RS66622B1 - Antigen-vezujući polipeptidni konstrukti koji sadrže kapa i lambda lake lance, i njihove upotrebe - Google Patents

Antigen-vezujući polipeptidni konstrukti koji sadrže kapa i lambda lake lance, i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS66622B1
RS66622B1 RS20250276A RSP20250276A RS66622B1 RS 66622 B1 RS66622 B1 RS 66622B1 RS 20250276 A RS20250276 A RS 20250276A RS P20250276 A RSP20250276 A RS P20250276A RS 66622 B1 RS66622 B1 RS 66622B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
amino acid
acid substitutions
contains amino
antigen
substitutions
Prior art date
Application number
RS20250276A
Other languages
English (en)
Inventor
Dunja Urosev
Mario Sanches
Stacey A L Tom-Yew
Leonard G Presta
Original Assignee
Zymeworks Bc Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymeworks Bc Inc filed Critical Zymeworks Bc Inc
Publication of RS66622B1 publication Critical patent/RS66622B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/92—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing an intein ("protein splicing")domain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

Opis
OSNOV PRONALASKA
[0001] Bispecifična antitela su sposobna da se vezuju za dva različita epitopa i često se pripremaju na osnovu teških i lakih lanaca imunoglobulina od dva različita monospecifična parentalna antitela. Sposobnost vezivanja za dva različita epitopa ili antigena čini bispecifična antitela atraktivnim alatom za terapijske primene gde postoji korist od ciljnog delovanja na više od jednog antigena ili epitopa u lečenju bolesti. Međutim, efikasna proizvodnja bispecifičnih antitela u formatu koji je sličan prirodnim antitelima može da bude teška, jer su teški lanci antitela evoluirali da vezuju lake lance antitela na relativno promiskuitetan način. Kao rezultat ovog promiskuitetnog sparivanja, istovremena ekspresija dva različita teška lanca i dva različita laka lanca bispecifičnog antitela prirodno dovodi do poremećenog sparivanja teškog lanca i lakog lanca. Ovo poremećeno sparivanje ostaje veliki izazov za generisanje bispecifičnih terapeutika, gde je homogeno sparivanje suštinski uslov za dobru mogućnost proizvodnje i biološku efikasnost.
[0002] Opisani su neki pristupi za pripremu bispecifičnih antitela u formatu koji je sličan prirodnim antitelima. Međutim, ovi pristupi su razvijeni i ilustrovani za slučajeve u kojima oba parentalna antitela koja se koriste za pripremu bispecifičnog antitela imaju lake lance kapa porodice gena.
[0003] Iako većina poznatih terapeutskih antitela (a time i potencijalnih parentalnih antitela) ima kapa lake lance, postoje neka antitela koji imaju lambda lake lance. Kapa i lambda laki lanci se međusobno razlikuju i po strukturi i po sekvenci.
[0004] Pregled različitih pristupa za proizvodnju bispecifičnih antitela u formatu sličnom prirodnim antitelima iz dva parentalna antitela može da se nađe kod autora Klein et al., (2012) mAbs 4:6, 1-11. Međunarodna patentna prijava br. PCT/EP2011/056388 (WO 2011/131746) opisuje in vitro metod za generisanje heterodimernog proteina, gde se asimetrične mutacije uvode u CH3 regione dva monospecifična polazna proteina kako bi se pokrenula usmerena razmena "Fab-ruke" ili "polu-molekula" između dva monospecifična IgG4 ili IgG4-slična antitela nakon inkubacije u redukujućim uslovima.
[0005] SAD patentna prijava br. 2009/0182127 (Novo Nordisk, Inc.) opisuje generisanje bi-specifičnih antitela modifikacijom aminokiselinskih ostataka na Fc dodirnoj površini i na CH1: CL dodirnoj površini parova lakih i teških lanaca koji smanjuju sposobnost lakog lanca jednog para da interaguje sa teškim lancem drugog para. Međunarodna patentna publikacija br. WO2014/081955 (Amgen) i WO2014/150973 (Eli Lilly) opisuju aminokiselinske ostatke u lambda lakom lancu koji potencijalno mogu da se modifikuju kako bi se pokrenula željena specifičnost sparivanja. Međunarodna patentna publikacija WO 2014/082179 opisuje inženjeringom izmenjene parove teških i lakih lanaca imunoglobulina i njihove upotrebe, uključujući modifikacije CH1/CL kapa dodirne površine. Nijedna od ovih publikacija ne opisuje modifikacije komplementarnih aminokiselina koje mogu da se koriste za pripremu bispecifičnog antitela od jednog parentalnog antitela sa kapa lakim lancem i drugog parentalnog antitela sa lambda lakim lancem. Međunarodna patentna publikacija br. WO2012/131555 (Glenmark), opisuje zamenu dodirne površine između teškog lanca i lambda lakog lanca antitela, sa dodirnom površinom TCR (T-ćelijski receptor) domena.
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0006] Predmetni prikaz obezbeđuje multispecifične antigen-vezujuće polipeptide koji sadrže laki lambda lanac imunoglobulina i laki kapa lanac imunoglobulina. Pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima. Svi aspekti koji su ovde otkriveni ili opisani, a koji ne spadaju u obim patentnih zahteva, služe samo u referentne svrhe.
[0007] U jednom aspektu, antigen-vezujući polipeptid je konstrukt koji sadrži prvi heterodimer i drugi heterodimer. U jednom aspektu, prvi heterodimer (H1L1) sadrži prvu polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca (H1) i polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog lakog lanca lambda lakog lanca (L1) koji formiraju prvi Fab region koja se specifično vezuje za prvi antigen; a drugi heterodimer (H2L2) sadrži drugu polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca (H2) i polipeptidnu sekvencu kapa imunoglobulinskog lakog lanca (L2) koja formira drugu Fab regiju koja se specifično vezuje za drugi antigen. U nekim primerima izvođenja, H1 se razlikuje od H2. U nekim primerima izvođenja, H1 i H2 sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH domen) i konstantni domen teškog lanca 1 (CH1 domen). U jednom primeru izvođenja, L1 sadrži varijabilni domen lambda lakog lanca (VL-lambda) i domen konstante lambda lakog lanca (CL-lambda). U jednom primeru izvođenja, L2 sadrži kapa promenljivu lanac (VL-kapa) domen i kapa konstantu lakog lanca (CL-kapa) domen. U nekim primerima izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije kao što je definisano u priloženim tvrdnjama u poređenju sa odgovarajućim divljim tipom H1, H2, L1 i L2 polipeptidnim sekvencama, pri čemu aminokiselinske modifikacije pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u odnosu na L2, i pospešuju preferencijalno sparivanje H2 sa L2 u odnosu na L1. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinske modifikacije ne uvode novi cistein ostatak. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije ne uklanjaju prirodni ostatak cisteina.
[0008] U nekim primerima izvođenja, konstrukt sadrži aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2, i/ili koje pospešuju preferencijalno sparivanje H2 sa L2 u poređenju sa L1, kada su H1, H2, L1 i L2 koeksprimirani u ćeliji ili ćeliji sisara, ili kada su H1, H2, L1 i L2 koeksprimirani u ekspresionom sistemu bez ćelija, ili kada se H1 i L1 proizvode u (prvoj) ćeliji, a H2 i L2 se proizvode u drugoj (npr. različitoj) ćeliji, a proizvodi dve ćelije se mešaju metodom redoks proizvodnje, ili kada se H1 i L1 proizvode u prvom ekspresionom sistemu bez ćelija i H2 i L2 se proizvode u drugom (npr. različitom) ekspresionom sistemu bez ćelija i proizvodi dva ekspresiona sistema bez ćelija se mešaju.
[0009] U nekim primerima izvođenja konstrukta, svaki heterodimer sadrži jedan Fab.
[0010] U nekim primerima izvođenja antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata prema ponalasku:
a. H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124; I
i. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186 ili 179, a L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 180;
ii. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186; i L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 133;
iii. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; i L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 133; ili
iv. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188; i L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 178;
U nekim aspektima antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata koji su ovde opisani b. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131; i
i. H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 186, ili 124 i 186, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 133, ili 133 i 160, ili 124 i 133, ili 176 i 180; ili
ii. H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188; i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 131;
iii. H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124 i 133, ili 124 i 133 i 180; c. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131; i
i. H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124 i 186, ili 124 i 179, ili 188, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176 i 178 ili 176 i 180, ili 131; ili
ii. H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143 i 188, ili 143, ili 124 i 143; a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124 i 176 i 178, ili 124 i 178, ili 124 i 180, ili 124 i 176 i 180, ili 124, ili 124 i 176; d. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 179, 186, 143 i/ili 188; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 180, 133 i/ili 176 i 178; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131 i/ili 124;
e. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 39 ili ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 38 ili ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 39, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 38;
f. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131; i
i. H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 188 ili 124 i 186, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176 i 178, ili 176 i 180, ili 131; ili
ii. H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143 ili 186; i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124 i 133, ili 124 i 133 i 180; g. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 176 ili 178, ili 178; i
i. H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 177 i 188; i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176 i 178; ili
ii. H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186 ili 124 ili 124 i 179; i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 176 ili 131 i 176; h. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 133; i
i. H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131; ili
ii. H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 177 i 188; i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 176 i 178; ili
H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124 i 190; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 135; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124 ili 188, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176, ili 176 i 178;
i. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 177 i 188; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 176 i 178; i
a.H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188 i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176 i 178, ili 131;
b.H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186; i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 133, ili 124 i 160 i 180; c.H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124, ili 124 i179, ili 124 i 186, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176, ili 176 i 178, ili 176 i 180; ili
d.H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 133, ili 124 i 133;
j. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 178; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124 ili 188, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176 i 178, ili 176 i 180, ili 176;
k. ili H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 145 i 188; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 178; i H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124 i/ili 188, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 124, 133 i 178;
l. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 174, 179 ili 186; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 176 ili 180; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143 ili 190, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 131, 135 ili 124; ili
m. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 174; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 176; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 190; i L2 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje ili sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 135;
n. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143 i 190; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 133; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 131 i 135; o. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143 i/ili 186; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 133; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131;
p. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143 i 179; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124 i 178; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 178 i 180, ili 160 i 180;;
q. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 179 ili 186, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124, i 160 i 180; r. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 180 ili 178 i 180; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143 i/ili 179, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124 i 178, ili 131;
s. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 179; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 180; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124;
t. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143 ili 186; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 180 ili ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143 i 145; i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124;
u. H1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 135; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 139; i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 116;
v. H1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje ili sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 45; L1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 45, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 44;
w. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 139; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 116; H2 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje; i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 135; ili
x. H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 176; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 176.
[0011] U nekim primerima izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili 100 puta u odnosu na afinitet za prvi antigen Fab regiona formiranog odgovarajućim H1 i L1 polipeptidnim sekvencama divljeg tipa i/ili afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili 100 puta u odnosu na afinitet za drugi antigen Fab regiona formiranog odgovarajućim H2 i L2 polipeptidnim sekvencama divljeg tipa.
[0012] U nekim primerima izvođenja, temperatura topljenja (Tm) prvog Fab regiona je unutar oko 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili 20°C od Tm Fab regiona formiranog odgovarajućim divljim tipom H1 i L1 polipeptidnih sekvenci za prvi antigen, i/ili temperatura topljenja (Tm) drugog Fab regiona je unutar oko 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 20°C od Tm Fab regiona formiranog odgovarajućim divljim tipom H2 i L2 polipeptidnih sekvenci za drugi antigen.
[0013] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt:
a. H1 i L1 su polipeptidne sekvence divljeg tipa, a i H2 i L2 sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju;
b. jedan ili više od H1, L1 i H2 sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju, a L2 je polipeptidna sekvenca divljeg tipa;
c. jedan ili više od H1, L1 i L2 sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju, a H2 je polipeptidna sekvenca divljeg tipa;
d. jedan ili više od H1, H2 i L2 sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju i L1 je polipeptidna sekvenca divljeg tipa;
e. jedan ili više od L1, H2 i L2 sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju i H1 je polipeptidna sekvenca divljeg tipa; ili
f. i H1 i L1 i H2 i L2 sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju.
[0014] U nekim primerima izvođenja, aminokiselinske modifikacije su u:
a. CH1 domenima H1 i H2, CL-lambda domenu L1 i CL-kapa domenu L2; ili b. CH1 i VH domenima H1 i H2, CL-lambda domenu i VL-lambda domenu L1, i CL-kapa domenu i VL-kapa domenu L2.
[0015] U nekim aspektima koji su ovde opisani, aminokiselinske modifikacije su u: a. najmanje dva CH1 domena H1, CH1 domenu H2, CL-lambda domenu L1 i CL-kapa domenu L2;
b. najmanje dva od CH 1 i VH domena H1 i H2, CL-lambda domenu i VL-lambda domenu L1, i CL-kapa domenu i VL-kapa domenu L2, ili
c. najmanje dva VH domena H1, VH domenu H2, VL-lambda domenu L1 i VL-kapa domenu L2.
[0016] U nekim primerima izvođenja, H1, L1, H2 i/ili L2 sadrže najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 aminokiselinskih mutacija u Fab regionu. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od H1, H2, L1 i L2 sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih modifikacija najmanje jednog konstantnog domena i/ili najmanje jednog varijabilnog domena.
[0017] U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1, u odnosu na L2, kako bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2, u odnosu na L1, kako bi se formirao H2L2, tako da je relativno sparivanje najmanje jednog od H1L1 ili H2L2 najmanje oko 10% veće u odnosu na divlji tip, a relativno sparivanje drugog je unutar oko 10% od divljeg tipa ili najmanje oko 10% veće u odnosu na divlji tip.
[0018] U nekim primerima izvođenja, aminokiselinske modifikacije pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1, u odnosu na L2, kako bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2, u odnosu na L1, kako bi se formirao H2L2, gde je odnos H1L1:H1L2 najmanje 40:60, a odnos H2L2:H2L1 najmanje 60:40; ili aminokiselinske modifikacije pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1, u odnosu na L2, kako bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2, u odnosu na L1, kako bi se formirao H2L2, gde je odnos H2L2:H2L1 najmanje 40:60, a odnos H1L1:H1L2 je najmanje 60:40.
[0019] U nekim primerima izvođenja, termička stabilnost prvog Fab regiona je unutar oko 0, 1, 2 ili 3°C od Tm Fab regiona formiranog od odgovarajućih H1 i L1 polipeptidnih sekvenci divljeg tipa. U nekim primerima izvođenja, termička stabilnost drugog Fab regiona je unutar oko 0, 1, 2 ili 3°C od Tm Fab regiona formiranog od odgovarajućih H2 i L2 polipeptidnih sekvenci divljeg tipa.
[0020] U nekim aspektima koji su ovde opisani, aminokiselinske modifikacije su odabrane iz grupe koja se sastoji od Mab dizajn setova sa jedinstvenim identifikacionim elementima, prikazanih u Tabeli 4A ili 4B. U nekim aspektima koji su ovde opisani, aminokiselinske modifikacije su odabrane iz grupe koja se sastoji od Mab dizajn setova sa jedinstvenim identifikatorima, prikazanih u jednoj ili više od tabela 10-A1 do 10-A12. U nekim aspektima koji su ovde opisani, aminokiselinske modifikacije su odabrane iz grupe koja se sastoji od Mab dizajn setova sa jedinstvenim identifikacionim elementima, prikazanim u bilo kojoj od tabela 10-B1 do 10-B 10.
[0021] U nekim primerima izvođenja, konstrukt dalje sadrži dimerni Fc koji ima dva Fc polipeptida od kojih svaki sadrži sekvencu CH3 domena i spojen je, sa ili bez linkera, sa jednim od Fab regiona, prvim ili drugim. U nekim primerima izvođenja, Fc je humani Fc, ili kao što je ovde opisano humani IgG1 Fc, humani IgA Fc, humani IgG Fc, humani IgD Fc, humani IgE Fc, humani IgM Fc, humani IgG2 Fc, humani IgG3 Fc ili humani IgG4 Fc. U jednom primeru izvođenja, Fc sadrži jednu ili više modifikacija, u odnosu na divlji tip, u najmanje jednoj od sekvenci CH3 domena koje pospešuju formiranje heterodimernog Fc.
[0022] U nekim primerima izvođenja, Fc sadrži:
i) heterodimerni IgG1 Fc koji ima modifikacije L351Y_F405A_Y407V u prvom Fc polipeptidu, i modifikacije T366L_K392M_T394W u drugom Fc polipeptidu;
ii) heterodimerni IgG1 Fc koji ima modifikacije L351Y_F405A_Y407V u prvom Fc polipeptidu, i modifikacije T366L_K392L_T394W u drugom Fc polipeptidu;
iii) heterodimerni IgG1 Fc koji ima modifikacije T350V_L351Y_F405A_Y407V u prvom Fc polipeptidu, i modifikacije T350V_T366L_K392L_T394W u drugom Fc polipeptidu
iv) heterodimerni IgG1 Fc koji ima modifikacije T350V_L351Y_F405A_Y407V u prvom Fc polipeptidu, i modifikacije T350V_T366L_K392M_T394W u drugom Fc polipeptidu; ili
v) heterodimerni IgG1 Fc koji ima modifikacije T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V u prvom Fc polipeptidu, i modifikacije T350V_T366L_N390R_K392M_T394W u drugom Fc polipeptidu.
[0023] U nekim primerima izvođenja, Fc dalje sadrži najmanje jednu sekvencu CH2 domena. U jednom aspektu koji je ovde opisan, Fc sadrži jednu ili više modifikacija koje pospešuju selektivno vezivanja Fc-gama receptora, smanjuju ili eliminišu vezivanje za Fc-gama receptore ili pospešuju vezivanje za FcRn.
[0024] U nekim primerima izvođenja, kada su H1, L1, H2 i L2 koeksprimirani, promena u iznosu ukupnog ispravnog sparivanja mereno zbirom H1L1 i H2L2 sparivanja je veća od oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, ili 45% u poređenju sa sparivanjem odgovarajućih H1, L1, H2 i L2 polipeptidnih lanaca bez aminokiselinskih supstitucija u Fab regionu koji pospešuju preferencijalno sparivanje; ili promena u iznosu ukupnog ispravnog sparivanja, mereno količinom bispecifičnih antitela proizvedenih kao procenat vrsta osim proizvedenih polu-antitela, veći je od oko 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ili 80%, u poređenju sa sparivanjem odgovarajućih H1, L1, H2 i L2 polipeptidnih lanaca bez aminokiselinskih supstitucija u Fab regionu koji pospešuju preferencijalno sparivanje, ili promena u količini ukupnog ispravnog sparivanja, mereno količinom bispecifičnog antitela proizvedenog kao procenat svih vrsta proizvedenih, veća je od oko 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ili 80%, u poređenju sa sparivanjem odgovarajućih H1, L1, H2 i L2 polipeptidnih lanaca bez aminokiselinskih supstitucija u Fab regionu koji pospešuju preferencijalno sparivanje.
[0025] U nekim primerima izvođenja, linkeri se sastoje od jednog ili više polipeptidnih linkera, jednog ili više zglobnih regiona antitela ili jednog ili više zglobnih regiona IgG1. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više polipeptidnih linkera sadrže jednu ili više modifikacija u poređenju sa polipeptidnim linkerom divljeg tipa.
[0026] U nekim primerima izvođenja, aminokiselinske modifikacije sadrže aminokiselinske supstitucije.
[0027] U nekim primerima izvođenja, sekvence jednog ili više H1, H2, L1 i L2 potiču iz ljudskih sekvenci ili humanizovanih sekvenci.
[0028] U nekim primerima izvođenja, konstrukti opisani ovde su konjugirani sa terapeutskim agensom ili lekom.
[0029] U drugom aspektu, prikaz obezbeđuje izolovani rekombinantni polinukleotid ili skup izolovanih rekombinantnih polinukleotida koji kodiraju konstrukte opisane ovde. U nekim primerima izvođenja, pod uslovom su vektor ili skup vektora koji sadrže jedan ili više polinukleotida ili skupova polinukleotida opisanih ovde. U nekim primerima izvođenja, vektor ili bar jedan vektor skupa vektora je multi-cistronic.
[0030] U drugom aspektu, prikaz obezbeđuje izolovanu ćeliju koja sadrži polinukleotid ili skup polinukleotida, ili vektor ili skup vektora opisanih ovde. U nekim primerima izvođenja, ćelija je ćelija kvasca, bakterijska ćelija, ćelija insekata ili ćelija sisara. U nekim primerima izvođenja, izolovana ćelija je stabilno transfektirana ili prolazno transfektirana sa vektorom ili skupom vektora opisanih ovde.
[0031] U drugom aspektu, obezbeđen je farmaceutska kompozicija koji sadrži polipeptidne konstrukte koji vezuju antigen. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija dalje obuhvata jednu ili više supstanci odabranih iz grupe koja se sastoji od pufera, antioksidant, molekula niske molekulske mase, leka, proteina, aminokiseline, ugljenih hidrata, lipida, helacionog agensa, stabilizatora i pomoćne materije.
[0032] U drugom aspektu, opisan je način pripreme ovde opisanih konstrukt. U nekim primerima izvođenja, metoda obuhvata korake:
(a) dobijanje ćelije domaćina koja sadrži polinukleotid ili skup polinukleotida koji kodiraju antigen-vezujući polipeptidni konstrukt;
(b) gajenje ćelije-domaćina u kulturi ćelija-domaćina pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta, i
(c) prikupljanje antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta iz kulture ćelijadomaćina.
[0033] U nekim primerima izvođenja, ćelija-domaćin je privremeno transfektovana ili stabilno transfektovana sa polinukleotidom ili setom polinukleotida koji su ovde opisani.
[0034] U drugom aspektu, obezbeđen je kompjuterski čitljiv medij za skladištenje. U nekim aspektima koji su ovde opisani, kompjuterski čitljiv medijum za skladištenje skladišti skup podataka koji sadrži podatke koji predstavljaju komplementarne aminokiselinske modifikacije u prvom heterodimeru koji sadrži prvu polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca (H1) i prvu imunoglobulin lambda polipeptidnu sekvencu lakog lanca (L1); i/ili drugi heterodimer koji sadrži drugu polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca (H2) i drugu polipeptidnu sekvencu kapa imunoglobulinskog lakog lanca (L2). U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 i H2 polipeptidne sekvence koje se nalaze u skupu podataka sadrže najmanje težak lanac promenljivog domena (VH domen) i konstantnog domena teškog lanca (CH1 domen) i razlikuju se jedni od drugih. U nekim primerima izvođenja, L1 i L2 polipeptidne sekvence koje se nalaze u skupu podataka obuhvataju najmanje varijabilni domen lakog lanca (VL domen) i konstantnog domena lakog lanca (CL domen). U nekim aspektima koji su ovde opisani, komplementarne aminokiselinske modifikacije koje se nalaze u skupu podataka pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2, i H2 sa L2 u poređenju sa L1. U nekim aspektima opisanim u ovom dokumentu, skup podataka sadrži podatke koji predstavljaju one modifikacije navedene u tabeli 4A ili tabeli 4B ili podskup tih modifikacija. U nekim aspektima opisanim u ovom dokumentu, skup podataka sadrži podatke koji predstavljaju one modifikacije navedene u jednoj ili više tabela 10-A1 do 10-A12 ili tabela 10-B1 do 10-B10, ili podskup tih modifikacija U drugom aspektu, opisan je metod proizvodnje bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta. U nekim primerima izvođenja, bispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt proizveden prema postupku, sadrži:
a. prvi heterodimer koji sadrži prvu polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca (H1) i prvu polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog lambda lakog lanca (L1); i
b. drugi heterodimer koji sadrži drugu polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca (H2) i drugu polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog kapa lakog lanca (L2).
[0035] U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 i H2 polipeptidne sekvence koje se nalaze u skupu podataka sadrže najmanje težak lanac promenljivog domena (VH domen) i konstantnog domena teškog lanca (CH1 domen) i razlikuju se jedni od drugih. U nekim primerima izvođenja, L1 i L2 polipeptidne sekvence koje se nalaze u skupu podataka obuhvataju najmanje varijabilni domen lakog lanca (VL domen) i konstantnog domena lakog lanca (CL domen). U nekim primerima izvođenja, jedan ili više H1, L1, H2, i L2 polipeptidnih sekvenci proizvedenih metodom sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2 i H2 sa L2 u odnosu na L1.
[0036] U nekim aspektima koji su ovde opisani, metoda proizvodnje bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta obuhvata:
a. uvođenje jedne ili više komplementarnih aminokiselinskih modifikacija iz ovde opisanog skupa podataka u H1, L1, H2 i/ili L2; i
b. koekspresiju H1, L1, H2 i L2 u ćeliji-domaćinu da bi se proizveo proizvod ekspresije koji sadrži bi-specifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt.
[0037] U nekim aspektima koji su ovde opisani, postupak dalje obuhvata određivanje količine bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta u proizvodu ekspresije u odnosu na druge polipeptidne proizvode kako bi se odabrao željeni podskup komplementarnih aminokiselinskih modifikacija koje obezbeđuju povećanu količinu bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta u poređenju sa količinom bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta u proizvodu ekspresije koji je rezultat koekspresija divljeg tipa H1, L1, H2 i L2. U nekim aspektima koji su ovde opisani, bispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt proizvodi se sa čistoćom većom od 70% u poređenju sa drugim polipeptidnim proizvodima. U nekim primerima izvođenja, konstrukt proizveden prema postupku sadrži Fc koji sadrži najmanje dve sekvence CH3 domena, a Fc je kuplovan, sa ili bez jednog ili više linkera, sa prvim heterodimerom i drugim heterodimerom. U nekim aspektima koji su ovde opisani, Fc je heterodimerni Fc koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija koje pospešuju formiranje heterodimernog Fc u odnosu na homodimerni Fc.
[0038] U nekim aspektima postupka, koji je opisan u ovom dokumentu, za proizvodnju bispecifičnog, antigen-vezujućeg polipeptidnig konstrukta, kada su H1, L1, H2 i L2 koeksprimirani, promena količine ukupnog ispravnog sparivanja mereno zbirom produkovanih %H1L1 i %H2L2 je veća od oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, ili 45% u poređenju sa sparivanjem odgovarajućih H1, L1, H2 i L2 polipeptidnih lanaca bez aminokiselinskih supstitucija u Fab regionu koje pospešuju preferencijalno sparivanje; ili promena količine ukupnog ispravnog sparivanja, mereno količinom proizvedenih bispecifičnih antitela kao procenta vrsta koje nisu proizvedena poluantitela, veća je od oko 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ili 80%, u poređenju sa sparivanjem odgovarajućih H1, L1, H2 i L2 polipeptidnih lanaca bez aminokiselinskih supstitucija u Fab regionu koje pospešuju preferencijalno sparivanje; ili je promena količine ukupnog ispravnog sparivanja, mereno količinom proizvedenog bispecifičnog antitela kao procenta svih proizvedenih vrsta, veća od oko 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ili 80%, u poređenju sa sparivanjem odgovarajućih H1, L1, H2 i L2 polipeptidnih lanaca bez aminokiselinskih supstitucija u Fab regionu koje pospešuju preferencijalno sparivanje.
KRATAK OPIS SLIKA
[0039]
Slika 1 prikazuje D3H44, Pertuzumab i CAT-2200 aminokiselinske sekvence teškog lanca i lakog lanca poravnane sa humanim sekvencama klicine linije za promenljive i konstantne domene. Translatirane proteinske sekvence za svaki domen, klicinu liniju i alel dobijene su direktnim upitom u IMGT/GENE-DB (http://www.imgt.org/genedb/query). IMGT/DomainGapAlign (http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi) je korišćen za određivanje najbližeg gena/alela. Identifikacija konsenzusnih sekvenci izvedena je pomoću programa BoxShade (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html) sa graničnom vrednošću od 0,8. Aminokiselinski ostaci osenčeni crnom predstavljaju identičnost aminokiselinske sekvence, dok ostaci osenčeni sivom predstavljaju sličnost aminokiselinske sekvence. Dodeljivanje aminokiselina za svaki domen na slici 1 je učinjeno u skladu sa IMGT definicijama kao što je opisano u Lefranc M.-P. et al. "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains" Dev. Comp. Immunol., 2005, 29, 185-203 i Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, G. "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains" Dev. Comp. Imunol., 27, 55-77 (2003). Slika 1A prikazuje Pertuzumab i D3H44 promenljive teške (VH) domene poravnane uz humane IGHV i IGHJ podgrupe klicine linije (za svaki gen i alel je prikazana jedna reprezentativna sekvenca). Najbliži gen i alelne sekvence za Pertuzumab IGHV i IGHJ su X92218|IGHV3-66*01 i J00256|IGHJ4*01, redom. Najbliži gen i alelne sekvence za D3H44 IGHV i IGHJ su X92218|IGHV3-66*01 i J00256|IGHJ4*01, redom. Slika 1B prikazuje Pertuzumab i D3H44 promenljive lake (VL) domene poravnane uz humane kapa IGKV i IGKJ podgrupe klicine linije (za svaki gen i alel je prikazana jedna reprezentativna sekvenca). Najbliži gen i alelne sekvence za Pertuzumab IGKV i IGKJ su Y14865|IGKV1-NL1*01 i J00242|GKJ2*01, redom. Najbliži gen i alelne sekvence za D3H44 IGKV and IGKJ su X59315|IGKV1-39*01 i J00242|IGKJ1*01, redom. Slika 1C prikazuje Pertuzumab i D3H44 konstantne teške 1 (CH1) domene poravnane uz humane CH1 IGHG podgrupe klicine linije. Najbliži gen i alelna sekvenca za Pertuzumab i D3H44 IGHG je J00228|IGHG1*01. Slika 1D prikazuje Pertuzumab i D3H44 konstantne lake (CL) domene poravnane uz humane kapa IGKC podgrupe klicine linije. Najbliži gen i alelna sekvenca za Pertuzumab i D3H44 IGKC je J00241|IGKC*01. Slika 1E prikazuje CAT-2200 VH domen poravnan uz humane IGHV i IGHJ podgrupe klicine linije (za svaki gen i alel je prikazana jedna reprezentativna sekvenca). Najbliži gen i alelne sekvence za CAT-2200 IGHV i IGHJ su M99660|IGHV3-23*01 i J00256|IGHJ4*01, redom. Slika 1F prikazuje CAT-2200 VL domen poravnan uz humane lambda IGLV i IGLJ podgrupe klicine linije (za svaki gen i alel je prikazana jedna reprezentativna sekvenca). Najbliži gen i alelne sekvence za CAT-2200 IGLV i IGLJ su Z73673|IGLV6-57*01 i M15641|IGLJ2*01, redom. Slika 1G prikazuje CAT-2200 CH1 domen poravnan uz humane CH1 IGHG podgrupe klicine linije. Najbliži gen i alelna sekvenca za CAT-2200 IGHG je J00228|IGHG1*01. Slika 1H prikazuje CAT-2200 CL domen poravnan uz humane lambda IGLC podgrupe klicine linije. Najbliži gen i alelna sekvenca za CAT-2200 IGLC je J00253|IGLC2*01.
Slika 2 prikazuje dijagram toka za identifikaciju ostataka na dodirnoj površini i za računarsko modeliranje dizajna sa preferencijalnim sparivanjem teškiog i lakog lanca.
Slika 3 prikazuje 3D strukturno poravnanje između konstantnih domena D3H44 (PDB ID 1JPT) i CAT-2200 (PDB-ID 2VXS). Slika 3A daje primer tipičnih konformacionih razlika koje se vide između kapa i lambda lakog lanca kada su poravnati na svom teškom lancu. Slika 3B predstavlja pogled na dodirnu površinu lakog lanca (gde je teški lanac uklonjen) modela predstavljenog na slici 3A, kako bi bio obezbeđen dodatni primer konformacionih razlika. Tačkaste strelice ukazuju na konformacioni rearanžman elemenata sekundarne strukture na dodirnoj površini između teških i lakih lanaca.
Slika 4 ilustruje, u velikoj meri šematski, pregled zahteva koji treba da budu ispunjeni da bi se inženjeringom formiralo bispecifično antitelo i zahteva za testiranje, neophodnih za kvantifikaciju parova teškog lanca i lakog lanca (H-L). Cilj dizajna, da se inženjeringom kreira bispecifično antitelo sa visokom čistoćom (tj. sa malim brojem ili bez pogrešno sparenih H-L asocijacija) može da se postigne racionalnim inženjeringom (uvođenjem specifičnih aminokiselinskih mutacija) preferencijalnog sparivanja dva jedinstvena teška lanca sa svojim jedinstvenim pripadajućim lakim lancima. Ovaj proces je prikazan šematski; ovde je H1 inženjeringom tako izmenjen da se preferencijalno sparuje sa L1 (označeno kvačicom), a ne sa L2 (označeno sa "X"). Isto tako, H2 je inženjeringom tako izmenjen da se preferencijalno sparuje sa L2, a ne L1. Strelice na H1L1 i H2L2 heterodimerima predstavljaju olakšano sparivanje između ovih H-L parova, dok strelice na H1L2 i H2L1 heterodimerima predstavljaju poremećaj sparivanja između ovih poslednjih H-L parova. Eksperimentalni skrining dizajna za pospešivanje preferencijalnog sparivanja zahteva test koji je u stanju da istovremeno kvantifikuje H1L1: H1L2 i H2L2: H2L1. Ovi zahtevi testa mogu da se pojednostave ako se pretpostavi da svaki bispecifični Fab krak može nezavisno da se izmeni inženjeringom. U ovom slučaju, test bi trebalo samo da kvantifikuje H1L1: H1L2 ili H2L2: H2L1, a ne oba istovremeno.
Slika 5 obezbeđuje šemu koja prikazuje kako teški lanci i laki lanci mogu da budu označeni i kako se određuje preferencijalno sparivanje. Na ovoj šemi, kružna granica predstavlja ćeliju u koju se transfektuju 3 konstrukta (jedan teški lanac i dva jedinstvena laka lanca). Proizvodi ekspresije se izlučuju iz ćelije i supernatant (SPNT) se sprovodi preko uređaja za detekciju, u ovom slučaju SPR čipa. Na osnovu detekcije dve različite oznake fuzionisane sa dva laka lanca koji su u kompeticiji za sparivanje sa teškim lancem, može da se dobije kvantitativna procena preferencijalnog sparivanja teškog lanca sa dva laka lanca.
Slika 6 prikazuje kriterijume za filtriranje performansi na osnovu dva LCCA rezultata za svaki dizajn. Ovi kriterijumi za filtriranje performansi korišćeni su za identifikaciju biblioteke K-L dizajna i biblioteke K-K-izvedenog K-L dizajna. Da bi bio uključen, dizajn treba da sadrži pozitivan LCCA rezultat iznad neutralne zone (neutralna zona je definisana kao region između odnosa spareni:pogrešno spareni 40:60 i 60:40), dok drugi LCCA mora da bude iznad donje granice neutralne zone (odnos spareni:pogrešno spareni 40:60). Scenario A i B predstavljaju dizajne koji prolaze kriterijume filtriranja. Treba zapaziti da je scenario B uključen jer je H2L2: H2L1 LCCA iznad neutralne zone, a H1L1: H1L2 LCCA unutar neutralne zone (ne ispod nje). Scenario C predstavlja dizajn koji je odbačen filtriranjem, gde su oba LCCA rezultata pozitivna, ali nijedan nije iznad neutralne zone. Scenario D i E predstavljaju dizajne koji su odbačeni filtriranjem jer je najmanje jedan od rezultata LCCA ispod neutralne zone, čak i ako je drugi LCCA iznad neutralne zone (vidi scenario D). Uključeni su i dizajni u kojima je označavanje H1L1 i H2L2 obrnuto. Ovaj opis ove slike pretpostavlja da je odnos sparivanja divljeg tipa 50:50.
Slika 7 prikazuje performanse odabranih K-L dizajna, kao i K-K-izvedenih K-L dizajna (na osnovu LCCA podataka za Mab dizajn set iz tabela 4A i 4B) kao što je definisano snagom dizajna = ΔH1:L1:L2_skalar ΔH2:L2:L1_skalar. Ova metrika je pokazatelj ukupnog uspeha sparivanja na nivou dizajna.
Slika 8 prikazuje potencijalne proizvode povezane sa teškim lancima koji se mogu očekivati kada su dva različita laka lanca koeksprimirana sa dva različita teška lanca u ćeliji.
Slika 9 prikazuje opšti postupak pripreme bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta koristeći biblioteku Mab dizajn setova koja je ovde obezbeđena.
Slika 10 prikazuje boks dijagrame sa minimumima i maksimumima, koji sumiraju performanse svih K-L dizajna testiranih u SMCA u tri bispecifična sistema, po klasteru dizajna. Slika 10A prikazuje performanse merene izračunavanjem ukupnih bispecifičnih (ΔBispecific%). Slika 10B prikazuje performanse merene izračunavanjem ukupnog sparivanja (ΔPairing%).
Slika 11 prikazuje grafik sa boks dijagramima sa minimumima i maksimumima, koji sumiraju performanse K-L dizajna i K-K-izvedenih K-L dizajna po bispecifičnom sistemu, po grupi iste transferabilnosti; "kl 3/3" označava K-L dizajne transferabilne u 3/3 bispecifična sistema, "kl 3/3 2/3" označava K-L dizajne transferabilne u najmanje 2 bispecifična sistema, i "kl all" označava sve testirane K-L dizajne. Slično tome, "kk 3/3" označava K-K-izvedene K-L dizajne transferabilne u 3/3 bispecifične sisteme, "kk 3/3 2/3" označava K-K-izvedene K-L dizajne transferabilne u najmanje 2 bispecifična sistema, i "kk all" označava sve testirane K-K-izvedene K-L dizajne; rezultati su predstavljeni na osnovu izračunavanja ukupnih bispecifičnih (ΔBispecific%).
Slika 12 prikazuje DSC senzorgrame bispecifičnih antitela proizvedenih korišćenjem Mab dizajn seta 3972 (SMCA dizajn ID) (u svakom od tri bispecifična sistema) i parentalna antitela divljeg tipa za svaki sistem. Slika 12A prikazuje CAT-2200 mAb divljeg tipa (tamno siva), Pertuzumab mAb divljeg tipa (srednje siva), i dizajn 3972 CAT-2200/Pertuzumab SMCA (svetlo siva); Slika 12B prikazuje CAT-2200 mAb divljeg tipa (tamno siva), SGN-CD19a mAb divljeg tipa (srednje siva), i dizajn 3972 CAT-2200/SGN-CD19a SMCA (svetlo siva); Slika 12C prikazuje SGN-CD19a mAb divljeg tipa (tamno siva), CR8071 mAb divljeg tipa (srednje siva), i dizajn 3972 CR8071/SGN-CD19a SMCA (svetlo siva).
Slika 13 prikazuje boks grafikon sa minimalnim i maksimalnim vrednostima, koji daje pregled za efekat aminokiselinskih supstitucija Mab dizajna na Tm testiranih Fab regiona. Rezultati se prikazuju kao promena Fab Tm u odnosu na WT i prikazani su za sve dizajne za koje je Tm merena ("All"), i razdvojeni paratopom.
Slika 14 prikazuje boks dijagram sa minimalnim i maksimalnim vrednostima, koji daje pregled za efekat aminokiselinskih supstitucija Mab dizajna na afinitet testiranih Fab regiona za njihov antigen. Rezultati se prikazuju kao razlika u log(KD) odgovarajućeg Fab iz bispecifične forme WT (-(log(KD_variant)-log(KD_wt)). Rezultati su prikazani za sve dizajne za koje je afinitet meren ("All"), i razdvojeni paratopom.
Slika 15 prikazuje UPLC-SEC profile proteina-A i prep-SEC prečišćenih bispecifičnih antitela i parentalnih antitela. Slika 15A prikazuje parentalno antitelo CAT-2200 divljeg tipa mAb; Slika 15B prikazuje parentalno antitelo divljeg tipa CR8071 mAb; Slika 15C prikazuje parentalno antitelo divljeg tipa SGN-CD19a mAb; Slika 15D prikazuje parentalno antitelo divljeg tipa Pertuzumab mAb; Slika 15E prikazuje bispecifično antitelo generisano korišćenjem dizajna 3972 CAT-2200/Pertuzumab SMCA; Slika 15F prikazuje bispecifično antitelo generisano korišćenjem dizajna 3972 CAT-2200/SGN-CD19a SMCA; i slika 15G prikazuje bispecifično antitelo generisano korišćenjem dizajna 3972 CR8071/SGN-CD19a SMCA.
Slika 16 prikazuje proces odabira referentnih vrednosti za divlji tip, za izračunavanje 'promene u ukupnom sparivanja u odnosu na WT" i "promene u ukupnim bispecifičnim, u odnosu na WT", za dizajne testirane u SMCA, u slučajevima kada odgovarajući WT bispecifični konstrukt nije bio procenjen pomoću SMCA. Slika 16A prikazuje proces za odabir referentnih vrednosti za divlji tip za "ukupno sparivanje" ("% H1L1 i % H2L2 sparivanje") za svaki od tri bispecifična sistema; Slika 16B prikazuje proces odabira referentnih vrednosti za divlji tip, za "ukupne bispecifične" ("H1L1_H2L2 i H1L2_H2L1**") za svaki od tri bispecifična sistema.
DETALJAN OPIS
[0040] Ovde su obezbeđena inženjeringom kreirana antitela (koja se ovde označavaju i kao multispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukti) koja mogu da sadrže prvi heterodimer (H1L1) koji ima prvi imunoglobulinski teški lanac (H1) i imunoglobulinski lambda laki lanac (L1) koji se sparuju kako bi formirali prvi Fab region, i drugi heterodimer (H2L2) koji ima imunoglobulinski teški lanac (H2) i imunoglobulinski kapa laki lanac (L2) koji se sparuju kako bi formirali drugi Fab region. Prvi Fab region se obično vezuje za prvi antigen, a drugi Fab region se obično vezuje za drugi antigen. U nekim primerima izvođenja, prvi i drugi antigen se razlikuju jedan od drugog. H1 se razlikuje od H2. Imunoglobulinski teški lanci i laki lanci su kreirani inženjeringom tako da sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje pravilno sparenih teških i lakih lanaca (H1L1 i H2L2) kada su koeksprimirani ili koproizvedeni. Tačnije, aminokiselinske modifikacije pospešuju preferencijalno sparivanje između svakog teškog lanca i ispravnog lakog lanca, tako da teški lanac prvog heterodimera (H1) može preferencijalno da se spari sa L1, pre nego sa L2, a teški lanac drugog heterodimera (H2) može preferencijalno da se spari sa L2, pre nego sa L1. Kao rezultat toga, koekspresija polipeptida H1, L1, H2 i L2 može da omogući proizvodnju pravilno sparenog bispecifičnog antitela sa smanjenim ili ograničenim pogrešnim sparivanjem, čime se smanjuje broj i količina proizvedenih pogrešno sparenih vrsta i potencijalno poboljšava mogućnost proizvodnje. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije u Fab regionima se sparuju sa aminokiselinskim modifikacijama u Fc regionu. što pospešuje formiranje heterodimernog Fc regiona kako bi se dodatno smanjila količina pogrešno sparenih teških lanaca. Aminokiselinske modifikacije ne utiču značajno na termičku stabilnost pravilno sparenih heterodimera, ili afinitet vezivanja svakog ispravno sparenog heterodimera za antigen, u poređenju sa heterodimerima koji su formirani od H1 i L1 ili H2 i L2 polipeptida divljeg tipa.
[0041] Ovde su takođe obezbeđeni postupci pravljenja multispecifičnih antigenvezujućih polipeptidnih konstrukata koji su opisani prethodno u tekstu.
Definicije
[0042] Osim ako nisu drugačije definisani, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje koje obično podrazumeva stručnjak u oblasti kojoj pripada predmet za koji se traži zaštita. U slučaju da za termine u ovom tekstu postoji veći broj definicija, podrazumevaće se definicije date u ovom odeljku. Kada se daje referenca na URL ili drugi identifikator ili adresu ove vrste, podrazumeva se da se ovi identifikatori mogu da se menjaju i da konkretne informacije na internetu mogu da se pojavljuju i nestaju, ali se ekvivalentne informacije mogu naći pretraživanjem interneta. Pozivanje na ove informacije svedoči da su one dostupne i da se javno dele.
[0043] Treba razumeti da su prethodni opšti opis i detaljan opis koji sledi dati samo kao primer i objašnjenje, i da nisu ograničavajući za bilo koji predmet za koji se traži zaštita. U ovoj aplikaciji, upotreba jednine uključuje množinu, osim ako nije drugačije specifično navedeno.
[0044] U predmetnom opisu, treba podrazumevati da bilo koji opseg koncentracija, procentualni opseg, opseg odnosa ili opseg celih brojeva, obuhvata vrednost bilo kog celog broja unutar navedenog opsega i, kada je potrebno, njihove frakcije (kao što je jedna desetina i stoti deo celog broja), osim ako nije drugačije naznačeno. Kako se ovde koristi, "oko" označava ± 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ili 10% naznačenog opsega, vrednosti, sekvence ili strukture, osim ako nije drugačije naznačeno. Treba razumeti da se jednina imenica koje se ovde koriste odnosi na "jednu ili više" pobrojanih komponenti, osim ako nije drugačije naznačeno ili ako kontekst ne nalaže drugačije. Potrebno je smatrati da upotreba alternative (npr. "ili") označava ili jedno, ili oba, ili bilo koju njihovu kombinaciju alternativa. Kao što se ovde koriste, termini "uključuju" i "sadrže" koriste se sinonimno. Osim toga, treba razumeti da su pojedinačni jednolančani polipeptidi ili imunoglobulinski konstrukti izvedeni iz različitih kombinacija struktura i supstituenata koji su ovde opisanih otkriveni predmetnom patentnom prijavom u istoj meri kao i da je svaki jednolančani polipeptid ili heterodimer prikazan pojedinačno. Dakle, izbor konkretnih komponenti za formiranje pojedinačnih jednolančanih polipeptida ili heterodimera je u obimu predmetnog otkrivanja.
[0045] Treba podrazumevati da ovde opisani postupci i kompozicije nisu ograničeni na konkretnu, ovde opisanu, metodologiju, protokole, ćelijske linije, konstrukte i reagense, i da kao takvi mogu da variraju. Takođe treba razumeti da terminologija koja se ovde koristi ima samo funkciju opisivanja konkretnih primera izvođenja, i da nije predviđeno da ograničava obim postupaka i kompozicija koje su ovde opisane, a koje će biti ograničene samo priloženim patentnim zahtevima.
[0046] Publikacije o kojima se ovde govori obezbeđene su isključivo u cilju njihovog otkrivanja pre datuma podnošenja ove prijave. Ništa u ovom tekstu ne treba tumačiti kao priznanje da pronalazači opisani ovde nemaju pravo da antidatiraju ovo otkrivanje na osnovu prethodnog pronalaska ili iz bilo kog drugog razloga.
[0047] U predmetnoj patentnoj prijavi, imena aminokiselina i imena atoma (npr. N, O, C, itd.) koriste se kao što je definisano u bazi podataka Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org), koja se bazira na IUPAC nomenklaturi (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (residue names, atom names etc.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984) zajedno sa njihovim ispravkama u Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985). Termin "aminokiselinski ostatak" prvenstveno ima za cilj da ukaže na aminokiselinski ostatak sadržan u grupi koja se sastoji od 20 prirodnih aminokiselina, tj. alanina (Ala ili A), cisteina (Cis ili C), asparaginske kiseline (Asp ili D), glutaminske kiseline (Glu ili E), fenilalanina (Phe ili F), glicin (Gly ili G), histidina (His ili H), izoleucina (Ile ili I), lizina (Lys ili K), leucina (Leu ili L), metionina (Met ili M), asparagina (Asn ili N), prolina (Pro ili P), glutamina (Gin ili Q), arginina (Arg ili R), serina (Ser ili S), treonina (Thr ili T), valina (Val ili V), triptofana (Trp ili W) i tirozina (Tyr ili Y) ostaci.
[0048] Termini "polipeptid", "peptid" i "protein" se ovde koriste naizmenično da bi se odnosili na polimer aminokiselinskih ostataka. To jest, opis usmeren na polipeptid odnosi se jednako na opis peptida i opis proteina, i obrnuto. Termini se odnose na prirodne aminokiselinske polimere, kao i aminokiselinske polimere u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka neprirodno kodirana aminokiselina. Kao što se ovde koristi, termini obuhvataju lance aminokiselina bilo koje dužine, uključujući proteine pune dužine, pri čemu su aminokiselinski ostaci povezani kovalentnim peptidnim vezama.
[0049] Termin "nukleotidna sekvenca" ili "sekvenca nukleinske kiseline" ima za cilj da ukaže na uzastopni potez dva ili više nukleotidnih molekula. Nukleotidna sekvenca može biti genomskog, cDNK, RNK, polusintetičkog ili sintetičkog porekla ili bilo koje njihove kombinacije.
[0050] "Ćelija", "ćelija domaćina", "ćelijska linija" i "ćelijska kultura" se ovde koriste naizmenično i treba smatrati da svi ovi termini uključuju potomstvo koje je rezultat rasta ili gajenja ćelije. "Transformacija" i "transfekcija" se koriste naizmenično tako da se odnose na proces uvođenja sekvence nukleinske kiseline u ćeliju.
[0051] Termin "aminokiselina" odnosi se na prirodne i ne-prirodne aminokiseline, kao i analoge aminokiselina i aminokiselinske mimetike koji funkcionišu na način sličan prirodnim aminokiselinama. Prirodno kodirane aminokiseline su 20 uobičajenih aminokiselina (alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutamin, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin i valin) i pirolizin i selenocistein. Analozi aminokiselina odnose se na jedinjenja koja imaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna aminokiselina, tj. Ugljenik koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu i R grupu, kao što su homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi imaju modifikovane R grupe (kao što je norleucin) ili modifikovane peptidne okosnice, ali zadržavaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna aminokiselina. Pozivanje na aminokiselinu uključuje, na primer, prirodne proteogene L-aminokiseline; D-aminokiseline, hemijski modifikovane aminokiseline kao što su varijante aminokiselina i derivati; prirodne neproteogene aminokiseline kao što su alanin, ornitin, itd .; i hemijski sintetizovani jedinjenja koja imaju svojstva poznata u stanju tehnike da su karakteristična za aminokiseline. Primeri aminokiselina koje se ne javljaju prirodno uključuju, ali nisu ograničeni na, N-metil aminokiseline (npr. Metil alanin), D-aminokiseline, aminokiseline slične histidinu (npr. 2-amino-histidin, hidroksi-histidin, homohistidin), aminokiseline koje imaju dodatni metilen u bočnom lancu ("homo" aminokiseline), i aminokiseline u kojima je funkcionalna grupa karboksilne kiseline u bočnom lancu zamenjena grupom sulfonske kiseline (npr. cisteinska kiselina). Uključivanje ne-prirodnih aminokiselina, uključujući sintetičke nenative aminokiseline, supstituisane aminokiseline, ili jedan ili više D-aminokiselina u proteine antigen-vezujući polipeptidnih konstrukata opisanih ovde može biti korisno na više različitih načina. Peptidi koji sadrže D-aminokiseline, itd., Pokazuju povećanu stabilnost in vitro ili in vivo u poređenju sa kolegama koje sadrže L-aminokiseline. Tako, izgradnja peptida, itd, uključujući D-aminokiseline može biti posebno korisno kada je poželjna ili potrebna veća intracelularna stabilnost. Tačnije, D-peptidi, itd., Otporni su na endogene peptidaze i proteaze, čime se obezbeđuje poboljšana bioraspoloživost molekula i produženi životni vek in vivo kada su takva svojstva poželjna. Pored toga, D-peptidi, itd., Ne mogu se efikasno obraditi za glavnu prezentaciju kompleksa histokompatibilnosti klase II ograničene na T pomoćne ćelije, i stoga je manje verovatno da će izazvati humoralne imune odgovore u celom organizmu.
