína, un aminoácido, un carbohidrato, un lípido, un agente quelante, un estabilizador y un excipiente.
11. Un método para preparar la construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende las etapas de:
(a) obtener una célula hospedadora que comprende un polinucleótido o conjunto de polinucleótidos que codifica la construcción polipeptídica de unión al antígeno;
(b) cultivar la célula hospedadora en un cultivo de células hospedadoras en condiciones que permitan la expresión de la construcción polipeptídica de unión al antígeno, y
(c) recoger la construcción polipeptídica de unión al antígeno del cultivo de células hospedadoras, opcionalmente
donde la célula hospedadora se transfecta de manera transitoria o se transfecta de manera estable con el polinucleótido o conjunto de polinucleótidos.
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