[0052] Aminokiseline se ovde označavaju ili svojim generalno poznatim simbolima od tri slova ili simbolima sa jednim slovom koje preporučuje IUPAC-IUB Komisija za biohemijsku nomenklaturu. Nukleotidi, slično tome, mogu da se označavaju svojim generalno prihvaćenim kodovima sa jednim slovom.
[0053] "Konzervativno modifikovane varijante" odnosi se i na aminokiselinske sekvence i nukleinskih kiselina. Što se tiče konkretnih sekvenci nukleinskih kiselina, "konzervativno modifikovane varijante" se odnosi na one nukleinske kiseline koje kodiraju identične ili suštinski identične aminokiselinske sekvence, ili, ako nukleinska kiselina ne kodira sekvencu aminokiselina, na suštinski identične sekvence. Zbog izrođenosti genetskog koda, veliki broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina kodira bilo koji dati protein. Na primer, kodoni GCA, GCC, GCG i GCU svi kodiraju aminokiselinu alanin. Tako, na svakoj poziciji na kojoj je alanin određen nekim kodonom, taj kodon može da se izmeni u bilo koji od odgovarajućih opisanih kodona, a da se pritom ne promeni kodirani polipeptid. Takve varijacije nukleinske kiseline su "tihe varijacije", koje su jedna vrsta konzervativno modifikovanih varijacija. Svaka sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid takođe opisuje svaku moguću tihu varijaciju nukleinske kiseline. Prosečan stručnjak u oblasti će prepoznati da svaki kodon u nukleinskoj kiselini (osim AUG, koji je obično jedini kodon za metionin, i TGG, koji je obično jedini kodon za triptofan) može da bude modifikovan kako bi dao funkcionalno identičan molekul. Shodno tome, svaka tiha varijacija nukleinske kiseline koja kodira polipeptid je implicitna u svakoj opisanoj sekvenci.
[0054] Što se tiče aminokiselinskih sekvenci, prosečan stručnjak u oblasti će prepoznati da su pojedinačne supstitucije, delecije ili adicije nukleinskoj kiselini, peptidu, polipeptidu ili proteinskoj sekvenci koja menja, dodaje ili briše jednu aminokiselinu ili mali procenat aminokiselina u kodiranoj sekvenci je "konzervativno modifikovana varijanta" gde promena rezultira delecijom aminokiseline, adicijom aminokiseline ili supstitucijom aminokiseline hemijski sličnom aminokiselinom. Tabele konzervativnih supstitucija koje obezbeđuju funkcionalno slične aminokiseline poznate su prosečnim stručnjacima u oblasti. Takve konzervativno modifikovane varijante su pored i ne isključuju polimorfne varijante, međuvrsne homologe i alele pronalaska.
[0055] Tabele sa konzervativnim supstitucijama koje daju funkcionalno slične aminokiseline poznate su stručnjacima u oblasti. Svaka od sledećih osam grupa sadrži aminokiseline za koje može da se smatra da jedna predstavlja konzervativnu supstituciju druge:
Alanin (A), glicin (G);
Asparaginska kiselina (D), glutaminska kiselina (E);
Asparagin (N), glutamin (Q);
Arginin (R), lizin (K);
Izoleucin (I), leucin (L), metionin (M), valin (V);
Fenilalanin (F), tirozin (Y), triptofan (W); i
Serin (S), treonin (T);
(Videti, na primer, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993).
[0056] Termini "identični" ili procenat "identičnosti", u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptidnih sekvenci, odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste. Sekvence su "suštinski identične" ili "suštinski slične" ako imaju procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida koji su isti (tj. najmanje oko 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti u određenom regionu), kada se uporede i poravnaju za maksimalnu korespondenciju preko prozora poređenja, ili određen region mereno korišćenjem jednog od sledećih algoritama za poređenje sekvenci (ili drugih algoritama dostupnih stručnjacima u oblasti) ili ručnim poravnanjem i vizuelnim pregledom. Ova definicija se takođe odnosi na dopunu testne sekvence. Identitet može postojati u regionu koji je najmanje oko 50 aminokiselina ili nukleotida u dužini, ili preko regiona koji je 75-100 aminokiselina ili nukleotida u dužini, ili, gde nije navedeno, preko cele sekvence polinukleotida ili polipeptida. Polinukleotid koji kodira polipeptid polipeptidnih konstrukata koji vezuju antigen koji su ovde opisani, uključujući homologe iz vrsta koje nisu humane, može se dobiti procesom koji se sastoji od koraka skrininga biblioteke pod strogim uslovima hibridizacije sa obeleženom sondom koja ima polinukleotidnu sekvencu polipeptidnih konstrukata koji vezuju antigen koji su ovde opisani ili njihov fragment, i izoluje cDNK i genomske klonove pune dužine koji sadrže pomenutu polinukleotidnu sekvencu. Ove tehnike hibridizacije su dobro poznate stručnjaku u oblasti.
[0057] Primeri algoritma koji je pogodan za određivanje procenta identičnosti sekvence i sličnosti sekvence su algoritmi BLAST<™>i BLAST<™>2.0, koji su opisani u Altschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977) i Altschul et al. (J. Mol. Biol.215: 403-10, 1990), respektivno. Softver za izvođenje BLAST<™>analize je javno dostupan preko Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (vidi internet na www.ncbi.nlm.nih.gov). Kumulativni rezultati se izračunavaju korišćenjem, za nukleotidne sekvence, parametara M (nagrada rezultat za par odgovarajućih ostataka; uvek >0) i N (kazneni rezultat za neusklađene ostatke; uvek <0). Za aminokiselinske sekvence, matrica bodovanja se koristi za izračunavanje kumulativnog rezultata. Proširenje reči pogodaka u svakom pravcu je zaustavljeno kada: kumulativni rezultat poravnanja pada za količinu X od maksimalne postignute vrednosti; kumulativni rezultat ide na nulu ili ispod, zbog akumulacije jednog ili više negativnih bodovanja poravnanja ostataka; ili je dostignut kraj bilo koje sekvence. Parametri algoritma BLAST W, T i X određuju osetljivost i brzinu poravnanja. Primeri parametara algoritma za BLASTN program (za nukleotidne sekvence) su dužina reči (W) od 11, očekivanje (E) od 10, M = 5, N = -4 i poređenje oba lanca. Za aminokiselinske sekvence, primeri parametara algoritma za BLASTP program su dužina reči 3, očekivanje (E) od 10, i BLOSUM62 bodovanje matrica (vidi Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 89: 10915, 1989) .
[0058] Za derivat ili varijantu polipeptida se kaže da deli "homologiju" ili da je "homologa" sa peptidom ako aminokiselinske sekvence derivata ili varijante imaju najmanje 50% identičnosti u sekvenci koja iznosi 100 aminokiselina dužine originalnog peptida. U određenim primerima izvođenja, derivat ili varijanta su najmanje 75% isti kao i derivat ili varijanta peptida ili fragmenta peptida koji ima isti broj aminokiselinskih ostataka kao derivat. U određenim primerima izvođenja, derivat ili varijanta su najmanje 85% isti kao i derivat ili varijanta peptida ili fragmenta peptida koji ima isti broj aminokiselinskih ostataka kao derivat. U određenim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca derivata je najmanje 90% ista kao i peptid ili fragment peptida koji ima isti broj aminokiselinskih ostataka kao derivat. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca derivata je najmanje 95% ista kao i peptid ili fragment peptida koji ima isti broj aminokiselinskih ostataka kao derivat. U određenim primerima izvođenja, derivat ili varijanta su najmanje 99% isti kao i derivat ili varijanta peptida ili fragmenta peptida koji ima isti broj aminokiselinskih ostataka kao derivat.
[0059] Kako se ovde koristi, "izolovani" polipeptid ili konstrukt označava konstrukt ili polipeptid koji je identifikovan i odvojen i/ili izdvojen iz komponente svog prirodnog okruženja ćelijske kulture. Kontaminirajuće komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji obično ometaju dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu heteromultimera i mogu da uključuju enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance.
[0060] U određenim primerima izvođenja, kako se ovde koriste, "izolovani" antigenvezujući polipeptidni konstrukti opisuju antigen-vezujuće polipeptidne konstrukte koji su identifikovani i odvojeni i/ili izdvojeni iz komponente svog prirodnog okruženja ćelijske kulture. Na primer, izolovani bispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt opisan ovde sadrži heterodimerne parove ili "izolovane" heterodimerne parove koji čine heterodimerni ili heterodimerni par koji je identifikovan i odvojen i/ili oporavljen od komponente svog prirodnog okruženja ćelijske kulture. Kontaminirajuće komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji obično ometaju dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu heterodimera ili antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata i mogu da uključuju enzime, hormone i druge proteinske ili ne-proteinske rastvorene supstance.
[0061] Heterodimeri i antigen-vezujući polipeptidni konstrukti mogu se prečistiti do suštinske homogenosti. Fraze "suštinski homogena", "suštinski homogena forma" i "suštinska homogenost" se koriste da označe da je pravilno spareni proizvod u suštini lišen nusproizvoda koji potiču od neželjenih polipeptidnih kombinacija (npr. homodimera ili pogrešno sparenih heterodimera). U kontekstu LCCA dizajn seta (H1L1L2), korektno spareni proizvod je heterodimer koji sadrži H1 i L1 (H1L1). U kontekstu LCCA dizajn seta (H2L1L2), korektno spareni proizvod je heterodimer koji sadrži H2 i L2 (H2L2). U jednom primeru izvođenja, u kontekstu bispecifičnog antigenvezujućeg polipeptidnog konstrukta, gde su eksprimirani H1, L1, H2 i L2, korektno spareni proizvod je heterodimerni par koji sadrži korektno sparene H1L1 i H2L2 (H1L1H2L2). U nekim primerima izvođenja, u kontekstu bispecifičnog antigenvezujućeg polipeptidnog konstrukta, gde su eksprimirani H1, L1, H2 i L2, korektno spareni proizvod može da sadrži dodatne proizvode koji pokazuju korektno sparivanje u najmanje jednom Fab regionu, kao što je, na primer, H1L1H2L1 ili H1L2H2L2, ili gde se proizvode "polu-antitela", H1L1 ili H2L2. Izraženo u smislu čistoće, u jednom primeru izvođenja, suštinska homogenost znači da količina potpuno pogrešno sparenih nusproizvoda ne prelazi 20%, na primer, nalazi se ispod 10%, ispod 5%, ispod 1%, ili ispod 0,5% ukupnog LC-MS intenziteta svih vrsta prisutnih u smeši, pri čemu procenti odražavaju rezultate masene spektrometrijske analize.
[0062] Svaki termin koji razumeju stručnjaci u oblasti tehnologije antitela ima značenje stečeno u stanju tehnike , osim ako ovde nije izričito drugačije definisano. Poznato je da antitela imaju varijabilne regione, zglobni region i konstantne domene. Pregled strukture i funkcije imunoglobulina dat je, na primer, u publikaciji Harlow et al, Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988).
[0063] Kako se ovde koriste, termini "antitelo" i "imunoglobulin" ili "antigen-vezujući polipeptidni konstrukt" koriste se naizmenično. "Antigen-vezujući polipeptidni konstrukt" odnosi se na polipeptid koji je suštinski kodiran imunoglobulinskim genom ili imunoglobulinskim genima ili jednim ili više njihovih fragmenata, koji specifično vezuju analit (antigen). Poznati imunoglobulinski geni uključuju gene kapa, lambda, alfa, gama, delta, epsilon i mu konstantnih regiona, kao i bezbroj gena imunoglobulinskih varijabilnih regiona. Laki lanci su klasifikovani ili kao kapa ili kao lambda. Teški lanci su klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta ili epsilon, koji sa svoje strane definišu imunoglobulinske izotipove, IgG, IgM, IgA, IgD i IgE, redom. Dalje, antitelo može da pripada jednom od brojnih podtipova, na primer, IgG može da pripada IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 podklasama.
[0064] Tipična strukturna jedinica imunoglobulina (antitela) sastoji se od dva para polipeptidnih lanaca, od kojih svaki par ima jedan imunoglobulinski "laki" (oko 25 kD) i jedan imunoglobulinski "teški" lanac (oko 50-70 kD). Ova vrsta imunoglobulina ili strukturne jedinice antitela smatra se "prirodnom". Termin "laki lanac" obuhvata laki lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljnu sekvencu varijabilnog domena da obezbede specifičnost vezivanja. Laki lanac pune dužine uključuje varijabilni domen, VL i konstantni domen, CL. Varijabilni domen lakog lanca je na amino-terminusu polipeptida. Laki lanci uključuju kapa lance i lambda lance. Termin "teški lanac" obuhvata teški lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljnu sekvencu varijabilnog domena da obezbede specifičnost vezivanja. Teški lanac pune dužine uključuje varijabilni domen, VH i tri konstantna domena, CH1, CH2 i CH3. VH domen je na amino-terminusu polipeptida, a CH domeni su na karboksi-terminusu, pri čemu je CH3 najbliži karboksi-terminusu polipeptida. Teški lanci mogu da budu bilo kog izotipa, uključujući IgG (koji uključuje IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 podklase), IgA (koji uključuje IgA1 i IgA2 podklase), IgM, IgD i IgE. Termin "varijabilni region" ili "varijabilni domen" odnosi se na deo lakih i/ili teških lanaca antitela, koji je u principu odgovoran za prepoznavanje antigena, i obično uključuje približno 120 do 130 amino-terminalnih aminokiselina u teškom lancu (VH) i oko 100 do 110 amino-terminalnih aminokiselina u lakom lancu (VL).
[0065] "Region koji određuje komplementarnost" ili "CDR" je aminokiselinska sekvenca koja doprinosi specifičnosti i afinitetu vezanja antigena. "Okvirni" regioni (FR) mogu da pomognu u održavanju pravilne konformacije CDR regiona, kako bi se pospešilo vezivanje antigen-vezujućeg regiona i antigena. Strukturno, okvirni regioni mogu da se nalaze u antitelima između CDR regiona. Varijabilni regioni obično pokazuju istu opštu strukturu relativno konzervisanih okvirnih regiona (FR) koji su povezani preko tri hiper varijabilna regiona, CDR regiona. CDR regioni iz dva lanca svakog para obično su usklađeni okvirnim regionima, što može da omogući vezivanje za spevifični epitop. Od N-terminalnog do C-terminalnog, varijabilni regioni i lakih i teških lanaca obično sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu je obično u skladu sa definicijama iz Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), osim ako nije drugačije navedeno.
[0066] "Multispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt" ili "multispecifično antitelo" je ono antitelo koje cilja ili se vezuje za više od jednog različitog antigena ili epitopa. "Bispecifični", "dualno-specifični" ili "bifunkcionalni" antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ili antitelo je vrsta multispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta koji cilja ili se vezuje za dva različita antigena ili epitopa. U principu, bispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt može da ima dva različita antigen-vezujuća domena. Dva antigen-vezujuća domena bispecifičnog antigenvezujućeg polipeptidnog konstrukta ili antitela će se vezati za dva različita epitopa, koji mogu da se nalaze na istim ili različitim molekulskim ciljevima. U jednom primeru izvođenja, bispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt je u prirodnom formatu. Drugim rečima, bispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima isti format kao i prirodno IgG, IgA, IgM, IgD ili IgE antitelo.
[0067] Teški lanci antitela sparuju se sa lakim lancima antitela i međusobno se susreću ili dolaze u kontakt na jednoj ili više "dodirnih površina". "Dodirna površina" uključuje jedan ili više "kontaktnih" aminokiselinskih ostataka u prvom polipeptidu koji interaguju sa jednim ili više "kontaktnih" aminokiselinskih ostataka drugog polipeptida. Na primer, dodirna površina postoji između dva CH3 domena dimerizovanog Fc regiona, između CH1 domena teškog lanca i CL domena lakog lanca, i između VH domena teškog lanca i VL domena lakog lanca. "Dodirna površina" može da bude izvedena iz IgG antitela i na primer, iz humanog IgG1 antitela.
[0068] Termin "aminokiselinske modifikacije", kako se ovde koristi, uključuje, ali nije ograničen na, aminokiselinske insercije, delecije, supstitucije, hemijske modifikacije, fizičke modifikacije i rearanžmane.
[0069] Aminokiselinski ostaci za teške i lake lance imunoglobulina mogu se numerisati prema nekoliko konvencija, uključujući Kabat (kao što je opisano kod autora Kabat and Wu, 1991; Kabat et al, Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication no.91-3242, p 647 (1991)), IMGT (kao što je navedeno u Lefranc, M.-P., et al.. IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® Nucl. Acids Res, 37, D1006-D1012 (2009) , i Lefranc, M.-P., IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System, Cold Spring Harb Protoc.2011 Jun 1; 2011(6)), 1JPT (kao što je opisano u Katja Faelber, Daniel Kirchhofer, Leonard Presta, Robert F Kelley, Yves A Muller, The 1.85 Å resolution crystal structures of tissue factor in complex with humanized fab d3h44 and of free humanized fab d3h44: revisiting the solvation of antigen combining sites1, Journal of Molecular Biology, Volume 313, Issue 1, Pages 83-97,) i EU (prema indeksu EU, kao u Kabatu, koji se odnosi na numerisanje antitela u EU (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85)). Kabat numeracija se ovde koristi za VH, CH1, CL i VL domene, osim ako nije drugačije naznačeno. EU numeracija se ovde koristi za CH3 i CH2 domene i zglobni region, osim ako nije drugačije naznačeno. Tabela 22A obezbeđuje tabelu korespondencije koja prikazuje numeraciju aminokiselina za odabrane pozicije u IgG1 polipeptidu teškog lanca, koristeći IMGT, Kabat, 1JPT i EU sisteme numerisanja. Tabela 22B obezbeđuje tabelu korespondencije koja prikazuje numeraciju aminokiselina za odabrane pozicije u lambda polipeptidu lakog lanca, koristeći IMGT i Kabat sisteme numerisanja. Tabela 22C obezbeđuje tabelu korespondencije koja prikazuje numeraciju aminokiselina za odabrane pozicije u kapa polipeptidu lakog lanca, koristeći IMGT, 1JPT i Kabat sisteme numerisanja.
Antigen-vezujući polipeptidni konstrukti
[0070] Antigen-vezujući polipeptidni konstrukti (tj. antitela) koji su ovde opisani, mogu da budu multispecifični ili bispecifični. Multispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt može da sadrži najmanje prvi heterodimer (H1L1) koji ima prvu polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca (H1) i polipeptidnu sekvencu lambda imunoglobulinskog lakog lanca (L1), koji formiraju prvi Fab region i najmanje drugi heterodimer (H2L2) koji ima polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca (H2) i polipeptidnu sekvencu kapa imunoglobulinskog lakog lanca (L2), koji formiraju drugi Fab region, pri čemu su H1 i H2 međusobno različiti. U jednom primeru izvođenja, bispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi heterodimer (H1L1) koji ima prvu polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca (H1) i polipeptidnu sekvencu lambda imunoglobulinskog lakog lanca (L1), koji formiraju prvi Fab region i drugi heterodimer (H2L2) koji ima polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca (H2) i polipeptidnu sekvencu kapa imunoglobulinskog lakog lanca (L2), koji formiraju drugi Fab region, pri čemu su H1 i H2 međusobno različiti. U jednom primeru izvođenja, svaki heterodimer sadrži samo jedan Fab region. Termin "Fab region", kako se ovde koristi, odnosi se na region koji je rezultat sparivanja polipeptidne sekvence jednog imunoglobulinskog lakog lanca sa polipeptidnom sekvencom jednog imunoglobulinskog teškog lanca, i sačinjen je od VH i CH1 domena polipeptidne sekvence imunoglobulinskog teškog lanca, i VL i CL domena polipeptidne sekvence imunoglobulinskog lakog lanca . U nekim primerima izvođenja, prvi Fab region se vezuje za prvi antigen, a drugi Fab region se vezuje za drugi antigen. Prvi i drugi antigen mogu da budu isti ili različiti. Imunoglobulinski teški lanci i laki lanci mogu da sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje korektno sparenih teških i lakih lanaca kada su eksprimirani ili proizvedeni zajedno.
[0071] Kada je antigen-vezujući polipeptidni konstrukt bispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt (tj. bispecifično antitelo), može se nazvati i "heterodimernim parom".
[0072] Radi ilustracije, prvi heterodimer antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta naziva se H1L1 i sadrži prvu polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca (H1) uparenu sa polipeptidnom sekvencom imunoglobulinskog lakog lanca lambda (L1), a drugi heterodimer se naziva H2L2 i sadrži drugu polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca (H2) uparenu sa polipeptidnom sekvencom kapa imunoglobulinskog lakog lanca (L2). Treba razumeti, međutim, da je ova oznaka proizvoljna i da ima za cilj samo da precizira da jedan heterodimer sadrži laki lanac imunoglobulina kapa, a drugi sadrži laki lanac imunoglobulina lambda. Fab region prvog heterodimera, H1L1, takođe se može nazvati "lambda Fab"; dok je Fab region drugog heterodimera, H2L2, takođe može da se označava ovde kao "kapa Fab." Parentalna antitela
[0073] Polipeptidne sekvence imunoglobulinskog teškog lanca, koje su označene i kao "teški lanci" i polipeptidne sekvence imunoglobulinskog lakog lanca, koje su označene i kao "laki lanci", svakog heterodimera, mogu da se dobiju iz jednog ili više parentalnih antitela, gde najmanje jedno parentalno antitelo sadrži kapa laki lanac i najmanje jedno drugo parentalno antitelo sadrži lambda laki lanac, a aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje inženjeringom su ubačene u ove teške i lake lance. Parentalne sekvence imunoglobulinskog teškog lanca i imunoglobulinskog lakog lanca kojima nedostaju aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje, označene su kao polipeptidne sekvence imunoglobulinskog teškog lanca divljeg tipa, polipeptidne sekvence imunoglobulinskog kapa lakog lanca divljeg tipa i polipeptidne sekvence imunoglobulinskog lambda lakog lanca divljeg tipa. U jednom primeru izvođenja, teški i laki lanci heterodimera antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta dobijaju se iz dva parentalna antitela. U principu, dva parentalna antitela se razlikuju jedno od drugog; međutim, to nije nužno uvek slučaj. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt je bispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt, gde se svaki heterodimer dobija iz različitog parentalnog antitela. U drugom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt je bispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt, gde se oba parentalna antitela vezuju za isti antigen, ali ciljaju različite epitope na istom antigenu. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedno parentalno antitelo je monospecifično, tj. može da se veže samo za jedan epitop. U drugom primeru izvođenja, najmanje jedno parentalno antitelo može da se veže za više od jednog epitopa.
[0074] Teški lanac i laki lanac svakog heterodimera u antigen-vezujućem polipeptidnom konstruktu, sparuju se kako bi formirali Fab region koji se specifično vezuje za isti antigen kao i parentalno antitelo iz kog su dobijeni. Na primer, ako je pripremljen bispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt na osnovu parentalnih antitela CAT-2200 (koje sadrži lambda laki lanac i vezuju se za IL-17A) i D3H44 (koje sadrži kapa laki lanac i vezuju se za tkivni faktor), teški lanac i laki lanac jednog heterodimera bi se sparili tako da formiraju Fab region koji se vezuje za IL-17A, a teški i laki lanac drugog heterodimera bi se sparili tako da formiraju Fab region koji se vezuje za tkivni faktor.
[0075] Parentalna antitela mogu da se dobiju od vrsta koje uključuju, ali nisu ograničene na, ljude, miševe, pacove, zečeve, ovce, krave, koze ili kamile. U jednom primeru izvođenja, parentalna antitela mogu da se dobiju od ljudi ili miševa.
[0076] Parentalna antitela mogu da uključuju i antitela pripremljena od hibridoma koristeći standardne protokole za proizvodnju monoklonskih antitela, kao što su oni koje su opisali Kohler i Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).
[0077] Antitela koja se vezuju za konkretan ciljni element takođe se mogu identifikovati brojnim različitim strategijama, uključujući prikaz na fagima, in vitro prikaz i druge postupke. Ove strategije rezultiraju antitelima koja su u scFv formatu, Fab formatu ili IgG formatu pune dužine. Pregled ovih strategija nalaze se u poglavlju 4 publikacije Therapeutic Antibody Engineering, Villiam R. Strohl i Lila M. Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1907568 37 9, Oct 2012. U jednom primeru izvođenja, parentalna antitela uključuju antitela identifikovana prikazom na fagima ili in vitro prikazom. Antitela identifikovana u formatima koji nisu formati Fab ili IgG pune dužine mogu u njih da se konvertuju kao što je poznato u stanju tehnike. Postupci konvertovanja scFvs u Fab regione su dobro poznati u stanju tehnike (vidi na primer, Steinwand et al. Mabs 6: 204-218, ili Zuberbuhler et al. Protein Engineering, Design & Selection 22:169-174). U jednom primeru izvođenja, antitela inicijalno identifikovana kao scFvs, ali gde je scFv konvertovan u Fab format i inženjeringom preveden u oblik konvencionalnog ili prirodnog antitela, takođe mogu da se koriste kao parentalna antitela.
[0078] U jednom primeru izvođenja, teški lanci i laki lanci svakog heterodimera antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta mogu da se dobiju iz parentalnog antitela koje je humanizovano antitelo. Humanizovana antitela mogu da se dobiju zamenom regiona koji određuje komplementarnost (CDR), humanog antitela, sa CDR antitela dobijenog od ne-humanog sisara, na primer, miša. Postupci za identifikaciju CDR regiona poznati su u stanju tehnike (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342:877). Opšte tehnike genetičke rekombinacije pogodne za ovu svrhu su takođe poznate (videti objavu evropske patentne prijave br. EP 125023; i WO 96/02576). Na primer, CDR mišjeg antitela može da se odredi poznatim metodama i DNK može da se pripremi tako da kodira antitelo u kojem je CDR ligiran sa okvirnom regionom (FR) humanog antitela. Humanizovano antitelo može zatim da se proizvede pomoću sistema koji koristi konvencionalne ekspresione vektore. Takve DNK mogu da se sintetišu PCR tehnikom, gde se kao prajmeri koriste nekoliko oligonukleotida dizajniranih tako da obuhvate delove koji se preklapaju sa krajevima CDR i FR regiona (vidi postupak opisan u WO 98/13388). FR regioni humanih antitela FR povezani preko CDR regiona, odabrani su tako da CDR regioni formiraju pogodno antigenvezujuće mesto. Ako je potrebno, aminokiseline u FR regionima varijabilnog regiona antitela mogu da se modifikuju tako da CDR regioni preoblikovanog humanog antitela mogu da formiraju pogodan antigen-vezujući domen (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53:851-856). Aminokiselinski ostaci u FR regionima, koji mogu da se modifikuju, uključuju delove koji se direktno vezuju za antigen preko nekovalentnih veza (Amit et al., Science (1986) 233: 747-53), delove koji imaju neki uticaj ili efekat na strukturu CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17) i delove koji su uključeni u interakciju između VH i VL (EP 239400).
[0079] U jednom primeru izvođenja, teški lanci i laki lanci svakog heterodimera antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta mogu da se dobiju iz parentalnog antitela koje je himerno antitelo. Himerna antitela su antitela pripremljena kombinovanjem sekvenci dobijenih za različite životinje. Na primer, himerno antitelo može da se proizvede kombinovanjem varijabilnih domena teškog lanca i lakog lanca iz antitela miša sa konstantnim domenima teškog lanca i lakog lanca iz humanog antitela. Himernna antitela mogu da se pripremaju poznatim postupcima. Da bi se dobila takva himerna antitela, na primer, DNK koja kodira varijabilni domen antitela može da se ligira sa nukleinskom kiselinom koja kodira konstantni domen humanog antitela; dobijeni proizvod ligacije može da se inserira u ekspresioni vektor; i konstrukt može da se uvede u ćeliju-domaćina kako bi bilo proizvedeno himerno antitelo.
[0080] Teški i laki lanci heterodimera mogu da se dobiju iz brojnih parentalnih antitela poznatih u stanju tehnike. Većina antitela može da posluži kao parentalno antitelo, pod uslovom da sadrže polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca koja se sparuje sa polipeptidnom sekvencom imunoglobulinskog lakog lanca, kako bi se formirao Fab region koji se vezuje za antigen. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedno parentalno antitelo je terapeutsko antitelo, tj antitelo koje se koristi za lečenje bolesti. Neograničavajući primeri pogodnih terapeutskih antitela koja sadrže kapa laki lanac i antigena za koje se ona vezuju identifikovani su u tabeli A u nastavku teksta:
Tabela A: Primeri terapeutskih antitela koja sadrže kapa laki lanac
[0081] Neograničavajući primeri pogodnih terapeutskih antitela koja sadrže lambda laki lanac i antigena za koje se ona vezuju, identifikovani su u tabeli B u nastavku teksta:
Tabela B: Primeri terapeutskih antitela koja sadrže lambda laki lanac
Subklase imunoglobulina
[0082] Imunoglobulinski teški lanci parentalnih antitela spadaju u sledeće klase: IgA1, IgA2, IgM, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U jednom primeru izvođenja, prvi i drugi heterodimer antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta sadrže IgG teški lanac. U jednom primeru izvođenja, prvi i drugi heterodimer antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta sadrže IgG1 teški lanac. Imunoglobulinski laki lanci parentalnih antitela su ili kapa laki lanci ili lambda laki lanci.
[0083] Ovde opisani antigen-vezujući polipeptidni konstrukti sadrže najmanje jedan heterodimer koji ima polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca i polipeptidnu sekvencu kapa imunoglobulinskog lakog lanca , i najmanje još jedan heterodimer koji ima polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca i polipeptidnu sekvencu lambda imunoglobulinskog lakog lanca . U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži jedan heterodimer koji ima polipeptidnu sekvencu IgG teškog lanca i polipeptidnu sekvencu kapa imunoglobulinskog lakog lanca i drugi heterodimer koji ima polipeptidnu sekvencu IgG teškog lanca i polipeptidnu sekvencu lambda imunoglobulinskog lakog lanca .
[0084] U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer koji ima teški lanac sa VH domenom izabranim iz grupa VH domena klicine linije IGHV1, IGHV2, IGHV3, IGHV4, IGHV5, IGHV6 ili IGHV7. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer koji ima teški lanac sa VH domenom iz podgrupe klicine linije IGHV3. U drugom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer koji ima teški lanac sa J segmentom izabranim od gena klicine linije za J segment IGHJ1, IGHJ2, IGHJ3, IGHJ4, IGHJ5 ili IGHJ6. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer koji ima teški lanac sa J segmentom iz podgrupe klicine linije IGHJ4. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer koji ima teški lanac sa CH1 domenom izabranim od CH1 domena podgrupa klicine linije IGHG1, IGHG2, IGHG3 ili IGHG4. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer koji ima teški lanac sa CH1 domenom iz podgrupe klicine linije IGHG1.
[0085] Za heterodimere koji sadrže polipeptidnu sekvencu lambda lakog lanca, lambda laki lanci mogu da sadrže CL-lambda domen izabran od gena klicine linije IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 ili IGLC7. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer koji ima lambda laki lanac koji sadrži CL-lambda domen iz podgrupe klicine linije IGLC2. Lambda laki lanci mogu sadržavati VL-lambda domen izabran iz podgrupa klicine linije IGLV1, IGLV2, IGLV3, IGLV4, IGLV5, IGLV6, IGLV7, IGLV8, IGLV9, IGLV10 ili IGLV11. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer sa lambda lakim lancem koji ima VL-lambda domen iz podgrupe klicine linije IGLV6. U drugom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer koji ima lambda laki lanac sa lambda J segmentom izabranim od gena klicine linije za J segment IGLJ1, IGLJ2, IGLJ3, IGLJ6 ili IGLJ7. U još jednom primeru izvođenja, antigenvezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer koji ima teški lanac sa lambda J segmentom iz podgrupe klicine linije .
[0086] Za heterodimere koji sadrže polipeptidnu sekvencu kapa lakog lanca, kapa laki lanci mogu da sadrže CL-kapa domen izabran od CL alela klicine linije IGKC*01, IGKC*02, IGKC*03, IGKC*04 ili IGKC*05. U jednom primeru izvođenja, antigenvezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer koji ima kapa laki lanac koji sadrži CL-kapa domen iz podgrupe klicine linije IGKC*01. Kapa laki lanci mogu da sadrže VL-kapa domen izabran iz podgrupa klicine linije IGKV1, IGKV1D, IGKV2, IGKV3, IGKV4, IGKV5 ili IGKV6. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer sa kapa lakim lancem koji ima VL-kapa domen iz podgrupe klicine linije IGKV1. U drugom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer koji ima kapa laki lanac sa J segmentom izabranim od gena klicine linije za J segment IGKJ1, IGKJ2, IGKJ3, IGKJ4 ili IGKJ5. U još jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži heterodimer koji ima kapa laki lanac sa J segmentom iz podgrupe klicine linije IGKJ1 ili IGKJ2.
[0087] Teški lanci imunoglobulina obično sadrže najmanje jedan varijabli (VH) domen i tri konstantna domena, CH1, CH2 i CH3. U jednom primeru izvođenja, svaki teški lanac prvog heterodimera i drugog heterodimera antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta, sadrži VH domen, CH1 domen, CH2 domen i CH3 domen. U drugom primeru izvođenja, svaki teški lanac prvog heterodimera i drugog heterodimera sadrži VH domen, CH 1 domen i CH3 domen. U drugom primeru izvođenja, svaki teški lanac prvog heterodimera i drugog heterodimera sadrži VH domen i CH1 domen. Imunoglobulinski laki lanci obično sadrže jedan varijabilni (VL) domen i jedan konstantan (CL) domen. U jednom primeru izvođenja, laki lanac svakog heterodimera sadrži VL domen i CL domen.
[0088] Kao što je navedeno prethodno u tekstu, u nekim primerima izvođenja, polipeptidna sekvenca imunoglobulinskog teškog lanca i polipeptidna sekvenca imunoglobulinskog lakog lanca svakog heterodimera mogu da se dobiju iz poznatog terapeutskog antitela ili iz antitela koje vezuje različite ciljne molekule ili kancer antigene. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence brojnih takvih molekula su lako dostupne (videti, na primer, GenBank pristupni br: AJ308087.1 (varijabilni region lakog lanca i CL domen humanizovanog anti-humanog antitela tkivnog faktora D3H44); GenBank pristupni br: AJ308086.1 (varijabilni region teškog lanca i CH1 domen humanizovanog anti-humanog antitela tkivnog faktora D3H44); GenBank pristupni br: HC359025.1 (genski modul lakog lanca za pertuzumab Fab); GenBank pristupni br: HC359024.1 (genski modul teškog lanca za pertuzumab Fab); GenBank pristupni br: GM685465.1 (antitelo trastuzumab (= herceptin) - divlji tip; laki lanac); GenBank pristupni br: GM685463.1 (antitelo trastuzumab (= herceptin) - divlji tip; teški lanac); GenBank pristupni br: GM685466.1 (antitelo trastuzumab (= herceptin) - GC-optimizovan laki lanac); i GenBank pristupni br: GM685464.1 (antitelo trastuzumab (= herceptin) - GC-optimizovan teški lanac. Sekvence svakog od polipeptida opisanih prethodno u tekstu, dostupne su na sajtu NCBI od 28. novembra 2012. godine. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence za cetuksimab su takođe poznate u stanju tehnike, videti na primer veb stranicu Drug Bank koju podržavaju Kanadski instituti za zdravstvena istraživanja, Alberta Innovates - Health Solutions i Centar za inovacije u metabolomici (TMIC), pristupni br. DB00002.
Aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje [0089] Teški i laki lanci H1, L1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje teških i lakih lanaca, koji su formirani inženjeringom u teškim i lakim lancima parentalnih antitela. U jednom aspektu koji je ovde opisan, dva od teških i lakih lanaca H1, L1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje teških i lakih lanaca. U jednom aspektu koji je ovde opisan, tri od teških i lakih lanaca H1, L1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje između teških i lakih lanaca.
[0090] U nekim primerima izvođenja, aminokiselinske modifikacije mogu da budu asimetrične, u tom smislu što se aminokiselinske pozicije koje su modifikovane razlikuju u H1 i H2, i u L1 i L2.
[0091] U jednom aspektu koji je ovde opisan, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje teških i lakih lanaca, dok ih H1 i L1 ne sadrže. U jednom aspektu koji je ovde opisan, H1, L1 i H2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje teških i lakih lanaca, dok ih L2 ne sadrži. U jednom aspektu koji je ovde opisan, H1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje teških i lakih lanaca, dok ih L1 ne sadrži U jednom aspektu koji je ovde opisan, L1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje teških i lakih lanaca, dok ih H1 ne sadrži.
[0092] U jednom primeru izvođenja, jedna ili više aminokiselinskih modifikacija sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija. Aminokiselinske modifikacije pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 i H2 sa L2 kada su H1 ili H2 koeksprimirani sa L1 i L2, ili kada su H1, L1, H2 i L2 koeksprimirani. Kao što je gore navedeno, radi ilustracije, heterodimeri antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta će biti identifikovani na sledeći način: H1L1 heterodimer sadrži lambda laki lanac L1, a H2L2 heterodimer sadrži kapa laki lanac L2.
[0093] "Mab dizajn" ili "Mab dizajn set", kako se ovde koristi, odnosi se na specifičan set aminokiselinskih modifikacija koje pospešuju preferencijalno sparivanje, a koje su prisutne u jednom setu H1, L1, H2 i L2, a takođe se identifikuje i kao H1L1H2L2. Aminokiselinske modifikacije u jednom ili više od H1, L1, H2 i L2, koje pospešuju preferencijalno sparivanje, označavaju se i prezentuju kao Mab dizajn ili Mab dizajn setovi (tj. H1L1H2L2). Mab dizajn setovi su inicijalno testirani kao LCCA dizajn setovi (tj. H1L1L2 ili H2L1L2), kako bi se utvrdila snaga specifičnosti sparivanja, gde su H1 i H2 pojedinačno koeksprimirani sa L1 i L2.
[0094] U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije mogu da budu napravljene na jednoj ili više aminokiselina koje su deo dodirne površine između lakog lanca i teškog lanca. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije uvedene u polipeptidne sekvence imunoglobulinskog teškog lanca i polipeptidne sekvence imunoglobulinskog lakog lanca su međusobno komplementarne. Komplementarnost na dodirnoj površini teškog i lakog lanca može da se postigne na osnovu sternih i hidrofobnih kontakata, elektrostatičkih interakcija/interakcija naelektrisanja ili kombinacije ovih i različitih drugih interakcija. Komplementarnost između proteinskih površina je široko opisana u literaturi, kao uklapanje brave i ključa, dugmeta i rupe, izbočenja i šupljine, donora i akceptora itd, što sve implicira prirodu strukturnog i hemijskog uklapanja dve interagujuće površine. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan od heterodimera sadrži aminokiselinsku modifikaciju uvedenu u imunoglobulinske teške i imunoglobulinske lake lance koja uvode novu vodoničnu vezu između lakog i teškog lanca na dodirnoj površini. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedan od heterodimera sadrži modifikaciju aminokiselina uvedenu u imunoglobulinskim teškim i imunoglobulinskim lakim lancima koji uvode novu vodoničnu vezu preko lakog i teškog lanca na dodirnoj površini.
[0095] U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije Mab dizajna seta pospešuju preferencijalno sparivanje pretežno putem elektrostatičkog privlačenja i odbijanja. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije u Mab dizajnu seta pospešuju preferencijalno sparivanje putem pretežno sternih mehanizama. Takvi Mab primeri i referentni dizajni su uključeni u tabelama 4A, 4B, 7A i 7B, pri čemu odabrani primeri uključuju primere koji imaju jedinstvene identifikatore 10771-11335, 10771-11360, 10780-11417. U jednom aspektu, aminokiselinske modifikacije u Mab dizajn setu pospešuju preferencijalno sparivanje koristeći i sterne i elektrostatičke mehanizme.
[0096] U jednom aspektu koji je ovde opisan, jedan ili više od H1, L1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije pri čemu H1 i L1 ne uključuju aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje, a i H2 i L2 sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju koja pospešuje preferencijalno sparivanje. U jednom aspektu koji je ovde opisan, jedan ili više od H1, L1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije pri čemu jedan ili više od H1, L1 i L2 sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju koja pospešuje preferencijalno sparivanje i L2 ne uključuje aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje. U jednom aspektu koji je ovde opisan, jedan ili više od H1, L1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije pri čemu jedan ili više od H1, L1 i L2 sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju koja pospešuje preferencijalno sparivanje i H2 ne uključuje aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje. U jednom aspektu koji je ovde opisan, jedan ili više od H1, L1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije pri čemu jedan il više od H1, H2 i L2 sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju koja pospešuje preferencijalno sparivanje i L1 ne uključuje aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje. U jednom aspektu koji je ovde opisan, jedan ili više od H1, L1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije pri čemu jedan il više od L1, H2 i L2 sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju koja pospešuje preferencijalno sparivanje i H1 ne uključuje aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje. U jednom aspektu koji je ovde opisan, jedan ili više od H1, L1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije pri čemu svaki od L1, H2 i L2 sadrži najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju koja pospešuje preferencijalno sparivanje.
[0097] Aminokiselinske modifikacije mogu da budu u konstantnim domenima i/ili varijabilnim domenima jednog ili više od H1, L1, H2 i L2. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije mogu da budu u CH1 domenima H1 i H2, CL-lambda domenu L1 i CL-kapa domenu L2. U drugom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije mogu da budu u CH1 i VH domenima H1 i H2, CL-lambda i VL-lambda domenima L1 i CL-kapa i VL-kapa domenima L2. U sledećem primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije mogu da budu u VH domenima H1 i H2, VL-lambda domenu L1 i VL-kapa domenu L2.
[0098] U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije mogu da budu u okvirnim regionima jednog ili više od H1, L1, H2 i L2. U jednom primeru izvođenja aminokiselinske modifikacije su ograničene na konzervativne okvirne ostatke varijabilnih (VH, VL) i konstantnih (CH1, CL) domena kao što je naznačeno numeracijom ostataka po Kabatu. Na primer, Almagro [Frontiers In Bioscience (2008) 13: 1619-1633] daje definiciju okvirnih ostataka na osnovu Kabat, Chotia i IMGT šema za numeraciju.
[0099] Broj aminokiselinskih modifikacija u svakom Mab dizajnu ili Mab dizajn setu može da varira. U jednom aspektu, H1 sadrži 0 do 8 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 7 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 6 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 5 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 4 aminokiselinske modifikacije, 0 do 3 aminokiselinske modifikacije, 0 do 2 aminokiselinske modifikacije, jednu aminokiselinsku modifikaciju ili nijednu aminokiselinsku modifikaciju. U jednom aspektu, L1 sadrži 0 do 8 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 7 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 6 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 5 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 4 aminokiselinske modifikacije, 0 do 3 aminokiselinske modifikacije, 0 do 2 aminokiselinske modifikacije, jednu aminokiselinsku modifikaciju ili nijednu aminokiselinsku modifikaciju. U jednom aspektu, H2 sadrži 0 do 8 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 7 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 6 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 5 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 4 aminokiselinske modifikacije, 0 do 3 aminokiselinske modifikacije, 0 do 2 aminokiselinske modifikacije, jednu aminokiselinsku modifikaciju ili nijednu aminokiselinsku modifikaciju. U jednom aspektu, L2 sadrži 0 do 8 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 7 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 6 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 5 aminokiselinskih modifikacija, 0 do 4 aminokiselinske modifikacije, 0 do 3 aminokiselinske modifikacije, 0 do 2 aminokiselinske modifikacije, jednu aminokiselinsku modifikaciju ili nijednu aminokiselinsku modifikaciju.
[0100] U jednom primeru izvođenja, ukupan broj aminokiselinskih modifikacija u H1, L1, H2 i L2 je manji od 20, manji od 15, manji od 12, manji od 11, manji od 10, manji od 9, . U jednom aspektu, ukupan broj aminokiselinskih modifikacija u H1, L1, H2 i L2 je 2.
[0101] U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije mogu da budu specifično dizajnirane za kapa-lambda sistem, gde jedno parentalno antitelo sadrži polipeptidnu sekvencu kapa lakog lanca, a jedno parentalno antitelo sadrži polipeptidnu sekvencu lambda lakog lanca. Ove aminokiselinske modifikacije ili dizajni se u ovom tekstu označavaju kao K-L dizajni. Tipični primeri i referentni primeri ovih aminokiselinskih modifikacija ili K-L dizajna su prikazani u tabeli 4A, tabeli 7A i tabelama 10-A1 do 10-A12.
[0102] U drugom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije mogu inicijalno da se identifikuju u odnosu na kapa-kapa sistem (K-K dizajni), gde oba parentalna antitela sadrže polipeptidnu sekvencu kapa lakog lanca, a zatim da se prenesu u kapa-lambda sistem. Stručnjak u oblasti bi razumeo kako ovi dizajni mogu da se prenesu u kapalambda sistem. Na primer, teški i laki lanci kapa i lambda parentalnih antitela mogu da se poravnaju kako bi se odredile ekvivalentne pozicije lambda lakog lanca koje odgovaraju K-K dizajnima. Ekvivalentne pozicije lambda lakog lanca mogu zatim da se modifikuju tako da se prilagode K-K dizajnu. Takve aminokiselinske modifikacije ili dizajni se ovde nazivaju K-K-izvedenim K-L dizajnom, i mogu pasti u sledeće grupe: a) one u kojima nisu potrebne promene u dizajnu, a aminokiselinski ostaci modifikovani u kapa-kapa sistemu su identični onima modifikovanim u kapa-lambda sistemu; b) one koje sadrže tihe modifikacije, gde je najmanje jedna modifikacija napravljena u kapa-kapa sistemu nepotrebna u kapa-lambda sistemu, jer modifikacija prirodno postoji u polipeptidnoj sekvenci lambda lakog lanca; c) one koje sadrže aminokiselinske modifikacije na najmanje jedan aminokiselinski ostatak na istom relativnom položaju u polipeptidnoj sekvenci lakog lanca kapa i polipeptidnoj sekvenci lambda lakog lanca, ali gde se početni aminokiselinski ostatak na tim pozicijama razlikuje između polipeptidnih sekvenci lakog lanca kapa i lambda, što rezultira istom modifikacijom aminokiselina na poziciji, i d) one koje sadrže najmanje jednu dodatnu modifikaciju aminokiselina u kapa-lambda sistemu u poređenju sa kapa-kapa sistemom. Tipični primeri i referentni primeri ovih K-K-izvedenih K-L dizajna su dati u tabeli 4B, tabeli 7B i tabelama 10-B 1 do 10-B 10. Konkretni primeri grupe a) su označeni zvezdicom u tabeli 4B. Konkretan primer grupe b) je prikazan Mab dizajn setom sa jedinstvenim identifikatorom 10689-10707. Tiha modifikacija je u L1 (Q160E je odsutan u WT u lambda, pošto je ostatak na poziciji 160 E, a ne Q). Specifičan primer grupe c) je demonstriran Mab dizajn setom sa jedinstvenim identifikatorom 10652-10734 gde je u L1, aminokiselinski ostatak 124 E u WT lambda i Q u WT kapa. Specifičan primer grupe d) je prikazan Mab dizajn setom sa jedinstvenim identifikatorom 10684-10706, koji uključuje aminokiselinsku modifikaciju K129T.
[0103] U jednom aspektu koji je ovde opisan, jedan ili više H1, L1, H2 i L2 sadrži aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2 i H2 sa L2 u poređenju sa L1, gde aminokiselinske modifikacije obuhvataju konzervativne aminokiselinske supstitucije Mab dizajn setova obezbeđenih u tabeli 4A, tabeli 4B, tabeli 7A, tabeli 7B, tabelama 10-A1 do 10-A 12, i tabelama 10-B 1 do 10-B 10.
[0104] U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije ne uvode novi cisteinski ostatak i ne uklanjaju prirodni cisteinski ostatak u imunoglobulinskim teškim lancima ili imunoglobulinskim lakim lancima u istom dizajnu.
[0105] Kombinacija aminokiselinskih modifikacija u H1, L1, H2 i L2 koje pospešuju preferencijalno sparivanje su uopšteno označeni kao dizajni. Dizajni mogu da budu specifičnije označeni kao "LCCA dizajni" (u kontekstu H1, L1, L2 ili H2, L1, L2) ili "Mab dizajni" (u kontekstu H1, L1, H2, L2). Tipično, LCCA dizajni su inženjeringom ostvareni sa jednim ili više specifičnih komplementarnih LCCA dizajna zasnovanih na svakom teškom lancu željenog bispecifičnog antitela i shodno tome su obično predstavljeni u formatu u kom su identifikovane aminokiselinske modifikacije u sva četiri polipeptidna lanca bispecifičnog antitela (videti na primer, tabele 4A i 4B). Iako u celom ovom tekstu mogu da budu identifikovane specifične aminokiselinske supstitucije, treba podrazumevati da konzervativna supstitucija može da bude razmatrana na svakoj aminokiselinskoj poziciji. Štaviše, radi ilustracije, H1L1 heterodimer predstavlja heterodimer koji sadrži lambda laki lanac, a H2L2 heterodimer predstavlja heterodimer koji sadrži kapa laki lanac, osim ako nije drugačije naznačeno. Na kraju, svi ostaci ili pozicije aminokiselina su numerisani prema Kabat sistemu numerisanja, osim ako nije drugačije naznačeno.
[0106] Dizajni sadrže drajver setove sa komplementarnin aminokiselinskin supstitucijama koje pospešuju preferencijalno sparivanje, a mogu da sadrže i sekundarne supstitucije. Sekundarne supstitucije mogu da deluju tako da se optimizuju performanse drajver setova.
[0107] Jedan ili više drajver setova mogu da se koriste za pospešivanje preferencijalnog sparivanja. Ovi drajver setovi mogu da se koriste za pospešivanje preferencijalnog sparivanja pojedinačno ili u kombinaciji. U jednom aspektu koji je ovde opisan, drajver set je elektrostatički drajver set u kojem se očekuje da elektrostatičko privlačenje i odbijanje budu dominantni faktori koji pospešuju preferencijalno sparivanje. Na primer, dizajn u kome H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju 186K, L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju 133D, H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju 188D i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju 131K, može da pospešuje preferencijalno sparivanje elektrostatičkim mehanizmom. Brojni drugi primeri elektrostatičkih drajvera mogu da se nađu na različitim mestima u odeljku sa primerima. Kao što je ovde opisano, jedan ili više setova elektrostatičkih drajvera može da bude izabran od setova koji su identifikovani u tabeli C:
Tabela C: Primeri elektrostatičkih drajver setova
[0108] U jednom aspektu, drajver set je drajver set koji upravlja disulfidima, koji može da deluje tako da ometa formiranje disulfidne veze u pogrešno sparenim heterodimerima. Primer ove vrste drajver seta bi uključivao 125R u H1, 122D u L1, 228D u H2 i 121K u L2.
[0109] U jednom aspektu drajver set može da bude sterni drajver set, koji može da deluje tako što pospešuje sterno komplementarne interakcije između pravilno sparenih heterodimera i sternu nekompatibilnosti između pogrešno uparenih heterodimera. Neograničavajući primeri sternih drajver setova su prikazani u tabeli D, gde "-" znači da nisu prisutne aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje.
Tabela D: Primeri sternih drajver setova
[0110] U jednom aspektu, drajver set je drajver set varijabilnog dizajna. Ovi drajver setovi varijabilnog dizajna sadrže jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u varijabilnim domenima kapa i/ili lambda Fab regiona koje pospešuju preferencijalno sparivanje. U jednom aspektu, drajver set varijabilnog dizajna pospešuje preferencijalno sparivanje zasnovano na sternim mehanizmima. U jednom aspektu, drajver set varijabilnog dizajna pospešuje preferencijalno sparivanje zasnovano na elektrostatičkim mehanizmima. Neograničavajući primeri drajver setova varijabilnog dizajna su prikazani u tabeli E, gde "-" znači da u tom polipeptidu nisu prisutne aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje.
Tabela E: Primeri drajver setova sa varijabilnim domenima
[0111] U jednom aspektu, jedna ili više ne-prirodnih disulfidnih veza mogu da se uvedu inženjeringom u jedan ili oba heterodimera antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta. Primer ovog tipa aminokiselinske modifikacije je onaj kod koga teški lanac sadrži supstituciju 122C, uparenu sa supstitucijom 124C u kapa lakom lancu.
[0112] Sekundarne supstitucije mogu da budu uključene u dizajn kako bi se optimizovale performanse sparivanja tog dizajna. Na primer, sekundarne supstitucije mogu da deluju tako da A) optimizuju broja kontakata između teškog i pravilno sparenog lakog lanca, B) obezbeđuju provodljivo okruženje za drajvere, C) optimizuju mrežu vodoničnih veza za drajver setove, ili D) obezbeđuju sterno smeštanje za drajvere. Ne-ograničavajući primeri ovih tipova sekundarnih supstitucija su prikazani u tabeli F, gde "Lk" označava specifičnu supstituciju u kapa lakom lancu, "Ll" označava specifičnu supstituciju u lambda lakom lancu. "L" označava specifičnu supstituciju bilo u kapa, bilo lambda lakom lancu, a "H" označava specifičnu supstituciju u teškom lancu.
Tabela F: Primeri sekundarnih supstitucija
[0113] Antigen-vezujući polipeptidni konstrukti mogu da budu izmenjeni inženjeringom sa različitim kombinacijama aminokiselinskih modifikacija koje odgovaraju drajver setovima i sekundarnim supstitucijama opisanim prethodno u tekstu. U nastavku teksta su opisani neograničavajući specifični primeri takvih kombinacija grupisanih u klastere na osnovu zajedničkih karakteristika. Kao što je ovde opisano, kombinacije aminokiselinskih modifikacija na više pozicija unutar jednog lanca identifikovane su pomoću "_" između svake modifikovane pozicije. Na primer, "124_186" znači da su obe pozicije, i 124 i 186, modifikovane u polipeptidnom lancu o kome je reč. Isto tako, "124_133_180" znači da su sve pozicije, 124, 133 i 180, modifikovane u polipeptidnom lancu o kome je reč.
K-L klaster 1:
[0114] Kao što je ovde opisano, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 1 pri čemu:
H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131; i
a) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 188 ili 124_186 i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176_178 ili 176_180 ili 131; ili b) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143 ili 186; i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_133 ili 124_133_180.
[0115] U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje obuhvata aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više pozicija 125, 145 i 179, L1 dalje obuhvata aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više pozicija 122, 124 i 133, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 228, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 121.
[0116] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 1, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 125_143_145; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 122_124_131; i H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 228, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 121_133. U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 179, L1 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 133, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 124,143,186 i 188, i L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 124, 131, 176, 178 i 180.
[0117] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 1, pri čemu H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 125_143_145, ili 125_143_145_179; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 122_124_131 ili 122_124_131_133; H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_186_228, 143_228, 143_186_228, 186_228 ili 188_228, i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 121_124_133, 121_124_133_180, 121_131_133_178, 121_133_176_178 ili 121_133_176_180.
[0118] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 1, pri čemu su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane od 125R, 145T, 143D, 143E, 179E i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane od 124Q, 122D, 131K, 131R, 133S i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane od 228D, 124R, 143I, 143R, 186K, 186R, 188K i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 124E, 121K, 131D, 176D, 178E, 178F, 180D, 180E, 133D, 1330, 133I i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0119] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 1, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0120] U jednom aspektu koji je ovde opisan, H1 sadrži 125R_143E_145T_179E i L1 sadrži 122D_124Q_131R. U drugom aspektu koji je ovde opisan, H1 sadrži 125R_143E_145T i L1 sadrži 122D_124Q_131R. U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 1, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0121] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, H1 sadrži 125R_143E_145T_179E, L1 sadrži 122D_124Q_131R, H2 sadrži 188K_228D, a L2 sadrži 121K_133I_176D_178E. U drugom aspektu koji je ovde opisan, H1 sadrži 125R_143D_145T, L1 sadrži 122D_124Q_131R, H2 sadrži 143R_228D, a L2 sadrži 121K_124E_133D.
[0122] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 1, koji sadrži drajver set za upravljanje disulfidima.
[0123] U jednom aspektu koji je ovde opisan, aminokiselinske kombinacije K-L klastera 1 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija odabranih iz tabele F.
[0124] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 1, kao što je izloženo u jednom ili više dizajna u tabeli 10-A1.
K-L klaster 2:
[0125] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 2 pri čemu:
H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131; i
c) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 186, ili 124_186, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 133, ili 133_160, ili 124_133, ili 176_180; ili
d) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188 i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131;
e) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_133 ili 124_133_180.
[0126] U nekim aspektima koji su opisani ovde, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 139, 145, 174 i 179, L1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 116, 124, 133 i 176, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 190, 39 i 45, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 135, 178, 38 i 44.
[0127] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 2, pri čemu H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143_145; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131; i H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 143 ili 186 ili 188, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 133. U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 139, 174 i 179, L1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 116, 124, 133 i 176, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 124, 190, 39 i 45 i L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 124, 131, 135, 160, 176, 178, 180, 38, 44.
[0128] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 2 pri čemu H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 139_143_145, 143_145, 143_145_174 ili 143_145_179; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 116_124_131_176, 124_131, 124_131_133, 124_131_133_176, 131 ili 131_133; H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_186_190, 143, 143_186, 143_186_190, 143_190, 186, 186_190, 188, 39_143 ili 45_143, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_133, 124_133_135, 124_133_135_180, 124_133_180, 131_133_135_178, 131_133_178, 133, 133_135_176_180, 133_160, 38_124_133, ili 44_124_133.
[0129] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 2 gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane od 139W, 143D, 145T, 174G, 179E i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane od 124Q, 176F, 116F, 131K, 131R, 133S i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane od 124R, 143I, 143K, 143R, 186K, 188K, 190F, 39E, 45P i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 124E, 131D, 131E, 133D, 133G, 135A, 135W, 160E, 176D, 178F, 180D, 180E, 38R, 44F, i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0130] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 2, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0131] U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 2, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0132] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je jedna od sledećih:
[0133] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 2, koji ima jedan ili više od elektrostatičkih drajver setova sterni 1, sterni 2, sterni varijabilnog domena ili varijabilni domen.
[0134] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina K-L klastera 2 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija odabranih iz tabele F.
[0135] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 2 kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-A2.
K-L klaster 3:
[0136] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 3 pri čemu:
H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131; i
a) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124_186 ili 124_179 ili 188, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176_178 ili 176_180 ili 131; ili b) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143_188 ili 143 ili 124_143; i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_176_178 ili 124_178 ili 124_180 ili 124_176_180, ili 124, ili 124_176.
[0137] U nekim aspektima koji su opisani ovde, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 139, 145, 174 i 179, L1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 116, 124 i 176, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 177, 190, 39 i 45, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 133, 135, 178, 38 i 44.
[0138] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 3, pri čemu H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143_145; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131; i H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 143 ili 186 ili 188, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 133. U nekim aspektima koji su opisani ovde, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 139, 145, 174 i 179, L1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 116, 124, 133 i 176, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 190, 39 i 45, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 135, 178, 38 i 44.
[0139] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 3 pri čemu H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 139_143_145, 139_143_145_179, 143_145, 143_145_174_179 ili 143_145_179; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 16_124_131_176 ili na 124_131; H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_143, 124_179, 124_186, 143, 143_188, 177_188, 188, 188_190, 39_124_179 ili 45_124_179, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_133, 124_133_176, 124_133_176_178, 124_133_176_180, 124_133_178, 124_133_180, 131_133_178, 133_135_176_178, 133_135_176_180, 133_176_178, 133_176_180, 176_178, 38_133_176_180 ili 44_133_176_180.
[0140] U nekim aspektima opisanim u ovom dokumentu, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 3 gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane od 139W, 174G, 145T, 143D, 143E, 179E i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane iz 116F, 124Q, 131K, 131R, 176F i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane iz 124R, 143K, 143R, 177I, 179K, 186K, 186R, 188K, 190F, 39E, 45P, i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 135A, 135W, 44F, 124E, 38R, 131D, 131E, 176D, 176E, 178D, 178E, 178F, 180D, 180E, 133D, 1330, 133I, 133L i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0141] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 3, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0142] U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 3, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0143] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je jedna od sledećih:
[0144] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 3, koji ima jedan ili više steričnih 1, steričnih 2, promenljivih domena steričnih ili promenljivih domena elektrostatičkih drajvera.
[0145] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina iz K-L klastera 3 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0146] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 3 kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-A3.
K-L klaster 4:
[0147] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 4 gde: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176_178 ili 178; i
a) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 177_188, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176_178; ili
b) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186 ili 124 ili 124 _179; i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 176 ili 131_176;
[0148] U nekim aspektima koji su opisani ovde, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 125, 139 i 177, L1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 122, 129 i 133, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 145, 228, 45 i 39, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 135, 44, 38, 121 i 133.
[0149] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 4 gde: H1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje ili sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188; L1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje ili sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176_178; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 188 ili 186_188, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176_178.
[0150] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 4 gde: H1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje ili sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188; L1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje ili sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 178; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 124, 186 i 188, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 176. U nekim aspektima koji su opisani ovde, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 125, 139 i 177, L1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 122, 129, 133 i 176, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 145, 228, 45, 177, 179 i 39, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 135, 44, 38, 121, 131, 178 i 133.
[0151] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema KL klasteru 4 pri čemu H1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje ili sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 125_188, 139_188, 188 ili 177_188; L1 ne sadrži zamene aminokiselina koje pospešuju preferencijalno sparivanje ili sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 129_176_178, 129_178, 122_129_176_178, 176_178 ili 133_176_178; H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 145_186, 145_186_228, 145_177_188, 124, 124_145_179, 124_145_179_186_188, 124_145_179_188, 124_186_188, 124_188, 45_124_145_179, 39_124_145_179, ili 186_188, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 44_131_133_176, 38_131_133_176, 121_131_176, 131_135_176, 131_176, 131_133_176, 131_133_176_178, 176, 176_178, 133_176, ili 133_176_178.
[0152] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 4, pri čemu su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane od 125R, 139W, 188A, 188K i 177I, i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane od 129T, 122D, 176A, 176D, 176E, 133I, 133L, 178D, 178E, 178T i 178W, i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane od 124E, 145T, 177D, 179E, 186E, 186I, 186L, 188D, 188W, 228D, 39E i 45P, i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 121K, 131K, 131R, 133A, 133G, 135W, 176A, 176K, 176R, 176V, 178A, 178K, 178L, 178R, 38R, i 44F, i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0153] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 4, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0154] U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 4, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0155] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je jedna od sledećih:
[0156] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 4, koji ima jedan ili više od elektrostatičkih, disulfid-upravljajućih, sternih 3, sternih varijabilnog domena i elektrostatičkih varijabilnog domena, drajver setova.
[0157] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina iz K-L klastera 4 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0158] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 4, kao što je izloženo u jednom ili više dizajna u tabeli 10-A4.
K-L klaster 5:
[0159] Kao što je ovde opisano, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 5, pri čemu:
H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 133; i
a) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131; ili
b) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 177_188, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 176_178, ili
pri čemu H1 sadrži aminokiselinsku supstitucije na pozicijama 124_190; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 135; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124 ili 188, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176 ili 176_178.
[0160] U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji, 143 i/ili 188, L1 dalje obuhvata aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131 i/ili 178, H2 dalje obuhvata aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143 i/ili 145, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 133 i/ili 178.
[0161] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 5, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186 ili 124; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 133 i/ili 135; i H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 188, 177 and 124, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176 i/ili 131.
[0162] U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 143, 188 i 190, L1 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 131 i/ili 178, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143 i/ili 145, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 133 i/ili 178.
[0163] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema KL klasteru 5 pri čemu H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_190, 143_186_188 ili 186_188; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 131_133_178, 133_135, 133_135_178, 133_178 ili 135_178; H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124, 143_188, 145_177_188 ili 177_188, i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 131_176_178, 131_178, 133_176, 133_176_178 ili 176_178.
[0164] U nekim aspektima opisanim u ovom dokumentu, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 5, pri čemu su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane od 124E, 143S, 186K, 188T, 190D, 190E i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane od 131S, 133D, 133I, 135K, 135R, 178F, 178T i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane od 124R, 143T, 145T, 177D, 177I, 188D, 188K i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 131K, 133G, 133L, 176A, 176D, 176K, 178E, 178K, 178R, 178S i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0165] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 5, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 5, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0166] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je ona u kojoj H1 sadrži 186K_188T, L1 sadrži 133D_178T, H2 sadrži 145T_177D_188D, a L2 sadrži 176K_178K.
[0167] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina iz K-L klastera 5 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0168] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 5 kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-A5.
K-L klaster 6:
[0169] Kao što je ovde opisano, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 6 pri čemu:
H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 177_188; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 176_178; i
a) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176_178 ili 131;
b) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186; i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 133, ili 124_160_180;
c) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124 ili 124_179 ili 124_186 i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176 ili 176_178 ili 176_180; ili
d) H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 13 ili 124_133;
[0170] U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na 145 i/ili 146, i/ili H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više pozicija 143 i/ili 177.
[0171] Kao što je ovde opisano, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 6 pri čemu:
H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 145 i 188; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 178; i H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124 i/ili 188, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 124, 133 i 178;
[0172] U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje obuhvata aminokiselinske supstitucije na 145 i/ili 146 pozicija, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 177, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više pozicija 124, 131, 160 i 180.
[0173] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 6, pri čemu H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_190, 143_186_188 ili 186_188; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 131_133_178, 133_135, 133_135_178, 133_178 ili 135_178; H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124, 143_188, 145_177_188 ili 177_188, i L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 131_176_178, 131_178, 133_176, 133_176_178 ili 176_178.
[0174] U nekim aspektima opisanim u ovom dokumentu, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 6, pri čemu su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane od 145T, 146T, 177D, 188D i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane od 176K, 178K, 178L, 178R i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane od 124R, 143K, 143R, 143S, 177I, 179K, 186K, 186R, 188K, 188T, 188W i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 124E, 131D, 131E, 133D, 1330, 133I, 133L, 160E, 176A, 176D, 176E, 178A, 178D, 178E, 178F, 180E i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0175] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 6, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0176] U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 6, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0177] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je jedna od sledećih:
[0178] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema KL klasteru 6, koji sadrži disulfidni upravljački pogon.
[0179] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina iz K-L klastera 6 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0180] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 6 kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-A6.
K-L klaster 7:
[0181] Kao što je ovde opisano, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 7 pri čemu:
H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 178; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124 ili 188, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176_178 ili 176_180 ili 176; U nekim aspektima koji su opisani ovde, H1 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 125, 139, 145 i 177, L1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 122, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 143, 177, 179, 186, 228, 39 i 45, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 121, 124, 133, 135, 160, 38 i 44.
[0182] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 7, pri čemu H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 145_188; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 178; i H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 124 i/ili 188, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 124, 133 i 178.
[0183] U nekim aspektima koji su opisani ovde, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 125, 139 i 177, L1 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 122, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 143, 177, 179, 186, 228, 39 i 45, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 121, 135, 160, 176, 180, 38 i 44.
[0184] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 7, pri čemu H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 125_145_188, 139_145_188, 145_177_188 ili 145_188; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 122_178, ili 178; H2 aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124, 124_143, 124_179, 124_186, 124_186_228, 124_188, 124_228, 143_188, 177_188, 179_188, 186_188, 188, 188_228, 39_124_179, ili 45_124_179, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 121_133_176, 121_133_176_180, 121_176_178, 124_133_176, 124_133_176_178, 124_133_176_178_180, 124_133_176_180, 124_133_178, 124_160_176_178, 124_160_176_178_180, 124_176_178_180, 124_176_180, 133_135_176, 133_135_176_180, 133_176, 133_176_178, 133_176_180, 135_176_178, 176_178, 38_133_176_180, ili 44_133_176_180.
[0185] U nekim aspektima opisanim u ovom dokumentu, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 7 gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane iz 125R, 139W, 145T, 177T, 188E i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane iz 122D, 178K i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane iz 124K, 124R, 143K, 143R, 177I, 179K, 186R, 188K, 228D, 39E, 45P, i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane iz 121K, 124E, 133D, 133G, 133L, 135W, 160E, 176D, 176E, 178D, 178E, 180E, 38R, 44F i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0186] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 7, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0187] U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 7, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0188] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je jedna od sledećih:
[0189] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt K-L klastera 7 sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija koje imaju jedan ili više drajver setova izabranih od drajver seta za upravljanje disulfidima, sternog 2 drajver seta i drajver seta varijabilnog domena.
[0190] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina iz K-L klastera 7 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0191] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 7, kao što je izloženo u jednom ili više dizajna izloženih u tabeli 10-A7.
K-L klaster 8:
[0192] U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 8 pri čemu:
H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124; i
a) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186 ili 179, a L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 180;
b) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186; i L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 133;
c) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; i L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 133; ili
d) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 188; i L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 178.
[0193] U nekim primerima izvođenja, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 124, 139, 177 i 190, L1 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 129, 131, 135 i 176, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 122, 124, 145, 179, 186, 188, 39 i 45, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 129, 133, 135, 160, 176, 178, 38 i 44.
[0194] U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 8, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143, 186, 179 i/ili 188; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 129 i/ili 178; i H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124. U nekim primerima izvođenja, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 124, 139, 177 i 190, L1 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 131, 133, 135, 176 i180, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 122, 124, 145, 179, 186, 188, 39 i 45, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 129, 133, 135, 160, 176, 178, 38 i 44.
[0195] U nekim primerima izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 8 pri čemu H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_143, 139_143, 139_143_186, 139_186, 139_188, 143, 143_179, 143_186, 143_186_188, 143_190, 177_188, 179, 179_190, 186, ili 186_188, 188; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 129_131_133, 129_133, 129_133_135, 129_133_135_180, 129_133_178, 129_133_180, 129_176_178, 129_176_178_180, 129_178, 129_178_180, 129_180, 133_176_178, 133_178, ili 176_178; H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 122_143_145, 122_143_145_179, 124_143_145, 124_143_145_179, 143_145, 143_145_179,143_145_179_186_188, 143_145_179_188, 143_145_188, 39_143_145_179, ili 45_143_145_179, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_129_160_178, 124_129_178, 124_133_178, 124_135_160_178, 124_135_178, 124_160_176_178, 124_160_178, 124_176_178, 124_178, 38_124_178, ili 44_124_178.
[0196] U nekim primerima izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema KL klasteru 8 gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane iz 124K, 139W, 143A, 143I, 143K, 143S, 177I, 179K, 186K, 186R, 188K, 188T, 190K i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane iz 129T, 131D, 131E, 133D, 133L, 133W, 135S, 176A, 176D, 176E, 178D, 178E, 178T, 178W, 180E i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane iz 122C, 124W, 143E, 145T, 179E, 186I, 188L, 188W, 39E, 45P i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane iz 124C, 124K, 124R, 129K, 133A, 135W, 160K, 160R, 176A, 178R, 38R, 44F i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0197] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 8, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0198] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 8, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0199] U nekim primerima izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom primeru izvođenja, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je jedna od sledećih:
[0200] U nekim primerima izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 8, koji ima jedan ili više drajver setova sternog 2, sternog 3, sternog 4 i varijabilnog domena. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 8 koji uvode ne-prirodnu disulfidnu vezu.
[0201] U jednom primeru izvođenja, kombinacije aminokiselina K-L klastera 8 obuhvataju jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0202] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 8, kao što je izloženo u jednom ili više dizajna u tabeli 10-A8.
K-L klaster 9:
[0203] Kao što je ovde opisano, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 9 pri čemu:
H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 179, 186, 143 i/ili 188; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 180, 133 i/ili 176 i 178; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131 i/ili 124. U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 125, L1 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 122 ili 129, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 145, 179 i 228, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 121, 129, 135, 160 i 178.
[0204] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 9, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 125; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 122_129; i H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 145, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 121 i/ili 124. U nekim aspektima koji su opisani ovde, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 143, 179, 186 i 188, L1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 133, 176, 178 i 180, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 143, 179 i 228, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 129, 131, 135, 160 i 178.
[0205] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 9, pri čemu H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 125_143, 125_179, 125_186 ili 125_188; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 122_129_133, 122_129_176_178 ili 122_129_180; H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 143_145, 143_145_179, 143_145_179_228, 143_145_228 ili 145_179_228, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 121_124_160_178, 121_124_178,121_129_131, 121_131, 124_135_160_178 ili 124_135_178.
[0206] U nekim aspektima opisanim u ovom dokumentu, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 9 gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane od 125R, 143K, 179K, 186R, 188K i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane iz 122D, 129T, 133D, 176D, 176E, 178E, 178T, 180E i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane iz 143E, 145T, 179E, 228D i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 135W, 124R, 160K, 121K, 131K, 129K, 178R i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0207] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 9, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0208] U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 9, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0209] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je jedna od sledećih:
[0210] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 9, koji ima drajver set za upravljanje disulfidima.
[0211] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina iz K-L klastera 9 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0212] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 9, kao što je izloženo u jednom ili više dizajna u tabeli 10-A9.
K-L klaster 10:
[0213] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 10, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 174, 179 ili 186; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 176 ili 180; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143 ili 190, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131, 135 ili 124; ili H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 174; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 176; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 190; i L2 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje ili sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 135. U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 143, L1 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 116, 129 i 133, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 145, 179 i 188, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 133, 160 i 178.
[0214] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema KL klasteru 10, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 174 i/ili 186; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 176 i/ili 180; i H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 145, 190 i/ili 188, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 135, 131, 178 ili 133 ili ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje. U nekim aspektima koji su opisani ovde, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 143 i/ili 179, L1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 116, 129 i 133, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143 i/ili 179, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124 i/ili 160.
[0215] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema KL klasteru 10, pri čemu H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 143_174, 174, 174_179, 174_186 ili 186; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 116_129_133_176, 116_129_176_180, 116_176, 129_180 ili 176; H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 143_145_179_188_190, 143_145_179_190,143_145_190,143_190, 145_179, 145_179_188_190, 188 ili 190, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_135_160_178, 124_135_178, 131, 131_135, 133, 135, 135_178, 178, ili ne sadrži zamene aminokiselina koje pospešuju preferencijalno sparivanje.
[0216] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 10 gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane od 143K, 174G, 179K, 186R i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane od 116F, 129T, 133D, 176F, 180E i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane od 143E, 143I, 145T, 179E, 188F, 190F i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 124K, 124R, 131K, 133A, 135A, 160K, 178F, 178R i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0217] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 10, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0218] U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 10, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0219] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je jedna od sledećih:
[0220] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 10, koji sadrži sterni 1drajver set.
[0221] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina iz K-L klastera 10 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0222] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 10 kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-A10.
K-L klaster 11:
[0223] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 11, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143_190; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 133; i H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 131_135. U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 125, L1 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 122, 129 i 135, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 139, 145 i 190 i 228, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 121.
[0224] Kao što je ovde opisano, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 11 pri čemu:
H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143_190; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 129_133_135; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124_145, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 131_135. U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje obuhvata aminokiselinske supstitucije na poziciji 125, L1 dalje obuhvata aminokiselinsku supstituciju na poziciji 122, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od poziciji 139, 190 i 228, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 121.
[0225] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 11, pri čemu H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 125_143_190, ili 143_190; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 122_129_133_135, ili 129_133_135; H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_139_145_190, 124_139_145_190_228, ili 124_145, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 121_131_135, ili 131_135.
[0226] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 11, gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane od 125R, 143K, 190K i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane od 122D, 129T, 133D, 135S i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane od 124E, 139I, 145T, 190I, 228D, i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 121K, 131K, 135K i njihovih konzervativnih supstitucija
[0227] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 11, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0228] U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 11, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0229] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je ona u kojoj H1 sadrži 143K_190K, L1 sadrži 129T_133D_135S, H2 sadrži 124E_145T i L2 sadrži 131K_135K.
[0230] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 11, koji ima drajver set za upravljanje disulfidima.
[0231] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina iz K-L klastera 11 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0232] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 11, kao što je izloženo u jednom ili više dizajna u tabeli 10-A11.
K-L klaster 12:
[0233] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 12, pri čemu H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143 i/ili 186; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 133; i H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 124, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 131. U nekim aspektima koji su opisani ovde, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 124, 125, 139 i 188, L1 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 122, 129, 131 i 178, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na jednoj ili više od pozicija 143, 145, 179, 186, 188, 228, 39 i 45, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 121, 133, 135, 176, 178, 38 i 44.
[0234] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema KL klasteru 12 pri čemu H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_143, 125_143, 125_143_186, 125_186, 125_186_188, 139_143, 139_143_186, 139_186, 139_186_188, 143 ili 186_188; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 122_129_133, 122_129_133_178, 122_133_178, 129_131_133, 129_133, 129_133_178, ili 133_178; H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_143_145, 124_145_179, 124_145_179_186_188, 124_145_179_188, 124_145_179_228, 124_145_186, 39_124_145_179 ili 45_124_145_179, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 121_131_133_176, 131_133_135, 131_133_135_176, 131_133_135_178, 131_133_176, 131_133_176_178, 38_131_133_176, ili 44_131_133_176.
[0235] U nekim aspektima koji su ovde oisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 12 gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane iz 124K, 125R, 139W, 143I, 143K, 186K, 188T, i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane iz 122D, 129T, 131D, 131E, 133D, 178T i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane iz 124E, 143E, 145T, 179E, 186E, 186I, 188W, 228D, 39E, 45P, i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane iz 121K, 131K, 131R, 133G, 133S, 133T, 135K, 135W, 176R, 178A, 178S, 38R, 44F i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0236] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 12, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0237] U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 12, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0238] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je jedna od sledećih:
[0239] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 12, koji ima jedan ili više od disulfid-upravljajućih, sternih 2, sternih 3, elektrostatičkih varijabilnog domena i sternih varijabilnog domena, drajver setova.
[0240] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina iz K-L klastera 12 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0241] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-L klasteru 12 kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-A12.
K-K klaster 1:
[0242] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 1, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143_179; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124_178; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 178_180 ili 160_180. U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 145.
[0243] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 1, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143_145_179; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124_178; i H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 180. U nekim aspektima koji su ovde opisani, L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 160 i/ili 178.
[0244] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 1, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 143_145_179; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124_178; i H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 186, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 178_180 ili 160_180.
[0245] U nekim aspektima opisanim u ovom dokumentu, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 1 gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane iz 143E, 145T, 179E i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane od 124K, 178R i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 je 186R ili njene konzervativne supstitucije; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 160E, 178E, 180E i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0246] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 1, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija: H1 sadrži 143E_145T_179E i L1 sadrži 124K_178R. U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 1, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija: H2 comprises 124K_178R and L2 comprises 178E_180E ili 160E_180E. U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju ovih H1L1 i H2L2 heterodimera.
[0247] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 1 kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-B1.
K-K klaster 2:
[0248] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 2, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 179 ili 186, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124_160_180. U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 145, i/ili H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 146.
[0249] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 2, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143_145; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124; i H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 179 ili 186, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124_160_180. U nekim aspektima koji su ovde opisani, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 146.
[0250] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 2, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 143_145; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 124; i H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 186, 179 ili 146_179, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124_160_180.
[0251] U nekim aspektima opisanim u ovom dokumentu, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 2 gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane iz 143E, 145T i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 je 124R i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane iz 186R, 179K, 1460 i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 124E, 160E, 180E i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0252] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 2, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija: H1 comprises 143E_145T and L1 comprises 124R. U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 2, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija: H2 comprises 186R, 179K or 146G_179K and L2 comprises 124E_160E_180E. U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigenvezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je ona u kojoj H1 sadrži 143E_145T, L1 sadrži 124R, H2 sadrži 179K, a L2 sadrži 124E_160E_180E.
[0253] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina K-K klastera 2 sadrži jednu ili više sekundarnih supstitucija odabranih iz tabele F.
[0254] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 2 kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-B2.
K-K klaster 3:
[0255] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 3 pri čemu:
H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 180 ili 178_180; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143 i/ili 179, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 124_178 ili 131. U nekim aspektima koji su ovde opisani, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 145.
[0256] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 3, pri čemu H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 186; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 180; i H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 145, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124 ili 131. U nekim aspektima koji su ovde opisani, L1 dalje obuhvata aminokiselinsku supstituciju na poziciji 178, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143 i/ili 179, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 178.
[0257] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 3, pri čemu H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijiI86; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 180 ili 178_180; i H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 143_145, 143_145_179 ili 145_179, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 131 ili 124_178.
[0258] U nekim aspektima opisanim u ovom dokumentu, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 3 gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane iz 186R i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane iz 178E, 180E i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane iz 143E, 145T, 179E i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 124K, 131K, 178R i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0259] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 3, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija: H1 sadrži 186R i L1 sadrži 178E_180E ili 180E. U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 3, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0260] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je ona u kojoj H1 sadrži 186R, L1 sadrži 180E, H2 sadrži 143E_145T_179E i L2 sadrži 124K_178R.
[0261] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina iz K-K klastera 3 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0262] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 3, kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-B3.
K-K klaster 4:
[0263] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 4, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 179; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 180; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124. U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 146, H2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijia 145, i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 160 i/ili 178
[0264] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 4, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 179; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 180; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143_145, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124. U nekim aspektima koji su ovde opisani, H1 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 146 i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 160 i/ili 178.
[0265] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 4, pri čemu H1 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 146_179 ili 179; L1 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 180; i H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 143_145, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124 ili 124_160_178.
[0266] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 4 gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane od 146G, 179K, i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su 180E ili njihove konzervativne supstitucije; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane od 143E, 145T i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 124R, 160K, 178R i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0267] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 4, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži sledeći set aminokiselinskih supstitucija: H1 comprises 179K ili 146G_179K, a L1 sadrži 180E. U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 4, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži sledeće setove aminokiselinskih supstitucija: H2 sadrži 143E_145T i L2 sadrži Q124R_Q160K_T178R ili Q124R. U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je ona u kojoj H1 sadrži 179K, L1 sadrži 180E, H2 sadrži 143E_145T, a L2 sadrži 124R_160K_178R
[0268] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina iz K-K klastera 4 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0269] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 4 kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-B4.
K-K klaster 5:
[0270] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 5, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 143 ili 186; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 180 ili ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 143_145, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124. U nekim aspektima koji su ovde opisani, L2 dalje sadrži aminokiselinske supstitucije na jednoj ili više od pozicija 160 i/ili 178. U dodatnom aspektu koji je ovde opisan, L2 sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 124, 124_178 ili 124_160_178
[0271] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 5 gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane od 186R, 143R, 143K i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane od 180E ili njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane od 143E, 145T i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 124R, 160K, 178R i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0272] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 5, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0273] U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 5, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0274] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom.
[0275] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina iz K-K klastera 5 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0276] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 5 kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-B5.
K-K klaster 6:
[0277] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 6 gde: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 39 ili ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 38 ili ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 39, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 38.
[0278] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 6 gde su aminokiselinske supstitucije u H1 izabrane od 39D, 39E, 39K, 39R i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane od 38D, 38E, 38K, 38R i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u H2 su izabrane od 39D, 39E, 39K, 39R i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 38D, 38E, 38K, 38R i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0279] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 6, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0280] U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 6, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija:
[0281] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom. U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacija H1L1 heterodimera i H2L2 heterodimera je ona u kojoj H1 sadrži 39R, L1 sadrži 38E, H2 sadrži 39D i L2 sadrži 38R.
[0282] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 6 kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-B6.U jednom aspektu koji je ovde opisan, dizajn K-K klastera 6 nije dizajn koji odgovara LCCA jedinstvenom identifikatoru 10674-10749 ili 10679-10744.
K-K klaster 7:
[0283] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 7, pri čemu: H1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 135; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 139, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 116. U nekim aspektima koji su ovde opisani, L2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 135.
[0284] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 7 u kojem je supstitucija aminokiselina u L1 135W, ili konzervativne supstitucije istih; supstitucija aminokiselina u H2 je 139W, ili konzervativne supstitucije istih; a aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane iz 116A, 135V, i njihove konzervativne supstitucije.
[0285] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 7, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži sledeći set aminokiselinskih supstitucija: H1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje, a L1 sadrži 135W. U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigenvezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 7, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija: H2 sadrži 139W, a L2 sadrži 116A ili 116A_1335V.U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju jednog H1L1 heterodimera sa jednim H2L2 heterodimerom.
[0286] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 7, kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-B7.
K-K klaster 8:
[0287] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 8, pri čemu: H1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje ili sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 45; L1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 45, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 44.
[0288] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 8 gde je aminokiselinska supstitucija u H1 45F ili njene konzervativne supstitucije; aminokiselinska supstitucija u H2 je 45P, 45A, ili njene konzervativne supstitucije; aminokiselinska supstitucija u L2 je 44F ili njene konzervativne supstitucije.
[0289] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 8, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži jedan od sledećih setova aminokiselinskih supstitucija: H1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje ili sadrži 45F, a L1 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje. U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 8, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži sledeći set aminokiselinskih supstitucija: H2 sadrži 45A ili 45P, a L2 sadrži 44F. U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju H1L1 i H2L2 heterodimera, gde H1 i L1 ne sadrže aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje, H2 sadrži 45A i L2 sadrži 44F
[0290] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 8 kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-B8.
K-K klaster 9:
[0291] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 9, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 139; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 116; H2 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje, a L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 135.
[0292] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 9 gde je aminokiselinska supstitucija u H1 139W ili njene konzervativne supstitucije; aminokiselinskih supstitucija u L1 je 116A ili njene konzervativne supstitucije; a aminokiselinska supstitucija u L2 je 135W ili njene konzervativne supstitucije.
[0293] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 9, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži sledeći set aminokiselinskih supstitucija: H1 sadrži 139W, a L1 sadrži 116A. U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 9, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži sledeći set aminokiselinskih supstitucija: H2 ne sadrži aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje i L2 sadrži 135W
[0294] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 9 kao što je navedeno u jednom ili više dizajna u tabeli 10-B9.
K-K klaster 10:
[0295] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K- K klasteru 10, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 176; H2 sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji 124, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 176. U nekim aspektima koji su ovde opisani, L1 i/ili L2 dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 133.
[0296] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 10, pri čemu: H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124; L1 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 133_176; H2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji 124, i L2 sadrži aminokiselinsku supstituciju na pozicijama 133_176.
[0297] U nekim aspektima opisanim u ovom dokumentu, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 10 gde je aminokiselinska supstitucija u H1 124E i njene konzervativne supstitucije; aminokiselinske supstitucije u L1 su izabrane iz 133G, 176R i njihovih konzervativnih supstitucija; aminokiselinska supstitucija u H2 je 124R ili njene konzervativne supstitucija; aminokiselinske supstitucije u L2 su izabrane od 133G, 176D i njihovih konzervativnih supstitucija.
[0298] U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H1L1 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 10, pri čemu H1L1 heterodimer sadrži sledeći set aminokiselinskih supstitucija: H1 sadrži 124E, a L1 sadrži 133G_176R. U daljim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt ima H2L2 heterodimer koji sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 10, pri čemu H2L2 heterodimer sadrži sledeći set aminokiselinskih supstitucija: H2 sadrži 124R, a L2 sadrži 133G_176D. U nekim aspektima koji su ovde opisani, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju ovih H1L1 i H2L2 heterodimera.
[0299] U jednom aspektu koji je ovde opisan, kombinacije aminokiselina iz K-L klastera 9 sadrže jednu ili više sekundarnih supstitucija izabranih iz tabele F.
[0300] U jednom aspektu koji je ovde opisan, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži kombinaciju aminokiselinskih supstitucija prema K-K klasteru 10 kao što je izloženo u tabeli 10-B10.
Preferencijalno sparivanje u LCCA dizajn setovima
[0301] Kao što je ovde opisano, jedan ili više od H1, L1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2 i H2 sa L2 u poređenju sa L1. U principu, u odsustvu aminokiselinskih modifikacija i bilo kakve prirodne sklonosti, sekvenca imunoglobulinskog teškog lanca divljeg tipa (H1), kada je koeksprimirana sa dve različite sekvence imunoglobulinskog lakog lanca divljeg tipa (L1 i L2), statistički će se jednako sparivati sa oba laka lanca, što će rezultirati smešom od približno 50:50 H1 uparenih sa L1 (H1L1, ispravno upareni) i H1 uparenih sa L2 (H1L2, pogrešno upareni). Isto tako, ako je divlji tip H2 koeksprimiran sa divljim tipom L1 i L2, teški lanac će se statistički jednako sparivati sa oba laka lanca, će rezultirati smešom od približno 50:50 H2 uparenih sa L1 (H2L1, pogrešno upareni) i H2 uparenih sa L2 (H2L2, ispravno uparen). Termin "preferencijalno sparivanje" se ovde koristi za opisivanje specifičnosti sparivanja ili preferencije sparivanja polipeptidne sekvence imunoglobulinskog teškog lanca sa jednom polipeptidnom sekvencom imunoglobulinskog lakog lanca u poređenju sa polipeptidnom sekvencom drugog imunoglobulinskog lakog lanca. U ovom kontekstu, preferencijalno sparivanje bi se javljalo između, na primer, H1 i L1, ako je količina H1L1 heterodimera veća od količine H1L2 heterodimera kada je H1 koeksprimiran i sa L1 i sa L2. Slično tome, preferencijalno sparivanje bi se javljalo između, na primer, H2 i L2, ako je količina H2L2 heterodimera veća od količine H2L1 heterodimera kada je H2 koeksprimiran i sa L1 i sa L2.
[0302] Međutim, u nekim slučajevima, postoji inherentna sklonost prilikom sparivanja koja se uočava kod polipeptidnih sekvenci teškog i lakog lanca divljeg tipa dobijenih od parentalnih antitela. Ova inherentna sklonost prilikom sparivanja može da se posmatra u kontekstu LCCA dizajna kod koga su parentalni H1 ili H2 divljeg tipa koeksprimirani sa parentalnim L1 i L2 divljeg tipa, gde se sa teškim lancima oba parentalna antitela preferencijalno sparuje jedan od lakih lanaca. U jednom primeru izvođenja, preferencijalno sparivanje se javlja kada aminokiselinske modifikacije u jednom ili više od H1, L1, H2 i L2 pospešuju preferencijalno sparivanje koje je veće od preferencijalnog sparivanja koje se javlja u odgovarajućem sistemu divljeg tipa.
[0303] Stepen preferencijalnog sparivanja, ili jačina dizajna, je mera sposobnosti aminokiselinskih modifikacija da pospešuju preferencijalno sparivanje. Stepen preferencijalnog sparivanja može se proceniti kao što je opisano na drugim mestima u ovom dokumentu, i u primerima, a zasniva se na merenju pravilno sparenih heterodimera (tj.H1L1 i H2L2) u poređenju sa pogrešno sparenim heterodimerima (tj. H1L2 i H2L1). Stepen preferencijalnog sparivanja može da se proceni u kontekstu LCCA dizajn setova (H1L1L2, ili H2L1L2) gde je jedan teški lanac koeksprimiran sa dva jedinstvena laka lanca, ili Mab dizajn seta (H1L1H2L2) gde su teški i laki lanci parentalnog antitela koeksprimirani.
[0304] Sledeći aspekti se odnose na kontekst LCCA dizajn setova. U svim izvođenjima u ovom odeljku, termin "oko" znači ± 5% navedenog odnosa, a preferencijalno sparivanje se upoređuje u odnosu na divlji tip, osim ako nije drugačije naznačeno. U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2 da se formira H1L1, ili H2 sa L2 u poređenju sa L1 da se formira H2L2, gde je odnos H1L1: H1L2 je najmanje oko 40:60 i odnos H2L2: H2L1 je najmanje oko 60:40. U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2 da se formira H1L1, ili H2 sa L2 u poređenju sa L1 da se formira H2L2, gde je odnos H2L2: H2L1 je najmanje oko 40:60 i odnos H1L1: H1L2 je najmanje oko 60:40.
[0305] U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u odnosu na L2 da bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2 u odnosu na L1 da bi se formirao H2L2, gde je odnos H1L1:H1L2 najmanje 40:60 i odnos H2L2:H2L1 je najmanje oko 65:35. U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u odnosu na L2 da bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2 u odnosu na L1 za formiranje H2L2, gde je odnos H2L2:H2L1 najmanje oko 40:60, a odnos H1L1:H1L2 je najmanje oko 65:35.
[0306] U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u odnosu na L2 da bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2 u odnosu na L1 da bi se formirao H2L2, pri čemu je odnos H1L1:H1L2 najmanje 40:60 i odnos H2L2:H2L1 je najmanje oko 70:30. U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u odnosu na L2 da bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2 u poređenju sa L1 za formiranje H2L2, gde je odnos H2L2:H2L1 najmanje oko 40:60, a odnos H1L1:H1L2 je najmanje oko 70:30.
[0307] U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u odnosu na L2 da bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2 u odnosu na L1 da bi se formirao H2L2, gde je odnos H1L1:H1L2 najmanje oko 40:60 i odnos H2L2:H2L1 je najmanje oko 75:25. U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje promovišu preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u odnosu na L2 da bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2 u odnosu na L1 za formiranje H2L2, gde je odnos H2L2:H2L1 najmanje oko 40:60, a odnos H1L1:H1L2 je najmanje oko 75:25.
[0308] U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u odnosu na L2 da bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2 u odnosu na L1 da bi se formirao H2L2, pri čemu je odnos H1L1:H1L2 najmanje oko 40:60 i odnos H2L2:H2L1 je najmanje oko 80:20. U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje promovišu preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u odnosu na L2 da bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2 u odnosu na L1 za formiranje H2L2, gde je odnos H2L2:H2L1 najmanje oko 40:60, a odnos H1L1:H1L2 je najmanje oko 80:20.
[0309] U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u odnosu na L2 da bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2 u odnosu na L1 da bi se formirao H2L2, gde je odnos H1L1:H1L2 najmanje oko 40:60 i odnos H2L2:H2L1 je najmanje oko 85:15. U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u odnosu na L2 da bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2 u odnosu na L1 da bi se formirao H2L2, gde je odnos H2L2:H2L1 najmanje oko 40:60, i odnos H1L1:H1L2 je najmanje oko 85:15.
[0310] U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u odnosu na L2 kako bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2 u odnosu na L1 da bi se formirao H2L2, gde je odnos H1L1:H1L2 najmanje oko 40:60 i odnos H2L2:H2L1 je najmanje oko 90:10. U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u odnosu na L2 da bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2 u odnosu na L1 da bi se formirao H2L2, gde je odnos H2L2:H2L1 najmanje oko 40:60, i odnos H1L1:H1L2 je najmanje oko 90:10.
[0311] U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2 da formira H1L1, ili H2 sa L2 u poređenju sa L1 da formira H2L2, gde je odnos H1L1: H1L2 je najmanje oko 40:60 i odnos H2L2: H2L1 je najmanje oko 95:5. U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2 da se formira H1L1, ili H2 sa L2 u poređenju sa L1 da se formira H2L2, gde je odnos H2L2: H2L1 je najmanje oko 40:60 i odnos H1L1: H1L2 je najmanje oko 95:5.
[0312] U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2 da formira H1L1, ili H2 sa L2 u poređenju sa L1 da formira H2L2, gde je odnos H1L1: H1L2 je najmanje oko 40:60 i odnos H2L2: H2L1 je najmanje oko 95:5. U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2 da se formira H1L1, ili H2 sa L2 u poređenju sa L1 da se formira H2L2, gde je odnos H2L2: H2L1 je najmanje oko 40:60 i odnos H1L1: H1L2 je najmanje oko 99:1.
[0313] U drugim izvođenjima, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2 da se formira H1L1, ili H2 sa L2 u poređenju sa L1 da se formira H2L2, tako da je količina H1L1 ili H2L2 veća od oko 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ili 99%.
[0314] U jednom primeru izvođenja, preferencijalno sparivanje se meri pomoću LCCA kao što je opisano u primerima. Rezultati LCCA su generalno prediktivni rezultata u kontekstu preferencijalnog sparivanja u Mab dizajn setovima (opisano u nastavku) u kojima su H1, L1, H2 i L2 koeksprimirani.
[0315] U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1, u odnosu na L2, kako bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2, u odnosu na L1, kako bi se formirao H2L2, tako da je relativno sparivanje najmanje jednog od H1L1 ili H2L2 najmanje oko 10% veće u odnosu na divlji tip, a relativno sparivanje drugog je unutar oko 10% divljeg tipa ili najmanje oko 10% veće u odnosu na divlji tip.
[0316] U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1, u odnosu na L2, kako bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2, u odnosu na L1, kako bi se formirao H2L2, tako da je relativno sparivanje najmanje jednog od H1L1 ili H2L2 najmanje oko 20% veće u odnosu na divlji tip, a relativno sparivanje drugog je unutar oko 10% divljeg tipa ili najmanje oko 10% veće u odnosu na divlji tip.
[0317] U jednom primeru izvođenja, H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1, u odnosu na L2, kako bi se formirao H1L1, ili H2 sa L2, u odnosu na L1, kako bi se formirao H2L2, tako da je relativno sparivanje najmanje jednog od H1L1 ili H2L2 najmanje oko 30% veće u odnosu na divlji tip, a relativno sparivanje drugog je unutar oko 10% divljeg tipa ili najmanje oko 10% veće u odnosu na divlji tip.
Preferencijalno sparivanje u Mab dizajn setovima
[0318] Preferencijalno sparivanje se takođe može proceniti u kontekstu Mab dizajn setova gde su H1, L1, H2 i L2 koeksprimirani, a jedan ili više H1, L1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 i H2 sa L2 da bi se formirao bispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji sadrži pravilno uparen prvi heterodimer (H1L1) i pravilno uparen drugi heterodimer (H2L2). U ovoj vrsti izvođenja, kao što je prikazano na slici 8, kada su dva različita imunoglobulin teškog lanca polipeptidne sekvence su koeksprimirana sa dva različita imunoglobulin lakog lanca polipeptidnih sekvenci, veliki broj potencijalnih proizvoda može rezultirati, četrnaest od kojih su prikazani na slici 8, od kojih je samo jedan je željeni, ili pravilno uparen, bispecifična antitela H1L1H2L2 (antitelo vrsta A na slici 8). Međutim, u kontekstu procene ispravnog sparivanja između teških lanaca i lakog lanca na osnovu Mab dizajn setova, neki od dodatnih proizvoda mogu se smatrati da pokazuju ispravno sparivanje u kontekstu Fab regiona, jer oni sadrže korektno sparene heterodimere na nivou Fab (vidi na primer vrste antitela E, H, K, i M na slici 8). U nekim primerima izvođenja, Fc deo antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta sadrži asimetrične aminokiselinske modifikacije koje pospešuju formiranje heterodimernog Fc. U ovim izvođenjima, broj i količina vrsta E do J se očekuje da se smanji.
[0319] Što se tiče setova dizajna LCCA, u kontekstu skupa dizajna Mab u kojem su sve četiri polipeptidne sekvence imunoglobulina H1, L1, H2 i L2 koeksprimirane, u nekim slučajevima može postojati inherentna sklonost u uparivanju što rezultira jednim od lakih lanaca (bilo L1 ili L2) preferencijalno sparivanje sa oba H1 i H2. Stoga, prilikom određivanja jačine dizajna Mab u kontekstu bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta, možda će biti potrebno procijeniti stepen sparivanja sa aminokiselinskim modifikacijama dizajna Mab u poređenju sa količinom ispravnog sparivanja posmatranog u odgovarajućem roditeljskom sistemu divljeg tipa (H1, L1, H2, L2 polipeptidne sekvence bez aminokiselinskih modifikacija Mab dizajna). Tako, u jednom primeru izvođenja, Mab dizajn se smatra da pokaže preferencijalno sparivanje ako je količina pravilno uparene bispecifične antigen-vezujuće polipeptidne konstrukcije veća od količine pravilno sparenog bispecifičnog antitela dobijenog u odgovarajućem roditeljskom sistemu divljeg tipa. Alternativno, smatra se da dizajn Mab pokazuje preferencijalno sparivanje ako je procenat pravilno sparenog bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta u ukupnom proizvodu ekspresije veći od procenta pravilno sparenog bispecifičnog antitela dobijenog u ukupnom proizvodu ekspresije u odgovarajućem roditeljskom sistemu divljeg tipa. U jednom primeru izvođenja, ukupan izraz proizvod može da sadrži vrste antitela A do N na slici 8. U jednom primeru izvođenja, ukupan proizvod izraza može biti samo one vrste antitela koje imaju dva teška lanca i dva laka lanca (antitela vrste A do J na slici 8). U drugom primeru izvođenja, preferencijalno sparivanje se meri kao procenat ukupnog bispecifičnog antitela, isključujući polu-antitela kao što su vrste K do N na slici 8).
[0320] U drugom primeru izvođenja, smatra se da dizajn Mab pokazuje preferencijalno sparivanje ako se količina ispravnog sparivanja poveća u heterodimeru bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta koji pokazuje visok stepen pogrešnog sparivanja u odgovarajućem roditeljskom sistemu divljeg tipa. U drugom primeru izvođenja, Mab dizajn se smatra da pokaže preferencijalno sparivanje ako je ukupan iznos ispravnog sparivanja između H1 i L1, i između H2 i L2, veći od onog koji je uočen u odgovarajućem roditeljskom sistemu divljeg tipa. Na primer, u odnosu na sliku 8, vrste A, B, H, I, i M će se smatrati ispravno uparen u odnosu na H1L1, i vrste A, C, E, F, i K će se smatrati ispravno uparen u odnosu na H2L2. U ovom izvođenju, preferencijalno sparivanje se meri kao procenat ukupnog sparivanja.
[0321] U jednom primeru izvođenja, preferencijalno sparivanje se meri pomoću SMCA kao što je ovde opisano.
[0322] U nekim primerima izvođenja, smatra se da Mab dizajn pospešuje preferencijalno sparivanje kada je promena u iznosu ukupnog ispravnog sparivanja mereno zbirom H1L1 i H2L2 sparivanja je veća od oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% ili 45% u poređenju sa sparivanjem odgovarajućih H1, L1, H2 i L2 polipeptidnih lanaca bez aminokiselinskih supstitucija u Fab regionu koje pospešuju preferencijalno sparivanje.
[0323] U nekom primeru izvođenja, smatra se da Mab dizajn pospešuje preferencijalno sparivanje kada je promena u iznosu ukupnog ispravnog sparivanja, mereno količinom bispecifičnog antitela proizvedenog kao procenat vrsta osim proizvedenih polu-antitela, veća od oko 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ili 80%, u poređenju sa sparivanjem odgovarajućih H1, L1, H2 i L2 polipeptidnih lanaca bez aminokiselinskih supstitucija u Fab regionu koje pospešuju preferencijalno sparivanje.
[0324] U nekim primerima izvođenja, smatra se da Mab dizajn pospešuje preferencijalno sparivanje kada je promena u iznosu ukupnog ispravnog sparivanja, mereno količinom bispecifičnog antitela proizvedenog kao procenat vrsta osim proizvedenih polu-antitela, veća od oko 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ili 80%, u poređenju sa sparivanjem odgovarajućih H1, L1, H2 i L2 polipeptidni lanci bez aminokiselinskih supstitucija u Fab regionu koji pospešuju preferencijalno sparivanje.
Termička stabilnost Fab regiona
[0325] aminokiselinske modifikacije u jednoj ili više polipeptidnih sekvenci H1, L1, H2 i L2 pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2 i H2 sa L2 u poređenju sa L1, i minimalno utiču na termičku stabilnost svakog heterodimera antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta. Efekat aminokiselinskih modifikacija na svakom heterodimera određuje se merenjem termičke stabilnosti Fab regiona formiranih od H1 i L1, ili H2 i L2, i upoređujući ga sa termičkom stabilnošću Fab regiona formiranog odgovarajućim divljim tipom H1 i L1 polipeptidnih sekvenci (wt prvi Fab region) ili odgovarajućim divljim tipom H2 i L2 polipeptidnih sekvenci (wt drugi Fab region). Termini "odgovarajuće polipeptidne sekvence divljeg tipa H1 i L1" i "odgovarajuće polipeptidne sekvence divljeg tipa H2 i L2", imaju za cilj da opišu odgovarajuće polipeptidne sekvence H1, L1, H2 i L2 koje nemaju aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje kao što je ovde opisano.
[0326] termička stabilnost može se meriti različitim metodama poznatim u ovoj oblasti i opisanim ovde, uključujući diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju (DSC) ili diferencijalnu skenirajuću fluorimetriju (DSF). Potonje metode pružaju meru toplotne stabilnosti u smislu "temperature topljenja" ili Tm.
[0327] U kontekstu sledećih izvođenja, izraz "oko" znači ± 10% od navedene temperature. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi Fab region koja ima Tm unutar oko 20°C od Tm odgovarajućeg wt prvog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi Fab region koja ima Tm unutar oko 15 °C od Tm odgovarajućeg wt prvog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi Fab region koja ima Tm unutar oko 10°C od Tm odgovarajućeg wt prvog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi Fab region koja ima Tm unutar oko 9°C od Tm odgovarajućeg wt prvog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi Fab region koja ima Tm unutar oko 8°C od Tm odgovarajućeg wt prvog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi Fab region koja ima Tm unutar oko 7°C od Tm odgovarajućeg wt prvog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi Fab region koja ima Tm unutar oko 6°C od Tm odgovarajućeg wt prvog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi Fab region koja ima Tm unutar oko 5°C od Tm odgovarajućeg wt prvog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi Fab region koja ima Tm unutar oko 4°C od Tm odgovarajućeg wt prvog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi Fab region koja ima Tm unutar oko 3°C od Tm odgovarajućeg wt prvog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi Fab region koja ima Tm unutar oko 2°C od Tm odgovarajućeg wt prvog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi Fab region koja ima Tm unutar oko 1°C od Tm odgovarajućeg wt prvog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi Fab region čija je Tm otprilike ista kao i za odgovarajući wt prvi Fab region
[0328] U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži drugi Fab region koja ima Tm unutar oko 20°C od Tm odgovarajućeg wt drugog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži drugi Fab region koja ima Tm unutar oko 15°C od Tm odgovarajućeg wt drugog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži drugi Fab region koja ima Tm unutar oko 10°C od Tm odgovarajućeg wt drugog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži drugi Fab region koja ima Tm unutar oko 9°C od Tm odgovarajućeg wt drugog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži drugi Fab region koja ima Tm unutar oko 8°C od Tm odgovarajućeg wt drugog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži drugi Fab region koja ima Tm unutar oko 7°C od Tm odgovarajućeg wt drugog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži drugi Fab region koja ima Tm unutar oko 6°C od Tm odgovarajućeg wt drugog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži drugi Fab region koja ima Tm unutar oko 5°C od Tm odgovarajućeg wt drugog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži drugi Fab region koja ima Tm unutar oko 4°C od Tm odgovarajućeg wt drugog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži drugi Fab region koja ima Tm unutar oko 3°C od Tm odgovarajućeg wt drugog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži drugi Fab region koja ima Tm unutar oko 2°C od Tm odgovarajućeg wt drugog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži drugi Fab region koja ima Tm unutar oko 1°C od Tm odgovarajućeg wt drugog Fab regiona. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži drugi Fab region čija je Tm otprilike ista kao i za odgovarajući wt drugi Fab region.
[0329] U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži prvi heterodimer i drugi heterodimer pri čemu je temperatura topljenja (Tm) prvog Fab regiona unutar oko 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 20°C Tm Fab regiona formiranog odgovarajućim divljim tipom H1 i L1 polipeptidnim sekvencama za prvi antigen (wt prvi Fab regon), i/ili temperatura topljenja (Tm) drugog Fab regiona je unutar oko 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili 20°C od Tm Fab regiona formiranog odgovarajućim divljim tipom H2 i L2 polipeptidnih sekvenci za drugi antigen (wt drugi Fab region).
[0330] Štaviše, u nekim primerima izvođenja, Tm prvog ili drugog Fab regiona je veći od odgovarajućeg wt prvog Fab ili odgovarajućeg drugog sa drugim Fab. Tako, u jednom primeru izvođenja, Tm prvog ili drugog Fab regiona je povećan za oko 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8.0.9, 1.0, 1.1, 1.2, .1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.5, 5.0 °C ili više u odnosu na odgovarajući wt first Fab region ili odgovarajući wt drugi Fab region.
[0331] U jednom primeru izvođenju, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži aminokiselinske supstitucije koje odgovaraju brojevima K-L dizajna 2979, 3018, 3041, 3102, 3898 i/ili 3947. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži aminokiselinske supstitucije koje odgovaraju brojevima K-L dizajna 3025, 3109, 3113, 3878, 3890, 3910, 3931, 3954, 3967, 4010 i/ili 4040.
Sposobnost Fab regiona da se vezuju za antigen
[0332] Aminokiselinske modifikacije u polipeptidnim sekvencama H1, L1, H2 i L2 pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2 i H2 sa L2 u poređenju sa L1, i minimalno utiču na sposobnost svakog heterodimera antigenvezujućeg polipeptidnog konstrukta da se veže za svoj antigen. Efekat aminokiselinskih modifikacija na svaki heterodimer određuje se merenjem sposobnosti Fab regiona koje formiraju H1 i L1 ili H2 i L2, da se vežu za svoje odgovarajuće antigene, i upoređuje sa sposobnošću odgovarajućeg wt prvog Fab regiona ili odgovarajućeg wt drugog Fab regiona da se veže za svoj odgovarajući antigene.
[0333] Sposobnost Fab regiona da se vezuju za svoje odgovarajuće antigene može da se meri brojnim postupcima poznatim u stanju tehnike, od kojih su neki opisani na drugim mestima u ovom tekstu. Na primer, površinska plazmonska rezonanca (SPR), ili testovi vezanja celih ćelija mogu se koristiti za procenu sposobnosti prvog Fab regiona da veže prvi antigen i drugog Fab regiona da veže drugi antigen. Poslednje dve metode mere sposobnost Fab regiona da se vezuju za svoje antigene određivanjem afiniteta Fab regiona za svog antigena.
[0334] U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 100 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 50 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 40 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 30 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 20 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 10 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 9 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 8 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 7 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 6 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 5 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 4 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 3 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je unutar razlike od oko 2 puta u odnosu na afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet prvog Fab regiona za prvi antigen je otprilike isti kao i afinitet prvog wt Fab regiona za prvi antigen.
[0335] U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 100 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 50 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 40 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 30 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 20 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 10 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 9 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 8 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 7 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 6 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 5 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 4 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 3 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je unutar razlike od oko 2 puta u odnosu na afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen. U jednom primeru izvođenja, afinitet drugog Fab regiona za drugi antigen je otprilike isti kao i afinitet wt drugog Fab regiona za drugi antigen.
Transferabilnost aminokiselinskih modifikacija ili dizajn setova
[0336] Aminokiselinske modifikacije ili dizajn setovi opisani ovde mogu se koristiti za pripremu bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta u kojem se polipeptidne sekvence imunoglobulina teškog lanca i polipeptidi imunoglobulinskog lakog lanca svakog heterodimera mogu dobiti iz jednog ili više parentalnih antitela, gde najmanje jedno parentalno antitelo sadrži kapa laki lanac, i najmanje još jedno parentalno antitelo sadrži lambda laki lanac. Na osnovu sledeće diskusije, Mab dizajn setovi mogu se primeniti na većinu takvih bispecifičnih polipeptidnih konstrukata koji vezuju antigen.
[0337] Ostaci interfejsa VH: VL i CH1: CL u interfejsu između teških i lakih lanaca imunoglobulina relativno su dobro očuvani (Padlan et al., 1986, Mol. Immunol.23 (9): 951-960). Ovo očuvanje sekvence, rezultat evolucionih ograničenja, povećava verovatnoću da će se funkcionalno aktivni domeni vezivanja antitela formirati tokom kombinatornog sparivanja lakih i teških lanaca. Kao rezultat ovog očuvanja sekvence, sledi da su Mab dizajn setovi opisani ovde i zasnovani na modeliranju struktura D3H44 kapa Fab i CAT-2200 lambda Fab, koji pokreću preferencijalno sparivanje, mogu se preneti na kapa Fabs i lambda Fabs drugih parentalnih antitela da vozi preferencijalno sparivanje, jer ovaj region pokazuje visoku očuvanje sekvence preko antitela. Dalje, kada se pojave razlike u sekvenci, one obično leže distalno od CH1: CL interfejsa. Ovo je posebno slučaj za CH1 i CL domene. U izvođenju, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti koji su ovde opisani sadrže heterodimere gde kapa Fab sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u CL i/ili CH1 domenima koji pospešuju preferencijalno sparivanje. U izvođenju, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti koji su ovde opisani sadrže heterodimere gde kapa Fab sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u CL i/ili CH1 domenima koji pospešuju preferencijalno sparivanje.
[0338] Postoji, međutim, određena varijabilnost sekvence na mestu vezivanja antigena u odnosu na CDR (regioni koji određuju komplementarnost) ostatke petlje (i dužinu), posebno za CDR-H3. Tako, u jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti koji su ovde opisani sadrže heterodimere gde kapa Fab sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u VH i/ili VL domenima koji leže distalno od CDR petlji kada je aminokiselinska sekvenca mesta vezivanja antigena značajno drugačija od one kod antitela D3H44. Tako, u jednom primeru izvođenja, antigenvezujući polipeptidni konstrukti koji su ovde opisani sadrže heterodimere gde kapa Fab sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u VH i/ili VL domenima koji leže distalno od CDR petlji kada je aminokiselinska sekvenca mesta vezivanja antigena značajno drugačija od one kod antitela CAT-2200. Tako, u jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti koji su ovde opisani sadrže heterodimere gde kapa Fab sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u VH i/ili VL domenima koji leže distalno od CDR petlji kada je aminokiselinska sekvenca mesta vezivanja antigena značajno drugačija od one kod antitela D3H44. U drugom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji je ovde opisan sadrži heterodimere u kojima lambda Fab sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u VH i/ili VL domenima, koje pospešuju preferencijalno sparivanje i koje leže proksimalno ili distalno u odnosu na CDR petlje, kada je aminoskelinska sekvenca antigen-vezujućeg mesta suštinski slična toj sekvenci u CAT-2200 antitelu. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji je ovde opisan sadrži heterodimere u kojima kapa Fab sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u CL i/ili CH1 domenima, kao i modifikacije u VH i/ili VL domenima, koje pospešuju preferencijalno sparivanje.. U jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji je ovde opisan sadrži heterodimere u kojima lambda Fab sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u CL i/ili CH1 domenima, kao i modifikacije u VH i/ili VL domenima, koje pospešuju preferencijalno sparivanje.
[0339] U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije u H1, L1, H2 i L2 antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta mogu da pospeše preferencijalno sparivanje u polipeptidnom konstruktu koji vezuje antigen, gde je kapa Fab jednog parentalnog antitela humani ili humanizovani IgG1 / κ. Ograničavajući primeri takvih parentalnih antitela uključuju Ofatumumab (humani) ili Trastuzumab, ili Bevacizumab (humanizovan). U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije u H1, L1, H2 i L2 antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta mogu da pospeše preferencijalno sparivanje u polipeptidnom konstruktu koji vezuje antigen, gde je kapa Fab jednog parentalnog antitela humani ili humanizovani IgG1 / κ. Ograničavajući primeri takvih ljudskih antitela uključuju Briakinumab ili Sifalimumab, dok je primer humanizovanog antitela Brontictuzumab.
[0340] U drugom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije opisane ovde su transferabilne na imunoglobulin teških i lakih lanaca antitela koristeći najčešće korišćene VH i VL podgrupe.
[0341] U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije opisane ovde su transferabilne na imunoglobulinske teške i lake lance antitela koji imaju okvir blizu klicine linije. Primeri takvih antitela uključuju Obinutuzumab.
[0342] U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije opisane ovde su transferabilne na imunoglobulinske teške i lake lance antitela koja imaju VH: VL interdomain ugao blizu proseka uočenog za teške i lake lanca parova. Primer ove vrste antitela uključuje, ali nije ograničen na Pertuzumab. U drugom primeru izvođenja, aminokiselinske modifikacije opisane ovde su transferabilne na imunoglobulinske teške i lake lance antitela koja imaju kanonske CL i CH1 domene. Pogodni primeri takvih antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Trastuzumab.
[0343] Primeri, slike i tabele pokazuju da su aminokiselinske modifikacije (npr. Unutar jednog ili više fragmenata Fab-a koji sadrže promenljivu regiju i konstantnu regiju) koje pospešuju preferencijalno sparivanje transferabilne na druge imunoglobuline teške i lake lance, što rezultira sličnim obrascima preferencijalnog sparivanja jednog imunoglobulina teškog lanca sa jednim od dva imunoglobulinska laka lanca.
Nosači
[0344] Heterodimeri antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta mogu da se se povežu sa nosačem. Nosač može da bude peptid, polipeptid, polimer, nanočestica ili neki drugi hemijski entitet. Heterodimeri antigen-vezujući polipeptidnog konstrukta mogu da budu povezani ili sa N- ili C-terminusom polipeptidnog nosača, pri čemu je nosač polipeptid. U jednom primeru izvođenja, nosač je albuminski polipeptid.
[0345] U drugom primeru izvođenja, nosač je imunoglobulinski Fc (Fc) ili njegov deo. U nekim primerima izvođenja, Fc sadrži najmanje jednu ili dve sekvence CH3 domena. U nekim primerima izvođenja, Fc dalje sadrži najmanje jednu ili dve sekvence CH2 domena. U nekim primerima izvođenja antigen-vezujući polipeptidni konstrukt sadrži Fc koji je spojen, sa ili bez jednog ili više linkera, na prvi heterodimer i/ili drugi heterodimer. U nekim primerima izvođenja, Fc je humani Fc. U nekim primerima izvođenja, Fc je humani IgG ili IgG1 Fc. U nekim primerima izvođenja, Fc je heterodimerni Fc. U nekim primerima izvođenja, Fc je jedan polipeptid. U nekim primerima izvođenja, Fc je više peptida, npr. dva polipeptida.
[0346] U nekim primerima izvođenja, Fc sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u najmanje jednoj od sekvenci CH3 domena. Aminokiselinske modifikacije mogu da se naprav na imunoglobulinskom Fc kako bi se pokrenulo preferencijalno sparivanje između sekvenci heterodimernih CH3 domena u odnosu na sekvence homodimernih CH3 domena. Ove aminokiselinske modifikacije su poznate u stanju tehnike i uključuju, na primer, modifikacije opisane, u objaviSAD patenta br.
2012/0149876. Alternativne strategije za pokretanje preferencijalnog sparivanja sekvenci heterodimernih CH3 domena u odnosu na sekvence homodimernih CH3 domena, uključuju, na primer, "dugmad u rupe", naelektrisane ostatke sa jonskim interakcijama, a mogu da se koriste i tehnologije izmene domena inženjeringom u cilju razmene lanaca (SEED). Ove poslednje strategije su opisane u stanju tehnike i njihov pregled je dat u publikaciji Klein et al, supra. Dalja diskusija o Fc domenima sledi u nastavku teksta.
[0347] U nekim aspektima, Fc je Fc opisan u patentnim prijavama PCT/CA2011/001238 (WO 2012/058768), podnetoj 4. novembra 2011. ili PCT/CA2012/050780 (WO 2013/063702), podnetoj 2. novembra 2012. godine.
[0348] U nekim aspektima, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji je ovde opisan sadrži heterodimerni Fc koji sadrži modifikovani CH3 domen koji je asimetrično modifikovan. Heterodimerni Fc može da sadrži dva polipeptida konstantnog domena teškog lanca: prvi polipeptid teškog lanca i drugi polipeptid teškog lanca, koji se mogu koristiti naizmenično pod uslovom da Fc sadrži jedan prvi polipeptid teškog lanca i jedan drugi polipeptid teškog lanca. U principu, prvi polipeptid teškog lanca sadrži prvu CH3 sekvencu, a drugi polipeptid teškog lanca sadrži drugu CH3 sekvencu.
[0349] Dve CH3 sekvence koje sadrže jednu ili više aminokiselinskih modifikacija uvedenih na asimetričan način generalno rezultiraju heterodimernim Fc, a ne homodimerom, kada se dve CH3 sekvence dimeriziraju. Kao što se ovde koristi, "asimetrična aminokiselinska modifikacija" odnosi se na modifikaciju gde se aminokiselina na određenom položaju na prvoj CH3 sekvenci razlikuje od aminokiseline na drugoj CH3 sekvenci na istoj poziciji i prva i druga CH3 sekvenca se preferencijalno sparuju kako bi se formirao heterodimer, pre nego homodimer. Ova heterodimerizacija može da bude rezultat modifikacije samo jedne od dve aminokiseline na istom odgovarajućem položaju aminokiseline na svakoj sekvenci, ili različitih modifikacija obe aminokiseline na svakoj sekvenci na istoj odgovarajućoj poziciji na svakoj od prve i druge CH3 sekvence. Svaka od prve i druge CH3 sekvence heterodimernog Fc može da sadrži jednu ili više od jedne asimetričnih aminokiselinskih modifikacija.
[0350] Tabela X prikazuje aminokiselinsku sekvencu Fc sekvence humanog IgG1 koja odgovara aminokiselinama 231 do 447 celog teškog lanca humanog IgG1.Sekvenca CH3 sadrži aminokiseline 341-447 celog teškog lanca humanog IgG1.
[0351] Tipično, Fc može da sadrži dve susedne sekvence teškog lanca (A i B) koje su sposobne za dimerizovanje. U nekim aspektima, jedna ili obe sekvence Fc uključuju jednu ili više mutacija ili modifikacija na sledećim lokacijama: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400 i/ili N390, koristeći EU numeraciju. U nekim aspektima, Fc uključuje mutantnu sekvencu prikazanu u tabeli X. U nekim aspektima, FC uključuje mutacije varijante 1 AB. U nekim aspektima, Fc uključuje mutacije varijante 2 A-B. U nekim aspektima, Fc uključuje mutacije varijante 3 A-B. U nekim aspektima, Fc uključuje mutacije varijante 4 A-B. U nekim aspektima, Fc uključuje mutacije varijante 5 A-B.
[0352] U nekim primerima izvođenja, Fc sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u najmanje jednoj od sekvenci CH2 domena. Brojne modifikacije u Fc poznate su u stanju tehnike po tome što selektivno menjaju afinitet Fc antitela za različite Fcgama receptore. U nekim primerima izvođenja, Fc sadrži jednu ili više modifikacija za izmenu vezivanja Fc-gama receptora za antigen-vezujući polipeptidni konstrukt.
[0353] CH2 domen odgovara aminokiselinama 231-340 sekvence prikazane u tabeli X. Tipične, neograničavajuće aminokiselinske modifikacije koje menjaju sposobnost Fc antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta da se veže za Fc-gama receptore su navedene u nastavku teksta:
S298A/E333A/K334A, S298A/E333A/K334A/K326A (Lu Y, Vernes JM, Chiang N, et al. J Immunol Methods.2011 Feb 28;365(1-2):132-41);
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L,F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L
(Stavenhagen JB, Gorlatov S, Tuaillon N, et al. Cancer Res. 2007 Sep 15;67(18):8882-90; Nordstrom JL, Gorlatov S, Zhang W, et al. Breast Cancer Res.
2011 Nov 30;13(6):R123); F243L (Stewart R, Thom G, Levens M, et al. Protein Eng Des Sel. 2011 Sep;24(9):671-8.), S298A/E333A/K334A (Shields RL, Namenuk AK, Hong K, et al. J Biol Chem.2001 Mar 2;276(9):6591-604);
S239D/I332E/A330L, S239D/I332E (Lazar GA, Dang W, Karki S, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-10); S239D/S267E, S267E/L328F (Chu SY, Vostiar I, Karki S, et al. Mol Immunol.2008 Sep;45(15):3926-33);
S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/S298A/K326A/A327H, G237F/S298A/A330L/ I332E, S239D/I332E/S298A, S239D/K326E/A330L/I332E/S298A, G236A/S239D/D270L/I332 E, S239E/S267E/H268D, L234F/S267E/N325L, G237F/V266L/S267D i druge mutacije navedene u WO2011/120134 i WO2011/120135. Therapeutic Antibody Engineering (autora William R. Strohl i Lila M. Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1907568 37 9, Oct 2012) na strani 283 opisuje dodatne modifikacije u Fc koje utiču na vezivanje Fc za Fc-gama receptore.
Dodatne modifikacije za poboljšanje efektorske funkcije.
[0354] U nekim primerima izvođenja Fc antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta koji je ovde opisan može se modifikovati kako bi se poboljšala njegova efektorska funkcija. Takve modifikacije su poznate u stanju tehnike i uključuju afukozilaciju, ili konstruisanje afiniteta Fc dela antitela prema aktivirajućem receptoru, uglavnom FCGR3a za ADCC, i prema C1q za CDC. Sledeća tabela Y sumira različite dizajne prijavljene u literaturi za inženjering efektorske funkcije.
[0355] Tako, u jednom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji je ovde opisan može uključivati dimerni Fc koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija kao što je navedeno u gornjoj tabeli koje daju poboljšanu funkciju efektora. U drugom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt može biti afukoziliran kako bi se poboljšala funkcija efektora.
FcRn vezivanje i PK parametri
[0356] Kao što je poznato u stanju tehnike , vezivanje za FcRn reciklira endocitozovana antitela iz endosoma nazad u krvotok (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12: 181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18: 739-766). Ovaj proces, zajedno sa prekluzijom filtracije bubrega zbog velike veličine molekula pune dužine, rezultira povoljnim poluživotom antitela u serumu, u rasponu od jedne do tri nedelje. Vezivanje Fc za FcRn takođe igra ključnu ulogu u transportu antitela. Tako, u jednom primeru izvođenja, Fc sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija koje menjaju ili pospešuju sposobnost Fc da se veže za FcRn.
Linkeri
[0357] Konstrukti opisani ovde mogu da uključuju jedan ili više ovde opisanih heterodimera, operativno kuplovanih sa Fc koji je ovde opisan. U nekim aspektima, Fc je kuplovan sa jednim ili više heterodimera sa ili bez jednog ili više linkera. U nekim aspektima, Fc je direktno kuplovan sa jednim ili više heterodimera. U nekim aspektima, Fc je kuplovan sa jednim ili više heterodimera sa ili bez jednog ili više linkera. U nekim aspektima, Fc je kuplovan sa teškim lancem svakog heterodimera pomoću linkera.
[0358] U nekim aspektima, jedan ili više linkera su jedan ili više polipeptidnih linkera. U nekim aspektima, jedan ili više linkera sadrže jedan ili više zglobnih regiona antitela. U nekim aspektima, jedan ili više linkera sadrže jedan ili više IgG1 zglobnih regiona.
Dodatne opcione modifikacije
[0359] U jednom primeru izvođenja, imunoglobulinski teški i laki lanci antigenvezujućeg polipeptidnog konstrukta opisan ovde mogu se dalje modifikovati (tj. Kovalentnim vezivanje različitih vrsta molekula) tako da kovalentna vezivanje ne ometa preferencijalno sparivanje između teških lanaca i lakih lanaca ili utiče na sposobnost heterodimera da se veže za svoj antigen, ili uticati na njegovu stabilnost. Takva modifikacija uključuje, na primer, ali ne putem ograničenja, glikozilaciju, acetilaciju, pegilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatim zaštitnim / blokirajućim grupama, proteolitičko cepanje, vezu sa ćelijskim ligandom ili drugim proteinom, itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može se izvesti poznatim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formilaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd.
[0360] U drugom primeru izvođenja, imunoglobulinski teški i laki lanci antigenvezujućeg polipeptidnog konstrukta koji je ovde opisan može biti konjugiran (direktno ili indirektno) sa terapijskim agensom ili delom leka koji modifikuje dati biološki odgovor. U određenim primerima izvođenja antigen-vezujući polipeptidni konstrukt je konjugiran sa lekom, npr. Toksinom, hemoterapijskim sredstvom, imunim modulatorom ili radioizotopom. Nekoliko metoda pripreme ADC-a (konjugati antitelalek ili polipeptidni konjugati koji vezuju antigen) poznati su u stanju tehnike i opisani su u američkim patentima 8,624,003 (pot metoda), 8,163,888 (jedan korak) i 5,208,020 (metoda u dva koraka) na primer. U nekim primerima izvođenja, lek se bira iz majtanzina, auristatina, kaliheamicina ili njegovog derivata. U drugim primerima izvođenja, lek je majtanzin izabran iz DM1 i DM4.
[0361] U nekim primerima izvođenja antigen-vezujući polipeptidni konstrukt je konjugiran sa citotoksičnim agensom. Termin "citotoksični agens" koji se ovde koristi odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili uzrokuje uništavanje ćelija. Termin je namenjen da obuhvati radioaktivne izotope (npr. At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 i Lu177), hemoterapeutske agense i toksine kao što su toksini malih molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući fragmente i/ili njihove varijante.
[0362] Terapeutska sredstva ili delovi lekova ne treba tumačiti kao ograničeni na klasične hemijske terapijske agense. Na primer, deo leka može biti protein ili polipeptid koji poseduje željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu uključivati, na primer, toksin kao što su abrin, ricin A, Onkonaza (ili druga citotoksična RNaza), pseudomonas egzotoksin, toksin kolere ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora, alfa-interferon, beta-interferon, faktor rasta nerva, faktor rasta izveden iz trombocita, aktivator plazminogena tkiva, apoptotski agens, npr. TNF-alfa, TNF-beta, AIM I (vidi, Međunarodna publikacija br. WO 97/33899), AIM II (vidi, Međunarodna publikacija br. WO 97/34911), Fas Ligand (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567) i VEGI (vidi, Međunarodna publikacija br. WO 99/23105), trombotski agens ili anti-angiogeni agens, npr. Angiostatin ili endostatin; ili, modifikator biološkog odgovora kao što je, na primer, limfokin (npr. Interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulacije kolonije makrofaga granulocita ("GM-CSF") i faktor stimulacije kolonije granulocita ("G-CSF")), ili faktor rasta (npr. Hormon rasta ("GH")). Štaviše, u alternativnom izvođenju, antigen-vezujući polipeptidni konstrukt može biti konjugovan sa terapijskim delovima kao što su radioaktivni materijali ili makrociklični helatori korisni za konjugaciju radiometalnih jona (vidi gore za primere radioaktivnih materijala). U određenim primerima izvođenja, makrociklični helator je 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-N,N',N",N"-tetrasirćetna kiselina (DOTA) koja se može vezati za antitelo preko molekula linkera. Takvi molekuli linkera su poznati u stanju tehnike i opisani u Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res.
4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem.10:553; and Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol.26:943.
[0363] U nekim primerima izvođenja, imunoglobulinski teški i laki lanci antigenvezujućeg polipeptidnog konstrukta kprimirani su kao fuzioni proteini koji sadrže oznaku kako bi se olakšalo prečišćavanje i/ili testiranje itd. Kao što je ovde navedeno, "oznaka" je svaka dodata serija aminokiselina koje su obezbeđene u proteinu na bilo C-kraju, N-kraju, ili interno koji doprinosi identifikaciji ili prečišćavanju proteina. Pogodne oznake uključuju, ali nisu ograničene na oznake poznate stručnjacima oblasti da budu korisni u prečišćavanju i/ili testiranju, kao što su domen vezivanja albumina (ABD), njegova oznaka, FLAG oznaka, glutation-s-transferaza, hemaglutinin (HA) i maltoza vezujući protein. Takvi označeni proteini takođe mogu da se izmene inženjeringom tako da sadrže mesto cepanja, kao što je mesto cepanja za trombin, enterokinazu ili faktor X, radi lakšeg uklanjanja oznake pre, tokom ili nakon prečišćavanja.
Postupci pripreme antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata
[0364] Kao što je gore opisano, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti koji su ovde opisani mogu sadržavati prvi heterodimer i drugi heterodimer, prvi heterodimer koji sadrži imunoglobulinski teški lanac ili njegov fragment koji ima najmanje VH i CH1 domen, i imunoglobulinski lambda laki lanac koji ima VL domen i CL domen, a drugi heterodimer koji sadrži imunoglobulinski teški lanac ili njegov fragment koji ima najmanje VH i CH 1 domen, i laki lanac imunoglobulin kapa koji ima VL domen i CL domen. Polipeptidne sekvence imunoglobulina su dizajnirane da uključe aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje kao što je ovde opisano. Shodno tome, u slučaju bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta, obično postoje četiri različite polipeptidne sekvence, dve polipeptidne sekvence imunoglobulinskog teškog lanca ili njihovi fragmenti i dve polipeptidne sekvence imunoglobulinskog lakog lanca , koje čine antigen-vezujući polipeptidni konstrukt. Polipeptidne sekvence imunoglobulinskog teškog lanca i polipeptidne sekvence imunoglobulinskog lakog lanca antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta mogu se lako pripremiti korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK poznate u ovoj tehnici. Standardne tehnike kao što su, na primer, one opisane u Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3rd ed., 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2nd ed., 1989); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., John Wiley and Sons, New York, 4th ed., 1999); and Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 2nd ed., 1998) mogu se koristiti za metode rekombinantne nukleinske kiseline, sintezu nukleinskih kiselina, ćelijsku kulturu, inkorporaciju transgena i ekspresiju rekombinantnih proteina.
[0365] Polinukleotidne i aminokiselinske sekvence imunoglobulina teških i lakih lanaca matičnih antitela koji čine antigen-vezujući polipeptidni konstrukt su ili poznati u stanju tehnike ili se mogu lako odrediti korišćenjem metoda sekvenciranja nukleinskih kiselina i/ili proteina.
[0366] Shodno tome, takođe su obezbeđeni polinukleotidi ili skup polinukleotida koji kodiraju imunoglobulinske teške i lake lance antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta. Takvi polinukleotidi uključuju DNK i RNK u jednolančanom i dvolančanom obliku, kao i odgovarajuće komplementarne sekvence. DNK uključuje, na primer, cDNK, genomsku DNK, hemijski sintetizovanu DNK, DNK umnoženu PCR-om i njihove kombinacije. Polinukleotidi uključuju gene pune dužine ili molekule cDNK, kao i kombinaciju njihovih fragmenata.
[0367] Polinukleotidi koji kodiraju inženjeringom kreirane polipeptide teškog i lakog imunoglobulinskog lanca opisane ovde, mogu se pripremiti mesto-specifičnom mutagenezom nukleotida u DNK koja kodira polipeptid, koristeći kasetu ili PCR mutagenezu ili druge tehnike dobro poznate u stanju tehnike, kako bi se proizvela DNK koja kodira inženjeringom kreirane polipeptide teškog i lakog imunoglobulinskog lanca, i nakon toge, ekspresijom rekombinantne DNK u ćelijskoj kulturi kao što je ovde ukratko objašnjeno. Međutim, polinukleotidi koji kodiraju inženjeringom dobijene polipeptide teškog i lakog imunoglobulinskog lanca mogu se takođe pripremiti sintezom gena in vitro korišćenjem ustanovljenih tehnika.
[0368] Kao što će razumeti stručnjaci u oblasti, zbog izrođenosti genetskog koda, može se napraviti izuzetno veliki broj polinukleotida, od kojih svi kodiraju inženjeringom izmenjene polipeptide teškog i lakog lanca imunoglobulina koji su ovde opisani. Tako, pošto su identifikovali određenu aminokiselinsku sekvencu, stručnjaci u oblasti mogli bi da naprave bilo koji broj različitih polinukleotida, jednostavnim modifikacijom sekvence jednog ili više kodona na način koji ne menja aminokiselinsku sekvencu kodiranog proteina.
[0369] Takođe su obezbeđeni sistemi ekspresije i konstrukti u obliku plazmida, ekspresionih vektora, transkripcije ili ekspresionih kaseta koje sadrže najmanje jedan polinukleotid kao što je prethodno u tekstu objašnjeno. Takođe su obezbeđene ćelijedomaćini koje sadrže takve ekspresione sisteme ili konstrukte.
[0370] Tipično, vektori ekspresije koji se koriste u ćelijama domaćina će sadržavati sekvence za održavanje plazmida i za kloniranje i ekspresiju egzogenih nukleotidnih sekvenci. Takve sekvence, koje se zajednički nazivaju "bočne sekvence", u određenim primerima izvođenja obično uključuju jednu ili više od sledećih nukleotidnih sekvenci: promotor, jedna ili više nhenserskih esekvenci, poreklo replikacije, transkripcijski prestanak sekvence, kompletna intronska sekvenca koja sadrži donatora i akceptora spajanja, sekvenca koja kodira lidersku sekvencu za sekreciju polipeptida, mesto vezivanja ribozoma, poliadenilaciona sekvenca, polilinker region za inserciju polinukleotida koji kodira polipeptid koji se eksprimira i element markera koji se može odabrati. Vektor može da bude multicistronskitj.takav da eksprimira dva ili više od polinukleotida koji kodiraju imunoglobulinske teške i lake lance antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta, ili set vektora može da eksprimira antigen-vezujući polipeptidni konstrukt, pri čemu svaki vektor eksprimira jedan ili više polinukleotida. Antigen-vezujući polipeptidni konstrukt takođe može da se eksprimira ako se koristi set vektora koji sadrži kombinaciju multicistronskih vektora i vektora koji sadrže samo jedan polinukleotid koji kodira jedan od imunoglobulinskih teških i lakih lanaca.
[0371] U nekim primerima izvođenja, vektor može sadržavati sekvencu koja kodira "oznaku", tj. oligonukleotidni molekul koji se nalazi na 5 'ili 3' kraju sekvence koja kodira polipeptid; oligonukleotidna sekvenca kodira poliHis (kao što je heksaHis), ili neku drugu "oznaku" kao što su FLAG, HA (hemaglutinin virusa gripa) ili myc, za koje postoje komercijalno dostupna antitela. Ova oznaka se obično fuzioniše sa polipeptidom nakon ekspresije polipeptida i može da služi kao sredstvo za afinitetno prečišćavanje ili detekciju polipeptida iz ćelije-domaćina. Afinitetno prečišćavanje može da se postigne, na primer, hromatografijom na koloni u kojoj se kao afinitetni matriks koriste antitela protiv oznake. Opciono, oznaka može naknadno da se ukloni iz prečišćenog polipeptida na različite načine, kao što je cepanje peptidazom.
[0372] Vektori obično sadrže promotor koji je prepoznat od strane organizma domaćina i operativno povezan sa polinukleotidom koji kodira polipeptid. Promotori su netranskribovane sekvence koje se nalaze uzvodno (tj. 5 ') do početnog kodona strukturnog gena (uglavnom unutar oko 100 do 1000 bp) koji kontrolišu transkripciju strukturnog gena. Promoteri su konvencionalno grupisani u jednu od dve klase: inducibilni promoteri i konstitutivni promoteri. Inducibilni promotori iniciraju povećane nivoe transkripcije iz DNK pod njihovom kontrolom kao odgovor na neke promene u uslovima kulture, kao što je prisustvo ili odsustvo hranljivih materija ili promena temperature. Konstitutivni promotori, s druge strane, ravnomerno transkribuju gen na koji su operativno povezani, to jest, sa malo ili nimalo kontrole nad ekspresijom gena. Veliki broj promotora, prepoznatih od strane različitih potencijalnih ćelija domaćina, dobro je poznat.
[0373] Pogodni promotori za upotrebu sa domaćinima kvasca, bakterijskim domaćinima i domaćinima insekata dobro su poznati u stanju tehnike. Enhenseri kvasca se povoljno koriste sa promotorima kvasca. Pogodni promotori za upotrebu sa ćelijama domaćina sisara su dobro poznati i uključuju, ali nisu ograničeni na, one dobijene iz genoma virusa kao što su virus polioma, virus boginja, adenovirus (kao što je adenovirus 2), virus goveđeg papiloma, virus ptičjeg sarkoma, citomegalovirus, retrovirusi, virus hepatitisa B i najpoželjnije Simian Virus 40 (SV40). Ostali pogodni promotori sisara uključuju heterologe promotore sisara, na primer, promotore toplotnog šoka i promotor aktina.
[0374] Vektor može sadržavati jedan ili više elemenata koji olakšavaju ekspresiju kada je vektor integrisan u genom ćelije domaćina. Primeri uključuju element EASE (Aldrich et al. 2003 Biotechnol Prog. 19: 1433-38) i region vezivanja matrice (MAR). MARs posreduju strukturnu organizaciju hromatina i mogu izolovati integrisani vektor od efekata "pozicije". Dakle, MAR-ovi su posebno korisni kada se vektor koristi za stvaranje stabilnih transfektanata. Veliki broj prirodnih i sintetičkih nukleinskih kiselina koje sadrže MAR su poznati u stanju tehnike , na primer, SAD Pat. br. 6,239,328; 7,326,567; 6,177,612; 6,388,066; 6,245,974; 7,259,010; 6,037,525; 7,422,874; 7,129,062.
[0375] Nakon što je vektor konstruisan i polinukleotid je ubačen u odgovarajuće mesto vektora, završeni vektor može biti umetnut u odgovarajuću ćeliju domaćina za amplifikaciju i/ili ekspresiju polipeptida. Transformacija ekspresionih vektora u odabranu ćeliju domaćina može se postići poznatim metodama, uključujući transfekciju, infekciju, ko-precipitaciju kalcijum fosfata, elektroporaciju, mikroinjekciju, lipofekciju, DEAE-dekstran posredovanu transfekciju ili druge poznate tehnike. Izabrani metod će delimično biti funkcija tipa ćelije domaćina koji će se koristiti. Ćelijedomaćini mogu da budu transfektovane privremeno ili ćelije domaćina mogu da budu transfektovane stabilno. Ove metode i druge pogodne metode su dobro poznate stručnjaku u oblasti, a izložene su, na primer, u Sambrook et al., 2001, supra.
[0376] Za dugoročnu proizvodnju rekombinantnih proteina sa visokim prinosom, često se prednost daje stabilnoj ekspresiji. Na primer, mogu se pripremiti ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju konstruisane teške i lake lance antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta. Umesto da koriste vektore ekspresije koji sadrže virusno poreklo replikacije, ćelije domaćina mogu se transformisati DNK kontrolisanim odgovarajućim elementima kontrole ekspresije (npr. promotor, nhensere, sekvence, terminatori transkripcije, mesta poliadenilacije, itd.) i marker koji se može odabrati. Nakon uvođenja strane DNK ili polinukleotida, konstruisanim ćelijama je dozvoljeno da rastu 1-2 dana u obogaćenom medijumu, a zatim se prebacuju na selektivni medijum. Marker koji se može odabrati u rekombinantnom plazmidu obezbeđuje rezistenciju na selekciju i omogućava ćelijama da stabilno integrišu plazmid u svoje hromozome i rastu kako bi formirali žarišta koja se zauzvrat mogu klonirati i proširiti u ćelijske linije.
[0377] Mogu se koristiti brojni sistemi selekcije, uključujući, ali ne ograničavajući se na timidin kinazu virusa herpes simpleksa (Vigler et al., 1977, Cell 11: 223), hipoksantin-guanin fosforiboziltransferazu (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) i adenin fosforiboziltransferazu (Lovi et al., 1980, Cell 22: 817) geni se mogu koristiti u tk-, hgprt- ili aprt-ćelijama, respektivno. Takođe, rezistencija na antimetabolite može da se koristi kao osnova selekcije za gen dhfr, koji obezbeđuje rezistenciju na metotreksat (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare et al., 1981 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, koji obezbeđuje rezistenciju na mikofenolnu kiselinu (Mulligan & Berg, 1981 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, koji obezbeđuje rezistenciju na aminoglikozid G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981 , J. Mol. Biol. 150: 1); i higro, koji obezbeđuje rezistenciju na higromicin (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).
[0378] Ćelija domaćin, kada se gaji pod odgovarajućim uslovima, proizvodi antigenvezujući polipeptidni konstrukt koji se naknadno može prikupiti iz medijuma za kulturu (ako ga ćelija domaćina izlučuje u medijum) ili direktno iz ćelije domaćina koja ga proizvodi (ako se ne izlučuje). Izbor odgovarajuće ćelije domaćina će zavisiti od različitih faktora, kao što su željeni nivoi ekspresije, polipeptidne modifikacije koje su poželjne ili neophodne za aktivnost (kao što su glikozilacija ili fosforilacija) i lakoća savijanja u biološki aktivan molekul. Ćelija domaćina može biti eukariotska ili prokariotska. Na primer, ekspresija u bakterijskom sistemu će proizvesti neglikozilovani proizvod, a ekspresija u kvascu će proizvesti glikozilovani proizvod. Mogu se koristiti eukariotske ćelije domaćina koje poseduju ćelijsku mašineriju za pravilnu obradu primarnog transkripta (npr. glikozilacija i fosforilacija) genskog proizvoda.
[0379] Sisarske ćelijske linije dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u stanju tehnike i uključuju, ali nisu ograničene na, imortalizovane ćelijske linije koje je moguće nabaviti od organizacije American Type Culture Collection (ATCC) i sve ćelijske linije koje se koriste u ekspresionim sistemima poznatim u stanju tehnike, mogu da se koriste za pravljenje rekombinantnih polipeptida opisanih u ovom dokumentu. U principu, ćelije-domaćini se transformišu rekombinantnim ekspresionim vektorom koji sadrži DNK koja kodira antigen-vezujući polipeptidni konstrukt. Među ćelijama-domaćinima koje mogu da se koriste su ćelije prokariota, kvasaca ili viših eukariota. Prokarioti uključuju gram negativne ili gram pozitivne organizme, na primer E. coli ili bacile. Ćelije viših eukariota uključuju ćelije insekata i uspostavljene ćelijske linije sisarskog porekla. Primeri pogodnih sisarskih ćelija domaćina uključuju COS-7 liniju majmunskih bubrežnih ćelija (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23: 175), L ćelije, C127 ćelije, 3T3 ćelije (ATCC CCL 163), ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ili njihovi derivati kao što su Veggie CHO i srodne ćelijske linije koje rastu u medijima bez seruma (Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31), HeLa ćelije, BHK (ATCC CRL10) ćelijske linije i ćelijska linija CV1/EBNA izvedena iz ćelijske linije bubrega afričkog zelenog majmuna CV1 (ATCC CCL 70) kako je opisano u McMahan et al., 1991, EMBO J.10: 2821, humane embrionalne ćelije bubrega kao što su 293, 293 EBNA ili MSR 293, humane epidermalne A431 ćelije, humane Colo205 ćelije, druge transformisane ćelijske linije primata, normalne diploidne ćelije, ćelijski sojevi izvedeni iz in vitro kulture primarnog tkiva, primarni eksplanti, HL-60, U937, HaK ili Jurkat ćelije. Alternativno, moguće je proizvesti polipeptid u nižim eukariotima kao što je kvasac ili u prokariotima kao što su bakterije. Pogodni kvasci uključuju sojeve Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyce , Candida, ili bilo koji soj kvasca koji može da eksprimira heterologe polipeptide. Pogodni bakterijski sojevi uključuju Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ili bilo koji bakterijski soj koji može da eksprimira heterologe polipeptide.
[0380] Ako se antigen-vezujući polipeptidni konstrukt proizvodi u kvascu ili bakterijama, može da bude poželjno da se u njima proizvedeni proizvod modifikuje, na primer fosforilacijom ili glikozilacijom odgovarajućih mesta, kako bi se dobio funkcionalni proizvod. Dodavanje tih kovalentno vezanih dodaci mogu da se postignu korišćenjem poznatih hemijskih ili enzimskih metoda. Antigen-vezujući polipeptidni konstrukt takođe može biti proizveden operativnim povezivanjem skupa polinukleotida sa odgovarajućim kontrolnim sekvencama u jednom ili više ekspresionih vektora insekata i upotrebom sistema za ekspresiju insekata. Materijali i metode za sisteme ekspresije bakulovirus/insekatske ćelije, komercijalno su dostupni u obliku kompleta dostupnih od kompanija, npr. Invitrogen, San Diego, Kalifornija, SAD (MaxBac<™>komplet), a ove metode su dobro poznate u stanju tehnike, kao što je opisano u Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555 (1987) i Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Odgovarajući vektori za kloniranje i ekspresiju za upotrebu sa ćelijama-domaćinima bakterija, gljiva, kvasaca i sisara opisuju autori Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985).
[0381] U određenim primerima izvođenja, ne-ćelijski sistemi za ekspresiju proteina mogu da se koriste za koekspresiju polipeptida (npr. polipeptida teškog i lakog lanca) sa skupa polinukleotida, bez upotrebe živih ćelija. Umesto u ćelijama, sve komponente potrebne da se DNK transkribuje u RNK i RNK translatira u protein (npr. ribozomi, tRNK, enzimi, kofaktori, aminokiseline) obezbeđene su u rastvoru za upotrebu in vitro.U određenim primerima izvođenja, in vitro ekspresija zahteva (1) genetički matricu (iRNK ili DNK) koji kodira polipeptide teškog i lakog lanca i (2) reakcijski rastvor koji sadrži neophodne transkripcijske i translacijske molekularne mašinerije. U određenim primerima izvođenja, ćelijski ekstrakti značajno snabdevaju komponente reakcionog rastvora, na primer: RNK polimeraze za transkripciju iRNK, ribozomi za polipeptidnu translaciju, tRNK, aminokiseline, enzimski kofaktori, izvor energije i ćelijske komponente neophodne za pravilno savijanje proteina. Sistemi za ekspresiju proteina bez ćelija mogu se pripremiti korišćenjem lizata izvedenih iz bakterijskih ćelija, ćelija kvasca, ćelija insekata, biljnih ćelija, ćelija sisara, ljudskih ćelija ili njihovih kombinacija. Takvi ćelijski lizati mogu da obezbede tačan sastav i proporciju enzima i gradivnih blokova potrebnih za translaciju. U nekim primerima izvođenja, ćelijske membrane se uklanjaju da napuste samo citosolne i organele komponente ćelije.
[0382] Nekoliko ne-ćelijskih sistema za ekspresiju proteina poznato je u stanju tehnike, kao što se vidi iz pregleda u Carlson et al. (2012) Biotechnol. Adv.30:1185-1194. Na primer, dostupni su ne-ćelijski sistemi za ekspresiju proteina na bazi prokariotskih ili eukariotskih ćelija. Primeri prokariotskih ne-ćelijskih ekspresionih sistema uključuju sisteme iz E. coli.Dostupni su eukariotski ne-ćelijski sistemi za ekspresiju proteina na bazi ekstrakata iz zečjih retikulocita, pšeničnih klica i ćelija insekata, na primer. Takvi prokariotski i eukariotski ne-ćelijski sistemi za ekspresiju proteina komercijalno su dostupni od kompanija kao što su Roche, Invitrogen, Qiagen i Novagen. Stručnjak u oblasti bi lako mogao da izabere pogodne ne-ćelijske sisteme za ekspresiju proteina koji bi proizveli polipeptide (npr. polipeptide teškog lanca i lakog lanca) koji su u stanju da se međusobno upare. Dalje, ne-ćelijski sistem za ekspresiju proteina može da se dopuni i šaperonima (npr. BiP) i izomerazama (npr. disulfid izomeraza), kako bi se poboljšala efikasnost IgG savijanja.
Koekspresija teških lanaca i lakih lanaca
[0383] Konstruisani imunoglobulinski teški lanci i laki lanci antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta opisan ovde mogu da budu koeksprimirani u sisarskim ćelijama, kao što je navedeno prethodno u tekstu. U jednom primeru izvođenja, imunoglobulinski teški lanci i imunoglobulinski laki lanci antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta su koeksprimirani u ćeliji-domaćinu. Dakle, u slučaju bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta, dva imunoglobulinska teška lanca i dva imunoglobulinska laka lanca su koeksprimirani u ćeliji-domaćinu. Međutim, u stanju tehnike su poznati i alternativni postupci za proizvodnje bispecifičnih antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata koji se ne oslanjaju na upotrebu jedne klonske ili tranzitorne ćelijske linije koja eksprimira sva četiri lanca (Gramer, et al. (2013) mAbs 5, 962; Strop et al. (2012) J Mol Biol 420, 204.). Ovi postupci se oslanjaju na postprodukcijsku razmenu, u redoks uslovima, ruku dva para lakog i teškog lanca koji su uključeni u formiranje bispecifičnih antitela (Redoks proizvodnja). U ovom pristupu H1L1 i H2L2 heterodimeri mogu da se eksprimiraju u dve različite ćelijske linije kako bi se nezavisno proizvela dva heterodimera. Nakon toga, dva heterodimera se mešaju pod odabranim redoks uslovima kako bi se postigla ponovna asocijacija dva jedinstvena teška lanca H1 i H2, kako bi se formirao bispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji sadrži H1L1H2L2.
[0384] Iako je preferencijalno sparivanje vođeno uglavnom inkorporacijom aminokiselinskih modifikacija Mab dizajna u polipeptide teškog i imunoglobulinskog lakog lanca , količina pravilno sparenih heterodimera može dalje da se optimizuje variranjem međusobnog odnosa polinukleotida koji kodiraju svaki polipeptid, kao što je prikazano u primerima.
Testiranje antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata
[0385] Kao što je opisano, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti sadrže prvi heterodimer koji sadrži H1 i L1, kao i drugi heterodimer koji sadrži H2 i L2, gde je L1 lambda laki lanac, a L2 je kapa laki lanac, i H1 i H2 su međusobno različiti. Kao što je ovde opisano, jedan ili više H1, L1, H2 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2 i H2 sa L2 u poređenju sa L1. Prvi Fab region H1L1 heterodimer i drugi Fab region H2L2 heterodimer su u stanju da se vezuju za antigen sa afinitetom koji je sličan odgovarajućem wt prvi Fab regionu ili wt drugom Fab regionu. Prvi Fab region H1L1 heterodimer i drugi Fab region H2L2 heterodimer takođe pokazuju toplotnu stabilnost koja je uporediva sa onom iz odgovarajućeg wt prvog Fab regiona ili wt drugog Fab regiona.
[0386] Afinitet svakog heterodimera heterodimernog para za odgovarajući antigen može se testirati kao što je opisano u nastavku. Termička stabilnost svakog heterodimera para heterodimera takođe se može testirati kao što je opisano u nastavku.
[0387] U jednom primeru izvođenja, jedan teški lanac je koeksprimiran sa dva različita laka lanca u LCCA dizajnu setu kao što je gore opisano, gde je teški lanac preferencijalno parova sa jednim od dva laka lanca. U drugom primeru izvođenja, dva jedinstvena teška lanca su eksprimirana sa dva jedinstvena laka lanca, gde se svaki teški lanac preferencijalno uparuje sa jednim od lakih lanaca.
Metode za merenje preferencijalnog sparivanja
[0388] Stepen preferencijalnog sparivanja može se proceniti, na primer, korišćenjem metoda opisanih u nastavku i u primerima. Preferencijalno sparivanje može se proceniti u kontekstu LCCA dizajn setova (H1L1L2, ili H2L1L2) ili Mab dizajn setova (H1L1H2L2).
[0389] U jednom primeru izvođenja, test Light Chain Competition Test (LCCA) može da se koristi za procenu preferencijalnog sparivanja u kontekstu LCCA dizajn setova. Prijava patenta u suvlasništvu PCT/US2013/063306 (WO 2014/055784), podneta 3. oktobra 2013. godine, opisuje različite primere izvođenja LCCA. Metoda omogućava kvantitativnu analizu sparivanja teških lanaca sa specifičnim lakim lancima u mešavini koeksprimiranih proteina i može se koristiti za utvrđivanje da li se jedan određeni imunoglobulinski teški lanac selektivno povezuje sa bilo kojim od dva laka imunoglobulinska lanca, kada su teški lanac i laki lanci koeksprimirani. Metoda je ukratko opisana na sledeći način: Najmanje jedan teški lanac i dva različita laka lanca su koeksprimirani u ćeliji, u odnosima tako da je teški lanac ograničavajući reaktant za sparivanje. Teški lanci i laki lanci mogu da budu označeni kako bi se olakšala detekcija. Izlučeni proteini mogu se odvojiti od ćelije, a polipeptidi imunoglobulinskog lakog lanca vezani za teški lanac izolovani su od drugih izlučenih proteina kako bi se proizvela izolovana frakcija teškog lanca. Zatim se detektuje količina svakog različitog lakog lanca u izolovanoj frakciji teškog lanca, a analizira se relativna količina svakog različitog lakog lanca u izolovanoj frakciji teškog lanca kako bi se utvrdila sposobnost teškog lanca da se selektivno upari sa jednim od lakih lanaca. Dalji detalji u vezi sa izvođenjem ove metode su dati u primerima.
[0390] U drugom primeru izvođenja, preferencijalno sparivanje se procenjuje u kontekstu Mab dizajn setova, gde su H1, L1, H2 i L2 koeksprimirani. U ovom izvođenju, jedan ili više H1, L2, H2, i L2 mogu biti označeni kako bi se olakšale detekcija i analiza. Dobijene vrste uparenih teških lanaca i lakih lanaca procenjuju se korišćenjem LCMS (tečna hromatografija - masena spektrometrija), na osnovu razlika u molekulskoj težini svake vrste. Test antigenske aktivnosti takođe se može koristiti za kvantifikaciju relativnih heterodimernih populacija koje sadrže svaki laki lanac, pri čemu bi se stepen merenja vezivanja (u odnosu na kontrole) koristio za procenu svake odgovarajuće heterodimerne populacije.
Termička stabilnost
[0391] Termička stabilnost heterodimera može se odrediti prema metodama poznatim u stanju tehnike . Temperatura topljenja svakog heterodimera ukazuje na njegovu termičku stabilnost. Tačka topljenja heterodimera može se meriti korišćenjem tehnika kao što su diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (Chen et al (2003) Pharm Res 20: 1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68: 47-52). Alternativno, termička stabilnost heterodimera može se meriti korišćenjem kružnog dikroizma (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40: 343-9).
Afinitet za antigen
[0392] Vezujući afinitet heterodimera za njihove antigene i off-rate interakcije može se odrediti konkurentnim vezujućim testovima prema metodama dobro poznatim u stanju tehnike. Jedan od primera kompetitivnog testa vezivanja je radioimunotest koji sadrži inkubaciju obeleženog antigena (npr. 3H ili 125I sa molekulom od interesa (npr. Heterodimeri opisani ovde) u prisustvu sve većih količina neobeleženog antigena i detekcije molekula vezanog za obeleženi ligand. Afinitet heterodimera za antigen i vezivanje off-rate može se odrediti iz podataka o zasićenju Scatchard analizom.
[0393] Kinetički parametri heterodimera opisanog ovde mogu se odrediti i korišćenjem površinske plazmonske rezonance (SPR) zasnovanih na testovima poznatim u stanju tehnike (npr. BIAcore kinetička analiza). Za pregled tehnologije zasnovane na SPR-u pogledajte Mullet et al., 2000, Metode 22: 77-91; Dong et al., 2002, Pregled u Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et al., 1998, Trenutno mišljenje u biotehnologiji 9: 97-101; Rich et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61. Pored toga, bilo koji od SPR instrumenata i metoda zasnovanih na SPR-u za merenje interakcija proteina i proteina opisanih u US Pat. br.6,373,577; 6,289,286; 5,322,798; 5,341,215; 6,268,125 su predviđeni u metodama pronalaska. FACS se takođe može koristiti za merenje afiniteta, kao što je poznato u stanju tehnike .
Farmaceutske kompozicije
[0394] Ovde su takođe obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže antigenvezujuće polipeptidne konstrukte koji su ovde opisani. Ove kompozicije sadrže terapeutski efikasnu količinu antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta i farmaceutski prihvatljiv nosač. U specifičnom primeru izvođenja, termin "farmaceutski prihvatljiv" znači odobren od strane regulatorne agencije savezne ili državne vlade ili naveden u Farmakopeji SAD ili nekoj drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, i, konkretnije, kod ljudi. Termin "nosač" se odnosi na razblaživači, adjuvans, pomoćnu supstancu ili vehikulum sa kojim se terapeutik primenjuje. Takvi farmaceutski nosači mogu da budu sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući ulja naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su ulje od kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Voda je poželjan nosač kada se farmaceutska kompozicija primenjuje intravenski. Slani rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerola mogu da se koriste kao tečni nosači, posebno za injekcione rastvore. Pogodni farmaceutski ekscipijensi uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Kompozicija, po želji, može da sadrži i manje količine sredstava za vlaženje ili emulgaciju ili sredstava za puferovanje pH. Ove kompozicije mogu da budu u obliku rastvora, suspenzija, emulzije, tableta, pilula, kapsula, praha, formulacija sa produženim oslobađanjem i slično. Kompozicija može da se formuliše kao supozitorija, sa tradicionalnim vezujućim sredstvima i nosačima kao što su trigliceridi. Oralna formulacija može da uključuje standardne nosače kao što su manitol, laktoza, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celuloza, magnezijum karbonat, itd. farmaceutske klase, Primeri pogodnih farmaceutskih nosača opisani su u "Remington's Pharmaceutical Sciences" autora E. W. Martin. Ove kompozicije će sadržati terapeutski efikasnu količinu jedinjenja, poželjno u prečišćenom obliku, zajedno sa pogodnom količinom nosača, kako bi se obezbedio oblik za pravilnu primenu kod pacijenta. Formulacija treba da odgovara načinu primene.
[0395] U određenim primerima izvođenja, kompozicija koja sadrži antigen-vezujući polipeptidni konstrukt formulisana je u skladu sa rutinskim procedurama, kao farmaceutska kompozicija prilagođena za intravensku primenu kod ljudi. Obično su kompozicije za intravensku primenu rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Kada je neophodno, kompozicija može da sadrži i solubilizacioni agens i lokalni anestetik kao što je lignokain, kako bi se ublažio bol na mestu injeciranja. U principu, sastojci se dostavljaju ili odvojeno ili pomešani u obliku jedinične doze, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili bezvodni koncentrat u hermetički zatvorenom kontejneru, kao što je ampula ili sašeta koja daje oznaku količine aktivnog agensa. Kada treba da se primeni infuzijom, kompozicija može da se dostavi uz pomoć infuzione boce koja sadrži sterilnu vodu ili fiziološki rastvor farmaceutske klase. Kada se kompozicija primenjuje pomoću injekcije, može da se obezbedi ampula sterilne vode za injekcije ili fiziološkog rastvora, kako bi sastojci mogli da se pomešaju pre primene.
[0396] U određenim primerima izvođenja, kompozicije opisane u ovom dokumentu su formulisane kao neutralne ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju one formirane sa anionima kao što su one izvedene iz hlorovodoničke, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline, itd., I one formirane sa kationima kao što su one izvedene iz natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, željeznog hidroksida izopropilamina, trietilamina, 2-etilamin etanola, histidina, prokaina itd.
[0397] Količina ovde opisanog sastava koji će biti efikasan u lečenju, inhibiciji i prevenciji bolesti ili poremećaja povezanog sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću terapeutskog proteina može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama. Pored toga, opciono mogu da se koriste in vitro testovi za identifikaciju optimalnih opsega doza. Tačna doza koja će se koristiti u formulaciji će takođe zavisiti od načina primene, i ozbiljnosti bolesti ili poremećaja, i treba da se odluči u skladu sa procenom lekara i okolnostima svakog pacijenta. Efikasne doze se ekstrapoliraju iz krivih zavisnosti odgovora od doze izvedenih iz sistema za testiranje in vitro ili na bazi životinjskih modela.
Antigen-vezujući polipeptidni konstrukti
[0398] Kao što je gore opisano, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti opisani ovde se dobijaju iz parentalnih antitela gde svaki heterodimer antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta odgovara jednom od parentalnih antitela, i projektovan je da uključi aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje teških i lakih lanaca imunoglobulina koji čine heterodimere. Shodno tome, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti koji su ovde opisani mogu se koristiti u lečenju ili prevenciji iste bolesti, poremećaja ili infekcije za koju se koristi parentalno antitelo ili kombinacija parentalnih antitela.
[0399] U drugom primeru izvođenja, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti koji su ovde opisani mogu se koristiti i u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima poznatim u stanju tehnike za lečenje ili prevenciju raka, autoimunih bolesti, inflamatornih poremećaja ili zaraznih bolesti. U specifičnom izvođenju, antigen-vezujući polipeptidni konstrukti koji su ovde opisani mogu se koristiti u kombinaciji sa monoklonskim ili himernim antitelima, limfokinima ili hematopoetskim faktorima rasta (kao što su, na primer, IL-2, IL-3 i IL-7), koji, na primer, služe za povećanje broja ili aktivnosti efektorskih ćelija koje su u interakciji sa molekulima i povećavaju imuni odgovor. Antigen-vezujući polipeptidni konstrukti koji su ovde opisani mogu se koristiti i u kombinaciji sa jednim ili više lekova koji se koriste za lečenje bolesti, poremećaja ili infekcije, kao što su, na primer, antikancerogeni agensi, antiinflamatorni agensi ili antivirusni agensi.
Generisanje bispecifičnih antitela pomoću biblioteke Mab dizajn setova
[0400] U jednom primeru izvođenja, Mab dizajn setovi opisani ovde mogu da se koriste za proizvodnju bispecifičnih antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata. Ovde opisani Mab dizajn setovi mogu se koristiti u obliku biblioteke Mab dizajn setova, gde biblioteka Mab dizajn setova sadrži Mab dizajn setove koji pokazuju korisnost pri pospešivanju preferencijalnog sparivanja u cilju formiranje bispecifičnih antigenvezujućih polipeptidnih konstrukata. U jednom primeru izvođenja, biblioteke Mab dizajn setova su predstavljene Mab dizajn setovima uključenim u tabelu 4A i tabelu 4B. U jednom primeru izvođenja, biblioteka Mab dizajn setova su predstavljene Mab dizajn setovima u jednoj ili više od tabela 10-A1 do 10-A12, i 10-B1 do 10-B10. U drugom primeru izvođenja, biblioteka Mab dizajn setova je predstavljena jednom ili više od tabela 10-A1 do 10-A12. U jednom primeru izvođenja, biblioteka Mab dizajn setova je predstavljena jednom ili više od tabela 10-B1, 10-B2, 10-B3, 10-B4, 10-B6, 10-B8 i 10-B10. Biblioteka Mab dizajn setova može da se koristi za proizvodnju antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta polazeći od dva parentalna antitela (tj. Mab1 i Mab2) na sledeći način. Radi ilustracije, Mab1 sadrži lambda Fab i sadrži polipeptid H1 imunoglobulinskog teškog lanca i polipeptid L1 imunoglobulinskog lakog lanca, dok Mab2 sadrži kapa Fab i sadrži polipeptid H2 imunoglobulinskog teškog lanca i polipeptid L2 imunoglobulinskog lakog lanca.
[0401] Aminokiselinske modifikacije Mab dizajn seta (H1L1H2L2) u biblioteci Mab dizajn setova uvode se u imunoglobulinski teški i laki lanac Mab1 (H1 i L2) i imunoglobulinski teški i laki lanac Mab2 (H2 i L2). H1, L1, H2 i L2 se zatim koeksprimiraju i određuje se količina pravilno sparenog bispecifičnog antigenvezujućeg polipeptidnog konstrukta. Jedan ili više Mab dizajn setova biblioteke Mab dizajna može se pojedinačno testirati ili pregledati kako bi se utvrdilo koje obezbeđuje željenu količinu bispecifičnog antigena vezujućeg polipeptidnog konstrukta. Svaki heterodimer bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta može se dalje testirati kako bi se procenila sposobnost svakog heterodimera da se veže za antigen ili da proceni njegovu termičku stabilnost, kao što je ovde opisano. Dodatna svojstva koja se mogu proceniti uključuju rastvorljivost, agregaciju, kon i koff stope, sposobnost da izdrže izlaganje kiselinama, bazama, oksidaciji, ciklusima zamrzavanja / odmrzavanja, agitaciji, pritisku itd. Bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta u poređenju sa parentalnim antitelima ili Fab regionima parentalnih antitela. Na poslednje osobine mogu uticati regioni koji određuju komplementarnost (CDR) antitela od interesa, i na taj način se mogu testirati za svaki generisani polipeptidni konstrukt koji vezuje bispecifični antigen.
[0402] U nekim primerima izvođenja količina pravilno sparenog bispecifičnog antigenvezujućeg polipeptidnog konstrukta procenjuje LCMS. U nekim primerima izvođenja količina pravilno uparene bispecifične antigen-vezujući polipeptidni konstrukt se procenjuje tehnikama razdvajanja na bazi naelektrisanja, kao što su kapilarni izoelektrični fokus (cIEF) tehnika ili hromatografske tehnike. Postupak za pripremu bispecifičnog antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta iz Mab1 i Mab2 koristeći biblioteku Mab dizajn setova je prikazan shematski na slici 9.
[0403] U jednom primeru izvođenja, biblioteka Mab dizajn set se čuva na računarski čitljivom mediju za skladištenje kako bi se olakšalo korišćenje Mab dizajn set biblioteke za dizajniranje bispecifičnih antigen-vezujući polipeptidnih konstrukata.
Računarska implementacija
[0404] U jednom primeru izvođenja, računar sadrži najmanje jedan procesor povezan sa čipsetom. Takođe, u kombinaciji sa čipsetom su memorija, uređaj za skladištenje, tastatura, grafički adapter, pokazivački uređaj i mrežni adapter. Ekran je povezan sa grafičkim adapterom. U jednom primeru izvođenja, funkcionalnost čipseta obezbeđuje čvorište memorijskog kontrolera i čvorište I/O kontrolera. U drugom primeru izvođenja, memorija je spojena direktno na procesor umesto čipseta.
[0405] Uređaj za skladištenje je bilo koji uređaj koji može da drži podatke, kao što je hard disk, kompaktni disk samo za čitanje memorije (CD-ROM), DVD ili SSD memorijski uređaj. Memorija sadrži instrukcije i podatke koje koristi procesor. Pokazivački uređaj može biti miš, kugla za praćenje ili druga vrsta pokazivačkog uređaja, a koristi se u kombinaciji sa tastaturom za unos podataka u računarski sistem. Grafički adapter prikazuje slike i druge informacije na ekranu. Mrežni adapter spaja računarski sistem na lokalnu ili široku mrežu.
[0406] Kao što je poznato u stanju tehnike, računar može da ima različite i/ili drugačije komponente od onih koje su prethodno opisane. Pored toga, računaru mogu nedostajati određene komponente. Štaviše, uređaj za skladištenje može da bude lokalni i/ili udaljen od računara (kao što je ugrađen u mreži za skladištenje (SAN)).
[0407] Kao što je poznato u stanju tehnike , računar je prilagođen za izvršavanje računarskih programskih modula za obezbeđivanje funkcionalnosti opisane u ovom dokumentu. Kao što se ovde koristi, termin "modul" se odnosi na logiku računarskog programa koja se koristi za obezbeđivanje određene funkcionalnosti. Dakle, modul se može implementirati u hardveru, firmveru i/ili softveru. U jednom primeru izvođenja, programski moduli se čuvaju na uređaju za skladištenje, učitavaju se u memoriju i izvršavaju od strane procesora.
PRIMERI
[0408] U nastavku teksta su dati primeri specifičnih primera izvođenja za pravljenje i korišćenje antigen-vezujućih polipeptidnih konstrukata koji su ovde opisani. Primeri su obezbeđeni samo u ilustrativne svrhe i nije predviđeno da na bilo koji način ograniče obim pronalaska. Uloženi su napori da se osigura tačnost kad su u pitanju brojevi koji se koriste (npr. količine, temperature, itd.), ali izvesne eksperimentalne greške i odstupanja bi, naravno, trebalo da budu dozvoljena.
[0409] Konstrukti i metode opisane u ovom dokumentu mogu se pripremiti i sprovesti upotrebom, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalnih metoda hemije proteina, biohemije, tehnika rekombinantne DNK i farmakologije, u okviru stanja tehnike. Ove tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti npr. T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992).
PRIMERI
Primer 1: Molekulsko modeliranje i kompjuterski vođeni inženjering dodirne površine Fab
[0410] Pristup vođen strukturom i računarskim molekularnim modeliranjem korišćen je za proizvodnju biblioteke kapa-lambda (K-L) dizajna za pripremu bispecifičnih antitela gde jedan Fab ima kapa laki lanac, a drugi Fab ima lambda laki lanac (tj. kapalambda sistem ili K-L sistem). Biblioteka dizajna K-L sadrži dizajne sa aminokiselinskim modifikacijama u Fab regionima teških i lakih lanaca koji pospešuju preferencijalno formiranje željenog bispecifičnog antitela kada su ovi teški i laki lanci koeksprimirani. Biblioteka dizajna KL koristi inherentne razlike između kapa i lambda lakih lanaca u bispecifičnim antitelima i stoga je optimizovana za kapa-lambda sisteme. K-L dizajn biblioteka je generisana proučavanjem strukture reprezentativnih Fabs, sa D3H44 (anti-tkivo faktor antitelo) kao reprezentativni Fab koji sadrži kapa laki lanac (kapa Fab), i CAT-2200 (anti-IL-17A antitelo) kao reprezentativni Fab koji sadrži lambda laki lanac (lambda Fab), ali biblioteka se može koristiti u kontekstu drugih bispecifičnih K-L sistema antitela ili njihovih fragmenata da identifikuju dizajne koji pokazuju željenu specifičnost sparivanja u antitela interes.
[0411] Reprezentativni Fabs su izabrani na osnovu kriterijuma navedenih u tabeli 1. Ovi kriterijumi su uključivali da Fabs biti humani ili humanizovani, obično koriste VH i VL podgrupe i sadrže minimalne mutacije okvirnog regiona. Takođe, izvršena je parna 3D superpozicija sa dostupnim neredundantnim (90% prag identičnosti sekvence) kapa i lambda strukturama (strukture dobijene iz RSCB PDB, što je baza podataka koju održavaju Univerzitet Rutgers (Camden, NJ) i Univerzitet Kalifornije u San Dijegu (San Diego, CA), videti na internetu, na stranici www.rcsb.org. Zajedno sa drugim parametrima opisanim u tabeli 1, niski H-L unakrsni domen RMSD (koren-srednja kvadratna odstupanja) za VH-VL ili CH1-CL je korišćen za odabir reprezentativne strukture za svaki od kapa i lambda sistema. Nakon izbora D3H44 (PDB ID 1JPT) i CAT-2200 (PDB ID 2VXS) kao reprezentativni Fabs, sprovedena je in silico strukturna analiza ovih Fab dodirnih površina kako bi se identifikovali i razumeli ostaci važni za interakcije između teških i lakih lanaca, koristeći dvokraki pristup.
[0412] Prvo, globalna analiza očuvanja sekvence preko Fab varijabilnih i konstantnih interfejsa je sprovedena preko sekvence i strukture poravnanja poznatih antitela. Usklađivanje konstantnih i varijabilnih sekvenci domena iz različitih podgrupa antitela, u poređenju sa sekvencama D3H44 i anti-HER2 antitela pertuzumab (oba sadrže kapa lake lance) i CAT-2200 (sadrži lambda laki lanac) je prikazano na slici 1. Slika 1A i slika 1E prikazuju poravnanje u poređenju reprezentativnih ljudskih VH zametnih podgrupa sa D3H44 / Pertuzumab i CAT-2200, respektivno. Slika 1B prikazuje poravnanje u poređenju D3H44 / Pertuzumab sa reprezentativnim humanim kapa VL podgrupe klicine linije. Slika 1C i slika 1G prikazuju poravnanje u poređenju humanih CH1 alela sekvenci sa D3H44/Pertuzumab i CAT-2200, respektivno. Slika 1D prikazuje poravnanje u poređenju D3H44/Pertuzumab sa humanim kapa alelnim sekvencama. Slika 1F prikazuje poravnanje u poređenju CAT-2200 sa reprezentativnim humanim lambda VL podgrupe klicine linije. Slika 1H prikazuje poravnanje u poređenju CAT-2200 sa humanim lambda alelnim sekvencama. Ova analiza je otkrila da pertuzumab i D3H44 pokazuju visok stepen očuvanja sekvence sa kapa konstantom i promenljivim domenskim zametnim linijama, dok CAT-2200 pokazuje visok stepen očuvanja sekvence sa lambda konstantom i promenljivim domenskim zametnim linijama. Ova poravnanja takođe ilustruju viši stepen očuvanja u stalnim domenima teških i lakih lanaca, čineći dizajne u interfejsu konstantnog domena verovatnije da će biti transferabilni na druga antitela.
[0413] Drugi pristup je uključivao analizu D3H44 i CAT-2200 dodirnih površina kristalne strukture koristeći veliki broj alata za molekulsko modelovanje, kao što je prikazano na slici 2 (npr. ResidueContacts<™>i AffinityDecomposition<™>). Da bi se poboljšala transferabilnost na druga antitela ili fragmente, analiza se fokusirala na konstantni domen gde je konzerviranost sekvence veća (videti sliku 1). Ove analize su korišćene za identifikaciju razlika u pozicijama žarišta (ključni ostaci interfejsa) između reprezentativnih kapa Fab (D3H44) i lambda Fab (CAT-2200) struktura, kao što je prikazano u tabeli 2. Postoje primetne konformacione razlike u konstantnom domenu između CH1-CL (kapa) i CH1-CL (lambda) struktura. Superponiranje dostupnih Fab struktura na CH1 domenu pokazalo je da CL (kapa) strukture usvajaju veoma sličnu konformaciju i formiraju čvrst klaster. CL (lambda) konformacije, međutim, imaju tendenciju da se nalaze u dva različita klastera: jedan bliži kapa orijentaciji (kapa-sličan klaster) i jedan više diskrepantne orijentacije (lambda klaster). Prema ovoj analizi D3H44 predstavlja tipičnu kapa strukturu, a CAT-2200 predstavlja tipičnu lambda strukturu (lambda klaster). Slika 3 ilustruje tipičnu kapa-lambda konformacionu razliku konstantnog domena, koristeći D3H44 i CAT-2200 kao reprezentativne strukture. Čini se da ove razlike proizilaze uglavnom iz kretanja krutog tela lakog konstantnog domena u odnosu na CH1 domen, koji menja prirodu H-L interfejsa u konstantnom domenu kapa u poređenju sa lambda sistemom. Identifikovana hotspot neslaganja (tabela 2), kao i prethodno pomenute konformacione razlike (slika 3) služio kao polazna tačka za inženjering dizajna H-L sparivanja za bispecifični sistem koji sadrži kapa Fab i lambda Fab. Numerisanje aminokiselina u parentalnim D3H44 i CAT-2200 sekvencama prema Kabatu je dato u tabeli 3A i tabeli 3B.
[0414] Zatim su simulirane i identifikovane potencijalne mutacije na pozicijama žarišta, kao i pozicije susedne u odnosu na žarišta od interesa u 3D kristalnoj strukturi putem in silico mutageneze i pakovanja/modeliranja sa Zymepack<™>. Zymepack<™>je softverski paket koji će, s obzirom na ulaznu strukturu i set mutacija, promeniti tipove ostataka u ulaznoj strukturi u skladu sa obezbeđenim mutacijama i generisati novu strukturu koja je aproksimacija fizičke strukture mutiranog proteina. Pored toga, Zymepack<™>procenjuje svojstva mutiranog proteina izračunavanjem različitih kvantitativnih metrika. Ove metrike uključuju mere sterne i elektrostatičke komplementarnosti, koje mogu da budu u korelaciji sa stabilnošću, afinitetom vezivanja ili heterodimernom specifičnošću mutantnog proteina.
[0415] Korišćenjem neslaganja na dodirnim površinama, uvedene su mutacije kako bi se pospešilo selektivno sparivanje željenih ili poželjnih polipeptidnih lanaca ili heterodimera, uz istovremeno otežavanje formiranje neispravno uparenih ili pogrešno uparenih polipeptidnih lanaca ili heterodimera. Na primer, da bi se pripremilo bispecifično antitelo sa jednim kapa Fab i jednim lambda Fab, potrebna su četiri polipeptidna lanca. Kapa Fab sadrži teški lanac 1 (H1) i kapa laki lanac 1 (L1), dok lambda Fab sadrži teški lanac 2 (H2) i lambda laki lanac 2 (L2). U ovom slučaju, željeni H-L parovi bi bili H1L1 i H2L2, dok bi nekorektni parovi bili H1L2 i H2L1. Treba zapaziti da je označavanje/numerisanje polipeptidnih lanaca ovde proizvoljno. Dakle, mutacije koje favorizuju upareni CH1-CL (kapa) interfejs (H1L1) u odnosu na pogrešno uparen CH1-CL (lambda) interfejs (H1L2) i mutacije koje favorizuju upareni CH1-CL (lambda) interfejs (H2L2) preko pogrešnog CH1-C L (kapa) interfejs (H2L1) su identifikovani za generisanje kapa Fab-lambda Fab prilagođenih dizajna u konstantnom domenu. Korišćenjem računarskih metoda, uključujući Zymepack<™>, sterička komplementarnost je modelirana i takođe izračunata na osnovu energetskih faktora kao što su van der Vaals pakovanje, efekti kavitacije i bliski kontakt hidrofobnih grupa. Slično tome, elektrostatičke energije interakcije su modelirane i procenjene na osnovu kulonskih interakcija između naelektrisanja, vodoničnih veza i efekata rastvaranja. I poželjni modeli teških i lakih lanaca H1L1 i H2L2, i pogrešni modeli para H1L2 i H2L1 dobijeni uvođenjem mutacija od interesa su simulirani da izračunaju relativne steričke i elektrostatičke rezultate. To je omogućilo da se utvrdi da li je određeni skup mutacija doveo do povoljnih energija, tj. veće sterne i/ili elektrostatičke komplementarnosti za željene parove teški - laki lanac u odnosu na nekorektne parove. Izračunate steričke i elektrostatičke energije su komponente slobodne energije povezane sa sparivanjem lakih i teških lanaca. Stoga veća sterička i elektrostatička komplementarnost ukazuje na veću promenu slobodne energije u vezi sa sparivanjem željenog para u odnosu na sparivanje pogrešnog para. Veća sterična i/ili elektrostatička komplementarnost rezultira preferencijalnim (selektivnim) sparivanjem željenih teških i lakih lanaca u odnosu na steričnu kaznu i/ili elektrostatičko odbijanje za pogrešan par.
Primer 2: Izbor i opis dizajna
[0416] Pristup opisan u primeru 1 korišćen je za dizajniranje heterodimernih parova teškog lanca i lakog lanca (tj.H1L1 i H2L2) koji pokazuju selektivno ili preferencijalno sparivanje kada jedan od H-L heterodimernih parova sadrži kapa laki lanac, a drugi sadrži lambda laki lanac. Heterodimeri su dizajnirani u parovima, koji su označeni kao "Mab dizajn" ili "Mab dizajn set", i uključuju set aminokiselinskih supstitucija na H1, L1, H2 i L2 lancima, koji pospešuje preferencijalno sparivanje. Mab dizajn setovi su inicijalno testirani kao "LCCA dizajni" gde je jedan teški lanac Mab dizajn seta bio eksprimiran zajedno sa dva laka lanca Mab dizajn seta, jednim kapa i jednim lambda, kako bi se procenilo relativno sparivanje. Aminokiselinske supstitucije opisane u svim primerima su identifikovane imajući u vidu tabelu 3A i tabelu 3B (za pertuzumab i CAT-2200 Fab regione), koristeći Kabat sistem numerisanja kao što je opisano kod autrora Kabat i Wu, 1991; Kabat et al, Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication no.91-3242, p 647 (1991), osim ako nije drugačije naznačeno. Za poređenje, međutim, tabele 22A, 22B i 22C obezbeđuju identifikaciju odabranih pozicija aminokiselina u teškom lancu, kapa lakom lancu i lambda lakom lancu, koristeći IMGT, 1JPT i EU sisteme numerisanja, po potrebi.
[0417] Mab dizajni su upakovani na molekularni model D3H44 i CAT-2200 i metrike su izračunate kao što je opisano u primeru 1. Najbolji dizajni su zatim odabrani na osnovu rizika (minimiziranje efekata na stabilnost, kao i imunogenost) i uticaja (koji uzima u obzir predloženu snagu specifičnosti sparivanja drajvera). Najbolji dizajni su zatim testirani testom kompeticije za laki lanac (LCCA), kako bi se eksperimentalno utvrdila njihova specifičnost sparivanja (videti primer 4). Iako su Mab dizajni identifikovani korišćenjem D3H44 i CAT-2200 kao reprezentativnih Fab regiona, oni su testirani u K-L sistemu koristeći Pertuzumab kao kapa Fab i CAT-2200 kao lambda Fab (pertuzumab-CAT-2200 K-L sistem). Kao što je prikazano na slici 1C i slici 1D, D3H44 i Pertuzumab imaju identične sekvence u konstantnom domenu, što omogućava neproblematičnu interkonverziju dva sistema. Ovi Mab dizajni su označeni kao K-L dizajni.
[0418] Drugi set dizajna je takođe testiran u pertuzumab/CAT-2200 K-L sistemu. Ovi dizajni su predloženi korišćenjem reprezentativnih dizajna koji odražavaju raznolikost dizajna iz biblioteke kapa-kapa (K-K) dizajn opisane u tabeli 30 Međunarodne patentne prijave broj PCT/CA2013/050914 (Međunarodna objava patenta br. WO2014/082179) kao polazne tačke. Ovi reprezentativni K-K-izvedeni dizajni uključivali su podskup dizajna koji su ili preneseni bez modifikacije u K-L sistem gde je to moguće, ili prilagođeni kapa-lambda-sistemu modifikacijom aminokiselinskih ostataka po potrebi da bi se uzele u obzir sekvence i strukturne razlike između kapa i lambda lakih lanaca. Obe vrste reprezentativnih K-K-izvedenih dizajna su označeni kao K-K-izvedeni K-L dizajni.
[0419] sparivanje specifičnost za K-L dizajna i K-K-izvedenih K-L dizajna je eksperimentalno procenjena kao LCCA dizajna pomoću LCCA u kapa-lambda sistemu, kao što je opisano u primeru 4.
Primer 3: Priprema Fab konstrukt koje kodiraju Pertuzumab IgG teške lance, Pertuzumab IgG lakih lanaca, CAT-2200 IgG teških lanaca i CAT-2200 IgG lakih lanaca.
[0420] Teški i laki lanci divljeg tipa Fab anti-HER2 antitela Pertuzumab i anti-IL17 antitela CAT-2200 pripremljeni su na sledeći način. Proteinske sekvence svetlog lanca pertuzumab Fab (GenBank Pristupanje br. HC359025.1, Seq ID NO:2) i teški lanac (GenBank pristupanje br. HC359024.1, Seq ID NO: 1) su obrnuto prevedeni u DNK, kodon optimizovan za ekspresiju sisara i sintetizovan gen (Seq ID NOs: 8 i 7, respektivno). Proteinske sekvence lakog lanca CAT-2200 Fab (2VXS lanac L, Seq ID NO: 4) i teški lanac (2VXS lanac H, Seq ID NO: 3) uzete su iz PDB unosa 2VXS, obrnuto prevedene u DNK, kodon optimizovan za ekspresiju sisara i sintetizovan gen (Seq ID NOs: 10 i 9, respektivno). Polipeptidne i DNK sekvence ovih antitela teških i lakih lanaca prikazane su u tabeli 3C.
[0421] Vektorski inserti lakog lanca, koji se sastoje od 5'-EcoRI mesto sečenja - HLA-A signalni peptid - HA ili FLAG oznaka - Ig klon lakog lanca - 'TGA ili TAA stop' - BamH1 mesto sečenja -3', bili su ligirani u pTT5 vektor (Durocher Y et al., Nucl. Acids Res.
2002; 30,No.2 e9) za proizvodnju ekspresionih vektora lakog lanca. Dobijeni vektori ekspresije lakog lanca su sekvencirani kako bi se potvrdio tačan okvir čitanja i sekvenca kodiranja DNK. Isto tako, vektorski umeci teškog lanca, koji se sastoje od 5'-EcoR1 restrikcije - HLA-A signalni peptid - klon teškog lanca (završava na T238; videti tabelu 3A) - ABD2-His6tag - TGA stop - BamH1 mesto sečenja-3', bili su ligirani u pTT5 vektor (ABD2 = dve kopije proteina domena vezivanja albumina, u tandemu) za proizvodnju ekspresionih vektora teškog lanca. Dobijeni ekspresioni vektori za teški lanac su takođe sekvencirani kako bi se potvrdio korektan okvir čitanja i sekvenca kodirajuće DNK. Različiti Pertuzumab ili CAT-2200 Fab konstrukti koji sadrže aminokiselinske supstitucije za Mab dizajn setove generisani su ili sintezom gena ili mesto-usmerenom mutagenezom (Braman J, Papworth C & Greener A., Methods Mol. Biol. (1996) 57:31-44).
[0422] Teški i laki lanci su označeni na C- i N-terminusi respektivno, kako bi se olakšala procena preferencijalnog sparivanja skriningom pomoću kompetitivnog testa-SPR (LCCA). ABD2-His6 oznaka teškog lanca omogućuje da se H-L kompleksi uhvate na površini SPR čipa sa anti-His oznakom, dok su FLAG i HA oznake lakog lanca omogućile relativnu kvantifikaciju L1 i L2 populacije.
Primer 4: Procena preferencijalnog sparivanja dizajniranih Fab heterodimera testom kompeticije za laki lanac (LCCA)
[0423] Konstrukti koji kodiraju CAT-2200 i Pertuzumab IgG teške i lake lance u Fab formatu koji sadrži aminokiselinske modifikacije pripremljeni su kao što je opisano u primeru 3. Sposobnost konstrukt da se preferencijalno uparuju kako bi formirali željeni H-L heterodimer u kontekstu LCCA dizajn seta (H1, L1, L2 ili H2, L2, L1) određena je korišćenjem testa konkurencije lakog lanca (LCCA).
[0424] LCCA kvantifikuje relativno sparivanje jednog teškog lanca sa najmanje dva jedinstvena laka lanca, jednim kapa i jednim lambda, i može se sažeti na sledeći način. Da bi se utvrdila specifičnost sparivanja za lambda Fab, jedan Fab konstrukt sa CAT-2200 teškim lancem je koeksprimiran sa jednim Fab konstruktom sa CAT-2200 lakim lancem (za spareni Fab proizvod H1L1) i jednim Fab konstruktom sa lakim lancem Pertuzumaba (za pogrešno sspareni Fab proizvod H1L2) i relativna specifičnost sparivanja za laki lanac (H1L1: H1L2) je određena iz testa kompeticije-SPR skrina, sprovedenog u duplikatu. Da bi se utvrdila specifičnost sparivanja za kapa Fab, jedan Fab konstrukt sa teškim lancem Pertuzumaba je koeksprimiran sa jednim Fab konstruktom sa lakim lancem Pertuzumaba(za spareni Fab proizvod H2L2) i jednim Fab konstruktom sa CAT-2200 lakim lancem (za pogrešno sparen Fab proizvod H2L1) i relativna specifičnost specifičnost za sparivanje lakog lanca (H2L2: H2L1) je određena iz testa kompeticije-SPR skrina, sprovedenog u duplikatu.
[0425] LCCA test je izveden istovremenim ekspresijom teških i lakih lanaca u odnosu 1:1:1 (po težini) za H1:L1:L2 ili H2:L2:L1, sa teškim lancem koji je u ograničavajućim količinama. Količina svakog formiranog heterodimera (tj.H1L1 i H1L2 ili H2L2 i H2L1) je određena vezivanjem teških lanaca na SPR čip putem prikupljanja pomoću his oznake, nakon čega sledi detekcija količine svake oznake na lakom lancu (HA ili FLAG) pomoću antitela specifičnih za ove oznake. Nakon toga, odabrani heterodimerni hitovi su verifikovani putem verifikacije testa kompeticije lakih lanaca, pri čemu su L1: L2 DNK koeficijenti ponovo provereni za odnos 1:1, zadržavajući teški lanac u ograničenim količinama. Za ove konkretne kombinacije kapa-lambda sistema oznake lakog lanca mogu imati uticaj na sparivanje divljeg tipa LCCA, što dovodi do odstupanja od očekivanog neutralnog odnosa 50%:50%. Iz tog razloga, aranžman sa najmanjom količinom odstupanja od neutralnog je izabran spajanjem Pertuzumab lakog lanca sa HA oznakom i CAT-2200 lakog lanca sa FLAG oznakom. Šema predstavlja dizajn testa je prikazan na slici 4. Slika 5 prikazuje kako su označeni teški lanci i laki lanci i kako se procenjuje preferencijalno sparivanje. Eksperimentalni detalji LCCA su obezbeđeni u nastavku teksta.
Postupak transfekcije
[0426] LCCA dizajni koji se sastoje od jedne teške lančane konstrukcije i dva laka lanca konstrukcije, pripremljene kao što je opisano u primeru 3, prebačeni su u CHO-3E7 ćelije na sledeći način. CHO-3E7 ćelije, u gustini od 1,7 - 2 × 10<6>ćelija/ml, kultivisane su na 37°C u FreeStyle<™>F17 medijumu (Invitrogen kat. br. A-1383501) dopunjenom sa 4 mM glutaminom i 0,1% KoliphorP188 (Sigma #K4894). Ukupna zapremina od 2 ml je transfektovana sa ukupno 2 μg DNK koristeći PEI-pro (Polyplus transfection # 115-375) u odnosu DNK: PEI od 1: 2,5. Sve transfekcije su izvedene korišćenjem 333 ng svakog teškog lanca i svakog lakog lanca (tj. H1:L1:L2 ili H2:L2:L1 = 1:1:1 odnos), 300 ng AKTdd pTT22 (vektor koji sadrži konstitutivno aktivni mutant protein kinaze B) i 700 ng ssDNK (DNK iz sperme lososa). Dvadeset četiri sata nakon dodavanja DNK-PEI smeše, 0,5 mM valproinske kiseline (finalna koncentracija) i 1% w/v triptona (finalna koncentracija) su dodani ćelijama koje su zatim prebačene na 32 ° C. Supernatanti su testirani na ekspresiju 7. dana ne-redukujućom analizom SDS-PAGE-a, nakon čega je usledilo plavo bojenje Coommassie kako bi se vizualizovale trake.
Postupak SPR kompetitivnog testa
[0427] Stepen preferencijalnog sparivanja teškog lanca sa svakim od dva laka lanca u LCCA dizajnu je procenjen korišćenjem očitavanja na bazi SPR, jedinstvenih oznaka epitopa koje se nalaze na N-terminusu svakog lakog lanca. CAT-2200 LC konstrukt sadrži FLAG oznaku, a Pertuzumab LC konstrukt sadrži HA oznaku.
[0428] Materijal za površinsku plazmonsku rezonancu (SPR). GLC senzorski čipovi, komplet za kuplovanje amina Biorad ProteOn (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorid (EDC), N-hidroksisulfosukcinimid (sNHS) i etanolamin) i 10 mM natrijum acetatni puferi nabavljeni su od firme Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON). 4-(2-hidroksietil)-7-piperazinetansulfonska kiselina (HEPES) pufer, etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA) i NaCl su kupljeni od Sigma-Aldrich (Oakville, ON).10% rastvor Tween 20 je nabavljen od firme Teknova (Hollister, CA).
[0429] SPR biosenzorski testovi.Svi testovi površinske plazmonske rezonance izvedeni su pomoću instrumenta BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)) sa PBST radnim puferom (PBS Teknova Inc sa 0,05% Tween20) na temperaturi od 25 °C. Površina za hvatanje anti-penta His<™>je generisana korišćenjem GLC senzorskog čipa koji se aktivira razblaženjem 1:5 standardnih BioRad sNHS/EDC rastvora tokom 140 s pri 100 μL/min u pravcu (horizontalnom) analita. Odmah nakon aktivacije, rastvor od 25 μg/mL anti-penta His<™>antitela (Qiagen Inc.) u 10 mM NaOAc pH 4,5, injeciran je u pravcu (vertikalnom) analita, pri brzini protoka od 25 μL/min dok se približno 3000 rezonantnih jedinica (RU jedinica) nije imobilizovalo. Preostale aktivne grupe su ugašene injeciranjem 1M etanolamina tokom 140 s, pri 100 μL/min u pravcu analita, a to takođe osigurava kreiranje međumesta koja se koriste kao blank.
[0430] Skrining heterodimera za vezivanje za anti-FLAG (Sigma Inc.) i anti-HA (Roche Inc.) monoklonska antitela odvijao se u dva koraka: indirektno hvatanje heterodimera na anti-penta His<™>površinu u pravcu liganda, nakon čega sledi injeciranje anti-FLAG i anti-HA u pravcu analita. Prvo, jedna injekcija PBST za 30 s na 100 μL/min u pravcu liganda korišćena je za stabilizaciju osnovne linije. Za svako hvatanje heterodimera, nepročišćeni heterodimeri u medijima ćelijske kulture su razblaženi na 4% u PBST. Jedan do pet heterodimera ili kontrola (tj. kontrole koje sadrže ili 100% HA-laki lanac ili 100% FLAG-laki lanac) su istovremeno injecirane u kanale za pojedinačne ligande tokom 240 s, pri protoku od 25 μL/min, što je rezultiralo hvatanjem zasićenog heterodimeraod približno 300 do 400 RU jedinica na anti-penta His površini. Prvi kanal za ligande je ostao prazan da bi se koristio kao blank kontrola, ukoliko je potrebno. Ovaj korak hvatanja heterodimera neposledno je praćen sa dve injekcije pufera u pravcu analita kako bi se stabilizovao osnovni nivo, a zatim su 5 nM anti-FLAG i 5 nM anti-HA ubrizgani u duplikatu, pri 50 μL/min, tokom 120 s sa fazom disocijacije od 180 s, što je rezultiralo skupom senzorgrama vezivanja sa puferom kao referencom za svaki od uhvaćenih heterodimera. Heterodimeri su regenerisani 18 s pulsom 0,85% fosforne kiseline tokom 18 s pri 100 μL/min, kako bi pripremili anti-penta His<™>površinu za sledeći ciklus injeciranja. Senzorgrami su poravnati i dvostruko referencirani pomoću injeciranja pufera i međumesta, a dobijeni senzorgrami su analizirani pomoću softvera ProteOn Manager v3.0.
Analiza podataka i opis LCCA metrike
[0431] Procena preferencijalnog sparivanja za svaki dizajn, prisutan u H1L1H2L2 formatu, procenjena je od strane dva komplementarna LCCA dizajn setova, jedan za kombinaciju H1L1L2, a drugi za kombinaciju H2L1L2. Svaki LCCA dizajn skup je označen sa "jedinstvenim identifikatorom" (na primer, 10629 ili 10695). Svaki Mab dizajn set (H1L1H2L2) je shodno tome identifikovan brojevima LCCA dizajna seta za dva konstitutivna LCCA (npr.10629-10695).
[0432] LCCA dizajn setovi (H1L1L2 ili H2L1L2) svakog Mab dizajn seta su testirani u LCCA, a dizajn setovi od interesa su identifikovani na osnovu sledećih kriterijuma za uključivanje. Da bi se smatralo dizajn od interesa, dizajn mora da sadrži najmanje jedan pozitivan LCCA rezultat iznad neutralne zone (> 60:40 ispravno uparen: mispaired odnos), dok je drugi komplementarni LCCA morao da bude iznad donje granice neutralne zone (40:60 ispravno uparen: mispaired odnos) kao što je prikazano na slici 6. Neutralna zona je definisana kao region između 40%: 60% i 60%: 40% ispravno upareni: pogrešno upareni odnosi, koristeći srednje normalizovane vrednosti za H1-L1: H1-L2 i H2-L2: H2-L1. Na primer, Scenariji A i B na slici 6 predstavljaju dizajne koji prolaze kriterijume za uključivanje. Treba zapaziti da je scenario B uključen jer je H2L2: H2L1 LCCA iznad neutralne zone, a H1L1: H1L2 LCCA unutar neutralne zone (ne ispod nje). Scenario C predstavlja dizajn u kojem su oba LCCA rezultata pozitivna, ali ni iznad neutralne zone, i stoga nije uključena. Scenariji D i E predstavljaju dizajne koji su filtrirani jer je najmanje jedan od rezultata LCCA ispod neutralne zone, čak i ako je drugi LCCA iznad neutralne zone (vidi scenario D). Tabele 4A (K-L dizajni) i 4B (K-K-izvedeni K-L dizajni) navode Mab dizajnerske setove koji su ispunili ove kriterijume, dok tabele 5A i 5B prikazuju rezultate LCCA za ove dizajne. U tabelama 4A i 4B i svim narednim tabelama koje navode aminokiselinske supstitucije LCCA dizajn setova ili Mab dizajn setova, odsustvo supstitucije u tabeli, ili "-" ukazuje na to da polipeptidni lanac ne uključuje aminokiselinsku supstituciju koja pospešuje preferencijalno sparivanje.
[0433] Performanse svakog LCCA dizajn seta opisane su sa dve skalarne vrednosti, ln (r1 / f1) ili ln (r2 / f2), gde r1 i r2 odgovaraju srednjim vrednostima odnosa H1L1: H1L2 i H2L2: H2L1, respektivno, a f1 i f2 odgovaraju odgovarajućim srednjim vrednostima odnosa H1L1: H1L2 i H2L2: H2L1. Normalizovane skalarne vrednosti se generišu oduzimanjem doprinosa WT (divljeg tipa) sistema od dizajna; ln(r1/f1)dizajn -ln(r1/f1)WT ili ln(r2/f2)dizajn - In(r2/f2)wr. Za CAT-2200 divljeg tipa (HC) u kompeticiji sa CAT-2200 (LC-FLAG) plus Pertuzumab (LC-HA) ln(r1/f1)WT = -0,48. Za divlji tip Pertuzumab (HC) u kompeticiji protiv Pertuzumab (LC-HA) plus CAT-2200 (LC-FLAG) ln(r2/f2) WT = 0,66. Ova procedura efikasno uklonila sve postojeće WT sparivanje sklonost i normalizuje specifičnost u odnosu na neutralni 50%:50% L1:L2 WT sistem. Ove vrednosti su prijavljene u kolonama 2 i 5 u tabelama 5A i 5B.
[0434] Pored toga, normalizovane skalarne vrednosti su takođe pretvorene u čisti normalizovani srednji odnos H1L1: H1L2 i H2L2: H2L1. Ova konverzija efikasno normalizuje LCCA koeficijente na 100% kao što je uočeno za neke dizajnirane Fabs da je ukupan iznos H1L1 i H1L2, ili H2L2 i H2L1 značajno razlikuje od 100%. Veruje se da je ovo odstupanje u ukupnom procentu lakog lanca delimično posledica pojave varijabilnog nespecifičnog vezivanja tokom početnog hvatanja heterodimera na SPR čipu. Ove vrednosti su prijavljene u kolonama 4 i 7 u tabelama 5A i 5B.
[0435] Štaviše, skalarni opseg za svaku normalizovanu LCCA dizajna (H1L1: H1L2 i H2L2: H2L1 eksperimenti), kao i opseg za normalizovani odnos pravilno uparen sa pogrešno uparenim Fab heterodimerima (opseg je isti od procenta L1 i procenta L2 u normalizovanom odnosu). Za rezultate prijavljene iz jednog merenja, vrednosti opsega su označene NA (nije primenljivo). Ove vrednosti su prijavljene u kolonama 3 i 6 u tabelama 5A i 5B.
[0436] Za referencu, Tabela 23 predstavlja korespondenciju između% uparenih: pogrešno uparenih heterodimera i odgovarajuće LCCA skalarne vrednosti.
Rezultati
[0437] Rezultati LCCA su prikazani u tabelama 5A i 5B u kontekstu Mab dizajn setova. Tabela 5A daje LCCA podatke koji se odnose na K-L dizajna opisanih u primeru 2, dok Tabela 5B daje LCCA podatke koji se odnose na K-K-izvedene K-L dizajna takođe opisan u primeru 2. Imajte na umu da su svi LCCA eksperimenti izvedeni na konstruktima koje sadrže međulančanu Fab disulfidnu vezu koja se nalazi u konstantnom domenu (H / C233-L / C214, Kabat numeracija).
[0438] Tabela 4A navodi 231 K-L dizajna koji su ispunili kriterijume za uključivanje. Podaci LCCA koji se odnose na ove dizajne je prikazan u tabeli 5A. Tabela 4B navodi 44 K-K-izvedenih K-L dizajna koji su ispunili kriterijume za uključivanje i tabela 5B prikazuje LCCA podatke koji se odnose na ove dizajne. Dizajni koji održavaju 100% identitet između originalne K-K biblioteke dizajna iz tabele 30 u gore navedenom PCT Application No. PCT / CA2013 / 050914 i novi kapa-lambda sistem (tj. Preneseni su bez modifikacija) identifikovani su zvezdicom (*) u tabeli 4B. Većina dizajna u tabeli 4B imaju aminokiseline modifikacije u stalnom regionu samo, sa nekoliko dizajna takođe uključuje aminokiselinske modifikacije u promenljivom regionu. Ovi dizajni su predloženi kako bi se dodatno pokrenula specifičnost sparivanja, a istovremeno favorizovala transferabilnost na druge sisteme antitela.
[0439] Snaga dizajna može se definisati kao zbir dve skalarne vrednosti LCCA za određeni dizajn. Upoređujući snagu dizajna K-K-izvedenih K-L dizajna sa K-L dizajna bilo je očigledno da su ti dizajni prilagođeni specijalno za K-L sistema imaju tendenciju da pokažu bolju specifičnost sparivanja od K-K dizajna prebačenih u K-L sistem, kao što je sažeto na slici 7. Srednja snaga dizajna za K-K-izvedene K-L dizajna bila je 1.86, sa maksimalnom projektnom snagom od 3.53. Srednja snaga dizajna za K-L dizajna bila je 2.69, sa maksimalnom projektnom snagom od 5.23.
Primer 5: Skaliranje dizajniranih Fab heterodimera za biofizičku karakterizaciju
[0440] Ispravno upareni heterodimeri H1L1 ili H2L2, kao što je naznačeno u jedinstvenim setovima identifikatora (tabele 4A i 4B), povećani su (obično do 20 ml) i prečišćeni na sledeći način kako bi se testirala termička stabilnost i vezivanje antigena. Za ove eksperimente, teški lanci Fab regiona su eksprimirani bez ABD2 oznake, dok su laki lanci eksprimirani sa istim HA ili FLAG oznakama koje se koriste u LCCA. Teški i laki lanci svakog heterodimera eksprimirani su u 20 ml kultura CHO-3E7 ćelija. CHO-3E7 ćelije, u gustini od 1,7 - 2 × 10<6>ćelija/ml, kultivisane su na 37°C u FreeStyle<™>F17 medijumu (Invitrogen kat. br. A-1383501) dopunjenom sa 4 mM glutaminom i 0,1% KoliphorP188 (Sigma #K4894). Ukupna zapremina od 20 ml je transfektovana sa ukupno 20 μg DNK koristeći PEI-pro (Polyplus transfection # 115-375) u odnosu DNK: PEI od 1: 2,5. Dvadeset četiri sata nakon dodavanja DNK-PEI smeše, 0,5 mM valproične kiseline (finalna koncentracija) i 1% w/v triptona (finalna koncentracija) su dodani ćelijama koje su zatim prebačene na 32 ° C.
[0441] Ćelije su centrifugirane 7 dana nakon transfekcije, a heterodimeri su prečišćeni iz supernatanta afinitetnim hvatanjem pomoću IgG-CH1 CaptureSelect<™>(Life Technologies<™>, kataloški br.: 194-320-005) na 4°C, na sledeći način. Supernatanti su razblaženi na 20 - 25% supernatantom ćelijske kulture u puferu za ekvilibraciju (Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) bez kalcijuma, magnezijuma i fenolno crvene (Hyclone<™># SH30028.02)), a zatim inkubirani uz mešanje tokom 16 sati sa IgG-CH1 CaptureSelect<™>, takođe prethodno ekvilibrisan puferom za ekvilibraciju. Smola je zatim prikupljena centrifugiranjem, prebačena u poroznu ploču sa 96 bunarčića, oprana puferom za ekvilibraciju tri puta. Vezani uzorci su eluirani sa 1 do 4 zapremine sloja pufera za eluiranje: 100 mM glicin pH 2,6. Eluirani uzorci su prikupljeni centrifugiranjem u UV-transparentnoj prijemnoj ploči sa 96 bunarčića, gde svaki bunarčić sadrži pufer za neutralizaciju: 1M Tris pH 9.0 na 10% zapremine elucije.
[0442] Nakon prečišćavanja, ekspresija heterodimera je procenjena ne-redukujućim testom High Throughput Protein Express pomoću sistema Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer #760499). Procedure su sprovedene u skladu sa korisničkim uputstvom HT Protein Express LabChip User Guide version2 LabChip GXII, sa sledećim modifikacijama. Uzorci heterodimera, od 2 μl ili 5 μl (opseg koncentracije 5-2000 ng/μl), dodati su u odvojene bunarčiće u ploče sa 96 bunarčića (BioRad # HSP9601) zajedno sa 7 μl pufera za uzorak HT Protein Express (Perkin Elmer # 760328). Uzorci heterodimera su zatim denaturisani na 70°C tokom 15 minuta. Instrumentom LabChip je operisano korišćenjem HT Protein Express Chip (Perkin Elmer #760499) i postavkom testa Ab-200. Nakon upotrebe, čip je očišćen MilliQ vodom i čuvan na 4°C.
[0443] Uključivanje modifikacija Mab dizajna nije imalo značajan uticaj na ekspresiju proteina. Nivoi ekspresije dobijeni za CAT-2200 Fab regione koji sadrže modifikacije dizajna su 0,45mg/20mL ekspresije (SD od 0,16mg), u poređenju sa 0,64mg/20mL ekspresije (SD od 0,1mg) za divlji tip Fab. Pertuzumab Fab regioni koji nose modifikacije dizajna eksprimiraju se se na 0,39mg/20 mL ekspresije (SD od 0,14mg), u poređenju sa 0,4mg/20mL ekspresijom (SD od 0,03mg) za divlji tip Fab. Caliper analiza pokazala je nivo čistoće uporediv sa WT Fab.
Primer 6: Merenja afiniteta za antigen dizajniranih Fab heterodimera.
[0444] Sposobnost CAT-2200 Fab heterodimera da se vezuju za IL-17A i Pertuzumab Fab da se vezuju za HER2-ECD je procenjena kako bi se utvrdilo da li su aminokiselinske supstitucije imale bilo kakav uticaj na sposobnost heterodimera da se veže za antigen. Fab heterodimeri su pripremljeni kao što je opisano u primeru 5. Afinitet svakog Fab heterodimera za njegov antigen određen je SPR-om na sledeći način.
[0445] Materijal za SPR. GLC senzorski čipovi, Biorad ProteOn komplet za aminsko kuplovanje (EDC, sNHS i etanolamin) i 10mM natrijum acetatni puferi kupljeni su od Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON). PBS radni pufer sa 0,05% Tween20 (PBST) je kupljen od Teknoca Inc. (Hollister, CA). Rekombinantni HER2 protein je kupljen od eBioscience (San Diego, CA). Kozje poliklonsko anti-humano Fc antitelo kupljeno je od Jackson Immuno Research Laboratories Inc. (Vest Grove, PA). Rekombinantni humani IL-17A je kupljen od firme R&D Systems (Mineapolis, MN).
[0446] CAT-2200:IL-17A određivanje afiniteta. Svi testovi površinske plazmonske rezonance izvedeni su pomoću instrumenta BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)) sa PBST radnim puferom na temperaturi od 25°C. Površina IL-17A je generisana korišćenjem GLC senzorskog čipa koji se aktivira razblaženjem 1:10 standardnih BioRad sNHS/EDC rastvora injektovanih tokom 140 s na 100 μL/min upravcu liganda (vertikalno). Odmah nakon aktivacije, 2 mikrog/mL rastvor IL-17A u 10 mM NaOAc pH 4,5 je injektovan u pravcu liganda (vertikalno) pri brzini protoka od 25 mikroL/min dok nije imobilisano približno 50 rezonantnih jedinica (RU).
[0447] Preostale aktivne grupe su ugašene 140 s injekcijom 1M etanolamina na 100 μL/min takođe u pravcu liganda.
[0448] Skrining dizajniranih Fabs za vezivanje za IL-17A je izvedena ubrizgavanjem prečišćenog CAT-2200 Fabs u analita (horizontalno) pravcu. Prvo, dve injekcije pufera za 30s na 100 mikroL / min u analitu (horizontalnom) pravcu su korišćene za stabilizaciju osnovne linije. Pet koncentracija trostrukog razblaživanja serije svakog CAT-2200 dizajniranog Fab-a (60nM, 20nM, 6.7nM, 2.2nM, 0.74nM) sa kontrolom praznog pufera istovremeno su ubrizgane na 50 mikroL / min za 120 s sa 15-minutnom fazom disocijacije, što je rezultiralo skupom vezujućih senzorgrama sa referencom pufera. CAT-2200: IL-17A kompleksi na površini SPR su disocirani i IL-17A površina regenerisana da se pripremi za sledeći ciklus injeciranja dva impulsa 0,85% fosforne kiseline za 18 s na 100 mikroL / min. Senzorgrami su poravnati i dvostruko referencirani pomoću injeciranja prazan pufera i interspota, a dobijeni senzorgrami su analizirani pomoću softvera ProteOn Manager v3.1. Dvostruko upućeni senzorgrami bili su prilagođeni Langmuirovom modelu vezivanja.
[0449] Pertuzumab: HER2 određivanje afiniteta.Svi testovi površinske plazmonske rezonance izvedeni su pomoću instrumenta BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)) sa PBST radnim puferom na temperaturi od 25°C. Površina za hvatanje anti-penta His<™>antitelo (Qiagen) je generisana korišćenjem GLC senzorskog čipa koji se aktivira razblaženjem 1:10 standardnih BioRad sNHS/EDC rastvora tokom 140 s pri 100 μL/min u pravcu (horizontalnom) analita. Odmah nakon aktivacije, rastvor od 10 μg/mL anti-penta His™ antitela (Qiagen Inc.) u 10 mM NaOAc pH 4,5, injeciran je u pravcu (vertikalnom) analita, pri brzini protoka od 25 μL/min dok se približno 3000 rezonantnih jedinica (RU jedinica) nije imobilizovalo. Preostale aktivne grupe su ugašene injeciranjem 1M etanolamina tokom 140 s, pri 100 μL/min u pravcu analita, a to takođe osigurava kreiranje međumesta koja se koriste kao blank.
[0450] Skrining dizajniranih Fabs za vezivanje za HER2 dogodio u dva koraka: indirektno hvatanje dizajniranih Fabs na anti-penta-His<™>površinu antitela u pravcu liganda praćeno istovremenim ubrizgavanjem 5 koncentracija prečišćenog HER2 antigena i jedan pufer prazno za dvostruko referenciranje u pravcu analita.
[0451] Prvo, jedna injekcija pufera za 30 s na 100 mikroL / min u pravcu liganda je korišćena za stabilizaciju osnovne linije. Za svaki dizajnirani Fab hvatanje, dizajnirani Fabs su razblaženi na 2 microg / mL u PBST. Jedan do pet dizajniranih Fabs ili kontrole su istovremeno ubrizgava u pojedinačnim ligand kanala za 240 s pri protoku 25 μL/min. To je rezultiralo hvatanjem oko 400 do 600 RUs na anti-ljudskoj Fc površini. Prvi ligand kanal je ostao prazan da se koristi kao prazna kontrola ako je potrebno. Ovaj korak hvatanja je odmah praćen sa dve injekcije pufera u pravcu analita da stabilizuje osnovnu liniju, a zatim 100nM, 33.3nM, 11.1nM, 3.7nM i 0.41nM Her2 zajedno sa puferom blank je istovremeno ubrizgava na 50 μL/min za 120 s sa 1200s fazom disocijacije. Zarobljene površine antitela regenerisane su 18 s pulsom 0,85% fosforne kiseline na 100 μL/min kako bi se pripremili za sledeći ciklus injeciranja. Senzorgrami su poravnati i dvostruko referencirani pomoću injeciranja prazan pufera i interspota, a dobijeni senzorgrami su analizirani pomoću softvera ProteOn Manager v3.1. Dvostruko upućeni senzorgrami bili su prilagođeni modelu vezivanja 1:1.
[0452] Rezultati.Vrednosti afiniteta za antigen (KD) za uzorke dizajniranih Fab heterodimera su navedeni u tabeli 6A (K-L dizajn) i tabeli 6B (K-K-izvedeni K-L dizajn) u kontekstu dizajniranih parova KD vrednosti H1L1 i H2L2 Fabs su uključene u kolone 2 i 4 (KD H1L1 CAT-2200 Fab heterodimer i H2L2 Pertuzumab Fab heterodimer, respektivno), i 3 i 5 (promena u KD H1L1 ili H2L2 Fab heterodimer u odnosu na odgovarajući divlji tip). KD vrednosti su određene samo za uzorke Fab heterodimera koji su pokazali Fab heterodimer hvatanje od najmanje 100 RU. Referentna KD vrednost za CAT-2200 divljeg tipa vezan za IL-17A koji se koristi za poređenje sa dizajniranim heterodimerima bila je 0,273 nM. Ova vrednost je srednja vrednost zasnovana na višestrukim merenjima CAT-2200 divljeg tipa Fab heterodimera gde laki lanac sadrži oznaku FLAG. Slično tome, referentna KD vrednost za pertuzumab divljeg tipa vezan za HER2 bila je 8.055 nM. Ova vrednost je srednja vrednost zasnovana na višestrukim merenjima pertuzumab Fab heterodimera divljeg tipa gde laki lanac sadrži HA oznaku. U tabeli 6, razlika u KD u odnosu na divlji tip antigen vezujućeg afiniteta je prikazan korišćenjem obračuna -(log(KD_dizajn) - log(KD_wt)), tako da pozitivne vrednosti ukazuju na niže vrednosti KD, dok negativne vrednosti ukazuju na povećane KD vrednosti Fab heterodimera u poređenju sa divljim tipom vezivanja afiniteta za antigen. NB označava da vezivanje nije detektovano. Treba napomenuti da neki Fab heterodimeri nemaju izmerene vrednosti KD i stoga su označeni kao neodređeni (ND). U nekim od ovih slučajeva, Fab heterodimeri su procenjeni, ali tehničke poteškoće (kao što su niske Fab heterodimerno hvatanje u SPR eksperimentu, tj. Manje od 100 RU), sprečile su tačna određivanja KD vrednosti.
[0453] Za većinu dizajniranih Fab heterodimera koji su testirani, aminokiselinske supstitucije su imale mali ili nikakav uticaj na KD vrednosti. Tri dizajna (Jedinstveni identifikatori 10881-11412, 10883-11236, i 10888-11415) na K-L dizajn biblioteci pokazao > 5-struko smanjenje KD na CAT-2200 Fab. Na bibioteci K-K-izvedenih K-L dizajna, jedan od heterodimera Pertuzumab Fab (dizajni koji sadrže 10724 kod u jedinstvenom identifikatoru) pokazao je >5-struko smanjenje KD na strani Pertuzumaba.
Primer 7: Merenja toplotne stabilnosti dizajniranih Fab heterodimera pomoću DSF.
[0454] Diferencijalna skenirajuća fluorescencija (DSF) korišćena je za merenje toplotne stabilnosti pravilno sparenih heterodimera u poređenju sa onom divljeg tipa, nemodifikovanog teškog para lanca-lakog lanca. Iako DSF je poznato da je manje precizan metod za merenje temperature topljenja, ovde je korišćen jer je to metoda visoke propusnosti merenja toplotne stabilnosti i na taj način dozvoljeno za određeno merenje toplotne stabilnosti da se dobije za veliki broj Fab heterodimera. Fab heterodimeri su pripremljeni kao što je opisano u primeru 5.
Merenje termičke stabilnosti pomoću DSF
[0455] Termička stabilnost dizajniranih Fab heterodimernih parova merena je pomoću DSF na sledeći način. Svaki heterodimer je prečišćen kao što je opisano u primeru 5 i razblažen do 0,5 mg/mL u DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, HyClone kat. br. SH30028.02). Za većinu uzoraka, radna zaliha Sypro Orange gel mrlje (Life Technologies Cat # S-6650) pripremljena je razblažujući 4 μL Sypro Orange gel mrlje na 2 ml DPBS. DSF uzorci su pripremljeni dodavanjem 14 μL 0,5 mg/mL proteina na 60 μL razblaženog Sypro Orange gel mrlje radne zalihe. Međutim, za proteine koji su imali manje od 0,5 mg/mL, svaki uzorak DSF-a pripremljen je dodavanjem 14 μL nerazblaženog proteina na 60 μL radne zalihe Sypro Orange boje (koja je razblažena do 1:1500 u DPBS). DSF analiza je zatim sprovedena, u duplikatu, na alikvotima od 20 μl, koristeći instrument Rotor-Gene 6000 qPCR instrument (QiaGen Inc). Svaki uzorak je skeniran od 30°C do 94°C koristeći intervale od 1°C sa ravnotežom od 10 sekundi između svakog koraka i 30 sekundi čekanja na početku. Korišćen je ekscitacioni filter od 470 nM i emisioni filter od 610 nM sa prinosom od 9. Podaci su analizirani pomoću softvera Rotor-Gene 6000, koristeći maksimalnu vrednost iz prvog derivata krive denaturacije kao Tm. Preostali uzorci DSF su pripremljeni i analizirani na sličan način, sa sledećim modifikacijama protokola koje ne menjaju izmerene Tm vrednosti: 1) radna zaliha je pripremljena razblaživanjem 1 μL Sypro Orange boje za gel u 2 ml DPBS, 2) alikvoti od 30 μl su analizirani i 3) i korišćen je prinos od 10.
[0456] DSF rezultati za dizajnirane uzorke Fab heterodimera su navedeni u tabelama 6A (K-L dizajn) i 6B (K-K-izvedeni K-L dizajn), u kontekstu Mab dizajn setova. Termička stabilnost H1L1 i H2L2 Fab regiona je uključena u kolone 6 i 8 (H1L1 se odnosi na CAT-2200 Fab heterodimer i H2L2 na Pertuzumab Fab heterodimer) u tabelama 6A i 6B. Za Fab heterodimere gde su sprovedena ponavljanja, navedena Tm vrednost je vrednost medijane. Poređenja Tm vrednosti dizajniranih Fab heterodimera sa Tm vrednostima Fab heterodimera divljeg tipa, navedeni su u koloni 7 za CAT-2200 H1L1 i u koloni 9 za Pertuzumab H2L2. Utvrđeno je da medijana za Tm za CAT-2200 Fab konstrukt divljeg tipa koji sadrži FLAG oznaku iznosi 76,9°C. Utvrđeno je da medijana za Tm za Pertuzumab Fab heterodimer divljeg tipa koji sadrži HA oznaku iznosi 82,4°C. S obzirom na ograničenja protoka u postupku skaliranja za veliki broj Fab heterodimera generisanih od strane Mab dizajn setova, DSF merenja su izvedena uzorkovanjem podskupa dizajniranih Fab heterodimera. Iz tog razloga, za neke Fab heterodimere ne postoje Tm vrednosti izmerene pomoću DSF i stoga su označeni kao neodređeni (ND). Većina testiranih dizajna pokazala je dobru termostabilnost, u okviru očekivanih Tm vrednosti koje se obično uočavaju za Fab regione divljeg tipa. Dizajnirani Fab heterodimeri koji sadrže mutacije K145T_V177D_S188D u HC i S176K_Y178L u lambda LC ili S176K_T178L u kapa LC, negativno su uticali na Tm vrednosti za >10°C u Fab heterodimeru koji sadrži te mutacije.
Primer 8: Merenja termičke stabilnosti dizajniranih Fab heterodimera pomoću DSC.
[0457] Da bi se dopunilo merenje termičke stabilnosti od strane DSF, precizniji metod diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) je takođe korišćen za merenje toplotne stabilnosti pravilno sparenih, dizajniranih Fab heterodimera u poređenju sa termičkom stabilnošću divljeg tipa, nemodifikovanog para teški lanac-laki lanac. Fab heterodimeri su pripremljeni kao što je opisano u primeru 5.
Merenje termičke stabilnosti pomoću DSC
[0458] Termička stabilnost dizajniranih Fab heterodimernih parova merena je korišćenjem DSC na sledeći način. 400 μL prečišćenih uzoraka, prvenstveno u koncentracijama od 0,2 mg/mL ili 0,4 mg/mL u PBS-u, korišćeni su za DSC analizu sa VP-kapilarnim DSC (GE Healthcare). Na početku svakog DSC određivanja, sprovedeno je 5 injeciranja pufera za blank prazne injekcije su izvedene da stabilizuje osnovna vrednost, a injeciranje pufera je bilo locirano pre svakog injeciranja uzorka za referenciranje. Svaki uzorak je skeniran od 20 do 100°C, brzinom od 60°C/h, sa niskom povratnom informacijom, filterom na 8 sek, 5 min preTstat i pritiskom azota od 70 psi. Dobijeni termogrami su upoređivani i analizirani pomoću softvera Origin 7.
[0459] Termička stabilnost HILl i H2L2 Fabs su uključeni u kolonama 10 i 12 (H1L1 se odnosi na CAT-2200 Fab heterodimer i H2L2 na Pertuzumab Fab heterodimer, respektivno) iz tabele 6. Za svaki Fab heterodimer gde su sprovedena ponavljanja, prijavljena Tm vrednost je srednja vrednost. Poređenja dizajniranih Fab heterodimer Tm vrednosti u odnosu na Tm vrednost divljeg tipa Fab heterodimer su prijavljeni u koloni 11 za CAT-2200 H1L1 (CAT-2200 divljeg tipa Fab konstrukt koji sadrži FLAG oznaku, sa medijanom Tm od 70.7 ° C) i kolona 13 za Pertuzumab H2L2 (divlji tip Pertuzumab Fab konstrukt koji sadrži HA oznaku, sa srednjim Tm od 78.7 ° C). S obzirom na visoke količine uzoraka uslov i nisku propusnost prirodu DSC, merenja su izvršena uzorkovanjem podskup dizajna. Iz tog razloga, za neke Fab heterodimere ne postoje Tm vrednosti izmerene pomoću DSC i stoga su oni označeni kao neodređeni (ND). Svi dizajnirani Fab heterodimeri testirani pomoću DSC pokazali su dobru termostabilnost. Tm vrednosti izvedene iz DSC bile su generalno niže od vrednosti uočenih pomoću DSF (primer 7).
Primer 9: Optimizacija dizajna
[0460] Performanse K-L dizajna i K-K-izvedenih K-L dizajna u pertuzumab/CAT-2200 sistemu, kao što je prikazano u tabelama 5A i 5B, respektivno, ispitani su kako bi se vodilo dalje razumevanje sposobnosti dizajna da vozi selektivno sparivanje. Ovo ispitivanje je omogućilo naknadni ciklus optimizacije dizajna kako bi se poboljšala specifičnost sparivanja gdje je to moguće i/ili povećala stabilnost heterodimera. Optimizacija dizajna uključivala je modifikaciju K-L dizajna i K-K-izvedenih K-L dizajna na određenom supstituisanom aminokiselinskom ostatku kako bi se procenio efekat alternativne aminokiselinske supstitucije na tom ostatku, dodajući aminokiselinske supstitucije na dodatnim aminokiselinskim ostacima, i/ili uklanjanje zamene aminokiselina na određenom ostatku (tj. pretvarajući ga nazad u divlji tip ostatka). Proces dizajna i izbor dizajna je izveden kao što je opisano u primerima 1 i 2, a rezultujući dizajni su testirani u pertuzumab/CAT-2200 K-L sistemu.
[0461] Dodatni skup K-L dizajna je predložen korišćenjem alternativne metode povećanja raznolikosti dizajna sa poboljšanim specifičnosti sparivanja, u kojoj su odabrani konstantni dizajn domena iz tabele 4A i 4B, kao i odabrani kandidati za dizajn optimizacije domena opisani u prethodnom paragrafu su kombinovani sa dva K-K promenljivih dizajna domena. Dva dizajna promenljivih domena K-K su uključeni u tabeli 4B, i imaju jedinstvene identifikatore 10621-10733 i 10623-10745. Ovi dizajni nisu pospešivali jaku specifičnost sparivanja sami po sebi i nisu uticali na vezivanje antigena, ali se pokazalo da poboljšavaju specifičnost sparivanja u kombinaciji sa određenim Fab konstantnim dizajnom domena u sistemu kapa-kapa antitela. Ovaj dodatni skup K-L dizajna takođe uključuje kombinacije konstantnih dizajna domena samo, gde su konstantni dizajn domena su izabrani iz tabele 4A, 4B i optimizacija dizajn kandidata opisanih u prethodnom paragrafu.
[0462] Konačno, još jedan dodatni skup K-K izvedenih K-L dizajna su predloženi korišćenjem reprezentativnih dizajna iz K-K biblioteke dizajna opisane u tabeli 5 PCT aplikacije br.PCT/IB2015/054107 kao polazna tačka, i testiran u pertuzumab/CAT-2200 K-L sistemu. Kao što je opisano u primeru 2, reprezentativni K-K-izvedeni dizajni su prilagođeni kapa-lambda-sistemu modifikujući aminokiselinske ostatke po potrebi da bi se objasnile sekvence i strukturne razlike između kapa i lambda lakih lanaca.
[0463] Specifičnost sparivanja dodatnih K-L dizajna i K-K-izvedenih K-L dizajna opisanih u ovom primeru je eksperimentalno procenjena pomoću LCCA u pertuzumab-CAT-2200 K-L sistemu kao što je opisano u primeru 10.
Primer 10: Priprema i procena preferencijalnog sparivanja dizajniranih Fab heterodimera pomoću LCCA
[0464] Pertuzumab i CAT-2200 Fab konstrukti koji sadrže aminokiselinske supstitucije koje odgovaraju Mab dizajn setovima su pripremljeni kao što je opisano u primeru 3. Kao što je opisano u primeru 4, svi LCCA eksperimenti su izvedeni na konstruktima koje sadrže međulančanu Fab disulfidnu vezu koja se nalazi u konstantnom domenu (H/C233-L/C214, Kabat numeracija). Da bi se procenilo preferencijalno sparivanje izloženo od strane Mab dizajn setova, preferencijalno sparivanje izloženo odgovarajućim LCCA dizajn setovima je mereno kao što je opisano u primeru 4, sa sledećim izuzecima.
[0465] Procena preferencijalnog sparivanja u LCCA dizajn setovima je sprovedena pomoću LCCA kao što je opisano u primeru 4, osim što je transfekcija izvršena sa teškim i lakim lancima u odnosu 1:1:3 (po težini) za H1:L1:L2 ili H2:L2:L1, umesto 1:1:1, pri čemu je teški lanac prisutan u graničnim količinama, a pogrešno spareni laki lanac prisutan u višku. Pošto su dizajni opisani u primeru 9 optimizovane verzije dizajna opisanih u tabelama 4A i 4B, ili čine kombinacije ova dva dizajna, od kojih neki već pokazuju relativno visoku specifičnost sparivanja, bilo je moguće da dalje poboljšanje tespecifičnosti (ako se postigne) ne može da se detektuje u LCCA pri H1:L1:L2 ili H2:L2:L1 od 1:1:1, zbog ograničenja testa. Tako je korišćen odnos DNK 1:1:3, a ne 1:1:1, kako bi se detektovalo poboljšanje specifičnosti. Sve transfekcije su izvedene korišćenjem 300 ng H1, 300 ng L1 i 900 ng L2 (tj. H1:L1:L2 ili H2:L2:L1 = 1:1:3 odnos), 100 ng AKTdd pTT22 (vektor koji sadrži konstitutivno aktivnu protein kinazu B mutant) i 400 ng ssDNK (DNK lososa).
Analiza podataka i opis LCCA metrike
[0466] Analiza podataka je sprovedena korišćenjem modifikovane verzije analize opisane u primeru 4, kao što je navedeno u nastavku teksta.
[0467] Svi LCCA dizajn setovi su testirani u LCCA, i dizajni od interesa su identifikovani na osnovu sledećih kriterijuma za uključivanje. Da bi se smatrao dizajnom od interesa, dizajn je morao da sadrži najmanje jedan pozitivan LCCA rezultat iznad gornje granice 95% WT skalarnog intervala pouzdanosti, dok je drugi komplementarni LCCA morao da bude iznad donje granice 95% WT skalarnog intervala pouzdanosti. Svi dizajni koji su prošli gore navedene kriterijume su uključeni u drugom K-L dizajn biblioteke kao što je identifikovano u tabeli 7A, ili drugi K-K izveden K-L dizajn biblioteku kao što je identifikovano u tabeli 7B.
[0468] Tabela 8A i Tabela 8B opisuju LCCA podatke dobijene za drugu K-L biblioteku dizajna i drugu K-K-izvedenu K-L biblioteku, respektivno, u kontekstu Mab dizajna. Performanse svakog LCCA dizajna postavljenog u ovom primeru opisane su sa dve skalarne vrednosti koje su odgovarale prirodnom logaritmu odnosa H1L1: H1L2 (srednja vrednost) i odnos H2L2: H2L1 (srednja vrednost), respektivno. Imajte na umu da se ove skalarne vrednosti malo razlikuju od skalarnih vrednosti izračunatih u primeru 4, ali se slično koriste za procenu preferencijalnog sparivanja. Ove skalarne vrednosti su navedene u kolonama 2 i 5 u tabeli 8A za drugu biblioteku K-L dizajna, i u tabeli 8B za drugu K-K-izvedenu K-L biblioteku. Za CAT-2200 divljeg tipa (HC) u kompeticiji sa CAT-2200 (LC-FLAG) plus Pertuzumab (LC-HA) 95% skalarni interval pouzdanosti je - 3,24 (donja granica) do -2,94 (gornja granica). Za Pertuzumab divljeg tipa (HC) u kompeticiji protiv Pertuzumab (LC-HA) plus CAT-2200 (LC-FLAG) 95% skalarni interval pouzdanosti je - 0,9 (donja granica) do -0,6 (gornja granica).
[0469] Skalarni opseg za svaki LCCA dizajna (H1L1L2 i H2L1L2 eksperimenti) je prikazan u kolonama 3 i 6 u tabelama 8A i 8B kao mera ponovljivosti rezultata, i predstavlja razliku između najviših i najnižih skalarnih vrednosti izmerenih za dizajn. Za rezultate prijavljene iz jednog merenja, vrednosti opsega su označene sa NA (nije primenljivo). Pored toga, skalarne vrednosti su takođe konvertovan nazad u čisti odnos medijana za H1L1:H1L2 i H2L2:H2L1. Ova konverzija efikasno normalizuje LCCA odnose na 100% pošto je u nekim slučajevima upčeno da se ukupna količina H1L1 i H1L2, ili H2L2 i H2L1 značajno razlikovala od 100%. Ove vrednosti su prijavljene u kolonama 4 i 7 u tabelama 8A i 8B.
Rezultati
[0470] Kao što je gore navedeno, rezultati LCCA su prikazani u tabelama 8A i 8B u kontekstu Mab dizajn setova. Tabela 8A obezbeđuje LCCA podatke koji se odnose na K-L dizajne opisane u primeru 9. 151 K-L dizajn setova je ispunio kriterijume za uključivanje, a većina dizajna ima aminokiselinske modifikacije samo u konstantnom regionu, sa nekoliko dizajna koji uključuju i aminokiselinske modifikacije u varijabilnom regionu (videti tabelu 7A). Ovi dizajni su predloženi kako bi se dodatno pokrenula specifičnost sparivanja i istovremeno favorizovala transferabilnost na druge sisteme antitela.
[0471] Tabela 8B obezbeđuje LCCA podatke koji se odnose na K-K-izvedene K-L dizajne takođe opisan u primeru 9.21 K-K-izvedenih K-L dizajna su ispunili kriterijume za uključivanje. Ovi dizajni uključuju samo dizajne konstantnih domena.
Primer 11: Skaliranje dizajniranih Fab heterodimera u cilju biofizičke karakterizacije
[0472] Da bi se ispitale biofizičke karakteristike pravilno sparenih heterodimera, priprema odabranih ispravno uparenih heterodimera H1L1 ili H2L2 (dizajnirani Fabs) identifikovanih u jedinstvenim identifikatorima prikazanim u tabelama 7A i 7B je povećana kao što je opisano u primeru 5, sa izuzetkom da je 50 ml skala izvršena umesto 20 ml. Eksprimirani Fab regioni su prečišćeni kao što je opisano u primeru 5 kako bi se testirala njihova termička stabilnost i vezivanje za antigene. Protokol za prečišćavanje je modifikovan da inkubira supernatante sa IgG-CH1 CaptureSelect<™>smole bez ikakvog početnog razblaživanja u ravnotežnom puferu i elucija vezanih uzoraka je izvedena sa 4 sloja zapremine elucije pufera.
[0473] Nakon prečišćavanja, ekspresija heterodimera je procenjena pomoću neredukujućeg i redukujućeg testa High Throughput Protein Express u kome se koristi Caliper LabChip GXII, kao što je ranije naznačeno u primeru 5.
[0474] Podaci su pokazali da uključivanje modifikacija Mab dizajna u dizajnirane Fabs nije imalo značajan uticaj na ekspresiju proteina, sudeći po prinosu nakon prečišćavanja. Prinos nakon prečišćavanja dobijen za dizajnirane CAT-2200 Fab je iznosio 1,3 mg/50 ml ekspresije (SD od 0,6), u poređenju sa 1,9 mg/50 ml ekspresije (SD od 0,5) za Fab divljeg tipa. Dizajnirani pertuzumab Fab pripremljeni su sa prinosom od 0,9 mg/50 ml ekspresije (SD od 0,4), u poređenju sa 1,1 mg/50 ml ekspresije (SD od 0,2) za Fab divljeg tipa. Caiper analiza pokazala je stepen čistoće uporediv sa WT Fab (podaci nisu prikazani). Veliki broj dizajniranih Fab regiona imao je sa sobom povezan precipitat (obeleženo sa '*' u tabelama 9A i 9B) posle prečišćavanja. Prethodno u tekstu navedene informacije o prinosu dobijene su merenjem nakon uklanjanja precipitata.
Primer 12: Merenje afiniteta za antigen dizajniranih Fab heterodimera
[0475] Sposobnost CAT-2200 dizajniranih Fab heterodimera da se vežu za IL-17A i pertuzumab dizajniranih Fab heterodimera da se vežu za HER2-ECD procenjena je kako bi se utvrdilo da li su aminokiselinske supstitucije imale bilo kakav efekat na sposobnost heterodimera da se veže za antigen. Vezivanje antigena je procenjeno kao što je opisano u primeru 6, osim što su CAT-2200 dizajnirani Fab fragmenti injecirani brzinom od 50 μL/min tokom 120s, sa fazom disocijacije od 600 do 800s, umesto faze disocijacije od 900s. Osim toga, skrining dizajniranih pertuzumab Fab regiona za vezivanje za HER2 je sproveden kao što je opisano u primeru 6, sa sledećim modifikacijama: za svako hvatanje Fab, Fab fragmenti su razblaženi do 2,5 μg/ml umesto 2 μg/ml sa vremenom injeciranja od 120s umesto 240s. Najniža injecirana koncentracija antigena HER2 bila je 1,23nM umesto 0,41 nM. Faza disocijacije za seriju koncentracije bila je 600s umesto 1200s.
[0476] Rezultati.Vrednosti afiniteta za antigen (KD) za uzorke dizajniranih Fab heterodimera su navedeni u tabeli 9A (K-L dizajni) i tabeli 9B (K-K-izvedeni K-L dizajni) u kontekstu Mab dizajn parova. KD vrednosti H1L1 i H2L2 Fab fragmenata su uključene u kolone 2 i 4 (KD za H1L1 CAT-2200 Fab heterodimer i H2L2 Pertuzumab Fab heterodimer, redom), i 3 i 5 (promena KD za H1L1 ili H2L2 Fab heterodimer u odnosu na odgovarajući divlji tip). KD vrednosti su određene samo za uzorke Fab heterodimera koji su pokazali hvatanje Fab heterodimera od najmanje 100 RU. Referentna KD vrednost za CAT-2200 divljeg tipa vezan za IL-17A ,koji se koristi za poređenje sa dizajniranim heterodimerima bila je 0,209 nM. Ova vrednost je srednja vrednost zasnovana na višestrukim merenjima CAT-2200 divljeg tipa Fab heterodimera gde laki lanac sadrži oznaku FLAG i ne razlikuje se značajno od vrednosti prijavljene u primeru 6. Slično tome, referentna KD vrednost za pertuzumab divljeg tipa vezan za HER2 bila je 7,8 nM. Ova vrednost je takođe srednja vrednost medijane na bazi većeg broja merenja pertuzumab Fab heterodimera divljeg tipa gde laki lanac sadrži HA oznaku, i ne razlikuje se značajno od vrednosti navedene u primeru 6. U tabelama 9A i 9B, razlika u KD u odnosu na afinitet vezivanja antigena divlji tip prikazana je korišćenjem kalkulacije -(log(KD_dizajn) - log(KD_wt)), tako da pozitivne vrednosti ukazuju na niže vrednosti KD, dok negativne vrednosti ukazuju na povećane KD vrednosti Fab heterodimera u poređenju sa afinitetom vezivanja divljeg tipa za antigen. Kao što je ranije napomenuto, s obzirom na ograničenja protoka u postupku skaliranja za veliki broj Fab heterodimera generisanih Mab dizajn setovima, SPR merenja su izvedena uzorkovanjem subseta dizajniranih Fab heterodimera. Iz tog razloga, za neke Fab heterodimere ne postoje KD vrednosti izmerene pomoću SPR i stoga su označeni kao neodređeni (ND). Za dizajnirane testirane Fab heterodimere, aminokiselinske supstitucije su imale mali ili nikakav uticaj na vrednosti KD (unutar razlike od 2 puta u odnosu na WT).
Primer 13: Merenja termičke stabilnosti dizajniranih Fab heterodimera pomoću DSF.
[0477] Diferencijalna skenirajuća fluorescencija (DSF) korišćena je za merenje termičke stabilnosti pravilno sparenih dizajniranih Fab heterodimera u poređenju sa Fab fragmentima divljeg tipa. Fab heterodimeri su pripremljeni kao što je opisano u primeru 11.
Merenje termičke stabilnosti pomoću DSF
[0478] Termička stabilnost dizajniranih Fab heterodimera merena je pomoću DSF na sledeći način. Svaki prečišćeni heterodimer je razblažen do 0,67 mg/mL u DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, Hyclone Cat # SH30028.02). Radna zaliha Sypro Orange boje za gel (Life Technologies Cat # S-6650) pripremljena je razblaženjem 1:1000 u DPBS. DSF uzorci su pripremljeni dodavanjem 15 μL proteina od 0,67 mg/mL u 15 μL radnog rastvora boje za gel Sypro Orange. Međutim, za proteine koji su imali koncentraciju manju od 0,67 mg/mL, svaki uzorak DSF je pripremljen dodavanjem 15 μL nerazblaženog proteina u 15 μL radnog rastvora Sypro Orange boje. DSF analiza je zatim sprovedena na alikvotima od 30 μl, koristeći instrument Rotor-Gene 6000 qPCR (QiaGen Inc). Svaki uzorak je skeniran od 30°C do 94 ° C koristeći intervale od 1 ° C sa ravnotežom od 10 sekundi između svakog koraka i 30 sekundi čekanja na početku. Korišćen je ekscitacioni filter od 470 nM i emisioni filter od 610 nM sa prinosom od 8. Podaci su analizirani pomoću softvera Rotor-Gene 6000 koristeći maksimalnu vrednost iz prvog derivata krive denaturacije kao Tm.
[0479] DSF rezultati za uzorke dizajniranih Fab heterodimera su navedeni u tabelama 9A (K-L dizajn) i 9B (K-K-izvedeni K-L dizajn), u kontekstu Mab dizajn setova. Termičke stabilnosti H1L1 i H2L2 Fab fragmenata su uključene u kolone 6 i 8 (H1L1 se odnosi na CAT-2200 Fab heterodimer i H2L2 na Pertuzumab Fab heterodimer) u tabelama 9A i 9B. Za Fab heterodimere gde su sprovedena ponavljanja, navedena Tm vrednost je vrednost medijane. Poređenja Tm vrednosti dizajniranih Fab heterodimera u odnosu na Tm vrednost Fab heterodimera divljeg tipa, prijavljeni su u koloni 7 za CAT-2200 H1L1 i u koloni 9 za Pertuzumab H2L2. Utvrđeno je da medijana za Tm za CAT-2200 Fab konstrukt divljeg tipa koji sadrži FLAG oznaku iznosi 77,0°C. Utvrđeno je da medijana za Tm za Pertuzumab Fab heterodimer divljeg tipa koji sadrži HA oznaku iznosi 81.7°C. Kao što je ranije pomenuto DSF merenja su izvedena uzorkovanjem podskupa dizajniranih Fab heterodimera, stoga neki Fab heterodimeri nemaju Tm vrednosti merene DSF i označeni su kao neodređeni (ND). Većina testiranih dizajna pokazala je dobru termostabilnost (pokazujući smanjenje Tm u odnosu na WT do 4-5 ° C), u rasponu očekivanih Tm vrednosti koje se obično primećuju za divlje tipove Fabs, sa sledećim izuzetkom. Prisustvo S131K_L135K mutacija u kapa lakom lancu u kombinaciji sa L124E_K145T mutacijama u kapa teškom lancu u dva Fab heterodimera izgleda da negativno utiče na njihove Tm vrednosti za > 10°C. Takođe, napomena, za neke od CAT-2200 dizajniran Fabs, rame do glavnog Fab vrha je uočeno u DSC spektrima (ovi Fabs su označeni sa '#' u tabelama 9A i 9B). Takav profil je takođe uočen za CAT-2200 divljeg tipa Fab.
Primer 14: Merenja termičke stabilnosti dizajniranih Fab heterodimera pomoću DSC
[0480] Da bi se dopunilo merenje termičke stabilnosti od strane DSF, precizniji metod diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) je takođe korišćen za merenje toplotne stabilnosti pravilno sparenih, dizajniranih Fab heterodimera u poređenju sa termičkom stabilnošću divljeg tipa, nemodifikovanog para teški lanac-laki lanac. Fab heterodimeri su pripremljeni kao što je opisano u primeru 11 i mera toplotne stabilnosti od strane DSC-a kao što je opisano u primeru 8. Međutim, za Fab heterodimere koji su imali koncentracije uzorka niže od onih navedenih u protokolu, DSC je izveden u raspoloživoj koncentraciji.
[0481] Merenja toplotne stabilnosti za H1L1 i H2L2 Fabs su prikazani u kolonama 10 i 12 (H1L1 se odnosi na CAT-2200 Fab heterodimer i H2L2 na Pertuzumab Fab heterodimer, respektivno) Tabele 9A i 9B. Za Fab heterodimere gde su sprovedena ponavljanja, navedena Tm vrednost je vrednost medijane. Poređenja Tm vrednosti dizajniranih Fab heterodimera u odnosu na Tm vrednost Fab heterodimera divljeg tipa su prijavljeni u koloni 11 za CAT-2200 H1L1 (Fab konstrukt CAT-2200 divljeg tipa koji sadrži FLAG oznaku, sa medijanom Tm od 70,7°C) i koloni 13 za Pertuzumab H2L2 ( Fab konstrukt Pertuzumaba divljeg tipa koji sadrži HA oznaku, sa medijanom Tm od 78,1°C). S obzirom na visoke zahteve u pogledu količine uzoraka i nisko propusnu prirodu DSC, merenja su izvršena uzorkovanjem podskupa dizajna koji su okarakterisani pomoću DSF. Iz tog razloga, za neke Fab heterodimere ne postoje Tm vrednosti izmerene pomoću DSC i stoga su označeni kao neodređeni (ND). Svi dizajnirani Fab heterodimeri koje je testirao DSC pokazali su dobru termostabilnost (smanjenje TM u odnosu na WT do 2-3 C). Tm vrednosti izvedene iz DSC bile su generalno niže od vrednosti uočenih pomoću DSF (primer 13). Iako je apsolutna razlika u Tm dizajniranih Fabs u odnosu na WT je uočeno da zavisi od metode koja se koristi, da li DSF ili DSC, relativni rang dizajniranih Fabs u odnosu na divlji tip Fab je isti nezavisno od metode koja se koristi.
Primer 15: Klasteriranje dizajna i izbor reprezentativnih dizajna
[0482] Primeri 2 do 14 opisali su dizajn i testiranje K-L dizajna i K-K-izvedenih K-L dizajna. Sposobnost ovih dizajna da pospešuje sparivanje je testiran u LCCA, u Fab formatu gde je određena sposobnost jednog teškog lanca svakog LCCA dizajna postavljenog za sparivanje sa odgovarajućim lakim lancem. Takođe su procenjeni efekti supstitucija aminokiselina na stabilnost i vezivanje antigena rezultirajućih ispravno uparenih heterodimera (jedan teški lanac i jedan laki lanac).
[0483] Da bi se testiralo da li su preferencijalni rezultati sparivanja za Mab dizajn setove (H1L1H2L2) dobijeni u LCCA formatu (koekspresija H1, L1 i L2, ili H2, L1 i L2) za K-L dizajne i K-K-izvedene K-L dizajne takođe primenjuju kada su polipeptidni lanci Mab dizajn seta koeksprimirani (tj. kada su H1, L1, H2 i L2 koeksprimirani), izabran je reprezentativan broj od preko 400 dizajna opisanih u tabelama 4A, 4B, 7A i 7B, jer nije bilo moguće testirati sve dizajne na ovaj način. Reprezentativni dizajni su testirani u testu koji se naziva "SMCA" (detaljno opisano u primeru 16).
[0484] Da bi bili izabrani reprezentativni dizajni, K-L dizajni identifikovani u tabelama 4A i 7A (n = 404) su kombinovani i grupisani u klastere na osnovu identičnosti pozicija supstituisanih aminokiselinskih ostataka. U nekim slučajevima gde je K-K-izvedeni K-L dizajn iz tabele 7B bio značajno modifikovan u odnosu na originalni K-K dizajn, on je takođe bio uključen i u ovu grupu K-L dizajna u cilju grupisanja u klastere. Tabele 10-A1 do 10-A12 prikazuju dobijene klastere 1 do 12 za K-L dizajne. Isto tako, K-K-izvedeni K-L dizajni prijavljeni u tabelama 4B i 7B (n = 43), isključujući one koji su premešteni u grupu K-L dizajna, takođe su kombinovani i grupisani u klastere. Tabele 10-B 1 do 10-B 10 prikazuju dobijene klastere 1 do 10 za K-K-izvedene K-L dizajne. Reprezentativni dizajni iz svakog klastera su zatim izabrani kao što je opisano u nastavku teksta. Finalni set odabranih reprezentativnih dizajna je takođe uključen u tabelama 11A (K-L dizajni) i 11B (K-K izvedeni K-L dizajni), uključujući označavanje za SMCA dizajn ID.
Reprezentativni dizajni za SMCA
[0485] Reprezentativni dizajni su izabrani na osnovu primarnih kriterijuma demonstriranja specifičnosti sparivanja i imaju minimalan ili nikakav uticaj na vezivanje antigena, kao i uzimajući u obzir sekundarne kriterijume kao što su: stabilnost dizajna, minimiziranje broja supstitucija, uporediv izraz sa WT. Maksimalna specifičnost sparivanja je procenjena uzimajući u obzir oba Fabs, kao i svaki Fab pojedinačno gde je jedan Fab uparen manje dobro od drugog Fab u heterodimernom paru, ali je ipak pokazao bolje od sparivanja divljeg tipa (Scenariji A i B kao što je prikazano na slici 6). Pored toga, raznolikost unutar klastera i broj dizajna u klasteru dodatno su vodili vrstu i broj izabranih predstavnika klastera.
[0486] Ukupno 33 reprezentativna K-L dizajna izabrano je iz klastera 1 do 12 za testiranje u SMCA formatu. Isto tako, 7 K-K-izvedenih K-L dizajna sa visokim do srednjim prosečnim vrednostima performansi LCCA su izabrani iz 7 klastera od 10 identifikovanih klastera. Tri klastera K-K izvedenih K-L dizajna nisu uključivali dizajne koji su ispunili kriterijume za reprezentativne dizajne u odnosu na primarne kriterijume kao što su kriterijumi LCCA performansi ili izostanak efekta na vezivanje antigena.
[0487] Najmanje jedan reprezentativni dizajn je izabran iz svakog klastera. Klasteri koji su predstavljeni samo jednim reprezentativnim dizajnom uključivali su K-L dizajn klastera 5 i 11, i sve 7 K-K-izvedenih K-L dizajnerskih klastera. Preostali klasteri su imali više od jednog reprezentativnog dizajna kao klasteri su bili ili veliki (tj klasteri 2, 3, 4, 6, 7, 8) i/ili su imali više dizajn pod-diverziteta (manji klasteri) (tj klasteri 1, 9, 10, 12). Iako su dizajni unutar svakog klastera imali sličnost sekvenci, manji klasteri unutar klastera razlikovali su se u najmanje jednom drajveru (aminokiselinska supstitucija). Reprezentativni dizajni za svaki klaster su istaknuti masnim slovima u tabelama 10-A1 do 10-A12 i 10-B1 do 10-B10. Kao što je napomenuto na drugom mestu u ovom dokumentu, "-" u ovim tabelama ukazuje na to da u tom konkretnom polipeptidnom lancu nisu bile prisutne aminokiselinske supstitucije koje pospešuju preferencijalno sparivanje.
Drajveri i sekundarne supstitucije
[0488] Ovde su opisani klasteri za koje su izabrani reprezentativni primeri, sa fokusom na identifikaciji "drajvera" ili "drajver setova" (aminokiselinske pozicije i/ili supstitucije) koji su pospešivali željenu specifičnost sparivanja u svakom klasteru, što je procenjeno pomoću LCCA. Termin "drajver set" odnosi se na set aminokiselinskih pozicija i supstitucija koje pospešuju preferencijalno sparivanje, dok se termin "drajver" odnosi na samo jednu poziciju/supstituciju unutar drajver seta. Međutim, drugi ostaci i supstitucije su ponekad asocirani sa dizajnom ili setom dizajna u klasteru. Ovi ostaci i supstitucije se označavaju kao "sekundarne" supstitucije, a ponekad su uključeni u Mab dizajn set kako bi se poboljšale performanse drajver seta ili drajver setova koji se koriste. Sa stanovišta mehanizma, ove sekundarne supstitucije mogu da deluju tako što i) pospešuju steričko smeštanje drajvera, ii) povećavaju broj kontakata ili nadomeštaju kontakte izgubljene nakon supstitucija na pozicijama drajver setova, na dodirnoj površini između teških i lakih lanaca, iii) optimizuju mrežu za uspostavljanje vodoničnih veza na bazi drajver setova, i/ili iv) kreiraju okruženje pogodno za poboljšane performanse drajver setova. Jedan ili više ovih mehanizama može da se koristi/predviđen je da poboljša performanse drajvera u svakom klasteru.
[0489] Neke od ovih sekundarnih supstitucija bile su uobičajene u nekoliko klastera. Na primer, K145T supstitucija u teškom lancu je korišćena ili u H1L1 ili u H2L2 kako bi se uklonilo pozitivno naelektrisanje kada su negativno naelektrisani drajver ili drajveri bili dizajnirani u njegovoj blizini. U velikom broju klastera, K129T supstitucija u lambda lakom lancu je ponekad korišćena za uklanjanje pozitivnog naelektrisanja kada su negativno naelektrisani drajver ili drajveri dizajnirani u njegovoj blizini (npr. K-L dizajn klaster 4 i klasteri 8-12). Osim toga, supstitucija E124Q u lambda lakom lancu je korišćena u nekim klasterima za uklanjanje negativnog naelektrisanja u blizini pozitivno naelektrisanog drajvera ili više drajvera (npr. K-L dizajn klasteri 1-3). V133G supstitucija je primenjena pretežno u kapa lakom lancu u nekim od dizajna kako bi se sterno smestili određeni drajver setovi (npr. pretežno u K-L dizajn klasterima 1, 3, 4, 6, 7, 10, 12 i K-K izvedeno K-L dizajn klasteru 10). Y178T u lambda lakom lancu uveden je u dizajnu za sterno smeštanje specifičnih drajver setova u odgovarajućim H1L1 (npr. K-L klasteri 4, 5, 8 i 12). V133S u lakom lancu je primenjen u još jednom drajver setu (npr. K-L klasteri 1, 2 i 12) sa ciljem da se poboljša mreža vodoničnih veza.
Opis K-L dizajn klastera
[0490] Za klaster 1, dva dizajna (13175-13486 i 13180-13515) su izabrani da predstavljaju klaster pošto ovi dizajni koriste slične elektrostatičke drajvere zauzimaju sličan prostor (videti tabelu 10-A1). Za sve članove ovog klastera, korišćena je kombinacija dva drajver seta. Prvi elektrostatički drajver set je dizajniran da omogući da negativno naelektrisana supstitucija (pretežno L143D) u H1 formira soli mostove sa pozitivno naelektrisanim supstitucije (T131K / R) u L1, dok je H2 dizajniran da omogući a) pozitivno naelektrisane supstitucije, S188K ili L124R_S186R, da se formiraju soli mostove sa negativno naelektrisanim supstitucija u L2 (S176D_T178E ili S176D_T180E) ili b) formiranje sonih mostova između L143R ili S186K u H2 i Q124E_V133D u L2. Drugi elektrostatički drajver set, nazvan "disulfidni upravljački upravljački set", dodan je kako bi se u nepovoljnost formiranje HL ili heterodimerne disulfidne veze u pogrešno sparenim heterodimerima u ranim fazama procesa asembliranja H-L. Drajver set za upravljanje disulfidima koristi pozitivno naelektrisanu supstituciju u H1 (A125R), negativno naelektrisanu supstituciju u L1 (S122D), negativno naelektrisanu supstituciju u H2 (K228D), i pozitivno naelektrisanu supstituciju u L2 (S121K). Ove aminokiselinske supstitucije se nalaze u blizini disulfidne veze, udaljene od zakopane (glavne) H-L dodirne površine gde se nalazi većina aminokiselinskih supstitucija u K-L dizajnu. Dva drajver seta su dizajnirana tako da formiraju sone mostove u preferencijalno sparenim heterodimerima, dok bi se pogrešno sparivanje destimulisalo, pre svega zbog elektrostatičkog odbijanja.
[0491] Za klaster 2, četiri reprezentativna dizajna (13282-13484, 13287-13494, 13218-13482 i 10945-11377) su izabrani da odražavaju stepen raznolikosti u ovom klasteru (videti tabelu 10-A2). Svi članovi ovog klastera su zasnovani na H1 dizajniran slično kao u klasteru 1 prvi elektrostatički drajver set, kako bi se omogućilo negativno naelektrisane supstitucije (L143D ili L143D_Q179E) da se formiraju soli mostovi sa pozitivno naelektrisanim supstitucije (T131K / R) u L1, dok H2 je dizajniran da omogući ili a) pozitivno naelektrisana supstitucija (S186K) da formira soli mostove sa negativno naelektrisanim supstitucija u L2, prvenstveno V133D ili V133D_Q160E; b) S188K za sparivanje sa S131D / E od L2; ili c) L143R / K za sparivanje sa Q124E_V133D L2. Neki članovi klastera 2 takođe su sadržavali sterički drajver pored elektrostatičkog drajvera. Korišćena su dva seta steričnih drajvera, nazvana "steric 1" i "steric 2". Steric 1 drajver set uključen F174G u H1, dizajniran da bude sterički komplementarna S176F ili T116F_S176F od L1, i V190F od H2 sterički komplementarna L135A od L2. Steric 2 drajver set uključen A139W u H1 sterički kompatibilan sa WT ostataka L1 i WT od H2 sterički kompatibilan sa L135W od L2. Stoga u ovom klasteru, neusklađeno sparivanje H1L2 i H2L1 bi bilo nepovoljno prvenstveno zbog elektrostatičkog odbijanja ili elektrostatičkog odbijanja u kombinaciji sa steričkom nekompatibilnosti. Postoje i dva člana klastera koji pored elektrostatičkog skupa drajvera sadrže varijabilnu komponentu dizajna ("varijabilni domen drajvera") u H2 lancu (Q39E ili L45P) i L2 lancu (Q38R ili P44F, respektivno) za koje predstavnici nisu izabrani, ali bi se očekivalo da poboljša sparivanje.
[0492] Za klaster 3, izabrano je pet reprezentativnih dizajna (10931-11263, 13221-13411, 10987-11257, 10983-11306 i 10947-11392) (videti tabelu 10-A3). Članovi ovog klastera koristili su slične elektrostatičke drajver setove u H1 (L143D ili L143E_Q179E) i L1 (T131R / K) kao u klasteru 2, ali su se razlikovali u odnosu na dizajn H2L2. Dizajn H2L2 je zasnovan pre svega na a) L124R_S186R / K ili L124R_Q179K ili S188K od H2 sparivanja sa S176D_T178E ili S176D_T180E od L2; ili b) L143R_S188K H2 sparivanja sa Q124E_V133D_S176D_T178D / E L2, što dovodi do nepovoljnog neusklađenih parova prvenstveno zbog elektrostatičkog odbijanja. Kao iu klasteru 2, neki članovi klastera su takođe koristili sterički 1 ili sterički 2 drajver pored elektrostatičkog drajvera. Predstavnik takve kombinacije drajvera je 13221-13411. Ovaj klaster je takođe uključivao dva dizajna koji sadrže "skup upravljačkih programa sa promenljivim domenom" pored skupa elektrostatičkih drajvera.
[0493] Tri reprezentativna dizajna (13335-13361, 13209-13364 i 11100-11205) su izabrani za klaster 4 (videti tabelu 10-A4). Većina članova ovog klastera koristi slične elektrostatičke drajvere na H1 (S188K) i L1 (S176E / D_Y178E) sa nekoliko varijacija u H2L2 paru: a) V177D_S188D H2 sparivanja sa S176K_T178R / K od L2; ili b) S186E ili L124E ili L124E_Q179E H2 sparivanja sa S176K / R ili S131K / R_S176R / K L2, što bi omogućilo formiranje solnih mostova u preferencijalno uparenim heterodimerima, dok bi neusklađeni parovi bili nepovoljni prvenstveno zbog elektrostatičkog odbijanja. Neki članovi ovog klastera koristili su samo sterički drajver set, tj. Steric 3 drajver set ili neke komponente steric 3 drajvera, pored elektrostatičkih drajver setova. Steric 3 drajver set je zasnovan na WT ostataka u H1L1 ili S188A u H1 i S176A_Y178W u L1 i S188W ili S186I / L_S188W u H2 dizajniran da bude sterički komplementaran S176V ili S176A_T178A u L2. Osim toga, neki članovi ovog klastera takođe su sadržavali disulfidni upravljački set pored elektrostatičkih drajver setova. Pored toga, nekoliko članova klastera sadržavalo je promenljivi skup upravljačkih programa domena pored elektrostatičkog drajvera.
[0494] Klaster 5 je predstavljen jedinstvenim identifikatorom 11066-11181 (videti tabelu 10-A5). Svi članovi ovog klastera koristili su elektrostatičke drajver setove. Prvi set elektrostatičkih drajvera bio je zasnovan na S186K u H1 uparivanju sa V133D u L1 i S188D ili V177D_S188D H2 sparivanja sa S131K ili S176K_T178R / K, respektivno, u L2. Drugi drajver seta je obrnute orijentacije naelektrisanja, pre svega L124E_V190D u H1 koji se sparuje sa L135K u L1 i L124R ili S188K u H2 koji se sparuje sa S176D ili S176D_T178E u L2.
[0495] Za klaster 6, dva reprezentativna dizajna (10808-11308 i 10814-11233) su izabrani (videti tabelu 10-A6). Svi članovi ovog klastera koristili su slične elektrostatičke drajver setove u H1L1 paru: V177D_S188D H1 sa S176K_Y178K / R L1 i raznovrsniji drajver set u H2L2 paru, naime a) S188K H2 sparivanja sa S176E / D_T178E ili S131D / E L2; b) S186K / R H2 sparivanja sa V133D ili Q124E_Q160E_T180E L2; c) L124R ili L124R_Q179K H2 sparivanja sa S176D ili S176D_T178D ili S176D_T180E L2; ili d) L143K / R H2 sparivanja sa V133D ili Q124E_V133D L2. Ove supstitucije su omogućile formiranje solnih mostova u preferencijalno uparenim heterodimerima, dok bi neusklađeni parovi bili nepovoljni prvenstveno zbog elektrostatičkog odbijanja.
[0496] Za klaster 7, tri dizajna (13167-13514, 13263-13493 i 12878-11240) su izabrani da predstavljaju klaster (videti tabelu 10-A7). Svi članovi klastera koriste elektrostatičke drajver setove na osnovu zajedničkog drajver seta u H1L1: S188E u H1 i Y178K u L1, sa nekim drajver skup raznolikosti u H2L2 paru: pre svega L124R ili S188K (takođe u kombinaciji sa L143K ili S186R ili Q179K) od H2 sparivanja prvenstveno sa S176D / E_T178D / E ili S176D / E_T180E ili u kombinaciji sa Q124E iz L2. Neki od članova klastera takođe su sadržavali disulfidni upravljački upravljački set, sterički 2 drajverski set ili varijabilni domen pored elektrostatičkog drajverskog seta.
[0497] Za klaster 8, pet dizajna (13320-13370, 12938-13469, 13226-13434, 11026-11270 i 13316-13451) su izabrani da predstavljaju klaster (videti tabelu 10-A7). Članovi ovog klastera imali su više varijabilnosti u H1L1 elektrostatičkom paru, dok je H2L2 par bio zasnovan na L143E ili L143E_Q179E drajvera u H2 sparivanja prvenstveno sa Q124R / K_T178R ili Q124R_Q160R / K_T178R drajvera u L2. Raznolikost drajvera H1L1 bila je sledeća: a) S186R ili Q179K korišćeni kao vozači u H1 uparen prvenstveno sa S180E vozačem L1 (S186K varijacija u H1 uparen sa V133D vozačem u L1); b) L143K drajver H1 uparen sa V133D ili T131E / D_V133D L1; ili c) S188K od H1 uparen prvenstveno sa S176D / E_Y178E od L1. Neki od članova klastera sadržao steric 2 ili steric 3 drajver skup ili steric 4 drajver skup zasnovan na L124W u H2 projektovan da bude sterički komplementaran V133A u L2 (neki članovi klastera kao deo drugog dizajna takođe koristi L143A zamenu u H1 i V133W u L1) pored elektrostatičkog drajvera seta. Štaviše, nekoliko članova klastera sadržalo je varijabilni domenski drajver pored elektrostatičkog skupa, za koji je izabran jedan predstavnik, ili je sadržavao konstruisanu disulfidnu vezu između F122C H2 i Q124C L2.
[0498] Za klaster 9, izabrana su dva reprezentativna dizajna (13208-13455 i 13194-13427) (videti tabelu 10-A9). Skoro svi članovi ovog klastera koristili su kombinaciju dva elektrostatička drajver seta. Prvi drajver set je pretežno sastavljen od Q179K ili S186R u H1 i S180E u L1 sa L143E ili L143E_Q179E u H2 i S131K ili Q124R_T178R ili Q124R_Q160K_T178R u L2, a drugi drajver set je drajver set za upravljanje disulfidom.
[0499] Za klaster 10 su izabrana dva reprezentativna dizajna (13238-13463 i 13304-13466) (videti tabelu 10-A10). Članovi ovog klastera su se zasnivali na sternim 1 drajverima, samim ili u kombinaciji sa elektrostatičkim drajver setovima koji se koriste u klasteru 9.
[0500] Za klaster 11, izabran je jedan reprezentativni dizajn (13306-13375) (videti tabelu 10-A11). Svi članovi ovog klastera koristili su elektrostatičke supstitucije za pokretanje preferencijalnog sparivanja heterodimera, na osnovu sledećih pokretača: L143K_V190K u H1 i V133D u L1 i L124E u H2 i S131K_L135K u L2.
[0501] Za klaster 12, izabrana su tri reprezentativna dizajna (13227-13383, 11065-11206 i 11034-11204) (videti tabelu 10-A12). Članovi ovog klastera prvenstveno su koristili elektrostatičke supstitucije za pokretanje preferencijalnog sparivanja heterodimera. To uključuje L143K ili S186K u H1 i V133D ili T131D / E_V133D u L1 i pretežno L124E_Q179E u H2 i S131K / R_S176R u L2. Neki članovi klastera dodatno su uključivali disulfidno upravljanje, sterički 2, sterički 3 ili skupove upravljačkih drajvera promenljivog domena.
Opis klastera K-K izvedenih K-L dizajna
[0502] Znatno manji skup K-K-izvedenih K-L dizajna je testiran (n = 43) u LCCA u odnosu na K-L dizajna. Dakle, svaki od deset kapa-kapa portovanih klastera je predstavljen jednim dizajnom. Većina klastera je koristila elektrostatičke drajver setove, osim dva koja su koristila setove steričnih drajvera. Osim toga, dva klastera su se sastojala od dizajna samo u promenljivom domenu, dok su ostali klasteri sačinjavali konstantne dizajne domena.
[0503] Klaster 1 je uključivao elektrostatičke dizajne zasnovane na sledećem skupu drajvera: L143E_Q179E u H1, E124K_Y178R u L1, S186R u H2 i T178E_T180E ili Q160E_T180E u L2 i predstavljen je dizajnom 10657-10760.
[0504] Klaster 2 je uključivao elektrostatičke drajver setove sa L143E u H1, E124R u L1 i S186R ili Q179K u H2, Q124E_Q160E_T180E u L2 (predstavnik dizajna 10652-10734).
[0505] Klaster 3 je sadržao pozitivno naelektrisani drajver S186R u H1 komplementaran sa negativno naelektrisanim drajverom S180E u L1, i negativno naelektrisan drajver L143E ili Q179E ili njihova kombinacija u H2 komplementarna pretežno na pozitivno naelektrisanog drajvera Q124K_T178R u L2 (predstavnik dizajna 10685-10726).
[0506] Klaster 4 koristi sledeće drajvere: Q179K u H1, S180E u L1 i L143E u H2, Q124R ili Q124R_Q160K_T178R u L2 (predstavnik dizajna 10665-10724).
[0507] Članovi klastera 6 sadržavali su promenljive dizajne domena zasnovane na elektrostatičkom paru Q39K / R i Q38E / D u jednoj ruci i Q39E / D sa Q38K / R u drugoj ruci (obe orijentacije naelektrisanja para su korišćene u H1L1 i H2L2 rukama) (predstavnik dizajna 10681-10741).
[0508] Članovi klastera 8 uključivali su drugi skup pokretača promenljivog domena, sterične prirode: WT ili L45F u H1 komplementarne WT u L1, i L45A / P u H2 komplementarne P44F L2 (predstavnik dizajna 10621-10733).
[0509] Klaster 10 je uključivao jedan dizajn zasnovan na L124E u H1, S176R u L1 i L124R u H2 i S176D u L2 (dizajn 10640-10713).
[0510] Predstavnici klastera 5, 7 i 9 nisu izabrani jer nisu ispunili kriterijume performansi, kao što su umerena do jako usmeravanje ili izostanak uticaja na vezivanje antigena u odnosu na parentalni Fab.
Primer 16: Procena preferencijalnog sparivanja dizajniranih heterodimera u Mab dizajn setovima u bispecifičnom formatu antitela
[0511] Primeri 2 do 4, i 10 su pokazali sposobnost dizajniranih Fabs da preferencijalno upariti u kontekstu LCCA dizajna (tj.H1, L1, L2, ili H2, L1, L2, gde je jedan teški lanac bio eksprimiran sa dva laka lanca u Fab formatu). U ovom primeru, dizajnirani heterodimeri u Mab dizajn setovima (H1, L1, H2, L2) su procenjeni da bi se utvrdilo da li pospešuju preferencijalno sparivanje u formatu bispecifičnih antitela (tj. kada su H1, L1, H2 i L2 koeksprimirani). Pored aminokiselinskih supstitucija Mab dizajna seta, Fc region pune dužine teškog lanca svakog heterodimera je asimetrično modifikovan tako da je jedan teški lanac sadržao aminokiselinske supstitucije T350V, L351Y, F405A i Y407V (lanac A), a drugi teški lanac je sadržao aminokiselinske supstitucije T350V, T366L, K392L i T394W (lanac B) gde je numeracija aminokiselina u Fc u skladu sa EU sistemom numeracije. Ove asimetrične Fc modifikacije su uključene kako bi se pospešila heterodimerizacija jedinstvenih teških lanaca.
[0512] Sposobnost dizajniranih heterodimera u Mab setovima da pospešuju preferencijalno sparivanje u kontekstu bispecifičnog antitela procenjena je u 3 bispecifična sistema koristeći kombinacije CAT-2200 i pertuzumab antitela opisanih u prethodnim primerima, i CR8071 (anti-influenca B hemaglutinin protein) antitelo i SGN-CD19a (anti-CD19). 3 testirana bispecifična sistema su bili: A) CAT-2200 (koji ima laki lanac lambda) / pertuzumab (koji ima laki lanac kapa), B) CAT-2200 (koji ima laki lanac lambda) / SGN-CD19a (koji ima laki lanac kapa) i C) CR8071 (ima laki lanac lambda) / SGN-CD19a (ima laki lanac kapa). CAT-2200 i CR8071 su ljudska antitela, dok su pertuzumab i SGN-CD19a humanizovana antitela.
Format testa (SMCA)
[0513] Sposobnost heterodimera koji sadrže aminokiselinske supstitucije Mab dizajn seta da se preferencijalno uparuju kako bi se formiralo ispravno upareno bispecifično antitelo procenjeno je kao što je opisano u nastavku. Test se zasniva na koekspresiji četiri lanca (H1 i L1 lanci iz jednog antitela sa H2 i L2 lancima iz drugog antitela) i detekciji prisustva pravilno formiranog bispecifičnog antitela pomoću masene spektrometrije (LC-MS). Slika 8 daje šematski prikaz četiri početne polipeptidne lance i potencijalne proizvode koji su rezultat koekspresije ovih početnih polipeptidnih lanaca u odsustvu preferencijalnog sparivanja između teških i lakih lanaca (u oba Fab i Fc regiona) heterodimernih parova. Dva jedinstvena konstrukta teških lanaca pune dužine su koeksprimirane sa dva jedinstvena konstrukta lakog lanca, dajući deset mogućih vrsta antitela (koji se nazivaju i Mab vrste): H1L1_H1L1, H1L2_H1L2, H1L1_H1L2, H2L1_H2L1, H2L2_H2L2, H2L1_H2L2, H1L1_H2L1, H1L2_H2L2, H1L2_H2L1 i H1L1_H2L2. H1L1_H2L2 vrsta je pravilno spareno bispecifično antitelo (videti sliku 8). Četiri tipa polu-antitelo (polu-Ab) vrsta su takođe moguće, kao što je prikazano na slici 8. Kada se modifikacije uvode u Fc region kako bi se pospešila heterodimerizacija jedinstvenih teških lanaca, broj potencijalnih Mab vrsta se smanjuje (tj. Uočavaju se manje vrsta E do J). Relativna specifičnost sparivanja u smislu količine pravilno sparenih bispecifičnih vrsta antitela H1L1_H2L2 u odnosu na druge vrste određena je korišćenjem LC-MS nakon proteina A (pA) prečišćavanja i deglikozilacije. Kada je to bilo moguće, lanci su ostavljeni neoznačeni, pod uslovom da su se sve vrste Mab i polu-Ab vrste razlikovale jedna od druge za najmanje 50 Da. Kada su masovne razlike isključile ovu mogućnost, N-terminalne oznake (HA ili FLAG) su dodate lakim lancima kako bi se obezbedila dovoljna masovna diferencijacija između vrsta, sa naglaskom na upotrebu FLAG oznake gde je to moguće, jer je ponekad uočeno cepanje HA oznake (u slučaju konstrukt koje sadrže CR8071, korišćena je samo FLAG oznaka).
[0514] Ovaj test, koji uključuje ekspresiju H1, L1, H2 i L2 bispecifičnog antitela, i naknadnu analizu uparenih proizvoda naziva se SMCA.
Priprema konstrukata
[0515] Konstrukcije koje kodiraju CAT-2200, pertuzumab, CR8071 i SGN-CD19a IgG teške i lake lance koji sadrže aminokiselinske modifikacije prema dizajnu pripremljeni su na sledeći način. Sekvence lakog lanca CAT-2200 i pertuzumab pripremljene su kao što je opisano u primeru 3, dok su sekvence teških lanaca u punoj dužini za ova antitela stvorene dodavanjem IgG1*01 DNK sekvence koja kodira parcijalne zglob-CH2-CH3 domene [SEQ ID NO: 6] i modifikovana da pospešuje heterodimerizaciju, na C-terminus CH1 domena Fab teških lanaca (koji sadrži deo zgloba i isključujući ABD2 proširenje koje se koristi za konstrukcije u LCCA) čija je priprema opisana u primeru 3. Konstrukti koji sadrže aminokiselinske supstitucije za Mab dizajn setove generisani su ili sintezom gena ili mutagenezom usmerenom na lokaciju kao što je navedeno u primeru 3. Napomena, kanonski C-terminal teški lanac lizin ostatak je uklonjen kako bi se sprečilo LC-MS signal heterogenost zbog C-terminala lizin clipping (Lawrence W. Dick Jr. et al., Biotechnol. Bioeng. (2008) 100: 1132-43).
[0516] Osnovne DNK sekvence za Fab deo teškog lanca (SEQ ID NO: 18) i DNK sekvence lakog lanca (SEQ ID NO: 19) CR8071 su prikazani u tabeli 3C. CR8071 Fab aminokiselinske sekvence za teški lanac (SEQ ID NO: 14) i laki lanac (SEQ ID NO: 15) odgovaraju onima u PDB unosu 4FQJ (kompleks Fab CR8071 i hemaglutinin) gde je napravljena zamena R222K u teškom lancu da se pretvori u najčešću IGHG1 * 01 sekvencu.
[0517] Osnovne DNK sekvence za Fab deo teškog lanca (SEQ ID NO:16) i DNK sekvence lakog lanca (SEQ ID NO:17) SGN-CD19a su prikazani u tabeli 3C. Sekvence SGN-CD19a odgovaraju SEQ ID NO: 7 i 17, koje su prijavljene u SAD patentu br. 8,242,252 i ovde su uključene kao SEQ ID NO:12 (teški lanac) i SEQ ID NO:13 (laki lanac).
[0518] Kao što je gore navedeno, sekvence lakog lanca CAT-2200, CR8071, pertuzumab i SGN-CD19a u nekim od dizajniranih heterodimera u Mab setovima pripremljene su sa ili bez FLAG ili HA oznaka kako bi se obezbedila dovoljna masovna diferencijacija između vrsta. Laki lanci sa oznakama su pripremljeni kao što je opisano u primeru 3.
[0519] Verzije divljeg tipa ovih konstrukt su takođe pripremljene kako bi se procenila prirodna sklonost u svakom sistemu, uočavanje potencijalnog efekta HA ili FLAG oznaka na sparivanje i za određivanje efekta dizajniranih konstrukt na preferencijalno sparivanje preko divljeg tipa.
Transfekcija, ekspresija i prečišćavanje konstrukata
[0520] Konstrukti koji kodiraju dva teška lanca i dva laka lanca svakog bispecifičnog sistema antitela, bilo divljeg tipa ili sa aminokiselinskim supstitucijama koje odgovaraju svakom testiranom Mab dizajn setu, transfektovani su u CHO-3E7 ćelije na sledeći način. CHO-3E7 ćelije, u gustini od 1,7 - 2 × 10<6>ćelija/ml, gajene su na 37°C u FreeStyle(TM) F17 medijumu (Invitrogen kat. br. A-1383501) suplementiranom sa 4 mM glutaminom i 0,1% Koliphor P188 (Sigma #K4894). Ukupna zapremina od 200 ml je transfektovana sa ukupno 200 μg DNK sa različitim odnosima H1:H2:L1:L2 (koji se sastoji od 100 μg DNK antitela i 100 μg GFP / AKT / punjenja DNK) koristeći PEI-mak (Polisciences Cat # 24765-2) u odnosu DNK: PEI od 1: 4. Dvadeset četiri sata nakon dodavanja DNK-PEI smeše, 0,5 mM valproične kiseline (finalna koncentracija) i 1% v / v triptona N1 (finalna koncentracija) dodani su ćelijama koje su zatim prebačene na 32 ° C i inkubirane 7 dana pre žetve. Medijumi za kulturu su sakupljeni centrifugiranjem i filtriranjem pomoću vakuuma koristeći filter Stericup 0,22 μm (Millipore kat. br. SCGPU05RE). Filtrirani medijum za gajenje je zatim prečišćen korišćenjem protein A MabSelect SuRe smole (GE Healthcare # 17-5438-02) koja je prethodno ekvilibrisana sa PBS pH 7,4. Vrsta antitela vezana za smolu je zatim isprana sa PBS pH 7.4 i eluirana sa 100 mM natrijum citrat pufer pH 3.6. Eluirane vrste antitela su koncentrovane i zamenjen im je pufer sa PBS pH 7,4, centrifugiranjem pomoću Amicon ultra 15 filtera za centrifugu Ultracel 10K (Millipore # SCGP00525). Dobijeni SMCA uzorci prečišćeni pomoću proteina A koji sadrže vrste antitela procenjeni su pomoću Calipera pre deglikozilacije i LC-MS.
Metoda masene spektrometrije
[0521] Stepen preferencijalnog sparivanja heterodimera vođenog Mab dizajn setovima u kontekstu bispecifičnog antitela procenjen je korišćenjem masene spektrometrije nakon prečišćavanja pomoću proteina A i nedenaturišuće deglikozilacije. Kako su heterodimeri sadržali samo Fc N-vezane glikane, SMCA uzorci su tretirani samo jednim enzimom, N-glikozidazom F (PNGaza-F). Prečišćeni uzorci su de-glikozilovani pomoću PNGaseF na sledeći način: 0,2U PNGaseF/μg antitela u 50mM Tris-HCl pH 7,0, inkubacija preko noći na 37°C, finalna koncentracija proteina 0,5 mg/mL. Nakon deglikozilacije, uzorci su čuvani na 4°C pre LC-MS analize.
[0522] Uzorci deglikozilovanih proteina analizirani su intaktnom LC-MS pomoću Agilent 1100 HPLC sistema spojenog sa masenim spektrometrom LTQ-Orbitrap XL (ThermoFisher Scientific) preko izvora elektrospreja Ion Max (ThermoFisher). Uzorci (5 μg) su ubrizgani na 2,1 × 30 mm Poros R2 reverzno-faznu kolonu (Applied Biosistems) i razdvojeni korišćenjem sledećih uslova gradijenta: 0-3 min: 20% rastvarač B; 3-6 min: 20-90% rastvarač B; 6-7 min: 90-20% rastvarač B; 7-9 min: 20% rastvarač B. Rastvarač A je bio degazirana 0,1% mravlja kiselina u vodi, a rastvarač B je bio degazirani acetonitril. Brzina protola je bila 3 mL/min. Protok je podeljen nakon kolone kako i se 100μL usmerilo na dodirnu površinu elektrospreja. Kolona je zagrejana na 82,5°C i rastvarači su zagrejani pre kolone na 80°C kako bi se poboljšao oblik proteinskog maksimuma. LTQ-Orbitrap XL je kalibrisan korišćenjem rastvora za kalibraciju LTQ Positive Ion ESI calibration solution (kofein, MRFA i Ultramark 1621) kompanije ThermoFisher Scientific i podešen korišćenjem rastvora CsI od 10 mg/mL. Napon konusa (podešavanje fragmentacije izvora) bio je 48 V, FT rezolucija je bila 7500 i opseg skeniranja je bio m/z 400-4000. LTQ-Orbitrap XL je podešen za optimalnu detekciju većih proteina (>50 kDa).
[0523] Opsezi koji sadrže višestruko naelektrisane jone iz antitela u punoj veličini (m/z 2000-3800) i polu-antitela (m/z 1400-2000) odvojeno su dekonvoluirani u profile molekulske težine koristeći MaxEnt 1 modul softver za kontrolu instrumenata i analizu podataka MassLynx (Waters). Ukratko, sirovi LC-MS podaci za proteine su najpre otvoreni u QualBrower modulu, koji je modul za pregledanje spektra softvera Xcalibur (Thermo Scientific) i konvertovani tako da budu kompatibilni sa MassLynx softverom, uz pomoć Databridge programa za konverziju datoteka, obezbeđenog od strane kompanije Waters. Konvertovani proteinski spektri su pregledani u Spectrum u modulu MassLynx softvera i dekonvoluirani pomoću MaxEnt 1. Količina svake vrste antitela u svakom uzorku određena je direktno iz dobijenih profila molekulske težine.
Analiza rezultata LC-MS
[0524] Sve u svemu, u većini slučajeva, tretmani deglikozilacije rezultirali su sposobnošću da se identifikuju sve moguće različite vrste antitela koje se identifikuju pomoću LC-MS. U mnogim slučajevima, svaka vrsta antitela je predstavljena jednim LC-MS maksimumom. Izuzeci su uključivali bočne maksimume koji verovatno takođe odgovaraju željenim bispecifičnim vrstama (eventualno adukti ili heterogenost prilikom cepanja vodećih peptida); međutim, ovi bočni maksimumi nisu uzimani u obzir u doprinosima bispecifičnim vrstama jer identitet vrste koja je rezultirala bočnim maksimumima nije bio jasan. Osim toga, željeni bispecifične vrste, H1L1_H2L2, u principu ne može eksperimentalno da se razlikuje od pogrešno sparenog tipa, H1L2_H2L1, na osnovu LC-MS. U tom smislu, kada se u tabelama registruje sadržaj bispecifičnih antitela, ne može se u potpunosti isključiti da on ne sadrži ovaj tip pogrešno sparenih vrsta. Međutim, veoma nizak sadržaj uočen za vrste kao što su H1L2_H1L2 i H2L1_H2L1, kao i poluantitela H1L2 i H2L1 ukazuje na to da je došlo samo do manje, ili nije došlo, do kontaminacije bispecifičnih vrsta sa pogrešno sparenim vrstama.
Procena prirodne sklonosti i uticaja oznaka na sparivanje u sistemima divljeg tipa
[0525] Kao prvi korak, za svaki od tri testirana bispecifična sistema, divlji tip (jedan od lakih lanaca koji sadrži oznaku ako je potrebno za dovoljnu diferencijaciju vrsta po masi), nemodifikovani teški i laki lanci parentalnih antitela za svaki sistem su koeksprimirani korišćenjem različitih odnosa DNK za H1:H2:L1:L2, a dobijene vrste antitela su identifikovane i kvantifikovane. To je omogućilo identifikaciju bilo kakve inherentne sklonosti sparivanja (ili one koja je uvedena prisustvom oznake) u svakom sistemu (na primer, ako laki lanac jednog parentalnog antitela u bispecifičnom sistemu preferencijalno vezuje teški lanac drugog parentalnog antitela u bispecifičnom sistemu), a takođe je dozvoljeno identifikaciju odnosa DNK za H1:H2:L1:L2 koji je obezbedio najveću količinu bispecifičnog antitela sa najmanjom količinom polu-Abs. DNK odnosi su izabrani tako da kompenzuju prirodne razlike u nivoima ekspresije i/ili unutrašnje sklonosti sparivanja između teških i lakih lanaca iz dva parentalna antitela i/ili uticaja oznake za svaki sistem. U testiranim bispecifičnim sistemima divljeg tipa A i B, L2 je označen oznakom FLAG. U bispecifičnom sistemu C, nijedan od lakih lanaca nije označen.
[0526] Tabela 12 prikazuje rezultat ove procene. Odnos DNK za H1:H2:L1:L2 koji je obezbedio najveću količinu bispecifičnog antitela sa najmanjom količinom polu-Abs bio je 10:20:24:46 za sistem A, 15:15:35:35 za sistem B i 15:15:35:35 za sistem C. Napomena, u CAT-2200/pertuzumab bispecifičnom Ab sistemu (sistem A), uočena je sklonost usled koje se teški lanac pertuzumaba (H2) preferencijalno sparuje sa lakim lancem CAT-2200 (L1). Ova sklonost je očigledna kada se razmatraju podaci za ekvivalentne odnosa teškog lanca 1 i teškog lanca 2, ali za inverzne odnose lakog lanca 1 i lakog lanca 2 (npr. razmotriti inverzne L1:L2 DNK odnose u H1:H2:L1:L2 od 8:22:17:53 i 8:22:53:17 u tabeli 12). Pod ovim uslovima H1:H2:L1:L2 = 8:22:53:17, preovlađujuće pogrešno oštećene vrste Mab H1L1_H2L1 su mnogo više u izobilju (79,6%) nego u slučaju H1:H2:L1:L2 = 8:22:17:53, gde su preovlađujuće pogrešno oštećene vrste H1L2_H2L2 činile oko 38,4%. To je ukazivalo na to da se teški lanac pertuzumaba izgleda sparuje preferencijalno sa lakim lancem CAT-2200 u ovom sistemu, kada je laki lanac pertuzumab imao oznaku FLAG.
[0527] SMCA dizajn konstrukti koji su sadržali N-terminalne oznake (HA ili FLAG) na jednom od lakih lanaca vodili su pripremu analognih WT SMCA konstrukata koje su ispitani zbog mogućeg uticaja oznaka na sposobnost lakih lanaca da se sparuju sa teškim lancima. Tabela 13 prikazuje rezultate ovog eksperimenta, i ukazuje da u nekim slučajevima oznaka imala uticaja na sparivanje lakih lanaca sa teškim lancima. Na primer, u odnosu na gore navedeni slučaj sistema A, gde je postojalo preferencijalno sparivanje teškog lanca pertuzumaba sa lakim lancem CAT-2200 kada je laki lanac pertuzumaba sadržao oznaku FLAG, kada je laki lanac CAT-2200 sadržao oznaku HA i 4 polipeptidna lanca bila eksprimirana u istom odnosu DNK, uočeno je preferencijalno sparivanje CAT-2200 teškog lanca sa lakim lancem pertuzumaba (videti tabelu 13, 'Sistem A, L1-HA' i uporediti 'Sistem A, L1-HA' sa 'Sistem A, L2-FLAG' u istom odnosu od 10:20:24:46). Osim toga, za SGN-CD19a/CAT-2200 bispecifični sistem (Sistem B), stepen pogrešnog sparivanja između teškog lanca SGN-CD19a sa lakim lancem CAT-2200 u sistemu koji sadrži SGN-CD19a laki lanac sa FLAG oznakom je veći nego u druge dve varijacije istog sistema u istom odnosu (Tabela 13, 'Sistem B, L1-FLAG' i uporediti 'Sistem B, L1-FLAG sa 'Sistem B, L2-FLAG i L2-HA' u istom odnosu od 15:15:35:35). Treba zapaziti da tabela 13 odražava podatke akumulirane za sva izvedena ponavljanja, tako da procenat vrsta može u nekim slučajevima da se razlikuje od podataka u početnoj fazi procene koji su obezbeđeni u tabeli 12.
[0528] Za testiranje svakog od 40 reprezentativnih dizajna u okviru svakog bispecifičnog sistema, korišćeni odnosi H1:H2:L1:L2 DNK bili su odnosi iz odgovarajućih bispecifičnih sistema divljeg tipa koji su dali najveću količinu bispecifičnih Ab vrsta i najmanju količinu polu-Ab. Kao što je prethodno u tekstu navedeno, za sistem CAT-2200/pertuzumab, korišćeni odnos je bio 10:20:24:46 (H1:H2:L1:L2), gde se H1 i L1 odnose na CAT-2200, a H2 i L2 se odnose na pertuzumab. Za sisteme SGN-CD19a/CAT-2200 i SGN-CD19a/CR8071, korišćeni odnos je bio 15:15:35:35 (H1:H2:L1:L2).
Rezultati za preferencijalno sparivanje u formatu bispecifičnih antitela
[0529] Rezultati SMCA sa 40 testiranih reprezentativnih dizajna prikazani su u tabelama 14 do 17. Tabele 14 do 17 odnose se na Mab dizajn setove kao "dizajne" i identifikovani su sa četvorocifrenim brojem. Svaki četvorocifreni broj odgovara jedinstvenom identifikatoru Mab dizajna (jedinstveni identifikatori LCCA seta) u tabelama 10-A1 do A12 i 10-B1 do 10-B10. Tabela 24 obezbeđuje tabelu odnosa između dizajna testiranih u SMCA i LCCA setovima jedinstvenih identifikatora. Analiza preferencijalnog sparivanja je izvedena na osnovu dve vrste izračunavanja. Prvi tip izračunavanja je označen kao "% H1L1 i % H2L2 sparivanja" u tabelama, i predstavlja količinu ispravnog sparivanja između H1 i L1 i između H2 i L2 u svim Mab vrstama i polu-Ab vrstama koje su posmatrane, uključujući i Mab vrste koje su možda imale samo jednu ispravno sparenu ruku, izraženo kao procenat ukupnog proizvoda (H1L1_H2L2_i_H1L2_H2L1 H1L1_H1L1 H2L2_H2L2 H1L1 H2L2 0,5 × (H1L1_H2L1 H1L1_H1L2 H1L2_H2L2 H2L1_H2L2)). Ova izračunavanje je označeno kao izračunavanje "ukupnog sparivanja". Drugi tip izračunavanja je označen kao "H1L1_H2L2 i H1L2_H2L1**" u tabelama, i predstavlja količinu ispravno sparenog bispecifičnog antitela, izraženu kao procenat svih vrsta Mab (tj. Mab vrsta A-J na slici 8) koje su posmatrane (H1L1_H2L2_i_H1L2_H2L1 / (HIL1_H2L2_i_H1L2_H2L1 H1L1_H1L1 H2L2_H2L2 H1L1_H2L1 H1L2_H2L2 H1L1_H1L2 H2L1_H2L2 H1L2_H1L2 H2L1_H2L1)). Ova izračunavanje je označeno kao izračunavanje "ukupnog bispecifičnog sparivanja". Polu-antitela nisu uzeta u obzir u ovom izračunavanju, jer ako su prisutna, mogu se ukloniti/minimizirati preparativnim SEC ili dodatnim titracijama H1:H2:L1:L2 DNK. Tabela 12 pokazuje da su DNK titracije efikasne u manipulaciji procentom eksprimiranih polu-Ab vrsta. Efikasnost prep-SEC prečišćavanja u smanjenju količine polu-Ab tipa "Fc lanac A" je prikazana u primeru 18.
[0530] Da bi se uzele u obzir sklonosti sparivanja koje su uočene u nekim bispecifičnim sistemima divljeg tipa, kao što je opisano prethodno u tekstu, podaci u vezi sa preferencijalnim sparivanjem su zabeleženi u vidu poređenja sa odgovarajućim bispecifičnim konstruktima divljeg tipa u istom odnosu H1:H2:L1:L2 DNK. Ovo poređenje je dato u kolonama "Promena % H1L1 i % H2L2 sparivanja u odnosu na divlji tip" (tj. promena ukupnog sparivanja u odnosu na WT) i "Promena H1L1_H2L2 i H1L2_H2L1** u odnosu na divlji tip" (tj. promena ukupnih bispecifičnih u odnosu na WT). Ako odgovarajući bispecifični konstrukt divljeg tipa nije bio procenjen pomoću SMCA, napravljeno je poređenje sa sličnim konstruktom divljeg tipa. Ovi slučajevi su označeni znakom "
" pored datih vrednosti. Sličan konstrukt divljeg tipa koji je izabran za poređenje, izabran je na sledeći način. Za svaki bispecifični sistem i konstrukt (sa ili bez oznaka), uzete su srednje vrednosti za "H1L1_H2L2 i H1L2_H2L1**" i srednje vrednosti za "% H1L1 i % H2L2 sparivanja" iz ponovljenih SMCA eksperimenata po DNK odnosu. Uzete su najveće vrednosti iz bilo kog odnosa u okviru svakog konstrukta, a medijana svih konstrukata je korišćen za predstavljanje WT reference za određeni sistem (videti sliku 16A i 16B).
[0531] Tabele 14 i 15 daju kratak pregled rezultata SMCA za reprezentativne testirane K-L dizajne, gde su dizajni raspoređeni u binove prema "Promena % H1L1 i % H2L2 sparivanja u odnosu na divlji tip" (tabela 14) ili "Promena H1L1_H2L2 i H1L2_H2L1** u odnosu na divlji tip" (tabela 15). Slično tome, tabele 16 i 17 daju kratak pregled rezultata SMCA za reprezentativne testirane K-K-izvedene K-L dizajne, gde su dizajni raspoređeni u binove prema izračunavanju promene ukupnog sparivanja (tabela 16) ili promene ukupnog bispecifičnog sparivanja (tabela 17).
Performanse
[0532] Performanse, ili sposobnost da se pospešuje preferencijalno sparivanje ispravnih teških i lakih lanaca, za svaki od reprezentativnih dizajna je procenjena korišćenjem izračunavanja ukupnog sparivanja i korišćenjem izračunavanja ukupnog bispecifičnog sparivanja. Prvo, pozitivna vrednost u koloni "Promena % H1L1 i % H2L2 sparivanja u odnosu na divlji tip" (promena ukupnog sparivanja u odnosu na WT) ukazala je na to da je Mab dizajn set mogao da pospeši preferencijalno sparivanje. Drugo, pozitivna vrednost u koloni "Promena H1L1_H2L2 i H1L2_H2L1** u odnosu na divlji tip" (promena ukupnog bispecifičnog sparivanja u odnosu na WT), takođe je ukazivala na Mab dizajn set koji je mogao da pospeši preferencijalno sparivanje.
[0533] Svi K-L dizajni i 18 od 21 K-K-izvedenog K-L dizajna, pokazali su smanjene količine primarnih pogrešno uparenih vrsta (H1L2_H2L2 ili H1L1_H2L1) u poređenju sa divljim tipom, iako je u nekim slučajevima količina različitih pogrešno sparenih vrsta bila povećana u odnosu na divlji tip. U proseku, i K-L i K-K-izvedeni K-L dizajni generisali najveći porast željenog bispecifika u odnosu na divlji tip (promena ukupnih bispecifika u odnosu na WT) u sistemu A (48,8 %), zatim u sistemu B (31,1 %) i sistemu C (14,5 %). U proseku, svi testirani dizajni rezultirali su relativno malim povećanjem ukupne količine polu-antitela u poređenju sa divljim tipom, sa 24,1 % na 27,9 %, ali su poboljšali prosečan odnos sparenih i pogrešno sparenih polu-antitela sa 1,5 na 6,9.
Transferabilnost
[0534] Sposobnost reprezentativnog seta Mab dizajna da pospeši preferencijalno sparivanje u većem broju sistema testirana je kao mera "transferabilnosti" dizajna. Koristeći izračunavanje 'promene ukupnog sparivanja u odnosu na WT', 29 od 33 K-L dizajna bilo je transferabilno u 3 od 3 testirana sistema i 3 dizajna su bila transferabilna u 2 od 3 testirana sistema (tabela 14). Drugim rečima, ovi dizajni su pokazali pozitivnu vrednost "promene sparivanja u odnosu na WT". Kada je preferencijalno sparivanje mereno korišćenjem izračunavanja 'promene ukupnog bispecifičnog u odnosu na WT', 24 od 33 K-L dizajna su identifikovani kao transferabilni u 3 od 3 sistema i 8 dizajna je bilo transferabilno u 2 od 3 sistema (tabela 15). Za K-K-izvedene K-L dizajna, 2 od 7 dizajna bila su transferabilna u 3 od 3 sistema i 4 dizajna su bila transferabilna u 2 od 3 sistema koristeći izračunavanje 'promene ukupnog sparivanja u odnosu na WT' (tabela 16). Koristeći izračunavanje 'promene ukupnog bispecifičnog sparivanja u odnosu na WT', 1 od 7 dizajna je bio transferabilan u 3 od 3 sistema i 5 dizajna je bilo transferabilno u 2 od 3 sistema (tabela 17).23 od 33 K-L dizajna i 1 od 7 K-K-izvedenih K-L dizajna je bilo transferabilno u 3 od 3 testiranih sistema, kada je procena obavljena korišćenjem oba izračunavanja.
[0535] Što se tiče performansi klastera, svi dizajni u okviru 9 od 12 K-L klastera bili su transferabilni u 3/3 sistema prema izračunavanju 'promene ukupnog sparivanja u odnosu na WT', i 4 od 12 prema izračunavanju 'promene ukupnog bispecifičnog sparivanja u odnosu na WT'. Svi dizajni unutar klastera kl-4, kl-9 i kl-12 bili su transferabilni u 3/3 sistema kada su korišćena oba izračunavanja. Slika 10 prikazuje boks dijagrame koji porede performanse reprezentativnih dizajna iz svakog klastera, na osnovu izračunavanja 'promene ukupnog bispecifičnog sparivanja u odnosu na WT' (slika 10A, promena bispecifičnog%) ili izračunavanja 'promene ukupnog sparivanja u odnosu na WT' (slika 10B, promena sparivanja%). Za K-K-izvedene K-L klastera, testiran je samo jedan dizajn po klasteru i tako je transferabilnost klastera bila ekvivalentna transferabilnosti dizajna koja je razmatrana prethodno u tekstu.
[0536] Sveukupno, K-L dizajni su bili u stanju da pospešuju preferencijalno sparivanje efikasnije od K-K-izvedenih K-L dizajna. Slika 11 prikazuje bok dijagrame koji prikazuju sposobnost K-L dizajna i K-K-izvedenih K-L dizajna da pospešuje preferencijalno sparivanje u svakom testiranih sistema, na osnovu izračunavanja 'promene ukupnog bispecifičnog u odnosu na WT'. Na primer, slika 11 pokazuje da K-L dizajni generalno pospešuju veći porast u količini bispecifičnih antitela u odnosu na WT nego K-K-izvedeni K-L dizajni (kada se poredi "kl all" vrednost saa "kk all" vrednošću za svaki sistem). Ovo važi i kada se razmatraju samo dizajni transferabilni u 2 ili više, ili u sva 3 sistema.
Primer 17: Preparativna hromatografija za isključivanje po veličini (SEC) odabranih SMCA bispecifičnih antitela i parentalnih Mabs za biofizičku karakterizaciju.
[0537] Da bi se procenile biofizičke karakteristike bispecifičnih antitela generisanih u SMCA opisanom u primeru 16, SMCA uzorci prečišćeni pomoću proteina A iz subseta testiranih reprezentativnih dizajna podvrgnuti su preparativnoj SEC, kako bi se uklonile polu-Ab vrste. SMCA uzorci koji imaju najmanje 60% "H1L1_H2L2 i H1L2_H2L1**" (ukupno bispecifični) su izabrani za ovaj korak (ukupno 36). Neki SMCA uzorci koji ne ispunjavaju uslov ove granične vrednosti su takođe uključeni radi potpunosti. Na primer, u slučajevima kada su SMCA uzorci za dati dizajn ispunili uslov ove granične vrednosti u dva od tri testirana bispecifična sistema, SMCA uzorak koji je ispunio uslov ove granične vrednosti, ali ne i treći, ključeni su SMCA uzorci za sva 3 sistema. Preparativna SEC je izvedena na sledeći način. Vrste antitela u SMCA uzorcima su odvojene korišćenjem kolone Superdex 200 10/300 Increase (GE Healthcare) montirane na GE Healthcare AKTA Avant 25 sistem opremljen autosemplerom ALIAS Bio Cool (Spark-Holland) koji se koristi za injeciranje uzoraka na kolonu. SMCA uzorci (0,9 ml) u PBS pH 7,4 (Hyclone DPBS/modifikovani, bez kalcijuma, bez magnezijuma, kat. br. SH-300028.02) su automatski naneseni na petlju od 2 ml ispunjenu sa PBS. Uzorci su zatim automatski injecirani na kolonu i razdvojeni pri 0,5ml/min sa zapreminom za eluranje od 1 CV. Eluiranje proteina je praćenao na OD280 i sakupljene su frakcije od 0,5 ml. Za svaki SMCA uzorak, frakcije koje su sadržale glavni maksimum (frakcije su procenjene pomoću Caliper) su objedinjene i dalje biofizički okarakterisane kao što je opisano u primerima 19 i 20.
Primer 18: Uklanjanje polu antitela preparativnom hromatografijom za isključivanje po veličini
[0538] U primeru 16, uočeno je da su polu-Ab isključena iz izračunavanja sparivanja prema izračunavanju 'ukupnih bispecifičnih', jer procenat proizvedenih polu-Ab može da se menja DNK titracijama ili, u slučaju polu-Ab tipa "Fc lanac A", ona takođe mogu da se uklone/minimiziraju prečišćavanjem pomoću preparativne SEC SMCA uzoraka prečišćenih pomoću proteina A. Da bi se demonstriralo uklanjanje "Fc lanac A polu-Ab" prečišćeni SMCA uzorci iz primera 17 za dva K-L dizajna u sva tri bispecifična sistema su podvrgnuti LC-MS analizi kao što je opisano u primeru 16. Dva odabrana K-L dizajna su bila 2901 i 3972 (kao što je identifikovano u tabeli 11A). Rezultati su prikazani u tabeli 18.
[0539] Poređenje LC-MS podatke iz tabele 18 sa odgovarajućim LC-MS podacima za SMCA uzorke prečišćene pomoću proteina A, iz tabele 14, pokazuje da preparativna SEC može da bude efikasna u uklanjanju/minimizaciji polu-Ab vrsta tipa 'Fc lanac A' (H1L1 u 2901 i 3972). U u svim testiranim uzorcima, došlo je do obogaćivanja u procentu željenih vrsta bispecifičnih antitela (H1L1_H2L2 i H1L2_H2L1), kao i smanjenja procenta vrsta polu-antitela tipa 'Fc lanac A' (H1L1 u tabeli 18).
Primer 19: Termička stabilnost SMCA bispecifičnih antitela.
[0540] Nakon preparativne SEC, merena je termička stabilnost SMCA bispecifičnih antitela prečišćenih pomoću prepr-SEC i upoređena sa parentalnim CAT-2200, pertuzumabom, CR8071 i SGN-CD19a monoklonskim antitelima kako bi se utvrdilo da li su aminokiselinske supstitucije imale bilo kakve efekte na termičku stabilnost.
Merenje termičke stabilnosti
[0541] Termička stabilnost odabranih bispecifičnih heterodimernih antitela i kontrola divljeg tipa merena je korišćenjem diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) na sledeći način. Nakon preparativnog tretmana pomoću SEC, uzorci od 400 μL primarno u koncentracijama od 0,4 mg/mL u PBS rastvoru korišćeni su za DSC analizu pomoću VP-Capillary DSC (GE Healthcare). Na početku svake runde DSC, izvedeno je 5 blank injeciranja pufera u cilju stabilizacije osnovne vrednosti, a injeciranje pufera je vršeno i pre svakog injeciranja uzorka, kao referenca. Svaki uzorak je skeniran od 20 do 100°C, brzinom od 60°C/h, sa niskom povratnom informacijom, filterom na 8 sec, 3 min preTstat i pritiskom azota od 70 psi. Dobijeni termogrami su referencirani i analizirani pomoću softvera Origin 7.
[0542] Rezultati su prikazani u tabeli 20 i tabeli 21. Tm vrednosti Fab divljeg tipa koje se koriste za izračunavanje "prosečna razlika za Fab Tm u odnosu na divlji tip (°C)" kao što je navedeno u tabelama, dobijene su iz DSC termograma parentalnih antitela CAT-2200 (71,2°C), pertuzumaba (76.7°C), CR8071 (66,9°C, što odgovara primarnom maksimumu) i SGN-CD19a (91,0°C). CR8071 parentalno antitelo je prikazalo dve Fab tranzicije. Za parentalna antitela, dodatne termičke tranzicije su uočene za CH2 i CH3 domene Fc (na približno 71°C i 82°C, redom) ako se nisu preklopili sa Fab tranzicijom (slika 12). Neki dizajni sa velikim količinama H2L2 'Fc lanac B' polu-antitela, pokazali su dodatnu termičku tranziciju na približno 60°C, verovatno usled prisustva nekovalentnih homodimera. U nekim slučajevima, dizajni su doveli do smanjenja Tm za pertuzumab Fab tako da je to dovelo do preklapanja CAT-2200 Fab, pertuzumab Fab i CH2 maksimuma u tim uzorcima (slika 12A, reprezentativni dizajn 3972). Isto tako, mnogi dizajni su smanjili Tm za SGN-CD19a Fab do te mere da je to dovelo do preklapanje sa CH3 maksimumima kod tih antitela (slika 12B i 12C, reprezentativni dizajn 3972). Ova preklapanja dovela do izvesne neodređenosti pri dodeljivanju Tm Fab komponentama koje imaju doprinos, a samim tim i Tm vrednosti date u tabelama 20 i 21 se smatraju aproksimacijama. Zanimljivo je da su bispecifična antitela CRS0711SGN-CD19a koja sadrže dizajne prikazala samo jednu CR8071 Fab tranziciju umesto dve tranzicije uočene kod bispecifičnih antitela divljeg tipa (npr. slika 12C).
[0543] Od svih testiranih K-L dizajna, prosečna razlika Tm za Fab u odnosu na divlji tip, u svim sistemima je bila između 0°C i -1,5°C za 6 dizajna, između -1,5°C i -3,0°C za 11 dizajna i između -3,0°C i -4,5°C za 15 dizajna (tabela 20). Od svih testiranih KK-izvedenih K-L dizajna, prosečna razlika je bila između 0°C i -1,5°C za 2 dizajna, između -1,5°C i -3,0°C za 1 dizajn, i između -3,0°C i -4,5°C za 1 dizajn (tabela 21). Prosečne razlike Tm za Fab u odnosu na divlji tip za sve testirane dizajne bile su -0.9°C za CAT-2200 (STDEV = 1,4), -4.6°C za pertuzumab (STDEV = 1.6), -5.8°C za SGN-CD19a (STDEV = 3.5), i 1.1°C za CR8071 (STDEV = 0.8). Slika 13 prikazuje boks dijagram promene Tm za Fab u odnosu na parentalno antitelo za testirane dizajne, za sve testirane dizajne ("All"), ili po paratopu (CAT-2200, pertuzumab, CR8071 ili SGN-CD19a).
Primer 20: Merenja afiniteta bispecifičnih antitela za antigen
[0544] Sposobnost bispecifičnih antitela da vezuju odgovarajuće antigene je procenjena kako bi se utvrdilo da li su aminokiselinske supstitucije imale bilo kakve efekte na vezivanje antigena. Afinitet vezanja antigena određen je pomoću SPR na sledeći način.
SPR biosenzorski testovi
[0545] Za studije na Biacore T200: CM5 Series S senzorski čip, Biacore komplet za kuplovanje amina (NHS, EDC i 1 M etanolamin) i 10 mM natrijum acetat puferi su kupljeni od GE Healthcare Life Science (Mississauga, ON, Kanada). Za studije na Biorad ProteOn: GLC senzorski čipovi, Biorad ProteOn komplet za kuplovanje amina (EDC, sNHS i etanolamin) i 10mM natrijum acetatni puferi su kupljeni od firme Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON). PBS radni pufer sa 0,05% Tween20 (PBST) je kupljen od Teknova Inc. (Hollister, CA). Kozje poliklonsko antihumano Fc antitelo kupljeno je od Jackson Immuno Research Laboratories Inc. (West Grove, PA). Antigeni: His-obeleženi rekombinantni humani CD-19 je kupljen od Abcam (Cambridge Velika Britanija) i His-obeleženi influenca B hemaglutinin (BBrisbane/60/2008) je kupljen od Sino Biological (Beijing, Kina). Rekombinantni Her2 ekstracelularni domen (ECD) protein je kupljen od eBioscience (San Diego, CA). Rekombinantni humani IL-17A je kupljen od R&D Systems (Mineapolis, MN).
[0546] Testovi površinske rezonance plazmona (SPR) sa antigenima hemaglutinin i CD-19 izvedeni su pomoću instrumenta Biacore T200 (GE Healthcare) sa PBST radnim puferom (sa 0,5 M EDTA stok rastvorom dodatim do finalne koncentracije od 3,4 mM) na temperaturi od 25°C. Testovi površinske rezonance plazmona sa antigenima HER2 ECD i IL-17 sprovedeni su pomoću instrumenta BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)) sa PBST radnim puferom na temperaturi od 25°C.
[0547] SGN-CD19a: Određivanje afiniteta za CD-19 je izvedeno na sledeći način. Skrining antitela (preparativni SEC prečišćeni SMCA uzorci i OAA kontrole) za vezivanje za CD-19 antigen dogodio se u dva koraka: indirektno hvatanje His-tagged CD-19 na anti-His IgG površinu, nakon čega sledi ubrizgavanje pet koncentracija prečišćenog antitela za kinetičku analizu koristeći kinetiku jednog ciklusa. Anti-His površina za hvatanje je pripremljena na CM5 Series S senzorskom čipu aminskim kuplovanjem približno 12000 RU anti-His IgG (His Capture Kit, GE Healthcare) na aktivne i referentne protočne ćelije, u skladu sa uputstvima proizvođača. CD-19 je injeciran u koncentraciji 10 μg/ml preko aktivne protočne ćelije tokom 60 s pri protoku od 10 μL/min. U principu, to je rezultiralo hvatanjem oko 250 RU CD-19 na anti-His IgG površini. CD-19 nije bio uhvaćen na referentnoj (blank) protočnoj ćeliji. Korak hvatanja pratilo je pet koncentracija prečišćenog antitela (200 nM i dvostruko razblaživanje, 80 nM i dvostruko razblaživanje ili 40 nM i dvostruko razblaživanje; u zavisnosti od antitela) koje su sekvencijalno injecirane preko aktivnih i referentnih protočnih ćelija u koncentraciji od 40 μL/min tokom 180 s sa fazom disocijacije od 600 s. Površine sa uhvaćenim antitelima su regenerisane pomoću 10 mM glicin pH 1,5 tokom 120 s pri ptotoku od 30 μL/min kako bi se površine pripremile za sledeći ciklus injeciranja. Najmanje dva kontrolna injeciranja pufera su izvedena za svako injeciranje analita i korišćena su kao referenca. Dobijeni senzorgrami kinetike za jedan ciklus analizirani su pomoću Biacore T200 BiaEvaluation softvera verzija 3.0 i uklapaju se u model vezivanja 1: 1.
[0548] CR8071: Određivanje afiniteta za hemaglutinin izvedeno je na sledeći način. Hemaglutinin (HA) je razblažen u 10 mM acetatnom puferu pH 5,5 i direktno imobilisan putem aminskog kuplovanja na CM5 Series S senzorski čip. To je rezultiralo sa približno 120-130 RU imobilisanog HA. Referentna protočna ćelija je ostala prazna (blokirana etanolaminom) kako bi se koristila kao blank kontrola. Antitela su injecirana preko HA površine u cilju kinetičke analize pomoću kinetike jednog ciklusa. Pet koncentracija (40 nM i dvostruko razblaženje) prečišćenog antitela (SMCA uzorci prečišćeni preparativnom SEC i OAA kontrole) su sekvencijalno injecirane preko i preko aktivnih i preko referentnih protočnih ćelija brzinom od 50 μL/min tokom 300 s, sa fazom disocijacije od 3600 s. HA površine su regenerisane pomoću 2 ciklusa 10 mM glicina pH 1,5 tokom 120 s pri 30 μL/min kkao bi se površine pripremile za sledeći ciklus injeciranja. Najmanje dva kontrolna injeciranja pufera su izvedena za svako injeciranje analita kako bi se koristili kao referenca. Dobijeni senzorgrami kinetike za jedan ciklus analizirani su pomoću Biacore T200 BiaEvaluation softvera verzija 3.0 i uklapaju se u model vezivanja 1: 1.
[0549] CAT-2200: IL-17 određivanje afiniteta je sprovedeno kao što je prethodno opisano u primeru 6 sa sledećim modifikacijama: testirana antitela su preparativni SEC prečišćeni SMCA uzorci i OAA kontrole umesto CAT-2200 Fabs. Jedno od kontrolnih antitela 13612 je injecirano pri početnoj koncentraciji od 10 nM umesto od 60 nM.
[0550] Pertuzumab: Određivanje afiniteta za HER2 izvedeno je na sledeći način. Sve linije su imobilizovane horizontalno sa 25 μg/ml kozjeg anti-humanog IgG, specifičnog za Fcy fragment (anti-humani Fc). U proseku je imobilisano 4058 rezonantnih jedinica (RU). Površina za hvatanje anti-humanog Fc antitela je generisana korišćenjem GLC senzorskog čipa koji se aktivira razblaženjem 1:10 standardnih BioRad sNHS/EDC rastvora tokom 140 s pri 100 μL/min u pravcu (horizontalnom) analita. Odmah nakon aktivacije, 25 μg / ml rastvor anti-humanog Fc antitela u 10 mMNaOAc pH4,5 je ubrizgan u analitnom (horizontalnom) pravcu pri protoku od 25 μL/min tokom 240 s dok približno 4000 rezonantnih jedinica (RU) su imobilisani. Preostale aktivne grupe su ugašene injeciranjem 1M etanolamina tokom 140 s, brzinom od 30 µl/min tokom 300s, takođe u pravcu analita, kako bi se osiguralo kreiranje lažno aktiviranih međumesta koja se koriste kao blank. Skrining antitela po tome da li se vezuju za HER2 odvijao se u dva koraka: indirektno hvatanje antitela (SMCA uzorci prečišćeni preparativnom SEC i OAA kontrole) na anti-humani IgG (specifičan za Fcy fragment) površinu u pravcu liganda, nakon čega sledi istovremeno ubrizgavanje 5 koncentracija prečišćenog HER2 ECD i jedan prazan pufer za dvostruko referenciranje u pravcu analita. Najpre je jedno injeciranje pufera tokom 30 s pri 100 μL/min u pravcu liganda korišćeno za stabilizaciju bazalne vrednosti. Za svako hvatanje antitela, antitela su razblažena do 2 μg/ml u PBST. Jedan do pet uzoraka antitela ili kontrola je istovremeno injecirano u pojedinačne kanale za ligande tokom 480 s pri protoku od 25 μl/min. To je rezultiralo hvatanjem približno 800 do 1200 RUs na površini sa anti-humanim Fc. Prvi kanal je ostao prazan kako bi se koristio kao blank kontrola ako je potrebno. Ovaj korak hvatanja neposredno je pratilo jedno injeciranje pufera u pravcu analita kako bi se stabilizovala osnovna vrednost, a zatim je istovremeno injecirano 100nM, 33,3nM, 11,1nM, 3,7nM i 0,41nM HER2 zajedno sa puferom za blank, pri protoku od 50 μl/min tokom 120 s, sa fazom disocijacije od 300 s. Površine sa uhvaćenim antitelima regenerisane su sa dva pulsa od po 18 s 0,85% fosforne kiseline pri protoku od 100 μl/min, kako bi se pripremile za sledeći ciklus injeciranja. Senzorgrami su poravnati i dvostruko referencirani pomoću injeciranja pufera za blank i međumesta, a dobijeni senzorgrami su analizirani pomoću softvera ProteOn Manager v3.1. Dvostruko referencirani senzorgrami bili su prilagođeni Langmuir modelu vezivanja.
[0551] Antigenski afiniteti heterodimernih antitela procenjeni su u odnosu na odgovarajuće OAA (jednoruke) kontrole divljeg tipa. Antigenski afiniteti su takođe dobijeni za bispecifična antitela divljeg tipa; međutim, SPR hvatanje WT bispecifika može biti heterogeno (npr. Uključuje hvatanje pogrešno uparenih heterodimera), čime se ometa određivanje KD. Osim toga, afiniteti divljeg tipa mereni su u OAA formatima koji sadrže relevantne oznake lakog lanca prisutne u antitelima. Uočeno je da prisustvo oznaka smanjuje afinitet SGN-CD-19a za CD19 čak 4-5 puta (tabela 19). Na primer, izmereni afinitet vezivanja SGN-CD-19a za CD19 smanjen sa 67,5 nM na 224,5 nM sa dodatkom FLAG oznake na lakom lancu (tabela 19). Zbog toga su sva izračunavanja promene afiniteta u odnosu na divlji tip izvedeni korišćenjem srednjih vrednosti odgovarajućih označenih konstrukata divljeg tipa.
[0552] Prilikom merenja vezivanja za CD-19, senzorgrami nekih antitela nisu mogli da se uklope u model vezivanja 1: 1. U ovim slučajevima, antitela su sadržavala velike količine "Fc lanac B" pola antitela koja su sklona homodimerizaciji, što je izazvalo efekte pohlepe i zaklonilo ponašanje vezivanja Fab. Za pogođena antitela, afinitet vezivanja je dalje procenjen u OAA formatu.
[0553] Većina testiranih dizajna (36 dizajna koji korespondiraju sa 96 napravljenih bispecifičnih antitela) prikazali su KD vrednosti uporedive sa vrednostima za odgovarajući divlji tip (tabele 20 i 21, slika 14). Devet dizajniranih Fab regiona prikazalo je smanjen afinitet, između 2- i 3 puta u odnosu na WT, a u jednom dizajniranom Fab, uočeno je smanjenje afiniteta od 4 puta. Od ovih 10 Fab regiona, samo jedan dizajn (#34) je bio prisutan dva puta, i 8 od 10 pogođenih Fab regiona bili su CR8071. Prosečna razlika log(KD) u odnosu na WT (-(log KD_antitelo- log KD_wt)) za sve bojeve glave koje poseduju dizajn bila je 0,003 sa standardnom devijacijom od 0,187 (npr. -0,3 odgovara dvostrukom smanjenju afiniteta, -0,6 odgovara četvorostrukom smanjenju afiniteta). Rezime rezultata je dat na slici 14, koja prikazuje boks dijagram promene Tm za Fab u odnosu na parentalno antitelo za testirane dizajne, za sve testirane dizajne ("All"), ili po paratopu (CAT-2200, pertuzumab, CR8071 ili SGN-CD19a).
Primer 21: Profili inženjeringom dobijenih bispecifičnih antitela u poređenju sa parentalnim antitelima, dobijeni tečnom hromatografijom ultra performansi i hromatografijom za isključenje po veličini (UPLC-SEC)
[0554] Da bi se procenio kvalitet inženjeringom dobijenih bispecifičnih antitela, antitela prečišćena preparativnom SEC kao u primeru 17 bila su podvrgnuta UPLC-SEC hromatografiji. UPLC-SEC je izvedena korišćenjem Waters BEH200 SEC kolone (2,5 mL, 4,6 x 150 mm, nerđajući čelik, čestice od 1,7 μm) podešene na 30°C i montirane na Waters Acquity UPLC sistem sa PDA detektorom. Vreme rada sastojalo se od 7 min i ukupne zapremine po injektiranju od 2,8 mL sa radnim puferom od PBS i 0,02% Tween 20 pH 7,4 pri 0,4 ml/min. Eluiranje je praćeno UV apsorbancijom u opsegu 210-400 nm, a hromatogrami su ekstrahovani na 280 nm. Integracija pikova je izvedena pomoću softvera Empower 3.
[0555] Slika 15A-D prikazuje UPLC-SEC profile parentalnih antitela i slika 15E-G prikazuje one koji odgovaraju dizajnu 3972 antitela u tri bispecifična sistema. Ovde je korišćen primerni dizajn 3972 da bi se pokazalo da dizajnirana/inženjeringom dobijena bispecifična antitela visokog sadržaja bispecifika (>80%) imaju UPLC-SEC profile koji su uporedivi sa profilima parentalnih antitela. Za takva inženjeringom dobijena bispecifična antitela medijana procenta monomernih vrsta je 95,2% (tj. detektovano je malo ili nimalo vrsta sa visokom molekulskom masom).
Tabela 1: Kriterijumi za Fab model
Kriterijumi Značaj
Humani ili humanizovani IgG1/κ ili IgG1/λ Ima VH i VL podgrupe koje se uobičajeno koriste Okvir blizak 3D strukturi klicine linije predstavlja tipičnu Sličnost kapa ili lambda konformaciju (donja RMSD izračunata po parovima)
Struktura dostupna za apo- i kompleksovane Fab Ne uočavaju se veće Dizajn strukturne promene nakon vezivanja antigena
Vezivanje antigena može lako da se testira Test
Tabela 2: Hotspot aminokiselinske pozicije (označen zvezdicom) na dodirnoj površini teških i lakih lanaca u D3H44 (1JPT, tipični Fab koji sadrži kapa laki lanac) i CAT-2200 (2VXS, tipični Fab koji sadrži lambda laki lanac).
Tabela 3A. Kabat numeracija aminokiselinskih sekvenci Fab regiona teškog lanca D3H44, Pertuzumab i CAT-2200.
KABAT numeracija D3H44 Pertuzumab (Seq ID No.1) CAT-2200 (Seq ID No.3)
Poreklo teškog lanca
KABAT numeracija D3H44 Pertuzumab (Seq ID No.1) CAT-2200 (Seq ID No.3)
Poreklo teškog lanca
KABAT numeracija D3H44 Pertuzumab (Seq ID No.1) CAT-2200 (Seq ID No.3)
Poreklo teškog lanca
KABAT numeracija D3H44 Pertuzumab (Seq ID No.1) CAT-2200 (Seq ID No.3)
Poreklo teškog lanca
KABAT numeracija D3H44 Pertuzumab (Seq ID No.1) CAT-2200 (Seq ID No.3)
Poreklo teškog lanca
KABAT numeracija D3H44 Pertuzumab (Seq ID No.1) CAT-2200 (Seq ID No.3)
Tabela 3B. Kabat numeracija aminokiselinskih sekvenci lakog lanca D3H44, Pertuzumab i CAT-2200.
Tabela 3C. Aminokiselinske i DNK sekvence
[0556] Veliki broj heterodimera je imao sa sobom asociran precipitat, što je obeleženo sa "*" u tabelama 9A i 9B ako je precipitat bio asociran sa H1L1 Fab; obeleženo sa "t" u tabelama 9A i 9B ako je precipitat bio asociran sa H2L2 Fab; i obeleženo sa "
" u tabelama 9A i 9B ako je precipitat bio asociran i sa H1L1 i sa H2L2 Fab regionima. #-označava prisustvo ramena kod glavnog Fab pika (tranzicija) u DSC termogramu
[0557] Veliki broj heterodimera je imao sa sobom asociran precipitat, što je obeleženo sa "*" u tabelama 9A i 9B ako je precipitat bio asociran sa H1L1 Fab; obeleženo sa "t" u tabelama 9A i 9B ako je precipitat bio asociran sa H2L2 Fab; i obeleženo sa "
" u tabelama 9A i 9B ako je precipitat bio asociran i sa H1L1 i sa H2L2 Fab regionima. #-označava prisustvo ramena kod glavnog Fab pika (tranzicija) u DSC termogramu
Tabela 10-A5 Klaster 5 K-L dizajna
Jedinstveni H1 mutacija (Kabat) L1 mutacija (Kabat) H2 mutacija (Kabat) L2 mutacija (Kabat)
Tabela 10-B1 Klaster 1 K-K-izvedeni K-L dizajni
a
Tabela 10-B7 Klaster 7 K-K-izvedeni K-L dizajni
Tabela 10-B9 Klaster 9 K-K-izvedeni K-L dizajni
Tabela 11B: Aminokiselinske mutacije u Fab regionima H1, L1, H2 i L2 za K-K izvedene K-L dizajne testirane u SMCA formatu (Kabat numeracija).
Tabela 19: Podaci o vezivanju antigena za paratope divljeg tipa u OAA formatu
Tabela 20: Afinitet vezivanja antigena i procena termičke stabilnosti za odabrane K-L dizajne
Dizajn<§>Klaster Sistem* H1L1 Razlika H1L1 H2L2 Razlika H2L2 Tm Tm Prosečna razlika Tm
*Sistem A: CAT-2200 H1/L1 i Pertuzumab H2/L2 (sa odnosom H1:H2:L1:L2 DNK od 10:20:24:46); sistem B: CAT-2200 H1/L1 i SGN-CD19a H2/L2 (sa odnosom H1:H2:L1:L2 DNK od 15:15:35:35); sistem C: CR8071 H1/L1 i SGN-CD19a H2/L2 (sa odnosom H1:H2:L1:L2 DNK od 15:15:35:35)
<§>Dizajni su grupisani i osenčeni u tri bina sa "Prosečna razlika Fab Tm u odnosu na divlji tip (°C)" od 0 do -1,5, -1,5 do --3,0, i manje od -3.
tND = Nije određeno
MVB = Mešovita valentnost vezivanje u SMCA formatu
** KD određena u OAA formatu
ttDSC za antitela je izvedena u SMCA formatu i dati su termički prelazi koji se mogu pripisati svakoj Fab ruci.
Tm za Fab divljeg tipa su dobijeni iz DSC eksperimenata u Mab formatu
Tabela 21: Afinitet vezivanja antigena i procena termičke stabilnosti za odabrane K-K izvedene K-L dizajne
Dizajn<§>Klaster Sistem* H1L1 Razlika H2L2 Razlika H2L2 Tm Tm Prosečna razlika
*Sistem A: CAT-2200 H1/L1 i Pertuzumab H2/L2 (sa odnosom H1:H2:L1:L2 DNK od 10:20:24:46); sistem B: CAT-2200 H1/L1 i SGN-CD19a H2/L2 (sa odnosom H1:H2:L1:L2 DNK od 15:15:35:35); sistem C: CR8071 H1/L1 i SGN-CD19a H2/L2 (sa odnosom H1:H2:L1:L2 DNK od 15:15:35:35)
<§>Dizajni su grupisani i osenčeni u tri bina sa "Prosečna razlika Fab Tm u odnosu na divlji tip (°C)" od 0 do -1,5, -1,5 do -3,0, i manje od -3.
tND = Nije određeno
tfDSC za antitela je izvedena u SMCA formatu i dati su termički prelazi koji se mogu pripisati svakoj Fab ruci.
Tm za Fab divljeg tipa su dobijene iz DSC eksperimenata u Mab formatu
Tabela 22A: Numeracija aminokiselinskih ostataka teškog lanca IgG1 prema IMGT, Kabat, 1JPT i EU sistemima numeracije
Tabela 22B: Numeracija aminokiselinskih ostataka lambda lakog lanca prema IMGT i Kabat sistemima numeracije
Tabela 22C: Numeracija aminokiselinskih ostataka kapa lakog lanca prema IMGT, Kabat i 1JPT sistemima numeracije
Tabela 24: Brojevi SMCA dizajna i odgovarajući jedinstveni identifikatori za LCCA setove
ID SMCA dizajna LCCA jedinstveni identifikator

Claims (11)

Patentni zahtevi
1. Multispecifični antigen-vezujući polipeptidni konstrukt koji sadrži prvi heterodimer i drugi heterodimer,
pri čemu prvi heterodimer (H1L1) sadrži polipeptidnu sekvencu prvog imunoglobulinskog teškog lanca G (IgG) (H1) i polipeptidnu sekvencu imunoglobulinskog lambda lakog lanca (L1), koje formiraju prvi Fab region koji se specifično vezuje za prvi antigen; i drugi heterodimer (H2L2) sadrži polipeptidnu sekvencu drugog imunoglobulinskog teškog lanca G (IgG) (H2) i polipeptidnu sekvencu kapa imunoglobulinskog kapa lakog lanca (L2), koje formiraju drugi Fab region koja se specifično vezuje za drugi antigen,
pri čemu:
sekvence svakog od H1, H2, L1 i L2 au izvedene iz humanih sekvenci ili humanizovanih sekvenci;
H1 se razlikuje od H2, a i H1 i H2 sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH domen) i konstantni domen teškog lanca 1 (CH1 domen);
L1 sadrži varijabilni domen lambda lakog lanca (VL-lambda) i konstantni domena lambda lakog lanca (CL-lambda), a L2 sadrži sadrži varijabilni domen kapa lakog lanca (VL-kapa) i konstantni domena kapa lakog lanca (CL-kapa); i
H1, H2, L1 i L2 sadrže aminokiselinske modifikacije koje pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1, u poređenju sa L2 i koje pospešuju preferencijalno sparivanje H2 sa L2 u poređenju sa L1, pri čemu je preferencijalno sparivanje veće od preferencijalnog sparivanja koje se javlja u odgovarajućem sistemu divljeg tipa, pri čemu navedene aminokiselinske modifikacije sadrže sledeće supstitucije, pri čemu je numeracija prema Kabatu:
(a) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju L143K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i V133D, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R;
(b) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju L143K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i V133D, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R;
(c) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju L143K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i V133D, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E i S188W, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, S176A i T178R; (d) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju L143K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i V133D, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E i S186I i S188W, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, S176A i T178R;
(e) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju L143K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i V133D, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160R i T178R;
(f) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju L143K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i V133D, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E i S188W, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160R, S176A i T178R;
(g) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju L143K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i V133D, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E i S186I i S188W, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160R, S176A i T178R;
(h) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju L143K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i V133D, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L124W, L143E i K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124K, V133A i T178R;
(i) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju L143K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i V133D, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124K i T178R;
(j) H1 sadrži aminokiselinske supstitucije A139W i L143K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i V133D, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, L135W i T178R;
(k) H1 sadrži aminokiselinske supstitucije L143A i S186R, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i V133W i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L124W, L143E i K145T a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124K, V133A i T178R;
(l) H1 sadrži aminokiselinske supstitucije L143A i Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T, V133W S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T Q179E i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160K i T178R;
(m) H1 sadrži aminokiselinske supstitucije A139W, L143I i S186K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T, V133D i Y178T, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, L135W, Q160K i T178R;
(n) H1 sadrži aminokiselinske supstitucije L143A i Q179K L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T, V133W i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R;
(o) H1 sadrži aminokiselinske supstitucije L143A i Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T, V133W i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R;
(p) H1 sadrži aminokiselinske supstitucije L143A i Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T, V133W i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160K i T178R;
(q) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S186R, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, T129K, Q160K i T178R;
(r) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S186R, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R;
(s) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S186R, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T, Q179E i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R;
(t) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S186R, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160K i T178R;
(u) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S186R, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160K i T178R;
(v) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S186R, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E i K145T, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160K i T178R;
(w) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S186R, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q39E, L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q38R, Q124K i T178R;
(x) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S186R, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L45P, L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije P44F, Q124K i T178R; (y) H1 sadrži aminokiselinske supstitucije A139W i S186K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T, V133D i Y178T, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, L135W, Q160K i T178R;
(z) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S186R, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, T129K, Q160K i T178R;
(aa) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S186R, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, T129K i T178R;
(bb) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S186R, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160K i T178R;
(cc) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S186R, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R;
(dd) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E i K145T, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160K i T178R;
(ee) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R;
(ff) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T, Y178E i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E i K145T, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160K i T178R;
(gg) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije F122C, L143E, K145T i Q179E a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124C, Q160K i T178R;
(hh) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T, Q179E i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160K i T178R;
(ii) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T, Y178E i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160K i T178R; (jj) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160K i T178R;
(kk) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, Q160K i T178R;
(ll) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R;
(mm) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T, Q179E i S188L, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R;
(nn) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T, Y178E i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R;
(oo) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, T129K i T178R;
(pp) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije F122C, L143E i K145T, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124C, Q160K i T178R;
(qq) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju Q179K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S180E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, T129K, Q160K i T178R;
(rr) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S188K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i Y178E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R;
(ss) H1 sadrži aminokiselinske supstitucije A139W i S188K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T, S176D i Y178T, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, L135W i T178R;
(tt) H1 sadrži aminokiselinske supstitucije A139W i S188K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T, S176E i Y178E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R, L135W i T178R;
(uu) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S188K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i Y178D, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E,a a L2 sdrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R;
(vv) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S188K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S176D i Y178T, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R; ili (ww) H1 sadrži aminokiselinsku supstituciju S188K, L1 sadrži aminokiselinske supstitucije K129T i S176E i Y178E, H2 sadrži aminokiselinske supstitucije L143E, K145T i Q179E, a L2 sadrži aminokiselinske supstitucije Q124R i T178R.
2. Konstrukt prema patentnom zahtevu 1, pri čemu aminokiselinske modifikacije pospešuju preferencijalno sparivanje H1 sa L1 u poređenju sa L2, i/ili pospešuju preferencijalno sparivanje H2 sa L2 u poređenju sa L1, kada su H1, H2, L1 i L2 koeksprimirani u ćeliji ili ćeliji sisara, ili kada su H1, H2, L1 i L2 koeksprimirani u ekspresionom sistemu bez ćelija, ili kada se H1 i L1 proizvode u ćeliji, a H2 i L2 se proizvode u različitoj ćeliji, i proizvodi te dve ćelije se mešaju postupkom redoks proizvodnje, ili kada se H1 i L1 proizvode u ekspresionom sistemu bez ćelija, a H2 i L2 se proizvode u različitom ekspresionom sistemu bez ćelija i proizvodi ta dva ekspresiona sistema bez ćelija se mešaju.
3. Konstrukt prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2, pri čemu konstrukt dalje sadrži dimerni Fc koji ima dva Fc polipeptida od kojih svaki sadrži sekvencu CH3 domensku sekvencu i kuplovan je, sa ili bez linkera, sa jednim od prvog Fab regiona i drugog Fab regiona, pri čemu je, opciono, Fc humani Fc.
4. Konstrukt prema patentnom zahtevu 3, pri čemu Fc sadrži jednu ili više modifikacija u odnosu na divlji tip,
pri čemu Fc sadrži:
i. heterodimerni IgG1 Fc koji ima modifikacije L351Y_F405A_Y407V u prvom Fc polipeptidu, i modifikacije T366L_K392M_T394W u drugom Fc polipeptidu;
ii. heterodimerni IgG1 Fc koji ima modifikacije L351Y_F405A_Y407V u prvom Fc polipeptidu, i modifikacije T366L_K392L_T394W u drugom Fc polipeptidu;
iii. heterodimerni IgG1 Fc koji ima modifikacije T350V_L351Y_F405A_Y407V u prvom Fc polipeptidu, i modifikacije T350V_T366L_K392L_T394W u drugom Fc polipeptidu; iv. heterodimerni IgG1 Fc koji ima modifikacije T350V_L351Y_F405A_Y407V u prvom Fc polipeptidu, i modifikacije T350V_T366L_K392M_T394W u drugom Fc polipeptidu; ili
v. heterodimerni IgG1 Fc koji ima modifikacije T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V u prvom Fc polipeptidu, i modifikacije T350V_T366L_N390R_K392M_T394W u drugom Fc polipeptidu;
pri čemu je numeracija aminokiselinskih ostataka u Fc u skladu sa EU sistemom numeracije; i/ili
pri čemu Fc dalje sadrži najmanje jednu sekvencu CH2 domena.
5. Konstrukt prema patentnom zahtevu 3 ili 4, pri čemu su linkeri jedan ili više polipeptidnih linkera, opciono,
pri čemu linkeri sadrže jedan ili više zglobnih regiona antitela, opciono,
pri čemu linkeri sadrže jedan ili više IgG1 zglobnih regiona.
6. Konstrukt prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu je konstrukt konjugovan sa terapeutskim agensom ili lekom.
7. Polinukleotid ili set polinukleotida koji kodira konstrukt prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5.
8. Vektor ili set vektora koji sadrži jedan ili više polinukleotida ili setova polinukleotida prema patentnom zahtevu 7, opciono, pri čemu je vektor, ili najmanje jedan vektor seta vektora multicistronski.
9. Izolovana ćelija koja sadrži polinukleotid ili set polinukleotida prema patentnom zahtevu 7, ili vektor ili set vektora prema patentnom zahtevu 8, opciono, pri čemu je ćelija ćelija kvasca, bakterijska ćelija, insekatska ćelija ili sisarska ćelija, opciono pri čemu je ćelija stabilno transfektovana ili privremeno transfektovana vektorom ili setom vektora prema patentnom zahtevu 8.
10. Farmaceutska kompozicija koji sadrži antigen-vezujući polipeptidni konstrukt prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 i farmaceutski prihvatljiv nosač, opciono, koja dalje sadrži jednu ili više supstanci odabranih iz grupe koja se sastoji od pufera, antioksidansa, molekula niske molekulske težine, leka, proteina, aminokiseline, ugljenog hidrata, lipida, helatnog agensa, stabilizatora i ekscipijensa.
11. Postupak pripreme konstrukta prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, koji sadrži korake:
(a) dobijanje ćelije-domaćina koja sadrži polinukleotid ili set polinukleotida koji kodiraju antigen-vezujući polipeptidni konstrukt;
(b) gajenje ćelije-domaćina u kulturi ćelija-domaćina pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta, i
(c) prikupljanje antigen-vezujućeg polipeptidnog konstrukta iz kulture ćelija-domaćina, opciono,
pri čemu je ćelija-domaćin privremeno transfektovana ili stabilno transfektovana polinukleotidom ili setom polinukleotida.
RS20250276A 2015-10-08 2016-10-07 Antigen-vezujući polipeptidni konstrukti koji sadrže kapa i lambda lake lance, i njihove upotrebe RS66622B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562239206P 2015-10-08 2015-10-08
US201562261769P 2015-12-01 2015-12-01
EP16852954.3A EP3359576B1 (en) 2015-10-08 2016-10-07 Antigen-binding polypeptide constructs comprising kappa and lambda light chains and uses thereof
PCT/CA2016/051183 WO2017059551A1 (en) 2015-10-08 2016-10-07 Antigen-binding polypeptide constructs comprising kappa and lambda light chains and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66622B1 true RS66622B1 (sr) 2025-04-30

Family

ID=58487196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250276A RS66622B1 (sr) 2015-10-08 2016-10-07 Antigen-vezujući polipeptidni konstrukti koji sadrže kapa i lambda lake lance, i njihove upotrebe

Country Status (19)

Country Link
US (2) US11161915B2 (sr)
EP (2) EP3359576B1 (sr)
JP (5) JP6932693B2 (sr)
KR (2) KR20260020494A (sr)
CN (2) CN116396393A (sr)
AU (3) AU2016334063B2 (sr)
BR (1) BR112018007152A2 (sr)
CA (2) CA3294001A1 (sr)
DK (1) DK3359576T3 (sr)
ES (1) ES3015389T3 (sr)
FI (1) FI3359576T3 (sr)
HK (1) HK1257174A1 (sr)
HR (1) HRP20250094T1 (sr)
HU (1) HUE070521T2 (sr)
MX (2) MX2018004285A (sr)
PL (1) PL3359576T3 (sr)
PT (1) PT3359576T (sr)
RS (1) RS66622B1 (sr)
WO (1) WO2017059551A1 (sr)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
CN105026430B (zh) 2012-11-28 2025-03-25 酵活英属哥伦比亚有限公司 工程化免疫球蛋白重链-轻链对及其用途
CA3244731A1 (en) 2014-05-28 2025-11-29 Zymeworks Bc Inc. Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
EP3359576B1 (en) * 2015-10-08 2024-12-25 Zymeworks BC Inc. Antigen-binding polypeptide constructs comprising kappa and lambda light chains and uses thereof
EP4063858A1 (en) * 2016-03-14 2022-09-28 Biogen International Neuroscience GmbH Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis assay for reliably measuring uptake of aggregated proteins
JP7274413B2 (ja) 2016-09-23 2023-05-16 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド ラムダ及びカッパ軽鎖を含む多重特異性抗体分子
US20200385472A1 (en) 2017-04-28 2020-12-10 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules comprising a non-immunoglobulin heterodimerization domain and uses thereof
UY37758A (es) * 2017-06-12 2019-01-31 Novartis Ag Método de fabricación de anticuerpos biespecíficos, anticuerpos biespecíficos y uso terapéutico de dichos anticuerpos
KR102611853B1 (ko) 2017-06-30 2023-12-08 자임워크스 비씨 인코포레이티드 안정화된 키메라 fabs
US12247060B2 (en) 2018-01-09 2025-03-11 Marengo Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases
EP3765517A1 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CA3105448A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
GB2599228B (en) 2019-02-21 2024-02-07 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
CN119039441A (zh) 2019-02-21 2024-11-29 马伦戈治疗公司 与nkp30结合的抗体分子及其用途
AU2020416273A1 (en) 2020-01-03 2022-07-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
EP4126933A1 (en) * 2020-03-22 2023-02-08 Quadrucept Bio Limited Multimers for viral strain evolution
EP4214239A4 (en) * 2020-10-14 2025-07-09 Univ Virginia Patent Foundation COMPOSITIONS AND METHODS FOR OVERCOMING DR5-INDUCED IMMUNE EVASION BY SOLID TUMORS
KR20230110291A (ko) 2020-11-18 2023-07-21 노파르티스 아게 Nlrc4-gof 염증복합체병증의 치료에 사용하기 위한 이중특이적 항체
CN118265726A (zh) * 2021-08-25 2024-06-28 广州凌腾生物医药有限公司 异源二聚体免疫球蛋白
JP2024534976A (ja) 2021-09-08 2024-09-26 ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド” Ｍｈｃタンパク質に基づくヘテロ二量体を含む二重特異性抗体
WO2023227641A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Use of tnf-alpha binding proteins and il-7 binding proteins in medical treatment
TW202434306A (zh) 2022-11-24 2024-09-01 瑞士商百濟神州瑞士有限責任公司 抗ｃｅａ抗體藥物軛合物及使用方法
CN121293352A (zh) 2023-01-19 2026-01-09 广州百济神州生物制药有限公司 抗cmet抗体及使用方法
CN120882743A (zh) 2023-03-02 2025-10-31 瑞韦博治疗公司 包含单特异性和双特异性非阻断性抗细胞因子抗体的基于细胞因子的疗法和方法
EP4676975A1 (en) 2023-03-03 2026-01-14 Beone Medicines I GmbH Muc1 and cd16a antibodies and methods of use
AR132043A1 (es) 2023-03-03 2025-05-21 Beigene Switzerland Gmbh Anticuerpos muc1 y métodos de uso
JP2026506241A (ja) 2023-03-03 2026-02-20 ビーワン メディシンズ ワン ゲーエムベーハー Ｃｄ１６ａ抗体及び使用方法
WO2024184812A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Anti-cldn6 antibodies and methods of use
WO2024184810A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Anti-cldn6 and anti-cd3 multispecific antibodies and methods of use
TW202436345A (zh) 2023-03-06 2024-09-16 瑞士商百濟神州瑞士有限責任公司 抗ｃｄ３多特異性抗體及使用方法
TW202544037A (zh) 2023-12-11 2025-11-16 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產發展有限公司 抗原結合蛋白
WO2025167974A1 (zh) * 2024-02-07 2025-08-14 上海齐鲁制药研究中心有限公司 多特异性抗体或抗原结合片段
TW202600597A (zh) * 2024-03-04 2026-01-01 加拿大商酵活英屬哥倫比亞有限公司 靶向ｄｌｌ３之三特異性抗體構築體及其使用方法
US20260008843A1 (en) 2024-06-21 2026-01-08 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Multispecific antigen binding proteins
WO2026021476A1 (en) 2024-07-24 2026-01-29 Beone Guangzhou Biologics Manufacturing Co., Ltd. Anti-cmet and anti-egfr multispecific antibody drug conjugates

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
FI85768C (fi) 1990-07-04 1992-05-25 Valtion Teknillinen Foerfarande foer utfoerning av ytplasmonresonansmaetning samt i foerfarandet anvaendbar givare.
DE69110032T2 (de) 1991-06-08 1995-12-21 Hewlett Packard Gmbh Verfahren und Gerät zur Feststellung und/oder Konzentrationsbestimmung von Biomolekülen.
CA2140280A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Avi J. Ashkenazi Bispecific immunoadhesins
US6239328B1 (en) 1992-10-05 2001-05-29 North Carolina State University Method for reducing expression variability of transgenes in plant cells
DE69535243T2 (de) 1994-07-13 2007-05-10 Chugai Seiyaku K.K. Gegen menschliches interleukin-8 gerichteter, rekonstituierter menschlicher antikörper
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
CA2248868A1 (en) 1996-03-22 1997-09-25 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule ii
US6037525A (en) 1996-08-01 2000-03-14 North Carolina State University Method for reducing expression variability of transgenes in plant cells
EP0962467A4 (en) 1996-09-26 2002-10-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody against human parathormone related peptides
GB9623820D0 (en) 1996-11-16 1997-01-08 Secr Defence Surface plasma resonance sensor
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6245974B1 (en) 1997-08-06 2001-06-12 North Carolina State University Matrix attachment regions
CA2309541C (en) 1997-11-03 2011-01-11 Human Genome Sciences, Inc. Vegi, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
PT1049787E (pt) 1998-01-23 2005-04-29 Vlaams Interuniv Inst Biotech Derivados de anticorpos multipropositos
JP2002518663A (ja) 1998-05-20 2002-06-25 グラッフィニティ ファルマシューティカル デザイン ゲーエムベーハー 液体状態で存在する多数の試料を同時に測定するためのｓｐｒセンサー
US6289286B1 (en) 1998-05-29 2001-09-11 Biacore Ab Surface regeneration of biosensors and characterization of biomolecules associated therewith
US6177612B1 (en) 1998-07-31 2001-01-23 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Department Of Agriculture And Agri-Food Canada Matrix attachment regions
WO2000018938A1 (en) 1998-09-29 2000-04-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Mar/sar elements flanking rsyn7-driven construct
CA2403739A1 (en) 2000-03-15 2001-09-20 Heska Corporation Three-dimensional model of a complex between a fc epsilon receptor alpha chain and a fc region of an ige antibody and uses thereof
KR100408844B1 (ko) 2000-07-29 2003-12-06 한국산업기술평가원 동물세포 발현벡터
WO2002048379A1 (en) 2000-12-15 2002-06-20 Pangen Biotech Inc. Expression vector for animal cell containing nuclear matrix attachment region fo interferon beta
DK1395669T3 (da) 2001-01-26 2009-11-16 Selexis Sa Matriks bindingsregioner og fremgangsmåder til anvendelse af disse
AU2002353018A1 (en) 2001-12-03 2003-06-17 Dyax Corporation Library screening
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US8005620B2 (en) 2003-08-01 2011-08-23 Dna Twopointo Inc. Systems and methods for biopolymer engineering
US7326567B2 (en) 2003-11-12 2008-02-05 Schering Corporation Plasmid system for multigene expression
KR20060132006A (ko) 2004-03-23 2006-12-20 비오겐 아이덱 엠에이 아이엔씨. 수용체 커플링제 및 이의 치료적 용도
US8150634B1 (en) 2004-11-12 2012-04-03 Bristol-Myers Squibb Company Protein-ligand NOE matching for high-throughput structure determination
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
WO2006108905A1 (es) 2005-04-13 2006-10-19 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Método in vitro para identificar compuestos para terapia del cáncer
CA2646508A1 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
EP2009101B1 (en) 2006-03-31 2017-10-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
ES2469676T3 (es) 2006-05-25 2014-06-18 Bayer Intellectual Property Gmbh Complejos moleculares dim�ricos
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
ES2593484T3 (es) 2007-03-29 2016-12-09 Genmab A/S Anticuerpos biespecíficos y métodos de producción de los mismos
DK2211904T3 (en) 2007-10-19 2016-10-24 Seattle Genetics Inc Cd19-binding agents and uses thereof
US20090148905A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Claire Ashman Antigen-binding constructs
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
US20090215119A1 (en) * 2008-02-13 2009-08-27 Dyax Corp. Methods for producing specific binding pairs
US20100075326A1 (en) 2008-09-12 2010-03-25 Cornell University Yeast surface two-hybrid system for quantitative detection of protein-protein interactions
EP2352765B1 (en) 2008-10-01 2018-01-03 Amgen Research (Munich) GmbH Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
JP2012515556A (ja) 2009-01-23 2012-07-12 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 低下したエフェクタ機能を有する安定化Ｆｃポリペプチドおよび使用方法
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
EP2417164A1 (en) 2009-04-07 2012-02-15 Roche Glycart AG Bispecific anti-erbb-2/anti-c-met antibodies
PE20120540A1 (es) 2009-05-27 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos triespecificos o tetraespecificos
SG10201810743WA (en) 2009-06-03 2018-12-28 Immunogen Inc Conjugation methods
MY192182A (en) 2009-06-26 2022-08-04 Regeneron Pharma Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
MX340971B (es) 2009-11-23 2016-08-02 Amgen Inc * Fragmento cristalizable (fc) de anticuerpo monomerico.
EP4012714A1 (en) 2010-03-23 2022-06-15 Iogenetics, LLC. Bioinformatic processes for determination of peptide binding
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
JP2013528357A (ja) 2010-03-29 2013-07-11 ザイムワークス，インコーポレイテッド 強化又は抑制されたエフェクター機能を有する抗体
HRP20241208T1 (hr) 2010-04-20 2024-11-22 Genmab A/S Heterodimerni proteini koji sadrže fc fragment protutijela i postupci za njihovu proizvodnju
KR101860963B1 (ko) 2010-04-23 2018-05-24 제넨테크, 인크. 이종다량체 단백질의 생산
CA2800769C (en) 2010-05-27 2021-11-02 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2 epitope
TW201217527A (en) 2010-07-09 2012-05-01 Biogen Idec Hemophilia Inc Processable single chain molecules and polypeptides made using same
KR101045084B1 (ko) 2010-07-12 2011-06-29 주식회사 디알텍 엑스선 검출기 및 검출방법
JP2013537416A (ja) 2010-08-13 2013-10-03 メディミューン リミテッド 変異型Ｆｃ領域を含むモノマーポリペプチド及び使用方法
CN103261220B (zh) 2010-08-16 2016-06-15 诺夫免疫股份有限公司 用于生成多特异性和多价抗体的方法
ES2758994T3 (es) 2010-11-05 2020-05-07 Zymeworks Inc Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
PT3434767T (pt) 2010-11-30 2026-01-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapêutico indutor de citotoxicidade
BR112013023918A2 (pt) 2011-03-25 2016-12-13 Glenmark Pharmaceuticals Sa imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento hetero-dimérico da mesma, método para produzir uma imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento hetero-dimérico da mesma, método para construir uma interface proteína-proteína de um domínio de uma proteína de múltiplos domínios e uso de um domínio doador de um primeiro e de um segundo membro de uma super-família de imunoglobulina de ocorrência natural
CN103796678B (zh) 2011-04-20 2018-02-27 健玛保 针对her2的双特异性抗体
EP2726504A1 (en) 2011-05-27 2014-05-07 Dutalys Antibodies with improved folding stability
TWI687439B (zh) 2011-06-30 2020-03-11 中外製藥股份有限公司 異源二聚化多胜肽
EP2543680A1 (en) * 2011-07-07 2013-01-09 Centre National de la Recherche Scientifique Multispecific mutated antibody Fab fragments
NO2748201T3 (sr) 2011-08-23 2018-05-12
SG11201401422VA (en) 2011-10-27 2014-09-26 Genmab As Production of heterodimeric proteins
CN109134658B (zh) 2011-10-31 2022-10-14 中外制药株式会社 控制了重链与轻链的缔合的抗原结合分子
BR112014010580B1 (pt) 2011-11-04 2021-01-12 Zymeworks, Inc. constructo de fc heteromultimérico isolado, composição, uso de um constructo de fc heteromultimérico isolado, composição de ácido nucléico e método para expressar o constructo de fc heteromultimérico isolado
RS60499B1 (sr) 2011-12-20 2020-08-31 Medimmune Llc Modifikovani polipeptidi za bispecifične skelete antitela
US9708388B2 (en) 2012-04-11 2017-07-18 Hoffmann-La Roche Inc. Antibody light chains
AU2013258834B2 (en) 2012-05-10 2017-09-07 Zymeworks Bc Inc. Heteromultimer constructs of immunoglobulin heavy chains with mutations in the Fc domain
US9499634B2 (en) 2012-06-25 2016-11-22 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
IN2015DN01299A (sr) * 2012-07-23 2015-07-03 Zymeworks Inc
EP2904093B1 (en) 2012-10-03 2019-04-10 Zymeworks Inc. Methods of quantitating heavy and light chain polypeptide pairs
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US9562110B2 (en) * 2012-11-21 2017-02-07 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Bispecific antibody
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
CN105026430B (zh) * 2012-11-28 2025-03-25 酵活英属哥伦比亚有限公司 工程化免疫球蛋白重链-轻链对及其用途
US10047163B2 (en) 2013-02-08 2018-08-14 Abbvie Stemcentrx Llc Multispecific constructs
ES2821753T3 (es) * 2013-03-15 2021-04-27 Lilly Co Eli Procedimientos de producción de Fab y de anticuerpos biespecíficos
WO2014182970A1 (en) * 2013-05-08 2014-11-13 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
EP3055362B1 (en) 2013-10-07 2021-04-21 PPG Industries Ohio, Inc. Treated fillers compositions containing same, and articles prepared therefrom
BR112016006929A2 (pt) 2013-10-11 2017-09-19 Hoffmann La Roche Anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de preparação de anticorpo, de tratamento de pacientes e de geração de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo
ES2936810T3 (es) * 2014-05-16 2023-03-22 Pfizer Anticuerpos biespecíficos con interfaces CH1-CL de ingeniería
CA3244731A1 (en) * 2014-05-28 2025-11-29 Zymeworks Bc Inc. Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
GB201414823D0 (en) 2014-08-20 2014-10-01 Argen X Bv Multispecific antibodies
WO2016172485A2 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Genentech, Inc. Multispecific antigen-binding proteins
US10941176B2 (en) * 2015-07-28 2021-03-09 Caris Science, Inc. Therapeutic oligonucleotides
EP3359576B1 (en) * 2015-10-08 2024-12-25 Zymeworks BC Inc. Antigen-binding polypeptide constructs comprising kappa and lambda light chains and uses thereof
CN108779182A (zh) 2015-12-28 2018-11-09 麻省理工学院 具有恒定区突变的双特异性抗体及其用途
JP7274413B2 (ja) 2016-09-23 2023-05-16 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド ラムダ及びカッパ軽鎖を含む多重特異性抗体分子
EP3577137A1 (en) 2017-02-02 2019-12-11 Merck Patent GmbH Preferred pairing of antibody domains
CN110382529B (zh) 2017-03-02 2024-03-08 诺华股份有限公司 工程化的异源二聚体蛋白质
UY37758A (es) 2017-06-12 2019-01-31 Novartis Ag Método de fabricación de anticuerpos biespecíficos, anticuerpos biespecíficos y uso terapéutico de dichos anticuerpos
CN120383671A (zh) 2019-09-30 2025-07-29 阿迪马布有限责任公司 被工程化用于优先轻链配对的ch1结构域变体和包括所述ch1结构域变体的多特异性抗体
AU2021256936A1 (en) * 2020-04-15 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates

Also Published As

Publication number Publication date
HUE070521T2 (hu) 2025-06-28
AU2016334063B2 (en) 2023-05-25
JP7478876B2 (ja) 2024-05-07
JP2025124635A (ja) 2025-08-26
MX2022013667A (es) 2022-11-30
US20190338048A1 (en) 2019-11-07
HK1256173A1 (en) 2019-09-13
CN116396393A (zh) 2023-07-07
KR20180069839A (ko) 2018-06-25
EP3359576A4 (en) 2019-08-28
ES3015389T3 (en) 2025-05-05
EP4524161A3 (en) 2025-06-04
HRP20250094T1 (hr) 2025-03-28
DK3359576T3 (da) 2025-01-27
BR112018007152A2 (en) 2018-11-06
EP3359576A1 (en) 2018-08-15
CN108283001A (zh) 2018-07-13
US11161915B2 (en) 2021-11-02
KR102916929B1 (ko) 2026-01-23
EP3359576B1 (en) 2024-12-25
AU2023214302B2 (en) 2025-10-09
RU2018116846A (ru) 2019-11-08
US12540198B2 (en) 2026-02-03
JP2018535947A (ja) 2018-12-06
RU2018116846A3 (sr) 2020-03-27
PT3359576T (pt) 2025-03-27
WO2017059551A1 (en) 2017-04-13
CA3294001A1 (en) 2026-03-02
CA3000869A1 (en) 2017-04-13
US20210355239A1 (en) 2021-11-18
FI3359576T3 (fi) 2025-01-29
JP7250863B2 (ja) 2023-04-03
MX2018004285A (es) 2018-11-09
KR20260020494A (ko) 2026-02-11
JP2021184741A (ja) 2021-12-09
AU2025283517A1 (en) 2026-01-22
JP6932693B2 (ja) 2021-09-08
CN108283001B (zh) 2022-08-19
AU2016334063A1 (en) 2018-04-26
JP2024097017A (ja) 2024-07-17
JP2023088986A (ja) 2023-06-27
JP7674560B2 (ja) 2025-05-09
PL3359576T3 (pl) 2025-04-14
EP4524161A2 (en) 2025-03-19
AU2023214302A1 (en) 2023-08-31
HK1257174A1 (zh) 2019-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7674560B2 (ja) カッパ及びラムダ軽鎖を含む抗原結合ポリペプチド構築物及びその使用
KR102611853B1 (ko) 안정화된 키메라 fabs
CA3064966C (en) Stabilized chimeric fabs
RU2824193C2 (ru) Антигенсвязывающие полипептидные конструкции, содержащие легкие цепи каппа и лямбда, и их применения
HK40120194A (en) Antigen-binding polypeptide constructs comprising kappa and lambda light chains and uses thereof
HK40094545A (zh) 包含κ和λ轻链的抗原结合多肽构建体及其用途
HK1256173B (en) Antigen-binding polypeptide constructs comprising kappa and lambda light chains and uses thereof
HK40020709A (en) Stabilized chimeric fabs
HK1237351A1 (en) Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof